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UNIVERSIDADE FEDERAL DE OURO PRETO
INSTITUTO DE CIÊNCIAS EXATAS E BIOLÓGICAS
DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
Caracterização inicial dos constituintes da
maquinaria de silenciamento gênico mediada por
microRNAs em Schistosoma mansoni
AUTOR: MATHEUS DE SOUZA GOMES
ORIENTADORA: PROF
a
. Dr
a
. RENATA GUERRA DE SÁ
CO-ORIENTADOR: PROF. Dr. ELIO HIDEO BABÁ
Dissertação submetida ao programa
de Pós-Graduação do Departamento
de Ciências Biológicas da
Universidade Federal de Ouro Preto,
como parte integrante dos requisitos
para obtenção do título de mestre em
Ciências Biológicas, área de
concentração Biologia Molecular.
Ouro Preto - MG, janeiro de 2008
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Milhares de livros grátis para download.
Catalogação:
G633c Gomes, Matheus de Souza.
Caracterização inicial dos constituintes da maquinaria de silenciamento
gênico mediada por microRNAs em Schistosoma mansoni [manuscrito] /
Matheus de Souza Gomes. - 2008.
112f.: il., color; graf.; tabs.; mapas.
Orientadora: Profa. Dra. Renata Guerra de Sá
Co-orientador: Prof. Dr. Elio Hideo Babá.
Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal de Ouro Preto.
Instituto de Ciências Exatas e Biológicas. Núcleo de Pesquisas em
Ciências Biológicas.
Área de concentração: Biologia molecular.
1. Schistosoma mansoni - Teses. 2. Código genético - Teses.
3. Reação em cadeia de polimerase - Teses. I. Universidade Federal de
Ouro Preto. II. Título.
CDU: 616.995.122
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Este trabalho foi desenvolvido no Laboratório de Bioquímica e Biologia Molecular
ICEB/NUPEB/UFOP, Centro de Pesquisa René-Rachou, Fiocruz-MG, e Faculdade de
Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, com apoio financeiro da
Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES).
Dedico esta dissertação aos meus pais, Luiz
e Rosânia, aos meus irmãos, Marcos, Júlia e
Daniela, aos meus avós, e familiares e a
minha querida Carol. Agradeço a todos pelo
apoio e compreensão, durante todo meu
percurso, e espero ainda mais, pois muito
caminho tenho ainda a percorrer.
"A felicidade não depende do que nos falta,
mas do bom uso que fazemos do que
temos."
- Thomas Hardy
Agradecimentos
A Deus;
Aos meus pais, Luiz e Rosânia, por serem meus exemplos de vida, humildade e
persistência, sempre indicando o caminho certo a trilhar, fazendo o bem;
À minhas queridas irmãs, Daniela e Júlia, pelo apoio e amor incondicionais, sempre
mostrando um ombro amigo para me acolher.
Ao meu irmão Marcos pela grande amizade, amor, companheirismo e, sobretudo, por
me ajudar e incentivar nos momentos mais difíceis.
Aos demais familiares, pelo carinho, preocupação e por me apoiar sempre;
Ao meu amor Carol, minha futura esposa, pela dedicação, compreensão, auxílio e,
sobretudo, por ter paciência e sabedoria, contribuindo imensuravelmente para realização
deste trabalho;
À família da Carol, seus pais e sua irmã Clarissa pelo incentivo e em especial Dona Lili
pela paciência e acolhimento, sendo importantes para finalização deste trabalho;
À Prof.
a
Dr.
a
Renata Guerra de Sá, pelos ensinamentos práticos e teóricos e pelo
exemplo de dedicação e profissionalismo. Pela minha formação como pesquisador e
como aprendiz de professor. E principalmente, por mostrar que, para conseguir,
primeiro, temos que sonhar.
Ao professor Dr. Elio Hideo Babá, pelo exemplo de pesquisador e professor. Pelos
ensinamentos na pesquisa e na vida. Por sempre se mostrar disposto a ajudar. E,
sobretudo, por ter aberto as portas do laboratório para mim, me acolhendo como parte
integrante desta família LBBM.
Aos professores Lucinha e Elísio pelo convívio agradável e aprendizado científico
transmitido.
Aos amigos da equipe do Laboratório de Bioquímica e Biologia Molecular (LBBM) da
UFOP, Daniel, Eneida, Gustavo, Leonardo, Leandro, Leandro Gonzaga, Michelini.
Míriam, Naiara, Natália, Nayara, Roberta, Robs, Thiago, Vanessa, pelo auxílio e
momentos compartilhados;
Ao Roenick, Letícia, Cássio e Nilza, pelas trocas de conselhos, pela amizade,
disponibilidade e, sobretudo, por toda ajuda nos serviços laboratoriais e extras
laboratoriais.
Ao Ezequiel pelo auxílio no trabalho e pelas boas risadas;
À Helaine pelas horas de trabalho compartilhadas, pela ajuda nos problemas
encontrados e pelos ensinamentos na realização deste trabalho;
À Claudinha pelo exemplo de profissionalismo, persistência, e organização, auxilando
imensamente em minha formação como pesquisador.
Aos professores Liana Janotti e Omar Carvalho, por gentilmente fornecer junto ao
moluscário os parasitos para a realização deste trabalho.
Ao moluscário do CPqRR em especial a Delza, Dilce e Sueleny pela disponibilização
dos parasitos, e paciência em responder as perguntas.
Ao professor Vanderlei Rodrigues e sua equipe da Faculdade de Medicina de Ribeirão
Preto (USP) pela oportunidade e grande colaboração nos experimentos ,em especial,
Fernanda, pelo auxílio na bancada, pelo acolhimento e pela amizade.
Aos colegas de pós-graduação, em especial, Carlito, Fabiana, Mônica, Ramon e Roberta
pelo companheirismo e pelos momentos de troca de conhecimento e risadas.
A todos do Laboratório de Imunoparasitologia da UFOP pelo grande suporte e auxílio
para meu crescimento científico.
A todos os professores do NUPEB, pela receptividade em seus Laboratórios;
A todos os amigos dos laboratórios do NUPEB pela saudável convivência contribuindo
para a realização deste trabalho;
À Cida, secretária prestativa, atenciosa e alegre sempre pronta para ajudar;
A República Tira Mágoa, moradores e ex-moradores, pela convivência, apoio e,
sobretudo, pelos momentos de descontração, aprendizado de vida, amizade e
cumplicidade.
Às seguintes instituições que colaboraram com recursos financeiros para a realização
deste trabalho: CNPq, CAPES e FAPEMIG.
E por todos aqueles que participaram direta ou indiretamente na realização deste
trabalho.
Resumo .............................................................................................................................1
Abstract.............................................................................................................................2
Lista de abreviaturas..........................................................................................................3
Lista de Figuras e tabelas..................................................................................................5
1. Introdução ................................................................................................................. 15
1.1 Aspectos gerais da Esquistossomose .................................................................... 16
1.2 O S. mansoni ......................................................................................................... 16
1.3 Genoma do parasito .............................................................................................. 18
1.4 Regulação da expressão gênica em S. mansoni .................................................... 20
1.5 Silenciamento gênico mediado por microRNA .................................................... 22
2. Objetivos .....................................................................................................................29
2.1 Objetivos Gerais ....................................................................................................30
2.1 Objetivos Específicos ........................................................................................... 30
3. Materiais e Métodos ................................................................................................. 31
3.1 Parasitos ................................................................................................................ 32
3.1.1 Esquistossômulos transformados mecanicamente ......................................... 32
3.2 Anotação da via de miRNA .................................................................................. 33
3.3- Alinhamentos entre seqüências e Análise filogenética ....................................... 34
3.4 Extração do DNA genômico................................................................................. 36
3.5 Extração de RNA total para RT-PCR ................................................................... 37
3.6 Extração do RNA total para PCR quantitativo em tempo real ............................. 37
3.7 Verificação da qualidade do RNA total extraído.................................................. 38
3.8 Quantificação de DNA e RNA ............................................................................. 39
3.9 Oligonucleotídeos iniciadores (Primers) .............................................................. 40
3.10 PCR (Reação da Polimerase em Cadeia) ............................................................ 40
3.10.1 PCR convencional ....................................................................................... 40
3.10.2 RT-PCR ....................................................................................................... 41
3.10.3 PCR quantitaviva em Tempo Real .............................................................. 41
3.11 Análise Estatística. ............................................................................................. 42
3.12 Verificação da qualidade do DNA ou cDNA ..................................................... 42
3.13 Purificação do produto de PCR .......................................................................... 42
3.13.1 FREEZE SQUEZE ...................................................................................... 42
3.14 Clonagem ............................................................................................................ 43
3.14.1 Reação de Ligação ....................................................................................... 43
3.14.2 Preparo de células competentes ................................................................... 43
3.14.3 Transformação Bacteriana ........................................................................... 44
3.14.4 PCR de Colônia ........................................................................................... 44
3.14.5 Minipreparação ............................................................................................ 44
3.14.4 PCR de Colônia ........................................................................................... 44
3.15 Sequenciamento .................................................................................................. 46
3.16 Análise computacional das seqüências ............................................................... 46
3.16.1 Seqüência consenso ..................................................................................... 46
3.16.2 Splicing alternativo ...................................................................................... 46
3.17 V Predição de miRNA ........................................................................................ 46
4 Resultados .................................................................................................................. 48
4.1 Reconstituição in silico da via de miRNA............................................................ 49
4.1.1 Análise in silico dos constituintes da via de miRNA .................................... 49
4.1.2 Análise das ESTs ........................................................................................... 61
4.1.3 Análise Filogenética das RNAse III e Argonautas ........................................ 67
4.1.4 Análise dos domínios conservados PIWI e endoND ..................................... 70
4.1.5 Análise de SmAgo4 ....................................................................................... 71
4.1.6 miRNAs preditos ........................................................................................... 73
4.2 Clonagem e seqüenciamento parcial da SmDicer1 ............................................... 73
4.3 Clonagem e seqüenciamento parcial de SmAgo5 ................................................. 74
4.4 Splicing Alternativo .............................................................................................. 76
4.5 Análise da expressão dos genes que codificam SmDicer1 e SmAgo2/3/4 utilizando
qRT-PCR ............................................................................................................ 79
5. Discussão ................................................................................................................... 82
5.1 Família das RNAse III .......................................................................................... 87
5.2 Família das Argonautas ........................................................................................ 88
5.3 Outras proteínas envolvidas na via de miRNA .................................................... 92
5.4 MiRNAs preditos .................................................................................................. 94
6. Conclusão .................................................................................................................. 96
7. Bibliografia ................................................................................................................ 98
8. Anexo ....................................................................................................................... 108
8.1 Anexo 1 .............................................................................................................. 109
8.2 Anexo 2 .............................................................................................................. 110
8.3 Anexo 3 .............................................................................................................. 111
8.4 Anexo 4 .............................................................................................................. 112
Resumo
1
O silenciamento de RNA refere-se a uma série de processos nucleares e
citoplasmáticos envolvidos na regulação da expressão gênica pós-transcricional ou
silenciamento pós-transcricional (PTGS), degradando ou silenciando seqüências
específicas de mRNA. O mecanismo é conservado em animais incluindo alguns pontos
distintos e vários pontos coincidentes, envolvidos tanto no silenciamento de pequenos
RNAs por via endógena quanto por via exógena. O pequeno RNA melhor caracterizado
é o microRNA (miRNAs), que predominantemente silencia genes através de uma
regulação pós-transcricional. Neste trabalho, utilizamos bioinformática para identificar
possíveis genes envolvidos na via de silenciamento gênico pós-transcricional mediado
por miRNA em S. mansoni. Nós pesquisamos os bancos de dados do genoma e do
transcriptoma de S. mansoni, com as seqüências de aminoácidos proteínas ortólogas
relacionadas à via de miRNA. Identificamos o total de 13 prováveis proteínas
envolvidas na via miRNA no parasito.
Em seguida, o níveis de SmDicer1 e SmAgo 2, 3 e 4 foram identificados por
qRT-PCR utilizando cercárias, vermes adultos, ovos e esquistossômulos com os
seguintes períodos de cultivo in vitro 3,5; 8,5; 18,5; 24; 48 e 72 horas. Este resultado
demonstrou que, os dois genes são diferencialmente expressos através do período de
diferenciação cercária-esquistossômulo, tendo níveis similares em ovos e vermes
adultos. Em cercárias SmDicer1 tem baixa expressão. Estes resultados sugerem que esta
via é um importante mecanismo de regulação da expressão gênica neste parasita.
Futuros experimentos são necessários para provar esta hipótese.
Abstract
2
RNA silencing refers to a series of nuclear and cytoplasmatic processes involved
in the post-transcriptional regulation of gene expression or post-transcriptional gene
silencing (PTGS), either by sequence-specific mRNA degradation or by translational
arrest. The mechanism is conserved in animals and includes at least distinct pathways
with several overlapping points, involved on silencing of endogenous or exogenous
sequences. The best characterized small RNA is microRNAs (miRNAs), which
predominantly makes genes silencing through post-transcriptional mechanisms. In this
work we used bioinformatics approach to identity gene products in parasitic trematode
S. mansoni with sharing similarities with enzymes involved in the post-transcriptional
gene silencing mediated by miRNA pathway. We searched the S. mansoni genome and
transcriptome databases, with the amino acid sequences of othologs proteins related to
the miRNA pathway. We identified the total of 13 putative proteins involved in miRNA
pathway in the parasite.
Next, the levels of SmDicer1 and SmAgo 2, 3 and 4 were identified by qRT-PCR
using cercariae, adult worms, eggs and schistosomula with the following times of in
vitro cultivation 3,5; 8,5; 18,5; 24; 48 and 72 hours. This results shown that, the two
genes are differentially expressed through cercariae-schistosomula differenciation, and
have similar levels in eggs, and adult worms. In cercariae SmDicer1 is down-regulated.
These results suggest that this pathway is an important mechanism for the regulation of
gene expression in this parasite. Future experiments are needed to prove this hypothesis.
Lista de abreviaturas
3
Lista de Abreviaturas
BSA ............................................... Albumina sérica bovina
cDNA ............................................... DNA complementar
DNA
...............................................
Ácido desorribonucleico
RNA
...............................................
Ácido ribonucleico
DEPC
...............................................
Dietilpirocarbonato
dNTP
...............................................
Deoxinucleotídeo trifosfato (N= A, C, G
ou T)
MOPS
...............................................
[Ácido 3-(N-Mofolino)Propanosulfônico]
mRNA
...............................................
RNA mensageiro
BLAST
...............................................
Basic Local Alignment and Search Tool
CDD
...............................................
Conserved domain database
CTAB
...............................................
Brometo de cetil-trimetil amônio
Tris
...............................................
Tris-hidroximetilaminometano
EST
...............................................
Etiquetas de seqüências expressas
IPTG
...............................................
Isopropylthio-β-galactoside
LB
...............................................
Meio de cultura Luria Bertani
PCR
...............................................
Reação em Cadeia da Polimerase
PB
...............................................
Pares de Bases
Open
Reading
Frame
...............................................
Fase Aberta de Leitura
RT-PCR
...............................................
Transcriptase Reversa – Reação
Polimerásica em Cadeia
Q.S.P
...............................................
Quantidade suficiente para
NaCl
...............................................
Cloreto de Sódio
MgCl
2
...............................................
Cloreto de Magnésio
NaOAc
...............................................
Acetato de sódio
MgSO
4
...............................................
Sulfato de magnésio
EDTA
...............................................
Ácido etilenodiaminotetracético
CaCl
2
...............................................
Cloreto de cálcio
SDS
...............................................
Sodio Dodecil Sulfato
Lista de abreviaturas
4
NaOH
...............................................
Hidróxido de sódio
pH
...............................................
Potencial hidrogeniônico
miRNA
...............................................
MicroRNA
siRNA
...............................................
Small interfering RNA
WHO
...............................................
World Health Organization –
Organização Mundial de Saúde
CNPq
...............................................
Conselho Nacional de Desenvolvimento
Científico e Tecnológico
FAPEMIG
...............................................
Fundação de Amparo a Pesquisa de
Minas Gerais
NCBI ............................................... National Center for Biotechnology
Information
Lista de tabelas e figuras
5
Figura 1: Ciclo de vida do S. mansoni. Dentro do seu hospedeiro vertebrado, as
formas larvais (esquistossômulo, B) dão origem a parasitos sexualmente maduros
(verme adulto, A), os quais se acasalam e produzem ovos (C) que são liberados para o
meio aquático. Os ovos eclodem (D) e liberam os miracídios (E), que penetram nos
caramujos, dando origem a numerosos esporocistos (F). Os esporocistos geram
cercárias (G) que saem do caramujo e são liberadas na água, as quais são as formas
infectantes para o hospedeiro vertebrado (Adaptado de Wilson, 1979).
Figura 2: Expressão gênica estágio-específicas em S. mansoni. Genes altamente
expressos estágio-específicos baseado nos projetos transcriptoma do parasito. Adaptado
de Hu e cols., 2004.
Figura 3: Prováveis pré-miRNAs correspondentes a lin-4 and let-7 de C. elegans.
As seqüências maduras dos miRNAs estão em vermelho próximo da extremidade 5’ do
pré-miRNA (Adaptado de Lee 1993).
Figure 4: Biogênese de miRNAs e siRNAs. A biogênese de miRNA ocorre em
dois passos distintos: um nuclear e outro citoplasmático, sendo finalizada quando uma
das fitas do duplex encontra RISC e seu respectivo mRNA alvo. Por outro lado, a via de
siRNA, ocorre apenas no citoplasma e o silenciamento do mRNA alvo, mediado por
ambas as fitas do duplex (Adaptado de Bartel, 2004).
Figura 5: Preparação de esquistossômulos de 24 horas. Os esquistossômulos
foram cultivados por 24 horas em estufa de CO
2
5% a 37ºC em meio 169 analisados em
lupa de aumento.
Figura 6: DNA genômico de verme adulto. Foram aplicados no gel
aproximadamente 2 µg de DNA e analisados em gel de agarose 0,6% e corado com
brometo de etídio.
Figura 7: Análise em gel de agarose/formaldeído a 1%. RNA total para RT-PCR
obtido a partir de vermes adultos (1), cercárias (2), esquistossômulos 3,0 horas (3);
esquistossômulos 8,5 horas (4); esquistossômulos 18,5 horas (5); esquistossômulos 24
horas (6); esquistossômulos 48 horas (7); esquistossômulos 72 horas (8); ovos (9)
Figura 8: Análise em gel de agarose/formaldeído a 1%. RNA total para PCR em
tempo real obtido a partir de vermes adultos (1), cercárias (2), esquistossômulos 3,0
Lista de tabelas e figuras
6
horas (3); esquistossômulos 8,5 horas (4); esquistossômulos 18,5 horas (5);
esquistossômulos 24 horas (6); esquistossômulos 48 horas (7); esquistossômulos 72
horas (8); ovos (9)
Figura 9: Análise da minipreparação dos clones em gel de agarose a 0,8%. Cerca
de 5 µL da minipreparação foram analisados em gel de agarose e corado com brometo
de etídeo.
Figura 10: Esquema dos domínios conservados, da região codificadora da
proteína SmDicer1 (Smp_169750).
Figura 11: Esquema dos domínios conservados, da região codificadora da enzima
SmDrosha1 (Smp_142510.1).
Figura 12: Esquema dos domínios conservados, da região codificadora da enzima
SmDrosha2 (Smp_142510.2).
Figura 13: Esquema dos domínios conservados, da região codificadora da enzima
SmAgo1 (Smp_140010).
Figura 14: Esquema dos domínios conservados, da região codificadora da enzima
SmAgo2 (Smp_179320).
Figura 15: Esquema dos domínios conservados, da região codificadora da enzima
SmAgo3 (Smp_102690.2).
Figura 16: Esquema dos domínios conservados, da região codificadora da enzima
SmAgo4 (Smp_102690.3).
Figura 17: Esquema dos domínios conservados, da região codificadora da enzima
SmFmr1 (Smp_099630).
Figura 18: Esquema dos domínios conservados, da região codificadora da enzima
SmTudor-SN (Sm01663).
Figura 19: Esquema dos domínios conservados, da região codificadora da enzima
SmPasha (Smp_087220).
Lista de tabelas e figuras
7
Figura 20: Esquema dos domínios conservados, da região codificadora da enzima
SmExportina5.1 (Smp_152800.1).
Figura 21: Esquema dos domínios conservados, da região codificadora da enzima
SmExportina5.2 (Smp_152800.2).
Figura 22: Esquema dos domínios conservados, da região codificadora da enzima
SmLoquacious (Smp_023670).
Figura 23 – Árvore filogenética consenso baseada na sequências de aminoácidos
do domínio endoND2. A construção da árvore e a análise do “bootstrap” foram
realizadas nos programas ClustalX 2,0 e MEGA 4.0. Para árvore consenso e
confiabilidade dos ramos formados foi utilizado o teste de filogenia bootstrap,
utilizando 1000 réplicas para cada sequência, sendo 60% o mínimo para se considerar o
ramo confiável. O primeiro colchete representa as proteínas da subfamília Dicer1, o
segundo da subfamília Dicer2 e a terceira da subfamília Drosha. A barra representa o
número de aminoácidos que foram substituídos de uma sequencia para outra. Os
códigos de acesso referentes às seqüencias estão mostrados na seção Materiais e
Métodos.
Figura 24 – Árvore filogenética consenso baseada na seqüência de aminoácidos
do domínio PIWI. A construção da árvore e a análise do “bootstrap” foram realizadas
nos programas ClustalX 2.0 e MEGA 4.0. Para árvore consenso e confiabilidade dos
ramos formados foi utilizado o teste de filogenia bootstrap, utilizando 1000 réplicas
para cada sequência, sendo 60% o mínimo para se considerar o ramo confiável. O
primeiro colchete representa as proteínas da subfamília Ago, o segundo proteínas órfãs
sem definição de posicionamento na árvore e a terceira da subfamília PIWI. A barra
representa o número de aminoácidos que foram substituídos de uma seqüência para
outra. Os códigos de acesso referentes às seqüencias estão mostrados na seção Materiais
e Métodos.
Figure 25: Alinhamento do domínio PIWI e apresentação dos resíduos catalíticos
responsáveis pela função Slicer. Alinhamento entre as seqüências de aminoácidos do
domínio conservado PIWI presente nas proteínas Argonautas das espécies C. elegans,
D. melanogaster, Mus musculus, H. sapiens, A. thaliana e S. mansoni. Está marcado
com um bloco e indicado por uma seta os 3 resíduos catalíticos conservados, dois ácidos
Lista de tabelas e figuras
8
aspárticos e uma histidina (D/D/H), determinantes da função intrínseca Slicer
(RNAseH) das proteínas da família Argonauta. Os códigos de acesso referentes às
seqüencias estão mostrados na seção Materiais e Métodos.
Figura 26: Alinhamento dos dominios endoND da familia RNAse III e
apresentação dos resíduos catalíticos. Alinhamento entre as seqüências de aminoácidos
dos domínios conservados endoND1 e endoND2 das espécies H. sapiens, D.
melanosgaster, C. elegans, e S. mansoni. Está em letra maior e mais escuro os 4
resíduos catalíticos conservados, E/D e D/E, determinantes da função nucleásica das
proteínas da família RNAse III. Os códigos de acesso referentes às seqüencias estão
mostrados na seção Materiais e Métodos.
