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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO
DEPARTAMENTO DE GENÉTICA
“
CITOGENÉTICA MOLECULAR APLICADA AO DIAGNÓSTICO
PRÉ
-
IMPLANTACIONAL DE ANEUPLOIDIAS
CROMOSSÔMICAS
”
Juliana Fabrícia Cuzzi
Ribeirão Preto
2008
Tese apresentada à Faculdade de
Medicina de Ribeirão Preto da
Universidade de São Paulo para
concorrer ao título de Doutor, pelo
curso de Pós-Graduação em Genética.
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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO
DEPARTAMENTO DE GENÉTICA
“
CITOGENÉTICA MOLECULAR APLICADA AO DIAGNÓSTICO
PRÉ
-
IMPLANTACIONAL DE ANEUPLOIDIAS
CROMOSSÔMICAS
”
Juliana Fabrícia Cuzzi
Orientadora: Profa. Dra. Lúcia Martelli
Ribeirão Preto
2008
Tese apresentada à Faculdade de Medicina
de Ribeirão Preto da Universidade de São
Paulo para concorrer ao título de Doutor,
pelo curso de Pós-Graduação em Genética.
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FICHA CATALOGRÁFICA
Cuzzi, Juliana Fabrícia
Citogenética-Molecular Aplicada Ao Diagnóstico Pré-Implantacional de
Aneuploidias Cromossômicas. Ribeirão Preto, São Paulo, 2008.
154p.: il. ; 30cm
Tese de Doutorado, apresentada à Faculdade de Medicina de Ribeirão
Preto/ USP – Área de concentração: Genética.
Orientadora: Martelli, Lúcia.
1. Diagnóstico Genético Pré-Implantacional. 2. Aneuploidias
Cromossômicas. 3. CGH. 4. FISH.
Data da Defesa: ____/____/____
BANCA EXAMINADORA
Prof.Dr. __________________________________________________________
Julgamento: __________________________Assinatura: ____________________
Prof.Dr. __________________________________________________________
Julgamento: __________________________Assinatura: ____________________
Prof.Dr. __________________________________________________________
Julgamento: __________________________Assinatura: ____________________
Prof.Dr. __________________________________________________________
Julgamento: __________________________Assinatura: ____________________
Prof.Dr. __________________________________________________________
Julgamento: __________________________Assinatura: ____________________
Aos meus pais,
Norma e Jorge Cuzzi
"Tem dias que eu fico pensando na vida, e sinceramente não vejo saída.
Como é por exemplo que dá pra entender? A gente mal nasce e começa
a morrer. Depois da chegada vem sempre a partida, porque não há
nada sem separação. Sei lá, Sei lá... A vida é uma grande ilusão. Sei lá,
sei lá... A vida tem sempre razão. A gente nem sabe que males se
apronta fazendo de conta, fingindo esquecer que nada renasce antes
que se acabe e o sol que desponta tem que adormecer. De nada adianta
ficar-se de fora a hora do sim é o descuido do não. Sei lá, sei lá... Só sei
que é preciso paixão. Sei lá, sei lá... A vida tem sempre razão."
Viníciu de Moraes
AGRADECIMENTOS
Ao Departamento de Genética da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade
de São Paulo e à Unidade de Biologia e Genética Médica do Departamento de Biologia Celular,
Fisiologia e Imunologia da Universidade Autônoma de Barcelona que, em parceria,
proporcionaram a estrutura necessária para a realização deste trabalho.
Às instituições de fomento a pesquisa, CAPES (bolsa de doutorado, CAPES/PROEX),
CNPq (bolsa de doutorado sanduíche, SWE) à FAEPA-HC/ FMRP pelo suporte financeiro
necessário para minha formação profissional e realização desse trabalho.
À Profª. Drª. Lúcia Martelli, por todo o trabalho desenvolvido, pela orientação e
ensinamento. Mais do que tudo, pelo carinho e a amizade cultivada nestes sete anos de
convivência.
A la Profª. Drª. Joaquima Maria Navarro Ferreté, además de todo el conocimiento que
trabajar con ella me ha proporcionado, agradezco por recibirme de forma tan abierta y por
haberse preocupado siempre con mis necesidades profesionales y personales. Por todo el cariño y
amistad, muchas gracias.
Al Prof. Dr. Jordi Benet, agradezco por su presencia siempre muy agradable, por haber
enriquecido mis conocimientos tanto científicos como culturales, gastronómicos y enológicos.
Ao Prof. Dr. Raysildo Barbosa Lobo e a Profª. Drª. Ester Silveira Ramos, pela contribuição
para minha formação acadêmica e por favorecerem os projetos científicos desenvolvidos no
Bloco C do Departamento de Genética da FMRP/USP.
Ao Prof. Dr. Péricles Assad Hassun Filho, pela parceria estabelecida que possibilitou a
realização deste trabalho e nos permitirá desenvolver novos projetos na área de genética
reprodutiva.
Aos Profs. Drs. Silvana Giuliatti e Ademilson Espencer Egea Soares pela disposição com a
qual realizam seu trabalho junto a pós-graduação deste departamento. Agradeço especialmente
por toda ajuda burocrática referente a minha bolsa sanduíche.
Aos Profs. Drs. Leila Montenegro Silveira Farah e Rui Alberto Ferriani por serem sempre
atenciosos e colaborarem de forma especial para a minha formação.
Ao Sílvio Avelino dos Santos, por ter estado sempre presente, sem a sua ajuda a realização
desse trabalho teria sido muito mais difícil.
Luiz Antonio Framartino Bezerra, Marco Pinto Corrado, Maria Aparecida Oliveira Silva
Elias, Marli Aparecida Vanni Galerani, Reginaldo Aparecido Vila, Sebastião Paulo Framartino
Bezerra e Susie Adriana Penha Nalon, obrigada por estarem sempre dispostos a me auxiliar.
À todos os pós-graduandos e estagiários do Bloco C do Departamento de Genética da
FMRP/USP, pelo agradável convívio e sugestões muitas vezes oportunas.
À Lucimar Laureano e à Maria Lúcia Machado, pelo auxílio técnico e pela simpatia com que
sempre me trataram.
À Comissão Organizadora do XII Curso de Verão em Genética, foi um prazer trabalhar com
vocês. É muito bom saber que mais do que colegas de trabalho, nos tornamos amigos.
Ao Fábio Pablo de Souza, Fernando Biase, Juliana Meola, Luciana Veiga Castelli, Maria
Silvina Juchniuk de Vozzi e Pedro Alejandro Vozzi, agradeço não só pela contribuição
acadêmica, mas principalmente pelos momentos divertidos que compartilhamos.
Dicen de los catalanes que de las piedras hacen panes. Quizá sea verdad, aunque durante el
tiempo que he estado en Barcelona no pude asegurarme de esto, pero otra cosa que ni siempre
dicen de los catalanes y que ya en el primer momento me di cuenta, es como son amigables, por
eso me conquistaron…
A los amigos Mariona, Edmon, Albert, Lidia, Miguel y Gemma por todos los momentos
que tuvimos juntos. Agradezco por tantas risas, cenas, cafés y charlas. Os echo de menos a cada
día.
A todo el grupo de docentes, alumnos y funcionarios de la Unidad de Biologia y Genética
Médica del Departamento de Biologia Celular, Fisiologia y Imunologia de la UAB, por haberme
ayudado siempre tan prontamente, por la convivencia agradable de cada día y claro, por toda la
gastronomía que me han presentado durante estos seis meses.
Aos meus amigos...
Amanda Gonçalves, Ana Carolina Laus, Daniel Dentillo, Dante Gavio, Fabiano Alves,
Juliana Nunes, Maria Fernanda Laus, Mariana Maschietto, Monika Chaves e Paula Nascimento,
agradeço por todos os momentos juntos, por estarem sempre perto mesmo que de longe e
principalmente por todo o apoio que sempre recebi de vocês.
Com todo meu amor, agradeço...
Aos meus pais, por serem simplesmente imprescindíveis. Não sei transformar em
palavras todo o sentimento que tenho por vocês, por hora digo apenas muito obrigada.
Ao melhor de todos os irmãos, tenho muito a agradecer, mas prefiro me limitar à
cumplicidade, lealdade e parceria incondicional. Claro, agradeço também por ter trazido para
nossa família uma pessoa tão especial quanto a Cláudia, que muitas vezes é quem acaba
segurando as pontas. Obrigada.
Ao meu avô, tias e primos, por toda torcida e carinho que dedicam a mim.
Ao Ricardo Rodrigues por me presentear a cada dia com a nossa história. Sou mais feliz
por ter você na minha vida.
RESUMO
CUZZI, J.F. Citogenética-Molecular aplicada ao Diagnóstico Pré-Implantacional de
Aneuploidias Cromossômicas. 2008. Tese de Doutorado – Faculdade de Medicina de Ribeirão
Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto.
Os seres humanos apresentam uma baixa capacidade fértil, quando comparados a outras espécies.
Casais com fertilidade comprovada e que tentam ter outro filho, têm somente 25% de chance de
sucesso por ciclo menstrual. O alto índice de morte embrionária contribui de forma significativa
para essa baixa fertilidade. Vários fatores estão relacionados com a perda gestacional prematura,
no entanto as anomalias cromossômicas são as mais importantes. Aproximadamente 70% dos
embriões morfologicamente normais apresentam alterações cromossômicas, sendo que mais de
50% dos embriões em estágio pré-implantacional possuem células aneuplóides. O Diagnóstico
Genético Pré-implantacional é uma forma precoce de diagnóstico pré-natal na qual é possível
detectar anomalias genéticas em oócitos e em embriões humanos. A maioria dos diagnósticos foi
obtida por meio da técnica de FISH (hibridação in situ fluorescente) com o intuito de detectar
anomalias de cromossomos específicos, existindo porém, limitações em relação ao número de
cromossomos que podem ser avaliados simultaneamente. A hibridação genômica comparativa
(CGH) não requer a fixação do núcleo da célula embrionária e é capaz de detectar perdas e
ganhos de seguimentos cromossomos maiores do que 10Mb em um único experimento. O
objetivo deste trabalho foi estabelecer o Diagnóstico Genético Pré-implantacional de
aneuploidias utilizando dois métodos de investigação citogenética molecular: (1) CGH em oócitos
(MII) e nos primeiros corpúsculos polares correspondentes (1CP) e (2) FISH em blastômeros
obtidos de embriões humanos em estágio de clivagem. Na primeira parte deste estudo,
realizamos com êxito, a análise por CGH de 16 células (MII+1CP) procedentes de oito oócitos
maduros e não criopreservados. Observou-se uma taxa de aneuploidias de 25% e os
cromossomos envolvidos foram o 16, 19 e 22. Estes dados sugerem uma associação entre o
tamanho do cromossomo e a freqüência de aneuploidias, o que está de acordo com relatos
anteriores da literatura. No segundo capítulo desta tese, descrevemos um novo protocolo de
FISH para PGD. Com o objetivo de ampliar o número de cromossomos analisados em cada
blastômero, aplicamos um procedimento de hibridações repetidas que permitiu identificar 15
cromossomos por núcleo (n=14). A porcentagem de perda nuclear foi de 35,7% após a primeira
etapa de FISH e 50% após a segunda hibridação. Encontramos um índice de aneuploidias de
100% que pôde ser relacionado às características morfológicas e de desenvolvimento dos
embriões. De acordo com os resultados obtidos concluímos que as técnicas de CGH e o
protocolo de FISH utilizando sondas de oligonucleotídeos foram eficientes, possibilitando maior
acurácia do diagnóstico citogenético pré-implantacional.
ABSTRACT
CUZZI, J.F. Molecular Cytogenetics applied for Primeplantation Diagnosis of
Chromosomal Aneuploidies. 2008. Tese de Doutorado – Faculdade de Medicina de Ribeirão
Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto.
Compared with other species for which data is available, human display a low fecundity, couples
of proven fertility that are trying to have another child have only a 25% chance of achieving a
viable pregnancy per menstrual cycle. The high level of embryonic death contributes significantly
to the observed low fecundity. Various factors may cause these early pregnancy failures, but
chromosome abnormality is likely to be the most important. Around 70% of morphologically
normal cleavage stage embryos show chromosomal abnormalities and more than 50% of them
have aneuploid cells. Preimplantation genetic diagnosis (PGD) is an early form of prenatal
diagnosis, which makes it possible to detect genetic disorders in oocytes and human embryos.
Most of the reliable data that has been collected of PGD has been obtained using fluorescent in
situ hybridization (FISH) to detect specific chromosomes. Unfortunately the interphase FISH is
subject to technical difficulties that limit the number of chromosomes that may be simultaneously
assessed. Comparative genomic hybridization (CGH) is technique does not require the
preparation of chromosomes from the sample and in a single experiment reveals gains and losses
of every chromosome segment bigger than 10Mb in size. The purpose of this study was to
establish the Preimplantation Genetic Diagnosis for aneuploidies applying two molecular
cytogenetics methods: (1) CGH in oocytes nuclei (MII) as well in theirs first polar body (1PB)
and (2) FISH in single blastomeres of cleavage-stage human embryos. In the first part of this
study, we have successfully performed CGH analysis of 16 cells (MII + 1PB) derived from eight
matured and non criopreservated oocytes. The aneuploidy rate was 25%. The involved
chromosomes were 16, 19 and 22, like previous reports of CGH conducted on 1PB, we found
relation between chromosome size and aneuploidy frequency. In the second chapter of this
thesis, we describe a new FISH protocol for PGD. In order to increase the number of
chromosomes examined in each blastomere we have developed repeated hybridization procedure
by which 15 chromosomes could be analysed per nucleus (n=14). The percentages of nuclear loss
was 35,7% after the first FISH and 50% after de second round. We found a 100% rate of
aneuploidies. It could be related to embryo developmental and morphological characteristics.
According to our point of view, results reported here had shown the reliability of the single cell
CGH and oligonucleotides probe FISH improving the preimplantational cytogenetic diagnosis
accuracy.
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Aplicação Clínica do PGD para doenças monogênicas, modificado de FRAGOULI et
al., 2007.
T
ABELA
2: Reagente utilizados no procedimento de DOP –PCR.
T
ABELA
3: Reagentes utilizados na marcação por Nick Translation.
Tabela 4: Resultado obtido pela técnica de CGH aplicada a 8 oócitos.
**
: Oócitos provenientes
da doadora número 1 e
*
: Oócitos provenientes da doadora número 5.
Tabela 5: Relação das 15 sondas de DNA e seus respectivos fluorocromos, utilizadas no
diagnóstico pré-implantacional.
Tabela 5: Resultados da FISH com sondas de oligonucleotídeos em 161 núcleos interfásicos de
linfócitos cultivados. Experimento controle para as três etapas de hibridação.
Tabela 6: Resultado da hibridação das sondas dos cromossomos X,Y, 15, 17, 20, 3, 7, 8, 10, 16,
2, 4, 6, 9q e 12 em 14 núcleos obtidos de 6 embriões.
ND = não detectado.
Tabela 7: Resultado da hibridação das sondas dos cromossomos X,Y, 15, 17, 20, 3, 7, 8, 10, 16,
2, 4, 6, 9q, 12, 13 e 21 em 3 núcleos.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Representação esquemática da divisão meiótica feminina normal e de três mecanismos
responsáveis por erros na segregação cromossômica de oócitos. Figura adaptada de Pellertor et
al., 2005.
Figura 2: Ilustração de cromossomos em metáfase II oocitária. A seta indica uma cromátide que
sofreu divisão precoce. Figura adaptada de Pellestor et al., 2005.
Figura 3: Análise de CGH demonstrando perfil normal. A razão entre as fluorescências verde e
vermelha equivale a aproximadamente 1,0.
Figura 4: Gel de eletroforese mostrando padrões ideais (2-7 e 9-12) e inadequados (1 e 8) para a
amplificação do DNA genômico. C- :Controle Negativo.
Figura 5: Etapas básicas para a realização da Hibridação Genômica Comparativa em células
únicas, neste caso, especificamente 1CP. Imagem cedida por O
BR ADORS
,
2007.
Figura 6: Perfis de CGH correspondentes à análise do oócito 190. (A) Resultado 1CP: 24,X,+22
e (B) Resultado MII: 23,X.
Figura 7: Perfis de CGH correspondentes à análise do oócito 191. (A) Resultado 1CP: 24,X,+16
e (B) Resultado MII: 23,-16,+19.
Figura 7C: Exemplo de uma das metáfases analisadas para obtenção do perfil de CGH do oócito
191 (1CP). As setas indicam os cromossomos 16 marcados mais intensamente com fluorocromo
vermelho, o que corresponde a ganho de material genético para este cromossomo.
Figura 8: O gráfico mostra os comprimentos de onda de luzes emitidas pelos fluorocromos
utilizados, evidenciando suas áreas de sobreposição
Figura 9: Primeira etapa de hibridação em núcleo interfásico de linfócito 46,XY. Os sinais
fluorescentes seguem a ordem: A) 20 em Spectrum Far Red; B) X em Spectrum Red; C) 15 em
Spectrum Orange; D) 17 em Spectrum Green; E) Y em Spectrum Aqua e F) Imagem composta, núcleo
euplóide.
Figura 10: Segunda etapa de hibridação em núcleo interfásico de linfócito 46,XY. Os sinais
fluorescentes seguem a ordem: A) 16 em Spectrum Far Red; B) 3 em Spectrum Red; C) 10 em
Spectrum Orange; D) 8 em Spectrum Green; E) 7 em Spectrum Aqua e F: Imagem composta, núcleo
euplóide.
Figura 11: Segunda etapa de hibridação em núcleo interfásico de linfócito 46,XY. Os sinais
fluorescentes seguem a ordem: A) 9q12 em Spectrum Far Red; B) 4 em Spectrum Red; C) 12 em
Spectrum Orange; D) 2 em Spectrum Green; E) 6 em Spectrum Aqua e F: Imagem composta, núcleo
euplóide.
Figura 12: Série de hibridações em blastômero (número 6, embrião 16BSF). A) Coloração com
DAPI para controle da morfologia; B) Etapa A, três sinais para os cromossomos X (Red), 15
(Orange), 17 (Green), 20 (Far Red) e ausência de sinal para o cromossomo Y (Aqua); C) Etapa B,
dois sinais para os cromossomos 3 (Red), 8 (Green), 16 (Far Red), três sinais para o cromossomo
7 (Aqua) e um sinal para o cromossomo 10 (Orange); D) Etapa C, dois sinais para os
cromossomos 2 (Green), 4 (Red), 6 (Aqua), 12 (Orange) e ausência de sinal para a região 9q12
(Far Red).
SUMÁRIO
RESUMO 11
ABSTRACT 13
LISTA DE TABELAS 15
LISTA DE FIGURAS 16
I
I
N
N
T
T
R
R
O
O
D
D
U
U
Ç
Ç
Ã
Ã
O
O
G
G
E
E
R
R
A
A
L
L 21
I.
E
FEITO DAS
A
LTERAÇÕES
C
ROMOSSÔMICAS NA
F
ERTILIDADE
H
UMANA
22
II.
D
IAGNÓSTICO
G
ENÉTICO
P
RÉ
-I
MPLANTACIONAL
(PGD):
R
EVISÃO DA
L
ITERATURA
24
II.1.
A
PLICAÇÕES DO
D
IAGNÓSTICO
G
ENÉTICO
P
RÉ
-I
MPLANTACIONAL
26
ANÁLISE
DE
CORPÚSCULOS
POLARES 26
ANÁLISE
DE
BLASTÔMEROS 27
ANÁLISE
DE
BLASTOCISTO 29
II.2.
I
NDICAÇÕES PARA O
D
IAGNÓSTICO
G
ENÉTICO
P
RÉ
-I
MPLANTACIONAL
29
SCREENING
PARA
ANEUPLOIDIAS
(PGD-AS) 29
PORTADORES
DE
TRANSLOCAÇÕES
EQUILIBRADAS 30
DOENÇAS
MONOGÊNICAS 31
J
J
U
U
S
S
T
T
I
I
F
F
I
I
C
C
A
A
T
T
I
I
V
V
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A
D
D
A
A
P
P
E
E
S
S
Q
Q
U
U
I
I
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S
A
A 34
D
D
I
I
A
A
G
G
N
N
Ó
Ó
S
S
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T
I
I
C
C
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-
-
I
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P
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H
H
I
I
B
B
R
R
I
I
D
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G
G
E
E
N
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Ô
Ô
M
M
I
I
C
C
A
A
C
C
O
O
M
M
P
P
A
A
R
R
A
A
T
T
I
I
V
V
A
A 37
INTRODUÇÃO 38
I.1.
N
ÃO
-D
ISJUNÇÃO
C
ROMOSSÔMICA E
A
NEUPLOIDIAS DO
G
AMETA
F
EMININO
40
CITOGENÉTICA
CONVENCIONAL
E
CARIOTIPAGEM 42
TÉCNICAS
DE
CITOGENÉTICA-MOLECULAR 43
HIBRIDAÇÃO
GENÔMICA
COMPARATIVA
(CGH) 44
OBJETIVOS 47
MATERIAIS E MÉTODOS 48
I.
C
ASUÍSTICA
48
II.
A
MOSTRAS
48
III.
M
ÉTODOS
49
H
IBRIDAÇÃO
G
ENÔMICA
C
OMPARATIVA
(CGH)
EM CÉLULA ÚNICA
: 49
III.1.
O
BTENÇÃO E
I
SOLAMENTO DAS CÉLULAS
49
III.2.
M
EDIDAS PARA EVITAR CONTAMINAÇÃO
50
III.3.
L
ISE CELULAR
51
III.4.
A
MPLIFICAÇÃO GENÔMICA DA CÉLULA ISOLADA POR
DOP
–
PCR 51
III.5.
E
LETROFORESE DE COMPROVAÇÃO
52
III.6.
M
ARCAÇÃO DA SONDA
53
III.7.
P
REPARAÇÃO DA SONDA
55
III.8.
L
ÂMINAS E
P
REPARAÇÕES
M
ETAFÁSICAS
55
III.9.
H
IBRIDAÇÃO
G
ENÔMICA
C
OMPARATIVA
56
III.10.
M
ICROSCOPIA E
A
NÁLISE DAS
I
MAGENS
57
RESULTADOS 60
DISCUSSÃO 65
C
ONSIDERAÇÕES SOBRE A
M
ETODOLOGIA
65
C
ONSIDERAÇÕES SOBRE A
A
MOSTRA
71
C
ONSIDERAÇÕES
F
INAIS
75
CONCLUSÕES 77
REFERÊNCIAS 78
ANEXO A 84
R
EAGENTES E
S
OLUÇÕES
: 84
1.
ISOLAMENTO
CELULAR 84
2.
LISE 84
3.
DOP-PCR 85
U
U
T
T
I
I
L
L
I
I
Z
Z
A
A
Ç
Ç
Ã
Ã
O
O
D
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A
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Ó
Ó
S
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I
C
C
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P
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É
-
-
I
I
M
M
P
P
L
L
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T
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A
C
C
I
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L
L
D
D
E
E
A
A
N
N
E
E
U
U
P
P
L
L
O
O
D
D
I
I
A
A
S
S 88
INTRODUÇÃO 89
I.3.
D
IAGNÓSTICO
P
RÉ
-I
MPLANTACIONAL DE
A
NEUPLOIDIAS
C
ROMOSSÔMICAS
89
I.2.
T
ÉCNICA DE
H
IBRIDAÇÃO IN SITU
F
LUORESCENTE
(FISH) 93
OBJETIVOS 97
MATERIAIS E MÉTODOS 98
I.
C
ASUÍSTICA
98
II.
A
MOSTRA
98
III.
M
ÉTODOS
99
III.1.
ISOLAMENTO
E
FIXAÇÃO
DE
BLASTÔMEROS 99
III.2.
HIBRIDAÇÃO
IN
SITU
FLUORESCENTE
(FISH) 100
III.2.1.TRATAMENTO
DAS
LÂMINAS 103
III.2.2.
SONDAS
E
HIBRIDAÇÃO 103
III.2.3.
LAVAGENS
PÓS
–
HIBRIDAÇÃO
E
COLORAÇÃO 104
III.2.4.
ANÁLISE
CITOGENÉTICA-MOLECULAR 104
IV. RESULTADOS 106
V. DISCUSSÃO 114
I.
C
ONSIDERAÇÕES SOBRE A
M
ETODOLOGIA
114
II.
C
ONSIDERAÇÕES SOBRE A
A
MOSTRA
116
REFERÊNCIAS 123
ANEXO B 129
R
EAGENTES E
S
OLUÇÕES
: 129
ISOLAMENTO
CELULAR 129
FIXAÇÃO
DE
BLASTÔMEROS 129
HIBRIDAÇÃO
IN
SITU
FLUORESCENTE 130
R
R
E
E
F
F
E
E
R
R
Ê
Ê
N
N
C
C
I
I
A
A
S
S 131
M
M
A
A
N
N
U
U
S
S
C
C
R
R
I
I
T
T
O
O 138
Introdução Geral
21
INTRODUÇÃO GERAL
Introdução Geral
22
I. Efeito das Alterações Cromossômicas na Fertilidade Humana
A probabilidade de sucesso reprodutivo para um casal fértil com faixa etária abaixo de 35
anos é somente 25% de probabilidade de sucesso por ciclo menstrual (WILCOX, 1988). Dados
da literatura sugerem que mais da metade das gestações humanas resultam em perdas fetais,
sendo esta taxa ainda mais elevada com o aumento da idade materna. Isto pode ser evidenciado
nos procedimentos relacionados à reprodução in vitro, onde muitos embriões cessam o
desenvolvimento antes que sejam transferidos para o útero materno. Somente 31% dos embriões
que sobrevivem à transferência, completam a gestação (Society for Assisted Reproductive
Technology and the American Society of Reprodutive Medicine, 2004).
Existem muitos fatores que influenciam negativamente a sobrevida do embrião, mas um dos
mais importantes é a alta incidência de alterações cromossômicas (LOS et al., 2004).
Aproximadamente 0,3% dos nascidos vivos são cromossomicamente anormais sendo que as
alterações mais comuns são as trissomias do cromossomo 21, 18 e 13 além das aneuploidias dos
cromossomos sexuais (HASSOLD and JACOBS, 1984, 1995). Entretanto, acredita-se que a
incidência de aneuploidias durante a concepção e nos primeiros dias pós-fertilização seja duas
vezes maior do que a taxa observada na população de nascidos vivos (HASSOLD & HUNT,
2001). Estudos citogenéticos de embriões em estágio pré-implantacional revelaram que mais da
metade de todos os embriões contém células aneuplóides (VOULLAIRE et al., 2000; WELLS &
DELHANTY, 2000). A maioria das anomalias cromossômicas presentes no período pré-
implantacional não são compatíveis com o desenvolvimento embrionário, impedindo que a
gestação chegue a termo.
De acordo com HASSOLD e colaboradores (1996) grande parte das trissomias e/ou
monossomias detectadas em amostras pré-natais ou em abortos se devem a erros na primeira
divisão da meiose materna. Estudos citogenéticos utilizando a técnica de FISH (hibridação in situ
fluorescente) em embriões mostram que as alterações cromossômicas de novo podem ser
Introdução Geral
23
originadas durante a meiose ou na fase pós-zigótica (HARPER et al., 1995). Para determinar a
origem dessas anomalias, foram estudados marcadores polimórficos de DNA (regiões próximas
ao centrômero) em abortos espontâneos e também em gametas humanos (especialmente oócitos)
por meio de análises citogenéticas (KULIEV et al., 2003). Esses estudos indicaram que a maioria
das aneuploidias humanas constitucionais, viáveis ou não, detectada durante o primeiro trimestre
de gestação e em nascidos vivos, era originária da meiose I materna (ANTONORAKIS, 1991;
NICOLAIDIS & PETERSEN, 1998; HASSOLD & HUNT, 2001). As exceções são a Síndrome
de Turner, na qual o espermatozóide é o gameta nulissômico em 80% dos casos e a trissomia 18,
que se origina majoritariamente na segunda divisão meiótica materna (FISHER et al., 1995;
JACOBS & HASSOLD, 1995; SAVAGE et al., 1998).
Uma possível explicação para este fenômeno é que na meiose materna, o ponto de controle
entre a metáfase I e a anáfase I, que regula o alinhamento correto dos cromossomos no fuso, não
é tão rigoroso como na espermatogênese (LEMARIE-ADKINS et al., 1997). Desta forma,
quando existe um erro neste alinhamento (por exemplo, a presença de um univalente), a meiose
masculina é bloqueada enquanto a meiose feminina tolera este erro e continua, originando
gametas aneuplóides (HUNT, et al., 1995).
O fato da idade materna ser o fator mais importante associado ao aumento de aneuploidias,
também explica porque a maioria dos erros de segregação ocorre durante a primeira divisão
meiótica, já que essa fase pode durar de 10 a 45 anos, enquanto que a segunda etapa da divisão
celular independe da idade da mulher (MILLER & THERMAN, 2001).
A idade materna além de estar correlacionada com um aumento do risco de abortos
(geralmente envolvendo aneuploidias dos cromossomos 15, 16, 22 e X) e do risco de gerar
descendentes portadores de cromossomopatias (que envolvem predominantemente os
cromossomos 13, 18, 21, X e Y), também está associada com a diminuição das taxas de
implantação, provavelmente devido à letalidade de muitas aberrações cromossômicas, e, portanto,
com a diminuição da fertilidade.
Introdução Geral
24
II. Diagnóstico Genético Pré-Implantacional (PGD): Revisão da Literatura
Estudos citogenéticos por meio da técnica de FISH mostraram que mais de 50% dos
embriões em estágio pré-implantacional possuem células aneuplóides (Munné et al., 1998a).
Considerando que a maioria dessas alterações impede o desenvolvimento embrionário e
conseqüente implantação, a identificação e seleção de embriões geneticamente normais é crucial
para a obtenção de gestações viáveis (Wells & Levy, 2003).
