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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
FFCLRP - DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA COMPARADA
“Citoesqueleto, motores moleculares e translocação pigmentar em
cromatossomos ovarianos do camarão
Macrobrachium olfersii
(Crustacea,
Decapoda)”
Fernanda Tinti Bell
Orientador: Prof. Dr. John Campbell McNamara
Dissertação apresentada à
Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de
Ribeirão Preto da USP, como parte das
exigências para a obtenção do título de Mestre
em Ciências, Área: Biologia Comparada
RIBEIRÃO PRETO -SP
2008
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1
Bell, Fernanda Tinti
Citoesqueleto, motores moleculares e translocação
pigmentar em cromatossomos ovarianos do camarão
Macrobrachium olfersii (Crustacea, Decapoda).
Ribeirão Preto, 2008.
56 p.
Bibliografia: p.
Dissertação apresentada ao PPG em Biologia
Comparada, Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de
Ribeirão Preto, USP.
Orientador: Prof. Dr. John Campbell McNamara
1. Cromatóforos 2. Translocação pigmentar 3.
Nucleotídeos cíclicos 4. Cálcio 5. Citoesqueleto
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2
Mestre: aquele que é perito ou versado numa
ciência ou arte;
aquele que tem algo a ensinar.
(Novo Dicionário da Língua Portuguesa,
Aurélio B.H. Ferreira, Ed. Nova Fronteira, 1975)
.
3
Ao
John
e ao
Max,
por não permitirem que eu desistisse dos meus sonhos.
4
Índice
Agradecimentos 5
Resumo 7
Abstract 9
1. Introdução 11
2. Objetivo 21
3. Material e métodos 22
3.1. Coleta e manutenção dos camarões 22
3.2. Preparação do ovário 22
3.3. Soluções fisiológicas 23
3.4. Protocolos Experimentais 23
3.5. Obs. da preparação e quantificação da translocação pigmentar 25
3.6. Análise quantitativa dos experimentos fisiológicos 26
3.6.1. Transformação dos dados em porcentagem de dispersão e
velocidade de translocação pigmentar
27
3.6.2. Ajuste do grau de dispersão pigmentar a uma função sigmóide 27
3.6.3. Análise estatística dos dados 27
3.7. Microscopia de Fluorescência para demonstrar o citoesqueleto de
actina nos cromatóforos 28
4. Resultados 30
5
4.1. Estabelecimento da resposta padrão à perfusão com hormônio de
agregação do pigmento vermelho (RPCH) 30
4.2. Envolvimento das cascatas de sinalização por AMPc e GMPc na
agregação pigmentar 32
4.2.1. Toxina do Cólera - ativador da Adenilil Ciclase (aumenta a
concentração de AMPc citosólico) 33
4.2.2. Zaprinast – inibidor da GMPc fosfodiesterase (aumenta a
concentração de GMPc citosólico)
33
4.3. Inibição do influxo de cálcio pelo bloqueio de canais de cálcio da
membrana plasmática 35
4.3.1. Gabapentina – inibidor de canal de cálcio do tipo-L 35
4.3.2. W-conotoxina MVIIC – inibidor de canal de cálcio do tipo-P/Q 35
4.4. Alteração do estado de polimerização do citoesqueleto 37
4.4.1. Taxol – estabilizador de microtúbulos 36
4.4.2. Faloidina-FITC – ligante à actina 37
4.5. Análise da dispersão pigmentar espontânea 39
4.6. Microscopia de Fluorescência dos cromatóforos ovarianos 41
5. Discussão 44
5.1. A participação de nucleotídeos cíclicos na cascata de sinalização 44
5.2. Participação do cálcio extracelular 45
5.3. O citoesqueleto e os motores moleculares 48
6. Bibliografia 53
6
Agradecimentos
Agradeço ao Prof. Dr. John Campbell McNamara pela orientação e
pela ótima convivência nos anos de iniciação científica e mestrado. Agradeço
não só pelos ensinamentos referentes à vida acadêmica, mas também por
aquilo que me foi ensinado para a vida.
Agradeço a Márcia Regina Ribeiro e Robert Tew Boyle, que através de
conversas e estudos anteriores nortearam grande parte das decisões
necessárias para o desenvolvimento deste trabalho. Agradeço ainda à
Márcia por todo o apoio e atenção, que desde a iniciação científica tem
ajudado a delinear a minha
persona científica.
Agradeço ao Departamento de Biologia e a toda Faculdade de
Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto pela possibilidade de realização
do trabalho.
Agradeço ao programa de Pós-Graduação em Biologia Comparada, nas
pessoas do coordenador Profa. Dra. Márcia Gentile Bitonti e da secretária
Renata Cavalari Andrade.
Agradeço ao CAPES/CNPq pelo apoio em forma de bolsa.
Agradeço ao CEBIMar e aos motoristas que me levaram e apoiaram
durante as coletas, em especial ao Sr. Bíscaro que sempre transformava as
viagens em momentos agradáveis de bate papo.
Agradecemos a Profª Elza Tiemi Sakamoto Hojo, do Laboratório de
Mutagênese, do Departamento de Biologia, da Faculdade de Filosofia,
Ciências e Letras de Ribeirão Preto pelo uso do microscópio de
Fluorescência.
7
Agradeço à técnica do laboratório Susie Keiko, pelo apoio técnico e
pelas conversas amigáveis. Também agradeço ao meu colega de laboratório
Rogério Oliveira Faleiros, cujo apelido
Capeta
revela algo sobre seu
comportamento e que é, sem dúvida, uma companhia bastante agradável e
descontraída. Agradeço também à Sarah Milograna e Cláudia Dói Antunes
pela agradável companhia e pelas conversas. Agradeço ainda à Alessandra
Augusto pela amizade e companhia no laboratório, embora por um breve
período.
Enfim agradeço à minha família que sempre apoiou todos os meus
passos e em especial ao meu marido Max e à minha filha, Giovanna, que
não permitiram outra coisa, senão que eu chegasse até aqui.
8
Resumo
Pressões seletivas têm conferido aos organismos a capacidade de se
alterar a sua coloração corporal em resposta ao ambiente em que se
encontram, assim como os crustáceos. Essa alteração acontece pela
translocação de grânulos de pigmento no interior de conjuntos de células
especializadas, chamadas cromatossomos. A regulação do movimento se dá
pela ação de neuropeptídeos antagonistas, sendo o Hormônio de Agregação
do Pigmento Vermelho (RPCH) o indutor da agregação desse e de outros
pigmentos escuros. O acoplamento do RPCH ao seu receptor desencadeia
cascatas de eventos intracelulares que ativam motores moleculares
associados ao citoesqueleto. Neste trabalho, pretendeu-se analisar a
participação dos nucleotídeos cíclicos AMPc e GMPc, dos canais de cálcio da
membrana plasmática operados por voltagem dos tipos -L e -P/Q nas
cascatas de sinalização e dos elementos do citoesqueleto, microtúbulos e
microfilamentos, visando avaliar seu papel na translocação de grânulos de
pigmento. A agregação dos grânulos pigmentares em cromatóforos ovarianos
de Macrobrachium olfersii parece relacionar-se à alta concentração de
GMPc, embora os resultados com o uso de Zaprinast não tenham
demonstrado essa participação claramente. Já a dispersão dos grânulos de
pigmento, assim como a inibição da agregação completa, parece relacionar-
se a um aumento de AMPc, como observado pelo uso de Toxina do Cólera.
Vários estudos demonstraram a dependência do Ca
2+
para a agregação
pigmentar em crustáceos. Em geral, a concentração citosólica de Ca
2+
livre
dos cromatóforos é mantida baixa, em torno de 10
-9
M, por um complexo
Equilíbrio Dinâmico estabelecido entre os mecanismos de influxo e efluxo do
9
íon nas células. A concentração de Ca
2+
citosólico pode aumentar devido ao
influxo decorrente da ação dos canais de cálcio de membrana plasmática ou
via liberação regulada por receptor de fontes intracelulares. No intuito de
avaliar a participação dos canais de cálcio de membrana na translocação
pigmentar, testaram-se os bloqueadores de canais tipo-L, a Gabapentina, e
tipo-P/Q, a ω-conotoxina MVIIC e verificou-se que os primeiros estão
presentes na superfície celular, embora não sejam a principal via de entrada
do Ca
2+
nestas células. Entretanto é necessária a entrada inicial de Ca
2+
do
meio extracelular para desencadear o processo de agregação pigmentar
induzida por RPCH, e a principal via são os canais de cálcio do tipo -P/-Q.
Estes, quando bloqueados, modificam o perfil de agregação e impedem que
esta se complete, sugerindo, ainda, que um aumento da concentração
citosólica de cálcio livre é originada pelo retículo endoplasmático, bem
desenvolvido neste tipo celular, por um mecanismo chamado Liberação de
Cálcio Induzida por Cálcio.
O movimento rápido da massa pigmentar parece estar relacionado
com os microtúbulos, já que o uso do Taxol interferiu no processo de
agregação, enquanto que a fase lenta da agregação parece estar envolvida
com os microfilamentos, embora a Faloidina-FITC não tenha interferido na
translocação pigmentar, provavelmente, devido ao seu sítio de ligação que
pode ser diferente do local onde se ligam as miosinas, para o transporte do
cargo. Foi possível identificar microfilamentos no interior de cromatóforos,
nas imagens obtidas por microscopia de fluorescência, embora eles tenham
sido observados em sua maioria nas células circunvizinhas, neste trabalho,
e em estudos anteriores, pela microscopia eletrônica de transmissão.
10
Abstract
Selective pressures have conferred on organisms the capability of
altering their body coloring in response to the environment in which they
find themselves; crustaceans too. This alteration occurs by the translocation
of pigment granules within the specialized cell array called chromatosomes.
