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UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS
ESCOLA DE VETERINÁRIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA ANIMAL
Clostridium estertheticum e C. gasigenes EM CARNES BOVINAS
REFRIGERADAS, EQUIPAMENTOS E AMBIENTE DE
MATADOUROS-FRIGORÍFICOS DE DIFERENTES ESTADOS
BRASILEIROS
Ursula Nunes Rauecker
Orientador: Prof. Dr. Albenones José de Mesquita
GOIÂNIA
2007
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Livros Grátis
http://www.livrosgratis.com.br
Milhares de livros grátis para download.
URSULA NUNES RAUECKER
Clostridium estertheticum e C. gasigenes EM CARNES BOVINAS
REFRIGERADAS, EQUIPAMENTOS E AMBIENTE DE
MATADOUROS-FRIGORÍFICOS DE DIFERENTES ESTADOS
BRASILEIROS
Dissertação apresentada para obtenção do
grau de Mestre em Ciência Animal junto à
Escola de Veterinária da Universidade Federal
de Goiás
Área de concentração:
Higiene e Tecnologia de Alimentos
Orientador:
Prof. Dr. Albenones José de Mesquita -EV/UFG
Comitê de orientação:
Prof. Dr. Iolanda A. Nunes – EV/UFG
Dr. José Gabriel Amoril - MAPA
GOIÂNIA
2007
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iii
A toda minha querida família, em
especial ao meu pai José Carlos e a
minha mãe: Idiana. Aos meus irmãos
Karolyne e José Carlos e ao meu
cunhado Ed, que sempre me apoiaram e
me amaram com o grande coração que
têm.
Amo vocês!
iv
AGRADECIMENTOS
Agradeço imensamente a Deus pelo Dom da vida. Tantos recomeços e
aprendizados...
A todos os mestres que me ensinaram o valor de uma vida com amor,
respeito e verdade;
A toda minha família, agradeço tanto amor;
À Escola de Veterinária da UFG e ao Centro de Pesquisa em Alimento,
pela oportunidade de crescimento;
Ao Programa de Pós-graduação da Escola de Veterinária, na pessoa
do Prof. Dr. Luiz Augusto Brito;
Ao CNPq pelo suporte financeiro;
Às unidades industriais das diferentes empresas que forneceram
amostras para a realização desse trabalho. Obrigada pela dedicação e critério na
colheita e envio de amostras. Foi um prazer trabalhar com vocês;
Ao Orientador: Prof. Dr. Albenones José de Mesquita, pelo apoio e
confiança, sempre me ensinando a encarar os dias difíceis com determinação;
A minha tia, vizinha, amiga e Co-orientadora Prof. Dra. Iolanda A.
Nunes, pelos ensinamentos, competência e grande coração. Tenho muito orgulho
em fazer parte de sua equipe! Agradeço a imensa ajuda no período de finalização
da dissertação;
Ao meu grande amigo e co-orientador José Gabriel Amoril, uma das
pessoas mais grandiosas que conheci;
Ao professor Antônio Nonato de Oliveira, pela disposição constante em
ajudar;
Ao Raphael Costa Pereira Primo: “Eu possa me dizer do amor (que
tive), que não seja imortal, posto que é chama, mas que seja infinito enquanto
dure”.
A minha querida amiga e companheira de atividades Flávia Isabel.
Organização é sinal de evolução! Obrigada pela ajuda constante e por tornar tudo
mais leve com seu sorriso. Sua ajuda e apoio foram fundamentais para a
finalização deste trabalho;
v
Aos amigos e estagiários Tiago Vilela Del’Acqua e Thays de Lima Dias
sempre presentes nos finais de semana e férias, com seu carinho e apoio
inestimáveis no período experimental.
A todos os meus filhotes, que passaram pelo laboratório de Biologia
Molecular: foi um prazer transferir ensinamentos nesses anos. Em especial aos
estagiários e amigos Anderson Mori, Tatiane Martins Rocha, Lívia Mara Felipe,
Adriano Queiroz de Mesquita, Laura Cristina Vilela Resende, Renan Bertazzi,
Leonardo Ozório, Henrique Giovanni Lozzi e Hugo Henrique Ferreira por sua
ajuda e carinho nesses anos de convivência.
Ao professor Dr. Guido Fontgalland Linhares pela paciência e grande
ajuda na captação de imagens das eletroforeses desse trabalho.
A professora Dra. Ângela Patrícia Santana, por me receber em Brasília
e realizar o sequenciamento das amostras na UnB.
Aos meus queridos e indispensáveis amigos: Júlia de Miranda Moraes,
Ana Helena Vilela Resende, Michele Veloso, Natane Guilarducci, Hugo de
Oliveira, Guilherme Menezes, Fábio Luiz Marques, Marcele Louise Arruda, Marília
Carvalho, Renata Rendy Ramos e Mara Lia Lisita Puça, eternamente em meu
coração.
Minhas maravilhosas amigas Marina Pacheco, Liliane Borges de
Menezes e Vanessa Silvestre: amo vocês!!!
A todos os meus amigos e companheiros de Programa de Pós-
graduação, em especial Rafael Vieira, Marcelo Seixo, Ediane, Eunice Rosaboni,
Leonardo França, Joice Vinhal, Sabrina Castilho, Eurídice Pinheiro, Cínita
Minafra, Rolando Mazzoni e Eurione Jardim.
Aos amigos Prof. Dr. Neuza Margarida, Prof.ª Maria Conceição, Prof.
Dr. Adilson Damasceno e Dr. Apóstolo pelo carinho e companhia sempre
agradável.
Aos funcionários e estagiários do CPA, Sandra de Queiroz Porto
Mesquita, Maria Magaly, Wilson Ricardo, Rosângela Nunes, Euza, Neuza, Lis,
Karole, Tati, Winder, Rodrigo Almeida, Rodrigo Balduíno, Silmara, Carlos
Henrique (Buxexa), Fabíola, Fredson, Ricardo, obrigada pela agradável
convivência diária.
vi
"Deixe-me ir, preciso andar
Vou por aí a procurar
Rir pra não chorar
Quero assistir ao sol nascer
Ver as águas dos rios correr
Ouvir os pássaros cantar
Eu quero nascer, quero viver
Deixe-me ir preciso andar
Vou por aí a procurar
Rir pra não chorar...”
Cartola
vii
SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS ix
LISTA DE TABELAS xi
LISTA DE QUADROS Xii
RESUMO xiii
ABSTRACT xiv
1. INTRODUÇÃO 1
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 3
2.1 Carne bovina fresca refrigerada embalada a vácuo 3
2.1.1 Características intrínsecas 3
2.1.1.1 Transformação do músculo em carne 3
2.1.1.2 Maturação 4
2.1.1.3 Cor 5
2.1.2 Aspectos microbiológicos e microrganismos deteriorantes 6
a) Bactérias ácido-láticas 7
b) Brochothrix termosphacta 9
c) Família Enterobacteriaceae 11
d) Clostridium spp. 11
- Clostridium estertheticum 13
- C. gasigenes 16
3. OBJETIVOS 19
3.1 Objetivo geral 19
3.2 Objetivos específicos 19
4 MATERIAL E MÉTODOS 20
4.1 Amostragem 20
4.1.1 Colheita de amostras 21
4.2 Técnica de PCR 22
4.2.1 Preparo das amostras e extração de DNA genômico 22
4.2.2 Eletroforese em gel de agarose para avaliação da qualidade e
quantificação do DNA obtido 22
4.2.3 Seleção de primers, mistura da reação e condições de amplificação 23
4.3 Confirmação da identidade molecular dos produtos de PCR 26
viii
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO 27
5.1 Detecção de C. estertheticum 27
5.1.1 Ocorrência de C. estertheticum de acordo com as fontes de
detecção 27
5.1.1.1 Correlação entre temperatura e freqüência de Clostridium
estertheticum
33
5.1.2 Distribuição de C. estertheticum segundo os pares de primers e
fontes de detecção 35
5.1.3 Associação de primers na detecção de C. estertheticum 40
5.1.4 Distribuição de C. estertheticum segundo os estabelecimentos de
abate e origem geográfica 42
5.2 Ocorrência de C. gasigenes 45
5.2.1 Ocorrência de C. gasigenes de acordo com as fontes de detecção 45
5.2.1.1 Correlação entre temperatura e freqüência de Clostridium
gasigenes
46
5.2.2 Distribuição de C. gasigenes segundo os estabelecimentos de
procedência e origem das amostras
49
5.3 Confirmação da identidade dos produtos de amplificação 50
6 CONCLUSÕES 53
ANEXOS 54
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 63
ix
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1 – Fotomicrografia de contraste de fase de células vegetativas de
C. estertheticum subsp. estertheticum DSM 8809
(a) e C. estertheticum
subsp. laramiense DSM 14864
(b).(SPRING et al., 2003) 15
FIGURA 2 – Fotomicrografia de contraste de fase de esporos de C.
estertheticum subsp. estertheticum DSM 8809
(a) e C. estertheticum subsp.
laramiense DSM 14864
(b) (SPRING et al., 2003) 15
FIGURA 3. Fotomicrografias de contraste de fase de C. gasigenes DB1A:
célula vegetativa (a) e células esporuladas (b). Fotomicrografia eletrônica de
célula vegetativa de C. gasigenes DB1A contendo flagelo petríqueo (c)
(BRODA et al., 2000) 18
FIGURA 4 - Cortes cárneos bovinos refrigerados, embalados a vácuo,
apresentando deterioração com intensa produção de gás e exsudação; filé (a)
e contrafilé(b). FONTE: RAUECKER, 2007 30
FIGURA 5 – Correlação entre temperatura e ocorrência de C.estertheticum
em amostras ambientais e de carnes bovinas 34
FIGURA 6 – Gel de eletroforese de produtos de PCR de 641 pb do 16S RNAr
de C. estertheticum obtidos a partir de cortes cárneos bovinos resfriados
embalados a vácuo empregando–se os pares de primers RFP/RRP. 1:
marcador de peso molecular (DNA ladder 100pb); 2: controle positivo (DSM
8809); 3 a 7 amostras positivas; 8 e 9: amostras negativas; 10 controle
negativo. 38
FIGURA 7 – Gel de eletroforese de produtos de PCR de 434 pb do 16S RNAr
de C. estertheticum obtidos a partir de cortes cárneos bovinos resfriados
embalados a vácuo empregando–se os pares de primers RFP/ORP. 1:
marcador de peso molecular (DNA ladder 100pb); 2 e 3: controles positivos
(DSMZ 8809
t
); 4 a 6: amostras positivas; 7 e 8: controles negativos. 38
FIGURA 8 – Gel de eletroforese de produtos de PCR de 790 pb do 16S RNAr
de C. estertheticum obtidos a partir de amostras de cortes cárneos bovinos
resfriados embalados a vácuo, empregando-se o par de primers
16SEF/16SER. 1: marcador de peso molecular (DNA ladder 100pb); 2:
controle negativo; 3: controle positivo (DSMZ 8809); 4 a 9: amostras positivas. 39
FIGURA 9 – Desempenho individual dos pares de primers RFP/RRP,
RFP/ORP e 16SEF/16SER na detecção de amostras positivas para C.
estertheticum
41
FIGURA 10 –
A
ssociações entre os pares de primers RFP/RRP, RFP/ORP e
16SEF/16SER na detecção de amostras positivas para C.estertheticum 41
FIGURA 11 – Correlação entre temperatura e C.gasigenes em amostras
ambientais e de carnes bovinas 47
FIGURA 12 – Eletroforese de produtos de PCR de 934 pb do 16S RNAr de C.
gasigenes obtidos a partir de amostras de córtes cárneos bovinos
refrigerados embalados a vácuo. 1: marcador de peso molecular (DNA ladder 48
x
100 pb); 2 e 3: controles positivos da reação (DSM 12272); 4 a 6: amostras
positivas; 7 e 8: controles negativos da reação.
FIGURA 13 – Concentração de amplicons. Canaletas 1 a 3, C. estertheticum
e canaleta 4 C. gasigenes, Canaleta 1 amplicon de 641 pb (par RFP/RRP); 2,
amplicon de 434 pb (RFP/ORP); 3, amplicon de 790 pb (16SEF/16SER); 4
amplicon de 935 pb (16DBF/16SDBR); canaleta 6 padrão de peso molecular
Low DNA Mass Ladder 51
FIGURA 14 – Homologia de 100%, resultante do alinhamento no
programa BLAST (GenBank®) entre o resultado do sequenciamento
(Query) e a seqüência de referencia (Sbjct) para C. gasigenes (nº de
acesso AF092549) 52
xi
LISTA DE TABELAS
TABELA 1 – Distribuição de C. estertheticum e C. gasigenes em amostras
de Matadouros-Frigoríficos brasileiros no período de 2003 a 2007, segundo
as fontes de detecção, por meio da técnica de PCR, Goiânia, 2007 29
TABELA 2 - Distribuição de C. estertheticum em amostras positivas em
Matadouros-Frigoríficos brasileiros, no período de 2003 a 2007, segundo os
pares de primers utilizados para a amplificação, Goiânia, 2007 37
TABELA 3 - Distribuição de C. estertheticum e C. gasigenes em amostras
positivas segundo os Estados e estabelecimentos de procedência no
período de 2003 a 2007, por meio da técnica de PCR. Goiânia, 2007 44
xii
LISTA DE QUADROS
QUADRO 1- Misturas das reações de PCR e concentrações finais dos
reagentes, segundo os pares de primers utilizados, para detecção
molecular de C. estertheticum 24
QUADRO 2 - Mistura da reação de PCR e concentrações finais dos
reagentes para a detecção de C. gasigenes 25
xiii
RESUMO
A deterioração de carnes frescas bovinas refrigeradas embaladas a vácuo é
considerada uma das principais causas de perda econômica da indústria cárnea,
em várias regiões do mundo. Diversos microrganismos podem estar envolvidos,
destacando-se duas espécies do gênero Clostridium, C. estertheticum e C.
gasigenes. A deterioração determinada se caracteriza pela produção de
compostos sulfurados voláteis, ésteres butíricos, butanol e sulfito de hidrogênio,
com intensa liberação de gases, causando distensão da embalagem. No Brasil
não existiam trabalhos que indicassem sua presença ou envolvimento em casos
de tufamento de carnes bovinas refrigeradas embaladas a vácuo. O presente
estudo avaliou 249 amostras provenientes dos Estados de São Paulo, Goiás,
Minas Gerais, Mato Grosso, Mato Grosso do Sul, Pará, Acre e Bahia, de 23
matadouros-frigoríficos de oito empresas diferentes credenciadas para
exportação. A detecção dos microrganismos foi feita por PCR, utilizando três
pares de primers (RFP/RRP, RFP/ORP, 16SEF/15SER) para C. estertheticum e
um para C. gasigenes (16DBF/16DBR). Os resultados obtidos evidenciam a
presença dos microrganismos no país. A frequência de positividade para C.
estertheticum foi de 41,37%, detectado em todas as fontes analisadas. C.
gasigenes foi detectado em 9,64% das amostras analisadas. As fontes de
detecção com maiores índices de positividade para C. estertheticum e C.
gasigenes foram fezes bovinas, box de atordoamento, carcaças antes da esfola,
meias-carcaças refrigeradas e cortes cárneos deteriorados. O Estado de Mato
Grosso do Sul apresentou maiores frequência de amostras positivas para C.
estertheticum e C. gasigenes, considerando a amostragem. Em todos os Estados,
matadouros-frigoríficos e fontes de detecção analisados detectou-se a presença
de C. estertheticum, evidenciando sua disseminação no país e nas plantas de
matadouros-frigoríficos brasileiros. Apesar do reduzido número de amostras
positivas obtidas para C. gasigenes, os resultados indicam sua presença e
disseminação no país.
