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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO
Maisa Luciana Santos de Souza
Caracterização dos glicosaminoglicanos sulfatados dos
órgãos elétricos e da pele da enguia elétrica Electrophorus
electricus.
Composição estrutural e atividades biológicas.
Rio de Janeiro
2007
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Maisa Luciana Santos de Souza
Caracterização dos glicosaminoglicanos sulfatados dos
órgãos elétricos e da pele da enguia elétrica Electrophorus
electricus.
Composição estrutural e atividades biológicas.
Tese de Doutorado submetida ao Programa de
Pós-graduação em Química Biológica, Instituto
de Bioquímica Médica da Universidade Federal
do Rio de Janeiro, como parte dos requisitos
necessários à obtenção do título de Doutor em
Química Biológica.
Orientador: Luiz Cláudio F. da Silva
Rio de Janeiro
2007
ii
ads:
Souza, Maisa Luciana Santos de Souza
Título / Maisa Luciana Santos de Souza – Rio de Janeiro/IbqM, 2007.
xi, 108f .: il.
Tese (Doutorado em Química Biológica) – Universidade Federal do
Rio de Janeiro, Instituto de Bioquímica Médica, 2005.
Orientador: Luiz Cláudio F. da Silva
1. Glicosaminoglicanos sulfatados. 2. Órgãos elétricos . 3. Pele 4.
Electrophorus electricus
. – Teses.
I. Silva, Luiz Cláudio Francisco da (Orient.). II. Universidade Federal
do Rio de Janeiro. Instituto de Bioquímica Médica/Programa de Pós-
graduação em Química Biológica. III. Título.
iii
Maisa Luciana Santos de Souza
Caracterização dos glicosaminoglicanos sulfatados dos órgãos elétricos e da pele da
enguia elétrica Electrophorus electricus.
Composição estrutural e atividades biológicas.
Tese de Doutorado submetida ao Programa de Pós-graduação em Química
Biológica, Instituto de Bioquímica Médica da Universidade Federal do Rio de Janeiro, como
parte dos requisitos necessários à obtenção do título de Doutor em Química Biológica.
Rio de Janeiro, 15 de março de 2007.
Aprovada por:
Profª. Eliana Barreto Bergter
Profª. Silvana Allodi
Profª. Georgia Correa Atella
Profª. Ana Cristina Espírito Santo de Vilela Silva
Prof. Robson Queiroz Monteiro
Prof. Luiz Cláudio Francisco da Silva
iv
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Electrophorus electricus (L.).
1
Figura 2 Esquema da anatomia interna do E. electricus (L.).
3
Figura 3 O eletrócito.
5
Figura 4 Distribuição dos GAGs sulfatados no reino animal.
12
Figura 5 Unidades dissacarídicas dos GAGs.
14
Figura 6 Região de ligação entre o esqueleto protéico e as cadeias de
GAGs de CS, DS, HS ou heparina.
18
Figura 7 Recrutamento de leucócitos para o sítio da inflamação.
24
Figura 8 Cascata de coagulação.
31
Figura 9 Desenho esquemático do complexo tenase extrínseco.
33
Figura 10 Desenho esquemático da cascata de coagulação no interior de um
vaso sanguíneo.
34
Figura 11 Desenho esquemático do mecanismo de inibição da trombina pelo
HCII.
38
Figura 12 Caracterização dos GAGs dos Órgãos elétricos.
56
Figura 13 Caracterização do HS nos órgãos elétricos.
57
Figura 14 Histoquímica e Imunohistoquímica do órgão elétrico Principal.
61
Figura 15 Histoquímica e Imunohistoquímica dos órgãos elétricos de Hunter
e de Sachs
62
Figura 16 Caracterização dos GAGs sulfatados da pele.
64
Figura 17 Avaliação do peso molecular do DS da pele da enguia elétrica.
65
Figura 18 Atividade anticoagulante do DS da pele.
67
Figura 19 Dose dependência do DS da enguia elétrica para a inativação da
trombina pelo HCII.
70
Figura 20 Dose dependência para a atividade antitrombótica de DS de pele
de enguia elétrica e de DS de mamífero
71
Figura 21 Efeito do DS da pele do Electrophorus electricus (L.) no número
de neutrófilos em lavados brônquio-alveolares de camundongos
que inalaram LPS
74
v
LISTA DE TABELAS
Tabela (I) Análise dissacarídica dos CS e CS/DS do órgão elétrico
Principal.
58
Tabela (II) Análise dissacarídica dos CS e CS/DS do órgão elétrico Sachs.
58
Tabela (III) Análise dissacarídica dos CS e CS/DS do órgão elétrico Hunter.
59
Tabela (IV) Análise dissacarídica do DS da pele da enguia elétrica.
66
Tabela (V) Tempo de sangramento do DS de pele do E. electricus (L.)
72
vi
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
A – face não-inervada
AChE – Acetilcolinesterase
AChR – Receptor de acetilcolina
ADP – Adenosina difosfato
AH- Ácido hialurônico
APTT – Tempo parcial de tromboplastina ativada
Arg – Arginina
AT – Antitrombina
C0S – condroitim não-sulfatado
C4S – condroitim 4-sulfato
C6S – condroitim 6-sulfato
CaCl
2
– Cloreto de cálcio
CETAVLON- Brometo de N-acetil-N,N,N-trimetilamônio
CPC – Cloreto de cetilpiridina
CS- Condroitim sulfato
DAB – 3,3 diaminobenzidina tetra hidroclorídrico
DMB- Azul de 1,9-dimetilmetileno
DS- Dermatam sulfato
EDTA- Etilenodiaminotetraacetato tetrasódico
Exo – exosítio
FGF- Fator de crescimento de fibroblasto
FPLC- Cromatografia líquida de rápida pressão
FT – Fator tecidual
GAG- Glicosaminoglicano
Gal- Galactose
GalNAc- N-acetil galactosamina
GlcA- Ácido glicurônico
GlcNAc – Glicosamina N acetilada
GlcNAc- N-acetil glicosamina
GlcNH
2
– Glicosamina N livre
GlcNSO
3
– Glicosamina N sulfatada
GM-CSF – fator estimulador de formação de colônia de macrófagos e granulócitos
HB-EGF – Fator de crescimento epidermal ligante de heparina
HCII – Cofator II da heparina
vii
HPLC- Cromatografia líquida de alta pressão
HS- Heparam sulfato
ICAM – Molécula de adesão intercelular
IdoA- Ácido idurônico
IL – interleucina
K
+
- Íon Potássio
LBA – Lavado brônquio alveolar
LFA – Antígeno associado a função leucocitária.
LPAM – Integrina α4 β7
LPS – lipopolissacarídeo
LSDS – Dermatam sulfato de baixo peso molecular
Mac – Antígeno de macrófago.
MCP – Proteínas quimioatrativas de monócitos
min- minutos
Na
+
- Íon Sódio
NaCl – Cloreto de sódio
P – face inervada
Pa – papilas
PAGE – Eletroforese em gel de poliacrilamida
PAR – Receptor ativador por protease
PEG – Polietilenoglicol
PG- Proteoglicano
PSGL-1 – glicoproteína ligante de P-selectina
QS- Queratam sulfato
RMN- Ressonância magnética nuclear
Ser – Serina
SL – Septo longitudinal
ST- Septo transversal
TNF – fator de necrose tumoral
TPS – Tampão fosfato salino
V – vasos
VCAM - Molécula de adesão de célula vascular.
VEGF – Fator de crescimento do endotélio vascular
VLA – Antígeno muito tardio.
Xil – Xilose
viii
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO
1.1 Aspectos Gerais sobre o peixe elétrico Eletrophorus electricus (L.)
1
1.1.1 Sinapse
8
1.2 Proteoglicanos e Glicosaminoglicanos
11
1.2.1 Nomenclatura e aspectos gerais dos glicosaminoglicanos
13
1.2.1.1 Ácido hialurônico
1.2.1.2 Condroitim sulfato/Dermatam sulfato
1.2.1.3 Queratam sulfato
1.2.1.4 Heparam sulfato/Heparina
14
15
16
16
1.2.2 Síntese de Proteoglicanos
17
1.3 GAGs e PGs em peixes e raias elétricas
1.3.1 Raias
1.3.2 Electrophorus electricus (L.)
18
19
20
1.4 Aspectos gerais sobre inflamação
1.4.1 Forma aguda
1.4.2 Forma crônica
1.4.3 Glicosaminoglicanos na inflamação
22
23
25
25
1.5 Aspectos Gerais sobre a coagulação sangüínea
1.5.1 Sistema hemostático
1.5.2 Coagulação sangüínea
1.5.3 Mecanismos de Inibição da coagulação sangüínea
1.5.4 Glicosaminoglicanos na coagulação sangüínea
30
30
30
35
37
1.6 Aspectos gerais sobre a trombose
1.6.1 Glicosaminoglicanos na trombose
39
40
2. OBJETIVOS
42
3. MATERIAL E MÉTODOS
43
3.1 Obtenção do Electrophorus electricus (L.)
43
ix
3.2 Material
43
3.3 Dissecção dos órgãos elétricos e da pele
44
3.4 Purificação dos GAGs sulfatados
44
3.5 Identificação dos GAGs sulfatados
45
3.5.1 Eletroforese em gel de agarose
3.5.2 Digestão com condroitinases AC, ABC e B
3.5.3 Desaminação com ácido nitroso
3.5.4 Eletroforese em gel de poliacrilamida
3.5.5 Análise dos dissacarídeos por HPLC
45
46
46
47
47
3.6 Histoquímica
48
3.6.1 Detecção dos glicosaminoglicanos sulfatados dos órgãos elétricos por
histoquímica
3.6.2 Detecção do CS por Imunohistoquímica dos órgãos elétricos
48
48
48
3.7 Tempo de tromboplastina parcial ativada (APTT)
49
3.8 Inibicão da trombina pelo cofator II da heparina na presença de DS de
pele de enguia elétrica
50
3.9 Animais
3.10 Modelo de trombose venosa
3.11 Tempo de sangramento
49
50
50
3.12 Efeito do DS da pele do Electrophorus electricus (L.) no número de
neutrófilos em lavados brônquio-alveolares de camundongos que
inalaram LPS
52
4. RESULTADOS
54
4.1 1ª parte: Órgãos elétricos do Electrophorus electricus (L.)
54
4.1.1 Purificação, caracterização e peso molecular dos GAGs sulfatados dos
órgãos elétricos do Electrophorus electricus (L.)
54
4.1.2 Composição dissacarídica dos CS e CS/DS purificados dos órgãos
elétricos do Electrophorus electricus (L.)
57
4.1.3 Localização histoquímica e imunohistoquímica dos GAGs sulfatados nos
órgãos elétricos
60
4.2 2ª Parte: Pele do Electrophorus electricus (L.)
63
4.2.1 Purificação, caracterização e peso molecular dos GAGs sulfatados da
63
x
pele do E. electricus (L.)
4.2.2 Análise estrutural do DS purificado da pele do Electrophorus electricus (L.)
65
4.2.3 Atividade anticoagulante do DS extraído da pele do Electrophorus
electricus (L.)
67
4.2.4 Efeito do DS do Electrophorus electricus (L.) na trombose venosa
69
4.2.5 Efeito do DS do Electrophorus electricus (L.) no tempo de sangramento
72
4.2.6 Efeito do DS da pele do Electrophorus electricus (L.) no número de
neutrófilos em lavados brônquio-alveolares de camundongos que inalaram LPS.
73
5 DISCUSSÃO
75
5.1 Órgãos elétricos
5.2 Pele
75
79
6 REFERÊNCIAS
86
7 ANEXOS
7.1 Artigo 1 - Identification and distribution of chondroitin sulfate in the three
electric organs of the electric eel, Electrophorus electricus
(L.).
7.2 Artigo 2 - Structural composition and anticoagulant activity of dermatan
sulfate from the skin of the electric eel, Electrophorus electricus
(L.)
7.3 Artigo 3 - Distribution of chondroitin sulfate in human endometrium.
xi
Abstract
In the present work we analyzed the structure and composition of
sulfated glycosaminoglycan (GAG) purified from the electric organs and the skin
of the electric eel Electrophorus electricus. The electrogenic tissue of the
electric eel Electrophorus electricus is distributed in three well-defined electric
organs, the Main electric organ, Sach’s organ and Hunter’s organ. Our results
showed in the three electric organs that chondroitin sulfate (CS) was the main
sulfated GAG species detected, accompanied by small and diminutive amounts
of CS/dermatan sulfate (DS) hybrid chains and heparan sulfate (HS),
respectively. However, HS was not detected in the Sach’s organ. CS was
predominantly detected in the innervated membrane face of the electroplaques
in the three electric organs. We also determined the anticoagulant,
antithrombotic and bleeding effects of electric eel skin DS. This DS is a potent
anticoagulant due to a high heparin co-factor II (HC II) activity. The electric eel
DS has a higher potency to prevent thrombus formation on an experimental
model and a lower bleeding effect in rats than the porcine DS. Interestingly, it
was recently demonstrated that DS obtained from skin of the eel Anguilla
japonica, which possesses a disaccharide composition very similar to that of
electric eel skin DS described here, did not show anticoagulant activity. Thus,
the anticoagulant activity of electric eel skin DS is not merely a consequence of
its charge density. We speculate that the differences among the anticoagulant
activities of these three DS may be related to different arrangements of the
disulfated disaccharide domain for binding to HC II within their polysaccharide
chains and that it may be more efficiently arranged along the carbohydrate
chain in electric eel skin DS than in the two other types of DS.
Resumo
Neste trabalho analisamos a estrutura e a composição dos
glicosaminoglicanos (GAG) sulfatados purificados dos órgãos elétricos e da
pele da enguia elétrica Eletrophorus electricus. O tecido eletrogênico da enguia
elétrica Eletrophorus electricus é distribuído em três órgãos elétricos bem
definidos, o órgão elétrico Principal, Sachs e Hunter. Nossos resultados
mostram que o condroitim sulfato (CS) é a principal espécie de GAG
encontrada nos três órgãos elétricos, acompanhado de pequenas quantidades
de cadeias híbridas de CS/dermatam sulfato (DS) e heparam sulfato (HS)
respectivamente. Entretanto, HS não foi detectado no órgão elétrico de Sachs.
CS foi predominantemente encontrado na face da membrana inervada das
eletroplacas nos três órgãos elétricos. Nós determinamos ainda os efeitos
anticoagulante, antitrombótico e sobre o tempo de sangramento do DS da pele
da enguia elétrica. Esse DS é um potente anticoagulante devido sua alta
atividade estimuladora sobre o cofator II da heparina (HCII). Em nossos
modelos experimentais, o DS da enguia elétrica apresentou uma alta
capacidade de prevenção na formação do trombo e um baixo efeito no tempo
de sangramento quando comparado com o DS de porco. Interessantemente, foi
demonstrado recentemente que o DS obtido da pele da enguia não elétrica
Anguilla japonica, que possui composição dissacaridica similar ao DS descrito
nesse trabalho, não apresentou atividade anticoagulante. Assim, a atividade
anticoagulante do DS da pele do Eletrophorus electricus
não é meramente
conseqüência da sua densidade de carga. Nós especulamos que a diferença
entre as atividades desses DS pode está relacionada com o arranjo espacial
dos domínios contendo dissacarídeos disulfatados essenciais para a ligação
com o HCII, estando, portanto, dispostos de maneira mais eficiente nas cadeias
de DS de pele da enguia elétrica.
1 - INTRODUÇÃO
1.1 Aspectos gerais sobre o peixe elétrico Electrophorus electricus (L.)
Figura 1- Electrophorus electricus (L.)
O Electrophorus electricus (L.) (Figura 1), conhecido vulgarmente como Poraquê, é
amplamente encontrado nos rios da Amazônia. Pertence à ordem Cypriniformes, a
subordem Gymnotodei, a família Electrophoridae e ao gênero Electrophorus. John
Hunter, em 1775, fez um estudo detalhado da anatomia do Poraquê , o qual quase dois
séculos depois, em 1948 foi completado por Courceiro e Ackerman. O peixe elétrico,
além de músculos, da coluna vertebral e da bexiga natatória, é caracterizado pela
ausência de nadadeiras dorsais e caudais, corpo cilíndrico delgado e alongado,
podendo medir até dois metros de comprimento por vinte centímetros de diâmetro,
sendo que 1/5 de seu tamanho corresponde à porção anterior cranial, onde estão
compactados os órgãos vitais, enquanto que os 4/5 restantes são ocupados
basicamente por um tecido gelatinoso e apigmentado, que possui características
elétricas; Esse tecido elétrico produz descargas elétricas por um complexo sistema de
1
coordenação que permite a sincronização e distribuição das mesmas, provenientes das
inúmeras eletroplacas (120 mV), podendo no animal adulto chegar a 800 volts (Albe-
Fessard e col., 1951). Dentre os peixes que produzem eletricidade, o E. electricus (L.) é
o que possui a maior descarga elétrica, que é utilizada para paralisar presa e
predadores, ou quando fraca, é utilizada para localizar a presa, já que o peixe elétrico
quase não possui capacidade visual (Lissmann, 1961).
O tecido eletrogênico do poraquê é diferenciado histo-fisiologicamente em três
órgãos elétricos, conhecidos como Principal, Hunter e Sachs, os quais se encontram
aos pares, dispostos lateralmente ao eixo céfalo-caudal, simetricamente à linha mediana
e logo abaixo da pele do animal. O órgão elétrico Principal, é o mais volumoso e está
situado na região dorsal do peixe. O de Hunter está situado ventralmente, entre os
miótomos da nadadeira ventral, enquanto o de Sachs corresponde ao extremo caudal
do órgão Principal, estando separado deste por um septo de tecido conjuntivo (Couceiro
e Ackerman, 1948; Esquibel e col., 1971) (Figura 2).
2
A
B
Figura 2 - A- Esquema da anatomia interna do E. electricus (L.). O desenho representa
o poraquê com a sua pele dissecada, mostrando a orientação anatômica dos órgãos
elétricos (Gotter e col., 1998). B- Esquema de uma seção transversal do poraquê. O
plano da seção está representado na figura 2A pelas linhas verticais tracejadas, e
corresponde à porção média do animal. Na ampliação estão esquematizadas colunas
de eletrócitos que se estendem através do comprimento do órgão elétrico Principal. As
linhas horizontais formam os septos que delineiam os blocos de eletrócitos com altura
de 1,5 mm. A largura do eletrócito corresponde a 80 µM. (Gotter e col., 1998).
3
Nos órgãos elétricos do E. electricus (L.), encontramos septos conjuntivos
transversais e longitudinais, os quais constituem lojas ou câmaras, no interior das quais
está presente a eletroplaca ou eletrócito, que é a unidade funcional do tecido elétrico
(Schwartz e col., 1975) (Figura 3). Os eletrócitos apresentam-se como um sincício
multinucleado formado pela fusão de várias células. A membrana das eletroplacas
apresenta regiões de estrutura e função diferentes, e também pelo fato de possuírem
forma hexaédrica, essas regiões de membrana são referidas como faces da eletroplaca.
Destas seis faces que o eletrócito possui, duas delas são bem diferenciadas: a anterior
e a posterior, em relação aos septos transversais conjuntivos que constituem as
respectivas paredes das lojas.
A face anterior é a que apresenta maior superfície, pois possui a área de
membrana aumentada pela presença de numerosas papilas arredondadas, distribuídas
uniformemente e com diâmetro e alturas praticamente iguais, que se encontram imersas
no tecido conjuntivo (Figura 3). A face posterior, inervada por fibras mielinizadas
(Couceiro e Ackerman, 1948), é rica em receptores de acetilcolina (AChR) (Couceiro e
col, 1953) (Figura 3), sendo encontrada também grande quantidade de
acetilcolinesterase (AChE), enzima que hidrolisa a acetilcolina, formando colina e
acetato. A AChE é a enzima marcadora desta face, entretanto esta face inervada
possui ainda outras enzimas importantes envolvidas no metabolismo energético, como a
(Na
+
, K
+
) ATPase. Nessa face ocorre a despolarização mediante estímulos nervosos ou
elétricos (Keynes e Martins-Ferreira, 1953), veiculados por sinapses neuroelétricas,
semelhantes as neuromusculares, onde a acetilcolina atua como mediador químico.
4
Figura 3 - O eletrócito. A – Imagem obtida através de microscopia ótica de campo claro,
mostrando a face inervada (P), a face não-inervada (A), os septos longitudinais (SL) e
transversais (ST) (Keynes e Martins Ferreira, 1953). B – Esquema mostrando detalhes
da imagem, estando a face não-inervada em azul, o que possibilita melhor visualização
das papilas (Pa), além de detalhar a presença de vasos (V) (Almeida e col, 1963).
AP
Pa
V
S.L.
N
A diferenciação dos três órgãos elétricos é possível através das características das
eletroplacas, muito próximas no órgão Principal e mais afastadas e maiores e no órgão
de Sachs; já no órgão de Hunter, os septos longitudinais nem sempre são extensos,
(Keynes e Martins Ferreira, 1953; Esquibel e col., 1971).
Os biologistas do século XIX se familiarizaram com os órgãos elétricos de
espécimes de gêneros dispares tais como Torpedo e Electrophorus e alertaram para o
fato de que os órgãos elétricos seriam embriologicamente derivados dos músculos
estriados. Darwin (1859), comentou a significância dessas observações no livro A
Origem das Espécies, notando que os órgãos elétricos tinham um problema potencial
A
A
B
B
5
para a teoria da evolução das espécies por seleção natural, já que estes eram difíceis
de contar para um valor adaptativo de um músculo em um estado transicional sem, no
entanto, ter uma função contráctil, mas talvez não sendo ainda um órgão elétrico
funcional (Zakon e Unguez, 1999).
Estudos com o emprego de técnicas eletrofisiológicas demonstraram que as
eletroplacas parecem se originar da diferenciação de um músculo que teve sua
atividade contráctil atrofiada e sua capacidade de gerar correntes elétricas desenvolvida
(Keynes e Martins Ferreira, 1953). A comprovação desta demonstração foi vista em
relação a: 1) presença de isoenzimas da desihidrogenase láctica no tecido elétrico, com
mobilidade eletroforética idêntica àquelas presentes no músculo (Torres da Matta e
col.,1975); 2) observação, através de microscopias ótica e eletrônica de transmissão, de
estruturas semelhantes a miofibrilas no citoplasma de eletroplacas em desenvolvimento
no órgão elétrico (Esquibel e col., 1971); 3) caracterização de uma isoforma da creatina
fosfoquinase com características intermediárias entre as isoformas muscular e nervosa
de mamíferos, e idêntica à do músculo do poraquê (Hazan-Carneiro e Hassón-Voloch,
1983); 4) presença de desmina, proteína das células musculares, nos três órgãos
elétricos do E. electricus (L.)
(Costa e col., 1986). A semelhança do órgão elétrico com o
tecido muscular induz ao estudo de: 1) enzimas como a creatina-fosfoquinase,
importante na manutenção do estoque de energia para a contração emergencial do
músculo (Hazan-Carneiro e Hassón-Voloch, 1983, Batista e Silva e col., 2000); 2)
síntese e hidrólise de substâncias neurotransmissoras como a acetilcolina, pela colina
acetiltransferase (Nachmansohn e col., 1946; Nunes-Tavares e Hassón-Voloch, 1998 e
Nunes-Tavares e col., 2000) e acetilcolinesterase, respectivamente (Hargreaves e Lobo,
1953; Nery Da Matta e Hassón-Voloch, 1975; Nery da Matta e col. 1996); 3) enzimas
6
transportadoras de cátions como a (Na
+
,K
+
)ATPase (Albers e col., 1966; Somló e col.,
1977; Somló e Hassón-Voloch, 1987; Araujo e col., 1993).
Essa característica de analogia do tecido elétrico com o tecido muscular não é
exclusiva ao Electrophorus electricus (L.), mas sim estendida aos outros peixes elétricos
(Bass e cols, 1986). O mecanismo bioquímico que leva a histodiferenciação do órgão
elétrico ainda não está bem esclarecido. Sendo assim, a diversidade de estratégias de
desenvolvimento nos peixes elétricos, para converter músculo em órgão elétrico, pode
fornecer informações preciosas na compreensão do desenvolvimento das células
musculares, e das patologias do tecido muscular que envolva implicações do
desenvolvimento do tecido, como por exemplo, distrofias.
Além disso, o tecido elétrico de peixes contém proteínas de membrana homólogas
as de outros tecidos excitáveis, como o do E. electricus (L.), o que o torna um modelo
apropriado para o estudo da bioquímica e eletrofisiologia de membranas excitáveis
(Chagas e Lobão, 1971; Gotter e col., 1998).
7
1.1.1 Sinapse
No peixe elétrico, a descarga elétrica é produzida por uma agregação de tecidos
especializados, que constitui o órgão elétrico. No E. electricus (L.) a descarga é
produzida por células conhecidas como eletrócitos, que são células musculares
modificadas. Em certos gêneros a descarga pode ser produzida por neurônios
especializados. Os órgãos elétricos formados por eletrócitos derivados de células
musculares são "miogênicos" (evoluídos a partir do músculo). Os que são formados por
eletrócitos derivados de neurônios são chamados de neurogênicos (evoluídos a partir
dos neurônios). Os órgãos elétricos miogênicos evoluíram independentemente em
vários e diferentes grupos de peixes e são capazes de produzir descargas mais
poderosas de que os órgãos neurogênicos. Na família Torpedinidae dos
elasmobrânquios (raias), os eletrócitos evoluíram a partir da musculatura branquial.
Outras famílias de elasmobrânquios, os Rajidae (raias), possuem órgãos elétricos
derivados dos músculos da cauda. No siluróide Malapterurus, o "catfish" elétrico, o
órgão evoluiu desde o músculo peitoral. A família Astroscopidae
de teleósteos marinhos,
os "stargazers", têm órgãos evoluídos a partir de músculos normalmente envolvidos no
controle do movimento do olho. Na enguia elétrica (Electrophorus
), os órgãos
miogênicos evoluíram a partir dos músculos axiais e da cauda. Neste caso, o órgão
miogênico pode descarregar rapidamente (1 ms) uma corrente de 1 ampere numa
voltagem de 800 volts. Os órgãos elétricos neurogênicos ocorrem apenas na família
Apterotidae
. Estes órgãos são resultados da evolução secundária de órgãos
miogênicos. lsto ocorreu por degeneração da parte miogênica do órgão e especialização
8
dos neurônios que inicialmente o enervaram. Os eletrócitos miogênicos estão,
geralmente, entre as maiores células do animal e podem ser em forma de fita, disco ou
fuso. Freqüentemente estão dispostos em pilhas, com todas as células orientadas no
mesmo sentido. Esta disposição é comum na maioria dos órgãos miogênicos e parece
ser um resultado da evolução convergente para permitir uma produção máxima de
voltagem pelo órgão.
