( PDF ) Estudo das proteases de micobactérias: clonagem, expressão e caracterização da protease recombinante HtrA2 produzida in vivo pelo Mycobacterium leprae

Download PDF

ads:

Universidade Federal do Rio de Janeiro

Instituto de Bioquímica Médica

MICHELLE LOPES RIBEIRO GUIMARÃES

Estudo das proteases de micobactérias: clonagem, expressão e caracterização da

protease recombinante HtrA2 produzida in vivo pelo Mycobacterium leprae

V. I

Rio de Janeiro

*2007*

ads:

Livros Grátis

http://www.livrosgratis.com.br

Milhares de livros grátis para download.

LOMBADA

MICHELLE LOPES RIBEIRO

GUIMARÃES

Estudo das proteases de

micobactérias: clonagem, expressão

e caracterização da protease

recombinante HtrA2 produzida in

vivo pelo Myco

bacterium leprae

UFRJ

V. I

ads:

Michelle Lopes Ribeiro Guimarães

Estudo das proteases de micobactérias: clonagem, expressão e

caracterização da protease recombinante HtrA2 produzida in

vivo pelo Mycobacterium leprae

Número de volumes: 1

Tese de Doutorado apresentada ao Programa de Pós-

Graduação em Química Biológica, Instituto de Bioquímica

Médica, Universidade Federal do Rio de Janeiro, como parte

dos requisitos necessários à obtenção do título de Doutor em

Química Biológica.

Orientador: Maria Cristina Vidal Pessolani

Rio de Janeiro

*2007*

FICHA CATALOGRÁFICA

Guimarães, Michelle Lopes Ribeiro.G..

Estudo das proteases de micobactérias: clonagem,

expressão e caracterização da protease recombinante HtrA2

produzida in vivo pelo Mycobacterium leprae / Michelle Lopes

Ribeiro Guimarães. Rio de Janeiro, 2007.

x, 128 f.: il.

Tese (Doutorado em Química Biológica) –

Universidade Federal do Rio de Janeiro, Instituto

de Bioquímica Médica, 2007.

Orientador: Maria Cristina Vidal Pessolani

1. Mycobacterium leprae. 2. Genômica

Comparativa. 3. Proteases. 4. HtrAs – Teses.

I.Pessolani, Maria Cristina Vidal (Orient.). II.

Universidade Federal do Rio de Janeiro. Instituto

de Bioquímica Médica. III. Título.

Michelle Lopes Ribeiro Guimarães

Estudo das proteases de micobactérias: clonagem, expressão e caracterização da

protease recombinante HtrA2 produzida in vivo pelo Mycobacterium leprae

Tese submetida ao corpo docente do Instituto de Bioquímica Médica da Universidade Federal

do Rio de Janeiro, como parte dos requisitos necessários à obtenção do título de Doutor em

Química Biológica.

Rio de Janeiro, 23 de Julho de 2007.

______________________________________________

Dra. Maria Cristina Vidal Pessolani, Chefe do Laboratório de Microbiologia Celular,

Instituto Oswaldo Cruz, FIOCRUZ.

(Orientador)

______________________________________________

Dr. Robson de Queiroz Monteiro, Professor Adjunto, Instituto de Bioquímica Médica

/ICB/UFRJ.

______________________________________________

Dr. Flavio Alves Lara, Pesquisador Assistente, Laboratório de Microbiologia Celular,

Instituto Oswaldo Cruz, FIOCRUZ.

______________________________________________

Dr. Carlos Roberto Alves, Pesquisador Associado, Laboratório de Biologia Molecular de

Doenças Endêmicas Manguinhos, Instituto Oswaldo Cruz, FIOCRUZ.

______________________________________________

Dr. Orlando Bonifácio Martins, Professor Adjunto, Instituto de Bioquímica

Médica/ICB/UFRJ.

(Suplente Interno)

______________________________________________

Dra. Maria Helena Feres Saad, Pesquisador Titular, Instituto Oswaldo Cruz, FIOCRUZ.

(Suplente Externo)

Este trabalho foi realizado no Laboratório de Microbiologia Celular, do Instituto Oswaldo

Cruz da Fundação Oswaldo Cruz, sob a orientação da Doutora Maria Cristina Vidal

Pessolani.

Este trabalho foi financiado pelo CNPq e FAPERJ.

Ao meu amado esposo Hugo

Aos meus pais, Vitorino e Cleusa

AGRADECIMENTOS

O reconhecimento – substantivo e o reconhecer – verbo, ambos se constroem, primeiro

com a desconstrução de realidades aparentemente reais e depois com o tempo – irremediável.

Aprendi durante este trajeto, muitas técnicas, formas para tornar respostas, perguntas que nos

pareciam mistérios aprendi que Ciência paradoxalmente é intuição, instinto, que conflitam com a

razão e os protocolos. Qual não é nossa emoção e realização quando nos deparamos frente a um

resultado próspero? No entanto, acredito que nosso maior aprendizado vem das pessoas que se

deparam e passam por nosso caminho, é para todas estas pessoas que agradeço, pois participaram

de forma inquestionável deste trabalho.

♦ Àquele que tudo criou e a nós não nos cabe definir, apenas crer em sua providência que sempre

nos provê o necessário;

♦ Ao meu amor Hugo, sem você sou um ser incompleto, pela metade. Sou uma mulher

plenamente realizada ao teu lado. Obrigada pela sua incondicional doação e amor. Paciência e

confiança num futuro de felicidade;

♦ Ao meu pai, Vitorino, que sempre me incentivou e apoiou. Sem a sua participação em minha

vida eu não estaria vivendo este momento agora;

♦ À minha mãe, Cleusa, por sempre ter me dado apoio em minhas decisões e, principalmente,

por ser minha melhor amiga;

♦ Este é um agradecimento mais que especial à minha orientadora e amiga, Dra. Maria Cristina

Vidal Pessolani por me acompanhar há mais de oito anos e formar meu caráter científico. Neste

período, sempre se empenhou em apoiar, elogiar, aconselhar e repreender minhas atitudes

equivocadas. Obrigada pela amizade, confiança, paciência, dedicação, e por ser um grande

exemplo pra mim. Obrigada pela ajuda em todas as etapas desse trabalho;

♦ À Dra. Fernanda Portaro, do laboratório de Imunoquímica, Instituto Butantã, São Paulo, pela

inestimável amizade, disponibilidade, incentivo. Obrigada por me acolher nas duas ocasiões em

que estive em Sampa. Obrigada por abrir as portas do seu laboratório, disponibilizando recursos e

pessoal, para agilizar meus experimentos. Minha tese não seria a mesma sem sua participação;

♦ À Eliana Blini Marengo, também do Instituto Butantã, por ser tão amiga e prestativa. Por me

abrigar e me fazer sentir em casa. Por colaborar, participar e acreditar no meu trabalho;

♦ À Natália

Pieranfeli dos Santos

, aluna de iniciação científica da Dra. Fernanda Portaro, por

sua dedicação, ajuda e eficiência;

♦ A todos do Centro Aplicado de Toxinologia, CAT, que me receberam tão bem e tornaram

minha estada em São Paulo muito agradável. Obrigada a todos os que contribuíram para este

trabalho se tornar realidade, de forma direta ou indireta;

♦ À Dra. Euzenir Nunes Sarno, pelo incentivo e amizade, tão importantes nesta jornada;

♦ À Dra. Eugênia Galo, pela generosidade e colaboração;

♦ Ao Dr. Sergio Antunes, pelas conversas e sugestões, ajuda e colaboração;

♦ À Dra. Maria Helena Saad, e aos demais chefes de laboratório, por sempre serem tão gentis e

prestativos comigo;

♦ Ao professor Dr. Orlando O. Martins, pela revisão cuidadosa da minha tese, pelas sugestões

sempre relevantes e pela amizade;

♦ Aos meus amigos de sala e cervejas, Elisa (Rock Balboa), Julio, Leonardo, descobri em vocês o

valor da verdadeira amizade, minha jornada foi muito menos árdua pela companhia de vocês;

♦ Ás minhas amigas Luciana, Tatiana (minha amiga, ainda bronquinha), por sua ajuda em vários

momentos e incentivo;

♦ Aos meus queridos amigos de labuta, que estão distantes apenas fisicamente, Cristiana e

Renato, vocês são pessoas de fibra e merecem todo o sucesso e felicidade possível;

♦ À Patrícia, minha querida ex-aluna, pois sem a sua participação esta tese não teria sido a

mesma;

♦ Aos colegas da sala 27, Adriano, André, Érika, Lucinéia, Márcia, Michel, a Érika (que o

duende escondeu) pelos inúmeros momentos agradáveis de convivência;

♦ Aos meus colegas e amigos Milton, Adalberto, Harrison, Sidra, Viviane, Amanda, Mara, pelo

companheirismo, carinho e ajudas;

♦ Ao Dr. José Augusto médico do Ambulatório Souza Araújo/Fiocruz/RJ, pela amizade,

prestabilidade e gentilezas. Enfermeira Denise e demais componentes do ambulatório Souza

Araújo/FIOCRUZ;

♦ Aos meus sogros, Sr. Agripino e Sra. Marlene, que deram a vida ao ser que mais amo, e por

darem tanto apoio e carinho sempre. Eu ganhei não um sogro e uma sogra, mais sim, um pai e

uma mãe;

♦ Aos meus avós maternos, Arnaldo e Izaura, em sua memória, e a toda a minha família pelo

suporte carinhoso de sempre;

♦ Aos meus avós paternos, Vitorino, in memorian, e Luzia, pelo carinho, amor e exemplo de luta

e amor pela vida;

♦ Ao meu gato Azinho, ou Zen gatinho, meu gato de guarda por toda a alegria e bem estar que

causa e pela inseparável companhia durante esses 12 anos em que estamos juntos;

♦ Ao Sr. Salles, que sempre me socorreu com seu carinho fraternal e amizade;

♦ Aos funcionários

da secretaria do programa de pós-graduação em Química Biológica, IBMQ,

UFRJ, em especial para a Teresa, pelo apoio sempre solícito em todos os momentos;

♦ A todos os professores do Instituto de Bioquímica Médica, a coordenação do programa de pós-

graduação, por formarem verdadeiros doutores e mestres e em particular pela solicitude sempre

presente durante toda minha estada neste instituto;

♦ A todos os que trabalham na secretaria da hanseníase, pelas xérox e outros favores que me

foram de grande valia;

♦ À Bené, Sr. Paulo, Solange, e todos os outros colaboradores, porque sem vocês este laboratório

não funcionaria;

♦ A todos os outros amigos, que eu não citei aqui, mas que fazem parte do meu coração;

♦ Ao Instituto Pasteur, France, por ter financiado minha participação no curso “First Joint

Pasteur Institute/Wellcome Trust Course on Genomics in South América”, realizado no Uruguai e

a todos os que de alguma forma contribuíram para minha introdução ao mundo da Bioinformática;

♦ Ao LNCC por ter financiado minha participação na “

Conferência em Bioinformática: Global

dialogues on emerging science and technology”, realizado em Petrópolis, Rio de Janeiro;

♦ Ao CNPq, por terem financiado este projeto, minha bolsa, além de outros benefícios;

♦ A FAPERJ por ter financiado este projeto.

"Toda a nossa ciência, comparada com a realidade, é primitiva e infantil - e, no entanto, é a

coisa mais preciosa que temos."

Albert Einstein

RESUMO

GUIMARÃES, Michelle Lopes Ribeiro. Estudo das proteases de micobactérias:

clonagem, expressão e caracterização da protease recombinante HtrA2 produzida in

vivo pelo Mycobacterium leprae. Rio de Janeiro, 2007. Tese (Doutorado em Química

Biológica) - Instituto de Bioquímica Médica, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de

Janeiro, 2007.

Embora as proteases sejam reconhecidas como importantes fatores de

virulência em microorganismos patogênicos, pouca informação está disponível na literatura a

respeito do papel potencial destas enzimas nas doenças causadas por micobactérias. Neste

trabalho, nós utilizamos ferramentas de bioinformática para comparar os genes que codificam

para proteases presentes nos genomas de Mycobacterium leprae, Mycobacterium tuberculosis,

Mycobacterium bovis e Mycobacterium avium paratuberculosis. Esta análise nos permitiu

realizar uma revisão da nomenclatura das famílias de proteases presentes nas micobactérias.

Devotamos especial atenção ao “depauperado genoma” do M. leprae onde observamos um

relativo grau de conservação desta classe, quando comparado com outras famílias de genes.

Um total de 39 genes dos 49 encontrados em M. bovis foram identificados em M. leprae.

Definimos um grupo bem conservado de 38 genes que codificam para proteases,

compartilhadas pelas quatro espécies. Este conjunto é provavelmente essencial para a

sobrevivência no hospedeiro e para o desenvolvimento da doença, podendo representar um

relevante alvo para o desenvolvimento de drogas que resultem em um melhor controle das

doenças provocadas por micobactérias. Cinco destes genes, três codificando para putativas

proteases secretadas, foram então selecionados a fim de investigarmos sua expressão em M.

leprae isolado de biópsias de tecido epitelial de pacientes com a forma multibacilar da

hanseníase. Através da técnica de RT-PCR, demonstramos que mycP1, htrA2, htrA4, gcp e

clpC foram expressos durante o curso da infecção humana, sugerindo seu envolvimento na

patogênese. Adicionalmente, a expressão de Gcp nas lesões de pacientes com hanseníase foi

confirmada por imunohistoquímica utilizando anticorpo produzido contra esta proteína. Esta

observação reforça o potencial papel das proteases de micobactérias no contexto da

hanseníase. Finalmente, selecionamos a protease HtrA2 de M. leprae para caracterizar as

propriedades bioquímicas desta enzima. As proteínas HtrA têm sido relacionadas com a

patogênese ocasionada por diversas bactérias, no entanto, pouca informação existe acerca

destas proteases em micobactérias. A HtrA2 partilha 70% de identidade com a Rv0983, uma

proteína secretada pelo M. tuberculosis, e previamente identificada em bactérias cultivadas

em meio axenico. Produzimos a forma recombinante da HtrA2 e a sua atividade enzimática

foi analisada utilizando um conjunto de peptídeos sintéticos com fluorescência apagada

(FRET). A HtrA2 recombinante de M. leprae mostrou atividade proteolítica contra tais

peptídeos revelando uma especificidade de clivagem após resíduos básicos e atividade

máxima em temperaturas superiores a 40°C. Esta especificidade difere da descrita para DegP

e DegS, enzimas homólogas em Escherichia coli que clivam preferencialmente após resíduos

hidrofóbicos. Em conjunto, esses resultados demonstram que o M. leprae produz in vivo uma

protease da família HtrA e indica esta proteína como potencial alvo para intervenções

profiláticas e terapêuticas nas doenças provocadas por micobactérias.

ABSTRACT

GUIMARÃES, Michelle Lopes Ribeiro. Estudo das proteases de micobactérias:

clonagem, expressão e caracterização da protease recombinante HtrA2 produzida in

vivo pelo Mycobacterium leprae. Rio de Janeiro, 2007. Tese (Doutorado em Química

Biológica) - Instituto de Bioquímica Médica, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de

Janeiro, 2007.

Although proteases are recognized as important virulent factors in pathogenic

microorganisms, little information is available so far regarding the potential role of these

enzymes in diseases caused by mycobacteria. Here we use bioinformatic tools to compare the

protease-coding genes present in the genome of Mycobacterium leprae, Mycobacterium

tuberculosis, Mycobacterium bovis and Mycobacterium avium paratuberculosis. This

analysis allowed a review of the nomenclature of the protease families present in

mycobacteria. A special attention was devoted to the `decaying genome` of M. leprae where

a relatively high level of conservation of protease-coding genes was observed when compared

to other genes families. A total of 39 genes out of the 49 found in M. bovis were identified in

M. leprae. Of relevance, a core of well-conserved 38 protease genes shared by the four

species was defined. This set of proteases is probably essential for survival in the host and

disease outcome and may constitute novel targets for drug development leading to a more

effective control of mycobacterial diseases. Five of these genes, three coding for putative

secreted proteases, were then selected to investigate their expression in M. leprae isolated

from skin biopsies of multibacillary leprosy patients. Via nested-PCR, it was demonstrated

that mycP1, htrA2, htrA4, gcp and clpC were expressed in vivo during the course of human

infection, suggesting their involvement in leprosy pathogenesis. Moreover, the expression of

Gcp in leprosy lesions was further confirmed by imunohistochemistry using a specific

hyperimmune serum. This observation reinforces the potential role of mycobacterial

proteases in the context of leprosy pathogenesis. Finally we obtained the recombinant HtrA2

protease of M. leprae for further enzymatic characterization. HtrA proteins have been shown

to play a role in bacterial pathogenesis, but the mycobacterial counterparts have not been

studied. M. leprae HtrA2 shares 70 % identity with Rv0983, a protein secreted by M.

tuberculosis, and previously identified in conditioned medium of bacteria grown in axenic

medium. The recombinant HtrA2 protein was produced and its enzymatic activity analyzed

using a collection of fluorescence resonance energy transfer (FRET) synthetic peptides. The

M. leprae recombinant HtrA2 displayed proteolytic activity toward the FRET peptides,

revealing a specificity of cleavage after Arg residues and maximum activity at temperatures

over 40°C. Together, our data demonstrate that M. leprae produces in vivo an HtrA2 like-

protease, and indicates this protein as a new potential target for prophylaxis and therapeutic

interventions in mycobacterial diseases.

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Figura Página

Figura 1: Mapa mostrando a distribuição da hanseníase no mundo em 2005. 4

Figura 2: Espectro clínico da hanseníase. 6

Figura 3: Esquema da parede celular de micobactérias. 9

Figura 4: Árvore filogenética para o gênero Mycobacterium. 13

Figura 5: Nomenclatura para descrever a interação do substrato com a protease. 17

Figura 6: Estrutura do sítio S1 da tripsina com um resíduo de lisina ligado a

cadeia.

Figura 7: Organização dos domínios moleculares dos membros da família HtrA. 21

Figura 8: Esquema da ativação das DegS. 22

Figura 9: Modelo anêmona para o mecanismo de ativação das HtrAs. 23

Figura 10: Regulação do promotor do gene degP em E. coli. 25

LISTA DE TABELAS

Tabela Página

Tabela 1: Análise das características gerais dos genomas. 12

Tabela 2: Clãs de serina proteases. 19

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

% - Porcentagem.

µg/mL -

Microgramas por mililitro.

µg – Micrograma.

µL – Microlitro.

µM – Micromolar.

C Grau Celsius.

A Adenosina.

BAAR Bacilo álcool ácido resistente.

BCG Bacilo de Calmette-Guérin.

BSA Albumina sérica bovina.

C Citidina.

cDNA DNA complementar.

CDS Seqüência codificante.

Degs Proteases que degradam proteínas mal formadas.

DFP Diisopropilfluorofosfato.

DNA Ácido desoxirribonuclêico.

dNTP Desoxirribonucleotídeos (N= A, C, G ou T).

eV Elétron volt.

FRET “fluorescence resonance energy transfer”.

g Grama (s).

G Guanosina.

g/L - Gramas por litro.

h - Hora.

HCl - Ácido clorídrico.

HtrAs Proteases com requerimento de elevadas tempetraturas para

sua atividade.

IB Índice baciloscópico.

IPTG Isopropil-D-galactosídeo.

kb Quilobases – 1 kb = 1 000 bases nucleotídicas.

kDa Quilodaltons – 1 kDa = 1 000 Daltons.

LAM Lipoarabinomanana.

LB Lura-Bertani – meio para cultura bacteriana.

LM Lipomanana.

M - Molar.

MAC Complexo Mycobacterium avium.

MCA Metilcoumarina.

mg Miligramas.

min. Minuto (s).

mL - Mililitro.

mm Milímetros.

mM - Milimolar.

ng Nanogramas.

nm Nanometros.

OMS Organização Mundial de Saúde.

PAGE - Eletroforese em gel de poliacrilamida.

pb - Par (es) de base (s).

PBS Tampão fosfato salino.

PCR Reação da polimerase em cadeia.

PDIM Fiotiocerol dimicocerosato.

PDZ Proteína densa pós-sináptica.

PGL-1 Glicolipídeo fenólico 1.

PIM Fosfatidilinositol manosídeo.

PMSF Fenilmetilsulfonil fluorido.

PQT Poliquiomioterapia.

rHtrAs Forma recombinante da protease com requerimento de

elevadas tempetraturas para sua atividade.

RNA Ácido ribonucleíco.

RNAm Molécula de RNA mensageiro.

RNAr Molécula de RNA ribossômico.

Rv0000 Código de duas letras e quatro números para a cepa H37Rv

de Mycobacterium tuberculosis.

RT Transcriptase reversa.

s Segundo (s).

SDS - Dodecil-sulfato de sódio.

T Timidina.

TBS Tampão Tris salina.

TBS/T Tween.

TMM Trealose monomicolato.

Tris - Trishidroximetilamino metano.

U Unidade.

V Volts.

X g - Velocidade de sedimentação em unidade gravitacional.

LISTA DE TRÊS E UMA LETRAS PARA OS AMINOÁCIDOS

Aminoácido Código de três letras Código de uma letra

Alanina Ala A

Arginina Arg R

Asparagina Asn N

Ácido aspártico Asp D

Ácido Glutâmico Glu E

Cisteína Cys C

Fenilalanina Phe F

Glicina Gly G

Glutamina Gln Q

Histidina His H

Isoleucina Ile I

Leucina Leu L

Lisina Lys K

Metionina Met M

Prolina Pro P

Serina Ser S

Tirosina Tyr Y

Treonina Thr T

Triptofano Trp W

Valina Val V

SUMÁRIO

1 Introdução

1.1 O gênero Mycobacterium 1

1.2 Epidemiologia das Micobactérias 2

1.3 Hanseníase 4

1.4 Características do Mycobacterium leprae 7

1.5 Genômica comparativa 10

1.6 Papel de proteases bacterianas na interação patógeno-hospedeiro 13

1.7 As famílias de proteases 15

1.8 Serina-proteases 17

1.9 A família das proteases com requerimento de elevadas

temperaturas, tipo A (HtrAs)

1.9.1 Regulação da atividade das HtrAs 23

2 Objetivos

2.1 Objetivo geral 27

2.2 Objetivos específicos 27

3 Resultados

Manuscrito 1

Manuscrito 2

Manuscrito 3

4 Discussão

5 Conclusão

6 Referência

7. Apêndice

Estudo das proteases de micobactérias

1 Introdução

1.1 O gênero Mycobacterium

O gênero Mycobacterium inclui mais de 70 espécies, a maioria saprófitas de vida livre

e apenas uma pequena proporção destas bactérias causam doenças crônicas em humanos e

animais. Juntamente com os gêneros Corynebacterium, Nocardia e Rhodococcus pertencem à

ordem dos Actinomycetales e família Mycobacteriacea, tendo em comum o fato de serem

bactérias aeróbicas com a parede celular rica em ácidos micólicos, Gram-positivas, álcool-

ácido resistentes e não formarem esporos (VAN SOOLINGEN, 2001).

Doenças como a tuberculose, a lepra, e uma gama de infecções oportunistas

provocadas por diversas espécies de micobactérias são consideradas extremamente

importantes no cenário da saúde pública mundial. Indivíduos imunodeprimidos podem ser

acometidos por infecções causadas por micobactérias oportunistas como o Mycobacterium

avium e Mycobacterium intracellulare integrantes do complexo Mycobacterium avium

(MAC). Estas infecções são difíceis de controlar devido à resistência natural destas espécies

aos antibióticos que são eficientes contra Mycobacterium tuberculosis e Mycobacterium

leprae (BIET, et al., 2005).

A tuberculose em humanos é causada principalmente pelo M. tuberculosis, no entanto,

o Mycobacterium bovis, agente etiológico da tuberculose bovina também pode ser

responsável pela doença. Dentre as medidas de combate às infecções micobacterianas estão à

vacinação com BCG (cepa atenuada do M. bovis) para controle da tuberculose e tratamento

com coquetéis antibióticos, medidas comuns a todas as infecções micobacterianas. Em 1921,

Estudo das proteases de micobactérias

a vacina BCG passou a ser administrada na França onde se mostrou extremamente eficiente,

reduzindo em 90% a mortalidade em crianças. A utilização desta vacina então, foi difundida

mundialmente e apesar do sucesso inicial, a vacinação com BCG não foi capaz de eliminar a

epidemia de tuberculose no mundo (DOHERTY & ANDERSEN, 2005). O mesmo cenário

pode ser visualizado para o tratamento com a utilização de antibióticos. Diante desse

panorama de insucesso, torna-se evidente a necessidade em desenvolver ferramentas para o

controle da dispersão destas doenças, ou mesmo formas terapêuticas mais eficientes.

1.2 Epidemiologia das Micobacterioses

Doenças como a tuberculose e a hanseníase são responsáveis por milhões de

casos novos detectados anualmente. A tuberculose é uma doença infecciosa crônica. O M.

tuberculosis inicialmente replica-se dentro das células do trato respiratório superior e depois

nos macrófagos alveolares de onde ocorre a sua disseminação. Uma vez que o sistema imune

inicie a resposta à infecção, as bactérias passam a se acumular em regiões restritas, os

granulomas. A tuberculose é uma doença rica em paradoxos, foi a primeira para a qual houve

vacina desenvolvida, além da disponibilidade de antibióticos efetivos contra a infecção desde

a metade do século. Tais medidas não foram suficientes para deter o status de grande número

de mortes ocasionadas pelo M. tuberculosis. Estima-se que anualmente provoque 2 - 3

milhões de mortes entre indivíduos com idade entre 15 - 49 anos e que nos próximos 20 anos,

um terço da população estará infectada com o M. tuberculosis e aproximadamente 200

milhões de indivíduos terão risco de desenvolver a doença. O impacto da severidade da

doença tem aumentado em parte pela epidemia de HIV. Estatisticamente a elevação da

Estudo das proteases de micobactérias

mortalidade pelo vírus HIV torna-se acentuada em casos de co-infecção com o M.

tuberculosis. Outro ponto relevante é resistência deste microorganismo às drogas utilizadas

em seu tratamento (GARCÍA, et al., 2005). Tal resistência é causada pela inexistência ou

pela interrupção do tratamento dos indivíduos acometidos

(http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs104/en/index.html).

A hanseníase é considerada uma das mais antigas doenças que acomete o

homem. As referências mais remotas datam de 600 A.C e procedem da Índia, que,

juntamente com a África, podem ser consideradas o berço da doença. Como pode ser

observado na Figura 1, os países mais atingidos pela doença se encontram no sudoeste da

Ásia, América do Sul e África. Dentre os países representantes das Américas, o Brasil é o

que apresenta maior número de casos com 38.410 em 2005 com uma taxa de prevalência de

30.7 por 10.000 indivíduos. Seguido pela República do Congo com 20.737 casos e

prevalência de 10.5 por 10.000 indivíduos (www.who.int/lep).

Diferentemente da taxa de prevalência que vem drasticamente decaindo desde 1985

com a implementação pela Organização Mundial de Saúde (OMS) da poliquimioterapia

(PQT), o número de casos novos detectados anualmente permanece elevado. Em 2005,

296.499 casos novos de hanseníase foram detectados contra 407.791 em 2004 e 514.718 em

2003. Esta persistência na taxa de incidência da doença, apesar da implementação maciça da

PQT nos países endêmicos, pode ser atribuída a vários fatores, tais como a intensidade na

busca de novos casos, a alta transmissão em certas áreas proveniente de indivíduos

assintomáticos transmissores, ou a recidiva de casos previamente tratados (www.who.int/lep).

Estudo das proteases de micobactérias

Figura 1 - Mapa mostrando a distribuição da hanseníase no mundo em 2005.

(http://www.who.int/lep/situation/en/)

1.3 Hanseníase

A hanseníase ou lepra é uma doença infecciosa crônica causada pelo Mycobacterium

leprae que afeta principalmente a pele e o sistema nervoso periférico. Esta enfermidade

dificilmente leva à morte, mas constitui a principal causa de neuropatia periférica infecciosa.

As deformidades e incapacidade físicas presentes em aproximadamente 30% dos indivíduos

afetados são responsáveis pelo forte estigma observado contra a doença até os dias atuais.

A via de transmissão da hanseníase não está totalmente esclarecida, mas acredita-se

que a via respiratória seja a mais provável, ainda que a infecção através de lesão na pele

permaneça uma possibilidade. O trato respiratório superior dos pacientes multibacilares é a

principal fonte de M. leprae encontrada no meio ambiente. O tempo de incubação varia de 2

Estudo das proteases de micobactérias

a 5 anos. Os tecidos primariamente infectados pelo M. leprae são usualmente os sítios

superficiais da pele e nervos devido à preferência deste por temperaturas mais baixas.

Entretanto órgãos internos também podem ser infectados nas formas disseminadas da doença

(revisto por VIDAL PESSOLANI, et al., 2003).

