( PDF ) Atividade antioxidante do chá mate (Ilex paraguariensis)

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Universidade de São Paulo

Faculdade de Saúde Pública

Atividade antioxidante do chá mate (Ilex

paraguariensis)

Ruth Lobato Teixeira Matsumoto

Dissertação apresentada ao

Programa de Pós-Graduação em

Saúde Pública para fins de

obtenção do título de Mestre em

Saúde Pública.

Área de concentração: Nutrição

Orientadora: Prof

. Assoc. Deborah Helena Markowicz Bastos

São Paulo

2008

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Atividade antioxidante do chá mate (Ilex

paraguariensis)

Ruth Lobato Teixeira Matsumoto

Dissertação apresentada ao

Programa de Pós-Graduação em

Saúde Pública para fins de

obtenção do título de Mestre em

Saúde Pública.

Área de concentração: Nutrição

Orientadora: Prof

Assoc. Deborah Helena Markowicz Bastos

São Paulo

2008

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À minha família,

em especial Vinicius e

Laura que fazem tudo na

minha vida valer a pena

AGRADECIMENTOS

À Profa. Deborah Helena Markowicz Bastos pela confiança, incentivo e incessante

colaboração;

Á Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo – FAPESP pelo suporte

financeiro para realização da pesquisa e pela concessão de bolsa de estudo;

À Empresa Leão Júnior pela doação de amostras de chá mate utilizadas nesta

pesquisa

A todas as participantes do protocolo, as quais gentilmente concordaram com todas as

normas e doaram sangue para realização deste estudo;

Ao Prof. Alejandro Gugliucci pela inspiração científica e colaboração para o

desenvolvimento deste estudo;

Ao Prof. Edson Luiz da Silva da Universidade Federal de Santa Catarina pela atenção

e todo auxílio dispensado ao longo desta pesquisa;

Á Dra. Simone Mendonça e Profa. Dra. Nágila Raquel Teixeira Damasceno pela

relevante cooperação na realização deste projeto;

À Profa. Titular Ana Cristina d’Andretta Tanaka por disponibilizar o Centro de Saúde

Escola Geraldo de Paula Souza para realização das coletas de sangue;

À Valéria S. Nunes, Fabiana Ferreira e Rodrigo Iborra do Laboratório de Lípides

(LIM 10) da Faculdade de Medicina da USP pelas análises de LDL;

Ao Prof. Dr. Marcelo Lima Ribeiro da Universidade São Francisco pela realização

das análises de PCR real time;

Às colegas de laboratório Geni Rodrigues Sampaio, Liania Luzia, Emília Ishimoto,

Lílian Pino e Rosana Manólio Soares pelo espírito de equipe e bons momentos;

À amiga Daniela Moura de Oliveira pela ajuda nas análises de eletroforese e pelo

fundamental apoio durante todo este trabalho.

Á aluna de iniciação científica Michele Moreira pela ajuda nos testes e coleta de

sangue dos voluntários;

RESUMO

INTRODUÇÃO: A erva-mate (Ilex paraguarienis), uma planta nativa e consumida

em grande parte da América do Sul, apresenta diversos compostos bioativos que já

demonstraram importante atividade antioxidante in vitro e in vivo. O chá mate é um

produto desta planta cujas propriedades antioxidantes ainda não foram avaliadas em

ensaios com humanos. OBJETIVO: Este projeto visa avaliar o potencial antioxidante

do chá mate in vivo e ex vivo sobre o plasma e LDL de humanos após a ingestão de

chá-mate. MÉTODOS: Indivíduos em jejum (n=20) tiveram seu sangue coletado em

três momentos: antes, após uma hora e depois de 1 semana (7 dias) da ingestão diária

de chá-mate. O plasma e a LDL obtidos nos três momentos foram submetidos à

oxidação por três mecanismos diferentes [Cobre (Cu

), lipoxigenase e peroxinitrito

(SIN-1)] e em seguida foram medidos os produtos de peroxidação lipídica formados:

a concentração de TBARs (substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico) e a formação

de dienos conjugados empregando-se métodos espectrofotométricos. Também foram

determinados o perfil antioxidante total do plasma (TAS), avaliação da

lipoperoxidação plasmática basal (TBARs), avaliação da fragmentação da

Apolipoproteína B após oxidação da LDL, por eletroforese em gel com SDS-PAGE e

os níveis de expressão, por meio de análise de PCR real time, de alguns genes

relacionados à produção de enzimas antioxidantes. Teste t de Student pareado foi

utilizado para verificar se houve diferença estatisticamente significante entre os

resultados das diversas análises antes e após o consumo do chá. RESULTADOS: Os

resultados obtidos pela maioria dos ensaios realizados demonstraram que o consumo

de chá mate aumentou a resistência à oxidação, a capacidade antioxidante plasmática

e a expressão de genes relacionados à produção de enzimas

antioxidantes. CONCLUSÃO: Esses resultados sugerem que o consumo de chá mate

por período curto pode atuar como antioxidante por múltiplos mecanismos e portanto

pode contribuir para diminuição do risco de desenvolvimento de doenças crônicas

relacionadas a processos oxidativo.

Descritores: Antioxidantes; compostos fenólicos; Ilex paraguariensis, peroxidação

lipídica, LDL, enzimas antioxidantes

ABSTRACT

INTRODUCTION: Yerba Mate (Ilex paraguariensis) is a native and widely

consumed South American plant. It contains high concentrations of bioactive

compounds that respond for its high antioxidant activity in vitro and in vivo. This

activity has not been demonstrated yet in humans for the mate tea, a product derived

from Yerba Mate. OBJECTIVE: The aim of this study was to evaluate the

antioxidant activity of maté tea in vivo and ex vivo on plasma and LDL human after

ingestion of mate tea infusion. METHODS: Fasting peripheral venous blood samples

of twenty healthy women (n=20) were taken in three different times: before drinking

the tea, one hour later and after one week of daily consumption (7 days) of mate tea.

The plasma and isolated LDL were oxidated with 3 different systems [copper

(CuSO

), lipoxygenase and peroxynitrite (SIN-1)].

Next, the peroxidation products

evaluated were: concentration of malonaldeyde (TBA) and conjugated dienes (lag

time), using spectrophotometric methods. We also measured the plasma total

antioxidant status (TAS), serum levels of malondialdehyde (MDA) as thiobarbituric

substances (TBARS), fragmentation of apo B using SDS-PAGE and the level of

antioxidant enzyme gene expression by PCR real time. Paired t student test was used

to analyze the results before and after ingestion of mate tea. RESULTS: The results

obtained by most of the tests showed that mate tea ingestion increased the plasma and

LDL resistance by ex vivo oxidation, the plasma antioxidant capacity and the level of

antioxidant enzyme gene expression. CONCLUSION: This study suggests that

regular consumption of mate tea can act as an antioxidant by multiple mechanisms

and thus may contribute decrease the risk of developing chronic diseases related to

oxidative processes.

Key words: Antioxidant; phenolic compounds; Ilex paraguariensis, Lipid

peroxidation, LDL, antioxidant enzymes

ÍNDICE

1. INTRODUÇÃO 14

2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 17

2.1 Radicais livres: conceito e formação

2.2 Peroxidação lipídica

2.3 Estresse oxidativo e antioxidantes

2.4 Compostos fenólicos como antioxidantes

2.5 Erva-Mate (llex paraguariensis)

2.5.1 Classificação dos principais produtos comerciais

2.5.1.1 Chimarrão e Tererê

2.5.1.2 Chá mate tostado

2.5.2 Propriedades funcionais da Erva-mate

3. JUSTIFICATIVA 41

4. OBJETIVOS 41

4.1 Objetivo geral

4.2 Objetivos específicos

5. MATERIAL E MÉTODOS 42

5.1 Casuística

5.2 Critérios de inclusão

5.3 Critérios de exclusão

5.4 Desenho do estudo

5.5 Preparação da infusão de chá-mate (Ilex paraguariensis)

5.6 Obtenção de sangue, plasma e LDL

5.7 Medida das variáveis bioquímicas

5.8 Oxidação do plasma e da LDL

5.8.1 Oxidação do plasma

5.8.2 Oxidação da LDL

5.9 Monitoramento da peroxidação lipídica

5.9.1 Formação de Dienos conjugados

5.9.1.1 Plasma

5.9.1.2 LDL

5.9.2 Determinação das Substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico

(TBARS)

5.10 Medida do perfil de antioxidantes totais no plasma

5.11 Avaliação da lipoperoxidação basal do plasma (TBARs)

5.12 Extração de RNA e síntese de cDNA

5.13 Quantificação da Expressão por PCR em Tempo real

5.14 Eletroforese da porção protéica da LDL

5.15 Avaliação do consumo alimentar

5.16 Análise dos resultados

5.17 Questões éticas

6. RESULTADOS 55

6.1 Características da população estudada

6.2 Quantificação dos produtos de peroxidação lipídica no plasma

6.2.1 Formação de Dienos conjugados

6.2.2 Determinação das Substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico

(TBARS)

6.3 Medida do perfil de antioxidantes totais no plasma

6.4 Avaliação da lipoperoxidação do plasma (TBARS)

6.5 Quantificação da expressão por PCR em tempo real

6.6 Quantificação dos produtos de oxidação da fração LDL

6.6.1 Formação de Dienos conjugados após indução oxidativa com

Sulfato de Cobre

6.6.2 Razão máxima de Formação de Dienos conjugados em LDL após

indução oxidativa com 3-morfolinosidinonimina (SIN-1) e

Lipoxigenase

6.6.3 Substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS)

6.7 Avaliação da fragmentação da Apolipoproteína B

6.8 Avaliação do consumo alimentar

7. DISCUSSÃO 68

8. CONCLUSÃO 84

9. BIBLIOGRAFIA CONSULTADA 85

ANEXOS

Anexo 1 – Registro de consumo alimentar

101

Anexo 2 – Termo de consentimento livre e esclarecido

102

LISTA DE FIGURAS

Figura 1: Peroxidação lipídica: uma reação em cadeia.

Figura 2: Esquema das defesas antioxidantes enzimáticas, mostrando a

geração de espécies reativas

Figura 3: Estrutura molecular dos alcalóides presentes na erva-mate

Figura 4: Estrutura molecular das saponinas presentes na erva-mate

Figura 5: Estrutura molecular dos ácidos fenólicos presentes na erva

mate

Figura 6: Desenho do estudo

Figura 7: Valores individuais da concentração de malonaldeído formado

na LDL (TBARS) antes (T=0), após 1 hora (t=1) e depois de 1 semana

(t=2) de consumo do chá-mate

Figura 8: Placa de eletroforese com as bandas de LDL oxidada e não

oxidada (controle) com sulfato de cobre de cada participante obtidas

antes (T=0), após 1 hora (T=1) e depois de 1 semana (T=2) de consumo

do chá-mate

Figura 9: Placa de eletroforese com as bandas de LDL oxidada com

sulfato de cobre de cada participante obtidas antes (T=0), após 1 hora

(T=1) e depois de 1 semana (T=2) de consumo do chá-mate

LISTA DE TABELAS

Tabela 1: Estudos sobre os efeitos biológicos de erva mate (Ilex

paraguariensis)

Tabela 2: Características da população estudada no período basal

Tabela 3: Lag Time de oxidação do plasma (Dienos conjugados) antes

(T=0), após 1 hora (T=1) e depois de 1 semana (T=2) de consumo do

chá-mate

Tabela 4: Concentração de malonaldeído formado no plasma (TBARS)

após indução oxidativa, antes (T=0), após 1 hora (T=1) e depois de 1

semana (T=2) de consumo do chá-mate

Tabela 5: Perfil de antioxidantes totais no plasma (TAS) antes (T=0),

após 1 hora (T=1) e depois de 1 semana (T=2) de consumo do chá-mate.

Tabela 6: Concentração de malonaldeído formado no plasma (TBARS)

antes (T=0), após 1 hora (T=1) e depois de 1 semana (T=2) de consumo

do chá-mate

Tabela 7: Avaliação da Expressão relativa das enzimas antioxidantes

Glutationa peroxidase (GPx), Superóxido dismutase (SOD) e Catalase

antes (T=0) e depois de 1 semana (T=2) de consumo do chá-mate

Tabela 8: Lag Time de oxidação da LDL (Dienos conjugados) antes

(T=0), após 1 hora (T=1) e depois de 1 semana (T=2) de consumo do

chá-mate

Tabela 9: Razão máxima de Formação de Dienos conjugados em LDL

após indução oxidativa com Sulfato de Cobre antes (T=0), após 1 hora

(T=1) e depois de 1 semana (T=2) de consumo do chá-mate

Tabela 10: Razão máxima de Formação de dienos conjugados em LDL

após indução oxidativa com lipoxigenase antes (T=0), após 1 hora (T=1)

e depois de 1 semana (T=2) de consumo do chá-mate

Tabela 11: Razão máxima de Formação de Dienos conjugados em LDL

após indução oxidativa com 3-morfolinosidinonimina (SIN-1), antes

(T=0), após 1 hora (T=1) e depois de 1 semana (T=2) de consumo do

chá-mate

Tabela 12: Concentração de malonaldeído formado na LDL (TBARS)

após indução oxidativa antes (T=0), após 1 hora (T=1) e depois de 1

semana (T=2) de consumo do chá-mate

Tabela 14: Composição nutricional estimada do consumo alimentar dos

indivíduos antes e durante o período de intervenção

Tabela 15: Composição nutricional do consumo alimentar dos

indivíduos estimada ajustado pela energia, antes e durante o período de

intervenção

1. INTRODUÇÃO

O estresse oxidativo induzido por espécies reativas de oxigênio é um dos

maiores focos da pesquisa recente relacionada ao câncer e a doenças cardiovasculares

(Halliwell 2000).

Estudos epidemiológicos mostram que uma dieta saudável, na qual a maior

parte da ingestão de calorias provém de vegetais, pode reduzir o risco de doenças

crônico-degenerativas como aterosclerose e câncer (Halliwell 2000). Este efeito

protetor advém não somente dos macronutrientes presentes nas plantas, como as

proteínas, carboidratos complexos e lipídeos, mas também de compostos originários

do seu metabolismo secundário que são denominados, genericamente, de fitoquímicos

(Bravo 1998; Visioli et al. 2000; Halliwell 2000). Estas substâncias são capazes de

agir como protetoras frente ao estresse oxidativo (conjunto de condições intra e

extracelulares que leva à geração exacerbada de radicais livres de oxigênio), atuando

como “varredores” de radicais livres e/ou moduladores dos mecanismos de defesa

antioxidante e do sistema de reparo do DNA (Moller e Loft 2006; Thompson et al.

2005; Johnston et al. 2004).

Dos vários produtos naturais que estão sendo estudados, os que contêm

compostos fenólicos tem sido objeto de muitas pesquisas (Manah et al. 2004).

Os compostos fenólicos constituem-se num complexo grupo de substâncias

químicas presentes em plantas e produtos de origem vegetal e fazem parte da dieta

humana (Lidsay 2000; Karakayas 2001; Clifford 2004). Estudos epidemiológicos

sugerem que o consumo de alimentos e bebidas contendo estes compostos exercem

um papel importante na prevenção de doenças crônicas não transmissíveis (Block et

al. 1992, Knert et al. 1996), decorrente, em grande parte, da sua reconhecida

atividade antioxidante (Johnston et al. 2004).

As bebidas a base de erva-mate (Ilex paraguariensis) contêm vários

compostos bioativos, como as metilxantinas (cafeína e teobromina), as saponinas e

os compostos fenólicos. Nesta última classe de compostos, os mais abundantes são os

ácidos fenólicos, normalmente os ácidos cafeoilquínicos ou clorogêncios (Clifford e

Ramirez 1990; Mazzafera 1997; Carini et al. 1998; Bastos et al. 2005; Bastos et al.

2006).

A atenção para a erva-mate e o seu potencial uso para a promoção de saúde,

vem sendo focado apenas recentemente pela comunidade científica. Em meados da

década de 90 foram publicados os primeiros trabalhos que demonstraram a atividade

antioxidante in vitro e in vivo de infusões de erva-mate verde (chimarrão) (Gigliucci e

Stahl 1995; Gigliucci 1996; Campos et al. 1996). Em seguida, outros resultados

publicados a partir de ensaios com infusões da erva-mate verde demonstraram outros

efeitos fisiológicos benéficos ao organismo relacionados ao seu consumo (Bracesco et

a. 2003; Ramirez-Mares et al. 2004; Gorzalczany et al. 2001; Baisch et al. 1998;

Stein et al. 2005; Gugliucci e Menini 2002; Lunceford e Gugliucci 2005).