Palavras chave: Deterioração de carnes, Clostridium spp., embalagem a vácuo,
PCR
xiv
ABSTRACT
The spoilage of vacuum-packed chilled beef is considered to be one of the main
causes of economic loss in the abattoir industries in many regions of the world.
Several microorganisms can be related to that, especially two species of
Clostridium, C. estertheticum and C. gasigenes. The identified spoilage is
characterized by intense release of gas and the production of sulphur compounds,
hydrogen sulphide, buthyl esters, butanol, hydrogen, carbon and nitrogen. In
Brazil, there was no study indicating the presence or relationship of this
occurrence in cases of “blown pack” in vacuum-packed chilled beef. This current
study evaluated 249 samples originated from 23 comercial abattoirs of eight
different companies all licensed to export. These samples were originated from the
states of São Paulo, Goiás, Minas Gerais, Mato Grosso, Mato Grosso do Sul,
Pará, Acre and Bahia. The microorganisms identification was done using
molecular procedures (PCR), using three pairs of primers (RFP/RRP, RFP/ORP,
16SEF/15SER) for C. estertheticum and one pair of primer (16DBF/16DBR) for C.
gasigenes. The results showed evidence of the presence of these microorganisms
in the country. C. estertheticum was identified in 41.37% of all analyzed sources.
C. gasigenes was identified in 9.64% of all analyzed samples. The sources with
the highest leves of C. estertheticum and C. gasigenes was from cattle fecal
matter, slaughter room, carcasses before skinning, refrigerated half carcasses and
spoiled beef cuts. The state of Mato Grosso do Sul showed the highest level of
samples containing C. estertheticum and C. gasigenes. In all States, all slaughter
houses and samples analyzed had the presence of C. estertheticum
demonstrating the dissemination throughout the country and in the plants of
slaughter houses. Although the presence of C. gasigenes in the samples was low,
the results still indicate its presence and dissemination throughout the country.
Keywords: Meat spoilage, Clostridium spp., vaccum-packed chilled beef, PCR
1 INTRODUÇÃO
Um dos mais significativos segmentos geradores de renda de nosso
país, a produção de carne bovina, passa por um processo de expansão em que o
ciclo da carne responde pelo emprego de milhões de brasileiros, envolvendo
direta e indiretamente vários outros segmentos.
A indústria cárnea passa por um momento de reestruturação que
objetiva acomodar não só a demanda crescente, mas principalmente atender aos
aspectos de qualidade e segurança, cada vez mais severamente almejados.
Apesar da implementação de programas de qualidade, ainda podem ser
observadas falhas operacionais relacionadas à capacidade máxima de matança
diária e/ou velocidade horária de abate, abuso de temperatura, esfola,
evisceração, além de outros fatores que implicam na obtenção de produto final
com elevada carga microbiana inicial.
A despeito da relevância econômica do comércio internacional de
carne bovina, as indústrias brasileiras de carne e derivados enfrentam alguns
gargalos, sendo a ocorrência de tufamento de embalagens de carne refrigerada
um dos mais frequentes e preocupantes. O problema pode ser considerado de
ocorrência nacional e de grande impacto no segmento. Desde a adoção de
embalagens a vácuo pela indústria cárnea brasileira são observados casos de
completa deterioração de grandes lotes de produtos ainda no prazo de validade.
Não existem dados conclusivos acerca das perdas econômicas
causadas, mas é inquestionável a sua importância para a cadeia produtiva. A
associação entre a contaminação da carne durante o fluxograma de produção por
microrganismos anaeróbios capazes de crescer em baixas temperaturas e a
submissão do produto à restrição de oxigênio, gera condições ideais para o
desenvolvimento de uma microbiota deteriorante ou patogênica capaz de se
desenvolver nessas condições. As características de crescimento microbiano
dependem, neste caso, da adequação da microbiota inicial à natureza do
substrato e condições de armazenamento.
A deterioração de carnes bovinas frescas refrigeradas embaladas a
vácuo caracteriza-se por intensa produção de gás com distensão da embalagem,
aumento da exsudação, alterações de cor e odor.
2
No entanto, os microrganismos associados a essas alterações
permanecem desconhecidos no Brasil, havendo ainda pouquíssimos relatos de
isolamento e identificação.
A literatura internacional destaca duas espécies dentro do gênero
Clostridium como determinantes deste tipo de deterioração, Clostridium
estertheticum e C. gasigenes. Entretanto, no Brasil não existem trabalhos que
comprovem a presença desses microrganismos, envolvimento na deterioração de
carnes bovinas frescas refrigeradas embaladas a vácuo ou sobre a disseminação
ambiental e controle efetivo em estabelecimentos de abate de bovinos.
O aumento de episódios de tufamento de embalagens de carnes
bovinas frescas refrigeradas, embaladas a vácuo em estabelecimentos de abate
das regiões Centro-Oeste e Sudeste do Brasil aliado a experiências prévias de
uma equipe de pesquisadores goianos, levantou suspeitas de contaminação por
C. estertheticum e C. gasigenes. Diante do exposto o presente trabalho foi
desenvolvido com o objetivo de identificar os agentes e determinar a ocorrência
destas duas espécies em cortes cárneos embalados a vácuo, carcaças, ambiente
e equipamentos de estabelecimentos de abate de bovinos em diferentes Estados
brasileiros por meio do emprego da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR).
3
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
Carne bovina fresca refrigerada embalada a vácuo
Características intrínsecas
Transformação do músculo em carne
Todos os cuidados ante-mortem e modificações post-mortem afetam a
qualidade do produto final, assim como fatores de ordem genética, manejo,
alimentação e idade de abate. Entre os fatores que influenciam na qualidade e
aceitação da carne bovina fresca refrigerada e embalada a vácuo destacam-se o
pH, características de maturação e cor (PARDI et al., 2006).
A queda do pH após o abate constitui um dos fatores mais importantes
na transformação do músculo em carne, interferindo diretamente em sua futura
qualidade e na dos produtos derivados. Os valores de pH final da carne podem
influenciar na maciez, na vida de prateleira e na cor da carne (PARDI et al., 2006).
Após a morte, as reservas de glicogênio muscular são transformadas
em ácido lático em um processo anaeróbio e o acúmulo deste ácido ocasiona a
diminuição do pH muscular. O músculo do animal recém-abatido, após o período
de descanso, apresenta pH entre 6,9 a 7,2 (LUCHIARI FILHO, 2000). A
velocidade de queda e o pH final da carne, após 24-48 horas são variáveis
(PARDI et al., 2006). Normalmente, a glicólise post-mortem se desenvolve
lentamente, sendo dependente de ação enzimática influenciada pela temperatura
(ROÇA, 2001).
No Brasil, os estabelecimentos de abate exportam carne com pH final
inferior a 5,9, avaliado diretamente no músculo Longissimus dorsi 24 horas post-
mortem (ROÇA, 2001). Este valor corresponde ao limite máximo admitido para
exportação de carnes frescas, conforme consta da CIRCULAR
Nº192/98/DCI/DIPOA, que trata da exportação de carne bovina brasileira para a
União Européia (BRASIL, 1998).
4
Esta Circular trata do controle sistemático da produção de carne, ou
seja, desde a obtenção à expedição. Preconiza que após 24 horas de
refrigeração, o pH das meias-carcaças deve ser determinado, fazendo-se a
seleção para a desossa (Documento Oficial obrigatório – Controle de pH –
Documento Nº10). O controle do pH é realizado em todas as meias-carcaças e o
registro feito no mapa de registro de pH em meias-carcaças, documento oficial e
de emissão obrigatória, preenchido pelo Serviço de Inspeção Federal (SIF).
Segundo a legislação específica (BRASIL, 1998), somente os quartos com pH até
5,9 são liberados para a desossa sendo desclassificados aqueles com pH acima
de 5,9.
A legislação brasileira para comércio interno, conforme consta dos
Métodos Analíticos para Controle de Produtos de Origem Animal e seus
Ingredientes – Métodos Físico-Químicos estabelece que valores de pH entre 5,8 e
6,2 referem-se a “carne boa para consumo”, ressaltando-se que valores iguais ou
superiores a 6,2 implicam em carnes para consumo imediato. Estabelece também
o valor de pH igual a 6,4 como limite crítico acima do qual a carne é considerada
imprópria para consumo. Igualmente, considera como impróprio para consumo o
pH menor que 5,5 em carnes bovinas frescas (BRASIL, 1998).
Maturação
Para avaliar o mecanismo de maturação torna-se necessário conhecer
a estrutura muscular. Apesar dos processos bioquímicos da maturação não serem
ainda compreendidos em sua totalidade sabe-se que a atividade de enzimas
proteolíticas endógenas está envolvida no processo de amaciamento da carne
(TSITSILONIS et al., 2002).
Desde a purificação da primeira calpaína em 1976, acumularam-se
evidências experimentais de que o sistema proteolítico das calpaínas possui
papel fundamental na degradação das proteínas miofibrilares e maciez da carne
(ILIAN et al., 2004). O sistema constitui-se de duas enzimas, a µ-calpaína, que
necessita de 5 a 50 µM de íons cálcio para sua atividade e a m-calpaína, que
5
requer de 300 a 1000 µM. Estas duas enzimas apresentam a propriedade de
autólise, inibindo a degradação excessiva das proteínas (ROÇA, 2001).
As calpaínas não atuam diretamente sobre miosina e actina, mas
degradam o disco Z e hidrolisam as proteínas desmina, titina, nebulina,
tropomiosina, troponina e proteína C (KUBOTA et al., 1993). A região do disco Z é
considerada o principal local onde ocorrem alterações estruturais durante a
maturação (PALKA, 2003). Observa-se também uma separação lateral das
miofibrilas pela ruptura da junção entre as bandas A e I (KOOHMARAIE, 1994,
HWANG & THOMPSON, 2001).
O complexo do sistema calpaínas é constituído também pela presença
de calpastatinas que inibem as calpaínas, alterando a maciez da carne. A relação
entre calpaínas e seus inibidores, post-mortem, depende do pH e temperatura
(HANNULA & PUOLANNE, 2004).
2.1.1.3 Cor
A cor, em carnes bovinas, é determinada principalmente pela
concentração e o estado dos pigmentos heme, mioglobina e hemoglobina e pela
micro-estrutura muscular. A de maior aceitação recai sobre o vermelho-brilhante,
quando a mioglobina encontra-se na forma de oximioglobina (PARDI et al., 2006,
HOLLEY & GILL, 2006).
A cor da carne é particularmente dependente do estado químico do
ferro dos heme-pigmentos (VENTURINI, 2003). Na carne embalada a vácuo ou
em pressões abaixo de 1,4 mm Hg, a oximioglobina passa predominantemente
para a forma reduzida de desoximioglobina, de coloração vermelho-púrpura, e
altamente instável (HOLLEY & GILL, 2006). Quando a carne é exposta ao
oxigênio, por meio da abertura da embalagem, a mioglobina volta a se combinar
rapidamente com o oxigênio, devido à grande afinidade entre ambos, formando a
MbO
2
(oximioglobina), vermelho brilhante (VENTURINI, 2003).
A oxidação do íon ferroso à forma férrica resulta na formação
irreversível de metamioglobina, composto altamente estável e incapaz de se ligar
6
ao oxigênio, determinando uma coloração marrom acinzentada ao produto.
Geralmente está associada a longos períodos de armazenagem de carnes
frescas embaladas a vácuo mantidas sob refrigeração, mas pode ter sua
ocorrência acelerada por de fatores intrínsecos como pH, tipo de músculo, raça,
sexo, dieta, e extrínsecos como manejo pré-abate e de abate, desossa,
temperatura de armazenagem, incidência de luz e desenvolvimento microbiano
(MANÇO, 2006).
Aspectos microbiológicos e microrganismos deteriorantes
Das carnes bovinas refrigeradas embaladas a vácuo espera-se uma
vida de prateleira de 9 a 12 semanas, quando as temperaturas de estocagem são
mantidas próximas a –1,5 ºC (HOLLEY & GILL, 2006).
Diferentes gêneros e espécies de microrganismos podem colonizar a
carne, seja por adesão à superfície ou por formação de glicocálix (ERCOLINI et
al., 2006). O tipo de crescimento predominante depende de fatores intrínsecos e
extrínsecos particulares ao ecossistema da carne, como pH, morfologia da
superfície do produto, oxigênio disponível, temperatura e presença e crescimento
de outros microrganismos (ERCOLINI et al., 2006; HOLLEY & GILL, 2006).
Ao restringir o oxigênio em carnes bovinas frescas, por meio de
embalagem a vácuo, o desenvolvimento microbiano sofre profundas modificações
devido às habilidades individuais para proliferação de cada gênero (JONES,
2004). Em carnes embaladas a vácuo, a ausência de oxigênio restringe o
crescimento de microrganismos como Pseudomonas spp., Acinetobacter e
Moraxella, deteriorantes de eleição em carnes refrigeradas mantidas em
aerobiose (HOLLEY & GILL, 2006).
A deterioração de carnes caracteriza-se como alterações de cor, odor e
aparência do produto, com intensificação da proteólise e exsudação, às vezes
imperceptíveis ao consumidor (KALCHAYANAND, 1997, GIL, 2000). A atividade
enzimática endógena que ocorre durante a maturação das carnes refrigeradas
7
embaladas a vácuo é capaz de desencadear modificações fisico-químicas que
caracterizam a putrefação (PARDI et al., 2006).
Além dos danos físicos, oxidação, alteração da cor, a deterioração é
determinada por um crescimento indesejado de microrganismos em níveis
inaceitáveis. A ação microbiana na superfície dos cortes cárneos, inevitável
devido à contaminação bacteriana durante o processamento, é a principal
determinante da deterioração (ERCOLINI et al., 2006, PARDI et al., 2006).
Os microrganismos detectados com maior frequência durante a
armazenagem sob refrigeração de carnes bovinas frescas embaladas a vácuo,
tipicamente associados à sua deterioração, são as bactérias ácido-láticas,
Brochothrix termosphacta, gêneros da família Enterobacteriaceae, Aeromonas
spp e espécies de psicrofílicas e psicrotróficas de Clostridium (LYHS, 2002,
JONES, 2004, ERCOLINI et al., 2006, HOLLEY & GILL, 2006).
a) Bactérias ácido-láticas
Bactérias ácido-láticas compreendem bastonetes anaeróbios
facultativos, Gram-positivos, não formadores de esporos e capazes de produzir
uma variedade de bacteriocinas, que são compostos antagonistas ao crescimento
de outros microrganismos (LYHS, 2002, JONES, 2004). São oxidase e catalase-
negativas e capazes de se desenvolver em temperaturas inferiores a –1,5ºC
(JONES, 2004).