A severidade e patologia da hanseníase dependem da imunidade do indivíduo

infectado e foi descrita por Ridley e Jopling como um espectro contínuo de estados da doença

(RIDLEY & JOPLING, 1966) (Figura 2). Em um polo do espectro encontramos pacientes

com vigorosa resposta celular, mediada por células T (tipo Th1) que exibem a forma clínica

tuberculóide (TT), uma doença localizada, com poucos bacilos e lesões limitadas. No outro

polo observa-se uma resposta celular pobre e forte resposta humoral (anticorpos anti-M.

leprae) manifestando a forma clínica lepromatosa (LL). Este polo reflete extrema

suscetibilidade ao M. leprae, no qual a proliferação disseminada do bacilo (em torno de 10

por grama de tecido) resulta em lesões de pele difusamente distribuídas. Borderline

tuberculoíde (BT), borderline-borderline (BB) e borderline lepromatoso (BL) são

considerados estados intermediários entre os dois polos, onde a progressiva redução da

resposta imune mediada por célula é acompanhada por lesões de pele e nervos mais

numerosas, aumento da carga bacilar e dos níveis de anticorpos. Alterações na imunidade ou

a própria terapia podem acarretar mudança no espectro da doença. O dano neural ocorre na

maioria dos pacientes e em todas as formas clínicas da doença (GANAPATI & REVANKAR,

1989), sendo, contudo mais severa em pacientes TT e BT do que em pacientes LL. Na forma

TT os nervos sensores abaixo da pele são afetados, resultando na perda da sensação a

estímulos como o toque e calor, enquanto que os danos nos nervos motores levam a perda da

função muscular (paralisias) na forma LL. Perda dos dedos das mãos e pés e desfigurações,

característica presente nos pacientes com hanseníase, são devido à osteoporose, inflamação,

trauma e infecções bacterianas secundárias. A lesão neurológica na hanseníase é

Estudo das proteases de micobactérias

principalmente agravada pela ocorrência de episódios de inflamação aguda que ocorrem

antes, durante ou mesmo após o término da PQT. Estes são chamados de reação reversa (RR)

ou do tipo I e eritema nodoso leproso (ENL) ou reação do tipo II. Os fatores que

desencadeiam as reações ainda não são conhecidos e o tratamento das mesmas se faz com

corticoides e talidomida. Nos piores casos de doentes não tratados, a inflamação causa

necrose dos nervos e paralisias irreversíveis.

Figura 2 – Espectro clínico da hanseníase. A imunidade mediada por células, medida pelo teste de

Mitsuda, é inversamente proporcional à carga bacilar, medida pelo índice baciloscópico (IB). TT-

forma polar (estável); LL – forma polar Virchowiana ou lepromatosa (estável), BT, BB e BL – grupo

Borderline (instável). (Adaptado de HARBOE, 1985).

Quando diagnosticada e tratada precocemente a hanseníase é uma doença que não

deixa seqüelas neurológicas. A utilização de quimioterápicos no tratamento da hanseníase

remonta do século VI, com a utilização na Birmânia do óleo de hydnocarpus, difundindo-se

esta prática por toda a Europa no século passado. A partir da década de 40, a monoterapia

com sulfonas foi adotada, causando um grande impacto no tratamento da doença. O

surgimento de casos sulfono resistentes, a persistência bacilar e o abandono ao tratamento

devido a sua longa duração levaram a OMS a recomendar em 1982 um tratamento

Estudo das proteases de micobactérias

poliquimioterápico (PQT) baseado na associação das drogas dapsona, rifampicina e

clofazemina. O tratamento para os pacientes multibacilares (formas LL e BL) tem duração de

12 meses com administração mensal de rifampicina (600 mg) e clofazamina (300 mg) e diária

de dapsona (100 mg) e clofazamina (50 mg). Para os pacientes paucibacilares (formas TT,

BT e BB) o tratamento tem duração de 6 meses com administração mensal de rifampicina e

diária de dapsona (OMS, 1982). Este regime de tratamento é utilizado com bastante eficácia.

As enzimas alvo para rifampicina e dapsona são a sub-unidade β da enzima RNA polimerase

e di-hidropteroato sintase (folP1), respectivamente. O alvo da clofazamina ainda não foi

determinado, mas pode estar ligado ao metabolismo dos ácidos nucléicos (WINDER, 1982).

A PQT tem obtido sucesso na redução da taxa de prevalência na situação global da hanseníase

de 12 casos por 10.000 indivíduos em 1985 para pouco mais de 1 caso por 10.000 no fim de

2000. O número de casos registrados tem declinado de 5.351.408 casos em 1985 para

298.626 em 2005. Contudo, permanece o incentivo para a busca de novas drogas que causem

menos efeitos colaterais e que permitam um tratamento de mais curta duração.

1.4 Características do Mycobacterium leprae

O M. leprae foi o primeiro microorganismo a ser identificado como agente etiológico

de uma doença humana por Gerhard Amauer Hansen, em 1873. O bacilo de Hansen, como

também é chamado, é um patógeno intracelular obrigatório não cultivável in vitro até os dias

atuais. No seu hospedeiro natural, o homem, é encontrado preferencialmente em células do

sistema de fagócitos mononucleares e células de Schwann (CS) do nervo periférico onde se

multiplica muito lentamente com um tempo de geração estimado em 14 dias.

Estudo das proteases de micobactérias

A morfologia do M. leprae é de um bastonete reto ou ligeiramente encurvado, de 1,5 a

8 micra de comprimento por 0,2 a 0,5 micra de largura. Cora-se de vermelho pela fucsina e

não se descora pela lavagem com solução álcool-ácida, sendo, portanto, um bacilo álcool-

ácido resistente (BAAR). É considerado Gram-positivo quando corado pelo método de Gram.

Nos esfregaços de pele e nos cortes histopatológicos os bacilos são vistos isolados ou em

agrupamentos com tamanhos variados (RESS, 1985). À semelhança das outras

micobactérias, o M. leprae, apresenta um envoltório de composição muito singular, rico em

lipídios complexos e distintos daqueles normalmente observados em outras bactérias Gram-

positivas e Gram-negativas. Os lipídios mais característicos do seu envelope celular são

ácidos graxos de 60 a 90 átomos de carbono, também denominados de ácidos micólicos

Figura 3. Muitas das propriedades relativas à virulência e à sobrevivência do M. leprae

dentro da célula hospedeira parecem estar associadas à estrutura peculiar do seu envelope.

Além disso, este envoltório é responsável pela baixa permeabilidade e consequentemente

grande resistência a agentes terapêuticos normalmente eficazes contra outras bactérias

(BRENNAN & NAKAIDO, 1995).

Estudo das proteases de micobactérias

Figura 3 – Esquema da parede celular de micobactérias. A membrana plasmática é coberta por

uma parede celular feita de peptídeoglicana covalentemente ligada a galactana. Três cadeias de

arabinana estão ligadas a galactana. A camada de peptídeoglicana-arabinogalactana forma a zona

eletro-densa. Ácidos micólicos são ligados a região terminal da cadeia arabinana. A camada exterior

é formada por ácidos micólicos e micoserosóicos de fitiocerol dimicocerosato (PDIMs) e glicolipídeo

fenólico (PGLs) como indicado na figura. Esta pseudo-bicamada forma a zona eletro-transparente. A

cápsula é composta de PGLs e outras moléculas como PDIMs, fosfatidilinositol manosídeo (PIMs) e

fosfolipídeos, que envolvem a bactéria (VISSA & BRENNAN, 2001).

Até pouco tempo acreditava-se que o homem era o único hospedeiro natural do M.

leprae. Sua multiplicação em outro mamífero foi conseguida pela primeira vez por Shepard,

em 1960 após inoculação no coxim plantar de camundongos Balb/c, observando-se uma lesão

localizada de hanseníase que regredia após o bacilo atingir o número de um milhão de células

bacterianas na lesão. O mesmo autor mostrou posteriormente que camundongos

timectomizados apresentavam uma infecção generalizada quando inoculados com M. leprae

(SHEPARD, 1962). Em 1971, Kirchheimer & Storrs demonstraram a ocorrência de tatus

naturalmente infectados capturados no Estado da Louisiana nos Estados Unidos da América.

Estudo das proteases de micobactérias

Estes tatus, da espécie Dasypus novemcinctus, apresentavam uma forma disseminada da

doença com comprometimento de pele, medula óssea, fígado, baço, linfonodos, pulmões,

meninges e olhos. A partir desta descoberta, estes animais vem sendo mantidos em cativeiro

para inoculação experimental de M. leprae, representando as principais fontes de bactéria para

estudos bioquímicos e imunológicos. Além do tatu de nove bandas, somente macacos

mangabei e chimpanzés foram encontrados naturalmente infectados com o M. leprae (revisto

por VIDAL PESSOLANI, et al., 2003).

Os mecanismos que permitem ao M. leprae infectar o homem e causar doença ainda

são pouco conhecidos. Os principais fatores que tem dificultado este entendimento são a

incapacidade de cultivo in vitro do bacilo e a ausência de um modelo animal que mimetize a

doença humana.

1.5 Genômica comparativa

Desde que o primeiro genoma procariótico foi finalizado, o número de projetos para

sequenciamento de genomas de micobactérias vem crescendo constantemente. Atualmente

existem 13 genomas completamente seqüenciados e outros 8 estão em progresso. Dentro

deste cenário, as micobactérias patogênicas foram as primeiras a serem seqüenciadas, sendo

assim, o genoma do M. tuberculosis foi finalizado em 1998 (COLE, et al., 1998; CAMUS, et

al., 2002) e do M. leprae em 2001 (COLE, et al., 2001). A comparação entre genomas

proporciona um melhor entendimento da biologia destas espécies quanto às características

bioquímicas, genéticas, fisiológicas e uma melhor compreensão sobre os mecanismos

patogênicos. Dentre as características mais marcantes encontradas, ressaltamos a extensiva

Estudo das proteases de micobactérias

deleção e inativação de genes observada no cromossomo do bacilo de hansen, um processo

denominado – evolução por redução, o que resultou no menor genoma dentre as

micobactérias (ANDERSSON & ANDERSSON, 1999; VISSA & BRENNAN, 2001;

MARRI, et al., 2006). Acredita-se que esta perda se deva ao ambiente extremamente estável,

rico em metabólitos, e que, portanto exige pouca versatilidade metabólica para a

sobrevivência do bacilo. Esta característica poderia explicar a taxa de crescimento lenta,

assim como a incapacidade M. leprae de crescer in vitro. Somente 49.5% do genoma do M.

leprae contém genes que codificam para proteínas, característica não observada em nenhum

outro genoma bacteriano até hoje seqüenciado. O genoma do M. leprae contém 1.116

pseudogenes ou genes degenerados, assim denominados devido à perda de regiões necessárias

para sua transcrição e/ou tradução. Uma análise funcional dos genes preservados em M.

leprae revela a integridade da maioria das vias anabólicas, mas deleções em algumas vias

catabólicas essenciais. Os genes perdidos na maioria dos casos constituem cópias de enzimas

essenciais presentes em duplicidade (isoenzimas) em M. tuberculosis cujo genoma apresenta

uma grande redundância. Acredita-se que o genoma degenerado do M. leprae seja resultado

de erros na replicação combinado a uma redução na capacidade de reparo do DNA (revisto

por VISSA & BRENNAN, 2002). Estes processos provocariam um acúmulo de mutações em

genes não mais essenciais para sobrevivência no ambiente intracelular. Este mecanismo

altera permanentemente o genótipo e resulta na adaptação ao ambiente em que a bactéria vive

(DOBRINDT & HACKER, 2001). A tabela 1 mostra a análise das características gerais dos

genomas das principais micobactérias patogênicas: M. leprae (COLE, et al., 2001), M.

tuberculosis H37Rv (COLE, et al., 1998; CAMUS, et al., 2002), M. bovis AF2122

(GARNIER, et al., 2003) e M. avium paratuberculosis str. K.10 (LINGLING, et al., 2005). A

característica comum a todas as micobactérias, é seu elevado percentual de GC no DNA.

Estudo das proteases de micobactérias

Tabela 1 – Análise das características gerais dos genomas

Característica M. leprae

M. tuberculosis

H37Rv

M. bovis

AF2122

M. avium

paratuberculosis str. k10

Tamanho do Genoma (MB) 3.27 4.41 4.35 4.83

Conteúdo GC (%) 57.79 65.61 65.63 69.30

Proteínas codificadas (%) 49.50 90.80 90.59 91.30

Genes (no.) 1.604 3.959 3.951 4.539

Pseudogenes 1.116 6 ~ 20 none

A definição das moléculas envolvidas no processo de patogênese de micobactérias

poderá nos auxiliar no controle ou mesmo na profilaxia destas doenças. A análise filogenética

baseada na região 16s do RNA ribossômico revela que a distância evolutiva existente entre M.

leprae e o M. avium paratuberculosis é menor que a observada entre este e as outras

micobactérias patogênicas (Figura 4), sugerindo uma explicação para as diferenças nas formas

de infecção, colonização e sobrevivência nos respectivos hospedeiros.

Estudo das proteases de micobactérias

Figura 4 – Árvore filogenética para o gênero Mycobacterium. Baseada na seqüência do RNAr 16s.

Em verde, estão representadas as espécies que na finalização deste trabalho tinham o sequenciamento

do genoma em progresso. Em vermelho, estão representados os genomas já finalizados. (Adaptado de

BROSCH, et al., 2001).

1.6 Papel de proteases bacterianas na interação patógeno-hospedeiro

Os microorganismos patogênicos expressam uma variedade de moléculas que

permitem sua sobrevivência e multiplicação no hospedeiro. Dentre os fatores de virulência

mais difundidos, as proteases têm sido implicadas na patogênese de variadas doenças

causadas por microorganismos. As peptidases bacterianas são predominantemente

extracelulares e foram primeiramente consideradas como enzimas importantes para a

aquisição de nutrientes pelo patógeno através da degradação de moléculas do hospedeiro

(revisado por TRAVIS, et al., 1995).

M. smegmatis

M. marinum

M. paratuberculosis

M. avium

M. bovis

BCG

Estudo das proteases de micobactérias

Proteases exercem um importante papel na regulação dos níveis de muitas proteínas

intracelulares. A proteólise é requerida nos processos de secreção e degradação de proteínas

mal enoveladas e na sobrevivência em condições de estresse, como a exposição a altas

temperaturas ou privação de nutrientes (WALLER & SAUER, 1996). Apresentam, contudo,

características bioquímicas e funcionais diferentes daquelas oriundas do hospedeiro. As

peptidases virais e bacterianas são, por exemplo, insensíveis aos inibidores de proteases

presentes em abundância no plasma e tecidos de mamíferos, sendo esta uma propriedade da

maior relevância na sua atuação como fatores de virulência. Por diferirem das enzimas do

hospedeiro, as proteases de microorganismos patogênicos constituem bons alvos para o

desenvolvimento de drogas alternativas para o tratamento de doenças infecciosas (TRAVIS &

POTEMPA, 2000). Um exemplo clássico constitui o tratamento da AIDS na qual a utilização

de inibidores sintéticos de proteases virais vem proporcionando excelentes resultados

terapêuticos.

A maioria das evidências relatadas implicando proteases microbianas como fatores de

virulência derivam de estudos que sugerem que mutantes deficientes de proteases são menos

virulentos nos modelos de infecções animais que as cepas selvagens. Dados da literatura

indicam que estas enzimas podem contribuir para a patogênese das doenças infecciosas

através de diversos mecanismos. Proteases microbianas podem, assim, atuar: 1)- Inativando

inibidores de proteases ou ativando pro-enzimas do hospedeiro, como por exemplo as

prometaloproteinases, estimulando a degradação indireta de moléculas da matriz extracelular;

2)- Degradando diretamente componentes da matriz extracelular; 3)- Desregulando o sistema

imune; 4)- Desregulando cascatas de proteases do hospedeiro tais como o sistema

calicreína/cinina, sistema complemento, a cascata de coagulação e a cascata fibrinolítica

(TRAVIS, et al., 1995). A literatura apresenta um destaque crescente para o envolvimento de

proteases com função relevante na patogenicidade de microorganismos intracelulares, como

Estudo das proteases de micobactérias

por exemplo, os gêneros: Yersinia (WILLIAMS, et al., 2000; HEUSIPP, et al., 2006),

Streptococcus (IBRAHIM, et al., 2004; LYON & CAPARON, 2004; BIWAS & BIWAS,

2005), Chlamydia (SHAW, et al., 2002; SHARMA, et al., 2005; MURTHY, et al., 2006) e

nas espécies: Legionella pneumophyla (PEDERSEN, et al., 2001), Vibrio cholerae (BEHARI,

et al., 2001), Listeria monocytogenes (WONDERLING, et al., 2004; STACK, et al., 2005) e

Campylobacter jejuni (BRONDSTED, et al., 2005).

1.7 As famílias de proteases

As proteases, peptidases, proteinases ou hidrolases são enzimas que clivam ligações

peptídicas. A classificação das proteases é feita de acordo com três principais critérios: (1) a

reação que catalizam, (2) a natureza química do sítio catalítico e (3) a relação evolutiva

baseada nas estruturas tridimensionais. De acordo com estes três critérios, as proteases

podem ser divididas em famílias que são agrupadas de acordo com o tipo catalítico da enzima

representado por uma letra maiúscula, assim: A, aspártico; C, cisteína; G, ácido glutâmico;

M, metalo; S, serina; T, treonina e U, desconhecido. Considerando ainda a divisão em

famílias, podem ser classificadas em exopeptidases ou endopeptidases. As exopeptidases

clivam as ligações peptídicas nas extremidades amino ou carboxi terminal do substrato. As

endopeptidases, por outro lado, clivam as regiões internas do substrato. Outra divisão aceita é

o agrupamento em clãs, que são formados por grupos de famílias para as quais existem

evidências de parentesco. Um clã que contém mais de um tipo de família é descrito com a

inicial P (RAWLINGS, et al., 2006).

Estudo das proteases de micobactérias

O mecanismo de catálise das cisteínas e serinas peptidases é muito semelhante. O

resíduo de cisteína é ativado pela histidina, exercendo o papel de nucleófilo que ataca a

ligação peptídica, modo semelhante ao resíduo de serina nas serina proteases. No caso das

aspartil proteases a característica principal é que o sítio ativo é formado por um par de

resíduos de ácido aspártico que atuam em conjunto para permitir que a molécula de água

ataque a ligação peptídica. As metaloproteases contêm um íon metálico ligado, em sua

maioria zinco, que ativa a molécula de água atuando então como o nucleófilo para atacar o

grupo carbonil do peptídeo. As glutamil proteases também têm a molécula de água atuando

como nucleófilo durante seu mecanismo de catálise (RAWLINGS, et al., 2006).

Na descrição da especificidade de uma peptidase utiliza-se um modelo em que o sítio

catalítico é flanqueado por um ou nos dois lados por subsítios específicos, cada um capaz de

acomodar a cadeia lateral de um único resíduo de aminoácido. Estes sítios são numerados

S1....Sn em direção a porção N-terminal da enzima e S1’....Sn’ em direção à porção C-

terminal. Os resíduos do substrato são numerados P1....Pn em direção à porção N-terminal e

P1’....Pn’ em direção à porção C-terminal, como indicado na Figura 5 (SCHECHTER &

BERGER, 1967).

Estudo das proteases de micobactérias

Figura 5 – Nomenclatura para descrever a interação do substrato com a protease. Neste sistema,

é considerado que os resíduos de aminoácidos da cadeia polipeptídica do substrato se ligam ao

subsítios do sítio ativo da enzima. Por convenção, os subsítios da protease são chamados S e os

resíduos de aminoácido do substrato são chamados P. Os resíduos de aminoácido voltados para a

região N-terminal até o ponto de hidrólise da ligação peptídica são numerados Pn....P1 e os resíduos

voltados para o lado C-terminal são numerados P1’....Pn’. Os subsítios da protease são numerados de

forma complementar aos sítios de ligação para o substrato e são numerados: S1....Sn em direção a

região N-terminal da protease e S1’....Sn’ em direção a sua porção C-terminal (SCHECHTER &

BERGER, 1967).

1.8 Serina-proteases

As enzimas proteolíticas que utilizam resíduos de serina na atividade catalítica têm

distribuição ubíqua. Existem mais de vinte famílias destas enzimas que são agrupadas em

clãs, conforme indicado na tabela 2. Embora com diferentes origens evolutivas, existem

similaridades quanto ao seu mecanismo de ação. As quimiotripsinas, subtilisinas e

carboxipeptidases possuem em comum a tríade catalítica formada por resíduos de Serina,

aspartato e histidina, onde a serina atua como o nucleófilo, o aspartato como eletrófilo e a

histidina como a base (ver figura 6). O arranjo linear dos resíduos que participam da tríade

catalítica sofre alteração dentro dos clãs (ver tabela 2). Considerando por exemplo a estrutura

S3 S2 S1

S’1

S’2 S’3

P4 P3

P2 P1 P’1 P’2 P’3

COO

Sítio de Clivagem

Estudo das proteases de micobactérias

do sítio S1 de especificidade de peptidases com enovelamento semelhante à tripsina, é

possível observar que possuem uma fenda catalítica tendo em sua base o resíduo de Asp. As

paredes da bolsa são formadas por três folhas-beta conectadas por duas pontes Cys. A

especificidade é usualmente determinada pelos resíduos das posições 189, 216 e 226. A

especificidade de hidrólise das peptidases está correlacionada com a hidrofobicidade do

resíduo P1. Asp189, Gly216 e Gly226 criam uma carga negativa no sítio S1 que torna as

peptidases semelhantes à quimiotripsina altamente específicas para substratos com resíduos

de Arg ou Lys na posição P1 (HUBER & BODE, 1978; BARRETT & RAWLINGS, 1995;

PERONA & CRAIK, 1995; PERONA & CRAIK, 1997; HEDSTROM, 2002).

Outra semelhança apresentada pelo grupo é a inibição da atividade catalítica por

diisopropilfluorofosfato (DFP). As proteases semelhantes à quimiotripsina estão envolvidas

em muitos processos fisiológicos, incluindo a digestão, homeostase, apoptose, transdução de

sinal, reprodução e na resposta imune. Participam da cascata de coagulação sanguínea,

fixação de complemento, fibrinólise e no desenvolvimento, modelagem e diferenciação da

matriz extracelular. Com tamanha diversidade de funções, as generalizações acerca deste

grupo devem ser feitas com cautela.

Estudo das proteases de micobactérias

Tabela 2 - Clãs de serina proteases

Clã Exemplos Resíduos

Catalíticos

Distribuição

Tríade Catalítica “Clássica”

PA(S) Quimiotripsina

His-Asp-Ser B,Ar,F,Pl,An,V

SB Subtilisina

Asp-His-Ser B,Ar,Pr,F,Pl,An,V

SC Carboxipeptidase Y

Ser-Asp-His B,Ar,Pr,F,Pl,An

SK Protease Clp

Ser-His-Asp B,Ar,Pr,F,Pl,An,V

“Novas” Serina Proteases

SE D-Ala-D-Ala carboxipeptidase A

Ser-Lys B,Ar,Pl,An

SF Peptidase sinal I

Ser-Lys/His B,Ar,F,Pl,An,V

SH Citomegalovirus assemblina

His-Ser-His V

SM “C-terminal processing protease-I”

Ser-Lys B,Ar,Pl

SN Dipeptidase E

Ser-His-Glu B,An

PB(S) Precursor amidohidrolase penicilina

Ser N-terminal B,Ar,Pr

Legenda: B, bactéria; Ar, arquea; Pr, protozoários; F, fungos; Pl, plantas; An, animais; V, vírus.

(HEDSTROM, 2002)

Figura 6 - Estrutura do sítio S1 da tripsina com um resíduo de lisina ligado a cadeia

(representado em verde). Os resíduos em evidência representam: Ser

195

, His

e Asp

102

(representado

em vermelho), os aminoácidos chave (azul) e os elementos estruturais distais (folhas vermelhas), que

determinam a especificidade ao substrato e consistem dos resíduos 169-175, 184-195 e 213-228

(PERONA & CRAIK, 1995).

Tyr172

Gly216

Asp189

Ser190

Cys220

Cys191

Estudo das proteases de micobactérias

1.9 A família das proteases com requerimento de elevadas temperaturas, tipo A (HtrAs)

Devido a natureza do trabalho apresentado, merece especial destaque um grupo de

serino proteases que são induzidas pelo calor, as HtrAs ou proteases que degradam proteínas

mal formadas no periplasma (DegP), um grupo de chaperonas com atividade independente de

ATP. Este grupo pertence a família S1 e clã PA(S) das quimiotripsinas. Os representantes

deste grupo incluem as peptidases DegP, DegQ e DegS de Escherichia coli. A HtrA ou DegP

foi primeiro caracterizada por Lipinska et al., (LIPINSKA, et al., 1988; LIPINSKA, et al.,

1990), como sendo uma serina protease associada ao envelope bacteriano responsável por

degradar proteínas mal formadas no periplasma. Seus representantes também são descritos

como essenciais para a sobrevivência a temperaturas acima de 42

C (KIM & KIM, 2005).

Atualmente sabe-se que esta família possui homólogos em outras bactérias, fungos, plantas e

até mesmo em humanos (CLAUSEN, et al., 2002). Homólogos em humanos têm sido

associados a processos como artrite, crescimento celular, resposta a condições de estresse,

morte celular programada e envelhecimento.

A família HtrA possui uma arquitetura molecular composta de um domínio “tripsina-

like” conservado e um ou mais domínios PDZ (“post-synaptic density protein, disc large and

zo-1 proteins”) na região C-terminal, que medeia a interação específica proteína-proteína (ver

figura 7). O número de domínios PDZ pode variar de um único na DegS de E. coli, a quatro

domínios na YNM3 de Saccharomyces cerevisae, por exemplo. O domínio PDZ também é

chamado de DHR ou GLGF, possui cerca de 80 – 100 resíduos de aminoácidos e foi primeiro

caracterizado em eucariotos. As HtrAs possuem duas estruturas dominantes onde cada uma

forma um barril com seis folhas beta pregueadas. O sítio ativo está localizado na interface

dos dois arranjos perpendiculares do domínio em forma de barril (PALLEN & PONTING,

Estudo das proteases de micobactérias

1997; SASSOON, et al., 1999; SPIERS, et al., 2002; MURWANTOKO, et al., 2004;

SCHLIEKER, et al., 2004).

Figura 7 – Organização dos domínios moleculares dos membros da família HtrA. Neste esquema

estão representados o nome da proteína, seguido do nome da espécie, o número de aminoácidos que

compõem a enzima, a seqüência do peptídeo sinal (SS), segmentos transmembrana (TM), domínio de

ligação para fator de crescimento insulina (IGFBP) em azul, domínio inibitório para a protease Kazal

(KI) em laranja, o domínio tripsina (em verde) e o domínio PDZ (em amarelo).

(CLAUSEN, et al.,

2002).

O reconhecimento da proteína como um alvo para a protease é diferente do

reconhecimento dos sítios de clivagem na proteína alvo. Estes processos são realizados de

maneira independente e em porções distintas da protease. O domínio PDZ medeia a interação

proteína alvo-protease e se liga preferencialmente através de três ou quatro resíduos de

aminoácido na região C-terminal da proteína alvo. A ligação do substrato ao domínio PDZ

altera a conformação da protease e então os resíduos do peptídeo interagem com o domínio

tripsina da enzima, provocando um rearranjo do sítio catalítico tornando-o exposto. A

Estudo das proteases de micobactérias

unidade funcional das HtrAs parece ser um trímero, que é estabilizado exclusivamente pelos

resíduos presentes no domínio protease (PALLEN & WREN, 1997; EHRMANN &

CLAUSEN, 2004; KIM & KIM, 2005). A estrutura básica do trímero tem a forma

semelhante a um funil com os domínios catalíticos localizados no topo e o domínio PDZ

estendidos para o lado de fora (figura 8).

Figura 8 – Esquema da ativação das DegS. Nas DegS o domínio PDZ possui uma função

regulatória, oferecendo um sítio de ligação para um ativador alostérico. O quadro superior direito

ressalta a ligação do ativador ao domínio PDZ da protease. Enquanto o ativador estiver ancorado ao

domínio PDZ, ocorre a interação do domínio PDZ com o sítio ativo da protease. Esta interação

dispara um rearranjo do domínio catalítico e a formação de um domínio catalítico ativo (EHRMANN

& CLAUSEN, 2004).

Dados da literatura demonstram que a baixas temperaturas (em torno de 20

C) o

domínio protease das HtrAs apresenta-se em uma conformação completamente inativada,

Estudo das proteases de micobactérias

onde a ligação do substrato, bem como, sua catálise são evitadas. Nesta situação, o acesso do

substrato ao sítio catalítico da protease parece estar completamente bloqueado pelo domínio

PDZ, que desta forma atua como o principal regulador da atividade das HtrAs (figura 9). Este

modelo de ativação foi denominado anêmona (PALLEN & WREN, 1997; KIM & KIM,

2005).

Figura 9 – Modelo anêmona para o mecanismo de ativação das HtrAs. HtrA2 de humano. O

domínio PDZ bloqueia o acesso ao sítio ativo da protease. (Retirado de KIM & KIM, 2005).

