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URI - CAMPUS ERECHIM
DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS
PROGRAMA DE MESTRADO EM ENGENHARIA DE ALIMENTOS
Estudo da produção de lipase por Penicillium simplicissimum
utilizando torta de soja como substrato
Gean Delise Leal Pasquali Vargas
Dissertação de Mestrado submetida ao Programa de
Mestrado em Engenharia de Alimentos da URI-Campus
de Erechim, como requisito parcial à obtenção do Grau
de Mestre em Engenharia de Alimentos, Área de
Concentração: Engenharia de Alimentos, da
Universidade Regional Integrada do Alto Uruguai e das
Missões – URI, Campus de Erechim.
ERECHIM, RS - BRASIL
MARÇO DE 2004
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ii
Estudo da produção de lipase por Penicillium simplicissimum
utilizando torta de soja como substrato
Gean Delise Leal Pasquali Vargas
Dissertação de Mestrado submetida à Comissão Julgadora do Programa de
Mestrado em Engenharia de Alimentos como parte dos requisitos necessários à
obtenção do Grau de Mestre em Engenharia de Alimentos, Área de Concentração:
Engenharia de Alimentos.
Comissão Julgadora:
____________________________________
Prof. Marco Di Luccio, D.Sc.
Orientador
____________________________________
Prof. Denise Maria Guimarães Freire, D.Sc.
____________________________________
Prof. Débora de Oliveira, D.Sc.
Erechim, 02 de Março de 2004
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iii
NESTA PÁGINA DEVERÁ SER INCLUÍDA A FICHA CATALOGRÁFICA DA
DISSERTAÇÃO DE MESTRADO. ESTA FICHA SERÁ ELABORADA DE ACORDO
COM OS PADRÕES DEFINIDOS PELO SETOR DE PROCESSOS TÉCNICOS DA
BIBLIOTECA DA URI – CAMPUS DE ERECHIM.
iv
“Esta conquista dedico a você meu amor,
meu querido Marcos”.
v
AGRADECIMENTOS
Ao Prof. Marco Di Luccio pela oportunidade de poder trabalhar ao seu lado, pela sua
disponibilidade em compartilhar seus conhecimentos, e acima de tudo, obrigado pela
dedicação, incentivo, minha eterna amizade e admiração.
À Prof. Helen Treichel pela boa vontade, apoio intelectual, pelos momentos de
descontração e principalmente por sua amizade.
Às Prof. Francine Padilha e Eunice Valduga, por sua disponibilidade e afeição.
A minhas amigas Losiane, Elisandra e Clarissa a mais sincera gratidão por terem
compartilhado minhas alegrias e tristezas.
Aos colegas e amigos do curso de mestrado e do Laboratório de Biotecnologia, pelos
momentos de alegria e descontração, e pelas experiências compartilhadas.
À minha querida Cláudia, pelo carinho e paciência.
À bolsista Stéphani Benetti, por sua disponibilidade, auxiliando sempre que lhe foi
solicitado.
À minha família por acreditarem na minha capacidade e estarem sempre ao meu lado,
“amo vocês.”
À CAPES pela concessão de bolsa de mestrado.
À URI-Campus de Erechim pelo apoio no desenvolvimento do projeto.
À FAPERGS por fornecer apoio financeiro (bolsas), viabilizando a realização do
projeto.
À Secretaria de Ciência e Tecnologia do RS (Programa de Pólos de Inovação
Tecnológica) pelo apoio financeiro ao projeto.
vi
“Procuramos tanto por algo que se chama
felicidade que nessa busca incansável não
vimos o quanto somos felizes. Esperamos
tanto os melhores momentos que só
vii
percebemos que eles existiram quando já se
foram.”
(Desconhecido)
Resumo da Dissertação apresentada ao Programa de Mestrado em Engenharia de
Alimentos como parte dos requisitos necessários para a obtenção do Grau de
Mestre em Engenharia de Alimentos.
Estudo da produção de lipase por Penicillium simplicissimum utilizando
torta de soja como substrato
Gean Delise Leal Pasquali Vargas
Março/2004
Orientador: Marco Di Luccio
As lipases têm conquistado uma faixa crescente do mercado de enzimas
devido a sua vasta aplicação na indústria e a série de vantagens que apresenta,
como a sua régio enâncio seletividade. No entanto, ainda é necessária a busca de
novas alternativas de substratos e microorganismos produtores de lipases, visando
diminuir os custos de obtenção destas enzimas. Neste trabalho investigou-se a
produção de lipases por P. simplicissimum utilizando como substrato a torta de soja,
que é um subproduto da indústria de óleo de soja. A influência da suplementação da
torta com diferentes fontes de carbono e nitrogênio, bem como os efeitos da
temperatura e umidade da torta na produção da enzima foram investigados. Através
da técnica de planejamento de experimentos foram avaliadas as atividades lipásica
e proteásica, crescimento microbiano, umidade residual, atividade de água e pH.
Observou-se que a temperatura de fermentação e a umidade da torta foram as
variáveis que mais afetaram a produção da lipase por Penicillium simplicissimum. A
maior produção da enzima ocorre em 27,5 °C e 55% de umidade, sendo a máxima
viii
atividade lipásica obtida de cerca de 30 U/g. Além disso, pode-se constatar que a
torta de soja já constitui um meio rico em nutrientes para o microorganismo, não
havendo necessidade de adição de fontes suplementares de carbono e nitrogênio.
ix
Abstract of Dissertation presented to Food Engineering Program as a partial
fulfillment of the requirements for the Master in Food Engineering
Assessment of production of lipase by Penicillium simplicissimum using
soybean cake as substrate
Gean Delise Leal Pasquali Vargas
Março/2004
Advisor: Marco Di Luccio
Lipases have conquered an increasing share of enzyme market due to the large
number of industrial applications and the number of advantages that such enzymes
present, such as its regioenantioselectivity. However, the search for different
substrates and microorganisms that produce lipase is still necessary to lower
production costs of the enzyme. In this work the production of lipase by P.
simplicissimum using soy cake as substrate was investigated. The effect of
supplementation of the cake with different sources of carbon and nitrogen on lipase
yield was studied, as well as the effects of temperature of incubation and moisture
content of the cake. Experimental design technique was used to evaluate the effect
of manipulated variables on lipase and protease activities, microbial growth, residual
moisture, water activity and pH. Incubation temperature and cake moisture were the
variables that most influenced lipase production by P. simplicissimum. The highest
yield of lipase (30 U/g) was obtained at 27.5 °C and in the cakes with 55 wt% of
moisture. It could also be concluded that soybean cake is a sufficiently nutrient rich
medium for the microorganism, and the use of supplementary fonts of carbon and
nitrogen is not necessary.
x
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO 2
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 5
2.1 Fermentação em Estado Sólido (FES) 5
2.1.1 Conceito 5
2.1.2 Histórico 5
2.1.3 Características da FES 6
2.1.4 Biorreatores e fermentação em estado sólido 10
2.1.5 Aplicações 12
2.2 Produção de Enzimas por Fermentação em Estado Sólido 13
2.2.1 Introdução 13
2.2.2 Produção de Lipases por Fermentação em Estado Sólido 14
2.2.3 Aplicações das Lipases 19
3 MATERIAL E MÉTODOS 24
3.1 Microorganismo 24
3.2 Preparo do Inóculo 24
3.3 Estudo da produção da lipase 25
3.3.1 Otimização da produção da lipase 25
3.3.2 Estudo da produção da Lipase em biorreator com agitação intermitente 27
3.4 Métodos analíticos 29
3.4.1 Caracterização dos substratos 29
3.4.2 Preparo das Amostras 29
3.5 Atividade Lipásica 31
3.6 Atividade Proteásica 32
3.7 Determinação da Umidade 33
3.8 Crescimento Microbiano 33
3.9 Atividade de água (a
w
) 34
4 RESULTADOS E DISCUSSÕES 36
4.1 Caracterização do substrato e suplementos 36
4.2 Cinéticas de fermentação 37
4.3 Estudo da produção da lipase 42
4.3.1 Otimização da produção da lipase 42
4.4 Otimização da produção de lipase 51
5 CONCLUSÕES E SUGESTÕES 72
5.1 Conclusões 72
5.2 Sugestões 72
6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 75
7 Anexo i 87
INTRODUÇÃO
Introdução
2
1 INTRODUÇÃO
As lipases são enzimas hidrolíticas que atuam na interface orgânica-aquosa
catalisando as reações de hidrólise de triglicerídeos. Em baixas concentrações de
água podem ainda catalisar reações de esterificação, transesterificação ou
interesterificação. Além das vantagens clássicas das enzimas, as lipases
microbianas apresentam uma série de vantagens se comparadas com as lipases
extraídas de fontes animais e vegetais. Estas vantagens estão relacionadas a
algumas das características peculiares das lipases como a sua régio enâncio
seletividade, a estabilidade a altas temperaturas e amplas faixas de pH (Essamri et
al., 1998; Maia et al., 1999; Sharma et al., 2001; Gutarra et al., 2003).
Atualmente as lipases vêm conquistando uma faixa crescente no mercado de
enzimas, devido ao grande número de aplicações industriais. As lipases têm sido
utilizadas na modificação de óleos e gorduras, formulação de detergentes,
manufatura de alimentos, nos processos de síntese usados pela indústria de química
fina e farmacêutica, manufatura de papel, produção de cosméticos, na indústria de
combustíveis, como auxiliares no tratamento de efluentes gordurosos, dentre outras
aplicações (Gandhi, 1997; Sharma et al., 2001; Leal et al., 2002; Pastore et al.,
2003).
No entanto, as enzimas disponíveis comercialmente apresentam ainda custo
elevado, uma vez que a maioria dos processos de produção são baseados em
fermentação submersa, o que muitas vezes pode tornar a sua utilização pouco
atrativa economicamente (Castilho et al., 2000). Assim, a busca por processos de
produção de lipases que possam diminuir os custos finais da enzima são de grande
interesse, pois pode viabilizar algumas aplicações pouco exploradas, como por
exemplo o tratamento de efluentes gordurosos (Leal et al., 2002).
A fermentação em estado sólido (FES) tem se mostrado como uma alternativa
na produção de enzimas microbianas, devido à possibilidade de utilização de
resíduos e subprodutos da agroindústria como fonte de nutrientes e suporte para o
desenvolvimento do microorganismo (Castilho et al., 2000; Soccol e Vandenberghe,
2003; Pandey, 2003). Além disso, a FES apresenta uma série de vantagens sobre a
Introdução
3
fermentação submersa, como altos rendimentos e facilidade na recuperação dos
produtos (Sharma et al., 2001).
A utilização de subprodutos agroindustriais como substrato na produção de
lipases, além de agregar valor a materiais de baixo custo no mercado como a torta
de soja, pode vir a reduzir em muito o preço final da enzima, sendo que a aplicação
da fermentação em estado sólido em muitos casos diminui consideravelmente os
custos do processo, quando comparada à fermentação submersa (Castilho et al.,
2000).
Desta forma, estudos sobre a utilização de diferentes microorganismos e
substratos para a produção de lipases em meio sólido podem contribuir no sentido
de se encontrar combinações ideais para se obter lipases com altos rendimentos,
utilizando substratos e condições operacionais que possibilitem a redução dos
custos do processo de produção em escala industrial.
Muitos microorganismos são conhecidos como bons produtores de lipases
quando cultivados em fermentação em estado sólido, devido à sua capacidade de
crescer em meios que apresentem baixo teor de umidade. Dentro deste panorama, o
objetivo deste trabalho foi avaliar a produção de lipase por fermentação em estado
sólido utilizando Penicillium simplicissimum, e um subproduto da indústria de óleo de
soja como substrato. Investigou-se o efeito de algumas variáveis de processo e
diferentes suplementações do meio sobre a produção de lipase em escala de
bancada, utilizando a técnica de planejamento de experimentos e análise de
superfície de resposta, visando obter condições que maximizem a produção de
enzima.
Dentro dos objetivos deste trabalho também se inclui a avaliação, em caráter
preliminar, de um biorreator, utilizando as condições otimizadas, avaliando-se ainda
os efeitos de umidade e vazão de ar injetado sobre a produção de lipase.
4
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
Revisão Bibliográfica
5
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1 Fermentação em Estado Sólido (FES)
2.1.1 Conceito
A fermentação em estado sólido pode ser definida como o processo que
envolve sólidos, em ausência ou quase ausência de água livre. Contudo, o substrato
deve possuir umidade suficiente para dar suporte ao crescimento e sustentabilidade
ao metabolismo do microorganismo (Germano, 2000; Pandey, 2003). Este tipo de
processo fermentativo tem recebido atenção especial, devido à grande quantidade
de enzimas extracelulares produzidas durante o processo, dentre outros metabólitos
(Sato e Sudo, 1999).
2.1.2 Histórico
A fermentação no estado sólido (FES) é provavelmente o método mais antigo
utilizado pelo homem na obtenção de benefícios a partir de microorganismos
(Germano, 2000). Vários tipos de alimentos utilizando esse processo fazem parte da
dieta de diversos povos há muitos séculos. Nos países de origem Oriental, a FES
tem uma importância primordial na produção de alimentos e bebidas alcoólicas
tradicionais, como o molho de soja, dentre outros, cuja origem da produção data de
1000 a.C., (Bianchi et al., 2001).
No final do século XIX, Takamine produziu uma enzima digestiva
(takadiastase) através de FES utilizando o fungo Aspergillus oryzae e farelo de trigo
como substrato. Este fato despertou o interesse da indústria para a busca de outras
aplicações deste tipo de fermentação (Sato e Sudo, 1999).
Revisão Bibliográfica
6
A partir de 1940, com a descoberta da penicilina através da fermentação
submersa, e sua enorme importância durante a Segunda Guerra Mundial, os
processos de fermentação no estado sólido foram praticamente abandonados nos
países ocidentais (Losane et al., 1985; Pandey, 2003). Contudo, entre 1960-1970 a
descoberta das micotoxinas, produzidas por fermentação em estado sólido, fez
ressurgir o interesse neste tipo de processo (Pandey, 2003).
2.1.3 Características da FES
No processo de fermentação em estado sólido deve-se levar em consideração
alguns aspectos importantes, como a seleção do microorganismo, a escolha do
substrato, a otimização dos parâmetros do processo, o isolamento e a purificação do
produto, dentre outros fatores (Pandey, 2003).
Uma das características principais da fermentação em estado sólido é a baixa
atividade de água (a
w
) do meio. Baseando-se na classificação teórica, em termos de
atividade de água, somente fungos e leveduras seriam microorganismos adequados
para fermentação em estado sólido. Culturas de bactérias exigem alta atividade de
água e portanto não seriam adequadas à FES. No entanto existem relatos que
demonstram que bactérias podem ser usadas nestes processos, quando bem
controladas e manipuladas (Pandey, 2003).
A água apresenta um papel primordial na FES, pois é a responsável pela
difusão de solutos, gases, e metabólitos inibitórios, bem como pela absorção celular.
Parâmetros cinéticos e termodinâmicos relativos à presença da água em FES devem
ser constantemente estudados para a avaliação dos efeitos causados no processo.
Os efeitos da água na fisiologia fúngica devem ser bem investigados, pois o fluxo de
água através da membrana é responsável pela manutenção da pressão intracelular.
No que diz respeito aos efeitos macroscópicos, a presença ou não da água afeta
significativamente a taxa de crescimento radial, a evolução da germinação,
esporulação e atividade metabólica das colônias, uma vez que se a quantidade de
água não for suficiente para manter as propriedades funcionais de algumas enzimas,
Revisão Bibliográfica
7
a perda de atividade enzimática pode levar ao desequilíbrio na cadeia metabólica
das células (Gervais e Molin, 2003). Assim, o controle deste parâmetro pode ser
usado para modificar a produção metabólica ou excreção de um microorganismo
(Pandey, 2003).
A seleção de um substrato próprio é outro aspecto chave da fermentação em
estado sólido. O material sólido não solúvel pode atuar apenas como suporte físico
ou ainda exercer a função de suporte e de fonte de nutrientes para o
microorganismo (substrato). O sólido pode ser de origem natural, como produtos
agrícolas, resíduos agroindustriais ou ser constituído por um suporte inerte
suplementado com os nutrientes necessários à FES (Christen et al., 1997; Pintado et
al., 1998; Dominguez et al., 2003; Pandey, 2003).
Enzimas hidrolíticas extracelulares e outros metabólitos são em muitos casos
produzidas em grande quantidade em fermentações em estado sólido. Embora não
se conheça a razão clara deste fato, esta característica é de extrema importância
para a sua aplicação (Sato e Sudo, 1999).