Todas elas produzem ácidos orgânicos a partir da fermentação de
carboidratos, reduzindo o pH e tornando o meio desfavorável para o crescimento
de outros microrganismos. Os principais gêneros relacionados com a deterioração
de carnes bovinas frescas refrigeradas embaladas a vácuo são Carnobacteria,
Leuconostoc e Lactobacillus (JONES, 2004).
O tipo e intensidade da fermentação variam entre as espécies. Em
meio anaeróbio, as bactérias ácido-láticas homofermentativas, capazes de
fermentar hexoses, produzem apenas ácido lático, enquanto que as
heterofermentativas produzem uma grande variedade de ácidos orgânicos e
8
etanol. Ambos os tipos produzem gás carbônico com intensidade capaz de causar
distensão em embalagens primárias de cortes cárneos (LYHS, 2002, JONES,
2004).
Os produtos do metabolismo de bactérias ácido-láticas tendem a ser
inócuos. O estabelecimento de um quadro de deterioração propriamente dito é
verificado apenas quando a multiplicação bacteriana atinge níveis próximos à
exaustão das fontes de carboidrato do substrato, quando o acúmulo de
catabólitos é elevado, tornando-os sensorialmente detectáveis (JONES, 2004).
Usualmente, ao submeter a carne bovina refrigerada à redução de
oxigênio por meio do uso de embalagem a vácuo, as espécies de bactérias ácido-
láticas que melhor se desenvolvem são as capazes de promover maiores
modificações no meio com o objetivo de antagonizar o crescimento de outros
microrganismos (LEISNER et al., 1996). Desta forma, produzem substâncias
capazes de causar alterações sensoriais significativas, estabelecendo um quadro
de deterioração do produto, mesmo em pequenas quantidades de compostos
voláteis. Aquelas capazes de produzir ácido butírico, sulfitos e ácidos orgânicos
de cadeia curta determinam um quadro de deterioração mais precoce nos
produtos cárneos (DAINTY et al., 1992 e JONES, 2004).
Entretanto, durante o período transcorrido entre a produção e o
consumo da carne embalada a vácuo, ocorre uma dinâmica entre as diferentes
espécies de bactérias ácido-láticas, assim como na concentração dos diferentes
ácidos produzidos. A microbiota contaminante inicial, temperatura de
armazenamento e flutuação de pH nos diferentes períodos de tempo são fatores
que influenciam esta dinâmica (JONES, 2004).
É importante ressaltar que as bactérias ácido-láticas competem entre
si. O fator responsável pelas mudanças na população parece estar relacionado à
flutuação de pH da carne provocada pela divergência na capacidade acidificante e
tolerância a pH mais baixo, existente entre gêneros de bactérias ácido-láticas
(HOLLEY & GILL, 2006). Bactérias do gênero Carnobacterium, não acidúricas e
grandes produtoras de etanol tendem a dominar o início do período de maturação,
sofrendo queda e substituição por gêneros mais acidúricos assim que o pH do
9
meio torna-se inferior a 5,4 devido a existência de gêneros mais ácido-tolerantes
(JONES, 2004, HOLLEY & GILL, 2006).
JONES (2004) observou esta dinâmica entre as espécies de bactérias
ácido-láticas. Analisando cortes de cárneos bovinos embalados a vácuo e
armazenados a –1,5ºC, em um período de 0 a 16 semanas, o autor constatou
uma predominância de Carnobacteria spp. nas primeiras quatro semanas,
seguida de uma substituição progressiva por Leuconostoc spp., que tornou-se
predominante a partir da oitava semana. A espécie Lactobacillus delbrueckii foi
predominante a partir da 12
ª
semana.
A dinâmica dos compostos formados acompanhou a alteração na
microbiota da carne. A produção de ácido butírico, ácido acético, gás carbônico e
etanol foi associada à espécie heterofermentativa Leuconostoc mesenteroides.
Houve intensificação na produção destes compostos após quatro semanas de
produção, atingindo níveis máximos de 5,7 µg/mL
-1
(JONES, 2004). O principal
gênero produtor de ácido acético foi Lactobacillus, atingindo níveis máximos de
17,1 µg/mL
-1
na 16
ª
semana pós-produção (JONES, 2004, HOLLEY & GILL,
2006).
b) Brochothrix thermosphacta
É um bastonete Gram-positivo, não esporulado, imóvel quando
cultivado entre 0 e 30ºC, temperatura ótima de multiplicação entre de 20 e 25ºC e
pH de 5 a 9. Anaeróbio facultativo, capaz de colonizar ambientes sob restrição de
oxigênio, sendo sua participação na deterioração de carnes bovinas frescas
refrigeradas e embaladas a vácuo atribuída a sua característica psicrotrófica
(ERCOLINI et al., 2006).
É um microrganismo essencialmente deteriorante de carnes frescas e
produtos cárneos processados conservados em condição de anerobiose, não
existindo evidências de patogenicidade. Fermenta a glicose e em condições de
anaerobiose seus principais catabólitos são o ácido lático e o gás carbônico
(BLICKSTAD, 1983).
10
Em aerobiose, produz uma grande variedade de compostos voláteis,
destacando-se a acetoína, proveniente do metabolismo de carboidratos.
Consideráveis quantidades de diacetil, butan-2,3-diol, 2-metilpropanol e 3-
metilbutanol também são detectadas (STANLEY et al., 1981). B. thermosphacta é
considerado um deteriorante secundário de carnes frescas embaladas a vácuo, já
que as alterações sensoriais são significativas apenas em condição de aerobiose
(GILL et al., 1986, HOYLE, 2005).
11
c) Família Enterobacteriaceae
A deterioração e produção de gás em carnes bovinas frescas
refrigeradas embaladas a vácuo, associadas a gêneros da família
Enterobacteriaceae, geralmente são resultantes de abuso de temperatura durante
a armazenagem do produto, notadamente em temperaturas superiores a 6ºC
(HOLLEY & GILL, 2006). Usualmente são isolados desses casos microrganismos
das espécies Serratia liquefaciens, Enterobacter aerogenes e Hafnia alvei
(BOEREMA et al., 2002).
São Bastonetes Gram-negativos, anaeróbios facultativos e
fermentadores de glicose e manitol. São predominantemente microrganismos
mesófilos que crescem entre 10ºC e 45ºC, sendo a temperatura ótima de
crescimento de 35ºC. Existem gêneros psicrotróficos cujos habitats são solo, água
e trato gastrintestinal do homem e de animais (ICMSF, 1980).
Alguns gêneros são capazes de produzir compostos voláteis sulfurados
e derivados de amina a partir do metabolismo de aminoácidos (HOYLE, 2005).
Todas as espécies são oxidase negativa, redutoras de nitrato em nitrito e não
formadoras de esporos. Todos os gêneros são móveis, com presença de flagelos,
com exceção dos gêneros Shighella, Klebsiella e Yersinia (imóveis a 37ºC).
d) Clostridium spp.
O gênero Clostridium é composto por bastonetes anaeróbios, Gram-
positivos, geralmente móveis, formadores de esporos e, na maioria, produtores de
toxinas. Todos os clostrídios encontram-se distribuídos no solo e podem ser
encontrados no tubo digestivo e fezes dos animais. Seus esporos, bastante
resistentes à dessecação, desinfetantes e calor, mantêm o solo e água
contaminados (CORRÊA & CORRÊA, 1992).
A participação de Clostridium spp. na deterioração de carnes
refrigeradas era considerada de pequena importância, pois acreditava-se que a
maioria das espécies introduzidas durante o abate e processamento de carnes
12
bovinas era incapaz de se desenvolver em temperaturas de refrigeração ou
determinar a deterioração da carne (GILL, 1979).
Posteriormente, o aumento na frequência de casos de deterioração de
produtos mantidos em temperaturas inferiores a 2ºC, sem relato de abuso de
temperatura de armazenamento, sugeriu a participação de microrganismos
anaeróbios estritos e/ou facultativos, psicrofílicos ou psicrotróficos, que poderiam
representar um perigo para a indústria de processamento de carnes (BRODA et
al., 1997).
Em 1989, no Reino Unido, foi estabelecido o envolvimento de
clostrídios psicrofílicos como agentes de deterioração de carnes bovinas frescas
refrigeradas embaladas a vácuo, quando uma espécie de Clostridium psicrofílico
foi isolada de um pacote de carne bovina, importado da África do Sul. Esse
produto apresentava deterioração com intensa produção de gás (DAINTY et al.,
1989). Posteriormente, a bactéria isolada foi denominada C. estertheticum
(COLLINS et al., 1992). Desde então, deteriorações semelhantes foram relatadas
em carnes frescas bovinas, ovinas e de cervo, embaladas a vácuo na Nova
Zelândia (BRODA et al., 1997). Em 2000, BRODA et al. identificaram ação similar
causada por C. gasigenes em carnes de carneiro embaladas a vácuo, com
grande produção de gás.
Em 2002, dois clostrídios psicrotolerantes que se desenvolvem em
temperaturas até 37ºC foram isolados de casos de deterioração profunda em
carne bovina fresca refrigerada embalada a vácuo, C. algidicarnis e C.
putrefaciens. Esses microrganismos são contaminantes intrínsecos, encontrados
normalmente na musculatura profunda, nas proximidades de ossos e cartilagens
de bovinos e ovinos, geralmente ausentes na superfície de cortes cárneos. Neste
caso, a deterioração não é caracterizada por produção intensa de gases,
ocorrendo apenas a alteração de odor devido à formação de ácido acético, ácido
fórmico e ácido lático (BRODA et al., 2000, BOEREMA et al., 2002).
Os métodos microbiológicos clássicos para detecção de Clostridium
spp psicrofílicos e psicrotolerantes associados com este tipo de deterioração é
difícil, envolvendo muito trabalho e tempo (BRODA et al., 1996). O efeito
antagônico provocado pelas bactérias ácido-lácteas inibe o crescimento de
13
espécies de clostrídios por produção de bactericinas no meio sólido, similar ao
que ocorre naturalmente na carne durante a estocagem em baixas temperaturas,
o que dificulta seu isolamento. Além disso, o restabelecimento dos
microrganismos é prejudicado devido ao efeito tóxico do butanol sobre aos
clostrídios, sensíveis a essa substância (CRANDALL & MONTVILLE, 1993).
O PCR pode ser uma alternativa para detecção de clostrídios
incriminados na deterioração de carnes bovina refrigeradas embaladas a vácuo,
sem a necessidade de isolamento em culturas puras. Atualmente existem apenas
dois trabalhos na literatura mundial que abordam o diagnóstico molecular de C.
estertheticum e apenas um sobre diagnóstico molecular de C. gasigenes. Os
únicos primers específicos para C. estertheticum são os descritos por HELPS et
al. (1999) e BRODA et al. (2003).
- C. estertheticum
Pertencente a um grupo não toxigênico de clostrídios psicrofílicos, C.
estertheticum deteriora a carne fresca refrigerada embalada a vácuo em
aproximadamente quatro semanas (BRODA et al., 1998). São consideradas
atualmente duas subspécies, C. estertheticum subsp. laramiense e C.
estertheticum subsp. estertheticum, classificadas pela Coleção Alemã de
Microrganismos e Culturas Celulares – DSMZ (Deutche Sammlung von
Mikroorganismen und Zellkulturen, Braunschweig, Alemanha) (SPRING et al.,
2003).
Podem ser encontrados em diversos ambientes, em especial no solo e
no trato gastrintestinal de animais como bovinos, eqüinos e ovinos (HELPS et al.,
1999). São bastonetes móveis, Gram-positivos (Figuras 1a e 1b), anaeróbios
estritos, com esporos elípticos, terminais ou subterminais (C. estertheticum subsp.
laramiense); subterminais ou centrais (C. estertheticum subsp. estertheticum)
(Figuras 2a e 2b), beta-hemolíticos (C. estertheticum subsp. laramiense) ou não-
hemolíticos em ágar-sangue de carneiro a 5% (C. estertheticum subsp.
estertheticum) (SPRING et al., 2003).
14
Ambas subspécies multiplicam-se em pH entre 4,5 e 7,5, com valor
ótimo de 6,5. Para C. estertheticum subsp. estertheticum, a faixa de temperatura
varia de -2 a 13ºC, com temperatura ótima entre 6 e 8ºC, enquanto que C.
estertheticum subsp. laramiense é capaz de multiplicar-se a -2 a 21ºC, com
temperatura ótima de 15ºC (SPRING et al., 2003).
São sacarolíticos, capazes de fermentar frutose, glicose, sucrose,
xylose e inulina, produzindo em grandes quantidades ácido butírico, 1-butanol,
ácido acético, ácido lático, ácido fórmico e etanol (SPRING et al., 2003). A
distensão da embalagem ocorre devido à liberação intensa de dióxido de carbono,
nitrogênio e hidrogênio e por compostos butíricos resultantes do metabolismo
fermentativo (FADDIN, 1976).
A carne deteriorada apresenta odor fecal. Os compostos formados no
processo de deterioração que provavelmente contribuem para o odor são ésteres
butíricos, propionato, isobutirato, butanol, compostos formados na fermentação de
carboidratos. Da descarboxilação de aminoácidos, são formados compostos
sulfurados voláteis, amônia e diaminas (cadaverina e putrescina) (FADDIN, 1976,
BRODA et al., 1997, BRODA et al., 2000).
15
FIGURA 1 – Fotomicrografia de contraste de fase de células
vegetativas de C. estertheticum subsp. estertheticum DSM 8809
(a) e C. estertheticum subsp. laramiense DSM 14864
(b)
(SPRING et al., 2003).
FIGURA 2 – Fotomicrografia de contraste de fase de
esporos de C. estertheticum subsp. estertheticum DSM
8809 (a) e C. estertheticum subsp. laramiense DSM 14864
(b) (SPRING et al., 2003).
16
- Clostridium gasigenes
Esses microrganismos desenvolvem-se em temperaturas de –1,5º a
26ºC, ótima de 20 a 22ºC e em faixa de pH de 5,4 a 8,6, ótimo de 6,2 a 8,6. São
bastonetes (FIGURA 3a), anaeróbios estritos e Gram-positivos, capazes de
produzir esporos elípticos e subterminais (FIGURA 3b). De forma semelhante a C.
estertheticum, são móveis, com presença de flagelo único conforme indicado na
Figura 4c (BRODA et al., 2000).
A espécie desenvolve-se pouco na ausência de carboidratos. É capaz
de fermentar celobiose, frutose, glucose, inositol, maltose, manose, salicina e
trealose produzindo, em caldo PYGS (Peptone Yeast Extract Glucose), etanol,
acetato, butirato, lactato, butanol, dióxido de carbono e hidrogênio. Ainda hidrolisa
gelatina, esculina e amido. Observa-se liberação de ácido acético, ácido lático,
ácido butírico, butanol, etanol, pentanol, cadaverina, putrescina e grandes
quantidades de dióxido de carbono e hidrogênio, determinando distensão de
embalagem (BRODA et al. 2000).
As colônias do C. gasigenes apresentam, em ágar-sangue de ovelha,
0,7-3,0mm de diâmetro, margem circular cinza ou branca, convexidade, caráter
brilhante e ação beta-hemolítica. (BRODA et al., 2000).