Dos três órgãos elétricos do E. electricus (L.), o de Sachs e a porção posterior do
órgão de Hunter, podem ser descarregados de maneira independente do órgão
Principal. Esta descarga é de baixa amplitude (10 V) e provavelmente é usada mais
para a detecção da presa do que para a sua captura. A notória descarga de 800 volts é
produzida quando todos os órgãos descarregam simultaneamente, sendo a maior
contribuição proveniente do órgão Principal. Grande parte da corrente produzida pela
descarga de alta voltagem é canalizada diretamente para o ambiente, reduzindo assim o
efeito sobre os tecidos do próprio animal, mas não será surpreendente descobrir que o
sistema nervoso central do animal possui adaptações especiais que o tornam tolerante
às correntes residuais que devam fluir através dele.
Os eletrócitos (eletroplacas) do órgão Principal na enguia elétrica são em forma de
fita, comprimidos rostro-caudalmente e se estendem lateralmente desde a linha
mediana. No adulto existem cerca de 6.000 eletroplacas dispostas em série. Existem
cerca de 25 dessas colunas dispostas em paralelo para formar o órgão Principal. Como
a maioria dos outros eletrócitos miogênicos, estes são fisiologicamente polarizados. As
duas faces dos eletrócitos diferem, em termos de sua excitabilidade elétrica. A face
posterior dos eletrócitos da enguia é inervada, eletricamente ativa e produz um pico de
9
potencial elétrico devido ao sódio em resposta ao sinal de comando neural. A face
anterior possui uma baixa resistência e é eletricamente inexcitável. Combinada com
tecidos acessórios isolantes, esta polarização maximiza a produção da corrente elétrica.
Parcialmente, devido a esta propriedade de polarização do eletrócito, o estudo dos
vários tipos de órgãos elétricos conduziu a importantes revelações a respeito das
propriedades das células excitáveis.
Em céluIas musculares normais, a contração é iniciada por um rápido evento
elétrico que se propaga através da célula. Numa célula única, a amplitude de pico a pico
deste evento elétrico é de 80 a 100 mV. Neste evento, o potencial de ação do músculo é
gerado como um resultado de uma estimulação sináptica proveniente de um neurônio
que traz informação do sistema nervoso central. A maioria dos eletrócitos, embora não
todos, assim como as células musculares das quais são derivados, produzem um
potencial de ação tudo ou nada quando excitados pela informação carregada pelo
neurônio inervador. Com os eletrócitos dispostos em série, como pilhas, e estimulados
simultaneamente, as voltagens das descargas dos eletrócitos individuais se somam. Se
não ocorre curto circuito das descargas, as 6.000 eletroplacas dispostas serialmente na
enguia-elétrica adulta produzirão uma descarga elétrica somada de 480 a 800 Volts, o
que de fato ocorre.
10
1.2 Proteoglicanos e Glicosaminoglicanos
Os proteoglicanos (PGs), são um grupo heterogêneo de glicoconjugados, formados
por uma cadeia protéica e uma ou mais cadeias polissacarídicas não ramificadas,
denominadas glicosaminoglicanos (GAGs). Os GAGs compõem o maior grupo de
polissacarídeos sulfatados e são amplamente distribuídos em tecidos animais, desde os
filos mais primitivos até os mais recentes (Nader e cols., 1999), (Figura 4).
Os GAGs possuem carga negativa, devido à presença de resíduos de açúcar
carboxilados e/ou sulfatados. Nestes polissacarídeos, um açúcar carboxilado (um ácido
hexurônico), alterna-se através de uma ligação O-glicosídica com um açúcar aminado
(uma hexosamina), formando unidades dissacarídicas que se repetem ao longo da
cadeia (Iozzo, 1998; Prydz e Dalen., 2000; Kresse e Schönherr, 2001). Estas
macromoléculas apresentam uma grande diversidade estrutural que resulta: 1- das
muitas possibilidades de inserção da cadeia polissacarídica no esqueleto protéico. 2- do
crescente e grande número de proteínas passíveis a essa substituição e 3- da
diversidade estrutural das cadeias dos GAGs, os quais contribuem para o envolvimento
dos PGs em uma grande variedade de funções biológicas.
Os PGs atuam como organizadores de tecidos, influenciam o crescimento e a
maturação das células de tecidos especializados, desempenham funções como filtros
biológicos, modulam a atividade de fatores de crescimento, regulam a fibrilogênese do
colágeno, afetam a invasão e o crescimento das células tumorais, regulam o
crescimento de neuritos, atraem cátions, atuam na inflamação, coagulação sangüínea e
11
na absorção (Iozzo, 1998; Funderburgh, 2000; Perrimon e Bernfield, 2000; Prydz e
Dalen., 2000; Kresse e Schönherr, 2001; Belting, 2003). As cadeias de GAGs são as
principais responsáveis pelas funções dos PGs, contudo a cadeia protéica atua não
somente como um suporte para os GAGs, mas também apresenta domínios com
atividades biológicas, tais como na sinalização celular, na gastrulação, na
organogênese, entre outras. (Iozzo, 1998; Kramer e Yost 2003).
Figura 4 - Distribuição dos GAGs sulfatados no Reino Animal (reproduzido de
Nader e col.,1999). CS: condroitim sulfato, HS: heparam sulfato, DS: dermatam
sulfato, QS: queratam sulfato, C0S: condroitim não sulfatado, C4S: condroitim 4-
sulfatado, C6S: condroitim 6-sulfatado, C4,6S: condroitim 4,6 dissulfatado,
Heparin: heparina.
12
1.2.1 Nomenclatura e aspectos gerais dos glicosaminoglicanos
Os GAGs, são classificados de acordo com sua organização estrutural (unidades
dissacarídicas), assim como pela extensão e natureza das suas modificações após a
polimerização (N-sulfatação, O-sulfatação e epimerização). Segundo a nomenclatura de
Jeanloz (1960), os GAGs são divididos nos seguintes grupos: (Figura 5) (Iozzo, 1998;
Kramer e Yost, 2003).
1.2.1.1 Ácido hialurônico
O ácido hialurônico (AH) apresenta uma maior simplicidade na sua composição
estrutural. Suas unidades dissacarídicas são constituídas por um ácido glicurônico
(GlcA) ligado a uma N-acetilglicosamina (GlcNAc) por ligações β 1 → 3 e não
apresentam sulfatação, logo, a propriedade aniônica do AH é dada apenas pelos seus
grupos carboxila. Diferente dos outros GAGs, o AH não é sintetizado covalentemente
ligado à cadeia protéica, sendo portanto classificado simplesmente como GAG (Prehm,
1983).
Eles formam polímeros de alto peso moleculares sendo importantes componentes
de matriz extracelular, onde interagem não covalentemente com os PGs. São
particularmente abundantes no tecido conjuntivo, derme, músculos lisos, pulmão, lâmina
própria da mucosa e camada adventícia que envolve os vasos sanguíneos (Naor e cols.,
1997).
13
Figura 5 - Unidades dissacarídicas dos GAGs. As estruturas dissacarídicas dos
diferentes tipos de GAGs estão representadas sem sulfatação. As diferentes posições
de sulfatação em cada GAG estão marcadas por um quadrado de linha tracejada
vermelha. Modificado a partir de Prydz e Dalen, 2000.
14
1.2.1.2 Condroitim sulfato e Dermatam sulfato
Condroitim sulfato (CS) e dermatam sulfato (DS) pertencem à mesma família uma
vez que apresentam em suas unidades dissacarídicas uma N-acetilgalactosamina
(GalNAc), sendo também chamados de galactosaminoglicanos (Sugahara e cols.,
2000).
O CS, principal GAG encontrado nas cartilagens, tem sua unidade dissacarídica
formada por um GlcA ligado a uma GalNAc por ligações β 1 → 3, e pode apresentar
sulfatação nas posições 4- ou 6- da GalNAc predominantemente, formando os
condroitim 4 (condroitim A) ou 6 (condroitim C) sulfatos, respectivamente. Normalmente
não apresentam sulfatação no GlcA.
O DS possui resíduos de GalNAc alternados com porções variáveis de resíduos de
GlcA e de ácido idurônico (IdoA), que são formados a partir da epimerização do GlcA
durante a polimerização e subsequente sulfatação na posição 4 da GalNAc. O DS pode
ser considerado como um variante do condroitim 4-sulfato sendo também chamado de
condroitim B. Além disso, o DS é freqüentemente sulfatado na posição 2 do IdoA e pode
ser sulfatado na posição 6 da GalNAc. (Kobayashi e cols., 1999; Trowbridge e Gallo,
2002; Kusche-Gullberg e Kjellén, 2003; Sugahara e cols., 2003). São sintetizados na
forma de PG. Diversos PGs de DS já tiveram suas cadeias protéicas caracterizadas
(Coster, 1991; Kresse e cols., 1993), sendo que grande parte das atividades biológicas
exercidas pelos PGs de DS estão associadas às cadeias de DS.
15
CS e DS desempenham funções no desenvolvimento do sistema nervoso central,
reparação tecidual, infecção, sinalização com fatores de crescimento, morfogênese e
divisão celular (Sugahara e cols., 2003). DS participa especificamente na coagulação
sanguínea, estabilidade da matriz extracelular e modulação de resposta inflamatória
(Trowbridge e Gallo, 2002) e o CS atua na memória e aprendizado, regulação do
crescimento axonal, adesão neuronal, migração e neuritogênese entre outras (Sugahara
e cols., 2003).
1.2.1.3 Queratam sulfato
O queratam sulfato (QS) apresenta unidades dissacarídicas compostas por GlcNAc
e um açúcar neutro no lugar do ácido hexurônico, uma galactose (Gal), β 1 → 3 ligados.
A posição C-6, de ambos resíduos, podem ser sulfatadas dando origem a unidades
mono e dissulfatadas (Funderburgh, 1996). O QS é comumente encontrado em
cartilagem e córnea humana.
1.2.1.4 Heparam sulfato e Heparina
O heparam sulfato (HS) e a heparina são GAGs de estrutura intimamente
relacionadas. Constituem um outro grupo de GAGs, onde a glicosamina é o açúcar
aminado e a ligação hexosaminídica está na configuração α 1 → 4. A glicosamina
apresenta-se N-sulfatada (GlcNSO
3
), N-acetilada (GlcNAc) ou N-livre (GlcNH
2
), e na
forma de GlcNSO
3
6-sulfatada. O ácido hexurônico pode ser GlcA ou IdoA O-sulfatado
16
na posição 2 (Silva e Dietrich, 1975; Gallagher, 2001). No HS cerca de 40-50% da
glicosamina apresenta-se N-sulfatada (Gallagher, 2001), já na heparina essa sulfatação
está em torno de 80% e este polissacarídeo consiste majoritariamente de dissacarídeos
trisulfatados (Nader e cols. 1987; Lindahl, 1989).
O HS regula diversas atividades biológicas como sinalização celular, organização
do citoesqueleto, migração, inflamação, metástase e formação sináptica. A heparina
além de sua conhecida atividade anticoagulante possui outras atividades
farmacológicas, como regulação do metabolismo lipídico, atividade antiproliferativa entre
várias outras (Cisar e cols., 1989; Kramer e Yost, 2003).
É importante destacar que a heparina pode ser isolada a partir de diferentes
tecidos animais, sejam eles vertebrados ou invertebrados (Nader, 1999). Nos mamíferos
ela é sintetizada e estocada em grânulos citoplasmáticos de mastócitos, sendo liberada
como cadeias livres, não ligadas a proteínas, após ativação e degranulação dos
mastócitos, em eventos associados ao sistema imune. O HS é sintetizado por uma
grande variedade de tipos celulares, podendo ser secretado tanto na forma de cadeias
livres de GAGs quanto de PGs (Lindahl, 1989; Piepkorn e cols., 1989; Salmivirta e cols.,
1996).
1.2.2 Síntese de Proteoglicanos
O processo de síntese dos PGs inicia-se no retículo endoplasmático rugoso com a
adição, à cadeia protéica do polipeptídeo nascente, de xilose O-ligada a resíduos de
serina. Em seguida duas unidades de galactose e um resíduo de GlcA são adicionados
por três transferases distintas, no Complexo de Golgi, formando o tetrassacarídeo de
17
ligação, também chamado região de ligação (Figura 6). Modificações dessa região por
sulfatação, fosforilação e epimerização do último açúcar geram diferenças estruturais
que podem determinar o tipo de GAG a ser sintetizado. A partir dessa região de ligação,
a cadeia é estendida pela adição de um açúcar aminado e um ácido hexurônico. (Prydz
e Dalen, 2000; Sugahara e Kitagawa, 2000; Kusche-Gullberg e Kjellén, 2003).
Ao ser sintetizada, a cadeia de GAG sulfatada (CS, DS, HS, heparina) é modificada
em diversas posições. As modificações segundo Prydz e Dalen (2000) incluem:
(1) deacetilação/N-sulfatação das unidades de GlcNAc em HS e heparina;
(2) epimerização do GlcA para IdoA em HS, heparina e também no DS;
(3) O-sulfatação em várias posições dos dissacarídeos de HS, heparina, CS e DS.
Tem sido postulado que o completo elongamento da cadeia de GAG depende de
uma eficiente sulfatação do polímero.
Após sua síntese, os PGs são transportados para três possíveis destinos: a matriz
extracelular, a superfície celular ou organelas intracelulares (Prydz e Dalen, 2000).
18
Figura 6 - Região de ligação entre o esqueleto protéico e as cadeias de GAGs de CS,
DS, HS ou heparina. O alongamento da cadeia de GAG é feito a partir de um
tetrassacarídeo de ligação, composto por xilose, galactose, galactose e ácido
glicurônico, que são inseridos por quatro transferases distintas formando a
região de ligação com a cadeia peptídica.
1.3 Glicosaminoglicanos e Proteoglicanos em peixes e raias elétricos
A presença de GAGs dos tipos AH e DS tem sido demonstrada na pele de
diferentes organismos marinhos, como raias, tubarão, atum e enguias.
Especialmente, com relação ao DS, tem sido mostrado que estes GAGs dermais
apresentam atividades biológicas in vitro e in vivo, mais especificamente em
relação às atividades anticoagulante e antitrombótica. Em outros sistemas, os
GAGs podem apresentar além da atividade anticoagulante, a capacidade de
interferir nos processos inflamatórios. Não existem relatos na literatura sobre a
composição estrutural e atividade biológica de GAGs dermais derivado do E.
electricus (L.).
19
A seguir serão abordados alguns aspectos relacionando a presença dos
GAGs em peixes e raias, assim como sua importante participação nos processos
da coagulação, trombose e inflamação.
1.3.1 Raias
Em 1982, foi identificado um GAG provavelmente sob a forma de PG, no órgão
elétrico da raia elétrica Torpedo marmorata, localizado dentro das vesículas sinápticas
colinérgicas, mais provavelmente associado à membrana (Jones e col., 1982). Mais
recentemente, nesta mesma raia, foi detectado PGHS, através de técnicas de
imunohistoquímica. Especula-se que esse PGHS esteja envolvido na aglomeração dos
receptores de acetilcolinesterase na fase inervada dos eletrócitos. (Jenniskens e col.,
2000). Foi demonstrado que a AChE é removida da lâmina basal sináptica do órgão
elétrico do Torpedo californica, com tampão de alta força iônica ou contendo heparina,
mostrando que a cadeia de HS pode estar interagindo com o domínio de ligação a
heparina presente na cauda de colágeno da enzima e assim estando envolvida no
mecanismo de ancoramento da enzima à lamina basal (Casanueva e col., 1998).
Brandam e col., em 1958, mostraram que o HS é um componente da matriz
extracelular do órgão elétrico da raia Discopyge tschudii, e que este GAG também
apresenta interações com a AChE assimétrica, podendo servir como ancora para essa
enzima. Posteriormente, foi feita uma análise mais criteriosa dos GAGs presentes na
membrana basal do órgão elétrico dessa mesma espécie, e os autores demonstraram a
presença de AH (49%), C6S (24%), HS (12%) e DS (14%). (Inestrosa e col., 1987).
20
Em outras duas espécies de raias elétricas, Discopyge ommata e Narcise
brasiliensis, foi descrito a presença um proteoglicano de condroitim sulfato, o PGCS
(PG-1000), formalmente chamado de TAP-1 e PGQS, que estão associados fortemente
à membrana basal do órgão elétrico. Através de métodos imunocitoquimícos, foi
demonstrado que o PG-1000 é um componente da matrix extracelular intertisticial, que
está localizado imediatamente adjacente a lamina basal do órgão elétrico, a lamina
reticular. (Carlson e col., 1996).
1.3.2 Electrophorus electricus (L.)
O AH foi o primeiro GAG isolado do órgão elétrico Principal, sendo descrito como
um componente da matriz extracelular, ocorrendo em uma concentração relativamente
elevada (Hassón e Chagas., 1959).
Em 1978, Bon e col. demonstraram a presença de AH e CS no órgão elétrico
Principal. Esses autores mostraram que o CS presente no órgão elétrico era capaz de
promover a agregação in vitro da AChE , sugerindo que este GAG seria o responsável
pelo ancoramento in vivo desta enzima na membrana basal do órgão elétrico Principal.
Mais tarde, em 1980, Granafrei e Hassón-Voloch estudaram algumas propriedades
físico-químicas do AH isolado do órgão elétrico Principal, através de técnicas de
viscometria e dispersão ótica rotatória.
Contraditoriamente ao descrito acima, Vigny e col., em 1983 sugeriram que a
AChE se liga mais fortemente a PGHS presentes na membrana basal do órgão elétrico
Principal e que essa interação é dependente da cauda de colágeno da enzima. Além
21
disso, apresentaram evidências indiretas que a AChE obtida a partir do órgão elétrico
Principal do E. electricus (L.) co-purificava com moléculas de HS.
Coletivamente esses estudos sugerem a presença de GAGs dos tipos AH, CS e
HS no órgão elétrico Principal. Contudo, esses se apresentam como estudos isolados e
suas conclusões se baseiam em evidências indiretas da presença dessas moléculas
neste órgão. Um estudo sistemático empregando técnicas apropriadas para o estudo
dos GAGs, ainda é necessário para que se determine claramente a composição exata
dessas moléculas neste órgão. Além disso, estes estudos devem ser estendidos para os
dois outros órgãos elétricos onde ainda não existem informações sobre a presença e
características destas moléculas. Dessa forma, seria possível traçar comparações entre
a composição dessas moléculas nos três órgãos na tentativa de elucidar o papel
desempenhado por essas moléculas neste sistema.
1.4 Aspectos Gerais sobre Inflamação
Denomina-se inflamação, o conjunto de eventos iniciados por uma perturbação da
homeostase tecidual. O requisito fundamental para o estabelecimento da inflamação é a
necessidade de que o tecido seja vascularizado ou que possua proximidade íntima com
a vascularização de tecidos vizinhos. Esse processo é geralmente produzido pela
presença de um agente provocador de lesão, que conseqüentemente leva a um
acúmulo de fluido e leucócitos nos tecidos extravasculares, que tem como objetivo,
destruir, diluir e isolar os agentes lesivos. Os participantes do processo inflamatório são:
a parede vascular, as células dos vasos sanguíneos (inflamatórias), os mastócitos, os
22
fibroblastos, os macrófagos residentes no tecido conjuntivo, os PGs, as fibras de
colágeno, elásticas e a membrana basal.
O processo de inflamação ocorre em organismos vivos com sistema circulatório
desenvolvido e pode ser desencadeada por diferentes eventos modificadores da
homeostase, tais como: agentes físicos (trauma e radiação), agentes químicos (toxinas,
ácidos, álcalis), agentes biológicos (bactérias, fungos, protozoários, helmintos, vírus),
neoplasia, necrose e distúrbios auto-imunes.
A inflamação é classicamente dividida em aguda e crônica. A forma aguda tem
duração que varia de algumas horas até poucos dias entre o início, o desenvolvimento e
o término. Já a forma crônica é considerada um processo prolongado, que pode ter
semanas ou até anos de duração. (COTRAN, Parte 1, cap. 3, 2003 VI ed).
1.4.1 A forma aguda
Imediatamente após a lesão, ocorrem alterações no calibre vascular levando a um
aumento do fluxo sanguíneo local. Conseqüentemente, ocorrem mudanças estruturais
na microvasculatura, aumentando sua permeabilidade, permitindo o extravasamento de
um líquido rico em proteínas plasmáticas e leucócitos para o interstício, promovendo a
formação do edema. Além disso, ocorre vasodilatação, a qual leva ao aumento do fluxo
sanguíneo caracterizando o calor e o rubor.
A abertura de novos leitos capilares causa uma redução na velocidade do sangue
e permite a orientação dos leucócitos para o endotélio, processo conhecido como
23
marginação/atachamento. Devido ao fluxo sanguíneo, os leucócitos são conduzidos
através das células endoteliais, em um processo conhecido como rolamento. Tanto o
atachamento quanto o rolamento dos leucócitos no endotélio vascular inflamado,
envolvem lectinas tipo C (lectinas dependente de cálcio) chamadas de selectinas (Lowe,
2002; Kannagi, 2002). A fase inicial do rolamento é mediada pela P-selectina endotelial
e seu ligante PSGL-1 (glicoproteina ligante a P-selectina) presente na superfície dos
leucócitos. Já a fase posterior depende da L-selectina, que é constitutivamente expressa
pelos leucócitos. A expressão da E-selectina é induzida após várias horas da ativação
endotelial por IL-1, endotoxina e fator de necrose tumoral (TNF-α) e resulta em um
rolamento lento dos leucócitos. Devido à redução na velocidade deste processo
mediado pelas selectinas, os leucócitos são capazes de interagir com quimiocinas, que
conseqüentemente leva a ativação de integrinas (LFA-1, Mac-1, VLA-4, LPAM-1), em
sua superfície que interage com proteínas de adesão (ICAM-1, ICAM-2, VCAM-1)
resultando em uma adesão mais forte com o endotélio. Finalmente, a aderência estável
dos leucócitos acompanhada do gradiente formado pelas quimiocinas na parede do
vaso sanguíneo, permite a entrada do leucócito no tecido inflamado, processo chamado
de diapedese. (Götte, 2003) (Figura 7). Os leucócitos (predominantemente neutrófilos)
chegam ao local e liberam mediadores inflamatórios de diferentes naturezas químicas e
funções, criando um ambiente extremamente citotóxico para destruir os
microorganismos invasores e, por vezes, o próprio tecido circunvizinho.
24
Vaso sanguíneo
Rolamento
do Leucócito
Quimiocinas
GAGs
Células
Endoteliais
Diapedese
Adesão
Espalhamento
Tecido
Adjacente
Figura 7 - Recrutamento de leucócitos para o sitio da inflamação – Um processo de várias
etapas envolvendo interação com moléculas de adesão, citocinas pró-inflamatórias e
quimiocinas. (Reproduzido de Handel e cols., 2005).
1.4.2 A forma crônica
Nesse processo, são encontradas simultaneamente reações de inflamação ativas,
destruição de tecido e tentativa de reparo. A forma crônica da inflamação pode ser
observada na fisiopatologia de muitas doenças, como a tuberculose, artrite reumatóide e
a doença pulmonar obstrutiva crônica.
Diferente da forma aguda, a crônica apresenta um infiltrado celular com predomínio
de macrófagos e linfócitos, além de angiogênese.
25
1.4.3 Glicosaminoglicanos na inflamação
Os fatores que influenciam a mudança na estrutura, na seqüência das cadeias dos
GAGs e a suas conseqüências no processo inflamatório constituem uma área de
pesquisa pouco explorada.
Os GAGs constituem uma fração considerável dos glicoconjugados encontrados
na membrana celular e na matriz extracelular. Com o avanço da glicobiologia, os GAGs,
assim como suas cadeias protéicas, estão cada vez mais presentes em uma variedade
de eventos celulares. Estudos recentes, demonstram a participação dessas moléculas
iniciando e controlando eventos associados com a inflamação. Exemplos de processos
influenciados pelos GAGs, incluem a produção e a ligação de quimiocinas/citocinas, o
recrutamento de leucócitos, a maturação das células inflamatórias, dentre outros
(Trowbridge e Gallo, 2002; Taylor e Gallo,2006).
Após a injúria, os GAGs são liberados da sua cadeia protéica ou da membrana
celular tornando-se solúveis. Esses GAGs podem ser posteriormente modificados,
sofrendo alteração no comprimento da cadeia ou revelando domínios específicos
mascarados anteriormente. O HS, por exemplo, é capaz de interagir com fatores de
crescimento como o FGF-1 (acídico) ou com o FGF-2 (básico). Ectodomínios do
sindecan-1 (um PG de HS e/ou CS que possui regiões transmembranas e
citoplasmáticas similares) solúveis são encontrados após a injúria, mas esses não
promovem a atividade do fator de crescimento FGF-2, sem o envolvimento da enzima
heparanase, que degrada o HS, produzindo fragmentos de baixo peso molecular.
(Kato,M e cols., 1998). Essa enzima é liberada por diferentes tipos celulares envolvidos
26
na inflamação, como plaquetas, neutrófilos, monócitos, entre outros. Esses
oligossacarídeos de HS, formados pela ação da enzima, contêm a região exata para
promover a atividade do FGF-2 (Bame, 2001; Gingis-Velitski e col., 2004).
Outros PGHS estão associados com o processo inflamatório. O CD44 é um
receptor de superfície celular multifuncional, conhecido pela sua interação com o AH.
