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UNIVERSIDADE LUTERANA DO BRASIL
PRÓ-REITORIA DE PESQUISA, PÓS-GRADUAÇÃO E EXTENSÃO
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM DIAGNÓSTICO GENÉTICO E
MOLECULAR
Estudo de associação entre o polimorfismo VNTR do gene do agrecano
e a doença degenerativa do disco intervertebral
Dissertação de Mestrado apresentada
como requisito para obtenção do
título de Mestre em Diagnóstico
Genético e Molecular.
Edilson Silva Machado
Orientador: Dr. Daniel Simon
Canoas
Agosto, 2007.
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Este trabalho foi desenvolvido no Laboratório de
Genética Molecular Humana do Programa de Pós-
Graduação em Diagnóstico Genético e Molecular
da Universidade Luterana do Brasil,
subvencionado pela Universidade Luterana do
Brasil (ULBRA).
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AGRADECIMENTOS
Aos meus pais, por apoiarem, desde cedo, meus sonhos e empreendimentos.
A minha esposa Graziela, pela compreensão e carinho demonstrados neste período, e
pelo maior presente que poderia ter me dado: Luiza.
Ao meu orientador, Dr. Daniel Simon, por acreditar e tornar concreto este projeto.
Aos profissionais e acadêmicos que, de alguma forma colaboraram neste trabalho.
Aos pacientes, sujeitos da pesquisa, que se doaram para o progresso da ciência.
4
ÍNDICE
RESUMO.......................................................................................................................5
ABSTRACT.................................................................................................. ................6
INTRODUÇÃO.............................................................................................................7
1. DOR LOMBAR.........................................................................................................7
1.1 DEFINIÇÃO.........................................................................................................7
1.2 EPIDEMIOLOGIA...............................................................................................7
1.3 CAUSAS DA DOR LOMBAR............................................................................8
2. COLUNA VERTEBRAL..........................................................................................9
2.1 BIOMECÂNICA.................................................................................................9
2.1 ESTRUTURA MACROSCÓPICA...................................................................11
2.2 ESTRUTURA MICROSCÓPICA....................................................................12
3. DEGENERAÇÃO DO DISCO INTERVERTEBRAL...........................................13
3.1 O PROCESSO DE DEGENERAÇÃO...............................................................13
3.2 FATORES DE RISCO PARA DEGENERAÇÃO... .......................................14
4. JUSTIFICATIVA E OBJETIVOS...........................................................................18
5. ARTIGO: “Associação entre o Polimorfismo VNTR do Gene Agrecano e a Doença
Degenerativa Do Disco Intervertebral”......................................................................19
INTRODUÇÃO...............................................................................................19
MÉTODOS......................................................................................................20
RESULTADOS...............................................................................................23
DISCUSSÃO...................................................................................................24
CONCLUSÃO.................................................................................................26
REFERÊNCIAS...............................................................................................27
TABELA 1.......................................................................................................30
TABELA 2.......................................................................................................31
6. CONCLUSÕES.......................................................................................................32
7. PERSPECTIVAS.....................................................................................................33
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS....................................................................34
5
RESUMO
A dor lombar é queixa comum no consultório médico e apresenta alta prevalência e
grandes conseqüências sócio-econômicas. Ela está fortemente relacionada à degeneração
discal. O disco intervertebral possui uma variedade de proteoglicanos em sua matriz
extracelular, sendo o agrecano o mais abundante deles. A hidratação do disco e a sua
capacidade de resistir às cargas compressivas dependem da integridade das moléculas da
matriz extracelular. Alterações nos proteoglicanos e conseqüente diminuição do conteúdo
aquoso do disco estão fortemente relacionadas com a degeneração discal. Estudos anteriores
indicam que um polimorfismo de número variável de repetições in tandem (VNTR, do inglês
variable number of tandem repeats) no gene do agrecano pode estar relacionado com a
doença degenerativa nos discos lombares. O polimorfismo, localizado no éxon 12, possui
diversos alelos que resultam em variações no tamanho do domínio de ligação do agrecano ao
sulfato de condroitina. Um domínio de ligação mais curto foi associado com o
desenvolvimento de degeneração discal em vários níveis em mulheres japonesas, numa idade
precoce. O presente estudo tem como objetivo analisar o polimorfismo VNTR do gene do
agrecano em um grupo de indivíduos brasileiros com degeneração discal. Foram incluídos no
estudo 54 indivíduos adultos, não relacionados (29 homens, 25 mulheres), com degeneração
discal avaliada através de ressonância nuclear magnética (RNM). Como grupo controle, foram
estudados 100 indivíduos saudáveis doadores de banco de sangue (75 homens, 25 mulheres).
O polimorfismo VNTR foi genotipado através da reação em cadeia da polimerase (PCR)
seguida de eletroforese em gel de poliacrilamida. No grupo controle foram observados 11
alelos e 21 genótipos, com 30% dos indivíduos sendo homozigotos. No grupo de pacientes
também foram observados 11 alelos e 21 genótipos, com 33,3% dos indivíduos sendo
homozigotos. Foi observada uma diferença significativa nas freqüências alélicas entre os
pacientes e o grupo controle (p=0,038). A freqüência de alelos menores que 26 repetições na
amostra de pacientes (16,7%) foi significativamente maior que no grupo controle (8,5%)
(p=0,031). Em conclusão, o presente estudo encontrou uma freqüência significativamente
maior de alelos com menos de 26 repetições na amostra de pacientes com degeneração do
disco intervertebral do que no grupo controle, indicando que o polimorfismo VNTR do gene
do agrecano pode ser um fator de risco para a doença degenerativa do disco intervertebral.
6
ABSTRACT
Back pain is common complain in medical office, and shows high prevalence with
great socio-economics consequences. It is strongly related to intervertebral disc degeneration.
The intervertebral discs have a variety of proteoglycans in the extracellular matrix (ECM),
being the aggrecan the most abundant. The disc capacity to resist to compressive loads
depends on ECM integrity. Breakdown of proteoglycans, resulting in water content loss, is
related to disc degeneration. Studies have shown that a polymorphism of variable number of
tandem repeats (VNTR) in the aggrecan gene could be associated to intervertebral disc
degeneration. This polymorphism, located on the aggrecan gene exon 12, has different alleles
that result in different lengths of aggrecan core protein. Shorter VNTR alleles were associated
to multilevel disc degeneration, which develops at an early age, in Japanese women. In the
present study the aggrecan gene polymorphism was investigated in Brazilian subjects with
disc degeneration. The participants were 54 adults (29 males, 25 females) presenting disc
degeneration in magnetic resonance imaging. The control group was composed by 100
healthy blood bank donors (75 males, 25 females). The aggrecan VNTR polymorphism was
analyzed by polymerase chain reaction (PCR), followed by polyacrylamide gel
electrophoresis. In the control group 11 alleles and 21 genotypes were observed, and 30% of
the individuals were homozygous. In the patients group 11 alleles, 21 genotypes and 33% of
homozygous were observed. A significant difference was found between allele frequencies of
patients and control group subjects (p=0.038). The frequency of alleles shorter than 26 repeats
in the patients group (16.7%) was significantly greater than in control group (8.5%)
(p=0.031). In conclusion, the present study found a significantly greater frequency of alleles
shorter than 26 repeats in the patients with disc degeneration, suggesting that the aggrecan
VNTR polymorphism could be a risk factor for degenerative disc disease.