Inicialmente as estratégias utilizadas para identificar, in vitro, embriões cromossomicamente
anômalos eram a seleção segundo a morfologia embrionária (PLACHOT et al., 1990) ou de
acordo com a sua capacidade de alcançar o estágio de blastocisto (MENEZO et al., 1992). No
entanto, aproximadamente 70% dos embriões morfologicamente normais apresentam alterações
cromossômicas (IWARSSON et al., 1999, SANDALINAS et al., 2001) e em torno de 40% dos
blastocistos são cromossomicamente anômalos (MAGLI et al., 1999).
Atualmente, a identificação confiável de embriões euplóides só pode ser determinada pelo
Diagnóstico Genético Pré-implantacional (PGD) O PGD envolve a interação entre as técnicas de
reprodução assistida, a biópsia de blastômero ou do corpúsculo polar e posterior análise da célula
única, possibilitando o diagnóstico de doenças geneticamente herdadas em embriões humanos
(HANDYSIDE et al., 1990; VERLINSKY et al., 1990).
A idéia do diagnóstico genético pré-implantacional é mais antiga do que Louise Brown, a
primeira criança nascida por meio do método de fertilização in vitro (FIV), há 21 anos. Ela teve
origem na década de sessenta, quando foi realizado o primeiro diagnóstico pré-natal para
sexagem de embriões de coelhos no estágio de blastocisto, por GARDNER & EDWARDS.
Entretanto, o PGD só se tornou possível após o desenvolvimento da FIV e da tecnologia
molecular, especificamente dos métodos de amplificação de DNA, incluindo a PCR (reação em
cadeia da polimerase), e da técnica de hibridação in situ por fluorescência (FISH) (VERLINSKY
et al., 2000).
Introdução Geral
25
A aplicação clínica desse método permite proporcionar aos casais com alto risco reprodutivo,
maiores chances de terem filhos não afetados, identificando os embriões portadores de alterações
gênicas ou cromossômicas e evitando que os mesmos sejam transferidos. Segundo LUDWIG e
colaboradores (2001), a técnica permite diminuir o risco de transmissão de alterações genéticas
em mais de 95%.
Os primeiros casos de Diagnóstico Genético Pré - Implantacional em embriões humanos
foram descritos independentemente por HANDYSIDE e colaboradores (1990) e VERLINSKY
e colaboradores. (1990).
HANDYSIDE e seus colaboradores ampliaram seqüências específicas do cromossomo Y
usando a técnica de PCR para determinar o sexo de embriões obtidos de casais com risco de
transmitir doenças recessivas ligadas ao cromossomo X. Somente embriões femininos foram
transferidos e várias meninas saudáveis nasceram após esse procedimento (HANDYSIDE et al.,
1990).
No mesmo ano, VERLINSKY e seus colaboradores descreveram o diagnóstico pré-
concepcional de doenças de herança autossômica recessiva, obtido por análise do primeiro
corpúsculo polar. Os autores adequaram a técnica de PCR para diferenciar oócitos segundo os
genótipos do tipo Z e M, para a deficiência de alfa-1-antitripsina e aplicaram a técnica para casais
com risco de transmitir o genótipo ZZ, responsável pela doença.
Desde as primeiras tentativas na década de noventa, centenas de PGD têm sido realizados,
demonstrando uma crescente aceitação da metodologia por diferentes populações. De acordo
com a classificação determinada pela ESHRE PGD Consortium, o diagnóstico genético pré-
implantacional deve ser dividido em duas categotias: (1) PGD de alto risco, que inclui casais com
anomalias cromossômicas e/ou doenças monogênicas; (2) PGD de baixo risco, que tem por
objetivo aumentar a taxa de implantação em casais com idade materna elevada, perdas fetais de
repetição ou com freqüentes falhas de fertilização in vitro.
Introdução Geral
26
Atualmente, sua indicação mais comum é o screening para aneuploidias em embriões gerados
por mães idosas (SERMON et al., 2007).
II.1. Aplicações do Diagnóstico Genético Pré-Implantacional
ANÁLISE DE CORPÚSCULOS POLARES
Na gametogênese feminina, durante a primeira divisão meiótica, um dos cromossomos
homólogos de cada bivalente segrega para o primeiro corpúsculo polar (1CP) e o outro para o
núcleo do oócito (MII) que se encontra em metáfase II da meiose. Desta forma, conclui-se que o
1CP tem o conteúdo genético complementar ao núcleo MII, o que significa dizer que um
desequilíbrio em MII implicará na alteração recíproca no corpúsculo polar.
Considerando que o 1CP por sofrer extrusão não tem função reprodutiva, a sua biópsia e
posterior análise permitem a caracterização indireta da constituição cromossômica do MII e a
identificação dos oócitos aneuplóides (GITLIN, 2003) sem comprometer a viabilidade do
gameta. Desta forma, a análise do primeiro corpúsculo polar tornou-se um método diagnóstico
atrativo por ser realizado antes da concepção, evitando dessa forma, o desenvolvimento de
embriões afetados (MUNNÉ et al., 1998a; VERLINSKY et al., 1996; DURBAN et al., 2001;
MONTAG et al., 2004; GUTIERREZ-MATEO et al., 2004a)
De fato, esta metodologia apresenta algumas vantagens: em primeiro lugar, a biópsia do 1CP
é realizada no mesmo dia em que a punção folicular, permitindo um prazo de 3 a 4 dias para
realização do diagnóstico antes da transferência embrionária. Além disso, a análise do 1CP por
FISH é de fácil interpretação, se comparada ao blastômero. Isto porque o 1CP, ao sofrer
extrusão, encontra-se estagnado no estágio de metáfase, enquanto os blastômeros, por serem
células proliferativas, podem ser fixados em qualquer fase do ciclo celular dificultando a
Introdução Geral
27
interpretação dos sinais da FISH (PUJOL et al.; 2004). Por último, a análise do 1CP, ao contrário
da análise de blastômeros, não sofre interferência de mosaicismo embrionário, ou seja, mais de
uma linhagem celular no mesmo embrião.
Contudo, a análise do 1CP também apresenta uma série de limitações, iniciando pela
impossibilidade de se avaliar a contribuição genética paterna (WELLS & DELHANTY, 2001).
Ainda que a maioria das aneuploidias detectadas no primeiro trimestre de gravidez tenha origem
na meiose materna, não podemos excluir as originadas na meiose paterna, embora menos
freqüentes. Além do mais, erros de segregação cromossômica durante o processo da segunda
divisão meiótica do oócito não podem ser detectados pela metodologia. Entretanto, já é bem
conhecido que a grande maioria dos erros de segregação é derivada da primeira divisão meiótica
(SHERMAN et al., 1994; FISHER et al., 1995; HASSOLD et al., 1995; PETERSON &
MIKKELSEN, 2000). Na literatura, há autores que indicam a investigação tanto do primeiro
quanto do segundo corpúsculo polar, para que seja possível detectar tanto as alterações
cromossômicas provenientes de erros da segunda divisão meiótica quanto para viabilizar a análise
de mutações originadas da recombinação dos homólogos (VERLINSKY et al., 1999;
RECHITSKY et al., 1999; KULIEV et al., 2003).
ANÁLISE DE BLASTÔMEROS
Trata-se da metodologia mais empregada no PGD (HANDYSIDE et al., 1990; GRIFFIN et
al., 1991; SERMON et al., 2005). Esse procedimento envolve a dissolução de uma região da zona
pelúcida e a aspiração de uma ou, no máximo, duas células embrionárias. A remoção de um
blastômero em embrião com o equivalente de 6-8 células parece não afetar o seu
desenvolvimento, in vitro, para o estágio de blastocisto (HARDY et al., 1990) sendo considerada
uma técnica eficiente (AO & HANDYSIDE, 1995).
Introdução Geral
28
A vantagem mais evidente é que, nesta metodologia, se analisa tanto a contribuição paterna
quanto a materna, pois neste estágio a constituição genética do embrião está completamente
formada; tornando o PGD em blastômeros um método comparável ao diagnóstico pré-natal. Por
outro lado, a desvantagem desta técnica é a coexistência de mais de uma linhagem celular no
embrião (linhagens cromossomicamente normais e linhagens aneuplóides), fenômeno chamado
de mosaicismo embrionário, que tem origem pós-zigótica e que tem sido detectado em uma
porcentagem considerável de embriões (MUNNÉ et al., 1994b; HAPER et al., 1995; MUNNÉ et
al., 1995a; VOULLAIRE et al., 2000; WELLS & DELHANTY, 2000; MALMGREN et al., 2002).
A presença deste mosaicismo dificulta o diagnóstico citogenético pré-implantacional em
blastômeros (MUNNÉ et al., 1994b; 2002), sobretudo nos casos em que apenas uma célula é
analisada. Em 2004, SERMON e colaboradores descreveram a necessidade de um estudo
prospectivo e randomizado que comparasse a viabilidade embrionária quando realizada a biópsia
de uma ou duas células e a incidência de erros no diagnóstico citogenético dos blastômeros.
Atualmente esta questão parece, ainda que de forma preliminar, estar solucionada. GOOSSENS e
colaboradores (2008), após analisarem 3377 embriões, concluíram que a remoção de 2
blastômeros interferia de forma negativa no desenvolvimento embrionário até o estágio de
blastocisto, enquanto a eficiência do diagnóstico por FISH não se alterava. No entanto, as
metodologias moleculares para detecção de mutações causadoras de doenças monogênicas
parecem ser mais eficientes aplicadas a duas células.
Outra desvantagem deste protocolo é que a biópsia do blastômero é realizada no terceiro dia
pós-fecundação. Consequentemente, o tempo para definição diagnóstica é reduzido, quando
comparado com a biópsia do 1CP.
Introdução Geral
29
ANÁLISE DE BLASTOCISTO
Este tipo de biópsia é a mais tardia que se pode proceder. Consiste em cultivar o embrião in
vitro até alcançar o estágio de blastocisto (aproximadamente 5 dias após a fecundação) e remover
de 10 a 30 células. As vantagens são: proporcionar a análise de diversas células e a seleção dos
embriões mais viáveis pela manutenção do seu cultivo até a fase de blastocisto (SANDALINAS et
al., 2001). A principal desvantagem é que não restam mais do que poucas horas após a biópsia
para a realização do diagnóstico, já que segundo o informe do ESHRE PGD Consortium
Steering Commitee (2004), a transferência embrionária deve ser realizada no máximo no 6º dia
pós-fecundação. Além disso, muitos centros de reprodução assistida têm dificuldades para
cultivar os embriões in vitro até blastocisto e, por esta razão, são poucos os centros no mundo que
praticam esta forma de biópsia (BOADA et al., 1998; DE BOER et al., 2004). No Brasil, de
acordo com a legislação do CREMESP (Processo 25784/01), a manipulação de blastocistos
humanos é considerada ilícita.
II.2. Indicações para o Diagnóstico Genético Pré-Implantacional
SCREENING PARA ANEUPLOIDIAS (PGD-AS)
É a aplicação mais freqüente do PGD (ANDERSEN et al., 2008). As anomalias
cromossômicas numéricas estão relacionadas tanto com falhas de implantação quanto com morte
e perda embrionária resultando em abortos espontâneos. A incidência de anomalias
cromossômicas é de 1,4% em embriões de mães com até 34 anos de idade e aumenta para 52,4%
em mulheres entre 40-47 anos (MÁRQUEZ et al., 2000). Estes dados confirmam o que já foi
mencionado, que mulheres com idade avançada têm um risco aumentado de conceber embriões
Introdução Geral
30
aneuplóides (MUNNÉ et al, 1995a). Da mesma forma, também foi detectada uma incidência
elevada de alterações cromossômicas em embriões de casais jovens com mais de três falhas de
implantação (>55% de embriões são aneuplóides) e em casais com pelo menos dois abortos
espontâneos (>68%) (GIANAROLI et al.,2001).
SHAHINE & CEDARS (2006) questionaram se a aplicação do PGD-AS em gametas e
embriões poderia ajudar a aumentar as taxas de implantação e gestação em casais com idade
materna elevada, em casais com falhas recorrentes de implantação, em mulheres que apresentam
abortos espontâneos de repetição e também em casais portadores de translocação equilibrada
para detectar alterações dos cromossomos envolvidos no rearranjo (MUNNÉ et al., 1999;
GIANAROLI et al., 2002; MUNNÉ et al., 2002; KULIEV et al., 2003; PUJOL et al., 2003).
Baseados em dados de 20.000 ciclos de PGD, KULIEV & VERLINSKY (2008) relataram que
apesar da necessidade de se realizar um estudo controle randomizado para quantificar o impacto
clínico da pré-seleção de embriões euplóides, o efeito positivo do PGD-AS é evidente quando
comparadas as taxas de sucesso reprodutivo dos mesmos pacientes, antes e depois da realização
do diagnóstico.
Dados da literatura descrevem uma variedade de técnicas empregadas na detecção de
aneuploidias em células únicas, porém a metodologia mais utilizada no PGD-AS é a hibridação in
situ fluorescente (FISH) para estudo de 5 a 9 pares cromossômicos (MUNNÉ et al., 1998a;
KULIEV et al., 2003; WILTON et al., 2003a; MONTAG et al., 2004).
PORTADORES DE TRANSLOCAÇÕES EQUILIBRADAS
As translocações recíprocas caracterizam-se pela troca de fragmentos de DNA entre
cromossomos. Entre essas estão as translocações do tipo robertsonianas que consistem na fusão
dos braços q de dois cromossomos acrocêntricos. Os portadores de translocações equilibradas,
Introdução Geral
31
apesar de aparentemente saudáveis, apresentam um risco maior risco de gerar descendentes
portadores de cariótipos desequilibrados, anomalias congênitas e deficiência mental. Além do
mais, freqüentemente apresentam abortos recorrentes e infertilidade.
Nesses casos, o objetivo do PGD nestes casos é reduzir a incidência dos abortos espontâneos
e obviamente, minimizar o risco de nascimento de um bebê com cariótipo desequilibrado.
Inicialmente, o diagnóstico pré-implantacional de translocações se dava pelo uso da FISH com
sondas de pinturas cromossômicas sobre 1CP fixados em lâmina (MUNNÉ et al., 1998c;
DURBAN et al., 2001). No entanto, esta estratégia não detectava as translocações de origem
paterna. Atualmente, o PGD para casais com translocações é realizado em blastômeros fixados
(MUNNÉ, 2002).
No caso das translocações robertsonianas, a abordagem metodológica é bastante simples, já
que para chegar ao diagnóstico, basta aplicar duas sondas locos específicas de diferentes cores,
uma para cada cromossomo envolvido. No entanto, no caso das translocações recíprocas, o PGD
é um pouco mais complicado já que cada translocação apresenta pontos de quebra específicos e
únicos para aquela família. Em cada caso, cabe estudar as translocações separadamente e
identificar 3 sondas com cores diferentes, para proceder o diagnóstico (SERMON et al., 2004).
Além disso, a combinação destas sondas, apesar de poder distinguir os embriões
cromossomicamente equilibrados dos não equilibrados, não permite distinguir entre os embriões
portadores da translocação equilibrada e os normais, que seriam preferencialmente transferidos
para evitar a herança da translocação (MUNNÉ et al., 1998b).
DOENÇAS MONOGÊNICAS
O primeiro PGD publicado teve por objetivo a sexagem embrionária com o intuito de evitar
a transmissão de doenças recessivas ligadas ao cromossomo X (HANDYSIDE et al., 1990). No
Introdução Geral
32
entanto esta estratégia implica na não transferência de embriões masculinos apesar de 50% deles
não serem afetados pela doença além da transferência de 50% de embriões femininos que podem
ser portadores da mutação.
Atualmente, as técnicas de diagnóstico molecular permitem a detecção direta das mutações
responsáveis por algumas doenças ligadas ao cromossomo X (hemofilia A, distrofia muscular de
Duchenne, X-frágil, retinite pigmentar, entre outras), além da detecção de mutações causadoras
de doenças autossômicas recessivas (fibrose cística, β-talassemia,Tay-Sachs, anemia de Fanconi,
etc.) e de doenças autossômicas dominantes acarretam um rico de 50% de ser transmitida para a
descendência (por exemplo, síndrome de Marfan, distrofia miotônica e corea de Huntington)
(Tabela 1).
D
OENÇA
N
ÚMERO DE CICLOS
Fibrose Cística
69
β- Talassemia 53
β- Talassemia + Seleção de HLA 8
Atrofia Espino-Muscular 29
Amenia Falciforme 9
Corea de Huntigton 90
Distrofia Miotônica tipo I 67
Polipose Adenomatosa 9
Síndrome de Marfan 8
Distrofia Muscular de Duchenne 17
Distrofia Muscular de Becker 4
Hemofilia 14
Síndrome do X-Frágil 27
Outras 112
Total 516
Tabela 1: Aplicação Clínica do PGD para doenças monogênicas, modificado de FRAGOULI et al., 2007.
A técnica mais utilizada para a detecção direta das mutações é a PCR (reação em cadeia da
polimerase). Paralelamente, deve ser feita a detecção de STRs (seqüências repetiras em tandem)
que permite um diagnóstico indireto e desempenha o papel de controle interno de contaminação.
O PGD em geral, e a PCR em células únicas em particular, são procedimentos que requerem um
Introdução Geral
33
trabalho muito especializado, o que reduz o número de centros capacitados para investigar e
desenvolver os testes específicos para diferentes mutações.
Mesmo assim, a lista de doenças monogênicas diagnosticadas em período pré-implantacional
tem aumentado pouco a pouco (SERMON, 2007).
JUSTIFICATIVA DA PESQUISA
Justificativa da Pesquisa
35
Trata-se de um estudo que permite o aprimoramento de técnicas citogenéticas utilizadas para
diagnóstico pré-implantacional. Este procedimento, além de diminuir a porcentagem de falhas de
implantação embrionária e possibilitar o nascimento de crianças não afetadas por
cromossomopatias, possibilita a investigação de fatores responsáveis pelo desenvolvimento
embrionário, como mecanismos de segregação cromossômica e a correlação genótipo/ fenótipo.
O primeiro passo para a definição do diagnóstico pré-implantacional em nosso laboratório
foi a sistematização de um protocolo para detecção de aneuploidias cromossômicas pela técnica
de FISH a partir da biópsia de blastômeros. Esta sistematização resultou na dissertação de
mestrado intitulada “Diagnóstico Genético Pré-Implantacional de Aneuploidias Cromossômicas”
que foi o primeiro projeto de pesquisa, encaminhado e aprovado pelo CONEP (663/2003),
envolvendo embriões humanos viáveis, em estágio pré-implantacional, para definição do
diagnóstico citogenético.
Posteriormente, consideramos que a aplicação das sondas de oligonucleotídeos em
blastômeros fixados tratava-se de uma opção viável para a análise de um grande número de
aneuploidias (15 cromossomos) por meio da técnica de FISH. Desta forma, padronizar este
protocolo significaria ampliar o screening de alterações numéricas em blastômeros de forma rápida
e economicamente viável.
Devido à experiência metodológica, aos resultados obtidos após investigação de casais de
risco para diagnóstico de rearranjos cromossômicos herdados, além da discussão por nosso grupo
de pesquisa sobre os aspectos éticos e as limitações técnicas da FISH, consideramos que o
diagnóstico pré-implantacional de oócitos pela técnica de Hibridação Genômica Comparativa
(CGH) contribuiria não só para o conhecimento dos mecanismos de segregação meiótica como
também para melhores resultados das técnicas de reprodução assistida.
Justificativa da Pesquisa
36
Sendo assim, decidimos trabalhar concomitantemente com as duas metodologias, FISH e
CGH em célula única, para aperfeiçoamentoe precisão do Diagnóstico Genético Pré-
Implantacional de aneuploidias cromossômicas.
Este projeto foi aprovado pelo comitê de ética local (CEP, HC/FMRP-USP) e pela comissão
nacional de ética em pesquisa (CONEP- Ministério da Saúde) recebendo o número de processo
HCRP 14587/2006.
DIAGNÓSTICO GENÉTICO PRÉ-IMPLANTACIONAL POR
HIBRIDAÇÃO GENÔMICA COMPARATIVA
Introdução
38
INTRODUÇÃO
Vários estudos descritos na literatura sugerem que a meiose materna é mais suscetível a erros
cromossômicos do que a paterna. Análises citogenéticas de oócitos humanos não fertilizados
revelaram dois principais mecanismos de não-disjunção. O primeiro foi proposto por ANGELL
(1991), cujas observações indicaram que o desequilíbrio cromossômico seria causado por uma
pré-divisão do centrômero antes da anáfase I, favorecendo uma segregação ao acaso das
cromátides irmãs para cada célula-filha. O segundo envolve a segregação do par de cromossomos
homólogos para o mesmo pólo durante a primeira fase de meiose, gerando células-filhas
dissômicas e nulissômicas (ZENZES & CASPER, 1992).
Diversas técnicas de análise citogenética têm sido utilizadas para estudo de oócitos e
corpúsculos polares. Dentre elas, estão o bandeamento cromossômico (VEIGA et al., 1987;
KAMIGUCHI et al.,1993; PELLESTOR et al., 2003), a hibridação in situ fluorescente (FISH)
(DAILEY et al., 1996; MAHMOOD et al., 2000; CUPISTI et al., 2003; PUJOL et al., 2003), o
cariótipo espectral (SKY) (SANDALINAS et al., 2002) e a FISH multicolorida (M-FISH)
(CLYDE et al., 2003). Os resultados obtidos com estas investigações confirmam a relação direta
entre o avanço da idade materna e o processo de não disjunção meiótica (SANDALINAS et al.,
2002; PELLESTOR et al., 2003).
A constatação de que algumas aneuploidias são mais freqüentes do que outras (MAHMOOD
et al., 2000; CUPISTI et al., 2003) indicava que um terceiro mecanismo pudesse explicar as
aneuploidias de origem materna. Trata-se da presença de uma linhagem celular trissômica nas
gônadas de algumas pacientes, caracterizando o mosaicismo gonadal ou germinativo
(MAHMOOD et al., 2000; CUPISTI et al., 2003; PUJOL et al., 2003).
As incidências relatadas de anomalias cromossômicas detectadas em oócitos e corpúsculos
polares são muito variáveis. PELLESTOR e colaboradores (2003) descreveram uma taxa de 11%
de aneuploidia em oócitos na fase II da meiose (MII) analisados por bandeamento R. Por outro
Introdução
39
lado, os achados de KULIEV e colaboradores (2003) em diagnósticos realizados por FISH em
corpúsculos polares e oócitos de mães com idade elevada revelaram 52,1% de aneuploidia. Esta
variabilidade de resultados deve-se a vários fatores, tais como a faixa etária do grupo analisado, a
história clínica das pacientes e o tipo de amostra que inclui oócitos maduros não fertilizados, MII
maturados in vitro ou apenas corpúsculos polares. Segundo PICKERING e colaboradores (1988),
a maturação in vitro de oócitos pode causar alterações morfológicas no fuso celular promovendo o
aumento da taxa de aneuploidia nestes oócitos. Além disso, embriões provenientes de oócitos
maturados in vitro têm uma incidência relatada de anomalias superior à encontrada em embriões
originados de oócitos maturados in vivo (DE SCISCIOLO et al., 2000).
Entretanto, o parâmetro técnico mais importante nesta variação é que a metodologia
empregada requer a fixação dos núcleos em lâminas de vidro, o que aumenta o risco de perda
cromossômica por artefato de técnica. Em geral, as técnicas que envolvem fixação celular em
lâminas são eficientes em diagnosticar casos de hiperploidia, falhando na detecção de
hipoploidias. Com o intuito de superar esta limitação técnica, Wells e colaboradores (1999) e
WELLS & DELHANTY (2000) descreveram e aprimoraram a aplicação da Hibridação
Genômica Comparativa (CGH) (KALLIONIEMI et al., 1992) em célula única.
Algumas dificuldades da técnica de CGH e alguns pontos críticos devem ser analisados,
como a qualidade das metáfases na lâmina, a qualidade do DNA que será usado como sonda, a
marcação desse DNA, a eficiência dos supressores das seqüências de DNA repetitivo, a qualidade
do equipamento utilizado e, principalmente, o tempo despendido até a emissão do resultado final.
Além disso, a supressão de seqüências de DNA repetitivo pelo Cot-1 DNA é um ponto
fundamental para realização da técnica, uma vez que essas regiões poderiam ser erroneamente
classificadas como regiões de amplificação pelo software que analisa os resultados obtidos após a
hibridação. Apesar dessas limitações, até o momento, a técnica de CGH é a única ferramenta
viável para determinação de ganhos ou perdas de regiões cromossômicas envolvendo os 24 pares
de cromossomos (WELLS et al., 1999; WELLS & DELHANTY et al., 2000).
Introdução
40
I.1.
Não-Disjunção Cromossômica e Aneuploidias do Gameta Feminino
Foram descritos dois principais mecanismos causadores de aneuploidias
:
Não-disjunção de bivalentes em meiose I
Este é o modelo clássico e define-se pelo ganho ou perda de um univalente (cromossomos
com cromátides duplicadas) (ZENZES et al., 1992; KAMIGUCHI et al., 1993; DAILEY et al.,
1996) (Figura 1)
Separação precoce de cromátides irmãs
Explica o ganho e a perda de cromátides. Este modelo foi proposto por Roslyn Angell em
1991 ao observar cromátides extras em fixações de oócitos em metáfase II (MIIs). A pré-divisão
de cromátides irmãs pode ser equilibrada ou desequilibrada, podendo ou não causar perdas e
ganhos de material genético (Figura 1). A separação prematura das cromátides é comumente
observada em síndromes de instabilidade e estudos em células somáticas sugerem que a base
desse fenômeno são erros no processo de checkpoint (MATSUURA et al., 2000). Recentemente foi
identificada uma nova classe de proteínas nucleares, responsáveis pelo funcionamento do fuso
meiótico e pela progressão da anáfase, chamadas coesinas. Essas proteínas são altamente
conservadas e promovem a coesão entre as cromátides irmãs, se opondo a força de tração
exercita pelos microtúbulos e estabilizando os pontos de recombinação (quiasmas) durante a
meiose. A perda dessas coesinas durante a meiose I pode ser responsável pela separação precoce
das cromátides irmãs observada em MII (PELLESTOR et al., 2005). Esse evento parece ser
dependente da idade materna.
Introdução
41
Figura 1: Representação esquemática da divisão meiótica feminina normal e de três mecanismos
responsáveis por erros na segregação cromossômica de oócitos. Figura adaptada de Pellertor et al., 2005.
Introdução
42
I.2. Análise Citogenética de Oócitos (MII) e Corpúsculos Polares
CITOGENÉTICA CONVENCIONAL E CARIOTIPAGEM
No ano de 1966 foi descrita por TARKOWSKI a primeira técnica para fixação de oócitos de
mamíferos. Na década de 80, a adaptação desta técnica permitiu a realização e publicação de um
grande número de estudos em oócitos humanos. No entanto, estes estudos mostraram uma
quantidade exagerada de monossomias (17.5%) se comparada com o número de trissomias
(8.5%) fato que indicava a elevada incidência de perdas de cromossomos por artefato de técnica
(MIKAMO & KAMIGUCHI, 1983). Além disso, a morfologia particular dos cromossomos em
MII (Figura 2), com cromatina muito condensada e as duas cromátides irmãs bem separadas,
dificulta a identificação individual dos cromossomos que ao serem corados com Giensa podem
apenas ser classificados segundo o método de Denver , em 7 grupos de acordo com tamanho e a
posição do centrômero (PELLESTOR, et al., 2006).
Figura 2: Ilustração de cromossomos em metáfase II oocitária. A seta indica uma cromátide que sofreu
divisão precoce. Figura adaptada de Pellestor et al., 2005.
Introdução
43
TÉCNICAS DE CITOGENÉTICA-MOLECULAR
O uso das técnicas de citogenética molecular tem favorecido os estudos em oócitos humanos.
Baseadas na utilização de diversos tipos de sondas de DNA (centroméricas, locos específicas ou
pinturas cromossômicas) e associadas a diferentes fluorocromos, essas metodologias vêm se
aprimorando com a evolução dos microscópios e dos sistemas de captura. Atualmente, as
técnicas de citogenética molecular constituem tanto protocolos de pesquisa quanto de
diagnóstico, adicionando sensibilidade e especificidade aos resultados obtidos por citogenética
convencional. Muitas dessas técnicas têm sido utilizadas com sucesso para screening de gametas
femininos, já que permitem estudar paralelamente oócitos e corpúsculos polares.
A hibridação in situ fluorescente (FISH) se tornou a técnica padrão para a avaliação de
aneuploidias, sendo possível analisar de duas a nove sondas cromossomo-específicas divididas em
uma, duas ou três etapas de hibridação (PUJOL et al., 2003). A FISH, assim como as técnicas de
citogenética convencional, depende da fixação do núcleo MII e portanto pode sofrer perdas de
cromossomos. Cabe destacar que o número de cromossomos que pode ser analisado em cada
etapa está ligado ao número limitado de fluorocromos disponíveis e à possibilidade de
sobreposição dos sinais (WELLS & LEVY, 2003; WILTON, 2005). Em resumo, na melhor das
possibilidades, é possível analisar somente 5 cromossomos em cada hibridação. Além disso, a
quantidade de vezes que o material genético pode ser hibridado também é limitada, sendo
observada perda considerável na qualidade da amostra a partir da terceira denaturação (LIU et al.,
1998). Outra limitação da FISH é que as informações obtidas referem-se à região de hibridação
da sonda e não a todo o cromossomo.
Limitações semelhantes são encontradas nas metodologias de PRINS (primed in situ labelling)
e PNAs (peptide nucleic acid) que tiveram suas aplicações ao PGD descritas por PETIT et
al.(2000) e PAULASOVA et al. (2004), respectivamente.