Assim como o C. estertheticum, está presente no solo e trato
gastrintestinal de bovinos, equinos e ovinos (BRODA et al., 2002). Foi identificado
em amostras de fezes, solo de estabelecimentos de abate, swabs de ambiente de
sala de desossa e câmara-fria, geralmente associado ao C. estertheticum
(BRODA et al., 2003). Recentemente foi identificado como microrganismo
predominante da microbiota intestinal de trutas arco-íris, Oncorhynchus mykiss,
introduzidas no Brasil, oriunda da Inglaterra, em 1913, indicando a presença do
microrganismo na água (POND et al., 2006).
É deteriorante de carnes bovinas frescas refrigeradas e embaladas a
vácuo, capaz de produzir grande variedade e concentração de compostos voláteis
semelhantes às produzidas pelo C. estertheticum. O microrganismo foi
identificado em carnes bovinas frescas embaladas a vácuo e refrigeradas a
temperatura de 2ºC que apresentaram deterioração, com produção de bolhas, 14
dias pós-produção (BRODA et al., 2000).
17
Foi isolado por BRODA et al. (2000) em carnes de cordeiro embaladas
a vácuo e refrigeradas nas quais havia tufamento de embalagem, alta exsudação
e degradação da carne. Foram isoladas duas cepas, inicialmente identificadas
como DB1A e R26 (BRODA et al., 2000). A cepa identificada como DB1A foi
depositada na DSMZ com número 12272. Comprovou ser pertencente ao gênero
Clostridium após a análise filogenética do seu DNA.
Em 2003, para a detecção molecular do Clostridium gasigenes foi
desenvolvido um par de primers, que tem como alvo uma seqüência da
subunidade 16S do RNA ribossômico de C. gasigenes produzindo um amplicon
de 935 pares de base (BRODA et al., 2003). Atualmente esse par de primers é o
único disponível para diagnóstico por PCR de C. gasigenes.
18
FIGURA 3. Fotomicrografias de contraste de fase de C. gasigenes DB1A:
célula vegetativa (a) e células esporuladas (b). Fotomicrografia eletrônica de
célula vegetativa de C. gasigenes DB1A contendo flagelo petríqueo (c)
(BRODA et al., 2000).
19
3. OBJETIVOS
3.1 Objetivo geral
Determinar a frequência de C. estertheticum e C. gasigenes em
carcaças, meias-carcaças refrigeradas, cortes cárneos resfriados embalados a
vácuo e em ambiente de estabelecimentos de abate e processamento de bovinos.
3.2 Objetivos específicos
Determinar a distribuição de C. estertheticum e C. gasigenes em
amostras de diferentes fontes em matadouros-frigoríficos;
Determinar a distribuição de C. estertheticum e C. gasigenes em
alguns Estados brasileiros e em matadouros-frigoríficos localizados em áreas
geográficas diversas;
Avaliar a aplicabilidade de três pares de primers para detecção de C.
estertheticum em amostras de diferentes fontes (swabs de carcaças, meias-
carcaças, ambiente e carnes bovinas) pela técnica de PCR.
20
4 MATERIAL E MÉTODOS
Amostragem
A amostragem foi composta por 249 entidades individuais oriundas de
25 unidades industriais pertencentes a oito matadouros-frigoríficos brasileiros.
Deste total, foram colhidas ao acaso, 142 amostras de ambiente, 49 de superfície
de carcaça, 48 de cortes cárneos bovinos refrigerados embalados a vácuo e 10
de fezes bovinas. Dentre as 142 amostras de ambiente, 91 eram provenientes de
salas de desossas, 30 de ralos de câmaras-frias e 21 de sala de matança. Dentre
as 49 amostras de superfície de carcaça, nove eram de carcaças antes da esfola,
14 depois da esfola e 26 de meias-carcaças refrigeradas, colhidas na entrada da
sala de desossa.
A distribuição das amostras analisadas, segundo as fontes e
estabelecimentos pode ser observada nos Quadros 1-7 (ANEXO).
As amostras procederam de estabelecimentos de abate habilitados
para realizar comércio internacional localizados nos Estados de Goiás, São Paulo,
Minas Gerais, Mato Grosso, Mato Grosso do Sul, Pará, Bahia e Acre. Essas
amostras foram colhidas e encaminhadas pelas indústrias ao laboratório de
Biologia Molecular do Centro de Pesquisas em Alimentos da Escola de
Veterinária da Universidade Federal de Goiás (CPA/EV/UFG) com a finalidade de
monitorar a presença de C. estertheticum em seus fluxogramas de produção.
Dos cortes cárneos, 27 apresentavam sinais de deterioração, sendo
que 17 consistiam em produtos devolvidos por clientes e ainda estavam dentro do
prazo de validade. Enquanto que 10 amostras estavam com o prazo de validade
ultrapassado e eram provenientes de testes de vida de prateleira. Dentre os
cortes deteriorados, apenas três não apresentaram produção de gás. Os 21
cortes cárneos restantes não apresentavam indícios de deterioração, tendo sido
encaminhados pelas indústrias ao laboratório, aproximadamente dois dias após
sua embalagem, com a finalidade de monitorar as condições de produção.
Do total da amostragem, 85 eram provenientes de matadouros-
frigoríficos situados no Estado de São Paulo (34,14%), 59 (23,70%) de Goiás, 37
(14,86%) de Minas Gerais, 35 (14,06%) do Mato Grosso, 16 (6,42%) do Mato
21
Grosso do Sul, 12 (4,82%) do Pará e cinco (2,00%) amostras de outros Estados
(Acre e Bahia).
Visando caracterizar as empresas de modo a não identifica-las, foram
adotadas letras do alfabeto sendo que do Matadouro frigorífico A foram
analisadas 109 amostras, do B 38, do C 32, do D 24, do E 23 e do F 17. Seis
amostras eram de dois outros estabelecimentos.
Como controles positivos das reações de PCR foram utilizadas
amostras de DNA genômico extraído a partir de cepas de referência adquiridas
junto a DSMZ (Coleção Alemã de Microrganismos e Culturas Celulares,
Braunschweig, Alemanha). Para C. estertheticum utilizou-se a cepa de referência
DSM 8809
e para C. gasigenes, DSM 12272.
Adicionalmente, cepas de C. frigoris (DSM 14204), C. frigidicarnis
(DSM 12271) e C. algidicarnis (DSM 15099) foram incluídas como controle
negativo.
4.1.1 Colheita de amostras
As amostras de ambiente, superfície de carcaças (paleta, coxão e
região perineal) e meias-carcaças foram colhidas com swabs umedecidos em
solução salina 0,85%, realizando-se esfregaços em áreas correspondentes a 100
cm
2
ou 10 cm
2
, em função da superfície disponível para colheita e acondicionadas
em tubos esterilizados. As amostras de fezes bovinas foram colhidas do reto dos
animais e embaladas em sacos plásticos esterilizados.
Após a identificação com etiquetas adesivas, as amostras foram
acondicionadas em caixas isotérmicas contendo gelo em escamas e
encaminhadas ao laboratório de Biologia Molecular do CPA/EV/UFG, onde foram
imediatamente processadas.
As carnes embaladas a vácuo foram igualmente encaminhadas em
caixas isotérmicas, observando-se a integridade física das embalagens e a
manutenção de baixas temperaturas dos cortes.
22
4.2 Técnica de PCR
4.2.1 Preparo das amostras e extração do DNA genômico
Aos swabs foram adicionados 5 mL de solução salina a 0,85%, seguido
por homogeneização. Das amostras de carne utilizou-se 3 mL do exsudato
presente no interior das embalagens. Das amostras de fezes, utilizou-se 1g
ressuspendido em 3 mL de solução salina a 0,85%. Estes foram acondicionados
em tubos cônicos e centrifugados a 10.000 rpm/15 min. O sobrenadante foi
descartado e o sedimento ressuspendido em 500 µL de tampão Tris-EDTA (TE,
10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8,0). Este foi transferido para um tubo de
polipropileno com capacidade de 1,5 mL. A extração foi realizada seguindo-se o
protocolo descrito por van SOOLINGEN et al. (1991).
4.2.2 Eletroforese em gel de agarose para avaliação da qualidade e
quantificação do DNA genômico
Objetivando a avaliação da integridade e a determinação da
concentração do DNA, 2 µL da solução de DNA obtido de cada amostra foram
submetidos à eletroforese em gel de agarose a 0,8%, a 90 volts (V) durante 40
minutos. O gel foi corado em solução de brometo de etídeo (0,6 µg/mL)
visualizado em luz ultravioleta e a documentação fotográfica realizada com
câmera digital (Cybershot DSC-S600, Sony).
As amostras que se apresentaram como bandas difusas ao longo do
gel foram descartadas e novas extrações conduzidas. Foram utilizados para a
amplificação apenas DNA cujos fragmentos foram visualizados como faixas
compactas na parte superior do gel. A concentração foi estimada através de
comparação visual com diluições conhecidas de λ DNA (Invitrogen®). Após a
quantificação do DNA, este foi diluído de forma a se obter uma solução contendo
100 ng/5µl, concentração utilizada para a amplificação.
23
4.2.3 Primers utilizados nas reações e condições de amplificação
Foram utilizados três pares de primers para a detecção de C.
estertheticum. Um par foi delineado por Helps et al. (1999) e é composto pelos
primers forward RFP (5’ TGATCGCATGATCTTAACATCAAAG 3’) e reverse RRP
(5’ CGACCCCCGACACCTAGTATT 3’), que se encontram nas posições 173-197
e 813-792, respectivamente, da subunidade 16S do RNAr de C. estertheticum, nº
de acesso no GenBank S46734 (GENBANK, 2007). Deste par obtém-se um
produto de amplificação de 641 pares de base (pb).
O par delineado por Broda et al. (2003) é composto pelos pares 16SEF
(5’ TCGGAATTTCACTTTGAG 3’) e 16SER (5’ AAGGACTTCACTCATCTCTG 3’)
que se encontram localizados nas posições 207-223 e 996-977, respectivamente,
da subunidade 16S do RNAr de C. estertheticum nº de acesso S46734
(GENBANK, 2007). Este par fornece um produto de amplificação de 790 pb.
O terceiro par empregado neste trabalho foi obtido a partir da avaliação
de dois pares de primers delineados por outros autores para a detecção de C.
estertheticum (HELPS et al., 1999). Com a recombinação dos pares, obteve-se
um par de primers com resultados satisfatórios quanto à homologia da seqüência
de bases depositadas no banco de dados do Genbank (GENBANK, 2007).
Amplifica um fragmento de 434 pb, é composto pelos primers RFP
(5’TGATCGCATGATCTTAACATCAAAG 3’) e ORP (5’
ATGCAGCACCCAAGTTAAGCTC 3’) que se encontram localizados nas posições
173-197 e 606-585, respectivamente, da subunidade 16S do RNAr de C.
estertheticum (nº S46734, GENBANK, 2007).
Para detecção de C. gasigenes, empregou-se o par proposto por Broda
et al. (2003), composto pelos primers 16SDBF (5’
GAGAGGAGTTCTTCGGAACGA 3’) e 16SDBR (5’ AAGCSACTTCCCCAATTAC
3’). Estes primers encontram-se localizados nas posições 61-81 e 995-977,
respectivamente, na seqüência de referência do microrganismo (nº de acesso
AF092548 e AF143692; GENBANK, 2007), amplificando fragmentos de 935 pb.
Utilizou-se os protocolos originais, propostos por Helps et al. (1999) e
Broda et al. (2003), das soluções que compuseram as misturas das reações e das
24
condições do PCR para cada par de primer. As concentrações finais encontram-
se descritas nos Quadros 1 e 2.
QUADRO 1- Misturas das reações de PCR e concentrações finais dos reagentes,
segundo os pares de primers utilizados, para detecção molecular de
C. estertheticum
REAGENTES
PARES DE PRIMERS
RFP/RRP 16SEF/16SER RFP/ORP
REFERÊNCIA HELPS et al. (1999) BRODA et al. (2003)
Presente
trabalho
AMPLICON 641 pb 790 pb 434 pb
TAMPÃO 10X
5
µL 5 µL 5 µL
100MM TRIS-HCL PH 8.3
500MM KCL
DNA 100 ng 100 ng 100 ng
PRIMERS 0,3 mM 0,5 mM 0,3 mM
DNTP 0,2 mM 0,2 mM 0,2 mM
MGCL
2
1,5 mM 1,5 mM 1,5 mM
TAQ DNA POLIMERASE 2U 4U 2U
VOLUME TOTAL
50µL 50µL 50µL
25
QUADRO 2 - Mistura da reação de PCR e concentrações finais dos reagentes
para a detecção de C. gasigenes
REAGENTES
PAR DE PRIMERS
16DBF/16DBR
REFERÊNCIA BRODA et al. (2003)
AMPLICON 935 pb
TAMPÃO PCR 10X
5 µL
100MMTRIS-HCL PH 8.3
500MM KCL
SOLUÇÃO DE DNA 100 ng
PRIMERS
0,5 mM
DNTP 0,2 mM
MGCL
2
1,5 mM
TAQ DNA POLIMERASE 2,5 U
VOLUME TOTAL
50 µL
Nas reações com os pares RFP e RRP (HELPS et al., 1999) e RFP e
ORP, as amostras foram submetidas à desnaturação inicial a 95ºC/5 min,
seguindo-se 40 ciclos de desnaturação a 94ºC/1 min, anelamento a 60ºC/1 min,
extensão a 72ºC/1 min, com extensão final a 72ºC/10 min.
Nas reações com os pares 16SEF/16SER e 16DBF/16DBR, segundo
proposto por Broda et al. (2003), as amostras foram submetidas à desnaturação
inicial a 93ºC/3 min, seguindo-se 30 ciclos que compreendem desnaturação a
92ºC/1 min, anelamento a 55ºC/1 min e extensão a 72ºC/2min, com extensão final
de 72ºC/3min.
Após as amplificações, os produtos de PCR foram submetidos à
eletroforese em gel de agarose a 1%, com alinhamento inicial de 130 v/10 min e
corrida 110 v/40 min. O marcador de padrão de peso molecular utilizado foi 100
pb DNA Ladder (Invitrogen®). Os géis foram corados em solução de brometo de
etídeo (0,6µg/mL), visualizados em transiluminador de luz ultravioleta e a
26
documentação fotográfica realizada com sistema digital de captura de imagens
(Vilber-Loumart, França).
4.3 Confirmação da identidade molecular dos produtos de PCR
Foram selecionadas 12 amostras positivas para C. estertheticum,
amplificadas com os três pares de primers estudados e quatro positivas para C.
gasigenes. Estas foram encaminhadas ao Laboratório de Biologia Celular da
Universidade de Brasília visando o sequenciamento para confirmar a identidade
molecular dos produtos de PCR obtidos.
