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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA – UNESP
FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
DEPARTAMENTO DE ANÁLISES CLÍNICAS
Liliana Scorzoni
“Estudo da atividade antifúngica e perfil de expressão de proteínas em leveduras
do gênero Candida após tratamento com extratos de Kielmeyera rubriflora”
Araraquara
2008
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II
UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA – UNESP
FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
DEPARTAMENTO DE ANÁLISES CLÍNICAS
Liliana Scorzoni
“Estudo da atividade antifúngica e perfil de expressão de proteínas em leveduras
do gênero Candida após tratamento com extratos de Kielmeyera rubriflora”
Tese apresentada ao programa de Pós- Graduação em
Análises Clínicas da Faculdade de Ciências
Farmacêuticas –
UNESP – Araraquara, como pré – requisito para
obtenção do título de Mestre Análises Clínicas.
Orientadora: Profa. Dra. Maria José Soares Mendes Giannini
Araraquara
2008
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III
Scorzoni, Liliana
S423e Estudo da atividade antifúngica e perfil de expressão de proteínas em
leveduras do gênero Candida após tratamento com extratos de Kielmeyera
rubriflora. / Liliana Scorzoni. – Araraquara, 2008.
102 f.
Dissertação (Mestrado) – Universidade Estadual Paulista. “Júlio
de Mesquita Filho”. Faculdade de Ciências Farmacêuticas. Programa de Pós
Graduação em Análises Clínicas
Orientador: Maria José Soares Mendes Giannini
1Candida spp. 2.Atividade antifúngica de plantas. 3.Micologia.
I.Giannini, Maria José Soares Mendes, orient.. II. Título.
CAPES: 40300005
Ficha Catalográfica
Elaborada Pelo Serviço Técnico de Biblioteca e Documentação
Faculdade de Ciências Farmacêuticas
UNESP – Campus de Araraquara
IV
Este trabalho foi desenvolvido no Laboratório de Micologia Clínica da Faculdade de
Ciências Farmacêuticas-UNESP Araraquara. Recebeu apoio financeiro da Fundação de Apoio
à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), da Coordenação de Aperfeiçoamento de
Pessoal de nível Superior (CAPES) e do PADC-FCFAr.
V
PIPOCA......
“...comidas, para mim, são entidades oníricas. Provocam a minha capacidade de
sonhar. Nunca imaginei, entretanto, que chegaria um dia em que a pipoca iria me fazer
sonhar. Pois foi precisamente isso que aconteceu.
A pipoca é um milho mirrado, sub-desenvolvido. Fosse eu agricultor ignorante, e
se no meio dos meus milhos graúdos aparecessem aquelas espigas nanicas, eu ficaria
bravo e trataria de me livrar delas. Pois o fato é que, sob o ponto de vista de tamanho,
os milhos da pipoca não podem competir com os milhos normais. Não sei como isso
aconteceu, mas o fato é que houve alguém que teve a idéia de debulhar as espigas e
colocá-las numa panela sobre o fogo, esperando que assim os grãos amolecessem e
pudessem ser comidos. Havendo fracassado a experiência com água, tentou a gordura.
O que aconteceu, ninguém jamais poderia ter imaginado. Repentinamente os grãos
começaram a estourar, saltavam da panela com uma enorme barulheira. Mas o
extraordinário era o que acontecia com eles: os grãos duros quebra-dentes se
transformavam em flores brancas e macias que até as crianças podiam comer. O
estouro das pipocas se transformou, então, de uma simples operação culinária, em uma
festa, brincadeira, molecagem, para os risos de todos, especialmente as crianças. É
muito divertido ver o estouro das pipocas!
Mas a transformação só acontece pelo poder do fogo. Milho de pipoca que não
passa pelo fogo continua a ser milho de pipoca, para sempre. Assim acontece com a
gente. As grandes transformações acontecem quando passamos pelo fogo. Quem não
passa pelo fogo fica do mesmo jeito, a vida inteira. São pessoas de uma mesmice e
dureza assombrosa. Só que elas não percebem. Acham que o seu jeito de ser é o melhor
jeito de ser. Mas, de repente, vem o fogo. O fogo é quando a vida nos lança numa
situação que nunca imaginamos. Dor. Pode ser fogo de fora: perder um amor, perder
um filho, ficar doente, perder um emprego, ficar pobre. Pode ser fogo de dentro. Pânico,
medo, ansiedade, depressão - sofrimentos cujas causas ignoramos. Há sempre o recurso
aos remédios. Apagar o fogo. Sem fogo o sofrimento diminui. E com isso a possibilidade
da grande transformação.
Em Minas, todo mundo sabe o que é piruá. Falando sobre os piruás com os
paulistas descobri que eles ignoram o que seja. Alguns, inclusive, acharam que era
gozação minha, que piruá é palavra inexistente. Cheguei a ser forçado a me valer do
Aurélio para confirmar. Com certeza tem uma explicação científica para os piruás. Mas,
no mundo da poesia as explicações científicas não valem. Por exemplo: em Minas ‘piruá’
é o nome que se dá às mulheres que não conseguiram casar. Mas acho que o poder
metafórico dos piruás é muito maior. Piruás são aquelas pessoas que, por mais que o
fogo esquente, se recusam a mudar. Elas acham que não pode existir coisa mais
maravilhosa do que o jeito delas serem. Ignoram o dito de Jesus: ‘Quem preservar a sua
vida perde-la-á.’ A sua presunção e o seu medo são a dura casca do milho que não
estoura. O destino delas é triste. Vão ficar duras a vida inteira. Não vão se transformar
na flor branca macia. Não vão dar alegria para ninguém. Terminado o estouro alegre da
pipoca, no fundo da panela ficam os piruás que não servem para nada. Seu destino é o
lixo. Quanto às pipocas que estouraram, são adultos que voltaram a ser crianças e que
sabem que a vida é uma grande brincadeira”. (Rubem Alves, O amor que acende a lua).
VI
“O dia mais belo: hoje
A coisa mais fácil: errar
O maior obstáculo: o medo
O maior erro: o abandono
A raiz de todos os males: o egoísmo
A distração mais bela: o trabalho
A pior derrota: o desânimo
Os melhores professores: as crianças
A primeira necessidade: comunicar-se
O que traz felicidade: ser útil aos demais
O pior defeito: o mau humor
A pessoa mais perigosa: a mentirosa
O pior sentimento: o rancor
O presente mais belo: o perdão
o mais imprescindível: o lar
A rota mais rápida: o caminho certo
A sensação mais agradável: a paz interior
A maior proteção efetiva: o sorriso
O maior remédio: o otimismo
A maior satisfação: o dever cumprido
A força mais potente do mundo: a fé
As pessoas mais necessárias: os pais
A mais bela de todas as coisas: O AMOR!!!” Madre Tereza de Calcutá
VII
Dedicatória:
A Deus pela vida, saúde, minha família, meus amigos e por me guiar nessa
incrível tarefa chamada pós graduação.
Em especial a minha querida família.
Aos meus pais por todo apoio, compreensão e por serem meus exemplos de luta,
persistência, honestidade e amor por estarem presentes em todos o momentos e por
não medirem esforços para a realização de meus sonhos.
Aos meus irmãos, meus irmãozinhos mais novos, pela empatia, carinho e
cumplicidade.
Ao meu namorado, grande companheiro e amigo, por estar sempre ao meu lado
me apoiando, por escutar a cada história mirabolante e por me conhecer tão bem.
Aos meu avós maternos e paternos por se interessarem pelo meu trabalho sempre
curiosos, perguntando, ouvindo com toda a atenção do mundo e ficando
entusiasmados, mesmo sem o conhecimento cientifico.
A vocês com muito carinho!
Amo vocês!
VIII
Agradecimentos:
À Profa. Dra. Maria José Soares Mendes Giannini, pelo exemplo de luta,
liderança e perseverança. Por instigar a atingir o desafio lançado. Obrigado
pela orientação e oportunidade e pelo crescimento pessoal e profissional.
Aos meus Anjos da Guarda, Elaine e Rosângela, pelos precisos
ensinamentos, (que vão desde técnicas de isolamento e identificação dos
fungos até a culinária), pelo carinho, conselhos e principalmente pela
paciência.
Aos meus companheiros “micológicos” pós-graduandos Aline, Ana Marisa,
Fernanda, Haroldo, Julhiany, José Nelson, Marcelo (valeu Japão !!!),
Marciano, Tatiane, Regina e Roberta e também companheiros “micológicos”
de iniciação científica e estagiários Ana Carolina (Pi), Ana Carolina e Bruna
(Uniara), Carol, Adriana, Marina, Juliana, Fábio, Natália, Alex Rodrigo, pelo
ótima convivência, pelo bom humor contagiante, pelas risadas que tornaram
meu trabalho mas leves e gostoso, por me escutarem e ajudarem nas
dificuldades e desafios encontrados nessa etapa. Carrego comigo um
pouquinho de cada um de vocês.
Aos que passagem por esse laboratório, (Lílian, Fabiana, Patricia, Rosana,
Susana) muitas saudades.
Á todos os agregados da Micologia, Bel Cito, Marisa Imuno, Gustavo, pela
colaboração e pelo bom convívio. E também a Rosemira por seu bom humor e
sorriso contagiante.
IX
As minhas vizinhas da kit por tornarem essa etapa mais agradável e divertida
e também a minha mais que vizinha, minha amigona, Gláucia, por estar ao
meu lado sempre, por escutar, não apenas ouvir.
Aos meus eternos amigos Diego Barione, Diego Arruda, Mariana Carla,
Mariana Coelho, Pedro (Mão), Rodrigo, Ricardo (Jurca) e suas digníssimas e
digníssimos namorados, por cada palavra e olhar de carinho, apoio e
compreensão, pra sempre.....
X
SUMÁRIO
PAG
Resumo 1
Abstract 3
1. Introdução 5
2. Justificativa 16
3. Objetivos 17
4. Metodologia 18
4.1. Microrganismo e condições de cultivo 18
4.2. Preparo das substâncias vegetais 18
4.3. Avaliação da atividade antifúngica 18
4.4. Concentração fungicida mínima 19
4.5. Seleção dos extratos 19
4.6. Tratamento das células fúngicas e extração das proteínas 19
4.7. Análise do perfil protéico por eletroforese em gel de poliacrilamida com
dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE)
20
4.8. Análise protéica por Eletroforese Bidimensional: 20
5. Resultados 21
5.1. Avaliação da atividade antifúngica 21
5.2. Seleção do extrato para contato com as leveduras de gênero Candida e
análise proteômica
27
5.3. Análise do perfil protéico por eletroforese em gel de poliacrilamida com
dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE)
28
5.4. Análise protéica por eletroforese bidimensional: 29
5.4.1. Candida albicans com e sem tratamento 29
5.4.2. Candida krusei com e sem tratamento 36
6. Discussão 46
7. Conclusões 53
8. Referencias Bibliográficas 54
XI
LISTA DE FIGURAS
PAG
Figura 1: Estrutura molecular dos antifúngicos anfotericina B e flucitosina 20
Figura 2: Estrutura molecular do colesterol e ergosterol. 22
Figura 3: Estrutura molecular do antifúngico fluconazol 23
Figura 4: Estrutura molecular do antifúngico caspofungina pertencente à classe
das equinocandinas.
23
Figura 5: SDS-PAGE dos componentes protéicos de C. albicans sem
tratamento (C-) e tratada com 1000µg/mL dos extratos brutos AcOEt e EtOH
de K. rubriflora e 1400 µg/mL de fluconazol
28
Figura 6: SDS-PAGE dos componentes protéicos de C. krusei sem tratamento
(C-) e tratada com 1000µg/mL dos extratos brutos AcOEt e EtOH de K.
rubriflora e 1400 µg/mL de fluconazol
29
Figura 7: Eletroforese bidimensional dos componentes protéicos totais de C.
albicans na faixa de pH de 3 a 10 com tratamento com fluconazol na
concentração de 1400 µg/mL em géis corados pelo azul de Coomassie.
30
Figura 8: Eletroforese bidimensional dos componentes protéicos totais de C.
albicans com tratamento com fluconazol na concentração de 1400 µg/mL,
visão ampliada das proteínas alteradas.
31
Figura 9: Eletroforese bidimensional dos componentes protéicos totais de C.
albicans na faixa de pH de 3 a 10 com tratamento com o extrato bruto acetato
de etila (AcOEt) de K. rubriflora, na concentração de 1000 µg/mL, em géis
corados pelo azul de Coomassie.
32
Figura 10: Eletroforese bidimensional dos componentes protéicos totais de C.
albicans com tratamento com o extrato bruto acetato de etila (AcOEt) de K.
rubriflora na concentração de 1000 µg/mL, visão ampliada das proteínas
alteradas.
