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DENIS FABRÍCIO MARCHI
AVALIAÇÃO DA SENSIBILIDADE DE FRANGOS AO
HALOTANO E AO ESTRESSE TÉRMICO E SUA RELAÇÃO
COM A QUALIDADE DA CARNE
Londrina
2008
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16
DENIS FABRÍCIO MARCHI
AVALIAÇÃO DA SENSIBILIDADE DE FRANGOS AO
HALOTANO E AO ESTRESSE TÉRMICO E SUA RELAÇÃO
COM A QUALIDADE DA CARNE
Dissertação apresentada ao Programa de
Mestrado e Doutorado em Ciência de
Alimentos da Universidade Estadual de
Londrina como requisito parcial para
obtenção do título de Mestre em Ciência de
Alimentos.
Orientador: Massami Shimokomaki, PhD
Co-orientadora: Profa. Dra. Adriana
Lourenço Soares
Londrina
2008
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DENIS FABRÍCIO MARCHI
AVALIAÇÃO DA SENSIBILIDADE DE FRANGOS
AO HALOTANO E AO ESTRESSE TÉRMICO E SUA RELAÇÃO COM
A QUALIDADE DA CARNE.
COMISSÃO EXAMINADORA
___________________________________
Prof. Dr. Massami Shimokomaki
Universidade Estadual de Londrina
___________________________________
Profa. Dra. Alice Eiko Murakami
Universidade Estadual de Maringá
___________________________________
Profa. Dra. Sandra Helena Prudêncio
Universidade Estadual de Londrina
Londrina, 16 de maio de 2008.
18
DEDICATÓRIA
Aos meus pais, Toninho e Fátima,
Elementos essenciais na minha vida.
Meus exemplos de vida e amor.
Ao meu irmão Kadu,
Amigo e parceiro em todos os momentos.
19
AGRADECIMENTOS
Ao meu orientador Prof. Dr. Massami Shimokomaki, o qual considero como um Pai
Científico. Muito obrigado pelos conselhos, contribuições para o meu crescimento
profissional, amizade e principalmente pela sábia orientação e confiança atribuída no
desenvolvimento deste trabalho.
À Profa. Dra. Adriana Lourenço Soares, pela amizade, pelos conselhos e dedicada
orientação, fundamentais para o desenvolvimento deste trabalho, o meu muito
obrigado.
Ao Prof. Dr. Alexandre Oba, pelos conselhos, amizade, constantes auxílios práticos
e teóricos, indispensáveis no decorrer do mestrado.
Ao CNPq (Conselho Nacional de Pesquisa), pela concessão da bolsa e auxílio
financeiro deste trabalho.
À Fundação Araucária pelo auxílio financeiro destinado à esta pesquisa.
À Profa. Dra. Elza Iouko Ida, pela amizade e conselhos dispensados para o meu
crescimento profissional.
Aos Prof. Dr. Marco Antônio Trindade, Prof. Dr. José Bento Ferraz e ao Tércio
Michelan Filho, que nos receberam em seu grupo de pesquisas na Universidade de
São Paulo – FZEA, abrindo as portas para uma das etapas deste experimento.
Ao Dr. João Cláudio, pelo apoio, sugestões e ajuda dispensada no decorrer deste
trabalho.
À empresa Big Frango, pelo espaço e amostras cedidos.
20
À Profa. Dra. Alice Murakami da Universidade Estadual de Maringá e ao Prof. Dr.
Francisco Javier Hernández Blazquez da Universidade de São Paulo pela
colaboração na obtenção de reagentes.
Ao Departamento de Ciência e Tecnologia de Alimentos pelas condições oferecidas
para a realização deste trabalho.
Aos docentes do Programa de Mestrado e Doutorado em Ciência de Alimentos desta
instituição pelos ensinamentos e atenção dispensada.
Aos alunos de Mestrado e Doutorado do Grupo de Carnes desta instituição: Íris,
Cassiana, Allan, Cristina, Marta, Gislaine, Luiz Gustavo e Adriana Droval pela
valiosa e indispensável ajuda nos experimentos realizados.
Aos estagiários do Grupo de Carnes desta instituição: Gleice, Bruno, Alberto,
Thaísa, Elisa, Lucas, Felipe, Janaina e Pedro e também ao Apoio Técnico Valdecir
pelos auxílios destinados aos experimentos deste trabalho.
Aos Funcionários do Departamento de Ciência e Tecnologia de Alimentos desta
instituição pela ajuda e atenção dispensada.
Aos alunos do curso de Zootecnia: Rimena, Gustavo, Vitor e Maurício, pelo auxílio
experimental dispensado no decorrer deste mestrado.
Aos meus amigos: Melícia, Melissa, Fernando, Valéria, Cleusa, Luiz Rodrigo,
Luciana Bernd, e Fernanda Campanha, pelo incentivo, amizade e por estarem
sempre presentes no decorrer destes 2 anos de trabalho, muito obrigado pela
amizade e consideração.
Aos colegas e companheiros da minha turma de mestrado, em especial: Ariane e
Ana Augusta pelos momentos compartilhados e pela amizade.
21
Aos colegas do Programa de Mestrado e Doutorado em Ciência de Alimentos, em
especial: Carolline Caliari, Norma Miranda, Elvis, Alexandre e Rafael, pela
convivência e parceria.
Aos colegas de graduação Eduardo Niehues, Michele Rosset e Tiago Jorge, pela
convivência contínua e apoio.
A Deus, pela vida e por todos os momentos dela, inclusive os difíceis.
22
Existe somente uma idade para a gente ser feliz, somente uma época na vida de cada pessoa
em que é possível sonhar e fazer planos e ter energia bastante para realizá-los a despeito de
todas as dificuldades e obstáculos. Tempo de entusiasmo e coragem em que todo desafio é
mais um convite à luta que a gente enfrenta com toda disposição de tentar algo NOVO, de
NOVO e de NOVO, e quantas vezes for preciso. Essa idade tão fugaz na vida da gente
chama-se PRESENTE e tem a duração do instante que passa.
(MÁRIO QUINTANA)
23
MARCHI, Denis Fabrício. Avaliação da sensibilidade de frangos ao halotano e ao
estresse térmico e sua relação com a qualidade da carne. 2008. 95f. Dissertação
(Mestrado em Ciência de Alimentos) – Universidade Estadual de Londrina. 2008.
RESUMO
Três experimentos foram conduzidos com o objetivo de avaliar a sensibilidade de
frangos ao halotano e ao estresse térmico e sua relação com o desenvolvimento de
filés PSE. Uma câmara foi elaborada exclusivamente para este trabalho, a qual foi
interligada a um aparelho de anestesia veterinária, em que 3 aves por vez foram
submetidas ao teste do halotano. No primeiro experimento, frangos de linhagem
comercial (n=352) foram submetidos ao teste do halotano e classificados como
sensíveis, indefinidos e não-sensíveis ao halotano baseados na rigidez dos seus
membros inferiores. Após 3 e 48h da aplicação do teste, amostras de sangue foram
coletadas de 12 aves de cada grupo e destinadas para a avaliação de parâmetros
hematológicos como concentração de glicose e atividade enzimática de creatina
quinase (CK) e lactato desidrogenase (LDH) Após 48h da aplicação do teste do
halotano, 25 aves de cada grupo foram abatidas e o músculo Pectoralis major foi
coletado 24h post mortem e o pH, cor (L*, a*, b*) e capacidade de retenção de água
(CRA) foram determinadas para a caracterização de carnes PSE. As análises do
valor de R foram realizadas em filés coletados aproximadamente 30 min post
mortem e armazenados em nitrogênio líquido (-196ºC). No segundo experimento,
298 aves bisavozeiras da linhagem fêmea foram também submetidas ao teste do
halotano. As amostras de sangue foram coletadas após 3h da aplicação do teste do
halotano para avaliação dos parâmetros hematológicos descritos anteriormente. Em
seguida, 2, 11 e 15 aves dos grupos Sensível, Indefinido e Não-sensível,
respectivamente, foram abatidas e os valores de pH
30min
e pH
24h
, cor e CRA foram
determinadas e os filés foram classificados quanto ao desenvolvimento de PSE. No
terceiro experimento, 24 frangos de linhagem comercial foram divididos em 4
tratamentos: HHH (frangos submetidos ao teste do halotano e abatidos 1h após o
teste), HET (frangos submetidos ao teste do halotano e a 35°C/1h após 48h a
realização do teste do halotano com posterior abate), EET (frangos submetidos ao
estresse térmico e abatidos imediatamente após este tratamento) e finalmente o
Controle (CCC) em que os frangos não foram submetidos ao teste do halotano e
nem ao estresse térmico. No primeiro experimento, 9,1% frangos foram sensíveis,
18,4% indefinidos e 72,5% não-sensíveis ao halotano. Contudo, no grupo Sensível,
40% foram classificados como carnes PSE, seguidos por também 40% obtidos no
grupo Indefinido e 28% no grupo Não-sensível. A concentração de glicose foi
significativamente menor (p≤0.05) em 48h após o teste do halotano em comparação
com o tempo de 3h em todos os grupos. A atividade de LDH no grupo Não-sensível
foi aproximadamente 40% menor em relação ao grupo Sensível em ambos os
tempos pós-teste do halotano. Estes resultados explicam a maior ocorrência de
carnes PSE no grupo Sensível devido à atividade da LDH na transformação de
piruvato a lactato durante a instalação do rigor mortis. No segundo experimento,
apenas 0,67% (n=2) das aves foram sensíveis, 3,69% (n=11) foram indefinidas e
95,6% (n=285) foram não-sensíveis ao halotano. Apenas 3 aves do grupo Indefinido
e 3 do grupo Não-sensível originaram filés PSE. A atividade da LDH foi 3 vezes
significativamente superior para os grupos sensível e indefinido em relação ao grupo
24
Não-sensível. No terceiro experimento, os tratamentos HHH, HET e EET
apresentaram 4 aves cada com carnes PSE e 2 aves do tratamento CCC originaram
filés PSE. O valor de pH
24h
foi maior (p≤0.05) para os filés do tratamento CCC em
comparação aos demais tratamentos e o valor de R foi maior para as aves dos
tratamentos HET e EET em comparação ao CCC (p≤0.05) sugerindo que o rigor
mortis foi instalado mais rapidamente nas amostras derivadas das aves submetidas
ao estresse térmico. A concentração de glicose e as atividades de CK e LDH não
mostraram diferenças significativas entre os tratamentos. Finalmente nossos
resultados demonstraram que os frangos sensíveis ao halotano corroboram com o
seu papel preditor de aves a originar carnes PSE como observado previamente em
suínos e perus. Além disso, o halotano mostrou ser um agente estressor
desencadeando alterações nos parâmetros hematológicos e no músculo das aves,
semelhantes às desencadeadas pelo estresse térmico pré-abate.
Palavras-chave: Teste do Halotano, Estresse Térmico, Carnes PSE.
25
MARCHI, Denis Fabrício. Evaluation of the sensibility of broiler chicken to
halothane and heat stress and relationship to meat quality. 2008. 95f.
Dissertation (Master’s Degree Dissertation) – State University of Londrina. 2008.
ABSTRACT
Three experiments were conducted in order to evaluate broiler sensibility towards
both halothane and thermal stress and its relationship to PSE fillet meat
development. An original camera was designed equipped with an upper outside
exhauster and three birds were tested per experiment and linked to the veterinarian
anesthetic equipment. In the first experiment, commercial lineage broilers (n=352)
were submitted to halothane test and classified as halothane sensitive, insensitive
and intermediate based on their response as leg rigidity. After 3 and 48 h of test
application blood samples were collected from 12 birds of each group and
quantitative analysis were carried out for hematological parameters evaluation as for
the determination of glucose concentration and enzyme activity of creatine kinase
(CK) and dehidrogenase lactate (LDH). Furthermore after 48h of halothane test 25
birds were slaughtered and Pectoralis major m. was collected after 24h post mortem
and pH value, color (L*, a*, b*) and water holding capacity (WHC) were determined in
order to characterize PSE meat. R value analysis was carried out in fillet samples
collected after approximately 30 min post mortem and stored in liquid nitrogen (-
196C). In the second experiment, 298 grand grandparents of female birds lineage
were also submitted to halothane test. Blood samples were collected after 3h of
halothane test in order to obtain the hematological parameters as described
previously. Thus 2, 11, and 15 birds from sensitive, intermediate and insensitive,
respectively, were slaughtered and values of pH
30min
and pH
24h
, color and WHC were
determined and fillet samples were characterized for PSE. In the third experiment, 24
birds from commercial lineage were left for 4 treatments as follows: HHH treatment
submitted to halothane test and slaughtered after 1h; HET treatment submitted to
halothane test and thermal stress at 35C for 1h after 48h after halothane test and
slaughtered immediately after this treatment; EET treatment submitted to thermal
stress and slaughtered immediately; and finally CCC treatment control submitted
neither to halothane test nor to thermal stress. In the first experiment, 9.1% were
sensitive, 18.4% intermediate and 72.5% insensitive. However, in the sensitive group
40.0% were classified as PSE meat and the same 40.0% were obtained in the
intermediate group and 28.0% in the insensitive group. The glucose concentration
was significantly lower (p≤0.05) at 48h after halothane treatment in comparison to 3h
in all groups and LDH activity in insensitive was app. 40.0% lower in relation to
sensitive group at both post halothane testing times. These results explained the
higher occurrence of PSE meat in sensitive group because of LDH activity on the
transformation of piruvate to lactate during the installation of muscle rigor mortis. In
the second experiment, only 0.67% (n=2) of birds were sensitive, 3.69% (n=11) were
intermediate and 95.6% (n=285) were insensitive. Only three birds from intermediate
group and three birds from insensitive group originated PSE fillet meat. LDH activity
was 3 times significantly higher for both sensitive and intermediate groups in relation
to insensitive group. In the experiment 3, HHH, HET, EET treatments presented 4
26
birds each which originated PSE meat and two birds from CCC oddly originated PSE
meat. The pH
24h
value was higher (p≤0.05) in the breast fillet meat from CCC
treatment in comparison to other treatments and R values on the other hand was
higher in samples from HET and EET in comparison to CCC (p≤0.05) suggesting that
rigor mortis was more rapidly installed in samples derived from thermally stress
muscles. Glucose concentration and CK and LDH enzymic activities didnot show
significant difference among those treatments. Finally our results, demonstrated that
broiler chickens were sensitive to halothane corroborating its role as predictor to
potentially of determining those birds to originate PSE breast fillet meat as observed
by other authors previously for pork and turkeys.
Key-words: Halothane Test, Heat Stress, PSE Meat.
27
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO...................................................................................................18
2 OBJETIVOS.......................................................................................................20
2.1 OBJETIVO GERAL.........................................................................................20
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ..........................................................................20
3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA..............................................................................21
3.1 QUALIDADE DA CARNE ...............................................................................21
3.2 ESTRESSE ANIMAL ......................................................................................22
3.3 PSS E PSE EM SUÍNOS................................................................................24
3.4 ALTERAÇÕES BIOQUÍMICAS E FISIOLÓGICAS RELACIONADAS COM
PSE .........................................................................................................................29
3.5 PSE EM AVES ...............................................................................................35
3.6 TESTE DO HALOTANO.................................................................................37
4 MATERIAIS E MÉTODOS.................................................................................41
4.1 EXPERIMENTO 1: Teste do halotano em linhagem comercial de frangos. ...41
4.1.1 Animais .......................................................................................................41
4.1.2 Teste do Halotano.......................................................................................41
4.1.3 Coleta de Sangue .......................................................................................43
4.1.3.1 Obtenção do Plasma Sanguíneo............................................................44
4.1.3.2 Obtenção do Soro Sanguíneo ................................................................44
4.1.4 Análise dos Parâmetros Hematológicos dos Animais.................................45
4.1.4.1 Medida de Glicose..................................................................................45
4.1.4.2 Medida da Atividade de Lactato Desidrogenase (LDH)..........................45
4.1.4.3 Medida da Atividade de Creatina Quinase (CK) .....................................45
4.1.5 Abate...........................................................................................................46
4.1.6 Análises no Músculo Pectoralis major.........................................................46
4.1.6.1 Medida de pH final..................................................................................46
4.1.6.2 Medida da Capacidade de Retenção de Água (CRA) ............................47
4.1.6.3 Medida do valor de R .............................................................................48
4.1.7 Classificação das Amostras ........................................................................48
4.1.8 Análise Estatística.......................................................................................48
4.2 EXPERIMENTO 2: Teste do halotano aves bisavozeiras de linha fêmea do
frango comercial........................................................................................................50
4.2.1 Animais .......................................................................................................50
28
4.2.2 Teste do Halotano.......................................................................................50
4.2.3 Coleta de Sangue .......................................................................................51
4.2.4 Análise dos Parâmetros Hematológicos dos Animais.................................51
4.2.5 Abate...........................................................................................................51
4.2.6 Análises no Músculo Pectoralis Major.........................................................52
4.2.7 Classificação das Amostras ........................................................................52
4.2.8 Análise Estatística.......................................................................................52
4.3 EXPERIMENTO 3: Efeito do halotano e do estresse térmico como agentes
estressores nas alterações bioquímicas e na qualidade da carne de frango. ...........53
4.3.1 Animais .......................................................................................................53
4.3.2 Tratamentos................................................................................................53
4.3.3 Teste do Halotano.......................................................................................54
4.3.4 Estresse térmico .........................................................................................54
4.3.5 Coleta de Sangue .......................................................................................55
4.3.6 Análise dos Parâmetros Hematológicos dos Animais.................................55
4.3.7 Abate...........................................................................................................55
4.3.8 Análises no Músculo Pectoralis major.........................................................56
4.3.9 Classificação das Amostras ........................................................................56
4.3.10 Análise Estatística.......................................................................................56
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO.........................................................................57
5.1 EXPERIMENTO 1: Teste do halotano em linhagem comercial de frangos. ...57
5.1.1 Sensibilidade ao Halotano ..........................................................................57
5.1.2 Avaliação do músculo Pectorallis major......................................................60
5.1.2.1 Incidência de Carnes PSE......................................................................60
5.1.2.2 Avaliação dos parâmetros de detecção de carnes PSE entre os grupos
.................................................................................................................62
5.1.2.2.1 pH final, Cor e CRA .............................................................................62
5.1.2.2.2 Valor de R............................................................................................63
5.1.3 Avaliação dos Parâmetros Hematológicos dos Animais .............................64
5.2 EXPERIMENTO 2: Teste do halotano em aves bisavozeiras da linhagem
fêmea do frango comercial........................................................................................69
5.2.1 Sensibilidade ao Halotano ..........................................................................69
5.2.2 Avaliação do músculo Pectoralis major.......................................................70
5.2.2.1 Incidência de Carnes PSE......................................................................70
5.2.2.2 Avaliação dos parâmetros de detecção de carnes PSE entre grupos....72
5.2.2.2.1 pH incial e final, Cor e CRA .................................................................72
5.2.3 Avaliação dos Parâmetros Hematológicos dos Animais .............................73
5.3 EXPERIMENTO 3: Efeito do halotano e do estresse térmico como agentes
estressores nas alterações bioquímicas e qualidade da carne de frango. ................76
