ads:
UNIVERSIDADE DE MOGI DAS CRUZES
FREDERICO ALEXANDRE OLIVEIRA VASCONCELOS
ANÁLISE DA ADMINISTRAÇÃO DE INSULINA POR
SONOFORESE E POR MICRO-AGULHAS SOBRE A
GLICEMIA EM RATOS DIABÉTICOS INDUZIDOS POR
ALOXANO
Mogi das Cruzes, SP
2007
ads:
Livros Grátis
http://www.livrosgratis.com.br
Milhares de livros grátis para download.
UNIVERSIDADE DE MOGI DAS CRUZES
FREDERICO ALEXANDRE OLIVEIRA VASCONCELOS
ANÁLISE DA ADMINISTRAÇÃO DE INSULINA POR
SONOFORESE E POR MICRO-AGULHAS SOBRE A
GLICEMIA EM RATOS DIABÉTICOS INDUZIDOS POR
ALOXANO
Orientador: Prof. Jean Jacques Bonvent
Mogi das Cruzes, SP
2007
Dissertação apresentada à Universidade
de Mogi das Cruzes, como exigência
parcial
para obtenção do título de Mestre
em Engenharia Biomédica.
ads:
DEDICATÓRIA
Dedico este trabalho primeiramente a Deus, por ter me concedido o poder do
raciocínio.
Dedico também aos meus pais, pelo apoio e pela força recebida para juntos
conseguirmos vencermos a saudade que em momentos difícieis não foi capaz de
me atrapalhar.
Dedico também este trabalho á minha filhinha Marina e minha namorada Carolina
que conseguiram superar todos os obstáculos com a minha ausência.
Ao professor Jean Jacques Bonvent, pela tarefa de aceitar e conduzir meus estudos,
buscando a elaboração de um trabalho de alto nível;
AGRADECIMENTOS
Primeiramente a Deus, que me deu forças e disposição para conclusão deste
trabalho;
Ao Professor Dr. Jean Jacques Bonvent que a todo instante me orientou de forma
brilhante durante todo trabalho;
Aos amigos do Doutorado, em especial Meire e Jaqueline que se disponibilizaram a
todo instante para nos ajudar;
Aos amigos: Rude de Souza Maciel, Sérgio Gomes da Silva, Fabiano Gomes
Novaes e Jandir pelo companheirismo de república;
Um agradecimento em especial também à amiga Fabiane Silva, secretária do NPT,
que esteve disposta a ajudar nas horas em que precisei;
Aos técnicos do Biotério: Paulo e Douglas pelo apoio e companheirismo;
Aos amigos de iniciação científica do laboratório de Estimulação Tecidual: Pedro,
Leon e Rafael;
Aos amigos do LEC: João Viannei, José Gustavo, Pedro Braga, Beatriz, Lívia e
Eliza;
Aos professores do NPT Annie, Henrique, Márcia, Fumagali, Goroso, Godoy, Fúlvio,
Arida;
Ao professor Afonso Caricati Neto que nos ajudou na elaboração deste trabalho;
Ao CNPq e Faep pelo apoio financeiro;
“O único lugar onde o sucesso vem
antes do trabalho é no dicionário”.
( Vidal Sasson )
RESUMO
Na última estimativa da Organização Mundial da Saúde, em 2003, constatou-se
que, pelo menos, 177 milhões de pessoas em todo o mundo sofrem de Diabetes,
dos quais, 5 milhões estão no Brasil. Este quadro pode duplicar até 2030. Com o
enorme crescimento de casos de diabetes, novas técnicas de tratamento estão
sendo pesquisadas. O transporte de medicamento através da pele sem a
necessidade de agulhas injetáveis é um dos métodos mais atrativos e práticos. Em
relação aos métodos tradicionais de administração de drogas, tais como a
administração oral e a administração através de injeções, a administração via
transdérmica evita a dor, a degradação da primeira passagem da droga pelo fígado,
como também diminui o risco de infecções. Apesar destas vantagens poucas
drogas são administradas via transdérmica devido à baixa permeabilidade da pele
humana. O presente trabalho tem como proposta a análise da administração de
insulina via transdérmica por meio da sonoforese e da aplicação de micro-agulhas.
Para a realização deste trabalho, utilizamos ratos diabéticos, aos quais forão
administrada insulina, via transdérmica mediante a sonoforese, a aplicação de
micro-agulhas e da combinação desses dois métodos. Um dispositivo com micro-
agulhas foi desenvolvido a fim de possibilitar a aplicação da insulina, logo após a
penetração das micro-agulhas na camada córnea. A concentração de glicose no
sangue dos ratos foi monitorada em função do tempo após a aplicação, para
analisar a eficiência desses métodos em relação à absorção da insulina.
Palavras chave: Sonoforese, ultra-som, insulina, via transdérmica, micro-agulhas,
micro-perfurações, glicose.
ABSTRACT
The last estimate of the World-wide Organization of the Health, in 2003, evidenced
that, at least, 177 millions of people in the world suffer from Diabetes, among which 5
million are in Brazil. This picture number can duplicate up to be duplicated in 2030.
With the enormous growth of diabetes cases of diabetes, new treatment techniques
of treatment are being studied. The transdermic administration of drugs, without the
need of injectable needles is one of the practical and most attractive methods. In
comparison with traditional methods, such as the oral and injection, the transdermic
administration prevents pain, the earlier drug degradation in the liver, as well as a
decrease of infection risk. Despite these advantages few drugs are administrated via
the transdermic way due to the low permeability of the human skin. The purpose of
the present work is to analyze the transdermic administration of insulin by means of
sonophorese and of micro-needles application. Diabetic induced rats were used, to
which insulin was administrated by sonophorese, micron-needles application and the
combination of these two methods. A device with micron-needles has been
developed in order to make possible the application of the drug, after the penetration
of the micron-needles in the cornea layer. The glucose concentration in the blood of
the rats will be monitored in function of the time after the application, to analyze the
efficiency of these methods with respect to the absorption of the insulin.
Keywords: Sonophorese, ultrasound, insulin, transdérmic, micro-needles, micro-
perforations, glucose.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1. Pâncreas e suas estruturas.......................................................................19
Figura 2. Representação da estrutura molecular da insulina humana......................23
Figura 3. Caneta Insulínica. Fonte: www.levemir-us.com.........................................24
Figura 4. Inalador de Insulina...................................................................................25
Figura 5. Sistema de Infusão Contínua de Insulina..................................................26
Figura 6. Exemplo de gráfico mostrando a variação de insulina basal.....................26
Figura 7. A pele e suas divisões anatômicas: epiderme e derme.............................29
Figura 9. Esquema mostrando a estrutura da camada córnea.................................31
Figura 10. Representação esquemática das rotas de penetração na pele..............32
Figura 11. Feixe ultra-sônico irregular no campo próximo tornando-se mais regular
no campo distante..............................................................................................35
Figura 12. Ultra-som de onda contínua (a). Ultra-som pulsado (b)..........................35
Figura 13. Representação esquemática da aplicação da sonoforese mostrando (a) a
corrente acústica para difusão do fármaco; (b) o processo de cavitação...........39
Figura 14. Esquema (a) do arranjo das micro-agulhas; (b) da aplicação na camada
córnea................................................................................................................42
Figura 15. Administração de aloxana via intravenosa pela veia da cauda. ..............44
Figura 18. Accu-Check Compact Blood Glucose, Diagnostics Roche.....................45
Figura 19. Aparelho elétrico de tosa Figura 19a. Figura 19b rato preparado para
administração de insulina via transdérmica........................................................46
Figura 20. Ultra-som utilizado para administração de insulina por sonoforese.........47
Figura 21. Dispositivo para a aplicação da sonoforese em ratos..............................47
Figura 22. Administração de insulina por sonoforese...............................................48
Figura 23. Imagens obtidas no microscópio óptico, com aumento de 20x, do
dispositivo de micro-agulhas (Figura 22a). Extremidade de uma agulha
insulínica, medindo 50
µ
m e uma micro-agulha para acupuntura, utilizadas no
dispositivo medindo 18
µ
m (Figura 22b).............................................................48
Figura 24. Dispositivo com micro-agulhas para administração da insulina...............49
Figura 25. Administração de insulina via transdérmica por micro poros...................49
Figura 26. Variação do nível de glicose dos ratos do grupo GC...............................53
Figura 27. Variação do nível de glicose dos ratos do grupo GS...............................54
Figura 28. Variação do nível de glicose dos ratos do grupo GMA............................55
Figura 29. Variação do nível de glicose dos ratos do grupo GMAS. ........................56
Figura 30: Percentual de absorção de insulina dos 4 grupos, 4 h e 8 h após
administração.....................................................................................................57
Figura 31. Variação do nível de glicose dos ratos do grupo GMA1..........................59
Figura 32. Variação do nível de glicose dos ratos do grupo GMA2..........................60
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Coeficiente de absorção de alguns meios para as freqüências ultra-
sônicas de 1 MHz e 3 MHz........................................................................................36
Tabela 2: Valores de glicose em mg/dl, no 15º dia após administração de aloxana.51
Tabela 3. Valores de glicemia medida (em mg/dl), para sete ratos (escolhidos
aleatoriamente) antes e após da administração do aloxana. ....................................52
Tabela 4: Valores de Glicose em mg/dl do Grupo GC..............................................53
Tabela 5: Valores de Glicose em mg/dl do Grupo GS. .............................................54
Tabela 7: Valores de Glicose em mg/dl do Grupo GMAS.........................................56
Tabela 8: Valor - p da análise estatística..................................................................57
Tabela 9: Valores de Glicose em mg/dl do Grupo GMA1.........................................59
LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS
DM Diabets Mellitus
a.C Antes de Cristo
d.C Depois de Cristo
mg/dl Miligrama por Decilitro
β Beta
∆ Delta
α
αα
α Alfa
ATP Adenosina Trifosfato
PP Polipeptídio Pancreático
NPH Neutral Protamine Hagedorm
Ml Mililitro
µ
µµ
µm Micrômetro
SIC Sistema de Infusão Contínua
m² Metro Quadrado
% Porcentagem
Cm Centímetro
mm Milímetro
nm Nanômetro
Da Dalton
Hz Hertz
KHz Quilohertz
MHz Megahertz
I Intensidade
T Tempo
ºC Graus Celsius
µ Micro
W/cm² Wats por Centímetro Quadrado
AINE’s Antiinflamatório não Esteróides
US Ultra-som
mW/cm² Miliwats por Centímetro Quadrado
ml/kg Militro por Quilograma
mg/kg Miligrama por Quilograma
DC Diabético Controle
DS Diabético Sonoforese
DMA Diabético Micro-Agulhas
DSMA Dabético Sonoforese Micro-Agulhas
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO......................................................................................14
2 OBJETIVO............................................................................................16
3 JUSTIFICATIVA...................................................................................17
4 CONCEITOS TEÓRICOS.....................................................................18
4.1 DIABETES MELLITUS.....................................................................................18
4.2 MONITORIZAÇÃO DA GLICOSE....................................................................20
4.3 TRATAMENTO DO DIABETES MELLITUS.....................................................21
4.3.1 Injeção de Insulina ....................................................................................21
4.3.2 Canetas de Administração Descartáveis ou Reutilizáveis.........................23
4.3.3 Administração de Insulina Por Inalação....................................................24
4.3.4 Sistema de Infusão Contínua de Insulina (sic)..........................................25
4.3.5 Terapia Genética Para o Diabetes............................................................27
4.3.6 Administração de Insulina Via Transdérmica ............................................28
4.3.6.1 Epiderme ............................................................................................29
4.3.6.2 Derme.................................................................................................30
4.3.6.3 Transporte transdérmico.....................................................................30
4.3.6.4 Conceitos Básicos das Ondas Ultra-Sônica .......................................34
4.3.6.4.1 Sonoforese...................................................................................37
4.3.6.4.2 Mecanismo da sonoforese...........................................................37
4.3.6.5 Micro-agulhas.....................................................................................41
5 METODOLOGIA...................................................................................43
5.1 ANIMAIS..........................................................................................................43
5.2 MODELO DE DIABETES MELLITUS ..............................................................43
5.3 APLICAÇÃO DA SONOFORESE....................................................................47
5.4 APLICAÇÃO DAS MICRO-AGULHAS.............................................................48
5.5 MICRO-PERFURAÇÕES SEGUIDAS DA SONOFORESE.............................49
5.6 MONITORIZAÇÃO DA GLICOSE....................................................................50
5.7 ANÁLISE ESTATÍSTICA..................................................................................50
6 RESULTADOS E DISCUSSÃO...........................................................51
6.1 INDUÇÃO DO DIABETES ...............................................................................51
6.2 ADMINISTRAÇÃO DE INSULINA....................................................................53
8 CONCLUSÃO......................................................................................63
REFERÊNCIAS .......................................................................................64
APÊNDICE A- Análise estatística.........................................................69
APÊNDICE B- Comitê de ética.............................................................73
14
1 INTRODUÇÃO
O primeiro caso de diabetes foi constatado no Egito em 1500 a.C. como uma
doença desconhecida. A denominação diabetes foi usada pela primeira vez por
Apolonio e Memphis em 250 a.C. Diabetes em grego quer dizer sifão (tubo para
aspirar a água), este nome foi dado devido a sintomatologia da doença que provoca
sede intensa e grande quantidade de urina. O diabetes só adquire a terminologia
mellitus no século I d.C. Mellitus, em latim, significa mel, logo a patologia passa a ser
chamada de urina doce (GAMA, 2002).