33
Figura 11: Eletroforese bidimensional dos componentes protéicos totais de C.
albicans na faixa de pH de 3 a 10 com tratamento com extrato bruto etanólico
34
XII
(EtOH) de K. rubriflora na concentração de 1000 µg/mL, em géis corados pelo
azul de Coomassie.
Figura 12: Eletroforese bidimensional dos componentes protéicos totais de C.
albicans com tratamento com o extrato bruto etanólico (EtOH) de K. rubriflora
na concentração de 1000 µg/mL, visão ampliada das proteínas.
35
Figura 13: Eletroforese bidimensional dos componentes protéicos totais de C.
krusei com tratamento com o fluconazol na concentração de 1400 µg/mL, em
géis corados pelo azul de Coomassie.
36
Figura 14: Eletroforese bidimensional dos componentes protéicos totais de C.
krusei com tratamento com o fluconazol na concentração de 1400 µg/mL,
visão ampliada das proteínas alteradas.
37
Figura 15: Eletroforese bidimensional dos componentes protéicos totais de C.
krusei na faixa de pH de 3 a 10 com tratamento com extrato bruto acetato de
etila (AcOEt) de K. rubriflora, na concentração de 1000 µg/mL, em géis
corados pelo azul de Coomassie
38
Figura 16: Eletroforese bidimensional dos componentes protéicos totais de C.
krusei com tratamento com extrato bruto acetato de etila (AcOEt) de K.
rubriflora, na concentração de 1000 µg/mL, visão ampliada das proteínas
alteradas.
39
Figura 17: Eletroforese bidimensional dos componentes protéicos totais de C.
krusei na faixa de pH de 3 a 10 com tratamento com Extrato bruto etanólico
(EtOH) de K. rubriflora, na concentração de 1000 µg/mL, em géis corados
pelo azul de Coomassie.
42
Figura 18: Eletroforese bidimensional dos componentes protéicos totais de C.
krusei com tratamento com Extrato bruto etanólico (EtOH) na concentração de
1000 µg/mL, visão ampliada das proteínas alteradas
43
XIII
LISTA DE TABELAS
PAG
Tabela 1: Valores de CIM e CMF de Alibertia sessilis, pertencente à família
Rubiaceae, testados contra C. albicans e C. krusei
21
Tabela 2: Valores de CIM e CMF de Alibertia macrophylla, pertencente à família
Rubiaceae, testados contra C. albicans e C. krusei.
22
Tabela 3: Valores de CIM e CMF de Alibertia edulis, pertencente à família
Rubiaceae, testados contra C. albicans e C. krusei
22
Tabela 4: Valores de CIM e CMF de Machaerium villosum, pertencente à família
Leguminosae, testados contra C. albicans e C. krusei.
23
Tabela 5: Valores de CIM e CMF de Cryptocarya mandioccana e moschata,
pertencente à família Lauraceae, testados contra C. albicans e C. krusei.
24
Tabela 6: Valores de CIM e CMF de Peperomia obtusifolia, pertencente à família
Piperaceae, testados contra C. albicans e C. krusei
25
Tabela 7: Valores de CIM e CMF de Peperomia sp, pertencente à família
Piperaceae, testados contra C. albicans e C. krusei.
26
Tabela 8: Valores de CIM e CMF de Kielmeyera rubriflora, pertencente à família
Clusiaceae, testados contra C. albicans e C. krusei
27
Tabela 9: Proteínas demonstradas na figura 7, seus respectivos pontos
isoelétricos (pI) e massas moleculares (MM) e alterações observadas com o
tratamento com fluconazol.
31
Tabela 10: Proteínas demonstradas na figura 9, seus respectivos pontos
isoelétricos (pI) e massas moleculares (MM) e alterações observadas com o
tratamento com AcOEt de K. rubriflora.
33
Tabela 11: Proteínas demonstrados na figura 11, seus respectivos pontos
isoelétricos (pI) e massas moleculares (MM) e alterações observadas com o
tratamento com EtOH de K. rubriflora.
35
Tabela 12: Proteínas demonstradas na figura 13, seus respectivos pontos
isoelétricos (pI) e massas moleculares (MM) e alterações observadas com o
tratamento com fluconazol.
37
XIV
Tabela 13: Proteínas demonstradas na figura 15, seus respectivos pontos
isoelétricos (pI) e massas moleculares (MM) e alterações observadas com o
tratamento com extrato bruto acetato de etila (AcOEt) de K. rubriflora.
40
Tabela 14: Proteínas não expressas com o tratamento com o extrato bruto
acetato de etila de K. rubriflora.
41
Tabela 15: Proteínas demonstradas na figura 17, seus respectivos pontos
isoelétricos (pI) e massas moleculares (MM) e alterações observadas com o
tratamento com extrato bruto etanólico (EtOH) de K. rubriflora
44
Tabela 16: Proteínas não expressas com o tratamento com o extrato bruto
etanólico.
45
XV
LISTA DE ABREVIATURAS
% Porcentagem
µg Micrograma
µL Microlitro
°C Graus Celcius
AcOEt Acetato de etila
ATCC American Type Culture Collection
CFM Concentração fungicida mínima
CIM Concentração inibitória mínima
CLSI Clinical and Laboratory Standards Institute
DNA Ácido desoxirribonucléico
EtOH Etanol
G Gravidade
HCl Ácido clorídrico
HIV Vírus da imunodeficiência humana
kDa Kilodalton
M Molaridade
mL Mililitro
mM Milimolar
MM Massa molecular
mRNA RNA mensageiro
OMS Organização Mundial da Saúde
pH Potencial hidrogeniônico
pI Ponto isoelétrico
RNA Ácido Ribonucléico
SDS-PAGE Eletroforese em gel de poliacrilamida com dodecil sulfato de sódio
UFC Unidades formadoras de colônia
YEPD Yeast Extract Peptone Dextrose
1
RESUMO
As novas descobertas tecnológicas e o avanço da medicina têm proporcionado a
sobrevida de muitos pacientes. No entanto, estes passam a ser mais suscetíveis a
infecções, principalmente por fungos. O aumento dessas infecções tem gerado
problemas no tocante ao diagnóstico, bem como na terapêutica empregada. A
disponibilidade de antifúngicos na prática médica é relativamente pequena, algumas
vezes ineficiente e com toxicidade elevada. Recentemente, houve um agravante do
quadro devido ao surgimento de resistência a determinadas drogas, o que reforçou a
demanda por novas alternativas terapêuticas. Nosso país é privilegiado pela grande
biodiversidade. A busca por novos alvos, o entendimento dos mecanismos de
virulência, bem como os de resistência microbiana são fundamentais diante do
quadro atual. O objetivo deste estudo foi pesquisar extratos e substâncias de plantas
com atividade antifúngica para Candida albicans e C. krusei, selecionar os de maior
atividade e verificar o perfil de proteínas de ambas as leveduras, antes e após o
contato com a substância de origem vegetal, realizando sua caracterização. Os
extratos acetato de etila (AcOEt) e etanólico (EtOH) de Kielmeyera rubriflora foram
os que apresentaram maior atividade antifúngica. Os componentes protéicos de C.
albicans sem tratamento e tratados com 1400 µg/mL de fluconazol e 1000 µg/mL dos
extratos AcOEt e EtOH foram analisados por SDS-PAGE e eletroforese
bidimensional. O tratamento com fluconazol revelou modificações na expressão de
nove proteínas, que variaram seus pIs de 5,64 a 6,67 e massa molecular de 59,1 a
17,4 kDa, enquanto que os extratos de plantas influenciaram na expressão de 10 e
11 proteínas, respectivamente. O extrato AcOEt influenciou na expressão de
proteínas na faixa de pIs de 5,7 a 5,2, massa molecular de 90,5 a 18,8 kDa,
enquanto que o EtOH, em pIs de 5,8 a 7,4, e massa molecular de 89,2 a 16,3 kDa.
Os extratos de plantas propiciaram a expressão diminuída de maior número de
proteínas do que fluconazol. O tratamento de C. krusei com fluconazol gerou 11
modificações na expressão das proteínas, sendo essas de pI entre 4,9 e 6,2 e massa
molecular de 89,3 a 17,0 kDa. O tratamento de C. krusei com ambos os extratos
influenciaram no aumento ou diminuição da expressão de 66 proteínas variando seus
2
pIs entre 4,3 e 7,4 e massas moleculares entre 96,0 e 14,1 kDa. Por outro lado, 44
proteínas com pIs variando de 4,7 a 8,8 e massas moleculares entre 89.3 e 14.1
kDa, respectivamente, não foram expressas após o tratamento. Aparentemente,
ambos os extratos foram mais eficientes para inibição da expressão protéica de C.
krusei, sugerindo a existência de alvos específicos.
3
ABSTRACT
The new discoveries and technological advances in medicine have provided the
survival of many patients. However, they become more susceptible to infections,
mainly by fungi. The increase in these infections has created problems regarding the
diagnosis and the therapy employed. The availability of antifungals in medical
practice is relatively small, inefficient and sometimes with high toxicity. Recently,
there was an aggravating problem due to the emergence of resistance to certain
drugs, which increased the demand for new alternative therapies. Our country is
privileged in biodiversity. The search for new targets, the understanding of the
mechanisms of virulence, as well as, the microbial resistance is essential before the
current framework. This study aimed to find extracts of plants and substances with
antifungal activity to Candida albicans and C. krusei, select the extracts with the best
activity and verify the profile of proteins of both yeasts, before and after contact with
the ethyl acetate (AcOEt) and ethanol (EtOH) extracts from Kielmeyera rubriflora,
performing its characterization. The AcOEt and EtOH extracts from K. rubriflora had
the greater antifungal activity. The C. albicans and C. krusei cells proteins untreated
and treated with 1400 µg / mL of fluconazole and 1000 µg / mL of AcOEt and EtOH
extracts were analyzed by SDS-PAGE and two-dimensional electrophoresis.
Treatment with fluconazole revealed changes in the expression of nine proteins,
which varied its pIs of 6.67 to 5.64 and molecular weight of 59.1 to 17.4 kDa, while
the plants extracts influenced the expression of 10 and 11 proteins, respectively. The
AcOEt extract influenced the expression of proteins in the range from pIs of 5.7 to
5.2, molecular weight of 90.5 to 18.8 kDa, while the EtOH in pIs of 5.8 to 7.4, and
mass molecular of 89.2 to 16.3 kDa. The plants extracts reduced greater number of
proteins than fluconazole and apparently the profile is different. The treatment of C.
krusei with fluconazole generated 11 changes in the expression of proteins, and
these were of pI of between 4.9 and 6.2 and molecular weight of 89.3 to 17.0 kDa.
The treatment of C. krusei with both extracts influenced the increase or decreases of
the 66 proteins expression with pIs ranging from 4.3 to 7.4 and molecular weights
from 96.0 to 14.1 kDa. In addition, 44 proteins were not expressed after treatment
4
and their pIs ranging from 4.7 to 8.8 and molecular weights from 89.3 to 14.1 kDa,
respectively. Apparently, both extracts were more efficient for C. krusei protein
expression changes than C. albicans, suggesting a specific target, opening
possibilities for new antifungal drugs.
5
1. INTRODUÇÃO
A incidência de infecções fúngicas oportunistas teve um aumento significativo
nas décadas recentes. Isto se deve ao crescimento da população de pacientes
imunocomprometidos como os pacientes com o vírus HIV, com câncer, aqueles sob
tratamento com quimioterápicos e drogas citotóxicas. Recentemente, as novas
descobertas tecnológicas e os avanços da medicina, proporcionaram a sobrevida de
muitos pacientes, em contrapartida, muitos destes tornaram-se altamente suscetíveis
a infecções causadas por organismos que eram considerados de baixa virulência ou
até mesmo não patogênicos (SANDVEN et al., 2000; GARBER et al., 2001;
PFALLER e DIEKEMA, 2007)
Os principais agentes etiológicos que contribuem para o aumento das
infecções são as espécies do gênero Candida, acometendo significativamente
pacientes nas unidades de terapia intensiva; Aspergillus, um dos principais
causadores de infecções invasivas; Fusarium e várias espécies de zigomicetos,
incluindo Rhizopus e Mucor (ZUPANIC-KRMEK et al., 2004; KAUFFMAN, 2006). As
dermatofitoses também sofreram um aumento significativo e Trichophyton rubrum,
sendo o agente de maior prevalência (BAEZA et. al., 2004; TAN, 2005; HAPCIOGLU
et al., 2006). Cryptococcus neoformans é o patógeno mais comumente encontrado
em infecções do sistema nervoso central em pacientes HIV positivos. Estima-se que
25-30% desses pacientes morrerão em conseqüência de meningite cryptocóccica
(PAPPALARDO e MELHEM, 2003; LARSEN et al., 2004).