5.3.1 Influência do Estresse Térmico e do Halotano sobre as características PSE.
76
5.3.1.1 Ocorrência de carnes PSE .....................................................................76
5.3.1.2 Avaliação dos parâmetros de detecção de carnes PSE.........................79
5.3.1.2.1 pH inicial e final, Cor e CRA................................................................79
5.3.1.2.2 Valor de R............................................................................................80
29
5.3.2 Avaliação dos Parâmetros Hematológicos dos Animais .............................82
6 DISCUSSÃO GERAL ........................................................................................86
7 CONCLUSÃO ....................................................................................................88
REFERÊNCIAS.........................................................................................................89
30
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1. Fatores ambientais de impacto sobre a qualidade da carne suína e de
aves...........................................................................................................................23
FIGURA 2. Mecanismo de contração muscular normal e em animais portadores da
PSS, que devido à elevação da temperatura também é chamada de Hipertermia
Maligna (HM) (MACLENNAM e PHILIPS, 1992).......................................................25
FIGURA 3. Parte do eixo da seqüência de aminoácidos no DNA, na qual ocorreu
uma mutação de Arg
615
para cisteína (localizada na caixa). A seqüência normal
GCGCTC foi alterada para GTGCTC (FUJII et al., 1991). ........................................27
FIGURA 4. Sistema muscular e o mecanismo de contração muscular, o qual
depende do estímulo nervoso que se propaga pelo sistema T fazendo com que o
retículo sarcoplasmático libere íons Ca
2+
, iniciando o processo de contração (b). ...30
FIGURA 5. Mecanismo de produção do ácido lático, a qual é catalisada pela enzima
Lactato Desidrogenase (LDH), relacionada à rápida queda do pH do músculo (ROÇA
e SERRANO, 1994, adaptada)..................................................................................31
FIGURA 6. Ações hormonais que levam a maior produção de glicose sanguinea... 33
FIGURA 7. Estruturas químicas dos hormônios corticosterona e cortisol.................33
FIGURA 8. Em situação de estresse, há maior liberação de Ca
2+
, o que promove
aceleração metabólica do músculo acarretando uma queda brusca do pH,
proporcionando assim carnes PSE. Ao mesmo tempo ocorre a quebra do ATP em
ADP e, finalmente deste último em IMP. (SOARES et al., 2007)..............................34
FIGURA 9. Procedimento de obtenção do composto halotano na sua forma líquida.
..................................................................................................................................38
FIGURA 10. Peru classificado como sensível ao gás halotano, exibindo sinais de
rigidez nos membros inferiores (a). Peru classificado como não sensível ao gás
halotano apresentando ausência de rigidez nos membros inferiores (b) (OWENS et
al., 2000b) .................................................................................................................39
FIGURA 11. Câmara de aplicação do teste do halotano (ao centro) elaborada
exclusivamente para o teste em frangos...................................................................42
FIGURA 12. Classificação dos frangos frente à aplicação do teste do halotano a 3 %
por 5 min.; a) não-sensível (ausência de enrijecimento dos membros inferiores), b)
sensível (enrijecimento dos membros inferiores) e c) indefinido (enrijecimento de
apenas um dos membros).........................................................................................43
31
FIGURA 13. Coleta de sangue realizada na asa do frango, após 3 e 48 h da
aplicação do teste do halotano, onde aproximadamente um volume de 5 mL do
mesmo foi coletado de cada animal. .........................................................................44
FIGURA 14. Câmara construída para a aplicação de estresse térmico (35ºC/1h) em
frangos. .....................................................................................................................54
FIGURA 15. Frangos desacordados após serem submetidos ao teste do halotano a
3 % por 5 min. .........................................................................................................577
FIGURA 16. Incidência de frangos sensíveis, indefinidos e não-sensíveis ao
halotano após serem submetidos ao anestésico halotano a 3% por 5 min...............58
FIGURA 17. Incidência de carnes de frango com características PSE nos grupos
Sensível (a), Indefinido (b) e Não-sensível (c) ao halotano após serem submetidos
ao anestésico halotano a 3% por 5 min................................................................... 60
FIGURA 18. Incidência de frangos sensíveis, indefinidos e não-sensíveis ao
halotano após serem submetidos ao anestésico halotano a 3% por 5 minutos. .......69
FIGURA 19. Incidência de carnes de frango com características PSE nos grupos
Sensível, Indefinido e Não-sensível ao halotano após serem submetidos ao
anestésico halotano a 3% por 5 min. ........................................................................71
FIGURA 20. Ocorrência de carnes com características PSE em frangos dos
tratamentos HHH (submetidos ao teste do halotano), HET (submetidos ao teste do
halotano e ao estresse térmico - 35°C/1h - 48 h após o teste), EET (submetidos ao
estresse térmico - 35°C/1h) e Controle. ....................................................................77
FIGURA 21. Frangos apresentando dispnéia típica durante a aplicação de estresse
térmico a 35 °C por 1 h. ............................................................................................78
32
LISTA DE TABELAS
TABELA 1. Valores médios de pH final (pH
f
), Cor (L*, a*, b*) e Capacidade de
Retenção de Água (CRA) dos filés de peito de frango 24h post mortem dos grupos
Sensível, Indefinido e Não-sensível ao halotano após serem submetidos ao
anestésico halotano a 3% por 5 min. ........................................................................62
TABELA 2. Valor de R de filés de frangos dos grupos Sensível, Indefinido e Não-
sensível ao halotano após serem submetidos ao anestésico halotano a 3% por 5
min. ...........................................................................................................................63
TABELA 3. Concentração de glicose sanguínea e das atividades de Creatina
Quinase (CK) e Lactato Desidrogenase (LDH) dos frangos dos grupos Sensível,
Indefinido e Não-sensível ao halotano, coletados após 3 e 48 h a serem submetidos
ao anestésico halotano a 3% por 5 min. ...................................................................65
TABELA 4. Valores médios de pH inicial (pH
i
) e final (pH
f
), Cor (L*, a*, b*) e
Capacidade de Retenção de Água (CRA) dos filés de peito de frango 24 h post
mortem dos grupos Sensível, Indefinido e Não-sensível ao halotano após serem
submetidos ao anestésico halotano a 3% por 5 min. ................................................73
TABELA 5. Concentração de glicose e das atividades de Creatina Quinase (CK) e
Lactato Desidrogenase (LDH) sanguíneas dos frangos dos grupos Sensível,
Indefinido e Não-sensível ao halotano, coletados após 3 h a serem submetidos ao
anestésico halotano a 3% por 5 min. ........................................................................73
TABELA 6. Valores médios de pH inicial (pH
i
) e final (pH
f
), Cor (L*, a*, b*) e
Capacidade de Retenção de Água (CRA) dos filés de peito de frango dos
tratamentos. ..............................................................................................................79
TABELA 7. Valor de R de filés de frango dos tratamentos......................................81
TABELA 8. Concentração de glicose sanguínea e das atividades de Creatina
Quinase (CK) e Lactato Desidrogenase (LDH) dos frangos dos tratamentos. ..........82
TABELA 9. Concentração de glicose e das atividades de Creatina Quinase (CK) e
Lactato Desidrogenase (LDH) sanguíneas dos frangos dos tratamentos. ................84
TABELA 10. Concentração de glicose sanguínea e das atividades de CK e LDH dos
frangos dos tratamentos............................................................................................85
18
1 INTRODUÇÃO
A cadeia produtiva de carne de aves está entre as mais importantes
cadeias agropecuárias do país, e devido sua dimensão e organização, o Brasil
desfruta a terceira posição na produção mundial de carne de frango, ficando atrás
apenas dos Estados Unidos e da China (APA, 2008). Em relação à exportação, o
Brasil ocupa o primeiro lugar, apresentando como um dos diferenciais a avançada
tecnologia aplicada, onde produtores e indústrias contam com investimentos que
permitem, por exemplo, programar a produção de frangos para obter maior
rendimento de partes nobres como peito, coxas e sobrecoxas (UBA, 2008).
Esse avanço genético foi responsável pela obtenção do “frango
moderno”, capaz de atingir 2 kg de peso em aproximadamente 42 dias. Porém,
pouco se sabe sobre o impacto que a seleção genética pode ter provocado sobre a
qualidade da carne de frango, e conseqüentemente, sobre suas propriedades
funcionais (LE BIHAN DUVAL, 2003; BARBUT, 1997).
Uma das possíveis conseqüências da seleção genética é a carne
PSE (Pale, Soft, Exudative), que apresenta como característica de superfície:
palidez, flacidez e perda de exsudato. Essas alterações são decorrentes do
desenvolvimento de uma glicólise post mortem elevada, ocasionando uma queda
drástica do pH muscular. Essa rápida queda do pH associada à elevada temperatura
da carcaça (aproximadamente 35 ºC) causa a desnaturação das proteínas
miofibrilares e sarcoplasmáticas, levando à perda de exsudato (BENDAL e
WISMER-PERDERSEN, 1962) e, conseqüentemente, compromete as propriedades
funcionais da carne (CANDEK-POTOKAR et al., 1998; BREWER e MCKEITH,
1999).
Estudos realizados com suínos mostram uma relação entre carnes
PSE e uma síndrome denominada Síndrome do Estresse Suíno (PSS - Porcine
Stress Syndrome) relacionada com a excessiva liberação de íons Ca
2+
celular
durante a contração muscular, o que leva ao rápido metabolismo anaeróbico e a
rigidez do músculo (MITCHELL e HEFFRON, 1982; BERTOL, 2005). Essa relação
foi comprovada por Fujii et al. (1991) que detectaram um ponto de mutação no gene
ryr1, responsável por codificar a proteína denominada receptora de rianodina do tipo
19
1 (RyR1) ou canal liberador de íons Ca
2+
, localizado no retículo sarcoplasmático
(RS) do músculo esquelético (O’BRIEN, 1995).
A PSS foi inicialmente detectada com auxílio do halotano, um
anestésico capaz de promover a rigidez muscular dos membros inferiores de suínos
portadores dessa síndrome (BERTOL, 2005). A ação do halotano também foi
avaliada em perus, onde foi constatado que os mesmos apresentavam reação
similar à encontrada em suínos (WHELLER et al., 1999; OWENS et al., 2000 a,b).
Em frangos um estudo realizado por Cavitt et al. (2004) demonstrou tal reação,
porém os autores afirmaram que a sensibilidade desses animais ao halotano não
explica toda a ocorrência de carnes PSE.
Fatores ambientais, tais como apanha dos animais, transporte,
temperatura e tempo de jejum, reconhecidamente, têm papel fundamental sobre a
qualidade final da carcaça dos animais. Entretanto, a alteração da qualidade pode
também ser obtida através do uso de diferentes tecnologias de abate e pós abate
como tempo de resfriamento, tempo e temperatura de maturação e estimulação
elétrica (KAUFFMAN e MARSH, 1987).
Dessa forma, tanto os fatores genéticos quanto ambientais podem
ter papeis relevantes sobre a qualidade da carne de frango, porém alguns ainda são
pouco evidenciados. Assim, pesquisas que possam avaliar as origens do estresse
em frangos através de parâmetros bioquímicos e fisiológicos são de extrema
importância para uma descrição objetiva da anomalia PSE.
20
2 OBJETIVOS
2.1 OBJETIVO GERAL
Avaliar a sensibilidade dos frangos ao halotano e ao estresse
térmico e sua relação com o desenvolvimento de filés PSE.
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Investigar a sensibilidade de frangos comerciais e bisavós ao
halotano através da aplicação do teste com este anestésico.
Avaliar a relação entre a sensibilidade ao halotano e a ocorrência de
filés PSE em frangos de linhagem comercial e bisavós.
Investigar a relação entre a sensibilidade ao halotano e as
alterações hematológicas e musculares de frangos.
Avaliar os efeitos do halotano e do estresse térmico pré-abate na
ocorrência de filés PSE e nas alterações hematológicas e do músculo de frangos
comerciais.
21
3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
3.1 QUALIDADE DA CARNE
Atualmente, o sucesso de um produto depende de sua aceitação
pelo consumidor. O termo “qualidade da carne” pressupõe um conceito bastante
amplo e complexo, pode envolver todas as etapas da cadeia agroindustrial, desde o
nascimento do animal até o preparo final da carne in natura e de produtos
processados. Resumidamente, qualidade pode ser definida como a medida das
características desejadas e valorizadas pelo consumidor.
Hofmann (1973) definiu qualidade da carne como sendo a soma de
todas as propriedades sensoriais, nutritivas, higiênicas, toxicológicas e tecnológicas.
Posteriormente, em 1974, o mesmo autor formulou uma forma breve e geral:
“Qualidade é a soma de todos os fatores qualitativos”.
Entre os aspectos qualitativos, os de maiores impactos são a cor e
maciez da carne. A coloração da carne é a primeira propriedade observada pelo
consumidor no momento de adquirir o produto nas gôndolas de supermercados
(PELICANO e PRATA, 2007).
A coloração observada na superfície das carnes é o resultado da
absorção seletiva da luz pela mioglobina e outros componentes importantes
presentes, como fibras musculares e suas proteínas. A quantidade de líquido livre e
a forma de corte estão também entre os fatores que influenciam na cor do produto
final (OLIVO et al., 2001).
A maciez da carne é a característica sensorial de maior influência no
julgamento da qualidade da carne (PELICANO e PRATA, 2007). A maciez é
decorrente do processo de degradação de algumas proteínas estruturais, por
enzimas endógenas (proteólise post mortem), estando o grau de maciez
correlacionado a três tipos de proteínas do tecido muscular: as do tecido conjuntivo,
as miofibrilares e as sarcoplasmáticas (LAWRIE, 1977).
22
Tanto a coloração quanto a maciez da carne podem ser afetadas por
fatores ante mortem, como susceptibilidade ao estresse e post mortem, como, por
exemplo, pH inicial e final da carcaça e a velocidade de queda da temperatura da
carcaça, relacionados a alguns problemas descritos nas próximas sessões.
3.2 ESTRESSE ANIMAL
Os seres vivos sobrevivem graças à manutenção de um equilíbrio
complexo, dinâmico e harmonioso, denominado homeostase, que é resultante de
respostas fisiológicas reguladoras. Portanto, toda vez que o organismo é ameaçado,
física ou psicologicamente, ocorre uma série de respostas adaptativas, que se
contrapõem aos efeitos dos estímulos, na tentativa de restabelecer a homeostasia.
Nessa condição, diz-se que o animal está em estado de estresse (FURLAN e FARIA
FILHO, 2003).
Dessa forma, o estresse é definido como uma condição do animal
que resulta da ação de um ou mais fatores estressantes, que podem ter origem tanto
externa como interna. Um fator estressante pode ser considerado prejudicial,
dependendo da forma como o organismo é capaz de lidar com uma situação
ameaçadora e como ele recupera a homeostase (SMITH et al., 2004). Caso o animal
seja incapaz de manter a homeostasia, a conseqüência direta será um eventual
prejuízo ao seu bem-estar, podendo refletir no desenvolvimento de reações
bioquímicas post mortem e na qualidade final da carne (LAWRIE, 1991).
Os dois principais sistemas fisiológicos mediadores da resposta ao
estresse são o sistema adrenal simpático (SAS), descrito como produtor da
“Síndrome de Emergência” ou “Reação de Luta ou Fuga” e o eixo hipotálamo
adenohipófise-adrenocortical (HPA), envolvido na “Síndrome Geral de Adaptação”
(GAS) (MITCHELL e KETTLEWELL, 1998).
O mecanismo de “luta e fuga” desencadeia muitos processos
adaptativos visando melhorar a capacidade física do animal. Nessa primeira fase,
ocorre um aumento no consumo de glicogênio, a fim de aumentar a disponibilidade
de ATP para os músculos locomotores e cardíaco. Nesse momento, também é
notável o aumento da temperatura corporal. A segunda fase, que é a adaptação ao
23
estresse, é caracterizada pela liberação de glicocorticóides, os quais atuam
amenizando os efeitos da adrenalina (BRESSAN, 1998, citado por COSTA, 2006).