A grande maioria dos trabalhos mencionados foi conduzida com a erva-mate

para chimarrão, isto é, a erva-mate verde seca e cancheada. Não há trabalhos in vivo

que evidenciem se o processo de torrefação da erva-mate verde para a produção do

chá-mate, o qual promove inúmeras transformações relativamente à composição

qualitativa e quantitativa dos compostos bioativos, influencia na atividade

antioxidante desta matéria prima.

Visto que: (a) o chá mate é um alimento de baixo custo, versátil, que pode ser

consumido na forma de bebida fria ou quente, constituindo-se em veículo de

substâncias bioativas naturalmente presentes num alimento saudável. (b) Não existir

publicações que evidenciem se erva-mate torrada apresenta potencial antioxidante in

vivo, este trabalho propôs a avaliar se o chá mate apresenta atividade antioxidante in

vivo e ex vivo sobre o plasma e LDL de humanos.

2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

2.1 Radicais livres: conceito e formação

A associação entre a presença de radicais livres e a patogênese de diversas

doenças, bem como a proteção conferida por certas substancias antioxidantes, tem

despertado o interesse da comunidade científica (Halliwell e Gutteridge 2000).

O termo radical livre é freqüentemente usado para designar qualquer átomo ou

molécula com existência independente, contendo um ou mais elétrons

desemparelhados na sua órbita externa. Isto determina uma atração para um campo

magnético, o que pode torná-lo altamente reativo, capaz de reagir com qualquer

composto situado próximo à sua órbita externa, passando a ter uma função oxidante

ou redutora. Os radicais livres são formados em um cenário de reações de óxido-

redução, isto é, ou cedem o elétron solitário, oxidando-se, ou recebem outro,

reduzindo-se. Portanto os radicais livres ou provocam ou resultam dessas reações de

óxido-redução (Halliwell e Gutteridge 2000).

A oxidação é parte fundamental da vida aeróbica e do nosso metabolismo e,

assim, radicais livres são formados fisiologicamente pelo organismo, como resultado

do processo de respiração celular que ocorre nas mitocôndrias das células, a fim de

gerar ATP. Os radicais livres produzidos pelos macrófagos e neutrófilos são

empregados contra bactérias e fungos invasores do organismo, produzindo ação lesiva

a estes microrganismos. Estes também podem ser formados pela exposição do

organismo a fatores exógenos, como ozônio, radiações gama e ultravioleta, tabaco,

substâncias tóxicas presentes em alimentos e bebidas (aditivos químicos, hormônios,

aflatoxinas, etc), alto consumo de gorduras saturadas (frituras, embutidos, etc) e de

certos medicamentos. Por outro lado, o excesso de radicais livres leva a importantes

alterações em nível molecular que estão associadas a danos às macromoléculas

biológicas como lipídios, proteínas e DNA, gerando alterações teciduais que estão

implicadas em inúmeros processos patológicos, como por exemplo: câncer,

aterosclerose, doenças neurodegenerativas, diabetes, cirrose, artrite reumatóide etc.

(Halliwell e Gutteridge 2000).

Em sua maioria, os radicais livres derivam do oxigênio e denominam-se

genericamente “Espécies Reativas de oxigênio” (EROs). Estas também podem se

referir às espécies que não são radicais livres, e sim algumas moléculas derivadas de

oxigênio capazes de gerar radical livre, como o peróxido de hidrogênio (H

)

(Abdalla 2006).

Dentre as EROs, o radical superóxido (O

), radical hidroxila (HO



) e

peróxido de hidrogênio (H

) são formados em todas as células aeróbias, enquanto a

espécie mais reativa, oxigênio singlete (

), é formada pela excitação do oxigênio

fundamental (

), pela energia térmica ou fotoquímica, dissipada por substancias

“sensibilizadoras” quando irradiadas com luz em comprimento de onda específico

(Abdalla 2006).

Os radicais livres podem ainda ser formados por reações químicas envolvendo

espécies reativas de nitrogênio (ERN), enxofre (ERS), pelas reações enzimáticas da

ciclooxigenase, lipoxigenase e aldeído oxidase, pelas reações catalisadas por metais

de transição como o ferro e o cobre, entre outras (Rover Júnior et al. 2001; Halliwell

2000; Belló 2002).

Radical superóxido

O radical superóxido (O

) é produzido continuamente através de diversos

processos celulares onde ocorre a redução de um elétron do oxigênio. A molécula

toma então uma carga negativa e torna-se radicular.





 O

O superóxido é formado em pequenas quantidades na cadeia respiratória

aeróbia. Também é produzido por macrófagos como agente antibacteriano. Algumas

enzimas têm o superóxido como intermediário reacional ou mesmo produto final. Os

principais danos causados pelo superóxido em sistemas biológicos são a destruição de

centros metálicos de proteínas, oxidação de cadeias laterais de aminoácidos e a

formação de outras espécies oxidativas, como o radical hidroxila e o peroxinitrito

(Winterbourn e Kettle 2003).

Peróxido de hidrogênio

O peróxido de hidrogênio (H

) apresenta poder oxidante indireto, gerando

radical hidroxila (HO



) e interagindo com o radical superóxido (O

). Nesse caso, ele

torna-se um potente oxidante e, dependendo da concentração, pode degradar qualquer

célula (Mattos et al. 2003).

Como é uma molécula relativamente apolar, o H

pode atravessar

membranas por difusão simples, reagindo localmente com íons metálicos como o

ferro (II) e o cobre (I) através da chamada reação de Fenton. Nesta reação ocorre a

formação do radical hidroxila. Este mecanismo é responsabilizado por danos

encontrados no DNA em situações de estresse oxidativo (Mattos et al. 2003).

O peróxido de hidrogênio é gerado pelas mesmas fontes que produzem o

radical superóxido, pois tanto a reação enzimática (superóxido dismutase):

2 O

+ 2 H





 O

+ 2 H

como a sua redução produzem peróxido de hidrogênio (Mattos et al. 2003).





 O







Radical hidroxila

O radical hidroxila (HO



) é considerado o mais poderoso oxidante de todas as

espécies reativas de oxigênio. Isso porque pode reagir com todos os tipos de

macromoléculas biológicas, produzindo derivados que não podem ser regenerados

através do metabolismo celular. Este radical pode ser gerado principalmente através

da reação de Fenton, mas também por outros mecanismos diversos, a partir do

peroxinitrito, radical superóxido e na presença da ação catalítica de metais de

transição (Halliwell e Gutteridge 2000).

Os principais alvos da ação do radical hidroxila são o DNA (que sofre danos

nas suas bases, levando à quebra da dupla cadeia) e os ácidos graxos insaturados (que

sofrem peroxidação lipídica) (Halliwell e Gutteridge 2000).

SOD

Oxigênio singlete

O oxigênio singlete (

) resulta da excitação da molécula de oxigênio, sem

ocorrer a sua ionização. O oxigênio (no estado fundamental) é excitado por moléculas

previamente excitadas pela luz, numa reação conhecida como fotossensibilização.

Também pode ser produzido em determinadas reações enzimáticas, sem a intervenção

da luz (Abdalla 2006).

O (

) pode reagir com biomoléculas adicionando-se a ligações duplas (como

por exemplo, em ácidos graxos insaturados) ou por transferência de energia (por

exemplo, eliminando radicais livres necessários para a catálise de algumas enzimas)

(Abdalla 2006).

Efeitos deletérios, observados quando determinadas células são expostas à luz,

têm sido atribuídos à produção do (

), que pode ser produzido em sistemas

biológicos tendo como agente fotossensível o pigmento retinal da púrpura visual ou a

porfirina (produto metabólico de compostos hemínicos). A excessiva formação de

(

) foi relacionada ao dano em células visuais expostas de forma prolongada à luz,

e a sintomas na epiderme (como erupções e espessamento), causados pelo acúmulo de

porfirina na pele, devido a alterações metabólicas congênitas (Halliwell e Gutteridge

2000).

Óxido nítrico e peroxinitrito

O óxido nítrico (NO



) é um radical livre sintetizado em nosso organismo, que

possui propriedades fisiológicas importantes, dentre as quais se destacam seus papéis

como neurotransmissor e como vasodilatador (Abdalla 2006).

Em algumas situações apresenta um potencial citotóxico relacionado à formação de

espécies de alta reatividade e citoxicidade. Por ser uma espécie radicalar, o (NO



) é

capaz de reagir rapidamente com outros radicais importantes do ponto de vista

biológico, tais como oxigênio molecular e o radical superóxido (O

), sendo o

peroxinitrito (

OONO) o produto desta reação. Tais espécies são potentes oxidantes,

capazes de oxidar lípides, proteínas e bases do DNA entre outros problemas (Queiroz

e Batista 1999).

2.2 Peroxidação lipídica

Todos os componentes celulares são suscetíveis à ação dos radicais livres,

porém a membrana é um dos mais atingidos em decorrência da peroxidação lipídica.

Isso ocorre devido ao fato dos ácidos graxos poliinsaturados serem, por causa de suas

múltiplas duplas ligações, excelente alvos para o ataque das EROs (Sies 1993).

Tal processo pode gerar uma série de reações deletérias que acarretam

alterações na sua estrutura e permeabilidade. Conseqüentemente, há perda da

seletividade na troca iônica e liberação do conteúdo de organelas, como as enzimas

hidrolíticas dos lisossomos, e formação de produtos citotóxicos (como malonaldeído e

dienos conjugados) culminando com a morte celular. A lipoperoxidação também pode

estar associada aos mecanismos de envelhecimento, câncer e à exacerbação da

toxicidade de xenobióticos (Halliwell e Gutteridge, 2000).

Assim como na formação dos radicais livres, nem sempre os processos de

lipoperoxidação são prejudiciais, pois seus produtos são importantes na resposta

inflamatória participando na formação de prostaglandinas e de outras vias de

transdução de sinais. Todavia, o excesso de tais produtos pode ser lesivo (Halliwell e

Gutteridge 2000).

Nos sistemas biológicos a peroxidação pode ocorrer principalmente por duas

vias: A primeira uma via enzimática envolvendo as ciclooxigenases e lipoxigenases

na oxigenação dos ácidos graxos poliinsaturados e a segunda, que envolve a

participação de espécies reativas de oxigênio e nitrogênio, metais de transição e

outros (Lima e Abdalla 2001).

O mecanismo de lipoperoxidação é uma reação em cadeia que pode ser

dividido didaticamente em três etapas (Dotan et al. 2004):

1º Etapa – Iniciação: As EROs são formadas a partir da reação de moléculas

de lipídeos com o oxigênio (O

) na presença de algum agente catalisador, como a luz,

calor, ou íons metálicos. Ao sofrer ataque das EROs, a cadeia poliinsaturada perde

um átomo de hidrogênio, formando assim um radical livre. Ou seja, o processo é

iniciado quando o radical hidroxila (HO) captura um átomo de hidrogênio do carbono

metileno na cadeia do ácido graxo, que se torna radical alquil (L



2º Etapa – propagação: Durante este processo, os radicais livres formados

reagem com o oxigênio para formar o radical peroxila (LOO



), que é muito instável e

reage posteriormente com um átomo de hidrogênio da molécula de ácido graxo

adjacente formando os hidroperóxidos, que ao se decomporem formam novos radicais

livres.

3º Etapa – Terminação: Nesta última etapa, ocorre a reação em cadeia entre os

próprios radicais originando produtos não radicais, como os aldeídos. O principal

deles é o malondialdeído (MDA), que é altamente tóxico. Estas etapas estão

representadas na Figura abaixo:

Figura 1: Peroxidação lipídica: uma reação em cadeia. Adaptado Mafra et al. 1999.

As oxidações dos lípides pelas EROs constituem a base da formação da placa

de aterosclerose, que é iniciada principalmente pela oxidação da LDL (Nordberger e

Arnèr 2001). Inúmeras outras patologias como diabetes, hiperlipidemia, doenças

hepáticas, cardiovasculares e neurodegenerativas mostram níveis aumentados de

produtos da lipoperoxidação no plasma, como por exemplo, hidroperóxidos, dienos

conjugados, aldeídos e outros (Halliwell e Gutteridge 2000).

1º Iniciação

→

2º Propagação

→

3º Terminação

→

2º Propagação

→

2.3

Estresse oxidativo e antioxidantes

O conjunto de condições intra e extracelulares que leva à geração exacerbada

de espécies reativas de oxigênio (EROs) é denominado “estresse oxidativo”

(Sies

1993). Tal evento é caracterizado como uma conseqüência da insuficiência do

potencial antioxidante do organismo ou da exacerbação de processos que induzam

uma maior formação de espécies oxidantes, resultando em danos oxidativos

responsáveis por várias ações deletérias, tais como aumento nos níveis de

peroxidação de lipídios de membranas, aumento na carbonilação de proteínas e até

danos ao DNA intracelular (Ferreira et al. 1997 e Diaz

et al.1997).

O estresse oxidativo tem sido relacionado com a etiologia de várias doenças,

incluindo doenças degenerativas tais como as cardiopatias, aterosclerose e alguns

tipos de câncer (Halliwell e Gutteridge 2000).

Para prevenir ou reduzir os efeitos do estresse oxidativo, o organismo está

equipado com diversos mecanismos de defesa antioxidante, tais como a presença dos

antioxidantes não enzimáticos (-caroteno, selênio, α-tocoferol, vitamina C,

compostos fenólicos etc.) e os antioxidantes enzimáticos (superóxido dismutase

(SOD), catalase (CAT) e a glutationa peroxidase (GPX) que neutralizam ou reduzem

a ação das EROs (Yu

1994).

Antioxidantes enzimáticos

O sistema antioxidante enzimático constitui a primeira defesa endógena a agir

aos ataques das espécies reativas de oxigênio, impedindo sua formação ou

seqüestram-nas de forma a impedir sua interação com alvos celulares, ou seja,

bloqueiam a etapa de iniciação da cadeia radicular (Rover Júnior et al. 2001)

Através da ação das enzimas antioxidantes, as células tentam manter baixas as

quantidades do radical superóxido e de peróxido de hidrogênio, evitando assim a

formação do radical hidroxila, que é extremamente reativo e deletério às células

(Boveris e Cadenas 1997).

O sistema antioxidante enzimático é formado por diversas enzimas, entre elas,

a superóxido dismutase (SOD), a catalase (CAT) e a glutationa peroxidase (GPx)

(Figura 2) (Halliwell e Gutteridge 2000).

A SOD corresponde a uma família de enzimas com diferentes grupos

prostéticos em sua composição. Nos sistemas eucariontes existem duas formas de

SOD. A forma SOD-cobre-zinco (CuZn-SOD) está presente principalmente no

citoplasma e nos fluidos extracelulares, enquanto que SOD-manganês (Mn-SOD) está

localizada primariamente na mitocôndria. Esta enzima tem papel fundamental na

defesa do organismo contra o ataque das EROs, pois atua através da dismutação do

radical superóxido em peróxido de hidrogênio (H

) e oxigênio (O

) (Winterbourn e

Kettle 2003).

A GPx, uma enzima antioxidante dependente de selênio, catalisa a redução do

peróxido de hidrogênio (H

) e de outros peróxidos orgânicos, às custas da

conversão da glutationa reduzida (GSH) a glutationa oxidada (GSSG) e água (H

O) e

peróxidos orgânicos a álcool. Assim, a GPx desempenha um papel importante na

inibição da peroxidação lipídica e na prevenção de danos no DNA e no RNA (Martins

2007).

A Catalase é uma hemeproteína citoplasmática localizada nos peroxissomos

do fígado e rins e em microperoxissomos de outras células. Tal enzima catalisa a

redução do peróxido de hidrogênio (H

) a água (H

O) e oxigênio (O

) (Rojkind et

al. 2002).

Figura 2: Esquema das defesas antioxidantes enzimáticas, mostrando a geração de espécies

reativas Mitocôndria, NADPHoxidase ou xantina oxidase e outros sistemas convertem (O

) em (O



o qual é dismutado pela superóxido dismutase (SOD), H

pode ser convertido em H

O pela catalase

(CAT) e/ou glutationa peroxidase (GPx), ou o H

pode formar radical hidroxil (



OH) após reação

com Fé

. A (GPx) reduz todos os hidroperóxidos além do H

utilizando glutationa reduzida (GSH),

um doador de hidrogênio. Outra enzima, a glutationa redutase (GR), mantêm o equilíbrio entre (GSH)

(99%) e (glutationa oxidade (GSSG 1%). O (O

-

), se não retirado do meio, pode reagir rapidamente

com óxido nítrico (NO



) para formar peroxinitrito (OONO



Fonte: Griending e Fitizgerald 2003.

