( PDF ) Avaliação do perfil de IgG e subclasses de IgG de pacientes portadores de infecção chagásica do município de Berilo, Vale do Jequitinhonha, Minas Gerais

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Universidade Federal de Ouro Preto

Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas – NUPEB

Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas

Avaliação do perfil de IgG e subclasses de IgG de pacientes portadores

de infecção chagásica do município de Berilo, Vale do Jequitinhonha,

Minas Gerais

Autora: Lílian da Silva Santos

Orientadora: Profª. Drª Marta de Lana

Co-Orientador: Dr. Pedro Albajar Viñas

Ouro Preto, 31 de janeiro de 2008

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Universidade Federal de Ouro Preto

Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas – NUPEB

Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas

Avaliação do perfil de IgG e subclasses de IgG de pacientes portadores

de infecção chagásica do município de Berilo, Vale do Jequitinhonha,

Minas Gerais

Autora: Lílian da Silva Santos

Orientadora: Profª. Drª. Marta de Lana

Co-Orientador: Dr. Pedro Albajar Viñas

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação

em Ciências Biológicas do Núcleo de Pesquisas em

Ciências Biológicas da Universidade Federal de Ouro

Preto, como parte integrante dos requisitos para obtenção

do Título de Mestre em Ciências Biológicas, área de

concentração: Imunobiologia de Protozoários

Ouro Preto, 31 de janeiro de 2008

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Catalogação: [email protected]

S237a Santos, Lílian da Silva.

Avaliação do perfil de IgG e subclasses de IgG de pacientes portadores de

infecção chagásica do município de Berilo, Vale do Jequitinhonha, Minas

Gerais [manuscrito] / Lílian da Silva Santos. – 2008.

xix, 132 f.: graf., tabs., mapas.

Orientadora: Profa. Dra. Marta de Lana.

Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal de Ouro Preto. Instituto

de Ciências Exatas e Biológicas. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas.

Área de concentração: Imunobiologia de protozoários.

1. Imunoglobulinas - Teses. 2. Chagas, Doença de - Teses. 3. Berilo (MG) -

Teses. I. Universidade Federal de Ouro Preto. II. Título.

CDU: 616.937(815.1)

III

Aceita a própria vida

Buscando melhorá-la.

Abraça os que te cercam,

Doando-lhes auxílio.

Nada exijas. Trabalha.

Não condenes. Constrói.

Se a provação chegou,

Acata-lhe os ensinos.

Sê fiel a ti mesmo,

Serve, segue e não temas.

Se te aceitas como és

Deus te fará feliz

Emmanuel

Aos meus amados pais, Maria e Wilson.

A todos os milhões de infectados pelo Trypanosoma cruzi

No estalla como las bombas,

ni suena como los tiros.

Como el hambre, mata callando.

Como el hambre, mata a los callados:

a los que viven condenados al silencio

y mueren condenados al olvido.

Tragedia que no suena,

enfermos que no pagan,

enfermedad que no vende.

El mal de Chagas no es negocio

que atraiga a la industria farmacéutica,

ni es tema que interese

a los políticos ni a los periodistas.

Elige a sus víctimas en el pobrerío.

Las muerde y lentamente,

poquito a poco,

va acabando con ellas.

Sus víctimas no tienen derechos,

ni dinero para comprar los derechos que no tienen.

Ni siquiera tienen el derecho de saber de qué mueren.

Eduardo Galeano

Agradeço a Deus por tudo que Ele proporciona em minha vida....

À Prof. Marta de Lana pela oportunidade de ingressar em um mundo até então

desconhecido por mim. Obrigada pela confiança e pelo empenho despendido para que

tudo desse certo.

Ao Dr. Pedro Albajar Viñas, agradeço pela sua colaboração em meu trabalho, por

sempre estar disponível a me ouvir, e me aconselhar com suas sábias palavras em

momentos decisivos e difíceis. Obrigada pelas longas conversas!

À Drª. Rosália agradeço não apenas pela colaboração em meu trabalho, mas pela

presença sempre alegre e amigável.

Ao Dr. Olindo, por ter cedido seus reagentes em um momento crucial do meu trabalho,

pelos soros disponibilizados e por toda a atenção dada a esse estudo.

A todos os professores do NUPEB.

À querida Cida, pessoa esplêndida, que com muito carinho, atenção e alegria sempre me

recebeu.

Aos meus colegas de Mestrado, em especial a turma da “Parasitologia”, Alexandra,

Alekson, Léo, Elisângela, Rafaela e Dani, que esteve unida em todos os momentos com

alegria e bom humor.

A todos do Laboratório de Doença de Chagas, em especial ao Auffy, Jaquelline, Lílian,

Arnaldo, Maykon, Rodrigo, Marcela, Érika, Rafaela, Gláucia, pela amizade, alegria e

por todos os favores pedidos, a Dani Sorriso, e ao Vítor pelo cuidado com as

hemoculturas.

Ao Léo e a Jamille, pela cumplicidade nas viagens, e por compartilharem comigo

grandes momentos, jamais esquecidos em Berilo.

Ao Prof. André Talvani pela oportunidade de compartilhar de suas aulas, pelas idéias e

discussões, que muito acrescentaram no meu conhecimento.

À Helen, que me ajudou prontamente em tudo que precisei, demonstrando seriedade,

competência e discernimento, em momentos de importância na minha jornada.

A todos de Berilo que direta ou indiretamente participaram desse projeto, em especial

aos funcionários do Hospital Municipal, da Secretaria de Saúde e dos PSFs.

Ao Padre Nuno, que com toda sua força luta em benefício dos pacientes com doença de

Chagas de Berilo.

Á querida Beth, por nos acolher em Berilo com tanto carinho e alegria.

Ao Nem, Tuca e Dona Araci, por nos oferecerem um ambiente agradável e uma comida

deliciosa, nos momentos de muito trabalho.

A todos os pacientes que participaram desse trabalho, especialmente a três deles que

perderam a vida durante esse estudo. É para evitar que mortes tão precoces aconteçam

que nos empenhamos nessa batalha.

Há pessoas que em nossas vidas surgem como um bálsamo em momentos difíceis,

e que nos aconselham, nos ouvem, sofrem junto, e estão sempre lá, do nosso lado,

mesmo à distância...

Agradeço a minha querida amiga Dani, porque sem ela esses anos não teriam sido os

mesmos. Agradeço por sempre me ajudar em todos os momentos, e por fazer crescer

entre nós uma amizade que ultrapassa qualquer fronteira.

Aos meus excepcionais pais, por sempre me apoiarem e me ouvirem, nunca me

impedindo de tomar minhas atitudes, apenas questionando as conseqüências dos meus

atos. Muito obrigada!!

VII

As minhas queridas irmãs por terem paciência e entenderem o momento vivido por

mim, e ao meu querido Arthur que deixa nossos dias repletos de alegria.

Ao querido Vitório, companheiro em todos os momentos, por sempre me dar apoio, e

acreditar em mim, e a sua linda família que me recebeu de coração e portas abertas.

A cidade de Ouro Preto, por ter sido o cenário dos momentos iniciais da minha vida

adulta.

A Escola de Farmácia, pela oportunidade de fazer parte de sua história.

A todos que de qualquer maneira participaram desse trabalho, muito obrigada.

... E eu digo que a vida é mesmo escuridão exceto quando existe necessidade,

E toda a necessidade é cega exceto quando existe sabedoria.

E toda a sabedoria é vã exceto quando existe trabalho,

E todo o trabalho é vazio exceto se houver amor;

E quando trabalhais com amor vocês estão se ligando a vocês mesmos, e uns aos outros,

e a Deus.

Kahlil Gibran

VIII

A pesquisa de técnicas sorológicas de alta especificidade e sensibilidade que

sejam capazes de avaliar a morbidade da doença de Chagas é de grande interesse. O

maior objetivo desse trabalho foi realizar uma avaliação sorológica pesquisando IgG

total e suas subclasses IgG1, IgG2 e IgG3, em diluições sucessivas de soro, em

pacientes do município de Berilo, Vale do Jequitinhonha, Minas Gerais, infectados pelo

Trypanosoma cruzi com diagnóstico sorológico positivo e previamente avaliados do

ponto de vista epidemiológico, clínico e parasitológico. O diagnóstico sorológico foi

feito pelas técnicas de ELISA e HAI e a hemocultura empregada na avaliação

parasitológica. A seguir, todos os pacientes responderam um questionário clínico-

epidemiológico. Para a avaliação clínica os pacientes passaram por exame físico,

eletrocardiograma, ecocardiograma e Raios-X do tórax e do esôfago e cólon

contrastados. Após estes exames, foram selecionados para este estudo 15 pacientes em

cada uma das seguintes formas clínicas da doença de Chagas: forma Indeterminada

(IND), forma Cardíaca 1 (CARD 1), forma Cardíaca 2 (CARD 2), forma Digestiva e/ou

Mista (DIG/MIS), além de um grupo com 15 indivíduos não reativos (grupo controle)

da mesma localidade. Inicialmente a técnica de ELISA não comercial rotineiramente

usada para o diagnóstico da doença de Chagas foi empregada para a dosagem das

imunoglobulinas nos pacientes com infecção chagásica e posteriormente aplicada a

soros de indivíduos com algumas doenças infecciosas tais como HIV, HCV, sífilis

(SIF), leishmaniose visceral (LV) e leishmaniose tegumentar (LT) com objetivo de

verificar seu desempenho. A análise dos aspectos epidemiológicos demonstrou que os

pacientes com infecção chagásica apresentaram piores condições sócio-econômicas

quando comparados aos pacientes do grupo controle não infectado. O grupo controle

apresentou melhores condições de moradia atuais e anteriormente a este estudo, maior

grau de escolaridade, e conseqüentemente melhores condições de trabalho. A taxa geral

de hemocultura positiva foi de 25% (15/60), com 33,33% (5/15) de positividade no

grupo IND, 26,66% (4/15) no grupo CARD 1 e no CARD 2 e 13,33% (2/15) no

DIG/MIS. Não houve diferença significativa entre as porcentagens de hemoculturas

positivas dos grupos clínicos. A análise do desempenho da técnica de ELISA não

comercial, rotineiramente utilizada por nosso grupo no diagnóstico sorológico da

doença de Chagas, demonstrou que o diagnóstico sorológico desta infecção pode ser

realizado com melhores resultados pela pesquisa de IgG total nas diluições 1:10 a

1:320, IgG1 a 1:10, IgG2 a 1:10 e 1:20 e IgG3 de 1:10 a 1:320. A pesquisa das

imunoglobulinas revelou que IgG total e IgG3 apresentaram níveis mais elevados,

seguidos por IgG2 e IgG1. O emprego desta metodologia na análise dos soros de

pacientes com outras doenças infecto-contagiosas demonstrou que o diagnóstico pode

ser feito com segurança para IgG total na diluição 1:40, para IgG1 e IgG2 na diluição

1:10 e para IgG3 na diluição 1:20. Foi detectada reatividade cruzada em soros de

pacientes com LV e LT na pesquisa de IgG1, IgG2 e IgG3 nas diluições selecionadas.

Apenas a pesquisa de IgG total nas diluições 1:10 a 1:80 não revelou reatividade

cruzada com os soros das outras infecções (HIV, HCV, SIF, LV e LT). O emprego desta

mesma metodologia na avaliação da morbidade da doença de Chagas revelou que o

grupo DIG/MIS apresentou níveis significativamente mais elevados de IgG total em

todas as diluições testadas em relação aos outros grupos clínicos. A pesquisa de IgG3

também apresentou níveis significativamente mais elevados no grupo IND em todas as

diluições avaliadas. IgG1 e IgG2 apresentaram níveis semelhantes em todos os grupos

clínicos. Em síntese, este estudo não demonstrou uma associação muito clara entre as

manifestações clínicas da doença de Chagas e os níveis das imunoglobulinas

pesquisadas.

