Download PDF
ads:
UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA – CÂMPUS DE BOTUCATU
INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS
DEPARTAMENTO DE PARASITOLOGIA
ESTRUTURA POPULACIONAL DE Lutzomyia longipalpis ATRAVÉS DA AMPLIFICAÇÃO E
SEQUENCIAMENTO DO SEGMENTO RIBOSSOMAL 12S DE DNA MITOCONDRIAL
Dissertação apresentada ao Curso de Pós-Graduação em
Biologia Geral e Aplicada, Área de concentração: Biologia de
Parasitas e Microorganismos do Instituto de Biociências-
UNESP, Universidade Estadual Paulista, para obtenção do
título de Mestre.
ALUNA: LETÍCIA TSIEME GUSHI
ORIENTADOR: PAULO EDUARDO MARTINS RIBOLLA
BOTUCATU / SP
2008
ads:
Livros Grátis
http://www.livrosgratis.com.br
Milhares de livros grátis para download.
Letícia Tsieme Gushi
Letícia Tsieme GushiLetícia Tsieme Gushi
Letícia Tsieme Gushi
ESTRUTURA POPULACIONAL DE Lutzomyia longipalpis ATRAVÉS DA AMPLIFICAÇÃO E
SEQUENCIAMENTO DO SEGMENTO RIBOSSOMAL 12S DE DNA MITOCONDRIAL
ORIENTADOR: PAULO EDUARDO MARTINS RIBOLLA
BOTUCATU / SP
2008
ads:
“Aos meus maiores ídolos, dedico este trabalho: meus
pais Sérgio Seitoko Gushi e Célia Regina Santa Rosa
Gushi por tanto apoiarem meus estudos, pelo amor
incondicional e por serem minha força nos momentos de
fraqueza”.
“Certa vez, um sábio chinês presenteou o imperador com um livro. O livro tinha apenas duas páginas. Ao
dá-lo, o sábio explicou: “No momento mais triste da sua vida, senhor imperador, leia a primeira página e feche
o livro. E no momento mais feliz, leia a segunda. O presente terá atingido seu objetivo.”
Tempos depois, o azar abateu-se sobre o império. Uma peste matou parte da população, uma praga
destruiu a lavoura, bárbaros invadiram as terras saqueando o que sobrara. Desesperado, o imperador lembrou-
se do livro: Na primeira página, somente uma frase curta: “Isso vai passar”.Incansável e laborioso, ele
convocou seus conselheiros e pediu o apoio de seu povo para expulsar os invasores, debelar a peste e recuperar
a lavoura.
Mais tarde, sua única filha casou-se com o filho de um imperador vizinho e os dois países se uniram num
único e imenso império. Feliz da vida, o imperador lembrou-se novamente do livro e foi direto à segunda
página, onde se lia apenas outra frase curta: “Isso também vai passar”.Moral da história: não devemos nos
embriagar pelas grandes alegrias e nem nos deixar abater pelas grandes frustrações.”.
Trecho retirado do livro: Transformando Suor em Ouro de Bernardinho.
Agradecimentos
AgradecimentosAgradecimentos
Agradecimentos
Agradeço primeiramente a Deus por fazer parte de uma minoria deste país que consegue concluir seus
estudos e lutar pelos seus sonhos.
Agradeço ao meu orientador Paulo Ribolla, por confiar no meu trabalho e oferecer-me esta oportunidade
dentro do seu laboratório, para que eu pudesse amadurecer profissionalmente. Uma pessoa admirável, sempre
muito acessível e com palavras de incentivo para todos seus orientados, proporcionando-nos um ambiente de
trabalho agradável e de liberdade plena no exercício da nossa criatividade.
Agradeço a FAPESP (Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo) por conceder a minha
bolsa de mestrado durante o período de 24 meses, assim pude dedicar-me integralmente a este trabalho.
Agradeço à Doutora Vera Lúcia Fonseca de Camargo-Neves, pesquisadora da Superintendência de
Controle de Endemias no estado de São Paulo, por fornecer gentilmente os insetos utilizados neste estudo e
por me oferecer a oportunidade de realizar o curso prático de Identificação Morfológica de Phlebotominae em
Araçatuba.
Agradeço a equipe do Laboratório de Entomologia Molecular: Jayme, Karina, Diego, Letícia, Aline,
Alberto, Bianca, Neto e Soneca por me passarem todos os conhecimentos que eu necessitei para realização
deste estudo e pela paciência com os meus muitos erros cometidos durante o caminho.
Agradeço à Lilian Aparecida Colebrusco Rodas e a Neusinha por me receberem tão bem em Araçatuba,
ministrando o curso de Identificação Morfológica de Phlebotominae, para que eu pudesse enriquecer meu
trabalho.
Sou muito grata a Virginia Coscrato, do Departamento de Genética, por ter atenciosamente me socorrido
nos últimos sequenciamentos que teimavam em dar errado.
Obrigada a todos docentes, funcionários e estagiários do Departamento de Parasitologia por me
receberem sempre prestativos e carinhosos com todos.
Agradeço especialmente minha família, por sempre apoiarem as minhas escolhas, incentivando-me a lutar
pelos meus objetivos. Muito obrigada: pai, mãe, minha irmã Lívia, meu cunhado Juliano e meu irmão Marcel
por estarem sempre presentes na minha vida, nos bons e maus momentos, por todo amor, compreensão, carinho,
confiança e respeito. Vocês são o meu porto-seguro nos momentos de insegurança. Amo muito todos vocês.
Agradeço meus avôs maternos Bortholo e Júlia e meus avôs paternos Francisco e Eunice por serem os
alicerces sólidos de uma família muito especial e amorosa. Obrigada por todo carinho e amor incondicional que
vocês dedicam a mim. Agradeço também a todos os meus tios por vibrarem com as minhas conquistas e
participarem de todos os momentos importantes da minha vida, agradeço especialmente aos meus tios Rosa e
João Tancler, Celso e Marileide Gushi e meu tio Maurício Santa Rosa.
Obrigada aos meus amigos, a família que Deus me permitiu escolher, por todos os momentos de
desabafos, de choros, de risadas, bagunça, churrascos, festas, por sempre estarem ao meu lado e vibrarem com o
meu sucesso, por compreenderem minha ausência nestes últimos tempos, a vocês que sempre estarão em meus
pensamentos: Kátia, Patrícia, Élen, Érica, Fer, Jú, Clívia “Tchutchuka” e Danilo, Gilsara “Kuel”, Liri, Paula
“Sedada”, Luciana “Capitu”, “Severina”, Lígia ”Xilema”, Cristiane “Bolor”, Sabrina “Maritaka”, Gorete,
Aline Benetti, Satie, “Ériquinha”, Tarina, Paula Souza, Damon, “Eré”, “Beto” e Alessa, muito obrigada por
fazerem parte da minha vida! É o amor de vocês que me guia quando me perco ao longo deste caminho cheio de
obstáculos que é viver.
E por último e não menos importante, meus sinceros agradecimentos a uma pessoa recém chegada a
minha vida, mas que se tornou muito especial, obrigada ao Emanuel por todo carinho, compreensão e
companheirismo.
Resumo
A leishmaniose visceral americana (LVA) é, primariamente, uma zoonose crônica, tendo como
agente etiológico, nas Américas, protozoários da espécie Leishmania chagasi. Sua transmissão,
inicialmente silvestre ou concentrada em pequenas localidades rurais, já ocorre em centros urbanos.
É um crescente problema de saúde pública no Brasil sendo uma endemia em franca expansão
geográfica. Está distribuída em 19 dos 27 Estados da Federação, atingindo quatro das cinco regiões
brasileiras
. Entre 1985 e 2000, a leishmaniose atingiu no Brasil 422,5 mil pessoas.
O contínuo crescimento antrópico desordenado vivenciado nas grandes áreas urbanas do
Estado de São Paulo, ocasiona em um gradativo aumento de áreas onde as condições precárias de
moradia contribuem para o aumento da população de flebotomíneos. A região oeste do Estado de
São Paulo registrou em 1998, pela primeira vez, um caso de cão infectado. A doença em cães,
desde o primeiro registro, já foi notificada em 45 municípios, ocorrendo em seis regiões
administrativas: Araçatuba, Bauru, Marília, Presidente Prudente, São João da Boa Vista e Grande
São Paulo. Em humanos, até junho de 2006, a doença já havia sido registrada em 34 municípios das
regiões de Araçatuba. Bauru, Marília e Presidente Prudente. A espécie Lutzomyia longipalpis até
junho de 2006 foi detectada em zona urbana de 68 municípios das regiões administrativas de
Araçatuba, Bauru, Marília e Presidente Prudente, e mais recentemente na região de São João da
Boa Vista, no município de Espírito Santo do Pinhal. Desde então, a sua expansão vem sendo
verificada a partir da adaptação do vetor em municípios vulneráveis. A importância do estudo da
população destes insetos é para potencializar o combate e a erradicação de tal moléstia, além de
incentivar esforços no sentido preventivo quanto a atividades sanitárias em detrimento das medidas
polêmicas atualmente utilizadas que envolvem sacrifícios de animais. Entretanto, têm-se acumulado
evidências que sugerem a existência de um complexo e não apenas uma espécie de Lutzomyia
longipalpis na natureza. O objetivo deste estudo foi comparar diferentes populações de Lutzomyia
longipalpis, provenientes de alguns municípios paulistas onde o Programa de Vigilância e Controle
da LVA detectou a presença da espécie vetora, e utilizamos como grupo externo uma população de
Teresina (Piauí), utilizando - se para tal da amplificação do segmento 12S rDNA mitocondrial como
ferramenta para estudar estas populações, verificando a variação intra-específica afim de
acrescentar ferramentas para o melhor entendimento da introdução da doença no estado de São
Paulo, e também para o combate do vetor no Brasil.
Palavras chaves: Lutzomyia longipalpis, 12S rDNA, estrutura populacional.
Abstract
American visceral leishmaniasis (AVL) is a chronic zooanotic disease that can affect the
humans and is caused by Leishmania chagasi. Its transmission first was in wild areas or small
agricultural localities, but recently it occurs in urban centers. It is an increasing problem in the Public
Health in Brazil. It is distributed in 19 of 27 states of this country. Between 1985 and 2000 the AVL
reached 422, 5 thousand people.
The continuous and disordered population growth in big urban centers at São Paulo state leads
increase gradual areas where precarious conditions of habitation contribute to an increasing of vector
population. The first register of AVL in this state was in 1998, an infected dog case. Since this first
register, the disease was informed in 45 cities, divided in 6 administrative regions: Araçatuba, Bauru,
Marília, Presidente Prudente, São João da Boa Vista e Grande São Paulo. In humans even 2006
June was registered in 34 cities around Araçatuba region. The specie Lutzomyia longipalpis was
detected in urban areas of 68 cities of the: Araçatuba, Bauru, Marília e Presidente Prudente and
more recently São João da Boa Vista region. Since then its expansion comes being noticed with a
vector adaptation in vulnerable cities. The studies about population this insect is important to control
and eradicate the AVL, beyond stimulating efforts to prevention in detriment of sanity providences
actuality utilized that involve animals sacrifices. However evidences have been accumulated that
Lutzomyia longipalpis isn’t single specie but is species complex in the nature. The objective this study
was to compare different Brazilian populations of Lutzomyia longipalpis by amplification and
sequencing the12S rDNA mitochondrial to study intra-specifics variations to understand the history of
introduction this disease in São Paulo state and control your vector in Brazil.
Key-words: Lutzomyia longipalpis, 12 S rDNA, population structure.
1. Introdução
1.1. Histórico da Leishmaniose
A primeira observação dos agentes etiológicos das leishmanioses ocorreu no final do século
XIX, quando CUNNINGHAM (1885), na Índia, descreveu formas amastigotas em casos
denominados “Calazar”. Posteriormente, em 1898, o pesquisador russo BOROVISKY demonstrou
ser um protozoário o agente etiológico encontrado no oriente, sem, entretanto lhe dar nome. Mais
tarde, LEISHMAN (1903), observou corpúsculos ovais com 2-3 µm de diâmetro em preparações de
baço de um soldado inglês que havia morrido de febre Dum-Dum, contraída em Calcutá na Índia. Ao
mesmo tempo, DONOVAN (1903), relatou esses mesmo parasitos em aspirados esplênicos de um
menino hindu com 12 anos de idade e que estava acometido de uma febre irregular. LASVERAN &
MESNIL em 1903 consideraram que o parasito associado ao calazar indiano um piroplasma,
nomeando-o então de Piroplasma donovani. Ainda em 1903, ROSS demonstrou que os organismos
evidenciados na preparação de DONOVAN não eram esporozoários como este havia proposto e
estabeleceu um novo gênero (Leishmania) e denominou de Leishmania donovani o agente etiológico
do calazar. Em 1904, ROGERS cultivou o protozoário em sangue citratado a 22ºC e demonstrou
serem flagelados. Em 1908 NICOLLE & COMTE demonstraram pela primeira vez o parasito em
cães na Tunísia, sugerindo seu possível papel como reservatório da doença. GENARO, 2005.
Em 1934, PENNA, relatou o primeiro encontro o parasita no Brasil, após examinar lâminas de
cortes histológicos de fígados, obtidos por meio de viscerotomia post-mortem para o diagnóstico
anatomopatológico da febre amarela, observou então o protozoário do gênero Leishmania em 41
lâminas GENARO, 2005.
Entre 1936 e 1939, Evandro Chagas e seus colaboradores realizaram extensos estudos
demonstrando então a doença em homens e em cães e o flebotomíneo Lutzomyia longipalpis foi
incriminado como provável vetor e como agente etiológico nas Américas foi classificado como
Leshmania chagasi CUNHA & CHAGAS (1937).
Lutzomyia longipalpis, flebotomíneo transmissor da leishmaniose visceral endemicamente
encontrado na região nordeste do Brasil, foi originalmente identificado como transmissor de tal
moléstia por LUTZ & NEIVA (1912).
Em 1969, MANGABEIRA, por meio de morfológicas e ecológicas observações observou
diferenças morfológicas entre populações do Norte e Nordeste do Brasil, sugerindo pela primeira vez
a existência de um complexo de espécies dentro da espécie Lu. longipalpis. Desde então, o acúmulo
de evidências sugere a existência de um complexo e não apenas de uma espécie deste transmissor,
em virtude da sua enorme diversidade presente nas diferentes partes do mundo.
FORATTINI et al. (1970) relata o encontro de indivíduos da espécie no estado de São Paulo,
na cidade de Salto de Pirapora.
Na última década houve um grande aumento de estudos genéticos desses flebotomíneos com
evidências que mostram a existência de um complexo de Lutzomyia longipalpis na natureza, cuja
diferenciação é taxonomicamente indistinguível pela proximidade das suas características
morfológicas, mostrando-se em muitos casos problemática ou impossível BAUZER (2002).
Atualmente as técnicas bioquímicas e moleculares têm sido amplamente utilizadas na
identificação das espécies ou cepas de parasita. O DNA ribossomal (rDNA), tem sido bastante
explorado nos estudos de seqüências nucleares em análises de evolução, por apresentar vantagens
como o alto ritmo de mutações no ITS2 (espaço interno transcrito 2), rapidez, fácil uso e abrangência
de múltiplos sítios alvo, o que pré-define esse tipo de sistema de marcadores. Outra técnica utilizada
para o estudo de variabilidade genética é a de microsatélites, que são seqüências de DNA com
unidade de repetição pequena, no máximo 6bp e comprimento total que geralmente não excede
200bp. Os microsatélites estão amplamente distribuídos no genoma de eucariotos e são bastante
polimórficos.
Neste sentido, o objetivo do projeto é adaptar e aplicar a metodologia 12rDNA para a análise
genética de populações de Lutzomyia sp, visando a sua utilização no estudo de monitoramento de
diferentes espécies, cujo propósito reside na análise de diversidade genética.
1.2. Ciclo de transmissão da Leishmaniose Visceral Americana, MICHALICK & GENARO
(2005).
O ciclo biológico da Leishmania chagasi, protozoário causador da Leishmaniose Visceral
Americana, é do tipo heteroxênico, isto é possui hospedeiro intermediário e definitivo, e possui como
transmissor as fêmeas da espécie Lutzomyia longipalpis, denominado também de hospedeiro
invertebrado; onde são encontradas as formas promastígotas e paramastígotas, estas se localizam
no lúmen do trato digestório.
As fêmeas de Lu. Longipalpis necessitam de alimentação sangüínea (repasto sangüíneo) para
o desenvolvimento dos ovos, ao se alimentarem do sangue de um animal infectado, as fêmeas
ingerem juntamente com o sangue, macrófagos e monócitos parasitados pelas formas amastígotas.
Estas células parasitadas rompem-se liberando as formas amastígotas que após divisão binária
transformam-se em promastígotas arredondadas e de flagelo curto, que se dividem intensamente ou
alongadas de flagelo longo cujo processo de divisão é bem menos intenso. Cerca de 48 a 71 horas
após o repasto sangüíneo a matriz peritrófica se rompe liberando as formas promastígotas livres que
migram para o intestino anterior. Na válvula estomadeo, no esôfago, na faringe e no cibário são
encontradas: paramastígotas metacíclicas que são infectantes para o hospedeiro vertebrado. A
transmissão do parasito ocorre quando as fêmeas infectadas se alimentam em vertebrados
susceptíveis.
No local da picada do inseto vetor, as formas promastigotas metacíclicas injetadas são
fagocitadas por células do SMF, onde encontram condições ideais para sua multiplicação,
imediatamente transformam-se em formas amastigotas e iniciam sua multiplicação por divisão
binária no interior do vacúolo fagocitário dos macrófagos. Quando estão densamente parasitados, os
macrófagos rompem-se liberando as formas amastigotas que serão fagocitadas por novos
macrófagos dando continuidade a sua multiplicação dentro do hospedeiro.
No hospedeiro vertebrado são encontradas as formas amastigotas da espécie L. chagasi,
parasitam células do sistema mononuclear fagocitário (SMF), principalmente os macrófagos. No
homem estas formas amastigotas localizam-se em órgãos linfóides, como a medula óssea, baço e
linfonodos. No hospedeiro invertebrado Lutzomyia longipalpis, são encontradas as formas
paramastígotas, promastígotas e promastígotas metacíclicas ao longo do intestino médio e anterior.
Anteriormente a transmissão da doença era relatada somente em áreas silvestres e rurais;
atualmente é relatada em centros urbanos. Acredita-se que um dos fatores que contribui para esta
mudança seja a maior adaptação do inseto a estas áreas. No entanto, os criadouros do inseto em
área urbana ainda não são conhecidos, o que dificulta o controle das populações de insetos nestes
locais.
Figura 1: Representando o ciclo biológico da doença.