Candida albicans presente na cavidade bucal e trato gastrintestinal de
indivíduos sadios são um dos principais agentes causadores das micoses humanas,
sendo a quarta causa mais comum de infecções sistêmicas (RANGEL-FRAUSTO et
al.,1999; SHAO et al., 2007). O prognóstico dessas infecções é limitado pela eficácia
reduzida das drogas atualmente disponíveis, pelo desenvolvimento de resistência e
também pela falta de testes diagnósticos rápidos e específicos (SANGLARD, 2002;
KONTOYIANNIS e LEWIS, 2002; SHAO et al., 2007). As razões para a falta de
diagnósticos específicos incluem as manifestações clínicas inespecíficas,
sensibilidade baixa das técnicas microbiológicas de hemoculturas, além da
6
indisponibilidade das culturas de amostras de tecidos profundos, devido aos riscos
associados aos procedimentos invasivos utilizados na obtenção desses tecidos
(BLUMBERG et al, 2001; MÉAN et al, 2008).
As infecções por leveduras têm-se destacado pelo aumento de casos
(SWOBODA et al, 2003; PASQUALOTTO et al, 2006; CAREY et al., 2008). Essa
incidência elevada tem sido documentada em vários lugares do mundo (PFALLER et
al., 2001; PFALLER e DIEKEMA, 2007). Nos Estados Unidos, as espécies de
Candida estão em quarto lugar entre as causas de infecções nosocomiais sendo
responsável por 8 a 15% dos casos de septicemia (WISPLINGHOFF et al, 2004;
PFALLER e DIEKEMA, 2007). Relatos de hospitais dos Estados Unidos e da Europa
detectaram o aumento na prevalência das infecções causadas por espécies de
Candida não-albicans como C. glabrata, C. krusei e C. parapsilosis (VISCOLI et al,
1999; TRICK et al, 2002; PFALLER e DIEKEMA, 2007). Na Alemanha, a espécie
mais freqüentemente isolada é C. albicans (58.5%), seguida por C. parapsilosis
(8.0%) e C. tropicalis (7.5%) (ZEPELIN et al, 2007). No Brasil, a taxa de incidência
relatada foi maior que a dos países europeus e dos Estados Unidos, sendo C.
albicans a espécie mais freqüentemente isolada em todos os hospitais, e entre as
Candida não-albicans houve predominância de C. parapsilosis e C. tropicalis
(COLOMBO 2000; MARCHETTI et al, 2004; COLOMBO et al., 2007). Com isso, a
candidíase representa um problema de saúde pública e as pesquisas de novos
alvos, bem como de novos agentes antifúngicos são essenciais para a melhora deste
quadro.
No mercado existem cinco classes de drogas antifúngicas disponíveis
(polienos, fluoropirimidinas, azóis, equinocandinas e alilaminas), todas elas com
sérias desvantagens, algumas não possuem amplo espectro de ação, outras não são
seletivas para o fungo, sendo tóxicas para o hospedeiro e muitas são fungistáticas e
não fungicidas havendo o risco de recidivas, além do aparecimento de cepas
resistentes aos antifúngicos de uso clínico, o que é atualmente um problema de difícil
solução (BECK-SAGUE e JARVIS 1993; REX el al., 2000; CHEN et al.; 2007).
A terapia contra infecções causadas por leveduras do gênero Candida é de
difícil tratamento devido ao número limitado de agentes antifúngicos disponíveis.
7
A anfotericina B (Figura 1), droga pertencente à classe dos polienos age
ligando-se aos esteróis, preferencialmente ao principal esterol da membrana celular
fúngica, o ergosterol. Essa ligação propicia a alteração da integridade da membrana
fúngica e causa desequilíbrio osmótico, resultando na perda de potássio intracelular,
magnésio, açúcares, e de outros metabólitos, levando a morte celular (TERRELL e
HUGHES, 1992; CHEN et al.; 2007). Apesar de ser a droga de primeira escolha no
tratamento das infecções causadas pelo gênero Candida, esta substância está
associada a vários efeitos tóxicos e requer administração intravenosa (GOODWIN et
al., 1995)
A flucitosina (Figura 1) é a única droga antifúngica do tipo antimetabólito.
Trata-se quimicamente de uma pirimidina, a qual dentro das células fúngicas sofre
uma desamilaçãoresponsável por sua ativação, transformando-se em 5-fluorouracil.
Ela inibe a síntese protéica fúngica, substituindo uracila pelo 5-flurouracil no RNA.
Flucitosina também interfere na síntese do DNA fúngico. A sua formulação
intravenosa não está mais disponível e é limitada pela sua toxicidade na medula
óssea e elevada taxa de mutação espontânea levando a resistência microbiana
(BENNETT, 1977; ANDES e OGTRO, 2000).
Figura 1. Estrutura molecular dos antifúngicos anfotericina B e flucitosina
Com o lançamento dos azóis, nova classe de antifúngicos com disponibilidade
de administração oral, o tratamento de infecções por Candida spp começou uma
nova era (SAAG e DISMUKES, 1988). Essa classe de medicamentos tem como
mecanismo de ação a inibição da biossíntese do ergosterol que é o principal esterol
presente na membrana da célula fúngica (figura 2).
Anfotericina B
Flucitosina
8
Figura 2. Estrutura molecular do colesterol e ergosterol.
Especificamente, os azóis inibem a atividade da enzima do citocromo P450,
lanosterol 14α-desmetilase (VERMITSKY et al., 2006). O cetoconazol foi o primeiro
agente disponível para o tratamento de candidíase mucocutânea, entretanto com
algum tempo de uso foram relatadas falhas terapêuticas associadas aos valores
elevados de concentração inibitória mínima (CIM) (HORSBURGH e
KIRKPATRICK,1983). A próxima droga a ser introduzida foi fluconazol (Figura 3),
triazol solúvel em água com biodisponibilidade superior a 90% após administração
oral, amplamente utilizado para tratamento de uma vasta gama de infecções
causadas por Candida, particularmente em indivíduos HIV positivos com candidíase
orofaríngea (SAAG e DISMUKES, 1988). Concomitante com a sua utilização
generalizada, em 15 milhões de pacientes desde 1988, tem havido relatos de
resistência ao fluconazol (figura 3). Dentre os mecanismos de resistência utilizados
pelos fungos é importante ressaltar a superprodução de enzimas, a implementação
de vias metabólicas alternativas e a produção de bombas de efluxo que expulsam o
medicamento da célula fúngica (WHITE et al., 1998; GOLDMAN et al., 2004;
FERREIRA et al., 2005; ESPINEL-INGROFF, 2008).
Outros exemplos de substâncias pertencentes à classe dos azóis são
itraconazol, voriconazol, posaconazol, ravuconazol, esta última substância está na
fase II dos testes clínicos, todas agem na síntese do ergosterol, entretanto em
diferentes etapas da cascata de síntese (CHEN e SORRELL ,2007)
Colesterol
Ergosterol
9
Figura 3. Estrutura molecular do antifúngico fluconazol
C. albicans geralmente é sensível a todos os agentes antifúngicos disponíveis.
Entre as espécies não-albicans, C. tropicalis e C. parapsilosis são também sensíveis
aos azóis, entretanto C. tropicalis possui sensibilidade menor ao fluconazol que C.
albicans. C. lusitaniae, responsável por 1–2% das candidemias é susceptível aos
azóis, contudo possui alta resistência intrínseca a anfotericina B (SINGH, 2001;
COSTA-DE-OLIVEIRA et al, 2008; CRUCIANI e SERPELLONI, 2008). Por outro
lado, C. krusei apresenta resistência intrínseca ao fluconazol e C. glabrata
desenvolve resistência rapidamente após contato com este fármaco. Ambas têm
emergido como importantes agentes em infecções sistêmicas em pacientes
hospitalizados (REX et al.,1995; SPELLBERG et al., 2006). No entanto, seus
mecanismos moleculares de resistência ainda são poucos explorados e necessitam
maiores investigações (GUINEA et al., 2006; ROGERS et al., 2006).
Novas drogas antifúngicas tornaram-se disponíveis visando o tratamento nos
casos de infecção por cepas menos sensíveis ou resistentes. Essa nova classe de
drogas, as equinocandinas, age inibindo a síntese de glucana presente na parede
celular dos fungos por meio da inibição da enzima β(1,3)-glucana sintase (Figura 4).
A inibição desta enzima resulta em esgotamento dos polímeros de glucana na célula
fúngica, resultando em uma parede celular anormal, fraca e incapaz de resistir ao
estresse osmótico. Toxicidade associada à equinocandina é rara, pois sua ação é
específica sobre a glucana presente na parede celular, e as células de mamíferos
não possuem essa estrutura (CHEN e SORRELL, 2007)
Fluconazol
10
Figura 4. Estrutura molecular do antifúngico caspofungina pertencente à
classe das equinocandinas.
Contrariamente ao que ocorre na terapêutica bacteriana, os avanços no
tratamento das infecções fúngicas são mais lentos, mas, nas últimas décadas há um
incremento importante na disponibilidade de novas moléculas (WALSH et al., 1992;
KRCMERY e KALAVSKY, 2007). Apesar de a indústria farmacêutica ter investido e
lançado novos antifúngicos nas três últimas décadas, as formas de resistência a
essas drogas por microrganismos têm aumentado. Ações devem ser tomadas para
reduzir o problema de resistência como, por exemplo, controlar o uso de
antifúngicos, desenvolvimento de pesquisas com os objetivos de entender os
mecanismos genéticos de resistência, encontrar alvos potenciais nos fungos para o
desenvolvimento de novas drogas, oferecendo assim, um tratamento apropriado e
eficiente com maior especificidade. Devido à grande diversidade da microbiota e a
dificuldade de recursos financeiros em alguns países, a Organização Mundial de
Saúde (OMS) tem incentivado a utilização de plantas como recurso para o
tratamento de muitas doenças. Acredita-se que esta alternativa, bem mais
econômica, possa beneficiar grande parte da população mundial que usa plantas
como primeiro recurso terapêutico, além de serem as melhores fontes para obtenção
de uma variedade de novos fármacos (NASCIMENTO, et al., 2000).
Caspofungina
11
As plantas são utilizadas desde os primórdios da civilização para tratamento e
cura de enfermidades sendo extensivamente empregadas na medicina popular por
representarem uma alternativa econômica, de fácil obtenção e aplicabilidade para
diversas patologias. Estas têm contribuído significativamente para o fortalecimento
da indústria farmacêutica, através do isolamento de substâncias bioativas, cuja
complexidade de muitas estruturas químicas inviabilizaria técnica e economicamente
a síntese orgânica de tais substâncias. (YUNES et al., 2001; HOLETZ et al., 2002;
MACIEL et al., 2002; ROJAS et al., 2006).
A ampla biodiversidade presente no território brasileiro nos coloca em posição
estratégica para o desenvolvimento da exploração racional e sustentável de novos
metabólitos de valor terapêutico. A grande extensão territorial do país, com uma
enorme diversidade de climas e solos, favorece a biodiversidade e diversidade
química. Determinadas áreas como a floresta Amazônica e Atlântica, o Cerrado e a
Caatinga são ricos em espécies que podem fornecer compostos naturais ativos para
uma variedade de enfermidades como doenças crônicas degenerativas, malária,
tuberculose, micoses e muitas outras (BASSO et al., 2005).
Pesquisas de novos agentes antibacterianos e antifúngicos obtidos a partir de
extratos de plantas se intensificaram devido ao arsenal relativamente pequeno de
drogas disponíveis para o tratamento das micoses principalmente, além da
problemática envolvendo cepas resistentes (BARRET, 2002). Estudos com plantas
brasileiras provenientes do Cerrado (Hyptis ovalifolia e Eugenia uniflora) mostraram
boa atividade contra dermatófitos e dentre estes, Trichophyton rubrum apresentou
sensibilidade alta (SOUZA et al., 2003). Dois componentes puros isolados da
Wedelia paludosa, planta nativa do Brasil e tradicionalmente usada na medicina
popular apresentaram atividade contra os dermatófitos T. rubrum, T. mentagrophytes
e Epidermophyton floccosum (SARTORI, 2003). Bauhinia racemosa encontrada na
Índia, China e Timor, usada no tratamento de cefaléia, problemas de pele e diarréia,
apresentou atividade contra bactérias Gram negativas, positivas e também C.
albicans, Aspergillus niger e Aspergillus flavus (KUMAR et al., 2005). Camellia
sinensis, o popular chá verde foi avaliado quanto à atividade antimicrobiana e
demonstrou ser ativo contra C. albicans e Streptococcus mutans (SIMONETTI et al.,
12
2004.). Isobe et al. (2002), estudando a planta Pothomorphe umbellata, conhecida
pelo nome popular de pariparoba ou caapeba e usada como analgésico, diurético,
antiespasmódico, antiinflamatório, antimalárico e antiasmático, verificaram que esta
planta também apresentava ação antimicrobiana. O óleo essencial obtido a partir das
sementes dos frutos de Caryocar brasiliensis,planta amplamente distribuída nas
regiões central e sudeste do Brasil, teve atividade antifúngica comprovada contra
Cryptococcus neoformans (PASSOS et al., 2002). As plantas Ziziphus joazeiro e
Caesalpinea pyramidalis, usadas popularmente no tratamento de micoses nos
estados do Paraná e Sergipe mostraram-se potentes contra os patógenos humanos
T. rubrum, C. guilliermondii, C. albicans, C. neoformans e Fonsecaea pedrosoi
(CRUZ et al.,2007).