The research of serological tests of high specificity and sensibility that could be

able to evaluate the morbidity of Chagas disease is of great interest. The major objective

of this work was to carry out a serological evaluation searching to total IgG and its

subclasses IgG1, IgG2 and IgG3 in successive dilutions of serum in patients from Berilo

municipality, Jequitinhonha Valley, Minas Gerais state, Brazil, infected by

Trypanosoma cruzi, with positive serological diagnosis and previously evaluated

epidemiological, clinical and parasitologically. The serological diagnosis was carried

out by ELISA and IHA tests and the hemoculture was employed in the parasitological

evaluation. Following, all patients were evaluated by a clinical-epidemiological

questionnaire. For clinical evaluation patients were submitted to physical examination,

electrocardiogram, ecocardiogram and X-rays of thorax, esophagus and colon

contrasted. After these examinations 15 patients in each of the following clinical forms

of Chagas disease were selected for this study: Indeterminated form (IND), Cardiac 1

form (CARD 1), Cardiac 2 form (CARD 2), Digestive and/or Mixed form (DIG/MIX)

and a group of 15 individuals not serologically reactive (control group) of the same

locality. Firstly the ELISA technique not commercial routinely used for the diagnosis

of Chagas disease was employed for dose the immunoglobulins mentioned in chagasic

patients and following applied to sera of individuals with other infectious diseases such

as HIV, HCV, syphilis (SYP), visceral leishmaniasis (VL) and tegumentary

leishmaniasis (TL). The analysis of the epidemiological aspects demonstrated that

patients with chagasic infection presented worse social-economical conditions when

compared with the control group. The control group presented nowadays and before this

study better home conditions, higher level of education and consequently better

conditions of work. The global rate of positive hemoculture was 25% (15/60), being

33.33% (5/15) of positivity in the IND group, 26.66% (4/15) in the CARD 1 and CARD

2 groups and 13.33% (2/15) in the DIG/MIX group. No significant differences were

observed between the rates of positivity of the clinical groups. The analysis of the not

commercial ELISA technique performance demonstrated that the serological diagnosis

of Chagas disease can be performed with better results by research of total IgG in 1:10

to 1:320 dilutions, of IgG1 in the 1:10 dilution, of IgG2 in 1:10 and 1:20 dilutions and

of IgG3 in the 1:10 to 1:320 dilutions. The research of the immunoglobulins revealed

that total IgG and IgG3 presented higher levels, followed by IgG2 and IgG1. The use of

this methodology in the analysis of sera of patients with other infect-contagious disease

demonstrated that the diagnosis can be better performed by the research of total IgG in

the 1:40 dilution, of IgG1 and IgG2 in the 1:10 dilution and of IgG3 in the 1:20 dilution.

Cross reactivity was detected in sera of patients with VL and TL for IgG1, IgG2 and

IgG3. Only the research of total IgG in the 1:10 to 1:80 dilutions do not presented cross

reactivity with sera of patients with other infections (HIV, HCV, SYP, VL and TL). The

use of this same methodology in the evaluation of the Chagas disease morbidity

revealed that the DIG/MIX group presented significant higher levels of total IgG in all

sera dilutions essayed in relation to the other clinical groups. The research of IgG3 also

presented higher significant levels in the IND group in all sera dilutions evaluated in

relation to CARD 2 and DIG/MIX groups. The IgG1 and IgG2 presented similar levels

in sera of all clinical groups. Thus, this study did not demonstrate a clear correlation

between the clinical manifestations of Chagas disease and the levels of the

immunoglobulins studied.

Figura 1 - Localização do município de Berilo no Estado de Minas Gerais.

..................................................................................................................................................... 26

Figura 2 - Padronização da técnica de ELISA não comercial para a pesquisa de IgG total, IgG1,

IgG2 e IgG3, utilizando antígeno alcalino de epimastigotas da cepa Y de T. cruzi

..................................................................................................................................................... 35

Figura 3 - Curva ROC das diluições de soro 1:40 e 1:160 para a pesquisa de IgG1

.................................................................................................................................................... 38

Figura 4 - Gráfico de dispersão para IgG1 na diluição de 1:10, construído a partir da técnica de

ELISA não comercial, utilizando antígeno alcalino de cepa Y de Trypanosoma cruzi, conjugado

anti-IgG1 diluído a 1:500 e HRP-estreptavidina a 1:1.000....................................................... 39

Figura 5 - Porcentagem de hemocultura positiva nos diferentes grupos clínicos de pacientes do

município de Berilo, Vale do Jequitinhonha, MG, portadores de infecção por Trypanosoma

cruzi

..................................................................................................................................................... 47

Figura 6 - ELISA não comercial em soros de pacientes de Berilo, Vale do Jequitinhonha, MG,

nas diluições de 1:10, 1:20, 1:40, 1:80, 1:160, 1:320, 1:640 e 1:1.280, utilizando antígeno

alcalino de cepa Y de Trypanososma cruzi, conjugado anti-IgG total diluído a 1:10.000, anti-

IgG1 diluído a 1:500, anti-IgG2 diluído a 1:2.500, anti-IgG3 diluído a 1:1.000 e HRP-

estreptavidina a 1:1.000 ............................................................................................................. 49

Figura 7 - Curvas ROC da técnica de ELISA não comercial para dosagem de IgG total

construídas a partir dos índices de sensibilidade e especificidade dos grupos CONT (não

infectado) e CH (com infecção chagásica) nas diluições de soro de 1:10, 1:20, 1:40, 1:80,

1:160, 1:320, 1:640 e 1:1.280...................................................................................................... 51

Figura 8 - Curvas ROC da técnica de ELISA não comercial para dosagem de IgG1, construídas

a partir dos índices de sensibilidade e especificidade dos grupos CONT (não infectado) e CH

(com infecção chagásica) nas diluições de soro de 1:10, 1:20, 1:40, 1:80 e 1:160

.................................................................................................................................................... 53

Figura 9 - Curvas ROC da técnica de ELISA não comercial para dosagem de IgG2 construídas

a partir dos índices de sensibilidade e especificidade dos grupos CONT (não infectado) e CH

(com infecção chagásica) nas diluições de soros de 1:10, 1:20, 1:40, 1:80, 1:160, 1:320, 1:640 e

1:1.280 ....................................................................................................................................... 56

Figura 10 - Curvas ROC da técnica de ELISA não comercial para dosagem de IgG3 construídas

a partir dos índices de sensibilidade e especificidade dos grupos CONT (não infectado) e CH

(com infecção chagásica) nas diluições de soros de 1:10, 1:20, 1:40, 1:80, 1:160, 1:320, 1:640 e

1:1.280 ........................................................................................................................................ 59

Figura 11 - ELISA não comercial em soros de pacientes de Berilo, Vale do Jequitinhonha, MG,

infectados ou não por Trypanosoma cruzi, nas diluições de 1:10, 1:20, 1:40, 1:80, 1:160, 1:320,

1:640 e 1:1.280, utilizando antígeno alcalino de cepa Y de Trypanosoma cruzi, conjugado anti-

IgG total diluído a 1:10.000 e HRP-estreptavidina a 1:1.000 .................................................. 61

Figura 12 - ELISA não comercial em soros de pacientes de Berilo, Vale do Jequitinhonha, MG,

infectados ou não por Trypanosoma cruzi, nas diluições de 1:10, 1:20 e 1:40, utilizando

antígeno alcalino de cepa Y de Trypanosoma cruzi, conjugado anti-IgG1 diluído a 1:500 e HRP-

estreptavidina a 1:1.000 .............................................................................................................. 62

Figura 13 - ELISA não comercial em soros de pacientes de Berilo, Vale do Jequitinhonha, MG,

infectados ou não por Trypanosoma cruzi, nas diluições de 1:10 , 1:20 e 1:40, utilizando

antígeno alcalino de cepa Y de Trypanosoma cruzi, conjugado anti-IgG2 diluído a 1:2.500 e

HRP-estreptavidina a 1:1.000 ................................................................................................... 63

Figura 14 - ELISA não comercial em soros de pacientes de Berilo, Vale do Jequitinhonha, MG,

infectados ou não por Trypanosoma cruzi, nas diluições de 1:10, 1:20, 1:40, 1:80, 1:160 e 1:320,

utilizando antígeno alcalino de cepa Y de T. cruzi, conjugado anti-IgG3 diluído a 1:1.000 e

HRP-estreptavidina a 1:1.000 .................................................................................................... 64

Figura 15 - Gráficos de dispersão e curvas ROC de IgG total para os soros de indivíduos do

grupo controle não infectado e portadores de outras infecções (NCH) e indivíduos com infecção

chagásica (CH) nas diluições de soro 1:10, 1:20, 1:40, 1:80, 1:160 e 1:320, construídos a partir

da técnica de ELISA não comercial utilizando antígeno alcalino de cepa Y de Trypanosoma

cruzi, IgG total diluído a 1:10.000 e HRP-estreptavidina a 1:1000 ......................................... 67

Figura 16 - Gráfico de dispersão e curva ROC de IgG1 para os soros de indivíduos do grupo

controle não infectado e portadores de outras infecções (NCH) e indivíduos com infecção

chagásica (CH) diluídos a 1:10, construídos a partir da técnica de ELISA não comercial

utilizando antígeno alcalino de cepa Y de Trypanosoma cruzi, IgG1 diluído a 1:500 e HRP-

estreptavidina a 1:1.000 ............................................................................................................. 68

Figura 17 - Gráfico de dispersão e curva ROC de IgG2 para os soros de indivíduos do grupo

controle não infectado e portadores de outras infecções (NCH) e indivíduos com infecção

chagásica (CH) diluídos a 1:10 e 1:20, construídos a partir da técnica de ELISA não comercial

utilizando antígeno alcalino de cepa Y de Trypanosoma cruzi, IgG2 diluído a 1:2.500 e HRP-

estreptavidina a 1:1.000 ............................................................................................................. 70

Figura 18 - Gráficos de dispersão e curvas ROC de IgG3 para os soros de indivíduos do grupo

controle não infectado e portadores de outras infecções (NCH) e indivíduos com infecção

chagásica (CH) diluídos a 1:10, 1:20, 1:40, 1:80, 1:160 e 1:320, construídos a partir da técnica

de ELISA não comercial utilizando antígeno alcalino de cepa Y de Trypanosoma cruzi, IgG3

diluído a 1:1.000 e HRP-estreptavidina a 1:1.000 .................................................................... 73

Figura 19 - Análise da reatividade de IgG e subclasses de IgG por meio da técnica de ELISA

não comercial para a pesquisa de IgG total na diluição 1:10.000, IgG1 1:500, IgG2 1:2.500,

IgG3 1:1.000, HRP-estreptavidina a 1:1.000, utilizando antígeno alcalino de cepa Y de

Trypanosoma cruzi, em soros de pacientes não infectados (CONT), e com infecção chagásica

(CH) do município de Berilo, Vale do Jequitinhonha, MG, e outras doenças infecto-parasitárias:

HIV, hepatite C (HCV), sífilis (SIF), leishmaniose visceral (LV) e leishmaniose tegumentar

(LT) ............................................................................................................................................. 74

Figura 20 - ELISA não comercial para a pesquisa de IgG total na diluição 1:10.000, IgG1

1:500, IgG2 1:2.500, IgG3 1:1.000, e HRP-estreptavidina a 1:1.000, utilizando antígeno

alcalino de cepa Y de Trypanosoma cruzi, em soros de pacientes com diferentes formas clínicas

da doença de Chagas do município de Berilo, Vale do Jequitinhonha, MG ............................ 76

Figura 21 - ELISA não comercial em soros de pacientes de Berilo, Vale do Jequitinhonha, MG,

nas diluições que apresentaram diferença significativa entre as medianas de DO dos grupos com

diferentes formas clínicas da doença de Chagas (1:10, 1:20, 1:40, 1:80, 1:160, 1:320, 1:640 e

1:1.280), utilizando antígeno alcalino de cepa Y de Trypanosoma cruzi, conjugado anti-IgG

total diluído a 1:10.000 e HRP-estreptavidina 1:1.000 .............................................................. 77

XII

Figura 22 - ELISA não comercial em soros de pacientes de Berilo, Vale do Jequitinhonha, MG,

nas diluições que apresentaram diferença significativa entre as medianas de DO dos grupos com

diferentes formas clínicas da doença de Chagas (1:10 e 1:20), utilizando antígeno alcalino de

cepa Y de Trypanosoma cruzi, conjugado anti-IgG1 diluído a 1:500 e HRP-estreptavidina

1:1.000

......................................................................................................................................................78

Figura 23 - ELISA não comercial em soros de pacientes de Berilo, Vale do Jequitinhonha, MG,

nas diluições que apresentaram diferença significativa entre as medianas de DO dos grupos com

diferentes formas clínicas da doença de Chagas (1:10, 1:20, 1:40 e 1:80), utilizando antígeno

alcalino de cepa Y de Trypanosoma cruzi, conjugado anti-IgG3 diluído a 1:1.000 e HRP-

estreptavidina 1:1.000 ................................................................................................................. 79