Outras características básicas da FES são (Bianchi et al., 2001; Sato e Sudo,
1999):
• A distribuição microbiana, o crescimento e a formação de produto ocorrem
principalmente na superfície sólida;
• O calor gerado durante o crescimento e metabolismo do microorganismo
eleva a temperatura do leito de substrato causando a redução da umidade do
meio;
• Os microorganismos geralmente utilizados são espécies que podem produzir
amilases, com a finalidade de degradar o amido e penetrar dentro do
substrato sólido, essas espécies apresentam morfologias diferentes, quanto
ao tipo de micélios (aéreas e submersas) com diferentes atividades
fisiológicas;
• O cultivo é geralmente estacionário, devido à dificuldade de agitação do meio.
A agitação pode causar danos às células em alguns casos. Nos casos em
Revisão Bibliográfica
8
que é necessária a agitação utilizam-se fermentadores de leito fluidizado, leito
fixo e de tambor rotativo.
A principal vantagem da utilização da fermentação em estado sólido se dá na
utilização de substratos com baixo valor agregado. Além desta, existem outras
vantagens que estão resumidas a seguir (Sato e Sudo, 1999; Palma et al., 2000;
Germano, 2000; Bianchi et al., 2001; Pandey e Soccol, 2001; Gervais e Molin, 2003):
• pode-se adicionar nutrientes suplementares ao substrato sólido;
• o volume de meio reacional é reduzido, implicando em um menor investimento
capital em biorreatores;
• os esporos dos microorganismos podem ser utilizados diretamente na
inoculação, evitando etapas prévias como pré-cultivos que envolvem grandes
volumes de meio e tanques para seu desenvolvimento;
• o crescimento dos fungos ocorre em condições similares às do seu habitat
natural;
• o fato de o meio de cultivo apresentar baixa atividade de água reduz o
problema de contaminações, especialmente por bactérias;
• a aeração do meio é facilitada devido ao maior espaço entre as partículas e
pela difusão do oxigênio na água utilizada para umidificar o meio;
• altos rendimentos quanto à formação de metabólitos, e simplicidade nas
etapas de purificação, pois os produtos estarão concentrados no líquido da
extração;
Embora a fermentação em estado sólido tenha se mostrado extremamente
vantajosa quanto a custos e facilidades, esta também apresenta alguns problemas
que dificultam a sua aplicação (Sato e Sudo, 1999; Germano, 2000; Bianchi et al.,
2001; Pandey e Soccol, 2001). A fermentação em estado sólido normalmente é
restrita a microorganismos capazes de crescer em sistemas com baixa umidade. No
entanto, já existem alguns relatos de processos de FES utilizando bactérias
(Pandey, 2003).
Revisão Bibliográfica
9
Outro problema clássico encontrado em processos de FES está na difícil
remoção do calor produzido devido à atividade metabólica microbiana e dificuldade
de controle dos parâmetros da fermentação, principalmente em processos em
grande escala. Este problema se deve em grande parte à dificuldade de
homogeneização do meio reacional, além dos problemas difusionais característicos
de processos envolvendo meios sólidos (Pandey e Soccol, 2001; Sato e Sudo, 1999;
Palma et al., 2000; Germano, 2000; Bianchi et al., 2001; Von Meien e Mitchell, 2002;
Mitchell et al., 2003a). Vários autores têm tentado contornar estes problemas através
de projetos de biorreatores adequados, conforme será descrito mais adiante.
Na FES a utilização de altos níveis de água diminui a porosidade do meio, o
que dificulta a penetração do oxigênio e facilita contaminações por bactérias. Em
contrapartida, meios com baixa umidade podem dificultar a acessibilidade dos
nutrientes, resultando em um crescimento microbiano reduzido (Gervais e Molin,
2003; Pandey, 2003). A Figura 2.1 apresenta um diagrama esquemático dos
fenômenos microscópicos e macroscópicos envolvidos em um processo de FES
(Mitchell et al., 2003b).
M
M
I
I
C
C
R
R
O
O
E
E
S
S
C
C
A
A
L
L
A
A
M
M
A
A
C
C
R
R
O
O
E
E
S
S
C
C
A
A
L
L
A
A
Filme de líquido na
superfície da partícula
difusão
consumo
consumo
translocação
difusão
difusão
reação
difusão
evaporação
convecção
Parede
condução
fluxo de ar
na entrada
fluxo de ar na saída
fluxo de água de
resfriamento
Vizinhanças
condução
agitação
Interior da
partícula
Gás estagnado
glicoamila
se
água
oxigêni
o
glicose
amido
condução
liberação
de calor
água
convecção
térmica
Revisão Bibliográfica
10
Figura 2.1: Diagrama esquemático de alguns fenômenos de transporte envolvidos no
processo de FES (Adaptada de Mitchell et al., 2003b).
Outro ponto complexo é a dificuldade na determinação do crescimento
microbiano. A biomassa não pode ser determinada de forma direta, pois os
microorganismos se encontram intimamente ligados ao substrato. Estudos cinéticos
do crescimento microbiano na FES, descrevem um baixo nível de desenvolvimento,
normalmente associado a fatores como a heterogeneidade do substrato,
complexidade da interação micélio/substrato e a determinação indireta da biomassa
(Soccol et al. 1994; Germano, 2000). Apesar das dificuldades encontradas na
determinação do crescimento microbiano em FES, técnicas que utilizam a medição
do O
2
consumido e CO
2
liberado durante a fermentação vêm sendo utilizadas, além
de outras medidas indiretas, como dosagem de glicosamina da parede celular de
fungos, ergosterol ou proteína celular (Durand, 1997; Koutinas et al, 2003; Mitchell
et al., 2003b;).
2.1.4 Biorreatores e fermentação em estado sólido
Os biorreatores mais comumente utilizados em processos em estado sólido
são os biorreatores em bandeja, tambor rotativo, de leito fixo e de leito fluidizado
(Bianchi, 2001; Robinson e Nigam, 2003; Mitchel et al., 2003b).
Na aplicação de biorreatores em escala industrial e piloto os maiores
problemas identificados estão relacionados à transferência de calor e massa,
causados por compactação do meio, criação de caminhos preferenciais, que por sua
vez levam à aeração deficiente. No entanto, estes problemas podem ser
minimizados através de estratégias como a circulação de ar ao redor do leito do
substrato e através deste, e ainda a utilização de diferentes estratégias de agitação
do leito. No entanto, a questão da agitação deve ser examinada com cautela, uma
vez que fungos que não apresentem septo nas hifas podem ser pouco resistentes à
agitação mecânica (Durand, 2003).
Revisão Bibliográfica
11
Os reatores mais simples são os reatores em bandeja e os de colunas de leito
fixo. Em escala de laboratório comumente se utilizam placas de Petri, erlenmeyeres
de boca larga, béqueres, e outros tipos de recipientes que promovam uma boa
superfície de contato entre o meio e o ar atmosférico. Usualmente em escala
reduzida somente se controla a temperatura do ambiente no qual o frasco contendo
o meio inoculado é incubado. Este tipo de estratégia é apropriada para avaliações
iniciais sobre os tipos de microorganismos e meios adequados ao processo de
interesse, por ser prática e fácil de se trabalhar com um grande número de
experimentos (Mitchell et al., 2003b; Durand, 2003).
Biorreatores de leito fixo também são bastante utilizados em escala
laboratorial. Neste tipo de biorreator o meio pré-inoculado é acondicionado em
colunas pequenas que são incubadas em banho termostático. Ar úmido é forçado
através do leito, buscando expandir o mesmo, aumentando a superfície de contato e
assim propiciando uma melhor transferência de calor. O ar utilizado deve ser
saturado em água para minimizar a evaporação. Este sistema facilita o
acompanhamento do crescimento microbiano através de técnicas de respirometria
(Sato e Sudo, 1999; Mitchell et al, 2003a). Este equipamento também apresenta
outras vantagens como o baixo custo e uso relativamente fácil (Durand, 2003).
Em ambos os casos, não se encontram problemas referentes ao acúmulo de
calor no interior do leito, devido ao pequeno volume de meio normalmente utilizado.
No entanto, em escala piloto ou industrial os biorreatores de leito fixo apresentam
como desvantagem a dificuldade de se obter um crescimento microbiano uniforme e
na dissipação do calor (Losane et al., 1985; Robinson e Nigam, 2003). Assim, a
formação de gradientes de temperatura durante a fermentação é inevitável e outras
estratégias devem ser utilizadas.
Em um processo industrial, a temperatura utilizada na fermentação é o fator
limitante da altura do leito. Nos estágios iniciais do processo de fermentação, a
temperatura e a concentração de oxigênio são iguais em todo o leito. No entanto,
com o decorrer do processo, surgem problemas na difusão de oxigênio e
transferência de calor, por compactação e encolhimento do meio. O calor e gases
gerados nas biorreações tendem a se acumular no leito, formando gradientes. Este
Revisão Bibliográfica
12
problema é bastante complexo e pode afetar o controle de dois parâmetros
fundamentais como a temperatura e o conteúdo de água no meio sólido, que por sua
vez podem levar a mudanças nas condições operacionais, prejudicando o
andamento do processo (Sangsurasak e Mitchell, 1998; Bianchi, 2001; Raghavarao
et al., 2003; Durand, 2003; Robinson e Nigam, 2003).
Nos biorreatores de tambor rotativo, o uso da rotação promove a agitação e
aeração do meio, sendo que estes biorreatores podem ainda ser utilizados em
processos contínuos. Durante a fermentação é possível se fazer uma pulverização
de água na superfície do leito, permitindo desta forma o uso de ar seco para remover
o calor gerado durante a fermentação. No entanto, no substrato pode haver
problemas de aglomeração ou atrito. O uso da agitação pode promover e facilitar a
transferência de massa e calor e uma distribuição mais uniforme dos nutrientes
(Sato e Sudo, 1999; Mitchell et al., 2003b; Robinson e Nigam, 2003).
Poucas melhorias têm sido desenvolvidas em termos de biorreatores para FES.
Na maioria dos casos, o escalonamento se baseia em procedimentos empíricos e na
mecanização de fermentadores de leito ou bandejas, utilizando-se agitadores
mecânicos planetários ou diferentes tipos de tambores rotativos (Durand, 2003). No
entanto, avanços significativos têm sido realizados no sentido de desenvolver
abordagens quantitativas da transferência de calor e massa em biorreatores de FES
(Mitchell et al., 2003a) e desenvolvimento de modelos matemáticos de biorreatores e
de crescimento microbiano (Von Meien e Mitchel, 2002; Mitchell et al., 2003a).
2.1.5 Aplicações
A FES tem sido utilizada no desenvolvimento de vários bioprocessos,
envolvendo ainda a biorremediação e biodegradação de compostos perigosos e
desintoxicação biológica de resíduos agroindustriais (Brand et al., 2000; Adams et
al., 2002). Este tipo de fermentação tem mostrado também um enorme potencial
tecnológico no que diz respeito ao desenvolvimento de produtos que apresentam
componentes derivados de microorganismos como rações para animais, produtos
Revisão Bibliográfica
13
para a indústria alimentícia, química e farmacêutica. Estas aplicações envolvem a
biotransformação de produtos e resíduos agrícolas para enriquecimento nutricional,
produção de biomassa, e formação produtos com alto valor agregado, como
metabólitos secundários biologicamente ativos, incluindo antibióticos, alcalóides,
enzimas, ácidos orgânicos, biopesticidas, micro-pesticidas e bioerbicidas,
biossufactantes, biocombustíveis, compostos aromáticos, etc. (Pandey, 2003).
Muitos estudos sobre aplicações da FES envolvem a agregação de valor a
resíduos agroindustriais, uma vez que a base da economia brasileira atual está
voltada diretamente à produção agroindustrial. A produção ou processamento de
diversos grãos e insumos agrícolas envolve a geração de resíduos que têm sido
utilizados como substrato ou suporte para FES. Dentre os resíduos mais utilizados
pode-se citar os resíduos de café (borra, casca) (Pandey et al., 2000a; Soccol e
Vandenberghe, 2003), bagaço de cana de açúcar (Pandey et al., 2000b;
Vandenberghe et al., 2000; Santos et al., 2003;), farelos e torta de soja (Bramorski et
al., 1998; Abdel-Fattah e Olama, 2002; Capra et al., 2003; Germano et al., 2003),
trigo (Camero et al., 1997; Ghanem et al., 2000; Couri et al., 2000; Bertolin et al.,
2001; Zhang et al., 2003; Pastore et al., 2003), gergelim (Kamini et al., 1998),
babaçu (Gombert et al., 1999; Palma et al., 2000) e bagaço de mandioca (Palma et
al., 2002).
2.2 Produção de Enzimas por Fermentação em Estado Sólido
2.2.1 Introdução
A produção de enzimas é uma área da biotecnologia em expansão,
movimentando bilhões de dólares anualmente (Viniegra-González et al., 2003). Hoje,
aproximadamente 4.000 enzimas são conhecidas, e destas, cerca de 200 são
usadas comercialmente, sendo que a maioria das enzimas industriais é de origem
microbiana (Sharma et al., 2001).
Revisão Bibliográfica
14
Comparando a produtividade volumétrica obtida nos processos de fermentação
em estado submerso com a fermentação em estado sólido, a FES tem mostrado
grande superioridade na produção de enzimas, (Meira et al., 2003; Dominguez et al.,
2003) apresentando um desempenho 10 vezes maior (Durand, 2003). Usualmente
se considera que os rendimentos de enzimas obtidas por FES são superiores aos
obtidos por fermentação submersa. No entanto, não existe nenhuma metodologia
para se comparar os rendimentos em cada tipo de fermentação em termos reais, e
nem se sabe ainda a razão exata para que isto ocorra. O motivo mais provável seria
o fato de que na FES as culturas estariam mais próximas do seu habitat natural, e
assim a sua atividade seria maior (Pandey, 2003).
Dentre os diversos tipos de enzimas que podem ser produzidas a partir da
fermentação em estado sólido, as mais estudadas são as lipases (Palma et al.,
2000; Capra et al., 2003; Dominguez et al., 2003), xilanases (Ghanem et al., 2000;
Rezende et al., 2002; Santos et al., 2003;), proteases (Couri et al., 2000; Germano et
al., 2003), invertases, pectinases, tanases (Viniegra-González et al., 2003),
lignoceluloses (Tengerdy e Szakacs, 2003), glicoamilases (Bertolin et al., 2001),
entre outras, mostrando assim o enorme potencial da FES no mercado de enzimas.
A maior parte destes estudos têm investigado a utilização de substratos e
suporte provenientes de resíduos agroindustriais e avaliam as condições de
fermentação em reatores de bancada utilizando modos de operação em batelada.
Os autores mostram a importância do monitoramento das condições de cultivo,
como temperatura, pH, umidade e atividade de água do meio, bem como os efeitos
causados por diferentes tipos de suplementação do meio na produção de enzimas.
2.2.2 Produção de Lipases por Fermentação em Estado Sólido
As lipases (glicerol éster hidrolases, E.C. 3.1.1.3) são enzimas hidrolíticas que
atuam na interface orgânica aquosa catalisando as reações de hidrólise de
triacilglicerídeos, resultando na formação de diacilglicerídeos, monoacilglicerídeos,
ácidos graxos e glicerol (Voet e Voet, 1995, Sharma et al., 2001). No entanto,
Revisão Bibliográfica
15
dependendo das condições reacionais como baixa concentração de água, as lipases
podem também catalisar a síntese, de mono, di ou triacilglicerol a partir de ácidos
graxos e glicerol (Jaeger et al., 1994; Maia et al., 2001).
Muitas lipases são ativas em presença de solventes orgânicos, onde elas
catalisam um grande número de reações, incluindo esterificação (Sharma et al.,
2001), transesterificação, acilação regioseletiva de glicóis e mentóis, e síntese de
peptídeos (Ducret et al., 1998; Sharma et al., 2001; Zhang et al., 2001).
As lipases propiciam a quebra de emulsões de ésteres, glicerinas e ácidos
graxos de cadeia longa, como por exemplo a trioleína e tripalmitina (Sharma et al.,
2001).
Ambas lipases e esterases são capazes de catalisar a hidrólise de ésteres,
embora apenas as lipases atuem sobre ésteres insolúveis em água como os
triglicerídeos (Freire, 1996). As lipases apresentam um modo de ação semelhante ao
das esterases, porém sua atividade aumenta em muito quando situadas na interface
polar/apolar. Talvez isto ocorra devido ao fato de uma parte da superfície da enzima
se encontrar em melhor equilíbrio termodinâmico quando inserida na interface
polar/apolar, colocando o sítio ativo da enzima em posição favorável para a catálise
(Pastore et al., 2003).
As lipases são glicoproteínas ácidas, que em sua maioria apresentam uma
quantidade de carboidratos na faixa de 2 a 15%, como resíduos glicosídicos de
manose, xilose, galactose e arabinose. Através de estudos de lipases com diferentes
seqüências de aminoácidos e obtidas de diferentes fontes, observa-se que estas
enzimas apresentam um peso molecular entre 22 e 60 kDa (Freire, 1996).