Os testes para determinação da atividade antifúngica de produtos naturais,
especialmente extratos de plantas apresentam muitos desafios. A diversidade de
metodologias e a inexistência de padronização para as condições do teste como a
concentração do inóculo e meio de cultura podem levar a falta de reprodutibilidade e
dificuldade na comparação intra e interlaboratoriais. Além disso, o fenômeno de
trailing, crescimento residual ou inibição parcial do crescimento, que ocorre com
leveduras do gênero Candida tornam difícil a determinação pontos de corte (LIU et
al., 2007). Contudo a padronização de testes de sensibilidade in vitro apresentou
grandes avanços em anos recentes, principalmente devido à publicação de
documentos de referência pelo National Committee for Clinical Laboratory Standards
- CLSI a respeito de metodologias testadas, padronizadas e revisadas por consenso.
Os documentos M27-A2 do CLSI recomendam a microdiluição em caldo como
método de referência para testar sensibilidade de leveduras do gênero Candida e
Cryptococcus e o documento M38-A para fungos filamentosos que causam infecções
invasivas incluindo espécies de Aspergillus, Fusarium, Rhizopus arrhizus,
Pseudallescheria boydii e Sporothrix schenckii. Estes documentos foram preparados
para drogas antifúngicas sintéticas. No entanto, muitos estudos ainda empregam
metodologias não validadas. Nos últimos anos, o teste de microdiluição foi usado e
recomendado para a determinação da atividade antifúngica de produtos naturais por
serem mais sensíveis, econômicas e requererem pequenas quantidades de amostras
13
(LEE, 1999; LI et al., 2003; LARCHER et al., 2004; SALGUEIRO et al., 2004).
Estudos recentes têm substituído o método tradicional de difusão em ágar pela
técnica de microdiluição (BOUAMAMA el al., 2006, BUWA e STADEN, 2006;
MOTSEI el al., 2003; SCORZONI et al., 2007 a; SCORZONI et al., 2007 b).
As proteínas são os principais alvos de drogas. A evolução das técnicas
proteômicas reveste-se de grande importância para a pesquisa e desenvolvimento
de novos fármacos. Por meio destas técnicas é possível identificar a mudança de
expressão de um determinado sistema em estado patológico ou quando exposto a
uma substância sendo útil para estudar os alvos e os mecanismos de ação das
substâncias testadas (WALGREN e THOMPSON, 2004).
O termo proteoma foi primeiramente usado em 1995 e foi definido como uma
caracterização em grande escala de um amplo conjunto de proteínas de uma
linhagem celular, tecido ou organismo (WASINGER et al, 1995; ANDERSON et al,
1996). Hoje duas definições são aceitas: a primeira e clássica é restrita a análises
em grande escala dos produtos dos genes e a segunda é mais ampla e combina a
análise das proteínas com estudos genéticos envolvendo transcritos (mRNA). No
entanto, a meta dos estudos proteômicos continua a mesma: obter uma visão global
e integrada da biologia de um sistema por meio do estudo das proteínas (PANDEY e
MANN, 2000).
Os primeiros estudos que podemos chamar de proteoma começaram em 1975
com a introdução da eletroforese bidimensional por O’ Farrell, Klose, e Scheele,
mapeando proteínas de Escherichia coli, rato e cobaio. Muitas proteínas foram
separadas e visualizadas, mas nenhuma foi identificada. Apesar de o
desenvolvimento da eletroforese bidimensional ser um grande passo para a ciência
proteômica, a identificação dessas proteínas era necessária. O principal problema a
ser solucionado era a falta de sensibilidade das técnicas de sequenciamento, isso
porque tanto a eletroforese unidimensional como a bidimensional possuem limites na
quantidade de proteína adicionada (AEBERSOLD, 1986, 1987,1988). A primeira
tecnologia a emergir foi a degradação de Edman (EDMAN, 1949), sendo possível
com isso a criação de banco de dados de eletroforese bidimensional. Algumas
décadas mais tarde, a espectrometria de massas trouxe avanços na identificação
14
protéica com grande sensibilidade e precisão (ANDERSEN e MANN, 2000). O
crescimento da proteômica é uma conseqüência direta dos avanços no
seqüenciamento genômico, sem essas informações as proteínas não poderiam ser
identificadas, mesmo com as melhorias introduzidas pela espectrometria de massas
(PANDEY e LEWITTER, 1999).
Assim, a proteômica é uma tecnologia emergente, sendo uma poderosa
ferramenta na identificação de biomarcadores de doenças, caracterização de
processos fisiológicos normais e patológicos, análise de interação entre as proteínas,
desenvolvimento farmacêutico e toxicológico (WESTERMEIER et al, 2005 ; UNWIN e
WHETTON, 2007).
O proteoma dos fungos é estudado para diversas finalidades. Rupp (2004)
analisou a parede celular de C. albicans investigando a resposta a drogas e
mudanças nos fatores de virulência em mutantes obtendo informações importantes
para o entendimento das interações fungo-hospedeiro. Outras análises do proteoma
de C. albicans foram focadas no dimorfismo, fatores de virulência e resistência a
drogas (PITARCH et al., 2003). Pitarch e colaboradores (2004) mapearam as
proteínas imunogênicas de C. albicans, reconhecidas por anticorpos no curso da
infecção sistêmica na busca de novos biomarcadores que pudessem ajudar no
diagnóstico e monitoramento terapêutico dessa micose. Isolados de C. glabrata
sensíveis e resistentes aos azólicos tiveram sua análise protéica comparada e
significativa diferença foi observada na expressão dos dois isolados (MARICHAL et.
al., 1997). A análise proteômica de componentes de superfície de A. fumigatus
identificou vinte seis proteínas, entre elas, a principal proteína presente nos conídios,
possivelmente os principais causadores do processo alérgico, sendo assim, essas
proteínas seriam grandes candidatas a produção de vacinas (ASIF et. al., 2006).
Modificações no proteoma de C. albicans foi observado quando esta levedura foi
tratada com droga inibidora da β-(1,3)-glucana sintetase, semelhante as
equinocandinas e também com dois triazóis mostrando que por meio de estudos
proteômicos é possível distinguir diferentes mecanismos de ação de antifúngicos
(BRUNEAU et al., 2003). Outros proteomas além do fúngico foram estudados,
Caledelari e colaboradores (2000) com o objetivo de entender os mecanismos de
15
resistência de Streptococcus gordonni à penicilina analisaram seu proteoma por
eletroforese bidimensional e verificaram que o microrganismo resistente apresentou
duas proteínas com intensidade aumentada, as quais mostraram relação com
resistência a penicilina. O perfil protéico de Mycobacterium avium foi avaliado
durante a infecção mostrando que um conjunto de dez proteínas teve sua expressão
aumentada, duas dessas tem papel na produção de energia (HUGHES et al.,2007).
Os estudos em proteomas virais são focados no entendimento dos efeitos do vírus
no hospedeiro (SEIPELT et al., 2000). Os vírus foram estudados durante muito
tempo não só para o entendimento da patologia causada por eles, mas também
como sistemas-modelo para processos moleculares bem como ferramentas para
identificar proteínas reguladoras celulares importantes. Recentes avanços em
técnicas proteômicas e espectrometria de massa facilitaram a detecção dos
componentes do virion, interações protéicas com células infectadas além de
mudanças induzidas do proteoma celular resultando em um melhor entendimento
mais da infecção virótica (MAXWELL e FRAPPIER, 2007). Em relação aos parasitas,
Trichomonas vaginalis, protozoário transmitido por via sexual, que infecta a área
urogenital humana causando a tricomoníase, teve seu primeiro mapa de referência
proteômico descrito (DE JESUS et al., 2007). As pesquisas são facilitadas nesses
organismos, em razão de seu proteôma ser relativamente pequeno, além disso,
muitos já foram descritos, baseando-se em estudos avançados de seqüências
genômicas. Como resultado do seqüenciamento gênico e análise proteômica muitos
genes e proteínas estão sendo descritos e disponibilizados para serem estudados
como novos alvos para drogas (FERNANDES, 2001).
16
2. JUSTIFICATIVA
Assim, no presente estudo, foi realizada prospecção da atividade antifúngica
de extratos, frações e substâncias isoladas de plantas. Extratos com atividade
antifúngica e com valores baixos de concentração inibitória mínima (CIM) foram
selecionados e foi verificado o perfil de proteínas antes e após o contato com o
extrato vegetal. A importância dessa análise pode gerar a identificação de alvos
interessantes na pesquisa de antifúngicos como também fornecer novas evidências
para o entendimento do papel dessas proteínas nos mecanismos de resistência e de
patogenicidade do microrganismo.
17
3. OBJETIVOS
- Realizar estudo da atividade antifúngica de extratos e substâncias das
plantas, Alibertia edulis, Alibertia sessilis, Alibertia macrophylla, Cryptocarya
mandioccana e moschata, Kielmeyera rubriflora, Machaerium villosum, Peperomia
obtusifolia por meio de técnicas adaptadas e padronizadas para a determinação da
concentração inibitória mínima (CIM) baseadas nas preconizadas pelo Clinical and
Laboratory Standards Institute – CLS contra as leveduras Candida albicans e
Candida krusei.
- Determinar a concentração fungicida mínima (CFM) e selecionar os extratos
com atividade antifúngica e com valores de CIM baixos para as duas leveduras;
- Realizar análise diferencial do perfil protéico das leveduras quando em
contato com substância de origem vegetal previamente escolhida que apresentou
atividade antifúngica, bem como a droga sintética fluconazol, em busca de possíveis
alvos para o desenvolvimento de novos fármacos.
18
4. MATERIAIS E MÉTODOS
4.1. Microrganismo e condições de cultivo
Para a realização dos testes foram empregadas as leveduras Candida
albicans ATCC 90028 e Candida krusei ATCC 6258, pertencentes à micoteca do
Laboratório de Micologia Clínica do Departamento de Análises Clínicas da Faculdade
de Ciências Farmacêuticas, UNESP, Araraquara. As leveduras foram cultivadas em
ágar Sabouraud sem a adição de cloranfenicol, incubadas a temperatura ambiente
por 24 horas.
4.2. Preparo das substâncias vegetais
Para a obtenção dos extratos, as folhas, galhos ou raízes das plantas foram
secas e moídas e, em seguida, submetidas a processos de extração e partição com
solventes orgânicos fornecendo as frações de diversas polaridades a serem
estudadas. As frações selecionadas foram submetidas a diferentes técnicas
cromatográficas, incluindo cromatografia em coluna sobre sílica ou Sephadex LH-20,
cromatografia em camada delgada, além da cromatografia líquida de alta eficiência
visando o isolamento e purificação de substâncias. A determinação das estruturas
químicas dos componentes puros foi realizada por análises espectrométricas.
4.3. Avaliação da atividade antifúngica
Os testes de sensibilidade foram realizados de acordo com o documento M27-
A2 (2002) do CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute) com modificações
(RODRIGUEZ-TUDELA et al., 1996). O meio de cultura utilizado para a realização
dos testes de sensibilidade e diluição das drogas sintéticas foi RPMI-1640 com L-
glutamina sem bicarbonato de sódio e acrescido de 2% de glicose, tamponado com
MOPS 0,165M, pH 7,0. A concentração da suspensão fúngica foi de 1x10
4
– 5x10
4
UFC/mL. Foram utilizadas duas drogas sintéticas anfotericina B e fluconazol como
controle do teste. Foram realizadas leituras visuais após 24 horas de incubação. A
concentração inibitória mínima é considerada a menor em que se observou a inibição
do crescimento fúngico. Os extratos que apresentaram um CIM menor que 75,µg/mL
19
a atividade antifúngica foi considerada forte, entre 75 a 150 µg/mL possuem atividade
antifúngica moderada, entre 150 a 250 µg/mL, fraca e maior que 250 µg/mL inativo
(SCORZONI et al., 2007).
