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Estudos sobre imunidade inata no mosquito
Aedes aegypti.
Maria Clara Leal Nascimento Silva
Dissertação de Doutorado apresentada ao Programa de Pós-graduação
em Química Biológica, do Instituto de Bioquímica Médica,
Universidade Federal do Rio de Janeiro, como parte dos requisitos
necessários à obtenção do título de Doutor em Química Biológica.
Orientador:
Marcos Henrique Ferreira Sorgine
Professor Adjunto do Instituto de Bioquímica
Médica - IBqM - UFRJ
Co-orientador:
Pedro Lagerblad Oliveira
Professor Titular do Instituto de Bioquímica
Médica - IBqM - UFRJ
Rio de Janeiro
Junho de 2008
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LOMBADA
MARIACLARALEAL
NASCIMENTOSILVA
Ativaçãodosistemaimuneinatono
mosquitoAedesaegypti.
UFRJ
2008
II
III
Maria Clara Leal Nascimento Silva
Estudos sobre imunidade inata no mosquito Aedes aegypti.
Nascimento-Silva. Rio de Janeiro, 2008.
Número de páginas fls. 210
Dissertação (Doutorado em Química Biológica)/UFRJ/Instituto de Bioquímica
Médica/Programa de Pós-Graduação em Química biológica, 2008.
Orientador: Marcos Henrique Ferreira Sorgine. Co-orientador: Pedro Lagerblad de
Oliveira.
Referências bibliográficas: f. 210
1. Aedes aegypti. 2. Imunidade inata. 3. Vírus. 4. Hematofagia
I Sorgine, Marcos Henreique Ferreira. II. Universidade Federal do Rio de Janeiro,
Instituto de Bioquímica Médica, Programa de Pós-Graduação em Química Biológica.
III. Título.
IV
FICHA DE APROVAÇÃO
Estudos sobre imunidade inata no mosquito Aedes aegypti
Maria Clara Leal Nascimento Silva
Dissertação de Doutorado submetida ao Programa de Pós-graduação em Química Biológica,
do Instituto de Bioquímica Médica, Universidade Federal do Rio de Janeiro - UFRJ, como
parte dos requisitos necessários à obtenção do título de Doutor em Química Biológica.
Aprovada por:
________________________________________________________________
Paulo Filemon Paolucci Pimenta
Doutor em Ciências Biológicas (Biofísica) pela Universidade de Federal do Rio de Janeiro (1987) e
Pesquisador Titular da Fundação Oswaldo Cruz,
Centro de Pesquisas René Rachou
Membro Externo
________________________________________________________________
Sirlei Daffre
Doutora em Ciências Biológicas (Bioquímica) pela Universidade de São Paulo (1988) e Professora da
Universidade de São Paulo
Membro Externo
________________________________________________________________
Yara Maria Traub-Cseko
Doutora em Biologia Molecular pela Columbia University, CUNYC (1977) e Pesquisador Titular da
Fundação Oswaldo Cruz
Membro Externo
________________________________________________________________
Eleonora Kurtenbach
Doutora em Ciências Biológicas (Biofísica) pela Universidade Federal do Rio de Janeiro em 1988 e
Professora Associada do Instituto de Biofísica/UFRJ.
Revisor e Suplente Interno
________________________________________________________________
Alexandre Afrânio Peixoto
Doutor em Genética pela Universidade de Leicester, Reino Unido em 1993 e Pesquisador Titular do
Instituto Oswaldo Cruz/Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular/FIOCRUZ/Laboratório
de Biologia Molecular de Insetos.
Suplente Externo
________________________________________________________________
Marcos Henrique Ferreira Sorgine
Doutor em Química Biológica pela Universidade Federal do Rio de Janeiro em 2001 e Professor
Adjunto do Instituto de Bioquímica Médica/UFRJ.
Orientador
________________________________________________________________
Pedro Lagerblad Oliveira
Doutor em Química Biológica pela Universidade Federal do Rio de Janeiro em 1990 e Professor Titular
do Instituto de Bioquímica Médica/UFRJ.
Co-orientador
Rio de Janeiro,
V
O presente trabalho foi realizado no Laboratório de Artrópodes Hematófagos do
Instituto de Bioquímica Médica da Universidade Federal do Rio de Janeiro, sob a
orientação do Professor Marcos Henrique Ferreira Sorgine e co-orientação do
Professor Pedro Lagerblad de Oliveira, na vigência de auxílios concedidos pela
FAPERJ (Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro), pelo CNPq
(Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico), PADCT-CNPq
(Programa de Apoio ao Desenvolvimento Científico e Tecnológico), PRONEX
(Programa de Apoio a Núcleos de Excelência), John Simon Guggenheim Memorial
Foundation e HHMI (Howard Hughes Medical Institute).
VI
"No esforço para compreender a realidade, somos como um homem tentando
entender o mecanismo de um relógio fechado. Ele vê o mostrador e os ponteiros,
ouve o seu tique-taque mas não tem meios para abrir a caixa. Se esse homem for
habilidoso, poderá imaginar um mecanismo responsável pelos fatos que observa,
mas nunca poderá ficar completamente seguro de que sua hipótese seja a única
possível." (Albert Einstein)
"Toda a nossa ciência, comparada com a realidade, é primitiva e infantil - e, no
entanto, é a coisa mais preciosa que temos." (Albert Einstein)
VII
Um galo sozinho não tece uma manhã:
ele precisará sempre de outros galos.
De um que apanhe esse grito que ele
e o lance a outro; de um outro galo
que apanhe o grito de um galo antes
e o lance a outro; e de outros galos
que com muitos outros galos se cruzem
os fios de sol de seus gritos de galo,
para que a manhã, desde uma teia tênue,
se vá tecendo, entre todos os galos.
À todos que me ajudaram e apoiaram nessa
jornada... Tenho certeza de que sem toda
essa ajuda não teria sido possível chegar
viva no final! Muito obrigada!
VIII
Agradecimentos
Eu não tinha idéia do quanto seria difícil escrever esse agradecimento até
realmente tentar começar. Tanta coisa aconteceu, tanto tempo se passou, tantas
pessoas fundamentais... me sinto totalmente incapaz de retribuir em palavras todo o
apoio e a importância que essas pessoas tiveram nesse trabalho e na minha vida de
uma forma geral.
Mas, de algum modo, tenho certeza que cada uma delas sabe exatamente o
tamanho do meu amor e da minha gratidão.
Preciso começar agradecendo àquelas pessoas que são a base de todo esse
trabalho: meus orientadores!
Ao Marcos, assim como no mestrado, por TUDO. Não existe modo de resumir
em algumas linhas a importância que você tem na minha vida. Obrigada por
acreditar em mim, mesmo quando eu mesma não consegui. Pelo seu otimismo
exagerado e por não querer me matar por reclamar de tudo o tempo todo!! Por ser
muito mais que um bom orientador, mas um amigo de verdade.
Ao Pedro, pela maneira que ele enxerga a ciência e traduz ela pra gente. Por
todas as discussões, no laboratório ou no bloco A, fossem elas sobre o trabalho em si,
o sentido da vida científica ou o sexo dos anjos! Sua amizade, sua preocupação e sua
presença constante foram muito importantes pra mim! Obrigada por tornar o
laboratório a nossa segunda casa e por mostrar que mais importante ainda do que
fazer algo bem feito é fazer bem feito e com prazer!
E por falar em ter prazer para trabalhar, não posso deixar de agradecer
imediatamente as minhas alunas de IC, que além de me ajudarem incrivelmente nos
experimentos, me proporcionaram o maior prazer de todos, o de ensinar!
À Bia e à Luciana, por todos os experimentos que fizemos juntas e,
principalmente, por todos os que vocês fizeram sozinhas! Ver vocês aprendendo as
coisas e crescendo nesse mundo da ciência foi, sem dúvida, a melhor parte de tudo
isso!! Muito obrigada!!
IX
Aos outros alunos que eu orientei, mas não ficaram no laboratório, ou apenas
não continuaram trabalhando diretamente comigo, o mesmo agradecimento pela
experiência maravilhosa e pela companhia de vocês! Luiza, Aline e Renata, Bia 1 e
Ana Carolina, muito obrigada, meninas!!
Algumas pessoas estiveram tão presentes nesses quatro anos de trabalho que
parecem fazer parte do trabalho propriamente dito. Tenho certeza que a ajuda e o
incentivo delas foi muito mais que importante e elas merecem todo o agradecimento
do mundo!
À Gabi e ao Marcus, por todas as idéias e as discussões sobre o projeto. Por
estarem sempre dispostos a ajudar quando foi necessário e por serem um exemplo
tanto profissional quanto pessoal para mim!
Ao Aurélio, pelo seu incentivo incondicional... Obrigada por me ouvir
reclamar e sempre saber exatamente dizer o que eu precisava ouvir pra seguir
adiante! Por acreditar em mim acima de qualquer coisa sempre. Por me mostrar que
o mundo pode ser sempre muito maior do que o que conhecemos, e é nossa
obrigação explorá-lo cada vez mais!
À Liliane, minha maior companheira de desespero... Mais uma vez passamos
por esse período maluco de incertezas e preocupações juntas, amiga!! Tenho certeza
de que tudo dará certo como na ultima vez! Mesmo no período que você estava mais
longe, a sua amizade sempre foi muito importante. Dividimos preocupações,
correrias, prazos, angústias... mas compartilhamos muitos bons momentos também!
E, com certeza, tudo ficou bem mais fácil e mais alegre por ter você por perto!! Muito
obrigada por ser essa pessoa tão especial!!
À Kath, por fazer daquele laboratório o lugar mais divertido do mundo –
porque qualquer lugar com a Kath é o lugar mais divertido do mundo!! Amiga, a sua
alegria e o seu bom humor são o maior presente que eu poderia ter! Obrigada por ser
essa amiga maravilhosa em todas as horas, dentro e fora do laboratório, uma
companheira de verdade. E não se preocupe, amizades assim não acabam nunca,
viu??
À Lulu, minha amiga feliz, pela companhia constante na bancada! Por todos
os experimentos que fizemos juntas, por todas as placas que pipetamos em conjunto!
X
Nosso trabalho em equipe funcionava tão bem que uma nem precisava falar pra
outra o que tinha que fazer em seguida!! Você fez muita falta no último ano, Lu!!
Espero que agora possamos voltar a pipetar plaquinhas lado a lado!!
À Aninha, que apesar de não estar mais presente no laboratório, sempre vai
fazer parte dele pra mim. A gente começou esse caminho juntas, há muitos anos
atrás, e apesar de todas as dificuldades e todas as pedras que encontramos, vamos
terminar ele juntas também, amiga!! Muito obrigada por ser essa pessoa fantástica,
sempre disposta a fazer qualquer coisa pra tornar a minha vida menos complicada!
Você é muito especial pra mim, garota!!
À todos os outros amigos do laboratório, por tornar nosso ambiente de
trabalho um lugar mais agradável, apesar de ser no sub-sub-solo! Chris, Tiago,
Renatinha, Zé, Renata, Juliana, Elen, Joana, Donato, João Paulo, Ana Caroline,
Carolzinha, Milane, Raquelzinha, Vanessa, Hana, Fabi, Cecília e outros que eu devo
ter esquecido!
À todos do Laboratório de Biologia Molecular, nossos companheiros de
bancada, pela convivência agradável e pela infinitas discussões nos seminários de
terça feira!
À todos os amigos do Instituto, que de alguma forma participaram da minha
vida nos últimos anos, tanto profissionalmente, como nos momentos de
descontração!
À porfa Eleonora, pela atenção durante o acompanhamento e a revisão desta
tese.
Aos membros da banca, Profa Sirlei Daffre, Profa Yara Traub-Cseko, Prof Paulo
Pimenta e Prof. Alexandre Peixoto, que tão gentilmente aceitaram ler esse trabalho e
avaliá-lo.
As pessoas de fora do laboratório também tiveram uma valiosa participação
neste trabalho, afinal de contas, ninguém trabalha bem se não está feliz!
Ao pessoal da faculdade, Paulinha, Bruno, Si, Paulo, Chico, Marcelo, Maria,
Chirs, Lulu, Aninha, Lele... por tudo o que passamos juntos, durante e depois da
faculdade! E por tudo o que ainda vamos passar!!
XI
Aos meus amigos mais antigos, aquele que já viraram família, não precisa nem
dizer o quanto amo todos vocês!
Dani (minha marida) e Paulinha, não existem palavras para explicar nossa
amizade... ela supera qualquer exemplo que eu consiga pensar! Muito obrigada por
fazerem parte da minha vida sempre, de perto ou de longe! Estaremos sempre juntas,
amigas, não importa como! Bobba, Livoca, Tati, Nathinha, sem vocês o mundo seria
um lugar tão mais triste!! Amo todas vocês demais!
Aos meus irmãozinhos, Luiz e João, por simplesmente serem parte da pessoa
que eu me tornei. Muito difícil imaginar como seria minha vida sem vocês!
Ao quarteto fantástico, é claro! Eu nunca poderia deixar de agradecer à vocês
quatro por toda a diversão, toda a cachaça, todas as missas e as risadas! Pela musica
boa no domingo de noite, pela piscina aquecida e pela infinita quantidade de besteira
que vocês são capazes de falar por unidade de tempo! Se o quesito for abobrinhas,
vocês realmente valem por quatro!!!!
Ao Rafael, por ter aparecido na minha vida bem na hora certa. A sua presença
e a sua alegria nos últimos meses me fizeram ver o quanto o mundo pode ser um
lugar maravilhoso! Obrigada por me aturar nesse período estressante e corrido,
trabalhando quase tanto quanto você...!!! Obrigada por tudo de bom que você trouxe
pra minha vida, e olha que essa lista não é nada pequena! Como eu já te disse antes,
perto de você todo dia é um dia de sol, mesmo que esteja chovendo!
E, finalmente, agradeço à minha família. Meus primos, minha irmã, meus
sobrinhos, meus avós, à essas pessoas que sempre me apoiaram e incentivaram meus
sonhos malucos de ser cientista desde pequenininha!
E, especialmente, um muito obrigada gigante ao meu pai e à minha mãe. Por
serem pessoas incríveis e terem me dado todo o tipo de suporte e carinho que uma
pessoa pode sonhar na vida! Pela paciência nas crises, pela paciências nas festas, pela
atenção incondicional. Mas, acima de tudo, pela visão incrível do mundo que vocês
têm, e por dividir essa visão comigo. Amo vocês mais que tudo!!!
XII
LISTA DE ABREVIATURAS
AMPs: “antimicrobial peptides” ou peptídeos antimicrobianos
Arbovírus: “arthropod-born virus” ou vírus nascidos em artrópodes
BSA: Albumina bovina
cDNA: ácido desoxiribonucleico complementar
Ct: “Cycle Threshold”
DAI: Dias após a infecção
DCV: Vírus C de Drosophila
DENV: Vírus da dengue
Dif: “dorsal immune factor” ou fator imune homólogo àdorsal
DMSO: dimetilsulfóxido
DXV: Vírus X de Drosophila
H
2
O
2
: peróxido de hidrogênio
HO: heme oxigenase
IkB: Inibidor do NF-kB
IKK: Quinase do inibidor de NF-kB
IL-1R: Receptor e Interleucina-1
IMD: “Immune deficiency” ou deficiência imunológica
JAK: Janus quinase
JEV: Vírus da encifalite Japonesa
JNK: Jun N-terminal quinase
LPS: lipopolisacarídeos
LRRs: “Leucine rich repeats” ou repetições ricas em Leucina
mRNA: ácido ribonucleico mensageiro
NF-kB: “nuclear factor kappa B”
Nrf2: “nuclear factor erythroid-2 related factor 2” ou fator nuclear relacionado ao
fator eritróide-2
OH
•
: radical hidroxila
XIII
PAMPS: “ Pathogens associated molecular patterns” ou padrões moleculares
associados a patógenos
PCR: reação em cadeia da polimerase
PGRPs: “Peptidoglycan recognition proteins” ou proteina de reconhecimento de
peptideogicanos
PKC: “protein kinase C” ou proteína quinase C
PM: Matriz peritrófica
PRRs: “pattern recognition receptor” ou receptors de reconhecimento de padrões
R
•
: radical alquil
RE: Retículo endoplasmático
RIP: “receptor interaction protein”
RNA: ácido ribonucleico
RNAse: ribonuclease
RO
•
: radical alcoxil
ROO
•
: radical peroxil
ROOH: hidroperóxido orgânico
ROS: “reactive oxygen species” ou espécies reativas de oxigênio
RP 49: Proteína Ribossoma de A. aegypti
rtPCR: “retro transcribed polymerase chain reaction” ou reação em cadeia da
polimerase por transcrição reversa
SBTI: inibidor de tripsina de soja
SDS: dodecil sulfato de sódio
SINV: Vírus Sindbis
SnPP IX: Estanho portoporfirina IX
STAT: “Signal Transducers and Activators of Transcription” ou Transdutor de sinal e
ativados de transcriçao
TEP: “thioester-containing protein” ou proteína rica em thio-ester
TIR: “Toll/interleukin-1 receptor”
TLRs: “Toll like receptors” ou receptores do tipo Toll
TM: temperatura de desnaturação
TOR: “Target of Rapamycin” ou alvo de rapamicina
XIV
WNV: Vírus West Nile
YFV: Vírus da febre amarela
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 – O ciclo de vida de Aedes aegypti
Figura 2 – O vírus da Dengue
Figura 3 – Ciclo replicativo dos Flavivirus
Figura 4 – Mapa da distribuição mundial da dengue
Figura 5 – Mapa da presença de dengue no Brasil
Figura 6 – Vírus Sindbis
Figura 7 – Esquema de replicação do genoma do vírus Sindbis
Figura 8 – Esquema das Barreiras de transmissão de patógenos
Figura 9– Aparelho digestivo de A aegypti.
Figura 10: Heme e geração de estresse oxidativo
Figura 11– Resumo esquemático simplificado mostrando as três principais vias de
ativação do sistema imune inato em Drosophila melanogaster
Figura 12 – Representação esquemática de proteínas da família NF-kB/REL e IkB
Figura 13 – Receptores Toll em D. melanogaster e em mamíferos
Figura 14 – Esquema comparando a ativação da via Toll em mamíferos e em D.
melanogaster.
Figura 15 – Esquema das via Toll e IMD em Drosophila melanogaster
Figura 16 – Evolução Gráfico mostrando ortólogos de genes entre Aedes aegypti,
Anopheles gambie e D melanogaster
Figura 17 – Genes e famílias gênicas envolvidas nas vias Toll e IMD
Figura 18 – Gráfico representativo de uma corrida de PCR em tempo real
Figura 19 – Expressão relativa de aaREL 1 nos diferentes estágios de vida do
mosquito Aedes aegypti e nos diferentes tecidos da fêmea adulta alimentada com
sangue.
Figura 20 – Expressão relativa de Cactus nos diferentes estágios de vida do mosquito
Aedes aegypti e nos diferentes tecidos da fêmea adulta alimentada com sangue
XV
Figura 21 – Expressão relativa de MYD 88 nos diferentes estágios de vida do
mosquito Aedes aegypti e nos diferentes tecidos da fêmea adulta alimentada com
sangue
Figura 22 – Expressão relativa de Serpina nos diferentes estágios de vida do
mosquito Aedes aegypti e nos diferentes tecidos da fêmea adulta alimentada com
sangue
Figura 23 – Expressão relativa de IMD nos diferentes estágios de vida do mosquito
Aedes aegypti e nos diferentes tecidos da fêmea adulta alimentada com sangue
Figura 24 – Expressão relativa de aaRel 2 nos diferentes estágios de vida do mosquito
Aedes aegypti e nos diferentes tecidos da fêmea adulta alimentada com sangue
Figura 25 – Expressão relativa de Defensina nos diferentes estágios de vida do
mosquito Aedes aegypti e nos diferentes tecidos da fêmea adulta alimentada com
sangue.
Figura 26 – Expressão relativa de STAT nos diferentes estágios de vida do mosquito
Aedes aegypti e nos diferentes tecidos da fêmea adulta alimentada com sangue
Figura 27 – Expressão relativa de TEP nos diferentes estágios de vida do mosquito
Aedes aegypti e nos diferentes tecidos da fêmea adulta alimentada com sangue.
Figura 28 – Infecção de células C6/36 com vírus Dengue.
Figura 29 – Infecção de células C6/36 com vírus Sindbis.
Figura 30 – Infecção mosquitos Aedes aegypti com vírus Sindbis
Figura 31 – Infecção mosquitos Aedes aegypti com vírus Sindbis – quarto dias após a
alimentação.
Figura 32 – Ativação das principais vias do sistema imune inato em fêmeas de Aedes
aegypti após a alimentação
Figura 33 – Captação de um análogo fluorescente de heme, a Sn-protoporfirina, por
células C6/36.
Figura 34 – Viabilidade de células C6/36 incubadas com heme e DMSO
Figura 35 – Ativação de aaREL 1 e aaREL 2 por heme em C6/36.
Figura 36 – Ativação das principais vias do sistema imune inato em fêmeas de Aedes
aegypti após a infecção com solução de esferas de látex.
XVI
Figura 37 – Ativação das principais vias do sistema imune inato em fêmeas de Aedes
aegypti após tratamento com antibióticos
Figura 38 – Quantificação viral em mosquitos Aedes aegypti alimentados com solução
de látex ou antibióticos.
Figura 39: Esquema da Conclusão
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 – Oligonucleotídeos utilizados para quantificação relativa por PCR em
tempo real
Tabela 2 – Eficiência dos oligonucleotídeos
XVII
Resumo
Nascimento-Silva, Maria Clara Leal. Estudos sobre imunidade inata no mosquito Aedes
aegypti. Rio de Janeiro, 2008. Dissertação de Doutorado, Programa de Pós-graduação em
Química Biológica, Instituto de Bioquímica Médica, Universidade Federal do Rio de Janeiro
– UFRJ, 2008.
Artrópodes são importantes vetores de parasitas e vírus responsáveis por
doenças de grande relevância para a saúde humana, como a malária, a Dengue e a
febre amarela. No entanto, muito pouco é conhecido sobre como o sistema imune
inato de insetos responde a infecções por vírus. No mosquito A. aegypti, infecções
por fungos predominantemente ativam a via Toll, através do fator de transcrição
aaREL 1, enquanto a via IMD é ativada por bactérias, pela regulação do fator de
transcrição AaREL 2. A via JAK/STAT também parece estar relacionada com o
controle de patógenos nesses organismos, regulando a expressão de proteínas
semelhantes as do sistema complemento, como, por exemplo, TEP 1, em D.
melanogaster.
Neste trabalho nos analisamos o perfil de expressão de nove genes ligados ao
sistema imune, em diferentes estágios do ciclo de vida do mosquito, e diferentes
tecidos da fêmea adulta, 24 horas após a alimentação com sangue.
Alem disso, observamos que os três fatores de transcrição das principais vias
relacionadas ao sistema imune inato em invertebrados (aaREL 1,aaREL2 e STAT)
estão super-expressos 24 horas após a alimentação com sangue, mas não após a
alimentação com albumina bovina (BSA) ou esferas de látex. Após a infecção com o
vírus Sindbis foi observado um aumento na expressão desses mesmos genes em
células C6/36 e em mosquitos adultos. Utilizando um sistema in vitro, mostramos
que células C6/36 são capazes de captar heme e a expressão de aaREL 1 e aaREL 2 se
encontra aumentada após 24 horas de incubação com esta molécula.
Mosquitos tratados com antibióticos, por quatro dias antes da alimentação,
apresentaram uma expressão reduzida de aaREL 2, mas não de aaREL 1 e STAT.
Quando analisamos a carga viral nos mosquitos infectados após o tratamento com
antibióticos ou utilizando a solução de látex como veiculo no lugar do sangue,
encontramos uma quantidade muito elevada em comparação com mosquitos
infectados com sangue sem nenhum tipo de tratamento.
Esses resultados sugerem que a alimentação com sangue, por si só, é capaz de
ativar as vias do sistema imune inato e que a super-expressão de aaREL 2 parece ser
devido ao aumento da microbiota intestinal do mosquito, afetando profundamente
na carga viral após a infecção por Sindbis.
XVIII
Abstract
Nascimento-Silva, Maria Clara Leal. Estudos sobre imunidade inata no mosquito Aedes
aegypti. Rio de Janeiro, 2008. Dissertação de Doutorado, Programa de Pós-graduação em
Química Biológica, Instituto de Bioquímica Médica, Universidade Federal do Rio de Janeiro
– UFRJ, 2008.
Diseases caused by arthropod-born virus are significant health problems, and
novel control methods are required to block pathogen transmission. An important
fact that preclude this goal is that little is known about Aedes aegypti responses to
viral infection. Innate immune responses are mediated by signaling pathways,
activated after specific cell-pathogens interactions. In the mosquito A. aegypti,
infections by fungi are known activators of the toll pathway, through NF-Kb related
transcription factor Rel 1, while bacteria mostly activate the IMD pathway, that
operates through a different NF-Kb othologous protein, Rel 2. The JAK/STAT
pathway is also related to pathogen clearance, a process that occurs by the regulation
of complement-like humoral proteins, such as TEP1 in Drosophila.
In this work we analyzed the expression profile of nine immune-related genes
in different stages of the mosquito life cycle and in different organs of the blood fed
female.
Furthermore we observed that three major mosquito immune-related
transcription factors (aaREL 1, aaREL 2 and STAT) are up regulated 24 hours after
blood meal but not after albumin (BSA) or latex feeding. After sindbis virus infection
an additional increase in these same genes could be observed by real time PCR
.Using an in vitro system, we were able to show heme uptake by C6/36 Aedes
albopictus cells and an upregulation of aaREL 1 and aaREL 2 after 24 hs incubations.
Mosquitoes treated four days with antibiotics before infection showed a
reduced expression of REL 2, but not of REL 1 and STAT mRNA levels. Interestingly,
sindbis infected mosquitoes pre-treated with antibiotics, as well as mosquitoes
infected through an artificial latex meal, instead of blood, showed an increase in the
viral load four days after infection when compared with mosquitoes infected with a
normal blood meal.
These results suggest that the blood meal per se is able to activate innate
immune pathways and the upregulation of REL 2 seems to be mediated by the gut
microbiota, profoundly affecting viral loads in Aedes aegypti.
XIX
ÍNDICE
Lista de abreviações
Lista de Figuras
Lista de Tabelas
Resumo
Abstract
1 - INTRODUÇÃO
1.1 - Doenças transmitidas por vetores 21
1.2 - O mosquito Aedes aegypti 22
1.3 - O gênero flavivirus 25
1.4 – Dengue 28
1.5 – Sindbis 32
1.6 – Competência Vetorial 37
1.7 - O aparelho digestivo 38
1.8 - A digestão do sangue e o estresse oxidativo 40
1.9 - Bactérias endossimbiontes 43
2.0 - A microbiota e a imunidade inata 44
2.1 - O sistema imune inato em invertebrados 45
2.2 - Ativação de proteínas da família NF-kB/Rel 48
2.3 - Ativação da via Toll 51
2.4 - Ativação da via IMD 55
2.5 - Ativação da via JAK/STAT 57
2.6 - Evolução das vias do sistema imune inato em insetos 58
2.7 - Imunidade inata em Aedes aegypti 62
2.8 - Resposta à infecção viral em insetos 63
XX
2 - OBJETIVOS 65
3 - MATERIAL E MÉTODOS
3.1 – Mosquitos 67
3.2 - Alimentação artificial dos mosquitos 68
3.2.1 – Infecção 68
3.2.2 - Alimentação com SBTI e BSA 69
3.2.3 - Alimentação comsolução de esferas de látex 69
3.2.4 - Pré-tratamento com antibióticos 70
3.3 - Dissecção dos mosquitos 70
3.4 - Extração de RNA e tratamento com DNAse 71
3.5 - Síntese da fita de cDNA 72
3.6- Amplificação do cDNA por reação em cadeia da
polimerase (PCR) 72
3.7 -PCR quantitativo em tempo real
3.7.1 – A reação de PCR em tempo real 73
3.7.2 – Calculo da quantificação relativa 76
3.7.3 – Analise estatística dos dados 78
3.8 - Cultura de células e propagação de vírus 79
3.9 - Infecção de células C6/36 79
3.10 - Tratamentos com heme e análogos de heme em C6/36 80
3.11 - Microscopia de fluorescência 81
3.12 - Viabilidade celular por redução de MTT 81
RESULTADOS
4.1 – Caracterização de genes do sistema imune em Aedes aegypti 83
4.2 – Ativação das principais vias do sistema imune inato
por infecção viral em células C6/36 de Aedes albopictus. 95
XXI
4.3 – Ativação das principais vias do sistema imune inato
por infecção viral em Aedes aegypti 99
4.4 – Aumento da expressão dos genes do sistema imune
disparado pela alimentação sanguínea 103
4.5 – Células C6/36 são capazes de captar heme 106
4.6 – Heme induz expressão de aaREL 1 em C6/36 109
4.7 – Alimentação com esferas de látex induz a expressão de aaREL 2 110
4.8 - Microbiota e a ativação do sistema imune 113
4.9 – A alimentação controla a carga viral em Aedes aegypti 116
DISCUSSÃO
5.1 – Perfil de expressão dos genes do sistema imune inato
em Aedes aegypti 118
5.2 - As principais vias do sistema imune inato são ativadas
por infecções virais em mosquitos 121
5.3 – A influência da alimentação na ativação do sistema imune 124
5.4 - Papel da molécula de heme na ativação do sistema imune 126
5.5 – A microbiota e a ativação do sistema imune 128
5.5 – A alimentação e o controle da carga viral 131
CONCLUSÕES 134
BIBLIOGRAFIA 136
APÊNDICE A - Immune activation in Aedes aegypti by blood feeding and virus
infection. Nascimento-Silva, MCL, Olveira, JHM, Pereira, LOR, Olviera, PL &
Sorgine, MHF. Artigo submetido
APÊNDICE B - BYC, an atypical aspartic endopeptidase from Rhipicephalus
(Boophilus) microplus eggs. Nascimento-Silva MC, Leal AT, Daffre S, Juliano L, da
XXII
Silva Vaz I Jr, Paiva-Silva Gde O, Oliveira PL, Sorgine MH.Comp Biochem Physiol B
Biochem Mol Biol. 2008 Apr;149(4):599-607. Epub 2007 Dec 28.
APÊNDICE C- Purification and antigenicity of two recombinant forms of Boophilus
microplus yolk pro-cathepsin expressed in inclusion bodies. Leal AT, Pohl PC,
Ferreira CA, Nascimento-Silva MC, Sorgine MH, Logullo C,Oliveira PL, Farias SE, da
Silva Vaz I Jr, Masuda A. Protein Expr Purif. 2006 Jan;45(1):107-14. Epub 2005 Aug 8.
APÊNDICE D - Vaccine potential of a tick vitellin-degrading enzyme (VTDCE).
Seixas A, Leal AT, Nascimento-Silva MC, Masuda A, Termignoni C, da Silva Vaz I
Jr. Vet Immunol Immunopathol. 2008 Aug 15;124(3-4):332-40. Epub 2008 Apr 16.
XXIII
Introdução
1 – Introdução
1.1 - Doenças transmitidas por vetores
Artrópodes são vetores de parasitas e vírus responsáveis por doenças de
grande relevância para a saúde humana, como a malária, a doença do sono, a doença
de Chagas, a leishmaniose, a filariose, a dengue e a febre amarela. Entre as dez
doenças que mais afetam os países em desenvolvimento, oito são transmitidas por
vetores invertebrados. Estas doenças, somadas, atingem cerca de 54 milhões de
pessoas causando a morte de 1,2 milhão por ano, principalmente em regiões de clima
tropical ou subtropical, em países em desenvolvimento e em áreas pobres e rurais
(http://www.who.int/tdr).
Algumas características dos insetos claramente contribuíram para o sucesso
deste grupo em ocupar quase todos os tipos de habitat existente no planeta, fazendo
com que se tornassem veículos ideais para transmissão de patógenos sanguíneos
entre humanos. Incluídas nestas características, podemos destacar a capacidade de
voar, a presença de órgãos de sentido extremamente sofisticados e a hematofagia
(Ratcliffe et al., 1979).
Curiosamente, apesar do alto valor nutricional do sangue, apenas quatro
ordens de insetos possuem a hematofagia como uma importante fonte de
alimentação: Anoplura, Heteroptera, Díptera e Siphonaptera.
Como estes animais vivem em ambientes ricos em patógenos e parasitos,
contam com seu sistema imune para conter infecções e permanecer vivos. Deste
modo torna-se importante ressaltar que a maioria dos parasitos transmitidos por
21
Introdução
artrópodes não apenas é transportado pelo vetor, mas também interage intimamente
com ele, sofrendo e induzindo mudanças químicas e moleculares. Essas alterações
são essenciais para o ciclo de vida destes parasitos, uma vez que influenciam sua
maturação e multiplicação. Por outro lado, os parasitos são capazes de manipular o
organismo parasitado para aperfeiçoar sua transmissão para novos hospedeiros
(Hurd & Ardin, 2003). Assim, alterações no comportamento alimentar e reprodutivo,
bem como a diminuiçao da quantidade de ovos produzidos, foram algumas
características observadas em fêmeas de diferentes mosquitos infectados por
Plasmodium yoelii nigeriensis (Jahan et al., 1997; Hogg et al., 1995).
1.2 - O mosquito Aedes aegypti
Dentre os insetos vetores, os mosquitos são o grupo mais importante, sendo
seguidos pelos carrapatos (Parola & Raoult, 2001). O mosquito Aedes aegypti pertence
à família Culicidae, sub-ordem Nematocera, ordem Díptera, e é o principal vetor de
diversos arbovírus (arthropod-borne virus), como, por exemplo, os vírus da dengue e
da febre amarela. Este mosquito possui uma distribuição bastante ampla,
principalmente nas regiões tropicais, entre 30 °N e 20 °S (Christophers, 1960; Knight
and Stone, 1977) e apresenta preferência por regiões de ocupação humana, utilizando
sítios artificiais de oviposição, como por exemplo pneus, vasos de plantas e caixas
d’água (Tabachnick, 1991).
O Aedes aegypti, assim como todos os mosquitos, sofre metamorfose completa
(Figura 1). A eclosão dos ovos, quando em ambiente úmido, dá origem a larvas
aquáticas, capazes de se alimentar sozinhas. Quando as larvas se tornam maduras,
22
Introdução
cerca de uma semana após a eclosão, dão origem a pupas, que são também formas
aquáticas, porém incapazes de se alimentar. Alguns dias após a transformação em
pupa, emergem os mosquitos adultos em sua forma alada, capazes de se alimentar
de néctar e sucos vegetais. As fêmeas, por sua vez, são também capazes de se
alimentar de sangue, sendo este tipo de alimentação essencial para a ovogênese.
23
Introdução
Figura 1 – O ciclo de vida de Aedes aegypti (Modificado de www.ipnc.nc/article.php3
?id_article=80
– abril/2008). Após a ovoposição (1), os ovos eclodem (2) dando origem à larvas de
primeiro estágio (3), que se desenvolvem em larvas de segundo (4), terceiro (5) e quarto (6) estágios. A
larva de quarto estágio dá origem à pupa (7), da qual eclode um mosquito adulto (8), na sua forma
alada, aproximadamente 10 dias após a eclosão do ovo. Cerca de 3 dias após a eclosão, a fêmea adulta é
capaz de se alimentar de sangue e começa o processo de fertilização (9) e maturação dos ovos (10). 3
dias após a alimentação com sangue a fêmea está pronta para ovoposiçao e o ciclo se reinicia.