Vários fatores podem promover o estresse e podem ser
classificados em: 1) estresse mental onde o medo exerce importante papel sobre o
bem estar animal; 2) estresse físico que provoca injúrias e estresse mental; 3)
estresse misto (mental e físico), em que o ambiente se mostra como um conjunto
de fatores interagindo onde prevalecem o manejo e o transporte (ELROM, 2000).
Os fatores ambientais exercem importante papel sobre o estresse
animal, onde os de maior impacto sobre a qualidade final da carne estão ilustrados
na Figura 1. Suas ações drásticas ou em conjunto podem levar ao estresse agudo
ou crônico prejudicando o bem-estar animal e, conseqüentemente, a qualidade final
da carne.
FIGURA 2. Fatores ambientais de impacto sobre a qualidade da carne suína e de
aves.
O transporte pré-abate é um fator de impacto sobre o estresse
sendo que a temperatura e a umidade ambiental representam juntas um dos maiores
problemas sobre o bem estar animal originando o estresse térmico, ocasionando
problemas na qualidade da carne (LANGER et al., 2007).
Transporte
Temperatura
Ambiental
Umidade
Radiação
Solar
Animal
Estresse
Transporte
Temperatura
Ambiental
Umidade
Radiação
Solar
Animal
Estresse
24
Em temperaturas ambientais fora da zona de conforto térmico do
animal, o centro hipotalâmico, responsável pelo sistema de termorregulação, é
ativado para a manutenção da temperatura corpórea. Em temperaturas baixas,
geralmente abaixo de 13ºC, pode ocorrer a hipotermia. Já em temperaturas
ambientais elevadas, a liberação de calor, na maioria das espécies animais, é
realizada por três mecanismos físicos: formação de suor, aumento da atividade
respiratória e dilatação das arteríolas cutâneas. No caso das aves, como não
dispõem de glândulas sudoríparas termorregulares ativas, a irrigação das porções
cutâneas desprovidas de penas e as trocas gasosas pela respiração são de suma
importância para o controle da temperatura corporal (BRESSAN et al., 2003).
3.3 PSS E PSE EM SUÍNOS
Nos últimos 40 anos, o setor produtor de suínos, a nível mundial,
tem se esforçado para selecionar animais com maior porcentagem de carne magra,
bem como o aumento de peso de abate (LUDTKE et al., 2006; BERTOL, 2005).
Porém foi observado que esta seleção aumentou a mortalidade de suínos por
estresse (LUDTKE et al., 2006). Essa susceptibilidade ao estresse foi detectada na
década de 70, sendo denominada pela sigla PSS, do inglês Porcine Estresse
Syndrome, a qual está relacionada com a liberação excessiva de íons Ca
2+
celular
durante a contração muscular, o que leva ao rápido metabolismo anaeróbico e à
rigidez do músculo (BERTOL, 2005).
O mecanismo de indução da PSS, causado por uma anomalia nos
canais liberadores de Ca
2+
do RS foi proposto por MacLennam e Phillips (1992) e
está ilustrado na Figura 2. A concentração de Ca
2+
no RS, especializado em estocar
e liberar estes íons, regula a contração muscular, glicólise e função mitocondrial. Em
um ciclo normal, durante a contração, o Ca
2+
é liberado de forma controlada pelos
canais do RS mediante a presença de energia obtida pelo metabolismo glicolítico e
aeróbico que são realizados de forma balanceada. Assim, a liberação de Ca
2+
é
regulada pela ATP, Mg
2+
e pela sua própria concentração. Na descontração, o Ca
2+
é
bombeado para dentro do RS por uma ATPase para iniciar o relaxamento. Em
condição anormal do PSS, os canais liberadores de Ca
2+
são sensíveis a baixas
25
concentrações de Ca
2+
, mantendo-se abertos e aumentando sua concentração no
citoplasma. A contração muscular é mantida, gerando a rigidez muscular. O
metabolismo glicolítico e aeróbico aumentam, gerando ácido lático, CO
2
e calor o
que pode ocasionar injúria nas membranas celulares e problemas sistêmicos típicos
do PSS (MACLENNAM e PHILIPS, 1992).
FIGURA 3. Mecanismo de contração muscular normal e em animais portadores da
PSS, que devido à elevação da temperatura também é chamada de Hipertermia
Maligna (HM) (MACLENNAM e PHILIPS, 1992).
Suínos afetados pela PSS quando vivos mostram inicialmente
tremor rápido da cauda, rigidez geral acompanhada do aumento na rigidez muscular
e dispnéia a ponto de respirarem pela boca. A temperatura corpórea se eleva
notavelmente até aproximadamente 45ºC, sendo observado também zonas
irregulares da pele com palidez. Nesta etapa, o animal é, freqüentemente, vítima de
ataques por outros suínos do grupo. Assim, o animal sofre colapso e morre. O tempo
total de duração desta síndrome é por volta de 4 a 6 minutos. A porcentagem de
perdas durante o transporte pode chegar a 1% dependendo da sensibilidade do
animal ao estresse e também das condições de transporte, sendo mais comum
quando os animais estão aglomerados e a temperatura ambiental está elevada
(verão) (BONELLI e SCHIFFERLI, 2001).
26
A predisposição genética para PSS tem os mesmos sintomas que
suínos susceptíveis à Hipertermia Maligna (HM), logo, PSS e HM são anormalidades
similares, diferenciando-se na sua origem uma vez que a PSS possui origem natural
ou artificial, como descrito anteriormente, e HM resulta somente da ação de agentes
anestésicos voláteis potentes como o gás halotano e também por administração de
succinilcolina (MITCHELL e HEFFRON, 1982).
A relação biológica entre o gene halotano (hal) ou gene rianodina
(ryr1) e a PSS, foi verificada por Fujii et al. (1991). No cromossomo 6 se encontra o
gene ryr1, que codifica esta proteína ou canal liberador de íons Ca
2+
localizado no
RS do músculo esquelético estriado, com um peso molecular de 564 kDA (O’BRIEN,
1995). A denominação “receptora de rianodina” é decorrente da sua capacidade de
ligação irreversível ao alcalóide rianodina, isolado do talo de Ryania speciosa. É um
agente paralisante que induz à contração irreversível da musculatura esquelética,
onde se liga aos sítios de alta afinidade do canal de Ca
2+
, bloqueando-o no estado
aberto. Porém, quando em alta concentração, liga-se ao sítio de baixa afinidade
fixando o canal no estado fechado (ROSSI e SORRENTINO, 2004).
Três tipos de receptores rianodina com sua distribuição específica
são conhecidos. A isoforma RyR1 é encontrada em todos os músculos esqueléticos
dos mamíferos. A isoforma RyR2 é predominante no músculo cardíaco e a isoforma
RyR3 está presente em músculos esqueléticos e cerebral (FRANZINI-ARMSTRONG
e PROTASI, 1997). Todas são codificadas por genes diferentes, ryr1, ryr2 e ryr3,
respectivamente (SUTKO e AIREY, 1996). São encontradas diferenças bem
definidas com relação ao padrão de distribuição dos canais de cálcio no músculo
esquelético de vertebrados, onde os mamíferos apresentam predominância da
isoforma RyR1 (OGAWA et al., 1999) e em músculo esquelético de aves, existem
duas isoformas de RyR encontradas em proporções semelhantes e denominadas de
α-RyR e β-RyR, equivalentes às RyR1 e RyR3, respectivamente (OTTINI et al.,
1996).
Fujii et al. (1991) detectaram o ponto de mutação no gene ryr1 que
se associou com a HM e 6 raças de suínos (BONELLI e SCHIFFERLI, 2001). Essa
mutação consiste na substituição de uma citosina por uma timina na posição 1843
da seqüência de DNA do gene ryr1, ocorrendo uma alteração do aminoácido 615,
em que o resíduo de arginina é substituído pelo resíduo de cisteína de animais
sensíveis ao estresse (Figura 3), provocando o surgimento de PSS em suínos.
27
FIGURA 4. Parte do eixo da seqüência de aminoácidos no DNA, na qual ocorreu
uma mutação de Arg
615
para cisteína (localizada na caixa). A seqüência normal
GCGCTC foi alterada para GTGCTC (FUJII et al., 1991).
Fujii et al. (1991) relataram que Arg
615
está envolvida na ligação de
reguladores do canal de Ca
2+
e esta alteração conduz a hipersensibilidade do canal
regulador de íons Ca
2+
, abrindo-o. Uma vez aberto, o canal poderá não responder
aos íons Ca
2+
e Mg
2+
, que induzem ao seu fechamento, conduzindo assim à
contração muscular, hipermetabolismo e hipertermia. Da mesma maneira, Mickelson
e Louis (1996) descreveram que as taxas aumentadas de liberação de Ca
2+
do RS e
a maior afinidade do canal de Ca
2+
para rianodina, em animais sensíveis a HM ou a
PSS, poderiam ser devido a maior permanência do canal no estado aberto.
O gene hal está relacionado com a sensíbilidade ao anestésico
halotano. Suínos normais são dominantes (NN), animais sensíveis são recessivos
(nn) e os híbridos são tidos como intermediários (Nn) (FUJJI et al, 1991).
Cheah et al (1984) avaliaram a relação de íons Ca
2+
sarcoplasmático
em suínos sensíveis e insensíveis ao halotano em vários intervalos de tempo post
mortem (8 min, 45 min, 5 h e 24 h) demonstrando uma relação positiva entre o teste
com o anestésico e a concentração de Ca
2+
no RS em todos os tempos, porém com
maior diferença no tempo de 45 min post mortem, onde a concentração de íons Ca
2+
foi aproximadamente cinco vezes maior para suínos sensíveis ao halotano. Isso está
de acordo com a teoria que a PSS e HM estão relacionadas a um defeito encontrado
no gene receptor da rianodina (RyR 1), que por sua vez codifica o canal liberador de
íons Ca
2+
(FUJII et al., 1991) conhecido também como gene halotano (LUDTKE et
al., 2006).
Este defeito, que originou a PSS, está diretamente relacionado com
a qualidade da carne. Suínos portadores desta síndrome apresentam maior
predisposição ao desenvolvimento de carnes com características PSE, do inglês
Pale, Soft e Exudative (CULAU et al., 2002), que traduzindo significam carnes com
características Pálida, Flácida e Exsudativa. As condições que conduzem ao PSE
28
resultam de uma taxa de glicólise post mortem extremamente elevada, levando a um
valor de pH muscular muito baixo, geralmente inferior a 5,8, enquanto a carcaça do
animal ainda está quente, por volta de 35ºC aos 45 minutos post mortem. A rápida
queda do pH causa a desnaturação das proteínas miofibrilares e sarcoplasmáticas,
levando à excessiva perda de exsudato (BENDALL e WISMER-PERDERSEN,
1962), prejudicando assim as propriedades funcionais da carne tal como a
capacidade de retenção de água (CRA) (CANDEK-POTOKAR et al., 1998).
Tam et al. (1998), avaliando a coloração da carne em suínos
portadores do gene hal NN, hal Nn e hal nn, verificaram uma coloração mais clara
(p≤0,05) para os animais recessivos e heterozigotos quando comparados aos suínos
dominantes. Estes mesmos autores observaram um pH inicial menor (p≤0,05) em
carcaças com os genótipos Nn e nn em comparação aos animais normais, em que
foi verificada uma correlação negativa, pois quanto maior a freqüência do alelo n no
genótipo halotano menor foi o pH inicial da carne.
Da mesma forma, em estudo realizado por Culau et al. (2001) em
que avaliaram a incidência de carnes PSE em suínos com os genótipos halotano
dominante (hal NN), heterozigoto (hal Nn) e recessivo (hal nn), os autores
verificaram uma maior porcentagem de carnes PSE em suínos hal nn e hal Nn
(71,43 e 47,06 % respectivamente) quando comparados aos suínos hal NN (17,20
%) e concluíram que o gene halotano é um dos fatores de maior contribuição para o
desenvolvimento de PSE em suínos. Porém, embora a presença de carnes PSE em
suínos hal nn e hal Nn tenha sido maior, os autores afirmam que o genótipo por si só
não explica toda a incidência de carnes PSE em suínos, visto que o grupo negativo
ao halotano também apresentou, embora numa menor porcentagem, carnes com
características PSE.
Uma possível explicação para a tendência ao desenvolvimento de
carnes PSE em suínos hal NN pode estar relacionado ao aumento da proporção em
área de fibras brancas glicolíticas devido às seleções genéticas para a melhora da
qualidade da carne suína. Estas fibras brancas apresentam maior diâmetro, em
comparação com os animais de mesma linhagem não selecionados. As fibras
glicolíticas respondem rapidamente às demandas de energia, seja em situações de
estresse e/ou exercício físico, produzindo energia preferencialmente pela via
anaeróbica, cujo produto final é o ácido lático, que por sua vez está diretamente
relacionado ao rápido declínio do pH originando carnes PSE (BERTOL, 2005).
29
Mesmo que exista correlação significativa entre animais portadores
do gene halotano e produção de carne PSE (SILVEIRA, 1996), é afirmado que o
genótipo por si só não explica totalmente a ocorrência dessa anomalia (WARRIS,
1995), havendo a necessidade de se avaliar tanto o músculo quanto o sangue dos
animais verificando suas alterações frente aos fatores genéticos e ambientais.
3.4 ALTERAÇÕES BIOQUÍMICAS E FISIOLÓGICAS RELACIONADAS COM PSE
O pH de um músculo vivo está em torno de 7,2 a 7,4, mas em
situações estressantes, o ácido lático é produzido e o pH pode temporariamente
diminuir até 6,2. Da mesma forma, em situações post mortem normais, esse efeito é
observado, porém o pH pode chegar a 5,5 em suínos e aproximadamente 5,8 em
aves (ODA et al., 2003; POSO e PUOLANE, 2005).
As mudanças estruturais mais importantes a nível muscular no post
mortem são a contração e o rigor mortis, que podem ser considerados dois
processos distintos. No músculo vivo, a contração muscular ocorre devido a uma
neuroestimulação que faz com que os íons Ca
2+
do RS sejam liberados para o
sarcoplasma. Estes, por sua vez, inativam o sistema troponina-tropomiosina por
ligação do Ca
2+
à troponina e, conseqüentemente, ocorre a reação entre a actina e a
miosina que resulta na contração muscular, o que faz com que o comprimento do
sarcômero diminua (ROÇA e SERRANO, 1994) (Figura 4).
30
b
FIGURA 5. Sistema muscular e o mecanismo de contração muscular, o qual
depende do estímulo nervoso que se propaga pelo sistema T fazendo com que o
retículo sarcoplasmático libere íons Ca
2+
, iniciando o processo de contração (b).
Em condições pré-abate drásticas que levam ao estresse o pH decai
rapidamente devido ao acúmulo de ácido lático no músculo, onde associado à
elevadas temperaturas, ocasiona o desenvolvimento da síndrome PSE,
comprometendo a qualidade final da carne e suas propriedades funcionais
(CANDEK-POTOKAR et al., 1998).
No momento do abate, a principal fonte de energia para a glicólise
post mortem provém do glicogênio, exclusivamente pela via anaeróbica (ODA et al.,
2003). Após a sangria, onde o suprimento de oxigênio é cortado, prevalece a via
anaeróbica e o ácido pirúvico, produto da via glicolítica, não entra no ciclo de Krebs-
Johnson e na cadeia citocrômica para formar ATP (ROÇA e SERRANO, 1994)
sendo utilizado pela via anaeróbica o qual resulta a redução de piruvato a lactato
(Figura 5), onde tal reação é catalisada pela enzima Lactato Desidrogenase (LDH)
no citosol celular (PUOLANNE et al., 2002).
31
FIGURA 6. Mecanismo de produção do ácido lático, a qual é catalisada pela enzima
Lactato Desidrogenase (LDH), relacionada à rápida queda do pH do músculo (ROÇA
e SERRANO, 1994, adaptada).
Em músculos, bem como em outros tecidos, a LDH ocorre como 5
isoenzimas tetraméricas (LDH 1 a LDH 5). A LDH 5 apresenta um elevado Km
(constante de Michaelis Menten) para o piruvato, favorecendo a formação de ácido
lático quando a taxa de glicólise está alta. A LDH é uma enzima da classe das oxi-
redutases, em que seu sítio ativo é formado pelos resíduos arginina 171 e histidina
195. Estes aminoácidos englobam a molécula do piruvato que é o substrato natural
desta enzima, promovendo a sua redução pela adição do hidreto fornecido pelo
cofator NADH (VOET e VOET, 1995).
O músculo de suínos apresenta elevada atividade de LDH e o
aumento da sua atividade está relacionada à ocorrência da PSS e HM (MITCHELL e
HEFFRON, 1982; POSO e PUOLANNE, 2005).
Uma outra enzima que também apresenta relação com a PSS é
Creatina Quinase (CK), encontrada no citoplasma dos músculos cardíacos ou
esqueléticos e sensível na indicação de lesões musculares, onde condições pré-
Glicogênio
muscular
Glicose 1-P
Via Glicolítica Ácido Pirúvico
4 H
+
Ácido Lático
Cadeia Citocrômica Mitocondrial
Ciclo de Krebs
Produtos da degradação
de Ácidos Graxos e
Amino-acidos
CO
2
6 O
2
4 ATP
30 ATP
H
2
O
Suprimento
Sanguíneo
4 – 2 ATP = 2 ATP
aerobiose
Anaerobiose
aerobiose
32
abate que conduzem ao estresse de animais sensíveis (PSS) elevam a atividade da
CK (MITCHEL e HEFFRON, 1982; MITCHELL et al., 2003).