Algumas de suas isoformas podem ser modificadas pela adição de cadeias de HS,
formando HSPGs. O CD44/HS é expresso em monócitos, após a diferenciação
monocítica a macrófago ou após a estimulação com IL-1β ou LPS. Ele é capaz de se
ligar ao FGF-2, ao VEGF e também ao HB-EGF (“heparin binding-EGF”) mas não a
quimiocinas como, MCP-1 e IL-8. Devido à importância dos macrófagos na regulação do
reparo tecidual e remodelamento, a expressão do CD44/HS, que é induzida nas
primeiras 24h após a estimulação com LPS, pode facilitar e regular a atividade dos
fatores de crescimento as células adjacentes. (Jones e cols., 2000)
HS influencia no recrutamento de leucócitos para os sítios de inflamação e injúria.
Isso ocorre pela regulação de HSPGs na formação do gradiente de quimiocinas e
citocinas, que são produzidas pelas células endoteliais e estilmuladas por fatores pró-
inflamatórios como o IL-1β e TNF-α. Várias quimiocinas têm sido implicadas nesse
processo, incluindo todos os membros da família das interleucinas, RANTES, MCP-1 e
MCP-4, IP-10 e GM-CSF. Existem diversos estudos que mostram que os sindecans 1 e
2, são capazes de reter IL-8 na superfície das células endoteliais criando um gradiente
para o recrutamento das células inflamatórias.
Enquanto existem muitas evidências do envolvimento do HS no processo
inflamatório, pouco se sabe sobre a participação do DS. A cadeia de DS após a injúria,
27
assim como o HS, torna-se solúvel e é considerado o maior componente do fluido
cicatrizante , compreendendo mais da metade do total de GAGs neste meio. Esse DS
solúvel é capaz de ativar fatores de crescimento, como o FGF-2 e o FGF-7 (também
conhecido como fator de crescimento de queratinócitos). Assim como descrito para HS,
estudos têm mostrado que existe um tamanho e uma seqüência específica para o DS
promover a atividade desses fatores de crescimento. O tamanho mínimo da cadeia de
DS requerido é um octassacarídeo, onde a sulfatação da GalNAc na posição O-4 é
suficiente para promover essa atividade. Aumentando-se a sulfatação nas posições O-2
do IdoA e O-4 da GalNAc aparentemente não aumenta essa atividade. Já a seqüência
requerida para a proliferação celular dependente de FGF-7 consiste de um
decassacarídeo que também possui a GalNAC sulfatada na posição O-4.
DS, assim como HS, se liga a várias moléculas que estão envolvidas no
recrutamento, rolamento e diapedese dos leucócitos. DS sinaliza um aumento da
expressão de ICAM-1 nas células endoteliais da microvasculatura da derme humana
(Penc e col., 1999).
As cadeias de DS se ligam a vários fatores, que estão envolvidos na adesão dos
leucócitos, como por exemplo, L e P-selectinas (que são dependentes da sulfatação) e
CD44 (independente da sulfatação). O versican (PG contendo cadeias de CS/DS), é
altamente expresso em vários tecidos, como o rim, a pele, o cérebro e a aorta, sendo
também capaz de se ligar aos fatores descritos acima.
As cadeias de DS altamente sulfatadas, que são capazes de ligar a L- ou P-
selectinas, também se ligam a algumas quimiocinas como SLC e IP-10, dentre outras.
Enquanto que cadeias híbridas de CS/DS que apresentam um alto teor de sulfatação,
inibem a atividade das quimiocinas devido a uma grande afinidade por estas, podendo
28
funcionar possivelmente como um reservatório para essas moléculas (Kawashima e col.,
2000).
O AH, é o GAG mais estudado na aplicação clínica devida sua forte influência na
inflamação. Após a injúria ou durante a inflamação, o AH é totalmente degradado ou
clivado em frações de pequeno peso molecular, que participam de uma variedade de
eventos de sinalização que incluem a proliferação celular, a migração, a diferenciação, a
angiogênese e a indução de citocinas e quimiocinas pró-inflamatórias. Devido à
ausência de modificações na sua estrutura, a sua função está relacionada
exclusivamente com o seu tamanho molecular.
Assim como descrito para o HS e DS, mas através de um mecanismo diferente, o
AH está envolvido no processo de recrutamento de leucócitos para os sítios de
inflamação, através da sua interação com CD44. A produção de um AH específico pelas
células endoteliais é induzida pelas citocinas pró-inflamatórias, como o TNF-α e o IL-β.
Este AH expresso pelas células endoteliais e o CD44 presente na superfície dos
leucócitos iniciam a interação entre os leucócitos e o endotélio. Contudo, o CD44
presente nas células B e T não são capazes de se ligar a AH, sugerindo que essa
interação é fortemente controlada (Johnson e col., 2000).
29
1.5 Aspectos Gerais sobre a coagulação sangüínea
1.5.1 Sistema Hemostático
Para que o sangue exerça suas funções no organismo é de extrema
importância que permaneça na forma fluida (livre de coágulos), mas que também
promova a interrupção do sangramento caso haja uma injúria vascular. O balanço
resultante da integração desses dois aspectos é conhecido como hemostasia.
Complexos mecanismos fisiológicos defendem o organismo contra a perda
de sangue. Agressões que levam a alteração ou perda de células endoteliais
vasculares levam à ativação de um mecanismo complexo e intrincado, conhecido
como sistema hemostático. Esse sistema recruta enzimas e plaquetas, que
promovem a formação de um “tampão” insolúvel, que impede o extravasamento
do sangue.
1.5.2 Coagulação sanguínea
O sítio de lesão vascular é inicialmente preenchido por plaquetas que aderem à
macromoléculas do tecido subendotelial exposto, passam para a forma ativada e
formam um tampão plaquetário inicial. Durante a formação do tampão plaquetário, as
plaquetas aderidas liberam uma série de substâncias de seus grânulos, que juntamente
com moléculas do espaço subendotelial, promovem a ativação local de fatores da
coagulação que se encontram solúveis no plasma.
30
O sistema de coagulação sangüínea é o resultado da ativação seqüencial
de proteases plasmáticas inativas (zimogênios) (Davie e c ol., 1991), que agem em
cadeia convergindo para a ativação do fator X, que após ativado atua na
transformação de protrombina em trombina que finalmente culmina na clivagem
do fibrinogênio em fibrina tendo como conseqüência a formação de uma rede de
fibrina insolúvel, que estabiliza o agregado de plaquetas formado no local da
injúria vascular. Por convenção, os fatores de coagulação são denominados por
algarismos romanos e após sua ativação por proteólise são denominados pelo
seu símbolo seguido da letra ”a” (Wright, 1962). (Figura 8).
Figura 8 - Cascata de coagulação. A cascata de coagulação é disparada logo após
uma injúria endotelial, a partir da exposição de fator tecidual (FT).
F
F
A
A
T
T
O
O
R
R
T
T
I
I
S
S
S
S
U
U
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L
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A
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(
F
F
T
T
)
)
+
+
V
V
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I
I
a
a
XI
XI
IX
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IXa
X
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P
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T
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R
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M
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B
I
I
N
N
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A
PL
VIIIa
V
VIII
FIBRINOGÊNIO
POLÍMEROS
FIBRINA
COÁGULO
FIBRINA
XII
XIII
V
T
T
R
R
O
O
M
M
B
B
I
I
N
N
A
A
FPA
,
F
31
Por muitos anos acreditava-se que a cascata de reações enzimáticas que
leva a formação de trombina pudesse ser ativada por duas vias: intrínseca ou
extrínseca. Porém, in vivo, essas vias não devem ser consideradas isoladamente
visto que estão acopladas por uma série de reações, embora haja evidências de
que a via intrínseca é importante para a manutenção e crescimento do coágulo
enquanto a via extrínseca é crucial para o início da sua formação (Davie e col.,
1991). Atualmente, considera-se que a coagulação sangüínea é iniciada pela via
do fator tecidual (FT).
O FT é uma proteína com cerca de 37 kDa, constitutivamente expressa na
superfície de células que normalmente não estão em contato com o sangue,
como por exemplo, fibroblastos e macrófagos. Células endoteliais também
expressam o FT quando estimuladas. Quando há uma injúria vascular, o plasma
é exposto a essas células dando início à coagulação.
O FT exposto associa-se ao fator VIIa presente no sangue, formando um
complexo denominado “tenase extrínseco” que ativa o fator X (Kalafatis e col.,
1994) (Figura 9).
32
FT
Figura 9 - Desenho esquemático do complexo tenase extrínseco. O fator
tecidual (FT) exposto associa-se ao fator VIIa presente no sangue, formando
um complexo que ativa o fator X em fator Xa.
Embora a ativação do fator VII seja feita pelo fator Xa, no plasma há
sempre uma quantidade significativa de fator VIIa disponível pra interagir com o
FT. O fator Xa gerado por essa via ativa uma pequena quantidade de
protrombina, promovendo a formação de trombina. Essa trombina catalisa a
ativação do fator V formando o fator Va (Suzuki e col., 1982).
O complexo FT–fator VIIa também catalisa a ativação do fator IX em fator
IXa. O fator IXa forma um complexo com seu cofator, o VIIIa, fosfolipídios e
cálcio, denominado “tenase intrínseco”. Esse complexo ativa o fator X de forma
idêntica ao “tenase extrínseco”, porém, apresentando uma maior eficiência
catalítica (Ahmad e col, 1992).
O fator Xa se associa com o fator Va na superfície de plaquetas ativadas,
numa reação dependente de cálcio, formando o complexo protrombinase. Esse
33
complexo passa a ser o responsável pela ativação da protrombina em trombina
(Davie e col., 1991; Mann, 1999) (Figura 10).
FT
FT
FT
FT
FT
FT
FT
F
FT
FT
Figura 10 - Desenho esquemático da cascata de coagulação no interior de um
vaso sangüíneo. Na superfície de plaquetas ativadas formam-se os complexos
“tenase intrínseco” e protrombinase, que promovem a geração de trombina e
conseqüente quebra do fibrinogênio em fibrina. (adaptada de
http://tollefsen.wustl.edu/)
A trombina é a enzima final do sistema de coagulação. Ela é a única enzima
capaz de converter o fibrinogênio em fibrina. Sua ação não se restringe apenas a
clivagem do fibrinogênio em fibrina, mas também atua na amplificação do mecanismo de
coagulação através da ativação de alguns fatores do sistema (tais como os fatores V,
VIII e XI).
34
Outras funções biológicas são atribuídas a essa protease uma vez que ela
possui alvos específicos em diferentes tipos celulares. A trombina também é
considerada um potente agonista plaquetário, promovendo a sua mudança de
forma e a liberação de outros ativadores como o ADP, serotonina e o
tromboxano A2, por meio da clivagem de receptores do tipo PAR (Dahlbäck,
2004). Além disso, a trombina é capaz de induzir a exposição da molécula de
adesão P-selectina e do ligante CD40 na superfície de plaquetas ativadas, além
de ativar a integrina αIIb/β3.
1.5.3 Mecanismos de inibição da coagulação sangüínea
As reações da coagulação são moduladas por mecanismos extremamente
complexos, uma vez que é fundamental para a hemostase que não haja a
formação de coágulos em locais inapropriados.
Um dos principais mecanismos de regulação da coagulação sangüínea
envolve a participação de inibidores das serinoproteases (serpinas) presentes no
plasma. Entre as serpinas destacam-se a antitrombina (AT) e o cofator II da
heparina (HCII). Esses inibidores ligam-se covalentemente à trombina, formando
um complexo covalente, no qual a enzima é inativa.
A antitrombina (AT), é uma glicoproteína com peso molecular de 58 kDa,
sintetizada pelo fígado. Está presente no plasma numa concentração de
aproximadamente 2,6 μM e é o principal inibidor fisiológico da trombina e do fator
Xa (Bombeli e cols, 1997). Durante a reação de inibição, a protease cliva a ligação
35
peptídica entre os resíduos Arg
393
e Ser
394
da molécula de antitrombina, liberando um
pequeno segmento peptídico e liga-se covalentemente ao restante da molécula. Essa
ligação inativa as duas proteínas do complexo de forma irreversível (Gils e Declerk,
1998; Carrel e col., 2001). A AT é relativamente ineficiente como inibidor na ausência de
PG de HS, presentes na superfície do endotélio ou da heparina (Jin e col., 1997). Na
presença desses GAGs, a taxa de inibição da antitrombina é acelerada em milhares de
vezes na ordem de magnitude (Olson e Björk, 1992).
O HCII é também uma glicoproteína presente no plasma em uma
concentração de aproximadamente 1,2 μM com peso molecular estimado em 66
kDa. O HCII também possui uma fraca atividade inibitória da trombina na ausência de
GAGs. Sua atividade in vivo é atribuída a presença de PGs de DS, encontrados
principalmente na matriz extracelular e em pequenas quantidades na superfície de
células endoteliais (Bombelli e col., 1997). A ação do HCII é mais específica do que
a da AT, visto que o HCII inibe exclusivamente a trombina.
36
1.5.4 Glicosaminoglicanos na coagulação sangüínea
Entre as várias atividades exibidas pelos GAGs, a anticoagulante e a
antitrombótica são as mais estudadas, sendo diretamente aplicadas na clínica
médica. Há mais de 70 anos a heparina vem sendo utilizada clinicamente, como
um importante agente terapêutico no tratamento de pacientes com trombose.
Essa atividade anticoagulante dos GAGs acontece por meio da
potencialização da ação dos inibidores plasmáticos da trombina, AT e HCII. Ao
ligar-se a GAGs, esses inibidores aumentam significativamente a velocidade de
inibição da trombina.
A heparina liga-se à AT, causando-lhe uma alteração conformacional que
expõe seu sítio reativo à trombina, aumentando a taxa de formação do complexo
AT-Trombina. Além disso, a heparina é capaz de se ligar ao exosítio II da
trombina, funcionando como uma ponte e assim aproximando a trombina da AT
(Olson e Bjork, 1992).
A atividade anticoagulante do DS, diferente daquela observada para
heparina, acontece exclusivamente através da sua ligação ao sítio de ligação a
GAGs do HCII, e é capaz de aumentar a taxa de inibição da trombina em cerca
de 1000 vezes (Tollefsen e col.,1983). Esse GAG não é capaz de inibir a
trombina através da AT.
O HCII pode ter sua atividade potencializada tanto pela heparina quanto
pelo DS. Quando um desses GAGs se liga ao HC II, esse expõe seu sítio reativo
à trombina. Nesse caso também ocorre um efeito ponte entre as duas proteínas
37
gerado pela alteração conformacional induzida pela ligação do GAG (Figura 11).
A molécula de HCII liga-se ao exosítio I da trombina por um domínio N-terminal
de sua cadeia. A ligação do GAG à trombina parece não ser necessária como no
mecanismo de inibição via AT. Mutações em aminoácidos aniônicos do exosítio
II da trombina não alteram os níveis de inibição da trombina estimulada por DS e
têm pouco efeito quando a inibição é estimulada por heparina (Sheehan e col,
1994).
Trombina
Figura 11 - Desenho esquemático do mecanismo de inibição da trombina pelo HCII,
mostrando a influência dos GAGs na formação do complexo Trombina-HCII
(Reproduzido de Tollefsen, 1994).
38
1.6 Aspectos gerais sobre a trombose
Nas últimas décadas, as doenças tromboembólicas aumentaram em todo o
mundo, sendo responsáveis por aproximadamente 44% das mortes em países em
desenvolvimento. Estas patologias vêm aumentando significativamente quando
comparadas a outras doenças, como câncer e doenças infecto-parasitárias. Atualmente,
estima-se que para cada grupo de 1.000 pessoas, cerca de 2 a 4 delas utilizam
anualmente algum tipo de terapia anticoagulante, gerando um gasto anual de cerca de 3
bilhões de dólares na aquisição de agentes terapêuticos (Li e col., 2004).
Uma série de eventos pode estar relacionada aos processos tromboembólicos,
dentre os quais podemos citar: alteração da coagulação sangüínea, lesão da parede
vascular, modificação no conteúdo de leucócitos e plaquetas circulantes e eventos de
estase. A importância relativa de cada um destes eventos permanece em discussão.
Cada tipo de trombose envolve a preponderância de um ou vários agentes em
combinações. Por exemplo, na trombose arterial a agregação plaquetária é uma etapa
crítica, enquanto na trombose venosa predominam a estase e o aumento da coagulação
do sangue como os agentes desencadeantes da trombose. Entretanto, em todas as
circunstâncias, a coagulação do sangue é considerada um elemento chave para a
formação de trombos. Atualmente, acredita-se que a natureza das lesões
tromboembólicas é mais bem entendida no contexto de sinalizações específicas de cada
leito vascular (Rosenberg e Aird, 1999).
39
1.6.1 Glicosaminoglicanos na trombose
A heparina é um polissacarídeo sulfatado que ocorre em grânulos no interior de
mastócitos. Sua obtenção para uso clínico é feita através da extração de tecidos, como
pulmão de bovinos e intestino de suínos. A heparina é um dos compostos naturais com
maior emprego na medicina, suplantada apenas pelo hormônio insulina. A potente
atividade anticoagulante da heparina é atribuída a sua capacidade de potencialização
da antitrombina e do HCII, relatados como os maiores inibidores das enzimas da
coagulação, em particular da trombina e do fator Xa.
A heparina possui em sua estrutura, uma seqüência pentassacarídica com uma
composição específica de açúcares e um padrão distinto de sulfatação e esta seqüência
é requerida para a interação com a AT (Lindahl e Bjork, 1983). A heparina ativa a
antitrombina através de dois mecanismos distintos, cuja contribuição relativa depende
da protease inibida. Um destes mecanismos envolve a mudança conformacional da
antitrombina e outro a formação de um complexo ternário entre a protease, o cofator
plasmático e o polissacarídeo. Em ambos os mecanismos, a antitrombina liga-se à
sequência pentassacarídica específica da heparina, sofrendo uma mudança
conformacional. Esta mudança é suficiente para acelerar a inibição do fator Xa. No
entanto, para a trombina, além da ativação da AT, a reação requer a ligação do inibidor
e da protease à mesma cadeia de GAG, formando um complexo ternário, onde a
heparina atua como superfície de aproximação (Streusand e col., 1995).
O efeito da heparina na inibição da trombina também é mediado pelo HCII. Para
esse mecanismo de inibição, não há indicação de uma seqüência oligossacarídica
específica na heparina, responsável pela interação com o inibidor (Tollefsen, 1994).
40
Entretanto, cadeias de heparina com mais de vinte resíduos são necessárias para a
catálise da reação (Liaw e col., 1999).
Apesar de ser uma droga de amplo uso clínico e eficácia reconhecida em eventos
tromboembólicos, a heparina apresenta uma série de efeitos indesejáveis, como
trombocitopenia (Warkentin, 1999; Visentin, 1999), hemorragia (Kelton e Hirsh, 1980),
incapacidade de ação em indivíduos com deficiências congênitas ou adquiridas de AT e
incapacidade de inibir trombina ligada à fibrina (Liaw e col., 2001), entre outras.
O DS é um GAG usualmente isolado de mucosa intestinal de bovinos e suínos,
mas também é encontrado em invertebrados marinhos (Vicente e col., 2004). O efeito
anticoagulante do DS é exercido através do HCII, aumentando a taxa de inibição da
trombina em cerca de 1000 vezes (Tollefsen e col., 1983).
Durante o processo de inibição, o HCII se liga preferencialmente a um sítio de
alta afinidade na cadeia de DS, constituído de três unidades dissacarídicas consecutivas
formadas por IdoA 2-O sulfatado e GalNAc 4-O-sulfatada (Maimone e Tollefsen, 1990).
O mecanismo molecular de ativação do HCII pelo DS ou pela heparina difere do descrito
para antitrombina. Nesse caso, o efeito estimulatório do GAG depende da presença de
um domínio polipeptídico ácido perto da região N-terminal do HCII. Após se ligar nesse
domínio, o GAG rompe interações moleculares no HCII, que levam a interação do seu
domínio N-terminal com o exosítio I da trombina, facilitando o ataque proteolítico da
enzima ao sítio reativo do HCII (Tollefsen, 1994).
O DS é também um agente antitrombótico, atualmente usado após cirurgias de
quadril e hemodiálise, e também como terapia anticoagulante para pacientes com
trombocitopenia induzida pelo uso de heparina (Nenci, 2002).
41
2. OBJETIVOS
1) Isolar, caracterizar e avaliar a distribuição tecidual dos
glicosaminoglicanos sulfatados presentes nos três órgãos elétricos (Principal,
Sachs e Hunter) da enguia elétrica Electrophorus electricus,
2) Isolar, caracterizar e avaliar in vitro e in vivo as atividades
anticoagulante, antitrombótica, assim como os efeitos sobre o tempo de
sangramento na presença do dermatam sulfato purificado da pele da enguia
elétrica.
3) Avaliar o potencial anti-inflamatório do dermatam sulfato obtido da
pele da enguia utilizando um modelo in vivo de inflamação induzida por LPS.
42
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Obtenção do Eletrophorus electricus (L.)
Os exemplares de E. electricus (L.)
foram obtidos por intermédio do
Museu Paraense Emílio Goeldi. Ao chegar, os peixes foram mantidos em tanques
apropriados com boas condições de sobrevivência, sendo alimentados com
alevinos de tilápias vivos obtidos na Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro,
até o dia de experimentação.
3.2 Material
Condroitim 4-sulfato de cartilagem de baleia, condroitim 6-sulfato de
cartilagem de tubarão, DS de pele de porco, HS e papaína bicristalizada (15 U/mg)
foram adquiridos de Sigma Chemical Co. Condroitinase AC de Arthrobacter
aurescens, Condroitinase ABC de Proteus vulgaris, Condroitinase B de
Flavobacterium heparinum
foram adquiridas da Sigma chemCo, EUA .
A α-trombina humana, α-trombina bovina, γ-trombina e o cofator II da heparina
foram obtidos da “Haematologic Technologies Inc”. O padrão internacional de
heparina (85/502) foi obtido do “National Institute for Biological Standards and
Controls, Potters Bar”, Reino Unido. O substrato cromogênico para trombina (S-
2238) foi obtido da “Chromogenix AB”, Mondal, Suécia. A tromboplastina e a
43
cefalina ativada foram obtidas da “Celite Biolab”, São Paulo. Ácido tiobarbitúrico
foi obtido da Sigma chemCo, EUA e Diff-Quick (Shandon, EUA).
3.3 Dissecção dos órgãos elétricos e da pele
O animal foi anestesiado em um recipiente contendo Uretana (2,0 g/L de
água filtrada gelada), em seguida sacrificado e decapitado na região crânio-dorsal.
Após a morte do peixe, os órgãos elétricos (Principal, Sachs e Hunter) e a
amostras de pele foram dissecados e colocados em acetona.
3.4 Purificação dos GAGs sulfatados
Os órgãos elétricos e as amostras de pele foram colocados na estufa a
60ºC para a remoção da acetona. Os tecidos secos foram pesados e incubados
em tampão acetato de sódio (pH 5,5) contendo papaína na presença de 5 mM
EDTA e 5 mM cisteína a 60°C por 24h. A suspensão foi centrifugada a 3000g por
30 min à temperatura ambiente e o sobrenadante, que contém os GAGs, foi
incubado com CPC 10% (Cloreto de cetilpiridina) por 24h à temperatura ambiente.
A suspensão foi centrifugada a 3000g por 30 min em temperatura ambiente e o
complexo GAG-CPC presente no precipitado foi solubilizado com NaCl 2 M/etanol
1:10 (v/v), e em seguida os GAGs livres foram precipitados por 24 h pela adição
de 2 volumes de etanol absoluto. O precipitado contendo os GAGs foi recolhido
por centrifugação, como descrito acima, e lavados com etanol 80% por duas vezes
(para a remoção de sal). Finalmente, o precipitado foi colocado em estufa a 60ºC
para secagem. Depois de secos, os GAGs foram ressuspendidos em água Milli-Q.
44
Os GAGs purificados foram aplicados numa coluna Mono Q- acoplada a um
FPLC, equilibrada com 20 mM Tris:HCl (pH 8,0), depois eluídos em um gradiente
descontínuo de 0,6 M NaCl e 3,0 M NaCl. As frações obtidas da coluna foram
dialisadas e liofilizadas.
3.5 Identificação dos GAGs sulfatados
Os GAGs foram caracterizados por uma série de métodos bioquímicos que
incluíram: eletroforese em gel de agarose, digestão com enzimas específicas,
tratamentos químicos, eletroforese em gel de poliacrilamida, como descritos a
seguir:
3.5.1 Eletroforese em gel de agarose
As amostras foram aplicadas, antes e depois do tratamento com
condroitinases AC, ABC, B ou clivagem deaminativa com ácido nitroso, assim
como uma mistura padrão contendo GAGs dos tipos condroitim 4-sulfato, DS e HS
em um gel de agarose 0,5% em tampão 0,05 M 1,3 diamino propano : acetato (pH
9,0). Após a eletroforese os GAGs foram fixados no gel com 0,1% de brometo de
N-acetil-N,N,N-trimetilamônio (CETAVLON) em água, e corados com azul de
toluidina 0,1% em ácido acético: etanol: água (0,1: 5: 5, v/v/v) (Silva, 2002).
45
3.5.2 Digestão com condroitinases AC, ABC e B
Os GAGs purificados foram incubados com 0,3 unidades de condroitinases
AC, ABC e B por 12h a 37°C em solução 50 mM Tris/HCl (pH 8,0), contendo 5 mM
EDTA e 15 mM de acetato de sódio (Saito e cols., 1968).
3.5.3 Desaminação com ácido nitroso
Os GAGs foram incubados com ácido nitroso em pH 1,5 recém preparado
em temperatura ambiente, por 30 min. A reação foi em seguida neutralizada com
1,0 M de carbonato de sódio (Shively e Conrad., 1976).
3.5.4 Eletroforese em gel de poliacrilamida
Os GAGs foram aplicados em um gel de poliacrilamida 6% com 1 mm de
espessura. A eletroforese foi desenvolvida a 100 V por aproximadamente 1 h em
0,06 M de barbital sódico (pH 8,6), o gel foi em seguida corado com azul toluidina
0,1% em ácido acético 1%. Após serem corados o gel foi lavado por 6 horas em
ácido acético 1% (Fernandez-Landeira e cols., 2000).