24
Introdução
1.3 – O gênero flavivirus
O vírus da Dengue pertence à família Flaviviridae que é constituída por três
gêneros: Flavivirus, Pestivirus e Hepacivirus. O gênero Flavivirus é o maior dentro da
família, incluindo mais de 70 diferentes vírus. Além do vírus Dengue, podemos
também destacar neste grupo o vírus da encefalite japonesa (JEV), o vírus da febre do
Nilo (WNV) e o vírus da febre amarela (YFV). O nome flavivirus é derivado da palavra
flavus, em Latim, que significa amarelo, devido à coloração característica de
indivíduos acometidos pelo vírus da febre amarela (Mukhopadhyay et al., 2005)
De um modo geral, os flavivirus são transmitidos por artrópodes e seus
sintomas variam bastante, abrangendo desde febre baixa e sensação de mal estar até
casos de encefalite fatal e febre hemorrágica.
Os vírus desse gênero possuem aproximadamente 500 Å de diâmetro e
possuem seu material genômico na forma de RNA fita simples de polaridade
positiva, empacotado por um nucleocapsídeo protéico e uma bicamada lipídica
derivada da célula hospedeira, contendo duas glicoproteínas virais (Figura 2 A)
(Lindenbach & Rice, 2003).
O genoma dos flavivirus possui aproximadamente 10,8 kb e apenas uma fase
aberta de leitura, codificando um único polipeptídio. A parte 5’ do genoma codifica
as três proteínas estruturais do vírus (capsídeo, membrana – M (ou prM quando se
refere à proteína precursora de M) e envelope – E). O restante do genoma codifica
sete proteínas não estruturais, essenciais no processo de replicação do vírus (Figura 2
B e C) (Lindenbach & Rice, 2003).
25
Introdução
A B
C
Figura 2 – O vírus da Dengue. A – Corte longitudinal central feito através de crio-elétron
microscopia (Zhang et al., 2003). B – Esquema mostrando a partícula viral intracelular (do
lado esquerdo) e extracelular (do lado direito), destacando o nucleocapsídeo, as proteínas E e
prM na membrana de partículas virais intracelulares e dímeros da proteína E, a proteína M
madura e sua precursora na membrana de partículas virais já externalizadas. C - Esquema da
organização do genoma dos Flavivirus, com as proteínas estruturais localizadas na porção 5’ e
as proteínas não estruturais que participam da replicação do material genético na região 3’.
26
Introdução
A proteína do capsídeo, de aproximadamente 120 aminoácidos, se liga ao
material genético do vírus em formação e ajuda na montagem do nucleocapsídeo. Já
as proteínas prM (aproximadamente 165 aminoácidos) e E (aproximadamente 495
aminoácidos) são glicoproteínas que contém duas hélices transmembrana cada.
Durante a formação da partícula, ainda na fase intracelular do ciclo, a proteína prM
parece funcionar como uma chaperona, ajudando a montagem da proteína E (Lorenz
et al., 2002). A proteína E, por sua vez, contém sítios de ligação a receptores e é
responsável pela fusão de membranas que ocorre durante a invasão da célula a ser
infectada (Stadler et al., 1997; Allison et al., 2001).
A entrada na célula hospedeira se dá através de endocitose mediada por
receptor. Logo após a formação do endossoma, a acidificação do meio neste
compartimento inicia um processo irreversível de trimerização da proteína E, que
resulta na fusão da membrana viral com a membrana da vesícula em questão. Deste
modo, o nucleocapsídeo é liberado no citoplasma, onde as proteínas e o RNA se
dissociam e a replicação do genoma se inicia (Allison et al., 1995). As partículas
imaturas se formam no interior do retículo endoplasmático (RE) e ainda não são
infecciosas, pois a proteína precursora de M ainda não foi clivada (Guirakhoo et al.,
1991). A clivagem de prM ocorre no complexo de Golgi, tornando essas partículas
infecciosas prontas para serem liberadas por exocitose (Figura 3) (Stadler et al., 1997;
Elshuber et al., 2003).
27
Introdução
Figura.3 – Ciclo replicativo dos Flavivirus (Adaptado de Mukhopadhyay et al., 2005). A
figura mostra o vírus entrando na célula através de fusão de mebranas e iniciando sua
replicação no citoplasma. A montagem se dá no RE e a partícula viral se torna madura no
endossoma pouco antes de ser exocitada.
1.4 – Dengue
Entre os diferentes flavivirus, o vírus Dengue é o responsável pelas mais altas
taxas de casos e de mortes em todo o mundo. O crescimento de sua importância para
a saúde pública global determinou que ela fosse incluída no portfólio da UNICEF,
UNDP, Banco Mundial, WHO Special Programme for Research e Training in Tropical
Diseases (TDR) desde 1999. A dengue é uma doença infecciosa re-emergente que
28
Introdução
ocorre em mais de 100 países, na África, Américas, Mediterrâneo Leste, Sudeste
Asiático e Pacífico Oeste (CDC, 2008) (Figura 4), colocando mais de 2,5 bilhões de
pessoas em risco. Estima-se uma incidência de 50 milhões de casos e,
aproximadamente, 24.000 mortes por ano. Entre as doenças transmitidas por vetores,
estes números assombrosos são ultrapassados somente pela malária (WHO, 2002).
Figura 4 – Mapa da distribuição mundial da dengue. A figura mostra, em bege, as áreas de
prevalência do mosquito da dengue, o Aedes aegypti, e em vermelho regiões onde se encontra
tanto o mosquito quanto a doença. (CDC – www.cdc.org – 2005).
Já foram descritos quatro subtipos do vírus Dengue (DENV1, DENV2, DENV3
E DENV4), que apresentam cerca de 60-80% de homologia entre eles.
No Estado do Rio de Janeiro, a introdução dos vírus DENV1, em 1986, e
DENV2, em 1990, deram origem a diversas epidemias da doença em diferentes
regiões (Nogueira et al., 1988; 1993; 1999). A introdução de DENV3 causou uma
29
Introdução
extensa epidemia no verão de 2002 no Estado do Rio de Janeiro, com 249.247 casos
notificados da doença e 91 óbitos (Figura 5) (Secretaria de Saúde do Estado do Rio de
Janeiro).
Segundo dados da Secretaria do Estado de Saúde e Defesa Civil, até 26 de
março de 2008 foram registrados 43.523 casos de dengue no Estado do Rio de Janeiro,
sendo que a maioria aconteceu na cidade do Rio de Janeiro (28.233). O Estado do Rio
de Janeiro registrou 8.486 casos nas primeiras cinco semanas de 2008, um aumento de
117,42% em relação ao mesmo período analisado no ano anterior
(http://portal.saude.gov.br/portal/aplicacoes/noticias/noticias_detalhe.cfm?co_seq
_noticia=42918 - 2008).
30
Introdução
Figura 5 – Mapa da presença de dengue no Brasil. O mapa 1 mostra os sorotipos circulantes
do vírus Dengue no Brasil nos anos de 2001 e 2002. O mapa 2 mostra a presença do mosquito
Aedes aegypti nos diferentes municípios brasileiros nos anos de 1997 e 2001, deixando nítido
um aumento significativo de municípios infestados por esse mosquito ao longo dos anos
(Instituto Virtual de Dengue – 2008).
Apesar do quadro de dengue no país, vários aspectos da doença são pouco
compreendidos. Dentre eles, a interação do vírus com o seu vetor apresenta diversas
questões fundamentais ainda sem resposta. Ao mesmo tempo em que o vírus Dengue
31
Introdução
é capaz de infectar eficientemente o mosquito Aedes aegypti, outros Flavivirus são
eliminados do trato digestivo deste inseto (Wolff et al., 2001). As variações de
suscetibilidade/refratoriedade do mosquito à infecção viral, em populações naturais,
têm sido relacionadas à existência de barreiras envolvendo a infecção das células do
intestino, a saída do vírus do intestino e a etapa de propagação para a glândula
salivar (Black et al., 2002; Gorrochotegui-Escalante, 2005). Essas barreiras de infecção
são específicas, dependem da população do inseto e, possivelmente, são um dos
determinantes da dinâmica epidemiológica da doença (Salazar et al., 2007). No
entanto, pouco se sabe a respeito dos mecanismos celulares e moleculares
responsáveis pela capacidade de uma dada população de mosquitos ser ou não
infectiva a um determinado vírus.
1.5 – O vírus Sindbis
O vírus Sindbis foi primeiramente isolado no Cairo, Egito, em 1952, de
mosquitos C. pipens e C. univittatus (Hurlbut, 1953; Taylor et al., 1955). Como outros
Alphavirus, o Sindbis é transmitido por mosquitos à hospedeiros vertebrados, como
aves e mamíferos.
As manifestações clínicas do vírus Sindbis são febre, vermelhidão e artralgia.
A doença é comum na parte sul e leste da África, no Egito, em Israel, nas Filipinas e
em algumas partes da Austrália.
O vírus Sindbis faz parte do gênero Alphavirus, da família Togaviridae. Esse
gênero possui 27 vírus, classificados de acordo com suas propriedades antigênicas.
São vírus esféricos, de 60 a 70 nm de diâmetro e possuem material genético na forma
32
Introdução
de RNA fita simples de polaridade positiva, com aproximadamente 11,7 Kb (Strauss
et al., 1984). O capsídeo icosaédrico contém uma proteína de aproximadamente 260
aminoácidos e RNA. O envelope lipídico possui três glicoproteínas (E1, E2 e E3)
responsáveis pela ligação, endocitose e fusão do vírus na membrana do endossoma
da célula hospedeira (Figura 6) (Strauss et al., 1994). Assim como nos flavivirus, a
acidificação do endossoma promove mudanças conformacionais nas proteínas do
envelope, acarretando na fusão de membranas e liberando o nucleocapsídeo no
citoplasma da célula hospedeira.
Figura 6 – Virus Sindbis: A – Crio–eletrón microscopia de partículas de vírus. B – Estrutura
do vírus Sindbis com resolução de 20 Å determinada através de crio-eletroón microscopia e
técnicas de reconstrução 3D de imagens. C – Corte de uma partícula de vírus Sindbis com
resolução de 11 Å, mostrando as glicoproteínas E1 e E2, a bicamada lipídica e a proteína do
capsídeo (NCP) (Zhang et al., 2002).
O genoma do Sindbis possui um CAP na extremidade 5` e poliadenilação na
terminação 3`. O RNA genômico funciona como RNAm e codifica quatro proteínas
33
Introdução
não estruturais, nsP1, nsP2, nsP3 e nsP4, na forma de duas poliproteínas, P123 e
P1234. A primeira contém apenas as três primeiras proteínas citadas acima, devido a
um códon de terminação entre nsP3 e nsP4. A segunda poliproteína é encontrada em
menor abundância e contém as quatro proteínas não estruturais (Lopez et al., 1985).
As poliproteínas são processadas, gerando intermediários com diferentes papéis no
processo de replicação e transcrição no vírus(Figura 7) (Hardy & Strauss, 1988; Lemm
& Rice, 1993, Shirako & Strauss, 1990). A replicação ocorre inteiramente no
citoplasma e de forma bastante rápida (aproximadamente 4 horas, enquanto os
Flavivirus levam entre 20 e 30 horas). As proteínas não estruturais já traduzidas,
junto com fatores celulares, usam o RNA genômico positivo (RNA(+)) como molde
para a síntese de fitas de RNA de polaridade negativa (RNA(-)). Estas, por sua vez,
servirão de molde para a produção de RNA(+) completas que serão encapsuladas.
Um promotor interno no RNA(-) é usado para a transcrição de um RNA(+) sub-
genômico de 26S. A tradução deste RNA dá origem a uma poliproteína estrutural,
que é clivada para produzir as proteínas do capsídeo (C), e as proteínas do envelope
(E1 e E2). As proteínas do capsídeo se ligam a fitas de RNA(+) completas para formar
novos nucleocapsídeos. Os nucleocapsídeos interagem com as proteínas de envelope
que já estão inseridas na membrana plasmática da célula, levando ao brotamento da
partícula viral (Strauss & Strauss, 1994).
34
Introdução
Figura 7 – Esquema de replicação do genoma do vírus Sindbis. A fita de RNA(+) dá origem
a poliproteínas não estruturais que, após o processamento, são responsáveis pela replicação
da fita de RNA. Um promotor interno na fita de RNA(-) gera um RNA (+) sub-genômico que
codifica as proteínas estruturais (Adaptado de Straus & Strauss, 1994).
O vírus Sindbis infecta tanto células de invertebrados, no caso de seus insetos
vetores, quanto células de vertebrados (aves, pequenos mamíferos e humanos)
(Calisher, 1994). Estudo utilizando culturas de células de mosquitos e de vertebrados
observaram marcantes diferenças entre a replicação e patogênese do vírus nessas
células. A principal diferença é que as células de mosquito, após a fase aguda,
desenvolvem uma infecção persistente (Karpf et al., 1997a,b). Por outro lado, as
35
Introdução
células de vertebrados não sobrevivem à fase aguda da infecção, aparentemente
devido a eventos apoptóticos (Levine et al., 1993).
O tropismo do vírus Sindbis pelo mosquito Aedes albopicutus foi determinado
por Bowers e colaboradores, em 1995. Após 18 dias de infecção, foi observado que os
ovaríolos e os túbulos de Malphigi eram refratários ao Sindis. Por outro lado, o corpo
gorduroso apresenta uma infecção permanente. Tecidos como o aparelho digestivo
médio anterior e posterior e os músculos toráxicos apresentaram uma infecção
transiente, diminuindo os títulos virais depois do sétimo dia (Bowers et al., 1995).
O curso temporal da infecção por Sindbis em mosquitos Aedes aegypti foi
determinado utilizando um vírus modificado, que codifica, além de seu genoma, a
proteína fluorescente verde (GFP). A expressão de GFP um dia após a infecção (DAI)
mostrou que neste período a infecção ainda não estava disseminada, possuindo
apenas alguns focos no aparelho digestivo médio. No quarto DAI o vírus já estava
disseminado pelo mosquito e os focos presentes no aparelho digestivo eram bem
maiores e em maior quantidade (Foy et al., 2004).
Ao longo dos anos, devido às semelhanças observadas com a infecção de
outros vírus, principalmente Flavivirus, o estudo da infecção por Sindbis em células
de mosquito tem se tornado uma importante ferramenta no combate à transmissão
não apenas deste vírus em particular, mas também dos arbovírus de uma forma
geral, funcionando como um sistema modelo para entender mais sobre a interação
entre os vírus e seus vetores invertebrados.
36
Introdução
1.6 – Competência Vetorial em artrópodes
A competência vetorial de um artrópode é determinada de acordo com
o grau de permissividade deste a uma determinada infecção. Já se sabe que diversas
linhagens de Aedes aegypti apresentam grandes diferenças com relação à competência
vetorial para Flavivirus, principalmente para o vírus da Dengue (Bennett et al., 2005,
Vazeille-Falcoz et al., 1999; Black et al., 2002), inclusive no Brasil (Lourenço-de-
Oliveira et al., 2004).
Após ser ingerido pelo mosquito durante a alimentação sanguínea, o vírus
precisa atravessar diversas barreiras de modo a realizar uma infecção bem sucedida.
No caso dos arbovírus, a principal barreira para o estabelecimento da infecção é a
entrada do vírus nas células do epitélio do aparelho digestivo (conhecida como
Midgut Infection Barrier, MIB). Uma vez colonizado este órgão, a segunda barreira
de infecção que se apresenta é a saída das partículas virais em direção à hemolinfa,
levando à infecção de outros tecidos (Midgut Escape Barrier, MEB) (Black et al.,
2002). Ainda considera-se uma terceira barreira, que seria a entrada do vírus no
lúmem da glândula salivar, de onde ele, finalmente, será transmitido ao próximo
hospedeiro (Transmission Barrier - TB). Uma vez suplantadas estas barreiras,
acredita-se que a infecção viral será bem sucedida (Figura 8) (Black et al., 2002).
37
Introdução
Figura 8 – Esquema das Barreiras de transmissão de patógenos em mosquitos (adaptado de
Black et al., 2002). A figura destaca as principais barreiras de transmissão de patógenos em
mosquitos e as principais partes do trato digestivo deste organismo.
1.7 - O aparelho digestivo dos mosquitos
O aparelho digestivo forma uma barreira física que protege os demais tecidos
das enzimas digestivas e dos agentes infecciosos que podem ser ingeridos durante a
alimentação sanguínea, sendo, portanto, o primeiro local de contato entre estes
patógenos e o organismo do vetor.
O aparelho digestivo do mosquito é composto por uma mono-camada de
células epiteliais e pode ser dividido em aparelho digestivo anterior, médio e
posterior (Figura 9). O aparelho digestivo anterior está envolvido principalmente
com a ingestão, condução e armazenamento do alimento (Romoser, 1996). Próximo à
38
Introdução
parte posterior do esôfago existem três divertículos, envoltos em cutícula
impermeável, que ficam normalmente repletos de bolhas de ar e são utilizados como
reservatórios de alimento (Consoli & Lourenço-de-Oliveira, 1994). Quando o
mosquito se alimenta de açúcar, na forma de néctar, por exemplo, essa solução é
estocada no divertículo e liberada gradativamente para o aparelho digestivo médio,
onde será digerida.
O aparelho digestivo médio é o ponto de maior vulnerabilidade do vetor, visto
que é o local onde o sangue fica estocado durante o processo digestivo (Romoser,
1996), propiciando ao parasita maior chance de penetrar através do epitélio. Além
disso, esta região do sistema digestivo é de origem endodérmica e, portanto, não é
recoberta por cutícula de quitina como todas as demais. Na maior parte dos insetos o
aparelho digestivo médio é recoberto por uma barreira não celular que envolve o
bolo alimentar. Nos mosquitos, essa camada é denominada matriz peritrófica (PM)
(Petters, 1992), constituindo mais uma barreira de proteção para danos causados pela
digestão do sangue (Richards & Richards, 1977; Peters, 1992; Abedi & Brown, 1962).
Embora essa barreira seja importante no processo de entrada de diversos parasitos
em seus vetores (Berner et al., 1983; Billingsley & Rudin, 1992), este não parece ser o
caso para os vírus, visto que estes parecem ser capazes de invadir as células do
epitélio do aparelho digestivo antes da formação desta estrutura (Figura 9)
(Comunicação pessoal, Stephen Higgs, 2007).
39
Introdução
Figura 9– Aparelho digestivo de A aegypti. A figura mostra a divisão entre aparelho
digestivo anterior, médio e posterior. A matriz peritrófica está assinalada como PM.
(Adaptado do livro Biology of disease vectors, capítulo 19, página 321).
Vários fatores parecem influenciar a entrada dos patógenos no aparelho
digestivo do vetor, entre eles a fonte sanguínea, o pH, a situação nutricional e
hormonal do hospedeiro (Nguu et al., 1996; Billingsley & Sinden, 2001; Feder et al.,
1997), a ação das enzimas digestivas (Kaplan et al., 2001), receptores de
glicoproteínas na superfície do epitélio do aparelho digestivo (Wilkins & Billingsley,
2001), presença de bactérias simbiontes (Dale & Welburn, 2001) e a ativação de genes
do sistema imune e peptídeos antimicrobianos (Lehane et al., 2003; Dimopoulos et al.,
1998).
1.8 – A digestão do sangue e o estresse oxidativo
Os insetos hematófagos precisam digerir uma quantidade muito grande de
sangue a cada alimentação sanguínea, visto que são capazes de ingerir várias vezes o
40
Introdução
valor do próprio peso em sangue durante um mesmo evento alimentar. A digestão
da hemoglobina presente neste sangue resulta em uma grande liberação de heme no
aparelho digestivo médio, o que é extremamente citotóxico, visto que o heme é uma
molécula anfipática, sendo capaz de desestabilizar membranas biológicas e causar
danos celulares. Além disso, o heme livre é um potente estimulador da formação de
radicais livres (Figura 10). Desta forma, a alimentação hematófaga pode ser
considerada um desafio oxidativo, tendo um impacto relevante sobre o equilíbrio
redox das células digestivas destes vetores.
Figura 10: Heme e geração de estresse oxidativo. Através da reação de Fenton o ferro pode
gerar radicais hidroxil (OH
•
). Estes radicais são capazes de iniciar uma cadeia de reações de
peroxidação lipídica removendo elétrons de outras moléculas como ácidos graxos
insaturados (RH), gerando radicais alquil (R
•
). Além disso, o heme induz a conversão de
hidroperóxidos orgânicos de baixa reatividade (ROOH) em radicais alcoxil (RO
•
) e peroxil
(ROO
•
) extremamente reativos (figura adaptada de Graça-Souza e cols., 2006).
41
Introdução
Em A. aegypti, experimentos utilizando técnicas de microarranjo mostraram
que a expressão gênica após a alimentação com sangue apresenta uma importante
ativação de genes de resposta ao estresse oxidativo (Sanders, 2003). Este fato já era
esperado, visto que a resposta celular ao estresse é um mecanismo bastante
conservado em organismos eucarióticos, envolvendo uma extensa reprogramação
gênica através da ativação de fatores de transcrição como NF-kB, nrf2 e AP-1.
O estresse oxidativo também parece estar envolvido diretamente na regulação
da resposta celular frente a diversos patógenos, tanto em mamíferos como em
invertebrados. Em células hepáticas humanas, por exemplo, já foi demonstrado que o
vírus da Dengue é responsável pela ativação de genes de resposta a estresse
oxidativo (Lin et al., 2000). Em mosquitos, foi mostrado que linhagens de Anopheles
gambiae refratárias à P. falcuparum experimentavam situações de estresse oxidativo
crônico e que a resistência à infecção pode ser atribuída à incapacidade do plasmódio
de sobreviver a este tipo de estresse. Além disso, a penetração do plasmódio no tubo
digestivo do mosquito parece ativar a produção de espécies reativas, por uma via
que envolve a ativação de STAT (Signal Transducers and Activator of Transcription).
Esse processo resultaria no aumento da expressão da enzima óxido nítrico sintase e
de uma peroxidase envolvida na nitração de proteínas, o que pode ser entendido
como um mecanismo de imunidade inata voltado para a neutralização do patógeno
por induzir a morte da célula infectada por apoptose (Kumar and Barillas-Mury,
2005).
42
Introdução
1.9 - Bactérias endossimbiontes
O epitélio do aparelho digestivo está em íntimo contato com um enorme
número de bactérias simbiontes. Sabe-se que as bactérias influenciam muitos
aspectos da fisiologia do organismo hospedeiro, dentre os quais podemos destacar
imunidade inata, desenvolvimento e homeostasia (Hooper et al., 2001). Apesar disso,
a relação entre a microbiota bacteriana e o aparelho digestivo do hospedeiro ainda é
extremamente pouco conhecida.
Organismos que apresentam uma dieta pobre tendem a possuir bactérias
endossimbiontes em maior quantidade no intuito de suprir deficiências especificas
(Douglas, 1989). O sangue, embora seja um alimento muito rico do ponto de vista
nutricional, possui uma grande deficiência em vitamina B e alguns aminoácidos.
Desta forma, vários artrópodes hematófagos, como carrapatos, pulgas, moscas e
outros, parecem suprir esta deficiência através de microorganismos simbiotes
(Buchner, 1965).
As vias de sinalização ativadas em Drosophila melanogaster pela presença de
patógenos como fungos e bactérias já foram extensivamente descritas, abrangendo
desde interações iniciais, que levam à produção de espécies reativas de oxigênio
(ROS), até a produção de moléculas efetoras, como peptídeos antimicrobianos
(AMPs). No entanto, estudos que levem em consideração a microbiota simbionte e
sua interação molecular com o organismo hospedeiro são muito raros.
Muito pouco é conhecido sobre a microbiota dos mosquitos. Os métodos
convencionais de cultura de bactérias impossibilitam o isolamento e a identificação
de todos os componentes desta microbiota, visto que estes não são capazes de
43
Introdução
reproduzir artificialmente as condições de crescimento destes organismos (Olson et
al., 1994).
Apesar dessa dificuldade, estudos realizados ao longo dos anos foram capazes
de identificar alguns microrganismos constituintes destas microbiotas em diferentes
mosquitos (DeMaio et al., 1996), inclusive em A. aegypti (Gusmão et al., 2007).
2.0 – A microbiota e a imunidade inata
A coexistencia de bactérias e outros patógenos no aparelho digestivo do vetor
podem resultar numa alteração da eficiência da infecção, como já foi mostrado para
mosquitos do gênero Anopheles co-infectados por bactérias e Plasmodium sp.(Seitz,
1987; Pumpuni et al., 1993, 1996; Gonzalez-ceron et al., 2003). Por exemplo, em um
estudo feito com Plasmodium falciparum e Anophles stephensi, a adição de bactérias
gram-negativas e parasitos, concomitantemente, foi capaz de inibir completa ou
parcialmente a formação de oocistos. No entanto, bactérias gram-positivas, LPS
(purificados de E. coli J5) ou bactérias pré-tratadas com formalina (E. coli H243) não
tiveram nenhum efeito na infecção por este parasito (Pumpuni et al., 1993). Além
disso, ainda não se sabe qual o efeito real da ativação dos peptídeos antimicrobianos
do mosquito após a alimentação com sangue no desenvolvimento deste e de outros
parasitas sanguíneos (Dimopoulos et al., 1997).
Em outro modelo, Azambuja e colaboradores, ao estudarem a interação entre
Rhodnius prolixus e o Tripanossoma cruzi, observaram que bactérias residentes no
estômago do inseto vetor produziam substâncias que causavam a lise do parasita,
corroborando a importância de estudar a microbiota do aparelho digestivo como
44
Introdução
parte do processo de interação parasita-hospedeiro em insetos vetores (Garcia et al,
1994, 1995).
2.1 – O sistema imune inato em invertebrados
Assim como os organismos superiores, os invertebrados dependem de um
conjunto de múltiplas reações do sistema imune inato para combater infecções. Esse
conjunto de reações inclui o uso de barreiras físicas (como a matriz peritrófica, por
exemplo), respostas locais (celulares) e sistêmicas (humoral). De um modo geral, o
patógeno entra em contato com o inseto pela alimentação. Neste caso, o epitélio do
aparelho digestivo age tanto como um barreira física, quanto produzindo AMPs e
ROS (Ryu et al., 2006). Já na hemolinfa, os hemócitos, células circulantes dos insetos,
participam deste processo de defesa através de fagocitose ou encapsulamento de
organismos estranhos. O corpo gorduroso, equivalente funcional do fígado em
mamíferos, participa destas defesa produzindo moléculas de resposta humoral, como
por exemplo AMPs.
O sistema imune inato depende, a princípio, de um sistema de receptores de
reconhecimento de patógenos (PRRs), responsáveis pela detecção de substâncias
derivadas destes agentes invasores (Janeway, 1989). A ativação do sistema imune
inato, através desses receptores, leva à síntese de diversas moléculas antimicrobianas
efetoras que irão atacar os patógenos em diferentes estágios da infecção.
Até o momento, Drosophila melanogaster é o inseto que possui o sistema imune
inato mais bem caracterizado. Diversos estudos mostram similaridades marcantes
entre as vias de ativação e sinalização do sistema imune inato de mamíferos e de
45
Introdução
Drosophila (Martinelli & Reichhart, 2005). Em ambos os casos, infecções com
diferentes patógenos levam à ativação de receptores Toll/TLR, iniciando uma cascata
intracelular que resulta na ativação de fatores de transcrição da familia NF-kB/Rel
(Martinelli & Reichhart, 2005).
Duas vias independentes de ativação de NF-kB já foram descritas em
Drosophila. Uma delas responde a fungos e a bactérias gram-positivas (via Toll),
enquanto a outra responde a bactérias gram-negativas ou tratamento com LPS (via
IMD) (Figura 11).
A indução da via Toll em Drosophila leva à ativação de dois homólogos de NF-
kB/Rel, chamados Dorsal e Dif (Dorsal immune factor). Dorsal parece ser muito
importante durante o desenvolvimento dorso-ventral do embrião (Belvin &
Anderson, 1996), enquanto Dif se mostrou essencial para o funcionamento do
sistema imune, levando à produção de peptídeos antifúngicos e antimicrobianos,
como a Drosomicina (Lemaitre et al., 1996, Rutschmann et al., 2002).
Paralelamente, foi identificado um mutante de D. melanosgaster que não era
capaz de resistir a infecções por bactérias gram-negativas, porém não era tão sensível
a bactérias gram-positivas e fungos como o mutante para o gene Toll. Ele foi
chamado “mutante com deficiência imunológica” (immune deficiency – IMD). A via
alterada nesse mutante foi então denominada via IMD e leva à ativação de um
terceiro homólogo de NF-kB/Rel, a proteína Relish. Relish é sintetizado como um
precursor citoplasmático inativo, clivado em resposta a uma infecção com bactérias
gram-negativas (ativação da via de IMD) estando pronto para entrar no núcleo e se
46
Introdução
ligar a seqüências especificas no DNA, promovendo a expressão de um conjunto de
genes, entre eles peptídeos antimicrobianos, como a Diptericina (Stoven et al., 2000).
Nunca foi descrita nenhuma função para a via IMD que não estivesse ligada
ao sistema imune inato, e os mutantes desta via que não adquirem nenhum tipo de
infecção são completamente viáveis e normais.
Além disso, em Drosophila, infecções também podem levar à ativação das vias
JNK (Sluss et al., 1996) e JAK/STAT (Lagueux et al., 2000). A função da via JNK na
infecção ainda não foi estabelecida, porém a via JAK/STAT é necessária à indução de
inúmeras proteínas similares às do sistema complemento, que recentemente foram
descritas como possuindo um importante papel na opsonização de bactérias gram-
negativas, promovendo fagocitose (Levashina et al., 2001) (Figura 11).
47
Introdução
Figura 11 – Resumo esquemático simplificado mostrando as três principais vias de
ativação do sistema imune inato em Drosophila melanogaster: Via Toll, via IMD e via
JAK/STAT e seus ativadores. Adaptado de Hoffmann e Lemaitre, 2007.
2.2 - Ativação de proteínas da família NF-kB/Rel
Em relação ao sistema imune inato, a principal semelhança encontrada ao
longo de todo o reino animal tem sido o papel central da familia NF-kB/Rel como
importantes fatores de transcrição.
Em células não estimuladas, proteínas da família NF-kB/Rel existem como
homo/heterodímeros no citoplasma celular devido a uma associação com inibidores
membros da família IkB. Diferentes sinais extracelulares podem gerar cascatas
48
Introdução
intracelulares que levam à destruição de proteínas tipo IkB e à conseqüente ativação
de proteínas da família NF-kB/Rel. Essas cascatas passam pela ativação de kinases
de IkB (IKK) e, conseqüentemente por fosforilações de resíduos de serina na região
N-terminal de IkB que sinalizam para a destruição desta proteína através da
ubiquitinação e degradação via proteossomas. A destruição de IkB libera a proteína
NF-kB/Rel, permitindo que ela entre no núcleo celular e se ligue a promotores ou
acentuadores, regulando a expressão de determinados genes específicos.
O homólogo à proteína IkB em D. melanogaster é uma proteína denominada
cactus, que, por ter uma grande homologia a IkB alfa, parece também ter sua
destruição regulada por fosforilação de resíduos de serina. Embora a kinase
responsável por essa fosforilação ainda não tenha sido identificada, já foi mostrado
que a destruição de cactus é dependente de proteossomas (Spencer et al., 1999).
Um outro mecanismo de ativação de proteínas NF-kB/Rel é a existência de
precursores longos incapazes de serem translocados para dentro do núcleo celular.
Esse exemplo se aplica à proteína Relish de D. melanogaster e a seus homólogos
humanos p100 e p105. O N-terminal destas proteínas contém domínios de ligação ao
DNA e domínios de dimerização (domínios de homologia Rel), enquanto o C-
terminal possui uma série de seqüências repetidas denominadas ankirinas,
semelhantes às de proteínas da família IkB. Assim, por possuírem seqüências
inibitórias do tipo IkB, essas proteínas ficam presas ao citoplasma celular até que seu
C-terminal seja clivado por proteólise, permitindo então sua entrada no núcleo e a
ativação de genes específicos (Figura 12).
49
Introdução
Em humanos essa clivagem se dá via proteossomo e o C-terminal da proteína
é completamente degradado. Nos insetos, no entanto, a clivagem de Relish parece ser
endoproteolítica, em resposta a uma infecção, gerando um C-terminal com domínios
de ankirina estável que permanece no citoplasma mesmo após a translocação do N-
terminal para o núcleo (Shin et al., 2002). O papel deste C-terminal ainda não foi
esclarecido.
Figura 12 – Representação esquemática de proteínas da família NF-kB/REL e IkB de
mamíferos. Em verde observa-se o domínio de homologia REL (RHD) e em azul, repetições
do domínio ankirina. P100 e p105 sofrem proteólise nos resíduos marcados com setas para
ativação, sendo homólogos a proteína Relish de D. melanogaster e aaREL 2 em Aedes aegypti
As proteínas kinases que fosforilam IkB são muito importantes na via de
ativação de NF-kB (Karin and Ben-Neriah, 2000). O complexo IKK alfa/beta/gama
50
Introdução
pode ser ativado por uma grande diversidade de estímulos, entre eles o tratamento
com LPS e infecção por vírus (O’Connel et al, 1998; Chu et al., 1999; Hawiger et al.,
1999). A ativação deste complexo envolve a fosforilação de dois resíduos de serina
localizados na alça de ativação do domínio kinase da IKK alfa ou beta. Em 2000,
Karin e Ben-Neriah demonstraram que algumas MAP3 kinases são capazes de
fosforilar esses domínios in vitro, ativando NF-kB (Karin & Ben-Neriah, 2000).
Em D. melanogaster, dois homólogos de IKK são conhecidos. O primeiro,
chamado de Dm IKKε, não teve sua função elucidada até o momento. O segundo,
DmIKKbeta ou DLAK é essencial para a via de sinalização imune contra bactérias.
DmIKKbeta faz parte do complexo DMIKK, que é ativado por LPS e fosforila
diretamente a proteína Relish, o que é essencial para sua clivagem e ativação
(Silverman et al., 2000).
A fosforilação induzida de proteínas da família NF-kB/Rel parece ter
diferentes funções, incluindo mudanças conformacionais no domínio de ativação,
que levam a um aumento de afinidade pelo DNA e promovem a ligação com
coativadores de transcrição (Schmitz et al., 2001).
2.3 – Ativação da via Toll
Receptores Toll e receptores do tipo Toll (TLRs) são caracterizados por
possuírem um domínio extracelular rico em repetições de leucina (LRRs), um único
domínio transmembrana e um domínio intracelular de sinalização, conhecido como
TIR (Figura 13) (Wilson et al., 1997).
51
Introdução
Dez diferentes receptores Toll já foram descritos em D. melanogaster, porém
apenas um foi associado diretamente à vias de sinalização do sistema imune inato
deste inseto.
Uma diferença marcante entre os TLRs de mamíferos e os de D. melanogaster é
que os primeiros reconhecem diretamente padrões moleculares associados a
patógenos (PAMP), enquanto nenhum receptor Toll de D. melanogaster é capaz de
apresentar esse tipo de reconhecimento. Em contrapartida, os receptores tipo Toll de
D. melanogaster possuem uma proteína ligante (Spatzle), podendo então responder a
estímulos vindos de diferentes patógenos, como fungos, bactéria e vírus (De
Gregório et al., 2001).
O receptor responsável pelo reconhecimento de LPS em humanos é o TLR4.
CD14 e MD2 são proteínas de membrana que também participam do reconhecimento
de LPS, junto com TLR4 (Moore et al., 2000; Shimazu et al., 1999). CD14 e TLR4
também estão envolvidos no reconhecimento de proteínas virais (Kurt-Jones et al.,
2000).