Figura 24 – Análise de correlação de IgG total e as formas clínicas IND, CARD1, CARD 2 e

DIG/MIS, nas diluições de soro 1:10, 1:20, 1:40, 1:80, 1:160, 1:320, 1:640 e 1:1.280............. 80

Figura 25 - Análise de correlação de IgG2 e as formas clínicas IND, CARD1, CARD 2 e

DIG/MIS, na diluição de soro 1:160........................................................................................... 81

Figura 26 - Análise de correlação de IgG3 e as formas clínicas IND, CARD1, CARD 2 e

DIG/MIS, na diluições de soro de 1:10 a 1:320......................................................................... 81

XIII

Tabela I - Estadiamento do comprometimento miocárdico na cardiopatia chagásica

crônica.......................................................................................................................................... 9

Tabela II - Aspectos epidemiológicos avaliados dos pacientes com infecção chagásica (CH) e

grupo controle não infectado (CONT), do município de Berilo, Vale do Jequitinhonha, Minas

Gerais........................................................................................................................................... 44

Tabela III - Relação entre o número de homens e mulheres na população estudada no

município de Berilo, Vale do Jequitinhonha, MG....................................................................... 46

Tabela IV - Relação entre número de tubos apresentando resultado positivo e o período de

positivação destes na hemocultura em pacientes do município de Berilo, Vale do Jequitinhonha,

MG, portadores de infecção por Trypanosoma cruzi.................................................................. 48

Tabela V- Análise de correlação entre as formas clínicas da doença de Chagas e a reatividade

do soro dos pacientes para as imunoglobulinas IgG total, IgG1, IgG2 e IgG3.......................... 82

XIV

AATV - Anticorpos anti-tripomastigotas vivos

ASC - Área sob a curva

BHC – Hexaclorociclobenzeno

CARD 1 - Forma Cardíaca Leve a Moderada

CARD 2 - Forma Cardíaca Avançada

CONT - Grupo controle não reativo

CRA - Antígenos citoplásmicos

Curva ROC - Receiver Operating Characteristic Curve

CH - Pacientes com infecção chagásica

DIG/MIS - Forma Digestiva e/ou Mista

DO - Densidade óptica

ECG - Eletrocardiograma

ELISA - Enzyme linked immunosorbent assay (Ensaio imunoenzimático)

Espec - Especificidade

FRA - Antígenos flagelares

HAI - Hemaglutinação Indireta

HBV - Hepatite B

HCV - Hepatite C

HIV - Vírus da Imunodeficiência humana

HRP-estreptavidina - Streptavidin and horseradish peroxidase

HTLV -Vírus Linfotrópico de células T Humanas

IFI - Imunofluorescência Indireta

IgG - Imunoglobulina G

IgG1 - Imunoglobulina G1

IgG2 - Imunoglobulina G2

IgG3 - Imunoglobulina G3

IgG total - Imunoglobulina G total

IgM - Imunoglobulina M

IND - Forma Indeterminada

FIOCRUZ - Fundação Oswaldo Cruz

LIT - Liver Infusion Tryptose

LT - Leishmaniose tegumentar

LV - Leishmaniose visceral

MG - Minas Gerais

NCH – Grupo controle não infectado e portadores de outras infecções

NK - Natural Killer

OMS - Organização Mundial de Saúde

PC - Ponto de Corte

PCR - Reação em Cadeia da Polimerase

PSF - Programa de Saúde da Família

rpm - rotações por minuto

RV - Razão de Verossimilhança

RV+ - Razão de Verossimilhança Positiva

RV- - Razão de Verossimilhança Negativa

Sens - Sensibilidade

SFB - Soro Fetal Bovino

SIF - Sífilis

SNA - Sistema Nervoso Autônomo

SST-Tween - Solução Salina Tamponada com 0,5% de Tween 20

SST - Solução Salina Tamponada

SUCAM - Superintendência de Campanhas de Saúde Pública

SUS - Sistema único de Saúde

XVI

EPÍGRAFE .............................................................................................................. III

DEDICATÓRIA ...................................................................................................... IV

AGRADECIMENTOS ............................................................................................ V

RESUMO ................................................................................................................. VIII

ABSTRACT ............................................................................................................. IX

LISTA DE FIGURAS ............................................................................................. X

LISTA DE TABELAS ............................................................................................ XIII

LISTA DE ABREVIATURAS .............................................................................. XIV

1. INTRODUÇÃO..................................................................................................... 1

1.1 Histórico e aspectos epidemiológicos da doença de Chagas................................ 2

1.2 Formas clínicas da doença de Chagas................................................................... 5

1.3 Diagnóstico da doença de Chagas......................................................................... 11

1.3.1 Fase aguda......................................................................................................... 11

1.3.2 Fase crônica....................................................................................................... 12

1.4 Resposta Imune humoral na doença de Chagas.................................................... 15

1.5 Doença de Chagas no município de Berilo.......................................................... 19

1.6 Justificativa........................................................................................................... 21

2. OBJETIVOS .................................................................................................... 22

2.1 Objetivo geral...................................................................................................... 23

2.2 Objetivos específicos........................................................................................... 23

3. CASUÍSTICA E MÉTODOS........................................................................... 24

3.1 Área do estudo................................................................................................... 25

3.1.1 Berilo......................................................................................................

........ 25

3.2 Triagem da população estudada........................................................................ 26

3.2.1 Diagnóstico sorológico................................................................................... 27

3.2.1.1 Reação de Hemaglutinação indireta............................................................ 27

3.2.1.2 ELISA convencional.................................................................................... 27

3.3 Avaliação de aspectos epidemiológicos............................................................ 30

3.4 Avaliação clínica................................................................................................ 30

3.5 Avaliação ecocardiográfica................................................................................. 32

3.6 Avaliação parasitológica...................................................................................... 33

XVII

3.6.1 Hemocultura...................................................................................................... 33

3.7 Análise de IgG e subclasses de IgG por meio do ensaio imunoenzimático não

comercial .................................................................................................................. 34

3.7.1 Padronização do ensaio imunoenzimático não comercial para dosagem de IgG

total, IgG1, IgG2 e IgG3............................................................................................ 34

3.7.2 Detecção da reatividade de IgG e subclasses de IgG anti-T. cruzi por meio do

ensaio imunoenzimático não comercial aplicado ao diagnóstico sorológico da doença de

Chagas ......................................................................................................................... 35

3.7.2.1 Seleção inicial das diluições de soro para IgG e subclasses de IgG capazes de

discriminar indivíduos com infecção chagásica dos não infectados ........................... 35

3.7.2.2 Avaliação do desempenho da técnica de ELISA não comercial por meio da

construção das curvas ROC de IgG e subclasses de IgG nas diluições previamente

selecionadas ................................................................................................................. 36

3.7.2.3 Seleção das diluições mais aplicáveis a distinção entre indivíduos com infecção

chagásica e não infectados através do cálculo da diferença entre a mediana de DO do

grupo com infecção chagásica e a DO do grupo controle ........................................... 38

3.7.3 Detecção da reatividade de IgG e subclasses de IgG anti-T. cruzi por meio do

ensaio imunoenzimático não comercial aplicado ao diagnóstico sorológico da doença de

Chagas numa população que inclui portadores de outras doenças infecto-parasitárias de

interesse médico ........................................................................................................... 39

3.8 Pesquisa de IgG e subclasses de IgG anti-T. cruzi por meio do ensaio

imunoenzimático não comercial aplicado a monitoração de morbidade da doença de

Chagas .......................................................................................................................... 40

3.8.1 Análise da reatividade de IgG e subclasses de IgG por meio da mediana de DO de

cada grupo clínico nas diluições de soro avaliadas ..................................................... 40

3.8.2 Análise individual da reatividade de IgG e subclasses de IgG em pacientes com

diferentes formas clínicas da doença de Chagas ......................................................... 41

3.8.2.1 Análise de correlação entre o perfil de imunoglobulinas de pacientes e as

diferentes formas clínicas ........................................................................................... 41

3.9 Análise Estatística ................................................................................................ 42

4. RESULTADOS...................................................................................................... 43

4.1 Diagnóstico sorológico da população estudada.................................................... 44

4.2 Avaliação epidemiológica...................................................... ............................... 44

XVIII

4.3 Avaliação clínica.................................................................................................... 45

4.4 Avaliação parasitológica....................................................................................... 46

4.4.1 Hemocultura...................................................................................................... 46

4.5 Detecção da reatividade de IgG e subclasses de IgG anti-T. cruzi por meio do

ensaio imunoenzimático não comercial aplicado ao diagnóstico sorológico da doença

de Chagas .................................................................................................................... 48

4.5.1 Seleção inicial das diluições de soro para IgG e subclasses de IgG capazes de

discriminar indivíduos com infecção chagásica dos não infectados ......................... 48

4.5.2 Avaliação do desempenho da técnica de ELISA não comercial por meio da

construção das curvas ROC de IgG e subclasses de IgG nas diluições previamente

selecionadas ................................................................................................................. 49

4.5.2.1 Curvas ROC de IgG total ................................................................................ 50

4.5.2.2 Curvas ROC de IgG1 ..................................................................................... 51

4.5.2.3 Curvas ROC de IgG2 ..................................................................................... 53

4.5.2.4 Curvas ROC de IgG3 ...................................................................................... 56

4.5.3 Seleção das diluições mais aplicáveis a distinção entre indivíduos com infecção

chagásica e não infectados através do cálculo da diferença entre a mediana de DO do

grupo com infecção chagásica e a DO do grupo controle ......................................... 60

4.5.3.1 Gráficos de dispersão de IgG total ................................................................ 60

4.5.3.2 Gráficos de dispersão de IgG1 ....................................................................... 61

4.5.3.3 Gráficos de dispersão de IgG2 ....................................................................... 62

4.5.3.4 Gráficos de dispersão de IgG3 ...................................................................... 63

4.6 Avaliação da aplicabilidade do ELISA não comercial na segregação sorológica de

indivíduos com infecção chagásica e portadores de outras doenças infecto-parasitárias

de interesse médico .................................................................................................... 64

4.6.1 Gráfico de dispersão de DO e curva ROC para IgG total ................................ 65

4.6.2 Gráfico de dispersão de DO e curva ROC para IgG1 ...................................... 67

4.6.3 Gráfico de dispersão de DO e curva ROC para IgG2 ....................................... 68

4.6.4 Gráfico de dispersão de DO e curva ROC para IgG3 ....................................... 70

4.7 Análise da reatividade de IgG e subclasses de IgG em pacientes portadores de

infecção chagásica com diferentes formas clínicas ................................................... 74

4.7.1 Análise da reatividade de IgG e subclasses de IgG por meio da mediana de DO de

cada grupo clínico nas diluições de soro avaliadas ................................................... 74

XIX

4.7.2 Análise individual da reatividade de IgG e subclasses de IgG em pacientes com

diferentes formas clínicas da doença de Chagas ...................................................... 76

4.7.2.1 Pesquisa de IgG total .................................................................................... 76

4.7.2.2 Pesquisa de IgG1 .......................................................................................... 78

4.7.2.3 Pesquisa de IgG3 ......................................................................................... 78

4.7.2.4 Análise de correlação entre as formas clínicas classificadas e as imunoglobulinas

avaliadas ..................................................................................................................... 79

5. DISCUSSÃO ...................................................................................................... 83

5.1 Avaliação de aspectos epidemiológicos ............................................................. 84

5.2 Avaliação parasitológica .................................................................................... 87

5.3 Avaliação do perfil sorológico ........................................................................... 90

5.3.1 Pesquisa da reatividade de IgG e subclasses de IgG anti-T. cruzi por meio do

ensaio imunoenzimático não comercial aplicado ao diagnóstico sorológico da doença de

Chagas ...................................................................................................................... 90

5.3.2 Pesquisa da reatividade de IgG e subclasses de IgG por meio do ensaio

imunoenzimático não comercial aplicado ao diagnóstico sorológico da doença de

Chagas em soro de pacientes portadores de outras doenças infecto-parasitárias ....... 94

5.3.3 Aplicabilidade da pesquisa de IgG e subclasses de IgG anti-T. cruzi detectada por

meio do ensaio imunoenzimático não comercial na monitoração de morbidade da

doença de Chagas ......................................................................................................... 97

6. CONCLUSÕES .................................................................................................... 107

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................... 110

8. ANEXOS ............................................................................................................... 121

1. INTRODUÇÃO

1.1 Histórico e aspectos epidemiológicos da doença de Chagas

O Trypanosoma cruzi, parasita hemoflagelado da família Tripanosomatidae, foi

descoberto em 1909, pelo médico e cientista brasileiro Carlos Ribeiro Justiniano das

Chagas, que o caracterizou como o causador de uma moléstia até então desconhecida, a

doença de Chagas. Esse brilhante pesquisador não apenas identificou o agente

etiológico da infecção, como também seu vetor, os insetos da família Reduviidae e seus

reservatórios, descrevendo ainda os efeitos da infecção no organismo humano

(CHAGAS, 1909; 1911).