The regulation of movement occurs by means of antagonistic neuropeptides,
where Red Pigment Hormone Aggregation (RPCH) is the aggregation inducer
of this and other dark pigments. The coupling of RPCH to its triggers
intracellular events which activate molecular motors associated with the
cytoskeleton. In this work we intended to analyze the participation of AMPc
and GMPc nucleotides, of the plasmatic membrane calcium operated by
voltage L-type and P/Q-type in the signalling cascade and the cytoskeleton,
microtubule and microfilament elements, to better relieve its role in the
translocation of pigment granules. The aggregation of pigment granules in
ovarian chromotossomes of
Macrobrachium olfersii
seems to be related to the
high GMPc concentration, although the results with the use of Zaprinast
have not clearly demonstrated this participation. But the dispersion of
pigment granules, as well as the inhibition of complete aggregation seems to
be related to an increase in AMPc, as observed by the use of Cholera Toxin.
Several studies demonstrate the dependence on Ca
2+
for the pigmentary
aggregation in crustaceans. In general, the cytosolic concentration of
Ca
2+
free from chromatophores is kept low, around 10
-9
M, by a Dynamic
Balance complex established between the ion influx and eflux mechanisms
in the cells. The cytosolic Ca
2+
concentration may increase due to the
consequent influx of the calcium channels of the plasmatic membrane or by
11
the regulated liberation by the receptor of the intracellular sources. With the
intention of evaluating the participation of the calcium channels in the
pigmentary translocation membrane, the type-L, type P/ Q, Gabapentine
and ω-conotoxin MVIIC channel blockers were tested and it was found that
the first are present on the cell surface, although they are not the main Ca
2+
entranceway into these cells.
12
1. Introdução
Pressões seletivas têm conferido aos organismos a capacidade de se
alterar a coloração corporal de acordo com os substratos em que se
encontram, como visto nos crustáceos. Essa mudança de cor possibilita
camuflagem, sinalização de alerta, ocupação territorial, indicativo de
receptividade para o acasalamento e, em alguns caranguejos terrestres, a
regulação térmica (Rao, 1985).
De maneira geral, a adaptação cromática em crustáceos se faz por
dois mecanismos: (i) cromogênico ou ‘morfológico’, de longa duração, que
depende da quantidade e do tipo de pigmento no interior dos cromatóforos
e/ou do número de cromatóforos por unidade de área, e (ii) cromomotor ou
‘fisiológico’, rápido, que depende do estado agregado ou disperso dos
grânulos de pigmento no interior de efetuadores pigmentares.
A alteração rápida da coloração corporal se dá, principalmente, pelo
movimento de grânulos de pigmento pelo citosol dos efetuadores
pigmentares chamados cromatossomos. Estes são compostos por conjuntos
de 2 a 12 células, irregulares e intimamente justapostas, dotadas de uma a
duas extensões celulares, os cromatóforos (McNamara, 1981). Estes
localizam-se na epiderme e nas cápsulas fibrosas de órgãos como o ovário,
hepatopâncreas, sistema digestivo e cordão nervoso ventral. Além dos
grânulos de pigmento que variam em composição química, tamanho e cor
(Elofsson & Hallberg, 1973), os cromatóforos possuem feixes de
microtúbulos abundantes, (Chassard-Bouchaud & Hubert, 1971; Elofsson
& Kauri, 1971; Robson & Charlton, 1973), microfilamentos (Ribeiro &
McNamara, 2001), retículo endoplasmático liso bem desenvolvido, retículo
13
endoplasmático rugoso, mitocôndrias, partículas de glicogênio, ribossomos
livres, polissomos e lisossomos (McNamara, 1980; McNamara & Moreira,
1983).
O transporte e o resultante estado de distribuição dos grânulos de
pigmento nos cromatóforos são regulados por neurohormônios peptídicos,
as cromatoforotropinas (Rao, 1985). O Hormônio Agregador do Pigmento
Vermelho (RPCH) induz translocação dos grânulos de pigmento das
extensões celulares até o pericário, enquanto que o Hormônio Dispersor do
Pigmento Vermelho (RPDH), antagonista, promove o transporte dos grânulos
pelas extensões (Rao, 1985; Fingerman, 1987). O RPCH é um hormônio
peptídico apolar de oito aminoácidos [pGlu-Leu-Asn-Phe-Ser-Pro-Gly-Trp-
NH
2
] (Josefsson, 1983), ativo in vivo na faixa de 2 a 50 picogramas
(Josefsson, 1975). O Hormônio de Dispersão do Pigmento Vermelho (RPDH),
um octadecapeptídeo, apresenta duas isoformas, α e β, isolados a partir dos
pedúnculos ópticos de Pandalus borealis (Fernlund, 1976) e dos gânglios
ópticos de Uca pugilator, respectivamente (Rao, 1985; Fingerman, 1987).
Entre outras fontes como os órgãos pós-comissurais, estes neuropeptídeos
são sintetizados nos pericários de células neuroendócrinas do Órgão-x e
armazenadas nos botões terminais, sendo liberadas à hemolinfa pela
glândula do seio (Fingerman, 1987, 1997). Este é o principal órgão
neuroendócrino dos crustáceos, responsável por regular diversas atividades
metabólicas (Nicholas
et al.
, 2001). No caso das cromatoforotropinas, a
liberação decorre do monitoramento da
Taxa de albedo
, ou seja, da razão
entre a iluminação incidente sobre a parte superior dos pedúnculos ópticos
14
e a luz refletida pelo substrato que atinge a região inferior destes (Rao,
1985).
O acoplamento de neurohormônios peptídicos a receptores específicos
na membrana plasmática de células alvo transduz um sinal externo a essa
membrana ao interior celular, desencadeando respostas intracelulares em
cascata (Alberts
et al
., 1994). Entre as principais vias de sinalização
conhecidas são as que envolvem como segundos mensageiros os
nucleotídeos cíclicos Adenosina Monofosfato cíclico (AMPc), a Guanosina
Monofosfato cíclico (GMPc), o Inositol Trisfosfato e o Diacilglicerol (IP
3
e
DAG), e como terceiro mensageiro o Cálcio ionizado (Ca
2+
) (Hunter, 2000).
Os nucleotídeos cíclicos AMPc e GMPc ativam as proteínas cinases A e G,
respectivamente (Wong & Garbers, 1992), e estas por sua vez, fosforilam
diferentes proteínas substratos, incluindo canais iônicos e proteínas
motoras. Ainda, o GMPc ativa fosfodiesterases, Ca
2+
-ATPases e promove
diretamente a abertura de canais iônicos (Wong & Garbers, 1992; Lincoln &
Cornwell, 1993). O DAG ativa a proteína cinase C quando inserida na
membrana plasmática (Berridge, 1993; Hunter, 2000; Carafoli, 2002),
envolvida na translocação pigmentar nos cromatóforos ovarianos do
camarão de água doce
Macrobrachium olfersii
(Bell
et al
., 2004).
Em cromatóforos de crustáceos palemonídeos, como em
M. olfersii
, a
PKA ativada leva à dispersão da massa pigmentar (Bell
et al
., 2005) como
também faz o AMPc exógeno (Nery & Castrucci, 1998). O Ca
2+
também é um
importante fator na agregação pigmentar induzida por RPCH nessa espécie
(McNamara & Ribeiro, 2000; 2007).
15
De modo geral, a concentração citosólica de Ca
2+
livre é mantida baixa
nas células, em torno de 10
-9
M, e sua participação nos processos
intracelulares se dá através de um complexo Equilíbrio Dinâmico, um
balanço entre os mecanismos que possibilitam sua entrada, tamponamento
e saída. Ainda, algumas organelas podem atuar como estoques
intracelulares de cálcio, como as mitocôndrias e o retículo endoplasmático
liso. Estas organelas, por sua vez, podem ser estimuladas por cascatas de
sinalização a liberarem este cálcio para o citosol e assim desencadear algum
tipo de resposta.
O aumento da concentração do cálcio citosólico nas células
pigmentares leva a agregação da massa pigmentar em peixes (Luby-Phelps
& Porter, 1982; McNiven & Ward, 1988; Kotz & McNiven, 1994) e crustáceos
(Nery & Castrucci, 1997; McNamara & Ribeiro, 2000; 2007), e à dispersão,
em anfíbios (Castrucci, 1980) e em répteis (Hadley, 1987). A agregação da
massa pigmentar em eritróforos (Kotz and McNiven, 1994; Oshima
et al
,
1988) e melanóforos (Oshima
et al
, 1988) de peixe é induzida pelo aumento
da concentração de Ca
2+
intracelular
(Kotz and McNiven, 1994). No
quelicerado
Limulus
, injeção de EGTA, um agente responsável por
seqüestrar o cálcio livre intracelular, diminuiu a capacidade de adaptação à
luz (Brown, 1977).
Dentre os mecanismos de entrada de cálcio na célula, está o gradiente
eletroquímico favorável, ocasionado pela elevada concentração extracelular
do íon na faixa de milimolar, que depende da participação dos canais de
cálcio. Os canais de cálcio da membrana plasmática podem ser de dois
tipos, de acordo com a maneira como suas atividades são controladas: (i)
16
canais operados por voltagem (VOCs), encontrados inicialmente em células
excitáveis como as nervosas, endócrinas ou musculares, e regulados por
sistemas mediados por receptores e mensageiros intracelulares, como o
AMPc, por exemplo; e (ii) canais operados por receptores (ROCs), ativados
pela ligação de agonistas extracelulares, como o receptor NMDA ativado por
glutamato, por exemplo. Existem ainda os receptores/canais de cálcio
situados na membrana de certas organelas que podem atuar como estoques
do íon (Heldin & Purton, 1996).
Os canais operados por voltagem incluem canais de sódio, potássio e
cálcio, sendo estes últimos a maior rota de fluxo de cálcio através da
membrana plasmática. Existem seis classes de canais de cálcio (L, N P, Q, R
e T) operados por voltagem, que estão diferencialmente distribuídos de
acordo com o tipo celular e sua localização. Podem ser distinguidos por
características eletrofisiológicas, farmacológicas e estruturais. O canal de
cálcio operado por voltagem se constitui em um hetero-multímero composto
pelas subunidades α
1,
α
2
-δ e β, e em músculo esquelético, também pela
subunidade γ. A subunidade α
1
é a maior unidade funcional do canal,
possuindo as funções de permeabilidade e acoplamento, e no caso dos
canais do tipo-L, o sítio de ligação de agonistas. Os canais de cálcio do tipo-
L são caracterizados por ligantes farmacológicos sintéticos pequenos como o
verapamil, nifedipina e diltiazem, enquanto que os canais dos tipos –N, -P e
-Q são sensíveis a toxinas peptídicas oriundas de moluscos e aranhas,
incluindo as conotoxinas e as agatoxinas (Bergsman et al., 2000).