46
3.5.5 Análise dos dissacarídeos por HPLC
Os GAGs purificados foram submetidos a digestão exaustiva com
condroitinase ABC. Os dissacarídeos formados e o GAGs resistentes ao
tratamento (em alguns casos HS) foram recuperados por gel filtração em uma
coluna Superdex-Peptide (Amerham Pharmacia Biotech) em sistema de HPLC
(Shimadzu, Tóquio, Japão). A coluna foi eluida com água destilada:acetonitrila:
acido trifluoroacetico (80:20:01 v/v/v) com fluxo de 0,5 mL/min e frações de 0,5
mL foram coletadas sendo monitoradas pela absorbância de 232 nm (para
detecção de dissacarídeos).
As frações correspondentes aos dissacarídeos formados foram agrupadas,
congeladas e liofilizadas. Os dissacarídeos formados pela ação da enzima e os
padrões foram analisados em uma coluna analítica de troca iônica forte SAX-
HPLC (Sigma-Aldrich). Após ter equilibrado a coluna com a fase móvel (água
destilada a pH 3,5, ajustada com HCl) a um fluxo de 0,5 mL/min, as amostras
foram injetadas e os dissacarídeos eluídos com um gradiente linear de 0 a 1,5 M
de NaCl na mesma fase móvel.
47
3.6 Histoquímica
3.6.1 Detecção dos glicosaminoglicanos sulfatados dos órgãos elétricos por
histoquímica
Os órgãos elétricos foram dissecados e fixados em paraformaldeido 4% a
4°C em tampão fosfato Sorensen (0,1 M, pH 4,0). Após serem fixados e lavados,
os tecidos foram desidratados em etanol e embebidos em parafina. Os cortes de 5
μm foram obtidos, coletados em uma lâmina, desparafinizados e corados com
corante catiônico azul de 1,9-dimetilmetileno (DMB) (Farndale e cols., 1986) ou
com hematoxilina-eosina. Os cortes foram depois examinados e digitalizados no
programa Image-Pro Plus (mídia cybernetics) em campo claro no microscópio
Nikon E400.
3.6.2 Detecção do CS por Imunohistoquímica dos órgãos elétricos
Os cortes foram desparafinados com xilol e hidratados em banhos
sucessivos com etanol 80%, 70% e tampão fosfato salino (TPS) 0,01 M (pH 7,4).
Em seguida foram tratados com tripsina 0.1% (pH 7,8) a 37º C e lavados com TPS
0.01 M (pH 7,4). Para a inativação da peroxidase endógena os cortes foram
imersos em uma solução de peróxido de hidrogênio a 30% em metanol e depois
lavados novamente com TPS 0.01 M (pH 7,4). Para bloquear os sítios
inespecíficos, os cortes foram incubados com soro normal de cabra 1% em
câmara úmida a temperatura ambiente. Logo após foram incubados com o
anticorpo primário anti –CS (Sigma) por 12h a 4º C e lavados com TPS 0.01 M (pH
48
7,4). Depois foram incubados com o anticorpo secundário (reagente C 1:150 – Kit
Dako Strep ABC complex) por 30 minutos à temperatura ambiente que foi seguido
de lavagem com TPS 0.01 M (pH 7.4). Após essa etapa, os cortes foram
incubados com 3,3 diaminobenzidina tetrahidroclorídrico (DAB) até obter uma
coloração acastanhada que foi monitorada pelo microscópio. Foram lavados com
água destilada e imersos em hematoxilina de Mayer 1:6 por três minutos a
temperatura ambiente. Em seguida, foram desidratados em banhos sucessivos
com etanol 70%, 80%, 90% e absoluto e depois clarificados com xilol. As lâminas
foram montadas em Entelan e examinadas e digitalizadas no programa Image-Pro
Plus (mídia cybernetics) em campo claro no microscópio Nikon E400.
3.7 Tempo de tromboplastina parcial ativada (APTT)
Os testes de APTT foram realizados de acordo com a metodologia descrita
por Anderson e col. (1976), com uso de um coagulômetro Amelung KC4A (Sigma
Diagnostics). Inicialmente foram colocados em cada cubeta, 90 μL de plasma
humano pobre em plaquetas e 10 μL da solução de DS de pele de enguia elétrica
em diferentes concentrações. O material foi incubado a 37
o
C por 1 min e após
esse tempo 100 μL de cefalina ativada (Celite Biolab) foi adicionado. Após
incubação de 2 min a reação foi disparada com adição de 100 μL de CaCl
2
25 mM
e o tempo necessário para formação do coágulo registrado.
49
3.8 Inibição da trombina mediada pelo cofator II da heparina na presença do
DS de pele de enguia elétrica
Para a realização deste ensaio, foram adicionados por poço da placa de
ELISA, 30 μL de tampão Tris-HCl 15 mM, pH 7,4 com NaCl 0,15 M e PEG 8.000 1
mg/mL, 10 μL da solução do DS em diferentes concentrações, cofator II da
heparina (120 nM) e 10 μL de α-trombina humana (20 nM). A mistura foi
submetida à agitação por 10 seg, seguida de incubação por 1 min a 37
o
C. Após
esse tempo, 25 μL de substrato cromogênico S-2238 (0,4 mM) foram adicionados
e a absorbância a 405 nm registrada continuamente por 5 min a 37
o
C. Nas
condições experimentais, a taxa de mudança da absorbância foi proporcional à
atividade residual da trombina na reação.
3.9 Animais
Os experimentos de trombose e tempo de sangramento, foram realizados
com ratos do tipo Wistar, pesando entre 150 e 200 g, previamente anestesiados
com uma mistura de xilasina e ketamina, 16 mg/kg e 100 mg/kg de peso corpóreo,
respectivamente. Os animais foram mantidos no biotério do Instituto de Bioquímica
Médica da UFRJ. Todos os procedimentos foram realizados com um número
mínimo de 4 ratos para cada dado obtido, seguindo as leis regimentais para
experimentação com animais de laboratório.
50
Foram utilizados camundongos isogênicos da linhagem C57BL/6 machos,
pesando entre 20 e 25 gramas. Esses animais foram obtidos no Núcleo de
Animais de Laboratório (NAL) da Universidade Federal Fluminense. Os animais
foram mantidos no biotério do Laboratório de Imunofarmacologia Celular, com um
ciclo de luz de 12 horas claro e escuro com oferta de ração (Purina, Brasil) e água
ad libitum, de acordo com as normas de utilização de camundongos em
laboratório.
3.10 Modelo de trombose venosa
Ratos devidamente sedados foram submetidos a uma incisão ventral e a
veia cava dissecada. Um segmento de 0,7 cm, que se estende da ramificação da
veia renal direita até sua posição mais proximal, foi isolado com o auxilio de fio
cirúrgico, que envolviam as extremidades do segmento em 3 nós frouxos. Após
esse procedimento, uma solução contendo o DS de pele de enguia elétrica foi
injetada na veia cava, 1 cm abaixo da extremidade inferior e deixado circular por 5
min. Posteriormente, uma solução de tromboplastina (5 mg/Kg) foi injetada na
mesma região e imediatamente após, todos os nós foram atados, criando um
segmento de veia em estase. Decorridos 15 min, uma das extremidades do
segmento venoso isolado foi cortado e o(s) trombo(s) foram retirados, lavados
rapidamente em solução de NaCl 0,15 M e postos para secar em estufa a 37
o
C.
Os pesos dos trombos obtidos foram comparados com os pesos dos trombos
controle e os resultados expressos em percentual.
51
3.11 Tempo de sangramento
Diferentes doses do DS de pele de enguia elétrica foram infundidas em
ratos através da artéria carótida, previamente canulada. O DS foi deixado em
circulação por 5 min e após esse tempo foi feito um corte de 3 mm na extremidade
da calda. Após isso, a calda foi imersa em uma proveta contendo 40 mL de água
destilada e deixada por um tempo de 60 min. A perda de sangue foi determinada
pela dosagem de hemoglobina na água (A
540 nm
) após o tempo experimental e
expressa em μL de sangue perdido, com base em uma curva de concentração
previamente estabelecida.
3.12 Efeito do DS da pele do Electrophorus electricus (L.) na migração de
neutrófilos.
Uma hora após a administração de diferentes doses de DS de pele da
enguia elétrica intraperitonealmente, os camundongos C57BL/6 foram colocados
para a inalação de LPS, em uma câmara composta de 8 tubos de vidro acoplados
a um kitazato de 1 litro. Foram vaporizados 2 mL de LPS para o interior do kitazato
com o auxílio de uma bomba de pressão positiva. Os animais foram sacrificados
por deslocamento cervical após 3 horas e suas traquéias expostas, canuladas e
os pulmões lavados com solução salina fisiológica para um volume final de 1,5 mL
colocados em tubos mantidos a 4°C. Uma alíquota de 300 μL do lavado foi
utilizada para a contagem e identificação das células. O número total de células foi
52
determinado em um contador de células do tipo Coulter Counter (Couter Eletronics
Inc. – EUA). A identificação dos diferentes tipos de células presentes no LBA foi
feita após a citocentrifugação de 100 μL de LBA a 80 x g por um minuto. As
lâminas preparadas a partir da citocentrifugacão foram coradas com o kit Diff-
Quick (Shandon – EUA). Foram contadas cerca de 200 células em cada lamina. A
identificação foi baseada conforme as descrições morfológicas decritas por
Stevens e Lowe (1995).
53
4. RESULTADOS
4.1 1ª Parte: Órgãos Elétricos do Electrophorus electricus (L.)
4.1.1 Purificação, caracterização e peso molecular dos GAGs sulfatados
isolados dos órgãos elétricos do Electrophorus electricus (L.).
Os GAGs foram extraídos dos órgãos elétricos, após uma exaustiva digestão
proteolítica dos tecidos com papaína. Posteriormente, os GAGs foram precipitados
com CPC a 10%. O extrato bruto contendo os GAGs, foi purificado em coluna de
troca iônica Mono-Q-FPLC. A coluna foi eluída inicialmente com um tampão
contendo 0.6 M de NaCl (para a remoção do AH) e posteriormente com tampão
contendo 3.0 M de NaCl para a obtenção dos GAGs sulfatados.
As soluções obtidas foram dialisadas contra água destilada e liofilizadas. Os
GAGs purificados foram pesados, e em seguida ressupendidos em água Milli-Q e
analisados por eletroforese em gel de agarose. Para os três órgãos elétricos, a
porção majoritária dos GAGs sulfatados apresentou uma migração eletroforética
semelhante aquela do padrão de CS. A parte inferior da banda eletroforética
apresentou uma migração semelhante a do padrão de DS. (Figura 12).
A identificação dos GAGs sulfatados presentes nos diferentes órgãos elétricos,
foi obtida através dos tratamentos enzimáticos com condroitinase AC (que
degrada especificamente o CS), condroitinase ABC (que degrada especificamente
CS e DS), condroitinase B (que degrada especificamente o DS) (Figura 12) ou
54
tratamento deaminativo com ácido nitroso (que degrada GAGs contendo
glicosaminas N-sulfatadas que ocorrem em HS). (Figura 13)
Nos três órgãos elétricos, tanto a banda com migração eletroforética
semelhante a do padrão de CS quanto ao de DS foram sensíveis aos tratamentos
com as condroitinases AC e ABC, enquanto somente a banda com mobilidade
semelhante ao DS (parte inferior), foi sensível ao tratamento com condroitinase B.
Baseado nestes comportamentos podemos identificar a banda superior como
sendo composta de CS e a banda inferior (com migração eletroforética
semelhante ao DS) como sendo uma cadeia híbrida de CS/DS (Figura 12).
Para obter uma melhor caracterização do HS nos três órgãos elétricos,
alíquotas com um volume 10 vezes superior ao aplicado anteriormente em gel de
agarose foram concentradas, tratadas exaustivamente com condroitinase ABC e
submetidas a eletroforese em gel de agarose (Figura 13). Uma banda com
mobilidade eletroforética semelhante ao padrão de HS e que foi sensível ao
tratamento com ácido nitroso pode ser observada no órgão elétrico Principal e no
de Hunter, enquanto que no órgão de Sachs nenhuma banda pôde ser observada
(Figura 13).
55
CS -
DS -
HS -
Princi
p
al
Sachs
CS -
DS -
HS -
Hunte
r
CS -
DS -
HS -
+
_ Origem
- + - -
- - + -
- - - +
Condroitinase ABC
Condroitinase B
Condroitinase AC
Figura 12 – Caracterização dos GAGs dos órgãos elétricos.
Eletroforese em gel de agarose dos órgãos elétricos Principal, Sachs e Hunter
antes (-) e após (+) os tratamentos enzimáticos com condroitinases AC, B e ABC.
56
a) Principal b) Sachs c) Hunter
4.1.2 Composição dissacarídica dos CS e CS/DS purificados dos órgãos
elétricos do Electrophorus electricus (L.).
Foram analisadas as composições dissacarídica dos CS e CS/DS,
presentes nos três órgãos elétricos, numa tentativa de evidenciarmos diferenças
estruturais. As frações de GAGs purificadas foram tratadas exaustivamente com
condroitinase ABC e submetidas a uma cromatografia de gel filtração. Os GAGs
sulfatados resistentes a esse tratamento (HS) foram recuperados e guardados. As
frações, contendo os dissacarídeos obtidos do CS e CS/DS foram recuperadas e
submetidas a uma cromatografia de troca iônica acoplada a um sistema de HPLC.
A análise das unidades dissacaridicas derivadas dos CS e CS/DS do órgão
elétrico Principal, mostrou a predominância de unidades 6-monosulfatadas (48%),
seguida das unidades 2,4-dissulfatada (26%), não-sulfatada (13%), 4-
monosulfatada (11%) e 2,6-dissulfatada (2%). (Tabela I).
Figura 13 – Caracterização dos HS nos órgãos elétricos.
Eletroforese em gel de agarose dos órgãos elétricos (a) Principal, (b) Sachs e (c)
Hunter antes (-) e após (+) o tratamento químico com ácido nitroso.
CS -
DS -
HS -
_ Origem
Ácido Nitroso
- + - + - +
+
57
Tabela (I): Análise dissacarídica dos CS e CS/DS do órgão elétrico Principal.
Os CS e CS/DS do órgão de Sachs apresentam majoritariamente unidades
dissacaridicas 4-monosulfatadas em torno de 39%. As unidades não-sulfatadas e
6-monosulfatadas, apresentam valores similares em torno de 20%, enquanto as
unidades 2,6-dissulfatadas e 2,4-disulfatadas correspondem a 16% e 5%,
respectivamente (Tabela II).
1- α – ΔUA - 1Æ 3 GalNAc
2
2
-
-
α
α
-
-
Δ
Δ
U
U
A
A
-
-
1
1
Æ
Æ
3
3
G
G
a
a
l
l
N
N
A
A
c
c
(
(
6
6
S
S
O
O
4
4
)
)
3- α - ΔUA - 1 Æ 3 GalNAc(4SO4)
4- α - ΔUA - 1 (2SO4) Æ 3 GalNAc(6SO4)
5- α – ΔUA -1 (2SO4) Æ 3 GalNAc(4SO4)
1
1
3
3
4
4
8
8
1
1
1
1
2
2
2
2
6
6
P
P
r
r
o
o
p
p
o
o
r
r
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a
a
c
c
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r
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í
d
d
e
e
o
o
s
s
Tabela (II): Análise dissacarídica dos CS e CS/DS do órgão elétrico de Sachs.
1- α – ΔUA - 1Æ 3 GalNAc
2
2
-
-
α
α
-
-
Δ
Δ
U
U
A
A
-
-
1
1
Æ
Æ
3
3
G
G
a
a
l
l
N
N
A
A
c
c
(
(
6
6
S
S
O
O
4
4
)
)
3- α - ΔUA - 1 Æ 3 GalNAc(4SO4)
4- α - ΔUA - 1 (2SO4) Æ 3 GalNAc(6SO4)
5- α – ΔUA -1 (2SO4) Æ 3 GalNAc(4SO4)
P
P
r
r
o
o
p
p
o
o
r
r
ç
ç
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o
o
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s
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a
a
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d
e
e
o
o
s
s
2
2
0
0
2
2
0
0
3
3
9
9
1
1
6
6
5
5
58
Os CS e CS/DS do órgão de Hunter apresentam unidades dissacarídicas
não-sulfatada, 6-monosulfatada e 2,6-dissulfatada em torno de 32%, e um
conteúdo diminuto de unidades 4-monosulfatada (5%) (Tabela III).
De um modo geral, podemos observar que existe uma marcante
variabilidade de unidades dissacarídicas presentes nas cadeias de CS e CS/DS
entre os três órgãos elétricos estudados.
Tabela III: Análise dissacarídica dos CS e CS/DS do órgão elétrico Hunter.
1- α – ΔUA - 1Æ 3 GalNAc
2
2
-
-
α
α
-
-
Δ
Δ
U
U
A
A
-
-
1
1
Æ
Æ
3
3
G
G
a
a
l
l
N
N
A
A
c
c
(
(
6
6
S
S
O
O
4
4
)
)
3- α - ΔUA - 1 Æ 3 GalNAc(4SO4)
4- α - ΔUA - 1 (2SO4) Æ 3 GalNAc(6SO4)
5- α – ΔUA -1 (2SO4) Æ 3 GalNAc(4SO4)
P
P
r
r
o
o
p
p
o
o
r
r
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ç
ã
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o
o
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a
a
c
c
a
a
r
r
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í
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d
e
e
o
o
s
s
3
3
1
1
3
3
1
1
5
5
3
3
2
2
1
1
59
4.1.3 Localização Histoquímica e Imunohistoquímica dos GAGs sulfatados
nos Órgãos Elétricos.
Análises histoquímicas também foram desenvolvidas a fim de localizar os
GAGs presentes nos diferentes órgãos elétricos. Os cortes histológicos de cada
órgão foram corados com hematoxilina e eosina para verificar a integridade dos
tecidos. Nossos achados histológicos confirmaram as características morfológicas
dos três órgãos elétricos. A unidade celular morfológica e funcional do órgão
elétrico é um sincisium multinucleado chamado eletroplaca ou eletrócito. Cada
eletrócito está localizado no interior de um septo composto de tecido conjuntivo, e
disposto por pilhas em arranjos superpostos um após o outro (dados não
mostrados). Posteriormente, os cortes histológicos dos três órgãos elétricos,
foram corados com um corante catiônico, o DMB (que revela a presença de
glicosaminoglicanos sulfatados por uma coloração violeta) e marcados com
anticorpo anti-CS, cuja coloração positiva é castanha.
Em todos os três órgãos elétricos, tanto a coloração com DMB quanto com
o anticorpo anti-CS, é possível observar marcação nos septos longitudinal e
transversal, contudo, com uma forte marcação na face inervada das eletroplacas.
(Figuras 14 e 15).
60
Órgão elétrico Principal
Imuno-marcação com anti -CS Coloração com DMB
A
C
B D
Figura 14 - Histoquímica e Imunohistoquímica do Órgão elétrico Principal.
Fotomicrografias, do órgão elétrico Principal, coradas com DMB (A,B) e com
anti-corpo anti-CS (C,D). Insert em D: controle negativo. (A, C) 100X; (B, D)
400X; insert 400X. Observe a abundante presença de material metacromático
violáceo (A,B) e produto da reação com peroxidase (C,D), distribuído pelos
septos longitudinais e transversais e concentrado na fase inervada das
eletroplacas ( ).
61
Imuno-marcação com anti -CS Coloração com DMB
Hunter
Figura 15 - Histoquímica e Imunohistoquímica dos órgãos elétricos de Hunter e de
Sachs. Fotomicrografias dos órgãos elétricos de Hunter (A,C) e de Sachs (B,D), coradas
com DMB (A,B) e com anti-corpo anti-CS (C,D). (A,B) 100X, (C,D) 40X. Observe a
abundante presença de material metacromático violáceo (A,B) e produto da reação com
peroxidase (C,D), distribuído pelos septos longitudinais e transversais e concentrado na
fase inervada das eletroplacas (
).
A
C
Sachs
B
D
62
4.2 2ª Parte: Pele do Electrophorus electricus (L.)
4.2.1 Purificação, caracterização e massa molecular dos GAGs sulfatados
obtidos da pele do E. electricus (L.).
Os procedimentos para a purificação, caracterização e determinação da
massa molecular dos GAGs sulfatados da pele foram idênticos aos descritos
anteriormente para os GAGs dos órgãos elétricos.
Os GAGs sulfatados purificados da pele da enguia elétrica foram
caracterizados por eletroforese em gel de agarose, antes e após o tratamento
enzimático com condroitinases AC e ABC. Foi possível observar uma única banda
com migração eletroforética semelhante ao padrão de DS, que foi levemente
reduzida pelo tratamento com condroitinase AC (que degrada especificamente o
CS) e completamente removida pelo tratamento com condroitinase ABC (que
degrada tanto o CS quanto o DS), mostrando que o DS é a principal espécie de
GAG sulfatado encontrado na pele da enguia elétrica. Baseado no pequeno
decréscimo apresentado pela banda eletroforética após o tratamento com
condroitinase AC, conclui-se que uma pequena contaminação com CS está
presente na fração de DS. Além disso, foi observada ainda uma discreta banda,
após o tratamento enzimático com condroitinase ABC, que pode corresponder a
uma pequena contaminação com HS (Figura 16).
63
CS -
DS -
_ Origem
+
HS -
Condroitinase AC - + -
Condroitinase ABC - - +
Figura 16 – Caracterização dos GAGs sulfatados da pele. Eletroforese em gel de
agarose dos GAGs sulfatados extraídos da pele do E. electricus, antes (-) e após (+) os
tratamentos enzimáticos com condroitinases AC e ABC.
A massa molecular do DS, purificado por gel filtração após o tratamento
com condroitinase AC (para a remoção de CS) foi avaliada através de eletroforese
em gel de poliacrilamida a 6%. O resultado obtido revelou que o DS da pele da
enguia elétrica apresenta uma mobilidade eletroforética similar tanto ao padrão de
condroitim 4-sulfato como ao DS extraído da mucosa intestinal de porco (MIP),
que possuem massa molecular aproximadamente de 40 Kda.
64
4.2.2 Análise estrutural do DS purificado da pele do Electrophorus electricus
(L.).
Foi analisada a composição dissacarídica do DS purificado da pele da
enguia elétrica. Para remover a presença de cadeias de CS (que afetaria a análise
dissacarídica das cadeias de DS), a fração de DS foi tratada exaustivamente com
condroitinase AC e aplicada em coluna de gel filtração. As frações contendo as
MIP E. electricus
Figura 17 – Avaliação do peso molecular do DS da pele da enguia elétrica. Eletroforese em gel
de poliacrilamida do DS purificado da pele do E. electricus (L.) e da mucosa intestinal de porco (MIP).
P1 corresponde ao padrão de Dextran sulfato (~500 KDa). P2 ao padrão de C6S, extraído de
cartilagem de tubarão (~60 KDa). P3 ao padrão de C4S, extraído da cartilagem de baleia (~40 KDa) e
P4 correspondente ao Dextran de baixo peso molecular (~8 KDa).
500 –
60 –
40 –
8 –
DS
(KDa)
Padrões
P1 P2 P3 P4
65
cadeias de DS (resistentes ao tratamento) foram agrupadas e liofilizadas, em
seguida foram re-supensas em água destilada e tratadas com condroitinase ABC.
Os dissacarídeos insaturados formados pela depolimerização das cadeias de DS
foram recuperados por gel filtração e analisados por cromatografia de troca iônica
forte (SAX) em um sistema de HPLC.
A análise das unidades dissacaridicas derivadas do DS mostrou a
predominância de unidades 4-monosulfatadas (72%), seguidas da unidade 2,4-
dissulfatada (14%), não sulfatada (2%), 4-monosulfatada (4%) e 2,6 dissulfatada
(8%) (Tabela IV).
1- α – ΔUA - 1Æ 3 GalNAc
2
2
-
-
α
α
-
-
Δ
Δ
U
U
A
A
-
-
1
1
Æ
Æ
3
3
G
G
a
a
l
l
N
N
A
A
c
c
(
(
6
6
S
S
O
O
4
4
)
)
3- α - ΔUA - 1 Æ 3 GalNAc(4SO4)
4- α - ΔUA - 1 (2SO4) Æ 3 GalNAc(6SO4)
5- α – ΔUA -1 (2SO4) Æ 3 GalNAc(4SO4)
P
P
r
r
o
o
p
p
o
o
r
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ç
ã
ã
o
o
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s
a
a
c
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a
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r
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í
d
d
e
e
o
o
s
s
2
2
4
4
7
7
2
2
8
8
1
1
4
4
Tabela (IV) - Análise dissacarídica do DS da pele da enguia elétrica.
66
4.2.3 Atividade anticoagulante do DS extraído da pele do Electrophorus
electricus
A atividade anticoagulante descrita para alguns tipos de DS apresenta
variações e ocorre através da inibição da trombina via HCII. Para medir a atividade
anticoagulante do DS extraído da enguia elétrica utilizamos o ensaio de APTT. Foi
observado que o DS da pele da enguia elétrica foi mais eficiente em prolongar o
APTT do que o DS de mucosa intestinal do mamífero (Figura 18).
0,01 0,1 1 10
40
60
80
100
120
Dermatam sulfato (mg/mL)
APTT (min.)
0,01 0,1 1 10
40
60
80
100
120
Dermatam sulfato (mg/mL)
APTT (min.)
Figura 18 - Atividade anticoagulante do DS da pele. O tempo de tromboplastina
parcial ativada (APTT) foi determinado na presença de concentrações crescentes de
DS usando plasma humano. O DS de mamífero foi usado para comparação.
Amostras: (ο) DS enguia elétrica e (●) DS de mamífero.
67
O DS da pele da enguia elétrica foi mais eficiente em inibir a trombina
através do HCII do que o DS de mamífero. O IC
50
para a inibição da trombina foi
aproximadamente 1.8 μg/mL para o DS de mamífero , comparado com 0.1μg/mL
para o DS da pele da enguia. O DS da enguia apresenta uma potencialização da
atividade do HCII em torno de 18 vezes maior do que aquela apresentada pelo DS
de mamífero (Figura 19).
Para verificar, a possível influência da pequena quantidade de HS presente
nas amostras de DS, preparações de DS foram previamente tratadas com
condroitinase ABC (que degrada o DS) e novamente testadas no ensaio de APTT,
após este tratamento as amostras tiveram seu efeito anticoagulante
completamente abolido. Da mesma forma, amostras de DS submetidas ao
tratamento com heparitinase (que degrada HS), apresentaram resultados similares
da inibição da trombina, quando comparada com as amostras de DS não tratadas.
