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UNIVERSIDADE FEDERAL DE OURO PRETO
NÚCLEO DE PESQUISAS EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
AVALIAÇÃO NUTRICIONAL E HIPERCOLESTEROLEMIANTE DA
“PROTEÍNA DO SORO DO LEITE” COMERCIAL
AUTOR: Fabiano Kenji Haraguchi
ORIENTADOR: Prof. Dr. Marcelo Eustáquio Silva
CO-ORIENTADOR: Profª. Drª. Maria Lucia Pedrosa
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE OURO PRETO
NÚCLEO DE PESQUISAS EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
AVALIAÇÃO NUTRICIONAL E HIPERCOLESTEROLEMIANTE DA
“PROTEÍNA DO SORO DO LEITE” COMERCIAL
AUTOR: Fabiano Kenji Haraguchi
ORIENTADOR: Prof. Dr. Marcelo Eustáquio Silva
CO-ORIENTADOR: Profª. Drª. Maria Lucia Pedrosa
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
Graduação do Núcleo de Pesquisas em Ciências
Biológicas da Universidade Federal de Ouro Preto,
como parte integrante dos requisitos para a obtenção
do título de Mestre em Ciências Biológicas, área de
concentração: Bioquímica Estrutural e Fisiológica.
Ouro Preto, 19 de Dezembro de 2007
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Sumário
RESUMO............................................................................................................................................5
1 – INTRODUÇÃO............................................................................................................................9
2 - REVISÃO DA LITERATURA...................................................................................................10
2.1 - As proteínas do soro do leite.................................................................................................10
2.2 - Avaliação do valor nutricional de proteínas.........................................................................13
2.2.1 - Coeficiente de utilização protéica (CUP)......................................................................14
2.2.2 - Razão Protéica Líquida (RPL).......................................................................................14
2.2.3 - Digestibilidade (D)........................................................................................................15
2.2.4 - Balanço Nitrogenado (BN)............................................................................................15
2.3 - Comparação entre as proteínas do soro do leite e as caseínas..............................................17
2.4 - As proteínas do soro em diversas condições fisiológicas e patológicas...............................18
2.4.1 - As proteínas do soro do leite e a nutrição esportiva....................................................18
2.4.2 – Câncer...........................................................................................................................21
2.4.3 – AIDS..............................................................................................................................22
2.4.4 - Atividade antimicrobiana e antiviral.............................................................................22
2.4.5 - Atividade Antioxidante...................................................................................................23
2.4.6 - Formação óssea.............................................................................................................
25
2.4.7 - Doenças cardiovasculares.............................................................................................26
2.4.7.1 – Obesidade...................................................................................................................26
2.4.7.2 – Hipertensão................................................................................................................28
2.4.7.3 – Dislipidemias..............................................................................................................29
3 - OBJETIVOS................................................................................................................................30
3.1 - OBJETIVO GERAL.............................................................................................................30
3.2 - OBJETIVOS ESPECÍFICOS................................................................................................31
4 - MATERIAL E MÉTODOS.........................................................................................................32
4.1 – Animais................................................................................................................................32
4.2 – Dietas....................................................................................................................................32
4
4.3 - Delineamento Experimental..................................................................................................34
4.4 - Avaliações biológicas...........................................................................................................35
4.4.1 - Coeficiente de Utilização Protéica (CUP)..................................................................... 35
4.4.2 - Razão Proteica Líquida (RPL).......................................................................................36
4.4.3 - Digestibilidade Verdadeira (DV)...................................................................................36
4.4.4 - Balanço Nitrogenado Aparente (BN
ap
)..........................................................................36
4.5 - Avaliações Bioquímicas........................................................................................................37
4.5.1 - Obtenção do Soro..........................................................................................................37
4.5.2 - Dosagens Bioquímicas...................................................................................................37
4.6 – Análise estatística.................................................................................................................38
5 - RESULTADOS...........................................................................................................................39
5.1 - Experimento 1.......................................................................................................................39
5.2 - Experimento 2.......................................................................................................................42
6 - DISCUSSÃO...............................................................................................................................45
6.1 - Experimento 1.......................................................................................................................45
6.2 - Experimento 2.......................................................................................................................49
7 – CONCLUSÕES...........................................................................................................................54
8 - REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.........................................................................................56
9 – ANEXO 1 – MANUAIS DOSAGENS BIOQUÍMICAS...........................................................66
5
RESUMO
As proteínas do soro do leite, conhecidas como whey protein, são extraídas da
porção aquosa do leite, gerada durante o processo de fabricação do queijo. Sua obtenção
envolve a separação das caseínas, que pode ser realizada por coagulação enzimática ou por
precipitação ácida da caseína. São geralmente encontradas comercialmente sob a forma de
pó em suplementos alimentares. Estudos têm relatado sua capacidade em modular respostas
orgânicas em diferentes condições metabólicas e patológicas, como câncer, AIDS e nas
dislepidemias. No que concerne à qualidade biológica desses suplementos alimentares,
poucos estudos são encontrados na literatura, sendo sua qualidade nutricional atribuída
principalmente à sua composição de aminoácidos. Seus efeitos sobre a atividade hepática e
renal de ratos hipercolesterolêmicos não são conhecidos, e os efeitos sobre o metabolismo
de lipídeos de ratos trazem resultados conflitantes.
64 ratos da linhagem Fisher foram utilizados em dois experimentos. No
experimento 1, 32 ratos Fisher recém desmamados foram divididos em 4 grupos, recebendo
as seguintes dietas: grupo C, dieta padrão; grupo PS, dieta padrão modificada, contendo as
proteínas do soro em substituição integral à caseína; dieta CP, substituição de 30% de
caseína pelas proteínas do soro; e grupo aprotéico, dieta aprotéica. A ingestão e o ganho de
peso foram monitorados semanalmente para o cálculo da “Razão Protéica Liquida” (RPL),
“Coeficiente de Utilização Protéica” (CUP), “Digestibilidade Verdadeira” (DV) e “Balanço
Nitrogenado” (BN). Após 4 semanas, o sangue dos animais foi coletado para dosagem
bioquímica e os animais sacrificados. No experimento 2, 32 ratos Fisher adultos foram
divididos em 4 grupos, recebendo as seguintes dietas: grupo C, dieta padrão (AIN-93M);
grupo H, dieta hipercolesterolemiante; grupo PS, dieta padrão e proteínas do soro; grupo
PSH dieta hipercolesterolemiante e proteínas do soro. A ingestão alimentar e o ganho de
peso foram monitorados semanalmente, e após 8 semanas, os animais foram sacrificados e
o sangue coletado para dosagem bioquímica.
Resultados do experimento 1 mostram que a dieta PS gerou valores estatisticamente
maiores de RPL, CUP e DV, assim como nas concentrações plasmáticas de albumina,
proteínas totais, colesterol total, colesterol HDL e glicose. A dieta CP não foi capaz de
6
promover tais diferenças. Encontrou-se ainda uma relação positiva entre as proteínas do
soro, colesterol HDL e atividade da paraoxonase (PON). Não foram observadas alterações
nos parâmetros bioquímicos usados para avaliar as funções hepáticas e renais em nenhum
dos grupos. No experimento 2, observamos que as proteínas do soro não reduziram o
colesterol plasmático de forma significativa. Observamos também que as proteínas do soro
promoveram um aumento na concentração plasmática de triglicérides. No entanto,
reduziram a atividade da aspartato aminotransferase e da fosfatase alcalina, assim como a
concentração plasmática de creatinina. Não observamos nenhum efeito sobre as defesas
antioxidantes avaliadas. As dietas contendo as proteínas do soro geraram também ossos
mais pesados, com maior diâmetro e comprimento que as dietas contendo caseína.
Nossos dados mostram que as proteínas do soro apresentam altos índices de
qualidade protéica. A avaliação bioquímica dos animais do experimento 1 revelou que as
proteínas do soro foram determinantes para a homeostase glicêmica no jejum prolongado,
melhorando também o perfil lipídico e a atividade da PON. No experimento2, não
observamos um efeito hipocolesterolêmico significativo em ratos, apesar de essa tendência
ter sido observada. No entanto, impediram de forma significativa a ocorrência de alterações
nos parâmetros indicadores das funções hepáticas e renais provocadas pela dieta
hipercolesterolemiante. Os dados sugerem também que as proteínas do soro afetam
positivamente a formação óssea, quando comparadas com as dietas contendo caseína.
7
ABSTRACT
The whey proteins are extracted during the process of cheese manufacturing. The
obtainment of whey protein involves its separation from caseins, what can be done by
enzymatic coagulation or by acidic precipitation of caseins. It is generally found in
commercial dietary supplements. Researches have shown its capacity in modulating
organic responses in different pathological and metabolic conditions, like cancer, AIDS
and dyslepidemia. In relation to biological quality of dietary supplements of whey protein
only a few researches are found in the literature and its nutrition quality is attributed
mainly to its amino acid composition. Its effect on hepatic and renal activities of
hypercholesterolemic rats are not know, and its effect on lipidic metabolism of rats have
produced conflicting results.
64 Fisher rats were used in two experiments. In experiment 1, 32 weaning rats were
divided in 4 groups, receiving the following diets: C group, standard diet; PS group,
modified standard diet with whey protein; CP group, modified diet with 30/70 (WP/casein);
and a protein free group. The food ingestion and weight gain were monitored weekly for
evaluation of “Net Protein Ratio” (NPR), “Protein Efficiency Ratio” (PER), “True
Digestibility” (TD) and “Nitrogen Balance” (BN). After 4 weeks, blood was collected for
biochemical analysis and the animals were killed. In experiment 2, 32 adult rats were
divided in 4 groups, receiving the following diets: C group, standard diet (AIN-93M); H
group, hypercholesterolemic diet; PS group, standard diet with whey protein; PSH group,
hypercholesterolemic diet with whey protein. Food ingestion and weight gain were
monitored weekly. After 8 weeks, blood was collected for biochemical analysis and the rats
were sacrificed.
Results of experiment 1 show that PS diet promoted significant differences for NPR,
PER and DV, as well as the hepatic synthesis of albumin, total protein, total cholesterol
and glucose. CP diet was not capable of generating these differences. A positive relation
between whey protein intake and HDL-cholesterol and paraoxonase activity was found.
Hepatic or renal dysfunctions were not observed in any groups. In experiment 2, we
observed that whey protein did not lower(ed) serum cholesterol significantly and promoted
8
an increased in serum tryglicerides. However, whey protein decreased the activity of
aspartate aminotransferase and alkaline phosphatase, as well as that of serum creatinine.
We did not observe any effect on the antioxidant activities evaluated. The diets containing
whey protein also generated heavier bones, with greater diameter and length than the
casein diets.
Our data revealed that whey protein has a high quality, as assessed by biological
methods. The biochemical evaluation of experiment 1 revealed that it was relevant for
glycemic homeostasis on prolonged fasting, improving lipid status and activity of
paraoxonase. In experiment 2, whey proteins did not show a significant
hypocholesterolemic effect in rats, although a tendency was observed. On the other hand
they prevented the occurrence of alterations in parameters indicating hepatic and renal
functions provoked by the hypercholesterolemic diet. Data also suggest that whey proteins
affect positively bone formation when compared to casein diets.
9
1 – INTRODUÇÃO
Há muito tempo sabemos que atletas e praticantes de atividades físicas ingerem
suplementos alimentares nutricionais à base de proteínas com os mais diversos objetivos,
seja com o intuito de aumentar a força, a massa muscular esquelética e mesmo o
desempenho esportivo. Desde a antiguidade, na Grécia antiga, há relatos de que atletas
faziam refeições ricas em alimentos de origem animal, pois se acreditava que o consumo
excessivo de carne estava associado a um maior desempenho esportivo (Grandjean, 1997).
Na era moderna, os primeiros suplementos alimentares comerciais de que se tem
noticia datam da década de 40, onde bebidas formuladas à base de chás e ervas tinham
como intuito aumentar os níveis de energia dos atletas (Salzano Jr, 1996). Nessa época,
começaram a surgir também os primeiros suplementos protéicos nutricionais, nos Estados
Unidos, consumidos principalmente por fisiculturistas daquele país. Os suplementos tinham
como base protéica a soja, devido a sua alta fração protéica (cerca de 90%), relativa
solubilidade e baixo custo. Com a explosão do consumo de suplementos, a indústria de
alimentos passou a explorar este grande mercado. Na década de 60, surgiram produtos
formulados com diferentes fontes protéicas, com o intuito de se conseguir um produto mais
“completo”, de maior valor biológico. Assim, vieram os suplementos à base de proteína do
ovo desidratada, conhecida como albumina, como também os primeiros produtos contendo
o leite em pó na sua formulação. A partir da década de 80, as proteínas do soro do leite, que
até então era dispensada pela indústria de alimentos, passaram a ter maior valor comercial.
O soro do leite gerado durante o processo de fabricação do queijo era desde a idade média,
destinado a criação de porcos e cabras, ou então era simplesmente descartado no meio
ambiente. No entanto, os criadores passaram a perceber que os animais que consumiam o
soro do leite cresciam fortes e resistentes a diversas infecções. Além disso, o soro quando
despejado no meio ambiente, é extremante poluente, pois este apresenta uma alta demanda
bioquímica de oxigênio (DBO) para ser degradado (Borges et al., 2001).
Evidências recentes sustentam a teoria de que as proteínas do soro do leite, além de
possuírem excelente composição de aminoácidos, possuem peptídeos bioativos, que atuam
10
modulando respostas orgânicas em diferentes situações metabólicas, como por exemplo, no
estresse oxidativo, como também em condições patológicas como câncer, hipertensão,
dislipidemias e AIDS. Apesar dessas características, algumas questões permanecem ainda
inconclusivas. A qualidade biológica dos suplementos alimentares comerciais disponíveis
para o consumo humano não é descrita. Além disso, a avaliação do seu efeito sobre vários
parâmetros bioquímicos do metabolismo de ratos pode esclarecer e elucidar futuros novos
benefícios e conseqüências advindas do seu consumo por humanos.