Introdução
44
Com o intuito de superar a limitação da FISH convencional, PRINS e PNAs, quanto ao
número de cromossomos analisados, alguns estudos relataram o uso de técnicas de FISH
multicolorida, como M-FISH (multiple-FISH), SKY (spectral karyotyping) e cenM-FISH no
diagnóstico de aneuploidias em núcleos MII (MARQUEZ et al., 1998; CLYDE et al., 2001 e 2003;
SANDALINAS et al., 2002). No entanto, são técnicas que exigem metáfases de ótima qualidade e
principalmente sem sobreposição dos cromossomos. Este fato fez com que grande parte do
oócitos fixados fosse descartada justificando assim, o tamanho reduzido das amostras nos
trabalhos citados.
HIBRIDAÇÃO GENÔMICA COMPARATIVA (CGH)
Esta metodologia permite detectar desequilíbrios no número de cópias de qualquer
cromossomo em apenas uma hibridação, sem a necessidade de fixar o material genético ou
empregar algum método de coloração para visualizar os cromossomos metafásicos.
A técnica de CGH foi primeiramente descrita por KALLIONIEMI e colaboradores em 1992
no estudo de DNA tumoral. Ela consiste na marcação do DNA teste com um fluorocromo
vermelho, que é misturado em uma razão de 1:1 com DNA normal marcado com um
fluorocromo verde. Ambos são hibridados em preparações metafásicas humanas normais fixadas
em uma lâmina controle. O DNA normal e as metáfases são obtidos de um voluntário saudável.
Os fragmentos de DNA marcados em verde e vermelho competem pela hibridação em seus
locos de origem na preparação metafásica. A proporção de fluorescência verde e vermelha
medida ao longo do eixo cromossômico representa perda (razão < 1) ou ganho (razão > 1) de
material genético na região específica da célula analisada. As metáfases são observadas com
auxílio de um microscópio de epifluorescência e as imagens obtidas são analisadas por softwares
(Figura 3).
Introdução
45
A primeira aplicação da CGH no diagnóstico pré-implantacional foi descrita em blastômeros
(VOULLAIRE et al., 2002). Neste caso, a biópsia deve ser realizada no terceiro dia após a
fecundação, sendo imprescindível a criopreservação dos embriões biopsiados até que se obtenha
o resultado da CGH. Após o diagnóstico, os embriões são descongelados e transferidos para o
útero materno em um ciclo posterior. Este procedimento foi aplicado com sucesso em mulheres
com falhas repetidas de implantação (WILTON et al., 2001) e apresentou taxas de implantação e
de gestação superiores às obtidas após PGD-FISH (WILTON et al., 2003). Mesmo assim, esta
estratégia iniciou uma controvérsia considerável (HILL, 2003; MUNNÉ & WELLS, 2003;
VERLINSKY & KULIEV, 2003; WILTON et al., 2003) já que 46% dos embriões não
sobrevivem ao processo de congelamento e descongelamento. Dessa forma, a vantagem de se
analisar todos os cromossomos foi mascarada pela perda de praticamente metade dos embriões
disponíveis.
Atualmente, a técnica de CGH tem sido aplicada ao diagnóstico do primeiro corpúsculo polar
(WELLS et al., 2002; GUTIERREZ-MATEO et al., 2004a, 2004b). A maior vantagem desta
estratégia é que a biópsia do 1CP é realizada no mesmo dia da ICSI, assim desenvolvimento de
um protocolo curto de hibridação permite a análise da CGH em um tempo compatível com a
transferência embrionária (dia +4 ou +5), dispensando a criopreservação do embrião.
No entanto, a técnica de CGH apresenta algumas limitações como: (1) ser capaz de detectar
apenas os ganhos e as perdas de DNA que sejam maiores de 10 Mb; (2) não detectar alterações
de ploidia (triploidia, tetraploidia...) e alterações cromossômicas equilibradas; (3) apresentar
resultados inespecíficos para algumas regiões cromossômicas heterocromáticas tais como,
centrômeros e telômeros, além de mostrar desvios por AT dos perfis correspondentes aos
cromossomos 17, 19 e 22. (KALLIONIEMI et al., 1992). Outro ponto a ser levado em
consideração é a escassez de DNA presente em uma única célula (5-10pg). Considerando que a
quantidade necessária para realizar a CGH é de 200ng-1µg, torna-se imprescindível que o DNA
total da célula seja pré-amplificado aproximadamente 40.000 vezes (WELLS & LEVY, 2003).
Introdução
46
Figura 3: Análise de CGH demonstrando perfil normal. A razão entre as fluorescências verde e vermelha
equivale a aproximadamente 1,0.
Objetivos
47
OBJETIVOS
Os objetivos deste trabalho foram:
1. Padronizar e estabelecer a técnica de CGH em corpúsculos polares para
Diagnóstico Genético Preimplantacional.
2. Validação da metodologia por meio do estudo de complementaridade entre
primeiro corpúsculo polar e núcleo oocitário em metáfase II
3. Determinar a freqüência de aneuploidias em Oócitos maduros, não
criopreservados e Primeiro Corpúsculo Polar proveniente de doadoras com
cariótipo normal:
4. Identificar os cromossomos mais freqüentemente envolvidos em aneuploidias
Materiais e Métodos
48
M
ATERIAIS E
M
ÉTODOS
I. Casuística
O trabalho foi realizado na Unidade de Biologia e Genética Médica do Departamento de
Biologia Celular, Fisiologia e Imunologia da Universidade Autônoma de Barcelona, coordenado
pela Prof
a
Joaquima M. Navarro Ferrete, em colaboração com o Departamento de Genética da
Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto – USP.
Devido às implicações éticas envolvidas na manipulação de gametas humanos, todos os
procedimentos descritos neste trabalho seguiram os preceitos éticos pertinentes à legislação
vigente no país onde foi realizada a pesquisa.
Os oócitos foram doados por cinco mulheres jovens, com faixa etária média de 23 anos, com
idade variando entre 20 e 26 anos, com cariótipo normal. As pacientes foram participantes do
programa de doação de oócitos da Clínica Eugin de Reprodução Assistida (Barcelona, Espanha),
tendo sido submetidas ao mesmo procedimento de estimulação hormonal e punção folicular.
II. Amostras
A amostra caracterizou-se por oito oócitos maduros e não criopreservados provenientes de
cinco doadoras. Em cada oócito foram realizadas duas análises de CGH: a primeira utilizando
DNA do primeiro corpúsculo polar (1CP) que por meio de biópsia foi separado do núcleo
oocitário (MII), no qual se realizou a segunda análise. Assim obtivemos resultados pareados que
serviram de controle para a eficiência da metodologia.
Materiais e Métodos
49
III. Métodos
A descrição e o preparo das soluções utilizadas encontram-se no Anexo A.
Hibridação Genômica Comparativa (CGH) em célula única:
A metodologia de CGH empregada neste trabalho baseou-se em GUTIÉRREZ-MATEO e
colaboradores (2004a e 2004b).
Na CGH de células isoladas, o DNA teste foi marcado com um fluorocromo vermelho,
misturado em uma razão de 1:1 com DNA normal marcado com um fluorocromo verde, e
ambos foram hibridados em preparações metafásicas humanas normais (lâmina controle). A
proporção de fluorescência vermelha e verde medida ao longo do eixo cromossômico
representava perda (razão <0,8:1) ou ganho (razão >1,2:1) de material genético na célula do
embrião naquela região específica. A análise foi feita em microscópio de epifluorescência
acoplado a sistema computadorizado. A figura 5 mostra as etapas principais da técnica de CGH
em corpúsculo polar.
III.1. Obtenção e Isolamento das células
Foram utilizadas células isoladas da mucosa oral, núcleos de oócitos em metáfase II (MII) e
primeiro corpúsculo polar oocitário (1CP).
As células da mucosa oral foram obtidas por meio de alguns segundos de enxagüe bucal com
água destilada. A partir dessa suspensão as células foram isoladas procedendo a sucessivas
diluições feitas em placa de Corning com pipetas Pasteur estiradas e sob o controle de um
estereomicroscópio. Desta forma, as células foram transferidas de gota em gota (contendo
Materiais e Métodos
50
solução PBS) até que uma única célula em um volume mínino de solução fosse transferida para
um tubo plástico de PCR.
Com relação aos oócitos, obtivemos a separação do 1CP e MII por meio de biópsia utilizando
microscópio invertido com sistema de micromanipulação (Zeiss). Os oócitos foram transferidos
para placas de Corning contendo microgotas de solução PBS. A abertura na zona pelúcida foi
feita de forma mecânica utilizando-se pipetas para biópsia. Após a biópsia, o 1CP e o MII foram
transferidos separadamente para tubos de PCR e permaneceram congelados até o início da etapa
de lise celular.
III.2. Medidas para evitar contaminação
A contaminação proveniente de células do próprio pesquisador, de bactérias e fungos ou de
produtos de PCR é um dos principais problemas no procedimento de amplificação genômica de
células únicas. Algumas das medidas utilizadas para evitar esta contaminação foram:
Determinou-se uma área no laboratório onde foram manipulados produtos de PCR ou
DNA que não pertencesse aos experimentos em questão.
Todos os procedimentos foram realizados em sistema de fluxo laminar previamente
desinfetado e esterilizado com luz ultravioleta por no mínimo 30 minutos antes do
procedimento.
Foi obrigatório o uso de luvas de procedimento sem talco, trocadas freqüentemente.
Todo material utilizado (placas de Corning, pipetas Pasteur, tubos de PCR...) foram
esterilizados e permaneceram sob luz ultravioleta por 30 minutos antes do início do
procedimento. As soluções também estiveram sob o efeito da luz ultravioleta, com
exceção do óleo mineral.
Materiais e Métodos
51
As pipetas e as estantes para suporte dos tubos plásticos permaneceram dentro do fluxo
laminar e foram de uso exclusivo da amplificação do DNA da célula isolada.
Foram utilizadas apenas ponteiras com filtro.
As soluções foram preparadas em condições estéreis e aliquotadas em pequenos volumes
para evitar o excesso de manuseio.
Controles negativos de contaminação foram rigorosamente utilizados em cada
experimento.
III.3. Lise celular
A lise celular foi obtida pela ação da proteinase K diluída em solução SDS. Foram adicionados
3 µl de solução de lise em cada microtubo e a amostra foi coberta por uma gota de óleo mineral.
Para que ocorresse a ativação da enzima as amostras foram incubadas durante 1h a 37ºC e, para
neutralizar a sua ação, mais 10 minutos de incubação a 95ºC.
III.4. Amplificação genômica da célula isolada por DOP – PCR
O protocolo de CGH utiliza, no mínimo, 200ng de DNA por amostra. O cálculo teórico para a
quantidade de DNA de uma única célula varia de 5 a 10 pg. Dessa forma, o genoma celular foi
amplificado para viabilizar a técnica de hibridação.
A amplificação do DNA genômico foi obtida pela técnica de Reação em Cadeia da Polimerase
com Primer de Oligonucleotídeo Degenerado (DOP–PCR), descrita por Telenius e
colaboradores em 1992. Esta técnica foi posteriormente modificada para a aplicação em células
únicas e análise de CGH (WELLS et al., 1999).
Materiais e Métodos
52
Após a reação de amplificação obtivemos uma solução de DNA com 50µl de volume final. O
volume e a concentração de cada reagente utilizado na reação de amplificação estão descritos na
tabela seguinte.
Reagente Composição e Concentração por Reação Volume
Água
Água milliQ estéril e filtrada 32,0µl
10x Long PCR Buffer
-MgSO
4
(Ambion)
1x (a solução 10x contém Tris-HCl 100mM
pH=9 e 500mM KoAc)
5,0µl
MgSO
4
(Ambion)
1,75mM (solução mãe com 25mM) 3,5µl
dNTPs Mix (1C:1G:1A: 1T)
(Ambion)
0,2mM dCTP, 0,2mM dGTP, 0,2mM dATP e
0,2mM dTTP
4,0µl
Primer de DOP 6MW
(Roche)
2 M de primer de DOP
5´-GACTCGAGNNNNNNATGTGG-3´
1,0µl
Super Taq Plus (Ambion)
2,5U 0,5µl
Amostra
Célula + aprox.1,0µl de solução de isolamento
+ 3,0 de solução de lise
4,0µl
T
ABELA
2: Reagente utilizados no procedimento de DOP –PCR.
A amostra foi então homogeneizada e submetida ao programa de PCR: denaturação da
amostra a 94º C por 4,5 minutos, 8 ciclos de 95º C por 30 segundos, 56º C por 1minuto e 72º C
por 3 minutos com uma etapa final de 72º C por 8 minutos. A PCR foi realizada em um
termociclador de gradiente T (Biometra, Goettingen, Germany). Controles negativos foram
incluídos em cada experimento para testar tanto as soluções utilizadas na reação de PCR quanto a
solução salina usada para obtenção da amostra.
III.5. Eletroforese de comprovação
A qualidade do DNA amplificado foi comprovada por eletroforese na qual se utilizou um gel
de agarose com concentração de 1,5%. O gel corado com brometo de etídeo e observado em
Materiais e Métodos
53
transiluminador. Os produtos da amplificação do DNA da célula devem parecer um smir com
maior quantidade de fragmentos acima de 600pb, indicando a boa qualidade do DNA obtido
com a amplificação. O tamanho foi determinado por comparação com o DNA marcador de
100pb (Invitrogem).
F
IGURA
4: Gel de eletroforese mostrando padrões ideais (2-7 e 9-12) e inadequados (1 e 8) para a
amplificação do DNA genômico. C- :Controle Negativo.
III.6. Marcação da sonda
Os produtos da amplificação das células isoladas (tanto DNA teste quanto DNA controle)
receberam a marcação fluorescente pela técnica de Nick Translation.
Materiais e Métodos
54
Esta metodologia associa a ação da enzima DNAse I capaz de fragmentar o DNA alvo, e da
enzima DNA polimerase I que segue unindo estes fragmentos. Durante esta polimerização,
nucleotídeos normais (dATP, dCTP, dGTP e dTTP) e também nucleotídeos marcados
fluorescentemente (dUTP) vão sendo incorporados ao DNA. No caso das células ¨teste¨ a
marcação foi feita com fluorescência de Spectrum Red-dUTP (Texas Red, Vysis Downers-Grove,
USA.) enquanto que para as células ¨controle¨ utilizou-se Spectrum Green- dUTP (FITC, Vysis
Downers-Grove, USA). O protocolo utilizado para a marcação das sondas foi ajustado para as
amostras em questão, seguindo as normas do fornecedor (Vysis Inc.). As soluções utilizadas neste
procedimento estão descritas na tabela abaixo
.
Reagentes Composição e Concentração por Reação Volume
Nick Translation
Enzime
25U de DNAse I e DNA polimerase I 5,0µl
10x Nick
Translation Buffer
1x (solução 10x contém Tris-HCl 500mM
pH=7,2, MgSO
4
10mM e DDT 1mM)
5,0 µl
dNTPs Mix
(1C:1G:1A)
0,02mM dCTP, 0,02mM dGTP, 0,02mM dATP
(solução inicial de 0,1mM de cada dNTP)
10,0 µl
dTTP
0,01mM dTTP (solução inicial de 0,1mM dTTP) 5,0 µl
dUTP marcado com
FITC e TR
0,01 mM Spectrum Green e 5 µM Spectrum Red
(solução inicial com 0,2mM FITC e 0,1 TR – por
ser mais intenso compensa na diluição)
2,5 µl
Produto de
Amplificação
500-800 ng de DNA 22,5 µl
T
ABELA
3: Reagentes utilizados na marcação por Nick Translation.
A reação com volume final de 50 µl foi mantida por 1h e 30 min a 15ºC e depois ter a sua
temperatura elevada para 70ºC permanecendo por mais 10 minutos para que as enzimas fossem
inativadas. O tamanho dos fragmentos (sondas) e a incorporação dos fluorocromos são fatores
decisivos na qualidade da hibridação e conseqüente análise dos resultados. Para comprovar a
Materiais e Métodos
55
incorporação dos fluorocromos à amostra, pode-se correr um gel de 1,5% agarose e observá-lo
no transiluminador sem passar pela etapa de coloração com brometo de etídeo. A sonda com
qualidade adequada (com aproximadamente 20% de incorporação) já deve conter fluorescência
suficiente permitindo a visualização do smir de DNA.
III.7. Preparação da sonda
Após a marcação fluorescente de DNA, as duas sondas (spectrum red - DNA teste e spectrum
green - DNA normal) foram transferidas para o mesmo tubo plástico. Para finalizar a preparação
da sonda adicionaram-se 5µl de Human Cot-1-DNA (concentração de 1µg/ µl), 0,1x o volume da
solução de acetato de sódio (NaAc) 3M, pH=5,5 e 2,5x o volume de etanol absoluto. Esta
solução foi deixada por no mínimo 1h a -80ºC para precipitação do DNA. Em seguida a amostra
foi centrifugada por 30 minutos a 12000rpm, o sobrenadante foi descartado, permanecendo em
temperatura ambiente para secar. Depois de seco, o pellet de DNA foi ressuspendido em 10µl de
solução de hibridação, permanecendo a 37ºC, até o momento da aplicação da sonda sobre a
amostra.
III.8. Lâminas e Preparações Metafásicas
Para a análise da CGH devem foram consideradas as metáfases que estejam completas, com
cromossomos alongados, sem sobreposições cromossômicas. Com o objetivo de conseguir
melhores preparados metafásicos, foram utilizadas lâminas comerciais da marca Vysis Downers-
Grove, USA contendo metáfases masculinas normais 46,XY. Estas lâminas permaneceram
estocadas em freezer a -20ºC até momento da hibridação. Antes do início das lavagens, as lâminas
foram observadas em microscópio de contraste de fase para que as áreas ideais para a análise
fossem demarcadas com caneta de diamante.
Materiais e Métodos
56
III.9. Hibridação Genômica Comparativa
P
RÉ
-
TRATAMENTO
,
S
ONDAS E
H
IBRIDAÇÃO
Metáfases 46,XY fixadas foram desidratadas em uma série de diferentes concentrações de
etanol (70, 85 e 100% por 2 minutos cada). Depois de secas, as lâminas foram denaturadas em
solução de 70% formamida a 73º C por 5 minutos e, imediatamente após, passaram por outra
série de álcoois gelados para evitar a união das cromátides cromossômicas (70, 85 e 100% por 2
minutos cada). Em seguida, as lâminas permaneceram em temperatura ambiente para que
secassem completamente.
As sondas foram denaturadas a 73º C por 10 minutos e aplicadas às lâminas, que foram
cobertas por lamínulas e então seladas. A hibridação ocorreu em câmera única a 37º C por 72h.
L
AVAGENS PÓS
-
HIBRIDAÇÃO
Todos os procedimentos após a hibridação foram realizados em local sem incidência direta
de luz. As lâminas foram lavadas em soluções com alta adstringência, 0,4x SSC/0,3% NP-40 a
73º C por 2 minutos e 2x SSC/0,1% NP-40 por 2 minutos em temperatura ambiente. Em seguida
foram desidratadas em álcool e mantidas à temperatura ambiente para secar. Com estas lavagens
foram feitas com o intuito de remover as hibridações inespecíficas e eliminar os resíduos da
preparação. Este tipo de background pode interferir na análise final comprometendo os resultados.
Finalmente as lâminas foram montadas aplicando-se a solução de DAPI/ Antifade
Vectashield (Vector Labs, Peterborough, UK) e para contrastar os cromossomos e núcleos e
impedir o photobleaching das marcações florescentes. As lâminas foram estocadas a 4ºC e
protegidas da luz.
Materiais e Métodos
57
III.10. Microscopia e Análise das Imagens
As preparações metafásicas foram analisadas utilizando um microscópio de epifluorescencia
(Nikon Eclipse 90i) equipado com câmera CCD (charge-coupled device) de alta sensibilidade e filtros
apropriados para a detecção dos fluorocromos empregados.
Filtro U-MNIBA para captura de emissões de fluorescência verde (Spectrum Green, luz de
excitação com comprimento de onda de 497nm e 524nm de emissão).
Filtro U-MWIY para captura de emissões de fluorescência vermelha (Spectrum Red, luz de
excitação com comprimento de onda de 592nm e 612nm de emissão).
Filtro U-MNU para captura de emissões de fluorescência azul (DAPI, luz de excitação
com comprimento de onda de 367nm e emissão de 452nm).
Foram capturadas e, posteriormente analisadas, 10 metáfases por caso utilizando os softwares
Metasystem ISIS-FISH Capture Analysis e Vysis Quips CGH. Para que as metáfases fossem
incluídas na análise deveriam seguir um padrão de confiabilidade:
Metáfases com cromossomos longos, separados e sem sobreposições.
Metáfases que apresentassem alta intensidade de fluorescência, sendo a verde e a
vermelha equivalentes.
Hibridação homogênea (sem grânulos) ao longo dos cromossomos.
Ausência ou pequena quantidade de artefatos de hibridação ao redor da metáfase ou
sobre os cromossomos.
A captura foi feita de forma seqüencial: primeiramente o sinal correspondente ao DAPI,
depois o spectrum de fluorescência verde e finalmente a fluorescência vermelha. Em seguida,
foram aplicadas as ferramentas do sistema computacional de análise com as quais se
individualizou dos cromossomos, determinando os perfis de hibridação.
Materiais e Métodos
58
A média entre as taxas de fluorescência verde/vermelha para cada cromossomo foi
determinada pelo software. Em regiões em que o número de cópias do DNA teste era idêntico ao
DNA normal, o perfil do CGH mostrou uma pequena variação na qual taxa esperada manteve-se
perto de 1,0. Desvios desse valor abaixo de 0,8 (o DNA teste está sub-representado) ou acima de
1,2 (o DNA teste está supra-representado) foram classificados, respectivamente, como perdas e
ganhos.
Materiais e Métodos
59
F
IGURA
5: Etapas básicas para a realização da Hibridação Genômica Comparativa em células únicas, neste
caso, especificamente 1CP. Imagem cedida por O
BR ADORS
,
2007.
I
I
C
C
S
S
I
I
MII
B
B
i
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Aprox. 2 horas
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D
D
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A
A
1
1
C
C
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P
D
D
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O
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P
-
-
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A
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F
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S
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H
4
4
4
4
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o
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A
A
n
n
á
á
l
l
i
i
s
s
e
e
C
C
G
G
H
H
Resultados
60
RESULTADOS
Foram analisados 8 oócitos frescos (não criopreservados) e maduros (coletados no estágio II
da meiose, ou seja, com 1CP evidente) totalizando 16 procedimentos de CGH, devido a análise
pareada de 1CP e do núcleo MII. As 16 células analisadas foram amplificadas pela técnica de
DOP-PCR apresentando um smear de DNA entre 200 e 4000pb.
A taxa de aneuploidia encontrada na amostra foi de 25%, já que 2 dos 8 oócitos analisados
apresentaram anomalias cromossômicas. Os resultados estão descritos na tabela abaixo.
Oócito Idade da Doadora Resultado 1CP Resultado MII Figuras
190
26
**
24,X,+22 23,X 6 (A) e (B)
191
26
**
24,X+16 23,X,-16,+19 7(A), (B), (C)
206
20 23,X 23,X
207
20 23,X 23,X
208
20 23,X 23,X
209
20
*
23,X 23,X
210
20
*
23,X 23,X
211
20
*
23,X 23,X
Tabela 4: Resultado obtido pela técnica de CGH aplicada a 8 oócitos.
**
: Oócitos provenientes da
doadora número 1 e
*
: Oócitos provenientes da doadora número 5.
Um dos oócitos alterados apresentou ganho do cromossomo 22 (24,X,+22) apenas na análise
do 1CP, ou seja, não houve concordância entre os perfis de CGH quando comparados 1CP e
núcleo MII, que neste caso foi diagnosticado como euplóide (23,X).
No segundo oócito aneuplóide, observou-se concordância parcial dos resultados. Desta vez,
foi detectado ganho do cromossomo 16 no 1CP (24,X,+16) e no núcleo MII, além da
correspondente perda de 16, também foi identificado ganho de 19 e cariótipo final 23,X,-16,+19.
Com relação aos oócitos cromossomicamente normais, todos apresentaram concordância
entre os diagnósticos de 1CP (23,X) e MII (23,X).
Resultados
61
Sendo assim, observou-se: (1) uma taxa de aneuploidia de 25% da amostra; (2) concordância
entre os perfis de 1CP e MII quando euplóides; (3) uma tendência ao ganho cromossômico em
1CP; (4) a não concordância de resultados entre 1CP e MII nos dois casos positivos de
aneuploidias.
Resultados
62
A
B
Figura 6: Perfis de CGH correspondentes à análise do oócito 190. (A) Resultado 1CP: 24,X,+22
e (B) Resultado MII: 23,X.
Resultados
63
A
B
Figura 7: Perfis de CGH correspondentes à análise do oócito 191. (A) Resultado 1CP: 24,X,+16
e (B) Resultado MII: 23,-16,+19.
Resultados
64
Figura 7C: Exemplo de uma das metáfases analisadas para obtenção do perfil de CGH do oócito 191
(1CP). As setas indicam os cromossomos 16 marcados mais intensamente com fluorocromo vermelho, o
que corresponde a ganho de material genético para este cromossomo.
Discussão
65
DISCUSSÃO
Considerações sobre a Metodologia
O primeiro ponto a ser discutido com relação à metodologia é a utilização de material
previamente amplificado para proceder a hibridação genômica comparativa. A maioria dos
protocolos descritos para a amplificação do DNA total de uma célula baseia-se na
utilização de primers degenerados ou parcialmente degenerados e temperaturas de
pareamento baixas, favorecendo uma amplificação totalmente inespecífica (TELENIUS et
al., 1992). Este fato exige que precações no sentido de evitar a contaminação com outros
DNAs que não sejam o da célula. Apesar de estarem descritas várias alternativas para a
amplificação do genoma celular, a técnica que parece se ajustar mais à CGH é a Degenerate
Oligonucleotide Primed PCR (DOP-PCR). Alguns estudos demonstraram que as características
citogenéticas obtidas por DOP-PCR-CGH são equivalentes às obtidas por meio da CGH
convencional, sem amplificação prévia do DNA (HARADA et al., 2000; LARSEN et al.,
2001).
Com relação à marcação da sonda, optou-se pela técnica de Nick Translation como
descrito por GUTIÉRREZ-MATEO e colaboradores em 2004. Esta metodologia permite
cortar a sonda e obter fragmentos de 300-3000pb, correspondente ao tamanho ideal para a
realização da CGH. Segundo a literatura, a marcação com Nick Translation resulta em
hibridações mais homogêneas e com menos background do que as hibridações de sondas
marcadas com DOP-PCR (LARSEN et al., 2001).
Como já citado anteriormente, o tempo desprendido para a realização do PGD é um
fator importante. Desta forma, uma característica a ser considerada no protocolo deste
trabalho é a redução do tempo de hibridação de 72 para 40h realizando uma etapa prévia
de 1h em microondas à 70W de potência. O tratamento com microondas acelera a
Discussão
66
hibridação permitindo a obtenção de sinais intensos, porém em menos tempo (BAHÇE et
al., 2000; GOSÁLVEZ et al., 2002). Os resultados das hibridações com duração de 72h e
40h mais 1h de microondas foram comparados e a intensidade dos sinais parece ser
equivalente (Navarro, comunicação pessoal).
Embora o número de publicações venha aumentando (WELLS et al., 1999; WELLS &
DELHANTY, 2000; GUTIÉRREZ-MATEO et al., 2004a,b; FRAGOULI et al., 2006a,b), a
eficiência e a precisão da técnica de CGH aplicada à análise de células únicas ainda é
controvertida. Por este motivo, foi realizada neste trabalho uma validação da CGH a partir
da análise de complementaridade dos pares 1CP-MII. Este delineamento experimental
garante um controle interno proporcionando informação sobre a confiabilidade dos
resultados (PELLESTOR et al., 2005).
Foram analisados 8 pares 1CP-MII, todos provenientes de mulheres jovens com
cariótipo normal. Observamos discordância entre 1CP e MII em 2 dos 8 pares analisados,
ou seja, 25%. Em um dos casos a análise do 1CP resultou no cariótipo 24,X,+22 enquanto
o complemento MII apresentou perfil normal compatível com o cariótipo 23,X. No outro
caso, detectamos aneuploidias nas duas células, sendo que os resultados foram parcialmente
concordantes, já que o ganho do cromossomo 16 (24,X,+16) observado em 1CP foi
confirmado com a sua correspondente perda em MII. No entanto, também apresentou
ganho para o cromossomo 19 com cariótipo 23,X,-16,+19. Em todos os casos em que o
1CP foi diagnosticado como normal (23,X) o complemento cromossômico encontrado em
MII correspondeu ao cariótipo esperado, também normal (23,X). Este dado representou
75% da amostra.
Há possíveis explicações para este padrão de concordância e discordância entre os
resultados encontrados para 1CP e MII. Com relação ao primeiro caso, com ganho do
cromossomo 22 em 1CP, a análise do CGH de MII evidenciou um desvio no perfil
compatível com perda cromossômica (para a esquerda) que, no entanto não ultrapassou o
Discussão
67
limite de 0,8. Esta falta de concordância pode ser explicada pelo fato de que a capacidade
da técnica de CGH em detectar perdas e ganhos cromossômicos muitas vezes está
relacionada com a quantidade de material genético envolvido na anomalia. Assim, perfis
duvidosos e difíceis de interpretar podem ser gerados, sobretudo, quando a alteração
observada envolver apenas cromátides e não cromossomos inteiros.
GUTIÉRREZ-MATEO e colaboradores (2004) mostraram que a técnica de CGH
aplicada às células únicas é capaz de detectar ganhos e perdas tanto de cromossomos
quanto de cromátides, entretanto distinguir entre os dois resultados é quase impossível. A
não ser em alguns casos de nulissomia (perda do cromossomo), nos quais se observa um
desvio muito pronunciado do perfil da CGH para a esquerda, ultrapassando o limite de 0,5.