Esses resultados mostram que a presença do HS é insignificante e não afeta as
propriedades anticoagulantes do DS purificado da pele da enguia elétrica E.
electricus.
68
4.2.4 Efeito do DS do Electrophorus electricus (L.) na trombose venosa
Foram testados os efeitos do DS da pele da enguia elétrica e de mucosa de
porco na trombose venosa. Estes foram administrados por via intravenosa e
deixados circular por 5 min. Após esse tempo, foi injetada uma solução de
tromboplastina (5 mg/kg de peso) e o segmento de veia isolado foi fechado. Após
estase de 15 min, o trombo formado foi seco e pesado.
O DS da pele da enguia apresenta uma curva dose-resposta distinta
daquela apresentada pelo DS de mamífero. O DS da enguia elétrica na dose de
0,8 mg/kg inibe aproximadamente 50% da trombose e na dose de 2,5 mg/kg
previne totalmente a formação do trombo em todos os animais testados. Já o DS
de mamífero na dose de 1,1 mg/kg provocou uma redução de 50% na trombose,
enquanto que na dose de 2,5 mg/kg a inibição foi de 80%.(Figura 20).
69
0,01 0,1 1 10
0
20
40
60
80
100
Dermatam sulfato (μg/mL)
Atividade da trombina (%)
0,01 0,1 1 10
0
20
40
60
80
100
Dermatam sulfato (μg/mL)
Atividade da trombina (%)
Figura 19 - Dose dependência do DS da enguia elétrica para a inativação da trombina pelo
HCII. Amostras: (○) DS pele e (●) DS de mamífero O DS de mamífero foi usado para
comparação. Os ensaios foram feitos com substrato cromogênico para a trombina (ver
Material e Métodos). Após 120 segundos, a atividade residual da trombina foi determinada
(A405nm/min).
70
Dermatam sulfato (mg/kg)
Trombose (%)
0,00,51,01,52,02
0
20
40
60
80
100
,5
Dermatam sulfato (mg/kg)
Trombose (%)
0,00,51,01,52,02
0
20
40
60
80
100
,5
Figura 20 - Dose dependência para a atividade antitrombótica de DS de pele de enguia
elétrica (○) e de DS de mamífero(●). A atividade antitrombótica foi investigada usando o
modelo da veia cava de ratos (ver Material e Métodos). Esta figura expressa a
percentagem do tamanho médio dos trombos em comparação ao trombo formado na
ausência de DS, sendo 100% representando a ausência de prevenção da trombose. A
trombose é expressa em função da concentração do DS mg/kg de peso.
71
4.2.5 Efeito do DS do Electrophorus electricus no tempo de sangramento
O risco hemorrágico do DS foi medido pela perda de sangue através
do corte feito na cauda do rato, 5 minutos após a administração intravascular do
DS. A cauda do rato foi cortada e imersa em 40 mL de água destilada à
temperatura ambiente. A perda de sangue foi determinada após 60 min dosando a
hemoglobina presente na água, através da absorbância a 540 nm. Na dose de 2.5
mg/kg, tanto o DS da pele da enguia elétrica quanto o DS de mamífero, não
modificaram significativamente a perda de sangue, quando comparado com os
ratos que receberam salina.
Tabela (V): Tempo de sangramento do DS de pele do E. electricus (L.). Efeito
do DS de mamífero e da pele de enguia elétrica no tempo de sangramento. DS de
mamífero e da pele de enguia elétrica (2.5 mg/Kg peso) foram injetados nos ratos
e circularam por 5 min. Os resultados foram expressos em μL.
Perda de sangue (μL)
a
Salina
DS pele da enguia elétrica
DS de mamífero
21 + 4
26 +
3
32 + 9
a
O volume de san
g
ue foi deduzido
p
ela curva
p
adrão de hemo
g
lobina a 540 nm.
72
4.2.6 Efeito do DS da pele do Electrophorus electricus (L.) na migração de
neutrófilos.
Foram feitos ensaios preliminares in vivo para avaliar o possível
efeito anti-inflamatório do DS da pele do Electrophorus electricus. Nestes
experimentos, foram injetados salina ou DS de pele de enguia elétrica em
diferentes concentrações (1, 5, 10 e 50 mg/Kg de peso do animal) em
camundongos BALB/c. Uma hora após as injeções, os animais foram
posicionados para a inalação de LPS. Nos camundongos que receberam injeções
de DS de pele de enguia elétrica, os lavados brônquio-alveolares realizados 3
horas após a inalação apresentaram uma diminuição no número de neutrófilos de
acordo com o aumento da concentração administrada de DS, quando comparados
com os valores encontrados para os animais injetados com salina (Figuras 21).
73
ctr
(n=3)
0
10
20
30
40
50
60
70
Neutrófilos
LPS
(n=5)
1
(n=3)
5
(n=4)
50
(n=4)
Dermatan sulfato (mg/kg)
Neutrófilos (x 10
3
/mL)
ctr
(n=3)
0
10
20
30
40
50
60
70
Neutrófilos
LPS
(n=5)
1
(n=3)
5
(n=4)
50
(n=4)
Dermatan sulfato (mg/kg)
Neutrófilos (x 10
3
/mL)
Figura 21 - Efeito do DS da pele do Electrophorus electricus (L.) na migração de
neutrófilos in vivo.
74
5. DISCUSSÃO
5.1 Órgãos elétricos:
A presença de GAGs no órgão elétrico de diversas espécies de peixes
elétricos tem sido relatada na literatura. Os trabalhos mais completos estão
focalizados em raias elétricas, onde diferentes tipos de PGs têm sido relatados.
Em 1991, Iwata e Carlson descreveram a presença de PGs de CS e QS no órgão
elétrico do Torpedo californica. Em 1996, foi demostrado por Carlson e cols., a
presença desses mesmos tipos de PGs em outra espécie de raia, a Discopyge
ommata
. PGs de HS foram imunolocalizados no órgão elétrico do Torpedo
marmorata (Jeninskens e cols., 2000). GAGs dos tipos AH, CS, HS e DS foram
identificados no órgão elétrico do Discopyge tschudii (Brandan e cols., 1985;
Inestrosa e cols., 1987). Além disso, existem evidências indicando que PGs de HS
presentes no órgão elétrico do D. tschudii e do T. california estão envolvidos no
ancoramento da acetilcolinesterase assimétrica contendo cauda de colágeno à
lâmina basal sináptica dos seus órgãos elétricos (Casanueva e cols., 1998;
Brandan e cols., 1985, respectivamente).
Em contraste, informações sobre a composição de GAGs no órgão elétrico
do E. electricus (L.) apresentam-se dispersas e contraditórias. GAGs constituídos
de AH foram descritos por Hásson e Chagas (1959) no órgão elétrico Principal da
enguia elétrica. Em 1978, Bon e cols. isolaram um agente agregante do órgão
elétrico Principal, através de digestão do tecido com pronase, que era capaz de
agregar in vitro a acetilcolinesterase em baixa forca iônica. Esse mesmo grupo,
usando eletroforese em placas de acetato celulose, identificou a presença de
75
GAGs compostos exclusivamente de CS e AH. Ainda nesse mesmo trabalho, os
autores postularam que o CS obtido no órgão elétrico Principal estaria envolvido
no ancoramento da acetilcolinesterase assimétrica neste órgão. Mais tarde, essa
hipótese foi reforçada pelos estudos de Tiller e Struve (1985) indicando que a
presença de CS ou AH exógenos aumentava a ligação de acetilcolinesterase
nativa à vesículas lipídicas, o que era consistente com a hipótese de Massoulié
(Bon e cols., 1978), indicando o CS como o GAG envolvido neste processo.
Por outro lado, Vigny e cols., em 1983, usando uma preparação de
acetilcolinesterase oriunda do Laboratório do Massoulié chegaram a resultados
completamente diferentes. Curiosamente, os autores usando preparações de
acetilcolinesterase assimétrica extraída do órgão elétrico Principal, apresentaram
evidências indiretas que cadeias de HS estavam associadas à enzima e
conseqüentemente seriam responsáveis pela agregação desta enzima à lâmina
basal no órgão elétrico Principal. Os autores reportaram que não foi possível
mensurar quimicamente a quantidade de GAGs devido a pequenas quantidades
de enzima disponível. A identificação da presença de HS no extrato enzimático foi
baseada na susceptibilidade da agregação da enzima em condições fisiológicas
salinas ao tratamento com heparinase. O tratamento com essa enzima aboliu a
agregação.
Na tentativa de esclarecer este ponto, nós analisamos a composição de
GAGs sulfatados presente no órgão elétrico Principal e ainda estendemos nossas
análises para os outros dois órgãos: Sachs e Hunter. Além disso, foram realizados
estudos histoquímicos e imunohistoquímicos, utilizando anticorpo anti-CS, no
sentindo de verificar a distribuição dos GAGs no tecido eletrogênico dos órgãos
76
elétricos. Não existem dados na literatura sobre a composição de GAGs nos dois
outros órgãos elétricos do E. electricus (L.), os órgãos de Sachs e Hunter.
Nossos estudos, através de técnicas bioquímicas, revelaram que os GAGs
sulfatados presentes nos três órgãos elétricos são compostos de CS, cadeias
híbridas de CS/DS e HS (exceto no órgão elétrico de Sachs). Sendo o CS
majoritário em comparação com o CS/DS híbrido, que é o segundo tipo de GAG
sulfatado predominante, seguido pelo HS que está presente em quantidades
minoritárias. Esses resultados estão de acordo com os reportados por Bon e cols.
(1978) e Vigny e cols. (1983). O CS está presente em grande quantidade no órgão
elétrico Principal como descrito por Bon e cols. (1978), enquanto que o HS está
presente em quantidades minoritárias como relatado por Vigny e cols. (1983),
explicando desta forma a razão pela qual o HS não foi detectado na preparação
de GAGs analisada por Bon e cols. (1978). A identificação de HS nas análises de
Vigny e cols., se deveu certamente ao fato deste ter trabalhado com uma fração
enriquecida neste GAG, a preparação de acetilcolinesterase, portanto, sem a
interferência dos outros GAGs majoritários. Além disso, esses dados sugerem que
o HS encontra-se altamente compartimentalizado e em íntimo contato com esta
enzima neste órgão.
Inesperadamente, nosso trabalho mostra a presença de pequenas
quantidades de cadeias híbridas de CS/DS nos três órgãos elétricos. Esse é o
primeiro relato da presença desse tipo de GAG sulfatado em órgãos elétricos de
peixes elétricos. Cadeias de DS foram identificadas no órgão elétrico da raia
elétrica D. tschudii
(Inestrosa e cols., 1987). A ocorrência de cadeias híbridas de
CS/DS, que são susceptíveis ao tratamento com condroitinases AC, ABC e B, foi
77
descrita na notocorda de “Hagfish” (Nandini e cols., 2004) e em pele de tubarão
(Nandini e cols., 2005).
Nossos resultados mostram que os CS e CS/DS apresentam uma grande
variedade em suas composições dissacarídicas. No órgão elétrico Principal, a
unidade dissacaridica predominantemente é composta de unidades
monosulfatadas na posição C-6 da GalNAc, enquanto que no órgão elétrico de
Sachs a unidade majoritária é aquela sulfatada na posição C-4 da GalNAc. Já no
órgão elétrico de Hunter, não se observa a predominância de um único tipo de
unidade dissacaridica, e sim uma distribuição mais eqüitativa entre as diferentes
unidades dissacaridicas identificadas.
Nossos resultados histoquímicos e imunohistoquímicos revelam que os
GAGs sulfatados, principalmente o CS, estão distribuídos nos septos conjuntivos
longitudinal e transversal, mas principalmente concentrados na face inervada das
eletroplacas nos três órgãos elétricos. O CS e HS têm sido descritos como
componentes ativos na agregação in vitro da acetilcolinesterase assimétrica (Bon
e cols., 1978; Vigny e cols., 1983, respectivamente). Coincidentemente, essa
enzima está localizada exclusivamente na face inervada das eletroplacas no órgão
elétrico Principal (Gotter e cols., 1998). A presença de macromoléculas
associadas à membrana basal, como fibronectina, laminina e colágenos dos tipos
IV e V tem sido detectada na face inervada das eletroplacas no órgão elétrico
Principal (Labat-Robert e cols., 1980).
Em vista dos nossos resultados bioquímicos, histoquímicos e
imunohistoquímicos sobre os GAGs sulfatados dos três órgãos elétricos do E.
78
electricus (L.) é possível especular que essas moléculas podem estar relacionadas
as diferenças morfológicas e funcionais entre os três tecidos eletrogênicos.
79
5.2 Pele:
O DS é o principal GAG sulfatado encontrado na pele de vertebrados
marinhos. DS com diferentes composições dissacarídicas e graus de sulfatação
têm sido descritos em pele de raias. Em 1999, Chatziioannids e cols.,
descreveram a presença de dois tipos de DS, presentes na raia Raja clavata, que
diferem no grau de sulfatação. O DSI, que é a espécie de GAG sulfatado
majoritária e DSII (pouco sulfatado), denominado de LSDS (“low-sulfated
dermatan sulfate”). O DSI apresenta dissacarídeos mono-sulfatados (65%),
dissulfatados (32%) e não sulfatados (3%). Os mono-sulfatados possuem
sulfatação no C-4 (61%) e no C-6 (4%) da GalNAc enquanto os dissulfatados
apresentam um padrão de sulfatação peculiar: podem ser sulfatados no C-2 e no
C-3 do IdoA ligado a uma GalNAc (64%), no C-3 do IdoA e no C-6 da GalNAc
(20%) e no C-2 do IdoA e no C-6 da GalNAc (13%). Já o LSDS, é composto
predominantemente de unidades dissacarídicas não sulfatadas (44%), seguido de
unidades mono-sulfatados nas posições C-4 (53%) e C-6 (3%) da GalNAc.
Dellias e cols., em 2004, isolaram e caracterizaram DS da pele ventral de
três espécies de raias que habitam no litoral brasileiro, Dasyatis americana
, a
Dasyatis gutatta e a Aetobatus narinari, e uma espécie típica do rio Amazonas, a
Potamotrygon motoro
. Os seus resultados mostraram que, o DS das quatro
espécies de raias, eram compostos predominantemente por unidades
dissacarídicas mono-sulfatadas no C-4 da GalNAc (50%, 51%, 47% 75% para D.
americana, a D. gutatta e a A. narinari, P. motoro, respectivamente), por unidades
dissacarídicas mono-sulfatadas no C-6 da GalNAc (5%, 11%, 11%, 16%) e
pequenas quantidades de não-sulfatadas (12%, 3%, 10%,e 12%). As unidades
80
dissulfatadas eram compostas por dissacarídeos sulfatados no C-2 do ácido
urônico e no C-4 da GalNAc (30%, 33%, 24%, 6%) e dissacarídeos sulfatados no
C-2 do ácido urônico e no C-6 da GalNAc (3%, 2%, 8%). Não foi observada a
presença de dissacarídeos sulfatados no C-2 do ácido urônico e no C-6 da
GalNAc na espécie P. motoro e de dissacarídeos 2-sulfatado ou 3-sulfatado e/ou
2,3-dissulfatado nos resíduos de acido urônico nos DS analisados de todas as
espécies de raias estudadas. (Dellias e cols., 2004).
O DS presente em outro vertebrado marinho, o tubarão da espécie
Prionace glauca
, foi caracterizado por Nandini e cols., em 2005. Neste trabalho
os autores demostraram a presença de um híbrido de CS/DS, bastante
heterogêneo, composto de múltiplas unidades dissacarídicas incluindo resíduos
não sulfatados contendo GlcUA e GalNAc, dissacarídeos mono-sulfatados nos C-4
ou C-6 da GalNAc, e unidades dissulfatadas de dissacarídeos B, dissacarídeos D
e dissacarídeos E. Inesperadamente, esses dissacarídeos dissulfatados
apresentam resíduos de GlcUA ou IdoA.
O DS da pele da enguia não elétrica, Anguila japonica
, é composto
principalmente por unidades dissacaridicas mono-sulfatados no C-4 da GalNAc
(81%) e dissacarídeos dissulfatados no C-2 do IdoA e no C-4 da GalNAc. Através
da espectroscopia de RMN–H1, os autores sugerem a presença de resíduos
sulfatados nas posições 3- e/ou 2,3 do IdoA.
No presente trabalho, nós isolamos e caracterizamos os GAGs sulfatados
presentes na pele da enguia elétrica Electrophorus electricus
. Nossos resultados
mostram que o DS da pele da enguia apresenta peso molecular estimado em 40
KDa. A análise das unidades dissacarídicas, mostra uma predominância de
81
unidades dissacarídicas mono-sulfatadas no C-4 da GalNAc (72%), pequenas
quantidades de resíduos não sulfatados (2%) e mono-sulfatados no C-6 da
GalNAc (4%), além de quantidades significativas de dissacarídeos B (14%) e
pequenas quantidades de dissacarídeos D (8%). Não encontramos evidências da
presença de resíduos sulfatados nas posições 3- ou 2,3 do IdoA.
A presença e a caracterização do DS presente na pele da enguia elétrica E.
electricus
juntamente com os dados reportados na literatura sobre a estrutura do
DS presente na pele de diferentes vertebrados marinhos, como da enguia A.
japonica, das cinco espécies de raias (R. clavata, D. americana, D. gutatta, A.
narinari e P. motoro) e do tubarão P. glauca, mostram uma heterogeneidade na
composição do DS da pele desses diferentes animais.
O DS da pele da enguia não elétrica A. japonica, apesar de apresentar o
dobro da quantidade de dissacarídeos B em relação ao DS de mamífero,
apresentou uma atividade anticoagulante menor. Em 1996, Mascellani e cols.,
descreveram que a presença de uma seqüência repetitiva específica de
dissacarídeos B na molécula de DS é necessária para que seja exercida a sua
atividade anticoagulante através da inibição da trombina pelo HCII. Já Sakai e
cols., em 2003, sugeriram que uma possível explicação para essa atividade
anticoagulante do DS da pele da A. japonica ser tão baixa, seria que a seqüência
dos dissacarídeos B no DS da enguia estaria espalhada pela molécula não
havendo, portanto, a seqüência específica necessária para exercer a atividade.
Estudos do nosso laboratório também reportaram diferenças na ação
anticoagulante do DS de pele de quatro diferentes espécies de raias, medidas
tanto pelo APTT quanto pelo ensaio da inibição da trombina pelo HCII quando
82
comparada com o DS de mamífero. O DS extraído de D. americana mostrou alta
atividade em ambos os ensaios (APTT e HCII) enquanto que o DS de D. gutatta
apresentou um perfil similar ao DS de mamífero. Já o DS da espécie A. narinari
não apresentou aumento no tempo de coagulação através do ensaio de APTT. Os
autores especularam que uma possível explicação para essa diferença na
atividade anticoagulante poderia estar relacionada ao arranjo espacial das
unidades dos dissacarídeos B nas moléculas de DS das diferentes espécies. O
DS de todas as espécies de raias estudadas apresentou composições
dissacarídicas similares, mas diferentes atividades anticoagulantes. O DS de D.
americana deve conter um arranjo de unidades B favorável para promover o
aumento no tempo de coagulação, enquanto que no DS de D. gutatta e de A.
narinari este arranjo deve estar ausente e as unidades devem estar espalhadas
pela molécula, assim como foi previamente sugerido por Sakai e cols., no caso do
DS de pele da enguia A. japonica.
No nosso presente estudo, nós também observamos diferenças na ação
anticoagulante do DS da pele da enguia elétrica E. electricus, medida por APTT e
nos ensaios da inibição da trombina pelo HCII, quando comparado com os DS de
mamífero e de pele de A. japonica
. O DS da pele do E. electricus, apresentou um
aumento tanto no APTT quanto no ensaio de HCII. Em contraste, o DS de pele de
A. japonica
não apresentou atividade anticoagulante significativa (Sakai e col.
2003). O DS da pele das enguias E. electricus
e A. japonica possuem uma
composição dissacarídica bastante semelhante. Uma possível explicação para
que somente o DS da pele de E. electricus apresente a habilidade em estimular a
inibição da trombina pelo HCII sugere que o arranjo espacial dos dissacarídeos B
83
neste DS é de fato fundamental. Nossos estudos sugerem que, o DS presente na
pele dos dois tipos de enguia, contem diferentes arranjos dos dissacarídeos B
capaz de ativar ou não o HCII.
No ensaio de trombose venosa, o DS do E. electricus mostrou um discreto
aumento no efeito antitrombótico quando comparado com o DS de mamífero, que
possui uma atividade moderada. Nós sugerimos que um aumento na atividade
estimuladora do HCII pelo DS pode resultar em um aumento na sua atividade
antitrombótica. Entretanto, Vicente e cols., em 2001, usando técnicas bastante
semelhantes reportaram que o DS de mamífero, com moderada atividade de HCII,
mostrou um maior efeito antitrombótico quando comparado com o DS das
ascídias, que apresenta uma alta afinidade pelo HCII. Contudo, em 1999,
Kyogashima e cols., mostraram que o DS obtido de galinha, que apresenta uma
baixa atividade de HCII, possui um efeito antitrombótico maior quando comparado
com o DS de mamífero. Ainda nesse trabalho, os autores mostraram que o nível
plasmático do DS de galinha injetado nos ratos utilizados nos ensaios
antitrombóticos era maior do que quando era injetado o DS de mamífero, os
autores então, especularam que essa poderia ter sido a razão da maior atividade
antitrombótica apresentada pelo DS de galinha. Um mecanismo similar pode estar
ocorrendo quando o DS de pele da enguia elétrica foi analisado nos ensaios
antitrombóticos realizados, mas futuros experimentos são necessários para
esclarecer esse ponto.
Os GAGs constituem uma fração considerável dos glicoconjugados
encontrados na membrana celular e na matriz extracelular. Com o avanço da
glicobiologia, os GAGs, assim como suas cadeias protéicas, estão cada vez mais
84
presentes em uma variedade de eventos celulares. Estudos recentes, demonstram
a participação dessas moléculas iniciando e controlando eventos associados com
a inflamação. Exemplos de processos influenciados pelos GAGs, incluem a
produção e a ligação de quimiocinas/citocinas, o recrutamento de leucócitos, a
maturação das células inflamatórias, dentre outros (Trowbridge e Gallo, 2002;
Taylor e Gallo,2006). Portanto, no presente trabalho nós examinamos de maneira
ainda bem preliminar o efeito do DS de pele de enguia elétrica no número de
neutrófilos em lavados brônquio-alveolares de camundongos que inalaram LPS.
Nos camundongos que receberam injeções de DS de pele de enguia elétrica, os
lavados brônquio-alveolares realizados 3 horas após a inalação apresentaram
uma diminuição no número de neutrófilos de acordo com o aumento da
concentração administrada de DS, quando comparados com os valores
encontrados para os animais injetados com salina. Esse resultado sugerindo que
essas moléculas possam ter um potencial antiinflamatório, ainda que muito
preliminar, representa um estimulo para um futuro aprofundamento nas
investigações das propriedades biológicas do DS de pele da enguia elétrica.
85
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Identification and distribution of chondroitin sulfate in the three electric
organs of the electric eel, Electrophorus electricus (L.)
Maisa L.S. Souza
a,b
, Cristiano F. Freitas
a,b
, Maria-Aparecida O. Domingos
d
,
Nilson Nunes-Tavares
c,e
, Aida Hasson-Voloch
c
, Luiz E. Nasciutti
d
, Luiz-Claudio F. Silva
a,b,
⁎
a
Laboratório de Tecido Conjuntivo, Hospital Universitário Clementino Fraga Filho, Centro de Ciências da Saúde,
Universidade Federal do Rio de Janeiro, 21941-590, Caixa Postal 68041, Rio de Janeiro, Brazil
b
Instituto de Bioquímica Médica, Programa de Glicobiologia, Centro de Ciências da Saúde, Universidade Federal do Rio de Janeiro,
21941-590, Caixa Postal 68041, Rio de Janeiro, Brazil
c
Laboratório de Físico Química-Biológica, Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, Centro de Ciências da Saúde,
Universidade Federal do Rio de Janeiro, 21941-590, Caixa Postal 68041, Rio de Janeiro, Brazil
d
Departamento de Histologia e Embriologia, Instituto de Ciências Biomédicas, Centro de Ciências da Saúde,
Universidade Federal do Rio de Janeiro, 21941-590, Caixa Postal 68041, Rio de Janeiro, Brazil
e
Centro Universitário da Zona Oeste (UEZO), Rio de Janeiro, Brazil
Received 22 August 2006; received in revised form 20 October 2006; accepted 21 October 2006
Available online 1 November 2006
Abstract
The electrogenic tissue of the electric eel Electrophorus electricus (L.) is distributed in three well-defined electric organs, the Main electric organ,
Sach's organ and Hunter's organ. Sulfated glycosaminoglycan (GAG) composition was characterized in the three electric organs of the electric eel.
Sulfated GAGs were analyzed in the electric organs using metachromatic staining, biochemical analysis including electrophoresis before and after
specific enzymatic or chemical degradations, and immunostaining with an antibody against chondroitin sulfate (CS). Our results showed in the three
electric organs that CS was the main sulfated GAG species detected, accompanied by small and diminutive amounts of CS/dermatan sulfate hybrid
chains and heparan sulfate (HS), respectively. However, HS was not detected in the Sach's organ. CS was predominantly detected in the innervated
membrane face of the electroplaques in the three electric organs. Our findings extend previous observations on the GAG composition in the electric
organs of E. electricus and provide new information regarding the tissue distribution and location of CS.
© 2006 Elsevier Inc. All rights reserved.
Keywords: Electric eel; Electric organ; Skin; Electrophorus electricus (L.); Sulfated glycosaminoglycan; Heparan sulfate; Chondroitin sulfate
1. Introduction
Glycosaminoglycans (GAGs) consist of hexosamine [
D-
glucosamine or
D-galactosamine] and either hexuronic acid [D-
glucuronic or
L-iduronic acid] or galactose units that are ar-
ranged in alternating unbranched sequence, and carry sulfate
substitutions in various positions. The sulfated GAG species are
composed of chondroitin sulfate (CS), dermatan sulfate (DS),
heparan sulfate (HS), heparin and keratan sulfate (KS) (Conrad,
1998; Funderburgh, 2000; Trowbridge and Gallo, 2002; Sugahara
et al., 2003; Nader et al., 2004; Coombe and Kett, 2005).