Antioxidantes não enzimáticos

Os antioxidantes não enzimáticos, em sua maioria, necessitam ser adquiridos

pela alimentação. As frutas e vegetais são as principais fontes destes antioxidantes. A

maior parte dos estudos científicos se concentrou em três nutrientes chaves: a

vitamina E, a vitamina C e os pigmentos carotenóides. Estes nutrientes parecem ter

uma ação conjunta eficiente na eliminação das EROs (ILSI 2002).

A vitamina E pode ser considerada a mais significante dos antioxidantes

lipofílicos, pois participa ativamente da inibição da oxidação da LDL. É encontrada

nas membranas das lipoproteínas e em tecidos como fígado, rins, tecido adiposo e

adrenal. A vitamina E bloqueia a peroxidação lipídica por atuar como scavenger de

radicais livres, tais como os radicais peroxila, radical superóxido, hidroxila e oxigênio

singlete. Para que ela possa atuar sobre os efeitos deletérios dos radicais livres, deve

se manter no seu estado não oxidado, o qual a torna dependente de outros

antioxidantes, como a vitamina C (Rique et al. 2002 e Martins et al. 2004).

A vitamina C é uma vitamina hidrofílica que pode funcionar como

neutralizador de espécies reativas de oxigênio. Acredita-se que o ácido ascórbico

possa proteger o organismo contra a ação dos radicais livres de duas formas:

diretamente, eliminando os radicais hidroxila e peróxido de hidrogênio antes que eles

iniciem a peroxidação lipídica e indiretamente, regenerando a forma ativa da vitamina

E e outros antioxidantes como os flavonóides e a glutationa, para que estes exerçam

seu potencial antioxidante (Rique et al. 2002 e Jacob 1998).



Os carotenóides compreendem uma família de compostos naturais, dos quais

mais de 600 variantes estruturais estão reportadas e caracterizadas. São pigmentos

freqüentemente encontrados em alimentos de origem vegetal e os responsáveis pelas

colorações amarela, alaranjada e vermelha. Os principais carotenóides presentes nos

alimento são o betacaroteno, licopeno, glutationa, quercetina e luteína. Alguns

carotenóides como betacaroteno se convertem em vitamina A no organismo. A

estrutura química dos carotenóides é baseada em uma cadeia de carbonos com a

presença de ligações duplas, compartilhadas ou não. Estas ligações duplas

características fazem desses compostos potenciais antioxidantes, uma vez que suas

moléculas são capazes de receber elétrons de espécies reativas, neutralizando os

radicais. A ação seqüestradora de radicais é proporcional ao número de ligações

duplas conjugadas, presentes nas moléculas dos carotenóides (Krinsky 1994).

Existe ainda uma série de outros antioxidantes não enzimáticos que participam

da defesa contra as EROs nos sistemas biológicos como, por exemplo os

oligoelementos (zinco, cobre, selênio etc) flavonóides e outros compostos fenólicos

(derivados de plantas). Esta última classe de antioxidante será descrita separadamente

no próximo item (Vannucchi et al. 1998 e Hanasaki et al. 1994).

2.4 Compostos fenólicos como antioxidantes

Os compostos fenólicos estão amplamente distribuídos no reino vegetal, sendo

conhecida atualmente mais de 8.000 estruturas. São metabólitos secundários de

plantas, que possuem um anel aromático com um ou mais substituintes hidroxílicos,

incluindo seus grupos funcionais. Tais substâncias ocorrem naturalmente em frutas

frescas, vegetais, nos chás e nos vinhos tintos e fazem parte integral da dieta humana

(Manach et al. 2004).

Pesquisas sobre a absorção e biodisponibilidade de polifenóis ainda são

escassas, principalmente devido ás limitações de métodos analíticos devidamente

validados. A maioria desses compostos está presente nos alimentos na forma de

ésteres, glicosídios ou de polímeros que não são possíveis de ser absorvidos na sua

forma nativa. Sabe-se que a estrutura química dos polifenóis e a composição da

microflora intestinal determinam a taxa e a extensão da absorção e a natureza dos

metabólitos circulantes no plasma (Scalbert 2000). A medida direta da concentração

destes compostos na circulação e urina e o aumento da capacidade antioxidante do

plasma após sua ingestão, pode fornecer evidências de sua absorção no trato

gastrointestinal (Manach et al. 2004).

Após a ingestão, os fenólicos são conjugados no intestino delgado e mais tarde

no fígado. Aparecem no plasma de 1 a 7h após sua ingestão, geralmente conjugados

com ácido glucurônico ou como compostos sulfatados e metilados (Manah et al.

2004; Nardine et al. 2002; Scalbert et al. 2005).

Acredita-se que a biodisponibilidade e atividade biológica dos polifenóis está

diretamente relacionada com sua estrutura química e, além disso, exista uma

variabilidade individual sobre o metabolismo e biodistribuição desses compostos em

humanos (Monteiro et al. 2007).

Os polifenóis têm sido objeto de estudo de muitas pesquisas por estarem

associados à prevenção de doenças crônico-degenerativas, como aterosclerose e

câncer. A bioatividade dos fenólicos pode estar relacionada com potencial

antioxidante, que é associada à própria natureza química deste grupo de compostos:

devido à sua estrutura, polifenóis são em geral bons agentes redutores e juntamente

com outros agentes redutores encontrados na dieta tais como vitamina C, vitamina E e

carotenóides, podem proteger tecidos e estruturas celulares contra danos oxidativos

(Vinson e Dabbag 1998). Tais substâncias são capazes de inibir a oxidação de

diversos substratos através da captação de radicais livres, bloqueando reações em

cadeia e algumas vezes agindo como quelantes de metais (Shahidi et al. 1992),

atuando tanto na etapa de iniciação como na propagação do processo oxidativo. Os

produtos intermediários, formados pela ação destes antioxidantes, são relativamente

estáveis devido à ressonância do anel aromático apresentada por estas substâncias

(Soares 2002).

Além do potencial antioxidante, os fenólicos possuem outras propriedades,

dentre elas, atividade antiinflamatória, anti-agregação plaquetária, diurética, antiviral

e anticarcinogênica, sendo também benéficos ao sistema cardiovascular por sua

participação na vasodilatação (Rice-Evans 1996; Neiva et al. 1999).

Os compostos fenólicos podem ser divididos em dois grandes grupos: Os

flavonóides e seus derivados e os ácidos fenólicos.

Os denominados de flavonóides são os que apresentam a estrutura química

descrita como C6-C3-C6, sendo estes os compostos mais diversificados no reino

vegetal. Podem ser representados pelas antocianinas, flavonas, flavonóis, catequinas,

taninos e isoflavonas. A distribuição dos flavonóides nos vegetais depende de

diversos fatores de acordo com a fila/ordem/família do vegetal, bem como da

variação das espécies. Os flavonóides são formados da combinação de derivados

sintetizados da fenilalanina (via metabólica do ácido chiquímico) e ácido acético. Os

padrões de distribuição dependem do grau de acesso à luminosidade, especialmente

raios ultravioletas, pois a formação dos flavonóides é acelerada pela luz (Degáspari e

Waszczynskyj 2004).

Os flavonóides atuam como antioxidantes na inativação dos radicais livres, em

ambos os compartimentos celulares lipofílico e hidrofílico. Esses compostos têm a

capacidade de doar átomos de hidrogênio e, portanto, inibir as reações em cadeia

provocadas pelos radicais livres (Bianchi e Antunes1999).

Os ácidos fenólicos caracterizam-se por terem um anel benzênico, um

grupamento carboxílico e um ou mais grupamentos de hidroxila e/ou metoxila na

molécula, conferindo propriedades antioxidantes tanto para os alimentos como para o

organismo, sendo, por isso, indicados para o tratamento e prevenção do câncer,

doenças cardiovasculares e outras doenças (Manah et al. 2004).

Os ácidos fenólicos podem ser divididos em três grupos. O primeiro é

composto pelos ácidos benzóicos, que possuem sete átomos de carbono (C

-C

) e são

os ácidos fenólicos mais simples encontrados na natureza. O segundo é formado pelos

ácidos cinâmicos, que possuem nove átomos de carbono (C

-C

), sendo sete os mais

comumente encontrados no reino vegetal. O terceiro grupo é representado pelos

ácidos fenólicos que, além de se apresentarem sob sua forma natural, podem também

se ligar entre si ou com outros compostos. A combinação mais importante destes

ácidos ocorre com o ácido caféico, o qual, associado a um álcool-ácido cíclico,

denominado ácido quínico, origina o ácido clorogênico (Soares 2002).

Os ácidos clorogênicos são um conjunto de 5 grupos principais de compostos

fenólicos e seus isômeros formados, principalmente, pela esterificação do ácido

quínico com um dos seguintes ácidos derivados do ácido cinâmico: o ácido cafeico, o

ferúlico, ou o p-cumárico. O ácido 5-O-cafeoilquínico (5-CQA) é o mais relatado

dentro desta classe de substâncias, sendo absorvido no intestino antes e após a

metabolização por bactérias (Olthof et al. 2001 e 2003).

Durante as últimas décadas, os efeitos protetores do ácido clorogênico (ACG)

sobre os sistemas biológicos foram abordados em diferentes estudos in vitro e in vivo.

Há diversos estudos que avaliaram produtos ricos em ACG na prevenção do câncer,

doenças cardiovasculares entre outras (Soares 2002; Karakayas 2001; Mancine-Filho

e Moreira 2003; Giada e Mancine-Filho 2004; Bravo 1998 e Waterman e Mole 1994).

Alguns autores verificaram seu efeito antioxidante na diminuição da oxidação in vitro

de LDL, sendo comparado ao poder encontrado para a Vitamina E, C e ß-Caroteno

(Laranjinha et al. 1994; Vinson e Dabbagh 1998). Essa ação antioxidante é devida à

presença de um grupamento orto-di-hidroxila no anel aromático do ácido cafêico, que

atuaria como um aceptor de radicais livres, participando na fase de iniciação e de

propagação do processo oxidativo (Monteiro e Trugo 2005). Em outro trabalho, foi

relatado que o 5-CQA apresentou propriedades anti-inflamatórias devido a sua

capacidade de inibição do processo inflamatório mediado por citocinas (Tatefuji et al.

1996). No estudo conduzido por Parker et al. (1998) e Herling et al. (1999)

observou-se uma diminuição dos níveis sanguíneos de glicose, por meio da inibição

da enzima glicose-6-fosfatase após uso de injeções de ACG.

Essa variedade de efeitos benéficos atribuídos ao ACG, preponderantemente

ao 5-CQA, tem encorajado muitos pesquisadores a trabalhar com essa família de

compostos fenólicos (Clifford e Ramirez-Martinez 1990; Nardine et al. 2002;

Gugliucci e Menine 2002; Olthoff et al. 2003; Bastos et al. 2005).

2.5 Erva- Mate (llex paraguariensis)

A Erva-mate é uma árvore da família das aqüifoliáceas, originária da região

subtropical da América do Sul, presente no sul do Brasil, norte da Argentina,

Paraguai e Uruguai. Entretanto, cerca de 80% da área de ocorrência pertence ao

Brasil, distribuindo-se entre os Estados do Mato Grosso do Sul, São Paulo, Paraná,

Santa Catarina e Rio Grande do Sul. A região Sul é a maior produtora, onde é

explorada por pequenos produtores que se reúnem em cooperativas para processá-la

ou comercializá-la (Heck e Mejla 2007).

O consumo de bebidas a base de erva-mate remonta de centenas de anos. Os

indígenas das nações Guarani e Quíchua tinham o hábito de beber infusões com suas

folhas. Atualmente os produtos da erva-mate são consumidos como chá quente ou

gelado, como chimarrão (Brasil) ou tererê (Mato Grosso do Sul e Paraguai)

(Esmelindro et al 2002 e

Bastos e Torres 2003).

A Ilex paraguariensis é utilizada na medicina popular e por herboristas

recomendada para artrite, dor de cabeça, constipação, reumatismo, hemorróidas,

obesidade, fadiga, retenção de líquido, hipertensão, digestão lenta e desordens

hepáticas. Devido a estas propriedades, a erva-mate encontra-se inclusa em

importantes farmacopéias como a Martingdale e a British Herbal Pharmacopoeia.

(Anesini et al. 2006).

Os principais fitoquímicos presentes na erva-mate são os compostos fenólicos,

as saponinas e as metilxantinas. Nesta última classe de compostos podemos citar a

cafeína, a teobromina e a teofilina (Figura 1) (Alikaridis 1987), componentes de

reconhecida ação sobre o sistema nervoso central, aos quais é atribuída a ação

estimulante do mate. Dentre a classe de saponinas encontram-se as agliconas, os

ácidos ursólico e oleanólico (Figura 2) (Gnoatto et al 2007). Tais substâncias são

responsáveis pelo amargor e espuma do mate e pela atividade antiinflamatória além

de outras inúmeras propriedades biológicas (Gnoatto et al 2007). Entre os compostos

fenólicos destaca-se o elevado conteúdo de derivados cafeoilquínicos, como o ácido

clorogênico (ACGs) e seus isômeros (Figura 3), aos quais se atribui a ação

adstringente e antioxidante do produto (Clifford 1990 e Cardozo-Junior et al. 2007).

Além do ácido clorogênico, os flavonóides rutina, quercetina, diglicosídeo de

luteolina, taninos e a cafeoilglicose também estão presentes no extrato aquoso de Ilex

paraguariensis (Ricco et al. 1991; Carini et al. 1998; Filip et al. 2001).

Figura 3: Estrutura molecular dos alcalóides presentes na erva mate Fonte: Bastos et al. 2007

Figura 4: Estrutura molecular das saponinas presentes na erva mate Fonte: Bastos et al. 2007

Cafeina

Teobromina Theophyline

Ácido oleanólico

Acido ursólico

Figura 5: Estrutura molecular dos ácidos fenólicos presentes na erva mate Fonte: Bastos et al. 2007

2.5.1 Classificação dos principais produtos comerciais

2.5.1.1 Chimarrão e Tererê

O chimarrão e o tererê são a denominações dada tradicionalmente à erva-mate

seca, triturada e socada com grande porcentagem de paus, folhas, pó e goma.

Chimarrão é destinado à degustação em cuia, com água quente conservando o

paladar amargo. O tererê consiste em infusão de erva-mate degustada com água

gelada (Bastos e Torres et al. 2003

e Embrapa 2006).

O processamento da erva-mate para chimarrão e tererê consiste basicamente

de três etapas: sapeco, secagem e cancheamento. O sapeco é realizado junto ao fogo

direto e consiste na passagem rápida dos ramos com folhas sobre as chamas do

sapecador. O equipamento consiste de um cilindro metálico, perfurado e inclinado

através do qual a erva colhida passa recebendo as chamas. Esta etapa tem por função

a retirada da umidade superficial e inativação de enzimas (peroxidase e

polifenoloxidase) que causam a oxidação do produto. A temperatura média da erva na

Ácido cafeoilquínico e derivados

= R

= H; R

= cafeoil (acido clorogênico)

= R

= H; R

= cafeoil (neo- acido clorogênico)

= R

= H; R

= cafeoil (crypto- acido

clorogênico)

Radical cafeoil

Ácido Dicafeoilquínico e derivados

= R

= H; R

= R

= cafeoil

= R

= H; R

= R

= cafeoil

= R

= H; R

= R

= cafeoil

= R

= H; R

= R

= cafeoil

entrada do sapecador é de 400°C e na saída é de 65°C. O tempo de residência oscila

em torno de 8 minutos. O tempo de residência e a temperatura média da erva nos

secadores dependem das características operacionais de cada sistema. No secador de

esteira, o tempo médio é de 3 horas e a temperatura varia entre 90 e 110°C. No

secador rotativo, o produto permanece em contato direto com a fumaça por

aproximadamente 30 minutos. No entanto, a temperatura não apresenta a mesma

uniformidade da utilizada no secador de esteira, sendo que na entrada do secador a

temperatura média é de 350°C e na saída 110°C.

O cancheamento consiste na trituração da erva após o processo de secagem.

Em seguida, a erva é peneirada e o material coletado passa a denominar-se erva

cancheada. Esta pode ser usada diretamente como matéria-prima para a produção de

chás ou, após passar por um processo de soque, como chimarrão

(Esmelindro et al.