Em peixes, bloqueadores de canais de cálcio tipo-L inibem
parcialmente a agregação pigmentar (Luby-Phelps & Porter, 1982).
17
Fingerman (1969) observou que a agregação pigmentar em eritróforos do
camarão Palaemonetes vulgaris induzida por um extrato de pedúnculo
óptico induz hiperpolarização da membrana. Entretanto Britto
et al
. (1996)
mostrou que não há alteração na voltagem com a perfusão de RPCH, e nem
na polaridade da membrana, em eritróforos de crustáceos dispersos.
Verapamil e Manganês, bloqueadores do canal de cálcio tipo-L, não
interferiram na distribuição e nem na velocidade de agregação pigmentar
induzida em cromatossomos de
Macrobrachium olfersii
por RPCH
(McNamara & Ribeiro, 2000).
A concentração de cálcio intracelular é mantida baixa, em torno de
10
-7
a 10
-9
M por um sistema regulatório composto por muitos elementos,
entre eles as Ca
2+
-ATPases da membrana plasmática (PMCA), responsáveis
pela extrusão desse íon para o meio extracelular; Ca
2+
-ATPases do retículo
sarco/endoplasmático (SERCAs) que carregam as organelas; uniportador de
cálcio e e trocadores Na
+
/Ca
2+
e H
+
/Ca
2+
nas mitocôndrias, que levam o Ca
2+
para o interior dessas organelas; e proteínas citosólicas com cargas
aniônicas Ca
2+
-ligantes que podem tamponar localmente a concentração de
Ca
2+
citosólico, incluindo-se as proteínas sensoras de cálcio como a
troponina C e a calmodulina (Berridge, 1990; Carafoli, 1994). No entanto se
o cálcio participa da cascata de sinalização do RPCH ou atua diretamente
sobre o citoesqueleto e os motores moleculares, não está claro (McNamara &
Ribeiro, 2000; Ribeiro & McNamara, 2007).
O citoesqueleto é uma complexa e dinâmica rede de filamentos de
proteínas polimerizadas que ocupam todo o citosol. As principais estruturas
constituintes são os microtúbulos e os microfilamentos, ambos envolvidos
18
com a motilidade celular (Rogers & Gelfand, 2000), e os filamentos
intermediários (Alberts et al, 1994).
Os microtúbulos são formados por heterodímeros de α- e β- tubulina,
que se polimerizam longitudinalmente em forma de um longo cilindro oco,
de 25 nm de diâmetro externo e de até alguns micrômetros de comprimento,
polarizados em geral. O pólo negativo situa-se próximo ao núcleo celular e o
pólo positivo, próximo à membrana plasmática.na periferia das células Os
microtúbulos são altamente dinâmicos, e suas subunidades de
α
- e
β
-
tubulina se associam e desassociam dos dois pólos (Hirokawa, 1998). Várias
substâncias alteram o equilíbrio dinâmico da polimerização dos
microtúbulos, como por exemplo a colchicina e a vinblastina, pois se ligam
às subunidades livres de tubulina, impedindo a polimerização. O taxol
estabiliza a forma polimerizada dos microtúbulos ao ligar-se aos monômeros
já polimerizados (Hirokawa, 1998).
Os microfilamentos de actina-F, formados por monômeros globulares
de actina-G, também são estruturas dinâmicas e polarizadas, que possuem
um pólo positivo como local de crescimento mais rápido (Lodish
et al
.,
2000). A Citocalasina B, que se liga ao pólo positivo do filamento e a
latrunculina-A inibem a polimerização dos microfilamentos. O
Jasplaquinolide induz sua polimerização.
Associados aos microtúbulos e aos microfilamentos encontram-se
enzimas mecanoquímicas ou motores moleculares que efetuam o
deslocamento espacial e incremental de diferentes organelas e complexos
macromoleculares, pela conversão de energia química em mecânica,
derivada da hidrólise de ATP (Hirokawa, 1998; Rogers & Gelfand, 2000;
19
Karcher et al., 2002). A estrutura molecular destes motores consiste em
duas partes fundamentais: (i) o domínio motor, com atividade ATPásica, que
converte energia química em mecânica, e que se liga reversivelmente ao
citoesqueleto através de um sítio ligante específico; e (ii) o domínio cauda,
que interage com o cargo a ser deslocado através das porções terminais de
suas cadeias leves (Karcher
et al.
, 2002). A natureza da molécula que será
transportada depende dos domínios específicos da cauda, diferentes em
cada proteína motora. Estas podem se ligar diretamente ao cargo
transportado pelas cadeias leves ou por meio de proteínas receptoras
acopladas situadas na superfície destas (Karcher
et al
., 2002).
Entre os motores moleculares que empregam os microtúbulos como
substrato estão as cinesinas e as dineínas. As cinesinas são tetrâmeros de
≈380 kDa, constituídos por duas cadeias leves de ≈64 kDa e duas cadeias
pesadas de ≈120 kDa. Alguns destes motores estão associadas ao retículo
endoplasmático, complexo de Golgi, mitocôndrias, lisossomos e endossomos
(Hirokawa, 1998). Cinesinas são os motores moleculares responsáveis pela
dispersão pigmentar em melanóforos do anuro Xenopus (Rogers
et al
., 1997;
Reilein et al., 1998; Tuma & Gelfand, 1999), e do teleósteo Gymnocorymbus
ternetzi (Rodionov et al., 1991; Rodionov & Borisy, 1997).
A dineína citoplasmática de ≈1,2 MDa é composta por duas cadeias
pesadas de ≈530 kDa cada, três cadeias intermediárias de ≈74 kDa cada e
quatro cadeias leves de ≈55 kDa (Hirokawa, 1998). Esse motor promove o
transporte retrógrado neuronal (Schroer, 1994) e a agregação pigmentar em
melanóforos de Xenopus (Rogers
et al
., 1997; Reilein
et al
., 1998; Tuma &
Gelfand, 1999) e G. ternetzi (Rodionov & Borisy, 1997).
20
O motor molecular mecanoquímico que tipicamente se associa ao
microfilamento de actina é a miosina, com mais de 20 classes já
identificadas. Desempenham inúmeras e diversas funções celulares como
por exemplo o tráfego de membrana em forma de vesículas, deslocamento
celular e sinalização intracelular (Mermall
et al
., 1998). A miosina-V
relaciona-se especificamente com o transporte de vesículas secretoras e
melanossomos, os grânulos de melanina e melanóforos (Mermall
et al
.,
1998; Karcher
et al
., 2002). Em células pigmentares, a miosina-V dispersa
os melanossomos nos melanóforos de Xenopus (Rogers & Gelfand, 1998;
Rogers
et al
, 1999; Tuma e Gelfand, 1999). Desse modo, modelos
desenvolvidos em anfíbios, peixes e crustáceos sugerem que o movimento
dos grânulos de pigmento nos cromatóforos se dá pela atividade coordenada
de proteínas motoras e componentes do citoesqueleto (Rogers & Gelfand,
1998; Rodionov et al., 1998; Robison & Charlton, 1973; Lambert &
Fingerman, 1978; Rao & Fingerman, 1983; McNamara & Ribeiro, 1999;
Boyle & McNamara, 2006). A Citocalasina B, que se liga ao pólo positivo da
actina-F inibindo a polimerização e ocasionando a despolimerização dos
microfilamentos, inibe totalmente ou impede a agregação pigmentar
completa em cromatóforos de
Palaemonetes vulgaris, Palaemonetes pugio,
Macrobrachium olfersii
e
Macrobrachium potiuna
(Robison & Charlton, 1973;
Fingerman
et al.
, 1975; Lambert & Fingerman, 1978; Tuma
et al
., 1995;
McNamara & Ribeiro, 1999). Em cromatóforos ovarianos de
Macrobrachium
olfersii, o inibidor da miosina ATPase, Butanedione monoxime inibe
parcialmente a agregação induzida por RPCH (McNamara & Ribeiro, 1999).
Nessa mesma espécie, marcação imunofluorescente de miosina em
21
fragmentos de cromatóforos fixados mostra a presença desse motor
associada aos grânulos pigmentares, numa ligação estável, que independe
do estado de distribuição do pigmento (Boyle & McNamara, 2006). Ainda,
um soro anti-miosina inibe a agregação pigmentar completainduzida pelo
RPCH, em experimentos in vitro (Boyle & McNamara, 2006). Esses dados
revelam a presença de um sistema de transporte em cromatóforos de
crustáceos baseado na interação entre actina e miosina.
Em melanócitos de mamíferos também é observado o transporte de
melanossomos que segue em “trilhas” constituídas de microtúbulos e
microfilamentos, com a participação da miosina V nestes últimos (Wu
et al
.,
1998). Os filamentos de vimentina também sofrem rearranjo durante a
agregação pigmentar, embora seu papel no processo de translocação ainda
não esteja claro (Leonova, 1992).
Neste trabalho, pretende-se analisar aspectos da cascata de
sinalização induzida pelo hormônio de agregação do pigmento vermelho
(RPCH), entre eles a participação dos segundos mensageiros AMPc e GMPc e
do cálcio exógeno através do bloqueio de canais de cálcio situados na
membrana plasmática dos tipos -L e -P/Q. Ainda, pretendeu-se discutir a
participação de proteínas filamentosas como ‘trilhos’ no processo de
agregação e dispersão dos grânulos pigmentares, e inferir assim a
participação de motores associados.
22
2. Objetivo
No presente estudo, pretende-se analisar a participação dos
nucleotídeos cíclicos AMPc e GMPc bem como dos canais de cálcio,
localizados na membrana plasmática e operados por voltagem dos tipos -L e
-P/Q na cascata de sinalização desencadeada pelo RPCH. Ainda, investigar-
se-ão os elementos do citoesqueleto, microtúbulos e microfilamentos,
visando avaliar seu papel na translocação de grânulos de pigmento,
empregando experimentos fisiológicos
in vitro
junto a alguns ensaios
empregando a microscopia de fluorescência
.