7
INTRODUÇÃO
1.DOR LOMBAR
1.1 Definição
A dor lombar pode ser definida como desconforto ou dor, espasmo muscular ou
contratura, localizada abaixo do gradil costal e acima das pregas glúteas, estendendo-se ou
não, aos membros inferiores (ciática) (Manek e MacGregor, 2005; van Tulder et al., 2006).
Em relação ao tempo de evolução, ela pode ser aguda (menos de 6 semanas), sub-aguda (6 a
12 semanas), e crônica (mais de 12 semanas). A dor lombar recorrente é definida como um
novo episódio após um período livre de sintomas de 6 meses (van Tulder et al., 2006). A dor
lombar pode ser específica ou inespecífica. A primeira tem ligação com doenças primárias,
tais como câncer, infecções ou fraturas, e soma aproximadamente 1% dos casos. Na história
clínica podem aparecer sinais de alerta (Red Flags), que são fatores de risco associados a estas
patologias: idade, trauma recente, dor torácica, neoplasia prévia (van Tulder et al., 2006). O
restante dos casos (99%), é considerado como dor inespecífica (van den Bosch et al., 2004),
sendo esta, fortemente relacionada com a degeneração do disco intervertebral (Luoma et al.,
2000).
1.2 Epidemiologia
A dor lombar é queixa comum no consultório médico e apresenta alta prevalência e
grandes conseqüências sócio-econômicas (Nachensom e Jonsonn, 2000). A prevalência anual
da dor lombar varia de 15 a 45% na população geral, sendo que desta, 70 a 85% apresentarão
pelo menos um episódio de dor lombar ao longo da vida (Anderson, 1999). Em 1990, 15
milhões de norte-americanos foram a um consultório médico com queixa de dor nas costas
(2,8% do total de consultas) (Hart et al., 1995). Um décimo dos indivíduos que apresenta uma
crise aguda de dor lombar sofrerá cronicamente deste problema, resultando em gastos
médicos, perda da produtividade e custos com benefícios sociais (Urban e Roberts, 2003).
Estas perdas, no Reino Unido, resultam em uma soma anual de 12 bilhões de libras
(Maniadakis e Gray, 2000). O prejuízo econômico com esta doença pode chegar a quase 2%
do Produto Interno Bruto em alguns países (Nachensom e Jonsonn, 2000). A dor lombar é
uma das causas mais comuns de afastamento do trabalho, e uma associação entre a
prevalência de lombalgia e o tipo de atividade laboral tem sido proposta (Guo, 2002). Estudo
8
recente demonstrou que os gastos e perdas econômicas com a dor nas costas nos EUA podem
chegar a 90 bilhões de dólares por ano (Luo et al., 2004). Em estudo comparativo sobre o
afastamento do trabalho devido à dor lombar, descobriu-se que nos EUA, ele é 60 vezes maior
que no Japão, sugerindo que a reação a esta patologia pode variar conforme o país e sua
cultura (Volinn et al., 2005). Fritzel et al. (2004) demonstraram que o custo social de um
paciente submetido à cirurgia de coluna é duas vezes maior do que aquele tratado de forma
conservadora, mas no mesmo estudo também concluíram que os efeitos positivos da cirurgia
foram significativamente maiores que os do tratamento conservador. Uma avaliação dos
custos e dos métodos de tratamento identificou diferenças entre a qualidade e os custos do
tratamento entre diferentes países da Europa (Gandjour et al., 2005). A Dinamarca apresentou
a melhor qualidade de tratamento com o menor uso de recursos. Alemanha, Inglaterra e Suíça
apresentaram até um terço de perda dos recursos em tratamentos não efetivos (Gandjour et al.,
2005).
1.3 Causas da Dor Lombar
A dor lombar está fortemente relacionada à degeneração discal (Luoma et al., 2000).
O processo degenerativo da coluna vertebral é conhecido genericamente como espondilose.
Ele envolve uma seqüência de alterações que ocorrem a nível bioquímico e celular,
biomecânico e morfológico (Adams e Dolan, 2005).
Estudos têm demonstrado alterações degenerativas nos três componentes do disco:
platô vertebral (Benneker et al., 2005), núcleo pulposo e ânulo fibroso (Thompson et al.,
1990). Na segunda década de vida ocorre diminuição do suprimento sanguíneo dos platôs
vertebrais (Boos et al., 2002). Benneker et al. (2005) encontraram correlação entre alteração
da vascularização dos platôs vertebrais e a degeneração discal. O núcleo pulposo, nos
primeiros anos de vida, apresenta células de origem notocordal, as quais vão gradativamente
sendo substituídas por condrócitos de origem mesenquimal (Urban et al., 2000). O conteúdo
aquoso vai diminuindo gradativamente e o núcleo começa a apresentar aspecto fibroso (Boos
et al., 2002). O anel fibroso sofre alterações no turnover do colágeno e torna-se mais propenso
ao surgimento de fissuras (Antoniou et al., 1996). Tais alterações resultam em diversos
fenômenos que podem ser considerados como causa de dor lombar: dor discogênica, prolapso
discal, rupturas anulares, hérnia discal, artrose facetária, lesões do platô vertebral e
sensibilização do nervo sinovertebral (Schwarzer et al., 1995; Adams e Dolan, 2005; Peng et
al., 2005, 2006).
9
A falência estrutural do disco é irreversível e progride devido a mecanismos
mecânicos e biológicos. Herança genética, idade, nutrição inadequada do disco e história de
sobrecarga mecânica são fatores que contribuem para a progressão desta falência (Adams e
Roughley, 2006).
Atualmente não existem terapias realmente efetivas para a degeneração discal e
potenciais aplicações de terapia genética têm sido estudadas (Nishida et al., 2000; Shimer et
al., 2004). Existem diversas opções de tratamento para a dor lombar. Revisões sistemáticas
destas opções têm sido apresentadas, tais como exercícios terapêuticos (Hayden et al., 2005);
ervas medicinais (Gagnier et al., 2007); acupuntura (Furlan et al., 2005); manipulações da
coluna vertebral (Assendelf et al., 2004); procedimentos cirúrgicos, tais como: discectomia
(Gibson et al., 2007) e artrodese (Gibson et al., 2005). Tais condutas visam o alívio dos
sintomas clínicos, entretanto não param com o processo de degeneração. Os procedimentos
cirúrgicos atuais objetivam o alívio da dor, mas não resultam em uma coluna novamente
saudável. Não está contemplada, nas técnicas correntes, a intervenção no disco, na tentativa
de restaurar sua fisiologia normal (Eisenstein e Roberts, 2003).
Para uma intervenção efetiva na patologia do disco intervertebral, é necessária uma
compreensão mecânica e biológica de seus componentes. Embora a patofisiologia exata da
degeneração discal ainda não seja claramente compreendida, as alterações estruturais que
ocorrem neste processo já estão sendo descritas (Cs-Szabo et al., 2002). Avanços no campo
da biologia molecular e celular estão permitindo que se desenvolvam novas abordagens com
intenção de intervir ou modular o curso da degeneração discal. O uso de fatores de
crescimento, tais como o fator de crescimento transformante beta 1 e o fator de crescimento
semelhante à insulina I, para estimular a produção de matriz discal tem sido testado in vitro,
mostrando resultados animadores (Gruber e Hanley, 2003). Estudos sobre potenciais
aplicações da terapia genética para modificar a biologia do disco, com um mecanismo de ação
mais duradouro, são encorajadores (Wallach et al., 2003).
