ads:
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA ANIMAL
FLORA SATIKO KANO
Anaplasma marginale: ANÁLISE DA VARIABILIDADE DO GENE
msp1α E AVALIAÇÃO IMUNOGÊNICA DA VACINA DE DNA
CONTENDO GENES PARA MSP1a, MSP1b E MSP5
EM
CAMUNDONGOS BALB/c.
Londrina
2007
ads:
Livros Grátis
http://www.livrosgratis.com.br
Milhares de livros grátis para download.
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA ANIMAL
FLORA SATIKO KANO
Anaplasma marginale: ANÁLISE DA VARIABILIDADE DO GENE
msp1α E AVALIAÇÃO IMUNOGÊNICA DA VACINA DE DNA
CONTENDO GENES PARA MSP1a, MSP1b E MSP5
EM
CAMUNDONGOS BALB/c.
Tese apresentada para a obtenção do título de
Doutor em Ciência Animal (área de concentração
em Sanidade Animal) da Universidade Estadual
de Londrina.
Orientadora: Prof
a
Dr
a
Marilda Carlos Vidotto
Co-Orientador: Prof. Dr. Odilon Vidotto
Londrina
2007
ads:
FLORA SATIKO KANO
Anaplasma marginale: ANÁLISE DA VARIABILIDADE DO GENE
msp1α E AVALIAÇÃO IMUNOGÊNICA DA VACINA DE DNA
CONTENDO GENES PARA MSP1a, MSP1b E MSP5
EM
CAMUNDONGOS BALB/c.
Tese apresentada para a obtenção do título de Doutor
em Ciência Animal (área de concentração em Sanidade
Animal) da Universidade Estadual de Londrina.
Comissão Examinadora
Prof
a
Dr
a
Rosângela Zacarias Machado
Universidade Estadual Paulista – Campus Jaboticabal
Prof. Dr. Emerson José Venâncio
Universidade Estadual de Londrina
Prof. Dr. João Luis Garcia
Universidade Estadual de Londrina
Prof. Dr. Amauri A. Alfieri
Universidade Estadual de Londrina
Prof
a
Dr
a
Marilda Carlos Vidotto
Universidade Estadual de Londrina
Londrina, 27 de abril de 2007.
O presente trabalho foi realizado no Laboratório de Protozoologia Animal,
Departamento de Medicina Veterinária Preventiva, Centro de Ciências Agrárias, Universidade
Estadual de Londrina como requisito para a obtenção do título de Doutor em Ciência Animal
pelo Programa de Pós-Graduação em Ciência Animal, área de concentração em Sanidade
Animal, sob orientação da Prof
a
Dr
a
Marilda Carlos Vidotto.
Os recursos financeiros para o desenvolvimento do projeto foram obtidos junto às
agências e órgãos de fomento à pesquisa abaixo relacionados:
1. CNPq: Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / MCT
2. CAPES: Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / MEC
3. FAP/PR: Fundação Araucária de Apoio ao Desenvolvimento Científico e
Tecnológico do Paraná / SETI
4. FINEP: Financiadora de Estudos e Projetos / MCT
DEDICATÓRIA
Aos meus queridos pais Mikio e Tokiko Kano pelo eterno incentivo e amor incondicional;
pelo exemplo de simplicidade, honestidade, respeito ao próximo e de otimismo de enfrentar as
situações mais adversas.
Aos meus irmãos pelo amor, carinho e amizade. Em especial minha irmã Emiko, minha maior
incentivadora e por me proporcionar uma base sólida a cada caminhada.
AGRADECIMENTOS
À Deus pela oportunidade de crescimento e evolução...
À Prof
a
Dr
a
Marilda C. Vidotto pela orientação, amizade, pela oportunidade de iniciar
os estudos na área de biologia molecular e por acreditar que eu pudesse atender suas
expectativas.
Ao Prof. Dr. Odilon Vidotto pela co-orientação, colaboração e pela amizade formada
nestes 11 anos de convívio, desde que iniciei atividades de iniciação científica sob sua
orientação.
Aos membros da Comissão Examinadora na banca de qualificação: Prof. Dr. Amauri
A. Alfieri, Prof. Dr. Emerson José Venâncio, Prof. Dr. João Luis Garcia, Prof. Dr. Odilon
Vidotto pelas valiosas contribuições.
Agradecimentos especiais ao pesquisador Dr. Fabio Gregori pela receptividade e
ensinamentos para a realização das análises filogenéticas; ao Prof. Dr. Selwyn Arlington
Headley pelo auxilio na reconstrução das análises filogenéticas, pela amizade, pelo exemplo
de otimismo e pelos agradáveis momentos filosóficos; ao Prof. Dr. João Luis Garcia pelo
enorme auxílio que foram indispensáveis nesta tese; ao Prof. Dr. Emerson José Venâncio pelo
auxilio em bioinformática; ao Prof. Dr. Laurival Antônio Vilas Boas pela paciência, coragem
e disponibilidade de auxiliar nos primeiros passos na utilização da bioinformática; à técnica e
amiga Kerlei Cristina Médici pelo preparo das células da linhagem Vero utilizado neste
estudo; a Prof
a
Dr
a
Eiko N. Itano e a Mari Sumigawa, técnica responsável pelo laboratório de
Imunologia, pela colaboração na execução da proliferação de células esplênicas.
À Coordenação de Aperfeiçoamento do Programa de Pessoal de Nível Superior
(CAPES) pela concessão da Bolsa de doutorado.
Á todos os professores do Programa de Pós Graduação em Ciência Animal pela
formação acadêmica científica. Agradecimento especial aos Prof. Dr. Italmar T. Navarro e
Prof. Dr. Amauri A. Alfieri pelas sábias palavras de encorajamento que me fizeram
prosseguir...
Ao pessoal da Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós-Graduação (PROPPG).
À Prof
a
Dr
a
Teresa Cristina de Oliveira por autorizar a utilização de equipamentos do
Departamento de Tecnologia de Alimentos, imprescindíveis para realização desta tese.
À Dr
a
Elizabete R. M. Marana, responsável pelo Laboratório de Protozoologia, pela
disponibilidade e auxílio técnico para realização desta tese.
Aos técnicos de laboratório Ademir, Jussevânia, Dalva, Dalíria, Maria Yoshie, Zé
Aldivino e Antônio (Sr. Toninho do Rx) pela ajuda incondicional, pela amizade e carinho.
Aos funcionários do Departamento de Medicina Veterinária Preventiva, em especial,
dona Cidinha, Neusa, Maria José e aos funcionários do Departamento de Microbiologia do
Centro de Ciências Biológicas, Ediel e Josefa (Dona Zefa) pelo bom dia alegre de cada dia
nestes longos anos de convivência.
Aos secretários Valdecir, Reinaldo, Nelson e Helenice pela paciência e colaboração na
parte burocrática.
Aos queridos amigos que tornaram esta caminhada em momentos especiais. À querida
amiga-irmã Betinha agradeço pelo carinho e pela amizade verdadeira incondicional, pelos
muitos momentos alegres e dificeis compartilhados ao longo destes anos. A sua amizade com
certeza persistirá pela vida inteira onde quer que estejamos. Às amigas Kátia, Michelle e
Paula (“as três japinhas”) pela amizade que tão rapidamente se tornou significativa e, por
tornar mais leve e tão alegres os intermináveis dias de trabalho; À querida amiga Renatinha
pelas valiosas palavras de incentivo e conforto, ensinamentos e pela disponibilidade dedicadas
a esta amizade. À Vanas (“japa”) pelo carinho e cuidados dispendidos à nossa amizade. Às
amigas Marlise, Ju Dias e Lu Takemura (Lulis) pela amizade, pelo caloroso carinho e zelo. À
querida amiga Silvia Trapp que sempre esteve presente em todos os momentos mesmo no
pensamento. À querida Dóris pela amizade e pelas inúmeras gargalhadas compartilhadas no
laboratório do CCB. À amiga Marisa que me recebeu com tanto carinho na sua casa. Aos
amigos e colegas do Laboratório de Zoonoses Felipe, Robertinha, Bruno, Kênio, Mauro e
Valeska pelos momentos agradáveis e pelas risadas compartilhadas. Aos amigos do
laboratório de Virologia Animal Alexandre, Danilo, Daniel (Frango), Michele, Aline, Rita
pela amizade e pelos momentos compartilhados. Agradeço também aos amigos Daniela Pilz,
Yurika, Liza, Walfrido, Eleine, Kledir, Melissa Campitelli, Kleber, Claudia e a todos os
colegas de pós-graduação.
A todos os estagiários e bolsistas de iniciação científica do Laboratório de
Protozoologia Animal, em especial a Adriana Coelho (Dri) que tanto me ajudou nesta etapa
final.
E a todos que de alguma forma, direta ou indiretamente, contribuíram para a realização
deste trabalho, Muito Obrigada!
RESUMO
KANO, F.S
. Anaplasma marginale: Análise da variabilidade do gene msp1α e avaliação
imunogênica da vacina de DNA contendo genes para MSP1a, MSP1b e MSP5 em camundongos
BALB/c.
2007. 142.f. Tese (Doutorado em Ciência Animal, área de concentração em Sanidade
Animal) – Universidade Estadual de Londrina, Londrina. 2007.
O Anaplasma marginale é um importante patógeno riquetsial de bovinos transmitido por carrapato que
invade e se multiplica dentro de eritrócitos, causando anemia hemolítica durante a infecção aguda. A
imunização com proteínas de membrana externa (OMP) purificadas induz proteção contra doença
aguda. Das 21 OMPs descritas, seis MSPs (1a, 1b, 2-5) já foram bem caracterizadas. O complexo
MSP1 (MSP1a e 1b) é adesinas de eritrócitos de bovinos. A MSP1a varia em tamanho pelo número de
repetições in tandem de 28-29 aminoácidos. Vacina de DNA contra a anaplasmose tem sido
investigada usando os genes msp1α e msp1β, e os resultados evidenciaram resposta celular e humoral
em camundongos e bovinos. A imunização com DNA plasmidial que codifica genes de interesse é
uma tecnologia nova e promissora no desenvolvimento de vacinas. Vacinas de DNA que visam
múltiplos epitopos têm se mostrado mais eficientes aumentando a imunogenicidade e a proteção de
animais vacinados quando comparadas com as de epitopo único. Os objetivos deste trabalho foram
analisar a variabilidade do gene msp1
α
de amostras paranaenses de A. marginale, testar a capacidade
dos plasmídios recombinantes expressarem MSP1a, MSP1b e MSP5 em células eucarióticas e avaliar
a imunogenicidade destas vacinas administradas individualmente ou em associação, em camundongos
BALB/c. A análise da região repetitiva do gene msp1
α
identificou a presença de seis, cinco e três
repetições nas amostras PR1, PR2 e PR3, respectivamente, e seis padrões de repetições inéditas.
Contudo, a região da MSP1a responsável pela imunogenicidade foi conservada. Os plasmídios
pcDNA/ msp1
α
, pcDNA/ msp1 β e pcDNA/ msp5, os quais codificam os genes das MSPs sob o
controle do promotor do citomegalovirus e intron A, foram construídos, multiplicados em E. coli
TOPO10 e purificados. A expressão das proteínas MSP1a, MSP1b e MSP5 in vitro foi realizada em
células Vero usando lipofectamina 2000 e Imunofluorescência Indireta (IFA), utilizando anticorpos
monoclonais. Sete grupos de camundongos foram imunizados para avaliar a produção de IgG total e
determinar os isotipos IgG1 e IgG2a: G1-100
µ
L PBS; G2-100
µ
g de vetor; G3- 100
µ
g de
corpúsculos iniciais de A. marginale + adjuvante de Freund; G4- 100
µ
g pcDNA-msp1
α
; G5-100
µ
g
pcDNA-msp1
β
; G6-100
µ
g of pcDNA-msp5 e G7- pool de plasmídios (33
µ
g de cada plasmídio). Três
semanas após a última imunização, os camundongos foram sacrificados para avaliar a proliferação dos
esplenócitos. As células Vero transfectadas com plasmídios recombinantes reagiram com anticorpos
monoclonais específicos, demonstrando a expressão dos genes msp. IgG específica para a MSP1a e
MSP5 foram detectadas tanto por ELISA quanto por Western blot. Os grupos que receberam pcDNA-
msp1
α
and pcDNA-msp5 mostraram predomínio do isotipo IgG2a, e proliferação de esplenócitos,
sugerindo que estes plasmídios são bons candidatos para estimular reposta imune Th1. A associação
dos três plasmídios recombinantes (pcDNA-msp1
α
, pcDNA-msp1
β
and pcDNA-msp5) empregados na
imunização de camundongos induziram altos títulos de anticorpos por ELISA e reagiram com todas
proteínas recombinantes (rMSP1a, rMSP1b e rMSP5) de A. marginale por Western blot.
Adicionalmente, a combinação dos plasmídios levou a uma forte proliferação de linfócitos (SI = 12,
2), enquanto o gene msp1
α
determinou significante proliferação significativa (SI = 2,6) e os genes
msp1
β
e msp5 não promoveram proliferação (SI<2). Os resultados demonstraram que a associação dos
plasmídios induziu a expressão das MSPs e estimulou significante produção de linfócitos T, podendo
ser uma estratégia eficiente para a imunoprofilaxia da anaplasmose.
Palavras-chave:
MSPs, Anaplasma marginale, Vacina DNA, imunogenicidade
ABSTRACT
KANO, F.S. Anaplasma marginale: Variability analysis of gene msp1
α
and immunogenic
evaluation of DNA vaccine containing genes for MSP1a, MSP1b and MSP5 in BALB/c
mice. 2007. 142.f. Thesis (Doctorate Degree in Animal Science) - Universidade Estadual de
Londrina, Londrina. 2007.
Anaplasma marginale is an important tick-transmitted rickettsial pathogen of cattle that invades
and multiplies within erythrocytes, causing severe hemolytic anemia during acute infection.
Immunization with purified outer membrane proteins (OMP) induces protection against acute A.
marginale disease. Of 21 OMP described six major surface proteins (MSPs 1a, 1b, 2-5) have been
well-characterized. The complex MSP1 (MSP1a and 1b) is an adhesin for bovine erythrocyte, and
MSP1a vary in size and sequence due to the number of tandem 28-29-amino acid repeats. DNA
vaccine against anaplasmosis has been investigated using the msp1
α
and msp1β genes, and the
results related cellular and humoral response in mice and cattle. Immunization with DNA
plasmids encoding antigens of interest represents a novel and promising method in vaccine
research and development. Multiepitope DNA vaccine is a new experience to increase
immunogenicity and protection for vaccinated animal as compared in single epitope. The
objectives of this study were to analyze the variability of the msp1
α
gene of A. marginale strains
from Parana State, evaluate the capacity of the recombinant plasmids to express MSP1a, MSP1b,
and MSP5 in eukaryotic cells, and evaluate the immunogenicity of BALB/c mice immunized with
these DNA vaccines encoding MSPs of A. marginale PR1 strain individually or in association.
The analysis of the msp1
α
gene identified the presence of six, five and three tandem repeats in
PR1, PR2 PR3, respectively; however, the region of MSP1a responsible for immunogenicity was
conserved. The plasmids pcDNA-msp1α, pcDNA-msp1β and pcDNA-msp5, which encode the
MSPs genes under the control of cytomegalovirus enhancer/promoter and intron A, were
constructed, multiplied in TOP10 E. coli and purified. Expression of MSP1a, MSP1b, and MSP5
in vitro was performed into Vero cells using lipofectamine 2000, following Indirect
Immunofluorescen Assay (IFA) using monoclonal antibodies. Seven experimental groups of mice
were immunized to evaluate the production of whole IgG and to determinate IgG1 and IgG2a
isotype: G1-100
µ
l PBS; G2-100
µ
g empty vector; G3-100
µ
g A. marginale initial bodies +
Freund´s adjuvant; G4-100
µ
g pcDNA-msp1
α
; G5-100
µ
g pcDNA-msp1
β
; G6-100
µ
g pcDNA-
msp5; and G7-pool of recombinant plasmids (33
µ
g for each). Three weeks after the last
immunization, mice were sacrified to evaluate spleen cells proliferation. Vero cells transfected
with recombinants plasmids reacted with specific monoclonal antibodies, demonstrating the
expression of msp genes. Specific IgG against MSP1a and MSP5 were detected in either by
ELISA and Western blot. The groups that received pcDNA-msp1
α
and pcDNA-msp5 exhibited
predominance for IgG2a production and splenocytes proliferation, suggesting that these
recombinant plasmids are good candidates for elicited T helper 1 immune response. The
association of three recombinant plasmids (pcDNA-msp1
α
, pcDNA-msp1
β
and pcDNA-msp5)
used in the immunization of mice induced high antibodies response by ELISA and reacted with all
recombinant proteins (rMSP1a, rMSP1b, and rMSP5) of A. marginale by Western blot. Also, the
combination of plasmids provide strong lymphoproliferation (SI = 12,2), whereas the genes to
MSP1a provide significant splenocytes (SI = 2,6) and the genes to MSP1b and MSP5 did not
provide significant proliferation (SI<2). The results showed no suppression when the recombinant
plasmids were taken in association, and demonstrated that they can generate significant T-cell
lymphocyte. Thus, the immunization in association of recombinant plasmids encoding MSPs can
be an effective strategy for immunoprofilaxy of anaplasmosis.
Key Words: MSPs, Anaplasma marginale, variability, DNA vaccine, immunogenicity
SUMÁRIO
1. REVISÃO DE LITERATURA
1.1. Revisão de Literatura ............................................................................................. 16
1.2. Artigo de Revisão .................................................................................................. 29
2. OBJETIVOS
2.1. Objetivo Geral ...................................................................................................... 65
2.2. Objetivos Específicos ........................................................................................... 65
3. ARTIGO PUBLICADO
3.1. Phylogenetic Analysis of Anaplasma marginale Strains from
Paraná State, Brazil, Using the msp1
α
and msp4 genes
Abstract ………………………………………………………………………..………………..
67
3.1.1. Introduction ………………………………………………………………………..……..
67
3.1.2. Materials and Methods …………………………………………………………………...
68
3.1.2.1.
Anaplasma marginale strains
…………………………………….…………………..
68
3.1.2.2.
Polymerase chain reaction
…………………………………………………………...
68
3.1.2.3.
Sequence
analysis………………………………………………………………..…..
68
3.1.2.4.
Sequence alignment and phylogenetic
analysis
………………………………….……..
68
3.1.3. Results …………………………………………………………………..………………..
68
3.1.4. Discussion …………………………………………………………………………….….
69
Acknowledgements …………………………………………………………………………..…
73
References ………………………………………………………………………………..……..
73
4. ARTIGOS PARA PUBLICAÇÃO
4.1. DNA vaccines encoding Anaplasma marginale MSPs induced immunogenicity in
BALB/c mice
Abstract ……………………………………………………..…………………………………...
77
4.1.1. Introduction …………………………………………………………..…………………...
77
4.1.2. Materials and Methods ………………………………………………………………..…..
79
4.1.2.1. Anaplasma marginale strain and DNA extract……………………………………..
79
4.1.2.2. Construction of the recombinant plasmids…………………………………..…….
79
4.1.2.3. Production of DNA vaccines ……………………………..……..............................
81
4.1.2.4. Production of recombinant MSPs protein………………………………………....
81
4.1.2.5.
Animal and experimental design ………………………..……………....................
82
4.1.2.6. Antibody assays and isotypes …………………………………..…...……..............
82
4.1.2.7. Western blot analysis ………………………………………………….…………..
83
4.1.2.8. Statistical analysis…………………………………..……......................................
83
4.1.2.9. Lymphocyte proliferation..........................................................................................
84
4.1.3. Results ……………………………………..……………………………………………..
84
4.1.3.1. A. marginale DNA vaccine construction……………………………………………
84
4.1.3.2. Humoral Immune response of mice elicited by DNA vaccination…………………
85
4.1.3.3. Cellular Immune response of mice elicited by DNA vaccination…………………..
86
4.1.4. Discussion ………………………………………………..……………………………….
86
Acknowledgements ……………………………………………..……………………………….
89
References …………………………………………………………………………..…………...
89
4.2. Enhanced immunogenicity of DNA vaccine encoding MSP1a, MSP1b, and
MSP5 antigens of Anaplasma marginale in association
Abstract..…………………………………………………………………………………..……...
101
4.2.1. Introduction………………………………………………………………….…………….
102
4.2.2. Material and Methods………………………………………………………………….…..
103
4.2.2.1. Anaplasma marginale strain and DNA extract……………………………………...
103
4.2.2.2. Production of DNA vaccines…………………………………………………………
103
4.2.2.3. Production of recombinant MSPs proteins……………………………………..……
104
4.2.2.4 In vitro transfection and expression………………………………………………….
104
4.2.2.5. Animal and experimental design……………………………………………………..
105
4.2.2.6. Antibody assays and isotypes………………………………………………………...
105
4.2.2.7. Western blot analysis…………………………………………………………………
106
4.2.2.8. Statistical analysis…………………………………………………………………....
106
4.2.2.9. Proliferation Assay…………………………………………………………………...
107
4.2.2. Results……………………………………………………………………………………...
107
4.2.2.1. Eukaryotic expression of MSPs antigens of A. marginale…………………………...
107
4.2.2.2. Humoral immune response of mice elicited by DNA vaccination……………………
108
4.2.2.3. T cell-mediated immune responses…………………………………………………..
109
4.2.3. Discussion………………………………………………………………………………….
109
Acknowledgements ……………………………………………………………………………...
112
References ……………………………………………………………………..………………..
113
5. CONCLUSÕES ……………………………….…………………………………………………….
122
APÊNDICES
A. Lista de reagentes …………………………………………………………………………….. 124
B. Soluções e tampões ………………………………………………………………………….. 126
C. Protocolo de técnicas ………………………………………………………………………… 129
ANEXOS
A. Normas de publicação do periódico
Semina Ciências Agrárias.
............................ 135
B. Normas de publicação do periódico
Research in Veterinary Science
..................... 138
LISTA DE FIGURAS
Artigo de Revisão
Fig.1.
Representação esquemática das principais características genéticas de um vetor
plasmidial utilizado na vacina de DNA......................................................................35
Fig.2.
Hipótese mais aceita do mecanismo de ação das vacina de DNA utilizando DNA
plasmidial. Após a imunização com vacina de DNA o antígeno pode ser apresentado
às células T pelas células apresentadoras de antígenos (APCs) ou células somáticas
(células musculares) transfectadas com o DNA plasmidial expressando antígenos.
Pelo contrário, estas células, particularmente as células somáticas, podem liberar
antígeno para outra APC, pela secreção ou da apoptose das células transfectadas.
Estas APCs podem então, apresentar antígeno para células T CD4+ e
CD8+............................................................................................................................39
Phylogenetic Analysis of Anaplasma marginale Strains from
Paraná State, Brazil, using the msp1
α
and msp4 genes
Fig.1.
Fig. 1. Amplification of
msp1
α
tandem repeat sequences from different strains of
Anaplasma marginale
by PCR using the 1733 forward and 2956 reverse primers
(Lew et al., 2002). Lanes 1 and 11, 100 bp ladder (Invitrogen
TM
); Lane 2–9
A.
marginale
strains: Lane 2, Florida; Lane 3, Parana1; Lane 4, Parana2; Lane 5,
Parana3; Lane 6, Rio Grande do Sul (RS18); Lane 7, Minas Gerais (UFV1); Lane 8,
Centro Oeste; Lane 9, São Paulo (Jaboticabal); Lane 10,
A. centrale.
.….............…68
Fig.2.
Sequence of MSP1a tandem repeats in New World strains of
Anaplasma marginale
.
(a) The one letter amino acid code was used to depict the different sequences found
in MSP1a repeats. Repeat forms
α
to
ϕ
were revised by de la Fuente et al. (2004) and
λ
to
θ
are the new repeat forms described from Brazilian strains. Asterisks indicate
identical amino acids. Gaps indicate deletions/insertions. (b) The structure of the
MSP1a repeat regions was represented for New World strains of
A. marginale
using
the repeat forms described in (a) ...………. ………………………………………...69
Fig.3.
Phylogenetic analysis of MSP1a amino acid sequences of
Anaplasma marginale.
Strains were divided according to the country of origin to emphasize geographical
distribution. Tree was constructed using the Vector NTI Advance
TM
10 Software
(bars represent substitutions per 1000 bp; sequence accessions numbers are given
after sequence) …………………………………………………………………...…70
Fig.4.
Phylogenetic analysis of MSP4 amino acid sequences of
Anaplasma marginale
.
Strains were divided according to the country of origin to emphasize geographical
distribution. Tree was constructed using the Vector NTI Advance
TM
10 Software
(bars represent substitutions per 1000 bp; sequence accessions numbers are given
after sequence) ………………...……………………………………………………71
Fig.5.
Phylogenetic tree showing the relationship of Anaplasma marginale strains
from different geographical locations based on the DNA msp
1
α
gene sequences
deposited in GenBank. Strains were divided according to the country of origin to
emphasize geographical distribution. Tree was constructed using the Vector NTI
Advance
TM
10 Software (bars represent substitutions per 1000 bp; sequence
accessions numbers are given after sequence)
…………………………………………………………….…72
Fig.6.
Phylogenetic tree showing the relationship of Anaplasma
marginale strains from different geographical locations
based on the DNA msp4 gene sequences deposited in
GenBank. Strains were divided according to the country of
origin to emphasize geographical distribution. Tree was
constructed using the Vector NTI Advance
TM
10 Software
(bars represent substitutions per 1000 bp; sequence
accessions numbers are given after sequence)
……………………………………………………………….72
DNA vaccines encoding Anaplasma marginale MSPs induced immunogenicity in BALB/c
mice
Fig.1.
Amplification of msp1
α
,
msp1
β
and
msp5
gene of
A. marginale
using pcDNA-
msp1
α
, pcDNA-
msp1
β
and pcDNA-
msp5
as template by PCR using specifics
primers for each full-length genes. Lane 1: 1 kb leader; Lane 2:
msp1
α
amplified
from pcDNA-
msp1
α
; Lane 3:
msp1
β
gene amplified from pcDNA-
msp1
β
; Lane 4:
msp5
gene amplified from pcDNA-
msp5;
Lane 5:100 bp ladder ……………….....95
Fig.2.
IgG antibody response measured by the indirect enzyme-linked immunosorbent
assay (ELISA) in BALB/c mice of the (a) G1 (phosphate buffer saline-PBS), (b) G2
(100
µ
g initial bodies
A. marginale
), (c) G3 (100
µ
g pcDNA-
msp1
α
), (d) G4 100
µ
g
pcDNA-
msp1
β
+ sucrose-phosphate-glutamato (SPG), (e) G4 (100
µ
g pcDNA-
msp1
β
+ 2% levamisole), (f) G5 (100
µ
g pcDNA-
msp5
+ SPG). Mice were
immunized and blood collected at weeks 0, 3, 6 and 9. Dashed line indicates positive
cut-off …………………………………………………………………………...…. 96
Fig.3.
Humoral responses of serum IgG isotype from BALB/c mice immunized with DNA-
vaccine encoding
A. marginale
MSP1a, MSP1b, and MSP5 proteins. Pool of serum
taken 0, 3, 6 and 9 weeks after initial immunization were analysed by ELISA. (a) G1
(phosphated buffer saline-PBS), G2 (100
µ
g initial bodies
A. marginale
+ Freund´s
Adjuvant), (c) G3 (100
µ
g pcDNA-
msp1
α
+ SPG), (d) G4 (100
µ
g pcDNA-
msp1
β
+
SPG), (e) G4 (100
µ
g pcDNA-
msp1
β
+ 2% levamisole) and (f) G5 (100
µ
g pcDNA-
msp5
+ SPG) ………………………………………………………...…………….. 97
Fig.4.
Figure. 4. Reactivity of sera from mice immunized with DNA vaccines encoding
MSP1a, MSP1b and MSP5 by Western blot. Serologic analysis was developed with a
pool of six groups antisera at weeks 0 and 9 from mice immunized in experimental
study. Lanes 1 and 2 represents pre immune sera. Lanes 3 and 4: post immune sera at
week 9. (A) G3 - pcDNA-
msp1
α
+ SPG (lanes 1 and 3: BL21
E. coli
; lanes 2 and 4:
rMSP1a). (B) G4 - pcDNA-
msp1
β
+ SPG (lanes 1 and 3: BL21
E. coli
; lanes 2 and
4: rMSP1b). (C) G5 - pcDNA-
msp1
β
+ levamisole 2% (lanes 1 and 3: BL21
E. coli
;
lanes 2 and 4: rMSP1b). (D) G6 - pcDNA-
msp5
+ SPG (lanes 1 and 3: BL21
E. coli
;
lanes 2 and 4: rMSP5). The positions and molecular masses (in kilodaltons) of
protein standarts are also shown ……….………………………….………………. 98
Fig.5.
In vitro
proliferation of splenocytes from DNA-vaccinated BALB/c mice after
stimulation of rMSP1b and rMSP5, MTT (3-(4.5-dimethylthaizol-2-yi)-2.5-
diphenyltetrazolium bromide) was added for 4 h. The incorporated MTT cell was
then measured. Control splenocytes from mice received the PBS. For comparative
purposes, splenocytes from no immunized BALB/c mice were included in the
experiment. Stimulation Index (SI) values higher than 2.0 (dashed line) was
considered significant …...……………………………………………...…………. 99
Enhanced immunogenicity of DNA vaccine encoding MSP1a, MSP1b, and MSP5
antigens of Anaplasma marginale in association
Fig.1.
Immunofluorescence of Vero cells transfected with DNA vaccine encoding
A.
marginale
MSP1a, MSP1b and MSP5 antigens, using monoclonal antibodies (400x)
a. non-transfected Vero cells; b. pcDNA-
lacZ
Vero cells transfected using anti-
histidine monoclonal antibody (positive control); c. pcDNA-
msp1
α
using ANA22B1
monoclonal antibody; d. pcDNA-
msp1
β
using anti-histidine monoclonal antibody; e.
pcDNA-
msp5
using ANAF16C1 monoclonal antibody ………………………….. 117
Fig.2.