Àquela época, Carlos Chagas já observara que o principal elo da cadeia

epidemiológica da doença seria o inseto vetor, e que sua eliminação poderia interromper

a transmissão da infecção. Em seu admirável trabalho (CHAGAS, 1909), Chagas

sugeriu que o controle da transmissão seria a melhor estratégia e também a mais difícil

de ser alcançada na luta contra a doença.

A infecção chagásica abrange desde os Estados Unidos até a Argentina, sendo

uma das doenças parasitárias com maior impacto social e econômico na América

Latina. Nos últimos anos, devido a intensificação das migrações internacionais, a

doença de Chagas pode ser encontrada com maior frequência em regiões não

endêmicas, como Europa, Japão e nos Estados Unidos, onde é estimado um contingente

de 500 a 650 mil imigrantes infectados pelo T. cruzi (XAVIER et al., 2006; SZTAJZEL

et al., 1996). A presença de imigrantes infectados em países não endêmicos gera dois

problemas potenciais: a dificuldade no diagnóstico e no manuseio terapêutico da doença

de Chagas, pelo desconhecimento da comunidade médica local dos aspectos peculiares

da doença, e a possibilidade de transmissão da infecção através da transfusão de sangue

ou do transplante de órgãos de um doador infectado (XAVIER et al., 2006).

Caracterizada como uma moléstia resultante da intervenção do homem no meio

ambiente, a doença de Chagas acomete principalmente indivíduos de classes

econômicas mais pobres, que possuem condições de habitação precárias, possibilitando

o abrigo e a colonização dos vetores.

Segundo dados da Organização Mundial de Saúde (OMS), atualmente existem

13 milhões de indivíduos infectados pelo parasito nas Américas Central e do Sul, com

incidência anual de 200.000 novos casos e 14.000 mortes em decorrência de danos

irreversíveis ao coração e ao trato digestivo (WHO, 2005).

Os primeiros esforços sistemáticos no combate à infecção foram iniciados em

1943 com a criação do Centro de Estudos do Instituto Oswaldo Cruz em Bambuí, Minas

Gerais, onde dezenas de casos agudos foram diagnosticados. A criação desse centro de

estudos representou a primeira iniciativa institucional para promover o controle da

infecção (DIAS & SCHOFIELD, 1999).

Em 1950, o controle nacional da transmissão vetorial foi institucionalizado

pelo Serviço Nacional de Malária e posteriormente continuado pelo Departamento

Nacional de Endemias Rurais (DNERu) (SILVEIRA & REZENDE, 1994). Entretanto,

programas de controle em larga escala não foram iniciados até o começo dos anos 60

devido à ausência de decisão política e de uma estrutura capaz de implementar tais

programas em nível nacional. Naquele momento, apenas o estado de São Paulo

desenvolveu ações contínuas. A partir de 1977-1978, foi estabelecida a sistematização

das ações de controle vetorial com alcance nacional (DIAS & SCHOFIELD, 1999).

Um inquérito sorológico nacional realizado entre 1975-1980, demonstrou uma

prevalência da infecção chagásica no Brasil de 4,22%. O estado de Minas Gerais

apresentou nesse inquérito, uma prevalência da infecção de 8,8%. Dentro deste estado, o

Vale do Jequitinhonha era uma das regiões mais afetadas, apresentando um índice de

infecção de 35,5% (CAMARGO et al., 1984).

A realização de um inquérito entomológico nacional nesse mesmo período

identificou 17 espécies de insetos vetores com variados graus de colonização e infecção

natural pelo T. cruzi. Destas, cinco espécies foram consideradas de grande importância

na transmissão da infecção ao homem: Triatoma infestans, T. brasiliensis, T.

pseudomaculata, T. sordida e Panstrongylus megistus (SILVEIRA et al., 1984).

Os dados obtidos através dos dois inquéritos demonstraram as áreas onde havia

maior risco de infecção, indicando os locais onde as medidas de controle deveriam ser

prioritárias.

Após os primeiros ciclos de borrifações de inseticida, houve uma redução das

taxas de infestação do T. infestans e, atualmente, este vetor está praticamente eliminado

do país, sendo encontrado apenas em focos residuais. Em 1993, verificou-se uma

redução nas taxas de infestação de 30,4% para 7,6%, significando uma drástica queda

do número de municípios com essa espécie de vetor (RAMOS-JÚNIOR &

CARVALHO, 2001).

Em 1991, países do chamado Cone Sul (Argentina, Bolívia, Brasil, Chile,

Paraguai e Uruguai) consensuaram interromper a transmissão do T. cruzi através da

eliminação de vetores domésticos (particularmente o T. infestans) em conjunto com

triagem de doadores em bancos de sangue para a redução da transmissão transfusional e

com o acompanhamento de gestantes chagásicas e recém-nascidos visando a redução da

infecção congênita. Esta iniciativa foi seguida por países do Pacto Andino (Colômbia,

Equador, Peru e Venezuela) e da América Central (El Salvador, Guatemala, Honduras e

Nicarágua), em 1997, e em 2004, foi lançada a iniciativa de vigilância nos nove países

da bacia Amazônica (SCHOFIELD et al., 2006). Para que houvesse sucesso, a expansão

dessa estratégia para diversas áreas foi acompanhada de adaptações em decorrência das

diferentes realidades locais encontradas (MONCAYO, 2003).

As medidas de controle vetorial e transfusional adotadas têm apresentado um

impacto na prevalência, morbidade e mortalidade da doença de Chagas no Brasil. Esse

controle certamente tem tido seu sucesso acompanhado pela redução nas taxas de

transmissão por outras vias de infecção como a congênita e a oral.

Segundo a extinta FUNASA (Fundação Nacional de Saúde), para a avaliação

das medidas de controle é recomendada a realização de inquéritos sorológicos para a

infecção em todos os municípios que se encontram na fase de vigilância epidemiológica

visando a detecção de casos novos na população nascida após o combate vetorial. Esta

vigilância baseia-se na permanente atenção em busca de possíveis focos de vetores em

locais já atendidos pelas medidas de ataque aos insetos, além de atenção aos casos já

existentes.

Os benefícios médicos das iniciativas de controle têm sido, entre outros, a

diminuição de hospitalizações decorrentes da doença de Chagas, uma vez que tem

havido uma redução de casos agudos, e aparentemente um declínio na severidade de

casos crônicos decorrente da interrupção de re-infecções (SCHOFIELD et al., 2006).

Em junho de 2006, a Organização Pan-Americana da Saúde (OPAS) certificou

o Brasil como livre da transmissão da doença pelo vetor T. infestans. Além do Brasil, a

transmissão por esse vetor foi efetivamente eliminada no Uruguai (1997), Chile (1999)

e em áreas significativas da Argentina, Bolívia, Paraguai e partes da América Central

(SCHOFIELD et al., 2006).

Entretanto, o sucesso social, médico e financeiro alcançado com tais iniciativas

vai de encontro a algumas dificuldades, especialmente a redução do interesse político

para a continuidade dos programas. Embora seja estimado que na América Latina cerca

de 60 milhões de pessoas tenham saído do risco de serem infectadas, aproximadamente

40 milhões permanecem sob esta ameaça. Calcula-se que cinco milhões de infecções

foram prevenidas, mas a transmissão ainda ocorre em alguns países, e há evidências de

sua elevação em partes da Argentina (GURTLER, 2005), Venezuela (FELICIANGELI

et al., 2003), México, Peru, Colômbia, Costa Rica e provavelmente na região

Amazônica (SCHOFIELD et al., 2006). Nesta última, há a possibilidade de dispersão da

doença em humanos, uma vez que existe ampla circulação do parasito em focos

silvestres compostos por várias espécies de vetores e reservatórios (COURA et al.,

2002).

1.2 Formas clínicas da doença de Chagas

A doença de Chagas é caracterizada por um curso clínico variado,

apresentando-se em duas fases: aguda e crônica, com várias formas clínicas.

Após um período de incubação de cerca de quatro a dez dias, inicia-se a fase

aguda da infecção caracterizada pela ausência de sintomatologia em cerca de 98,0% dos

casos e, ocasionalmente, pelos sinais de porta de entrada (sinal de Romaña e chagoma

de inoculação). Este período que dura em média dois meses, apresenta parasitemia

patente, podendo ocorrer febre e inflamação ganglionar, entre outros (RASSI et al.,

2000; WHO, 2002). Esta fase pode ser mais grave em crianças abaixo de dois anos,

especialmente se interrompido o aleitamento materno, nas quais a mortalidade pode

chegar a 10,0% na ausência do tratamento etiológico (RIBEIRO et al., 1998).

A fase crônica inicia-se após cerca de oito semanas, caracterizando-se

tipicamente pela ausência de manifestações clínicas, eletrocardiográficas ou

radiológicas. Em 1985, na Primeira Reunião de Pesquisa Aplicada em doença de

Chagas, em Araxá, MG, foi estabelecido o conceito de forma indeterminada, que inclui

aqueles indivíduos com diagnóstico confirmado através de testes sorológicos positivos e

exames parasitológicos positivos ou negativos; ausência de sinais e sintomas da doença;

estudo eletrocardiográfico normal e estudo radiológico do coração, esôfago e cólon

normais (Consenso Brasileiro em doença de Chagas, 2005). Entretanto, quando exames

sensíveis como o ecocardiograma, Holter e teste ergométrico são realizados, é possível

verificar que alguns indivíduos na forma indeterminada apresentam alterações, não

significando que estes não estejam mais classificados na forma indeterminada. As

alterações detectadas podem não estar relacionadas à infecção, sendo de outra origem.

Por outro lado, certas alterações podem ter valor prognóstico para antecipar a detecção

de uma possível evolução para formas cardíacas, e nesses casos uma adequada

intervenção terapêutica e de adaptação de estilo de vida devem ser instituídas para tentar

impedir a progressão da doença.

Em áreas endêmicas, um diagnóstico sorológico positivo sem a adequada

avaliação clínica do paciente pode acarretar um sério problema social, uma vez que esse

indivíduo pode ser discriminado por empresas que contratam mão de obra operária,

alegando doença quando esta só se apresenta numa porcentagem minoritária dos

pacientes. A uma pessoa com a forma indeterminada da doença não está contra-indicada

a prática de atividades físicas, sendo dessa forma o seu afastamento do trabalho não

justificado, além de ilegal.

Diversos são os fatores que possivelmente influenciam a evolução da doença

de Chagas, já que uma porcentagem dos pacientes permanece assintomática durante

toda a vida, enquanto outros evoluem para formas graves após 10 a 30 anos de infecção.

Os possíveis fatores de risco associados à progressão da cardiopatia na doença de

Chagas são: o tempo de duração da doença, sexo masculino, atividade física intensa, a

cepa do parasito, exposição à re-infecções, fatores genéticos, etnia, idade, severidade da

infecção aguda, status nutricional, alcoolismo e outras doenças concomitantes (PRATA,

2001; RIBEIRO et al., 1998). Estima-se que cerca de 27,0% dos infectados, após vários

anos na forma indeterminada, desenvolverão manifestações cardíacas, 6,0% evoluirão

para forma digestiva e 3,0% apresentarão comprometimento nervoso periférico

(MONCAYO, 1999).

Eletrocardiogramas realizados em áreas endêmicas têm demonstrado que cerca

de 2,0% dos pacientes com a forma indeterminada progridem para a forma cardíaca a

cada ano (PRATA, 2001). Uma variável proporção de pacientes submetidos a exames

clínicos, incluindo radiografias e eletrocardiograma (ECG), apresenta anormalidades em

alguns deles, que podem também ser detectadas em indivíduos saudáveis. O valor de

tais achados não é completamente esclarecido. Alguns pesquisadores acreditam que

esses pacientes possam ser considerados como possíveis apresentadores de formas

iniciais de manifestações cardíacas ou digestivas, dependendo da alteração encontrada.