2. COLUNA VERTEBRAL
2.1 Biomecânica
A coluna vertebral é conhecida como o eixo mecânico do corpo (Kapandji, 2000). Este
eixo deve conciliar ao mesmo tempo rigidez e flexibilidade. Esta flexibilidade é obtida graças
ao conjunto de múltiplas peças vertebrais sobrepostas, que apresentam entre si uma discreta
mobilidade, mas, somando-se os diversos segmentos, resulta em um amplo grau de
10
movimento. A vértebra é um osso curto, de forma irregular, com uma porção anterior,
formada pelo corpo vertebral e uma posterior, formada pelo arco posterior. Cada vértebra se
une com sua adjacente através de dois tipos de articulação. Anteriormente, os corpos
vertebrais unem-se entre si através do disco intervertebral. O disco forma uma articulação
cartilagínea (anfiartrose) do tipo sínfise (Goss, 1977). Os elementos posteriores se articulam
através dos processos articulares (articulações zigoapofisárias). Estas articulações são
classificadas como do tipo sinovial e plana (Goss, 1977). A presença destas articulações
permite que a coluna realize movimentos em várias direções (flexão, extensão, rotação,
inclinação). Estudos biomecânicos observaram que os corpos vertebrais e os discos suportam
cargas compressivas, enquanto os processos posteriores e seus ligamentos resistem a forças de
distração (Rockwood et al., 1996).
A coluna pode ser dividida em três porções: coluna anterior - metade anterior do corpo
vertebral e do disco e ligamento longitudinal anterior; coluna média - metade posterior do
corpo vertebral e disco e ligamento longitudinal posterior; e, coluna posterior - complexo
ligamentar posterior (Denis, 1984). A coluna média atua como um fulcro para os movimentos
de flexão e extensão. A coluna anterior, onde se encontram o corpo vertebral e o disco, recebe
65 a 80% da carga compressiva, enquanto a coluna posterior recebe 20 a 35% (Aebi et al.,
1998). Observando a coluna no plano sagital, temos a presença de três curvaturas móveis,
uma com concavidade anterior (cifose) e duas com concavidade posterior (lordose). A
presença de tais curvaturas resulta em um aumento da resistência aos esforços de compressão
axial. Cálculos de engenharia revelam que a resistência de uma coluna com curvaturas é igual
ao quadrado do número de curvas mais um (R = N2 + 1). A coluna vertebral do ser humano
possui 3 curvaturas móveis (cervical, torácica e lombar), logo, é 10 vezes mais resistente do
que seria uma coluna retilínea (Kapandji, 2000).
As pressões que os segmentos vertebrais sofrem, aumentam em direção caudal. Os
segmentos cervicais suportam o peso da cabeça (aproximadamente 3kg), na região torácica
suporta também os membros superiores e parte do tronco (40kg), e na região lombar o
restante do tronco com a soma dos anteriores (60 kg). A este valor devemos acrescentar a
pressão exercida pelo tônus da musculatura paravertebral. Sato et al. (1999) avaliaram a
pressão intradiscal em voluntários normais e encontraram os seguintes resultados: 91 kPa em
decúbito ventral, 539 kPa em ortostatismo e 1324 kPa em ortostatismo com flexão anterior.
Este estudo concluiu que a pressão depende da posição do corpo em indivíduos normais.
Também encontrou diferenças ao comparar voluntários normais e pacientes com degeneração,
onde estes mostraram uma diminuição significativa da pressão intradiscal. O principal papel
11
do disco está relacionado à mecânica, absorvendo e transmitindo cargas e permitindo
flexibilidade à coluna. A alta pressão osmótica dentro do disco (1-3 atmosferas), resultante de
sua hidratação, é um dos fatores que torna o disco hábil para suportar tais cargas (Urban e
Roberts, 2003).
2.2 Estrutura Macroscópica
A formação da coluna vertebral se dá no período embrionário, com células notocordais
e mesenquimais. A porção notocordal dará origem a porção central, chamada de núcleo
pulposo e a mesenquimal a um forte anel externo, chamado ânulo fibroso (Rougley, 2004). O
limite entre as duas regiões é facilmente identificável nas duas primeiras décadas de vida.
O disco intervertebral é uma estrutura complexa, formando, junto com os platôs dos
corpos vertebrais, uma articulação do tipo fibrosa (Goos, 1977). Assim como o tamanho das
vértebras, suas dimensões aumentam no sentido crânio-caudal. O disco lombar humano
apresenta uma média de área de superfície de 1500 mm
2
e aproximadamente 10 mm de altura
(Elliott e Sarver, 2004). Em relação à altura da coluna, o disco ocupa 25 a 30% do total
(Urban e Roberts, 2003). Variações na altura do disco foram observadas ao longo do dia, em
estudo com voluntários jovens, onde se mediu a hidratação e a altura discal através de
ressonância nuclear magnética pela manhã e ao final do dia (Park, 1997). O disco
intervertebral é considerado a maior estrutura avascular do corpo humano (Bartels et al.,
1998), pois não há em seu interior, vasos sanguíneos, sendo a nutrição feita principalmente
através de difusão pelos poros do platô vertebral (Benneker et al., 2005). O disco apresenta
comportamento anisotrópico, principalmente em tensão, com diferentes resistências nas forças
de direção circunferencial, axial e radial (Setton e Chen, 2004). O núcleo suporta 75% da
pressão exercida sobre a coluna, sendo os restantes 25% distribuídos no anel fibroso. Em
condições fisiológicas, o ânulo fibroso recebe carga significativa durante os movimentos
articulares. Tais cargas resultam em deformação e saliência de sua periferia. A cartilagem dos
platôs vertebrais (superior e inferior) apresenta um papel crítico na regulação da pressão
intradiscal, pois regula o fluxo de nutrientes, metabólitos e fluidos do disco (Selard et al.,
2003).
12
2.3 Estrutura Microscópica
O disco possui elementos celulares esparsos, dispersos na matriz extracelular (MEC).
A quantidade de células representa menos de 1% do conteúdo discal, isto é, aproximadamente
5000/mm
3
(Urban e Roberts, 2003). Na matriz encontramos fibras colágenas, proteoglicanos e
água. A proporção dos componentes, bem como seu arranjo, é diferente entre o ânulo e o
núcleo. O ânulo fibroso é formado por uma série de 15 a 25 anéis concêntricos (lamelas),
compostos basicamente de fibras colágenas. Os tipos mais comuns de colágeno são o tipo I e
o tipo II (80% do total) (Roughley, 2004). As lamelas estão orientadas aproximadamente a 60
graus em relação ao eixo vertical do platô vertebral e são perpendiculares entre si. Fibras de
elastina descansam entre as lamelas, provavelmente auxiliando no retorno a forma normal
após uma carga compressiva. O núcleo pulposo é composto por fibras colágenas e
proteoglicanos (Urban et al., 2000).