Segundo KALLIONEMI e colaboradores (1992) a técnica de CGH permite a
quantificação dos cromossomos inteiros e, portanto, no caso de uma trissomia (ou de um
ganho de cromátide em células haplóides) o desvio teórico esperado para o perfil da CGH
estaria exatamente sobre o limite de 1,5 enquanto que nos casos de tetrassomias (ganho de
um cromossomo completo em células haplóides) este perfil deveria apresentar um desvio
maior posicionando-se sobre o limite com valor igual a 2,0. Os autores descreveram que os
perfis de CGH apresentados foram semelhantes tanto em anomalias de cromátides quanto
de cromossomos, sendo difícil determinar qual o tipo de erro observado. Esses resultados
foram questionados por outros autores que discutem que a CGH nem sempre permite a
quantificação dos ganhos e perdas e que estes perfis teóricos poucas vezes são observados
na prática (LESTOU et al., 1999; VOULLAIRE et al., 2002).
Contudo, é importante destacar que nem todas as falhas de complementaridade podem
ser atribuídas aos erros na interpretação dos perfis da CGH ou à falta de sensibilidade da
técnica. Alterações nos mecanismos de meiose materna e, portanto, implicados na origem
das aneuploidias também devem ser consideradas. Do ponto de vista biológico, existem
duas possíveis explicações para a não concordância em 25% dos pares analisados.
Discussão
68
A primeira explicação foi sugerida por GUTIÉRREZ-MATEO e colaboradores
(2004a) e baseia-se na possível existência de mosaicismo gonadal em algumas pacientes. De
fato, resultados obtidos a partir de FISH em pares 1CP-MII evidenciaram que oócitos
provenientes de mulheres com cariótipo normal, pareciam ter sido originados de linhagens
celulares germinativas trissomicas. Alguns pares mostraram uma cromátide extra tanto no
1CP como no oócito, enquanto outros tinham um cromossomo extra sem a perda
recíproca de material genético na sua célula complementar (MAHMOOD et al., 2000;
CUPISTI et al.,2003; PUJOL et al., 2003).
Já a segunda pode ser discutida com base nos trabalhos de VERLINSKY e
colaboradores (1996, 1999) e KULIEV e colaboradores (2003), que relataram uma grande
quantidade de dados referentes às aneuploidias presentes em primeiro e segundo
corpúsculos polares comparando ao seu complemento MII. Esses estudos demonstraram
que, embora haja uma prevalência de anomalias cromossômicas provenientes da meiose I
(42%), erros tanto na primeira quanto na segunda divisão meiótica contribuam para a
ocorrência de aneuploidias, sendo que uma porcentagem significativa de células (29%)
apresentava alteração nas duas etapas da divisão. Um dado importante relatado pelos
autores foi observação de que entre 30 e 35% dos segundos corpúsculos polares são
aneuplóides. Além disso, 50% dos erros na meiose II foram encontrados em oócitos que
apresentavam alterações prévias na meiose I, resultando assim, em núcleos MII
aparentemente normais. Sendo assim, KULIEV & VERLINSKY sugeriram em 2004 que, a
não disjunção na segunda divisão meiótica deve ser conseqüência de erros ocorridos já na
primeira divisão e que, um mecanismo hipotético para a resolução da aneuploidia poderia
explicar a formação de zigotos cromossomicamente equilibrados por meio de erros
seqüenciais na primeira e na segunda etapa da divisão meiótica feminina.
Cabe lembrar que os pontos discutidos acima, não só esclarecem os motivos pelos
quais não foi observada concordância entre 1CP-MII nos casos onde foram detectadas
Discussão
69
aneuploidias, como também justifica a complementaridade presente nos pares euplóides
(75% dos casos). Desta forma, sugerimos que o diagnóstico do 1CP seja capaz de revelar
informações importantes quanto à condição cromossômica do núcleo oocitário MII, já que
o maior risco desta estratégia está na obtenção de resultados falsos positivos (casos em que
1CP é aneuploide e MII normal) e não em falhas diagnósticas do 1CP. Nossos resultados
mostraram 100% de concordância entre os complementos cromossômicos quando o 1CP
foi diagnosticado como normal.
Esta afirmação vai de acordo com FRAGOULI e colaboradores (2006a), que diz que a
soma dos resultados obtidos por seu grupo com os dados publicados por GUTIÉRREZ-
MATEO e colaboradores (2004a) é suficiente para comprovar a confiabilidade da aplicação
da CGH no estudo de oócitos.
Os resultados falsos positivos exigem algumas considerações. As regiões centroméricas
e as regiões de heterocromatina (1qh, 9qh e 16qh) são partes do genoma de difícil
interpretação e costumam apresentar desvios inespecíficos dos perfis da CGH
(KALLIONEMI et al., 1994). Estas regiões são ricas em seqüências repetitivas e são
bloqueadas durante a CGH pelo Cot-1-DNA, resultando em regiões onde a intensidade de
fluorescência é tão baixa que não pode ser captada de forma adequada pelo software de
análise. Esse fato pode levar a desequilíbrios entre as fluorescências verdes e vermelhas e,
portanto, gerar perfis não confiáveis para estas regiões (MOORE et al., 1997). Além disso,
em relação aos telômeros existe também uma dificuldade do programa em localizar com
precisão o limite final dos cromossomos sendo mais uma justificativa para os perfis
inespecíficos encontrados nessa região (MOORE et al., 1997).
De acordo com LARRAMENDY e colaboradores (1998), um dos mecanismos
responsáveis pelos desvios nos perfis da CGH, nas regiões citadas acima, é a maior
afinidade dos fluorocromos (Spectrum Green e Spectrum Red) por regiões de DNA repetitivo
que não se distribuem homogeneamente pelo genoma. Os autores sugerem que uma
Discussão
70
marcação reversa (ou seja, DNA teste marcado em vermelho e DNA controle marcado em
verde), ou seja, contrária da descrita inicialmente por Kallionemi onde DNA teste foi
marcado em verde e controle em vermelho, poderia diminuir os artefatos da técnica nessas
regiões.
Embora os resultados apresentados neste trabalho tenham sido obtidos por meio da
aplicação da CGH com marcação reversa, as regiões teloméricas e controméricas foram
excluídas da análise, assim como sugerido por KALLIONEMI e colaboradores (1994) e
adotado pela maioria dos grupos que realiza CGH em células isoladas.
Outras regiões de conflito no genoma são a região 1p33-pter, o braço curto do
cromossomo 16 e os cromossomos 17, 19 e 22. Desvios nos perfis da CGH envolvendo
dois ou mais desses cromossomos pode ser indicativo do artefato da técnica e não de
alteração cromossômica real. No entanto, o que se espera é que esses desvios mostrem
igualmente ganho ou perda para todos os cromossomos. A detecção de aneuploidias desses
cromossomos deve ser feita com muita precaução, já que muitas vezes as alterações são
reais e não devem ser desconsideradas. Em nosso trabalho, relatamos ganho do
cromossomo 22 (1CP), ganho do cromossomo 16 (1CP) e perda de 16 associada ao ganho
do cromossomo 19 na mesma célula (MII). Após análise cuidadosa dos perfis, os
resultados foram considerados reais e não artefatos da técnica de CGH. Alguns fatores
auxiliaram neste diagnóstico. O mais importante é o fato de que nas análises para
aneuploidias, perdas e ganhos de regiões cromossômicas não são considerados, ou seja, são
relevantes apenas os desvios envolvendo o cromossomo todo e que ultrapassem o limite
estatístico previamente estipulado (0,8 - 1,2). Dentre os resultados apresentados, o único
que poderia causar dúvida é a perda do cromossomo 16 e o ganho do cromossomo 19 na
mesma célula. No entanto, como discutido anteriormente, os resultados falsos positivos
Discussão
71
envolvendo estes cromossomos deveriam ser caracterizados por ganho ou perda de ambos
e não uma perda e um ganho no mesmo cariótipo.
Considerações sobre a Amostra
A incidência de anomalias cromossômicas varia em função das características do
estudo. Os resultados originados de estudos com FISH variam de acordo com o número e
de quais cromossomos são analisados. PELLESTOR e colaboradores (2006) descreveram
que a taxa de aneuploidias observada em 12 trabalhos, publicados entre 1996 e 2003, nos
quais foram analisados de 2 a 9 cromossomos variou de 3,0 a 45,7 %. Em 5 estudos,
também publicados entre 1996 e 2003, envolvendo de 648 a 7103 corpúsculos polares e 3 a
5 sondas para FISH, a freqüência média de aneuploidias foi estipulada em 42,6%. Certa
variabilidade na taxa de aneuploidias também é observada quando considerados os estudos
que avaliam todo o complemento cromossômico, já que a bibliografia aponta para uma
média de 21% de oócitos aneuplóides após análise por cariótipo convencional, de 20 a
100% de aneuploidias em 4 estudos com SKY e uma média de 69% (48 a 90%) relatada em
dois estudos utilizando DOP-PCR e CGH (PELLESTOR et al., 2005, 2006).
Detectamos uma taxa de aneuploidia de 25% que pode ser considerada baixa, quando
comparada à taxa de 48% descrita por GUTIERREZ-MATEO e colaboradores (2004).
Embora os dois estudos se utilizem da mesma metodologia, o presente trabalho descreve
os resultados encontrados em um número reduzido de oócitos que, no entanto, segue um
padrão rígido de caracterização morfológica, estágio de desenvolvimento, tipo de
maturação, idade materna e ausência de relatos prévios de infertilidade feminina. É
importante considerar que no estudo anterior e em outros trabalhos, foram utilizados
oócitos previamente descartados de ciclos de fertilização in vitro e a maioria provem de
Discussão
72
mulheres inférteis. Dessa forma, a incidência de aneuploidias diagnosticada nesses estudos
não pode ser extrapolada para a população em geral.
Paralelamente, outro estudo realizado no mesmo laboratório e, portanto aplicando a
mesma metodologia em 29 oócitos (1CP e MII) frescos, maduros e provenientes de
mulheres férteis, jovens e com cariótipo normal mostrou taxa semelhante de aneuploidias
(OBRADORS et al., in press).
Todas as técnicas baseadas na fixação do material cromossômico de MII e 1CPs
apresentam uma limitação importante que é a dificuldade em determinar se a perda
cromossômica corresponde realmente a uma hipohaploidia ou se deve ser considerada
como artefato. De fato, a análise dos complementos 1CP e MII determinou que mais de
25% das hipohaploidias detectadas são, na realidade, artefatos de técnica (PUJOL, et al.,
2003). O restante pode ser devido a uma série de mecanismos biológicos como o atraso
anafásico, alterações de citoesqueleto ou a perda de cromossomos na meiose feminina.
A dificuldade em distinguir entre perdas reais e artefato explica porque muitos autores
optaram por estimar uma taxa conservadora para aneuploidias, ou seja, duplicar a taxa de
hiperhaploidias já que as perdas e os ganhos cromossômicos são originados em igual
proporção com resultado de uma segregação independe dos cromossomos entre o núcleo
MII e o primeiro corpúsculo polar (PELLESTOR et al., 2006) No entanto, esta estimativa
poderia não considerar de maneira correta a freqüência real de aneuploidias em oócitos. A
maioria dos estudos relata um excesso de nulissomias em comparação com as dissomias, o
que era geralmente justificado pela incidência de perdas de material genético devido à
fixação do núcleo MII, somada às perdas reais. No entanto, trabalhos recentes, nos quais
foram empregadas as metodologias de FISH e CGH, mostraram que há uma maior
incidência de ganhos cromossômicos em MII e conseqüente perda em 1CP (WELLS et al.,
2002; KULIEV et al., 2003; PUJOL et al., 2003; GUTIÉRREZ-MATEO et al, 2004a).
Discussão
73
Em nosso trabalho, observamos uma tendência a ganhos cromossômicos em 1CP e a
única perda cromossômica observada foi, justamente, no núcleo MII (23,X,-16,+19). Os
dados descritos podem, contar com o suporte de estudo prévio realizado no mesmo
laboratório e seguindo os mesmos critérios para a amostra, que detectou ganho de 11 e
perda de 3 cromossomos em 27 1CPs analisados. Além disso, o mesmo padrão foi
encontrado na análise de 22 primeiros corpúsculos polares biopsiados de oócitos não
criopreservados provenientes de 2 pacientes, jovens e com cariótipo normal, sob
tratamento de reprodução assistida. Dentre os 22 1CP estudados, 12 apresentavam
aneuploidias sendo que apenas 2 foram diagnosticados como perdas e 10 apresentaram
ganhos cromossômicos.
MUNNÉ e colabaoradores (2004) observaram um excesso de monossomias em
blastômeros analisados por FISH, o que comumente é atribuído à hibridação deficiente das
sondas, à sobreposição dos sinais da FISH ou à perda de micronúcleos (HARPER et al.,
1995; MUNNÉ et al.,1998). Além dos fatores biológicos, como erros durante a segunda
divisão meiótica, nulissomia do gameta paterno e erros na divisão pós zigótica (COONEN
et al., 2004; DAPHNIS et al., 2004 ; MUNNÉ et al., 2004).
As aneuploidias encontradas no presente trabalho afetaram os grupos cromossômicos
E (cromossomo 16), F (cromossomo 19) e G (cromossomo 22). Este resultado está de
acordo com os dados da literatura que sugerem uma maior incidência de aneuploidias para
os cromossomos pequenos (GUTIÉRREZ-MATEO et al., 2004a).
Enquanto, a distribuição de aneuploidias em espermatozóides é geralmente homogênea
nos diferentes grupos cromossômicos (PELLESTOR, et al. 1991), os erros na segregação
cromossômica de oócitos e embriões parecem seguir um padrão de freqüência (MUNNÉ et
al, 2004). Os cromossomos são divididos em grupos de acordo com o seu tamanho; os
cromossomos considerados grandes vão desde o 1 até o 12 e incluem o cromossomo X, e
Discussão
74
os cromossomos pequenos compreendem do par 13 até o 22. Outros autores também
observaram que os cromossomos pequenos são mais afetados por erros de segregação
(MAHMOOD et al., 2002; SANDALINAS et al., 2002; WELLS et al, 2002; CUPISTI et al.,
2003; PELLESTOR et al., 2005) já que os mesmos tendem a apresentar menos quiasmas
durante a meiose e já foi descrito que taxas reduzidas de recombinação podem levar à
predisposição da não-disjunção meiótica (THOMAS et al., 2001). Por outro lado, alguns
autores sugeriram a existência de uma relação entre a não-disjunção e o tamanho reduzido
da região de DNA alfa-satélite nos centrômeros (LO et al., 1999; MARATOU et al., 2000).
A divisão precoce das cromátides (pré-divisão) parece refletir o fato de que o tamanho
reduzido da região centromérica (DNA alfa-satélite) dificulta a ação das coesinas
promovendo falhas na coesão entre cromátides homólogas. Por outro lado, a assimetria da
divisão meiótica feminina, resultando em somente um gameta funcional e dois corpúsculos
polares, pode favorecer a segregação meiótica não aleatória dos cromossomos e das
cromátides (PARDO-MANUEL DE VILLENA & SAPIENZA, 2001). Enquanto alguns
estudos mostram que o cromossomo 22 é o mais freqüentemente envolvido em
aneuploidias de oócitos e embriões (SANDALINAS et al., 2002; CLYDE et al., 2003;
MUNNÉ et al., 2004) outros relatam que é o cromossomo 16 que apresenta mais erros
(VOULLAIRE et al., 2002; ABDELHADI et al., 2003; PUJOL et al.,2003). De qualquer
modo, esta variabilidade na não-disjunção indica que erros no processo de segregação na
meiose feminina não são um evento ao acaso e que os dados obtidos pelas análises
citogenéticas dos oócitos humanos são de grande valia para a compreensão deste
mecanismo.
Se fossem comparadas as incidências de aneuploidias para os diferentes cromossomos
em embriões ou em oócitos com a descrita em abortos espontâneos ou nascidos vivos, s
dados seriam discordantes. Isto porque as anomalias dos diferentes cromossomos
apresentam viabilidade variável ao longo do desenvolvimento embrionário
Discussão
75
(SANDALINAS et al., 2001; MUNNÉ et al., 2004). Por exemplo, a aneuploidia para o
cromossomo 22 tem a sua incidência reduzida em 11 vezes desde embriões (24,5%)
(BAHÇE et al, 1999) até abortos espontâneos (2,26%) (SIMPSON, 1990). O mesmo se
observa com relação às aneuploidias para o cromossomo 1, que foram detectadas em 16%
dos embriões (BAHÇE et al, 1999) e apenas um caso de trissomia 1 foi publicado em
gestação de primeiro trimestre (HANNA et al., 1997). Desta forma, as aneuploidias que não
foram detectadas em nascidos vivos trissômicos ou em abortos espontâneos podem ser, na
realidade, comuns no momento da concepção.
Considerações Finais
A técnica de CGH permite a análise confiável de todos os cromossomos permitindo
detecção de não somente das aneuploidias mais freqüentes, como também de todas que
podem interferir negativamente no desenvolvimento do embrião e na sua conseqüente
implantação. Além do mais, a CGH possibilita a detecção real de nulissomias já que esta
técnica não exige a fixação do material genético e, desta forma, evita as perdas
cromossômicas por artefato, possibilitando a análise cromossômica em toda a sua
longitude, o que não é possível por meio da FISH (WELLS & DELHANTY, 2000).
No entanto, o tempo que a metodologia requer, desde a obtenção da célula até a
determinação do resultado, restringe sua aplicação, de forma segura, à análise do primeiro
corpúsculo polar. A utilização do 1CP no PGD, por sua vez, também apresenta limitações.
Em primeiro lugar, não analisar o 2CP impossibilita a detecção dos erros da segunda
divisão meiótica, sendo que já foram descritas taxas similares de aneuploidias originadas
tanto na primeira (41,8%) como na segunda divisão (37,%) (KULIEV et al., 2003).
Também cabe considerar que aproximadamente um terço dos erros da primeira divisão
Discussão
76
meiótica pode ser corrigido durante a segunda divisão e, portanto, avaliar somente o 1CP
seria super valorizar a taxa de aneuploidia destes oócitos (WELLS et al., 2002; KULIEV &
VERLINSKY, 2004). Outra desvantagem é que a análise exclusiva de oócitos não permite
reconhecer as anomalias de origem paterna, ainda que esta contribuição seja baixa, ao redor
de 10%, quando comparada ao total de aneuploidias embrionárias.
Estas limitações poderiam ser solucionadas se as aneuploidias encontradas em 1CP
fossem confirmadas pela análise de um blastômero do embrião proveniente da fecundação
deste oócito pré-avaliado (MAGLI et al., 2004). No entanto, o efeito de duas biópsias no
desenvolvimento embrionário permanece desconhecido.
Uma opção que parece ser cada vez mais viável é a aplicação da CGH no estudo de
blastômeros. Para isto seria necessário desenvolver um protocolo onde houvesse uma
diminuição considerável do tempo, evitando a criopreservação do embrião. Em 2007,
LANDWEHR e colaboradores publicaram um trabalho em que 32 1CP foram analisados
por um protocolo rápido de CGH, no qual foi possível chegar ao resultado após 16 horas
do início do procedimento. Uma metodologia com este tempo de duração possibilitaria
novas aplicações de técnicas de screening genômico, tanto para o diagnóstico pré-natal
quanto para o pré-implantacional.
77
CONCLUSÕES
(1) A técnica de CGH utilizada neste trabalho foi eficaz em avaliar todos os cromossomos
de uma única célula, permitindo avaliar de forma acurada tanto a perda quanto o ganho de
qualquer cromossomo e podendo ser aplicada para screening de aneuploidias em oócitos.
(2) A análise de complementaridade entre 1CP-MII permitiu a avaliação da sensibilidade da
CGH na detecção de ganhos e perdas cromossômicas.
(3) A análise por CGH indicou uma prevalência de aneuploidias envolvendo ganho
cromossômico em 1CP, que pode estar relacionada às características da amostra,
constituída por oócitos maduros e não criopreservados provenientes de doadoras.
(4) As aneuploidias envolveram cromossomos pertencentes aos grupos E, F e G, sendo
concordante com a literatura, que relata uma maior incidência de aneuploidias para os
cromossomos pequenos.
78
REFERÊNCIAS
A
Abdelhadi, I., Colls, P., Sandalinas, M., Escudero, T. and Munne, S. (2003) Preimplantation genetic
diagnosis of numerical abnormalities for 13 chromosomes. Reprod Biomed Online 6, 226-
231.
Angell, R. R. (1991) Predivision in human oocytes at meiosis I: a mechanism for trisomy formation
in man. Hum Genet 86, 383-387.
B
Bahce, M., Cohen, J. and Munne, S. (1999) Preimplantation genetic diagnosis of aneuploidy: were
we looking at the wrong chromosomes? J Assist Reprod Genet 16, 176-181.
Bahce, M., Escudero, T., Sandalinas, M., Morrison, L., Legator, M. and Munne, S. (2000)
Improvements of preimplantation diagnosis of aneuploidy by using microwave
hybridization, cell recycling and monocolour labelling of probes. Mol Hum Reprod 6, 849-
854.
C
Clyde, J. M., Gosden, R. G., Rutherford, A. J. and Picton, H. M. (2001) Demonstration of a
mechanism of aneuploidy in human oocytes using Multifluor fluorescence in situ
hybridization. Fertil Steril 76, 837-840.
Clyde, J. M., Hogg, J. E., Rutherford, A. J. and Picton, H. M. (2003) Karyotyping of human
metaphase II oocytes by multifluor fluorescence in situ hybridization. Fertil Steril 80, 1003-
1011.
Coonen, E., Derhaag, J. G., Dumoulin, J. C., van Wissen, L. C., Bras, M., Janssen, M., Evers, J. L.
and Geraedts, J. P. (2004) Anaphase lagging mainly explains chromosomal mosaicism in
human preimplantation embryos. Hum Reprod 19, 316-324.
Cupisti, S., Conn, C. M., Fragouli, E., Whalley, K., Mills, J. A., Faed, M. J. and Delhanty, J. D.
(2003) Sequential FISH analysis of oocytes and polar bodies reveals aneuploidy
mechanisms. Prenat Diagn 23, 663-668.
D
Dailey, T., Dale, B., Cohen, J. and Munne, S. (1996) Association between nondisjunction and
maternal age in meiosis-II human oocytes. Am J Hum Genet 59, 176-184.
Daphnis, D. D., Delhanty, J. D., Jerkovic, S., Geyer, J., Craft, I. and Harper, J. C. (2005) Detailed
FISH analysis of day 5 human embryos reveals the mechanisms leading to mosaic
aneuploidy. Hum Reprod 20, 129-137.
79
DeScisciolo, C., Wright, D. L., Mayer, J. F., Gibbons, W., Muasher, S. J. and Lanzendorf, S. E.
(2000) Human embryos derived from in vitro and in vivo matured oocytes: analysis for
chromosomal abnormalities and nuclear morphology. J Assist Reprod Genet 17, 284-292.
F
Fragouli, E., Wells, D., Whalley, K. M., Mills, J. A., Faed, M. J. and Delhanty, J. D. (2006a)
Increased susceptibility to maternal aneuploidy demonstrated by comparative genomic
hybridization analysis of human MII oocytes and first polar bodies. Cytogenet Genome
Res 114, 30-38.
Fragouli, E., Wells, D., Doshi, A., Gotts, S., Harper, J. C. and Delhanty, J. D. (2006b) Complete
cytogenetic investigation of oocytes from a young cancer patient with the use of
comparative genomic hybridisation reveals meiotic errors. Prenat Diagn 26, 71-76.
Fragouli, E. (2007) Preimplantation genetic diagnosis: present and future. J Assist Reprod Genet 24,
201-207.
G
Gonsálvez, J., De La Torre, J, Pita, M, Martinez-Ramirez, A, López-Fernández, C, Goyanes, V,
Fernández, JL (2002) FISHing in the microwave: the easy way to preserve proteins.
Colocalization of DNA probes and surface antigens in human leukocytes. Chromosome
Research 10, 137-143.
Gutierrez-Mateo, C., Wells, D., Benet, J., Sanchez-Garcia, J. F., Bermudez, M. G., Belil, I., Egozcue,
J., Munne, S. and Navarro, J. (2004a) Reliability of comparative genomic hybridization to
detect chromosome abnormalities in first polar bodies and metaphase II oocytes. Hum
Reprod 19, 2118-2125.
Gutierrez-Mateo, C., Benet, J., Wells, D., Colls, P., Bermudez, M. G., Sanchez-Garcia, J. F.,
Egozcue, J., Navarro, J. and Munne, S. (2004b) Aneuploidy study of human oocytes first
polar body comparative genomic hybridization and metaphase II fluorescence in situ
hybridization analysis. Hum Reprod 19, 2859-2868.
H
Hanna, J. S., Shires, P. and Matile, G. (1997) Trisomy 1 in a clinically recognized pregnancy. Am J
Med Genet 68, 98.
Harada, T., Shiraishi, K., Kusano, N., Umayahara, K., Kondoh, S., Okita, K. and Sasaki, K. (2000)
Evaluation of the reliability of chromosomal imbalances detected by combined use of
universal DNA amplification and comparative genomic hybridization. Jpn J Cancer Res 91,
1119-1125.
Harper, J. C., Dawson, K., Delhanty, J. D. and Winston, R. M. (1995) The use of fluorescent in-situ
hybridization (FISH) for the analysis of in-vitro fertilization embryos: a diagnostic tool for
the infertile couple. Hum Reprod 10, 3255-3258.
80
Hill, D. L. (2003) Aneuploidy screening of preimplantation embryos using comparative genomic
hybridization versus fluorescence in situ hybridization techniques. Fertil Steril 80, 873-874;
discussion 875.
K
Kallioniemi, A., Kallioniemi, O. P., Sudar, D., Rutovitz, D., Gray, J. W., Waldman, F. and Pinkel,
D. (1992) Comparative genomic hybridization for molecular cytogenetic analysis of solid
tumors. Science 258, 818-821.
Kallioniemi, O.-P., Kallioniemi, A, Piper, J, Isola, J, Waldman, F, Gray, JW, Pinkel, D (1994)
Optimizing comparative genomic hybridization for analysis of DNA sequence copy
number changes in solid tumors. Gene, Chromosome and Cancer 10, 231-243.
Kamiguchi, Y., Rosenbusch, B., Sterzik, K. and Mikamo, K. (1993) Chromosomal analysis of
unfertilized human oocytes prepared by a gradual fixation-air drying method. Hum Genet
90, 533-541.
Kuliev, A., Cieslak, J., Ilkevitch, Y. and Verlinsky, Y. (2003) Chromosomal abnormalities in a series
of 6,733 human oocytes in preimplantation diagnosis for age-related aneuploidies. Reprod
Biomed Online 6, 54-59.
Kuliev, A. and Verlinsky, Y. (2004) Meiotic and mitotic nondisjunction: lessons from
preimplantation genetic diagnosis. Hum Reprod Update 10, 401-407.
L
Landwehr, C., Montag, M., van der Ven, K. and Weber, R. G. (2007) Rapid comparative genomic
hybridization protocol for prenatal diagnosis and its application to aneuploidy screening of
human polar bodies. Fertil Steril.
Larramendy, M. L., El-Rifai, W. and Knuutila, S. (1998) Comparison of fluorescein isothiocyanate-
and Texas red-conjugated nucleotides for direct labeling in comparative genomic
hybridization. Cytometry 31, 174-179.
Larsen, J., Ottesen, A. M., Lundsteen, C., Leffers, H. and Larsen, J. K. (2001) Optimization of
DOP-PCR amplification of DNA for high-resolution comparative genomic hybridization
analysis. Cytometry 44, 317-325.
Lestou, V. S., Lomax, B. L., Barrett, I. J. and Kalousek, D. K. (1999) Screening of human placentas
for chromosomal mosaicism using comparative genomic hybridization. Teratology 59, 325-
330.
Liu, J., Tsai, Y. L., Zheng, X. Z., Yazigi, R. A., Baramki, T. A., Compton, G. and Katz, E. (1998)
Feasibility study of repeated fluorescent in-situ hybridization in the same human
blastomeres for preimplantation genetic diagnosis. Mol Hum Reprod 4, 972-977.
Lo, A. W., Liao, G. C., Rocchi, M. and Choo, K. H. (1999) Extreme reduction of chromosome-
specific alpha-satellite array is unusually common in human chromosome 21. Genome Res
9, 895-908.
81
M
Magli, M. C., Gianaroli, L., Ferraretti, A. P., Toschi, M., Esposito, F. and Fasolino, M. C. (2004)
The combination of polar body and embryo biopsy does not affect embryo viability. Hum
Reprod 19, 1163-1169.
Mahmood, R., Brierley, C. H., Faed, M. J., Mills, J. A. and Delhanty, J. D. (2000) Mechanisms of
maternal aneuploidy: FISH analysis of oocytes and polar bodies in patients undergoing
assisted conception. Hum Genet 106, 620-626.
Maratou, K., Siddique, Y., Kessling, A. M. and Davies, G. E. (2000) Variation in alphoid DNA size
and trisomy 21: a possible cause of nondisjunction. Hum Genet 106, 525-530.
Marquez, C., Cohen, J. and Munne, S. (1998) Chromosome identification in human oocytes and
polar bodies by spectral karyotyping. Cytogenet Cell Genet 81, 254-258.
Matsuura, S., Ito, E., Tauchi, H., Komatsu, K., Ikeuchi, T. and Kajii, T. (2000) Chromosomal
instability syndrome of total premature chromatid separation with mosaic variegated
aneuploidy is defective in mitotic-spindle checkpoint. Am J Hum Genet 67, 483-486.