A CK é uma enzima intracelular que está envolvida na
transfosforilação reversível da adenosina difosfato (ADP) e creatina, sendo essencial
para a manutenção das reservas de energia celular, através do tamponamento das
concentrações de ATP. Portanto, a CK é controlada em uma série de tecidos com
elevada atividade metabólica específica. Nos mamíferos, a CK está presente em três
formas iso-enzimáticas com origem no músculo esquelético (MM-CK), no cérebro
(BB-CK) e no miocárdio (MB-CK) A separação de isoenzimas e a determinação de
seus perfis de atividade no soro ou no plasma sanguíneo podem, portanto, serem
empregadas para identificar o local e os padrões de desenvolvimento de patologia
tecidual (MITCHELL et al., 2003).
Ações estressantes podem promover injúrias musculares levando ao
efluxo destas enzimas, refletindo-se também no aumento da sua atividade na
corrente sanguínea (MITCHELL e HEFFRON, 1982).
Além de elevar as atividades das enzimas CK e LDH, o manejo pré-
abate estressante e animais portadores da PSS apresentam elevados níveis
plasmáticos de hormônios corticóides e catecolaminas, como cortisol e adrenalina,
respectivamente, que em resposta ao estresse psicológico sofrido, prepara o
organismo com o suprimento extra de glicose no sangue para permitir a “reação de
luta e fuga” (MITCHELL e HEFFRON, 1982; LUDTKE et al., 2006). O mecanismo
dessas ações hormonais está ilustrado resumidamente na Figura 6.
Em situações de estresse, a adrenalina ativa a adenilciclase,
aumentando a produção de ácido cicloadenílico que estimula a transformação da
fosforilase b em a. Com essa ativação no fígado, ocorre a glicogenólise, com
aumento da glicose que é lançada posteriormente no sangue. Concomitantemente, o
estresse estimula o hipotálamo a secretar o fator de liberação da corticotrofina. Este
fator estimula a hipófise a aumentar a secreção de ACTH (adrenocorticotrópicos),
que por sua vez estimula a secreção de cortisol e corticosterona (em aves) liberando
glicose na corrente sanguínea.
33
FIGURA 7. Ações hormonais que levam a maior produção de glicose sanguínea.
Brow et al. (1998) estabeleceram para os suínos abatidos em
condições estressantes valores médios de cortisol de 17,02 µg/100 mL e em
situações de manejo normal, valores próximos de 7,62 µg/100 mL de plasma. Em
aves, a corticosterona é o glicorticorticóide mais importante diferindo do cortisol
apenas no carbono 17 da sua estrutura, onde o cortisol apresenta um grupamento
OH (Figura 7) (GUTRTLER et al., 1984).
FIGURA 8. Estruturas químicas dos hormônios corticosterona e cortisol.
Liberação de Adrenalina
ESTRESSE
Ativação da Adenilciclase
Ácido Cicloadenílico
Fosforilase b Æ Fosforilase a
Glicogenólise
[Glicose]
Liberação de Corticotrofina
Secreção de ACTH
Cortisol Corticosterona
Desoxicortisol Desoxicorticosterona
O
HO
CH
3
CH
3
C
O
H
2
COH
O
HO
CH
3
CH
3
C
O
H
2
COH
OH
Corticosterona
Cortisol
O
HO
CH
3
CH
3
C
O
H
2
COH
O
HO
CH
3
CH
3
C
O
H
2
COH
O
HO
CH
3
CH
3
C
O
H
2
COH
O
HO
CH
3
CH
3
C
O
H
2
COH
OH
Corticosterona
Cortisol
34
Outro fator que está associado à condição PSE e à PSS é o valor de
R. As carnes PSE apresentam alterações nos níveis dos nucleotídeos adenosina e
inosina. A depleção de ATP (adenosina trifosfato) é a causa do início do rigor mortis.
Após a morte do animal, o ATP é rapidamente convertido em ADP (adenosina
difosfato) e subsequentemente em AMP (adenosina monofosfato) e IMP (inosina
monofosfato). Nas carnes PSE, a quebra dos nucleotídeos de adenosina em IMP
ocorre mais rapidamente que em carnes normais (Figura 8). Portanto, músculos PSE
contêm baixos níveis de ATP e altos níveis de IMP enquanto que altas
concentrações de ATP e baixas quantidades de IMP são observadas para músculos
normais (BATLLE et al., 2000). O valor de R, determinado pela metodologia
desenvolvida por Honikel e Fischer (1977), permite a quantificação da relação entre
IMP e ATP no músculo no momento do abate. Conforme sugerido por Honikel et al.
(1981) e evidenciado por Sams e Mills (1993), o valor de R igual ou maior do que
1,10 indica predominância de ATP e é utilizado com critério de que a ave encontra-
se em rigor mortis.
FIGURA 9. Em situação de estresse, há maior liberação de Ca
2+
, o que promove
aceleração metabólica do músculo acarretando uma queda brusca do pH,
proporcionando assim carnes PSE. Ao mesmo tempo ocorre a quebra do ATP em
ADP e, finalmente deste último em IMP (SOARES et al., 2007).
35
Embora a PSS causa várias mudanças metabólicas, algumas
análises relacionadas à sua ocorrência têm explicado pouco as variações
encontradas em nível de desvios de qualidade muscular com impacto na
industrialização da carne, principalmente em se tratando da formação da carne
Pálida, Mole e Exudativa - PSE (PELOSO, 2001). Portanto, avaliar tanto os
parâmetros sanguíneos quanto os musculares permitem uma melhor descrição
desta anomalia.
3.5 PSE EM AVES
As condições de manejo pré-abate a que são submetidas as aves,
como transporte, temperatura, umidade relativa do ambiente, são fatores que
conduzem ao estresse, influenciando a qualidade da carne e aumentando a
incidência de carnes PSE (SAMS, 1999). Segundo McCurdy et al. (1996) e Barbut
(1998) a incidência de PSE em perus é maior nos meses de verão, quando a
temperatura ambiente é elevada, sugerindo a susceptibilidade das aves ao estresse
térmico. Da mesma forma, McKee e Sams (1997) sugeriram que o estresse térmico
acelera o metabolismo post mortem e mudanças bioquímicas no músculo,
produzindo assim carnes de perus com características PSE. Olivo et al. (2001)
demonstraram que frangos foram susceptíveis ao estresse térmico com
desenvolvimento de carnes PSE, com propriedades funcionais comprometidas e que
a suplementação com vitamina E na dieta foi capaz de inibir o desenvolvimento da
carne PSE.
A transformação do músculo em carne compreende três fases
bioquímicas (pré-rigor, rigor e post-rigor), que se diferenciam com relação às
reservas de energia e produtos finais destas reações. As fontes intracelulares de
energia disponíveis para o metabolismo são: o ATP, a fosfocreatina e o glicogênio. A
glicose é responsável, no post mortem, pela transformação das reservas de
glicogênio muscular em lactato. Dessa forma, o acúmulo do ácido lático e a queda
do pH no post mortem dependem fundamentalmente da quantidade de glicogênio no
momento do sacrifício (PEARSON, 1994).
36
A condição PSE em aves, assim como em suínos, também é
caracterizada pelo processo de rigor mortis acelerado, com pH baixo (< 5,80) e uma
temperatura muscular elevada (acima de 35
o
C), levando à desnaturação das
proteínas miofibrilares (SOSNICKI et al., 1998). Olivo et al. (2001) constataram que
em frangos pode-se obter valores de pH abaixo de 5,8 em até 15 minutos post
mortem, indicando que o rigor mortis é mais acelerado do que em suínos, cujo pH
final é atingido após 45 minutos.
A incidência destas carnes no Brasil pode chegar a 22% conforme já
detectado pelo nosso grupo de pesquisa (SOARES et al., 2003a). Entretanto, as
origens do PSE em frangos ainda não estão bem esclarecidas, apenas que o
estresse ante-mortem a que são submetidos os animais favorecem o seu
desenvolvimento como as elevadas temperaturas durante o transporte (OLIVO et al.,
2001; GUARNIERI et al., 2002).
Estudos recentes realizados com perus evidenciam, conforme já
observado em suínos, uma relação positiva entre o desenvolvimento de carnes PSE
e a sua positividade (sensibilidade) ao teste do halotano. Owens et al. (2000b)
utilizaram o teste com este anestésico para verificar a predisposição de perus em
desenvolverem carnes com características PSE quando transportados antes do
abate e constataram uma incidência maior de carnes PSE (70 %) em perus
sensíveis ao anestésico, embora o grupo normal (não sensíveis ao halotano) tenha
apresentado elevada incidência de carnes PSE (50 %). Assim, os autores
concluíram que o teste do halotano seria um limitado preditor de PSE em perus. Em
um outro estudo, avaliado com um outro fator estressante, o calor, Owens et al.
(2000a), trabalharam com exposição de perus com 20 semanas de idade (10%
halotanos positivos e metade dos halotanos negativos) à fatores estressantes de
calor a 30ºC durante o dia e 36ºC durante a noite, por 4 semanas, onde metade dos
halotanos negativos foram expostos a temperaturas de 21°C durante o dia e 13ºC
durante a noite. A incidência de aves com características PSE foi significativamente
maior nos animais sensíveis ao halotano (34,7%) comparado aos não sensíveis
(13,4%).
Em contrapartida alguns estudos mostram que o teste, embora
tenha sido caracterizado em aves pelo enrijecimento dos seus membros inferiores,
não mostrou-se um preditor eficiente para carnes com características PSE. Wheeler
et al. (1999) aplicaram o teste do halotano em perus com 4 semanas de idade e os
37
abateram com 20 semanas. Os autores não encontraram diferenças significativas de
pH e capacidade de retenção de água (CRA) entre os grupos halotano positivo e
negativo sugerindo que a susceptibilidade de perus do grupo positivo ao
desenvolvimento de carnes PSE não é 100 %. Já Cavitt et al. (2004) avaliaram o
efeito da ação do halotano e da injeção de succinilcolina (relaxante muscular) em
frangos com 4 semanas de idade, demosntrando que o halotano em conjunto com a
succinilcolina não foi preditor para detecção de aves propensas a desenvolverem
carnes com características PSE.
Recentemente, nosso grupo de pesquisa avaliou a incidência de
carnes com características PSE em 140 frangos comerciais através da aplicação do
teste do halotano, onde dos 13,6 % frangos positivos ao teste, 42,1 % apresentaram
carnes PSE evidenciando uma provável correlação entre esta anomalia e a
sensibilidade ao anestésico halotano e conseqüentemente à síndrome estressante
em frangos (Soares et al., 2007). Mesmo havendo evidências de que a manifestação
de carnes PSE têm origem genética e terem sido encontradas em outras espécies
como os suínos (FUJII, 1991) e em perus (STRASBURG & CHIANG, 2003), em
frangos, esse mecanismo ainda não foi elucidado, apesar dos trabalhos de Lara
(2003), Droval (2004) e Oda (2006).
Assim, é necessária uma maior investigação das origens da
anomalia PSE a fim de avaliar uma possível síndrome de estresse em aves e
elucidar os problemas relacionados à qualidade da carne de frango.
3.6 TESTE DO HALOTANO
Halotano é o nome usual do hidrocarboneto halogenado bromo-2-
cloro-2-trifluoretano-1,1,1, largamente utilizado como inalador anestésico. É um
líquido, onde apresenta como método de preparação, a reação de adição de ácido
fluorídrico ao tricloroetileno em presença de cloreto antimônico seguida de uma
reação de substituição com bromo, conforme mostra a Figura 9 (HALL e CLARKE,
1987).
38
Halotano
FIGURA 10. Procedimento de obtenção do composto halotano na sua forma líquida.
Na anestesia inalatória, o halotano é mesclado com o oxigênio, onde
difunde-se do alvéolo para o seu local de ação, no sistema nervoso central (SNC). A
suspensão da administração de anestésico desenvolve instantaneamente um
gradiente de difusão reversa e o sangue leva o halotano do SNC novamente ao
alvéolo, do qual ele é expirado (FIALHO, 1986).
O julgamento do plano ou estágio anestésico em animais baseia-se
no esquema clássico de Guedel citado por Manssone (2003), na anestesia pelo éter,
adaptado posteriormente os outros anestésicos, inclusive o halotano. O autor
estabeleceu quatro estágios definidos:
Estágio 1: pode ser definido como aquele que vai desde o início da
administração do fármaco até a perda da consciência do animal.
Estágio 2: conhecido como excitação e delírio, este estágio é
responsável pela perda da consciência e alterações no SNC.
Estágio 3: caracteriza-se por perda de consciência e depressão
progressiva do SNC, podendo chegar à parada respiratória.
Estágio 4: é o mais crítico de todos os anteriormente citados, pois é
nele que se observam a abolição ou diminuição de certos reflexos, além de eventual
parada respiratória e cardíaca que, se não socorrida em segundo, pode levar à
morte do animal.
A sensibilidade ao halotano, anestésico utilizado em cirurgias
humanas, foi inicialmente detectada em suínos que faziam parte do programa de
transplante de fígados em humanos, e participavam como animais experimentais. Os
animais sensíveis ao anestésico apresentavam-se ofegantes, com cianose, pernas
enrijecidas, taquicardia, acidose metabólica e temperatura de 44ºC. (HARRISON,
citado por OHNISHI e OHNISHI, 1994), Sintomatologia semelhante é observada em
humanos com hipertermia maligna, entretanto, o quadro pode ser revertido pela
administração do medicamento dantrolene, que provoca o relaxamento dos
39
músculos esqueléticos (OHNISHI e OHNISHI, 1994). A descoberta da PSS em 1967
e sua direta relação com o halotano permitiram o desenvolvimento do teste com este
anestésico, e sua correlação com a síndrome PSE, pois animais portadores da PSS
apresentavam maior predisposição ao desenvolvimento desta, ou seja, são mais
sensíveis ao estresse (MICTHELL e HEFFRON, 1982).
Até a década de 90, suínos positivos à PSS eram identificados
através do teste com halotano na sua forma gasosa (CULAU et al., 2001; BERTOL,
2005). Neste teste, os animais inalam o gás por 5 min., e o surgimento da rigidez
muscular no tempo de 1 a 4 min. de exposição ao anestésico, indica sensibilidade
ao halotano e maior predisposição ao desenvolvimento de carnes PSE
(MCGLOUGHLIN, 1980).
O gene do halotano além de determinar a maior predisposição ao
estresse em suínos, é responsável pela produção de carcaças com maior produção
de carne magra também relacionado à produção de carnes PSE (MITCHELL e
HEFFRON, 1982; CULAU, 2001).
Em aves há recentes estudos no sentido de detectar a relação entre
a genética e o desenvolvimento de carnes PSE. A positividade ao teste do halotano
é observada em aves que apresentam rigidez dos seus membros inferiores
(WHEELER et al., 1999; OWENS et al., 2000b) conforme mostra a Figura 10.
a b
Figura 11. Peru classificado como sensível ao gás halotano, exibindo sinais de
rigidez nos membros inferiores (a). Peru classificado como não sensível ao gás
halotano apresentando ausência de rigidez nos membros inferiores (b) (OWENS et
al., 2000b).
40
Cavitt et al. (2004) avaliaram a eficiência do teste do halotano para
detectar o PSE em frangos de corte de várias linhagens comerciais e observaram
que a sensibilidade ao halotano variou de 13,2 a 22,9% dependendo da linhagem
comercial. Owens et al. (2000 a) avaliaram o teste halotano em duas linhagens de
perus com 4 semanas de idade e observaram que aproximadamente 10% das
amostras estudadas foram sensíveis ao halotano, apresentando rigidez muscular.
Aplicando o teste do halotano em frangos comerciais, Soares et al. (2007)
encontraram valores próximos aos anteriores evidenciados pela incidência de 13,6
% de frangos positivos ao teste. Já Wheeler et al., (1999) encontraram apenas 5 %
de perus sensíveis ao halotano em 120 animais avaliados, em que neste
experimento, os animais que não apresentaram rigidez total dos membros inferiores
foram classificados como halotano indefinidos.
Embora as reações frente ao teste do halotano em aves tenham se
mostrado similares ao observado em suínos, pouco se sabe sobre os eventos
bioquímicos ocorrrentes e sua relação com a anomalia PSE.
41
4 MATERIAIS E MÉTODOS
O presente trabalho foi conduzido em 3 experimentos, com o
objetivo de avaliar o halotano como agente preditor e estressor em associação com
estresse térmico nas alterações bioquímicas e na qualidade da carne, descritos a
seguir.
4.1 EXPERIMENTO 1: Teste do halotano em linhagem comercial de frangos.
Neste experimento, o efeito do halotano como preditor de uma
possível síndrome estressante em frangos e sua relação com a síndrome PSE e
alterações bioquímicas foi avaliada.
4.1.1 Animais
Os frangos machos de uma linhagem comercial (n=352) foram
criados na Fazenda Escola da Universidade Estadual de Londrina até a realização
do teste com o anestésico halotano.