O disco possui uma variedade de proteoglicanos em sua matriz extracelular: grandes
agregantes (agrecano e versicano) e pequenos componentes intersticiais (versicano, decorina
,
biglicano, fibromodulina, lumicano e perlecano) (CS-Czabo et al., 2002). O principal
proteoglicano, agrecano, é formado por uma proteína central ligada a mais de uma centena de
glicosaminoglicanos altamente sulfatados, principalmente sulfato de condroitina e sulfato de
queratan (Alberts et al., 2002). Estas cadeias, carregadas negativamente, atraem moléculas de
água, tornando o disco altamente hidratado (a água soma de 65 a 80 % do volume de um disco
saudável). A alta pressão osmótica resultante, de 1 a 3 atmosferas em seu interior, é a força
que permite ao disco continuamente absorver água (Eisenstein e Roberts, 2003). O agrecano
irá inchar até ser contido pela tensão da rede de colágeno, outro importante componente da
matriz. O equilíbrio entre estas duas substâncias cria um tecido resistente à carga, o qual
mantém cada unidade da coluna em sua posição relativamente correta, enquanto permite o
movimento desta estrutura rígida. O gel de agrecano apresenta outras funções. Ele determina
com que rapidez os fluidos entram e saem do disco. O agrecano também controla o tamanho
dos poros da matriz, que são de aproximadamente 2-4 nm (Eisenstein e Roberts, 2003) .
Os pequenos proteoglicanos se ligam às fibras de colágeno, a fatores de crescimento e
a outros componentes da matriz. Acredita-se que eles tenham um papel importante na
regulação da montagem e reparo do disco após uma lesão (Cs-Czabo et al., 2002).
Funcionalmente, a rede formada pelas fibras de colágeno oferece resistência às forças de
tensão, e os proteoglicanos às forças de compressão (Schmidt et al., 1990).
A matriz contém também proteínas comuns em tecidos conectivos, como fibronectina
e elastina, sendo que a primeira aumenta seus níveis quando há degeneração (Oegema et al.,
13
2000). A molécula de elastina está associada com a capacidade do tecido em suportar cargas
compressivas e recuperar sua forma normal após cargas compressivas (Yu, 2002). A matriz
extracelular está em constante produção e degradação de seus componentes (Roberts et al.,
2000).
3. DEGENERAÇÃO DO DISCO INTERVERTEBRAL
3.1 O processo de degeneração
Na visão macroscópica, os limites entre o ânulo fibroso e o núcleo pulposo são
facilmente identificáveis nas duas primeiras décadas de vida. Com o aumento da idade, a
estrutura das fibras vai se desorganizando e o gel perdendo sua hidratação (Buckwalter,
1995). As células notocordais são gradualmente substituídas por células de origem
mesenquimal (condrócitos) até o final da primeira década de vida (Smits e Lefebvre, 2003). O
fato das células notocordais desaparecerem no início da segunda década de vida, na mesma
época em que iniciam as alterações degenerativas, faz supor uma relação causal entre os fatos
(Oegema, 2002). Alterações degenerativas, relacionadas com a idade, reduzem o diâmetro
sagital do núcleo e conseqüentemente diminuem a pressão hidrostática interna, o que resulta
em aumento da pressão na porção posterior do anel fibroso em até 160%. O aumento de
pressão nesta região pode ser a causa da ruptura do disco (Adams et al., 1996).
Alterações nos proteoglicanos, e conseqüente diminuição do conteúdo aquoso do
disco, alteram suas características mecânicas, e estão fortemente relacionadas com a
degeneração discal (Adams et al., 1996). No processo de degeneração ocorre perda do
agrecano, o que resulta em alterações químicas e mecânicas nas células que controlam a
matriz. Com o agrecano diminuído, a mesma carga neste disco resultará em aumento da
deformação da matriz e das células nela presentes. O equilíbrio entre a síntese e a degradação
se perde neste caso, e há um aumento de enzimas conhecidas como metaloproteinases de
matriz (MMPs). As MMPs formam uma família de enzimas que são capazes de degradar a
maioria dos componentes estruturais da matriz (Roberts et al., 2000). Níveis elevados destas
enzimas têm sido encontrados em discos com processo degenerativo (Goupille et al., 1998).
Estudos em animais têm demonstrado uma mudança na expressão gênica quando ocorre lesão
do disco, o que suporta a necessidade de mais estudos sobre quais genes são ativados no
processo degenerativo (Anderson et al., 2002). O núcleo pulposo é um tecido biologicamente
14
ativo e responde a estímulos pró-inflamatórios. Os principais mediadores encontrados foram
interleucina 6 e 8 e prostaglandina E2 (Burke et al., 2003).
Há evidências de que a degeneração ocorra inicialmente no núcleo pulposo do disco
(Nishida et al., 2000). O que causa exatamente o início do processo degenerativo ainda não
foi esclarecido. A natureza avascular do disco resulta em baixo nível de oxigenação, baixo pH
e a pequena quantidade de células na matriz, contribuindo para a degeneração (Antoniou et
al., 1996). O grau de degeneração pode ser avaliado através de análise macroscópica do disco
(Thompson et al., 1990; Adams et al., 1996), através de exames de imagem (Fardon et al.,
2001), ou pela avaliação dos componentes e sua renovação (Antoniou et al., 1996). Durante o
processo de degeneração discal, a expressão de mRNA de proteoglicanos das células do
núcleo pulposo diminui, conseqüentemente o conteúdo protéico também cai, tornando o disco
mais vulnerável à degeneração (Cs-Szabo et al., 2002).
3.2 Fatores de risco para degeneração
A degeneração discal pode ser interpretada como conseqüência inevitável do
envelhecimento. Ela foi detectada na autópsia de 97% dos indivíduos acima de 50 anos de
idade (Buckwalter, 1995). A natureza avascular do disco também é um fator que explica a
dificuldade de reparo dos danos que ocorrem no disco (Rudert e Tillmann, 1993). A alteração
da celularidade original, com desaparecimento das células notocordais do núcleo pulposo
após a primeira década de vida também tem sido cogitada como fator de degeneração
(Oegema, 2002). A etiologia precisa da degeneração discal, ainda continua controversa, mas
se acredita que a dor lombar seja o resultado da interação de fatores individuais, psicossociais,
ocupacionais, genéticos e biomecânicos (Wallach et al., 2003; Manek e MacGregor, 2005).
Solovieva et al. (2002) estudaram o efeito da obesidade e sua relação com polimorfismos do
colágeno IX, onde encontraram uma relação entre persistência de alto peso e degeneração.
Estudos familiares e estudos de gêmeos têm sugerido que fatores genéticos contribuam
para o desenvolvimento da doença discal. Em revisão de familiares de pacientes jovens
(menores de 21 anos) submetidos a tratamento cirúrgico de hérnia discal, encontrou-se
história familiar positiva em 32% dos casos, comparado com 7% do grupo controle (Varlotta
et al., 1991). Uma revisão de pacientes operados para hérnia discal lombar e seus parentes
próximos sugeriu que há uma predisposição genética para o desenvolvimento de degeneração
e herniação discal (Matsui et al., 1998). Simmons et al. (1996), em estudo com familiares de
65 pacientes submetidos à artrodese da coluna lombar, encontraram história positiva de
15
doença discal em 44,6% dos casos, contra 25,4% dos familiares do grupo controle. Um relato
de espondilose cervical severa, acometendo três pacientes (mãe e dois filhos) foi apresentado
por Origitano e Yoo (1998), sugerindo uma causa hereditária da doença.
