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MARIZA KOLODA
CINÉTICA DE PRODUÇÃO DE ANTICORPOS EM BEZERRAS
IMUNIZADAS COM A CEPA B-19 DE Brucella abortus (Frederick
Bang, 1897)
CURITIBA
2005
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MARIZA KOLODA
CINÉTICA DE PRODUÇÃO DE ANTICORPOS EM BEZERRAS
IMUNIZADAS COM CEPA B-19 DE Brucella abortus (Frederick
Bang, 1897)
Dissertação apresentada como requisito
parcial à obtenção do grau de Mestre em
Ciências Veterinárias, Curso de Pós-
Graduação em Ciências Veterinárias, Setor
de Ciências Agrárias, Universidade Federal
do Paraná.
Orientador: Prof. Dr. José Francisco Warth
Co-orientadora: Profª. Dra. Rosangela
Locatelli Dittrich
CURITIBA
2005
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AGRADECIMENTOS
A Deus, meu protetor e defensor, por mais esta benção em minha vida;
A minha família, em especial a minha mãe e minhas irmãs que sempre estiveram por
perto para que eu pudesse seguir-lhes o exemplo;
Aos amigos, que sempre confiaram em mim;
Ao TECPAR e seus funcionários, em especial ao Médico Veterinário Jorge Victor
Bacila Agottani e ao técnico de laboratório Rafael Igreja, pelo apoio, generosidade e
valiosa colaboração;
Ao meu orientador Prof. Dr. José Francisco Warth e a Co-orientadora Profª. Drª.
Rosangela Locatelli Dittrich, pelas lições que aprendi;
A UFPR, seus professores e funcionários;
Aos meus amigos, Aglaci Tomporoski e José Carlos Fantini Filho, pela “força” que
me levou adiante;
Aos pesquisadores que mesmo sem me conhecer, se dispuseram a me auxiliar;
Ao Médico Veterinário José Cirino pela ajuda, amizade e colaboração neste trabalho;
Ao Dr. Nélio Ribas Centa e ao Sr. Garcia, pela generosidade e disposição em
auxiliar as pesquisas, em especial este trabalho;
A Secretaria de Estado da Agricultura e Abastecimento do Paraná – SEAB, pelo
auxilio e apoio a esta pesquisa;
Aqueles que não foram citados aqui, mas por quem eu peço uma benção especial de
Deus.
SUMÁRIO
Ao Senhor meu Deus, que toda a honra e glória lhe sejam dadas!
“Porque planejam as nações pagãs fazer revoltas? Porque perdem tempo
pensando em revoluções ? Os seus reis se revoltam,e os seus governantes
se ajuntam contra o Deus Eterno e o rei que Ele escolheu. Eles dizem: “
Vamos nos livrar do seu domínio; acabemos com o poder que eles tem
sobre nós.” Do seu trono lá no céu, o Senhor ri e zomba deles. Então, muito
irado, fala com eles e os assusta com seu furor. Deus diz: ”Já coloquei o
meu rei no trono lá em Sião, no seu santo monte”. O rei diz: “Anunciarei o
que o Deus Eterno afirmou. O Eterno me disse: ”Você é o meu filho; hoje
eu me tornei seu pai. Peça, e eu lhe darei todas as nações, e a terra toda
será sua.Com uma barra de ferro você as quebrará e as fará em pedaços
como se fossem um pote de barro.”
Salmo 2: 1-9
DEDICO
Ao Senhor meu Deus, que toda a honra e glória lhe sejam dadas!
“Porque planejam as nações pagãs fazer revoltas? Porque perdem tempo
pensando em revoluções ? Os seus reis se revoltam,e os seus governantes
se ajuntam contra o Deus Eterno e o rei que Ele escolheu. Eles dizem: “
Vamos nos livrar do seu domínio; acabemos com o poder que eles tem
sobre nós.” Do seu trono lá no céu, o Senhor ri e zomba deles. Então, muito
irado, fala com eles e os assusta com seu furor. Deus diz: ”Já coloquei o
meu rei no trono lá em Sião, no seu santo monte”. O rei diz: “Anunciarei o
que o Deus Eterno afirmou. O Eterno me disse: ”Você é o meu filho; hoje
eu me tornei seu pai. Peça, e eu lhe darei todas as nações, e a terra toda
será sua.Com uma barra de ferro você as quebrará e as fará em pedaços
como se fossem um pote de barro.”
Salmo 2: 1-9
DEDICO
SUMÁRIO
LISTA DE GRÁFICOS .......................................................................................... v
LISTA DE TABELAS............................................................................................. vi
LISTA DE ANEXOS ................ ............................................................................. vii
LISTA DE ABREVIATURAS ................................................................................ viii
RESUMO .............................................................................................................. ix
ABSTRACT........................................................................................................... x
1 INTRODUÇÃO.................................................................................................... 01
2 OBJETIVOS........................................................................................................ 03
3 REVISÃO DE LITERATURA.............................................................................. 04
3.1 ETIOLOGIA ..................................................................................................... 04
3.2 ASPECTOS HISTÓRICOS DA BRUCELOSE ................................................ 05
3.2.1 BRUCELOSE NO MUNDO..... ..................................................................... 05
3.2.1.1 OCORRÊNCIA NO HOMEM........ ............................................................. 06
3.2.2 BRUCELOSE NO BRASIL ........................................................................... 06
3.2.2.1 OUTROS ANIMAIS ................................................................................... 08
3.2.3 BRUCELOSE NO PARANÁ.......................................................................... 09
3.3 MECANISMOS DE INFECÇÃO ..................................................................... 11
3.3.1 NOS BOVINOS............................................................................................. 11
3.3.2 OUTROS ANIMAIS ...................................................................................... 11
3.3.3 NO HOMEM ................................................................................................. 12
3.4 EPIDEMIOLOGIA ............................................................................................ 12
3.4.1 BOVINOS ..................................................................................................... 13
3.4.2 OUTROS ANIMAIS ...................................................................................... 14
3.4.3 HOMEM ....................................................................................................... 15
3.5 SINAIS CLÍNICOS .......................................................................................... 15
3.5.1 BOVINOS ..................................................................................................... 15
3.5.2 OUTROS ANIMAIS ...................................................................................... 16
iii
3.5.3 HOMEM ........................................................................................................ 17
3.6 RESPOSTA IMUNOLÓGICA .......................................................................... 17
3.7 DIAGNÓSTICO ............................................................................................... 19
3.7.1 NO HOMEM ................................................................................................. 21
3.7.2 TESTES DE DIAGNÓSTICO INDIRETO ..................................................... 21
3.8 CONTROLE ..................................................................................................... 24
3.8.1 PROGRAMA DE CONTROLE DA BRUCELOSE......................................... 25
3.9 RESPOSTAS SOROLÓGICAS PÓS-VACINAIS............................................. 26
4. MATERIAL E MÉTODOS.................................................................................... 30
4.1 PROCEDÊNCIA DOS ANIMAIS ...................................................................... 30
4.2 ANIMAIS .......................................................................................................... 30
4.3 VACINAÇÃO ................................................................................................... 30
4.4 COLHEITA DE AMOSTRAS SANGÜÍNEAS ................................................... 30
4.5 BASE FÍSICA LABORATORIAL ...................................................................... 31
4.6 PROCEDÊNCIA DOS ANTÍGENOS ............................................................... 31
4.7 TÉCNICAS SOROLÓGICAS ........................................................................... 31
5. ANÁLISE ESTATÍSTICA .................................................................................. 32
5.1 CORRELAÇÃO ............................................................................................... 32
6. RESULTADOS................................................................................................... 33
7. DISCUSSÃO...................................................................................................... 38
8. CONCLUSÕES E CONSIDERAÇÕES FINAIS................................................. 46
9. REFERÊNCIAS................................................................................................... 47
10. ANEXOS............................................................................................................ 55
iv
LISTA DE GRÁFICOS
GRÁFICO 1 - Animais com resultados considerados positivos ao teste de
SAR (≥1/100), conforme interpretação da tabela do PNCEBT/
MAPA/2001, para fêmeas não vacinadas e machos com
idade superior a oito meses , em relação ao tempo decorrido
(dias), após a vacinação com a cepa B19, amostra de
Brucella abortus.................................................................................. 35
GRÁFICO 2 - Animais com resultados considerados positivos ao teste
de 2-ME (1/25), conforme interpretação da tabela do PNCEBT/
MAPA 2001, para fêmeas não vacinadas e machos com idade
superior a oito meses ,em relação ao tempo decorrido (dias) após
a vacinação com a cepa B19, amostra de Brucella abortus........... 36
GRÁFICO 3 - Animais com resultados positivos ao teste de AAT, em relação
ao tempo decorrido (dias) após a vacinação com a cepa
B19, amostra de Brucella abortus................................................... 37
v
LISTA DE TABELAS
TABELA 1 - TABELA DE RUGG - COEFICIENTES DE CORRELAÇÃO ENTRE
DUAS VARIÁVEIS .........................................................................
32
TABELA 2 -TITULAÇÃO AOS TESTES DE SAR, AAT E 2-ME, APRESENTADA
POR 45 FÊMEAS VACINADAS COM CEPA B19 DE Brucella
abortus, EM RELAÇÃO AO TEMPO DECORRIDO (DIAS) PÓS-
VACINAÇÃO....................................................................................... 33
vi
LISTA DE ANEXOS
ANEXO 1 - TÉCNICA DA PROVA DO MERCAPTOETANOL - 2-ME ................ 56
ANEXO 2 - TÉCNICA DA PROVA DE SOROAGLUTINAÇÃO RÁPIDA EM
PLACA - SAR..................................................................................... 59
ANEXO 3 - TÉCNICA DA PROVA DO ANTÍGENO ACIDIFICADO
TAMPONADO – AAT........................................................................ 61
vii
LISTA DE ABREVIATURAS
AAT - Antígeno Acidificado Tamponado
B. abortus - Brucella abortus
2-ME - 2 – Mercaptoetanol
FC - Fixação de Complemento
IS - Instrução de Serviço
IN - Instrução Normativa
MAPA - Ministério da Agricultura Pecuária e da Abastecimento
PECEBT - Programa Estadual de Controle e Erradicação da Brucelose e da
Tuberculose Animal
PNCEBT - Programa Nacional de Controle e Erradicação da Brucelose e da
Tuberculose Animal
SAR - Soroaglutinação Rápida em Placa
TPF -Teste de Polarização de Fluorescência
viii
RESUMO
Com o objetivo de verificar a cinética de produção de anticorpos em bezerras
vacinadas contra Brucelose, foram acompanhadas 47 fêmeas, vacinadas com idade
entre três e oito meses, com vacina comercial, viva atenuada de Brucella abortus,
cepa B19
.
As amostras de sangue das bezerras foram colhidas no dia da vacinação
(dia zero) e após 30, 60, 90, 150, 180, 210, 240, 270, 300, 330 e 360 dias. Os soros
foram avaliados pelas técnicas de Soroaglutinação Rápida em Placa - SAR;
Antígeno Acidificado Tamponado – AAT e ao 2-Mercaptoetanol - 2-ME. Antes da
vacinação os soros foram submetidos ao teste de SAR, com o objetivo de verificar a
presença de anticorpos maternos contra a doença. Todas as amostras apresentaram
resultado negativo pré vacinação. Dois animais vacinados não apresentaram
anticorpos pós–vacinais durante todo o experimento. Após 30 dias, 45 fêmeas
apresentaram títulos acima de 1:25 no teste de SAR e AAT positivo. No 2-ME, os
maiores títulos foram observados aos 30 dias, quando 40 animais apresentaram
títulos acima de 1:25. Aos 90 dias 45 fêmeas mantiveram a titulação >1:25 ao SAR,
mas apenas 20 delas ≥100. No AAT, 30 animais apresentaram-se positivos,
enquanto no 2-ME 19 animais apresentavam este resultado. Aos 180 dias, 31
animais apresentaram-se negativos ao AAT, 35 ao 2-ME e um dos animais obteve
titulação ≥1:100 no SAR, sendo considerado positivo. Aos 240 dias os 45 animais
apresentaram resultados negativos ao SAR, aos 300 dias no 2-ME e aos 360 dias no
AAT. Aos 360 dias após a vacinação os 45 animais obtiveram resultados negativos
aos três testes, sugerindo que os testes sorológicos podem ser utilizados em
bezerras vacinadas entre três e oito meses de idade, doze meses após esta
vacinação.
Palavras-chave: Brucelose, Brucella abortus, imunização, soroaglutinação.
ix
ABSTRACT
With the objetive to verify the cinetic of production of antibodies in heifers vaccinated
against brucellosis, 47 females had been folloied, vaccinated with age between three
and eigth months, with commercial vaccine, alive attenuated, B19 standard, strain of
Brucella abortus. The samples of heifers blood had been harvested in the vaccination
day (zero day) and after 30, 60, 90, 150, 180, 210, 240, 270, 300, 300 and 360 days.