2002; Bastos e Torres 2003

e EMBRAPA 2006)

2.5.1.2

Chá mate tostado

A erva-mate padronizada para preparação do chá mate tostado é o produto

beneficiado constituído somente de folhas ou de folhas e de galhos, triturados,

tostados em equipamentos apropriados. A erva-mate passa por um sistema de forno

com fogo indireto semelhante ao que se usa para torrefação de café, para então dar

origem ao chá mate tostado. Depois de tostado o mate passa por um processo de

extração, por água quente e vapor sob pressão, em colunas extratoras, onde são

retirados os sólidos solúveis. O líquido extraído (extrato) é adoçado transformando-se

em xarope. O extrato é desidratado em contato com ar quente transformando-se em

mate solúvel (Bastos e Torres 2003 e

EMBRAPA 2006).

O processo de torrefação leva á modificações importantes em produtos de

origem vegetal devido à degradação térmica progressiva, como a perda de nutrientes,

assim como a possível diminuição do teor de polifenólicos. Contudo, este efeito pode

ser minimizado pela formação de produtos antioxidantes da reação de Maillard, tais

como as melanoidinas, que possuem uma forte atividade antioxidante atuando como

captadores de metais pesados e promovendo a decomposição de hidroperóxidos.

Essas mudanças refletem-se na atividade antioxidante desses produtos (Bastos e

Torres 2003; Manzocco et al. 2001).

A erva-mate padronizada para preparação do chá mate verde é o produto

beneficiado, constituído somente de folhas, ou de folhas e de galhos, triturados,

conservando a cor de origem (Bastos e Torres 2003 e

EMBRAPA, 2006).

2.5.2

Propriedades funcionais da Erva-mate

O interesse no potencial uso da erva-mate para a promoção de saúde é

relativamente recente. Em meados da década de 90 foram publicados os primeiros

trabalhos que demonstraram a atividade antioxidante in vitro e in vivo de infusões de

erva-mate verde e seca (chimarrão)

(Glugliucci 1996; Glugliucci e Stahl 1995 e

Campos et al.1996)

Filip et al. 2000 e 2001 observou um maior potencial antioxidante da erva-

mate quando comparada a diferentes espécies de Ilex consumidas na América do sul.

No estudo realizado por Bastos e colaboradores (2007), os extratos de erva-mate

verde e tostada apresentaram atividade antioxidante in vitro superior à do chá verde

(Camellia sinesis). Em outra pesquisa verificou-se que a erva-mate apresentava

atividade antioxidante equivalente ou superior à vitamina C, Vitamina E e ou Trolox,

substâncias consideradas como padrão para essa propriedade (Laranjinha et al. 1994;

Vinson e Dabbagh 1998; Schinella et al. 2000; Gugliucci e Menini 2002 e Chandra e

Mejia 2004). Na seqüência, outros resultados publicados a partir de ensaios com

infusões da erva-mate verde demonstraram alguns dos efeitos farmacológicos

popularmente atribuídos a esta planta: efeito colerético e de propulsão intestinal

(Gorzalczany et al 2001); inibição da glicação, reação na qual açúcares reagem com

proteínas e lipídes plasmáticos que se acumulam formando locais propícios à

formação de radicais livres (Lunceford e Gugliucci et al. 2005); ação

hipocolesterolêmica (Stein et al. 2005) efeito vasodilatador e vasorelaxante (Baisch et

al. 1998; Felippi 2005 e Stein et al. 2005); atuação na progressão da aterosclerose

(Mosimann et al. 2006) e outros trabalhos sobre a atividade antioxidante

relacionados ou não com a inibição do processo de oxidação da LDL e alterações na

estrutura e no sistema de reparo do DNA, o que poderia contribuir para prevenção da

aterosclerose e câncer (Filip et al. 2000; Gugliucci e Menini 2002; Bracesco et al.

2003; Ramirez-Mares et al. 2004; Bastos et al. 2006; Menine et al. 2007 e

Miranda et

al 2008)

A Tabela 1 descreve resumidamente alguns trabalhos sobre os efeitos

biológicos da infusão de erva-mate in vitro, in vivo e ex vivo, em que se confrontam

os objetivos, a metodologia empregada e os resultados observados.

A grande maioria das pesquisas aqui relacionadas foi conduzida com a erva-

mate beneficiada para chimarrão, isto é, a erva mate verde seca e cancheada. A

torrefação promove mudanças na composição química da erva mate, como a

degradação de cafeína e ácidos fenólicos e a formação de melanoidinas, pirazinas e

pirinas, assim como altera a cinética de extração dos compostos bioativos (Bastos et

al. 2006), o que pode levar a modificações na biodisponibilidade e em atividades

biológicas, como a atividade antioxidante.

Tabela 1: Estudos sobre os efeitos biológicos de erva-]mate (Ilex paraguariensis)

Amostra -

Tipo de

estudo

Objetivo Metodologia Resultado Referência

Infusão de erva-mate

verde, indivíduos

saudáveis – ex vivo

Verificar efeito da

ingestão de infusão de

mate em LDL humana

Produção de TBARs; Dienos

conjugados; fragmentação de

Apo B por SDS-PAGE.

A infusão foi capaz de

minimizar a oxidação

induzida conforme avaliada

por todos os métodos

empregados

Gugliucci e

Menini 2002

Infusão de erva-mate

verde, indivíduos

saudáveis – ex vivo

Avaliar a prevenção de

oxidação de LDL

humano e prevenção de

desnaturação de DNA de

Saccharomices

cerevisiae

Indução da quebra da cadeia

de DNA por peróxido de

hidrogênio; Oxidação da

LDL por ação da

lipoxigenase e por peróxido.

A oxidação da LDL e a

quebra do DNA foram

inibidos pela infusão de mate

em um mecanismo dose-

dependente

Brasceno et al.

2003

Extrato de erva-mate

verde, Ratos machos

Wistar –e x vivo

Investigar as

propriedades

vasorelaxantes de

diferentes extratos de

erva mate em artéria

mesentérica de ratos.

Perfil lipídico; Leito arterial

mesentérico de ratos.

O extrato de erva-mate

possui efeito

hipocol

esterolêmico e, ainda,

atividade vasorelaxante

dose-dependente em artéria

mesentérica de ratos,

sugerindo o envolvimento do

óxido nítrico nesse efeito.

Stein et al 2005

Extrato de erva-mate

verde, Coelhos

machos New

Zealand – in vivo

Verificar se a erva mate

pode reduzir a

progressão da

aterosclerose em coelhos

alimentados com

colesterol.

Avaliação da lesão

aterosclerótica na artéria

aorta; Perfil lipídico;

dosagem de TBARs;

Enzimas antioxidantes.

O extrato de erva-mate

possui a habilidade de

reduzir a progressão de

aterosclerose experimental

vivo.

Mosimann et al

2006

Erva-mate verde

(chimarrão),

voluntários saudáveis

– ex vivo

Verificar se o consumo

de chimarrão influencia

atividade da enzima

antioxidante, paroxonose

(PON-1) , presente na

HDL

Atividade sérica da PON-1 O consumo de chimarrão

aumentou atividade da

enzima PON-1.

Menine et al

2007

Erva-mate verde,

tostada e chá verde -

in vitro

Avaliar a atividade

antioxidante do chá mate

e chá verde em extratos

aquoso, alcóolico e

etanólico.

Atividade antioxidante por

captação do radical livre

DPPH e inibição da oxidação

por sistema ß-

caroteno/ácido

linoléico.

Elevada atividade

antioxidante de diferentes

extratos de erva-mate (verde

e tostada) e de chá verde

Bastos et al

2007

Erva-mate verde ,

Ratos Wistar – ex

vivo

Avaliar a ação do extrato

de erva mate verde sobre

a secreção de enzimas

antioxidantes presentes

na cavidade oral

(peroxidases)

Atividade de secreção de

peroxidases em glândulas

submandbulares através de

métodos espectrofotômetros.

Aumento significante da

secreção de peroxidases e

potencial ação

quimiopreventiva da

cavidade oral

Filip et al 2007

Erva-mate tostada,

Ratos machos Swiss

- ex vivo

Avaliar a atividade

antioxidante do chá mate

e sua influência no

sistema de reparo do

DNA.

Ensaio cometa A ingestão regular de chá

mate aumentou a resistência

do DNA à oxidação

induzida por peróxido de

hidrogênio e melhorou a

reparação do DNA em

células do fígado,

independentemente da dose

ingerida.

Miranda et al

2008

3. JUSTIFICATIVA

Considerando que o consumo de bebidas a base de erva-mate verde (llex

paraguariensis) pode ser benéfico à saúde visto sua comprovada atividade

antioxidante in vitro e in vivo, assim como outros efeitos fisiológicos já relatados pela

literatura científica, o presente estudo pretende avaliar se a erva-mate torrada (chá

mate) pode promover o mesmo efeito antioxidante observado para a erva-mate verde

no plasma e na fração lipoprotéica (LDL) do sangue de indivíduos saudáveis.

OBJETIVOS

4.1 Objetivo geral

Avaliar o potencial antioxidante do chá mate sobre o plasma e LDL de

humanos após a sua ingestão.

4.2 Objetivos específicos

Avaliar se a ingestão de chá mate altera a susceptibilidade à oxidação do plasma e

LDL de humanos;

Avaliar se a ingestão de chá mate altera o grau de fragmentação protéica da LDL

após indução oxidativa;

Avaliar se a ingestão de chá mate é capaz de aumentar a capacidade antioxidante

total e diminuir produção de lipoperóxidos no plasma de humanos;

Avaliar se a ingestão de chá mate altera os níveis de expressão de genes

relacionados à síntese das enzimas antioxidantes: superóxido dismutase, catalase e

a glutationa peroxidase;

5. MATERIAL E MÉTODOS

5.1 Casuística

Foram selecionadas 20 voluntárias saudáveis provenientes da Faculdade de

Saúde Pública da USP. Com 15 delas as análises foram feitas no plasma e as 5

restantes na LDL. Todas assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido antes

do início do protocolo (Anexo 2).

5.2 Critérios de inclusão

Mulheres com idades entre 18 e 35 anos, com índice de massa corpórea (IMC)

entre 19 a 30 kg/m

perfil lipídico normal (III Consenso Brasileiro sobre

Dislipidemias 2001), clinicamente saudáveis e sem tratamento medicamentoso.

5.3

Critérios de exclusão

Mulheres fumantes, com IMC < 19 ou >30 kg/m

e que façam uso regular de

medicamento ou suplemento com propriedades antioxidantes e/ou hipolipemiante.

5.4 Desenho do estudo

O estudo foi longitudinal, de intervenção com duração de 2 semanas (15 dias).

Os participantes desta pesquisa foram orientados a evitar café, chá, bebida

alcoólica, refrigerante, chocolate e a manter a alimentação habitual durante todo o

andamento do estudo (período washout e período intervenção com chá mate) (Figura

6). Foi permitida a ingestão de no máximo 2 copos de suco de fruta por dia (300ml)

no decorrer do protocolo (Murso et al. 2005). Depois de terminado o período

washout, os participantes ingeriram 300ml de chá-mate (5g/300ml) logo após ter sido

realizada a primeira coleta de sangue (T=0) e o mesmo volume uma vez por dia,

durante uma semana (período de intervenção). A segunda coleta de sangue foi

efetuada após 1 hora de consumo do chá-mate (T=1) para avaliar o efeito agudo da

ingestão da bebida, conforme a metodologia empregada por Gugliucci (1996) e

Gugliucci e Menini (2002). Finalizado o período de intervenção (7 dias), os

voluntários foram submetidos a uma nova coleta de sangue (T=2) para avaliar o efeito

do consumo prolongado, conforme metodologia empregada por Yukawa et al. (2004)

e Murso et al. (2005)

VISITA 1 VISITA 2 VISITA 3

________________________________________________________________________

1º dia 8º dia 15º dia

Período washout Período de intervenção

Figura 6: Desenho do estudo

5.5 Preparo da infusão de chá mate (Ilex paraguariensis)

As amostras de erva-mate torrada liofilizada foram cedidas pela empresa Leão

Jr. (Curitiba- PR), sendo utilizado um único lote em todo o experimento. A

quantidade de chá mate estabelecida a ser ingerida pelos participantes seguiu a

mesma concentração utilizada por Gugliucci (1996) e Gugliucci e Menini (2002), em

que 5 gramas de chá mate em pó solúvel foram imersos em 300ml a 500ml de água.

• Seleção dos participantes

• Consentimento

• Início período de dieta

• Avaliação do consumo

alimentar

• Coleta de sangue (T=0 e

T=1)

• Consumo de chá mate

•

• Avaliação do consumo

alimentar

• Coleta de sangue (T=2)

• Fim do período de dieta

e término do estudo

Neste volume havia aproximadamente 375mg de teor de fenólicos totais por grama de

chá mate solúvel, determinação de acordo com Genovese et al. (2003).

5.6 Obtenção de sangue, plasma e LDL

Depois de finalizado o período washout, de cada um dos participantes foi

coletado 30mL de sangue após jejum de doze horas (T=0), 30mL de sangue após uma

hora da ingestão de chá-mate (T=1), e a seguir, a mesma quantidade de amostra,

depois de finalizado o período de intervenção com chá após doze horas de jejum

(T=2).

A coleta foi realizada por profissional capacitado (técnico ou auxiliar de

enfermagem) e em local reservado e equipado exclusivamente para este fim. Todo

material necessário para coleta de sangue foi utilizado pela primeira vez para este fim

e teve seu descarte efetuado dentro dos padrões de segurança laboratorial.

Para separação do plasma, o sangue foi coletado em tubos vacuntainer

contendo Heparina, o qual foi centrifugado a 4ºC por 15 minutos a 1500 x g. O

plasma obtido foi armazenado a -70ºC até início das análises.

Para a análise referente à partícula LDL, o sangue foi coletado em tubos

vacuntainer contendo EDTA, o qual foi submetido à centrifugação nas mesmas

condições descritas acima para separação do plasma e em seguida acrescida dos

seguintes inibidores de proteases: Aprotinina (2µg/ml), Benzamidina (2mM), PMSF

(1mM) e o antioxidante BHT (2mM). Essas amostras foram mantidas sob

refrigeração (4ºC) e imediatamente após a obtenção do plasma, a fração LDL foi

isolada de acordo com método proposto por Havel et al. (1955). Resumidamente a

densidade do plasma foi ajustada para 1.019g/ml através da adição de solução de

Brometo de potássio (KBr) e posteriormente submetido a ultracentrifugação

seqüencial por 18 horas a 40.000 rpm a 4ºC. Após remoção da camada superior

contendo a fração VLDL, a densidade do plasma foi ajustada para 1.063g/ml com a

adição de KBr e novamente ultracentrifugada nas mesmas condições descritas acima.

A camada superior onde estavam presentes as LDL foi coletada por aspiração e

dialisada a 4ºC por 12h contra tampão salino pH=7,4 (150mM de NaCl, 1,0mM de

EDTA e 10,0mM de Trizma base). A LDL teve sua concentração protéica ajustada

para 100µg de proteína/mL

com tampão fosfato de sódio 0,02M, pH 7,4 .

A LDL dos voluntários foi armazenada, por no máximo uma semana a 4ºC ao

abrigo da luz, até início dos ensaios de oxidação.

5.7 Medida das variáveis bioquímicas

O perfil lipídico dos voluntários (Colesterol total, triglicérides e HDL) foi

realizado no Laboratório de Lípides da Faculdade de Medicina da USP, sendo

determinado por métodos enzimáticos colorimétricos da Roche Diagnostics

Corp.(Indianápolis, IN), por meio de sistema automatizado (COBAS MIRA, Roche

Diagnostics –Mannheim, Alemanha), sendo o cálculo do colesterol LDL (LDL)

realizado pela fórmula de Friedwald, 1972.

A concentração de proteína total das LDL (100µg/ml) teve sua concentração

determinada por meio da utilização de kit comercial da LABTEST, que se baseia no

método de Biureto (Gornall et al. 1949).

5.8 Oxidação do plasma e da LDL

O plasma e a LDL isolados foram oxidados e utilizados para avaliar a

capacidade de inibição da peroxidação lipídica através de ensaios ex vivo. A oxidação

foi realizada nas amostras retiradas em jejum (T=0), após 1 hora (T=1) e após período

de intervenção (T=2).