De fato, são necessárias avaliações regulares ao longo da vida de indivíduos com

infecção chagásica, para verificar se há evolução da infecção, e que medidas podem ser

tomadas para retardar tal progressão, assim como para garantir qualidade de vida para

essas pessoas.

A forma cardíaca da doença de Chagas é responsável pela elevada morbi-

mortalidade ocorrida na infecção, gerando grande impacto social pela produção de

aposentadorias precoces e gastos onerosos em atendimento médico especializado, mas,

sobretudo, pela morte de pessoas, especialmente jovens adultos em idade produtiva.

A cardiopatia chagásica crônica é caracterizada, do ponto de vista

anatomopatológico, por áreas de fibrose substituindo a massa muscular cardíaca e

ocasionando a interrupção das fibras do coração, destruição do sistema nervoso

autônomo (SNA) simpático e parassimpático e pela presença de um exsudato

inflamatório ativo. A hipertrofia, dilatação e alteração da arquitetura do músculo

cardíaco induzem ao aumento do tamanho do coração caracterizado pela cardiomegalia.

Em casos avançados de cardiomegalia, fenômenos tromboembólicos e sinais de

congestão passiva são os principais achados patológicos. O aneurisma cardíaco apical é

um achado freqüente e é patognomônico da cardiopatia chagásica crônica (WHO,

2002). Em áreas endêmicas essa lesão ocorre em 19,0% dos pacientes com infecção

chagásica, estando sua freqüência diretamente relacionada à severidade da

cardiomiopatia (PRATA, 2001).

Clinicamente os indivíduos podem apresentar manifestações de diferentes

níveis de gravidade, variando de anormalidades assintomáticas identificadas através de

exames complementares mais sensíveis, a formas graves. A cardiomiopatia é a forma

mais comum da doença de Chagas na fase crônica, manifestando-se como

cardiomiopatia dilatada, insuficiência cardíaca congestiva, tromboembolismo, arritmias,

transtornos de condução intraventricular, síncope e morte súbita (CAROD-ARTAL,

2006).

O exame físico em fases mais precoces da cardiopatia pode revelar

irregularidade do ritmo cardíaco devido a extra-sístoles isoladas. Em fases mais

avançadas podem ser observados sinais de cardiomegalia com o desvio do ictus cordis.

Os sinais e sintomas mais frequentemente associados à cardiopatia chagásica

são os seguintes:

- Sintomas secundários a bradiarritmias ou taquiarritmias, como palpitações,

síncope, pré-síncope e morte súbita;

- Sintomas de insuficiência cardíaca como dispnéia de esforço, dor no

hipocôndrio direito, ortopnéia e dispnéia paroxística noturna;

- Sintomas secundários a fenômenos tromboembólicos venosos e sistêmicos

como trombose venosa profunda, embolias pulmonares sistêmicas e acidente vascular

cerebral;

- Alterações microvasculares como dor precordial ou retroesternal (GASCON

et al., 2006).

Nas fases iniciais da cardiopatia chagásica crônica, são detectadas alterações

discretas e inespecíficas no ECG. Algumas alterações eletrocardiográficas têm sido

associadas à cardiopatia chagásica, apesar de não haver um padrão eletrocardiográfico

patognomônico. A alteração mais frequentemente detectada na cardiopatia chagásica é o

bloqueio de ramo direito isolado ou associado ao hemibloqueio anterior esquerdo.

As alterações eletrocardiográficas na cardiopatia chagásica em ordem de maior

a menor freqüência são as seguintes:

- Extra-sístoles ventriculares isoladas ou repetitivas;

- Alteração primária da repolarização ventricular, que pode simular cardiopatia

isquêmica;

- Zonas eletricamente inativas; bloqueios aurículo-ventriculares; bloqueio de

ramo esquerdo por disfunção sinusal e taquiarritmia supraventricular (GASCON et al.,

2006; XAVIER et al., 2006).

Em casos mais avançados da cardiopatia, tais alterações, além de serem mais

graves podem se sobrepor, constituindo um conjunto de anormalidades.

Radiografias de tórax são relevantes no manejo dos pacientes nessa forma, pois

permitem uma categorização mais precisa através da análise do tamanho do coração e

da circulação pulmonar. Em fases mais avançadas da cardiopatia chagásica, observa-se

aumento acentuado da silhueta cardíaca, identificado através da observação do cálculo

do índice cardio-torácico. As radiografias que apresentam sinais de hipertensão

venocapilar, crescimento de cavidades ou um índice cardio-torácico superior a 0,60 são

consideradas alteradas.

Na cardiopatia chagásica crônica a disfunção sistólica global do ventrículo

esquerdo apresenta-se como um importante fator prognóstico. Uma classificação para

insuficiência cardíaca considerando a função sistólica do ventrículo esquerdo, obtida

através de ecocardiografia, foi adotada para identificação de subgrupos de cardiopatas

chagásicos crônicos. Essa normatização colabora para o manejo do paciente em nível

prognóstico e terapêutico (Consenso Brasileiro em doença de Chagas, 2005) (Tabela I).

Tabela I - Estadiamento do comprometimento miocárdico na cardiopatia chagásica

crônica

Estádios Eletrocardiograma Ecocardiograma Insuficiência Cardíaca

A Alterado Normal Ausente

B1 Alterado Alterado FEVE>45% Ausente

B2 Alterado Alterado FEVE<45% Ausente

C Alterado Alterado Compensável

D Alterado Alterado Refratária

*FEVE- Fração de Ejeção Ventricular Esquerda

A forma digestiva da doença de Chagas caracteriza-se por alterações de

motilidade do esôfago e do cólon, e pelo aumento do diâmetro resultando em

megaesôfago e megacólon. O megaesôfago é de evolução mais precoce ocorrendo entre

20 e 40 anos de idade, manifestando-se mais frequentemente na forma de disfagia,

especialmente com alimentos frios e secos, regurgitação, dores retroesternais

esofagianas, singulto, pirose, obstipação intestinal, desnutrição, hipertrofia das

glândulas salivares e manifestações pulmonares em fases avançadas (LANA &

TAFURI, 2000; VAZ et al., 1995).

Para a detecção de esofagopatia chagásica aconselha-se a realização de

radiografia de tórax em posição oblíqua anterior após 1 minuto da ingestão de 150 mL

de contraste de sulfato de bário. As seguintes observações são suficientes para o

diagnóstico de acometimento esofágico:

- Esvaziamento incompleto do esôfago, com permanência de contraste de

sulfato de bário com um nível horizontal

- Presença de coluna de ar acima do nível de contraste

- Diâmetro aumentado do esôfago com mais de cinco centímetros

Essa técnica pode não revelar todos os casos de esofagopatia, mas, sua

vantagem é a identificação de casos da ausência de dilatação, que podem ser

manifestações iniciais da forma esofágica.

A classificação radiográfica proposta por REZENDE em 1960 subdividiu as

manifestações esofágicas em quatro grupos:

Grupo I - Esôfago apresenta calibre aparentemente normal ao exame

radiológico, com trânsito lento e pequena retenção na radiografia tomada um minuto

após a ingestão de sulfato de bário.

Grupo II - Esôfago com pequeno a moderado aumento no calibre,

apreciável retenção de contraste e presença de ondas terciárias, associadas ou não a

hipertonia do esôfago.

Grupo III - Esôfago com grande aumento no diâmetro, atividade motora

reduzida, hipotonia do esôfago inferior e grande retenção de contraste.

Grupo IV - Dólicomegaesôfago, esôfago com grande capacidade de retenção,

atônico, alongado, dobrando-se sobre a cúpula diafragmática.

O megacólon é de evolução mais tardia do que o megaesôfago, sendo

observado em adultos entre 30 a 60 anos de idade, caracterizando-se por obstipação

intestinal, meteorismo e disquesia (LANA & TAFURI, 2000; REZENDE et al., 1976).

A detecção de pacientes com megacólon pode ser realizada através de um estudo de

triagem colônica que não requer preparo com dieta prévia, utilizando-se 300 mL de

contraste baritado diluídos em 900 mL de água colocados em recipiente situado um

metro acima da mesa radiológica, e deixado cair como enema, por gravidade. O

resultado é positivo no adulto se na radiografia abdominal se constata uma dilatação

superior a 6 cm.

Raramente, o diagnóstico radiológico da colonopatia chagásica é concluído

antes de um aumento característico do calibre do cólon. Em quase 100% dos casos,

dilatações e alongamentos colônicos predominam no sigmóide. O achado usual nessa

patologia é a retenção prolongada de contraste baritado em radiografias realizadas dias

após o estudo contrastado (FIGUEIRÊDO et al., 2002). Existem ainda megas de menor

freqüência que acometem outras vísceras ocas tais como bexiga, ureter, e outros.

A forma mista da infecção, compreendida por manifestações cardíacas e

digestivas simultaneamente acomete uma pequena proporção dos indivíduos infectados

crônicos, compreendendo cerca de 8,0% dos infectados na fase crônica.

1.3 Diagnóstico da doença de Chagas

1.3.1 Fase aguda

O diagnóstico laboratorial da doença de Chagas deve ser direcionado de acordo

com a fase da doença em que o paciente se encontra, baseando-se na busca direta ou

indireta do parasito e na detecção de anticorpos anti-T. cruzi.

A doença de Chagas aguda caracteriza-se pelo surgimento de imunoglobulinas

de classes específicas. Em geral ocorre uma produção inicial de IgM com pico perto do

17º dia após a infecção, seguido de queda dos níveis até o 66º dia, não retornando aos

níveis basais até o 93º dia após a infecção. Níveis específicos de IgG também se elevam

após uma ou duas semanas de infecção, alcançando pico de produção no 30º dia,

perdurando por toda fase crônica caso não haja tratamento e cura parasitológica

(GRAUERT et al., 1993).

Na infecção aguda são utilizados testes sorológicos para a pesquisa de IgM.

Atualmente há dificuldades para o diagnóstico sorológico de fase aguda devido a

escassez de kits comercialmente disponíveis e carência de controles positivos para IgM.

Uma possibilidade de diagnóstico já comercializada e que apresenta a vantagem de ser

rápida e de fácil execução, é o Simple CHAGASWB (Operon, S.A), que consiste em

um teste imunocromatográfico que utiliza antígenos recombinantes para a detecção de

anticorpos anti-T. cruzi.

Em laboratórios regionais de referência, recomenda-se a utilização de

metodologias de maior complexidade a partir de IFI-IgM (Imunofluorescência Indireta

com pesquisa de IgM), Western Blot e ELISA- IgM (Consenso Brasileiro em doença de

Chagas, 2005). A detecção de anticorpos IgM através de imunoblotting utilizando

antígenos de tripomastigotas secretados ou excretados (TESA blot) tem demonstrado

ser uma técnica de grande utilidade para o diagnóstico em casos de suspeita de fase

aguda ou infecção congênita. Além disso, a alta sensibilidade do TESA blot na detecção

de casos crônicos associada a ausência de reações cruzadas com outras infecções, indica

que esta técnica pode ser uma alternativa aos testes sorológicos convencionais

(UMEZAWA et al., 1996 a).

Em casos de suspeita de fase aguda, em decorrência da alta parasitemia, devem

ser priorizados os exames parasitológicos diretos, que são realizados rapidamente e

apresentam resultado imediato. O exame do sangue periférico a fresco devido a sua

simplicidade e elevado índice de resultados satisfatórios deve ser o método de escolha

nessa fase. Porém, para sua realização é necessário que haja treinamento específico

quanto à preparação da lâmina e identificação do parasito (LUQUETTI & RASSI,

2000). Em caso de negatividade do exame a fresco e forte suspeita de doença aguda,

como na presença de sintomas por mais de trinta dias, métodos de concentração como

micro-hematócrito, teste de Strout, Quantitative Buffy Coat (QBC), gota espessa, e

lâmina com esfregaço corado devem ser priorizados (Consenso Brasileiro em doença de

Chagas, 2005). Esses métodos apresentam sensibilidade entre 80 a 90%, entretanto

devido ao alto custo do QBC, atualmente recomenda-se o uso do micro-hematócrito ou

teste de Strout como método de concentração escolhido.

Se os exames parasitológicos diretos forem negativos, métodos parasitológicos

indiretos, como o xenodiagnóstico (BRUMPT, 1914) e a hemocultura (CHIARI et al.,

1989), devem ser utilizados. Apesar da possibilidade desses exames apresentarem 100%

de positividade na fase aguda, estas metodologias são indicadas para o diagnóstico da

fase crônica da infecção dada à complexidade para sua realização, que exige condições

de laboratório muito especializadas, como também pela demora de obtenção dos

resultados.