4.4. Concentração fungicida mínima
Após o tempo de incubação, uma alíquota de cada um dos 96 poços da placa
de microdiluição foi retirada e colocada cuidadosamente em ágar Sabouraud contido
em placas grandes. Após 24 horas de incubação a 35
o
C, foi verificado o crescimento
ou não de colônias e as respectivas concentrações.
4.5. Seleção dos extratos
Para a análise diferencial do perfil protéico das leveduras foram selecionados
extratos que apresentaram atividade antifúngica com baixos valores de CIM tanto
para C. albicans como para C. krusei.
4.6. Tratamento das células fúngicas e extração das proteínas
As leveduras foram cultivadas em meio YEPD na concentração de 1x10
4
–
5x10
4
UFC/mL até atingirem a fase log da curva de crescimento, então os extratos
foram adicionados na concentração de 1000µg/mL ficando em contato por 16 horas,
o mesmo foi realizado com fluconazol na concentração de 1400 µg/mL. Essas
concentrações dos extratos e do fluconazol foram usadas, pois segundo Bruneau el
al., 2003, concentrações a partir de 750 µg/mL correspondem a quantidade
necessária para verificar os efeitos de alterações protéicas e identificações do
possível mecanismo de ação. Concentrações mais baixas dos extratos (250 e 500
µg/mL) também foram testadas, entretanto não foram observadas modificações
relevantes nos perfis protéicos, portanto elegeu-se 1000µg/mL a concentração de
extrato para o teste e 1400 µg/mL a de fluconazol. O cultivo foi centrifugado e lavado
de 3 a 5 vezes com água gelada para a retirada do meio de cultura e do extrato. O
pellet foi acrescido de solução 10mM Tris – HCl e macerado com nitrogênio líquido, a
seguir centifugado por 40 minutos 13.000 g
.
20
3.7. Análise do perfil protéico por eletroforese em gel de poliacrilamida
com dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE)
As proteínas foram submetidas à dosagem pelo método de Bradford (1976).
Os perfis protéicos foram analisados quanto a sua alteração após a exposição à
droga vegetal por eletroforese em gel de poliacrilamida com dodecil sulfato de sódio,
SDS-PAGE, sob condições redutoras, utilizando sistema de tampão descontínuo de
Laemmili, (1970) e Studier, (1973).
3.8. Análise protéica por Eletroforese Bidimensional
Os componentes protéicos dos isolados foram primeiramente submetidos à
focalização isoelétrica, utilizando Ettan IPGphor 3 (GE Healthcare). A segunda
dimensão, realizada para a separação das proteínas de acordo com a massa
molecular, foi realizada em gel de poliacrilamida 12.5% de acordo com Laemmli
(1970). Os géis foram corados com Coomassie Azul Brilhante G-250 segundo
Neuhoff et al. (1988). A analise dos dados foi realizada com auxilio do programa 2D
Platinum da GE.
21
5. Resultados
5.1. Avaliação da atividade antifúngica
A avaliação da atividade antifúngica de extratos e substâncias das plantas,
Alibertia edulis, Alibertia sessilis, Alibertia macrophylla, Cryptocarya mandioccana e
moschata, Kielmeyera rubriflora, Machaerium villosum, Peperomia obtusifolia, foi
realizada pela técnica de microdiluição segundo o documento M27-A do CLSI,
visando obter os valores de concentração inibitória mínima (CIM) e também
determinar a concentração fungicida mínima (CFM) conforme dados das tabelas 1 a
8.
Tabela 1: Valores de CIM e CMF de
Alibertia sessilis, pertencente à família
Rubiaceae, testados contra C. albicans e C. krusei.
Candida albicans Candida krusei Fração
CIM
(µg/mL)
CFM
(µg/mL)
CIM
(µg/mL)
CFM
(µg/mL)
Extrato bruto etanólico 250 250 15,6 31,2
Fração AcOEt 250 250 31,2 62,5
AsFH (bruto) 125 250 250 250
AsFA (bruto) 250 250 125 125
AsFB (bruto) 250 250 125 125
AsCAC2 (fração) 125 250 125 250
AsCAC4 (fração) 125 250 125 250
AsCaC5i (fração) 250 250 250 250
AsCBf (fração) 125 250 15,6 250
AsCB2-4 (fração) 250 250 125 250
AsCB5-6 (fração) 250 250 125 250
Planta
Alibertia sessilis
AsCHDA (bruto) 250 250 125 250
SA:
Sem atividade na faixa de concentração selecionada para o teste.
Alibertia sessilis apresentou valores elevados de CIM e de CFM contra C.
albicans tanto para extratos brutos como também para as frações, com atividade
antifúngica variando de moderada a fraca. Resultados semelhantes foram obtidos
para C. krusei, com exceção do extrato bruto etanólico apresentando forte atividade
antifúngica com valor de CIM de 15,6 µg/mL e CFM de 31,2 µg/mL e as frações
AcOEt e AsCBf com valores de CIM de 31,2 µg/mL e 62,5 µg/mL.
22
Tabela 2: Valores de CIM e CMF de Alibertia macrophylla, pertencente à
família Rubiaceae, testados contra C. albicans e C. krusei.
Candida albicans Candida krusei Fração
CIM
(µg/mL)
CFM
(µg/mL)
CIM
(µg/mL)
CFM
(µg/mL)
Extrato Bruto Etanólico SA SA 62,5 250
Fração Hexânica SA SA SA AS
Fração Metanólica SA SA 250 250
AmFH (bruto) 125 250 125 250
Planta
Alibertia macrophylla
AmFA (bruto) 250 250 125 125
SA:
Sem atividade na faixa de concentração selecionada para o teste.
Dois extratos brutos de Alibertia macrophylla apresentaram atividade contra C.
albicans, AmFH e AmFA, sendo seus valores de CIM 125 µg/mL (atividade
moderada) e 250 µg/mL (atividade fraca). Em relação a C. krusei, a melhor atividade
antifúngica foi do extrato bruto etanólico, com valor de CIM e de CFM de 62,5 e 250
µg/mL respectivamente. Para os outros extratos brutos e frações a atividade
antifúngica variou entre moderada e inativa.
Tabela 3: Valores de CIM e CMF de Alibertia edulis, pertencente à família
Rubiaceae, testados contra C. albicans e C. krusei
Candida albicans Candida krusei Fração
CIM
(µg/mL)
CFM
(µg/mL)
CIM
(µg/mL)
CFM
(µg/mL)
Extrato bruto etanólico 125 250
15,6
250
Fração Hexânica SA SA 250 250
Fração AcOEt 250 250
15,6
250
AeFH (bruto) 250 250 250 250
AeFA (bruto) 250 250 250 250
AeFHDA (bruto) 250 250 125 250
AeC45Me (Fração) 125 250 125 250
AeC5SAC (Fração) 250 250
62,5 125
AeC5SHO (Fração) 250 250 125 250
AeC5in (Fração) 125 250
31,2
250
Planta
Alibertia edulis
AeC6p (Fração) 125 250
31,2
62,5
SA: Sem atividade na faixa de concentração selecionada para o teste.
Os extratos brutos e frações de Alibertia edulis apresentaram-se inativos ou
com atividade antifúngica moderada para C. albicans. Melhores resultados foram
23
obtidos para C. krusei com grande parte dos extratos brutos e frações apresentando
atividade variando entre forte e moderada.
Tabela 4: Valores de CIM e CMF de Machaerium villosum, pertencente à família
Leguminosae, testados contra C. albicans e C. krusei.
Candida albicans Candida krusei Fração
CIM
(µg/mL)
CFM
(µg/mL)
CIM
(µg/mL)
CFM
(µg/mL)
Extrato ETOH
Bruto
SA SA 125 250
Fração
Hexano
250 250 250 250
Fração
AcOEt
250 250 125 125
Fração
N- Butanol
250 250 250 250
Planta
Machaerium villosum
Fração
Hidroalcoólica
SA SA SA SA
SA: Sem atividade na faixa de concentração selecionada para o teste.
Machaerium villosum apresentou atividade de moderada a fraca contra as
duas leveduras com valores de CIM e CFM variando de 125 a 250 µg/mL.
24
Tabela 5: Valores de CIM e CMF de Cryptocarya mandioccana e moschata,
pertencente à família Lauraceae, testados contra C. albicans e C. krusei.
Candida albicans Candida krusei Fração
CIM
(µg/mL)
CFM
(µg/mL)
CIM
(µg/mL)
CFM
(µg/mL)
FAR1 (Pura) 125 125 125 250
FAR2 (Pura) 125 250 125 250
FAR3 (Pura) 125 250 125 250
FAR5 (Pura) 125 250 125 250
FAR6 (Pura) 125 250 125 250
FAR7 (Pura) 125 250 125 250
FAR8 (Pura) 125 250 125 250
FAR9 (Pura) 125 250 125 250
FAR10 (Pura) 125 125 125 250
FAR12 (Pura) SA SA 125 250
FAR13 (Pura) SA SA 125 250
FAR14(Pura) 125 250 125 250
FAR15 (Pura) 125 250 125 250
FAR16 (Pura) 125 250 125 250
FAR17 (Pura) 125 250 125 250
FAR19 (Pura) 250 250 125 250
FAR20 (Pura) 250 250 125 250
FAR21 (Pura) 250 250 125 250
FAR22 (Pura) 250 250 125 250
Planta
Cryptocarya mandioccana
e moschata
FAR23 (Pura) 250 250 125 250
SA: Sem atividade na faixa de concentração selecionada para o teste.
Os testes realizados com as substâncias puras de Cryptocarya mandioccana e
moschata revelaram atividade antifúngica moderada a fraca.
25
Tabela 6: Valores de CIM e CMF de Peperomia obtusifolia, pertencente à
família Piperaceae, testados contra C. albicans e C. krusei.
Candida albicans Candida krusei Fração
CIM
(µg/mL)
CFM
(µg/mL)
CIM
(µg/mL)
CFM
(µg/mL)
Extrato Bruto
(folhas)
125 125 62,5 62,5
Fração Hexânica
(folhas)
62,5 62,5 31,2 31,2
Fração
Hexano/Acetato
(folhas)
SA SA 250 250
Fração MEOH/
H2O (folhas)
SA SA 250 250
Fração AcOEt
(folhas)
SA SA 250 250
Fração Hexânica
(caules)
SA SA 125 125
Fração Hexânica
(caules)
SA SA 250 250
Fração
Hexano/Acetato
(caules)
250 250 125 125
Fração Hexano/
Partição
(caules)
250 250 62,5 62,5
Planta
Peperomia obtusifolia
Fração Hidro/
AcOEt
(caules)
250 250 15,6 15,6
SA: Sem atividade na faixa de concentração selecionada para o teste.
A fração hexânica de folhas Peperomia obtusifolia destaca-se por apresentar
boa atividade antifúngica para as duas leveduras, além disso, o extrato bruto das
folhas fração Hexano/ Partição e a Fração Hidro/ AcOEt dos caules apresentaram
também forte atividade antifúngica para C. krusei. Os outros extratos e frações de
folhas e caules testados apresentaram valores altos de CIM e CFM sendo
considerados com atividade antifúngica moderada a inativos.
26
Tabela 7: Valores de CIM e CMF de Peperomia sp, pertencente à família
Piperaceae, testados contra C. albicans e C. krusei.
Candida albicans Candida krusei Fração
CIM
(µg/mL)
CFM
(µg/mL)
CIM
(µg/mL)
CFM
(µg/mL)
Extrato Etanólico F
(Bruto)
SA SA 250 250
Extrato Etanólico C
(Bruto)
SA SA 250 250
Partição Hexânica F
(Bruto)
SA SA 250 250
Partição AcOEt
(Bruto)
SA SA SA SA
Partição Hidroalcoólica
(Bruto)
SA SA SA SA
Extrato Diclorometano
(Bruto)
SA SA SA SA
Extrato MeOH F
(Bruto)
SA SA SA SA
Fr 1-3
(Fração)
SA SA SA SA
FR 4 (Fração) SA SA SA SA
FR5 (Fração) SA SA SA SA
Fr 6-10 (Fração) 250 SA SA SA
FR 19-33 (Pura) SA SA SA SA
Planta
Piperomia sp
FR34-50 (Pura) SA SA SA SA
SA:Sem atividade na faixa de concentração selecionada para o teste.
Os extratos brutos, frações e substâncias puras de Peperomia sp foram todos
inativos para C. albicans, com exceção da fração Fr 6-10 apresentando atividade
antifúngica fraca. Semelhante a C. albicans, para C. krusei apenas três extratos
brutos de Peperomia sp apresentaram atividade antifúngica fraca.