The serum had been evaluated by the techniques of : plate agglutination, rose bengal
plate and mercaptoethanol. Before the vaccination the serum had been submitted to
the plate agglutination with the objective to verify the presence of maternal antibodies
against the illness. All the samples had presented negative result before the
vaccination. Two vaccinated animals had not presented antibodies after-vaccine
during all the experiment. After 30 days, 45 females presented level above of 1:25 in
the plate agglutination and rose bengal plate positive. In the mercaptoethanol, the
biggest headings were observed to the 30 days, when 40 animals presented levels
above of 1:25. On the 90 days, the 45 females had kept with level > 1:25 to the plate
agglutination, but only 20 of them ≥ 1:100. In the rose bengal plate, 30 animals had
been presented positive result, while in the mercaptoethanol, 19 animal presented
this result. In the 180 days, 33 animals had presented negative to the rose bengal
plate, 37 to the mercatoethanol and one of the animals got with level ≥ 1:100 in the
plate agglutination, being considered positive. In 240 days, the 45 animals had
presented negative result to the plate agglutination, in 300 days in the
mercaptoethanol and in the 360 days in the rose bengal plate. In 360 days ofter the
vaccination the 45 animals had gotten negatives result in the three tests, suggesting
that agglutination tests can be used in heifers vaccinated between three and eight
months of age, twelve months after this vaccination.
Key words: Brucellosis, Brucella abortus, immunization, agglutination test.
x
1. INTRODUÇÃO
A brucelose é uma enfermidade de evolução crônica e de caráter infeccioso,
altamente transmissível. Causada por uma bactéria denominada Brucella abortus,
acomete preferencialmente fêmeas em idade de reprodução, e eventualmente os
machos. O caráter intracelular da bactéria dificulta as medidas terapêuticas, assim às
medidas preventivas de vacinação das fêmeas, tem importância fundamental no
combate a doença (ACHA e SZYFRES, 1987; LORD et al., 1998; POESTER, 1998;
CAMPANÃ et al. 2003).
A brucelose bovina é uma das zoonoses de maior importância nas Américas,
não somente por sua implicação para a saúde humana, mas também pelas sérias
perdas que causa à criação industrial, com a conseqüente diminuição da oferta de
gêneros alimentícios (CARRILLO, 1990 A).
A ocorrência da brucelose já causou elevados prejuízos à criação de
bovinos, como no período de 1930 a 1945, quando a prevalência atingiu cifras entre
40% - 60%. Em 1955 teve início, em alguns países com ocorrência endêmica, os
Programas de erradicação, obtendo sucesso graças a identificação e eliminação dos
animais reagentes (ISHIZUKA, 2004).
No Brasil, a brucelose bovina é endêmica em todo o território nacional e
existe heterogenicidade entre as regiões quanto a sua freqüência (PAULIN e
FERREIRA NETO, 2003). O último diagnóstico da brucelose bovina no país foi
realizado em 1975. A porcentagem de animais soropositivos foi estimada em 4,0%
na Região Sul; 7,5% na Região Sudeste; 6,8% na Região Centro-Oeste; 2,5% na
Região Nordeste e 4,1% na Região Norte (BRASIL/MAPA, 2001).
O controle da brucelose no Brasil estava regulamentado pela Portaria
Ministerial 23/76, mas não obteve a eficácia desejada, por falta de um programa
estruturado, que estimulasse os produtores a adotarem ações sanitárias adequadas
em suas propriedades. Em 2001, o Ministério da Agricultura Pecuária e
Abastecimento – MAPA - iniciou o Programa Nacional de Controle e Erradicação da
Brucelose e Tuberculose Animal - PNCEBT, que objetivas baixar a prevalência e a
incidência da brucelose e entre outras medidas, determina a obrigatoriedade da
vacinação de fêmeas entre três e oito meses de idade com a vacina B19 e o uso dos
testes sorológicos: Antígeno Acidificado Tamponado – AAT, para triagem e o teste
do 2-Mercaptoetanol - 2-ME, como confirmatório. Estes testes devem ser feitos após
os 24 meses de idade nas fêmeas vacinadas para evitar que anticorpos vacinais
interfiram nos resultados (BRASIL/MAPA, 1976; BRASIL/MAPA, 2001).
O presente estudo objetiva avaliar durante 12 meses, a resposta sorológica
de bezerras vacinadas contra a brucelose entre três e oito meses de idade,
possibilitando a avaliação da situação sanitária de um rebanho, utilizando testes
sorológicos em bezerras antes dos 24 meses de idade, sem a interferência de
anticorpos induzidos pela vacinação.
HIPÓTESE: Demonstrar a partir de que idade as fêmeas bovinas vacinadas
com a cepa B19 de Brucella abortus, podem ser examinadas com testes de
soroaglutinação, sem que ocorram falsos positivos, uma vez que os testes hoje
disponíveis a baixo custo, não diferenciam animais vacinados com a cepa B19
daqueles infectados.
2. OBJETIVOS
Considerando a ocorrência de resultados falso-positivos em testes
sorológicos de bezerras antes dos 24 meses de idade em virtude da vacinação de
bezerras contra a brucelose, o presente trabalho tem como objetivos:
• Demonstrar a partir de que idade as fêmeas bovinas vacinadas com a
cepa B19 de Brucella abortus, tem o declínio dos títulos vacinais, uma
vez que os testes hoje disponíveis a baixo custo, não diferenciam animais
vacinados com a cepa B19
daqueles infectados.
• O acompanhamento do perfil sorológico de animais vacinados contra a
brucelose, entre três e oito meses de idade, com a vacina viva atenuada
de Brucella abortus, cepa B19.
• Verificar a possibilidade da realização de testes sorológicos para
brucelose, em fêmeas vacinadas, antes da idade de 24 meses,
permitindo assim a avaliação do estatus sanitário de um rebanho, sem
que os resíduos de anticorpos pós-vacinais interfiram nestes resultados.
3. REVISÃO DA LITERATURA
3.1 ETIOLOGIA
As bactérias do gênero Brucella apresentam-se como cocobactérias gram
negativas, curtas (0,6 – 1,5 mm x 0,5 – 0,7 mm), não capsuladas não esporuladas,
aeróbicas ou microaerófilas, imóveis e podem apresentar-se em cultivos primários
com morfologia colonial lisa ou rugosa (rugosa estrita ou mucóide). Esta morfologia
está diretamente associada à composição bioquímica da molécula lipopolissacarídeo
da parede celular e para algumas espécies tem relação com a virulência. É uma
bactéria intracelular facultativa (POESTER, 1998; CAMPANHA et al., 2003).
Dentro do gênero Brucella, são descritas seis espécies independentes, e
mesmo não sendo espécie-específica, cada uma apresenta um hospedeiro
preferencial: Brucella abortus - bovinos e bubalinos, B. suis – suínos, B. canis –
cães, B. ovis – ovinos, B. melitensis – caprinos, B. neotomae – rato do deserto.
A B. melitensis, B. abortus e a B. suis, são denominadas “Brucelas
Clássicas” e são divididas em biovares que se distinguem por diferentes
características bioquímicas, de comportamento, ou ambas, frente a soros
monoespecíficos A. (abortus) e M. (melitensis). Assim a B. melitensis está dividida
em três biovares, de 1 a 3, a B. abortus em sete biovares, de 1 a 7 e a B. suis em
cinco biovares, de 1 a 5 (ACHA e SZYFRES, 2001).
Os bovinos são suscetíveis à B. melitensis e B. suis, mas a espécie mais
importante para os bovinos e a responsável pela maior parte das infecções é a B.
abortus (CORREIA e CORREIA, 1975; BRASIL/MAPA, 2001).
O homem é suscetível à brucelose causada por B. melitensis, B. suis, B.
abortus e B. canis, sendo um grande risco a saúde pública principalmente em países
em desenvolvimento (BRASIL/MAPA, 2001).
3.2 ASPECTOS HISTÓRICOS DA BRUCELOSE
3.2.1 BRUCELOSE NO MUNDO
Sob o nome genérico de brucelose incluem-se, atualmente, todas as
doenças causadas por agentes do gênero Brucella, sem considerar-se as espécies
animais infectadas e as manifestações decorrentes da infecção.
David Bruce em 1887, isolou pela primeira vez, um microorganismo gram
negativo de casos fatais de infecção em soldados ingleses aquartelados na Ilha de
Malta, acometidos de "febre do Mediterrâneo” ou "febre ondulante", já conhecida por
Hipócrates e bastante disseminada no Velho Mundo no século XVII. Sendo então o
agente isolado, denominado de Micrococcus melitensis (ISHIZUKA, 2004).
Concomitantemente ao achado de Sir Bruce, Nocard em 1885, já havia
observado numeroso organismos cocóides em casos de abortos bovinos e em 1987
Bang e Stribolt cultivaram e isolaram o agente dos abortos (ISHIZUKA, 2004).
Em Nova Jersey, no ano de 1906, foi detectado a B. melitensis no leite de
cabras importadas da Ilha de Malta. Estas mesmas cabras já haviam contagiado
grande parte da tripulação e dos passageiros do barco “Joshua Nicholson”. Nas
Américas, a brucelose pode ter suas origens na época das conquistas e a infecção
ingressada com os animais domésticos importados da Espanha e de outros países
europeus (CARRILLO, 1990 B).
Desde seu isolamento e descrição, a brucelose tornou-se uma das
enfermidades zoonóticas mais difundidas no mundo, sendo encontrada em mais de
200 espécies de mamíferos, bem como em muitas espécies de aves (ACHA e
SZYFRES, 1977).
Poucos são os países considerados livres da doença, como por exemplo:
Alemanha, Dinamarca e Suécia ou com regiões do país livres, como a Grã-
Bretanha e a Itália (JORNAL OFICIAL DA U.E. , 2003).
3.2.1.1 OCORRÊNCIA NO HOMEM
Em 1863, Marston fez uma descrição minuciosa da doença, mas esta já era
conhecida anteriormente a esta data, por ocorrer no homem, recebendo nomes
diversos, como febre de Chipre, ou de Malta (CORREA e CORREA, 1992).
No homem, a doença está relacionada com a prevalência da infecção nos
reservatórios animais. O homem é suscetível a infecção por B. melitensis, B.
abortus, B. canis e B. suis. A espécie de maior importância para o homem é a B.
melitensis, seguida pela B. suis (exceto pelo biovar 2), B. abortus e B. canis, sendo
que a B. ovis e B. neotomae não foram comprovados. As infecções por B. abortus e
B. suis ocorrem com maior freqüência em grupos ocupacionais, como veterinários,
tratadores de animais, etc., e a B. melitensis é mais freqüente na população em
geral, sendo neste caso os quadros humanos mais graves (ACHA e SZYFRES,
2001; BRASIL/MAPA, 2001).
Na América Latina os países que registram maiores números de casos são a
Argentina o México e o Peru. O mesmo acontece nos países que rodeiam o Mar
Mediterrâneo, no Iram, na Antiga União Soviética e na Mongólia, entre outros (ACHA
e SZYFRES, 2001).
Nos países onde foram instituídos programas de controle da brucelose, o
índice em humanos diminuiu significativamente, como por exemplo, na Dinamarca,
que entre 1931 e 1939 registrava 500 casos por ano, e após erradicar a doença nos
animais em 1962, a doença em humanos desapareceu (ACHA e SZYFRES, 1977;
ACHA e SZYFRES, 2001).
3.2.2 BRUCELOSE NO BRASIL
O primeiro estudo sobre brucelose bovina no Brasil foi feito por Tineciro
Icibaci, por ocasião do I Congresso Nacional de Medicina Veterinária, em 1922.
Pesquisando tecidos oriundos de fetos abortados, descreveu um foco de brucelose
bovina no Município de São Carlos, São Paulo. Em 1917, Thomaz Pompeo
Sobrinho, havia estudado abortos em eqüinos, em ovinos e em bovinos. Em 1928 os
pesquisadores Tiago Melo e Neiva, isolaram B. abortus do sangue de uma vaca que
havia abortado. Silvio Torres em 1931, verificou a existência de oito animais
soropositivos para brucelose e 19 suspeitos em um lote de 51 bovinos importados
(BRASIL/MAPA, 1997; BRASIL/MAPA, 2001).
Em 1933, Sílvio Pinto propôs testes em animais importados como
forma de impedir a disseminação da doença no país, logo após em 1936, Desidério
Finamor detectou a brucelose bovina pela primeira vez no Rio Grande do Sul pelo
sorodiagnóstico. Mello em 1950, relatou a disseminação da brucelose bovina por
todo o país apontando para uma prevalência de 10 a 20%, sendo que os índices
mais altos estavam nas regiões leiteiras do Rio Grande do Sul, São Paulo, Rio de
Janeiro e Minas Gerais (PAULIN e FERREIRA NETO, 2002).
Estudos mostram que a brucelose bovina está disseminada em todo o
território nacional, com variações regionais. Em 1975 foi efetuado o primeiro e mais
amplo inquérito epidemiológico nacional, onde verificou-se uma prevalência regional
de 4% na região Sul; 7,5% na região Sudeste; 6,8% na região Centro-Oeste; 2,5%
na região Nordeste e 4,1% na região Norte (BRASIL/MAPA, 2001).