1.3.2 Fase crônica

Os baixos níveis de parasitemia nessa fase da infecção indicam a sorologia

como escolha para o diagnóstico confirmatório. Para tal, é essencial a aplicação de um

teste de elevada sensibilidade associado a outro com alta especificidade, como os testes

de Imunofluorescência Indireta (IFI), Imunoensaio Enzimático (ELISA), e

Hemaglutinação Indireta (HAI). Entretanto, apesar da alta sensibilidade e

especificidade, esses testes podem gerar resultados não conclusivos ou conflitantes,

devido aos diferentes procedimentos empregados nas suas preparações antigênicas.

O emprego de antígenos de T. cruzi secretados ou excretados em técnicas

imunodiagnósticas tem revelado altas especificidade e sensibilidade quando comparado

a técnicas de sorologia convencional. Em um trabalho recente realizado em uma área

endêmica da Bolívia, foi demonstrada a aplicabilidade dos testes baseados no TESA

(Antígenos de T. cruzi secretados ou excretados) em relação aos testes aplicados na

sorologia convencional. De 742 amostras de soro coletadas, 329 foram positivas pelo

TESA, que detectou 9 indivíduos infectados não diagnosticados pela sorologia

convencional (ZARATE-BLADES et al., 2006). Esse achado é um indicativo de que

testes baseados no TESA podem ser uma alternativa aos extratos antigênicos utilizados

na sorologia convencional.

Entretanto, a sorologia convencional realizada por ELISA, IFI e HAI, baseada

na pesquisa de anticorpos IgG anti-T.cruzi, permanece ainda como a escolha para a

rotina diagnóstica. A OMS recomenda para o diagnóstico da doença de Chagas a

utilização de duas técnicas sorológicas com princípios distintos, que, se discordantes,

devem ser repetidas. Se houver ainda discordância, é recomendada a realização de uma

terceira técnica sorológica, e caso esta persista uma quarta técnica deve ser aplicada ou

outro método diagnóstico não sorológico deve ser realizado (WHO, 1991; 2002, MS,

2000).

Os anticorpos detectados na sorologia convencional são classificados como não

protetores, já aqueles capazes de induzir lise de formas tripomastigotas na presença do

Complemento são classificados como protetores, sendo denominados como anticorpos

líticos (KRETTLI, 1982). Esses anticorpos reconhecem uma proteína de 160KD

localizada na superfície da membrana de tripomastigotas vivos.

Os anticorpos líticos são detectados através de duas técnicas, a lise mediada pelo

Complemento (KRETTLI & BRENER, 1982) e a citometria de fluxo (MARTINS-

FILHO et al., 1995). Essas técnicas têm ampla aplicabilidade para a realização de

controle de cura, considerando-se que os anticorpos da sorologia convencional podem

ser detectados por vários anos após o tratamento da infecção, não distinguindo os

curados dos não curados. Os anticorpos líticos só reconhecerão formas vivas do

parasito, e sua detecção em soros de pacientes já tratados é um indicativo da infecção

ativa, sendo por isto sua pesquisa empregada como critério de cura (KRETTLI, 1982;

GALVÃO et al., 1993).

Uma outra possibilidade mais sofisticada disponível com o uso de testes

sorológicos é a identificação de classes das imunoglobulinas e de suas subclasses

empregada no estudo do perfil da resposta imune humoral do paciente.

Na fase crônica da infecção, a parasitemia é em geral baixa e variável, o que

torna os métodos parasitológicos diretos não aplicáveis. Nessa fase, os métodos de

diagnóstico parasitológico indireto geralmente não ultrapassam 50,0% de positividade.

Desde a década de 50, a técnica de hemocultura vem sendo aplicada,

inicialmente com resultados inferiores aos obtidos com o xenodiagnóstico. Com o

objetivo de aumentar sua sensibilidade, algumas modificações foram introduzidas na

técnica tais como: a remoção do plasma contendo anticorpos (MOURÃO & MELLO,

1975), a coleta de um volume maior de sangue (30mL) (CHIARI et al., 1989) e maior

período de cultivo e observação (MINTER-GOELDBLOED, 1978).

CHIARI et al. (1989) obtiveram uma taxa de hemocultura positiva de 55,08%

com a aplicação de modificações como a lavagem das células com meio LIT ou PBS e

remoção imediata por centrifugação, incubação das culturas a 28ºC e exames no 15

, 45

e 60

dias de cultivo. Quando não era possível o imediato processamento, o

plasma era removido, ao sedimento era acrescentado meio LIT, e o material preservado

a 4ºC até processamento de toda técnica.

LUZ et al. (1994) demonstraram a importância do rápido processamento à baixa

temperatura na sensibilidade da técnica. Utilizando a metodologia proposta por CHIARI

et al. (1989), reduzindo o tempo de processamento da amostra e usando uma centrífuga

refrigerada foi possível alcançar 94,0% de positividade quando três hemoculturas foram

realizadas no mesmo paciente.

A PCR (GONZALEZ et al., 1984; ASHALL et al., 1988) apresenta resultados

promissores, indicando que no futuro esta técnica poderá ser utilizada como teste

confirmatório e de rotina, apesar de sua complexidade e necessidade de laboratórios

especializados com protocolos definidos e técnicas padronizadas para sua execução

(Consenso Brasileiro em doença de Chagas, 2005; WHO, 2002). O uso da técnica de

PCR está indicado em algumas situações como em indivíduos com testes sorológicos

não conclusivos, em controle de cura pós-tratamento, em estudos comparativos com

outras técnicas sorológicas ou parasitológicas, na detecção do nível de parasitemia em

imunossuprimidos e em transplantados (PORTELA-LINDOSO et al., 2003).

1.4 Resposta imune humoral na doença de Chagas

A resposta imune que se segue à infecção pelo T. cruzi é essencial para a

resistência do hospedeiro, mas também é responsável em parte pelas diversas

manifestações patológicas observadas na doença de Chagas. O parasito sensibiliza

diferentes setores do sistema imune, produzindo resposta celular e humoral específicas

(BRODSKYN & BARRAL-NETO, 2000). A identificação dos mecanismos

relacionados à indução da resposta imune durante a infecção é essencial para a

compreensão da história natural da doença de Chagas.

A ativação policlonal de linfócitos B no início da infecção induz a produção de

imunoglobulinas pertencentes a várias classes. Na fase aguda da doença em humanos,

grande parte da resposta humoral induzida está direcionada a glicosilfosfatidilinositol

ancorados em mucinas (GPI mucinas) localizadas na superfície de tripomastigotas.

Nessa fase, anticorpos IgM e IgG são amplamente detectados. A maior parte desses

anticorpos reconhece epitopos de galactosylα1-3galactose (Galα1,3Gal), que estão

presentes nas GPI mucinas.

ANTAS et al. (1999) classificaram a fase aguda da doença de Chagas como

inicial, intermediária e tardia em crianças de 2 a 15 anos de idade, verificando os níveis

de anticorpos anti-Galα

1,3

Gal IgG (Gal), IgM e IgG específicos anti-T. cruzi por meio da

técnica de ELISA. A fase inicial da infecção aguda apresentou reatividade apenas para

IgM, enquanto na fase intermediária três possibilidades foram encontradas: (i) IgM e

Gal reativos e IgG não reativo; (ii) IgM e IgG reativos e Gal não reativo; e (iii) IgM,

IgG e Gal reativos. Na fase tardia IgG e Gal foram reativos e IgM não reativo. A

associação do anticorpo IgG anti-Gal com a sorologia específica possibilitou a detecção

mais precisa da fase aguda da doença de Chagas, sugerindo a possibilidade do uso desse

anticorpo na detecção de infecções recentes, pelo menos em áreas endêmicas.

UMEZAWA et al. (1996 a) utilizaram soros de pacientes com infecção

chagásica nas fases aguda e crônica testando quatro frações antigênicas de T. cruzi para

a detecção de anticorpos IgG, IgM e IgA. Análises feitas por ELISA e imunoblotting

demonstraram que a proporção de IgG reagente com antígenos de superfície de

tripomastigotas foi mais elevada em pacientes agudos, e o oposto foi verificado com os

antígenos internos. Os soros de fase aguda apresentaram maior porcentagem de IgG

reativa a epitopos de carboidratos Galα

1,3

Gal expressos na superfície de tripomastigotas

do que os soros de fase crônica. A IgA foi encontrada exclusivamente em soros agudos

assim como IgM, produzindo 100% de positividade quando antígenos de superfície,

íntegros e secretados foram utilizados.

Nos seres humanos, quatro subclasses de imunoglobulina G (IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4)

são produzidas, e tal produção parece ser induzida por diferentes citocinas (KAWANO

et al., 1994). Alguns estudos indicam que a produção das subclasses IgG1 e IgG3 é

auxiliada pela indução de citocinas anti-inflamatórias (IL-4, IL-5, IL-10 e TGF-ß),

enquanto citocinas com perfil inflamatório (IL-12, INF-γ, TNF-α) induziriam a

produção de IgG2 (BRIERE et al., 1994; REED & SCOTT, 1993). Experimentos in

vitro já demonstraram que IFN-γ inibe a produção de IgG1 e eleva a secreção de IgG2

por antagonizar a síntese de IgG1 mediada por IL-6 e auxiliar IL-6 na produção de

IgG2 (KAWANO et al., 1994). Estes dados corroboram o trabalho de FINKELMAN et

al. (1990), que descreveram que o IFN-γ pode suprimir IgG1 e estimular IgG2a, mas

IL-4 parece não ser requerida para a produção de IgG1 in vivo.

Quantitativamente, as concentrações relativas de tais imunogobulinas nos soro

são IgG1>IgG2>IgG3>IgG4. Essas quatro subclasses apresentam mais de 95,0% de

homologia nas suas seqüências de aminoácidos das cadeias pesadas, sendo encontradas

suas principais diferenças estruturais na região de dobradiça. A subclasse IgG2 pode

apresentar como função a opsonização de parasitos, levando a sua destruição seja pelo

mecanismo de lise mediada por Complemento ou pela fagocitose feita por macrófagos

tendo, portanto, uma participação importante nos mecanismos de proteção humoral ao

longo da infecção. As subclasses IgG1 e IgG3 parecem não ativar o Complemento, mas

podem se ligar a receptores de células fagocitárias, sendo envolvidas na defesa dos

hospedeiros mediada por célula.

A utilização de preparações antigênicas derivadas de formas epimastigotas de

T. cruzi para avaliar a reatividade de subclasses de IgG revelou títulos elevados de IgG1

e IgG3 em soros de pacientes na fase crônica de infecção classificados em diferentes

formas clínicas (CERBAN et al., 1993; MORGAN et al., 1996).

CERBAN et al. (1993) não observaram diferença nos níveis de IgG1, IgG2 e

IgG3 entre indivíduos portadores de diferentes formas clínicas da doença utilizando

duas fontes antigênicas distintas. Foi observada em todos os diferentes grupos de

pacientes, a predominância de níveis mais elevados de IgG1 e IgG3, seguidos de níveis

mais baixos de IgG2 e IgG4 quando epimastigotas foram usados como antígenos. Para a

fração antigênica citosólica de T. cruzi os níveis de IgG1 foram mais elevados em todos

os diferentes grupos de pacientes.

Entretanto, MORGAN et al. (1996) utilizando formas epimastigotas como

antígeno na técnica de ELISA, ao avaliarem 73 pacientes de uma área endêmica de

Minas Gerais, que apresentavam as formas clínicas indeterminada, cardíaca, digestiva e

mista, com idades variando entre 20 e 84 anos, obtiveram níveis mais elevados de

anticorpos IgG2 nos soros dos pacientes portadores de formas clínicas cardíaca e cardio-

digestiva quando comparados com indivíduos não infectados e com aqueles

apresentando forma indeterminada da doença.

Expandindo o estudo anterior, MORGAN et al. (1998) avaliaram os mesmos

pacientes infectados cronicamente com diferentes manifestações clínicas da doença de

Chagas através de uma análise feita por western blot. Foi observado que a ligação de

alguns antígenos particulares pelos isotipos de anticorpos era mais prevalente em alguns

grupos de formas clínicas, quando comparado com outros. Os perfis de antígenos

reconhecidos pelos anticorpos eram distintos, considerando IgG1, IgG2, IgG3, IgM e

IgA. Um grande número de bandas distintas foi encontrado para o isotipo IgG1 nos

grupos com diferentes manifestações clínicas. Entretanto poucas bandas foram

detectadas para os outros anticorpos. Foi ainda verificada uma predominância de IgG3

nas formas indeterminada e digestiva, IgG2 na forma cardíaca e IgM na forma

indeterminada.