23
3
. Material e métodos
3.1. Coleta e manutenção dos camarões
Fêmeas do camarão de água doce,
Macrobrachium olfersii,
de ≈4 cm de
comprimento total, foram coletadas da vegetação, nas margens do rio
Paúba, litoral norte do Estado de São Paulo, com o auxílio de uma peneira
de aço de malha 3 mm, sob autorização do IBAMA (processo nº 070/2004).
Os camarões foram transportados em galões de 30 litros, com água e capim
do local de coleta, até o Laboratório de Fisiologia de Crustáceos do
Departamento de Biologia da Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras da
Universidade de São Paulo, em Ribeirão Preto, onde foram mantidos em
tanques contendo 60 litros de água, aerada continuamente. Foram
alimentados em dias alternados com carne crua bovina.
3.2. Preparação do ovário
Para esta investigação foi utilizada uma preparação
in vitro
do ovário.
Foram utilizados cromatossomos vermelhos de ovário de camarões que se
encontravam no estágio C (intermuda) do ciclo de muda (Peebles, 1977).
Antes dos experimentos, os camarões foram colocados em recipientes
com fundo preto e iluminados por cerca de 2 horas para dispersar o
pigmento vermelho nos cromatossomos.
Os camarões foram então transeccionados entre o cefalotórax e o
abdômen. O ovário foi dissecado sob salina, retirado intacto e seccionado
transversalmente, sendo a metade anterior transferida para uma câmara de
perfusão contendo uma salina fisiológica (SF) específica (ver 3.3). A
24
dissecção toda foi feita nessa salina, sob lupa, com o auxílio de tesoura de
iridectomia e pinça de relojoeiro fina.
3.3. Soluções fisiológicas
Para manter o volume celular dos cromatóforos, a salina foi feita para
proporcionar uma osmolalidade final de
≈
360 mOsm/kg H
2
O, semelhante à
hemolinfa de
Macrobrachium olfersii
(McNamara & Ribeiro, 1999)
.
As
medidas da osmolalidade foram realizadas em um micro-osmômetro a
pressão de vapor (Wescor, modelo 5500).
Assim, a Salina Fisiológica (SF) continha, em mM, concentrações
iônicas dos principais íons da hemolinfa baseadas em Prosser (1973) e
McNamara
et al.
(1990): Na
+
180, K
+
5, Ca
2+
5,5 e Mg
2+
1, como cloretos
(≈198), tamponada com bicarbonato de sódio (2,5) e HEPES (5). O pH foi
ajustado para 7,4 e foi adicionada glicose (2) como substrato exógeno de
energia, já que os experimentos foram realizados
in vitro
.
3.4. Protocolos Experimentais
Os reagentes empregados foram dissolvidos em SF a partir de
soluções estoques preparadas em água destilada ou dimetilsulfóxido
(DMSO, Sigma) (Tabela 1). A porcentagem máxima final de DMSO foi
restringida a 0,5%, o que não altera por si a distribuição dos pigmentos.
25
Tabela 1. Reagentes utilizados nos protocolos experimentais com suas concentrações finais,
diluentes, efeito principal e origem
Reagente Concentração
(M)
Diluente Efeito Principal Origem
RPCH 10
-8
Água
destilada
Agregador do
pigmento vermelho
Península
Lab., USA
Toxina do
Cólera
1,1 x 10
-8
Água
destilada
Ativador da Adenilil
Ciclase
Sigma,
USA
Zaprinast 30 x 10
-6
DMSO Inibidor da
fosfodiesterase tipo
5 (aumenta o nível
intracelular de
GMPc)
Sigma,
USA
Gabapentina 10
-3
M Água
destilada
Bloqueador do
canal de cálcio
operado por
voltagem do tipo-L
Sigma,
USA
Conotoxina
MVII C
10
-6
M Água
destilada
Bloqueador do
canal de cálcio
operado por
voltagem do tipo-
P/Q
Sigma,
USA
Taxol 3 x 10
-6
DMSO Estabilizador de
microtúbulos no
estado polimerizado
Sigma,
USA
Faloidina-FITC 3 x 10
-7
Água
destilada
Ligante à actina Sigma,
USA
O protocolo experimental consistiu em se perfundir a preparação dos
cromatossomos, obedecendo-se à seqüência: (i) SF, 10 min, como período de
ajuste, permitindo-se a estabilização da preparação; (ii) perfusão com SF +
26
DMSO, 10 min (nos tratamentos com Zaprinast e Taxol); (iii) SF + DMSO+ o
reagente a ser testado, 30 min; (iv) SF + DMSO + reagente + RPCH (10
-8
M),
30 min; (v) DMSO + reagente, 30 min, para averiguar a reversibilidade do
efeito do RPCH e (vi) DMSO, 30 min, para avaliar a integridade do
mecanismo de dispersão. Nos experimentos com os reagentes Toxina do
Cólera, Gabapentina e w-Conotoxina MVIIC o DMSO não foi utilizado como
diluente.
O protocolo para perfusão com a Faloidina-FITC diferiu dos demais.
Inicialmente, após a dissecção, o ovário foi incubado em uma solução de SF
com Faloidina-FITC (300 nM) por 40 min, num recipiente à parte.
Posteriormente a preparação foi colocada na câmara de perfusão. Em
seguida, a perfusão se deu da seguinte forma: (i) SF, 30 min, para lavagem
da Faloidina-FITC em excesso; (ii) SF + RPCH (10
-8
M), 30 min e (iii) SF, 30
min.
3.5. Observação da preparação e quantificação da translocação pigmentar
A câmara de perfusão consistiu em um bloco acrílico de 10 cm de
diâmetro com uma pequena perfuração cilíndrica central, de 154 µl de
volume, de 7 mm de diâmetro por 7 mm de profundidade, cujo fundo foi
recoberto por uma camada de resina inerte Sylgard, à qual o ovário com os
cromatossomos foi fixado com microagulhas de prata. A câmara recebeu
duas agulhas comuns #30-20, diametralmente opostas, ligadas por cânulas
de polietileno a uma válvula multidirecional e ligado por sua vez via cânulas
de polietileno a duas seringas de vidro que continham as soluções
perfusoras.
27
Após fixado o ovário com os cromatossomos orientados dorsalmente, a
câmara foi fechada com uma lamínula vedada com graxa de silicone, e
perfundida usando um fluxo de 0,7 ml de salina/min determinado por
gravidade, mantendo as seringas a 20 cm acima do nível da câmara.
O deslocamento da massa dos grânulos de pigmento pelas extensões
celulares dos cromatóforos ovarianos foi observado a cada 2 min em um
estéreo-microscópio Wild M10 acoplado a uma câmara de vídeo SONY DXC
151A CCD, por luz transmitida e incidente, a um aumento de 200 vezes,
usando-se uma escala ocular calibrada.
Foram usados cromatossomos com diâmetros entre 150 e 250 µm.
Cada experimento foi repetido 7 vezes, usando-se medidas registradas de
apenas um cromatossomo por preparação.
3.6. Análise quantitativa dos experimentos fisiológicos
3.6.1. Transformação dos dados em porcentagem de dispersão e velocidade
de translocação pigmentar
Os diâmetros dos cromatossomos foram medidos da ponta de uma
extensão celular à ponta de uma outra diametralmente oposta. As medidas
em intervalos da escala ocular calibrada foram convertidas em micrômetros
(1 intervalo = 3,52 µm no aumento empregado) e transformados em
porcentagem de dispersão pigmentar (%), e em velocidade de translocação
pigmentar (em µm/min) em função do tempo conforme segue:
28
1. Grau de dispersão pigmentar(%)=diâmetro medido - diâmetro mínimo x 100
diâmetro máximo - diâmetro mínimo
2. Velocidade de translocação (µm/min)= diâmetro medido
(t+1)
- diâmetro medido
(t)
2 min (intervalo de observação) x 2 (correção por movimento bidirecional ao
longo de extensões opostas)
sendo (t) igual a um intervalo específico durante a perfusão, e (t+1) a medida
no próximo intervalo de perfusão, a dois minutos adiante.
Os valores do grau de dispersão e da velocidade de translocação foram
obtidos a partir da mesma série de dados gerados em cada experimento
individual.
Após a tabulação, os valores das médias e dos respectivos erros
padrão da média, referentes ao grau de dispersão pigmentar e às
velocidades de translocação para o conjunto de 7 replicatas, a cada
intervalo de medida, foram obtidos utilizando-se a planilha do aplicativo
estatístico Statgraphics para Windows 5.0 Plus. Estes valores foram
plotados graficamente em função do tempo, utilizando-se o aplicativo Slide
Write 5.01 Plus para Windows.
3.6.2. Ajuste do grau de dispersão pigmentar a uma função sigmóide
Para se avaliar o efeito dos reagentes no grau e na velocidade de
dispersão pigmentar durante os 20 min posteriores à lavagem do RPCH da
perfusão [etapa (v) do protocolo, ver 4.4], ajustou-se uma função sigmoidal
cuja equação geral é Y= a
0
+a
1
/(1 + exp(-(x-a
2
)/a
3
)) aos dados de dispersão
em porcentagem, visando uma comparação de parâmetros objetiva entre a
dispersão nos experimentos controle e nos diferentes tratamentos.
29
Comparou-se estatisticamente o parâmetro ‘a
2
’ da função que determina
o momento de crescimento máximo da curva sigmóide. Este momento em
que a velocidade de dispersão do pigmento é máxima chama-se de Ponto de
Inflexão e pode ser obtido calculando-se a segunda derivada da função (Y’’) e
igualando-a a zero, conforme segue:
Y”(x)= a
1 .
e
-x-a2/a3
=0
a
3
(1+ e
a2/a3
)
Utilizou-se o aplicativo SlideWrite Plus 5.01 para Windows para
implementar este ajuste e plotar os gráficos, e o aplicativo SigmaStat 2.03
para Windows para a comparação estatística.
3.6.3. Análise estatística dos dados
Para se a analisar os efeitos dos inibidores testados sobre o grau de
agregação e dispersão pigmentar bem como sobre a velocidade de
translocação, foram empregados testes estatísticos paramétricos. Utilizou-se
uma Análise de Variância de um único fator (tratamento) seguida do teste
Student-Newman-Keuls (SNK) para identificar as médias diferentes. Efeitos
e diferenças foram considerados significativos em nível de P=0,05.