A elevada e ascendente prevalência dos Diabetes Mellitus (DM) e o
conseqüente aumento da morbidade, devido às suas complicações crônicas, passou
a ser um sério problema de saúde pública (BRAGA, 2001). Na última estimativa de
Word Health Organization (Who), em 1999, contatou-se que, pelo menos, 177
milhões de pessoas em todo o mundo sofrem de Diabetes, dos quais, 5 milhões
estão no Brasil. Este quadro pode duplicar até 2030. Os motivos para esta grande
incidência do Diabetes estão relacionados com o crescimento populacional, idade,
dietas não balanceadas, obesidade, sedentarismo dentre outros fatores,
principalmente nos países em desenvolvimento com grande incidência do diabetes
do tipo 2 , o qual compreende 80% a 90% dos casos (WHO, 2003 TEIXEIRA &
MACHADO, 1999).
Segundo Zagury e colaboradores (2000), o diabetes pode ser causado também
por: cirurgias, estresse, alimentação rica em carboidratos, concentrados como balas,
doces, açúcar, menopausa e certos medicamentos. Embora os homens tenham
maior predisposição para desenvolver o diabetes, existem mais mulheres diabéticas
(WILO ET AL, 2004). No Brasil, por exemplo, 30,79% da população com diabetes
são homens, enquanto que as mulheres representam 69.2% da população com
diabetes (MINISTÉRIO DA SAÚDE 2000).
O Diabetes Mellitus é uma doença multifatorial, resultado de uma interação de
fatores genéticos e ambientais. Compreende um grupo de distúrbio metabólico de
múltipla etiologia, que se caracteriza bioquimicamente por hiperglicemia crônica e
clinicamente pelo desenvolvimento, a longo prazo, de complicações micro-
vasculares, as chamadas micro-angiopatia diabética (MACHADO & OLIVEIRA
JUNIOR, 2002).
15
As neuropatias, também são complicações, “o encéfalo depende da glicose
pela demanda excessiva de energia que as funções encefálicas necessitam”
(Grünspun, 1980). Podem-se notar distúrbios como: cefaléia, inquietude,
irritabilidade, palidez, sudorese, taquicardia, confusões mentais, desmaios,
convulsões e até o coma.
Todo ano morrem aproximadamente 4 milhões de pessoas devido às
complicações causadas pelo diabetes mellitus. Os países mais atingidos são: Índia,
China, Eua, Indonésia, Rússia, Japão, Brasil e Itália (Who 1999).
O diabetes mellitus é diagnosticado quando os valores de glicemia ultrapassam
250 mg/dl, no entanto atualmente já tem sido aceitos valores acima de 100 mg/dl
como padrão para diagnóstico desta doença.
Como as estimativas mostram, o diabetes é uma doença que atinge milhões de
pessoas e que tende a crescer, ou seja, há uma grande população que enfrenta uma
doença crônica e incurável que está se alastrando. Sendo uma doença incurável é
preciso investir no diagnóstico precoce e em seu tratamento para obtenção da
melhor qualidade de vida possível ao seu portador. Sabe-se que grande parte dos
novos casos de diabetes tipo 2 poderiam ser prevenidos evitando o excesso de peso
e combatendo o sedentarismo. Já nos casos do tipo 1 ainda não há medidas de
prevenção da doença, mas pode-se prevenir as complicações crônicas decorrentes
do diabetes (GEED, 2003).
16
2 OBJETIVO
Analisar a eficiência da administração via transdérmica de insulina mediante
as técnicas de sonoforese, aplicação de micro-agulhas e da combinação dessas
duas técnicas, em ratos diabéticos.
17
3 JUSTIFICATIVA
A via transdérmica representa uma via alternativa quando o trato
gastrintestinal apresenta algum tipo de problema quanto à administração de drogas.
Evita o primeiro efeito de degradação da droga em sua passagem pelo fígado
e permite aplicação em diferentes locais do corpo.
Entre as técnicas de administração via transdérmica, a sonoforese e a
aplicação de micro-agulhas são consideradas promissoras para a administração de
proteínas, peptídeos, nanopartículas e de fármacos de alto peso molecular; além
disso, a aplicação de micro-agulhas representa uma técnica simples e de baixo
custo favorecendo assim sua aplicabilidade.
É considerada como pouco invasiva, além de proporcionar uma diminuição da
dor, em comparação com a administração feita pela injeção, é de fácil manuseio,
fazendo com que o tratamento se torne mais agradável, aumentando assim a
adesão do paciente ao tratamento.
Vale ressaltar que, em particular, o uso de micro-agulhas é uma técnica
bastante recente que requer ainda intensos estudos a fim de comprovar os
benefícios reais e minimizar os riscos relacionados, para um eventual uso clínico.
18
4 CONCEITOS TEÓRICOS
4.1 DIABETES MELLITUS
O diabetes mellitus é uma desordem crônica do metabolismo da glicose que
afeta 5% da população das nações industrializadas. A falha ou redução severa de
geração de insulina devido a destruição auto-imune das células betas pancreáticas é
responsável pelo diabetes mellitus tipo 1 (insulino dependente).
A forma prevalente, diabetes mellitus tipo 2, (não insulino dependente) atinge
mais de 80% dos casos. Esta tem patogênese complexa, envolvendo
desenvolvimento progressivo de resistência à insulina e relativa deficiência da
secreção de insulina, causando assim hiperglicemia, mas vale ressaltar que a
insulina é essencial para manter a homeostase da glicose e regular o metabolismo
dos carboidratos, lipídios e proteínas.
Os sintomas quando aparecem são: polidipsia relacionado com o aumento da
sede, polifagia relacionado com o aumento da fome e poliúria relacionado com o
excesso de urina. Algumas das complicações crônicas são: cansaço, fraqueza,
perda de peso, confusão mental aguda, incontinência urinária, infecções freqüentes,
dificuldade de cicatrização de feridas, dormência, dores nas mãos e diminuição da
visão.
Convém ressaltar que, apesar de os dois principais tipos de diabetes mellitus
terem mecanismos patogênicos e, características metabólicas diferentes, as
complicações a longo prazo nos vasos sangüíneos, nos rins, nos olhos e nos nervos
ocorrem em ambos os tipos e representam as principais causas de morbidez e morte
nos diabetes (LERNMARK & OLEFSKY, 1985).
A deficiência crônica de insulina desenvolve a cetose e é decorrente de uma
alteração pancreática caracterizada por uma menor ação hormonal em nível
periférico, ou menor secreção de insulina (WILSON & FOSTER 1998).
O pâncreas endócrino (Figura 1) está situado abaixo e atrás do estômago, e
consiste aproximadamente 1 milhão de unidades de células microscópicas,
denominadas Ilhotas de Langherans e em poucas células espalhadas dentro dos
pequenos ductos pancreáticos. Em conjunto as Ilhotas pesam aproximadamente
1,5g (CLAYTON ET AL., 1993; GODOY, 2000).
19
Figura 1: Pâncreas e suas estruturas.
Fonte: www.esadi.com.br/images/pancreas2.jpg.
As Ilhotas consistem de quatro tipos de células:
• β (beta) produzem insulina, hormônio responsável pela redução da
glicemia (taxa de glicose no sangue) ao promover a penetração de
glicose nas células, também exerce a função no consumo de
carboidratos, da síntese de proteínas e na armazenagem de lipídios
(gorduras);
• α (alfa) secretam glucagom (Gluco – glicose, agon – agonista). Sua
função principal é aumentar a glicemia, contrapondo o efeito da insulina,
agindo na conversão do ATP (trifosfato de adenosina) em AMP-cíclico,
composto importante na iniciação da glicogenólise;
• ∆ (delta) contém somatostatina, que suprime tanto a liberação de
insulina quanto glucagom. As células delta possuem grandes grânulos
pálidos com membranas intimamente aderidas;
• PP (polipeptídio pancreático) estimulam a secreção das enzimas
gástricas e intestinais.
Apesar das dimensões minúsculas destas células, as disfunções do pâncreas
endócrino, são responsáveis por uma soma desproporcional de morbidez e
mortalidade. O diabetes mellitus situa-se sozinho entre as 10 principais causas de
morte no mundo, apesar dos importantes aprimoramentos em seu controle clínico,
ainda não foi possível controlar de fato suas conseqüências letais, portanto o
pâncreas endócrino é uma fonte de doença clínica significativa (GUYTON,1997).
20
4.2 MONITORIZAÇÃO DA GLICOSE
A avaliação do controle glicêmico no paciente com diabetes mellitus envolve
tradicionalmente a observação das taxas de glicose no sangue (glicemia), glicose na
urina (glicosúria) e cetonas na urina (cetonúria).
A auto-monitorização de glicemias capilares realizadas em glicosímetros de
uso domiciliar é um excelente recurso utilizado para retratar as flutuações glicêmicas
ao longo do dia, sendo uma ferramenta bastante utilizada no acompanhamento dos
pacientes com diabetes mellitus em esquema de tratamento intensivo especialmente
naqueles sob uso de múltiplas doses de insulina.
A glicemia reflete o nível exato de glicose sanguínea num determinado
momento. O teste de glicemia, com um glicosímetro de uso domiciliar, é muito
simples de ser realizado: puncionando-se uns dos dedos da mão com uma lanceta,
obtêm-se uma gota de sangue, que é aplicada na área de reação da tira reagente. A
glicose contida nesta gota de sangue reage com os produtos químicos da área
reagente no elemento sensor, que provoca uma mudança de cor ou de intensidade
da corrente elétrica, proporcional à quantidade de glicose existente no sangue.
Segundo a American Diabetes Association, 2001, a glicosúria seria uma
medida indireta de glicemia; não existe, uma relação nítida entre níveis de glicemia e
glicosúria. A glicose só é detectada na urina quando níveis de glicemia atingem
valores maiores ou iguais a 180 mg/dl, sendo assim, estes testes não detectam
valores normais de glicose ou então uma ocasional hipoglicemia, glicose menor que
60mg/dl.
Outro parâmetro relacionado à glicemia é o teste de cetonúria; porém,
pacientes normais ou com o diabetes bem controlado não apresentam este tipo de
alteração, por ser um fator de descontrole metabólico. As células utilizam os
açúcares como fonte de energia; quando não há insulina suficiente para permitir a
entrada de açúcares nas células, estas começam a metabolizar gorduras para
satisfazer as necessidades de energia celular, como forma de compensar o déficit
de açúcar. As cetonas são os resultados da metabolização dessas gorduras,
provocando um descontrole metabólico (AMERICAN DIABETES ASSOCIATION,
2001).
21
4.3 TRATAMENTO DO DIABETES MELLITUS
Os modelos de diabetes experimental em animais de laboratórios têm sido
amplamente utilizados para simular o diabetes mellitus a fim de realizar estudos para
o tratamento desta doença. O modelo experimental pode ser induzido por hormônios
ou substâncias químicas que provocam lesões irreversíveis nas células beta
pancreáticas, as quais deixam de produzir a insulina, tornando o organismo
diabético (ELLIOT ET AL., 1997). Dentre os agentes diabengênicos que atuam
diretamente na degeneração das células beta pode-se destacar o diazóxido,
fenitocina, streptozotocina e aloxana (GILMAN & GOODMAN 1975). Compostos
químicos tais como aloxana ou streptozotocina tem o poder de induzir o diabetes em
animais (FLATT, ET AL. 1992; DUARTE,1996; GORUS; MALAISSE; PIPELEERS,
1982).
As droga aloxana (2,4,5,6, - Tetraoxypyrimida; 5-6- Dioxyuracila/
monohidratada) produz diabetes química devido aos efeitos citotóxicos nas células
beta das ilhotas de Langherans. A ação citotóxica destes agentes é mediada pela
reação ao oxigênio que desencadeia um aumento na concentração de cálcio,
resultando em necrose e completo desaparecimento destas células pancreáticas,
produzindo assim o diabetes mellitus em ratos (SZKUDELSKI, 2001).
Há relato de que a aloxana se acumula rápida e seletivamente nas células
beta, em comparação com outras células. Os alvos sob o efeito da aloxana, que
levam à inibição da liberação de hormônio, não são necessariamente os mesmos
que induze à necrose das células beta (GORUS; MALAISE; PIPELEERS, 1992).
Vários relatos indicam direta ou indiretamente que aloxana afeta o potencial
da membrana e os canais de íons das células beta (HERSON; ASFORD, 1997).
Dependendo da dose ministrada, podem ocorrer síndromes similares a
diabetes mellitus do tipo 1 ou 2 .
4.3.1 Injeção de Insulina
De acordo com Fuchs & Wannmacher (1992), a insulina é um hormônio
essencialmente anabolizante, que propicia a utilização periférica da glicose nos
22
tecidos musculares e adiposos, inibe a glicogenólise e a neoglicogênese hepática
aumentando a síntese protéica e lipídica.
Apesar de novas pesquisas em buscas de novas drogas para o controle do
diabetes mellitus, a injeção de insulina é ainda uma das principais estratégias de
controle da doença. Hoje existem insulinas de ação: rápida, média e longa, que
melhoram a qualidade de vida dos pacientes e fazem com que tenham uma vida
praticamente normal.