Mikamo, K. and Kamiguchi, Y. (1983) Primary incidences of spontaneous chromosomal anomalies
and their origins and causal mechanisms in the Chinese hamster. Mutat Res 108, 265-278.
Moore, D. H., 2nd, Pallavicini, M., Cher, M. L. and Gray, J. W. (1997) A t-statistic for objective
interpretation of comparative genomic hybridization (CGH) profiles. Cytometry 28, 183-
190.
Munne, S., Morrison, L., Fung, J., Marquez, C., Weier, U., Bahce, M., Sable, D., Grundfeld, L.,
Schoolcraft, B., Scott, R. et al. (1998) Spontaneous abortions are reduced after
preconception diagnosis of translocations. J Assist Reprod Genet 15, 290-296.
Munne, S. and Wells, D. (2003) Questions concerning the suitability of comparative genomic
hybridization for preimplantation genetic diagnosis. Fertil Steril 80, 871-872; discussion
875.
Munne, S., Bahce, M., Sandalinas, M., Escudero, T., Marquez, C., Velilla, E., Colls, P., Oter, M.,
Alikani, M. and Cohen, J. (2004) Differences in chromosome susceptibility to aneuploidy
and survival to first trimester. Reprod Biomed Online 8, 81-90.
P
Pardo-Manuel de Villena, F. and Sapienza, C. (2001) Nonrandom segregation during meiosis: the
unfairness of females. Mamm Genome 12, 331-339.
Paulasova, P., Andreo, B., Diblik, J., Macek, M. and Pellestor, F. (2004) The peptide nucleic acids as
probes for chromosomal analysis: application to human oocytes, polar bodies and
preimplantation embryos. Mol Hum Reprod 10, 467-472.
Pellestor, F. (1991) Differential distribution of aneuploidy in human gametes according to their sex.
Hum Reprod 6, 1252-1258.
Pellestor, F., Andreo, B., Arnal, F., Humeau, C. and Demaille, J. (2003) Maternal aging and
chromosomal abnormalities: new data drawn from in vitro unfertilized human oocytes.
Hum Genet 112, 195-203.
82
Pellestor, F., Anahory, T. and Hamamah, S. (2005) The chromosomal analysis of human oocytes.
An overview of established procedures. Hum Reprod Update 11, 15-32.
Pellestor, F., Andreo, B., Anahory, T. and Hamamah, S. (2006) The occurrence of aneuploidy in
human: lessons from the cytogenetic studies of human oocytes. Eur J Med Genet 49, 103-
116.
Petit, C., Martel-Petit, V., Fleurentin, A., Monnier-Barbarino, P., Jonveaux, P. and Gerard, H.
(2000) Use of PRINS for preconception screening of polar bodies for common
aneuploidies. Prenat Diagn 20, 1067-1071.
Pujol, A., Durban, M., Benet, J., Boiso, I., Calafell, J. M., Egozcue, J. and Navarro, J. (2003)
Multiple aneuploidies in the oocytes of balanced translocation carriers: a preimplantation
genetic diagnosis study using first polar body Reproduction, pp. 701-711.
S
Sandalinas, M., Sadowy, S., Alikani, M., Calderon, G., Cohen, J. and Munne, S. (2001)
Developmental ability of chromosomally abnormal human embryos to develop to the
blastocyst stage. Hum Reprod 16, 1954-1958.
Sandalinas, M., Marquez, C. and Munne, S. (2002) Spectral karyotyping of fresh, non-inseminated
oocytes. Mol Hum Reprod 8, 580-585.
Simpson, J. L. (1990) Incidence and timing of pregnancy losses: relevance to evaluating safety of
early prenatal diagnosis. Am J Med Genet 35, 165-173.
T
Tarkowski, A. (1996) An air drying method for chromosome preparation from mouse eggs.
Cytogenetics 5, 394-400
Thomas, N. S., Ennis, S., Sharp, A. J., Durkie, M., Hassold, T. J., Collins, A. R. and Jacobs, P. A.
(2001) Maternal sex chromosome non-disjunction: evidence for X chromosome-specific
risk factors. Hum Mol Genet 10, 243-250.
V
Veiga, A., Calderon, G., Santalo, J., Barri, P. N. and Egozcue, J. (1987) Chromosome studies in
oocytes and zygotes from an IVF programme. Hum Reprod 2, 425-430.
Verlinsky, Y., Cieslak, J., Freidine, M., Ivakhnenko, V., Wolf, G., Kovalinskaya, L., White, M.,
Lifchez, A., Kaplan, B., Moise, J. et al. (1996) Polar body diagnosis of common
aneuploidies by FISH. J Assist Reprod Genet 13, 157-162.
83
Verlinsky, Y., Cieslak, J., Ivakhnenko, V., Evsikov, S., Wolf, G., White, M., Lifchez, A., Kaplan, B.,
Moise, J., Valle, J. et al. (1999) Prevention of age-related aneuploidies by polar body testing
of oocytes. J Assist Reprod Genet 16, 165-169.
Verlinsky, Y. and Kuliev, A. (2003) Preimplantation diagnosis for aneuploidies using fluorescence
in situ hybridization or comparative genomic hybridization. Fertil Steril 80, 869-870;
discussion 875.
Voullaire, L., Wilton, L., McBain, J., Callaghan, T. and Williamson, R. (2002) Chromosome
abnormalities identified by comparative genomic hybridization in embryos from women
with repeated implantation failure. Mol Hum Reprod 8, 1035-1041.
W
Wells, D., Sherlock, J. K., Handyside, A. H. and Delhanty, J. D. (1999) Detailed chromosomal and
molecular genetic analysis of single cells by whole genome amplification and comparative
genomic hybridisation. Nucleic Acids Res 27, 1214-1218.
Wells, D. and Delhanty, J. D. (2000) Comprehensive chromosomal analysis of human
preimplantation embryos using whole genome amplification and single cell comparative
genomic hybridization. Mol Hum Reprod 6, 1055-1062.
Wells, D., Escudero, T., Levy, B., Hirschhorn, K., Delhanty, J. D. and Munne, S. (2002) First
clinical application of comparative genomic hybridization and polar body testing for
preimplantation genetic diagnosis of aneuploidy. Fertil Steril 78, 543-549.
Wells, D. and Levy, B. (2003) Cytogenetics in reproductive medicine: the contribution of
comparative genomic hybridization (CGH). Bioessays 25, 289-300.
Wilton, L., Williamson, R., McBain, J., Edgar, D. and Voullaire, L. (2001) Birth of a healthy infant
after preimplantation confirmation of euploidy by comparative genomic hybridization. N
Engl J Med 345, 1537-1541.
Wilton, L., Voullaire, L., Sargeant, P., Williamson, R. and McBain, J. (2003) Preimplantation
aneuploidy screening using comparative genomic hybridization or fluorescence in situ
hybridization of embryos from patients with recurrent implantation failure. Fertil Steril 80,
860-868.
Wilton, L. (2005) Preimplantation genetic diagnosis and chromosome analysis of blastomeres using
comparative genomic hybridization. Hum Reprod Update 11, 33-41.
Z
Zenzes, M. T. and Casper, R. F. (1992) Cytogenetics of human oocytes, zygotes, and embryos after
in vitro fertilization. Hum Genet 88, 367-375.
Anexo A
84
ANEXO A
Reagentes e Soluções:
1. ISOLAMENTO CELULAR
Solução de Isolamento: tampão fosfato (PBS)-0,1% polivinil álcool (PVA)
Foi preparada uma solução 10x PBS livre de Ca
+2
e Mg
+2
(80g de NaCl; 25,08g de
Na
2
HPO
4
dihidratado, 2g de KCl e 1,5g de KH
2
PO
4
dissolvidos em 1l de água miliQ). Esta
solução foi então autoclavada com pH ajustado para 7,2. Partindo da dessa concentração
foi feita uma diluição 1/10 adicionando 100ml de 10xPBS em 900ml de água miliQ. Na
solução de PBS já diluída adicionou-se 1g de PVA, que foi filtrada e estocada em alíquotas
de 1,5ml. O PVA evita que as células se fixem na superfície da placa e o PBS livre de Ca
+2
e
Mg
+2
desestabiliza os íons intracelulares e faz com que as células se desagreguem mais
facilmente.
Tripsina:
A tripsina (Sigma) foi diluída a 30mg/ml em PBS (pH 7,2).
2. LISE
Solução de Lise: 1µl de SDS (17µM) + 2µl de proteinase K (125µg/ml)
A proteinase K (Roche) foi preparada em concentração de aproximadamente 20mg/ml,
aliquotada em condições estéreis e conservada a 4
o
C. Foi diluída para 125µg/ml em água
miliQ e filtrada no momento do uso (1µl de proteinase K em 160µl de água). O SDS
(sodium dodecyl sulpahte, Sigma) a 10% foi aliquotado e mantido a temperatura ambiente.
Para obter uma concentração de 17µM foi realizada uma diluição de 1/100 e após agitação,
Anexo A
85
uma nova diluição de 1/200. Finalmente foi obtida a solução SDS-proteinase K em
proporção 1:2, mantida refrigerada até a sua utilização.
3. DOP-PCR
Primer de DOP
É importante que os primers sigam um alto padrão de qualidade e que sejam
dessalinizados ao máximo, liofilizados e purificados com RP-HPLC (cromatografia líquida
de alto rendimento e de fase reversa). Isto garante que os primers incompletos ou com erro
na seqüência de bases sejam eliminados. Os primers liofilizados foram diluídos em água
miliQ estéril e filtrada para obter uma solução de trabalho com concentração de 100µM.
4. ELETROFORESE
50xTAE:
Foram preparados 100ml de EDTA 0,5M diluindo 18,61g de EDTA (Sigma) em 95ml de
água miliQ, com pH ajustado para 8,0. Aos 100ml de EDTA foram adicionados 242g de
Tris e 57,1ml de ácido acético glacial. O volume final de 1000ml de solução foi alcançado
pela adição de água miliQ.
Gel de agarose a 2%:
Foram utilizados géis de agarose de 65x80mm (30ml de volume final). Foram diluídos
0,6g de agarose em 30ml de 1xTAE (20ml de 50xTAE e 980ml de água miliQ). A solução
foi aquecida em microondas por 1,5 minutos a 450W de potência e colocada na cuba do
aparelho de eletroforese para polimerizar. O DNA marcador utilizado, determinante do
padrão de bandas, foi de 100pb (Invitrogen).
Anexo A
86
III.5. MARCAÇÃO
COM
NICK
TRANSLATION
Mix dNTPs (1A: 1C: 1G):
Cada dNTP foi fornecido originalmente em uma solução concentrada de 0,3mM.
A solução de trabalho foi preparada na proporção de 1:1:1 de dATP: dCTP: dGTP,
obtendo assim, a concentração de 0,1mM por dNTP.
dTTP:
A solução inicial foi de 0,3mM, sendo necessário proceder uma diluição 1:3 com água
miliQ livre de DNAse para obter uma concentração final de 0,1mM.
dUTP- Spectrum Red e dUTP- Spectrum Green:
A solução original de 1mM foi diluída, 1:5 para o dUTP-spectrum green e 1:10 para spectrum
red, ambos em água miliQ livre de DNAse, para obter concentração final de 0,2mM e
0,1mM respectivamente.
III.6. HIBRIDAÇÃO COMPARATIVA
20xSSC:
Em 1litro de água miliQ foram diluídos 88g de citrato tri-sódico dihidratato e 175g de
cloreto de sódio. O pH da solução foi ajustado em 5,5.
Tampão de Hibridação: (50% Formamida/ 10% Dextran sulfato/ 2xSSC)
Anexo A
87
A solução estoque foi composta por 2g de dextran sulfato, 2ml de 20xSSC e 8ml de água
miliQ. A solução de hibridação foi composta por 50% formamida deionizada e 50% de
solução estoque, conservada a -20ºC.
Solução de Denaturação: (70% Formamida/ 2xSSC)
Em cabine de fluxo laminar, foram adicionados 35ml de formamida, 5ml de 20xSSC e
10ml de água miliQ. O pH da solução foi ajustado entre 6,8-7,2.
Solução I de Lavagem: (0,4xSSC/ 3% NP-40)
Adicionados 20ml de 20xSSC, 3ml de NP-40, completando com água miliQ até obter
volume final de 1litro de solução. O pH foi ajustado entre 6,8-7,2.
Solução II de Lavagem: (2xSSC/ 0,1% NP-40)
Adicionados 100ml de 20xSSC, 1ml de NP-40, completando com água miliQ até obter
volume final de 1 litro. O pH foi ajustado da solução entre 6,8-7,2.
Solução DAPI:
A solução de uso foi preparada a partir da solução de estoque de 4,6-diamino-2-fenilindol
(DAPI, Sigma) a 2,5µg/ml. Para obter essa concentração, o produto na sua forma
comercial (1mg/ml) sofreu uma série de 2 diluições: primeiro, 1:10 e depois, 1:40. A
concentração final do DAPI foi de 125ng/ml (50µl DAPI com concentração 2,5µg/ml,
50µl de água miliQ e 900ml de antifade). A solução antifade (1,4-fenildiamina, Vectashield)
foi fornecida pela Vector Lab. A solução de uso foi mantida a temperatura de 4ºC.
UTILIZAÇÃO DE SONDAS DE OLIGONUCLEOTÍDEOS PARA
DIAGNÓSTICO PRÉ-IMPLANTACIONAL DE ANEUPLODIAS
Introdução
89
INTRODUÇÃO
O Diagnóstico Genético Pré-Implantacional (PGD) foi realizado, a princípio, em embriões
fertilizados in vitro para detecção de doenças gênicas, como alternativa para o diagnóstico pré-
natal e consequentemente evitar a interrupção da gestação. Esta aplicação do PGD rapidamente
evoluiu para o screening de aneuploidias, por meio da técnica de FISH (hibridação in situ
fluorescente) em células únicas. A Sociedade Internacional de Diagnóstico Genético Pré-
Implantacional classifica esse processo de seleção embrionária para aberrações cromossômicas
numéricas como “PGD para infertilidade”. Inicialmente, um conjunto de cinco sondas de DNA
foram aplicadas para diagnóstico. Recentemente, várias combinações de sondas são oferecidas,
podendo-se avaliar até 12 cromossomos, o que ainda parece não ser suficiente, já que existem
relatos de embriões portadores de aneuploidias envolvendo quase todos os cromossomos
(LATHI et al., 2008).
I.3. Diagnóstico Pré-Implantacional de Aneuploidias Cromossômicas
Muitas vezes, as falhas das técnicas de reprodução assistida são explicadas por alterações
endometriais que interferem na implantação do embrião, causando a interrupção da gestação.
Entretanto, é reconhecido que as características genéticas do embrião desempenham um papel
relevante na manutenção e evolução da gravidez.
Estudos citogenéticos de abortos demonstraram que 50 a 70% dos casos envolviam
anormalidades cromossômicas (EIBEN et al., 1990; STEPHENSON et al., 2002; LATHI et al.,
2002, 2004, 2008), sugerindo uma maior incidência de aneuploidias específicas em perdas
espontâneas de primeiro trimestre (LJUNGER et al., 2005). Segundo JOBANPUTRA e
Introdução
90
colaboradores (2002), a análise de oito cromossomos (X, Y, 13, 15, 16, 18, 21 e 22) foi capaz de
identificar 83% das anomalias cromossômicas encontradas no estudo de 57 abortos espontâneos.
Além disso, as monossomias autossômicas raramente foram detectadas nesta amostra, sugerindo
que elas sejam responsáveis pelas perdas embrionárias precoces.
De acordo com DE BRAEKELEER & DÃO (1990), somente 4,7% dos casais com dois ou
mais abortos apresentam alterações cromossômicas estruturais equilibradas. Entretanto, o estudo
citogenético realizado em nosso laboratório, analisando uma amostra rigorosamente selecionada
de 120 casais com dois ou mais abortamentos sem causa estabelecida, evidenciou que 7,5%
desses casais eram portadores de translocações equilibradas (PEREIRA-MARTINS, 2000).
Além disso, a maior incidência de falhas na implantação parece estar relacionada com a idade
materna elevada e pode ser explicada por uma ocorrência maior de aneuploidias em conceptos
originados de mulheres com mais de 35 anos. FARFALLI e colaboradores (2007) relataram, após
avaliar por FISH 1.437 oócitos, uma alta incidência de aneuploidias em oócitos tanto de mulheres
acima de 38 anos como daquelas que apresentavam falhas repetidas de fertilização in vitro. Além
disso, foi observado um aumento significativo de anomalias dos cromossomos 16, 21 e 22 em
pacientes acima de 43 anos, se comparadas com pacientes abaixo de 35 anos. De acordo com
RUBIO e colaboradores (2003), 33% dos embriões gerados in vitro por mães jovens e saudáveis
são anormais para sete cromossomos analisados (13, 16, 18, 21, 22, X e Y). Quando
consideramos mães com idade superior ou igual a 37 anos, esse valor dobra e quando incluídas
portadoras de translocações e de abortos recorrentes, essa taxa alcança 70% (ESHRE PGD
Consotium Steering Committee, 2002). Segundo KULIEV e colaboradores (2003), a idade
materna avançada de aproximadamente 38 anos, é uma indicação absoluta para a realização do
PGD em corpúsculos polares. Os autores demonstraram que, entre 6.733 oócitos, 3.509 (52,1%)
eram aneuploides quando testados para os cromossomos 13, 16, 18, 21 e 22.
Em uma revisão publicada recentemente pela SISMER (Sociedade Italiana Estudos de
Medicina da Reprodução), 67% de 5.115 embriões foram diagnosticados como
Introdução
91
cromossomicamente alterados. Desses, 825 (16%) eram portadores de aneuploidias compatíveis
com a implantação, incluindo 123 trissômicos para o cromossomo 21, 90 para o cromossomo 13
e 49 para o cromossomo 18. Embora a capacidade implantacional dos embriões aneuploides seja
inferior da apresentada por embriões normais, estes dados proporcionam uma estimativa de
quanto o PGD diminui o risco de concepção de um feto cromossomicamente anormal
(FARFALLI et al., 2007).
A análise por FISH multicolor para a identificação do sexo de embriões que mantiveram o
processo inicial de clivagem revelou uma alta incidência de mosaicismo cromossômico pós-
zigótico, incluindo não-disjunção mitótica, mosaicismo de ploidia e distribuição “caótica” dos
cromossomos. A origem e os mecanismos de desenvolvimento dessas anormalidades são
desconhecidos, mas alterações nucleares foram freqüentemente observadas em embriões
humanos in vitro. Células binucleadas podem surgir por falhas durante a citocinese, ou ainda
células multinucleadas ou tetraplóides podem originar-se a partir de alterações no fuso mitótico
(RAY & HANDYSIDE, 1996; HARDY et al., 1993).
Em embriões predominantemente diplóides, a presença de linhagens haplóides é mais difícil
de ser explicada, podendo ter diferentes causas: fertilização por mais de um espermatozóide, falta
de sincronismo dos pró-núcleos, segregação da linhagem zigótica durante a clivagem ou
ocorrência de divisão, semelhante à redução meiótica, formando núcleos haplóides derivados de
células diplóides (DELHANTY et al., 1997).
No início do processo de clivagem de embriões humanos, podemos encontrar também uma
distribuição de cromossomos completamente caótica, semelhante a observada em cariótipos de
células malignas. Uma das possíveis explicações para esse fato é que os checkpoints que ocorrem
normalmente durante o ciclo celular, responsáveis pela checagem e conclusão de eventos
essenciais à progressão da célula nas diferentes fases do ciclo, não estariam operando
efetivamente durante a clivagem, devido à inativação de genes que controlam os mesmos
(DELHANTY & HANDYSIDE, 1995).
Introdução
92
As conseqüências do mosaicismo cromossômico no desenvolvimento embrionário humano
permanecem desconhecidas. Algumas trissomias ou a monossomia do X são compatíveis com o
desenvolvimento da gestação e termo, mas muitos desses fetos são perdidos durante estágios
diferentes da gestação (SANDALINAS et al., 2001; MUNNÉ et al., 2004). Outras anormalidades
como células trissômicas ou poliplóides, podem ser compatíveis com a divisão e diferenciação em
linhagens específicas, como nos casos de mosaicismo limitado ao tecido placentário, detectado
por exames de amostras de vilosidade coriônica, em que algumas ou todas as células são
aneuploides (HANDYSIDE & DELHANTY, 1997).
Aproximadamente metade dos embriões cultivados in vitro cessa o seu desenvolvimento entre
o primeiro e segundo dia após a fertilização (GRIFO et al., 1996). A associação entre a
constituição cromossômica e o desenvolvimento embrionário já foi demonstrada. Parece ser
evidente que embriões que alcançam o estágio de 7 a 8 células no 3º dia após a fertilização (entre
62-64h) apresentam uma menor taxa de aneuploidias quando comparados aos que sofrem atraso
no desenvolvimento ou aos que apresentam uma divisão celular acelerada (FARFALLI et al.,
2007).
Aneuploidias recorrentes têm sido relacionadas à predisposição de algumas mulheres de
gerarem embriões aneuploides devido a uma alteração no processo meiótico ou mitótico
(GUTIÉRREZ-MATEO et al., 2004). Isto pode explicar os casos de abortos espontâneos
repetidos em casais com cariótipos somáticos normais e porque alguns casais não obtêm sucesso
nos procedimentos de fertilização in vitro. Nessas situações, se fossem transferidos apenas
embriões euploides, a taxa de abortos poderia diminuir (LATHI et al., 2008) e a de implantação
aumentar (GIANAROLI, et al., 1997).
A maioria dos estudos limita-se a avaliar numericamente os cromossomos envolvidos nas
trissomias mais comuns em nascidos vivos (X, Y, 13, 18 e 21) ou aqueles sabidamente
relacionados com abortos espontâneos, como o 15, 16 e o 22 utilizando kits de cinco sondas para
o diagnóstico de aneuploidias em corpúsculos polares (13, 16, 18, 21 e 22) e para o diagnóstico de
Introdução
93
aneuploidias em blastômeros (X, Y, 13, 18 e 21). Contudo, outros conjuntos de nove sondas (X,
Y, 13, 15, 16, 17, 18, 21 e 22 – Reprogenetics New Jersey e California), dez sondas (X, Y, 8, 9, 13,
15, 16, 18, 21 e 22 – Genzy Califórnia) e doze sondas (X, Y, 8, 13, 14, 5, 16, 17, 18, 20, 21 e 22 -
Reprogenetics New Jersey e Califórnia) também estão disponíveis. No entanto, a análise de 12
cromossomos parece não ser suficiente para evitar a transferência de um embrião aneuploide para
o útero materno. Segundo LATHI e colaboradores (2008), a trissomia envolvendo os
cromossomos 2, 3, 4, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 20, 21 e 22 é responsável por
somente 69% das anomalias cromossômicas de embriões em estágio preimplantacional.
I.2. Técnica de Hibridação in situ Fluorescente (FISH)
A hibridação in situ fluorescente (FISH) aplicada à análise de corpúsculos polares ou
blastômeros é a técnica mais amplamente utilizada para o diagnóstico genético pré-implantacional
de anomalias cromossômicas, já que fornece informações sobre a ploidia de núcleos interfásicos
(SERMON et al, 2007).
A hibridação in situ fluorescente é um procedimento de pareamento específico entre uma
sonda de ácido nucleico marcada com fluoresceína e seqüências de ácido nucleico pertencentes à
amostra analisada. A análise cromossômica por FISH teve início quando a citogenética
convencional combinou-se com a metodologia do DNA recombinante, originando a citogenética
molecular. Anteriormente, seqüências específicas de DNA e RNA eram detectadas em metáfases
ou núcleos interfásicos pela hibridação in situ utilizando sondas de ácido nucléicos marcadas
radioativamente. Entretanto, quando se tornaram disponíveis sondas marcadas com
fluorocromos, como a biotina, a técnica de hibridação in situ incorporou muitas vantagens, como
o manuseio mais seguro das sondas, a maior estabilidade entre sonda e amostra, a obtenção mais
rápida dos resultados, localização espacial mais precisa da seqüência analisada, menor quantidade
Introdução
94
de background e o uso de sondas marcadas com fluorocromos de cores diferentes, diversificando
as possibilidades de diagnóstico (BEATTY, MAI e SQUIRE, 2002).
Atualmente, a FISH é considerada uma técnica amplamente utilizada e versátil, que permite a
localização de seqüências de DNA em cromossomos metafásicos, o mapeamento de fibras
cromatídicas, a quantificação de DNA microarray e análises de expressão de RNA em núcleo e
citoplasma celular, em diferentes tipos de amostras. Dois terços dos casos de PGD realizados no
mundo utilizaram a técnica de FISH com sondas cromossomo-específicas para diagnóstico de
aneuploidias. O principal motivo de encaminhamento foi a idade materna acima de 35 anos para
mulheres submetidas às técnicas de reprodução assistida (ANDERSON et al., 2008).
Primeiramente, a eficiência da técnica de FISH para detecção de aneuploidias em embriões
foi confirmada pelos estudos de MUNNÉ (1994a, 1994b, 1995). Comparando os resultados
obtidos por FISH entre embriões humanos com graus diferentes de qualidade morfológica e
originados por mães em faixas etárias distintas, foi possível determinar que as alterações
cromossômicas observadas estavam associadas às características dos grupos estudados
(morfologia anormal do embrião e idade materna elevada), excluindo a possibilidade de erros
metodológicos. Mais recentemente, DE UGARTE e colaboradores (2008) reanalisaram 241
embriões previamente diagnosticados por FISH para determinar o valor preditivo positivo (VPP)
e o valor preditivo negativo (VPN) desta técnica. Os autores determinaram os valores para VPP e
VPN como sendo 83 e 81% respectivamente, responsabilizando a presença de mosaicismo
embrionário pela maior parte dos erros encontrados no diagnóstico por FISH.
Embora uma taxa de 12% de mosaicismo constitutivo seja esperada na fase inicial do
desenvolvimento embrionário, uma quantidade particularmente significativa de mosaicos foi
detectada em embriões que apresentavam divisão celular lenta ou interrupção do processo de
clivagem (MUNNÉ et al., 1994b; FARFALLI, et al., 2007). De modo geral, tem sido relatado que
50% dos embriões produzidos in vitro possuem mosaicismo constitutivo (KATAGIRI &
KATAYAMA, 1996; HANDYSIDE & DELHANTY, 1997; BAART et al., 2004). O diagnóstico
Introdução
95
de mosaicismo representa um desafio e uma limitação para a análise de aneuploidias por FISH e
detecção de alterações gênicas por PCR. Segundo EVSIKOV (1998), o mosaicismo representa
um problema de diagnóstico não apenas quando consideramos embriões com poucas células em
fase de blastômero, mas também em blastocistos. Nesse caso, ao contrário do que se esperava, a
linhagem celular alterada parece não migrar completamente para a formação do trofoblasto,
sendo possível detectá-la na massa celular interna do blastocisto.
Segundo a Sociedade Européia de Reprodução Humana e Embriologia (ESHRE), Consórcio
PGD, a maioria dos procedimentos diagnósticos pode acarretar erros, sendo que no último
relatório deste consórcio foram apresentados 7 erros diagnósticos após PGD por FISH e 10 por
PCR (SERMON, et al., 2007). De acordo com MUNNÉ et al. (2002, 2003), 7,2% dos embriões
não transferidos para o útero materno após o procedimento de PGD foram diagnosticados
erroneamente por FISH, sendo que 60% desses embriões foram diagnosticados como falso-
positivos devido à presença de mosaicismo. Outros trabalhos já haviam relatado índices
parecidos, onde as taxas para resultados falsos negativos e falsos positivos foram estipuladas em
1,5 e 19% respectivamente (GIANAROLI et al., 2001; MUNNÉ et al., 1998).
Com o intuito de evitar os erros diagnósticos secundários ao mosaicismo embrionário, alguns
autores sugeriram que, em embriões de 6 a 8 células, dois blastômeros deveriam ser analisados.
Esta proposta gerou discussões que, por um lado, questionavam a segurança e o possível efeito
negativo de se remover duas células do embrião e por outro, quanto este procedimento
melhoraria a eficiência do PGD. GOOSSENS e colaboradores (2008) sugeriram, após analisarem
3377 embriões, que a remoção de 2 blastômeros interfere negativamente no desenvolvimento
embrionário até o estágio de blastocisto, mas não na taxa de nascimento. Ou seja, seu
desenvolvimento após a transferência para o útero materno segue inalterado. Enquanto a
eficiência do PGD por FISH parece não se alterar após análise de uma ou duas células (98.2% e
97.5% respectivamente), os métodos moleculares para detecção de mutações responsáveis por
Introdução
96
doenças monogênicas parecem ser mais eficientes quando aplicadas a duas células, devido ao
aumento da quantidade inicial de DNA e diminuição do risco de contaminação.
Sendo assim, considerando o alto índice de aneuploidias presente em embriões gerados in
vitro, a necessidade de analisar o maior número possível de cromossomos por blastômero e a
elevada eficiência da técnica de hibridação in situ fluorescente, novos protocolos devem ser
propostos para aumentar a eficácia do diagnóstico citogenético pré-implantacional
.
Objetivos
97
OBJETIVOS
O objetivo principal do projeto foi estabelecer um novo protocolo de FISH utilizando sondas
de oligonucleotídeos para determinação do Diagnóstico Pré-implantacional de aneuploidias de
quinze cromossomos em blastômeros humanos.
Os objetivos intermediários foram:
1) Avaliar a eficiência desta metodologia para definição do diagnóstico de aneuploidias dos
cromossomos 2, 3, 4, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 16, 17, 20, X e Y em blastômeros;
2) Determinar a freqüência dessas aneuploidias em núcleos provenientes de embriões
descartados durante o procedimento de reprodução assistida.