1.9.1 Regulação da atividade das HtrAs

Duas vias de transdução de sinal controlam a atividade do promotor da DegP de E.

coli, são elas a Cpx e a δ

(figura 10). As duas vias respondem à presença de proteínas mal

enoveladas e transmitem sinais através da membrana citoplasmática estimulando a transcrição

de degP. As duas vias convergem para um fator sigma-E alternativo, RpoE. RpoE interage

com a RNA polimerase e ocorre a transcrição de degP. A via Cpx é sistema clássico que

possui dois componentes regulatórios. A CpxA que é uma proteína transmembrana que

funciona como um sensor e CpxR que é um elemento regulador. CpxR estimula a transcrição

o promotor de degP apenas quando está fosforilado. A fosforilação de CpxR é controlada por

CpxA que pode atuar tanto como uma proteína fosfatase quanto como proteína kinase. A

Estudo das proteases de micobactérias

alternância entre os dois estados de CpxA é regulada pela concentração de proteínas mal

enoveladas. Este controle é mediado por outra proteína, CpxP, que interage diretamente com

as proteínas mal enoveladas e a ligação deste com a CpxA é interrompida, sendo este o sinal

para CpxA fosforilar CpxR. A via δ

é composta do fator alternativo RpoE e três proteínas

RseABC que são reguladores da atividade de RpoE. RpoE interage diretamente com o fator

anti-δ

RseA que é uma proteína integral de membrana com uma porção citoplasmática. Sem a

presença de proteínas mal formadas RseA e RseB formam um complexo com RpoE associado

a ele, e desse modo não há transcrição de degP. Sob condições de estresse, RseB se liga as

proteínas com conformação alterada e em seqüência RseA é clivada por outra protease da

família HtrA, a DegS. Após a clivagem de RseA, RpoE estará livre para ativar o promotor de

degP (ALBA, et al., 2001; CLAUSEN, et al., 2002; ALBA & GROSS, 2004; ISAAC, et al.,

2005; BUELOW & RAIVIO, 2005).

Em M. tuberculosis, a identificação e caracterização da via equivalente a CpX de E.

coli foi estabelecida. A expressão do sistema regulatório mprA e mprB são essenciais para a

manutenção e persistência da infecção latente causada por M. tuberculosis (HE & ZAHRT,

2005). Através do alinhamento de seqüências é possível determinar que MprA (Rv0981)

corresponde ao regulador citoplasmático CpxR e MprB (Rv0982) compreende um sensor

histidina kinase semelhante a CpxA. A organização molecular deste grupo apresenta ainda a

protease HtrA2 (Rv0983) que tem sua expressão regulada por este sistema. A via δ

não está

esclarecida, no entanto a busca de seqüências homólogas no genoma de M. tuberculosis revela

a possível existência desta via de regulação. Quando comparado com E. coli, o genoma de M.

tuberculosis apresenta um fator sigma alternativo a RNA polimerase, sigE (Rv1221) que

apresenta 32% de similaridade com o fator alternativo rpoE e Rv2480, descrita como uma

proteína hipotética conservada apresenta 37% de similaridade com rseB. Outro aspecto que

corrobora a teoria da existência desta via em M. tuberculosis, é a proximidade de htrA3

Estudo das proteases de micobactérias

(Rv1223) e um gene Rv1222, anotado como uma proteína hipotética, que estaria exercendo

um papel semelhante a rseA de E. coli. Em M. leprae, nenhuma destas vias foram

caracterizadas. Entretanto a organização molecular, responsável pelo controle da expressão

de htrA2, é exatamente a mesma que a encontrada em M. tuberculosis, sugerindo que estas

vias estão ativas em M. leprae (RIBEIRO-GUIMARÃES, resultado não publicado).

Figura 10 – Regulação do promotor do gene degP em E. coli. Duas vias de transdução de sinal

(Cpx e RpoE) estão envolvidas na regulação da transcrição de degP. Proteínas mal enoveladas são

detectadas tanto por CpxP quanto por RseB, que por sua vez, interagem com CpxA ou RseA,

respectivamente. Após a detecção de proteínas com conformação alterada, CpxA ativa CpxR, que

então induz o promotor de degP enquanto que RseA pode ser degradada por DegS antes que o RpoE

possa atuar como fator δ. CM significa membrana citoplasmática

(Adaptado de CLAUSEN, et al.,

2002)

A determinação dos mecanismos de virulência e patogenicidade envolvidos na

hanseníase, constituem alvo importante para o controle e prevenção da doença. Os esforços

não se limitam a busca de novos medicamentos ou testes que permitam um diagnóstico

(ML0193)

(MprB)

(MprA)

(ML1557)

(HtrA2)

(SigE)

(ML1077)

(HtrA3)

Estudo das proteases de micobactérias

precoce da patologia. A obtenção de uma vacina eficiente tem sido alvo de constantes

pesquisas e esforços. Dentro desta perspectiva, a proteína Rv0125 ou HtrA4 (também

chamada MTB32A) de M. tuberculosis está sendo utilizada como complemento de vacina

para a tuberculose em fusão com Rv1196 que codifica uma proteína da família PPE (também

chamada MTB39), formando uma poliproteína denominada Mtb72F (SKEIKY, et al., 1999;

SKEIKY, et al., 2004; BRANDT, et al., 2004).

Estudo das proteases de micobactérias

2 Objetivos

2.1 Objetivo geral

Um número cada vez maior de proteases vem sendo descrito como importantes fatores

de virulência de microorganismos patogênicos. Estas enzimas foram, contudo, pouco

estudadas no gênero Mycobacterium e o papel das mesmas como fatores de virulência é

desconhecido. Este trabalho é parte integrante de um projeto que visa em longo prazo

determinar os fatores de virulência envolvidos na patogenicidade da hanseníase. Este trabalho

visa à caracterização bioquímica e funcional de proteases do M. leprae, enzimas estas, que

poderão contribuir no processo de identificação de moléculas candidatas ao desenvolvimento

de novas ferramentas para o controle da hanseníase.

2.2 Objetivos específicos

 Analisar detalhadamente, através de ferramentas de bioinformática, as proteases descritas e

anotadas como tais, nos bancos de dados genômicos de micobactérias. Buscamos também

novas proteases não anotadas através de análises de homólogos.

 Avaliar a expressão de proteases secretadas pelo M.leprae na infecção humana.

Estudo das proteases de micobactérias

 Clonar, expressar o gene ML0176 ou htrA2 no vetor pET32a e purificar a forma

recombinante da proteína para:

 Produzir anticorpo específico contra a protease recombinante – rHtrA2.

 Realizar imunohistoquímica de biópsias de pele e nervo de pacientes.

 Caracterizar a atividade enzimática da protease recombinante – rHtrA2 do M. leprae,

utilizando substratos biológicos e através de ensaios fluorimétricos com peptídeos sintéticos.

Estudo das proteases de micobactérias

3 Resultados

Nesta seção estão representados e discutidos os resultados que foram submetidos para

publicação ou redigidos na forma de manuscrito durante o desenvolvimento do projeto de

doutorado. Os resultados serão apresentados diretamente na forma de artigos.

A seqüência de apresentação dos trabalhos não apresentará ordem cronológica, mas

serão ordenados de acordo com o tema de estudo.

Os resultados serão divididos em 3 seções distintas. Na primeira parte faremos uma

análise de genomas das micobactérias no contexto de uma família de proteínas intimamente

relacionadas com a patogênese de inúmeras doenças, as proteases. A análise foi realizada

através da construção de bancos de dados para cada espécie analisada. Estes bancos foram

cruzados e a validação dos resultados foi feita por reconhecimento de domínios característicos

de proteases, utilizando plataformas como Pfam, Prosite, Merops e InterPro.

Na segunda seção avaliaremos a presença nas lesões de pacientes multibacilares de

algumas proteases que foram previamente selecionadas. Três dos genes selecionados

codificam para proteases secretadas, tendo assim maior probabilidade de interagirem com

moléculas do hospedeiro e desenvolverem algum papel na patogenia do M. leprae. Os outros

dois apresentam homologia com fatores de virulência encontrados em outras bactérias. Esta

presença foi confirmada tanto pela detecção de moléculas de RNAm, quanto pela presença

das proteínas. Estas características aumentam a probabilidade de que o produto destes genes

possa interagir com moléculas do hospedeiro e desempenhar algum papel na patogenia do M.

leprae.

Uma vez demonstrada a transcrição dos genes acima mencionados, decidimos clonar e

expressar a forma recombinante da proteína HtrA2. Devido ao potencial envolvimento na

Estudo das proteases de micobactérias

patogênese relacionada a outras bactérias, partimos então para a avaliação bioquímica e

funcional da serino protease HtrA2 de M. leprae. A partir da forma recombinante desta

proteína, mostramos que a HtrA2 apresenta atividade catalítica contra oligopeptídeos

sintéticos e seqüências de peptídeos biologicamente ativos, clivando preferencialmente após

resíduos básicos e determinamos também as condições de temperatura e pH ótimos de

atividade.

Estudo das proteases de micobactérias

Manuscrito 1

“Comparative genomics of mycobacterial proteases”

Micro. path. (2007), http://dx.doi.org/10.1016/j.micpath.2007.05.010.

Este artigo foi submetido e aceito pela revista Microbial Pathogenesis. Feitas as

devidas correções, se encontra agora em fase de publicação e está disponível on-line no

endereço http://dx.doi.org/10.1016/j.micpath.2007.05.010.

As proteases são reconhecidamente importantes fatores de virulência. No contexto de

doenças causadas por micobactérias, no entanto, o nível de informação acerca dos possíveis

papéis que estas proteínas desempenham na doença é extremamente reduzido.

Neste trabalho realizamos uma extensa revisão e análise de genomas de micobactérias

utilizando a bioinformática como ferramenta para comparar os genes que codificam para

proteases nos genomas de Mycobacterium leprae, Mycobacterium tuberculosis,

Mycobacterium bovis e Mycobacterium avium paratuberculosis. Esta análise nos permitiu

atualizar a nomenclatura das famílias de proteases presentes em micobactérias. Dedicamos

especial atenção ao genoma do M. leprae. Apesar de ser apresentado como um genoma que

sofreu evolução por redução do número de genes, observamos um elevado nível de

conservação da família de proteases. Um total de 39 genes dos 49 encontrados em M. bovis

encontram-se conservados em M. leprae. Foi possível identificar também um conjunto

conservado de 38 proteases que são partilhadas por todas as espécies analisadas. Este grupo

de proteínas é provavelmente essencial para a sobrevivência no hospedeiro e pode representar

Estudo das proteases de micobactérias

um alvo para o desenho de novas drogas, que possibilitem um controle mais efetivo destas

doenças.

Um dado surpreendente nos foi revelado quando realizamos uma comparação do

número de proteases encontradas no genoma do M. leprae com outras famílias de genes.

Existe um elevado nível de preservação nesta classe. É importante ressaltar que o genoma do

M. leprae constitui um dos mais degenerados dentre todos os genomas até o momento

seqüenciados. Preservar as proteases demonstra claramente o importante papel que estas

proteínas desempenham na sobrevivência, manutenção e possivelmente na patogenia

relacionada a esta bactéria. Nossos dados corroboram as análises filogenéticas que indicam a

proximidade existente entre o M. leprae e o M. avium paratuberculosis, visto que, o grupo de

proteases encontrado nas duas espécies foi bastante similar. As proteases perdidas pelo M.

leprae podem ser explicadas como casos de genes duplicados e que provavelmente exercem

funções muito semelhantes no contexto da sua sobrevivência.

Estudo das proteases de micobactérias

Manuscrito 2

“Expression analysis of proteases of Mycobacterium leprae in human skin lesions”

Micro. path. (2007), http://dx.doi.org/10.1016/j.micpath.2007.05.011.

Este artigo foi submetido e aceito pela revista Microbial Pathogenesis. Feitas as

devidas correções, se encontra agora em fase de publicação e está disponível on-line no

endereço: http://dx.doi.org/10.1016/j.micpath.2007.05.011.

Um número crescente de proteases produzidas por microorganismos patogênicos tem

sido descrito como fatores de virulência, contribuindo muitas vezes de maneira essencial para

o estabelecimento de um variado número de manifestações clínicas da infecção. A primeira

questão a ser considerada em nosso estudo foi a transcrição durante a infecção de cinco

putativas proteases do bacilo de Hansen. Verificamos através da técnica de RT-PCR, a

presença de moléculas de RNAm para genes que codificam para putativas proteases do M.

leprae, sendo eles: mycP1, htrA2, htrA4, gcp e clpC em bacilo isolado de lesões de pacientes

com hanseníase.

A segunda etapa deste trabalho foi a produção de anticorpos policlonais contra duas

proteases selecionadas, a HtrA2 e Gcp. O anticorpo contra a proteína Gcp foi produzido pelo

aluno de Mestrado Julio Jablonski Amaral. Após purificarmos os dois anticorpos e

verificarmos as especificidades, realizamos imunohistoquímica em cortes de pacientes com a

forma multibacilar da doença. Até o momento da submissão deste trabalho, apenas os

anticorpos contra a Gcp apresentaram marcação positiva nas lesões. Estes resultados nos

sugerem uma possível regulação pós-transcripicional destas proteases e a provável produção

Estudo das proteases de micobactérias

pelo microorganismo durante o longo período de incubação no hospedeiro, desta forma

podem desempenhar algum papel relevante na patogenia.

Estudo das proteases de micobactérias

Manuscrito 3

“Cloning, expression and characterization of a HtrA-like serine protease produced in

vivo by Mycobacterium leprae”

Este Manuscrito foi submetido a revista Biochimica et Biophysica Acta (BBA).

Este manuscrito é fruto da nossa colaboração com o grupo de pesquisa da Dra.

Fernanda Portaro, pesquisadora do Centro de Toxinologia Aplicada (CAT-CEPID), do

Instituto Butantã, São Paulo. Todos os experimentos que envolvem a caracterização

funcional e bioquímica da forma recombinante da protease HtrA2 de M. leprae foram

realizados em seu laboratório, com o auxílio de Eliana Blini Marengo, que foi aluna de

Mestrado do Dr. Antonio Carlos Martins de Camargo, Diretor do Laboratório Especial de

toxinologia aplicada - CAT-CEPID e Natalia Pieranfeli dos Santos, aluna de iniciação

científica da Dra. Fernanda Portaro, além da participação do grupo de espectrometria de

massa, sob supervisão do Dr. Daniel Carvalho Pimenta, do CAT-CEPID.

Através deste trabalho mostramos pela primeira vez que a rHtrA2 de M. leprae

apresenta atividade catalítica quando incubada com oligopeptídeos. Utilizamos peptídeos

sintéticos com flourescência apagada (FRETs), flanqueados por Abz (ortho-aminobenzoic

acid) e EDDnp ([N-ethylenediamine-(2,4-dinitrophenyl)]). O peptídeo Abz-GFSPRRQ-

EDDnp (FRET-1) foi hidrolisado pela rHtrA2 e então foi tomado por base para a construção

de peptídeos modificados nas posições P2, P3 e P4. A HtrA2 revelou atividade de serina

protease confirmando os dados provenientes do sequenciamento do genoma do M. leprae que

prediziam a função serina protease desta enzima. Realizamos também ensaios com substratos

Estudo das proteases de micobactérias

com seqüências de peptídeos biologicamente ativos: neurotensina1-13, dinorfina A, oxitocina,

angiotensina I e bradicinina a fim de caracterizar os seus potenciais substratos.

Determinamos também as condições ótimas de temperatura e pH, além de verificar a inibição

desta enzima utilizando inibidores específicos de serina proteases. A partir destes ensaios

verificamos a especificidade desta enzima, que se mostrou altamente seletiva quando clivou

os peptídeos predominantemente com resíduos básicos, diferentemente das homólogas DegP

e DegQ de E.coli que clivam preferencialmente após resíduos hidrofóbicos.

As HtrAs são uma família amplamente estudada, no entanto, não existe nenhuma

caracterização destas enzimas em M. leprae. Estes resultados evidenciam a presença de um

sítio estendido (S4-S1) na rHtrA2 necessário para a atividade catalítica. A relação da

clivagem da dinorfina e neurotensina com a rHtrA2 de M. leprae não está clara, estes achados

estão sendo investigados em nosso laboratório.

Estudo das proteases de micobactérias

4 Discussão

A hanseníase ainda constitui um problema de saúde pública no Brasil. O programa

nacional para o controle desta endemia se baseia atualmente na detecção e tratamento dos

indivíduos afetados, com PQT e na vacinação dos contatos domiciliares dos doentes com a

vacina BCG. Apesar da implementação destas medidas, a incidência anual da hanseníase no

país na última década conta com a detecção persistente de trinta e cinco a quarenta mil novos

casos por ano (http://portal.saude.gov.br/portal/saude/visualizar_texto.cfm?idtxt=26961). Um

outro dado preocupante são as seqüelas neurológicas observadas em aproximadamente 30%

dos doentes, mesmo naqueles em que a cura bacteriológica foi obtida, e cujo grau de

severidade é na maioria das vezes dependente de quão precocemente a hanseníase é tratada.

Dessa forma, a busca de novas medidas de controle é fortemente recomendada, e para tal, um

melhor entendimento dos mecanismos de patogênese envolvidos na infecção pelo M. leprae

constitui um pré-requisito essencial. Estas novas medidas incluem a utilização de drogas de

segunda geração que causem menos efeitos colaterais e que permitam um tratamento de

menor duração, medicamentos alternativos para os episódios reacionais, novos testes para o

diagnóstico precoce da infecção, bem como a aplicação de uma vacina mais eficaz contra a

doença (http://www.who.int/lep/stat2002/global02.htm).

A genômica comparativa permite estabelecer uma sólida relação filogenética entre

grupos, ajudando, sobretudo a identificar similaridades e dicotomias entre vias metabólicas e

fisiológicas antes impossíveis de determinar. A comparação dos genomas de micobactérias

consiste de um excelente meio para identificar as bases genéticas das diferenças entre os

fenótipos existentes no grupo. Sobretudo no contexto de micobactérias, a análise de genomas

torna-se uma importante ferramenta para um melhor entendimento da biologia e mecanismos

Estudo das proteases de micobactérias

de patogenicidade em espécies de difícil manipulação como o M. leprae que não cresce in

vitro (COLE, et al., 2001).

O atual conhecimento dos mecanismos patogênicos e a determinação dos fatores de

virulência que causam a hanseníase são limitados. Os patógenos possuem um arsenal de

fatores de virulência que participam de processos como a colonização, evasão das defesas do

hospedeiro, disseminação e sobrevivência. Dentre esses fatores, as enzimas proteolíticas, são

muito importantes em processos como proliferação e degradação de tecidos do hospedeiro,

além da participação em muitas outras vias (PAYNE, 1976).

Realizamos uma análise comparativa in silico para as proteases de micobactérias que

apresentam seu genoma seqüenciado. Utilizamos para esta análise os genomas de M. avium

paratuberculosis str. K10 (LINGLING, et al., 2005), M. tuberculosis H37Rv (COLE, et al.,

1998; CAMUS, et al., 2002), M. tuberculosis CDC1555 (http://cmr.tigr.org/tigr-

scripts/CMR/GenomePage.cgi?database=gmt), M. bovis AF2122 (GARNIER, et al., 2003),

M. bovis BCG (http://www.pasteur.fr/recherche/unites/Lgmb/mycogenomics.html#bovis),

que foram comparados com o genoma do M. leprae (COLE, et al., 2001). Construímos

bancos de dados de proteases para cada espécie e realizamos análise de seqüências entre eles.

Dedicamos especial atenção ao M. leprae tomando por base o paradigma de que a

característica mais marcante deste genoma é a extensiva deleção e inativação do número de

genes, fenômeno denominado evolução por redução. Através desta análise fomos capazes de

identificar proteínas não categorizadas como proteases em todas as espécies analisadas,

realizar uma atualização na nomenclatura de diversos genes e especialmente identificar um

grupo homogêneo de proteases conservadas em todas as micobactérias estudadas. O número

de genes que codificam para proteases em M. leprae e M. avium paratuberculosis foi

semelhante. Nossos dados recebem suporte de estudo filogenético realizado por BROSCH, et

al., 2001, que analisa a região 16s do RNA ribossômico e revela um ancestral comum que

Estudo das proteases de micobactérias

evoluiu diferentemente, originando dois ramos, um onde encontramos M. leprae e M. avium

paratuberculosis e o outro onde estão as micobactérias do complexo tuberculose. Esta

separação pode representar uma possível explicação para as diferenças nas formas de

infecção, colonização e sobrevivência nos respectivos hospedeiros.

O genoma do M. leprae contém cerca de 1130 pseudogenes e o menor conjunto de

genes de todas as espécies de micobactérias até o momento seqüenciadas. A perda de vias

metabólicas pelo M. leprae parece ter resultado na impossibilidade de cultivar esse

microorganismo in vitro (COLE, et al., 2001, EIGLMEIER, et al., 2001) e o estabelecimento

intrínseco de um nicho colonizado apenas por esta bactéria, o nervo periférico. Nosso estudo

revela, então, um aspecto de fundamental importância dentro deste cenário, onde observamos

um elevado grau de preservação de genes que codificam para proteases no genoma de M.

leprae, quando comparada com outras famílias de genes. Podemos inferir que este grupo é

essencial para a sobrevivência e patogenicidade nesta bactéria.

Um número crescente de proteases produzidas por microorganismos patogênicos tem

sido descrito como fatores de virulência, contribuindo muitas vezes de maneira essencial para

o estabelecimento de um variado número de manifestações clínicas da infecção. As proteases

podem participar de forma efetiva nos processos de invasão e colonização dos tecidos alvo e

degradação tecidual, na modulação e inativação das defesas do hospedeiro, inativando fatores

de transcrição envolvidos com a síntese de proteínas responsáveis pela resposta imune

(Brown, et al., 2000), entre outros (revisto por Travis, et al., 1995; Travis & Potempa, 2000).

Em espécies de bactérias de gêneros como Yersinia (WILLIAMS, et al., 2000; HEUSIPP, et

al., 2006), Streptococcus (IBRAHIM, et al., 2004; LYON & CAPARON, 2004; BIWAS &

BIWAS, 2005), Chlamydia (SHAW, et al., 2002; SHARMA, et al., 2005; MURTHY, et al.,

2006) e nas espécies: Legionella pneumophyla (PEDERSEN, et al., 2001), Vibrio cholerae

(BEHARI, et al., 2001), Listeria monocytogenes (WONDERLING, et al., 2004; STACK, et

Estudo das proteases de micobactérias

al., 2005) e Campylobacter jejuni (BRONDSTED, et al., 2005), a correlação das proteases

com a patogênese decorrente destes organismos está bem estabelecida.

Em micobactérias, a descrição da atividade de proteases relacionadas com a

patogênese é bastante restrita. Poderíamos considerar as proteases expressas pelo M. leprae

como boas candidatas a desempenharem um papel importante na sua interação com o

hospedeiro. Estas enzimas poderiam, por exemplo, auxiliar na disseminação da bactéria no

hospedeiro a partir do trato respiratório, provável porta de entrada do M. leprae. Durante sua

trajetória até a célula de Schwann, presume-se que o M. leprae tenha que atravessar diversas

lâminas basais, como as que servem de suporte ao endotélio vascular e à própria membrana

basal que recobre cada célula de Schwann, e proteases produzidas pela bactéria poderiam

contribuir neste processo. Também é razoável assumir que existe uma contribuição similar de

proteases na disseminação de M. tuberculosis, visto que cepas avirulentas possuem

capacidade proteolítica reduzida, quando comparadas com cepas virulentas (MASSÓ, et al.,

1999).

A etapa seguinte do nosso trabalho foi investigar então a expressão de proteases em

pacientes com hanseníase. Do conjunto de proteases encontradas em M. leprae, selecionamos

os genes ML0041 ou mycP1, ML0176 ou htrA2, ML2659 ou htrA4, ML0235 ou clpC e

ML0379 ou gcp. Os três primeiros estão descritos como proteases possivelmente secretadas,

considerados desta forma moléculas de interface na interação patógeno-hospedeiro. O gene

que codifica para gcp uma o-sialoglicoproteina endopeptidase tem evidência experimental em

Pseudomonas de que é secretada (ABDULLAH, et al., 1992; MELLORS & LO, 1995;

SUTHERLAND, et al., 1992). A ATP-dependente clp protease teve sua expressão indireta

detectada através de ELISA utilizando soro de pacientes infectados com M. leprae (MISRA,

et al., 1996). Desta forma, isolamos bactérias provenientes de lesões de indivíduos com a

forma multibacilar da doença, onde o número de bactérias por lesão é relativamente alto.

Estudo das proteases de micobactérias

Optamos por esta fonte de bacilos, descartando o M. leprae isolado de tatu, a fim de buscar

um melhor entendimento acerca do possível envolvimento destas proteases no decurso da

infecção humana. No processo de isolamento dos bacilos não houve a remoção completa de

contaminantes de tecidos do hospedeiro. A escolha desta metodologia foi proposital, visando

uma recuperação de um número maior de bactérias em detrimento de sua pureza, visto que, as

reações de RT-PCR eram realizadas com iniciadores específicos para os genes selecionados.

A não amplificação do DNA humano contaminante nestas preparações foi confirmada pela

inclusão deste DNA em reações incluídas como controle negativo. As tentativas iniciais de

amplificação da região codificante para as proteases selecionadas não se mostraram bem

sucedidas observando apenas a amplificação de clpC. Para aumentar a sensibilidade das

reações desenhamos oligonucleotídeos que permitiam a amplificação de fragmentos internos

dos genes mycP1, htrA2, htrA4 e gcp. Desta forma, conduzimos novas reações de RT-PCR

tendo como molde os produtos gerados nas reações iniciais. A presença de RNAm para

mycP1, htrA2, htrA4 e gcp foi claramente evidenciada após reações de reamplificação. A

utilização de dois pares de iniciadores para cada gene representou uma garantia de

especificidade das nossas reações.

O grau de dificuldade em observar a presença de RNAm nas reações realizadas pode

ser um reflexo do grau de expressão in vivo de cada gene em questão. Até o presente

momento não está estabelecido o papel e o envolvimento de cada uma destas proteases na

patogênese causada pelo M. leprae. É possível, entretanto, supor que possam existir

diferentes mecanismos de interação e regulação destas proteases ou mesmo que a transcrição

das moléculas de RNAm seja diferenciada entre elas.

Uma vez demonstrada a transcrição dos genes acima mencionados, partimos para a

etapa de clonagem e expressão da forma recombinante da proteína HtrA2. Depois de

purificada, esta proteína foi inoculada em camundongos para a posterior obtenção de

Estudo das proteases de micobactérias

anticorpos policlonais. O gene que codifica para a HtrA2 foi clonado no sistema pET32a-c(+)

que produz uma proteína recombinante fusionada a tireodoxina e uma cauda de histidina.

Desta forma, após a obtenção dos anticorpos policlonais contra a HtrA2, realizamos

cromatografia de afinidade para retirar os anticorpos produzidos contra a porção

tireodoxina/histidina, utilizando uma HiTrap NHS que interage com grupos amina.

Incubamos a coluna com tireodoxina/histidina previamente produzidas e então passamos o

soro proveniente dos camundongos imunizados com a rHtrA2. Desta forma, obtivemos um

soro enriquecido apenas com anticorpos contra HtrA2. Os anticorpos contra a proteína HtrA2

foram então utilizados para a realização de imunohistoquímica em pacientes com hanseníase.

Até o momento da publicação do artigo que apresenta os resultados equivalentes a esta etapa

do trabalho, a marcação para HtrA2 não foi observada. Consideramos que a HtrA2 tem sua

expressão regulada por várias vias de transdução de sinal e desta forma a presença da proteína

esteja limitada a momentos específicos da infecção. Os experimentos de RT-PCR para

avaliar a presença de moléculas de RNA mensageiro e imunohistoquímica para detectar a

presença de proteínas foram realizados a partir de diferentes amostras de pacientes. Desta

forma, é possível que estando os pacientes em etapas distintas do processo de infecção, a

expressão destas proteínas também seja diferenciada.

Estes resultados são consistentes com dados recentes da literatura que mostram a

expressão destes genes no modelo experimental de infecção pelo M. leprae em camundongos

atímicos nu/nu. A avaliação por RT-PCR em bacilos isolados destes animais mostrou a

presença de RNAm para as cinco proteases em estudo, indicando que também neste modelo

experimental as proteases mycP1, htrA2, htrA4, clpC e gcp são possivelmente produzidas pelo

M. leprae (WILLIAMS, et al., 2004). Mais recentemente, a expressão das proteínas ClpC e

Gcp foi confirmada pela análise de proteoma de M. leprae derivado de tatu (MARQUES, et

al., resultado não publicado).

Estudo das proteases de micobactérias

A função específica destas proteases na biologia e patogênese ocasionadas pelo M.

leprae não está totalmente esclarecida. ML0235 mostra homologia com membros do

complexo clp (“Caseinolytic protein”), uma classe de proteínas altamente conservadas

implicadas na tolerância ao estresse de muitos organismos, tanto em procariotos como em

eucariotos (GOTTESMAN, et al., 1990; KRÜGER, et al., 2000). Membros desta família

incluem ATPases que apresentam atividade de chaperona e proteínas que têm atividade de

serino protease (DOUGAN, et al., 2002). O complexo protéico clpC/ClpP é encontrado nas

bactérias, a subunidade clpC possui atividade de chaperona, enquanto a clpP, constitui o

módulo catalítico. Em bactérias, assim como em células eucarióticas, as proteínas de choque

térmico fazem parte da maquinaria celular responsável pela verificação da conformação,

reparo e degradação de moléculas. A família de proteínas Clp ATP-dependentes pode atuar

como proteases e como chaperoninas em condições de estresse prevenindo agregação protéica

e garantindo a manutenção das proteínas celulares em sua conformação nativa. A clpC

constitui o único gene selecionado previamente descrito em M. leprae (MISRA, et al., 1996).