3.7. Microscopia de Fluorescência para demonstrar o citoesqueleto de actina
nos cromatóforos
A Fluorescência é uma técnica analítica em que fluorocromos
acoplados a anticorpos são excitados pela absorção de uma faixa de
radiação eletromagnética específica e quando estas retornam ao estado
30
fundamental, liberam o seu excesso de energia na forma de fótons, em
intervalos inferiores a 10
-5
segundos. Podem-se registrar as emissões que
ocorram num comprimento de onda fixo, geralmente aquele em que o
fluorocromo emite com maior intensidade. Os filtros usualmente utilizados e
capazes de captar o comprimento de onda emitido pelas moléculas excitadas
são o FITC (Isotiocianato de Fluoresceína, 492-525 nm), o DAPI (4',6-
Diamidino-2-fenilindola, 358-461 nm) e o TRITC (Tetrametil Rodamina Iso-
thiocianato, 554-570nm).
Os cromatossomos sob os ovários foram incubados com PBS + Triton
X - 100 por 5 min sobre gelo e depois com PBS + Faloidina-FITC (300 nM)
por 1 h e 30 min sobre gelo. A seguir as preparações foram fixadas com
paraformaldeído a 4% durante 40 min, sendo a cápsula de tecido fibroso
externo contendo os cromatóforos retirado e colocado em uma lâmina com
uma gotícula de Vectashield
Mounting Médium. A preparação foi recoberta
com uma lamínula apropriada e observada por microscopia de
epifluorescência.
Para observação das preparações foi usado um microscópio Zeiss
modelo Axiophot acoplado a uma câmera fotográfica digital Axiocam, sendo
as imagens capturadas por mais de um sistema Axiovision Zeiss.
31
4. Resultados
4.1. Estabelecimento da resposta padrão à perfusão com hormônio de
agregação do pigmento vermelho (RPCH)
Perfusão da preparação com o RPCH a 10
-8
M induz agregação total dos
pigmentos nos cromatossomos em um período de aproximadamente 26 min
(Figura 1 A1), sendo que
≈
50% da agregação pigmentar ocorre nos primeiros
2 min (Tabela 2, RPCH-controle).
O perfil da velocidade de agregação pigmentar é formado por duas fases
(Figura 1 B1): (i) um período de velocidade elevada, o qual incorpora um
pico de velocidade máxima de 18,5
±
1,7
µ
m/min (n=9) que dura 2 min
(Tabela 2, RPCH-controle); e (ii) um platô de velocidade reduzida de 4,8
±
3,3
µm/min (n=9), que dura 10 min (Figura 1 B1: minutos 18-26); em seguida,
a velocidade decresce lentamente, até cessar.
A dispersão pigmentar observada após a retirada do RPCH (Figura 1
A1) atinge cerca de 57% (n=7) em 20 min e 63% ao final do experimento
(Tabela 3, RPCH-controle). O perfil de velocidade dispersão é constituído por
uma única fase variável e oscilante de um mínimo de 0,3 ± 0,3 µm/min
(n=7) a um máximo de 3,9 ± 1,8 µm/min (n=7), com média de 2,4 ± 1,3
µm/min (n=7) (Tabela 3, RPCH-controle).
32
Figura 1. Perfil do estado de dispersão (%) (A) e da velocidade (µm/min) de
translocação (B) da massa pigmentar em cromatóforos ovarianos do camarão M.
olfersii induzida por RPCH. A subseqüente dispersão após a remoção do RPCH do
perfusado é espontânea. Note em A, que a agregação pigmentar completa ocorre
após 26 minutos após o início da perfusão com RPCH. Em B, a fase rápida de
agregação pigmentar é composta por um pico de translocação (minuto 12) e um
platô de velocidade menor que compreende o período entre os minutos 18 e 26. A
velocidade de dispersão é composta por uma única fase, de velocidade variável e
oscilante.
Tabela 2. Caracterização da resposta dos cromatóforos ovarianos de M. olfersii ao
hormônio de agregação do pigmento vermelho (RPCH-controle). Mostra-se o efeito
de substâncias que aumentam os níveis dos nucleotídeos cíclicos AMPc e GMPc
(Toxina do Cólera e Zaprinast), de substâncias inibidoras dos canais de cálcio do
tipo-L (Gabapentina) e dos tipos-P/Q (ω-conotoxina MVIIC), e ainda de agentes que
estabilizam os microtúbulos, o Taxol, e microfilamentos, a Faloidina-FITC na
agregação pigmentar induzida pelo RPCH. Dados são a média ± EPM (N=7-9).
*P<0,05 comparado ao controle (ANOVA, 1-fator, SNK).
Condição/
Agente
Grau de
dispersão 2
min após
RPCH (%)
Grau de
agregação
máxima
(%)
Velocidade
máxima de
agregação
(µ
µµ
µm/min)
Velocidade
média do
platô
(µ
µµ
µm/min)
RPCH-controle
53,0 ± 3,6 100,0 ± 0,0 18,5 ± 1,7 4,8 ± 3,3
Toxina do
Cólera
71,3 ± 3,5 90,8 ± 2,4* 10,0 ± 3,9* 0,8 ±0,8*
Zaprinast
56,5 ± 4,1 87,9 ± 2,3* 13,2 ± 4,6* 1,4 ±0,5*
Gabapentina
68,3 ± 9,1* 100,0 ± 0,0 6,3 ± 1,3* 0,9 ± 0,14*
ω-conotoxina
MVIIC
40,8
±
6,3* 73,1
±
4,9* 4,6
±
2,1* 0,7
±
0,2*
Taxol
38,0 ± 4,7 100,0 ± 0,0 14,6 ± 2,6 0,7 ± 0,4*
Faloidina-FITC
52,4 ± 4,5 100,0 ± 0,0 15,7 ± 1,7 6,4 ± 4,2
33
Tabela 3. Caracterização da dispersão pigmentar espontânea nos cromatóforos
ovarianos de M. olfersii após a remoção do RPCH. Mostra-se o efeito dos agentes
que aumentam as concentrações dos nucleotídeos cíclicos AMPc e GMPc, que são
Toxina do Cólera e Zaprinast, inibidor de canais de cálcio tipo-L, a Gabapentina, e
do tipo-P/Q, a w-Conotoxina MVIIC, e de agentes estabilizadores de microtúbulos,
o Taxol, e de microfilamentos, a Faloidina-FITC. *Reagentes que demonstraram
diferenças em relação ao RPCH (Anova, 1-fator). Dados são a média ± EPM (N=7-9).
Condição/
Agente
Grau de
dispersão 10
min após a
remoção do
RPCH (%)
Grau de
dispersão
20 min
após
remoção do
RPCH (%)
Velocidade
média de
dispersão
(µm/min)
Velocidade de
dispersão 10
min após
remoção do
RPCH
(µm/min)
RPCH-
controle
29,6
±
8,4 56,9
±
5,5 2,4
±
1,2 3,9
±
1,8
Toxina do
Cólera
38,3 ± 8,1* 56,4 ± 8,2 1,9 ± 0,5 2,8 ± 0,8
Zaprinast
44,8 ± 7,0* 53,5 ± 6,7 0,4 ± 0,1* 0,6 ± 0,2*
Gabapentina
15,6 ± 5,1 28,4 ± 5,9* 1,0 ± 0,1 1,2 ± 0,5
w-Conotoxina
MVIIC
42,3 ± 8,4* 45,7 ± 8,0 0,7 ± 0,1* 1,2 ± 0,4
Taxol
23,4
±
7,2 31,4
±
7,2* 1,2
±
0,3 1,3
±
0,5
Faloidina-
FITC
19,5 ± 5,9 37,8 ± 9,9 1,2 ± 0,4 1,0 ± 0,6
4.2. Envolvimento das cascatas de sinalização por AMPc e GMPc na
agregação pigmentar
4.2.1. Toxina do Cólera - ativador da Adenilil Ciclase (aumenta a
concentração de AMPc citosólico)
A Toxina do cólera que aumenta o AMPc citosólico (1,1 x 10
-8
M) não
causou agregação por si quando se perfundiu a preparação por 30 minutos
(Figura 2 A2). Ao se adicionar o RPCH, a agregação nos dois primeiros
minutos foi de cerca de 29% (n=8), e menor que o RPCH-controle (SNK,
P<0,05). Semelhante ao RPCH por si, a agregação com Toxina do Cólera
mantém o perfil de velocidade formado pelas duas fases (Figura 2 B2): (i) um
pico de velocidade de translocação de 10,0 ± 3,87 µm/min (n=8) (Tabela 2)
34
que dura 2 minutos, menor que o RPCH (SNK, P<0,05); e (ii) um platô de
velocidade 0,8 ± 0,81 µm/min (n=8), que dura 10 minutos (do minuto 48 ao
56), menor que o do RPCH (SNK, P<0,05).
Ao fim da perfusão da preparação com RPCH + Toxina do Cólera por
30 min, a agregação pigmentar foi parcial, terminando em uma agregação
máxima de ≈90%. Após a remoção do RPCH, a dispersão espontânea da
massa pigmentar atingiu aproximadamente 56% (n=8) em 20 minutos de
perfusão com uma velocidade média de 1,9 ± 0,47 µm/min (n=8) (Tabela 3).
Após removida a Toxina do Cólera, a dispersão continuou, atingindo cerca
de 70% em 10 min.
4.2.2. Zaprinast – inibidor da GMPc fosfodiesterase (aumenta a
concentração de GMPc citosólico)
O Zaprinast (Zap, 30
µM), que aumenta o GMPc citosólico, causou
cerca de 3% de agregação por si quando perfundiu-se a preparação por 30
min (Figura 2 A3). Ao se adicionar o RPCH, a agregação nos dois primeiros
minutos foi de cerca de 40% (n=7), semelhante ao RPCH-controle (SNK,
P>0,05). A agregação induzida por Zap mantém o perfil de velocidade
formado pelas duas fases (Figura 2 B3), sendo um pico de velocidade de
translocação de 13,2
±
4,6 µm/min (n=7) (Tabela 2) que dura 2 min,
semelhante ao RPCH (SNK, P>0,05). Entretanto a velocidade subseqüente a
esse pico de velocidade difere em relação ao controle, já que é perceptível a
eliminação do ‘ombro’ visto na Figura 1 B1, durante os minutos 12 a 14.