4.1.2 Teste do Halotano
O teste do halotano foi aplicado com o auxílio de uma câmara
elaborada exclusivamente para este experimento. A mesma apresenta três entradas
frontais, onde foi inserida a cabeça de cada frango, e dimensões internas de
12x12x100cm. A câmara foi interligada a um aparelho de anestesia veterinária
acoplado a um cilindro de O
2
conforme ilustrado na Figura 11.
42
FIGURA 12. Câmara de aplicação do teste do halotano (ao centro) elaborada
exclusivamente para o teste em frangos.
Assim, o oxigênio foi liberado do cilindro com uma vazão de 6 L/min.
chegando ao aparelho de anestesia veterinária, onde foi mesclado com o halotano a
uma concentração de 3,0%, sendo então, enviado para a câmara e inalado pelos
frangos por um período de 5 min (WHELLER et al., 1999, OWENS et al., 2000 a,b).
Ao mesmo tempo, os frangos foram avaliados, em três animais por vez, por três
julgadores aleatórios e um julgador fixo sendo selecionados e classificados em três
grupos: frangos sensíveis ao halotano (enrijecimento dos dois membros inferiores),
indefinidos (enrijecimento de apenas um dos membros) e não-sensíveis (ausência
de enrijecimento) conforme ilustrado na Figura 12. Após a realização do teste do
halotano, os frangos permaneceram por aproximadamente 2 a 3 min. desacordados,
demonstrando o efeito da anestesia sobre os mesmos.
Exaustor
Entradas Frontais
Câmara de aplicação do teste
Cilindro
de O
2
Aparelho
Anestésico
Exaustor
Entradas Frontais
Câmara de aplicação do teste
Cilindro
de O
2
Aparelho
Anestésico
43
FIGURA 13. Classificação dos frangos frente à aplicação do teste do halotano a 3 %
por 5 min.; a) não-sensível (ausência de enrijecimento dos membros inferiores), b)
sensível (enrijecimento dos membros inferiores) e c) indefinido (enrijecimento de
apenas um dos membros).
4.1.3 Coleta de Sangue
Após 3 e 48 horas da aplicação do teste do halotano, o sangue dos
frangos sensíveis, indefinidos e não-sensíveis (n=12 para cada grupo) foi coletado
da asa dos animais (Figura 13) com o auxílio de uma seringa de 5 mL e agulha (0,7
x 2,5 mm) e armazenado em tubos de vidro contendo anticoagulante (oxalato +
fluoreto) e em tubos plásticos (12 x 75 mm), ambos com tampa, para posterior
extração de plasma e soro, respectivamente.
44
Figura 14. Coleta de sangue realizada na asa do frango, após 3 e 48 h da aplicação
do teste do halotano, onde aproximadamente um volume de 5 mL do mesmo foi
coletado de cada ave.
4.1.3.1 Obtenção do Plasma Sanguíneo
Após 2 h de coletado o sangue e armazenado em tubos contendo
anticoagulante, este foi centrifgado à 2500 rpm por um período de 10 min. Em
seguida, o sobrenadante (plasma) foi coletado sendo então armazenado em tubos
plásticos com tampa e congelados à -22ºC, por um período máximo de 3 meses.
4.1.3.2 Obtenção do Soro Sanguíneo
Depois de reservado em tubos plásticos com tampa, o sangue foi
deixado em repouso por 2 a 4 horas para que ocorresse a dessoração sanguínea e
conseqüente obtenção do soro. Em seguida os tubos foram centrifugados a 2500
rpm/10min. e o sobrenadante (soro) armazenado em tubos plásticos com tampa,
sendo posteriormente congelados à -22ºC, por 3 meses no máximo.
45
4.1.4 Análise dos Parâmetros Hematológicos dos Animais
Todas as análises sanguíneas foram determinadas através de kits
específicos e analisadas em um auto-analisador bioquímico da marca Bayer,
modelo: ADVIA 1650. A análise de glicose foi realizada no plasma e as medidas das
atividades de LDH e CK foram feitas no soro sanguíneo, por espectrofotometria.
4.1.4.1 Medida de Glicose
A glicose foi determinada segundo a técnica descrita por Kunst et al.
(1983). O nível de glicose foi avaliado pela oxidação da glicose catalisada pela
glicose oxidase com formação de peróxido de hidrogênio, o qual reagiu em seguida
com 4-aminoantipirina e fenol, sob ação catalisadora da peroxidase, formando
antipirilquinomina, de coloração vermelha, cuja intensidade de cor (490-520 nm), é
proporcional à concentração de glicose na amostra, expressa em mg/dL.
4.1.4.2 Medida da Atividade de Lactato Desidrogenase (LDH)
A atividade da LDH foi determinada através da conversão de
piruvato a lactato na presença de NADH, onde a oxidação do NADH foi verificada
em comprimento de onda de 405 nm que é proporcional à atividade da LDH na
amostra, a qual foi expressa em U/L (unidades enzimáticas/litro).
4.1.4.3 Medida da Atividade de Creatina Quinase (CK)
46
A medida da atividade de CK foi determinada segundo a técnica
descrita por Oliver (1955) e Rosalki (1967) e modificada por Tietz (1986). A N-acetil-
L-cisteína (NAC) foi incluída na reação para assegurar a total ativação da creatina
quinase no soro.
Para a análise, cada frasco do substrato do kit foi dissolvido e
homogeneizado suavemente até a completa dissolução. Então, a solução foi
incubada por 5 min. e em seguida a amostra foi adicionada e misturada suavemente
por imersão. Decorridos 3 min., a leitura da amostra foi realizada a 340 nm sendo as
leituras repetidas exatamente em 1, 2 e 3 min. após a primeira leitura, em que a
atividade de CK foi expressa em U/L.
4.1.5 Abate
Após 48h à realização do teste do halotano, 25 aves de cada grupo
(Sensível, Indefinido e Não-sensível) com 46 dias de idade, foram deixadas em
jejum alimentar por aproximadamente 10 h, e então abatidas de acordo com os
procedimentos de abate de uma planta comercial, isto é, insensibilização elétrica,
sangria, depenagem, evisceração, chiller, desossa e refrigeração (NORTHCUTT,
2001, GUARNIERI et al., 2004). As medidas de pH e cor foram determinadas após
24 h de estocagem dos filés a 4ºC (GUARNIERI et al., 2004).
4.1.6 Análises no Músculo Pectoralis major
4.1.6.1 Medida de pH final
As medidas de pH foram realizadas 24 h post mortem em duplicata
diretamente no filé com auxílio do um potenciômetro de contato Testo 205. Os
47
pontos de incisão do eletrodo foram na parte cranial ventral do filé conforme descrito
por Boulianne e King (1995) e adaptado por Olivo et al. (2001).
4.1.6.2 Medida de Cor
As medidas de cor foram realizadas 24 h post mostem na face
ventral do filé, tomando-se três pontos diferentes de leitura por amostra. Esta medida
foi utilizada utilizando um colorímetro Minolta CR 400 com iluminante D65 e ângulo
de visão de 10°. Os valores medidos foram os de L* (luminosidade), a* (componente
vermelho-verde) b* (componente amarelo-azul), expressos no sistema de cor
CIELAB.
4.1.6.2 Medida da Capacidade de Retenção de Água (CRA)
A avaliação da CRA foi realizada 24 h post mortem conforme
procedimento descrito por Hamm (1960). A amostra utilizada para esta análise foi
coletada na parte cranial do peito de frango. O procedimento foi realizado em
duplicata, onde a amostra foi cortada em cubo com um peso inicial de 2,0 g. Em
seguida, a amostra foi colocada entre dois papéis filtro e posteriormente entre duas
placas de acrílico. Este sistema foi deixado sob um peso de 10 kg por 5 min.
Finalmente, a carne foi pesada e o cálculo da média de CRA determinado utilizando
a fórmula abaixo:
CRA = 100 – (P
inicial
- P
final
x 100)
(P
inicial
)
Onde: P
inicial
e P
final
são os pesos inicial e final da carne, respectivamente.
48
4.1.6.3 Medida do valor de R
O valor de R representa a razão entre monofosfato de inosina e
trifosfato de adenosina e avalia o consumo de ATP no momento do abate. As
amostras de filés de frango foram coletadas da parte cranial do músculo Pectoralis
major aproximadamente 30 min. post mortem e congeladas em nitrogênio líquido (-
196 ºC) até realização das análises. A determinação foi realizada, em duplicata,
segundo metodologia de Honikel e Fischer (1977) em que a extração dos
nucleotídeos de 2,0 g de amostra foi obtida através de homogeneização por 30
segundos em solução de ácido perclórico 1 M, na proporção de 1:10 em p/v. A
seguir, esta foi filtrada e centrifugada por 5 minutos a 4800 rpm. Uma alíquota de 0,2
mL do sobrenadante foi diluída em 4,8 mL de tampão fosfato a 0,1 M em pH 7,0 e
lida em espectrofotômetro a 250 nm (monofosfato de inosina) e 260 nm (trifosfato de
adenosina). O tampão fosfato foi utilizado como branco e o valor de R foi calculado
como a razão entre as duas absorbâncias.
4.1.7 Classificação das Amostras
O valor de L* foi utilizado como parâmetro determinante para a
classificação dos filés, onde filés com valores de L* ≥ 53,0 foram classificados como
PSE conforme já padronizado por Soares et al. (2002). Essa classificação foi
realizada nos três grupos (Sensível, Indefinido e Não-sensível).
4.1.8 Análise Estatística
O programa STATISTICA for Windows versão 6.0 foi utilizado para a
análise dos resultados.
49
Os frangos foram classificados em três grupos: Sensível
(enrijecimento dos membros inferiores) Indefinido (enrijecimento parcial) e Não-
sensível (ausência de enrijecimento) pelo teste do halotano. O teste de médias de
Tukey a 5% de probabilidade foi aplicado para comparar as diferenças entre os três
grupos com relação às medidas de pH final, Cor (L*, a*, b*), CRA, valor de R,
concentração de glicose sanguínea, LDH e CK.
O teste t-student a 5% probabilidade foi aplicado para comparar as
diferenças entre os diferentes tempos de coleta de sangue com relação às medidas
da concentração de glicose, atividades de CK e LDH.
50
4.2 EXPERIMENTO 2: Teste do halotano aves bisavozeiras de linha fêmea do
frango comercial.
Este experimento foi conduzido com o objetivo de avaliar o efeito do
halotano como preditor de uma síndrome estressante em frangos e sua relação com
aves bisavós da linha fêmea.
O termo bisavozeiras ou bisavós é atribuído às aves que geram os
galos nas linhas machos e as galinhas nas linhas fêmeas que serão os pais das
matrizes que são responsáveis pela produção de ovos férteis dando origem ao
frango de corte. As aves bisavós de linha fêmea são selecionadas e melhoradas
geneticamente para o sistema reprodutor enquanto que bisavôs de linha macho são
melhorados geneticamente para maior rendimento muscular.
4.2.1 Animais
Os frangos machos de linha fêmea (n=298) foram criados, por uma
empresa situada no estado de Minas Gerais, até a realização do teste com o
anestésico halotano e abate, realizados na unidade experimental da Universidade de
São Paulo, campus do município de Pirassununga – FEZEA, SP.
4.2.2 Teste do Halotano
O teste do halotano foi aplicado nas mesmas condições conforme
descrito no item 4.1.2., onde a classificação dos frangos também foi realizada da
mesma forma como ilustrado na Figura 12.
51
4.2.3 Coleta de Sangue
Após 3 h da aplicação do teste do halotano, o sangue dos frangos
sensíveis, indefinidos e não-sensíveis (n=2, 11 e 15 respectivamente) foi coletado
seguindo o mesmo procedimento descrito no ítem 4.1.3. A obtenção do plasma e do
soro sanguíneo foram realizados conforme descrito nos itens 4.1.3.1 e 4.1.3.2,
respectivamente.
4.2.4 Análise dos Parâmetros Hematológicos dos Animais
As análises sanguíneas de glicose, LDH e CK seguiram os
procedimentos descritos nos itens 4.1.5.1, 4.1.5.2 e 4.1.5.3., respectivamente.
4.2.5 Abate
Após 3 h à realização do teste do halotano, 2 frangos sensíveis, 11
indefinidos e 15 não-sensíveis ao halotano, com 42 dias de idade, foram deixados
em jejum alimentar por aproximadamente 20 h em jejum, e então foram abatidos de
acordo com os procedimentos de abate de uma planta comercial, isto é,
insensibilização elétrica, sangria, depenagem, evisceração, chiller, desossa e
refrigeração (NORTHCUTT, 2001, GUARNIERI et al., 2004). O pH inicial do músculo
Pectoralis major foi realizado aproximadamente 30 min. post mortem e o pH final e
cor foram determinados após 24 h de estocagem dos filés a 4ºC (GUARNIERI et al.,
2004).
52
4.2.6 Análises no Músculo Pectoralis Major
A medida de pH inicial foi realizada aproximadamente 30 min. post
mortem diretamente no filé com auxílio do um potenciômetro de contato Texto 205.
Os pontos de incisão do eletrodo foram na parte cranial ventral do filé conforme
descrito por Boulianne e King (1995) e adaptado por Olivo et al. (2001).
As demais análises, ou seja, pH final, Cor (L*, a*, b*), CRA e valor
de R foram realizadas seguindo os procedimentos descritos anteriormente nos itens
4.1.6.1, 4.1.6.2, 4.1.6.3 e 4.1.6.4, respectivamente.
4.2.7 Classificação das Amostras
O valor de L* foi utilizado como parâmetro determinante para a
classificação dos filés, onde filés com valores de L* ≥ 53,0 foram classificados como
PSE conforme já padronizado por Soares et al. (2002). Essa classificação foi
realizada nos três grupos (sensível, indefinido e não-sensível ao halotano).
4.2.8 Análise Estatística
O programa STATISTICA for Windows versão 6.0 foi utilizado para a
análise dos resultados.
O teste de médias de Tukey a 5% de probabilidade foi aplicado para
comparar as diferenças significativas entre os três grupos (Sensível, Indefinido e
Não-sensível), com relação às medidas de pH inicial e final, Cor (L*, a*, b*), CRA,
glicose, LDH e CK.
53
4.3 EXPERIMENTO 3: Efeito do halotano e do estresse térmico como agentes
estressores nas alterações bioquímicas e na qualidade da carne de frango.
Neste experimento, foram avaliadas as ações do halotano como
agente estressor e do estresse térmico com o objetivo de verificar o impacto destes
dois parâmetros nas alterações bioquímicas e na qualidade da carne de frango.
4.3.1 Animais
Os frangos machos de linhagem comercial (n=24) foram criados na
Fazenda Escola da Universidade Estadual de Londrina – UEL até a realização do
teste com o anestésico halotano, estresse térmico e finalmente o abate.
4.3.2 Tratamentos
Os frangos foram divididos em 4 tratamentos compostos por 6
animais cada. A seguir estão apresentadas a descrição de cada um dos 4
tratamentos.
Tratamento HHH: Frangos submetidos ao teste do halotano e abatidos após 1 h de
aplicação do teste.
Tratamento HET: Frangos submetidos ao teste do halotano, estresse térmico, 48 h
após aplicação do teste e posterior abate.
Tratamento EET: Frangos submetidos ao estresse térmico e posterior abate.
54
Tratamento CCC (Controle): Frangos não foram submetidos ao teste do halotano e
nem ao estresse térmico.
4.3.3 Teste do Halotano
O teste do halotano foi aplicado nos frangos com 44 dias de idade
seguindo as mesmas condições descritas no item 4.1.2. Neste teste não foram
realizadas as classificações quanto ao enrijecimento dos membros inferiores dos
frangos.
4.3.4 Estresse térmico
O estresse térmico foi aplicado com o auxílio de um compartimento
fechado regulado à 35ºC. Os frangos foram deixados em 6 animais por vez por 1 h,
imediatamente antes do abate, no mesmo, conforme pode ser observado na Figura
14.
FIGURA 15. Câmara construída para a aplicação de estresse térmico (35ºC/1h) em
frangos.
55
4.3.5 Coleta de Sangue
As coletas de sangue foram realizadas nos frangos dos quatro
tratamentos, descritos no item 4.3.2. O sangue foi coletado da asa dos animais
(Figura 13) com o auxílio de uma seringa de 5 mL e agulha (0,7 x 2,5 mm) e
armazenado em tubos de vidro contendo anticoagulante (oxalato + fluoreto) para
análise de glicose e em tubos contendo heparina para as análises de LDH e CK, até
a posterior extração do plasma que seguiu o procedimento descrito no item 4.1.3.1.
Nos animais dos tratamentos HHH e HET, as coletas de sangue
foram realizadas 1 h após o teste do halotano, sendo que logo após a aplicação do
estresse térmico, as aves do grupo HET foram submetidas novamente à coleta de
sangue, seguidas pelas aves do tratamento ET, sendo imediatamente abatidas.
4.3.6 Análise dos Parâmetros Hematológicos dos Animais
As análises sanguíneas de glicose, LDH e CK seguiram os
procedimentos descritos nos itens 4.1.5.1, 4.1.5.2 e 4.1.5.3, respectivamente.
4.3.7 Abate
As aves do grupo controle e tratamentos H foram abatidas com 44
dias de idade. Já os frangos dos tratamentos HET e ET foram abatidos com 46 dias
de idade. O abate foi realizado de acordo com os procedimentos de abate de uma
planta comercial, isto é, insensibilização elétrica, sangria, depenagem, evisceração,
chiller, desossa e refrigeração (NORTHCUTT, 2001, GUARNIERI et al., 2004).
Neste experimento, as aves não foram deixadas em jejum.