Posteriormente, outros levantamentos sorológicos por amostragem,
realizados em alguns estados, revelaram pequenas alterações na prevalência de
brucelose desde 1975. No Rio Grande do Sul a prevalência passou de 2,0%, em
1975, para 0,3% em 1986; em Santa Catarina passou de 0,2%, em 1975, para 0,6%
em 1996; no Mato Grosso do Sul a prevalência estimada em 1998 foi de 6,3%,
idêntica ao valor encontrado em 1975 no antigo estado do Mato Grosso; em Minas
Gerais passou de 7,6%, em 1975, para 6,7% em 1980; no Paraná, a prevalência
estimada em 1975 foi de 9,6%, passando para 4,6% de bovinos soropositivos em
1989 (BRASIL/MAPA, 2001; POESTER et al., 2002; DIAS, 2003).
Desde 1944, o Ministério da Agricultura vem propondo tentativas de controle
da brucelose bovina por meio de programas, que visavam principalmente a
vacinação e a identificação de animais, abate voluntário e diagnóstico nos rebanhos
(DIAS, 2003).
Em 1976, o controle da brucelose bovina foi regulamentado pela portaria
ministerial 23/76, que continha medidas regulamentadas para a profilaxia da
brucelose animal, prevendo a notificação de focos, aconselhava a eliminação ou o
isolamento dos positivos e a vacinação de fêmeas entre três e oito meses de idade.
Contudo, as medidas não estavam atingindo a eficácia desejada, em razão
da ausência de um programa estruturado que criasse estímulos para os pecuaristas
adotarem ações sanitárias mais adequadas (BRASIL/MAPA, 1976).
Apesar das medidas adotadas pela Instrução Normativa 23/76, os dados
oficiais do Boletim de Defesa Sanitária Animal, demonstraram que a prevalência de
animais positivos se manteve entre 4% e 5%, no período entre 1988 e 1998
(BRASIL/MAPA, 2001).
Em janeiro de 2001 o Ministério da Agricultura Pecuária e Abastecimento-
MAPA, lançou o Programa Nacional de Controle e Erradicação da Brucelose e da
Tuberculose Animal- PNCEBT, que objetiva diminuir a prevalência e a incidência
destas enfermidades. Entre outras medidas, o PNCEBT determina a obrigatoriedade
da vacinação da brucelose em fêmeas entre três e oito meses de idade, com a cepa
B19 de Brucella abortus, e a eliminação em no máximo 30 dias, dos animais
reagentes positivos (BRASIL/MAPA 2001).
3.2.2.1 OUTROS ANIMAIS
A brucelose em suínos é controlada de acordo com as normas de certificação
de Granjas de Reprodutores de Suínos Certificada – GRSC, da Secretaria de Defesa
Agropecuária, que estabelecem procedimentos de diagnóstico e controle na
população de matrizes, utilizando o monitoramento sorológico.
A brucelose ovina e caprina de importância epidemiológica, causada por
Brucella melitensis, não foi até hoje diagnosticada no Brasil. A epididimite ovina,
causada por Brucella ovis, não estão incluídas no Programa Nacional, mas sim em
normas estabelecidas pelo Ministério da Agricultura, em programas distintos da
brucelose bovina (BRASIL/MAPA 2001).
3.2.3 BRUCELOSE NO PARANÁ
Palmiquist em 1947 diagnosticou, pela primeira vez no Estado do Paraná, a
brucelose bovina, utilizando provas de soro-aglutinação (PALMQUIST, 1949).
Um levantamento sobre a incidência da doença, a fim de determinar o mais
precisamente possível a sua freqüência, foi iniciado em 1947. Os trabalhos foram
iniciados pelo gado leiteiro da região de Curitiba, mas por dificuldades encontradas
nas condições, principalmente de locomoção, não foi possível examinar todos os
estábulos da região, sendo então escolhidos 647 estábulos em distritos diferentes da
região. Nos nove distritos estudados, foram coletados soros de 647 animais, onde
foram encontrados 11 positivos e 11 suspeitos, dando uma porcentagem de 3,4 %
de reagentes à prova.
Para a avaliação do gado de campo (corte), o Estado foi dividido três zonas:
Norte, Centro e Sul. A zona Norte com os municípios de Andirá, Bandeirantes,
Cambará, Comélio Procópio, Cariópolis, Jacarézinho e Santo Antônio da Platina. Na
zona do Centro foram Ponta Grossa, Jaguariaíva e Castro, e na zona do Sul os
municípios de Palmeira, Piraquara, Palmas, Porto Amazonas e Lapa.
Na zona Norte foram examinados 569 animais, obtendo 110 animais
positivos e 39 suspeitos, resultando em uma porcentagem de 21,18% de reagentes à
prova. Na zona do centro, foram examinados 183 animais, obtendo 15 positivos e 14
suspeitos, perfazendo o índice de 15,83% de animais reagentes. Na zona Sul foram
examinados 104 animais, obtendo somente um animal com resultado positivo,
resultando em 0,96% de animais reagentes à prova (PALMQUIST, 1949).
Em 1975 o Ministério da Agricultura promoveu o primeiro levantamento
nacional, por meio de um inquérito soroepidemiológico por amostragem. Neste
inquérito o estado do Paraná obteve o índice de prevalência de 9,6%.
Posteriormente cada estado brasileiro fez seu levantamento soroepidemiológico,
quando então o Paraná demonstrou que suas medidas de profilaxia e a vacinação
de bezerras entre três e oito meses de idade, apesar de não ser obrigatória no
estado, estavam obtendo alguns resultados, mas não o esperado. Neste
levantamento obteve-se a prevalência de animais positivos de 4,6% (BRASIL/MAPA,
2001).
No ano de 2001, em consonância com o PNCEBT, o Paraná lançou o
Programa Estadual de Controle e Erradicação da Brucelose e da Tuberculose
Animal- PECEBT, cujo regulamente técnico prevê a obrigatoriedade da vacinação de
bezerras entre três e oito meses de idade, a eliminação de animais reagentes
positivos e a certificação de propriedades como livre ou monitoradas para estas
enfermidades (PARANÁ, 2001).
Em 2002, o Estado do Paraná promoveu seu último levantamento
soroepidemiológico da brucelose bovina. O estado foi dividido em sete circuitos
produtores, representadas pelo número de propriedades, número total de bovinos e
fêmeas com idade igual ou superior a 24 meses. Foram coletadas amostras de
14.855 animais, provenientes de 2.098 propriedades (de escolha aleatória)
distribuídos nos sete circuitos. Dos 2.094 rebanhos analisados, 97 foram positivos,
obtendo a prevalência de 3,89% em propriedades e dos 14.808 animais analisados,
149 foram sororeagentes à brucelose, com uma prevalência de 2,34% (DIAS, 2003).
3. 3 MECANISMOS DE INFECÇÃO
3.3.1. NOS BOVINOS
A principal fonte de infecção bovina são os restos fetais, envolturas fetais e
descargas vaginais contendo grande número de brucelas. O pasto também pode ser
contaminado por fezes de bezerros que se alimentam de leite infectado, pois nem
todas as brucelas são eliminadas pelo trato digestivo (ACHA e SZYFRES, 2001).
A principal porta de entrada do agente no animal é a mucosa do aparelho
digestivo (via oral). Após atravessar a barreira intestinal, alcança a circulação
sangüínea por meio do sistema porta. A primeira infecção ocorre quando estas
entram nos macrófagos, multiplicando-se e posteriormente dirigindo-se aos órgãos
de eleição (aparelho reprodutor) (ACHA e SZYFRES, 2001; CAMPANÃ, 2003).
A principal causa da ocorrência da doença em um rebanho de animais livres é
com a entrada de animais infectados, podendo ainda entrar pela inseminação
artificial ou ainda quando uma vaca entra em contato com pasto contaminado, restos
placentários, placentas, etc. (DERIVAUX, 1982).
Quando a brucelose recém-ingressa em uma criação ela pode comportar-se
como epidemia, causando surto de abortos (CORREA e CORREA, 1992).
3.3.2 OUTROS ANIMAIS
Nos suínos a B. suis é o principal agente, sendo a B. abortus e a B.
melitensis, de ocorrência ocasional. As fontes de infecção são as mesmas que para
os bovinos. As vias principais de transmissão são a digestiva e a venérea, sendo a
monta natural um modo comum e importante de transmissão da infecção
(DERIVAUX, 1982; ACHA e SZYFRES, 2001).
As cabras e em menor grau, as ovelhas, são suscetíveis a B. melitensis e se
infectam de forma similar ao bovino. A contaminação se dá por via digestiva,
respiratória e pela penetração da bactéria pelas mucosas, especialmente pela
digestiva (DERIVAUX, 1982).O macho pode contrair a brucelose depois de cobrir
uma fêmea infectada e depois transmiti-la a outras fêmeas, porém este papel do
macho na transmissão ainda não está bem definido. A excreção se dá pela urina e
pelo leite. Na epididimite no carneiro pela B. ovis, o sêmen é a principal fonte de
infecção, e a transmissão se dá por contato retal e prepucial entre um macho e
outro. A infecção nas fêmeas é pouco freqüente, se dá por via venérea e
normalmente de pouca duração (DERIVAUX, 1982; ACHA e SZYFRES, 2001).
3.3.3 NO HOMEM
A transmissão da brucelose ocorre pelo contato do agente com mucosas ou
soluções de continuidade da pele. A carne crua com restos de tecido linfático e o
sangue de animais infectados, embora apresente menor risco, pode conter
microorganismos viáveis e, portanto significa risco para a população humana
consumidora (BRASIL/MAPA, 2001).
O homem pode se infectar ao auxiliar os animais brucélicos no parto, com o
feto, líquidos fetais e restos de placenta. O hábito de consumir leite cru e outros
produtos de origem animal sem cozimento também representam fonte de infecção
ao homem (ACHA e SZYFRES, 2001).
3. 4 EPIDEMIOLOGIA
A brucelose é uma enfermidade de distribuição mundial, apesar de alguns
países da Europa, Canadá e EUA a manterem sob controle ou já a erradicaram,
como os nórdicos.
O papel dos animais na epidemiologia é essencial, pois a brucelose é uma
zoonose. Os casos de transmissão entre humanos são raros (ACHA e SZYFRES,
2001).
3.4.1 BOVINOS
A infecção entra em um rebanho sadio pela compra de um animal infectado
ou pela inseminação artificial. Uma fêmea sadia, gestante, que entra em contato com
material contaminado, pode ser infectada rapidamente e abortar (CAMPANÃ, 2003).
A eliminação da brucela pelo animal contaminado ocorre principalmente no
momento do parto, contaminando o ambiente (solo, pasto, água, etc.) com restos e
líquidos fetais, bem como as pessoas que os manipulam e os animais que o
ingerem, contribuindo com a disseminação da doença. Após o aborto, a infecção se
localiza no úbere e nos gânglios supramamários, e a eliminação do agente pelo leite
pode durar muito tempo, mas de forma irregular e intermitente (DERIVAUX, 1982)
Os bezerros são relativamente resistentes, mas se forem alimentados com
leite de vacas brucelicas podem eliminar o agente nas fezes, tornando-se assim
fontes de infecção nas propriedades (DERIVAUX, 1982). Bezerras infectadas antes
do nascimento, ou logo após o nascimento, se permanecerem infectadas, podem
tornar-se fontes de infecção nos rebanhos (CORREA e CORREA, 1992).
O período de incubação pode variar conforme o período da prenhez em que
a vaca se infectou. Quanto mais adiantada a prenhez, menor o período de
incubação. Em uma contaminação via oral, em período de monta, o tempo de
incubação pode chegar a 200 dias. O período desde a infecção ao aparecimento de
anticorpos, é variável de semanas até meses. Fatores como a virulência da bactéria,
doses e vias de infecção fazem com que o período de incubação varie (ACHA e
SZYFRES, 2001).
3.4.2 OUTROS ANIMAIS
Nos suínos a brucelose é eliminada via espermática, e pode prolongar-se por
um grande período. Quando a brucelose entra em uma propriedade livre, todos os
animais são suscetíveis. Os leitões podem permanecer infectados até a idade adulta,
sendo de importância para o controle da doença em uma propriedade. As fêmeas
infectadas podem eliminar a brucela em grande quantidade no momento do parto e
com o leite (DERIVAUX, 1982).
Em algumas espécies como ovinos, tanto a via venérea quanto a
contaminação de pastos e instalações podem ser responsáveis pela infecção.
Animais domésticos tais como o gato, o cachorro e as aves, não tem papel relevante
na eliminação da brucelose ao homem ou a outros animais (MERCK, 1986)
Os animais silvestres podem ser portadores, mas seu papel como
transmissores ainda não está bem definido (SZYFRES e TOMÉ,1964). Alguns
animais silvestres são fontes naturais de infecção, como os ratos do deserto
(Neotoma lepida) que são reservatórios de B. neotomae (ACHA e SZYFRES, 1977;
ACHA e SZYFRES, 2001).