Materiais e Métodos
98
MATERIAIS E MÉTODOS
I. Casuística
O trabalho foi realizado na Unidade de Biologia e Genética Médica do Departamento de
Biologia Celular, Fisiologia e Imunologia da Universidade Autônoma de Barcelona, coordenado
pela Prof
a
Joaquima M. Navarro Ferrete, em colaboração com o Departamento de Genética da
Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto – USP.
Os casais assinaram termo de consentimento livre e esclarecido para a doação de embriões à
pesquisa, de acordo com os preceitos éticos pertinentes à legislação vigente na Espanha. O
projeto foi aprovado no CEP e no CONEP, registro HCRP 14587/2006.
II. Amostra
A amostra caracterizou-se por núcleos interfásicos obtidos por meio de cultura
temporária de linfócitos de doador masculino com cariótipo normal e 14 núcleos de blastômeros
provenientes de seis embriões gerados in vitro. Foram utilizados embriões com aspectos
morfológicos e padrão de desenvolvimento inadequados para a transferência materna ou
criopreservação, independentemente da idade materna.
Materiais e Métodos
99
III. Métodos
III.1. ISOLAMENTO E FIXAÇÃO DE BLASTÔMEROS
O primeiro passo para obtenção dos blastômeros foi a digestão da membrana embrionária
com ácido Tyrode (pH=2,5). A seguir, o embrião foi transferido para uma gota de PBS livre de
cálcio e magnésio para facilitar a desagregação das células. Com movimentos de aspirar e soltar,
os blastômeros foram separados mecanicamente para depois serem fixados um a um.
Em geral, a fixação depende de três fatores:
⇒ Tratamento hipotônico: quanto mais longo o tratamento com a solução hipotônica, mais
rápido será o rompimento da membrana. Isso diminui o controle sobre o processo de
fixação e aumenta os riscos de perda do núcleo. No entanto, se este procedimento não for
suficientemente longo, a célula pode não se romper e o núcleo continuar inacessível.
⇒ Temperatura ambiente: a temperatura ambiente interfere no tempo de evaporação do
fixador e conseqüentemente na remoção do citoplasma.
⇒ Umidade ambiental: também interfere na evaporação do fixador e, portanto, na qualidade
do núcleo fixado.
Depois de isolado, o blastômero foi transferido para uma gota de solução hipotônica, citrato
de sódio a concentração 1%, à temperatura ambiente, por aproximadamente cinco minutos. As
condições ideais são 5 a 6 minutos de hipotonização com aproximadamente 25ºC de temperatura
ambiente e 50% de umidade relativa. Durante o tratamento com solução hipotônica, o
blastômero deve ser mantido sob observação.
Em seguida, o núcleo foi transferido (em um volume mínimo de solução de citrato de sódio)
para a superfície de uma lâmina de vidro. Quando a gota da solução hipotônica começou
evaporar, uma gota de fixador Carnoy foi aplicada sobre a célula com o intuito de romper a
Materiais e Métodos
100
membrana e remover o citoplasma celular, fixando assim, apenas o núcleo. Esta etapa foi repetida
o número de vezes necessário para a total retirada do citoplasma.
Então a lâmina foi deixada para secar ao ar e depois analisada no microscópio de contraste de
fase para confirmar a presença do núcleo, determinar suas coordenadas na lâmina e observar se
ainda restava citoplasma sobre a amostra. As lâminas foram então desidratadas em série de
etanóis e estocadas a -20ºC até o momento da hibridação.
Todos os núcleos passaram por uma coloração controle com solução DAPI (5µl de solução
DAPI em uma lamínula 20x20mm). As imagens então capturadas serviram como padrão para as
características morfológicas do núcleo a ser analisado. Isto porque, a realização de três ou mais
etapas de denaturação compromete a morfologia e a integridade do núcleo interfásico,
interferindo assim no diagnóstico por FISH.
Após a obtenção das imagens, o DAPI foi eliminado das lâminas lavando-as por 5 minutos a
temperatura ambiente com a solução de 2xSSC/ 0,1% Tween 20. Em seguida, a amostra foi
novamente desidratada em uma série de etanóis.
III.2. HIBRIDAÇÃO IN SITU FLUORESCENTE (FISH)
A aplicação desta metodologia teve por objetivo padronizar o uso de oligonucleotídeos
marcados com fluorescência no diagnóstico de diferentes aneuploidias em células embrionárias
humanas. Para isto, utilizamos quinze sondas de oligonucleotídeos, distribuídas em três etapas de
hibridação para cinco cromossomos cada (Tabela 5 e Figura 8). Os kits dessas sondas foram
fornecidos por One Cell Systems, Inc.
Materiais e Métodos
101
A primeira etapa de hibridação (Etapa A) incluiu oligonucleotídeos marcados para as regiões
centroméricas dos cromossomos X em Spectrum Red, 15 em Spectrum Orange, 17 em Spectrum Green
e 20 em Spectrum Far Red e para a região satélite III do cromossomo Y em Spectrum Aqua.
Cromossomo Cor
X Red (ex 580nm/ em 599nmn) DY590
Y Aqua (ex 418nm/ em 467nm) DY415
15 Orange (ex 558nm/ em 572nm) DY549
17 Green (ex 490nm/em 516nm) DY490
20 Far Red (ex 653nm/ em 647nm) DY649
3 Red (ex 580nm/ em 599nm) DY590
7 Aqua (ex 418nm/ em 467nm) DY415
8 Green (ex 490nm/em 516nm) DY490
10 Orange (ex 558nm/ em 572nm) DY549
16 Far Red (ex 653nm/ em 647nm) DY649
2 Green (ex 490nm/em 516nm) DY490
4 Red (ex 580nm/ em 599nm) DY590
6 Aqua (ex 418nm/ em 467nm) DY415
9q12 Orange (ex 558nm/ em 572nm) DY549
12 Far Red (ex 653nm/ em 647nm) DY649
Tabela 5: Relação das 15 sondas de DNA e seus respectivos fluorocromos, utilizadas no diagnóstico
pré-implantacional.
Na segunda etapa (Etapa B) foram aplicadas sondas correspondentes às regiões centroméricas
dos cromossomos 3 em Spectrum Red, 7 em Spectrum Aqua, 8 em Spectrum Green, 10 em Spectrum
Orange e 16 em Spectrum Far Red.
Materiais e Métodos
102
A última hibridação (Etapa C) incluiu oligonucleotídeos específicos para as regiões
centroméricas dos cromossomos 2 em Spectrum Green, 4 em Spectrum Red, 6 em Spectrum Aqua e 12
em Spectrum Orange e para a região heterocromática 9q12 em Spectrum Far Red
Figura 8: O gráfico mostra os comprimentos de onda de luzes emitidas pelos fluorocromos
utilizados, evidenciando suas áreas de sobreposição
Para determinação da eficácia do protocolo, as três etapas de hibridação foram inicialmente
aplicadas em núcleos interfásicos de linfócitos cultivados, obtidos de um doador masculino com
cariótipo normal. Foram analisados em torno de 50 núcleos para cada etapa de hibridação, todos
apresentando diâmetro aproximado ao esperado para núcleos embrionários no terceiro dia de
desenvolvimento in vitro. A partir deste experimento prévio, determinamos a porcentagem de
eficiência para a hibridação de cada sonda e sua correspondente margem de erro. O mesmo
protocolo de hibridação foi aplicado aos blastômeros fixados.
Materiais e Métodos
103
III.2.1.TRATAMENTO DAS LÂMINAS
As lâminas foram então retiradas do congelador e mantidas no mínimo 30 minutos à
temperatura ambiente. Foram então lavadas em solução PBS e em água purificada. Após imersão
em três diluições de etanol (70, 85 e 100%) por dois minutos cada, as lâminas secaram em
temperatura ambiente.
III.2.2. SONDAS E HIBRIDAÇÃO
A hibridação foi realizada em três tempos. Primeiro utilizando as sondas dos cromossomos
X, Y, 15, 17 e 20, em seguida as sondas do 3, 7, 8, 10 e 16 e por último as sondas do 2, 4, 6, 9q12
e 12 (One Cell Systems, Inc.), marcadas diretamente com os fluorocromos Red (DY590), Aqua
(DY415), Green (DY490), Orange (DY549) e Far Red (DY649). Todos os oligonucleotídeos citados
apresentavam localização pericentromérica, com exceção da sonda referente ao cromossomo 9
que marcava a região 9q12.
A solução de hibridação para as 3 etapas foi constituída de 5,0
µL de sonda e 5,0µL de
tampão, de acordo com protocolo do fornecedor. A hibridação foi realizada adicionando-se
3,0µL dessa solução por lâmina na etapa correspondente. A relação entre o volume de sonda e o
a área da lamínula está descrita na tabela a seguir:
As sondas foram diluídas em solução-tampão (30% Formamida) específica para este tipo de
seqüência de DNA (oligonucleotídeos), aplicadas sobre a amostra, cobertas por lamínula circular
e não foram seladas. Ambas, sondas e amostra foram denaturadas em placa aquecedora a 76
o
C
por 5 minutos. O processo de hibridação ocorreu em câmara escura, úmida e pré-aquecida (37
o
C)
por 10 minutos sob agitação do material.
Materiais e Métodos
104
III.2.3. LAVAGENS PÓS – HIBRIDAÇÃO E COLORAÇÃO
Os procedimentos foram realizados em local sem incidência direta de luz, devido à marcação
direta dos fluorocromos.
Após remoção das lamínulas em solução 2xSSC com agitação, as lâminas foram lavadas a
50
o
C em solução 0,2xSSC/ 0,1%SDS durante dois minutos. Em temperatura ambiente, as
lâminas foram lavadas em solução 2xSSC e sofreram desidratação por uma série de três diluições
de etanol (70, 85 e 100%) por um minuto cada. Quando seco, o material foi corado com solução
de DAPI/Antifade (125 ng/ mL) e coberto com lamínula 24x50mm para análise microscópica.
Entre as três etapas de hibridação, efetuamos alguns passos para que as primeiras sondas e o
corante DAPI fossem removidos. Desta forma, após a análise microscópica de cada conjunto de
sondas, as lâminas foram lavadas, em temperatura ambiente em solução PBS por cinco minutos e
então desidratadas em uma série de três diluições de etanol (70, 85 e 100%) por dois minutos
cada, reiniciando então o ciclo seguinte de hibridação.
III.2.4. ANÁLISE CITOGENÉTICA-MOLECULAR
As lâminas foram analisadas imediatamente após a aplicação da solução de DAPI/Antifade.
Para que não houvesse erros na interpretação dos sinais foram considerados aqueles que
apresentaram a mesma intensidade de cor e estavam completamente separados uns dos outros.
Além disso, o tamanho e a cor característicos de cada sonda foram cuidadosamente considerados.
A análise foi realizada em microscópio de epifluorescência (Nikon Eclipse 90i) equipado com
câmera CCD (charge-coupled device) de alta sensibilidade e filtros apropriados para a detecção dos
fluorocromos empregados sob objetiva de imersão (100X) acoplado ao sistema computadorizado
de captura de imagem MetaSystem com software Isis. Obedecendo aos comprimentos de onda dos
fluorocromos utilizados (Figura 8), tanto de excitação quando de emissão, seguiu-se a seguinte
Materiais e Métodos
105
ordem para a análise e captura dos sinais: Far Red → Red → Orange → Green → Aqua → DAPI.
Após as 6 capturas, cada uma para um fluorocromo específico, a imagem foi montada
posicionando o sinal de cada sonda sobre o núcleo corado em DAPI
Resultados
106
IV.
RESULTADOS
Por meio da técnica de FISH com sondas de oligonucleotídeos, foram detectados sinais
fluorescentes correspondentes aos cromossomos X, Y, 2, 3, 4, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 16, 17 e 20
em 161 núcleos interfásicos de sangue periférico e 14 núcleos obtidos a partir de 6 embriões.
Sonda
Valor
Absoluo
Hibr.
Eficiente
(%)
Margem
Erro
(%)
Valor
Absoluto
Hibr.
Ineficiente
(%)
Margem
Erro
(%)
Cromossomo X
(Red)
52 94,54 6,00 3 5,45 6,00
Cromossomo 15
(Orange)
49 89,10 8,24 6 10,90 8,24
Cromossomo 20
(Far Red)
45 81,80 10,20 10 18,19 10,20
Cromossomo 17
(Green)
49 89,10 8,24 6 10,90 8,24
Cromossomo Y
(Aqua)
55 100,00 0,00 0 Zero 0,00
Cromossomo 3
(Red)
48 82,75 9,72 10 17,25 9,72
Cromossomo 10
(Orange)
57 98,27 3,36 1 1,73 3,36
Cromossomo 16
(Far Red)
48 82,75 9,72 10 17,25 9,72
Cromossomo 8
(Green)
49 84,50 9,31 9 15,50 9,31
Cromossomo 7
(Aqua)
55 94,83 5,70 3 5,17 5,70
Cromossomo 4
(Red)
47 97,90 4,06 1 2,10 4,06
Cromossomo 12
(Orange)
47 97,90 4,06 1 2,10 4,06
Cromossomo 9q12
(Far Red)
12 25 12,25 36 75 12,25
Cromossomo 2
(Green)
47
97,90
4,06 1 2,10 4,06
Cromossomo 6
(Aqua)
47 97,90 4,06 1 2,10 4,06
Tabela 5: Resultados da FISH com sondas de oligonucleotídeos em 161 núcleos interfásicos de linfócitos
cultivados. Experimento controle para as três etapas de hibridação.
Resultados
107
A Tabela 5 apresenta os resultados obtidos por FISH em 161 núcleos de linfócitos incluindo
as porcentagens de hibridação eficiente e ineficiente e as respectivas margens de erro. A
porcentagem de hibridação foi de 87,6% quando considerados os 15 cromossomos, no entanto a
mesma eleva-se para 92% quando descartamos a porcentagem de hibridação referente à sonda
9q12. A sonda que apresentou melhor resultado foi a do cromossomo Y marcada com
fluorocromo Aqua (100%) e a de pior resultado foi a sonda da região 9q12 marcada com o
fluorocromo Far Red (25%).
Número de Sinais por Cromossomo
Embrião
Núcleo
X
Y
15
17
20
3
7
8
10
16
2
4
6
9q
12
M2B 1 1 3 3 1 1 1
1
2
1 1 2
2
2
1 3
29BSF 2 6 - 6 8 6 8
7
5
6 5 7
5
7
- 7
12BSF 3 3 1 1 2 2 2
2
2
2 2 2
2
2
2 2
16BSF 4 3 - 3 3 3 3
2
2
2 1 2
-
2
- 2
5 3 - 3 3 3 5
1
2
2 - 1
1
2
- 1
6 3 - 3 3 3 2
3
2
1 2 2
2
2
- 2
7 2 - 2 2 3 2
2
2
2 2 2
3
2
- 2
8 1 - 1 1 1 1
1
1
1 1 ND
2B2 9 4 - 4 4 5 6
3
4
5 - ND
10 1 - 1 1 2 ND ND
11 1 - 1 1 1 ND ND
26BSF 12 3 - 3 2 2 ND ND
13 4 - 4 3 4 ND ND
14 4 - 4 4 2 ND ND
Tabela 6: Resultado da hibridação das sondas dos cromossomos X,Y, 15, 17, 20, 3, 7, 8, 10, 16, 2, 4, 6, 9q
e 12 em 14 núcleos obtidos de 6 embriões.
ND = não detectado.
A Tabela 6 apresenta os dados obtidos por FISH em núcleos fixados de blastômeros, obtidos
a partir de embriões descartados por não serem viáveis para transferência. A tabela inclui, os
resultados referentes ao número de sinais encontrados para cada sonda. Em 35,7% dos núcleos
(n=5) não foi possível realizar as análises referentes às segunda e terceira etapas de hibridação,
pois estes núcleos foram perdidos após o segundo procedimento de denaturação. Durante a
Resultados
108
terceira etapa foram perdidos mais dois núcleos, sendo os 15 cromossomos analisados em 50%
dos núcleos (n=7).
Dos núcleos que apresentaram boa morfologia após as três etapas de hibridação, três foram
submetidos a mais um ciclo de hibridação com as sondas para os cromossomos 13 e 21 da marca
Vysis Inc. As informações obtidas a partir desta última hibridação foram utilizadas para validação
do diagnóstico de aneuploidias detectadas nestes núcleos, ou seja, os núcleos 1, 14 e 15 que se
mostraram aneuplóides para vários cromossomos, também apresentaram alterações no número
de sinais correspondentes aos cromossomos 13 e 21 (Tabela 7).
Número de Sinais por Cromossomos Vysis Inc.
Embrião
Núcleo
X
Y
15
17
20
3
7
8
10
16
2
4
6
9q
12
13 21
M2B 1 1
3
3
1
1 1
1
2
1
1
2
2
2
1 3
1 2
29BSF 2 6
-
6
8
6 8
7
5
6
5
7
5
7
- 7
9 6
12BSF 3 3
1
1
2
2 2
2
2
2
2
2
2
2
2 2
3 1
Tabela 7: Resultado da hibridação das sondas dos cromossomos X,Y, 15, 17, 20, 3, 7, 8, 10, 16, 2, 4, 6,
9q, 12, 13 e 21 em 3 núcleos.
Todos os núcleos avaliados neste trabalho apresentaram algum tipo de aneuploidia e apenas
um mostrou-se euplóide para os cromossomos sexuais (núcleo número 5). Com relação à
primeira etapa de hibridação (n=14 núcleos), a freqüência de alterações encontradas em cada
cromossomo foi de 92,85% para o cromossomo 15; 78,57% para o cromossomo 17 e 71,42%
para o cromossomo 20. Para as sondas da segunda etapa de hibridação (n=9 núcleos) detectamos
66,66% de aneuploidia dos cromossomos 3, 7 e 16; 55,55% do cromossomo 10 e 33,33% do
cromossomo 8. Por fim, as alterações cromossômicas encontradas após a terceira etapa de
hibridação (n=7) foram detectadas em 57,14% para o cromossomo 4; 42,85% para o
cromossomo 12; 28,57% para o cromossomo 2 e 14,28% para o cromossomo 6. Como esperado
após o experimento controle com linfócitos, a sonda da região 9q12 mostrou-se pouco eficiente,
Resultados
109
sendo informativa em apenas 2 de 7 núcleos. Dentre estes, um foi diagnosticado como euplóide e
o outro como monossômico.
Dentre os resultados descritos neste trabalho foi observada alta freqüência de alterações
cromossômicas denominadas caóticas, de acordo com critérios definidos por LAVERGE e
colaboradores (1998) e IWARSSON e colaboradores (1999)
Resultados
110
Figura 9: Primeira etapa de hibridação em núcleo interfásico de linfócito 46,XY. Os sinais
fluorescentes seguem a ordem: A)
20 em Spectrum Far Red; B) X em Spectrum Red; C) 15 em
Spectrum Orange; D) 17 em Spectrum Green; E) Y em Spectrum Aqua e F) Imagem composta,
núcleo euplóide.
D
D
C
C
B
B
A
A
E
E
F
F
Resultados
111
Figura 10: Segunda etapa de hibridação em núcleo interfásico de linfócito 46,XY. Os sinais
fluorescentes seguem a ordem: A)
16 em Spectrum Far Red; B) 3 em Spectrum Red; C) 10 em
Spectrum Orange; D) 8 em Spectrum Green; E) 7 em Spectrum Aqua e F: Imagem composta,
núcleo euplóide.
A
A
B
B
C
C
D
D
E
E
F
F
Resultados
112
Figura 11: Segunda etapa de hibridação em núcleo interfásico de linfócito 46,XY. Os sinais
fluorescentes seguem a ordem: A)
9q12 em Spectrum Far Red; B) 4 em Spectrum Red; C) 12 em
Spectrum Orange; D) 2 em Spectrum Green; E) 6 em Spectrum Aqua e F: Imagem composta,
núcleo euplóide.
B
B
A
A
D
D
C
C
F
F
E
E
Resultados
113
Figura 12: Série de hibridações em blastômero (número 6, embrião 16BSF). A) Coloração com DAPI
para controle da morfologia; B) Etapa A, três sinais para os cromossomos X (Red), 15 (Orange), 17
(Green), 20 (Far Red) e ausência de sinal para o cromossomo Y (Aqua); C) Etapa B, dois sinais para
os cromossomos 3 (Red), 8 (Green), 16 (Far Red), três sinais para o cromossomo 7 (Aqua) e um sinal
para o cromossomo 10 (Orange); D) Etapa C, dois sinais para os cromossomos 2 (Green), 4 (Red), 6
(Aqua), 12 (Orange) e ausência de sinal para a região 9q12 (Far Red).
A
A
B
B
C
C
D
D
Discussão
114
V. DISCUSSÃO
I. Considerações sobre a Metodologia
O Diagnóstico Genético Pré-Implantacional (PGD) não é um procedimento simples e inclui
uma série de limitações metodológicas, desde a biópsia do corpúsculo polar ou do blastômero, a
escolha e aplicação do protocolo investigativo na célula única e finalmente a análise para
determinação do diagnóstico. O PGD pode ser utilizado na detecção de um número cada vez
maior de doenças e de acordo com BARUCH e colaboradores (2005), mais de 100 anomalias
genéticas diferentes já podem ser diagnosticadas. Desta forma, muitos estudos têm sido
realizados com o intuito de esclarecer as dúvidas e reduzir as limitações em torno das técnicas de
remoção celular, o protocolo de fixação ou de pré-amplificação de DNA e a seleção do conjunto
de sondas adequado pra a realização da FISH (DE VOS & VAN STEIRTEGHEM, 2001;
COHEN & MUNNÉ, 2005; COHEN et al., 2007; MUNNÉ et al., 2007).
O principal objetivo desde trabalho foi propor uma metodologia para o diagnóstico de
aneuploidias em blastômeros, capaz de determinar a ploidia do maior número possível de
cromossomos, ampliando o espectro do diagnóstico citogenético. Tendo em vista tal objetivo,
utilizamos 15 sondas de oligonucleotídeos, marcadas com cinco fluorocromos distintos, divididas
em três procedimentos de FISH.
As sondas foram primeiramente testadas em uma série de hibridações controle utilizando-se
núcleos interfásicos de linfócitos cultivados, masculinos e cromossomicamente normais. Foi
encontrada uma taxa de 87,6% de hibridações eficientes para os 15 cromossomos, no entanto
este valor pôde ser elevado para 92% quando a porcentagem de hibridação referente à sonda
9q12 foi retirada da análise. Independentemente deste fato, os resultados obtidos estão aquém do
esperado já que a metodologia de FISH apresenta 98% de eficiência na maioria das suas
Discussão
115
aplicações. Esta porcentagem foi confirmada pela assessoria científica da One Cell System, Inc.
quando questionada sobre os índices de hibridação das diferentes sondas de oligonucleotídeos
fornecidas pela empresa (Joan Aurich, comunicação pessoal). O protocolo proposto por esta
companhia sugere que a denaturação do DNA seja feita a temperatura de 85ºC, no entanto os
resultados aqui descritos foram obtidos após procedimento de denaturação por 5 minutos a 76ºC
de temperatura. Este pode ser um dos fatores que favoreceu a menor eficiência de hibridação das
sondas testadas em núcleos de linfócitos. Contudo, tendo em vista a aplicabilidade deste
protocolo para PGD, a temperatura de 76ºC foi escolhida considerando a suscetibilidade da
célula embrionária a altas temperaturas, principalmente quando a FISH exige mais de duas etapas.
A confiabilidade de um diagnóstico realizado por FISH depende da qualidade da seqüência
de DNA e da sua marcação fluorescente, do grau de preservação da amostra, padronização do
protocolo empregado na realização da técnica e por fim, das características do sistema utilizado
para a análise (microscópio, objetivas e filtros) e a captura (software de processamento de imagem)
das imagens (BEATTY, MAI e SQUIRE, 2002).
Dentre as sondas empregadas neste estudo, a que apresentou melhor resultado foi a do
cromossomo Y marcada com fluorocromo Aqua (100%) e a de menor eficiência foi a sonda para
a região 9q12 marcada com o fluorocromo Far Red (25%). A seqüência de DNA utilizada para
identificar o cromossomo Y foi a região satélite III, que por ser de grande tamanho e composta
por DNA repetitivo, facilita a hibridação e gera um sinal de fácil identificação. Outro fator que
possivelmente contribuiu para o sucesso desta sonda foi a sua marcação com o fluorocromo
Aqua. Esse fluocromo emite um sinal luminoso com o menor comprimento de onda de luz entre
as fluorescências utilizadas (467nm) que evita a sua sobreposição com outros sinais,
proporcionando assim a observação de um sinal limpo e definido. Por outro lado, a sonda do
cromossomo 9 mostrou uma taxa de hibridação muito abaixo do esperado, possivelmente devido
ao fato do experimento ter utilizado amostra de apenas um indivíduo e a região 9q12 ser
Discussão
116
polimórfica, apresentando variações de tamanho na população normal. A influência negativa do
fluorocromo Far Red, que emite luz com um comprimento de onda que coincide com o spectrum
Red, foi desconsiderada já que as sondas para os cromossomos 20 e 16, marcadas com a mesma
fluorescência apresentaram taxas de hibridação de 81,8 e 82,75% respectivamente.
Dentre os resultados descritos na Tabela 1 está a porcentagem de ineficiência na hibridação
das sondas referentes a cada cromossomo. Este dado é a somatória da quantidade de núcleos que
não apresentaram sinal fluorescente e dos núcleos com número de sinais diferente do esperado
pra um indivíduo normal do sexo masculino. Desta forma, podem-se considerar duas prováveis
causas para este dado de ineficiência: (1) falha real na hibridação; (2) erros da divisão mitótica das
células sanguíneas em cultura; (3) inclusão de núcleos em diferentes fases do ciclo celular, por
exemplo, em G2.
II. Considerações sobre a Amostra
A triagem de aneuploidias (PGD-AS) é a aplicação mais comum do diagnóstico pré-
implantacional (ANDERSEN et al., 2008), já que as anomalias cromossômicas numéricas estão
relacionadas tanto com falhas de implantação quanto com morte e perda embrionária por
abortamentos espontâneos. A incidência de anomalias cromossômicas é de 1,4% em embriões de
mães com até 34 anos de idade e aumenta para 52,4% em mulheres entre 40-47 anos
(MÁRQUEZ et al., 2000). Da mesma forma, também é conhecida uma elevada incidência de
anomalias cromossômicas em embriões de casais jovens com mais de três falhas de implantação
(>55% dos embriões são aneuploides) e em casais com pelo menos dois abortos espontâneos
(>68%) (GIANAROLI et al.,2001). SHAHINE & CEDARS (2006) questionaram se a aplicação
do PGD-AS em gametas e embriões poderia colaborar para maiores taxas de implantação e de
gestação em casais com idade materna elevada, em casais com falhas recorrentes de implantação,
Discussão
117
em mulheres que apresentaram abortos espontâneos de repetição e também em casais portadores
de translocação equilibrada, já que estas são as principais indicações pra o screening pré-
implantacional de anuploidias (MUNNÉ et al., 1999; GIANAROLI et al., 2002; MUNNÉ et al.,
2002; KULIEV et al., 2003; PUJOL et al., 2003). Baseados em dados de 20.000 ciclos de PGD,
KULIEV & VERLINSKY (2008) relataram que apesar da necessidade de se realizar um estudo
controle para quantificar o impacto clínico da pré-seleção de embriões euplóides, o efeito
positivo do PGD-AS é particularmente evidente quando comparadas as taxas de sucesso
reprodutivo dos mesmos casais, antes e depois da realização do diagnóstico.
A literatura descreve uma variedade de técnicas empregadas para detecção de aneuploidias em
células únicas, porém a metodologia mais utilizada no PGD-AS é a hibridação in situ fluorescente
(FISH) para o estudo de 5 a 9 cromossomos (MUNNÉ et al., 1998a; KULIEV et al., 2003;
WILTON et al., 2003; MONTAG et al., 2004).
Com o objetivo de proporcionar análise de uma maior quantidade de cromossomos em um
único núcleo, este trabalho propõe três ou quatro ciclos de FISH em um mesmo blastômero. Foi
observado que o número de núcleos que apresentaram sinal fluorescente diminuiu
gradativamente da primeira (n=14) para a segunda (n=9) etapa de hibridação e da segunda para a
terceira (n=7), sendo que apenas três núcleos foram considerados ideais para proceder a quarta
hibridação. A diminuição da eficiência na segunda e terceira etapa possivelmente está relacionada
com as sucessivas lavagens e procedimentos de desnaturação, que podem afetar a hibridação
entre as sondas de DNA e as seqüências alvo. Já a perda do núcleo fixado pode ocorrer durante a
técnica de FISH com apenas uma hibridação ou entre as etapas de um procedimento em série.
Os motivos relacionados com estas perdas são a qualidade do núcleo, o protocolo de fixação ou
mesmo a seqüência de lavagens à qual o núcleo é submetido (LIU et al., 1998a; 1998b). Ainda de
acordo com estes autores, a baixa qualidade dos núcleos é o motivo principal da falta de
eficiência na hibridação de alguns blastômeros, assim como os altos índices de resultados
anormais. No presente trabalho foram analisados 14 núcleos embrionários obtidos a partir de seis
Discussão
118
embriões gerados in vitro. Nenhum núcleo foi diagnosticado como normal, euplóide para os 15
cromossomos avaliados e os diagnósticos citogenéticos descritos permitiram a diferenciação de
três categorias: os núcleos poliplóides, os portadores de aneuploidia (monossomia ou trissomia)
para poucos cromossomos e os núcleos “caóticos”, portadores de alterações numéricas para
vários cromossomos analisados. As duas últimas categorias parecem ser os tipos mais freqüentes
de aneuploidias quando considerados embriões em estágio de 2 células até mórula. BIELANSKA
e colaboradores (2002) avaliaram por meio de FISH os cromossomos X, Y, 2, 7, 13, 16, 18, 21 e
22 de 216 embriões em estágios diferentes do desenvolvimento, detectando 48,1% de
mosaicismo. Dentre os aneuplóides, os achados mais freqüentes foram os complementos
cromossômicos caóticos.