27
Tabela 8: Valores de CIM e CMF de Kielmeyera rubriflora, pertencente à família
Clusiaceae, testados contra C. albicans e C. krusei
Candida albicans Candida krusei Fração
CIM (µg/mL
)
CFM
(µg/mL
)
CIM (µg/mL)
CFM
(µg/mL
)
Ext. Bruto
Hexano
SA SA 125 125
Ext. Bruto
AcOEt
31,2 250 7,8 31,2
Ext. Bruto
ETOH
31,2 62,5 7,8 62,5
Ext. Bruto
Soxlet
62,5 250 7,8 62,5
Xantona 3 15,6 125 0,97 125
Xantona 5 31,2 250 15,6 250
Xantona 6 125 250 125 250
Planta
Kielmeyera rubriflora
Xantona 8 62,5 250 15,6 125
SA: Sem atividade na faixa de concentração selecionada para o teste.
A atividade antifúngica de Kielmeyera rubriflora foi a de maior destaque entre
todas as plantas. A maior parte de seus extratos brutos e substâncias puras
apresentaram atividade forte e moderada para as duas leveduras, apenas extrato
bruto hexânico mostrou-se inativo contra C. albicans. As substâncias 3, 5, 6 e 8
correspondem a diferentes xantonas, obtidas do extrato acetato de etila. A
substância 3 apresentou valor de CIM menor que os extratos brutos, quando C.
krusei foi avaliada.
O extrato de caules de K. rubriflora após secos e moídos, submetidos a
percolação a frio com hexano, acetato de etila e etanol, obtendo assim os extratos
brutos hexano, acetato de etila e etanólico. Em seguida foi realizada a extração com
soxlet, obtendo assim o extrato soxlet. As xantonas foram obtidas a partir de técnicas
cromatográficas a partir do extrato bruto acetato de etia.
28
5.2. Seleção do extrato para contato com as leveduras de gênero Candida e
análise proteômica
A análise dos resultados dos valores de CIM e CFM levou à seleção da
Kielmeyera rubriflora pertencente à família Clusiaceae para realização do contato
com as leveduras e posterior análise diferencial da expressão protéica, pois foi a que
mais se destacou em relação à atividade, apresentando valores baixos de CIM,
sendo considerada de atividade antifúngica potente, tanto para C. albicans como
para C. krusei.
5.3. Análise do perfil protéico por eletroforese em gel de poliacrilamida com
dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE)
Os componentes totais de C. albicans e C. krusei sem tratamento e tratados
com 1400µg/mL de fluconazol e 1000µg/mL dos extratos etanólico (EtOH) e acetato
de etlia (AcOEt) de K. rubriflora foram analisados por SDS-PAGE. O perfil
eletroforético mostrou diferenças principalmente quanto à intensidade e número de
bandas. Entretanto esses dados não foram suficientes para uma clara caracterização
das proteínas diferencialmente expressas, sendo então, necessária realização da
eletroforese bidimensional para uma melhor caracterização.
kDa
94
67
30
45
20
1
4
C
-
AcOEt EtOH
Fluconazol
29
Figura 5: SDS-PAGE dos componentes protéicos de C.albicans sem tratamento (C-)
e tratada com 1000 µg/mL dos extratos brutos AcOEt e EtOH de K. rubriflora e 1400
µg/mL de fluconazol .
Figura 6: SDS-PAGE dos componentes protéicos de C. krusei sem tratament (C-) e
tratada com 1000 µg/mL dos extratos brutos AcOEt e EtOH de K. rubriflora e 1400
µg/mL de fluconazol .
5.4. Análise protéica por eletroforese bidimensional
5.4.1. Candida albicans com e sem tratamento
A eletroforese bidimensional foi realizada com os componentes totais de C.
albicans sem tratamento, tratada com fluconazol (figuras 7 e 8) e com extratos AcOEt
(figuras 9 e 10) e EtOH (figuras 11 e 12) de K. rubriflora para verificar a diferença de
expressão de proteínas e seus respectivos pontos isoelétricos (pIs). Foram
detectadas proteínas na eletroforese bidimensional com massas moleculares entre
103 e 12 kDa e pI entre 4 e 10.
A análise diferencial da expressão protéica de C.
albicans com e sem contato com fluconazol e os extratos vegetais revelou a
diminuição e aumento de expressão das proteínas quando em contato. Esses dados
estão descritos nas tabelas 9, 10 e 11.
C- AcOEt EtOH fluconazol
30
Figura 7: Eletroforese bidimensional dos componentes protéicos totais de C.
albicans na faixa de pH de 3 a 10 com tratamento com fluconazol na concentração
de 1400 µg/mL em géis corados pelo azul de Coomassie.
kDa
94
67
30
45
20
14
10
-
3
C. albicans sem tratamento
kDa
94
67
30
45
20
14
10
-
3
C. albicans tratada com Fluconazol
1
2
3
4
1
3
4
45
30
45
30
31
Figura 8: Eletroforese bidimensional dos componentes protéicos totais de C.
albicans com tratamento com fluconazol na concentração de 1400 µg/mL, visão
ampliada das proteínas alteradas.
Tabela 9: Proteínas demonstradas na figura 8 com seus respectivos pontos
isoelétricos (pI), massas moleculares (MM) e alterações observadas com o
tratamento com fluconazol.
Spot PI MM (kDa) Alteração na expressão
A 5,6 59.1 Diminuição de 3,4 vezes com Fluconazol
B 6,4 56.3 Diminuição de 3,0 vezes com Fluconazol
C 5,8 25.3 Aumento de 9,4 vezes com Fluconazol
D 5,6 19.8 Aumento de 4,6 vezes com Fluconazol
E 8,3 17.3 Aumento de 3,0 vezes com Fluconazol
F 4,6 13,2 Aumento de 3,0 vezes com Fluconazol
G 5,8 19.6 Aumento de 3,8 vezes com Fluconazol
H 6,6 17.4 Aumento de 2,8 vezes com Fluconazol
I 6,7 17.4 Aumento de 2,2 vezes com Fluconazol
1
1
2
3
4
A
A
B
B
C
C
D
D
E
E
F
F
G
G
H H
I
I
3
4
2
1
C. albicans em tratamento C. albicans tratada com fluconazol
32
Figura 9: Eletroforese bidimensional dos componentes protéicos totais de C. albicans na faixa
de pH de 3 a 10 com tratamento com o extrato bruto acetato de etila (AcOEt) de K. rubriflora, na
concentração de 1000 µg/mL, em géis corados pelo azul de Coomassie.
kDa
94
67
30
45
20
14
10
-
3
C. albicans tratada com ACOET
kDa
94
67
30
45
20
14
10
-
3
C. albicans
sem tratamento
1
2
3
1
2
3
4
4
45
30
45
30
AcoEt
33
Figura 10: Eletroforese bidimensional dos componentes protéicos totais de C.
albicans com tratamento com o extrato bruto acetato de etila (AcOEt) de K. rubriflora
na concentração de 1000 µg/mL, visão ampliada das proteínas alteradas.
Tabela 10: Proteínas demonstradas na figura 10 com seus respectivos pontos
isoelétricos (pI), massas moleculares (MM) e alterações observadas com o
tratamento com ACOET.
Spot PI MM (kDa) Alteração na expressão
A 5,7 90.5 Diminuição de 3,4 vezes com AcOEt
B 6,3 67.4 Diminuição de 5,1 vezes com AcOEt
C 6,5 62.3 Diminuição de 3,4 vezes com AcOEt
D 6,8 61.8 Diminuição de 3,3 vezes com AcOEt
E 6,4 56.3 Diminuição de 5,3 vezes com AcOEt
F 5,1 29.8 Aumento de 3,8 vezes com AcOEt
G 4,9 29.6 Aumento de 3,5 vezes com AcOEt
H 9,4 29.5 Aumento de 4,8 vezes com AcOEt
I 5,0 18.9 Aumento de 2,2 vezes com AcOEt
J 5,2 18.8 Aumento de 2,3 vezes com AcOEt
A
B
A
B
C
D
C
D
E
E
1
2
F
F
G
G
I
J
J
I
3
H
4
H
3
4
2
C. albicans em tratamento C. albicans tratada com AcOEt
34
Figura 11: Eletroforese bidimensional dos componentes protéicos totais de C. albicans na
faixa de pH de 3 a 10 com tratamento com extrato bruto etanólico (EtOH) de K. rubriflora na
concentração de 1000 µg/mL, em géis corados pelo azul de Coomassie.
kDa
94
67
30
45
20
14
10
-
3
C. albicans tratada com ETOH
1
2
3
4
kDa
94
67
30
45
20
14
10
-
3
C. albicans sem tratamento
4
3
2
1
4
5
4
5
EtOH
35
Figura 12: Eletroforese bidimensional dos componentes protéicos totais de C.
albicans com tratamento com o extrato bruto etanólico (EtOH) de K. rubriflora na
concentração de 1000 µg/mL, visão ampliada das proteínas.
Tabela 11: Proteínas demonstradas na figura 12 com seus respectivos pontos
isoelétricos (pI), massas moleculares (MM) e alterações observadas com o
tratamento com EtOH de K. rubriflora.
Spot PI MM (kDa) Alteração na expressão
A 5,8 89.2 Diminuição de 8,5 vezes com EtOH
B 5,9 89.2 Diminuição de 6,8 vezes com EtOH
C 6,3 67.4 Diminuição de 4,0 vezes com EtOH
D 6,5 62.2 Diminuição de 3,0 vezes com EtOH
E 6,8 62.3 Diminuição de 2,2 vezes com EtOH
F 6,4 56.3 Diminuição de 5,3 vezes com EtOH
G 4,9 29.8 Aumento de 4,3 vezes com EtOH
H 4,8 33.2 Aumento de 5,3 vezes com EtOH
I 4,9 27.0 Aumento de 3,3 vezes com EtOH
J 5,1 21.3 Aumento de 2,0 vezes com EtOH
K 7,4 16.2 Diminuição de 8,4 vezes com EtOH
A
B
C
D
E
F
1
A
B
C
D
E
F
G
H
I
2
G
H
I
J
3
J
K
K
3
2
4
1
C. albicans em tratamento C. albicans tratada com EtOH
36
5.4.2. Candida krusei com e sem tratamento
A análise por eletroforese bidimensional foi também realizada com os
componentes protéicos totais de C. krusei sem tratamento e comparada com o
tratado com fluconazol (figura 13 e 14), com extrato AcOEt (figura 15 e 16) e EtOH
(figura 17 e 18) para verificar a diferença de expressão de proteínas e seus
respectivos pontos isoelétricos (pIs) e massas moleculares. Foram detectadas
proteínas com massas moleculares entre 100 e 14,2 kDa e pI entre 4 e 10.
A
análise diferencial da expressão protéica de C. krusei com e sem contato com
fluconazol e os extratos vegetais revelou a diminuição e aumento de expressão das
proteínas quando em contato algumas proteínas deixaram de ser expressas com o
tratamento com os extratos. Esses dados estão descritos nas tabelas 12 a 16.
Figura 13: Eletroforese bidimensional dos componentes protéicos totais de C. krusei na
faixa de pH de 3 a 10 com tratamento com extrato fluconazol na concentração de 1400
µg/mL, em géis corados pelo azul de Coomassie.
10 - 3
kDa
94
67
45
30
20
14
C. krusei sem tratamento
kDa
94
67
45
30
20
14
C.
krusei
tratada com Fluconazol
1
1
2 2
5
3
3
4
4
5
6 6
7
7
10 - 3
37
Figura 14: Eletroforese bidimensional dos componentes protéicos totais de C.
krusei com tratamento com o fluconazol na concentração de 1400 µg/mL, visão
ampliada das proteínas alteradas.
Tabela 12: Proteínas demonstradas na figura 14 com seus respectivos pontos
isoelétricos (pI), massas moleculares (MM) e alterações observadas com o
tratamento com fluconazol.