Em estudo com mulheres gêmeas, encontrou-se uma forte influência genética na dor e
degeneração discal (Sambrook et al., 2004). Foram comparados exames de ressonância
nuclear magnética e questionários de 1064 mulheres gêmeas (181 monozigóticas e 351
dizigóticas), e se encontrarou evidências de fatores genéticos influenciando a dor lombar e
cervical, tendo a dor lombar uma herdabilidade de 52 a 68% (Sambrook et al., 2004). Esta
observação sugere uma importante influência genética na degeneração do disco intervertebral.
Estudos sobre as bases genéticas da degeneração do disco intervertebral ainda são
escassos. Em estudo com gêmeos, Videman et al. (1998) encontraram um polimorfismo no
gene do receptor de vitamina D relacionado à degeneração discal. Esta associação foi
confirmada também por Kawaguchi et al. (2002). Variações na seqüência das cadeias do
colágeno tipo IX foram relacionadas com doença lombar em um grupo populacional
homogêneo (Annunen et al., 1999). Mas os resultados não se repetiram quando se investigou
um grupo populacional aberto (Kales et al., 2004). Em um grande estudo populacional,
envolvendo 804 voluntários chineses, de 15 a 45 anos, Jim et al. (2005) encontraram
associação entre o alelo Trp2 do Colágeno IX (COL9A2) e degeneração discal. Recentemente
foi demonstrada associação entre polimorfismos da interleucina 1 e degeneração discal
(Solovieva et al., 2004).
Análises bioquímicas do núcleo pulposo obtido em pacientes com hérnia discal têm
revelado elevados níveis de metaloproteinases de matriz e citoquinas nos discos com
degeneração. A MMP3, também chamada estromelisina, apresenta polimorfismo em sua
região promotora, com um alelo possuindo 5 adeninas (5A) e outro 6 adeninas (6A). O
indivíduo com o alelo 5A apresenta um risco maior de desenvolver doença discal (Takahashi
et al., 2001). Seki et al. (2005) encontraram polimorfismos na proteína CILP (Cartilage
Intermediate Layer Protein) associados a sua expressão. Além disso, observaram expressão
aumentada da proteína em indivíduos com doença discal, mostrando ainda uma interação
entre a CILP e TGF-beta. Yu (2002) estudou a função da rede de elastina, presente entre as
fibras colágenas do disco, e encontrou uma rede altamente organizada com diferentes
distribuições e orientações no ânulo e no núcleo.
Doege et al. (1991) realizaram o sequenciamento do principal proteoglicano do disco,
o agrecano. Neste estudo, é citada uma região em CS1 com seqüências de 19 aminoácidos
repetidas diversas vezes e altamente conservadas. Em estudo posterior, Doege et al. (1997)
16
descreveram um polimorfismo na região codificadora do gene agrecano, em forma de número
variável de repetições em tandem (VNTR – Variable Number of Tandem Repeats) (Figura 1).
Foram descritos 13 alelos, com 13 a 33 repetições destas seqüências de 19 aminoácidos. Este
polimorfismo resulta em variação no tamanho da proteína de agrecano (Figura 2). Neste
mesmo estudo foi sugerido que as propriedades funcionais do agrecano também pudessem
apresentar variações.
Kawaguchi et al. (1999) descreveram associação entre um polimorfismo no gene
responsável pela produção do agrecano e doença degenerativa nos discos lombares. O
polimorfismo, localizado no éxon 12, possui diversos alelos que resultam em variações no
tamanho do domínio de ligação do agrecano ao sulfato de condroitina. Um domínio de ligação
mais curto foi associado com uma maior probabilidade de haver degeneração de disco.
Figura 1. Representação do polimorfismo de número variável de repetições em tandem
(VNTR) do gene agreca humano. A parte superior da figura mostra um modelo do agrecano
humano. A linha horizontal representa a proteína e as linhas verticais representam as cadeias
de glicosaminoglicanos ligadas à proteína, com as linhas longas representando o número e
posição das cadeias de sulfato de condoitrina, e as linhas curtas representando as cadeias de
sulfato de queratan. A porção destacada em cinza representa a parte da proteína na qual está
localizado o polimorfismo VNTR. Diferenças nesta região são mostradas para os alelos 27 (o
mais freqüente em diversas populações), 33 (o maior alelo descrito) e 13 (o menor alelo
descrito) (Adaptado de Doege et al., 1999).
17
HA
Figura 2. Variação no número de repetições em tandem no domínio CS1 resulta em
diferentes tamanhos da molécula de agrecano humano. São representadas moléculas de um
indivíduo heterozigoto que possui alelos com pequeno (1) e grande (2) número de repetições.
CS1, domínio de ligação ao sulfato de condroitina 1; CS2, domínio de ligação ao sulfato de
condroitina 2; G1; domínio globular 1; G2, domínio glubular 2; G3, domínio globular 3; HA,
ácido hialurônico; IGD;domínio intraglobular; KS, domínio de ligação ao sulfato de queratan;
LP, proteína de ligação.
18
JUSTIFICATIVA E OBJETIVOS
A dor lombar apresenta alta prevalência e o número de indivíduos que sofrem
cronicamente deste problema causa enorme impacto social e econômico em nosso meio. A
relação entre a dor lombar e a degeneração do disco intervertebral já está bem estabelecida e a
influência de fatores genéticos tem sido investigada em diversos estudos. A possibilidade de
encontrar marcadores genéticos ou celulares que possam prever o risco de desenvolvimento
da doença discal é o primeiro passo para uma intervenção precoce no disco, e pouparia o
sofrimento de milhões de indivíduos.
Tendo em vista a contribuição de fatores genéticos para o desenvolvimento da doença
degenerativa do disco intervertebral, o presente estudo tem como objetivo investigar a
associação entre o polimorfismo do éxon 12 do gene do agrecano e o risco de
desenvolvimento da doença degenerativa do disco intervertebral.
A seguir os dados do presente estudo são apresentados na forma de um artigo a ser
submetido à publicação na revista European Spine Journal.
19
ASSOCIAÇÃO ENTRE O POLIMORFISMO VNTR DO GENE AGRECANO E A
DOENÇA DEGENERATIVA DO DISCO INTERVERTEBRAL
INTRODUÇÃO
A dor lombar é extremamente comum, sendo uma das queixas mais freqüentes em
indivíduos adultos (Deyo et al., 2006). Ao longo da vida, até 84% da população poderá
apresentar um episódio de dor lombar (Walker, 2000). Sua prevalência anual varia de 15% a
45%, e o volume de admissões hospitalares e procedimentos cirúrgicos para o tratamento
desta patologia tem aumentado (Anderson, 1999). Ela é causa comum de afastamento do
trabalho em diversos países (Palmer et al., 2000; Gandjour et al., 2005; Volinn et al., 2005).