Fonte: www.brilhantels.com
1.3. O vetor
O principal mecanismo de transmissão da L. chagasi em condições naturais e de importância
epidemiológica ocorre através da picada da fêmea de Lu longipalpis nas quais as formas
metacíclicas movimentam-se livremente na probóscida e são inoculadas no hospedeiro através do
repasto sangüíneo. Alguns autores acreditam que em decorrência do intenso parasitismo e de
enzimas produzidas pelos parasitos no intestino anterior do inseto, possa ocorrer um bloqueio e
lesão da válvula proventricular, provocando então, a regurgitação dos promastígotas para a derme
do vertebrado no momento da alimentação do flebotomíneo. (MICHALICK & GENARO, 2005)
Os insetos veiculadores da Leishmania sp. pertencem a família usualmente denominada de
Psycodidae. Essa família apresenta seis subfamílias: Bruchomyiinae, Trichomyiinae, Horaiellinae,
Psychodinae, Phlebotominae e Sycoracinae. Sendo somente as duas últimas de importância
médica, devido aos hábitos hematófagos de suas fêmeas. As fêmeas da subfamília Sycoracinae
alimentam-se do sangue de vertebrados heterotermos, já as fêmeas da subfamília Phlebotominae
alimentam-se do sangue de anfíbios, répteis, aves e mamíferos, inclusive o homem. Os
flebotomíneos apresentam ampla distribuição geográfica, sendo encontrados em diversas condições
climáticas e de altitude, em ambientes silvestres, rurais e urbanos.
No Brasil, são popularmente conhecidos como: asa branca, birigui, cangalhinha, flebótomo (ou
freboti), mosquito-palha e tatuquira.
Medem de 2 a 4 mm de comprimento, possuem o corpo coberto por pêlos finos, apresentam
escamas intermescladas sobre as asas e esternitos abdominais. Estes insetos possuem como
característica acentuada, a posição da cabeça formando um ângulo de 90º em relação ao eixo
longitudinal do tórax; quando vivos, em posição de repouso, as asas são mantidas divergentes em
posição semi-ereta; possui extremidade posterior do abdome bem diferenciada: sendo nos machos
bifurcada e nas fêmeas pontiaguda ou ligeiramente arredondada (Figuras 2 e 3). Suas peças bucais
são do tipo sugador pungitivo, constituídas pelo labro, um par de mandíbulas, hipofaringe, um par de
maxilas e lábio. Nos machos, geralmente a mandíbula está ausente. Pouquíssimos grupos
apresentam a mandíbula rudimentar GALATI (2003), o que os incapacita de penetrar a pele de
vertebrados e portando os impedem de alimentarem-se de sangue. Portanto, somente as fêmeas
alimentam-se de sangue, o qual é a fonte de proteínas e aminoácidos necessários para o
desenvolvimento dos ovos.
Quanto à necessidade de açúcar, esta ocorre em ambos os sexos, tanto machos quanto
fêmeas necessitam de carboidratos como fonte de energia. Estudos sobre flebótomos capturados
em campo revelaram a presença da melesitose e do seu produto da hidrólise, a tiranose, em seus
tratos digestórios. A melesitose é um constituinte da substância pegajosa excretada por afídios
(pulgões) e depositada sobre a superfície das folhas e caules de plantas em que se alimentam da
seiva; trata-se de uma substância produzida dentro do sistema digestório destes insetos. Outro
açúcar encontrado na substância pegajosa é a frutomaltose, cujos produtos de decomposição
(maltose, sacarose, glucose, frutose) são os açúcares mais comumente encontrados nos
flebotomíneos capturados em campo.
Os promastígotas de Leishmania necessitam de açúcares para se desenvolver e se multiplicar
no trato digestório destes insetos, portanto acredita-se que a distribuição geográfica da doença pode
depender da disponibilidade de fontes naturais de carboidratos.
Figura 2 (à esquerda): Macho de Lutzomyia sp Figura 3 (à direita): Fêmea de Lutzomyia sp
(fonte: www.antropozoonosi.it/vettori/flebotomi.htm).
1.4. Ciclo Biológico dos Flebotomíneos, WILIAMS & DIAS (2005)
Pouco se conhece sobre os locais de desenvolvimento dos flebotomíneos, suas formas
imaturas têm sido encontradas, geralmente em pequeno número, em detritos de fendas rochosas,
no chão de cavernas, no solo entre raízes de árvores, debaixo de folhas mortas e úmidas de
florestas. A única informação segura é que os flebotomíneos desenvolvem-se em substrato úmido,
porém não molhado rico em matéria orgânica em decomposição. Devido à dificuldade de encontrar
os locais naturais de desenvolvimento, a maior parte das informações sobre os estágios imaturos
provém das observações das criações em laboratório. Acredita-se que neste substrato rico em
matéria orgânica a fêmea deposita seus ovos que possuem como características serem alongados,
elípticos, ligeiramente recurvados e esbranquiçados. Medem de 300 a 500 micrômetros. Destes
ovos eclodem as larvas que irão passar por 4 estádios larvais. Apresentam a cabeça bem definida e
escura. Seu corpo é vermiforme, com três segmentos torácicos e nove abdominais, os quais
apresentam pseudópodos que permitem a locomoção das larvas no substrato. Após atingir o quarto
estádio larval o próximo estágio, o de pupa, estas são cilíndricas, medem cerca de 2 mm. Possuem
um cefalotórax sem segmentação nítida e uma abdome com nove segmentos. A extremidade
posterior do abdome da pupa é envolvida pela exúvia do quarto estádio larval. Da pupa emerge o
inseto adulto. (Fig.4)
Figura 4: Ilustração dos estágios evolutivos do vetor.(Fonte: WILLIAMS & DIAS, 2005)
1.5. Identificação Morfológica de Flebotomíneos
Para que seja possível a identificação morfológica das espécies de flebotomíneos, são
necessários tratamentos denominados: clarificação e em alguns caso coloração dos insetos para
que possam ser visualizadas as estruturas importantes para a leitura da chave de identificação
(Figura 6). Após estes processos, o espécime é dissecado, para ser preparada a lâmina. Os machos
são divididos em: cabeça e tórax, sua cabeça é posicionada de forma dorso-ventral e o tórax e
abdome em posição lateral, já as fêmeas são separadas em: cabeça, tórax e abdome, e posicionada
de forma que a cabeça fique de forma ventral, e o tórax e abdome em posição lateral. São
observadas então em microscópio óptico, as estruturas presentes nas chaves de identificação dos
táxons da América, que foram desenvolvidas de acordo com a classificação de Galati (1995), esta
classificação é utilizada principalmente no estado de São Paulo no entanto, existem outras
classificações que também são utilizadas. Este método de identificação requer habilidade e
experiência na montagem e análise das lâminas, pois muitas vezes a manipulação do inseto leva a
perda ou deslocamento de estruturas importantes para se seguir as chaves de identificação e por se
tratar de um inseto muito pequeno é necessário um bom treinamento para realizar a identificação
das espécies, já que são estruturas delicadas e difíceis de serem observadas. Quando a fauna local
já foi previamente estudada e se tem conhecimento das espécies que ocorrem no local; para tornar
mais ágil o processo de identificação, já que analisam grandes números de lâminas, os profissionais
do órgão responsável pelo controle da doença no estado de São Paulo, a Superintendência de
Controle das Endemias - SUCEN identificam as espécies através das suas genitálias. Nos machos
observam-se os ductos ejaculadores e a bomba ejaculadora e nas fêmeas observam-se: na cabeça
o cibário e no abdome as espermatecas com seus ductos individuais. Cada espécie possui uma
morfologia bem diferenciada como está exemplificada na Figura 5, onde se observa um esquema
das genitálias de diferentes espécies de flebotomíneos como são vistas em lâmina após o processo
de clarificação e montagem dos insetos.
Fig. 5: Esquema de espermatecas, ductos espermatecais e forquilha genital de fêmea e
terminália de macho da espécie Lutzomyia longipalpis. (Fonte: WILLIAMS & DIAS, 2005)
Figura 6: Extremidade posterior do abdome de uma fêmea da espécie Lutzomyia longipalpis e
Figura 7: Extremidade posterior do abdome de um macho da espécie Lutzomyia longipalpis,
observadas em microscópio de luz.
1.6. Controle do vetor
O programa brasileiro de controle da leishmaniose visceral possui três medidas básicas
para impedir o avanço da doença no país: a detecção e tratamento de casos humanos, a
eliminação de reservatórios domésticos e controle dos vetores da área de foco, ou seja, a área
que compreende em 200 m em torno do caso humano ou canino notificado pelos órgãos
responsáveis FUNDAÇÃO NACIONAL DE SAÚDE, 2003.
Para o controle do vetor, de acordo com o Manual de Vigilância e Controle da Leishmaniose
Visceral Americana do Estado de São Paulo, 2006, são tomadas as seguintes medidas:
1. Manejo ambiental: Consiste na poda de árvores, eliminação de matéria orgânica do solo e
de vegetação em quintais e jardins (peridomicílio), praças, parques públicos e terrenos
baldios, para que assim diminua-se a quantidade de matéria orgânica e locais sombreados,
condições que são favoráveis ao estabelecimento de criadouros do vetor.
2. Controle químico: Aplicação de inseticida de ação residual nos municípios com transmissão
humana durante o período climático favorável ao aumento da densidade do vetor, que
compreende no período de dezembro a fevereiro. A aplicação do inseticida deve ser
realizada pelos municípios, e de deve abranger o intra e peridomicílio dos imóveis da área
foco delimitada. Os inseticidas atualmente recomendados pelo Ministério da Saúde, para tal
controle, são os inseticidas do grupo dos piretróides sintéticos. Para os diferentes tipos de
acabamentos das paredes a serem tratadas há uma formulação adequada que deve ser
rigorosamente seguida.
3. Atividades educativas: Consiste na sensibilização da população quanto sua participação no
combate e controle da doença para isso é necessário o desenvolvimento de práticas de
educação em saúde voltadas para uma melhoria da qualidade de vida, individual e coletiva,
levando à população informações sobre a doença e sua prevenção. Para o sucesso desta
atividade é importante o envolvimento não apenas dos órgãos responsáveis pelo controle
da doença e sim incluir a participação de todos os profissionais de saúde e dos membros da
comunidade. São as seguintes ações que a população deve adotar para o combate à
Leishmaniose Visceral:
• Notificar ao órgão responsável pelo combate de doenças a presença de insetos
incômodos picando durante a noite;
• Redução de possíveis criadouros através da freqüente poda de árvores e gramados e a
retirada de matéria orgânica do solo;
• Instalar tela de malha fina nas residências para minimizar o contato do vetor com a
população humana;
• Notificar a presença de cães sintomáticos e entregar o animal doente ao setor
responsável do município;
• Colaborar com a equipe de saúde nos inquéritos sorológicos ou nas atividades de
investigação do foco, facilitando a coleta de amostras de sangue durante a busca ativa
de cães assintomáticos e recolhimento de cães doentes e soropositivos para a doença.
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
Em 1993, a Organização Mundial da Saúde - OMS considerou a Leishmaniose como a
segunda doença de importância pública causada por protozoário nos quatro continentes,
considerando-a endêmica em 88 países dos quais, 72 estão em desenvolvimento. Assim, 90% dos
casos de leishmaniose visceral são registrados em Bangladesh, Brasil, Nepal, Índia e Sudão. No
Brasil, encontra-se disseminada em 17 estados das regiões Norte, Nordeste, Centro-Oeste e no
Sudeste RATH et. al.(2003).
Pelo menos vinte espécies de Leishmania foram identificadas nas Américas as quais foram
agrupadas em quatro complexos de acordo com as características clínicas da doença: leishmaniose
cutânea persistente, cutânea difusa, muco-cutânea e leishmaniose visceral, tendo como principais
responsáveis respectivamente pela Leishmania (L.) mexicana, Leishmania (L.) amazonensis,
Leishmania (V.) braziliensis e Leishmania (L.) chagasi GRIMALDI & TESH (1993), DESJEUX (1996).
Quanto à descrição de sua estrutura organizacional, existe uma enorme dificuldade na
elaboração da taxonomia e sistemática deste gênero devido a grande semelhança morfológica das
várias espécies. De acordo com LAINSON & SHAW (1987), de uma maneira geral, podem-se
distinguir dois subgêneros apresentados como Leishmania e Viannia, tomando-se por base o
desenvolvimento do parasita em seu vetor natural, na pele de hamsters e em meio de cultura ágar
sangue.
Portanto, a especiação, ou seja, a identificação da origem das espécies dentro destes dois
subgêneros depende de vários fatores segundo MARFURT et al. (2003): distribuição geográfica,
apresentação clínica da doença, espécie do vetor e reservatório animal. A identificação do agente
causal e sua relação com seus vetores transmissores e reservatórios são necessárias para o
desenvolvimento e implantação das medidas de controle em pauta.
O contínuo crescimento antrópico vivenciado nas áreas urbanas do estado de São Paulo nos
últimos anos é responsável por apresentar profundas alterações no meio ambiente como um todo,
revelando expressivas reduções na cobertura vegetal de suas reservas nativas, acompanhado de
perto pelo gradativo aumento da população de baixa renda, onde a falta de saneamento básico e as
más condições peri-domiciliares contribuem, por conseqüência, para a composição da fauna
flebotomínica presente em maior densidade e de forma endêmica sob estas condições no final deste
século TOLEZANO et. al (2001). Assim, algumas espécies de flebótomos do gênero Lutzomyia,
encontram características propícias para colonizar o círculo peri-domiciliar em áreas desmatadas,
mantendo altos focos de transmissão de Leishmania neste novo ambiente.
A transmissão da Leishmania ao homem, naturalmente influenciada pelas condições supra
descritas, se dá pela picada das fêmeas de flebotomíneos dos gêneros Lutzomyia no “Novo Mundo”
e Phlebotomus e Sergentomyia no “Velho Mundo”. No Brasil, a LVA tem como principal vetor a
Lutzomyia longipalpis GENARO (2005).
Ward et al. (1983) realizaram experimentos de cruzamento em laboratório e identificaram
duas formas sexualmente isoladas. Em 1988 Ward et al. Realizaram novamente cruzamentos em
laboratório somados à analises de feromônios e cantos de corte, concluindo que populações que
produziam ferômonios distintos estavam reprodutivamente isoladas. Neste estudo também ocorreu o
primeiro relado de comunicação sonora entre os indivíduos da espécie Lu longipalpis.
Em relação à diferenciação dos flebotomíneos através do DNA, um dos primeiros relatos
realizado por LANZARO et al. (1993) com o uso da técnica denominada de “polimorfismo no
comprimento de fragmentos de restrição” (RFLPs), indicaram uma alta variabilidade existente entre
populações encontradas na Colômbia, Brasil e Costa Rica. Anos depois, DIAS et. al. (1998)
utilizando polimorfismo de DNA amplificado ao acaso (RAPD), e comparando quatro populações de
Lutzomyia longipalpis nestes mesmos países, na Ilha de Marajó, PA, onde o iniciador OPG-01
identificou a população estudada com um fragmento de 629bp, já as outras três (Gruta da Lapinha,
MG; Melgar, Colômbia e Libéria, Costa Rica), não apresentaram distinção.
Uma variabilidade associada às populações de Lutzomyia longipalpis tem sido observada em
vários níveis incluindo morfológicos, isoenzimáticos, bioquímicos e moleculares URIBE (1999).
Vários autores têm utilizado a técnica de reação em cadeia da polimerase (PCR), a qual tem
revolucionado as técnicas de diagnóstico de várias doenças e variações inter - e intra-específica das
espécies.
Em 2000 Arrivillaga & Feliciangeli por meio de estudos morfológicos analisaram indivíduos da
espécie e observaram que larvas morfologicamente diferenciadas originavam adultos que
apresentaria diferentes perfis isoenzimáticos o que indicaria uma separação genética entre eles. Em
2001 Arrivillaga & Feliciangeli, utilizando-se de analises de caracteres morfométricos descrevem na
Venezuela uma nova espécie Lu pseudolongipalpis.
Na identificação dos vetores da leishmaniose no Velho Mundo cutânea MUKHOPADHYAY et.
al. (2000) estudaram, através da RAPD, os vetores Phlebotomus papatasi e Phlebotomus duboscqi
e conseguiram diferenciar as espécies deste gênero. No ano seguinte, PEIXOTO et al. (2001),
usando iniciadores degenerados para isolar fragmentos de Lutzomyia longipalpis, estudaram dois
genes cacophony e period e concluíram que esses novos marcadores moleculares podem ser
utilizados em genética de populações e estudos de evolução em flebotomíneos, estabelecendo um
preliminar mapa genético.
Soto et al. (2001) realizaram estudos moleculares através de analises da variação de
nucleotídeos no gene mitocondrial ND4, sugerindo a existência de espécies irmãs na Colômbia e
Brasil.
Desta forma, estes estudos moleculares discutem a possibilidade de que a Lutzomyia
longipalpis é formada por um complexo de espécies, e por esta razão HODGKINSON et al. (2002)
usando polimorfismo de conformação na fita simples (SSCP), mostraram existir diferentes
populações de Lutzomyia longipalpis por meio do haplótipo citocromo B mitocondrial.
Num empenho de melhor entender a dinâmica das populações e a especiação dos
flebótomos, WATTS et al. (2002), através de marcadores microsatélites, estudaram populações de
Lutzomyia longipalpis obtidas em laboratório observando sua alta heterozigosidade. MAINGON et al.
(2003).
BAUZER et. al. (2002) estudando Lutzomyia longipalpis de Jacobina (BA), Lapinha (MG) e
Natal (RN), num total de 167 seqüências obtidas de 66 amostras, descrevem o polimorfismo
molecular caracterizado com um fragmento de 266 pb, identificando uma alta diferenciação entre as
populações analisadas. Estes resultados foram somados a trabalhos sobre ferômonios e sons de
cópula, sugerindo a existência de um complexo de espécies correlatas no Brasil.
BEATI et al. (2004) realizaram um estudo sobre sistemática molecular entre diferentes espécies
do gênero Lutzomyia para o qual utilizaram como ferramentas de análises seqüências dos
segmentos de genes ribossomais 12S e 28S, descrevendo assim por meio molecular, diferentes
espécies de tal gênero ocorrentes na Colômbia e Peru.
Há algum tempo, a PCR-RFLP do ITS-rDNA tem sido utilizada na identificação molecular de
espécies de Aedes WEST et al. (1997),
bem como na separação de espécies semelhantes de
helmintos EOM et al. (2002). DEPAQUIT et al. (2002) pesquisando espécies de Phlebotomus
sergenti e Phlebotomus similis com o propósito de identificar o transmissor da Leishmania tropica,
utilizaram primers ITS 2, e observaram grande variação nas seqüências e uma alta suscetibilidade.
Mais recentemente, KAMPEN et al. (2003) baseando-se nas seqüências do gene ribossomal ITS 2,
desenharam primers para diferenciar espécies correlatas do mosquito Anopheles.
O genoma dos eucariotos contém diversas cópias do gene codificador do RNA ribossomal.