Whole IgG antibody response measured by the indirect enzyme-linked
immunossorbent assay (ELISA) in immunized BALB/c mice. (a) G2 (only vector),
(b) G3 (100
µ
g initial bodies of
A. marginale
), (c) G4 (100
µ
g pcDNA-
msp1
α
), (d)
G5 (100
µ
g pcDNA-
msp1
β
), (e) G6 (100
µ
g pcDNA-
msp5
), (f) G7 (33
µ
g for each
pcDNA-
msp1
α
, pcDNA-
msp1
β
and pcDNA-
msp5
). Mice were immunized at weeks
0, 2, 5, 8 and 11, and the blood collect were at weeks –1, 1, 4, 7, 11 and 15 (back
arrows). Dashed line indicates positive cut-off ………………………….….…… 118
Fig.3.
IgG isotype humoral responses of serum from BALB/c mice immunized with DNA-
vaccine encoding
A. marginale
MSP1a, MSP1b, and MSP5 proteins. (a) G2 (only
vector), (b) G3 (100
µ
g initial
A. marginale
), (c) G4 (100
µ
g pcDNA-
msp1
α
), (d) G5
(100
µ
g pcDNA-
msp1
β
), (e) G6 (100
µ
g pcDNA-ms
p5
), and G7 pool of plasmids
(33
µ
g each pcDNA-
msp1
α
, pcDNA-
msp1
β
, and pcDNA-
msp5
). Measured IgG1
and IgG2a responses were taken of pool of serum at –1, 4, 11, and 15 weeks after
initial immunization by ELISA ………………...………………….……………... 119
Fig.4.
Reactivity of mice sera from
A. marginale
and DNA vaccine encoding MSP1a,
MSP1b and MSP5 of
A. marginale
by Western blot. Serologic analysis was
developed with a pool of seven antisera at weeks –1 and 15 from experimental group.
In A: mice immunized with empty vector (G2) (lane 1 and 2),
A. marginale
initial
bodies – G3 (lane 3 and 4), pcDNA-
msp1
α
– G4 (lane 5 and 6), pcDNA-
msp1
β
– G5
(lane 7 and 8), pcDNA-
msp5
– G6 (lane 9 and 10). In B: mice immunized with pool
of plasmid (pCnda-
msp1
α
, pcDNA-
msp1
β
and pcDNA-
msp5
). The positions and
molecular masses (in kilodaltons) of protein standarts are also
shown……………………………………………………………………………….118
Fig.5.
Proliferation of splenocytes cells from mice immunized with single DNA vaccine
encoding MSP1a, MSP1b and MSP5 and in association. The data are presented for
splenocytes proliferation cultured for 5 days with 5
µ
g of
A. marginale
homogenate/ml. Results are presented as means count per minute of triplicate ultures
in Stimulation Index values (SI). SI values > 2.0 (dashed line) were considered
significant. Experimental groups were: G1 (saline); G2 (empty vector); G3 (100
µ
g
initial bodies
A. marginale
); G4 (100
µ
g pcDNA-
msp1
α
); G5 (100
µ
g pcDNA-
msp1
β
); G6 (100
µ
g pcDNA-
msp5
) and G7 (33
µ
g for each pcDNA-
msp1
α
,
pcDNA-
msp1
β
and pcDNA-
msp5
) ………………………………..……………... 121
LISTA DE TABELAS
Phylogenetic Analysis of Anaplasma marginale Strains from
Paraná State, Brazil, using the msp1
α
and msp4 genes
Table 1.
Source of Anaplasma marginale strains used in this
study including molecular size and predicted number of
internal repeats of each product
amplified…………………………………………………….…………………..69
1. REVISÃO DE LITERATURA
17
1.1. REVISÃO DE LITERATURA
A anaplasmose é uma hemoparasitose de caráter febril e hemolítico de bovinos
causada pelo A
naplasma marginale
(Theiler, 1910). Esta riquétsia pertence à família
Anaplasmataceae (Dumler et al., 2001) e tem distribuição mundial. Bovinos das regiões de
clima tropical e subtropical são mais acometidos devido às condições climáticas favoráveis ao
desenvolvimento dos transmissores biológicos (carrapatos ixodídeos) e mecânicos (insetos
hematófagos) (Rickey, 1981; Kocan et al., 2004).
Os prejuízos econômicos ocasionados pela anaplasmose bovina são atribuídos à
redução na produção de carne e leite, abortamento, morte e ao custo com o tratamento dos
animais (Rickey, 1981; Kuttler, 1984). Bovinos que se recuperam da doença aguda tornam-se
persistentemente infectados e estão protegidos contra o desafio com cepas homólogas e
parcialmente protegidos ao desafio com cepas heterólogas (Kocan et al., 2003).
As medidas de controle da anaplasmose incluem: redução ou eliminação dos
transmissores utilizando o tratamento dos animais com produtos acaricidas e rotação de
pastagem; quimioprofilaxia; premunição com sangue de bovinos portadores; vacinação com
cepas vivas atenuadas ou com cepa heteróloga não-patogênica (
Anaplasma centrale
) ou com
vacinas mortas (Palmer, 1989; Kocan et al., 2003).
As vacinas em uso para a anaplasmose são compostas por cepas vivas atenuadas
de
A. marginale
ou pela cepa heteróloga de
A. centrale
. Essas vacinas apresentam limitações
devido à necessidade de criopreservação; eficácia (incapacidade para proteger contra cepa
heteróloga de
A. marginale
); dificuldade de padronização da quantidade de inóculo; risco de
transmissão de outros patógenos como os vírus da leucose enzoótica bovina (Rogers et al.,
1988),
Babesia
spp,
Trypanossoma
spp,
Brucella
spp,
Mycobacterium
spp e cepas heterólogas
de
A. marginale
, e possibilidade de indução de isoeritrólise nos recém nascidos (Kuttler et al.,
1984).
18
Os corpúsculos iniciais de
A. marginale
semipurificados induziram imunidade
eficaz contra a doença clínica (Montenegro-James et al. 1991). Adicionalmente, bovinos
imunizados com a fração de membrana externa do
A. marginale
demonstraram proteção total
aos desafios homólogos e heterólogos pela redução significativa de riquetsemia nos animais
imunizados (Tebele et al., 1991).
Estudos com bovinos e camundongos identificaram que a principal resposta da
imunidade protetora está relacionada com a proliferação de linfócito T CD4
+
, e a síntese de
interferon–gama (IFN-
γ
) e anticorpos da subclasse IgG2 contra os antígenos de superfície do
microrganismo do gênero
Anaplasma
(Brown et al., 1998). Entretanto, a identificação de
antígenos de membrana externa do
A. marginale
que confere imunidade protetora não é bem
caracterizada.
O seqüenciamento do genoma do
A. marginale
(cepa Saint Maries) identificou 21
proteínas antigênicas de membrana externa, das quais, quatorze são proteínas de secreção do
tipo IV (Lopes et al., 2005). Entre elas, seis proteínas principais de superfícies (MSPs) foram
melhor caracterizadas e designadas de MSP1a (105 kDa), MSP1b (100 kDa), MSP2 (36
kDa), MSP3 (86 kDa), MSP4 (31 kDa) e MSP5 (19 kDa) (McGuire, et al., 1984; Visser et al.,
1992; Oberle et al., 1993; McGarey et al., 1994; Palmer & Alleman et al., 1997). Estas
proteínas estão envolvidas nos mecanismos de transporte de nutrientes, adesão e invasão dos
eritrócitos, multiplicação nas células hospedeiras e com o mecanismo de evasão do sistema
imune (McGarey et al., 1994; McGarey & Allred, 1994; Lanzer et al., 1997; French et al.,
1998).
A MSP1 é um complexo protéico formado pelas MSP1a e MSP1b. A MSP1a é
codificada por um único gene (
msp1
α
) e apresenta variação na massa molecular de 70 a 105
kDa devido ao número de repetições
in tandem
de 28 a 29 aminoácidos entre as diferentes
cepas de
A. marginale
(Allred et al., 1990, de la Fuente et al., 2001; 2003). A MSP1b é
19
codificada por família multigênica (
msp
β
1
e
msp
β
2
) e apresenta massa molecular de 100 kDa
(Barbet & Allred, 1991, Camacho-Nuez et al., 2000). Este complexo protéico apresenta
função de adesina, onde a MSP1a participa na adesão em células de carrapatos e eritrócitos
bovinos e a MSP1b faz a adesão apenas em eritrócitos bovinos (McGarey et al., 1994; Blouin
et al., 2003; Garcia-Garcia et al., 2004).
A reação em cadeia pela polimerase (PCR), utilizando oligonucleotídeos
iniciadores (
primers)
que flanqueiam a região da seqüência repetitiva, possibilitou a
identificação do número de repetições existente entre as cepas de
A. marginale
(Lew et al.,
2002; Vidotto et al., 2006). As cepas australianas apresentaram apenas uma única seqüência
repetitiva, o que não foi verificado nas cepas de origem americana, mexicana, argentina e
brasileira de
A. marginale
que variaram entre uma a oito repetições
in tandem
(de la Fuente et
al., 2004, Vidotto et al., 2006). O gene
msp1
α
demonstrou ser um marcador genético estável
entre as cepas americanas de
A. marginale
(de la Fuente et al., 2001, Bowie et al., 2002).
Entretanto, a análise filogenética da seqüência de aminoácidos e de nucleotídeos da MSP1a
não possibilitou a definição ou distribuição das cepas brasileiras e do Novo Mundo de
A.
marginale
por regiões geográficas (de la Fuente et al., 2003).
A caracterização antigênica da MSP1a, utilizando o anticorpo monoclonal
ANA22B1, de cepas de
A. marginale
de diferentes regiões geográficas demonstrou a
conservação do epitopo (Kano et al., 2002, Oliveira et al., 2003). Dentro das seqüências
repetitivas da MSP1a existem aminoácidos conservados e variáveis e são reconhecidos
epitopos para linfócito T CD4
+
localizados, preferencialmente, na região amino-terminal
(Brown et al., 2002). A resposta humoral também é direcionada mais fracamente para a região
carboxi-terminal da MSP1a, diferentemente da região amino-terminal (Garcia-Garcia et al.,
2004). O epitopo da MSP1a foi reconhecido pelos linfócitos CD4
+
de memórias em bovinos
20
imunizados com proteínas de membrana externa e os bovinos apresentaram proteção total
contra o desenvolvimento da riquetsemia (Brown et al., 1998).
Animais imunizados com as proteínas MSP1a e MSP1b apresentaram diminuição
da parasitemia, leve queda de hematócrito e redução do número e gravidade dos casos clínicos
da doença. Os animais foram protegidos contra desafios homólogos e heterólogos (Palmer et
al., 1986; Barbet et al., 1987; Palmer et al., 1989; Brown et al., 2002).
A imunidade protetora conferida pela fração de membrana externa de
A. marginale
inclui as seis MSPs. Bovinos imunizados com esta fração, tiveram predomínio da resposta
humoral e celular (linfócito T) direcionada contra a MSP1, MSP2 e MSP3. Bovinos
imunizados com pcDNA/
msp1
β
, após o desafio também apresentaram forte resposta de
anticorpos direcionados para a MSP2 (Andrade et al., 2004). A MSP2 e a MSP3 são
codificadas por multigenes que apresentam variação genética e antigênica entre as cepas de
A.
marginale
(Alleman et al., 1997; French et al., 1998; Kano et al., 2002; Oliveira et al., 2003).
A variação antigênica da MSP2 pode ocorrer num mesmo ciclo de riquetsemia da infecção
aguda (Eid et al., 1996) e foram detectadas três variantes antigênicas da MSP2 numa infecção
persistente. Polimorfismos genéticos e antigênicos foram identificados na MSP2 e MSP3 e,
em função disso, são atribuídas a estas proteínas atividades no mecanismo de evasão da
resposta imune e persistência do microrganismo no hospedeiro (, French et al., 1998; Palmer
et al., 2000). A região hipervariável da MSP2 existem múltiplos epitopos para linfócito T
CD4
+
com produção de IFN-
γ
e estão em maior número na membrana (Brown et al., 2003;
Lopez et al., 2005).
As proteínas MSP4 e MSP5 são codificadas por um único gene (
msp4
e
msp5
) e são
conservadas antigênica e molecularmente em todas as cepas de
A. marginale
estudadas e entre
as espécies de
A. centrale
e
A. marginale
(Visser et al., 1992; Oberle et al., 1993; Knowles et
al., 1996; Kano et al., 2002). A MSP4 mostrou-se pouco imunogênica frente aos soros de
21
animais vacinados com a proteína nativa purificada do isolado Flórida de
A. marginale
(Oberle et al., 1993). A MSP5 é uma das proteínas de
A. marginale
mais estudadas e
utilizadas no diagnóstico de anaplasmose, além de demonstrar boa imunogenicidade
(Knowles et al., 1996; Lopez et al., 2005; Marana et al., 2006).
Cepas brasileiros de
A. marginale
apresentaram certo polimorfismo quanto aos
epitopos reconhecidos pelos anticorpos monoclonais, produzidos contra as MSPs da cepa
Florida, entre eles, os epitopos da MSP1b e MSP2. A MSP1a e MSP4 estão conservados entre
as cepas brasileiras. A MSP5 que apresenta epitopos conformacionais também se apresentou
conservada (Patarroyo et al., 1994; Kano et al., 2002).
A imunidade contra o
A. marginale
requer mecanismos humorais e celulares.
Anticorpos direcionados contra os corpúsculos iniciais bloqueiam a infectividade da riquétsia
(Palmer & McGuire, 1984). Possivelmente, anticorpos contra as MSPs funcionam como
opsoninas, facilitando a fagocitose e a eliminação de
A. marginale
por macrófagos (Cantor et
al., 1993). Outra possível função dos anticorpos neutralizantes seria o bloqueio da invasão da
riquétsia em eritrócitos. Anticorpos contra a MSP1a e a MSP1b bloqueiam a aglutinação de
eritrócitos de bovinos por corpúsculos inicias de
A. marginale
(McGarey & Allred, 1994; de la
Fuente et al., 2003; Tamekuni et al., 2006).
Isoladamente, é pouco provável que os anticorpos contra o
A. marginale
sejam
capazes de proteger os bovinos contra a anaplasmose (Brown et al., 2001), pois a inoculação
de soro de animais imunes em bovinos susceptíveis não protegeu contra o desafio com
A.
marginale
(Gale et al., 1992). Dessa forma, evidencia-se a importância da resposta celular, a
qual envolve a participação de linfócitos T auxiliadores (CD4
+
), produtores de interferon-
gama (IFN-
γ
) (Brown et al., 1998). Esta citocina ativa macrófagos, aumentando a produção de
óxido nítrico (NO), substância que apresenta ação tóxica sobre o
A. marginale
, estimulando a
expressão de receptores de Fc e a fusão de fagossomo e lisossomos (Brown et al., 1998). Em
22
bovinos o IFN-
γ
atua sobre linfócitos B, estimulando a produção de IgG2
(Cantor et al., 1994).
Este isotipo de imunoglobulina apresenta maior capacidade de promover fagocitose por meio
da opsonização em comparação ao isotipo IgG1 (McGuire et al, 1979), possivelmente por
estar envolvido no processo de neutralização da infectividade de corpúsculos iniciais de
A.
marginale
mediada por anticorpos (Tuo et al., 2000). Valdez et al. (2002) investigaram,
in
vitro
, a função de linfócitos T CD4
+
durante a anaplasmose aguda, mediante a depleção parcial
destas células com anticorpo monoclonal anti-CD4 em bezerros esplenectomizados. Não
foram observadas diferenças significativas com relação ao decréscimo do volume globular e
de riquétsemia dos animais com depleção de linfócitos CD4
+
e o grupo controle. Estes
resultados evidenciam a participação de linfócitos T CD4
+
na imunidade protetora para a
anaplasmose.
A avaliação da indução da resposta imune e a proteção clínica foram avaliadas
utilizando cepas heterólogas de
A. centrale
(Vidotto et al., 1998), fração de membrana externa
(Tebele et al., 1991), MSPs nativas (Palmer et al., 1986), MSPs recombinantes isoladamente
(Palmer et al., 1989), vacinas de DNA com os genes
msp1
α
(Arulkanthan et al., 1999) ou
msp1
β
(Andrade et al., 2004) de
A. marginale
. Os resultados obtidos demonstram o
desenvolvimento da indução da imunidade com proteção parcial ou total contra desafios
homólogos e heterólogos. A agregação de rMSPs recombinantes ao Complexo
Imunoestimulante (ISCOM) demonstrou boa indução da resposta humoral e celular em
camundongos (Kawasaki et al., 2007
in press
), o que pode ser avaliado em bovinos para
verificar a capacidade protetora desta construção. Recentemente, a identificação de novas
proteínas de membrana externa de
A. marginale
, como a VirB9 em vetor plasmidial de
expressão em células de mamíferos demonstrou capacidade promissora na indução da
imunidade protetora em bovinos (Lopez et al., 2007
in press
).
23
A identificação de outras proteínas com capacidade de indução da resposta imune
protetora é de grande importância para a incorporação em vacinas, para permitir o
entendimento das funções destas proteínas na patogênese do
A. marginale
e,
conseqüentemente, a proteção total contra cepas homólogas e heterólogas.
24
Referência Bibliográfica
ALLEMAN, A.R., BARBET, A.F., 1997. Evaluation of Anaplasma
marginale major surface protein 3 (MSP3) as a diagnostic test
antigen. Journal of Clinical Microbiology, v 34, 270-276,
1997.
ALLRED, D.R., MCGUIRE, T.C., PALMER, G.H., LEIB, S.R., HARLLINS, T.M.,
MCELWAIN, T.F., BARBET, A.F. Molecular basis for surface antigen size polymorphisms
and conservation of a neutralization-sensitive epitope in
Anaplasma marginale
.
Proceedings
of the National Academy of Sciences of the United States of America
, v.87, p.3220–3224,
1990.
ANDRADE, G.M., R.Z. MACHADO, R.Z., VIDOTTO, M.C., VIDOTTO, O. Immunization
of bovines using a DNA vaccine (pcDNA3.1/MSP1b) prepared from the Jaboticabal strain of
Anaplasma marginale
.
Annals of the New York Academy of Sciences
, v.1026, p.257-266,
2004.
ARULKANTHAN, A., BROWN, W.C., MCGUIRE, T.C., KNOWLES, D.P. Biased
immunoglobulin G1 isotype responses induced in cattle with DNA expressing
msp1
a of
Anaplasma marginale. Infection and Immunity
, v.67, n.7, p.3481–3487, 1999.
BARBET, A.F.; PALMER, G.H.; MYLER, P.J.; McGUIRE, T.C. Characterization of an
immunoprotective protein complex of
Anaplasma marginale
by cloning and expression of the
gene coding for polypeptide Am105L.
Infection and Immunity,
v.55, p.2428-2435, 1987.
BARBET, A. F.; ALLRED, D. R. The
msp1
β
multigene family of
Anaplasma marginale
:
nucleotide sequence analysis of an expressed copy.
Infection and Immunity
, v.59, n.3, p.971-
976, 1991.
BLOUIN, E.F., SALIKI, J.T., DE LA FUENTE, J., GARCIA-GARCIA, J.C., KOCAN, K.M.
Antibodies to
Anaplasma marginale
major surface proteins 1a and 1b inhibit infectivity for
cultured tick cells
. Veterinary Parasitology
, v.111, p.247-260, 2003.
BOWIE, M. V., de la FUENTE, J., KOCAN, K. M., BLOUIN, E. F., BARBET, A. F.
Conservation of major surface protein 1 genes of the ehrlichial pathogen
Anaplasma
marginale during cycling transmission between ticks and cattle.
Gene
, v.282, p.95–102, 2002.
BROWN, W.C., SHKAP, V., ZHU, D., McGUIRE, T.C., TUO, W., MCELWAIN, T.F.,
PALMER, G.H. CD4
+
T lymphocytes and immunoglobulin G2 responses in claves
immunized with
Anaplasma marginale
outer membranes and protected against homologous
challenge.
Infection and Immunity
, v.66, p.5406-5413, 1998.
BROWN, W.C.; PALMER, G.H.; LEWIN, H.A.; McGUIRE, T.C. CD4
+
T lymphocyte from
calves immunized with
Anaplasma marginale
Major Surface Protein 1 (MSP1), a heteromeric
complex of MSP1a and MSP1b, preferentially recognize the MSP1a carboxyl terminus that is
conserved among strains.
Infection and Immunity
, v.69, n.11, p.6853-6862, 2001.
BROWN, W.C.; McGUIRE, T.C.; MWANGI, W.; KEGERREIS, K.A.; MACMILLAN, H.;
LEWIN, H.A.; PALMER, G.H. Major histocompatibility complex class II-derived DR-
restricted memory CD4
+
T lymphocytes recognize conserved immunodominant epitopes of
Anaplasma
marginale major surface protein 1a.
Infection and Immunity
, v. 70, p. 5521, 2002.
BROWN, W.C., BRAYTON, K.A., STYLER, C.M., PALMER, G.H. The hypervariable
region of
Anaplasma marginale
major surface protein 2 (MSP2) contains multiple
immunodominant CD4
+
T lymphocyte epitopes that elicit variant-specific proliferative and
IFN-
γ
responses in MSP2 vaccinates.
The Journal of Immunology
, v.170, p.3790-3798, 2003.
25
CAMACHO-NUEZ, M., MUNHOZ, M. L., SUAREZ, C.E., MCGUIRE, T.C.,
BROWN, W.C., PALMER, G.H. Expression of polymorphic msp1b
genes during acute Anaplasma marginale rickettsemia. Infection
and Immunity, v.68, 1946-1952, 2000.
CANTOR, G.H., PONTZER, C.H., PALMER, G.H. Opsonization of
Anaplasma marginale mediated by bovine antibody against
surface protein MSP-1. Veterinary Immunology Immunophatology,
v.37, p.343-350, 1993.
de la FUENTE, J.; GARCIA-GARCIA, J.C.; BLOUIN, E.F.; KOCAN, K.M. Differential
adhesion of major surface proteins 1a and 1b of the erlichial cattle pathogen
Anaplasma
marginale
to bovine erythrocytes and tick cells.
Internal of Journal of Parasitology
, v.31,
p.145-153, 2001.
de la FUENTE, J.; GARCIA-GARCIA, J. C.; BLOWIN, E. F.; KOCAN, K. M.
Characterization of the functional domain of major surface protein 1a involved in adhesion of
the rickettsia
Anaplasma marginale
to host cells
. Veterinary Microbiology
, v.91, n. 2-3,
p.265-283, 2003.
de la FUENTE, J.; GARCIA-GARCIA, J.C.; BARBET, A.F.; BLOUIN, E.F.; KOCAN, K.M.
Adhesion of outer membrane proteins containing tandem repeats of
Anaplasma
and
Ehrlichia
species (Rickettsiales: Anaplasmataceae) to tick cells.
Veterinary Microbiology
, v.98, p.313-
322, 2004.
DUMLER, J. S., BARBET, A. F., BEKKER, C. P. J., DASCH, G. A.,
PALMER, G. H., RAY, S.T., RIKIHISA, Y., RURANGIRWA, F. R.
Reorganization of genera in families Rickettsiaceae and
Anaplasmataceae in the order Rickettsiales: unification of
some species of Ehrlichia with Anaplasma, Cowdria with
Ehrlichia with Neorickettsia, descriptions of six new species
combinations and designation of Ehrlichia equi and “EGH
agent” as subjective synonyms of Ehrlichia phagocytophila.
International Journal of Systematic and Evolutionary
Microbiology, v.51, p.2145-2165, 2001.
EID, G.; FRENCH, D. M.; LUNDGREN, A. M.; BARBET, A. F.; McELWAIN, T. F.;
PALMER, G. H. Expression of major surface protein 2 antigenic variants during acute
Anaplasma marginale
rickettsemia.
Infection and Immunity
, v.64, n.3, p.836-841, 1996.
FRENCH, D. M.; McELWAIN, T. F.; McGUIRE, T. C.; PALMER, G. H. Expression of
Anaplasma marginale
major surface protein 2 variants during persistent cyclic rickettsemia.
Infection and Immunity
, v.66, n.3, p.1200-1207, 1998.
GALE, K.R.; LEATCH, G.; GARTSIDE, M.; DIMMOCK, C.M.
Anaplasma marginale
:
failure of sera from immune cattle to confer protection in passive transfer experiments.
Parasitology Research
, v.78, p.410-415, 1992.
GARCIA-GARCIA, J.C., DE LA FUENTE, J., BLOUIN, E.F., JONSON, T.J., ALBUR, T.,
ONET, V.C., SALIKI, J.T., KOCAN, K.M. Differential expression of the
msp1
α
gene of
Anaplasma marginale
occurs in bovine erythrocytes and ticks cells.
Veterinary microbiology
,
v.98, p.261-272, 2004.
LEW, A.E., BOCK, R.E., MINCHIN, C.M., MASAKA, S. A
msp1
α
Polymerase Chain
Reaction assay for species detection and differentiation of
Anaplasma marginale
isolates.
Veterinary Microbiology
, v.86, p.325-335, 2002.
LOPEZ, J.E., SIEMS, W.F., PALMER, G.H., BRAYTON, K.A., McGUIRE, T.C.,
NORIMINE, J., BROWN, W.C. Identification of novel antigenic proteins in a complex
26
Anaplasma marginale
outer membrane immunogen by mass spectrometry and genomic
mapping.
Infection and Immunity
, v.73, p.8109-8118, 2005.
KANO, F., VIDOTTO, O., PACHECO, R.C., VIDOTTO, M.C. Antigenic
characterization of Anaplasma marginale isolates from
different regions of Brazil. Veterinary Microbiology, v.87,
p.131-138, 2002.
KAWASAKI, P.M., KANO, F.S., TAMEKUNI, K., GARCIA, J.L.,
MARANA, E.R., VIDOTTO, O., VIDOTTO, M.C. immune response of
BALB/c mouse immunized with recombinant MSPs proteins of
Anaplasma marginale binding to immunostimulant complex
(ISCOM). Research in Veterinary Science, v., 2007. in press
KOCAN, K.M., de la FUENTE, J., GUGIELMONE, A.A., MELÉNDEZ, R.D. Antigens and
alternatives for control of
Anaplasma marginale
infection in cattle.
Clinical Microbiology
Reviews
, v.16, p.698-712, 2003.
KOCAN, K.M., de la FUENTE, J., BLOUIN, E.F., GARCIA-GARCIA,
J.C. Anaplasma marginale (Rickettsiales: Anaplasmataceae)
recent advances in defening host-pathogen adaptations of a
tick-borne rickettsia. Parasitology, v.129, p.S285-S300, 2004.
KUTTLER K.L. Anaplasma infections in wild and domestic
ruminants: a review. Journal Wild Disease, v. 20, p.12-20,
1984.
LANZER, M.; GROSS, U.; MOLL, H. Mechanisms of parasite persistence and immune
evasion
. Parasitology Today
, v.13, n.1, p.1-3, 1997.
KNOWLES D., TORIONI DE ECHAIDE, S., PALMER G.H., MCGUIRE T.C., STILLER
D., MCELWAIN T.F. Antibody against
Anaplasma marginale
MSP-5 epitope common to
tick and erythrocyte stages identifies persistently infected cattle.
Journal of Clinical
Microbiology
, v.34, p.2225-2230, 1996.
LOPEZ, J.E., SIEMS, W.F., PALMER, G.H., BRAYTON, K.A., McGUIRE, T.C.,
NORIMINE, J., BROWN, W.C. Identification of novel antigenic proteins in a complex
Anaplasma marginale
outer membrane immunogen by mass spectrometry and genomic
mapping.
Infection and Immunity
, v.73, p.8109-8118, 2005.
LOPEZ, J.E., PALMER, G.H., BRAYTON, K.A., DARK, M.J., LEACH,
S.E., BROWN, W.C. Immunogenicity of Anaplasma marginale type
IV secretion system proteins in a protective outer membrane
vaccine. Infection and Immunity… in press
MARANA, E.R.M., KANO, F.S., TAMEKUNI, K., ATALIBA, A.C.,
VICENTINI, J.C., SPURIO, R.S., VIDOTTO, M.C., VIDOTTO, O.
Padronização e avaliação de um teste de ELISA por competição
para o diagnóstico da anaplasmose bovina utilizando a proteína
recombinante Msp5-PR1. Congresso Brasileiro de Parasitologia
Veterinária e II Simpósio Latino-Americano de Riquetisioses,
Anais..., 5, Ribeirão Preto,SP, 2006.
MCGAREY, D.J. AND ALLRED, D.R. Characterization of
hemagglutinating components on the Anaplasma marginale initial
body surface and identification of possible adhesins.
Infection and Immunity, v.62, 4587-4593, 1994.
MCGAREY, D.J., BARBET, A.F., PALMER, G.H., MCGUIRE, T.C.,
ALLRED, D.R. Putative adhesins of Anaplasma marginale: major
surface polypepitides 1a and 1b. Infection and Immunity, v.62,
p.4594-4601, 1994.
27
McGUIRE, T. C.; MUSOKE, A. J.; KURTTI, T. Functional properties of bovine IgG1 and
IgG2: interaction with complement, macrophages, neutrophils and skin
. Immunology
, v.38,
p.249-256, 1979.
MONTENEGRO-JAMES, S., JAMES, M.A, BENITEZ,M.T., LEON, E., BAEK, B.K.,
GUILLEN, A T. Efficacy of purified
Anaplasma marginale
initial bodies as a vaccine against
anaplasmosis.
Parasitology Research
, v.77, p.93-101, 1991.
OBERLE, S.M., PALMER, G.H., BARBET, A.F. Expression and immune
recognition of the conserved MSP-4 outer membrane protein of
Anaplasma marginale. Infection and Immunity, v.61, p.5245-
5251, 1993.
OLIVEIRA, J.B., MADRUGA, C.R., SCHENK, M.A.M, KESSLER, R.H., MIGUITA, M.,
ARAÚJO, F.R. 2003. Antigenic characterization of four Brazilian isolates of
Anaplasma
marginale
Rickettsiaceae: Ehrlichiae.
Memórias do Instituto Oswaldo Cruz
, v.98, p.395-400,
2003.
PALMER, G.H., MCGUIRE, W.C. Immune serum against
Anaplasma marginale
initial
bodies neutralizes infectivity for cattle.
The Journal Immunology
, v.133, p.1010–1015, 1984.