5.8.1 Oxidação do plasma

Foi empregado um sistema modelo em que o plasma foi diluído (1:10) pela

adição de tampão fosfato de sódio 0,02M pH 7,4. Em seguida, foi adicionado o

agente oxidante sulfato de cobre (CuSO

), na concentração final de 0,5mM preparado

em água MiliQ. A incubação do sistema foi feita em banho-maria com agitação a

37°C por até 6h. No final desse período a reação foi interrompida pela adição dos

antioxidantes BHT (40µM) e EDTA (5mM) e resfriamento em gelo, conforme

descrito por Gugliucci e Menini (2002). A seguir foram quantificados os

lipoperóxidos formados (item 5.9.2).

5.8.2 Oxidação da LDL

Para oxidação da LDL foram utilizados 3 métodos de oxidação distintos,

conforme descrito por Gugliucci e Menini (2002) e recomendado por Halliweel

(2000). Primeiramente a LDL foi oxidada nas mesmas condições descritas no item

5.8.1 utilizando 10µM de CuSO

para posteriormente serem determinados os produtos

de peroxidação formados através da análise de TBARS (item 5.9.2). Além disso foi

oxidada por:

a) 1mM do agente oxidante 3-morfolinosidinonimina (SIN-1) recentemente

preparado em solução tampão fosfato de sódio 50mM, pH=7,4;

b) 200U/ml de Lipoxigenase da soja (EC 1.13.11.12) diluída em tampão

borato 50mM, pH=9,0;

c) 5µM de sulfato de cobre (CuSO

) preparado em tampão fosfato de sódio

0,02M pH 7,4.

Nestes três últimos métodos empregados, a concentração protéica da LDL

(100µg/ml)

foi ajustada pela adição de cada um dos diferentes tampões utilizados para

preparação dos respectivos agentes oxidantes. Em seguida foi monitorada a produção

de dienos conjugados (item 5.9.1.2).

5.9 Monitoramento da peroxidação lipídica

5.9.1 Formação de Dienos conjugados

5.9.1.1 Plasma

A cinética da oxidação do plasma foi continuamente monitorada pela medida

da formação de dienos conjugados, por meio da variação da absorbância a 234 nm em

equipamento Shimadzu modelo UV-1650PC. Resumidamente 20µL de plasma foram

ressuspendidos em 3 mL de solução tampão fosfato (pH 7,4 0,02 M) até a

concentração de0,67%(1:150). Alíquotas de 2mL foram retiradas dessa solução e 100

µL de CuSO

(1,25 mM)

foram adicionados. A absorbância foi analisada em

intervalos de 5min por até 3 horas a 37ºC. A forma de apresentação dos resultados

foi através da lag time (tempo de latência para a partícula de LDL se oxidar, em

minutos) (Proudfoot et al. 1997 e Mursu et al. 2005)

5.9.1.2 LDL

A formação de dienos conjugados na LDL foi determinada pela variação na

absorbância, monitorada continuamente em 234nm, durante 3h, em intervalos de 5

minutos a 37ºC. Os resultados foram expressos através de lag time (minutos) e

cálculo da razão máxima de formação de dienos conjugados (abs/min), que é obtida

pela divisão da absorbância máxima pelo tempo em que ela ocorreu. Quanto menor

for este valor, mais lenta é a produção de dienos conjugados em LDL (Esterbauer e

Zollner 1989 e Iborra et al. 2008)

5.9.2 Determinação das Substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico

(TBARS)

Os lipoperóxidos do plasma e LDL gerados pela indução oxidativa, conforme

descrita nos itens 5.8.1 e 5.8.2, foram analisados através da quantificação do

malonaldeído formado, utilizando-se para isso, a reação com o ácido tiobarbitúrico

(TBA), e o composto formado detectado através de espectrofotômetro Shimadzu

modelo UV-1650PC.

O plasma e a LDL oxidadas foram adicionadas de 1ml de solução de ácido

tiobarbitútico (0,046M), ácido tricloroacético (0,92M) e ácido clorídrico (0,25M) e o

sistema foi aquecido a 100ºC por 30 minutos. Em seguida foi centrifugado a 4ºC por

15 minutos a 8000 x g e a leitura do sobrenadante foi feita a 535 nm. A quantificação

foi feita utilizando-se uma curva de calibração com 1,1,3,3 tetraetoxipropano- TEP

(Antolovich et al. 2002; Cirico e Omaye 2006

e Mursu et al. 2005). Os valores foram

expressos em µmol de TBARs/ml de plasma e µmol de TBARs/mg de proteína da

LDL. Todas as análises foram realizadas em duplicata.

5.10 Medida do perfil de antioxidantes totais no plasma

A determinação do perfil de antioxidantes totais no plasma (“TAS” Randox

Laboratories LTD, UK) foi realizada no Laboratório de Lípides da Faculdade de

Medicina da USP, por meio de sistema automatizado (COBAS MIRA, Roche

Diagnostics –Mannheim, Alemanha) sendo obtida por meio da incubação de ABTS

(“2,2-Azino-Diethyl benzothiazoline sulfonic acid”) com a peroxidase

(metmioglobine) e peróxido de hidrogênio (H

), resultando na produção do radical

cátion ABTS

®+

, o qual é detectado com comprimento de onda de 600nm. As

substâncias antioxidantes, presentes na amostra, impedem a reação gerando uma

redução na intensidade de cor. Assim, a redução da intensidade de cor é proporcional

à concentração de antioxidantes totais no plasma. Todas as reações foram feitas em

duplicata.

5.11 Avaliação da lipoperoxidação do plasma (TBARS)

A concentração de TBARS foi realizada como indicativa de peroxidação

lipídica in vivo no plasma dos participantes. 1ml de solução de TBA (TBA 0,046M;

TCA 0,092Me HCL 0,25M) foi adicionada em 500µl de plasma (diluição 1:10 em

PBS 0.02M pH=7.4). Em seguida as amostras foram colocadas em banho-maria em

ebulição por 30min. Após este procedimento as amostras foram submetidas à

centrifugação (15min/8000g a 4ºC) e, a seguir, o sobrenadante foi lido em

espectrofotômetro com comprimento de onda de 535nm. A quantificação foi feita

utilizando-se uma curva de calibração com 1,1,3,3 tetraetoxipropano- TEP

(Antolovich et al. 2002; Cirico e Omaye 2006

e Mursu et al. 2005) e expressa como

µmol de TBARS/ml de plasma. Todas as análises foram realizadas em duplicata.

5.12 Extração de RNA e síntese de cDNA

A análise de expressão dos genes superóxido dismutase (SOD), catalase

(CAT) e glutationa peroxidase (GPx) foram feitas por meio do ensaio de PCR real

time (Livak et al. 2001). Para isso o sangue dos voluntários foi colhido em tubos

contendo heparina e aproximadamente 2ml foram destinados à extração de RNA.

Para a estabilização e proteção do RNA, todas as amostras destinadas a este fim

foram armazenadas em RNAholder (BioAgency) -20ºC até o momento da extração do

RNA. Essa foi feita usando-se o QIAamp RNA Blood





(QIAGEN) seguindo o

protocolo do fabricante. Após a extração, aproximadamente 100 µg de RNA foram

usados para a síntese do cDNA usando o High Capacity cDNA Archive Kit (Applied

Biosystems, Foster City, CA, USA).

5.13 Quantificação da Expressão por PCR em Tempo real

Cerca de 500 µL de sangue foram retiradas das voluntárias e adicionadas à

1,3ml de RNAlater Solution (Ambion) e armazenadas a -70°C. O RNA total foi

isolado usando o RiboPureTM-Blood Kit (Ambion) seguindo as instruções do

fabricante. Para a síntese do cDNA usou-se o High Capacity cDNA Archive Kit

(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA).

A quantificação da expressão dos genes Glutationa Peroxidase (GPx),

Superóxido Dismutase (SOD), Catalase (Cat) e do gene constitutivo β-actina

(utilizado para “normalizar” as amostras por estar presente em todas as células e ser

expresso continuamente da mesma forma) foi feita por meio de PCR em tempo real.

As reações de PCR em tempo real foram realizadas no equipamento 7300 Real-Time

PCR System (Applied Biosystems), e o C

(threshold cycle - momento da reação em

que a fluorescência da amostra começa a ser detectada) determinado com o auxílio do

RQ Study Software (Applied Biosystems). O C

de uma reação é determinado,

principalmente, pela quantidade de cDNA molde presente no começo da reação de

amplificação.

Para um volume final de 50 µl a reação foi preparada como descrito a seguir:

25 µl de Platinum

SYBR

Green qPCR SuperMix-UDG (Invitrogen), 10 µM de cada

primer e 10 µl de cDNA total (100 ng). Os primers foram desenhados com o auxílio

do programa Primer3 (http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi),

utilizando como molde a seqüência de nucleotídeos:

CAT

R 5´TCT GGT GAT ATC GTG GGT GA 3´

F 5´CCT CGT TCA GGA TGT GGT TT 3´

SOD

R 5´GCT TGA TAG CCT CCA GCA AC 3´

F 5´TCA ATG GTG GGG GAC ATA TT 3´

GPx

R 5´CAT TCC GCA GGA AGG TAA AG 3´

F 5´GGT TCG AGC CCA ATT TAA CA 3´

Para amplificação foi usado o ciclo descrito a seguir: 2 min a 50°C de pré-

tratamento de UDG (Uracil-DNA Glicosilase) e desnaturação de 2 min a 95°C,

seguido de 45 ciclos de desnaturação a 95°C por 15 s, e uma extensão a 72°C por 30s,

seguida de uma análise de curva de melting (40 ciclos com um decréscimo de 1°C a

cada 15 s iniciando-se em 95°C). Através desta análise foi possível averiguar a

especificidade da reação de amplificação, uma vez que o fluoróforo usado emite luz

sempre que um dímero de DNA é formado (Livak et al. 2001).

Todas as reações foram feitas em triplicata e a média do C

usada para

avaliação da expressão gênica. Os genes GPx, SOD e Cat foram analisados e sua

expressão normalizada de acordo com a expressão do gene constitutivo β-actina, e a

expressão relativa calculada de acordo com a formula 2

-(En – Rn)

, sendo que En

corresponde ao valor do C

do gene estudado (GPx, SOD e Cat) e Rn o valor do C

gene constitutivo. A expressão relativa foi expressa em Unidades Arbitrárias (U.A).

5.14 Eletroforese da porção protéica da LDL

Para realização da eletroforese SDS-PAGE, a LDL (100µg de proteína/mL)

foi diluída em tampão fosfato de sódio 0,02M pH 7,4. Em seguida, foi adicionado

agente oxidante sulfato de cobre, na concentração de 10µM preparado na mesma

solução tampão (Gugliucci et al. 2002).

A incubação do sistema foi feita em banho-maria (37°C) por até 16h. Após

esse período uma alíquota foi retirada e as reações interrompidas pela adição dos

antioxidantes BHT (40µM) e EDTA (5mM) e resfriamento em gelo. Todas as

amostras foram mantidas sob refrigeração a 4ºC por no máximo uma semana até o

momento da análise de eletroforese.

A eletroforese foi conduzida de acordo com Laemmli (1970). O gel

concentrador contendo 7,5% de acrilamida em tampão TRIS-HCl pH 6,8 foi

preparado sobre o gel de análise com 10% de acrilamida em tampão TRIS-HCl pH

8,8. Os dois equipamentos utilizados para eletroforese foram do tipo vertical, da

Amersham Biosciences (Uppsala, Suécia) o modelo Hoefer miniVE conferiu ao gel

dimensões de 8 cm x 9 cm x 1,0 mm. O equipamento Hoefer SE250 conferiu aos géis

as dimensões de 8cm x 7 cm x 0,75 mm. Trinta microgramas (30 g) de proteína

(LDL oxidada) foram aplicadas em cada poço. A amperagem foi fixada em 20 mA

para cada gel de 1,0 mm e 15 mA para géis de 0,75 mm; voltagem auto-ajustável, até

o máximo de 300V. Após a corrida, os géis foram corados com Solução de Azul de

Comassie R Brilhante 0,025% em 40% de metanol e 7% de ácido acético, e descorada

no mesmo solvente. Os padrões de peso molecular utilizados foram: miosina (203

kDa), beta-galactosidase (120 kDa), albumina bovina sérica (95 kDa) e ovalbumina

(49 kDa).

Para analisar as placas de eletroforese foi verificado o número de bandas de

proteína formadas nas LDL de cada voluntário resultante da oxidação com sulfato de

cobre. Para isso foi adotado como critério de avaliação a comparação entre as bandas

de proteína não oxidadas (controle) e as bandas das proteínas das estruturas que foram

oxidadas obtidas nos três momentos de tratamento (T=0, T=1 e T=2). Quanto maior a

semelhança, em termos de densidade óptica, entre a banda oxidada e a banda

controle menor terá sido o dano à estrutura da proteína.

5.15 Avaliação do consumo alimentar

Cada voluntário foi orientado a preencher, antes da coleta de sangue (período

basal) e durante o período de intervenção, um inquérito de consumo alimentar

constituído por registro de 3 dias, o qual relata os hábitos alimentares mais comuns,

sendo 2 dias de semana e 1 de final de semana. Esse instrumento de avaliação do

hábito alimentar foi empregado com objetivo de verificar se os voluntários seguiram

as orientações estabelecidas para participação do estudo (ANEXO 1).

O consumo alimentar foi avaliado utilizando o programa Nut Win (versão 2.0)

da Escola Paulista de Medicina - UNIFESP.

5.16 Análise dos resultados

Os resultados das diferentes análises foram apresentados como média e desvio

padrão. Teste t de Student pareado foi utilizado para verificar se houve diferença

estatisticamente significante, ao nível de 5%, entre os resultados das diversas análises

antes (T=0) e após o consumo do chá (T=1 e T=2). Esta análise foi feita utilizando o

programa SPSS versão10.0 for Windows.

5.17 Questões éticas

Este trabalho foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Faculdade de

Saúde Pública da Universidade de São Paulo (processo n

169/2006) e os

responsáveis e participantes assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido,

antes do seu início, que os deixou cientes do conteúdo, possíveis riscos e finalidade

do projeto (ANEXO 2).

6. RESULTADOS

6.1 Características da população estudada

As variáveis, perfil antropométrico (idade, índice de massa corporal) e perfil

lipídico encontram-se dentro dos critérios de inclusão estipulados pelo estudo, sendo

ambos apresentados na Tabela 2.

Tabela 2: Características da população estudada

Valores*

Nº de indivíduos

Idade (anos)

25,25 ± 3,43

IMC (kg/m

)

23,18 ± 2,40

Colesterol total (mg/dl)

172 ± 28,8

LDL (mg/dl)

91,3 ± 20,1

HDL (mg/dl)

53,3 ± 10,7

TG (mg/dl)

93,8 ± 23,1

Média ±DP

6.2 Quantificação dos produtos de peroxidação lipídica no plasma

6.2.1 Formação de Dienos conjugados

A suscetibilidade do plasma à oxidação foi determinada pelo tempo de

resistência do plasma à oxidação (“Lag Time”). Os resultados revelaram que a

capacidade média de retardar a oxidação do plasma depois de uma hora (T=1) e após

uma semana de consumo diário de chá (T=2) da ordem de 21,15 e 23,90 minutos,

respectivamente, foi significativamente maior que no período basal (T=0) de 12,46

minutos (Tabela 3).

Tabela 3: Lag Time de oxidação do plasma (Dienos conjugados) antes (T=0), após 1

hora (T=1) e depois de 1 semana (T=2) de consumo do chá-mate

Período de Tratamento

(T)

Lag Time de oxidação do

plasma (min)*

Sig. Entre os

grupos (p)

12,46 ± 7,58

21,15 ± 11,46

23,90 ± 20,3

0,008

0,048

*Valores expressos como média ± DP (N=15).

** Valor da probabilidade obtido por Teste t pareado.

p =Comparação do período basal (T=0) com o período agudo (T=1).

p = Comparação do período basal (T=0) com o período intervenção (T=2).

6.2.2 Determinação das Substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS)

A concentração de malonaldeído produzida após indução oxidativa reduziu

significativamente entre os períodos agudo (T=1; 4,69 µmol/l) e período intervenção

(T=2; 4,44 µmol/l) de consumo de chá mate quando comparado com o período basal

(T=0; 5,30 µmol/l) (Tabela 4).

Tabela 4: Concentração de malonaldeído formado no plasma (TBARS) após indução

oxidativa antes (T=0), após 1 hora (T=1) e depois de 1 semana (T=2) de consumo do

chá-mate

Período de Tratamento

(T)

TBARS (µ

µµ

µmol/l)*

Sig. Entre os

grupos (p)

5,30 ± 1,38

4,69 ± 0,98

4,44 ± 0,81

0,004

0,001

*Valores expressos como média ± DP (N=15).