Em D. melanogaster, os receptores do tipo Toll foram descritos inicialmente na
via de desenvolvimento do eixo dorso-ventral durante a embriogênese. Porém,
posteriormente, observou-se que a cascata de sinalização via receptores Toll também
é responsável pela defesa da mosca e outros insetos contra fungos e algumas
bactérias gram-positivas (Lemaitre et al., 1996).
52
Introdução
Drosophila Mamíferos
Figura 13 – Receptores Toll em D. melanogaster e em mamíferos. A porção extracelular
destes receptores é composta por domínios LRRs, flaqueados por resíduos ricos em cisteínas.
A porção intracelular possui um domínio TIR, similar ao dos receptores de interleucina de
mamíferos, como, por exemplo, o IL-1R. Esquema adaptado de Bilak et al., 2003.
Essa cascata começa pela ligação de PAMPs de bactérias ou fungos a
receptores de peptideoglicanas (PGRPs) ou a proteínas ligadoras de bactérias gram-
positivas. Essa ligação dispara uma cascata de serino proteases que cliva Spatzle, o
ligante do receptor Toll. Quando essa forma clivada de Spatzle se liga ao receptor
Toll, inicia-se uma cascata de sinalização que resulta na degradação da proteína
homóloga a IkB, Cactus. A degradação de cactus permite que os homólogos ao NF-
53
Introdução
kB (Dorsal ou Dif) migrem para o núcleo da célula, ativando seletivamente a
expressão de genes que possuem o motivo de ligação kB, como, por exemplo,
peptídeos antimicrobianos (Figura 14).
Figura 14 – Esquema comparando a ativação da via Toll em mamíferos e em D.
melanogaster. Deve-se ressaltar as principais diferenças entre as vias, como o fato da
proteína TLR 4 ser ativada diretamente pelo LPS do patógeno, enquanto a proteína Toll sofre
uma ativação indireta, através da proteina Spatzle
(genomebiology.com/2000/1/1/REVIEWS/106/figure/F1 - 2008) (Adaptado de Medzhitov
& Janeway Jr, 2000).
Os componentes canônicos dessa via são: a citocina extracelular chamada
Spatzle (que possui similaridades estuturais com NGF – nerve growth factor), o
receptor transmembrana Toll, os adaptadores Tube e MyD88, a quinase Pelle, Cactus
54
Introdução
(homólogo ao inibidor de NF-kB – IkB) e os fatores de transcrição homólogos ao NF-
kB, Dorsal e Dif.
Dif e Dorsal parecem ter papéis redundantes em larvas, no que diz respeito à
produção de AMPs. Apesar disso, Dif é suficiente para a resposta imune em moscas
adultas (Meng et al., 1999, Manfruelli et al., 1999, Rutschmann et al., 2000)
É importante ressaltar que a ativação da via Toll, num processo auto-
regulatório, leva à indução de vários genes da própria via (Spaetzle, Toll, Pelle,
Cactus e Dif,), não apenas de AMPS (Figura 15) (De Gregório et al., 2002).
2.4 - Ativação da via IMD
A via IMD é ativada de modo semelhante à via Toll. Acredita-se que exista a
participação de peptideoglicanos e de receptores como o PGRP-LC. Os receptores
ativados são capazes de recrutar a proteína IMD, que possui um domínio death (DD)
(homóloga ao gene Receptor Interaction Protein – RIP em mamíferos) e se liga a
dFadd. Este interage com Dreed, proteína homóloga à caspase 8 humana que, por
sua vez, se associa e cliva a proteína Relish fosforilada. Relish é fosforilada pelo
complexo kinase de ikB de D. melanogaster (DmIKK complex), que é ativado por uma
MAPKKK chamada dTAK1, de um modo dependente de IMD. A forma clivada de
Relish pode migrar para o núcleo celular, ativando a expressão de diversos genes
ligados à resposta imune. A via IMD guarda diversas semelhanças com a via TNF-R
de mamíferos, porém sua organização molecular ainda é pouco conhecida (Figura
15).
55
Introdução
Figura 15 – Esquema das via Toll e IMD em Drosophila melanogaster (Adaptado de
Hoffmann & Lemaitre, 2007). A via Toll é preferencialmente ativada por Fungos, leveduras e
bactérias Gram-positivas, enquanto a via IMD é ativada por bactérias Gram-negativas.
Ambas as vias de sinalização culminam na ativação de fatores de transcrição da família NF-
kB/REL. Esses fatores de trancrição, uma vez dentro do núcleo, participam da ativação da
transcrição de diversos genes de defesa, entre eles peptídeos antimicrobianos.
56
Introdução
2.5 - Ativação da via JAK/STAT
Originalmente descrita por seu papel na segmentação embrionária, a via
JAK/STAT em D. melanogaster possui três principais componentes: o receptor
domeless, a janus quinase (JAK) Hopschotch e o ativador de transcrição STAT
(Agaisse & Perrimon, 2004). Os primeiros indícios da participação desta via no
sistema imune de insetos vieram de trabalhos realizados com Anopheless gambiae
infectados com bactéria, nos quais se observou um acúmulo de STAT no núcleo após
a infecção (Barillas-Mury et al., 1999).
Atualmente já se conhece alguns dos genes controlados por essa via em D.
melanogaster, como a proteína TEP2, de função homóloga a proteínas do sistema
complemento de mamíferos, importante na opsonização de patógenos, e os genes de
estresse do tipo Turandot, de função ainda desconhecida (Boutros et al., 2002,
Lagueux et al., 2000, Agaisse et al., 2003).
Moscas mutantes para essa via possuem o mesmo grau de resistência a fungos
e bactérias do que moscas selvagens, além de não apresentarem nenhuma alteração
no perfil de expressão de AMPs. Apesar disso, esses mutantes se mostraram mais
sensíveis a infecções pelo vírus C de Drosophila (Dostert, 2005), sugerindo a
participação desta via na defesa antiviral na mosca. No entanto, até o momento,
nenhum gene efetor foi encontrado ativado após infecções virais.
O papel desta via no contexto geral da defesa imune inata, tanto em D.
melanogaster quanto em outros insetos, ainda é pouco claro e precisa ser mais bem
estudado.
57
Introdução
2.6 – Evolução das vias do sistema imune inato em insetos
Após o sequenciamento do genoma de A. aegypti (Nenê et al., 2007) foi
possível ter uma melhor visão evolutiva do quadro da imunidade inata em insetos,
comparando famílias de genes relacionadas ao sistema imune entre diferentes
espécies. A. aegypti (Aa) e A. gambiae (Ag) são espécies de mosquitos afastadas
evolutivamente, tendo divergido há cerca de 150 milhões de anos. Quando
comparado com os genes de D. melanogaster (Dm), que divergiu destes mosquitos há
aproximadamente 250 milhões de anos, este quadro se torna ainda mais rico e
completo, permitindo a estimativa de distâncias genéticas mais confiáveis do que
pela simples comparação entre A. gambiae e D melanogaster (Waterhouse et al., 2007,
Christophides et al., 2002).
Waterhouse e colaboradores, utilizando métodos de bioinformática em larga
escala, anotações manuais e análise filogenética, identificaram 285 genes em Dm, 338
em Ag e 353 em Aa, de 31 famílias gênicas e/ou grupos funcionais ligados a
imunidade ou defesa. Neste trabalho foram identificados 4951 ortólogos nas três
espécies e 886 ortólogos específicos de mosquitos (não existiam em D. melanogaster ou
em Apis melífera).
Comparando ortólogos relacionados ao sistema imune com ortólogos totais no
genoma desses três organismos, podemos perceber que o repertório imune possuiu
maior divergência em grupos funcionais do que todos os outros (Figura 16).
58
Introdução
Figura 16 – Gráfico mostrando ortólogos de genes entre Aedes aegypti (Aa), Anopheles
gambiae (Ag) e D. melanogaster (Dm). Em azul, trios de ortólogos no genoma. Em vermelho,
apenas genes relacionados ao sistema imune. (Adaptado de Waterhouse et al., 2007)
Quando analisamos a presença ou ausência de ortólogos nas famílias gênicas
individualmente, levando em consideração a fase em que elas participam da resposta
imune, observamos que algumas possuem grande variação entre as espécies,
enquanto outras são bastante conservadas.
O repertório de receptores de reconhecimento de patógenos (PRRs), existente
nas três espécies, parece ter sido montado através de expansão gênica e rearranjo de
domínios, de acordo com os patógenos encontrados por cada organismo. Assim,
domínios antigos de reconhecimento, como o LRRs, parecem ter evoluído, formando
novos modelos de receptores com diferentes funções.
59
Introdução
A modulação imune é a etapa que regula a ativação das vias após o
reconhecimento do patógeno. Alguns exemplos seriam a modulação da ativação da
via Toll pela ativação de Spaetzle e a ativação da cascata de melanização. Ambos os
eventos envolvem a ativação de uma cascata de serino proteases e seus inibidores
(serpinas) e são espécie específicos, sugerindo que co-evoluíram junto com os
patógenos de cada organismo.
As vias de transdução de sinal intracelulares, como a via Toll, IMD e
JAK/STAT são altamente conservadas, e seus genes parecem evoluir sempre em
conjunto com outros genes da mesma via, para que esta não deixe de funcionar
(Figura 17).
Por último, os genes efetores seguem padrões evolutivos de acordo com seu
modo de ação: alguns são altamente específicos, como os AMPs e outros altamente
conservados, como os mecanismos de defesa oxidativa (enzimas antioxidantes)
(Waterhouse et al., 2007).
60
Introdução
Figura 17 – Genes e famílias gênicas envolvidas nas vias Toll e IMD (verde e roxo,
respectivamente). As fases caracterizadas, desde o reconhecimento até a produção de
efetores, estão marcadas. Os genes de D. melanogaster estão em azul, os de Anopheles gambiae
em vermelho e os de Aedes aegpyti em amarelo. Adaptado de Waterhouse et al., 2007.
61
Introdução
2.7 - Imunidade inata em Aedes aegypti
No genoma do mosquito A. aegypti foram encontrados 12 seqüências
homólogas ao receptor Toll de D. melanogaster. No entanto, até o momento apenas
três foram caracterizados, e esta via parece estar predominantemente envolvida no
controle de infecções causadas por fungos (Luna et al., 2003). Embora um gene
homólogo à Dif nunca tenha sido encontrado em nenhuma espécie de mosquito, o
homólogo de Dorsal (AaREL 1) parece ser ativado por estímulos imunológicos e
induzir a transcrição de peptídeos antimicrobianos in vitro. AaREL 1 possui dois
transcritos, codificando as isoformas A e B (Shin et al., 2005).
A via IMD, em mosquitos, começou a ser descrita com a clonagem e
caracterização do homólogo da proteína Relish (AaREL 2). Assim como em D.
melanogaster, este fator de transcrição possui ambos os domínios NF-kB e IkB na
mesma cadeia peptídica e é ativado por infecção com bactérias (Shin et al., 2002). Em
A. aegypti existem três isoformas de Relish, frutos de splicing diferencial de um
mesmo gene. A primeira delas possui o domínio Rel e o domínio inibidor de NF-kB
(IkB), assim como a proteína homóloga em D. melanogaster (Relish) e em mamíferos
(p100 e p105). Os dois outros transcritos que foram identificados possuem apenas a
região de homologia ao domínio REL ou apenas o domínio similar ao IkB (Shin et al.,
2002).
Em 2004, Lin et al., caracterizaram os análogos de STAT em Aedes albopictus e
demonstraram que, em cultura de células isoladas desse mosquito (C6/36), a
infecção por Japonese Encephalitis Vírus (JEV) leva à diminuição da fosforilação de
62
Introdução
STAT e, conseqüentemente, à diminuição de sua capacidade de se ligar ao DNA
celular e regular a expressão de genes efetores.
2.8 – Resposta à infecção viral em insetos
Muito pouco é conhecido sobre como o sistema imune inato de insetos
responde a infecções por vírus. Já foi demonstrado que ambas as vias Toll e IMD
podem ser ativadas em D. melanogaster pela infecção por Vírus X de Drosophila
(DXV), visto que a produção de peptídeos antimicrobianos (AMPs) se encontra
elevada, chegando a níveis comparáveis aos vistos em infecções com bactérias.
Porém, a análise com moscas mutantes para genes destas vias demonstrou que
apenas a via Toll parece ser essencial na defesa do organismo contra a infecção viral,
já que mutantes Relish possuem a mesma capacidade de lidar com a infecção do que
moscas selvagens. Ao mesmo tempo, a análise de mutantes que super-expressam
AMPs não mostra nenhuma diminuição na infecção pelo vírus. Sendo assim, se estas
moléculas possuem algum papel no combate à infecção, este papel parece ser
indireto, talvez auxiliando na ativação dos hemócitos e, conseqüentemente, na
resposta celular à presença do vírus (Zambon et al., 2005). Essa teoria é sustentada
pelo fato de que, em Lepidopteras, por exemplo, hemócitos são capazes de
reconhecer e melanizar células infectadas por vírus (Trudeau et al., 2001).
Estudos que investigaram a resposta de D. melanogaster ao vírus C de
Drosophila (DCV) identificaram diversos genes ativados após a infecção, sendo que
muitos deles possuíam uma seqüência de ligação para STAT em sua região
promotora. Além disso, este mesmo trabalho mostrou a ativação de STAT após
63
Introdução
infecção pelo DCV, assim como um aumento em sua atividade de ligação ao DNA,
sugerindo que a via JAK/STAT é ativada em moscas após infecção viral (Dostert et
al., 2005).
Recentemente, Sanders et al. (2005), utilizando técnicas de microarranjo de
DNA, demonstraram que a infecção de A. aegypti por vírus Sindbis leva à ativação de
genes ligados ao citoesqueleto e vias de transporte intracelular. Além disso, também
foi observado um aumento de duas vezes na expressão de aaRel 1 no primeiro dia
após a infecção, mostrando que a via Toll parece estar sendo ativada pela entrada do
vírus.
Assim como no trabalho citado acima, podem ser encontradas outras
referências de situações nas quais um fator de transcrição específico de uma via
possui sua expressão aumentada quando esta parece estar ativada por um desafio
imunológico. Em Frankliniella occidentalis, inseto vetor do TSWV (Tomato spotted wilt
virus), um experimento utilizando subtração de bibliotecas de cDNA de animais
infectados ou não pelo vírus mostraram um aumento da proteína homóloga ao fator
de transcrição aaRel 2 de A aegypti, além de vários outros genes das vias Toll e IMD,
inclusive peptídeos antimicrobianos (Medeiros et al, 2004). Em mamíferos já foi
mostrado que STAT 1 e STAT 3 são capazes de ativar a expressão deles mesmo,
promovendo uma alça positiva de ativação para essa via (Yang & Stark, 2008). Esses
dados sugerem que o nível de expressão de um determinado fator de transcrição
pode ser usado como um valioso indicativo da atividade daquela mesma via.
64
Objetivos
2 – Objetivos
Este trabalho tem como objetivo geral caracterizar a ativação das principais vias
do sistema imune inato de Aedes aegypti após a alimentação hematófaga, na
presença ou não de vírus, através da análise da expressão de genes ligados a
essas vias.
Objetivos específicos:
- Caracterizar a expressão de genes ligados às vias do sistema imune de Aedes
aegypti em diferentes estágios do desenvolvimento deste mosquito e em
diferentes órgãos da fêmea adulta alimentada com sangue.
- Observar a ativação das principais vias do sistema imune inato in vitro através
da infecção de células de Aedes albopictus em cultura (C6/36) com vírus Sindbis
e Dengue em diferentes tempos após a infecção.
- Analisar a ativação destas em mosquitos Aedes aegypti infectados por vírus
Sindbis.
- Analisar a ativação destas vias após o repasto sanguíneo, correlacionando a
ativação observada com a distensão do aparelho digestivo do mosquito e com a
digestão da hemoglobina.
65
Objetivos
- Caracterizar a captação de heme pela célula C6/36, os possíveis danos
oxidativos e a ativação de genes do sistema imune inato decorrentes desse
processo.
- Avaliar a influência da presença de heme na ativação destas vias e na carga
viral utilizando suspensão de esferas de látex como veículo para a infecção do
mosquito.
- Avaliar o papel da microbiota residente do aparelho digestivo médio do
mosquito na infecção por vírus Sindbis.
66
Material e Métodos
3 – Materiais e Métodos
3.1 – Mosquitos
Os mosquitos utilizados nesse trabalho eram adultos da espécie Aedes
aegypti, cepa Red-eye, mantidos no Laboratório de Biologia e Bioquímica de
Insetos do Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, CCS, UFRJ.
Ovos, larvas, pupas e adultos foram submetidos a um fotoperíodo de 12 h
de claro e 12h de escuro, com umidade relativa do ar entre 75 e 80%, e
temperatura ambiente de 28 ± 1 °C.
Para eclosão, os ovos foram submetidos ao vácuo por 20 minutos em água.
As larvas recém eclodidas foram transferidas para bandejas com água e
alimentadas com ração de cachorro triturada, sendo re-divididas pelo menos
duas vezes nos dias seguintes para garantir condições de crescimento
homogêneas para toda a população. As pupas recém-eclodidas foram
transferidas para gaiolas, onde os adultos eram mantidos e alimentados com
sacarose 5% “ad libitum”. Toda a água utilizada foi filtrada e descansada por
pelo menos 12 h para reduzir os níveis de cloro.
Todos os experimentos envolvendo alimentação artificial foram realizados
com fêmeas de Aedes aegypti, entre 3 e 7 dias após a eclosão dos adultos, que
jamais haviam sido alimentadas com sangue anteriormente.
67
Material e Métodos
3.2 – Alimentação artificial dos mosquitos
Fêmeas adultas entre 3 e 7 dias após a eclosão foram deixadas 24 horas
sem a solução de sacarose 5% antes de qualquer alimentação artificial. As
diferentes soluções de alimentação (detalhadas nos itens 3.2.1, 3.2.2, 3.2.3 e
3.2.4) foram oferecidas aos mosquitos utilizando um alimentador artificial de
vidro jaquetado, aquecido por água a 37 °C, durante aproximadamente 1 hora,
utilizando uma membrana de Parafilme (adaptado de
Garcia et al., 1975). ATP
(1mM) foi acrescentado em todas as soluções com função fagoestimulante.
Após a alimentação, os mosquitos foram anestesiados a -20 °C, por 2 minutos, e
as fêmeas alimentadas foram separadas numa nova gaiola. Os mosquitos
alimentados foram mantidos nas mesmas condições da colônia citada no item
3.1, até o momento da extração de RNA total.
3.2.1 – Infecção de mosquitos com vírus sindbis
As infecções com o vírus Sindbis foram feitas adaptando o protocolo
descrito por Lourenço-de-Oliveira et al., 2004 para infecção de mosquitos em
laboratório com o vírus Dengue. Resumidamente: sangue de coelho retirado na
presença de heparina foi lavado três vezes com PBS, centrifugando por 10
minutos a 3000 rpm. Esse lavado de hemácias (350 μL) foi misturado com
solução de vírus clarificado (150 μL) (como descrito no item XX) ou com
68
Material e Métodos
sobrenadante de cultura de células não infectadas. Essa solução (500 μL) foi
oferecida às fêmeas como descrito no item 3.2.
3.2.2 - Alimentação com Inibidor de tripsina (SBTI) e albumina bovina
(BSA)
Soluções de SBTI (1mM) e BSA (100mg/mL) foram preparadas na hora
em tampão fosfato 0,1 M pH 7.4. A solução de SBTI foi adicionada ao sangue
numa concentração final de 100 μM. A solução de BSA foi oferecida aos
mosquitos pura, sem adição de sangue. Neste experimento, a alimentação com
sangue foi acrescida do mesmo volume de tampão fosfato de sódio 0,1M pH 7.4
dos pontos experimentais e todas as soluções foram oferecidas aos mosquitos
como descrito no item 3.3.
3.2.3 – Alimentação com solução de esferas de látex (poliestireno)
A suspensão de esferas de látex foi preparada na hora da alimentação e
continha 10 mg de glicose, 10 μL de tampão bicarbonato de sódio 500mM,
pH7.4, 0,5 mg de agarose de baixo ponto de fusão e 50 μL de esferas de látex
(Sigma – LB-5). O volume final foi acertado para 350 μL utilizando NaCl 150
mM. Na hora da alimentação foi adicionado 150 μL de solução de vírus
69
Material e Métodos
clarificado ou sobrenadante de cultura de células não infectadas. Essa solução
(500 μL) foi oferecida às fêmeas como descrito no item 3.3.
3.2.4 – Pré-tratamento com antibióticos
Soluções de penicilina (100 U/mL) e estreptomicina (0,1 mg/mL) foram
misturadas com a solução de sacarose 5 % e oferecidas diariamente aos
mosquitos, por quatro dias antes da alimentação artificial, exceto nas ultimas 24
horas, quando os mosquitos foram mantidos em jejum. A infecção dos
mosquitos foi realizada como descrito no item 3.3.1. Após a separação das
fêmeas alimentadas, os mosquitos dos grupos pré-tratados continuavam
recebendo soluções de açúcar com antibióticos por mais quatro dias, até o
momento da extração do RNA.
3.3 - Dissecção dos mosquitos
Os mosquitos foram imobilizados à -20
°
C por 2 minutos, e transferidos
para uma placa de petri no gelo. A dissecção dos órgãos (cabeça, corpo
gorduroso, aparelho digestivo, ovários e tórax) foi feita sobre lâminas, em
etanol 50%, com o auxílio de pinças n° 5.
70
Material e Métodos
3.4 - Extração de RNA total e tratamento com DNAse
A extração de RNA total foi realizada utilizando o reagente TRIzol -
Invitrogen (Chomczynski, 1987). No caso de mosquitos inteiros, utilizamos
grupos de cinco mosquitos para cada extração. Em experimentos com
mosquitos dissecados, foram utilizados 10 orgãos por extração. O procedimento
consiste em uma homogeneização da amostra desejada em 1 mL do reagente,
uma solução monofásica de fenol e isotiocianato de guanidina, que garante a
integridade do RNA durante o processo de lise celular. A seguir, a adição de
clorofórmio e uma rápida centrifugação dividem o material em duas fases: uma
fase orgânica e uma fase aquosa, na qual se encontra o RNA. Após a passagem
da fase aquosa, contendo o RNA desejado, para um novo tubo, este pode ser
recuperado através de uma precipitação com isopropanol. Neste experimento,
após a precipitação, o RNA foi lavado com etanol 70% e ressuspenso em 10 μL
de água para a dosagem no espectrofotômetro.
O RNA total purificado foi dosado e sua qualidade monitorada por
medida da absorção de luz à 260, 280 e 320 nm . Aproximadamente 1 μg de
RNA foi tratado com 1 U de DNase I (Invitrogen) de acordo com o protocolo do
fabricante. Após 30 minutos, foi acrescentado 1 μl EDTA 25 mM e as amostras
foram incubadas a 65 °C, por 10 minutos, para inativação da enzima.
71
Material e Métodos
3.5 – Síntese da fita de cDNA
A síntese da primeira fita de DNA complementar (cDNA) foi realizada
por transcrição reversa do RNA obtido, utilizando o kit " High Capacity cDNA
Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems)”, conforme o protocolo do
fabricante. Todo o volume obtido no tratamento com DNAse foi utilizado para
a reação de síntese de cDNA. A reação ocorre com a adição de dNTPs, random
primers, tampão e a enzima transcriptase reversa do KIT ao RNA já tratado.
Após 2 horas a 37 ºC, a reação é interrompida através da desnaturação da
enzima à 75 ºC, por 10 minutos. Os cDNA foram estocados à –20 ºC até serem
utilizados.
3.6 - Amplificação do cDNA por reação em cadeia da polimerase (PCR)
Para conferir a amplificação do segmento desejado do cDNA, todos os
pares de iniciadores foram testados através de PCRs convencionais antes do
teste na máquina de PCR em tempo real. As reações continham tampão da
enzima Taq (10 X), dNTPs (0,2 mM), os oligonucleotídios (0.6 μM), 1 μl de
cDNA, água e a enzima Taq DNA polimerase (1 U) numa reação de 15 μl.
Todos os genes foram amplificados numa reação de 40 ciclos (94 °C – 30 seg
– desnaturação; 60 °C – 30 seg – anelamento; 72 °C – 30 seg – extensão) num
termociclador Gene Amp PCR System 2400 (Applied Biosystems) e analisados em
gel de agarose 2%.
72
Material e Métodos
3.7 – PCR quantitativo em tempo real
3.7.1 – A reação de PCR em tempo real
A análise da expressão relativa dos genes do sistema imune em Aedes
aegypti foi realizada utilizando a técnica de PCR em tempo real.
As reações de PCR em tempo real foram conduzidas em um
equipamento Applied Biosystms 7500 Real Time PCR System (Applied
Biosystems). Como sistema de detecção foi utilizado o SYBR Green (Power
SYBR® Green PCR Master Mix – Applied Biosystems), um reagente que emite
fluorescência ao se ligar inespecificamente a qualquer dupla fita de DNA.
Por causa dessa característica não especifica do SYBR Green, todas as
amostras utilizadas nos ensaios de PCR em tempo real foram previamente
tratadas com DNAse, com o intuito de eliminar qualquer tipo de contaminação
com DNA genômico que atrapalhasse a quantificação. As amostras de RNA
tratadas com DNAse foram testadas para garantir que não havia contaminação
genômica através de PCR convencional.
Todos os experimentos de quantificação foram realizados no mínimo
duas vezes, sendo que cada experimento era composto de uma duplicata
biológica. Alguns foram realizados em maior número de replicatas, o que será
descrito na legenda das respectivas figuras.
Para cada gene estudado foi utilizado um par de oligonucleotídeos
específico (Tabela 1). Antes de realizar a quantificação, cada oligonucleotídeo
73
Material e Métodos
foi testado por PCR convencional para estabelecer as condições ótimas da
reação. Posteriormente, os oligonucleotídeos eram submetidos a uma curva de
eficiência. Neste teste, um par de oligonucleotídeos (0,3 μM final) era utilizado
em reações com diferentes diluições de um mesmo cDNA (1, 1:10, 1:100 e
1:1000). A curva gerada neste procedimento indica a eficiência de reação
daquele determinado oligonucleotídeo naquela amostra, nos permitindo
garantir que a quantificação será valida dentro do método escolhido para o
processamento dos resultados (Método do ΔΔCt - User boletin #2, Applied
Biosystems, 2001) (Tabela 3.2).
Como o SYBR Green marca qualquer dupla fita de DNA, a análise do
branco de reação (reação que não contém cDNA) nos permite determinar a
temperatura de desnaturação (TM) do dímero de oligonucleotídeo formado na
ausência de amplificação. A temperatura de desnaturação (TM) do fragmento
amplificado foi determinada a partir da curva de eficiência. Essas temperaturas
nos permitem avaliar, após cada experimento, se a reação produziu o resultado
esperado para aquele determinado par de oligonucleotídeos.
A tabela 3.1 apresenta a listagem de todos os oligonucleotídeos utilizados
nesse trabalho, mostrando a seqüência de nucleotídeos de cada um deles.
74
Material e Métodos
Gene Seqüência dos olignucleotídeos
iniciadores
F GACTCGTCGGAGCTGAAATC
aaREL
R CGGTTTGTTCAGGTTGTTGA
F TCTGTCGGCAGATGAAGTGA
aaREL
R GCACTGGAATGGAGAATCAAA
F TCTTGCGTTGAAGTGAGTGG
Cactus
R GACCCTCTGAAAGGGAAAGG
D1 TCAATATGCTGAAACGCGCGAGAAACCG
Dengue
TS2 CGCCACAAGGGCCATGAACAG
F GATTCGGCGTTGGTGATAGT
Defensina
R TTATTCAATTCCGGCAGACG
F TCGTCAAACTCGGTTTTCCT
IMD
R TGGCGGAGTTGAAGGTAAAG
F CGATGCGTTCATTTTGTTTG
MyD88
R CACCGCTCAGAAATCAGCTT
F GCTATGACAAGCTTGCCCCCA
RP49
R TCATCAGCACCTCCAGCT
F ACGTGATGGATTGGATGGAG
Serpina
R GTGCCTGCACTTGTTTCTGA
F TGACTAACCGGGGTAGGT
SINDBIS
R TTGGCTTCGGTGGGCATC
F CGTTCACCTTCTGGGAGTGG
STAT alb
R AATGGCTGGATGTGCAGGAT
F CACACAAAAAGGACGAAGCA
STAT
R TCCAGTTCCCCTAAAGCTCA
F ATTTTTGACGGCTTTTGTGG
TEP
R TGGATTACTTGCCCCACTTC
Tabela 1 – Oligonucleotídeos utilizados para quantificação relativa por PCR em
tempo real dos genes listados.
O gene RP49 (Gentile et al., 2005), que codifica uma proteína ribossomal,
foi utilizado como controle endógeno para a normalização em todos os
experimentos, tanto em células C6/36 quanto em mosquitos.
75
Material e Métodos
As reações eram realizadas utilizando 7,5 μL do kit Power SYBR® Green
PCR Master Mix (Applied Biosystems), 0,5 μL do par de oligonucleotídeos
específico a ser analisado (10 μM), 6,5 μL de água Milli-Q autoclavada e 5 μL do
cDNA (previamente diluído de acordo com o experimento em questão), num
volume final de 15 μL de reação.
As reações foram realizadas nas seguintes condições: 95 °C por 10
minutos, 40 ciclos de duas temperaturas: 95 °C por 15 segundos e 60 °C por 1
minuto, seguido de uma curva de desnaturação.
3.7.2 – Cálculo da quantificação relativa
O programa ABI Prism 7500 Sequence Detection software versão 1.2.3
(Applied Biosystems) acompanha a reação de PCR em tempo real, gerando um
gráfico correspondente ao logaritmo do valor da fluorescência medida em cada
poço pelo número do ciclo correspondente (Figura 3.2). Uma linha de corte
(denominada Threshold) é delimitada em um ponto onde todas as curvas (de
todos os poços do experimento) estejam em sua fase exponencial (Figura 2.1).
O ciclo do PCR no qual a curva de amplificação de um determinado gene
cruza a linha de corte é denominado Ct (Ciclo de acordo com o Threshold). De
acordo com a quantidade inicial de DNA presente em cada amostra analisada,
esta amostra irá levar um número maior ou menor de ciclos para que sua curva
de amplificação alcance a linha de corte (threshold). Deste modo, amostras com
pouco DNA apresentarão um Ct elevado, enquanto amostras com mais DNA
apresentarão um Ct mais baixo.
76
Material e Métodos
Figura 18 – Gráfico representativo de uma corrida de PCR em tempo real. O gráfico
representa o Log da fluorescência medida pelo aparelho versus o número do ciclo de
leitura da fluorescência. As setas pretas indicam a fase exponencial do processo de
amplificação do DNA e a linha de corte ou Threshold determinada pelo aparelho em
um ponto no qual todas as curvas do experimento estão na fase exponencial. Adaptado
de Real Time PCR vs. Tradicional PCR, Applied Biosystems,
(http://www.appliedbiosystems.com/support/tutorials/pdf/rtpcr_vs_tradpcr.pdf,
2008).
O método que utilizamos para realizar a quantificação relativa dos genes
do sistema imune neste trabalho foi o Comparative Ct Method, também chamado
de Método do ΔΔCt (Livak & Schmittgen, 2001; Pfaffl, 2001), utilizando o gene
RP 49 como normalizador endógeno. O detalhamento dos cálculos utilizados
para a análise dos dados encontra-se explicado nos manuais da Applied
Biosystems (Método do ΔΔCt - User boletin #2, Applied Biosystems, 2001).
A expressão relativa final de cada gene foi estabelecida pela média entre
as expressões relativas dos diferentes experimentos.
77
Material e Métodos
A validação do Método do ΔΔCt foi efetuada de acordo com o manual da
Applied Biosystems (User boletin #2, Applied Biosystems, 2001), através da
comparação entre as curvas de eficiência de cada par de oligonucleotídeo
utilizado com a curva de eficiência do normalizador endógeno, o RP49 (Tabela
3.2).
Gene TM (°C) R
2
Curva de eficiência
Eficiência
aaREL 1 81,1 0,9989 1,1516
aaREL 2 79,7 0,9999 1,1144
Cactus 79,2 0,993 1,034
Dengue 81,0 0,9984 1,0988
Defensina 81,9 0,9992 0,9955
IMD 78,9 0,9925 1,1068
MyD88 76,8 0,9889 1,03
RP49 83,7 0,9879 1,2002
Serpina 79,2 0,9995 1,0149
SINV 83,3 0,9955 1,1034
STAT 75,7 1 1,1797
TEP 78,9 0,9992 1,0604
Tabela 2 – Eficiência dos oligonucleotídeos. Nome do gene, temperatura de
desnaturação (TM), o R
2
da curva de eficiência e a eficiência de amplificação de cada
um dos oligonucleotídeos utilizados nesse trabalho. A eficiência foi calculada
utilizando a formula E=10
(-1/slope)
-1.
3.7.3 – Análise estatística dos dados
As análises estatísticas dos dados foram feitas utilizando análises de
variância (ANOVA) e o teste t de Student. Nas análises de variância e correlação
78
Material e Métodos
dos resultados de quantificação relativa foram utilizados os valores de ΔCt de
cada experimento.
3.8 – Cultura de células e propagação de vírus
A linhagem celular C6/36, derivada da linhagem original isolada por
Singh (Singh, 1967) foi mantida em meio L-15 suplementado com 10% de soro
fetal bovino, 0,2g/L de L-glutamina, 1% de aminoácidos essenciais, 1% de
antibióticos, 0,1% de fungizona e 10 % de Triptose fosfato.
O vírus Sindbis, cepa AR339, foi propagado e titulado como descrito em
Gaspar et al., 2001. Resumidamente Células BHK-21 (Baby hamster kidney)
foram mantidas em meio DMEM (Dulbecco’s modified Eagle’s médium –
Sigma Chemical Co.) suplementado com 10% de soro fetal bovino e 3% de
triptose fosfato a 37 °C em um estufa com 5% de CO2. As células foram
infectados com uma MOI (multiplicity of infection) de 1 e mantidas por 48
horas a 37 °C. O sobrenadante foi coletado e clarificado de restos celulares por
centrifugação e congelado a -70 °C até o momento das infecções.
O vírus Sindbis foi titulado utilizando ensaio de placa em células BHK-
21, utilizando meio 199 sem soro e CMC 1% por 48 horas a 37 °C. Após 48 horas
as placas foram fixadas com formaldeído 20% por duas horas, lavadas e coradas
com cristal violeta (1 g % em etanol 20%).
79
Material e Métodos
3.9 – Infecção das células C6/36
Células C6/36 crescidas em garrafas de cultura de tecidos de 25 cm
2
por
24 horas foram infectadas com vírus Sindbis ou Dengue.
O vírus Sindbis ou Dengue (numa MOI de 10 e 1, respectivamente) foi
ressuspenso em 1 mL de L-15 sem soro fetal bovino e incubado com as células
por 1 hora a 28 °C. Após a incubação, as células foram lavadas três vezes com
PBS estéril e 5 mL de meio L-15 com 10% de soro fetal bovino foi adicionado. As
células controle foram manipuladas da mesma maneira, porém o meio sem soro
não foi acrescido de nenhum tipo de vírus. As células foram mantidas a 28 °C
por diferentes períodos de tempo.
3.10 - Tratamentos com heme e análogos de heme em C6/36
Células C6/36 crescidas em garrafas de cultura de tecidos de 25 cm
2
ou
placas de 6 poços com lamínulas estéreis de vidro no fundo para microscopia
por 24 horas foram com heme ou Sn-Protoporfirina.