2 - REVISÃO DA LITERATURA
2.1 - As proteínas do soro do leite
O leite humano é o alimento de escolha para o desenvolvimento dos recém-
nascidos, satisfazendo suas necessidades nutricionais e metabólicas nos primeiros meses de
vida. Após o desmame, o leite bovino passa a ter maior significância para a nutrição
humana. Assim como na maioria dos leites de mamíferos, as proteínas do leite bovino são
compostas pelas caseínas e pelas proteínas do soro. As caseínas são as proteínas que
precipitam quando o leite é mantido a um pH de 4.6 e 20ºC, enquanto que as proteínas do
soro permanecem no soro nestas mesmas condições (Sgarbieri, 1996). A sua obtenção
envolve a separação das caseínas, que pode ser realizada por coagulação enzimática ou por
precipitação ácida da caseína, gerando o soro “doce” ou “ácido” respectivamente (Borges et
al., 2001). Esse soro, contendo proteínas, gordura, lactose e minerais é então processado
por diferentes técnicas de separação de proteínas, com o intuito de se obter um concentrado
de proteínas do soro, whey protein concentrate (WPC) ou um isolado de proteínas do soro,
whey protein isolate (WPI) com alta fração protéica. Esses concentrados e isolados
protéicos podem ser obtidos também pela separação física das micelas de caseínas por
microfiltração. Durante décadas, essa parte do leite era dispensada pela indústria de
alimentos. Em 1971, o Dr. Paavo Airola, descreveu-as como parte importante no tratamento
e prevenção de flatulências, prisão de ventre e putrefação intestinal (Salzano Jr, 1996). Seu
11
consumo faz parte do hábito alimentar de diversas culturas, povos e grupos populacionais
específicos. Na Islândia, as proteínas do soro, conhecidas como syra, são fermentadas e
estocadas em barris. Diluída em água, é uma bebida comumente consumida pela população
daqueles países (Marshal, 2004). Atletas, praticantes de atividades físicas, pessoas
fisicamente ativas e até mesmo portadores de doenças vêm procurando benefícios nesta
fonte protéica.
As proteínas do soro estão presentes em todos os tipos de leite, sendo que a proteína
do leite bovino, assim como o leite de cabra e búfala contém cerca de 80% de caseína e
20% de proteínas do soro. Este percentual pode variar em função da raça do animal, ração
fornecida, país de origem, entre outros (Salzano Jr, 1996; Marshal, 2004). No leite humano,
o percentual das proteínas do soro é modificado ao longo da lactação. No colostro as
proteínas do soro representam cerca de 80%. Com o decorrer da lactação esse percentual
diminui para 50%
(Borges et al., 2001). Essas proteínas apresentam uma estrutura globular
contendo algumas pontes de dissulfeto, que conferem à proteína certo grau de estabilidade
estrutural. Entre as principais proteínas presentes no soro do leite destacam-se a beta-
lactoglobulina (BLG), alfa-lactoalbumina (ALA), albumina do soro bovino (BSA),
imunoglobulinas (Ig`s) e glicomacropeptídeos (GMP). As sub-frações ou peptídeos
secundários das proteínas do soro são assim denominadas por se apresentarem em pequenas
concentrações no leite. Compreendem as sub-frações: lactoferrina, beta-microglobulinas,
lactoperoxidase, lisozima, lactolina, relaxina, lactofano, fatores de crescimento IGF-1,
IGF-2 e proteoses-peptonas. A BLG é o maior peptídeo do soro (45-57%); no leite bovino
representa cerca de 3,2 g/L. Apresenta médio peso molecular (18,4-36,8 kDa), o que lhe
confere resistência à ação de ácidos e enzimas proteolíticas presentes no estômago, sendo
portanto absorvida no intestino delgado. É o peptídeo que apresenta maior teor de
aminoácidos de cadeia ramificada (BCAA), com cerca de 25,1%. É uma importante
carreadora de retinol (pró vitamina A) materno para o filhote. Em humanos essa função
biológica é desprezada, uma vez que a BLG não está presente no leite humano (de Wit,
1998). Em termos quantitativos, a ALA é o segundo peptídeo do soro (15-25%) no leite
bovino e o principal do leite humano (Shannon et al., 2003). Apresenta peso molecular de
14,2 kDa e caracteriza-se por ser de fácil e rápida digestão. Contém o maior teor de
12
triptofano (6%) dentre todas as fontes protéicas alimentares, sendo também rica em lisina,
leucina, treonina e cisteína (Kinsella & Whitehead, 1989; Markus et al., 2002). A ALA é
precursora na biossíntese de lactose no tecido mamário e possui a capacidade de se ligar a
certos minerais como o cálcio e zinco, o que pode afetar positivamente sua absorção. Além
disso, a fração ALA apresenta atividade antimicrobiana contra bactérias patogênicas, como
por exemplo, Escherichia coli, Staphylococcus aureus e Klebsiella pneumoniae (Lönnerdal,
2003). A BSA corresponde à cerca de 10% das proteínas do soro do leite. É um peptídeo de
alto peso molecular (66 kD), rico em cisteína (aproximadamente 6%). É um importante
precursor da síntese de glutationa. Possui afinidade por ácidos graxos livres e outros
lipídeos, favorecendo seu transporte na corrente sangüínea (Kinsella & Whitehead, 1989;
de Wit, 1998). As Ig’s são proteínas de alto peso molecular (150 -1.000 kDa). Quatro das
cinco classes das Ig’s estão presentes no leite bovino (IgG, IgA, IgM e IgE), sendo a IgG a
principal, constituindo cerca de 80% do total. No leite humano, a IgA constitui a principal
imunoglobulina (> 90%). Suas principais ações biológicas residem na imunidade passiva e
atividade antioxidante (de Wit, 1998; Ha & Zemel, 2003). O GMP (6,7 kDa) é um peptídeo
resistente ao calor, digestão assim como a mudanças de pH. Curiosamente, muitos autores
não descrevem o GMP como um peptídeo do soro. Na verdade, o GMP é um peptídeo
derivado da digestão da caseína-kapa, pela ação da quimosina durante a coagulação do
queijo. Essa fração está presente em um tipo de proteína do soro conhecida como whey
rennet (Etzel, 2004). Apresenta alta carga negativa, que favorece a absorção de minerais
pelo epitélio intestinal (Shannon et al., 2003). Assim como a fração BLG, apresenta alto
teor de aminoácidos essenciais (47%).
A produção e a utilização mundial de concentrados e isolados protéicos do soro do
leite vêm crescendo muito ao longo dos anos. Os Estados Unidos estão entre os maiores
produtores mundiais, com uma produção anual que representa cerca de 25% de toda a
produção mundial. Na última década, a exportação de concentrados protéicos do soro do
leite (WPC) pelos EUA cresceu cerca de 800%. Em 2006, a produção norte-americana de
proteínas do soro do leite e seus subprodutos atingiram 935 mil toneladas (U.S. Dairy
Export Council and USDA, 2007). Além da sua utilização para a produção de suplementos
protéicos alimentares, as proteínas do soro são extensivamente utilizadas pela indústria de
13
alimentos, na produção de fórmulas infantis, panificação, embutidos, sorveteria e bebidas
(Kinsela & Whitehead, 1989; U.S. Dairy Export Council and USDA, 2007). No Brasil,
dados do Anuário da Pecuária Brasileira (Anualpec), revelam que em 2002, a produção
nacional foi estimada em 470 mil toneladas (Nakamae, 2004). Entretanto
,a maioria do soro
gerado é indevidamente descartado. Uma pequena proporção é usada para nutrição animal,
enquanto outro pequeno percentual é secado por algumas indústrias, porém sem a completa
concentração das proteínas. A produção de bebidas lácteas é uma das principais opções de
aproveitamento do soro do leite no Brasil, sendo que as mais comercializadas são as
bebidas fermentadas, com características sensoriais semelhantes ao iogurte, e bebidas
lácteas não-fermentadas. Contudo, o aproveitamento desse subproduto atinge apenas 15%
do total de soro produzido (Neves, 2001).
No que concerne ao seu valor nutricional, diversos autores destacam a sua
composição de aminoácidos, apresentando alto percentual de aminoácidos essenciais e
principalmente dos de cadeia ramificada (Salzano Jr, 1996; Etzel, 2004; Ha & Zemel,
2003). Dados sobre a avaliação biológica das proteínas do soro são escassos (Gilani &
Sepehr, 2003; Borges et al., 2001), não sendo conhecidos no entanto, dados da avaliação
biológica de produtos comerciais composto por essas proteínas.
2.2 - Avaliação do valor nutricional de proteínas
O valor nutricional de uma proteína é determinado em primeiro lugar pela sua
composição de aminoácidos. No entanto, este potencial pode não ser real se a proteína não
for digerida completamente, ou se algum de seus aminoácidos não for totalmente
disponível ao organismo. Portanto, para se determinar qualidade real de uma proteína é
imprescindível a avaliação biológica. No início do século XX, várias técnicas foram
desenvolvidas para a avaliação biológica de proteínas, baseadas no balanço de nitrogênio e
no crescimento de ratos. Entretanto, até 1940, as técnicas analíticas não estavam
suficientemente adiantadas, para que os dados fossem usados na predição da qualidade da
proteína. Os métodos utilizados para medir a qualidade de uma proteína procuram
14
quantificar quão boa ela é para fins de síntese protéica. A proteína sintetizada pelo
organismo destina-se ao crescimento, manutenção, reparação e reprodução.
2.2.1 - Coeficiente de utilização protéica (CUP)
O método mais simples para se avaliar a qualidade nutricional de uma proteína é a
medida da taxa de crescimento de animais jovens alimentados com uma dieta-teste. O CUP
se baseia na relação entre o ganho de peso pela quantidade de proteína ingerida. Apesar de
ser o procedimento mais conhecido para se avaliar a qualidade de uma proteína, apresenta a
desvantagem de seus valores não serem proporcionais, isto é, um valor igual a 2 não é duas
vezes melhor que um valor igual a 1. Além disso, nem o sempre o aumento de peso reflete
diretamente a incorporação de proteínas, e fatores que influenciam a ingestão total de
alimentos aumentam a variabilidade da estimativa desse índice, reduzindo a capacidade de
discriminação das proteínas (Pellet & Young, 1980).
2.2.2 - Razão Protéica Líquida (RPL)
Tendo em vista que nem sempre o aumento de peso reflete diretamente a
incorporação de proteína, tentou-se melhorar a informação acerca da qualidade das
proteínas, introduzindo-se outro método, que consiste também em medir as variações de
peso corporal considerando porém, o peso que o animal teria perdido se não tivesse
ingerido a proteína, usando para tal fim um grupo controle recebendo dieta aprotéica. Ou
seja, calcula-se a eficiência da proteína ingerida em “manter” e “aumentar” o peso corporal
(de Angelis, 1995).
15
2.2.3 - Digestibilidade (D)
A digestibilidade é a medida do porcentual de proteína ingerida que é digerida e
efetivamente absorvida no trato gastrointestinal e, portanto, oferecido aos tecidos sob a
forma de aminoácidos, ou seja, é um método que avalia a qualidade de uma proteína
baseado na retenção do nitrogênio. A parte não digerida é, naturalmente, eliminada nas
fezes. É um dos fatores que afetam a qualidade nutricional da proteína, pois está
diretamente relacionada à disponibilidade de aminoácidos ao organismo (Pellet, 1978),
sendo portanto considerada um indicador de sua qualidade. Assim, por exemplo, sabe-se
que os alimentos de origem animal apresentam maior digestibilidade que os de origem
vegetal. Tal fato tem sido atribuído a um menor conteúdo de fibra crua dos alimentos de
origem animal, fazendo com que a velocidade de trânsito pelo intestino seja mais lenta e,
conseqüentemente, se obtendo maior absorção de nutrientes. Além disso, a estrutura
terciária de proteínas animais é menos complexa, fazendo com que sejam mais facilmente
digeridas pelas enzimas intestinais. Outros fatores que diminuem a digestibilidade dos
alimentos de origem vegetal são alguns elementos tóxicos, como os inibidores de proteases,
taninos e hemaglutininas (Hernandez et al., 1984). Em ensaios biológicos, a digestibilidade
relaciona o nitrogênio absorvido com a ingestão de nitrogênio pelo animal. Pode-se
determinar a digestibilidade verdadeira ou a digestibilidade aparente. Nessa última, não se
considera o nitrogênio metabólico, ou seja, aquele que é excretado nas fezes dos animais
alimentados com a dieta aproteica (Pellet, 1978).
2.2.4 - Balanço Nitrogenado (BN)
O balanço nitrogenado é um método que permanece como alternativa primária para
se determinar requerimentos de proteína e determinar a qualidade de alimentos protéicos. O
valor biológico usa técnica de balanço nitrogenado para determinar a fração de nitrogênio
absorvido retido no organismo para crescimento e manutenção. O balanço nitrogenado
mede a quantidade de nitrogênio ingerida na dieta e a quantidade excretada nas fezes e
16
urina (Pellet & Young, 1980). Muitas vezes a mensuração do nitrogênio excretado na urina
pode ser desprezada, determinando-se assim apenas o BN aparente.
A aplicação das técnicas de avaliação biológica de proteínas tem revelado a
importância de diversas proteínas presentes na nutrição humana. Entre os métodos
descritos, o CUP é o método padrão adotado pela AOAC (1975) e é atualmente utilizado na
legislação de rotulagem de alimentos nos Estados Unidos (Pellet & Young, 1980). Como
conseqüência, este método tem sido um dos mais utilizados em todo mundo. No Brasil,
diversos autores utilizam o CUP como também o RPL, não havendo portanto um método
oficial (Miura et al., 2001; de Paula et al., 2004; Costa et al., 1990).
A caseína apresenta excelentes índices de CUP, RPL e de D, demonstrando ser uma
proteína de alto valor biológico, amplamente utilizada como proteína de referência para
estudos de análise da qualidade protéica (de Angelis, 1981; Chávez & Pellet, 1982).
Entretanto, a qualidade biológica das proteínas do soro raramente é encontrada na literatura.
Gilani & Sepehr (2003) encontraram valores estatisticamente semelhantes de D da caseína
e das proteínas do soro, assim como na digestibilidade corrigida pelo escore aminoacídico
(PDCAAS). McDonough. et al. (1976) observaram que o concentrado de proteínas do soro
(WPC) apresenta maior CUP que o leite em pó desnatado. Borges et al. (2001) não
observaram diferenças significativas no RPL e CUP de um concentrado de proteínas do
soro não comercial, quando comparado à caseína. Apesar das diferenças e semelhanças
encontradas por esses autores, a proteína do soro do leite utilizada nesses estudos não se
destina ao consumo final. São obtidas em laboratórios próprios, destinada apenas para
experimentos. A qualidade biológica de suplementos protéicos comerciais compostos pelas
proteínas do soro do leite disponíveis para o consumo humano não é descrita na literatura.