Nos carnívoros, a infecção é adquirida pela ingestão de fetos ou restos
fetais de aborto, mas não há comprovação da transmissão de um indivíduo para
outro entre um carnívoro e outro. É provável que ao se controlar a brucelose dos
animais domésticos, esta seja extinta neste grupo. Os animais domésticos também
podem transmitir a infecção para os animais silvestres, como no caso da Argentina
onde ocorre a infecção de raposas (Dusicyon gymnocercus, D griseus) por B.
abortus biotipo 1. A situação se torna relevante quando há transmissão de animais
domésticos aos silvestres onde a brucelose se perpetua, como no caso do antílope
das estepes (Saiga tatarica) ou o bisonte americano (Bison bisom) (ACHA e
SZYFRES, 2001).
3.4.3 HOMEM
A brucelose zoonótica é considerada uma doença de caráter ocupacional,
pois pode infectar a pessoa que manipula anexos e fluídos fetais e carcaças de
oriundas de animais infectados, como bovinos, suínos, caprinos e ovinos.
Magarefes, trabalhadores das indústrias de laticínios e até mesmo donas de casa
estão sujeitos a infecção pelo contato com a carne ou leite contaminados
(BRASIL/MAPA, 2001).
O grande risco para a saúde pública é decorrente da ingestão de leite cru e
produtos lácteos oriundos de animais infectados e não submetidos a tratamento
térmico (queijo fresco, iogurte, etc.). O período de incubação pode variar de uma a
três semanas, mas pode prolongar-se por até alguns meses (ACHA e SZYFRES,
2001).
3.5 SINAIS CLÍNICOS
3.5.1 BOVINOS
Quando a brucelose entra em um rebanho, o principal sinal clínico é o
aborto, principalmente entre o sétimo e o oitavo mês de gestação, mas pode ser
mais precoce. A esterilidade temporária ou permanente, repetição de cio e perdas na
produção de leite por mastites inespecíficas, também são características da
enfermidade (DERIVAUX, 1982; ACHA e SZYFRES, 2001).
O período de incubação varia entre 14 a 180 dias, sendo a febre um sinal
presente.
A secreção vaginal, purulenta ou não, é freqüente, com coloração cinza ou
vermelho pardo, e a infecção ocorre na glândula mamária. A imunidade é lenta, o
que pode ocasionar até três abortos na mesma fêmea, até que as gestações sigam
normalmente. Estima-se que em torno de 10 a 25% das vacas abortam pela
segunda vez e depois voltam a ter uma função reprodutora normal. As gestações
seguem normalmente e os bezerros nascem a termo (ACHA e SZYFRES, 1977).
Nos machos as brucelas podem localizar-se nos testículos e nas glândulas
genitais anexas e quando a enfermidade se manifesta clinicamente, os testículos
podem aumentar de volume, com diminuição da libido e infertilidade (ACHA e
SZYFRES, 2001).
Observa-se artrite no tarso e metatarso ou poliartrite, tenosinovite, bursites e
abcessos cutâneos. As lesões observadas nos fetos abortados são: edema de pele,
pericárdio e no cordão umbilical e transudato sero-hemorrágico nas cavidades
torácica e abdominal e no pericárdio (CAMPANÃ et al., 2003).
3.5.2 OUTROS ANIMAIS
Nos suínos a infecção por B. abortus, é geralmente assintomática, limitando-
se aos gânglios da cabeça. Quando a brucelose por B. suis entra em uma
propriedade livre, a enfermidade apresenta-se de forma aguda. Ocorrem abortos,
infertilidade, nascimento de leitões fracos, orquite, epididimite e artrite (ACHA e
SZYFRES, 2001).
Nos caprinos a sintomatologia é similar àquelas observadas em outras
espécies, com o aborto entre o terceiro e quarto mês, a principal manifestação. Em
uma infecção natural, outros sintomas como artrite ou mastite são raros. As cabras
não prenhes, mas sexualmente maduras são suscetíveis e sofrem infecção crônica,
inaparentes e podem apresentar riscos a outros animais do rebanho. A brucelose
ovina tem a sintomatologia similar a caprina, sendo os ovinos mais resistentes que
os caprinos (ACHA e SZYFRES, 2001).
3.5.3 HOMEM
A Brucella mais patogênica ao homem é a B. melitensis, seguida pela B. suis
(exceto pelo biovar 2) B. abortus e B. canis. O período de incubação da brucelose
dura de uma a três semanas, mas pode prolongar-se por vários meses. É uma
doença septicêmica, de início repentino, com febre contínua, intermitente ou irregular
(BRASIL/MAPA, 2001). Os sintomas da brucelose aguda são semelhantes aos de
diversas outras enfermidades, como calafrios, sudorese profusa e febre. Um sintoma
muito comum é a astenia e qualquer exercício produz um profundo cansaço. A
temperatura pode variar de normal pela manhã, até 40º C à tarde. A sudorese
apresenta-se durante a noite e tem um odor característico (CORRÊA e CORRÊA,
1992; ACHA e SZYFRES, 2001).
Os sintomas comuns são: insônia, impotência sexual, constipação, anorexia,
dor de cabeça, dores articulares e dores generalizadas. A doença produz um grande
impacto sobre o sistema nervoso, traduzido por irritabilidade, nervosismo e
depressão. Muitos pacientes ficam com os gânglios periféricos aumentados e
também com o baço e o fígado inchados. A icterícia é rara (ACHA e SZYFRES,
2001).
3.6 RESPOSTA IMUNOLÓGICA
A Brucella tem estrutura antigênica completa, entre os antígenos mais
importantes estão o lipopolissacarídeo–LPS, o hapteno nativo–HP, proteínas
citoplasmáticas e de membrana externa. Por estar localizada na superfície da célula
e por sua imunogenicidade, o LPS é o primeiro antígeno a induzir o aparecimento de
anticorpos (SANCHES et al., 2000).
Uma vez que a Brucella invadiu a mucosa, macrófagos e neutrófilos
presentes na submucosa, fagocitam a bactéria (GORVEL e MORENO, 2002).
A Brucella utiliza-se de macrófagos e neutrófilos como proteção contra
organismos celulares e humorais durante a bacteremia. Esta bacteremia ocorre após
duas a quatro semanas, e quando ele se liberta dos neutrófilos, é fagocitado
exclusivamente por macrófagos dos órgãos onde se encontra, se multiplicará,
causando uma reticuloendoteliose difusa (CORREIA e CORREIA, 1992).
Após uma a duas semanas aparecerá a IgM e após quatro semanas a IgG e
IgM. Poderá ocorrer a formação de nodulação de macrófagos em células epitelióides
e infiltração por linfócitos e plasmócitos, ocorrendo necrose de caseificação, quando
a distribuição do agente não for muito difusa (POSTER, 1975).
Na placenta da vaca, ocorre grande quantidade de eritritol, um hidrato de
carbono, que estimula a multiplicação da espécie, o que explicaria a grande
suscetibilidade dos tecidos fetais dos bovinos. Estando na placenta a bactéria tem
predileção pelo epitélio trofoblástico, resultando em placentite necrótica, causando
aborto por comprometimento da circulação materno-fetal (ACHA e AZYFRES, 2001).
Em geral a infeção com Brucella induz a respostas imunológicas humorais e
mediadas por células. Em magnitude e duração, estas respostas podem ser
influenciadas por muitos fatores, como a virulência da cepa infectante, a quantidade
de inócuo, a idade, sexo, gestação, espécie e estado imunológico dos hospedeiros
(OMS, 1986).
Os anticorpos circulantes estão ligados a frações séricas denominadas
imunoglobulinas. A macroglobulina IgM, do grupo 19S, aparece nos períodos iniciais
da infecção enquanto as microglobulinas IgG, do grupo 7S, aparecem
posteriormente. No leite de vacas brucélicas são encontradas as imunoglobulinas do
grupo 12S, sendo que o aparecimento de outras imunoglobulinas como a IgA e a
IgD, não está bem esclarecido (CARRILLO, 1970).
3.7 DIAGNÓSTICO
No diagnóstico da brucelose, os sinais clínicos devem ser considerados
como indicativos da enfermidade, mas o diagnóstico final deverá ser sempre
sorológico ou bacteriológico, por ser o aborto um sinal clínico de diversas
enfermidades em animais (CORREA e CORREA, 1992).
Para um exame bacteriológico, os materiais a serem enviados são fetos,
envolturas fetais, secreções vaginais, leite e semen. A eliminação da bactéria pelo
leite de uma vaca infectada é constante e intermitente, sendo um excelente material
para o isolamento da Brucella (ACHA e AZYFRES, 2001).
A Brucella tem um bom crescimento em ágar sangue 5 –10%, no entanto o
conteúdo abomasal do feto e o colostro normalmente estão contaminados por
fungos e bactérias, sendo então necessário um meio seletivo composto de ágar
sangue com 5% de soro negativo eqüino ou bovino e um suplemento antibiótico. O
suplemento antibiótico normalmente utilizado para B.ovis é diferente daquele
utilizado para B. abortus (QUINN , et al., 1994).
Existem diferenças entre a B. abortus biotipo 1, de campo e a amostra cepa
B19, derivada da B. abortus, utilizada na vacinas. Ocorrem reações similares no
teste do CO
2,
mas a cepa B19 é inibida pelo eritritol e suscetível a penicilina,
enquanto a B. abortus tem crescimento em presença do eritritol e apresenta-se
resistente a penicilina (QUINN , et al., 1994).
O diagnóstico diferencial da brucelose é realizado com o isolamento e a
identificação do agente. No entanto há circunstâncias em que não é possível o
diagnóstico bacteriológico, sendo então conveniente utilizar os métodos sorológicos,
como por exemplo os realizados nos Programas de erradicação (OMS, 1986).
Os testes de soroaglutinação são os principais métodos de diagnóstico da
brucelose bovina e bubalina no Brasil. Ressalta-se o papel, quase exclusivo, da
soroaglutinação como prova utilizada para diagnóstico individual da brucelose. Estas
provas contribuíram muito para os Programas de controle e erradicação desta
enfermidade em diversos países, apesar de não diferenciarem animais vacinados
com a cepa B19
daqueles realmente infectados (SAMARTINO, 2002).
Vários países tem como eleição as provas de soroaglutinação para o
diagnóstico da brucelose nos seus programas de controle da enfermidade. As provas
mais utilizadas são: AAT, SAR e o 2-ME.
No Brasil são utilizados os testes do AAT como triagem e o 2-ME ou a
Fixação de Complemento – FC, como confirmatórios. No trânsito internacional é
exigido a FC. O SAR, a partir de 2003, não é mais aceita como prova de triagem no
Brasil, por ser considerada inadequada. Estudos comparativos entre diversos testes
de diagnóstico, demonstraram que esta prova é inapta por não apresentar resultados
confiáveis, não sendo mais permitida sua comercialização e utilização
(BRASIL/MAPA, 2001).
Os resultados das provas sorológicas apresentam interferência dos
anticorpos vacinais, quando os animais são vacinados com amostra B19 de Brucella
abortus, sendo necessário precaução na interpretação destas provas, em conjunto
com boa coleta de dados dos animas em questão (JACOBO et al., 2001).
Para evitar a ocorrência de falsos positivos por causa da vacinação, o MAPA
determina que em fêmeas vacinadas com amostra B19, os testes sorológicos sejam
feitos após os 24 meses de idade do animal (BRASIL/MAPA, 2001).
Vários testes estão sendo desenvolvidos com o intuito de diferenciar os
anticorpos vacinais daqueles resultantes de infecção por Brucella abortus, ou ainda
que apresentem reações cruzadas com outros microorganismos como por exemplo a
Yersinia enterocolítica O:9, Salmonella urbana O:30, Pseudomonas maltophilia e
Vibrio cólera O:1 (OMS, 1986).
3.7.1 NO HOMEM
O diagnóstico da brucelose no homem é baseado na sintomatologia
apresentada e complementada pelo diagnóstico laboratorial. Para confirmar a
enfermidade, são utilizados o isolamento e a tipificação da bactéria, o que também
pode identificar a fonte de infecção. O material utilizado para os exames de
diagnóstico são entre outros, gânglios e líquido cefaloraquidiano e de abcessos.
Em áreas enzoóticas de B. abortus, é recomendada a repetição dos exames,
pois muitas vezes o paciente faz uso de antibióticos antes do diagnóstico final
(ACHA e SZYFRES, 2001).
3.7.2 TESTES DE DIAGNÓSTICO INDIRETO
Entre os testes desenvolvidos estão o Teste de Polarização de
Fluorescência – TPF, o Teste de Elisa Indireto (I-Elisa), o Teste de Elisa Competitivo
(C-Elisa) e o Teste do Anel do Leite – TAL e para o Programa Nacional ficaram
estabelecidos os testes de AAT e o 2-ME, em conjunto com a Prova Lenta em Tubo
– PL (BRASIL/MAPA, 2001).
O TPF, sendo que o antígeno utilizado neste testes é preparado com
polissacáride O (cadeia O) de B. abortus conjugado com isotiocianato de
fluoresceína. A prova baseia-se no movimento ao acaso de uma molécula em ação,
sendo que o tamanho molecular é o principal fator que influencia a taxa de rotação
de uma molécula e é inversamente proporcional a esta. O soro ou o leite podem ser
utilizados neste teste (BRASIL/MAPA, 2001). O TPF, apresenta boa acurácia quanto
a detecção de anticorpos de infecção e não de vacinação e pode ser utilizado como
confirmatório (OMS, 1986).