Este inclui repetições tandem das regiões codificadoras 18 S, 5.8 S, 28 S e das regiões espaçadoras
conhecidas como “transcritas internas” (ITS 1, região espaçadora transcrita interna 1 e ITS 2,
espaçadora transcrita interna 2). As regiões codificadoras possuem seqüências muito conservadas e
são separadas pelas regiões transcritas internas, que são regiões não codificadoras e, portanto,
muito variáveis segundo PALUMBI (1996).
A presença das seqüências altamente conservadas (18 S, 5.8 S e 28 S) flanqueando regiões
muito variáveis (ITS 1 e ITS 2), favorece a construção de iniciadores universais, que podem ser
utilizados na PCR permitindo o estudo de diferentes espécimes oriundos de diferentes regiões.
Assim, diante dessa facilidade de construção dos iniciadores e ainda pelo fato do rDNA possuir
regiões que sofrem taxas evolutivas distintas (regiões codificadoras e espaçadoras), este, tem sido
amplamente utilizado em estudos de relações filogenéticas em diferentes níveis taxonômicos.
Pouco é conhecido sobre as relações filogenéticas entre populações de L. longipalpis. Este
conhecimento é necessário para o desenvolvimento de modelos que possam fornecer uma melhor
compreensão da atual distribuição geográfica e os processos de especiação para os membros
desse complexo de espécies ARRIVILLAGA et. al, (2006).
3. OBJETIVOS DO TRABALHO
• Adaptar e aplicar a metodologia de amplificação e seqüenciamento da região 12S rDNA
mitocondrial para a análise genética de diferentes populações da espécie Lutzomyia
longipalpis, tendo como foco a questão de ser ou não um complexo de espécies.
• Aplicar a técnica de amplificação e seqüenciamento da região 12S rDNA mitocondrial para
verificar as interações e variações intra-específicas de Lutzomyia longipalpis que compõem as
comunidades.
4. MATERIAIS E MÉTODOS
4.1. MATERIAL BIOLÓGICO
As amostras de insetos foram coletadas de distintas regiões geográficas do Brasil: pela
Superintendência de Controle de Endemias (SUCEN) na cidade de Araçatuba e região, no Estado
de São Paulo; e também pelos centros responsáveis nos Estados de Piauí.
4.2. COLETA DOS INSETOS
As coletas dos insetos foram realizadas através de capturas manuais e armadilhas elétricas. A
coleta manual foi realizada com aspiradores elétricos, restringindo-se o emprego do capturador de
Castro a locais em que houvesse dificuldade de realizar a captura com o aspirador. O ponto
selecionado é previamente avaliado para o estabelecimento do melhor local de captura no peri-
domicílio, devendo ser pesquisados os locais propícios para o repouso dos flebotomíneos e de
possíveis criadouros, assim como o local onde estão os animais domésticos. Em cada ponto
selecionado foram instaladas armadilhas elétricas por um período de 12 horas, iniciando-se,
também, 30 minutos após o crepúsculo. Ao final deste período, um capturador faz a troca dos copos
coletores.
Os insetos coletados, tanto nas capturas manuais como àqueles capturados por armadilhas
CDC, foram acondicionados nos copos coletores, recobertos com gesso, pré-umedecido, até o
momento em que são encaminhados ao Laboratório de Flebotomíneos do Serviço Regional da
SUCEN e identificados.
4.3.EXTRAÇÃO DE DNA GENÔMICO
Os insetos foram conservados em álcool 70% e posteriormente triturados com auxílio de
pistilo plástico em tubos de 1,5 ml em 300 µl da solução de resina Chelex 5%. Misturou-se a
solução com ajuda de vortex por 15s. Centrifugou-se por 20s a 13000 rpm. Levou-se a banho-
maria 80ºC por 30 min. Misturou-se a solução mais uma vez por 15 s no vortex. Centrifugou-se
por 20s a 13000 rpm. O sobrenadante foi retirado e transferido para outro tubo eppendorf
devidamente esterilizado e depois congelado.
4.4. REAÇÃO DE PCR DA REGIÃO 12 S.
Para a amplificação do espaço região 12S rDNA mitocondrial, foi realizada uma reação em
cadeia de polimerase (PCR), com iniciadores utilizados em estudos prévios com Lutzomyia sp. por
Beati, L. et. al, 2004. Os oligonucleotídeos iniciadores utilizados foram: T1B(5´-
AAACTAGGATTAGATACCT-3´) e T2B(5´-AATGAGAGCGACGGGCGATG-3´). Para reação,
contendo um volume total de 25 µl foi utilizado: 2,5 µl de tampão 10x (Plantinum, Invitrogen Life
Technologies), 1,0 µl de MgCl
2
(50mM), 0,5 µl dNTPs (0,1 mM) (PCR nucleotide mix Invitrogen Life
Technologies); 1,0 de cada oligonucleotideo (10 pmol/µl); 0,3 Taq Plantinum, Invitrogen Life
Technologies ( 5 U/ µl) e 5,0 µl da solução contendo DNA. A reação foi levada ao termociclador por
5 ciclos de desnaturação a 94ºC por 15s; anelamento 51º C por 30s; alongamento a 68ºC por 30;
seguido por 25 ciclos de desnaturação a 94ºC por 15s; anelamento a 53º C por 30s e alongamento a
70º C por 30s. O alongamento é completado com um ciclo de 70ºC por 5min. Os fragmentos
amplificados de DNA foram visualizados, após eletroforese em gel de agarose, na concentração de
1%, corado com brometo de etídeo; para observação foi utilizada luz U.V.
4.5. SEQUENCIAMENTO DA REGIÃO 12 S rDNA MITOCONDRIAL
As amostras resultantes da reação de PCR foram purificadas com auxílio do Kit EXOSAP - IT,
conforme o protocolo do fabricante.
A reação de seqüenciamento contendo um volume total de 20µl cada, foi realizada utilizando-
se 2µl de BigDye Terminator (Amersham Pharmacia Biotech); 6,0µl de Save Money; 3,2µl de um
dos iniciadores (1pmol/µl); 4,8µl de água ultrapura e 4,0µl de DNA (50ng/µl). A programação
utilizada para a reação de seqüenciamento inclui um ciclo de 35 vezes a 95°C por 20 segundos,
50°C por 15 segundos e 60°C por 2 minutos em termociclador (MJ Research modelo PTC100-96V).
Uma vez realizada a reação, o DNA amplificado foi precipitado utilizando-se 80µl de isopropanol
65%, deixando-se no escuro por 20 minutos. A mistura foi centrifugada por 25 minutos a 10.000 rpm
em temperatura ambiente. O sobrenadante foi descartado, e o sedimento foi lavado com 200µL de
etanol 70% e centrifugado por 5 minutos a 10.000 rpm, em temperatura ambiente, o sobrenadante
foi retirado novamente com auxílio de uma pipeta e o DNA precipitado foi secado à temperatura
ambiente por aproximadamente 2 horas. Após a secagem das amostras, foram adicionados 3,0µL
de tampão de carregamento Loading Dye (kit do BigDye Terminator). As amostras foram aquecidas
a 95°C por 3 minutos para desnaturação das fitas e levadas ao gelo sendo imediatamente depois
aplicadas no gel e levadas ao seqüenciador automático ABI377.
4.6. ANÁLISE DAS SEQÜÊNCIAS
As seqüências das fitas 5´- 3 e 3´- 5 foram alinhadas utilizando-se do pacote EMBOSS GUI
(
http://bioinfo.hku.hk/EMBOSS/) via internet com o auxílio do programa merger, onde foi obtido o
alinhamento consenso.
Os consensos adquiridos de cada isolado foram alinhados no programa computacional Clustal
X (THOMPSON et al., 1997). As análises de similaridades genéticas e filogenias foram realizadas no
software MEGA 3.1 utilizando como parâmetro o método Neighbor-Joining para a construção da
árvore filogenética. Os polimorfismos entre as seqüências foram analisados através do programa
DNA SP 4.10 (JULIO ROZAS et al., 2006
5. RESULTADOS
Foi extraído o material genético de um total de 120 indivíduos, sendo 30 indivíduos para cada
população: Andradina, Araçatuba, Birigui e Teresina, conforme estão representadas na figura 8. Foi
realizada a PCR e em seguida observado fragmentos de aproximadamente 360 p.b., assim como
descrito por (Fig.9). Para todos os indivíduos apenas o produto de 360 p.b. foi visualizado no gel,
indicando que a reação é específica e reprodutiva em 100% dos casos.
Ao analisar as seqüências, observou-se similaridade entre as seqüências obtidas das
populações analisadas no estudo e as seqüências depositadas no GENBANK, porém apresentando
alguns SNPs (Fig.10). A sequência similar obtida do banco de dados é referente a um espécime de
Lutzomyia longipalpis coletado na Colômbia (BEATI ET AL., 2004). Os consensos adquiridos de
cada isolado foram alinhados no programa computacional Clustal X (THOMPSON et al., 1997).
Estes sítios polimórficos estão espalhados por toda a sequência. Não foram detectadas deleções
e/ou inserções nas seqüências de Lutzomyia longipalpis coletadas no Brasil. A única exceção foi o
aparecimento de uma inserção de 1 nucleotídeo na seqüência do indivíduo proveniente da
Colômbia.
As análises de similaridades genéticas e filogenias foram realizadas no software MEGA 3.1
utilizando como parâmetro o algoritmo de Kimura (Kimura 2 parâmetros) que leva em conta a
ocorrência de transições e transversões, dando pesos diferentes para estas duas modificações. Para
a construção da árvore filogenética foi utilizado o método Neighbor-Joining (Fig.11). Podemos
observar na árvore 3 grupos distintos de indivíduos, um, localizado em um ramo basal, que contem a
maioria das seqüências com representantes das 4 populações analisadas. Um ramo se destaca na
parte superior da árvore e contem apenas indivíduos provenientes do Piauí. Este grupo também
contém a seqüência proveniente do indivíduo da Colômbia. Outro ramo na parte inferior da árvore
contém apenas indivíduos de Araçatuba. Este ramo mostra grande diversidade com vários
haplótipos.
Figura 8: Mapa geográfico indicando as populações analisadas.
Figura 9: Gel de agarose, visualizado em luz U.V. À esquerda do gel indicado por setas está o
padrão de tamanho molecular e à direita os produtos da PCR para a região 12S rDNA
mitocondrial.
500pb
250pb
Produto de PCR
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....|
5 15 25 35 45 55 65 75 85 95 105 115 125 135 145 155 165 175
1Aracatuba TTTATGAAAT TAAAATAATT TGGCGGTATT TTAGTTTATT CAGAGGAATT TGTTTTATAA TCGATAATCC CCGTTAAATC TTACTTATTT TATTTAATTT GTATATCGTT GTCATTAGAA TATTTTATAA GAATAATAAT TTTCTTAAAT TATTTAAAAT TTTATGTCAA ATCAAGGTGC
28Aracatuba TTTATGAAAT TAAAATAATT TGGCGGTATT TTAGTTTATT CAGAGGAATT TGTTTTATAA TCGATAATCC CCGTTAAATC TTACTTATTT TATTTAATTT GTATATCGTT GTCATTAGAA TATTTTATAA GAATAATAAT TTTCTTAAAT TATTTAAAAT TTTATGTCAA ATCAAGGTGC
27Aracatuba TTTATGAAAT TAAAATAATT TGGCGGTATT TTAGTTTATT CAGAGGAATT TGTTTTATAA TCGATAATCC CCGTTAAATC TTATTTATTT TATTTAATTT GTATATCGTT GTCATTAGAA TATTTTATAA GAATAATAAT TTTCTTAAAT TATTTAAAAT TTTATGTCAA ATCAAGGTGC
29Aracatuba TTTATGAAAT TAAAATAATT TGGCGGTATT TTAGTTTATT CAGAGGAATT TGTTTTATAA TCGATAATCC CCGTTAAATC TTATTTATTT TATTTAATTT GTATATCGTT GTCATTAGAA TATTTTATAA GAATAATAAT TTTCTTAAAT TATTTAAAAT TTTATGTCAA ATCAAGGTGC
26Aracatuba TTTATGAAAT TAAAATAATT TGGCGGTATT TTAGTTTATT CAGAGGAATT TGTTTTATAA TCGATAATCC CCGTTAAATC TTACTTATTT TATTTAATTT GTATATCGTT GTCATTAGAA TATTTTATAA GAATAATAAT TTTCTTAAAT TATTTAAAAT TTTATGTCAA ATCAAGGTGC
18Aracatuba TTTATGAAAT TAAAATAATT TGGCGGTATT TTAGTTTATT CAGAGGAATT TGTTTTATAA TCGATAATCC CCGTTAAATC TTACTTATTT TATTTAATTT GTATATCGTT GTCATTAGAA TATTTTATAA GAATAATAAT TTTCTTAAAT TATTTAAAAT TTTATGTCAA ATCAAGGGGC
19Aracatuba TTTATGAAAT TAAAATAATT TGGCGGTATT TTAGTTTATT CAGAGGAATT TGTTTTATAA TCGATAATCC CCGTTAAATC TTACTTATTT TATTTAATTT GTATATCGTT GTCATTAGAA TATTTTATAA GAATAATAAT TTTCTTAAAT TATTTAAAAT TTTATGTCAA ATCAAGGGGC
21Aracatuba TTTATGAAAT TAAAATAATT TGGCGGTATT TTAGTTTATT CAGAGGAATT TGTTTTATAA TCGATAATCC CCGTTAAATC TTACTTATTT TATTTAATTT GTATATCGTT GTCATTAGAA TATTTTATAA GAATAATAAT TTTCTTAAAT TATTTAAAAT TTTATGTCAA ATCAAGGGGC
22Aracatuba TTTATGAAAT TAAAATAATT TGGCGGTATT TTAGTCTATT CAGAGGAATT TGTTTTATAA TCGATAATCC CCGTTAAATC TTACTTATTT TATTTAATTT GTATATCGTT GTCATTAGAA TATTTTATAA GAATAATAAT TTTCTTAAAT TATTTAAAAT TTTATGTCAA ATCAAGGGGC
20Aracatuba TTTATGAAAT TAAAATAATT TGGCGGTATT TTAGTCTATT CAGAGGAATT TGTTTTATAA TCGATAATCC CCGTTAAATC TTACTTATTT TATTTAATTT GTATATCGTT GTCATTAGAA TATTTTATAA GAATAATAAT TTTCTTAAAT TATTTAAAAT TTTATGTCAA ATCAAGGGGC