O número de cromossomos investigados em uma única célula, por meio da técnica de FISH,
é limitado pela probabilidade de falha na hibridação e pela possibilidade dos sinais fluorescentes
de cromossomos diferentes se sobreporem, aparentando ser um único sinal. Esses problemas
ocorrem devido à configuração tridimensional dos cromossomos em um núcleo interfásico e ao
número limitado de fluorocromos para marcação das sondas. A sobreposição de sinais pode
causar uma super estimativa das incidências de deleções e monossomias. Além disso, erros
ocasionais podem acontecer devido a forma em duplicação (split) do sinal, sugerindo que dois
sinais estejam muito próximos um do outro (COHEN et al., 2007; MUNNÉ et al., 2007). Devido
às limitações descritas, o procedimento de FISH em núcleo interfásico apresenta uma taxa maior
do que 5% de erro por sonda por célula, não sendo indicada a utilização de mais de 9 sondas por
blastômero para diagnóstico pré-implantacional em uma única etapa de hibridação
(RUANGVUTILERT et al., 2000).
Embora a incidência elevada de aneuploidias em blastômeros já tenha sido extensivamente
relatada, as freqüências variam de acordo com o número de cromossomos analisados. Estudos
recentes utilizando a técnica de CGH (Hibridação Genômica Comparativa) demonstraram
alterações cromossômicas envolvendo quase todos os cromossomos. (WELLS & LEVY, 2003;
Discussão
119
GUTIERREZ-MATEO et al., 2004; PELLESTOR et al., 2005; 2006; FRAGOULI, 2007). O
número de sondas utilizadas na realização do PGD para exclusão de aneuploidias varia de 5 a 9,
dependendo do protocolo da instituição que conduz o diagnóstico. Muitos estudos têm se
limitado à análise dos cromossomos envolvidos nas aneuploidias viáveis (X, Y, 13, 18 e 21) e
daqueles associados aos abortos espontâneos (15, 16 e 22) (COHEN et al., 2007; SERMON et al.,
2007; GROOSSENS et al., 2008). Em 1999, BAHÇE e colaboradores sugeriram que os
cromossomos envolvidos na falha de implantação poderiam ser diferentes dos relacionados às
trissomias e aos abortos espontâneos. A partir desse estudo, os cromossomos 1 e 17 passaram a
ser incluídos, por alguns centros, na investigação de aneuploidias. No entanto, uma variedade de
aneuploidias que raramente é observada em diagnósticos pré-natais é tolerada durante o estágio
pré-implantacional, podendo impedir o desenvolvimento tardio do embrião. Essas aneuploidias
não podem ser detectadas pelo PGD com as sondas utilizadas de rotina.
Novas técnicas de citogenética-molecular,
como o M-FISH (Multiplex Fluorescence In Situ
Hybridization) e o cariótipo espectral (SKY) permitem que todos os cromossomos de uma
metáfase sejam identificados com cores diferentes (SCHRÖCK et al., 1996; SPEICHER et al.,
1996). Entretanto, assim como a técnica convencional de bandamento GTG, esses métodos
exigem que os cromossomos estejam em metáfases, não podendo ser aplicadas aos núcleos
interfásicos. O desenvolvimento da técnica de CGH parece responder algumas questões não
resolvidas pela FISH, permitindo a análise de todo o material cromossômico da célula
.
Em 2004, GUTIERREZ-MATEO e colaboradores confirmaram a aplicabilidade da CGH no
diagnóstico pré-implantacional e relataram uma taxa de 48% de aneuploidias em sua amostra.
Segundo os autores, 58,3% das anomalias observadas não seriam detectadas com a análise de 5
cromossomos (X, Y, 13, 18 e 21) (KULIEV et al., 2003; MONTAG et al., 2004); 31,3% dessas
alterações ainda não seriam identificadas pela FISH com 11 cromossomos (X, Y, 8, 9, 13, 15, 16,
17, 18, 21 e 22) (www.reprogenetics.com
) e aproximadamente 25% dos casos não seriam
Discussão
120
diagnosticados pelo protocolo de 9 sondas (1, 13, 15, 16, 17, 18, 21 e 22) descrito por PUJOL e
colaboradores (2003).
Na literatura, poucos embriões foram estudados por CGH, entretanto já é possível confirmar
e ampliar os achados citogenéticos obtidos por FISH (WELLS & LEVY, 2003). Algumas
aneuploidias incomuns, como monossomia de cromossomos dos grupos A e B e de nulissomias,
têm sido detectadas pelas duas técnicas. Presume-se que essas alterações cromossômicas
começam a limitar o desenvolvimento embrionário assim que iniciada a expressão gênica no
embrião (WELLS & DELHANTY, 2000; VOULLAIRE et al., 2000). A aplicação da hibridação
comparativa em blastômeros também confirmou a alta freqüência de mosaicismo em embriões
pré-implantação, particularmente em embriões classificados como mosaicos “caóticos”. Esse tipo
de embrião contém células com múltiplas aneuploidias, devido a uma falência no mecanismo de
segregação meiótica da célula. A existência de embriões caóticos foi inicialmente detectada pela
FISH, mas sua caracterização completa só foi feita pela técnica de CGH, revelando que um
núcleo caótico pode apresentar até 14 cromossomos alterados simultaneamente (WELLS &
DELHANTY, 2000).
Todos os blastômeros analisados neste estudo apresentaram alterações numéricas em pelo
menos dois pares cromossômicos, sendo que as aneuploidias para os cromossomos sexuais e o
cromossomo 15
foram observadas com maior freqüência (92,8%) enquanto o cromossomos 6
apresentou a menor freqüência (14,3%). Embora a elevada taxa de aneuploidia possa ser
correlacionada à metodologia utilizada, as características da amostra também podem justificar
nossos resultados. Além de terem sido mantidos em cultivo por mais de 5 dias, os embriões
empregados neste trabalho não alcançavam os critérios morfológicos e o padrão mínino de
desenvolvimento para serem transferidos para o útero materno ou mesmo criopreservados. De
acordo com a literatura (MAGLI et al., 1998; BIELANSKA et al., 2002; ZIEBE et al., 2003; DE
UGARTE et al, 2008), estas características estão intimamente relacionadas com a alto índice de
anomalias cromossômicas em embriões em estágio pré-implantacional cultivados in vitro.
Discussão
121
Com o intuito de descartar possíveis erros resultantes da aplicação de novas sondas de DNA
(One Cell System, Inc.) para diagnóstico, realizamos uma quarta etapa de hibridação com sondas
amplamente testadas na literatura (cromossomos 13 e 21, Vysis Inc.) em três núcleos que
mantiveram a morfologia após os ciclos anteriores de hibridação. A detecção de alterações
numéricas para os cromossomos 13 e 21 evidenciaram a presença de aneuploidias nestes núcleos,
confirmando a eficiência das sondas de oligonucleotídeos. A validação dos resultados indica que
o procedimento pode ser utilizado para qualquer seqüência cromossomo-específica, tornando
viável o diagnóstico de aneuploidia de diferentes cromossomos em célula única.
Por se tratar do método diagnóstico mais utilizado no PGD (SERMON et al., 2007), DE
UGARTE e colaboradores (2008) reavaliaram 241 embriões previamente diagnosticados por
FISH para determinar o VPP (Valor Preditivo Positivo) e o VPN (Valor Preditivo Negativo) da
técnica quando aplicada para diagnóstico pré-implantacional. Os autores determinaram os valores
para VPP e VPN como sendo 83 e 81% respectivamente, responsabilizando a presença de
mosaicismo embrionário pela maior parte dos erros encontrados no diagnóstico por FISH.
Nossos resultados confirmaram a eficiência da técnica de FISH mesmo após séries sucessivas
de hibridação. A utilização de sondas cromossômicas combinadas possibilitou uma ampliação do
diagnóstico de aneuploidias em células únicas e, principalmente introduziu, com sucesso, o uso
de sondas de oligonucleotídeos; acessíveis comercialmente aos países em desenvolvimento.
122
CONCLUSÕES
(1) O protocolo de FISH estabelecido com objetivo de determinar o diagnóstico pré-
implantacional em blastômeros foi eficaz na detecção de aneuploidias de 14 pares
cromossômicos.
(2) As sondas de oligonucleotideos para diagnóstico de aneuploidias cromossômicas
mostraram taxa de hibridação entre 81,8 e 100% para os cromossomos 2, 3, 4, 6, 7, 8, 10,
12, 15, 16, 17, 20, X e Y. A sonda especifica da região 9q12 foi considerada ineficaz para
diagnóstico, devido a sua baixa taxa de hibridação (25%).
.
123
REFERÊNCIAS
A
Andersen, A. N., Goossens, V., Ferraretti, A. P., Bhattacharya, S., Felberbaum, R., de Mouzon, J.
and Nygren, K. G. (2008) Assisted reproductive technology in Europe, 2004: results
generated from European registers by ESHRE. Hum Reprod 23, 756-771.
B
Baart, E. B., Van Opstal, D., Los, F. J., Fauser, B. C. and Martini, E. (2004) Fluorescence in situ
hybridization analysis of two blastomeres from day 3 frozen-thawed embryos followed by
analysis of the remaining embryo on day 5. Hum Reprod 19, 685-693.
Bahce, M., Cohen, J. and Munne, S. (1999) Preimplantation genetic diagnosis of aneuploidy: were
we looking at the wrong chromosomes? J Assist Reprod Genet 16, 176-181.
Baruch, S., Adamson, G. D., Cohen, J., Gibbons, W. E., Hughes, M. R., Kuliev, A., Munne, S.,
Rebar, R. W., Simpson, J. L., Verlinsky, Y. et al. (2005) Genetic testing of embryos: a
critical need for data. Reprod Biomed Online 11, 667-670.
Beatty, B., May, S., Squire, J. (2002) FISH. 1ª edn, Oxford University Press, Toronto.
Bielanska, M., Tan, S. L. and Ao, A. (2002) Chromosomal mosaicism throughout human
preimplantation development in vitro: incidence, type, and relevance to embryo outcome.
Hum Reprod 17, 413-419.
C
Cohen, J. and Munne, S. (2005) Comment 2 on Staessen et al. (2004). Two-cell biopsy and PGD
pregnancy outcome. Hum Reprod 20, 2363-2364; author reply 2364-2365.
Cohen, J. and Grifo, J. A. (2007) Multicentre trial of preimplantation genetic screening reported in
the New England Journal of Medicine: an in-depth look at the findings. Reprod Biomed
Online 15, 365-366.
D
De Braekeleer, M., Dao, T.N (1990) Cytogenetic studies in couples experiencing repeated
pregnancy losses. Hum Reprod 5, 519-528.
124
De Vos A, V. S. A. (2001) Aspects of biopsy procedures prior to preimplantation genetic diagnosis.
Prenat Diagn 21, 767-780.
Delhanty, J. D. and Handyside, A. H. (1995) The origin of genetic defects in the human and their
detection in the preimplantation embryo. Hum Reprod Update 1, 201-215.
Delhanty, J. D., Harper, J. C., Ao, A., Handyside, A. H. and Winston, R. M. (1997) Multicolour
FISH detects frequent chromosomal mosaicism and chaotic division in normal
preimplantation embryos from fertile patients. Hum Genet 99, 755-760.
Deugarte, C. M., Li, M., Surrey, M., Danzer, H., Hill, D. and Decherney, A. H. (2008) Accuracy of
FISH Analysis in Predicting Chromosomal Status in Patients Undergoing Preimplantation
Genetic Diagnosis. Fertil Steril.
E
Eiben, B., Bartels, I., Bahr-Porsch, S., Borgmann, S., Gatz, G., Gellert, G., Goebel, R., Hammans,
W., Hentemann, M., Osmers, R. et al. (1990) Cytogenetic analysis of 750 spontaneous
abortions with the direct-preparation method of chorionic villi and its implications for
studying genetic causes of pregnancy wastage. Am J Hum Genet 47, 656-663.
Evsikov, S. and Verlinsky, Y. (1998) Mosaicism in the inner cell mass of human blastocysts. Hum
Reprod 13, 3151-3155.
F
Farfalli, V. I., Magli, M. C., Ferraretti, A. P. and Gianaroli, L. (2007) Role of aneuploidy on embryo
implantation. Gynecol Obstet Invest 64, 161-165.
Fragouli, E. (2007) Preimplantation genetic diagnosis: present and future. J Assist Reprod Genet 24,
201-207.
G
Gianaroli, L., Magli, M. C., Ferraretti, A. P., Fiorentino, A., Garrisi, J. and Munne, S. (1997)
Preimplantation genetic diagnosis increases the implantation rate in human in vitro
fertilization by avoiding the transfer of chromosomally abnormal embryos. Fertil Steril 68,
1128-1131.
Gianaroli, L., Magli, M. C. and Ferraretti, A. P. (2001) The in vivo and in vitro efficiency and
efficacy of PGD for aneuploidy. Mol Cell Endocrinol 183 Suppl 1, S13-18.
Gianaroli, L., Magli, M. C., Ferraretti, A. P., Munne, S., Balicchia, B., Escudero, T. and Crippa, A.
(2002) Possible interchromosomal effect in embryos generated by gametes from
translocation carriers. Hum Reprod 17, 3201-3207.
Goossens, V., De Rycke, M., De Vos, A., Staessen, C., Michiels, A., Verpoest, W., Van Steirteghem,
A., Bertrand, C., Liebaers, I., Devroey, P. et al. (2008) Diagnostic efficiency, embryonic
development and clinical outcome after the biopsy of one or two blastomeres for
preimplantation genetic diagnosis. Hum Reprod 23, 481-492.
125
Grifo, J. A., Tang, Y. X., Munne, S. and Krey, L. (1996) Update in preimplantation genetic
diagnosis: successes, advances, and problems. Curr Opin Obstet Gynecol 8, 135-138.
Gutierrez-Mateo, C., Wells, D., Benet, J., Sanchez-Garcia, J. F., Bermudez, M. G., Belil, I., Egozcue,
J., Munne, S. and Navarro, J. (2004) Reliability of comparative genomic hybridization to
detect chromosome abnormalities in first polar bodies and metaphase II oocytes. Hum
Reprod 19, 2118-2125.
H
Handyside, A. H. and Delhanty, J. D. (1997) Preimplantation genetic diagnosis: strategies and
surprises. Trends Genet 13, 270-275.
Hardy, K., Winston, R. M. and Handyside, A. H. (1993) Binucleate blastomeres in preimplantation
human embryos in vitro: failure of cytokinesis during early cleavage. J Reprod Fertil 98,
549-558.
I
Iwarsson, E., Lundqvist, M., Inzunza, J., Ahrlund-Richter, L., Sjoblom, P., Lundkvist, O., Simberg,
N., Nordenskjold, M. and Blennow, E. (1999) A high degree of aneuploidy in frozen-
thawed human preimplantation embryos. Hum Genet 104, 376-382.
J
Jobanputra, V., Sobrino, A., Kinney, A., Kline, J. and Warburton, D. (2002) Multiplex interphase
FISH as a screen for common aneuploidies in spontaneous abortions. Hum Reprod 17,
1166-1170.
K
Katagiri, Y. and Katayama, S. (1996) Influence of mosaicism on sexing of human preembryos
detected by the polymerase chain reaction. J Assist Reprod Genet 13, 586-591.
Kuliev, A., Cieslak, J., Ilkevitch, Y. and Verlinsky, Y. (2003) Chromosomal abnormalities in a series
of 6,733 human oocytes in preimplantation diagnosis for age-related aneuploidies. Reprod
Biomed Online 6, 54-59.
Kuliev, A. and Verlinsky, Y. (2008) Impact of preimplantation genetic diagnosis for chromosomal
disorders on reproductive outcome. Reprod Biomed Online 16, 9-10.
L
Lathi, R. B. and Milki, A. A. (2002) Tissue sampling technique affects accuracy of karyotype from
missed abortions. J Assist Reprod Genet 19, 536-538.
126
Lathi, R. B. and Milki, A. A. (2004) Rate of aneuploidy in miscarriages following in vitro
fertilization and intracytoplasmic sperm injection. Fertil Steril 81, 1270-1272.
Lathi, R. B., Westphal, L. M. and Milki, A. A. (2008) Aneuploidy in the miscarriages of infertile
women and the potential benefit of preimplanation genetic diagnosis. Fertil Steril 89, 353-
357.
Laverge, H., Van der Elst, J., De Sutter, P., Verschraegen-Spae, M. R., De Paepe, A. and Dhont, M.
(1998) Fluorescent in-situ hybridization on human embryos showing cleavage arrest after
freezing and thawing. Hum Reprod 13, 425-429.
Liu, J., Tsai, Y. L., Zheng, X. Z., Yazigi, R. A., Baramki, T. A., Compton, G. and Katz, E. (1998a)
Feasibility study of repeated fluorescent in-situ hybridization in the same human
blastomeres for preimplantation genetic diagnosis. Mol Hum Reprod 4, 972-977.
Liu, J., Tsai, Y. L., Zheng, X. Z., Baramki, T. A., Yazigi, R. A. and Katz, E. (1998b) Potential use of
repeated fluorescence in situ hybridization in the same human blastomeres for
preimplantation genetic diagnosis. Fertil Steril 70, 729-733.
Ljunger, E., Cnattingius, S., Lundin, C. and Anneren, G. (2005) Chromosomal anomalies in first-
trimester miscarriages. Acta Obstet Gynecol Scand 84, 1103-1107.
M
Magli, M. C., Gianaroli, L., Munne, S. and Ferraretti, A. P. (1998) Incidence of chromosomal
abnormalities from a morphologically normal cohort of embryos in poor-prognosis
patients. J Assist Reprod Genet 15, 297-301.
Marquez, C., Sandalinas, M., Bahce, M., Alikani, M. and Munne, S. (2000) Chromosome
abnormalities in 1255 cleavage-stage human embryos. Reprod Biomed Online 1, 17-26.
Montag, M., van der Ven, K., Dorn, C. and van der Ven, H. (2004) Outcome of laser-assisted polar
body biopsy and aneuploidy testing. Reprod Biomed Online 9, 425-429.
Munne, S., Tang, Y. X., Grifo, J., Rosenwaks, Z. and Cohen, J. (1994) Sex determination of human
embryos using the polymerase chain reaction and confirmation by fluorescence in situ
hybridization. Fertil Steril 61, 111-117.
Munne, S., Weier, H. U., Grifo, J. and Cohen, J. (1994b) Chromosome mosaicism in human
embryos. Biol Reprod 51, 373-379.
Munne, S., Alikani, M., Tomkin, G., Grifo, J. and Cohen, J. (1995) Embryo morphology,
developmental rates, and maternal age are correlated with chromosome abnormalities.
Fertil Steril 64, 382-391.
Munne, S., Magli, C., Bahce, M., Fung, J., Legator, M., Morrison, L., Cohert, J. and Gianaroli, L.
(1998) Preimplantation diagnosis of the aneuploidies most commonly found in
spontaneous abortions and live births: XY, 13, 14, 15, 16, 18, 21, 22. Prenat Diagn 18,
1459-1466.
Munne, S., Magli, C., Cohen, J., Morton, P., Sadowy, S., Gianaroli, L., Tucker, M., Marquez, C.,
Sable, D., Ferraretti, A. P. et al. (1999) Positive outcome after preimplantation diagnosis of
aneuploidy in human embryos. Hum Reprod 14, 2191-2199.
127
Munne, S., Cohen, J. and Sable, D. (2002) Preimplantation genetic diagnosis for advanced maternal
age and other indications. Fertil Steril 78, 234-236.
Munne, S. and Wells, D. (2003) Questions concerning the suitability of comparative genomic
hybridization for preimplantation genetic diagnosis. Fertil Steril 80, 871-872; discussion
875.
Munne, S., Bahce, M., Sandalinas, M., Escudero, T., Marquez, C., Velilla, E., Colls, P., Oter, M.,
Alikani, M. and Cohen, J. (2004) Differences in chromosome susceptibility to aneuploidy
and survival to first trimester. Reprod Biomed Online 8, 81-90.
Munne, S., Gianaroli, L., Tur-Kaspa, I., Magli, C., Sandalinas, M., Grifo, J., Cram, D., Kahraman, S.,
Verlinsky, Y. and Simpson, J. L. (2007) Substandard application of preimplantation genetic
screening may interfere with its clinical success. Fertil Steril 88, 781-784.
P
Pellestor, F., Anahory, T. and Hamamah, S. (2005) The chromosomal analysis of human oocytes.
An overview of established procedures. Hum Reprod Update 11, 15-32.
Pellestor, F., Andreo, B., Anahory, T. and Hamamah, S. (2006) The occurrence of aneuploidy in
human: lessons from the cytogenetic studies of human oocytes. Eur J Med Genet 49, 103-
116.
Pujol, A., Durban, M., Benet, J., Boiso, I., Calafell, J. M., Egozcue, J. and Navarro, J. (2003)
Multiple aneuploidies in the oocytes of balanced translocation carriers: a preimplantation
genetic diagnosis study using first polar body Reproduction, pp. 701-711.
R
Ray, P. F. and Handyside, A. H. (1996) Increasing the denaturation temperature during the first
cycles of amplification reduces allele dropout from single cells for preimplantation genetic
diagnosis. Mol Hum Reprod 2, 213-218.
Ruangvutilert, P., Delhanty, J. D., Serhal, P., Simopoulou, M., Rodeck, C. H. and Harper, J. C.
(2000) FISH analysis on day 5 post-insemination of human arrested and blastocyst stage
embryos. Prenat Diagn 20, 552-560.
S
Sandalinas, M., Sadowy, S., Alikani, M., Calderon, G., Cohen, J. and Munne, S. (2001)
Developmental ability of chromosomally abnormal human embryos to develop to the
blastocyst stage. Hum Reprod 16, 1954-1958.
Schrock, E., du Manoir, S., Veldman, T., Schoell, B., Wienberg, J., Ferguson-Smith, M. A., Ning, Y.,
Ledbetter, D. H., Bar-Am, I., Soenksen, D. et al. (1996) Multicolor spectral karyotyping of
human chromosomes. Science 273, 494-497.
128
Sermon, K. D., Michiels, A., Harton, G., Moutou, C., Repping, S., Scriven, P. N., SenGupta, S.,
Traeger-Synodinos, J., Vesela, K., Viville, S. et al. (2007) ESHRE PGD Consortium data
collection VI: cycles from January to December 2003 with pregnancy follow-up to October
2004. Hum Reprod 22, 323-336.
Speicher, M. R., Gwyn Ballard, S. and Ward, D. C. (1996) Karyotyping human chromosomes by
combinatorial multi-fluor FISH. Nat Genet 12, 368-375.
Stephenson, M. D., Awartani, K. A. and Robinson, W. P. (2002) Cytogenetic analysis of
miscarriages from couples with recurrent miscarriage: a case-control study. Hum Reprod
17, 446-451.
V
Voullaire, L., Slater, H., Williamson, R. and Wilton, L. (2000) Chromosome analysis of blastomeres
from human embryos by using comparative genomic hybridization. Hum Genet 106, 210-
217.
W
Wells, D. and Delhanty, J. D. (2000) Comprehensive chromosomal analysis of human
preimplantation embryos using whole genome amplification and single cell comparative
genomic hybridization. Mol Hum Reprod 6, 1055-1062.
Wells, D. and Levy, B. (2003) Cytogenetics in reproductive medicine: the contribution of
comparative genomic hybridization (CGH). Bioessays 25, 289-300.
Wilton, L., Voullaire, L., Sargeant, P., Williamson, R. and McBain, J. (2003) Preimplantation
aneuploidy screening using comparative genomic hybridization or fluorescence in situ
hybridization of embryos from patients with recurrent implantation failure. Fertil Steril 80,
860-868.
Z
Ziebe, S., Lundin, K., Loft, A., Bergh, C., Nyboe Andersen, A., Selleskog, U., Nielsen, D.,
Grondahl, C., Kim, H. and Arce, J. C. (2003) FISH analysis for chromosomes 13, 16, 18,
21, 22, X and Y in all blastomeres of IVF pre-embryos from 144 randomly selected
donated human oocytes and impact on pre-embryo morphology. Hum Reprod 18, 2575-
2581.
Anexo B
129
ANEXO B
Reagentes e Soluções:
ISOLAMENTO
CELULAR
Solução de Isolamento: tampão fosfato (PBS)-0,1% polivinil álcool (PVA)
Foi preparada uma solução 10x PBS livre de Ca
+2
e Mg
+2
(80g de NaCl; 25,08g de
Na
2
HPO
4
dihidratado, 2g de KCl e 1,5g de KH
2
PO
4
dissolvidos em 1l de água miliQ). Esta
solução é então autoclavada e tem o pH ajustado para 7,2. Partindo da dessa concentração
é feita uma diluição 1/10 adicionando 100ml de 10xPBS em 900ml de água miliQ. Na
solução de PBS já diluída adiciona-se 1g de PVA, que então é filtrada e estocada em
alíquotas de 1,5ml. O PVA evita que as células se fixem na superfície da placa e o PBS livre
de Ca
+2
e Mg
+2
desestabiliza os íons intracelulares e faz com que as células se desagreguem
mais facilmente.
FIXAÇÃO DE BLASTÔMEROS
Solução Hipotônica: (1% citrato de sódio)
A solução de citrato de sódio foi escolhida em detrimento da solução alternativa de KCl
por evitar lise celular. Diluiu-se 10g do sal citrato de sódio em 1litro de água miliQ.
Fixador Carnoy:
Utilizou-se, como fixador, a solução Carnoy (3 partes de metanol para 1 de ácido acético
glacial) à 4ºC. Esta solução deve ser refeita a cada fez que for utilizada.
Anexo B
130
HIBRIDAÇÃO IN SITU FLUORESCENTE
Sondas de Oligonucleotídeos:
Foram utilizados oligonucleotídeos marcados com diferentes fluorocromos(One Cell
Systems, Inc.) para 15 cromossomos diferentes. As sondas foram diluídas na concentração
1:1 (sonda: tampão de hibridação), de acordo com a indicação do fabricante.
Washing Solution
: (0,2xSSC/ 0,1% SDS)
Adicionou-se 1ml de SDS (sodium dodecyl sulphate, Sigma) em 100ml de solução 2xSSC
(10ml 20xSSC + 90ml água miliQ).
20xSSC:
Em 1litro de água miliQ devem ser diluídos 88g de citrato tri-sódico dihidratato e 175g
de cloreto de sódio. O pH da solução deve ser ajustado em 5,5.
2xSSC:
Para 100ml de solução, 10ml de 20xSSC deve ser adicionada a 90ml de água miliQ e o
pH ajustado entre 6,8 e 7,2.
131
REFERÊNCIAS
132
A
Andersen, A. N., Goossens, V., Ferraretti, A. P., Bhattacharya, S., Felberbaum, R., de Mouzon, J.
and Nygren, K. G. (2008) Assisted reproductive technology in Europe, 2004: results
generated from European registers by ESHRE. Hum Reprod 23, 756-771.
Antonorakis, S. E. (1991) Parental origin of the extra chromosome in trisomy 21 as indicated by
analysis of DNA polimorfisms. N Engl Med 234, 872:876.
Ao, A. & Handyside, A. H. (1995) Cleavage stage human embryo biopsy. Hum. Reprod. Update 1,
(Petersen and Mikkelsen 2000)
B
Boada, M., Carrera, M., De La Iglesia, C., Sandalinas, M., Barri, P. N. and Veiga, A. (1998)
Successful use of a laser for human embryo biopsy in preimplantation genetic diagnosis:
report of two cases. J Assist Reprod Genet 15, 302-307.
de Boer, K. A., Catt, J. W., Jansen, R. P., Leigh, D. and McArthur, S. (2004) Moving to blastocyst
biopsy for preimplantation genetic diagnosis and single embryo transfer at Sydney IVF.
Fertil Steril 82, 295-298.
D
Durban, M., Benet, J., Boada, M., Fernandez, E., Calafell, J. M., Lailla, J. M., Sanchez-Garcia, J. F.,
Pujol, A., Egozcue, J. and Navarro, J. (2001) PGD in female carriers of balanced
Robertsonian and reciprocal translocations by first polar body analysis. Hum Reprod
Update 7, 591-602.
F
Fisher, J. M., Harvey, J. F., Morton, N. E. and Jacobs, P. A. (1995) Trisomy 18: studies of the
parent and cell division of origin and the effect of aberrant recombination on
nondisjunction. Am J Hum Genet 56, 669-675.
Fragouli, E. (2007) Preimplantation genetic diagnosis: present and future. J Assist Reprod Genet 24,
201-207.
G
Gardner, R. L. & Edwards, R. G. (1968) Control of the sex ratio at full term in the rabbit by
transfeerring sexed blastocysts. Nature 218, 346:348.
Gianaroli, L., Magli, M. C. and Ferraretti, A. P. (2001) The in vivo and in vitro efficiency and
efficacy of PGD for aneuploidy. Mol Cell Endocrinol 183 Suppl 1, S13-18.
133
Gianaroli, L., Magli, M. C., Ferraretti, A. P., Munne, S., Balicchia, B., Escudero, T. and Crippa, A.
(2002) Possible interchromosomal effect in embryos generated by gametes from
translocation carriers. Hum Reprod 17, 3201-3207.
Gitlin, S. A., Gibbons, W. E. and Gosden, R. G. (2003) Oocyte biology and genetics revelations
from polar bodies. Reprod Biomed Online 6, 403-409.
Griffin, D. K., Handyside, A. H., Penketh, R. J., Winston, R. M. and Delhanty, J. D. (1991)
Fluorescent in-situ hybridization to interphase nuclei of human preimplantation embryos
with X and Y chromosome specific probes. Hum Reprod 6, 101-105.