Em 1889, Minkowski e Von Mehring identificaram a causa do diabetes após
uma experiência com um cão. Eles retiraram o pâncreas do animal e notaram que
sua urina passou a ter uma consistência diferente e que atraia moscas. Após análise
da urina, descobriram um nível muito alto de glicose, o que os levou a concluir que o
pâncreas tinha papel importante na redução da glicose no organismo. Algum tempo
depois identificaram que o pâncreas produziu uma secreção responsável pela
absorção da glicose, ou seja, a insulina.
Em 1920, iniciou o tratamento pela deficiência do pâncreas produzir insulina.
Já em 1921, Charles Best & Frederick Banting descobriram a insulina – hormônio
extraído do pâncreas – e iniciaram as pesquisas para o tratamento de pacientes
portadores de diabetes mellitus com insulina.
O grande desafio então, seria a extração da insulina do pâncreas de um
animal. Em 1922 dois cientistas dinamarqueses conseguiram extrair com sucesso
uma pequena quantidade de insulina do pâncreas suíno. A partir daí as pesquisas e
a produção de insulina em escala industrial não pararam, mais, já que a demanda
era enorme, os pesquisadores então começaram a se preocupar com a duração do
efeito da insulina, o que reduziria o número de aplicações durante o dia, e
descobriram em 1936 que o efeito poderia ser prolongado, adicionando-se à insulina
uma proteína chamada protamina. Esta descoberta foi o ponto crucial para o
desenvolvimento de todos os outros tipos de insulina existentes hoje no mercado.
Na segunda metade de década de 1960, as pesquisas foram focadas no
desenvolvimento de insulinas mais próximas da humana, o que reduziria os efeitos
adversos no paciente e também o risco maior de hipoglicemia.
De 1960 a 2006 a modificação molecular da insulina fez surgir mais um tipo
de insulina chamada análoga, ou seja, uma insulina de longa duração com um
mecanismo único. Uma destas insulinas é a Detemir, que permite uma maior
23
previsibilidade no controle de glicemia, um menor risco de hipoglicemia e menor
ganho de peso, quando comparado à insulina de média duração.
A insulina é uma substância de alto peso molecular (~6000 Da), tem como
formula química C
257
H
383
N
65
O
77
S
6
, e é composta por duas seqüências diferentes de
aminoácidos: a primeira cadeia (A) é formada de 21 aminoácidos e a segunda (B) de
30 aminoácidos, que são ligados através de cistinas. A insulina humana é idêntica a
do porco, exceto pela última cadeia de aminoácidos da cadeia B, que no porco é a
alamina (Ala) e no homem é a Treonina (Trh). A estrutura molecular da insulina é
representada na figura 2.
Figura 2 – Representação da estrutura molecular da insulina humana.
Estudos estão sendo desenvolvidos por vários grupos de pesquisa a fim de
propor métodos alternativos para a administração de insulina como também para
restabelecer a produção de insulina pelo pâncreas com o transplante de células.
4.3.2 Canetas de Administração Descartáveis ou Reutilizáveis
As canetas de administração funcionam com cartuchos de insulina e uma
agulha a uma extremidade da caneta, que é trocada a cada aplicação (Figura 3). No
caso das descartáveis, ao terminar o conteúdo no cartucho todo sistema caneta-
cartucho é desprezado, enquanto que para a caneta reutilizável apenas o cartucho é
descartado. Os cartuchos podem conter 1,5 ml (150 U) ou 3,0 ml (300 U) de insulina
humana NPH regular e pré-misturas (NPH/regular) ou análogo de ação ultra-rápida.
24
Figura 3. Caneta Insulínica. Fonte: www.levemir-us.com
A precisão da dose administrada, associada a grande satisfação dos usuários
neste método de aplicação tem disseminado seu emprego em todo o mundo. Este
método apresenta vários benefícios quando comparado aos tradicionais (seringas e
agulhas) como: não requer assepsia do frasco da insulina, aspiração da dose e as
freqüentes correções dos artefatos técnicos (bolhas de ar). Estas características
fazem com que o processo de aplicação da insulina seja mais simples, rápido,
conveniente e discreto. O uso de agulhas mais finas e curtas e o fato de sofrerem
danos da passagem através de uma tampa de borracha auxiliam para que a
administração com a caneta seja menos dolorosa, estima-se que 60% a 80% dos
diabéticos em uso de seringas falham em algum aspecto da administração da
insulina (GRAFF & MCCLANAHAN, 1998).
No caso de aplicações com múltiplas doses de insulina, que exige a utilização
de diferentes tipos de insulina para correção das alterações glicêmicas, a injeção por
seringa é recomendada, pois permite a mistura prévia de insulinas, o que possibilita
minimizar o número de picadas. Esta economia de picada já não é possível quando
se utiliza caneta, além de requerer duas canetas com cartuchos de insulinas
distintas, ou pelo menos dois cartuchos distintos.
4.3.3 Administração de Insulina Por Inalação
Ao ser colocada em um inalador parecido com o usado nas crises de
bronquite, a insulina em pó (sistema de aerossol) é inalada pela boca e logo
absorvida pelos pulmões que segue para a corrente sanguínea. De uma maneira
geral, a administração de drogas pela via respiratória implica que as partículas
25
sejam de tamanho em 1 e 3 µm; além disso, a inalação precisa ser lenta e profunda
(OSSWALD & GUIMARÃES, 1999).
A inalação da insulina de ação rápida substitui as três injeções, em média,
que os diabéticos (especialmente tipo 1) tomam antes das refeições. Segundo
Quattrin, (2004), a insulina inalável (Exubera, da Pfizer inc.) só poderá ser utilizada
por pessoas acima de 18 anos, por terem desenvolvido os estudos clínicos só em
adultos, nos primeiros dias de tratamento com a insulina inalada, os pacientes
apresentaram tosse, produção de anticorpos contra insulina, falta de ar, garganta e
boca seca. Os estudos mostraram que a Exubera atinge o pico mais rapidamente
que a insulina normal. O pico foi atingindo aos 49 minutos com a Exubera,
comparando com os 105 minutos com insulina normal.
Figura 4. Inalador de Insulina.
Fonte: www.exubera.com
4.3.4 Sistema de Infusão Contínua de Insulina (sic)
A infusão subcutânea contínua de insulina permite uma substituição das
múltiplas injeções diárias com canetas. Este método oferece mais independência e
conforto para os diabéticos insulino-dependentes. Além disso, a terapia com SIC de
insulina pode ser empregada com sucesso em crianças, adolescentes e mulheres
grávidas. A bomba de infusão de insulina é um aparelho ligado ao corpo por um
finíssimo cateter com uma agulha flexível na ponta (Figura 5). A agulha é inserida na
26
região subcutânea do abdômen ou da coxa, e deve ser substituída a cada dois ou
três dias para evitar obstruções.
A bomba de infusão de insulina libera quantidades programadas de insulina
basal, a fim de imitar o funcionamento do pâncreas de uma pessoa normal.
Figura 5. Sistema de Infusão Contínua de Insulina.
Fonte: http://www.accu-chek.com.br/
Figura 6. Exemplo de gráfico mostrando a variação de insulina basal.
27
4.3.5 Terapia Genética Para o Diabetes
Existe um interesse crescente no estudo de células-tronco para sintetizar e
secretar insulina de modo fisiológico, como alternativa para transplante em diabetes,
considerando um baixo número de doadores de pâncreas e o risco de resposta auto-
imune contra as células β transplantadas (TANIGUCHI, 1992).
A necessidade de se produzir, por meio de manipulação genética, todo o
complexo aparato necessário para a secreção de insulina em resposta ao estímulo
da glicose, levou ao estudo de células que possuem originalmente algumas das
características das células β, tais como as células hipofisárias, adrenais e hepáticas.
(MOORE 1983 & FURTH 1953).
Nos últimos anos tem-se observado um crescente interesse no estudo do
transplante celular para o tratamento do diabetes mellitus. O sucesso desta forma de
terapia representaria a cura do diabetes mellitus com o fim das injeções, da
monitorização da glicemia e do controle da dieta na tentativa de se manter a
homeostase metabólica e de se reduzir à ocorrência das complicações tardias. Um
grande esforço tem sido dedicado no desenvolvimento do transplante de ilhotas
pancreáticas. Recentemente observaram-se resultados extremamente
encorajadores obtidos pelo grupo da Universidade de Alberta, no Canadá
(SHAPIRO, 2000). Entretanto a escassez de tecido primário ainda representa um
importante obstáculo que deve ser superado, tornando-se um dos maiores alvos
para a terapia gênica nesta área. A dificuldade em se reproduzir as complexas
funções da célula β torna o desenvolvimento de células secretoras de insulina a
partir de células extra-pancreáticas uma tarefa extremamente difícil. Embora
importantes avanços tenham ocorrido quanto à expansão in vitro de células
primárias, o limitado entendimento da biologia da célula b ainda impede sua
utilização em larga escala.
A obtenção de células especializadas a partir de células-tronco
indiferenciadas constitui uma alternativa extremamente interessante, mas ainda
enfrenta os mesmos obstáculos quando ao insuficiente conhecimento do
desenvolvimento da célula β. Embora a geração de linhagens celulares represente
uma alternativa promissora, os problemas técnicos associados ao risco proveniente
28
do emprego de oncogênes ainda devem ser superados. Enfim, a chave para a
obtenção de uma terapia de reposição celular efetiva para diabetes mellitus
dependerá, portanto, do melhor entendimento dos processos de crescimento e
diferenciação da célula β.
Um estudo realizado pela Faculdade de Medicina da Universidade de São
Paulo (USP), em parceria com a Universidade Northwestern (Chicago, Estados
Unidos) mostrou que um tratamento experimental com células-tronco permitiu que
14 portadores de diabetes mellitus tipo 1 ficassem livres das injeções diárias de
insulina ou da ingestão de outros medicamentos por meses (VOLTARELLI, 2007).
Após a coleta de células-tronco dos pacientes, uma quimioterapia a longo prazo foi
feita para destruir a parte do sistema imunológico que atacava o pâncreas. Em
seguida, as células-tronco foram transplantadas para reconstituir o sistema
imunológico. Os autores enfatizaram o fato que o procedimento não possui efeitos
colaterais entre os voluntários.
4.3.6 Administração de Insulina Via Transdérmica
A via transdérmica é uma cômoda e eficiente via de administração de
fármacos, de proteínas, e de nano partículas, sendo uma alternativa às demais vias
usuais, como a via oral ou injetável. A administração via transdérmica se refere ao
transporte de uma determinada substância através da pele. Após a permeação
cutânea, a substância pode atingir regiões mais profundas (tecidos subjacentes) ou
mesmo a corrente sangüínea para uma ação sistêmica.
A pele é composta de duas camadas principais: a epiderme, camada
superficial composta de células epiteliais intimamente unidas e a derme, camada
mais profunda composta de tecido conjuntivo denso irregular. O limite entre a
epiderme e a derme não é regular, mas caracteriza-se pela presença de saliências e
reentrâncias das duas camadas que se embricam e se ajustam entre si, formando as
papilas dérmicas. A Figura 7 ilustra as camadas da pele.
29
Figura 7. A pele e suas divisões anatômicas: epiderme e derme.
Fonte: Bear,M.F., Connors, B.W. & Paradiso, Porto Alegre, 2 ed.Editora Artmed, 2002.
4.3.6.1 Epiderme
A epiderme é constituída essencialmente por um epitélio estratificado
pavimentoso queratinizado, de origem ectodérmica. Além desse epitélio, que
constitui a maior parte da epiderme, observa-se a presença de melanócitos, que são
responsáveis pela produção de melanina como mostra na figura 8 (JUNQUEIRA E
CARNEIRO, 1995).
Figura 8. Camada córnea, representação esquemática.
A porção mais profunda da epiderme é constituída de células epiteliais que se
proliferam. Tipicamente, em todos os epitélios, não há vasos sanguíneos, embora a
derme seja bem vascularizada. Como resultado, o único meio pelo qual as células
30
de epiderme podem obter os nutrientes, é através da difusão dos leitos capilares na
derme. Esse processo é suficiente para as células mais próximas da derme, mas à
medida que as células se dividem e são empurradas para superfície, ficam mais
longe da fonte de nutrientes (derme) e morrem.
Quando as células da epiderme morrem se convertem em escamas de
queratina que se desprendem da superfície epidérmica. A queratina é uma proteína
que se hidrata facilmente e isto explica a tumefação da pele por imersão na água.
A espessura da epiderme apresenta variações topográficas ao longo do
organismo desde 75µm a 150µm, à exceção das palmas das mãos e plantas dos
pés onde sua espessura atinge desde 0,4 milímetros até 1 milímetro.
4.3.6.2 Derme
Localizada abaixo da epiderme, a derme constitui 90% da massa da pele. Ela
é um manto denso de fortes fibras brancas (colágeno) e fibras amarelas (elastina),
através das quais os vasos sanguíneos, células musculares, fibras nervosas, canais
linfáticos, folículos pilosos e glândulas estão entremeados.
A derme concede força e elasticidade à pele. À medida que envelhecemos, a
derme vai afinando e a pele se torna transparente, o que contribui para a saliência
dos vasos sanguíneos na pele das pessoas mais idosas.
4.3.6.3 Transporte transdérmico
A maior barreira da pele é constituída pela camada córnea (Figura 8). Esta se
trata de uma barreira extremamente efetiva, o que dificulta o processo de transporte
por esta via. Segundo Hadgraft (2001), a razão para baixa permeabilidade da
camada córnea da pele encontra-se na estrutura, pois se sabe que a mesma é
organizada estruturalmente em bicamadas de lipídios, que segundo Lehninger
(2002) são arranjadas como uma dupla camada contínua com cerca de 5 nm de
espessura. Esta bicamada fornece a estrutura básica da membrana e atua como
31
uma barreira relativamente impermeável à passagem da maioria das moléculas
hidrossolúveis.