Spot PI MM (kDa) Alteração na expressão
A 5,8 89,3 Diminuição de 3,8 vezes com Fluconazol
B 5,4 64,9 Diminuição de 3,2 vezes com Fluconazol
C 5,6 56,7 Aumento de 3,8 vezes com Fluconazol
D 5,9 46,1 Diminuição de 3 vezes com Fluconazol
E 4,9 33,6 Diminuição de 2 vezes com Fluconazol
F 5,6 38,5 Diminuição de 2,5 vezes com Fluconazol
G 6,2 34,3 Diminuição de 3,3 vezes com Fluconazol
H 5,3 34,3 Diminuição de 2,5 vezes com Fluconazol
I 5,5 34,0 Diminuição de 2,3 vezes com Fluconazol
J 5,6 29,3 Diminuição de 2,3 vezes com Fluconazol
K 6,0 17,0 Aumento de 2,0 vezes com Fluconazol
1
2
3
4
7 5
4
1
2
3
7 5
A
C
B
A
C
B
D
F
D
F
K
K
G
G
E
E
H
H
I
I
C. krusei em tratamento C. Krusei tratada com fluconazol
38
Figura 15: Eletroforese bidimensional dos componentes protéicos totais de C. krusei na
faixa de pH de 3 a 10 com tratamento com extrato bruto acetato de etila (AcOEt) de K.
rubriflora, na concentração de 1000 µg/mL, em géis corados pelo azul de Coomassie.
kDa
96
64
45
30
20
14
C. krusei tratada com AcOEt
1
2
3
4
5
6
7
8
kDa
96
64
45
30
20
14
C. krusei sem tratamento
1
2
3
4
5
6
7
8
39
Figura 16: Eletroforese bidimensional dos componentes protéicos totais de C.
krusei com tratamento com extrato bruto acetato de etila (AcOEt) de K. rubriflora, na
concentração de 1000 µg/mL, visão ampliada das proteínas alteradas.
3
1
2
4
5
]
8
7
6
1
2
3
4
5
6
7
8
A
B C
A
B C
D
D
E
E F F
H
H
L
K
L
K
I
I
P
P
G
J
G
J
M
O
N
M
O
N
C. krusei em tratamento C. Krusei tratada com AcOEt
40
Tabela 13: Proteínas demonstradas na figura 16 com seus respectivos pontos
isoelétricos (pI), massas moleculares (MM) e alterações observadas com o
tratamento com extrato bruto acetato de etila (AcOEt) de K. rubriflora.
Spot PI MM (kDa) Alteração na expressão
A 5,3 79,1 Diminuição de com 3,0 vezes AcOEt
B 5,5 56,7 Aumento de 3,0 vezes AcOEt
C 5,6 56,7 Aumento de 5,0 vezes AcOEt
D 5,0 43,6 Diminuição de 2,3 vezes AcOEt
E 5,8 41,0 Aumento de 2,3 vezes AcOEt
F 5,4 35,5 Aumento de 2,7 vezes AcOEt
G 6,5 35,0 Aumento de 3,0 vezes AcOEt
H 5,5 34,0 Diminuição de 3,0 vezes AcOEt
I 5,6 29,2 Diminuição de 3,0 vezes AcOEt
J 7,1 27,3 Diminuição de 4,0 vezes AcOEt
K 5,3 26,5 Aumento de 3,2 vezes AcOEt
L 5,1 26,6 Aumento de 2,2 vezes AcOEt
M 6,1 26,5 Diminuição de 7,3 vezes AcOEt
N 5,5 24,0 Aumento de 10,3 vezes AcOEt
O 5,8 23,8 Aumento de 10,5 vezes AcOEt
P 6,0 17,0 Diminuição de 2,0 vezes AcOEt
41
Tabela 14: Proteínas não expressas, após tratamento com o extrato de acetato de
etila de K. rubriflora
Nº da
Proteína
MM pI
33
89,3
5,8
42 5,4
44
79,1
5,2
49
76,5
4,7
50 6,7
51
75,2
5,5
70
64,9
5,4
73
64,4
5,4
79
63,4
6,0
82
60,3
6,0
142
44,0
5,0
162
42,1
5,5
184 5,6
185
40,2
5,4
187
40,1
5,5
201
38,4
5,6
222 6,4
223
35,2
6,2
227 6,2
228
34,3
5,4
245
31,8
5,7
257
29,6
5,5
263
29,2
8,8
270
27,5
6,4
277
26,8
5,7
278
26,6
5,8
280
26,4
8,8
281
24,0
4,8
282
24,4
6,5
287
23,8
5,1
289
22,0
5,6
293
20,6
5,5
298 5,6
301
19,3
5,6
307
17,8
5,9
309
17,2
5,0
312
17,0
5,7
315 5,8
316 5,0
317
15,6
6,3
319 6,0
320
15,5
5,6
323
14,7
7,5
329
14,1
5,8
42
Na tabela 14 estão representadas as proteínas não expressas quando C.
krusei foi tratada com extrato bruto de acetato de etila de K. rubriflora,
correspondendo a 44 proteínas com pIs variando de 4,7 a 8,8 e massa moleculares
entre 89.3 e 14.1 kDa
Figura 17: Eletroforese bidimensional dos componentes protéicos totais de C. krusei na
faixa de pH de 3 a 10 com tratamento com Extrato bruto etanólico (EtOH) de K. rubriflora,
na concentração de 1000 µg/mL, em géis corados pelo azul de Coomassie.
kDa
96
64
45
30
20
14
C
. krusei
tratada com EtOH
kDa
96
64
45
30
20
14
C. krusei
sem tratamento
1
1
2
2
3
3
4
4
5
5
43
Figura 18: Eletroforese bidimensional dos componentes protéicos totais de C.
krusei após tratamento com extrato EtOH na concentração de 1000 µg/mL, visão
ampliada das proteínas alteradas.
L
L
M
M
C. krusei em tratamento C. Krusei tratada com EtOH
44
Tabela 15: Proteínas demonstradas na figura 18 com seus respectivos pontos
isoelétricos (pI), massas moleculares (MM) e alterações observadas com o
tratamento com Extrato bruto etanólico (EtOH) de K. rubriflora.
Spot PI MM (kDa) Alteração na expressão
A 5,3 56,0 Aumento de 2,7 vezes com EtOH
B 4,8 54,7 Aumento de 2,3 vezes com EtOH
C 6,1 45,2 Diminuição de 6,6 vezes com EtOH
D 5,7 42,1 Aumento de 12,7 vezes com EtOH
E 5,7 41,2 Aumento de 3,0 vezes com EtOH
F 5,7 40,0 Aumento de 11,3 vezes com EtOH
G 5,7 38,1 Diminuição de 5,2 vezes com EtOH
H 5,4 35,5 Aumento de 3,0 vezes com EtOH
I 5,5 34,0 Diminuição de 2,0 vezes com EtOH
J 5,4 32,0 Aumento de 3,6 vezes com EtOH
K 5,6 29,2 Diminuição de 4,0 vezes com EtOH
L 6,15 26,4 Diminuição de 3,0 vezes com EtOH
M 5,3 26,5 Aumento de 2,8 vezes com EtOH
N 5,8 24,0 Aumento de 4,6 vezes com EtOH
45
Tabela 16: Proteínas não expressas após tratamento com o Extrato bruto etanólico
de K. rubriflora.
A tabela 16 apresenta as proteínas não expressas de C. krusei após
tratamento com o extrato etanólico. Verificou-se que 66 proteínas, variando seu pI
entre 4,3 e 7,4 e massa molecular entre 96,0 e 14,1 kDa, não foram expressas após
o tratamento com o extrato de K. rubriflora.
N° Spot
pI MM
21 96,0 4,60
22 90,8 6,0
28 5,9
32 6,0
33
89,3
5,8
43 5,4
44 5,3
45
79,0
5,2
48 77,3 4,4
49 76,5 4,7
50 6,7
51
75,2
5,5
53 74,4 5,6
54 73,6 5,0
64 69,2 6,1
65 69,6 6,0
72 5,5
73
64,4
5,5
75 62,2 4,9
79 63,4 5,9
82 60,3 6,0
90 5,7
91
56,7
5,5
97 54,7 4,8
102 51,6 4,8
135 45,2 6,1
141 44,5 6,4
142 44,0 5,0
143 43,6 5,0
144 44,1 4,9
147 5,4
149 5,5
152
43,6
5,7
N° Spot
MM pI
158 42,7 6,4
162 42,1 5,5
166 41,0 5,8
167 41,7 5,4
176 40,7 5,4
184 5,6
187
40,2
5,5
195 38,0 5,8
199 38,2 5,7
223 35,2 6,2
227 6,2
228
34,3
5,4
257 29,6 5,5
265 28,4 5,6
270 27,6 6,5
272 27,3 7,1
278 26,7 5,8
288 23,1 5,5
289 21,8 5,6
298 19,4 5,6
300 5,8
301
19,3
5,6
307 17,8 5,9
309 17,2 5,0
310 16,9 6,0
312 17,0 5,7
315 5,8
316
15,7
4,9
317 15,6 6,3
319 5,9
320
15,5
5,6
323 14,8 7,5
329 14,2 5,8
46
6. DISCUSSAO:
As leveduras estão entre os principais microrganismos causadores de um
amplo leque de infecções, que vão desde as que não comprometem a vida dos
pacientes como as infecções cutâneas e mucocutâneas até processos invasivos que
podem envolver qualquer órgão. Embora Candida albicans continue a ser o patógeno
mais comum, espécies não-albicans são cada vez mais freqüentes (SOBEL et al.,
1997; PFALLER et al., 1998; GONÇALVES et al.,2006 ). Apesar da susceptibilidade
das espécies de Candida aos agentes antifúngicos atualmente disponíveis ser
prevista para as espécies conhecidas, alguns isolados, não necessariamente
seguem o padrão (MARTINEZ-SUAREZ e RODRIGUEZ-TUDELA, 1995; NGUYEN
et al., 1998; REX et al., 1998). Assim, tem-se observado aumento nos casos de
resistência aos medicamentos por vários fungos patogênicos humanos (HOF, 2008).
O pequeno número de classes de antifúngicos disponíveis tem estimulado a
investigação de novas drogas de outras fontes, tais como de produtos naturais. A
crise econômica, o elevado custo dos medicamentos industrializados, o acesso
público ineficiente aos cuidados médicos e farmacêuticos, além dos efeitos colaterais
causados pelas drogas sintéticas são alguns dos aspectos que contribuem para o
uso das plantas medicinais no cuidado a saúde (HOLETZ et al., 2002; ROJAS et al.,
2006; ABAD et al., 2007).
Apesar da grande biodiversidade do Cerrado e Mata Atlântica no Brasil, o
potencial de espécies vegetais como fontes de novos medicamentos permanece
inexplorado. Menos de 20% de todas as espécies vegetais a partir deste ambiente
foram estudadas para a presença de substâncias biologicamente ativas. Nos últimos
anos, as propriedades antimicrobianas de extratos de plantas são cada vez mais
notificadas em diferentes partes do mundo. Os extratos vegetais têm potencial para
atuarem em diferentes alvos diferindo daqueles utilizados pelos agentes
antimicrobianos atualmente disponíveis, podendo apresentar atividade contra os
microrganismos resistentes às drogas sintéticas (JOHANN et al., 2007).
Existem poucos exemplos da descoberta de substâncias bioativas da
biodiversidade brasileira que têm servido como protótipos para o desenvolvimento de
agentes fitoterápicos e produtos farmacêuticos no Brasil. Além disso, muitas das
47
substâncias ativas, presentes nos extratos de plantas nativas do Brasil, ainda não
foram identificadas havendo uma necessidade de maior desenvolvimento nesse
campo (MOREIRA et al. 2006). Como exemplo de produtos comerciais derivados de
plantas brasileiras pode-se mencionar Lerobina
®
, que é utilizado no tratamento da
indigestão (BOTION et al. 2005), e o antiinflamatório fitoterápico Acheflan
®
(GIORGETTI et al. 2007). Nos últimos anos, a interação entre universidades e
empresas públicas principalmente no Brasil, bem como a legislação sobre patentes
brasileiras foram insuficientes para a transformação dos resultados das investigaçôes
no sentido de desenvolver produtos e patentes (MOREIRA et al. 2006, GIORGETTI
et al. 2007). Porém, este quadro está se alterando, e atualmente há um grande
interesse no desenvolvimento destes produtos.
A atividade antifúngica de extratos e de compostos extraídos de plantas pode
ser detectada por vários métodos, entretanto eles não são igualmente sensíveis. A
metodologia para a determinação da atividade antifúngica em compostos naturais é
variável e cada grupo de pesquisa tem empregado diferentes tipos de testes. Os
mais utilizados são bioautografia (COZ et al., 2006), disco difusão (BARTNER et al.,
1994), difusão em ágar (PASSOS et al., 2002; SOUZA et al., 2003; CORDELL e
COLVARD, 2005) e diluição em meio líquido. Atualmente, o método de diluição em
meio líquido é recomendado para ensaio com drogas antifúngicas para leveduras
(M27-A2 do CLSI) e para fungos filamentosos (M38-A do CLSI).
Técnicas de diluição seriada foram recomendadas para determinação da
atividade antifúngica de produtos naturais (PAULI e KUBECZKA, 1996; HADACEK e
GREGER, 2000). Inicialmente, em nosso laboratório, a avaliação da atividade
antifúngica dos extratos e frações obtidas de plantas foi realizada pela técnica de
difusão em ágar, entretanto, este método não foi suficientemente sensível.