Para o teste de Elisa Indireto (I-Elisa) existem várias técnicas que
apresentam bons resultados. Utiliza-se como antígeno o lipopolissacarídeo de B.
abortus imobilizado em placas de 96 poços. Como conjugado utiliza-se um anticorpo
monoclonal anti-IgG1 bovina conjugado à peroxidase. Agentes quelantes
(EDTA/EGTA) são utilizados para minimizar reações não específicas.
Este teste apresenta alta sensibilidade, no entanto sua especificidade
assemelha-se a do AAT (BRASIL/MAPA, 2001).
Para efetuar o teste de Elisa Competitivo (C-Elisa) utiliza-se como antígeno na
fase sólida o lipopolissacarídeo de B. abortus. O soro a testar é misturado a um
anticorpo monoclonal específico contra o polissacarídeo O (cadeia O) de B. abortus.
Um conjugado peroxidade-anti-IgG de camudongo é utilizado para a detecção do
anticorpo monoclonal ligado ao polissacarídeo na fase sólida do teste. Quanto maior
a quantidade de anticorpos anti-antígeno O de Brucella sp no soro testado, maior a
competição com o anticorpo monoclonal específico e menor a quantidade de cor
desenvolvida. Por comparação a um controle, é possível quantificar a quantidade
relativa de anticorpos anti-brucella no soro teste. Este teste é muito sensível e
específico, porém de custo elevado. Está aprovada para utilização como teste
confirmatório pela OIE (BRASIL/MAPA, 2001).
O Teste do Anel do leite – TAL, deve ser aplicado em misturas de leite de
vários animais, pois a baixa concentração celular do antígeno (4%), torna-o bastante
sensível. Se houver anticorpos presentes no leite, a combinação de antígenos
corados com hematoxilina combinam com B. abortus do antígeno e se aderem aos
glóbulos de gordura, fazendo com que se forme um anel azulado com a coluna de
leite branca abaixo, representado reação positiva. Não havendo anticorpos
presentes, o anel será branco e a reação negativa. Esta prova é útil na detecção de
rebanhos infectados e no monitoramento dos livres, no entanto pode apresentar
falsos-positivos em presença de leite ácido de animais em início de lactação ou
portadores de mamites (BRASIL/MAPA, 2001).
O SAR ou Prova de Huddleson foi desenvolvida por Huddleson em 1920,
sendo esta técnica difundida mundialmente, especialmente nas Américas, onde é um
método de rotina, pois tem as vantagens de ser rápida e simples. Esta prova detecta
IgM e IgG, e é feita com soro dos animais contra antígeno padronizado, constituído
por suspensão de B. abortus corada com cristal-violeta ou verde brilhante
(CARRILLO, 1970).
No Brasil, o SAR não é mais utilizado desde 2003 (BRASIL/MAPA, 2001).
A prova do AAT teve sua origem no Departamento de Agricultura dos
Estados Unidos. O desenvolvimento da prova ocorreu a partir da observação de que
a IgGı bovina é menos ativa em pH neutro, mudando o seu comportamento
bioquímico em meio ácido. O pH 3,65 ± 0,05 aumenta o poder da aglutinação da
IgGı, reduz a reatividade da IgM e destrói aglutininas inespecíficas (GARCIA e
CARRILLO, 1982; WRIGHT e NIELSEN, 2002).
O AAT é uma prova qualitativa e não quantitativa, pois não determina a
concentração de anticorpos no soro. Nesta prova o antígeno é tamponado em pH
baixo, o que reduz a atividade da IgM, tornando-a seletiva à identificação da
subclasse IgG
1
(MEGID et al., 2000).
O AAT, em substituição do SAR, possibilita estratégias de controle da
brucelose em menor espaço de tempo, em virtude de sua alta sensibilidade,
especificidade, praticidade e baixo custo. Esta prova é utilizada nos Estados Unidos
e na Inglaterra, como prova rápida para separar bovinos positivos de negativos e
posteriormente confirmada com outras provas (MEGID et al., 2000). No Brasil esta
prova é utilizada como prova de triagem a campo, quando da certificação de
propriedades livres ou monitoradas para brucelose (BRASIL/MAPA, 2001).
A prova do 2-ME detecta tanto a IgG
1
como IgG
2
, sendo que o reagente do
2-ME aumenta a sensibilidade do teste, pela reatividade da IgG
1,
aumentando a
tendência de detectá-la, em comparação a IgG
2
. Isto provavelmente ocorra pelo pH
ácido (5,5) do 2-ME a 0,714%, utilizado na prova. Os compostos químicos com
grupos sulfidrilos (radical tiol), como o 2-ME, por exemplo, conferem ao teste a
propriedade de inativar as imunoglobulinas IgM, que tem sua formação em
pentâmeros degradada, perdendo assim sua atividade aglutinante. Esta prova é
utilizada como prova confirmatória, após o AAT (ALTON, 1976; PAULIN, 2002).
Para auxiliar na interpretação da prova do 2-ME, ela deve ser realizada com
conjunto com a prova lenta em tubo “standard”, que consiste no mesmo método do
2-ME, apenas sem a presença do reagente e com as mesmas diluições (GARCIA e
CARRILLO, 1971).
3.8 CONTROLE
O controle da brucelose está baseado principalmente no diagnóstico
presuntivo, na vacinação das bezerras, no isolamento dos animais reagentes
positivos do restante do rebanho e a eliminação destes (SAMARTINO et al., 2000).
Para se obter um bom controle e profilaxia da enfermidade, com a
eliminação das fontes de infecção e o descarte dos animais reagentes positivos,
após um teste de triagem, seguido por um teste confirmatório, devem ser tomadas
medidas relativas aos animais suscetíveis como, a vacinação das bezerras entre
três e oito meses de idade, entrada controlada de animais na propriedade, medidas
de higiene, principalmente pós-parto, e sorologia periódica (ISHIZUKA, 2003).
Uma das vacinas mais utilizadas em programas governamentais é a B19, de
Brucella abortus, mas esta vacina causa a grande maioria dos falso-positivos, nos
testes de soroaglutinação. Esta reação advém do fato de que a amostra 19 de
Brucella abortus apresenta morfologia colonial lisa, que é incapaz de alterar sua
virulência por passagens sucessivas em animais (ALTON, 1998).
A vacina RB51 foi desenvolvida a partir da amostra 2308 virulenta, uma
mutante rugosa que tem a característica de não induzir no animal vacinado a
formação da cadeia O – polissacarídeo-específico, que interfere nos testes
sorológicos, e poderá ser utilizada em programas governamentais (LORD, 1998).
O uso da vacina RB51
no Brasil está liberada
para uso em casos especiais
como os surtos em uma área determinada ou outros casos determinados pelo
Serviço Oficial, mas ainda não há produção nacional. A vacina oficial estabelecida
para programa de controle empreendido pelo governo brasileiro e utilizada para
diminuir a prevalência da doença no país é a B19
(BRASIL/MAPA, 2001).
3.8.1 PROGRAMA DE CONTROLE DA BRUCELOSE
As decisões quanto às estratégias apropriadas para combater e/ou erradicar
a brucelose, devem ser adaptadas para uso nacional, entretanto alguns países
delegam aos Estados ou Províncias as aplicações que mais se adaptem às
condições epidemiológicas e socioeconômicas existentes (OMS, 1986).
Em 2001 o Ministério da Agricultura lançou o Programa Nacional de Controle
e Erradicação da Brucelose e da Tuberculose Animal- PNCEBT, e entre as medidas
adotadas estão: a vacinação compulsória, padronização dos testes de diagnóstico
utilizados, isolamento e abate dos animais reagentes positivos, controle da
movimentação de animais para a reprodução, cursos de treinamento para médicos
veterinários e a certificação de propriedades como livres ou monitoradas para estas
enfermidades ( POESTER et al., 2002).
A vacinação obrigatória das bezerras com idade entre três e oito meses, visa
diminuir a prevalência e a incidência desta enfermidade. A certificação de
propriedades como Livres ou Monitoradas para a brucelose e a tuberculose, que
estão dentro dos princípios técnicos sugeridos pelo Código Zoosanitário
Internacional e são aceitos internacionalmente, e são instrumentos para que os
produtores e o setor agro-industrial valorizem os seus produtos (BRASIL/MAPA,
2001).
A adesão à certificação de uma propriedade é voluntária, sendo a
certificação monitorada, indicada para as propriedades destinadas a gado de corte e
genética e a certificação de livre, para as propriedades especializadas em gado de
leite.
Nas propriedades a serem certificadas como livres, serão feitos testes em
todo o rebanho, respeitando a faixa etária, obtendo-se a certificação após três testes
consecutivos negativos. Em propriedades monitoradas, os testes são realizados por
amostragens de reprodutores no plantel, utilizando-se o conceito de gestão de risco.
Após a obtenção do certificado, somente podem ingressar na propriedade animais
oriundos de outras propriedades com a mesma situação sanitária ou com dois
exames de diagnóstico negativos, um na origem e outro no destino (BRASIL/MAPA,
2001).
3.9 RESPOSTAS SOROLÓGICAS PÓS-VACINAIS
A vacina recomendada para utilização em programas governamentais é a
cepa B19 de Brucella abortus. Em pesquisa realizada em 24 países americanos,
nove utilizam a cepa B19, dois utilizam a cepa RB51, seis deles aplicam ambas as
cepas e sete deles não informaram qual delas utilizam (OPS/OMS, 2000).
Preparada a partir de cepa atenuada de B. abortus, a B19 induz a imunidade
celular e humoral. Os anticorpos decorrentes da imunidade humoral são reduzidos a
níveis não detectáveis ou discrimináveis em sorologia realizada quando os animais
chegam a fase adulta. Esta vacina protege os animais contra o aborto, mas não
impede totalmente a infecção, principalmente no úbere (ISHIZUKA, 2003).
A vacina cepa B19
é uma vacina viva atenuada, que apresenta morfologia
colonial lisa e incapacidade de alterar sua virulência por passagens sucessivas em
animais e não cresce em presença de eritritol (ALTON, 1998).
Um dos pontos mais preocupantes no uso da vacina é a persistência de
anticorpos sorológicos pós-vacinais, o que gera muitos resultados falso-positivos nas
provas sorológicas hoje utilizadas, sendo difícil distinguir anticorpos de infecção,
daqueles resultantes da vacinação. Com a utilização da vacina, podem ocorrer
reações cruzadas com outros microorganismos como: Escherichia coli O157,
Yersinia enterocolitica O:9, Francisella tularensis, Salmonella urbana, Pseudomonas
maltophilia (OMS, 1986; MEGID et al., 2000).
Ao ser vacinado, o animal produz anticorpos das classes IgM e IgG. As IgM
se formam primeiramente, podendo ser detectadas entre cinco a sete dias após a
vacinação, com pico entre 13 e 21 dias. Depois sua concentração diminui, mas não
desaparece por vários meses. As IgG se formam logo após, entre os 14 e 21 dias
após a vacinação, com a máxima concentração em 28 e 42 dias. Em um animal
vacinado as IgG (7S) declinam rapidamente e desaparecem antes que os anticorpos
IgM (19S) (OLASCOAGA, 1976).
Os testes hoje preconizados pelo Ministério da Agricultura e adotados nos
programas de controle e erradicação dos estados, que são o AAT, como prova de
triagem e o 2-ME para confirmação, com opção para Fixação de Complemento-FC,
não são capazes de fazer a distinção de resposta vacinal, daquela resultante de
infecção (BRASIL/MAPA, 2001). Para que não ocorram estes resultados falsos-
positivos, são necessários testes com alta especificidade e habilidade para
diagnosticar como positivo um animal que fora vacinado com a B19 (DAFDNER et
al., 1999).
Quando os animais são vacinados entre três e oito meses de idade, nas
provas de soroaglutinação, há uma rápida resposta imunológica humoral, quando
então os animais apresentam altos títulos de anticorpos. Este pico de anticorpos,
segundo os pesquizadores MATHIAS et al. (1998) ocorre aproximadamente aos 14
dias, utilizando a prova do SAR, já RIBEIRO et al. (1997) descrevem ter observado o
pico de anticorpos nas provas do AAT e 2-ME, entre 28 a 42 dias pós-vacinação,
verificando declínio dos anticorpos após este período. Os pesquisadores COCKS e
DAVIES (1972) descrevem em sua pesquisa, ter encontrado o pico de anticorpos,
em fêmeas vacinadas aos cinco meses de idade, entre sete e quatorze dias pós-
vacinação na prova do SAR e na prova do AAT aos cinco dias, porém neste teste os
anticorpos começaram a declinar somente após a oitava semana (56 dias) pós
vacinação.