Portanto, sua avaliação biológica torna-se necessária, pois o conhecimento do seu real
potencial para fins de crescimento e síntese protéica e de suas diferenças em relação a
proteínas de referência, como a caseína, pode corroborar com o que é descrito na literatura
assim como elucidar possíveis novos benefícios e conseqüências advindos de seu consumo.
17
2.3 - Comparação entre as proteínas do soro do leite e as caseínas.
O conceito de proteínas de metabolização rápida e lenta surgiu em 1997, a partir das
pesquisas de Boirie et al. (1997). Segundo esses autores, as proteínas apresentam diferenças
nas velocidades de digestão, absorção e portanto na utilização pelo organismo. As proteínas
do soro de leite se caracterizam por serem rapidamente digeríveis e absorvidas, enquanto
que as caseínas contêm uma grande quantidade de α-caseína, uma fração que não é
facilmente digerida por seres humanos. A rápida digestão das proteínas do soro promove
um aumento na concentração plasmática de aminoácidos essenciais de maneira rápida e
aguda, atingindo um pico máximo em torno de 60 minutos após a ingestão. Esse aumento
agudo dos aminoácidos essenciais, em especial da leucina, é o principal estimulo para
síntese global de proteínas (Anthony et al., 2001). Entretanto, esse aumento agudo na
concentração de aminoácidos é acompanhado também por um aumento da sua oxidação,
enquanto que as caseínas promovem uma deposição protéica por inibição do catabolismo
protéico, sem um excessivo aumento na concentração plasmática e oxidação de
aminoácidos. Portanto, as proteínas do soro poderiam ser muito adequadas em situações de
estresses metabólicos em que a reposição de proteínas no organismo se torna emergencial
(Sgarbieri, 2004; Dangin et al., 2001).
A composição de aminoácidos das proteínas do soro difere da caseína em aspectos
que afetam processos metabólicos e fisiológicos. As proteínas do soro são conhecidas pelo
alto teor de aminoácidos essenciais, principalmente os de cadeira ramificada (BCAA).
Apresentam em média 25% mais BCAA que a caseína comercial, além de apresentar teores
mais elevados dos aminoácidos treonina, aminoácidos sulfurados (metionina + cisteína),
lisina e triptofano, apresentando no entanto, teores mais baixos dos aminoácidos de cadeias
aromáticas (fenilalanina + tirosina) (Borges et al., 2001). A oxidação dos aminoácidos de
conhecido potencial gliconeogênico, assim como os de cadeia ramificada, pode afetar o
processo de regulação da homeostase glicêmica (Layman, 2003).
Apesar das diferenças na composição de aminoácidos e velocidade de absorção
dessas proteínas, é pela presença dos peptídeos com propriedades bioativas que as proteínas
18
do soro diferem das caseínas. A presença dos principais peptídeos, assim como das
subfrações, confere às proteínas do soro diferentes propriedades fisiológicas-funcionais
(Sgarbieri, 2004; Ha & Zemel, 2003).
2.4 - As proteínas do soro em diversas condições fisiológicas e patológicas
2.4.1 - As proteínas do soro do leite e a nutrição esportiva
Os suplementos protéicos alimentares mais procurados e utilizados atualmente são
aqueles compostos pelas proteínas do soro do leite. Pesquisas recentes têm demonstrado
sua grande aplicabilidade no esporte, com possíveis efeitos sobre a síntese protéica
muscular esquelética, redução da gordura corporal e melhora do desempenho físico (Lands
et al., 1999; Burke et al., 2001; Ha & Zemel, 2003; Haraguchi et al., 2006).
Existem diferentes vias pelas quais as proteínas do soro favorecem a hipertrofia
muscular e o ganho de força, otimizando dessa forma o treinamento e o desempenho físico.
Sabe-se que a diminuição da massa muscular esquelética está associada à idade e à
inatividade física. Já está suficientemente comprovado que a manutenção ou ganho de
massa muscular esquelética, principalmente em pessoas idosas, contribui para uma melhor
qualidade e prolongamento da vida. Exercícios físicos, principalmente os resistidos com
pesos, são de extrema importância para impedir a atrofia e favorecer o processo de
hipertrofia muscular (Phillips et al., 1999; Yarasheski
et al.,1999; Hasten
et al., 2000),
melhorando assim a qualidade de vida dos indivíduos. Neste contexto, a nutrição exerce
papel fundamental. Pessoas fisicamente ativas e atletas necessitam de maior quantidade
protéica que as estabelecidas para indivíduos sedentários. Segundo Lemon (1998), pessoas
envolvidas em treinos de resistência necessitam de 1,2 a 1,4 g de proteína por quilograma
de peso ao dia, enquanto que atletas de força, 1,6 a 1,7 g.kg
-1
.dia
-1
, bem superior às 0,8-1,0
g.kg
-1
.dia
-1
estabelecidas para indivíduos sedentários. A ingestão de proteína ou
aminoácidos após exercícios físicos favorece a recuperação e a síntese protéica muscular
(Lemon, 1998; Ivy et al., 2002). Além disso, quanto menor o intervalo entre o término do
19
exercício e a ingestão protéica, melhor será a resposta anabólica ao exercício (Esmarck et
al., 2001). A quantidade e o tipo de proteína ou aminoácidos fornecidos após o exercício
influenciam a síntese protéica (Wolfe, 2000). Estudos têm mostrado que somente os
aminoácidos essenciais, especialmente a leucina, são necessários para estimular a síntese
protéica (Kimbal 2002; Anthony et al., 2001). van Loon et al.( 2000) demonstraram que a
ingestão de uma solução contendo proteínas do soro e carboidratos aumentou
significantemente as concentrações plasmáticas de 7 aminoácidos essenciais, incluindo a
leucina, quando comparado à caseína. Anthony et al. (2001) sugerem que a leucina
participe no processo de iniciação da ativação da síntese protéica. Segundo os autores, a
leucina tem um papel fundamental no processo de fosforilação de proteínas envolvidas na
formação do complexo do fator de iniciação eucariótico 4F (eIF4F), que por sua vez inicia
a tradução do RNA mensageiro (RNAm) para a síntese global de proteínas. A leucina atua
também na cascata de reações que promove a fosforilação da proteína S6 cinase ribossomal
(S6K1), que ativa a tradução de proteínas envolvidas no aparato de síntese protéica. Por ser
considerada uma proteína de metabolização rápida, essa rápida absorção faz com que as
concentrações plasmáticas de muitos aminoácidos, inclusive a leucina, atinjam altos valores
logo após a sua ingestão (Dangin et al., 2001), favorecendo desta forma, o anabolismo
muscular. Ha & Zamel (2003) destacam que o perfil de aminoácidos das proteínas do soro é
muito similar ao do músculo esquelético, fornecendo quase todos os aminoácidos em
proporção similar às do mesmo, classificando-a como um efetivo suplemento anabólico.
Estudos sugerem que o estresse oxidativo causado pelos agentes oxidantes
produzidos durante a atividade física contribui para o desenvolvimento da fadiga muscular
(Pedersen & Hoffman-Goetz, 2000), diminuindo assim o desempenho. Sabe-se também que
a glutationa é o principal agente antioxidante intracelular, o qual é dependente da
concentração intracelular do aminoácido cisteína para ser sintetizado. Lands et al. (1999)
compararam o efeito de um suplemento à base de proteínas concentradas do soro (WPC) e
da caseína (placebo) sobre o desempenho físico de adultos jovens, medido através de um
teste isocinético em bicicletas. Administrando 20 g/dia de WPC durante três meses, o grupo
suplementado com WPC apresentou um aumento de 35,5% na concentração de glutationa.
Além disso, os voluntários suplementados conseguiram gerar mais potência e maior
20
quantidade de trabalho em testes de velocidade, sugerindo melhor rendimento. O provável
efeito estaria relacionado ao alto teor de cisteína presente nas proteínas do soro, o que
resultaria em um aumento da concentração de glutationa, diminuindo desta forma a
disfunção muscular causada pelos agentes oxidantes. Este foi o primeiro trabalho
relacionando os efeitos das proteínas do soro aos parâmetros diretos do desempenho físico.
As proteínas do soro apresentam também um alto potencial insulinotrópico. Além
de aumentar as concentrações plasmáticas de aminoácidos, a ingestão de soluções contendo
as proteínas do soro aumenta significativamente a concentração de insulina plasmática
(Zawadzki et al., 1992; Calbet & Maclean, 2002), favorecendo desta forma a captação de
aminoácidos para o interior da célula muscular, otimizando a síntese e reduzindo o
catabolismo protéico. Calbet & MacLean (2002) avaliaram o efeito de quatro diferentes
soluções, uma contendo somente 25 g/L de glicose (C) e três contendo 25 g/L de glicose e
0,25 g/kg de peso corporal de três diferentes fontes protéicas: ervilhas (E), proteínas do
soro (W) e leite integral (L) sobre as concentrações de insulina e aminoácidos. Observaram
que, após 20 minutos da ingestão, a solução contendo as proteínas do soro provocou
elevação na concentração plasmática de insulina de forma significante (p<0,05). Essa
elevação foi aproximadamente duas vezes maior que a observada com a solução contendo
leite integral (615±104 pmol/L e 388±51 pmol/L para W e L, respectivamente) e quatro
vezes maior que a solução contendo somente glicose (C) (615±104 pmol/L e 208±53
pmol/L para W e C respectivamente). Após 80 minutos, a concentração de insulina em
todos os grupos voltou aos valores iniciais. Observaram também que, após 20 minutos, a
solução W provocou uma maior elevação na concentração plasmática de aminoácidos
essenciais (738±75 µmol/L para 1.586±178 µmol/L), principalmente os BCAA, do que as
outras soluções. O aumento na concentração de BCAA induzida pelas proteínas do soro
pode atuar também inibindo a degradação protéica muscular (Werustsky, 1995).
Resumindo, seus benefícios sobre o ganho de massa muscular estão relacionados ao
perfil de aminoácidos, principalmente da leucina (um importante desencadeador da síntese
protéica), à rápida absorção intestinal de seus aminoácidos e peptídeos e a sua ação sobre a
liberação de hormônios anabólicos, como por exemplo, a insulina.
21
2.4.2 – Câncer
Diversas pesquisas têm demonstrado que os concentrados de proteínas do soro
(WPC) apresentam atividade anticâncer em modelos animais e em culturas de células
(Marshal, 2004). Esses efeitos estão relacionados ao alto teor de aminoácidos precursores
da glutationa, em especial a cisteína (Bounous, 2000). Segundo o autor, essa
disponibilidade de precursores da glutationa pode aumentar sua concentração, estimulando
a imunidade e detoxificando possíveis agentes cancerígenos. A capacidade de ligação ao
ferro de peptídeos como a lactoferrina e beta-lactoglobulina parece contribuir para este
potencial, uma vez que o ferro pode agir como um agente mutagênico, causando danos
oxidativos em diferentes tecidos (Weinberg, 1996).
Avaliando o efeito das caseínas e das proteínas do soro em ratos submetidos a
injeções de azoxymetano, indutor de câncer de cólon, Hakkak et al. (2001) observaram que
os animais alimentados com dietas à base de caseína apresentaram uma incidência de 56%
de câncer de cólon, enquanto que em ratos alimentados com as proteínas do soro, a
incidência foi de 30%. Observaram também que essa incidência estava inversamente
relacionada ao tempo de consumo das dietas contendo as proteínas do soro. Kent et al.
(2003) demonstraram in vitro que um isolado de proteínas do soro (WPI) foi capaz de
proteger células da próstata humana contra a morte celular induzida por agentes oxidantes.
Em ambos os trabalhos, os autores associaram estes efeitos a maior síntese de glutationa
induzida pelas proteínas do soro. Segundo McIntosh et al. (2001), as frações lactoferrina e
beta-lactoglobulina, quando adicionadas a dieta de soja apresentaram efeito inibidor de
lesões cancerígenas tão eficientemente ao WPC.
22
2.4.3 – AIDS
Uma das principais propriedades funcionais das proteínas do soro está na sua
capacidade em aumentar as concentrações de glutationa (Bounous, 2000) no baço, fígado e
em outros órgãos (Sgarbieri, 2004). Sua deficiência é o problema mais comum encontrado
em indivíduos infectados pelo vírus HIV. Neste sentido, diversas pesquisas têm avaliado a
capacidade das proteínas soro em aumentar a disponibilidade de cisteína e
consequentemente de glutationa em pacientes HIV positivos (Micke et al., 2002; Agin et
al., 2001; Moreno et al., 2005). Micke et al. (2002) observaram que a administração
aleatória de 45g de proteínas do soro em 30 indivíduos portadores de HIV por 6 meses,
promoveu aumento na concentração de glutationa após 2 semanas, permanecendo elevada
após os 6 meses de estudo. Em um estudo prospectivo, randomizado realizado com 30
mulheres HIV positivas, submetidas a sessões de exercício, Agin et al. (2001) observaram
que a suplementação com as proteínas do soro (1g/Kg dia) promoveu aumento da massa
muscular esquelética e a qualidade de vida dessas pacientes. No estudo de Moreno et al.
(2005), os autores realizam um ensaio clinico duplo-cego com 18 crianças HIV positivas
por 4 meses. Observaram que a administração de WPC, em doses iniciais de 20% da
recomendação diária de proteína (RDA), atingindo 30% após 3 meses e 50% ao final do
estudo, promoveu aumento significativo na concentração de glutationa e uma tendência em
aumentar a razão de células linfocitárias T CD4
+
/CD8
+
, diminuindo assim a ocorrência de
infecções agudas oportunistas.