Comparando os resultados com ambas as metodologias, observou-se que o método
de difusão em ágar foi menos sensível do que o de microdiluição, além disso, esse
último pode ainda determinar os valores de CIM, informações importantes para a
investigação e produção de novos antifúngicos (SCORZONI et al., 2007-a;
SCORZONI et al., 2007-b).
48
Na busca de novas fontes de substâncias antifúngicas, assim como o
entendimento de seu mecanismo de ação, nosso grupo tem estudado atividade
antifúngica de espécies de plantas originárias do Cerrado e Mata Atlântica do Brasil.
Dentre os extratos, frações, e substâncias estudadas, 60%, 63,6% e 80.6% dos
extratos brutos, frações e substâncias puras, respectivamente apresentaram
atividade contra C. albicans. A melhor atividade encontrada, ou seja, valores
menores que 75 µg/mL foram encontrados na família Clusiaceae. Em relação a C.
krusei, 84%, 81,6% e 92,2% dos extratos brutos, frações e substâncias puras
mostraram-se ativas, respectivamente. A família que mais se destacou com extratos
brutos ativos foi Clusiaceae, e a família Rubiaceae apresentou os mais baixos CIM
de frações cromatográficas.
A família Clusiaceae vem despertando grande interesse na comunidade
científica, devido aos promissores resultados químicos e biológicos. Esta família é
composta de 25 gêneros que se distribuem nas regiões tropicais do globo, sendo
algumas espécies de ocorrência predominante no Brasil principalmente na Mata
Atlântica e no Cerrado. Muitas destas espécies são empregadas na medicina popular
para tratar injúrias como dor, processos infecciosos, inflamatórios e úlceras
(DHARMARATNE et al., 1999). Do ponto de vista químico, as espécies dessa família
são reconhecidas como fontes de xantonas, benzofenonas, terpenos, esteróides,
cumarinas e biflavonóides quanto às atividades biológicas, destacando-se as
propriedades antibacterianas, antifúngicas, citotóxicas, inibitória da promoção de
tumor, inibitória da replicação do vírus HIV-1. Ensaios farmacológicos com xantonas
naturais mostraram diferentes atividades, como antiinflamatória, antileucêmica,
antitumoral, anti-hepatotóxica, antiulcerogênica, antiviral (herpes), estimulante do
miocárdio e do sistema nervoso central, hipertensora, antimicrobiana com atividade
sobre fungos e bactérias, analgésica, e imunossupressora, o que evidencia o
potencial desses metabólitos especiais como agentes medicinais (CRINCHTON et
al., 1984; BENNET et al., 1989; NOLDIN et al., 2006).
Kielmeyera spp, pertencente à família Clusiaceae, é planta tipicamente
encontrada no Cerrado brasileiro. A decocção dos caules de K. coriacea é
tradicionalmente usada no tratamento de várias doenças tropicais, incluindo
49
esquistossomose, leishmaniose, malária e infecções bacterianas e fúngicas (ALVES
et al, 2000). Um extrato hidro-etanólico das folhas de Kielmeyera coriacea quando
administrado cronicamente por sonda, exibiram um notável efeito ansiolítico em ratos
(AUDI et al., 2002). Xantonas e triterpenos foram isolados a partir desta planta, e
exibiram atividade antifúngica contra Cladosporium cucumerinum e C. albicans
(CORTEZ et al., 1998). As xantonas derivadas de Kielmeyera variabilis, planta
tradicionalmente utilizada na medicina popular brasileira, apresentou atividade contra
Staphylococcus aureus e Bacillus subtilis (PINHEIRO et al., 2003).
Dentre as plantas analisadas, dois extratos brutos (acetato de etila e etanólico)
da planta Kielmeyera rubriflora foram selecionados por apresentarem acentuada
atividade antifúngica. K. rubriflora conhecida popularmente por rosa-do-campo ou
rosa-do-cerrado, ocorre nos estados de Goiás, Minas Gerais, Mato Grosso do Sul e
São Paulo (LORENZI, 1998). Embora estudos indicaram que um extrato bruto dessa
planta apresentou forte atividade antifúngica contra Cladosporium cladosporioides e
C. sphaerospermu quando avaliada por bioautografia, não existem relatos na
literatura de seu uso contra leveduras potencialmente patogênicas (MONTEIRO et
al., 1996) . Ambos os extratos selecionados apresentaram valores de CIM inferiores
a 75,0 µg/mL, tanto para C. albicans como para C. krusei, sendo assim, a atividade
antifúngica foi considerada forte (SCORZONI et al., 2007). Os valores de CFM
variaram de 250 a 62,5 µg/mL para C. albicans e 125 a 62,5 µg/mL para C. krusei.
Nosso interesse voltou-se para esta espécie pelo fato de termos encontrado poucos
relatos, na literatura, sobre o estudo desta planta (GOTTLIEB, et al., 1971;
MONTEIRO et al., 1996)
Na seqüência deste estudo procurou-se verificar quais proteínas estariam
envolvidas na resposta destas leveduras aos extratos de K. rubriflora e a droga
fluconazol, empregada como controle. Existe uma crescente necessidade de se obter
drogas efetivas contra novos alvos. As proteínas são os principais alvos na
descoberta de novas drogas, com isso, identificar um alvo protéico essencial à célula
é um desafio importante e as tecnologias proteômicas são fundamentais nesse
campo. Apesar da complexidade das estruturas e funções das proteínas, as
indústrias farmacêuticas e de biotecnologia tem investido enorme quantidade de
50
recursos para decifrar e utilizar os dados proteômicos no desenvolvimento de drogas
mais eficazes e bem sucedidas (WALGREN et al., 2004; KOPEC et al., 2005;
GOMASE et al., 2008).
Infecções causadas por C. krusei têm aumentado nos últimos anos como
conseqüência da sua resistência intrínseca aos azóis. Um dos principais
mecanismos de resistência ao fluconazol em C. krusei é a diminuição da afinidade e
encaixe das enzimas do citocromo P450, entre elas a esterol 14α-desmetilase
(CYP51) (FUKUOKA et al, 2003; GUINEA et al., 2006). Um mecanismo alternativo de
resistência é atividade da bomba de efluxo, expressa por uma superfamília de
transportadores ABC ou ATPases de transporte. Esta é a maior e mais diversificada
das famílias de proteínas, envolvidas no transporte de substâncias através das
membranas biológicas. As proteínas membros desta superfamília transportam uma
variedade de substratos através da membrana celular, os quais incluem açúcares,
aminoácidos, peptídeos, proteínas, metais, íons inorgânicos, toxinas e antibióticos
(CROOP et al., 1998).
A análise proteômica tem auxiliado no entendimento dos fenômenos de
resistência às drogas antifúngicas. Com o objetivo de detectar alterações protéicas
durante o desenvolvimento da resistência, a análise proteômica de cepas sensíveis e
resistentes de C. albicans ao fluconazol, revelou que proteínas envolvidas na síntese
do ergosterol estavam alteradas (HOOSHDARAN et al., 2004). Em trabalho
subseqüente, Yan et al., 2007 verificaram que de 22 diferentes proteínas, a maioria
era relacionada com o metabolismo de energia (Pgk1, Fba1, and Adh1), e algumas
estavam relacionadas a resistência de C.albicans a fluconazol (Ald5, Cdc19 e Gap1).
Por outro lado, C. gabrata, uma levedura emergente causadora de infecções
fúngicas é intrinsecamente resistente aos triazóis, no entanto, os mecanismos
responsáveis pela susceptibilidade reduzida ainda não são compreendidos. A
exposição dessa levedura ao fluconazol induziu a expressão de duas proteínas, uma
de 169-kDa e outra de 61-kDa, identificadas respectivamente, como responsáveis
pela bomba de efluxo e correspondente a lanosterol 14-α-demetilase, enzima
responsável pela biossíntese do ergosterol. A rápida indução de proteínas envolvidas
51
na bomba de efluxo e a super expressão de lanosterol 14-α-demetilase são as
responsáveis pela resistência intrínseca ao fluconazol (NIIMI et al., 2002).
A candidíase normalmente é tratada com derivados azólicos. No entanto, pode
haver falha no tratamento devido ao aparecimento de resistência. As equinocandinas
são uma alternativa para o tratamento de infecções fúngicas e sendo ativa contra
isolados de Candida resistentes aos azóis. Os azóis inibem a 14-α-demetilase,
enzima chave na síntese do ergosterol. Em contrapartida, a classe das
equinocandinas inibe a síntese da β-(1,3)-D-glucana. A análise proteômica de C.
albicans tratada com drogas azólicas e com derivados de equinocandina revelou
alterações na expressão protéica. Este estudo mostra que antifúngicos com
mecanismo de ação comum podem causar efeitos comparáveis em proteínas, assim
como as drogas com diferentes mecanismos de ação provocam alterações
proteômicas diferentes, dessa forma, a análise proteômica pode ser utilizada para
distinguir diferentes antifúngicos, com a promessa de se tornar uma ferramenta útil
para estudo de drogas através da triagem de proteínas alvos envolvidas em
mecanismos de ação desconhecidos (BRUNEAU et al., 2003).
Visando um melhor entendimento da ação dos extratos na célula fúngica
desenvolveu-se ensaios onde se realizou o contato dos extratos brutos AcOEt e
EtOH de Kielmeyera rubriflora e da droga comercial fluconazol com as leveduras C.
albicans e C. krusei. Posteriormente foi realizada a análise protéica por eletroforese
bidimensional.
O contato de C. albicans com fluconazol revelou modificações na expressão
de nove proteínas, que variaram seus pIs de 5,6 a 6,7 e a massa molecular de 59,0 a
17,4 kDa. Por outro lado, o tratamento com os extratos da planta influenciou na
expressão de 10 e 11 proteínas, respectivamente. O extrato AcOEt alterou a
expressão de proteínas na faixa de pIs de 5,7 a 5,2 e nas massas moleculares de
90,5 a 18,8, enquanto que o etanólico, nos pIs de 5,8 a 7,4 e com massas
moleculares de 89,2 a 16,3. Os extratos de plantas causaram modificações nas
leveduras diminuindo ou aumentando a expressão de proteínas. Estas modificações
foram mais significativas que as causadas pelo fluconazol.
52
Nos ensaios de C. krusei com a droga comercial fluconazol, houve modificações na
expressão de onze proteínas, as quais variaram seus pIs de 5,90 a 6,03 e as massas
moleculares de 90,0 a 17,0 kDa. O tratamento com o extrato AcOEt influenciou na
expressão de 16 proteínas com pIs entre 5,03 e 7,10 e massas moleculares variando
entre 79,0 e 16,9 kDa, além disso, ocorreram alterações significativas, em que 44
proteínas não foram expressas com esse tratamento. O extrato EtOH influenciou a
expressão de 14 proteínas na faixa de pIs de 4,7 a 6,1 e de massas moleculares de
56,5 a 23,8. Neste caso, interessantemente também não houve expressão de 66
proteínas, sugerindo um suposto bloqueio de uma ou mais vias, podendo existir
vários alvos potenciais a serem caracterizados. Maiores informações poderão ser
adicionadas após o seqüenciamento das proteínas não expressas após o contato
com o extrato vegetal. Aparentemente, ambos os extratos foram mais eficientes para
C. krusei, sugerindo a existência de alvos específicos, abrindo possibilidades para o
desenvolvimento de novas drogas antifúngicas.
53
7. CONCLUSÕES
• O método M27- A2 do CLSI com modificações adaptado para
determinação da concentração inibitória mínima de extratos vegetais foi
adequado e apresentou reprodutibilidade.
• O método para determinação do CFM foi adequado para avaliar a ação
dos extratos e substâncias vegetais.
• A eletroforese bidimensional é uma metodologia útil e sensível para a
caracterização das proteínas envolvidas em ensaios de triagem de
alvos para drogas vegetais.
• O extrato AcOEt da planta Kielmeyera rubriflora apresentou atividade
antifúngica e teve ação fungicida em concentração de 250 µg/mL para
C. albicans e 31,2 µg/mL para C. krusei.
• O extrato EtOH da planta Kielmeyera rubriflora apresentou atividade
antifúngica e teve ação fungicida em concentração de 62,5 µg/mL para
C. albicans e C. krusei.
• Várias proteínas foram alteradas em sua expressão quando C. albicans
e C. krusei foram tratadas com ambos os extratos de K. rubriflora, bem
como com fluconazol.
• Aparentemente, ambos os extratos foram mais eficientes para inibição
da expressão protéica de C. krusei, sugerindo a existência de alvos
específicos.
54
8. REFERÊNCIAS:
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