PALMER, G. H.; BARBET, A. F.; DAVIS, W.; McGUIRE, T. C. Immunization with an
isolate common surface protein protects cattle against anaplasmosis.
Science
, v.231, p.1299-
1302, 1986.
PALMER, G.H.
Anaplasma vaccines
. In: Wright, I.G. (Ed.), Vet. Protozoan Hemoparasite
Vaccine. CRC Press, Boca Raton, FL, pp. 1–29, 1989.
PATARROYO, J.H., HENCKEL, D.J., PRATES, A. A., MAFRA, C.L.
Antigenic profile of pure isolate of Anaplasma marginale of
Brazilian origin using western blot technique. Veterinary
Parasitology, v.52, p.124-137, 1994.
RICHEY, E.J. Bovine anaplasmosis. In: Howard, R.J. (ed.)
Current Veterinary Therapy: Food Animal Practice, p.767-772,
1981.
ROGERS, R.J., DIMMOCK, C.K., VOS, A.J., RODWELL, B.J. Bovine
leucosis virus contamination of a vaccine produced in vivo
against bovine babesiosis and anaplasmosis.
Australian Veterinary
Journal
, v.65, p.285-287, 1988.
TAMEKUNI K., KANO F.S., KAWASAKI P.M., IGARASHI M., ATALIBA
A.C., COELHO A.L.M., MARANA E.R.M., VIDOTTO M.C., VIDOTTO O.
Cloning, sequencing and antigenic characterization of Msp1a
and Msp1b recombinant proteins of the Anaplasma marginale PR1
strain. Congresso Brasileiro de Parasitologia Veterinária e
II Simpósio Latino-Americano de Riquetisioses, Anais..., 5,
Ribeirão Preto, SP., 2006.
TEBELE, N., MCGUIRE, T.C., PALMER, G.H., 1991. Induction of
protective immunity using Anaplasma marginale initial body
membranes. Infection and Immunity, v.59, p.3199-3204, 1991.
TUO, W.; PALMER, G.H.; McGUIRE, T.C.; ZHU, D.; BROWN, W.C. Interleukin-12 as an
adjuvant promotes immunoglobulin G and type 1 cytokine recall responses to major surface
protein 2 of the ehrlichial pathogen
Anaplasma marginale
.
Infection and Immunity
, v.68,
p.270, 2000.
VALDEZ, RA, MCGUIRE, TC, BROWN, WC, DAVIS, WC, JORDAN, JM, KNOWLES,
DP. Selective in vivo depletion of CD4
+
T lymphocytes with anti-CD4 monoclonal antibodies
28
during acute infection of calves with
Anaplasma marginale
.
Clinical and Diagnostic
Laboratory Immunology
, v.9, p.417-424, 2002.
VIDOTTO, O, FREIRE, R. L., MACHADO, R. Z., ROCHA, M. A., SILVA, S. S. Avaliação
do desempenho de uma vacina constituída por
Anaplasma centrale
e cepas atenuadas de
Babesia bigemina
e
Babesia bovis
contra a Tristeza Parasitária Bovina.
Semina: Ciências
Agrárias
, v.19, p.26-30, 1998.
VIDOTTO, M.C., KANO, F.S., GREGORI, F., HEADLEY, S.A.,
VIDOTTO, O. Phylogenetic analysis of Anaplasma marginale
strains from Paraná State, Brazil, using the msp1
α
and msp4.
Journal of Veterinary Medicine. B, Infectious Diseases and Veterinary Public Health
, v. 53,
p.404-411, 2006.
VISSER, F.S., MCGUIRE, T.C., PALMER, G.H., DAVIS, W.C., SHKAP,
V., PIPANO, E., KNOWLES, D.P. The Anaplasma marginale MSP-5
gene encodes a 19 kilodalton protein conserved in all
recognized Anaplasma species. Infection and Immunity, v.60,
p.5139-5144, 1992.
29
30
1.2. ARTIGO DE REVISÃO
Artigo editado de acordo com as normas de publicação do periódico Semina: Ciências
Agrárias
Vacina de DNA: Aspectos gerais e sua aplicação na medicina humana e veterinária
DNA vaccines: General concerns and its applications in human and veterinary medicine
Authors:
Flora S. Kano, Odilon Vidotto e Marilda C. Vidotto*
Universidade Estadual de Londrina, Departamento de Medicina Veterinária Preventiva, Campus Universitário, Caixa postal 6001, 86051-970
Londrina, Paraná, Brasil.
*Universidade Estadual de Londrina, Depto de Medicina Veterinária Preventiva-CCA, Campus
Universitário, Caixa Postal 6001, 86051-970 – Londrina, Pr- Brasil.
Fone: 55- 021 43 3371 4068. Fax: 55- 021 43 33274207 E-mail: [email protected]
31
32
Resumo
A vacinação com DNA é uma das mais promissoras técnicas de imunização contra uma variedade de
patógenos e tumores, para os quais os métodos convencionais não tem sido eficientes. Vacinas de
DNA são capazes de induzir resposta imune humoral e celular, tanto para resposta de linfócitos CD4
+
quanto CD8
+
, sem a necessidade de microrganismos vivos. Apesar do grande potencial de induzir
imunidade protetora, a vacina de DNA nem sempre apresenta bons resultados. A imunidade depende
de vários fatores como a seleção do gene alvo, construção do vetor de expressão, freqüência e via de
administração da vacina, quantidade de DNA, localização do antígeno codificado pelo plasmídio e
idade, saúde e espécies de animais vacinados. Esta revisão relata o desenvolvimento de algumas
vacinas de DNA para doenças de interesse na medicina veterinária e humana.
Palavras-chave:
Anaplasma marginale, vacina de DNA, bovinos, resposta humoral, resposta celular
Abstract
The vaccination with DNA is one of the most promising immunization techniques against a pathogens
variety and tumors, for which the conventional methods have not been efficient. DNA vaccines are
capable to induce immune humoral and cellular response, directed to lymphocytes CD4+ and CD8+,
without the necessity of live microorganisms. In spite of the great potential of inducing protective
immunity, the DNA vaccine not always has success. The immunity depends on several factors such as
the selection of the target gene, construction of the expression vector, frequency and route of
administration of the vaccine, amount of DNA, location of the antigen codified by the plasmid and age,
health and species of vaccinated animals. This revision shows the development of some vaccines of
DNA for diseases of interest in the veterinary and human medicine.
Key words:
Anaplasma marginale, DNA vaccine, cattle, humoral response, cellular response
Introdução
A vacinação é a medida mais eficiente e menos dispendiosa para evitar doenças infecciosas.
Apesar dos grandes benefícios das vacinas existentes, há ainda muitas doenças para as quais não
33
existem vacinas. Recentemente tem ocorrido o ressurgimento de várias doenças, principalmente nos
países em desenvolvimento.
Diversas estratégias têm sido utilizadas para o desenvolvimento de diferentes tipos de vacinas.
As vacinas de primeira geração foram produzidas com microrganismos vivos e atenuados, como a
vacina BCG contra a tuberculose, ou mortos e inativados como a vacina contra a Bordetella pertussis
(BLOOM, 1989). Na última década, o grande avanço da biologia molecular permitiu a introdução de
novas estratégias para a obtenção e a produção de antígenos e foram otimizadas novas maneiras de se
administrar e apresentar esses antígenos para as células do sistema imune. Estas estratégias permitiram
o desenvolvimento de vacinas mais seguras, eficazes e polivalentes. Entre estas estão as de
subunidades, consideradas de segunda geração, constituídas de antígenos purificados e provenientes de
fontes naturais ou sintéticas, e antígenos recombinantes. As vacinas gênicas ou de terceira geração
surgiram com a introdução de genes ou fragmentos de genes, que codificam antígenos potencialmente
imunogênicos, em vetores virais ou em DNA plasmidial (RODRIGUES JR et al., 2004).
A vacina de DNA foi descrita em 1990, quando o plasmídio contendo um gene repórter que
codifica a β-galactosidase expressou a proteína após a inoculação direta no músculo de camundongos
(WOLFF et al., 1990). Este estudo avaliou fatores que determinam a eficiência da transferência do
gene e da imunogenicidade conferida pela inoculação do plasmídio. Posteriormente, a inoculação de
DNA que codifica uma proteína imunogênica do vírus influenza conferiu imunidade protetora em
camundongos (ULMER et al., 1993). A partir destes resultados, o entendimento sobre o mecanismo
imunológico induzido por este tipo de vacina despertou interesse da comunidade científica.
Diversos trabalhos têm demonstrado a indução da imunidade protetora em camundongos pela
imunização genética contra uma variedade de microrganismos como vírus (DAVIS & McCLUSKIE,
1999), bactérias (STRUGNELL et al., 1997) e protozoários (KALINNA, 1997), contra o câncer (LIU
et al., 2004) e algumas doenças autoimunes (RAMSHAW et al., 1997). Na medicina humana, as
pesquisas com vacinas de DNA têm sido direcionadas principalmente para a AIDS, malária e
tuberculose (WANG et al., 1998, WANG et al., 2005; ZHANG et al., 2007). A utilização da vacinação
por DNA na terapia contra tumores gerou resultados satisfatórios (LIU et al., 2004) e, recentemente,
resultou no controle de crescimento de melanoma em estágio avançado (LIAO et al., 2006).
34
A administração de uma única dose de plasmídio pode proporcionar um amplo espectro de
resposta imune, incluindo a ativação dos linfócitos T CD8
+
e linfócitos T CD4
+
, os quais secretam
citocinas e têm função reguladora na produção de anticorpos (KOWALCZYK & ERTL, 1999). O
sucesso da imunização com DNA depende, principalmente, da natureza dos antígenos, da freqüência e
via de administração, da concentração de DNA administrada, da localização celular do antígeno
codificado pelo plasmídio (secretado, ligado à membrana ou citoplasmático), da idade e saúde do
hospedeiro e da espécie dos animais vacinados (RAINCZUK et al., 2003; MOREL et al., 2004;
ROBINSON, 1997; FYAN et al., 1993).
O material genético dos microrganismos é pouco estável na célula humana devido ao tamanho
da molécula de DNA e à repulsão existente entre as cargas negativas da membrana da célula e do
DNA. Quando o material genético não é transfectado à célula, rapidamente é degradado pelas
nucleases (LEVY et al., 1996) e não haverá produção de anticorpos pela ausência da expressão
protéica. Para facilitar a entrada do DNA na célula são utilizadas, em geral, partículas virais e
lipossomas (PERKINS et al., 2005; BRIANE et al., 2002), mas há reações adversas. No caso das
partículas virais o risco está na toxicidade dos vírus, que podem se integrar à célula (GLENTING &
WESSELS, 2005). Melhorar a propagação pelas células é de grande importância para o
desenvolvimento de vacinas de DNA, uma vez que a indução efetiva da imunidade tem requerido
várias imunizações utilizando concentrações altas de plasmídios (MWANGI et al., 2005).
Construção da vacina de DNA
A vacina é baseada na tecnologia do DNA recombinante que envolve a transferência de um
determinado gene (transgene), que codifica uma proteína (imunógeno), dentro de um vetor de
expressão para células eucarióticas (WAINE & McMANUS, 1995).
Durante a década de 90, diferentes vetores que expressam genes em células de mamíferos
foram desenvolvidos, bem como novos métodos de transferência gênica direta (AZEVEDO et al.,
1999). Um vetor ideal deve carrear grande capacidade genômica; ser de fácil produção; direcionar a
resposta imune para tipos específicos de células; não permitir replicação autônoma do DNA; garantir
uma expressão gênica por longo período; não ser tóxico; e não induzir reações de tolerância e auto-
35
imune nos hospedeiros (GLENTING & WESSLES, 2005). Os vetores virais e plasmidiais são os mais
utilizados na transferência gênica direta.
Os vetores virais são de fácil propagação entre as células, eficazes na ativação tanto da resposta
imune humoral quanto celular e requerem muitas vezes, apenas uma aplicação (SEDEGAH et al.,
1998). Entretanto, têm a desvantagem de serem derivados de patógenos; apresentarem risco de
mutagênese insercional; inativação pelo sistema complemento; e serem contra-indicados para pessoas
com imunodepressão. Portanto, os vetores virais são de interesse limitado para o propósito de
imunização dependendo do gene em questão (GLENTING & WESSELS, 2005).
Um dos vetores utilizados nas vacinas de DNA é o plasmídio bacteriano, desenvolvido
originalmente para expressão in vitro de proteínas em células de mamíferos (DAVIS & McCluskie,
1999). Os plasmídios apresentam maior segurança biológica, baixo custo, fácil produção, relativa
estabilidade e capacidade genômica de 2 a 19 kilobases, que podem ser transferidos para as células
musculares.
Os plasmídios utilizados como vacinas devem conter os seguintes elementos
essenciais: i) um promotor de expressão para células de mamíferos; ii) sinal de poliadenilação
(poliA) do transcrito (mRNA), iii) um marcador de seleção; iv) uma origem de replicação
procariótica e v) sítio de múltipla clonagem onde é inserido o gene de interesse. Outras
seqüências também são importantes como intron que aumenta a atividade do promotor,
peptídeo sinal e seqüências de seis nucleotídeos com função imunoestimulatória
(GURUNATHAN et al., 2000; GLENTING & WESSELS, 2005), como mostra a Figura 1.
36
Figura 1. Representação esquemática das principais características genéticas de um vetor plasmidial
utilizado na vacina de DNA. Fonte: GLENTING & WESSELS, 2005
Os plasmídios que possuem um forte promotor e que induzem a expressão em altos níveis da
proteína em células eucarióticas, induzem uma melhor resposta imune (GARMONY et al., 2003). Os
promotores de origem vírica como do citomegalovírus humano (hCMV) ou do vírus Simius 40 (SV40)
induzem forte expressão protéica quando comparados com outros promotores (NORMAN et al., 1997,
GARMONY et al., 2003), embora promotores de expressão alternativos como do vírus do sarcoma
(RSV) possam ser utilizados. A expressão de um gene varia conforme o elemento regulatório. A
expressão da glicoproteína D (gD) do herpesvírus bovino 1 (BoHV-1) sob o controle do promotor do
citomegalovírus foi superior ao promotor originado do vírus do sarcoma humano. Entretanto, a
característica do gene em questão pode influenciar na expressão protéica sob a regulação do mesmo
promotor. A expressão da hemaglutinina do parainfluenzavírus bovino 3 e o gene OMLA do
Actinobacillus pleuropneumoniae sob a regulação do promotor hCMV foi significativamente superior
ao gene da gD do BoHV-1 (van DRUNEN LITTEL-van den HURCK et al., 1999).
Posteriormente à região do promotor de expressão há uma região de múltiplos sítios de
clonagem, seguida do gene da seqüência de poliadenilação (poliA), para proporcionar estabilidade à
fita do RNA mensageiro (RNAm). A origem da seqüência de poliA mais utilizada é originada do gene
do hormônio de crescimento bovino (BGH) ou do SV40 (XU, et al., 2001, GARMONY et al., 2003).
37
Os genes bacterianos de resistência aos antibióticos como a ampicilina e a kanamicina são os
marcadores de seleção mais utilizados. Entretanto, a tendência é a substituição por vetores que não
utilizam genes de resistência aos antimicrobianos devido ao risco do plasmídio transformar a
microbiota do hospedeiro e disseminar a resistência aos antimicrobianos (GLENTING & WESSELS,
2005). A origem de replicação bacteriana é derivada da Escherichia coli ColE1 que está presente nos
plasmídios de clonagem da série pUC. Esta origem de replicação proporciona um elevado número de
cópias de plasmídios, a qual permite a obtenção de grande quantidade de plasmídios purificados
(AZEVEDO et al., 1999, GURUNATHAN et al., 2000, GARMONY et al., 2003).
Vantagens e os potenciais problemas das vacinas de DNA
As vacinas de DNA oferecem uma série de vantagens quando comparadas às vacinas clássicas,
em termos econômicos e técnicos. O custo de produção das vacinas gênicas em larga escala é
consideravelmente menor ao custo de produção das vacinas compostas de fração subcelular, proteínas
recombinantes e peptídeos sintéticos (WHALEN, 1996, ROBINSON, 1997). O controle de qualidade é
mais fácil, a comercialização não necessita de uma rede de refrigeração, pois estas vacinas são estáveis
à temperatura ambiente e podem ser liofilizadas (WAINE & McMANUS, 1995). Estes fatores
facilitam o transporte, a distribuição e o estabelecimento de amplos programas de imunizações em
regiões de difícil acesso, o que seria interessante para a realidade brasileira e de outros países em
desenvolvimento (AZEVEDO et al., 1999, GLENTING & WESSLES, 2005).
A principal vantagem da vacina de DNA é que assim como as vacinas atenuadas ela induz a
produção de anticorpos e de resposta imune celular, tanto linfócitos T auxiliares (CD4
+
) quanto T
citotóxico (CD8
+
) (van TIENHOVEN et al., 2001, NAGATA et al., 2004). Adicionalmente, as vacinas
gênicas não são afetadas pelos anticorpos maternos, não apresentam risco de reversão da atenuação e
podem ser produzidas contra agentes infecciosos de difícil cultivo e atenuação. A vacina pode ainda ser
co-administrada para multiagentes ou multiepitopos de um determinado agente infeccioso (HAN et al.,
1999, DOOLAN & HOFFMAN, 1997).
No caso de indivíduos imunocomprometidos, um grupo com alto risco de desenvolver uma
doença, a vacina de DNA seria interessante, pois uma vacina comercial como, por exemplo, contra a
38
tuberculose (BCG) é contra-indicada (WHALEN, 1996). Em crianças e idosos, cujo sistema
imunológico se apresenta imaturo ou deficiente, a avaliação da vacina de DNA não apresentou os
riscos proporcionados pelas vacinas vivas atenuadas (SIEGRIST, 1997).
A tecnologia do DNA recombinante permite modificações nas seqüências gênicas, objetivando
a melhoria na resposta imunológica do hospedeiro, tais como incorporações de seqüências
imunoestimulatórias (ISS), seqüências de genes que codificam interleucinas e genes virais que
codificam proteínas que melhoram a propagação em células
(RAINCZUK et al., 2003; ZHENG et al.,
2005).
Os riscos que podem ser gerados com vacinas de DNA, como a integração do plasmídio ao
genoma hospedeiro, gerando mutagênese pela ativação de protoncogenes ou pela inativação de genes
supressores de tumor, estão sendo avaliados. Estudos têm mostrado baixa probabilidade de ocorrer
integração do plasmídio. Três diferentes vacinas de DNA contendo genes virais foram avaliadas em
camundongos, e se a integração tivesse ocorrido, a freqüência seria de oito integrações do DNA por
células diplóides. Isto seria três vezes abaixo da freqüência de mutação espontânea. Contudo, ensaios
de integração são necessários para todos os DNA plasmidiais que serão usados em vacinas ara uso
clínico. Outros riscos incluem a indução de tolerância, devido à apresentação do antígeno em longo
prazo, ou reações auto-imunes devido à indução de anticorpos anti-DNA. Estes anticorpos têm
aumentado de 20-30% em seres humanos, os quais não induzem qualquer doença com os títulos
apresentados, ao contrário do aumento de 100-1000 vezes detectado em pacientes com doenças auto-
imunes (HENKE, 2002).
Mecanismo de Ação e Indução da Resposta Imune
Inicialmente os mecanismos de processamento e apresentação de antígenos em células
musculares foram questionados, uma vez que estas células não expressam antígenos associados ao
complexo principal de histocompatibilidade de classe II (MHC II), moléculas co-estimuladoras B-7 e
ao antígeno-3 associado à função da integrina do leucócito, presentes em células especializadas em
apresentação de antígenos (BOYLE et al., 1998; LATOUCHE & SADELAIN, 2000). As células
musculares, provavelmente, liberam antígenos localmente, os quais são processados pelas células
39
apresentadoras de antígenos (APCs), tais como as células dendríticas e as de Langerhans (RAZ et al.,
1993, WOLFF et al., 1990, MUMPER & LEDEBUR, 2001).
No mecanismo proposto (Figura 2), após a inoculação intramuscular, o DNA é incorporado às
células musculares (miócitos) e/ou células APC. Os DNAs que forem endocitados pelas células no sítio
de inoculação permanecem no núcleo celular sem ocorrer incorporação ao genoma da célula
hospedeira. As vias metabólicas da célula hospedeira são utilizadas para os processos de transcrição do
DNA inoculado e, em seguida, o RNA mensageiro é traduzido para que ocorra a síntese do antígeno
protéico relacionado ao agente infeccioso. Os antígenos expressos endogenamente são processados
pelas APCs e os fragmentos resultantes complexados com moléculas de classe I que são codificadas
por genes do complexo de histocompatibilidade (MHC I). Em seguida, estes peptídeos são
apresentados na superfície celular para o reconhecimento e ativação específica de linfócitos T CD8
citotóxicos. Alguns dos antígenos produzidos pelas células musculares são secretados para o espaço
extracelular, onde podem tanto estimular linfócitos B a produzir anticorpos específicos como ser
endocitados por outras células apresentadoras de antígenos. No processo de endocitose os antígenos
passam do compartimento extracelular para o interior das células APC e, por este motivo, são
considerados antígenos exógenos e assim processados em compartimentos celulares diferentes
daqueles realizados quando o antígeno é originado dentro da célula. Os fragmentos de antígenos
exógenos são complexados com moléculas da classe II e apresentados na superfície das células
apresentadoras para o reconhecimento e ativação de linfócitos T CD4 auxiliares. As vacinas de DNA
são, portanto, capazes de induzir ambos os tipos de imunidade protetora, humoral e celular, com a
estimulação de linfócitos T CD4
+
e T CD8
+
, sem alguns dos possíveis riscos associados às vacinas com
organismos vivos (HENKE, 2002).
Após o processamento e apresentação de antígenos pelas APCs são produzidas citocinas, como
a IL-12, que estimula a diferenciação das células T virgens em Th1 efetoras (SIN et al., 1999). Por sua
vez, as células Th1 produzem citocinas como o IFN-
γ
que pode atuar na célula alvo que carreia o
transgene (OLIVEIRA et al., 1998; NAGATA et al., 2004) e melhorar a expressão de moléculas de
MHC classe II pelos macrófagos, facilitando a apresentação do antígeno e a ativação da célula T.
40
Figura 2. Hipótese mais aceita do mecanismo de ação da vacina de DNA utilizando DNA plasmidial.
Após a imunização com vacina de DNA o antígeno pode ser apresentado às células T pelas células
apresentadoras de antígenos (APCs) ou células somáticas (células musculares) transfectadas com o
DNA plasmidial expressando antígenos. Estas células, particularmente as células somáticas, podem
liberar antígeno para outra APC, pela secreção ou por apoptose das células transfectadas. Estas APCs
podem então, apresentar antígeno para células T CD4+ e CD8+. Fonte: adaptado
http://www.brookscole.com
No plasmídio contendo o transgene, pode-se clonar os genes que codificam os componentes
estimuladores da resposta imune (IL-2, IL-12 e IFN-
γ
) ou mesmo co-administrar os plasmídios
recombinantes que codificam estas citocinas. Isto auxilia no processo de reconhecimento antigênico
entre as APCs e os linfócitos (RAZ et al., 1993; XIANG et al., 1997).
41
A imunidade adquirida pela vacina de DNA persiste por longo período de tempo devido à
constante produção endógena do antígeno pela célula hospedeira e à capacidade destes antígenos
estimularem linfócitos de memória imunológica (SNADEEP et al., 1996).
A imunidade humoral é responsável por uma significativa resposta preventiva nas infecções e a
IgG2a tem sido o isotipo predominantemente induzido pelas vacinas de DNA plasmidial
(VERCAMMEN et al., 2000; OÑATE et al., 2003). O IFN-
γ
produzido pelo linfócito Th1 é uma
importante citocina moduladora de células B para a secreção de IgG2a antígeno específico. Em muitas
infecções por microrganismos intracelulares em camundongos a resposta humoral é caracterizada pelo
predomínio dessa imunoglobulina (COUTELIER et al., 1991, NAGATA et al., 2004). Por outro lado, a
produção de imunoglobulinas IgG1 e IgE específicas, dependem, em parte, da presença da interleucina
4 (IL-4) produzida pela subpopulação de linfócitos T auxiliares (Th2) (SNAPPER et al., 1988).
Fatores como dose de antígeno, tipo de patógeno, a espécie animal, via de infecção ou
imunização, formulação da vacina, e a forma do antígeno (solúvel ou associado) influenciam no
desenvolvimento do tipo de resposta imune (FYAN et al. 1993, MOREL et al. 2004, JIN et al., 2004,
NAGATA et al., 2004).
Adjuvantes para vacina de DNA e seu papel na imunidade inata
Nas vacinas de subunidade, tais como as vacinas constituídas por proteínas recombinantes,
freqüentemente há necessidade da utilização de adjuvantes para aumentar a imunogenicidade do
antígeno (ULMER et al., 2006). Os adjuvantes, em sua maioria, são moléculas derivadas de patógenos
como o lipídeo monofosforil; derivados de saponina QS21; adjuvantes químicos como o levamisol e a
bupivacaína; e seqüências CpG que ativam células do sistema imune inato. Uma vez ativada essas
células modulam e direcionam para a resposta imune adquirida ou adaptativa (SINGH & O’HAGAN,
2002; LIMA et al., 2004, JIN et al., 2004).
As seqüências CpG imunoestimulatórias são originadas de DNA bacteriano, não metiladas
com dinucleotídeos CpG flanqueados por purinas e pirimidinas, diferentemente do DNA de
vertebrados. Estas seqüências podem estar presentes em plasmídios bacterianos ou ser associadas ao
plasmídio recombinante para aumentar a efetividade da vacina. O sistema imune de vertebrados detecta
42
a presença do DNA CpG estranho pela ligação com o receptor Toll-like (TLRs) das células APCs e
liberação de citocinas, os quais estimulam a resposta imune adquirida (SINGH & O’HAGAN, 2002).
O efeito adjuvante das seqüências CpG é influenciado pela presença do antígeno e liberação do DNA
(SINGH et al., 2000; COBAN et al., 2005). Existem controvérsias sobre o efeito adjuvante das
seqüências CpG porque nem sempre a incorporação em plasmídio demonstrou melhora na resposta
imune. Entretanto, há resultados que demonstram o aumento da imunogenicidade da vacina (ULMER
et al., 2006).
Seqüências que codificam citocinas, quimiocinas e moléculas co-estimulantes podem ser
incorporadas ou co-administradas aos plasmídios recombinantes para modular a resposta imune
(ULMER et al., 2006). As citocinas avaliadas como adjuvantes incluem IL-1, IL-2, IL-12, IFN-γ e o
fator estimulante de macrófago granulocítico (GM-CSF) (PASQUINI et al., 1997). Contudo, todas
estas moléculas exibem toxicidade relacionada à dose. Genes que codificam citocinas, incluindo IL-2,
IL-4, IFN-γ foram testados para avaliar a habilidade de ampliação da resposta imune em camundongos
(DUFOUR, 2001). A incorporação do gene do GM-CSF de suíno na vacina de DNA contra a Doença
de Aujeszky (DA) demonstrou aumento da proteção clínica de suínos, proporcionada pelo aumento da
atividade de célula T (SOMASUNDARAM et al., 1999). A adição do gene que codifica o IFN-γ à
vacina de DNA contra vírus da imunodeficiência felina (FIV) também aumentou a proteção clínica
revelando um decréscimo da carga viral após a infecção (HOSIE et al., 1999). Entretanto, a
incorporação do gene do IFN-γ suíno reduziu a proteção clínica contra a DA (SOMASUNDARAM et
al., 1999).
Outra citocina particularmente interessante, a IL-15, semelhante a IL-2, tem importante
participação na proliferação das células T de memória CD8
+
(KUTZLER et al., 2005). Porém, o DNA
plasmidial que codifica a IL-15 tem o seu uso limitado devido sua regulação complexa, que resulta na
baixa expressão da citocina in situ. Contudo, em recente estudo, uma forma do plasmídio IL-15
aumentou a proliferação, longevidade e função efetora das células T CD8+, quando medida pelo
aumento da imunogenicidade e eficácia protetora da vacina de DNA para influenza e HIV em
camundongos (KUTZLER et al., 2005).
43
Genes de receptores estimulatórios (NKG2D) encontrado nas células natural killer (NK) e nas
células T citotóxica também podem ser incorporados ao DNA plasmidial. Esta incorporação
demonstrou aumento da eficácia das vacinas de DNA contra o câncer em camundongos (ZHOU et al.,
2005).
Vias de administração da vacina de DNA
A administração da vacina de DNA utilizando a inoculação direta do plasmídio pelas vias
intratraqueal, intravenosa, intrabursal, intraorbital, intradérmica, intramuscular, oral, subcutânea e via
mucosa demonstraram sucesso na indução da resposta imune em todas as vias testadas (FYNAN et al.,
1993; ULMER et al., 1997; UCHIJIMA et al., 1998; REN et al., 2002; YOSHIDA et al., 2000; CONG
et al., 2005, LI, et al., 2006). Entretanto, algumas vias proporcionaram maior ou menor nível de
expressão de antígenos influenciando diretamente na imunogenicidade da vacina.
Os níveis de expressão dos antígenos obtidos pelas diferentes vias de administração parecem
estar relacionados com a quantidade de células transfectadas obtidas após administração dos
plasmídios. A via intramuscular (i.m.) e a intradérmica (i.d.) liberam o DNA plasmidial no meio
extracelular, localização pela qual, a maioria do DNA é rapidamente degradada pelas nucleases (LEVY
et al., 1996). Diferentemente, o sistema gene gun libera o DNA dentro das células amenizando a perda
inicial do DNA. Nos trabalhos iniciais avaliando as vias de administração da vacina foi necessária uma
concentração de DNA pela via intramuscular 100 vezes maior que o sistema gene gun para
proporcionar uma resposta imune equivalente (ROBINSON, 1997).
O sistema gene gun utilizado para vacinas de DNA foi avaliado em bovinos, eqüinos, suínos,
caninos e em aves (FYAN et al., 1993; MACKLIN et al., 1998; VANROMPAY et al., 1999). Em
galinhas, o gene gun foi o sistema mais eficiente para a liberação da vacina de DNA para influenza
(FYNAN et al., 1993). Em perus, a combinação das vias i.m. e intranasal induziu equivalente proteção
contra a Clamydia psittaci comparada à liberação obtida pelo gene gun (VANROMPAY et al., 1999).