Hyaluronic acid (HA) is also a GAG species, but it is not sulfated
(Toole, 2004). Owing to the variability in sulfate substitution, all
GAGs display considerable sequence heterogeneity, and it is
believed that structural differences are responsible for highly
specific interactions of GAGs with other macr omolecules
(Coombe and Kett, 2005). Their strategic location and highly
charged nature make them important biological players in cell–
cell and cell–matrix interactions that take place during normal
and pathological events, including organogenesis in embryonic
development, cell recognition, adhesion, migration, regulation
of growth factor action, lipid metabolism, neural development
Comparative Biochemistry and Physiology, Part B 146 (2007) 227 – 233
www.elsevier.com/locate/cbpb
⁎
Corresponding author. Instituto de Bioquímica Médica, Centro de Ciências
da Saúde, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Caixa Postal 68041, Rio de
Janeiro, RJ, 21941-590, Brazil. Fax: +55 21 2562 2090.
E-mail address: lclaudio@hucff.ufrj.br (L.-C.F. Silva).
1096-4959/$ - see front matter © 2006 Elsevier Inc. All rights reserved.
doi:10.1016/j.cbpb.2006.10.107
and regeneration, and initiation and modulation of inflam-
mation (Kresse and Schonnherr, 2001; Sugahara et al., 2003;
Laabs et al., 2005; Whitelock and Iozzo, 2005; Taylor and
Gallo, 2006).
The electric eel Electrophorus electricus (L.) is a fresh water
teleost showing an electrogenic tissue that produces electric
discharges. The electrogenic tissue is distributed in three well-
defined electric organs that may be found symmetrically along
both sides of the animal. The Main electric organ extends from
behind the peritoneal cavity of the viscera down the tail of the
animal where it gives rise to Sach's organ, which occupies the
remainder of the caudal portion. Hunter's organ is located sub-
jacent to the other electric organs and dorsal to the long swimming
fin on the ventral surface of the animal (Gotter et al., 1998;
Mermelstein et al., 2000). The Main electric organ generates
powerful high voltage discharges, whereas the tonically active
Hunter's organ and Sach's organ emit low voltage discharges and
are thought to be involved in electrolocation (Gotter et al., 1998).
Indirect studies have provided isolated information concerning
the GAG composition in the Main electric organ of E. electricus.
Bon et al. (1978) isolated GAGs composed of CS and HA from the
Main electric organ of Electr ophorus. Granafei and Hasson-
Vo l o c h ( 1 9 8 0 ) studied chemical properties of HA from the Main
electric organ, which was identified in this organ with histochem-
ical methods by Couceiro and Freire (1951). In 1983, curiously,
Vigny and colleagues analyzing an acetylcholinesterase enzyme
preparation from the Main electric organ of Electr ophorus have
provided indirect evidences that HS GAG chains were associated
with the enzyme. So far, only these three GAG species (CS, HS
and HA) have been identified in the Main electric organ of Elec-
trophorus. There is no information on the presence of GAGs in the
other two electric organs. Here, we examined the sulfated GAG
composition and tissue distribution in the three electric organs of
E. electricus, using biochemical and immunohistochemical
analysis, and demonstrated that CS was the predominant sulfated
GAG species present, accompanied by small and diminutive
amounts of CS/DS hybrid chains and HS, respectively.
2. Materials and methods
2.1. Electric organs from Electrophorus electricus (L.)
All experiments were performed with adult specimens of E.
electricus (L.) supplied by Museu Paraense Emílio Goeldi
(Belém do Pará, Brazil) and kept in an aquarium filled with fresh
filtered water. Each animal was anesthetized in ice-cold water
containing 2.0% urethane before being killed by decapitation.
Slices of electric organ were obtained from the E. electricus Main
electric organ and from Hunter's and Sach's electric organs.
2.2. Material
CS, DS, HS, twice-crystallized papain (15U/mg protein),
chondroitin B lyase (EC 4.2.2) from Flavobacterium heparinum
Fig. 1. Photomicrographs of the Main electric organ stained with DMB (A, B) or immunostained with an antibody against CS (C, D). Observe abundant purple
metachromatic material (A, B) and peroxidase product (C, D) distributed all over the longitudinal and transverse connective septa and concentrated in the innervated
face of the electroplaques (→). Insert in D: negative control. (A, C) 100×; (B, D) 400×; insert 400×.
228 M.L.S. Souza et al. / Comparative Biochemistry and Physiology, Part B 146 (2007) 227–233
were purchased from Sigma-Aldrich Chemical Co. (St Louis, MO,
USA). Chondroitin AC lyase (EC 4.2.2.5) from Arthrobacter
aur escens and chondroitin ABC lyase (EC 4.2.2.4) from Pr oteus
vulgaris were purchased from Seikagaku American Inc (Rockville,
MD, USA). CS antibody was purchased from Sigma-Aldrich.
2.3. Metachromatic staining of sulfated GAGs
Tissue sections from the three electric organs were separately
fixed overnight in PFA 4% in the Sorensen phosphate buffer
(0.1 M, pH 7.4), at 4 °C. After fixation and washing, the tis sues
were dehydrated in ethanol and embedded in paraffin. Tissue
sections (7 μm) were collected on polylysine-coated slides and
stained with the cationic dye 1.9-dimethylmethylene blue (DMB)
in 0.1 M HCl, containing 0.04 mM glycine and 0.04 mM NaCl.
The sections were then examined and photographed using a light
microscope (Zeiss, Axioskop 2). The positive reaction reveals
GAGs as metachromatic structures (colored in purple).
2.4. Isolation of GAGs
Tissue samples of the three electric organs were separately
incubated with acetone for 24 h at room temperature and dried.
The tissues were suspended in the sodium acetate buffer, pH 5.5,
containing 40 mg papain in the presence of 5 mM EDTA and
5 mM cyste ine, and incubated at 60 °C for 24 h. The incubation
mixture was centrifuged at 2000 ×g for 10 min at room temper-
ature, and the supernatant, which contained the GAGs was
retained. A 10% cetylpyridinium chloride solution was added to
the supernatant to a final concentration of 0.5% and the mix ture
left to stand at room temperature for 24 h. The solution was
centrifuged at 2000 ×g for 10 min at room temperature and the
pellet was washed with 10 mL 0.05% cetylpyridinium solution.
This pellet, a GAG-cetylpyridinium complex, was dissolved
with 3.7 mL solution of 2 M NaCl/absolute ethanol (100:15, v/v)
and the GAGs were precipitated with the addition of 6 mL
absolute ethanol. After 24 h at 4 °C, the precipitate was collected
by centrifugation and washed twice with 10 mL 80% ethanol,
followed by the same volume of absolute ethanol. The final
pellet, which constitutes the total tissue GAG preparation, was
dissolved in 2 mL distilled water (Tovar et al., 1998).
2.5. Identification of the sulfated GAGs
Sulfated GAGs were characterized by agarose gel electro-
phoresis, digestion with chondroitin lyases and deaminative
Fig. 2. Fotomicrographs of the Sach's organ and the Hunter's organ stained with DMB (A, C) or immunostained with an antibody against CS (B, D). Observe abundant
purple metachromatic material (A, C) and peroxidase product (B, D) distributed all over the longitudinal and transverse connective septa and concentrated in the
innervated face of the electroplaques (→). (A,B) 100×, (C,D) 40×.
229M.L.S. Souza et al. / Comparative Biochemistry and Physiology, Part B 146 (2007) 227–233
cleavage with nitrous acid as described below (Nasciutti et al.,
2006).
Agarose gel electrophoresis was carried out as described
elsewhere (Volpi and Maccari, 2006). Approximately 10 μgof
electric organ sulfated GAGs, estimated by a metachromatic
staining procedure with the cationic dye 1.9-dimethylmethylene
blue (Farndale et al., 1986), before and after chondroitin lyase
digestion or deaminative cleavage with nitrous acid (see below),
as well as a mixture of standard CS, DS, HS (10 μg of each) were
applied to 0.5% agarose gels in 0.05 M 1,3-diaminopropane:
acetate (pH 9.0). After electrophoresis, sulfated GAGs were
fixed in the gel with 0.1% N-acetyl-N, N, N-trimethylammonium
bromide in water, and stained with 0.1% toluidine blue in acetic
acid:ethanol: water (0.1:5:5, v/v).
Digestions with chondroitin B, AC or ABC lyases were
carried out according to Nandini et al. (2005). Approximately
10 μg of electric organ sulfated GAGs were incubated with 0.3
units of chondroitin B lyase, chondroitin AC lyase or chondroi-
tin ABC lyase for 8 h at 37 °C in 100 μL 50 mM Tris:HCl (pH
8.0) containing 5 mM EDTA and 15 mM sodium acetate.
Deamination by nitrous acid at pH 1.5 was performed as
previously described (Shively and Conrad, 1976). Briefly, ap-
proximately 10 μg electric organ sulfated GAGs were incubated
with 200 μL freshly generated HNO
2
at room temperature for
10 min. The reaction mixture was then neutralized with 1.0 M
Na
2
CO
3
.
2.6. Immunodetection of CS
Tissue sections of the three electric organs were prepared as
described above for histochemistry. The endogenous peroxidase
activity was blocked with 3% hydrogen peroxide. The tissues
were then incubated with goat normal serum and 1% bovine
serum a lbumin (BSA) to reduce nonspecific antibody binding.
After washing in 0.01 M phosphate buffer saline (PBS) pH 7.5,
the sections were incubated overnight at 4 °C with monoclonal
anti-CS antibody (mouse IgM isotype) (Sigma-Aldrich) at 1:200
dilution. The reaction was revealed with StreptAB Com plex/
HRP Duet Kit (Dako Corporation, Carpinteria, CA, USA) and
3.3′ diaminobenzidine (DAB) tabl ets. Counterstaining was car-
ried out with Harris's haematoxylin. Negative controls were
obtained omitting the primary antibody (incubating the sections
in 0.01 M phosphate buffer saline pH 7.5).
3. Results
Our histological findings confirmed the morphological char-
acteristics of the tree electric organs. The morphological and
Fig. 3. Representative electrophoretograms used for the detection of CS and CS/DS hybrid chains (A) and HS (B). Samples of total sulfated GAGs from the Main
electric organ (a), Sach's organ (b) and Hunter's organ (c) before (−) and after enzymatic degradation with chondroitin AC, ABC and B lyases (+) were analyzed by
agarose gel electrophoresis (A). In (B) samples of sulfated GAGs from the Main electric organ (a), Sach's organ (b) and Hunter's organ (c) after degradation of CS+
hybrid CS/DS by chondroitin ABC lyase were analyzed by agarose gel electrophoresis before (−) and after deaminative cleavage by nitrous acid (+). The agarose gel
electrophoresis was performed as described in Section 2. Sulfated GAGs were detected on gels by staining with toluidine blue. Note that chondroitin AC lyase
degrades CS standard, chondroitin ABC lyase degrades both CS and DS standards, while chondroitin B lyase degrades specifically DS standard. Treatment with
nitrous acid specifically degrades HS standard.
230 M.L.S. Souza et al. / Comparative Biochemistry and Physiology, Part B 146 (2007) 227–233
functional cellular unit of the electric organ is a multinucleated
syncytium called electroplaque or electrocyte. Each electrocyte
is placed in the interior of an insulating septa composed of
connective tissue, and disposed by stacks in files superposed one
after anothe r (data not shown).
3.1. Metachromatic staining of electric organ sulfated GAGs
The electric organ stained with cationic dye DMB showed
abundant metachrom atic (purple) material, distributed all over
the longitudinal and transverse connective septa and concen-
trated in the innervated face of the electroplaques. The meta-
chromatic distribution was similar among the three electric
organs (Figs. 1A,B and 2A,C ).
3.2. Characterization of electric organ sulfated GAGs
The sulfated GAGs were characterized, in two steps, upon
their migration on agarose gel and digestion with specific lyases
or deamination with nitrous acid. In the first step, a sample of
total purified sulfated GAG s was analyzed by agarose gel elec-
trophoresis (Fig. 3A). The sulfated GAG preponderant in the
three electric organs migrated on agarose gel as the CS standard
(superior part of the electrophoretic band seen in panels a–cin
Fig. 3A), disappeared totally from the gel after chondroitin AC
or ABC lyase digestions (these enzymes degrade CS and CS/DS
respectively) and persisted after treatment with chondroitin B
lyase (this enzyme degrades specifically DS). The inferior part of
the electrophoretic band behaved as a CS/DS hybrid GAG chain
since it was degraded by the three types of chondroitin lyases
(Fig. 3A, a–c). In order to look for the presence of very small
amounts of other sulfated GAG species that would be present in
the three electric organs, we took a larger sample aliquot than
that used in the first analytic step and submitted it to exhaustive
degradation with chondroitin ABC lyase aiming to degrade CS +
CS/DS hybrid chains. These solution s were used to the identi-
fication of the presence of HS (Fig. 3B). Using this approach, we
could detect the presence of an electrophoretic band migrating as
the HS standard in both the Main electric organ and Hunter's
organ, that was totally degraded after deaminative cleavage by
nitrous acid (Fig. 3B, a,c). No electrophoretic band was seen in
the sample from Sach's organ (Fig. 3B, b). These experiments
characterized these sulfated GAGs as CS, CS/DS hybrid chains
and HS respectively, and revealed a great dominance of CS in
comparison with hybrid CS/DS which was the second most
present sulfated GAG, and HS that was presen t in diminutive
amount (Fig. 3A, B). With these procedures, we had no evidence
for the presence of KS in the three electric organs.
3.3. CS tissue distribution in electric organs
As revealed by the biochemical analysis, CS was very abun-
dant in three electric organs. Using a monoclonal antibody against
CS GAG chains, we decided to investigate the localization of
these molecules. CS was observed in the same regions as the DMB
metachromatic staining. As expected, the peroxidase deposit was
observed in three electric organs, distributed overall the
longitudinal and transverse connective septa and concentrated in
the innervated face of the electroplaques (Figs. 1C,D and 2B,D).
4. Discussion
SeveralsulfatedGAGspecieshavebeenidentifiedinthe
electric organ of electric fishes. DS has been identified in the
electric organ of the electric ray Dyscopyge tschudii (Inestrosa
et al., 1987). Using immunohistochemistry, KS has been identified
in the electric org an of the electric rays Torpedo californica and
Dyscopyge ommata (Iwata and Carlson, 1991). CS has been
identified in the electric organ of the electric rays T. californica, D.
ommata (Iwata and Carlson, 1991)andD. tschudii (Inestrosa et al.,
1987). HS has been identified in the electric organ of the electric
rays T. californica (Casanueva et al., 1998), Torpedo marmorata
(Stadler and Dowe, 1982)andD. tschudii (Inestrosa et al., 1987).
Available information regarding sulfated GAGs distrib ution
in the electric organ of E. electricus is indirect and contradictory.
Bon et al. (1978) isolated an aggregating agent from the Main
electric organ of Electrophorus by pronase digestion of the
tissue. This aggregating agent was able to aggregate in vitro
asymmetric acetylcholinesterase at low ionic strength. Using
electrophoresis on cellulose acetate plates they identified the
presence of GAGs composed exclusively of HA and CS. They
also identified CS as the GAG responsible for the aggregation. In
1983, curiously, Vigny and co-worker using an asymmetric
acetylcholinesterase enzyme preparation from the Main electric
organ of Electrophorus (a gift of Drs. J. Massoulié and S. Bon)
presented indirect evidences that HS GAG chains were asso-
ciated with it and also that this component appeared to be
responsible for the aggregation in vitro of the enzyme at low
ionic strength. The authors reported that it was not possible to
measure the amount of GAGs chemically due to the small
amounts of enzyme available. Therefore, the identification of the
presence of HS in the en zymatic extract was based on the
susceptibility of the enzyme aggregation under physiological
salt conditions to treatment with heparinase. The heparinase-
treated enzyme failed to aggregate.
So far, only these two sulfated GAG species (CS and HS)
have been identified in the Main electric organ of Electrophorus.
There is no information on the presence of GAGs in the other
two electric organs. In order to clarify the discrepancies between
these two conflicting reports on sulfated GAGs in the Main
electric organ of E. electricus and to provide new information on
the sulf ated GAG composition in the other two electric organs,
we performed biochemical and histochemical analysis of sul-
fated GAGs in samples of the three electric organs.
In our study, we showed by biochemical methods that in the
three electric organs sulf ated GAGs were composed of CS, CS/
DS hybrid chains and HS, and it also revealed a great dominance
of CS in comparison with hybrid CS/DS which was the second
most present sulfated GAG, and HS that was present in diminu-
tive amount. However, HS was not detected in the Sach's organ.
These results are in agreement with those reported by Bon et al.
(1978) and Vigny et al. (1983). CS is present in large excess in
the Main electric organ of Electrophorus, as reported by Bon
et al. (1978), while HS is present in diminutive amounts, as
231M.L.S. Souza et al. / Comparative Biochemistry and Physiology, Part B 146 (2007) 227–233
suggested by Vigny et al. (1983) and it might explain why HS
was not detected in the crude GAG preparation analyzed by Bon
et al. (1978).
Unexpectedly, our work showed the presence of small
amounts of hybrid CS/DS chains in the three electric organs of
Electrophorus. This is the first time the presence of such GAG
molecules is showed in the electric organ of electric fishes. Pure
DS GAG chains have already been identified in the electric organ
of the electric ray D. tschudii (Inestrosa et al., 1987). The
occurrence of Hybrid CS/DS GAG chains, which were suscep-
tible to degradation by chondroitin AC, ABC and B lyases, have
been described in the notochord of hagfish (Nandini et al., 2004)
and in shark skin (Nandini et al., 2005).
The morphologic al and functional cellular unit of t he
electric organ is a multinucl eated syncytium called electro-
plaque or electrocyte. Each electrocyte is placed in the interior
of a insulating septa composed of connective tissue, and
disposed by stacks i n files supe rpos ed one after another (Luft,
1957). The electrocytes are flatten cellular structures with six
surfaces, t wo of which are well-defined: the posterior
membrane, innervated and flat, and the anterior membrane,
non-innervated and with undulations. The electrocyte mor-
phology and the overall cellular distribution in the tissue
reflect the sp ecia lized p hysi ol ogical function of these cells,
which is to produce pronounced hyperpo larizations in
membrane potential. This cellular morphology is maintained
by a c ytos ke leta l meshwork (Cartaud et al., 2000).
Our histochemical and immunohistochemical results re-
vealed that metachromatic sulfated GAGs, especially CS, were
distributed all over the longitudinal and transverse connective
septa and concentrated in the innervated face of the electroplaques
in the three electric organs. CS and HS have been reported as
active components in the in vitro aggregation of asymmetric
acetylcholinesterase (Bon et al., 1978; Vigny et al., 1983; res-
pectively). Coincidentally, this enzyme is exclus ively localized
on the innervated face of the electroplaques in the Main electric
organ of Electrophorus (Gotter et al., 1998). The presence of
basement membrane-associated macromolecules, such as fibro-
nectin, laminin and collagen type IV and V have also been
detected on the innervated face of the electroplaques in the Main
electric organ of Electrophorus (Labat-Robert et al., 1980).
Further characterization of individual GAG species and
identification of the specific location of a given GAG species in
the electric organ is under consideration by our group and will be
the subject of future investigation. It would also be interesting to
analyze by biochemical techniques the sulfated GAG compo-
sition of microsomal fractions derived from both innervated and
non-innervated faces of the electric organ.
In conclusion, our results with the histochemical, biochem-
ical and immunohistochemical procedures developed with the
electric organs of E. electricus add new information on the GAG
composition in electric organ of electric fishes.
Acknowledgements
This work was supported by Conselho Nacional de Desen-
volvimento Científico e Tecnológico (CNPq) and Fundação de
Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ). We
thank Manuel Gustavo Leitão Ribeiro for his helpful assistance
and Sergio Luiz Carvalho for his technical assistance.
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Structural composition and anticoagulant activity of dermatan sulfate from
the skin of the electric eel, Electrophorus electricus (L.)
Maisa L.S. Souza, João M.M. Dellias, Fábio R. Melo, Luiz-Claudio F. Silva
⁎
Laboratório de Tecido Conjuntivo, Hospital Universitário Clementino Fraga Filho, Instituto de Bioquímica Médica,
Programa de Glicobiologia, Centro de Ciências da Saúde, Universidade Federal do Rio de Janeiro,
21941–590, Caixa Postal 68041, Rio de Janeiro, Brasil
Received 10 November 2006; received in revised form 5 February 2007; accepted 5 February 2007
Available online 14 February 2007
Abstract
We determined the disaccharide composition of dermatan sulfate (DS) purified from the skin of the electric eel Electrophorus electricus.DS
obtained from the electric eel was composed of non-sulfated, mono-sulfated disaccharides bearing esterified sulfate groups at positions C-4 or C-6
of N-acetyl galactosamine (GalNAc), and disulfated disaccharides bearing esterified sulfate groups at positions C-2 of the uronic acid and at
position C-4 or C-6 of GalNAc. The anticoagulant, antithrombotic and bleeding effects of electric eel skin DS were compared to those of porcine
DS and also to those described previously for DS purified from skin of eel, Anguilla japonica. DS from electric eel is a potent anticoagulant due to
a high heparin co-factor II (HC II) activity. The electric eel DS has a higher potency to prevent thrombus formation on an experimental model and
a lower bleeding effect in rats than the porcine DS. Interestingly, it was recently demonstrated that DS obtained from skin of the eel Anguilla
japonica, which possesses a disaccharide composition very similar to that of electric eel skin DS described here, did not show anticoagulant
activity. Thus, the anticoagulant activity of electric eel skin DS is not merely a consequence of its charge density. We speculate that the differences
among the anticoagulant activities of these three DS may be related to different arrangements of the disulfated disaccharide domain for binding to
HC II within their polysaccharide chains and that it may be more efficiently arranged along the carbohydrate chain in electric eel skin DS than in
the two other types of DS.
© 2007 Elsevier Inc. All rights reserved.
Keywords: Electric eel; Electrophorus electricus; Glycosaminoglycan; Dermatan sulfate; Blood coagulation; Thrombin
1. Introduction
Dermatan sulfate (DS) glycosaminoglycan (GAG) chains
are composed of l inear polysaccharides assembled as disac-
charide units containing a hexosamine, N-acetyl galactosamine
(GalNAc) an d L-Iduronic acid (IdoA) joined by β 1,4 or 1,3
linkagesrespectivelyandusuallysulfatedatposition4of
GalNAc. Disaccharides with a different number and position
of sulfate groups can be located, in different percentages,
inside the polysaccharide chains, such as the non-sulfated or
disulfated disaccharides in which two sulfate groups are O-
linkedinposition2ofIdoAand4 of GalNAc (disaccharide B),
in position 2 of IdoA and 6 of G alNAc (disaccharide D), or in
positions 4 and 6 of GalNAc (disaccharide E) (Trowbridge and
Gallo, 2002; Volpi, 2004). These heterogeneous st ru ctur es , in
terms of percent age of var iou sly sulf at ed dis acc hari des an d
degree of sulfati on, depe ndi ng on the tiss ue of origi n, are
responsibl e for different a nd more specialize d functio ns of
these GAGs (Trowbridge and Gallo, 2002; Volpi, 2004;
Sugahara et al., 2003).
One particularly well-studied DS binding interaction occurs
with heparin cofactor II (HC II). This serpin homolog of an-
tithrombin III acts by inhibiting the procoag ulative effect of
thrombin. This effect is enhanced 1000-fold in the presence of
DS. A hexasaccharide sequence composed of 3 disaccharide B,
which is responsible for DS binding to HC II, has b een described
Comparative Biochemistry and Physiology, Part B 147 (2007) 387 – 394
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⁎
Corresponding author. Instituto de Bioquímica Médica, Centro de Ciências
da Saúde, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Caixa Postal 68041, Rio de
Janeiro, RJ, 21941–590, Brasil. Fax: +55 21 2562 2090.
E-mail address: lclaudio@hucff.ufrj.br (L.-C.F. Silva).
1096-4959/$ - see front matter © 2007 Elsevier Inc. All rights reserved.
doi:10.1016/j.cbpb.2007.02.003
in porcine skin DS by Maimone and Tollefsen (1990). Although
this hexasaccharide increased the rate of thrombin inhibition
approximately 100-fold, DS chains 12 to 14 residues in length
were necessary for maximal stimulation of HC II (∼ 10 000-fold)
(Tolle fsen et al., 1986). Recently, Halldórsdótirr et al. (2006)
demonstrated th at decas acchar ides an d dodeca saccha rides
containing 1 or 3 disaccharide D units originated from porcine
intestinal mucosa DS were able to stimulate thrombin inhibition
by HC II and to prolong the clotting time of normal but not HC
II-depleted human plasma.
The antithrombotic activity of DS isolated from porcine or
bovine intestinal mucosa has been documented in several mo-
dels of arterial or venous thrombosis (Hennan et al., 2002;
Nenci, 2002). Vicente et al. (2004) showed that porcine skin DS
inhibits thrombosis follow ing carotid injury in wild-type mice
but has no effect in HC II-deficient mice. These authors provided
the firs t direct evidence that HCII is required for antithrombotic
activity of DS in vivo. Tov ar et al. (2005) showed that DS is the
predominant antithrombotic GAG in vessel walls, suggesting a
GAG-dependent anticoagulant pathway present in the vascular
wall based on HC II activation by DS prote oglycans synthesized
by cells from the subendothelial layer.
DS is the predominant GAG expressed in the skin of marine
vertebrates. DS isolated from the skin of the eel, Anguilla
japonica, has been shown to be composed mainly of mono-
sulfated disacc harid es bearing esterified sulfate groups at
positions C-4 of GalNAc, and disulfated disaccharides units
of disaccharide B. It has also been shown that this eel skin DS
has no appreciable anticoagulant activity (Sakai et al., 2003).
Nader et al. (2001) found that a DS extracted from skin of tuna
fish has a potent activity on HC II-mediated thrombin inhi-
bition, but there is no information available on the disaccharide
structure of this GAG.
Studies on DS from the skin of the ray Raja clavata, which
inhabits the Greek seacoast, showed the presence of two DS
with different degrees of sulfation (Karamanos et al., 1991;
Tsegenidis, 1992; Chatziioannidis et al., 1999a,b). Whether or
not ray skin DS from R. clavata presents appreciable anti-
coagulant activity is not yet know n.