** Valor da probabilidade obtido por Teste t pareado.

p =Comparação do período basal (T=0) com o período agudo (T=1).

p = Comparação do período basal (T=0) com o período intervenção (T=2).

6.3 Medida do perfil de antioxidantes totais no plasma

O perfil de antioxidantes totais no plasma (TAS) foi estatisticamente maior

após 1 semana de consumo diário de chá mate (T=2; 0,97mmol/l) comparando-se

com o período basal (T=0; 0,92 mmol/l). No entanto, não foi observada diferença ao

se comparar com o período agudo (T=1; 0,91 mmol/l) (Tabela 5).

Tabela 5: Perfil de antioxidantes totais no plasma (TAS), antes (T=0), após 1 hora

(T=1) e depois de 1 semana (T=2) de consumo do chá-mate.

Período de Tratamento

(T)

TAS (mmol/l) *

Sig. Entre os

grupos (p)

0,92 ± 0,10

0,91 ± 0,11

0,97 ± 0,09

0,579

0,001

*Valores expressos como média ± DP (N=15).

** Valor da probabilidade obtido por Teste t pareado.

p =Comparação do período basal (T=0) com o período agudo (T=1).

p = Comparação do período basal (T=0) com o período intervenção (T=2).

6.4 Avaliação da lipoperoxidação do plasma (TBARS)

A concentração de malonaldeído presente no plasma dos voluntários,

determinada pelo método de TBARS, diferiu significantemente revelando que a

formação média de produtos de oxidação não é estatisticamente a mesma nos três

momentos de tratamento. A produção média de lipoperóxidos basais após uma hora e

depois de uma semana de consumo diário de chá da ordem de 3,60 e 2,73µmol/l,

respectivamente foi significantemente menor que o período basal de 4,32µmol/l

(Tabela 6).

Tabela 6: Concentração de malonaldeído formado no plasma (TBARS) antes (T=0),

após 1 hora (T=1) e depois de 1 semana (T=2) de consumo do chá-mate

Período de Tratamento

(T)

TBARS (µ

µµ

µmol/l)*

Sig. Entre os

grupos (p)

4,32 ± 1,15

3,60 ± 1,15

2,73 ± 0,65

0,000

*Valores expressos como média ± DP (N=15).

** Valor da probabilidade obtido por Teste t pareado.

p =Comparação do período basal (T=0) com o período agudo (T=1).

p = Comparação do período basal (T=0) com o período intervenção (T=2).

6.5 Quantificação da expressão por PCR em tempo real

Comparando com a situação basal (T=0), notamos que a ingestão diária de chá

mate por uma semana (T=2) aumentou significantemente a expressão dos genes

responsáveis pela produção das enzimas antioxidantes Glutationa peroxidase (GPx),

Superóxido dismutase (SOD) e Catalase (Tabela 7).

Tabela 7: Avaliação da Expressão relativa das enzimas antioxidantes Glutationa

peroxidase (GPx), Superóxido dismutase (SOD) e Catalase antes (T=0) e depois de 1

semana (T=2) de consumo do chá-mate

Enzimas

T=0*

(UA)

T=2*

(UA)

Sig. Entre

os grupos

(p)

GPx

1,45 30,35 0,000

SOD

0,2 4,69 0,000

CATALASE

0,11 1,91 0,001

*Valores expressos como média ± DP (N=15).

** Valor da probabilidade obtido por Teste t pareado.

UA Unidades arbitrarias

6.6 Quantificação dos produtos de oxidação da fração LDL

6.6.1 Formação de Dienos conjugados após indução oxidativa com Sulfato

de Cobre

Assim como para o plasma, a suscetibilidade das LDL à oxidação foi

determinada pelo tempo de resistência à oxidação (“Lag Time”) após as mesmas

terem sido submetidas a peroxidação induzida com sulfato de cobre. Além disso foi

avaliada a razão máxima de formação de dienos conjugados, a qual indica a

quantidade de formação de dienos durante o processo oxidação. Quanto menor for

este valor menor será a formação de produtos de oxidação (dienos conjugados).

Observou-se que após os períodos de consumo de chá mate, T=1 (

36,24

min) e T=2

(39,34 min), as LDL apresentaram maior capacidade de retardar a oxidação quando

comparadas com o período basal (T=0; 32,50min). (Tabela 8). Nota-se também, que

houve uma produção significativamente menor de dienos conjugados apenas após o

consumo prolongado (T=2) de chá mate (Tabela 9).

Tabela 8: Lag Time de oxidação da LDL (Dienos conjugados) antes (T=0), após 1

hora (T=1) e depois de 1 semana (T=2) de consumo do chá-mate

Período de Tratamento

(T)

Lag Time de oxidação da LDL

(min)*

Sig. Entre os

grupos (p)

32,50 ± 11,60

36,24± 11,76

39,34 ± 14,17

0,006

0,010

*Valores expressos como média ± DP (N=5).

** Valor da probabilidade obtido por Teste t pareado.

p =Comparação do período basal (T=0) com o período agudo (T=1).

p = Comparação do período basal (T=0) com o período intervenção (T=2).

Tabela 9: Razão máxima de Formação de Dienos conjugados em LDL após indução

oxidativa com Sulfato de Cobre antes (T=0), após 1 hora (T=1) e depois de 1 semana

(T=2) de consumo do chá-mate

Período de Tratamento

(T)

Razão máxima de formação de

Dienos ( abs/time) *

Sig. Entre os

grupos (p)

0,0031 ± 0,00072

0,0028 ± 0,00039

0,0020 ± 0,00011

0,452

0,029

*Valores expressos como média ± DP (N=5).

** Valor da probabilidade obtido por Teste t pareado.

p =Comparação do período basal (T=0) com o período agudo (T=1).

p = Comparação do período basal (T=0) com o período intervenção (T=2).

6.6.2 Razão máxima de Formação de Dienos conjugados em LDL após

indução oxidativa com 3-morfolinosidinonimina (SIN-1) e Lipoxigenase

Outros mecanismos de peroxidação, que podem ser considerados mais

próximos daqueles que acontecem nos organismos, foram testados. Para tanto, o 3-

morfolinosidinonimina (SIN-1) e a lipoxigenase da soja (EC 1.13.11.12) foram

utilizados como indutores da oxidação. A produção de dienos conjugados foi

analisada por meio da razão máxima de formação de dienos e não houve diferença

significativa na produção de lipoperóxidos devido à ingestão do chá-mate com ambos

os oxidantes utilizados (Tabela 10 e Tabela 11).

Tabela 10: Razão máxima de Formação de dienos conjugados em LDL após indução

oxidativa com lipoxigenase antes (T=0), após 1 hora (T=1) e depois de 1 semana

(T=2) de consumo do chá-mate

Período de Tratamento

(T)

Razão máxima de formação de

Dienos ( abs/time) *

Sig. Entre os

grupos (p)

0,0014 ± 0,00023

0,0014 ± 0,00016

0,0010 ± 0,00039

0,977

0,144

*Valores expressos como média ± DP (N=5).

** Valor da probabilidade obtido por Teste t pareado.

p =Comparação do período basal (T=0) com o período agudo (T=1).

p = Comparação do período basal (T=0) com o período intervenção (T=2).

Tabela 11: Razão máxima de Formação de Dienos conjugados em LDL após indução

oxidativa com 3-morfolinosidinonimina (SIN-1), antes (T=0), após 1 hora (T=1) e

depois de 1 semana (T=2) de consumo do chá-mate

Período de Tratamento

(T)

Razão máxima de formação de

Dienos ( abs/time) *

Sig. Entre os

grupos (p)

0,0082 ± 0,0038

0,0067 ± 0,0024

0,0077 ± 0,0009

0,203

0,688

*Valores expressos como média ± DP (N=5).

** Valor da probabilidade obtido por Teste t pareado.

p =Comparação do período basal (T=0) com o período agudo (T=1).

p = Comparação do período basal (T=0) com o período intervenção (T=2).

6.6.3 Substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS)

A concentração de malonaldeído formado nas LDL após a indução oxidativa

com sulfato de cobre foi significativamente menor somente após uma hora de

consumo de chá mate (T=1; 4,12µmol/g de LDL) quando comparado com o período

basal (T=0; 4,90µmol/g de LDL). No entanto, podemos observar uma diminuição na

quantidade de lipoperóxidos formados na LDL após o consumo diário de chá (T=2;

3,85µmol/g de LDL), que provavelmente não foi significativa devido a um indivíduo

(Tabela 12 e Figura 7).

Tabela 12: Concentração de malonaldeído formado na LDL (TBARS) após indução

oxidativa antes (T=0), após 1 hora (T=1) e depois de 1 semana (T=2) de consumo do

chá-mate

Período de Tratamento

(T)

TBARS (µ

µµ

µmol/g de proteína

LDL)

Sig. Entre os

grupos (p)

4,90± 0,32

4,12 ± 0,35

3,85 ± 0,78

0,018

0,058

*Valores expressos como média ± DP (N=5).

** Valor da probabilidade obtido por Teste t pareado.

p =Comparação do período basal (T=0) com o período agudo (T=1).

p = Comparação do período basal (T=0) com o período intervenção (T=2).

Figura 7: Concentração de malonaldeído formado na LDL (TBARS) de cada

participante antes (T=0), após 1 hora (t=1) e depois de 1 semana (t=2) de consumo do

chá-mate

2,50

3,00

3,50

4,00

4,50

5,00

5,50

0 1 2

Períodode tratamento

TBARS (mmol/g de proteína LDL)

6.7 Avaliação da fragmentação da Apolipoproteína B

A partir da comparação entre as bandas de proteína das LDL (Apo B) oxidada

e não oxidada (controle) de cada um dos voluntários obtida nos 3 momentos de

tratamento do estudo (T=0, T=1 e T=2) foi possível avaliar o grau de fragmentação da

apolipoproteína B. Os resultados deste ensaio demonstraram que parece haver uma

diferença no grau de fragmentação da Apo B após o período intervenção do estudo

(T=2), ou seja, as bandas que representam o período de consumo diário de chá mate

assemelham-se com as bandas controle, sugerindo uma possível proteção dos

fenólicos da erva mate no processo de oxidação induzido por metais (Figura 8 e

Figura 9).

Figura 8: Placa de eletroforese com as bandas de LDL oxidada e não oxidada

(controle) com sulfato de cobre de cada participante obtidas antes (T=0), após 1 hora

(T=1) e depois de 1 semana (T=2) de consumo do chá-mate

T=0 T=1 T=2

Voluntário

oxidada controle oxidada controle oxidada controle

T=0 T=1 T=2

Voluntário

oxidada controle oxidada controle oxidada controle

Figura 9: Placa de eletroforese com as bandas de LDL oxidada com sulfato de cobre

de cada participante obtidas antes (T=0), após 1 hora (T=1) e depois de 1 semana

(T=2) de consumo do chá-mate

203 KDa

120 KDa

95KDa

49KDa

Local de medição

1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

2 2 2 2

203 KDa

120 KDa

95KDa

49KDa

Local de medição

1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

2 2 2 2

= 1 Banda

= 2 Bandas

6.8 Avaliação do consumo alimentar

A Tabela 14 apresenta a composição nutricional estimada da dieta dos

indivíduos durante o período washout e período intervenção do estudo. Pode-se

observar que a composição de nutrientes consumida não se alterou entre os períodos

de pesquisa, mesmo depois de realizado o ajuste do consumo dos nutrientes pela

energia ingerida (Tabela 15).

Tabela 14: Composição nutricional estimada do consumo alimentar dos indivíduos

antes e durante o período de intervenção

Nutrientes

Período washout Período intervenção

Sig. (p)

Energia (Kcal)

1688,62 ± 372,88 1480,23 ± 427,09 0,038

Carboidrato (%)

57,14 ± 5,76 54,74 ± 8,09 0,245

Proteína (%)

16,54 ± 2,41 16,68 ± 3,87 0,860

Lipídeos (%)

26,37 ± 5,38 28,56 ± 5,81 0,150

Ácidos graxos saturados (g)

19,77 ± 13,27 17,14 ± 9,55 0,395

Ácidos graxos

monoinsaturado (g)

12,25 ± 4,99 11,74 ± 5,69 0,679

Ácidos graxos

polinsaturados (g)

7,20 ± 3,73 5,87± 2,100 0,125

Vitamina A (UI)

4848,49 ± 4248,40

4430,64 ± 2,582,28 0,577

Vitamina E (ATE)

7,29 ± 6,19 9,14 ± 11,10 0,47

Vitamina C (mg)

135,23± 124,99 91,96 ± 51,22 0,152

1 Valores expressos como média ± DP (N=20)

2 Test t para amostras pareadas

Tabela 15: Composição nutricional do consumo alimentar dos indivíduos estimada

ajustado pela energia, antes e durante o período de intervenção

Nutrientes

Período Washout Período intervenção

Sig. (p)

Energia (Kcal)

1688,62 ± 372,88

1480,23 ± 427,09 0,038

Carboidrato (%)

60,77 ± 14,95 60,03 ± 17,90 0,860

Proteína (%)

17,62 ± 4,93 17,48 ± 6,90 0,902

Lipídeos (%)

12,74 ± 3,78 13,93 ± 5,02 0,259

Ácidos graxos saturados (g)

19,44 ± 12,55 17,20 ± 8,05 0,413

Ácidos graxos

monoinsaturado (g)

12,25 ± 4,12 11,75 ± 5,16 0,651

Ácidos graxos

polinsaturados (g)

8,32 ± 3,08 5,93 ± 2,84 0,360

Vitamina A (UI)

4848,49 ± 4248,40

4430,64 ± 2,582,28

0,577

Vitamina E (ATE)

7,29 ± 6,19 9,14 ± 11,10 0,470

Vitamina C (mg)

135,23± 124,99 91,96 ± 51,22 0,152

1 Valores expressos como média ± DP (N=20)

2 Test t para amostras pareadas

7. DISCUSSÃO

Nas últimas décadas, diversos estudos têm demonstrado a participação dos

radicais livres na etiologia de diversas doenças, das quais destacam-se as

cardiovasculares e alguns tipos de câncer. Neste sentido, surgiu o interesse por parte

da comunidade científica em investigar a ação de substancias presentes naturalmente

nos alimentos, as quais poderiam atuar como protetores frente ao estresse oxidativo,

prevenindo a formação ou seqüestrando os radicais livres e interrompendo a cadeia de

reações de propagação.

Recentemente muita atenção tem sido voltada aos derivados polifenólicos,

produzidos no metabolismo secundário de plantas, os quais têm se mostrado

promissores na quimioprevenção das doenças crônicas não transmissíveis,

possivelmente devido a suas propriedades antioxidantes (Bravo 1998). Dentro desse

grupo de compostos destacam-se os ácidos hidroxicinâmicos, que estão presentes nos

alimentos principalmente esterificados com o ácido quínico, denominando-se ácido

clorogênico (ácido 5-cafeoilquínico). O café é a maior fonte de ácido clorogênico na

dieta humana, sendo que outras fontes dietéticas incluem frutas, legumes, grãos

(Clifford et al. 1990; Clifford 1999) e a erva-mate (Carini et al. 1998; Bastos et al.

2007), a qual possui particular importância para a população brasileira.

Em grande parte da América do Sul, aproximadamente um terço da população

ingere erva mate na forma de chimarrão, tereré ou na de chá. O consumo se dá por

simples hábito cultural ou na medicina popular como no tratamento de artrite,

dificuldades na digestão, dores de cabeça, reumatismo, obesidade e doenças hepáticas

(Filip et al. 2000).

Estudos utilizando diversos modelos de oxidação in vitro e ex vivo já

constataram que os compostos polifenólicos presentes na erva-mate têm propriedades

antioxidantes (Gugliucci e Stahl 1995; Gugluiucci 1996; Gugliucci e Menine 2002).

A maioria destas pesquisas foi realizada com a erva-mate verde e cancheada (Ilex

paraguariensi) não havendo trabalhos in vivo que evidenciem se o processo de

torrefação desta planta influencia na atividade antioxidante desta matéria prima.