Lipases podem ser encontradas em células de tecidos animais e vegetais e
podem ainda ser produzidas por microorganismos como bactérias, fungos e
leveduras (Sharma et al., 2001; Pastore et al., 2003).
As lipases microbianas demonstram um enorme potencial biotecnológico, por
apresentarem fatores peculiares como estabilidade em solventes orgânicos, não
requerem cofatores, possuem especificidade de substratos, que dependerá do tipo
Revisão Bibliográfica
16
de reação e de susbtrato, e exibem uma alta enâncioseletividade e
enâncioespecificidade (Elibol e Ozer, 2000).
Muitos microorganismos como fungos filamentosos, bactérias e leveduras são
conhecidos como bons produtores de lipases. Dentre estes, se pode citar algumas
das espécies que vem sendo mais investigadas: Fusarium solani (Maia et al., 2001),
Penicillium restrictum (Freire et al., 1997a,b; Gombert et al., 1999), Penicillium
citrinum (Miranda et al., 1999), Penicillium chrysogenum (Ferrer et al., 2000),
Rhizopus arrhizus (Elibol e Ozer, 2002; Mahadik et al., 2002), Rhizopus oligosporus
(Ul-Haq et al., 2002), Aspergillus niger (Kamini et al., 1998; Mahadik et al., 2002),
Candida rugosa (Rao et al., 1993; Benjamin e Pandey, 2001), Yarrowia lipolytica
(Corzo e Revah, 1999; Dominguez et al., 2003), Rhizomucor pusillus e Rhizopus
rhizopodiformis (Cordova et al., 1998).
A maioria dos microorganismos produtores são mesofílicos, sendo
normalmente utilizadas temperaturas de incubação de cerca de 30 °C. No entanto
alguns microorganismos termofílicos podem ser utilizados, como é o caso da
Humicola lanuginosa e o Tolorymyces emersoni (Pastore, 2000). Os fungos
filamentosos têm sido amplamente empregados pela indústria nos processos de
produção de lipases (Maras et al., 1999; Novozymes, 2003).
As lipases microbianas apresentam uma série de vantagens se comparadas
as de origem animal e vegetal, uma vez que são enzimas extracelulares em sua
grande maioria, são facilmente separadas do micélio por filtração ou centrifugação
(Essamri et al., 1998), o processo pode ser facilmente conduzido (Jesus et al.,
1999), possuem alta velocidade de síntese e alto rendimento de conversão de
substrato em produto (Leal, 2000). Além disso, são enzimas termoestáveis (Corzo e
Revah, 1999; Sharma et al, 2001) e apresentam versatilidade e simplicidade na
manipulação ambiental e genética de sua capacidade produtiva (Sharma et al,
2001). No caso de FES, o uso de substratos de baixo custo pode ainda reduzir os
custos da operação do processo (Dominguez et al., 2003).
A estabilidade das lipases microbianas em presença de solventes orgânicos é
uma característica que vem sendo amplamente investigada, pois esta pode vir a
Revisão Bibliográfica
17
possibilitar a realização de reações onde não é possível a presença de água
(Essamri et al., 1998; Maia et al., 1999).
Comparando a relação de microorganismos citados na literatura como
produtores de lipase, com os microorganismos para a obtenção de lipases
comerciais, verifica-se que esta última é bastante reduzida, pois as informações
reportadas na literatura sobre a produção de lipases microbianas ainda se baseiam
em estudos exploratórios em escala de bancada, sendo poucos os dados
disponíveis sobre a produção de lipase em escala industrial (Pastore, 2000).
Apesar de todos os avanços obtidos atualmente, objetivando maximizar a
síntese das lipases através do uso das cepas microbianas já conhecidas, é
fundamental buscar ferramentas como melhoramentos genéticos, tecnologia de DNA
recombinante, análises genômicas, de forma a tornar estes microorganismos
apropriados para o uso comercial (Bennett, 1998; Fungaro e Maccheroni Jr., 2002)
No entanto, a seleção de cepas selvagens hiperprodutoras ainda é uma
técnica de grande importância, principalmente em países que apresentam uma
grande biodiversidade como o Brasil (Freire e Castilho, 2000).
Enzimas de interesse industrial, como as lipases, são produzidas
tradicionalmente por fermentação submersa. No entanto, a FES pode ser uma
alternativa bastante interessante quando se utilizam rejeitos de baixo custo como
meio de fermentação (Gombert et al., 1999; Palma et al., 2000; Gutarra et al., 2003).
Vários trabalhos têm reportado o uso de resíduos proveniente da
agroindústria na produção de lipase por fermentação em estado sólido. Estes são
utilizados como fonte de nutrientes para o crescimento microbiano. Resíduos como
os da indústria de óleos vegetais (óleo de oliva, óleo de soja, óleo de babaçu, óleo
gergelim, óleo de semente de girassol, óleo de coco) (Cordova et al., 1998; Kamini et
al., 1998; Gombert et al., 1999; Palma et al., 2000; Capra et al., 2003; Leal et al.,
2003) e subprodutos como farelo de casca de trigo (Bertolin et al., 2001; Benjamin e
Pandey, 2001; Mahadik et al., 2002; Ul-Haq et al., 2002; Meira et al., 2003), farelo de
cevada (Dominguez et al., 2003), farelo de arroz (Rao et al., 1993) dentre outros,
vêm sendo utilizados.
Revisão Bibliográfica
18
A produção de lipase por FES, em alguns casos, mostra-se altamente
dependente da relação de carbono/nitrogênio e do tipo de fonte de carbono do meio
(Gombert et al., 1999; Dominguez et al., 2003), por isso estudos utilizando diferentes
fontes suplementares de carbono e nitrogênio, com o objetivo de enriquecer o meio
e induzir a síntese da lipase vêm sendo desenvolvidos.
Recentemente vários trabalhos buscam elucidar os efeitos causados pela
adição de nutrientes, e a presença de indutores durante o processo de produção da
lipase, em estado sólido ou submerso (Freire et al., 1997b; Maia et al., 1999;
Gombert et al., 1999; Corzo e Revah, 1999; Pastore, 2000; Palma et al., 2000; Maia
et al., 2001; Elibol e Ozer, 2002; Dominguez et al., 2003). Em alguns casos, o uso de
suplementações tem possibilitado aumentos razoáveis na capacidade produtiva dos
microorganismos. Contudo, alguns trabalhos que utilizam a FES para a produção de
lipase mostram que dependendo da composição do substrato utilizado na
fermentação a adição de fontes suplementares de carbono e nitrogênio é
desnecessária (Kamini et al., 1998).
O uso de triglicerídeos como fonte de carbono é adequado para crescimento
celular e produção de enzima, embora a indução da biossíntese da lipase em
presença de ácidos graxos livres ou triglicerídeos seja controverso (Freire et al.,
1997b). A presença de materiais que apresentam lipídeos no meio de cultura
usualmente aumenta em muito os níveis de atividade lipásica (Dominguez et al.,
2003).
Outros fatores que afetam a produção de lipase extracelular por fermentação
em estado sólido são o pH do meio durante o processo de produção, a temperatura
de condução da fermentação, a aeração e a composição do meio (Dominguez et al.,
2003).
Estudos mostram que as lipases microbianas produzidas por FES se mantém
estáveis na faixa de pH entre 5,0 a 8,0 e apresentam maior atividade na faixa de
temperatura de 30 a 40°C, no entanto, algumas lipases têm mostrado níveis de
estabilidade consideráveis mesmo em temperaturas extremas, como 5°C e 60°C
(Freire et al., 1997a; Kamini et al., 1998; Maia et al., 1999; Ferrer et al., 2000;
Benjamin e Pandey, 2001; Pastore et al., 2003). No entanto, algumas lipases
Revisão Bibliográfica
19
produzidas através de fermentação em estado sólido são enzimas sensíveis quanto
à presença de proteases e aumentos no pH do meio, tendo sua atividade
comprometida por estes fatores (Gombert et al., 1999; Benjamin e Pandey, 2001).
2.2.3 Aplicações das Lipases
Atualmente, as lipases dominam cerca de 5 % do mercado mundial de
enzimas. Entretanto nota-se uma inclinação ao crescimento deste mercado, devido
ao vasto número de aplicações reveladas (Palma et al., 2000).
As lipases têm encontrado um vasto campo de atuação nas indústrias, sendo
utilizada em diversas aplicações como no processamento de óleos e gorduras,
formulação de detergentes, processamento de alimentos, nos processos de síntese
usados pela indústria de química fina e farmacêutica, manufatura de papel,
produção de cosméticos, na indústria de combustíveis na modificação de ésteres,
no processamento de peles, como biossensores pela indústria médica, na
determinação de lipídeos no sangue e no tratamento de efluentes (Gandhi, 1997;
Sharma et al., 2001; Leal et al.,2002; Pastore et al., 2003).
As propriedades características peculiares das lipases têm propiciado um
vasto crescimento nas aplicações dentro da indústria de óleos e gorduras, cujo
processo produz cerca de 100 milhões de toneladas de matéria-prima ao ano (Freire
et al., 1997a). As lipases apresentam uma série de características interessantes para
a indústria de óleos e gorduras, como a sua capacidade hidrolítica de cadeias de
ésteres de triacilglicerol, e de reação reversa, ou seja, a síntese de ésteres em
baixas concentrações de água. Assim, a utilização de lipases em processamentos
oleoquímicos tem resultado na redução dos gastos de energia e minimizado
problemas relacionados à degradação térmica durante os processos de alcoólise,
acidólise, hidrólises e glicerólises (Sharma et al., 2001). As lipases vem sendo
utilizadas na modificação das propriedades de misturas de triglicerídeos objetivando
Revisão Bibliográfica
20
a produção de margarinas, gorduras dietéticas e gorduras especiais como a
manteiga de cacau (Freire,1996).
A modificação enzimática de óleos que contém um alto percentual de ácidos
graxos polinsaturados (PUFAs) é um processo que apresenta excelentes
perspectivas comerciais, uma vez que estes são facilmente sujeitos à decomposição
no processo por via química (Freire e Castilho, 2000).
Devido à sua habilidade em hidrolisar gorduras, as lipases têm sido
amplamente utilizadas como aditivo pela indústria de limpeza e detergentes, sendo
que os detergentes que apresentam lipases em sua composição são especialmente
seletivos (Sharma et al., 2001). A idéia da utilização de enzimas como as lipases,
proteases, amilases e celulases na fabricação de agentes de lavagem enzimática
(detergentes biológicos) não é nova, sendo que desde meados de 1960, esta vem
sendo uma das principais aplicações de enzimas (Novozymes, 2003). Embora as
manchas ocasionadas por proteínas sejam facilmente digeridas pelas enzimas, as
manchas de óleos e gorduras são de difícil remoção, devido às baixas temperaturas
utilizadas nas lavagens. Assim, em 1988 a Novo Nordisk (atual Novozymes) colocou
no mercado um produto contendo lipase fúngica desenvolvida mediante aplicação
de engenharia genética, denominado comercialmente “Lipolase”. Todavia, outros
produtos, como “Lumafast” e o “Lipomax”, já apresentam lipases extracelulares em
sua formulação com estabilidade e atividade ótimas sob condições de lavagem
(Freire e Castilho, 2000; Sharma et al., 2001).
A utilização de lipases na prática não tem sido maior devido aos custos de
produção e as restrições de estabilidade necessárias à sua aplicação. Atualmente,
estes problemas estão sendo resolvidos mediante a utilização de lipases com
propriedades compatíveis com as condições de aplicação e a obtenção de
rendimentos de fermentação elevados viabilizando economicamente a sua utilização
(Freire, 1996).
A tecnologia da aplicação de lipases pela indústria alimentícia tem utilizado as
reações de hidrólise e síntese com o objetivo de reduzir algumas gorduras presentes
na manteiga de cacau, que dificultam a sua utilização na fabricação de chocolates
(Undurraga et al., 2001). No entanto, as lipases são utilizadas em diversos campos
Revisão Bibliográfica
21
da manufatura de alimentos. Estas enzimas também são amplamente utilizadas no
melhoramento da textura de massas, pela indústria de panificação, na redução do
período de maturação de alimentos cárneos e queijos, no desenvolvimento de
aromas e sabores, na hidrólise de gorduras do leite, modificação de gorduras
presentes em manteigas, na produção de condimentos e essências, dentre outras
aplicações (Freire e Castilho, 2000; Sharma et al., 2001).
O uso das lipases em sínteses químicas orgânicas tem se tornado essencial
para a indústria farmacêutica, química fina e cosmética, devido às suas
características peculiares. Desta forma, a estéreo-seletividade das lipases vem
sendo usada na resolução de misturas de ácidos orgânicos racêmicos em sistemas
imiscíveis ou bifásicos (Sharma et al., 2001) e na remoção seletiva de certos
compostos. Lipases em meio orgânicos sem presença de água livre, são conhecidas
por catalisar reações de grande interesse científico e comercial, como as
biotransformações e as sínteses (Klibanov, 1997; Ducret, 1998). O uso de lipases na
síntese de compostos enâncio puros tem sido amplamente discutido (Itoh et al.,
1998; Sharma e Chattopadhyay, 2000).
Os ácidos graxos poli-insaturados (PUFAs) livres e seus mono e diglicerideos
são subseqüentemente usados para produzir uma variedade de produtos
farmacêuticos, como anti-colesterolênicos, anti-inflamatórios dentre outros (Gill e
Valivety, 1997; Belarbi et al., 2000). As lipases também estão sendo utilizadas no
processo de produção de outros medicamentos como antidepresivos, anti-
hipertensivos e vasodilatadores (Freire e Castilho, 2000).
A indústria de cosméticos e perfumaria tem desenvolvido processos, que
empregam lipases na produção de emulsificantes, aromas, surfactantes e
emolientes que fazem parte da composição de cremes (Leal, 2000; Sharma et al.,
2001).
O uso de lipases na indústria de manufatura de papel surgiu a partir de 1991
(Freire, 1996). A utilização das lipases no tratamento da polpa de papel tem
contribuído consideravelmente, reduzindo a decomposição de resinas nos cilindros
de secagem, fato este que afetava a produtividade e a qualidade do papel, com isto
Revisão Bibliográfica
22
tornando desnecessárias as limpezas freqüentes dos cilindros (Freire, 1996; Jaeger
e Reetz,1998).
As lipases também podem ser utilizadas para acelerar os processos de
degradação de gorduras em detritos industriais e no tratamento de efluentes.
Atualmente, a aplicação de lipases tem sido também sugerida na degradação
biológica e remoção de carga lipolítica de efluentes industriais, gerados em
frigoríficos e abatedouros, laticínios e indústrias de alimentos em geral (Gandhi,
1997; Masse et al., 2001; Pastore et al., 2003; Rigoni et al., 2003; Mendes e Castro,
2003). Efluentes que contém elevados teores de gorduras apresentam elevada
Demanda Bioquímica de Oxigênio (DBO). A degradação biológica desses rejeitos é
um processo lento, tendo como etapa limitante a liberação de ácidos graxos pelos
microorganismos com atividade lipolítica. Assim a adição de lipases pode auxiliar na
redução do tempo de retenção hidráulica e aumentar significantemente a eficiência
do processo (Pereira et al., 2002; Mendes e Castro, 2003).
Algumas lipases produzidas através de fermentações em estado sólido já
estão sendo utilizadas na realização de hidrólise enzimática de efluente de laticínios,
como uma etapa que antecede ao tratamento biológico em reator de lodos ativados
de batelada seqüencial. Os resultados obtidos com o efluente previamente
hidrolisado, mostram que é possível se obter remoções de Demanda Química de
Oxigênio (DQO) acima de 90 %, independentemente do teor de gordura no meio
(Jung et al., 2002). Outros trabalhos utilizando lipases produzidas por FES mostram
que o pré-tratamento enzimático é eficiente na redução da DQO do efluente de
latícinios, facilitando a operação de reatores do tipo manta de lodo (UASB)
(Cammarota et al., 2001).
23
MATERIAL E MÉTODOS
Material e Métodos
24
3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Microorganismo
O fungo Penicillium simplicissimum foi isolado previamente por Freire (1996) a
partir do flotado da fermentação natural das amêndoas de babaçu. Este fungo foi
selecionado como um bom produtor de lipases utilizando-se metodologias de
seleção em meio sólido e líquido descritas na literatura (Freire, 1996). O fungo foi
estocado em meio sólido constituído por (p/v): amido solúvel 2%, óleo de oliva 1%,
extrato de levedura 0,1%, CaCO
3
0,5%, MgSO
4
0,025%, (NH
4
)
2
SO
4
0,5%, KH
2
PO
4
0,05% e ágar 2% sob refrigeração, sendo que novos repiques foram realizados a
cada três meses.