A avaliação de pacientes na fase crônica da infecção por ZAUZA et al. (2001)

evidenciou uma associação direta entre os níveis de IgG e a progressão de cardiopatia

chagásica, indicando que a resposta imune humoral está diretamente relacionada à

evolução dessa forma clínica da doença.

A análise da reatividade de subtipos de IgG anti-T. cruzi em cardiopatas

chagásicos crônicos, indicou que os níveis de IgG1 e IgG2 foram consideravelmente

mais elevados, seguidos de IgG3 e de níveis ainda mais baixos de IgG4. No grupo de

pacientes avaliado foi possível verificar uma tendência de associação entre níveis de

IgG2 mais elevados e presença de cardiomegalia severa (HERNANDEZ-BECERRIL et

al., 2001).

CORDEIRO et al. (2001) avaliaram o perfil de subclasses de IgG presente na

sorologia convencional (SC) e na pesquisa de anticorpos anti-tripomastigotas vivos

(AATV) detectados por imunofluorescência indireta e citometria de fluxo

respectivamente, em soros de pacientes com infecção chagásica crônica portadores das

formas indeterminada (IND), cardíaca (CARD) e digestiva (DIG) da doença. As

subclasses IgG1 e IgG2 foram os principais anticorpos encontrados na SC, enquanto

IgG1 e IgG3 foram predominantes na pesquisa de AATV. Os baixos níveis de IgG1 e

IgG3 na pesquisa de AATV estavam associados aos pacientes com a forma CARD e os

elevados níveis de IgG1 na pesquisa de AATV foram detectados principalmente, em

pacientes apresentando a forma IND da doença. A reatividade de IgG2 anti-

epimastigotas foi mais elevada em pacientes com a forma indeterminada e cardíaca.

MICHAILOWSKY et al. (2003) utilizaram antígenos de proteínas de flagelos

de T. cruzi para avaliar a resposta imune humoral e celular em pacientes com doença de

Chagas crônica apresentadores de diferentes formas clínicas, e verificaram que IgG1 e

IgG3 foram as principais imunoglobulinas detectadas. Em relação à resposta celular, os

resultados do estudo indicaram que os linfócitos T CD4

são as principais fontes de

IFN-γ quando estimulados por antígenos do parasito in vitro.

Em um trabalho recente realizado em nosso laboratório, foi verificado que

diferentes níveis de IgG, IgG1, IgG2a e IgG2b em camundongos infectados com

diferentes clones de T. cruzi, estavam associados ao genótipo do parasito presente e com

a fase da infecção. De forma geral, a infecção com T. cruzi I induziu altos níveis de

todas as subclasses em ambas as fases da infecção, em comparação a linhagem de T.

cruzi II (SANTOS, 2007).

O uso de antígenos flagelares (FRA) e citoplásmicos (CRA) de T. cruzi para a

análise do perfil de subclasses de IgG em pacientes apresentando diferentes formas

clínicas, indicou que IgG2 anti-FRA foi detectado em níveis mais elevados no grupo

cardíaco. Esse resultado sugere o uso potencial dessa subclasse para prognóstico,

monitoração da progressão da doença e avaliação do fator de risco de dano cardíaco

(VERÇOSA et al., 2007).

1.5 Doença de Chagas no município de Berilo

Entre o final dos anos 40 e início dos anos 50, foi realizado pelo Serviço

Nacional de Malária, o primeiro estudo entomológico no Vale do Jequitinhonha. Na

década de 60 foram iniciados os primeiros combates aos triatomíneos vetores da doença

de Chagas nessa região pelo DNERu. Entre 1970 e 1980, o combate aos vetores na

região esteve sob a direção da Coordenação do Desenvolvimento do Vale do

Jequitinhonha (CODEVALE) e do Centro Regional de Saúde de Diamantina.

Em um levantamento triatomínico realizado pela SUCAM em 1982, constatou-

se que 69,5% das espécies de vetores capturadas eram Panstrongylus megistus, e 15,8%

eram Triatoma infestans (MS, 1982).

No inquérito sorológico nacional realizado entre 1975 e 1980, o então

município de Berilo, hoje municípios de José Gonçalves de Minas e Berilo, localizado

no Vale do Jequitinhonha, apresentou 35,5% de prevalência para a infecção chagásica

(CAMARGO et al., 1984). Em 1982, esses dados foram confirmados com a obtenção de

35,1% de prevalência da infecção em uma amostra de 3.730 indivíduos (DIAS et al.,

1985).

Foram realizados entre 1985 e 1986, ataques aos insetos vetores utilizando BHC

(Hexaclorociclobenzeno), e em 1987, verificou-se o benefício destas ações com a

redução significativa do número de insetos capturados nos domicílios (MACHADO DE

ASSIS, 2006).

Em 1988, AGUILAR avaliou 1.150 indivíduos em Berilo, constatando que

12,69% dessa amostra apresentavam sorologia reativa para T. cruzi. Esse resultado

evidenciou um decréscimo em relação à prevalência obtida no inquérito de 1982.

Em 1997, MONTOYA realizou um inquérito sorológico em Berilo utilizando

uma amostra de 2.261 indivíduos para avaliar a prevalência da infecção chagásica.

Verificou-se uma prevalência da infecção na população geral de 18,7%. Em indivíduos

acima de 30 anos de idade essa taxa foi de 50,0%, e em menores de 10 anos, de 0,17%.

Nesse trabalho um grupo de 226 indivíduos sororeativos para a infecção pelo T. cruzi

foi pareado com número igual de pacientes não reativos para comparar os achados

clínicos e eletrocardiográficos. A prevalência de alterações eletrocardiográficas foi de

55,7% nos pacientes soro-reativos e 13,7% no grupo controle, sendo a cardiopatia

chagásica mais freqüente no sexo masculino. O mesmo pesquisador avaliou a evolução

de 177 indivíduos com infecção chagásica e sem infecção que fizeram parte de um

estudo realizado em 1987 por AGUILAR, (1988). MONTOYA verificou que a

mortalidade geral entre os pacientes com a infecção foi de 1,9% ao ano, sendo 5,6 vezes

maior do que no grupo soronegativo, com 21 mortes ocorridas nos 10 anos de intervalo

entre os estudos. Dos pacientes incluídos no estudo de 1987, 134 (67 com infecção

chagásica e 67 não infectados) foram reavaliados clínica e eletrocardiograficamente. A

doença de Chagas evoluiu progressivamente em 28,0% dos indivíduos com sorologia

reativa, sendo um fenômeno mais freqüente entre os pacientes que já apresentavam

eletrocardiogramas alterados previamente (MONTOYA, 1998).

Mais recentemente o nosso grupo (BORGES et al., 2006) realizou um

inquérito sorológico em crianças de 7 a 14 anos nos municípios de Berilo e José

Gonçalves de Minas, que desde 1997 são administrativamente independentes. A

prevalência da infecção na faixa etária avaliada foi de 0,4% (6 crianças). A prevalência

por município foi de 0,35% (3 crianças) em Berilo, e 0,53% (3 crianças) em José

Gonçalves de Minas. Os resultados de prevalência da infecção na faixa etária de 0 a 7

anos de idade na pesquisa realizada por MONTOYA, (1998) e de sete a 14 anos por

BORGES et al. (2006), sugerem que houve interrupção da transmissão da infecção na

região.

Nossa equipe realizou no ano seguinte (MACHADO DE ASSIS, 2006), uma

pesquisa triatomínica integral no município de Berilo, vistoriando todos os domicílios

rurais e urbanos. A pesquisa resultou na captura de 391 insetos, os quais não

apresentavam infecção pelo T. cruzi, pertencentes às espécies P. megistus (72,0%) e T.

pseudomaculata (28,0%). O peridomicílio (galinheiro) foi o principal local das capturas.

Ressalta-se que pela primeira vez no estado de Minas Gerais foi encontrado um grande

foco intradomiciliar de T. pseudomaculata. Os moradores das residências onde os

vetores foram encontrados foram submetidos a testes sorológicos para o diagnóstico da

doença de Chagas. A infecção pelo T. cruzi foi detectada em 31 indivíduos (25,0%),

destes, 97,0% eram maiores de 30 anos indicando que estes tenham sido infectados

antes da instalação da vigilância epidemiológica, período no qual a transmissão vetorial

era presente.

Os dados obtidos através dos inquéritos sorológicos e vetoriais realizados no

município de Berilo ao longo de vários anos indicam que a transmissão vetorial da

infecção está praticamente interrompida. Isso não significa, entretanto, que estudos em

doença de Chagas não sejam relevantes nessa área.

Diante do numeroso contingente de indivíduos infectados e doentes no

município, estudos abordando diferentes aspectos da infecção chagásica não apenas

contribuirão para o aperfeiçoamento do conhecimento a respeito da doença, seu

diagnóstico e tratamento, como também para a melhoria da qualidade de vida da

população.

1.6 Justificativa

Diante da situação atual existente no Município de Berilo, que apresenta um

grande contingente de indivíduos com manifestações clínicas da doença de Chagas sem

atendimento médico adequado, considerando a relação ainda não definitivamente

esclarecida entre o perfil de subclasses de imunoglobulinas e as formas clínicas da

doença e a necessidade de um diagnóstico sorológico diferencial entre as infecções mais

comumente passíveis de apresentar reatividade cruzada, este trabalho propôs verificar a

existência desta correlação e testar uma metodologia de diagnóstico que permita

diferenciar a doença de Chagas de outras infecções, possibilitando após sua execução, o

acesso dos pacientes ao tratamento etiológico e à assistência clínica necessários para

melhoria de sua qualidade de vida.

2. OBJETIVOS

2.1 Objetivo geral

Avaliar o desempenho da pesquisa de IgG e subclasses de IgG anti-

Trypanosoma cruzi por meio de um ensaio imunoenzimático não comercial, aplicado ao

diagnóstico e monitoração de morbidade da doença de Chagas.

2.2 Objetivos específicos

Realizar o diagnóstico sorológico da infecção pelo Trypanosoma cruzi e após a

confirmação da infecção:

1- Avaliar alguns aspectos epidemiológicos dos pacientes, realizar o diagnóstico

parasitológico através da coleta de hemocultura, associando com as formas

clínicas dos mesmos;

2- Estabelecer critérios de interpretação para a reatividade de IgG e subclasses de

IgG anti-T. cruzi detectada por meio do ensaio imunoenzimático não comercial

aplicado ao diagnóstico sorológico da doença de Chagas;

3- Estabelecer critérios de interpretação para a reatividade de IgG e subclasses de

IgG anti-T. cruzi detectada por meio do ensaio imunoenzimático não comercial

aplicado ao diagnóstico sorológico da doença de Chagas em amostras de soro

de pacientes portadores de outras doenças infecto-parasitárias de interesse

médico, como HIV, hepatite C (HCV), sífilis, leishmaniose visceral e

leishmaniose tegumentar;

4- Avaliar a aplicabilidade da pesquisa de IgG e subclasses de IgG anti-T. cruzi

detectada por meio do ensaio imunoenzimático não comercial aplicado a

monitoração de morbidade da doença de Chagas.

3. CASUÍSTICA E MÉTODOS

3.1 Área do estudo

3.1.1 Berilo

O município de Berilo está situado no nordeste do estado de Minas Gerais, a

760 Km de Ouro Preto (Figura 1), na meso-região do Vale do Jequitinhonha. Seu

surgimento está associado à exploração de ouro ocorrida no início do século XVIII com

a ida de bandeirantes para a região. Por volta de 1727, foram descobertas minas de ouro

na área por dois bandeirantes, Sebastião Leme do Prado e Domingos de Abreu Vieira,

originando o primeiro núcleo populacional denominado Água Suja. Em 1877, a área

passou a se chamar Água Limpa e em 1923, Vila Berilo. Em 1962, o distrito se desligou

politicamente de Minas Novas, elevando-se á categoria de município, então denominado

Berilo. Em 1963, uma nova divisão ocorreu, levando a separação entre Berilo e José

Gonçalves de Minas, este último até então considerado distrito de Berilo e elevado à

categoria de município em 1997.