Figura 9. Esquema mostrando a estrutura da camada córnea.
A permeabilidade das bicamadas para uma determinada substância depende
em parte do tamanho da substância, mas esta permeabilidade depende
principalmente da sua liposolubilidade. Em geral, quanto menor a molécula e mais
liposolúvel (isto é, quanto mais hidrofóbica, ou não polar ela for) mais rapidamente
ela se difundirá através da bicamada lipídica da membrana (DEROBERTIS, 1983).
Pequenas moléculas não-polares, tais como o oxigênio (32Da) e o gás carbônico
(44Da), facilmente se dissolvem nas bicamadas lipídicas e, portanto difundem-se
rapidamente através delas. Moléculas polares sem carga também se difundem
rapidamente através de uma bicamada se forem suficientemente pequenas. A água
(18Da), o etanol (46Da), e a uréia (60Da), por exemplo, passam rapidamente, o
glicerol (92Da) difunde-se menos rapidamente, e a glicose (180Da), praticamente
não se difunde (ALBERTS E BRAY 1997).
Hadgraft (2001) relata que existem três vias para uma substância atravessar
a camada córnea: Intercelular, transcelular e a via anexa. Em condições normais, o
transporte feito através da via anexa (folículo piloso e glândulas sudoríparas) não é
significativo, isto ocorre devido à baixa área superficial ocupada pelos apêndices. É
muito difícil determinar a diferença entre os outros dois tipos de transporte,
entretanto, o desenvolvimento de estudos mediante técnicas analíticas tem
mostrado que os espaços intercelulares podem sofrer alterações que facilitam o
transporte de substância através da pele (Figura 10).
Corneócitos
(ou queratinócitos)
Lipídios (espaço intercelular)
32
Para avaliar a difusão de uma substância através da pele a primeira lei de
Fick pode ser utilizada:
Onde J é o fluxo da substância por unidade de área; D é o coeficiente de
difusão da pele; K é o coeficiente de partição; ∆c é a diferença de concentração da
substância e h é o caminho da difusão. Muitas técnicas já foram testadas para
aumentar a difusão de substâncias através da pele, este advento recebe o nome de
transporte não invasivo; e a administração da droga ocorre sem a quebra da
estrutura microscópica da pele. Vários métodos estão sendo desenvolvidos para que
muitos medicamentos injetados possam ser transportados sem dor e os riscos
associados ao uso tradicional de agulhas; que se inclui o emprego de campos
elétricos de agentes químicos, de ondas ultra-sônicas e micro agulhas.
Figura 10. Representação esquemática das rotas de penetração na pele.
Fonte: (adaptado da referência Hadgraft, J.; International Journal of Pharmaceutics, 1-18, 2000).
A via transdérmica pode ser utilizada para administrar medicamentos de ação
mais local, como os AINE´S (antiinflamatórios não esteróides) para tratar tecidos
musculares locais, ou mesmo medicamentos de ação sistêmica, como a nicotina e
alguns hormônios cuja absorção percutânea é feita mediante os “patches”. Algumas
vantagens desta via de administração de fármacos podem ser citadas a seguir:
Folículos
Pelos
Intercelular
Transcelular
h
cKD
J
∆
=
..
33
• É uma via alternativa ao trato gastrintestinal, quando este é contra-indicado
por algum motivo;
• Evita o metabolismo de primeira passagem hepática;
• Permite controlar a absorção de determinada quantidade de fármaco;
• Permite a aplicação em diferentes locais do corpo;
• Aumenta a adesão do paciente ao tratamento, devido à facilidade de
administração e diminuição da toxicidade sistêmica.
Existem também desvantagens desta via, como:
• A possibilidade de irritação localizada, variando o aparecimento ou não e o
grau de intensidade de indivíduo para indivíduo;
• A possibilidade de reações alérgicas cutâneas;
• A necessidade de um tempo mínimo para o fármaco se perfundir;
• Limitações nas dosagens de certos fármacos.
Por mais interessante que a via transdérmica possa parecer, e por mais
vantagens que a mesma apresenta, ainda poucos fármacos podem ser
administrados por esta via. De fato, são ainda necessários bastante estudos para
que a via transdérmica possa ter aplicações mais abrangentes. Um dos aspectos
que recebe muita atenção do ponto de vista da pesquisa básica é o uso de fatores
de promoção e otimização da penetração transcutânea, como os agentes químicos
ou de dispositivos (eletro-mecânico) para uma difusão assistida.
Neste contexto, os principais métodos, que suscitam interesse para estudos
científicos para facilitar o transporte através da pele, são os “patches”, a iontoforese,
a sonoforese (ou fonoforese), as injeções por jato e o uso de micro-agulhas.
Os “patches” são adesivos que podem ser fixados sobre a pele integra. É um
sistema que administra uma dose controlada de um fármaco através da pele por um
longo período, geralmente uma semana. O “patch” transdérmico mais familiar é o de
nicotina. Em geral, a adição de um agente químico (solventes e surfactantes) faz-se
necessária; os solventes agem para quebrar a estrutura dos lipídios e os
surfactantes diminuem temporariamente a resistência da barreira córnea (GOOMEY,
2001). A desvantagem deste tipo de aplicação é o número limitado de fármacos que
34
podem ser transportados, sendo possível somente o transporte de substâncias de
baixo peso molecular (MITRAGOTRY, 1995).
A iontoforese é a introdução de medicamentos através da pele com o auxílio
de uma corrente galvânica. Trata-se de uma técnica de administração indolor, não-
invasiva e efetiva para aplicações localizadas de fármacos (PRENTICE, 1998 &
NAIR, 1999). A iontoforese aumenta a penetração de soluções por três
mecanismos: eletro-repulsão, eletroosmose e mudanças da permeabilidade,
produzidas eletricamente (LEONARD, 2000). Os íons penetram no tecido pela
repulsão proveniente do pólo do eletrodo que é da mesma carga elétrica da
substância, que é absorvida e levada pela circulação sangüínea (KITCHEN, 1998). A
iontoforese encontra a mesma limitação que os “patches”, em relação ao tamanho
da substância.
4.3.6.4 Conceitos Básicos das Ondas Ultra-Sônica
As ondas ultra-sônicas são geradas quando uma tensão elétrica de alta
freqüência (acima de 20 KHz), é aplicada num cristal piezelétrico, localizado no
transdutor do aparelho de ultra-som. Os materiais piezoelétricos mais utilizados são:
quartzo, turmalina, sal de rochelle, titanato de bário e titanato zirconato de chumbo
(PZT).
O campo acústico gerado pelo transdutor é caracterizado por duas regiões:
- campo próximo (região de Fresnel).
- campo distante (região de Fraunhofer).
Os efeitos do ultra-som ocorrem na região do campo próximo. O comprimento
do campo próximo depende do diâmetro do transdutor e da freqüência do ultra-som.
A região de Fresnel não é uniforme, mesmo em um meio homogêneo;
algumas ondas se cancelam entre si, outras se reforçam, de modo que o resultado
final é um padrão irregular de ondas sonoras na região próximas da face do
transdutor, como é ilustrado na Figura 11 (WILLIAMS, 1987). No campo distante ou
zona de Fraunhofer, o campo sonoro se alastra e se torna muito mais regular (LOW
& REED, 2001).
35
Figura 11. Feixe ultra-sônico irregular no campo próximo tornando-se mais regular no campo
distante.
O ultra-som pode ser aplicado segundo duas modalidades: onda contínua ou
pulsada (Figura 12). Ondas contínuas são produzidas quando o campo elétrico é
aplicado de maneira contínua sobre o cristal piezoelétrico, durante todo o período
tratamento; enquanto que as ondas pulsadas são geradas por um campo elétrico em
trem de pulsos (HAAR, 1998).
Figura 12. Ultra-som de onda contínua (a). Ultra-som pulsado (b).
Os efeitos biológicos das ondas ultra-sônicas ao penetrar nos tecidos são
decorrentes da absorção da energia acústica. O coeficiente de absorção é usado
como medida da absorção em diversos órgãos. Para uma incidência normal (feixe
perpendicular à superfície), a atenuação da onda acústica, devido à absorção à
medida que penetra o meio, ao longo de uma direção x, pode ser expressa da
seguinte maneira:
36
Onde:
I(x): irradiância (ou densidade de potência), em W/cm², a uma distância x da
superfície.
Io: irradiância (ou densidade de potência), em W/cm², na superfície do meio.
α = coeficiente de absorção (em cm
-1
).
Na tabela 1, são mostrados os coeficientes de absorção de alguns meios
biológicos.
Tabela 1: Coeficiente de absorção de alguns meios para
as freqüências ultra-sônicas de 1 MHz e 3 MHz.
Coeficiente de
absorção
Meio 1 MHz 3 MHz
Sangue 0,028 0,084
Vasos sanguíneos 0,4 1,2
Tecido ósseo 3,22 ----
Pele 0,62 1,86
Cartilagem 1,16 3,48
Ar (20º C) 2,76 8,28
Tendão 1,12 3,36
Tecido muscular (Feixe perpendicular) 0,76 2,28
Tecido muscular (Feixe paralelo) 0,28 0,84
Gordura 0,14 0,42
Água (20ºC) 0,0006 0,0018
Fonte
:
HARR, Gail T. Princípios eletrofísicos. In: KITCHEN, Sheila; BAZIN, Sarah. Eletroterapia de
Clayton. 10ª ed. São Paulo, Manole, 1999, p. 3-30.
x
o
eIxI
.
.)(
α
αα
α
−
=
37
4.3.6.4.1 Sonoforese
Na área biomédica, a sonoforese refere-se o processo de administração de
fármacos mediante a utilização de ondas ultra-sônicas (US), a fim de alcançar
concentrações terapêuticas em locais selecionados. A aplicação do ultra-som em
freqüências terapêuticas (1-3 MHz) facilita um transporte de insulina através da pele
de ratos, mesmo sendo menos eficiente que em baixas freqüências. Estudos da
sonoforese “in vivo” feitos em ratos mostram que ocorre uma diminuição sensível do
nível glicemia no sangue dos ratos, decorrente da absorção de insulina; além disso,
existe uma forte dependência do aumento da difusão de insulina tanto com a
densidade de energia quanto com o tempo de aplicação (BOUCAUD, 2002).
4.3.6.4.2 Mecanismo da sonoforese
A sonoforese baseia-se em processos mecânicos produzidos pelas ondas
ultra-sônicas ao atravessar a pele, que favorecem a absorção de certos fármacos
(MITRAGOTRI, 2000 E BOUCAUD, 2002). Três processos básicos podem ser
citados para explicar o aumento da concentração de uma determinada substância
através da pele mediante a sonoforese: as ondas acústicas produzem uma elevação
da temperatura local, devido ao aumento da pressão, que facilita a difusão da
substância; a corrente acústica gerada pela onda também auxilia no transporte da
substância através da pele (Figura 13a); o terceiro processo é conhecido como
cavitação, ou seja, o crescimento e oscilações de bolsas de ar presentes na camada
córnea, que provoca uma desorganização da camada de lipídios (Figura 13b).
A formação de bolhas da ordem 10 µm, ao irradiar com ultra-som em um
líquido caracteriza dois tipos de cavitação: estável ou transitória. A cavitação estável
ocorre quando bolhas oscilam de um lado para o outro dentro das ondas de pressão
do ultra-som, mas permanecem intactas. Isto resulta em micro vibrações que
produzem um fluxo de líquido localizado ao redor das bolhas e, conseqüentemente,
adjacente às células.
No caso da cavitação transitória, que ocorre com altas intensidades ultra-
sônicas, o volume das bolhas aumenta, gerando um colapso (implosão), e
38
conseqüentemente um aumento na temperatura e na pressão local, e eventualmente
danos teciduais.
Gaertner (1954) provou que os efeitos da cavitação são inversamente
proporcionais à freqüência do ultra-som, ou seja, quanto menor a freqüência do
ultra-som maior será o fenômeno de cavitação, e consequentemente uma maior
desorganização na camada córnea da pele.
Mitragotry (1995) mostrou que o fenômeno de cavitação pode ser acentuado
pelo uso de ultra-som de baixa freqüência (da ordem de 20 KHz), que aumenta por
um fator de 1000 vezes o transporte transdérmico nessa faixa de baixas freqüências,
os defeitos induzidos pelas ondas US na pele humana podem ser da ordem de 20
µm (WU, 1998). Esta desorganização, gerada na camada córnea, não causa uma
perda permanente das propriedades de barreira da pele, sendo que após
aproximadamente duas horas da sonoforese essas propriedades são restabelecidas
(WU, 1998).
Através de uma análise de microscopia de fluorescência (WU, et al. 1998)
verificaram que as ondas sonoras emitidas pelo ultra-som de 168 KHz com
intensidade de 1,2 W/cm² causaram uma modificação estrutural significativa na
camada córnea de cadáveres humanos. O aspecto dos queratinócitos antes de
sofrerem a irradiação sônica era normal, ou seja, organizadas de forma hexagonal.