3.2 Preparo do Inóculo
O meio para produção do inóculo era constituído por (p/v): amido solúvel 2%,
óleo de oliva 1%, extrato de levedura 0,1%, CaCO
3
0,5%, MgSO
4
0,025%,
(NH
4
)
2
SO
4
0,5%, KH
2
PO
4
0,05% e ágar 2%. Os componentes do meio foram
solubilizados, sendo então feito o ajuste do pH a 5,5 com HCl 0,1 N. O meio foi
emulsificado utilizando-se um mixer manual (Britânia) e 100 mL de meio foram
transferidos para erlenmeyeres de 500 mL. Estes foram então autoclavados durante
30 minutos a 1,0 atm. Após a autoclavagem estes erlenmeyers foram inoculados
com 100 µL de suspensão de esporos obtida a partir do tubo estoque, sendo então
incubados por sete dias a 30 °C. A coleta dos esporos foi realizada adicionando-se
10 mL de solução de Tween 80 0,1% (v/v) e pérolas de vidro estéreis ao erlenmeyer
para uma melhor remoção dos esporos. Estes então foram estocados a 4 °C, na
mesma solução, por 15 dias.
Material e Métodos
25
3.3 Estudo da produção da lipase
3.3.1 Otimização da produção da lipase
O substrato utilizado em todos os experimentos consistiu de torta de soja
(resíduo da indústria do óleo de soja obtido após a prensagem dos grãos) obtida do
moinho Olfar localizado em Erechim (RS). Esta torta foi moída, peneirada (Tyler 35-
60) e armazenada em freezer até o momento da sua utilização. Em uma primeira
etapa, as fermentações foram conduzidas em béqueres de polipropileno de 600 mL
tampados com manta acrílica hidrofóbica. Para que as condições de produção de
lipase fossem otimizadas utilizou-se a técnica de planejamento fatorial de
experimentos e análise de superfície de resposta.
Primeiramente avaliou-se o efeito da temperatura de incubação, umidade inicial
da torta, tipo de suplementação e concentração da suplementação. Os efeitos
destas variáveis foram determinados através um planejamento fatorial fracionário do
tipo Taguchi e os níveis estudados, determinados com base na experiência prévia
do grupo (Capra et al, 2003) e trabalhos disponíveis na literatura (Castilho, 2003),
estão apresentados na Tabela 3.1. Os suplementos testados foram o óleo de soja
puro (Soya) e o efluente bruto de frigorífico (obtido em um frigorífico de suínos da
região de Erechim), como fonte adicional de carbono ao meio; e água de maceração
de milho (AMM) e hidrolisado de levedura (HL), como fontes adicionais de nitrogênio.
A água de maceração de milho consiste no resíduo da indústria de extração de
amido e glúten e foi fornecida pela empresa de Refinações de Milho do Brasil Ltda.
O hidrolisado de levedura era obtido no próprio laboratório segundo a metodologia
descrita no Anexo I.
Material e Métodos
26
Tabela 3.1: Níveis das variáveis estudadas no primeiro planejamento experimental
Nível -1 0 +1
Temperatura (°C) 25 32,5 40
Umidade (%) 40 60 80
Tipo de fonte de Carbono* OS OS + EF EF
Concentração fonte de C (%) 1 4,5 8
Concentração fonte de N
**
(%) 1 4,5 8
*OS = óleo de soja; EF = efluente de frigorífico
** O planejamento foi realizado uma vez com hidrolisado de levedura (HL) e outra com água de maceração de milho (AMM)
como fonte de suplementação de nitrogênio.
Conhecendo-se as variáveis que possuem efeito significativo na produção da
lipase, partiu-se para a otimização desta produção através de um planejamento
experimental completo 2
2
, com 4 pontos axiais e 3 pontos centrais. Nesta etapa
foram estudadas a variável temperatura e umidade, utilizando-se a torta de soja sem
nenhuma suplementação. Os níveis estudados neste planejamento estão
apresentados na Tabela 3.2.
Tabela 3.2: Níveis das variáveis estudadas no segundo planejamento experimental
Nível -1,41 -1 0 1 +1,41
Temperatura (°C) 15 18,63 27,5 36,37 40
Umidade% 30 37,27 55 72,73 80
Nos dois planejamentos experimentais realizados em béqueres (Figura 3.1),
cada ensaio foi realizado em duplicata sendo o ponto central realizado em triplicata.
Os béqueres de cada ponto experimental continham 10 g de torta de soja (em base
seca). Para a realização das suplementações com efluente de frigorífico, óleo de
soja, hidrolisado de levedura e água de maceração de milho foi preparada uma
emulsão com água deionizada, homogeneizando-se com mixer por 3 minutos. A
concentração da emulsão foi ajustada de acordo com a umidade final desejada na
torta, levando-se em consideração a quantidade de água presente no inóculo.
As emulsões foram adicionadas por gotejamento manual com auxílio de pipeta
automática, de forma que toda a área da torta fosse recoberta, melhorando assim a
homogeneidade do meio. Os béqueres foram então fechados com manta acrílica e
Material e Métodos
27
autoclavados a 1 atm por 30 minutos. Após o resfriamento, estes foram então
inoculados com uma suspensão de esporos, previamente diluída até a concentração
de esporos desejada, para a obtenção do teor de umidade final previsto em cada
experimento, e se obter uma concentração de esporos na torta de 10
8
esporos/g de
torta seca. A concentração de esporos da suspensão de estoque foi determinada em
câmara de Neubauer após diluição adequada.
Os béqueres foram então incubados em estufa a temperatura variada,
conforme definido pelo planejamento de experimentos, com injeção de ar
umidificado, de forma a se manter a umidade interna da câmara em 99 %. As
amostras foram retiradas periodicamente para a determinação da cinética em alguns
experimentos e posteriormente em 48 e 67 horas de fermentação.
Figura 3.1: Béqueres utilizados para a FES
3.3.2 Estudo da produção da Lipase em biorreator com agitação intermitente
Além dos experimentos em béqueres, foram realizados experimentos com
biorreatores com agitação intermitente. Os reatores foram construídos em vidro e
polipropileno no próprio laboratório. A Figura 3.2 apresenta a montagem
experimental dos biorreatores.
Material e Métodos
28
Figura 3.2: Biorreatores utilizados no processo fermentativo
Em cada experimento pesou-se 70 g de torta de soja em béqueres de
polipropileno, a umidade da torta foi ajustada, levando-se em consideração a água
presente no inóculo e a umidade final desejada no experimento. Os béqueres foram
então fechados com manta acrílica e autoclavados a 1 atm por 30 minutos. Após o
resfriamento, estes foram então inoculados com uma suspensão de esporos,
previamente diluída para se obter a concentração de 10
8
esporos/g de torta seca,
levando-se em consideração ainda a umidade final desejada. Após a inoculação do
meio, este foi transferido para os reatores, cuja assepsia era realizada por exposição
à luz ultravioleta em câmara de fluxo laminar por 18h. A temperatura de incubação
foi fixada com base nos resultados dos planejamentos de experimentos anteriores
em 27,5
o
C. Nestes experimentos foi utilizada a torta de soja sem nenhuma
suplementação e variou-se apenas o teor de umidade inicial da torta e a vazão de ar
injetada no biorreator, segundo um planejamento de experimentos fatorial completo
2
2
, com 3 pontos centrais. Os níveis estudados estão apresentados na Tabela 3.3.
A injeção de ar dentro dos reatores foi controlada por meio de um rotâmetro
para gases. Antes de chegar ao interior dos reatores, o ar foi umidificado através da
passagem em um recipiente com água, a fim de se manter a umidade do meio.
Diariamente, retirava-se cerca de 6 g de amostra de cada reator, após
Material e Métodos
29
homogeneização manual em câmara de fluxo. Cada experimento foi conduzido por
7 dias.
Tabela 3.3: Níveis das variáveis estudadas no terceiro planejamento experimental
Experimento -1 0 + 1
Umidade (%) 40 50 60
Vazão (L/min) 1 4,5 8
3.4 Métodos analíticos
3.4.1 Caracterização dos substratos
A caracterização da torta de soja e do hidrolisado de levedura foi feita seguindo
as normas do Instituto Adolfo Lutz (IAL, 1985). As análises realizadas na torta de
soja foram: umidade, lipídios, nitrogênio e cinzas. Na caracterização do efluente de
frigorífico foram realizadas análises de lipídeos, cinzas, umidade, nitrogênio e DQO.
Os dados da composição da água de maceração de milho foram obtidos da empresa
Refinações de Milho do Brasil Ltda. A caracterização da torta de soja, quanto ao teor
de carbono foi fornecida por Castilho (2003) sendo que está análise foi realizada no
Instituto de Química da UFRJ e os dados referentes ao óleo de soja foram obtidos
da U.S. Department of Agriculture (USDA, 2004).
3.4.2 Preparo das Amostras
As amostras de meio fermentado foram cominuídas e de cada uma delas
retirava-se 3 alíquotas de 0,5 g para análise de umidade, pH e atividade de água. O
restante do material foi pesado e adicionado a 45 mL de tampão fosfato de sódio
100 mM pH 7,0. A mistura foi então incubada em agitador orbital a 35 °C e 160 rpm
por 30 minutos. Em seguida foi feita a extração da fração líquida por prensagem
Material e Métodos
30
manual em filtro de nylon e o sobrenadante foi utilizado para a dosagem de atividade
lipásica e proteásica. A fração sólida retida no filtro foi utilizada para dosagem de
glicosamina, que foi utilizada como medida indicativa do crescimento microbiano
(Aidoo et al., 1981). A Figura 3.3 apresenta a rotina de análise das amostras.
AMOSTRA
Pesar 0,5g,
adicionar 5 mL de
H
2
O, medir pH.
Pesar 0,5g,
medir umidade
por gravimetria
Pesar o restante,
adicionar 45 mL de
tampão fosfato 100 mM
pH 7,0.
Extração por 30
minutos a 35°C,
160 rpm.
Prensagem manual
(filtro)
SOBRENADANTE
SÓLIDO
Dosagem de
Glicosamina
Pesar 0,5g,
medir atividade
de água.
Dosagem de
Atividades
Enzimáticas
Figura 3.3: Fluxograma da rotina de análise das amostras
Material e Métodos
31
3.5 Atividade Lipásica
Para a dosagem da atividade lipásica utilizava-se como substrato uma emulsão
com óleo de oliva 10 % (p/v) e goma arábica 5 % (p/v) em tampão fosfato de sódio
100 mM pH 7,0. A 18 mL desta emulsão eram adicionados 2 mL da amostra. Após
incubação por 15 minutos a 37 °C com agitação de 160 rpm, a reação foi
interrompida e os ácidos graxos extraídos através da adição de uma solução de
acetona-etanol (1:1 v/v). Os ácidos graxos liberados durante a reação foram então
titulados até pH 11 com solução 0,1 N de NaOH. Os brancos reacionais foram
preparados adicionando-se a amostra juntamente com a solução de acetona-etanol
e então titulados. As dosagens de atividade foram feitas em duplicata, com exceção
do ponto central dos planejamentos, que foi feito em triplicata. Uma unidade de
atividade lipásica foi definida como a quantidade de enzima capaz de liberar 1 µmol
de ácido graxo por minuto nas condições descritas acima, que pode ser determinada
através da Equação 3.1 (Leal, 2000).
(
)
Vc.t
1000.N.VbVa
A
−
=
(3.1)
Onde:
A = atividade lipásica (U/mL)
Va = volume da amostra titulada (mL)
Vb = volume do branco titulado (mL)
Vc = volume da amostra usada na reação (mL)
t = tempo de reação (minutos)
N = normalidade da solução de NaOH
Material e Métodos
32
3.6 Atividade Proteásica
Em tubos de polipropileno de 1,5 mL foram adicionados 0,5 mL de amostra e
0,5 mL de solução de azocaseína
1
0,5% (p/v) preparada em tampão acetato 50 mM
pH 5,0. Os tubos foram então incubados durante 15 minutos
2
a 37°C. Após o
período de incubação a reação enzimática foi interrompida adicionando-se 0,5 mL
de solução de ácido tricloro-acético (TCA) 10% (p/v), em banho de gelo. Os tubos
com a mistura foram centrifugados a 12.900 x g por 20 minutos. Retirava-se então 1
mL do sobrenadante, ao qual foi adicionado 1 mL de solução de hidróxido de
potássio 5 N. Fazia-se então a determinação da absorbância da solução por
espectrofotometria em 428 nm. O branco das reações era preparado adicionando-se
a amostra após a adição do TCA. O branco do aparelho foi preparado substituindo-
se o volume de amostra por tampão acetato 50 mM pH 5,0. Uma unidade de
atividade proteásica foi definida como a quantidade de enzima que produz uma
diferença unitária de absorbância por minuto de reação entre o branco reacional e a
amostra nas condições de ensaio. Determinada através da Equação 3.2 (Charney e
Tomarelli, 1947).
Va.t
)f.Absf.Abs(
A
bbaa
−
= (3.2)
Onde:
A = atividade proteásica (U/mL)
Abs
a
= leitura de absorbância da amostra
Abs
b
= leitura de absorbância do branco
f = fator de diluição
t = tempo de reação (minutos)
Va = volume de amostra (mL)
1
Detalhes sobre o preparo desta solução se encontram no Anexo I.
2
Tempo determinado após acompanhamento cinético da reação utilizando algumas amostras.
Material e Métodos
33
3.7 Determinação da Umidade
A umidade foi determinada por gravimetria, através da perda de água sofrida
pela amostra (0,5 g) após 12 horas em estufa a 105° C.
3.8 Crescimento Microbiano
Como forma indireta de quantificar o crescimento celular foi utilizada a
dosagem de glicosamina, segundo Aidoo et al. (1981). Adicionavam-se 5 mL de uma
solução de ácido clorídrico 6 N a 0,5 g de amostra, colocando-se a mistura em
banho de água fervente por duas horas. Em seguida a amostra foi resfriada e filtrada
a vácuo. Do sobrenadante, transferia-se 1 mL para um balão de 25 mL, adicionando-
se uma gota de solução alcoólica de fenolftaleína 0,5% (p/v). Logo após, a
neutralização foi efetuada adicionando-se solução de hidróxido de sódio 3 N, até que
a mistura atingisse a coloração rosa. Procedia-se então à titulação reversa com uma
solução de KHSO
4
1%, até que a coloração rosa desaparecesse. O volume do balão
foi então completado com água destilada.
Após a etapa de extração descrita acima, tomava-se 1 mL da solução e
adicionava-se à mesma 1 mL de solução de acetil acetona
3
em Na
2
CO
3
0,5 N,
colocando a mistura em banho de água fervente por 20 minutos. Após o
resfriamento das amostras, adicionava-se 6 mL de etanol, em seguida, 1 mL de
reagente de Erlich
4
. Os tubos foram então incubados a 65º C por 10 minutos, e a
absorbância era lida em 530 nm. O branco foi preparado adicionando-se água no
lugar da amostra.
3
Detalhes sobre preparo desta solução, ver Anexo I
4
Idem nota 3.
Material e Métodos
34
3.9 Atividade de água (a
w
)
As análises de atividade de água foram realizadas utilizando-se o aparelho
Aqualab CX-2. A calibração inicial do aparelho foi feita utilizando água Milli-Q
®
(Millipore), até a obtenção de três leituras consecutivas idênticas (a
w
= 1.000), a
27°C. O segundo ponto de calibração foi feito utilizando-se uma solução salina de
NaCl com a
w
de 0,817, também se realizando leituras até a obtenção de 3 leituras
consecutivas iguais. Para a análise da atividade de água do meio, pesava-se 0,5 g
de amostra que foi colocada no frasco de leitura, efetuando-se então leituras até a
obtenção de três resultados consecutivos idênticos.
35
RESULTADOS E DISCUSSÕES
Resultados e Discussões
36
4 RESULTADOS E DISCUSSÕES
4.1 Caracterização do substrato e suplementos
A Tabela 4.1 apresenta os resultados da caracterização da torta de soja e dos
suplementos utilizados neste trabalho. Em uma análise preliminar, pode-se
considerar que a torta de soja é um meio rico em nutrientes e, portanto, possa
constituir-se em um substrato adequado à fermentação. De fato, ao se comparar a
composição deste meio com outras tortas provenientes da agroindústria, observa-se
que o teor de nitrogênio (proporcional ao teor de proteína) da torta de soja é cerca
do dobro do teor de nitrogênio de outras tortas como a de babaçu (Gombert et al.,
1999; Palma et al., 2000; Leal et al., 2003, Castilho, 2003), de coco, de arroz, farelo
de trigo (Ul-Haq et al., 2002) e torta de oliva (Cordova et al., 1998). Ainda assim,
optou-se por se realizar um estudo sistemático da suplementação da torta de soja
com outros componentes de baixo custo, a fim de se verificar as necessidades
nutricionais do microorganismo para maximizar a produção de lipase.