Ainda, o perfil de velocidade apresenta um platô de velocidade de 1,4
±
0,5
µm/min (n=7), que dura 10 min, menor que o do RPCH (SNK, P<0,05). Após
35
a perfusão com RPCH + Zap por 30 minutos, a agregação foi parcial,
atingindo 22% de agregação.
Retirado o RPCH, a massa pigmentar dispersou espontaneamente até
aproximadamente 54% de dispersão (n=7) em 20 min de perfusão a uma
velocidade média de ≈1,8
±
0,2 µm/min (n=7) (Tabela 3). A retirada do
Zaprinast da preparação leva à dispersão pigmentar numa velocidade um
pouco menor do que a observada na sua presença.
Figura 2. Decurso temporal do grau de agregação pigmentar (%) (A) e da velocidade
de translocação pigmentar (µm/min) (B) em cromatossomos ovarianos do camarão
de água doce M. olfersii. Em A2 e B2 os cromatossomos foram perfundidos com
Toxina do Cólera (TC) por 30 minutos, seguido de RPCH. Observou-se uma
diminuição do pico e do platô de velocidade em relação ao RPCH-controle (ver
Figura 1B) (SNK, P< 0,05). A agregação completa da massa pigmentar foi inibida,
embora a dispersão pigmentar não foi afetada. Em A3 e B3 os cromatossomos
foram perfundidos com Zaprinast (Zap) por 30 minutos, o que aboliu o ‘ombro’ de
velocidade subseqüente ao pico e diminuiu o platô de velocidade de agregação
(SNK, P<0,05). Ainda, impediu a agregação completa da massa pigmentar. A
dispersão foi inibida até a remoção do Zap (entre os minutos 90-110).
36
4.3. Inibição do influxo de cálcio pelo bloqueio de canais de cálcio da
membrana plasmática
4.3.1. Gabapentina – inibidor de canal de cálcio do tipo-L
Perfusão com a Gabapentina a 1 mM por si induz uma agregação de
≈17% (n=8) (Figura 3 A4). Quando o RPCH foi adicionado ao perfusado, o
grau de dispersão nos 2 primeiros minutos foi de 68,3% (n=8) (Tabela 1) e
nos 28 min subseqüentes a agregação se completou.
O perfil de velocidade de translocação pigmentar também é formado
por duas fases, com um pico retardado em 2 min em relação ao controle e
reduzido a 6,3 ± 1,4 µm/min (n=8) (SNK, P<0,05), de 4 min de duração
(Tabela 2). O platô de velocidade de 1,0 ± 0,1 µm/min (n=8) é menor (SNK,
P<0,05) que o controle (Figura 3 B4).
A dispersão observada após 20 min da retirada do RPCH é de 28%
(n=8), atingindo ≈52% ao final do experimento (Tabela 3). O perfil de
velocidade é constituído de uma única fase variável e oscilante entre os
valores 0,1 ± 0,1 µm/min e 2,4 ± 0,9 µm/min, com média 1,0 ± 0,1 µm/min.
4.3.2. W-conotoxina MVIIC – inibidor de canal de cálcio do tipo-P/Q
A ω-conotoxina MVIIC (1
µM) causou ≈39% de agregação por si
quando se perfundiu a preparação por 30 min (Figura 3 A5). Ao se adicionar
o RPCH, a agregação nos dois primeiros minutos foi de cerca de 8% (n=7),
bem menor que o RPCH-controle (SNK, P<0,05). Semelhante ao RPCH, a
agregação mantém o perfil de velocidade formado pelas duas fases (Figura 3
B5): (i) um pico de velocidade de translocação de 4,6 ± 2,1 µm/min (n=7)
(Tabela 2) que dura 2 minutos, menor que o RPCH (SNK, P<0,05), porém 4
37
min atrasados, se comparado ao RPCH-controle; e (ii) um platô de
velocidade 0,8 ± 0,2 µm/min (n=7), que dura 10 minutos, menor do que o
do RPCH (SNK, P<0,05).
Depois da perfusão da preparação por 30 min com o RPCH, a
agregação induzida é apenas parcial, estabilizando-se em ≈27% (n=7). Após
a retirada do RPCH, a massa pigmentar dispersa lentamente e atinge
aproximadamente 46% em 20 min de perfusão com uma velocidade média
de 0,7 ± 0,1 µm/min (n=7) (Tabela 3). Ao remover a w-conotoxina, dispersa
a 53%.
Figura 4. Decurso temporal do grau de agregação pigmentar (%) (A) e da velocidade
de translocação pigmentar (µm/min) (B), em cromatossomos ovarianos do camarão
de água doce M. olfersii. Em A4 e B4, na presença da Gabapentina (1 mM),
observa-se uma agregação inicial de cerca de 17%. Após RPCH, há um
retardamento de 2 min do pico de velocidade que se mostra reduzido, de 6,3
µm/min. Em A5 e B5, ω-conotoxina MVIIC (1 µM) induz por si agregação de cerca
de 47%, e a inibição da agregação quase completa da resposta ao RPCH. O pico de
velocidade sofre um retardamento de 4 min e apresenta-se bastante reduzido,
cerca de 4,6 µm/min.
38
4.4. Alteração do estado de polimerização do citoesqueleto
4.4.1. Taxol – estabilizador de microtúbulos
O taxol a 3 µM (Figura 4 A6) induziu uma lenta e constante agregação
pigmentar parcial de ≈22% por si quando perfundido na preparação por 30
min. Dois minutos após a perfusão com RPCH a dispersão da massa
pigmentar foi de ≈38%. O perfil de velocidade de agregação (Figura 4 B6)
também é formado por duas fases: um intervalo de 2 minutos que incorpora
um pico de 14,6 ± 2,6 µm/min (n=8) (Tabela 2) que dura 2 min, semelhante
ao RPCH-controle (SNK, P>0,05) e um platô de 0,7
±
0,4 µm/min, menor
que o controle (SNK, P<0,05). Em seguida a velocidade diminui até a
agregação completa da massa pigmentar, em 28 minutos.
A dispersão após 10 minutos de lavagem do RPCH foi de 20,5% e,
após 20 minutos, de aproximadamente 27,5% (n=7). A velocidade média
com que o pigmento se dispersa é de 1,2 ± 0,3 µm/min (n=7) (Tabela 3).
Após a remoção do Taxol, segue uma dispersão de cerca de 5% nos 10 min
seguintes.
4.4.2. Faloidina-FITC – ligante à actina
A preparação foi incubada com Faloidina-FITC a 300 nM, por 40 min
antes de se iniciar a perfusão, etapa não apresentada na Figura 4 A7, B7, e
não induziu agregação pigmentar por si. Durante a lavagem de Faloidina-
FITC não houve alteração da distribuição da massa pigmentar durante os
30 min (SF). Quando iniciada a perfusão com RPCH sem a Faloidina-FITC
no perfusado, a agregação foi completa, semelhante ao RPCH-controle, em
26 minutos (Figura 4 A7). Nos dois primeiros minutos após a adição do
39
RPCH a agregação pigmentar atingiu cerca de 48% (n=7) (Tabela 2). O perfil
de velocidade de agregação (Figura 4 B7) é formado por duas fases: (i) um
pico de 15,7 ± 4,4 µm/min (n=7) (Tabela 2) que dura 2 min; e (ii) um platô
de 10 min com velocidade 6,4 ± 4,2 µm/min (n=7), ambos semelhantes ao
RPCH-controle (SNK, P>0,05). Vinte minutos após a retirada do RPCH a
dispersão pigmentar correspondia a ≈38% (n=7). A velocidade média da
dispersão foi de 1,2 ± 0,4 µm/min (n=7) (Tabela 3).
Figura 5. Decurso temporal do grau de dispersão pigmentar (%) (A), e da velocidade
de translocação pigmentar (µm/min) (B), em cromatossomos ovarianos do camarão
de água doce M. olfersii tratados com Taxol, em A6 e B6. Observou-se uma
substancial agregação pigmentar induzida pelo Taxol. A agregação com RPCH é
completa e normal. Em A7 e B7, os cromatossomos foram previamente incubados
por 40 min com Faloidina-FITC sem alteração (não mostrado, anterior ao tempo=0).
O RPCH induz agregação pigmentar normal seguida pela subseqüente dispersão
espontânea após a retirada do mesmo. A Faloidina-FITC não interfere na
velocidade de dispersão pigmentar (ANOVA, P> 0,05).
40
4.5. Análise da dispersão pigmentar espontânea
Para ajudar a quantificar os efeitos inibitórios dos diversos
reagentes na dispersão pigmentar espontânea após a remoção do RPCH,
uma função sigmoidal, representada pela equação geral y=a
0
+a
1
/(1+exp(-(x-
a
2
)/a
3
)) foi ajustada aos dados de dispersão pigmentar mostrados nas
Figuras 1 a 4 (A1 a A7), usando o aplicativo Slide Write Plus 5.01 para
Windows.
As curvas resultantes ajustadas às médias do grau de dispersão do
pigmento a cada 2 min, para o RPCH-controle e para os vários reagentes
agrupados por efeito compostos usados estão plotadas na Figura 7A, B, C.
Mostra-se que a dispersão pigmentar ocorre em uma velocidade variável em
função do tempo em cada caso. Em torno de 10 min após a remoção do
RPCH (minuto 80), realizado no minuto 70, encontra-se o Ponto de Inflexão
da Curva (a
2
), que corresponde ao momento em que o crescimento da curva
é máximo, ou seja, onde temporalmente ocorre a maior velocidade de
dispersão do pigmento (Tabela 4).
Repare que os valores ajustados da
velocidade máxima de dispersão (Tabela 4) se aproximam dos valores reais
registrados 10 minutos após a remoção do RPCH (última coluna da Tabela
3). Essa consistência valida o ajuste sigmóide como modelo da dispersão
pigmentar. Os valores do parâmetro a
2
(ponto após a retirada do RPCH que
corresponde temporalmente ao crescimento máximo da curva ajustada),
bem como de velocidade de dispersão máxima calculados são semelhantes
para todas as condições usadas (Tabela 4).