Já após 15 minutos de ultra-som, ocorreu uma mudança no arranjo dos
queratinócitos da camada córnea da pele. Há também a presença de bolsas de ar
com cerca de 20 µm de diâmetro, as quais seriam responsáveis em aumentar a
permeabilidade (Figura 13a).
39
Figura 13. Representação esquemática da aplicação da sonoforese mostrando (a) A corrente
acústica para difusão do fármaco; (b) o processo de cavitação.
Apesar de pesquisas relatarem um efeito positivo do ultra-som, em várias
publicações, há algumas inconsistências na literatura para a intensificação da
permeabilidade da droga na pele aproximadamente 75% dos estudos relatam o
efeito da sonoforese, enquanto que os outros não conseguiram esta intensificação
da permeabilidade da droga na pele. (BLY, 1995).
Mitragotri et al (1995) estudaram o efeito do ultra-som de baixa freqüência (20
KHz) no processo de sonoforese, para o transporte de proteínas de alto peso
molecular, através da pele. As proteínas escolhidas foram: insulina (peso molecular
6000 Da), interferon (~17000 Da) e eritroproteinas (~48000Da). A permeabilidade da
pele a estas proteínas é zero. Para avaliar se a aplicação do ultra-som aumenta o
fluxo da proteína, foi medida a permeabilidade da pele para estas proteínas na
presença do ultra-som “in vitro”, através da epiderme de cadáver humano. O ultra-
som de 20 KHz foi aplicado com irradiância de 12,5 a 225 mW/cm², por um tempo de
4 horas. Os autores concluíram que a aplicação do ultra-som promoveu um aumento
da permeabilidade da pele suficiente para promover uma significante penetração das
três proteínas.
Fang et al, (1999) também encontraram resultados semelhantes na avaliação
da segurança do processo de sonoforese de baixa freqüência, realizando estudos
histológicos em epidermes e tecidos musculares profundos expostos ao ultra-som na
freqüência que varia de 20 a 40 KHz. Neste estudo, os pesquisadores utilizaram
duas maneiras diferentes de aplicação do ultra-som, o modo continuo e o pulsátil.
(a)
(b)
40
Também trabalharam com a variação na intensidade dos pulsos e no tipo de
membrana de pele. A substância utilizada foi o clobetasol 17 – propionato, que é de
alto peso molecular. Os resultados mostraram que a baixa freqüência do ultra-som
aumenta a permeabilidade em todas as intensidades estudadas, porém o efeito do
aumento no transporte da droga não era proporcional à magnitude do ultra-som.
Monti et al (2001) também compararam o efeito do ultra-som na
administração de doses em freqüências e intensidades diferentes. Utilizou-se de um
aparelho de ultra-som de baixa freqüência (40 KHz) com freqüência que variava de
1,5 a 3,0 MHz. O experimento foi realizado com duas drogas distintas, a cafeína e a
morfina e como barreira foi utilizada pele de ratos raspada. Como resultados
observaram que, quando o transporte das drogas foi testado utilizando-se o ultra-
som que trabalhava na freqüência de 1,5 a 3,0 MHz, não houve aumento
significativo no transporte das drogas por via transdérmica. Porém quando foi
utilizado o ultra-som de 40 KHz, em intensidades que variavam de 130-440 mW/cm²,
ocorreu um aumento significativo na indução das drogas, o que reforça a eficiência
do ultra-som de baixa freqüência como meio alternativo no transporte de drogas
através da pele. Entretanto, existe uma ressalva em relação a esta eficiência. Os
pesquisadores observaram que quando a intensidade era de 130 mW/cm² esta não
era capaz de induzir o aumento do transporte das drogas através da pele. Ainda de
acordo com este estudo, os pesquisadores puderam concluir que o aumento mais
significativo no transporte das drogas se deu a intensidade de 440 mW/cm² e após o
termino do processo de sonoforese a pele não apresentava alterações histológicas.
Mitragotri et al. (2000) realizaram estudos para determinar a quantidade de
energia que seria necessária para que o ultra-som pudesse induzir o transporte de
drogas via transdérmica. Para a pesquisa os autores utilizaram um aparelho de ultra-
som de baixa freqüência (20 KHz) com intensidade variando de 0 a 14 W/cm² e um
tempo de exposição de 15 minutos. No inicio da aplicação, a condutividade da
substância através da pele aumentou linearmente com a intensidade, o que levaria a
se supor a existência de um aumento na permeabilidade da pele proporcional ao
aumento de intensidade do ultra-som, porém, isto não foi observado. Os autores
concluíram que este aumento da permeabilidade da pele está também relacionado
ao tempo de aplicação do ultra-som.
Boucaud et al (2002) realizaram um estudo para administração de insulina
através da pele de ratos “in vivo”, utilizando o mesmo tipo de ultra-som, a fim de
41
analisar a influência de três intensidades diferentes do ultra-som: 2,5, 5 e 10 W/cm².
De acordo com os resultados obtidos, houve um aumento da quantidade de insulina
no sangue dos ratos, que foi dependente da dose de energia utilizada e do tempo de
aplicação do aparelho. O efeito mais significativo conseguido pelo autor para baixar
o nível de glicemia foi obtido com a aplicação de 15 minutos do ultra-som a uma
intensidade de 2,5 W/cm².
Machet e Boucaud (2002) mostraram que a sonoforese de baixa freqüência é
um bom método alternativo para introdução de medicamentos pela via transdérmica,
porém, ainda não se conseguiu relacionar qual a melhor dose para a realização de
tal procedimento sem que se corram riscos de promover lesões na pele “in vivo” de
seres humanos. Portanto, maiores investigações devem ser feitas para comprovar a
segurança da sonoforese de baixa freqüência em seres humanos antes de se iniciar
a aplicação clínica de drogas por esta importante via.
4.3.6.5 Micro-agulhas
As agulhas hipodérmicas são eficazes na administração de drogas, mas
causam dor durante a inserção e não são eficazes para administração por grande
período. Como uma nova alternativa, está sendo usada a tecnologia de micro-
agulhas, que quando perfuram a pele, a droga penetra facilmente no tecido
tegumentar. A fim de possibilitar a absorção correta da droga e evitar a dor, as
agulhas têm de ser finas e com comprimento suficiente para alcançar as regiões
permeáveis, com certa distância de penetração abaixo da camada córnea, sem
estimular os nervos.
O emprego de micro-agulhas para administração transdérmica de fármacos é
relativamente recente, e representa uma técnica bastante promissora. As micro-
agulhas são geralmente usadas como um conjunto, fixados num suporte (“array”),
que permite a perfuração da camada córnea em vários pontos de uma determinada
região da pele (HENRY, 1998). A aplicação das micro-agulhas produz micro-furos na
camada córnea, esses micro-furos são então considerados como caminhos físicos
para o transporte do fármaco. As micro-agulhas podem ser também ocas,
possibilitando assim a injeção do fármaco (MCALLISTER, 2000). Nas Figuras 14a e
42
14b, são mostrados os esquemas do arranjo da micro-agulhas no suporte e a
ilustração da perfuração da camada córnea, respectivamente.
Figura 14. Esquema (a) do arranjo das micro-agulhas; (b) da aplicação na camada córnea.
Os principais problemas da aplicação de micro-agulhas são: os riscos de
quebra das mesmas durante a perfuração e/ou a retirada e o fechamento rápido dos
poros; este último risco diz respeito às micro-agulhas maciças e pode ser evitado
empregando micro-agulhas ocas. A porcentagem de micro-agulhas danificadas
durante a aplicação, mesmo sendo baixa, representa uma grande preocupação
(HENRY, 1998 & KAUSHIK, 2001). Estudos recentes mostraram que o uso de
materiais resistentes (silício, ligas metálicas, etc.) ou biodegradáveis (certos
polímeros) permite minimizar o risco de quebra das micro-agulhas e as
complicações decorrentes (MCALLISTER, 2003, DAVIS SP, MARTANTO W, ALLEN
MG, PRAUNITZ MR, 2005).
(a)
(b)
43
5 METODOLOGIA
5.1 ANIMAIS
A amostra foi composta inicialmente de 55 ratos machos (Rattus norvergicus
albinos), da linhagem WISTAR, com peso corpóreo variando entre 280 a 350
gramas, adultos procedentes do Biotério da Universidade de Mogi das Cruzes –
UMC, Mogi das Cruzes, SP.
Os animais foram confinados em gaiolas de 0,15 m², com 5 animais por
gaiola, mantidos em condições padronizadas de claro/escuro fotoperiodo de 12
horas, com temperatura e umidade controladas, com livre acesso a ração e água
fornecidos “Ad Libitum”.
5.2 MODELO DE DIABETES MELLITUS
Para a indução do diabetes experimental, foi feito um teste piloto com 15
ratos, a fim de aperfeiçoar as condições de indução, em base aos trabalhos da
literatura (GILMAN & GOODMAN 1975; FLATT, et al. 1992; DUARTE, 1996;
GORUS, 1982; MALAISSE & PIPELEERS, 1982). Os ratos foram divididos em 3
grupos de 5 animais, em função do local de injeção da droga: veia caudal, veia
dorsal do pênis, e via intraperitoneal. Como droga de indução, foi utilizada a aloxana
(Sigma), diluído a 2% em solução de citrato de sódio 0,1M, com pH de 4,5 (MARLES
& FARNSWORTH, 1995).
A Figura 15 ilustra o procedimento para a injeção na veia da cauda. Neste
caso, foi empregada uma dose de aloxana de 50 mg/kg. O rato foi colocado em uma
caixa de contensão, onde só a cauda ficava exposta para melhor administração e
visualização da veia. Uma prévia exposição por 20 minutos a uma lâmpada foi feita
para produzir vasodilatação, a fim de facilitar o procedimento.
Para a injeção intravenosa na veia dorsal peniana (Figura 16), uma dose de
50 mg/kg de aloxana foi utilizada, após administração de anestésicos (mistura de
44
40mg de Ketamina e 20mg de Xilazina). O rato foi então imobilizado em decúbito
dorsal para a injeção.
O terceiro grupo recebeu uma dose de 150 mg/kg, de aloxana via
intraperitoneal, como mostra a figura 17.
Os ratos receberam a aloxana após jejum de 24 horas, pois nestas condições
tornavam-se mais susceptíveis ao diabetes. Seis horas após a injeção de aloxana,
os animais foram tratados com solução de glicose (10%), para evitar convulsões e
morte, comuns na fase hipoglicêmica. Após 24 horas, os animais receberam água,
sem glicose.
Figura 15. Administração de aloxana via intravenosa pela veia da cauda.
Figura 16. Administração de aloxana via intravenosa pela veia peniana.
45
Figura 17. Administração de aloxana via intraperitoneal.
A fim de verificar o diabetes, 15 dias após a injeção de aloxana foi medida a
glicemia nos ratos, utilizando o glicosímetro: Accu-Check Active da marca Roche,
mostrado na Figura 18. O resultado obtido através da comparação entre os grupos:
veia caudal, veia peniana e peritônio, foi o parâmetro estabelecido para escolha do
método de administração mais adequado para indução do diabetes em ratos. Os
ratos com glicemia em jejum igual ou superior a 200 mg/dl foram considerados
diabéticos, uma média entre os valores encontrados na literatura.
Figura 18. Accu-Check Compact Blood Glucose, Diagnostics Roche.
46
Para a preparação da área de aplicação da sonoforese e das micro-agulhas,
foi realizada a tricotomia, em uma área de aproximadamente 4 cm
2
, a qual era
suficiente para receber o dispositivo para aplicação da insulina (Figura 19b). Optou-
se pelo uso de um aparelho elétrico de tosa profissional com lamina 40 (Figura 19a),
para evitar lesões na pele dos ratos.
(A) (B)
Figura 19. Aparelho elétrico de tosa Figura 19a. Figura 19b rato preparado para administração de
insulina via transdérmica.
Os ratos foram distribuídos em 4 grupos de 5 animais:
• Grupo Controle (GC);
• Grupo Sonoforese (GS);
• Grupo Micro-agulhas (GMA);
• Grupo micro-agulhas e sonoforese (GMAS).
O grupo chamado GC recebeu o tratamento convencional, ou seja, a
administração de insulina por injeção via subcutânea através de seringas específicas
para o tratamento. O grupo GS recebeu o tratamento por via transdérmica
(sonoforese). Para o grupo GMA, a administração de insulina foi realizada através
de uso prévio de micro-agulhas, produzindo assim micro-poros. Já o grupo DMAS foi
submetido à aplicação de micro-agulhas, seguida da sonoforese.
47
5.3 APLICAÇÃO DA SONOFORESE
Foi utilizado um aparelho de ultra-som (Figura 20) marca Bioset com
transdutor (cabeçote) de 2.5cm², a uma distância de aproximadamente 1 cm da pele,
no modo pulsátil, com intensidade de 2,5w/cm² e freqüência de 1MHz, utilizando-se
insulina (Novolin®), nas concentrações de: 1UI/ml, 5UI/ml, diluída em uma solução
fisiológica; e ná concentração de 100UI/ml, administradas por um período de 15
minutos.
Figura 20. Ultra-som utilizado para administração de insulina por sonoforese.
O dispositivo empregado para promover a difusão da insulina na pele é
ilustrado na Figura 21. A solução de insulina foi injetada no recipiente após o
posicionamento firme do dispositivo sobre a região da pele do rato, previamente
raspada e limpa, antes de ligar o aparelho. A aplicação da sonoforese foi feita na
região abdominal do rato (Figura 22).