Todos os suplementos utilizados, com exceção do óleo se soja (OS), contêm
alto teor de umidade, que foi levada em consideração nos ajustes de umidade dos
meios durante os experimentos. O hidrolisado de levedura (HL) e a água de
maceração de milho (AMM), ao contrário do efluente de frigorífico (EF) apresentam
alto teor de nitrogênio, sendo considerados então bons suplementos para
incrementar o teor deste componente no meio. Já o efluente e o óleo de soja, foram
considerados fontes suplementares de carbono ao meio. É interessante observar o
alto valor da DQO do efluente, o que significa que este possui alto teor de matéria
orgânica oxidável. Boa parte desta consiste em óleos e gorduras, como pode ser
observado pelo alto valor do teor de lipídeos na Tabela 4.1.
Resultados e Discussões
37
Tabela 4.1: Caracterização química do substrato e dos suplementos
Análise
Torta de
soja
Efluente de
frigorífico
Óleo de
soja
a
Hidrolisado de
levedura
Água
maceração de
milho
b
Umidade (%) 3,0 89,2 0 67,5 55,0
Proteína (%) 42,5 0,14 0 17,5 18,8
Lipídeos (%) 8,5 3,1 100 0,05 1,0
Carboidrato (%)
c
30 6,5 0 5,8 7,5
Fibras (%) 10
a
n.d.
d
0 8,0
a
13
Cinzas (%) 6,0 1,1 0 1,2 4,5
Nitrogênio (%) 6,8 0,02 0 2,8 3,0
Carbono (%) 45,4
e
n.a.
f
77,4 n.a. 15,9
DQO (g/L)
g
- 2.000 - - -
a
Fonte: USDA (2004)
b
Fonte: Refinações de Milho do Brasil Ltda.
c
por diferença
d
não detectado (< 0,01%)
e
Castilho,(IQ/UFRJ, 2003)
f
não avaliado
g
Demanda Química de Oxigênio
4.2 Cinéticas de fermentação
O primeiro planejamento foi montado com o objetivo de elucidar quais os
efeitos causados pela adição de nutrientes e variações de temperatura e umidade na
síntese da lipases por fermentação em estado sólido. Antes da realização do
planejamento, porém, optou-se por realizar algumas condições, acompanhando-se a
cinética da fermentação, através do monitoramento das atividades lipásica,
proteásica e de água, umidade e pH. A temperatura foi fixada em 40 °C (limite
superior do planejamento) e a umidade foi testada nos dois níveis (40 e 80%). Como
suplemento de fonte de nitrogênio utilizou-se em todos os ensaios o hidrolisado de
levedura. Como fonte suplementar de carbono foram testados os óleos de soja e
oliva e o efluente de frigorífico. O objetivo deste acompanhamento cinético foi
identificar a fase de máxima produção de lipase e protease. Pode-se ainda obter
uma avaliação preliminar dos efeitos de diferentes suplementos, além da queda do
teor de umidade do meio, um problema típico deste tipo de fermentação.
Como se pode observar através da Figura 4.1, para todos os experimentos
obteve-se baixa atividade protéasica até cerca de 48 h. Após este tempo, há um
aumento mais acentuado desta, com exceção do experimento realizado com alto
Resultados e Discussões
38
teor de umidade inicial e de suplementos, sugerindo que uma alta umidade
associada ao elevado teor de carbono e nitrogênio tenham efeito inibitório. Observa-
se, analogamente, um aumento do pH ao longo do tempo de fermentação (Figura
4.2), mais acentuado após o início do crescimento da atividade proteásica. Este
efeito possivelmente está relacionado à proteólise, que gera aminoácidos, cuja
desaminação libera amônia para o meio (Freire et al., 1997b; Palma et al., 2000). Os
incrementos de atividade proteásica e pH ao longo do tempo de fermentação neste
trabalho foram bem inferiores aos relatados pela literatura, onde a atividade
proteásica chega a atingir cerca de 8 U/g e pH em torno de 8,0 (Maia et al., 1999;
Gombert et al., 1999; Palma et al., 2000). No entanto, o comportamento cinético da
atividade proteásica é similar ao observado nestes trabalhos, mostrando que a
produção de proteases só ocorre após um certo tempo de fermentação.
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
1.0
0 20 40 60 80 100 120
Tempo (h)
Atividade Proteásica (U/g)
1%EF/1%HL/
40ºC/40%U
1%OS/1%HL
/40ºC/40%U
1%OO/1%HL
/40ºC/40%U
8%EF/8%HL/
40ºC/80%U
Figura 4.1: Cinética de produção de protease em diferentes condições experimentais.
Na maioria dos experimentos obteve-se elevada atividade lipásica em torno de
65 a 75 h de fermentação, com exceção do experimento com alta umidade inicial e
alta concentração de suplementos, conforme pode ser observado na Figura 4.3.
Este comportamento já dá indicativos de ocorrência de inibição por excesso de
substratos, o que é confirmado pelos resultados do primeiro planejamento, que
serão apresentados mais adiante.
Resultados e Discussões
39
6.0
6.4
6.8
7.2
7.6
8.0
0 20 40 60 80 100 120
Tempo (h)
pH
1%EF/1%HL/
40ºC/40%U
1%OS/1%HL
/40ºC/40%U
1%OO/1%HL
/40ºC/40%U
8%EF/8%HL/
40ºC/80%U
Figura 4.2: Variação do pH ao longo do tempo de fermentação em diferentes condições
experimentais
É interessante notar que não se observa um pico de atividade lipásica
claramente. Em muitos estudos sobre produção de lipase por FES (Gombert et al.,
1999; Palma et al., 2000; Leal et al., 2003) e em fermentação submersa (Corzo e
Revah, 1999) é comum a ocorrência do pico na atividade lipásica. No entanto é
possível se encontrar relatos onde não se observa queda na atividade lipásica em
fermentações conduzidas por até 12 dias (Maia et al, 1999; Dominguez et al, 2003).
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
0 20 40 60 80 100 120
Tempo (h)
Atividade Lipásica (U/g)
1%EF/1%HL/
40ºC/40%U
1%OS/1%HL
/40ºC/40%U
1%OO/1%HL
/40ºC/40%U
8%EF/8%HL/
40ºC/80%U
Figura 4.3: Cinética de produção de lipase em diferentes condições experimentais
Resultados e Discussões
40
A princípio, um aumento da atividade proteásica ou a alcalinização do meio
levaria à queda na atividade lipásica, conforme demonstrado por Gombert et al
(1999). No entanto, é interessante ressaltar que a lipase produzida pelo Penicillium
simplicissimum não é afetada pela proteólise e pelo pH contrariando os resultados
observados nos trabalhos com o fungo Penicillium restrictum (Gombert, 1999;
Palma, 2000). Esta é uma característica desejável quando se busca maximizar a
produção de lipases. Este comportamento pode ser relacionado à baixa atividade
proteásica obtida, sendo ainda confirmado através da obtenção de baixos
coeficientes de correlação (r<0,7) entre as atividades lipásica e proteásica. As duas
cinéticas foram apresentadas em um mesmo gráfico (Figura 4.4), para melhor
visualização. Na Figura 4.3 pode-se ainda observar que, nas mesmas condições
experimentais, o óleo de oliva e o de soja levam a maiores taxas de produção de
lipase. No entanto, em 48 de fermentação, a diferença entre as atividades obtidas
utilizando estes suplementos é reduzida.
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
0 20 40 60 80 100 120
Tempo (h)
Atividade Lipásica (U/g)
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
Atividade proteásica (U/g)
1%EF/1%HL/
40ºC/40%U
1%OS/1%HL/
40ºC/40%U
1%OO/1%HL/
40ºC/40%U
8%EF/8%HL/
40ºC/80%U
Figura 4.4: Comparação das cinéticas de produção de lipase e protease em diferentes
condições de cultivo.
A evolução da umidade residual do meio e a atividade de água ao longo da
fermentação podem ser observadas nas Figuras 4.5 e 4.6. Ambas apresentaram
comportamentos similares, conforme o esperado. Observa-se também que a
umidade e a atividade de água se mantêm até cerca de 60 h de fermentação,
apresentando queda acentuada no caso do experimento com baixo teor de umidade
inicial e utilizando o efluente como fonte suplementar de carbono. Este
Resultados e Discussões
41
comportamento sugere que a utilização de óleo como suplemento restringe a
evaporação de água do sistema reduzindo a perda de umidade nos experimentos
conduzidos com esta fonte de carbono.
0
20
40
60
80
100
0 20 40 60 80 100 120
Tempo (h)
Umidade %
1%EF/1%HL/
40ºC/40%U
1%OS/1%HL/
40ºC/40%U
1%OO/1%HL
/40ºC/40%U
8%EF/8%HL/
40ºC/80%U
Figura 4.5: Evolução da umidade residual no meio durante a fermentação.
0.80
0.84
0.88
0.92
0.96
1.00
0 20 40 60 80 100 120
Tempo (h)
a
w
1%EF/1%HL/
40ºC/40%U
1%OS/1%HL/
40ºC/40%U
1%OO/1%HL/
40ºC/40%U
8%EF/8%HL/
40ºC/80%U
Figura 4.6: Evolução da atividade de água do meio durante a fermentação.
Resultados e Discussões
42
4.3 Estudo da produção da lipase
4.3.1 Otimização da produção da lipase
Na primeira etapa do estudo de otimização da produção da lipase realizaram-
se dois planejamentos experimentais fracionários do tipo Taguchi, para que os
principais efeitos das variáveis em estudo pudessem ser avaliados.
Planejamento Fatorial utilizando Hidrolisado de Levedura como fonte
suplementar de nitrogênio.
A Tabela 4.2 apresenta a matriz do primeiro planejamento com os valores
reais, codificados e as respostas para a atividade lipásica. Em uma análise
preliminar, pode-se notar que as condições experimentais 2, 4, 10 e 11 foram as que
permitiram se obter a maior atividade lipásica. É interessante notar que todas estas
condições se basearam em uma baixa umidade inicial do meio. Observa-se também
que a baixa umidade e níveis maiores de temperatura favorecem a atividade
metabólica aumentando a concentração de glicosamina. Os menores valores para
atividade lipásica foram obtidos em níveis maiores de umidade, como no ponto
central (60%) e nos experimentos com 80% de umidade inicial. Possivelmente o alto
teor de umidade reduz a porosidade do meio dificultando a penetração do oxigênio e
assim interferindo no metabolismo microbiano, ou ainda pode prejudicar a
transferência de calor do meio (Pandey, 2003).
A Tabela 4.3 apresenta outras respostas obtidas no primeiro planejamento
experimental. Na maioria dos experimentos, a perda de umidade foi inferior a 5%,
com exceção para os experimentos 9 a 12, que foram realizados com baixa umidade
inicial (40%) e alta temperatura (40°C), o que favorece a perda de água por
evaporação. Entretanto, mesmo em condições de baixa umidade (<30%), a atividade
de água do meio ainda está dentro da faixa considerada ótima (a
w
> 0,8) para o
crescimento de fungos (Farkas, 1997) embora, como se pode observar pelos
Resultados e Discussões
43
resultados de teor glicosamina para estes experimentos, houve menor crescimento
do fungo, quando comparado aos outros experimentos. Pode observar-se ainda que
o menor crescimento foi obtido no ensaio 10, que além de menor umidade, foi
realizado com elevado teor de óleo de soja, sugerindo que o excesso de óleo pode
ter causado a inibição da troca gasosa entre o fungo e o ar prejudicando o
crescimento microbiano. Entretanto, deve-se destacar a dificuldade em avaliar os
resultados referentes ao crescimento microbiano, pois o microorganismo pode
apresentar comportamento distinto, em relação ao teor de glicosamina, ao
administrarem-se diferentes tipos de suplementos.
Tabela 4.2: Matriz do planejamento experimental fracionário (valores reais e codificados)
com as respostas da atividade lipásica após 48h de fermentação, utilizando
hidrolisado de levedura como fonte suplementar de nitrogênio.
Ensaio
Temperatura
(°C)
Umidade
(%)
Tipo de
fonte de
Carbono*
Concentração
fonte
de C (%)
Concentração
fonte
de N(%)
Atividade
Lipásica
(U/g)
1 25(-1) 40(-1) OS(-1) 1(-1) 1(-1)
5,5±2,1
2 25(-1) 40(-1) OS(-1) 1(-1) 8(1)
6,4±1,6
3 25(-1) 40(-1) EF(1) 8(1) 1(-1)
5,3±0,6
4 25(-1) 40(-1) EF (1) 8(1) 8(1)
5,9±2,0
5 25(-1) 80(1) OS(-1) 8(1) 1(-1)
2,9±2,7
6 25(-1) 80(1) OS(-1) 8(1) 8(1)
2,4±2,0
7 25(-1) 80(1) EF (1) 1(-1) 1(-1)
3,5±3,5
8 25(-1) 80(1) EF(1) 1(-1) 8(1)
4,0±1,4
9 40(1) 40(-1) OS(-1) 8(1) 1(-1)
3,3±2,1
10 40(1) 40(-1) OS(-1) 8(1) 8(1)
6,7±0,7
11 40(1) 40(-1) EF(1) 1(-1) 1(-1)
6,6±5,4
12 40(1) 40(-1) EF(1) 1(-1) 8(1)
4,1±1,9
13 40(1) 80(1) OS(-1) 1(-1) 1(-1)
3,4±0,6
14 40(1) 80(1) OS(-1) 1(-1) 8(1)
3,2±3,1
15 40(1) 80(1) EF(1) 8(1) 1(-1)
3,6±0,2
16 40(1) 80(1) EF(1) 8(1) 8(1)
2,6±0,3
17
**
32,5(0) 60(0) OS + EF(0) 4,5(0) 4,5(0)
1,5±0,2
*OS = óleo de soja; EF = efluente de frigorífico
**média de três experimentos independentes
O crescimento microbiano foi medido indiretamente pelo teor de glicosamina
nos sólidos e valores elevados de glicosamina no meio foram obtidos em condições
que forneceram baixa atividade lipásica. Este comportamento pode estar relacionado
às diferentes respostas fisiológicas do fungo quando este é submetido a diferentes
Resultados e Discussões
44
condições nutricionais, podendo haver um desvio metabólico para o crescimento em
detrimento da produção de lipase. Além disso, este resultado pode estar também
associado ao fato que um maior acúmulo de biomassa pode levar ao aumento de
protease no meio, devido à lise celular, e conseqüentemente à queda da atividade
lipásica, conforme já observado em meio submerso para Penicillium restrictum
(Freire et al., 1997b). No entanto, este efeito ainda necessita de maior investigação.
Tabela 4.3: Demais respostas obtidas no primeiro planejamento experimental, após 48h de
fermentação utilizando hidrolisado de levedura como fonte suplementar de
nitrogênio.
Ensaio
Atividade
Proteásica
(U/g)
Conc.
Glicosamina
(mg/g)
Umidade
Residual
(%)
a
w
pH
1
0,076±0,001 4,8±1,0 39,03±0,06 0,969±0,001 6,63±0,12
2
0,078±0,008 4,9±0,8 38,54±1,34 0,972±0,001 6,63±0,01
3
0,115±0,007 4,5±0,5 38,52±1,53 0,963±0,004 6,61±0,16
4
0,102±0,019 4,8±0,9 38,04±2,53 0,962±0,004 6,52±0,05
5
0,052±0,012 4,6±0,4 79,32±0,16 0,997±0,001 6,26±0,03
6
0,059±0,007 4,3±0,1 77,11±0,11 0,997±0,002 6,19±0,08
7
0,069±0,020 5,8±0,4 77,88±0,62 0,997±0,001 6,22±0,03
8
0,054±0,014 3,8±1,0 77,43±0,13 0,998±0,001 6,21±0,02
9
0,045±0,017 3,1±0,2 22,02±1,05 0,893±0,006 6,56±0,20
10
0,062±0,005 2,8±0,5 24,15±2,22 0,915±0,018 6,43±0,13
11
0,057±0,017 3,2±0,1 26,81±2,60 0,927±0,018 6,48±0,01
12
0,044±0,001 3,1±0,1 24,35±3,20 0,913±0,019 6,35±0,04
13
0,021±0,008 4,2±0,1 75,66±1,52 0,999±0,001 6,28±0,25
14
0,039±0,001 3,9±0,1 75,68±0,68 0,999±0,001 6,41±0,20
15
0,028±0,013 4,2±0,1 76,03±1,27 0,999±0,001 6,34±0,04
16
0,026±0,009 3,8±0,2 74,53±0,18 0,999±0,001 6,31±0,01
17
**
0,465±0,326 5,6±0,7 56,61±0,97 0,981±0,002 7,66±0,08
**
Média de três experimentos independentes.