1Andradina TTTATGAAAT TAAAATAATT TGGCGGTATT TTAGTCTATT CAGAGGAATT TGTTTTATAA TCGATAATCC CCGTTAAATC TTACTTATTT TATTTAATTT GTATATCGTT GTCATTAGAA TATTTTATAA GAATAATAAT TTTCTTAAAT TATTTAAAAT TTTATGTCAA ATCAAGGTGC
18Piaui TTTATGAAAT TAAAATAATT TGGCGGTATT TTAGTCTATT CAGAGGAATT TGTTTTATAA TCGATAATCC CCGTTAAATC TTACTTATTT TATTTAATTT GTATATCGTT GTCATTAGAA TATTTTATAA GAATAATAAT TTTCTTAAAT TATTTAAAAT TTTATGTCAA ATCAAGGTGC
2Andradina TTTATGAAAT TAAAATAATT TGGCGGTATT TTAGTCTATT CAGAGGAATT TGTTTTATAA TCGATAATCC CCGTTAAATC TTACTTATTT TATTTAATTT GTATATCGTT GTCATTAGAA TATTTTATAA GAATAATAAT TTTCTTAAAT TATTTAAAAT TTTATGTCAA ATCAAGGTGC
3Andradina TTTATGAAAT TAAAATAATT TGGCGGTATT TTAGTCTATT CAGAGGAATT TGTTTTATAA TCGATAATCC CCGTTAAATC TTACTTATTT TATTTAATTT GTATATCGTT GTCATTAGAA TATTTTATAA GAATAATAAT TTTCTTAAAT TATTTAAAAT TTTATGTCAA ATCAAGGTGC
3Piaui TTTATGAAAT TAAAATAATT TGGCGGTATT TTAGTCTATT CAGAGGAATT TGTTTTATAA TCGATAATCC CCGTTAAATC TTACTTATTT TATTTAATTT GTATATCGTT GTCATTAGAA TATTTTATAA GAATAATAAT TTTCTTAAAT TATTTAAAAT TTTATGTCAA ATCAAGGTGC
4Andradina TTTATGAAAT TAAAATAATT TGGCGGTATT TTAGTCTATT CAGAGGAATT TGTTTTATAA TCGATAATCC CCGTTAAATC TTACTTATTT TATTTAATTT GTATATCGTT GTCATTAGAA TATTTTATAA GAATAATAAT TTTCTTAAAT TATTTAAAAT TTTATGTCAA ATCAAGGTGC
5Andradina TTTATGAAAT TAAAATAATT TGGCGGTATT TTAGTCTATT CAGAGGAATT TGTTTTATAA TCGATAATCC CCGTTAAATC TTACTTATTT TATTTAATTT GTATATCGTT GTCATTAGAA TATTTTATAA GAATAATAAT TTTCTTAAAT TATTTAAAAT TTTATGTCAA ATCAAGGTGC
4Piaui TTTATGAAAT TAAAATAATT TGGCGGTATT TTAGTCTATT CAGAGGAATT TGTTTTATAA TCGATAATCC CCGTTAAATC TTACTTATTT TATTTAATTT GTATATCGTT GTCATTAGAA TATTTTATAA GAATAATAAT TTTCTTAAAT TATTTAAAAT TTTATGTCAA ATCAAGGTGC
6Andradina TTTATGAAAT TAAAATAATT TGGCGGTATT TTAGTCTATT CAGAGGAATT TGTTTTATAA TCGATAATCC CCGTTAAATC TTACTTATTT TATTTAATTT GTATATCGTT GTCATTAGAA TATTTTATAA GAATAATAAT TTTCTTAAAT TATTTAAAAT TTTATGTCAA ATCAAGGTGC
8Piaui TTTATGAAAT TAAAATAATT TGGCGGTATT TTAGTCTATT CAGAGGAATT TGTTTTATAA TCGATAATCC CCGTTAAATC TTACTTATTT TATTTAATTT GTATATCGTT GTCATTAGAA TATTTTATAA GAATAATAAT TTTCTTAAAT TATTTAAAAT TTTATGTCAA ATCAAGGTGC
2Aracatuba TTTATGAAAT TAAAATAATT TGGCGGTATT TTAGTCTATT CAGAGGAATT TGTTTTATAA TCGATAATCC CCGTTAAATC TTACTTATTT TATTTAATTT GTATATCGTT GTCATTAGAA TATTTTATAA GAATAATAAT TTTCTTAAAT TATTTAAAAT TTTATGTCAA ATCAAGGTGC
7Andradina TTTATGAAAT TAAAATAATT TGGCGGTATT TTAGTCTATT CAGAGGAATT TGTTTTATAA TCGATAATCC CCGTTAAATC TTACTTATTT TATTTAATTT GTATATCGTT GTCATTAGAA TATTTTATAA GAATAATAAT TTTCTTAAAT TATTTAAAAT TTTATGTCAA ATCAAGGTGC
8Andradina TTTATGAAAT TAAAATAATT TGGCGGTATT TTAGTCTATT CAGAGGAATT TGTTTTATAA TCGATAATCC CCGTTAAATC TTACTTATTT TATTTAATTT GTATATCGTT GTCATTAGAA TATTTTATAA GAATAATAAT TTTCTTAAAT TATTTAAAAT TTTATGTCAA ATCAAGGTGC
9Andradina TTTATGAAAT TAAAATAATT TGGCGGTATT TTAGTCTATT CAGAGGAATT TGTTTTATAA TCGATAATCC CCGTTAAATC TTACTTATTT TATTTAATTT GTATATCGTT GTCATTAGAA TATTTTATAA GAATAATAAT TTTCTTAAAT TATTTAAAAT TTTATGTCAA ATCAAGGTGC
10Piaui TTTATGAAAT TAAAATAATT TGGCGGTATT TTAGTCTATT CAGAGGAATT TGTTTTATAA TCGATAATCC CCGTTAAATC TTACTTATTT TATTTAATTT GTATATCGTT GTCATTAGAA TATTTTATAA GAATAATAAT TTTCTTAAAT TATTTAAAAT TTTATGTCAA ATCAAGGTGC
10Andradina TTTATGAAAT TAAAATAATT TGGCGGTATT TTAGTCTATT CAGAGGAATT TGTTTTATAA TCGATAATCC CCGTTAAATC TTACTTATTT TATTTAATTT GTATATCGTT GTCATTAGAA TATTTTATAA GAATAATAAT TTTCTTAAAT TATTTAAAAT TTTATGTCAA ATCAAGGTGC
11Andradina TTTATGAAAT TAAAATAATT TGGCGGTATT TTAGTCTATT CAGAGGAATT TGTTTTATAA TCGATAATCC CCGTTAAATC TTACTTATTT TATTTAATTT GTATATCGTT GTCATTAGAA TATTTTATAA GAATAATAAT TTTCTTAAAT TATTTAAAAT TTTATGTCAA ATCAAGGTGC
23Aracatuba TTTATGAAAT TAAAATAATT TGGCGGTATT TTAGTCTATT CAGAGGAATT TGTTTTATAA TCGATAATCC CCGTTAAATC TTACTTATTT TATTTAATTT GTATATCGTT GTCATTAGAA TATTTTATAA GAATAATAAT TTTCTTAAAT TATTTAAAAT TTTATGTCAA ATCAAGGTGC
11Piaui TTTATGAAAT TAAAATAATT TGGCGGTATT TTAGTCTATT CAGAGGAATT TGTTTTATAA TCGATAATCC CCGTTAAATC TTACTTATTT TATTTAATTT GTATATCGTT GTCATTAGAA TATTTTATAA GAATAATAAT TTTCTTAAAT TATTTAAAAT TTTATGTCAA ATCAAGGTGC
16Piaui TTTATGAAAT TAAAATAATT TGGCGGTATT TTAGTCTATT CAGAGGAATT TGTTTTATAA TCGATAATCC CCGTTAAATC TTACTTATTT TATTTAATTT GTATATCGTT GTCATTAGAA TATTTTATAA GAATAATAAT TTTCTTAAAT TATTTAAAAT TTTATGTCAA ATCAAGGTGC
17Piaui TTTATGAAAT TAAAATAATT TGGCGGTATT TTAGTCTATT CAGAGGAATT TGTTTTATAA TCGATAATCC CCGTTAAATC TTACTTATTT TATTTAATTT GTATATCGTT GTCATTAGAA TATTTTATAA GAATAATAAT TTTCTTAAAT TATTTAAAAT TTTATGTCAA ATCAAGGTGC
24Aracatuba TTTATGAAAT TAAAATAATT TGGCGGTATT TTAGTCTATT CAGAGGAATT TGTTTTATAA TCGATAATCC CCGTTAAATC TTACTTATTT TATTTAATTT GTATATCGTT GTCATTAGAA TATTTTATAA GAATAATAAT TTTCTTAAAT TATTTAAAAT TTTATGTCAA ATCAAGGTGC
26Piaui TTTATGAAAT TAAAATAATT TGGCGGTATT TTAGTCTATT CAGAGGAATT TGTTTTATAA TCGATAATCC CCGTTAAATC TTACTTATTT TATTTAATTT GTATATCGTT GTCATTAGAA TATTTTATAA GAATAATAAT TTTCTTAAAT TATTTAAAAT TTTATGTCAA ATCAAGGTGC
25Aracatuba TTTATGAAAT TAAAATAATT TGGCGGTATT TTAGTCTATT CAGAGGAATT TGTTTTATAA TCGATAATCC CCGTTAAATC TTACTTATTT TATTTAATTT GTATATCGTT GTCATTAGAA TATTTTATAA GAATAATAAT TTTCTTAAAT TATTTAAAAT TTTATGTCAA ATCAAGGTGC
2Birigui TTTATGAAAT TAAAATAATT TGGCGGTATT TTAGTCTATT CAGAGGAATT TGTTTTATAA TCGATAATCC CCGTTAAATC TTACTTATTT TATTTAATTT GTATATCGTT GTCATTAGAA TATTTTATAA GAATAATAAT TTTCTTAAAT TATTTAAAAT TTTATGTCAA ATCAAGGTGC
8Birigui TTTATGAAAT TAAAATAATT TGGCGGTATT TTAGTCTATT CAGAGGAATT TGTTTTATAA TCGATAATCC CCGTTAAATC TTACTTATTT TATTTAATTT GTATATCGTT GTCATTAGAA TATTTTATAA GAATAATAAT TTTCTTAAAT TATTTAAAAT TTTATGTCAA ATCAAGGTGC
9Birigui TTTATGAAAT TAAAATAATT TGGCGGTATT TTAGTCTATT CAGAGGAATT TGTTTTATAA TCGATAATCC CCGTTAAATC TTACTTATTT TATTTAATTT GTATATCGTT GTCATTAGAA TATTTTATAA GAATAATAAT TTTCTTAAAT TATTTAAAAT TTTATGTCAA ATCAAGGTGC
12Birigui TTTATGAAAT TAAAATAATT TGGCGGTATT TTAGTCTATT CAGAGGAATT TGTTTTATAA TCGATAATCC CCGTTAAATC TTACTTATTT TATTTAATTT GTATATCGTT GTCATTAGAA TATTTTATAA GAATAATAAT TTTCTTAAAT TATTTAAAAT TTTATGTCAA ATCAAGGTGC
13Birigui TTTATGAAAT TAAAATAATT TGGCGGTATT TTAGTCTATT CAGAGGAATT TGTTTTATAA TCGATAATCC CCGTTAAATC TTACTTATTT TATTTAATTT GTATATCGTT GTCATTAGAA TATTTTATAA GAATAATAAT TTTCTTAAAT TATTTAAAAT TTTATGTCAA ATCAAGGTGC
15Birigui TTTATGAAAT TAAAATAATT TGGCGGTATT TTAGTCTATT CAGAGGAATT TGTTTTATAA TCGATAATCC CCGTTAAATC TTACTTATTT TATTTAATTT GTATATCGTT GTCATTAGAA TATTTTATAA GAATAATAAT TTTCTTAAAT TATTTAAAAT TTTATGTCAA ATCAAGGTGC
16Birigui TTTATGAAAT TAAAATAATT TGGCGGTATT TTAGTCTATT CAGAGGAATT TGTTTTATAA TCGATAATCC CCGTTAAATC TTACTTATTT TATTTAATTT GTATATCGTT GTCATTAGAA TATTTTATAA GAATAATAAT TTTCTTAAAT TATTTAAAAT TTTATGTCAA ATCAAGGTGC
18Birigui TTTATGAAAT TAAAATAATT TGGCGGTATT TTAGTCTATT CAGAGGAATT TGTTTTATAA TCGATAATCC CCGTTAAATC TTACTTATTT TATTTAATTT GTATATCGTT GTCATTAGAA TATTTTATAA GAATAATAAT TTTCTTAAAT TATTTAAAAT TTTATGTCAA ATCAAGGTGC
29Andradina TTTATGAAAT TAAAATAATT TGGCGGTATT TTAGTCTATT CAGAGGAATT TGTTTTATAA TCGATAATCC CCGTTAAATC TTACTTATTT TATTTAATTT GTATATCGTT GTCATTAGAA TATTTTATAA GAATAATAAT TTTCTTAAAT TATTTAAAAT TTTATGTCAA ATCAAGGTGC
30Andradina TTTATGAAAT TAAAATAATT TGGCGGTATT TTAGTCTATT CAGAGGAATT TGTTTTATAA TCGATAATCC CCGTTAAATC TTACTTATTT TATTTAATTT GTATATCGTT GTCATTAGAA TATTTTATAA GAATAATAAT TTTCTTAAAT TATTTAAAAT TTTATGTCAA ATCAAGGTGC
28Andradina TTTATGAAAT TAAAATAATT TGGCGGTATT TTAGTCTATT CAGAGGAATT TGTTTTATAA TCGATAATCC CCGTTAAATC TTACTTATTT TATTTAATTT GTATATCGTT GTCATTAGAA TATTTTATAA GAATAATAAT TTTCTTAAAT TATTTAAAAT TTTATGTCAA ATCAAGGTGC
27Andradina TTTATGAAAT TAAAATAATT TGGCGGTATT TTAGTCTATT CAGAGGAATT TGTTTTATAA TCGATAATCC CCGTTAAATC TTACTTATTT TATTTAATTT GTATATCGTT GTCATTAGAA TATTTTATAA GAATAATAAT TTTCTTAAAT TATTTAAAAT TTTATGTCAA ATCAAGGTGC
26Andradina TTTATGAAAT TAAAATAATT TGGCGGTATT TTAGTCTATT CAGAGGAATT TGTTTTATAA TCGATAATCC CCGTTAAATC TTACTTATTT TATTTAATTT GTATATCGTT GTCATTAGAA TATTTTATAA GAATAATAAT TTTCTTAAAT TATTTAAAAT TTTATGTCAA ATCAAGGTGC
25Andradina TTTATGAAAT TAAAATAATT TGGCGGTATT TTAGTCTATT CAGAGGAATT TGTTTTATAA TCGATAATCC CCGTTAAATC TTACTTATTT TATTTAATTT GTATATCGTT GTCATTAGAA TATTTTATAA GAATAATAAT TTTCTTAAAT TATTTAAAAT TTTATGTCAA ATCAAGGTGC
24Andradina TTTATGAAAT TAAAATAATT TGGCGGTATT TTAGTCTATT CAGAGGAATT TGTTTTATAA TCGATAATCC CCGTTAAATC TTACTTATTT TATTTAATTT GTATATCGTT GTCATTAGAA TATTTTATAA GAATAATAAT TTTCTTAAAT TATTTAAAAT TTTATGTCAA ATCAAGGTGC
23Andradina TTTATGAAAT TAAAATAATT TGGCGGTATT TTAGTCTATT CAGAGGAATT TGTTTTATAA TCGATAATCC CCGTTAAATC TTACTTATTT TATTTAATTT GTATATCGTT GTCATTAGAA TATTTTATAA GAATAATAAT TTTCTTAAAT TATTTAAAAT TTTATGTCAA ATCAAGGTGC
22Andradina TTTATGAAAT TAAAATAATT TGGCGGTATT TTAGTCTATT CAGAGGAATT TGTTTTATAA TCGATAATCC CCGTTAAATC TTACTTATTT TATTTAATTT GTATATCGTT GTCATTAGAA TATTTTATAA GAATAATAAT TTTCTTAAAT TATTTAAAAT TTTATGTCAA ATCAAGGTGC
21Andradina TTTATGAAAT TAAAATAATT TGGCGGTATT TTAGTCTATT CAGAGGAATT TGTTTTATAA TCGATAATCC CCGTTAAATC TTACTTATTT TATTTAATTT GTATATCGTT GTCATTAGAA TATTTTATAA GAATAATAAT TTTCTTAAAT TATTTAAAAT TTTATGTCAA ATCAAGGTGC
20Andradina TTTATGAAAT TAAAATAATT TGGCGGTATT TTAGTCTATT CAGAGGAATT TGTTTTATAA TCGATAATCC CCGTTAAATC TTACTTATTT TATTTAATTT GTATATCGTT GTCATTAGAA TATTTTATAA GAATAATAAT TTTCTTAAAT TATTTAAAAT TTTATGTCAA ATCAAGGTGC
19Andradina TTTATGAAAT TAAAATAATT TGGCGGTATT TTAGTCTATT CAGAGGAATT TGTTTTATAA TCGATAATCC CCGTTAAATC TTACTTATTT TATTTAATTT GTATATCGTT GTCATTAGAA TATTTTATAA GAATAATAAT TTTCTTAAAT TATTTAAAAT TTTATGTCAA ATCAAGGTGC
18Andradina TTTATGAAAT TAAAATAATT TGGCGGTATT TTAGTCTATT CAGAGGAATT TGTTTTATAA TCGATAATCC CCGTTAAATC TTACTTATTT TATTTAATTT GTATATCGTT GTCATTAGAA TATTTTATAA GAATAATAAT TTTCTTAAAT TATTTAAAAT TTTATGTCAA ATCAAGGTGC
17Andradina TTTATGAAAT TAAAATAATT TGGCGGTATT TTAGTCTATT CAGAGGAATT TGTTTTATAA TCGATAATCC CCGTTAAATC TTACTTATTT TATTTAATTT GTATATCGTT GTCATTAGAA TATTTTATAA GAATAATAAT TTTCTTAAAT TATTTAAAAT TTTATGTCAA ATCAAGGTGC
16Andradina TTTATGAAAT TAAAATAATT TGGCGGTATT TTAGTCTATT CAGAGGAATT TGTTTTATAA TCGATAATCC CCGTTAAATC TTACTTATTT TATTTAATTT GTATATCGTT GTCATTAGAA TATTTTATAA GAATAATAAT TTTCTTAAAT TATTTAAAAT TTTATGTCAA ATCAAGGTGC
15Andradina TTTATGAAAT TAAAATAATT TGGCGGTATT TTAGTCTATT CAGAGGAATT TGTTTTATAA TCGATAATCC CCGTTAAATC TTACTTATTT TATTTAATTT GTATATCGTT GTCATTAGAA TATTTTATAA GAATAATAAT TTTCTTAAAT TATTTAAAAT TTTATGTCAA ATCAAGGTGC
14Andradina TTTATGAAAT TAAAATAATT TGGCGGTATT TTAGTCTATT CAGAGGAATT TGTTTTATAA TCGATAATCC CCGTTAAATC TTACTTATTT TATTTAATTT GTATATCGTT GTCATTAGAA TATTTTATAA GAATAATAAT TTTCTTAAAT TATTTAAAAT TTTATGTCAA ATCAAGGTGC
17Aracatuba TTTATGAAAT TAAAATAATT TGGCGGTATT TTAGTCTATT CAGAGGAATT TGTTTTATAA TCGATAATCC CCGTTAAATC TTACTTATTT TATTTAATTT GTATATCGTT GTCATTAGAA TATTTTATAA GAATAATAAT TTTCTTAAAT TATTTAAAAT TTTATGTCAA ATCAAGGTGC
16Aracatuba TTTATGAAAT TAAAATAATT TGGCGGTATT TTAGTCTATT CAGAGGAATT TGTTTTATAA TCGATAATCC CCGTTAAATC TTACTTATTT TATTTAATTT GTATATCGTT GTCATTAGAA TATTTTATAA GAATAATAAT TTTCTTAAAT TATTTAAAAT TTTATGTCAA ATCAAGGTGC
15Aracatuba TTTATGAAAT TAAAATAATT TGGCGGTATT TTAGTCTATT CAGAGGAATT TGTTTTATAA TCGATAATCC CCGTTAAATC TTACTTATTT TATTTAATTT GTATATCGTT GTCATTAGAA TATTTTATAA GAATAATAAT TTTCTTAAAT TATTTAAAAT TTTATGTCAA ATCAAGGTGC
14Aracatuba TTTATGAAAT TAAAATAATT TGGCGGTATT TTAGTCTATT CAGAGGAATT TGTTTTATAA TCGATAATCC CCGTTAAATC TTACTTATTT TATTTAATTT GTATATCGTT GTCATTAGAA TATTTTATAA GAATAATAAT TTTCTTAAAT TATTTAAAAT TTTATGTCAA ATCAAGGTGC
13Aracatuba TTTATGAAAT TAAAATAATT TGGCGGTATT TTAGTCTATT CAGAGGAATT TGTTTTATAA TCGATAATCC CCGTTAAATC TTACTTATTT TATTTAATTT GTATATCGTT GTCATTAGAA TATTTTATAA GAATAATAAT TTTCTTAAAT TATTTAAAAT TTTATGTCAA ATCAAGGTGC
12Aracatuba TTTATGAAAT TAAAATAATT TGGCGGTATT TTAGTCTATT CAGAGGAATT TGTTTTATAA TCGATAATCC CCGTTAAATC TTACTTATTT TATTTAATTT GTATATCGTT GTCATTAGAA TATTTTATAA GAATAATAAT TTTCTTAAAT TATTTAAAAT TTTATGTCAA ATCAAGGTGC
11Aracatuba TTTATGAAAT TAAAATAATT TGGCGGTATT TTAGTCTATT CAGAGGAATT TGTTTTATAA TCGATAATCC CCGTTAAATC TTACTTATTT TATTTAATTT GTATATCGTT GTCATTAGAA TATTTTATAA GAATAATAAT TTTCTTAAAT TATTTAAAAT TTTATGTCAA ATCAAGGTGC