A fim de verificar o potencial antioxidante do chá mate, diversas

metodologias in vivo e ex vivo foram realizadas no plasma e na LDL de humanos

antes e após o consumo de chá. Dentre os métodos empregados estão o ensaio das

Substâncias Reativas ao ácido Tiobarbitúrico (TBARS), que nos permite fazer a

avaliação da degradação oxidativa de ácidos graxos plasmáticos através da

quantificação de um produto de oxidação chamado Malonaldeído;

a conjugação de

dienos, outro produto resultante da oxidação lipídica de primeira geração e com pico

de absorção a 230-235nm, que é comumente usada como ponto final para

determinação da atividade antioxidante de uma amostra; e o ensaio de descoloração

do radical 2,2’-azinobis-(3-etilbenzotiazolina-6-sulfonato) - ABTS

, sendo possível

fazer a avaliação da capacidade antioxidante, através da descoloração do ABTS

presença de antioxidantes redutores, e assim dar uma idéia da ação acumulativa dos

antioxidantes do chá mate presentes no plasma após seu consumo (Giada e Mancini-

Filho 2004).

Os resultados dos ensaios de dienos conjugados realizados no plasma, após

indução oxidativa com sulfato de cobre, são apresentados na Tabela 3. Nota-se que o

chá mate consumido após 1 hora (T=1) e diariamente durante 1 semana (T=2)

favoreceu aumento significativo da resistência do plasma à oxidação. O mesmo efeito

foi observado quando utilizamos a LDL como substrato, não havendo alteração sobre

a produção de dienos somente quando comparado ao consumo agudo (Tabela 8 e

Tabela 9). Esses resultados sugerem que o chá mate apresenta atividade antioxidante

ex vivo por retardar a oxidação do plasma e LDL e diminuir a lipoperoxidação, o que

representa uma possível proteção contra o desenvolvimento de aterosclerose.

Resultado semelhante foi observado por estudos conduzido por Gugliucci e Stahl

(1995) e Gugliucci (1996), em que o consumo após uma hora de infusão de erva-mate

verde mostrou importante atividade antioxidante sobre a oxidação da LDL in vitro e

ex vivo, respectivamente. É possível verificar que o mesmo comportamento ocorre no

caso do café, onde a ingestão diária de uma grande quantidade de café arabica

(8g/150ml) durante uma semana por indivíduos saudáveis contribuiu para redução da

suscetibilidade da LDL à oxidação (Basal=101,0 ± 8,4min vs Intervenção com café =

130,0 ± 12,9 min p<0,001) (Yukawa et al. 2004). Segundo os autores, esses

resultados são atribuídos aos compostos fenólicos presentes em tal bebida, como o

ácido clorogênico e caféico.

A proteção contra a lipoperoxidação induzida, conferida por compostos

fenólicos dietéticos, também foi demonstrada por um estudo feito com chocolate,

resultando em menores valores de F2-isoprostano no plasma dos participantes, 2 e 4 h

após seu consumo (Wiswedel et al. 2004).

O mecanismo antioxidante proposto relaciona-se possivelmente com a

presença de substâncias (ácidos fenólicos) capazes de quelar metais e seqüestrarem

radicais livres formados tanto na etapa de iniciação como na de propagação do

processo oxidativo (Gugliucci e Stahl 1995; Gugluiucci 1996; Gugliucci e Menine

2002).

Segundo Cintra (1999) os compostos fenólicos podem reagir com as EROs,

como o radical superóxido e hidroxila, atuando como agentes redutores, doadores de

hidrogênio e seqüestradores de radicais livres. Pesquisas atuais sugerem que esses

metabólitos são absorvidos no trato gastrointestinal e estão biodisponíveis no plasma

dentro de 0,5 a 4 horas depois de sua ingestão, cujo pico de absorção ocorre após 1h

de consumo (Monteiro et al. 2007; Nardine et al. 2002) . Tal fenômeno pode explicar

os efeitos benéficos resultantes do consumo agudo e prolongado de chá mate, visto

que, do mesmo modo que no café, a erva mate também apresenta altos teores de ácido

clorogênico e cafeíco (Clifford et al. 1990; Bastos et al. 2006).

É importante salientar que, mesmo sendo considerado um antioxidante

hidrofílico, uma outra hipótese para que os ácidos fenólicos presentes no chá mate

tornem a LDL mais resistente à oxidação seja, possivelmente através da regeneração

da vitamina E (radical -tocoferila a -tocoferol) e de outros antioxidantes associados

a esta lipoproteína,

participando de forma similar à vitamina C do mecanismo

protetor contra lipoperoxidação (Nardini et al. 1997; Silva et al. 1998).

Epicatequinas e catequinas podem prevenir a depleção de -tocoferol

(vitamina E), atuando como um antioxidante de reatividade intermediária entre

ascorbato e -tocoferol (Lolito e Fraga 1998). De acordo com Arteel e Sies (1999) e

Zhu (2002), é necessária uma concentração de 0,22M a 40M de catequina,

considerada elevada, para que ela tenha efeito antioxidante. É provável que alguns

estudos sobre avaliação de atividade antioxidante de ácidos fenólicos in vivo e ex vivo

apresentaram resultados desfavoráveis no que diz respeito à redução da

susceptibilidade da LDL à oxidação devido à quantidade insuficiente de antioxidante

administrado ou, talvez, por falhas na metodologia, no desenho e controle dos

participantes no estudo (Hodgson et al. 2000; Caccetta et al. 2000; Murso et al 2005).

Os mecanismos moleculares que iniciam a oxidação da LDL in vivo ainda são

desconhecidos, no entanto sabe-se que algumas substâncias estão potencialmente

envolvidas neste processo, como a oxidação da LDL por metais de transição (Cu

). Além desse mecanismo outros também já foram evidenciados como a interação

desta lipoproteína com peroxinitrito, (3-morfolinosidinonimina – SIN-1) e ação

enzimática via lipoxigenase (Halliwell 2000).

Os metais de transição agem como um pro-oxidantes catalisando a formação

de radicais livres de oxigênio, os quais podem reagir com a LDL ocasionando

aumento na produção hidroperóxidos lipídicos (Halliwell 2000). No caso da 3-

morfolinosidinonimina (SIN-1) os radicais livres são formados por reações químicas

envolvendo espécies reativas de nitrogênio (ERN), onde ocorre a formação de

peroxinitrito (

OONO) através da reação do óxido nítrico (NO

) com o radical

superóxido (O

). O SIN-1 oxida as partes protéicas e lipídicas da LDL e sua

utilização pode ser justificada porque a geração de

–

OONO, a partir desse composto,

ocorre com um fluxo lento e de forma constante, o que seria mais semelhante à via de

formação de

OONO em situações fisiológicas (Thomas et al. 1998). Através de

reações enzimáticas ocorre a produção de radicais livres pela lipoxigenase. Tal

enzima participa da formação das prostaglandinas e leucotrienos, substâncias

responsáveis pelo desenvolvimento de processos inflamatórios, que quando com

atividade aumentada pode gerar acréscimos de hidroperóxidos lipídicos, e dessa

forma contribuir para o aparecimento da aterosclerose (Silva et al. 1998 e 2002).

Como o processo de oxidação-antioxidação é complexo e pode envolver

diferentes vias, torna-se necessária a avaliação de vários parâmetros capazes de

fornecer um perfil da atividade antioxidante de uma amostra. Desta forma foi avaliada

a eficiência do chá mate como antioxidante utilizando 3 métodos de peroxidação,

conforme descrito por Gugliucci e Menini (2002) e recomendado por Halliweel

(2000): (1) a indução da oxidação por peroxinitrito (SIN-1), (2) a indução por sulfato

de cobre (Cu

) e (3) por lipoxigenase da soja (EC 1.13.11.12).

Em um ensaio in vitro realizado por Gugliucci e Menine (2002), onde se

pretendia avaliar a proteção antioxidante da erva-mate verde sobre a LDL de

indivíduos saudáveis após a mesma ter sido incubada com lipoxigenase e SIN-1,

observou-se uma expressiva diminuição dose-dependende da oxidação desta

lipoproteína em ambos oxidantes utilizados. Os autores atribuem estes resultados a

capacidade do extrato de erva mate verde atuar como scavengers dos radicais livres

de nitrogênio e, também, interagir com a lipoxigenase modificando o estado redox de

ferro, o qual é necessário para o funcionamento adequado desta enzima.

No presente estudo, não foi observado efeito estatisticamente significativo

relativamente aos marcadores da peroxidação lipídica no qual foram utilizados o SIN-

1 (Tabela 11) e lipoxigenase (Tabela 10) como indutores da oxidação, devido ao

consumo de chá-mate.

Isso deve ter ocorrido possivelmente devido ao fato dos fitoquímicos

presentes no chá mate não serem aptos a reagir com espécies reativas de nitrogênio ou

inativar a atividade de enzimas que possam ser aterogênicas, como a lipoxigenase, e

sim serem capazes de atuar como seqüestradores de metais de transição e/ou como

neutralizadores de espécies reativas de oxigênio (Gugliucci 1996). Outra hipótese

seria que, talvez, por o chá mate passar por um processo de torrefação, na qual sofra

alterações químicas, que por sua vez contribua para perda parcial da

biodisponibilidade dos compostos fenólicos, possam ter colaborado para esses

resultados. No entanto a suposição preponderantemente mais acertada seria que a

metodologia elegida para avaliar a ação do chá mate como antioxidante (Dienos

conjugados) não fosse a mais apropriada no que se refere ao SIN-1 e à lipoxigenase,

ou não foi devidamente padronizada, já que os resultados foram positivos no caso da

utilização do sulfato de cobre (Tabela 8 e Tabela 9). Neste caso, o método mais

adequado para determinação do dano oxidativo induzido por SIN-1 seria o que fosse

mais específico para produtos de oxidação gerados por espécies reativas de nitrogênio

(ERN), como nitrito, nitratos, carbonilas, resíduos de nitrotirosina, etc (Vasconcelos

et al. 2007). O mesmo se aplica no caso da lipoxigenase. Deste modo, mais estudos

são necessários a fim de investigar essas hipóteses.

Presume-se que a oxidação de LDL in vivo se inicie nos ácidos graxos

poliinsaturados dos fosfolípides da superfície da membrana e, a seguir, se propague

aos lípides do núcleo, resultando em modificação oxidativa tanto dos ácidos graxos

poliinsaturados, como do colesterol e fosfolípides e, finalmente, modificação e

degradação da apolipoproteína B (apo B) (Batlouni 1997).

Produtos finais da peroxidação lipídica, como o malonaldeído podem

fragmentar e na seqüência promover o cross-link entre lisina e arginina na Apo B,

modificando seu perfil eletroforético e com isso provocar alterações funcionais na

partícula de LDL que culminam com o aparecimento da aterosclerose (Steinberg et al.

1990; Gugliucci e Menine 2002). A fim de verificar se a ingestão de chá mate poderia

inibir esse processo conduzimos a análise de eletroforese em gel com SDS-PAGE

após as LDL dos participantes serem submetidas a peroxidação ex vivo com sulfato de

cobre.

Estudos in vitro e in vivo demonstram que a erva mate verde é capaz de evitar

a fragmentação da proteína presente na LDL (apo B) (Gugliucci 1996 e Gugliucci e

Menini 2002). Ervas tradicionalmente utilizadas na medicina popular chinesa e

coreana, como a Scolopendra subspinipes, comprovaram efeito similar num estudo in

vitro (Yoon et al. 2006). Em nosso estudo também foi verificada uma menor

degradação na maior parte das bandas de proteína das LDL obtidas após uma semana

de consumo de chá mate (T=2), quando comparadas com as bandas controle (Figuras

8 e 9). Este efeito pode ser explicado pela presença de compostos com atividade

antioxidante no chá mate, tais como os ácidos clorogênicos, que têm demonstrado

serem aptos a neutralizar radicais livres, captar metais de transição ou decompor

peróxidos inibindo, desse modo, a degradação oxidativa nas proteínas (Waszczynskyj

2004). Portanto sugere-se que a erva mate torrada seja capaz de proteger as proteínas

da peroxidação lipídica e com isso possa prevenir alterações na Apolipoproteína B.

A quantidade máxima de lipoperóxidos formados ocorre aproximadamente 6

horas após a indução oxidativa plasmática, quando os antioxidantes endógenos, como

a vitamina E, são esgotados (Silva et al. 1998). A partir desses dados a

lipoperoxidação do plasma e da LDL isolada foram induzidas por 6 horas, conforme

metodologia detalhada nos itens 5.8.1 e 5.8.2 e determinada após esse período através

do ensaio das substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS). Após os períodos

de consumo de chá, agudo (T=1) e prolongado (T=2), a concentração de TBARS

reduziu significativamente em ambas as amostras avaliadas em relação ao controle

(T=0). Os resultados estão expressos na Tabela 4 (PLASMA) e na Tabela 12 (LDL).

O efeito protetor do chá mate também foi claramente demonstrado mediante

as modificações nos valores de hidroperóxidos lipídicos presentes no plasma,

verificadas nos mesmos momentos de tratamento (p<0,05 e p<0,001,

respectivamente) (Tabela 6).

O hidroperóxido lipídico tem sido considerado um adequado biomarcador do

início da peroxidação lipídica (Giada e Mancini-filho 2004). Desse modo, os achados

deste estudo confirmaram o potencial protetor dos fitoquímicos presentes no chá

mate, particularmente os ácidos clorogênicos, contra o ataque de espécies reativas a

estruturas lipídicas do organismo, tais como membranas celulares e lipoproteínas

plasmáticas (Salah et al. 1995; Gugliucci 1996; Gugliucci e Menini 2002; Brascesco

et al. 2003; Yukawa et al. 2004; Murso et al. 2005 e Cirico et al. 2006;).

Nos tecidos, a maioria dos polifenóis interage com a superfície da membrana

plasmática, devido a sua hidrofilia, mas alguns conseguem penetrar a membrana

(Saija et al. 1995). Em pH fisiológico, a maioria dos polifenóis interage com a cabeça

polar dos fosfolipídeos da membrana, formando pontes de hidrogênio envolvendo os

grupos hidroxil do polifenol (Verstraeten et al. 2003). Com o aumento do pH, ocorre

uma desprotonação dos grupos hidroxil, aumentando a interação do polifenol com a

membrana. A adsorção dos polifenóis a membrana plasmática limita o acesso de

oxidantes que iriam atacar a superfície membranar (Manach et al. 2004).

Em razão das propriedades antioxidantes anfifílicas do ácido clorogênico, e de

seus metabólitos (Salah et al. 1995; Gugliucci 1996 e Cren-Olivé et al. 2003), o

consumo de chá mate pelos participantes pode ter contribuído com a atuação de

antioxidantes da fase aquosa, na regeneração da vitamina E, conforme demonstrado e

discutido no ensaio de dienos conjugados (Tabela 3 e Tabela 8), além de ter,

provavelmente, favorecido a manutenção da concentração de vitamina E e de -

caroteno em estruturas lipídicas no plasma e em outros tecidos (Salah et al. 1995; Zhu

et al.1999; Rice-Evans et al. 1996). Outra explicação pode ser atribuída as saponinas

presentes no chá mate, as quais podem reduzir a expressão de genes pró-inflamatórios

como o TNF-α e NF-κB (Heck e Meija 2007; Shishodia et al. 2003) o que,

hipoteticamente, contribuiria na redução do estresse oxidativo.

A integridade das estruturas lipídicas no organismo depende primariamente da

atividade de antioxidantes lipossolúveis, tais como a vitamina E e o -caroteno. A

vitamina E é essencial na defesa antioxidante de membranas celulares e lipoproteínas

plasmáticas (Kontush et al. 1996 ; Gohil et al. 1986; Burton e Ingold 1986). Além

disso, a efetividade da ação antioxidante desta vitamina é estreitamente dependente

do sinergismo entre antioxidantes presentes na fase aquosa, principalmente a vitamina

C e a glutationa (Gohil et al. 1986).

Enquanto consideráveis evidências indicam que a maioria dos fitoquímicos

presentes em vegetais e frutas apresenta atividade antioxidante in vitro (Sichel et al.

1991; Gugliucci 1995; Bastos et al. 2007) pouco se sabe se a ingestão destes

alimentos poderia promover o mesmo beneficio in vivo, visto que, diversos fatores

interferem na absorção e metabolismo destes compostos tais como: a reatividade da

substância antioxidante relativamente aos radicais livres, o número de radicais que

podem ser inativados por essa substância, as vias metabólicas dos produtos formados,

a interação entre substâncias antioxidantes, a sua localização e o seu caráter

hidrofílico ou hidrofóbico, a biodisponibilidade entre outros (Manah et al. 2004).

Por meio da análise do perfil de antioxidantes totais no plasma (“TAS”), pôde-

se avaliar, in vivo, as alterações na concentração dos antioxidantes plasmáticos após

tratamento agudo (T=1) e prolongado (T=2) com chá mate.