We recently compared the disaccharide compo sition of DS
purified from the ventral skin of three species of rays from the
Brazilian seacoast, Dasyatis americana, Dasyatis gutatta and
Aetobatus narinari (Dellias et al., 2004 ). The anticoagulant
actions of ray skin DS, measured by both APTT clotting and HC
II-mediated inhibition of thrombin assays and its structural
composition revealed that these molecules possessed similar
structures, but differential anticoagulant activities. Recently,
Nandini et al. (2005) characterized DS from the skin of the so-
called blue shark Prionace glauca. The authors showed that this
GAG is composed of chondroitin sulfate (CS)/DS hybrid chains
with a unique heterogeneous sulfation pattern, and also that it
has a moderate activity on HC II-mediated thrombin inhibition
(Nandini et al., 2005). Whether or not shark skin DS presents
appreciable antithrombotic activity is not yet known.
Here, we provide additional information on skin DS from
marine vertebrates by analyzing DS from the skin of the electric
eel Electrophorus electricus.
2. Materials and methods
2.1. Materials
Porcine intestinal mucosa DS was purchased from Sigm a
Chemical Co. (St. Louis, MO, USA). DS was treated with
nitrous acid prior to use. Chondroitin 4-sulfate (C-4S), HS,
twice-crystallized papain (15 U/mg protein), the standard
disaccharides α-ΔUA(2SO
4
)-1→3-GlcNAc(4SO
4
)(Δdi-
diS
B
), α-ΔUA(2SO
4
)-1→3-GalNAc(6SO
4
)(Δdi-diS
D
), α-
ΔUA-1→ 3-GalNAc(4,6-diSO
4
)(Δdi-diS
E
)andα-ΔUA
(2SO
4
)-1→3-GalNAc(4,6-diSO
4
)(Δdi-triS) were purchas ed
from Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA). Chondroitin
AC lyase (EC 4.2.2.5) from Arthrobacter aurescens, chondroi-
tin ABC lyase (EC 4.2.2.4) from Proteus vulgaris were
purchased from Seikagaku American Inc. (Rockville, MD,
USA). The standard disaccharides α-ΔUA-1→3-GlcNAc (Δdi-
0S), α-ΔUA-1→3-GalNAc(4SO
4
)(Δdi-4S) and α-ΔUA-1→3-
GalNAc(6SO
4
)(Δdi-6S), were purchased from Seikagaku
American Inc. (Rockville, MD). The abbreviations used were
α-ΔUA(2SO
4
), α-Δ
4,5
-unsaturated hexuronic acid 2-sulfated;
α-ΔUA, α-Δ
4,5
-unsaturated hexuronic acid; GalNAc, N-
acetylated galactosamine; GalNAc(4SO
4
) and GalNAc(6SO
4
)
derivatives of N-acetylated galactosamine bearing a sulfate
ester at position 4 and at position 6, respectively; Δdi-0S, α-
ΔUA-1→3-GlcNAc; Δdi-4S, α-ΔUA-1→3-GalNAc(4SO
4
);
Δdi-6S, α-ΔUA-1→3-GalNAc( 6SO
4
); Δdi-diS
B
, α-ΔUA
(2SO
4
)-1→3-GlcNAc(4SO
4
); Δdi-diS
D
, α-ΔUA(2SO
4
)-1→3-
GalNAc(6SO
4
); Δdi-diS
E
, α-ΔUA-1→3-GalNAc(4,6-diSO
4
)
and Δdi-triS, α- ΔUA(2SO
4
)-1→3-GalNAc(4,6-d iSO
4
). APTT,
activated partial thromboplastin time.
2.2. Eel skin samples
Skin samples from the electric eel E. electricus (L.), a fresh
water species that inhabits the Amazon River in Brazil, were
provided by Emilio Goeldi Museum, Pará, Brazil. This electric
eel is capable of generating an electrical potential of up to 600 V,
making it the greatest producer of bioelectricity in the animal
kingdom (Gotter et al., 1998; Melmerstein et al., 2000).
2.3. Isolation and purification of skin GAGs
GAGs were isolated from skin samples following a
previously described method (Dellias et al., 2004; Passos
et al., 2003). Briefly, dried skin samples were suspended in
sodium acetate buffer, pH 5.5, containing 40 mg papain in the
presence of 5 mM EDTA and 5 mM cysteine at 60 °C for 24 h.
The incubation mixtures were then centrifuged (2000 ×g for
10 min at room temperature) and GAGs in the supernatants were
precipitated with cetylpyridinium (CPC) solution as described
elsewhere (Tovar et al., 1998). The partially purified GAG
samples were applied to a Mono Q-FPLC column (HR 5/5),
equilibrated with 20 mM TRIS:HCl (pH 8.0). The column was
washed with 20 mL of the same buffer and then eluted stepwise
with 20 ml of TRIS:HCl (pH 8.0) containing 0.6 M NaCl, to
remove unsulfated GAGs as hyaluronic acid if present, and the
388 M.L.S. Souza et al. / Comparative Biochemistry and Physiology, Part B 147 (2007) 387–394
bound sulfated GAGs were eluted with 20 ml of TRIS:HCl (pH
8.0) containing 2.0 M NaCl (see Fig. 3 in Martins et al., 2003).
The sulfated GAGs eluted from the column were exhaustively
dialyzed against distilled water, lyophilized and dissolved in
1.0 mL of distilled water.
2.4. Identification of the skin GAGs
Skin GAGs were characterized by agarose gel electropho-
resis, before and after digestion with chondroitin lyases and
deaminative cleavage with nitrous acid, as described below.
2.4.1. Agarose gel electrophoresis
Approximately 0.01 mg of skin sulfated GAGs, before or
after enzymatic or chemical treatments, as well as a mixture of
standard C-4S, DS and HS (approximately 0.01 mg of each)
were applied to 0.5% agarose gels in 0.05 M 1,3-diaminopro-
pane:acetate (pH 9.0). After electrophoresis, GAGs were fixed
in the gel with 0.1% N-cetyl- N,N,N-trimethylammonium
bromide in water, and stained with 0.1% toluidine blue in acetic
acid:ethanol:water (0.1:5:5, v/v) (Dietrich and Dietrich, 1976).
2.4.2. Enzymatic depolymerisation of the skin GAGs
2.4.2.1. Digestion with chondroitin lyases. Digestions with
chondroitin AC and ABC lyases were carried out according to
Saito et al. (1968). Approximately 0.1 mg of skin GAGs were
incubated with 0.3 units of chondroitin AC or ABC lyases for
8 h at 37 °C in 0.1 mL of 50 mM Tris:HCl (pH 8.0) containing
5 mM EDTA and 15 mM sodium acetate.
2.4.2.2. Deaminative cleavage with nitrous acid. Deamina-
tion by nitrous acid at pH 1.5, was performed as described by
Shively and Conrad (1976). Briefly, approximately 0.1 mg of
skin GAGs were incubated with 0.2 mL of fresh generated
HNO
2
at room temperature for 90 min.
2.5. Analysis of the disaccharides from purified eel skin DS
formed by enzymatic depolymerisation on a SAX- HPLC
Purified skin sulfated GAGs obtained on Mono Q-FPLC
were submitted to exhaustive digestion with chondroitin AC
lyase (see above). Disaccharides and chondroitin AC lyase-
resistant GAGs (composed of DS chains) were recovered by a
Superdex peptide-column (Amersham Pharmacia Biotech)
linked to a HPLC system from Shimadzu (Tokyo, Japan). The
column was eluted with distilled water:a cetonitrile:trifluoroa-
cetic acid (80:20:0.1,v/v) at a flow rate of 0.5 mL/min. Fractions
of 0.5 mL were collected, monitored for UV absorbance at
232 nm and by their metachromatic prope rty using 1,9-
dimethylmethylene blue. Fractions corresponding to the
chondroitin AC lyase-resistant GAGs (eluted at the void
volume) were pooled, freeze dried, and stored at − 20 °C.
Purified eel skin DS, obtained after chondroitin AC lyase
digestion (void volume of Superdex peptide HPLC, see above)
were submitted to exhaustive digestion with chondroitin ABC
lyase. Unsaturated disaccharides, derived from DS chains,
were recovered by a Superdex peptide-column linked to a
HPLC system. The column was eluted with distilled water:
acetonitrile:trifluoroacetic acid (80:20:0.1,v/v) at a flow rate
of 0.5 mL/min. Fractions of 0.5 mL w ere collec ted, monitored
for UV absorbance at 232 nm. F raction s c orresponding to
unsaturated disaccharides were pooled, freeze dried, and
stored at − 20 °C.
The lyase-derived DS unsaturated disacchari des and standard
compounds were subjected to a SAX-HPLC analytical column
(250-mm ×4.6-mm, Sigma-Aldrich), as follows. After equili-
bration in the mobile phase (distilled water adjusted to pH 3.5
with HCl) at 0.5-mL/min, samples were injected and unsaturated
disaccharides eluted with a linear gradient of NaCl from 0 to
1.5 M over 50 min in the same mobile phase. The eluant was
monitored for UV absorbance at 232 nm for comparison with
lyase derived disaccharide standards (Dellias et al., 2004).
2.6. Polyacrylamide gel electrophoresis
The molecular masses of porcine mucosa DS or purified eel
skin DS (after chondroitin AC lyase treatment) were estimated
by polyacrylamide gel electrophoresis. Samples were applied to
a 1-mm-thick 6% polyacrylamide slab gel and after electro-
phoresis at 100 V for ∼ 1 h in 0.06 M sodium barbital (pH 8.6),
the gel was stained with 0.1% toluidine blue in 1% acetic acid.
After staining, the gel was washed for ∼ 6 h in 1% acetic acid.
The molecular mass markers were the same as those used
previously (Pavão et al. 1998).
2.7. Anticoagulant action of the eel skin DS measured by APTT
clotting assay
Pure preparations of skin DS (free of contamination with
CS) were obtained by submitting purified skin sulfated GAGs
obtained on Mono Q-FPLC to exhaustive digestion with
chondroitin AC lyase to degrade contaminant CS. Degrada-
tive products and intact DS chains were separately recovered
by a Superose 12-FPLC gel filtration column. These purified
DS fractions were analyzed by agarose gel electrophoresis
to certify the absence of contamination by other sulfated
GAG species and used in the anticoagulant assays described
bellow.
APTT clotting assays we re carried out as descr ibed (Dellias
et al., 2004). Normal citrate-anticoagulated human plasma
(0.09 mL) was incubated with 0.01 mL of a solution of
purified skin electric eel D S or stand ard porc ine DS at di f-
ferent concentrations and 0.1 mL of kaolin +bovine brain
phospholipid reagent (Reagent Celite, Biolab, Merieux). After
5minofincubationat37°C,0.1mLof0.25MCaCl
2
was
added, and the clotting time was recorded in a coagulometer
(Amelung KC4A).
2.8. Inhibition of thrombin by HCII in the presence of eel skin DS
Incubations were perf ormed in disposabl e se mimicr o-
cuvettes. The f inal concentration s o f reactants included
68 nM HCII, 15 nM thrombin (both fr om Diagnosti ca Stago,
389M.L.S. Souza et al. / Comparative Biochemistry and Physiology, Part B 147 (2007) 387–394
Asnières, France) and 0–1 mg/mL of DS samples in 0.1 mL
of 0.02 TRIS- HCl, 0.15 M NaCl, and 1.0 mg/mL pol yeth-
ylene glycol (pH 7.4) (TS/PEG buffer). Thrombin was added
last to initiate the reaction. After a 60-s incubation at room
temperatur e, 0. 5 mL o f 0.1 mM chromogenic su bstra te S-22 38
(Chromogenix AB, Molndal, Sweden) in TS/PEG buffer was
added, and the absorbance at 405 nm was recorded for 120 s.
The rate o f c ha nge of absorb anc e w as proportio nal to the
thrombin activity remaining in the incubation. No i nhibition
occurred in control e xperiments in which thrombin was in-
cubated with HCII in absence of DS. Nor did inhibition occur
when thrombin was incubated with DS alone over the range of
concentrations tested (Dellias et al., 2004).
2.9. Assessment of antithrombotic properties
Antithrombotic activity was investigated in rats with brain
thromboplastin as the thrombotic stimulus (Tovar et al., 2005).
We followed the institutional guidelines for animal care and
experimentation. Briefly, rats (males, ∼ 200 g body weight) were
anaesthetized with an intramuscular injection of 100 mg/kg body
weight of ketamine and 16 mg/kg body weight of xylazine.
Inferior cava vein was isolated and the right carotid artery
cannulated. Different doses of the eel skin or porcine DS were
injected into the right carotid artery and allowed to circulate for
5 min. Then, brain thromboplastin (5 mg/ kg body weight) was
slowly injected intravenously and after 1 min 0.7 cm of isolated
cava was clamped off using distal and proximal sutures. A high
dose of thromboplastin was used in order to decrease the platelet
activation role in the development of venous thrombosis. After
20 min stasis, the thrombus formed inside the occluded segment
was carefully pulled out, washed with 5% sodium citrate, dried
for 1 h at 60 °C and weighted. Thrombosis was expressed as
percentages of thrombus formati on, with 100% representing
absence of any prevention of thrombosis.
2.10. Bleeding effect
For evaluation of the bleeding effect rats (males, ∼ 200 g
body weight) were anaesthe tized with a combination of
ketamine and xylazine, as described above. A cannula was
inserted into the right carotid artery for the administration of DS
samples (2.5 mg/kg). The GAG was allowed to circulate for
5 min and the rat tail was cut 3 mm from the tip. The tail carefully
immersed in 40 ml of distillated water at room temperature.
Blood loss was determined 60 min later by measurement of the
hemoglobin content in water solution using a spectrophotomet-
ric method, as described by Herbert et al. (1996). The volume of
blood was deduced from a standard curve based on absorbance
at 540 nm. At least 5 animals were used per group.
3. Results
3.1. Isolation and characterization of eel skin sulfated GAGs
GAGs were extracted from skin samples by papain diges-
tion and partially purified by precipitation with CPC solution.
Subsequently, the crude GAG samples were applied into a
Mono Q-FPLC column, where the column-bound sulfated
GAGs were eluted step-wise with 2 M NaCl. The fraction
containing the sulfated GAGs was dialyzed and lyophilized.
The purified skin sulfated GAGs were characterized by agaros e
gel electrophor esis, before and after enzymatic digestions with
chondroitin AC and ABC lyases and by deaminative cleavage
by nitrous acid (Fig. 1). Nearly only one electrophoretic band
with migration similar to that of DS standard, which was
slightly reduced by treatment with chondroitin AC lyase (that
specifically degrades CS standard) and completely removed by
treatment with chondroitin ABC lyase (that specifically
degrades both CS and DS standards), was observed, demon-
strating that DS was the main sulfated GAG species. The slight
decrease of the skin DS electrophoretic band, observed after
treatment with chondroitin AC lyase, showed a small con-
tamination of the DS fraction with CS (Fig. 1). A very week
band is still seen in the stained gels after chondroitin ABC lyase
treatment, and this very small amount of sulfated GAGs may
corresponds to trace amounts of contaminant HS.
3.2. Disaccharide composition of eel skin DS chains
In order to remove the presence of CS chains in the purified
eel skin DS fraction, which will affect the disaccharide analysis
of DS, this fraction was exhaustively treated with chondroitin
AC lyase and the chondroitin AC lyase-resistant GAGs
(composed of DS chains) were recovered by gel filtration
chromatography. The CS-depleted fraction was exhaustively
treated with chondroitin ABC lyase and the unsaturated
disaccharides formed by the depolimerisation of DS chains
were analyzed by HPLC-anion exchange chromatography. The
disaccharide composition of eel skin DS is shown in Table 1.
The main unsaturated disaccharide found was Δdi-4S. Small
amounts of Δdi-0S and Δ di-6S were also observ ed. Significant
amounts of Δdi-diS
B
, accompanied by small content of Δdi-
diS
D
were found in the eel skin DS (Table 1). The amount of the
disaccharide B, which is known to be the binding site to HC II,
in DS from electric eel skin, is similar to that of eel skin and
much higher than that of porcine intestinal mucosa (Table 1).
Fig. 1. Agarose gel electrophoresis of purified sulfated GAGs from the skin of
the electric eel E. electricus, before (−) and after (+) chondroitin AC and ABC
lyase digestions or deaminative cleavage by nitrous acid. After enzymatic or
chemical incubation, the sulfated GAGs were applied to 0,5% agarose gel and
electrophoresis was carried out as described in Section 2. CS, chondroitin 4-
sulfate; DS, dermatan sulfate; HS, heparan sulfate.
390 M.L.S. Souza et al. / Comparative Biochemistry and Physiology, Part B 147 (2007) 387–394
3.3. Estimation of the molecular masses of DS samples
The molecular masses of porcine mucosa DS or purified eel
skin DS (aft er chondroitin AC lyase treatment) were estimated
by polyacrylamide gel electrophoresis. These DS samples
showed a similar molecular size of approximately 40 kDa, since
they showed electrophor etic migrati ons similar to that of
chondroitin 4-sultate standard, which has a molecular mass of
approximately 40 kDa (Fig. 2, porcine, eel and S3, respec tive-
ly). It has been shown that porcine intestinal mucosa DS
presented a molecular mass of approximately 34 kDa, when it
was evaluated by size-exclus ion HPLC chromatography
(Mascellani et al., 1993).
3.4. Skin DS from eels and porcine presented differences in
their anticoagulant activities
Differences were observ ed in the anticoagulant action of the
three types of skin DS, measured by APTT clotting assay.
Electric eel skin DS was more effective in prolonging the APTT
(Fig. 3, open circles) than the porcine DS ( Fig. 3, closed circles).
Unexpectedly, it was shown by Sakai et al. (2003) that skin DS
from eel A. japonica has no anticoagulant activity. Fig. 4 shows
direct measurement of inhibition of thrombin by HC II in the
presence of electric eel skin (Fig. 4, open circles) and porcine
(Fig. 4, closed circles) DS. The IC
50
for thrombin inhibition is ∼
1.8 μg/mL for porci ne DS. Interestingly, the IC
50
for thrombin
inhibition in the presence of HC II for electric eel skin DS (IC
50
∼ 0.1 μg/mL) is 18 times lower when compared with the IC
50
for porcine DS. In contrast, Sakai et al. (2003) found no
appreciable inhibition of HC II in the presence of eel skin DS
(from A. japonica), showing that this DS has no anticoagulant
activity.
In order to access the possible influence of HS trace
contamination present in purified eel skin DS samples, we
performed assays using eel DS preparations that have been
treated with chondroitin ABC lyase or heparan sulfate lyase and
we found that the anticoagulant activities (APTT and stimula-
tion of HC II) were abolished or showed similar results when
compared to those of untreated eel DS samples, respectively
(not shown). These experiment s show that the contamination
with trace amount of HS does not affect the anticoagulant
properties of purified eel skin DS.
3.5. Effect of electric eel skin DS on thrombosis
The effect of electric eel skin and porcine DS on thrombosis
was inves tigated using an experimental venous thrombosis
model in rats. A single injection of electric eel skin DS, given
5 min before the thrombogenic stimulus with rabbit brain
thromboplastin caused a dose-dependent inhibition of thrombus
Table 1
Disaccharide composition of dermatan sulfates (DSs) from eels and porcine
Disaccharide Proportion of disaccharides (%)
E. electricus
a
A. japonica
b
Porcine
c
Δdi-0S 2 6 n.d.
Δdi-4S 72 82 84
Δdi-6S 4 n.d. 6
Δdi-diS
B
14 12 4
Δdi-diS
D
8 n.d. n.d.
Δdi-diS
E
n.d. n.d. 6
n.d.: not detected.
a
Electric eel skin DS. This work.
b
Eel skin DS. Data from Sakai et al. (2003).
c
Porcine intestinal mucosa DS. A similar disaccharide composition has been
reported in Mascellani et al. (1993).
Fig. 2. Polyacrylamide gel electrophoresis of the electric eel and porcine DSs.
Porcine intestinal DS and purified and chondroitin lyase-treated electric eel skin
DS were applied to 6% 1-mm-thick polyacrylamide gel slab in 0.02 M sodium
barbital (pH 8.6) and run for 30 min at 100 V. After electrophoresis the DSs were
stained with 0.1% toluidine blue in 1% acetic acid and then washed for about 4 h
in 1% acetic acid. The molecular mass markers were high molecular mass
dextran sulfate (S1, ∼ 500 kDa), chondroitin 6-sulfate from shark cartilage (S2,
∼ 60 kDa), chondroitin 4-sulfate from whale cartilage (S3, ∼ 40 kDa) and low
molecular mass dextran sulfate (S4, ∼ 8 kDa).
Fig. 3. Analysis of the anticoagulant activity of electric eel skin DS as measured
by the APTT test. Porcine DS is included for comparison. The panel shows a
typical result representative of two different experiments.
391M.L.S. Souza et al. / Comparative Biochemistry and Physiology, Part B 147 (2007) 387–394
formation (Fig. 5, open circles). Electric eel skin DS was more
effective to inhibit thrombosis than porcine DS. With a dose of
∼ 0.8 mg/kg body weight, a 50% reduction of thrombosis was
observed and with 2.5 mg/kg body weight, electric eel DS totally
prevented thrombus formation in all animals tested (Fig. 5, open
circles). A 50% reduction in thrombosis was observed at the
dose of ∼ 1.1 mg/ kg body weight and with 2.5 mg/kg, porcine
DS caused a reduction of ∼ 80% in thrombosis (Fig. 5, closed
circles).
3.6. Bleeding effect of electric eel skin DS
The hemorrhagic risk of DS was assessed based on blood
loss from a rat cut-tail, after intravascular administration of the
glycans. At the dose of 2.5 mg/kg body weight, DS from either
electric eel skin or porcine did not significantly modify the
blood loss compared with rats receiving saline (Table 2).
4. Discussion
DS is the predominant GAG expressed in the skin of marine
vertebrates. DS molecules with distinguished disaccharide
composition and degree of sulfation have been reported in ray
skin (Chatziioannidis et al., 1999a,b; Dellias et al., 2004). DS
from the skin of shark P. glauca (Nandini et al., 2005), a hybrid
CS/DS GAG, has been shown to be highly heterogeneous and
characterized by multiple disaccharides including non-su lfated
disaccharides containing D-glucuronic acid (GlcUA) and
GalNac, mono-sulfated disaccharides bearing GlcUA or IdoA
and esterified sulfate groups at positions C-4 or C-6 of GalNAc,
and disulfated disaccharides units of disaccharide B, disaccha-
ride D and disaccharide E. Unexpectedly, these disulfated
disaccharides were shown to contain GlcUA or IdoA units. DS
isolated from the skin of the eel, A. japonica, has been shown to
be composed mainly of mono-sul fated disaccharides bearing
esterified sulfate groups at positions C-4 of GalNAc (81%), and
disulfated disaccharides units of disaccharide B (12%). Based
on
1
H nuclear magnetic resonance spectroscopy, the presen ce of
3-sulfated and/or 2,3-sulfated IdoA residues has also been
suggested (Sakai et al., 2003).
In the present work we provide additional information on DS
of eel skin by analyzing DS from the skin of the electric eel E.
electricus. Our results showed that electric eel skin DS was
composed mainly of mono-sulfated disaccharides bearing
esterified sulf ate groups at positions C-4 of GalNAc (72%).
Small amounts of non-sulfated (2%) and of mono-sulfated
disaccharides beari ng esterified sulfate groups at positions C-6
of GalNAc (4%) were also observed. Significant amounts of
disulfated disaccharides bearing esterified sulfate groups at
positions C-2 of the uronic acid and at position C-4 of GalNAc
(disaccharide B) (14%), accompanied by small content of
disulfated disaccharides bearing esterified sulfate groups at
positions C-2 of the uronic acid and at position C-6 of GalNAc
(disaccharide D) (8%) were also detected in electric eel skin DS.
We found no evidences to the presen ce of 3-sulfated and/or 2,3-
sulfated uronic acid residues in this eel skin DS.
Altogether, our present results on DS from the skin of the
electric eel E. electricus and the data reported on DS structure
Fig. 4. Dependence on the concentration of electric eel skin DS for inactivation
of thrombin by HC II. Porcine DS is included for comparison. The assays were
performed with a chromogenic substrate for thrombin as referred to in Section 2.
After 120 s, the remaining thrombin activity was determined (A
405 nm
/min). The
panel shows a typical result representative of two different experiments.
Fig. 5. Dose dependence for antithrombotic activity o f DS samples.
Antithrombotic activity was investigated using a stasis thrombosis model in
rats (see Section 2). This figure is expressed as percentages of thrombus
formation (thrombosis), with 100% representing absence of any prevention of
thrombosis. Thrombosis (mean ± SEM, n = 4) is expressed as a function of DS
concentration as mg/kg body mass.
Table 2
Bleeding effect of porcine and electric eel skin DSs
Blood loss (μL)
a
Saline 21.30± 4.3
Electric eel skin DS 26.52± 3.4
Porcine DS 31.73± 8.6
Porcine or electric eel DSs (2.5 mg/kg body weight) were infused into rats and
allowed to circulate for 5 min. The rat-tail was cut 3 mm from the tip and
immersed in 40 ml of distilled water at room temperature. Blood loss was
determined 60 min later by measuring the hemoglobin in the water. The results
are expressed as μL (mean + SEM, n = 5).
a
The volume of blood was deduced from a standard curve of blood base on
absorbance at 540 nm.
392 M.L.S. Souza et al. / Comparative Biochemistry and Physiology, Part B 147 (2007) 387–394
from skin of the following marine vertebrates: eel A. japonica,
five different species of ray ( R. clavata, D. americana,
D. gutatta, A. narinari and P. motoro) and shark P. glauca,
showed structural heter ogeneities among DS from skin of
different marine vertebrates.