As soluções estoque de heme e Sn-Protoporfirina foram sempre feitas na
hora, em DMSO, para uma concentração de 30 mM. A solução estoque foi
diluída em 1 mL de L15 já suplementado com soro fetal bovino para uma
concentração de 25 μM e adicionada às células. Os pontos controle sempre
receberam a mesma quantidade de DMSO dos experimentais (sempre menos de
80
Material e Métodos
0,1% de DMSO, concentração não nociva para célula, como mostrado na figura
34).
As células foram mantidas com o estímulo à 28 °C durante o tempo de
cada experimento.
3.11 - Microscopia de fluorescência das células incubadas com Sn-
protoporfirina
As lamínulas com células foram mantidas em formaldeído 4% preparado
na hora em PBS a 4 °C e posteriormente colocadas em uma lâmina e observadas
por contraste de interferência diferencial, utilizando-se um microscópio
Axioplan 2 (Zeiss). As imagens de fluorescência foram obtidas usando uma
lâmpada de mercúrio de 100 W como a fonte de excitação e um filtro Zeiss-15
(BP 546 nm-12/FT 580 nm/LP 590 nm).
3.12 - Viabilidade celular por redução de MTT
Os experimentos de MTT foram realizados com amostras tratadas como
descrito no item 3.11. Após a incubação das células com os estímulos por 24
horas, o meio era retirado e as células foram lavadas com PBS pH 7,4. Após a
lavagem foi adicionado 300 μL de solução de MTT 0,5 mg/mL em PBS. A placa
foi mantida por 15 minutos no escuro a 37 °C, quando então a solução contendo
MTT foi retirada e adicionou-se 200 μL de DMSO. Após 15 minutos sob
81
Material e Métodos
agitação cada amostra foi lida à 540 nm em um espectrofotômetro. A amostra
com valor mais alto foi considerada 100% para cálculo da percentagem de
viabilidade celular.
82
Resultados
83
4- Resultados
4.1 – Caracterização de genes do sistema imune em Aedes aegypti
A ativação das principais vias do sistema imune inato em resposta a infecções
por fungos e bactérias em insetos vem sendo alvo constante de diversos estudos.
Inicialmente em D. melanogaster e mais recentemente nos mosquitos A. gambiae e A
aegypti, o seqüenciamento do genoma nos permitiu identificar genes ortólogos
ligados à resposta imune, permitindo-nos fazer um mapa bastante amplo das
principais vias existentes em cada organismo bem como de seus genes efetores.
Deste modo, utilizamos os dados provenientes do seqüenciamento do genoma
de A aegypti para selecionar nove genes ligados às três principais vias do sistema
imune inato deste mosquito para este estudo. A partir de sua seqüência de cDNA,
desenhamos um par de oligonucleotídeos iniciadores para cada um destes genes, no
intuito de quantificar sua expressão nos diferentes tecidos, estágios e gêneros do
mosquito através de PCR em tempo real, como descrito em Material e Métodos.
Os genes escolhidos para essa análise inicial foram: aaREL 1, Cactus, MYD88 e
Serpina 27A (pertencentes a via Toll); IMD, aaREL 2 e Defensina (pertencentes a via
IMD); STAT e TEP (pertencentes a via JAK/STAT) (Figura 15, Tabela 1). Os níveis de
expressão destes nove genes foram medidos em RNA total extraído de diferentes
estágios do ciclo de vida do mosquito: larvas de primeiro, segundo/terceiro e quarto
estágios, pupas, machos e fêmeas recém eclodidos (Figuras de 19 A a 27 A).
Resultados
84
O primeiro estágio larvar (L1) apresentou o nível mais baixo da expressão de
todos os genes estudados quando comparado com os outros estágios do ciclo de vida
utilizados nesse trabalho.
Surpreendentemente, o macho apresentou expressão mais elevada de quase
todos os genes citados em relação aos outros estágios estudados e às fêmeas não
alimentadas com sangue. Os genes aaREL 1 (Fig 19 A), Cactus (Fig 20 A) e IMD (Fig
23A) foram os únicos que apresentaram expressão no macho inferior a 2 vezes a
expressão da fêmea.
Observando os demais estágios do ciclo de vida do mosquito, a expressão dos
nove genes não apresentou nenhuma outra característica marcante, apenas uma alta
expressão de IMD em larvas de quarto estágio (L4) (Figura 23 A).
Paralelamente, fêmeas adultas alimentadas com sangue foram dissecadas e os
diferentes tecidos foram submetidos a uma extração de RNA total como descrito em
materiais e métodos e analisados pela mesma metodologia. Os tecidos estudados
foram: Cabeça (C), Corpo gorduroso (CG), Aparelho digestivo médio (MG), Ovários
(OV) e Tórax (T) (Figuras 19 B a 27 B).
Podemos observar uma alta expressão de aaREL 1 e Cactus no ovário (Figuras
19 B e 20 B) enquanto aaREL 2 é claramente muito expresso no aparelho digestivo
(Figura 24 B). O peptídeo antimicrobiano estudado, a Defensina, tem sua expressão
bastante alta no corpo gorduroso (Figura 25B), órgão previamente caracterizado
como responsável pela produção de AMPs em insetos. Os demais genes, MYD88,
Serpina 27A, IMD, STAT e TEP, apresentaram uma expressão mais alta na cabeça do
que nos demais tecidos (Figura 21 B, 22 B, 23 B, 26 B e 27 B, respectivamente).
Resultados
85
É possível também observar que, genes que dão origem a proteínas secretadas,
como a Serpina 27A, a Defensina e TEP, apresentaram altos níveis de expressão no
corpo gorduroso, enquanto genes que codificam fatores de transcrição, como
aaREL1, aaREL 2 e STAT, apresentaram-se pouco expressos neste órgão de síntese.
Resultados
86
Figura 19 – Expressão relativa de aaREL 1 nos diferentes estágios de vida do mosquito
Aedes aegypti e nos diferentes tecidos da fêmea adulta alimentada com sangue.
Resultado de dois experimentos independentes de quantificação relativa por PCR em tempo
real. O gráfico A representa a expressão relativa em diferentes estágios de vida do mosquito:
larva estágio 1 (L1), larva estágios 2 e 3 (L2/3), larva estágio 4 (L4), pupa (P), fêmea (F) e
macho (M) recém eclodidos. O gráfico B representa a expressão relativa deste mesmo gene
nos diferentes tecidos da fêmea adulta, 24 horas após a alimentação com sangue: Cabeça (C),
Corpo gorduroso (CG), Aparelho digestivo (MG), ovário (OV) e Tórax (T).
Resultados
87
Figura 20 – Expressão relativa de Cactus nos diferentes estágios de vida do mosquito Aedes
aegypti e nos diferentes tecidos da fêmea adulta alimentada com sangue.
Resultado de dois experimentos independentes de quantificação relativa por PCR em tempo
real. O gráfico A representa a expressão relativa em diferentes estágios de vida do mosquito:
larva estágio 1 (L1), larva estágios 2 e 3 (L2/3), larva estágio 4 (L4), pupa (P), fêmea (F) e
macho (M) recém eclodidos. O gráfico B representa a expressão relativa deste mesmo gene
nos diferentes tecidos da fêmea adulta, 24 horas após a alimentação com sangue: Cabeça (C),
Corpo gorduroso (CG), Aparelho digestivo (MG), ovário (OV) e Tórax (T).
Resultados
88
Figura 21 – Expressão relativa de MYD 88 nos diferentes estágios de vida do mosquito
Aedes aegypti e nos diferentes tecidos da fêmea adulta alimentada com sangue.
Resultado de dois experimentos independentes de quantificação relativa por PCR em tempo
real. O gráfico A representa a expressão relativa em diferentes estágios de vida do mosquito:
larva estágio 1 (L1), larva estágios 2 e 3 (L2/3), larva estágio 4 (L4), pupa (P), fêmea (F) e
macho (M) recém eclodidos. O gráfico B representa a expressão relativa deste mesmo gene
nos diferentes tecidos da fêmea adulta, 24 horas após a alimentação com sangue: Cabeça (C),
Corpo gorduroso (CG), Aparelho digestivo (MG), ovário (OV) e Tórax (T).
Resultados
89
Figura 22 – Expressão relativa de Serpina nos diferentes estágios de vida do mosquito
Aedes aegypti e nos diferentes tecidos da fêmea adulta alimentada com sangue.
Resultado de dois experimentos independentes de quantificação relativa por PCR em tempo
real. O gráfico A representa a expressão relativa em diferentes estágios de vida do mosquito:
larva estágio 1 (L1), larva estágios 2 e 3 (L2/3), larva estágio 4 (L4), pupa (P), fêmea (F) e
macho (M) recém eclodidos. O gráfico B representa a expressão relativa deste mesmo gene
nos diferentes tecidos da fêmea adulta, 24 horas após a alimentação com sangue: Cabeça (C),
Corpo gorduroso (CG), Aparelho digestivo (MG), ovário (OV) e Tórax (T).
Resultados
90
Figura 23 – Expressão relativa de IMD nos diferentes estágios de vida do mosquito Aedes
aegypti e nos diferentes tecidos da fêmea adulta alimentada com sangue.
Resultado de dois experimentos independentes de quantificação relativa por PCR em tempo
real. O gráfico A representa a expressão relativa em diferentes estágios de vida do mosquito:
larva estágio 1 (L1), larva estágios 2 e 3 (L2/3), larva estágio 4 (L4), pupa (P), fêmea (F) e
macho (M) recém eclodidos. O gráfico B representa a expressão relativa deste mesmo gene
nos diferentes tecidos da fêmea adulta, 24 horas após a alimentação com sangue: Cabeça (C),
Corpo gorduroso (CG), Aparelho digestivo (MG), ovário (OV) e Tórax (T).
Resultados
91
Figura 24 – Expressão relativa de aaRel 2 nos diferentes estágios de vida do mosquito
Aedes aegypti e nos diferentes tecidos da fêmea adulta alimentada com sangue.
Resultado de dois experimentos independentes de quantificação relativa por PCR em tempo
real. O gráfico A representa a expressão relativa em diferentes estágios de vida do mosquito:
larva estágio 1 (L1), larva estágios 2 e 3 (L2/3), larva estágio 4 (L4), pupa (P), fêmea (F) e
macho (M) recém eclodidos. O gráfico B representa a expressão relativa deste mesmo gene
nos diferentes tecidos da fêmea adulta, 24 horas após a alimentação com sangue: Cabeça (C),
Corpo gorduroso (CG), Aparelho digestivo (MG), ovário (OV) e Tórax (T).
Resultados
92
Figura 25 – Expressão relativa de Defensina nos diferentes estágios de vida do mosquito
Aedes aegypti e nos diferentes tecidos da fêmea adulta alimentada com sangue.
Resultado de dois experimentos independentes de quantificação relativa por PCR em tempo
real. O gráfico A representa a expressão relativa em diferentes estágios de vida do mosquito:
larva estágio 1 (L1), larva estágios 2 e 3 (L2/3), larva estágio 4 (L4), pupa (P), fêmea (F) e
macho (M) recém eclodidos. O gráfico B representa a expressão relativa deste mesmo gene
nos diferentes tecidos da fêmea adulta, 24 horas após a alimentação com sangue: Cabeça (C),
Corpo gorduroso (CG), Aparelho digestivo (MG), ovário (OV) e Tórax (T).
Resultados
93
Figura 26 – Expressão relativa de STAT nos diferentes estágios de vida do mosquito Aedes
aegypti e nos diferentes tecidos da fêmea adulta alimentada com sangue.
Resultado de dois experimentos independentes de quantificação relativa por PCR em tempo
real. O gráfico A representa a expressão relativa em diferentes estágios de vida do mosquito:
larva estágio 1 (L1), larva estágios 2 e 3 (L2/3), larva estágio 4 (L4), pupa (P), fêmea (F) e
macho (M) recém eclodidos. O gráfico B representa a expressão relativa deste mesmo gene
nos diferentes tecidos da fêmea adulta, 24 horas após a alimentação com sangue: Cabeça (C),
Corpo gorduroso (CG), Aparelho digestivo (MG), ovário (OV) e Tórax (T).
Resultados
94
Figura 27 – Expressão relativa de TEP nos diferentes estágios de vida do mosquito Aedes
aegypti e nos diferentes tecidos da fêmea adulta alimentada com sangue.
Resultado de dois experimentos independentes de quantificação relativa por PCR em tempo
real. O gráfico A representa a expressão relativa em diferentes estágios de vida do mosquito:
larva estágio 1 (L1), larva estágios 2 e 3 (L2/3), larva estágio 4 (L4), pupa (P), fêmea (F) e
macho (M) recém eclodidos. O gráfico B representa a expressão relativa deste mesmo gene
nos diferentes tecidos da fêmea adulta, 24 horas após a alimentação com sangue: Cabeça (C),
Corpo gorduroso (CG), Aparelho digestivo (MG), ovário (OV) e Tórax (T).
Resultados
95
4.2 – Ativação das principais vias do sistema imune inato por infecção viral em
células C6/36 de Aedes albopictus.
Apesar da resposta a fungos e bactérias estar bastante bem caracterizada em
insetos, muito pouco é conhecido sobre a ativação dessas vias em resposta à infecção
viral. No entanto, alguns indícios apontam para a participação das vias Toll e
JAK/STAT em D. melanogaster (Zambon et al., 2005, Dostert et al., 2005), como
discutido anteriormente. A via Toll também se mostrou ativada em Aedes aegypti
infectado por vírus Sindbis, um dia após a infecção (Sanders et al., 2005).
Baseado nesses estudos decidimos caracterizar a participação das vias Toll,
IMD e JAK/STAT em uma linhagem embrionária de células em cultura de Aedes
albopicuts (C6/36) infectadas com vírus Dengue e Sindbis. Para isso, usamos a
expressão dos fatores de transcrição das respectivas vias como marcadores da
ativação das mesmas (Sanders et al., 2005, Yang & Stark, 2008, Medeiros et al, 2004).
Em células C6/36, a infecção por Dengue foi bem sucedida, como mostra a
Figura 28A, que representa a quantidade de RNA viral contida no interior das células
normalizada pela expressão de um gene constitutivo (RP49) do mosquito. Podemos
observar um aumento de cerca de 2 vezes no primeiro dia e cerca de 80 vezes no
sétimo dia em relação ao momento imediatamente após a infecção (0 hora).
Quando investigamos a expressão relativa dos fatores de transcrição aaREL 1,
aaREL 2 e STAT (Figura 28 B, C e D, respectivamente), observamos um aumento
destes genes nas células infectadas quando comparadas às células não infectadas que
passaram pela mesma manipulação. Estes resultados sugerem uma ativação das três
principais vias do sistema imune inato em insetos após a infecção pelo vírus da
Resultados
96
dengue. Apesar de todos os genes estarem aumentados no início da infecção, STAT
parece sofrer uma queda após o primeiro dia de infecção, o que pode significar uma
ativação desta via apenas em eventos agudos da infecção.
No intuito de observar se essa ativação era específica da infecção por vírus
Dengue ou comum a infecções por outros arbovírus de famílias diferentes,
infectamos células C6/36 com um alphavirus, o vírus Sindbis.
Neste caso a infecção também foi bem sucedida, como pode ser observado
através da quantificação do RNA do vírus Sindbis (Figura 29 A). As células
infectadas com Sindbis também apresentaram um aumento no nível de expressão
dos três fatores de transcrição analisados, aaREL 1, aaREL 2 e STAT. Este aumento,
no entanto, só foi significativo em tempos mais prolongados (7 dias), não sendo
observado no primeiro dia após a infecção (Figura 29 B, C e D).
Resultados
97
Figura 28 – Infecção de células C6/36 com vírus Dengue.
Resultado de três experimentos independentes de quantificação relativa por PCR em tempo
real. O gráfico A representa a expressão relativa do RNA viral normalizado pelo gene
ribossomal do mosquito RP49. O tempo 0 é usado como calibrador e, portanto, fixado em 1.
A escala da expressão relativa está representada como [Log10] para facilitar a visualização.
Os gráficos B, C e D mostram, respectivamente, a expressão relativa de aaREL 1, aa REL 2 e
STAT nos tempos 0, 1 e 7 dias após a infecção. O gene RP49 foi usado como normalizador em
todos os casos e células não infectadas, mas que passaram por manipulações idênticas num
mesmo intervalo de tempo, foram usadas como calibradores para o cálculo da expressão
relativa. A análise da variância (ANOVA) indicou diferenças significativas entre alguns
pontos, sinalizados com * em cada gráfico.
Resultados
98
Figura 29 – Infecção de células C6/36 com vírus Sindbis.
Resultado de dois experimentos independentes de quantificação relativa por PCR em tempo
real. O gráfico A representa a expressão relativa do RNA viral normalizado pelo gene
ribossomal do mosquito RP49. O tempo 0 é usado como calibrador e, portanto, fixado em 1.
A escala da expressão relativa está representada como [Log10] para facilitar a visualização.
Os gráficos B, C e D mostram, respectivamente, a expressão relativa de aaREL 1, aa REL 2 e
STAT nos tempos 0, 1 e 7 dias após a infecção. O gene RP49 foi usado como normalizador em
todos os casos e células não infectadas, mas que passaram por manipulações idênticas num
mesmo intervalo de tempo, foram usadas como calibradores para o cálculo da expressão
relativa. A análise da variância (ANOVA) indicou diferenças significativas entre alguns
pontos, sinalizados com * em cada gráfico.
Resultados
99
4.3 – Ativação das principais vias do sistema imune inato por infecção viral em
Aedes aegypti
Com o objetivo de caracterizar a ativação destas vias no mosquito adulto,
partimos para a infecção de Aedes aegypti em sistema de alimentação artificial. Apesar
de diversas tentativas não fomos capazes de infectar nossa linhagem de mosquitos
com o vírus Dengue, mesmo utilizando o protocolo já descrito na literatura (Lanciotii
et al, 1992). Contudo, a infecção artificial com o vírus Sindbis se mostrou muito
eficiente (Figura 30 A) e permitiu que avaliássemos alguns dos parâmetros desejados.
As expressões de aaREL 1, aaREL 2 e STAT mostraram uma tendência de
aumento em diferentes tempos após a infecção, como pode ser visto nas Figuras 30 B,
C e D. Os fatores de transcrição aaREL 1 e STAT se comportaram de modo
semelhante ao visto em C6/36, apresentando um aumento mais expressivo em
momentos mais avançados da infecção. No entanto, aaREL 2 mostrou maior ativação
um dia após a infecção.
Como obtivemos uma variação experimental muito grande, decorrente de
uma grande variação biológica dos parâmetros observados, escolhemos realizar os
ensaios com apenas um tempo após a infecção, porém com mais réplicas por
experimento. Escolhemos o tempo de quatro dias após a infecção para dar
continuidade aos experimentos, visto que este é um momento no qual não existe
mais sangue no aparelho digestivo médio do mosquito, de modo que todo vírus
detectado está necessariamente contido nas células do hospedeiro. Além disso, de
acordo com Foy e colaboradores, em 2004, o quarto dia já apresenta sinais de infecção
disseminada e ainda possui muitos focos de infecção no aparelho digestivo.
Resultados
100
Esta análise mais cuidadosa do quarto dia após a infecção, nos permitiu
observar uma tendência ao aumento da expressão de aaREL 1 e aaREL 2 neste
momento, e nenhum aumento na expressão de STAT em relação aos mosquitos não
infectados (Figura 31). Nestes experimentos foi extraído RNA total de mosquitos
inteiros, o que pode ter influenciado negativamente o resultado, visto que
observamos expressão diferenciada destes fatores de transcrição nos diferentes
órgãos do mosquito 24 horas após a alimentação (aaREL 1 mais alto nos ovários,
aaREL2 no aparelho digestivo e STAT na cabeça). Dados preliminares mostraram
que, quando o RNA total é extraído apenas de aparelho digestivo médio, o aumento
desses fatores de transcrição parece mais pronunciado.
Resultados
101
Figura 30 – Infecção mosquitos Aedes aegypti com vírus Sindbis.
Resultado de dois experimentos independentes de quantificação relativa por PCR em tempo
real. O gráfico A representa a expressão relativa do RNA viral normalizado pelo gene
ribossomal do mosquito RP49. O tempo 1 é usado como calibrador e, portanto, fixado em 1.
A escala da expressão relativa está representada como [Log10] para facilitar a visualização.
Os gráficos B, C e D mostram, respectivamente, a expressão relativa de aaREL 1, aa REL 2 e
STAT nos tempos 1, 4 e 7 dias após a infecção. O gene RP49 foi usado como normalizador em
todos os casos, e mosquitos não infectados, alimentados artificialmente com sangue em
intervalos idênticos aos infectados, foram usadas como calibradores para o cálculo da
expressão relativa. A análise da variância (ANOVA) não indicou nenhuma diferença
significativa neste experimento.
Resultados
102
Figura 31 – Infecção de mosquitos Aedes aegypti com vírus Sindbis – quarto dias após a
alimentação.
Resultado de três experimentos independentes, cada um com uma duplicata biológica
interna, de quantificação relativa por PCR em tempo real. O gráfico representa a expressão
relativa de aaREL 1, aa REL 2 e STAT 4 dias após a infecção com vírus Sindbis. O gene RP49
foi usado como normalizador em todos os casos, e mosquitos não infectados, alimentados
artificialmente com sangue em intervalos idênticos aos infectados, foram usados como
calibradores para o cálculo da expressão relativa, sendo fixados em 1 (linha pontilhada). A
análise da variância (ANOVA) não indicou nenhuma diferença significativa neste
experimento.
Resultados
103
4.4 – Aumento da expressão dos genes do sistema imune disparado pela
alimentação sanguínea
Considerando que o vírus, assim como a maioria dos patógenos transmitidos
por vetores, invade o aparelho digestivo médio do mosquito durante o repasto
sanguíneo, resolvemos avaliar o quanto cada um dos diferentes componentes deste
processo participa da regulação da ativação destas vias do sistema imune.
Para isso, alimentamos mosquitos artificialmente utilizando sacarose 5%,
sangue, sangue suplementado com SBTI (no intuito de inibir a principal enzima
digestiva do mosquito, uma tripsina) e BSA, este último em uma concentração
protéica semelhante à presente no sangue (Figura 32 A, B e C). Convém ressaltar que
os mosquitos alimentados apenas com açúcar apresentam conteúdo alimentar
reduzido no aparelho digestivo médio, visto que a solução de sacarose se acumula no
divertículo, sendo liberada para o intestino em pequenas porções.
Assim, após diferentes tipos de alimentação, os mosquitos foram mantidos na
colônia por 24 horas e então dissecados. Apenas o aparelho digestivo médio foi
utilizado para a extração do RNA total e quantificação dos genes de interesse, visto
que queríamos observar o efeito local da ingestão do alimento oferecido.
Quando comparados com mosquitos alimentados com sacarose, os mosquitos
alimentados com sangue apresentaram um aumento de duas ou mais vezes de
aaREL 1 e STAT e de 1,7 vezes de aaREL 2. Já os mosquitos alimentados com BSA
não apresentaram nenhum aumento significativo de aaREL 1 e 2 e um pequeno
aumento em STAT. Esse resultado indica que apenas a distensão do aparelho
digestivo médio ou a presença de aminoácidos e/ou proteínas não parece ser capaz
Resultados
104
de ativar a via Toll e a via IMD do mesmo modo que o sangue, mas possui algum
efeito na via JAK/STAT, sugerindo que a qualidade do alimento ingerido é
importante para a ativação ou não das vias estudadas.
Com a intenção de saber se o próprio sangue era o indutor desse aumento, ou
algum produto proveniente de sua degradação, observamos os mosquitos
alimentados com sangue acrescido de SBTI. Estes mosquitos apresentavam o
aparelho digestivo médio ainda cheio de sangue 24 horas após a alimentação,
indicando que a digestão estava realmente comprometida. Os mosquitos níveis
equivalente de aaREL 2 e STAT aos níveis observados nos animais alimentados
somente com sangue (Figura 32 B e C), porém os níveis de aaREL 1 (Figura 32 A)
eram próximos aos do controle dos mosquitos alimentados apenas com açúcar.
Resultados
105
Figura 32 – Ativação das principais vias do sistema imune inato em fêmeas de Aedes
aegypti após a alimentação.
Resultado de três experimentos independentes de quantificação relativa por PCR em tempo
real. Os gráficos A, B e C representam a expressão relativa de aaREL 1, aa REL 2 e STAT,
respectivamente, em mosquitos alimentados com açúcar, sangue, sangue suplementado de
SBTI e BSA. O gene RP49 foi usado como normalizador em todos os casos, e os mosquitos
alimentados com açucar foram usados como calibradores para o cálculo da expressão
relativa, tendo sua expressão fixada em 1. A análise da variância (ANOVA) indicou
diferenças significativas entre alguns pontos, sinalizados com * em cada gráfico.
Resultados
106
4.5 – Células C6/36 são capazes de captar heme
Como a expressão de aaREL 1 parece ser dependente da digestão do sangue,
decidimos investigar se o heme, grupamento prostético da hemoglobina, é capaz de
induzir alguma modificação na expressão dos genes selecionados. Para isso
utilizamos, inicialmente, sistema in vitro de cultura de células C6/36.
As células C6/36 foram incubadas com uma porfirina fluorescente, utilizada
como análogo da molécula de heme, a Sn protoporfirina IX. Este análogo possui o
anel porfirínico semelhante ao do heme, com uma substituição do átomo de ferro
central por um átomo de estanho. Ao contrario do heme, esta molécula tem a
propriedade de ser fluorescente, tornando possível a observação de sua localização
dentro da célula por microscopia. Este procedimento já foi utilizado com outras
porfirinas fluorescente, como a Pd-proptorfirina IX , com a mesma finalidade (Lara et
al., 2005).
Após diferentes tempos de incubação com 25 µM de Sn-protoporfirina, as
células foram fixadas com fomaldeído e as lâminas observadas no microscópio de
fluorescência. É possível notar um aumento da fluorescência no interior das células
incubadas com a Sn-protoporfirina, sugerindo que esta linhagem celular é capaz de
captar heme do meio de cultura (Figura 33).
Com o objetivo de identificar se a molécula de heme captado pela C6/36
causava algum dano celular, realizamos um ensaio de viabilidade em células em
C6/36 incubadas por 24 horas com 25 µM de heme (Figura 34), no qual pode-se notar
que a viabilidade das células com heme é semelhante a das células controle. O
DMSO, utilizado como veículo tanto para o heme como para a Sn-protoporfirina,
Resultados
107
quando na concentração final de 0,01%, também não altera a viabilidade celular. No
entanto, concentrações mais altas de DMSO (1%) são letais às células C6/36 (Figura
34).
Figura 33 – Captação de um análogo fluorescente de heme, a Sn-protoporfirina, por células
C6/36.
Na coluna da esquerda (A-G) são mostradas as imagens de contraste por interferência
diferencial (DIC) e na coluna da direita (B-H) as imagens de fluorescência. Células C6/36
crescidas sobre lamínulas de vidro foram incubadas em meio L15 sem soro com 25 µM de
Sn-protoporfirina por 0 (C e D), 2 (E e F) e 4 horas (G e H). Após o período de incubação, as
células foram lavadas com PBS e fixadas com formaldeído para posterior observação no
Resultados
108
microscópio. Nos painéis A e B estão representadas células não incubadas com o análogo de
heme.
Figura 34 – Viabilidade de células C6/36 incubadas com heme e DMSO.
Células C6/36 foram incubadas com meio L15 contendo 25 μM de heme diluído em DMSO
por 24 horas. Como controle utilizamos células incubadas apenas com meio L15
suplementado com soro, células incubadas com L15 suplementado com soro e 0.01% de
DMSO e células incubadas com L15 suplementado com soro e 1% de DMSO.
Resultados
109
4.6 – Heme induz expressão de aaREL 1 em C6/36
Tendo visto que as células C6/36 eram capazes de captar heme, decidimos
investigar se este heme, uma vez internalizado, induziria alguma modificação na
expressão dos fatores de transcrição estudados neste trabalho. Células C6/36 em
cultura foram incubadas com 25µM de heme, por 24 horas. Em seguida tiveram seu
RNA total extraído e foi feita uma quantificação relativa da expressão de aaREL 1, aa
REL 2 e STAT por PCR em tempo real, utilizando o gene RP49 como controle
endógeno. Neste sistema in vitro o heme se mostrou capaz de induzir um aumento de
cerca de 2 vezes na expressão de aaREL 1 e 1,5 vezes na expressão de aaREL 2. a
expressão de STAT não se mostrou aumentada nas células incubadas com heme
quando comparado a células não tratadas (Figura 35).
Resultados
110
Figura 35 – Ativação de aaREL 1 e aaREL 2 por heme em C6/36.
Resultado de três experimentos independentes de quantificação relativa por PCR em tempo
real. O gráfico representa a expressão relativa de aaREL 1, aa REL 2 e STAT em células C6/36
de Aedes albopicutus após 24 horas de incubação com 25 µM de heme em DMSO. O gene RP49
foi usado como normalizador, em todos os casos, e células tratadas apenas com DMSO foram
usadas como calibradores para o cálculo da expressão relativa. sendo fixadas em 1 (linha
pontilhada). A análise da variância (ANOVA) não indicou nenhuma diferença significativa
neste experimento.
4.7 – Alimentação com esferas de látex induz a expressão de aaREL 2
Para verificar se o heme é o produto da digestão do sangue responsável pelo
aumento observado em aaREL 1 (Figura 32 A), mosquitos foram alimentados com
uma solução artificial que se acumula no aparelho digestivo médio do mosquito, não
ficando apenas no divertículo como a sacarose pura, mas, no entanto, não contém
hemoglobina ou heme. Esta solução consiste em uma suspensão de esferas de látex
Resultados
111
diluídas em um tampão com pH controlado, sacarose, NaCl e agarose de baixo ponto
de fusão. Este sistema foi escolhido uma vez que, de acordo com a literatura, a
alimentação artificial com solução de esferas de látex simula diversas das alterações
fisiológicas que ocorrem no aparelho digestivo do mosquito após a alimentação com
sangue, como, por exemplo, a secreção da matriz peritrófica.
Dados prévios do nosso laboratório mostraram que mosquitos alimentados
com esta solução de esferas de látex possuem grande quantidade de radicais livres de
oxigênio no lúmem de seu aparelho digestivo. No entanto, a quantidade de bactérias
da microbiota intestinal desses mosquitos é semelhante à de mosquitos alimentados
com sangue.
Alimentamos mosquitos com solução de esferas de látex, contendo ou não
vírus Sindbis, e observamos a expressão relativa dos fatores de transcrição quatro
dias após a infecção. Como era de se esperar, aaREL 2 teve sua expressão ativada no
mesmo nível em mosquitos que comeram sangue e vírus Sindbis ou látex e Sindbis.
Já aaREL 1 e STAT apresentaram expressão reduzida nos mosquitos que comeram
látex e vírus Sindbis quando comparados aos mosquitos que foram infectados com
sangue. (Figura 36 A, B e C).
Resultados
112
Figura 36 – Ativação das principais vias do sistema imune inato em fêmeas de Aedes
aegypti após a infecção com solução de esferas de látex.
Resultado de três experimentos independentes com duplicatas biológicas internas de
quantificação relativa por PCR em tempo real. Os gráficos A, B e C representam a expressão
relativa de aaREL 1, aa REL 2 e STAT, respectivamente, em mosquitos infectados usando
como veículo solução de esferas de látex ou sangue. O gene RP49 foi usado como
normalizador em todos os casos e os mosquitos alimentados com solução de látex e vírus
foram usados como calibradores para o cálculo da expressão relativa, sendo fixados em 1. A
análise da variância (ANOVA) indicou diferenças significativas entre alguns pontos,
sinalizados com * em cada gráfico.
Resultados
113
4.8 - Microbiota e a ativação do sistema imune
Considerando que aaREL 2 não têm sua expressão regulada por nenhum fator
proveniente do sangue, decidimos observar o papel da microbiota do aparelho
digestivo médio na expressão destes genes.
Sabe-se que as populações de bactérias comensais aumentam em grande
quantidade no aparelho digestivo médio de fêmeas após a alimentação com sangue
(Luckhart et al., 1998), principalmente devido ao grande aporte de nutrientes
decorrente deste processo. Também já se sabe que em diversos sistemas esta
microbiota é responsável por ativação do sistema imune (Hooper et al., 2001). Assim,
decidimos avaliar se a microbiota de Aedes aegypti possui algum papel na ativação
das vias do sistema imune observada após a ingestão de sangue.
Para isso, tratamos mosquitos por quatro dias antes da alimentação com uma
solução de sacarose 5% suplementada com penicilina e estreptomicina. Neste
momento, mosquitos foram dissecados e seus aparelhos digestivos foram
homegenizados e plaqueados em uma placa de LB Agar. A observação destas placas,
após 24 horas de incubação a 37 °C, nos permitiu observar que o tratamento com
antibiótico estava sendo eficaz, visto que os mosquitos tratados apresentavam muito
pouca ou nenhuma bactéria (dado não mostrado). Em seguida os mosquitos foram
alimentados artificialmente com sangue, contendo ou não vírus Sindbis. Os
mosquitos foram então mantidos por quatro dias, sendo submetidos durante este
período ao mesmo tratamento com antibióticos. No quarto dia os mosquitos foram
homogenizados e o RNA total foi extraído para a quantificação.
Resultados
114
Mosquitos tratados com antibióticos mostraram uma diminuição significativa
na expressão de aaREL 2 (Figura 37B), entretanto não houve alteração significativa na
expressão de aaREL 1 e STAT (Figuras 37 A e C). Em todos os casos, a infecção por
Sindbis não fez nenhuma diferença na expressão destes genes quando comparava-se
os mosquitos tratados com antibióticos com os não tratados (Figuras 37 A, B e C).
Resultados
115
Figura 37 – Ativação das principais vias do sistema imune inato em fêmeas de Aedes
aegypti após tratamento com antibióticos.
Resultado de dois experimentos independentes de quantificação relativa por PCR em tempo
real. Os gráficos A, B e C representam a expressão relativa de aaREL 1, aa REL 2 e STAT,
respectivamente, em mosquitos infectados ou não, pré-tratados com antibióticos para
eliminar a microbiota do aparelho digestivo. O gene RP49 foi usado como normalizador em
todos os casos, e os mosquitos alimentados apenas com sangue e não tratados com
antibióticos foram usados como calibradores para o cálculo da expressão relativa, sendo
fixados em 1. A análise da variância (ANOVA) indicou diferenças significativas entre alguns
pontos, sinalizados com * em cada gráfico.
Resultados
116
4.9 – A alimentação controla a carga viral em Aedes aegypti
Considerando que os mosquitos tratados com antibióticos ou alimentados com
solução de esferas de látex possuem níveis mais baixos de alguns fatores de
transcrição (aaREL 2 e aaREL 1/STAT, respectivamente) (Figuras 36 e 37), decidimos
analisar a carga viral desses mosquitos quatro dias após a infecção.
A carga viral foi determinada, de modo análogo ao usado em C6/36 (Figura
29 A), através de quantificação relativa por PCR em tempo real do vírus Sindbis,
utilizando o gene RP49 do mosquito como controle para normalização.
Quando comparados com mosquitos infectados através de alimentações com
sangue, ambas as situações levaram a uma carga viral maior após quatro dias de
infecção. Em fêmeas tratadas com antibióticos, a carga viral encontrava-se em torno
de 10 vezes mais alta do que as de fêmeas não tratadas (Figura 38 A), enquanto
fêmeas alimentadas com solução de látex possuíam até 100 vezes mais vírus do que
aquelas infectadas com sangue (Figura 38 B).
Estes resultados indicam que a alimentação sanguínea controla a ativação das
vias do sistema imune do mosquito Aedes aegypti e que, a inibição da ativação de
qualquer uma destas vias leva a uma maior proliferação do vírus no mosquito.