Figura 27: Esquema do DNA genômico, cDNA e proteína de SmAgo4. A Figura
mostra o DNA genômico contendo 13381 pares de base, divididos em 17 íntrons em
azul e 19 éxons em verde. O seu cDNA contendo 3102 pares de bases e a proteína 924
aminoácidos com os domínios conservados PIWI em azul e PAZ em vermelho. A seta
azul mostra o splicing na região 5’ não traduzida e a seta vermelha o sinal consenso de
cauda poli-A na região 3’ não traduzida.
Figura 28: Estrutura do pré-miRNA seus prováveis miRNAs processados. Está
predito pré-miRNA foi processada no programa disponível web Mfold 3.0 gerando uma
estrutura secundária com um delta G igual a -30,2 kcal/mol. Em vermelho e azul estão
os preditos miRNAs 1A e 1A*, respectivamente.
Figura 29: Amplificação por RT-PCR utilizando oligonucleotídeos específicos
para SmDicer1. cDNA parcial do domínio conservado endoND1 de SmDicer de
tamanho 469pb utilizando como molde cDNA de vermes adultos. Na primeira canaleta
padrão de peso molecular de 100 pb (Invitrogen). *Gel de agarose 1,2% e corado com
brometo de etídio.
Figura 30: Amplificação por RT-PCR e PCR convencional (molde DNA
genômico) utilizando oligonucleotídeos específicos para SmAgo5. cDNA parcial do
domínio conservado PIWI de SmAgo5 de tamanho 711pb utilizando como molde cDNA
de vermes adultos. DNA genômico parcial de SmAgo5 de tamanho 1283 pares de base.
Na primeira canaleta padrão de peso molecular de 100 pb (Invitrogen). *5µL do produto
de PCR foram analisados em gel de agarose.
Lista de tabelas e figuras
9
Figura 31: Alinhamento entre as seqüências de DNA genômico do geneDB e
cDNA consenso (SmAgo5) e cDNA C604197.1 da FAPESP. As seqüências alinhadas
possuem o domínio PIWI característico das proteínas Argonautas. As setas com os
blocos delimitam os iniciadores F e R do fragmento amplificado e o bloco com linhas
tracejadas representa o íntron/éxon inserido na seqüência consenso de cDNA.
Figura 32: Alinhamento entre as seqüências de cDNA consenso(SmAgo5),
SmAgo3 e SmAgo4. As setas com os blocos delimitam os splicing alternativos de
SmAgo3, 4 e cDNA consenso parcialmente seqüenciado, SmAgo5, sendo o primeiro de
80 nt diferenciando SmAgo5, das outras duas e o segundo de 93 nt diferenciando
SmAgo3 das outras duas.
Figura 33: Splicing alternativo diferenciando SmAgo3 e SmAgo4 mostrado no
banco da FAPESP. A seta com o bloco verde aponta e delimita a seqüência consenso do
contig da FAPESP C604197.1. A seta com o bloco vermelho aponta e delimita o singlet
MS1-0053 da FAPESP. O alinhamento mostra as diferenças entre as seqüências e o
local do splicing alternativo sendo o clone MS1-0053 similar a sequência SmAgo3.
Figura 34: Splicing alternativo diferenciando SmAgo3 e SmAgo4 do consenso de
cDNA obtido neste trabalho (SmAgo5) mostrado no banco da FAPESP. A seta com o
bloco verde aponta e delimita a seqüência consenso do contig da FAPESP C604197.1.
A seta com o bloco vermelho aponta e delimita o singlet ML1-0048T da FAPESP. O
alinhamento mostra as diferenças entre as seqüências e o local do splicing alternativo
sendo o clone ML1-0048T similar ao consenso de cDNA, SmAgo5.
Figura 35: Expressão do gene SmDicer1 no desenvolvimento de S. mansoni. A
expressão de SmDicer1 foi avaliada nos estágios de cercárias, esquistossômulos
mecanicamente transformados (EMT-3,5, EMT-8,5, EMT-18,5, EMT-24, EMT-48,
EMT-72 horas), vermes adultos e ovos. Como normalizador (gene constitutivo) foi
utilizado o gene da α-tubulina e a expressão gênica relativa foi determinada pelo método
do 2
-∆∆Ct
, utilizando como calibrador o estágio EMT-24 horas.
Figura 36: Expressão do gene SmAgo2/3/4 no desenvolvimento de S. mansoni. A
expressão de SmAgo2/3/4 foi avaliada nos estágios de cercárias, esquistossômulos
mecanicamente transformados (EMT-3,5, EMT-8,5, EMT-18,5, EMT-24, EMT-48,
EMT-72 horas), vermes adultos e ovos. Como normalizador (gene constitutivo) foi
Lista de tabelas e figuras
10
utilizado o gene da α-tubulina e a expressão gênica relativa foi determinada pelo método
do 2
-∆∆Ct
, utilizando como calibrador o estágio EMT-24 horas.
Figura 37: Elucidação da via de miRNA em S. mansoni. Prováveis proteínas
envolvidas na via de silenciamento gênico mediada por miRNA em S. mansoni.
Tabela 1- Meio 169 com seus componentes e concentração.
Tabela 2: Tabela de Primers. Primers utilizados em diversas reações de PCR com
diferentes temperaturas de anelamento.
Tabela 3: Prováveis seqüências da via de miRNA em S. mansoni. As seqüências
de S. mansoni foram recuperadas do banco de dados geneDB. As seqüências de seus
ortólogos D. melanogaster, C. elegans e humano, foram recuperadas dos bancos
Flybase, Wormbase, e Genebank, respectivamente. As seqüências dos prováveis
ortólogos presentes em S. japonicum também foram recuperadas no Genebank.
Tabela 4A: Regiões de cobertura dos domínios conservados da enzima SmDicer1
e seus respectivos alinhamentos característicos com os domínios consenso dos bancos
de dados PFAM e CDD.
Tabela 4B: Comparação entre SmDicer1 e suas ortólogas relacionando tamanho e
similaridade.
Tabela 5A: Regiões de cobertura dos domínios conservados da enzima
SmDrosha1 e seus respectivos alinhamentos característicos com os domínios consenso
dos bancos de dados CDD.
Tabela 5B: Comparação entre SmDrosha1 e suas ortólogas relacionando tamanho
e similaridade.
Tabela 6A: Regiões de cobertura dos domínios conservados da enzima
SmDrosha1 e seus respectivos alinhamentos característicos com os domínios consenso
dos bancos de dados CDD.
Lista de tabelas e figuras
11
Tabela 6B: Comparação entre SmDrosha2 e suas ortólogas relacionando tamanho
e similaridade.
Tabela 7A: Regiões de cobertura dos domínios conservados da enzima SmAgo1
e seus respectivos alinhamentos característicos com os domínios consenso dos bancos
de dados PFAM e CDD.
Tabela 7B: Comparação entre SmAgo1 e suas ortólogas relacionando tamanho e
similaridade.
Tabela 8A: Regiões de cobertura dos domínios conservados da enzima SmAgo2
e seus respectivos alinhamentos característicos com os domínios consenso dos bancos
de dados PFAM e CDD.
Tabela 8B: Comparação entre SmAgo2 e suas ortólogas relacionando tamanho e
similaridade.
Tabela 9A: Regiões de cobertura dos domínios conservados da enzima SmAgo3
e seus respectivos alinhamentos característicos com os domínios consenso dos bancos
de dados PFAM e CDD.
Tabela 9B: Comparação entre SmAgo3 e suas ortólogas relacionando tamanho e
similaridade.
Tabela 10A: Regiões de cobertura dos domínios conservados da enzima SmAgo4
e seus respectivos alinhamentos característicos com os domínios consenso dos bancos
de dados PFAM e CDD.
Tabela 10B: Comparação entre SmAgo4 e suas ortólogas relacionando tamanho e
similaridade.
Tabela 11A: Regiões de cobertura dos domínios conservados da enzima SmFmr1
e seus respectivos alinhamentos característicos com os domínios consenso dos bancos
de dados.
Tabela 11B: Comparação entre SmFmr1 e suas ortólogas relacionando tamanho e
similaridade.
Lista de tabelas e figuras
12
Tabela 12A: Regiões de cobertura dos domínios conservados da enzima
SmTudor-SN e seus respectivos alinhamentos característicos com os domínios consenso
dos bancos de dados PFAM e CDD.
Tabela 12B: Comparação entre SmTudor-SN e suas ortólogas relacionando
tamanho e similaridade.
Tabela 13A: Regiões de cobertura dos domínios conservados da enzima SmPasha
e seus respectivos alinhamentos característicos com os domínios consenso dos bancos
de dados PFAM e CDD.
Tabela 13B: Comparação entre SmPasha e suas ortólogas relacionando tamanho e
similaridade.
Tabela 14A: Regiões de cobertura dos domínios conservados da enzima
SmExportina5.1 e seus respectivos alinhamentos característicos com os domínios
consenso dos bancos de dados PFAM e COG.
Tabela 14B: Comparação entre SmExportina5.1 e suas ortólogas relacionando
tamanho e similaridade.
Tabela 15A: Regiões de cobertura dos domínios conservados da enzima
SmExportina5.1 e seus respectivos alinhamentos característicos com os domínios
consenso dos bancos de dados PFAM e COG.
Tabela 15B: Comparação entre SmExportina5.2 e suas ortólogas relacionando
tamanho e similaridade.
Tabela 16A: Regiões de cobertura dos domínios conservados da enzima
SmLoquacious e seus respectivos alinhamentos característicos com os domínios
consenso dos bancos de dados CDD.
Tabela 16B: Comparação entre SmLoquacious e suas ortólogas relacionando
tamanho e similaridade.
Tabela 17: Contig ou singlet do banco de dados da FAPESP de S. mansoni
similares à proteína SmDicer1 relacionando tamanho de cada um, posição e os estágios
evolutivos que foram obtidos. A, estágio evolutivo vermes adultos, M, estágio evolutivo
Lista de tabelas e figuras
13
macho adulto, F, estágio evolutivo fêmea adulta, E, estágio evolutivo ovos, L, estágio
evolutivo, miracídios, G, esporocistos, C, cercária e S, esquistossômulos.
Tabela 18: Contig ou singlet do banco de dados da FAPESP de S. mansoni
similares à proteína SmDrosha1 relacionando tamanho de cada um, posição e os
estágios evolutivos que foram obtidos. A, estágio evolutivo vermes adultos, M, estágio
evolutivo macho adulto, F, estágio evolutivo fêmea adulta, E, estágio evolutivo ovos, L,
estágio evolutivo, miracídios, G, esporocistos, C, cercária e S, esquistossômulos.
Tabela 19: Contig ou singlet do banco de dados da FAPESP de S. mansoni
similares à proteína SmDrosha2 relacionando tamanho de cada um, posição e os
estágios evolutivos que foram obtidos. A, estágio evolutivo vermes adultos, M, estágio
evolutivo macho adulto, F, estágio evolutivo fêmea adulta, E, estágio evolutivo ovos, L,
estágio evolutivo, miracídios, G, esporocistos, C, cercária e S, esquistossômulos.
Tabela 20: Contig ou singlet do banco de dados da FAPESP de S. mansoni
similares à proteína SmAgo1 relacionando tamanho de cada um, posição e os estágios
evolutivos que foram obtidos. A, estágio evolutivo vermes adultos, M, estágio evolutivo
macho adulto, F, estágio evolutivo fêmea adulta, E, estágio evolutivo ovos, L, estágio
evolutivo, miracídios, G, esporocistos, C, cercária e S, esquistossômulos.
Tabela 21: Contig ou singlet do banco de dados da FAPESP de S. mansoni
similares à proteína SmAgo2 relacionando tamanho de cada um, posição e os estágios
evolutivos que foram obtidos. A, estágio evolutivo vermes adultos, M, estágio evolutivo
macho adulto, F, estágio evolutivo fêmea adulta, E, estágio evolutivo ovos, L, estágio
evolutivo, miracídios, G, esporocistos, C, cercária e S, esquistossômulos.
Tabela 22: Contig ou singlet do banco de dados da FAPESP de S. mansoni
similares à proteína SmAgo3 relacionando tamanho de cada um, posição e os estágios
evolutivos que foram obtidos. A, estágio evolutivo vermes adultos, M, estágio evolutivo
macho adulto, F, estágio evolutivo fêmea adulta, E, estágio evolutivo ovos, L, estágio
evolutivo, miracídios, G, esporocistos, C, cercária e S, esquistossômulos.
Tabela 23: Contig ou singlet do banco de dados da FAPESP de S. mansoni
similares à proteína SmAgo4 relacionando tamanho de cada um, posição e os estágios
evolutivos que foram obtidos. A, estágio evolutivo vermes adultos, M, estágio evolutivo
Lista de tabelas e figuras
14
macho adulto, F, estágio evolutivo fêmea adulta, E, estágio evolutivo ovos, L, estágio
evolutivo, miracídios, G, esporocistos, C, cercária e S, esquistossômulos.
Tabela 24: Contig ou singlet do banco de dados da FAPESP de S. mansoni
similares à proteína SmFmr1 relacionando tamanho de cada um, posição e os estágios
evolutivos que foram obtidos. A, estágio evolutivo vermes adultos, M, estágio evolutivo
macho adulto, F, estágio evolutivo fêmea adulta, E, estágio evolutivo ovos, L, estágio
evolutivo, miracídios, G, esporocistos, C, cercária e S, esquistossômulos.
Tabela 25: Contig ou singlet do banco de dados da FAPESP de S. mansoni
similares à proteína SmTudor-SN relacionando tamanho de cada um, posição e os
estágios evolutivos que foram obtidos. A, estágio evolutivo vermes adultos, M, estágio
evolutivo macho adulto, F, estágio evolutivo fêmea adulta, E, estágio evolutivo ovos, L,
estágio evolutivo, miracídios, G, esporocistos, C, cercária e S, esquistossômulos.
Tabela 26: Contig ou singlet do banco de dados da FAPESP de S. mansoni
similares à proteína SmPasha relacionando tamanho de cada um, posição e os estágios
evolutivos que foram obtidos. A, estágio evolutivo vermes adultos, M, estágio evolutivo
macho adulto, F, estágio evolutivo fêmea adulta, E, estágio evolutivo ovos, L, estágio
evolutivo, miracídios, G, esporocistos, C, cercária e S, esquistossômulos.
Tabela 27: Contig ou singlet do banco de dados da FAPESP de S. mansoni
similares à proteína SmExportina5.1 relacionando tamanho de cada um, posição e os
estágios evolutivos que foram obtidos. A, estágio evolutivo vermes adultos, M, estágio
evolutivo macho adulto, F, estágio evolutivo fêmea adulta, E, estágio evolutivo ovos, L,
estágio evolutivo, miracídios, G, esporocistos, C, cercária e S, esquistossômulos.
Tabela 28: Contig ou singlet do banco de dados da FAPESP de S. mansoni
similares à proteína SmExportina5.1 relacionando tamanho de cada um, posição e os
estágios evolutivos que foram obtidos. A, estágio evolutivo vermes adultos, M, estágio
evolutivo macho adulto, F, estágio evolutivo fêmea adulta, E, estágio evolutivo ovos, L,
estágio evolutivo, miracídios, G, esporocistos, C, cercária e S, esquistossômulos.
Introdução
15
1-INTRODUÇÃO
Introdução
16
1.1 Aspectos gerais da Esquistossomose
A esquistossomose é uma doença crônico-debilitante que afeta 200 milhões de
indivíduos distribuídos em 76 países nos continentes africano, asiático e americanos e
estima-se que ocorram entre 250 a 500 mil mortes por ano (Hu e cols., 2004). Dentre os
infectados 10% apresentam a forma severa da doença e aproximadamente 50% exibem
manifestações clínicas da doença, constituindo um sério problema de saúde pública.
Além disso, estima-se que 500 a 600 milhões de pessoas estão em risco de infecção pela
esquistossomose (Chitsulo e cols., 2000).
A esquistossomose humana é causada por 6 espécies do gênero Schistosoma,
sendo: S. mansoni, S. haematobium, S. intercalatum, S. japonicum, S. mekongi e S.
malayensis. Somente a espécie S. mansoni existe no Brasil. Estima-se que no Brasil 12
milhões de pessoas estejam infectadas e destas, aproximadamente 1.000.000 sofram
com a forma severa da doença (Kloetzel, 1989). No Brasil, acredita-se que a parasitose
tenha sido introduzida através do tráfico de escravos africanos, tendo como porta de
entrada o estado da Bahia.
A espécie foi descrita primeiramente por Bilharz em 1852 e posteriormente,
Weinland em 1858 denominou o gênero deste helminto de Schistosoma, uma vez que o
macho apresenta o corpo fendido (schisto=fenda; soma=corpo), mas a denominação da
espécie S. mansoni foi dada por Sambon em 1907. Os estudos de Pirajá da Silva na
Bahia, realizados na mesma época contribuíram muito para a confirmação que o S.
mansoni produzia ovos, habitava as veias mesentéricas e tratava-se de uma espécie
distinta.
1.2 O S. mansoni
O parasito S. mansoni pertence ao Filo Platelminto, a classe Trematódea e a
família Schistosomatidae que apresenta sexos separados e parasita vasos sanguíneos de
mamíferos e aves. Essa família é dividida em duas subfamílias: Bilharzielinae e
Schistosomatinae. Na primeira, encontramos os vermes sem dimorfismo sexual, que
parasitam aves e alguns mamíferos domésticos ou silvestres, portanto sem interesse
médico direto. Na segunda, estão incluídos os que apresentam um nítido dimorfismo
sexual e que parasitam o homem e animais (Neves, 2005). Além de apresentarem
Introdução
17
dimorfismo sexual na fase adulta estes possuem o corpo achatado dorso-ventralmente.
O macho mede cerca de 1,0 cm, com a superfície coberta por tegumentos e espinhas e
um canal ginecóforo para albergar a fêmea e fecundá-la. A fêmea mede cerca de 1,5 cm
e possui o tegumento liso.
O S. mansoni é um trematodo digenético que apresenta um ciclo de vida
complexo que inclui dois hospedeiros. Os vermes adultos parasitam praticamente todos
os sistemas dos vertebrados. A transmissão está geralmente a cargo de dois estágios
larvais e, na sua maioria, os ciclos vitais dos digenéticos dependem da água para a sua
realização (Wilson, 1979).
O ciclo de vida de S. mansoni é complexo, compreendendo duas fases distintas:
uma fase sexuada que ocorre no hospedeiro definitivo, mamífero, e uma fase assexuada,
no hospedeiro intermediário que compreendem os caramujos do gênero Biomphalaria
das espécies B. glabrata, B. straminae e B. tenagophila (Figura 1). O ciclo de vida deste
parasito foi descrito por Leiper em 1915 e inicia-se quando as fezes de indivíduos
infectados, contendo ovos, são eliminadas e entram em contato com a água. Os ovos
eclodem liberando a forma infectante do hospedeiro invertebrado, os miracídios. As
larvas, que têm sexo definido, penetram ativamente na hemocele do caramujo e se
desenvolvem transformando-se em esporocisto primário ou mãe. Cada esporocisto
primário origina de 150 a 200 esporocistos filhos que migram para as glândulas
digestivas e hepatopâncreas do caramujo onde se diferenciam por expansão clonal
dando origem à terceira geração, as larvas agora denominadas cercárias (Wilson, 1979).
Sob o estímulo da luz e calor, as cercárias deixam o caramujo após a quarta
semana de infecção, permanecendo no meio aquático onde buscam o hospedeiro
definitivo. Esta o infecta por penetração ativa na pele perdendo sua cauda bifurcada e
transformando-se em esquistossômulo. A passagem pela epiderme e derme do
hospedeiro pode durar de 24 a 72 horas aproximadamente. Por volta do quarto dia, os
esquistossômulos chegam no sistema sanguíneo ou linfático iniciando a migração para
os pulmões a dia atingindo o pico máximo entre o sétimo e nono dia após a infecção.
Até a fase pulmonar os esquistossômulos sofrem apenas um elongamento, ou seja, um
processo de diferenciação, não havendo sinais de divisão celular ou crescimento,
mantendo a razão massa/esquistossômulo constante (Clegg, 1965). A partir do oitavo
dia passa por diversos órgãos e já podem ser encontrados na veia porta-hepática onde
alimentam-se do sangue do hospedeiro definitivo e inicia a divisão celular (Clegg,
1965).
Introdução
18
Após 45 dias de infecção o parasito atinge a maturidade vivendo por vários anos
no sistema porta hepático. O macho e a fêmea se acasalam e as fêmeas realizam a
postura de seus ovos completando assim o ciclo evolutivo. Parte dos ovos ficam presos
nos tecidos do hospedeiro gerando reações imunológicas conhecidas como granuloma
(Cunha, 1970).
Figura 2: Ciclo de vida do S. mansoni. Dentro do seu hospedeiro vertebrado, as formas larvais
(esquistossômulo, B) dão origem a parasitos sexualmente maduros (verme adulto, A), os quais
se acasalam e produzem ovos (C) que são liberados para o meio aquático. Os ovos eclodem
(D) e liberam os miracídios (E), que penetram nos caramujos, dando origem a numerosos
esporocistos (F). Os esporocistos geram cercárias (G) que saem do caramujo e são liberadas na
água, as quais são as formas infectantes para o hospedeiro vertebrado (Adaptado de Wilson,
1979).
1.3 Genoma do parasito
O S. mansoni é um organismo diplóide (2n=16), possuindo oito pares de
cromossomos, sendo sete pares autossômicos e um par sexual. O sexo heterogamético
no parasito é a fêmea (ZW), enquanto o macho é homogamético (ZZ) (Short e cols.,
1960, Short e cols., 1979). O tamanho do genoma haplóide compreende
Introdução
19
aproximadamente 270 Mega bases, com um conteúdo de GC de aproximadamente 34%
(Simpson e cols., 1982)
O Projeto Genoma do Schistosoma foi criado no ano de 1992 contando com o
apoio do The Institute for Genomic Research (TIGR), FAPEMIG (Fundação de Amparo
à Pesquisa de Minas Gerais), Fundação Oswaldo Cruz. Em 1994, e apoio internacional
da Organização Mundial da Saúde (WHO/UNDP/World Bank Special Program for
Research), do Centro de Treinamento em Doenças Tropicais (Training in Tropical
Diseases – TDR ) e de laboratórios de pesquisas de diversos países. O alvo destas
pesquisas foram as espécies S. mansoni e S. japonicum tendo como objetivo promover o
desenvolvimento de novas drogas e quimioterápicos.
As primeiras ESTs (Etiquetas de seqüências transcritas) foram depositadas por
Franco e colaboradores, em 1995, sendo seqüenciadas 607 de uma biblioteca de cDNA
de vermes adultos, dando início a era de descoberta de genes do S. mansoni. Em
outubro de 2003, o lançamento e conclusão de dois projetos transcriptomas para as
espécies S. mansoni e S. japonicum revolucionaram e ampliaram de maneira
significativa as perspectivas para a pesquisa científica neste parasito. No projeto
transcriptoma do S. mansoni foram seqüenciados 163.586 ESTs, sendo que 151.684
foram originadas de bibliotecas do tipo ORESTES (Open reading frames ESTs), ESTs
de janelas de leitura abertas, ou seja, a região central do gene, e os 11.902 seqüências
restantes foram originadas de bibliotecas normalizadas de vermes adultos. Desta forma
o total predito de genes foi aproximadamente 14.000 genes, cobrindo aproximadamente
92% do transcriptoma do parasito (Verjovski e cols, 2003).