Como já observado no acompanhamento cinético de algumas condições
mostrado anteriormente, a atividade proteásica se manteve baixa em todos os
experimentos. Observou-se pouca variação com as diferentes condições
experimentais testadas no planejamento, a não ser no ponto central onde se obteve
o maior resultado de atividade desta enzima. O mesmo ocorre com o pH do meio
Resultados e Discussões
45
fermentado, que também apresentou baixa variação e a ocorrência do valor máximo
(7,66) no ponto central. Conforme já discutido, o aumento da alcalinização do meio
pode estar relacionado à proteólise, uma vez que a ação da protease libera
aminoácidos, cuja desaminação leva ao aumento do pH do meio.
Para uma análise mais consistente dos resultados do primeiro planejamento,
os dados foram tabulados e analisados utilizando o pacote Statistica, módulo de
Planejamento de Experimentos (“Experimental design”). Um planejamento
fracionário permite apenas a avaliação dos efeitos principais e estes são melhor
visualizados através do Gráfico de Pareto, que apresenta a magnitude dos efeitos
absolutos das variáveis manipuladas sobre as variáveis de resposta.
A Figura 4.7 apresenta o gráfico de Pareto para os resultados do primeiro
planejamento, utilizando a atividade lipásica como variável de resposta. Pode-se
observar que a umidade (e também a atividade de água) é a variável que mais
influencia a produção de lipase, apresentando um efeito negativo significativo a 95%
de confiança. Esta análise confirma as observações preliminares da Tabela 4.2 e
demonstra que a produção de lipase é prejudicada quando se utilizam níveis
elevados de umidade no processo fermentativo. Embora a presença da água seja
uma necessidade para o microorganismo em diversas funções, conforme já discutido
no item (2.1.3); o excesso de umidade pode causar a redução da porosidade do
meio dificultando assim a penetração do oxigênio na torta. Além disso, o excesso de
água dificulta ainda a remoção de calor do meio (Mitchell et al., 2003b; Pandey,
2003). A temperatura, tipo de fonte de carbono e concentrações dos suplementos
não apresentaram efeito significativo (nível de 95%) sobre a atividade lipásica,
utilizando hidrolisado de levedura como fonte suplementar de nitrogênio,
continuando a análise preliminar da Tabela 4.2.
Resultados e Discussões
46
Efeito absoluto
,1897699
,3140825
-,408766
-,631305
-2,91708
p=,05
N
TC
T
C
U
-0,5 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5
Figura 4.7: Efeito das variáveis manipuladas sobre a atividade lipásica utilizando hidrolisado
de levedura como fonte suplementar de nitrogênio.
A análise estatística foi estendida considerando outras variáveis como
resposta, como a atividade proteásica, concentração de glicosamina, umidade, e pH
final da torta. Esta análise demonstrou que nenhuma das variáveis tem influência
significativa (nível de 95% de confiança) sobre a atividade proteásica obtida. Este
efeito pode ter ocorrido em função dos resultados de atividade proteásica terem sido
extremamente baixos e ainda por não se ter conhecimento do tipo de protease
produzido no processo. A temperatura apresentou efeito significativo (95%) sobre a
concentração de glicosamina no meio, e conseqüentemente sobre o crescimento do
fungo, provavelmente devido à aceleração do metabolismo do microorganismo. Esta
variável também afeta significativamente a umidade residual e a atividade de água
da torta, conforme o esperado.
O pH foi afetado significativamente apenas pelo conteúdo de água inicial do
meio, sendo que nos experimentos conduzidos com menor teor de umidade notou-
se um pequeno aumento do pH, no entanto este aumento foi bastante reduzido
quando comparado ao obtido nos experimentos com alto teor de umidade inicial.
Resultados e Discussões
47
Planejamento Fatorial utilizando água de maceração de milho como fonte
suplementar de nitrogênio.
A Tabela 4.4 apresenta os resultados obtidos no primeiro planejamento fatorial
fracionário, utilizando água de maceração de milho como fonte suplementar de
nitrogênio. A Tabela 4.5 apresenta outras respostas obtidas no primeiro
planejamento experimental.
Utilizando esta fonte suplementar de nitrogênio foi possível se obter em media,
maiores valores de atividade lipásica do que os obtidos com o hidrolisado de
levedura. As condições experimentais que forneceram os maiores resultados foram
as do experimento 2 e do ponto central. As condições do experimento 2 foram
baseadas no menor nível de temperatura (25°C), umidade inicial (40%), óleo de soja
como fonte suplementar de carbono em concentração 1% e 8% de AMM. Pode se
observar que os resultados obtidos nos experimentos conduzidos utilizando a AMM
como fonte de nitrogênio foram superiores aos obtidos quando se utilizou o HL. Este
desempenho pode estar relacionado ao maior teor de gordura da AMM e/ou à
presença de vitaminas ou outros componentes em sua composição, que estariam
estimulando a produção da lipase. O HL pode ainda conter algum componente que
estaria prejudicando a produção da enzima. Os menores valores para atividade
lipásica também foram obtidos nos experimentos com 80% de umidade na torta, e
alta concentração de suplementos.
Na maioria dos experimentos, a perda de umidade foi inferior a 5%, exceto
para os experimentos 9 a 12, que foram realizados com baixa umidade inicial (40%)
e alta temperatura (40°C), conforme o observado anteriormente para o planejamento
utilizando HL. Neste caso também, nas condições de baixa umidade (~30%), apesar
atividade de água do meio ainda está dentro da faixa considerada ótima para o
crescimento de fungos (Farkas, 1997) mas também houve menor crescimento do
fungo, como pode ser verificado pelo menor teor de glicosamina para estes
experimentos.
Resultados e Discussões
48
Tabela 4.4: Matriz do planejamento experimental fracionário (valores reais e codificados)
com as respostas da atividade lipásica após 48h de fermentação, utilizando
água de maceração de milho como fonte suplementar de nitrogênio.
Ensaio
Temper.
(°C)
Umidade
(%)
Tipo de fonte
de Carbono*
Concentração
fonte de C
(%)
Concentração
fonte de N
(%)
Atividade
Lipásica
(U/g)
1 25(-1) 40(-1) OS(-1) 1(-1) 1(-1)
7,9±0,7
2 25(-1) 40(-1) OS(-1) 1(-1) 8(1)
12,4±2,4
3 25(-1) 40(-1) EF(1) 8(1) 1(-1)
7,0±0,8
4 25(-1) 40(-1) EF (1) 8(1) 8(1)
5,4±0,8
5 25(-1) 80(1) OS(-1) 8(1) 1(-1)
2,6±0,4
6 25(-1) 80(1) OS(-1) 8(1) 8(1)
1,3±0,1
7 25(-1) 80(1) EF (1) 1(-1) 1(-1)
1,6±0,3
8 25(-1) 80(1) EF(1) 1(-1) 8(1)
3,2±0,5
9 40(1) 40(-1) OS(-1) 8(1) 1(-1)
3,3±1,1
10 40(1) 40(-1) OS(-1) 8(1) 8(1)
1,7±0,9
11 40(1) 40(-1) EF(1) 1(-1) 1(-1)
3,6±0,1
12 40(1) 40(-1) EF(1) 1(-1) 8(1)
4,6±0,1
13 40(1) 80(1) OS(-1) 1(-1) 1(-1)
5,0±4,0
14 40(1) 80(1) OS(-1) 1(-1) 8(1)
2,6±0,7
15 40(1) 80(1) EF(1) 8(1) 1(-1)
1,8±1,0
16 40(1) 80(1) EF(1) 8(1) 8(1)
4,2±1,5
17
**
32,5(0) 60(0) OS + EF(0) 4,5(0) 4,5(0)
10,2±1,5
*OS = óleo de soja; EF = efluente de frigorífico
**média de três experimentos independentes
Como nos casos já apresentados, a atividade proteásica também se manteve
reduzida e apresentou pouca variação para todas as condições, apresentando
valores maiores nas condições 1, 2, 3 e no ponto central. O mesmo comportamento
pode ser observado para o pH.
Com a análise estatística dos efeitos das variáveis, que é apresentada sob a
forma do gráfico de Pareto apresentado na Figura 4.8, constatou-se que aquela que
apresenta maior influência na atividade da lipase continua sendo a umidade, desta
vez, seguida pela temperatura, a concentração da fonte de carbono. Todas estas
variáveis apresentaram efeitos negativos significativos (95%). O efeito negativo da
umidade confirma o já observado pela análise preliminar da Tabela 4.4, onde se
observou que os melhores resultados foram obtidos em menor nível de umidade,
atribuído à dificuldade de transferência de massa e calor em altos níveis de
umidade. O efeito negativo da temperatura pode estar relacionado ao fato de que
uma maior temperatura leva à maior queda de umidade no meio, enquanto o efeito
negativo da concentração de fonte de carbono pode ser relacionado com a inibição
por excesso de substrato, como já observado por outros autores (Kamini et al.,
Resultados e Discussões
49
1998). As demais variáveis não apresentaram efeitos estatisticamente significativos
em nível de 95% de confiança, conforme já observado nos experimentos com HL
como suplemento.
Tabela 4.5: Demais respostas obtidas no primeiro planejamento experimental, após 48h de
fermentação, utilizando água de maceração de milho (AMM) como fonte
suplementar de nitrogênio.
Ensaio
Atividade
Proteásica
(U/g)
Conc.
Glicosamina
(mg/g)
Umidade
Residual
(%)
a
w
pH
1
0,455±0,049 5,2±0,6 37,90±0,39 0,945±0,001 6,37±0,04
2
0,310±0,001 4,1±0,5 37,27±0,31 0,939±0,001 6,26±0,03
3
0,385±0,007 4,9±0,4 38,59±1,21 0,946±0,003 6,59±0,05
4
0,175±0,007 4,9±0,1 37,49±0,06 0,939±0,001 6,27±0,05
5
0,053±0,031 4,9±0,1 79,29±0,85 0,982±0,001 6,39±0,02
6
0,049±0,049 5,4±0,2 77,44±0,40 0,983±0,001 5,93±0,04
7
0,021±0,001 4,3±0,6 79,51±0,05 0,985±0,001 6,36±0,03
8
0,013±0,006 4,8±0,3 79,09±1,23 0,984±0,001 5,93±0,01
9
0,090±0,025 3,9±0,8 31,09±1,21 0,946±0,005 6,73±0,03
10
0,027±0,004 2,8±0,2 32,30±0,71 0,938±0,001 6,31±0,04
11
0,101±0,013 3,9±0,1 34,97±0,09 0,956±0,002 6,55±0,01
12
0,052±0,001 3,0±0,2 32,46±1,12 0,937±0,006 6,30±0,03
13
0,006±0,001 3,2±0,3 76,60±0,21 0,999±0,001 6,66±0,01
14
0,004±0,004 3,0±0,1 75,11±0,01 0,999±0,001 6,24±0,01
15
0,062±0,059 3,4±0,1 77,88±1,01 0,999±0,001 7,02±0,02
16
0,034±0,027 3,5±0,6 77,05±0,35 0,999±0,001 6,64±0,45
17**
0,326±0,157 5,3±0,8 56,08±2,12 0,984±0,002 7,21±0,10
**Média de três experimentos independentes.
Resultados e Discussões
50
Efeito absoluto
,5988823
-1,42432
-3,44214
-3,66613
-5,93998
p=,05
N
TC
C
T
U
0 1 2 3 4 5 6 7
Figura 4.8: Efeito das variáveis manipuladas sobre a atividade lipásica utilizando água de
maceração de milho como fonte suplementar de nitrogênio
Em uma avaliação global pode-se notar que a água de maceração de milho
leva a uma maior produção de lipase, quando comparada aos experimentos
utilizando hidrolisado de levedura. Pela Tabela 4.1 percebe-se que o teor de
nitrogênio de ambas as fontes é praticamente o mesmo, e assim este resultado pode
estar associado ao maior teor de gordura e outros nutrientes da AMM, que poderia
induzir à maior produção de lipase.
0
2
4
6
8
10
12
14
T
o
r
t
a
P
ura
1
%O
S/
1
%HL
1%OS/1%AMM
1%OS/8%HL
1
%OS/8%A
MM
8%E
F
/
1
%HL
8
%EF
/
1
%A
MM
8
%EF
/
8
%H
L
8%EF
/
8%AMM
Atividade Lipásica (U/g)
Figura 4.9: Comparação dos resultados da atividade lipásica utilizando a torta de soja pura e
suplementações de óleo de soja e efluente de frigorífico como fonte de carbono,
hidrolisado de levedura e água de maceração de milho como fonte de nitrogênio
Resultados e Discussões
51
A Figura 4.9 mostra um gráfico comparativo dos resultados obtidos de atividade
lipásica em 48 horas de fermentação em diferentes condições suplementares de
fonte de carbono e nitrogênio e utilizando a torta de soja pura.
Como conclusão parcial, pode-se considerar que a utilização de
suplementações com o objetivo de aumentar o teor nutricional da torta de soja é
desnecessária, sendo que estas em sua maioria causaram a inibição da produção
de lipase, apresentando efeitos negativos sobre a atividade lipásica ou ainda
estatisticamente não significativos. Portanto, pode-se considerar que a torta de soja
consiste em um substrato já rico o suficiente em fonte de carbono e nitrogênio,
dispensando a suplementação com outras fontes externas.
4.4 Otimização da produção de lipase
Com os resultados obtidos no primeiro planejamento, observou-se
desnecessária a utilização de fontes suplementares de nutrientes na torta de soja.
Assim, desenvolveu-se um novo planejamento de experimentos tendo como
finalidade avaliar o efeito da temperatura e da umidade na produção de lipase por
fermentação em estado sólido, maximizando a produção da enzima em função das
condições operacionais. Este planejamento consistiu em um fatorial completo com
os pontos axiais (Neto et al, 2002) para verificação dos efeitos de primeira e
segunda ordem, bem como as interações entre as variáveis. As faixas de estudo
foram ajustadas, em função dos resultados obtidos no primeiro planejamento.
Nestes experimentos, além das amostras de 48 h de fermentação, foram coletadas
amostras no tempo de 67 h, uma vez que durante a avaliação cinética preliminar
observou-se que o máximo de produção de lipase se encontrava próximo a este
ponto. As Tabelas 4.6 a 4.9 apresentam os resultados para o segundo planejamento
fatorial nos tempos de 48 e 67 h, respectivamente.
Resultados e Discussões
52
Tabela 4.6: Matriz do planejamento experimental completo (valores reais e codificados) com
as respostas da atividade lipásica, proteásica e glicosamina após 48h de
fermentação
Ensaio
Temperatura
(°C)
Umidade
Inicial (%)
Atividade
Lipásica
(U/g)
Atividade
Proteásica
(U/g)
Conc.
Glicosamina
(mg/g)
1 18,6(-1) 37,3(-1)
3,7±1,0 0,164±0,039 3,0±0,3
2 36,4(1) 37,3(-1)
8,1±1,0 0,199±0,017 4,3±0,1
3 18,6(-1) 72,7(1)
1,0±0,4 0,165±0,072 3,4±0,2
4 36,4(1) 72,7(1)
2,1±0,2 0,159±0,013 5,7±0,3
5 15(-1,41) 55(0)
2,7±0,3 0,152±0,006 2,6±0,2
6 40(1,41) 55(0)
2,2±0,9 0,460±0,064 3,7±0,1
7 27,5(0) 30(-1,41)
9,2±0,4 0,218±0,006 4,2±0,7
8 27,5(0) 80(1,41)
4,4±0,4 0,134±0,016 5,0±0,7
9
a
27,5(0) 55(0)
12,5±0,9 0,210±0,008 7,2±0,2
a
Experimento 9: ponto central realizado em triplicata.
Nas Tabelas 4.6 e 4.8 pode-se observar que a atividade lipásica máxima
obtida nos dois tempos analisados ocorreu no ponto central (T=27,5°C/U=55%),
seguida da condição experimental 7 (T=27,5°C/U=30%). Nota-se ainda que houve
um pequeno aumento na atividade no tempo de 67 h. O mínimo obtido nos dois
tempos foi encontrado na condição experimental 3 (T=18,6°C/U=72%). Nota-se que
o microorganismo tende a produzir mais lipase em menores níveis de umidade,
conforme já observado nos resultados do primeiro planejamento.
Nestes experimentos não se notou uma relação clara do crescimento medido
indiretamente pelo teor de glicosamina com a atividade lipásica. Observou-se uma
correlação positiva entre as duas respostas, mas estatisticamente não significativa.
O crescimento máximo se deu nas condições do ponto central, assim como a
atividade lipásica. No entanto, o menor crescimento microbiano obtido foi utilizando a
menor temperatura (15°C) combinada com 55% de umidade, provavelmente devido
à baixa temperatura, entretanto esta não foi a condição onde se obteve menor
atividade lipásica.