O tempo de permanência dos animais com títulos de anticorpos pós-vacinais
pode durar vários meses e os relatos destes períodos variam consideravelmente. Os
pesquisadores COCKS e DAVIES (1976) descrevem que todas as 24 fêmeas
vacinadas entre quatro e cinco meses de idade, não apresentavam reação de
aglutinação aos testes de SAR e AAT, 38 semanas (266 dias) após a vacinação e
CARRILLO e OLASCOAGA (1976) obtiveram todas as 40 fêmeas vacinadas entre
três e seis meses de idade, sem reação de aglutinação no 2-ME, aos 270 dias após
a vacinação; já RIBEIRO et al. (1998) demonstraram em seu experimento que todas
as 33 fêmeas vacinadas entre três e oito meses de idade, não apresentaram reação
a soroaglutinação nos testes de AAT e 2-ME, aos 308 dias após a vacinação. Os
resultados descritos por MATHIAS et al. (1998) demonstram que todas as 10 fêmeas
vacinadas entre três e nove meses de idade, não apresentaram reação de
aglutinação ao teste de SAR, aos 160 dias após a vacinação e no teste de AAT, aos
259 dias.
Quando a vacinação é feita em fêmeas com idade superior a oito meses, os
títulos de anticorpos pós-vacinais persistem por mais tempo do que quando a fêmea
é vacinada mais jovem (MATHIAS et al.,1998). Os títulos pós-vacinais podem
permanecer por mais de 18 meses após a vacinação, conforme descrito por
MATHIAS et al. (2001) em estudo feito com 108 fêmeas vacinadas aos 18 meses de
idade. Destas 108 fêmeas adultas, nove ainda apresentavam reação positiva ao
teste do AAT aos 18 meses após a vacinação.
4. MATERIAL E MÉTODOS
4.1 PROCEDÊNCIA DOS ANIMAIS
Os animais são provenientes de duas propriedades com um bom controle de
brucelose, no município de Piraquara, região metropolitana de Curitiba.
Uma propriedade é de gado leiteiro, predominantemente animais de raça
Holandesa e a outra de gado de corte, predominantemente de raça Simental. Ambas
praticam a vacinação sistemática contra a brucelose e realizam testes de
soroaglutinação periódicos.
4.2 ANIMAIS
Foram inicialmente utilizados 47 bovinos fêmeas, com idade entre três e oito
meses de idade, ainda não vacinadas contra a brucelose, sendo dois animais da
raça Jersey, 38 da raça Holandesa e sete da raça Simental.
4.3 VACINAÇÃO
No dia zero, foram colhidas amostras de sangue de todas as fêmeas e logo
após, os animais receberam uma dose de vacina comercial liofilizada, viva,
atenuada de Brucella abortus, cepa 19, via subcutânea.
4. 4 COLHEITA DE AMOSTRAS SANGUÍNEAS
As colheitas de sangue foram feitas na veia caudal ou na jugular, utilizando
tubos “vacutainer” de 10 ml e agulhas descartáveis. As amostras foram centrifugadas
a 7.000 rpm por cinco minutos, para obtenção do soro.
Nos dias 30, 60, 90, 150, 180, 210, 240, 270, 300, 330 e 360, foram colhidas
amostras de sangue destas fêmeas para posterior análise dos níveis de anticorpos
por provas sorológicas de: SAR, AAT e 2-ME.
4.5 BASE FÍSICA LABORATORIAL
As amostras de soro foram processadas no Instituto de Tecnologia do
Paraná -TECPAR, na Unidade de Curitiba.
4.6 PROCEDÊNCIA DOS ANTÍGENOS
Os antígenos utilizados na presente pesquisa foram produzidos pelo Instituto
de Tecnologia do Paraná - TECPAR, licenciado pelo MAPA sob nº 3362/90.
4.7 TÉCNICAS SOROLÓGICAS
A escolha das provas sorológicas foi baseada no PNCEBT, que preconiza o
uso do testes do AAT, como triagem e o 2-ME como confirmatória. A prova do SAR,
apesar de ter seu uso proibido a partir de 2003 por apresentar resultados
inespecíficos, também foi utilizada, pois é uma prova que foi utilizada por Médicos
Veterinários, à campo e por detectar tanto a IgG e IgM. As provas foram realizadas
conforme descrito no Manual Técnico do PNCEBT (BRASIL/MAPA, 2001). As
técnicas das três provas estão descritas nos anexos 1, 2 e 3.
5. ANÁLISE ESTATÍSTICA
5.1 CORRELAÇÃO
Em estatística, em particular na estatística biológica, é importante conhecer a
associação ou interdependência entre duas variáveis, medindo o grau de correlação
entre elas. Na afirmação de que duas variáveis “são relacionadas” há o significado
de que a dependência entre elas é de fato definitiva e imutável ou apenas uma
pequena associação entre as duas (WAUGH, 1963; SPIEGEL, 1968; SOUNIS,
1975).
No presente estudo, foi observado o comportamento conjunto de duas
variáveis utilizando gráficos de dispersão, e medidos por uma constante determinada
de “coeficiente de correlação”, representado pela notação “r”. Os coeficientes de
correlação variam de uma maneira contínua entre os limites de –1 e + 1, e quando a
correlação tem valor compreendido entre zero e 1, é positiva e representada por r2.
Demonstramos os valores de r2 nos gráficos apresentados no presente
estudo, utilizando a tabela de Rugg para determinar se o valor encontrado é “alto” ou
“baixo”, conforme TABELA 1. Coeficientes iguais a ± 1 indicam correlação perfeita.
TABELA 1 – TABELA DE RUGG – COEFICIENTES DE CORRELAÇÃO ENTRE DUAS VARIÁVEIS
Valor de r Interpretação
r < 0,15 Despresível
0,15 < r < 0,29 Baixo
0,30 < r < 0,49 Apreciável
r < 0,50 Acentuado
Fonte: SOUNIS, 1975
6. RESULTADOS
O acompanhamento das 47 fêmeas bovinas, vacinadas com a cepa B19 de
B. abortus, teve início com a colheita do sangue antes da vacinação (dia zero),
seguindo até o dia 360 pós-vacinação. Duas das fêmeas vacinadas não
apresentaram resposta imunológica humoral em nenhum dos três testes sorológicos,
sendo então considerados os resultados apresentados por 45 femeas.
Os resultados dos testes sorológicos de SAR, AAT e 2 - ME, estão
apresentados na Tabela 2.
No dia zero, todos os animais apresentaram resultado negativo ao teste de
SAR, ou seja, nenhuma fêmea apresentava anticorpos contra a B. abortus.
TABELA 2 – Titulação aos testes de SAR, AAT e 2-ME, apresentada por 45 fêmeas
vacinadas com cepa B19 de Brucella abortus em relação ao tempo decorrido
(dias) pós-vacinação.
SAR AAT 2-ME
DIA REAG. 1:25 1:50 1:100 1:200 REAG REAG 1:25 1:50 1:100 1:200
F % F % F % F % F % F % F % F % F % F % F %
0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
30 45
100
45
100
45
100
36 80 20 44 45
100
40 89 40 89 32 71 16 36 05 11
60 45
100
45
100
45
100
36 80 21 47 44 98 31 69 31 69 25 56 14 31 06 13
90 45
100
45
100
39
87
20 44 16 36 30 64 19 42 19 42 15 33 09 20 04 9
150 42
93
42
93
32
71
13 29 05 11 23 49 14 31 14 31 09 20 04 9 02 4
180 20
44
20
44
10
22
01 2 0 0 14 30 10 22 10 22 07 16 04 9 01 2
210 19
42
19
42
13
29
01 2 0 0 09 20 05 11 05 11 04 9 03 7 01 2
240 13 29 13 29
09
20
0 0 0 0 05 11 03 7 03 7 03 7 01 2 0 0
270 05 11 05 11 0 0 0 0 0 0 04 9 01 2 01 2 01 2 01 2 0 0
300 03 7 03 7 0 0 0 0 0 0 01 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
330 01 2 01 2 0 0 0 0 0 0 01 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
360 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
SAR = Soroaglutinação Rápida em Placa; AAT = Antígeno Acidificado Tamponado; 2-ME = 2 Mercaptoetanol; DIA = Dias após
a vacinação; REAG = Reagente; F = Fêmeas;
Aos 30 dias após a vacinação com B. abortus, 45/45 (100%) fêmeas
vacinadas apresentaram titulação ao teste de SAR (≥ 1:25), sendo que 20/45 (44%)
apresentavam titulação ≥ 1:200, sendo consideradas positivas ao teste, segundo a
tabela da I.S. 20/02 do DDA/MAPA, para fêmeas com idade igual ou superior a 24
meses, vacinadas entre três e oito meses de idade ( Anexo 2). O pico de reação de
soroaglutinação ao teste de AAT, deu-se aos 30 dias pós-vacinação, quando então
45/45 (100%) das fêmeas apresentaram resultado positivo ao teste. Os maiores
títulos ao teste do 2-ME foram observados aos 30 dias pós-vacinação, quando 40/45
(89%) das fêmeas apresentavam títulos 1:25; 32/45 (71) com 1:50; 16/45 (36%) com
1:100 e 05/45 (11%) com 1:200 (Tabela 2).
Aos 60 dias pós-vacinação observou-se o pico de titulação ao teste de SAR,
quando 45/45 (100%) das fêmeas apresentaram titulação 1:50; 36/45 (80%) com
1:100 e 21/45 (47%) com 1:200.
Após 90 dias da vacinação 45/45 (100%) fêmeas ainda apresentavam
reação à soroaglutinação no teste de SAR, no entanto 16/45 (36%) delas com
titulação suficiente para considerá-las positivas (≥1:200). No teste do 2-ME 19/45
(42%) mantinham o resultado positivo (≥1:25), sendo que no 2-ME e no AAT,
respectivamente, 28/45 (62%) e 17/45 (38%) das fêmeas apresentavam resultados
negativos aos 90 dias após a vacinação.
Aos 150 dias após a vacinação, 53% (24/45) das fêmeas apresentaram-se
negativas no AAT, e 73% (33/45) ao 2-ME. No SAR, aos 150 dias pós vacinação,
apenas 11% (05/45) apresentaram resultados positivos ao teste (≥1:200). Das
fêmeas, 5/45 (11%) apresentaram-se não reagentes ou com títulos menores que
1:25 no teste de SAR, aos 150 dias pós-vacinação.
Após os 180 dias da vacinação (100%) 45/45, das fêmeas vacinadas
apresentaram titulação igual ou abaixo de 1:100, sendo consideradas negativas
segundo a I.S. 20/02 do DDA/MAPA, (Gráfico 1), sendo que apenas uma delas
permanecia com resultado considerado inconclusivo ao SAR (1:100).
GRÁFICO 1 - Animais com resultados considerados positivos ao teste
de SAR (≥1/200), conforme a tabela da I.S. 20/02 do DDA/MAPA, para fêmeas
com idade igual ou superior a 24 meses, vacinadas entre três e oito meses de
idade, em relação ao tempo decorrido (dias), após a vacinação com a cepa
B19, amostra de Brucella abortus.
20
21
16
5
0
0
0
0
0
0
0
R
2
= 0,873
0
10
20
30
40
50
60
Dias após a vacinação
número de fêmeas
SAR
Positivo
Linha de
Tendência
30 60 90 150 180 210 240 270 300 330 360
A linha de tendência logarítmica apresentada no Gráfico 1, demonstra que o
R
2
= 0,873 é positivo, pois tem seu valor compreendido entre zero e um. Por ter o
valor de r<50, o coeficiente de correlação entre as duas variáveis é “acentuado”.
Indica também uma correlação perfeita, pois o coeficiente está muito próximo a ± 1.
Aos 270 dias após a vacinação, 01/45 (2%) das fêmeas apresentou
resultados positivo ao 2-ME, tornando-se negativa ao 300 dias, quando então 45/45
(100%) das fêmeas tornaram-se negativas (Gráfico 2).
GRÁFICO 2 - Animais com resultados considerados positivos ao teste de 2-
ME (1/25), conforme interpretação da tabela do PNCEBT/MAPA/2001, para fêmeas
não vacinadas e machos com idade superior a oito meses de idade, em relação ao
tempo decorrido (dias) após a vacinação com a cepa B19, amostra de Brucella
abortus.
40
31
14
10
5
3
0
0
0
1
19
R
2
= 0,9839
0
10
20
30
40
50
60
Dias após a vacinação
Número de fêmeas
2 -M E
P o s it iv o
L in h a d e
T e n d ê n c ia
30 60 90 150 180 210 240 270 300 330 360
A linha de tendência logarítmica do Gráfico 2, demonstra um R
2
= 0,9839
positivo e a correlação entre as duas variáveis é “acentuado”. Indica também uma
correlação perfeita, pois o coeficiente está muito próximo a ± 1.
No teste do AAT, 01/45 (2%) das fêmeas apresentava resultado positivo aos
300 dias pós-vacinação. Este resultado foi mantido aos 330 dias pós-vacinação e
aos 360 dias esta fêmea tornou-se negativa, quando então 45/45 (100%) das fêmeas
tornaram-se negativas (Gráfico 3).
GRÁFICO 3 – Animais com resultados positivos ao teste de AAT, em
relação ao tempo decorrido (dias) após a vacinação com a cepa B19, amostra
de Brucella abortus.