A análise do transcriptoma através da classificação funcional dos transcritos pelo
Gene Ontology (GO) confirma a presença de genes associados a eucariotos e processos
específicos dos metazoários, como diferenciação eixo anterior-posterior, dorso-ventral,
epitélio, processo neural, motilidade, diferenciação sexual, maturação, longevidade,
parasitismo, evasão imune e resposta a stress. Além disso, genes envolvidos com o
controle da expressão gênica e a diferenciação ficaram evidenciados sugerindo sua
implicação no nível de silenciamento da cromatina (Verjovski e cols, 2003).
1.4 Regulação da expressão gênica em S. mansoni
Introdução
20
O S. mansoni apresenta um ciclo biológico bastante peculiar, no qual diversas
alterações bioquímicas e morfológicas ocorrem no parasito. Estas mudanças são
adaptações evolutivas encontradas pelo parasito para sobreviver nos distintos
ambientes, como na água e interior dos hospedeiros, onde se acredita que um conjunto
de genes deve ser expresso coordenadamente em cada estágio para permitir a adaptação
do parasito aos seus hospedeiros.
Análises do transcriptoma e proteoma têm sido usadas para investigar padrões da
expressão real e da complexidade protéica em todo o parasito (Wilson e cols., 2007).
Mesmo assim, existem vários problemas iminentes para busca do entendimento e do
arranjo correto da estrutura e da organização molecular do parasito. Um grande
problema para uma anotação correta de proteínas é a ausência de informação sobre
homólogos a impedindo correlações que levariam a informações pertinentes como
estrutura e função (Verjovski-Almeida e cols., 2003).
Uma das formas viáveis e de mais fácil alcance para cobrir estes problemas é o
estudo do transcriptoma. Este tem propiciado a descoberta de novos genes, elaboração
de modelos gênicos, desenho de sondas de microarranjos, clonagem de genes de
interesse e outras informações pertinentes para o entendimento da biologia da célula
(Brindley and Pearce, 2007; Wilson e cols., 2007). Plataformas de microarranjos vêm
sendo utilizadas extensivamente para S. mansoni para análise em larga escala do seu
transcriptoma enfatizando padrões de expressão entre estágios, cepas , espécies e sexos
(Fitzpatrick e cols., 2005, 2006; Hoffmann, 2002; DeMarco, 2006; Dillon, 2006;
Vermeire, 2006).
Outra técnica utilizada para uma análise em larga escala do transcriptoma do S.
mansoni é a técnica de SAGE. Ojopi e colaboradores em 2007, utilizando SAGE,
analisaram 6263 etiquetas de seqüências do estágio de verme adulto. O mRNA mais
abundante estava relacionado com o desenvolvimento de ovos, proteína da casca do
ovo, seguido de mRNA que codificam actina e miosina, proteínas do choque térmico,
proteínas ribossomais e outras. O estudo destes transcriptomas, separados
espacialmente, provindos de um mesmo genoma, é de extrema importância para melhor
entendimento da biologia molecular do parasito e elaboração de vacinas e novas drogas
específicas (Figura 2) (Hu, 2004). Além destas metodologias, outros experimentos
visando desvendar a biologia celular deste parasito vêm utilizando a manipulação do
genoma silenciando genes utilizando a técnica de RNA interferente (RNA i), o estudo
Introdução
21
do proteoma através da separação de proteínas por eletroforese bidimensional e a PCR
quantitativa em tempo real.
De maneira particular o período de transformação de cercária em
esquistossômulo deve ser ressaltado devido a grande mudança no perfil de expressão
protéica representado nesta fase. Durante esse período ocorrem várias mudanças
morfológicas e bioquímicas como perda da cauda, secreção do conteúdo da glândula
acetabular, duplicação da bicamada lipídica da superfície, perda do glicocálix, mudança
do núcleo heterocromático para eucromático, intolerância à água e às proteínas da via
do complemento do sistema imune e redução no catabolismo do piruvato. (Ramalho-
Pinto, 1974; Blanton e cols., 1987). Sabe-se que a diferenciação na composição de
proteínas específicas entre esses dois estágios está relacionada a alterações na regulação
de genes.
O seqüenciamento do genoma e do transcriptoma do S. mansoni tem aberto
várias perspectivas para o estudo da biologia do parasito, no sentido de manipulação de
genes essenciais no desenvolvimento e manutenção do parasitismo, no estabelecimento
de novas drogas contra a parasitose e também no estabelecimento de uma vacina para
prevenção e terapêutica.
Estudos relacionados à manipulação do genoma utilizando o RNAi, como
descrito por Skelly e cols 2003, mostrou que o gene que codifica para catepsina B no
estágio de desenvolvimento de esquistossômulo a verme adulto, pode perfeitamente ser
silenciado. Outros estudos demonstraram que todo ciclo de vida deste parasito,
esporocistos, esquistossômulos, vermes adultos (machos e fêmeas) são susceptíveis a
entrada de RNAi e sua manipulação no meio intracelular (Boyle e cols., 2003;
Dinguirard, 2006; Osman e cols., 2006).
Introdução
22
Figura 2: Expressão gênica estágio-específicas em S. mansoni. Genes altamente expressos
estágio-específicos baseado nos projetos transcriptoma do parasito. Adaptado de Hu e cols.,
2004.
O RNAi é extremamente promissor uma vez que suas aplicações abrangem,
entre outros, a genética reversa, genômica funcional, terapia gênica, desenvolvimento de
animais modelo, estudos do comportamento, validação de alvos para novas drogas e o
combate a patógenos (Baum, 2004).
A iniciativa de descoberta de proteínas relacionadas com a via de pequenos
RNAs interferentes exógenos ou endógenos tem sido extensivamente estudada em
outros organismos (Meister e Tuschl, 2004). Desta forma, o estudo sistemático nos
bancos de dados deste parasito das proteínas da via, podem levar tanto ao avanço da
biologia celular quanto ao possível controle da parasitose.
1.5 Silenciamento gênico mediado por microRNA
O termo “silenciamento gênico” se refere a diversos mecanismos nos quais a
expressão de um ou mais genes é regulada. Este mecanismo se iniciou como um sistema
de defesa atuando na identificação e degradação de moléculas de RNA estranhas ao
Introdução
23
transcriptoma de uma célula sadia como acontece com plantas resistentes a vírus
(Lindbo e Dougherty, 1992). Uma dessas moléculas é o dsRNA, naturalmente gerada na
replicação viral ou mobilização de elementos transponíveis, sendo reconhecidas como
sinal de perigo ou alerta. Esses dsRNAs levam à destruição de RNAs fita simples
(ssRNAs) que sejam similares em seqüência. A interpretação sobre esta via vai mais
além, sendo como um “sistema imune” do transcriptoma e os RNAs exógenos,
aplicados a fim de estudos de genética reversa, como uma doença auto-imune induzida.
Atualmente este mecanismo, eficiente de regulação gênica inata, atua principalmente no
controle de genes envolvidos no desenvolvimento do organismo e na manutenção da
integridade do genoma (Denli e Hannon, 2003).
Estudos demonstram a existência de três vias de silenciamento de RNA com
sobreposição em alguns pontos (He e Hannon, 2004). Apesar de algumas
particularidades nos mecanismos, as vias são conservadas entre diferentes organismos
sugerindo a existência de um mecanismo ancestral comum (Zamore, 2002). A clonagem
e caracterização de diversos genes que codificam componentes destas vias em
Arabidopsis thaliana, C. elegans, Drosophila melanogaster, Neurospora crassa,
Schizosaccharomyces pombe, Tetrahymena thermophila, camundongos e humanos,
apóiam essa hipótese (Denli e Hannon, 2003, Meister e Tuschl, 2004; Gregory, 2006).
A primeira via de silenciamento de RNA é a mediada por siRNAs. Esta está
envolvida na degradação de RNA viral, transposon e transgene. A 2ª via é a de
silenciamento de mRNAs endógenos, mediada por miRNAs. Os miRNAs regulam a
expressão gênica negativamente por meio do pareamento de bases específicas a um
mRNA alvo, resultando na clivagem do mRNA ou na repressão de sua tradução. A 3ª
via é nuclear e está associada à metilação de DNA e à formação de heterocromatina.
(Bartel, 2004).
Em 1993, os microRNAs ou miRNAs, foram pela primeira vez relatados. Lee e
colaboradores demonstraram que o gene Lin-4, conhecido por controlar o tempo de
desenvolvimento do estágio larval de C. elegans, não codificava nenhuma proteína, mas
sim, um par de pequenos RNAs, um com 22 nt e o outro com 16 nt (Figura 3). Estes
pequenos RNAs eram complementares a várias regiões da região 3’ não-traduzida
(3’UTR) do gene Lin-14, e mediavam sua repressão por pareamento na região UTR,
inibindo sua tradução. Posteriormente, descobriram Let-7, que codificava um pequeno
RNA de 22 nt, que também estava envolvido no desenvolvimento de C. elegans
(Reinhart e cols., 2000) (Figura 3). Devido ao papel de ambos miRNAs no controle do
Introdução
24
desenvolvimento, foram também denominados de pequenos RNAs temporais, ou small
temporal RNAs (stRNAs).
Estes miRNAs, hoje, somam uma classe de milhares de exemplares. Estes
pequenos RNAs de 21-24 nt são originados a partir de um precursor transcrito endógeno
com capacidade de adquirir estrutura secundária em forma de grampo e ser processado
por uma série de proteínas intranucleares e citoplasmáticas (Hutvagner e cols., 2001).
Figura 3: Prováveis pré-miRNAs correspondentes a lin-4 and let-7 de C. elegans. As seqüências
maduras dos miRNAs estão em vermelho próximo da extremidade 5’ do pré-miRNA (Adaptado
de Lee 1993).
O modelo atual para a biogênese de miRNAs em animais propõe que a
maturação dos miRNAs ocorre em duas etapas: clivagem intranuclear e clivagem
citoplasmática. Antes destas duas clivagens, os miRNAs são transcritos por uma
polimerase em um produto primário (pri-miRNA) complexo, com várias características
peculiares como formação de grampos e voltas (loops), os tornando reconhecíveis pela
maquinaria no meio intranuclear (Meister e Tuschl, 2004).
Diversas evidências indicam que os miRNAs não são transcritos pela RNApol
III, pois eles são um pouco mais longos do que os demais RNAs usualmente transcritos
por esta enzima. Além disso, por possuirem seqüência internas com mais de quatro
uracilas seguidas, o que usualmente sinaliza o término da transcrição para a RNApol III
(Lee e cols., 2002), um grande número de miRNAs e transcritos adjacentes têm sido
Introdução
25
encontrados em ESTs, incluindo exemplos com a presença de uma cauda poli-A,
sugerindo que foram transcritos pela RNA polimerase II (Smalheiser, 2003).
A primeira etapa do processamento dos miRNAs consiste na clivagem nuclear
do pri-miRNA, que libera um intermediário com estrutura secundária em forma de
grampo com aproximadamente 60-70 nt, denominado pré-miRNA (precursor miRNA)
(Lee e cols., 2002). Esta clivagem é realizada pela por um microcomplexo liderado pela
enzima RNase III Drosha, que cliva ambas as fitas do pri-miRNA em sítios próximos à
base da estrutura em forma de grampo, gerando um pré-miRNA com um fosfato em sua
extremidade 5’ e 2 nucleotídeos despareados na extremidade 3’ (Lee e cols., 2003). O
pré-miRNA é transportado de forma ativa, com gasto de ATP, do núcleo para o
citoplasma pelo complexo Ran-GTP/Exportina-5 (Lund e cols., 2004). A clivagem
nuclear define a extremidade 5’ do miRNA, que é a mesma do pré-miRNA. A
extremidade 3’ é processada no citoplasma pela enzima Dicer, juntamente com uma
proteína ligante de RNA fita dupla, que em D. melanogaster é chamada Loquacious e
R2D2, e em C. elegans, R3D1. (Tabara e cols., 2002; Saito e cols., 2005; Hutvagner e
Zamore, 2002).
Na segunda etapa, Dicer atua de forma idêntica à clivagem de dsRNA no
processo de silenciamento de RNA. Inicialmente ocorre o reconhecimento da região de
fita dupla do pré-miRNA, provavelmente por afinidade da enzima com o fosfato 5’ e os
2 nt despareados na extremidade 3’. Em seguida, ocorre a clivagem, liberando um
miRNA de fita dupla com aproximadamente 21-25 pb, contendo fosfatos nas
extremidades 5’ e dois nucleotídeos despareados nas extremidades 3’ (Hutvagner e
Zamore, 2002). De acordo com este modelo, a especificidade da primeira clivagem
determina a posição correta da segunda clivagem do pré-miRNA, definindo assim
ambas as extremidades do miRNA (Lee e cols., 2003).
Após esta clivagem, o miRNA maduro será apresentado para o complexo de
silenciamento mediado por RNA, denominado RISC. Inicialmente os miRNAs foram
encontrados em associação com um complexo ribonucleoprotéico denominado miRNP
(miRNA ribonuclein complex), que em humanos inclui a proteína Argonauta eIF2C2, a
helicase GEMIN3 e GEMIN4 (Mourelatos e cols., 2002) e em D. melanogaster inclue a
Argonauta Ago1, Fmr1, Tudor-SN e VIG (Meister e Tuschl, 2004). Desta forma, foi
sugerido que o complexo miRNP corresponde ao RISC, que direciona a clivagem de
mRNAs no mecanismo de silenciamento de RNA (Hutvagner e Zamore, 2002).
Somente uma das fitas do miRNA de fita dupla é incorporada ao RISC. Quando isso
Introdução
26
ocorre, a outra fita é degradada. Estudos para determinar qual das fitas é incorporada no
RISC mostraram que a fita incorporada é aquela que possui o terminal 5’ com
pareamento de bases mais instável (Schwarz e cols., 2002). Uma vez incorporado ao
RISC, o miRNA vai direcionar a clivagem específica de mRNAs complementares ou
reprimir sua tradução (Doench e cols., 2003; Meister e Tuschl, 2004) (Figura 4).
A identificação dos mRNAs alvos demonstrou que os miRNAs estão
predominantemente envolvidos na regulação de genes relacionados ao desenvolvimento
de órgãos e tecidos, incluindo diversos fatores de transcrição (Dugas e Bartel, 2004).
Além disso, a expressão de genes relacionados com a própria maquinaria do
silenciamento de RNA, é regulada por miRNAs (miRbase Target,
http://microrna.sanger.ac.uk/).
Figura 4: Biogênese de miRNAs e siRNAs. A biogênese de miRNA ocorre em dois passos
distintos: um nuclear e outro citoplasmático, sendo finalizada quando uma das fitas do duplex
encontra RISC e seu respectivo mRNA alvo. Por outro lado, a via de siRNA, ocorre apenas no
citoplasma e o silenciamento do mRNA alvo, mediado por ambas as fitas do duplex (Adaptado
de Bartel, 2004).
Introdução
27
Os miRNAs atuam de forma semelhante aos siRNAs, regulando a expressão de
mRNAs alvos, sendo seus alvos de origens e naturezas distintas. Os siRNAs são
derivados do próprio mRNA alvo, sendo este transcrito um transgene, vírus ou
transposon. Os miRNAs são processados a partir de transcritos endógenos que não
codificam proteínas e possuem como alvos mRNAs endógenos. O número de genes que
codificam miRNAs está estimado em 0,5 - 1% do número total de genes do genoma em
questão tornando os a maior classe de moléculas regulatórias em animais. C. elegans e
D. melanogaster possuem aproximadamente 100 a 140 genes que codificam miRNAs,
enquanto seres humanos possuem de 200 a 255. Esta representatividade relativa é
comparável à de outras famílias gênicas envolvidas na regulação gênica como, por
exemplo, a de fatores de transcrição que se ligam a DNA (Nakahara e Carthew, 2004).
A maioria dos genes codificando miRNAs são conservados entre espécies relacionadas
e aproximadamente 30% destes, altamente conservados, com ortólogos em vertebrados
e invertebrados, sugerindo uma conservação evolutiva com base em sua função
biológica. A maioria dos genes que codifica miRNAs se localiza em regiões
intergênicas, sugerindo que são transcritos a partir de unidades transcricionais
independentes (Lagos-Quintana e cols., 2001; Lee e Ambros, 2001).
A clonagem e o seqüenciamento direto destes pequenos RNAs tem permitido a
identificação de muitos miRNAs. Estes pequenos RNAs já foram encontrados em
diversos organismos como D. melanogaster, C. elegans, A. thaliana e H. sapiens
(Lagos- Quintana e cols., 2001; Lee e Ambros, 2001; Llave e cols., 2002). Entretanto,
algumas impossibilidades vêm dificultando a clonagem e identificação destes RNAs
como: padrões de expressão estágio específicos do miRNA, presença de produtos de
degradação de mRNAs e outros pequenos RNAs não codificantes. (Lai e cols., 2003).
Sendo assim, a descoberta de novas formas de busca de prováveis miRNAs tem
aumentado expressivamente nos últimos anos.
No início de 2003, não mais que 33 microRNA tinham sido validados em seres
humanos, sem perspectiva para mais avanços utilizando técnicas não computacionais
(Lim, 2003a). No mesmo ano, foi predito, utilizando técnicas computacionais, 300
miRNAs, sendo deste total, 16 validados (Berezikov, 2005). Estudos recentes estimam
que 600 miRNAs esperam para sua validação em humanos (Bentwich, 2005). Sendo
assim, a predição de miRNAs e seus alvos está em fase de crescimento, tendo um longo
e brilhante caminho para alcançar, sendo estas ferramentas promissoras para um futuro
próximo.
Introdução
28
O S. mansoni é um parasito que passa por vários estágios evolutivos em seu
ciclo de vida, apresentando um conjunto de genes com expressão estágio-específica
supostamente envolvidos com a adaptação do parasito aos distintos hospedeiros e
habitats. Apesar dos progressos decorrentes do seqüenciamento do genoma e do
transcriptoma deste parasito, ainda permanece por ser entendido o repertório de
mecanismos utilizados pelo parasito na regulação diferencial da expressão gênica. Neste
sentido, o mecanismo de silenciamento de mRNAs mediado por modificações pós-
transcricionais foi sugerido por Blanton e Licate, em 1992, como parte da hipótese de
crescimento desacoplado do processo de diferenciação no parasito. Como revisado por
Nakahara e Carthew em 2004, os miRNAs e sua maquinaria possuem papel
fundamental na regulação gênica pós-transcricional, com papel em processos como a
proliferação celular, apoptose, sinalização e principalmente diferenciação, esta via pode
ter um papel significativo na regulação da expressão gênica diferencial observado entre
os diferentes estágios evolutivos deste parasito.
Objetivos
29
2-Objetivos
Objetivos
30
2.1 Objetivo Geral
O objetivo deste trabalho foi analisar in silico todas as seqüências relacionadas
com a via de silenciamento gênico mediada por miRNA nos bancos de dados
disponíveis do parasito, além de analisar por PCR em tempo real a expressão relativa
das duas proteínas principais da via, Dicer e Argonauta.
2.2 Objetivos específicos
- Análisar in silico a via de silenciamento gênico mediada por miRNA nos bancos de
dados de genoma, geneDB (Sanger Institute) e transcriptoma, FAPESP;
- Analisar a conservação dos domínios conservados das famílias de proteínas, RNAse
III e Argonauta;
- Clonar e seqüenciar parcialmente o DNA genômico e cDNA da família Argonauta;
- Predizer os miRNAs do parasito;
- Avaliar o perfil de expressão gênica de SmDicer1 e Argonauta2/3/4 nos estágios de:
verme adulto, cercária, esquistossômulo mecanicamente transformado (EMT) de 3,0;
8,5; 18,5; 24; 48; e 72 horas de cultivo in vitro;
Materiais e métodos
31
3-MATERIAIS E MÉTODOS
Materiais e métodos
32
3.1 Parasitos
Neste trabalho foram utilizados parasitos da espécie S.mansoni cepa LE, em
diferentes etapas do ciclo. Vermes adultos e cercárias, foram cedidos pelo Moluscário
do CPqRR/FIOCRUZ (Centro de Pesquisa René Rachou, Fundação Oswaldo Cruz) em
Belo Horizonte/MG e ovos pelo Laboratório de Biologia Molecular de Parasitos, do
Departamento de Bioquímica e Imunologia da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto
- USP.
Os vermes adultos foram obtidos a partir da perfusão do sistema porta-hepático
de camundongos da linhagem Swiss Webster infectados com aproximadamente 100
cercárias por via subcutânea após 50 dias, conforme descrito por SMITHERS e
TERRY, 1965. Após a coleta, os vermes adultos foram armazenados em tubo de1,5 ml
a -80ºC para posterior utilização.
Para obtenção dos ovos inicialmete o fígado dos camundongos infectados foram
triturados com auxílio de um liquidificador em solução tampão (0,9% p/v Na2HPO4 e
0,005% p/v KH2PO4) e em seguida, filtrados em peneiras de 0,180mm/80 Tyler e
0,30mm/48 Tyler sucessivamente. Os ovos foram lavados e decantados por 5 minutos.
O sobrenadante foi separado e repetiu-se o passo acima por 3 vezes, ou até não se retirar
mais ovos do material. Após a coleta, os ovos foram armazenados em tubo de1,5 ml a -
80ºC para posterior utilização.
O hospedeiro intermediário Biomphalaria glabrata após 27 a 31 dias de infecção
com miracídeos foi induzido à eliminação de cercárias por um processo artificial. Em
água declorada aquecida a 28º C foram colocados os caramujos, e estes expostos à luz
branca fria em uma estufa a 25º C. Depois de duas horas de exposição a luz as cercárias
eliminadas na água foram recolhidas. Para armazenamento desta forma do parasito, o
material coletado é deixado por duas horas em gelo para decantação. A forma larval,
cercária, é separada do sobrenadante e das impurezas contidas no meio e armazenada
em tubos de 1,5 ml a -80ºC para posterior utilização.
3.1.1 Esquistossômulos transformados mecanicamente
As cercárias, após banho de gelo (2 horas) e separação das impurezas, foram
transferidas para tubos falcons de 15 mL, com aproximadamente 200.000 cercárias por
Materiais e métodos
33
tubo, contendo 5 mL de RPMI 1640 (INVITROGEN). Os tubos foram homogeneizados
com auxílio de um vortex em velocidade máxima por 1 minuto repetido por 3 vezes
para efetuar a separação mecânica entre a cauda e o corpo cercariano. O volume do tubo
foi transferido para uma garrafa estéril de cultura de 50 mL. Em seguida, foi
acrescentado no frasco 30 mL de meio de cultura RPMI suplementado com 10% de
penicilina / estreptomicina100 mg/mL, e incubado em estufa de CO2 5% a 37°C por 3
horas e meia. (Harrop e Wilson, 1993)
Após este intervalo foi iniciada a retirada das caudas presentes no meio. Os
esquistossômulos foram submetidos a lavagens sucessivas (5 a 8) com meio RPMI em
intervalos de 4 minutos para sedimentação e remoção das caudas suspensas no
sobrenadante. A detecção da existência de caudas juntamente com os esquistossômulos
foi feita com auxílio de uma lupa. O precipitado de esquistossômulos sem a presença de
caudas foi considerado esquistossômulos de 3,5 horas. Estes foram separados e
utilizados para cultivo ou armazenados em tubos de 1,5 ml a -80ºC para posterior uso.
O cultivo dos esquistossômulos foi realizado em placas de 6 poços contendo 8
mL de meio 169 (Tabela 1) suplementado com 10% de soro fetal bovino (Gibco) e 1%
penicilina / estreptomicina100 mg/mL por poço. Os tempos de cultivo foram 8,5; 18,5;
24; 48 e 72 horas.