Uma crise aguda de dor lombar aguda é usualmente auto-limitada, e se resolve em
aproximadamente seis semanas, mas 2% a 7% destes pacientes poderão desenvolver dor
lombar crônica (van Tulder et al., 2006), resultando em gastos médicos, perda da
produtividade e custos com benefícios sociais (Urban e Roberts, 2003).
Estudos têm demonstrado relação entre a dor lombar e o processo de degeneração do
disco intervertebral (Luoma et al., 2000; Peng et al., 2005, 2006). Não existe uma clara
definição da causa da degeneração discal (Antoniou et al., 1996; Battié et al., 2004; Adams e
Roughley, 2006). Historicamente, fatores mecânicos e ambientais têm sido propostos como
responsáveis pela dor lombar e o processo degenerativo (Guo, 2002; Hartvigsen et al., 2003;
Manek e MacGregor, 2005). Mais recentemente, estudos têm demonstrado uma associação
entre fatores genéticos e degeneração discal (Ala-Kokko, 2002; Battié e Videman, 2006; Chan
et al., 2006). Avanços no campo da biologia molecular têm permitido comprovar a influência
da genética nas doenças ortopédicas (Evans e Rosier, 2005). Abordagens experimentais têm
permitido aos pesquisadores um olhar mais crítico em relação à função da célula discal. Isto é
importante porque a célula produz os componentes da matriz extracelular (MEC), os quais,
por sua vez são os responsáveis pelas funções biomecânicas do disco (Gruber e Hanley,
2003).
No disco, os três principais componentes da MEC são: água, fibras de colágeno e
agrecano, um grande proteoglicano agregador constituído de uma proteína central ligada a
mais de uma centena de glicosaminoglicanos altamente sulfatados, principalmente sulfato de
condroitina (CS) e sulfato de queratan (KS) (Urban et al., 2000). A característica hidrofóbica
20
destes agregados é responsável pela alta pressão osmótica intra-discal, e dela depende a
capacidade do disco de reter água e resistir às forças de compressão (Feng et al., 2006). Com
o envelhecimento, ocorre perda de proteoglicanos e de água no disco, resultando na
diminuição da capacidade funcional do disco (Eisenstein e Roberts, 2003).
A seqüência codificadora completa do gene do agrecano foi descrita por Doege et al.
(1991), e sua localização (15q26) foi descrita por Korenberg et al. (1993). O gene do
agrecano possui 19 éxons, variando em tamanho de 77 a 4224 bp (Valhmu et al., 1995).
Doege et al. (1997) descreveram um polimorfismo no éxon 12 do gene do agrecano, região
que codifica a maioria das ligações de glicosaminoglicanos (sulfato de condroitina e sulfato
de queratan). Este polimorfismo apresenta um número variável de repetições in tandem
(VNTR, do inglês Variable Number of Tandem Repeats). Treze diferentes alelos foram
descritos, variando entre 13 e 33 repetições. Este polimorfismo resulta em indivíduos com
moléculas de agrecano de diferentes comprimentos, sugerindo variação em suas propriedades
funcionais. Em estudo com mulheres jovens com degeneração discal, Kawaguchi et al. (1999)
encontraram relação entre os alelos de menor tamanho do gene do agrecano e degeneração em
idade precoce. Em publicação sobre a associação do polimorfismo do agrecano com a
degeneração do disco intervertebral e da cartilagem articular, Roughley et al. (2006) não
encontraram relação direta entre estas patologias e o polimorfismo.
O presente estudo tem como objetivo investigar a associação do polimorfismo VNTR
do éxon 12 do gene do agrecano e a degeneração do disco intervertebral em indivíduos do Sul
do Brasil.
MÉTODOS
Pacientes
O presente estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa do Hospital Cristo
Redentor e da Universidade Luterana do Brasil. Foram incluídos no estudo 54 indivíduos
adultos, não relacionados, sendo 29 homens (53,7%) e 25 mulheres (46,3%), que procuraram
atendimento com o autor principal, com queixa de dor lombar. A média de idade dos
pacientes foi de 44,7 anos, com desvio padrão de 11,1 anos. A menor idade foi de 17 anos e a
maior de 64 anos. Estes pacientes não apresentavam história de infecção, tumor, ou fratura na
coluna, bem como intervenção cirúrgica prévia ao exame de ressonância nuclear magnética.
Após os pacientes assinarem o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido, responderam a
21
um questionário padronizado, com dados relacionados à profissão, história clínica e perfil
demográfico.
Os exames de ressonância nuclear magnética (RNM) foram avaliados quanto ao grau
de degeneração conforme classificação proposta por Pfirrmann et al. (2001), em imagem
médio-sagital de todo o segmento lombar em T2. Resumidamente, grau I apresenta estrutura
homogênea, brilhante e clara distinção entre núcleo e anulo, com sinal hiperintenso em T2,
com altura discal normal; grau II apresenta estrutura não homogênea, com ou sem bandas
horizontais; grau III apresenta estrutura não homogênea, intensidade do sinal intermediária, de
cor acinzentada; grau IV apresenta estrutura não homogênea, sinal intermediário ou
hipointenso, de cor cinza ou preta, com diminuição do espaço discal; grau V, sinal
hipointenso, de cor preta, sem distinção entre o núcleo e o anel, com colapso do espaço discal.
Realizaram a classificação um ortopedista e um radiologista, de forma cega em relação aos
dados dos pacientes. Os casos discordantes foram analisados novamente em conjunto para se
obter concordância.
Como grupo controle, foram estudados 100 indivíduos saudáveis doadores de banco
de sangue, sendo 75 homens (75%) e 25 mulheres (25%). Os indivíduos incluídos no grupo
controle foram pareados por idade em relação ao grupo de pacientes, sendo que a média de
idade no grupo controle foi de 45,0 anos, com desvio padrão de ± 7,1 anos. A menor idade foi
de 31 anos e a maior de 59 anos. Os indivíduos não foram estratificados por sexo, visto que
estudos recentes não têm demonstrado diferenças significativas entre os gêneros no curso
natural da dor lombar (Mortimer et al., 2006).
Estudando a ancestralidade étnica da população do sul do Brasil Alves-Silva et al.
(2000) e Parra et al. (2003) ressaltam que cruzamentos inter-étnicos ocorreram de forma
massiva durante os 500 anos de história do Brasil, e destacam que grandes áreas urbanas, tais
como a região metropolitana de Porto Alegre (com 3,5 milhões de habitantes) não apresentam
grupos étnicos isolados de forma significativa. Desta forma, os indivíduos estudados são de
uma população que não apresenta estratificação. A população estudada no grupo controle é
descendente de europeus, provenientes principalmente de Portugal, Espanha, Itália e
Alemanha (Salzano e Freire-Maia, 1970).
Extração de DNA:
DNA de alto peso molecular foi extraído a partir de sangue total pelo método descrito
por Boom et al. (1990) para os indivíduos do grupo de pacientes ou pelo método descrito por
Lahiri e Nurnberger (1991) para os indivíduos do grupo controle.