41
A)
B)
C)
Figura 6. Curvas mostrando o ajuste de uma função sigmoidal y=a
0
+a
1
/(1+exp(-(x-
a
2
)/a
3
)) às médias (± EPM; N=7-9) do grau de dispersão pigmentar após retirada do
RPCH (momento 70 min) no experimento controle (RPCH/controle) e em cada
tratamento, em uma preparação in vitro de cromatóforos ovarianos do camarão de
água doce M. olfersii. Os valores de ajuste variam de R
2
=0,991 a 0,998. A,
reagentes que afetam o ‘pool’ de nucleotídeos cíclicos. B, inibidores de canais de
cálcio (L, P/Q) da membrana plasmática. C, reagentes que afetam a polimerização
do citoesqueleto (microtúbulos e microfilamentos)
.
42
Tabela 4. Caracterização da dispersão pigmentar após a retirada do RPCH no
minuto 70 em cromatóforos ovarianos de M. olfersii, segundo o ajuste da função
sigmoidal aos dados obtidos
,
na situação controle, e na presença dos inibidores
substâncias que aumentam os níveis dos nucleotídeos cíclicos AMPc e GMPc
(Toxina do Cólera e Zaprinast), de substâncias inibidoras dos canais de cálcio do
tipo-L (Gabapentina) e dos tipos-P/Q (ω-conotoxina MVIIC), e ainda de agentes que
estabilizam os microtúbulos, o Taxol, e microfilamentos, a Faloidina-FITC na
agregação pigmentar induzida pelo RPCH. Como fatores analisados, têm-se o
parâmetro a
2
(Ponto de inflexão)
e a velocidade máxima de dispersão pigmentar
para cada reagente. Não há efeito dos compostos sobre o parâmetro a
2
ou sobre a
velocidade máxima de dispersão pigmentar. Dados são a média ± EPM (N=7-9).
Condição/Agente a
2
(minuto após a retirada do
RPCH em 70 min)
Velocidade máxima de
dispersão (µm/min)
RPCH-controle
80,8 ± 1,4 3,9 ± 1,7
Toxina do Cólera
83,1 ± 5,0 2,9 ± 1,3
Zaprinast
85,5 ± 1,0 1,5 ± 0,6
Gabapentina
77,8 ± 4,2 3,2 ± 0,8
ω-conotoxina MVIIC
78,2
±
6,1 1,8
±
0,5
Taxol
78,3
±
8,6 1,5
±
0,6
Faloidina-FITC
78,3 ± 7,0 2,2 ± 0,6
4.6. Microscopia de Fluorescência dos cromatóforos ovarianos
Os cromatossomos ovarianos do camarão Macrobrachium olfersii
constituem-se de cromatóforos justapostos envolvidos por uma cápsula
fibrosa. Esta é bastante rica em feixes de microfilamentos de ≈120µm de
comprimento em média, dispostos transversalmente, formando uma malha.
A incubação de ovários em SF + Faloidina-FITC (300nm) por 40 min em
temperatura ambiente e posteriormente a adição de RPCH (10
-8
M) revelou
abundantes feixes de microfilamentos nos fibroblastos do tecido adjacente
aos cromatóforos, observados na Figura 7(B).
43
Figura 7. Imagem em Campo Claro (A) e observado sob o filtro FITC (B) de
cromatossomos ovarianos envolvidos pela cápsula fibrosa incubados previamente
com faloidina-FITC (300nM, temperatura ambiente) durante a agregação pigmentar
induzida por RPCH (10
-8
M). Nota-se forte marcação de feixes de microfilamentos
nos fibroblastos da cápsula.
Nas preparações que continham feixes de tecido muscular liso dentro
da cápsula fibrosa há um forte sinal de fluorescência que corresponde
aparentemente aos filamentos de actina dos sarcômeros (Figuras 7A, B).
Figura 8. Cápsula fibrosa de M.olfersii, incubados com Faloidina-FITC 300nM,
temperatura ambiente, e posteriormente com RPCH (10
-8
M), contendo feixes de
músculo liso (setas) e cromatossomos com os pigmentos agregados visualizados em
Campo Claro (A). Em B, nota-se uma forte marcação fluorescente de feixes de
microfilamentos em possíveis fragmentos do tecido muscular indicados pelas setas.
40 um
A
B
40 um
44
Quando os cromatossomos da cápsula fibrosa do ovário da M olfersii
são dissecados em SF e fixados em SF + paraformaldeído 4%, sobre gelo, e
incubados em SF + Faloidina-FITC (300nM), por 40 min sobre gelo, e
observados ao microscópio de epifluorescência visualizam-se feixes de sinal
que correspondem a microfilamentos, distribuídos radialmente nos
cromatossomos, como observado na Figura 9.
Figura 9. A) e C) Cromatossomos da cápsula fibrosa do ovário da M olfersii fixados
com paraformaldeído 4% e marcados com Faloidina-FITC (300nM), sobre gelo, e
observados em campo claro, e B) e D) observados sob o filtro FITC. Podem-se
visualizar feixes de sinal que correspondem a microfilamentos, distribuídos
radialmente nos cromatossomos.
Bell, FT
A
B
C
D
40 um
40 um
45
5. Discussão
5.1. A participação de nucleotídeos cíclicos na cascata de sinalização
O aumento do ‘pool’ de AMPc pela ativação da adenilato ciclase,
induzida pela Toxina do Cólera, diminuiu o pico e platô de agregação
pigmentar e ainda não permitiu agregação completa da massa pigmentar.
Isso sugere que a concentração elevada de AMPc nesse tipo celular leva os
grânulos de pigmento a se dispersarem, sendo uma das vias a fosforilação
de uma fosfo-proteína pela ação da PKA. Segundo Nery & Castrucci (1998),
no estado fosforilado esta proteína se destaca do citoesqueleto e os grânulos
ficam livres para serem carregados para a periferia da célula por uma
cinesina (Boyle & McNamara, 2006), um motor molecular que se desloca
sobre os microtúbulos em direção à região periférica causando a dispersão
da massa pigmentar. Corroborando essa hipótese, experimentos com db-
AMPc, um análogo permeável de AMPc, e forscolina, outro ativador da
adenilil ciclase, induzem a dispersão da massa pigmentar em cromatóforos
epidérmicos de
Macrobrachium potiuna
(Nery & Castrucci, 1998).
A via de sinalização celular pelo AMPc é altamente conservada do
ponto de vista evolutivo (Nery & Castrucci, 1997). O aumento da
concentração de AMPc pela inibição de fosfodiesterases, pelo uso de
metilxantinas, sugeriu que a dispersão pigmentar é mediada por esse
nucleotídeo cíclico em crustáceos (Fingerman, 1969), teleósteos (Novales &
Fuji, 1970), anfíbios (Castrucci, 1980) e répteis (Hadley & Goldman, 1969),
embora por mecanismos distintos.
A inibição da hidrólise de GMPc pelo Zaprinast, um inibidor seletivo
das fosfodiesterases tipo 5 e 6 (Maurice et al.,2003), induziu uma pequena
46
agregação por si, aboliu o platô, e não permitiu a agregação completa. Em
experimentos com o GMPc exógeno a 10 mM em Palaemonetes pugio não
houve agregação pigmentar (Lambert & Fingerman, 1979), o que pode ser
decorrente da sua composição não lipossolúvel impedir a sua difusão pela
membrana plasmática destas células. Entretanto, o db-GMPc (0,1 mM) em
cromatóforos epidérmicos de
Macrobrachium potiuna
, um análogo
lipossolúvel do GMPc, também não induziu agregação pigmentar (Nery &
Castrucci, 1998). Em estudos anteriores em nosso laboratório, o db-GMPc
exógeno (10 µM) causa uma agregação da massa pigmentar semelhante ao
hormônio de agregação do pigmento vermelho, ou seja, completa e com o
mesmo perfil de velocidade e de tempo (Ribeiro, 2002). Ainda, o uso de
nitroprussiato de sódio (SNP) e morfolinosidnonimina (SIN-1), ambos
agentes que liberam NO, que ativa a guanilato ciclase citosólica
aumentando os níveis de GMPc, causaram agregação parcial. Por outro
lado, o uso de inibidores da guanilato ciclase citosólica ZnPP-IX e o
LY83583 inibiram cerca de 35% da agregação pigmentar final induzida por
RPCH. Entretanto, o uso de enterotoxina (Sta), o agonista que ativa o
receptor guanilato ciclase de membrana tipo-C, não causou agregação
pigmentar (Ribeiro, 2002). Embora os dados aqui apresentados não
mostrem um resultado conclusivo do envolvimento do GMPc na cascata, os
dados antes encontrados neste laboratório sugerem o envolvimento do
GMPc na cascata de sinalização do RPCH, e ainda aponta a ausência de
receptores guanilato ciclase de membrana tipo-C nestes cromatóforos.
47
5.2. Participação do cálcio extracelular
Embora a dependência de Ca
2+
no processo de agregação pigmentar
tenha sido demonstrada, os movimentos de Ca
2+
entre o fluido extracelular,
o citosol e os compartimentos internos que podem armazenar o íon não
foram ainda investigados fisiologicamente e ultraestruturalmente. Em
particular, o retículo endoplasmático liso, um reservatório comum de Ca
2+
, e
que se encontra bastante desenvolvido nos cromatóforos (Chassard-
Bouchaud & Hubert, 1971; Robison & Charlton, 1973; McNamara, 1981;
McNamara & Ribeiro, 1999) tem recebido pouca atenção.
Vários estudos demonstraram a dependência do Ca
2+
da agregação
pigmentar em cromatóforos de crustáceos (Fingerman, 1969; Robison &
Charlton, 1973; Lambert & Fingerman, 1979; Britto et al, 1990; McNamara
& Ribeiro, 1999; Ribeiro & McNamara, 2007). De maneira geral, a
concentração citosólica de Ca
2+
livre no citosol dos cromatóforos é mantida
baixa, em torno de 10
-9
M (McNamara & Ribeiro, 1999), através de um
complexo
Equilíbrio Dinâmico
estabelecido entre os mecanismos de influxo e
efluxo deste íon nas células. Em muitas células, sob estímulo, a
concentração de Ca
2+
pode aumentar até cerca de 10 a 100 vezes via influxo
extracelular, decorrente da abertura de canais de cálcio da membrana
plasmática, ou via liberação regulada por vários receptores de fontes
intracelulares, como o retículo endoplasmático ou sarcoplasmático e
mitocôndrias (Carafoli, 2002).