Por outro lado, em suínos as imunizações pela via i.m. da vacina de DNA contra peste suína clássica
induziram mais altos títulos de anticorpos do que pelo sistema gene gun (ANDREW et al., 2000).
44
Assim, a eficácia da vacina de DNA varia com vários fatores que podem influenciar nestas vias de
administração, como vetor, adsorção às partículas, a espécie animal e o patógeno.
O tipo de vetor utilizado nas imunizações com DNA na geração da resposta imune protetora
adquirida foi relatado. A imunização de camundongos com os vetores VR1020 (expressa proteína
secretória) e o vetor que expressa a proteína quimotática associada ao monócito 3 (MCP-3),
administradas pela via i.d., induziram altos títulos de anticorpos. Contudo apenas o vetor MCP-3
apresentou resposta imune protetora pela imunização com DNA plasmidial. A proteção utilizando o
vetor VR1020 foi observada apenas após o reforço da dose com proteínas recombinantes (RAINCZUK
et al., 2003).
A localização celular da proteína, influenciada pela via, é importante no tipo de resposta imune
gerada (LEWIS et al., 1999, MOREL et al., 2004). Geralmente, a imunização pela via i.m. induz
preferencialmente a resposta Th1, enquanto que o sistema gene gun administrado na derme, estimula a
reposta Th2 ou uma resposta balanceada Th1/Th2, caracterizando a resposta imune humoral
(NAFTZGER et al., 1996; WEBER et al., 1998). Entretanto, a imunização de camundongos por
sistema gene gun com plasmídios que codificam proteínas (ovoalbumina) citoplasmáticas e
transmembrana induziram forte resposta imune Th1 e CD8
+
(MOREL et al., 2004). O predomínio da
resposta Th1, determinada pelos títulos de IgG2a (razão de IgG2a/IgG1 =3), também foi demonstrado
em camundongos imunizados com o plasmídio contendo o gene da proteína do envelope do vírus da
encefalite japonesa. Por outro lado, quando os plasmídios foram administrados revestidos com
micropartículas catiônicas foram observadas tanto a resposta Th1 quanto Th2 e os títulos de anticorpos
IgG2a e IgG1 foram similares (razão of IgG2a/IgG1 =1.13) (KAUR et al., 2004).
Recentes avanços para aumentar a imunogenicidade da vacina de DNA
A vacina de DNA tem apresentado baixa imunogenicidade em primatas, entretanto duas
vacinas foram recentemente licenciadas para animais, uma contra o vírus da febre do Nilo do Ocidente
em eqüinos e a outra contra vírus da necrose hematopoiética infecciosa em salmão (ULMER et al.,
45
2006). Provavelmente, a falha da vacina de DNA em induzir forte resposta imune em seres humanos é
a baixa produção de antígenos, a liberação celular do DNA plasmidial e a estimulação ineficiente do
sistema imune inato ineficiente. Os esforços para aumentar estes aspectos da vacina de DNA
aumentaram sua eficácia em animais (ULMER et al., 2006).
Alterações nos vetores têm sido realizadas para melhorar a potência da vacina como alteração
no vetor para aumentar a eficiência do promotor; utilização de seqüência líder alternativa e substituição
de códons de mamíferos pelos usados por patógenos. Esta última alteração, a construção de vetores
com otimização de códons, é para evitar as limitações do conteúdo celular de tRNA com códons virais
e bacterianos, uma vez que os requerimentos para a tradução do mRNA do patógeno são diferentes dos
das células de mamíferos. A otimização do códon resultou no aumento da expressão do antígeno gp120
do HIV, contribuindo para uma melhor disponibilidade de tRNA e maior estabilidade do mRNA
específico (WANG et al., 2005).
A captação do DNA plasmidial pelas células após a injeção é ineficiente. Somente uma
pequena proporção do material injetado é internalizada pelas células que resulta em sucesso na
transfecção, isto é, produção de antígeno pelas células do animal vacinado. Entretanto, duas estratégias
têm sido utilizadas para aumentar a potência da vacina: i) liberação física para alcançar altos níveis de
antígenos e ii) formulação com micropartículas para células alvo apresentadoras de antígenos (APCs)
(ULMER et al., 2006).
Uma efetiva tecnologia de liberação física do plasmídio usa a eletroporação (EP) in situ para a
liberação do vetor diretamente dentro das células. Esta tecnologia foi adaptada para uso em animais
vivos, pelo qual um campo elétrico é criado nos tecidos perto do sítio de inoculação da vacina. A EP
aumenta substancialmente a produção de antígenos e a resposta da célula T em primatas não-humanos,
produzindo altos níveis de célula T CD8
+
como 5% do total de célula T (OTTEN et al., 2006). Este
nível de imunogenicidade em primatas é usualmente obtido somente pelo uso de vetores virais vivos,
como adenovírus recombinante (ULMER et al., 2006). Outra recente tecnologia de liberação física do
plasmídio usa tattooing com o objetivo de administrar o DNA nas células da pele (BINS et al., 2005).
Esta técnica, a qual é similar à vacinação efetiva com a varíola, parece diminuir o tempo requerido para
46
a indução de resposta imune potente e protetora. Isto deve estar relacionado com a rápida produção do
antígeno após a vacinação.
Uma segunda estratégia para liberação da vacina de DNA envolve a tecnologia baseada em
micropartículas para as APCs alvo. A eficácia das vacinas de DNA aumenta se o material genético for
revestido por microesferas biodegradáveis que o protegem e liberam de forma gradual nas células do
organismo vacinado. Partículas de 1-3 µm de diâmetro são rapidamente fagocitadas pelos macrófagos e
células dentríticas (DCs). Duas distintas formulações, baseadas em polímeros (ácido láctico e ácido
glicólico PLG) e lipídio catiônico foram relatadas recentemente. Estas formulações mostraram-se
efetivas para a liberação da vacina de DNA para o HIV em modelos primatas (OTTEN et al., 2005) e
antrax em coelhos (HERMANSON et al., 2004). Em ambos os casos, a interação de moléculas de
DNA plasmidial carregadas negativamente com a formulação carregada positivamente é crucial para
liberação do DNA dentro das APCs, resultando no aumento da apresentação do antígeno para o sistema
imune. Os polímeros PLG são biocompatíveis com as membranas celulares, pois são produzidos pelo
organismo humano e as microesferas não são tóxicas e liberam o material genético de forma gradual, o
que garante a produção contínua de antígenos e anticorpos. A quantidade de cada substância nas
microesferas determina o ritmo da liberação do DNA. (RODRIGUES JR et al., 2004).
Uma das razões pela quais as vacinas de DNA são menos potentes que as vacinas vivas
atenuadas é que o DNA não se distribui de maneira uniforme entre as células inicialmente
transfectadas, enquanto o número das células infectadas pelo microrganismo atenuado aumenta quando
este se replica. Esforços têm sido realizados para aumentar o trânsito intracelular do antígeno,
explorando a capacidade de espalhamento célula-célula da proteína VP22 do herpesvírus humano tipo1
ou do BoHV-1. Vários grupos têm demonstrado que construções de DNA, que codificam proteínas de
fusão da VP22 ligada a antígenos, aumentam a resposta imune em camundongos (KIM et al., 2004;
PERKINS et al., 2005) e bovinos (ZHENG et al., 2005). Contudo, há controvérsia nesses resultados.
Alguns grupos mostraram que proteínas fusionadas com VP22 aumentam o espalhamento intracelular
quando avaliado in vitro (MWANGI et al., 2005), ou pelo número de células dendríticas transfectadas
em nódulos linfáticos (KIM et al., 2004). A incorporação do gene da VP22 proteína de fusão do
BoHV-1 demonstrou aumento da aquisição do DNA plasmidial pelas células dendríticas e macrófagos,
47
o qual, melhorou a resposta celular de linfócitos T auxiliar (CD4
+
) com quantidades menores de DNA
plasmidial (MWANGI et al., 2005). Contudo, um estudo não constatou a diferença na distribuição das
proteínas de fusão-VP22 e que o antígeno isoladamente, obtido da transfecção do respectivo plasmídio
dentro das células de mamíferos, aumentou a resposta imune in vivo (PERKINS et al., 2005). Mais
estudos são necessários para elucidar o modo de ação desta estratégia.
Vacina de DNA na medicina humana e veterinária
Vacinas de DNA mostraram serem efetivas para várias doenças causadas por vírus, bactérias,
protozoários e também para tumores. Conseqüentemente, esse tipo de vacina contribui para o controle
de doenças infecciosas, parasitárias e na terapia oncogênica em medicina humana e veterinária.
As vacinas de DNA que codificam antígenos virais têm sido as mais investigadas e aquelas
específicas para o HIV foram as primeiras vacinas contra doenças infecciosas a serem avaliadas em
seres humanos (MacGREGOR et al., 1998). O HIV possui uma glicoproteína do envelope altamente
variável e a maioria dos anticorpos gerados são muito específicos para essa proteína. Em contraste, a
resposta celular pode ser direcionada contra epítopos que são derivados de várias proteínas, incluindo
aquelas altamente conservadas entre diferentes estirpes virais. As atuais pesquisas têm focado o uso do
DNA na primo-vacinação, seguida de um reforço heterólogo utilizando um vetor viral, pois a primo-
vacinação com DNA demonstrou ser mais potente em primatas não-humanos (ULMER et al., 2006).
A vacina de DNA contra o HIV induziu resposta imune mediada por células (CMI) em
camundongos, mas estimulou fraca produção de IFN-
γ
pelas células T em primata não-humano e
também em seres humanos. A análise de esplenócitos de camundongos BALB/c imunizados com uma
única dose de vacina de DNA demonstrou duas populações de linfócitos T, o CD4+ e CD8+, que
foram específicos para os antígenos do HIV. Os linfócitos CD8+ produtores e não-produtores de IFN-
γ
foram detectados nos estágios inicial e intermediário após a imunização (ARRODE et al., 2007).
Vacinas de DNA para a hepatite B foram analisadas em suínos e primatas não-humano. Três
doses da vacina induziram títulos de anticorpos protetores nos animais e a resposta em suínos foi
comparável aos títulos induzidos com três doses da vacina comercial com proteínas recombinantes
48
(FULLER at al., 2006). Em humanos, esta vacina constituída do antígeno sAg induziu resposta celular
CD8
+
e CD4
+
significativa em 100% dos indivíduos (ROY et al. 2000).
Vacinas de DNA para os vírus da influenza (MACKLIN et al., 1998) e do sarampo também
foram analisadas em suínos e macacos por gene gun, mas induziram produção de anticorpos duas a dez
vezes menor do que as respectivas vacinas virais com vírus inativado. Contudo, estas vacinas de DNA
ainda mostraram proteção significativa contra a infecção, demonstrando que, embora a vacina de DNA
induza imunogenicidade mais baixa, quando comparado com as vacinas existentes, os níveis são ainda
suficientes para proporcionar proteção (FULLER et al., 2006).
A vacina de DNA para a raiva administrada em macacos por gene gun, similarmente à vacina
para o vírus da influenza, induziu comparável produção de anticorpos e proteção contra infecção letal
com vírus da raiva, como na vacina produzida em células diplóides (LODMELL et al., 1998).
Entre as vacinas de DNA para infecções bacterianas, a vacina para o controle da tuberculose
humana e bovina foi uma das primeiras vacinas estudadas. O antígeno MPB83 do Mycobacterium
bovis demonstrou boa proteção em camundongos imunizados quando desafiados com cepas virulentas
e estimulou resposta mista de IgG1 e IgG2a. Posteriormente, a imunogenicidade da vacina foi avaliada
em bovinos que apresentaram alta taxa de resposta proliferativa ao antígeno MPB83 (CHAMBERS et
al., 2000). A utilização do gene da proteína hsp65 do M. tuberculosis foi avaliada na imunização
genética de camundongos BALB/c pela via intramuscular nas formas “nua” (naked) e sistema gene
gun. A administração do plasmídio pelo sistema gene gun induziu resposta imune com doses 100 vezes
menor do que as requeridas pela imunização i.m. Contudo, a imunização i.m. protegeu os
camundongos e a imunização pelo sistema gene gun induziu a resposta Th2 com altos títulos de IL-4 e
IL-10, mas não protegeu os camundongos contra o desafio com cepas virulentas (LIMA et al., 2001).
A associação do gene da hsp65 de M. tuberculosis à expressão da IL-12 induzida pelo vírus
hemaglutinante do Japão (HVJ) incorporada ao lipossoma (HSP65+IL-12/HVJ) demonstrou melhor
eficácia na proteção de camundongos e de cobaios quando comparados com a vacina BCG. Em
macacos Cynomolgus, esta formulação apresentou eficácia na proteção relacionada à mortalidade, peso
corporal, achados radiográficos e imunogenicidade. A combinação da vacina HSP65+IL-12/HVJ e
BCG demonstrou efeito sinérgico nos macacos infectados com tuberculose, determinando 100% de
49
sobrevivência. Estes dados indicam um novo modelo de vacina de DNA contra o M. tuberculosis que
pode ser utilizado para os ensaios clínicos fase inicial em humanos (OKADA et al., 2007).
A administração inicial do DNA plasmidial contendo o gene da proteína 58 (Ag85B) do M.
tuberculosis demonstrou proteção contra a infecção pelo M. tuberculosis e associou-se a participação
de linfócitos CD4+ específicos ao Ag58B na produção de IFN-
γ
e de controle do crescimento
intramacrofágico do M. tuberculosis. Surpreendentemente, essa proteção foi eliminada após o reforço
vacinal com a proteína recombinante (rAg58B). Segundo os autores, a perda da proteção foi
relacionada com a excessiva proliferação de linfócitos CD4+ e à produção de IFN-
γ
em resposta à
proteína Ag58B. Estudos realizados no Brasil, utilizando a proteína P58 do Mycobacterium na
construção de uma vacina de DNA, identificaram uma atividade anti-cancerígena importante deste
gene em pacientes com melanoma, um dos mais graves tumores de pele. Após o tratamento houve a
remissão do tumor em dois pacientes com diagnóstico de melanoma (RODRIGUES JR et al., 2004).
Para o controle da brucelose, uma vacina de DNA contendo o gene da enzima superóxido
dismutase (SOD) de Brucella abortus foi construída com o objetivo de diminuir os riscos de
contaminação dos manipuladores com a utilização da vacina viva atenuada (cepas B19 e RB51)
(VELIKOVSKY et al., 2002). Camundongos BALB/c receberam três doses por via i.m. e apresentaram
altos títulos de anticorpos com predomínio da IgG2a e proliferação de linfócitos com produção de IFN-
γ
. O grau de proteção dos camundongos desafiados com 10
4
UFC da cepa B. abortus 2308, após cinco
semanas da última imunização, foi similar aos animais vacinados com a cepa vacinal RB51 (OÑATE
et al., 2003). Posteriormente, camundongos foram imunizados com esta mesma construção pela via
intraesplênica para induzir resposta celular. Até o final do experimento não foram detectados
anticorpos específicos para a SOD. Na estimulação de esplenócitos, foi detectada secreção de IFN-
γ
,
mas não de IL-4 e apenas a população de CD8+ apresentou atividade citotóxica. Após quatro semanas
da imunização, camundongos foram desafiados intraperitonialmente com cepas virulentas de B.
abortus, mostrando proteção superior à via i.m. (MUÑOZ-MONTESINE et al., 2004).
Para o Staphylococcus aureus a vacina de DNA contendo um gene importante da adesina da
bactéria (ClfA) induziu a produção de anticorpos específicos e resposta celular em vacas em lactação.
50
A inclusão de adjuvantes com os plasmídios diminuiu a variabilidade da resposta entre os animais e a
resposta de anticorpos foi altamente direcionada para IgG2 no soro e leite, ocorrendo uma fraca
resposta de IgG1 específica para ClfA sem adjuvante. A estratégia de se utilizar um reforço com
proteínas induziu anticorpos que aumentaram a fagocitose e diminuíram a adesão da bactéria. Os
resultados sugerem que a injeção intramuscular do plasmídio codificando ClfA de S. aureus gera
resposta Th1 em vacas leiteiras e a estratégia de vacinação combinando adjuvantes moleculares e
reforço com adesinas será um importante componente da vacina contra a mastite bovina ocasionada
pelo S. aureus (NOUR EL-DIN, et al., 2006).
A vacina de DNA contra a leptospirose que codifica uma proteína associada à hemólise
(Hap1) foi avaliada em gerbil. Após três semanas da imunização os animais foram protegidos contra o
desafio com a Leptospira interrogans patogênica (BRANGER et al., 2005).
Genes que codificam proteínas do Plasmodium falciparum, agente da malária, foram relatados
como seguros e imunogênicos para seres humanos (WANG et al., 1998; EPSTEIN et al., 2004; WANG
et al., 2005). Estudos com diferentes proteínas do Plasmodium spp estão sendo desenvolvidos na
tentativa de caracterizar e eleger os antígenos mais imunogênicos e protetores para a doença.
Tentativas de utilização de diversos genes para mimetizar os antígenos do protozoário mostraram que
alguns genes interferem negativamente, inibindo a expressão de um outro antígeno (SEDEGAH et al.,
2004).
A imunização de camundongos com os plasmídios contendo os genes que codificam as
proteínas GRA1, GRA7 e ROP2 de Toxoplasma gondii induziu imunidade protetora parcial contra
desafios letais. Na linhagem de camundongos C3H a razão Ig2a/IgG1 foi maior quando comparada às
linhagens BALB/c e C57BL/6 de camundongos. Coincidentemente, a porcentagem de proteção contra
desafios letais com cistos de T. gondii foi maior em camundongos da linhagem C3H (VERCAMMEN
et al., 2000).
Para Taenia solium a imunização com DNA plasmidial contendo o gene do antígeno B de
Cisticercus cellulosae conferiu 92,6% de proteção quando os suínos foram desafiados com ovos de
Taenia solium. Quatro de cinco animais imunizados com 1000
µ
g de plasmídio recombinante e
51
desafiados não apresentaram cistos viáveis de cisticercose. Entretanto, a imunização com 200
µ
g de
plasmidio recombinante não foi capaz de impedir a formação de cistos viáveis (GUO et al., 2007).
Vacina de DNA contra a anaplasmose bovina tem sido investigada com diferentes proteínas de
superfície (MSPs). O gene (msp1
α
) que codifica MSP1a do Anaplasma marginale foi inserido no
plasmídio pVCL, vetor de células de mamíferos. A soroconversão, após a inoculação de camundongos
e de bovinos com o DNA plasmidial contendo o gene msp1
α
, foi demonstrada após 21 dias e seis a
oito semanas, respectivamente. Em bovinos a produção de imunoglobulina foi restrita ao isotipo IgG1,
embora a estimulação de linfócito T auxiliar também foi verificada com a produção de IFN-
γ
(ARULKANTHAN et al., 1999). A imunização de bovinos utilizando apenas o gene que codifica a
MSP1b em plasmídio de expressão para células de mamíferos (pcDNA3.1./msp1
β
), não estimulou
satisfatoriamente a produção de anticorpos no período de vacinação, mostrando a necessidade de mais
estudos para o desenvolvimento de uma vacina de DNA para o controle da anaplasmose (ANDRADE
et al., 2004). Uma vacina para anaplasmose incorporando a proteína VP22 do BoHV-1 demonstrou a
habilidade desta proteína melhorar a expressão da MSP1a de Anaplasma marginale pelas células
dendríticas e macrófagos, o que sugere uma melhora na propagação da vacina de DNA para as células
T CD4
+
(MWANGI et al., 2005).
Segurança biológica
As pesquisas têm focado na construção funcional das vacinas de DNA, portanto, a ênfase na
segurança tem sido limitada. Os elementos genéticos e as características do hospedeiro relacionado à
biossegurança das vacinas de DNA foram discutidos por GLENTING & WESSELS (2005). A
tendência da construção das vacinas é a utilização de vetores isentos de genes virais, substituição de
genes de resistência aos antimicrobianos por genes sintéticos e mutações para seleção de clones.
Os procedimentos associados à construção da vacina, a avaliação pré-clínica e os ensaios
clínicos para estas vacinas são similares ao outros produtos biológicos. Em função do limitado
conhecimento científico sobre a segurança biológica das vacinas de DNA, os estudos pré-clínicos
devem ser enfatizados para a avaliação da segurança destas vacinas antes do uso comercial.
52
Considerações finais
A vacinação com DNA é uma tecnologia promissora na prevenção e controle de doenças em
medicina humana e veterinária. Fatores como o tipo de vetor (promotor) e da localização do plasmídio,
dose e tipo do antígeno, via de administração, formulação da vacina, presença ou ausência de
seqüências imunoestimulatórias, presença de plasmídio adicional ou na forma de vacina de DNA
multivalente, influenciam no desenvolvimento do tipo de resposta imune. Estes fatores podem ser
otimizados para melhorar a resposta imune no modelo de espécie animal para cada doença.
53
Referência Bibliográfica
ANDRADE, G.M., R.Z. MACHADO, R.Z., VIDOTTO, M.C., VIDOTTO, O. Immunization of
bovines using a DNA vaccine (pcDNA3.1/MSP1b) prepared from the Jaboticabal strain of Anaplasma
marginale. Annals of the New York Academy of Sciences, v.1026, p.257-266, 2004.
ANDREW, M.C., MORRISSY, C.J., LENGHAUS, C., OKE, P.G., SPROAT, K.W., HODGSON,
A.L.M., JOHNSON, M.A., COUPER, B.E.H. Protection of pigs against classical swine fever with
DNA delivered gp55. Vaccine, v.18, p.1932-1938, 2000.
ARRODE, G., HEDGE, R., MANI, A., JUN, Y., CHEBLOUNE, Y., NARAYAN, O. Phenotypic and
functional analysis of immune CD8+ T cell responses induced by a single injection of a HIV DNA
vaccine in mice. The Journal Immunology, v.178, n.4, p.2318-2327, 2007.
ARULKANTHAN, A., BROWN, W.C., MCGUIRE, T.C., KNOWLES, D.P. Biased immunoglobulin
G1 isotype responses induced in cattle with DNA expressing msp1a of Anaplasma marginale.
Infection and Immunity
,
v.67, n.7, p.3481–3487, 1999.
AZEVEDO, V., LEVITUS, G., MIYOSHI, A., CÂNDIDO, A.L., GÓES, A.M., OLIVEIRA, S.C.
Main features of DNA-based immunization vectores. Brazilian Journal of Medical and Biology
Research, v.32, n.2, p.147-153, 1999.
BINS, A.D., JORRITSMA, A., WOLKERS, M.C., HUNG, C.F., WU,T.C., SCHUMACHER, T.N.,
HAANEN, J.B. rapid and potent DNA vaccination strategy defined by in vivo monitoring of antigen
expression. Nature Medicine, v.11, n.8, p.899-904, 2005.
BLOOM, B.R. New approaches to vaccine development. Reviews of infectious diseases, v.11, p.460-
466, 1989.
BOYLE, J.S., BRADY, J.L., LEW, A.M. Enhanced responses to a DNA vaccine encoding a fusion
antigen that is directed to sites of immune induction. Nature
,
v.392, n., p.408-411, 1998.
BRANGER, C.; CHATRENET, B.; GAUVRIT, A.; AVIAT, F.; AUBERT, A.; BACH, J.M.;
ANDRE-FONTAINE, G. Protection against Leptospira interrogans Sensu Lato Challenge by DNA
54
Immunization with the Gene Encoding Haemolysin-Associated Protein 1. Infection and Immunity,
v.73, n.7, p.4062-4069, 2005.
BRIANE, D., LESAGE, D., CAO, A., COUDERT, R., LIEVRE, N., SALZMANN, J.L.,
TAILLANDIER, E. Cellular pathway of plasmids vectorized by cholesterol-based cationic
lipossomes. The Journal of Histochemistry & Cytochemistry, v.50, n.7, 983-991, 2002.
CHAMBERS, M. A., VORDERMEIER, H.M., WHELAN, A., COMMANDER, N., TASCON, R.,
LOWRIE, D., HEWINSON, R. G. Vaccination of Mice and Cattle with Plasmid DNA Encoding the
Mycobacterium bovis Antigen MPB83. Clinical Infectious Diseases, v.30, p.S283–S287, 2000.
COBAN, C., ISHII, K.J., GURSEL, M., KLINMAN, D.M., KUMAR, N. Effect of plasmid backbone
modification by different human CpG motifs on the immunogenicity of DNA vaccine vectors. Journal
of Leukocyte Biology, v.78, n.5, p. 647-655, 2005.
CONG, H., GU, Q.M., ZHOU, H.Y., GUO, L., YANG, T.L., HE, S.Y., LI, Y., ZHAO, Q.L. Oral
mixed DNA vaccine protects mice from infection of Toxoplasma gondii
.
Zhongguo Ji Sheng Chong
Xue Yu Ji Sheng Chong Bing Za Zhi, v.23, n.3, p.159-162, 2005.
COUTELIER, J.P., VANDER, LOGT, J.T.M., HEENSSEN, F.W.A. IgG subclass distribution of
primary and secondary immune responses concomitant with viral infection. Journal of Immunology,
v.147, n., p.1383-1386, 1991.
DAVIS, H.L., MCCLUSKIE, M.J. DNA vaccines for viral diseases.
Microbes Infection, v.1, n., p.7-
21, 1999.
DOOLAN, D.L., HOFFMAN, S.L. Multi-gene Vaccination against Malaria: A Multistage, Multi-
immune Response Approach. Parasitology Today, v.13, n.5, p.171-178, 1997.
DUFOUR, V. DNA vaccines: new applications for veterinary medicine. Veterinary Sciences
Tomorrow, v.2, n.1, p.1-25, 2001.
EPSTEIN, J.E., CHAROENVIT, Y., KERSTERB, K.E., WANG, R., NEWCOMER, FITZPATRICK,
S., RICHIE, T.L., TORNIEPORTH, N., HEPPNER, D.G., OCKENHOUSE, C., MAJAM, V.,
HOLLAND, C., ABOT, E., GANESHAN, H., BERZINS, M., JONES, T., FREYDBERG, C.N., NG,
55
J., NORMAN, J., CARUCCI, D.J., COHEN, J., HOFFMAN, S.L. Safety, tolerability, and antibody
responses in humans after sequential immunization with PfCSP DNA vaccine followed by the
recombinant protein vaccine RTS,S/AS02A.
Vaccine, v.22, p.1592-1603, 2004.
FYAN, F.F., WEBSTER, R.G., FULLER, D.H., HAYNES, J.R., SANTORO, J.C., ROBINSON, H.L.
DNA vaccines: protective immunizations by parenteral, mucosal, and gene-gun inoculations.
Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America
,
v.90, n.42,
p.11478-11482, 1993.
FULLER, D.H., LOUDON, P., SCHMALJOHN, C. Preclinical and clinical progress of particle-
mediated DNA vaccines for infection diseases. Methods, v. 40, p. 86-97, 2006.
GARMONY, H.S., BROWN, K.A., TITBALL, R.W. DNA vaccines: improving expression of
antigens. Genetic Vaccines and Therapy
,
v.1, n.2, p. , 2003.
GLENTING, J., WESSELS, S. Ensuring safety of DNA vaccines. Microbial Cell Factories
,
v.4, n.26,
p.1-5, 2005.
GUO, A., JIN, Z., ZHENG, Y., HAI, G., YUAN, G., LI, H., CAI, X. Induction of protection against
porcine cysticercosis in growing pigs by DNA vaccination. Vaccine, v. 25: 170-175, 2007.
GURUNATHAN, S., KLINMAN, D.M., SEDER, R.A. DNA vaccines: Immunology, applications,
and optimization. Annual Review of Immunology, v.18, n., p.927-974, 2000.
HAN, R., CLADEL, N.M., REED, C.A., PENG, X., CHRISTENSEN, N.D. Protection of rabbits
from viral challenge by gene gun-based intracutaneous vaccination with a combination of cottontail
rabbit papillomavirus E1, E2, E6, and E7 genes. Journal of Virology, v.73, n.8, p.7039–7043, 1999.
HENKE, A. DNA immunization – a new chance in vaccine research? Medical microbiology and
immunology, v.191, p.187-190, 2002.
HERMANSON, G. A cationic lipid-formulated plasmid DNA vaccine confers antibody-mediated
protective against aerosolized anthrax spores. Proceedings of the National Academy of Sciences of the
United States of America, v.101, n.37, p.13601-13606, 2004.
56
JIN, H., LI, Y., MA, Z., ZHANG, F., XIE, Q., GUD, D., WANG, BIN. Effect of chemical adjuvants
on DNA vaccination. Vaccine, v.22, p.2925–2935, 2004.
KALINNA, B.H. DNA vaccines for parasitic infections. Immunology and Cell Biology, v.75, p.370-
375, 1997.
KAUR R, RAUTHAN M, VRATI S. Immunogenicity in mice of a cationic microparticle-absorbed
plasmid DNA encoding Japanese encephalitis virus envelope protein. Vaccine, v.22, p.2776-2782,
2004.
KIM, T.W., HUNG, C.F., ZHENG, M., BOYD, D.A., HE, L., PAI, S.I., WU, T.C. A DNA vccine co-
expressing antigen and an anti-apoptotic molecule further enhances the antigen specific CD8
+
T cell
immune response. Journal of Biomedical Science, v.11, p.493-499, 2004
KOWALCZYK, D.W., ERTL, H.C. Immune response to DNA vaccine. Cellular and Molecular Life
Sciences, v. 55, p.751-701, 1999.
KUTZLER, M.A., ROBINSON, T.M., CHATTERGOON, M.A., CHOO, D.K., CHOO, A.Y., CHOE,
P.Y., RAMANATHAN, M.P., PARKINSON, R., KUDCHODKAR, S., TAMURA, Y., SIDHU, M.,
ROOPCHAND, V., JOSEPH KIM, J., PAVLAKIS, G.N., FELBER, B.K., WALDMANN, T.,
BOYER, J.D., WEINER, D.B. Coimmunization with an optimized IL-15 plasmid results in enhanced
function and longevity of CD8 T cells that are partially independent of CD4 T cell help. The Journal
of Immunology, v.175, p. 112-123, 2005.
LATOUCHE, J.B., SADELAIN, M. Induction of human cytotoxic T lymphocytes by artificial
antigen-presenting cells. Nature Biotechnology, v.18, n.4, p.405-40, 2000.