Resultados
117
Figura 38 – Quantificação viral em mosquitos Aedes aegypti alimentados com solução de
látex ou antibióticos.
Resultado de três experimentos independentes de quantificação relativa por PCR em tempo
real para cada condição. O gráfico A representa a expressão relativa do RNA viral
normalizado pelo gene ribossomal do mosquito RP49 em mosquitos infectados utilizando
sangue ou solução de esferas de látex como veículo para o vírus. O gráfico B mostra a
expressão relativa do RNA viral normalizado pelo gene ribossomal do mosquito RP49 em
mosquitos infectados pré-tratados ou não com antibióticos. Mosquitos infectados com
sangue sem nenhum tipo de tratamento, foram usados como calibrador e, portanto, fixado
em 1. A escala da expressão relativa está representada como [Log10] para facilitar a
visualização. A análise da variância (ANOVA) indicou diferenças significativas entre alguns
pontos, sinalizados com * em cada gráfico.
Discussão
5 – Discussão
5.1 – Perfil de expressão dos genes do sistema imune inato em Aedes aegypti
Com a publicação do genoma de Aedes aegypti (Nene et al., 2007) e a
comparação entre os genes anotados neste mosquito com aqueles já conhecidos em
A. gambiae (Holt et al., 2002) e D. melanogaster (Adams et al., 2000), diversos genes
relacionados ao sistema imune deste mosquito foram identificados (Waterhouse et
al., 2007). Apesar disso, existem poucos dados na literatura sobre o perfil de
expressão destes genes nos diferentes estágios de desenvolvimento do mosquito e
nos diferentes tecidos.
Como já discutido no item 2.6 da introdução, uma comparação feita entre
diferentes famílias gênicas destes três insetos mostrou que genes relacionados com
imunidade, principalmente aqueles ligados ao reconhecimento de patógenos,
possuem menor quantidade de ortólogos quando comparados com outras famílias
gênicas. De um modo geral, o repertório imune é considerado um dos grupos
funcionais mais divergentes pela classificação do “Gene Ontology”
(http://www.geneontology.org/ - 2008) (Waterhouse et al., 2007).
Quando observamos o perfil de expressão de genes relacionados com o
sistema imune em A. aegypti, nos diferentes estágios de vida do mosquito, notamos
uma acentuada expressão de quase todos os genes estudados em machos recém
eclodidos, seja quando comparados aos outros estágios, ou a fêmeas recém eclodidas
(Figuras 19 A a 27A). Essa diferença pode ser determinada geneticamente ou pode
ser decorrência do modo de alimentação distinto de machos e fêmeas, visto que as
118
Discussão
fêmeas apresentam um aumento significativo na expressão de alguns desses genes
(aaREL, aaREL 2 e STAT) após a alimentação com sangue (Figura 32 A, B e C).
Estudos estão sendo realizados em nosso laboratório a fim de entender melhor a
natureza dessa diferença.
Quando analisamos o perfil de expressão dos genes nos diferentes tecidos da
fêmea adulta, 24 horas após a alimentação com sangue (Figuras 19 B a 27 B), notamos
que o perfil de expressão de aaREL 1 e seu inibidor Cactus é semelhante, sendo mais
alto no ovário, o que é compatível com o conhecido papel destes genes no
desenvolvimento embrionário, ao menos em Drosophila (Figuras 19 B e 20 B) (Drier
et al., 1997).
Observando a via IMD podemos destacar uma alta expressão de aaREL 2 no
aparelho digestivo, quando comprarado aos demais tecidos estudados (Figura 24B).
Este resultado mostra-se particularmente relevante frente ao fato desta via ter sido
implicada na resposta a infecções bacterianas, tanto por outros autores (Shin et al.,
2002) quanto por este trabalho (Figura 37). Sabe-se que, após a alimentação, ocorre
um grande aumento da população de bactérias no trato digestivo do mosquito
(Luckhart et al., 1998). O aumento observado na atividade expressão de aaREL 2 no
aparelho digestivo parece ser decorrente deste fato e, conseqüentemente, importante
para o controle da população desta microbiota pelo inseto (Figuras 37). A via Toll,
por outro lado, ao contrário de Drosophila, modelo na qual está relacionada ao
combate de infecções por fungos e bactérias gram-positivas, tem sido implicada no
controle de infecções apenas por fungos neste mosquito (Shin et al., 2005), fato
corroborado por nossos resultados.
119
Discussão
No entanto, a expressão de Defensina, um peptídeo antimicrobiano
sabidamente regulado pela via IMD em mosquitos, se mostrou elevada no corpo
gorduroso, e não no aparelho digestivo (Figura 25B). Esse resultado, embora pareça
contrariar o anterior, está de acordo com o fato de o corpo gorduroso ser o principal
órgão de síntese e secreção de proteínas nos insetos, inclusive de AMPs.
Todos os demais genes estudados apresentaram expressão mais elevada na
cabeça do que nos demais órgãos dissecados. É possível que isso se deva ao fato da
de que a cabeça possui estruturas sensoriais bastantes expostas ao meio ambiente, o
que poderia levar a um aumento local de exposição a patógenos e, conseqüentemente
a uma ativação de genes relacionados ao sistema imune.
Curiosamente, como descrito em Resultados, todos os genes estudados que
dão origem a proteínas secretadas possuem maior expressão no corpo gorduroso do
que nos outros órgãos (Figuras 22B, 25B e 27B). Este resultado é condizente com o
papel secretor desse órgão no mosquito. Por outro lado, os genes que codificam os
fatores de transcrição aaREL1, aaREL2 e STAT, possuem sua expressão baixa no
corpo gorduroso e elevada em outros órgãos, indicando um possível papel destes
genes na ativação de outros genes efetores não estudados aqui e talvez ainda
desconhecidos (Figuras 19B, 24B e 26B).
120
Discussão
5.2 - As principais vias do sistema imune inato são ativadas por infecções virais em
mosquitos
Neste trabalho analisamos a ativação das três principais vias relacionadas ao
sistema imune inato em Aedes aegypti através do perfil de expressão de seus fatores
de transcrição, aaREL 1, aaREL 2 e STAT, após diferentes desafios, tais como a
alimentação com sangue e a infecção com o vírus Sindbis.
O principal modo de ativação conhecido para estas vias, como descrito na
introdução, é a ativação dos fatores de transcrição da família NF-kB, através da
degradação de seu inibidor, o que permite que estes possam entrar no núcleo e
promover a transcrição de genes efetores. No entanto já foi descrito em diferentes
modelos, para as três vias escolhidas para este estudo, que a ativação da via leva a
um aumento na transcrição dos próprios fatores de transcrição, formando uma alça
de ativação positiva, o que permite que aumentos na expressão dos mesmos seja
utilizada como indicador da ativação de sua respectiva via (Sanders et al., 2005, Yang
& Stark, 2008, Medeiros et al, 2004).
Deste modo, a escolha de trabalhar com a expressão destes fatores de
transcrição baseou-se nestas informações e no fato de não termos acesso a anticorpos
de qualidade para as proteínas do mosquito com a mesma facilidade do que para as
de mamíferos, o que dificulta a caracterização da atividade da via através da
observação de mudanças relacionadas à ativação protéica. Por outro lado, é
importante lembrar que um pequeno aumento na expressão de fatores de transcrição
pode resultar em um aumento bem maior na expressão dos genes efetores
controlados por eles.
121
Discussão
O sistema imune de insetos possui diversos componentes, incluindo barreiras
físicas (como, por exemplo, a matriz peritrófica em mosquitos), respostas celulares
como a fagocitose e a encapsulação (Lavine & Strand, 2002; Levashina, et al., 2001) e
resposta humoral, como a produção de espécies reativas de oxigênio (Nappi et al.,
2000) e de peptídeos antimicrobianos (AMPs) (Hetru et al., 2003).
Como já descrito na introdução, a via Toll foi identificada como parte da
resposta de Drosophila melanogaster ao vírus X de Drsosphila (DXV) (Zambon et al.,
2005). Por outro lado, a super-expressão de AMPs regulados por essa via não
diminuiu a infecção viral na mosca, sugerindo um mecanismo efetor de defesa
diferente do observado para fungos e bactérias (Zambon et al., 2005).
Um outro trabalho interessante sobre infecção viral em D. melanogaster utilizou
o vírus C de Drosophila (DCV) para investigar os genes ativados após a infecção,
através de ensaios de micro-arranjo de DNA. Neste caso foi observada uma ativação
da via JAK/STAT. Além disso, o DCV induziu ativação de STAT in vitro bem como
aumentou sua atividade de ligação ao DNA (Dostert et al. 2005).
Nossos resultados mostram um aumento na expressão dos três fatores de
transcrição das principais vias do sistema imune inato em invertebrados Toll, IMD e
JAK/STAT, após a infecção com vírus Dengue (Figura 28 A-D) e Sindbis (Figura 29
A-D, em cultura de células de Aedes albopictus C6/36, o que sugere que estas vias
estão ativadas nesta condição.
As células infectadas com vírus Dengue mostraram um aumento na expressão
dos três fatores de transcrição desde o primeiro dia após a infecção (DAI) (Figura 28
B-D), enquanto as células infectadas com Sindbis apresentaram um aumento tardio
122
Discussão
na regulação da expressão destes genes, sendo observada alteração apenas no sétimo
DAI (Figura 29 B-D).
Para analisar essa alteração in vivo, infectamos mosquitos Aedes aegypti com
vírus Sindbis e observamos a expressão dos genes em diferentes dias após a infecção
(1, 4 e 7) (Figura 30 A-D). Neste experimento concluímos que as variações na
expressão dos genes estudados era pequena e a diferença entre as replicatas
biológicas, muito grande.
Para reduzir este problema o experimento foi realizado seis vezes de modo
independente, com pelo menos uma duplicata biológica interna, apenas no quarto
DAI. As amostras com valores muito diferentes das demais foram retiradas e os
ΔΔCts foram utilizados para a análise estatística utilizando o teste t de Student.
Esta análise mais detalhada mostrou uma tendência ao aumento na expressão
de aaREL 1, aaREL 2 e STAT no quarto dia após a infecção com vírus Sindbis em
mosquitos, porem esse aumento não é significativo estatisticamente neste período
(Figura 31).
Embora os aumentos absolutos observados neste trabalho possam ser
considerados pequenos, é importante que alguns pontos sejam levados em
consideração:
1 - Conforme já discutido, os genes utilizados para este estudo são fatores de
transcrição, de modo que um pequeno aumento em sua expressão pode representar
uma variação muito mais expressiva na síntese de eventuais proteínas efetoras.
2 - Os níveis de aumento de expressão observados neste trabalho, após infecções
virais, são compatíveis com os aumentos observados na expressão dos genes da
123
Discussão
mesma família em outros modelos de inseto, mesmo após desafios com infecções
bacterianas (Schlüns et al., 2007).
3 – Os experimentos apresentados nesta tese foram feitos utilizando mosquitos
inteiros, o que pode mascarar alguns resultados, uma vez que uma ativação restrita a
um determinado órgão pode não ser significativa por ser “diluída” quando colocada
junto aos demais. Experimentos preliminares, feitos apenas com o aparelho
digestivo, mostram uma ativação bem mais significativa na expressão relativa de
aaREL 1.
5.3 – A influência da alimentação na ativação do sistema imune
A infecção viral, para ser bem sucedida, precisa suplantar diversas barreiras
no mosquito (Black et al., 2002). Considerando que a primeira, e notadamente a mais
importante delas, é a entrada do vírus nas células do epitélio do aparelho digestivo
médio do mosquito, resolvemos analisar a influência da alimentação sanguínea e de
seus diferentes componentes no processo de infecção viral.
Nossos resultados mostram que a alimentação com sangue é capaz de
aumentar a expressão dos três fatores de transcrição estudados entre 1,5 e 3 vezes
(Figura 32 A-C). No entanto, quando o sangue é ingerido junto com um inibidor da
atividade das principais enzimas digestivas do mosquito (tripsinas), o SBTI, apenas
aaREL 2 e STAT mostram um nível de ativação igual ao dos animais alimentados
sem o inibidor (Figura 32 B e C). Esse resultado indica que a ativação de aaREL 1
após a alimentação sanguínea depende, em algum nível, da digestão do sangue
124
Discussão
(Figura 32 A), não podendo portanto ser atribuído exclusivamente à dilatação do
trato gastro-intestinal ou ao aumento da microbiota observado após a alimentação.
Já que a ativação de aaREL2 e STAT não depende da digestão do sangue,
alimentamos mosquitos com albumina bovina (BSA) para saber se uma outra fonte
de aminoácidos ou proteínas seria capaz de induzir um aumento na expressão destes
genes ou se este efeito era de algum elemento (exceto a albumina) específico do
sangue. Neste caso, aaREL 1 e aaREL 2 não mostraram aumento de expressão
significativo, indicando que sua ativação não parece ser decorrente de uma
alimentação apenas protéica (Figura 32 A e B). Por outro lado, STAT mostrou uma
pequena ativação em mosquitos alimentados com BSA, sugerindo um mecanismo de
ativação diferente dos fatores de transcrição da via Toll e IMD (Figura 32C). Esta
ativação, embora significativa, representa apenas cerca de 50% da ativação vista
anteriormente com sangue, o que sugere que a disponibilidade protéica é apenas
parte do estímulo responsável pela ativação desta via em mosquitos.
Em diferentes organismos, a via TOR (Target of Rapamycin) constitui uma das
mais importantes vias reguladas por nutrientes, sendo de extrema importância na
regulação do crescimento e proliferação desde leveduras e insetos até mamíferos
(Jacinto & Hall, 2003). Em mosquitos, a ativaçao da via TOR após a alimentação com
sangue leva a síntese do fator de transcrição GATA, que possui seqüências de ligação
no promotor de genes regulados pela alimentação sangüínea como a Vitelogenina,
para dar inicio a ovogenese (Park et al., 2006). Alem disso, em D. melanogaster já foi
mostrado que GATA possui sítios de ligação ao promotor de alguns AMPs, sendo
responsável, junto com os homólogos de NF-kB da mosca pela ativação destes
125
Discussão
(Senger et al., 2006). Diante dessas informações, é possível imaginar que a via TOR,
ativada pelos aminoácidos presentes na alimentação, através da ativação do fator de
transcrição GATA, esteja de alguma forma regulando os efeitos observados neste
trabalho, principalmente no caso de STAT, que parece depender da ingestão de
nutrientes para sua ativação.
5.4 - Papel da molécula de heme na ativação do sistema imune
Por muito tempo se acreditou que o principal objetivo do sistema imune era
reconhecer moléculas que não pertencessem ao organismo para combatê-las. Nos
últimos anos, no entanto, novos conceitos vêm abordando a idéia de que o sistema
imune não apenas combate patógenos, mas protege o organismo contra sinais de
perigo de um modo geral, causando inflamações estéreis e remodelamento tecidual
após dano celular (Matizenger, 1992; Figueiredo et al., 2007). Assim, em processos
inflamatórios na ausência patógeno, moléculas liberadas pelas células danificadas,
por exemplo, podem ser responsáveis por ativar e/ou amplificar a resposta imune
(Beutler, 2004).
Considerando que observamos a indução dos três fatores de transcrição
estudados após a alimentação com sangue, mas apenas aaREL 2 parece ter sua
expressão regulada pelo aumento da microbiota do aparelho digestivo, resolvemos
investigar qual(is) poderia(m) ser o(s) outro(s) fator(es) decorrente(s) da ingestão do
sangue responsável(is) por esta indução.
A molécula de heme, grupo prostético da hemoglobina, é um conhecido
agente pró-inflamatório em mamíferos, sendo capaz de ativar células do sistema
126
Discussão
imune inato através da sua ligação ao TLR-4 (Figueiredo et al, 2007). Já foi
demonstrado também que a hemozoína, o pigmento do parasito Plasmodium
falciparum, um cristal de dímeros de heme, é capaz de se ligar ao TLR-9 ativando a
resposta imune inata in vivo e in vitro, através da produção de citocinas e quimiocinas
(Coban et al., 2005). Deste modo, tendo em vista que o sangue, quando digerido, gera
quantidades muito elevadas de heme livre no aparelho digestivo médio do mosquito,
decidimos investigar o papel da molécula de heme na indução do sistema imune
inato em Aedes aegypti.
Primeiramente mostramos, utilizando um análogo fluorescente desta
molécula, que a linhagem celular C6/36 é capaz de captar heme do meio de cultura
(Figura 33). Além disso, observamos também que esse heme não causa morte celular
nas quantidades utilizadas nesse estudo (Figura 34).
Feitos estes controles, utilizamos a quantificação por PCR em tempo real para
avaliar os níveis de expressão dos fatores de transcrição estudados em células
tratadas ou não com heme. Como esperávamos, os níveis de aaREL 1 se encontravam
elevados em relação às células não tratadas, sugerindo que o heme deve ser um dos
fatores responsáveis pela ativação desta via após a alimentação com sangue. No
entanto o mesmo não é verdade para STAT, o que significa que, pelo menos in vitro,
apenas a molécula de heme não é suficiente para ativar a transcrição deste gene
(Figura 35). A expressão de aaREL 2 se mostrou levemente aumentada após o
tratamento com heme, no entanto esse aumento não foi estatisticamente significativo.
Para avaliar essa ativação in vivo, alimentamos mosquitos com uma solução
sem hemoglobina. Inicialmente tentamos alimentações artificiais com plasma, porém
127
Discussão
esbarramos em problemas experimentais com a quantificação da expressão gênica
nestes mosquitos, visto que a expressão dos genes de controle endógeno também era
radicalmente diminuída após este tipo de alimentação, o que comprometia a
normalização dos dados e, portanto, a interpretação dos resultados do PCR em
tempo real. Numa tentativa de contornar este problema, utilizamos uma solução de
esferas de látex, em tampão com pH fisiológico e sacarose, como veículo para estudar
a infecção em um sistema sem heme ou hemoglobina (Figura 36).
Os mosquitos infectados com solução de látex apresentaram níveis muito mais
baixos de expressão de aaREL 1 e STAT quando comparados aos infectados na
presença de sangue, o que se mostra condizente com os experimentos anteriores que
indicavam que o sangue era essencial para a ativação dessas vias (Figura 36 A e C).
Dados anteriores do nosso laboratório mostraram que mosquitos alimentados
com esferas de látex possuem uma microbiota intestinal bastante semelhante em
número àqueles alimentados com sangue. Assim, mosquitos infectados com látex e
com sangue mostraram níveis semelhantes de expressão de aaREL 2, o que também
corrobora nossos experimentos nos quais vimos uma indução desta via pelo aumento
da microbiota e não pela natureza do conteúdo alimentar em si (Figura 37 B).
5.5 – A microbiota e a ativação do sistema imune
Conforme discutido anteriormente, um evento muito importante induzido
pela alimentação sanguínea é o enorme aumento observado na população de
bactérias do aparelho digestivo do mosquito (Luckhart et al., 1998). Após a
alimentação, devido principalmente ao grande aporte de nutrientes, a quantidade de
128
Discussão
bactérias da microbiota comensal destes organismos é incrivelmente aumentada, fato
que parece ser muito importante para a sobrevivência e capacidade de infecção dos
parasitos destes organismos (Azambuja et al., 2005).
Resultados recentes de estudos sobre a importância da microbiota na ativação
do sistema imune e na resposta a patógenos vêm mostrando que muito pouco ainda
é entendido deste delicado e essencial equilíbrio.
Este ano, Ryu e colaboradores mostraram, em D. melanogaster, que bactérias
patogênicas e bactérias da microbiota modulam os níveis de secreção de AMPS,
através do balanço entre dois fatores de transcrição no epitélio intestinal, relish e
caudal (Ryu et al., 2008). Este conceito já havia sido descrito previamente em
vertebrados, como no caso da bactéria Bacteroides thetaiotaomicron, membro da
microbiota de camundongos que induz a expressão de proteínas antimicrobianas
capazes de combater bactérias patogênicas a este animal, mas não afeta a
sobrevivência da própria Bacteroides thetaiotaomicron (Cash et al., 2006). Se bactérias
diferentes são capazes de produzir diferentes respostas no organismo infectado,
induzindo AMPs com diferentes especificidades, isso leva a crer que a microbiota
pode possuir um papel ativo em modular a resposta imune do hospedeiro
(Muyskens et al., 2008). Ryu e colaboradores também responderam esta pergunta
mostrando que o espectro de AMPs expresso no aparelho digestivo, por sua vez,
define a comunidade microbiana e, consequentemente, a saúde do hospedeiro (Ryu
et al., 2008).
No entanto, muitas perguntas ainda permanecem sem resposta sobre como
ocorre o equilíbrio destes fatores de transcrição e principalmente sobre quais os
129
Discussão
mecanismos utilizados pelo vetor para “perceber” a diferença entre bactérias
comensais e patogênicas que muitas vezes apresentam padrões moleculares (PAMPs
– “pathogen associated molecular patterns”) muito parecidos.
Os mosquitos axênicos, obtidos através de tratamentos com penicilina e
estreptomicina neste trabalho, apresentaram níveis de aaREL 1 e STAT iguais aos dos
mosquitos não tratados, sugerindo que a microbiota não possui nenhum efeito na
expressão destes genes (Figura 37 A e C). Este dado é, mais uma vez, condizente com
a idéia de que, em mosquitos, a via Toll parece ser pouco ou não responsiva a
infecções bacterianas, conforme sugerido por Shin et al;, 2002. Entretanto, o aumento
observado na expressão de aaREL 2 após a alimentação com sangue e/ou sangue
infectado com vírus Sindbis não é observada nos mosquitos tratados com
antibióticos, indicando que a ativação desta via observada, após a alimentação com
sangue, é causada majoritariamente pelo aumento das bactérias da microbiota
(Figura 37 B). Mais uma vez este resultado corrobora os dados observados por Shin e
colaboradores, em 2002, sugerindo a ativação da via IMD após infecção por bactérias
em Aedes aegypti. No entanto é importante ressaltar que neste os autores apenas
observam um aumento na expressão da via IMD após infecção dos mosquitos por
bactérias (Enterobacter cloacae) injetadas e, portanto, não pertencentes à microbiota do
inseto. Nossos dados, por outro lado, demonstram que esta via é importante, não
apenas para o combate de infecções causadas por bactérias “estranhas” ao mosquito,
mas também é ativada pelo aumento da população da própria microbiota residente.
130
Discussão
5.5 – A alimentação e o controle da carga viral
Levando em consideração que tanto nossos dados quanto evidências da
literatura indicavam que a alimentação possui um importante papel na ativação das
principais vias do sistema imune inato do mosquito, decidimos medir a carga viral
após a infecção realizada através das diferentes alimentações utilizadas nesse estudo.
É importante lembrar que, tanto em alimentações com esferas de látex, quanto
nas alimentações feitas após tratamentos com antibióticos tínhamos observado
menor expressão de algum fator de transcrição (aaREL1/STAT e aaREL 2,
respectivamente). Por causa disso, imaginamos que a administração de vírus ao
mosquito, em uma ou outra condição, poderia ser um interessante instrumento para
nos revelar a importância da ativação dessas vias na infecção do mosquito por
infecção viral durante a alimentação.
Analisamos a carga viral nesses dois tipos de infecção quatro dias após a
alimentação contendo o vírus e, em ambos os casos, a carga viral encontrava-se mais
alta nos mosquitos que foram submetidos a tratamentos que preveniam a ativação de
alguma das vias do que nos controles (não tratados com antibióticos e alimentados
com sangue) (Figura 38 A e B). Este resultado sugere que a ativação das principais
vias de imunidade do mosquito, após a alimentação sanguínea, é extremamente
importante para que o mesmo possa proteger-se da infecção por patógenos presentes
no alimento e que, ao menos para Sindbis, a supressão da ativação de qualquer uma
destas vias leva a um pronunciado aumento da susceptibilidade do mosquito à
infecção. Este fato evidencia que, tanto a via de IMD quando a de Toll/Jak-STAT, são
importantes para o combate da infecção por Sindbis pelo mosquito.
131
Discussão
Acreditamos que, caso este evento mostre-se verdadeiro para infecção por
outros vírus, mais do que revelar que o mosquito emprega diferentes vias de
imunidade para o combate da infecção viral, esses dados revelam um fascinante
aspecto da adaptação dos mosquitos à hematofagia. Considerando que este é o
momento no qual o mosquito encontra-se mais susceptível à infecção, um aumento
da defesa contra patógenos, seja induzido pela digestão do sangue, seja induzido
pela própria microbiota do aparelho digestivo, é um importante mecanismo
adaptativo desses animais para um melhor controle de organismos invasores (Figura
39).
132
Conclusões
6 – Conclusões
Com base nos resultados obtidos neste trabalho e utilizando como
fundamento as informações disponíveis na literatura aqui discutidas, foi possível
chegar as seguintes conclusões:
• As três vias estudadas neste trabalho, Toll, IMD e JAK/STAT,
cooperam na resposta à infecção viral após uma alimentação sangüínea.
• Embora os três fatores de transcrição estudados estejam aumentados
após a ingestão de sangue, eles parecem responder a diferentes
estímulos: aaREL 2 é regulado pelo aumento da microbiota no aparelho
digestivo médio do mosquito; aaREL 1 responde à algum fator
decorrente da digestão do sangue ingerido, possivelmente a molécula
de heme; e STAT parece ter sua expressão aumentada após a ingestão
de nutrientes, o que sugere um participação da via TOR.
• Esse efeito imunomodulatório decorrente da ingestão de sangue se
mostrou de grande importância no controle da infecção viral pelo
mosquito A. aegypti como resumido na figura 39.
134
Conclusões
Figura 39 – Esquema proposto para a modulação das vias estudadas nesse
trabalho (Toll, IMD e JAK/STAT) pela alimentação sangüínea e sua importância no
controle da carga viral pelo mosquito Aedes aegypti .
135
136
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Baker TS, Strauss JH, Rossmann MG, Kuhn RJ. Visualization of membrane
protein domains by cryo-electron microscopy of dengue virus. Nat.Struct.Biol.
2003; 10: 907-912.
Apêndice A
Immune Response Activation in Aedes Aegypti by Blood Feeding and
Virus Infection
$
Running title: Aedes immune activation by virus
Maria Clara L. Nascimento-Silva
1
, Jose Henrique Maia de Oliveira
1
, Luiza
Pereira Ramos de Oliveira
1
, Pedro L. Oliveira
1
and Marcos Henrique F.
Sorgine
1
*
1
Instituto de Bioquímica Médica, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio
de Janeiro, Brazil
*Corresponding author:
Marcos Henrique F. Sorgine, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Centro
de Ciências da Saúde, Instituto de Bioquímica Médica, Bloco D – Sala SS05 –
Ilha do Fundão, RJ – CEP: 21.941-590 Brazil, Tel 552125626751.
E-mail: sorgine@bioqmed.ufrj.br
$
This work is dedicated to Prof. Leopoldo de Meis for his inspiring example and for his 70
th
birthday.
Abstract
In the mosquito A. aegypti, infections by fungi are known activators of the
toll pathway, through NF-Kb related transcription factor Rel 1, while bacteria
mostly activate the IMD pathway, which operates through Rel 2, another NF-Kb
ortholog. The JAK/STAT pathway is also related to pathogen clearance, a
process that occurs by the regulation of complement-like humoral proteins, such
as TEP1 in Drosophila. In contrast, little is known about Aedes aegypti
responses to viral infection. In this work we observed that three major mosquito
immune-related transcription factors (aaREL 1, aaREL 2 and STAT) are up
regulated 24 h after a blood meal but not after feeding insects with albumin
(BSA). When sindbis virus was given with the blood meal, an additional
increase in expression of these genes was observed. In contrast, when
mosquitoes were treated four days with antibiotics before oral infection, a
reduced expression of REL 2 mRNA was observed, but not of REL 1 and STAT.
Interestingly, sindbis infected mosquitoes pre-treated with antibiotics showed an
increase in the viral load when compared with mosquitoes infected with a
normal blood meal. These results suggest that a blood meal per se is able to
activate innate immune pathways and that the upregulation of REL 2 seems to
be mediated by the presence of gut microbiota, profoundly affecting viral loads
in Aedes aegypti.
1-Introduction
A wide array of information has been learned using Drosophila
melanogaster to study insect immune system, allowing the development of
general picture concerning the mechanisms by which other insect’s immune
system operates. In this insect, multiple cellular and humoral responses [1] are
activated to combat infection, such as proteolytic cascades leading to
coagulation and/or melanization, microorganism phagocytosis by hemocytes
and the production of effector molecules, including antimicrobial peptides
(AMPs) [2]. Usually produced by fat body cells or hemocytes, AMPs are
hemolymphatic peptides capable of direct killing of pathogens, [3]. Two main
pathways regulate the expression of AMP genes, Toll and IMD, which activate
transcription factors of the REL/NF-kB family [4,5]. In adult flies the Toll pathway
controls fungal and gram-positive bacterial infections through the activation of
the transcription factor Dif (dorsal immune factor) [6], an NFkB homologue. On
the other hand, gram-negative bacteria stimulate the IMD pathway, leading to
the activation of another NFkB homologue, Relish [7,8]. Together with the
recognition of other conserved transduction pathways also involved in immune
response, such as JNK [9], MAPK [10] and JAK/STAT pathways [11], the great
similarity between Toll and IMD pathways and the vertebrate TLR (toll-like
receptor) and TNF (tumor necrosis factor) pathways revealed a remarkable
level of conservation of innate immune response throughout animal evolution
[12].
The mosquito Aedes aegypti is the main vector of important arthropod-
borne viruses (arboviruses), such as dengue and yellow fever virus. Despite the
great importance of these diseases, very little is known about mosquito
responses to virus infection. The availability of the complete genome sequence
of Aedes aegypti [13] created new possibilities to study mosquito immune
response. In A. aegypti, where 3 Toll homologues were characterized, this
pathway seems to be involved only in antifungal response [14]. Despite the fact
that a transcription factor Dif homologue has never been found in mosquitoes,
the Dorsal homologue (AaREL 1) is activated by immunological stimuli and
regulates AMP expression in adult mosquitoes in vitro [15]. The IMD pathway in
A aegypti is modulated by bacteria and activates Relish’s homologue (AaREL 2)
[16]. Recently, the involvement of Toll and JNK pathways in the mosquito
response against viral infection was recognized by Sanders [17], who used a
DNA microarray to study gene expression during SINV infection.
Although commensal microbiota are known to influence host physiology
[18] including innate immunity [19] and consequently vectorial capacity [20], the
knowledge on this subject is still limited. Ryu et al. showed, in D melanogaster,
that the intestinal homeobox gene Caudal regulates gut microbiota by
repressing Relish-dependent AMP expression. When Caudal is suppressed,
commensal microbiota is disrupted and gut epithelial cell apoptosis and host
mortality is observed due to the dominance of a pathogenic bacteria [21]. These
results indicate the interrelationship between host immunity and the gut
microbiota as an important factor in gut homeostasis and pathogen control.
In this work we investigated the activation of the three main pathways of
A. aegypti immune system through the expression profile of their transcription
factors (aaRel1, aaRel2 and STAT) after SINV infection. We also addressed
possible roles of the blood meal and gut bacteria in immune activation. Our
results reveal that activation of A. aegypti main immune pathways after blood
meal is in part dependent on gut microbiota (aaRel2) and in part on blood
digestion and/or other factors of cellular stress (aaRel1 and STAT).
2- Methods
2.1 – Mosquitoes and artificial meals
Aedes aegypti Red-eye strain mosquitoes were reared at 28 °C, 70-80%
humidity in a 12:12 light:dark photoperiod. Mosquitoes were fed with sucrose
5%. For artificial meal, 4-8 days old females were starved for 24 hours.
Mosquitoes were allowed to feed until repletion (1 hour) in an artificial feeder
and then were anaesthetized by cold. Fully engorged females were separated
on ice and put into a new cage. Females were maintained in the same
conditions as before for different periods of time until RNA extraction. All
experiments were repeated at least three times.
SBTI (1mM) was added directly to rabbit blood before feeding, in a final
concentration of 100 µM. BSA (100mg/mL) were offered in water-jacketed
artificial feeders maintained at 37 °C and parafilm was used as a membrane to
be pierced by the mosquitoes. ATP (1mM) was added as phagostimulant.
2.2 – SINV infection
SINV infections were adapted from Lanciotti protocols for Dengue virus infection
[22]. Briefly, 350 µl of rabbit blood were mixed with 150 µl of 10
8
pfu/mL virus
stock or 150 µl of virus-free cell culture medium and were offered in an artificial
feeder as described above. Mosquitoes were maintained under the same
conditions as before.
2.3 – Antibiotics treatments
To obtain insects free of bacteria, penicillin (100 U/mL) and streptomycin (0,1
mg/mL) were added to the 5 % sucrose solution used to feed insects, which
was changed daily for four days before and four days after blood meal. After the
first four days of treatment, mosquitoes were dissected and midguts were
homogenized and platted onto a LB-agar medium. Bacteria colonies were
estimated 24 h after plating to control for efficacy of antibiotics (Figure 4).
2.4 - Cell culture and virus
C6/36 cell line [23], was maintained in L-15 medium supplemented with 10%
fetal calf serum, 0,2g/L L-glutamine, 10 % triptose phosphate broth, 1% non
essential amino acids and 1% penicillin/ streptomycin at 28
0
C.
SINV virus, MR16 strain, was propagated and titrated as described before [24].
2.5 – Cell infection and heme treatment
Aedes albopicutus cells treatments were performed in 25 cm
2
tissue culture
flasks 24 h after plating.
SINV (MOI of approximately 10 PFU per cell) was suspended in 1 mL of L-15
medium without fetal calf serum and incubated with the cells for 1 h at 28
0
C.
Cells were washed 3 X with sterile PBS and fresh medium with fetal calf serum
(10 %) was added to the flasks. Control cells were handled in an identical
manner. At different time points, cells were washed again with PBS and
ressuspended in TRIzol for RNA extraction.
Heme (30 mM freshly made in DMSO) was diluted in 1 mL of L-15 medium with
fetal calf serum to a final concentration of 25 µm and added to cell flasks.
Control cells were handled in an identical manner, receiving only DMSO instead
of heme. Cells were maintained at 28
0
C for 24 h and then washed in PBS and
ressuspended in TRIzol.
2.6 - RNA extraction and cDNA synthesis
Total RNA was isolated from pools of five females each, using TRIzol reagent
(Invitrogen) according to the manufacturer’s instructions. Total RNA was
quantified in a spectrophotometer and 1 µg were treated with 1 U of DNAse
RNAse free (Invitrogen) for 30 min at 37
0
C. Reactions were stopped by adding
1 µl of 20 mM EDTA and heating for 10 min at 65
0
C. cDNA synthesis was
performed from the DNAse treated RNA according to High Capacity cDNA
Reverse Transcription Kit from Applied Biosystems.
2.7 - Primers and PCR
All primers were made using Primer 3 (http://frodo.wi.mit.edu/primer3/
input.htm) and Oligo analyzer software (http://www.idtdna.com/analyzer/
Applications/OligoAnalyzer/Default.aspx/oligocalc.asp). Primers were:
Gene Seqüência
aaREL 1F GACTCGTCGGAGCTGAAATC
aaREL 1R CGGTTTGTTCAGGTTGTTGA
aaREL 2F TCTGTCGGCAGATGAAGTGA
aaREL 2R GCACTGGAATGGAGAATCAAA
RP49 F GCTATGACAAGCTTGCCCCCA
RP49R TCATCAGCACCTCCAGCT
SINVF TGACTAACCGGGGTAGGT
SINVR TTGGCTTCGGTGGGCATC
STAT albF CGTTCACCTTCTGGGAGTGG
STAT albR AATGGCTGGATGTGCAGGAT
STAT F CACACAAAAAGGACGAAGCA
STAT R TCCAGTTCCCCTAAAGCTCA
Before Real Time PCR reactions all primers pairs were tested by conventional
PCR using a 40 cycles reaction (94
0
C – 30 s – denaturation; 60
0
C – 30 s –
annealing; 72
0
C – 30 s – Taq extension) in a thermocycler and analysed in 2%
agarose gel.