Nesse trabalho, os autores mostraram a presença de anticorpos contra esta proteína em

pacientes com hanseníase. Estudos recentes desta família de proteínas de choque térmico

sugerem sua atuação essencial na adaptação e sobrevivência de L. monocytogenes ao

ambiente intracelular (GAILLOT, et al., 2000). O gene clpC, por exemplo, é essencial para o

escape da bactéria do compartimento fagossomal para o citoplasma da célula hospedeira

(ROUQUETTE, et al., 1996), além de estar envolvido em eventos de adesão e invasão celular

demonstradas pela redução significativa na infecção de hepatócitos de camundongos

infectados (NAIR, et al., 2000). Entre as chaperoninas presentes em grande abundância no M.

leprae está a groEL. Portaro et al., 2002 mostraram pela primeira vez que esta chaperonina

tem atividade proteolítica em M. leprae.

Estudo das proteases de micobactérias

A protease ML0379 possui homologia com uma o-sialoglicoprotease de Pasteurella

haemolytica. Esta enzima é uma metaloprotease dependente de zinco e cliva

preferencialmente substratos protéicos ricos em o-sialoglicanas ligadas a resíduos de treonina

e serina (MELLORS & LO, 1995). A diferenciação e crescimento de células hematopoiéticas

em leucócitos maduros é acompanhada pela aquisição ou perda de glicoproteínas de

superfície celular que assim delineiam as formas de associação, interação e resposta a

estímulos ambientais. Uma grande variedade de glicoproteínas, dentre elas CD34, CD43,

CD44 e CD45, os ligantes para P- e L- selectinas, a proteína de adesão vascular VAP-1,

glicoproteína Iβ e cranina, uma O-sialoglicoproteína encontrada no cérebro (JIANG &

MELLORS, 1998) são clivadas pela o-sialoglicoprotease de Pasteurella haemolytica, atuando

assim, de forma direta na modulação da resposta imune do hospedeiro (SUTHERLAND, et

al., 1992; ABDULLAH, et al., 1992).

Por outro lado, ML2659 e ML0176 codificam para uma provável serina protease que

possui homologia com a protease HtrA4 do M. tuberculosis e com a protease DegS de E. coli.

As proteases DegS, DegP e DegQ presentes em E. coli são constituintes da família HtrA

(WALLER & SAUER, 1996). Nesta família encontram-se serino proteases periplasmáticas

requeridas para o crescimento de cepas de E. coli em temperaturas elevadas (MEESAS, et al.,

1993). Em Salmonella typhimurium, entretanto, HtrA é essencial para a resistência ao

estresse oxidativo e sobrevivência dentro de macrófagos (WILLIAMS, et al., 2000).

MycP1 pertence a um grupo interessante de proteases, chamadas micosinas. O

genoma do M. tuberculosis H37Rv codifica para 5 micosinas designadas micosinas 1 a 5

(MycP1- MycP5) e anotadas como Rv3883c, Rv3886, Rv0291, Rv3449 e Rv1796,

respectivamente (BROWN, et al., 2000). A identidade entre essas proteínas varia entre 40

47% sugerindo um caso de duplicação gênica. Dois destes genes foram perdidos pelo M.

leprae: mycP2 (ML0037) que compreende um pseudogene e mycP4 que foi deletado

Estudo das proteases de micobactérias

(http://www.sanger.ac.uk/Projects). mycP1 pertence a região RD1 que inclui o gene que

codifica para “the 6 kDa early-secreted antigenic target” (ESAT-6) e “10KDa culture filtrate

protein” (CFP-10) que são eficientemente secretadas por via alternativa de secreção em

micobactérias, snm. Os genes que participam da via snm situam-se próximos a esat-6 e cfp-10

na região RD1 (SKJOT, et al., 2000) e mycP1 (snm8) é parte desta via. Toda esta região foi

preservada no genoma de M. leprae exceto pelo gene snm5 (ML0057) que é um pseudogene.

A análise genética deste locus em Mycobacterium smegmatis revelou que a secreção de

ESAT-6 e CFP-10 requerem o gene mycP1 (CONVERSE & COX, 2005). A correlação da

região RD1 e a virulência em M. tuberculosis foi demonstrada experimentalmente. Deleções

nesta região resultam em atenuação nas culturas de macrófagos e camundongos (BRODIN, et

al., 2006). Em pacientes com hanseníase, a expressão in vivo de ESAT-6 e CFP-10 foi

indiretamente demonstrada pela presença de resposta imune específica contra essas proteínas

(GELUK, et al., 2004). Os dados da literatura estão de acordo com as nossas evidências de

que MycP1 é expressa na hanseníase.

Depois de demonstrada a presença das proteases analisadas nas lesões de pacientes

hansenianos, passamos a uma etapa de avaliação da atividade catalítica e mecanismos

enzimáticos da rHtrA2. A proteína recombinante Gcp constitui tema de estudo da dissertação

de Mestrado de Julio Jablonski Amaral, aluno do Instituto de Bioquímica Médica/UFRJ,

também sob a orientação da Dra. Maria Cristina V. Pessolani.

As HtrAs são uma família amplamente estudada. No entanto, não existe nenhuma

caracterização das HtrAs de M. leprae. A rHtrA2 de M. leprae foi purificada utilizando-se

resina Ni-NTA em uma única etapa e a ausência de proteínas contaminantes foi avaliada

através de SDS-PAGE e imunobloting realizado com anticorpo anti-6x His-tag, que é capaz

de detectar a cauda de seis histidinas presente apenas na forma recombinante da proteína. A

análise desta purificação foi verificada também através de cromatografia de filtração em gel

Estudo das proteases de micobactérias

em coluna Shepadex G.75. As análises de homologia da seqüência da HtrA2 de M. leprae

revelam que esta proteína possui um domínio tripsina (resíduos 96-249) que contém a tríade

catalítica formada por H182, D224, S305, um domínio PDZ (resíduos 297-382), além de uma

seqüência consenso para peptídeo sinal na região N-terminal (resíduos 1-36), indicando a

possibilidade de ser secretada. A análise primária de sua seqüência sugere que esta proteína

pertence a família S1, composta de serina proteases com atividade “quimiotripsina-like”

(RAWLINGS, et al., 2006).

Iniciamos a caracterização da rHtrA2 de M. leprae testando uma série de peptídeos

sintéticos com flourescência apagada (FRETs), flanqueados por Abz (ortho-aminobenzoic

acid) e EDDnp ([N-ethylenediamine-(2,4-dinitrophenyl)]) que mudavam a composição dos

aminoácidos em diferentes posições. Nestes ensaios fomos capazes de determinar a eficiência

catalítica, algumas informações acerca dos subsítios P4-P1, confirmar a preferência de

clivagem após resíduos R, indicarmos que a enzima reconhece seu substrato não apenas

através da interação P1-S1, mas também por outros aminoácidos no substrato que interagem

com o sítio estendido de ligação da enzima. Os resultados obtidos indicam que rHtrA2 de M.

leprae possui uma especificidade diferenciada entre os substratos quando comparada com

outras HtrAs. A descrição para a atividade desta família retrata seus membros como

possuindo uma variabilidade grande e dependente somente da posição P1. Majoritariamente a

literatura indica que estas proteases clivam após resíduos hidrofóbicos. Em contraste, nossos

resultados indicam uma maior seletividade da rHtrA2 de M. leprae e a necessidade de

resíduos de Arg para haver clivagem. Cabe ressaltar, entretanto, que tais descrições são

baseadas em enzimas que apresentam similaridade em torno de 40% com a rHtrA2 de M.

leprae, e provavelmente estas diferenças refletem na especificidade da rHtrA2. Utilizamos

em seguida, um substrato flourescente, metilcoumarina (MCA) que possui um único sítio de

clivagem R-R. Os resultados revelaram a excelente hidrólise do MCA e quando tentamos

Estudo das proteases de micobactérias

inibir sua atividade com inibidores clássicos de serina protease, observamos que somente a

aprotinina foi capaz de tal efeito. Ainda durante a investigação dos mecanismos enzimáticos

para a melhor atividade da rHtrA2, realizamos testes para verificar a temperatura ótima de

atividade, bem como pH. Conforme descrito, a atividade da enzima foi ótima numa faixa de

temperatura entre 37

C a 55

C e o pH entre 6,0 e 10,0, indicando uma grande plasticidade. É

possível que assim como seus homólogos, a rHtrA2 de M. leprae possua uma variação de

atividade de acordo com a temperatura. A literatura indica que ensaios in vitro, realizados em

baixas temperaturas (em torno de 20

C) prevaleça a atividade chaperona e em temperaturas

mais elevadas atue como protease.

Realizamos também ensaios com porções peptídicas derivados de moléculas

biologicamente ativas, a fim de verificar potenciais substratos para a HtrA2, monitorando a

hidrólise dos mesmos por HPLC. A hidrólise de dinorfina e neurotensina indicam que rHtrA2

de M. leprae tem real preferência por aminoácidos básicos na posição P1. Até o presente

momento não há descrição de substratos naturais para rHtrA2 de M. leprae. As HtrA2 de

mamíferos estão envolvidas na proteção contra o estresse celular e a sua deleção resulta em

uma perda seletiva da população de neurônios estriatais (MARTINS, et al., 2004). A relação

da clivagem da dinorfina e neurotensina com a rHtrA2 de M. leprae não está clara, estes

achados estão sendo investigados em nosso laboratório.

Vale a pena ressaltar que a hanseníase é uma doença que apresenta um longo período

de incubação, podendo variar de 5 a 10 anos. Determinar o exato papel de cada molécula

expressa pelo M. leprae no processo de colonização e dispersão até a chegada do bacilo ao

nervo periférico, pode ser uma tarefa impossível de se realizar. Certamente dentro do

hospedeiro a HtrA2 deve exercer seu papel biológico associada a várias outras moléculas.

Dessa forma baseados nas evidências experimentais, podemos supor o envolvimento da

HtrA2 em alguma etapa do processo infeccioso. Por exemplo, a entrada do patógeno no

Estudo das proteases de micobactérias

sistema circulatório do hospedeiro é usualmente acompanhada por uma elevação da

temperatura corporal. É esperado então que genes que codificam para proteínas de choque

térmico exerçam um importante papel na infecção bacteriana. É importante ressaltar que os

soros de pacientes apresentam elevados títulos contra essas proteínas. De fato, HtrA4 ou

Rv0125 tem sido utilizada como complemento de vacina para a tuberculose. A elevação de

temperatura pode gerar agregação protéica. A expressão da HtrA2 em M. leprae

provavelmente é regulada pelo sistema Cpx ou o RpoE, cujos genes estão presentes no

genoma, logo a presença de proteínas mal formadas pode representar o sinal para a expressão

da HtrA2.

Através da literatura é possível verificar que mutações nos genes htrAs de Salmonella,

Brucella e Yersinia causam diminuição da taxa de sobrevivência em camundongos e que os

mutantes htrA podem atuar como vacinas. Os resultados apresentados propiciam novas

possibilidades para o envolvimento desta protease em inúmeros processos patofiosiológicos

na hanseníase.

Estudo das proteases de micobactérias

5 Conclusão

Os resultados desta tese de Doutorado nos permitiram chegar às seguintes conclusões:

 Realizamos uma análise comparativa in silico para as proteases de micobactérias que

apresentavam seu genoma seqüenciado. Através desta análise identificamos proteínas não

categorizadas como proteases em todas as espécies analisadas, atualizamos a nomenclatura de

diversos genes e especialmente identificamos um grupo homogêneo de proteases conservadas

em todas as micobactérias estudadas. Encontramos um número semelhante de genes que

codificam para proteases em M. leprae e M. avium paratuberculosis. Nossos dados recebem

suporte de estudo filogenético realizado, que analisa a região 16s do RNA ribossômico,

revelando um ancestral comum que evoluiu diferentemente, originando dois ramos, um onde

encontramos M. leprae e M. avium paratuberculosis e o outro onde estão as micobactérias do

complexo tuberculose. Esta separação pode representar uma possível explicação para as

diferenças nas formas de infecção, colonização e sobrevivência nos respectivos hospedeiros.

 Neste trabalho verificamos, através da técnica de RT-PCR, a presença de RNAm para as

proteases mycP1, htrA2, htrA4 e gcp e clpC em M. leprae isolado de lesões de pacientes com

hanseníase. A não amplificação do DNA humano contaminante nestas preparações foi

confirmada pela inclusão deste DNA em reações incluídas como controle negativo. Estes

resultados sugerem que estas proteases são produzidas pelo microorganismo durante a

infecção e podem, portanto, desempenhar algum papel na sua patogenia.

Estudo das proteases de micobactérias

 Analisando a seqüência da HtrA2 de M. leprae por homologia fomos capazes de identificar

um domínio tripsina (resíduos 96-249) que contém a tríade catalítica formada por H182,

D224, S305, domínio PDZ (resíduos 297-382), além de uma seqüência consenso para

peptídeo sinal na região N-terminal (resíduos 1-36), indicando a possibilidade de ser

secretada. Estes achados sugerem que esta proteína pertence a família S1, composta de serina

proteases com atividade “quimiotripsina-like”.

 Utilizamos peptídeos sintéticos com flourescência apagada (FRETs), flanqueados por Abz

(ortho-aminobenzoic acid) e EDDnp ([N-ethylenediamine-(2,4-dinitrophenyl)]) para

confirmar a preferência de clivagem após resíduos de R da rHtrA2 de M. leprae, utilizando

um conjunto de substratos FRET que mudavam a composição dos aminoácidos em diferentes

posições. Nestes ensaios fomos capazes de determinar a eficiência catalítica, algumas

informações acerca dos subsítios P4-P1, confirmar a preferência de resíduos R, indicarmos

que a enzima reconhece seu substrato não apenas através da interação P1-S1, mas também por

outros aminoácidos no substrato que interagem com o sítio estendido de ligação da enzima.

Os resultados obtidos indicam que rHtrA2 de M. leprae possui uma especificidade

diferenciada entre os substratos quando comparada com outras HtrAs.

 Testamos a hipótese de atividade “quimiotripsina-like” para a HtrA2 de M. leprae

utilizando o substrato fluorescente metilcoumarina (MCA) que possui um único sítio de

clivagem R-R a fim de caracterizar a atividade catalítica da HtrA2 de M. leprae. Os

Estudo das proteases de micobactérias

resultados revelaram a excelente hidrólise do MCA, confirmando a preferência por resíduos

básicos para clivagem.

 Realizamos também ensaios que visavam a caracterização inicial dos potenciais substratos

da rHtrA2. Utilizamos peptídeos biologicamente ativos e monitoramos a sua hidrólise por

HPLC. A hidrólise de dinorfina e neurotensina indicam que rHtrA2 de M. leprae tem real

preferência por aminoácidos básicos na posição P1. Até o presente momento não há

descrição de substratos naturais para rHtrA2 de M. leprae. As HtrA2 de mamíferos estão

envolvidas na proteção contra o estresse celular e a sua deleção resulta em uma perda seletiva

da população de neurônios estriatais. A relação da clivagem da dinorfina e neurotensina com

a rHtrA2 de M. leprae não está clara, estes achados estão sendo investigados em nosso

laboratório.

 Realizamos ensaios com a rHtrA2 de M. leprae a fim de determinar os mecanismos

enzimáticos para a inibição sua atividade, bem como, pH e temperatura ótimos de atividade.

Utilizando inibidores clássicos de serina protease, observamos que somente a aprotinina foi

capaz de tal efeito. Ainda durante a investigação dos mecanismos enzimáticos para a melhor

atividade da rHtrA2, realizamos testes para verificar a temperatura ótima de atividade e

verificamos que a faixa ótima é de 37

C a 55

C e o pH entre 6,0 e 10,0, indicando uma grande

plasticidade. A literatura indica que em baixas temperaturas (em torno de 20

C) prevaleça a

atividade chaperona e em temperaturas mais elevadas atue como protease.

Estudo das proteases de micobactérias

6 Referência

ABDULLAH, K.M., Udoh, E.A., Shewen, P.E. & Mellors, A. (1992). A neutral

glycoprotease of Pasteurella haemolytica A1 specifically cleaves O-

sialoglycoproteins. Infection and Immunity. 60(1), 56-62.

ALBA, B.M. & Gross, C.A. (2004). Regulation of the Escherichia coli

δδ

–dependent

envelope stress response. Molecular Microbiology. 52, 613-619.

ALBA, B.M., Zhong, H.J., Pelayo, J.C. & Gross, C.A. (2001). degS (hhoB) is a essential

Escherichia coli gene whose indispensable function is to provide δ

activity.

Molecular Microbiology. 40,1323-1333.

ANDERSSON, J.O. & Andersson, S.G. (1999). Insights into the evolutionary process of

genome degradation. Current Opinion in Genetics & Development. 9, 664 – 671.

BARRET, A.J. & Rawlings, N.D. (1995). Perspectives in biochemistry and biophysics.

Families and clans of serine peptidases. Archives of biochemistry and biophysics.

318(2), 247-250.

BEHARI, J., Stagon, L. & Calderwood, S.B. (2001). pepA, a gene mediating pH

regulation of virulence genes in Vibrio cholerae. Journal of Bacteriology. 183 (1),

178-181.

BIET, F., Boschiroli, M.L., Thorel, M.F., Guilloteau, L.A. (2005). Zoonotic aspects of

Mycobacterium bovis and Mycobacterium avium – intracellulare complex (MAC). Vet

Res. 36, 411–436 – Review.

BIWAS, S. & Biwas, I. (2005). Role of HtrA in surface protein expression and biofilm

formation by Streptococcus mutans. Infection and Immunity. 73(10), 6923-6934.

BRANDT, L., Skeiky, Y.A.W., Alderson, M.R., Lobet, Y., Dalemans, W., Turner, O.C.,

Basaraba, R.J., Izzo, A.A., Lasco, T.M., Chapman, P.L., Reed, S.G. & Orme, I.M.

(2004). The protective effect of the Mycobacterium bovis BCG vaccine is increased by

coadministration with the Mycobacterium tuberculosis 72-Kilodalton fusion

polyprotein Mtb72F in M. tuberculosis-Infected Guinea Pigs. Infection and Immunity.

72, 6622–6632.

Estudo das proteases de micobactérias

BRENNAN, P.J. & Nikaido, H. (1995). The envelope of Mycobacteria. Annual Reviews

Biochemistry. 64, 29 – 61.

BRODIN, P., Majlessi, L., Marsollier, L., de Jonge, M.I., Bottai, D., Demangel, C., Hinds, J.,

Neyrolles, O., Butcher, P.D., Leclerc, C., Cole, S.T. & Brosch, R. (2006). Dissection of

ESAT-6 system 1 of Mycobacterium tuberculosis and impact on immunogenicity and

virulence. Infection and Immunity. 74, 88-98.

BRONDSTED, L., Andersen, M.T., Parker, M., Jorgensen, K. & Ingmer, H. (2005). The

HtrA protease of Campylobacter jejuni is required for heat and oxygen tolerance and

for optimal interaction with human epithelial cells. Applied and Environmental

Micrbiology. 71(6), 3205-3212.

BROSCH, R., Pym, A.S., Gordon, S.V. & Cole, S.T. (2001). The evolution of

mycobacterial pathogenicity: clues from comparative genomics. TRENDS in

Microbiol. 9, 452-458.

BROWN, G.D., Dave, J.A., van Pittius, N.G., Stevens, L., Ehlers, M.R.W. & Beyers, A.D.

(2000). The mycosins of Mycobacterium tuberculosis H37Rv: a family of subtilisin-

like serine proteases. Gene. 254, 147 – 155.

BUELOW, D.R. & Raivio, T.L. (2005). Cpx signal transduction is influenced by a

conserved N-terminal domain in the novel inhibitor CpxP and the periplasmic

protease DegP. J bacterial. 187, 6622-6630.

CAMUS, J.C., Pryor, M.J., Medigue, C. & Cole, S.T. (2002). Re-annotation of the genome

sequence of Mycobacterium tuberculosis H37Rv. Microbiology. 148, 2967-2973.

CLAUSEN, T., Southan, C. & Ehrmann, M. (2002). The HtrA family of proteases:

implications for protein composition and cell fate. Mol cell. 10, 443-455.

COLE, S.T., Brosch, R., Parkhill, J., Garnier, T., Churcher, C., Harris, D., Gordon, S.V.,

Elglmeier, K., Gas, S., Barry III, C.E., Tekaia, F., Badcock, K., Basham, D., Brown, D.,

Chillingworth, T., Connor, R., Davies, R., Devlin, K., Feltwell, T., Gentles, S., Hamlin,

N., Holroyd, S., Hornsby, T., Jagels, K., Krogh, A., McLean, J., Muole, S., Murphy, L.,

Oliver, K., Osborne, J., Quail, M.A., Rajandream, M.–A., Rogers, J., Rutter, S., Seeger,

K., Skelton, J., Squares, R., Squares, S., Sulston, J.E., Taylor, K., Whitehead, S., &

Barrell, B.G. (1998). Deciphering the biology the biology of Mycobacterium

tuberculosis from the complete genome sequence. Nature. 393, 537-544.

Estudo das proteases de micobactérias

COLE, S.T., Elglmeier, K., Parkhill, J., James, K.D., Thomson, N.R., Wheeler, P.R., Honoré,

N., Garnier, T., Churcher, C., Harris, D., Mungall, K., Basham, D., Brown, D.,

Chillingworth, T., Connor, R., Davies, R.M., Devlin, K., Duthoy, S., Feltwell, T., Fraser,

A., Hamlin, N., Holroyd, S., Hornsby, T., Jagels, K., Lacroix, C., McLean, J., Muole, S.,

Murphy, L., Oliver, K., Quail, M.A., Rajandream, M.–A., Rutherford, K.M., Rutter, S.,

Seeger, K., Simon, S., Simmonds, M., Skelton, J., Squares, R., Squares, S., Stevens, K.,

Taylor, K., Whitehead, S., Woodward, J.R. & Barrell, B.G. (2001). Massive gene decay

in the leprosy bacillus. Nature. 409, 1007-1011.

CONVERSE, S.E. & Cox, J.S. (2005). A protein secretion pathway critical for

Mycobacterium tuberculosis virulence is conserved and functional in Mycobacterium

smegmatis. J Bacteriol. 187, 1238–1245.

DOBRINDT, U. & Hacker, J. (2001). Whole genome plasticity in pathogenic bacteria.

Current Opinion in Microbiology. 4, 550 – 557.

DOHERTY, T.M. & Andersen, P. (2005). Vaccines for tuberculosis: novel concepts and

recent progress. Clinical Microbiology Reviews. 18, 687-702.

DOUGAN, D.A., Mogk, A. & Bakau, B. (2002). Protein folding and degradation in

bacteria: To degrade or not to degrade? That is the question. CMLS Cellular and

Molecular life Sciences. 59, 1607 – 1616.

EHRMANN, M. & Clausen, T. (2004). Proteolysis as a regulatory mechanism. Annual

Review of Genetics. 38, 709-724.

EIGLMEIER, K., Parkhill, J., Honoré, N., Garnier, T., Tekaia, F., Telenti, A., Klatser, P.,

James, K.D., Thomson, N.R., Wheeler, P.R., Churcher, C., Harris, D., Mungall, K.,

Barrel, B.G. & Cole, S.T. (2001). The decaying genome of Mycobacterium leprae.

Lepr Rev. 72, 387-398.

GAILLOT, O., Pellegrini, E., Bregenhott, S., Nair, S. & Berche, P. (2000). The ClpP serine

protease is essential for the intracellular parasitism and virulence of Listeria

monocytogenes. Molecular Microbiology. 35 (6), 1286 – 1294.

GANAPATI, R. & Revankar, C.R. (1989). Clinical aspects of leprosy. In: “The biology of

the mycobacteria”. Vol. 3. pp. 327 – 358. Academic Press Limited, London.

GARCÍA J.M.G., Gutiérrez, J.J.P. & Antuña, A.A.S. (2005). Respiratory infections caused

by environmental mycobacteria. Arch Bronconeumol. 41(4), 206-219.

Estudo das proteases de micobactérias

GARNIER, T., Eiglmeier, K., Camus, J.C., Medina, N., Mansoor, H., Pryor, M., Duthoy, S.,

Grodin, S., Lacroix, C., Monsempe, C., Simon, S., Harris, B., Atkin, R., Doggett, J.,

Mayes, R., Keating, L.,Wheeler, P.R., Parkhill, J., Barrell, B.G., Cole, S.T., Gordon, S.V.

& Hewinson, R.G. (2003). The complete genome sequence of Mycobacterium bovis.

Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 7877-7882.

GELUK, A., van Meijgaarden, K.E., Franken, K.L.M.C., Wieles, B., Arend, S.M., Faber,

W.R., Naafs, B. & Ottenhoff, T.H.M. (2004). Immunological crossreactivity of the

Mycobacterium leprae CFP-10 with its homologue in Mycobacterium tuberculosis.

Scand J Immunol. 59, 66-70.

GOTTESMAN, S., Squires, C., Pichersky, E., Carrington, M., Hobbs, M., Mattick, J.S.,

Darlymple, B., Kuramitsu, H., Shiroza, T., Foster, T., Clark, W.P., Ross, B., Squires,

C.L. & Maurizi, M.R. (1990). Conservation of the regulatory subunit for the Clp

ATP-dependent protease in prokaryotes and eukaryotes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA.

87, 3513 – 3517.

HARBOE, M. The immunology of leprosy. (1985) In: “Hastings RC (ed) Leprosy”. 1

edition, Churchill Livingstone, Inc, New York, pp. 53 – 87.

HE, H. & Zahrt, T.C. Identification and characterization of a regulatory sequence

recognized by Mycobacterium tuberculosis persistence regulator MprA. Journal of

Bacteriology. 187 (1), 202 – 212.

HEDSTROM, L. (2002). Serine protease mechanisms and specificity. Chem Rev. 102,

4501-4523.

HEUSIPP, G., Spekker, K., Brast, S., Fälker, S. & Schmidt, A. (2006) YopM of Yersinia

enterocolitica specifically interacts with a1-antitrypsin without affecting the anti-

protease activity. Mycrobiology. 152, 1327-1335.

HUBER, R & Bode , W. (1978). Structural basis of the activation and action of trypsin.

Accounts of Chemical Research. 11, 114-122.

IBRAHIM, Y.M., Kerr, A.R., McCluskey, J. & Mitchel, T.M. (2004). Role of HtrA in the

virulence and competence of Streptococcus pneumoniae. Infection and Immnunity.

72(6), 3584-3591.

ISAAC, D.D., Pinkner, J.S., Hultgren, S.J. & Silhavy, T.J. (2005). The extracytoplasmic

adaptor protein CpxP is degraded with substrate by DegP. PNAS. 102, 17775-17779.

Estudo das proteases de micobactérias

JIANG, P. & Mellors, A. (1998). Membrane Protein Proteolysis Assayed by

Fluorescence Quenching: Assay of O-Sialoglycoprotein Endopeptidase. Anal

Biochem. 259, 8–15.

KIM, D.Y. & Kim, K.K. (2005). Structure and function of HtrA family proteins, the key

players in protein quality control. J Biochem Mol Biol. 38, 266-274.

KRÜGER, E., Witt, E., Ohlmeier, S., Hanschke, R. & Hecker, M. (2000). The Clp

proteases of Bacillus subtilis are directly involved in degradation of misfolded

proteins. Journal of Bacteriology. 182 (11), 3259 – 3265.

LINGLING, L., Bannantine, J.P., Zhang, Q., Amonsin, A., May, B.J., Alt, D., Banerji, N.,

Kanjilal, S. & Kapur, V. (2005). The complete genome sequence of Mycobacterium

avium subspecies paratuberculosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 12344–12349.

LIPINSKA, B., Sharma, S. & Georgopoulos, C. (1988). Sequence analysis and regulation

of the htrA gene of Escherichia coli: a δ

-independent mechanism of heat-inducible

transcription. Nucleic Acid Research. 16(21), 10053-10067.

LIPINSKA, B., Zylicz, M. & Georgopoulos, C. (1990). The HtrA (DegP) protein,

essential for Escherichia coli survival at high temperatures, is an endopeptidase. J

bacteriol. 172, 1791-1797.

LYON, W.R. & Caparon, M.G. (2004). Role for serine protease HtrA (DegP) of

Streptococcus pyogenes in the biogenesis of virulence factors SpeB and the hemolysin

streptolysin S. Infection and Immnunity. 72(3), 1618-1625.

MARRI, P.R., Bannantine, J.P. & Golding, G.B. (2006). Comparative genomics of

metabolic pathways in Mycobacterium species: gene duplication, gene decayand

lateral gene transfer. FEMS Microbiol Ver. 30, 906-925.

MARTINS, L.M., Morrison, A., Klupsch, K., Fedele, V., Moisoi, N., Teismann, P., Abuin,

A., Grau, E., Geppert, M., Livi, G.P., Creasy, C.L., Martin, A., Hargreaves, I., Heales,

S.J., Okada, H., Brandner, S., Schulz, J.B., Mak, T. & Downward1, J. (2004).

Neuroprotective role of the reaper-related serine protease HtrA2/Omi revealed by

targeted deletion in mice. Molecular and Cell Biology. 24, 9848–9862.

MASSÓ, F., Paez, A., Varela, E., De Leon, L. D., Zenteno, E. & Montano, L. F. (1998).

Collagen degrading acitivity associated with Mycobacterium species. Thorax. 54 (5),

439 - 4.