LEVY, M.Y., BARRON, L.G., MEYER, K.B., SZOKA, F.C. Characterization of plasmid DNA
transfer into mouse skeletal muscle: evaluation of uptake mechanism, expression and secretion of gene
products into the blood. Gene Therapy, v.3, p.201-211, 1996.
LEWIS, P.J., DRUNEN LITTLE-van den HURK, S., BABIUK, L.A. Altering the cellular location of
an antigen expressed by a DNA-based vaccine modulates the immune response.
Journal of Virology,
v.73, n.12, p.10214-10223, 1999.
57
LI, L., FANG, W., LI, J., HUANG, Y., YU, L. Oral DNA vaccination with the polyprotein gene of
infectious bursal disease virus (IBDV) delivered by the attenuated Salmonella elicits protective
immune responses in chickens. Vaccine, v.24, n.33-34, p.5919-5927, 2006.
LIAO, J.C.F., GREGOR, P., WOLCHOK, J.D., ORLANDI, F., CRAFT, D., LEUNG, C.,
HOUGHTON, A.N., BERGAMAN, P.J. Vaccination with human tyrosinase DNA induces antibodies
responses in dogs with advanced melanoma. Cancer Immunity, v.6, n.8, p.2-10, 2006.
LIU, M., ACRES, B., BALLOUL, J.M., BIZOUARNE, N., APUL, S., SLOS, SQUIBAN, P. Gene-
based vaccines and immunotherapeutics. Proceedings of the National Academy of Sciences of the
United States of America, v. 101, n.2, p.14567-14571, 2004.
LIMA KM, BONATO VL, FACCIOLI LH, BRANDAO IT, DOS SANTOS SA, COELHO-
CASTELO AA. Comparison of different delivery systems of vaccination for the induction of
protection against tuberculosis in mice. Vaccine, v.19, p.25–26, 2001.
LIMA, K. M., SANTOS, S.A., RODRIGUES JR., J.M., SILVA, C.L. Vaccine adjuvant: it makes the
difference. Vaccine, v.22, n., p.2374–2379, 2004.
LIU, M., ACRES, B., BALLOUL, J.M., BIZOUARNE, N., PAUL, S., SLOS, P., et al. Gene-based
vaccines and immunotherapeutics. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United
States of America
,
v.101, n.2, p.14567-14571, 2004.
LODMELL, D.L., RAY, N.B., PARNELL, M.J., EWALT, L.C., HANLON, C.A., SHADDOCK,
D.S., SANDERLIN, D.S., RUPPRECHT, C.E. DNA immunization protects nonhuman primates
against rabies virus.
Nature Medicine,
v. 4, p.8, p.949-952, 1998.
MACKLIN, M.D., McCABE, D., McGREGOR, M.W., NEUMANN, V., MEYER, T., CALLAN, R.,
HINSHAW, V.S. SAWAIN, W.T. Immunization of pigs with a particle-mediated DNA vaccine to
influenza A virus protects against challenge with homologous virus. The Journal of Virology, v.72,
p.1491-1496, 1998.
58
MacGREGOR, R.R., GINSBERG, R., UGEN, K.E., BAINE, Y., KANG, C.U., TU, X.M., HIGGINS,
T., WEINER, D.B., BOYER, J.D. T-cell responses induced in normal volunteers immunized with a
DNA-based vaccine containing HIV-1 env and rev. AIDS, v. 16, p.2137-2143, 2002.
MOREL, P.A., FALKNER, D., PLOWEY, J., LARREGINA, A.T., FALO JR., L.D. DNA
immunization: altering the cellular localization of expressed protein and the immunization route
allows manipulation of the immune response. Vaccine
,
v.22, p.447–456, 2004.
MUMPER, R.J., LEDEBUR JR, H.C. Dendritic cell delivery of plasmid DNA. Applications for
controlled genetic immunization. Molecular Biotechnology, v.19, n.1, p.79-95, 2001.
MUÑOZ-MONTESINE, C., ANDREWS, E., RIVERS, R., GONZÁLEZ-SMITH, A., MORAGA-
CID, G., FOLCH, H., CÉSPEDES, S., OÑATE, A.A. Intraspleen delivery of a DNA vaccine coding
for superoxide dismutase (SOD) of Brucella abortus induces SOD-specific CD4+ and CD8+ T cells.
Infection and Immunity
,
v.72, n.4, p.2081-2087, 2004.
MWANGI, W., BROWN, W.C., SPLITTER, G.A., ZHUANG, Y., KEGERREIS, K., PALMER, G.H.
Enhancement of antigen acquisition by dendritic cells and MHC class II-restricted epitope presentation
to CD4+ T cells using VP22 DNA vaccine vectors that promote intercellular spreading following
initial transfection. Journal of Leukocyte Biology, v.78, n.2, p.401-411, 2005.
NAFTZGER, C., TAKECHI, Y., KOHDA, H., HARA, I., VIJAYASARADHI, S., HOUGHTON,
A.N. Immune response to a differentiation antigen induced by altered antigen a study of tumor
rejection and autoimmunity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of
America, v.93, p.14809-14814, 1996.
NAGATA, T., UCHIJIMA, M., YOSHIDA, A., KAWASHIMA, M., KOIDE, Y. Codon optimization
effect on translational efficiency of DNA vaccine in mammalian cells; analysis of plasmid DNA
encoding a CTL epitope derived from microorganisms. Biochemical and Biophysical Research
Communications, v.261, p.445-451, 1999.
59
NAGATA, T., AOSHI, T., UCHUIMA, M., SUZUKI, M., KOIDE, Y. 2004. Cytotoxic T-
lymphocyte, and helper T-lymphocyte oriented DNA vaccination. DNA and Cell Biology
,
v.23, n.2,
p.93-106, 2004.
NORMAN, J.A., HOBART, P., MANTHIRPE, M., FELGNER, P., WHEELER, C. Development of
improved vectors for DNA-based immunization and other gene therapy applications. Vaccine, v.15,
n.8, p.801-803, 1997.
NOUR-EL-DIN, A.N., SHKRETA, L., TALBOT, B.G., DIARRA, M.S., LACASSE, P. DNA
immunization of dairy cows with the clumping factor A of Staphylococcus aureus. Vaccine, v.15,
n.12, p. Epub., 2006.
OKADA, M., KITA, Y., NAKAJIMA, T., KANAMARU, N., HASHIMOTO, S., NAGASAWA, T.,
KANEDA, Y., YOSHIDA, S., NISHIDA, Y., KUKAMUZU, R., TSUNAI, Y., INOUE, R.,
NAKATANI, H., NAMIE, Y., YAMADA, J., TAKAO, K., ASAI, R., MATSUMOTO, M.,
McMURRAY, D.N., DELA CRUZ, E.C., TAN, E.V., ABALOS, R.M., BURGOS, J.A., GELBER, R.,
SAKATANI, M. Evaluation of a novel vaccine (HVJ-liposome/HSP65 DNA+IL-12 DNA) against
tuberculosis using the Cynomolgus monkey model of TB. Vaccine
,
v.22, 2007. Epub ahead of print
OLIVEIRA, S.C., HARMS, J.S., RECH, E.L, RODART, R.S., BOCCA, A.L., GOES, A.M.,
SPLITTER, G.A. The role of T cell subsets and cytokines in the regulation of an intracellular
bacterial infection. Brazilian Journal of Medical and Biological Research, v.32, p.77-84, 1998.
OÑATE, A.A.; CÉSPEDES, S.; CABRERA, A.; RIVERS, R.; GONZÁLES, A.; MUÑOZ, C.;
FOLCH, H.; ANDREWS, E. A DNA vaccine encoding Cu, Zn superoxide dismutase of Brucella
abortus induces protective immunity in BALB/c mice. Infection and Immunity, v.71, n.9, p.4857-
4861, 2003.
OSORIO, J.E., TOMLINSON, C.C., FRANK, R.S., HAANES, E.J., RUSHLOW, K., HAYNES, J.R.,
STINCHOMB, D.T. Immunization of dogs and cats with a DNA vaccine against rabies virus.
Vaccine, v.17, p.1109-1116, 1999.
60
OTTEN, G.R., SCHAEFER, M., DOE, B., LIU, H., MEGEDE, J.Z., DONNELY, J., TABUSSAY, D.,
BARNETT, S., ULMER, J.B. Potent immunogenicity of ana HIV-1 gag-pol fusion DNA vaccine
delivered by in vivo eletroporation. Vaccine, v.24, n.21, p.4503-4509, 2006.
PASQUINI, S., XIANG, Z., WANG, Y., HE, Z., DENG, H., BLASCZYK-THURIN, M., ERTL,
H.C.J. Cytokines and costimulatory molecules as genetic adjuvant. Immunology and Cell Biology,
v.75, p.397-401, 1997.
PERKINS, S.D., FLICK-SMITH, H.C., GARMONY, H.S., ESSEX-LOPRESTI, A.E., STEVENSON,
F.K., PHILLPOTTS, R.J. Evaluation of the VP22 protein for enhancement of a DNA vaccine against
anthrax. Genetic Vaccines and Therapy, v.3, n.3, p.1-9, 2005.
RAINCZUK, A., SMOOKER, P.M., KEDZIERSKI, L., BLACK, C.G., COPPEL, R.L., SPITHILL,
T.W. The protective efficacy of MSP4/5 against lethal Plasmodium chabaudi adami challenge is
dependent on the type of DNA vaccine vector and vaccination protocol. Vaccine, v.21, p.3030-3042,
2003.
RAMSHAW, I.A., FORDHAM, S.A., BERNARD, C.A., MAGUIRE, D., COWDEN, W.B.,
WILLENBORG, D.O. DNA vaccine for the treatment of autoimune disease. Immunology and Cell
Biology, v.75, p.409-413, 1997.
RAZ, E., WATANABE, A., BAIRD, S M., EISENBERG, R A., PARR, T B., LOTZ, M., KIPPS, T J.,
CARSON, D A. Systemic immunological effects of cytokine genes injected into skeletal muscle.
Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, v.90, n.10, p.4523–
4527, 1993.
REN, S., LI, M., SMITH, J.M., DETOLLA, L. J., FURTH, P.A. Low-volume jet injection for
intradermal immunization in rabbits. BMC Biotechnology
,
v.2, n.10, p.1-6, 2002.
ROBINSON, H.L. Nucleic acid vaccines: an overview. Vaccine, v.15, n.8, p.785-787, 1997.
RODRIGUES Jr, J.M., LIMA, K.M., CASTELO, A.A.M., MARTINS, L.D.B., SANTOS, S.A.S.,
FACCIOLI, L.H., SILVA, C.L. É possível uma vacina gênica auxiliar no controle da tuberculose?
Jornal Brasileiro de Pneumologia, v.30, p.468-477, 2004.
61
SNADEEP, K., TRIPATHY, S.K., SVENSSON, E.C., BLACK, H.B., GOLDWASSER, E.,
MARGALITH, M., HOBART, P.M., LEIDEN, J.M. Long-term expression of erythropoietin in the
systemic circulation of mice after intramuscular injection of a plasmid DNA vector. Genectics, v.93,
p.10876-10880, 1996.
SEDEGAH, M., JONES, T.R., KAUR, M., HEDSTROM, R., HOBART, P., TINES, J.A.,
HOFFMAN, S.L. Boosting with recombinant vaccinia increases immunogenicity and protective
efficacy of malaria DNA vaccine. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United
States of America, v.95, p.7648-7653, 1998.
SEDEGAH, M., CHAROENVIT, L., BELMONTE, M., MAJAN, V.F., ABOT, S., GANESHAN, H.,
KUMAR, S., BACON, D.J., STOWERS, A., NARUM, D.L., CARUCCI, D.J., ROGERS, W.O.
Reduced immunogenicity of DNA vaccine plasmids in mixtures. Gene Therapy, v. 1: p.448-456,
2004.
SIEGRIST, C.A. Potential advantages and risks of nucleic acid vaccines for infant immunization.
Vaccine, v.15, n.8, p.798-800, 1997.
SIN, J.I., KIM, J.J., ARNOLD, R.L., SHROFF, K.E., MCCALLUS, D., PACHUK, C., MCELHINEY,
S.P., WOLF, M.W., POMPA-DE BRUIN, S.J., HIGGINS, T.J., CICCARELLI, R.B. AND WEINER,
D.B. IL-12 gene as a DNA vaccine adjuvant in a herpes mouse model: IL-12 enhances Th1-type
CD4(+) T cell-mediated protective immunity against herpes simplex virus-2 challenge. Journal
Immunology, v.162, p.2912-2921, 1999.
SINGH M, BRIONES M, OTT G, O’HAGAN D. Cationic microparticles: a potent delivery system for
DNA vaccines Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,
v.97, p.811–816, 2000.
SINGH, M., O’HAGAN, D.T. Recent advances in vaccine adjuvants. Pharmaceutical Research
,
v.19,
n.6, p.715-728, 2002.
SNAPPER, C.M., FINKELMAN, F.D., PAUL, W.E. Regulation of IgG1 and IgE production by
interleukin 4. Immunological Reviews, v.102, p.51-75, 1988.
62
SOMASUNDARAM, C., TAKAMATSU, H., ANDREONI, C., AUDONNET, J.C., FISHER, L.,
LEFEVRE, F., CHARLEY, B. Enhanced protective response and immune adjuvant effects of porcine
CM-CSF on DNA vaccination of pigs against Aujeszky’s disease virus. Veterinary Immunology and
Immunopathology, v.70, p.277-287, 1999.
ULMER, J.B., DONNELLY, J.J., PARKER, S.E., PODES, G.H., FELGNER, P.L., DWARKI, V.J.,
GROMKOWSKI, S.H., RANDALL DECK, R., DeWITT, C.M. FRIEDMAN, A., HAWE, L.A.,
LEANDER, K.R., MARTINEZ, D., PERRY, H.C., SHIVER, J.W., MONTGOMERY, D.L., LIU,
M.A. Heterologous protection against influenza by injection of DNA encoding a viral protein.
Science, v. 259, p.1745-1749, 1993.
ULMER, J.B., DECK, R.R., DEWITT, C.M., FU, T.M., DONNELLY, J.J., CAULFIELD, M.J., LIU,
M.A. Expression of a viral protein by muscle cells in vivo induces protective cell-mediated immunity.
Vaccine
,
v.15, n.8, p.839-841, 1997.
ULMER, J.B., WAHREN, B., LIU, M.A. Gene-based vaccines: recent technical and clinical
advances. TRENDS in Molecular Medicine, v.12, n.5, p.216-222, 2006.
UCHIJIMA, M., YOSHIDA, A., NAGATA, T., KOIDE, Y. Optimization of codon usage of plasmid
DNA vaccine is required for the effective MHC class I-restrict T cell responses against an intracellular
bacterium. Journal Immunology, v.161, p.5594-5599, 1998.
VANROMPAY, D., COX, E., VANDENBUSSCHE, F., VOLCKAERT, G., GODDEERIS, B.
Protection of turkeys against Clamydia psitaci challenge by gene gun-based DNA immunizations.
Vaccine, v.17, p.2628-2635, 1999.
van DRUNEN LITTEL-van den HURCK, S., BRAUN, R.P., KARVONEN, B.C., KING, T., YOO,
D., BABIUK, L.A. Immune response and protection induced by DNA vaccines encoding bovine
parainfluenza virus type 3 glycoprotein. Virology, v.260, p.35-46, 1999.
van TIENHOVEN, E.A.E., TEN BRINK, C.T.B., van BERGEN, J., KONING, F., van EDEN, W.,
BROEREN, C.P.M. Induction of antigen specific CD4
+
T cell responses by invariant chain based
DNA vaccines. Vaccine, v.19, p.1515-1519, 2001.
63
VELIKOVSKY, C. A., J. CASSATARO, G. H. GIAMBARTOLOMEI, F. A. GOLDBAUM, S.,
ESTEIN, R. A. BODWEN, L. BRUNO, C. A. FOSSATI, AND M. SPITZ. 2002. A DNA vaccine
encoding lumazine synthase from Brucella abortus induce protective immunity in BALB/c mice.
Infection and Immunity, v.70, p.2507–2511, 2002.
VERCAMMEN, M.; SCORZA, T.; HUYGEN, K.; DE BRAEKELEER, J.; DIET, R.; JACOBS, D.;
SAMAN, E.; VERSHUEREN, H. DNA vaccination with genes encoding Toxoplasma gondii antigens
GRA1, GRA7, and ROP2 induces partially protective immunity against lethal challenge in mice
.
Infection and Immunity, v.68, n.1, p.38-45, 2000.
XIANG, Z.Q., HE, Z., QANG, Y., ERTL, H. The effect of interferon-
γ
on genetic immunization.
Vaccine, v.15, n.8, p.896-898, 1997.
XU, Z.L., MIZUGUCHI, H., ISHII-WATABE, A., UCHIDA, E., MAYUMI, T., HAYAKAWA, T.
Optimization of transcriptional regulatory elements for constructing plasmid vectors. Gene, v.272,
p.149-156, 2001.
ZHANG, X., DIVANGAHI, M., NGAI, P., SANTOSUOSSO, M., MILLAR, J., ZGANIAZ, A.,
WANG, J., BRAMSON, J., XING, ZHOU. Intramuscular immunization with a monogenic plasmid
DNA tuberculosis vaccine: Enhanced immunogenicity by electroporation and co-expression of GM-
CSF transgene. Vaccine
,
v.25, n.7, p.1342-1352, 2007.
ZHENG, C., BABIUK, L.A., VAN DRUNEM LITTLE-VAN DEN HURK, S. Bovine Herpesvirus 1
VP22 enhances the efficacy of DNA vaccine in cattle. Journal of Virology, v.79. n.3, p.1948-1953,
2005.
ZHOU, H., DNA-based vaccines activate innate and adaptive antitumor immunity by engaging the
NKG2D receptor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,
v.102, n.31, p.10846–10851, 2005.
YOSHIDA A, NAGATA T, UCHIJIMA M, HIGASHI T, KOIDE Y. Advantage of gene gun-
mediated over intramuscular inoculation of plasmid DNA vaccine in reproducible induction of specific
immune responses. Vaccine, v.18, p.1725–1729, 2000.
64
WAINE, G.J., McMANUS, D.P. Nucleic Acids: Vaccines of the future. Parasitology Today, v.11,
n.3, p.113-116, 1995.
WANG, R., DOOLAN, D.L., LE, T.P., HEDSTROM, R.C., COONAN, K.M. CHAROENVIT, Y.
Induction of antigen-specific cytotoxic T lymphocytes in humans by malaria DNA vaccine. Science,
v.282, p.476-480, 1998.
WANG, S., FARFAN-ARRIBAS, D.J., SHEN, S., CHOU, Te-H.W., HIRSCH, A., HE, F., LU, S.
Relative contributions of codon usage, promotor efficiency and teader sequence to the antigen
expression and immunogenicity of HIV-1 Env DNA vaccine. Vaccine, v.24, n.21, p.4531-4540, 2005.
WEBER LW, BOWNE WB, WOLCHOK JD, SRINIVASAN R, QIN J, MOROI Y, CLYNES R,
SONG P, LEWIS JJ, HOUGHTON AN. Tumor immunity and autoimmunity induced by
immunization with homologous DNA. The Journal of Clinical Investigation, v.102, n.6, p.1258-1264,
1998.
WHALEN, R.G. DNA Vaccines for Emerging Infectious Diseases: What If? Emerging Infectious
Diseases, v.2, n.3, p.168-175, 1996.
WOLFF, J.A., MALONE, R.W., WILLIAMS, P., CHONG, W., ACSADI. G., JANI, A., FELGHER,
P.L. Direct gene transfer into mouse muscle in vivo. Science
,
v.247, p.1465-1468, 1990.
65
2. OBJETIVOS
66
2. OBJETIVOS
2.1. Objetivo geral
•
Analisar a variabilidade dos genes
msp
1α de diferentes amostras de
A. marginale
e
avaliar a imunogenicidade de plasmídios recombinantes contendo genes que codificam
as MSPs em camundongos BALB/c.
2.2. Objetivos específicos
•
Determinar a relação filogenética entre as seqüências dos genes
msp
1α das amostras de
A. marginale
isoladas no Paraná e em outras regiões geográficas.
•
Construir vacinas de DNA com os genes
msp
1α ,
msp
1β e
msp
5 em vetor de expressos
em célula eucariótica.
•
Avaliar a imunogenicidade das vacinas de DNA para MSP1a, MSP1b e MSP5 de
A.
marginale
em camundongos BALB/c, utilizando os plasmídios recombinantes
individualmente e em associação.
3. ARTIGO PUBLICADO
67
68
69
70
71
72
73
74
75
4. ARTIGOS PARA PUBLICAÇÃO
76
4.1. DNA vaccines encoding Anaplasma marginale MSPs induced
immunogenicity in BALB/c mice
Artigo editado de acordo com as normas de publicação do periódico Research
in Veterinary Science
77
DNA vaccines encoding Anaplasma marginale MSPs induced immunogenicity in BALB/c
mice
Abstract
This study evaluated the immunogenicity of DNA vaccines encoding major surface proteins
of Anaplasma marginale PR1 strain in BALB/c mice. The plasmids pcDNA-msp1α, pcDNA-
msp1β and pcDNA-msp5, which encode the complete gene of MSP1a, MSP1b, and MSP5
protein under the control of cytomegalovirus enhancer/promoter and intron A, were
constructed. The antigens expression and immune response were evaluated by inoculation of
these recombinant plasmids in BALB/c mice. Six groups with eight mice each, G1 (100 µl
PBS); G2 (100 µg A. marginale initial bodies + Freund´s adjuvants); G3 (100 µg pcDNA-
msp1α + sucrose-phosphate-glutamato-SPG); G4 (100 µg pcDNA-msp1β + SPG); G5 (100
µg of pcDNA- msp1β + 2% levamisole) and G6 (100 µg pcDNA-msp5 + SPG) were
immunized by intramuscular route with three doses each 3 weeks. The immunization of mice
with MSP1a and MSP5-DNA vaccine elicited humoral response. ELISA no detected specific
IgG against MSP1b in two groups, which received pcDNA-msp1β with SPG or levamisole.
However, specific IgG MSP1b were detected in pools of mouse sera by Western blot started
after third immunization using rMSP1b. Specific IgG against MSP1a and MSP5 were
detected in either by ELISA and Western blot. The results from groups that received pcDNA-
msp1α and pcDNA-msp5 exhibited predominance for IgG2a production, and splenocytes
proliferation that suggest that these recombinant plasmids are good candidates for elicited T
helper 1 immune response.
Key words: Anaplasma marginale, DNA vaccine, BALB/c mice, Immunogenicity, MSPs
Introduction
Anaplasma marginale is an important tick-transmitted rickettsial pathogen of cattle
that invades and multiplies within erythrocytes, causing severe hemolytic anemia during acute
78
infection (Kuttler, 1984). Cattle immunization with outer membrane fraction of A. marginale
resulted in complete to partial protection after challenging with homologous and heterologous
strains (Tebele et al., 1991). Complete protection was associated with development of
immunoglobulin G2 (IgG2) responses directed predominantly against antigen specific, and
production of interferon gamma (IFN-γ) by antigen specific T cells (Brown et al., 1998; Tuo
et al., 2000).
Outer membrane proteins of the erythrocytic stage of A. marginale have been the
focus of research direct toward an improved vaccine against anaplasmosis (Palmer et al.,
1999). Six major outer membrane proteins designed major surface proteins (MSPs) were
described in A. marginale. MSP1a and MSP1b (MSP1 complex) are important in adhesion
and invasion of A. marginale in host cells. MSP1a adhere in bovine erythrocytes and tick
cells, while MSP1b adhere only in bovine erythrocytes (McGarey et al., 1984; Garcia-Garcia
et al., 2004). MSP4 and MSP5 were conserved in different isolates of A. marginale in the
world (Visser et al, 1992, Oberle et al., 1993, Kano et al., 2002), and MSP5 was useful to
diagnostic of bovine anaplasmosis (Knowles et al., 1996, Andrade et al., 2001, Yoshihara et
al., 2003). The MSP2 and MSP3 proteins were polymorphic in different isolates and elicited
distinct antigens during rickettsemia cycle; the MSP2 showed strong immune response (Eid et
al., 1996, Brown et al., 2003).
DNA vaccines were used successfully to raising immune responses humoral and
particularly the cell-mediated immunity (CMI), against several pathogens, such as virus,
bacteria, parasites, and tumor antigens using diverse animal models (Ulmer et al., 1997;
Vercammen et al., 2000; van Drunen Little-van den Hurk et al., 2001, Liao et al., 2006).
Furthermore, DNA vaccine demonstrated many advantages over the standard immunization
procedure, such as no risk of infection, induction of a long-lived immune response, better
stability than live attenuated vaccines, low cost (Donnelly et al., 1997), and specially to
79
induce strong CMI responses, which can be very effective vaccine against intracellular
microorganisms (Doolan & Hoffman, 1997). DNA vaccines can mimic characteristic of live
vaccines due to their ability to induce production of microbial antigens in both transiently
transfected non-immune cells and antigen-presenting cells in the vaccine inoculation site and
nearby draining lymph nodes (Condon et al., 1996, Donnely et al., 1997, Del Giudice &
Rappuoli, 1999).
Mixing adjuvants with DNA vaccines can sometimes enhance their potency. This
effect is observed with both conventional adjuvants and experimental immune potentiators
that are known to stimulate innate immune responses or facilitate co-stimulation. Chemical
adjuvants as levamisole and bupivacaine, and CpG sequence that active cells of innate
immune system (Ulmer et al., 2006).
The objective of this work was to evaluate the capacity of the DNA vaccines
pcDNA-msp1α, pcDNA-msp1β, and pcDNA-msp5 induce immunogenicity in BALB/c mice.
For pcDNA-msp1β was evaluate two adjuvants, sucrose-phosphate-glutamate (SPG) and
levamisole, to elicited immune response.
Materials and Methods
Anaplasma marginale isolate and DNA extract
A. marginale isolate was obtained from infected cattle of Parana State (PR), Brazil,
and designed PR1 (Ferreira et al., 2001; Kano et al., 2002). DNA was extracted from stabilate
PR1 A. marginale using Purigene DNA Extract Kit (Gentra System, Minneapolis, MN, USA)
according to manufacture’s recommendation.
Construction of the recombinant plasmids
80
Mammalian expression vector pcDNA3.1/TOPO ((Invitrogen
TM
Life Technologies,
Carlsbad, CA, USA) was used to construct DNA vaccines. This vector is designed to promote
constitutive expression of cloned DNA inserts in mammalian cells. The three genes encoding
the antigens of interest (MSP1a, MSP1b, and MSP5) were amplified by PCR using primers
based on complete gene sequence of A. marginale obtained of GenBank (accession number
AY602768, M59845, and AY714547). At position 5’ of the forward primers were included
CACC that is complementary sequence of vector pcDNA3.1/TOPO (Invitrogen
TM
Life
Technologies). In the reverse primers were excluded the stop codon. The set of primers for
msp1α
(F: 5’CACCATGTCAGAGTATGTG3’ and R: 5’CGCCGCCGCCGCCTGCGCC3’),
msp1β
(F: 5’CACCATGACAGAAGACGACAA3’ and R: 5’CCTAGACCAACCAGAAGACTGC3’),
and
for msp5
(F:5’CACCATGAGAATTTTCAAGATTGTG3’ and
R:5’AGAATTAAGCATGTGACCGCTG3’)
were optimizing of the parameters of PCR with the
respective targets genes. PCR reagent mixture (50µl) consisting of 20 pmol of each primer,
200 mM deoxynucleotide triphosphates, one unit of Pfx DNA polymerase (Invitrogen
TM
Life
Technologies, Carlsbad, CA, USA), 1.5 mM MgSO
4
. The reaction was performed in a Perkin
Elmer DNA Thermal Cycler 9600 (Norwalk, CT) with the following time and temperature
conditions: one step of 5 min/94
o
C; followed by 35 cycles of 1 min/94
o
C, 1 min/60
o
C, 1
min/68
o
C, and a final step of 7 min/68
o
C for msp1α gene, and 5 min/94
o
C followed by 35
cycles of 1 min/94
o
C, 1 min/58
o
C, 1 min/68
o
C and a final step of 7 min/68
o
C for msp1β
and msp5 genes.
The products were analyzed by electrophoresis in a 1.5% agarose gel in TBE buffer
pH 8.4 (89 mM Tris; 89 mM boric acid; 2 mM EDTA), ethidium bromide (0,5 µg/ml) stained,
and visualized under UV light. The fragments were purified for cloning by QiAquick Gel
Extraction Kit (Qiagen, Valencia, CA, USA).
81
The msp1α, msp1β and msp5 genes were cloned into pcDNA3.1/TOPO as
manufacturer’s instructions (Invitrogen
TM
Life Technologies, Carlsbad, CA, USA). After,
One Shot TOP10 chemically competent E. coli was transformed with 3 µl of the cloning
reaction. The bacterial culture was spread on Luria Bertani (LB) agar (1.0% tryptone, 0.5%
yeast extract, 1.0% NaCl and 1.5% agar, pH 7.0) containing ampicillin (100 µg/ml). The
isolate colony was cultured in LB broth to extract plasmids using Qiaprep Spin Miniprep Kit
(Qiagen, Valencia, CA, USA).
The presence of inserts in recombinant plasmids from transformed colonies was
confirmed by PCR assay using primers of full-length fragment of the genes. Furthermore, the
correct in frame orientation of genes was confirmed by sequencing by Mega Bace
1000/Automated 96 Capillary DNA Sequencer (GE Healthcare, Little Chalfont, UK). The
quality of each sequence obtained was analysed with Phred/Phrap/Consed Analysis Program
(www.phrap.org) and the sequence identity was verified with sequences deposited in the
GenBank using BLAST software (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST).
Production of DNA vaccines
Large scales culture of TOP10 E. coli containing recombinant plasmids were growing
in LB broth at 37
o
C, and the Qiagen Plasmid Mega Kit (Qiagen, Valencia, CA, USA) was
used to prepare DNA. The recombinant plasmids were quantified by spectofotometry
measuring the optical density at 280 nm.