DS from eel skin (A. japonica), which has a high content of
the disaccharide B sequence, showed a lesser anticoagul ant
activity when compared to that of the porcine DS skin, which
has two fold lesser disaccharide B sequences than the DS from
eel skin (Sakai et al., 2003). It has been reported that the
presence in the structure of DS of contiguous sequences of
disaccharide B, of at least four repeating sequences, is required
for anticoagulant activity through HC II (Mascellani et al.,
1996). Therefore, Sakai et al. (2003) suggested, as one possible
explanation why eel skin DS has a very low anticoagulant
activity that the disaccharide B sequences in DS from eel skin
might be delocalized, and there was no contiguous sequences of
these disaccharide units. Subsequently, we reported differences
in the anticoagulant action of ray skin DS from the ray species
D. americana, D. gutatta and A. narinari, measured by both
APTT clotting and HC II-mediated inhibition of thrombin
assays, when compared to mammalian DS (Dellias et al., 2004).
DS from D. americana had both high APTT and HC II
activities, whereas DS from D. gutatta showed activity profiles
similar to those of mammalian DS. In contrast, DS from A.
narinari had no measurable activity in the APTT assay. We
speculated that a possible explanatio n for these diffe rent
anticoagulant activities would be related to differences in the
disaccharide arrangement of the disulfated disaccharide B units
within the chains of those three ray skin DS. Other authors have
previously reported similar patterns when they have analyzed
the relations hips between structure and anticoagulant activities
of bovine DS prepar ations (Mascellani et al., 1993; Denti et al.,
1995).
Differences were also observed in the anticoagulant action of
electric eel skin DS from E. electricus, measured by both APTT
clotting and HC II-mediated inhibition of thrombin assays,
when compared to eel or porcine DS. DS from E. electricus had
both high APTT and HC II activities (this work). In contrast, DS
from the eel A. japonica had no appreciable anticoagulant
activity (Sakai et al., 2003). As we used pure preparations of
electric eel skin DS, free of CS contam ination (see Section 2),
these differences were exclusively due to the electric eel skin
DS. DS from both E. electricus and A. japonica presented a
very similar disaccharide composition, but very different
anticoagulant activities. The ability of DS from E. electricus
but not from A. japonica to stimulate thrombin inhibition by HC
II suggests that the arrangement of the disaccharide B subunits
within the glycan chain is important. Our study suggests that DS
molecules present in the two types of eel skin contain different
arrangements of disulfated disaccharide units capable or not of
activating HC II. DS from E. electricus might present
contiguous disulfated disaccharide B units, whereas in DS of
A. japonica these units might be delocalized resulting in the
lack of contiguous sequences of this unit.
Alternatively, the differential anticoagulant activity between
the two eel skin DS might be explained by differences in the
molecular mass of these GAGs. However, confl icting results
have been reported concerning the importance of molecular
mass on the in vitro stimulation of HC II by DS from different
sources. Mascellani et al. (1993) demonstrated that differences
in the m olecular mass of b ovine DS preparations were
correlated with its differential ability to activate HC II. They
showed that the HC II activity of DS fragments decreased with
decreasing molecular mass. On the other hand, Kyogashima
et al. (1999) showed that DS from bovine intestine with a mean
molecular weight of 16 kDa exhibited an effect on stimulation
of HC II higher than that of DS from avian crown with a mean
molecular weight of 38 kDa. The molecular mass of purified eel
skin DS (after chondroitin AC lyase treatment) was estimated
by polyacrylamide gel electrop horesis and it showed a
molecular size of approximately 40 kDa, which is higher than
that of Anguila
skin DS, which was reported to correspond to
14 kDa. Although we think that the distribution of disaccharide
units B along the eel skin DS chains is a key point on its
anticoagulant activity, w e cannot completely exclude the
possibility that the differences in the anticoagulant activities
of these two eel skin DS might be related to their differences in
molecular mass.
In our experimental thrombosis assay, electric eel skin DS,
with a high HCII activity, showed a higher antithrombotic effect
when compared to that of porcine DS, which has a moderate HC
II activity. It might suggest that an enhancement of the catalytic
activity of DS would result in an increase in its antithrombotic
activity. However, Vicente et al. (2001) using similar experi-
mental condition reported that mammalian DS, with a moderate
HC II activity, showed a higher antithrombotic effect when
compared with ascidian DS, which has a high HC II activity.
Moreover, Kyogashima et al. (1999) found that avian crown
DS, with a low HC II activity, showed a higher antithrombotic
effect when compared with mammalian DS, which has
moderate HC II activity. These authors showed that the plasma
levels of avian crown DS were higher than those of mammalian
DS, and speculated that this might be the reason for the higher
antithrombotic activity of avian crown DS. A similar mecha-
nism might be operating here for electric eel DS, but further
experiments would be necessary to clarify this point.
Acknowledgments
This work was supported by Conselho Nacional de Desen-
volvimento Científico e Tecnológico (CNPq) and Fundação de
Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ).
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Distribution of chondroitin sulfate in human endometrium
Luiz E. Nasciutti
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, Renato Ferrari
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Departamento de Histologia e Embriologia, Instituto de Cie
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Cidade Universita
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o, 21941-590 Rio de Janeiro, RJ Brazil
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Laborato
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rio de Tecido Conjuntivo, Hospital Universita
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Universidade Federal do Rio de Janeiro, Brazil
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Departamento de Obstetrı
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cia e Ginecologia, Universidade de Sa
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o Paulo, Brazil
Received 10 November 2005; received in revised form 7 December 2005; accepted 8 December 2005
Abstract
Sulfated glycosaminoglycan (GAG) composition was characterized in the human endometrium during proliferative and secretory phases of the
menstrual cycle. Sulfated GAGs were analyzed in endometrium tissue using metachromatic staining, biochemical analysis including electro-
phoresis before and after specific enzymatic or chemical degradations, and immunostaining with an antibody against chondroitin sulfate (CS). Our
results showed that CS was the main sulfated GAG species detected, accompanied by small amounts of heparan sulfate and dermatan sulfate. CS
was distributed overall the connective stroma, around arteriole vessels and glands, and there was no important difference in the immunostaining
between the proliferative and secretory endometrium phases. Our findings extend previous observations on the GAG composition in the human
endometrium providing new information regarding the tissue distribution and location of endometrial CS.
# 2005 Elsevier Ltd. All rights reserved.
Keywords: Chondroitin sulfate; Glycosaminoglycan; Human endometrium
1. Introduction
During the menstrual cycle, under the influence of ovarian
hormones estrogen (E) and progesterone (P), deep structural
changes occur in the superficial and glandular epithelium, and
in the stroma endometrium. Following menstrual shedding,
under E stimulation, a proliferative phase turns again the tissue
to its functional thickness. After ovulation, P stimulates a
secretory phase, in which changes of the cell secretion prepare a
favorable environment for blastocyst implantation and sub-
sequent fetal development. Extracellular matrix (ECM)
composition and organization are also subjected to cyclic
oscillations of plasma E and P levels (Cidadao et al., 1990). In
the human endometrium, one of the changes in response to
fluctuating steroid hormone levels is the degree of hydration of
the endometrium and the appearance of edema in the stroma
during the P-dominant phase of the cycle.
Glycosaminoglycan (GAGs) consist of hexosamine [
D-
glucosamine or
D-galactosamine] and either hexuronic aci d
[
D-glucuronic or L-iduronic acid] or galactose units that are
arranged in alternating unbranched sequence, and carry
sulfate substitutions in various positions. The common GAGs
include the galactosaminoglycans, chondroitin sulfate (CS)
and dermatan sulfate (DS) and the glucosaminoglycans,
heparan sulfate (HS), heparin, keratan sulfate (KS) and
hyaluronic acid (HA). DS, HS, and heparin contain both
glucuronic acid and iduronic acid units, whereas CS and HA
have the glucuronic acid as the only hexuronic acid. In the
tissue, GAGs are covalent ly bound to a protein core forming a
structure knowing as proteoglycan (PG). The only exception
is the HA, a nonsulfated GAG, which exists a s a protein-free
polysaccharide on cell surfaces and in the ECM (Iozzo, 1998).
The h ighly negatively charged GAG side chains attract
osmotically active cations and an accompaniment of water-
endowing PGs with the ability to contribute to tissue
hydration and expansion (Laurent and Fraser, 1986). Owing
to the variability in s ulfate substitution, all GAGs display
co nsiderable sequence heterogeneity, and it is bel ieved that
structural differences are responsible for highly specific
www.elsevier.com/locate/micron
Micron 37 (2006) 544–550
* Corresponding author. Fax: +55 21 2562 6480.
E-mail address: [email protected] (L.E. Nasciutti).
0968-4328/$ – see front matter # 2005 Elsevier Ltd. All rights reserved.
doi:10.1016/j.micron.2005.12.005
interactions of GAGs with other macromolecules (Powell
et al., 2004; Coombe and Kett, 2005).
Investigations of uterine GAGs have focused their histo-
chemical distribution during the menstrual cycle and at times of
dramatic structural changes, such as during pregnancy or in
association with dilatation of the cervix prior delivery. HA was
observed in the human female reproductive tract, distributed in
the connective tissue lamina propr ia (Edelstam et al., 1991). In
the human endometrium, dramatic changes in HA deposition in
the stromal compartment were demonstrated, which were
correlated to the cyclic growth and remodeling (Salamonsen
et al., 2001). In addition, tw o classes of polypeptide-ass ociated
KS in glan dular and luminal epithelium of human endometrium
were identified by immunohistochemistry and correlated to the
changes in the envir onment of the impla nting embryo (Hoadley
et al., 1990). It was also shown that analysis of secretory KS in
women gives an index of hormonally regulated epithelial
differentiation in the peri-implantation phase (Graham et al.,
1994). These glycans are hormonally regulated in endome-
trium, and show increased abundance in the secretory phase and
may be important in the regulation of embryo attachment
(Aplin et al., 1988).
Although different authors have been suggested that GAGs
play an important role in wound repair, much less is known about
their occurrence during human endometrial cycle changes, and
HA and KS are the only GAGs reported to participate in this
process. Here, we examined the sulfated GAG composition
and tissue distribution in human endometrium in the prolif-
erative/E and secretory/P phases, using biochemical and
immunohistochemical analysis, and demonstrated that CS
was the predominant sulfated GAG species present.
2. Materials and methods
2.1. Human endometrial tissue
We studied 18 cycling patients, betwee n 35- and 45-year-
old, 9 in the proliferative phase (days 9–13), and 9 in the
secretory phase (days 19–26) of the cycle. Endometrium was
obtained from women undergoing hysterectomy for benign
diseases not involving the endometrium, who have not taken
hormones for the last 3 months, at the Service of Gynecology of
the Clementino Fraga Filho Hospital in the Federal University
of Rio de Janeiro, RJ, Brazil, after approval of the Hospital
Ethical Committee. After the hysterectomy, the sample was
taken with a blade after the uterus had been opened from the
lateral wall. A part of the sample was fixed in 4%
paraformaldehyde (PFA) for immu nohistochemistry, and a
part was incubated with acetone for biochemistry procedures.
Histopathology study was done to discard abnormal endome-
trium, and to date the endometrium phase using previously
established criteria (Kohorn and Tchao, 1969).
2.2. Material
CS, DS, HS, twice-crystallized papain (15 U/mg protein),
and deoxyribonuclease I from bovine pancreas were purchased
from Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, USA). Chondroitin
AC lyase (EC 4.2.2.5) from Arthrobacter aurescens, and
chondroitin ABC lyase (EC 4.2.2.4) from Proteus vulgaris
were purchased from Seikagaku American Inc (Rockville, MD,
USA). CS antibody was purchased from Sigma Chemical Co.
(St. Louis, MO, USA).
2.3. Metachromatic staining of sulfated GAGs
Endometrium tissue s were fixed overnight in PFA, 4% in
the Sorensen phosphate buffer (0.1 M, pH 7.4), at 4 8C. After
fixation and washing, the tissues were dehydrated in ethanol
and embedded in paraffin. Tissue sections (7 mm) were
collected on polilysine-coated slides and stained with the
cationic dye 1.9-dimethylmethylene blue (DMB) in 0.1 N HCl,
containing 0.04 mM glycine and 0.04 mM NaCl. The sections
were then examined and photographed using a light microscope
(Zeiss, Axioskop 2). The positive reaction reveals GAGs as
metachromatic structures (colored in purple).
2.4. Isolation of endometrial GAGs
Endometrial tissue was incubated with acetone for 24 h at
room temperat ure and dr ied . The tissue s were suspe nd ed in the
sodium acetate buffer, pH 5.5, containing 40 mg papain in the
presence of 5 mM EDTA and 5 mM cystei ne, and incubated at
60 8C for 24 h. The incubation m ixture was centrifuged at
2000 Â g for 10 min at room temperatur e, and the super natan t,
which contained the G AGs was retained. A 10% cetylpyr-
idinium c hloride solution was added to the supernatant to a
final concentration of 0.5% and the mixture left to stand at
room temperature for 24 h. The solution was centrifuged at
2000 Â g for 10 min at room temperature and the pellet was
washed with 10 mL 0.05% cetylpyridinium solution. This
pellet, a GAG-cetylpyridinium c omplex, was dissolved with
3.7 mL solution of 2 M NaCl/absolute ethanol (100:15, v/v)
and the GAGs were precipitated with the addition of 6 mL
absolute ethanol. After 24 h at 4 8C, the precipitate was
collected by centrifugation and washed twice with 10 mL 80%
ethanol, followed by the same volume of absolute ethanol. The
final pellet, which constitutes the total tissue GAG preparation,
was dissolved in 2 mL phosphate-buffered saline containing
approximately 0.5 mg deoxyribonuclease I and incubated f or
12 h at 37 8C. Finally, the incub ati on mixture was lyophil ize d
and dissolved in 0.2 mL distilled water (Tovar et al., 1998).
2.5. Identification of the endometrial sulfated GAGs
Sulfated GAGs were characterized by agarose gel electro-
phoresis, digestion with chondroiti n lyases and deaminative
cleavage with nitrous acid as described below (Rocha et al.,
2000).
Agarose gel electrophoresis was carried out as previously
described. Approximately, 10 mg of endometrial sulfated GAGs,
estimated by a metachromatic staining procedure with the
cationic dye 1.9-dimethylmethylene blue (Farndale et al., 1986),
before and after chondroitin lyase digestion or deaminative
L.E. Nasciutti et al. / Micron 37 (2006) 544–550 545
cleavage with nitrous acid (see below), as well as a mixture of
standard CS, DS, HS (10 mg of each) were applied to 0.5%
agarose gels in 0.05 M 1,3-diaminopropane: acetate (pH 9.0).
After electrophoresis, sulfated GAGs were fixed in the gel with
0.1% N-acetyl-N,N,N-trimethylammonium bromide in water,
and stained with 0.1% toluidine blue in acetic acid:ethanol:water
(0.1:5:5, v/v).
Digestions with chondroitin AC or ABC lyases were carried
out according to Saito et al. (1968). Approximately, 10 m gof
endometrial sulfated GAGs were incubated with 0.3 units of
chondroitin AC lyase or chondroitin ABC lyase for 8 h at 37 8C
in 100 mL 50 mM Tris–HCl (pH 8.0) containing 5 mM EDTA
and 15 mM sodium acetate.
Deamination by nitrous acid at pH 1.5 was performed as
previously described (Shively and Conrad, 1976). Briefly,
approximately 10 mg endometrial sulfat ed GAGs were incu-
bated with 200 mL freshly generated HNO
2
at room temperature
for 10 min. The reaction mixture was then neutralized with
1.0 M Na
2
CO
3
.
2.6. Immunodetection of CS
Endometrium tissues were prepared as described above for
histochemistry. The endogenous peroxidase activity was
blocked with 3% hydrogen peroxide. The slices were then
incubated with goat normal serum and 1% bovine serum
albumin (BSA) to reduce nonspecific antibody binding. After
washing in 0.01 M phosphate buffer saline (PBS) pH 7 .5, the
sections were incubated overnight at 4 8C with monoclonal
anti-CS antibody (mouse IgM isotype) (Sigma) at 1:200
dilution. The reaction was revealed with StreptAB Complex/
HRP Duet Kit (Dako Corporation, Carpinteria, CA, USA) and
3,3
0
diaminobenzidine (DAB) tablets. Counterstaining was
carried out with Harris’s haematoxylin. Negative controls were
L.E. Nasciutti et al. / Micron 37 (2006) 544–550546
Fig. 1. Fotomicrographies of human endometrium in proliferative (A–C) and secretory (D–F) phases of menstrual cycle, stained with DMB. Observe abundant purple
metachromatic material distributed all over the stroma, concentrated around blood vessels ()), endometrial glands and in the basement membrane (!). Note that the
metachromasia is more diffuse in the secretory phase. In some glands, the staining is present inside the lumen at the secretory product (^). (A–F) 400Â.
obtained omitting the primary antibody (incubating the sections
in 0.01 M phosphate buffer saline pH 7.5).
3. Results
Histological findings confirmed the morphological char-
acteristics of normal human endometrium during proliferative
and s ecretor y phases (data not shown). In t he proliferative
phase, the tubular glands were straight and lined by quite
regular, tall, columnar cells. Mitotic figures were numerous,
associated with epithelial pseudoestratifica tion, and there was
no evidence of mucus secretion or vacuolation. The
endometrial stroma was composed of thickly compacted
spindle cells (fibroblasts) that had a scant cytoplasm but
abundant mitotic activity. After ovulation, the secretory
endometrium was marked by basal secretory vac uoles beneath
the nuclei in the glandular e pithelium and the t ortuosity of the
glands. In some cases, we observed rupture of columnar
epithelial cells and release of secretions into the gland lumen.
The stroma between the glands became edematous, and the
spiral arterioles more prominent. Scattered neutrophils and
occasional lymphocytes w ere also noted.
3.1. Metachromatic staining of endometrial sulfated GAGs
The endometrium stained with cationic dye DMB showed
abundant metachromatic (purple) material, distributed all
over the stroma. In the proliferative phase (Fig. 1A–C),
metachromatic staining w as intense and homogeneous
between the connective cells in stroma, and more concen-
trated on the basal layer close to the myometrium. In some
sub-epithelial regions of superficial or glandular epithelia,
the basal membrane region was evident. Medium staining
intensity was found around arterioles, but not around
venules. In the secretory endometrium (Fig. 1D–F), the
metachromatic distribution was similar. As expected, in this
phase the stroma is edematous and the purple material was
more diffuse. In some sections, metachromatic reaction was
observed in the apical surface of epithelial cells and inside the
lumen of the glands.
3.2. Characterization of endometrium sulfated GAGs
The GAGs were characterized upon their migration on
agarose gel and digestion with specific lyases or deamination
with nitrous acid. The GAG preponderant in the human
endometrium, both in proliferative and secretory phases,
migrated on agarose gel as the CS standard, and disappeared
totally from the gel after chondroitin AC lyase digestion. Two
other GAGs, found in minor amounts, migrated as HS and DS
standards, which disappeared totally from the gel after
deaminative cleavage with nitrous acid and digestion by
chondroitin ABC lyase, respectively. These experiments
characterized these sulfated GAGs as CS, HS and DS,
respectively, and revealed a great dominance of CS in
comparison with HS which was the second most present
sulfated GAG, and DS the third one (Fig. 2). With these
procedures, we had no evidence for the presence of KS in the
endometrium. However, we cannot rule out the possibility that
endometrial KS, detected immunohistochemically by other
authors previously, if present in the tissue of our patients, might
not either be large enough or present in a concentration
insufficient to be precipitated, and was not detected in these
studies.
3.3. Tissue distribution of endometrial CS
As revealed by the biochemistry analysis, CS was very
abundant in human endometrium. Using a monoclonal antibody
against CS GAG chains, we decided to investigate the
localization of these molecules in the proliferative and
secretory phases of endometrium. CS was observed in the
same regions as the DMB metachromatic staining. As expected,
the peroxidase deposit was observed in both endometrial
phases, distributed overall the connective stroma, concentrated
around the arteriole vessels and the glands, and in the epithelial
basal membranes. In the secretory phase, the peroxidase
product was present concentrated around the edematous
regions, and also in the lumen of some glands (Fig. 3).
L.E. Nasciutti et al. / Micron 37 (2006) 544–550 547
Fig. 2. Representative electrophoretograms of sulfated GAGs from prolifera-
tive (B) and secretory (C) human endometrium, before (À) and after enzymatic
degradation with chondroitin AC and ABC lyases (+) or deaminative cleavage
by nitrous acid (+). The agarose gel electrophoresis was performed as described
in Section 2. Sulfated GAGs were detected on gels by staining with toluidine
blue. In (A) a mixture of standard GAGs containing heparan sulfate (HS),
dermatan sulfate (DS) and chondroitin sulfate (CS) was analyzed by agarose gel
electrophoresis as described above. Note that chondroitin AC lyase degrades CS
standard, while chondroitin ABC lyase degrades both CS and DS standards.
Treatment with nitrous acid specifically degrades HS standard.
4. Discussion
Many studies have demonstrated the importance of ECM
components in tissue behavior and organization. In particular,
GAGs and PGs have important roles during normal and
pathological events, related to organogenesis in embryonic
development, cell recognition, cell division, adhesion, migra-
tion, regulation of growth factor action, lipid metabolism,
wound repair and infection (Lindahl et al., 1998; Sugahara and
Kitagawa, 2000; Sugahara et al., 2003).
In humans, the endometrial tissue undergoes cyclic
morphological and functional modifications, stimulated by
estrogen and progesterone, and involving rearrangement of
extracellular matrix components. Unfortunately, studies regard-
ing GAGs distribution during the human endometrial cycle are
scarce. An analysis of the HA distribution was performed in
biopsy specimens from the female reproductive tract, using a
biotinylated hyaluronan binding protein (HABP) as a histo-
chemical probe (Edelstam et al., 1991). In normal endome-
trium, the staining was confined to the vessels wall and to a
weak and patchy distribution in the connective tissue, and no
cyclic changes in HA content were observed. On the other hand,
histochemical analysis has shown peaks of HA deposition in the
stromal compartment during the mid-proliferative (days 5–10)
and the mid-secretory phases (days 19–23) of the human
endometrium cycle. In contrast, the HA staining around blood
vessels was constant throughout the cycle (Salamonsen et al.,
2001). Besides HA, KS was the other GAG molecule detected
in human endometrium. Using immunohistochemistry, KS was
observed associated with glandular epithelium throughout the
normal human endometrium cycle, increasing in the secretory
phase of the cycle, inside the epithelial cells and secretions, and
L.E. Nasciutti et al. / Micron 37 (2006) 544–550548
Fig. 3. Fotomicrographies of human endometrium in proliferative (A–C) and secretory (D–F) phases of menstrual cycle, immunostained with an antibody against CS.
The peroxidase product is distributed overall the stroma, concentrated around blood vessels ()), endometrial glands and in the basal membrane (!). In the lumen of
some glands, the secretory product is also immunostained (^). Observe that the edema regions in the secretory endometrium stroma are delimited by CS deposit.
Insert in C: negative control. (A–F) 400Â; insert 100Â.
probably correlated to the regulation of embryo attachment
(Graham et al., 1994; Aplin et al., 1988).
In our study, we showed by biochemical methods that CS
was the major sulfated GAG species, followed by HS and DS,
present in proliferative and secretory phases of human
endometrial cycle. KS might be present in trace amounts,
which escaped from our biochemical methods and could be
only detected by immunohistochemical methods such as those
performed by other authors (Graham et al., 1994; Aplin et al.,
1988). These observations confirmed the occurrence of an
abundant sulfated material distributed all over endomet rial
phases, as suggested by DMB metachromatic staining. In the
ovine endometrium, it was shown significant differences
between the GAG content during estrogen- and progester-
one-dominant phases of the estrous cycle, with estrogen-
dominant tissue containing significantly more total GAG.
Characterization of endogenous GAGs showed the presence
of CS, HA, HS and KS, with CS and HA contributing over 80%
of total GAG (Tellbach et al., 2003).
When compare d to HA distribution observed by other
authors (Salamonsen et al., 2001), the tissue localization of CS
was similar: it was present overall the stroma and concentrated
around blood vessels and glands. In addition, we also observed
CS deposition in the epithelial basal membrane regions,
suggesting its participation in basal membrane composition
and function.
In the secretory phase, which is concomitant to the
implantation of the conceptus in a fertile cycle, CS was
present at the epithelial surface and i nside the lumen of glands.
This localization was very similar to that observed for KS in
endometrium (Graham et al., 1994; Aplin et al., 1988).
Interestingly, we also observed a CS concentration around the
edematous regions, suggesting its participation in the physical
control of these formations and in the degree of hydration of
the endometrium. The presence of CS in the gland secretions
raises questions regarding endometrial glandular maturation
in the normal cycle, the influence of progesterone in the c ontrol
of this localization, and the CS participation in embryo
attachment. The important distribution of CS in the whole
endometrium tissue could be also re lat ed to the growth factors
storage and the modulation of the cyclic angiogenesis
processes. Interestingly, very r ecently Yamaguchi et al.
(2006) reported a homogeneous immunoreactivity for chon-
droitin sulfate proteoglycan 2 (CSPG2) distributed all over
epithelium, stroma and endothelium of proliferative and
secretory human endometrium. CSPG2 is a PG that binds to
selectin L u sing its specific GAG chains (Kawashima et al.,
2000). The immunoreactivity for CSPG2 was membranous,
cytoplasmatic, and homogeneous in the epithelium. The
immunostaining intensity in the stroma was equivalent to that
in the epithelium which elevated from the proliferative phase to
the secretory phase (Yamaguchietal.,2006). The authors
concluded that their findings support the idea that the
interaction between selectin L a nd selectin L ligands, as the
endometrial CSPG2, functions in the postovulatory selective
recruitment of CD16(À) natural killer cells from peripheral
blood into the endometrium.
In conclusion, our results with the histochemical, biochem-
ical and immunohistoc hemical procedures showed a predomi-
nance of CS as the main sulfated GAG present in human
endometrium. The present study extends previous observations
on the GAG composition in human endometrium providing new
information regarding the tissue distribution and location of
endometrial CS. These observations may be useful for future
investigations aiming to evaluate the possible implication of
these GAGs in normal and pathologic human endometrial cycle.
Acknowledgements
This work was supported by Conselho Nacional de
Desenvolvimento Cientı
´
fico e Tecnolo
´
gico (CNPq: PADCT
and PRONEX), Fundac¸a
˜
o Universita
´
ria Jose
´
Bonifa
´
cio (FUJB)
and Fundac¸a
˜
o de Amparo a
`
Pesquisa do Estado do Rio de
Janeiro (FAPERJ).
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