Tabela 1- Meio 169 com seus componentes e concentração.
Componentes Concentração
Hidrolisado de lactoalbumina 0,1%
Glicose 0,1%
Hipoxantina 5 X 10
-7
M
Triiodotironina (T3) 2 X10
-7
M
Serotonina 1 X 10
-6
M
Hidrocortisona 1 X 10
-6
M
Meio Mínimo Vitamina 0,5%
Meio Schneider 5%
HEPES 20 mM
RPMI q.s.p. 500 mL
Materiais e métodos
34
Figura 5: Preparação de esquistossômulos de 24 horas. Os esquistossômulos foram cultivados
por 24 horas em estufa de CO
2
5% a 37ºC em meio 169 analisados em lupa de aumento.
3.2 Anotação da via de miRNA
Para a identificação e comparação das seqüências envolvidas na via de miRNA
em S. mansoni, primeiramente foi necessário a recuperação de seqüências em banco de
dados de organismos onde a via está bem estudada como D. melanogaster (FlyBase), C.
elegans (WormBase) e H. sapiens (NCBI). Em seguida, estas seqüências foram
alinhadas via BLASTp, com E-value máximo de e-5, nos bancos transcriptoma
(http://verjo18.iq.usp.br/schisto/) e genoma do S. mansoni
(http://www.sanger.ac.uk/Projects/S_mansoni/). Todas as sequências que apresentaram
similaridade com genes relacionados á via foram extraídas dos bancos de dados e
analisadas. As seqüências prováveis de participação na via presentes em S. japonicum
foram recuperadas (GenBank-NCBI). As análises para a identificação dos domínios e
motivos protéicos conservados foram realizadas utilizando os programas Pfam e CDD
(Conserved domain database, NCBI).
3.3 Alinhamentos entre seqüências e Análise filogenética
A árvore filogenética das seqüências foi inferida usando o método Neighbor-
Joining (Saitou and Nei, 1987). A árvore filogenética consenso foi montada utilizando a
análise de bootstrap de 1000 réplicas. Os braços das árvores correspondendo a partes
Materiais e métodos
35
que repetiram em menos de 50% das réplicas de bootstrap foram colapsados. A
distância entre os ramos horizontais, separando duas seqüências foram proporcionais a
divergência entre as seqüências, sendo a quantidade de identidade de aminoácidos a
medida utilizada. O alinhamento entre as seqüências foram feitos utilizando ClustalX
2.0 e a árvore filogenética foi conduzida utilizando o programa MEGA4 (Tamura e
cols., 2007). O número de acesso das sequências utilizadas neste trabalho foi: Dm.Ago1
(NP_725342), Dm.Ago2 (ABB54719.1), Dm.Ago3 (ABO26294), Dm.Aubergine
(CAA64320), Dm.PIWI (AAD08705.1), Ce.ALG1 (NP_510322.2), Ce.ALG2
(NP_493837.1), Ce.RDE1 (NP_7411.1), Ce.ERGO1( NP_503362.2), Ce.SAGO2
(NP_871859.1), Ce.SAGO1 (NP_5040.1), Ce.PPW1 (NP_740835.1), Ce.PPW2
(NP_491535.1), Ce.PRG1( NP_492.1), At.AGO1( gbAAB91987.1), At.AGO4
(NP_565633.1), Ce.TAG76 (NP_499192.1), CE.PRG2( NP_500994.1), Sp.AGO1
(CAA19275.1), At.AGO7 (NP_177103.1), At.Zwille (CAA11429.1), At.AGO9
(CAD66636.1), Pt.PTIWI10 (CAI39070.1), Pt.PTIWI11 (CAI39069.1), Pt.PTIWI06
(CAI39075.1), Pt.PTIWI03 (CAI39076.1), Pt.PTIWI08 (CAI39073.1), Pt.PTIWI15
(CAI39065.1), Pt.PTIWI13 (CAI39067.1), Pt.PTIWI14 (CAI39066.1), Pt.PTIWI09
(CAI39072.1), Hs.HIWI (AAK92281.1), Pt.PTIWI02 (CAI44470.1), Pt.PTIWI12
(CAI39068.1), Pt.PTIWI05 (CAI44468.1), Hs.PIWIL1 (NP_004755.2), Hs.PIWIL4
(NP_689644.1), Hs.PIWIL3 (BAC81343.1), Hs.HILI (BAC81342.1), Hs.AGO1
(Q9UL18), Hs.AGO2 (Q9UKV8), Hs.AGO3 (Q9H9G7), Hs.AGO4 (Q9HCK5),
Mm.AGO2 (Q8CJG0), Mm.AGO1 (Q8CJG1), Mm.AGO3 (Q8CJF9), Mm.AGO4
(Q8CJF8), Mm.MIWI2 (AAN75583.1), Mm.MIWI (EDL19532.1), Mm.MILI
(AAK31965.1), Sme.SMEDWI1 (Q2Q5Y9), Sme.SMEDWI2 (Q2Q5Y8), Sj.3
(AAW25407.1), Sj.2 (AAX25645.2), Sj.1 (AAW26476.1), Dj.PIWIL (Q2PC95),
Dm.Dicer1 (NP_524453.1), Hs.Dicer1 (NP_085124.2), Mm.Dicer1 (NP_683750.2),
Aa.Dicer1 (XP_001659747.1), At.DCL1 (NP_171612.1), Am.Dicer1 (XP_624510.2),
Ce.DCR1 (NP_498761.1), Cb.Dicer1 (XP_001666666.1), Dm.Dicer2 (ABB54751.1),
Ds.Dicer2 (ABB54760.1), Hs.Drosha (Q9NRR4), Dp.GA21287 (XP_001361471.1),
Dy.Dicer2 (ABB54764.1), Aa.Drosha (XP_001653338.1), Dm.Drosha (NP_477436.1),
Am.Drosha (XP_394444.2), Aa.Dicer2 (AAW48725.1), At.Dicer2 (NP_001078101.1),
Dp.Dicer2 (XP_001360634.1), Mm.Drosha (XP_001473806.1), Ce.Drsh1
(NP_492599.1).
Materiais e métodos
36
3.4 Extração do DNA genômico
Para a extração do DNA genômico de S. mansoni foram utilizados vermes
adultos retirados do -80ºC. O protocolo adotado para extração foi descrito por Costa
(Tese de Doutorado, 1997).
Para cada 200 mg de vermes adultos, foram adicionados 500 µL do tampão de
extração (Tris 0,05 M, EDTA 1 mM, pH 7,5 e 1% de N-Lauril sarcosina) e 1000 µg/mL
de proteinase K. A amostra foi mantida a 37°C durante 6 horas. A seguir, foram
acrescentados 100µL de NaCl 5M e a mistura incubada por 10 minutos a 65°C.
Posteriormente foram adicionados 50µL de uma solução de CTAB/NaCl a 10%,
seguido por uma incubação de 20 minutos a 65°C. Após os 20 minutos foi adicionado o
mesmo volume de clorofórmio. As fases aquosa e orgânica foram separadas por
centrifugação a 12.000 x g por 15 minutos sendo em seguida a fase aquosa transferida
para outro tubo tipo eppendorf. O DNA presente na fase aquosa foi então precipitado
com igual volume de isopropanol, seguido de incubação por 30 minutos à -20ºC.
Posteriormente, o DNA foi centrifugado a 12000 x g por 15 minutos, lavado com etanol
70%, seco na capela por 15 minutos e ressuspenso em 100µL de água mili-Q estéril. O
DNA foi incubado durante por 16 horas a 37°C para homogeneização. Uma alíquota de
5 µL foi analisada em gel de agarose 0,5% em eletroforese a 90 volts. (Figura 6)
Figura 6: DNA genômico de verme adulto. Foram aplicados no gel aproximadamente 2 µg de
DNA e analisados em gel de agarose 0,6% e corado com brometo de etídio.
Materiais e métodos
37
3.5 Extração de RNA total para RT-PCR
Cerca de 100mg de vermes adultos, cercárias e ovos foram homogenizados em
1mL de Trizol (INVITROGEN) com auxílio de um vortex, na rotação máxima, em 4
intervalos de 14 minutos de incubação e 1 de homogeneização em temperatura
ambiente. Após a homogeneização, a mistura foi passada 5 vezes em uma seringa com
agulha (10 mL/25x8mm) a fim de fragmentar todo DNA genômico presente. Em
seguida, foram adicionados à mistura 200 µL de clorofórmio. As amostras foram
agitadas lentamente em vortex por 1 minuto e incubadas a temperatura ambiente durante
20 minutos, sendo posteriormente centrifugadas a 10000 x g por 10 minutos. Após esta
etapa de centrifugação, 3 fases se destacaram. Uma fase inferior de cor vermelha fenol-
clorofórmio, uma fase mediana incolor mas imiscível com a aquosa e uma fase superior
incolor aquosa. O DNA fica na interfase, as proteínas na fase orgânica, e o RNA
permanece exclusivamente na fase aquosa. A fase aquosa foi transferida para um novo
tubo estéril, tipo eppendorf, e em seguida adicionados 500 µL de isopropanol para a
precipitação do RNA total. O tubo foi invertido por três vezes cuidadosamente, e
incubada por 30 minutos à temperatura ambiente. Após a incubação o RNA foi então
recuperado por centrifugação a 10000 x g por 10 minutos. O sobrenadante foi
desprezado e o precipitado lavado, invertendo 3 vezes vagarosamente, com 1,0 mL de
etanol 70% em água tratada com dietilpirocarbonato (DEPC). Em seguida, o RNA foi
centrifugado a 10000 x g por 5 minutos e o precipitado final foi seco em fluxo laminar
por 15 minutos. Por fim RNA total foi ressuspenso em 40 µL de água livre de RNAses e
incubado por 10 minutos a 56°C para completa homogeneização.
3.6 Extração do RNA total para PCR quantitativo em tempo real
Cerca de 100 mg de vermes adultos, cercárias, ovos, esquistossômulos de 3,0
horas, 8,5 horas, 18,5 horas, 24 horas, 48 horas e 72 horas foram utilizados para
extração de RNA total utilizando o kit "Purelink Micro-to-Midi Total RNA purification
system" (Invitrogen).
A cada amostra foi adicionado 1 mL de Trizol e com auxílio de um politron, por
aproximadamente 1 minuto todo material foi completamente solubilizado. Em seguida,
Materiais e métodos
38
a mistura foi incubada por 5 minutos a temperatura ambiente. Depois da extração do
RNA, fases de separação com clorofórmio, e precipitação com isopropanol e etanol
70%, como descrito pelo método acima, procedemos à lavagem e eluição do ácido
nucléico, conforme o boletim técnico do fabricante, mostrado resumidamente abaixo.
Para o procedimento de lavagem, foram transferidos aproximadamente 700 µL
da amostra de RNA com etanol para a coluna com resina, e foi centrifugada a 12.000xg
por 1 minuto. Após centrifugação o volume eluido da coluna foi descartado. Esse
processo foi repetido por 2 vezes sendo posteriormente, foram adicionados 700 µL do
tampão de lavagem (Wash buffer I) e centrifugado por 1 minuto a 12.000xg. A seguir
foram adicionados 500 µL do tampão de lavagem II (Wash buffer II), e centrifugado a
12.000xg por 1 minuto. Todo material eluido foi descartado e a coluna transferida para
o tubo coletor onde o RNA foi eluido em 30 µL de água livre de RNAse e incubado por
1 minuto. Para separar o RNA total da amostra, este foi centrifugado por 12.000xg por 2
minutos, e mantido a -70ºC até o uso.
3.7 Verificação da qualidade do RNA total extraído
A qualidade do RNA total foi avaliada em gel de agarose-formaldeído 1%. Para
a preparação do gel, inicialmente 600 mg de agarose foi dissolvido em 40,0 mL de água
DEPEC autoclavada, livre de RNAses. Em outro recipiente, foram adicionados: 12,8
mL de água livre de RNAses, 6,0 mL de MOPS 10x (MOPS, acetato de sódio
diidratado, EDTA tetrassódico, água livre de RNAses, para um volume final de 500
mL) e 1,2 mL de de formaldeído e 0,5 µL de brometo de etídio. A solução foi misturada
à agarose e deixada em repouso até completa solidificação. As amostras foram
previamente desnaturadas em tampão (formamida, formaldeído, MOPS, azul de
bromofenol, água DEPEC e brometo de etídio), incubadas por 15 minutos a 65°C,
deixadas em banho de gelo durante 3 minutos e aplicadas no gel. As condições de
realização da eletroforese foram: 80 volts em tampão de corrida (MOPS 1x) por
aproximadamente 75 minutos (Figura 7 e 8).
Materiais e métodos
39
Figura 7: Análise em gel de agarose/formaldeído a 1%. RNA total para RT-PCR obtido a partir
de vermes adultos (1), cercárias (2), esquistossômulos 3,0 horas (3); esquistossômulos 8,5 horas
(4); esquistossômulos 18,5 horas (5); esquistossômulos 24 horas (6); esquistossômulos 48 horas
(7); esquistossômulos 72 horas (8); ovos (9).
Figura 8: Análise em gel de agarose/formaldeído a 1%. RNA total para PCR em tempo real
obtido a partir de vermes adultos (1), cercárias (2), esquistossômulos 3,0 horas (3);
esquistossômulos 8,5 horas (4); esquistossômulos 18,5 horas (5); esquistossômulos 24 horas (6);
esquistossômulos 48 horas (7); esquistossômulos 72 horas (8); ovos (9).
3.8 Quantificação de DNA e RNA
As concentrações de DNA e RNA foram estimadas a partir da medida de
absorbância a 260nm. Uma unidade de absorbância a 260nm corresponde
aproximadamente a 50µg/mL de DNA de fita dupla e 40µg/mL para RNA e DNA de
fita simples. O grau de pureza da preparação foi estimado através da relação entre as
leituras a 260 e 280nm. As preparações foram consideradas boas, quando o valor da
razão A=260/280 variou entre 1,6-2,3.
Materiais e métodos
40
3.9 Oligonucleotídeos iniciadores (Primers)
Os oligonucleotídeos iniciadores específicos foram idealizados utilizando o
programa Gene Runner e VectorNTI® (Invitrogen) para amplificação de DNA
genômico, cDNA para RT-PCR e para PCR em Tempo Real. Estes foram baseados nas
sequências de cDNA depositadas no banco ONSA da FAPESP (Fundação de Apoio à
Pesquisa do Estado de São Paulo), e GenBank para os genes Dicer (C604739),
Argonauta (C604197) e alfa tubulina (M80214). Todos primers amplificam parte dos
domínios conservados e funcionais da respectiva proteína codificada pela sequência
referente (Tabela 2).
Tabela 2: Tabela de Primers. Primers utilizados em diversas reações de PCR com
diferentes temperaturas de anelamento.
Proteína
DNA
PCR
Foward
(5’ 3’)
Reverse
(5’ 3’)
Temperatura
de anelamento
Argonauta
cDNA
RT
-
PCR
TCCTGGTTCCACATTCCG
CGATGATTTGGCCTACGG
59ºC
cDNA PCR em
Tempo
Real e
RT
-
PCR
TCACGCACGGTAGATCAGG
AGGTCCGCGTCAATTTGG
60ºC
DNA
genômico
PCR
convencio
nal
TCCTGGTTCCACATTCCG
CGATGATTTGGCCTACGG
59ºC
Dicer
cDNA
RT
-
PCR
TTTGTTCCTTCTGGTTCC
ATGACGACGAAGAAGATG
57ºC
cDNA
PCR em
Tempo
Real e
RT
-
PCR
TCTTCCGTCCACCATTCG
TGCCAACAACACAATTCC
60ºC
Alfa
tubulina
cDNA
PCR em
Tempo
Real
CGTATTCGCAAGTTGGCTGACC
A
CCATCGAAGCGCAGTGATGC
A
60ºC
3.10 PCR (Reação da Polimerase em Cadeia)
3.10.1 PCR convencional
Para validação das temperaturas de anelamento dos primers, sequenciamento e
síntese de DNA genômico foi utlizado a técnica de PCR convencional.
Foi utilizado para cada reação de amplificação 350 ng de DNA genômico, 10
mM de cada dNTP (dATP, dCTP, dTTP, e dGTP - Promega), 50 mM de MgCl
2
, 10
Materiais e métodos
41
picomoles de cada oligonucleotídeo (direto e reverso), 2,5 unidades de Platinum Taq
DNA polimerase (Invitrogen), 1X do tampão PCR 10X concentrado sem Mg
+2
e com
água milli-Q para completar o volume. O aparelho utilizado foi Thermo Hybaid Px2 e o
ciclo das reações de amplificação foi iniciado por desnaturação de 5 minutos a 95ºC, 35
ciclos pré-estabelecidos, com desnaturação a 95ºC por 1 minuto, anelamento a
temperatura específica de cada primer, extensão por 90 segundos a 72ºC e finalizado
com uma extensão de 6 minutos a 72ºC.
3.10.2 RT-PCR
A primeira fita do cDNA foi sintetizada utilizando o Kit Thermoscript RT-PCR
System (Invitrogen), seguindo as recomendações dadas pelo fabricante.
Foram utilizados 5 µg de RNA total, 50 pmol de oligodT, 10 mM de dNTPs e
água livre de RNAse para um volume final de 10 µL. A desnaturação do RNA foi
realizada através da incubação da mistura a 65°C em termociclador (Thermo Hybaid
Px2) durante 5 minutos, seguido de banho de gelo por 1 minuto. Em seguida, foram
adicionados o tampão da enzima, 0,1 M de DTT (ditiltreitol) e 15 unidades da enzima
transcriptase reversa. Posteriormente, essa mistura foi incubada novamente em
termociclador a 42°C durante 60 minutos e 85°C por 5 minutos. Por fim foi
acrescentado 1,0 µL de RNAseH e a amostra incubada por 20 minutos a 37ºC. A
amostra foi estocada a -20°C até o momento do uso.
No intuito de obter o cDNA fita dupla, amplificações foram realizadas utilizando
2µL do cDNA como molde, combinados com os mesmos reagentes e etapas de reação
descritos no item de DNA genômico, com exceção dos primers por sua especificidade e
temperatura de anelamento.
3.10.3 PCR quantitaviva em Tempo Real
Para análise da expressão dos genes supracitados foi utilizada a técnica de PCR
em tempo real. As reações foram realizadas utilizando o kit Platinum SYBR green
qPCR SuperMix-UDG ROX (INVITROGEN), conforme o manual do fabricante. A
reação de PCR quantitativo em Tempo Real foi conduzida conforme programação
contida no aparelho ABI 7500 Applied Biosystems. As análises foram feitas utilizando
Materiais e métodos
42
o método do ∆∆Ct, uilizando a fórmula 2-∆∆Ct , para calcular a expressão gênica
relativa dos genes em estudo, conforme boletim técnico do fabricante do aparelho de
qPCR (Applied Biosystems).
3.11 Análise Estatística
A expressão relativa nos estágios do parasito foi comparada utilizando a análise
da variância por ONE-WAY (Teste de Tukey). Foi considerado estatisticamente
significante P<0.001. A análise estatística foi feita utilizando o programa PRISM.
3.12 Verificação da qualidade do DNA ou cDNA
Os produtos das PCR’s supracitadas foram aplicados em gel de agarose 1,2%
(90 volts – 75 minutos), a temperatura ambiente, juntamente com o padrão de peso
molecular 100pb DNA Ladder (Invitrogen). O gel foi corado com brometo de etídio,
observado ao transiluminador (Vilber Lourmat) e fotografado.
3.13 Purificação do produto de PCR
O produto obtido na reação de PCR foi transferido para um novo tubo tipo
eppendorf e adicionado 1/10 do volume inicial de acetato de sódio 3M pH 7,0 (10µL) e
2,5 do volume (250µL) de etanol absoluto. Posteriormente esta mistura foi incubada a -
20ºC por 30 minutos e em seguida, centrifugada a 10000 x g por 5 minutos. O
precipitado foi lavado com etanol 70% e seco. O DNA foi suspenso em 50 µL de água
milli-Q estéril.
3.13.1FREEZE SQUEZE
De acordo com a metodologia descrita por Tautz e Renz (1983) as banda de
interesse, contendo os fragmentos de DNA, foram cortadas do gel de agarose, com
auxílio de um estilete. Em seguida, foram transferidas para um becker contendo 10 mL
de uma solução composta de NaOAc 300 mM/EDTA 1 mM pH 7,0 e incubada no
Materiais e métodos
43
escuro, sob agitação lenta por 30 min. Posteriormente, as bandas foram transferidas para
um tubo contendo um lã de vidro e mantidas a -80ºC por 30 minutos. O DNA livre da
agarose foi obtido por centrifugação a 12000 x g por 15 minutos e recuperado a -20ºC
pela precipitação com 1/10 de acetato de sódio 3M pH 7,0 e 2,5 volume de etanol
absoluto. Após a lavagem com etanol 70% e seco, o DNA foi suspenso em 50 µL de
água milli-Q estéril.
3.14 Clonagem
3.14.1 Reação de Ligação
As amostras purificadas foram ligadas ao vetor plasmidial de sequenciamento
pGEM-T easy (Promega) utilizando 5 µL de tampão, 3 µL do produto de PCR, 1 µL de
vetor pGEM-T easy e 1 µL de DNA ligase. A reação foi incubada no termociclador a
4ºC por 16 horas para efetuar a ligação.
3.14.2 Preparo de células competentes
Uma colônia de células de Escherichia coli DH5α foram inoculadas inicialmente
em 5 mL de meio LB (bacto-triptona 10g/L; extrato de levedura 5g/L; NaCl 5g/L;
pH=7,5) em um tubo tipo Falcon de 15 mL e incubadas a 37ºC por 16 horas sob
agitação de 200 rpm. Após a incubação, 250µL do pré-inóculo foram transferidos para
um tubo tipo Falcon de 50 mL e o volume completado para 25 mL com meio SOB
(bacto-triptona 2g/L; extrato de levedura 5g/L; NaCl 0,58; KCl 0,2g/L; pH=7,5)
suplementado com 250µL de MgSO
4
1M e 250µL de MgCl
2
1M. A cultura foi incubada
por duas horas a 37ºC sob agitação (200 rpm) até que a concentração de células
atingisse uma densidade ótica (600nm) entre 0,4 e 0,6. A seguir, as células foram
incubadas em banho de gelo por 30 minutos e recuperadas por centrifugação a 3000 x g
durante 10 minutos a 4ºC. O sobrenadante foi descartado e o precipitado ressuspenso
com auxílio de um pipetador automático em 10 mL de tampão Pipes (60 mM de CaCl
2
,
10mM de Pipes e 15% de glicerol P.A) para a lavagem das células. As bactérias foram
novamente centrifugadas a 2000 x g durante 10 minutos a 4ºC. A lavagem foi repetida
duas vezes nas mesmas condições. Após as lavagens, as células foram incubadas por 30
Materiais e métodos
44
minutos em banho de gelo e em seguida centrifugadas a 2000 x g por 10 minutos a 4ºC.
Depois da centrifugação, o sobrenadante foi descartado e o precipitado ressuspenso em
1,2 mL de tampão Pipes. As células competentes foram então alíquotadas e
armazenadas a -80ºC até o momento do uso.