2.4.4 - Atividade antimicrobiana e antiviral
Alguns dos diferentes peptídeos bioativos presentes nas proteínas do soro
apresentam atividades antimicrobiana e antiviral. Além das imunoglobulinas, os WPC e
WPI encontrados no mercado para o consumo geralmente são enriquecidos com L-
glutamina, um aminoácido que pode ser considerado como condicionalmente essencial em
situações metabólicas específicas (Ha & Zemel 2003). Atividade antimicrobiana e antiviral
23
também tem sido demonstrada pelos peptídeos lactoferrina, lactoferricina, lisozima, alfa-
lactoalbumina (ALA) e beta-lactoglobulinas (BLG). Esses peptídeos demonstram
forte atividade antimicrobiana em estudos com animais e em cultura de células, fornecendo
proteção contra diversos vírus e bactérias, incluindo Escherichia coli, Salmonela
typhimurium, Shigella dysinteriae, Lysteria monocytogenes, Bacillus stearothermophilus,
Bacillus subtilis, Micrococcus luteus e Helicobacter pylori (Ikeda et al. 1998; Batish et al.,
1998; Saito et al., 1991; Di Mario et al., 2003; Pacheco et al., 2006).
Avaliando o efeito de um hidrolisado de proteínas do soro na proteção contra o
processo ulcerativo induzido pela indometacina e etanol, Pacheco et al. (2006) observaram
que o hidrolisado administrado em dose única resultou em 65,5% de redução dos índices de
lesão ulcerativa do epitélio da mucosa do estômago de ratos Wistar adultos, e em 77,4%
quando administrado em dose dupla. Em um estudo com pacientes portadores de infecção
por H. pylori, Di Mario et al. (2003) observaram que a administração de 200mg de
lactoferrina encapsulada concomitante a terapia tradicional contra H. pylori promoveu uma
taxa de cura de 100%, enquanto que a terapia tradicional com antibióticos gerou uma taxa
de 76,9% de cura.
2.4.5 - Atividade Antioxidante
A produção de espécies reativas de oxigênio (ERO), entre outras espécies reativas, é
parte integrante do metabolismo e é exacerbada em diversas condições fisiológicas. O
exercício físico, tabaco e fatores dietéticos são importantes causas na produção exacerbada
das ERO. Tem sido relatado que a hiperlipidemia e a hipercolesterolemia aumentam o
estresse oxidativo, resultado do desequilíbrio entre o sistema pró e antioxidante, com o
predomínio dos oxidantes (Ohara et al.,1993; Ceriello et al., 2004). Diversos constituintes
alimentares apresentam capacidade antioxidante, incluindo vitaminas, compostos fenólicos,
peptídeos bioativos, entre outros. Esses compostos seqüestram substâncias potencialmente
oxidativas, ou ativam a síntese de substâncias antioxidantes celulares, destruindo e
diminuindo a produção das ERO. Dentre as substâncias celulares potencialmente
24
antioxidantes, destacam-se a glutationa e a lipoproteína de alta densidade (HDL). A
glutationa é um tripeptídeo (L-γ-glutamil-L-cisteinil-glicina) que apresenta pelo menos
90% do total dos grupos sulfirilas na forma livre, não protéica, sendo encontrada em
praticamente todas as células aeróbias (Sem, 1995). O alto teor de do aminoácido cisteína
das proteínas do soro, além das repetidas seqüências glutamil-cistina na seqüência primária
dessas proteínas, geradas na sua digestão e absorvidas como tal (Sgarbieri, 2004),
favorecem a produção de glutationa. A lactoferrina e a lactoferricina, dois peptídeos
presentes nas proteínas do soro podem funcionar também como antioxidantes, via suas
capacidades de ligação ao ferro. A lactoferrina em seu estado nativo está apenas
parcialmente saturada (8-30%), uma condição que permite a quelação do ferro e
conseqüentemente inibição do crescimento bacteriano ou de reações oxidativas (Ha &
Zemel, 2003).
A lipoproteina de alta densidade (HDL) faz parte da família das lipoproteínas. São
caracterizadas por serem ricas em proteínas e relativamente pobres em colesterol.
Apresenta atividade anti-aterosclerótica em modelos animais (Barter et al., 2003), através
de sua atividade no transporte reverso do colesterol. Além disso, apresenta capacidade em
inibir a oxidação e a inflamação de células arteriais. A atividade antioxidante dessa
lipoproteína se deve principalmente a presença da paraoxonase (PON), uma enzima que se
encontra associada a esta lipoproteina. A PON apresenta habilidade em hidrolisar
compostos organofosforados tóxicos, e sua denominação deriva de um organofosforado
comumente conhecido, o paraoxon (Aviram, 2004). A PON retarda a oxidação da
lipoproteina LDL hidrolisando fosfolipídios oxidados e destruindo moléculas inflamatórias
envolvidas na progressão de lesões ateroscleróticas (Rantala et al., 2002). A associação da
PON com o HDL é um pré-requisito para sua atividade normal. O HDL atua como um
receptor fisiológico, estimulando sua secreção e estabilizando-a. Fatores fisiológicos, como
o exercício, patológicos, como infecções virais e bacterianas, inflamação e diabetes afetam
a atividade da PON (Aviram, 2004). Fatores dietéticos são também potentes moduladores.
Dietas ricas em gorduras reduzem sua atividade (Thomàs-Moyà et al., 2007), enquanto que
antioxidantes nutricionais, como os polifenóis aumentam a expressão e a atividade da PON
(Aviram & Rosenblat, 2005).
25
A atividade antioxidante conferida às proteínas do soro do leite se deve
principalmente na sua capacidade em aumentar a concentração de glutationa (Sgarbieri,
2004; Há & Zemel 2003). Alguns estudos mostram que as proteínas do soro melhoram
parâmetros bioquímicos do perfil lipídico, afetando positivamente a concentração do
colesterol HDL (Kawase et al., 2000). Entretanto, relações entre as proteínas do soro e a
atividade da PON não são descritas na literatura. A investigação dessa relação pode
elucidar novos mecanismos pelo qual as proteínas do soro afetam a atividade antioxidante
celular.
2.4.6 - Formação óssea
A característica do leite em favorecer o desenvolvimento e a prevenção de doenças
ósseas está no seu conteúdo de cálcio. Entretanto, pesquisas têm revelado que além do
cálcio, a presença de peptídeos presentes no leite é responsável por esse efeito protetor dos
ossos. As proteínas do soro contêm um componente conhecido como proteína básica do
leite (milk basic protein – MBP). O MBP é preparado a partir do fracionamento das
proteínas do soro, através de uma resina de troca catiônica. Contém mais de 98% de
proteína, e peptídeos como a lactoferrina, lactoperoxidase e outros componentes menores
(Marshal, 2004). Diversos estudos in vitro e com animais mostram que o MBP possui a
habilidade de estimular a proliferação e a diferenciação de células osteoblásticas, assim
como suprimir a reabsorção óssea (Takada et al., 1996; Toba et al., 2000; Aoe et al.,2001 ),
afetando desta forma a formação óssea. Takada et al.,(1996) observaram que as proteínas
do soro apresentaram a habilidade em aumentar a resistência do osso femoral de ratos
ovarioectomizados. Mais recentemente, Yamamura et al. (2002) conduziram um estudo
duplo cego com 30 mulheres durante um período de 6 meses. Resultados indicaram que
uma dose diária de 40mg de MBP aumentou significativamente a densidade óssea.
Os efeitos das proteínas do soro sobre o desenvolvimento ósseo foram conduzidos
utilizando-se o MBP. Dados referentes aos efeitos dos WPC WPI, principalmente os
comerciais, disponíveis para o consumo humano não são descritos. Parâmetros
26
morfométricos como comprimento, peso e diâmetro podem ser usados com indicadores do
desenvolvimento ósseo em ratos (Souza et al.,2007). Neste sentido a avaliação do efeito das
proteínas do soro do leite comercial sobre tais parâmetros pode revelar sua eficácia, assim
como do MBP em promover o desenvolvimento ósseo de ratos.
2.4.7 - Doenças cardiovasculares
O efeito terapêutico ou preventivo de diversos alimentos ou constituintes
alimentares sobre as doenças cardiovasculares (DCV) pode estar associado à cura ou
prevenção de outras patologias primárias, desencadeadoras das DCV, como por exemplo
obesidade, hipertensão, dislipidemias, etc. Neste contexto, diversos trabalhos têm mostrado
que as proteínas do soro podem atuar de diversas formas, diminuindo o risco de
aparecimento das DCV.
2.4.7.1 – Obesidade
Vários trabalhos têm mostrado que as proteínas do soro favorecem o processo de
redução da gordura corporal, através de mecanismos associados ao cálcio e por apresentar
altas concentrações de BCAA. As proteínas do soro são ricas em cálcio (aproximadamente
600 mg/100g). Estudos epidemiológicos têm verificado uma relação inversa entre a
ingestão de cálcio proveniente do leite e seus derivados e a gordura corporal (Zemel, 2004).
Um provável mecanismo de ação seria de que o aumento no cálcio dietético reduz as
concentrações dos hormônios calcitrópicos, principalmente o 1,25 hidroxicolecalciferol
(1,25(OH)2D), que por sua vez inibe (feedback negativo) a transferência de cálcio para os
adipócitos. Nos adipócitos, baixas concentrações de cálcio levam a redução da lipogênese
(síntese de novo) e um aumento da lipólise. Esse processo pode ajudar a diminuir a
deposição de gordura nos tecidos adiposos. As proteínas do soro poderiam oferecer uma
vantagem sobre o leite como fonte de cálcio em pessoas intolerantes à lactose, uma vez que
27
grande parte dos suplementos à base de proteínas do soro é praticamente isenta de lactose, e
pelo fato desta proteína apresentar percentual de gordura menor que 2%.
Estudos têm mostrado que o alto teor de BCAA presente nas proteínas do soro afeta
os processos metabólicos da regulação energética, favorecendo o controle e a redução da
gordura corporal. Em uma série de estudos, Layman (2003), Layman & Baum (2004) e
Layman et al. (2003) mostraram que dietas com maior relação proteína/carboidratos são
mais eficientes para o controle da glicemia e da insulina pós prandial, favorecendo desta
forma, a redução da gordura corporal e a preservação da massa muscular durante a perda de
peso. Os BCAA contribuem para a homeostase glicêmica, pois esses aminoácidos são
degradados nos tecidos musculares em proporção relativa à sua ingestão. Essa degradação
aumenta as concentrações plasmáticas dos aminoácidos alanina e glutamina, que são
transportadas para o fígado para a produção de glicose (gliconeogênese). Estudos sugerem
que o ciclo alanina-glicose contribui em até 40% com a glicose endógena produzida
durante o exercício e em até 70% depois de um jejum noturno, estabilizando desta forma a
glicemia em períodos de jejum, e reduzindo a resposta da insulina após as refeições
(Layman, 2003). Por elevar as concentrações plasmáticas de BCAA (Esmarck et al., 2001)
a utilização de proteínas do soro nesses tipos de dietas seria vantajosa por reduzir a
liberação de insulina pós prandial e maximizar a ação do fígado no controle da glicemia,
através da gliconeogênese hepática. Além disso, pelo fato da leucina atuar nos processos de
síntese protéica, altas concentrações desse aminoácido favorecem a manutenção da massa
muscular durante a perda de peso (Layman, 2003).
Para avaliar tais hipóteses, Layman et al. (2003), submeteram mulheres obesas
(>15% do peso ideal) a dois tipos de dietas isocalóricas. Um grupo (Protéico) recebeu dieta
com 1,5 g.kg
-1
.dia
-1
de proteína, com 22,3 g/dia de BCAA, sendo 9,9 g/dia de leucina, 40%
das energias provenientes de carboidratos e 30% de lipídeos. O outro grupo (Controle)
recebeu dieta contendo 0,8 g.kg
-1
.dia
-1
de proteína, com 12,3 g/dia de BCAA, sendo 5,4
g/dia de leucina, 55% das energias provenientes de carboidratos e 30% de lipídeos. Todos
os voluntários foram precisamente controlados quanto à ingestão das dietas e a realização
de exercícios. Após 10 semanas, os autores observaram que o grupo Protéico apresentou
valores estatisticamente maiores de glicose em jejum e menores valores de glicose pós
28
prandial. A dieta protéica gerou também melhor controle da insulina pós prandial, com
valores estatisticamente menores (p<0,05). Em outro estudo com o mesmo grupo de
mulheres e aplicando os mesmos tipos de dietas, Layman (2003) observou que, após 16
semanas, a dieta protéica ocasionou uma perda significante de peso, gordura corporal e
resultou uma menor perda de massa magra (p<0,05). Em um estudo anterior realizado com
ratos, Bouthegourd et al. (2002) observaram que refeições pré-exercício contendo as
proteínas do soro enriquecidas com a fração ALA foram mais eficientes para a manutenção
da massa muscular na perda de peso e mantinham uma alta taxa de oxidação lipídica
durante o exercício similar às taxas observadas quando o exercício era realizado em jejum.
Os autores sugerem que a captação intestinal e a composição de aminoácidos da proteína
tiveram papel decisivo nos resultados observados. Porém os mecanismos de ação não
tinham sido esclarecidos. Possivelmente a leucina e os outros BCAA tiveram efeito similiar
aos observados no estudo de Layman (2003) e Layman et al.(2003).
A colecistoquinina (CCK) e o peptídeo similar ao glucagon (GLP-1) são dois
hormônios intestinais e sua liberação na corrente sanguínea ocorre em presença de
macronutrientes no duodeno, produzindo efeito supressor do apetite (Hall et al., 2003).
Comparando as duas proteínas do leite, caseína e as proteínas do soro, Hall et al. (2003)
estudaram seus efeitos sobre o apetite, percepção de fome, saciedade e hormônios
gastrointestinais. Observaram que, quando os voluntários ingeriam uma solução contendo
48 g de proteínas do soro 90 minutos antes da refeição, apresentavam uma redução
significativa do apetite, da ingestão calórica e aumento da saciedade em comparação a um
grupo que ingeriu a mesma solução contendo caseína. Esta percepção, apesar de subjetiva,
estava relacionada às maiores concentrações sanguíneas de CCK e do GLP-1, geradas pela
ingestão da solução contendo as proteínas do soro.