10Aracatuba TTTATGAAAT TAAAATAATT TGGCGGTATT TTAGTCTATT CAGAGGAATT TGTTTTATAA TCGATAATCC CCGTTAAATC TTACTTATTT TATTTAATTT GTATATCGTT GTCATTAGAA TATTTTATAA GAATAATAAT TTTCTTAAAT TATTTAAAAT TTTATGTCAA ATCAAGGTGC
9Aracatuba TTTATGAAAT TAAAATAATT TGGCGGTATT TTAGTCTATT CAGAGGAATT TGTTTTATAA TCGATAATCC CCGTTAAATC TTACTTATTT TATTTAATTT GTATATCGTT GTCATTAGAA TATTTTATAA GAATAATAAT TTTCTTAAAT TATTTAAAAT TTTATGTCAA ATCAAGGTGC
8Aracatuba TTTATGAAAT TAAAATAATT TGGCGGTATT TTAGTCTATT CAGAGGAATT TGTTTTATAA TCGATAATCC CCGTTAAATC TTACTTATTT TATTTAATTT GTATATCGTT GTCATTAGAA TATTTTATAA GAATAATAAT TTTCTTAAAT TATTTAAAAT TTTATGTCAA ATCAAGGTGC
7Aracatuba TTTATGAAAT TAAAATAATT TGGCGGTATT TTAGTCTATT CAGAGGAATT TGTTTTATAA TCGATAATCC CCGTTAAATC TTACTTATTT TATTTAATTT GTATATCGTT GTCATTAGAA TATTTTATAA GAATAATAAT TTTCTTAAAT TATTTAAAAT TTTATGTCAA ATCAAGGTGC
6Aracatuba TTTATGAAAT TAAAATAATT TGGCGGTATT TTAGTCTATT CAGAGGAATT TGTTTTATAA TCGATAATCC CCGTTAAATC TTACTTATTT TATTTAATTT GTATATCGTT GTCATTAGAA TATTTTATAA GAATAATAAT TTTCTTAAAT TATTTAAAAT TTTATGTCAA ATCAAGGTGC
5Aracatuba TTTATGAAAT TAAAATAATT TGGCGGTATT TTAGTCTATT CAGAGGAATT TGTTTTATAA TCGATAATCC CCGTTAAATC TTACTTATTT TATTTAATTT GTATATCGTT GTCATTAGAA TATTTTATAA GAATAATAAT TTTCTTAAAT TATTTAAAAT TTTATGTCAA ATCAAGGTGC
4Aracatuba TTTATGAAAT TAAAATAATT TGGCGGTATT TTAGTCTATT CAGAGGAATT TGTTTTATAA TCGATAATCC CCGTTAAATC TTACTTATTT TATTTAATTT GTATATCGTT GTCATTAGAA TATTTTATAA GAATAATAAT TTTCTTAAAT TATTTAAAAT TTTATGTCAA ATCAAGGTGC
3Aracatuba TTTATGAAAT TAAAATAATT TGGCGGTATT TTAGTCTATT CAGAGGAATT TGTTTTATAA TCGATAATCC CCGTTAAATC TTACTTATTT TATTTAATTT GTATATCGTT GTCATTAGAA TATTTTATAA GAATAATAAT TTTCTTAAAT TATTTAAAAT TTTATGTCAA ATCAAGGTGC
30Piaui TTTATGAAAT TAAAATAATT TGGCGGTATT TTAGTCTATT CAGAGGAATT TGTTTTATAA TCGATAATCC CCGTTAAATC TTACTTATTT TATTTAATTT GTATATCGTT GTCATTAGAA TATTTTATAA GAATAATAAT TTTCTTAAAT TATTTAAAAT TTTATGTCAA ATCAAGGTGC
28Piaui TTTATGAAAT TAAAATAATT TGGCGGTATT TTAGTCTATT CAGAGGAATT TGTTTTATAA TCGATAATCC CCGTTAAATC TTACTTATTT TATTTAATTT GTATATCGTT GTCATTAGAA TATTTTATAA GAATAATAAT TTTCTTAAAT TATTTAAAAT TTTATGTCAA ATCAAGGTGC
1Piaui TTTATGAAAT TAAAATAATT TGGCGGTATT TTAGTCTATT CAGAGGAATT TGTTTTATAA TCGATAATCC CCGTTAAATC TTACTTATTT TATTTAATTT GTATATCGTT GTCATTAGAA TATTTTATAA GAATAATAAT TTTCTTAAAT TATTTAAAAT TTTATGTCAA ATCAAGGTGC
30Birigui TTTATGAAAT TAAAATAATT TGGCGGTATT TTAGTCTATT CAGAGGAATT TGTTTTATAA TCGATAATCC CCGTTAAATC TTACTTATTT TATTTAATTT GTATATCGTT GTCATTAGAA TATTTTATAA GAATAATAAT TTTCTTAAAT TATTTAAAAT TTTATGTCAA ATCAAGGTGC
29Birigui TTTATGAAAT TAAAATAATT TGGCGGTATT TTAGTCTATT CAGAGGAATT TGTTTTATAA TCGATAATCC CCGTTAAATC TTACTTATTT TATTTAATTT GTATATCGTT GTCATTAGAA TATTTTATAA GAATAATAAT TTTCTTAAAT TATTTAAAAT TTTATGTCAA ATCAAGGTGC
28Birigui TTTATGAAAT TAAAATAATT TGGCGGTATT TTAGTCTATT CAGAGGAATT TGTTTTATAA TCGATAATCC CCGTTAAATC TTACTTATTT TATTTAATTT GTATATCGTT GTCATTAGAA TATTTTATAA GAATAATAAT TTTCTTAAAT TATTTAAAAT TTTATGTCAA ATCAAGGTGC
27Birigui TTTATGAAAT TAAAATAATT TGGCGGTATT TTAGTCTATT CAGAGGAATT TGTTTTATAA TCGATAATCC CCGTTAAATC TTACTTATTT TATTTAATTT GTATATCGTT GTCATTAGAA TATTTTATAA GAATAATAAT TTTCTTAAAT TATTTAAAAT TTTATGTCAA ATCAAGGTGC
26Birigui TTTATGAAAT TAAAATAATT TGGCGGTATT TTAGTCTATT CAGAGGAATT TGTTTTATAA TCGATAATCC CCGTTAAATC TTACTTATTT TATTTAATTT GTATATCGTT GTCATTAGAA TATTTTATAA GAATAATAAT TTTCTTAAAT TATTTAAAAT TTTATGTCAA ATCAAGGTGC
25Birigui TTTATGAAAT TAAAATAATT TGGCGGTATT TTAGTCTATT CAGAGGAATT TGTTTTATAA TCGATAATCC CCGTTAAATC TTACTTATTT TATTTAATTT GTATATCGTT GTCATTAGAA TATTTTATAA GAATAATAAT TTTCTTAAAT TATTTAAAAT TTTATGTCAA ATCAAGGTGC
24Birigui TTTATGAAAT TAAAATAATT TGGCGGTATT TTAGTCTATT CAGAGGAATT TGTTTTATAA TCGATAATCC CCGTTAAATC TTACTTATTT TATTTAATTT GTATATCGTT GTCATTAGAA TATTTTATAA GAATAATAAT TTTCTTAAAT TATTTAAAAT TTTATGTCAA ATCAAGGTGC
23Birigui TTTATGAAAT TAAAATAATT TGGCGGTATT TTAGTCTATT CAGAGGAATT TGTTTTATAA TCGATAATCC CCGTTAAATC TTACTTATTT TATTTAATTT GTATATCGTT GTCATTAGAA TATTTTATAA GAATAATAAT TTTCTTAAAT TATTTAAAAT TTTATGTCAA ATCAAGGTGC
22Birigui TTTATGAAAT TAAAATAATT TGGCGGTATT TTAGTCTATT CAGAGGAATT TGTTTTATAA TCGATAATCC CCGTTAAATC TTACTTATTT TATTTAATTT GTATATCGTT GTCATTAGAA TATTTTATAA GAATAATAAT TTTCTTAAAT TATTTAAAAT TTTATGTCAA ATCAAGGTGC
21Birigui TTTATGAAAT TAAAATAATT TGGCGGTATT TTAGTCTATT CAGAGGAATT TGTTTTATAA TCGATAATCC CCGTTAAATC TTACTTATTT TATTTAATTT GTATATCGTT GTCATTAGAA TATTTTATAA GAATAATAAT TTTCTTAAAT TATTTAAAAT TTTATGTCAA ATCAAGGTGC
20Birigui TTTATGAAAT TAAAATAATT TGGCGGTATT TTAGTCTATT CAGAGGAATT TGTTTTATAA TCGATAATCC CCGTTAAATC TTACTTATTT TATTTAATTT GTATATCGTT GTCATTAGAA TATTTTATAA GAATAATAAT TTTCTTAAAT TATTTAAAAT TTTATGTCAA ATCAAGGTGC
19Birigui TTTATGAAAT TAAAATAATT TGGCGGTATT TTAGTCTATT CAGAGGAATT TGTTTTATAA TCGATAATCC CCGTTAAATC TTACTTATTT TATTTAATTT GTATATCGTT GTCATTAGAA TATTTTATAA GAATAATAAT TTTCTTAAAT TATTTAAAAT TTTATGTCAA ATCAAGGTGC
17Birigui TTTATGAAAT TAAAATAATT TGGCGGTATT TTAGTCTATT CAGAGGAATT TGTTTTATAA TCGATAATCC CCGTTAAATC TTACTTATTT TATTTAATTT GTATATCGTT GTCATTAGAA TATTTTATAA GAATAATAAT TTTCTTAAAT TATTTAAAAT TTTATGTCAA ATCAAGGTGC
14Birigui TTTATGAAAT TAAAATAATT TGGCGGTATT TTAGTCTATT CAGAGGAATT TGTTTTATAA TCGATAATCC CCGTTAAATC TTACTTATTT TATTTAATTT GTATATCGTT GTCATTAGAA TATTTTATAA GAATAATAAT TTTCTTAAAT TATTTAAAAT TTTATGTCAA ATCAAGGTGC
11Birigui TTTATGAAAT TAAAATAATT TGGCGGTATT TTAGTCTATT CAGAGGAATT TGTTTTATAA TCGATAATCC CCGTTAAATC TTACTTATTT TATTTAATTT GTATATCGTT GTCATTAGAA TATTTTATAA GAATAATAAT TTTCTTAAAT TATTTAAAAT TTTATGTCAA ATCAAGGTGC
10Birigui TTTATGAAAT TAAAATAATT TGGCGGTATT TTAGTCTATT CAGAGGAATT TGTTTTATAA TCGATAATCC CCGTTAAATC TTACTTATTT TATTTAATTT GTATATCGTT GTCATTAGAA TATTTTATAA GAATAATAAT TTTCTTAAAT TATTTAAAAT TTTATGTCAA ATCAAGGTGC
7Birigui TTTATGAAAT TAAAATAATT TGGCGGTATT TTAGTCTATT CAGAGGAATT TGTTTTATAA TCGATAATCC CCGTTAAATC TTACTTATTT TATTTAATTT GTATATCGTT GTCATTAGAA TATTTTATAA GAATAATAAT TTTCTTAAAT TATTTAAAAT TTTATGTCAA ATCAAGGTGC
5Birigui TTTATGAAAT TAAAATAATT TGGCGGTATT TTAGTCTATT CAGAGGAATT TGTTTTATAA TCGATAATCC CCGTTAAATC TTACTTATTT TATTTAATTT GTATATCGTT GTCATTAGAA TATTTTATAA GAATAATAAT TTTCTTAAAT TATTTAAAAT TTTATGTCAA ATCAAGGTGC
6Birigui TTTATGAAAT TAAAATAATT TGGCGGTATT TTAGTCTATT CAGAGGAATT TGTTTTATAA TCGATAATCC CCGTTAAATC TTACTTATTT TATTTAATTT GTATATCGTT GTCATTAGAA TATTTTATAA GAATAATAAT TTTCTTAAAT TATTTAAAAT TTTATGTCAA ATCAAGGTGC
4Birigui TTTATGAAAT TAAAATAATT TGGCGGTATT TTAGTCTATT CAGAGGAATT TGTTTTATAA TCGATAATCC CCGTTAAATC TTACTTATTT TATTTAATTT GTATATCGTT GTCATTAGAA TATTTTATAA GAATAATAAT TTTCTTAAAT TATTTAAAAT TTTATGTCAA ATCAAGGTGC
3Birigui TTTATGAAAT TAAAATAATT TGGCGGTATT TTAGTCTATT CAGAGGAATT TGTTTTATAA TCGATAATCC CCGTTAAATC TTACTTATTT TATTTAATTT GTATATCGTT GTCATTAGAA TATTTTATAA GAATAATAAT TTTCTTAAAT TATTTAAAAT TTTATGTCAA ATCAAGGTGC
1Birigui TTTATGAAAT TAAAATAATT TGGCGGTATT TTAGTCTATT CAGAGGAATT TGTTTTATAA TCGATAATCC CCGTTAAATC TTACTTATTT TATTTAATTT GTATATCGTT GTCATTAGAA TATTTTATAA GAATAATAAT TTTCTTAAAT TATTTAAAAT TTTATGTCAA ATCAAGGTGC
30Aracatuba TTTATGAAAT TAAAATAATT TGGCGGTATT TTAGTCTATT CAGAGGAATT TGTTTTATAA TCGATAATCC CCGTTAAATC TTACTTATTT TATTTAATTT GTATATCGTT GTCATTAGAA TATTTTATAA GAATAATAAT TTTCTTAAAT TATTTAAAAT TTTATGTCAA ATCAAGGTGC
13Andradina TTTATGAAAT TAAAATAATT TGGCGGTATT TTAGTCTATT CAGAGGAATT TGTTTTATAA TCGATAATCC CCGTTAAATC TTACTTATTT TATTTAATTT GTATATCGTT GTCATTAGAA TATTTTATAA GAATAATAAT TTTCTTAAAT TATTTAAAAT TTTATGTCAA ATCAAGGTGC
12Andradina TTTATGAAAT TAAAATAATT TGGCGGTATT TTAGTCTATT CAGAGGAATT TGTTTTATAA TCGATAATCC CCGTTAAATC TTACTTATTT TATTTAATTT GTATATCGTT GTCATTAGAA TATTTTATAA GAATAATAAT TTTCTTAAAT TATTTAAAAT TTTATGTCAA ATCAAGGTGC
rede TTTATGAAAT TAAAATAATT TGGCGGTATT TTAGTCTATT CAGAGGAATT TGTTTTATAA TCGATAATCC TCGTTAAATC TTACTTATTT TATTTAATTT GTATATCGTT GTCATTAGAA TATTTTATAA GAATAATAAT TTTCTTAAAT TATTTAAAAT TTTATGTCAA ATCAAGGTGC
2Piaui TTTATGAAAT TAAAATAATT TGGCGGTATT TTAGTCTATT CAGAGGAATT TGTTTTATAA TCGATAATCC CCGTTAAATC TTACTTATTT TATTTAATTT GTATATCGTT GTCATTAGAA TATTTTATAA GAATAATAAT TTTCTTAAAT TATTTAAAAT TTTATGTCAA ATCAAGGTGC
9Piaui TTTATGAAAT TAAAATAATT TGGCGGTATT TTAGTCTATT CAGAGGAATT TGTTTTATAA TCGATAATCC CCGTTAAATC TTACTTATTT TATTTAATTT GTATATCGTT GTCATTAGAA TATTTTATAA GAATAATAAT TTTCTTAAAT TATTTAAAAT TTTATGTCAA ATCAAGGTGC
5Piaui TTTATGAAAT TAAAATAATT TGGCGGTATT TTAGTCTATT CAGAGGAATT TGTTTTATAA TCGATAATCC CCGTTAAATC TTACTTATTT TATTTAATTT GTATATCGTT GTCATTAGAA TATTTTATAA GAATAATAAT TTTCTTAAAT TATTTAAAAT TTTATGTCAA ATCAAGGTGC
6Piaui TTTATGAAAT TAAAATAATT TGGCGGTATT TTAGTCTATT CAGAGGAATT TGTTTTATAA TCGATAATCC CCGTTAAATC TTACTTATTT TATTTAATTT GTATATCGTT GTCATTAGAA TATTTTATAA GAATAATAAT TTTCTTAAAT TATTTAAAAT TTTATGTCAA ATCAAGGTGC
7Piaui TTTATGAAAT TAAAATAATT TGGCGGTATT TTAGTCTATT CAGAGGAATT TGTTTTATAA TCGATAATCC CCGTTAAATC TTACTTATTT TATTTAATTT GTATATCGTT GTCATTAGAA TATTTTATAA GAATAATAAT TTTCTTAAAT TATTTAAAAT TTTATGTCAA ATCAAGGTGC
12Piaui TTTATGAAAT TAAAATAATT TGGCGGTATT TTAGTCTATT CAGAGGAATT TGTTTTATAA TCGATAATCC CCGTTAAATC TTACTTATTT TATTTAATTT GTATATCGTT GTCATTAGAA TATTTTATAA GAATAATAAT TTTCTTAAAT TATTTAAAAT TTTATGTCAA ATCAAGGTGC
15Piaui TTTATGAAAT TAAAATAATT TGGCGGTATT TTAGTCTATT CAGAGGAATT TGTTTTATAA TCGATAATCC CCGTTAAATC TTACTTATTT TATTTAATTT GTATATCGTT GTCATTAGAA TATTTTATAA GAATAATAAT TTTCTTAAAT TATTTAAAAT TTTATGTCAA ATCAAGGTGC
19Piaui TTTATGAAAT TAAAATAATT TGGCGGTATT TTAGTCTATT CAGAGGAATT TGTTTTATAA TCGATAATCC CCGTTAAATC TTACTTATTT TATTTAATTT GTATATCGTT GTCATTAGAA TATTTTATAA GAATAATAAT TTTCTTAAAT TATTTAAAAT TTTATGTCAA ATCAAGGTGC
21Piaui TTTATGAAAT TAAAATAATT TGGCGGTATT TTAGTCTATT CAGAGGAATT TGTTTTATAA TCGATAATCC CCGTTAAATC TTACTTATTT TATTTAATTT GTATATCGTT GTCATTAGAA TATTTTATAA GAATAATAAT TTTCTTAAAT TATTTAAAAT TTTATGTCAA ATCAAGGTGC
23Piaui TTTATGAAAT TAAAATAATT TGGCGGTATT TTAGTCTATT CAGAGGAATT TGTTTTATAA TCGATAATCC CCGTTAAATC TTACTTATTT TATTTAATTT GTATATCGTT GTCATTAGAA TATTTTATAA GAATAATAAT TTTCTTAAAT TATTTAAAAT TTTATGTCAA ATCAAGGTGC
24Piaui TTTATGAAAT TAAAATAATT TGGCGGTATT TTAGTCTATT CAGAGGAATT TGTTTTATAA TCGATAATCC CCGTTAAATC TTACTTATTT TATTTAATTT GTATATCGTT GTCATTAGAA TATTTTATAA GAATAATAAT TTTCTTAAAT TATTTAAAAT TTTATGTCAA ATCAAGGTGC
25Piaui TTTATGAAAT TAAAATAATT TGGCGGTATT TTAGTCTATT CAGAGGAATT TGTTTTATAA TCGATAATCC CCGTTAAATC TTACTTATTT TATTTAATTT GTATATCGTT GTCATTAGAA TATTTTATAA GAATAATAAT TTTCTTAAAT TATTTAAAAT TTTATGTCAA ATCAAGGTGC
27Piaui TTTATGAAAT TAAAATAATT TGGCGGTATT TTAGTCTATT CAGAGGAATT TGTTTTATAA TCGATAATCC CCGTTAAATC TTACTTATTT TATTTAATTT GTATATCGTT GTCATTAGAA TATTTTATAA GAATAATAAT TTTCTTAAAT TATTTAAAAT TTTATGTCAA ATCAAGGTGC
29Piaui TTTATGAAAT TAAAATAATT TGGCGGTATT TTAGTCTATT CAGAGGAATT TGTTTTATAA TCGATAATCC CCGTTAAATC TTACTTATTT TATTTAATTT GTATATCGTT GTCATTAGAA TATTTTATAA GAATAATAAT TTTCTTAAAT TATTTAAAAT TTTATGTCAA ATCAAGGTGC
13Piaui TTTATGAAAT TAAAATAATT TGGCGGTATT TTAGTCTATT CAGAGGAATT TGTTTTATAA TCGATAATCC CCGTTAAATC TTACTTATTT TATTTAATTT GTATATTGTT GTCATTAGAA TATTTTATAA GAATAATAAT TTTCTTAAAT TATTTAAAAT TTTATGTCAA ATCAAGGTGC
22Piaui TTTATGAAAT TAAAATAATT TGGCGGTATT TTAGTCTATT CAGAGGAATT TGTTTTATAA TCGATAATCC CCGTTAAATC TTATTTATTT TATTTAATTT GTATATTGTT GTCATTAGAA TATTTTATAA GAATAATAAT TTTCTTAAAT TATTTAAAAT TTTATGTCAA ATCAAGGTGC
14Piaui TTTATGAAAT TAAAATAATT TGGCGGTATT TTAGTCTATT CAGAGGAATT TGTTTTATAA TCGATAATCC CCGTTAAATT TTATTTATTT TATTTAATTT GTATATCGTT GTCATTAGAA TATTTTATAA GAATAATAAT TTTCTTAAAT TATTTAAAAT TTTATGTCAA ATCAAGGTGC
Clustal Consensus ********** ********** ********** ***** **** ********** ********** ********** ******** *** ****** ********** ****** *** ********** ********** ********** ********** ********** ********** ******* **
....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ....|....| ...