Figura 21. Dispositivo para a aplicação da sonoforese em ratos.
Cabeçote do US
Orifício para injeção da solução
de insulina
Recipiente para a
solução de insulina
48
Figura 22. Administração de insulina por sonoforese.
5.4 APLICAÇÃO DAS MICRO-AGULHAS
Um dispositivo com micro-agulhas foi desenvolvido para administração da
insulina por micro-perfurações (Figura 23a). As micro-agulhas metálicas maciças
foram fixadas em uma borracha com uma área de 2,54cm² com uma disposição de
100 micro-agulhas distribuídas uniformemente por toda borracha. A altura de cada
micro agulha é de aproximadamente 150µm, com diâmetro de 18µm (corpo da
agulha), e a ponta das micro-agulhas tem aproximadamente raio de 1µ de curvatura
(Figura 23b). A influência da densidade de micro-agulhas sobre a eficiência da
difusão da insulina através da pele foi também analisada, considerando um número
maior de micro-agulhas. Na Figura 24, é apresentado o esquema do dispositivo com
as micro-agulhas para administraçao da insulina.
(A) (B)
Figura 23: Imagens obtidas no microscópio óptico, com aumento de 20x, do dispositivo de
micro-agulhas (Figura 22a). Extremidade de uma agulha insulínica, medindo 50 µm e uma
micro-agulha para acupuntura, utilizadas no dispositivo medindo 18 µm (Figura 22b).
Extremidade de uma
agulha convencional
para injeção de
insulina
49
Figura 24. Dispositivo com micro-agulhas para administração da insulina.
A administração da insulina foi feita após as micro-perfurações e a retirada
das micro-agulhas, através de um orifício do recipiente em contato físico firme com a
pele do rato (na região previamente raspada e limpa), durante 15 minutos, como
mostra a Figura 25; o uso do recipiente permitiu, além de conter a solução, limitar a
área de aplicação da insulina.
Figura 25. Administração de insulina via transdérmica por micro poros.
5.5 MICRO-PERFURAÇÕES SEGUIDAS DA SONOFORESE
A eficiência da administração da insulina mediante a combinação de micro-
agulhas e da sonoforese foi também analisada. Em uma primeira etapa os ratos do
grupo GMAS foram submetidos à micro-perfurações por meio do dispositivo de
micro-agulhas. Em seguida, após a retirada das micro-agulhas, foi realizada a
sonoforese, com o objetivo de aumentar a absorção de insulina pela via
transdérmica, elevando assim a difusão da insulina através da pele.
Pele
Suporte para
aplicação Recipiente para
insulina
Orifício para
injeção da insulina
Resina com as
micro-agulhas
50
5.6 MONITORIZAÇÃO DA GLICOSE
Com o objetivo de monitorar a absorção da insulina na pele e a passagem da
mesma para circulação sanguínea, mensurou-se o nível de glicose no sangue dos
ratos 3 vezes a cada 4 h, lembrando que, a insulina utilizada (Novolin®) começa a
agir 2 h após administração e atinge um pico máximo de ação entre 4 e 12 h, sendo
este o fator que nos levou a estabelecer intervalo de mensuração de 4 h. Utilizou-se
o monitor de glicemia Accu-chek Active, da marca Roche (Figura 18), que nos
permite medidas rápidas e precisas com apenas uma gota de sangue, com intervalo
de medição entre 10-600mg/dl, ou seja, limites inferiores e superiores
respectivamente há 10mg/dl e 600mg/dl , com uma margem de erro menor ou igual
a 3%. Os valores obtidos com as tiras testes Accu-Chek Active estão de acordo com
o método laboratorial (método da hexoquinase com desproteinação).
5.7 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Para interpretar os dados experimentais, uma análise estatística foi feita
mediante o software MINITAB®, que permite execução de vários testes de
hipóteses, a fim de verificar a igualdade entre duas médias, para um determinado
nível de significância, entre os valores da concentração de glicose antes e após a
administração de insulina, utilizando-se do método t-student com nível de
significância de p < 0,05; pela sua praticidade, pelo amplo emprego na literatura
científica e por sua utilização na análise de dados clínicos.
51
6 RESULTADOS E DISCUSSÃO
6.1 INDUÇÃO DO DIABETES
O teste piloto, feito com 15 ratos para a indução do diabetes experimental,
mostrou que a via intraperitoneal apresentou melhores resultados quando
comparado a outros procedimentos utilizados. Foi observado que: pela veia dorsal
do pênis dos 5 ratos utilizados, 2 tornaram-se diabéticos e 3 morreram; pela veia
caudal observou que 1 animal tornou-se diabético, 1 morreu e 3 não foram
induzidos; já pela via intraperitoneal, dos 5 animais utilizados, 2 tornaram-se
diabéticos e 3 não foram induzidos, sendo que não ocorreu nenhuma morte.
Após este teste piloto, 40 ratos foram submetidos à indução do diabetes,
através da administração da aloxana pela via intraperitoneal. Foi observado que 18
animais se tornaram diabéticos, 6 morreram e 16 permaneceram normais, sendo
novamente submetidos à nova aplicação da aloxana. Na Tabela 2 são apresentados
os valores de glicemia obtidos no 15º dia após a primeira administração da aloxana.
Tabela 2: Valores de glicose em mg/dl, no 15º dia após administração intraperitoneal de aloxana.
Animais Glicemia Animais Glicemia
1 420 21 150
2 330 22 298
3 ----- 23 336
4 118 24 -----
5 ----- 25 202
6 436 26 112
7 84 27 147
8 116 28 365
9 290 29 400
10 100 30 95
11 140 31 265
12 ----- 32 125
13 110 33 324
14 85 34 100
15 155 35 492
16 459 36 332
17 200 37 91
18 321 38 -----
19 258 39 380
20 ----- 40 120
52
Para acompanhar a indução do diabetes, foram selecionados aleatoriamente
7 animais. A Tabela 3 apresenta os valores de glicose mensurados antes da
administração do Aloxana, nos ratos com dieta normal e, após jejum de 24 horas,
sendo novamente mensurados no 5º e 15º dia após a administração da droga.
Podemos observar que dos 7 ratos monitorados, 4 se tornaram diabéticos, o que
corresponde em torno de 57% dos ratos.
Tabela 3. Valores de glicemia medida (em mg/dl), para sete ratos (escolhidos
aleatoriamente) antes e após da administração intraperitoneal do aloxana.
Antes da administração
Ratos
Dieta
Normal
Em jejum
5 DIAS após a
administração
15 DIAS após a
administração
1
118 86 149 136
2
124 67 326 464
3
130 72 156 130
4 118 69 126 185
5 125 78 377 398
6 124 72 404 471
7 130 90 394 453
Média 124,14 76,29 276,00 319,57
Desvio
Padrão
4,91 8,77 126,52 160,98
53
6.2 ADMINISTRAÇÃO DE INSULINA
A administração de insulina foi realizada em 20 ratos diabéticos dos 23
induzidos experimentalmente, que foram divididos em quatro grupos: Grupo Controle
(GC), Grupo Sonoforese (GS), Grupo Micro-agulhas (GMA) e Grupo micro-agulhas e
sonoforese (GMAS), dos 3 ratos diabéticos que restaram foram considerados para
reposição.
Nas Tabelas de 4 a 7, são apresentados os resultados obtidos do nível de
glicose, junto com os valores das médias e desvio padrão, nos 5 ratos de todos os
grupos, antes da administração de insulina, 4 e 8 h após a administração.
Tabela 4: Valores de Glicose em mg/dl do Grupo GC.
Rato 1
Rato 2
Rato 3
Rato 4
Rato 5
Média
Con.Norm
Des. Pad.
Antes 513 185 299 356 401 350,8
100,00 121,48
Após 4 h
67 39 49 60 81 59,2 16,88 16,19
Após 8 h
459 357 295 339 378 365,6
104,22 60,5
Pode ser observado na Tabela 4, que a injeção de insulina pela via
convencional ou via subcutânea provoca uma diminuição brusca do nível de glicose
até 4 h após a administração da droga e um comportamento instável após o período
de 8 h, retornando em alguns ratos a valores maiores. Estes resultados podem ser
visualizados na Figura 26.
0
100
200
300
400
500
600
Antes Após 4 h Após 8 h
Tempo de mensuração
Nível de glicose em mg/dl
rato 1
rato 2
rato 3
rato 4
rato 5
Figura 26. Variação do nível de glicose dos ratos do grupo GC.
54
Tabela 5: Valores de Glicose em mg/dl do Grupo GS.
Rato 1
Rato 2
Rato 3
Rato 4
Rato 5
Média
Con.Norm
Des. Pad.
Antes 321 344 271 208 417 312,2
100,00 78,46
Após 4 h
403 369 185 217 411 317 101,54 107,66
Após 8 h
390 328 172 200 402 298,4
95,58 106,84
Dos 5 ratos do grupo GS, 2 deles (ratos: 1, 2, 4) apresentaram
comportamentos semelhantes entre si, ou seja, um discreto aumento não
significativo estatisticamente do nível de glicose 4 h após a administração de
insulina; porém após 8 h observa-se uma pequena diminuição não significativa
estatisticamente do nível de glicose (ratos 2,4), podendo ser considerada como um
comportamento estável, devido à margem de erro do equipamento. Enquanto que
para os ratos 3 e 5, um comportamento oposto foi observado 4 h após a
administração, como mostra a Figura 27.
0
100
200
300
400
500
Antes Após 4 h Após 8 h
Tempo de mensuração
Nível de glicose em mg/dl
rato 1
rato 2
rato 3
rato 4
rato 5
Figura 27. Variação do nível de glicose dos ratos do grupo GS.
55
Tabela 6: Valores de Glicose em mg/dl do Grupo GMA
.
Rato 1
Rato 2
Rato 3
Rato 4
Rato 5
Média
Con.Norm
Des. Pad.
Antes 410 383 320 417 208 347,6
100,00 86,91
Após 4 h
344 341 189 380 195 289,8
83,37 90,61
Após 8 h
305 319 166 339 170 259,8
74,74 84,68
Na Tabela 6 observa-se que após 4 h da administração de insulina, o grupo
GMA apresentou uma diminuição do nível de glicose, menos acentuada em relação
à obtida no grupo GC; porém, esta diminuição continua mesmo após 8 h da
administração de insulina, diferente do grupo GC que apresentou um aumento em
seu nível de glicose. A representação gráfica dos dados da tabela 06 encontra-se na
figura 28.
0
100
200
300
400
500
Antes Após 4 h Após 8 h
Tempo de mensuração
Nível de glicose em mg/dl
rato 1
rato 2
rato 3
rato 4
rato 5
Figura 28. Variação do nível de glicose dos ratos do grupo GMA.
56
Tabela 7: Valores de Glicose em mg/dl do Grupo GMAS
Rato 1
Rato 2
Rato 3
Rato 4
Rato 5
Média
Con.Norm
Des. Pad.
Antes 386 356 218 302 201 292,6
100,00 81,83
Após 4 h
396 371 226 278 156 285,4
97,54 99,86
Após 8 h
338 350 189 220 128 245 83,73 96,34
Dos 5 ratos do grupo GMAS, 3 deles apresentaram comportamentos
semelhantes (ratos 1,2,3), sendo valores estáveis no período de 4 h após a
administração de insulina. No período 8 h após a administração da droga,
mostraram uma pequena diminuição, como podemos observar na Tabela 7 e na
Figura 29. Considerando a precisão do equipamento, este comportamento pode ser
considerado estável. Já o rato 4 e 5 apresentou comportamento do nível de glicose
diferente dos demais, diminuindo seus valores durante todos os períodos do
experimento.
0
100
200
300
400
500
Antes Após 4 h Após 8 h
Tempo de mensuração
Nível de glicose em mg/dl
rato 1
rato 2
rato 3
rato 4
rato 5
Figura 29
. Variação do nível de glicose dos ratos do grupo GMAS.
57
A figura 30 apresenta a variação percentual da concentração normalizada de
glicose para os diferentes grupos investigados.
0
20
40
60
80
100
120
Antes Após 4 h Após 8 h
Tempo de Mensuração
Concentração Normalizada de Glicose
(%).
GC
GS
GMA
GMAS
Figura 30:
Percentual de absorção de insulina dos 4 grupos, 4 h e 8 h após administração.
Considerando as médias e os desvios-padrão pode-se destacar que somente
o grupo controle (GC) apresenta uma acentuada redução da glicemia em resposta à
administração de insulina, ou seja, uma forte queda da concentração de glicose 4 h
após a administração, alguns ratos alcançando valores hipoglicêmicos, seguida de
recuperação dos valores basais. Enquanto, para os outros grupos, os desvios-
padrão são bastante elevados, o que dificulta a obtenção de uma tendência geral.
A fim de verificar se existe uma diferença significativa entre os valores da
concentração de glicose antes e após a administração de insulina, foi realizada uma
análise estática, utilizando o teste t-student, com nível de significância de p < 0,05
com o programa MINITAB
®
. Os resultados obtidos para o valor p, para os grupos
investigados, são mostrados na Tabela 8.
Tabela 8:
Valor - p da análise estatística
Comparação GC GS GMA GMAS
Antes/Após 4h 0,004 0,868 0,045 0,571
Antes/Após 8h 0,731 0,631 0,011 0,027
Pode-se destacar da análise estatística, que a administração de insulina no
GC produz uma diminuição significativa da concentração de glicose (p = 0,004), em
58
comparação com a concentração antes da administração. Enquanto que, após 8 h a
administração de insulina, a concentração de glicose volta ao seu nível inicial, como
indica o valor p igual a 0,731.