2.4.7.2 – Hipertensão
As proteínas do leite possuem peptídeos que inibem a ação da enzima conversora
de angiotensina (ECA), que por sua vez está envolvida no sistema renina-angiotensina. A
29
ECA catalisa a formação de um potente vasoconstritor, a angiotensina II e inibe a ação da
bradicinina, um vasodilatador. Os peptídeos da caseína (casocininas) e das proteínas do
soro (lactocininas) apresentam potente efeito inibidor da ECA (Groziak & Miller, 2000;
Fitzgerlad, 2004). Apesar de muitos resultados serem observados in vitro, Pins & Keenan
(2006) avaliaram o efeito de um hidrolisado de proteínas do soro e observaram que sua
utilização reduziu significativamente a pressão sangüínea, tanto sistólica como diastólica,
via inibição da ECA e aumentou a atividade da bradicinina em humanos. Em outro estudo,
Kawase et al. (2000) observaram que a administração de leite fermentado enriquecido com
WPC diminuiu significativamente a pressão sanguínea sistólica em humanos após oito
semanas de estudo.
2.4.7.3 – Dislipidemias
Diversas pesquisas têm sido realizadas com intuito de se avaliar um possível efeito
hipocolesterolemiante das proteínas do soro do leite. Estudos com diferentes modelos
animais e mesmo com seres humanos já foram realizados (Sautier et al., 1983, Choi et al.,
1988, Lovati et al., 1990, Zhang & Beyner, 1993; Nagaoka et al., 1992, Kawase et al.,
2000, Jacobucci et al., 2001). Em coelhos, Lovatti et al. (1990) demonstraram efeito
hipocolesterolemiante das proteínas do soro comparado à caseína após 29 dias de estudo.
Estudos com humanos são escassos. Em estudo conduzido com 20 adultos saudáveis,
Kawase et al., (2000), observaram que a administração de 400mL de leite fermentado
suplementado com WPC promoveu, após 8 semanas, um aumento significativo na
concentração da fração HDL do colesterol e uma redução na concentração de triglicérides.
Observaram também uma diminuição não significativa na concentração de colesterol total e
da fração LDL. Entretanto, estudos com ratos trazem resultados conflitantes. Sautier et al.
(1983) observaram que dietas sem a adição de colesterol contendo as proteínas do soro
apresentaram um efeito hipocolesterolemiante em ratos adultos. Choi et al. (1988)
observaram que quando as dietas não eram acrescidas de colesterol, nenhum efeito sobre o
perfil lipídico de ratos adultos era observado. Entretanto, com a adição dietética de
30
colesterol, as proteínas do soro apresentaram efeito hipocolesterolemiante tanto em animais
adultos como jovens. Zhang & Beyner (1993)
observaram que somente dietas com 30% de
proteínas reduziram o colesterol plasmático e hepático, como também a concentração de
triglicérides. Jacobucci et al. (2001)
observaram efeito hipocolesterolemiante das proteínas
do soro quando comparado à caseína, sendo este no entanto acompanhado por um aumento
na concentração de triglicérides. Neste sentido, a literatura apresenta ainda dados
inconsistentes. Parece que a quantidade de proteína na dieta oferecida é um fator essencial
para se observar o efeito hipocolesterolemiante. Guias para elaboração de dietas para
animais de laboratório preconizam dietas com 17% de proteínas para animais em
crescimento, gestação e lactação (AIN-93G) e 12% de proteínas para animais adultos (AIN-
93M) (Reeves et al.1993). Neste sentido, dados sobre o efeito de dietas de manutenção
(AIN-93M) modificadas na fonte protéica (proteínas do soro pela caseína comercial) são
escassos, ou ineficazes (Zhang & Beyner, 1993).
Portanto, existe ainda a necessidade de se investigar os efeitos das proteínas do soro
do leite sobre os parâmetros do metabolismo lipídico em ratos, principalmente utilizando-se
dietas de composição conhecidas e preconizadas, como a AIN-93M, modificada apenas na
fonte protéica. Faz-se necessário também avaliar os efeitos das proteínas do soro sobre
outros parâmetros bioquímicos envolvidos tanto no metabolismo lipídico, como por
exemplo, parâmetros da atividade hepática como também de outros parâmetros
bioquímicos indicadores da função orgânica. Além disso, há o interesse em se avaliar seus
efeitos sobre parâmetros ainda não descritos, como atividade da paraoxonase (PON) e
claro, seus efeitos comparativos sobre o crescimento de ratos, através da avaliação de sua
qualidade biológica e nutricional.
3 - OBJETIVOS
3.1 - OBJETIVO GERAL
Avaliar a qualidade biológica de um suplemento alimentar composto pelas proteínas
do soro do leite e seus efeitos sobre o metabolismo lipídico, atividade hepática, renal e
antioxidante de ratos jovens recém desmamados e adultos hipercolesterolêmicos.
31
3.2 - OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Nos animais jovens, recém-desmamados, os objetivos específicos foram:
- Avaliar a qualidade biológica de um suplemento alimentar composto pelas
proteínas do soro através dos seguintes parâmetros: “Coeficiente de Utilização Protéica”,
(CUP); “Razão Protéica Líquida”, (RPL); “Digestibilidade Verdadeira” (DV); “Balanço
Nitrogenado aparente” (BN
ap
);
- Avaliar o efeito de um suplemento alimentar composto das proteínas do soro do
leite sobre os seguintes parâmetros bioquímicos: colesterol total, colesterol HDL,
triglicérides, concentração de proteínas totais, albumina, atividade da aspartato
aminotransferase (AST) e alanina aminotransferase (ALA), glicose e creatinina;
- Avaliar o efeito de um suplemento nutricional composto das proteínas do soro do
leite sobre as defesas antioxidantes, através da atividade da paraoxonase (PON);
Nos animais adultos, submetidos à dieta hipercolesterolemiante, os objetivos
específicos foram:
- Avaliar o efeito de um suplemento alimentar composto pelas proteínas do soro do
leite sobre os seguintes parâmetros bioquímicos: colesterol total, colesterol HDL,
triglicérides, concentração plasmática de proteínas totais, albumina, atividade da aspartato
aminotransferase (AST) e alanina aminotransferase (ALA) e creatinina
- Avaliar o efeito de um suplemento alimentar composto pelas proteínas do soro do
leite sobre as defesas antioxidantes, através da dosagem de sulfidrilas e atividade da
paraoxonase (PON);
- Avaliar o efeito de um suplemento alimentar composto pelas proteínas do soro
leite sobre parâmetros morfométricos como mensuração do comprimento, diâmetro e peso
do osso fêmur.
32
4 - MATERIAL E MÉTODOS
4.1 – Animais
Para se verificar os objetivos propostos, foram realizados 2 experimentos,
utilizando-se no total, 64 ratos da linhagem Fisher machos. No experimento 1 foram
utilizados 32 ratos recém desmamados, com idade de 21-23 dias e peso médio de 39g. Para
o experimento 2, foram utilizados ratos adultos, com peso médio de 207g. Todos os
animais foram mantidos em gaiolas individuais dispostas em ambiente com temperatura,
luminosidade e umidade controladas. Todos os procedimentos foram cuidadosamente
realizados seguindo as normas recomendadas pelo Colégio Brasileiro de Experimentação
Animal (COBEA).
4.2 – Dietas
A composição das diferentes dietas está apresentada nas tabelas I e II para os
experimentos 1 e 2 respectivamente. Para o experimento 1, as dietas foram confeccionadas
de acordo com as recomendações da AOAC (1975). A diferença entre as dietas estava
somente na fonte protéica utilizada. Preparou-se, ainda, uma dieta livre de nitrogênio (dieta
aprotéica) para ser utilizada na determinação da Razão Protéica Líquida (RPL) e
Digestibilidade Verdadeira (DV). Para o experimento 2, as dietas foram confeccionadas
segundo a metodologia de Reeves et. al.(1993), modelo AIN-93M e Matos et al. (2005)
(tabela II).
33
Tabela I – Composição (g/1000g) das dietas controle (C), proteínas do soro (PS), caseína-
proteina do soro (CP) aproteica (AP) utilizadas no Experimento 1.
Ingredientes C PS CP AP
Caseína 120,0 - 82 0
Proteína do soro - 123,0 37 0
Mistura Mineral 50,0 50,0 50,0 50,0
Mistura Vitamínica 10,0 10,0 10,0 10,0
Óleo de Soja 80,0 80,0 80,0 80,0
Colina 2,0 2,0 2,0 2,0
Celulose 10,0 10,0 10,0 10,0
Amido de milho 728 725 729 848
Total 1.000,0 1.000,0 1.000,0 1.000,0
A mistura salina utilizada para a elaboração das dietas possui a seguinte composição (g/Kg de mistura): NaCl,
139,3; KI, 0,79; MgSO4.7H2O, 57,3; CaCO3, 381,4; MnSO4.H2O, 4,01; FeSO4.7H2O, 27; ZnSO4.7/H2O,
0,548; CuSO4.5/H2O, 0,477; CoCl2.6/H2O, 0,023; KH2PO4, 389. A mistura vitamínica utilizada possui a
seguinte composição (mg/Kg da mistura): vitamina A, 20000 (UI); vitamina D, 2000 (UI); vitamina E, 100
(UI); menadiona, 5; colina, 2000; ácido p-aminobenzócio, 100; inositol, 100; niacina, 40; pantotenato de
cálcio, 40; riboflavina, 80; tiamina HCl, 5; piridoxina, 5; ácido fólico, 2; biotina, 0,4; cianocobalamina, 0,03;
sacarose q.s.p. 1 Kg. (AOAC, 1975).
34
Tabela II – Composição (g/1000g) das dietas controle (C), hipercolesterolemiante (H),
proteínas do soro (PS) e hipercolesterolemiante+proteínas do soro (PSH) utilizadas no
Experimento 2.
Ingredientes C H PS PSH
Caseína 140,0 140,0 - -
Proteína do soro - - 148,0 148,0
Mistura Mineral 35,0 35,0 35,0 35,0
Mistura Vitamínica 10,0 10,0 10,0 10,0
Óleo de Soja 40,0 250,0 40,0 250,0
Colesterol - 10 - 10
Colina 2,5 2,5 2,5 2,5
Celulose 50,0 50,0 50,0 50,0
Amido de milho 725,5 503 715 495
Total 1.000,0 1.000,0 1.000,0 1.000,0
A mistura salina utilizada para a elaboração das dietas possui a seguinte composição (g/Kg de mistura):
CaCO3, 357; KH2PO4, 250; NaCl, 74; K2SO4, 46,6; citrato tri-potássico, 28; MgO, 24; citrato de Fe, 6,06;
ZnCO3, 1,65; MnCO3, 0,63; CuCO3, 0,3; KI, 0,01; Na2SeO4, 0,01; (NH4)6MoO24•4H2O, 0,00795. A
mistura vitamínica utilizada possui a seguinte composição (g/Kg da mistura): niacina, 3; pantotenato de
cálcio, 1,6; piridoxina HCl, 0,7; tiamina HCl, 0,6; riboflavina, 0,6; ácido fólico, 0,2; biotina, 0,02;
cianocobalamina, 2,5; vitamina E (500IU/g), 15; vitamina A (500,000 IU/g), 0,8; vitamina D, (400,000 IU/g),
0,25;vitamina K, 0,075; sacarose q.s.p. 1 Kg. (Reeves et al., 1993).
Foi utilizado como fonte de proteínas do soro um produto comercial que, segundo
dados do fabricante, contêm 81% de uma mistura de WPC e WPI.
4.3 - Delineamento Experimental
No experimento 1, os ratos recém desmamados foram divididos em 4 grupos de 8
animais cada. O grupo controle (C) recebeu dieta padrão, o grupo proteínas do soro (PS)
recebeu dieta padrão, modificada na fonte protéica, com as proteínas do soro em
substituição à caseína, o grupo caseína-proteina do soro (CP) recebeu dieta onde as
35
proteínas do soro foram utilizadas na forma de complementação à caseína, com o intuito de
se mimetizar uma suplementação, e o grupo aprotéico (Aprot) recebeu dieta aprotéica. Os
animais foram mantidos em gaiolas individuais, receberam as respectivas dietas e água ad
libitum por 4 semanas. A ingestão alimentar, e o ganho de peso foram monitorados
semanalmente. A coleta de fezes foi realizada semanalmente e diariamente por 1 semana
para a determinação do nitrogênio endógeno.
No experimento 2, os animais adultos foram divididos em 4 grupos de 8 animais
cada. O grupo controle (C) recebeu dieta padrão (AIN-93M), o grupo hipercolesterolêmico
(H) recebeu dieta hipercolesterolemiante, o grupo proteínas do soro (PS) recebeu dieta
AIN-93M modificada na fonte protéica, com as proteínas do soro em substituição à caseína
e o grupo PSH recebeu dieta hipercolesterolemiante e com a substituição da caseína pelas
proteínas do soro. A ingestão alimentar, coleta das fezes e o ganho de peso foram
monitorados semanalmente. Os animais foram mantidos em gaiolas individuais, receberam
as respectivas dietas e água ad libitum por 8 semanas. Todos os procedimentos foram
cuidadosamente realizados seguindo as normas recomendadas pelo Colégio Brasileiro de
Experimentação Animal (COBEA)
4.4 - Avaliações biológicas
4.4.1 - Coeficiente de Utilização Protéica (CUP)
Calculado através do quociente entre o ganho de peso e a ingestão protéica dos
animais, após 28 dias para cada um dos animais em experimento (de Angelis, 1995).
(g) testegrupo pelo consumida Proteína
(g) testegrupo do peso de Ganho
=CUP
36
4.4.2 - Razão Proteica Líquida (RPL)
Esse método tem a duração de 14 dias e é definido pela variação de peso corporal
do grupo de animais alimentados com a dieta a 10% da proteína a ser testada, adicionada à
perda de peso dos animais que receberam dieta aprotéica, dividida pela quantidade de
proteína ingerida pelos primeiros (de Angelis, 1995). A seguinte expressão numérica é
utilizada para calcular a RPL:
4.4.3 - Digestibilidade Verdadeira (DV)
Do 14º ao 21º dia de experimento, as fezes foram coletadas diariamente e secas a
105°C. O conteúdo de nitrogênio nas fezes foi determinado pelo método de Kjedahl
(AOAC, 1975). A seguinte expressão numérica foi utilizada para calcular a DV.
4.4.4 - Balanço Nitrogenado Aparente (BN
ap
)
O balanço nitrogenado (BN) mede a quantidade de nitrogênio ingerida na dieta e a
quantidade excretada nas fezes e urina (Pellet & Young, 1980). Muitas vezes a mensuração
do nitrogênio excretado na urina pode ser desprezado, determinando-se assim apenas o BN
aparente. O BN
ap
é calculado pela seguinte equação:
(g) testegrupo pelo consumida Proteína
(g) aprotéico grupo do peso de Perda (g) testegrupo do peso de Ganho
+
=RPL
(
)()
[]
nitrogênio de Ingestão
aproteico grupo fecal nitrogênio testegrupo fecal nitrogênio - Nitrogênio de Ingestão
−
=DV
BN
ap
= nitrogênio ingerido – nitrogênio excretado nas fezes.