Estudo das proteases de micobactérias

MEESAS, J., Rouviere, P.E., Erickson, J.W., Donuhue, T.J. & Gross, C.A. (1993). The

activity of sigma E, an Escherichia coli heat-inducible sigma-factor, is modulated by

expression of outer membrane proteins. Genes Dev. 7, 2618 – 2628.

MELLORS, A. & Lo, R.Y.C. (1995). O-Sialoglycoprotease from Pasteurella haemolytica.

Methods in Enzymology. 248, 728 –739.

MISRA, N., Habib, S., Ranjan, A., Hasnain, S.E. & Nath, I. (1996). Expression and

functional chracterization of the clpC gene of Mycobacterium leprae: ClpC protein

elicts human antibody response. Gene. 172, 99 – 104.

MURTHY, A.K., Cong, Y., Murphey, C., Guentzel, M.N., Forsthuber, T.G., Zhong, G. &

Arulanandam, B.P. (2006). Chlamydial protease-like activity factor induces

protective immunity against genital chlamydial infection in transgenic mice that

express the human HLA-DR4 allele. Infection and Immnunity. 74(12), 6722-6729.

MURWANTOKO, Yano, M., Ueta, Y., Murasaki, A., Kanda, H., Oka, C. & Kawaichi, M.

(2004). Binding of proteins to the PDZ domain regulates proteolytic activity of

HtrA1 serine protease. Biochemichal Journal. 381, 895-904.

NAIR, S., Milohanic, E. & Berche, P. (2000). ClpC ATPase is required for cell adhesion

and invasion of Listeria monocytogenes. Infection and Immunity. 68 (12), 7061 – 7068.

PALLEN, M.J. & Ponting, C.P. (1997). PDZ domains in bacterial proteins. Molecular

Microbiology. 26(2), 411 – 415.

PALLEN, M.J. & Wren, B.W. (1997). The HtrA family of serine proteases. Molecular

Microbiology. 26, 209 – 221.

PAYNE, J.W. (1976). Peptides and micro-organisms. Adv Microb Physiol. 13, 55-113.

PEDERSEN, L.L., Radulic, M., Doric, M. & Abu Kwaik, Y. (2001). HtrA homologue of

Legionella pneumophila: an indispensable element for intracellular infection of

mammalian but not protozoan cells. Infection and Immnunity. 69(4), 2569-79.

PERONA, J.J. & Craik, C.S. (1995). Structural basis of substrate specificity in the serine

proteases. Protein Science. 4, 337-360.

Estudo das proteases de micobactérias

PERONA, J.J. & Craik, C.S. (1997). Evolutionary divergence of substrate specificity

within the chymotrypsin-like serine protease fold. The Journal of Biological

Chemistry. 272(48), 29987-29990.

PORTARO, F.C.V., Hayashi, M.A.F., de Arauz, L.J., Palma, M.S., Assakura, M.T., Silva,

C.L. & de Camargo, C.M. (2002). The Mycobacterium leprae hsp65 display

proteolytic activity. Mutagenesis studies indicate that the M. leprae hsp65

proteolytic activity is catalytically related to the Hs1VU protease. Biochemistry. 41,

7400 – 7406.

RAWLINGS, N.D., Morton, F.R. & Barrett, A.J. (2006). MEROPS: the peptidase

database. Nucleic Acids Res. 34, D270-D272.

RESS, R.F.W. (1985). The microbiology of leprosy. In: hastings RC (ed) Leprosy, 1

edition, Churchill Livingtone Inc, New York, p, 31 – 52.

RIDLEY, D.S. & Jopling, W.H. (1966). Classification of leprosy according to immunity.

A five group system. Int. J. Lepr. 34, 255 – 273.

ROUQUETTE, C., Ripio, M.T., Pellegrini, E., Bolla, J.M., Tascon, R.I., Vazquez-Boland,

J.A. & Berche, P. (1996). Identification of a ClpC ATPase required for stress

tolerance and in vivo survival of Listeria monocytogenes. Mol. Microbiol. 21, 977 –

987.

SASSOON, N., Arié, J.P. & Betton, J.M. (1999). PDZ domains determine the native

oligomeric structure of the DegP (HtrA) protease. Molecular Microbiology. 33(3),

583-589.

SCHECHTER, I. & Berger, A. (1967). On the size of the active site in proteases.

Biochem. Biophys. Res. Com. 27, 157-162.

SCHLIEKER, C., Mogk, A. & Bukau, B. (2004). A PDZ switch for a cellular stress

response. Cell. 117, 417-420.

SHARMA, J., Dong, F., Pirbhai, M. & Zhong, G. (2005). Inhibition of proteolytic activity

of a chlamydial proteasome/protease-like activity factor by antibodies from humans

infected with Chlamydia trachomatis. Infection and Immnunity. 73(7), 4414-4419.

Estudo das proteases de micobactérias

SHAW, A. C., Vandahl, B.B., Larsen, M.R., Roepstorff, P., Gevaert, K., Vandekerckhove, J.,

Christiansen, G. & Birkelund, S. (2002). Characterization of a secreted Chlamydia

protease. Cellular Microbiology. 4 (7), 411 – 424.

SHEPARD, C.C. (1962). Multiplication of Mycobacterium leprae in the foot-pad of the

mouse. International Journal of Leprosy. 3, 291 – 306.

SKEIKY, Y.A.W., Alderson, M.R., Guderian, J.A., Ovendale, P.A., Brandt, L., Campos-

Neto, A., Lobet, Y., Dalemans, W., Orme, I.M. & Reed, S.G. (2004). Differential

immune responses and protective efficacy induced by components of a tuberculosis

polyprotein vaccine, Mtb72f, delivered as naked DNA or as recombinant protein. J

Immunol. 172, 7618–7628.

SKEIKY, Y.A.W., Lodes, M.J., Guderian, J.A., Mohamath, R., Boment, T., Alderson, M.R.

& Reed, S.G. (1999). Cloning, expression, and immunological evaluation of two

putative secreted serine protease antigens of Mycobacterium tuberculosis. Infect.

Immunol. 67, 3998 – 4007.

SKJOT, R.L., Oettinger, T., Rosenkrands, I., Ravn, P., Brock, I., Jacobsen, S. & Andersen, P.

(2000). Comparative evaluation of low-molecular-mass proteins from

Mycobacterium tuberculosis identifies members of the ESAT-6 family as

immunodominant T-cell antigens. Infection and Immunity. 68, 214–220.

SPIERS, A., Lamb, H.K., Cocklin, S., Wheeler, K.A., Budworth, J., Dodds, A.L., Pallen,

M.J., Maskell, D.J., Charles, I.G. & Hawkins, A.R. (2002). PDZ domains facilitate

binding of high temperature requirement protease A (HtrA) and tail-specific

protease (Tsp) to heterologous substrates through recognition of the small stable

RNA A (ssrA)-encoded peptide. The Journal of Biological Chemistry. 277(42), 39443-

39449.

STACK, H.M., Sleator, R.D., Bowers, M., Hill, C. & Gahan, C.G.M. (2005). Role for HtrA

in stress induction and virulence potential in Listeria monocytogenes. Applied and

Environmental Micrbiology. 71(8), 4241-4247.

SUTHERLAND, D.R., Abdullah, K.M., Cyopick, P. & Mellors, A. (1992). Cleavage of the

cell-surface O-sialoglycoproteins CD34, CD43, CD44, and CD45 by a novel

glycoprotease from Pasteurella haemolytica. J. Immunol. 148(5), 1458-64.

TRAVIS, J. & Potempa, J. (2000). Bacterial proteinases as target for the development of

second-generation antibiotics. Biochimica et Biophysica Acta. 1477, 35 – 50.

Estudo das proteases de micobactérias

TRAVIS, J., Potempa, J. & Maeda, H. (1995). Are bacterial proteinases pathogenic

factors? Trends in Microbiology. 3 (10), 405 – 407.

VAN SOOLINGEN, D. (2001). Molecular epidemiology of tuberculosis and other

mycobacterial infections: main methodologies and achievements. Journal of Internal

Medicine. 249, 1-26.

VIDAL PESSOLANI, M.C., de Melo Marques, M.A., Reddy, V.M., Lochtt, C. & Menozzi,

T.D. (2003). Systemic dissemination in tuberculosis and leprosy: do micobacterial

adhesins play a role? Microbes and Infection. 5(7), 677 – 684.

VISSA, D.V. & Brennan, J.P. (2002). Impact of the Mycobacterium leprae genome

sequence on leprosy reserch. In: “Genomics of rich Gram-positive bacteria”. pp. 85 –

117. Caister Academic Press, Wymondham, UK.

VISSA, V.D. & Brennan, P.J. (2001). The genome of Mycobacterium leprae: a minimal

Mycobacterial gene set. Genome Biol. 28, 10231–10238.

WALLER, P.R.H. & Sauer, R.T. (1996). Characterization of degQ and degS, Escherichia

coli genes encoding homologs of the DegP protease. Journal of bacteriology. 178 (4),

1146 – 1153.

WILLIAMS, D.L., Torrero, M., Wheeler, P.R., Truman, R.W., Yoder, M., Morrison, N.,

Bishai, W.R. & Gillis, T.P. (2004). Biological implications of Mycobacterium leprae

gene expression during infection. J Mol Microbiol Biotechnol. 8, 58 – 72.

WILLIAMS, K., Oyston, P.C.F., Dorrel, N., Li, S.R., Titball, R.W. & Wren, B.W. (2000).

Investigation into the role of the serine protease HtrA in Yersinia pestis pathogenesis.

FEMS Microbiology Letters. 186, 281-286.

WINDER, F. (1982). Mode of action of the antimycobaterial agents and the associated

aspects of the molecular biology of the mycobacteria. In: the biology of the

mycobacteria. C. Ratledge and J. Stanford, eds., Academic press, London. P. 353 – 438.

WONDERLING, L.D., Wilkinson, B.J. & Bayles, D.O. (2004). The htrA (degP) gene of

Listeria monocytogenes 10403S is essential for optimal growth under stress

conditions. Applied and Environmental Micrbiology. 70(4), 1935-1943.

Estudo das proteases de micobactérias

World Health Organization Study Group. 1982. Chemotherapy of leprosy for control

programmes. WHO Technical Report Series N

675. World Health Organization,

Geneva.

Estudo das proteases de micobactérias

7 Apêndice

PATHOGENESIS

MICROBIAL

Microbial Pathogenesis ] (]]]]) ]]]–]]]

Mini review

Comparative genomics of mycobacterial proteases

Michelle Lopes Ribeiro-Guimara

a,b

, Maria Cristina Vidal Pessolani

a,Ã

Laboratory of Cellular Microbiology, Department of Mycobacterioses - Oswaldo Cruz Institute, Oswaldo Cruz Foundation – FIOCRUZ,

Av. Brasil 4365 – Manguinhos, 21040-900 Rio de Janeiro, RJ, Brazil

Instituto de Bioquı

mica Me

dica, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, RJ 21941-590, Brazil

Received 20 November 2006; received in revised form 5 May 2007; accepted 12 May 2007

Abstract

Although proteases are recognized as important virulent factors in pathogenic microorganisms, little information is available so far

regarding the potential role of these enzymes in diseases caused by mycobacteria. Here we use bioinformatic tools to compare the

protease-coding genes present in the genome of Mycobacterium leprae, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium bovis and

Mycobacterium avium paratuberculosis. This analysis allowed a review of the nomenclature of the protease family present in

mycobacteria. A special attention was devoted to the ‘decaying genome’ of M. leprae where a relatively high level of conservation of

protease-coding genes was observed when compared to other genes families. A total of 39 genes out of the 49 found in M. bovis were

identiﬁed in M. leprae. Of relevance, a core of well-conserved 38 protease genes shared by the four species was deﬁned. This set of

proteases is probably essential for survival in the host and disease outcome and may constitute novel targets for drug development

leading to a more effective control of mycobacterial diseases.

Keyword: Mycobacteria; Proteases; Bioinformatics; Comparative genomics; Pathogenesis

Contents

Acknowledgments . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6

References . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6

Infections caused by species of the genus Mycobacterium

still adversely affect the life of millions worldwide.

Tuberculosis alone, caused by Mycobacterium tuberculosis,

is responsible for 2–3 million deaths annually. Efforts to

control it have been faced with a variety of obstacles

including the inefﬁciency of the BCG vaccine in preventing

tuberculosis and the emergence of multidrug resistant

strains [1]. At the same time, leprosy, caused by Myco-

bacterium leprae, is still a major public health concern,

particularly in countries such as Brazil, Ethiopia, and India

that together account for 64% of the leprosy prevalence

rate and 78% of annual new cases [2]. Additionally,

infections in immunocompromised individuals caused by

opportunistic mycobacterial species such as Mycobacter-

ium avium and Mycobacterium intracellulare belonging to

the M. avium complex have gained epidemiological

importance since the emergence of AIDS [3]. These

infections are difﬁcult to control due to the natural

resistance of these mycobacterial species to antibiotics that

are effective against M. tuberculosis and M. leprae.

Likewise, tuberculosis in bovines, caused by Mycobacter-

ium bovis, capable of provoking the disease in humans as

well, remains a major health challenge in the international

ARTICLE IN PRESS

www.elsevier.com/locate/micpath

doi:10.1016/j.micpath.2007.05.010

Corresponding author. Tel.: +55 21 2598 4467; fax: +55 21 2270 9997.

E-mail address: cpessola@ioc.ﬁocruz.br (M.C.V. Pessolani).

Please cite this article as: Ribeiro-Guimara

es ML, Pessolani MCV. Comparative genomics of mycobacterial proteases. Microb Pathog (2007),

doi:10.1016/j.micpath.2007.05.010

trade of animals and animal products, causing signiﬁcant

economic loss to the industry as a whole [4]. This

discouraging scenario urgently demands short-term but

effective tools for controlling the spread of mycobacterial

infections as quickly as possible.

In this review, a comparative genomics analysis of the

protease-coding genes predicted in the sequenced myco-

bacterial genomes was performed. The idea was to generate

a useful data for those working on proteases. We focused

on proteases based on their critical roles in bacterial

pathogenesis [5], and the absent of a detail comparison of

protease-coding genes across mycobacterial genomes.

Moreover, proteases constitute potential good targets for

the development of novel anti-mycobacterial drugs, an

urgent need in the mycobacterial ﬁeld.

So far the entire genome sequences of M. leprae [6],

M. tuberculosis [7,8], M. bovis [9],andM. avium paratuber-

culosis str. K10 [10] have been deciphered, and of another

11 are at various stages of completion [11]. By comparing

general genome features, the most striking feature found

was the extensive deletion and inactivation of genes

observed in the leprosy bacillus chromosome, a process

termed reductive evolution [12]. Since diverging from the

last common mycobacterial ancestor, the leprosy bacillus

may have lost over 2000 genes, deﬁning the minimal gene

set for a pathogenic mycobacteria [13]. Thus, the precise

analysis of the M. leprae protease-coding genes could

provide clues about the group of essential genes necessary

for intr acellular survival and disease outcome.

A comparative analysis of the protease-coding genes was

performed using the Basic Local Alignment Search Tool

(BLAST) [14]. M. leprae, M. tuberculosis H37Rv, and

M. bovis AF2122 CDS were predicted and annotated by

The Welcome Trust Sanger Institute [15]. The sequence of

M. avium paratuberculosis str. K10 chromosome has been

completed by the University of Minnesota [16]. A search was

initiated at the mycobacterial databases of the Pasteur

Institute (Paris, France) [17] by way of protease, peptidase,

and hydrolase inputs. Databases were constructed with these

output results, which were used as templates to identify the

homologues present in M. avium paratuberculosis str. K10

genome using the BLASTP program in conjunction with the

BLOSUM-62 weight matrix. Validation of the results was

based on predictors of the protein domain/motif Pfam,

InterPro, and Prosite. Gene products were considered

homologs when their identity was equal or over 60%.

We examined closely the genome of M. leprae and a

review of the genes annotated as proteases was performed.

Besides the 32 protease genes originally grouped into the

functional sub-class II.B.3—proteins, peptides and glyco-

peptides, 12 additional protease genes were found. These

genes were ML0222 or ftsH, ML0691 or dacB1, ML1199

or lspA, ML1 339, ML1582, ML1612 or lepB, ML16 32,

ML1633, ML2278 or htpX, ML2295, ML2490 or clpB

and ML2704. Additionally, an update of gene nomination

was performed based on the nomenclature used for

M. tuberculosis, as followed: ML0041—mycP1, M L0864—

pepB, ML0997— hﬂX, ML1486—pepN, ML1538—mycP5,

and ML2528—mycP3. The nomination of the three genes

encoding predicted HtrA-like proteases was also revised

based on further bioinformatics analysis using the site

Merops—the peptidase database [18]. ML0176, ML1078

and ML2659, which homologs in M. tuberculosis were

originally designated as pepD, htrA and pepA, respectively,

were now more appropriately designated as htrA2, htrA3

and htrA4. Actually, recent experimental data on the

recombinant ML0176 product indicate an optimal enzy-

matic activity at 45–55 1C, reinforcing the idea that this

enzyme constitutes a HtrA-like protease (M. L. Ribeiro-

Guimara

es, unpublished results).

The complete group of protease genes found in each

of the mycobacterial genomes here analyzed is listed in

Table 1. These genes were grouped according to their

function. A summary of the differences in protease genes

found across the four mycobacterial species are better

visualized in Fig. 1 . When compared to other gene families,

a relatively high level of preservation of protease-coding

genes was observed in the genome of M. leprae [13]. A total

of 39 genes were identiﬁed in M. leprae, 38 of them

constituting a core of conserved protease genes found

across all four species with homology ranging from 63% to

97%. A quite similar set of proteases composed of 43 genes

was found in M. avium paratuberculosis, reinforcing

previous analysis indicating a closer phylogenetic proxi-

mity between M. leprae and M. avium paratuberculosis as

compared to the M. tuberculosis complex [21]. All the genes

present in M. leprae and M. avium paratuberculosis were

shared with M. tuberculosis and M. bovis. One gene present

in M. leprae, ML2613—a probable metalloprotease, was

not found in M. avium paratuberculosis.

Forty-nine genes were found in M. bovis, all shared

with M. tuberculosis (Fig. 1). Rv1977, a gene coding

for a putative iminopeptida se that probably acts as a

Zn-dependent enzyme with chaperone function, was found

only in M. tuberculosis. Another feature only found in the

M. tuberculosis H37Rv strain was related to the ptrB gene

coding for the oligopeptidase B, a gene ﬁrst characterized

in Escherichia coli and probably involved in host cell

invasion [22]. A single ptrB gene coding for a protein with

around 700 amino acids was found in M. leprae, M. avium

paratuberculosis, M. tuberculosis CDC 1555 strain and

M. bovis. In contrast, this gene was split into two open

reading frames in the genome of M. tuberculosis H37Rv

strain, Rv0781 and Rv078 2, and denominated ptrBa and

ptrBb, respectively. In fact, this was the only difference

found between M. tuberculosis H37Rv and M. tuberculosis

CDC 1555 strains in the context of protease-coding genes.

The proteas e genes missing in at least one of the

mycobacterial genomes analyzed probably play redundant

roles or are responsible for differences in the pathogenesis

between the species. One example is the family of mycosin

(myc) genes. Five myc genes are found in M. tuberculosis

with identi ty ranging from 40% to 47%, suggesting that

they probably arose through gene duplication. Individual

ARTICLE IN PRESS

M.L. Ribeiro-Guimara˜es, M.C.V. Pessolani / Microbial Pathogenesis ] (]]]]) ]]]–]]]2

Please cite this article as: Ribeiro-Guimara

es ML, Pessolani MCV. Comparative genomics of mycobacterial proteases. Microb Pathog (2007),

doi:10.1016/j.micpath.2007.05.010

ARTICLE IN PRESS

Table 1

Protease-coding genes in M. tuberculosis, M. bovis, M. avium paratuberculosis and M. leprae genomes

Protein name M. leprae Sanger

M. tuberculosis

H37Rv Sanger

M. bovis AF2122

Sanger ID

M. avium

paratuberculosis str.

k10 UM ID

Comments about function

Aminohydrolases

AmiA1 ML0709 Rv3305c Mb3333c – Involved in cellular metabolism. It hydrolyses

l-amino acid and amides(P) 77%

77%

AmiB1 ML0708 Rv3306c Mb3334c

(P) 73% 73% –

Aminopeptidases

MapA ML1831c Rv0734 Mb0755 MAP4200 Removes the amino-terminal methionine from

nascent proteins72% 72% 80%

MapB ML1576c

Rv2861c Mb2886c MAP2934c

89% 89% 92%

Probable Carboxypeptidase (penicillin-binding protein)

DacB1 ML0691c Rv3330 Mb3363 MAP3448 Involved in peptidoglycan synthesis (at ﬁnal

stages). It hydrolyzes the bound

D-alanyl-D-

alanine

77% 77% 80%

DacB2 – Rv2911 Mb2935 MAP2979

Metalloproteases

FtsH ML0222 Rv3610c Mb3640c MAP0448 FtsH is a probable membrane-bound protease

(cell division protein). Thought to act as an

ATP-dependent Zn

metallopeptidase.

Probably it has a regulatory role in stress

response and speciﬁc protein secretion for

adaptation to host environment. Gcp is

probable a O-sialoglycoprotein

endopeptidase. It hydrolyzes O-

sialoglycoproteins

86% 86% 91%

Gcp ML0379

Rv3419c Mb3453c MAP4263

80% 80% 88%

– ML2613c Rv0198c Mb0204c –

79% 79%

Chaperonins

ClpB ML2490c htpM, Rv0384c Mb0391c MAP3853 Clp family cleaves peptides in various proteins

in a process that requires ATP hydrolysis. It

plays a major role in the degradation of

misfolded proteins. It shows a chymotrypsin-

like activity. ClpB—thought to be an ATPase

subunit of an intracellular ATP-dependent

protease. It seems to be regulated positively by

sigH (Rv3223c product) and negatively by

hspR (Rv0353 product)

85% 85% 90%

ClpC ML0235

d,e

Rv3596c Mb3627c MAP0461

91% 91% 96%

ClpX ML1477c Rv2457c Mb2484c MAP2278c

94% 94% 96%

ClpX

– Rv2667 Mb2686 MAP2787

ClpP2 ML1479c

Rv2460c Mb2487c MAP0426c

92% 92% 97%

ClpP1 ML1480c Rv2461c Mb2488c MAP2281c

95% 95% 90%

Probable GTP-binding protein

HﬂX ML0997 Rv2725c Mb2744c MAP2839c Possibly a putative GTPase, modulating

activity of HﬂK and HﬂC proteins76% 76% 83%

Mycosins

MycP1 ML0041

Rv3883c Mb3913c MAP4239c

69% 69% 41%

MycP2 ML0037 Rv3886c Mb3916c – Probable membrane-anchored proteins.

Thought to have proteolytic activity. They are

expressed during infection of macrophages

(P) 83% 83%

MycP3 ML2528c Rv0291 Mb0299 MAP3787

68% 68% 67%

MycP4 – Rv3449 Mb3479 MAP4239c

MycP5 ML1538c Rv1796 Mb1824 MAP1511

63% 63% 67%

HtrAs

HtrA3 ML1078 Rv1223 Mb1255 MAP2555c HtrA or DegP is a family of heat-shock

proteins that is required for growth at elevated

temperatures, probably functioning in the

degradation of unfolded proteins.

72% 72% 80%

HtrA4 ML2659

MTB32A,

Rv0125

Mb0130 MAP3527

69% 69% 72%

M.L. Ribeiro-Guimara˜es, M.C.V. Pessolani / Microbial Pathogenesis ] (]]]]) ]]]–]]] 3

Please cite this article as: Ribeiro-Guimara

es ML, Pessolani MCV. Comparative genomics of mycobacterial proteases. Microb Pathog (2007),

doi:10.1016/j.micpath.2007.05.010

ARTICLE IN PRESS

Table 1 (continued )

Protein name M. leprae Sanger

M. tuberculosis

H37Rv Sanger

M. bovis AF2122

Sanger ID

M. avium

paratuberculosis str.

k10 UM ID

Comments about function

HtrA2 ML0176

MTB32B,

Rv0983

Mb1009 MAP0918

70% 70% 79%

Peps

PepB ML0864c Rv2213 Mb2236 MAP1953 PepB, PepC and PepN are probable

aminopeptidase. They hydrolyze peptides and/

or proteins. PepE and PepQ are probable

peptidases. PepR is a probable zinc protease.

76% 76% 78%

PepC ML2213c Rv0800 Mb0823 MAP0632

76% 76% 79%

PepE ML1136 Rv2089c Mb2116c MAP1823c

(P) 73% 73% 75%

PepN ML1486 Rv2467 Mb2494 MAP2287

76% 76% 82%

PepQ ML0521

Rv2535c Mb2564c MAP1096

77% 77% 77%

PepR ML0855 Rv2782c Mb2805c MAP2890

74% 74% 83%

Proteasomes

PrcA ML1323

Rv2109c Mb2133c MAP1834c Proteasome subunits

86% 86% 86%

PrcB ML1322

Rv2110c Mb2134c MAP1835c

73% 73% 81%

Probable protease II (oligopeptidase B)

PtrB ML2226 PtrBa, Rv0781

PtrBb, Rv0782

Mb0804 MAP0615 Cleaves peptide bonds on the C-terminal side

of lysyl and argininyl residues

77% 77% 75%

Possible protease IV (endopeptidase IV) signal peptide peptidase

SppA ML1839c

Rv0724 Mb0745 MAP4188 Involved in the digestion of the cleaved signal

peptide. This activity is necessary to maintain

proper secretion of mature proteins across the

membrane

72% 72% 72%

Probable protease

– ML2704 Rv3915 Mb3946 MAP4341

86% 86% 85%

– ML2295c Rv3668c Mb3692c MAP0406

80% 80% 77%

– ML1288 Rv2141c Mb2165c MAP1886c

85% 85% 85%

– ML2382c Rv0457c Mb0466c –

(P) 73% 73%

Probable SsrA-binding protein

SmpB ML0671 Rv3100c Mb3127c MAP3170c

84% 84% 84%

Possible membrane-associated serine protease

– ML2298c Rv3671c Mb3695c MAP0403 Probable hydrolyses peptides and/or proteins

(possibly cleaved preferentially after serine

residue)

63% 63% 82%

Possible intermembrane cleaving protease

– ML1582c Rv2869c Mb2894c MAP2939c

80% 84% 83%

Probable protease transmembrane heat shock protein Htpx

HtpX ML2278 Rv0563 Mb0578 MAP4059 Possibly involved in adaptation. It hydrolyzes

speciﬁc peptides and/or proteins83% 83% 89%

Iminopeptidases

Pip – Rv0840c Mb0863c MAP0684c

– – Rv1977 – –

Pyrrolidone-carboxylate peptidase

Pcp – Rv0319 Mb0327 –

M.L. Ribeiro-Guimara˜es, M.C.V. Pessolani / Microbial Pathogenesis ] (]]]]) ]]]–]]]4

Please cite this article as: Ribeiro-Guimara

es ML, Pessolani MCV. Comparative genomics of mycobacterial proteases. Microb Pathog (2007),

doi:10.1016/j.micpath.2007.05.010

ARTICLE IN PRESS

Table 1 (continued )

Protein name M. leprae Sanger

M. tuberculosis

H37Rv Sanger

M. bovis AF2122

Sanger ID

M. avium

paratuberculosis str.

k10 UM ID

Comments about function

Protein and peptide secretion

LepB ML1612c Rv2903c Mb2927c MAP2971c LepB is probable a signal peptidase I (Spase I

or leader peptidase I). It cleaves the N-

terminal leader sequences from secreted

protein precursors. LspA is probable a signal

peptidase II. It speciﬁcally catalyzes the

removal of signal peptides from

prolipoproteins

70% 70% 71%

LspA ML1199 Rv1539 Mb1566 MAP1250

69% 69% 90%

Probable secreted protease

– ML1339c Rv2672 Mb2691 MAP2792

67% 67% 78%

– ML1632c Rv2223c Mb2247c MAP1967c

72% 72% 78%

– ML1633c

Rv2224c Mb2248c MAP1968c

80% 80% 85%

Proteases in bold are conserved across the species. P, pseudogene.

The Sanger ID refers to (http://www.sanger.ac.uk/Projects/M_leprae [15]).

The UM ID refers to (http://www.cbc.umn.edu/ResearchProjects/AGAC/Mptb/Mptbhome.html [16]).

Percentages refer to protein sequence identity related to the M. leprae homologue.

Identiﬁed in M. leprae by proteomic studies (unpublished results).

Expression shown in M.leprae by transcription analysis [19].

Identiﬁed in M. leprae by proteomic studies [20].

ML2613

. leprae

(1)

DacB2

ClpX’

MycP4

M. avium

paratuberculosis

(5)

DacB2

MycP4

ClpX’

MycP2

miB1

AmiA1

MB0466c

B0204c

Pcp

M. bovis

(11)

Pip

miA1

miB1

MycP2

Rv045

DacB2

ClpX’

MycP4

Rv1977

Pcp

Rv0198

M. tuberculosis

(13)

PtrBa

Fig. 1. Comparative analyses of mycobacterial protease-coding genes. The diagram shows a central circle that represents the core of preserved proteases

shared by M. leprae, M. tuberculosis, M. bovis and M. avium paratuberculosis. The protease genes found in individual genomes that are not conserved

across the species are represented in the peripheral triangles. Their sizes are related to the number of these genes indicated in parenthesis. The cod es for the

genes are: Underline—genes shares by M. tuberculosis, M. bovis and M. avium paratuberculosis, and absent in M. leprae. Italics—common genes between

M. tuberculosis and M. bovis and absent in M. leprae and M. avium paratuberculosis. Bold—speciﬁc gene of M. tuberculosis. A—gene present in M. leprae,

but not shared with M. avium paratuberculosis.