Resultados e Discussões
53
Tabela 4.7: Demais respostas obtidas no segundo planejamento experimental (48h de
fermentação)
Ensaio
Umidade
Residual (%)
a
w
pH
1
33,31±0,12 0,951±0,002 6,72±0,04
2
26,86±1,33 0,921±0,004 6,48±0,01
3
71,09±0,95 0,994±0,001 6,57±0,01
4
67,89±0,61 0,995±0,001 6,80±0,03
5
52,23±0,95 0,994±0,001 6,76±0,04
6
32,60±0,52 0,949±0,004 7,67±0,16
7
32,58±0,45 0,952±0,001 6,64±0,05
8
79,70±0,33 0,999±0,001 6,52±0,06
9
a
53,04±0,60 0,989±0,001 6,60±0,04
a
Experimento 9: ponto central realizado em triplicata.
A atividade proteásica máxima para o tempo de 48 h ocorreu no experimento 6
(T=40°C/U=55%), seguido da condição 7 (T=27,5°C/U=30%). Para o tempo de 67 h,
obteve-se o máximo no ponto central, seguido pelos experimentos 6 e 7. Não se
observou também uma correlação significativa entre as atividades lipásica e
proteásica. Os valores de atividade proteásica neste segundo planejamento foram
visivelmente maiores que os obtidos anteriormente. É provável que a suplementação
tenha também inibido ou retardado a produção desta enzima. No entanto, os níveis
de protease obtidos ainda foram bem inferiores aos reportados na literatura para
outros microorganismos (Maia et al., 1999; Palma et al., 2000; Leal et al., 2003). O
comportamento do pH seguiu a tendência da atividade proteásica, devido à
liberação de aminoácidos e amônia ao meio.
Resultados e Discussões
54
Tabela 4.8: Matriz do planejamento experimental completo (valores reais e codificados) com
as respostas da atividade lipásica após 67 h de fermentação
Ensaio
Temperatura
(°C)
Umidade
Inicial
(%)
Atividade
Lipásica
(U/g)
Atividade
Proteásica
(U/g)
Conc.
Glicosamina
(mg/g)
1 18,6(-1) 37,3(-1)
3,0±0,4 0,142±0,001 3,7±0,7
2 36,4(1) 37,3(-1)
6,9±0,2 0,196±0,017 3,7±0,1
3 18,6(-1) 72,7(1)
1,4±0,1 0,138±0,002 4,6±0,2
4 36,4(1) 72,7(1)
5,7±0,3 0,194±0,068 11,0±0,3
5 15(-1,41) 55(0)
2,6±0,4 0,117±0,001 3,0±0,1
6 40(1,41) 55(0)
2,8±0,1 0,424±0,052 4,6±0,2
7 27,5(0) 30(-1,41)
10,4±1,4 0,374±0,017 4,8±0,1
8 27,5(0) 80(1,41)
5,5±0,9 0,159±0,007 8,2±1,0
9
a
27,5(0) 55(0)
15,6±1,5 0,446±0,037 10,3±0,2
a
Experimento 9: ponto central realizado em triplicata.
Tabela 4.9. Demais respostas obtidas no segundo planejamento experimental (67 h de
fermentação)
Experimento
Umidade
Residual (%)
a
w
pH
1
32,49±0,13 0,941±0,001 6,29±0,04
2
24,72±0,69 0,891±0,004 6,14±0,02
3
70,69±0,62 0,992±0,001 6,06±0,01
4
67,03±0,87 0,987±0,005 7,16±0,06
5
49,98±0,26 0,990±0,001 6,77±0,07
6
27,83±0,09 0,926±0,002 7,45±0,11
7
31,17±0,61 0,932±0,003 6,46±0,13
8
79,85±0,38 0,993±0,001 6,74±0,01
9
a
53,21±2,35 0,969±0,003 6,95±0,01
a
Experimento 9: ponto central realizado em triplicata.
Analogamente à análise do primeiro planejamento, realizou-se a avaliação
estatística dos resultados obtidos neste planejamento utilizando o pacote Statistica
®
.
Com a análise estatística do planejamento completo foi possível se obter um modelo
empírico para a atividade lipásica em função da temperatura e da umidade, para
cada tempo de fermentação analisado. Os modelos codificados otimizados (Eq. 4.1
Resultados e Discussões
55
e 4.2) para a atividade lipásica foram validados pelas análises de variância
(ANOVA), apresentadas nas Tabelas 4.10 e 4.11. Observa-se que os coeficientes de
correlação obtidos (0,97 e 0,94, respectivamente) e o teste F (7,7 vezes maior que o
F
tab
para as atividades em 48 h de fermentação e 6,8 vezes para 67 h) foram válidos
a 95% de confiança. Com os modelos validados foi possível construir as superfícies
de resposta que são apresentadas juntamente com as curvas de contorno na Figura
4.10.
22
085,3959,1279,5534,1248 UUTAL ⋅−⋅−⋅−=
(4.1)
onde,
AL= atividade lipásica em 48h de fermentação
T= temperatura
U= umidade
Tabela 4.10: Análise de variância para atividade lipásica no tempo de 48 h
Soma dos
quadrados
Graus de
liberdade
Soma dos
quadrados
média
F
calculado
Regressão 201,36 3 67,12 33,7
Resíduo 13,94 7 1,99
Falta de ajuste 12,43 5
Erro puro 1,51 2
Total 215,30 10
F
tab,3,7,95%
= 4,35
r = 0,97
22
105,4756,6634,1567 UTAL ⋅−⋅−=
(4.2)
onde,
AL= atividade lipásica em 67h de fermentação
Tabela 4.11: Análise de variância para atividade lipásica no tempo de 67 h
Soma dos
quadrados
Graus de
liberdade
Soma dos
quadrados
média
F
calculado
Regressão
283,63
2
141,82 30,49
Resíduo
37,20
8
4,65
Falta de ajuste
32,58
6
Erro puro
4,62
2
Total
320,83
10
F
tab,2,8,95%
= 4,46
r = 0,94
Resultados e Discussões
56
As superfícies de resposta mostram que em ambos os casos o máximo de
atividade lipásica se encontra em torno do ponto central o que determina a
otimização da produção da enzima nas faixas estudadas (T=27,5°C e U=55%), o
que pode ser melhor observado nas curvas de contorno (Fig. 4.10b). A atividade
máxima obtida pode alcançar cerca de 12,5 U/g de torta seca para 48 h de
fermentação e 15,6 U/g para 67 h de fermentação. Através desta análise fica
evidente que extremos de temperatura e umidade tendem a reduzir a produção de
lipase, uma vez que baixas temperaturas reduzem a atividade metabólica e altas
temperaturas podem levar à desativação enzimática. A umidade em níveis muito
baixos prejudica a transporte de nutrientes e toxinas através da membrana e pode
causar a perda das propriedades funcionais de enzimas da cadeia metabólica
celular (Gervais e Molin, 2003). O excesso de umidade reduz a porosidade do
substrato prejudicando a transferência de calor e de oxigênio (Pandey, 2003).
1.485
3.107
4.728
6.349
7.971
9.592
11.213
above
0.627
2.503
4.379
6.255
8.131
10.007
11.882
13.758
above
Temperatura (oC)
Umidade (%)
30
40
50
60
70
80
15 20 25 30 35 40
Temperatura (oC)
Umidade (%)
30
40
50
60
70
80
15 20 25 30 35 40
48 h 67 h
Figura 4.10: (a) Superfícies de resposta e (b) curvas de contorno para atividade lipásica
(a)
(b)
Resultados e Discussões
57
Os resultados de glicosamina também foram avaliados estatisticamente,
obtendo-se os modelos codificados em função da temperatura e umidade
apresentados nas equações 4.3 e 4.4. Estes foram validados pela análise de
variância, apresentadas nas Tabelas 4.12 e 4.13. Os elevados coeficientes de
correlação (0,96 e 0,98, respectivamente) e os valores de F calculado (6,9 e 4,5
vezes maior que o tabelado) validaram os modelos. Com os modelos codificados foi
possível se obter as superfícies de resposta e curvas de contorno, apresentadas na
Figura 4.11.
22
263,1998,1653,048 UTTG ⋅−⋅−⋅=
(4.3)
onde,
G= concentração de glicosamina em 48h de fermentação
T= temperatura
U= umidade
Tabela 4.12: Análise de variância para a concentração de glicosamina em 48 h
Soma dos
quadrados
Graus de
liberdade
Soma dos
quadrados
média
F
calculado
Regressão
28,607 3 9,54 30,22
Resíduo
2,209 7 0,315
Falta de ajuste
2,084 5
Erro puro
0,125 2
Total
30,816 10
F
tab3,7,95%
= 4,35
r = 0,96
UTUUTTG ⋅⋅+⋅−⋅+⋅−⋅= 6,1736,1618,1107,3085,167
22
(4.4)
onde,
G= concentração de glicosamina em 67h de fermentação
Tabela 4.13: Análise de variância para a concentração de glicosamina em 67 h
Soma dos
quadrados
Graus de
liberdade
Soma dos
quadrados
média
F
calculado
Regressão
98,82 5 19,763 23,0
Resíduo
4,30 5 0,860
Falta de ajuste
4,23 3 1,409
Erro puro
0,07 2 0,036
Total
103,12 10
F
tab,5,5,95%
= 5,05
r = 0,98
Resultados e Discussões
58
2.649
3.311
3.973
4.636
5.298
5.960
6.622
above
0.799
2.249
3.699
5.148
6.598
8.048
9.498
above
Temperatura (oC)
Umidade (%)
30
40
50
60
70
80
15 20 25 30 35 40
Temperatura (oC)
Umidade (%)
30
40
50
60
70
80
15 20 25 30 35 40
48 h 67 h
Figura 4.11: (a) Superfícies de resposta e (b) curvas de contorno para glicosamina
As curvas de contorno permitem observar que em ambos os casos o
crescimento máximo se encontra na região do ponto central (T=27,5°C e U=55%).
Nota-se que as condições de crescimento máximo não são exatamente as mesmas
das condições nas quais se obteve o máximo de atividade lipásica, mas concordam
com o comportamento associado observado pela determinação da correlação entre
as duas respostas. Estudos de FES com A. niger (Kamini, 1998) e P. restrictum
(Freire et al., 1997b) apresentam claramente esta associação na fermentação de
torta de gergelim e de babaçu. Comportamento similar também tem sido observado
em meio submerso (Miranda et al., 1999; Maia et al., 1999).
(a)
(b)
Resultados e Discussões
59
A análise estatística do crescimento mostra então que, assim como na
atividade lipásica, extremos de temperatura e umidade tendem a reduzir o
crescimento, pelas mesmas razões descritas anteriormente.
A análise estatística dos resultados de atividade proteásica permitiu somente a
obtenção dos efeitos de primeira e segunda ordem da umidade e temperatura sobre
esta resposta, uma vez que não foi possível se obter um modelo estatisticamente
significativo. Os efeitos foram expressos na forma de gráficos de Pareto
apresentados na Figura 4.12. É interessante observar que o comportamento em 67
h é distinto do comportamento em 48 h. Em ambos os casos, a temperatura
apresenta efeito (linear) positivo, enquanto a umidade apresenta efeito negativo,
embora, este não seja estatisticamente significativo para o tempo de 67 h.
Efeito absoluto
-2,51453
-6,86042
8,900303
-9,9894
20,08368
p=,05
TxU
U(L)
T(Q)
U(Q)
T(L)
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22
Efeito absoluto
,0290548
-2,95893
5,194718
-7,27168
-7,39395
p=,05
TxU
U(L)
T(L)
T(Q)
U(Q)
-1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
48h 67h
Figura 4.12: Efeitos das variáveis manipuladas sobre a atividade proteásica.
Como conclusão parcial dos experimentos e análise estatística do segundo
planejamento, chegou-se à condição ótima para a produção de lipase em escala
laboratorial por fermentação em estado sólido utilizando o fungo Penicillium
simplicissimum, dentro da faixa investigada.
4.4.1 Cinética de fermentação para as condições otimizadas
A melhor condição para a produção da lipase por fermentação em estado
sólido, determinada através da metodologia de análise de superfície de resposta, foi
Resultados e Discussões
60
a condição experimental do ponto central do segundo planejamento (T = 27,5 °C e
U = 55 %). Esta condição foi então realizada novamente para acompanhamento
cinético.
A Figura 4.13 apresenta a cinética de crescimento, produção de lipase e
protease para a condição otimizada. A atividade lipásica desta vez apresentou um
pico de atividade máxima de cerca de 30 U/g, em torno de 80 horas de fermentação.
Este valor é comparável aos obtidos por FES utilizando P. restrictum e torta de
babaçu (Gombert, 1999), mas bem inferior do que os obtidos por FES de torta de
gergelim e outros substratos utilizando A. niger (Kamini et al., 1998). Neste gráfico
pode-se também observar que ocorre um aumento da atividade de ambas as
enzimas ao longo da fermentação. Após 80 h de fermentação há uma queda na
atividade lipásica enquanto a proteásica permanece constante. Como já relatado
anteriormente, a queda da atividade lipásica ocorre provavelmente devido à
inativação pela ação da protease, ou ainda à desativação pelo aumento do pH do
meio pela ação da protease.
0
5
10
15
20
25
30
35
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180
Tempo (h)
Atividade Lipásica (U/g)
Conc. Glicosamina (mg/g)
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
Atividade proteásica (U/g)
At. Lipase
Glicosamina
At. Protease
Figura 4.13: Cinética de crescimento (glicosamina), produção de lipase e protease da
condição experimental ótima
Nestas curvas cinéticas pode-se notar com clareza a associação do
crescimento com a produção de lipase, conforme o observado por Kamini et al.
(1998), e ainda com a produção de protease. A determinação das correlações entre
estas variáveis de resposta, considerando-se apenas os valores até o ponto de
Resultados e Discussões
61
máxima atividade lipásica (r = 0,70 e r = 0,90, respectivamente), confirma o
observado visualmente.
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
4,0
4,5
5,0
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180
Tempo (h)
YP/X
Yp/x
Figura 4.14: Evolução do rendimento no decorrer da fermentação
0
20
40
60
80
100
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180
Tempo (h)
Umidade (%)
0.80
0.84
0.88
0.92
0.96
1.00
Atividade de água
Umidade
Atividade
de água
Figura 4.15: Evolução da umidade e atividade de água do meio como tempo de
fermentação
5
.
5
Dados de atividade de água disponíveis somente para as primeiras 100 h de fermentação.
Resultados e Discussões
62
A Figura 4.14 mostra a evolução do rendimento da produção de lipase no
decorrer da fermentação, onde se pode observar que a máxima produtividade foi
obtida em torno de 63 horas de fermentação.
A Figura 4.15 apresenta a evolução da umidade e da atividade de água ao
longo da fermentação. Nota-se que o meio manteve a umidade no nível
estabelecido, havendo somente uma pequena queda na atividade de água.
A evolução do pH durante a fermentação pode ser acompanhada através da
Figura 4.16. Observa-se que o pH apresenta o mesmo comportamento que a
atividade proteásica, embora o aumento do pH seja bem pequeno quando
comparado com outros trabalhos em FES, assim como o observado para a atividade
proteásica (Gombert et al., 1999, Palma et al., 2000; Kamini et al., 1998; Capra et al.,
2003; Dominguez et al., 2003), sugerindo que a proteólise neste caso é inferior ao
observado por outros autores.
6.0
6.4
6.8
7.2
7.6
8.0
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180
Tempo (h)
pH
Figura 4.16: Evolução do pH ao longo do tempo de fermentação
4.5 Biorreator com agitação intermitente
Nos experimentos com o biorreator, optou-se por manter a temperatura fixa em
27,5 °C, que foi a temperatura ótima para a produção de lipases encontrada através
do segundo planejamento. As variáveis estudadas neste planejamento foram o teor
Resultados e Discussões
63
de umidade da torta e a vazão de ar injetada no leito. A matriz do planejamento de
experimentos com os valores reais e codificados utilizados nesta etapa, juntamente
com os resultados de atividade lipásica é apresentada na Tabela 4.14. As respostas
de atividade proteásica, glicosamina, umidade e pH estão apresentadas nas Tabelas
4.15 e 4.16.
Tabela 4.14: Matriz do planejamento experimental completo (valores reais e codificados)
com as respostas da atividade lipásica após 48 e 72 h de fermentação para
experimentos em biorreator com agitação intermitente
Ensaio Umidade (%)
Vazão
(L/min)
Atividade
lipásica
(48h)
Atividade
lipásica
(72h)
1 40(-1) 1(-1) 18,2±0,3 32,8±1,1
2 60(1) 1(-1) 5,4±0,9 7,7±0,2
3 40(-1) 8(1) 9,9±0,3 12,6±0,3
4 60(1) 8(1) 10,0±0,4 22,7±0,7
5
*
50(0) 4,5(0) 14,8±0,3 21,3±1,1
*Ponto central em duplicata.