37
4.5 - Avaliações Bioquímicas
4.5.1 - Obtenção do Soro
Após o período experimental, os animais foram mantidos em jejum por 12 horas e
posteriormente anestesiados com éter. O sangue foi então coletado por secção do plexo
braquial até a morte. O sangue de cada animal foi recolhido em 3 tubos de polietileno com
capacidade de 1,5mL e posteriormente centrifugado a 3000 x g por 10 minutos para
obtenção do soro que era guardado sob refrigeração (4ºC). Todas as dosagens foram
realizadas em até 3 dias.
4.5.2 - Dosagens Bioquímicas
Todas as dosagens bioquímicas, colesterol total, HDL-colesterol, triglicérides,
proteínas totais, albumina, glicose, creatinina, uréia, fosfatase alcalina e as atividades das
enzimas aspartato aminotransferase (ASP) e alanina aminotransferase (ALT) foram
realizadas utilizando-se kits comerciais (Labtest Diagnóstica, Lagoa Santa, MG- Brasil –
vide anexo I). A atividade enzimática da paraoxonase (PON) foi medida com base na
velocidade de hidrólise do fenilacetato, segundo a metodologia descrita por Beltowski et al.
(2003). Para tal, uma solução contendo 1μL de fenilacetato e 1500 μL de Tris HCl (2-
Amino-2-(hidroximetil)-1,3-propanediol, hidroclorido) 9mM, pH 8 foi preparada. Dessa
solução foram retirados 0,5 mL e misturados com 2 mL de Tris HCl 9mM, pH 8, contendo
CaCl
2
0,9mM. Foram pipetados então 5μL de soro, misturado à solução e a absorbância a
270nm foi lida em 3 minutos exatamente. Para o preparo do branco utilizado para zerar o
espectofotômetro, utilizou-se o mesmo procedimento, entretanto sem a adição do soro e a
absorbância obtida foi subtraída das absorbâncias de cada amostra. Foi usado o coeficiente
de extinção molar do fenilacetato (1.310 mol/L_1cm_1) e os resultados foram expressos em
U/mL onde uma unidade de arilestarase hidrolisa 1 mmol de fenilacatato por minuto.
38
Os grupamentos sufidrilas totais e sulfidrilas livres foram determinados usando o
reagente de Ellman, como descrito previamente por Sedlak (1968). Sulfidrilas totais
correspondem aos grupos sulfidrilas ligados à proteína e aos grupos sulfidrilas livres.
Foram determinados usando-se o ácido 5,5’-Ditio-bis(2-nitrobenzoico) - DTNB (reagente
de Ellman). Os grupos tióis reagem com DTNB formando um composto colorido, que
absorve luz a 412 nm. Para determinar os grupos sulfidrilas livres, as proteínas são
precipitadas usando tricloroacético (TCA), utilizando-se o sobrenadante para a dosagem.
Para a determinação dos grupamentos sulfidrilas totais foram misturados 40
μL de soro,
150
μL de TrisHCl 30mM pH 8,2, 50 μL de DTNB (Sigma) e 800 μL de metanol.
Centrifugou-se a 3000g por 5 minutos e a leitura foi realizada a 412 nm no
espectrofotômetro. Para se determinar os grupamentos sulfidrilas livres foram utilizados
200
μL de amostra, 200 μL de ácido tricloroacético (TCA), centrifugados por 15 minutos a
1500 rpm, 150
μL do sobrenadante foram tratados com 600 μL de Tris pH 8.9, 60 μL de
DTNB, 150
μL de sobrenadante e foram feitas as leituras a 412 nm no espectrofotômetro.
Após estes procedimentos, é determinada então a curva padrão para os grupamentos
sufidrilas totais e sulfidrilas livres usando-se glutationa estoque (20 mM) que foi diluída em
Trietanolamina-HCl (TEA). Para a determinação da quantidade de grupos sulfidrilas
ligados às proteínas subtrai-se os valores dos grupos sulfidrilas livres dos totais. As
concentrações são obtidas em μmol/L.
4.6 – Análise estatística
Os resultados foram expressos com média ± desvio padrão. Para o experimento 1
foi utilizada a análise de variância univariada ANOVA. Teste de Tukey foi utilizado
quando p<0.05 para determinação das diferenças específicas entre as médias. Para o
experimento 2, os dados foram testados pela análise bivariada ANOVA. Quando as
alterações eram significativas, o teste de Tukey foi feito para determinar as diferenças
específicas entre as médias. A diferença de p< 0,05 foi considerada significativa.
39
5 - RESULTADOS
5.1 - Experimento 1
Os dados relacionados ao perfil alimentar e nutricional dos animais são mostrados
na tabela III. O peso inicial foi estatisticamente igual entre os grupos. Os animais dos
grupos proteína do soro (PS) e caseina-proteinas do soro (CP) apresentaram maior peso
final que o grupo controle. Conseqüentemente, o ganho de peso foi maior para os grupos
PS e CP, estatisticamente maior que do grupo controle (C). O consumo alimentar (CA) e a
ingestão protéica (IP) foram iguais entre os grupos.
Tabela III – Peso inicial (PI), peso final (PF), ganho de peso (GP), consumo alimentar(CA)
e ingestão protéica (IP)
1
para grupos de ratos mantidos em dieta controle (C), proteína do
soro (PS) e caseína-proteinas do soro (CP).
Grupos
PI (g) PF (g) GP (g) CA (g) IP (g)
C
40,99 ± 3,50ª 110,6 ± 10,81
b
69,61 ± 9,44
b
282,75 ± 19,30
a
28,27 ± 1,93
a
PS
39,93 ± 5,49
a
126,94 ± 7,08
a
87,01 ± 6,12
a
274,83 ± 23,12
a
27,48 ± 2,31
a
CP
40,18 ± 7,34
a
124,29 ± 13,15
a
84,11 ± 10,96
a
307,3 ± 24,58
a
30,73 ± 2,46
a
1
Valores médios de 8 animais por grupo ± desvio padrão
a,b
Letras diferentes na mesma coluna indicam valores estatisticamente diferentes (p<0,05).
A tabela IV mostra os resultados da avaliação biológica das dietas. Apenas a dieta
PS gerou valores maiores para “Razão Protéica Liquida” (RPL), “Coeficiente de Utilização
Protéica” (CUP) e “Digestibilidade Verdadeira” (DV) em relação aos grupos C e CP, que
por sua vez, foram iguais entre si. O “Balanço Nitrogenado Aparente” (BN
AP
) foi
estatisticamente semelhante entre todos os grupos.
40
Tabela IV – “Razão Protéica Liquida” (RPL), “Coeficiente de Utilização Protéica” (CUP),
“Digestibilidade Verdadeira” (DV) e “Balanço Nitrogenado” (BN) para os grupos controle
(C), proteína do soro (PS) e caseína-proteinas do soro (CP).
Grupos
RPL CUP DV BN
ap
C
3,21 ± 0,43
b
2,45 ± 0,19
b
0,95 ± 0,02
b
1,95 ± 0,22
a
PS
4,07 ± 0,27
a
3,18 ± 0,31
a
0,98 ± 0,01
a
1,92 ± 0,19
a
CP
3,55 ± 0,50
b
2,74 ± 0,33
b
0,95 ± 0,02
b
2,18 ± 0,26
a
a,b
Letras diferentes na mesma coluna indicam valores estatisticamente diferentes (p<0,05).
As concentrações plasmáticas de proteínas totais, albumina, glicose, alanina
aminotransferase, aspartato aminotransferase e creatinina estão mostrados na tabela V.
Apenas a dieta PS gerou valores estatisticamente maiores de proteínas totais, albumina,
glicose. As enzimas ALT e AST apresentaram atividade semelhante em todos os grupos. A
concentração de creatinina plasmática também foi semelhante entre os grupos.
O perfil lipídico e a atividade da paraoxonase (PON) do sangue dos animais
alimentados com as diferentes fontes protéicas estão mostrados na tabela VI. O colesterol
total dos grupos PS e CP foi diferente entre eles, sendo no entanto igual ao grupo C. A dieta
PS gerou valores estatisticamente maiores de colesterol HDL. As concentrações de
triglicérides e outras frações de colesterol foram similares em todos os grupos.
41
Tabela V – Concentrações plasmáticas de proteínas totais, albumina, glicose, alanina
aminotransferase (ALT), aspartato aminotransferase (ALT) e creatinina dos animais
alimentados com as dietas controle(C), proteína do soro(PS) e caseína-proteinas do
soro(CP)
1
.
Parâmetro/Grupos
C PS CP
Proteínas totais (g/L)
56,2 ± 1,72
b
65,76 ± 1,77
a
58,22 ± 1,57
b
Albumina (g/L)
41,81 ± 4,26
b
47,43 ± 1,71
a
42,66 ± 2,19
b
Glicose (mmol/L)
6,45 ± 1,32
b
8,06 ± 1,03
a
6,02 ± 1,29
b
ALT (UI)
4,21±1,22
a
3,58±0,95
a
4,82±1,74
a
AST (UI)
25,80±7,10
a
20,43±0,92
a
20,72±1,81
a
Creatinina (mmol/L)
73,77±5,62
a
73,13±8,84
a
72,40±7,98
a
1
Valores médios±desvio-padrão
a,b
Letras diferentes na mesma linha indicam valores estatisticamente diferentes (p<0,05).
Tabela VI – Perfil lipídico e atividade da paraoxonase (PON) do sangue dos animais
alimentados com as dietas controle(C), proteína do soro(PS) e caseína-proteinas do soro
(CP)
1
.
Parâmetro/Grupos
C PS CP
Triglicérides (mmol/L)
1,23 ± 0,52
a
1,50 ± 0,65
a
1,22 ± 0,75
a
Colesterol total (mmol/L)
1,72 ± 0,22
a,b
2,01 ± 0,36
a
1,60 ± 0,22
b
Colesterol HDL (mmol/L)
0,78 ± 0,06
b
1,08 ± 0,18
a
0,66 ± 0,16
b
Colesterol – outras frações
(mmol/L)
0,95 ± 0,19
a
0,93 ± 0,20
a
0,94 ± 0,13
a
PON (U/mL)
136,70 ± 16,33
b
159,61 ± 13,02
a
93,26 ± 16,58
c
1
Valores médios±desvio-padrão
a,b
Letras diferentes na mesma linha indicam valores estatisticamente diferentes (p<0,05).
42
5.2 - Experimento 2
Os dados relacionados ao perfil alimentar, nutricional, lipídico e às defesas
antioxidantes dos animais submetidos ao 2º experimento estão mostrados na tabela VII. O
consumo alimentar e o peso dos animais sofreram efeito da dieta. Os animais que
receberam dieta hipercolesterolemiante (H e PSH) consumiram menor quantidade de
alimento, apresentando no entanto maior ganho de peso. O perfil lipídico mostra que as
dietas hipercolesterolemiantes promoveram um aumento nas concentrações de colesterol
total e das frações aterogênicas, assim como uma redução na concentração do colesterol
HDL. Observa-se a presença de uma interação entre a dieta e o tratamento sobre a
concentração do colesterol HDL e triglicérides, sendo esta última afetada também pelo
tratamento. As proteínas do soro quando adicionadas à dieta hipercolesterolemiante
promoveram um aumento significativo da concentração de triglicérides. Não foi observada
nenhuma diferença nas concentrações de sulfidrilas protéicas e livres entre os grupos. As
dietas hipercolesterolemiantes promoveram redução na atividade da paraoxonase (PON).
Na tabela VIII observa-se que as dietas hipercolesterolemiantes promoveram
aumento no peso do fígado, na atividade da alanima aminotransferase (ALT), aspartato
aminotransferase (AST), fosfatase alcalina, concentração de proteínas totais e redução na
concentração de albumina. Entretanto, as proteínas do soro impediram de forma
significativa um aumento na atividade da AST provocada pela dieta hipercolesterolemiante.
A atividade da fosfatase alcalina foi afetada também pelo tratamento. Os animais dos
grupos PS e PSH apresentaram menor atividade da fosfatase alcalina que os animais dos
grupos controle (C) e hipercolesterolêmico (H). O peso dos rins foi semelhante entre os
grupos, assim como a concentração de uréia. A concentração de creatinina foi aumentada
pela dieta hipercolesterolemiante, ocorrendo também uma interação com o tratamento.
Quando a dieta hipercolesterolemiante foi associada com as proteínas do soro este efeito
não foi observado.
43
Tabela VII - Consumo alimentar, ganho de peso, perfil lipídico (colesterol total, colesterol
HDL, outras frações) e defesas antioxidantes (sulfidrilas protéicas, sulfidrilas livres e
atividade da paraoxonase – PON) dos animais após 8 semanas de experimento.
Grupos
C H PS PSH
Ganho de peso (g)
*
31,50 ± 17,83 58 ± 14,43 28,38 ± 3,81 46,63 ± 14,55
Consumo Alimentar (g)
*
584,15 ± 35,52 456,43 ± 43,83 565,92 ± 43,31 449,56 ± 37,27
Colesterol total (mg/dL)
*
81,57 ± 7,21 438,54 ± 230,35 80,1 ± 10,06 344,82 ± 188,77
Colesterol HDL (mg/dL)
* i
57,84 ± 10,10
a
9,33 ± 1,90
b
48,61 ± 9,10
a
15,96 ± 16,20
b
Outras frações (mg/dL)
*
23,73 ± 7,64 429,21 ± 229,50 31,50 ± 5,84 328,86 ± 191,53
Triglicérides (mg/dL)
# i
92,23 ± 53,94
b
,c
47,48 ± 30,23
c
128,78 ± 38,78
b
196,22 ± 30,32
a
Sulfidrilas protéicas (g/dL) 329,26 ± 46,33 315,82 ± 20,24 310,72 ± 30,38 335,51 ± 29,84
Sulfidrilas livres (g/dL) 74,17 ± 4,08 71,85 ± 7,06 74,40 ± 5,24 79,27 ± 6,25
Paraoxonase (U/mL)
* i
48,92 ± 6,29
a
21,41 ± 1,80
b
39,31 ± 5,87
a
28,75 ± 11,26
b
Valores expressos em média ±DP, n=8 por grupo.