M.L. Ribeiro-Guimara˜es, M.C.V. Pessolani / Microbial Pathogenesis ] (]]]]) ]]]–]]] 5

Please cite this article as: Ribeiro-Guimara

es ML, Pessolani MCV. Comparative genomics of mycobacterial proteases. Microb Pathog (2007),

doi:10.1016/j.micpath.2007.05.010

myc genes are part of ﬁve RD (region of difference) found

in the bacterial chromosome [23]. Two of these genes

are missing in M. leprae: mycP2 (ML0037) is a pseudogene

and mycP4 is deleted. Actually, the complete set of

genes constituting the RD2 region is missing, and in the

RD4 region only one gene (ML0363) is present in M. leprae

[24]. Another gene absent in M. leprae, but present in

M. tuberculosis, clpX

, shares signiﬁcant homology with

clpC, suggesting that is also a case of gene duplication. The

protease ClpX

requires ATP and seems to play a major

role in the degradation of misfolded proteins showing a

chymotrypsin-like activity.

The comparison of the genomes of mycobacterial species

provides an efﬁcient mean of identifying the genetic basis

of the differences in host range, phenotype and pathogeni-

city of these inherently difﬁcult to manipulate bacteria [13].

In this work, for the ﬁrst time, a comparison of protease-

coding genes present in the genomes of four species of

mycobacteria was performed, including the most relevant

pathogenic species M. leprae and M. tuberculosis. This

comparison allowed the identiﬁcation of a group of 38

well-conserved proteases shared by the four species and

probably essential for in vivo survi val and pathogenecity.

In order to further clarify the role of proteases in

mycobacterial diseases, in a companion article, we focused

on ﬁve of these genes and showed that they are expressed in

human leprosy lesions [25].

Acknowledgments

We are most grateful to the Fundac- a

o Carlos Chagas

Filho de Amparo a

Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro

(FAPERJ) for supporting this study. M.L.R.G was a

recipient of a fellowship from the Conselho Nacional de

Desenvolvimento Cientı

ﬁco e Tecnolo

gico (CNPq). We

would also like to thank Judy Grevan for editing the text.

References

[1] /http://www.who.int/topics/tuberculosis/en/S.

[2] Lockwood DN, Suneetha S. Leprosy: too complex a disease for a

simple elimination paradigm. Bull World Health Organ

2005;83:230–5 [Review].

[3] Garcı

a Garcı

a JM, Palacios Gutierrez JJ, Sanchez Antuna

AA.

Respiratory infections caused by environmental mycobacteria. Arch

Bronconeumol 2005;41:206–19.

[4] Biet F, Boschiroli ML, Thorel MF, Guilloteau LA. Zoonotic aspects

of Mycobacterium bovis and Mycobacterium avium—intracellulare

complex (MAC). Vet Res 2005;36:411–36 [Review].

[5] Travis J, Potempa J, Maeda H. Are bacterial proteinases pathogenic

factors? Trends Microbiol 1995;3:405–7.

[6] Cole ST, Eiglmeier K, Parkhill J, James KD, Thomson NR, Wheeler

PR. Massive gene decay in the leprosy bacillus. Nature 2001;409:

1007–11.

[7] Cole ST, Brosch R, Parkhill J, Garnier T, Churcher C, Harris D.

Deciphering the biology of Mycobacterium tuberculosis from the

complete genome sequence. Nature 1998;393:537–44.

[8] Camus JC, Pryor MJ, Medigue C, Cole ST. Re-annotation of the

genome sequence of Mycobacterium tuberculosis H37Rv. Microbiol-

ogy 2002;148:2967–73.

[9] Garnier T, Eiglmeier K, Camus JC, et al. The complete genome

sequence of Mycobacterium bovis. Proc Natl Acad Sci USA

2003;100:7877–82.

[10] Lingling L, Bannantine JP, Zhang Q, Amonsin A, May BJ, Alt D,

et al. The complete genome sequence of Mycobacterium avium

subspecies paratuberculosis. Proc Natl Acad Sci USA 2005;102:

12344–9.

[11] /http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/lproks.cgiS

[12] Vissa VD, Brennan PJ. The genome of Mycobacterium leprae:a

minimal Mycobacterial gene set. Genome Biol 2001;28:10231–8

[Review].

[13] Eiglmeier K, Parkhill J, Honore

N, et al. The decaying genome of

Mycobacterium leprae. Lepr Rev 2001;72:387–98.

[14] Altschul SF, Gish W, Myers EW, Lipman DJ. Basic local alignment

search tool. J Mol Biol 1999;215:403–10.

[15] /http://www.sanger.ac.uk/ProjectsS.

[16] /http://www.cbc.umn.edu/ResearchProjects/AGAC/Mptb/Mptbhome.

htmlS.

[17] /http://www.pasteur.fr/recherche/unites/Lgmb/mycogenomics.htmlS.

[18] Rawlings ND, Morton FR, Barrett AJ. MEROPS: the peptidase

database. Nucleic Acids Res 2006;34:D270–2.

[19] Williams DL, Torrero M, Wheeler PR, Truman RW, Yoder M,

Morrison N, et al. Biological implications of Mycobacterium leprae

gene expression during infection. J Mol Microbiol Biotechnol 2004;8:

58–72.

[20] Marques MA, Espinosa BJ, Xavier da Silveira EK, Pessolani MC,

Chapeaurouge A, Perales J, et al. Continued proteomic analysis of

Mycobacterium leprae subcellular fractions. Proteomics 2004;4:

2942–53.

[21] Brosch R, Pym AS, Gordon SV, Cole ST. The evolution of

mycobacterial pathogenicity: clues from comparative genomics.

Trends Microbiol 2001;9:452–8.

[22] Pacaud M, Richaud C. Protease II from Escherichia coli. J Biol Chem

1975;250:7771–9.

[23] Brown GD, Dave JA, Gey van Pittius NC, Stevens L, Ehlers MRW,

Beyers AD. The mycosins of Mycobacterium tuberculosis H37Rv:

a family of subtilisin-like serine proteases. Gene 2000;254:

147–55.

[24] Gey Van Pittius NC, Gamieldien J, Hide W, Brown GD, Siezen RJ,

Beyers AD. The ESAT-6 gene cluster of Mycobacterium tuberculosis

and other high G+C Gram-positive bacteria. Genome Biology

2001;2:0044.1–0044.18.

[25] Ribeiro-Guimara

es ML, Tempone AJ, Amaral JJ, Nery JA, Antunes

SLG, Pessolani MCV. Expression analysis of proteases of Myco-

bacterium leprae in human skin lesions. Microb Pathlog 2007; in

press, doi:10.1016/j.micpath.2007.05.011.

ARTICLE IN PRESS

M.L. Ribeiro-Guimara˜es, M.C.V. Pessolani / Microbial Pathogenesis ] (]]]]) ]]]–]]]6

Please cite this article as: Ribeiro-Guimara

es ML, Pessolani MCV. Comparative genomics of mycobacterial proteases. Microb Pathog (2007),

doi:10.1016/j.micpath.2007.05.010

PATHOGENESIS

MICROBIAL

Microbial Pathogenesis ] (]]]]) ]]]–]]]

Short communication

Expression analysis of proteases of Mycobacterium leprae

in human skin lesions

Michelle Lopes Ribeiro-Guimara

a,b

, Antonio Jorge Tempone

, Julio Jablonski Amaral

a,b

Jose Augusto Nery

, Sergio Luiz Gomes Antunes

, Maria Cristina Vidal Pessolani

a,Ã

Laboratory of Cellular Microbiology, Department of Mycobacterioses-Oswaldo Cruz Institute, Oswaldo Cruz Foundation – FIOCRUZ,

Av. Brasil 4365 – Manguinhos, 21040-900 Rio de Janeiro, RJ, Brazil

Instituto de Bioquı

mica Me

dica, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, RJ 21941-590, Brazil

Received 20 November 2006; received in revised form 5 May 2007; accepted 12 May 2007

Abstract

Proteases are commonly involved in bacterial pathogenesis and their inhibition has represented a successful therapeutic approach to

treat infectious diseases. However, there is little information on the role of proteases in the pathogenesis of Mycobacteria. Five of these

genes, three coding for putative secreted proteases, were selected in the present study to investigate their expression in Mycobacterium

leprae isolated from skin biopsies of multibacillary leprosy patients. Via nested-PCR, it was demonstrated that mycP1 or ML0041, htrA2

or ML0176, htrA4 or ML2659, gcp or ML0379 and clpC or ML0235 are transcribed in vivo during the course of human infection.

Moreover, the expression of Gcp in leprosy lesions was further conﬁrmed by immunohistochemistry using a speciﬁc hyperimmune serum.

This observation reinforces the potential role of mycobacterial proteases in the context of leprosy pathogenesis.

Keywords: Mycobacterium leprae; Proteases; Leprosy; Expression; Lesion; RT-PCR

1. Introduction

Proteases are commonly involved in bacterial pathogen-

esis and their inhibition has represented a successful

therapeutic approach against several microorganisms. For

many years, it was believed that their main function was

the acquisition of nutrients for growth and proliferation in

the host tissue. However, recent observations have

indicated that pathogen-derived proteolytic enzymes may

also play important roles as virulent factors to ensure

successful colonization of microbes within a hostile host

environment [1]. These roles include the deregulation of

critical host processes such as activation of cascade

pathways, disruption of cytokine networks, excision of cell

surface receptors, turnover and modiﬁcation of cellular

proteins, and inactivation of host proteinase inhibi tors [2].

Even so, it is surprising that to date only a few proteases in

Mycobacteria have been investigated [3].

Leprosy, one of the oldest recorded diseases, remains an

important cause of morbidity with approximately 219,826

new cases per year (www.who.int/lep). Mycobacterium

leprae, the causative agent of leprosy, is a slow growing,

obligate, intracellular pathogen that is unique among

bacterial pathogens in its ability to invade the peripheral

nervous system. This unique tissue tropism is the basis of

the characteristic nerve damage associated with leprosy,

often leading to peripheral neuropathy, a serious sequel of

leprosy and common in endemic countries. Treatment of

patients with multidrug therapy, a combination of the

antibiotics rifampicine, dapsone and clofazimine, success-

fully achieves bacteriological sterility, but only partially

reverses or prevents loss of nerve-function in patients.

Thus, a better understanding of the disease mechanisms is

needed to develop new tools for prevention and treatment

of nerve damage in leprosy (www.who.int/lep).

Although M. leprae was the ﬁrst bacterium to be

described as a causing agent of a human infectious

disease in 1873, deciphering the biology of this bacterium

has constituted one of the greatest challenges for

ARTICLE IN PRESS

www.elsevier.com/locate/micpath

doi:10.1016/j.micpath.2007.05.011

Corresponding author. Tel.: +55 21 2598 4467; fax: +55 21 2270 9997.

E-mail address: cpessola@ioc.ﬁocruz.br (M.C.V. Pessolani).

Please cite this article as: Ribeiro-Guimara

es ML, et al. Expression analysis of proteases of Mycobacterium leprae in human skin lesions. Microb

Pathog (2007), doi:10.1016/j.micpath.2007.05.011

microbiologist over time due to its unique features.

Recently, the sequence of the M. leprae chromosome was

completed [4]. By comparing general genome features, the

most striking feature observed in the leprosy bacillus

chromosome was the extensive deletion and inactivation of

genes, a process termed reductive evolution. Since diver-

ging from the last common mycobact erial ancestor, the

leprosy bacillus may have lost over 2000 genes, deﬁning the

minimal gene set for a pathogenic mycobacteria [5]. Thus,

the precise analysis of M. leprae functional genes could

provide clues about the group of essential genes necessary

for intr acellular survival and disease outcome.

In an accompanying review [6], a comparative genomics

revealed a high degree of preservation of the protease-

coding genes found in Mycobacterium tuberculosis in the

degenerate chromossome of M. leprae. Looking for a

better deﬁnition of the roles of these enzymes in

mycobacterial pathogenesis, in the present study we

investigated the expression of ﬁve of these genes during

the course of leprosy.

2. Result s and discussion

2.1. Expression of M. leprae putative proteases in infected

human tissue

We evaluated the expression in human leprosy lesions of

ﬁve protease-coding genes, namely: mycP1 (ML0041),

htrA2 (ML0176), htrA4 (ML2659), gcp (ML0379), and

clpC (ML0235 ). These genes were selec ted on the basis of

their potential role in leprosy pathogenesis. The genes

mycP1, htrA2,andhtrA4 code for putative secreted

proteases since their ORFs include typical signal sequences

(http://genolist.pasteur.fr/M_leprae), and as such are at the

site of the host–pathogen interface. The gene gcp, on the

other hand, codes for a probable glycoprotease, which

orthologue in Pasteurella spp. has been implicated in

virulence [7]. And, lastly, analysis of the clpC gene was

included as a positive control in view of a previous study

demonstrating the presence of speciﬁc antibodies to this

protein in serum samples of leprosy patients, suggesting

that M. leprae expresses this gene during infection [8]. The

expression of these genes was investigated by RT-PCR in

M. leprae derived from a pool of leprosy skin lesions. Total

bacterial RNA was isolated and converted into cDNA.

PCR reactions were conducted in the presence of protease-

speciﬁc primers designed to amplify the full open reading

frame of the selected genes. Fig. 1A shows that only the

clpC transcript was detected after the ﬁrst round of

ampliﬁcation. Nested-PCR with internal primers was then

conducted using the PCR products allowing the detection

of mycP1, htrA2, htrA4 and gcp transcripts, which

conﬁrmed their in vivo transcription (Fig. 1B). These

results are consistent with recent data showing that these

ORFs are also transcribed during M. leprae infection in

nude mouse foot pads as detected by cross-species DNA

microarray and RT-PCR analyses [9]. More recently, the

expression of ClpC and Gcp proteins was conﬁrmed

by proteome analysis of armadillo-derived M. leprae

(Marques et al., unpublished results).

We were able to go further and conﬁrm the expression of

one of these genes at the protein level during the course of

leprosy. For this purpose, the gcp

gene was cloned, and the

recombinant protein was produced in Escherichia coli using

the Gateway cloning and exp ression system. The His-

tagged recombinant Gcp (rGcp) was puriﬁed in a Ni-NTA

column and the puriﬁed protein was used to generat e a

speciﬁc hyperimmune serum in mice. Fig. 2A shows the

speciﬁcity of the anti-rGcp serum, monitored by western

blot. A single band with the expected Mw of 35.5 kDa was

ARTICLE IN PRESS

1 2 3 4 5

3,054

2,036

1,018

ML0235

1 2 3 4 5 6 7 8 9

10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

506

1,018

1,636

ML0041

ML0176

ML2659 ML0379

Fig. 1. Transcription of the protease-coding genes clpC, mycP1, htrA2, htrA4, and gcp by M. leprae during the course of human infection monitored by

RT-PCR. Products of RT-PCR from bacterial RNA isolated from biopsies of leprosy patients were analyzed in an ethidium bromide-stained agarose gel.

(A) Lane 1: molecular-size marker; lane 2: ampliﬁcation of clpC from M. leprae cDNA; lane 3: ampliﬁcation of clpC from mock M. leprae cDNA; lane 4:

ampliﬁcation of clpC from human DNA; and lane 5: negative control reaction without template. (B) Lanes 1, 6, 11, and 16—molecular-size markers; lanes

2, 7, 12, and 17—ﬁrst ampliﬁcation reaction of ML0041, ML0176, ML2659, and ML0379, respectively from M. leprae cDNA; lanes 3, 8, 13, and 18—

nested-PCR from products of the ﬁrst ampliﬁcation of ML0041, ML0176, ML2659, and ML0379, respectively; lanes 4, 9, 14, and 19—nested-PCR from

mock M. leprae cDNA; and, ﬁnally, lanes 5, 10, 15, and 20—RT-PCR of ML0041, ML0176, ML2659, and ML0379, respectively from human DNA.

M.L. Ribeiro-Guimara˜es et al. / Microbial Pathogenesis ] (]]]]) ]]]–]]]2

Please cite this article as: Ribeiro-Guimara

es ML, et al. Expression analysis of proteases of Mycobacterium leprae in human skin lesions. Microb

Pathog (2007), doi:10.1016/j.micpath.2007.05.011

detected in total lysates of the recombinant E. coli BL21-

clone expressing M. leprae rGcp upon induction with

0.2%

L(+)-arabinose, but not in the uninduced clone.

Tissue sections from biopsies of three lepromatous leprosy

patients and one borderline tuberculoid were then im-

munostained with the speciﬁc anti-rGcp serum. Fig. 2B

shows the Gcp-immunoreactivity in one of these biopsies.

Expression of Gcp protease could be detected on the

bacilli-loaded macrophages of the borderline lepromatous

lesions. Instead, the borderline tuberculoid leprosy lesion

was not immunopositive, probably because tuberculoid

patients can clear M. leprae more effectively, so that bacilli

are rarely found in this clinical form. The biopsy with

normal histological appearance showed no immunoreac-

tive pattern on its sections. These results demonstrate that

the Gcp protease is expressed by M. leprae in inﬂammatory

macrophages of lepromatous cutaneous lesions.

The speciﬁc functions of these proteases in the biology

and pathogenesis of M. leprae remain obscure. MycP1 is

part of an interesting group of proteases, designated

mycosins. The M. tuberculosis H37Rv genome codes for

ﬁve mycosins, designated mycosin-1 to 5 (MycP1–MycP5)

and annotated as Rv3883c, Rv3886, Rv0291, Rv3449, and

Rv1796, respectively. The identity of these proteins ranged

from 40% to 47%, suggesting that they probably arose

through gene duplication. Two of these genes are missing

in M. leprae: mycP2 (ML0037) is a pseudogene and mycP4

is deleted (http://www.sanger.ac.uk/Projects). In the same

vein, mycP1 belongs to the RD1 region that includes the

gene for the 6 kDa early-secreted antigenic target (ESAT-6)

and 10 kDa cultured ﬁltrate protein (CFP-10). ESAT -6 and

CFP-10 are efﬁciently secreted by an alternative secretion

pathway termed the snm (secretion in mycobacteria)

pathway. The snm genes are located in the neighborhood

of the esat-6 and cfp-10 genes in the RD1 region [10]; and

mycP1 (snm8) is part of the snm pathway. This whole

region is preserved in the M. leprae genome, except for the

snm5 gene (ML0057)—a pseudogene. A genetic analysis of

this locus in Mycobacterium smegmatis revealed that

ESAT-6 and CFP-10 secretion requires the gene mycP1

[11]. The link between RD1 and M. tuberculosis virulence

has been demonstrated experimentally. Deletions in this

region result in an attenuation in cultured macrophages

and mice [12] . In leprosy patients, the in vivo expression of

ESAT-6 and CFP-10 has been indirectly demonstrated by

the presence of a speciﬁc immune response against these

proteins [13]. This observation is in agreement with our

demonstration that MycP1 is expressed during the course

of leprosy, making possible the secretion of ESAT-6 and

CFP-10, which probably contribute to the pathogenesis of

the diseas e.

A functional class of proteases that are conserved in

M. leprae despite an extreme reduction in number of genes

are the heat shock-induced serine proteases HtrAs or Deg.

This class includes the proteins ML0176, ML1078 and

ML2659, originally designated as pepD, htrA and pepA,

respectively. In the accompanying review, the nomination

of the three genes encoding predicted HtrA-like proteases

was revised based on bioinformatics and more appro-

priately designated as htrA2, htrA3 and htrA4, respectively.

These proteases are considerably similar sharing over 30%

identity. Required for E. coli growth at elevated tempera-

tures, HtrA proteases are involved in the degradation of

abnormal periplasmic proteins. The HtrA family shares a

modular architecture composed of an N-terminal segment

believed to have regulatory functions, a conserved trypsin-

like protease domain, and one or two PDZ domains that

mediate speciﬁc protein–protein interactions and preferen-

tially bind three to four residues of the target protein to its

C-terminal region (http://www.expasy.org/sprot). Muta-

tions in the htrA gene may cause susceptibility to heat and

oxidative stress, as in E. coli,

Brucella abortus, and

B. melitensis, or loss of virulence, as in Salmonella

typhimurium [14]. Moreover, Flannagan et al., 2007. [15]

deﬁned HtrA protease in Burkholderia cenocepacia that is

required for bacterial survival in vivo and for growth under

osmotic and long-term thermal stress. Added to this aspect,

the M. tuberculosis HtrA4 (so-called MTB32A) has been

used as a vaccine complement for tuberculosis in a fusion

of this protein with the MTB39 or Rv1196 that codiﬁes for

a protein of the PPE family [16].

Gcp is the O-sialoglycoprotein endopeptidase (glycopro-

tease), an enzyme conserved within the bacteria. It was ﬁrst

characterized in Pasteurella haemolytica as secreted pro-

tease [7]. The host molecules that work as substrates

include the human cell surface glycoproteins glycophorin

A, CD34, CD43, CD44, and CD45; the ligands for P- and

L-selectins; the tumor antigen epitectin; the vascular

adhesion protein VAP-1; platelet glycoprotein Ib; and

cranin, a brain O-sialoglycoprotein [17].

ARTICLE IN PRESS

rGcp

sgd

Fig. 2. In situ immunohistochemical expression of the Gcp protease on a

multibacillary cutaneous leprosy lesion. (A) Crude extracts of uninduced

(lane 1) or arabinose-induced cells (lane 2) were prepared and analyzed by

SDS-15% PAGE stained with Coomassie blue (left panel) or transferred

to a nitrocellulose membrane and blot was incubated with a anti-Gcp

speciﬁc antibody (right panel). (B) Granular Gcp-immunoreactivity

(brownish red color, arrows) was observed in the cytoplasm of

macrophages inﬁltrating the perianexial space, among sweat gland ducts

(sgd). Streptavidin-biotin immunoperoxidase staining of a cryostat section

of skin biopsy with polyclonal anti-Gcp. Scale bar ¼ 25 mm.

M.L. Ribeiro-Guimara˜es et al. / Microbial Pathogenesis ] (]]]]) ]]]–]]] 3

Please cite this article as: Ribeiro-Guimara

es ML, et al. Expression analysis of proteases of Mycobacterium leprae in human skin lesions. Microb

Pathog (2007), doi:10.1016/j.micpath.2007.05.011

In conclusion, the data herein described contribute to the

study of mycobacterial proteases abo ut which so little is

known. The extension of this type of research to the entire

class of proteases would surely lead to the clariﬁcation of

their possible involvement in the course of mycobact erial

infection, and the potential identiﬁcation of targets for the

development of new tools in controlling the dissemination

of both M. tuberculosis and M. leprae.

3. Experimental/materials and methods

3.1. Isolation of M. leprae from human skin lesions

Biopsies were collected from four patients with a

bacteriologic index (BI) of+3.0,+2.0,+4.9 and+4.0

before treatment, and M. leprae was isolated as described

previously [18]. The procedures described in this study were

approved by the Ethics Committee of the Oswaldo Cruz

Foundation and all volunteers were required to sign a

written consent.

3.2. RNA extraction and RT-PCR

Total bacterial RNA was extracted using guanidinium

isothiocyanate–phenol–chloroform (Invitrogen, Carlsbad,

CA, USA). Total amount of RNA was quantiﬁed by

ultraviolet absorvance at 260 nm. First-strand cDNA was

synthesized by using the total RNA (2–10 mg) as a template

with random hexamers primers (Amersham Pharmacia

Biotech, Piscataway, USA) with (‘‘good cDNA’’) or

without Superscript II Reverse Transcriptase (Invitrogen)

(‘‘mock cDNA’’) according to the manufacturer’s instruc-

tions. For PCR, the cDNA (1 mL) was amplidied using a

PTC 100-thermocycler (MJ Research Inc.) in a ﬁnal

volume of 25 mL containing 1 mM of each speciﬁc primer

for each protease, 0.1 mM dNTPs, and 1 U Taq DNA

polymerase (Biotools, Edmonton, Alta., Canada). Controls

for PCR consisted of reactions using human DNA, mock

cDNA, and water as a template. The sequences of the

primers are listed in Table 1. PCR was performed as

follows: 94 1C for 5 min, followed by 35 thermal cycles of

1 min at 95 1C denaturing, 1 min at 58 1C annealing, and

1 min at 72 1C elongation with a ﬁnal extension step of

7 min at 72 1C. Fifteen mL of the ampliﬁed PCR products

were applied on 1.5% agarose gel. After elect rophoresis the

gel was stained with 0.5 mg/mL ethidium bromide and the

image acquired via Image Master

VDS (Amersham

Pharmacia Biotech). A 1-kb DNA ladder standard

(Invitrogen) was used as a size marker. A second round

of re-ampliﬁcation was performed using new primers

corresponding to an internal nucleotide sequence of the

PCR products generated in the ﬁrst reaction (Table 1). The

PCR reaction mixture and cycling conditions in this round

of nested-PCR reactions (nPCR) were the same, except

that 2.5 mL of the PCR product from the ﬁrst round was

used as a template.

3.3. Preparation of recombinant M. leprae Gcp

The primers for the gcp gene were constructed to

correspond to the 5

and 3

ends of the open reading frame

previously identiﬁed. The sequences of 5

and 3

primers

were 5

-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT-

TCGAAGGAGATAGAACCATGACGATCTCTGCTG-

TGCCC-3

and 5

-GGGGACCACTTTGTACAAGAAA-

GCTGGGTCTCAATTAATCTGCCTTTT-3

, respectively.

The underlined sequences represent the attB1 and attB2

recombination sites, respectively, incorporated into the

primers for subsequent cloning. The gene was PCR

ampliﬁed from M. leprae genomic DNA with Deep Vent

DNA polymerase. The PCR method was performed as

described above, except for the annealing temperature that

was 551C. PCR products were gel puriﬁed, cloned into the

vector pDONR

201 and subclone d into the vectors

pDEST

17 and pDEST

14 (Gateway Technology-

Invitrogen), both by site-speciﬁc recombination reactions.

Recombinant vectors were transformed into electrocompe-

tent E. coli BL21-AI

Overexpression and puriﬁcation of the M. leprae Gcp

protein were performed according to the QIAexpressionist

manual (QIAGEN). Brieﬂy, E. coli BL21-AI

harboring

the plasmid constructs was grown up to an OD

600

0.8 in

ampicillin-containing Luria–Bertani medium.

L(+)-arabi-

nose was added to a ﬁnal concentration of 0.2% and grown

ARTICLE IN PRESS

Table 1

Sequences of primers used for ampliﬁcation of M. leprae protease-coding genes

Sanger ID

/gene Primer’s Sequences (ﬁrst ampliﬁcation) Primer’s sequences (second ampliﬁcation)

ML0041/mycP1 U5

AGTAGAATTCGTGCACCGTATCTTG3

TTCATCGAGCGGCTTATTTGC 3

ACGTACTCGAGCTGGATTCCTCA3

GCAAATAAGCCGCTCGATGAA 3

ML0176/htrA2 U5

GTTGGAATTCATGATTCCGCCCGGT3

CCCCGATTACGATGGGCTCT 3

ACAACTCGAGCTCTCGATTATTAAT3

AGAGCCCATCGTAATCGGGG 3

ML2659/htrA4 U5

AGATGAATTCATGAGCAGACAACCC3

TCCACCCTGGCCGCCCGTGTT 3

GGCCCTCGAGACTATCCGACCGGATG3

AACACGGGCGGCCAGGGTGGA 3

ML0379/gcp U5

GGGACTGCAGATGACGATCTCTGCT3

GCAGGTGCGTTCACTTGGG 3

CCTGCTCGAGGGCGTCTCTAGCTCA3

CCCAAGTGAACGCACCTGC 3

ML0235/clpCU5

GTAAGAATTCATGTTCGAAAGATTT3’

CGTTCTCGAGGCTGGATGGCTTGGC3’

The Sanger ID refers to (http://www.sanger.ac.uk/Projects/M_leprae).

M.L. Ribeiro-Guimara˜es et al. / Microbial Pathogenesis ] (]]]]) ]]]–]]]4

Please cite this article as: Ribeiro-Guimara

es ML, et al. Expression analysis of proteases of Mycobacterium leprae in human skin lesions. Microb

Pathog (2007), doi:10.1016/j.micpath.2007.05.011

at 37 1C for another 3 h. Cells were harvested and store d at

À80 1C. For puriﬁcation, cells were resuspended in 8 M

urea, 0.1 M Na-phosphate, 0.01 M Tris/HCl, pH 8.0

(buffer B) and stirred for 1 h at room temperature for

disruption. Debris were removed by centrifugation at

10,000 Â g for 15 min at 4 1C and the supernatant was

loaded onto a 4 mL Ni-NTA column pre-equilibrated in

buffer B. Unbound proteins were removed by washing the

column with two column volumes of buffer B, followed by

four column volumes of 8 M urea, 0.1 M Na-phosphate,

0.01 M Tris/HCl, pH 6.3 (buffer C). The recombinant

protein was eluted with three column volumes of 8 M urea,

0.1 M Na-phosphate, 0.01 M Tris/HCl, pH 5.9 (buffer D),

followed by three column volumes of 8 M urea, 0.1 M Na-

phosphate, 0.01 M Tris/HCl, pH 4.5 (buffer E). Purity of

the fractions was checked by SDS-PAGE and western

blotting. The purest fractions were pooled and dialyzed

against 0.1 M Na-phosphate, 0.01 M Tris/HCl, pH 8.0 at

4 1C to remove urea. The aggregated protein was cen-

trifuged at 3200 Â g for 10 min at 4 1C, and the pellet was

resuspended with PBS (10 mM phosphate buffer, pH 7.2,

0.15 M NaCl). Protein concentration was measured with

the BCA

Protein Assay Reagents (Pierce Chemical

Company, Rockford, IL, USA) using BSA as standard.