29
22
0
45
1
1
4
5
9
13
44
R
2
= 0,955
0
10
20
30
40
50
60
Dias após a vacinação
Número de fêmeas
A A T
P o s it iv o
L in h a d e
t e n d ê n c ia
30 60 90 150 180 210 240 270 300 330 360
A linha de tendência logarítmica do Gráfico 3, demonstra um R
2
= 0,955
positivo e a correlação entre as duas variáveis é “acentuado”. Indica também uma
correlação perfeita, pois o coeficiente está muito próximo a ± 1.
7. DISCUSSÃO
Os trabalhos de pesquisa desenvolvidos recentemente com a vacina B19
são escassos, porque esta vacina está sendo gradativamente substituída pela
vacina não indutora de anticorpos aglutinantes - RB51. Nos Estados Unidos, em
1996, a vacina RB51 foi licenciada condicionalmente, substituindo gradualmente a
B19 (COTRINA et al., 1999). No entanto no Brasil, com o lançamento do PNCEBT
em 2001, foi normatizada como obrigatória o uso da vacina B19 de Brucella abortus
nas bezerras entre três e oito meses de idade.
Os resultados deste estudo com a vacina B19 serão discutidos em relação
ao período em que os testes sorológicos foram realizados, após a vacinação.
Antes da vacinação todas as fêmeas apresentaram resultados negativos no
SAR, não apresentado nenhuma reação de aglutinação. Estes dados conferem com
aqueles descritos por BARDÓN et al. (2001), que avaliaram 146 fêmeas antes da
vacinação, onde todas apresentaram resultados negativos. MATHIAS et al. (2001)
encontraram resultados semelhantes ao avaliar 108 fêmeas, aos 18 meses de idade,
antes de serem vacinadas com a B19, embora oito animais tenham apresentado
título de 1:25.
Na análise das 45 fêmeas vacinadas com cepa B19 de Brucella abortus,
verificou-se que, após apresentarem resultados negativos aos testes de SAR, aos
150 dias após a vacinação, quatro fêmeas apresentaram leve oscilação nos níveis
de anticorpos, de 1:25 para 1:50, o que não foi o suficiente para torná-las positivas,
retornando a 1:25 na próxima colheita, 30 dias após. MATHIAS et al. (1998),
verificaram este fenômeno em uma das fêmeas examinadas em seu experimento e
citam que GONZALEZ et al. (1978), também verificaram estas oscilações nos títulos
aglutinantes e atribuíram estas variações a fatores estressantes decorrentes das
práticas de manejo.
No teste de SAR, o pico de títulos foi atingido pelo maior número de fêmeas
aos 60 dias pós-vacinação, quando 45 animais apresentavam títulos entre 1:25 a
1:200, sendo que 21 animais obtiveram o título de 1:200, desde então teve início o
declínio de anticorpos. Estes resultados diferem dos encontrados por outros
pesquisadores (COCKS e DAVIS,1972; RIBEIRO et al. 1997; MATHIAS et al., 1998),
pois a média encontrada por eles, foi de 20 dias.
COCKS e DAVIS (1972), que acompanharam 23 fêmeas vacinadas aos
cinco meses de idade, com cepa B19 amostra de Brucella abortus, por 38 semanas
(266 dias), demonstraram que aos cinco dias após vacinação todos os animais
apresentavam-se positivos aos teste de SAR , sendo que a mais alta média
registrada foi entre sete e 14 dias após a vacinação. RIBEIRO et al. (1997), que
avaliaram 33 fêmeas vacinadas entre três e oito meses de idade, com a cepa B19,
amostra de Brucella abortus, por 728 dias após vacinação, por meio de testes de
SAR, AAT e 2-ME, obtiveram como resultado a titulação máxima aos 14º-18º dias
pós-vacinação no teste de SAR.
No estudo desenvolvido por MATHIAS et al. (1998), onde foram avaliadas 17
fêmeas entre três e 18 meses de idade, sendo sete com três a cinco meses, três
entre seis e nove meses e sete com idade entre 10 e 18 meses, vacinadas com cepa
B19 amostra de Brucella abortus, por um período de 364 dias, as fêmeas
apresentaram a mais alta média de títulos de anticorpos no SAR, aos 14 dias após a
vacinação, sendo que aos seis dias foram detectados títulos entre 1:25 e 1:400
nesta prova.
Aos 180 dias após a vacinação, nenhuma das fêmeas do presente estudo
seria considerada positiva ao teste do SAR, conforme a tabela de interpretação da
I.S. nº 20/02 do DDA/MAPA (ANEXO 4) para fêmeas acima de 24 meses, vacinadas
entre três e oito meses de idade, que considera positivos os resultados ≥1:200.
Entretanto 20 (44%) das fêmeas ainda apresentavam reação de aglutinação ao
teste, sendo 20 com título 1:25; 10 com 1:50 e uma com 1:100. Esta última
considerada inconclusiva pela referida IS, manteve este resultados aos 210 dias,
tornando-se negativa aos 240 dias após a vacinação. Estes resultados diferem
daqueles encontrados por COCKS e DAVIS (1972) que observaram resultados não
reagentes a soroaglutinação em todas as fêmeas examinadas em 28 semanas (196
dias) e por MATHIAS et al., (1998) que observaram duas das 17 bezerras avaliadas
por eles, com título aglutinante após 215 dias da vacinação; uma delas com título de
1:25 e a outra de 1:50, sendo que esta persistiu até o 364º dias pós vacinação.
Entretanto os resultados da presente pesquisa são similares aos encontrados por
RIBEIRO et al., (1997) que observaram um animal positivo e dois suspeitos
(atualmente denominados inconclusivos) aos 210 dias após a vacinação no teste de
SAR, sendo que animais apresentaram-se negativos aos 273 dias pós-vacinação.
Nesta pesquisa, observou-se que o teste do AAT foi aquele em que mais
tempo (360 dias) uma das fêmeas vacinadas manteve o resultado positivo. Aos 240
dias, 42 (93%) fêmeas já se apresentavam negativas ao AAT e aos 300 dias, apenas
uma delas permanecia positiva, tornando-se negativa aos 360 dias, quando 100%
delas tornaram-se negativas. Resultados próximos a estes foram descritos por
RIBEIRO et al., (1997), que obtiveram resultado não reagente ao AAT em todas as
bezerras aos 308 dias pós-vacinação e aos 182 dias pós-vacinação somente cinco
animais apresentavam resultado positivo neste teste.
No presente trabalho, aos 240 dias após a vacinação, cinco animais ainda
apresentavam reação de aglutinação ao AAT, entretanto os resultados encontrados
por MATHIAS et al., (1998) diferem desta pesquisa, pois aos 98 dias pós vacinação,
apenas uma das 17 bezerras avaliadas por estes pesquisadores apresentava títulos
na prova do AAT. Contudo, quando analisados os resultados finais, a diferença de
dados encontrados diminui, sendo que no presente trabalho todos os animais
vacinados tornam-se negativos aos 360 dias e os pesquisadores chegam a este
resultado aos 259 dias. O presente trabalho também difere daquele encontrado por
COCKS e DAVIS (1972), quanto aos testes de AAT, pois estes relatam que as 23
fêmeas avaliadas por eles, deixaram de apresentar reação de soroaglutinação no
teste de AAT às 28 semanas (196 dias) após a vacinação.
Resultados similares aos encontrados nesta pesquisa, quanto a persistência
de reações positivas no teste de AAT, foram descritos por HERR e BRUGGE (1985),
que acompanharam dez animais adultos vacinados com B19, por 47 semanas (329
dias). Os autores observaram que no teste de AAT, todos os animais permaneceram
positivos após a 11ª semana (77 dias) da vacinação, sendo que dois deles
negativaram na 20ª e 34ª semanas ( 140 e 238 dias), mas um deles retornou ao
resultado positivo e somente um se manteve negativo até a 47ª semana (329 dias).
Nesta pesquisa observou-se que aos 90 dias, 28 (62%) fêmeas
apresentaram resultados negativos ao teste do 2-ME, e aos 210 dias, 42 (93%) delas
já apresentavam este resultado. Das fêmeas vacinadas apenas uma delas persistiu
com resultado positivo aos 270 dias, tornando-se negativa aos 300 dias, quando
então 45 (100%) fêmeas vacinadas obtiveram este resultado no 2-ME.
Observamos no presente estudo que uma das fêmeas, após apresentar
resultado negativo ao teste de AAT aos 150 dias, apresentou novamente resultado
positivo ao teste, 60 dias após, tornando-se negativa definitivamente, já na próxima
coleta, 30 dias após. Tal fato provavelmente deve-se fatores estressantes do
manejo, segundo MATHIAS et al., (1998), já citado anteriormente.
Os resultados encontrados no teste do 2-ME, conferem com aqueles
descritos por RIBEIRO et al., (1997) que avaliaram 33 fêmeas vacinadas entre três e
oito meses de idade. Os autores demonstraram que a titulação máxima no 2-ME foi
encontrada aos 28º e 42º dias pós-vacinação e que aos 182 dias pós-vacinação
somente seis animais eram positivos ao teste, sendo que todas as bezerras
apresentavam resultados negativos ao 2-ME aos 308 dias pós-vacinação.
Estes resultados também conferem com aqueles descritos por BARDÓN et
al., (2001), onde foram avaliados com provas de diagnóstico incluindo o 2-ME, dois
grupos de fêmeas bovinas com idade média de seis meses. Um grupo composto de
100 fêmeas e o outro com 46, vacinadas com cepa B19 amostra de Brucella abortus.
No grupo de 100 fêmeas, 98% delas apresentaram resultado positivo ao 2-ME 25
dias após a vacinação, mas aos 240 dias após a vacinação, apenas uma das
fêmeas ainda apresentava resultado positivo ao teste. No grupo de 46 fêmeas,
100% delas apresentaram resultado positivo ao 2-ME, aos 25 dias da vacinação,
mas 150 após a vacinação 2,2% das fêmeas ainda apresentavam resultado positivo
ao teste.
Os resultados do presente estudo, demonstram que as maiores titulações no
2-ME foram encontradas aos 30 dias pós-vacinação. Estes resultados conferem com
aqueles encontrados por CARRILLO e OLASCOAGA (1976), que descrevem ter
encontrado estas titulações aos 21 dias após a vacinação. Porém na presente
pesquisa, aos 180 dias, 14 (31%) fêmeas testadas ainda apresentavam reação à
soroaglutinação ao teste do 2-ME, sendo 10 (22%) delas, com reação consideradas
positivas (≥1:25), já estes pesquisadores descrevem que todos os 40 animais
avaliados por eles, tornaram-se não reagentes à soroaglutinação no teste do 2-ME
aos 180 dias após a vacinação.
Alguns pesquisadores observaram animais adultos vacinados com cepa B19
de Brucella abortus, obtendo rápido declínio nos títulos sorológicos nos testes de
soroaglutinação, como POESTER et al., (2001) que descreveram que ao comparar
duas vacinas, entre elas a B19, vacinaram 25 fêmeas entre dois e cinco anos, e
obtiveram resultados negativos ao teste de AAT, aos 270 dias após a vacinação com
cepa B19
de Brucella abortus. Também MATHIAS et al., (2001), observaram em sua
pesquisa com 108 fêmeas vacinadas aos 18 meses de idade, que há uma sensível
redução no título sorológico após 12 meses da vacinação. No teste do AAT, 89,81%
das fêmeas vacinadas apresentavam resultados negativos ao teste após 12 meses
da vacinação, porém 11 das 108 fêmeas ainda apresentando resultado positivo ao
teste.
Estes resultados confirmam os observados na presente pesquisa de que
ocorre um rápido declínio do título de anticorpos, desde que a vacinação seja
efetuada entre os três e oito meses de idade. Aos 300 dias após a vacinação, 100%
das fêmeas vacinadas apresentam resultado negativo na prova do 2-ME,
considerada prova confirmatória segundo o PNCEBT.
Neste experimento, aos 360 dias todas as fêmeas apresentaram resultados
negativos ao AAT, no entanto, quando submetidas ao exame do 2-ME,
apresentaram-se negativas já aos 300 dias. Estes resultados conferem com o que foi
descrito por PAULIN et al., (2002), de que o 2-ME apresenta boa sensibilidade para
validar os testes de triagem a campo e também com o que determinam as normas
do PNCEBT/MAPA quanto ao uso do AAT como triagem e o 2-ME como
confirmatório (BRASIL/MAPA, 2001).
Duas fêmeas não apresentaram resposta imunológica humoral em nenhum
dos três testes de soroaglutinação. Após 12 meses de acompanhamento e ainda
sem apresentarem resultados, estas fêmeas foram submetidas a testes sorológicos
de diagnóstico de leptospirose, no qual ambas apresentaram resultado negativo.
Após estes testes, as fêmeas receberam uma dose de vacina L-7, contra
leptospirose, composta por sete diferentes sorovares: Leptospira
icterohaemorrhagiae, L. copenhageni, L. canicola, L . pomona, L. grippotyphosa, L.
hebdomadis, L. wolffi, L. tarassovi, L. hardjo e L. bratislava. Quinze e trinta dias após
a vacinação, os soros destes animais foram testados para os sete sorovares, sendo
que as fêmeas não apresentaram resposta a nenhum dos testes. Não obtendo
resposta imunológica humoral também à vacinação contra leptospirose, conclui-se
que pode ser descartada a possibilidade de erro na vacinação anterior.