Production of recombinant MSPs proteins
The recombinant plasmids pET101-msp1α, pET101-msp1β (Tamekuni et al., 2006)
and pRSET-msp5 (Marana et al., 2006) were used to produce recombinants MSP1a, MSP1b
82
and MSP5 as a fusion product with 6xHis. The rMSP1a, rMSP1b and rMSP5 were purified
using Ni-NTA resin according to the supplier’s instructions (Qiagen, Valencia, CA, USA).
Animal and experimental design
Four to six weeks old female BALB/c mice were randomly distributed into six
experimental groups with eight animals each. The mice were kept in conventional animal
facilities and received water and food ad libitum, and used under animal protocols approved
by the Institutional Research Committee (process number 26927/05).
Mice were anaesthetized prior following the injected with 100 µg of recombinant
plasmids in sucrose-phosphate-glutamate (SPG) buffer (Dong-Ji et al., 2000) or levamisole
for pcDNA-msp1β in each leg muscle. Six groups were formed: G1- negative control (100 µl
phosphate buffered saline (PBS); G2- positive control (100 µg A. marginale PR1 strain initial
bodies + Freund´s adjuvant); G3- (100 µg pcDNA-msp1α + SPG); G4- (100 µg pcDNA-
msp1β + SPG); G5- (100 µg pcDNA-msp1β + 2% levamisole); G6 (100 µg pcDNA-msp5 +
SPG). In the positive control group, the BALB/c mice were inoculated with 100 µg PR1 A.
marginale initial bodies emulsified with complete Freund’s adjuvant, and following two
immunizations with incomplete Freund’s adjuvant. The mice were vaccinated at weeks 0, 3, 6
weeks and blood samples were collected at weeks 0, 3, 6, and 9. The sera samples were stored
at – 20
o
C until analysis.
Antibody assays and isotypes
Optimal dilutions were established using check board titrations with dilutions of sera
and conjugates. ELISA plates (Nunc-Immuno
TM
Maxisorp, Roskilde, Denmark) were coated
with 100 µl of the rMSP1a (5µg/ml) for G3; rMSP1b (5 µg/ml) for G4 and G5; rMSP5
(5µg/ml) for G6; pool of rMSPs (5µg/ml) for G1 and G2. After overnight incubation at 4
o
C,
83
samples of serum from mice immunized groups were diluted 1:50 in PBS-Tween 20 pH 7.4
plus 5% non-fat dry milk. Then, diluted samples were added in duplicate to each well, and the
plates were incubated at 37
o
C for 45 min. Positive and negative control sera were included in
each plate. Conjugates were used. Peroxidase-labeled anti mouse whole anti-IgG (Sigma)
(1:10.000), anti-mouse IgG1, and IgG2a horseradish peroxidase conjugate (1:50.000). The
substrate for the enzyme was OPD (ortho-phenylenediamine) 0.4 mg/ml, in H
2
O
2
0.04% in
substrate buffer (0.1M acid citric, 0.2M Na
2
HPO
4
). The reaction was stopped with 50 µL of
1N HCl. The absorbance values were average and the optic density (OD) values were
calculated as previously described (Garcia et al., 2006).
Western blot analysis
rMSP1a (G3), rMSP1b (G4 and G5), rMSP5 (G6), and whole antigens of E. coli BL21
(all the groups) were electrophoresed on 7.5-17.5% gradient SDS-PAGE (Laemmli, 1970).
The proteins were transferred onto a nitrocellulose membrane, 0.45 µm (Hybond-ECL
TM
,
Amershan Biosciences UK Limited), as previously described (Towbin and Gordon, 1984).
After transfer, the nitrocellulose membrane was blocked (7mM Na
2
HPO
4
, 3mM NaH
2
PO
4
,
140mM NaCl and 5% non-fat dried milk) for 1 h at room temperature. After washing, strips
of nitrocellulose membrane were incubated with pre immune and post immune pool sera of
mice from each group (G1 to G6) diluted 1:50 in a blocking solution. After washing, strips
were incubated with peroxidase-labeled protein G (1:5.000), and incubated for 1 h at room
temperature. The peroxidase activity was revealed using enhanced chemiluminescence (ECL)
(Amershan International, Amershan, UK). Protein molecular weight markers (BenchMark
TM
Invitrogen Life Technologies, USA) were used as standard.
Statistical analysis
84
The OD results from IgG2a and IgG1 were compared by ANOVA test, using
GraphPad Prism statistical package, a P-value of < 0.05 was
considered as significant.
Lymphocyte proliferation
Female BALB/c mice immunized with recombinant plasmids and mice from control
groups were sacrificed three weeks after the last immunization. Single–cell suspension was
prepared from spleens for each group (Bonenfant et al., 2001). The splenocytes were culture
in microtiter, in triplicate wells at 2 x 10
5
cells/well, in RPMI 1640 supplemented with 10%
FCS, 2mM glutamine, 0.05 mM 2-mercaptoetanol and 100 U/ml penicillin-streptomicin). The
culture was stimulated with one of the following: 2.5 µg/ml of Con A (positive control) (type
IV, Sigma), PBS for negative control and 10 µg/ml of the rMSP1a for G3, rMSP1b for G4
and G5, rMSP5 for G6, and a pool of recombinant proteins for G2. The culture were
maintained at 37
o
C with 5% CO
2
. To quantity cell proliferation, 3-(4.5-dimethylthaizol-2-yi)-
2.5-diphenyltetrazolium bromide (Vybrant MTT Cell Proliferation Assay Kit, Molecular
Probes) was prepared at 12 mM in PBS pH 7.2 and 10 µl of the solution were added to each
well in culture after 72 h. The plates with MTT were incubated for 4h at 37
o
C. After labbing
the cells with MTT, 50 µl of DMSO was added and incubate for 10 min at 37
o
C. The plates
were read absorbance at 540 nm by plate reader. The Stimulation Index (SI) was calculated as
the triplicate of stimulated cells (cells + Ag) divided by the cell control (cell + RPMI). An SI
> 2 was considered significant.
Results
A. marginale DNA vaccine construction
85
The vaccines were constructed with the recombinant plasmids designated pcDNA-msp1α,
pcDNA-msp1β and pcDNA-msp5. The expected fragment lengths of the msp1α, msp1β and
msp5 genes were amplified by PCR assay from recombinant plasmids, pcDNA- msp1α,
pcDNA- msp1β, and pcDNA-msp5, using specifics set of primers for each genes. The
expected fragment lengths amplified were 2.2, 2.0 and 0.6 kb for msp1α, msp1β, and msp5
genes, respectively (Fig.1). Sequencing demonstrated the correct insertion of genes into
pcDNA vector and demonstrated identity with msp1α, msp1β and msp5 sequences using
BLAST software (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST).
Humoral Immune response of mice elicited by DNA vaccination
Serological responses were evaluated through the immunizations by ELISA and Western
blot. The whole IgG production in mice is showed in Fig.2. All pre-immune and control group
sera (G1) were considered negative (reacted below cut-off). G2 showed seroconversion after
second immunization and maintained stable through the experiment. In G3 and G6 groups
seroconversion started after second immunization, but only after third immunization all
animals were positives for specifics rMSP1a and rMSP5 proteins. In contrast, in mice sera
from G4 and G5 no seroconversion was observed by ELISA through the experimental weeks.
The IgG1 and IgG2a responses against MSP1a, MSP1b and MSP5 from vaccinated
BALB/c mice at 0, 3, 6 and 9 weeks after immunization showed in figure 3. The IgG isotype
humoral response demonstrated IgG2a isotype polarization for G3 and G6 groups that were
immunized with pcDNA-msp1α and pcDNA-msp5, respectively. In contrast, mice immunized
with A. marginale proteins emulsified in Freund´s adjuvants (G2) demonstrated predominance
for IgG1 isotype, and the IgG1 polarization at weeks 6 and 9 was significant (p<0.05). The
IgG2a isotype was predominant for mice immunized with MSP5-DNA and MSP1a-DNA
vaccine after third immunization (p<0.05).
86
Western blot results using pool of sera are shown in Fig.4. Sera from mice immunized
with pcDNA-msp1β + SPG (G4) and pcDNA-msp1β + 2% levamisole (G5) reacted with 100
kDa (rMSP1b). Moreover, sera from mice immunized with pcDNA-msp1α (G3) reacted with
70-105 kDa and pcDNA-msp5 (G5) reacted at 31 kDa (rMSP5). Mice sera from positive
control group (G2) demonstrated reaction with rMSP1a, rMSP1b and rMSP5 (data not
showed). All pre-immune sera, and sera post immune of mice from G1 (negative control) did
not show any reaction.
Cellular Immune response of mice elicited by DNA vaccination
The lymphoproliferation of spleen cells from mice immunized with pcDNA-msp1α
and pcDNA-msp5 was significant (SI >2). In mice immunized with pcDNA-msp1β did not
show any proliferation (SI < 2) in both G4 and G5, with SPG and levamisole used as
adjuvant. No proliferation was verified in assay with spleen cells from G1 and G2 (Fig.5).
Discussion
The protective immune mechanism against bovine anaplasmosis has been associated
with both neutralizing and opsonizing IgG antibody and IFN-γ mediated activation of
phagocytes (Cantor et al., 1993, Brown et al., 2003). Epitopes from MSP1 complex are
important for elicited CD4
+
T-cell response and humoral responses, and to induce protective
immunity against A. marginale challenge (Brown et al., 2001). The native MSP1 is naturally
processed for T-cell epitope presentation by antigen presentation cells (APC) that initiate
IFN-γ-producing CD4
+
T-cell responses (Brown et al., 2002)
Immunization with DNA plasmids encoding for the antigen of interest represents a
novel and promising method in vaccine research and development. Studies have demonstrated
87
that after naked DNA immunization, the antigen is naturally processed and presented on
major histocompatibility complex class I and class II molecules, inducing a broad range of
immune responses including antibody production, CD4
+
T helper cell activation, and CD8
+
cytotoxic T cells (CTLs) (Donnelly et al., 1997, Ulmer et al., 1993, Nagata et al., 2004).
Few works with A. marginale DNA vaccine have been related and the DNA vaccines
to MSP1a and MSP1b have induced immune responses both BALB/c mice and calves
(Arulkanthan et al., 1999; Andrade et al., 2004).
In the present work, immunization of BALB/c mice with pcDNA-msp1α (G3) and
pcDNA-msp5 (G4) elicited specific antibodies for MSP1a and MSP5 of A. marginale after
third immunization. The mice immunized with pcDNA-msp1β (G4 and G5) no elicited
response in ELISA using rMSP1b, although, mice sera from these groups strongly reacted
with specific rMSP1b (100 kDa) in Western blot. It’s need further investigation.
The MSP1b is an important MSP that is associated with MSP1a in the native protein
through disulfide bonds (Vidotto et al., 1994). It presents variable regions with variant
specific epitopes that bind to different erythrocyte receptors (Camacho-Nuez et al., 2000).
After immunization of cattle with complex MSP1, all calves developed high titers of IgG
antibodies to both MSP1a and MSP1b polypeptides, although CD4
+
T-cell responses were
reproducibly detected only against MSP1a (Brown et al., 2001). The authors suggested that
MSP1a-specific T cells provide cognate help to both MSP1b specific B cells and MSP1a-
specific B cells.
In this work, mice immunized with pcDNA-msp1α encoding MSP1a and pcDNA-
msp5 encoding MSP5 of A. marginale exhibited predominance of IgG2a antibody over IgG1
(p<0.05). The presence of the IgG2a isotype is often considered as evidence of a Th1 immune
response (Oñate et al., 2003). Additionally, the protection against infection by an intracellular
pathogen, including Anaplasma, requires the generation of a Th1 immune response over time
88
(Brown et al., 1998, Oñate et al., 2003, Nagata et al., 2004). Thus, our results suggest that
intramuscular injection of plasmids encoding MSP1a and MSP5 generate a response biased
towards a Th1 response in mice, and could be used in the immunization of cattle.
In contrast, the G2 elicited IgG1 production five times higher than IgG2a. This is due
the antigens associated with Freund´s adjuvant that preferentially stimulate the Th2 immunity
and vigorously suppress the Th1 type (Yip et al., 1999).
The route of DNA immunization and the cellular localization of the expressed protein
affect the type of immune response generated (Morel et al., 2004). In general, DNA
immunization by intramuscular injection induces Th1 responses, whereas gene gun
immunization into the skin stimulates Th2 responses. However, it has been demonstrated that
gene gun immunization of mice with plasmid encoding cytoplasmic or transmembrane viral
antigens resulted strong Th1/CLT responses (Morel et al., 2004). The plasmid synthesizing
the Japanese encephalitis virus envelope protein injected as the naked DNA induced distinct
Th1 type of immune responses as evidenced by the preponderance of IgG2a antibodies (Kaur
et al., 2004).
The failure of DNA vaccine to induce a potent immune response can be attributed by
low levels of antigen production and inefficient stimulation of the innate immune system
(Ulmer et al., 2006). Different adjuvants with immunomodulatory and carrier properties have
been used together with DNA vaccine (Lima et al., 2004). The predominance of Th1
stimulatory activity determined by IgG2a production was reached when levamisole were used
as chemical adjuvant on DNA vaccination for foot and mouth diseases virus (Jin et al. 2004).
However, in our experiments, the results of use of levamisole and SPG with pcDNA-msp1β
was not conclusive, because the rMSP1b was not detected by antibodies from sera immunized
mice, by ELISA.
89
In conclusion, the immunization of mice with plasmids encoding MSP1a and MSP5
induced Th1 immune response, predicted by IgG2a production, which stimulates its use in
immunization of cattle.
Acknowledgments
We wish to thanks Prof. Dr. Selwyn Arlington Headley for revising the manuscript.
This work was financially supported by CNPq, CAPES, and Fundação Araucária do Paraná.
References
Andrade, G.M., Vidotto, O., Vidotto, M.C., Yoshihara, E., Kano, F.S., Amaral, C.H., 2001.
Seroprevalence of Anaplasma marginale in dairy cattle and, studies on the dynamics of
natural infection of Holstein calves in Southern Brazil. Semina: Ciências Agrárias 22, 155-
160.
Andrade, G.M., Machado, R.Z., Vidotto, M.C., Vidotto, O., 2004. Immunization of bovines
using a DNA vaccine (pcDNA3.1/MSP1b) prepared from the Jaboticabal strain of Anaplasma
marginale. Annals of the New York Academy of Sciences 1026, 257-266.
Arulkanthan, A., Brown, W., McGuire, T.C., Knowles, D.P., 1999. Biased Immunoglobulin
isotype response induced in cattle with DNA expressing msp1a of Anaplasma marginale.
Infection and Immunity 67, 3481-3487.
Bonenfart, C., Dimier-Poisson, I., Velge-Roussel, F., Buzoni-Gatel, D., Rappuoli, R., Bout,
D., 2001. Intranasal immunization with SAG1 and nontoxic mutant heat-labile enterotoxins
protects mice against Toxoplasma gondii. Infection and Immunity 69, 1605-1612.
Brown, W.C., Shakp, V., Zhu, D., McGuire, T.C., Tuo, W., McElwain, T.F., Palmer, G.H.,
1998. CD4
+
T-lymphocyte and immunoglobulin G2 responses in calves immunized with
Anaplasma marginale outer membranes and protected against homologous challenge.
Infection and Immunity 66, 5406-5413.
Brown, W.C., Palmer, G.H., Lewin, H.A., McGuire, T.C., 2001. CD4
+
T-lymphocytes from
calves immunized with Anaplasma marginale major surface protein 1 (MSP1), a heteromeric
90
complex of MSP1a and MSP1b, preferentially recognize the MSP1a carboxyl terminus that is
conserved among strains. Infection and Immunity 69, 6853-6862.
Brown, W.C., McGuire, T.C., Mwangi, W., Kegerreis, K.A., Macmillsn, H., Lewin, H.A.,
Palmer, G.H., 2002. Major Histocompatibility Complex Class II DR-Restricted Memory
CD4+ T Lymphocytes Recognize Conserved Immunodominant Epitopes of Anaplasma
marginale Major Surface Protein 1a. Infection and Immunity 70, 5521–5532.
Brown, W.C., Brayton, K.A., Styer, C.M., Palmer, G.H., 2003. The hypervariable region of
Anaplasma marginale major surface protein 2 (MSP2) contains multiple immunodominant
CD4
+
T lymphocytes epitopes that elicit variant-specific proliferative and IFN-γ responses in
MSP2 vaccinates. The Journal of Immunology 170, 3790-37.
Camacho-Nuez, M., Mun’oz, L., Suarez, C.E., McGuire, T.C., Brown, W.C., Palmer, G.H.,
2000. Expression of polymorphic msp1b genes during acute Anaplasma marginale
rickettsemia. Infection and Immunity 68, 1946-1952.
Cantor, G.H., Pontzer, C.H., Palmer, G.H., 1993. Opsonization of Anaplasma marginale
mediated by bovine antibody against surface protein MSP-1. Veterinary Immunology and
Immunopathology 37, 343–350.
Condon, C., Watkins, S.C., Celluzzi, C.M., Thompson, K., Falo, D.J., 1996. DNA-based
immunization by in vivo transfection of dendritic dells. Nature Medicine 2, 1122-1128.
Del Giudice, G., Rappuoli, R., 1999. Genetically derived toxoids for use as vaccines and
adjuvants. Vaccine 17, S44-S52.
Dong-Ji, Z., Yang, X., Shen, C., Lu, H., Murdin, A., Brunham, R.C., 2000. Priming with
Clamydia trachomatis major outer membrane protein (MOMP) DNA followed by MOMP
ISCOM boosting enhances protection and is associated with increased immunoglobulin A and
Th1 cellular immune responses. Infection and Immunity 68, 3074-3078.
Donnelly, J.J., Ulmer, J.F., Shiver, J.W., Liu, M.A., 1997. DNA vaccines. Annual Review of
Immunology15, 617-648.
Doolan, D.L., Hoffman, S.L., 1997. Multi-gene vaccination against malaria: A multistage,
multi-immune response Approach. Parasitology Today 13, 171-178.
Eid, G., French, D.M., Lundgren, A.M., Barbet, A.F., McElwain, T.F., Palmer, G.H., 1996.
Expression of major surface protein 2 antigenic variants during acute rickettsemia. Infection
and Immnunity 64, 836.
91
Ferreira, A.M.T., Suzart, S., Knowles, D.P., Vidotto, M.C., 2001. Use of repetitive DNA
elements to define genetic relationships among Anaplasma marginale isolates. FEMS
microbiology letters 197, 139-143.
Garcia, J.L., Navarro, I.T., Vidotto, O., Gennari, S.M., Machado, R.Z., Sinhorini, I.L., 2006.
Toxoplasma gondii comparison of rhoptry-ELISA with IFAT and MAT for antibody detection
in sera of experimentally infected pigs. Experimental Parasitology 113, 100- 105.
Garcia-Garcia, J., de la Fuente, J., Kocan, K.M., Blouin, E.F., Albur, T., Onet, V.C., Saliki,
J.T., 2004. Mapping of B-cell epitopes in the N-terminal repeated peptides of Anaplasma
marginale major surface protein 1a and characterization of the humoral immune response of
cattle immunized with recombinant and whole organism antigens. Veterinary Immunology
and Immunopathology 98, 137-151.
Jin, H., Li, Y., Ma, Z., Zhang, F., Xie, Q., Gu, D., Wang, B., 2004. Effect of chemical
adjuvants on DNA vaccination. Vaccine 22, 2925-2935.
Kano, F.S., Vidotto, O., Pacheco, R.C., Vidotto, M.C., 2002 Antigenic characterization of
Anaplasma marginale isolates from different regions of Brazil. Veterinary Microbiology 87,
131-138.
Kaur, R., Rauthan, M., Vrati, S., 2004. Immunogenicity in mice of a cationic microparticle-
absorbed plasmid DNA encoding Japanese encephalitis virus envelope protein. Vaccine 22,
2776-2782.
Knowles, D.P., de Echaide, T., Palmer, G., McGuire, T.C., Stiller, D., McElwain, T.F., 1996.
Antibody against an Anaplasma marginale MSP5 epitope common to tick and erythrocyte
stages identifies persistently infected cattle. Journal Clinical Microbiology 34, 2225-2230.
Kongkasuriyachai, D., Andrews, L.B., Stowers, A., Collins, W.E., Sullivan, J., Sattabongkot,
J., Torii, M., Tsuboi, T., Kumar, N., 2004. Potent immunogenicity of DNA vaccines
encoding Plasmodium vivax transmission-blocking vaccine candidates Pvs25 and Pvs28 –
evolution of homologous and heterologous antigen-delivery prime-boost strategy. Vaccine 22,
3205-3213.
Kuttler K.L., 1984. Anaplasma infections in wild and domestic ruminants: a review.
Journal Wild Disease 20, 12-20. 334.
Laemmili, U.K., 1970. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of
bacteriophage T4. Nature 227, 680 – 685.
92
Liao, J.C.F., Gregor, P., Wolchok, J.D., Orlandi, F., Craft, D., Leung, C., Houghton, A.N.,
Bergaman, P.J., 2006. Vaccination with human tyrosinase DNA induces antibodies responses
in dogs with advanced melanoma. Cancer Immunity 6, 2-10.
Lima, K. M., Santos, S.A., Rodrigues Jr., J.M., Silva, C.L., 2004. Vaccine adjuvant: it makes the
difference. Vaccine 22, 2374–2379.
Marana, E.R.M., Kano, F.S., Tamekuni, K., Ataliba, A.C.,
Vicentini, J.C., Spurio, R.S., Vidotto, M.C., Vidotto, O., 2006. Padronização e
avaliação de um teste de ELISA por competição para o diagnóstico da anaplasmose bovina
utilizando a proteína recombinante MSP5-PR1. Congresso Brasileiro de Parasitologia
Veterinária e II Simpósio Latino-Americano de Riquetsioses, Anais..., 5, Ribeirão Preto,
SP.
McGarey, D.J., Barbet, A.F., Palmer, G.H., McGuire, T.C., Allred, D.R., 1984. Putative
adhesions of Anaplasma marginale major surface polypeptides 1a and 1b. Infection and
Immunity 62, 4594-4601.
Morel, P.A., Falkner, D., Plowey, J., Larregina, A.T., Falo Jr, L.D., 2004. DNA
immunization altering the cellular localization of expressed protein and the immunization
route allows manipulation of the immune response. Vaccine 22, 447-456.
Nagata, T., Aoshi, T., Uchima, M., Suzuki, M., Koide, Y., 2004. Cytotoxic T-lymphocyte,
and helper-T-lymphocyte-oriented DNA vaccination. DNA and Cell Biology 23, 93-106.
Oberle, S.M., Palmer, G.H., Barbet, A.F., 1993. Expression and immune recognition of the
conserved MSP4 outer membrane protein of Anaplasma marginale. Infection and Immunity
61, 5245-5251.
Oliveira, J.B., Madruga, C.R., Kessler, R.H., Miguita, M., Araújo, F.R., 2003. Antigenic
characterization of Brazilian isolates of Anaplasma marginale. Memórias do Instituto
Oswaldo Cruz 98, 395-400.
Oñate, A.A, Céspedes, S., Cabrera, A., Rivers, R., González, A., Muñoz, C., Folch, H.,
Andrews, E.A., 2003. DNA vaccine encoding Cu, Zn superoxide dismutase of Brucella
abortus induces protective immunity in BALB/c mice. Infection and Immunity 71, 4857-
4861.
93
Palmer, G.H., Rurangirwa, F.R., Kocan, K.M., Brown, W.C., 1999. Molecular basis for
vaccine development against the ehrlichial pathogen Anaplasma marginale. Parasitology
Today 15, 281-286.
Tamekuni, K., Kano, F.S., Kawasaki, P.M., Igarashi, M.,
Ataliba, A.C., Coelho, A.L.M., Marana, E.R.M., Vidotto, M.C., Vidotto, O., 2006.
Cloning, sequencing and antigenic characterization of Msp1a and Msp1b recombinant
proteins of the Anaplasma marginale PR1 strain. Congresso Brasileiro de
Parasitologia Veterinária e II Simpósio Latino-Americano de Riquetsioses, Anais..., 5,
Ribeirão Preto, SP.
Tebele, N., McGuire, T.C., Palmer, G.H., 1991. Induction of protective immunity by using
Anaplasma marginale initial body membranes. Infection and Immunity 59, 3199-3204.
Towbin, H., Gordon, H., 1984. Immunoblotting and dot immunoblotting: current status and
out look. Journal of Immunological Methods 72, 313-340.
Tuo, W., Palmer, G.H., McGuire, T.C., Zhu, D., Brown, W., 2000. Interleukin-12 as an
adjuvant promotes immunoglobulin G and type I cytokine recall responses to major surface
protein 2 of the ehrlichial pathogen Anaplasma marginale. Infection and Immunity 68, 270-
280.
Ulmer, J.B., Donnelly, J.J., Parker, S.E., 1993. Heterologous protection against influenza by
injection of DNA encoding a viral protein. Science 253, 1745-1749.
Ulmer, J.B., Liu, M.A., Montgomery, D.L., Yawman, A.M., Deck, R.R., DeWitt, C.M., 1997.
Content J. Expression and immunogenity of Mycobacterium tuberculosis antigen 85 by DNA
vaccination. Vaccine 15, 792-794.
Ulmer, J.B., Wahren, B., Liu, M.A., 2006. Gene-based vaccines: recent technical and clinical
advances. TRENDS in Molecular Medicine 12, 216-222.
van Drunen Little-van den Hurk, S., Loerh, B.I., Babiuk, L.A., 2001. Immunization of livestock
with DNA vaccines: current studies and future prospects. Vaccine 19, 2474-2479.
Vercammen, M., Scorza, T., Huygen, K., De Braekeleer, J., Diet, R., Jacobs, D., Saman, E.,
Verchueren, H., 2000. DNA vaccination with genes encoding Toxoplasma gondii antigens
GRA1, GRA7, and ROP2 induces partially protective immunity against lethal challenge in
mice. Infection and Immunity 68, 38-45.
94
Vidotto, M.C., McGuire, T.C., McElwain, T.F., Palmer, G.H., Knowles Jr, D.P., 1994.
Intermolecular relationships of major surface proteins of Anaplasma marginale. Infection and
Immunity 62, 2940-2946.
Visser, E.S., McGuire, T.C., Palmer, G.H., Davis, W.C., Shkap, V., Pipano, E., Knowles,
D.P., 1992. The Anaplasma marginale msp5 gene encodes a 19 kilodalton protein conserved
in all recognized Anaplasma species. Infection and Immunity 60, 5139-5144.
Yip, H.C., Karulin, A.Y., Tary-Lehmann, M., Hesse, M.D., Radeke, H., Heeger, P.S., Trezza,
R.P., Heinzel, P., Forsthuber, T., Lehmann, P.V., 1999. Adjuvant-Guided type 1 and type 2
immunity: Infections/noninfection dichotomy defines the class of response. The Journal of
Immunology 162, 3942-3949.
Yoshihara, E., Vidotto, O., Yamamura, M.H., Marana, E.R.M., Pacheco, R., Silveira, A.P.,
2003. Studies of natural infection with Anaplasma marginale in Nelore cattle in the
Umuarama municipality, Parana State. Revista Brasileira de Parasitologia Veterinária 12, 21-
26.
95
Figure 1. Amplification of msp1α, msp1β and msp5 genes of A. marginale using pcDNA-
msp1α, pcDNA-msp1β and pcDNA-msp5 as template by PCR using specifics primers for
each full length genes. Lane 1: 1 kb leader; Lane 2: msp1α amplified from pcDNA-msp1α;
Lane 3: msp1β gene amplified from pcDNA- msp1β; Lane 4: msp5 gene amplified from
pcDNA- msp5; Lane 5:100 bp ladder.
2,2
2,0
0,63
0.5 kb --
1.0 kb
--
1.6 kb --
2.0 kb --
3.0 kb --
4.0 kb --
-- 600 bp
96
a)
0369
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
Experimental weeks
OD
490nm
b)
0369
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
Experimental weeks
OD
490nm
c)
0369
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
Experimental weeks
OD
490nm
d)
0369
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
Experimental weeks
OD
490nm
e)
0369
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
Experimental weeks
OD
490nm
f)
0369
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
Experimental weeks
OD
490nm
Figure 2. IgG antibody response measured by the indirect enzyme-linked immunosorbent
assay (ELISA) in BALB/c mice of the (a) G1 (100 µl phosphate buffered saline-PBS), (b) G2
(100 µg initial bodies A. marginale), (c) G3 (100 µg pcDNA-msp1α), (d) G4 100 µg pcDNA-
msp1β + sucrose-phosphate-glutamato-SPG), (e) G4 (100 µg pcDNA-msp1β + 2%
levamisole), (f) G5 (100 µg pcDNA-msp5 + SPG). Mice were immunized at weeks 0, 3, and
6; Blood was collect at weeks 0, 3, 6, and 9. Dashed line indicates positive cut-off.
97
a)
0369
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
Exp e r i m e t a l
weeks
b)
0369
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
Exp e r i m e t al
weeks
c)
0369
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
Exp e r i m e t al
weeks
IgG1
IgG2a
d)
0369
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
Ex p e r i m e t a l
weeks
e)
0369
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
Ex p e r i m e t al
weeks
f)
0369
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
Experimetal
weeks
Ig G1
Ig G2 a
Figure 3. Humoral responses of serum IgG isotype from BALB/c mice immunized with
DNA-vaccine encoding A. marginale MSP1a, MSP1b, and MSP5 proteins. Pool of serum
taken 0, 3, 6 and 9 weeks after initial immunization were analyzed by ELISA. (a) G1
(phosphate buffer saline-PBS), G2 (100 µg initial bodies A. marginale + Freund´s Adjuvant),
(c) G3 (100 µg pcDNA-msp1α + sucrose phosphate glutamate-SPG), (d) G4 (100 µg pcDNA-
msp1b + SPG), (e) G4 (100 µg pcDNA-msp1b + 2% levamisole) and (f) G5 (100 µg pcDNA-
msp5 + SPG).