3.4. Production of anti-Gcp antibodies

To prepare speciﬁc antibodies to Gcp, ﬁve male Balb/c

mice were injected subcutaneously in the abdomen with

10–50 mg of rGcp in an emulsion with incomplete Freund’s

adjuvant (0.2 mL per mouse). Three additional injections

were performed in each animal with 15–30 interval days

between each one. Fifteen days after the last immunization,

the sera wer e examined for antibodies to Gcp by dot blot.

The mice were boosted again and bled after 10 days.

Antibody speciﬁcity was monitored by western blo t with

total lisates of recombinant E. coli BL21-AI

induced or

uninduced with 0.2%

L(+)-arabinose.

3.5. SDS-PAGE and immunoblotting analysis

Proteins were fractionated on SDS-polyacrylamide gel

electrophoresis [19] and transferred to nitrocellulose as

described [20]. The membranes were blocked with 2% BSA

in Tris-buffered saline containing Tween 20 (TBS/T)

(10 mM Tris–HCl pH 8.0, 0.15 M NaCl, 0.05% Tween

20). Membranes were incubated with the anti-rGcp serum

(1:1000). The membranes were then washed three times

with TBS/T and incubated with appropriate alkaline

phosphate-conjugated secondary antibodies. The sub-

strates nitro blue tetrazolium and 5-bromo-4-chloro-3-

indolyl phosphate were used for color development.

3.6. Immunohistochemistry

Cutaneous biopsies from three borderline-lepromatous

(BL) patients, presenting nodular lesions with baciloscopic

logarithmic index from 2.7 to 4.7, and from one borderline-

tuberculoid patient were selected for this study. In

addition, one biopsy from a patient with non-diagnosed

cutaneous diseas e, but whose biopsy had a normal

histological appearance was collected as a control. The

biopsies were conducted at the Souza Arau´ jo Outlet Unit,

Oswaldo Cruz Foundation, Rio de Janeiro, Brazil. The

skin biopsies were obtained and processed as described

previously [18] . The primary antibody was the anti-rGcp

polyclonal antibody (1:50 diluted) obtained from mice

immunized with M. leprae rGcp as described above. On the

negative control slides, the primary antibody was replaced

with nor mal mouse serum.

Acknowledgments

We are most grateful to the Fundac- a

o Carlos Chagas

Filho de Amparo a

Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro

(FAPERJ) for supporting this study. M.L.R.G. and J.J.A.

received fellowships from the Conselho Nacional de

Desenvolvimento Cientı

ﬁco e Tecnolo

gico (CNPq) and

Coordenac- a

o de Aperfeic- oamento de Pessoal de Nı

vel

Superior (CAPES), respectively. We would also like to

thank Judy Grevan for editing the text and Antonio Jose

da Silva Gonc- alves for technical support.

References

[1] Maeda H, Yamammoto T. Pathogenic mechanisms induced by

microbial proteases in microbial infections. Biol Chem Hoppe Seyler

1996;377:217–26.

[2] Travis J, Potempa J, Maeda H. Are bacterial proteinases pathogenic

factors? Trends Microbiol 1995;3:405–7.

[3] Brown GD, Dave JA, Gey van Pittius NC, Stevens L, Ehlers MRW,

Beyers AD. The mycosins of Mycobacterium tuberculosis H37Rv: a

family of subtilisin-like serine proteases. Gene 2000;254:147–55.

[4] Cole ST, Eiglmeier K, Parkhill J, James KD, Thomson NR, Wheeler

PR. Massive gene decay in the leprosy bacillus. Nature 2001;409:

1007–11.

[5] Eiglmeier K, Parkhill J, Honore

N, et al. The decaying genome of

Mycobacterium leprae. Lepr Rev 2001;72:387–98.

[6] Ribeiro-Guimara

es ML, Pessolani MCV. Comparative genomics of

mycobacterial proteases. Microb Pathog (2007), doi:10.1016/j.

micpath.2007.05.010.

[7] Abdullah KM, Udoh EA, Shewen PE, Mellors A. A neutral

glycoprotease of Pasteurella haemolytica Al speciﬁcally cleaves

O-sialoglycoproteins. Infect Immun 1992;60:56–62.

[8] Misra N, Habib S, Ranjan A, Hasnain SE, Nath I. Expression and

functional characterisation of the clpC gene of Mycobacterium leprae:

ClpC protein elicits human response antibody response. Gene

1996;172:99–104.

[9] Williams DL, Torrero M, Wheeler PR, Truman RW, Yoder M,

Morrison N, et al. Biological implications of Mycobacterium leprae

gene expression during infection. J Mol Microbiol Biotechnol

2004;8:58–72.

[10] Skjot RL, Oettinger T, Rosenkrands I, Ravn P, Brock I, Jacobsen S,

et al. Comparative evaluation of low-molecular-mass proteins from

Mycobacterium tuberculosis identiﬁes members of the ESAT-6 family

as immunodominant T-cell antigens. Infect Immun 2000;68:214–20.

[11] Converse SE, Cox JS. A protein secretion pathway critical for

Mycobacterium tuberculosis virulence is conserved and functional in

Mycobacterium smegmatis. J Bacteriol 2005;187:1238–45.

ARTICLE IN PRESS

M.L. Ribeiro-Guimara˜es et al. / Microbial Pathogenesis ] (]]]]) ]]]–]]] 5

Please cite this article as: Ribeiro-Guimara

es ML, et al. Expression analysis of proteases of Mycobacterium leprae in human skin lesions. Microb

Pathog (2007), doi:10.1016/j.micpath.2007.05.011

[12] Brodin P, Majlessi L, Marsollier L, de Jonge MI, Bottai D, Demangel

C, et al. Dissection of ESAT-6 system 1 of Mycobacterium

tuberculosis and impact on immunogenicity and virulence. Infect

Immun 2006;74:88–98.

[13] Geluk A, van Meijgaarden KE, Franken KLMC, Wieles B, Arend

SM, Faber WR, et al. Immunological crossreactivity of the

Mycobacterium leprae CFP-10 with its homologue in Mycobacterium

tuberculosis. Scand J Immunol 2004;59:66–70.

[14] Sko

rko-Glonek J, Lipinska B, Krzewski K, Zolese G, Bertoli E, Tanfani

F. HtrA heat shock protease interacts with phospholipid membranes

and undergoes conformational changes. J Biol Chem 1997;272:8974–82.

[15] Flannagan RS, Aubert D, Kooi C, Sokol PA, Valvanoi MA.

Burkholderia cenocepacia requires a periplasmic HtrA protease for

growth under thermal and osmotic stress and for survival in vivo.

Infect Immun 2007;75:1679–89.

[16] Brandt L, Skeiky YAW, Alderson MR, Lobet Y, Dalemans W,

Turner OC, et al. The protective effect of the Mycobacterium

bovis BCG vaccine is increased by coadministration with the

Mycobacterium tuberculosis 72-kilodalton fusion polyprotein Mtb72F

in M. tuberculosis-infected Guinea Pigs. Infect Immun 2004;72:

6622–32.

[17] Jiang P, Mellors A. Membrane protein proteolysis assayed by

ﬂuorescence quenching: assay of O-sialoglycoprotein endopeptidase.

Anal Biochem 1998;259:8–15.

[18] Lima CS, Zulianello L, Marques MA, Kim H, Portugal MI, Antunes

SL, et al. Mapping the laminin-binding and adhesive domain of the

cell surface-associated Hlp/LBP protein from Mycobacterium leprae.

Microbes Infect 2005;7:1097–109.

[19] Laemmli UK. Cleavage of structural proteins during the assembly of

the head of bacteriophage T4. Nature 1970;227:680–5.

[20] Towbin H, Staehelin T, Gordon J. Electrophoretic transfer of

proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: proce-

dure and some applications. Proc Natl Acad Sci USA 1979;76:

4350–4.

ARTICLE IN PRESS

M.L. Ribeiro-Guimara˜es et al. / Microbial Pathogenesis ] (]]]]) ]]]–]]]6

Please cite this article as: Ribeiro-Guimara

es ML, et al. Expression analysis of proteases of Mycobacterium leprae in human skin lesions. Microb

Pathog (2007), doi:10.1016/j.micpath.2007.05.011

----- Original Message -----

From: "BBA - Proteins and Proteomics (ELS)"

<bbapro@elsevier.com>

To: <cpess[email protected]ocruz.br>

Sent: Friday, August 10, 2007 2:20 PM

Subject: BBA - Proteins and Proteomics Submission:

Manuscript Number

Assigned:BBAPRO-07-307

> Manuscript No.: BBAPRO-07-307

> Title: Cloning, expression, and characterization of an HtrA-like serine

> protease produced in vivo by Mycobacterium leprae

> Corresponding Author: Dr. Maria Cristina Vidal Pessolani

> All Authors: Michelle L Ribeiro-Guimarães, Ph.D.; Eliana B Marengo,

Ms.C; Antonio J Tempone, Ph.D.; Julio J Amaral, Ms.C; Clécio F Klitzke,

Ph.D.; Erika K Xavier da Silveira, Ph.D.; Fernanda V Portaro, Ph.D.; Maria

Cristina Vidal Pessolani, Ph.D.

> Dear Dr. Pessolani,

> Your submission, referenced above, has been assigned the

following

> manuscript number: BBAPRO-07-307

> You will be able to check on the progress of your paper

by logging on to

> the Elsevier Editorial System as an author:

> http://ees.elsevier.com/bbapro/

> On behalf of the Editors, we thank you for submitting

your work to BBA -

> Proteins and Proteomics.

> Sincerely,

> Rachel Carpenter

> Journal Manager

> BBA - Proteins and Proteomics

> Click here to sign-up for the next issue of the BBA

Newsletter

http://www.processrequest.com/quickstart/LeadCapture/Display_LeadCapture.as

p?e=XbcbcgceBI-RaA&oid=UdfhiCD

(OVHYLHU(GLWRULDO6\VWHPWPIRU%%$3URWHLQVDQG3URWHRPLFV

0DQXVFULSW'UDIW

0DQXVFULSW1XPEHU

7LWOH&ORQLQJH[SUHVVLRQDQGFKDUDFWHUL]DWLRQRIDQ+WU$OLNHVHULQHSURWHDVHSURGXFHGLQYLYRE\

0\FREDFWHULXPOHSUDH 

$UWLFOH7\SH5HJXODU3DSHU

6HFWLRQ&DWHJRU\

.H\ZRUGV0\FREDFWHULXPOHSUDH+WU$SURWHDVHHQ]\PDWLFDFWLYLW\)5(7SHSWLGHVSDWKRJHQHVLV

&RUUHVSRQGLQJ$XWKRU'U0DULD&ULVWLQD9LGDO3HVVRODQL3K'

&RUUHVSRQGLQJ$XWKRUV,QVWLWXWLRQ2VZDOGR&UX])RXQGDWLRQ),2&58=

)LUVW$XWKRU0DULD&ULVWLQD9LGDO3HVVRODQL3K'

2UGHURI$XWKRUV0DULD&ULVWLQD9LGDO3HVVRODQL3K'0LFKHOOH/5LEHLUR*XLPDU¥HV3K'(OLDQD%

0DUHQJR0V&$QWRQLR-7HPSRQH3K'-XOLR-$PDUDO0V&&O«FLR).OLW]NH3K'(ULND.;DYLHUGD

6LOYHLUD3K')HUQDQGD93RUWDUR3K'

0DQXVFULSW5HJLRQRI2ULJLQ

$EVWUDFW:KLOHPHPEHUVRIWKHKLJKWHPSHUDWXUHUHTXLUHPHQW$+WU$IDPLO\RIFKDSHURQHSURWHDVHVKDYH

EHHQVKRZQWRSOD\DUROHLQEDFWHULDOSDWKRJHQHVLVWKHLUP\FREDFWHULDOFRXQWHUSDUWVKDYHQRW\HWEHHQ

VWXGLHG,QDUHFHQWUHSRUWZHGHPRQVWUDWHGWKDWWKHJHQH0/FRGLQJIRUDSUHGLFWHG+WU$OLNH

SURWHDVHLVWUDQVFULEHGE\0\FREDFWHULXPOHSUDHLQKXPDQOHSURV\OHVLRQV,QWKHSUHVHQWVWXG\WKH

UHFRPELQDQW0/SURWHLQZDVSURGXFHGDQGLWVHQ]\PDWLFSURSHUWLHVLQYHVWLJDWHG0OHSUDH

UHFRPELQDQW0/ZDVDEOHWRK\GURO\]HDYDULHW\RIV\QWKHWLFDQGQDWXUDOSHSWLGHV6LPLODUO\WRRWKHU

+WU$SURWHLQVWKLVHQ]\PHGLVSOD\HGPD[LPXPSURWHRO\WLFDFWLYLW\DWWHPSHUDWXUHVDERYH  &DQGZDV

FRPSOHWHO\LQDFWLYDWHGE\DSURWLQLQDSURWHDVHLQKLELWRUZLWKDKLJKVHOHFWLYLW\IRUVHULQHSURWHDVHV)LQDOO\

DQDO\VLVRI0OHSUDH0/VSHFLILFLW\VXJJHVWHGDFOHDYDJHSUHIHUHQFHDIWHUEDVLFUHVLGXHVGLIIHULQJLQ

WKLVDVSHFWIURP(VFKHULFKLDFROL'HJ3DQG'HJ6KRPRORJVZKRVHNQRZQVSHFLILFLW\LVGLUHFWHGWRZDUGWKH

DPLQRVLGHRIK\GURSKRELFUHVLGXHV,QVXPPDU\RXUGDWDGHPRQVWUDWHGWKDW0OHSUDHSURGXFHVDQ+WU$

OLNHSURWHDVHGXULQJWKHFRXUVHRIOHSURV\ZLWKDQDSSDUHQWO\GLVWLQFWVXEVWUDWHVSHFLILFLW\WKDQ(FROL+WU$

HQ]\PHV

August 10, 2007

Executive Editors:

P.F. Cook, A. Fink, F. Lottspeich

Biochimica et Biophysica Acta

Proteins and Proteomic Section

Dear Editors,

I would like to submit the enclosed manuscript “

Cloning, expression, and

characterization of an HtrA-like serine protease produced in vivo by Mycobacterium

leprae

” by Ribeiro-Guimarães et al. for publication at Biochimica et Biophysica Acta as a regular

paper. This study describes for the first time the characterization of a well conserved HtrA serine

protease from Mycobacteria. This class of proteases

has been shown to be essential for

virulence and survival under environmental stress in a wide range of bacterial species. In a

previous study we were able to demonstrate that this protease is expressed by M. leprae in

human leprosy lesions, reinforcing its potential role in pathogenesis. Our data contribute to

the identification of new targets for the development of novel strategies for controlling the

dissemination of both leprosy and tuberculosis.

For correspondence, please contact:

Maria Cristina Vidal Pessolani (Fax: 55-21-2270-9997; Tel.: 55-21-2598-4467; e-

mail: [email protected]).

Laboratory of Cellular Microbiology

Oswaldo Cruz Institute

Oswaldo Cruz Foundation – FIOCRUZ

Av. Brasil 4365 – Manguinhos

Rio de Janeiro, RJ

Brazil 21040-900

As to the choice of the referees, please we would like to ask you to forward this study to the

following experts:

Dr. Vincent Dive

Comissariat à l´Energie Atomique, Departement d’Ingenierie et d’Estudes des Proteines,

DSV,

Ministério da Saude

Fundação Oswaldo Cruz - FIOCRUZ

Lab de Microbiologia Celular

Av. Brasil, 4365 – Manguinhos

21.045-900 Rio de Janeiro, RJ

Cover Letter

Saclay, Gif-sur-Yvette, France, phone: (33) 1 69083585, fax: (33) 1 69089071,

e-mail address:

[email protected];

Dr. László Polgár

Institute of Enzymology, Biological Research Center, Hungarian Academy of Sciences,

H-1518 Budapest 112, P.O. Box 7, Hungary

E-mail address:

[email protected].

Dr. Richard Slyden

Rocky Mountain Regional Center of Excellence and Department of Microbiology,

Immunology and Pathology, Colorado State University, Fort Collins, CO 80523-1682, and

Department of Chemistry, SUNY Stony Brook, Stony Brook, NY 11794-3400

E-mail address:

[email protected]

Dr. Diana Williams

Molecular Biology Research Department, Laboratory Research Branch, National Hansen's

Disease Programs at LSU-SVM, Rm. 3517W, Skip Bertman Drive, Baton Rouge, LA

70803, USA.

E-mail address:

[email protected]

Yours Sincerely,

Maria Cristina Vidal Pessolani, Ph.D.

Cloning, expression, and characterization of an HtrA-like serine protease produced in

vivo by Mycobacterium leprae

Michelle Lopes Ribeiro-Guimarães

1,2

, Eliana Blini Marengo

, Antonio Jorge Tempone

, Julio

Jablonski Amaral

1,2

, Clécio F. Klitzke

, Erika K. Xavier da Silveira

, Fernanda Calheta Vieira

Portaro

, and Maria Cristina Vidal Pessolani

Laboratory of Cellular Microbiology, Instituto Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, RJ 21040-900,

Brazil;

Instituto de Bioquímica Médica, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de

Janeiro, RJ 21941-590, Brazil;

Laboratory of Immunochemistry and LETA (Center for

Applied Toxinology Program), Butantan Institute, São Paulo, SP 05503-900, Brazil.

Corresponding author:

Maria Cristina Vidal Pessolani (Fax: 55-21-2270-9997; Tel.: 55-21-2598-4467; e-

mail: [email protected]).

Laboratory of Cellular Microbiology

Oswaldo Cruz Institute

Oswaldo Cruz Foundation – FIOCRUZ

Av. Brasil 4365 – Manguinhos

Rio de Janeiro, RJ

Brazil 21040-900

* Manuscript

Abstract1

While members of the high temperature requirement A (HtrA) family of chaperone 4

proteases have been shown to play a role in bacterial pathogenesis, their mycobacterial 5

counterparts have not yet been studied. In a recent report, we demonstrated that the gene 6

ML0176 coding for a predicted HtrA-like protease is transcribed by Mycobacterium leprae in 7

human leprosy lesions. In the present study, the recombinant ML0176 protein was produced 8

and its enzymatic properties investigated.

M. leprae recombinant ML0176 was able to 9

hydrolyze a variety of synthetic and natural peptides. Similarly to other HtrA proteins, this 10

enzyme displayed maximum proteolytic activity at temperatures above 40qC, and was 11

completely inactivated by aprotinin, a protease inhibitor with a high selectivity for serine 12

proteases. Finally, analysis of M. leprae ML0176 specificity suggested a cleavage preference 13

after basic residues, differing in this aspect from Escherichia coli DegP and DegS homologs 14

whose known specificity is directed toward the amino side of hydrophobic residues. In 15

summary, our data demonstrated that M. leprae produces an HtrA-like protease during the 16

course of leprosy with an apparently distinct substrate specificity than

E. coli HtrA enzymes.17

Keywords: Mycobacterium leprae; HtrA2; protease; enzymatic activity; FRET peptides;21

pathogenesis.22

1. Introduction1

Infections caused by species of the genus

Mycobacterium continue to adversely affect 4

the lives of millions worldwide. Leprosy, caused by Mycobacterium leprae, remains a public 5

health problem in several developing countries, including Brazil, and is responsible for the 6

legacy of countless numbers of people with permanent physical deformities 7

(http://www.wpro.who.int/sites/leprosy). On the other hand, tuberculosis, caused by 8

Mycobacterium tuberculosis, is responsible for 2–3 million annual deaths 9

(http:///www.who.int/tb/en). Furthermore, infections in immunocompromised individuals 10

caused by opportunistic mycobacterial species such as M. avium and M. intracellulare11

belonging to the M. avium complex have gained additional epidemiological importance since 12

the emergence of AIDS [1]. Deciphering the mechanisms implicated in mycobacterial 13

pathogenesis is currently a major challenge in leprosy and tuberculosis research that 14

eventually may lead to the development of new prophylactic and/or therapeutic strategies. 15

The envelope-associated serine proteases of the HtrA family are an important, highly 16

conserved class of proteases in bacteria. HtrA proteins perform crucial functions involving 17

protein quality control in the periplasmic space, functioning as both molecular chaperones and 18

proteases [2]. It has been shown that, within a wide range of bacterial species, HtrA proteases 19

are essential for virulence and survival under environmental stress. In fact, mutations in the 20

htrA gene have been seen to affect bacterial tolerance to both thermal and environmental 21

stress, in addition to loss of virulence such as is found in Salmonella typhimurium, 22

Streptococcus pyogenes, Listeria monocytogenes and Burkhoderia cenocepacia [3-12]. 23

However, to date, their mycobacterial counterparts have not yet been characterized. 24

Biochemical analysis of the three HtrA proteins found in Escherichia coli - DegP, DegQ, and 25

DegS - has provided insights into their function and regulation [2]. In contrast to other 1

bacterial quality control proteases, HtrA protein activity is not regulated by ATP while these 2

proteins exhibit a temperature switch mechanism responsible for changing their molecular 3

chaperon function to a protease [13].4

A recent comparison of the protease-coding genes present in the genomes of M. 5

leprae, M. tuberculosis, Mycobacterium bovis, and Mycobacterium paratuberculosis revealed 6

that three well-conserved putative HtrA-like genes are shared by all four species [14]. 7

Moreover, two of these genes, ML0176 and ML2659, coding for probable

htrA2 and htrA4, 8

respectively, have been found to be transcribed by M. leprae isolated from the skin biopsies of 9

multibacillary leprosy patients [15]. The availability of the M. leprae genome sequence 10

provides an opportunity to study the enzymes of this microorganism, which are inaccessible 11

to direct study. For the first time, the present study demonstrated that the recombinant M.12

leprae ML0176 exhibited proteolytic activity toward synthetic and naturally-occurring 13

peptides, revealing physicochemical properties of a typical HtrA-like protease.14

2. Materials and Methods1

Materials4

The fluorescence resonance energy transfer (FRET) peptides used in the present study 6

(Table 1) were synthesized and purified, as described elsewhere [16]. The purity and the 7

molecular masses of these peptides were determined by HPLC and by MALDI-TOF mass 8

spectrometry (TofSpec-E, Micromass, UK), respectively. N

D-RR-methylcoumarin (MCA), 9

dynorphin A, neurotensin 1-13, bradikinin and angiotensin I peptides and the protease 10

inhibitors phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) and aprotinin were purchased from Sigma 11

Co (St. Luis, MO). Trypsin was purchased from Roche Diagnostics (Indianapolis, IN).12

2.1. Cloning, expression, and purification of rHtrA215

The primers for the

htrA2 gene were constructed to correspond to the 5’ and 3’ ends of 17

the open reading frame previously identified. The sequences of 5’ and 3’ primers were 5`-18

GTTGGAATTC

ATGATTCCGCCCGGT-3` and 5’-ACAACTCGAGCTCTCGATTAT 19

TAAT-3’, respectively. The underlined sequences represent the sites for the restriction 20

enzymes EcorI and XhoI, respectively, incorporated into the primers for subsequent cloning. 21

The gene was PCR amplified from

M. leprae genomic DNA by/with Deep Vent DNA 22

polymerase. The touchdown PCR method was used in a PTC-100

(MJ Research, Inc.) at 23

an annealing temperature of 58

C. The PCR product was gel purified and digested with 24

EcoRI and XhoI followed by cloning into pET32a-c (+) (Novagen, San Diego, CA) previously 25

digested with the same enzymes. Overexpression and purification of the M. leprae HtrA2 1

protein were performed according to The QIAexpressionist manual (QIAGEN, Valencia, 2

CA). Briefly,

E. coli BL21-AI

harboring the recombinant plasmid was grown up to an 3

600

0.8 in ampicillin-containing Luria-Bertani medium. Expression of rHtrA2 was then 4

induced by addition of 1 mM IPTG; and cultures were incubated at 37

C for another 3 h. 5

Cells were harvested, ressuspended in lysis buffer (100 mM NaH

, 10 mM Tris

Cl pH 6

8.0), and disrupted by sonication. Debris was removed by centrifugation at 10,000xg for 15 7

min at 4

C and rHtrA2 was purified from the supernatant by adding 1 mL of a 50% Ni-NTA 8

slurry (QIAGEN,) pre-equilibrated in lysis buffer to 4 mL of the lysate. After incubation for 9

1 h at 4

C, the lysate-Ni-NTA mixture was loaded into a column. Unbound proteins were 10

removed by washing the column with 2 column volumes of lysis buffer. The column was 11

washed twice with 4 mL of 100 mM NaH

, 10 mM Tris

Cl, pH 6.3; and the recombinant 12

protein was eluted with 4 column volumes of 100 mM NaH

pH 4.5. Fractions were 13

analyzed by SDS-PAGE and Western Blot. Nitrocellulose membranes were probed with an 14

anti-6xHis tag antibody (New England Biolabs, Ipswich, MA). The purified enzyme was 15

stored in 50% glycerol at -20

C.16

2.2. HPLC analysis of rHtrA219

The fractions eluted from the Ni-NTA matrix enriched in the rHtrA2 were 21

concentrated and at a flow rate of 1.0 mL/min in a Superdex

75 gel filtration column (GE 22

Healthcare Life Science do Brasil, São Paulo, Brazil) pre-equilibrated in 0.05 M sodium 23

phosphate, 0.15 M NaCl, pH 6.8. Protein-containing fractions were analyzed by SDS-PAGE 24

followed by silver staining. Protein concentration was determined according to Bradford [17] 25

using BSA as a standard.1

2.3. Mass spectrometry analysis of recombinant HtrA24

The purified recombinant HtrA2 protein was digested with trypsin. The resulting 6

peptides were applied onto a 0.2 x 50 mm C

capillary reverse phase column (Michrom 7

BioResources, Auburn, CA) and eluted with an increasing acetonitrile gradient using a 8

MicroPro capillary HPLC system (Eldex Laboratories, Napa, CA). The reverse-phase 9

effluent was introduced directly into a Finnigan LCQ electrospray mass spectrometer 10

(Thermoquest, San Jose, CA). The peptides were analyzed by MS or MS/MS followed by a 11

search in the M. leprae database via Xcalibur, Bioworks 3.1 turbo SEQUEST software 12

(ThermoFinnigan, San Jose, CA) under the conditions and parameters previously described 13

[18]. 14

2.4. Enzyme assays of recombinant HtrA217

The hydrolyses of the fluorescent substrates (stock solution in 10 % DMSO) were 19

conducted at 37°C in 50 mM Tris-HCl, pH 8.0, containing 20 mM NaCl. The hydrolysis of 20

the ND-RR-MCA and the FRET substrates were monitored by measuring fluorescence at Oem 21

= 460 nm and Oex = 380 nm and Oem = 420 nm and Oex = 320 nm, respectively, in a Hitachi 22

F-2000 spectrofluorimeter, as previously described [19]. The slope was converted into moles 23

of hydrolyzed substrate per min based on the fluorescence curves of standard peptide 24

solutions before and after total enzymatic hydrolysis with trypsin. The 1 cm path length 25

cuvette containing 1 mL of substrate solution was placed in a thermostatically controlled cell 1

compartment prior to adding the enzyme solution. Enzyme concentrations ranged from 10 to 2

100 nM and FRET substrates, from 1/10 to 10 times the K

value. The increase of 3

fluorescence over time was continuously recorded for 5-15 min. The kinetic parameters were 4

calculated according to Wilkinson [20]. One unit (U) of recombinant HtrA2 activity was 5

defined as the amount of enzyme needed to hydrolyze 1 µmoL of ND-RR-MCA in 1 min. As 6

previously described, the inner-filter effect of the FRET substrates was corrected by an 7

empirical equation [19]. 8

2.5. HPLC analysis of peptides hydrolyzed by rHtrA2 11

The peptide solutions (50 µM) in 50 mM Tris-HCl, pH 8.0, containing 20 mM NaCl13

were incubated with rHtrA2 (10 nM) at 37°C for 4 hours. Samples (100 µL) were 14

periodically withdrawn for HPLC analysis. The hydrolysis products were fractionated by 15

reverse-phase HPLC (Class VP, Shimadzu), manually collected, and submitted to mass 16

spectrometry analysis. The HPLC conditions used for the analytical procedure were: 0.1% 17

trifluoroacetic acid in water (solvent A) and acetonitrile-solvent A (9:1) as solvent B. The 18

separations were performed at a flow rate of 1 mL/min using a J.T. Baker C

column (4.6 x 19

300 mm) and a 10-80% gradient of B for 30 min. Fractions were monitored for the presence 20

of peptides fragments using an SPD-10AV Shimadzu uv/vis detector (214 nm) and a RF-21