22
Determinação dos genótipos:
O polimorfismo VNTR do gene do agrecano foi genotipado através da amplificação
das amostras pela reação em cadeia da polimerase (PCR). A seqüência dos primers utilizados
foi 5’-ATTGAGTGGCCCAGCACTCCTACG-3’ e 5’ –
AGGTCCCCTACCGCAGAGGTAGAA – 3’. A reação de amplificação foi realizada em 25
µl contendo DNA genômico, 1 mM de cada primer, 1,5 mM MgCl
2
, 200 µM dNTPs, 50 mM
KCl, 10 mM Tris-HCl (pH=8,3) e 1 U de Taq DNA polimerase. As amplificações foram
realizadas em 35 ciclos, cada ciclo consistindo de desnaturação a 94°C por 15 segundos, e
anelamento e extensão a 72°C por 2,5 minutos. Os fragmentos amplificados podiam variar de
742 pares de bases, para o alelo de 13 repetições, até 1882 pares de bases, para o alelo de 33
repetições. As análises moleculares foram realizadas no Laboratório de Genética Molecular
Humana do Programa de Pós-Graduação em Diagnóstico Genético e Molecular da
Universidade Luterana do Brasil.
Análise dos produtos amplificados:
Os fragmentos foram analisados por eletroforese em gel de poliacrilamida 6%. O
tamanho dos fragmentos foi analisado e estimado por comparação com a migração das bandas
de DNA dos marcadores de peso molecular 100pb DNA Ladder (Promega) e Low DNA Mass
Ladder (Invitrogen). Os géis foram corados com nitrato de prata (Sanguinetti et al., 1994).
Análise estatística:
As freqüências alélicas foram determinadas através da contagem direta dos alelos.
Desvios do equilíbrio de Hardy-Weinberg foram calculados através do teste de χ
2
. A
comparação das freqüências alélicas com outras populações também foi realizada através do
teste de χ
2
. Variáveis quantitativas foram comparadas usando o teste t de Student ou o teste
não paramétrico de Mann-Whitney, conforme indicação. Valores de p<0,05 foram
considerados significativos.
23
RESULTADOS
As freqüências alélicas dos pacientes e controles são mostradas na Tabela 1. Os alelos
mais freqüentes foram 26, 27 e 28 em ambos os grupos. No grupo controle foram observados
11 alelos e 21 genótipos, com 30% dos indivíduos sendo homozigotos. No grupo de pacientes
também foram observados 11 alelos e 21 genótipos, com 33,3% dos indivíduos sendo
homozigotos. Foi observada uma diferença significativa nas freqüências alélicas entre os
pacientes e o grupo controle (p=0,038). A freqüência de alelos menores que 26 na amostra de
pacientes (16,7%) é significativamente maior que no grupo controle (8,5%) (p=0,031). As
freqüências alélicas estão em equilíbrio de Hardy-Weinberg nos dois grupos amostrais
estudados. O escore dos genótipos (soma dos alelos) não mostrou diferença entre os dois
grupos (média pacientes = 53,1 ± 3,4; média controles = 53,9 ± 2,1) (Mann-Whitney U test =
2527,5; p=0,504).
No grupo de pacientes, 23 indivíduos apresentaram história de tabagismo (42,6%).
Relataram história familiar de doença discal ou cirurgia da coluna, 29 pacientes (53,7%). O
índice de massa corporal teve uma média de 25,3 ± 3,1. Nenhuma destas variáveis apresentou
associação quando comparada entre indivíduos com 1 ou 2 alelos menores do que 26 e
indivíduos portadores de alelos com 26 repetições ou mais.
Em relação à presença de degeneração, todos os pacientes apresentaram grau III ou
mais em pelo menos um nível. Cinqüenta indivíduos (92,6%) apresentaram degeneração em
mais de um nível. A distribuição dos graus de degeneração por nível é mostrada na Tabela 2.
Em relação à atividade profissional, a amostra de pacientes foi constituída de 13
indivíduos com histórico de trabalho braçal pesado, 10 motoristas (ônibus, caminhão e
empilhadeira) e 31 indivíduos que exerciam atividades consideradas leves e moderadas. A
soma dos graus de degeneração nos 5 níveis foi utilizada para comparar as diversas atividades
profissionais. Foram divididos em 3 grupos: motoristas (n=10, média= 15,9), trabalho braçal
pesado (n=13, média 17,7) e outros (n=32, média 15,7). As diferenças nos somatórios dos
graus de degeneração entre os grupos não foram estatisticamente significativas.
24
DISCUSSÃO
O presente estudo revelou que indivíduos com degeneração do disco intervertebral
apresentam uma freqüência maior de alelos menores do polimorfismo VNTR do gene
agrecano do que indivíduos do grupo controle. Kawaguchi et al. (1999) ao analisarem o
mesmo polimorfismo, compararam mulheres japonesas jovens com e sem degeneração discal.
Foi observada uma diferença significativa na distribuição, com uma maior representação dos
alelos menores (considerados no estudo os alelos 18 e 21) em indivíduos com degeneração em
vários níveis. Desta forma foi sugerido que indivíduos portadores de alelos com menor
número de repetições no gene do agrecano apresentam maior risco de desenvolver
degeneração discal em vários níveis, numa idade precoce. Este foi o primeiro estudo
populacional a investigar a relação do polimorfismo do agrecano com a degeneração discal.
Mesmo com uma amostra de 32 casos e 32 controles, encontrou-se uma diferença
significativa entre os indivíduos afetados e os controles.
Mais recentemente, Roughley et al. (2006) realizaram estudo envolvendo 165
indivíduos de ambos os sexos, divididos em três grupos: degeneração discal (n=44);
osteoartrose do quadril (n=63) e um grupo controle (n=58). Ao analisar o polimorfismo do
gene agrecano, não foram encontradas diferenças significativas entre os grupos. Porém, os
autores comentam as limitações do estudo, tais como tamanho relativamente pequeno da
amostra e larga faixa etária dos participantes (18 a 77 anos). Baseado nos seus resultados e
nos dados escassos da literatura, os autores afirmam não haver certeza se há ou não relação
entre degeneração discal e polimorfismo do gene agrecano, e concluem que, devido a sua
importância clínica, ele continuará sendo objeto de estudo no campo da ortopedia.
Em estudo envolvendo 132 homens finlandeses, com idade de 41 a 46 anos, com três
diferentes atividades profissionais (carpinteiros, motoristas e trabalhadores em escritório),
Solovieva et al. (2007) encontraram uma representação estatisticamente maior do alelo 26
nos indivíduos com sinais de desidratação no exame de Ressonância Nuclear Magnética,
sugerindo o envolvimento do polimorfismo VNTR do gene agrecano na degeneração discal.
A matriz extracelular da cartilagem articular apresenta uma composição semelhante à
do disco intervertebral. O agrecano é um de seus principais componentes, e a capacidade de
resistir a forças compressivas depende da presença de grandes agregados de proteoglicanos.
Assim como no disco intervertebral, uma alteração no agrecano poderia resultar em prejuízo
na função da cartilagem articular (Aigner e McKenna, 2002). O polimorfismo do éxon 12 do
agrecano foi estudado em outras patologias articulares, principalmente osteoartrose, com
25
resultados controversos. Horton et al. (1998), em estudo com 93 indivíduos americanos
caucasóides, demonstraram associação entre o polimorfismo do gene agrecano e osteoartrose
das mãos. Kirk et al. (2003) em estudo de gêmeos australianos sugerem que alguns alelos
(com 25 e 28 repetições) do gene agrecano podem aumentar o risco para algumas formas de
osteoartrose. Em estudo com 530 mulheres trabalhadoras finlandesas, Kämäräinem et al.