*
Efeito da dieta p<0,05. # Efeito do tratamento, p<0,05. i
indica ocorrência de interação entre a dieta e tratamento. Letras diferentes na mesma linha indicam diferença
para p<0,05. C: ratos alimentados com dieta padrão; H: ratos alimentados com dieta hipercolesterolemiante;
PS: ratos alimentados com dieta composta pelas proteínas do soro em substituição a caseína; PSH: ratos
alimentados com dieta hipercolesterolemiante, composta pelas proteínas do soro em substituição a caseína.
As características dos ossos dos animais alimentados com as diferentes dietas estão
mostradas na tabela IX. O tratamento afetou todos os parâmetros estudados. As dietas PS e
PSH geraram fêmures maiores, mais pesados e com maior diâmetro que as dietas C e H.
44
Tabela VIII: Peso do fígado, rins, função hepática (alanina aminotransferase, aspartato
aminotransferase, fosfatase alcalina, proteínas totais e albumina) e renal (uréia e creatinina)
dos animais após 8 semanas de experimento.
Grupos
C H PS PSH
Peso do fígado (g)
*
6,13 ± 0,58 10,98 ± 1,09 5,79 ± 0,34 9,69 ± 2,07
Alanina aminotransferase (UI)
*
17,68 ± 5,66 32,33 ± 10,80 15,75 ± 4,29 29,16 ± 12,43
Aspartato aminotransferase (UI)
* i
51,08 ± 7,15
c
112,62 ± 19,80
a
55,04 ± 19,79
c
85,69 ± 15,76
b
Fosfatase alcalina (U/L)
* #
21,38 ± 4,81 54,19 ± 17,56 18,21 ± 3,41 36,91 ± 12,65
Proteínas totais (g/dL)
*
7,17 ± 0,69 8,29 ± 0,82 7,53 ± 0,29 7,84 ± 0,60
Albumina (g/dL)
*
3,59 ± 0,32 3,35 ± 0,30 3,72 ± 0,29 3,46 ± 0,23
Peso dos rins (g) 1,21 ± 0,06 1,25 ± 0,13 1,23 ± 0,07 1,28 ± 0,15
Uréia (mg/dL)
29,29 ± 7,88 26,92 ± 2,57 26,73 ± 5,70 27,20 ± 4,58
Creatinina (mg/dL)
* i
1,16 ± 0,14
c
1,65 ± 0,25
a
1,23 ± 0,12
b
,c
1,42 ± 0,12
b
Valores expressos em média ±DP, n=8 por grupo.
*
Efeito da dieta p<0,05.
#
Efeito do tratamento, p<0,05.
i
indica ocorrência de interação entre a dieta e tratamento. Letras diferentes na mesma linha indicam diferença
para p<0,05. C: ratos alimentados com dieta padrão; H: ratos alimentados com dieta hipercolesterolemiante;
PS: ratos alimentados com dieta composta pelas proteínas do soro em substituição a caseína; PSH: ratos
alimentados com dieta hipercolesterolemiante, composta pelas proteínas do soro em substituição a caseína.
Tabela IX: Peso, diâmetro e comprimento do fêmur.
Grupos
C H PS PSH
Fêmur (g)
#
0,85 ± 0,04 0,88 ± 0,07 0,91 ± 0,06 0,92 ± 0,06
Comprimento do fêmur (cm)
#
3,84 ± 0,04 3,83 ± 0,07 3,89 ± 0,09 3,90 ± 0,08
Diâmetro do fêmur (mm)
#
3,20 ± 0,19 3,16 ± 0,15 3,40 ± 0,24 3,40 ± 0,24
Valores expressos em média ±DP, n=8 por grupo.
#
Efeito do tratamento, p<0,05. C: ratos alimentados com
dieta padrão; H: ratos alimentados com dieta; PS: ratos alimentados com dieta composta pelas proteínas do
soro em substituição a caseína; PSH: ratos alimentados com dieta hipercolesterolemiante, composta pelas
proteínas do soro em substituição a caseína.
45
6 - DISCUSSÃO
6.1 - Experimento 1
A qualidade nutricional dos suplementos alimentares compostos pelas proteínas do
soro é conhecida basicamente pela sua composição de aminoácidos. Poucos trabalhos de
sua avaliação biológica são encontrados na literatura (Borges et al. 2001). Os resultados do
presente trabalho mostraram que, apesar da ingestão protéica e do ganho de peso serem
semelhantes nos grupos proteína do soro (PS) e caseína-proteina do soro (CP), os animais
apresentaram diferenças na utilização das proteínas para o crescimento, como pode ser
observado pelos valores da “Razão Protéica Liquida” (RPL) e do “Coeficiente de
Utilização Protéica” (CUP). A substituição de 30% de caseína pelas proteínas do soro
(grupo CP) não afetou essa utilização, fato observado somente quando a substituição é
integral (grupo PS). Esses resultados podem ser, em parte, explicados pelos dados da
“Digestibilidade Verdadeira” (DV) das proteínas avaliadas. As proteínas do soro
apresentaram melhor digestibilidade, contribuindo assim para uma melhor utilização da
proteína pelo organismo para o crescimento. Avaliando a DV de diferentes fontes protéicas,
Gilani & Sepehr (2003) encontraram altos valores de DV para WPC, sendo no entanto,
estatisticamente iguais aos da caseína. Por ser utilizada como proteína de referência para
avaliação da qualidade biológica de proteínas, parâmetros como CUP e RPL da caseína são
bastante citados na literatura. Experimentos anteriores realizados em nosso laboratório
corroboram com os valores observados no presente trabalho. Avaliando a qualidade
biológica de multimisturas utilizadas para a recuperação de crianças desnutridas, de Paula
et al. (2004) encontraram valores de 2,41±0,17 para o CUP, 3.96± 0.48 para o RPL e
0,92±0,7 para a DV de dietas contendo 10% de caseína comercial, valores estes muitos
semelhantes ao observado em nosso trabalho. Dados da literatura revelam valores
semelhantes (Silva & Hernan-Gomez, 2000), assim como discrepantes. Borges et al.
(2001), comparando a qualidade biológica de um WPC não comercial com a caseína,
encontraram para a dieta contendo 10% de caseína, CUP = 3,42±0,25, bem superior ao
observado em nosso trabalho, mas valores semelhantes de RPL (3,78±0,15) e de DV
46
(0,935±0,97). Entretanto, os autores não observaram diferenças significativas no RPL e
CUP da caseína quando comparado WPC não comercial, obtido por ultrafiltração seguido
de diafiltração. Vale ressaltar que o suplemento alimentar utilizado em nosso estudo é
composto tanto de WPC como WPI, obtidos por uma combinação de técnicas
(microfiltração e cromatografia de troca iônica, além da ultrafiltração), concentrando e
isolando peptídeos com diferentes características bioativas (Kinsella & Withehead, 1989;
Ha & Zemel, 2003) e conferindo uma qualidade nutricional não apenas relacionada ao seu
perfil de aminoácidos.
A análise do “Balanço Nitrogenado Aparente” (BN
ap
) revelou que a utilização das
proteínas do soro em substituição integral à caseína ou na forma de complementação (dietas
PS e CP) foi suficiente para promover um balanço nitrogenado positivo, assim como na
dieta contendo 10% de caseína comercial (dieta C).
As concentrações plasmáticas de proteínas totais, albumina e glicose nos animais do
grupo C não diferiram dos animais do grupo CP, e são semelhantes ao observado por de
Paula et al. (2004), quando esses autores comparam o efeito de dietas contendo caseína ou
suplemento de multimisturas sobre tais parâmetros bioquímicos. Apesar das proteínas do
soro apresentarem importantes diferenças nos parâmetros biológicos, é nas propriedades
fisiológicas e funcionais que essas proteínas parecem diferir da caseína (Ha & Zemel, 2003;
de Wit, 1998). A qualidade biológica das proteínas do soro, observada pelos valores de
RPL, CUP e DV, influenciou a concentração de proteínas hepáticas dos animais do grupo
PS, afetando as concentrações de albumina, e conseqüentemente, de proteínas totais. Além
de uma melhor digestibilidade, as proteínas do soro são rapidamente absorvidas. (Boirie et
al., 1997). Pequenos peptídeos provenientes da sua digestão são muitas vezes absorvidos
dessa forma, sendo mais eficientemente utilizados para a síntese de novas proteínas
sanguíneas e teciduais (Sgarbieri, 2004). Entretanto sua utilização em substituição parcial
da caseína (grupo CP) não alterou a produção dessas proteínas pelo fígado.
As proteínas do soro influenciaram também a concentração de glicose nos animais
do grupo PS. Essas proteínas caracterizam-se pela composição de aminoácidos de
conhecido potencial gliconeogênico, apresentando uma maior concentração de aminoácidos
47
sulfurados metionina e cistina, assim como os aminoácidos de cadeia ramificada (BCAA).
Os BCAA contribuem em diferentes processos metabólicos, desde seu papel como
substrato para síntese protéica, até como substrato energético no tecido muscular. Neste
processo, o aumento da concentração dos BCAA nas células musculares favorece sua
transaminação, com conseqüente síntese dos aminoácidos alanina e glutamina. No fígado,
esses aminoácidos são utilizados como fonte de carbono para a gliconeogênese hepática,
via ciclo alanina-glicose. Estudos sugerem que o ciclo alanina-glicose contribui em até 40%
com a glicose endógena produzida durante o exercício e em até 70% depois de um jejum
noturno (Ahlborg et al., 1974; Balasubramanyam, et al., 1999). Considerando que a
concentração de glicose mensurada reflete uma condição de jejum prolongado (8 a 10
horas), os dados sugerem que as proteínas do soro tiveram papel decisivo em manter a
homeostase glicêmica desses animais durante o jejum prolongado. Entretanto, a utilização
de 30% de proteínas do soro em substituição à caseína (dieta CP) não foi capaz de
promover os mesmos efeitos.
A atividade das enzimas alanina aminotransferase (ALT) e aspartato
aminotransferase (AST) foi semelhante entre todos os grupos, assim como a concentração
de creatinina, sugerindo não ter ocorrido lesão hepática, bem como alterações da função
renal desses animais. Embora a atividade da ALT e AST não seja específica para o fígado,
pois estão presentes em diversos tecidos do organismo, elevam-se mais freqüentemente nas
doenças hepáticas, podendo refletir um dano no mesmo (Mincis & Mincis, 2007). A ALT é
encontrada principalmente no citoplasma do hepatócitos, enquanto 80% da AST estão
presentes na mitocôndria. Esta diferença tem auxiliado no diagnóstico e prognóstico de
doenças hepáticas. Em um dano hepatocelular leve, a forma predominante no soro é
citoplasmática, enquanto que em lesões graves há liberação da enzima mitocondrial,
elevando a relação AST/ALT (Motta, 2000).
No metabolismo de lipídeos, nenhum efeito das dietas sobre as concentrações
plasmáticas de triglicérides foi observado, corroborando com o trabalho de Sautier et
al.(1982). Entretanto, caseína e proteínas do soro tiveram diferentes efeitos sobre as
concentrações plasmáticas de colesterol. A concentração plasmática de colesterol dos
animais mantidos em dieta C foi semelhante ao encontrado em outros trabalhos (de Paula
48
et. al. (2004). A utilização das proteínas do soro na dieta PS promoveu um aumento no
colesterol total em comparação à dieta CP, conseqüência do aumento na concentração do
colesterol HDL, uma vez que as concentrações das frações aterogênicas de colesterol
permaneceram inalteradas. Estudos de avaliação dos efeitos das proteínas do soro sobre o
perfil lipídico de ratos são escassos. Sautier et al. (1982) observaram que quando
comparado à caseína, as proteínas do soro do leite não alteraram as concentrações de
triglicérides, mas reduziram a concentração plasmática de colesterol total em ratos adultos
submetidos a dietas com baixa concentração de colesterol, diferentemente do que foi
observado nosso experimento. Entretanto, observaram que essa redução do colesterol total
era decorrente de uma diminuição significativa na concentração do colesterol HDL.
Estudos em animais mostram que o colesterol LDL apresenta propriedades aterogênicas,
enquanto que o colesterol HDL mostra característica inversa (Barter et al., 2003),
principalmente por promover o transporte reverso de colesterol, tido como a função
principal de HDL em proteger o organismo contra aterosclerose e distúrbios
cardiovasculares. Embora a dieta CP não tenha afetado as concentrações plasmáticas de
colesterol total e colesterol HDL, nossos dados mostram que as proteínas do soro do leite
quando administradas em substituição integral à caseína, aumentaram sua concentração
plasmática, melhorando assim o perfil lipídico desses animais.
Ao avaliarmos a atividade da paraoxonase (PON), observamos uma relação positiva
entre as proteínas do soro, colesterol HDL e atividade da PON. A PON é uma
estearase/lactonase que se encontra associada ao colesterol HDL de mamíferos
principalmente. Estudos têm demonstrado que a PON apresenta ação antioxidante,
destruindo biologicamente lipídeos peroxidados em lipoproteínas e nas células arteriais
impedindo a progressão de lesões ateroscleróticas A PON pode também impedir a
biossíntese de colesterol nas células arteriais e estimular o transporte reverso de colesterol,
apresentando portanto uma possível atividade cardioprotetora (Aviram, 2004; Durrington,
2003). Fatores fisiológicos como o exercício, patológicos e mesmo dietéticos afetam a
atividade da PON (Aviram, 2004). Alimentos como as uvas, vinho tinto e óleo de oliva
ricos em substâncias antioxidantes como os flavonóides e os polifenóis são conhecidos por
afetarem positivamente a atividade da PON (Aviram & Rosenblat, 2005). Os efeitos das
49
proteínas do soro do leite sobre a atividade da PON são desconhecidos na literatura. Este
foi o primeiro estudo reportando uma relação entre as proteínas do soro e a atividade da
PON em animais.