2.8 - Real Time PCR
Real Time PCR was performed in an ABIXX (Aplied Byosystems) using power
SYBR-GREEN PCR master MIX. The Comparative Ct Method [25,26] was used
to compare changes in gene expression levels. RP-49 was used as
endogenous control [27].
2.9 – Statistical analysis
Statistical analysis were made using ANOVA and Student´s t-test of ∆Ct values.
3 – Results
3.1 – SINV infection induces the expression of immuno-related
transcription factors in C6/36 Aedes albopicuts cells and in adult female
A. aegypti mosquitoes.
Real Time PCR was used to measure mRNA expression of three
major immune-related transcription factor, aaRel 1, aaRel 2 and STAT in
infected cells and mosquitoes. C6/36 cells infected with SINV were analyzed on
0, 1, 3 and 7 days post-infection (DPI). Viral load increased in a time-
dependent manner, as expected (Fig 1A), but an increase in all three
transcription factors was observed only in late infection (Fig 1B, C and D). Adult
females fed with SINV presented an increase in viral particles 4 DPI (Fig 2A).
Although differences in individual experiments were not statistically significative,
a tendency to upregulation of Rel-1 and Rel-2 (but not of STAT) at 4 DPI was
consistently observed in all experiments (Fig 2B).
3.2 – Blood feeding induces immune activation in A. aegypti females.
To understand a possible role of blood feeding on innate immune
activation and pathogen transmission, we analyzed aaRel 1, aaRel 2 and STAT
mRNA expression after blood intake. All three genes were up regulated in the
midgut 24 h after meal (Fig 3A, B and C). Induction of STAT and aaRel 2 was
not affected when insects were fed with blood containing SBTI, an inhibitor of
trypsin, the major mosquito digestive protease (Fig B and C). In contrast, aaRel
1 expression seems to depend on blood digestion for its upregulation, since its
induction was prevented by SBTI (Fig 3A). Furthermore, BSA fed mosquitoes
presented a small upregulation of the studied genes, suggesting that this
regulation is not just a physical response to distention of the gut or to the
formation of a free aminoacid pool generated by digestion of a protein meal but
also dependent on the quality of the meal.
3.3 – Antibiotics treatment decreases aaREL2 expression after a blood
meal.
Gut commensal microbiota is an important factor on innate immune
activation [28] and it is known to increase after blood feeding [29], mainly
because the great intake of nutrients. In order to evaluate how gut microbiota
contributes to the immune activation observed after blood feeding, mosquitoes
were treated with antibiotics during four days before receiving a blood meal.
After this treatment, midguts were dissected, homogenized and plated onto LB
agar plates to control for absence of bacterial growth (Fig 4). Female
mosquitoes were then fed with blood and kept for four days on antibiotics until
RNA extraction. aaRel 2 showed a down regulation in antibiotics treated
mosquitoes (Fig 4B), but not aaRel 1 and STAT (Fig 4A and C). It is also
interesting to notice that, in treated mosquitoes, the increase in expression of
the transcriptional factors observed in Fig 2 is no longer observed, suggesting a
cross-talk between bacterial and viral immune response.
3.4 – Blood meal controls viral load in A. aegypti
Considering that antibiotic-treated mosquitoes down-regulated aaRel 2, we
decided to analyze infection levels under these conditions. When compared to
control mosquitoes, antibiotics treated ones presented about 6 times more viral
RNA, measured by Real Time PCR (Fig 7). This result suggests that blood
meal-induced activation of innate immune pathways, especially of Rel2 by the
increase in gut microbiota that follows a blood meal, is required to control of
pathogen entry and infection.
4 – Discussion
Despite all the knowledge that exists about immune response to fungi
and bacteria, much less is known about innate response to viral infection. The
Toll pathway was identified as an important part of D. melanogaster response
against Drosophila X virus (DXV). AMP genes were regulated by viral infection
reaching levels similar to those found in bacterial infection, but overexpression
of these genes did not diminish viral titers in flies, suggesting a that other
effector molecules than AMPs that are also under control of the Toll pathway
are involved in resistance against virus [30]. Investigating D. melanogaster
response to Drosophila C virus (DCV), [31] showed that JAK/STAT pathway is
activated in D. melanogaster after viral infection and that several viral-induced
genes contained the consensus binding site for STAT, a transcription factor of
JAK/STAT pathway [32]. In this study we analyzed the activation of the three
major immune-related pathways in A. aegypti mosquitoes by making an mRNA
expression profile of its transcription factors in different situations after blood
meal and SINV infection. Ours results showed an up regulation of aaRel 1 and
aaRel 2, two NF-kB homologs and STAT in Aedes albopictus cells persistently
infected with SINV (Fig 1). However, only a mild up regulation was observed in
vivo, in orally infected mosquitoes at 4 DPI (Fig 2), a time point when we have
already found production of viral transcripts and when other authors have
reported that there is intense viral replication in the midgut and that infection is
already disseminated throughout the insect body [33].
To get infected by a virus, females must ingest blood from an infected
host and the virus must be capable of enter and replicate in midgut cells
(outcoming the so-called midgut infecting barrier). After that, the virus must
leave the midgut towards the hemocoel and other organs (overcoming the
midgut escape barriers). Studies of refractoriness to viral infection of
arboviruses in natural populations have shown that frequently midgut barriers
are the major component of the vectorial competence [34], leading to the
conclusion that a better comprehension of the cell biology of the midgut
epithelium will be essential to understand host-pathogen interaction. The data
presented here showed that all three transcription factors of immune pathways
studied here were up regulated after blood meal, but not after a BSA meal, what
means that this activation was not a reaction to midgut distention (Fig 3).
Furthermore, mosquitoes fed with blood and SBTI were not capable of inducing
aaRel 1, what suggests this regulation is somehow dependent on blood
digestion (Fig 3A).
One important factor triggered by blood meal is the enormous increase of
commensal microbiota in the gut [35]. Proliferation of gut microbial population
could explain the increase of immune related transcription factors observed
here for aaRel 2, which was down regulated after antibiotic treatment (Fig 4B).
Expression of aaRel 1 and STAT in blood fed mosquitoes, on the other hand,
(Fig 4A and C) was equally increased both in normal and in antibiotics treated
insects, suggesting that the increase in expression observed after a blood meal
was not related to the presence of the microbiota, being triggered by the
presence of one or more digestion products.
SINV transcript levels in antibiotics treated mosquitoes 4 DPI were
significantly higher than in non-treated mosquitoes. We believe that the
decrease observed in aaRel 2 after elimination of microbiota might accomplish
for this increased viral susceptibility observed in antibiotics treated mosquitoes
(Fig 7B). In this way, we suggest that the increase of the population of gut
microbiota that follows a blood meal leads to the activation of IMD pathway,
which by an unknown mechanism might play an important role in virus control.
This conclusion is in line with some reports that indicated that midgut microbiota
in insect vectors could be very important for parasites survival and infection,
being important for the midgut infection barrier or constituting one [36]. Taken
together our results indicate that the upregulation of all three major midgut
immune pathways after a blood meal is important for the control of viral titers in
A. aegypti. In this way, disrupting that response by decreasing aaRel 2
expression leads to higher viral infection, indicating the importance of the insect
immune balance in controlling pathogen invasion after blood meal.
Besides, as far as we know, this is the first work to emphasize the
upregulation of midgut immune pathways caused by a non infected blood meal.
We believe that, in addition to being effective in control of SINV infection, this
might be an important adaptative mechanism developed by the mosquito to turn
on midgut immune pathways in the moment it is exposed to different pathogens.
In this way, this “anticipatory” immune trigger might constitute a key mechanism
to the establishment of the so called midgut infection barrier (MIB), which has
been shown to be the most important barrier to the establishment of all the
mosquito infections studied so far [37].
Recently, Xi et al.,[38] reported the role of Aedes aegypti Toll pathway in
controlling Dengue Virus infection. In this article it is shown that activation of
transcription of Toll controlled genes is observed in infected mosquitoes and
that a constitutive activation of Toll pathway by “knock down” of cactus by RNAi
leads to increased levels of viral particles in the mosquito. The same is not
observed for the IMD pathway, which is suggested to play a minor role in the
control of Dengue infection. It is also suggested that the mosquito’s natural
microbiota might modulate Dengue virus infection, through stimulation of the
mosquito’s immune system. Our results working with sindbis virus are in
agreement with these data and reinforce the idea that activation of basal
immunity by the gut microbiota might be important to an effective antiviral
response in the mosquito. It is also noteworthy that both in our work and in the
report from Xi et al., activation of Toll, IMD and Jak/STAT pathways are
observed after an infected blood meal, what might represent a general pattern
for mosquito response to a viral infection.
On the other hand, data showed here clearly points to an important role
for IMD pathway in controlling Sindbis infection, as can be observed by the
increased viral levels in antibiotics treated mosquitoes, which do not activate
aaRel 2 after a blood meal. Additional studies are still required to demonstrate if
this activation is required specifically for the control of Sindbis virus or if it can
also be involved in the control of other virus, such as Dengue.
Acknowledgements
We are grateful to Katia Anastácio Laia and S. R. Cassia for technical
assistance. This work was supported by grants from HHMI, PRONEX and
CNPq.
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Capture do figures
Fig 1 – C6/36 SINV infected cells
C6/36 cells were infected with sindbis virus (MOI=10) and incubated at 28 °C.
RNA extraction were performed at 0, 1, and 7 DPI. Viral titer was estimated by
Real Time PCR with primers for SINV genomic RNA, using 0 DPI as reference
(A). aaRel 1 (B), aaRel 2 (C) and STAT (D) mRNA expression were also
measured by Real Time PCR using RP49 as endogenous control and mock
infected cell as reference..
Fig 2 – SINV infected mosquitoes
Female mosquitoes were infected with sindbis virus (approximately 10
8
) and
maintained for 4 DPI. RNA extraction were performed at 1, 4 and 7 DPI. Viral
titer was estimated also by Real Time PCR with primers for SINV genomic
RNA, using 1 DPI as reference (A). aaRel 1, aaRel 2 and STAT (B) mRNA
expression was measured by Real Time PCR using RP49 as endogenous
control and non-infected mosquitoes as reference.
Fig 3 – Blood feeding induces immune activation in mosquitoes
Female mosquitoes were artificially fed on sugar, rabbit’s blood, blood with
SBTI or BSA. Midguts were dissected 24 hours after feeding. aaRel 1 (A),
aaRel 2 (B) and STAT (C) mRNA expression were measured by Real Time
PCR using RP49 as endogenous control and sugar fed mosquitoes as
reference.
Fig 4 – Antibiotics treated mosquitoes
Mosquitoes were treated with antibiotics (penicillin/streptomycin) during four
days, dissected and midguts were homogenized and platted onto a LB-agar
medium. Bacteria colonies were estimated 24 h after plating.
Fig 5 – Antibiotics treatment decreases aaRel-2 expression
Mosquitoes treated with antibiotics (penicillin/streptomycin) during four days
were infected by artificial blood feeding. aaRel 1 (A), aaRel 2 (B) and STAT (C)
mRNA expression was measured by Real Time PCR using RP49 as
endogenous control and non-treated mosquitoes as reference.
Fig 6 – Viral load in antibiotics treated mosquitoes
Viral titers were estimated by Real Time PCR with primers for SINV genomic
RNA, using RP49 as endogenous control and non-treated mosquitoes as
reference.
Figure 1
Figure 2
Figure 3
Figure 4
Figure 5
Figure 6
Apêndice B
BYC, an atypical aspartic endopeptidase from Rhipicephalus
(Boophilus) microplus eggs
Maria Clara L. Nascimento-Silva
a
, Alexandre T. Leal
b
, Sirlei Daffre
c
, Luiz Juliano
d
,
Itabajara da Silva Vaz Jr.
b
, Gabriela de O. Paiva-Silva
a
,
Pedro L. Oliveira
a
, Marcos Henrique F. Sorgine
a,
⁎
a
Instituto de Bioquímica Médica, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, Brazil
b
Centro de Biotecnologia, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, Brazil
c
Departamento de Parasitologia, Instituto de Ciencias Biomedicas, Universidade de Sao Paulo, Sao Paulo, Brazil
d
Departamento de Biofisica, Escola Paulista de Medicina, Universidade Federal de São Paulo, São Paulo, Brazil
Received 24 August 2007; received in revised form 13 December 2007; accepted 14 December 2007
Available online 28 December 2007
Abstract
An aspartic endopeptidase was purified in our laboratory from Rhipicephalus (Boophilus) microplus eggs [Logullo, C., Vaz, I.S., Sorgine, M.H.,
Paiva-Silva, G.O., Faria, F.S., Zingali, R.B., De Lima, M.F., Abreu, L., Oliveira, E.F., Alves, E.W., Masuda, H., Gonzales, J.C., Masuda, A., and
Oliveira, P.L., 1998. Isolation of an aspartic proteinase precursor from the egg of a hard tick, Rhipicephalus (Boophilus) microplus. Parasitology 116,
525–532]. Boophilus yolk cathepsin (BYC) was tested as component of a protective vaccine against the tick, inducing a significant immune response
in cattle [da Silva, V.I., Jr., Logullo, C., Sorgine, M., Velloso, F.F., Rosa de Lima, M.F., Gonzales, J.C., Masuda, H., Oliveira, P.L., and Masuda, A. ,
1998. Immunization of bovines with an aspartic proteinase precursor isolated from Rhipicephalus (Boophilus) microplus eggs. Vet. Immunol.
Immunopathol. 66, 331–341]. In this work, BYC was cloned and its primary sequence showed high similarity with other aspartic endopeptidases. In
spite of this similarity, BYC sequence shows many important differences in relation to other aspartic peptidases, the most important being the lack of
the second catalytic Asp residue, considered to be essential for the catalysis of this class of endopeptidases. When we determined BYC cleavage
specificity by LC-MS, we found out that it presents a preference for hydrophobic residues in P1 and P1' in accordance to most aspartic
endopeptidases. Also, when analyzed by circular dicroism, BYC presented high β sheet content, also a characteristic of aspartic endopeptidases. On
the other hand, although both native and recombinant BYC are catalytically active, they present a very low specific activity, what seems to indicate
that this peptidase will digest its natural substrate, vitellin, very slowly. We speculate that such a slow Vn degradative process might constitute an
important strategy to preserve egg protein content to the hatching larvae.
© 2007 Elsevier Inc. All rights reserved.
Keywords: Rhipicephalus microplus; Aspartic endopeptidases; Catalytic mechanism; Vitellin degradation
1. Introduction
The hard tick Rhipicephalus (Boophilus) microplus (Acari:
Ixodidae) is a bovine ectoparasite responsible for great econom-
ical losses in tropical and subtropical areas of the globe, such as
Central and South America and Australia. Besides the damage
caused by blood feeding, R. microplus is also the vector of several
lethal cattle diseases, such as babesiosis and anaplasmosis
(Jongejan and Uilenberg, 2004).
Endopeptidases form a large protein functional group and
account for almost 2% of all sequenced genes in eukaryotic
genomes (Barrett et al., 1998). The knowledge about aspartic
endopeptidases catalytic mechanism is very limited when com-
pared to other endopeptidases. The exact mechanism by which the
A
vailable online at www.sciencedirect.com
Comparative Biochemistry and Physiology, Part B 149 (2008) 599 – 607
www.elsevier.com/locate/cbpb
⁎
Corresponding author. Universidade Federal do Rio de Janeiro, Centro de
Ciências da Saúde, Instituto de Bioquímica Médica, Bloco D-Sala SS05-Ilha do
Fundão, RJ-CEP: 21.941-590 Brazil. Tel.: +55 21 25626751.
1096-4959/$ - see front matter © 2007 Elsevier Inc. All rights reserved.
doi:10.1016/j.cbpb.2007.12.007
hydrolysis reaction takes place is not completely understood, but
it is known that, in the catalytic pocket of aspartic endopeptidases,
two aspartic acid residues are responsible for binding water
molecules, essential for the cleavage of the peptide-bond.
Structural characterization of retropepsins, the aspartic endo-
peptidases of retroviruses, provided support to the concept that
the two aspartic acid residues are essential for peptide-bond
hydrolysis by aspartic endopeptidases. Since retropepsins have
only one Asp residue in each polypeptide chain, this enzyme
only works as a homodimer (Lapatto et al., 1989).
In this work, the cDNA coding for BYC was cloned by RT-
PCR and the analysis of its deduced amino acid sequence
confirmed great similarity with other aspartic endopeptidases.
However, BYC sequence showed a unique feature, which was
the lack of the highly conserved second Asp residue found in
the active site of this class of endopeptidases. We have tried to
define molecular aspects of the protein catalysis for this unique
enzyme and speculate about the consequence of the lack of one
Asp catalytic residue to the enzyme role in yolk degradation and
tick development.
2. Materials and methods
2.1. Animals
R. (B.) microplus of Porto Alegre strain, were reared on
calves obtained from a tick-free area and mai ntained at the
Faculdade de Veterinaria of the Universidade Federal do Rio
Grande do Sul, Brazil. Engorged adult females were kept in Petri
dishes at 28 C and 85% relative humidity. Eggs were collected at
the first day after oviposition and were frozen at − 70 C until use.
2.2. Egg homogenates
Eggs were homogenized in a Potter-Elvehjem tissue grinder in
20 mM Tris–HCl buffer, pH 7.4, with soybean trypsin inhibitor
(20 μM), leupeptin (10 μM), and benzamidine (20 μM). Egg
homogenates were centrifuged at 45,000 g for 60 min at 4 °C. The
floating lipids and the pellet were discarded, and the crude egg
extract supernatant was used for protein isolation.
2.3. Electrophoresis
Polyacrylamide gels (10%) were run in the presence of SDS at
a constant current of 20 mA. Gels were stained with Coomassie
Blue G according to the method of Neuhoff et al., 1988.and
destained with deionized water.
2.4. Native BYC purification
BYC was purified as previously described (Logullo et al.,
1998). Briefly, first-day egg homogenate was applied to an anion
exchange DEAE-Toyopearl (20 × 3 cm) column equilibrated
with 10 mM Tris–HCl, pH 8.4 and eluted with a NaCl gradient
(0 to 0.3 M NaCl) at a 1 mL/min flow. Fractions containing BYC
(identified by SDS-PAGE) were concentrated in a Speed-Vac
system (Savant) and applied to a Sephacryl S-200 column
(120 × 2.4 cm) equilibrated with 0.15 M NaCl, 10 mM Tris–HCl
buffer, pH 7.2. Protein purity was monitored by SDS-PAGE.
2.5. cDNA cloning and analysis
Total RNA from fat bodies of engorged female ticks was
purified using TRIzol reagent (Invitrogen Inc.). Five micrograms
of total RNA were reverse transcribed using the ‘Superscript pre-
amplification system’ (Invitrogen Inc). A degenerated primer
(CGNAARGAYCGNATHATHATG) based on BYC amino-
terminal sequence (Logullo et al., 1998) was used together with
a NotI-(dT)18 primer (Amersham Pharmacia Biotech) to amplify
BYC cDNA in a 35 cycles PCR reaction (94 °C for denaturation,
55 °C for annealing and 70 °C for extension) using Pfx DNA
polymerase. The PCR product was analyzed in 1% agarose gel
and extracted using “Concert Rapid Gel Extraction System” (Life
Technologies Inc.). This product was cloned into a pT7Blue-3
vector using the Perfectly Blunt TM cloning kit (Novagen Inc.),
according to the manufacturer's instructions. DNA sequencing
was performed using the dideoxy method at the Molecular
Genetics Instrumentation Facility of the University of Georgia.
Several clones produced in different PCR and cloning reactions
were sequenced.
The obtained sequences were subjected to similarity
searches in non- redu nda nt sequence databases such as NCBI
(www.ncbi. nlm. nih.go v/BLAST ). Multiple alignments were
made using ClustalW (www.expasy.org)(Thompson et al.,
1994) and T-co ffee, version 1.4(http: //www. ch. em bne t.org/
software/TCoffe e.htmL)(Notredame et al., 2000). Physico-
chemical a nd structural fe at ures were analyz ed using the fo l-
lowing programs : Prot-Para m (www.expasy.org), for gener al
parameters (Guruprasad et al., 1990); SignalP 3.0 (http://www.
cbs.dtu.dk/s erv ices/ Sign alP/ ) for signal peptide cleavage site
identification; PROSITE search (www.expasy.org) for second-
ary structure prediction (Bairoch et al., 1997); SwissModel
First Approach Mode (http://www.expasy.org/spdbv/)for
secondary structure comparison and alignment and SwissM o-
del First Approach Mode (ht tp://www.expasy. org/spdbv/ )for
tertiary structure modeli ng (Pe itsch and Tschopp , 1995; Guex
and Peitsch, 1997; Sch wed e et al., 2003).
2.6. Recombinant BYC
The amino acid sequence of the BYC clone obtained in this
work was incomplete when compared to the sequence de-
termined by Logullo et al., 1998, since the six N-terminal amino
acids were absent. In order to express recombinant BYC, the full
coding sequence was restored by PCR and sub-cloned into a
pET32b (Novagen) vector, producing a recombinant protein
fused with histidine tagged thioredoxin protein (rBYC-trx) (Leal
et al., 2006).
Recombinant BYC (rBYC-trx) was expressed in inclusion
bodies. The in clus io n bod ies were purified as described by
Marks et al., 2001. Briefly, the induction w as made using
1 mM I PTG in 250 m L of LB medium for 6 h at 37 °C. Cultures
were centrifuged at 3000 × g for 10 min at 4 °C, the cell pellet
was incubated in KTE (50 mM Tris pH 8, 100 mM KCl, 1 mM
600 M.C.L. Nascimento-Silva et al. / Comparative Biochemistry and Physiology, Part B 149 (2008) 599–607
EDTA) with 5 μg/mLDNAasefor10minandsonicatedonice.
After that, the preparation was centrifuged at 15,000 ×g for
15minat4°CandwashedwithKTE.Thisprocedurewas
repeated four times. The obtained inclusion bodies were
washed tw ice in 20 mM Tris pH 8.5, 2.5 mM EDTA, 5 mM
imidazole, 1% Triton X-100, centrifuged at 27,000 ×g for
10minat4°Candsolubilizedin15mL0.3%N-laurosyl
sarcosine with 50 mM CAPS, pH 11, and 1 mM DTT for
30 min at room temperature. After that, the preparation was
centrifuged at 11,000 × g for15minat4°Candthesupernatant
was collected and dialyzed at 4 °C against 0.15 M NaCl,
20 mM Tris–HCl, pH 8.0, using three refolding steps, 4 h per
step:1)0.1mMDTT2)bufferonly3)with0.2mMoxidized
glutathi one and 1 mM reduced glutathion e. Protein purity was
monitored by SDS-PAGE.
2.7. Proteolytic activity
To determine peptidase activity, both native and recombinant
BYC were incubated in 0.1 M sodium acetate buffer, pH 3.5, at
37 °C with its substrates. Abz-peptidyl-EDD np fluorogenic
substrates (6 μM) were incubated with 0.5 μM of the enzyme
and the reactions were monitored after 12 h by measuring the
fluorescence (excitation at 320 nm wavelength, emission at
420 nm) with a Cary Eclipse spectrofluorometer.
2.8. Hemoglobin hydrolysis and BYCs cleavage specificity
analysis by LC-MS
To foll ow hydrolysis of hemoglobi n, 20 μgofnativeBYC
and 20 μg of bovine hemoglobin were incubated in 0.1 M
sodium acetate buffer pH 3.5, at 37 °C for different times.
Reactions were stopped by the addition of 3 μlofSDSsample
buffer to the 15 μl of the reaction mixture and the samples were
immediately boiled for 3 min. Hemoglobin h ydrolysis was
observed by SDS-PAGE.
For analysis of cleavage specificity, 50 μg of native BYC and
65 μg of bovine hemoglobin were incubated in 0.1 M sodium
acetate buf fer pH 3.5, at 37 °C for 12 h in a 50 μl reaction. This
reaction was diluted 10 times in 0.05% TFA and fractioned in a
C18 capillary HPLC column equilibrated in 5% acetonitrile, 0.05%
TFA and eluted by a 5–80% acetonitrile gradient. This column was
coupled to a Finnigan LCQ Duo ion T rap mass spectrometer . Data
was obtained with 3 s intervals in a 150–2000 m/z range. The
sequenced fragments were analyzed by T urbo Sequest (Thermo
Finnigan) software, using bovine proteins database.
2.9. Circular dichroism
CD spectra were made at room temperature in a Jasco J-715
spectropolarimeter, between 190–260 nm, using a 1 mm cuvette
Fig. 1. BYC cloning. BYC complete nucleotide and amino acid sequence. The box marks the region corresponding to the primer used for PCR. The shaded region
corresponds to the pre-pro-region. The asterisk corresponds to the cleavage site of the pre-pro-BYC, predicted using SignalP, which matches the amino terminal
determined by Edmann degradation (Logullo et al., 1998).
601M.C.L. Nascimento-Silva et al. / Comparative Biochemistry and Physiology, Part B 149 (2008) 599–607
and 0.05 mg/mL of BYC, in 0.10 M sodium acetate buffer, pH
3.5.
2.10. Fluorogenic synthetic peptides
All fluorogenic peptides used in this work were synthesized
as previously described (Hirata et al., 1991).
3. Results
3.1. BYC cloning
The amino-terminal sequence, obtained by Edman degrada-
tion of native BYC (Logullo et al., 1998), was used to construct a
degenerated primer (CGNAARGAYCGNATHATHATG) that,
together with a NotI-(dT) 18 primer, was used to clone BYC
from tick fat body RNA (GenBank accession no. AY966003).
The obtained cDNA was Blasted against B. microplus sequences
available at The Institute for Genomic Research (TIGR) Gene
Index Project (http://compbio.dfci.harvard.edu/tgi/cgi-bin/tgi/
gimain.pl?gudb=b_microplus) and a sequence named
BEACL02 was identified as identical to BYC, containing not
only its coding sequence but also its 5'UTR. When translated,
the obtained sequences encodes a protein of 375 amino acids
(41,844.6 Da) with a pI of 5.38 (Fig. 1). When this cDNA
sequence was used to perform a search in NCBI Blastp database,
some of the closest obtained identities were with aspartic
endopeptidases from Schistossoma mansoni (GenBank acces-
sion no. SMU60995) and Aedes a egypti (GenBank accession
no. H477377) (34% and 35%, respectively), which were aligned
with BYC in Fig. 2.
3.2. BYC sequence analysis
When BYC sequence was compared with other aspartic
endopeptidases, we noticed some import an t differences in the
amino-acids of its active site ( Fig. 2). The substrate b inding S2
sub-site,inthecarboxy-endofBYCaminoacidsequencewas
not preserved, as well as the nearby conserved cysteine pair.
But the most important change was the absence of the second
aspartic acid residue, highly conserved in this enzyme class. As
previously desc ribed, aspar tic endopepti dases have two
aspartic residues, responsible for binding the water m olecules
in its active site, leading to substra te hydr olys is (Barre tt et al.,
1998).
3.3. Secondary and tertiary structure prediction
BYC amino acid sequence was analyzed using Predictpro-
tein (Columbia University) and SWISS-MODEL software for
secondary structure prediction. The higher identity matches in
SWISS-MODEL template databa se were with re nnin, from
Mus musculus (code 1smrA, 32% identity) and Homo sapiens
(code 1hrnA, 33% identity). The predicted secondary structure
Fig. 2. Alignment of BYC amino acid sequence wi th Aedes aegypti (GenBank accession no. H477377) and Schistossoma mansoni (GenBank accession no.
SMU60995) aspartic endopeptidases. The structural and functional domains are assigned: Conserved loops are shaded, catalytic aspartic residues are in gray
boxes marked with an arrow; S2 substrate subsite i s assigned with a dark star; S3 substrate subsite is assigned with a white star and Cys residues with
arrowheads.
602 M.C.L. Nascimento-Silva et al. / Comparative Biochemistry and Physiology, Part B 149 (2008) 599–607
showed a predominance of β-sheet, which was in accordance
with the circular dichroism spectra of native BYC, which
displayed a typical β-sheet profile, with a negative peak at
216 nm (Fig. 3).
Using the alignments with M. musculus and H. sapiens
rennins we obtained a tertiary structure model for BYC, using
the “first approach” mode of Swiss-Model. Besides, another
alignment was don e, using T-Coffee software, having human
recombinant renin (PDB- 2Ren) as template. Fro m this second
alignment, another BYC model was made, using the “Alignment
Interface” mode of Swiss-Model. Both models were analyzed on
RasTop and SPDBV software and the main residues were
located in nearly identical positions. The comparison of BYC
model with renin structure showed a serine residue in BYC
sequence that would be in the same position occupied by one of
the rennin catalytic asp residues, suggesting a role for this amino
acid in BYC catalytic mechanism (Fig. 4).
3.4. Determinat ion of cleavage specificity by LC-MS
Native BYC activity was tested against hemoglobin, a classic
substrate for aspartic endopeptidases (Fig. 5). When incubated
in acidic medium for 12 h, purified native BYC was able to
hydrolyze hemoglobin. However, when incubated in neutral
medium or in presence of pepstatin A, an aspartic endopeptidase
inhibitor, proteolysis was totally abolished.
Considering that BYC is an active aspartic endopeptidase
that lacks an important residue in its catalytic site, we wanted to
determine its cleavage specificity. BYC (20 μg) was incuba ted
Fig. 3. Circular Dichroism of BYC. BYC presented a β-sheet typical profile,
with a negative peak at 216 nm.
Fig. 4. BYC Structure prediction. (A) The prediction was made using first approach mode, SWISS-MODEL. Human recombinant renin PDB — 2ren_ two catalytic
Asp-residues are shown in (B) and BYC residues that align in the active region are shown in (C).
Fig. 5. Bovine hemoglobin hydrolysis by BYC. SDS PAGE (20%) of BYC
incubated with hemoglobin for 12 h. 1-BYC and hemoglobin without incu-
bation, 2-acidic medium pH 3.5, 3-acidic medium i n the presenc e of pepstatin
A and 4-neutral medium.
603M.C.L. Nascimento-Silva et al. / Comparative Biochemistry and Physiology, Part B 149 (2008) 599–607
with hemoglobin (20 μg) for 15 h. The reaction mixture was
analyzed in a HPLC capillary C18 column coupled to a mass
spectrometer (LC-MS). The proteolysis products were partially
sequenced and analyzed using a bovine protein database. It
was possible to identify 17 different BYC cleavage sites in
hemoglobin sequence (Fig. 6A).
3.5. Fluorogenic synthetic peptides
Based on the cleavage profile obtained by the LC-MS an-
alysis, 14 synthetic peptides with 8 amino acids were made
(from P4 to P4'). In these peptides, P1 and P1' were the
probable cleavage site determined by bovine hemoglobin
proteolysis (Fig. 6A). One more peptide was synthesized,
using a consensus hydrolysis sequence for aspartic endopepti-
dases (peptide A, AIAFFSRQ). All the synthetic peptides were
incubated wi th native BYC for 48 h and the reaction medi um
fluorescence was registered at different times. When the fluo-
rescence values obtained were analyzed, three peptides were
more efficiently cleaved than the others, reaching the maximum
of fluorescence after 20 h of incubation (HSLLVTLA, VVV-
LARNF and AIAFFSRQ); eight peptides presented a lower
cleavage rate (LERMFLSP, AEALERMF, SHSLLVTL, LV-
TLASHL, TAFWGKV, LGRLLVVY, TQRFFESF and GR-
LLVVYP) and the other four were not susceptible at all to
proteolysis by BYC (LDKFLANV, STVLTSKY, FLANVSTV
and LQADFQKV) (Fig. 6B).
3.6. Recombinant BYC activity
Bacteria containing pET-32b/BYC (Leal et al., 2006) were
grown in LB medium with IPTG. The recombinant BYC , fused
with histidine tagged thioredoxin (Trx) was expressed in
inclusion bodies, which were purified to obtain rBYC-Trx.
After refolding, the extraction product presented the expected
molecular mass for rBYC-Trx (50 kDa ) when observed by SDS
PAGE (Fig. 7A).
Recombinant BYC activity was measured using the syn-
thetic peptide A, co nse ns us for aspartic endopeptid ases , in the
same conditions as the native protein. Recombinant BYC was
able to hydrolyze peptide A and its activi ty was abolished in
the presence of pepstatin A, a specific aspartic endopeptidase
Fig. 6. Clevage specificity analysis. (A) Cleavage sites identificed by “⁎” in α and β chains of bovine hemoglobin by overnight 15 h incubations with BYC were
determined by mass spectrometry LC-MS (B) Cleavage profile of the fluorogenic peptides by BYC after a 20 h incubation, pH 3,5 and 37 °C. Results are indicated as
means ± S.E.M. of three independent experiments.
604 M.C.L. Nascimento-Silva et al. / Comparative Biochemistry and Physiology, Part B 149 (2008) 599–607
inhibitor (Fig. 7B). Bacterial extracts containing only PET32b
plasmid showed no activity u nder these conditions (data not
shown).
4. Discussion
4.1. An atypical aspartic endopeptidase
BYC amino terminal sequence (Logullo et al., 1998) was used
to design a degenerated primer to clone its cDNA by RT-PCR
(Fig. 1). The first amino-acids and the 5'UTR of the gene were
further obtained by blasting the obtained sequence against the
Boophilus microplus EST database at the TIGR Gene Index
Project. BYC cDNA sequence (Fig. 1) was compared to other
aspartic endopeptidases. BLASTp analysis showed great
sequence identities (about 35%) with arthropods endopeptidases,
and with those of Schistossoma mansoni (34%). Despite overall
sequence similarity, BYC showed important differences towards
these typical aspartic endopeptidases (Fig. 2). The most important
is the absence of the second Asp residue from the catalytic site.
Since present knowledge about the reaction mechanism of
aspartic endopeptidases establishes that two conserved Asp
residues must bind the water molecules responsible for hydrolysis
of substrate peptide bond, we wonder how BYC could preserve
proteolytic activity even in the lack of this residue of aspartic acid.
A few reports on aspartic endopeptidases that also lack im-
portant residues in their active sites can be found in the literature
and include mammal PSPs, cockroach proteins and an aspartic
peptidase from Plasmodium falciparum.
The Pregnancy Specif ic Proteins (PSPs) are found in placenta
of ungulate mammals and are described as inactive mem bers of
the aspartic endopeptidase family (Xie et al., 1991). PSPs
present several modifications in its catalytic site, among which
the most relevant is the absence of the second Asp residue, a
feature that is also observed in BYC sequence. These proteins
are proposed to have no catalytic activity, in spite of being
capable of binding peptides (up to 7 amino acids) to its active site
(Butler et al., 1982).
Lma-p54 is a surface protein present in adult Leucophaea
maderae and proposed to be closely related to aspartic endo-
peptidases. However, some amino-acid substitutions at the active
site seem to result in the absence of enzymatic activity. Proteolysis
assays performed in conditions close to those observed in the
natural secretions suggested that Lma-p54 is not active on the
insect body surface (Cornette et al., 1991). The most similar
protein to Lma-p54 is the cockroach allergen Bla g 2, of B.
germanica (Arruda et al., 1995) (48.5% amino acid Identity). The
structure of Bla g 2, obtained using recombinant enzyme
expressed in Pichia pastoris revealed that this protein has a
bilobal fold with a large cleft located between the two domains, as
expected for aspartic endopeptidases. However, four critical
amino-acid substitutions in the active site and in the flap region
cause important modifications in the orientation of the aspartate
residues important to its catalytic mechanism (Gustchina et al.,
2005). No enzymatic activity was measured using milk-clotting
and hemoglobin assays but a residual proteolytic activity was
found at high protein concentrations (approximately 4 mM),
suggesting that proteolysis may not be the primary function of this
allergen. (Wünschmann et al., 2005).