98
Figure. 4. Reactivity of sera from mice immunized with DNA vaccines encoding MSP1a,
MSP1b and MSP5 by Western blot. Serologic analysis was developed with a pool of six
groups antisera at weeks 0 and 9 from mice immunized in experimental study. Lanes 1 and 2
represents pre immune sera. Lanes 3 and 4: post immune sera at week 9. (A) G3 - pcDNA-
msp1α + SPG (lanes 1 and 3: BL21 E. coli; lanes 2 and 4: rMSP1a). (B) G4 - pcDNA-msp1β
+ SPG (lanes 1 and 3: BL21 E. coli; lanes 2 and 4: rMSP1b). (C) G5 - pcDNA-msp1β +
levamisole 2% (lanes 1 and 3: BL21 E. coli; lanes 2 and 4: rMSP1b). (D) G6 - pcDNA-msp5
+ SPG (lanes 1 and 3: BL21 E. coli; lanes 2 and 4: rMSP5). The positions and molecular
masses (in kilodaltons) of protein standarts are also shown.
40
80
90
120
20
30
60
15
25
50
70
100
220
160
kDa
31
100
100
105
70
99
Figure 5. In vitro proliferation of splenocytes from DNA-vaccinated BALB/c mice after
stimulation of rMSP1b and rMSP5, MTT (3-(4.5-dimethylthaizol-2-yi)-2.5-
diphenyltetrazolium bromide) was added for 4 h. The incorporated MTT cell was then
measured. Control splenocytes from mice received the PBS. For comparative purposes,
splenocytes from no immunized BALB/c mice were included in the experiment. Stimulation
Index (SI) values higher than 2.0 (dashed line) was considered significant.
- PBS
- A. marginale + Freund´s adjuvant
-pcDNA-msp1α + SPG
-pcDNA-msp1
β
+ SPG
-pcDNA-msp1
β
+ levamisole
-pcDNA-msp5 + SPG
G1 G2 G3 G4 G5 G6
0
5
10
15
G1
G2
G3
G4
G5
G6
Stimulation Index (SI)
100
4.2. Enhanced immunogenicity of DNA vaccine encoding MSP1a, MSP1b,
and MSP5 antigens of Anaplasma marginale in association
Artigo editado de acordo com as normas de publicação do periódico Research in Veterinary
Science
101
Enhanced immunogenicity of DNA vaccine encoding MSP1a, MSP1b, and MSP5
antigens of Anaplasma marginale in association
Abstract
Immunization with DNA plasmids encoding for the antigen of interest represents a
novel and promising method in vaccine research and development. Multiepitope DNA
vaccine is a new experience to increase immunogenicity and protection for vaccinated animal
as compared in single epitope. This study evaluated the capacity of the recombinant plasmids
to express MSP1a, MSP1b, and MSP5 in eukaryotic cells in vitro, and the immunogenicity in
BALB/c mice immunized with recombinant plasmids individually or in association.
Recombinant plasmids used were pcDNA-msp1α, pcDNA-msp1β, and pcDNA-mp5,
multiplied in TOP10 E. coli, and purified. Expression of MSP1a, MSP1b, and MSP5 in vitro
was performed into Vero cells using lipofectamine 2000, following Indirect
Immunofluorescence Assay (IFA) using monoclonal antibodies. Seven experimental groups
of mice were immunized to evaluate the production of whole IgG and to determinate IgG1
and IgG2a isotype: G1-100 µl PBS; G2-100 µg empty vector + SPG; G3-100 µg A. marginale
initial bodies + Freund´s adjuvant; G4-100 µg pcDNA-msp1α + SPG; G5-100 µg pcDNA-
msp1β + SPG; G6-100 µg pcDNA-msp5 + SPG; and G7-pool of recombinant plasmids + SPG
(33 µg for each). Three weeks after the last immunization, mice were sacrificed to evaluated
spleen cells proliferation. Vero cells transfected with recombinants plasmids reacted with
specifics monoclonal antibodies, demonstrating the expression of msps genes. The G3 (A.
marginale) showed seroconversion after second immunization and the groups G4 (MSP1a),
G6 (MSP5) and G7 (pool) showed seroconversion after third immunization. The G5 (MSP1b)
showed the lost seroconversion after fifth immunization. The IgG2a/IgG1 ratios demonstrated
IgG2a isotype polarization in all groups immunized with DNA vaccines, and G3
demonstrated predominance for humoral IgG1 isotype. The association of three recombinant
plasmids (pcDNA-msp1α, pcDNA-msp1β and pcDNA-msp5) in the immunization of mice
showed high antibodies response by ELISA and reacted with all recombinant proteins
(rMSP1a, rMSP1b, and rMSP5) of A. marginale by Western blot. Also, when the recombinant
plasmids were administrated in combination, the strong enhancer lymphoproliferation was
observed (SI = 12,2), whereas the genes to MSP1a provide significant splenocytes (SI = 2,6)
and the genes to MSP1b and MSP5 did not provide significant proliferation (SI < 2). These
102
results demonstrated that no suppression was observed when these recombinant plasmids
were used in association could generate significant T-cell lymphocyte. Thus, the
immunization with recombinant plasmids encoding MSPs in association can be an effective
strategy for immunoprofilaxis of anaplasmosis.
Key words: Anaplasma marginale, DNA vaccine, Vero cells, BALB/c mice, Immunogenicity
Introduction
Outer membrane proteins of Anaplasma marginale have been the focus of research
direct toward an improved vaccine against bovine anaplasmosis (Palmer et al., 1999).
Immunization with purified outer membranes induces protection against acute A. marginale
infection and disease (Tebele et al., 1991). Various major outer membranes have been
described after proteomic and genomic approach and were identified 21 proteins within the
outer membrane immunogen (Lopez et al., 2005). Some outer membranes proteins well
characterized and designed major surface proteins (MSPs): MSP1a, MSP1b, MSP2, MSP3,
MSP4 and MSP5 and evaluated candidates as antigen for vaccine and diagnostic test
(McGarey et al., 1984; Visser et al., 1992; Oberle et al., 1994; Alleman and Barbet, 1996;
Kano et al., 2002; Garcia-Garcia et al., 2004).
Immunization with DNA plasmids encoding for the antigen of interest represents a
novel and promising method in vaccine research and development. Studies have demonstrated
that after naked DNA immunization, the antigen is naturally processed and presented on
major histocompatibility complex class I and class II molecules, inducing a broad range of
immune responses including antibody production, CD4
+
T helper cell (Th1), and CD8
+
cytotoxic T cells (CTLs) (Ulmer et al., 1993, Donnelly et al., 1997, Nagata et al., 2004).
Incorporation of multiepitope in DNA immunization consisting new experience to increase
immunogenicity and protection for vaccinated animal as compared in single epitope (Morris
et al., 2000).
103
Immunization against anaplasmosis with single DNA vaccine (pVCL/msp1α)
developed antibodies against MSP1a protein in mice and calves (Arulkanthan et al., 1999). In
another experiment, immunization with pcDNA-msp1β elicited antibodies and cattle
immunized showed partial protected against a virulent homologous challenge.
The aimed of the present work was to evaluate the capacity of the recombinant
plasmids to express MSP1a, MSP1b, MSP5 in eukaryotic cells in vitro, and the
immunogenicity in BALB/c mice immunized with these recombinant plasmids individually or
in combination.
Materials and Methods
Anaplasma marginale isolate and DNA extract
A. marginale isolate was obtained from infected cattle of Paraná State (PR), Brazil,
and designed PR1 (Ferreira et al., 2001; Kano et al., 2002). DNA was extracted from stabilate
PR1 A. marginale using Purigene DNA Extract Kit (Gentra System, Minneapolis, MN, USA)
according to manufacture’s recommendation.
Production of DNA vaccines
The recombinant plasmids (pcDNA-msp1α, pcDNA-msp1β, pcDNA-msp5) were
construct in previously study for our group (unpublished). Large scales culture of TOP10 E.
coli containing recombinant plasmids were growing in LB broth at 37
o
C, and the Qiagen
Plasmid Mega Kit (Qiagen, Valencia, CA, USA) was used to prepare DNA. The recombinant
plasmids were quantified using by spectofotometry measuring the optical density at 280 nm.
104
Production of recombinant MSPs proteins
The recombinant plasmids pET102-msp1α, pET101-msp1β (Tamekuni et al., 2006),
pRSET-msp5 (Marana et al., 2006) were used to produce recombinant MSP1a, MSP1b, and
MSP5 as a fusion product with 6xHis. The rMSPs were purified using Ni-NTA resin
according to the supplier’s instructions (Qiagen, Valencia, CA, USA).
In vitro transfection and expression
The recombinant plasmids were examined for antigen expression by transfection into
Vero cells using lipofectamine 2000 (Invitrogen
TM
Life Technologies, Carlsbad, CA, USA).
After 72 hrs for transient transfection, cells were fixed in coverslips with cold
methanol for 10 min, acetone for 1 min, following Indirect Immunofluorescence Assay (IFA).
Non-transfected Vero cells and pcDNA/LacZ transfected Vero cells were used as negative
and positive controls, respectively. Prior to use in IFA, positive control cells were evaluated
for the transfection efficiency by X-gal staining (1 mg/ml X-gal, 5 mM potassium
ferrocyanide, 5 mM potassium ferricyanide, 2 mM MgCl
2
) as described by Briane et al.
(2002). The IFA was performed with anti-histidine diluted 1:5.000 (for MSP1b), anti-MSP1a
monoclonal antibody ANA22B1 diluted 2µg/ml (MSP1a), and anti-MSP5 monoclonal
antibody ANAF16C1 2µg/ml (MSP5) diluted in PBS containing 2% BSA, and incubated for
45 min at 37
o
C. After three times washes in PBS-Tween 20, the coverslips were incubated
for 45 min with FITC-anti-mouse IgG (Sigma-Aldrich Co, USA) diluted 1:900 in PBS
containing 2% BSA. The IFA was examined using a fluorescence microscope with
appropriate filters.
105
Animal and experimental design
Seven to eight weeks old female BALB/c mice were randomly distributed into seven
experimental groups with eight animals each. Mice were kept in conventional animal facilities
and received water and food ad libitum, and used under animal protocols approved by the
Institutional Research Committee (process number 26927/05).
Mice were anaesthetized prior following injection with 100 µg of recombinant
plasmids in sucrose-phosphate-glutamate buffer (SPG) (Dong-Ji et al., 2000) in each leg
muscle. G1-negative control (100 µl PBS); G2-empty vector (100 µg pcDNA); G3-positive
control (100 µg PR1 strain A. marginale initial bodies + Freund´s adjuvant); G4-pcDNA-
msp1α; G5-pcDNA-msp1β; G6-pcDNA-msp5; and G7-pool of recombinant plasmids (33 µg
for each pcDNA-msp1α, pcDNA-msp1β, and pcDNA-msp5). In the positive control group,
the BALB/c mice were inoculated with 100 µg PR1 A. marginale initial bodies emulsified
with complete Freund’s adjuvant, and following two immunizations with incomplete Freund’s
adjuvant. Mice were vaccinated at 0, 2, 5, 8 and 12 weeks. Blood samples were collected at –
1, 1, 4, 7, 11 and 15 weeks, and the sera samples stored at – 20
o
C until analysis.
Antibody assays and isotypes
Optimal dilutions were established using check board titrations with dilutions of sera
and conjugates. ELISA plates (Nunc-Immuno
TM
Maxisorp, Roskilde, Denmark) were coated
with 100 µl of the rMSP1a (5 µg/ml) for G4; rMSP1b (5 µg/ml) for G5; rMSP5 (5 µg/ml) for
G6; and pool of rMSP1a, rMSP1b, rMSP5 (5 µg/ml) for G7 and A. marginale initial bodies
(10 µg/ml) for G3, G1 and G2. After overnight incubation at 4
o
C, samples of serum from
groups of immunized mice were diluted 1:50 in PBS-Tween 20 pH 7.4 plus 5% non-fat dry
milk. Then, diluted samples were added in duplicate to each well, and the plates were
incubated at 37
o
C for 45 min. The positive and negative control sera were included in each
106
plate. Three second antibodies were used, horseradish peroxidase-labeled anti mouse whole
anti-IgG (Sigma) (1:10.000), and anti-mouse IgG1, and anti-mouse IgG2a peroxidase
conjugate (1:50.000), each incubated for 45 min at 37
o
C. The substrate for the enzyme was
OPD (ortho-phenylenediamine) 0.4 mg/ml, in H
2
O
2
0.04% in substrate buffer (0.1 M acid
citric, 0.2 M Na
2
HPO
4
). The reaction was stopped with 50 µl of 1N HCl. The absorbance
values were average and the optic density (OD) values were calculated as previously
described (Garcia et al., 2006).
Western blot analysis
rMSP1a (G4), rMSP1b (G5), rMSP5 (G6), a pool of rMSPs (G7), and A. marginale
initial bodies (G3) were electrophoresed on 7.5-17.5% gradient SDS-PAGE (Laemmli, 1970).
The proteins were transferred onto a nitrocellulose membrane, 0.45 µm (Hybond-ECL
TM
,
Amershan Biosciences, Sunnyvale, CA, USA), as previously described (Towbin and Gordon,
1984). After blocking, strips of nitrocellulose membrane were incubated with pre immune and
post immune pool of serum from mice of the each group (G1 to G7) diluted 1:50 in blocking
solution. Peroxidase-labeled protein G (1:5.000) was used as second antibody, and incubated
for 1 h at room temperature. The peroxidase activity was revealed using enhanced
chemiluminescence (ECL) (Amershan Biosciences, Sunnyvale, CA, USA). Protein molecular
weight markers (BenchMark
TM
Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) were used
as standard.
Statistical analysis.
The student’s t test was performed for statistical evaluation of data from IgG2a and
IgG1 production.
107
Proliferation Assay
Spleen from mice immunized with recombinant plasmids, control group and normal
mice were removed aseptically and teased. The erythrocytes were lysed with tris-ammonium
chloride, and the cell suspension was washed three times in RPMI 1640 medium. For
proliferative assays, 100 µl of the cells were cultured in triplicate wells at a concentration of 1
x10
6
cells/ml in RPMI 1640 containing 10% fetal calf serum in 96-well flat-bottom culture
plates. Homogenate A. marginale was then added to each well at concentrations of 5 µg/ml.
The cells were cultured for 5 days at 37°C with 5% CO
2
, and were pulsed with 1 µCi of [³H]
thymidine 18 h before harvesting on glass filter strips. The radioactivity was determined by
cintilator (Beckman LS 6.800). The Stimulation Index was calculated as the triplicate of
stimulated cells (cells + Ag) divided by the cell control (cell + RPMI 1640). An SI of > 2 was
considered significant
Results
Eukaryotic expression of MSPs antigens of A. marginale
Cells transfected with recombinant plasmids (pcDNA-msp1α, pcDNA-msp1β, and
pcDNA-msp5) revealed the expression of specific proteins by IFA (Fig.1). Non-transfected
Vero cells did not express any immunoreactive protein with anti-histidine, ANA22B1,
ANAF16C1 monoclonal antibodies by IFA (Fig 1a). The immunoreaction was verified in
Vero cells transfected with pcDNA-msp1α using ANA22B1 monoclonal antibody against
MSP1a (Fig.1c). Also, anti-histidine monoclonal antibody was used to detected six histidine
aminoacid that express fusioned with recombinant MSP1b (Fig.1d) and ANAF16C1 bound to
cells transfected with pcDNA-msp5 (Fig.1e).
108
Humoral immune response of mice elicited by DNA vaccination
Serological responses were evaluated throughout of the immunizations by ELISA and
Western blot analysis. The whole IgG production in mice was showed in Fig.2. All pre-
immune and control group sera (G1 and G2) reacted below cut-off and were considered
negative. Mice sera from group immunized with A. marginale (G3) showed seroconversion
after second immunization that maintained stable throughout of the experiment. In G4
(pcDNA-msp1α), G6 (pcDNA-msp5), and G7 (pool of plasmids) the seroconversion started
after second immunization, but only after third immunization all animals were positives for
specific proteins. In contrast, mice sera from G5 (pcDNA-msp1β) showed lower
seroconversion and few animals had OD above cut-off after fifth immunization.
The IgG1 and IgG2a responses against MSP1a, MSP1b, and MSP5 were analysed from
pool sera from DNA-vaccinated BALB/c mice at -1, 4, 11, and 15 weeks after initial
immunization (Fig.3). The OD values for IgG1 and IgG2a demonstrated IgG2a isotype
polarization at all groups immunized with DNA vaccines. Significant IgG2a production over
IgG1 production were detected after fourth immunization with DNA vaccine, and G4, G6 and
G7 had strong polarization for IgG2a at week 4 (p<0.01). Mice immunized with A. marginale
(G3) demonstrated predominance for humoral IgG1 isotype and the significant IgG1 levels
was verify at week 4 (p<0.01). The predominance of IgG2a over IgG1 isotype suggests that in
the DNA vaccinated BALB/c mice elicited a pronounced Th1 response.
Western blot results using pool of sera are shown in Fig.4. All pre-immune sera, and
sera post immune of mice from G1 (PBS) (data not showed) and G2 (vector alone) did not
show any reaction. Sera from mice immunized with pcDNA-msp1α (G4) showed reactivity
approximately in 105-70 kDa and approximately 20 kDa (rMSP1a), and mice immunized with
pcDNA-msp1β (G5) reacted poorly with 100 kDa (rMSP1b). Moreover, sera from mice
immunized with pcDNA-msp5 (G6) reacted at 31 kDa (rMSP5). Mice sera from G7 that
109
received recombinant plasmids in mixture reacted with all recombinant proteins (rMSP1a,
rMSP1b, and rMSP5) of A. marginale. This result demonstrated that no suppression was
observed when these recombinant plasmids had taken in association.
T cell-mediated immune responses
Splenocytes proliferation from mice immunized using A. marginale homogenate
presented in Fig. 5. Significant proliferation was observed only in mice spleen cells from G4
that received pcDNA-msp1a (SI = 2,6). In others groups no significant proliferation was
observed (SI < 2). Although poorly lymproliferation was observed in spleen cells from mice
immunized with recombinant plasmids individually, when they were administrated in
combination, the strong enhancer lymphoproliferation was observed (SI = 12,2).
Discussion
In this work, the MSP1a, MSP1b, and MSP5 of A. marginale were successful detected
in Vero cells transfected with pcDNA-msp1α, pcDNA-msp1β, and pcDNA-msp5,
respectively, as demonstrated by IFA using monoclonal antibodies, and the injection of the
recombinant plasmids (pcDNA-msp1α, pcDNA-msp1β and pcDNA-msp5) elicited specific
antibodies against MSP1a, MSP1b and MSP5 in BALB/c mice. Previous works also related
that DNA vaccines to A. marginale induced immune responses in BALB/c mice immunized
with DNA vaccine encoding MSP1a (Arulkanthan et al., 1999). These authors immunized
calves with pVCL/ msp1α and detected only IgG1 antibodies in sera of animals following
DNA vaccination, differently of positive-control bovine serum that contained both IgG1 and
IgG2 antibodies with specificity for MSP1a. The few studies about control of anaplasmosis
using DNA vaccination are based in either genes msp1α or msp1β genes, and they showed
110
partial protection for virulent challenge with A. marginale strain (Arulkanthan et al., 1999,
Andrade et al., 2004).
The mice immunized with pcDNA-msp1β elicited a small response compared with the
response from mice immunized with cDNA-msp1α and pcDNA-msp5, evaluated by ELISA.
Only two of eight animals produced titer of specific antibodies with OD above cut-off, after
fifth immunization. However, the sera from mice immunized with pcDNA-msp1β reacted
specifically with r-MSP1b by Western blot. The MSP1a and MSP1b are associated in the
native membrane through disulfide bonds (Vidotto et al., 1994), and the IgG titters specific
for MSP1a and MSP1b were comparable in complex MSP1-immunized cattle. Moreover,
CD4
+
T-cell responses were detected only against MSP1a (Brown et al., 2001), suggesting
that MSP1a-specific T cells provide cognate help to both MSP1a and MSP1b specific B cells.
The mice immunized with DNA vaccines to A. marginale (pcDNA-msp1α, pcDNA-
msp1β, and pcDNA-msp5) exhibited predominance of IgG2a antibody over IgG1 (ratio of
IgG2a/IgG1 > 2.0). The presence of the IgG2 isotype is often considered as evidence of a Th1
immune response (Oñate et al., 2003). Thus, our results suggest that intramuscular injection
with plasmids encoding MSPs generate a response biased towards a Th1 response in mice. In
contrast, the group that received initial bodies of A. marginale elicited predominance IgG1
production. This result is explained since antigens associated with Freund´s adjuvant
preferentially stimulate the Th2 immunity, and vigorously suppress the Th1 type (Yip et al.,
1999). It is well established that protection against infection by an intracellular pathogen,
including A. marginale, requires the generation of a Th1-type immune response over time
(Brown et al., 1998; Oñate et al., 2003; Nagata et al., 2004).
In this study, only the mice immunized with pcDNA/msp1α provided significant
splenocytes proliferation. MSP1a contain variant and conserved amino acid in the carboxy
terminal region that response specifically, which stimulate high levels of IFN-γ production by
111
CD4+ cells (Brown et al., 1998, 2001, 2002). Peripheral blood mononuclear cells and CD4+
T-cell lines from MSP1-immunized calves proliferated vigorously in response to the
immunization with Florida strain and heterologous strains of A. marginale. In contrast, there
was either weak or no recognition of MSP1b proteins (Brown et al., 2001).
Mice immunized with the recombinant plasmids (pcDNA-msp1α, pcDNA-msp1β and
pcDNA-msp5) showed high antibodies response by ELISA and were able to react with all
recombinant proteins (rMSP1a, rMSP1b, and rMSP5) in Western blot. Additionally, a strong
lymphoproliferation was observed, whereas the genes to MSP1a provide significant
splenocytes and the genes to MSP1b and MSP5 did not. These results can demonstrate both
immune response and T-cell lymphocyte were generated. Thus, the immunization with
recombinant plasmids encoding MSPs in association can be an effective strategy for
immunoprofilaxis of anaplasmosis. In contrast, the administration of nine different plasmids
encoding antigens from Plasmodium falciparum, pooled in cocktail and injected in a single
site shown significant suppression or complete abrogation of responses (Sedegah et al., 2004).
Additionally, the combination of four DNA vaccines increased protection for
pulmonary tuberculosis in the mouse model (Morris et al., 2000). The association of three
DNA vaccine constructions against schistosomiasis showed higher protection for BALB/c
mice than immunization with double or individually (Nascimento et al., 2002). Rabbits
immunized with single papillomavirus early genes or with a combination of the four genes
provided strong and complete protection against viral challenge (Han et al., 1999). Similar
results were observed in DNA vaccines against simian immunodeficiency vírus (SIV),
Plasmodium chabaudi adami, and Plasmodium yoelii (Subbramanian et al., 2003; Wang et al.,
2004; Scorza et al., 2005).
In conclusion, administration of plasmids encoding A. marginale MSPs in association
in BALB/c mice induced better induction of Th1 immune response than individually
112
plasmids. For the future multiepitope DNA vaccine should be evaluated in bovine protection
for challenge of anaplasmosis.
Acknowledgments
We wish to thanks Kerlei Cristina Médici from Virology Laboratory to prepared Vero
cells, Profa. Dra. Eiko N. Itano and Mari Sumigawa for hepful to performed splenocytes
proliferation, Prof. Dr. Selwyn Arlington Headley for revising the manuscript. This work was
financially supported by CNPq, CAPES and Fundação Araucária do Paraná.
113
References
Andrade, G.M., R.Z. Machado, R.Z., Vidotto, M.C., Vidotto, O., 2004. Immunization of
bovines using a DNA vaccine (pcDNA3.1/MSP1b) prepared from the Jaboticabal strain of
Anaplasma marginale. Annals of the New York Academy of Sciences 1026, 257-266.
Alleman, A.R., Barbet, A.F., 1996. Evaluation of Anaplasma marginale major surface
protein 3 (MSP3) as a diagnostic test antigen. Journal of Clinical Microbiology 34, 270-276.
Arulkanthan A, Brown W, McGuire TC, Knowles, DP., 1999. Biased Immunoglobulin
isotype response induced in cattle with DNA expressing msp1a of Anaplasma marginale.
Infection and Immunity 67, 3481-87.
Briane D, Lesage D, Cao A, Coudert R, Lievre N, Salzmann JL., 2002. Cellular pathway of
plasmids vectorized by cholesterol-based cationic liposomes. The Journal of Histochemistry
& Cytochemistry 50, 983-991.
Brown WC, Shakp V, Zhu D, McGuire TC, Tuo W, McElwain TF, Palmer GH., 1998. CD4
+
T-lymphocyte and immunoglobulin G2 responses in calves immunized with Anaplasma
marginale outer membranes and protected against homologous challenge. Infection and
Immunity 66 , 5406-5413.
Brown WC, Palmer GH, Lewin HA, McGuire TC., 2001. CD4
+
T-lymphocytes from calves
immunized with Anaplasma marginale major surface protein 1 (MSP1), a heteromeric
complex of MSP1a and MSP1b, preferentially recognize the MSP1a carboxyl terminus that is
conserved among strains. Infection and Immunity 69, 6853-6862.
Brown WC, McGuire TC, Mwangi W, Kegerreis, KA, Macmillan, H, Lewin HA, Palmer
GH., 2002. Major hiscompatibility complex class II DR-restricted memory CD4
+
T
lymphocytes recognize conserved immunodominant epitopes of Anaplasma marginale major
surface protein 1a. Infection and Immunity 70, 5521-5532.
Dong-Ji Z, Yang X, Shen C, Lu H, Murdin A, Brunham RC., 2000. Priming with Clamydia
trachomatis major outer membrane protein (MOMP) DNA followed by MOMP ISCOM
boosting enhances protection and is associated with increased immunoglobulin A and Th1
cellular immune responses. Infection and Immunity 68, 3074-3078.
Donnelly JJ, Ulmer JF, Shiver JW, Liu MA., 1997. DNA vaccines. Annual Review of
Immunology 15, 617-648.
114
Ferreira AMT, Suzart S, Knowles DP, Vidotto MC., 2001. Use of repetitive DNA elements to
define genetic relationships among Anaplasma marginale isolates. FEMS Microbiology
Letters 197, 139-143.
Garcia J.L., Navarro I.T., Vidotto O., Gennari S.M., Machado
R.Z., Sinhorini I.L., 2006. Toxoplasma gondii: comparison of
rhoptry-ELISA with IFAT and MAT for antibody detection in sera
of experimentally infected pigs. Experimental Parasitology
113,100-105.
Garcia-Garcia J, de la Fuente J, Kocan KM, Blouin E F, Albur T, Onet VC, Saliki JT., 2004.
Mapping of B-cell epitopes in the N-terminal repeated peptides of Anaplasma marginale
major surface protein 1a and characterization of the humoral immune response of cattle
immunized with recombinant and whole organism antigens. Veterinary Immunology and
Immunopathology 98, 137-151.
Han, R., Cladel, N.M., Reed, C.A., Peng, X., Christensen, N.D., 1999. Protection of rabbits
from viral challenge by gene gun-based intracutaneous vaccination with a combination of
cottontail rabbit papillomavirus E1, E2, E6, and E7 genes. Journal of Virology 73, 7039-7043.
Kano FS, Vidotto O, Pacheco RC, Vidotto MC., 2002. Antigenic characterization of
Anaplasma marginale isolates from different regions of Brazil. Veterinary Microbiology 87,
131-138.
Laemmili UK., 1970. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of
bacteriophage T4. Nature 227, 680 – 685.
Lopez, J.E., Siems, W.F., Palmer, G.H., Brayton, K.A., McGuire, T.C., Norimine, J., Brown,
W.C., 2005. Identification of novel antigenic proteins in a complex Anaplasma marginale
outer membrane immunogen by mass spectrometry and genomic mapping. Infection and
Immunity 73, 8109-8119.
Marana E.R.M., Kano F.S., Tamekuni K., Ataliba A.C., Vicentini
J.C., Spurio, R.S., Vidotto M.C., Vidotto O., 2006. Padronização e avaliação de um
teste de ELISA por competição para o diagnóstico da anaplasmose bovina utilizando a
proteína recombinante MSP5-PR1. Congresso Brasileiro de Parasitologia Veterinária e II
Simpósio Latino-Americano de Riquetsioses, Anais..., 5, Ribeirão Preto, SP.
115
McGarey DJ, Barbet AF, Palmer GH, McGuire TC, Allred DR., 1984. Putative adhesions of
Anaplasma marginale major surface polypeptides 1a and 1b. Infection and Immunity 62,
4594-4601.
Morris, S., Kelley, C., Howard, A., Li, Z., Collins, F., 2000. The immunogenicity of single
and combination DNA vaccines against tuberculosis. Vaccine 18, 2155-2163.
Nagata T, Aoshi T, Uchima M, Suzuki M, Koide Y., 2004. Cytotoxic T-lymphocyte, and
helper-T-lymphocyte-oriented DNA vaccination. DNA and Cell Biology 23, 93-106.
Nascimento, E., Leão, I.C., Pereira, V.R.A., Gomes, Y.M., Chikhlikar, P., August, T.,
Marques, e., Lucena-Silva, N., 2002. Protective immunity of single and multi-antigen DNA
vaccine against shistosomiasis. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz 97, 105-109.
Oberle SM, Palmer GH, Barbet AF., 1993. Expression and immune recognition of the
conserved MSP4 outer membrane protein of Anaplasma marginale. Infection and Immunity
61, 5245-5251.
Oñate AA, Céspedes S, Cabrera A, Rivers R, González A, Muñoz C, Folch H, Andrews E.,
2003. A DNA vaccine encoding Cu,Zn superoxide dismutase of Brucella aborttus induces
protective immunity in BALB/c mice. Infection and Immunity 71, 4857-4861.
Palmer, G.H., Rurangirwa, F.R., Kocan, K.M., Brown, W.C., 1999. Molecular basis for
vaccine development against the ehrlichial pathogen Anaplasma marginale. Parasitology
Today 15, 281-286.
Scorza, t., Grubb, K., Smooker, P., Rainckuk, A., Proll, D., Spithill, T.W., 2005. Induction of
strain-transcending immunity against Plasmodium chabaudi adami malaria with a
multiepitope DNA vaccine. Infection and Immunity 73, 2974-2985.
Sedegah, M., Charoenvit, L., Belmonte, M., Majan, V.F., Abot, S., Ganeshan, H., Kumar, S.,
Bacon, D.J., Stowers, A., Narum, D.L., Carucci, D.J., Rogers, W.O., 2004. Reduced
immunogenicity of DNA vaccine plasmids in mixtures. Gene Therapy 11, 448-456.