No caso do grupo GS, a diminuição do nível de glicemia observada não é
significativa, tanto após 4h como 8h; os valores de p obtidos são de 0,868 e 0,631,
respectivamente.
Com a técnica de micro-agulhas, grupo GMA, a diminuição do nível de
glicemia obtida mostra uma diferença significativa, 4h e 8h após a administração de
insulina, em relação ao nível inicial.
Para o grupo GMAS, da análise estatística pode-se verificar que o aumento
na absorção de insulina observado é significativo somente 8h após a administração
de insulina.
Destaca-se da análise estatística que os melhores resultados para a
diminuição do nível de glicose foram alcançados por meio da técnica de micro-
agulhas.
A fim de tentar otimizar a absorção transdérmica de insulina, pela aplicação
de micro-agulhas, aumentou-se a concentração da insulina de 1UI/ml para 5 UI/ml
(grupo GMA1). Os valores de glicose, após 4 e 8 h da administração, são
apresentados na Tabela 09. Observa-se que os ratos (1, 2, 3, 5) deste grupo
mostram uma sensível diminuição contínua da glicemia 4 h e 8 h após a
administração de insulina. Enquanto que o rato 4 apresenta um comportamento
diferente, ou seja, uma diminuição mais sensível da glicemia após 4 h da
administração de insulina e um aumento após 8 h. Esses resultados podem ser
melhores visualizados na Figura 31.
59
Tabela 9:
Valores de Glicose em mg/dl do Grupo GMA1
0
100
200
300
400
500
600
Antes Após 4 h Após 8 h
Tempo de mensuração
Nível de glicose mg/dl
rato 1
rato 2
rato 3
rato 4
rato 5
Figura 31.
Variação do nível de glicose dos ratos do grupo GMA1.
Para verificar se o aumento da absorção do nível de glicose em função do
aumento na concentração de insulina continuaria ocorrendo, realizou-se um
experimento com um grupo de 3 ratos (GMA2). Para este grupo administrou-se
insulina na concentração de 100 UI/ml, ou seja, 100 e 20 vezes mais concentrada
que para os grupos GMA e GMA1, respectivamente. Os valores da concentração de
glicose obtidos são mostrados na Tabela 10 e na Figura 32.
Rato 1 Rato 2 Rato 3 Rato 4 Rato 5 Média Des. Pad.
Antes 493 377 356 430 288 388,80
77,35
Após 4 h 371 328 350 327 280 331,20
33,86
Após 8 h 360 299 306 340 179 296,80
70,40
60
Tabela 10.
Valores de Glicose em mg/dl do Grupo GMA2
.
Rato 1 Rato 2 Rato 3 Média Des. Pad.
Antes 493 377 420 430,00 58,64
Após 4 h 371 318 301 330,00 36,51
Após 8 h 360 299 260 306,33 50,40
0
100
200
300
400
500
Antes Após 4 h Após 8 h
Tempo de mensuração
Nível de glicose em mg/dl
rato 1
rato 2
rato 3
Figura 32
. Variação do nível de glicose dos ratos do grupo GMA2.
Observa-se um aumento da absorção de insulina pela via transdérmica
quando se utiliza concentrações maiores da insulina. Vale ressaltar que a diminuição
do nível de glicose obtida pela utilização da técnica de micro-agulhas é
relativamente pequena, implicando uma baixa absorção de insulina, em comparação
com o método convencional (por injeção).
Entre os processos de facilitação do transporte transdérmico, a sonoforese é
hoje tema de estudos intensivos, mostrando muitas vantagens, pelo fato de ser uma
via alternativa que evita o primeiro efeito de degradação da droga em sua passagem
pelo fígado e possibilita a aplicação em diferentes locais do corpo sem que ocorra
dor (ELIAS, 1999). A desvantagem deste tipo de administração é o número limitado
de fármacos que podem ser transportados, sendo possível somente o transporte de
substâncias de baixo peso molecular (MITRAGOTRI, 1995).
Em nosso estudo, foi utilizado o ultra-som em freqüência terapêutica de 1
MHz, em modo pulsátil, com uma intensidade de 2,5 W/cm². Os resultados obtidos
61
mostram uma baixa absorção de insulina, por sonoforese, pois o nível de glicose
ficou praticamente inalterado 8 h após a administração. Comparando esses
resultados com aqueles obtidos por Frigeiro et al. (2004), que realizaram
experimentos de difusão de insulina por sonoforese in vitro, na pele isolada de rato,
pode-se destacar um comportamento semelhante, pois a absorção de insulina é
muito baixa, inferior a 10%.
Num estudo pioneiro, Mitragotri et al. (1995) demonstraram que o uso de
ultra-som de baixa freqüência, entre 20 e 40 kHz, proporciona um aumento da
absorção de substâncias de alto peso molecular como a insulina. Boucaud et al.
(2002) realizaram um estudo onde foi analisado a administração de insulina através
da pele de ratos “in vivo”, utilizando ultra-som com uma freqüência de 20 kHz, com
intensidade de 2,5 W/cm² e um tempo de exposição de 15 minutos. Os autores
encontraram uma diminuição cerca de 70 % do nível de glicose, 1,5 h após a
administração de insulina. Vale ressaltar que a insulina utilizada foi de ação rápida
(Humulin Rapide, Lilly, France), com uma concentração de 100 U/ml. Os autores não
relatam se os ratos eram diabéticos ou não.
A fim de aumentar a absorção de insulina, pela via transdérmica, uma outra
técnica foi empregada em nosso estudo: a aplicação de micro-agulhas. Segundo
Henry (1998), as micro-agulhas, quando administradas na pele, abrem caminhos
físicos (micro-poros) na camada córnea facilitando a absorção das drogas, sem
causar danos à pele.
Os resultados obtidos com o uso de micro-agulhas mostram uma eficiência
maior desta técnica em comparação com a sonoforese e a combinação, micro-
agulhas/sonoforese. Porém, uma diminuição da concentração de glicose da ordem
de 25 % foi obtida 8 h após a administração de insulina, que pode ser considerada
baixa quando comparada com a injeção convencional (cerca 80%).
MCALLISTER (2000), em experimentos realizados para administração de
insulina 100 U/ml (Humulin-R), via transdérmica em ratos diabéticos com micro-
agulhas, encontrou uma diminuição de 70 % do nível de glicose nos ratos, 5 h após
a administração da insulina. Vale ressaltar que nesse estudo, uma alta densidade
micro-agulhas ocas foram empregadas para injeção da insulina; uma densidade da
ordem de 1000 micro-agulhas por cm
2
, enquanto o nosso dispositivo tem uma
densidade muito inferior, cerca 40 micro-agulhas por cm
2
, ou seja, 25 vezes menos
denso.
62
Como mostrou a revisão bibliográfica realizada até o presente momento,
que o ultra-som e as micro-agulhas aumentam a absorção de insulina pela via
transdérmica, levantou-se a hipótese de que associando estas técnicas teríamos um
aumento na absorção de insulina pela via transdérmica. Com a análise dos
resultados do grupo GMAS esta hipótese não veio a se confirmar, tendo este grupo
uma absorção de insulina na ordem de 8% menor que o GMA, enquanto era
esperada uma melhor absorção, por ser o grupo onde se utilizou a combinação das
técnicas. No momento não temos uma explicação para este comportamento;
experimentos complementares devem ser feitos para verificar estes resultados.
63
8 CONCLUSÃO
Neste estudo, foi analisada a eficiência da administração via transdérmica de
insulina mediante as técnicas de sonoforese, aplicação de micro-agulhas e da
combinação dessas duas técnicas, em ratos diabéticos. Os resultados obtidos
mostram que uma baixa absorção de insulina é alcançada com essas técnicas
investigadas. Entretanto, destaca-se que a técnica por micro-agulhas proporciona os
melhores resultados. Vale ressaltar também que para aumentar a absorção de
insulina convêm empregar uma concentração de insulina de 100UI/ml.
No tratamento por sonoforese, acredita-se que aumentando o tempo de
aplicação do ultra-som (até uma hora) ou utilizando freqüência menores (20KHz a
40KHz) seria possível alcançar melhores resultados no que se diz respeito a
absorção de insulina pela via transdérmica.
No caso da técnica de micro-agulhas, seria necessário à confecção de um
dispositivo contendo um maior número de agulhas ou a utilização de agulhas com
diâmetros maiores (25µm) a fim de obter uma melhor absorção de insulina pela via
transdérmica. Além disso, acredita-se que aumentando o tempo de aplicação
permitirá obter resultados mais satisfatórios.
64
REFERÊNCIAS
ALBERTS, B; BRAY, D. Biologia Molecular da Célula, 3 ed. Porto Alegre: Arte
Médica, 1997.
AMERICAN DIABETES ASSOCIATION. Clínical Practice Recommendations.
Diabetes Care., 24 (suppl 1), Jan, 2001.
ASAYAMA, K. Chemoluminescence as an index of drug-induced free radical
production in pancreatic islets. Diabetes, v. 33, p. 160-163, 1984.
BLY, N. N. The use of ultrasound as an enhancer for transcutaneus drug delivery:
phonophoresis. Physical Therapy, v. 75, p. 481- 488, 1995.
BOUCAUD, A. Garrige, M.A. Machet, L. Vaillant, L. Patat, F.; Jornal Controlled
Release, v. 81, p. 113-119, 2002.
CAMPOS, M. S. M. P. Fibro Edema Gelóide Subcutâneo. Revista de Ciência e
Tecnologia (UNIMEP), Apostila, 1992.
CLAYTON, H. A.; JAMES, R. F.; LONDON, N. J. Islet microencapsulation: a review.
Acta Diabetologica, v. 30, p. 181-189, 1993.
DEROBERTIS, E.D.P; DeRobertis, E.M.F, Jr. – Bases da Biologia Celular e
Molecular; 2ª edição, Ed. Guanabara Koogan, Rio de Janeiro, 1983.
DUARTE, A. C. G. O. Estudo experimental dos efeitos da estimulação ultrasônica de
baixa intensidade na consolidação óssea em ratos submetidos ao diabetes
aloxânico. 1996. Dissertação (Mestrado em Bioengenharia) Faculdade de Medicina
de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto.
ELLIOTT, J. I.; EWCHAND, H.; ALTMANN, D. M. Streptozotocin-induced diabetes in
mice laking β cells.Clinical Experimental Emmunology, Bethesda, USA,v.109, p.116-
120, 1997.
FALQUI, L,; MARTINENGHI, S,; SEVERINI, G.M.; CORBELLA, P,; TAGLIETTI,M.V,;
ARCELLONI, C. Reversal of diabetes in mice by implantation of human fibroblasts
genetically engineered to release mature human insulin [see comments]. Hum Gene
Ther 1753-62, 1999.
FANG, J.Y; FANG, C.L; SUNG, K.C; CHEN, H.Y. Effect of low frequency ultrasound
on the in vitro percutaneous absortion of clobetasol propionate. International journal
of Pharmaceutics, v. 191, p 33-42, july, 1999.
FLATT, P. R. et al. Defective insulin secretion in diabetes and insulinoma. London:
Portland Press, 1992.
65
FRIGERO, M. Análise do processo de sonoforese para administração de insulina.
Efeito da freqüência, da intensidade e do tempo de exposição ao ultra-som;
Dissertação de Mestrado, Engenharia Biomédica, Universidade de Mogi das
Cruzes, Mogi das Cruzes, S.P, P.1-60, 2004.
FUCHS, F. D.; WANNMACHER, L. Farmacologia Clínica. Fundamentos da
Terapêutica Racional. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 1992.
FURTH, J.; GADSEN, EL.; UPTON, A.C. ACTH Secreting Transplantable Pituitary
Tumors. Proc Soc Exp Biol Med; v.84 p.253-4, 1953.
GAERTNER, W. J. Acoust.Soc.Am.26,p.977-980,1954.
GEED, H. Grupo de Estudos em Endocrinologia & Diabetes. Proposta de um estudo
multicêntrico com diabéticos em uso de insulina. Endocrinologia & Diabetes Clínica e
Experimental (Curitiba), v.1 p. 15-18, 2001.
GILMAN, L.; GOODMAN, S. The pharmacological basics of therapeutics. 5ª ed. New
York: Macmillian Publishine, 1975.
GODOY, P. Pâncreas Endócrino. In: BOGLIOLO, L.Patologia. 6. ed. Rio de Janeiro:
Guanabara Koogan, p. 1004-1008, 2000.
GOOMEY, J.R. - Minimally Invasive Medical Technology, Cap. 18, p. 278-306, 2001.
GORUS, F. K., MALAISSE, W. J.; PIPELEERS, D.G. Selective uptake of alloxan by
pancreatic B-cells. Biochem. J., n. 208, p. 513-551, 1982.
GRAFF MR, MCCLANAHAN MA. Assessment by patients with diabetes mellitus of
two insulin pen delivery systems versus a vial and syringe. Clin Ther; cap.30 p.486-
96, 1998.
GRIFFIN, J.E.; TOUCHSTONE, J.C. Low-intensity phonophoresis of cortisol in
swine. Physical Therapy, v. 48, p. 1336-1344, 1968.
GROSKREUTZ DJ, SLIWKOWSKI MX, GORMAN MX. Genetically engineered
proinsulin constitutively processed and secreted as mature, active insulin. J Biol
Chem; p. 6241-5. 1994.