Despite a very low activity, both Bla g 2 and PSPs are
capable of biding ligands to its active site (Butler et al., 1982,
Wünschmann et al., 2005) and their role as a ligand-binding or
carrier molecules are under investigation.
Another aspartic endopeptidase presenting a modification in
its catalytic site has been characterized. HAP (Histo-aspartic
endopeptidase) is an aspart ic endopeptidase located in the
digestive vacuole of Plasmodium falciparum that presents a His
residue in the place of the first Asp catalytic residue (Berry et al.,
1999). This substitution allows the enzyme to be active,
although it results in a change of the enzyme optimum pH
towards more neutral instead of acidic ones. This data shows that
other amino-acids can also bind the water molecule, performing
role of at least one of the aspartic acid residues in hydrolysis of
substrate peptide bonds. Nevertheless, it is important to notice
that, in the case of BYC, a change in the enzyme optimum
activity pH is not observed, being its activity maximum at acidic
pHs, similar to all the other “classical” aspartic endopeptidases
(Fig. 5).
An alternative explanation would be that BYC, as well as
HIV retropepid ase, works as a dimmer, using only one aspartic
acid residue from ea ch subunit to break the peptide bond.
Nevertheless, all molecular weight determinations, by native
PAGE or gel exclusion chromatography, showed no evidence of
such fact and, indeed, indicate that BYC works as a monomer
(Logullo et al., 1998).
Comparison of BYC amino acid sequence with other aspartic
endopeptidases shows that the region around the first Asp
residue is highly conserved, including the Gln residue of the S3
sub-site, important in substrate binding. In contrast, the region
near the position of the missing Asp residue of BYC is also
different from other aspartic endopeptidases since a sequence
similar to the whole S2 sub-site is not found in the tick peptidase.
Fig. 7. Recombinant BYC is proteolytic active (A) SDS PAGE (10%) of
recombinant BYC 1-Molecular mass marker and 2-purified inclusion bodies.
The arrow indicates BYC. (B) Synthetic peptide A fluorescence when incubated
with recombinant BYC in the absence (1) or presence (2) of pepstatin A. Results
are representative of three independent experiments.
605M.C.L. Nascimento-Silva et al. / Comparative Biochemistry and Physiology, Part B 149 (2008) 599–607
Several studies with vertebrate and fungi aspartic endopepti-
dases suggested that S2 and S3 sub-sites are both essential for
peptidase-substrate interaction (Dunn et al., 1986; Dunn et al.,
1987 and Wong et al., 1997).
Vertebrate cathepsins D present eight conserved loops, some
of them involved in maturation and processing of precursor
polypeptides. Loop 3 is responsible for a cleavage that leads to
dimer formati on, stabilizing the tertiary structure of the enzyme
(Yonezawa et al., 1988). Some enzymes do not have this loop
but, instead, present other cleavage site or never form a dimer.
BYC and the peptidases that alignment better with it did not
present loop 3 (Fig. 2).
Secondary structure prediction using BYC amino acid
sequence indicates a high β sheet content, a known characteristic
of aspartic endopeptidases (Davies, 1990). This prediction was in
agreement with circular dichroism spectra of native BYC (Fig. 3).
When BYC was compared to other aspartic endopeptidases that
already have its tertiary structure determined (SWISS-PROT
database), it presented higher similarity with rennins. Based on the
structure of human rennin, a model for BYC tertiary structure was
created, making it possible to compare the different amino acid
positions in the active site region (Fig. 4). The residue that better
fits the second Asp position, in this model, was a serine. The lack
of a cysteine pair in this region could lead to a modified con-
formation in comparison to other aspartic endopeptidases, sug-
gesting that only a complete resolution of BYC structure, together
with a site-directed mutagenesis study, could answer this question.
4.2. BYC activity, cleavage specificity and import ance to the
tick larvae
Brindley et al., 1997, studied carefully the cleavage
specificity of the cathepsin D — like aspartyl endopeptidases
of S. mansoni and S. japonicum. Using human hemoglobin as
substrate they found 15 and 13 cleavages sites, respectively.
Both enzymes showed preference for hydrophobic residues in
P1 and P1', specially leucine and phenylalanine. BYC cleavage
specificity analysis by LC-MS identified seventeen cleavage
sites in bovine hemoglobin (Fig. 6A). Ten of these sites were in
hemoglobin α chain and seven in β chain. Among them, thirteen
had leucine or phenylalanine in P1 and six in P1'. This profile is
very similar to the one exhibited by S. mansoni cathepsin D
when assayed against human hemoglobin (Brindley et al., 1997).
Furthermore, BYC shares six of the thirteen human cathepsin D
cleavage sites in bovine hemoglobin (Fruitier et al., 1998).
The cleavage profile of synthetic peptides by BYC confirmed
the enzyme preference for hydrophobic and aromatic residues in
P1 and P1' (Fig. 6 B). These results showed that BYC displays a
typical cathepsin D-like cleavage primary specificity, although
lacking an important residue in its active site.
To exclude the possibility that BYC previously demonstrated
activity (Logullo et al., 1998) was due to a min or contamination
of the preparation by another egg aspartic endopeptidase, such
as THAP (Sorgine et al., 2000), we expressed the protein in E.
coli system (Leal et al., 2006). After purification, activity was
tested using synthetic peptide A, showing that the recombinant
enzyme is proteolytically active (Fig. 7) and shows the same
cleavage specificity of the native enzyme. For these reasons, we
believe that BYC, as described here, might constitute a novel
aspartic endopept idase with a unique catalytic mechanism.
Further studies, particularly using single point mutations, are
still necessary to better elucidate its action mechanism.
Vitellins (Vns) are the major storage proteins of arthropod
eggs and are degraded during embryogenesis to provide raw
materials/substrates for embryo development (Postlethwait and
Giorgi, 1985). BYC is associated with yolk degradation in R.
microplus (Abreu et al., 2004). Logullo et al., 2002, showed that
only one third of total Vn is degraded during the embryogenesis
of R. mic roplus – which ta kes about three weeks from
oviposition to hatching
– suggesting that this is a very slow
and controlled process. Besides BYC, two other yolk
endopeptidases from R. (B.) microplus eggs have already been
described: a cysteine endopeptidase VTDCE (vitellin degrading
cysteine endopeptidase) (Seixas et al., 2003) and another
aspartic endopeptidases, THAP (Tick Heme-binding Aspartic
endopeptidase) (Sorgine et al., 2000). If the activity of these
peptidases were not tightly controlled, Vn would probably be
degraded much faster than it actually occurs in vivo. Therefore,
the mechanisms by which each one of these enzymes is
regulated are not only extremely important for a better
understanding of embryogenes is in the tick, but also represents
a very interesting model to increase our understanding on
substrate-enzyme interaction and cleavage specificity.
One important issue about BYC activity is that significant
levels of activity can only be detected after long incuba tions in
high enzyme/substrate molar ratios, sometimes close to 1:1,
indicating that the enzyme possesses a very low specific
activity. It seems much likely that this low specific activity be
due to the lack of the second Asp catalytic residue. BYC is the
most abundant endopeptidase in R. microplus eggs. When
determined by densitometr y of SDS gels, this protein
represents approximately 6% of egg total protein content
(data not shown). Considering that Vn may constitute up to
90% of the egg protein content (Logullo et al., 2002), one may
conclude that the physiological molar ratio of BYC to Vn in
the egg is of approximately 0.6 to 1, which is probably one of
the highest enzyme to substrate ratios ever described. In this
way, if BYC had a high specific activity, Vn would be
degraded too soon, a fact that cannot happen since by the time
of hatching only 40% of the original Vn content has been
consumed and the rest of this protein is necessary to sustain the
larvae before it finds a new host (a process that can take a few
months) (Log ullo et al., 2002). In this way, we believe that the
presence of an endopeptidase with high specificity and low
activity might constitute an important strategy developed by
the tick to spare egg energetic resources for the first periods of
larvae existence.
Acknowledgements
We are grateful to Dr. Misao Onuma for cooperation in
cloning experiments and S R Cassia for technical assistance.
This work was supported by grants from HHMI, PRONEX
and CNPq.
606 M.C.L. Nascimento-Silva et al. / Comparative Biochemistry and Physiology, Part B 149 (2008) 599–607
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Apêndice C
Protein Expression and PuriWcation 45 (2006) 107–114
www.elsevier.com/locate/yprep
1046-5928/$ - see front matter 2005 Elsevier Inc. All rights reserved.
doi:10.1016/j.pep.2005.07.009
PuriWcation and antigenicity of two recombinant forms of Boophilus
microplus yolk pro-cathepsin expressed in inclusion bodies
Alexandre T. Leal
a
, Paula C. Pohl
a
, Carlos A.S. Ferreira
b
, Maria C.L. Nascimento-Silva
c
,
Marcos H.F. Sorgine
c
, Carlos Logullo
d
, Pedro L. Oliveira
c
, Sandra E. Farias
a
,
Itabajara da Silva Vaz Jr.
a,e
, Aoi Masuda
a,¤
a
Centro de Biotecnologia, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Avenida Bento Gonçalves, 9500, Porto Alegre-RS 91501-970, Brazil
b
Laboratório de Imunologia, Faculdade de Biociências, Pontifícia Universidade Católica, Porto Alegre-RS, Brazil
c
Departamento de Bioquímica Médica, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro-RJ, Brazil
d
Laboratório de Química e Função de Proteínas e Peptídeos, Universidade Estadual do Norte Fluminense, Campos de Goytacazes-RJ, Brazil
e
Faculdade de Veterinária, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre-RS, Brazil
Received 11 April 2005, and in revised form 8 July 2005
Available online 8 August 2005
Abstract
The tick Boophilus microplus is a bovine ectoparasite present in tropical and subtropical areas of the world and the use of vaccines
is a promising method for tick control. BYC is an aspartic proteinase found in eggs that is involved in the embryogenesis of B. micro-
plus and was proposed as an important antigen in the development of an anti-tick vaccine. The cDNA of BYC was ampliWed by PCR
and cloned for expression in two forms with and without thioredoxin fusion protein (Trx), coding recombinant proteins named
rBYC-Trx and rBYC, respectively. Expression, solubility, and yields of the two forms were analyzed. The recombinant proteins were
expressed in inclusion bodies (IBs) and three denaturant agents (N-lauroyl sarcosine, guanidine hydrochloride, and urea) were tested
for IBs solubilization. The N-lauroyl sarcosine solubilized 90.4 and 92.4% of rBYC-Trx and rBYC IBs, respectively, and was the
most eYcient denaturant. Two recombinant forms were aYnity-puriWed by Ni
2+
-Sepharose under denaturing conditions. After dial-
ysis, the yield of soluble protein was 84.1% for r-BYC-Trx and 5.9% for rBYC. These proteins were immune-reactive against sera
from rabbit, mouse, and bovine previously immunized with native BYC, which conWrms the antigenicity of the recombinant BYCs
expressed in the Escherichia coli system.
2005 Elsevier Inc. All rights reserved.
Keywords: Boophilus microplus; BYC; Thioredoxin; Inclusion bodies; N-Lauroyl sarcosine; Vaccine
The tick Boophilus microplus is an important cattle
ectoparasite in South and Central Americas, Asia,
Africa, and Oceania [1]. This ixodidae tick causes consid-
erable economical losses to cattle breeding, either
directly, due to the blood-sucking deleterious eVects
which cause losses in animal production, or indirectly by
increasing pest control costs. Besides, B. microplus is a
vector of diseases such as anaplasmosis and babesiosis.
Conventional tick control methods are based mainly on
the use of acaricides, in spite of the high costs and the
rapid appearance of resistance in the tick population [2].
The presence of chemical residues in meat and milk
emphasizes the need for novel control methods [3].
Therefore, eVorts are being made to develop new meth-
odologies to monitor the appearance of acaricide resis-
tance [4] as well as to promote alternative approaches to
tick control such as vaccines [5–9] and biological control
[10–12]. An anti-tick vaccine is considered one of the
most promising methods; however, its development still
*
Corresponding author. Fax: +55 51 3316 7309.
E-mail address: aoi@cbiot.ufrgs.br (A. Masuda).
108 A.T. Leal et al. / Protein Expression and PuriWcation 45 (2006) 107–114
depends on the identiWcation and characterization of
one or more protective tick antigens [13,14]. The success
of this strategy depends on the identiWcation and cloning
of key tick molecules and the characterization of their
roles in arthropod physiology [14,15].
The Boophilus yolk pro-cathepsin (BYC)
1
is an aspar-
tic proteinase present in B. microplus eggs [16]. The
54 kDa BYC is activated in vitro by auto-proteolysis
when incubated in acidic pH, and converted to a 47-kDa
polypeptide that can be detected in vivo, during embryo-
genesis. Recently, the role of BYC was demonstrated in
the degradation of vitellin (VT), the major yolk protein,
conWrming its importance in embryogenesis [17]. Cattle
immunized with puriWed BYC showed an immune
response partially protective against tick infestation that
was mostly due to an increase in the number of sterile
eggs [7]. These data support BYC as an antigen candi-
date to design an anti-tick vaccine. Aspartic proteinases
produced in Escherichia coli are usually expressed in
inclusion bodies (IBs), and fusion proteins as thiore-
doxin (Trx) [18,19] or maltose-binding protein (MBP)
have been used in order to improve solubility of recom-
binant proteins [20]. In the present study, the BYC
cDNA was cloned in a vector with thioredoxin and His-
tag as fusion protein and in other vector only with His-
tag at the carboxy-terminus of the protein. Therefore, we
report the expression of the two recombinant forms of
BYC (rBYC) in E. coli as inclusion bodies, and the anal-
ysis of various denaturants to solubilize the IBs in order
to purify rBYC by aYnity Ni
2+
-Sepharose chromatogra-
phy. We also report the eYciency of solubility and the
recognition of rBYC not fused and fused with Trx by
hyperimmune sera raised in animals immunized with the
native BYC protein.
Materials and methods
Cloning of BYC
The cDNA encoding BYC was previously cloned by
RT-PCR from fat body of engorged tick females (Maria
Nascimento-Silva, personal communication). According
to the amino acid sequencing of BYC [16] the cDNA
was incomplete, without the coding sequence for the six
N-terminal amino acids (GenBank Accession No.
AY966003). The full coding sequence was restored by
PCR and the complete cDNA was cloned into two
expression vectors, pET-32b (Novagen), which produces
a recombinant protein fused with histidine tagged thio-
redoxin protein (Trx), and pET-19b (Novagen), which
produces a recombinant protein fused with a histidine
tag. For cloning into pET-32b vector via NcoI and XhoI
sites, the following primers were used: sense, tatca-
attccatggcaaaaatt cgcattccgcttcgcaaggatcgtattattatgtc;
antisense, atcagggc tcgagttagtacacgattgggcgg (NcoI and
XhoI restriction sites are in italics, the bases coding the
missing amino acids are in bold). PCR ampliWcation
with Elongase polymerase (Invitrogen) was performed
using 10 ng of template plasmid (pT7-Blue/BYC). Reac-
tion conditions were: an initial 5-min denaturation at
94 °C, 30 cycles of 30 s at 94 °C, 30 s at 54 °C, 60 s at
68 °C, and a 5-min Wnal extension at 68 °C. The ampliWed
DNA (1106 bp) sequence encoding the exon of BYC was
digested with NcoI and XhoI, and cloned into plasmid
pET-32b at NcoI/XhoI restriction sites downstream to
the gene of thioredoxin (Trx) and histidine tag to give
the pET-32b/BYC plasmid. For ligation, digested insert
and vector were puriWed in a MicroSpin S-400 HR col-
umn (Amersham Biosciences) and ligated with T4 DNA
ligase (Invitrogen). After the cloning into pET-32b, the
BYC cDNA was subcloned into pET-19b using the fol-
lowing primers: sense, tatcaattccatggcaaaaattcgcattc;
antisense,atcagggctcgagttagtggtggtggtggtggtggtacacgatt
gggcgggtg (NcoI and XhoI restriction sites are in italics,
the encoding histidine tag included into antisense primer
are in bold). Reaction conditions were: an initial 5-min
denaturation at 94 °C, 30 cycles of 30 s at 94 °C, 30 s at
55.9 °C, 60 s at 68 °C, and a 5-min Wnal extension at
68 °C. The 1123 bp PCR product and plasmid were
digested with NcoI and XhoI, puriWed in MicroSpin S-
400 column (Amersham Biosciences), and ligated with
T4 DNA ligase (Invitrogen) to give pET-19b/BYC plas-
mid. The resulting plasmids pET-32b/BYC and pET-
19b/BYC, coding the rBYC-Trx and rBYC proteins,
respectively, were transformed by electroporation into
XL1 Blue E. coli cells (Novagen) and selected in Luria–
Bertani (LB) medium containing ampicillin
(100 gml
¡1
). The BYC cDNA integrity was conWrmed
by sequencing the plasmid DNA.
Expression and preparation of inclusion bodies
The recombinant plasmids pET-32b/BYC and pET-
19b/BYC were transformed into E. coli strain AD494
DES LysS (Novagen) and plated onto LB agar plates
containing ampicillin. Single colonies were inoculated
into 2.5 ml SOB medium [21] containing ampicillin
(100 gml
¡1
) and grown overnight at 37 °C with shaking
at 180 rpm. The overnight cultures were harvested by
centrifugation, resuspended in fresh medium, and used
to inoculate 500 ml of SOB medium in 2-L Xasks. These
Xasks were incubated at 37 °C with shaking at 180 rpm
until an OD
600
of 0.5 was reached. For induction, isopro-
pylthio--
D-galactoside (IPTG, Invitrogen) was added to
a Wnal concentration of 0.4mM and the culture was
1
Abbreviations used: BYC, Boophilus yolk pro-cathepsin; VT, vitel-
lin; IBs, inclusion bodies; Trx, thioredoxin; MBP, maltose-binding pro-
tein; LB, Luria–Bertani; IPTG, isopropylthio--
D-galactoside; GuHCl,
guanidine hydrochloride; ORFs, open reading frames; CMC, critical
micelle concentration.
A.T. Leal et al. / Protein Expression and PuriWcation 45 (2006) 107–114 109
grown at 30 °C for 17 h. The cell culture was centrifuged
at 10,000g for 10 min at 4 °C and the cell pellet was resus-
pended in phosphate buVer (10 mM sodium phosphate,
150 mM NaCl, pH 7.4). For cell lysis, the suspension was
frozen, thawed out and sonicated on ice. The protease
inhibitor PMSF (1 mM) was added prior to sonication.
The soluble and insoluble fractions were separated by
centrifugation at 10,000g for 10 min at 4 °C. The pellet
containing the IBs was resuspended with washing buVer
(50 mM Tris–HCl, 100 mM NaCl, 1 M urea, and 1% Tri-
ton X-100, pH 8.0) and centrifuged at 8000g for 10 min
at 4 °C. This step was repeated three times.
Solubilization of recombinant proteins
The IBs were treated with three denaturant agents
(0.3% N-lauroyl sarcosine, guanidine hydrochloride, and
urea), as described below. After each denaturant treat-
ment, solubilization yields were analyzed by sodium
dodecyl sulfate–polyacrylamide gel electrophoresis 12%
(SDS–PAGE) [22] and protein quantiWcation was deter-
mined by the Bradford method [23] with bovine serum
albumin as standard.
Solubilization with 0.3% N-lauroyl sarcosine
The washed IBs were denatured and solubilized in
lysis buVer A (0.3% N-lauroyl sarcosine, 50 mM CAPS
buVer, and 0.3 M NaCl, pH 11.0) for 1 h and centrifuged
at 10,000g for 15 min at 4 °C. The rBYC-Trx and rBYC
proteins, which contain His-tag, were aYnity-puriWed by
Ni
2+
-Sepharose. In brief, the supernatant was applied to
a His Trap HP column (Amersham Biosciences) and the
column was then washed with washing buVer A (30 mM
imidazole, 0.3% N-lauroyl sarcosine, 50 mM CAPS
buVer, and 150 mM NaCl, pH 11.0). The proteins were
eluted with a serial concentration increase of imidazole
(50, 100, 200, and 500 mM) in elution buVer A (0.3% N-
lauroyl sarcosine, 50 mM CAPS buVer, and 150 mM
NaCl, pH 11.0). Eluted fractions were analyzed by 12%
SDS–PAGE. The denatured puriWed proteins in the
eluted fractions were dialyzed in 20 mM Tris–HCl,
150 mM NaCl buVer with gradual pH reduction (pH 10,
pH 9, and pH 8). Each dialysis step was performed at
4 °C during 12 h against at least 20£ sample volume.
Samples at pH 9.0 were collected for SDS–PAGE
analysis.
Solubilization with 6 M guanidine hydrochloride
and 8 M urea
The washed IBs were denatured and solubilized with
lysis buVer B (20 mM sodium phosphate, 500 mM NaCl,
6 M guanidine hydrochloride (GuHCl), and 1 mM -
mercaptoethanol, pH 7.4) for 1 h and centrifuged at
10,000g for 15min at 4 °C. The solubilized proteins
(rBYC-Trx and rBYC) were puriWed in Ni
2+
-Sepharose
column following the manufacturer’s instructions
(Amersham Biosciences). PuriWcations were performed
under denaturing conditions. Samples were loaded and
the columns washed with the same lysis buVer B contain-
ing 30 mM imidazole. Proteins of interest were eluted
with 100 mM imidazole in elution buVer B (20 mM
sodium phosphate, 500 mM NaCl, and 6M GuHCl, pH
7.4). The puriWed proteins were dialyzed against 20 mM
Tris–HCl, 300 mM NaCl (pH 7.4). Eluted fractions were
analyzed by 12% SDS–PAGE. Urea (8 M) was also
tested for solubilization of recombinant proteins.
Washed IBs were solubilized with lysis buVer C (20 mM
sodium phosphate, 500 mM NaCl, and 8 M urea, pH 7.4)
for 1 h at room temperature. The samples were centri-
fuged at 10,000g for 15 min at 4 °C and the soluble frac-
tions were analyzed by 12% SDS–PAGE.
Western blotting with anti-BYC antibody
To verify antigenicity, Western blot assays using
serum against native BYC of diVerent species were car-
ried out. The recombinant proteins (rBYC-Trx and
rBYC) were separated by 12% SDS–PAGE and trans-
ferred onto a nitrocellulose membrane and probed with
bovine, rabbit or mouse sera (1:500) previously immu-
nized with native BYC. Anti-IgG species-speciWc alka-
line phosphatase conjugates were used as secondary
antibodies and NBT/BCIP (Sigma) were used as sub-
strate.
Results
Cloning of BYC cDNA
The DNA sequence analysis conWrmed the deduced
sequences of the cloned cDNAs, which possess open
reading frames (ORFs) of 1560 bp in pET-32b/BYC, and
of 1101 bp in pET-19b/BYC. These ORFs encode to
polypeptides with predicted molecular masses of
57,563 Da (rBYC-Trx) and 41,257 Da (rBYC), respec-
tively.
Expression of recombinant proteins
rBYC-Trx and rBYC were detected by 12% SDS–
PAGE and immunoblotting against rabbit anti-BYC
serum. The apparent molecular masses of rBYC-Trx
and rBYC were of approximately 56 and 40 kDa,
respectively (Fig. 1). Both supernatant and pellet of cell
lysates were tested for the presence of recombinant
proteins. As shown in Fig. 1, the majority of the
expressed recombinant proteins was present in inclu-
sion bodies. The predicted molecular mass of the BYC
amino acid sequence is 40.4 kDa, but the native BYC is
110 A.T. Leal et al. / Protein Expression and PuriWcation 45 (2006) 107–114
a glycoprotein with apparent molecular mass of 54 kDa
[16]. The major bands visualized in SDS–PAGE were
conWrmed as rBYC and rBYC-Trx proteins by Western
blotting with rabbit anti-BYC serum and showed
apparent molecular masses of 40 and 56 kDa, respec-
tively (Fig. 2).
Solubilization of inclusion bodies
The IBs were partially puriWed after washing with
buVer containing 1 M urea and 1% Triton X-100 (Fig. 1).
Three denaturant agents were tested for solubilization of
recombinant proteins. The alkalinized lysis buVer con-
taining 0.3% N-lauroyl sarcosine was the most eYcient
for rBYC and rBYC-Trx IBs solubilization, as shown in
Fig. 3 and Table 1. The highest yield of solubilization
was achieved with N-lauroyl sarcosine, which was over
90% for both rBYC-Trx and rBYC (Table 1). Guanidine
hydrochloride was also eYcient and solubilized approxi-
mately 78% for rBYC-Trx and 65% for rBYC (Table 1).
The IBs were only partially solubilized in 8 M urea with
more than 80% of rBYC and rBYC-Trx proteins still
residing in the precipitate after lysate centrifugation.
As the recombinant protein-containing IBs were barely
solubilized in 8 M urea, further puriWcation was not
carried out.
PuriWcation of recombinant proteins
rBYC and rBYC-Trx solubilized with the N-lauroyl
sarcosine treatment were puriWed under denaturing con-
ditions using Ni
2+
-Sepharose. This one-step puriWcation
yielded highly puriWed rBYC and rBYC-Trx proteins
(Fig. 4). The recombinant proteins were eluted with both
50 and 100 mM imidazole, although they showed a
higher degree of purity with 100 mM (Figs. 4A and B).
The Xowthrough was loaded a second time onto Ni
2+
-
Sepharose to increase the yield of recombinant protein
recovery. PuriWcation yields with N-lauroyl sarcosine are
summarized in Table 2. The IBs solubilized with 6 M
GuHCl were also aYnity-puriWed by Ni
2+
-Sepharose.
However, rBYC and rBYC-Trx re-aggregated and pre-
cipitated during dialysis for GuHCl removal (data not
shown).
Solubility of puriWed recombinant proteins
The puriWed protein was dialyzed for removal of the
N-lauroyl sarcosine and gradual pH reduction. After
each dialysis step (pH 10, pH 9, and pH 8), an aliquot
was taken and centrifuged to separate soluble and insol-
uble fractions. Analysis by SDS–PAGE indicated that
Fig. 1. SDS–PAGE (12% gel performed under reducing conditions) of
recombinant BYC proteins in soluble and insoluble fractions of crude
extracts stained with Coomassie blue G-250. Samples were lysed with
SDS loading buVer and boiled for 5 min. Lane 1, native BYC; lane 2,
supernatant of pET-19b/BYC bacterial extract; lane 3, pellet of pET-
19b/BYC bacterial extract; lane 4, pET-19b/BYC inclusion bodies
after washing; lane 5, supernatant of pET-32b/BYC bacterial extract;
lane 6, pellet of pET-32b/BYC bacterial extract; and lane 7, pET-32b/
BYC inclusion bodies after washing step. MW marker £ 10
3
.
Fig. 2. Western blot of recombinant BYC proteins in soluble and
insoluble fractions of crude extracts probed with rabbit BYC antise-
rum (1:500). Lane 1, native BYC; lane 2, supernatant of pET-19b/BYC
bacterial extract; lane 3, pellet of pET-19b/BYC bacterial extract; lane
4, pET-19b/BYC inclusion bodies after washing; lane 5, supernatant of
pET-32b/BYC bacterial extract; lane 6, pellet of pET-32b/BYC bacte-
rial extract; and lane 7, pET-32b/BYC inclusion bodies after washing.
Alkaline phosphatase-conjugated anti-rabbit IgG (1:5000) and NBT/
BCIP were used. MW marker £ 10
3
.
Fig. 3. Solubilization of IBs with three denaturant agents. Samples
were analyzed by SDS–PAGE and stained with Coomassie blue G-
250. Samples were resuspended directly in SDS loading buVer and
boiled for 5 min. Lane 1, rBYC 6 M GuHCl treated; lane 2, rBYC N-
lauroyl sarcosine treated; lane 3, rBYC 8 M urea treated; lane 4,
rBYC-Trx 6 M GuHCl treated; lane 5, rBYC-Trx N-lauroyl sarcosine
treated; and lane 6, rBYC-Trx 8 M urea treated. MW marker £ 10
3
.
A.T. Leal et al. / Protein Expression and PuriWcation 45 (2006) 107–114 111
pH reduction was critical for solubility of recombinant
proteins, especially rBYC. As shown in Fig. 5, rBYC was
almost totally precipitated at pH 8.0 and partially pre-
cipitated at pH 9.0. On the other hand, recombinant thi-
oredoxin-fusion protein (rBYC-Trx) remained in
solution after N-lauroyl sarcosine removal at the pH val-
ues tested (Fig. 5). The solubility rates of both recombi-
nant proteins are shown in Table 2.
Western blotting with anti-BYC antibodies
A Western blot with rabbit anti-BYC serum con-
Wrmed the expression of the recombinant proteins and
indicated its immune-reactivity (Fig. 2). Another indica-
tion of antigenicity was the recognition by bovine and
mouse anti-native BYC sera. Sera of bovines immunized
with four doses of native BYC [7] also recognized the
rBYC and rBYC-Trx, with a somewhat weaker intensity
when compared to native BYC, as summarized in Fig. 6.
Anti-native BYC mouse serum also recognized the
recombinant proteins (Fig. 7). These results demonstrate
that the immunogenicity potential was maintained in the
rBYC and rBYC-Trx.
Discussion
Our group has characterized three proteinases from
B. microplus eggs. Two aspartic proteinases named BYC
[16] and THAP [24], and one cysteine proteinase [25].
Fig. 4. SDS–PAGE of N-lauroyl sarcosine solubilized protein fractions after aYnity puriWcation in Ni
2+
-Sepharose. Samples were resuspended
directly in SDS loading buVer and boiled for 5 min. (A) rBYC; (B) rBYC-Trx. Lanes 1, solubilized IBs before puriWcation; lanes 2, proteins in the
Xowthrough fraction; lanes 3, washing fractions with 30 mM imidazole; lanes 4, elution fraction with 50 mM imidazole; lanes 5, elution fraction with
100 mM imidazole; lanes 6, elution fraction with 200 mM imidazole; and lanes 7, elution fraction with 500 mM imidazole. Gel stained with Coo-
massie blue G-250.
T
a
bl
e
2
PuriWcation and solubility rate of recombinant BYC proteins treated with N-lauroyl sarcosine
a
From 1 L of induced culture.
Recombinant
protein
Total protein
in solubilized
IBs (mg)
a
PuriWed protein
with His Trap
column (mg)
Soluble protein (mg) Solubility rate pH 8.0 (%)
pH 9.0 pH 8.0 From IBs From puriWcation
rBYC 90.5 78.6 68.7 4.6 5.1 5.9
rBYC-Trx 120.2 64.9 63.0 54.5 45.4 84.1
T
a
bl
e
1
EYciency of solubilization of inclusion bodies containing the recombinant BYC proteins with three denaturant agents
a
From 1 L of induced culture.
Recombinant protein Denaturant Total protein in
washed IBs (mg)
a
Total protein in solubilized IBs
a
(mg) (%)
rBYC GuHCl 98 64.3 65.7
N-Lauroyl sarcosine 98 90.5 92.4
Urea 98 16.9 17.3
rBYC-Trx GuHCl 133 104.4 78.5
N-Lauroyl sarcosine 133 120.2 90.4
Urea 133 21.0 15.8
112 A.T. Leal et al. / Protein Expression and PuriWcation 45 (2006) 107–114
The most abundant protein (BYC) is the precursor of an
aspartic proteinase that is synthesized in the fat body
and gut of the tick, secreted to the hemolymph, and
stored in the oocyte [16]. This protease is activated by
autoproteolysis under acidic conditions, a process that
has been described in other invertebrates where the par-
ticipation of diVerent classes of acid proteases is also
observed in digestion of egg yolk [26–28]. Recently, it
was demonstrated (in vitro) that BYC is highly speciWc
for vitellin [17], reinforcing the hypothesis that it plays a
key role in the degradation of yolk proteins, an essential
process for embryogenesis [16,17]. In previous reports,
we demonstrated that cattle vaccination with native
BYC induces an humoral response and functional anti-
BYC antibodies were observed in the hemolymph of
ticks feeding on vaccinated cattle [29], resulting in an
overall protection between 14 and 36% of bovines chal-
lenged with B. microplus larvae. Consistent with the
in vitro data, egg fertility and egg laying capacities were
the principal parameters aVected by immunization [7].
Other authors have provided evidence that anti-tick
immunity induced by a cocktail vaccine is more eVective
as compared to a single antigen vaccine [5,30]. Based on
these data we can suggest that BYC is an antigen with
potential to become part of a cocktail vaccine against B.
microplus.
The production of recombinant proteins in heterolo-
gous systems is a key process to vaccine development.
High expression of foreign proteins in bacteria often
results in aggregation and accumulation [31]. This may
be due to a protein translation rate that may exceed the
cell capacity to fold the newly synthesized proteins [32].
Aspartic proteinases produced in E. coli are generally
expressed in IBs [20]. Thioredoxin is a small monomer
which facilitates the soluble expression and refolding of
recombinant proteins [18,19]. To compare the expression
of rBYC and the role of a fusion protein in its solubility,
BYC cDNA was cloned into two vectors, pET-32b and
pET-19b, with and without Trx, respectively. Both
expression vectors induced high levels of recombinant
BYC expression in the E. coli system. However, rBYC
accumulated in inclusion bodies independently of vec-
tors and expression conditions tested. One way to over-
come the formation of inclusion bodies consists in
reducing the protein translation rate by inducing expres-
sion at a lower temperature [33]. We tested inductions at
23 and 18 °C, but the lower temperatures had no eVect
on the expression of soluble rBYC and rBYC-Trx (data
not shown).
Guanidine hydrochloride and urea are denaturing
agents commonly used for solubilization of proteins
expressed in IBs. However, rBYC and rBYC-Trx
obtained in IBs were not eYciently solubilized with 8 M
urea. GuHCl, a strong denaturant, was eYcient in rBYC
and rBYC-Trx solubilization with yields of 65 and 78%,
respectively. GuHCl-solubilized proteins were puriWed
under denaturant conditions in Ni
2+
-Sepharose chroma-
tography (not shown). Both puriWed proteins were
unable to refold eYciently due to aggregation and
Fig. 5. Solubility of the puriWed proteins after dialysis. Samples were
submitted to SDS–PAGE 12% and were stained with Coomassie blue
G-250. Samples were resuspended directly in SDS loading buVer and
boiled for 5 min. Lane 1, rBYC supernatant pH 8; lane 2, rBYC pellet
pH 8; lane 3, rBYC-Trx supernatant pH 8;.lane 4, rBYC-Trx pellet pH
8; lane 5, rBYC supernatant pH 9; lane 6, rBYC pellet pH 9; lane 7,
rBYC-Trx supernatant pH 9; and lane 8, rBYC-Trx pellet pH 9.
Fig. 6. Western blot of puriWed BYC and rBYC probed with bovine
serum anti-native BYC. Lane 1, rBYC-Trx; lane 2, rBYC; and lane 3,
native BYC. Alkaline phosphatase-conjugated anti-bovine IgG
(1:5000). MW marker £ 10
3
.
Fig. 7. Western blot of puriWed BYC and rBYC probed with mouse
serum anti-native BYC. Lane 1, rBYC-Trx; lane 2, rBYC; and lane 3,
native BYC. Alkaline phosphatase-conjugated anti-mouse IgG
(1:5000). MW marker £ 10
3
.