56
4.3.8 Análises no Músculo Pectoralis major
A medida de pH inicial foi realizada aproximadamente 30 min. post
mortem diretamente no filé com auxílio do um potenciômetro de contato Testo 205.
Os pontos de incisão do eletrodo foram na parte cranial ventral do filé conforme
descrito por Boulianne e King (1995) e adaptado por Olivo et al. (2001).
As demais análises, ou seja, pH final, Cor (L*, a*, b*), CRA e valor
de R foram realizadas seguindo os procedimentos descritos anteriormente nos ítens
4.1.6.1, 4.1.6.2, 4.1.6.3 e 4.1.6.4, respectivamente.
4.3.9 Classificação das Amostras
O valor de L* foi utilizado como parâmetro determinante para a
classificação dos filés, onde filés com valores de L* ≥ 53,0 foram classificados como
PSE conforme já padronizado por Soares et al. (2002). Essa classificação foi
realizada para os 4 tratamentos.
4.3.10 Análise Estatística
O programa STATISTICA for Windows versão 6.0 foi utilizado para a
análise dos resultados.
O teste de média de Tukey a 5 % de probabilidade foi aplicado para
comparar as diferenças entre os 4 tratamentos em relação às medidas de pH inicial
e final, Cor (L*, a*, b*), CRA, valor de R, glicose, LDH e CK.
O teste t-student a 5% de probabilidade também foi utilizado, apenas
quando as comparações foram realizadas entre 2 tratamentos.
57
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1 EXPERIMENTO 1: Teste do halotano em linhagem comercial de frangos.
5.1.1 Sensibilidade ao Halotano
No presente experimento, todas as aves avaliadas pelo teste do
halotano saíram desacordadas da câmara de aplicação do teste (Figura 15), e
permaneceram neste estado por aproximadamente 2 a 3 min. demonstrando a ação
anestésica do mesmo, em que segundo Bennett (1992), a indução anestésica com
halotano pode variar entre 2 e 4 min. e a dose mínima anestésica (DAM) está em
torno de 0,85 V%.
FIGURA 16. Frangos desacordados após serem submetidos ao teste do halotano a
3 % por 5 min.
O tempo em que as aves foram avaliadas com relação à
sensibilidade ao halotano variou entre 3 e 4 min., tempo em que provavelmente as
58
aves apresentavam-se entre o 2º e 3º estágios anestésico (GUEDEL, 1951, citado
por MANSSONE, 2003) frente às reações observadas nestes animais que
apresentavam-se desacordados (inconscientes) e com respiração lenta.
O tempo de recuperação após a aplicação do teste do halotano
variou entre 2 e 3 min., resultado similar ao relatado por Bennett (1992) que
demonstrou que a recuperação pode variar entre 3 e 5 min.
A ocorrência de frangos comerciais sensíveis, indefinidos e não-
sensíveis ao halotano está ilustrada na Figura 16. Dos 352 frangos comerciais
avaliados neste experimento, 9,1 % mostraram-se sensíveis, 18,4% indefinidos e
72,5% não-sensíveis ao halotano.
FIGURA 17. Incidência de frangos sensíveis, indefinidos e não-sensíveis ao halotano
após serem submetidos ao anestésico halotano a 3% por 5 min.
Assim como em suínos, para que o teste do halotano possa ser bem
sucedido, é necessário, primeiramente, que ele seja de fácil qualificação, onde a
sensibilidade ao halotano possa ser facilmente visualizada (WHELLER et al., 1999).
Portanto, somente os animais que apresentaram completa rigidez dos dois membros
inferiores foram classificados como sensíveis ao halotano neste experimento.
A ocorrência de 9,1% de frangos sensíveis ao halotano foi similar ao
encontrado nos experimentos realizados com perus. Wheller et al. (1999)
encontraram 5 % em 120 animais avaliados. Owens et al. (2000 a,b) em dois
Sensível Intermediário Não-Sensível
72,5 %
18,4 %
9,1%
Sensível Intermediário Não-Sensível
72,5 %
18,4 %
9,1%
Indefinido
Sensível Intermediário Não-Sensível
72,5 %
18,4 %
9,1%
Sensível Intermediário Não-Sensível
72,5 %
18,4 %
9,1%
Indefinido
59
trabalhos realizados também com perus, encontraram uma incidência de animais
sensíveis ao halotano que variou de 3,5% a 10%.
Em comparação ao estudo realizado por Cavitt et al. (2004) com
frangos, este resultado, embora próximo apresentou-se menor. Os autores
encontraram uma variação de 13,2 a 22,9%, dependendo da linhagem comercial
avaliada, demonstrando uma maior sensibilidade desses animais ao halotano.
Resultado similar aos de Cavitt et al. (2004) foi encontrado por Soares et al. (2007),
que avaliando também frangos comerciais, obtiveram uma incidência de 13,6% de
aves sensíveis a este anestésico.
Essa menor incidência encontrada no presente experimento (9,1%)
pode estar relacionada à variação quanto à detecção das aves sensíveis ao
halotano. Por ser um método qualitativo, sua variação pode ser elevada, dificultando
a comparação entre um experimento e outro quando os julgadores são distintos. Em
suínos, essa sensibilidade ao halotano é bem variável, podendo alcançar 88% em
alguns casos. Porém em muitas raças essa incidência pode variar apenas de 0 a 20
% (WEBB et al., 1982), onde foi comprovado que a sensibilidade à ação do halotano
é resultado de excessivas contrações induzidas por este anestésico decorrente de
um dilúvio de íons Ca
2+
no tecido muscular, devido ao defeito no gene que codifica o
canal liberador destes íons (MICKELSON e LOUIS, 1996).
A classificação dos frangos como indefinidos ao halotano foi
primeiramente observada por Wheeler et al. (1999), que encontraram uma incidência
de 10% de perus com respostas parciais ao halotano, comparando com os dados
deste trabalho observa-se uma incidência 8,4% maior com relação à estes frangos.
Uma possível justificativa relatada pelos autores para essa resposta parcial foi de
que talvez estas aves pudessem ser mais resistentes à ação do anestésico, pois se
duas formas do receptor de rianodina estão presentes no músculo, poderia ser
possível que apenas um desses receptores fosse defeituoso. Assim, o receptor não
defeituoso poderia promover adequada regulação de íons Ca
2+
, ocorrendo então
tanto respostas negativas (ausência de sensibilidade) e parciais frente à ação do
halotano.
60
5.1.2 Avaliação do músculo Pectorallis major
5.1.2.1 Incidência de Carnes PSE
A incidência de carnes caracterizadas como PSE está ilustrada na
Figura 17. Ambos os grupos, Sensível e Indefinido ao halotano, apresentaram 40%
de carnes PSE cada, seguidos de 28% no grupo Não-sensível.
FIGURA 18. Incidência de carnes de frango com características PSE nos grupos
Sensível (a), Indefinido (b) e Não-sensível (c) ao halotano após serem submetidos
ao anestésico halotano a 3% por 5 min.
40%
60%
PSE não-PSE
Grupo Sensível
40%
60%
PSE não-PSE
Grupo Sensível
40%
60%
PSE não-PSE
Grupo Indefinido
40%
60%
PSE não-PSE
Grupo Indefinido
28%
72%
PSE não-PSE
Grupo Não-sensível
28%
72%
PSE não-PSE
Grupo Não-sensível
a
b
c
61
Essa maior ocorrência de carnes com características PSE no grupo
Sensível (Figura 17) está de acordo com a teoria tanto relatada em suínos
(MITCHELL e HEFFRON, 1982) quanto em aves (OWENS et al., 2000b). Em
recente estudo, realizado por Soares et al. (2007) com frangos comerciais, onde foi
avaliada a incidência de carnes PSE, os autores observaram que o grupo sensível
ao halotano apresentou 42,1% de filés com características PSE, resultado similar ao
encontrado neste experimento (40%).
Owens et al. (2000b) aplicaram o teste do halotano em perus para
verificar a predisposição destes animais em desenvolverem filés PSE quando
transportados antes do abate, constatando que 70% dos perus sensíveis ao
halotano apresentaram carnes com características PSE.
Quanto à ocorrência da mesma incidência de PSE nos grupos
Indefinido e Sensível, essa relação ainda não é clara em aves. Wheller et al., (1999),
embora tenham encontrado perus com respostas parciais, não chegaram a avaliar
os efeitos dos parâmetros de qualidade final da carne nestes animais. O que se
sabe até o momento é que em suínos heterozigotos, o enrijecimento dos membros
frente à ação do halotano não é estimulado na maior parte do tempo (MICKELSON e
LOUIS, 1996). Em aves, essa relação com animais heterozigotos ainda não pode ser
afirmada em decorrência do problema genético não ter sido ainda elucidado.
Entretanto, a maior incidência de carnes PSE no grupo Sensível demonstra que os
frangos apresentam sensibilidade ao halotano e o PSE possivelmente indica origem
genética, mas provavelmente diferente de suínos. Em frangos, o controle do fluxo de
íons Ca
2+
do RS é feito por duas isoformas da rianodina, a α-RYR e a β-RYR
(OTTINI et al., 1996), enquanto que este controle é realizado apenas pela isoforma
RYR1, a qual é codificada pelo gene que sofreu mutação de ponto promovendo a
falta de controle desta isoforma. Em aves, até o momento não foram encontradas
mutações similares, mas têm sido objeto de estudo (LARA, 2003; DROVAL, 20004;
ODA, 2006).
Importante salientar que não só os grupos Sensível e Indefinido ao
halotano apresentaram carnes caracterizadas como PSE. O grupo Não-sensível,
embora em uma menor quantidade, mas não baixa (28 %) (Figura 17), apresentou
também a anomalia. No trabalho de Owens et al. (2000b), além de terem encontrado
70% de carnes PSE em perus sensíveis ao halotano, observaram também que 50%
dos animais que não apresentaram sensibilidade ao anestésico, exibiram filés PSE,
62
deduzindo que o teste do halotano não seria um preditor 100 % deste fenômeno.
Portanto, o PSE também pode ser desencadeado por fatores ambientais de estresse
pré-abate, além de sua possível origem genética.
Diversos trabalhos têm demonstrado que o problema PSE pode
estar relacionado também a fatores de ordem ambiental, onde a temperatura e o
transporte são de suma importância, comprometendo a qualidade da carne
(BARBUT, 1997; BRESSAN e BERAQUET, 2002; AKSIT et al., 2006), como também
já verificado por Lara et al., 2002 e Langer et al., 2007. O mesmo pode ser
observado em suínos submetidos a uma variedade de fatores estressantes
simulando condições comerciais de pré-abate (BROW et al., 1998; BERTOL, 2005).
Esses fatores em conjunto geram um problema multifatorial difícil de ser
solucionado, porém, podendo ser amenizado quando controlado.
5.1.2.2 Avaliação dos parâmetros de detecção de carnes PSE entre os grupos
5.1.2.2.1 pH final, Cor e CRA
Estão apresentados na Tabela 1 os valores das medidas de pH final
(pH
f
), Cor (L*, a*, b*) e CRA dos filés de peito de frango dos grupos Sensível,
Indefinido e Não-sensível. Não foram encontradas diferenças significativas (p ≥ 0,05)
entre os parâmetros avaliados. A ausência de resultados distintos entre os grupos
Sensível e Indefinido e o grupo Não-sensível provavelmente deve-se ao fato de que
em todos os grupos foram observadas carnes PSE, embora no grupo Não-sensível
esta tenha ocorrido em menor quantidade.
TABELA 1. Valores médios de pH final (pH
f
), Cor (L*, a*, b*) e Capacidade de
Retenção de Água (CRA) dos filés de peito de frango 24h post mortem dos grupos
Sensível, Indefinido e Não-sensível ao halotano após serem submetidos ao
anestésico halotano a 3% por 5 min.
63
Grupos pH
f
L* a* b* CRA (%)
n = 20
Sensível
(n=25)
6,04
a
± 0,14
52,48
a
± 3,93
2,60
a
± 1,02
9,67
a
± 1,84
73,38
a
± 2,04
Indefinido
(n=25)
6,02
a
± 0,11
51,84
a
± 2,74
2,36
a
± 0,68
9,02
a
± 1,50
73,43
a
± 2,89
Não-sensível
(n=25)
6,04
a
± 0,11
51,77
a
± 2,54
2,44
a
± 0,98
9,45
a
± 1,84
73,77
a
± 3,63
Médias seguidas de letras diferentes na mesma coluna diferem entre si pelo teste Tukey a 5,0% de
probabilidade (p ≤ 0,05).
± Desvio-padrão
Wheller et al., (1999) avaliaram os valores de pH e cor (L*) 1 e 24 h
post mortem respectivamente em perus que responderam positivamente (sensíveis)
e negativamente (não-sensíveis) ao halotano. Os autores não evidenciaram
diferenças significativas tanto entre o pH 1h quanto o valor de L* 24h post mortem. O
mesmo foi encontrado por Owens et al. (2000b) que também não observaram
diferenças (p>0,05) tanto entre o pH inicial e final quanto entre o valor de L* de filés
de frangos sensíveis e não sensíveis ao halotano.
5.1.2.2.2 Valor de R
A medida do valor de R, denominada como a relação entre inosina
monofosfato (IMP) e adenosina trifosfato (ATP), diretamente relacionados ao
desenvolvimento de carnes PSE (Honikel e Fischer, 1977), está apresentada na
Tabela 2.
TABELA 2.
Valor de R de filés de frangos dos grupos Sensível, Indefinido e Não-
sensível ao halotano após serem submetidos ao anestésico halotano a 3% por 5
min.
Grupos Valor de R
64
n = 6
Sensível
1,21
a
± 0,06
Indefinido
1,20
a
± 0,03
Não-sensível
1,27
a
± 0,02
Médias seguidas de letras diferentes na mesma coluna diferem entre si pelo teste Tukey a 5,0% de
probabilidade (p ≤ 0,05).
± Desvio-padrão
Não foram observadas diferenças significativas (p ≥ 0,05) entre os
grupos, demonstrando direta relação com as demais análises avaliadas
anteriormente, que também não apresentaram diferenças (p>0,05). Segundo Honikel
(1981), quando o valor de R é igual ou superior a 1,10, indica que as carnes das
aves encontram-se em rigor mortis. O que se pode verificar, é que todos os valores
de R da Tabela 2 apresentaram-se superiores a 1,10 demonstrando que o rigor já
havia se instalado nos filés avaliados, devido ao tempo de coleta do filé ter sido
realizado em aproximadamente 30 min., pois segundo Olivo et al. (2001) e Chiang et
al. (2008) a instalação do rigor em aves ocorre por volta de 10 a 15 min.
Resultado similar a este foi observado por Soares et al. (2007)
quando avaliaram carnes PSE, normais e análogas ao DFD (Dark, Firm, Dry),
sugerindo que esses elevados valores poderiam ser uma provável explicação para a
não ocorrência de diferenças (p>0,05) entre os filés avaliados.
5.1.3 Avaliação dos Parâmetros Hematológicos dos Animais
65
Algumas análises sanguíneas são de suma importância para a
averiguação dos transtornos metabólicos relacionados ao estresse de suínos
(MITCHELL e HEFFRON, 1982). A Tabela 3 apresenta as avaliações de glicose,
realizadas no plasma, e de CK e LDH, ambas realizadas no soro sanguíneo dos
frangos testados com halotano.
A coleta de sangue 48 h após o teste do halotano foi destinada para
avaliação do efeito de possíveis fatores ambientais comuns nas práticas de manejo
pré-abate. Segundo Mitchell et al. (1999), que investigaram os efeitos da exposição
de aves ao halotano, este anestésico promove, independente da positividade das
aves ao teste, aumentos significativos nas atividades de CK e LDH permanecendo
por aproximadamente 48 h.
Embora haja relatos que indiquem maiores concentrações de glicose
sanguínea em suínos portadores da PSS e conseqüentemente, sensíveis ao
anestésico halotano (MITCHELL e HEFFRON, 1982), não foram encontradas
diferenças significativas (p ≥ 0,05) entre os três grupos (Sensível, Indefinido e Não-
sensível) quanto à sua concentração no plasma sanguíneo coletados tanto no tempo
de 3 h quanto no de 48 h após o teste do halotano (Tabela 3). Em aves, a escassez
de estudos voltados para este tipo de pesquisa dificulta concluir algo em relação a
tal resultado. O que se permite hipotisar até o presente momento é que somente a
sensibilidade ao teste do halotano não foi capaz de desencadear reações
hormonais, tais como as catecolaminas e corticosterona, que atuam liberando
glicose na corrente sanguínea das aves.
Quando a média das concentrações de glicose foi comparada entres
os diferentes tempos de coleta do plasma nas aves de cada grupo, foi possível
observar diferenças significativas (p ≤ 0,05), em que as concentrações de glicose
mostraram-se superiores no plasma coletado no tempo de 3 h (Tabela 3). A menor
concentração de glicose plasmática coletada no tempo de 48 h, provavelmente, está
relacionada ao jejum pré-abate (10 h), o qual as aves passam a utilizar suas
reservas energéticas para suprir a demanda de energia requerida para a sua
sobrevivência (MOREIRA, 2005).
TABELA 3. Concentração de glicose sanguínea e das atividades de Creatina
Quinase (CK) e Lactato Desidrogenase (LDH) dos frangos dos grupos Sensível,
Indefinido e Não-sensível ao halotano, coletados após 3 e 48 h a serem submetidos
ao anestésico halotano a 3% por 5 min.