GRÜNSPUN, H. Distúrbios psicossomáticos na criança. Rio de Janeiro: Atheneu,
1980.
GUIRRO, E.; GUIRRO, R. Fisioterapia Dermato-Funcional – Fundamentos,
Guanabara Koogan, 1995.
GUYTON A. C. Tratado de Fisiologia Médica. RJ Ed. Guanabara Koogan 9° ed.
1997.
GUYTON, AC, HALL, JE Tratado de fisiologia médica. 9 ed. Rio de Janeiro :
Interamericana, 1990.
66
HAAR, G. T. (1998). Princípios eletrofísicos. In: KITCHEN, S; BAZIN, S.
Eletroterapia de Clayton. SP, Manole. Cap. 1, p.23-30, 1998.
HADGRAFT, J.; International Journal of Pharmaceutics, p.1-18, 2001.
HENRY, S., McAllister, D.V., Allen, M.G., Prausnitz, M.R. Journal Pharm. Sci., ; v.87,
p.922-925, 1998.
HERSON, P. S.; ASHFORD, M.L J. Activation of a novel non-selective cation
channel by alloxan and H2O2 in the rat insulin-secreting cell line CRI-G1. J. Physiol.,
v. 501, p. 59-66, 1997.
JUNQUEIRA, L. C.; CARNEIRO, J. Histologia Básica 8. ed. Rio de Janeiro:
Guanabara Koogan, 1997.
JUNQUEIRA, L.C.U.; CARNEIROJ.S.F. Histologia Básica. 7. ed. Rio de Janeiro:
Guanabara Koogan, 1990.
KAUSHIK, S., Hord, A.H., Denson, D.D.; McAllister, D.V., Smitra, S., Allen, M.G.,
Prausnitz, M.R.; Anesth. Analg., 92, 502-504, 2001.
KITCHEN, S; Bazin, S - Eletroterapia de Clayton- 10. ed., Editora Manole, 1998.
LEHNINGER. Princípios de Bioquímica. 3ª ed, p.301 – 304, Sarvier, 2002.
LEONARD, M.; Creed, E.; Brayden, D.; Baird, A. W.; Pharm. Res., v.17, p.476-478,
2000.
LERNMARK, A. Molecular biology of type 1 (insulin-dependent) diabetes mellitus,
Diabetologia, v.28, n. 4, p. 195-203, 1985.
LOW, L.; REED, A. Eletroterapia Explicada: Princípios e Pratica. 3ª ed., Barueri- SP:
Manole, 2001.
MACHET, L; BOUCAUD, A. Phonophoresis: efficiency, mechanisms and skin
tolerance. Int. J. Pharma, v. 243, p. 1-15, 2002.
MARLES, R. J.; FARNSWORTH, N. R. Antidiabetic plantsand their active
constituents.Review. Phytomedicine, v.2, p. 137-189, 1995.
MCALLISTER, D. V.; PNAS, v. 100 no. 24, p.13755-13760, November, 2003.
MCALLISTER, D.V., Allen, M.G., Prausnitz, M.R.; Annu. Rev. Biomed., 2, 289-313,
2000.
MCALLISTER, , Martanto W, Allen MG, Prausnitz MR.; IEEE Trans Biomed Eng. 2
(5), p. 909-15, 2003.
67
MITRAGOTRI S, BLANKSCHTEIN D, LANGER R. An explanation for the variation of
the sonophoretic transdermal transport enhancement from drug to drug. J Pharm
Sci, v. 86, p.1190-1192, 1997.
MITRAGOTRI, S. Farrell, J. Tang, H. Terahara, T. Kost, J. Langer, R.; J. Control.
Release, 63 41-52, 2000.
MITRAGOTRY, S. Blankstein, D. Lager, R.; Science, 269, 850-53, 1995.
MONTI, D. GIANNELLI, R. CHETONI, P. BURGALASSI, S. – Comparison of the
effect of ultrasound and chemical enhancers on transdermal permeation of and
morphine through hairlees mouse skin in vitro. Journal of Pharmaceutics, vol.229, p-
131-137-2001.
MOORE H-P, WALKER MD, LEE F, KELLY RB. Expressing a human proinsulin DNA
in a mouse ACTH-secreting cell. Intracellular storage, proteolytic processing, and
secretion on stimulation. v35, p.531-8, 1983.
NAIR, V. Pillai, O. Poduri, R. Pachagnula, R.- Transdermal iontophoresis. Part.21, p.
139-151, 1999.
NORWOOD P, DUMAS R, ENGLAND RD, RIESE RJ, TEETER JG; Exubera Phase
3 Study Group. Inhaled insulin (Exubera) achieves tight glycemic control and is well
tolerated inpatients with type I diabetes. Program and abstracts of the European
Association for the Study of Diabetes 41st Annual Meeting; September p. 12-15,
2005.
OSSWALD W, GUIMARÃES S - Terapêutica Medicamentosa e suas Bases
Farmacológicas. 4ªed. Porto: Porto Editora, 2000Rang HP, Dale MM,Ritter JM –
Pharmacology. 4th ed. Churchill Livingstone. 1999.
PRENTICE, W.E- Iontophoresis. En: Prentice W.E (ed). Therapeutic modalities for
allied health professionals, New York, p. 134-146, 1998.
QUATTRIN, T., Inhaled insulin: recent advances in the therapy of Type 1 and 2
diabetes. Expert Opin Pharmacother; 5(12), p. 2597-2604, 2004.
SCHMIDT MI, et al. Variation in glucose tolerance with ambient temperature. Lancet,
v. 15, n. 344 p.1054-1055, 1994.
SHAPIRO A, LAKEY J, RYAN E, KORBUTT G, TOTH E, WARNOCK G. Islet
transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-
free immunossuppressive regimen. N Engl J Med 2000.
SIMPSON AM, TUCH BE, SWAN MA, TU J, MARSHALL GM. Functional expression
of the human insulin gene in a human hepatoma cell line (HEP G2). Gene Ther, V.2,
P. 223-31, 1995.
SZKUDELSKI, T. The mechanism of Alloxanand Streptozotocin Action in B Cells the
Rat pancreas. Physiological Research. Vol. 50, P. 536-546, 2001.
68
TANIGUCHI H, NAKAUCHI H, IWATA H, AMEMIYA H, FUKAO K. Treatment of
diabetic mice with encapsulated fibroblasts producing human proinsulin. Transplant
Proc, V. 24, P.2977-8, 1992.
VOLTARELLI, J. C. Journal American Medical Association, JAMA, V. 297 No. 14,
Pag, 1568-1576, Abril, 2007.
VON MERING, J.; MINKOWSKI, O. Diabetes mellitus nach Pankreas exstirpation.
Zbl Klin Méd; v. 10 p. 393-394, 1889.
WILLIAMS, R. Production and transmission of ultrasound. Physiotherapy, n. 73, p.
113-16, 1987.
WILSON J. D.; FOSTER, D. W. Williams: Tratado de endocrinologia. Sao Paulo:
manole, 1998.
WORLD HEALTH ORGANIZATION. Diabetes – preventing and managing the global
epidemic. Report of a WHO Consultation (Technical Report Series, nº. 894).
Geneva;1999.
WU J., Chappelow J., Weimann L; Ultrasound Med. Biol., V.24, P.705 -10, 1998.
69
APÊNDICE A- Análise estatística
70
Results for: Data GC
Paired T-Test and CI: Antes; Após 4h
Paired T for Antes - Após 4h
N Mean StDev SE Mean
Antes 5 350,800 121,479 54,327
Após 4h 5 59,200 16,193 7,242
Difference 5 291,600 109,082 48,783
95% CI for mean difference: (156,157; 427,043)
T-Test of mean difference = 0 (vs not = 0): T-Value = 5,98 P-Value = 0,004
Paired T-Test and CI: Antes; Após 8h
Paired T for Antes - Após 8h
N Mean StDev SE Mean
Antes 5 350,800 121,479 54,327
Após 8h 5 365,600 60,505 27,058
Difference 5 -14,8000 89,7758 40,1490
95% CI for mean difference: (-126,2714; 96,6714)
T-Test of mean difference = 0 (vs not = 0): T-Value = -0,37 P-Value =
0,731
Results for: Data GS
Paired T-Test and CI: Antes; Após 4h
Paired T for Antes - Após 4h
N Mean StDev SE Mean
Antes 5 312,200 78,465 35,090
Após 4h 5 317,000 107,657 48,146
Difference 5 -4,80000 60,71820 27,15401
95% CI for mean difference: (-80,19160; 70,59160)
T-Test of mean difference = 0 (vs not = 0): T-Value = -0,18 P-Value =
0,868
Paired T-Test and CI: Antes; Após 8h
Paired T for Antes - Após 8h
N Mean StDev SE Mean
Antes 5 312,200 78,465 35,090
Após 8h 5 298,400 106,840 47,780
Difference 5 13,8000 59,4870 26,6034
71
95% CI for mean difference: (-60,0628; 87,6628)
T-Test of mean difference = 0 (vs not = 0): T-Value = 0,52 P-Value = 0,631
Results for: Data GMA
Paired T-Test and CI: Antes; Após 4h
Paired T for Antes - Após 4h
N Mean StDev SE Mean
Antes 5 347,600 86,910 38,867
Após 4h 5 289,800 90,613 40,523
Difference 5 57,8000 45,0411 20,1430
95% CI for mean difference: (1,8741; 113,7259)
T-Test of mean difference = 0 (vs not = 0): T-Value = 2,87 P-Value = 0,045
Paired T-Test and CI: Antes; Após 8h
Paired T for Antes - Após 8h
N Mean StDev SE Mean
Antes 5 347,600 86,910 38,867
Após 8h 5 259,800 84,680 37,870
Difference 5 87,8000 44,2176 19,7747
95% CI for mean difference: (32,8965; 142,7035)
T-Test of mean difference = 0 (vs not = 0): T-Value = 4,44 P-Value = 0,011
Results for: Data GMAS
Paired T-Test and CI: Antes; Após 4h
Paired T for Antes - Após 4h
N Mean StDev SE Mean
Antes 5 292,600 81,834 36,597
Após 4h 5 285,400 99,859 44,658
Difference 5 7,20000 26,12853 11,68503
95% CI for mean difference: (-25,24285; 39,64285)
T-Test of mean difference = 0 (vs not = 0): T-Value = 0,62 P-Value = 0,571
Paired T-Test and CI: Antes; Após 8h
Paired T for Antes - Após 8h
N Mean StDev SE Mean
72
Antes 5 292,600 81,834 36,597
Após 8h 5 245,000 96,338 43,084
Difference 5 47,6000 31,2458 13,9735
95% CI for mean difference: (8,8032; 86,3968)
T-Test of mean difference = 0 (vs not = 0): T-Value = 3,41 P-Value = 0,027
Results for: Data GMA2
Paired T-Test and CI: Antes; Após 4h
Paired T for Antes - Após 4h
N Mean StDev SE Mean
Antes 3 430,000 58,643 33,858
Após 4h 3 330,000 36,510 21,079
Difference 3 100,000 35,539 20,518
95% CI for mean difference: (11,717; 188,283)
T-Test of mean difference = 0 (vs not = 0): T-Value = 4,87 P-Value = 0,040
Paired T-Test and CI: Antes; Após 8h
Paired T for Antes - Após 8h
N Mean StDev SE Mean
Antes 3 430,000 58,643 33,858
Após 8h 3 306,333 50,402 29,099
Difference 3 123,667 41,789 24,127
95% CI for mean difference: (19,857; 227,477)
T-Test of mean difference = 0 (vs not = 0): T-Value = 5,13 P-Value = 0,036
73
APÊNDICE B- Comitê de ética
74
Livros Grátis
( http://www.livrosgratis.com.br )
Milhares de Livros para Download:
Baixar livros de Administração
Baixar livros de Agronomia
Baixar livros de Arquitetura
Baixar livros de Artes
Baixar livros de Astronomia
Baixar livros de Biologia Geral
Baixar livros de Ciência da Computação
Baixar livros de Ciência da Informação
Baixar livros de Ciência Política
Baixar livros de Ciências da Saúde
Baixar livros de Comunicação
Baixar livros do Conselho Nacional de Educação - CNE
Baixar livros de Defesa civil
Baixar livros de Direito
Baixar livros de Direitos humanos
Baixar livros de Economia
Baixar livros de Economia Doméstica
Baixar livros de Educação
Baixar livros de Educação - Trânsito
Baixar livros de Educação Física
Baixar livros de Engenharia Aeroespacial
Baixar livros de Farmácia
Baixar livros de Filosofia
Baixar livros de Física
Baixar livros de Geociências
Baixar livros de Geografia
Baixar livros de História
Baixar livros de Línguas
Baixar livros de Literatura
Baixar livros de Literatura de Cordel
Baixar livros de Literatura Infantil
Baixar livros de Matemática
Baixar livros de Medicina
Baixar livros de Medicina Veterinária
Baixar livros de Meio Ambiente
Baixar livros de Meteorologia
Baixar Monografias e TCC
Baixar livros Multidisciplinar
Baixar livros de Música
Baixar livros de Psicologia
Baixar livros de Química
Baixar livros de Saúde Coletiva
Baixar livros de Serviço Social
Baixar livros de Sociologia
Baixar livros de Teologia
Baixar livros de Trabalho
Baixar livros de Turismo