Subbramanian, R., Kuroda, M.J., Charini, W.A., Barouch, D.H., Costantino, C., Santra, S.,
Schmitz, J.E., Martin, K.L., Lifton, M.A., Gorgone, D.A., Shiver, J.W., Letvin, N.L., 2003.
Magnitude and diversity of cytotoxic-T-lymphocyte responses elicited by multiepitope DNA
vaccination in Rhesus monkeys. Journal of Virology 77, 10113-10118.
Tamekuni K., Kano F.S., Kawasaki P.M., Igarashi M., Ataliba
A.C., Coelho, A.L.M., Marana E.R.M., Vidotto M.C., Vidotto O., 2006. Cloning,
116
sequencing and antigenic characterization of Msp1a and Msp1b recombinant proteins of the
Anaplasma marginale PR1 strain. Congresso Brasileiro de Parasitologia Veterinária e
II Simpósio Latino-Americano de Riquetsioses, Anais..., 5, Ribeirão Preto, SP.
Tebele N, McGuire TC, Palmer GH., 1991. Induction of protective immunity by using
Anaplasma marginale initial body membranes. Infection and Immunity 59, 3199-3204.
Towbin H, Gordon H., 1984. Immunoblotting and dot immunoblotting: current status and out
look. Journal of Immunological Methods 72, 313-340.
Ulmer JB, Donnelly JJ, Parker SE., 1993. Heterologous protection against influenza by
injection of DNA encoding a viral protein. Science 253, 1745-1749.
Vidotto MC, McGuire TC, McElwain TF, Palmer GH, Knowles Jr DP., 1994. Intermolecular
relationships of major surface proteins of Anaplasma marginale. Infection and Immunity 62,
2940-2946.
Visser, E.S., McGuire, T.C., Palmer, G.H., Davis, W.C., Shkap, V., Pipano, E., Knowles,
D.P., 1992. The Anaplasma marginale msp5 gene encodes a 19 kilodalton protein conserved
in all recognized Anaplasma species. Infection and Immunity 60, 5139-5144.
Wang, R., Epstein, J., Charoenvit, Y., Baraceros, F.M., Rahardjo, N., Gay, T., Banania, J.G.,
Chattopadhyay, R., de la Vega, P., Richie, T.L., tornieporth, N., Doolan, D.L., Kester, K.E.,
Heppner, D.G., Norman, J., Carucci, D.J., Cohen, J.D., Hoffman, S.L., 2004. Induction in
humans of CD8+ and CD4+ T cell and antibody responses by sequential immunization with
malaria DNA and recombinant protein. The Journal of Immunology 172, 5561-5569.
Yip HC, Karulin AY, Tary-Lehmann M, Hesse MD, Radeke H, Heeger PS, Trezza RP,
Heinzel P, Forsthuber T, Lehmann PV., 1999. Adjuvant-Guided type 1 and type 2 immunity:
Infections/noninfection dichotomy defines the class of response. The journal of Immunology
162, 3942-3949.
117
Fig.1. Immunofluorescence of Vero cells transfected with DNA vaccine encoding A.
marginale MSP1a, MSP1b and MSP5 antigens, using monoclonal antibodies (400x) a. non-
transfected Vero cells; b. pcDNA-lacZ Vero cells transfected using anti-histidine monoclonal
antibody (positive control); c. pcDNA-msp1α using ANA22B1 monoclonal antibody; d.
pcDNA-msp1β using anti-histidine monoclonal antibody; e. pcDNA-msp5 using ANAF16C1
monoclonal antibody
118
a)
-1 1 4 7 11 15
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
Experimental weeks
OD
490nm
b)
-1 1 4 7 11 15
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
Experimental weeks
OD
490nm
c)
-1 1 4 7 11 15
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
Experimental weeks
OD
490nm
d)
-1 1 4 7 11 15
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
Experimental w eeks
OD
490nm
e)
-1 1 4 7 11 15
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
Experimental days
OD
490nm
f)
-1 1 4 7 11 15
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
Experimental weeks
OD
490nm
Fig.2. Whole IgG antibody response measured by the indirect enzyme-linked immunosorbent
assay (ELISA) in immunized BALB/c mice. (a) G2 (only vector); (b) G3 (100 µg initial
bodies of A. marginale); (c) G4 (100 µg pcDNA-msp1α); (d) G5 (100 µg pcDNA-msp1β);
(e) G6 (100 µg pcDNA-msp5); (f) G7 (33 µg for each pcDNA-msp1α, pcDNA-msp1β and
pcDNA-msp5). Mice were immunized at weeks 0, 2, 5, 8, and 11 and the blood collect were
at weeks –1, 1, 4, 7, 11 and 15 (back arrows). Dashed line indicates positive cut-off.
119
a)
-1 4 11 15
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
Exp e r i m e t a l
weeks
b)
-1 4 11 15
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
Exp e r i m e t a l
weeks
c)
-1 4 11 15
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
Exp e r i m e t a l
weeks
IgG1
IgG2a
d)
-1 4 11 15
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
Exp e r i m e t a l
weeks
e)
-1 4 11 15
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
Exp e r i m e t a l
weeks
f)
-1 4 11 15
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
Exp e r i m e t al
weeks
Fig.3. IgG isotype humoral responses of serum from BALB/c mice immunized with DNA-
vaccine encoding A. marginale MSP1a, MSP1b, and MSP5 proteins. (a) The result of G2
(only vector); (b) G3 (100 µg initial bodies A. marginale); (c) G4 (100 µg pcDNA-msp1α);
(d) G5 (100 µg pcDNA-msp1β); (e) G6 (100 µg pcDNA-msp5); (f) G7 pool of plasmids (33
µg each pcDNA-msp1α, pcDNA-msp1β, and pcDNA-msp5). Measured IgG1 and IgG2a
responses were taken of pool of serum at -1, 4, 11 and 15 weeks after initial immunization by
ELISA.
120
Fig. 4. Reactivity of sera from mice immunized with A. marginale, and DNA vaccine
encoding MSP1a, MSP1b, and MSP5 of A. marginale by Western blot. A: A. marginale PR1
strain initial bodies. B: lane 1 and 2, rMSP1a; lane 3 and 4, rMSP1b; lane 5 and 6, rMSP5;
lanes 7 and 8, pool of rMSPs. In A: pre and post immune sera of mice immunized with empty
vector (G2: lane 1 and 2); with A. marginale initial bodies (G3: lane 3 and 4); In B: pool of
mice sera (at week 15) diluted 1:50 immunized with pcDNA-msp1α (G4: lane 1 and 2); with
pcDNA-msp1β (G5: lane 3 and 4); with pcDNA-msp5 (G6: lane 5 and 6); with pool of
plasmid (pDNA-msp1α, pcDNA-msp1β and pcDNA-msp5) (G7: lane7 and 8). The positions
and molecular masses (kDa) of protein standards are also shown.
105
70
100
31
121
Fig. 5. Proliferation of splenocytes cells from mice immunized with single DNA vaccine
encoding MSP1a, MSP1b and MSP5 and in association. The data are presented for
splenocytes proliferation cultured for 5 days with 5 µg of A. marginale homogenate/ml.
Results are presented as means count per minute of triplicate cultures in Stimulation Index
values (SI). SI values ≥ 2.0 (dashed line) were considered significant. Experimental groups
were: G1 (PBS); G2 (empty vector); G3 (100 µg A. marginale initial bodies); G4 (100 µg
pcDNA-msp1α); G5 (100 µg pcDNA-msp1β); G6 (100 µg pcDNA-msp5) and G7 (33 µg for
each pcDNA-msp1α, pcDNA-msp1β and pcDNA-msp5).
122
5. CONCLUSÕES
• As amostras de A. marginale isoladas no Paraná diferiram quanto ao número de
seqüências repetitivas in tandem da proteína MSP1a e apresentaram seis novas
seqüências não descritas na literatura. A análise filogenética utilizando as seqüências
das proteínas MSP1a e MSP4 não permite a diferenciação filogeográfica dos isolados
brasileiros.
• As vacinas de DNA contendo os genes msp1α, msp1β e msp5 expressaram as proteínas
MSP1a, MSP1b e MSP5 in vitro e in vivo.
• Os plasmídios recombinantes induziram resposta imune humoral em camundongos
BALB/c, com predomínio do isotipo IG2a, indicativo de resposta Th1.
• A resposta celular obtida com a associação dos plasmídios recombinantes foi maior do
que a induzida pelos plasmídios individuais.
123
APÊNDICES
124
APÊNDICE A: Lista de Reagentes
• Reação em Cadeia pela Polimerase gel de agarose
1. 100 mM dNTP, 4 x 250 µl; 25µmol cada (solução de 100 mM dATP, 100 mM dCTP,
100 mM dGTP, 100 mM dTTP) (Invitrogen Life Technologies
TM
)
2. Tampão PCR 10 x (200 mM Tris-HCl, pH 8.4, 500 mM KCl) (Invitrogen Life
Technologies
TM
)
3. Padrão de tamanho molecular 100 bp DNA Ladder e 1 kb DNA Ladder (Invitrogen
Life Technologies
TM
)
4. Ácido bórico (H
3
BO
3
) P.M. 61,83
5. Ácido etilenodiaminotetraácido Sal di-sódico – EDTA, P.A. (C
10
H
14
N
2
O
8
Na
2
2H
2
O)
P.M. 372,24 (Reagen®)
6. Agarose (Invitrogen Life Technologies
TM
)
7. Azul de bromofenol (Sigma®)
8. Brometo de etídio (C
21
H
20
N
3
Br) P.M. 394,3 (Sigma®)
9. Hidroximetil amino metano – TRIS 99% P.M. 121,14 (Invitrogen Life
Techonologies®)
10. Platinum Pfx DNA Polymerase recombinante 100 unidades (Invitrogen Life
Technologies®)
• Transformação da E. coli TOP10
1. Ampicilina
2. Cloreto de magnésio, MgCl
2
10mM
3. Cloreto de potássio, PM: 74,55.
4. Cloreto de sódio, NaCl, PM: 58,45
5. Extrato de levedura
6. Glicose 20mM
7. Sulfato de magnésio, MgSO
4
10mM.
8. Triptona
• Gel de poliacrilamida, tampão de corrida e transferência
1. Ácido acético, CH
3
COOH, PM: 60,05
2. Acrilamida, C
3
H
5
NO, PM: 71,08.
3. Azul brilhante R-250, C
45
H
44
N
3
O
7
S
2
Na, PM: 826,0.
4. Mercaptoetanol, C
2
H
6
O
5
, PM: 79,13.
5. Dodecil Sulfato de Sódio (SDS), C
12
H
25
NaO
4
SPM: 288,38.
6. Glicerol, C
3
H
8
O
3
, PM: 92,09.
7. Glicina, C
2
H
5
O
2
N, PM: 75,07.
8. Metanol, CH
3
OH, PM: 32,04
9. N, N’ Metileno-bis-acrilamida, C
7
H
10
N
2
O
2
, PM: 154,2 ·.
10. Persulfato de amônio P.A., (NH
4
)
2
S
2
O
8
, PM: 288,2
11. Temed, N, N, N’, N’ – Tetramethylenediamine, C
6
H
16
N
2
, PM: 116,21.
12. Tris-base, NH
2
C(CH
2
OH)
3
, PM: 121,14
• Western-blotting
1. Cloreto de sódio, NaCl, PM: 58,45.
2. Fosfato de sódio dibásico, Na
2
HPO
4
, PM: 141,96.
3. Fosfato de sódio monobásico, NaH
2
PO
4
.H
2
O, PM: 137,99.
4. Glicina, C
2
H
5
O
2
N, PM: 75,07
125
5. Metanol, CH
3
OH, PM: 32,04
6. Leite em pó desnatado (Molico)
7. Tris-base, NH
2
C(CH2OH)
3
, PM: 121,14
8. Tween 20, número de hidroxila: 96-108.
126
APÊNDICE B: Soluções e Tampões
• LB caldo pH 7,0
Triptona 10g
Extrato de levedura 5g
Cloreto de sódio 5g
H
2
O destilada 1000mL
• Meio SOC (Invitrogen
TM
Life Technologies)
Triptona 2%
Extrato de Levedura 0,5%
NaCl 10mM
KCl 2,5mM
MgCl
2
10mM
MgSO
4
10mM
Glicose 20mM
• Tampão de transformação
KCl 0,74g
CaCl
2
0,75g
Dissolver em 80 mL de água destilada e autoclavar
Diluir 0,2g de MÊS [2(N-morpholino) ethane sulfonic acid] em 15 mL e filtrar na
solução anterior.
OBS: utilizar gelada
• Acrilamida 30%
N, N’ Metileno-bis-acrilamida 1g
Acrilamida 29g
Água destilada 100mL
• Lower Tris/SDS 1,5M pH 8,8
TRIS base 18,165g
SDS 0,4g
Água destilada 100mL
• Upper Tris/SDS 0,5M pH 6,8
TRIS base 6,055g
SDS 0,4g
Água destilada 100mL
• Persulfato de amônio (10%)
Persulfato de amônio 0,1g
Água bidestilada 10mL
• Tampão da amostra 1X Concentrado
Solução Tris-HCl 0,5 M pH: 6,8 1,25mL
Glicerol (100%) 1,00mL
β Mercaptoetanol 0,2mL
Azul de Bromofenol 0,01g
127
SDS 0,2g
Água ultrapura estéril q.s.p 10mL
• Tampão de corrida SDS-PAGE pH 8,8
Glicina 14,4g
Tris-base 3g
SDS 1,0g
Água bidestilada q.s.p 1000mL
• Salina Tamponada (PBS) pH 7,2
Fosfato de sódio dibásico 1,05g
Fosfato de sódio monobásico 0,36g
Cloreto de sódio 8,17g
H2O destilada q.s.p. 1000mL
• Tampão de Bloqueio (100ml)
PBS 100mL
Tween 20 100µL
Leite em pó molico 5 g
• Tampão de lavagem (500ml)
PBS 500mL
Tween 20 500 µL
• Tampão de transferência (2000ml)
Tris base 6,82g
Glicina 32,4g
Metanol 450mL
H2O destilada q.s.p. 2000mL
• Tampão de sensibilização (0,05M Carbonato/Bicarbonato pH 9,6)
Na
2
CO
3
1,59g
NaHCO
3
2,93g
H2O destilada q.s.p. 1000mL
• Tampão de bloqueio
Tampão de sensibilização + 8% de leite em pó desnatado
• PBS-Tween 20 pH 7,2-7,4
NaCl 8,0g
KH
2
PO
4
0,2g
Na
2
HPO
4
.12H
2
O 2,9g
KCl 0,2g
Tween 20 0,5mL
H2O destilada q.s.p. 1000mL
• Tampão de substrato cromógeno
0,1M Ácido Cítrico (21g/litro) 24,3mL
0,2M Fosfato (28g Na
2
HPO
4
/1litro) 25,7mL
128
água destilada 50mL
• Substrato cromógeno
Tampão substrato 100mL
OPD 40mg
H
2
O
2
PA 30% 40µL
• RPMI completo
2 mM glutamina
50 µM 2-mercaptoetanol
100 U/mL penicilina/estreptomicina
10% soro fetal bovino inativado
• Azul de Tripan 0,1%
Azul de tripan 1 mg
Água destilada 10 mL
129
APÊNDICE C: Protocolo de Técnicas
• Extração de DNA de sangue (KIT PUREGENE)
1. Descongele o sangue armazenado à -20°C em banho Maria 37°C
2. Adicione 1mL de reagente RBC em tubo de 1,5ml
3. Acrescente 300µL do sangue e incube 10 minutos à temperatura ambiente
4. Centrifugue a 3000RPM por 2 min. A 4-8°C
5. Remova o sobrenadante com cuidado, deixado aproximadamente 10 a 20µL de
resíduo.
6. Adicione ao resíduo 300µL de solução de lise celular, 6µL proteinase K
7. Homogeneizar em vórtex
8. Incube a 37°C por 1 hora
9. Resfrie as amostras no gelo
10. Adicione 200µL de solução de precipitação de proteína e homogeneíze
11. Centrifugue a 13000 RPM por 3 minutos para formação do precipitado escuro
12. pipete 300µL de Isopropanol 100% em tubo novo estéril e adicione o sobrenadante
obtido
13. Misture as amostras, invertendo delicadamente até homogeneização completa
14. Centrifugue a 13000RPM por 3min.
15. Despreze o sobrenadante e drene o tubo com papel absorvente
16. Adicione 300µL de Etanol 70% misture e centrifugue a 13000RPM por 2 minutos
despreze o etanol e drene os tubos
17. Deixe secar
18. Adicione 100µL de solução de hidratação ou água
19. Deixe T.A. ou refrigerada durante à noite para hidratar
20. Estoque as amostras
• Gel de agarose 1%
1. 0,5 g de agarose
2. 50 mL de TEB 1 x [ ]
3. 25 µl ethidium bromide
• Purificação DNA em gel agarose (Kit QUIAGEN)
1. Corte a banda do gene no gel de agarose
2. Acrescente Buffer QG (3x Buffer: 1x peso gel)
3. Incube 30°C por 10 minutos até dissolver completamente o gel, vortex 1-2 minutos
durante a incubação
4. Depois do gel dissolvido checar a cor (deve ser amarelo da cor do buffer QG)
* Caso seja alaranjado ou violeta adicione 10µL de acetato de sódio 3M, pH 5 e
misture a cor voltará a ser amarelo (adsorção de DNA eficiente só pH ≤ 7,5)
5. Adicione 1x volume do gel de isopropanol e misture
seis. Despeje na coluna centrifugue o restante e centrifugue
7. Se for + 800µL acrescente o restante e centrifugue
oito. Descarte o centrifugado
9. (opcional) Adicione 0,5mL de Buffer QG e centrifugue 1 min.
10. Para lavar 0,75mL de Buffer QG e centrifugue por 1 minuto (deixar em repouso
de 2-5 minutos após adição de buffer PE)
130
11. Descarte o centrifugado e centrifugue novamente por 1 minuto para remover o
excesso
12. Passe a coluna em tubo de 1,5mL
13. Para eluir o DNA adicione 50µL de Buffer EB ou água destilada no centro da
membrana e centrifugue por 1 minuto, após aguardar 1minuto
• Transformação da E. coli TOP10
1. Descongele no gelo, a E. coli TOP10 competente para transformação
2. Adicione 5-10 ng do DNA em um volume de 1 a 5µL em TOP10 e misture
delicadamente com o pipetador
3. Incubar no gelo por 30 min.
4. Aqueça por 30 segundos a 42
o
C sem agitar
5. Transfira imediatamente os tubos para o gelo
6. Adicione 250µL de meio SOC à temperatura ambiente
7. Feche o tubo firmemente, prenda os tubos em seus lugares (para maior aeração) e
incube a 37
o
C por 30 minutos sob agitação (2000rpm)
8. Espalhe 200 µL da reação de transformação em uma placa com LB ágar contendo
antibiótico apropriado (ampicilina 100µg/mL)
9. Crescer “overnight” em estufa 37
o
C.
• Purificação de plasmidios pelo kit Mega plasmidio Quiagen
1. Escolha uma colônia isolada de uma cultura fresca da placa de cultura e a inocule o
pré-inóculo em 5 a 10 mL de meio LB contendo 100 µg/mL de ampicilina. Incube
por 8 h a 37
o
C sob agitação (300 rpm).
2. Dilua o pré-inóculo em 1:500 a 1:1000 em LB com o respectivo antibiótico. Para
altas cópias inocule em 500 mL ou 2,5 litros de meio. Para baixas cópias semear
em 2,5 litros ou 5 litros de meio com o respectivo antibiótico. Cresça a 37
o
C por
12-16 h sob agitação (300 rpm).
3. Centrifugue a cultura a 6.000 x g at 4
o
C por 10minutos
4. Ressuspenda o precipitado bacteriano em 50 mL ou 125 mL de tampão P1.
5. Adicione 50 mL ou 125 mL de tampão P2, misture gentilmente pelo inversão 4 a
6 vezes, e incube a temperatura ambiente por 5 min.
6. Adicione 50 mL ou 125 mL de tampão P3, mix immediately by inverting 4-6
times, and incubate on ice for 30 min.
7. Centrifuge a 20.000 x g por 30 minutes a 4
o
C. Remova o sobrenadante contendo o
DNA plasmidial
8. Centrifugue o sobrenadante novamente a 20.000 x g por 15 minutos a 4
o
C.
Remova o sobrenadante contendo o DNA plasmidial.
9. Equilibrar uma QIAGEN tip-2500 ou QIAGEN tip-10000 com 35 mL ou 75 mL
de tampão QBT e, permitir o esvaziamento por gravidade.
10. Aplicar o sobrenadante do passo 8 para a QIAGEN tip e permitir a entrada na
coluna pela gravidade.
11. Lavar a QIAGEN-tip com 200 mL ou 600 mL de tampão QC.
12. Eluir o DNA com 35 mL ou 100 mL de tampão QF.
13. Precipitar o DNA pela adição de 24,5 mL ou 70 mL (0,7 volumes) de isopropanol
em temperatura ambiente para eluir o DNA plasmidial. Misture e centrifugue
imediatamente a 15.000 x g por 30 minutos a 4
o
C. Cuidadosamente decante o
sobrenadante.
131
14. Lavar o precipitado de DNA com 7 mL ou 10 mL de etanol 70% a temperatura
ambiente e, centrifugar a 15.000 x g por 10 minutos. Cuidadosamente decante o
sobrenadante sem desfazer o precipitado.
15. Secar o precipitado por 10-20 minutos e, hidratar o DNA com o tampão num
volume apropriado (e.x., TE Buffer, pH 8,0 ou 10 mM Tris-HCl, pH 8,5)
• Transfecção de células eucarióticas in vitro
1. Um dia anterior ao procedimento de preparar as células na concentração de 0,5 – 2x
10
5
células em 500 µL de meio de crescimento sem antibiótico. (placa de 24
orifícios). Utilizar as células quando o tapete celular estiver com 90-95% de
confluência;
2. Dilua separadamente o DNA em meio livre de soro fetal e antibiótico (Opti-
MEM) na concentração de 0,8 µg de DNA em 50 µL de meio. Misture
gentilmente.
4. Misture a lipofectamine 2000
TM
com 50 µL de Opti-MEM, misture gentilmente e
incube por 5 min em temperatura ambiente.
5. Adicione a lipofectamine + Opti-MEM ao DNA. Misture gentilmente e incube por
20 minutos.
6. Paralelamente, retire o meio de crescimento e lave duas vezes o tapete celular com
PBS estéril gelado. Adicione 500 µL de meio Opti-MEM.
7. Após 20 minutos, adicione 100 µL do complexo DNA + Lipofectamine em cada
orificio. Misture gentilmente.
8. Incube por 4-6 horas em estufa a 37
o
C com 5% CO
2
.
9. Retire o meio e recoloque o meio de crescimento contendo 10% de soro fetal
bovino.
10. Incube por 48-72 horas.
• Avaliação da eficácia da transfecção pelo teste X-Gal (Briane et al., 2002)
1. Após 48 horas do início da transfecção, lavar as células 2 vezes com PBS gelado e
estéril;
2. Fixar as células por 3 minutos com solução com 1% paraformaldeído e 0,02%
glutaraldeído;
3. Adicionar o reagente X-gal (1 mg/mL X-gal; 5 mM ferrocianeto de potássio; 5
mM de ferricianeto de potássio; 2 mM MgCl
2
);
4. Observar as células após 6 horas.
• Imunofluorescência Indireta para cultura de células
1. Crescer a cultura de células transfectadas que expressa a proteína fusionada à
histidina sobre uma lamínula estéril à 37
o
C.
2. Lave as células cuidadosamente em PBS
3. Fixe as células com metanol (-20
o
C) durante 10 minutos e então, com acetona (-20
o
C) durante 1 minuto.
4. Lave as lamínulas 2 vezes em PBS durante 5 minutos (cada lavagem)
OBS: bloqueie com PBS contendo 1% BSA durante 10 minutos em temperatura
ambiente. Depois seque para incubar com o anticorpo primário.
5. Incube com o anticorpo primário diluído em PBS com 1% BSA durante 60 minutos
6. Lave 3 vezes em PBS
7. Incube com o anticorpo secundário marcado com isoticionato de fluoresceína
diluído em - PBS com 1% BSA, durante 30 minutos.
8. Lave 3 vezes em PBS
132
9. Seque e adicione glicerina e lamínula para fazer a leitura em microscópio
epifluorescente.
• ELISA Indireto
1. Sensibilizar as placas com 100 µL de solução de antígeno + tampão de
sensibilização (Tampão carbonato/bicarbonato pH 9,6). Concentração do antígeno
5 µg/mL (proteína recombinante) ou 10 µg/mL (antígeno bruto /Anaplasma).
Deixar “overnight” a 4
o
C.
2. Lavar 3 vezes com 200 µL de PBS-Tween 20;
3. Cobrir os orifícios com 200 µL de tampão de bloqueio (Tampão carbonato 0,1 M +
8% de leite em pó desnatado);
4. Lavar 3 vezes com 200 µL de PBS-Tween 20;
5. Adicionar em duplicata 100 µL do soro diluído (1:50). O soro deve ser diluído em
PBS-Tween 20 contendo 5% de leite em pó desnatado. Incubar a placa a 37
o
C por
45 minutos em câmara úmida.
6. Lavar 3 vezes com 200 µL de PBS-Tween 20;
7. Adicionar 100 µL de conjugado peroxidase espécie específica diluído 1:_____
(whole IgG anti-mouse sigma – 1:10.000; anti-mouse IgG1 1:50.000; anti-mouse
IgG2a 1:50.000) em PBS-Tween 20. Incubar a 37
o
C durante 45 minutos em
câmara úmida;
8. Lavar 3 vezes com 200 µL de PBS-Tween 20;
9. Adicionar 100 µL de Tampão substrato cromógeno. Manter em agitação
10. Parar a reação com 10 minutos adicionando 50 µL de 1M HCl. Fazer a leitura com
filtro de 490 nm.
• Gel De Poliacrilamida 7,5 – 17,5%
Lower gel 7,5% 17,5%
H2O Destilada 1,98 mL 0,66 mL
1,5M Tris/SDS pH 8,8 1,0 mL 1,0 mL
Bis/Acrilamida 30% 1,0 mL 1,0 mL
P.A. 10% 15 µL 15 µL
TEMED 1,5 µL 1,5 µL
Stacking gel
H2O Destilada 1,68mL
0,5M Tris/SDS pH 6,8 0,75mL
Bis/Acrilamida 30% 0,54mL
P.A. 10% 15µL
TEMED 1,5µL
• Western Blotting
1. Retirar a membrana de nitrocelulose do tampão de transferência;
2. Enquanto seca a membrana de nitrocelulose, marcar com um lápis, os respectivos
pesos moleculares do padrão;
3. Rehidratar a membrana em água destilada;
4. Bloquear a membrana com o tampão de bloqueio (PBS + 0.1% Tween 20 + 5%
leite em pó desnatado) por, pelo menos, 1 hora;
5. Lavar a membrana em PBS-T (PBS + 0,1% Tween 20) 3 x de 5 minutos;
133
6. Incubar com o anticorpo (anti-histidina – HRP) diluída 1:5000 em tampão de
bloqueio por 1 hora;
7. Lavar a membrana em PBS-T 3 x 5 minutos
8. Revelar a reação com o kit de ECL (quimioluminescência), seguindo as
recomendações do fabricante (diluição em partes iguais).
9. Tempo de exposição do filme de Rx: 5 minutos a 20 minutos (dependendo do
anticorpo)
• Preparação de células esplênicas de camundongo
1. Retirar o baço um recipiente estéril com RPMI 1640 e lavar o baço 2 vezes
2. Gentilmente liberar as células esplênicas pela ruptura da cápsula esplênica
utilizando agulhas 21 G + 5 mL RPMI
3. “Puxar” os esplenócitos com uma seringa de 5 mL utilizando uma agulha 21 G
para cima e para baixo uma vez e duas vezes com uma agulha 26,5 G com pressão
moderada
4. Centrifugar a 500 x g por 5 min.
5. Lavar duas vezes com RPMI incompleto
6. Adicionar cloreto de amônio pra lisar os eritrócitos
7. Lavar duas vezes (centrifugar duas vezes a 500 x g por 5 min)
8. Ressuspender as células em 5 mL de RPMI 1640 completo
134
ANEXOS
135
ANEXO A: Normas de Publicação do periódico Semina Ciências Agrárias
136
137
138
ANEXO A: Normas de Publicação do periódico Research in Veterinary
Science
139
140
141
142
Livros Grátis
( http://www.livrosgratis.com.br )
Milhares de Livros para Download:
Baixar livros de Administração
Baixar livros de Agronomia
Baixar livros de Arquitetura
Baixar livros de Artes
Baixar livros de Astronomia
Baixar livros de Biologia Geral
Baixar livros de Ciência da Computação
Baixar livros de Ciência da Informação
Baixar livros de Ciência Política
Baixar livros de Ciências da Saúde
Baixar livros de Comunicação
Baixar livros do Conselho Nacional de Educação - CNE
Baixar livros de Defesa civil
Baixar livros de Direito
Baixar livros de Direitos humanos
Baixar livros de Economia
Baixar livros de Economia Doméstica
Baixar livros de Educação
Baixar livros de Educação - Trânsito
Baixar livros de Educação Física
Baixar livros de Engenharia Aeroespacial
Baixar livros de Farmácia
Baixar livros de Filosofia
Baixar livros de Física
Baixar livros de Geociências
Baixar livros de Geografia
Baixar livros de História
Baixar livros de Línguas
Baixar livros de Literatura
Baixar livros de Literatura de Cordel
Baixar livros de Literatura Infantil
Baixar livros de Matemática
Baixar livros de Medicina
Baixar livros de Medicina Veterinária
Baixar livros de Meio Ambiente
Baixar livros de Meteorologia
Baixar Monografias e TCC
Baixar livros Multidisciplinar
Baixar livros de Música
Baixar livros de Psicologia
Baixar livros de Química
Baixar livros de Saúde Coletiva
Baixar livros de Serviço Social
Baixar livros de Sociologia
Baixar livros de Teologia
Baixar livros de Trabalho
Baixar livros de Turismo