3.14.3 Transformação Bacteriana
Foram adicionados 5µL do produto da reação de ligação, conforme obtido em
uma alíquota de célula competente (100µL). Essa mistura foi incubada em banho de
gelo durante 30 minutos, submetida a choque térmico à 42ºC por 90 segundos e
retornada ao banho de gelo em seguida por 2 minutos. Esta foi transferida para um tubo
tipo Eppendorf contendo 950µL de meio SOB e incubada durante 90 minutos a uma
temperatura de 37ºC sob agitação constante (200 rpm). Após esse período, a suspensão
bacteriana foi centrifugada a 3000 x g por 5 minutos e o precipitado transferido para
placas de Petri com meio LB-ágar contendo ampicilina (100µg/mL), X-Gal (20µg/mL)
e IPTG. A presença de X-Gal permitiu a seleção dos clones recombinates. As placas
contendo as células transformadas foram incubadas durante 16 horas a 37ºC em estufa.
3.14.4 PCR de Colônia
As colônias recombinantes foram transferidas para 1,5 mL de caldo
LB/ampicilina durante 14 horas e submetidas à amplificação por PCR para confirmação
da presença do inserto de interesse na colônia.
3.14.5 Minipreparação
Uma alíquota de 20µL da cultura das células transformadas foram inoculadas em
5 mL de meio LB/ampicilina (100µg/mL) e incubadas durante 16 horas a 37ºC sob
agitação constante (200 rpm). O método de extração utilizado foi o da lise alcalina
descrito por Maniatis e cols., 1989. Um volume de 1,5 mL de cultura bacteriana foi
centrifugado a 14000 x g durante 3 minutos. O sobrenadante foi removido e o
procedimento realizado novamente. Em seguida, o precipitado foi suspenso em 100µL
de solução TGE (Glicose 50mM, EDTA 10mM e Tris-HCl 25mM pH 8,0)
Materiais e métodos
45
suplementada com 5 µL RNAse 20mg/mL. Após a lise alcalina das bactérias com
solução composta de NaOH 0,2 N e SDS a 1% e precipitação das proteínas com acetato
de potássio 3M pH 4,0, 500 µL de isopropanol foi adicionado para a precipitação do
DNA plasmidial. A amostra contendo DNA plasmidial foi incubada a temperatura
ambiente por 20 minutos e centrifugada novamente a 14000 x g por 15 minutos. Após o
descarte do sobrenadante o pellet foi lavado com etanol 70% e centrifugado durante 5
minutos a 14000 x g. Novamente o sobrenadante foi descartado, sendo em seguida o
precipitado seco a temperatura ambiente e ressuspendido em 50 µL de água milli-Q.
Uma alíquota de 5 µL foi aplicada em gel de agarose 0,8% para confirmação da
preparação (Figura 9)
Figura 9: Análise da minipreparação dos clones em gel de agarose a 0,8%. Cerca de 5
µL da minipreparação foram analisados em gel de agarose e corado com brometo de
etídeo.
3.15 Sequenciamento
Materiais e métodos
46
As reações de sequenciamento foram realizadas utilizando o kit Big-Dye
Terminator (Applied Biosystems), de acordo com as instruções do fabricante e as
reações, analisadas no seqüenciador automático de DNA, ABI 3100 Genetic Analyzer
(Applied Biosystems). Os plasmídeos foram seqüenciados, nas direções “direta” e
“reversa”.
3.16 Análise computacional das seqüências
3.16.1 Seqüência consenso
As seqüências obtidas no seqüenciamento foram submetidas um alinhamento
entre elas para obtenção da seqüência consenso. Posteriormente foram utilizadas
seqüências do banco de dados de transcriptoma (http://verjo18.iq.usp.br/schisto/) e
genoma do S. mansoni (http://www.sanger.ac.uk/Projects/S_mansoni/) para busca de
similaridade. Para o alinhamento entre as seqüências foram utilizados os programas
BLAST2 (NCBI) e ClustalX 2.0
3.16.2 Splicing alternativo
As seqüências consenso e aquelas presentes nos bancos de dados da FAPESP
(ONSA) e geneDB representantes da família Argonauta no parasito foram alinhadas
utilizando os programas BLAST2 (NCBI) e ClustalX 2.0.
3.17 Predição de miRNA
Candidatos a miRNA em S. mansoni foram escolhidos de 2 formas: utilizando
regiões de miRNAs não maduros (pré-miRNA) de D. melanogaster e C. elegans como
molde para busca e utilizando sequências intergênicas recuperadas do GeneDB. As
seqüências que obtiveram similaridade satisfatória foram pré-selecionadas. Todas as
seqüências pré-selecionadas foram rodadas no programa WEB Mfold 3.2
(www.mfold.com) para a obtenção da sua respectiva estrutura secundária. A partir deste
momento as seguintes características foram analisadas: números de estruturas geradas
Materiais e métodos
47
pela mesma seqüência, números de grampos por estrutura, tamanho do grampo (“loop”),
simetria e energia livre (∆G kcal/mol) da estrutura final.
Resultados
48
4-RESULTADOS
Resultados
49
4.1 Reconstituição in silico da via de miRNA
As seqüências relacionadas ao mRNA, DNA genômico e proteína da via de
silenciamento mediada por miRNAs, foram recuperadas dos bancos de dados do
geneDB (Sanger Institute) e FAPESP (ONSA). Estas foram selecionadas por possuírem
alta similaridade com ortólogos onde a via está quase toda descrita como D.
melanogaster, C. elegans e H. sapiens, e também com prováveis ortólogos da via como
S. japonicum. Os ortólogos encontrados em S. mansoni foram nomeados utilizando as
primeiras letras do nome da espécie, Sm, seguido pelo nome da proteína encontrada nos
organismos relacionados e um número quando ocorrer a existência de parálogos.
Além das proteínas da via e suas correlações, também identificamos um
provável microRNA com características intrínsecas expressivas de um miRNA.
4.1.1 Análise in silico dos constituintes da via de miRNA
A Tabela 3 mostra os genes identificados nos bancos de dados com uma suposta
função de envolvimento na biogênese de miRNA em S. mansoni representando o
estágio nuclear, mediado pela proteína SmDrosha1/2 e SmPasha, passando pela
carioteca, com SmExportina-5.1/2, até chegar no estágio citoplasmático, representado
pela SmDicer1, SmLoquacious e pelas proteínas componentes de RISC,
SmArgonautas1/2/3/4, SmFmr1 e SmTudor-SN.
As Figuras 10 a 22 mostram a representação esquemática da estrutura protéica
primária das proteínas identificadas. As Tabelas 4 a 16 mostram as regiões de cobertura
destes domínios e sua similaridade com banco de dados de domínios conservados, e a
comparação por tamanho e similaridade com seus ortólogos.
A Figura 10 mostra o contig Smp_169750 depositado no banco de dados
geneDB que representa a proteína SmDicer1 com uma ORF predita de 2174
aminoácidos. A Tabela 4A mostra os domínios conservados presentes, HEL, DUF283,
PAZ e RIBOc (endoND1 e endoND2), bem como a similaridade com o consenso dos
bancos de dados CDD e PFAM. A Tabela 4B mostra os ortólogos de SmDicer1 e uma
comparação entre os tamanhos e similaridade variando de 3e-124 em D. melanogaster a
1e-84 em H. sapiens.
Resultados
50
Tabela 3: Prováveis seqüências da via de miRNA em S. mansoni. As seqüências de
S. mansoni foram recuperadas do banco de dados geneDB. As seqüências de seus
ortólogos D. melanogaster, C. elegans e humano, foram recuperadas dos bancos
Flybase, Wormbase, e Genebank, respectivamente. As seqüências dos prováveis
ortólogos presentes em S. japonicum também foram recuperadas no Genebank.
Via de miRNA Prováveis
ortólogos de
S. mansoni
Função Domínios Ortólogos de
humanos
(GeneBank)
Ortólogos de
D. melanogaster
(FlyBase)
Ortólogos de
C. elegans
(WormBase)
Prováveis
ortólogos de
S. japonicum
(GeneBank)
RNAse III
Dicer Smp_169750 Processamento de
pré-miRNA
RNase III, PAZ,
dsRBD
NP_085124
FBgn0039016 WBGene00000939 SJCHGC08817
Drosha Smp_142510.2
Smp_142510.1
Processamento de
pri-miRNA
RNase III, dsRBD
AAF80558
FBgn0026722 WBGene00009163 SJCHGC08309
Componente de RISC
Argonaute Smp_140010
Smp_179320
Smp_102690.2
Smp_102690.3
Ligante de RNA e
nuclease
PAZ, PIWI
Q9UL18
NP_079128
FBgn0026611
FBgn0046812
WBGene00000105
WBGene00000106
SJCHGC07755
SJCHGC07884
SJCHGC01111
SJCHGC05069
SJCHGC07014
SJCHGC02502
Tudor-SN Sm01663 Nuclease Tudor, SNc
Q7KZF4
FBgn0035121 WBGene00006626 SJCHGC09149
SJCHGC04700
SJCHGC05245
Fmr1 Smp_099630 Ligante de RNA KH, PRK11824
AAC50155
FBgn0028734 - SJCHGC09283
Outros fatores
Pasha Smp_087220 Ligante de fita
dupla de RNA
dsRBD
BAB83032
FBgn0039861 WBGene00011908 SJCHGC09172
Loquacious Smp_023670 Ligante de fita
dupla de RNA
dsRBD
NP_004169
FBgn0032515 - -
Exportin-5
Smp_152800.1
Smp_152800.2
Exportadora
nuclear de pré-
miRNA
CRM1, Xpo1
NP_065801
FBgn0031051
-
SJCHGC09381
SJCHGC05562
Figura 10: Esquema dos domínios conservados, da região codificadora da proteína
SmDicer1 (Smp_169750).
Tabela 4A: Regiões de cobertura dos domínios conservados da enzima SmDicer1 e
seus respectivos alinhamentos característicos com os domínios consenso dos bancos de
dados PFAM e CDD.
Domínio Região de
cobertura (aa)
Código de acesso
do domínio
E-value
(Blastp)
HEL 628-684 pfam00271 0,006
DUF283 802-918 pfam03368 1e-12
PAZ 1236-1337 cd02843 7e-26
RIBOc (endoND1) 1637-1719 cd00593 4e-16
RIBOc (endoND2) 1906-2086 cd00593 9e-28
Resultados
51
Tabela 4B: Comparação entre SmDicer1 e suas ortólogas relacionando tamanho e
similaridade.
Espécie Ortóloga Código de acesso Tamanho
(aa)
E-value
(Blastp)
S. mansoni SmDicer1 Smp_169750 2174 -
D. melanogaster Dicer-1 FBgn0039016 2249 3e-124
C. elegans Dcr-1 WBGene00000939
1845 1e-98
H. sapiens Dicer1 NP_085124 1922 1e-84
As Figura 11 e 12 mostram os contig Smp_142510.1 e Smp_142510.1
depositados no banco de dados geneDB que representam as proteínas SmDrosha1 e
SmDrosha2 com uma ORF predita de 1531 e 1577 aminoácidos, respectivamente. As
duas representam seqüências de cDNA provindas de um mesmo DNA genômico
representando um splicing alternativo.
As Tabelas 5A e 6A mostram os domínios conservados presentes, RIBOc
(endoND1 e endoND2), e DSRM e as similaridades com o consenso do banco de dados
CDD. As Figuras 5B e 6B mostram os ortólogos de SmDrosha1 e SmDrosha2 e uma
comparação entre os tamanhos e similaridade entre eles. Os valores de similaridade
variaram de 0 a 1e-130.
Figura 11: Esquema dos domínios conservados, da região codificadora da enzima
SmDrosha1 (Smp_142510.1).
Tabela 5A: Regiões de cobertura dos domínios conservados da enzima SmDrosha1 e
seus respectivos alinhamentos característicos com os domínios consenso dos bancos de
dados CDD.
Domínio Região de
cobertura (aa)
Código de acesso
do domínio
E-value
(Blastp)
RIBOc (endoND1) 951-1064 cd00593 1e-24
RIBOc (endoND2) 1123-1258 cd00593 4e-24
DSRM 1264-1334 cd00048 1e-08
Resultados
52
Tabela 5B: Comparação entre SmDrosha1 e suas ortólogas relacionando tamanho e
similaridade.
Espécie Ortóloga Código de acesso Tamanho
(aa)
E-value
(Blastp)
S. mansoni SmDrosha1 Smp_1425.1 1531 -
D. melanogaster Drosha FBgn0026722 1327 0
C. elegans Drsh-1 WBGene00009163
1086 1e-130
H. sapiens Drosha AAF80558 1374 0
Figura 12: Esquema dos domínios conservados, da região codificadora da enzima
SmDrosha2 (Smp_142510.2).
Tabela 6A: Regiões de cobertura dos domínios conservados da enzima SmDrosha1 e
seus respectivos alinhamentos característicos com os domínios consenso dos bancos de
dados CDD.
Domínio Região de
cobertura (aa)
Código de acesso
do domínio
E-value
(Blastp)
Ribonuclease III 905-1018 cd00593 1e-24
Ribonuclease III 1077-1212 cd00593 4e-24
DSRM 1218-1288 cd00048 1e-08
Tabela 6B: Comparação entre SmDrosha2 e suas ortólogas relacionando tamanho e
similaridade.
Espécie Ortóloga Código de acesso Tamanho
(aa)
E-value
(Blastp)
S. mansoni SmDrosha2 Smp_142510.2 1577 -
D. melanogaster Drosha FBgn0026722 1327 0
C. elegans Drsh-1 WBGene00009163
1086 3e-105
H. sapiens Drosha AAF80558 1374 0
A família de Agonautas é representada em S. mansoni por 4 proteínas, SmAgo1,
SmAgo2, SmAgo3 e SmAgo4 com seqüências completas e uma quinta provável com
seqüência parcial apresentada mais abaixo nesta mesma seção Resultados.
Resultados
53
As Figuras 13, 14, 15 e 16 representam as seqüências SmAgo1, SmAgo2,
SmAgo3 e SmAgo4, respectivamente. Os contigs depositado no banco de dados
geneDB de cada uma estão mostrados nas Figuras. As ORFs preditas das 4 proteínas
variam de 876 a 955 aminoácidos. As Tabelas 7A, 8A, 9A e 10A mostram os domínios
conservados presentes, PIWI e PAZ característicos de todas as proteínas da família e
suas similaridades com os consensos dos bancos de dados CDD e PFAM. Além disso, a
SmAgo1 apresenta um domínio DUF1785, de função desconhecida, presentes nas
Argonautas do tipo 1 como Ago1 (D. melanogaster) e Alg-1 (C. elegans). As Tabelas
7B, 8B, 9B e 10B mostram os ortólogos de SmAgos e uma comparação entre os
tamanhos e sua similaridade. SmAgo1 atingiu o maior valor de similaridade (zero) em
relação a suas ortólogas. SmAgo2, SmAgo3 e SmAgo4 apresentaram similaridades que
variaram de 5e-99 a 3e-108, 4e-52 a 8e-62 e 1e-98 a 1e-101, respectivamente.
Figura 13: Esquema dos domínios conservados, da região codificadora da enzima
SmAgo1 (Smp_140010).
Tabela 7A: Regiões de cobertura dos domínios conservados da enzima SmAgo1 e seus
respectivos alinhamentos característicos com os domínios consenso dos bancos de
dados PFAM e CDD.
Domínio Região de
cobertura (aa)
Código de acesso
do domínio
E-value
(Blastp)
DUF1785 234-286 pfam08699 2e-16
PAZ 286-406 cd02846 2e-30
PIWI 451-834 cd04657 9e-140
Tabela 7B: Comparação entre SmAgo1 e suas ortólogas relacionando tamanho e
similaridade.
Espécie Ortóloga Código de acesso Tamanho
(pb)
E-value
(Blastp)
S. mansoni SmAgo1 Smp_140010 876 -
D. melanogaster Ago-1 FBgn0026611 984 0
C. elegans Alg-1 WBGene00000105
1002 0
H. sapiens EIF2-C.2 NP_036286 859 0
Resultados
54
Figura 14: Esquema dos domínios conservados, da região codificadora da enzima
SmAgo2 (Smp_179320).
Tabela 8A: Regiões de cobertura dos domínios conservados da enzima SmAgo2 e seus
respectivos alinhamentos característicos com os domínios consenso dos bancos de
dados PFAM e CDD.
Domínio Região de
cobertura (aa)
Código de acesso
do domínio
E-value
(Blastp)
PAZ 363/471 pfam02170 1e-10
PIWI 510/927 cd04657 1e-120
Tabela 8B: Comparação entre SmAgo2 e suas ortólogas relacionando tamanho e
similaridade.
Espécie Ortóloga Código de acesso Tamanho
(pb)
E-value
(Blastp)
S. mansoni SmAgo2 Smp_179320 955 -
D. melanogaster Ago-1 FBgn0026611 984 7e-104
C. elegans Alg-1 WBGene00000105
1002 5e-99
H. sapiens EIF2-C.2 NP_036286 859 3e-108
Figura 15: Esquema dos domínios conservados, da região codificadora da enzima
SmAgo3 (Smp_102690.2).
Tabela 9A: Regiões de cobertura dos domínios conservados da enzima SmAgo3 e seus
respectivos alinhamentos característicos com os domínios consenso dos bancos de
dados PFAM e CDD.
Domínio Região de
cobertura (aa)
Código de acesso
do domínio
E-value
(Blastp)
PAZ 329/437 pfam02170 5e-09
PIWI 481/809 cd04657 2e-64
Resultados
55
Tabela 9B: Comparação entre SmAgo3 e suas ortólogas relacionando tamanho e
similaridade.
Espécie Ortóloga Código de acesso Tamanho
(pb)
E-value
(Blastp)
S. mansoni SmAgo3 Smp_102690.2 854 -
D. melanogaster Ago-1 FBgn0026611 984 8e-62
C. elegans Alg-1 WBGene00000105
1002 4e-52
H. sapiens EIF2-C.3 NP_079128 860 2e-58
Figura 16: Esquema dos domínios conservados, da região codificadora da enzima
SmAgo4 (Smp_102690.3).
Tabela 10A: Regiões de cobertura dos domínios conservados da enzima SmAgo4 e
seus respectivos alinhamentos característicos com os domínios consenso dos bancos de
dados PFAM e CDD.
Domínio Região de cobertura
(aa)
Código de acesso
do domínio
E-value
(Blastp)
PAZ 329/437 pfam02170 4e-09
PIWI 481/895 cd04657 3e-113
Tabela 10B: Comparação entre SmAgo4 e suas ortólogas relacionando tamanho e
similaridade.
Espécie Ortóloga Código de acesso Tamanho
(pb)
E-value
(Blastp)
S. mansoni SmAgo4 Smp_102690.3 924 -
D. melanogaster Ago-1 FBgn0026611 984 1e-101
C. elegans Alg-1 WBGene00000105
1002 8e-101
H. sapiens EIF2-C.3 NP_079128 860 1e-98
A Figura 17 mostra o contig Smp_099630 depositado no banco de dados
geneDB que representa a proteína SmFmr1 com uma ORF predita de 598 aminoácidos.
A Tabela 11A mostra os domínio conservado presente, PRK11824 e sua similaridade
com o consenso do banco de dados. A Tabela 11B mostra os ortólogos de SmFmr1,
Resultados
56
uma comparação entre seus tamanhos e similaridade entre eles variando entre 5e-37 e
4e-43.
Figura 17: Esquema dos domínios conservados, da região codificadora da enzima
SmFmr1 (Smp_099630).
Tabela 11A: Regiões de cobertura dos domínios conservados da enzima SmFmr1 e
seus respectivos alinhamentos característicos com os domínios consenso dos bancos de
dados.
Domínio Região de
cobertura (aa)
Código de acesso
do domínio
E-value
(Blastp)
PRK11824 272-350 PRK11824 0.006
Tabela 11B: Comparação entre SmFmr1 e suas ortólogas relacionando tamanho e
similaridade.
Espécie Ortóloga Código de
acesso
Tamanho
(pb)
E-value
(Blastp)
S. mansoni SmFmr1 Smp_099630 598 -
D. melanogaster Fmr1 FBgn0028734 643 5e-37
C. elegans - - - -
H. sapiens FXR1 AAC50155 621 4e-43
A Figura 18 mostra o contig Sm01663 representando a proteína SmTudor-SN
sendo a única proteína da via oriunda de seqüências do transcriptoma (geneDB) com
uma ORF de 1023 aminoácidos. A Tabela 12A mostra os domínios conservados
presentes, SNc e Tudor e suas similaridades com o consenso dos bancos de dados CDD
e PFAM. A Tabela 12B mostra os ortólogos de SmTudor-SN, seus tamanhos e uma
similaridade que varia de 5e-159 a 0.
Figura 18: Esquema dos domínios conservados, da região codificadora da enzima
SmTudor-SN (Sm01663).
Resultados
57
Tabela 12A: Regiões de cobertura dos domínios conservados da enzima SmTudor-SN e
seus respectivos alinhamentos característicos com os domínios consenso dos bancos de
dados PFAM e CDD.
Domínio Região de
cobertura (aa)
Código de acesso
do domínio
E-value
(Blastp)
SNc 24-164 cd00175 3e-22
SNc 199-334 cd00175 4e-15
SNc 364-507 cd00175 5e-16
SNc 544-704 cd00175 3e-19
TUDOR 788-893 pfam00567 4e-10
Tabela 12B: Comparação entre SmTudor-SN e suas ortólogas relacionando tamanho e
similaridade.
Espécie Ortóloga Código de acesso Tamanho
(pb)
E-value
(Blastp)
S. mansoni SmTudor-SN Sm_01663 1023 -
D. melanogaster Tudor-SN FBgn0035121 926 5e-159
C. elegans Tsn-1 WBGene00006626
914 3e-168
H. sapiens SND-1 Q7KZF4 910 0
A Figura 19 mostra o contig Smp_087220 depositado no banco de dados
geneDB representando a proteína SmPasha com uma ORF predita de 732 aminoácidos.
A Tabela 13A mostra o domínio conservado presente, DSRM, e sua similaridade com o
consenso do banco de dados CDD. A Figura 13B mostra os ortólogos de SmPasha, uma
comparação entre seus tamanhos e a similaridade entre eles, que varia de 4e-13 a 4e-47
Figura 19: Esquema dos domínios conservados, da região codificadora da enzima
SmPasha (Smp_087220).
Resultados
58
Tabela 13A: Regiões de cobertura dos domínios conservados da enzima SmPasha e
seus respectivos alinhamentos característicos com os domínios consenso dos bancos de
dados PFAM e CDD.
Domínio Região de
cobertura (aa)
Código de acesso
do domínio
E-value
(Blastp)
DSRM 443-507 cd00048 1e-08
Tabela 13B: Comparação entre SmPasha e suas ortólogas relacionando tamanho e
similaridade.
Espécie Ortóloga Código de acesso Tamanho
(pb)
E-value
(Blastp)
S. mansoni SmPasha Smp_087220 732 -
D. melanogaster PASHA FBgn0039861 642 4e-47
C. elegans Pash-1 WBGene00011908
790 4e-13
H. sapiens DGCR8 BAB83032 773 3e-38
As Figuras 20 e 21 mostram os contig Smp_152800.1 e Smp_152800.1
depositados no banco de dados geneDB que representam as proteínas SmExportina5.1 e
SmExportina5.2 com ORFs preditas de 1286 e 1026 aminoácidos, respectivamente.
provindas de um mesmo DNA genômico como acontece com SmDrosha1 e 2 e
SmAgo3 e 4. As Tabelas 14A e 15A mostram os domínios conservados presentes,
CRM1 e Xpo1, e as similaridades com o consenso dos bancos de dadoa PFAM e COG.