Os produtos de PCR foram purificados utilizando-se kit comercial
(QIAquick PCR Purification Kit, Qiagen) e quantificados por meio de comparação
visual das amostras com o padrão de PM (Low DNA Mass Ladder, Invitrogen) em
gel de agarose a 2% com brometo de etídeo (0,6µg/mL), visualizado em
transiluminador de luz ultravioleta. Após a determinação das concentrações, as
amostras foram seqüenciadas (seqüenciador automático Megabace 1000 –
Amersham Biotech®). As sequências obtidas foram analisadas utilizando
ferramentas de bioinformática Phred, Phrap e CAP3 e comparadas com as
seqüências de referência registradas no GenBank (nº de acesso S46734 para C.
estertheticum e nº de acesso AF092548 e AF143692 para C. gasigenes ).
27
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Detecção C. estertheticum
Ocorrência de C. estertheticum de acordo com as fontes de detecção
A Tabela 1 apresenta a distribuição de C. estertheticum nas diferentes
fontes analisadas, por meio da técnica de PCR. Do total de amostras, 103/249
(41,37%) foram positivas pelo menos a par de primers, enquanto que 146/249
(58,63%) foram negativas.
Considerando as fontes de detecção, nas amostras de sala de
desossa, 23/91 (25,28%) foram positivas e 67/91 (74,72%) negativas. As maiores
frequências de amostras positivas foram observadas em esteira, 07/20 (35%), e
ralos, 10/30 (33,33%). Em evaporador e rolete de esteira, 04/20 (20%) e 02/21
(9,52%) foram positivas, respectivamente. Por outro lado, amostras negativas
foram observadas em 13/20 (65%) e 20/30 (66,67%) das esteiras e ralos,
respectivamente; em evaporadores, 16/20 (80%) e em rolete de esteira,
19/21(90,48%) (TABELA 1).
Dos cortes cárneos, 25/48 (52,08%) foram positivos e 23/48 (47,92%)
negativos. Dos cortes deteriorados, 23/27 (85,18%) foram positivos e 04/27
(14,82%) negativos, enquanto que, dos não deteriorados, 02/21 (9,52%) e 19/21
(90,48%) foram positivos e negativos, respectivamente. Apenas duas amostras
deterioradas não apresentavam indícios de produção de gás, característica do
crescimento de C. estertheticum, e foram negativas. Na Figura 4 pode-se
observar a apresentação de cortes cárneos, sendo destacadas a alteração de cor,
intensa produção de gás e liberação de exsudato no interior da embalagem.
Todos os cortes não deteriorados eram de produção recente e foram
analisados após um período de dois a três dias após a embalagem. A baixa
frequência de C. estertheticum em cortes não deteriorados pode ser atribuída à
realização de análise após curto período de produção, insuficiente para ocorrer
germinação dos esporos e aumento do número de células vegetativas. Deve-se
28
considerar a possibilidade do microrganismo estar presente em número reduzido
de células, inferior aos limiares de detecção da técnica, visto que as amostras
foram submetidas à extração direta de DNA, ou seja sem enriquecimento.
Ao avaliar os resultados obtidos em carnes deterioradas, torna-se
importante ressaltar que não foi propósito deste trabalho firmar diagnóstico
diferencial entre espécies que determinam um quadro de deterioração com
intensa produção de gás. Outros microrganismos, como bactérias ácido-láticas e
da família Enterobacteriaceae devem ser considerados. Neste caso, deve ser
analisado o histórico do problema, observando se existem relatos de abuso de
temperatura de armazenamento dos cortes, intensidade de produção de gás nos
cortes, características sensoriais, período decorrido entre produção dos cortes e
início das alterações e distribuição ambiental de C. estertheticum nos
estabelecimento de origem.
29
TABELA 1 – Distribuição de C. estertheticum e C. gasigenes em amostras de matadouros-frigoríficos brasileiros no período de
2003 a 2007, segundo as fontes de detecção, por meio da técnica de PCR. Goiânia, 2007
FONTES C. estertheticum C. gasigenes
(+) (-) (+) (-)
N°
%
N°
%
N°
%
N°
%
SALA DE DESOSSA
RALO
EVAPORADOR
ESTEIRA
ROLETE (ESTEIRA)
23/91
10/30
04/20
07/20
02/21
25,28
33,33
20,00
35,00
9,52
68/91
20/30
16/20
13/20
19/21
74,72
66,67
80,00
65,00
90,48
05/91
01/30
-
1
02/20
02/21
5,49
3,33
-
10,00
9,52
86/91
29/30
20/20
18/20
19/21
94,51
96,67
100,00
90,00
90,48
CORTES CÁRNEOS
DETERIORADOS
NÃO-DETERIORADOS
25/48
23/27
02/21
52,08
81,18
9,52
23/48
04/27
19/21
47,92
14,82
90,98
06/48
05/27
01/21
12,50
18,52
4,76
42/48
22/27
20/21
87,50
81,48
95,24
RALO (CAMARA FRIA)
12/30 40,00 18/30 60,00 1/30 3,33 29/30 96,67
M
EIAS-CARCAÇAS
REFRIGERADAS
14/26 53,84 12/26 46,15 04/26 15,38 22/26 84,61
C
ARCAÇAS
ANTES DA ESFOLA
DEPOIS DA ESFOLA
11/23
06/09
05/14
47,83
66,66
35,71
12/23
03/09
09/14
52,17
33,34
64,29
03/23
02/09
01/14
13,04
22,22
7,14
20/23
07/09
13/14
86,96
77,78
92,86
S
ALA DE MATANÇA
RALO
ROLETE
BOX
PISO
09/21
03/08
02/07
04/05
-
42.86
37,50
28,57
80,0
-
12/21
05/08
05/07
01/05
01/01
57.14
62,50
71,43
20,0
100,00
02/21
-
01/07
01/05
01/01
9,52
-
14,29
20,00
100,00
19/21
08/08
06/07
04/05
-
90,48
100,00
85,71
80,00
-
F
EZES
09/10 90,00 01/10 10,00 03/10 30,00 07/10 70,00
TOTAL 103/249 41,37 146/249 58,63 24/249 9,64 225/249 90,36
1.
nenhuma amostra positiva detectada; (+) positivo; (-) negativo..
30
FIGURA 4 - Cortes cárneos bovinos frescos refrigerados embalados a
vácuo, apresentando deterioração com intensa produção de gás e
exsudação; (a) filé mignon; (b) contra-filé.
FONTE: RAUECKER, 2007
a
b
31
Em ralos de câmara-fria foram observadas 12/30 (40%) amostras
positivas e 18/30 (60%) negativas ao passo que em meias-carcaças refrigeradas,
14/26 (53,84%) e 12/26 (46,15%) apresentaram resultados positivos e negativos,
respectivamente. Em carcaças, 11/23 (47,83%) foram positivas e 12/23 (52,17%)
negativas. Destas, 06/09 (66,66%) carcaças foram positivas e 03/09 (33,34%)
negativas antes da esfola, colhidas de pele e região perianal, 05/14 (35,71%) e
09/14 (64,29%) foram positivas e negativas, respectivamente, após a esfola.
Na sala de matança, 09/21 (42,86%) amostras foram positivas,
enquanto que 12/21 (57,14%) foram negativas. O ponto de colheita com maior
número de amostras positivas foi o box de atordoamento, com 04/05 (80%). Em
ralo e rolete de pele 03/08 (37,50%) e 02/07 (28,57%) foram positivas,
respectivamente, enquanto que 05/08 (62,50%) e 05/07 (71,43%) negativas.
Apenas uma amostra de piso foi analisada e seu resultado foi negativo (TABELA
1).
Em fezes bovinas foram detectadas 09/10 (90%) amostras positivas e
uma foi negativa. Apesar do pequeno número de amostras analisadas, estes
resultados revelam a presença de C. estertheticum em percentuais elevados no
trato gastrintestinal de bovinos no Brasil, conforme já indicado por HELPS et al.
(1999) e BRODA et al. (1998, 2002, 2003) no Reino Unido e Nova Zelândia,
respectivamente.
Os resultados obtidos evidenciam a presença e disseminação de C.
estertheticum em todas as fontes analisadas. A elevada frequência em fezes e
ambiente de sala de matança indicam como fontes potenciais de contaminação,
fezes, conteúdo gastrintestinal, pele e pêlos, em concordância com BRODA et al.
(2002) e BOEREMA et al. (2003).
Devem ser considerados elementos favoráveis à disseminação dos
microrganismos, tais como a contaminação cruzada entre a pele, equipamentos e
ambiente durante o abate e esfola, além da propagação nas operações do
fluxograma de abate, por meio da contaminação ambiental. Os microrganismos
são introduzidos durante o abate devido às falhas operacionais, permanecem na
superfície das carcaças durante o processo e contaminam o ambiente
comprometendo toda a produção.
32
A manutenção de células viáveis de C. estertheticum no ambiente
deve-se a capacidade do microrganismo ser capaz de se manter por longos
períodos na forma esporulada, sendo resistente à maioria dos sanitizantes
utilizados. O uso de substâncias com poder esporicida não é rotineiro em
estabelecimentos de abate devido ao seu caráter corrosivo e oxidante. Portanto,
uma vez introduzido o microrganismo na planta do estabelecimento, os
sanitizantes normalmente utilizados na higienização da indústria são incapazes de
eliminá-lo.
As carcaças contaminadas dão origem a meias-carcaças e cortes
contaminados, responsáveis por grande contaminação ambiental, destacando-se
as de câmaras-frias e salas de desossa. Os percentuais de positividade obtidos
em amostras de câmaras-frias atingem 40%, corroborando com elevado grau de
contaminação de meias-carcaças após sua refrigeração, 53,84%.
À medida em que o produto é submetido à manipulação e contato com
superfícies contaminadas, a positividade cresce progressivamente, como pode
ser observado na Tabela 1. Isso preocupa, pois observa-se que na sala de
desossa os pontos de maior contaminação são as esteiras (35%) e ralos
(33,33%). As esteiras entram em contato direto com o produto, sendo um dos
principais responsáveis pela contaminação de origem ambiental na sala de
desossa.
A alta positividade verificada em amostras de ralos da sala de dessosa
e câmara-fria indica que esses locais provalvelmente tornam-se nichos ecológicos
de C. estertheticum após uma contaminação inicial proveniente das meias-
carcaças, já que podem apresentar condições para o desenvolvimento dos
microrganismos. A temperatura de no máximo 10ºC da sala de desossa (PARDI
et al., 2006) é ideal para a germinação dos esporos, se uma situação de redução
de tensão de oxigênio for criada. Soma-se a isso o fato de que os ralos recebem
uma elevada carga de contaminação e acúmulo de matéria orgânica proveniente
de toda a sala.
Ao comparar os resultados obtidos com o único trabalho existente na
literatura internacional envolvendo frequência de C. estertheticum em ambiente de
matadouros frigoríficos e fezes bovinas (BOEREMA et al., 2003) observa-se que
no presente trabalho, o microrganismo foi detectado em todos os 14 pontos de
33
colheita analisados, enquanto que no estudo conduzido por Boerema et al. (2003)
o microrganismo foi detectado em apenas oito amostras, provenientes de solo,
fezes, área de sangria e pele de animais.
Mesmo considerando as amostras positivas obtidas utilizando o par
16SEF/16SER, o mesmo par adotado no trabalho conduzido por Boerema et al.
(2003), foi observado um número superior de amostras positivas detectadas,
oriundas de diversas fontes, como evaporador da sala de desossa, esteira, rolete,
cortes cárneos, meias-carcaças refrigeradas, carcaças na sala de matança, rolete
de pele, box de atordoamento, piso de sala de matança e fezes, num total de
38/103 (36,89%) amostras positivas. Essa frequência superior de amostras
positivas pode indicar um elevado grau de contaminação e ampla disseminação
do microrganismo em matadouros-frigoríficos brasileiros.
5.1.1.1 Correlação entre temperatura e frequência de C. estertheticum
Ao correlacionar valores de temperatura de carcaças, cortes cárneos e
do ambiente onde foram colhidas as amostras conforme cada fonte analisada
com as frequências de amostras positivas para C. estertheticum (FIGURA 5),
verifica-se que o maior número de amostras positivas foi obtido em temperaturas
entre 0 e 10ºC, referentes a cortes cárneos refrigerados, meias carcaças
refrigeradas e sala de desossa. Nas amostras obtidas em fontes com
temperaturas próximas a 40ºC, ocorreu um aumento gradativo de positividade,
conforme pode ser observado na referida Figura.
Os pontos com maiores frequências de positividade, temperatura entre
0 e 10ºC, coincidem com a faixa ótima de multiplicação de C. estertheticum
subsp. estertheticum, que é entre 6 e 8ºC (SPRING et al., 2003) e compreende a
faixa de crescimento da subespécie laramiense. Esses resultados sugerem que
existem condições de multiplicação do microrganismo em ambiente de sala de
desossa, o que pode agravar a disseminação ambiental de C. estertheticum em
matadouros-frigoríficos.
A correlação entre aumento de frequência de amostras positivas em
amostras provenientes de fontes com temperaturas próximas a 40ºC deve-se a
34
natureza dessas fontes, ralo de sala de abate, região perineal e rolete de retirada
da pele, locais com elevados índices de contaminação por partículas de solo e
fezes.
C. Estherticum
(r=0,258, p=0,053)
0
5
10
15
20
25
0 10203040
temperatura (C)
numero de amostras
comtaminadas
C. estertheticum
r = 0,258 p = 0,053
FIGURA 5 - Correlação entre temperatura e ocorrência de C.
estertheticum em amostras ambientais e de carnes bovinas
35
Distribuição de C. estertheticum segundo os pares de primers e fontes de
detecção
Na Tabela 2 encontra-se a distribuição de C. estertheticum, nas
diferentes fontes de detecção segundo os pares de primers utilizados para
amplificação. Das 103 amostras positivas identificadas no presente trabalho,
81/103 (78,64%) foram detectadas com o par de primers RFP/RRP (FIGURA 6),
59/103 (57,28%) com RFP/ORP (FIGURA 7) e 38/103 (36,89%) com
16SEF/16SER (FIGURA 8).
De modo geral, o par RFP/RRP apresentou maior eficiência para
detecção de C. estertheticum, com algumas variações de acordo com as fontes
analisadas. Na sala da desossa, este par detectou 15 das 23 amostras positivas
(65,22%), seguido por RFP/ORP 09/23 (39,13%) e 16SEF/16SER 8/23 (37,78%).
Dentre as 15 amostras detectadas com o par RFP/RRP, 10/10 (100%) eram
provenientes de ralo, 03/04 (75%) de evaporador e 02/07 (28,57%) de esteira. As
nove amostras positivas com o par RFP/ORP, eram provenientes de ralo, 05/10
(50%) de evaporadores, 02/04 (50%) e de esteiras, 02/07 (28,57%). Com o par
16SEF/16SER foi detectada positividade em 03/04 (75%) amostras de
evaporadores, 03/07 (42,86) amostras de esteira e 02/02 amostras de rolete
(100%). Considerando as fontes estudadas pode-se observar que o par
16SEF/16SER foi capaz de identificar um maior número de amostras positivas em
em esteiras e roletes.