Gutierrez-Mateo, C., Wells, D., Benet, J., Sanchez-Garcia, J. F., Bermudez, M. G., Belil, I., Egozcue,
J., Munne, S. and Navarro, J. (2004a) Reliability of comparative genomic hybridization to
detect chromosome abnormalities in first polar bodies and metaphase II oocytes. Hum
Reprod 19, 2118-2125.
Gutierrez-Mateo, C., Benet, J., Wells, D., Colls, P., Bermudez, M. G., Sanchez-Garcia, J. F.,
Egozcue, J., Navarro, J. and Munne, S. (2004b) Aneuploidy study of human oocytes first
polar body comparative genomic hybridization and metaphase II fluorescence in situ
hybridization analysis. Hum Reprod 19, 2859-2868.
H
Handyside, A. H., Kontogianni, E. H., Hardy, K. and Winston, R. M. (1990) Pregnancies from
biopsied human preimplantation embryos sexed by Y-specific DNA amplification. Nature
344, 768-770.
Hardy, K., Martin, K. L., Leese, H. J., Winston, R. M. and Handyside, A. H. (1990) Human
preimplantation development in vitro is not adversely affected by biopsy at the 8-cell stage.
Hum Reprod 5, 708-714.
Harper, J. C., Dawson, K., Delhanty, J. D. and Winston, R. M. (1995) The use of fluorescent in-situ
hybridization (FISH) for the analysis of in-vitro fertilization embryos: a diagnostic tool for
the infertile couple. Hum Reprod 10, 3255-3258.
Hassold, T. and Hunt, P. (2001) To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy.
Nat Rev Genet 2, 280-291.
Hassold, T., Merrill, M., Adkins, K., Freeman, S. and Sherman, S. (1995) Recombination and
maternal age-dependent nondisjunction: molecular studies of trisomy 16. Am J Hum Genet
57, 867-874.
Hassold, T. J. and Jacobs, P. A. (1984) Trisomy in man. Annu Rev Genet 18, 69-97.
Hunt, P., LeMaire, R., Embury, P., Sheean, L. and Mroz, K. (1995) Analysis of chromosome
behavior in intact mammalian oocytes: monitoring the segregation of a univalent
chromosome during female meiosis. Hum Mol Genet 4, 2007-2012.
134
I
Iwarsson, E., Lundqvist, M., Inzunza, J., Ahrlund-Richter, L., Sjoblom, P., Lundkvist, O., Simberg,
N., Nordenskjold, M. and Blennow, E. (1999) A high degree of aneuploidy in frozen-
thawed human preimplantation embryos. Hum Genet 104, 376-382.
J
Jacobs, P. A. and Hassold, T. J. (1995) The origin of numerical chromosome abnormalities. Adv
Genet 33, 101-133.
K
Kuliev, A., Cieslak, J., Ilkevitch, Y. and Verlinsky, Y. (2003) Chromosomal abnormalities in a series
of 6,733 human oocytes in preimplantation diagnosis for age-related aneuploidies. Reprod
Biomed Online 6, 54-59.
Kuliev, A. and Verlinsky, Y. (2008) Impact of preimplantation genetic diagnosis for chromosomal
disorders on reproductive outcome. Reprod Biomed Online 16, 9-10.
L
LeMarie-Adkins, R., Radke, K., Hunt, P. A. (1997) Lack of checkpoint control at the metaphase/
anaphase transition: a mechanism of meiotic nondisjunction in mammalian females. J Cell
Biol 139, 1611:1619.
Ludwig, M., Diedrich, K. and Schwinger, E. (2001) Preimplantation genetic diagnosis: the German
situation. Trends Genet 17, 473-474.
M
Magli, M. C., Gianaroli, L., Fortini, D., Ferraretti, A. P. and Munne, S. (1999) Impact of blastomere
biopsy and cryopreservation techniques on human embryo viability. Hum Reprod 14, 770-
773.
Malmgren, H., Sahlen, S., Inzunza, J., Aho, M., Rosenlund, B., Fridstrom, M., Hovatta, O.,
Ahrlund-Richter, L., Nordenskjold, M. and Blennow, E. (2002) Single cell CGH analysis
reveals a high degree of mosaicism in human embryos from patients with balanced
structural chromosome aberrations. Mol Hum Reprod 8, 502-510.
Marquez, C., Sandalinas, M., Bahce, M., Alikani, M. and Munne, S. (2000) Chromosome
abnormalities in 1255 cleavage-stage human embryos. Reprod Biomed Online 1, 17-26.
Menezo, Y., Hazout, A., Dumont, M., Herbaut, N. and Nicollet, B. (1992) Coculture of embryos on
Vero cells and transfer of blastocysts in humans. Hum Reprod 7 Suppl 1, 101-106.
Montag, M., van der Ven, K., Dorn, C. and van der Ven, H. (2004) Outcome of laser-assisted polar
body biopsy and aneuploidy testing. Reprod Biomed Online 9, 425-429.
135
Munne, S., Grifo, J., Cohen, J. and Weier, H. U. (1994) Chromosome abnormalities in human
arrested preimplantation embryos: a multiple-probe FISH study. Am J Hum Genet 55,
150-159
Munne, S., Alikani, M., Tomkin, G., Grifo, J. and Cohen, J. (1995) Embryo morphology,
developmental rates, and maternal age are correlated with chromosome abnormalities.
Fertil Steril 64, 382-391.
Munne, S., Morrison, L., Fung, J., Marquez, C., Weier, U., Bahce, M., Sable, D., Grundfeld, L.,
Schoolcraft, B., Scott, R. et al. (1998a) Spontaneous abortions are reduced after
preconception diagnosis of translocations. J Assist Reprod Genet 15, 290-296.
Munne, S., Scott, R., Sable, D. and Cohen, J. (1998b) First pregnancies after preconception
diagnosis of translocations of maternal origin. Fertil Steril 69, 675-681.
Munne, S., Magli, C., Cohen, J., Morton, P., Sadowy, S., Gianaroli, L., Tucker, M., Marquez, C.,
Sable, D., Ferraretti, A. P. et al. (1999) Positive outcome after preimplantation diagnosis of
aneuploidy in human embryos. Hum Reprod 14, 2191-2199.
Munne, S. (2002) Preimplantation genetic diagnosis of numerical and structural chromosome
abnormalities. Reprod Biomed Online 4, 183-196.
Munne, S., Cohen, J. and Sable, D. (2002) Preimplantation genetic diagnosis for advanced maternal
age and other indications. Fertil Steril 78, 234-236.
N
Nicolaidis, P. and Petersen, M. B. (1998) Origin and mechanisms of non-disjunction in human
autosomal trisomies. Hum Reprod 13, 313-319.
P
Petersen, M. B. and Mikkelsen, M. (2000) Nondisjunction in trisomy 21: origin and mechanisms.
Cytogenet Cell Genet 91, 199-203.
Plachot, M., de Grouchy, J., Cohen, J. and Salat-Baroux, J. (1990) [Chromosome abnormalities of
the fertilized human egg]. Reprod Nutr Dev Suppl 1, 83s-88s.
Pujol, A., Benet, J., Campillo, M., Codina-Pascual, M., Egozcue, J. and Navarro, J. (2004) The use
of a cell-cycle phase-marker may decrease the percentage of errors when using FISH in
PGD. Cytogenet Genome Res 105, 29-35.
Pujol, A., Durban, M., Benet, J., Boiso, I., Calafell, J. M., Egozcue, J. and Navarro, J. (2003)
Multiple aneuploidies in the oocytes of balanced translocation carriers: a preimplantation
genetic diagnosis study using first polar body Reproduction, pp. 701-711.
136
R
Rechitsky, S., Strom, C., Verlinsky, O., Amet, T., Ivakhnenko, V., Kukharenko, V., Kuliev, A. and
Verlinsky, Y. (1999) Accuracy of preimplantation diagnosis of single-gene disorders by
polar body analysis of oocytes. J Assist Reprod Genet 16, 192-198.
S
Sandalinas, M., Sadowy, S., Alikani, M., Calderon, G., Cohen, J. and Munne, S. (2001)
Developmental ability of chromosomally abnormal human embryos to develop to the
blastocyst stage. Hum Reprod 16, 1954-1958.
Savage, A. R., Petersen, M. B., Pettay, D., Taft, L., Allran, K., Freeman, S. B., Karadima, G.,
Avramopoulos, D., Torfs, C., Mikkelsen, M. et al. (1998) Elucidating the mechanisms of
paternal non-disjunction of chromosome 21 in humans. Hum Mol Genet 7, 1221-1227.
Sermon, K., Moutou, C., Harper, J., Geraedts, J., Scriven, P., Wilton, L., Magli, M. C., Michiels, A.,
Viville, S. and De Die, C. (2005) ESHRE PGD Consortium data collection IV: May-
December 2001. Hum Reprod 20, 19-34.
Sermon, K., Van Steirteghem, A. and Liebaers, I. (2004) Preimplantation genetic diagnosis. Lancet
363, 1633-1641.
Sermon, K. D., Michiels, A., Harton, G., Moutou, C., Repping, S., Scriven, P. N., SenGupta, S.,
Traeger-Synodinos, J., Vesela, K., Viville, S. et al. (2007) ESHRE PGD Consortium data
collection VI: cycles from January to December 2003 with pregnancy follow-up to October
2004. Hum Reprod 22, 323-336.
Shahine, L. K. and Cedars, M. I. (2006) Preimplantation genetic diagnosis does not increase
pregnancy rates in patients at risk for aneuploidy. Fertil Steril 85, 51-56.
Sherman, S. L., Petersen, M. B., Freeman, S. B., Hersey, J., Pettay, D., Taft, L., Frantzen, M.,
Mikkelsen, M. and Hassold, T. J. (1994) Non-disjunction of chromosome 21 in maternal
meiosis I: evidence for a maternal age-dependent mechanism involving reduced
recombination. Hum Mol Genet 3, 1529-1535.
V
Verlinsky, Y., Cieslak, J., Freidine, M., Ivakhnenko, V., Wolf, G., Kovalinskaya, L., White, M.,
Lifchez, A., Kaplan, B., Moise, J. et al. (1996) Polar body diagnosis of common
aneuploidies by FISH. J Assist Reprod Genet 13, 157-162.
Verlinsky, Y., Cieslak, J., Ivakhnenko, V., Evsikov, S., Wolf, G., White, M., Lifchez, A., Kaplan, B.,
Moise, J., Valle, J. et al. (1999) Prevention of age-related aneuploidies by polar body testing
of oocytes. J Assist Reprod Genet 16, 165-169.
Verlinsky, Y., Ginsberg, N., Lifchez, A., Valle, J., Moise, J. and Strom, C. M. (1990) Analysis of the
first polar body: preconception genetic diagnosis. Hum Reprod 5, 826-829.
Verlinsky, Y., Rechitsky, S., Verlinsky, O., Strom, C. and Kuliev, A. (2000) Preimplantation
diagnosis for ornithine transcarbamylase deficiency. Reprod Biomed Online 1, 45-47.
137
Voullaire, L., Slater, H., Williamson, R. and Wilton, L. (2000) Chromosome analysis of blastomeres
from human embryos by using comparative genomic hybridization. Hum Genet 106, 210-
217.
W
Wells, D. and Delhanty, J. D. (2000) Comprehensive chromosomal analysis of human
preimplantation embryos using whole genome amplification and single cell comparative
genomic hybridization. Mol Hum Reprod 6, 1055-1062.
138
MANUSCRITO
139
PREFERENTIAL MEIOTIC SEGREGATION CONFIRMED BY
PREIMPLANTATION GENETIC DIAGNOSIS
Juliana F. Cuzzi
(1)
; Lúcia Martelli
(1)
; Claudia G. Petersen
(2)
; Ana L. Mauri
(2)
; Ricardo L. R. Baruffi
(2)
; José G. Franco Jr.
(2)
(1)
Department of Genetics, School of Medicine of Ribeirão Preto – University of São Paulo,
Brazil
(2)
Center of Human Reproduction, Sinhá Junqueira Maternity Hospital, Ribeirão Preto, São
Paulo, Brazil
Running tittle: PGD for balanced translocations
Juliana Fabrícia Cuzzi
Dept. Genetics, School of Medicine of Ribeirao Preto, USP
Av Bandeirantes, 3900.
Ribeirao Preto-SP, Brazil
14040-030
Phone: +55 16 602-3081 / Fax: +55 16 633-1610
e-mail: [email protected]
140
ABSTRACT
Chromosome translocations can originate abnormal gametes which are responsible for
embryos with unbalanced karyotypes and, consequently, for first trimester abortions, fetal losses
or malformed liveborns due to a variety of chromosomal syndromes. Preimplantation genetic
diagnosis (PGD) is an early form of prenatal diagnosis, which makes it possible to detect genetic
disorders in oocytes and human embryos. In this study, we have performed PGD in two young
couples who presented 2 miscarriages, both due to a maternal reciprocal translocation. In the
first couple (A), the woman was the carrier of a Robertsonian translocation involving
chromosomes 13 and 14, with karyotype 45,XX,der(13;14)(q10;q10). In the second (couple B),
the reciprocal balanced translocation involves the chromosomes 7 and 18, with karyotype
46,XX,t(7;18)(q31;q22). Our objective was to establish a molecular cytogenetic diagnosis, to
indicate the transfer of normal embryos. In Couple A, seven embryos were biopsied at the 6–10-
cell stage, and 8 intact blastomeres were obtained and spread individually. During fixation, no
nuclei were observed in 2 blastomeres removed from distinct embryos, and 6 nuclei were
submitted to fluorescent in situ hybridization (FISH) technique, using 14q telomeric and LSI –
13q14 probes. The hybridization index was 100%. All nuclei showed 2 signals corresponding to
chromosome 14, but presented aneuploidy of chromosome 13, three of them being monosomic
and two trisomic. In Couple B, five embryos were biopsied and 5 intact blastomeres were
obtained and submitted to FISH technique, using 7q telomeric and 18q telomeric probes. All
nuclei showed 2 signals related to chromosome 18 and aneuploidy of chromosome 7, three of
them being trisomic and two monosomic. Therefore, the transfer of the embryos was not
indicated in both cases. The PGD results suggested that these women are developing a
preferential meiotic segregation being all oocytes abnormal for one of the involved
chromosomes. PGD made it possible not only the embryos selection, as the definition of the risk
for the offspring, preventing embryo implantation failure, fetal losses or affected newborns.
Key Words: PGD, Robertsonian Translocation, Meiotic Segregation
141
INTRODUCTION
Balanced translocations occur in 0.2% of the newborn population, but cytogenetic
investigations have shown that the frequency of translocations is higher in couples with
recurrent spontaneous abortions. Reciprocal translocations are usually phenotypically
harmless, since there is a balanced gene complement. Translocations, however, are
associated with the production of a large number of gametes with an unbalanced genetic
complement and therefore with an increased potential for one or more spontaneous
abortions or phenotypically abnormal liveborns.
According to Stern et al. (1999), balanced translocations were found in 0.6% of
infertile couples, in 3.2% of couples who failed more than 10 IVF cycles, and in 9.2% of
fertile couples who experienced three or more consecutive first trimester abortions. The
frequency of Robertsonian translocations was around 0.7%, usually carried by the mother.
Preimplantation genetic diagnosis (PGD) is a very early form of prenatal diagnosis
that makes the detection of hereditary genetic diseases possible in human embryos.
However, only 25% of the blastomere nuclei show metaphase chromosomes after anti-
meiotic treatment, and even fewer nuclei show banding quality chromosomes (Santaló et al.,
1995). For this reason, several techniques involving alternative ways to obtain metaphase
stage chromosomes have been developed. Whenever metaphases are not available,
diagnosis is made using FISH technique in interphase nuclei.
Preimplantation genetic diagnosis (PGD) can be offered to carriers
of balanced
translocations to reduce the risk of the unbalanced
transmission of aberrant chromosomes.
PGD can thus reduce the
risk of chromosomally abnormal offspring, reduce the frequency
of miscarriages and, as a result, increase the baby take home
rate. In 2001, the ESHRE
consortium has reported 51 PGD cycles for
carriers of Robertsonian translocations and 96
PGD cycles for
carriers of balanced reciprocal translocations (ESHRE PGD Consortium
142
Steering Committee, 2002). The large majority of reciprocal
translocations are terminal
translocations. It is well established
that reciprocal translocations form quadrivalents during
meiosis
which, in turn, lead to a higher incidence of chromosomal anomalies
(Goldman and
Hulten, 1993; Martin and Hulten, 1993). Not only can the 2:2 segregants be unbalanced
for
the translocation chromosomes, but also a higher incidence
of 3:1 segregants resulting in
aneuploidy for the abnormal chromosomes
was observed. PGD of such translocations has
been performed by fluorescence
in situ hybridization (FISH), using a variety of approaches
(Scriven et al., 1998). The most
common approach is FISH on blastomeres, with specific
probes
spanning the breakpoints of each translocation (Munné
et al., 1998).
Another possibility is the spectral karyotyping, used to identify all 23 chromosomes
in polar bodies, but this technique requires well-spread chromosomes in order to identify
each one of them (Márquez et al., 1998). Having observed that more than 90% first polar
bodies fixed up to six hours after retrieval were at the metaphase stage, Munné et al. (1998)
proposed metaphase analysis of first polar bodies. However, this approach presents some
problems, like the occurrence of crossing-over and predivision of chromatids, interstitial
crossover with subsequent segregation of balanced and unbalanced sets of chromosomes
during the second meiotic division, and the state of condensation of polar body
chromosomes, making difficult the diagnosis of terminal translocations.
Willadsen et al. (1999) described another method of obtaining metaphase
chromosomes, but from blastomeres. Human blastomeres were fused with enucleated cow
oocytes, and the nuclei changed to metaphase. The fused blastomeres can be either banded
or analyzed with painting probes or spectral karyotyping.
Considering all the technical difficulties and the time-consuming, the FISH
technique is the best choice for PGD of translocations.
143
In our study, we describe the development of PGD in two couples where the
women are the carriers of a Robertsonian translocation between chromosomes 13 and 14
and a apparently balanced translocation between chromosomes 7 and 18. The protocol
involved hybridization of specific probes with interphase nuclei obtained from embryos at
the third day of in vitro development. The objective was to detect embryos with
aneuploidies and unbalanced karyotypes, to avoid implantation failure, abortion or fetal
loss.
144
SUBJECTS AND METHODS
Patients
Both non consanguineous couples was referred to Human Reproduction Centre
presenting two miscarriages due to maternal balanced translocations. Investigative protocol
for infertility has excluded hormonal, biochemical and immunological etiologic fators.
Blastomere biopsy and spreading
Embryos at the 7–10-cell stage were placed in oil 25µL drops of magnesium and
calcium-free medium. Each embryo was immobilized against a holding pipette, and an
opening was made in the zona pellucida using laser (15 to 25 milli seconds of irradiation
time). The blastomere was extracted using a biopsy pipette controlled by a Narashige IM-6
microinjector. The biopsied embryos returned to culture, and the isolated blastomeres were
fixed on to slides using a spreading solution (0.01 HCl/ 1%Tween 20) at 37
o
C. The
blastomere was constantly observed under an inverted microscope, and, after lysis, the
spreading solution was removed. Slides were dried for 1h at room temperature, and then
FISH was carried out.
FISH technique
Slides were washed in PBS for 5 min and then fixed in Carnoy solution at 4
o
C for
10 min. After fixation, the slides were rinsed once in PBS, then twice in bi-distilled water,
and then dehydrated in an ethanol series (70% - 90% - 100%). For the Couple A, seven
embryos were biopsied and 6 nuclei were submitted to fluorescent in situ hybridization
145
(FISH) technique, using 14q telomeric and LSI – 13q14 probes. Regarding the Couple B,
five embryos were biopsied and 5 blastomeres were obtained and submitted to FISH
technique, using 7q and 18q telomeric probes.
The hybridization mixture (3.0 µL probe and 7.0 µL of buffer from Vysis, Inc.) was added
to the slide under a cover slip. Nuclear DNA and probes were denatured simultaneously
for 2 min at 75
o
C. The slides were then incubated overnight in a moist chamber at 37
o
C, to
allow hybridization with the DNA probes. After hybridization, the slides were washed two
times with 50% formamide/ 2 x SSC, 5 min each, and with 2 x SSC for 5 min at 42
o
C,
followed by two additional washes with 2 x SSC/ 0,1% NP40, 2 min each at room
temperature, and then dehydrated in an ethanol series (70-90-100%). Then the slides were
counterstained with DAPI and examined using a Zeiss epifluorescence microscope.
146
RESULTS
The results are summarized in table 1 and 2. The table 1 shows the FISH results
for single blastomeres related to Couple A. A total of 7 embryos were biopsied, and 8
intact blastomeres were obtained. We did not observe nuclei in 2 blastomeres (blastomeres
4 and 5). From the 8 blastomeres spread, 6 nuclei were obtained, giving a spreading
efficiency of 75%. All 6 nuclei exhibited a FISH signal, 100% per nucleus and 75% per
blastomere. All nuclei were normal regarding chromosome 14, but abnormal regarding
chromosome 13. In this case, none of the embryos was indicated for transfer. Table 2
resume the FISH results for single blastomeres in Couple B. Five embryos were biopsied,
we had 5 blastomeres spreaded (100% of spreading eficiency) and 4 nuclei showed FISH
conclusive signals. In this case we had 80% of hybridation efficiency. All nuclei were
normal regarding chromosome 18, but abnormal regarding chromosome 7. As we
determineted for couple A, we did not indicate embryo transfer for couple B.
147
DISCUSSION
The present study describes a preimplantation genetic diagnosis (PGD) approach to
a Robertsonian translocation and a balanced tranlocation of maternal origin. PGD was
based on FISH analysis using specific probes in interphase nuclei to select euploid
embryos, aiming at ensuring a normal pregnancy. This procedure does not allow
differentiating normal from balanced embryos, so both should be transferred.
Ten embryos reported here were aneuploidies (trisomic or monosomic) for
chromosome 13 (couple A) or chromosome 18 (couple B) due to adjacent mode of meiotic
segregation.
For most translocation carriers, consecutive pregnancy losses are the main
motivation for seeking PGD procedures. The unbalanced products of translocations are
usually incompatible with life, therefore increasing the risk of pregnancy loss. Some studies
have demonstrated that PGD substantially increases the chances of couples with
translocations of sustaining a pregnancy to full term.
Menezo et al. (1997) suggested that growing embryos to the blastocyst stage may
select against unbalanced embryos, but, according to Munné (2001), this procedure is
unreliable, at best because many unbalanced embryos, in this stage of development,
implant and are then spontaneously aborted.
The ten embryos reported here were aneuploid (trisomic or monosomic) for
chromosomes 13 and 7, due to the adjacent mode of meiotic segregation (Figures 1, 2, 3
and 4). The meiotic segregation patterns found in female Robertsonian translocations are
different from those described in male carriers, with higher rates of unbalanced gametes in
females than in males (Munné et al., 2000).
Little is known at the gamete and embryo level about chromosome segregation in
female carriers of balanced translocations. Data available on female translocation carriers
148
report only rates of spontaneous abortions and live births. Since most unbalanced
segregations have to be considered as lethal, no reliable information is available on female
segregation of translocations. PGD of translocations should provide important information
regarding this subject; in particular, it will be very informative for Robertsonian
translocations and for reciprocal translocations of patients producing large cohorts of
oocytes.
Ogilvie and Scriven (2002) presented data collected from 25 PGD cycles of 18
couples carrying 15 different reciprocal translocations. Overall, 47.7% of the embryos
tested showed signal patterns consistent with alternate segregation, 24.8% with adjacent-1
segregation, 10.1% with adjacent-2 segregation, and 17.4% others. The frequencies of
alternate and adjacent-1 segregation were similar in male and female carriers; however,
5.7% of the embryos from female translocation carriers showed adjacent-2 segregation,
while the corresponding figure for male carriers was 4.5%.
According to Boué and Gallano (1984), amniocenteses from carriers of 45,XY,
der(14;21)(q10;q10) and 45,XY,der(21;22)(q10;q10) karyotypes showed almost no
unbalanced karyotypes when the origin was paternal, but 15% when it was maternal. In
1998, Munné et al. published a PGD study on translocations of maternal origin in polar
bodies, concluding that 23% of the oocytes were unbalanced.
This is the first Brazilian report of preimplantation genetic diagnosis (PGD) of a
balanced translocation and shows that the PGD approach applied to these couples was
efficient for diagnosis of unbalanced abnormalities. All tested embryos were originated
from meiotic adjacent segregation oocytes. Our findings confirmed that, in maternal
translocations, the rate of abnormal embryos can be 100% due to a preerential mechanism
of meiotic segregation.
149
REFERENCES
Boué A and Gallano P (1984) Collaborative study of the segregation of inherited
chromosome structural rearrangements in 1356 prenatal diagnoses. Prenat Diagn 4:
45-67.
ESHRE PGD Consortium Steering Committee (2002) ESHRE Preimplantation Genetic
Diagnosis Consortium: data collection III (May 2001). Hum Reprod 17, 233–246.
Goldman AS and Hulten MA (1993) Analysis of chiasma frequency and first meiotic
segregation in a human male reciprocal translocation heterozygote,
t(1;11)(p36.3;q13.1), using fluorescence in situ hybridisation. Cytogenet Cell Genet
63, 16–23.
Márquez C, Cohen J and Munné S (1998) Chromosome identification on human oocytes
and polar bodies by spectral karyotyping. Cytogenet Cell Genet 81: 254-258.
Martin RH and Hulten M (1993) Chromosome complements in 695 sperm from three men
heterozygous for reciprocal translocations, and a review of the literature. Hereditas
118, 165–175
Menezo YJ, Bellec V, Zaroukian A and Benkhalifa M (1997) Embryo selection by IVF, co-
culture and transfer at the blastocyst stage in case of translocation. Hum Reprod.
12(12):2802-3.
Munné S (2001) Preimplantation genetic diagnosis of structural abnormalities. Mol Cell
End 183: 55-58.
Munné S, Sandalinas M, Escudero T, Fung J, Gianaroli L and Cohen J (2000) Outcome of
preimplantation genetic diagnosis of translocations. Fertil Steril 73: 1209-1218.
150
Munné S, Scott R, Sable D and Cohen J (1998) First pregnancies after preconception
diagnosis of translocations of maternal origin. Fertil Steril 69: 675-681.
Munné S, Fung J, Cassel MJ, Marquez C and Weier HU (1998) Preimplantation genetic
analysis of translocations: case-specific probes for interphase cell analysis. Hum
Genet 102, 663–674
Ogilvie CM and Scriven PN (2002) Meiotic outcomes in reciprocal translocation carriers
ascertained in 3-day human embryos. Eur J Hum Genet 10: 801-6.
Santaló J, Veiga A, Calafell JM, Calderon G, Vidal F, Barri, PN et al. (1995) Evaluation of
cytogenetic analysis for clinical preimplantation diagnosis. Fertil Steril 64: 44-50.
Scriven PN, Handyside AH and Ogilvie CM (1998) Chromosome translocations:
segregation modes and strategies for preimplantation genetic diagnosis. Prenat Diagn
18, 1437–1449
Stern C, Pertile M, Noris H, Hale L and Baker HWG (1999) Chromosome translocations
in couples with in vitro fertilization implantation failure. Hum Reprod 14: 2097-101.
Willadsen S, Levron J, Munné S, Schimmel T, Márquez C, Scott R, Cohen J (1999) Rapid
visualization of metaphase chromosomes in single human blastomeres after fusion
with in vitro matured bovine eggs. Hum Reprod 2: 470-475.
151
LEGENDS
Table 1. Fluorescent in situ hybridization (FISH) results using directly labeled
probes for chromosomes 13 (LSI 13q14) and 14 (tel 14q) on interphase nuclei obtained by
biopsy from couple A blastomeres.
Table 2. Fluorescent in situ hybridization (FISH) results using directly labelled
probes for chromosomes 7 (tel 7q) and 18 (tel 18q) on interphase nuclei obtained by biopsy
from couple B blastomeres.
Figure 1: Monosomic nucleus, 2 red signals corresponding to the telomeric
14q probe and 1 green signal corresponding to LSI 13q14.
Figure 2: Trisomic nucleus, 2 red signals corresponding to the telomeric 14q
probe and 3 green signals corresponding to LSI 13q14.
152
Table 1: Fluorescent in situ hybridization (FISH) results using directly labeled
probes for chromosomes 13 (LSI 13q14) and 14 (tel 14q) on interphase nuclei
obtained by biopsy from human blastomeres.
Blastomere
Reference
Nuclei
Reference
Probes signals
13 14
FISH result
1
1A
3 signals
2 signals TRISOMY 13
2
2A
1 signal
2 signals MONOSOMY 13
3 3A
1signal
2 signals MONOSOMY 13
6 6A
1signal
2 signals MONOSOMY 13
7
7A
7B
3 signals
3 signals
2 signals
2 signals
TRISOMY 13
TRISOMY 13
153
Table 2. Fluorescent in situ hybridization (FISH) results using directly labelled probes for
chromosomes 7 (tel 7q) and 18 (tel 18q) on interphase nuclei obtained by biopsy from
couple B blastomeres.
Blastomere
Reference
Nuclei
Reference
Probes signals
7 18
FISH result
1 1A 1 signal 2 signals MONOSOMY 7
2 2A 3 signals 2 signals TRISOMY 7
3 2A 3 signals 2 siagnals TRISOMY 7
4 4A - - INCONCLUSIVE
5 5A 3 signals 2 signals TRISOMY 7
154
Figure 1: Monosomic nucleus, 2 red signals corresponding to the telomeric 14q probe
and 1 green signal corresponding to LSI 13q14.
Figure 2: Trisomic nucleus, 2 red signals corresponding to the telomeric 14q probe and
3 green signals corresponding to LSI 13q14
155
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