(2006) encontraram um efeito protetor do alelo 27 na ocorrência de osteoartrose das mãos e
sugerem uma influência do tamanho do alelo na função da cartilagem. Marosi et al. (2006), ao
estudarem a associação do polimorfismo do gene agrecano e escoliose idiopática familiar em
296 indivíduos (48 famílias), não encontraram relação entre o tamanho dos alelos e a
freqüência da doença, nem com a magnitude da curvatura. Uma forma de displasia
espondiloepifisária (SEDK – Spondyloepiphyseal Dysplasia type Kimberley) foi associada
com uma mutação no gene agrecano por Gleghorn et al. (2005). As displasias
espondiloepifisárias são um grupo heterogêneo de condrodisplasias com anormalidades dos
corpos vertebrais e das epífises proximais. Alguns subtipos (congênita e tardia) são causados
por mutações no gene do colágeno tipo II e no gene Sedlin. Em estudo sobre o locus desta
doença (15q26.1), o gene agrecano foi inicialmente excluído como causador da doença (Eyre
et al., 2002), mas investigações posteriores o incluíram novamente como candidato a causador
da displasia espondiloepifisária (Eyre et al., 2005).
No processo de degeneração do disco intervertebral, ocorre diminuição do conteúdo de
água e degradação dos proteoglicanos (Antoniou et al., 1996). Com a ação das
metaloproteinases, particularmente agrecanases, ocorre degradação das cadeias CS2 do
agrecano (Pratta et al., 2000). Restando apenas as cadeias CS1, se tornam mais pronunciadas
as diferenças de tamanho dos alelos. Os alelos menores, apresentando menor número de
cadeias CS poderiam levar a uma redução na capacidade do agrecano de desempenhar suas
funções estruturais, como, por exemplo, resistir a cargas compressivas, originando um
aumento de suscetibilidade à degradação tecidual (Urban et al., 2000; Roughley et al., 2006).
Cargas compressivas moderadas, que na população em geral seriam inócuas, podem resultar
em dano tecidual nos portadores de alelos menores, desencadeando respostas celulares
adversas como a secreção aumentada de proteases, levando a mais degradação tecidual
(Adams e Dolan, 2005).
26
CONCLUSÃO
O presente estudo encontrou uma freqüência significativamente maior de alelos com
menos de 26 repetições na amostra de pacientes com degeneração do disco intervertebral do
que no grupo controle, indicando que o polimorfismo VNTR do gene do agrecano pode ser
um fator de risco para a doença degenerativa do disco intervertebral.
27
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30
Tabela 1. Freqüências alélicas do polimorfismo VNTR do gene do agrecano em pacientes
com doença degenerativa do disco intervertebral e indivíduos do grupo controle.
Alelo Pacientes
(n=54)
Controles
(n=100)
n % n %
18 1
0,9
0
0
19 1
0,9
0
0
20 0
0
1
0,5
21 4
3,7
2
1,0
22 5
4,6
4
2,0
23 1
0,9
6
3,0
24 1
0,9
0
0
25 5
4,6
4
2,0
26 8
7,4
23
11,5
27 49
45,4
87
43,5
28 26
24,2
68
34,0
29 7
6,5
3
1,5
30 0
0
1
0,5
31 0
0
1
0,5
31
Tabela 2. Grau de degeneração por nível lombar, determinado por ressonância nuclear
magnética (RNM) conforme classificação proposta por Pfirrmann et al. (2001).
Grau de Nível
Degeneração L1-L2 L2-L3 L3-L4 L4-L5 L5-S1
I
II
III
IV
V
n (%)
1 (1,9)
22 (40,7)
21 (38,9)
10 (18,5)
0 (0)
n (%)
1 (1,9)
20 (37,0)
25 (46,3)
8 (14,8)
0 (0)
n (%)
1 (1,9)
14 (25,9)
22 (40,7)
14 (25,9)
3 (5,6)
n (%)
0 (0)
1 (1,9)
19 (35,2)
28 (51,9)
6 (11,1)
n (%)
1 (1,9)
4 (7,4)
17 (31,5)
21 (38,9)
11 (20,4)
32
CONCLUSÕES
1. Este foi o primeiro estudo envolvendo o gene agrecano em uma população brasileira,
tendo sido observados 14 diferentes alelos.
2. Na amostra estudada, não foi encontrada relação significativa entre tipo de atividade
profissional e grau de degeneração.
3. O presente estudo encontrou uma freqüência significativamente maior de alelos com
menos de 26 repetições na amostra de pacientes com degeneração do disco
intervertebral do que no grupo controle, indicando que o polimorfismo VNTR do gene
do agrecano pode ser um fator de risco para a doença degenerativa do disco
intervertebral.
33
PERSPECTIVAS
Problemas associados à degeneração do disco intervertebral impõem um peso
econômico similar ao das doenças cardíacas e maior que outras doenças como a diabetes,
Alzheimer e nefropatias (Maniadakis e Gray, 2000). O disco intervertebral tem sido pouco
estudado quando comparado a outras estruturas do sistema musculo-esquelético e muito
pouco estudado quando comparado a outros sistemas (Urban e Roberts, 2003).
Pesquisas envolvendo a biologia do disco intervertebral têm trazido avanços na
compreensão de seu funcionamento e de possíveis causas da sua degeneração. Diversos
componentes da matriz extracelular têm sido objeto de estudos com relação à influência
genética na função discal (Valdes et al., 2005). Estudos familiares e com gêmeos mono e
dizigóticos foram os primeiros a demonstrar a possibilidade da influência genética na
degeneração discal (Simmons et al., 1996; Richardson et al., 1997; Sambrook et al., 1999).
Com a viabilidade metodológica de investigar polimorfismos dos genes dos componentes
estruturais do disco, vários genes candidatos têm sido analisados (Valdes et al., 2005).
Embora os estudos envolvendo o gene agrecano não apresentem amostras de grande
magnitude, seus resultados têm sido encorajadores (Kawaguchi et al., 1999; Solovieva et al.,
2007). Com a facilidade de troca de informações e mesmo de amostras, entre pesquisadores
de diferentes localidades, a idéia de grupos de pesquisa se reunirem em consórcios, pode
permitir um aumento considerável no tamanho das populações estudadas. Propostas como a
do EURODISC (2007), na qual sete grupos de pesquisa de seis países europeus realizam
protocolos conjuntos, com troca de informações e de amostras, permitirão avanços mais
rápidos no conhecimento do disco intervertebral e as causas de sua degeneração. Tal iniciativa
também já teve seu primeiro passo dado entre pesquisadores brasileiros. Já se encontra em
fase de preparo o primeiro estudo multicêntrico do perfil genético de pacientes com patologia
de coluna no Brasil. Esta foi uma iniciativa resultante do presente estudo.
Com base neste estudo, o gene agrecano continua sendo um candidato na investigação
das causas da degeneração discal. Com o surgimento de novas técnicas de investigação, bem
como a perspectiva de amostras maiores, poderemos compreender o real papel deste
componente na degeneração discal.
34
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