As Tabelas 14B e 15B mostram os ortólogos de SmExportina5.1 e SmExportina5.2 e
uma comparação entre seus tamanhos e similaridade variando de 6e-35 a 1e-38 e 2e-28
a 7e-29, respectivamente.
Figura 20: Esquema dos domínios conservados, da região codificadora da enzima
SmExportina5.1 (Smp_152800.1).
Resultados
59
Tabela 14A: Regiões de cobertura dos domínios conservados da enzima
SmExportina5.1 e seus respectivos alinhamentos característicos com os domínios
consenso dos bancos de dados PFAM e COG.
Domínio Região de
cobertura (aa)
Código de acesso
do domínio
E-value
(Blastp)
CRM1 19-186 COG5101 9e-06
Xpo1 110-231 pfam08389 8e-08
Tabela 14B: Comparação entre SmExportina5.1 e suas ortólogas relacionando tamanho
e similaridade.
Espécie Ortóloga Código de
acesso
Tamanho
(pb)
E-value
(Blastp)
S. mansoni SmExportina5.1 Smp_152800.1 1286 -
D. melanogaster RanBP21 FBgn0031051 1241 6e-35
C. elegans - - - -
H. sapiens Exportin 5 NP_065801 1204 1e-38
Figura 21: Esquema dos domínios conservados, da região codificadora da enzima
SmExportina5.2 (Smp_152800.2).
Tabela 15A: Regiões de cobertura dos domínios conservados da enzima
SmExportina5.1 e seus respectivos alinhamentos característicos com os domínios
consenso dos bancos de dados PFAM e COG.
Domínio Região de
cobertura (aa)
Código de acesso
do domínio
E-value
(Blastp)
CRM1 19-186 COG5101 8e-06
Xpo1 110-231 pfam08389 1e-07
Resultados
60
Tabela 15B: Comparação entre SmExportina5.2 e suas ortólogas relacionando tamanho
e similaridade.
Espécie Ortóloga Código de
acesso
Tamanho
(pb)
E-value
(Blastp)
S. mansoni SmExportin5.2 Smp_152800.2 1021 -
D. melanogaster RanBP21 FBgn0031051 1241 2e-28
C. elegans - - - -
H. sapiens Exportin 5 NP_065801 1204 7e-29
A Figura 22 mostra o contig Smp_023670 depositado no banco de dados
geneDB representando a proteína SmLoquacious com uma ORF de 356 aminoácidos. A
Tabela 16A mostra os domínios conservados presentes, DSRMs, e suas similaridades
com o consenso do banco de dados CDD. A Tabela 16B mostra os ortólogos de
SmLoquacious e uma comparação entre os tamanhos e suas similaridade, variando de
6e-12 a 3e-22
Figura 22: Esquema dos domínios conservados, da região codificadora da enzima
SmLoquacious (Smp_023670).
Tabela 16A: Regiões de cobertura dos domínios conservados da enzima SmLoquacious
e seus respectivos alinhamentos característicos com os domínios consenso dos bancos
de dados CDD.
Domínio Região de
cobertura (aa)
Código de acesso
do domínio
E-value
(Blastp)
DSRM 9-74 cd00048 6e-10
DSRM 126-193 cd00048 1e-08
Tabela 16B: Comparação entre SmLoquacious e suas ortólogas relacionando tamanho
e similaridade.
Espécie Ortóloga Código de
acesso
Tamanho
(pb)
E-value
(Blastp)
S. mansoni SmLoquacious Smp_023670 356 -
D. melanogaster Loquacious FBgn0032515 465 3e-22
C. elegans - - - -
H. sapiens TARBP2 NP_004169 345 6e-12
Resultados
61
4.1.2 Análise das ESTs
Abaixo, as Tabela de 17 a 28 mostram os alinhamentos, utilizando o algoritmo
BLASTn, das prováveis seqüências de cDNA das proteínas da via de miRNA do
parasito com as ESTs do banco de dados do transcriptoma da FAPESP (ONSA) e o
tamanho da seqüência de EST, sendo representada por um singlets ou por um contig.
Além disso, foi também representado em cada Tabela o estágio evolutivo do parasito
que o clone da seqüência EST foi seqüenciado. SmLoquacious não apresentou
sequências similares no banco de dados do transcriptoma.
A porcentagem relativa das ESTs representadas no banco de dados da FAPESP
(ONSA) referentes às proteínas da via de miRNA e os estágios que elas pertencem, está
mostrada nos anexos 4 e 5.
Tabela 17: Contig ou singlet do banco de dados da FAPESP de S. mansoni similares à
proteína SmDicer1 relacionando tamanho de cada um, posição e os estágios evolutivos
que foram obtidos. A, estágio evolutivo vermes adultos, M, estágio evolutivo macho
adulto, F, estágio evolutivo fêmea adulta, E, estágio evolutivo ovos, L, estágio
evolutivo, miracídios, G, esporocistos, C, cercária e S, esquistossômulos.
Código de acesso do
contig ou singlet
Tamanho (pb) do
contig ou singlet
Estágios
evolutivos
Região de
cobertura
E-value
(Blastn)
C713374.1 468 1(L) 5436-5902 0
C604739.1 728 2(L), 1(S) 6048-6351 1e-171
C705307.1 242 1(G) 1168-1409 1e-134
C716281.1 281 1(A) 121-318 1e-100
Resultados
62
Tabela 18: Contig ou singlet do banco de dados da FAPESP de S. mansoni similares à
proteína SmDrosha1 relacionando tamanho de cada um, posição e os estágios
evolutivos que foram obtidos. A, estágio evolutivo vermes adultos, M, estágio evolutivo
macho adulto, F, estágio evolutivo fêmea adulta, E, estágio evolutivo ovos, L, estágio
evolutivo, miracídios, G, esporocistos, C, cercária e S, esquistossômulos.
Código de acesso do
contig ou singlet
Tamanho (pb) do
contig ou singlet
Estágios
evolutivos
Região de
cobertura
E-value
(Blastn)
C602470.1 875 4(L), 1(G)
1-564 0
C606975.1 755 2(M), 2(L),
1(E)
1905-2454 0
C700852.1 370 1(S)
3674-4043 0
C710110.1 145 1(A)
1531-1677 8e-66
C717779.1 150 1(A) 390-533 6e-48
Tabela 19: Contig ou singlet do banco de dados da FAPESP de S. mansoni similares à
proteína SmDrosha2 relacionando tamanho de cada um, posição e os estágios
evolutivos que foram obtidos. A, estágio evolutivo vermes adultos, M, estágio evolutivo
macho adulto, F, estágio evolutivo fêmea adulta, E, estágio evolutivo ovos, L, estágio
evolutivo, miracídios, G, esporocistos, C, cercária e S, esquistossômulos.
Código de acesso do
contig ou singlet
Tamanho (pb) do
contig ou singlet
Estágios
evolutivos
Região de
cobertura
E-value
(Blastn)
C606975.1 755 2(M), 2(L),
1(E)
1862- 2592 0
C602470.1 875 4(L), 1(G)
1- 564 0
C700852.1 370 1(S)
3812- 4181 0
C710110.1 145 1(A)
1531- 1677 8e-66
C717779.1 150 1(A) 390- 533 7e-48
Resultados
63
Tabela 20: Contig ou singlet do banco de dados da FAPESP de S. mansoni similares à
proteína SmAgo1 relacionando tamanho de cada um, posição e os estágios evolutivos
que foram obtidos. A, estágio evolutivo vermes adultos, M, estágio evolutivo macho
adulto, F, estágio evolutivo fêmea adulta, E, estágio evolutivo ovos, L, estágio
evolutivo, miracídios, G, esporocistos, C, cercária e S, esquistossômulos.
Código de acesso do
contig ou singlet
Tamanho (pb) do
contig ou singlet
Estágios
evolutivos
Região de
cobertura
E-value
(Blastn)
C719260.1 495
1(S)
696-1038 0
C719260.1 495
1(S)
574-695 2e-56
C705711.1 460
1(L)
1324-1580 1e-143
C705058.1 463
1(L)
1175-1325 2e-80
C716122.1 381
1(S)
1680-1818 3e-73
C716122.1 381
1(S)
1829-1938 6e-56
Tabela 21: Contig ou singlet do banco de dados da FAPESP de S. mansoni similares à
proteína SmAgo2 relacionando tamanho de cada um, posição e os estágios evolutivos
que foram obtidos. A, estágio evolutivo vermes adultos, M, estágio evolutivo macho
adulto, F, estágio evolutivo fêmea adulta, E, estágio evolutivo ovos, L, estágio
evolutivo, miracídios, G, esporocistos, C, cercária e S, esquistossômulos.
Código de acesso do
contig ou singlet
Tamanho (pb) do
contig ou singlet
Estágios
evolutivos
Região de
cobertura
E-value
(Blastn)
C603705.1 1294
30(A), 15(F),
12(L), 2(E),
1(G)
572-1841 0
C608655.1 979
7(A),2(L)
1954-2868 0
C604197.1 3071
10(E), 9(L),
5(F), 4(A),
2(S), 1(G)
925-1484 0
C601842.1 510
3(E)
371-683 1e-174
C601842.1 510
3(E)
905-1108 1e-112
C612177.1 515
2(L), 1(F)
258-578 1e-167
C612177.1 515
2(L), 1(F)
1-101 4e-48
C702511.1 329
1(S)
1013-1151 2e-44
Resultados
64
Tabela 22: Contig ou singlet do banco de dados da FAPESP de S. mansoni similares à
proteína SmAgo3 relacionando tamanho de cada um, posição e os estágios evolutivos
que foram obtidos. A, estágio evolutivo vermes adultos, M, estágio evolutivo macho
adulto, F, estágio evolutivo fêmea adulta, E, estágio evolutivo ovos, L, estágio
evolutivo, miracídios, G, esporocistos, C, cercária e S, esquistossômulos.
Código de acesso do
contig ou singlet
Tamanho (pb) do
contig ou singlet
Estágios
evolutivos
Região de
cobertura
E-value
(Blastn)
C604197.1 3071
10(E), 9(L),
5(F), 4(A),
2(S), 1(G)
1-2413 0
C604197.1 3071
10(E), 9(L),
5(F), 4(A),
2(S), 1(G)
2409-2565 6e-84
C603705.1 1294
30(A), 15(F),
12(L), 2(E),
1(G)
823-1382 0
C702511.1 329 1(S)
755-1049 1e-66
C601842.1 510
3(E)
823-1006 3e-45
Tabela 23: Contig ou singlet do banco de dados da FAPESP de S. mansoni similares à
proteína SmAgo4 relacionando tamanho de cada um, posição e os estágios evolutivos
que foram obtidos. A, estágio evolutivo vermes adultos, M, estágio evolutivo macho
adulto, F, estágio evolutivo fêmea adulta, E, estágio evolutivo ovos, L, estágio
evolutivo, miracídios, G, esporocistos, C, cercária e S, esquistossômulos.
Código de acesso do
contig ou singlet
Tamanho (pb) do
contig ou singlet
Estágios
evolutivos
Região de
cobertura
E-value
(Blastn)
C604197.1 3071
10(E), 9(L),
5(F), 4(A),
2(S), 1(G)
1-2775 0
C603705.1 1294
30(A), 15(F),
12(L), 2(E),
1(G)
823-1382 0
C702511.1 329 1(S) 755-1049 1e-66
C608655.1 979
7(A),2(L)
2332-2332 1e-66
C601842.1 510 3(E) 823-1006 3e-45
Resultados
65
Tabela 24: Contig ou singlet do banco de dados da FAPESP de S. mansoni similares à
proteína SmFmr1 relacionando tamanho de cada um, posição e os estágios evolutivos
que foram obtidos. A, estágio evolutivo vermes adultos, M, estágio evolutivo macho
adulto, F, estágio evolutivo fêmea adulta, E, estágio evolutivo ovos, L, estágio
evolutivo, miracídios, G, esporocistos, C, cercária e S, esquistossômulos.
Código de acesso do
contig ou singlet
Tamanho (pb) do
contig ou singlet
Estágios
evolutivos
Região de
cobertura
E-value
(Blastn)
C611449.1 1981
14(A), 9(L),
8(F), 8(E),
3(S), 1(G)
227-1797 0
C608108.1 566
2(E), 1(F),
1(S)
185-569 0
C608108.1 566
2(E), 1(F),
1(S)
570-678 2e-55
Tabela 25: Contig ou singlet do banco de dados da FAPESP de S. mansoni similares à
proteína SmTudor-SN relacionando tamanho de cada um, posição e os estágios
evolutivos que foram obtidos. A, estágio evolutivo vermes adultos, M, estágio evolutivo
macho adulto, F, estágio evolutivo fêmea adulta, E, estágio evolutivo ovos, L, estágio
evolutivo, miracídios, G, esporocistos, C, cercária e S, esquistossômulos.
Código de acesso do
contig ou singlet
Tamanho (pb) do
contig ou singlet
Estágios
evolutivos
Região de
cobertura
E-value
(Blastn)
C605675.1 2944
13(E),
10(A), 4(L),
4(S), 3(F),
1(G), 1(C)
1944-3452 0
C605675.1 2944
13(E),
10(A), 4(L),
4(S), 3(F),
1(G), 1(C)
730-1523 0
C605675.1 2944
13(E),
10(A), 4(L),
4(S), 3(F),
1(G), 1(C)
542-731 1e-101
C706365.1 597
1(E)
209-802 0
Resultados
66
Tabela 26: Contig ou singlet do banco de dados da FAPESP de S. mansoni similares à
proteína SmPasha relacionando tamanho de cada um, posição e os estágios evolutivos
que foram obtidos. A, estágio evolutivo vermes adultos, M, estágio evolutivo macho
adulto, F, estágio evolutivo fêmea adulta, E, estágio evolutivo ovos, L, estágio
evolutivo, miracídios, G, esporocistos, C, cercária e S, esquistossômulos.
Código de acesso do
contig ou singlet
Tamanho (pb) do
contig ou singlet
Estágios
evolutivos
Região de
cobertura
E-value
(Blastn)
C704682.1 478
1(L)
1253-1730 0
C604888.1 364
2(C)
724-1090 0
Tabela 27: Contig ou singlet do banco de dados da FAPESP de S. mansoni similares à
proteína SmExportina5.1 relacionando tamanho de cada um, posição e os estágios
evolutivos que foram obtidos. A, estágio evolutivo vermes adultos, M, estágio evolutivo
macho adulto, F, estágio evolutivo fêmea adulta, E, estágio evolutivo ovos, L, estágio
evolutivo, miracídios, G, esporocistos, C, cercária e S, esquistossômulos.
Código de acesso do
contig ou singlet
Tamanho (pb) do
contig ou singlet
Estágios
evolutivos
Região de
cobertura
E-value
(Blastn)
C606377.1 1002
5(L), 3(E),
2(F), 1(G),
1(S)
2527-3125 0
C606377.1 1002
5(L), 3(E),
2(F), 1(G),
1(S)
3148-3544 0
C711114.1 187 1 (S)
1659-1845 1e-101
C706220.1 581 1 (F) 1180-1307 2e-66
Resultados
67
Tabela 28: Contig ou singlet do banco de dados da FAPESP de S. mansoni similares à
proteína SmExportina5.1 relacionando tamanho de cada um, posição e os estágios
evolutivos que foram obtidos. A, estágio evolutivo vermes adultos, M, estágio evolutivo
macho adulto, F, estágio evolutivo fêmea adulta, E, estágio evolutivo ovos, L, estágio
evolutivo, miracídios, G, esporocistos, C, cercária e S, esquistossômulos.
Código de acesso do
contig ou singlet
Tamanho (pb) do
contig ou singlet
Estágios
evolutivos
Região de
cobertura
E-value
(Blastn)
C606377.1 1002
5(L), 3(E),
2(F), 1(G),
1(S)
2527-2997 0
C711114.1 187 1 (S)
1659-1845 1e-102
C706220.1 581 1 (F) 1180-1307 1e-66
4.1.3 Análise Filogenética das RNAse III e Argonautas
Para construção da árvore da família RNAse III foi selecionado o domínio
conservado endoND2 (RIBOc II) das proteínas SmDicer1, SmDrosha1, SmDrosha2 e
suas homólogas Dicer1-símile, Dicer2-símile e Drosha-símile em outros organismos
(Figura 23).
Resultados
68
Figura 23 – Árvore filogenética consenso baseada na sequências de aminoácidos do
domínio endoND2. A construção da árvore e a análise do “bootstrap” foram realizadas
nos programas ClustalX 2,0 e MEGA 4.0. Para árvore consenso e confiabilidade dos
ramos formados foi utilizado o teste de filogenia bootstrap, utilizando 1000 réplicas
para cada sequência, sendo 60% o mínimo para se considerar o ramo confiável. O
primeiro colchete representa as proteínas da subfamília Dicer1, o segundo da subfamília
Dicer2 e a terceira da subfamília Drosha. A barra representa o número de aminoácidos
que foram substituídos de uma sequencia para outra. Os códigos de acesso referentes às
seqüencias estão mostrados na seção Materiais e Métodos.
Para família das Argonautas foi selecionado o domínio conservado PIWI das
proteínas SmAgo1, SmAgo2, SmAgo3, SmAgo4 e suas homólogas Ago-símile e PIWI-
símile de outros organismos. A correlação evolutiva está sendo enfatizada, pela
presença da classificação Bilateria, Eubilateria e Coelomata proposta por Hausdorf em
2000.
Resultados
69
Figura 24 – Árvore filogenética consenso baseada na seqüência de aminoácidos do
domínio PIWI. A construção da árvore e a análise do “bootstrap” foram realizadas nos
programas ClustalX 2.0 e MEGA 4.0. Para árvore consenso e confiabilidade dos ramos
formados foi utilizado o teste de filogenia bootstrap, utilizando 1000 réplicas para cada
sequência, sendo 60% o mínimo para se considerar o ramo confiável. O primeiro
colchete representa as proteínas da subfamília Ago, o segundo proteínas órfãs sem
definição de posicionamento na árvore e a terceira da subfamília PIWI. A barra
representa o número de aminoácidos que foram substituídos de uma seqüência para
outra. Os códigos de acesso referentes às seqüencias estão mostrados na seção Materiais
e Métodos.
Resultados
70
4.1.4 Análise dos domínios conservados PIWI e endoND
O domínio conservado completo PIWI predito das seqüências SmAgo1, 2 e 4 foi
alinhado com sua seqüência de aminoácidos com seus ortólogos de C. elegans, D.
melanogaster, Mus musculus, H. sapiens e A. thaliana utilizando o programa de
alinhamento ClustalX 2.0. Os membros de Argonauta no parasito, representados por
SmAgo1, 2 e 4, exibiram um domínio PIWI bastante conservado, contendo os 3
resíduos chaves (D/D/H), coordenados pelo Mg
2+
com função intrínseca de Slicer
(RNAse H) (Figura 25).
Figure 25: Alinhamento do domínio PIWI e apresentação dos resíduos catalíticos
responsáveis pela função Slicer. Alinhamento entre as seqüências de aminoácidos do
domínio conservado PIWI presente nas proteínas Argonautas das espécies C. elegans,
D. melanogaster, Mus musculus, H. sapiens, A. thaliana e S. mansoni. Está marcado
com um bloco e indicado por uma seta os 3 resíduos catalíticos conservados, dois ácidos
aspárticos e uma histidina (D/D/H), determinantes da função intrínseca Slicer
(RNAseH) das proteínas da família Argonauta. Os códigos de acesso referentes às
seqüencias estão mostrados na seção Materiais e Métodos.
Os domínios endoND são estritamente conservados em todos membros da
família RNAse III. Em S. mansoni esta família está representada por SmDicer1,
SmDrosha1 e SmDrosha2. Os domínios endoND preditos destas seqüências foram
alinhados com seus ortólogos de C. elegans, D. melanogaster, Mus musculus e H.
sapiens utilizando o programa de alinhamento ClustalX 2.0. A Figura 26 mostra
claramente a conservação entre os domínios dos ortólogos a presença dos resíduos
catalíticos conservados E/D e D/E responsáveis pela função ribonucleásica das
Resultados
71
proteínas. Nossos resultados confirmam a ausência de 2 resíduos no domínio endoND1
de SmDrosha1 e 2 como em seus ortólogos.
RNAse III
endoND1 endoND2
Dicer
1
Hs.Dicer1
ERL
E
MLG
D
.......
D
CV
E
QRL
E
FLG
D
.......
D
IF
E
Dm.Dicer1
ERL
E
TIG
D
.......
D
CV
E
QRL
E
FLG
D
.......
D
VF
E
Ce.DCR1
ERF
E
TIG
D
.......
D
AV
E
QRL
E
FLG
D
.......
D
IF
E
S
m
.
Dicer1
ERM
E
TIG
D
.......
D
CV
E
QRL
E
FLG
D
.......
D
IF
E
Drosha
Hs.Drosha
ERL
E
FLG
D
QRM
E
FLG
D
.......
D
LL
E
Dm.Drosha
ERL
E
FLG
D
QRL
E
FLG
D
.......
D
LL
E
Ce.Drsh1
ERL
E
YLG
D
QRL
E
WLG
D
.......
D
LV
E
Sm.Drosha1/2
ERL
E
FLG
D
QRL
E
FLG
D
.......
D
LL
E
Figura 26: Alinhamento dos dominios endoND da familia RNAse III e apresentação
dos resíduos catalíticos. Alinhamento entre as seqüências de aminoácidos dos domínios
conservados endoND1 e endoND2 das espécies H. sapiens, D. melanosgaster, C.
elegans, e S. mansoni. Está em letra maior e mais escuro os 4 resíduos catalíticos
conservados, E/D e D/E, determinantes da função nucleásica das proteínas da família
RNAse III. Os códigos de acesso referentes às seqüencias estão mostrados na seção
Materiais e Métodos.
4.1.5 Análise de SmAgo4
A proteína SmAgo4 está melhor representada no banco de dados de ESTs
(FAPESP) pelo contig C604197.1 e genômico no banco de dados geneDB pela
sequência Smp_102690.3.
A Figura 27 representa um esquema do DNA genômico possuindo 13381 pares
de base, cDNA 3102 pares de base e uma ORF predita de 924 aminoácidos com os
domínios conservados PIWI e PAZ determinates para sua função. O cDNA mostrado
nos bancos de dados geneDB e FAPESP representa apenas a região traduzida ficando de
fora a região não menos importante 5’ e 3’ não traduzida.
A Figura 27 mostra também um splicing na região 5’ não traduzida, seguindo a
regra canônica de emenda de éxons e retirada de íntrons GT....AG. Os íntrons
representados se encontram em tamanhos que variam de 30 até 3375 pares de bases e os
éxons de 27 a 457 pares de base. Além disso observamos o sítio de poliadenilação na
região 3’ não traduzida com o sinal consenso AATAAA, para cauda de Poli-A,
localizado a 171 pares de base do códon TGA.
Resultados
72
Figura 27: Esquema do DNA genômico, cDNA e proteína de SmAgo4. A Figura mostra o DNA genômico contendo 13381 pares de base,
divididos em 17 íntrons em azul e 19 éxons em verde. O seu cDNA contendo 3102 pares de bases e a proteína 924 aminoácidos com os domínios
conservados PIWI em azul e PAZ em vermelho. A seta azul mostra o splicing na região 5’ não traduzida e a seta vermelha o sinal consenso de
cauda poli-A na região 3’ não traduzida.