A capacidade antioxidante total (“TAS”) dos voluntários aumentou

significativamente após uma semana de intervenção com chá mate indicando uma

elevação do perfil antioxidante plasmático (Tabela 5), não havendo alteração após 1h

de consumo da bebida. Esta última constatação é contrária ao que, em geral, está

descrito na literatura. Vários estudos demonstraram que há um aumento na

capacidade antioxidante plasmática após aproximadamente 1 hora de consumo de

bebidas ricas em compostos fenólicos, tais como o chá verde (Rietveld et al. 2003).

Esta resposta tem sido atribuída ao aumento do ácido úrico plasmático, o qual é

responsável por cerca de 60% da atividade antioxidante total do plasma (Benzie e

Strain 1996 e Manah et al. 2004). Em concordância com esses resultados, uma

pesquisa recente sugere que o café pode contribuir para o aumento da capacidade

antioxidante plasmática pouco tempo após sua ingestão. Nesse estudo o consumo de

200ml de café aumentou após 1 hora em 6 e 7% a capacidade antioxidante plasmática

de indivíduos saudáveis quando analisadas pelos métodos de CROCIN e TRAP,

respectivamente (Natella et al. 2002).

A ocorrência de resultados contraditórios entre o nosso estudo e os

mencionados acima, talvez esteja relacionada não apenas à diferença na metodologia

empregada e período em que a mesma foi realizada, já que realizamos as análises de

“TAS” após 1 mês da coleta de sangue dos voluntários, sendo o mesmo devidamente

armazenado (-70ºC), mas também por outros fatores que devem ser considerados,

como o consumo nutricional do grupo de estudo (Tabela 14). Ou seja, a ausência de

alteração no TAS após o consumo agudo de chá mate (Tabela 5), talvez esteja

refletindo discreta falha na resposta de alguns componentes nutricionais na

alimentação dos voluntários, que participam da capacidade antioxidante total.

Ressalta-se, entretanto, que a ausência de análises bioquímicas, relativas ao estado de

vitaminas antioxidantes dos participantes, limita as conclusões que possam ser feitas,

com respeito à influência do consumo dietético habitual desses indivíduos, nos

resultados da intervenção com chá mate observados na pesquisa. Além disso, não

houve diferença no padrão alimentar dos voluntários antes e após o tratamento com

chá, conforme mostra a Tabela 14 e 15 (valores dos nutrientes ajustados pela energia).

Por outro lado, independentemente das reais condições do estado nutricional dos

voluntários no período inicial da realização do estudo (T=0 e T=1), os resultados

sobre o efeito antioxidante do consumo diário de chá mate (T=2) são corroborados

pela observação de outros protocolos que avaliaram o efeito da ingestão prolongada

de alimentos ricos em compostos fenólicos na capacidade antioxidante plasmática,

como por exemplo, o chá verde e o vinho tinto. Um estudo verificou que o consumo

diário de duas xícaras de chá verde promoveu uma melhora no estado antioxidante de

indivíduos saudáveis (Erba et al. 2005). Da mesma forma foi relatado que a ingestão

moderada de vinho tinto, por duas semanas, resultou em aumento de 7% da

capacidade antioxidante plasmática quando comparado com o período basal (Sang et

al. 2005). Estes resultados confirmam os achados de Micallef e colaboradores (2007)

comprovando que o consumo moderado de vinho tinto por um período curto induziu

um significativo aumento do status antioxidante plasmáticos em jovens e idosos

saudáveis.

Provavelmente o consumo diário de chá mate (período intervenção), em

comparação a uma única dose consumida no dia (consumo agudo), tenha sido

indispensável para que ocorressem as alterações positivas nos valores do TAS

verificadas no presente estudo. Confirmando estas suposições, foi relatado que a

ingestão de dieta pobre ou rica em vegetais e frutas, por duas semanas, resultou em

diferentes efeitos na concentração de carotenóides no plasma e, conseqüentemente, na

capacidade antioxidante total, sendo verificado aumento apenas no grupo que

consumiu grande quantidade de antioxidantes. (Thompson et al. 2005). Por fim,

esses resultados sugerem que a ingestão regular de chá mate pode incrementar o

potencial de defesa antioxidante do organismo.

Os sistemas antioxidantes endógeno existem para proteger o organismo contra

os efeitos danosos dos radicais livres, os quais são produzidos em condições

fisiológicas normais do metabolismo aeróbico resultante de diversos processos

bioquímicos. A defesa primária é dada, por enzimas que cataliticamente inativam a

formação de radicais livres. Elas agem principalmente evitando a formação de EROS

que poderiam danificar as estruturas celulares dando início a peroxidação (Barreiros

et al. 2006).

Os radicais livres, quando produzidos em excesso, geram estresse oxidativo

podendo lesar tecidos e/ou se associar com moléculas (açúcares, proteínas, lipídios,

DNA), o que resulta na etiologia de várias doenças, dentre elas a aterosclerose e

câncer (Halliwell 2000).

Pesquisas indicam que as defesas antioxidantes naturais (endógenas) podem

ser reforçadas pela introdução de substâncias advindas através da dieta, assim como

os compostos fenólicos (Park et al. 2003). Além da sua atividade antioxidante direta,

vários estudos têm destacado múltiplas funções e mecanismos importantes

relacionados à habilidade dos compostos fenólicos de se ligarem a receptores

celulares e transportadores de membrana e influenciarem a expressão gênica de

enzimas, a sinalização e a adesão celular (Giada e Mancini-Filho 2006; Frei e

Higdon 2003).

Uma vez que a deficiência no sistema de defesa antioxidante pode ser a causa

de aumento da lipoperoxidação e, conseqüentemente do aparecimento de doenças

degenerativas; (Halliwell 2000) e dos relatos de que os mecanismos endógenos de

defesa antioxidante podem ser auxiliados favoravelmente com a introdução de

alimentos ricos em compostos fenólicos por meio da dieta (Park et al. 2003) avaliou-

se os níveis de expressão de alguns genes relacionados à produção das enzimas

antioxidantes superóxido dismutase (SOD), Catalase (CAT) e Glutationa peroxidase

(GPx) antes (T=0) e após o período prolongado de consumo de chá mate (T=2).

A superóxido dismutase (SOD), uma enzima que promove a dismutação do

radical superóxido até peróxido de hidrogênio (Niki 2004), a glutationa peroxidase

(GPx) uma enzima que utiliza como substrato a glutationa e é capaz de eliminar

peróxidos e detoxificar produtos eletrofílicos (Niki 2004) e a catalase (CAT), uma

enzima responsável pela decomposição do peróxido de hidrogênio para produzir água

e oxigênio molecular (Niki 2004), apresentaram aumento significativo de sua

expressão genética após tratamento com chá mate, o que pode ter contribuído para a

diminuição na lipoperoxidação e aumento da capacidade antioxidante plasmática

observada neste grupo de estudo. Esses dados estão apresentados na Tabela 7.

Os polifenóis podem exercer habilidade antioxidante por neutralizarem

radicais livres, mas também através da proteção dos antioxidantes endógenos, por

aumentar sua expressão, como foi observado num estudo conduzido por Ross e

Kasum (2002), onde houve aumento na concentração das enzimas GPx e SOD em

eritrócitos humanos após o consumo de apigenina, um flavonóide encontrado em

frutas e ervas. Do mesmo modo, foi demonstrado por Toyokuni e colaboradores

(2003) que ácidos fenólicos presentes em extratos de plantas de Mauritânia foram

capazes de aumentar a expressão de enzimas antioxidantes em células COS 7 .

Um dos possíveis mecanismos de ação desses fitoquímicos envolve a

modulação da expressão genética de enzimas antioxidantes, as quais auxiliam na

eliminação de carcinógenos e toxinas prejudiciais ao organismo, como os

lipoperóxidos, prevenindo assim a interação com macromoléculas (proteínas, lipídios

e DNA), o que poderia provocar mutações e culminar no aparecimento de cânceres

(Yeh e Yen 2006).

Em geral, ácidos fenólicos que são capazes de induzir atividade de enzimas

antioxidantes apresentam grande habilidade antioxidante plasmática (Yeh e Yen

2006). Neste estudo foi possível verificar aumento do perfil de antioxidantes

plasmáticos (TAS) somente após 1 semana de consumo de chá mate (Tabela 5),

entretanto observamos uma significativa diminuição de lipoperóxidos plasmáticos em

ambos os períodos de tratamento quando comparado com período basal (Tabela 6).

Esses resultados indicam que, provavelmente houve um ligeiro aumento da

capacidade antioxidante aguda, mas que deva estar abaixo do limite detectável pela

análise de “TAS”. Essa hipótese poderia ser confirmada pelos resultados que

obtivemos com aumento da expressão genética das enzimas responsáveis pela

produção de GPx, SOD e CAT, no entanto não foi possível realizar essa análise no

período agudo de consumo da bebida, já que outros estudos indicam que para que

ocorra algum aumento da atividade de enzimas antioxidantes é necessário um período

maior de tratamento com o alimento antioxidante que se pretende testar (Fernández-

Pachón et al. 2006).

No geral observou-se que os resultados mais significativos, no que se refere à

ação antioxidante do chá mate, ocorreram com as análises realizadas no plasma

(Dienos, TBARS, TAS e PCR real time) do que na LDL (Dienos, TBARS,

Fragmentação da Apo B). Isso provavelmente ocorreu devido o plasma ser

relativamente protegido da oxidação pelos antioxidantes presentes naturalmente no

plasma, como as vitaminas C, E e beta-caroteno. Além desses componentes,

substâncias fenólicas, como as presentes no chá mate, também auxiliam na defesa

antioxidante plasmática. As lipoproteínas, em especial a LDL, também apresentam

antioxidantes contidos em suas próprias partículas, como alfa-tocoferol e (vitamina E)

o beta-caroteno. No entanto, os antioxidantes que podem protegê-las do processo

oxidativo no meio plasmático, como os polifenois presentes no chá mate, são sujeitos

a remoção durante o procedimento de isolamento da fração LDL (diálise) tornando-se

mais suscetíveis à oxidação, de modo que poderiam atuar com maior potencialidade

como antioxidante in vivo do que em ensaios ex vivo (Halliwell 2000). Ou seja, pode

ser que os resultados dos ensaios no plasma foram melhores decorrentes de uma

menor quantidade de substâncias antioxidantes do chá ativas na LDL.

8. CONCLUSÃO

Os resultados obtidos pela maioria dos ensaios ex vivos e in vivo

demonstraram que o consumo de chá mate aumentou a resistência à oxidação,

diminuiu a produção de lipoperóxidos formados no plasma e na LDL e contribuiu

para redução da fragmentação da proteína presente na LDL após indução oxidativa.

Além disso, foi observado que o consumo de uma única dose diária de chá mate

durante uma semana (T=2) aumentou significativamente o perfil de antioxidantes

plasmáticos e a expressão de genes relacionados à produção de enzimas

antioxidantes, tais como Glutationa peroxidase (GPx), Superóxido dismutase (SOD) e

Catalase (CAT).

Nesse contexto, sugere-se que a atividade antioxidante dos fitoquímicos do

chá mate pode atuar por diferentes mecanismos: além de ocorrer diretamente, por

meio da neutralização de espécies reativas, pode se processar através de mecanismos

indiretos, como, por exemplo, a modulação de enzimas antioxidantes, as quais podem

resultar em modificações do estado redox celular (Scalbert et al. 2005). Portanto, a

ingestão de chá mate pode contribuir para diminuição do risco de desenvolvimento de

doenças crônicas relacionadas a processos oxidativo, tais como a aterosclerose e

câncer. Além disso, é importante reconhecer que as doenças degenerativas envolvem

diferentes mecanismos e é difícil para qualquer antioxidante ser efetivo em todos. Os

efeitos da ingestão de uma planta medicinal podem não ser resultados de um simples

composto, mas de uma sinergia entre compostos.

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101

ANEXOS

Anexo 1 - Registro de consumo alimentar

Nome:________________Idade____Peso:___Altura:_______IMC:_______Data___

Marque

tudo

o que você comeu, desde hora em que acordou até a hora em que foi

dormir, nos 3 (três) dias descritos abaixo:

Dia:____/_____/2007, terça-feira.

Horário Refeição Alimento e/ou Bebida Quantidade

Café da manhã

Lanche da manhã

Almoço

Lanche da tarde

Jantar

Lanche da noite

OBS: Se comeu algo fora das refeições descritas acima, mencione aqui: __________

Dia:____/_____/2007, quinta-feira.

Horário Refeição Alimento e/ou Bebida Quantidade

Café da manhã

Lanche da manhã

Almoço

Lanche da tarde

Jantar

Lanche da noite

OBS: Se comeu algo fora das refeições descritas acima, mencione aqui: __________

Dia:____/_____/2007, sábado.

Horário Refeição Alimento e/ou Bebida Quantidade

Café da manhã

Lanche da manhã

Almoço

Lanche da tarde

Jantar

Lanche da noite

OBS: Se comeu algo fora das refeições descritas acima, mencione aqui:_________

102

Anexo 2 - Termo de Consentimento Livre e Esclarecido

Resolução n. 196, de 10 de outubro de 1996, segundo o Conselho Nacional de Saúde.

Título do Protocolo de Pesquisa: Avaliação da atividade antioxidante ex vivo de

infusões de erva-mate (llex Paraguariensis.

Objetivo: O presente projeto de pesquisa irá avaliar se o chá-mate (llex

Paraguariensis) apresenta atividade antioxidante, podendo proteger as lipoproteínas

presentes no sangue humano de reações que podem ser prejudiciais à saúde.

População de Estudo: Alunos e funcionários da comunidade universitária.

Orientadora: Deborah Helena Markowicz Bastos

Autora da Pesquisa: discente de pós-graduação- FSP/USP – Ruth Lobato

Teixeira Matsumoto

Caro Colaborador:

Para a realização desta pesquisa será coletada amostras de seu sangue (30,0 ml

cada) em três momentos: antes, após uma hora e depois de 1 semana (7 dias) da

ingestão diária de chá-mate. A coleta será feita por uma pessoa treinada em local

apropriado.Também serão coletadas informações alimentares.

O sangue e as informações alimentares servirão para avaliar tanto as condições

de proteção de seu sangue a processos de oxidação, isto é, reações que podem causar

problemas à sua saúde, como para avaliar se o chá-mate pode prevenir este processo

em sistemas modelo, isto é, fora do organismo humano.

Para retirar o sangue você sentirá uma picada e o local da picada poderá ficar

arroxeado, o que sumirá em poucos dias sem prejuízos à sua saúde.

Todos os resultados obtidos estarão a sua disposição, sendo sua identidade

mantida em total sigilo. O sangue retirado será utilizado apenas neste estudo.

Você tem o direito de se retirar deste projeto a qualquer tempo.Este projeto

será desenvolvido pelo Departamento de Nutrição da Faculdade de Saúde Pública da

Universidade São Paulo.

Risco: O estudo não trará risco à sua integridade física e moral.

Benefícios: As informações obtidas neste estudo serão úteis cientificamente (a) para

avaliar a variação do grau de proteção à reações de oxidação de uma amostra da

103

comunidade universitária e (b) para avaliar se o chá-mate que é consumido em grande

parte do nosso país e conhecido por possuir substâncias antioxidantes é capaz de

proteger lipoproteínas do sangue contra processos oxidativos que levam ao

aparecimento de doenças.

Privacidade: As informações obtidas neste estudo poderão ser divulgadas em

publicações, congressos, porém sem identificação do participante.

O pesquisador garante fornecer resposta a qualquer pergunta ou esclarecer qualquer

dúvida que houver sobre os procedimentos, riscos, benefícios e outros assuntos

relacionados com a pesquisa.

A participação de vossa senhoria é voluntária, podendo retirar seu consentimento e

deixar de participar da pesquisa a qualquer momento sem maiores conseqüências.

Ciente do compromisso assumido na minha colaboração com esta pesquisa, e pela

importância da mesma subscrevo-me a seguir:

Nome (completo):__________________________________________________

Assinatura:________________________________________________________

Assinatura do pesquisador:____________________________________________

Caso necessite informações complementares sobre a pesquisa, entrar em contato

com:

Mestranda Ruth Lobato Teixeira Matsumoto e Profª Deborah Helena Markowicz

Bastos, Departamento de Nutrição da Faculdade de Saúde Pública da Universidade

de São Paulo. Av. Dr. Arnaldo, 715, ou pelo telefone 3061 7771 ou 3061 7701.

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