66
ANÁLISE
TEMPOS DE
COLETA
SENSÍVEL INDEFINIDO
NÃO-
SENSÍVEL
GLICOSE
(mg/dL)
3h
(n=12)
256,2
aA
± 17,64
247,2
aA
± 13,95
249,5
aA
± 20,99
48 h
(n=12)
228,17
aB
± 21,85
212,25
aB
± 9,44
224,33
aB
± 15,94
CK (U/L)
3h
(n=12)
4606,8
aA
±1.291,1
4983,0
aA
±956,32
4914,5
aA
±1.172,8
48 h
(n=12)
3847,2
aA
±1625,9
4099,6
aA
±1833,2
4051,3
aA
±1693,1
LDH (U/L)
3h
(n=12)
2004,9
aA
±472,10
1508,8
abA
± 513,4
1390,6
bA
± 515,4
48 h
(n=12)
2081,0
aA
±782,0
1756,0
abA
± 713,8
1253,0
bA
± 519,1
Médias seguidas de letras minúsculas diferentes na mesma linha diferem entre si pelo teste Tukey a
5,0% de probabilidade (p ≤ 0,05).
Médias seguidas de letras maiúsculas diferentes na mesma coluna, entre as mesmas análises,
diferem entre si pelo teste t-student a 5,0% de probabilidade (p ≤ 0,05).
± Desvio-padrão
A atividade da enzima CK, responsável por catalisar a via mais
rápida de produção de energia na forma de ATP pela conversão de fosfocreatina à
creatina com liberação de grupamentos fosfatos (MITCHELL e HEFFRON, 1982),
não foi significativamente diferente (p ≥ 0,05) tanto entre os grupos quanto entre os
diferentes tempos de coleta do soro (Tabela 3). A similaridade entre os valores
observados pode estar relacionada ao elevado desvio-padrão encontrado, onde o
67
coeficiente de variação ultrapassou 20% em todos os grupos. Embora estudos
relacionem a atividade de CK com a PSS e também com estresse de ordem não
genética (MITCHEL E HEFFRON, 1982; MITCHELL et al., 2003) alguns autores já
demonstraram dificuldades em se encontrar diferenças significativas entre a
atividade de CK em suínos normais e susceptíveis ao estresse devido à alta
variabilidade dos resultados encontrados, sem conclusões quanto a sua causa
(NELSON et al., 1974; FÀBREGA et al., 2003).
Mitchell e Heffon (1982) atribuem a elevada variabilidade da
atividade de CK em suínos a três fatores: 1) variação diurna que pode ter um
aumento de até 50%, 2) relação com a atividade muscular e 3) idade do animal, que
segundo os autores seria a mais importante, onde a atividade máxima de CK está
relacionada com o pico do anabolismo protéico, que ocorre entre 11 e 28 semanas
de idade, tornando difícil a distinção das atividades de CK em suínos nessa faixa de
idade.
Com relação às medidas da atividade de LDH, foram observadas
diferenças (p≤ 0,05) na sua atividade quando comparando-se com os grupos
Sensível e Não-sensível ao halotano tanto para o tempo de 3h quanto para o tempo
de 48 h após o teste do halotano. A atividade desta enzima mostrou-se
aproximadamente 40 % maior nas aves do grupo Sensível do que no grupo Não-
sensível, condizendo com a maior ocorrência de carnes PSE no grupo Sensível, pois
a LDH atua catalisando a transformação de piruvato a lactato (PUOLANNE et al.,
2002). Esta enzima interfere de forma significativa sobre a qualidade final da carne,
pois ela está diretamente relacionada à rápida queda do pH da carne devido a
acelerada produção de lactato (PUOLANNE et al., 2002) levando à maior ocorrência
de carnes PSE (OLIVO e SHIMOKOMAKI, 2006). Estes resultados são semelhantes
aos evidenciados pela literatura (MITCHELL e HEFFRON, 1982; PUOLANNE et al.,
2002), onde os autores afirmam que a atividade de LDH é aumentada em resposta a
ações estressantes e também em suínos com maior susceptibilidade ao estresse.
Portanto, estes resultados indicam que o halotano é um agente identificador e
desencadeador de estresse em frangos, em decorrência das maiores atividades
observadas tanto no tempo de 3 h quanto no de 48 h após a aplicação do teste do
halotano.
Apesar da detecção de aves portadoras de uma possível síndrome
estressante pelo teste do halotano e sua relação com o fenômeno PSE estarem em
68
fases iniciais de pesquisa, estes resultados permitem evidenciar que o teste do
halotano e sua relação com a susceptibilidade ao estresse em aves tem fundamento,
uma vez que aves com sensibilidade ao halotano apresentaram maior atividade de
LDH (Tabela 3) e maior incidência de carnes PSE (Figura 17)
69
5.2 EXPERIMENTO 2: Teste do halotano em aves bisavozeiras da linhagem
fêmea do frango comercial.
5.2.1 Sensibilidade ao Halotano
A ocorrência de aves bisavozeiras da linha fêmea sensíveis,
indefinidas e não-sensíveis ao halotano está ilustrada na Figura 18. Dos 298 frangos
avaliados neste experimento, apenas 0,67 % mostraram-se sensíveis, seguidos por
3,69 % indefinidos e 95,64 % não-sensíveis ao halotano.
FIGURA 19. Incidência de frangos sensíveis, indefinidos e não-sensíveis ao halotano
após serem submetidos ao anestésico halotano a 3% por 5 minutos.
Assim como ocorreu no Experimento 1, todas as aves avaliadas pelo
teste do halotano saíram desacordadas da câmara de aplicação do teste,
permanecendo nesse estado por um tempo que variou de 2 a 3 min., comprovando
a ação anestésica do halotano (Figura 15).
Como pode ser observado na Figura 18, a incidência de frangos
sensíveis ao halotano apresentou-se muito baixa (0,67%, 2 animais) quando
comparada à incidência nos frangos de linhagem comercial que foi de 9,1% (Figura
16) e com dados de outros pesquisadores (WHELLER et al., 1999; OWENS et al.,
Sensível Indefinido Não-Sensível
95,66 %
0,67 %
3,69 %
Sensível Indefinido Não-Sensível
95,66 %
0,67 %
3,69 %
70
2000a; CAVITT et al., 2004; SOARES et al., 2007). Provavelmente, esta baixa
incidência deve-se a linha analisada ser fêmea que é desenvolvida com o objetivo
de melhorar o sistema reprodutor enquanto que os frangos da linhagem macho são
desenvolvidos para um acelerado ganho de peso e maior rendimento de carcaça e
peito (SCHEUERMANN, 2005) Existem relatos de que o melhoramento genético
para aumento de peso levaram à alterações metabólicas e algumas anomalias tais
como o PSE (OBA, et al., 2006). Portanto, hipotetiza-se que a baixa incidência de
animais sensíveis ao halotano bem como de animais classificados como indefinidos
(3,69%, 11 animais) está relacionada com a linha fêmea, possivelmente se o teste
fosse aplicado em animais de linha macho esta incidência seria maior.
Resultados relativamente baixos também foram observados no
grupo classificado como Indefinido. Apenas 11 animais (3,69%) de 298 frangos
avaliados mostraram respostas parciais frente ao halotano, resultado este menor ao
encontrado no Experimento 1 (18,4 %). O restante das aves (95,66%) não
apresentaram reações que as classificassem como sensíveis ou indefinidas ao
halotano. Assim, as mesmas foram intituladas como não-sensíveis ao anestésico.
5.2.2 Avaliação do músculo Pectoralis major
5.2.2.1 Incidência de Carnes PSE
A incidência de carnes PSE está ilustrada na Figura 19. O grupo
Sensível ao halotano não apresentou carnes caracterizadas como PSE. As
características PSE foram observadas apenas no grupo Indefinido, que apresentou 3
animais de 11 selecionados pelo teste do halotano, e no grupo Não-Sensível que
também teve 3 frangos com carnes PSE de 15 animais selecionados após o teste do
halotano. O baixo número de aves sensíveis ao halotano (n=2) dificultou a
observação de carnes com características PSE, provavelmente se um número maior
de aves apresentassem sensibilidade ao halotano seria possível a detecção e
71
caracterização de carnes PSE, semelhantemente ao ocorrido no experimento com
frangos de linhagem comercial.
0
2
4
6
8
10
12
14
16
Nº de
Frangos
Sensível Indefinido Não-sensível
Grupos
Carne PSE Carne Normal
FIGURA 20. Incidência de carnes de frango com características PSE nos grupos
Sensível, Indefinido e Não-sensível ao halotano após serem submetidos ao
anestésico halotano a 3% por 5 min.
Embora as aves da linhagem fêmea também possam apresentar
carnes PSE, frente aos resultados encontrados neste experimento, é bem provável
que elevadas incidências de carnes PSE estão mais relacionadas aos frangos
oriundos da linhagem macho, destinados ao rápido crescimento e ganho de massa
muscular (DRANSFIELD e SOSNICKI, 1999). Segundo Oba et al. (2006) a seleção
genética destas aves para ganho de massa muscular desenvolveu um aumento da
área transversal das fibras, que proporcionou o desenvolvimento de miopatias
relacionadas à qualidade da carne e também o problema PSE.
A incidência em frangos da linha macho do frango comercial com
carnes caracterizadas como PSE é preocupante, a qual vários autores têm focado
suas pesquisas para este problema. Soares et al. (2003,a), avaliando a incidência de
PSE em frangos comerciais no Brasil, encontraram 22% de carnes caracterizadas
como PSE. Outra pesquisa realizada por Woelfel et al. (2002) demonstrou que 47 %
dos filés avaliados apresentaram-se classificados como carnes PSE, demonstrando
a dimensão do problema.
72
Os manejos pré-abate e fatores ambientais também são importante
em relação à ocorrência de carnes PSE (GUARNIERI et al., 2002; LANGER et al.,
2007). Portanto, além da genética, outra possível explicação para a baixa ocorrência
de carnes PSE no presente experimento quando comparado aos estudos dos
autores citados acima, está relacionada ao tempo de jejum das aves antes do abate
que foi de aproximadamente 20 h. Esse elevado período de restrição alimentar pode
ter contribuído para a baixa reserva de glicogênio no momento do abate que
conduziu a baixa formação de ácido láctico e conseqüentemente a pH superiores e
não característicos de PSE (ROÇA e SERRANO, 1994).
5.2.2.2 Avaliação dos parâmetros de detecção de carnes PSE entre grupos
5.2.2.2.1 pH incial e final, Cor e CRA
Estão apresentados na Tabela 4 os valores das medidas de pH
inicial (pHi) e final (pH
f
), Cor (L*, a*, b*) e CRA dos filés de peito de frango dos
grupos Sensível, Indefinido e Não-sensível ao halotano.
Os três grupos avaliados sensível, indefinido e não-sensíveis ao
halotano diferiram (p ≤ 0,05) apenas com relação ao pH inicial, sendo maior para os
frangos sensíveis, seguidos pelos indefinidos e não-sensíveis. Os outros parâmetros
avaliados não diferiram (p > 0,05), possivelmente devido ao baixo número de aves
com características PSE e a baixa amostragem de animais sensíveis ao halotano.
73
TABELA 4. Valores médios de pH inicial (pH
i
) e final (pH
f
), Cor (L*, a*, b*) e
Capacidade de Retenção de Água (CRA) dos filés de peito de frango 24 h post
mortem dos grupos Sensível, Indefinido e Não-sensível ao halotano após serem
submetidos ao anestésico halotano a 3% por 5 min.
Grupos pH
i
pH
f
L* a* b* CRA
%
Sensível
(n=2)
6,86
a
± 0,14
5,90
a
± 0,12
50,28
a
± 2,28
3,05
a
± 0,13
5,30
a
± 0,37
74,22
a
± 1,19
Indefinido
(n=11)
6,35
ab
± 0,24
5,96
a
± 0,16
51,43
a
± 1,99
3,68
a
± 0,81
6,67
a
± 0,59
73,59
a
± 3,19
Não-sensível
(n=15)
6,30
b
± 0,20
5,97
a
± 0,15
51,71
a
± 1,32
4,25
a
± 1,57
6,31
a
± 1,41
75,34
a
± 3,68
Médias seguidas de letras diferentes na mesma coluna diferem entre si pelo teste de Tukey a 5,0%
de probabilidade (p ≤ 0,05).
± Desvio-padrão
5.2.3 Avaliação dos Parâmetros Hematológicos dos Animais
A Tabela 5 apresenta as avaliações de glicose, realizadas no
plasma, e de CK e LDH, ambas realizadas no soro sanguíneo dos frangos testados
com halotano.
TABELA 5. Concentração de glicose e das atividades de Creatina Quinase (CK) e
Lactato Desidrogenase (LDH) sanguíneas dos frangos dos grupos Sensível,
74
Indefinido e Não-sensível ao halotano, coletados após 3 h a serem submetidos ao
anestésico halotano a 3% por 5 min.
Grupos Glicose
(mg/dL)
CK
(U/L)
LDH
(U/L)
Sensível
(n=2)
187,0
a
± 4,24
8471,5
a
±364,2
2822,0
a
±534,6
Indefinido
(n=11)
186,6
a
± 10,80
6222,1
a
±1567,7
2724,3
a
±749,6
Não-sensível
(n=15)
169,8
a
± 19,40
7488,5
a
±2414,4
967,6
b
± 236,8
Médias seguidas de letras diferentes na mesma coluna diferem entre si pelo teste Tukey a 5,0% de
probabilidade (p ≤ 0,05).
± Desvio-padrão
As concentrações de glicose sanguínea não apresentaram
diferenças (p ≥ 0,05) entre os grupos avaliados, resultado similar ao observado no
experimento com frangos de linhagem comercial. Assim como no experimento
anterior, o que se pode observar até o presente momento é que somente a
positividade ao teste do halotano também não foi capaz de desencadear reações
hormonais que pudessem levar à maior liberação de glicose na corrente sanguínea
das aves, conforme mostrado no esquema ilustrado na Figura 6.
A atividade de CK também não mostrou diferença (p > 0,05) entre os
grupos. Entretanto, observa-se que os valores de atividade de CK da Tabela 5 são
superiores aos descritos na Tabela 3. Esta diferença pode estar relacionada à
atividade muscular elevada resultante do transporte destes animais que foi de
aproximadamente 5 h enquanto que os animais do primeiro experimento não foram
transportados. Este fator está diretamente relacionado tanto a elevadas atividades
de CK, quanto às suas elevadas variações (MITCHELL e HEFFRON, 1982;
MITCHELL et al., 2003).
75
As atividades de LDH foram menores (p ≤ 0,05) para os animais do
grupo Não-sensível ao halotano quando comparadas com dos animais dos grupos
Sensível e Indefinido, indicando que frente às ações estressantes, as aves sensíveis
e indefinidas ao teste do halotano tendem a produzir maiores concentrações de
ácido lático no músculo ocasionando a queda do pH. Porém, os valores de pH não
diferiram (p > 0,05) entre os três grupos avaliados como pode ser observado na
Tabela 4. A queda de pH não foi observada, pois estes animais permaneceram em
jejum por 20 h antes do abate, o que provavelmente ocasionou o consumo de
glicogênio não havendo substrato suficiente para atuação da LDH levando a maior
formação do ácido láctico. Outra hipótese levantada foi de que o halotano por si só
possa ser uma agente estressante capaz de desencadear reações nas aves
conduzindo a alterações bioquímicas o que será discutido com mais detalhes no
próximo capítulo.
76
5.3 EXPERIMENTO 3: Efeito do halotano e do estresse térmico como agentes
estressores nas alterações bioquímicas e qualidade da carne de frango.
5.3.1 Influência do Estresse Térmico e do Halotano sobre as características PSE.
5.3.1.1 Ocorrência de carnes PSE
Neste experimento foram avaliados os efeitos do estresse térmico
pré-abate e do halotano em frangos sobre o desenvolvimento de carnes PSE, para
tanto os frangos foram divididos em quatro tratamentos:
Tratamento HHH: Frangos (n=6) submetidos ao teste do halotano e abatidos após 1
h de aplicação do teste.
Tratamento HET: Frangos (n=6) submetidos ao teste do halotano, estresse térmico,
48h após aplicação do teste e posterior abate.
Tratamento EET: Frangos (n=6) submetidos ao estresse térmico e posterior abate.
Tratamento CCC (Controle): Frangos (n=6) não foram submetidos ao teste do
halotano e nem ao estresse térmico.
Em cada tratamento foi verificada a ocorrência de carnes com
características PSE, conforme apresentado na Figura 20. Para classificar as carnes
em PSE e não PSE foi utilizado o valor de L* conforme estabelecido por Soares et
al. (2002) e descrito anteriormente (item 4.1.7)
77
0
1
2
3
4
5
6
n
HHH HET EET Controle
Tratamento
Carne PSE Carne Normal
FIGURA 21. Ocorrência de carnes com características PSE em frangos dos
tratamentos HHH (submetidos ao teste do halotano), HET (submetidos ao teste do
halotano e ao estresse térmico - 35°C/1h - 48 h após o teste), EET (submetidos ao
estresse térmico - 35°C/1h) e Controle.