Resultados
73
4.1.6 miRNAs preditos
A Figura 28 mostra a estrutura do pré-miRNA contendo aproximadamente 80
nucleotídeos e as duas preditas estruturas dos miRNAs 1A em vermelho e 1A* em azul,
com 20 nucleotídeos cada. A estrutura predita apresenta um dG (energia livre) teórico
de -30,2 kcal/mol.
Figura 28: Estrutura do pré-miRNA seus prováveis miRNAs processados. Está predito
pré-miRNA foi processada no programa disponível web Mfold 3.0 gerando uma
estrutura secundária com um delta G igual a -30,2 kcal/mol. Em vermelho e azul estão
os preditos miRNAs 1A e 1A*, respectivamente.
4.2 Clonagem e seqüenciamento parcial da SmDicer1
Para a validação parcial dos resultados in silico dos genes de SmDicer1, foram
desenhados oligonucleotídeos compreendendo a região codificadora dos domínios
Resultados
74
conservados endoND. A Figura 29 mostra a análise de um RT-PCR a a partir de vermes
adultos apresentando um produto amplificado de 469pb. Este produto foi clonado e 3
colônias independentes foram seqüenciadas.
A seqüência consenso foi obtida utilizando o programa de alinhamento ClustalX
2.0. A comparação da seqüência obtida com a depositada no banco dados da FAPESP
(Anexo 1) mostra uma troca de T por C no consenso.
Figura 29: Amplificação por RT-PCR utilizando oligonucleotídeos específicos para
SmDicer1. cDNA parcial do domínio conservado endoND1 de SmDicer de tamanho
469pb utilizando como molde cDNA de vermes adultos. Na primeira canaleta padrão de
peso molecular de 100 pb (Invitrogen). *Gel de agarose 1,2% e corado com brometo de
etídio.
4.3 Clonagem e seqüenciamento parcial de SmAgo5
Após RT-PCR e PCR convencional (molde DNA genômico) para o gene
SmAgo5 utilizando um par de iniciadores (primers) que amplificava tanto no cDNA
quanto no DNA genômico, ou seja, estando presentes em éxons, obtivemos produtos
amplificados de 711 e 1283 pares de base, respectivamente (Figura 30). Estes produtos
foram clonados em várias réplicas e seqüenciados.
Resultados
75
Figura 30: Amplificação por RT-PCR e PCR convencional (molde DNA genômico)
utilizando oligonucleotídeos específicos para SmAgo5. cDNA parcial do domínio
conservado PIWI de SmAgo5 de tamanho 711pb utilizando como molde cDNA de
vermes adultos. DNA genômico parcial de SmAgo5 de tamanho 1283 pares de base. Na
primeira canaleta padrão de peso molecular de 100 pb (Invitrogen). *5µL do produto de
PCR foram analisados em gel de agarose.
Para geração da seqüência consenso tanto de cDNA quanto de DNA genômico
foi utilizado o programa de alinhamento ClustalX 2.0. As seqüências consenso de
cDNA e DNA genômico formadas a partir das seqüências geradas no seqüenciamento
estão mostradas no anexo 2 e 3.
O produto seqüenciado consenso cDNA não alinhou em 100% dos nucleotídeos
com as seqüências de cDNA depositadas nos bancos de dados da FAPESP e geneDB.
Na seqüência consenso do cDNA está inserido uma seqüência íntrônica de 80 pb,
funcionando neste caso como éxon, que segue a regra canônica de splicing, GT...AG,
como mostra a Figura 31. Para as seqüências SmAgo3 (Smp_102690.2) e SmAgo4
(Smp_102690.3), depositadas no banco de dados geneDB, e para seqüência C604197.1,
depositada na FAPESP, este fragmento inserido na seqüência consenso representa um
íntron, por isso, o não aparecimento deste nos mRNAs já processados.
Resultados
76
Figura 31: Alinhamento entre as seqüências de DNA genômico do geneDB e cDNA
consenso (SmAgo5) e cDNA C604197.1 da FAPESP. As seqüências alinhadas possuem
o domínio PIWI característico das proteínas Argonautas. As setas com os blocos
delimitam os iniciadores F e R do fragmento amplificado e o bloco com linhas
tracejadas representa o íntron/éxon inserido na seqüência consenso de cDNA.
4.4 Splicing Alternativo
O splicing alternativo pôde ser observado duas vezes nas seqüências SmAgos
representados pela mesma seqüência de DNA genômico. Um utilizamos seqüências
Resultados
77
completas depositadas no banco de dados de S. mansoni para defini-lo, SmAgo3 e
SmAgo4. Outro, utilizamos cDNA consenso parcialmente seqüenciado, provável 5ª
Argonauta da família no parasito (SmAgo5);
A seqüência de DNA genômico Smp_102690 possui duas seqüências de cDNA
no banco de dados do geneDB, Smp_102690.2 e Smp_102690.3, e uma parcialmente
seqüenciada neste trabalho, SmAgo5. O alinhamento completo entre estas seqüências
está mostrado em anexo. Estas três tem propriedade de splicing alternativo na região 3’,
sendo que 2 íntrons ou parte deles funcionam ora funciona como íntron, e ora como
éxon como mostra a Figura 32.
Figura 32: Alinhamento entre as seqüências de cDNA consenso(SmAgo5), SmAgo3 e
SmAgo4. As setas com os blocos delimitam os splicing alternativos de SmAgo3, 4 e
cDNA consenso parcialmente seqüenciado, SmAgo5, sendo o primeiro de 80 nt
diferenciando SmAgo5, das outras duas e o segundo de 93 nt diferenciando SmAgo3 das
outras duas.
Resultados
78
A representação no banco de dados a partir de DNA genômico pode ser
confirmada com dados do transcriptoma da FAPESP. A Figura 33 mostra leituras de
diferentes clones no contig C604197.1 do banco da FAPESP sendo um deles marcado
por quadros pretos representando um mau alinhamento. Este clone mau alinhado,
denominado MS1-0053 representa o splicing alternativo de 93 aminoácidos que separa
SmAgo3 e SmAgo4.
.
Figura 33: Splicing alternativo diferenciando SmAgo3 e SmAgo4 mostrado no banco da
FAPESP. A seta com o bloco verde aponta e delimita a seqüência consenso do contig da
FAPESP C604197.1. A seta com o bloco vermelho aponta e delimita o singlet MS1-
0053 da FAPESP. O alinhamento mostra as diferenças entre as seqüências e o local do
splicing alternativo sendo o clone MS1-0053 similar a sequência SmAgo3.
A Figura 34 também mostra leituras de diferentes clones no contig C604197.1
do banco da FAPESP sendo um deles marcado por quadros pretos representando um
mau alinhamento. Este clone mau alinhado, denominado ML1-0048T representa um
splicing alternativo de 80 aminoácidos que separa cDNA consenso parcialmente
seqüenciado, SmAgo5, de SmAgo3 e SmAgo4.
Resultados
79
Figura 34: Splicing alternativo diferenciando SmAgo3 e SmAgo4 do consenso de cDNA
obtido neste trabalho (SmAgo5) mostrado no banco da FAPESP. A seta com o bloco
verde aponta e delimita a seqüência consenso do contig da FAPESP C604197.1. A seta
com o bloco vermelho aponta e delimita o singlet ML1-0048T da FAPESP. O
alinhamento mostra as diferenças entre as seqüências e o local do splicing alternativo
sendo o clone ML1-0048T similar ao consenso de cDNA, SmAgo5.
4.5 Análise da expressão dos genes que codificam SmDicer1 e
SmAgo2/3/4 utilizando qRT-PCR
Foi analisada a expressão relativa dos mRNAs de SmAgo2/3/4 e SmDicer1 por
PCR quantitativa em tempo real como descrito em Materiais e Métodos. Foram
desenhados oligonucleotídeos específicos e próprios para análise desta PCR,
compreendendo a região codificadora dos domínios conservados endoND1 para
SmDicer1, gerando um amplificado de 289 pares de bases e PIWI para SmAgo2/3/4,
gerando um amplificado de 321 pares de bases. Previamente a qRT-PCR, os fragmentos
foram amplificados, clonados e seqüenciados para validação experimental. A análise da
Resultados
80
expressão destes genes foi executada nos seguintes estágios do parasito: verme adulto,
cercária, esquistossômulo mecanicamente transformado de 3,5 horas (EMT-3,5), 8,5
horas (EMT-8,5), 18,5 horas (EMT-18,5), 24 horas (EMT-24), 48 horas (EMT-48), 72
horas (EMT-72) e ovos (Gráfico 1). Os dados foram normalizados utilizando o gene α-
tubulina. Como padrão endógeno relativo foi escolhido esquistossômulo de 24 horas
(EMT-24) que possue o menor índice de transcrição real. Foi notado tanto para
SmDicer1 quanto para SmAgo2/3/4 expressão em todos os estágios sendo seus valores
significativamente diferentes com P>0,001.
A Figura 35 mostra um aumento significativo nos níveis de mRNA de SmDicer1
depois da transformação de cercária em esquistossômulo. Em ovos detectamos a maior
expressão deste gene, sendo estes 30 vezes mais abundantes quando comparados com
cercárias e 3 vezes comparados com vermes adultos.
Figura 35: Expressão do gene SmDicer1 no desenvolvimento de S. mansoni. A
expressão de SmDicer1 foi avaliada nos estágios de cercárias, esquistossômulos
mecanicamente transformados (EMT-3,5, EMT-8,5, EMT-18,5, EMT-24, EMT-48,
EMT-72 horas), vermes adultos e ovos. Como normalizador (gene constitutivo) foi
utilizado o gene da α-tubulina e a expressão gênica relativa foi determinada pelo método
do 2
-∆∆Ct
, utilizando como calibrador o estágio EMT-24 horas.
A Figura 36 mostra o padrão de expressão de SmAgo2/3/4 nos mesmos estágios
descritos anteriormente. Observamos um padrão de expressão gênica diferencial com
uma queda expressiva nos níveis de mRNA entre cercária e EMT-8,5, aproximadamente
15 vezes. Em EMT-18,5 horas detectamos um aumento real de transcrição (3,5 vezes) e
9 vezes após 48 horas. Após este período, foi observada uma queda em EMT-72 horas
Resultados
81
(5 vezes). Além disso, não detectamos diferença estatisticamente significativa entre os
níveis de SmAgos2/3/4 em vermes adultos comparados com cercária. Corroborando com
os resultados descritos acima de SmDicer1, em ovos houve a maior expressão destes
genes, comparados com os outros estágios estudados.
Em conjunto estes resultados evidenciaram dois momentos em que a síntese
predominou (EMT-18,5 horas e EMT-48,0 horas) sobre a degradação. E três momentos
onde a degradação predominou sobre a síntese EMT-3,5, EMT-8,5 e EMT-72 horas.
Figura 36: Expressão do gene SmAgo2/3/4 no desenvolvimento de S. mansoni. A
expressão de SmAgo2/3/4 foi avaliada nos estágios de cercárias, esquistossômulos
mecanicamente transformados (EMT-3,5, EMT-8,5, EMT-18,5, EMT-24, EMT-48,
EMT-72 horas), vermes adultos e ovos. Como normalizador (gene constitutivo) foi
utilizado o gene da α-tubulina e a expressão gênica relativa foi determinada pelo método
do 2
-∆∆Ct
, utilizando como calibrador o estágio EMT-24 horas.
Discussão
82
5-Discussão
Discussão
83
A descoberta do mecanismo de silenciamento da expressão gênica através de
pequenos RNAs e a elucidação e caracterização de proteínas envolvidas nesta via, em
diferentes organismos, constituem, nos últimos anos, uma das maiores descobertas
científicas visto que repercutiram por diversas áreas distintas como biologia, medicina,
genômica funcional, computação, matemática, química, dentre outras (Meister e Tuschl,
2004). A fita dupla de RNA, geradora destes pequenos RNAs e unificadora dos
processos do silenciamento gênico, induz uma resposta celular levando à degradação ou
ao silenciamento dos mRNAs homólogos. Este processo é chamado de silenciamento
gênico pós-transcricional ou PTGS (posttranscriptional gene silencing) e atualmente
categorizado em três vias: de silenciamento mediada por miRNA, de silenciamento
mediada por siRNA e nuclear associada a metilação de DNA (Bartel, 2004).
Apesar desta diversidade de vias e funções intermediárias totalmente diferentes,
o objetivo final é o mesmo, o silenciamento da expressão gênica. Sendo assim, existem
alguns pontos comuns e conservados entre as 3 vias e entre diferentes organismos
sugerindo então a existência de um mecanismo ancestral comum (Zamore, 2002).
Neste trabalho buscamos enfatizar a via de miRNA, envolvida no silenciamento
de mRNAs endógenos atuando principalmente no controle de genes envolvidos no
desenvolvimento do organismo sendo um alvo de estudo promissor tanto para o avanço
da biologia celular do organismo quanto para o possível controle da parasitose. Para o
processamento destes miRNAs existe um grupo complexo de proteínas presentes em
dois compartimentos: o núcleo e o citoplasma (Bartel, 2004).
O primeiro objetivo específico deste trabalho foi elucidar e caracterizar in silico
a via completa no parasito. Para isto as seqüências de aminoácidos das proteínas
ortólogas, cuja via está bem descrita, como os organismos modelos D. melanogaster, C.
elegans e H. sapiens, foram alinhadas, utilizando o algoritmo BLASTp, com seqüências
previamente anotadas de S. mansoni. Esta análise permitiu a identificação dos principais
constituintes da maquinaria de miRNA depositadas no banco de dados geneDB do
parasito (Tabela 3).
Durante estas análises também foi possível verificar algumas particularidades
espécie-específica. Por exemplo, C.elegans, não apresentou os ortólogos para Fmr1,
Loquacious ou Exportina-5. Considerando os dados experimentais que ressaltam a
importância da via de miRNA em C. elegans a ausência destas proteínas pode ser
compensada pela existência de outras que exerçam a mesma função. Além desta
espécie, também comparamos os resultados obtidos em S. mansoni com S. japonicum
Discussão
84
(Tabela 3). Estas análises mostraram várias seqüências com similaridades significativas,
sugerindo a presença desta via, também neste organismo.
Recentemente, vários grupos independentes mostraram que vários estágios do
parasito podem incorporar RNA exógeno e processá-los com RNA anti-senso. Esta
maquinaria de processamento compartilha alguns componentes da via de síntese
endógena de miRNAs. Analisados em conjunto, os experimentos com esporocistos,
esquistossômulos, e vermes adultos e os obtidos neste trabalho, sugerimos que o
silenciamento gênico mediado por pequenos RNA tem um papel importante na
regulação da expressão gênica do parasito (Boyle e cols.., 2003; Skelly e cols., 2003;
Dinguirard, 2006; Osman e cols., 2006). Entretanto, apesar de documentada a
importância desta via no parasito, várias questões ainda permanecem por ser
esclarecidas como, por exemplo: o padrão de expressão de todos componentes deste
sistema, o repertório de genes de miRNA, o silenciamento estágio-específico mediado
por esta via bem como seus alvos naturais.
Desta forma, uma das abordagens deste trabalho foi à busca por seqüências
preditas envolvidas na via de miRNA depositadas nos bancos de dados de domínio
público. Esta análise nos permitiu verificar que estas proteínas não eram conservadas
apenas no tamanho, mas também mantinham a disposição dos domínios conservados
em sua estrutura primária. Os valores obtidos, quando utilizamos a ferramenta
BLASTp, comparando os domínios conservados consenso, CDD (Conserved Domain
Database), PFAM e COG com as seqüências recuperadas de S. mansoni, ficou
evidenciada sua similaridade (Figuras 10 a 22). Com relação às seqüências primárias de
aminoácidos, observamos uma variação de no máximo 30% no tamanho das proteínas.
Além das características protéicas também foi nosso objetivo verificar quais
estágios contribuíram com seqüências para a montagem das ORFs preditas. Para isso,
utilizamos os dados do transcriptoma. Esta busca de ESTs é importante, pois é um dado
físico real utilizado para a validação de seqüências de mRNA, que foram geradas a
partir do seqüenciamento genômico. Considerando que o banco geneDB utiliza os
programas Glimmer e Twinscan para mostrar sequências de exóns e íntrons, a presença
de ESTs cobrindo estas regiões corrobora com os dados computacionais (Banco de
dados da FAPESP, ONSA).
Neste trabalho foram utilizadas seqüências do banco de dados da FAPESP,
composto por 125 mil seqüências, sendo 27% de vermes adultos, 15% de ovos, 15% de
miracídios, 13% de esporocistos, 8% de cercária e 22% de esquistossômulos de 7 dias
Discussão
85
correspondendo a 92% do transcriptoma do organismo para validar as seqüências de
cDNA das prováveis proteínas encontradas no banco de dados do geneDB (Tabelas 17 a
28) (Verjovski-Almeida e cols., 2003).
A manutenção das características estruturais das proteínas da via são importantes
para demonstrar a sua conservação. A literatura mostra que as proteínas da família
RNAse III e Argonauta são elementos chaves na via de silenciamento mediada por
miRNA. Desta forma, nosso próximo objetivo foi à utilização de ferramentas
computacionais para localização dos resíduos conservados envolvidos com as funções
catalíticas, nas proteínas destas famílias (Figuras 26 e 27).
Além disso, é possível estabelecer uma boa correlação utilizando árvores
filogenéticas como parâmetro. As árvores consenso (Figura 23 e 24) foram construídas
utilizando o método Neighbor-Joining a partir das seqüências de aminoácidos dos
domínios conservados RIBOc (endoND2) e PIWI das proteínas RNAse III e
Argonautas, respectivamente, presentes em diversos organismos.
A proximidade filogenética dos Bilateria, principalmente àqueles semelhantes
evolutivamente, é ainda um pouco confusa. A relação filogenética entre os grupos
Bilateria, Platelmintos (S. mansoni), Nematodos (C. elegans), Artrópodes (D.
melanogaster) e Cordados (H. sapiens) diferem tanto em árvores baseadas em dados
morfológicos, quanto em árvores baseadas nas seqüências do RNA ribossomal 18S
(Nielsen, 1995; Aguinaldo, 1997.). Hausdorfs em 2000, utilizando seqüências de 10
genes nucleares chegou a uma árvore filogenética consenso que relaciona estes grupos
Bilateria, o qual corrobora com os resultados da família Argonauta obtidos neste
trabalho (Figura 24).
Também vale ressaltar que a família das proteínas Argonautas é bastante diversa
possuindo variações nos números de parálogos de uma espécie para outra. Para
exemplificar esta característica, temos um representante apenas desta família em
Schizosaccharomyces pombe, aproximadamente vinte e sete em C. elegans (Carmell e
cols., 2002), dez em A. thaliana (Hunter e cols., 2003), cinco em D. melanogaster
(Williams e cols., 2002) e oito em humanos (Sasaki e cols., 2003). Atualmente,
acredita-se que a diversidade gênica observada seja devido à duplicação gênica e
splicing alternativo (Hutvagner, 2008). Em S. mansoni, até o momento, encontramos
cinco prováveis representantes desta família sendo quatro com seqüências completas no
banco de dados geneDB, SmAgo1, SmAgo2, SmAgo3 e SmAgo4, e uma, SmAgo5,
seqüenciada parcialmente neste trabalho. Os resultados obtidos sugerem a presença de 3
Discussão
86
genes e 5 produtos protéicos sugerindo que a diversidade protéica é mediada por
splicing alternativo. A ocorrência deste processo nesta via, pode ser evidenciado pela
presença das proteínas Ago1 e Alg-2 de D. melanogaster e C. elegans, respectivamente,
que possuem 3 seqüências parálogas provindas de uma mesma seqüência genômica
(FlyBase - http://flybase.bio.indiana.edu/ and WormBase - http://www.wormbase.org/).
Em S. mansoni existem vários exemplos deste processo, como exemplo podemos citar o
fator de crescimento epidermal (Shoemaker, 1992), a proteína ligante de ácidos graxos
Sm14 (Ramos, 2003) e o receptor de serina/treonina quinase do tipo II SmRK2
(Forrester, 2004) que a partir de uma mesma sequência genômica gera 3 transcritos. A
comprovação do splicing alternativo nos membros da família Argonauta de proteínas
neste parasito está sendo realizado no nosso laboratório.
Estas evidências nos motivaram a analisar o perfil de expressão das duas
principais proteínas da via de miRNA, SmDicer1 e SmAgos, no parasito. Para esta
investigação foram utilizados os seguintes estágios de vida: vermes adultos, ovos,
cercárias e esquistossômulos cultivados in vitro por 3,5; 8,5; 18,5; 24; 48 e 72 horas. O
tempo de cultivo in vitro foi baseado em dados anteriores de nosso grupo que sugerem
que durante a transição cercária-esquistossômulo não há uma taxa real de transcrição,
nas primeiras 24 horas de cultivo in vitro (Guerra-Sá, 2004). Além disso, trabalhos de
proteômica desenvolvidos também pelo nosso grupo sugerem que 72 horas após a
transformação cercária em esquistossômulo todas as proteínas oriundas no estágio de
cercária foram degradadas (Castro-Borges, 2005). Estes resultados corroboram com os
dados experimentais que mostraram a cinética de síntese de proteínas em cercária,
medida pela taxa de incorporação de S
35
é praticamente nula, sugerindo uma inibição da
tradução. Experimentos equivalentes realizados com esquistossômulos mantidos in vitro
mostraram que a taxa de síntese protéica em esquistossômulo com 8 dias de cultivo é 11
vezes maior quando comparado a esquistossômulos com 24 horas (Harrop Wilson,
1993; Castro-Borges, 2007)
Para estudar o papel da via de miRNA no silenciamento gênico em S. mansoni
nós analisamos por qRT-PCR duas proteínas chaves da via de miRNA, SmDicer1 e
SmAgo2/3/4, sugerindo a atuação desta via no bloqueio dos mRNAs em
esquistossômulos jovens. Essas três proteínas Argonautas possuem uma região
consenso presente no domínio PAZ (Figura 36) e SmDicer1 uma seqüência cobrindo
parte do domínio endoND1 (Figura 35) escolhidas para a análise de qRT-PCR. Os
níveis destes mRNAs foram normalizados com um gene constitutivo endógeno, alfa-
Discussão
87
tubulina, e em seguida comparados a um padrão endógeno relativo, EMT-24 horas. A
expressão de SmDicer1 e SmAgos foi verificada em todos estágios estudados, sendo
todos valores encontrados estatisticamente significantes.
5.1 Família das RNAse III
A família RNAse III representa uma família de proteínas com função de
clivagem de RNAs de fita dupla. Estas estão presentes em eucariotos e procariotos
representadas por 4 subfamílias como mostrado por Blaszczyk e colaboradores em
2004. Nosso estudo abordou as subfamílias encontradas em eucariotos Dicer e Drosha.
sendo que a atuação de cada uma acontece em compartimentos diferentes, Drosha no
núcleo, e Dicer no citoplasma. Em S. mansoni estas proteínas são representadas por
SmDicer1, SmDrosha1 e SmDrosha2.
A proteína SmDicer1, representante de Dicer 1 no parasito, mostrou alta
similaridade e tamanho bem semelhante às proteínas ortólogas dos organismos
metazoários (Tabela 4B). Além disso, SmDicer1 contém todos os domínios
característicos de Dicer 1 como indicado na Figura 10, corroborando os resultados
demonstrados pelo grupo de Krautz-Peterson, 2007. A proteína Dicer estudada por este
grupo difere apenas no N-terminal da seqüência identificada no banco geneDB e
apresentada neste trabalho. Estas diferenças observadas foram, provavelmente, devido a
sequência do geneDB estar incompleta.