Dentre os 23 cortes cárneos positivos, 23/25 (92%) foram positivos ao
utilizar o par RFP/RRP, 21/23 (91,30) com o par RFP/ORP e 14/23 (56%) com o
par 16SEF/16SER. Nessa fonte de detecção os pares RFP/RRP e RFP/ORP
determinaram percentuais semelhantes, sendo os mais eficientes na detecção de
C. estertheticum em cortes cárneos.
Nas amostras de ralos de câmara-fria, 12 foram positivas. Nesta fonte
o par RFP/RRP novamente apresentou maior eficiência, detectando 10/12
(83,33%). Com o par RFP/ORP, 04/12 (33,33%) foram positivas. Nenhuma
amostra foi positiva com o par 16SEF/16SER.
36
Nas 14 amostras positivas de superfície de meias-carcaças
refrigeradas, 10 foram detectadas com o par RFP/ORP (71,43%), apresentando
maior eficiência nesta fonte. Com o par RFP/RRP, 08/14 foram detectadas e com
o par 16SEF/16SER, 05/14.
Em 11 amostras de carcaça positivas, 09/11 (81,82%) foram
detectadas com o par RFP/RRP, 05/11 (45,46%), com o par RFP/ORP e 03/11
(27,27%) com o par 16SEF/16SER. Nas amostras de Sala de Matança 09/09
foram positivas com o par RFP/RRP, 05/09 com o par RFP/ORP e 03/09 com o
par 16SEF/16SER. Nas amostras de fezes, 09 foram positivas, todas detectadas
com o par RFP/RRP, enquanto que com os pares RFP/ORP e 16SEF/16SER
foram verificadas 05/09 (55,55%) positivas com cada um deles.
A eficiência apresentada pelo par RFP/ORP no total das amostras
pode ser considerada baixa, uma vez que o mesmo detectou menos de 60% do
total das amostras positivas deste trabalho, apesar de ter se mostrado superior ao
16SEF/16SER, que permitiu detectar 36,89%. Por outro lado, o par RFP/RRP,
embora tenha identificado 74,76% das amostras positivas, não apresentou
eficiência satisfatória.
Ao avaliar as amostras positivas analisadas e os pares de primers
adotados, observa-se que a amplificação que empregou o par RFP/RRP
possibilitou a identificação de todas as amostras positivas apenas em amostras
de ralo da sala de desossa, carcaças antes da esfola, rolete da sala de matança e
em fezes. Por outro lado, este par não detectou nenhuma amostra positiva
identificada em rolete de esteira, sendo essa amostra positiva apenas quando
empregado o par 16SEF/16SER.
O par RFP/ORP não detectou amostras positivas em rolete de sala de
desossa, mas identificou todas as amostras positivas da sala de matança. Este
par apresentou elevado desempenho para detecção de C. estertheticum em
amostras de cortes cárneos (21/25). Seus piores desempenhos foram obtidos nas
amostras de sala de desossa (39,13% das positivas) e ralo da câmara-fria
(33,33%).
37
TABELA 2 - Distribuição de C. estertheticum em amostras positivas em
Matadouros-Frigoríficos brasileiros, no período de 2003 a 2007,
segundo os pares de primers utilizados para amplificação, Goiânia,
2007
FONTES C. estertheticum
Helps et al. (1999) Presente trabalho Broda et al. (2003)
(+) (+) (+)
N°
%
N°
%
N°
%
SALA DE DESOSSA
RALO
EVAPORADOR
ESTEIRA
ROLETE (ESTEIRA)
15/23
10/10
03/04
02/07
-
65,22
100,00
75,00
28,57
-
09/23
05/10
02/04
02/07
-
39,13
50,00
50,00
28,57
-
08/23
-
1
03/04
03/07
02/02
37,78
-
75,00
42,86
100,00
CORTES CÁRNEOS
23/25 92,00 21/25 91,30 14/25 56,00
R
ALO
(
CAMARA FRIA)
10/12 83,33 04/12 33,33 - -
M
EIAS-CARCAÇAS
REFRIGERADAS
08/14 57,14 10/14 71,43 05/14 35,71
C
ARCAÇAS
ANTES DA ESFOLA
DEPOIS DA ESFOLA
09/11
06/06
03/05
81,82
100,00
60,00
05/11
03/06
02/05
45,46
50,00
40,00
03/11
02/06
01/05
27,27
33,33
20,00
S
ALA DE MATANÇA
RALO
ROLETE
BOX
PISO
07/09
02/03
02/02
03/04
-
77,78
6,67
100,00
75,00
-
05/09
03/03
01/02
01/04
-
55,56
100,00
50,00
25,00
-
03/09
-
01/02
02/04
-
33,33
-
50,00
50,00
-
F
EZES
09/09 100,00 05/09 55,55 05/09 55,55
TOTAL 81/103 78,64 59/103 57,28 38/103 36,89
1. nenhuma amostra positiva detectada
(+). amostra positiva
38
12345678910
641pb
FIGURA 6 – Gel de eletroforese de produtos de PCR de 641 pb do 16S
RNAr de C. estertheticum obtidos a partir de cortes cárneos bovinos
resfriados embalados a vácuo empregando–se os pares de primers
RFP/RRP. 1: marcador de peso molecular (DNA ladder 100pb); 2:
controle positivo (DSM 8809); 3 a 7 amostras positivas; 8 e 9: amostras
negativas; 10 controle negativo.
12345678
FIGURA 7 – Gel de eletroforese de produtos de PCR de 434 pb do
16S RNAr de C. estertheticum obtidos a partir de cortes cárneos
bovinos resfriados embalados a vácuo empregando–se os pares de
primers RFP/ORP. 1: marcador de peso molecular (DNA ladder
100pb); 2 e 3: controles positivos (DSMZ 8809
t
); 4 a 6: amostras
positivas; 7 e 8: controles negativos.
434pb
39
12345
6789
790pb
FIGURA 8 – Gel de eletroforese de produtos de PCR de
790 pb do 16S RNAr de C. estertheticum obtidos a partir
de amostras de cortes cárneos bovinos resfriados
embalados a vácuo, empregando-se o par de primers
16SEF/16SER. 1: marcador de peso molecular (DNA
ladder 100pb); 2: controle negativo; 3: controle positivo
(DSMZ 8809); 4 a 9: amostras positivas.
40
Associação de primers na detecção de C. estertheticum
No presente estudo, de 249 amostras analisadas, foram identificadas
103 amostras positivas para C. estertheticum, independente dos pares de primers
utilizados. A Figura 9 apresenta a distribuição desta espécie nas amostras
positivas, segundo os três pares de primers utilizados. Pode-se observar que
77/103 (74,76%) amostras foram identificadas com a amplificação com o par
RFP/RRP, 62/103 (60/19%) com RFP/ORP e 38/103 (36,89%) com 16SEF/16SER
(FIGURA 9). Estes dados revelam o desempenho superior apresentado pelo par
RFP/RRP no total da amostragem, bem como a baixa eficiência do
16SEF/16SER.
Considerando o total de amostras positivas obtidas neste trabalho, os
resultados evidenciam a necessidade de se utilizar associações entre os três
pares para se elevar o percentual de detecção de amostras positivas. A técnica de
PCR mostrou-se satisfatória na detecção das espécies analisadas em carnes,
equipamentos e ambiente de abate, embora a obtenção da totalidade das
amostras positivas para C. estertheticum tenha sido possível apenas com a
associação dos três pares de primers;
Ao considerar as possíveis associações entre os primers, Figura 10
pode-se observar que a combinação dos resultados obtidos com cada um
individualmente proporciona um aumento do número de amostras positivas
identificadas no total analisado, em níveis que variam de acordo com a
associação realizada entre eles.
Dentre as associações, apresentadas na Figura 10, os pares RFP/RRP-
RFP/ORP identificaram 95/103 (92,2 %) e os pares RFP/RRP-16SEF/16SER e
RFP/ORP-16SEF/16SER, 89/103 (86,41%) e 71/103 (68,93%), respectivamente.
As combinações dos pares RFP/RRP-RFP/ORP e RFP/RRP-16SEF/16SER
apresentaram os melhores resultados. Nota-se, entretanto, que eficiência elevada
foi obtida com RFP/RRP-RFP/ORP (95/103, 92,23%) e reduzida com os pares
RFP/ORP-16SEF/16SER.
41
FIGURA 10 – Associações entre os pares de primers
RFP/RRP, RFP/ORP e 16SEF/16SER na detecção de
amostras positivas para C. estertheticum
FIGURA 9 – Desempenho individual dos pares de
primers RFP/RRP, RFP/ORP e 16SEF/16SER na
detecção de amostras positivas para C. estertheticum
42
Qualquer uma das associações mostrou-se eficiente para detecção de
amostras adicionais, em relação aos resultados obtidos com o uso de um único
par. A amplificação com o par RFP/RRP detectou 77 amostras positivas. A
associação deste par de primers com os outros dois pares determinou uma
elevação de amostras positivas para 95, quando associado ao par RFP/ORP e
para 89, quando associado ao par 16SEF/16SER. Se a amplificação com apenas
o par RFP/ORP detectou 62 amostras positivas, a combinação com qualquer um
dos demais foi suficiente para elevar o número de amostras identificadas.
Levando-se em conta que apenas 38 amostras positivas foram detectadas com o
par 16SEF/16SER, tanto a combinação com o par RFP/RRP, ou com RFP/ORP,
aumentou significativamente o número de positivas, que de 38 passou para 89
com o par RFP/RRP e para 71 com RFP/ORP. A identificação de 100% das
amostras positivas só foi alcançada com a amplificação das amostras com os três
pares e os resultados obtidos considerados em conjunto.
5.1.4 Distribuição de C. estertheticum segundo os estabelecimentos de
procedência e a origem geográfica das amostras
Os resultados das amostras positivas, segundo sua origem, encontram-
se na Tabela 4. Para C. estertheticum, o Estado com maior índice de positividade,
considerando a amostragem analisada, foi Mato Grosso do Sul com 10/16
(62,50%), seguido pelo Estado do Pará, 06/12 (50%), Minas Gerais, 18/37
(48,65%), Goiás, 28/59 (47,46%), São Paulo, 29 (34,12%), Mato Grosso, 10/35
(28,57%).Nos outros Estados (Acre e Bahia), 02/05 (40%) foram positivas para C.
estertheticum.
Estes resultados não são suficientes para classificar os Estados
analisados de acordo com os percentuais observados devido a baixa amostragem
dos Estados da Bahia, Pará e Acre, mas são fundamentais para avaliar a
disseminação geográfica dos microrganismos no país. C. estertheticum foi
detectado em todos os Estados avaliados, das regiões Norte, Nordeste, Sudeste
e Centro-Oeste.
43
Os resultados obtidos de amostras provenientes de estabelecimentos
de abate de todos os Estados são preocupantes, pois independente do número de
amostras positivas, a presença do microrganismo é indicativa de falhas
operacionais e contaminação ambiental e de carne bovina por partículas de solo e
fezes.
Dos oito estabelecimentos incluídos neste trabalho, as maiores
freqüências de detecção de C. estertheticum foram verificadas nos frigoríficos E,
F, C, B, A e D, nesta ordem, em porcentagens que variaram de 20,83% a 78,26%
(TABELA 4), resultados que podem ser considerados muito elevados. Nos
estabelecimentos G e H (Outros), os índices encontrados foram de 16,67%.
Estes resultados indicam que C. estertheticum se apresenta
amplamente distribuído nos diferentes estabelecimentos de abate. Independente
do porte do estabelecimento, a disseminação do microrganismo ocorre de forma
semelhante, implicando que as falhas operacionais e problemas de higienização
ocorrem de forma generalizada.
44
TABELA 3 - Distribuição de C. estertheticum e C. gasigenes em amostras positivas segundo os
Estados e estabelecimentos de procedência no período de 2003 a 2007, por meio da
técnica de PCR. Goiânia, 2007
O
RIGEM GEOGRÁFICA
SP
(
85
)
GO
(
59
)
MG
(
37
)
MT
(
35
)
MS
(
16
)
PA
(
12
)
OUTROS
(
05
)
1
Nº
%
Nº
%
Nº
%
Nº
%
Nº
%
Nº
%
Nº
%
C. estertheticum
29/85 31,12 28/59 47,46 18/37 48,65 10/35 28,57 10/16 62,50 06/12 50,00 02/05 40,00
C. gasigenes
05/85 5,88 06/59 10,17 02/37 5,40 07/35 20,00 04/16 25,00 -
2
- -
-
M
ATADOUROS-FRIGORÍFICOS
A
(
109
)
B
(
38
)
C
(
32
)
D
(
24
)
E
(
23
)
F
(
17
)
OUTROS
(
06
)
3
Nº
%
Nº
%
Nº
%
Nº
%
Nº
%
Nº
%
Nº
%
C. estertheticum
36/109 33,03
16/38
42,10 17/32 53,12 05/24 20,83 18/23 78,26 10/17 58,82 01/06 16,67
C. gasigenes
08/109
7,34 - - 09/32 28,12 01/24 4,17 03/23 13,04 02/17 11,76 01/06 16,67
1.
AC e BA
2.
- nenhuma amostra positiva detectada
3.
- G e H
45
5.2 Ocorrência de C. gasigenes
5.2.1 Clostridium gasigenes segundo as fontes de detecção
Na Tabela 1 pode-se observar que do total de amostras analisadas 24/249
(9,64%) foram positivas (FIGURA 10), e 225/249 (90,36%) negativas para C.
gasigenes.
Considerando as fontes estudadas, os pontos que apresentaram maior
frequência de resultados positivos foram fezes bovinas 03/10 (30%), meias-carcaças
refrigeradas 04/26 (15,38%), carcaças na sala de matança 03/23 (13,04%), cortes
cárneos 06/48 (12,50%), sala de matança 02/21 (9,52%), sala de desossa 05/91
(5,49%) e ralo de câmara-fria 01/30 (3,33%).
Da sala de desossa, observou-se 05/91 (5,49%) amostras positivas para
C. gasigenes e 85/91 (94,51%) de negativas. Nas amostras de ralo 01/30 (3,33%) foi
positiva e 29/30 (96,67%) negativas, enquanto que todas de evaporadores foram
negativas. Por outro lado, nas esteiras e roletes de esteiras foram verificadas, 02/20
(10%) e 02/21 (9,52%) positivas, respectivamente e 18/20 (90%) e 18/21 (90,48%)
negativas, nas mesmas fontes.
Em cortes cárneos, dentre as amostras deterioradas, 05/27 (18,52%)
foram positivas e 22/27 (81,48%) negativas. Apenas uma não deteriorada apresentou
resultado positivo (TABELA 1).
Nas superfícies de carcaças verificou-se que 02/09 (22,22%) e 01/14
(7,145) foram positivas antes e depois da esfola, respectivamente, enquanto 07/09
(77,78%) e 13/14 (92,86%) foram negativas.
Considerando os pontos de colheita na sala de matança foram observadas
amostras positivas apenas em rolete da pele 01/07 (14,29%), box de insensibilização
01/05 (20%) e de piso 01/01.
Ao considerar que a eficiência máxima de detecção de C. estertheticum só
foi possível com a associação de três pares de primers, o baixo número de amostras
positivas obtidas para C. gasigenes pode ser decorrente do uso de apenas um par
46
de primers e do tipo de extração conduzida em material sem enriquecimento,
podendo obter uma solução de DNA com concentração inferior ao limiar de detecção
do par de primers adotado.