O anestésico halotano é utilizado como preditor da síndrome PSS
em suínos (MITCHELL e HEFFRON, 1982) e atualmente está sendo também
utilizado em aves como forma de prever os animais sensíveis que poderiam
desenvolver carnes com as características de PSE (WHELLER et al., 1999; OWENS
et al., 2000a,b, CAVITT et al., 2004; SOARES et al., 2007). O halotano quando
inalado por alguns animais pode levar ao aumento do metabolismo anaeróbico com
maior produção de ácido lático e calor, além da manutenção da contração muscular,
que pode ser observada pela rigidez dos membros inferiores (MITCHELL e
HEFFRON, 1982). Estes sintomas estão associados a defeitos genéticos no gene
hal que codifica a proteína rianodina responsável pelo controle do fluxo de íons Ca
2+
no RS (FUJII et al., 1991). Devido à ação do halotano em acelerar o metabolismo
dos animais a alterar a atividade de algumas enzimas tais como CK e LDH
(MITCHELL et al., 1999), foi levantada à hipótese de que este poderia atuar como
agente estressor e levar a maior produção de carnes PSE. Os resultados
apresentados indicam que o halotano realmente atuou como agente estressor, o que
pode ser constatado pelo maior número de filés PSE no tratamento HHH quando
comparados com o tratamento Controle.
78
Por outro lado, o efeito do estresse térmico sobre o
desenvolvimento de carnes PSE já vêm sendo descrito por vários pesquisadores
(OLIVO et al., 2001; BRESSAN e BERAQUET, 2002; SOARES, 2003; AKSIT et al.,
2006). Entretanto, alguns autores relatam que o estresse térmico por si só não é
capaz de determinar a ocorrência significativa de carnes PSE, sugerindo que esta
anomalia é conseqüência de uma interação de fatores ambientais e genéticos, onde
um único fator tomado isoladamente não pode caracterizar satisfatoriamente esta
síndrome (LARA et al., 2002). Os resultados mostraram que o estresse térmico
provocou o desenvolvimento de maior número de filés com características PSE
quando comparados com o controle. Realmente, os animais submetidos ao estresse
térmico apresentaram dispnéia durante o tempo em que permaneceram na câmara
térmica, permitindo-se verificar a influência da temperatura sobre o bem-estar destes
animais, como pode ser visualizado na Figura 21.
FIGURA 22. Frangos apresentando dispnéia típica durante a aplicação de estresse
térmico a 35 °C por 1 h.
Entretanto, o fato do tratamento Controle ter apresentado carnes
com as características PSE, embora em quantidade menor, demonstra que vários
fatores pré-abate podem influenciar a qualidade final das carnes e não só o estresse
térmico, mas o próprio procedimento de abate pode ser considerado um fator
estressante para os animais.
79
5.3.1.2 Avaliação dos parâmetros de detecção de carnes PSE
5.3.1.2.1 pH inicial e final, Cor e CRA
Na Tabela 6 estão apresentados os valores das medidas de pH
inicial (pHi) e final (pH
f
), Cor (L*, a*, b*) e CRA dos filés de peito de frango dos
tratamentos: HHH, HET e EET e Controle.
TABELA 6. Valores médios de pH inicial (pH
i
) e final (pH
f
), Cor (L*, a*, b*) e
Capacidade de Retenção de Água (CRA) dos filés de peito de frango dos
tratamentos.
Tratamentos pH
i
pH
f
L* a* b* CRA
%
HHH
(n=6)
6,09
a
± 0,25
5,79
b
± 0,10
53,92
a
± 2,57
3,59
a
±1,40
7,37
a
± 0,75
70,51
a
± 3,91
HET
(n=6)
6,31
a
± 0,23
5,79
b
± 0,08
53,61
a
± 0,90
3,26
a
±1,35
7,46
a
± 0,95
72,76
a
± 1,70
EET
(n=6)
6,11
a
± 0,16
5,76
b
± 0,05
53,92
a
± 2,57
2,84
a
± 0,91
7,29
a
± 1,14
70,51
a
± 3,91
CCC
(n=6)
6,25
a
± 0,25
5,92
a
± 0,09
52,00
a
± 2,78
3,01
a
± 0,84
7,08
a
± 0,79
72,78
a
± 2,08
Médias seguidas de letras diferentes na mesma coluna diferem entre si pelo teste de Tukey a 5,0%
de probabilidade (p ≤ 0,05).
± Desvio-padrão
Tratamentos: HHH (submetidos ao teste do halotano), HET (submetidos ao teste do halotano e ao
estresse térmico - 35°C/1h - 48 h após o teste), EET (submetidos ao estresse térmico - 35°C/1h) e
Controle.
80
Dos parâmetros avaliados apenas o pH final diferiu
significativamente (p ≤ 0,05) entre o controle e os demais tratamentos. O menor pH
observado nos filés de frango dos tratamentos HHH, HET e EET está relacionado
com o estresse destes animais que levaram a maior produção de ácido lático e
consequentemente a maior ocorrência de PSE, conforme constatado na Figura 20.
O valor de L* geralmente está relacionado com o pH, quanto menor o pH maior a
luminosidade, ou seja, mais pálido apresenta-se o filé (SOARES, 2003; ODA,
2006). A CRA não diferiu significativamente entre os tratamentos, resultado
semelhante foi descrito por Lara et al. (2002).
5.3.1.2.2 Valor de R
A medida do valor de R, denominada como a relação entre inosina
monofosfato (IMP) e adenosina trifosfato (ATP), para os tratamentos HHH, HET,
EET e controle, está apresentada na Tabela 7.
Conforme já relatado anteriormente, valores de R superiores a 1,10
demonstram a instalação de rigor mortis e a presença do fenômeno PSE no filé
(HONIKEL, 1981). Embora os valores de R estejam todos superiores a 1,10 foi
possível evidenciar diferenças (p ≤ 0,05) entre os filés do tratamento controle e os
tratamentos HET e EET. As aves que sofreram ação do estresse térmico (HET e
EET) apresentaram maiores valores (p ≤ 0,05) do que o grupo controle
demonstrando que os frangos destes tratamentos apresentaram estágios mais
elevados de rigor mortis, com maior produção de IMP e conseqüentemente menores
concentrações de ATP (HONIKEL e FISCHER, 1977).
81
TABELA 7. Valor de R de filés de frango dos tratamentos.
Tratamentos Valor de R
HHH
(n=2)
1,15
ab
± 0,06
HET
(n=4)
1,18
a
± 0,03
EET
(n=4)
1,22
a
± 0,02
Controle
(n=4)
1,11
b
± 0,02
Médias seguidas de letras diferentes na mesma coluna diferem entre si pelo teste Tukey a 5,0% de
probabilidade (p ≤ 0,05).
± Desvio-padrão
Tratamentos: HHH (submetidos ao teste do halotano), HET (submetidos ao teste do halotano e ao
estresse térmico - 35°C/1h - 48 h após o teste), EET (submetidos ao estresse térmico - 35°C/1h) e
Controle.
Estes resultados corroboram com o relatado por Bressam e Araújo
(2003), onde os autores afirmam que as aves submetidas, no pré-abate, ao excesso
de calor apresentam aceleração da glicólise e hidrólise de ATP, entretanto, em
temperaturas ambientais baixas essa evolução é retardada. Resultados similares
também foram encontrados por Bressan e Beraquet (2002), onde o tratamento com
temperatura em torno de 30ºC foi suficiente para promover maior valor de R em filés
quando comparados aos peitos dos frangos submetidos à temperatura de 17ºC.
Por outro lado, os filés do tratamento HHH apresentaram valores de
R similares aos demais tratamentos, indicando que o halotano não influenciou tanto
quanto o estresse térmico na hidrólise do ATP.
82
5.3.2 Avaliação dos Parâmetros Hematológicos dos Animais
A Tabela 8 apresenta a concentração de glicose sanguínea e das
atividades de CK e LDH dos frangos dos tratamentos HHH, HET, EET e Controle.
TABELA 8.
Concentração de glicose sanguínea e das atividades de Creatina
Quinase (CK) e Lactato Desidrogenase (LDH) dos frangos dos tratamentos.
Tratamentos Glicose
(mg/dL)
CK
(U/L)
LDH
(U/L)
HHH
(n=6)
238,3
a
± 3,33
4458,3
a
±1625,8
1386,8
a
±214,7
HET
(n=6)
231,3
a
± 10,15
5116,0
a
±1976,3
1127,3
a
±175,5
EET
(n=6)
237,8
a
± 10,80
3629,5
a
±1464,4
1053,4
a
±121,9
Controle
(n=6)
245,3
a
± 25,54
5585,3
a
±2088,9
1299,3
a
± 276,6
Médias seguidas de letras diferentes na mesma coluna diferem entre si pelo teste Tukey a 5,0% de
probabilidade (p ≤ 0,05).
± Desvio-padrão
Tratamentos: HHH (submetidos ao teste do halotano), HET (submetidos ao teste do halotano e ao
estresse térmico - 35°C/1h - 48 h após o teste), EET (submetidos ao estresse térmico - 35°C/1h) e
Controle.
As concentrações de glicose e as atividades de CK e LDH não
diferiram (p ≥ 0,05) entre os tratamentos. O emprego de tubos contendo heparina
(anticoagulante) neste experimento tinha o objetivo de diminuir a variação das
atividades enzimáticas encontradas nos experimentos anteriores, pois como a
dessoração do sangue era demorada e bem variável, imaginava-se que este tempo
83
oscilante estivesse influenciando sobre as medidas das atividades tanto de CK
quanto de LDH. Entretanto, mesmo em condições mais controladas e com tempos
de extração mais próximos, o elevado desvio-padrão permaneceu, sendo
característico do tipo de análise enzimática conforme constado por outros autores
(NELSON et al., 1974; FÀBREGA et al., 2003).
Mitchell et al. (1999) monitoraram a concentração de glicose e das
atividades de CK e LDH no plasma sanguíneo de aves após a aplicação do teste do
halotano por um período de 48 h e as compararam com o grupo controle (sem teste
do halotano). Os autores também não observaram diferenças (p > 0,05) entre as
concentrações de glicose, porém as atividades de ambas as enzimas apresentaram-
se diferentes (p ≤ 0,05) em comparação ao grupo controle, onde a maior atividade
de ambas esteve entre o período de 1 e 6 h após a aplicação do teste do halotano.
Para avaliar precisamente a influência do estresse térmico sobre os
parâmetros sanguíneos avaliados, a concentração de glicose e as atividades de CK
e LDH foram estimadas nos mesmos animais, ou seja, antes (Controle 2) e após à
aplicação do estresse térmico (ET 2). A seguir são apresentadas na Tabela 9, as
concentrações de glicose e as atividades de CK e LDH sanguíneas das aves antes.
O estresse térmico não afetou de forma significativa as aves a ponto
de promoverem alterações tanto nos teores de glicose quanto nas atividades de CK
e LDH, quando comparadas com as aves do tratamento Controle 2.
84
TABELA 9. Concentração de glicose e das atividades de Creatina Quinase (CK) e
Lactato Desidrogenase (LDH) sanguíneas dos frangos dos tratamentos.
Tratamentos Glicose
(mg/dL)
CK
(U/L)
LDH
(U/L)
Controle 2
(n=6)
238,7
a
± 17,92
3751,5
a
±1748,2
1307,2
a
±231,8
ET 2
(n=6)
237,8
a
± 12,84
3629,5
a
±1464,4
1053,4
a
±121,9
Médias seguidas de letras diferentes na mesma coluna diferem entre si pelo teste t-student a 5,0%
de probabilidade (p ≤ 0,05).
± Desvio-padrão
Tratamentos: HHH (submetidos ao teste do halotano), HET (submetidos ao teste do halotano e ao
estresse térmico - 35°C/1h - 48 h após o teste), EET (submetidos ao estresse térmico - 35°C/1h) e
Controle.
As ações do halotano e do estresse térmico foram avaliadas nos
mesmos animais para verificar qual dos dois fatores apresentava maior influência
sobre os parâmetros sanguíneos avaliados. O tratamento com halotano (HH 3) foi
realizado 48 h antes de submeter as mesmas aves ao estresse térmico (ET 3). A
comparação entre os resultados obtidos está apresentada na tabela 10.
Houve diferenças (p ≤ 0,05) entre os níveis de glicose, em que os
frangos submetidos ao teste do halotano (tratamento HH 3) apresentaram maiores
concentrações, comprovando a ação deste anestésico como agente estressor.
Essa ação se reflete sobre os hormônios do estresse, neste caso, sobre as
catecolaminas e a corticosterona que atuam em situações estressantes suprindo as
demandas de energia com o objetivo de manter a homeostasia do animal.
85
TABELA 10. Concentração de glicose sanguínea e das atividades de CK e LDH dos
frangos dos tratamentos.
Grupos Glicose CK LDH
HH 3
(n=6)
247,4
a
± 11,70
5434,0
a
±1752,6
1445,3
a
±164,78
ET 3
(n=6)
231,3
b
± 10,15
5116,0
a
±1976,6
1127,3
b
±175,53
Médias seguidas de letras diferentes na mesma coluna diferem entre si pelo teste t-student a 5,0%
de probabilidade (p ≤ 0,05).
Tratamentos: HHH (submetidos ao teste do halotano), HET (submetidos ao teste do halotano e ao
estresse térmico - 35°C/1h - 48 h após o teste), EET (submetidos ao estresse térmico - 35°C/1h) e
Controle.
A atividade de LDH também foi mais elevada (p ≤ 0,05) nos frangos
do tratamento HH 3, demonstrando que além de alterações hormonais, o halotano
pode interferir de forma significativa sobre a atividade da LDH promovendo uma
aceleração na transformação de piruvato a lactato, o que leva a um rápido declínio
do pH muscular em temperaturas ainda elevadas, prejudicando o bem-estar animal
e conseqüentemente a qualidade da carne pela maior ocorrência de carnes PSE.
Não foram encontradas diferenças (p > 0,05) nas atividades de CK,
provavelmente em relação ao elevado desvio-padrão, como mencionado nos
experimentos anteriores.
86
6 DISCUSSÃO GERAL
Há diversos fatores ante mortem e post mortem que originam as
carnes PSE em frangos (ALVARADO e SAMS, 2004). Porém, assim como em perus,
a seleção genética para maior ganho de peso contribuiu para o aumento de
anormalidades em frangos refletindo-se na qualidade da carne (OBA et al., 2006).
Evidências estas que puderam ser observadas neste trabalho.
A relação do halotano com a mutação no gene ryr1, responsável por
codificar a proteína RyR1 em suínos (FUJII et al., 1991), permite hipotisar que o PSE
em frangos tem origem genética e pode não ser apenas decorrente de fatores
ambientais ou práticas inadequadas de manejo pré-abate, devido à similaridade da
reação das aves frente à aplicação do teste do halotano. Além disso, foi possível
observar uma maior ocorrência de carnes PSE nos animais sensíveis ao halotano,
bem como algumas alterações nos parâmetros sanguíneos avaliados, corroborando
com a teoria de que este anestésico é um preditor da susceptibilidade ao estresse e
conseqüentemente do desenvolvimento de carnes PSE. Portanto, o PSE em frangos
possivelmente tem origem genética, embora ainda não esteja totalmente
esclarecida.
Em frangos existem duas isoformas da proteína RyR, a α e β RyR,
que controlam o fluxo de íons Ca
2+
no RS do músculo esquelético equivalentes às
formas RyR1 e RyR2 em suínos, respectivamente (OTTINI et al., 1996). É provável
que a origem genética do PSE em aves não esteja na mesma região que a mutação
de ponto encontrada no gene hal em suínos, além disso, pode ser que mais de uma
mutação possa ter ocorrido, o que justifica o fato de que em frangos apesar da
existência da sensibilidade ao halotano a sua relação com o desenvolvimento de
carnes PSE é menor que em suínos, ou seja, em suínos praticamente todos os
animais sensíveis ao halotano desenvolvem carnes com características PSE
enquanto que em frangos a incidência de PSE em animais sensíveis ao halotano
está ao redor de 40 % (MITCHELL e HEFFRON, 1982; OWENS et al., 2000b;
SOARES et al., 2007). Assim, o fenômeno PSE em frangos é influenciado por outros
fatores do manejo pré-abate o que pôde ser constatado pela ocorrência de filés PSE
nos animais não-sensíveis ao halotano (experimentos 1 e 2).
87
Foi verificada uma maior sensibilidade ao halotano pelos frangos de
linha macho comercial, uma vez que as aves bisavozeiras de linha fêmea quase não
demonstraram sensibilidade ao teste do halotano. Este fato deve-se provavelmente
que a sensibilidade ao halotano em frangos e o fenômeno PSE estão relacionados
com a seleção genética que propiciaram o desenvolvimento do frango moderno com
um rápido ganho de peso em curto espaço de tempo levando à anormalidades
nestes animais e conseqüentemente na qualidade de suas carnes.
O anestésico halotano também mostrou ser um agente estressor em
frangos quando aplicado antes do abate dos animais conduzindo a alterações tanto
musculares quanto sanguíneas em aves e ao desenvolvimento de carnes PSE,
conforme constatado no experimento 3.
Foi observado que o estresse térmico é um importante fator do
manejo pré-abate para o desenvolvimento de filés PSE, promovendo alterações
musculares e sanguíneas em frangos semelhantes às desencadeadas pelo halotano
(experimento 3).
88
7 CONCLUSÃO
Os frangos demonstraram sensibilidade ao halotano através do
enrijecimento dos seus membros inferiores assim como observado em suínos e
perus, sendo que animais sensíveis apresentaram maior ocorrência de filés PSE,
comprovando assim o seu efeito como preditor de carnes PSE. Além disso, o
halotano mostrou ser uma agente estressor desencadeando alterações nos
parâmetros hematológicos e no músculo das aves, semelhantes às desencadeadas
pelo estresse térmico pré-abate.
89
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