As proteínas SmDrosha, mostraram alta similaridade e semelhança em tamanho
com as proteínas ortólogas dos organismos metazoários (Tabela 5B e 6B). Os domínios
endoND1 e endoND2, responsáveis pela função da proteína, foram bem similares ao
consenso do banco de dados de domínios conservados.
A clivagem da fita dupla de RNA é dependente dos domínios endoND1 e
endoND2 e os 4 resíduos E/D e D/E conservados essencial para atividade
endonucleásica. As proteínas Dicer1-símile e Drosha-símile de D. melanogaster, C.
elegans e H.sapiens e S. mansoni, foram alinhadas apresentando grande conservação,
tanto nos domínios endoND1 e endoND2 quanto nos 4 resíduos específicos E/D e D/E,
como visto na Figura 26. Além disso os nosso resultados sugerem que SmDrosha1 e
SmDrosha2 possuem os resíduos conservados E/D e D/E, nas mesmas posições que
Discussão
88
seus ortólogos, e os resíduos vizinhos, compartilham 100% de identidade entre S.
mansoni e D. melanogaster.
Além da similaridade, dados filogenéticos reforçam o agrupamento das proteínas
RNA III de S. mansoni em suas respectivas subfamílias. Podemos observar na Figura 23
que na raiz da árvore um ancestral comum divergiu nas subfamílias Drosha-Símile e
Dicer-Símile. Posteriormente as subfamílias provavelmente por mecanismo de
duplicação gênica divergiram em Dicer1-Símile e Dicer2-Símile. A proteína SmDicer1
agrupou dentro do ramo de Dicer1-Símile corroborando com resultados demostrados
por Krautz-Peterson em 2007. O mesmo aconteceu com SmDrosha1 e SmDrosha2
agrupando-se no ramo característico de proteínas Drosha-Símile. Novos experimentos
estão sendo realizados em nosso laboratório para comprovar a hipótese que SmDrosha 1
e 2 são produtos de splicing alternativo.
A conservação, durante a evolução das espécies, da seqüência, dos resíduos
funcionais dos sítios ativos e da própria função e disposição do domínio conservado
demonstra que as proteínas desta família são importantes para manutenção da via de
miRNA ativa nos processos biológicos do organismo.
5.2 Família das Argonautas
A característica marcante na família de proteínas Argonautas é a presença dos
domínios PAZ e PIWI em sua estrutura (Hutvagner, 2008). O domínio PAZ
(Piwi/Argonauta/Zwile) identificado nas proteínas Argonautas e Dicer, consiste de 130
aminoácidos. A função deste domínio é mediar o complexo de formação entre as
proteínas Argonautas e Dicer formando um hetero-dímero (Yan, 2003; Song, 2004).
PIWI tem a função de direcionar dsRNA para hidrólise. A determinação da estrutura em
cristal das Argonautas revelou que PIWI se aproxima funcionalmente das RNAse H. A
diferença é que as RNAse H atuam utilizando o quarteto catalítico Asp-Asp-Glu/Asp
coordenando 2 íons magnésio para sua atividade nucleásica. Já as proteínas Argonautas,
representadas pelo domínio PIWI, utilizam uma tríade Asp-Asp-His coordenando
somente um íon magnésio (Ma, 2004; Tolia e cols, 2007). A Figura 25 enfatiza a
presença desta função no parasito representada pelos resíduos Asp-Asp-His no domínio
PIWI das proteínas SmAgo1, SmAgo2 e SmAgo4. A seqüência de SmAgo3 apresenta
Discussão
89
apenas os resíduos Asp-Asp, pois seu carboxi-terminal foi reduzido provavelmente por
splicing alternativo.
Gostaríamos de ressaltar a notável similaridade da SmAgo1 com seus ortólogos
(Tabela 7 B) o mesmo não sendo observados para seus parálogos. Entre as seqüências
SmAgo2, SmAgo3 e SmAgo4 a similaridade com os ortólogos e a similaridade com o
consenso do banco de dados de domínios conservados são bem semelhantes. Isto é
devida a existência de regiões idênticas nas seqüências, supondo a presença de um gene
ancestral comum.
Transcritos de SmAgo3, SmAgo4 e SmAgo5 provêm da mesma seqüência
genômica, evidenciando que a diversidade dos membros desta família de proteínas esta
relacionado ao mecanismo de splicing alternativo. Os dois splicing alternativos acima
citados são confirmados com os dados do transcriptoma da FAPESP. O splicing
alternativo de SmAgo3 e SmAgo4 é mostrado nas Figuras 32 e 33, representando 93
pares de base de diferença no splicing e 210 no total devido a antecipação do códon de
terminação TAG devido a mudança de leitura (frame) para frente. Na Figura 33 fica
evidenciado este splicing alternativo pela presença da seqüência do clone no
transcriptoma da FAPESP MS1-0053. Este clone representando SmAgo3 não alinhou
com o contig consenso da FAPESP C604197.1, devido a ausência de um fragmento que
no caso em SmAgo3 funciona como íntron e em SmAgo4 e C604197.1 funciona como
éxon. O splicing alternativo separando a provável quinta Argonauta da família no
parasito, SmAgo5, de SmAgo3 e SmAgo4 é mostrado nas Figuras 32 e 34. Este splicing
alternativo ocorre também na porção carboxi-terminal, sendo um íntron de SmAgo3 e
SmAgo4 de 80 nucleotídeos funcionando como éxon em SmAgo5. Na Figura 34 este
splicing é confirmado pela presença do clone no transcriptoma da FAPESP ML1-
0048T. A seqüência do clone da fase de miracídio não alinha com o contig da FAPESP
C604197.1, pois este está representando esta parte como um íntron já retirado antes da
montagem do contig.
As Argonautas de S mansoni foram separadas em 2 subfamílias: PIWI-Símile e
AGO-Símile. Para confirmação desta separação foi comparada a separação filogenética
dos Bilateria. A relação filogenética entre os grupos Bilateria, Platelmintos (S.
mansoni), Nematodos (C. elegans), Artrópodes (D. melanogaster) e Cordados (H.
sapiens) diferem tanto em árvores baseadas em dados morfológicos, quanto em árvores
baseadas nas seqüências do RNA ribossomal 18S (Nielsen, 1995, Aguinaldo e cols.,
1997). Hausdorfs em 2000 utilizando seqüências de 10 genes nucleares chegou a uma
Discussão
90
árvore filogenética consenso que relaciona estes grupos Bilateria. A árvore filogenética
(Figura 24) consenso construída a partir da seqüência de aminoácidos do domínio
conservado PIWI das proteínas Argonautas de S. mansoni, C. elegans, D. melanogaster,
H. sapiens e outras 6 espécies corroboraram a árvore consenso de Hausdorfs separando
Bilateria, Eubilateria e Coelomata. A separação entre PIWI-Símile e AGO-Símile
ocorre em resposta a diferenças no domínio PIWI e na proteína fazendo com que esta
interaja com diferentes pequenos RNAs (Yigit, 2006; Carmell, 2002, Seto, 2007).
Existem algumas proteínas que possuem uma distância evolutiva semelhante não se
enquadrando em nenhuma das duas subfamílias, sendo estas proteínas órfãs. As
proteínas SmAgo1, SmAgo2, SmAgo3 e SmAgo4 se enquadraram na sub-família AGO-
Símile. Proteínas da subfamília AGO interagem principalmente com miRNAs e típicos
siRNAs, diferentemente das proteínas da subfamília PIWI que interagem com piRNAs e
rasiRNAs (siRNAs não típicos). As proteínas SmAgo2 , SmAgo3 e SmAgo4 estão mais
próximas evolutivamente entre si que a proteína SmAgo1. A diferença entre estas
proteínas não está só na estrutura primária do domínio PIWI, mas também em um
domínio denominado DUF1785, presente em SmAgo1, que possue função
desconhecida, e se encontra também presente em ortólogos como Ago1 de D.
melanogaster e Alg-1 de C. elegans.
Uma proteína Argonauta bem estudada pelo nosso grupo foi a proteína SmAgo4.
Ela está representada nos bancos de dados da FAPESP pelo contig C604197.1 e pela
seqüência Smp_102690.3 no banco de dados geneDB. A Figura 27 mostra a sequência
de DNA genômico que codifica esta proteina com 13381 pares de base, 17 íntrons e 19
éxons. O splicing na extremidade 5’ não traduzida seguiu a regra canônica GT / AG
confirmada pelos dados de transcriptoma. Na extensão da região 3’ não traduzida do
cDNA de 3102 pares de bases encontramos o sinal consenso de poli adenilação,
posicionado 171 pares de base do sinal de terminação TAG. A confirmação das
seqüências completas das outras Argonautas é alvo de posteriores estudos do nosso
grupo.
Tanto as proteínas RNAse III quanto as proteínas Argonautas estão bem
representada no banco de dados do transcriptoma sendo expressas em todos estágios do
parasito (Tabela 17 a 23). Isto demonstra a importância destas famílias nos processos
biológicos do parasito independente do estágio em que se encontra.
Mesmo sendo presente em todos os estágios do parasito, confirmado pelos dados
do transcriptoma, o estudo destas sequencias nas fases de transição, por exemplo
Discussão
91
cercaria-esquistossômulos, é importante para evidenciar a contribuição desta via nos
mecanismos de adaptação do parasito aos diferentes ambientes. A fase de transição
cercária-esquistossômulo até 72 horas enfatiza uma característica importante: a
diferenciação prevalece sobre a morfogênese no parasito. Esquistossômulos jovens são
caracterizados pelo estado de semi-quiescência sem síntese real de proteína (Lawson e
Wilson) e com um arraste no ciclo celular (Clegg, 1965) sugerindo um remodelamento
da estrutura da cromatina. Lawson e Wilson, 1980, mostraram que esta fase
representava apenas o elongamento do organismo sem aumento da massa corporal. Esta
situação mostra o desacoplamento entre diferenciação e morfogênese refletindo a
mudança brusca de ambiente e da forma corporal específica de esquistossômulo e
posteriormente verme adulto. A baixa taxa de síntese de proteína foi também verificada
por Nagai e cols. em 1977 nos esquistossômulos e relacionada ao uso de proteínas pré-
sintetizadas na fase de cercária (Hockley, 1973). Em termos de proteoma, os
esquistossômulos adquirem aparato protéico após o terceiro dia de cultivo in vitro
quando todas as proteínas de cercárias são degradadas como mostrado por Castro-
Borges em 2007. Se não ocorre síntese real de proteínas de alguma forma os mRNAs
estão sendo bloqueados. Blanton e Licate, em 1992, sugeriram que esta baixa síntese de
proteínas nos estágios jovens de esquistossômulos não era devido a uma queda nas
quantidades de mRNAs, mas sim devido a um bloqueio pós-transcricional da tradução.
A expressão de SmDicer1 em verme adulto, cercária e ovos confirmaram os
resultados apresentados por Krautz-Peterson e cols. em 2007. Entretanto, foi mostrado
que em esquistossômulos jovens ocorre a presença de SmAgos e SmDicer1 aumenta até
48 horas.
Estes dados sugerem a atuação da via de miRNA na inibição da tradução de
mRNAs nesta fase de transição cercaria-esquistossomulo. Além disto, SmAgos e
SmDicer1 possuíram alta expressão de seus mRNAs na fase de ovos. Sugerimos que
esta alta expressão em ovos seja devido a ação desta via no bloqueio de mRNAs
maternos reprimindo sua tradução ou promovendo sua degradação (Schier, 2007).
Nosso grupo esta trabalhando para verificar esta hipótese. Os resultados mostram que as
2 proteinas são diferencialmente expressas durante o ciclo. Gostaríamos de ressaltar que
este é o primeiro trabalho que analisa o perfil de expressão gênica temporal durante a
diferenciação de cercária em esquistossômulo.
A mimetização do estado in vivo do parasito na forma de esquistossômulos
cultivados in vitro possui duas linhas: uma que aceita o processo como uma
Discussão
92
mimetização real da biologia do organismo levando em consideração os aspectos
bioquímicos e fisiológicos e outra que defende a idéia que fatores diversos no
hospedeiro, impedem esta mimetização. Tentamos neste trabalho mimetizar ao máximo
este ambiente do hospedeiro, com temperatura, concentração de gases e meio de cultura
contendo hormônios e outras substâncias importantes para sua sobrevivência. O RNA
destas preparações foram utilizados também para analisar o padrão de expressão de
outras vias metabólicas, como por exemplo SUMO E3ligase, COP9 signalossomo,
proteassoma 20S mostrando uma correlação direta com a atividade bioquímica das
proteínas codificadas por estes genes (Cabral, 2008).
5.3 Outras proteínas envolvidas na via de miRNA
Além das proteínas da família RNAse III e Argonautas estudamos mais 5
proteínas envolvidas na via de miRNA. Os alinhamentos com seus respectivos
homólogos metazoários foram bem expressivos com valores, para maioria dos
alinhamentos, aproximando-se no máximo de um e
-5
(Tabelas 4A a 16A). Valores bem
próximos de zero, e-values menores que e
-100
, também foram encontrados. Tudo isto
mostra mais uma vez que a via é conservada em S. mansoni.
As proteínas envolvidas em RISC são proteínas auxiliares da proteína principal
Argonauta para execução do complexo. Experimentos mostram diversas composições
de RISC em diversos organismos sendo que em D. melanogaster as principais proteínas
que o compõe são VIG dFMR1 (proteína relacionada ao X frágil), Tudor-SN
(nuclease), helicases, proteínas diversas Argonautas (Caudy, 2002; Caudy, 2003). Em
humanos, além dessas proteínas associadas à RISC, duas helicases importantes se ligam
ao complexo, Gemin3 e Gemin4 (Meister e Tuschl, 2004).
A proteína Tudor-SN (tudor staphylococcal nuclease) obteve e-values bastante
expressivos quando comparada a seus ortólogos, chegando a 3e-168, como mostra a
Tabela 12B. Tudor-SN (tudor staphylococcal nuclease) é uma proteína que contém 4 ou
5 domínios SNc determinantes da sua atividade nucleásica, e um domínio Tudor (Figura
18). Estes domínios mostraram-se bastante similares aos domínios consensos do banco
de dados como mostra a Tabela 12A. Tudor-SN é um componente de RISC onde
primeiramente foi reconhecido um domínio com função nucleásica contribuindo para
ação de RISC na degradação dos mRNAs alvos.
Discussão
93
SmFmr1 mostrou-se bastante similar a suas ortólogas de D. melanogaster e H.
sapiens, apresentando valores de e-values de 5e-37 a 4e-43, respectivamente (Tabela
11B). Quando observamos o alinhamento entre os domínios consenso dos bancos de
dados e o domínio conservado da proteína, observamos um valor alto para e-value,
devido a pequena cobertura correlacionada entre os domínio.
Duas prováveis proteínas ligantes de fita dupla de RNA, auxiliares das proteínas
RNAse III, SmDrosha e SmDicer1, foram encontradas em S. mansoni. Estas
desempenham papéis importantes na via, sendo que a ausência destas provoca o
acúmulo de pré-miRNA ou pri-miRNA na célula (Saito, 2005). A auxiliar de Drosha,
proteína ligante de fita dupla de RNA, conhecida em D. melanogaster e C. elegans
como Pasha, tem sua correspondente em S. mansoni, SmPasha. (Denli, 2004; Gregory,
2004; Han, 2005). A auxiliar de Dicer-1 em D. melanogaster, Loquacious, tem uma
paráloga, R2D2, que se liga a Dicer-2. Em S. mansoni, até o momento, identificamos
representante de Loquacious, SmLoquacious, mesmo porque, também identificamos
apenas ortólogas de Dicer-1, SmDicer1 (Saito, 2005). Tanto SmLoquacious quanto
SmPasha apresentaram o domínio DSRM, que tem função de ligação a fita dupla de
RNA, na sua estrutura primária, bem conservado (Figuras 19 e 22; Tabelas 13A e 16A).
Além disso, a conservação entre os ortólogos foi bastante expressiva mostrando valores
de alta similaridade como entre os ortólogos de D. melanogaster Pasha, 4e-47, e
Loquacious, 3e-22. Em C. elegans não foi encontrado ortólogo para SmLoquacious com
similaridade significativa. Mas a literatura mostra que em C. elegans quem desempenha
esta função é a proteína Rde-4, não sendo encontrado em S. mansoni ortólogos desta
proteína (Grishok, 2005)
Expotina-5 é uma proteína nuclear conservada em diversos organismos com
diversas funções sendo a principal exportar pequenos RNAs não codificantes assim
como precursores de miRNA (Shibata, 2006). Em S. mansoni foi identificada duas
proteínas SmExportina5.1 e SmExportina5.2 provindas de uma mesma seqüência de
DNA genômico, mas com diferentes mRNAs, processadas diferentemente pela
propriedade de splicing alternativo. Nosso grupo está trabalhando para validação deste
splicing. Estas proteínas apresentaram sinilaridade alta com ortólogas de D.
melanogaster e H. sapiens além de significativos valores de similaridade entre os
domínios conservados da proteína e os domínios conservados consenso, mostrando
grande conservação desta proteína no parasito.
Discussão
94
Todas proteínas, exceto SmLoquacious, apresentaram ESTs correlacionadas em
diversos estágios do parasito no banco de dados do transcriptoma da FAPESP,
confirmando a presença destas em S. mansoni.
Baseado nos resultados apresentados neste trabalho a via de miRNA em S.
mansoni é composta por 13 proteínas, como resumido na Figura 37.
Figura 37: Elucidação da via de miRNA em S. mansoni. Prováveis proteínas
envolvidas na via de silenciamento gênico mediada por miRNA em S. mansoni.
5.4 MiRNAs preditos
A alta similaridade entre as proteínas ortólogas envolvidas na via de
processamento de miRNAs em S. mansoni, D. melanogaster, C. elegans e H.sapiens
ficou evidenciada. O mesmo não aconteceu com as seqüências de miRNAs homólogas
Discussão
95
em diversos organismos mantidas na evolução. É o caso da família de miRNA let-7 que
é encontrada em diversos organismos e não foi encontrada em S. mansoni até o
momento como D. melanogaster, C. elegans e H. sapiens e a família lin-4 que é
encontrada em C. elegans e H. sapiens e também não foi encontrada no parasito ( Lim,
2003b). Na busca por miRNAs homólogos, como let-7 e lin-4, no genoma do S.
mansoni, não obtivemos resultados satisfatórios até o momento. A única seqüência
provável que possui características para preditos miRNAs encontrada até o momento
esta mostrada na Figura 28, não possuindo homologia com miRNA de outra espécie.
Para as buscas destes miRNAs preditos levamos em conta algumas considerações, tais
como: tamanho do grampo (hairpin) formado, a necessidade de no mínimo 50
nucleotídeos integrados entre si na estrutura secundária; distância da haste do grampo
em relação à volta (loop) (com no mínino 21 nucleotídeos em cada extremidade); e a
característica mais expressiva: estabilidades termodinâmicas do grampo, utilizando um
·G de energia livre de formação de -25 kcal/mol. Esta estabilidade termodinâmica
máxima adotada foi baseada na termodinâmica das estruturas secundárias geradas por
pré-miRNAs das espécies D. melanogaster (-25 kcal/mol), e C. elegans (-23 kcal/mol)
que possuem uma maquinaria de miRNA próxima em termos evolutivos com o S.
mansoni (Lim, 2003; Lai, 2003).
Na Figura 28 podemos observar que a estrutura do miRNA predito e seu
precursor no parasito, se enquadram nas características abordadas como grampo com
uma haste longa bem alinhada com as extremidades 5’ e 3’terminal, pouco estáveis e
um loop para fechamento do grampo. Além disso, a estrutura secundária do RNA de fita
dupla com uma energia livre de formação espontânea de -30,2 kcal/mol, tornando a
estrutura bastante estável. Os miRNAs preditos encontrados no parasito foram
denominados miRNA1A e miRNA1A*. Novos experimentos estão sendo realizados
para conhecer os níveis de expressão deste miRNA durante a transição cercária-
esquistossômulo.
Conclusão
96
6- Conclusão
Conclusão
97
Os principais resultados obtidos neste trabalho foram:
1- Identificação in silico de 14 prováveis proteínas envolvidas na via de
silenciamento mediada por miRNA, sendo uma sem ORF completa;
2- Identificação de prováveis splicing alternativos, ocorrendo com um membro
nuclear, SmDrosha, um membro de transporte núcleo-citoplasma,
SmExportina5, e um membro citoplasmático, SmAgo.
3- Distância evolutiva da família Argonauta e RNAse III no parasito em relação
aos ortólogos;
4- Expressão diferencial de SmDicer1 e SmAgo2/3/4 são na fase de transição
cercária-esquistossômulo e com maior abundância em ovos.
Diante destes resultados obtidos podemos concluir que a via de processamento
de miRNA em S. mansoni é bastante conservada, mas, requer mais estudos para seu
entendimento completo, podendo assim, auxiliar futuramente, na elucidação dos
mecanismos envolvidos na regulação gênica pós-transcricional, proliferação celular,
apoptose, sinalização e diferenciação no parasito.
Bibliografia
98
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Adamson, R.E.; Ashton, P.D.; Bonaldo, M.F.; Coulson, P.S.; Dillon, G.P.;
Farias, L.P.; Gregorio, S.P.; Ho, P.L.; Leite, R.A.; Malaquias, L.C.; Marques,
R.C.; Miyasato, P.A.; Nascimento, A.L.; Ohlweiler, F.P.; Reis, E.M.; Ribeiro,
M.A.; Sa, R.G.; Stukart, G.C.; Soares, M.B.; Gargioni, C.; Kawano, T.;
Rodrigues, V.; Madeira, A.M.; Wilson, R.A.; Menck, C.F.; Setubal, J.C.; Leite,
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Anexo
108
8-ANEXO
Anexo
109
8.1 Anexo 1
Alinhamento entre os fragmentos de cDNA representantes do domínio endoND1
seqüenciados e a recuperados do banco de dados da FAPESP de S. mansoni.
Anexo
110
8.2 Anexo 2
Alinhamento entre as seqüências de DNA genômico representantes do
domínio PIWI seqüenciadas e a recuperada do banco de dados geneDB de S.
mansoni.
As setas com os blocos delimitam os iniciadores F e R do fragmento
amplificado.
Anexo
111
8.3 Anexo 3
Alinhamento entre os fragmentos seqüenciados de cDNA representantes do
domínio PIWI.
As setas com os blocos delimitam os iniciadores F e R do fragmento amplificado
e o bloco com linhas tracejadas representa o íntron/éxon inserido na seqüência consenso
de cDNA.
Anexo
112
8.4 Anexo 4
Porcentagem relativa das ESTs referentes às proteínas da via de miRNA.
Foi levado em consideração o número de ESTs seqüenciadas por estágio no
projeto transcriptoma da FAPÈSP para o cálculo de porcentagem relativa. Em amarelo o
estágio de ovos, em vermelho, esporocistos, em verde miracídios, em roxo cercária, em
azul esquistossômulos e em alaranjado vermes adultos.
9.5 Anexo 5
Porcentagem das ESTs presentes nas proteínas depositadas no banco da
FAPESP SmDicer1, SmDrosha1 e 2, SmAgo1, 2, 3 e 4, SmFmr1, SmTudor-SN,
SmPasha, SmExportina5.1, 5.2.
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