Apesar no número reduzido de amostras positivas para C. gasigenes
pode-se observar que sua distribuição nos pontos de detecção foi semelhante à
obtida para C. estertheticum. Presume-se então, como os dois microrganismos
dividem o mesmo habitat, que sua disseminação está associada às mesmas falhas
operacionais ocorridas na esfola, oclusão do reto, evisceração, além da limpeza e
desinfecção inadequadas do ambiente.
5.2.1.1 Correlação entre temperatura e C. gasigenes
Ao correlacionar valores de temperatura de carcaças, cortes cárneos e do
ambiente onde foram colhidas as amostras conforme cada fonte analisada com as
frequências de amostras positivas para C. gasigenes (FIGURA 11), verifica-se que o
maior número de amostras positivas foi obtido em temperaturas próximas a 20ºC,
com elevação de frequência de amostras positivas a partir de 10ºC e início de
declínio em temperaturas superiores a 20ºC.
As faixas de temperatura com maiores frequências de positividade,
próximas a 20ºC, coincidem com a faixa ótima de multiplicação de C. gasigenes, que
é de 20 a 22ºC (BRODA et al., 2000). Esses resultados sugerem que existem
condições de multiplicação ambiental do microrganismo, o que pode dificultar o seu
controle.
47
Figura 11 - Correlação entre temperatura e ocorrência de C.
gasigenes em amostras ambientais e de carnes bovinas
C. gasineses
(r=0,259, p=0,058)
0,00
1,00
2,00
3,00
4,00
5,00
6,00
010203040
temperatura (C)
numero de amostras
com taminadas
48
FIGURA 12 – Eletroforese de produtos de PCR de 934 pb do 16S
RNAr de C. gasigenes obtidos a partir de amostras de córtes
cárneos bovinos refrigerados embalados a vácuo. 1: marcador de
peso molecular (DNA ladder 100 pb); 2 e 3: controles positivos da
reação (DSM 12272); 4 a 6: amostras positivas; 7 e 8: controles
negativos da reação.
123
456 78
935pb
49
5.2.2 Distribuição de C. gasigenes segundo os estabelecimentos de procedência e
a origem geográfica das amostras
Os resultados das amostras positivas, segundo sua origem, encontram-se
na Tabela 4. Segundo a distribuição geográfica das amostras, o Estado com maior
número de amostras positivas foi Mato Grosso do Sul, com 04/16 (25%). No Mato
Grosso, 07/35 (20%) foram positivas, seguido por Goiás 06/59 (10,17%) e São Paulo,
05 (5,88%). Das 37 amostras de Minas Gerais apenas duas foram positivas (5,41%).
Nos outros Estados (Acre e Bahia) não foram identificadas amostras positivas para C.
gasigenes.
Considerando os estabelecimentos de abate, C. gasigenes foi identificado
em todos, com exceção do matadouro-frigorífico B. Os estabelecimentos com maior
percentual de amostras positivas foi o matadouro-frigorífico C, com 9/32 (28,12%),
seguido pelos estabelecimentos de abate G e H (Outros) com 01/06 (16,67%) de
amostras positivas.
Do matadouro-frigorífico E, foram verificadas 03/23 (13,04%) de positivas,
no estabelecimento F 02/17 (11,76%) enquanto que no matadouro-frigorífico A foram
detectadas 08/109 (7,34%) amostras positivas. No estabelecimento B não foram
verificadas amostras positivas.
Apesar do baixo percentual de C. gasigenes, os resultados aqui
apresentados revelam que o microrganismo está presente na maioria dos Estados e
matadouros-frigoríficos analisados. Não se pode afirmar que a ausência do
microrganismo observada nos Estados da Bahia, Acre e Pará e nos matadouros-
frigoríficos da empresa B é conclusiva, devido ao reduzido número de amostras
analisadas provenientes destas regiões.
50
5.3 Confirmação da identidade dos produtos de amplificação
Embora os produtos de amplificação purificados (FIGURA 11) das duas
espécies de Clostridium em estudo tenham sido encaminhados para
sequenciamento, estes foram apenas parcialmente seqüenciados. Dos produtos de
amplificação para C. estertheticum obtidos com o par RFP/RRP, foram sequenciados
299 pb dos 641 pb (46,65%), enquanto que os do par RFP/ORP foram sequenciados
232 pb dos 434 pb (53,46%). Dos fragmentos obtidos a partir da amplificação com o
par 16SEF/16SER, foram seqüenciadas 317 pb (40,13%) dos 790 pb do fragmento
total.
Ao comparar os resultados das sequências obtidas com as sequências de
referência depositadas no banco de dados do GenBank (GENBANK, 2007), verificou-
se 100 % de homologia com C. estertheticum (n.º de acesso S46734), porém outros
microrganismos apresentaram similaridade, nenhum deles incriminados em
deterioração de carnes.
Das amostras amplificadas para detecção de C. gasigenes (par
16DBF/16DBR), foram sequenciados 459 pb (49,09%) dos 935 pb do fragmento. Ao
submeter a seqüência obtida ao alinhamento do programa BLAST do GenBank
(GENBANK, 2007), obteve-se homologia de 100% apenas com as sequências de
referência da subunidade 16S do RNAr de C. gasigenes (n.º de acesso AF092549 e
AF143692), confirmando a identidade molecular do amplicon. O alinhamento obtido
encontra-se descrito na Figura 12.
51
FIGURA 13 – Gel de concentração de amplicons. Canaletas 1 a 3, C.
estertheticum e canaleta 4 C. gasigenes, Canaleta 1 amplicon de 641 pb
(par RFP/RRP); 2, amplicon de 434 pb (RFP/ORP); 3, amplicon de 790
pb (16SEF/16SER); 4 amplicon de 935 pb (16DBF/16SDBR); canaleta 6
padrão de peso molecular Low DNA Mass Ladder
52
6
FIGURA 14 – Homologia de 100% resultante do alinhamento no programa BLAST
(GENBANK, 2007) entre o resultado do sequenciamento (Query) e a seqüência de
referencia (Sbjct) para C. gasigenes (nº de acesso AF092549)
Clostridium gasigenes 16S ribosomal RNA gene, partial sequence
Length=1483 pb
Score = 910 bits (459 pb), Expect = 0.0
Identities = 459/459 (100%), Gaps = 0/459 (0%)
53
6 CONCLUSÕES
- O C. estertheticum está amplamente disseminado nas diferentes fontes de
contaminação estudadas e em níveis que podem ser considerados elevados,
sendo sua freqüência de ocorrência superior às obtidas para C. gasigenes;
- O C. gasigenes está presente nas diferentes fontes estudadas, apesar da
baixa ocorrência observada na amostragem total;
- As maiores freqüências de contaminação por C. estertheticum e C. gasigenes
foram observadas em fezes, box de atordoamento, carcaças antes da esfola,
meias-carcaças refrigeradas e cortes cárneos deteriorados;
- O par de primers RFP/RRP revelou maior eficiência na detecção de C.
estertheticum e sua associação com os pares 16SEF/16SER e RFP/ORP
aumentou significativamente os níveis de detecção;
- O par de primers 16SEF/16SER apresentou baixa eficiência na detecção de
C. estertheticum na maioria das fontes estudadas, não sendo recomendável
como opção para uso de primers isolados.
- A presença de C. estertheticum foi identificada nos oito matadouros-frigoríficos
e em todas as suas Unidades Industriais, enquanto que C. gasigenes não foi
detectado apenas no Matadouro-Frigorífico B;
- O Clostridium estertheticum e C. gasigenes apresentaram maiores
frequências de detecção no Mato Grosso do Sul. A ocorrência de C.
estertheticum foi verificada nos Estados de SP, GO, MG, MT, MS, PA, AC e
BA, enquanto que C. gasigenes não foi identificado apenas nestes três últimos
Estados.
54
ANEXO, QUADRO 1 - Distribuição de C. estertheticum e C. gasigenes em sala de
desossa no período de 2003 a 2007, segundo os pares de primers utilizados, o
estabelecimento e a origem geográfica das amostras. Goiânia, 2007
Amostra
MATADOURO
FRIGORÍFICO
UF
C.
estertheticum
C. estertheticum
C.
gasigenes
HELPS
et al.
(1999)
PRESENTE
TRABALHO
BRODA
et al.
(2003)
Rolete da esteira
01 RED A MT - - - - -
02 RED D MT - - - - -
03 RED A SP - - - - -
04 RED A SP - - - - -
05 RED A MG - - - - -
06 RED F SP - - - - -
07 RED A MS - - - - -
08 RED F SP - - - - -
09 RED A MG - - - - -
10 RED A SP - - - - -
11 RED A SP - - - - -
12 RED A MT - - - - -
13 RED A MG - - - - -
14 RED A SP - - - - -
15 RED A MT - - - - +
16 RED G GO - - - - +
17 RED A MG - - - - -
18 RED C SP + - - + -
19 RED F SP + - - + -
20 RED A SP - - - - -
21 RED A MT - - - - -
Ralo
22 RD A MT + + - - -
23 RD D MT + + - - -
24 RD B SP - - - - -
25 RD A SP - - - - -
26 RD B PA - - - - -
27 RD A MG - - - - -
28 RD B MG - - - - -
29 RD F SP - - - - -
30 RD B PA + + - - -
31 RD F SP - - - - -
31 RD A MG - - - - -
33 RD A MT - - - - -
34 RD A SP - - - - -
35 RD A MT - - - - +
36 RD A GO - - - - -
37 RD A SP - - - - -
38 RD A MS - - - - -
39 RD A SP - - - - -
40 RD A MG - - - - -
41 RD A AC - - - - -
42 RD B GO + + + - -
55
Continuação...
ANEXO, QUADRO 1 - Distribuição de C. estertheticum e C. gasigenes em sala de
desossa no período de 2003 a 2007, segundo os pares de primers utilizados, o
estabelecimento e a origem geográfica das amostras. Goiânia, 2007
Amostra
MATADOURO
FRIGORÍFICO
UF
C.
estertheticum
C. estertheticum
C.
gasigenes
HELPS
et al.
(1999)
P
RESENTE
TRABALHO
B
RODA
et al.
(2000B)
Ralo
43 RD B MG + + + - -
44 RD B BA + + + - -
45 RD B SP - - - - -
46 RD B MS + + - - -
47 RD B GO + + + - -
48 RD B SP + + + - -
49 RD A MT - - - - -
50 RD A MG + + - - -
51 RD F SP - - - - -
ESTEIRA
52 ED A MT + - + - -
53 ED B PA + - + - -
54 ED C GO - - - - -
55 ED D MT - - - - -
56 ED A SP - - - - -
57 ED A SP + + - - -
58 ED B PA + + - - -
59 ED C GO - - - - -
60 ED A MG + - - + -
61 ED F SP + - - + -
62 ED C MT - - - - -
63 ED C MT - - - - +
64 ED C GO - - - - -
65 ED B PA - - - - -
66 ED C SP + - - + +
67 ED C SP - - - - -
68 ED A MT - - - - -
69 ED D SP - - - - -
70 ED D SP - - - - -
71 ED C GO - - - - -
EVAPORADOR
72 EVP B PA + + + - -
73 EVP A MT - - - - -
74 EVP D SP - - - - -
75 EVP B SP - - - - -
76 EVP F SP - - - - -
77 EVP B PA - - - - -
78 EVP A MG + + + - -
79 EVP F SP - - - - -
80 EVP B PA - - - - -
81 EVP A MT - - - - -
82 EVP A SP - - - - -
56
Continuação...
ANEXO, QUADRO 1 - Distribuição de C. estertheticum e C. gasigenes em sala de
desossa no período de 2003 a 2007, segundo os pares de primers utilizados, o
estabelecimento e a origem geográfica das amostras. Goiânia, 2007
Amostra
MATADOURO
FRIGORÍFICO
UF
C.
estertheticum
C. estertheticum
C.
gasigenes
HELPS
et al.
(1999)
P
RESENTE
TRABALHO
B
RODA
et al.
(2003)
EVAPORADOR
83 EVP F SP - - - - -
84 EVP A MG - - - - -
85 EVP A SP - - - - -
86 EVP A AC - - - - -
87 EVP A MT + - - + -
88 EVP A SP + + + + -
89 EVP A SP - - - - -
90 EVP A MS - - - - -
91 EVP A SP - - - - -
57
ANEXO, QUADRO 2 - Distribuição de C. estertheticum e C. gasigenes em cortes
cárneos no período de 2003 a 2007, segundo os pares de primers utilizados, o
estabelecimento e a origem geográfica das amostras. Goiânia, 2007
Amostra MATADOURO
FRIGORÍFICO
UF
C.
estertheticum
C. estertheticum C.
gasigenes
HELPS et al.
(1999)
P
RESENTE
TRABALHO
B
RODA
et al.
(2003)
1
E GO + + + + -
2
E GO + + + + -
3
E GO + + + + -
4
C SP + + + + -
5
C SP + + + + +
6
E GO + + + + -
7
E GO + + + + -
8
E GO + + + - -
9
E GO + + + - -
10
E GO + + - - -
11
A SP + + - - +
12
A MG + + + + -
13
A MG - - - - -
14
A MG + + + - -
15
A MG - - - - -
16
A MG + + + + -
17
A MG + + + - -
18
A MG + + + + -
19
A MG + - + - -
20
A MG + - + - +
21
A MG + + + + -
22
E GO - - - - -
23
E GO - - - - -
24
E GO + + + - -
25
C GO - - - - -
26
C GO - - - - -
27
A SP - - - - -
28
A SP - - - - +
29
A SP - - - - -
30
A SP - - - - -
31
A GO - - - - -
32
A GO - - - - -
33
E GO - - - - -
34
E GO - - - - -
35
C GO - - - - -
36
D SP - - - - -
37
D SP - - - - -
38
D SP - - - - -
39
D SP - - - - -
40
D SP - - - - -
41
D SP - - - - -
42
C GO + + + + +
43CC
C GO + + + + -
44CC
C GO + + + + +
45CC
A MT - - - - -
46CC
D SP + + - - -
47CC
C SP - - - - -
48CC
A SP + + - - -
58
ANEXO, QUADRO 3 - Distribuição de C. estertheticum e C. gasigenes em ralo de
câmara-fria no período de 2003 a 2007, segundo os pares de primers utilizados, o
estabelecimento e a origem geográfica das amostras. Goiânia, 2007
Amostra MATADOURO
FRIGORÍFICO
UF
C.
estertheticum
C. estertheticum C.
gasigenes
HELPS et
al. (1999)
P
RESENTE
TRABALHO
BRODA
et al.