Inicialmente nossas preparações foram perfundidas com inibidores de
canais de cálcio, e estes por si causam agregação, em menor ou maior grau,
como a Gabapentina e a ω-conotoxina MVIIC, respectivamente. Estes
48
bloqueadores, que fecham os canais que permitem a passagem do Ca
2+
do
fluido extracelular para o citosol dos cromatóforos. Desta forma, o íon,
impedido de entrar por suas vias convencionais, os canais de cálcio
operados por voltagem, tem sua concentração no citosol reduzida
momentaneamente. Aparentemente, ao restabelecer um novo equilíbrio
entre a entrada e a saída do Ca
2+
dos cromatóforos, os estoques
intracelulares são levados a liberarem Ca
2+
para o citosol, o que pode
ocasionar a agregação parcial observada.
Após bloqueio nos experimentos com a Gabapentina, ao se adicionar
RPCH à preparação, observa-se uma inibição da agregação. Também se nota
o retardamento em 4 min e a notável redução do pico de velocidade de
agregação. Desta forma pode-se inferir que canais de cálcio do tipo-L estão
presentes na membrana plasmática dos cromatóforos, embora
aparentemente não sejam a principal via de entrada do Ca
2+
nestas células.
Quando se bloqueia este tipo de canal, dificulta-se a entrada do Ca
2+
nos
cromatóforos. É possível que seja necessária uma entrada inicial de Ca
2+
do
meio extracelular induzida por RPCH para desencadear o processo de
agregação pigmentar. Isso é corroborado pela diminuição da porcentagem
agregada nos dois primeiros minutos e pelo retardamento do pico de
velocidade.
Quando o RPCH foi adicionado à preparação contendo a ω-conotoxina
MVIIC, percebe-se uma porcentagem de agregação bastante reduzida, com
um perfil de velocidade atípico, apresentando pico e platô bastante
diminuídos. Aparentemente há uma entrada importante de Ca
2+
oriundo do
fluido extracelular, sendo a principal via os canais de cálcio do tipo P/-Q,
49
que quando bloqueados modificam o perfil de agregação e impedem a
agregação completa.
Curiosamente, o verapamil (Zhang
et al
, 1997), um inibidor de canal
de cálcio tipo-L, e Mn
2+
(Zhang
et al
. 1997), um bloqueador não específico de
canal de cálcio, não inibiram a agregação pigmentar em cromatóforos
ovarianos de
M. olfersii
(McNamara & Ribeiro, 2000).
Porém a Tapsigargina,
um inibidor de SERCA, induz agregação completa com um perfil bastante
similar ao do RPCH, e o Ácido Ciclopiazônico induz agregação parcial
(Ribeiro & McNamara, 2007). Essas respostas sugerem que um aumento da
concentração citosólica de cálcio livre originada pelo retículo
endoplasmático, que é bem desenvolvido neste tipo celular, leva à
agregação. Ainda, em salina com baixo cálcio residual (Ca
2+
10
-11
M), a
Tapsigargina e o Ácido Ciclopiazônico não causam agregação da massa
pigmentar por si (Ribeiro & McNamara, 2007). Isso sugere que a cascata de
sinalização do RPCH
in vivo
com a concentração normal de cálcio da
hemolinfa, em torno de ≈5mM, estimula a entrada de cálcio do meio externo
por vias, que podem ser os canais de cálcio do tipo-P/Q o que,
conseqüentemente, estimularia a saída do íon do retículo endoplasmático
liso, mecanismo esse conhecido como Liberação de Cálcio Induzida por
Cálcio
.
Entretanto, os eventos subseqüentes ao acoplamento RPCH/receptor
que afetam a distribuição de Ca
2+
em cromatóforos de crustáceos ainda não
estão bem estabelecidos.
Da mesma maneira, quando os canais de cálcio do tipo-L e P/Q estão
bloqueados, o grau de dispersão e a velocidade de dispersão são diminuídos
em relação ao controle. Este fato também nos leva a inferir que o
50
fechamento das vias de entrada na membrana plasmática de Ca
2+
nos
cromatóforos provoca uma interferência no Equilíbrio Dinâmico deste íon
nestas células, desencadeando alterações tanto na agregação quanto na
dispersão espontânea após a retirada do RPCH.
5.3. O citoesqueleto e os motores moleculares
A estabilização de microtúbulos polimerizados pelo Taxol permitiu
uma pequena agregação parcial inicial da massa pigmentar. Quando o
RPCH foi adicionado, houve uma diminuição da velocidade na fase lenta em
relação ao controle e ainda a agregação completa se deu em 28 minutos,
mais lenta que a do RPCH-controle. Os microtúbulos são estruturas
altamente dinâmicas e polares, cujas subunidades de α- e β-tubulina se
associam e desassociam constantemente do pólo positivo e negativo,
respectivamente, possuindo mais afinidade pelo pólo positivo (Hirokawa,
1998). Quando o taxol se liga pólos dos microtúbulos, estabiliza seu
tamanho, mas não impede a despolarização do pólo negativo. Assim, poderá
reduzir uma possível “trilha” por onde passam os motores moleculares ao
carregar os grânulos de pigmento (cargos), o que possibilita uma explicação
sobre a agregação parcial. No entanto, em estudos anteriores, o uso de
colchicina, um inibidor da polimerização dos microtúbulos, por si, causou
apenas uma agregação parcial, mas não inibe a agregação final ocasionada
pelo RPCH (McNamara & Ribeiro, 1999). Ainda, o uso de EHNA, um
inibidor seletivo da Dineína-ATPase inibiu a agregação parcial induzida por
RPCH. Porém, o uso de Metavanadato, outro composto de mesmo efeito,
entretanto um pouco menos seletivo, não inibiu a agregação nestes
51
cromatóforos (Ribeiro & McNamara, 1999). Estes dados somados aos dados
aqui apresentados sugerem uma participação indireta dos microtúbulos no
processo, talvez apenas relacionados à fase rápida do processo de agregação
induzida pelo RPCH.
A Faloidina-FITC é uma toxina derivada do fungo
Amanita phalloides
que se liga fortemente às subunidades de actina que constituem os
microfilamentos (Wulf
et al
., 1979). A Faloidina-FITC aparentemente não
interfere na agregação pigmentar induzida por RPCH e, embora de difícil
visualização sob o filtro FITC, a marcação de feixes de microfilamentos é
apresentada nas fotografias do item 4.6. Estes dados sugerem que os
microfilamentos encontrados nas extensões celulares dos cromatóforos,
vistos também em micrografias eletrônicas de transmissão (Ribeiro &
McNamara, 2001), podem ser constituídos de uma isoforma de actina de
difícil marcação pela Faloidina-FITC utilizada. Ainda, uma outra hipótese é
que o sítio de ligação dos microfilamentos com afinidade para a Faloidina-
FITC esteja encoberto por alguma outra molécula, dificultando a ligação.
A literatura sugere uma atividade coordenada de proteínas motoras e
componentes do citoesqueleto (Robison & Charlton, 1973; Lambert &
Fingerman, 1978; Rao & Fingerman, 1983; McNamara & Ribeiro, 1999;
Boyle & McNamara, 2006) para a translocação de grânulos de pigmento em
cromatóforos de anfíbios, peixes e crustáceos. Experimentos com
Latrunculina A e Citocalasina B, agentes que inibem a polimerização de
microfilamentos de actina, revelaram a participação destes como base para
o deslocamento da miosina, interferindo com a fase lenta da agregação
(McNamara & Ribeiro, 1999). O Jasplaquinolide, um agente que induz a
52
polimerização dos microfilamentos também inibiu parcialmente a agregação
induzida por RPCH. Ainda, foi revelada a participação da miosina com o uso
de Butanedione Monoxime, um inibidor da miosina-ATPase, o qual inibiu
parcialmente a agregação pigmentar causada por RPCH (Ribeiro &
McNamara, 2003).
A translocação de organelas em eucariotos pode se dar pela
cooperação entre os motores moleculares associados aos microfilamentos e
microtúbulos, através de “trilhas” formadas pelos elementos do
citoesqueleto. Ainda, foi proposto que no modelo de transporte em “pista
dupla”, ou seja, decorrente da cooperação entre os dois tipos de elementos
do citoesqueleto, que os microtúbulos são responsáveis pelo movimento por
distâncias maiores e os microfilamentos, por movimentos locais (Langford,
1995). Isto sugere que, junto ao citoesqueleto, nos cromatóforos, os motores
moleculares formam um conjunto regulável por translocar organelas ao
longo dos microtúbulos e dos microfilamentos.
Um modelo de transporte intracelular de grânulos pigmentares foi
proposto baseado no equilíbrio de forças resultantes agindo sobre uma
matriz pigmentar elástica (Boyle & McNamara, 2008). Esse modelo descreve
um mecanismo de transporte pigmentar no qual proteínas motoras
mecanoquímicas como cinesina e miosina, estruturalmente unidas, que
alternativamente se esticam e se comprimem numa matriz elástica.
Dado que a agregação pigmentar se dá em duas fases, sendo uma
lenta e outra rápida a análise das propriedades quantificáveis da matriz
elástica obedecem razoavelmente à Lei de Hooke. A cinética da fase rápida
da agregação sugere que cada fase representa a liberação de energia
53
cinética, provavelmente produzida por proteínas motoras mecanoquímicas,
e estocadas em forma de mola deformada durante a fase lenta da
translocação.
54
6. Bibliografia
Alberts B, Bray D, Lewis J, Raff M, Roberts K, Watson JD 1994. Capítulos 15 (Sinalização
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Macrobrachium olfersii (Crustacea, Decapoda), 2º Encontro da Biologia Comparada
“Desafios da Biologia Comparada no Conhecimento da Biodiversidade”, Ribeirão Preto,
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