A.T. Leal et al. / Protein Expression and PuriWcation 45 (2006) 107–114 113
precipitation of the proteins once the denaturant was
gradually removed by dialysis. Gradual concentration
reduction of denaturant agent and co-solvents as
glycerol, reduced glutathione, oxidized glutathione, and
L-arginine have been used to improve the refolding of
recombinant proteins solubilized with GuHCl, but the
results are diVerent for each protein [31,34,35,37]. We
have not tested these co-solvents in the refolding of
rBYC, since N-lauroyl sarcosine proved to be a better
denaturing agent for rBYC and rBYC-Trx.
N-Lauroyl sarcosine, an anionic denaturant, reduces
hydrophobicity due to its capacity to interact with
hydrophobic residues, and can be removed by dialysis
when its concentration lies below critical micelle concen-
tration (CMC) [35,36]. N-Lauroyl sarcosine was highly
eYcient for rBYC and rBYC-Trx solubilization with
yields higher than 90%, the best result among the dena-
turants tested. The puriWcation with His Trap column
(Amersham Biosciences) was performed under denatur-
ant conditions, indicating that the N-lauroyl sarcosine
did not abolish adsorption of proteins to Ni
2+
charged
resin. The elution proWle was not aVected by Trx and
most of the contents of both recombinant proteins were
eluted with 100 mM imidazole and SDS–PAGE analyses
showed few contaminating bands (Fig. 4) after a single
puriWcation step. The puriWed proteins were dialyzed for
denaturant removal with gradual pH reduction. The Trx
fusion partner increased the yield of soluble proteins
(rBYC-Trx) after dialysis, which was also inXuenced by
pH. In pH 9.0 solutions, the majority of the recombinant
proteins was soluble. However, in pH 8.0 solutions
rBYC was almost totally precipitated and rBYC-Trx
remained soluble. Therefore, Trx facilitated the recovery
of soluble protein after dialysis. The role of Trx and
MBP in the increase of solubility during refolding of
other recombinant aspartic proteases was previously
described [20]. The predicted pIs of rBYC (5.77) and
rBYC-Trx (5.36) are similar. Thus, the higher solubility
of the rBYC-Trx compared to rBYC is remotely due to
diVerences in the pIs of the two proteins. Sachdev and
Chirgwin [20] suggested that during refolding fusion
proteins block side-reactions, hence avoiding the aggre-
gation of the recombinant proteins.
The BYC amino acid sequence indicates a molecular
mass of 40.4 kDa, whereas the native glycoprotein has a
molecular mass of 54 kDa—a diVerence due to glycosyla-
tion and phosphorylation [16]. Therefore, the possible
involvement of glycosylation in the antigenicity of rBYC
needs to be evaluated. In Western blot, the rBYC and
rBYC-Trx were recognized by rabbit anti-BYC serum
(Fig. 2). This, associated with Western blot assays with
bovine and mouse anti-BYC sera, conWrmed the presence
of antigenicity for both recombinant forms (rBYC and
rBYC-Trx). The recognition of rBYC by hyperimmune
sera conWrms that the recombinant protein displays epi-
topes that were immunogenic in the vaccination with
native BYC. This characteristic is of paramount impor-
tance for a potential vaccine based on rBYC. However,
investigation into the capacity of rBYC to induce protec-
tive humoral response in vaccinated bovines is required to
authenticate its use as vaccine antigen. In this report, we
described a method for expression, solubilization, and
dialysis of the aspartic proteinase, a potential candidate to
design a B. microplus vaccine. The presence of Trx as
fusion protein in rBYC increased the solubility after dialy-
sis of the recombinant protein. In addition, the aggrega-
tion dependence on pH values of dialysis solutions was
demonstrated. This method might be applicable to other
recombinant proteins. In this work, we veriWed that our
recombinant proteins showed similar immunological
properties as compared to native protein. Therefore, het-
erologous expression of recombinant protein could pro-
vide a valuable resource of BYC, which is a potential
candidate as an antigen for multi-component vaccines
against B. microplus.
Acknowledgments
This work was supported by grants from CNPq,
PRONEX, and FAPERGS.
Appendix A. Supplementary data
Supplementary data associated with this article can
be found, in the online version, at doi:10.1016/
j.pep.2005.07.009.
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Apêndice D
Vaccine potential of a tick vitellin-degrading enzyme (VTDCE)
Adriana Seixas
a,1
, Alexandre T. Leal
a,1
, Maria Clara L. Nascimento-Silva
b
,
Aoi Masuda
a,c
, Carlos Termignoni
a,d
, Itabajara da Silva Vaz Jr.
a,e,
*
a
Centro de Biotecnologia, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Avenida Bento Gonc¸alves,
9500 Pre
´
dio 43421, Porto Alegre, RS 91501-970, Brazil
b
Instituto de Bioquı
´
mica Me
´
dica, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, RJ, Brazil
c
Departamento de Biologia Molecular e Biotecnologia, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, RS, Brazil
d
Departamento de Bioquı
´
mica, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, RS, Brazil
e
Faculdade de Veterina
´
ria, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, RS, Brazil
Received 21 December 2007; received in revised form 7 April 2008; accepted 9 April 2008
Abstract
VTDCE (Vitelin-Degrading Cysteine Endopeptidase) is a peptidase with an active role in Rhipicephalus (Boophilus) microplus
embryogenesis. VTDCE is found in the tick’s eggs and was shown to be the most active protein in vitellin (VT) hydrolysis of the
three peptidases already characterized in R. microplus eggs (Boophilus Yolk pro-cathepsin (BYC), Tick Heme Binding Aspartic
Proteinase (THAP) and VTDCE). VTDCE activity was assessed in vitro using the natural substrate and a synthetic substrate (N-
Cbz-Phe-Arg-MCA). The activity was inhibited by anti-VTDCE antibodies. In the present study, it was shown that VTDCE acts
differently from BYC and THAP in VT hydrolysis and that the vaccination of bovines with VTDCE induces a partial protective
immune response against R. microplus infestation. Immunized bovines challenged with R. microplus larvae presented an overall
protection of 21%, and a reduction in the weight of fertile eggs of 17.6% was observed. The data obtained indicate that VTDCE
seems to be important for tick physiology, and that it induces partial protective immune response when inoculated in bovines. This
suggests that VTDCE can be useful to improve the protective capacity observed for other antigens.
# 2008 Elsevier B.V. All rights reserved.
Keywords: Rhipicephalus (Boophilus) microplus; Tick vaccine; VTDCE; Cysteine endopeptidase; Vitellin
1. Introduction
Recently, all Boophilus species including B. micro-
plus were reclassified under the genus Rhipicephalus
(Murrell and Barker, 2003). Consensus says that this
genus includes the major tick pests of cattle in tropical
and subtropical regions of the world (Peter et al., 2005).
Infestations with Rhipicephalus microplus cause eco-
nomical impact to cattle production by impairing
weight gain, reducing milk production, and by
transmitting pathogens that cause babesiosis (Babesia
bovis and Babesia bigemia) and anaplasmosis (Ana-
plasma marginale)(Willadsen, 2006a).
Current tick control methods are based on the use of
acaricides (Graef et al., 2004). However, the use of
acaricides is often accompanied by serious drawbacks,
including environmental, milk, and meat contamina-
tion, apart from the worrisome selection of acaricide-
resistant ticks (Willadsen, 2004; de la Fuente et al.,
www.elsevier.com/locate/vetimm
A
vailable online at www.sciencedirect.com
Veterinary Immunology and Immunopathology 124 (2008) 332–340
* Corresponding author at: Centro de Biotecnologia, Universidade
Federal do Rio Grande do Sul, Avenida Bento Gonc¸alves, 9500 Pre
´
dio
43421, Porto Alegre, RS 91501-970, Brazil. Tel.: +55 51 3308 6078;
fax: +55 51 3308 7309.
1
These authors contributed equally to this work.
0165-2427/$ – see front matter # 2008 Elsevier B.V. All rights reserved.
doi:10.1016/j.vetimm.2008.04.001
2007b). These drawbacks point to an urgent call for new
tick control methods in order to reduce or replace the
use of acaricides, especially in regions where extensive
tick resistance has occurred (Martins and Furlong,
2001; de la Fuente and Kocan, 2006). Among the new
approaches proposed to improve tick control are the use
of pheromone-impregnated decoys for attracting and
killing ticks, of biological control agents, and of
vaccines (Samish et al., 2004; Sonenshine et al., 2006;
Willadsen, 2006b). In this context, the development of
vaccines against tick infestations offers a cost-effective
and environmentally sound control strategy. In addition,
multiantigenic vaccines could be used to target a broad
range of species and prevent or reduce the transmission
of pathogens (Nuttall et al., 2006; Labuda et al., 2006;
de la Fuente et al., 2007a).
The feasibility of vaccination as a control method for
ectoparasites was established over a decade ago with the
commercialization of tick vaccine for cattle, based on
the R. microplus gut Bm86 antigen (Willadsen et al.,
1995; reviewed by de la Fuente et al., 2007b). Since
then, research has continued in search of new antigens,
which could increase the efficacy of tick vaccines. In
recent years, a broad range of molecules of physiolo-
gical importance, including peptidases and their
inhibitors, are becoming gradually available, and such
molecules are now considered putative targets for an
anti-tick vaccine (reviewed by Willadsen, 2006a). Some
of these molecules confer partial protection against tick
infestations, showing that anti-tick vaccine antigens are
not restricted to midgut or salivary glands proteins (da
Silva Vaz et al., 1998; Tellam et al., 2002; Andreotti
et al., 2002; Imamura et al., 2005).
In this context, we have been studying several
physiologic processes in the cattle tick R. microplus in
order to find molecules to be used as targets for an anti-
tick vaccine. One of these processes is tick embryogen-
esis. Three enzymes involved in vitellin digestion in R.
microplus eggs were characterized. Two aspartic-
endopeptidases, the Boophilus Yolk pro-cathepsin
(BYC) and the Tick Heme Binding Aspartic Proteinase
(THAP) (Logullo et al., 1998; Sorgine et al., 2000), and
a Vitelin-Degrading Cysteine Endopeptidase (VTDCE;
Seixas et al., 2003) have been tested as antigen to
immunize bovines, conferring partial protection against
R. microplus (da Silva Vaz et al., 1998; Leal et al.,
2006).
VTDCE is a cysteine endopeptidase naturally
associated to its putative physiological substrate VT.
This enzyme was previously purified from R. microplus
eggs (Seixas et al., 2003) and it is also present in
maternal tissues, including ovary and gut (Seixas et al.,
submitted for publication). In the present study, we
compare the in vitro activity of VTDCE, BYC and
THAP upon the VT different-length peptides (Canal
et al., 1995) and evaluate the use of VTDCE as antigen
for bovine immunization against the cattle tick R.
microplus.
2. Materials and methods
2.1. Antigen preparation
VTDCE was purified from R. microplus eggs
according to the protocol established by Seixas et al.
(2003) with modifications. Eggs from the 1st to the 10th
day after oviposition were homogenized in a Potter-
Elvehjem tissue grinder with 10 mM phosphate buffer,
pH 7.2 (1 g of eggs/ml). The homogenate was
centrifuged (16,000 Â g for 5 min) and the supernatant
was filtered through a sequence of filters (AP glass fiber
filter, 0.45 mm and 0.22 mm). The sample was then
applied onto a 5 Â 5 ml Hitrap Q HP (GE Healthcare,
Uppsala, Sweden) column previously equilibrated with
10 mM sodium phosphate buffer, pH 7.2 and eluted
with a 0–0.8 M NaCl gradient in the same buffer system
at room temperature with a flow rate of 0.5 ml/min.
Activity containing fractions (6–7 ml) were pooled and
submitted to autolysis. In this step, the pooled fractions
were acidified to pH 4.0 with 1.0 M citric acid and
incubated at 37 8C for approximately 3 h, after which
the sample was centrifuged at 3000 Â g for 15 min.
The supernatant was concentrated in a Centricon-10
and applied onto a 1.0 cm  30 cm Superdex 75 HR
(GE Healthcare, Uppsala, Sweden) column equilibrated
with 10 mM acetate buffer, pH 4.0, using a Fast-
Purification-Liquid Chromatography system (FPLC) at
room temperature with a flow rate of 0.5 ml/min. The
pool of active fractions was then applied onto a Mono Q
HR 5/5 column (0.5 cm  5.0 cm), previously equili-
brated with acetate buffer 10 mM, pH 4.0. The enzyme
was eluted with a 0–0.8 M NaCl gradient in the same
buffer.
2.2. Polyclonal antibodies against VTDCE
A rabbit was inoculated subcutaneously with 100 mg
of purified VTDCE emulsified in Freund’s complete
adjuvant followed by three boosters of VTDCE
(100 mg) in Freund’s incomplete adjuvant at 15-day
intervals. The VTDCE used to produce antibodies was
previously tested with a monoclonal anti-VT antibody
to check any VT contamination in the protein
preparation (anti-VT was kindly supplied by Sandra
A. Seixas et al. / Veterinary Immunology and Immunopathology 124 (2008) 332–340 333
E. Farias, Centro de Biotecnologia do Estado do Rio
Grande do Sul, Brazil).
2.3. Enzyme activity and vitellin hydrolysis
Enzyme activity present in chromatographic fractions
was monitored with N-carboxibenzoyl-Phe-Arg-7-
amido-4-methylcoumarin, 14 mM (N-Cbz-Phe-Arg-
MCA (Sigma–Aldrich, St. Louis, USA) as substrate in
50 mM sodium citrate/sodium phosphate buffer, 10 mM
ditiotreitol (DTT; Sigma–Aldrich, St. Louis, USA) in a
microplate fluorimeter (M2e, Molecular Devices Cor-
poration, Sunnyvale, USA) as described by Seixas et al.
(2003). Anti-serum effect was tested using the same
assay described above, except for the fact that the enzyme
was pre-incubated with polyclonal anti-VTDCE or pre-
immune serum (diluted 1:10) for 10 min before
the addition of the substrate. The inhibition values
were calculated by the initial velocity of the enzyme
reaction, deducting the effect caused by pre-immune
serum. The same reaction without serum was developed
as a control.
Vitellin hydrolysis was tested incubating vitellin
purified from 1-day-old egg (60 mg) and the R.
microplus enzymes VTDCE (1 mg), BYC (10 mg)
and THAP (10 mg) in acetate buffer pH 3.5, 1 h at
37 8C. DTT (10 mM) was added to the VTDCE pool
reaction, since this enzyme is a cysteine endopeptidase
and requires reducing conditions for activity. BYC and
THAP are aspartic-endopeptidases, so their enzymatic
activity does not depend on reducing conditions. The
hydrolysis products were analyzed by SDS-PAGE 10%
stained with comassie brilliant blue G. VT and THAP
were purified according to Sorgine et al. (2000) and
BYC according to Logullo et al. (1998).
2.4. SDS-PAGE and Western blot
Samples were electrophoresed on sodium dodecyl
sulfate-polyacrylamide gels (SDS-PAGE) under non-
denaturing conditions (Laemmli, 1970). Electrophor-
esis was performed using a Bio-Rad Mini-Protean Cell
II unit. Resolving and stacking gels were 10 or 14 and
5% polyacrylamide, respectively. In Western blot,
samples were separated by 14% SDS-PAGE (Laemmli,
1970) and transferred to a nitrocellulose membrane
(0.45 mm, Schleicher & Schuell, Germany) at 0.8 mA/
cm
2
for 1 h in a semi-dry system (GE-Healthcare,
Uppsala, Sweden) using 25 mM Tris, 192 mM ami-
noacetic acid, 30% methanol, pH 8.4. Nitrocellulose
sheets were blocked with blotto (5% non-fat cow dry
milk in PBS [sodium phosphate (10 mM), NaCl
(150 mM), pH 7.2] and probed with rabbit polyclonal
antibodies against VTDCE, vaccinated and control
bovine sera diluted in blotto. After 3 washes, anti-rabbit
or anti-bovine IgG alkaline phosphatase conjugates
were used as secondary antibody. Development was
performed with nitro blue tetrazolium/5-bromo-4-
chloro-3-indolyl-phosphate p-toluidine salt (NBT/
BCIP; USB Corporation, OH, USA) as previously
described (Rosa de Lima et al., 2002).
2.5. Bovine immunization and challenge infestation
Hereford breed females (14-month-old) purchased
from a tick-free area were used. The bovines were
individually housed in tick-proof pens on slatted floors
and fed twice a day with hay and concentrate, with
water available ad libitum. The animals were divided
into two groups: control group (bovines 1, 2, 3, 4) and
treatment group (bovines 5, 6, 7, 8). The animals
received 5 subcutaneous inoculations in the neck at
10-day intervals. After the challenge experiment,
animals in the vaccinated group received five boosters
with the orginal vaccine. Treatment group animals
received an emulsion of 1 ml VTDCE (100 mg) plus
1 ml adjuvant (Marcol 52 and Montanide 888). The
control group received emulsion composed of 1 ml
PBS plus 1 ml of adjuvant per dose. Ten days after the
last inoculation, bovines were challenged with 20,000
10-day-old Porto Alegre strain larvae of R. microplus,
Babesia spp. and Anaplasma spp. free. R. microplus
eggs (1 g) were packed into 20 ml-syringes closed
with a cotton plug and kept at colony conditions
(27 8C, 80% humidity) upon larvae hatching. At the
challengedaythesyringeswerefixed,oneperbovine,
on the animal dorsum and the plug was removed to
allow larvae to disperse.
2.6. Serological analysis
Sera samples were collected before the first
inoculation, and 10 days after each subsequent
inoculation before and after the infestation period.
The humoral response was verified by ELISA and
Western blot using purified VTDCE as antigen. For
Western blot, blood samples were collected 10 days
after the fifth immunization. For ELISA analysis,
microtitration plates were coated with 0.1 mgof
VTDCE in 20 mM carbonate buffer (pH 9.6) by
incubation at 4 8C overnight, washed three times and
incubated for 1 h at 37 8C with blotto. The sera diluted
1:100 were considered positive when the reaction of
post-inoculation samples showed a difference in optical
A. Seixas et al. / Veterinary Immunology and Immunopathology 124 (2008) 332–340334
density (O.D.) that was at least twice as high the O.D.
value obtained with pre-inoculation serum (control).
Then rabbit anti-IgG–peroxidase conjugate in 5% blotto
was incubated for 1 h at 37 8C. O-phenylenediamine
(OPD; Sigma–Aldrich, St. Louis, USA) was used as
chromogen and O.D. was determined at 492 nm
(Harlow and Lane, 1988).
2.7. Ticks analysis
Ticks that detached spontaneously from the host
were collected once a day, from the 17th post-challenge
day until the end of the infestation period. Collected
females were classified as fully or partially engorged,
counted and weighed. Up to 5 g of fully engorged
females were incubated at 27 8C, 80% humidity, for egg
laying. Eggs were analyzed, weighed and incubated
again for other 20 days until larvae hatched. Lastly,
larvae were separated and weighed. Overall protection
was calculated based on the number of fully engorged
ticks, egg laying capacity and egg fertility using the
formula (Willadsen et al., 1996; Canales et al., 1997; da
Silva Vaz et al., 1998; Leal et al., 2006):
Overall protection ratio
¼ 100 ½1 ÀðNFE  WE  WLÞ
where NFE—number of fully engorged ticks from
VTDCE vaccinated bovines divided by number of fully
engorged ticks from control bovines, WE—egg laying
capacity of ticks from VTDCE vaccinated bovines
divided by egg laying capacity of ticks from control
bovines, WL—egg fertility of ticks from VTDCE vac-
cinated bovines divided by egg fertility of ticks from
control bovines.
The statistical significance of the results shown in
Table 1 was tested using t-test and ANOVA, as
previously described (da Silva Vaz et al., 1998).
3. Results
3.1. VT hydrolysis by the R. microplus egg
peptidases
SDS-PAGE analysis showed that after 1-h incubation
at 37 8C in acidic pH, VTDCE was able to completely
hydrolyze all VT-related polypeptides. No molecular
weight fragments in the range of 30–130 kDa were
observed (Fig. 1, line 3). The aspartic-endopeptidase
THAP also exerted high activity upon VT at these
conditions. However, the VT hydrolysis by THAP was
only partial, not as complete as the hydrolysis by
VTDCE (Fig. 1, line 5). After incubation, under the
same conditions with BYC, another egg aspartic-
A. Seixas et al. / Veterinary Immunology and Immunopathology 124 (2008) 332–340 335
Table 1
Biological parameters of detached R. microplus from cattle immunized with VTDCE and control group
Group Fully engnorged
b
Index
Bovine Number Weight (g) Fertile eggs (g) Egg laying capacity
c
Egg fertility
d
Control 1 2415 700 6.81 0.415 0.330
2 1915 494 5.64 0.399 0.320
3 1198 309 4.36 0.433 0.286
4 3245 916 6.89 0.402 0.309
Total 8773 2419 23.70 1.650 1.245
Mean 2193 605 5.92 0.412 0.311
S.D. 861 262 1.19 0.015 0.019
VTDCE 5 2019 557 0.40 0.400 0.294
6 1584 414 4.98 0.407 0.357
7 1303 326 4.43 0.404 0.276
8 2586 654 4.61 0.388 0.258
Total 7492 1952 19.53 1.599 1.186
Mean 1873 488 4.88 0.400 0.296
S.D. 559 146 0.47 0.008 0.043
Difference (%)
a
14.60 19.32 17.60 3.09 4.74
a
Difference (%) = 100 Â [1 À (total value of vaccinated group/control group)].
b
Collected during 14 days in the course of the infestation period.
c
The weight of eggs laid by samples of fully engorged ticks, collected daily during 14 days in the course of the infestation period, was used to
calculate the proportion of the weight of ticks that was converted into eggs.
d
Proportion between weight of fertile eggs and weight of eggs laid.
endopeptidase, VT polypeptides were still intact (Fig. 1,
line 4). Moreover, it is important to note that, comparing
with the other two peptidases, VTDCE activity is even
higher than the visual observation suggests (Fig. 1),
because the molar concentration of VTDCE used was
approximately four times lower than that of BYC and
THAP, in this experiment.
3.2. Anti-VTDCE antibodies interfere in enzyme
activity
Immunization of the rabbit with VTDCE induced
specific antibody with an ELISA titer of 16,000. This
immune serum was used for the enzyme inactivation
experiment. The enzyme was pre-incubated with
polyclonal serum anti-VTDCE (diluted 1:10) for
10 min before the addition of the substrate (N-cbz-
Phe-Arg-MCA). Enzyme kinetics was monitored for
30 min and a dose-dependent inactivation was observed
when compared to the control with no serum (Fig. 2,
closed cross). In comparison to the pre-immune serum,
the specific reduction in the enzyme activity was
25 Æ 3.8% with 1 ml of serum, 61 Æ 5.0% with 3 ml and
71 Æ 1.6% with 4 ml of serum. Some unspecific
inactivation was observed when pre-immune serum
was used as a control, though this effect was not as
evident as when anti-VTDCE was used (Fig. 2). This
result shows that antibodies against VTDCE were able
to block the enzyme catalytic activity.
3.3. Homogeneity of VTDCE preparation and
reaction with rabbit polyclonal serum
The VTDCE preparation used for cattle immuniza-
tion was analyzed by SDS-PAGE (14%), and shown to
be homogeneous (Fig. 3). This preparation showed a 17-
kDa protein in SDS-PAGE that corresponds to the lower
molecular weight protein previously characterized by
Seixas et al. (2003) , which can be the result of a distinct
processing during autolysis. However, enzyme prepara-
tion has the same catalytic properties previously
characterized (data not shown). VTDCE was found to
be immunogenic when inoculated in a rabbit, and only
one protein was observed in Western blot (Fig. 3).
3.4. Serological analyses by ELISA and Western
blot
The kinetics of the host humoral response during
immunization and after the challenge with R. microplus
larvae was monitored by ELISA (Fig. 4). Serum
antibody reactivity to VTDCE increased gradually
A. Seixas et al. / Veterinary Immunology and Immunopathology 124 (2008) 332–340336
Fig. 1. Vitellin hydrolysis by the three known R. microplus egg
enzymes with VT digestion activity VTDCE, BYC and THAP. VT
(60 mg) was incubated with VTDCE (1 mg), BYC (10 mg), THAP
(10 mg) in acetate buffer pH 4.0, 1 h at 37 8C (see Section 2). The
hydrolysis products were analyzed by SDS-PAGE 10% stained with
Coomassie brilliant blue G. Molecular weight markers were run at
lane 1 (kDa); lane 2 shows VT (60 mg) used as a control.
Fig. 2. Effect of anti-VTDCE on the VTDCE activity. Rabbit poly-
clonal serum anti-VTDCE (opened) or rabbit pre-immune serum
(closed) diluted 1:10 were incubated with VTDCE (10 min) in
100 ml sodium citrate/sodium phosphate buffer 50 mM, 10 mM
DTT, before adding the substrate N-cbz-Phe-Arg-MCA (1.4 mM).
Enzyme kinetics was monitored per 30 min, and a dose-dependent
inactivation was observed by comparison to the control without serum
(closed cross). Doses of serum are identified by symbols: squares
(1 ml), triangles (3 ml) and circles (4 ml). Enzymatic activity is shown
in relative fluorescence units (R.F.U.).
during immunizations (Fig. 4). A small drop in anti-
VTDCE antibody concentration was observed 50 days
after challenge, and after additional boosters the
immune response increased, suggesting the develop-
ment of immunological memory (Fig. 4). Western blot
analyses confirmed that specific VTDCE IgG was
elicited in vaccinated bovines and no response was
detected in control bovines (data not shown).
The antibody titer of the vaccinated bovine serum on
the challenge day was determined as the dilution that
achieved an O.D. value that was twice that of the pre-
immune serum at the same dilution. Serum samples
were diluted (1:200–1:3200) and tested by ELISA. IgG
titers were 1:200 (bovine 7), 1:400 (bovine 5), 1:800
(bovine 8) and 1:1600 (bovine 6), showing individual
variation among the animals. Bovine 7 had the lowest
titer, since the pre-immune serum of this bovine
presented high unspecific absorbance in ELISA.
3.5. Challenge and changes in tick biological
parameters
Ticks that naturally detached in the period between
the 17th and 30th day post-infestation were collected
daily and some biological parameters were analyzed.
The means of the results for each parameter and the
differences between groups are presented in Table 1.
The fully engorged females showing no macroscopic
lesions were counted and weighed, and a sample of up
to 5 g per day was incubated for egg laying and fertility
analysis. The VTDCE vaccinated bovines presented a
reduction of 14.6% and 19.32% in number and weight
of engorged ticks respectively. These differences were
not statistically significant due to variations in the
responses of different animals. Tick egg laying capacity
and egg fertility were respectively reduced by 3.09%
and 4.74% in vaccinated animals. Also, the difference in
weight of fertile eggs was not statistically significant
( p < 0.07; Table 1). Despite this, the biological
performance of ticks from bovines vaccinated with
VTDCE tended to be lower than that of ticks from
control animals. The overall efficacy of vaccine
formulations against R. microplus considering the
effect on tick infestations and oviposition was 21%.
4. Discussion
Different proteinases that are able to digest VT have
been identified in R. microplus eggs. Our research group
characterized two aspartic-endopeptidases, named
BYC (Logullo et al., 1998) and THAP (Sorgine
et al., 2000), and one cysteine endopeptidase (VTDCE)
(Seixas et al., 2003) involved in VT hydrolysis during
tick embryogenesis. More recently, another cysteine
endopeptidase, RmLCE, was partially isolated and
characterized from R. microplus larvae (Estrela et al.,
2007). Also, the larvae cysteine endopeptidase seems to
play an active role in VT digestion, by providing amino
acids and energy for larval survival until a host is
encountered and feeding starts (Estrela et al., 2007).
Among R. microplus egg protein-digesting enzymes,
VTDCE seems to be the most active enzyme upon VT
(Fig. 1), reinforcing the hypothesis that VTDCE plays a
key role in yolk protein degradation, an essential
process for embryogenesis. In addition, different from
the aspartic-endopeptidases, VTDCE is associated to its
putative physiological substrate (VT). Dissociation was
A. Seixas et al. / Veterinary Immunology and Immunopathology 124 (2008) 332–340 337
Fig. 3. SDS-PAGE (14%) of the purified VTDCE (30 mg) used for
bovine immunization and Western blot using rabbit polyclonal serum
anti-VTDCE (1:300). Molecular weight markers are in kDa.
Fig. 4. Dynamics of the humoral immune response of bovines
immunized with R. microplus VTDCE determined by ELISA (sera
diluted 1:100). Arrows indicate the day of immunization, and the
triangle shows the day of infestation.
only achieved by an autolysis reaction in acidic pH,
which was included in the purification protocol.
Autolysis occurs in pH 4.0, and after that the enzyme
must be maintained in acidic pH, otherwise it
inactivates. Also, after this step VTDCE is susceptible
to additional autolysis, which may cause variation in the
protein size in the final preparation. It is well known
that, for cathepsin L-like enzymes, autolysis is
frequently observed in the final steps of purification
(Cristofoletti et al., 2005). This may explain why the
VTDCE preparation used here shows a different mass in
comparison to values previously found (Seixas et al.,
2003).
VTDCE activity was inhibited in a dose-dependent
manner by a polyclonal anti-VTDCE serum, in vitro.
This is of major importance, if one considers that bovine
functional antibodies (anti-tick proteins) were detected
in the hemolymph of ticks fed in animals immunized
with a R. microplus egg protein (BYC) (da Silva Vaz
et al., 1996). Moreover, this inhibition was observed in
pH 4.0, showing that the antibodies are viable even
under acidic conditions. Unspecific inhibition was
observed in control assays using pre-immune serum
(Fig. 2). Nevertheless, albumin is a major protein in the
serum, and it is known that this protein, as well as
others, like hemoglobin and gelatin, is a substrate for
VTDCE (Seixas et al., 2003). In this experiment, where
the enzyme activity was measured using synthetic
substrate, it is possible that albumin caused a substrate-
competitive inhibition that resulted in enzymatic
activity reduction. Obviously, this is observed even in
assays with pre-immune serum. As both sera came from
the same animal, it does not impair experiment results
since the specific VTDCE inhibition by anti-VTDCE
antibodies was analyzed in the light of the difference
between the inhibition caused by the immune and pre-
immune serum. A control to check the enzyme
preparation was done without serum.
In turn, BYC is very abundant in eggs and expresses
preference for VT over other proteic substrates (Abreu
et al., 2004). However, greater amounts of enzyme
(milligrams) and long periods of incubation are
necessary to detect in vitro VT hydrolysis by BYC
(Abreu et al., 2004). Recently, the native and
recombinant BYC activity upon synthetic and natural
substrates was evaluated, and data clearly show that
BYC digestion rate is in fact slow (Nascimento-Silva
et al., 2008). As it is known that enzyme activity is
strongly decreased as a consequence of modifications in
the active site, the same authors show that BYC action
mechanism is affected by an important mutation, in
comparison with typical aspartic-endopeptidases.
These new data could explain our results that show
that VTDCE is more active than BYC in VT hydrolysis
(Fig. 1).
THAP, the other R. microplus egg aspartic-endo-
peptidase, has its activity upon VT regulated in a
specific manner. THAP uses heme bound to VT as a
docking site to increase specificity and regulate VT
degradation according to heme availability (Sorgine
et al., 2000). These differences among VTDCE, BYC
and THAP may be related to the control of VT
degradation during R. microplus embryogenesis.
As these enzymes are involved in a such very
important physiological process as reproduction, the
study of their potential as targets in an anti-tick vaccine
is impelling. With this objective, BYC was tested in
native (da Silva Vaz et al., 1998) and recombinant (Leal
et al., 2006) forms as immunogen for bovine vaccina-
tion. Cattle immunized with BYC showed a partially
protective immune response (between 14% and 36% for
native and 25% for recombinant protein) against R.
microplus infestations. This protection was mostly due
to an increase in the number of sterile eggs (da Silva Vaz
et al., 1998; Leal et al., 2006). These data support BYC
as a candidate to a multiantigenic anti-tick vaccine.
The use of VTDCE as an antigen for bovine
immunization was supported by the analysis of this
enzyme’s putative role in tick physiology (Seixas et al.,
2003). Initially, its ability to induce a specific antibody
was checked in rabbits. So, in this study, the
characterization of bovine antibody responses provided
by VTDCE immunization and the determination of the
protection against experimental tick infestation was
investigated. ELISA and Western blot analysis reveal
that VTDCE elicited specific antibodies in vaccinated
bovines, while sera from control animals remained
negative during the experimental period. All experi-
mental bovines responded to immunization with
VTDCE and presented titers between 200 (bovine 7)
and 1600 (bovine 6). Individual variation in antibody
titers observed is usual in vaccination of outbred
animals. Immunization of 98 bovines with Bm86
produced variable antibody titers and 6% of the animals
failed to respond to the vaccination, presenting very low
antibody titers (Rodriguez et al., 1995).
Titers obtained for VTDCE were lower than those for
bovines vaccinated with BYC, which presented titers
between 1000 and 6400 (da Silva Vaz et al., 1998; Leal
et al., 2006). The lowest titer was obtained for bovine 7
(200). Different from the others, this bovine showed an
unspecific reactivity, which was already detected in the
pre-immune serum. Moreover, a localized nonspecific
granulomatous reaction was observed at the sites of
A. Seixas et al. / Veterinary Immunology and Immunopathology 124 (2008) 332–340338
inoculation. We do not know whether these findings are
actually able to interfere with the development of
specific immune responses against VTDCE.
In this study, ticks fed on cattle immunized with
VTDCE display changes in biological parameters,
resulting in an overall protection of 21% as compared
with the control group. Considering individual biolo-
gical parameters, vaccinated bovines presented a
reduction of 14.6% and 19.32% in number and weight
of engorged ticks, respectively, and a reduction in the
weight of fertile eggs of 17.6% (Table 1). Also, egg
laying capacity and egg fertility were reduced (3.09%
and 4.74%, respectively). Biological parameters like
these are quite difficult to analyze, because outbred
animals show a strong degree of individual variation.
Apart from this, it is not feasible to perform experiments
with a large number of bovines per group, as observed in
other vaccination and tick challenge experiments
(Riding et al., 1994; Andreotti, 2007; Biesenkamp-
Uhe et al., 2007; Piercy et al., 2007).
Physiological and biochemical studies showed that
VTDCE may play a role in tick survival by offering
nutrients during embryogenesis (Seixas et al., 2003). It
is likely that anti-VTDCE immune response can be
modulated to improve its protective action by altering
the adjuvant or inoculation protocols as dose and
inoculum site. Patarroyo et al. (2002) achieved a
protection of 81% by vaccinating cattle with synthetic
peptides derived from the R. microplus gut protein
Bm86 using twenty times more immunogen (2.0 mg). A
large quantity of VTDCE will be required to carry out
experimental immunizations with higher numbers of
animals; therefore, the production of the recombinant
protein is impelling. Recombinant protein production is
an important step, since the purification protocol of
VTDCE and of other proteins used in tick vaccination
experiments is complex and unpractical for the high-
scale production of an antigen to be used in a
commercial vaccine (Rand et al., 1989; Riding et al.,
1994; Andreotti et al., 2002). Accordingly, we already
cloned and determined the nucleotide sequence of the
VTDCE gene and have initiated the overexpression of
VTDCE in heterologous expression system.
The overall protection afforded by VTDCE is not
enough to allow its use as a sole vaccinal antigen.
Indeed, all studies conducted so far have shown that
there is not one single protein that achieves the
protection level necessary for an efficient and practical
vaccine (de la Fuente and Kocan, 2006). Therefore, a
useful vaccine must be multiantigenic and the VTDCE
protection level could be complementary to the
protective action of other antigens.
Acknowledgments
This work was supported by grants from CNPq,
FINEP, PRONEX, CAPES and FAPERGS.
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