185 195 205 215 225 235 245 255
1Aracatuba AGTTTATATT TAAGTAAAAA TGAATTACAT TAATATATAA TTAAATGAAT TAAAAATTGA AATATTTTTA TGAAGGTGGA TTT
28Aracatuba AGTTTATATT TAAGTAAAAA TGAATTACAT TAATATATAA TTAAATGAAT TAAAAATTGA AATATTTTTA TGAAGGTGGA TTT
27Aracatuba AGTTTATATT TAAGTAAAAA TGAATTACAT TAATATATAA TTAAATGAAT TAAAAATTGA AATATTTTTA TGAAGGGGGA TTT
29Aracatuba AGTTTATATT TAAGTAAAAA TGAATTACAT TAATATATAA TTAAATGAAT TAAAAATTGA AATATTTTTA TGAAGGGGGA TTT
26Aracatuba AGTTTATATT TAAGTAAAAA TGAATTACAT TAATATATAA TTAAATGAAT TAAAAATTGA AATATTTTTA TGAAGGGGGA TTT
18Aracatuba AGTTTATATT TAAGTAAAAA TGAATTACAT TAATATATAA TTAAATGAAT TAAAAATTGA AATATTTTTA TGAAGGGGGA TTT
19Aracatuba AGTTTATATT TAAGTAAAAA TGAATTACAT TAATATATAA TTAAATGAAT TAAAAATTGA AATATTTTTA TGAAGGGGGA TTT
21Aracatuba AGTTTATATT TAAGTAAAAA TGAATTACAT TAATATATAA TTAAATGAAT TAAAAATTGA AATATTTTTA TGAAGGGGGA TTT
22Aracatuba AGTTTATATT TAAGTAAAAA TGAATTACAT TAATATATAA TTAAATGAAT TAAAAATTGA AATATTTTTA TGAAGGGGGA TTT
20Aracatuba AGTTTATATT TAAGTAAAAA TGAATTACAT TAATATATAA TTAAATGAAT TAAAAATTGA AATATTTTTA TGAAGGTGGA TTT
1Andradina AGTTTATATT TAAGTAAAAA TGAATTACAT TAATATATAA TTAAATGAAT TAAAAATTGA AATATTTTTA TGAAGGTGGA TTT
18Piaui AGTTTATATT TAAATAAAAA TGAATTACAT TAATATATAA TTAAATGAAT TAAAAATTGA AATATTTTTA TGAAGGTGGA TTT
2Andradina AGTTTATATT TAAGTAAAAA TGAATTACAT TAATATATAA TTAAATGAAT TAAAAATTGA AATATTTTTA TGAAGGTGGA TTT
3Andradina AGTTTATATT TAAGTAAAAA TGAATTACAT TAATATATAA TTAAATGAAT TAAAAATTGA AATATTTTTA TGAAGGTGGA TTT
3Piaui AGTTTATATT TAAGTAAAAA TGAATTACAT TAATATATAA TTAAATGAAT TAAAAATTGA AATATTTTTA TGAAGGTGGA TTT
4Andradina AGTTTATATT TAAGTAAAAA TGAATTACAT TAATATATAA TTAAATGAAT TAAAAATTGA AATATTTTTA TGAAGGTGGA TTT
5Andradina AGTTTATATT TAAGTAAAAA TGAATTACAT TAATATATAA TTAAATGAAT TAAAAATTGA AATATTTTTA TGAAGGTGGA TTT
4Piaui AGTTTATATT TAAGTAAAAA TGAATTACAT TAATATATAA TTAAATGAAT TAAAAATTGA AATATTTTTA TGAAGGTGGA TTT
6Andradina AGTTTATATT TAAGTAAAAA TGAATTACAT TAATATATAA TTAAATGAAT TAAAAATTGA AATATTTTTA TGAAGGTGGA TTT
8Piaui AGTTTATATT TAAGTAAAAA TGAATTACAT TAATATATAA TTAAATGAAT TAAAAATTGA AATATTTTTA TGAAGGTGGA TTT
2Aracatuba AGTTTATATT TAAGTAAAAA TGAATTACAT TAATATATAA TTAAATGAAT TAAAAATTGA AATATTTTTA TGAAGGTGGA TTT
7Andradina AGTTTATATT TAAGTAAAAA TGAATTACAT TAATATATAA TTAAATGAAT TAAAAATTGA AATATTTTTA TGAAGGTGGA TTT
8Andradina AGTTTATATT TAAGTAAAAA TGAATTACAT TAATATATAA TTAAATGAAT TAAAAATTGA AATATTTTTA TGAAGGTGGA TTT
9Andradina AGTTTATATT TAAGTAAAAA TGAATTACAT TAATATATAA TTAAATGAAT TAAAAATTGA AATATTTTTA TGAAGGTGGA TTT
10Piaui AGTTTATATT TAAGTAAAAA TGAATTACAT TAATATATAA TTAAATGAAT TAAAAATTGA AATATTTTTA TGAAGGTGGA TTT
10Andradina AGTTTATATT TAAGTAAAAA TGAATTACAT TAATATATAA TTAAATGAAT TAAAAATTGA AATATTTTTA TGAAGGTGGA TTT
11Andradina AGTTTATATT TAAGTAAAAA TGAATTACAT TAATATATAA TTAAATGAAT TAAAAATTGA AATATTTTTA TGAAGGTGGA TTT
23Aracatuba AGTTTATATT TAAGTAAAAA TGAATTACAT TAATATATAA TTAAATGAAT TAAAAATTGA AATATTTTTA TGAAGGTGGA TTT
11Piaui AGTTTATATT TAAGTAAAAA TGAATTACAT TAATATATAA TTAAATGAAT TAAAAATTGA AATATTTTTA TGAAGGTGGA TTT
16Piaui AGTTTATATT TAAGTAAAAA TGAATTACAT TAATATATAA TTAAATGAAT TAAAAATTGA AATATTTTTA TGAAGGTGGA TTT
17Piaui AGTTTATATT TAAGTAAAAA TGAATTACAT TAATATATAA TTAAATGAAT TAAAAATTGA AATATTTTTA TGAAGGTGGA TTT
24Aracatuba AGTTTATATT TAAGTAAAAA TGAATTACAT TAATATATAA TTAAATGAAT TAAAAATTGA AATATTTTTA TGAAGGTGGA TTT
26Piaui AGTTTATATT TAAGTAAAAA TGAATTACAT TAATATATAA TTAAATGAAT TAAAAATTGA AATATTTTTA TGAAGGTGGA TTT
25Aracatuba AGTTTATATT TAAGTAAAAA TGAATTACAT TAATATATAA TTAAATGAAT TAAAAATTGA AATATTTTTA TGAAGGTGGA TTT
2Birigui AGTTTATATT TAAGTAAAAA TGAATTACAT TAATATATAA TTAAATGAAT TAAAAATTGA AATATTTTTA TGAAGGTGGA TTT
8Birigui AGTTTATATT TAAGTAAAAA TGAATTACAT TAATATATAA TTAAATGAAT TAAAAATTGA AATATTTTTA TGAAGGTGGA TTT
9Birigui AGTTTATATT TAAGTAAAAA TGAATTACAT TAATATATAA TTAAATGAAT TAAAAATTGA AATATTTTTA TGAAGGTGGA TTT
12Birigui AGTTTATATT TAAGTAAAAA TGAATTACAT TAATATATAA TTAAATGAAT TAAAAATTGA AATATTTTTA TGAAGGTGGA TTT
13Birigui AGTTTATATT TAAGTAAAAA TGAATTACAT TAATATATAA TTAAATGAAT TAAAAATTGA AATATTTTTA TGAAGGTGGA TTT
15Birigui AGTTTATATT TAAGTAAAAA TGAATTACAT TAATATATAA TTAAATGAAT TAAAAATTGA AATATTTTTA TGAAGGTGGA TTT
16Birigui AGTTTATATT TAAGTAAAAA TGAATTACAT TAATATATAA TTAAATGAAT TAAAAATTGA AATATTTTTA TGAAGGTGGA TTT
18Birigui AGTTTATATT TAAGTAAAAA TGAATTACAT TAATATATAA TTAAATGAAT TAAAAATTGA AATATTTTTA TGAAGGTGGA TTT
29Andradina AGTTTATATT TAAGTAAAAA TGAATTACAT TAATATATAA TTAAATGAAT TAAAAATTGA AATATTTTTA TGAAGGTGGA TTT
30Andradina AGTTTATATT TAAGTAAAAA TGAATTACAT TAATATATAA TTAAATGAAT TAAAAATTGA AATATTTTTA TGAAGGTGGA TTT
28Andradina AGTTTATATT TAAGTAAAAA TGAATTACAT TAATATATAA TTAAATGAAT TAAAAATTGA AATATTTTTA TGAAGGTGGA TTT
27Andradina AGTTTATATT TAAGTAAAAA TGAATTACAT TAATATATAA TTAAATGAAT TAAAAATTGA AATATTTTTA TGAAGGTGGA TTT
26Andradina AGTTTATATT TAAGTAAAAA TGAATTACAT TAATATATAA TTAAATGAAT TAAAAATTGA AATATTTTTA TGAAGGTGGA TTT
25Andradina AGTTTATATT TAAGTAAAAA TGAATTACAT TAATATATAA TTAAATGAAT TAAAAATTGA AATATTTTTA TGAAGGTGGA TTT
24Andradina AGTTTATATT TAAGTAAAAA TGAATTACAT TAATATATAA TTAAATGAAT TAAAAATTGA AATATTTTTA TGAAGGTGGA TTT
23Andradina AGTTTATATT TAAGTAAAAA TGAATTACAT TAATATATAA TTAAATGAAT TAAAAATTGA AATATTTTTA TGAAGGTGGA TTT
22Andradina AGTTTATATT TAAGTAAAAA TGAATTACAT TAATATATAA TTAAATGAAT TAAAAATTGA AATATTTTTA TGAAGGTGGA TTT
21Andradina AGTTTATATT TAAGTAAAAA TGAATTACAT TAATATATAA TTAAATGAAT TAAAAATTGA AATATTTTTA TGAAGGTGGA TTT
20Andradina AGTTTATATT TAAGTAAAAA TGAATTACAT TAATATATAA TTAAATGAAT TAAAAATTGA AATATTTTTA TGAAGGTGGA TTT
19Andradina AGTTTATATT TAAGTAAAAA TGAATTACAT TAATATATAA TTAAATGAAT TAAAAATTGA AATATTTTTA TGAAGGTGGA TTT
18Andradina AGTTTATATT TAAGTAAAAA TGAATTACAT TAATATATAA TTAAATGAAT TAAAAATTGA AATATTTTTA TGAAGGTGGA TTT
17Andradina AGTTTATATT TAAGTAAAAA TGAATTACAT TAATATATAA TTAAATGAAT TAAAAATTGA AATATTTTTA TGAAGGTGGA TTT
16Andradina AGTTTATATT TAAGTAAAAA TGAATTACAT TAATATATAA TTAAATGAAT TAAAAATTGA AATATTTTTA TGAAGGTGGA TTT
15Andradina AGTTTATATT TAAGTAAAAA TGAATTACAT TAATATATAA TTAAATGAAT TAAAAATTGA AATATTTTTA TGAAGGTGGA TTT
14Andradina AGTTTATATT TAAGTAAAAA TGAATTACAT TAATATATAA TTAAATGAAT TAAAAATTGA AATATTTTTA TGAAGGTGGA TTT
17Aracatuba AGTTTATATT TAAGTAAAAA TGAATTACAT TAATATATAA TTAAATGAAT TAAAAATTGA AATATTTTTA TGAAGGTGGA TTT
16Aracatuba AGTTTATATT TAAGTAAAAA TGAATTACAT TAATATATAA TTAAATGAAT TAAAAATTGA AATATTTTTA TGAAGGTGGA TTT
15Aracatuba AGTTTATATT TAAGTAAAAA TGAATTACAT TAATATATAA TTAAATGAAT TAAAAATTGA AATATTTTTA TGAAGGTGGA TTT
14Aracatuba AGTTTATATT TAAGTAAAAA TGAATTACAT TAATATATAA TTAAATGAAT TAAAAATTGA AATATTTTTA TGAAGGTGGA TTT
13Aracatuba AGTTTATATT TAAGTAAAAA TGAATTACAT TAATATATAA TTAAATGAAT TAAAAATTGA AATATTTTTA TGAAGGTGGA TTT
12Aracatuba AGTTTATATT TAAGTAAAAA TGAATTACAT TAATATATAA TTAAATGAAT TAAAAATTGA AATATTTTTA TGAAGGTGGA TTT
11Aracatuba AGTTTATATT TAAGTAAAAA TGAATTACAT TAATATATAA TTAAATGAAT TAAAAATTGA AATATTTTTA TGAAGGTGGA TTT
10Aracatuba AGTTTATATT TAAGTAAAAA TGAATTACAT TAATATATAA TTAAATGAAT TAAAAATTGA AATATTTTTA TGAAGGTGGA TTT
9Aracatuba AGTTTATATT TAAGTAAAAA TGAATTACAT TAATATATAA TTAAATGAAT TAAAAATTGA AATATTTTTA TGAAGGTGGA TTT
8Aracatuba AGTTTATATT TAAGTAAAAA TGAATTACAT TAATATATAA TTAAATGAAT TAAAAATTGA AATATTTTTA TGAAGGTGGA TTT
7Aracatuba AGTTTATATT TAAGTAAAAA TGAATTACAT TAATATATAA TTAAATGAAT TAAAAATTGA AATATTTTTA TGAAGGTGGA TTT
6Aracatuba AGTTTATATT TAAGTAAAAA TGAATTACAT TAATATATAA TTAAATGAAT TAAAAATTGA AATATTTTTA TGAAGGTGGA TTT
5Aracatuba AGTTTATATT TAAGTAAAAA TGAATTACAT TAATATATAA TTAAATGAAT TAAAAATTGA AATATTTTTA TGAAGGTGGA TTT
4Aracatuba AGTTTATATT TAAGTAAAAA TGAATTACAT TAATATATAA TTAAATGAAT TAAAAATTGA AATATTTTTA TGAAGGTGGA TTT
3Aracatuba AGTTTATATT TAAGTAAAAA TGAATTACAT TAATATATAA TTAAATGAAT TAAAAATTGA AATATTTTTA TGAAGGTGGA TTT
30Piaui AGTTTATATT TAAGTAAAAA TGAATTACAT TAATATATAA TTAAATGAAT TAAAAATTGA AATATTTTTA TGAAGGTGGA TTT
28Piaui AGTTTATATT TAAGTAAAAA TGAATTACAT TAATATATAA TTAAATGAAT TAAAAATTGA AATATTTTTA TGAAGGTGGA TTT
1Piaui AGTTTATATT TAAGTAAAAA TGAATTACAT TAATATATAA TTAAATGAAT TAAAAATTGA AATATTTTTA TGAAGGTGGA TTT
30Birigui AGTTTATATT TAAGTAAAAA TGAATTACAT TAATATATAA TTAAATGAAT TAAAAATTGA AATATTTTTA TGAAGGTGGA TTT
29Birigui AGTTTATATT TAAGTAAAAA TGAATTACAT TAATATATAA TTAAATGAAT TAAAAATTGA AATATTTTTA TGAAGGTGGA TTT
28Birigui AGTTTATATT TAAGTAAAAA TGAATTACAT TAATATATAA TTAAATGAAT TAAAAATTGA AATATTTTTA TGAAGGTGGA TTT
27Birigui AGTTTATATT TAAGTAAAAA TGAATTACAT TAATATATAA TTAAATGAAT TAAAAATTGA AATATTTTTA TGAAGGTGGA TTT
26Birigui AGTTTATATT TAAGTAAAAA TGAATTACAT TAATATATAA TTAAATGAAT TAAAAATTGA AATATTTTTA TGAAGGTGGA TTT
25Birigui AGTTTATATT TAAGTAAAAA TGAATTACAT TAATATATAA TTAAATGAAT TAAAAATTGA AATATTTTTA TGAAGGTGGA TTT
24Birigui AGTTTATATT TAAGTAAAAA TGAATTACAT TAATATATAA TTAAATGAAT TAAAAATTGA AATATTTTTA TGAAGGTGGA TTT
23Birigui AGTTTATATT TAAGTAAAAA TGAATTACAT TAATATATAA TTAAATGAAT TAAAAATTGA AATATTTTTA TGAAGGTGGA TTT
22Birigui AGTTTATATT TAAGTAAAAA TGAATTACAT TAATATATAA TTAAATGAAT TAAAAATTGA AATATTTTTA TGAAGGTGGA TTT
21Birigui AGTTTATATT TAAGTAAAAA TGAATTACAT TAATATATAA TTAAATGAAT TAAAAATTGA AATATTTTTA TGAAGGTGGA TTT
20Birigui AGTTTATATT TAAGTAAAAA TGAATTACAT TAATATATAA TTAAATGAAT TAAAAATTGA AATATTTTTA TGAAGGTGGA TTT
19Birigui AGTTTATATT TAAGTAAAAA TGAATTACAT TAATATATAA TTAAATGAAT TAAAAATTGA AATATTTTTA TGAAGGTGGA TTT
17Birigui AGTTTATATT TAAGTAAAAA TGAATTACAT TAATATATAA TTAAATGAAT TAAAAATTGA AATATTTTTA TGAAGGTGGA TTT
14Birigui AGTTTATATT TAAGTAAAAA TGAATTACAT TAATATATAA TTAAATGAAT TAAAAATTGA AATATTTTTA TGAAGGTGGA TTT
11Birigui AGTTTATATT TAAGTAAAAA TGAATTACAT TAATATATAA TTAAATGAAT TAAAAATTGA AATATTTTTA TGAAGGTGGA TTT
10Birigui AGTTTATATT TAAGTAAAAA TGAATTACAT TAATATATAA TTAAATGAAT TAAAAATTGA AATATTTTTA TGAAGGTGGA TTT
7Birigui AGTTTATATT TAAGTAAAAA TGAATTACAT TAATATATAA TTAAATGAAT TAAAAATTGA AATATTTTTA TGAAGGTGGA TTT
5Birigui AGTTTATATT TAAGTAAAAA TGAATTACAT TAATATATAA TTAAATGAAT TAAAAATTGA AATATTTTTA TGAAGGTGGA TTT
6Birigui AGTTTATATT TAAGTAAAAA TGAATTACAT TAATATATAA TTAAATGAAT TAAAAATTGA AATATTTTTA TGAAGGTGGA TTT
4Birigui AGTTTATATT TAAGTAAAAA TGAATTACAT TAATATATAA TTAAATGAAT TAAAAATTGA AATATTTTTA TGAAGGTGGA TTT
3Birigui AGTTTATATT TAAGTAAAAA TGAATTACAT TAATATATAA TTAAATGAAT TAAAAATTGA AATATTTTTA TGAAGGTGGA TTT
1Birigui AGTTTATATT TAAGTAAAAA TGAATTACAT TAATATATAA TTAAATGAAT TAAAAATTGA AATATTTTTA TGAAGGTGGA TTT
30Aracatuba AGTTTATATT TAAGTAAAAA TGAATTACAT TAATATATAA TTAAATGAAT TAAAAATTGA AATATTTTTA TGAAGGTGGA TTT
13Andradina AGTTTATATT TAAGTAAAAA TGAATTACAT TAATATATAA TTAAATGAAT TAAAAATTGA AATATTTTTA TGAAGGTGGA TTT
12Andradina AGTTTATATT TAAGTAAAAA TGAATTACAT TAATATATAA TTAAATGAAT TAAAAATTGA AATATTTTTA TGAAGGTGGA TTT
rede AGTTTATATT -AAGTAAAAA TGAATTACAT TAATATATAA TTAAATGAAT TAAAAATTGA AAAATTTTTA TGAAGGTGGA TTT
2Piaui AGTTTATATT TAAGTAAAAA TGAATTACAT TAATATATAA TTAAATGAAT TAAAAATTGA AACATTTTTA TGAAGGTGGA TTT
9Piaui AGTTTATATT TAAGTAAAAA TGAATTACAT TAATATATAA TTAAATGAAT TAAAAATTGA AACGTTTTTA TGAAGGTGGA TTT
5Piaui AGTTTATATT TAAGTAAAAA TGAATTACAT TAATATATAA TTAAATGAAT TAAAAATTGA AACATTTTTA TGAAGGTGGA TTT
6Piaui AGTTTATATT TAAGTAAAAA TGAATTACAT TAATATATAA TTAAATGAAT TAAAAATTGA AACATTTTTA TGAAGGTGGA TTT
7Piaui AGTTTATATT TAAGTAAAAA TGAATTACAT TAATATATAA TTAAATGAAT TAAAAATTGA AACATTTTTA TGAAGGTGGA TTT
12Piaui AGTTTATATT TAAGTAAAAA TGAATTACAT TAATATATAA TTAAATGAAT TAAAAATTGA AACATTTTTA TGAAGGTGGA TTT
15Piaui AGTTTATATT TAAGTAAAAA TGAATTACAT TAATATATAA TTAAATGAAT TAAAAATTGA AACATTTTTA TGAAGGTGGA TTT
19Piaui AGTTTATATT TAAGTAAAAA TGAATTACAT TAATATATAA TTAAATGAAT TAAAAATTGA AACATTTTTA TGAAGGTGGA TTT
21Piaui AGTTTATATT TAAGTAAAAA TGAATTACAT TAATATATAA TTAAATGAAT TAAAAATTGA AACATTTTTA TGAAGGTGGA TTT
23Piaui AGTTTATATT TAAGTAAAAA TGAATTACAT TAATATATAA TTAAATGAAT TAAAAATTGA AACATTTTTA TGAAGGTGGA TTT
24Piaui AGTTTATATT TAAGTAAAAA TGAATTACAT TAATATATAA TTAAATGAAT TAAAAATTGA AACATTTTTA TGAAGGTGGA TTT
25Piaui AGTTTATATT TAAGTAAAAA TGAATTACAT TAATATATAA TTAAATGAAT TAAAAATTGA AACATTTTTA TGAAGGTGGA TTT
27Piaui AGTTTATATT TAAGTAAAAA TGAATTACAT TAATATATAA TTAAATGAAT TAAAAATTGA AACATTTTTA TGAAGGTGGA TTT
29Piaui AGTTTATATT TAAGTAAAAA TGAATTACAT TAATATATAA TTAAATGAAT TAAAAATTGA AACATTTTTA TGAAGGTGGA TTT
13Piaui AGTTTATATT TAAGTAAAAA TGAATTACAT TAATATATAA TTAAATGAAT TAAAAATTGA AACATTTTTA TGAAGGTGGA TTT
22Piaui AGTTTATATT TAAGTAAAAA TGAATTACAT TAATATATAA TTAAATGAAT TAAAAATTGA AACATTTTTA TGAAGGTGGA TTT
14Piaui AGTTTATATT TAAGTAAAAA TGAATTACAT TAATATATAA TTAAATGAAT TAAAAATTGA AACATTTTTA TGAAGGTGGA TTT