CORREA e CORREA, (1992), descreveram que existem várias causas de
problemas relacionados a resposta imunológica em um animal, como a imuno-
paralisia - quando uma dose de antígeno é muito alta e estes consomem todos os
anticorpos até impedir a produção dos mesmos e a imuno-indiferença ou imuno-
tolerância – quando o antígeno é reconhecido pelo sistema retículo-histiocitário e
linfóide como próprio, não havendo produção anticorpos contra ele. Isto ocorre
porque os fetos já produzem anticorpos quando seu sistema retículo-histiocitário e
linfóide estão formados e diferenciados, ou seja, se tornam imunocompetentes,
aproximadamente aos 2/3 da gestação e se as células deste sistema entrarem em
contato com um antígeno estranho neste período, estas células ao se diferenciarem,
o reconhecerão como próprio.
Quando a fêmea bovina se infecta durante o terço inicial da gestação, ocorre
uma infecção fetal, causando o nascimento de bezerros imunotolerantes, ou
persistentemente infectados - PI. Estes animais apresentam importante papel na
epidemiologia de uma doença, pois podem eliminar o agente infectante
continuamente em suas secreções (BOTTON, et al., 1998; CAMARGO et al., 2003).
Os resultados das provas sorológicas a que foram submetidas as fêmeas do
presente estudo, demonstraram declínio contínuo dos títulos de anticorpos, sendo
que todas as fêmeas apresentaram resultados negativos aos seis meses após a
vacinação no SAR, aos dez meses no 2-ME e aos 12 meses no AAT. Estes
resultados concordam com as recomendações feitas por RIBEIRO et al., (1997), de
que estas provas poderiam ser empregadas mais cedo do que preconizava o
Ministério da Agricultura em 1979, que era de 30 meses após vacinação. Com o
lançamento do PNCEBT em 2001, este prazo foi alterado para 24 meses após a
vacinação.
No teste do AAT, oficialmente designado para triagem a campo, os
resultados do presente estudo demonstraram que os animais tornaram-se negativos
após 12 meses da vacinação, ou seja, se vacinados entre três e oito meses, estarão
com idade entre com idade entre 15 e 20 meses, quando então os rebanhos poderão
ser testados sem que ocorram resultados falso positivos em virtude da vacinação.
Também, segundo os pesquisadores MEGID et al., (2000) a susbtituição da prova do
SAR pelo AAT, que é mais sensível e específico, possibilita aos veterinários um
diagnóstico mais apurado e reduz o envio de grande número de amostras aos
laboratórios especializados e o reteste de animais suspeitos.
8. CONCLUSÕES E CONSIDERAÇÕES FINAIS
As conclusões encontradas neste experimento em relação aos títulos
sorológicos pós-vacinais em bezerras imunizadas com cepa B19 de Brucella abortus
foram:
1 - Em fêmeas vacinadas entre três e oito meses de idade, o declínio dos
anticorpos pós-vacinais, detectáveis na soroaglutinação, inicia aos 30 dias após a
vacinação, com o desaparecimento total destes anticorpos, aos 360 dias da
vacinação;
2 - É possível utilizar a prova do AAT, aos 150 dias após a vacinação,
obtendo resultados negativos ao teste em 50% das fêmeas vacinadas entre três e
oito meses de idade;
3 - Utilizando o teste do 2-ME como confirmatório, é possível obter estes
resultados em 60% das fêmeas, aos 90 dias após a vacinação;
4 - Após 360 dias da vacinação, é possível utilizar o teste de AAT, como
triagem a campo, em 100% das fêmeas vacinadas, sem que ocorram reações de
falso-positivos em virtude da vacinação.
5 – Aos 30 dias após a vacinação, duas das 47 fêmeas (4,25%) não
apresentaram resposta imunológica humoral, frente à vacina B19, e este resultado
persistiu pelos 360 dias em que foram acompanhadas.
6 – Animais vacinados entre três e oito meses de idade, após 360 dias desta
vacinação, quando estarão entre 15 e 20 meses de idade, poderão ser testados sem
que ocorram resultados falsos positivos.
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Instituto Biológico, São Paulo, v.69, n.4, p.41-47, out./dez., 2002.
ANEXOS
ANEXO 1 – TÉCNICA DA PROVA DO MERCAPTOETANOL – 2-ME
Material: Antígeno para soroaglutinação lenta em tubos; 2-mercaptoetanol;
salina 0,85%; salina 0,85%, fenicada 0,5%; tubos de 10x75mm ou
10x100mm;pipetas de Bang ou micropipetador de volume ajustável; dispensador
automático de 1ml e 2 ml; pipetas de 10ml; caixa de luz indireta; vidrarias.
Técnica: Colocar em estante 2 fileiras de 4 tubos 10 x 100mm ou 10x75;
Marcar a 1ª fileira com a letra T (Lenta) e a 2ª com a letra M (2-ME).
Com pipeta graduada ou de Bang, fluir no 1º tubo da 1ª fileira 0,08ml de
soro, no 2º tubo 0,04, no 3º tubo 0,02 e no 4º 0,01ml. Repetir o procedimento na
segunda fileira.
Inclui-se um soro controle conhecido com atividade aglutinante na prova
lenta em tubos com título de 1:200 ou superior e outro negativo na prova 2-ME.
Na fileira "T", com o dispensador automático de 2ml ou pipeta de 10ml,
pipetar em cada um dos 4 tubos, 2ml do antígeno diluído 1:100 (0,045% de células)
em salina fenicada (0,5% de fenol).
Na fileira "M", com o dispensador automático de 2ml (regulado para 1ml) ou
pipeta de 10ml, pipetar 1 ml de solução de 2-mercaptoetanol 0,1M (diluída em
solução salina sem fenol), em cada tubo.
Mistura-se agitando bem a estante.
Aguardar em temperatura ambiente 30 minutos. Após este tempo, agregar
em cada tubo "M", 1 ml do antígeno diluído 1:50 (0,09% de células) em solução
salina fisiológica (sem fenol). A concentração final do antígeno na solução será
0,045%;
Agitar os frascos. Incubar a 37º por 48h ± 3h;
A leitura deve ser com fonte de luz indireta contra um fundo escuro e opaco,
com uma fonte de luz que atravesse os tubos.
Interpretação: O grau de aglutinação em cada uma das distintas diluições
deve ser classificado como: completo (+), incompleto (I) ou negativo (-).
Reação Completa (+) – O líquido da mistura antígeno + soro aparece
translúcida, com formação de película e os grumos não se rompem com a agitação
suave.
Reação Incompleta (I) – O líquido da mistura antígeno + soro aparece
parcialmente translúcida e os grumos não rompem com agitação suave.
Reação Negativa (-) – O líquido da mistura antígeno + soro aparece
opaco e uma agitação suave não revela grumos.
A interpretação das provas é feita utilizando-se os quadros a seguir:
a) Interpretação da prova do 2-ME, para fêmeas com idade igual ou
superior a 24 meses e vacinadas entre três e oito meses.
SAL \ 2ME NR 25 I 25 50 I 50 100 I 100 200 I 200
NR -
25 I - -
25 - - +
50 I - - + +
50 - - + + +
100 I - - + + + +
100 Inc Inc + + + + +
200 I Inc Inc + + + + + +
200 Inc Inc + + + + + + +
Fonte: PNCEBT/MAPA, 2001
CONVENÇÕES:
2-ME – 2 -Mercaptoetanol
SAL – Soro-Aglutinação Lenta
NR – Não reagiu
I – Reação Incompleta
Inc – Reação Inconclusiva
Cinza – Reação que não pode ocorrer
b) Interpretação da prova do 2-ME, para fêmeas não vacinadas e machos
com idade superior a oito meses.
SAL \ 2ME NR 25 I 25 50 I 50 100 I 100 200 I 200
NR -
25 I - -
25 - - +
50 I - - + +
50 Inc Inc + + +
100 I Inc Inc + + + +
100 Inc Inc + + + + +
200 I Inc Inc + + + + + +
200 Inc Inc + + + + + + +
Fonte: PNCEBT/MAPA, 2001
CONVENÇÕES:
2-ME – 2-Mercaptoetanol
SAL – Soro-Aglutinação Lenta
NR – Não reagiu
I – Reação Incompleta
Inc – Reação Inconclusiva
Cinza – Reação que não pode ocorrer
ANEXO 2 – TÉCNICA DA PROVA DE SOROAGLUTINAÇÃO RÁPIDA EM PLACA
– SAR
Material: Antígeno para prova rápida; caixa especial; pipetas sorológicas de
0,2 ml com graduação de 0,01 ml ou de Bang 0,2 ml; micropipetador de 30 μl ou
ajustável ou conta-gotas calibrado; Misturador múltiplo ou simples.
Técnica: Deixar antígeno e soro à temperatura ambiente; homogeneizar
muito bem o antígeno, antes e no decorrer da prova.
Adicionar 0,08 – 0,04 – 0,02 – 0,01 ml de soro, com a pipeta de Bang ou
micropipetador, tocando a placa em posição de 45º.
Posicionar o conta-gotas na vertical e sem tocar o soro, deixar cair uma gota
(0,03ml) do antígeno, em cada quadrado.
Misturar com o misturador, iniciando na diluição (1:200), 0,01 ml de soro +
0,03 ml de antígeno, (diâmetro da mistura 18mm), terminando na diluição (1:25) 0,08
ml + 0,03 ml de antígeno (diâmetro da mistura 27mm). Limpar o misturador a cada
soro processado.
Proceder 3 a 4 movimentos basculantes e rotativos para homogeneizar a
mistura.Tampar a placa para evitar evaporação; marca-se o tempo e após 4 minutos
fazer novos movimentos; no oitavo minuto acender a luz e fazer a leitura,
direcionando a placa para o fundo da caixa.
Interpretação:
1º - Reação Completa – presença de grumos azulados (pequenos e
grandes) suspensos em líquido transparente.
2º - Reação Incompleta (I) – presença de grumos azulados (pequenos)
suspensos em líquido com turbidez.
3º - Reação Negativa – Não há presença de grumos. O resultado é obtido
onde ocorre a última aglutinação, procedendo-se a leitura de 1:25 para 1:200.
A interpretação dos resultados como negativos ou positivos da prova do
SAR, em animais vacinados ou não, encontram-se nos quadros seguintes.
a) Interpretação da prova do SAR, para fêmeas não vacinadas e machos
com idade superior a 8 meses de idade.
1: 25
25 UI/ml
1:50
50 UI/ml
1:100
100UI/ml
1:200
200UI/ml
Interpretação
- - - - Negativo
I - - - Negativo
+ - - - Negativo
+ I - - Inconclusivo
+ + - - Inconclusivo
+ + I - Inconclusivo
+ + + - Positivo
+ + + i Positivo
+ + + + positivo
Fonte: Instrução de Serviço DDA 20/02
b) Interpretação da prova do SAR, para fêmeas com idade igual ou superior
a 24 meses, vacinadas entre três e oito meses de idade.
1: 25
25 UI/ml
1:50
50 UI/ml
1:100
100 UI/ml
1:200
200 UI/ml
Interpretação
- - - - Negativo
I - - - Negativo
+ - - - Negativo
+ I - - Negativo
+ + - - Negativo
+ + I - Inconclusivo
+ + + - Inconclusivo
+ + + i Inconclusivo
+ + + + positivo
Fonte: Instrução de Serviço DDA 20/02
CONVENÇÕES:
i – Aglutinação Incompleta
+ - Aglutinação Completa
UI – Unidades Internacionais
ANEXO 3 – TÉCNICA DA PROVA DO ANTÍGENO ACIDIFICADO TAMPONADO –
AAT
Material: Antígeno para AAT; pipetas de Bang; micropipetador 30 μl
ou ajustável; conta gotas; placa de vidro; misturador de plástico ou metal; caixa de
luz indireta.
Técnica: A suspensão do antígeno e os soros em temperatura ambiente uma
hora antes de iniciar a prova. A temperatura de execução desejável do teste deve
ser em torno de 22ºC ± 4ºC, devendo-se evitar temperaturas muito abaixo ou acima
deste valor.
Homogeneizar o antígeno agitando suavemente o frasco.
Com o auxilio do pipetador de 30 μL (ou de Bang 0,04 a 0,0l), encostando a
ponta na placa de vidro em ângulo de 45º, dispensar 30μL de soro na placa.
Desprezar as duas primeiras gotas de antígeno para eliminar o ar contido no
conta gotas, colocar uma gota (30μL) ao lado do soro.
Misturar o antígeno e o soro com movimentos circulares, de modo a obter
um círculo de aproximadamente 2 cm.
Com movimentos oscilatórios, em uma freqüência de 30 movimentos por
minuto, agitar a placa por 4 minutos, continuamente.
Após os 4 minutos, proceder a leitura com luz indireta. Desconsiderar as
reações de aglutinação que ocorreram após os 4 minutos.
Interpretação: Presença de grumos = reagente.
Ausência de grumos = não reagente.
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