6.2 - Experimento 2
Os animais que receberam dietas hipercolesterolemiantes (H e PSH) apresentaram
maior ganho de peso que os demais, apesar de terem consumido uma quantidade
significativamente menor de alimento. Esse comportamento é comumente observado em
ratos, onde a ingestão alimentar é inversamente proporcional à densidade calórica do
mesmo. Dietas hipercolesterolemiantes caracterizam-se pelo alto percentual de gordura
(25%), tornado-as altamente calóricas. Há que se destacar também o fato dos animais
utilizados no segundo experimento serem adultos, diferentemente de ratos jovens, onde a
necessidade e a utilização de lipídeos para o crescimento é maior. Assim, essas dietas
tendem a promover em animais adultos, maior acúmulo de gordura subcutânea e visceral,
contribuindo para o maior ganho de peso.
Ao analisarmos o perfil sérico de lipídeos, observamos que as dietas
hipercolesterolemiantes promoveram um grande aumento na concentração de colesterol
total, sendo este decorrente do aumento nas concentrações das frações aterogênicas (LDL e
VLDL). Observamos que a dieta PSH não foi capaz de reduzir o colesterol plasmático de
forma significativa. Apesar do efeito hipocolesterolêmico das proteínas do soro já ter sido
demonstrado em outros modelos animais (Lovatti et al., 1990), em ratos a literatura mostra
ainda dados conflitantes. Trabalhando com dietas contendo 23% de proteínas do soro e
baixa concentração de colesterol, Sautier et al.,(1983) observaram que as proteínas do soro
reduziram o colesterol total de ratos adultos quando comparado à caseína. Entretanto, os
autores observaram que esse efeito era resultante de uma diminuição do colesterol HDL.
Trabalhando com dietas de diferentes concentrações protéicas, Zhang & Beynen, (1993)
observaram que somente dietas com alto teor de proteínas do soro (30%) foram capazes de
reduzir o colesterol total de ratos. Dietas contendo 15% de proteínas não afetaram a
50
concentração plasmática de colesterol total, mas reduziram a concentração de colesterol
hepático. Segundo os autores, as proteínas do soro estariam interferindo na síntese hepática
de colesterol. Semelhantemente ao observado no trabalho de Zhang & Beynen (1993),
observamos que dietas com 12% de proteínas do soro do leite não foram suficientes para
promover uma redução significativa do colesterol plasmático, apesar de uma tendência ter
sido observada. Ao analisarmos as frações do colesterol, não observamos nenhum efeito
significativo das proteínas do soro do leite, diferentemente também do que foi reportado em
outros trabalhos. A dieta PSH não afetou a concentração do colesterol HDL, apesar de uma
tendência ter sido observada. Nagaoka et al. (1992) usando uma dieta
hipercolesterolemiante por 14 dias observaram um aumento significativo na concentração
do colesterol HDL de ratos quando comparado à caseína e à soja, e uma redução nas
concentrações das frações LDL e VLDL. Entretanto, Zhang & Beynen (1993) também não
observaram nenhum efeito das proteínas do soro do leite sobre o colesterol HDL, tanto em
dietas contendo 15 ou 30% de proteínas do soro. Quanto às frações aterogênicas,
observaram apenas uma redução na fração VLDL quando a dieta continha 30% de
proteínas do soro.
Ao avaliarmos a concentração de triglicérides, observamos que as dietas PS e PSH
aumentaram significativamente sua concentração. Estudos anteriores mostram também
resultados conflitantes. Gonçalves et al., (2006) não observaram nenhum efeito da dieta
hipercolesterolemiante sobre a concentração de triglicérides quando comparado à dieta
contendo caseína. Assim como no presente trabalho, Matos et. al., (2005) observaram que
dietas hipercolesterolemiantes contendo caseína promoviam a mesma redução não
significativa na sua concentração. Em relação à avaliação das dietas contendo as proteínas
do soro, Choi et al.,(1989); Jacobucci et al.,(2001) observaram que as proteínas do soro
reduziram o colesterol plasmático de ratos alimentados com dietas hipercolesterolemiantes,
mas observaram, assim como no presente estudo, um aumento na concentração de
triglicérides. Sautier et al.(1982) e Zhang & Beynen (1993) observaram uma redução do
colesterol total sem alterações na concentração de triglicérides. Portanto nossos dados e dos
demais autores sugerem que o efeito das proteínas do soro sobre o metabolismo lipídico de
ratos é dependente de uma complexa interação entre a fonte e a quantidade protéica, já que
51
dietas com 15% ou menos de proteína não afetaram a concentração de colesterol
plasmático, o colesterol dietético e a idade dos animais, uma vez que observamos
comportamentos diferentes entre animais jovens e adultos.
Os radicais sulfidrilas representam todos os grupos tióis encontrados na glutationa,
em proteínas e compostos de baixo peso molecular no plasma. Tióis podem ser oxidados
quando o estresse oxidativo está elevado, diminuindo assim sua concentração no plasma
(Wisdom et al., 1991). A albumina é a principal fonte de grupos tióis no plasma e é
quantitativamente o mais importante componente extracelular de defesa antioxidante.
Outras fontes de grupos tióis apresentam baixo peso molecular que constituem as sulfidrilas
livres que são representadas por compostos como a glutationa, cisteína, homocisteína e
cisteinil-glicina (Mircescu et al., 2005). Nossos dados revelam que não houve nenhuma
diferença nas concentrações de sulfidrilas protéicas e livres entre os grupos. O efeito de
dietas hipercolesterolemiantes sobre a concentração de sulfidrilas protéicas e livres já foi
avaliado em outros trabalhos de nosso laboratório. Gonçalves et al., (2006) também não
observaram diferenças na concentração de sulfidrilas protéicas e livres de animais
submetidos a dietas controle e hipercolesterolemiante.
A menor concentração de colesterol HDL dos grupos H e PSH afetaram também a
atividade da paraoxonase (PON). Em uma condição de estresse oxidativo, não é só a LDL
que é modificada, mas também outras lipoproteínas séricas, inclusive o colesterol HDL.
Estudos de Shih et al.(1996) mostraram que animais alimentados com dietas ricas em
gorduras e colesterol apresentam redução na expressão gênica e a atividade sérica da PON.
Nevin et al. (1996) sugeriram previamente que a massa plasmática da PON pode depender
do número de carreadores de partículas de colesterol HDL. Semelhantemente, Blatter-Garin
et al. (1994) sugeriram que a concentração do colesterol HDL pode ser um importante
determinante da concentração plasmática da PON. Nossos resultados corroboram com estas
observações. Estudos envolvendo a análise do efeito das proteínas do soro sobre a atividade
da PON em animais submetidos a dietas hipercolesterolemiantes não são conhecidos.
Dados de nosso experimento 1 mostraram uma correlação entre o colesterol HDL, proteínas
do soro e a atividade da PON. Apesar de não termos encontrado uma diferença
52
significativa, observamos que as proteínas do soro apresentaram uma tendência em impedir
a redução da atividade da PON ocasionada pela dieta hipercolesterolemiante.
O fígado dos animais submetidos às dietas hipercolesterolemiantes apresentaram-se
maiores e mais pesados. O acúmulo de gordura no fígado é comumente observado em ratos
submetidos à dieta hipercolesterolemiante. Portanto, nossos dados corroboram com dados
de outros trabalhos (Story & Baldino 1981; Rosa et al. 1998, Matos et. al., 2005). A
concentração plasmática das enzimas alanina aminotransferase (ALT) e aspartato
aminotransferase (AST) são importantes marcadores de doenças ou lesão tecidual do fígado
(Mincis & Mincis, 2007; Ozaki et al., 1995).
Estas enzimas estão presentes nos hepatócitos
e qualquer lesão tissular afetando o parênquima hepático liberará uma maior quantidade
dessas enzimas para a corrente sangüínea. Dietas ricas em colesterol promovem um
aumento no estresse oxidativo no fígado (Kanhal
et al., 2002), resultando também em um
aumento na atividade dessas enzimas. Trabalhos anteriores utilizando os mesmos modelos
de animais e de dietas mostram tais alterações (Matos et. al., 2005). Observamos que as
proteínas do soro, quando adicionadas à dieta rica em colesterol (PSH), impediram o
aumento da AST de forma significativa, sugerindo um efeito protetor ao estresse oxidativo
provocado pela dieta hipercolesterolemiante. Esse efeito protetor pode ser corroborado
também por termos observado uma redução na atividade da fosfatase alcalina nos animais
que receberam as proteínas do soro. A determinação da atividade da fosfatase alcalina é
bastante útil no diagnóstico das doenças hepatobiliares (Fukatsu, 2001). Sua concentração
permanece elevada em diversas condições patológicas, como na obstrução biliar extra e
intra-hepática, colestases e hepatite. Uma elevação menor que três vezes dos níveis normais
é considerada não específica, insuficiente para fornecer um diagnóstico preciso e definitivo.
Aumentos maiores são correlacionados com desordens específicas, incluindo obstrução
biliar maligna, cirrose biliar primária, linfoma hepático, entre outras (Saif et al., 2005).
Dietas ricas em gordura favorecem a formação de cálculos biliares, podendo gerar danos
hepáticos por obstrução dos canais biliares no fígado (Muriel, 1995). Assim nossos dados
sugerem que as proteínas do soro apresentaram um efeito protetor para o fígado contra os
efeitos deletérios da dieta hipercolesterolemiante.
53
A análise das concentrações de proteínas totais e albumina revelaram que os fígados
dos animais hipercolesterolêmicos apresentaram hiperproteinemia, causada por um
aumento na síntese das globulinas, uma vez que as concentrações séricas de albumina
foram menores para os animais destes grupos. Dentre as condições patológicas que podem
ocasionar hiperproteinemia, estão as enfermidades monoclonais, ocasionadas por um
aumento na concentração das imunoglobulinas como nas enfermidades policlonais
crônicas, onde se observam aumentos difusos das gamaglobulinas. Este aumento das
gamaglobulinas é comumente observado em condições patológicas como na hepatite aguda
crônica e cirrose biliar primária, e também em respostas de fase aguda, como no infarto
(Motta, 2000). Observamos que as proteínas do soro não afetaram a concentração de
proteínas totais e albumina, apesar dos valores denotarem uma tendência das proteínas do
soro em impedir tais alterações.
Não observamos nenhuma diferença para o peso dos rins entre os grupos, assim
como para a concentração de uréia. Concentração de uréia observado no grupo C são
semelhantes os dados encontrados por Matos et. al. (2005) e Gonçalves et. al. (2006). A
concentração de creatinina foi afetada pela dieta hipercolesterolemiante, indicando um
possível dano renal. Danos renais podem ser induzidos em ratos por dietas hiperlipídicas
(Fu et al., 2006; Lu et al., 2003), e este comportamento já foi observado em animais
submetidos à dieta hipercolesterolemiante (Gonçalves et. al., 2006). A creatinina, sendo um
dos produtos do metabolismo nitrogenado, deve ser removida do organismo continuamente
através dos rins. A constância na formação e excreção da creatinina faz dela um marcador
muito útil de função renal, principalmente da filtração glomerular, em virtude da sua
relativa independência de fatores como dieta, grau de hidratação e metabolismo protéico.
Sua determinação plasmática é um teste de função renal mais seguro do que a uréia, pois
nas doenças renais, sua concentração se eleva mais vagarosamente do que a uréia (Burtis &
Ashwood, 1998). Observamos que as proteínas do soro impediram de forma significativa o
aumento na concentração de creatinina, sugerindo também um efeito protetor aos danos
gerados pela dieta hipercolesterolemiante.
A avaliação das diferentes dietas sobre o peso, comprimento e diâmetro do fêmur
mostram que as dietas contendo as proteínas do soro do leite comercial (PS e PSH) geraram
54
animais com fêmures maiores, mais pesados e com maior diâmetro. Não são conhecidos na
literatura trabalhos envolvendo a análise das proteínas do soro sobre medidas ósseas.
Entretanto, diversos trabalhos têm verificado que a administração de um componente do
leite conhecido como Proteína Básica do Leite (Milk Basic Protein – MBP) favorece a
formação e o desenvolvimento ósseo. Toba et al. (2001) verificaram que a administração de
300mg de MBP em 30 homens adultos saudáveis aumentou a concentração de hormônios
indicadores da formação óssea, osteocalcina e do pró-peptídeo pró-colágeno I (PICP) após
16 dias de estudo. No estudo de Aoe et al. (2001) a suplementação de 40mg de MBP em
um grupo de 33 mulheres adultas resultou em um aumento na densidade mineral óssea das
mulheres suplementadas em comparação ao grupo placebo. Marcadores bioquímicos
indicaram também uma inibição de reabsorção óssea medida pelos osteoclastos. Os dados
de nosso trabalho sugerem que as proteínas do soro do leite favoreceram também o
desenvolvimento ósseo. Possivelmente, a presença de peptídeos bioativos das proteínas do
soro foi determinante para esses efeitos. Takada et al. (1996) sugerem que esses
componentes bioativos são importantes para a formação óssea via ativação dos
osteoblastos. Assim, nossos resultados indicam que a utilização desses concentrados e
isolados protéico do soro (WPC e WPI) parece exercer os mesmos efeitos observados com
a administração do MBP.
7 – CONCLUSÕES
• As proteínas do soro apresentam altos índices de avaliação da qualidade
protéica, mostrando diferenças nos valores da “Razão Protéica Liquida”
(RPL), “Coeficiente de Utilização Protéica” (CUP), “Digestibilidade
Verdadeira” (DV). A substituição de 30% da caseína pelas proteínas do soro
na dieta não afetou a utilização da proteína para o crescimento;
• A avaliação bioquímica revelou que as proteínas do soro foram
determinantes para a homeostase glicêmica no jejum prolongado,
55
melhorando também o perfil lipídico e a atividade da PON sem promover
alterações na função hepática e renal dos animais;
• As proteínas do soro não apresentaram um efeito hipocolesterolemiante
significativo em ratos, apesar de essa tendência ter sido observada.
• Observamos que as proteínas do soro reduziram de forma significativa a
ocorrência de alterações nos parâmetros indicadores das funções hepáticas e
renais provocadas pela dieta hipercolesterolemiante.
• Os dados sugerem também que as dietas contendo as proteínas do soro
afetam positivamente a formação óssea, quando comparadas com as dietas
contendo caseína, hipercolesterolemiantes ou não.
56
8 - REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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body cell mass, muscle strength, and quality of life in women with HIV. AIDS
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9 – ANEXO 1 – MANUAIS DOSAGENS BIOQUÍMICAS
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