Clustal Consensus ********** ** ****** ********** ********** ********** ********** ** ****** ****** *** ***
Figura 10: Alinhamento das seqüências obtidas até o presente momento, realizado através do programa CLUSTAL X (1.81).
Os sítios polimórficos estão assinaladso em cinza.
13Piaui
22Piaui
14Piaui
27Piaui
25Piaui
9Piaui
29Piaui
24Piaui
23Piaui
21Piaui
19Piaui
15Piaui
12Piaui
7Piaui
6Piaui
5Piaui
2Piaui
rede
13Andradina
3Birigui
5Birigui
11Birigui
19Birigui
22Birigui
25Birigui
28Birigui
1Piaui
3Aracatuba
6Aracatuba
9Aracatuba
12Aracatuba
15Aracatuba
14Andradina
17Andradina
20Andradina
23Andradina
26Andradina
30Andradina
16Birigui
12Birigui
2Birigui
24Aracatuba
11Piaui
10Andradina
8Andradina
8Piaui
5Andradina
3Andradina
2Andradina
4Andradina
6Andradina
7Andradina
10Piaui
23Aracatuba
17Piaui
25Aracatuba
9Birigui
15Birigui
29Andradina
27Andradina
24Andradina
21Andradina
18Andradina
15Andradina
16Aracatuba
13Aracatuba
10Aracatuba
7Aracatuba
4Aracatuba
28Piaui
29Birigui
26Birigui
23Birigui
20Birigui
14Birigui
7Birigui
4Birigui
18Piaui
30Aracatuba
1Andradina
3Piaui
4Piaui
2Aracatuba
9Andradina
11Andradina
16Piaui
26Piaui
8Birigui
13Birigui
18Birigui
28Andradina
25Andradina
22Andradina
19Andradina
16Andradina
17Aracatuba
14Aracatuba
11Aracatuba
8Aracatuba
5Aracatuba
30Piaui
30Birigui
27Birigui
24Birigui
21Birigui
17Birigui
10Birigui
6Birigui
1Birigui
12Andradina
27Aracatuba
29Aracatuba
26Aracatuba
28Aracatuba
1Aracatuba
20Aracatuba
18Aracatuba
19Aracatuba
21Aracatuba
22Aracatuba
0.001
Figura 11: Árvore filogenética confeccionada pelo software MEGA 3.1, utilizando como parâmetro
Neighbor-Joining para a sua construção.
Os dados obtidos através da analise dos haplótipos podem ser observados nas tabelas 1 e 2.
A tabela 1 representa os 12 haplótipos e seus respectivos sítios onde ocorreram os polimorfismos.
Como pode ser observado na tabela, a maioria dos haplótipos esta representada por apenas 1
individuo. Os haplótipos 1 e 7 são os que mais representativos e diferem entre si por apenas um sítio
polimórfico (posição 243). Interessante notar que esta mutação esta presente nos haplótipos H7, H8,
H9, H10 e H12, todos de indivíduos provenientes de Teresina.
Já na tabela 2 encontram se os dados referentes a cada população tais como: número de
haplótipos encontrados dentro de cada população (h), a taxa de diversidade destes haplótipos para
cada população (Hd), a média das diversidades observadas dentro de cada população (K) e por fim
a taxa de diversidade de nucleotídeos dentro de cada uma delas (Pi). A última coluna é referente
aos valores totais, ou seja, os valores do N total que é igual a 120 indivíduos. As populações de
Birigui e Andradina, por apresentarem apenas 1 haplótipo, não possuem diversidade em nenhum
nível analisado. Apesar da população de Teresina apresentar maior número de haplótipos e,
portanto, maior diversidade haplotípica, em Araçatuba são encontrados os maiores níveis de
diversidade genética. Entretanto estas diferenças entre Teresina e Araçatuba são muito pequenas.
Um mapa dos 12 haplótipos foi construído e está apresentado na Figura 12. Podemos
observar por este mapa que grande parte dos indivíduos (91%) apresentou um haplótipo (H1).
Todas as conecções entre os haplótipos representam apenas um passo mutacional. Os haplótipos
derivados de H1 podem ser divididos em 2 grupos, um com indivíduos apenas de Teresina (H7 a
H12) e outro grupo com indivíduos de Araçatuba (H2 a H6).
Tabela 1: Sítios polimórficos e suas respectivas posições e total de indivíduos estes polimorfismos:
Tabela 2: Valores de diferenciação genética calculados através do programa DnaSP Ver.4.10.9:
Andradina Araçatuba Birigui Teresina Total
Nº de
haplótipos (h)
1 6 1 7 12
Diversidade
haplótipica
(Hd)
0,00000 0,54483 0,00000 0,66437 0,41261
Média das
diferenças (K)
0,00000 1,07356 0,00000 0,95402 0,67703
Diversidade de
nucleotídeos
(Pi)
0,00000 0,00408 0,00000 0,00364 0,00257
Haplótipos Total de indivíduos
1 C C C C T G T A T 91
2 T
2
3
G
G 4
4
G
G 1
5
G 1
6 T
T
G 2
7
C
13
8
C G
1
9
T
C
1
10
T T
C
1
11
A
1
12
T T
C
1
Posição dos sítios variáveis
36
80
84
107
178
194
243
244
257
Figura 12:
Árvore confeccionada a partir dos dados de haplótipos citados na
tabela 1.
Indivíduos de Teresina
Indivíduos de todas as populações, predominantemente Andradina e
Birigui
Indivíduos de Araçatuba
5. DISCUSSÃO
Foram amplificados e seqüenciados parte do gene mitocondrial referente à partícula ribossomal
12S de 120 indivíduos a espécie Lutzomyia longipalpis, coletados em 4 diferentes cidades:
Andradina, Araçatuba e Birigui, todas estas cidades do estado de São Paulo e uma população de
Teresina, estado do Piauí (Figura 8).
Até o momento, não foi possível a amplificação do gene ribossomal nuclear 28S das amostras
de Lutzomyia longipalpis do Brasil. Apesar deste gene já ter sido utilizado em estudos de genética
populacional de amostras do Peru e Colômbia BEATI et al. (2003), as mesmas condições de
amplificação não resultaram em produto detectável das amostras brasileiras até o momento. Esta
não amplificação pode significar diferenças no DNA ribossomal das espécies estudadas por BEATI
et al. (2003) em relação aos espécimes coletados no Brasil, demonstrando um possível isolamento
entre estas duas populações, suficiente para gerar estas diferenças.
Por outro lado, os oligonucleotídeos iniciadores T1B e T2A descritos no mesmo trabalho
(BEATI et al. (2003)) referentes ao fragmento 12S rDNA mitocondrial foram utilizados na reação de
PCR gerando um produto de aproximadamente 360pb como os ilustrados na Figura 9
.
O sequenciamento dos fragmentos de DNA mostraram a presença de polimorfismos em
diferentes posições neste fragmento (Figura 10). Observou–se um SNP (single nucleotide
polymorphism) em todas as 120 seqüências analisadas (-AATCCCCGTT-) quando submetidas à
comparação com a seqüência depositada no GENBANK (-AATCCTCGTT-) proveniente de espécime
coletada na Colômbia (120:1 indivíduos). Este pode ser outro indicativo de isolamento destas duas
populações. Além deste SNP, foi observada uma deleção na seqüência de L. longipalpis da
Colômbia e Peru, quando comparada com as 120 sequências obtidas no Brasil. Uma vez que este
gene não é traduzido, deleções ou inserções podem ocorrer desde que não modifiquem
drasticamente a estrutura terciária do RNA transcrito.
Outro polimorfismo apresentou 3 diferentes alelos, um presente no isolado por BEATI et al.
(2003) (-TTGAAAAATTT-), um presente na maioria dos indivíduos analisados do Brasil (-
TTGAAATATTT-) e outro presente em 17 indivíduos de Teresina (-TTGAAACATTT-). (1:103:17)
Estas diferenças indicam que as populações do Brasil podem ser distintas de outras
populações de Lutzomyia longipalpis encontradas na América do Sul. Além disto, parece que dentro
do Brasil, a população do Nordeste possui certo isolamento das populações do Estado de São
Paulo, o que pode ter levado a uma divergência genética entre elas. Foram observados também dois
polimorfismos que diferenciam indivíduos da população de Araçatuba, a primeira consiste na região
(-TAGTTTATTC-) na quais 5 indivíduos (25:5) de Araçatuba apresentaram o polimorfismo: (-
TAGTTCATTC-). A segunda região (–GAAGGTGGATTT-) apresentou diferença em 7 indivíduos
(23:7) (–GAAGGGGGATTT-).
A cidade de Araçatuba representa um ponto importante no histórico da Leishmaniose Visceral
no Estado de São Paulo, devido ao fato de ter sido o primeiro foco registrado da doença no Estado
(CAMARGO-NEVES & KARTZ 1999, GALIMBERTTI et al. 1999).
Quando construída a árvore filogenética (Figura 11), a partir destas seqüências do segmento
12S rDNA mitocondrial, observa se que há grande similaridade entre os indivíduos, já que se trata
de um segmento de gene conservado, porém construíram-se dois ramos bem definidos, um
agrupamento de 17 indivíduos da população de Piauí mais próximos a seqüência depositada no
GENBANK e o outro formado por 10 indivíduos de Araçatuba, devido aos SNPs já citados
anteriormente. Ainda que se trate de diferenças genéticas muito sutis, porém não menos
interessantes, estas podem servir como base para estudos mais aprofundados com marcadores
mais polimórficos que comprovem se realmente já existam grandes divergências entre populações
do Brasil.
Outro resultado curioso foi a semelhança revelada entre as populações de Andradina e
Birigui, já que esta última cidade encontra-se geograficamente muito mais próxima de Araçatuba,
como podemos observar na figura 8, e a cidade de Andradina encontra-se bem próxima a fronteira
do estado de São Paulo com o estado de Mato Grosso do Sul. Acreditamos que uma explicação
para este fato seja devido a maior densidade demográfica da cidade de Araçatuba, 169.303
habitantes, possuir uma infra-estrutura melhor o que atrai pessoas de diferentes localidades e por
estar localizada na rota rodoviária que liga o estado de São Paulo ao estado de Mato Grosso do Sul,
o que nos leva a supor que a população de insetos de Araçatuba entre em contato mais facilmente
com outras populações de fora, levando a uma maior diversidade genética em relação a Andradina e
Birigui, que são cidades menores, 54.824 e 94.685 habitantes respectivamente.
Encontramos 12 haplótipos entre as populações, e ao avaliarmos mais detalhadamente estes
haplótipos encontrados (Tabela 1 e 2), podemos observar que as seqüências realmente são
bastante homogêneas quanto a sua composição, especialmente as populações de Andradina e
Birigui, onde não foram observados polimorfismos. Encontramos nas populações de Araçatuba e
Teresina polimorfismos significativos sendo 6 haplótipos observados em Araçatuba e 7 em Teresina.
Como podemos observar na figura 12, os haplótipos que forneceram dados interessantes
foram: para Araçatuba: H2= 2 indivíduos, H3=2 indivíduos e H6=4 indivíduos e para Teresina: H7, 13
indivíduos, dados que reproduzem no diagrama de haplótipos dois ramos bem definidos para estas
populações destacando os polimorfismos observados entre as populações analisadas. Dados que
nos leva a supor que realmente já exista uma diferenciação entre as populações do nordeste do país
e as populações presentes no estado de São Paulo. Já o haplótipo H1=91 indivíduos que inclui
alguns espécimes das 4 populações estudadas e todos os indivíduos de Andradina e Birigui, revela
uma uniformidade entre as populações, onde se encontram a maior parte dos indivíduos agrupados.
Quanto aos valores de Diversidade haplótipica (Hd), Diversidade de nucleotídeos (Pi) e Média
das diferenças (K) obtidos na Tabela 2, não é possível afirmar através deles se estes polimorfismos
realmente são relevantes, pois não encontramos trabalhos sobre os haplótipos dentro da espécie
Lutzomyia longipalpis. Apenas é possível afirmar que a população de Araçatuba, apesar de possuir
um número menor de haplótipos, possui uma maior diversidade de nucleotídeos e um K, maior em
relação à população de Teresina, podemos portanto apenas afirmar que a população de Araçatuba é
mais polimórfica que a de Teresina, fato que possivelmente se deva ao intenso fluxo de pessoas que
ocorre nesta cidade que é uma importante ligação entre os estados de São Paulo e Mato Grosso do
Sul.
Desde o primeiro artigo relatando a possibilidade de Lu. longipalpis ser um complexo de
espécies MANGABEIRA (1969) alguns estudos vem sido realizados a fim de esclarecer este ponto.
Como podemos observar na revisão de BAUZER (2007) a maioria destes trabalhos concluíram que
realmente trata-se de um complexo de espécies. Porém, assim como está muito bem destacado na
conclusão de MAINGON (2007), para que se esclareça essa incógnita é necessária a união de
diferentes áreas, pois se trata de uma questão multidisciplinar. Os dados presentes neste trabalho
indicam, que pelo menos para as populações analisadas, não possuímos grandes divergências que
indiquem a ocorrência de espécies crípticas. Apesar disso, temos que tratar estes resultados com
ressalva visto dois fatores: um pequeno número de populações foram analisadas, principalmente do
Nordeste, onde apenas uma população foi avaliada; além disso, o marcador utilizado neste trabalho
consiste de um gene mitocondrial, ou seja, um gene de origem materna no qual não ocorre
recombinação. Mesmo levando em conta estes dois fatores, pudemos observar um grau de
polimorfismo que indica que estas populações compreendem um ramo monofilético que representam
uma espécie, Lutzomyia longipalpis.