Tabela 4.15: Demais respostas obtidas no terceiro planejamento experimental após 48 e 72
h de fermentação, para experimentos em biorreator com agitação intermitente
Ensaio At. proteásica (U/g) Glicosamina (U/g)
48 h 72 h 48 h 72 h
1 0.521±0,003 0.494±0,001 1,7±0,2 1,6±0,2
2 0.538±0,006 0.545±0,007 4,5±0,1 3,4±0,1
3 0.202±0,002 0.189±0,013 2,7±0,4 2,2±0,6
4 0.589±0,003 0.558±0,001 2,7±0,4 3,1±0,2
5
*
0,419±0,003 0,339±0,004 3,1±0,2 3,1±0,1
*Ponto central em duplicata.
Tabela 4.16: Demais respostas obtidas no terceiro planejamento experimental após 48 e 72
h de fermentação, para experimentos em biorreator com agitação intermitente
Umidade residual (%) pH
Ensaio
48 h 72 h 48 h 72 h
1 31.48±0,21 25.58±0,27 7.43 7.12
2 54.04±0,89 33.49±1,53 8.34 8.59
3 10.00±0,59 10.65±0,14 6.55 6.45
4 23.68±1,00 12.10±0,24 7.87 7.62
5
*
24,40±0,30 12,43±0,08 6,68±0,03 6,57±0,07
*Ponto central em duplicata.
Uma adversidade observada nos experimentos com o biorreator foi a formação
de gradientes de temperatura no leito no decorrer do processo. Após 48 h de
fermentação, o fundo do leito se apresentava mais quente do que a parte central e o
Resultados e Discussões
64
topo. Este comportamento também tem sido descrito na literatura. Este pode ser
atribuído a uma combinação de efeitos. A maior parte do calor do leito é eliminada
por convecção e por evaporação da água. Devido à maior intensidade de aeração
no fundo do leito, há a maior geração de calor metabólico, que se acumula no fundo
do reator, devido à baixa condutividade térmica do leito. Com a secagem do leito ao
longo da fermentação, a transferência de calor é ainda mais prejudicada, havendo
então a formação de gradientes de temperatura (Sangsurasak e Mitchell,1998;
Palma et al., 2002; Durand, 2003).
Outro problema encontrado foi a redução do volume do leito devido ao
crescimento do micélio e perda de umidade, o que pode levar à redução da
transferência de oxigênio no processo, bem como a criação de caminhos
preferenciais no leito (Durand, 2003). Para minimizar este problema o leito foi
revolvido diariamente, antes da retirada de amostras para análise.
A cinética de produção de lipase para todos os ensaios pode ser observada na
Figura 4.17. O pico de atividade lipásica (33 U/g) foi obtido em 72 horas de
fermentação, utilizando 40% de umidade inicial e uma vazão de ar de 1 L/min. Este
resultado reproduz o resultado encontrado no ponto ótimo na fermentação realizada
em béqueres, sendo que o máximo no biorreator foi obtido em um menor tempo,
representando uma maior produtividade (0,458 U/g.h contra 0,375 U/g.h).
0
5
10
15
20
25
30
35
0 20 40 60 80 100 120 140 160
Tempo (h)
Atividade Lipásica (U/g)
U 40% V 1L/min.
U 60% V 1L/min.
U 40% V 8L/min.
U 60% V 8L/min.
U 50% V 4,5L/min.
Figura 4.17: Cinéticas de produção de lipase em biorreator de agitação intermitente.
Resultados e Discussões
65
Uma vazão de ar menor, associada a um baixo teor de umidade inicial,
favoreceu a produção de lipase. A baixa vazão de ar utilizada no experimento 1,
pode ter retardado o processo de perda de umidade, propiciando melhores
condições para a produção de lipase. Observa-se que de fato esta condição foi a
que propiciou a menor perda de umidade durante a fermentação, apesar de ser a
condição com o menor teor de umidade inicial. O ensaio 2, realizado com mesma
vazão de ar, mas umidade inicial maior, apresentou maior perda de umidade, maior
crescimento, maior produção de protease e, conseqüentemente, menor produção de
lipase (Tabelas 4.14, 4.15 e 4.16). A baixa produção de lipase neste caso, pode
estar relacionada tanto ao efeito da redução da transferência de massa e calor em
umidades maiores, ou ainda à queda brusca da umidade após 72 horas de
fermentação. Com a queda da umidade do sistema, a produção de lipase é
inviabilizada devido à lise celular ou à quantidade de água insuficiente para a
manutenção da atividade celular. A quebra das hifas do microorganismo durante a
agitação do meio pode ainda ter modificado seu comportamento fisiológico.
0
5
10
15
20
25
0 20 40 60 80 100 120 140 160
Tempo (h)
YP/X
U 40% V 1L/min.
U 60% V 1L/min.
U 40% V 8L/min.
U 60% V 8L/min.
U 50% V 4,5L/min.
Figura 4.18: Rendimento em biorreator de agitação intermitente.
A Figura 4.18 mostra a evolução do rendimento em produção de lipase para os
experimentos utilizando o biorreator com agitação intermitente. Pode-se observar
que o rendimento máximo foi obtido na condição a 40 % de umidade e uma vazão
de ar de 1 L/minuto em 72 horas de fermentação. Após este tempo de fermentação
Resultados e Discussões
66
nota-se uma queda acentuada na atividade lipásica em todos os ensaios, sugerindo
que após este período de fermentação ocorre a secagem do leito prejudicando a
produção de lipase em todas as condições estudadas.
Ao contrário dos experimentos anteriores , nos experimentos com biorreator não
foi possível identificar uma associação da produção de lipase com o crescimento
microbiano, conforme pode ser observado nas Tabelas 4.14 a 4.15. Na verdade,
nota-se uma tendência inversa, ou seja, uma condição que resulta em baixa
concentração de glicosamina favoreceu um alto rendimento em lipase e vice-versa,
sugerindo que a produção de lipase neste caso se dá em detrimento do crescimento.
Estudos em fermentação submersa mostram que a maior disponibilidade de oxigênio
leva a maior crescimento e assim a maior concentração de protease no meio, devido
à lise celular (Freire et al., 1997b). No entanto este comportamento ainda deve ser
melhor investigado.
A condição experimental que forneceu menor atividade proteásica não foi a que
se obteve maior atividade lipásica, como pode ser observado através das Tabelas
4.14 a 4.15 e Figuras 4.17 e 4.19. Provavelmente nesta condição (U=40% V=8L/min)
houve rápida secagem do leito, como pode ser observado na Figura 4.20, o que
pode ter prejudicado a produção de ambas as enzimas. Deve-se ainda considerar
que com a queda da umidade observou-se um aumento no pH o que pode ter
prejudicado a produção da lipase.
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1
0 20 40 60 80 100 120 140 160
Tempo (h)
Atividade Proteásica (U/g)
U 40% V 1L/min.
U 60% V 1L/min.
U 40% V 8L/min.
U 60% V 8L/min.
U 50% V 4,5L/min.
Figura 4.19: Cinéticas de produção de protease em biorreator de agitação intermitente.
Resultados e Discussões
67
0
20
40
60
80
100
0 20 40 60 80 100 120 140 160
Tempo (h)
Umidade %
U 40% V 1L/min.
U 60% V 1L/min.
U 40% V 8L/min.
U 60% V 8L/min.
U 50% V 4,5L/min.
Figura 4.20: Evolução da umidade da torta ao longo do tempo para os experimentos em
biorreator
Observa-se também através da Tabela 4.15 e Figura 4.21 que o crescimento
do microorganismo no biorreator foi, em média, menor que o obtido nos demais
planejamentos e na condição otimizada (Tabelas 4.6 e 4.8).
A atividade proteásica apresentou uma correlação positiva com o pH, em todos
os experimentos, como já havia sido observado anteriormente neste trabalho e por
outros autores (Gombert et al., 1999; Maia et al., 1999). Contudo deve-se ressaltar
que nem sempre o aumento do pH está relacionado à proteólise. Nos ensaios com o
biorreator observa-se uma relação maior entre a umidade do sistema e o pH, sendo
que o aumento do pH do meio (Figura 4.22) ocorre após a queda da umidade.
Nestes experimentos, ao contrário do que ocorreu nos outros planejamentos, um pH
acima de 8,0 foi obtido nas condições (ensaio 2) de alta umidade e baixa vazão de
ar, onde também se obteve máxima atividade proteásica. Na maior parte dos
experimentos, com exceção do ponto central, obteve-se uma elevada correlação
positiva entre atividade proteásica e concentração de glicosamina, mostrando que a
produção desta enzima está associada ao crescimento.
Resultados e Discussões
68
0
1
2
3
4
5
6
7
8
0 20 40 60 80 100 120 140 160
Tempo (h)
Conc. Glicosamina (mg/g)
U 40% V 1L/min.
U 60% V 1L/min.
U 40% V 8L/min.
U 60% V 8L/min.
U 50% V 4,5L/min.
Figura 4.21: Cinética de crescimento para experimentos em biorreator de leito fixo
6.0
6.5
7.0
7.5
8.0
8.5
9.0
0 20 40 60 80 100 120 140 160
Tempo (h)
pH
U 40% V 1L/min.
U 60% V 1L/min.
U 40% V 8L/min.
U 60% V 8L/min.
U 50% V 4,5L/min.
Figura 4.22: Evolução do pH ao longo do tempo para os experimentos em biorreator
A análise estatística dos resultados deste planejamento foi realizada da mesma
forma que as anteriores, para os dois tempos de fermentação selecionados (48 e
72h). No entanto, não foi possível se validar modelos de primeira ordem para
nenhuma das variáveis de resposta em ambos os casos. Portanto, são apresentadas
na Figura 4.23 os efeitos dos parâmetros e suas interações sobre as respostas
apenas para o tempo de 48 h, uma vez que os mesmos comportamentos foram
obtidos para os dois tempos de fermentação. Para a otimização das condições
experimentais da FES em biorreator, deveria se montar um novo planejamento
experimental, deslocando-se as faixas de estudo em função dos resultados dos
Resultados e Discussões
69
efeitos de primeira ordem. Deve-se ainda acrescentar os pontos axiais para
avaliação dos efeitos de segunda ordem, no tratamento estatístico dos resultados foi
possível verificar que os efeitos de curvatura são relevantes neste caso.
A análise dos gráficos de Pareto mostra que ambas a umidade e vazão de ar
afetam significativamente (95%) a atividade lipásica e proteásica, além da umidade e
pH. O crescimento microbiano não foi afetado significativamente por nenhuma das
duas variáveis manipuladas.
A vazão de ar isoladamente não apresentou efeito significativo sobre a
atividade lipásica, enquanto a interação entre a vazão de ar e umidade apresentou
forte efeito positivo. A umidade isoladamente exerce um forte efeito negativo na
produção de lipase. Estes resultados podem ser relacionados com a rápida redução
da umidade em maiores vazões de ar, conforme foi observado na Figura 4.20, que
levaria a níveis de umidade abaixo do necessário para se manter as funções
metabólicas do microorganismo. Teores de umidade mais elevados mostram aqui,
novamente, que são prejudiciais à produção de lipase, possivelmente devido à
diminuição da porosidade do meio e da eficiência de transferência de massa e calor.
Este efeito pode ser conseqüência do aumento da atividade proteásica, uma vez
que, ao contrário do que ocorre com a atividade lipásica, observa-se que a umidade
apresenta um efeito fortemente positivo sobre a atividade proteásica. A vazão de ar,
por sua vez, tem efeito negativo significativo sobre a produção de protease,
provavelmente devido à secagem do leito. Este comportamento se repete quando
se analisa o pH final do meio, devido à alta correlação entre estas duas variáveis,
como já comentado anteriormente. Através dos resultados é possível observar que a
vazão de ar reduz a umidade do leito prejudicando a produção da lipase.
Resultados e Discussões
70
Efeito absoluto
-6,01041
-20,474
20,79537
p=,05
Q
U
QxU
4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24
Efeito absoluto
-37,9716
52,25519
57,06352
p=,05
Q
QxU
U
5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
(a) (b)
Efeito absoluto
-1,65059
-5,56998
5,582103
p=,05
Q
QxU
U
0 2 4 6 8 10 12 14
Efeito absoluto
7,247845
-23,8649
39,4212
p=,05
QxU
Q
U
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45
(c) (d)
Figura 4.23: Efeitos das variáveis manipuladas sobre (t=48h): (a) atividade lipásica; (b)
atividade proteásica; (c) crescimento microbiano (glicosamina); (d) pH
Através da análise destes resultados, observou-se que os experimentos em
biorreatores conduzidos em níveis de umidade maior dificultam a síntese da lipase.
Desta forma, a associação entre um teor de umidade baixo e uma vazão de ar baixa,
direcionou o metabolismo do fungo para a produção da lipase, sendo que o oposto
ocorreu quando se utilizou uma umidade elevada e uma vazão de ar elevada.
71
CONCLUSÕES E SUGESTÕES
Conclusões e Sugestões
72
5 CONCLUSÕES E SUGESTÕES
5.1 Conclusões
A utilização de fermentação em estado sólido na produção de lipase utilizando
como substrato a torta de soja apresentou resultados satisfatórios. O fungo
Penicillium simplicissimum apresentou um bom desempenho na produção da
enzima, permitindo se obter altos valores de atividade lipásica (30 a 33 U/g) nas
condições operacionais otimizadas (T=27,5°C, U=55%) e no biorreator. Além disso
obteve-se baixa atividade proteásica, quando comparado a outros microorganismos
e meios reportados na literatura, o que torna vantajoso a utilização deste sistema
para a produção de lipases.
A torta de soja demonstrou ter um grande potencial nutricional, possibilitando o
bom desenvolvimento do microorganismo tanto em termos de crescimento quanto
em produção de lipase, uma vez que os resultados obtidos neste trabalho mostraram
não haver a necessidade de utilização de fontes suplementares de carbono e
nitrogênio, o que pode levar a uma considerável economia com matérias-primas no
processo industrial.
5.2 Sugestões
A partir dos resultados obtidos neste trabalho, observa-se que ainda existem
muitos pontos a serem explorados a respeito deste sistema de fermentação, como:
• A continuidade dos experimentos com o biorreator de agitação
intermitente, buscando otimizar o processo para a produção de lipase,
bem como procurar alternativas capazes minimizar os problemas de
transferência de calor e massa no interior do biorreator;
• A utilização das técnicas de dosagem do crescimento microbiano, com
utilização de métodos respirométricos, para uma avaliação mais precisa
Conclusões e Sugestões
73
do crescimento e verificação da associação da produção da enzima com
o crescimento microbiano;
• O desenvolvimento de técnicas de dosagem de substratos
metabolizáveis pelo microorganismo, visando relacionar o consumo de
substrato com a produção da lipase;
• O desenvolvimento de modelos matemáticos semi-empíricos e
estimação de parâmetros utilizando os dados de consumo de substrato,
crescimento e produção de lipase;
• Caracterização e purificação da(s) lipase(s) produzida(s) pelo fungo nas
condições operacionais investigadas neste trabalho;
• O prosseguimento dos estudos utilizando a torta de soja como substrato,
para a produção de lipase e outras enzimas utilizando outros
microorganismos;
• A realização de estudos com outros tipos e configurações de biorreator
(p.ex.: tambor rotativo) utilizando torta de soja como substrato e P.
simplicissimum ou outros microrganismos para a produção de lipases.
74
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Anexo I
87
7 ANEXO I
Procedimentos para o preparo de algumas soluções
1. Hidrolisado de levedura
Dissolver 120 g de fermento biológico em 171 mL de H
2
O (70 % p/v), gotejar
H
2
SO
4
até atingir pH 2,0. Incubar a mistura por 2 horas entre 70 a 80 °C. Resfriar a
mistura e centrifugar por 10 minutos a 3000 rpm. O sobrenadante deve ser
desprezado.
2. Solução de azocaseína 0,5%
Pesar 1 g de azocaseína, adicionar 20 mL de água destilada, acrescentar
solução de hidróxido de sódio 40% até chegar a pH 12,0. Adicionar ácido acético
até chegar ao pH 5,0, completar o volume para 200 mL com tampão acetato de
sódio 50 mM pH 5,0.
3. Solução de acetil acetona em Na
2
CO
3
0,5 N
Misturar 1 mL de acetil acetona em 50 mL de solução de Na
2
CO
3
0,5 N.
Obs: Esta solução não pode ser estocada, deve ser preparada na hora do ensaio.
Anexo I
88
4. Reagente de Erlich
Dissolver 2,67 g de DAB (p-dimetilaminobenzaldeído) em um volume pequeno
de etanol/ácido clorídrico 1:1. Após a dissolução, completar o volume para 100 mL
com água destilada.
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