(2003)
1 RCF
A MT + + - - +
2 RCF
D MT - - - - -
3 RCF
B SP - - - - -
4 RCF
G GO - - - - -
5 RCF
A SP - - - - -
6 RCF
A MG - - - - -
7 RCF
B MG - - - - -
8 RCF
F SP + + - - -
9 RCF
B PA + + - - -
10 RCF
D SP + + - - -
11 RCF
D SP - - - - -
12 RCF
A GO + + + - -
13 RCF
D SP - - - - -
14 RCF
A MG + + - - -
15 RCF
A MT - - - - -
16 RCF
A SP - - - - -
17 RCF
A SP + - + - -
18 RCF
A GO - - - - -
19 RCF
A MG - - - - -
20 RCF
B PA - - - - -
21 RCF
B GO + + + - -
22 RCF
B MG + - + - -
23 RCF
B BA - - - - -
24 RCF
A SP + + - - -
25 RCF
B SP + + - - -
26 RCF
B MS - - - - -
27 RCF
B GO - - - - -
28 RCF
B SP - - - - -
29 RCF
A MT + + - - -
30 RCF
A MG - - - - -
59
ANEXO, QUADRO 4 - Distribuição de C. estertheticum e C. gasigenes em meias-
carcaças refrigeradas no período de 2003 a 2007, segundo os pares de primers, o
estabelecimento e a origem geográfica das amostras. Goiânia, 2007
Amostra MATADOURO
FRIGORÍFICO
UF
C.
estertheticum
C. estertheticum C.
gasigenes
HELPS et
al. (1999)
P
RESENTE
TRABALHO
BRODA
et al.
(2003)
1 MCR
C GO - - - - -
2 MCR
A MT + + + - -
3 MCR
C MS + - + - +
4 MCR
C MS + - + - +
5 MCR
A SP - - - - -
6 MCR
B PA + + - - -
7 MCR
A MG + - - + -
8 MCR
B SP - - - - -
9 MCR
C MS + - + + -
10 MCR
C MS + - + - -
11 MCR
C MS + - + - +
12 MCR
C MS + - + + -
13 MCR
A MT + - + + +
14 MCR
D SP + - + - -
15 MCR
C GO - - - - -
16 MCR
A MG + + - - -
17 MCR
A MT - - - - -
18 MCR
A GO - - - - -
19 MCR
B GO - - - - -
20 MCR
B MG - - - - -
21 MCR
B BA + + + + -
22 MCR
A SP + + + + -
23 MCR
B SP - - - - -
24 MCR
B SP - - - - -
25 MCR
A MT - - - - -
26 MCR
B GO - - - - -
60
ANEXO, QUADRO 5- Distribuição de C. estertheticum e C. gasigenes em carcaças
no período de 2003 a 2007, segundo os pares de primers utilizados, o
estabelecimento e a origem geográfica das amostras. Goiânia, 2007
Amostra
MATADOURO
FRIGORÍFICO
UF
C.
esterthetic
um
C. estertheticum C. gasigenes
HELPS et
al. (1999)
P
RESENTE
TRABALHO
B
RODA et
al.
(2003)
ANTES DA ESFOLA
01 CA
C GO - - - - -
02 CA
C GO + + + - -
03 CA
D MT - - - - +
04 CA
C GO - - - - -
05 CA
A MG + + + + -
06 CA
F SP + + - - -
07 CA
C MS + + + + +
08 CA
C GO + + - - -
09 CA
C MS + + - - -
DEPOIS DA ESFOLA
10 CE
A SP - - - - -
11 CE
A SP + + - - -
12 CE
F SP + + - - -
13 CE
A MT + - + + +
14 CE
A MS - - - - -
15 CE
D SP + - + - -
16 CE
F SP - - - - -
17 CE
A MG - - - - -
18 CE
A MT - - - - -
19 CE
A MG - - - - -
20 CE
B PA - - - - -
21 CE
A SP + + - - -
22 CE
A SP - - - - -
23 CE
A MT - - - - -
61
ANEXO, QUADRO 6 - Distribuição de C. estertheticum e C. gasigenes em sala de
matança no período de 2003 a 2007, segundo os pares de primers utilizados, o
estabelecimento e a origem geográfica das amostras. Goiânia, 2007
Amostra
MATADOURO
FRIGORÍFICO
UF C.
estertheticum
C. estertheticum C.
gasigenes
HELPS
et al.
(1999)
PRESENTE
TRABALHO
BRODA
et al.
(2003)
RALO
01 RM
A MT + - + - -
02 RM
G GO - - - - -
03 RM
A GO - - - - -
04 RM
A MS - - - - -
05 RM
G GO - - - - -
06 RM
A SP + + + - -
07 RM
H MS + + + - -
08 RM
A MT - - - - -
ROLETE
09 RE
D MT - - - - -
10 RE
A MG - - - - -
11 RE
F SP + + + + +
12 RE
A GO - - - - -
13 RE
D SP - - - - -
14 RE
G GO - - - - -
15 RE
F SP + + - - -
BOX
16 BX
D MT - - - -
17 BX
A MG + + + + +
18 BX
F SP + - - + -
19 BX
F SP + + - - -
20 BX
A GO + + - - -
PISO
21 BX
D SP - - - - -
62
ANEXO, QUADRO 7 - Distribuição de C. estertheticum e C. gasigenes em fezes de
bovinos abatidos no Matadouro-Frigorífico E, no período de 2003 a 2007 no Estado
de Goiás, segundo os pares de primers utilizados. Goiânia, 2007
Amostra
C.
estertheticum
C. estertheticum C. gasigenes
HELPS
et al.
(1999)
PRESENTE
TRABALHO
B
RODA
et al.
(2003)
01F
+ + + - -
02F
+ - + + -
03F
+ + - - -
04F
+ + + + +
05F
+ + + + -
06F
+ + - + -
07F
+ + + + +
08F
- - - - -
09F
+ + - - -
10F
+ + + - +
63
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
1. BLICKSTAD, E. Growth and end product formation of two psychrotrophic
Lactobacillus spp. and Brochothrix termosphacta ATCC 11509T at different pH values
and temperatures. Applied and Enviromental Microbiology, v.46, p.1345-1350,
1983.
2. BOEREMA, J., A., BRODA, D., M., BELL, R., G. Abattoir sources of
psychrophilic clostridia causing blow pack spoilage of vaccum-packed chilled meats
determined by culture based and molecular detection procedures. Letters in Applied
Microbiology, v.36, p.406-411, 2003.
3. BOEREMA, J., A., BRODA, D., M., BELL, R., G. PCR of psychrotolerant
clostridia associated with deep tissue spoilage of vacuum-packed chilled meats.
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4. BRASIL. Ministério da Agricultura, Pecuária e abastecimento. Departamento
de Inspeção de Produtos de Origem Animal. Regulamento de Inspeção Industrial e
Sanitária de Produtos de Origem Animal. Brasília, p.67-89, 1998.
5. BRODA, D., M., BOEREMA, J., A., BELL, R., G. PCR detection of
psychrophilic Clostridium spp. causing 'blown pack' spoilage of vacuum-packed
chilled meats. Journal of Applied Microbiology, v.94, p.515-522, 2003
6. BRODA, D., M., BELL, R., G., BOEREMA, J., A., MUSGRAVE, D., R. The
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p.817-824, 2002.
7. BRODA, D., M., SAUL, D., M., LAWSON, P., A., BELL, R., G., MUSGRAVE,
D., R. Clostridium gasigenes sp. nov., a psychrophile causing spoilage in vacuum-
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Microbiology, v.50, p.107-118, 2000.
8. . BRODA, D., De LACY, K., M., BELL, R., G. Influence of culture media on the
recovery of psychrotrophic Clostridium spp. associated with the spoilage of vacuum-
packed chilled meats. International Journal of Food Microbiology, v.39, p.69-78,
1998.
9. BRODA, D., M., DELACY, K., M., COOK, R., L., BELL, R., G. Prevalence of
cold tolerant clostridia associated with vacuum-packed beef and lamb stored at
abusive and chill temperatures. New Zealand Journal of Agricultural Research,
v.40, p.93-98, 1997.
64
10. BRODA, D., M., DELACEY, K., M., BELL, R., G., BRAGGINS, T., J., COOK,
R., L. Psychrotrophic Clostridium spp. associated with “Blown pack” spoilage of
chilled vacuum-packed red meats and dog rolls in gas-impermeable plastic casings.
International Journal of Food Microbiology, v.29, p.335-352, 1996.
11. COLLINS, M., D., RODRIGUES, U., M., DAINTY, R.,H., EDWARDS, R., A.,
ROBERTS,T., A. Taxonomic studies on a psychrophilic Clostridium from vacuum-
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v.96, p.235-240, 1992.
12. CORREA, W., M., CORREA, C., N. Enfermidades Infecciosas dos animais
Domésticos. Botucatu: Editora Medsi,1992.
13. CRANDALL, A., D.; MONTVILLE, T., J. Inhibition of Clostridium botulinum
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1993.
14. DAINTY, R., H., EDWARDS, R., A., HIBBARD, C., M. Spoilage of vaccum-
packed beef by Clostridium sp. Journal of the Science of Food and Agriculture,
v.49, p.473-486, 1989.
15. ERCOLINI, D., RUSSO, F., TORRIERI, E., MASI, P., VILLANI, F. Changes in
spoilage-related microbiota of beef during refrigerated storage under different
packagin conditions. Applied and Enviromental Microbiology, v.72, n.07, p.4663-
4671, 2006.
16. FADDIN, J., F., M. Biochemical Tests for Identification of Medical Bacteria.
Baltimore: The Williams & Wilkins Company, 1976, 312p.
17. GENBANK. Entrez. Nucleotide. Capturado em 03 de jan. 2007. On line.
Disponível na Internet http://www.ncbi.nlm.nih.gov/.
18. GIL, J., I. Manual de Inspeção Sanitária de Carnes. 2ed. Portugal: Fundação
Calouste GulbenKian, 2000. 485p.
19. GILL, C., O. Intrinsic bacteria in meat. Journal of Applied Bacteriology, v.47,
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20. GILL, C., O. The control of microbial spoilage in fresh meats. In: PEARSON,
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Microbiology. Connecticut: AVI Publishing Company Incorporation, 1986. p.49-88,
1986.
65
21. HANULLA, T., PUOLANNE, E. The effect of cooling rate on beef tenderness:
The significance of pH at 7ºC. Meat Science, v.67, p.403-408, 2004.
22. HELPS, C., R., HARBOUR, D., A., H., CORRY, J., E., L. PCR-based 16S
ribosomal DNA detection technique for Clostridium estertheticum causing spoilage en
vacuum-packed chill-stored beef. International Journal of Food Microbiology,
v.52, p.57-65, 1999.
23. HOLLEY, R., A., GILL, C., O. Usos da embalagem em atmosfera modificada
para carnes e produtos cárneos. In: III CONGRESSO BRASILEIRO DE CIÊNCIA E
TECNOLOGIA DE CARNES, 2005, São Pedro. Anais... São Pedro: CTC, 2005.
24. HOYLE, A., R. Spoilage characteristics of ground beef with added lactic acid
bacteria at abusive and refrigerated temperatures packaged in modified atmosphere
and traditional packaging. 2005. 149f. Dissertação (Mestrado em Tecnologia de
Alimentos) – Texas Tech University, Estados Unidos.
25. HWANG, I., H., THOMPSON, J., M. The interaction between pH and
temperature decline early postmortem on the calpain system and objective
tenderness in eletrically stimulated beef longissimus dorsi muscle. Meat Science,
v.30, p.97-114, 2001.
26. ILIAN, M. et al. The relationship between meat tenderization, miofibril
fragmentation and autolysis of calpain 3 during post-mortem aging. Meat Science,
v.66, p.387-397, 2004.
27. INTERNATIONAL COMISSION ON MICROBIOLOGICAL SPECIFICATION
FOR FOODS (ICMSF). Ecologia microbiana de los alimentos: productos
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28.
JONES, R., J. Observations on the succession dynamics of lactic acid bacteria
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29. KALCHAYANAND, N., RAY, B., FIELD, R., A., JOHNSON, M., C. Spoilage of
vacuum-packaged refrigerated beef by Clostridium. Journal of Food Protection,
v.52, p.424-426, 1989.
30. KOOHMARAIE, M. Muscle proteinases and meat aging. Meat Science, v.36,
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31. KUBOTA, E., H., OLIVO, R., SHIMOKOMAKI, M. Maturação da carne: um
processo enzimático. Revista Nacional da Carne, v.18, n.200, p.12-15, 1993.
66
32. LEISNER, J., J., GREER, G., G., STILES, M. E. Control of beef spoilage by a
sulphide-producting Lactobacillus sake strain with bacteriocinogenic Leuconostoc
gelidum UAL187 during anaerobic storage at 2ºC. Applied and Enviromental
Microbiology, v.62, p.2610-2614, 1996.
33. LUCHIARI FILHO, A. Pecuária da carne bovina. São Paulo: Luchiari Filho,
2000. 134p.
34. LYHS U. Lactic acid bacteria associated with the spoilage of fish products.
2002. 81f. Dissertação (Mestrado em Veterinária) – Faculty of Veterinary Medicine,
University of Helsinki, Finlândia.
35. MANÇO, M., C., W. Características físico-químicas, sensoriais e higiênicas da
carne bovina em duas classes de maturidade e sob influência da maturação. 2006.
140f. Tese (Mestrado em Nutrição e Produção Animal) – Faculdade de Medicina
Veterinária e Zootecnia, Universidade Estadual Paulista.
36. PALKA, K. The influence of post-mortem ageing and roasting on the
microestructure, texture and collagen solubility of bovine semitendinosus muscle.
Meat Science, v.64, p.191-198, 2003.
37. PARDI, M., C.; SANTOS, I., F.; SOUZA, E., R.; PARDI, H., S. Ciência,
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38. POND, M., J., STONE, D., M., ALDERMAN, D., J. Comparison of conventional
and molecular techniques to investigate the intestinal microflora of rainbow trout
(Oncorhynchus mykiss). Aquaculture, v.261, p.194-203, 2006.
39. ROÇA, R., O. Tecnologia da carne e produtos derivados. Botucatu: FCA,
2001. 201p.
40. SPRING, S., MERKHOFFER, B., WEISS, N., KROPPENSTEDT, R., M.,
HIPPE, H., STACKEBRANDT. Characterization of novel psychrophilic clostridia from
Antartic microbial mat: description of Clostridium frigoris sp. nov., Clostridium
lacusfryxellense sp. nov., Clostridium bowmanii sp. nov., and Clostridium
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estertheticum subsp. laramiense subsp. nov. International journal of systematic
and Evolutionary Microbiology, v.53, p.1019-1029, 2003.
41. STANLEY, G., SHAW, K., J., EGAN, A., F. Volatile Compounds associated
with spoilage of vacuum-packaged sliced luncheon meat by Brochothrix termosphact.
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42. TSITSILONIS, O.E. et al. A skeletal muscle troponin-T specific ELISA based
on the use of an antibody against the soluble troponin T (16-31) fragment. Journal of
Immunological Methods, v.268, p.141-148, 2002.
43. VAN SOOLINGEN, D.; HERMANS, P. W. M.; HAAS, P. E. W.; SOLL, E. R.
van EMBDEN, J. D. A. Occurence and stability of insertion sequences in sequence-
dependent DNA polymorphism as a tool in the epidemiology of tuberculosis. Journal
of Clinic Microbiology, 29, p 2578-86, 1991.
44. VENTURINI, A., C. Embalagens de transporte (MASTERPACK) com
atmosfera modificada e absorventes de oxigênio para o aumento da vida útil da
carne. 2003. 122f. Dissertação (Mestrado em Ciência e Tecnologia de Alimentos) –
Escola Superior de Agricultura Luiz Queiroz, Universidade de São Paulo.
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