7. CONSIDERAÇÕES FINAIS
Os dados presentes neste trabalho indicam, que pelo menos para as populações analisadas,
não possuímos grandes divergências que indiquem a ocorrência de espécies crípticas. O grau de
polimorfismo observado indica que estas populações compreendem um ramo monofilético que
representam uma espécie: Lutzomyia longipalpis.
Apesar destes polimorfismos não terem ocorrido em um número consistente de indivíduos e
para variações intra-especificas este talvez não seja o melhor marcador molecular, estes dados são
relevantes; pois, trata-se um gene mitocondrial, ou seja, um gene de origem materna, portanto,
permite analises de linhagens históricas e também se trata de um segmento conservado, o que leva
a supor que realmente exista divergência entre as populações. Esses dados podem servir de base
para estudos com outros marcadores moleculares, de regiões com maiores taxas de polimorfismos;
pois os estudos genéticos sobre a espécie Lutzomyia longipalpis ainda são recentes e em pequeno
número, e a doença tem sido notificada em números crescentes anualmente, portanto ainda é um
importante campo de estudo a ser explorado.
Para que se esclareça se Lutzomyia longipalpis trata-se realmente de um complexo de
espécies é necessária a união de diferentes áreas, pois se trata de uma questão multidisciplinar
(Maigon et al., 2007)
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
1. ARRIVILLAGA, J.C., FELICIANGELI, M.D. Larval morphological differentiation between pppulations of
Lutzomyia longipalpis (Lutz & Neiva) in Venezuela (Díptera: Psychodidae). Bol Entomol Venez. 15:
229-234, 2000.
2. ARRIVILLAGA, J.C., FELICIANGELI, M.D. Lutzomyia pseudolongipalpis: the first new species witin the
longipalpis (Díptera: Psychodidae: Phlebotominae) complex from La Riconada, Curarigua, Lara State,
Venezuela. J Med Entomol. 38: 783-790, 2001.
3. ARRIVILLAGA, J.C., NORRIS, D.E., FELICIANGELI, M.D., LANZARO, G.C. Phylogeography of the
neotropical sand fly Lutzomyia longipalpis inferred from mitochondrial DNA sequences. Infection,
Genetic and Evolution 2, p: 83-95, 2002.
4. BAUZER, L. G. S. R., SOUZA, N.A., WARD, R. D., KYRIACOU, C. P. PEIXOTO, A.A. The period gene
and genetic differentiation between three Brazilian populations of Lutzomyia longipalpis. Insect
Molecular Biology, v.11 (4): p. 315-323, 2002.
5. BAUZER, L.G.S.R., SOUZA, N.A., MAIGON, R.D.C., PEIXOTO, A.A. Lutzomyia longipalpis in Brazil: a
complex or a single species? A mini-review. Mem Inst Oswaldo Cruz, v.102 (1): p.1-12, 2007.
6. BEATI, L and KEIRANS, J. E., Analysis of the systematic relationships among ticks of de genera
Rhipicephalus and Boophilus (Acari:Ixodidae) based on the mitochondrial 12S ribosomal DNA gene
sequences and morphological characters. J. Parasitol., v. 87(1), 2001, p. 32–48
7. BEATI, L., CÁRCERES, A.G., LEE, J.A., MUNSTERMANN, L.E. Systematic relationships among
Lutzomyia sand flies (Diptera: Psychodidae) of Peru and Colombia based on the analysis of 12S end
28S ribosomal DNA sequences. International Journal for Parasitology, v. 34, 2004, p.225-234.
8. BOROVISKY (1898) apud ____ RATH, S., TRIVELIN, L. A., IMBRUNITO, T. R., TOMAZELA, D. M.,
JESUS, M.N., MARZAL, P. C. Antimoniais empregados no tratamento da leishmaniose: Estado da
arte. Química Nova v. 26(4): p. 550-555, 2003.
9. CAMARGO-NEVES, VLF de, KATZ, G. Leishmaniose visceral americanas no estado de São Paulo.
Rev. Soc. Bras. de Méd. Tropical v. 32 (Supl.II): p.63-64, 1999.
10. CAMARGO - NEVES, V.L.F., GLASSER, C.M., CRUZ, L.L., ALMEIDA, R.G. Manual de Vigilância e
Controle da Leishmaniose Visceral Americana no Estado de São Paulo. Governo do Estado de São
Paulo, Secretaria de Estado da Saúde, Superintendência de Controles de Endemias e
Coordenadoria de Controles de Saúde. São Paulo, 2006.
11. CUNHA, A. M. & CHAGAS, E.1937. Nova espécie de protozoário do Gênero Leishmania
pathogênico para o homem (nota prévia). O Hospital vol. XI (2): 5-9.
12. CUNNINGHAM (1885) apud ____ RATH, S., TRIVELIN, L. A., IMBRUNITO, T. R., TOMAZELA, D. M.,
JESUS, M.N., MARZAL, P. C. Antimoniais empregados no tratamento da leishmaniose: Estado da
arte. Química Nova v. 26(4): p. 550-555, 2003.
13. DEPAQUIT, J. FERTÉ, H., LÉGER, N., KILLICK-KENDRICK, R., RIOUX, J. A., KILLICK-KENDRICK,
M., HANAFI, H. A., GOBERT, S. Molecular systematics of the Phlebotomine sandflies of the subgenus
Paraphlebotomus (Diptera, Psychodidae, Phlebotomus) based on ITS 2 rDNA sequences. Hypotheses
of dispersion and speciation. Insect Molecular Biology, v 9 (3): p. 293-300, 2000.
14. DEPAQUIT, J., FERTÉ, H., LÉGER, N., LEFRANC, F., ALVES-PIRES, C., HANAFI, H., MAROLI, M..,
MORILLAS-MARQUEZ, F., RIOUX, J-A., SVOBODOVA, M., VOLF, P. ITS 2 sequences heterogeneity
in Phlebotomus sergenti and Phebotomus similis (Diptera, Psychodidae): possible consequences in
their ability to transmit Leishmania tropica. International Journal for Parasitology, v. 32: p. 1123-
1131, 2002.
15. DESJEUX, P. Leishmaniasis: public health aspects and control. Clinics in Dermatology, v. 14: p. 417-
423, 1996.
16. DIAS, E. S., FORTES-DIAS, C. L., STITELER, J. M., PERKINS P. V., LAWYER, P. G. Random
amplified polymorphic DNA (RAPD) analysis of Lutzomyia longipalpis laboratory populations. Revista
do Instituto de Medicina Tropical de São Paulo, v. 40: p. 49-53, 1998.
17. DONOVAN, C. On the possibility of occurrence of trypanosomiasis in Índia. BMJ, v. 2: p. 79, 1903.
18. EOM, K. S., JEON, H-K., KONG, Y., HWANG, U. W., YANG, Y., LI, X., XU, L., FENG, Z.,
PAWLOWSKI, Z. S., RIM, H.-J. Identification of Taenia asiática in China: molecular, morphological,
and epidemiological analysis of a Luzhai isolate. Journal Parasitology, v. 88(4): p. 758-764, 2002.
19. EWING, B., GREEN, P. Base-calling of automated sequencer traces using Phred. II. Error probabilities.
Genome Research, v. 8: p. 186-194, 1998.
20. FORATTINI, O.; RABELLO, E. X. & PATTOLI, D. G. B. Sobre o encontro de Lutzomyia longipalpis
(Lutz & Neiva) no estado de São Paulo, Brasil. Rev. Saúde Públ., v. 4(1): 99- 100, 1970.
21. FUNDAÇÃO NACIONAL DE SAÚDE. Controle, diagnóstico e tratamento da leishmaniose visceral
(Calazar): Normas técnicas. Ministério da Saúde. Brasília, 2003.
22. GALATI, E.A.B. Phylogenetic systematics of the Phlebotominae (Diptera, Psychodidae) with emphasis
on American groups. (II Intern. Symp. Phlebotominae Sandflies). Bol. Dir. Malariol. Saneam. Amb. 35
(supl. 1): 133-142, 2003.
23. GALATI, EAB. Morfologia, terminologia de adultos e identificação dos táxons da América. In Rangel
EF, Lainson R. Flebotomíneos do Brasil. Rio de Janeiro., Fiocruz. pg. 55, 2003.
24. GALIMBERTI, M.Z., KATZ, G., CAMARGO-NEVES, V.L. F de, RODAS, L.A.C., CASANOVA, C.,
COSTA, I.P., ARAÚJO, M.F.L., TANIGUCHI, H.H., BARBOSA, J.A.R., BARBOSA, J.R.E., TOLEZANO,
J.E., PINTO, P.L.S. Leishmaniose visceral americana no Estado de São Paulo. Ver. Soc. Bras. Med.
Trop. v. 32: p.217-218, 1999.
25. GENARO, O & MICHALICK, M. S. M. Leishmaniose visceral americana. In: Neves, D. P.
Parasitologia Humana. São Paulo, Editora Ateneu. 11ª ed.cap. 10, p. 67-83, 2005.
26. GRIMALDI, G. Jr., & TESH, R. B. L. Leishmaniases of the new World: current concepts and
implications for future research. Clinical Microbiol Review, v. 6: 230-250, 1993.
27. HODGKINSON, V. H., BIRUNGI, J., HAGHPANAH, M., JOSHI, S., MUNSTERMANN, L. E. Rapid
identification of mitochondrial cytochrome B haplotypes by single strand conformation polymorphism in
Lutzomyia longipalpis (Diptera: Psychodidade) populations. Journal of Medicine Entomology, v.
39(4): p. 689-694, 2002.
28. KAMPEN, H., STERNBERG, A., PROFT, J., BASTIAN, S., SCHAFFNER, F., MAIER, W., SEITZ, H. M.
Polymerase chain reaction-based differentiation of the mosquito sibling species Anopheles claviger ss
and Anopheles petragnani (Diptera: Culicidae). American Journal Tropica Medicine Hygiene, v.
69(2): p. 195-199, 2003.
29. LAINSON R., SHAW, J.J. Evolution, classification and geographical distribution. In The Leishmaniasis
in Biology and Medicine. Academic Press Inc., London 1: p. 1-120, 1987.
30. LANZARO, G. C., OSTROVSKA, K., HERRERO, M. V., LAWYER, P. G., WARBURG, A. Lutzomyia
longipalpis is a species complex: genetic divergence and interspecific hybrid sterility among three
populations. Am J Trop Med Hyg. 49:839-847.
31. American Journal Tropical Medicine Hygiene, v. 48: p. 839-847, 1993.
32. LASVERAN & MESNIL (1903) apud ____ RATH, S., TRIVELIN, L. A., IMBRUNITO, T. R.,
TOMAZELA, D. M., JESUS, M.N., MARZAL, P. C. Antimoniais empregados no tratamento da
leishmaniose: Estado da arte. Química Nova v. 26(4): p. 550-555, 2003.
33. LEISHMAN, W. B. On the possibility of occurrence of trypanosomiasis in Índia. BMJ, v. 2: p. 79, 1903.
34. LUTZ, A., NEIVA, A. Contribuição para o conhecimento das espécies do gênero Phlebotomus
existentes no Brasil. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz, v. 4: p. 84-95, 1912.
35. MAINGON, R. D. C., WARD, R. D., HAMILTON, J. G. C., NOYES, H. A., SOUZA, N., KEMP, S. J.,
WATTS, P. C. Genetic identification of two sibling species of Lutzomyia longipalpis (Diptera:
Psychodidade) that produce distinct male sex pheromones in Sobral, Ceará State, Brazil. Molecular
Ecology, v. 12 (7): p. 1879 – 1894, 2003.
36. MAINGON, R. D. C., WARD, R. D., HAMILTON, BAUZER, L.G.S.R., PEIXOTO, A.A., The Lutzomyia
longipalpis species complex: does population sub-structure matter to Leishmania transmission?
TRENDS in Parasitology, v.24 (1): p.12-16.
37. MANGABEIRA, O. Sobre a sistemática e biologia dos flebótomos do Ceará. Ver Brás Mal Doen Trop,
v. 21: p. 3-26, 1969.
38. MARFURT, J., NIEDERWIESER, I., MAKIA, N. D., BECK, H-P., FELGER, I. Diagnostic genotyping of
Old and New World Leishmania species by PCR-RFLP. Diagnostic Microbiology and Infectious
Disease, v. 46: p. 115-124, 2003.
39. MUKHOPADHYAY, J., GHOSH, K., BRAIG, H. R. Identification of cutaneous Leishmaniasis vectors,
Phlebotomus papatasi and P. duboscqi using random amplified polymorphic DNA. Acta Tropica v. 76:
p. 277-283, 2000.
40. PALUMBI S. R. PCR and molecular systematics. Molecular Systematics, 2 ed.: p. 205-247, 1996.
41. PEIXOTO, A. A., GOMES, C. A., AMORETTY, P. R., LINS, R. M. M. A., MEIRELES-FILHO, A. C. A.,
SOUZA, N. A., KYRIACOU, C. P. New molecular markers for phlebotomine sand flies. International
Journal for Parasitology v. 31: p. 635-639, 2001.
42. PENNA, H. A., 1934. Leishmaniose visceral no Brasil. Brasil Médico, 48: 949-950.
43. RATH, S., TRIVELIN, L. A., IMBRUNITO, T. R., TOMAZELA, D. M., JESUS, M.N., MARZAL, P. C.
Antimoniais empregados no tratamento da leishmaniose: Estado da arte. Química Nova v. 26(4): p.
550-555, 2003.
44. REFSETH, U. H., FANGAN, B. M., JAKOBSEN, K. S. Hybridization capture of microsatéllites directly
from genomic DNA. Electrophoresis, v. 18: 1519 – 1523, 1997.
45. ROGERS, L (1904) Preliminary note on the development of Trypanossoma in cultures of Cunningham-
Leshman-Donovan bodies of cachexial fever and kala-azar. Lancet 2:215-216.
46. ROSS (1903) apud ____ RATH, S., TRIVELIN, L. A., IMBRUNITO, T. R., TOMAZELA, D. M., JESUS,
M.N., MARZAL, P. C. Antimoniais empregados no tratamento da leishmaniose: Estado da arte.
Química Nova v. 26(4): p. 550-555, 2003.
47. ROZEN, S. & SKALETSKY, H.J. Primer 3. Code available at http://
www.genome.wi.mit.edu/genome_software/other/primer3.html
48. SOTO, S.I.; LEHMANN, T.; ROWTON, E.D.,; VELEZ, B.I.D.; PORTER, C.H. Speciation and population
structure in the morphospecies Lutzomyia longipalpis (Lutz & Neiva) as derived from mitochondrial
ND4 gene. Mol Phylogen Evol. 18: 84-93.
49. SWOFFORD, D. L. PAUP – Phylogenetic analysis using parsimony, Version 4. Sinauer Associates,
Sunderland, Massachusetts, 2000.
50. THOMPSON, J. D. GIBSON, T. J., PLEWNIAK, F., HIGGINS, D. G. The Clustal X windows interface
flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools. Nucleic Acids
Research, v. 25: p. 4876-4882, 1997.
51. TOLEZANO, J. E., TANIGUCHI, H. H., ELIAS, C. R., LAROSA, R. Epidemiologia da Leishmaniose
Tegumentar Americana (LTA) no Estado de São Paulo. Revista do Instituto Adolfo Lutz, v. 60(1): p.
47-51, 2001.
52. URIBE, S. The status of the Lutzomyia longipalpis species complex and possible implications for
Leishmania transmission. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz, v. 94(6): p. 729-734, 1999.
53. WARD, R.D.; RIBEIRO, A.L.; READY, P.R., MURTAGH, A. Reproductive isolation between different
forms of Lutzomyia longipalpis (Lutz & Neiva), (Diptera:Psychodidade), the vector of Leishmania
donovani chagasi (Cunha & Chagas) and its significance to kala-azar distribuition in South America.
Mem Inst Oswaldo Cruz. 78:269-280. 1983
54. WARD, R.D.; PHILLIPS, A.; BRUNET, B.; MARCONDES, C.B.. The Lutzomyia longipalpis complex
and distribution. In MW Service, Biosystematics of Haematophagous Insects, Oxford University
Press, Oxford, p.258-269, 1988.
55. WATTS, P. C., BOYLAND, E., NOYES, H. A., MAINGON, R., KEMP, S. J. Polymorphic dinucleotide
microsatellite loci in the sandfly Lutzomyia longipalpis (Diptera: Phlebotominae). Molecular Ecology
Notes, v. 2: p. 62-64, 2002.
56. WEST, D. F., PAYETTE, T., MUNDY, T., BLACK, W. C. Regional molecular genetic key of thirteen
snow pool Aedes species (Diptera: Culicidae) in northern Colorado. Journal of Medical Entomology,
v. 34(4): p. 404 – 410, 1997.
57. WILIAMS, P & DIAS, E. S. Psychodidae. In: Neves, D. P. Parasitologia Humana. São Paulo, Editora
Ateneu. 11ª ed. Cap. 42, p. 345 - 353, 2005.
58. WHO/OMS – World Health Organization/ Organisation Mondiale de La Santé. Disease and its impact.
Geographical distribution. Disponível em: htt://www.who.int/emc/diseases/leish/index.html
Acessado em: 25/09/03.
Livros Grátis
( http://www.livrosgratis.com.br )
Milhares de Livros para Download:
Baixar livros de Administração
Baixar livros de Agronomia
Baixar livros de Arquitetura
Baixar livros de Artes
Baixar livros de Astronomia
Baixar livros de Biologia Geral
Baixar livros de Ciência da Computação
Baixar livros de Ciência da Informação
Baixar livros de Ciência Política
Baixar livros de Ciências da Saúde
Baixar livros de Comunicação
Baixar livros do Conselho Nacional de Educação - CNE
Baixar livros de Defesa civil
Baixar livros de Direito
Baixar livros de Direitos humanos
Baixar livros de Economia
Baixar livros de Economia Doméstica
Baixar livros de Educação
Baixar livros de Educação - Trânsito
Baixar livros de Educação Física
Baixar livros de Engenharia Aeroespacial
Baixar livros de Farmácia
Baixar livros de Filosofia
Baixar livros de Física
Baixar livros de Geociências
Baixar livros de Geografia
Baixar livros de História
Baixar livros de Línguas
Baixar livros de Literatura
Baixar livros de Literatura de Cordel
Baixar livros de Literatura Infantil
Baixar livros de Matemática
Baixar livros de Medicina
Baixar livros de Medicina Veterinária
Baixar livros de Meio Ambiente
Baixar livros de Meteorologia
Baixar Monografias e TCC
Baixar livros Multidisciplinar
Baixar livros de Música
Baixar livros de Psicologia
Baixar livros de Química
Baixar livros de Saúde Coletiva
Baixar livros de Serviço Social
Baixar livros de Sociologia
Baixar livros de Teologia
Baixar livros de Trabalho
Baixar livros de Turismo