10Ax fluorescence detector (O

= 420 nm and O

= 320 nm). 22

2.6. Mass spectrometry analysis of peptides substrates hydrolyzed by rHtrA225

The peptide fragments were detected by scanning from a m/z 50 to 2000 at 6s/scan 2

with a 31V cone. Product-ions from the MS/MS experiments were detected during several 3

scannings through the appropriated mass range for each situation, using high energy (25 eV) 4

for single-charged and low-collision energy (15 eV) for multiple-charged precursor ions. No 5

tandem MS was recorded for peptides smaller than four amino acid residues. The scissile 6

bonds were deduced from the amino acid compositions of the fragments. 7

2.7. Effect of pH, temperature, and inhibitors on peptidase activity10

The pH studies were performed in 50 mM sodium citrate buffer (pH 3.0 - 5.3), 50 mM 12

sodium phosphate buffer (pH 5.2 - 7.5), and 50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.3 - 10) containing 13

20 mM NaCl. The stock solutions and the work concentration of the synthetic inhibitors used 14

in the characterization of the HtrA2 proteolytic activity were done as previously described15

[21]. The pH, temperature effects, and inhibition studies were determined by fluorometric 16

assay using the peptide N

D-RR-MCA (10 PM) as a substrate. The temperature range used 17

was 28 to 60 qC, and the enzymatic reactions were performed in 50 mM phosphate buffer, pH 18

8.0 19

3. Results and Discussion1

3.1 Cloning, expression, and purification of M. leprae HtrA24

The gene coding for a putative HtrA2 protease was amplified from M. leprae genomic 6

DNA and successfully cloned into pET32. E. coli BL21 harboring the recombinant vector 7

was grown in an LB medium containing ampicilin and induced by IPTG. The soluble hexa-8

histidine-tagged fusion protein was purified in one step by immobilized, metal-affinity 9

chromatography (IMAC) from cell lysates using the Ni-NTA resin. A single band 10

corresponding to the recombinant HtrA2 protein with the expected Mw 52.3 kDa was 11

observed in a silver stained SDS-PAGE (Figure 1A). The purified protein was also 12

transferred to a nitrocellulose membrane and recognized by the anti-6xHis tag antibody 13

(Figure 1A). A high degree of purity of the recombinant ML0176 was ensured by loading the 14

protein onto a Superdex 75 gel filtration column. The elution profile shown in Figure 1B 15

revealed a single homogeneous pick corresponding to the enzyme, as confirmed by SDS-16

PAGE followed by trypsin digestion and MS/MS analysis. The following peptides, all 17

matching the predicted amino acid sequence of

M. leprae ML0176, were sequenced: 18

KVVPSVVMLETDLGRQ

132

KTTVTFFDGRT

140

, 19

141

RTASFTVVGADPTSDIAVVRV

159

160

RVQSISGLPPITMGSSADLLRV

178

, 20

339

RLISSADALVAAVRS

351

and

359

KVSLTYQDQSGSSRT

371

. 21

3.2 Primary sequence analysis of M. leprae rHtrA224

Members of the HtrA family share a conserved trypsin-like protease domain and at 1

least one C-terminal PDZ domain, which mediates specific protein-protein interactions, is 2

involved in substrate recognition [22]. Figure 2 shows the amino-acid sequence alignment of 3

HtrA2 from M. leprae, HtrA2 from M. tuberculosis H37Rv, and DegS from E. coli. HtrA2 4

from M. leprae shares a 70% identity with the HtrA2 of M. tuberculosis H37Rv and a 26 % 5

identity with E. coli Deg S. This alignment indicates the conservation of a putative catalytic 6

triad in mycobacterial HtrA2 consisting of the amino acid residues His182, Asp224, and 7

Ser305 and a consensus of the PDZ domain at the C-terminal region. 8

3.3. Analysis of cleavage specificity and kinetic parameters11

HtrA proteins belong to the PA clan of proteases composed of serine proteases that 13

display three main types of activity: trypsin-like (the cleavage of the amide bond occurs 14

subsequent to Arg or Lys at P1); chymotrypsin-like (cleavage occurs following one of the 15

hydrophobic amino acids at P1; and elastase-like (cleavage following an Ala at P1). A variety 16

of substrates, including synthetic and natural peptides, were then tested for cleavage by the 17

recombinant ML0176 protein.18

A collection of twelve synthetic fluorescence resonance energy transfer (FRET) 19

peptides of seven amino acid residues derived from the bradykinin sequence was used as 20

substrates. These peptides also conveniently determine kinetic parameters since the 21

hydrolysis of any peptide bond of the FRET substrates can be easily monitored [16]. Table 1 22

displays the K

, k

cat

, and k

cat

/ K

values that were determined for the hydrolysis of the FRET 23

substrates by M. leprae rHtrA2. All cleaved peptides were hydrolyzed at the R-Q bond, 24

indicating an enzymatic preference for cleavage after Arg residues. Catalytic efficiency (k

cat

/ 25

) varied from no hydrolysis of the FRET-2 peptide to 19.90 (s

mM)

-1

of the FRET-1 1

peptide. Three series of peptides, with Arg in P1 and sequence variations in P2, P3, and P4, 2

respectively, were tested to confirm the preference of

M. leprae HtrA2 for cleavage after Arg3

residues and to obtain information about the P2-P4 subsites. Among the FRET- 1 to - 6 4

peptides with variable amino acid residues at the P2 position, the best substrate was FRET- 1, 5

showing an Arg residue in this position. In contrast, the presence of Asp at position P

(FRET-2) resulted in a total absence of interaction between the enzyme and the substrate. 7

The FRET-7 to -9 peptides revealed that rHtrA from

M. leprae preferred amino acid residues 8

with an aliphatic chain like Ile or Leu instead of Phe at P3. Among the FRET-10 to -15 9

peptides with amino acid residue changes at P4, the best substrate was FRET-12 with an Arg10

residue at this position. In summary, all peptides were hydrolyzed at the R-Q bond although 11

FRET-1 and FRET-12 presented Arg residues in more than one position. These results 12

suggested that M. leprae HtrA2 possesses a different substrate specificity than E. coli DegP 13

and DegS. Indeed, these enzymes display a cleavage preference after hydrophobic residues 14

[22]. Moreover, the activity of HtrA family members has been predicted to depend solely on 15

what is present in the P1 position [13, 22]. However, the effect of changes in the amino acids 16

at the P2, P3, and P4 positions on HtrA cleavage efficiency suggested that the M. leprae17

enzyme recognized the substrate not only via P1-S1 interaction but within an extended 18

binding site for interaction with the substrate. The differences found between the specificity 19

for the M. leprae HtrA2 and its homologues to substrate specificity are probably related with 20

the primary dissimilar sequences close to the active site.21

Five naturally-occurring peptides of various sizes and amino acid sequences were also 22

tested for cleavage by the enzyme. Hydrolysis was monitored by HPLC and the results are 23

summarized in Table 2. Among the substrates utilized in the present study, the most 24

susceptible was neurotensin1-13, which presented one minor (R8Ļ5) and two major 25

cleavage sites (Y3Ļ( and Y11Ļ,). When dynorphin was the substrate, rHtrA2 showed a 1

preference for hydrolysis involving basic amino acid residues in a P

position (R6Ļ5DQG2

Ļ,. M. leprae rHtrA2 failed to hydrolyze oxytocin, angiotensin I, and bradykinin, 3

although the sequences of the last two peptides contain basic residues. This enzymatic profile 4

suggested that the specificity of the recombinant M. leprae HtrA2 displays a narrow 5

selectivity for its substrates in view of the fact that peptides such as oxytocin, angiotensin I, 6

and bradykinin were not significantly hydrolyzed even subsequent to extending incubation 7

times. Moreover, hydrolysis of dynorphin and neurotensin reinforced the notion that M. 8

leprae rHtrA2 has a preference for basic amino acids in the P1 position despite the ability of 9

the enzyme to cleave after Tyr residues. 10

3.4. Physicochemical properties13

Further characterization of M. leprae rHtrA2 was performed by using the fluorescent 15

methylcoumarin (MCA) derivative of arginine (ND-RR-MCA ), which has only one cleavage 16

site at the R-MCA position, as a substrate. Panel A in Figure 3 shows that ND-RR-MCA was 17

efficiently cleaved by M. leprae rHtrA2. 18

To confirm the class of the protease, tests were performed to determine whether the 19

activity of M. leprae rHtrA2 was affected by PMSF and aprotinin, two classical inhibitors of 20

serine peptidases. The proteolytic activity of M. leprae rHtrA2 was markedly reduced by 21

both inhibitors; and, at 4.2 mU, aprotinin was able to completely inactivate the enzyme 22

(Figure 3A). 23

The effect of pH on the catalytic activity of the enzyme was studied at 37

C between 24

pH 4.0 and 10.0. The pH curve displayed maximal activity at pH ranging from 7.5 to 9.0, as 25

shown in Figure 3B. The activity of the enzyme was also investigated at various temperatures 1

from 28

C to 60

C. And as Figure 3C shows, M. leprae rHtrA2 was active at a broad range of 2

temperatures, reaching maximum activity at 45-55

C. This preference for high temperatures 3

is a typical feature of proteases belonging to the HtrA family [23]. Actually, classical HtrA 4

proteases possess a temperature-dependent, functional switch that makes it possible to 5

transform a formerly chaperone activity to one of protease. At low temperatures, these 6

enzymes exhibit the activity of molecular chaperones while their proteolytic activities rapidly 7

increase between 32qC and 42qC [3; 24]. 8

Taken together, our results confirmed that ML0176 codes for a serine protease 9

displaying the physicochemical characteristics typical of an HtrA protein, except for an 10

apparently distinct substrate specificity in comparison to other bacterial HtrA enzymes. The 11

possible role of the proteolytic activity of M. leprae HtrA2 in leprosy disease remains to be 12

studied and is under investigation in our laboratory.13

Acknowledgments 1

We are most grateful to the Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo à Pesquisa do 4

Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ) for supporting this study. M.L.R.G and J.J.A received 5

fellowships from the Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico 6

(CNPq) and the Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), 7

respectively. We would also like to thank Judy Grevan for editing the text and Natalia 8

Pierangeli dos Santos for her technical assistance9

References

[1] J.M. García García, J.J. Palacios Gutierrez, A.A. Sanchez Antunã, Respiratory

infections caused by environmental mycobacteria, Arch Bronconeumol. 41 (2005) 206–

19.

[2] M.J. Pallen, B.W. Wren, The HtrA family of serine proteases, Mol Microbiol. 26 (1997)

209-221.

[3] B Lipinska, O Fayet, L Baird, C Georgopoulos, Identification, characterization, and

mapping of the Escherichia coli htrA gene, whose product is essential for bacterial

growth only at elevated temperatures, J Bacteriol. 171(1989) 1574-84.

[4] G. Cortés, B. Astorza, V.J. Benedí, S. Albertí, Role of the htrA Gene in Klebsiella

pneumoniae

Virulence, Infection and Immunity. 70 (2002) 4772–4776.

[5] K. Williams, P.C.F. Oyston, N. Dorrel, S. Li, R.W. Titball, B.W. Wren, Investigation

into the role of the serine protease HtrA in Yersinia pestis pathogenesis, FEMS

Microbiol Lett. 186 (2000) 281-286.

[6] S. Biswas, I. Biswas, Role of HtrA in Surface Protein Expression and Biofilm

Formation by Streptococcus mutans, Infection and Immunity. 73 (2005) 6923–6934.

[7] R.W. Phillips, P.H. Elzer, G.T. Robertson, S.D. Hagius, J.V. Walker, M.B. Fatemi, F.M.

Enright, F.M. Roop II, A Brucella melitensis high-temperature-requirement A (htrA)

deletion mutant is attenuated in goats and protects against abortion, Research Veterinary

Science. 63 (1997) 165-167.

[8] L. Brøndsted, T. Andersen, M. Parker, K. Jørgensen, H. Ingmer, The HtrA protease of

Campylobacter jejuni is required for heat and oxygen tolerance and for optimal

interaction with human epithelial cells, Applied Environmental Microbiology. 71 (2005)

3205-3212.

[9] E. Mo, S.E. Peters, C. Willers, D.J. Maskell, I.G. Charles, Single, double and triple

mutants of

Salmonella enterica serovar Typhimurium degP (htrA), degQ (hhoA) and

degS (hhoB) have diverse phenotypes on exposure to elevated temperature and their

growth in vivo is attenuated to different extents, Microbial Pathogenesis. 41 (2006) 174-

182.

[10] C.H. Jones, T.C. Bolken, K.F. Jones, G.O. Zeller, D.E. Hruby, Conserved DegP

protease in gram-positive bacteria is essential for thermal and oxidative tolerance and

full virulence in Streptococcus pyogenes, Infection and Immunity. 69 (2001) 5538–

5545.

[11] H.M. Stack, R.D. Sleator, M. Bowers, C. Hill, C.G.M. Gahan, Role for HtrA in stress

induction and virulence potential in Listeria monocytogenes, Applied Environmental

Microbiology. 71 (2005) 4241-4247.

[12] R.S. Flannagan, D. Aubert, C. Kooi, P.A. Sokol, M.A. Valvanoi,

Burkholderia

cenocepacia requires a periplasmic HtrA protease for growth under thermal and osmotic

stress and for survival in vivo, Infection and Immunity. 75 (2004)1679–1689.

[13] D.Y. Kim, K.K. Kim, Structure and function of HtrA family proteins, the key players

in protein quality control, J Biochem Mol Biol. 38 (2005) 266-274.

[14] M.L. Ribeiro-Guimarães, M.C.V. Pessolani, Comparative genomics of mycobacterial

proteases. Microb Pathog (2007), doi:10.1016/j.micpath.2007.05.010

[15] M.L. Ribeiro-Guimarães, A.J. Tempone, J.J. Amaral, J.A. Nery, S.L.G. Antunes,

M.C.V. Pessolani, Expression analysis of proteases of Mycobacterium leprae in human

skin lesions, Microb Pathog (2007), doi:10.1016/j.micpath.2007.05.011

[16] I.Y. Hirata, M.H. Cezari, C.R. Nakaie, P. Boschcov, A.S. Ito, M.A. Juliano, L. Juliano,

Internally quenched fluorogenic protease substrates: Solid-phase synthesis and

fluorescence spectroscopy of peptides containing ortho-aminobenzoyl/dinitrophenyl

groups as donor-acceptor pairs, Lett Pept Sci. 1 (1994) 299-308.

[17] M.M. Bradford, A rapid and sensitive method for the quantification of microgram

quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding, Anal Biochem. 72

(1976) 248-254.

[18] Biet F, Angela de Melo Marques M, Grayon M, Xavier da Silveira EK, Brennan

PJ,Drobecq H, Raze D, Vidal Pessolani MC, Locht C, Menozzi FD, Mycobacterium

smegmatis

produces an HBHA homologue which is not involved in epithelial

adherence, Microbes Infect. 9 (2007) 175-82.

[19] V. Oliveira, M. Campos, R.L. Melo, E.S. Ferro, A.C.M. Camargo, M.A. Juliano, L.

Juliano, Substrate specificity characterization of recombinant metallo oligo-peptidases

thimet oligopeptidase and neurolysin, Biochemistry. 40 (2001) 4417-4425.

[20] Wilkinson, G.R., Statistical estimations in enzyme kinetics, Biochem J. 80 (1961) 324-

32.

[21] B.M. Dunn, H.R.J. Beynon, J.S. Bond, Proteolytic enzymes: a practical approach.

England, Oxford University Press. Ref Type: Serial (Book,Monograph), 1989.

[22] T. Clausen, C. Southan, M. Ehrmann, The HtrA family of proteases: implications for

protein composition and cell fate, Mol Cell. 10 (2002) 443-455.

Figure Legends

Fig. 1.

Purification of M. leprae rHtrA2. (A) SDS-PAGE and Western blot showing the

rHtrA2 (4 µg) obtained after purification by immobilizedmetal-affinity chromatography

(IMAC) on Ni-NTA resin. The gel was stained with silver; and Western blot was

developed with anti-His tag antibody. The positions of molecular size markers are shown

on the left. (B) Elution profile of the purified rHtrA protein from a Superdex G75 gel

filtration column.

Fig. 2. Alignment of the amino acid residues from M. leprae and M. tuberculosis

HtrA2 and E. coli DegS. The signal sequence predicted

(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/

) for HtrA2 of M. leprae is double underlined

(residues 1-36). The domain for the trypsin family (IPR001254) is underlined (residues

102-249). The conserved residues that probably compose the catalytic triad are in bold.

The PDZ domain (IPR001478) is indicated by an open box (residues 287-382).

Fig. 3. Physicochemical properties of M. leprae rHtrA2. (A) - Effect of serine protease

inhibitors on rHtrA2 activity: Assays were carried out in 500 Pl of 50 mM phosphate

buffer, pH 8.0, at 37qC; and enzymatic activities were measured by fluorometric assays

using 5 PM ND-RR-MCA as substrate. One hundred percent represents HtrA2 hydrolysis

of ND-RR-MCA/min in the absence of an inhibitor. Purified rHtrA2 (2 mU) were

incubated in the presence of 1 mM PMSF or 4.2 mU aprotinin under the conditions

described above. n.h.

- no hydrolysis detected. (B) – Effect of pH upon rHtrA2

enzymatic activity: The pH studies were performed at 37qC in 50 mM sodium citrate

buffer (pH 3.0 - 5.3), 50mM sodium phosphate buffer (pH 5.2 - 7.5), and 50 mM Tris-HCl

buffer (pH 7.3 - 10). The enzymatic activity was determined as in (A). (C) - Effect of

temperature on rHtrA2 activity. The experiments were carried out at the stipulated

temperatures using the same buffer and substrate as in A. Enzymatic assays were carried

out under the same conditions seen in Panel A, except for temperature variation. The data

represent the mean of three independent experiments

Table 1 - Kinetic parameters for the degradation of substrates derived from Abz-

GFSPFRQ-EDDnp by rHtrA2

Substrates (Abz-…-EDDnp)

N. P

P’

(PM)

cat

-1

)

cat

/ K

mM)

-1

1 G F S P

3.16 ± 0.43

63.00 ± 3.0 19.90

2 G F S P

R Q

n.h.

n.h. n.h.

3 G F S P

6.96 ± 0.64

4.80 ± 0.30 0.68

4 G F S P

3.40 ± 0.36

9.40 ± 0.50 2.76

5 G F S P

9.48 ± 0.90

27.00 ± 3.00 2.85

6 G F S P

4.58 ± 0.90

4.20 ± 0.30 0.92

7 G F S

F R

2.09 ± 0.20

19.00 ± 1.00 9.13

8 G F S

F R

7.78 ± 0.78

26.00 ± 2.00 3.34

9 G F S

F R

2.04 ± 0.19

6.60 ± 0.50 3.23

10 G F

P F R

5.30 ± 0.41

3.70 ± 0.25 0.70

11 G F

P F R

1.96 ± 0.20

10.00 ± 1.00 5.10

12 G F

P F R

3.18 ± 0.30

31.00 ± 3.00 9.75

13 G F

P F R

6.96 ± 0.64

4.80 ± 0.30 0.69

14 G F

P F R

6.27 ± 0.60

5.20 ± 0.40 0.83

15 G F

P F R

2.83 ± 0.28

2.00 ± 0.15 0.71

Cleavage sites, determined by mass spectrometry analysis, are indicated by Ļ

Assays were

carried out in a 50mM phosphate buffer, pH 8.0, at 37

C. The kinetic parameters were obtained in

the presence of 1/10 to 10 times the K

value of peptide substrate and 10 –100 nM of rHtrA2, with

a substrate consumption of less than 5%. The velocity was recorded for 5 –15 min. and the

parameters were calculated as mean value (

r SD). All enzymatic assays were performed in

triplicate.

Figure

Table 2 - Hydrolysis of bioactive peptides by rHtrA2

Substrate Rates of hydrolysis

(nmol/µg/min)

Peptide sequence

Dynorphin A 112

YGGFLRp

RpIRPKLK

Neurotensin

1-13

ELYp

ENKPRpRPYpIL

Angiotensin I n.h.

DRVYIHPFHL

Bradykinin n.h.

RPPGFSPFR

Oxytocin n.h.

CYIQNCPLG

Cleavage sites, determined by mass spectrometry analysis, are indicated by Ļ$VVD\V

were carried out in 300µL of 50 mM Tris-HCl buffer, pH 8.0, at 42°C, using 50µM of

each peptide and 5 nM of rHtrA2. Control samples were identical, except for the

enzyme that was omitted. After 30 minutes, the reactions were stopped with TFA0.1%

and the hydrolysis rates were determined by comparing the peak areas of control

samples versus digested ones. The peaks were manually collected and submitted to

mass spectrometry analysis to cleavage bond determinations.n.h.

- no hydrolysis

detected; p

, cleavage site.

Figure 1.

HtrA2

A 280 nm

min

94.0

67.0

43.0

30.0

HtrA2

Figure 2

ML|HtrA2 ------------------------------------------------------------

H37Rv|HtrA2 MAKLARVVGLVQEEQPSDMTNHPRYSPPPQQPGTPGYAQGQQQTYSQQFDWRYPPSPPPQ 60

DegS_E.coli ------------------------------------------------------------

ML|HtrA2 -------------------------MIPPGRVADRRPRAGMLAVSALAIAVVSAGIGGVA 35

H37Rv|HtrA2 PTQYRQPYEALGGTRPGLIPGVIPTMTPPPGMVRQRPRAGMLAIGAVTIAVVSAGIGGAA 120

DegS_E.coli -----------MKKTTLALSALALSLGLALSPLSATAAETSSATTAQQMPSLAPMLEKVM 49

: . . * * :. ::. : .

ML|HtrA2 ATVVALGTRVAGGNGAGPVTGPAASVPAANMPSGSVEQVAVKVVPSVVMLETDLGRQSE- 94

H37Rv|HtrA2 ASLVGFNRAPAGPSGGPVAASAAPSIPAANMPPGSVEQVAAKVVPSVVMLETDLGRQSE- 179

DegS_E.coli PSVVSINVEGSTTVNTPRMPRNFQQFFGDDSPFCQEGSPFQSSPFCQGGLGGNGGGQQQK 109

::*.:. : . . .. . : * . . . . * : * *.:

ML|HtrA2 ---EGSGVILSADG-LILTNNHVVAVAAKPGGGPGGGLSPKTTVTFFDGRTASFTVVGAD 150

H37Rv|HtrA2 ---EGSGIILSAEG-LILTNNHVIAAAAKP---PLGSPPPKTTVTFSDGRTAPFTVVGAD 232

DegS_E.coli FMALGSGVIIDADKGYVVTNNHVVDN------------ATVIKVQLSDGRKFDAKMVGKD 157

***:*:.*: ::*****: .. .* : ***. .:** *

ML|HtrA2 PTSDIAVVRVQSISGLTPITMGSSADLRVGQPVVAVGSPLGLAGTVTSGIVSALNRPVST 210

H37Rv|HtrA2 PTSDIAVVRVQGVSGLTPISLGSSSDLRVGQPVLAIGSPLGLEGTVTTGIVSALNRPVST 292

DegS_E.coli PRSDIALIQIQNPKNLTAIKMADSDALRVGDYTVAIGNPFGLGETVTSGIVSALGR---- 213

* ****::::*. ..**.*.:..* ****: .:*:*.*:** ***:******.*

ML|HtrA2 TGESGNQNTVLDAIQTDAAINPGNSGGALVNMGGQLVGVNSAIATLGADSGDAQSGSIGL 270

H37Rv|HtrA2 TGEAGNQNTVLDAIQTDAAINPGNSGGALVNMNAQLVGVNSAIATLGADSADAQSGSIGL 352

DegS_E.coli --SGLNAENYENFIQTDAAINRGNSGGALVNLNGELIGINTAILAP-------DGGNIGI 264

.. * :. : ******** *********:..:*:*:

*:** : :.*.**:

ML|HtrA2 GFAIPVDQAKRIADELISTGKATHASLGVQVATD----------KGTPGAKVMDVVAGGA 320

H37Rv|HtrA2 GFAIPVDQAKRIADELISTGKASHASLGVQVTND----------KDTLGAKIVEVVAGGA 402

DegS_E.coli GFAIPSNMVKNLTSQMVEYGQVKRGELGIMGTELNSDLAKAMKVDAQRGAFVSQVLPNSS 324

***** : .*.::.:::. *:..:..**: : . ** : :*:...:

ML|HtrA2 AANAAVPKGVVLTKVDDRLISSADALVAAVRSKAPGDKVSLTYQDQSGSSRTVQVTLGKA 380

H37Rv|HtrA2 AANAGVPKGVVVTKVDDRPINSADALVAAVRSKAPGATVALTFQDPSGGSRTVQVTLGKA 462

DegS_E.coli AAKAGIKAGDVITSLNGKPISSFAALRAQVGTMPVGSKLTLGLLR-DGKQVNVNLELQQS 383

**:*.: * *:*.::.: *.* ** * * : . * .::* .* . .*:: * ::

ML|HtrA2 EQ---------------------------------------------------------- 382

H37Rv|HtrA2 EQ---------------------------------------------------------- 464

DegS_E.coli SQNQVDSSTIFNGIEGAEMSNKGKDQGVVVNNVKTGTPAAQIGLKKGDVIIGANQQAVKN 443

ML|HtrA2 -------------------------------

H37Rv|HtrA2 -------------------------------

DegS_E.coli IAELRKVLDSKPSVLALNIQRGDSTIYLLMQ 474

Figure 3

Inhibitors Velocity (nmol/g

-1

.min

-1

) Residual activity (%)

Control 0.0861 100

PMSF (1 mM) 0.0115 13

Aprotinin (4.2U) n.h.* 0

Curriculum Vitae

Nome : Michelle Lopes Ribeiro

Nascimento : 25/11/1976

Naturalidade : Rio de Janeiro

Formação Acadêmica:

- Faculdade de Biologia – Modalidade Licenciatura em Ciências Biológicas pela Universidade

Federal do Rio de Janeiro, de agosto de 1996 a Dezembro de 2000.

- Doutorado em Química Biológica no Instituto de Bioquímica Médica - Universidade Federal

do Rio de Janeiro

Orientação de Estudantes:

1 – Nívea Dias dos Santos – Iniciação Científica de Janeiro/2003 a Janeiro/2004.

2 – Patrícia Vieira - Iniciação Científica de Janeiro/2004 a Janeiro/2006.

Comunicações em Congresso:

- 5 Comunicação em congressos Nacionais

- 1 Comunicação em congresso Internacional

Publicações:

Lima, C. S., Ribeiro, M. L., Souza, L. A., Sardella, A. E., Wolf, V. M. A. and Pessolani, M.

C. V. 2000. Intracellular signals triggered during association of Mycobacterium leprae and

Mycobacterium bovis ECG with human monocytes.

Guimarães MLR, Pessolani MCV. 2007. Comparative genomics of mycobacterial proteases.

Microbial Pathogenesis. In press. Disponível no site:

http://dx.doi.org/10.1016/j.micpath.2007.05.010

Guimarães MLR, Tempone AJ, Amaral JJ, Nery JA, Antunes SLG, Pessolani MCV. 2007.

Expression analysis of proteases of Mycobacterium leprae in human skin lesions. Microbial

Pathogenesis. In press. Disponível no site: http://dx.doi.org/10.1016/j.micpath.2007.05.011

Guimarães MLR, Marengo EB, Portaro FCV, Tempone AJ, Amaral JJ, Klitzke CF,

Pessolani MCV. Cloning, expression and characterization of a HtrA2 serine protease

produced in vivo by Mycobacterium leprae. Manuscrito será submetido à Biochimica et

Biophysica Acta (BBA).

Livros Grátis
( http://www.livrosgratis.com.br )
 
Milhares de Livros para Download:
 
Baixar livros de Administração
Baixar livros de Agronomia
Baixar livros de Arquitetura
Baixar livros de Artes
Baixar livros de Astronomia
Baixar livros de Biologia Geral
Baixar livros de Ciência da Computação
Baixar livros de Ciência da Informação
Baixar livros de Ciência Política
Baixar livros de Ciências da Saúde
Baixar livros de Comunicação
Baixar livros do Conselho Nacional de Educação - CNE
Baixar livros de Defesa civil
Baixar livros de Direito
Baixar livros de Direitos humanos
Baixar livros de Economia
Baixar livros de Economia Doméstica
Baixar livros de Educação
Baixar livros de Educação - Trânsito
Baixar livros de Educação Física
Baixar livros de Engenharia Aeroespacial
Baixar livros de Farmácia
Baixar livros de Filosofia
Baixar livros de Física
Baixar livros de Geociências
Baixar livros de Geografia
Baixar livros de História
Baixar livros de Línguas

Baixar livros de Literatura
Baixar livros de Literatura de Cordel
Baixar livros de Literatura Infantil
Baixar livros de Matemática
Baixar livros de Medicina
Baixar livros de Medicina Veterinária
Baixar livros de Meio Ambiente
Baixar livros de Meteorologia
Baixar Monografias e TCC
Baixar livros Multidisciplinar
Baixar livros de Música
Baixar livros de Psicologia
Baixar livros de Química
Baixar livros de Saúde Coletiva
Baixar livros de Serviço Social
Baixar livros de Sociologia
Baixar livros de Teologia
Baixar livros de Trabalho
Baixar livros de Turismo
 
 