Berilo possui uma extensão territorial de 586 quilômetros quadrados limitando-

se com os municípios de José Gonçalves de Minas, Francisco Badaró, Virgem da Lapa,

Chapada do Norte, Cristália e Grão Mogol.

O município não apresenta qualquer atividade de processamento de matéria-

prima, necessitando ser abastecido por produtos industrializados. Sua economia está

baseada em atividades agropecuárias, como o cultivo de diversas lavouras e criação de

rebanho leiteiro.

Dados do censo populacional de 2006 revelam que Berilo apresenta uma

população de 17.549 habitantes (8.920 homens e 8.629 mulheres), com 23,0% vivendo

em área urbana e 77,0% na zona rural.

Figura 1 - Localização do município de Berilo no Estado de Minas Gerais

A cidade possui um hospital municipal com 40 leitos e cinco postos de saúde

distribuídos entre a zona urbana e rural. Esses postos foram integrados ao Programa de

Saúde da Família (PSF) destinado a prestar atendimento integral à população,

enfatizando a prevenção e promoção da saúde. Atualmente existem quatro unidades de

PSF atuantes no município de Berilo, sendo cada uma responsável por uma área

delimitada composta por comunidades (na zona rural) e/ou bairros (na cidade). Os PSFs

Saúde em Casa e Centro, atendem localidades dispersas entre a área rural e urbana, o

primeiro abrange 25 localidades e o segundo 16. Os demais postos atendem

exclusivamente áreas rurais do município. O PSF São Norberto atende 22 comunidades;

e o PSF Viva Berilo atende 13 comunidades da zona rural.

3.2 Triagem da população estudada

No período compreendido entre Março e Novembro de 2006, foi realizada uma

busca de indivíduos portadores da infecção chagásica no município de Berilo, através da

realização do diagnóstico sorológico para confirmação da infecção. Em um primeiro

momento, os moradores da cidade compareceram voluntariamente ao hospital

municipal, onde após leitura e assinatura do Termo de Consentimento, Processo

07/2002 (Anexo I) aprovado pelo Conselho de Ética de Pesquisa em Seres Humanos do

Instituto René Rachou (FIOCRUZ) de Belo Horizonte, Minas Gerais, foi feita a coleta

de sangue para a realização dos exames sorológicos após o recolhimento de informações

como o nome, idade e local de moradia de cada indivíduo.

3.2.1 Diagnóstico sorológico

O diagnóstico sorológico foi realizado no laboratório de Doença de Chagas da

Universidade Federal de Ouro Preto, através das técnicas de ELISA e HAI.

A coleta de sangue para a sorologia confirmatória foi realizada em tubos

Vacutainer® de 5mL, sem anticoagulante. O soro foi obtido por centrifugação por 10

minutos a 3000 rpm, aliquotado, acondicionado em tubos plásticos de 1,5mL, mantido a

–20

C, e transportado em isopor com gelo para ser examinado na Universidade Federal

de Ouro Preto.

3.2.1.1 Reação de Hemaglutinação Indireta

A reação de hemaglutinação indireta foi realizada utilizando as amostras de

soros e os controles positivo e negativo, diluídos a 1:20 e 1:40 no diluente especificado

no kit Hemacruzi da Biomérieux® (Brasil). A técnica foi processada segundo as

recomendações do fabricante.

3.2.1.2 ELISA convencional

O teste de ELISA convencional para a detecção de anticorpos IgG anti-T. cruzi

foi realizado segundo metodologia de VOLLER et al. (1976) modificada. Como

antígeno foram utilizadas as formas epimastigotas da cepa Y em meio LIT na fase

exponencial de crescimento, preparado segundo VITOR & CHIARI, 1987.

A reação foi efetuada em placas de poliestireno de 96 poços com fundo chato,

sensibilizadas com 100µL/poço de solução antigênica a uma concentração de 4,5 µg/mL

de solução tampão carbonato de sódio, pH 9,6, incubada a 4ºC por 12 horas.

Após o período de incubação, as placas foram lavadas quatro vezes com

solução salina contendo Tween-20 a 0,05% (solução de lavagem) para eliminação da

solução diluente do antígeno e de seu excesso. As placas foram bloqueadas com

100µL/poço de solução salina tamponada (SST) com soro fetal bovino (SFB) e

incubadas a 37ºC, por 45 minutos. Após esta etapa, elas foram lavadas três vezes com a

solução de lavagem.

As placas foram a seguir, incubadas por 45 minutos a 37ºC com 100µL/poço

das amostras de soros diluídas a 1:80. Após a incubação, as placas foram lavadas como

anteriormente e novamente incubadas por 45 minutos a 37ºC com 100µL/poço do

conjugado anti-IgG humano, marcado com peroxidase (SIGMA, St. Louis, EUA),

diluído a 1:10.000 em solução salina tamponada com 0,05% de Tween 20 (SST-

Tween). Após esta incubação, as placas foram novamente lavadas quatro vezes com

solução de lavagem.

A seguir a solução de substrato constituída por 1mg de Orto-fenileno-diamino

(OPD) + 3µL de H

30 volumes + 15mL de tampão citrato-fosfato foi adicionada ás

placas que foram novamente incubadas a 37ºC, durante 5 minutos. A reação foi

interrompida com a adição de 32µL/poço de H

2,5 M.

A leitura da reação foi realizada em um leitor de ELISA (SOFT-MAX® PRO

4.0-Life Sciences edition) com filtro a 490nm. As amostras contendo valores de

absorbância iguais ou superiores ao ponto de corte (média das absorbâncias de 10 soros

padrões não reativos + 3 desvios padrão) foram consideradas reativas, e as que

apresentaram valores de absorbância abaixo do ponto de corte foram consideradas não

reativas.

Aqueles indivíduos que apresentaram sorologia reativa para os dois testes e um

grupo de pacientes não reativos foram convocados para responder um questionário

clínico-epidemiológico (Anexo II), e avaliados segundo o Delineamento Experimental

abaixo.

DELINEAMENTO EXPERIMENTAL

Sorologia confirmatória

(ELISA e HAI)

Não Reativa

(n = 15)

Avaliação parasitológica

Hemocultura (CHIARI et al., 1989)

Avaliação Clí

nica

Seleção aleatória de

pareados por idade

e sexo

Reativa

Idade > 60 anos

Patologias associadas

Exclusão do estudo

Avaliação Sorológica

ELISA (IgG total, IgG1,IgG2, IgG3)

Forma

Digestiva/Mista

(n = 15)

Avaliação clínica

ECG

RX tórax, esôfago e cólon

Cardiopatia 1

(n = 15)

Cardiopatia 2

(n = 15)

Forma

Cardíaca

(n = 30)

Reativa

(n = 60)

Forma Indeterminada

(n = 15)

Soros de indivíduos com

outras infecções:

Leishmaniose Visceral (n=7)

Leishmaniose Tegumentar

(n=8)

Classificação das formas clínicas

Análise Estatística

Avaliação

epidemiológica

Avaliação

epidemiológica

Grupo controle

(n = 15)

Avaliação

Ecocardiográfica

A seguir foi feita coleta de sangue para hemocultura, anamnese, exame físico

do paciente, radiografia simples de tórax, radiografia contrastada de esôfago e cólon,

ECG e ecocardiograma. A avaliação ecocardiográfica foi realizada pela cardiologista

Dr.ª Rosália Morais Torres (UFMG), para discriminar casos de pacientes com

classificação clínica duvidosa, como aqueles apresentando áreas cardíacas limítrofes,

com presença de alterações de ECG não típicas de doença de Chagas ou sob tratamento

sem indicação conhecida. Dentre os indivíduos não reativos, 15 foram selecionados

para a formação de um grupo controle (CONT).

A realização de testes sorológicos manteve-se disponível para todos os

moradores do município interessados em fazer os exames para o diagnóstico da infecção

chagásica, sem distinção de idade, sexo ou local de moradia. Entretanto, para este

estudo, apenas os indivíduos com idade abaixo e/ou igual a 60 anos foram selecionados

para evitar a influência de alterações geriátricas relacionadas com a senilidade que

pudessem interferir na classificação das formas clínicas manifestadas pelos pacientes.

3.3 Avaliação de aspectos epidemiológicos

A avaliação de alguns dados de relevância epidemiológica dos pacientes com

infecção chagásica foi realizada através da aplicação de um questionário epidemiológico

(Anexo II).

3.4 Avaliação Clínica

A avaliação clínica dos pacientes consistiu na anamnese e exame físico, análise

do ECG, radiografia simples de tórax, e radiografia contrastada de esôfago e cólon, em

conjunto com o preenchimento da parte clínica do questionário clínico-epidemiológico

realizado pelo clínico Dr. Pedro Albajar Viñas (FIOCRUZ/RJ), no momento do exame

físico.

Alguns critérios foram adotados para a exclusão de pacientes que não

apresentavam as formas clínicas de interesse para o estudo. Sistematicamente foram

aplicados os seguintes critérios de exclusão:

A) Pacientes que apresentavam co-morbidades, com exceção de hipertensão arterial

leve a moderada.

B) Todos os pacientes que apresentavam formas cardíacas intermediárias, de difícil

classificação, entre Cardiopatia 1 e Cardiopatia 2, e que não se enquadravam

exatamente nos critérios de seleção mais abaixo explicados.

A classificação dos quatro grupos de formas clínicas foi baseada nos seguintes

critérios de inclusão:

Fase crônica e forma Indeterminada: IND - Pacientes com os resultados dos

dois testes sorológicos positivos, sem sintomatologia, sem alterações no exame físico e

com ECG, radiografia de tórax, radiografia e contrastada de esôfago e cólon dentro da

normalidade.

Fase crônica e forma Cardíaca Leve a Moderada: Cardiopatia 1 (CARD 1) -

Pacientes sem insuficiência cardíaca e/ou arritmias graves, sem sintomatologia e

alterações no exame físico específicos de cardiopatia chagásica de moderada a

avançada, com arritmias ventriculares com formas simples ou apresentando alterações

eletrocardiográficas, como:

- extra-sístoles isoladas ou monomorfas

- bradicardia sinusal com mais de 40 batimentos por minuto- bpm

- baixa voltagem, bloqueio de ramo direito-BRD

- bloqueio divisional ântero-superior - BDAS

- bloqueio auriculoventricular de primeiro grau - BAV

- alterações inespecíficas das ondas ST-T

Radiografia de tórax e radiografia contrastada de esôfago e cólon dentro da

normalidade.

Fase crônica e forma Cardíaca Avançada: Cardiopatia 2 (CARD 2) - Pacientes

com presença de insuficiência cardíaca e/ou arritmias graves, com sintomatologia

específica de cardiopatia chagásica avançada, com alterações no exame físico e/ou com

arritmias no ECG com formas complexas:

- arritmias polimorfas em pares e períodos de taquicardia ventricular não-

sustentada ou sustentada

Apresentando alterações eletrocardiográficas avançadas, como:

- distúrbios da condução do estímulo atrioventricular e intraventricular

- alteração primária da repolarização da onda T/ área eletricamente inativa

- disfunção do nó sinusal

- freqüência cardíaca < 40 bpm

Radiografia de tórax ou ecocardiografia evidenciando dilatação de câmaras cardíacas

(ou na ausência de dilatação apresentando arritmia grave concomitante) e radiografia

contrastada de esôfago e cólon dentro da normalidade.

Fase crônica e forma Digestiva ou mista: DIG/MIS - Pacientes com

sintomatologia digestiva, com ou sem sintomatologia cardíaca, com ou sem alterações

no exame físico cardiovascular e no ECG, radiografia de tórax e radiografia contrastada

de esôfago e/ou cólon alterada.

Um grupo com 15 indivíduos não reativos, com faixa etária entre 17 e 58 anos,

foi selecionado aleatoriamente para pareamento com os grupos de estudo de acordo com

a idade e sexo. Este grupo classificado como grupo controle (CONT) foi submetido à

avaliação clínica constituída pela anamnese, exame físico, radiografia de tórax e ECG, e

avaliação sorológica através da dosagem das imunoglobulinas pesquisadas.

3.5 Avaliação ecocardiográfica

A avaliação ecodopplercardiográfica foi realizada de forma sistematizada, por

um só examinador experiente, utilizando-se aparelhagem de ecocardiografia portátil

Cypress dotada dos modos Unidimensional, Bidimensional, Doppler pulsado, contínuo,

mapeamento de fluxo em cores e adaptado para obtenção do Doppler tecidual. Utilizou-

se transdutor multifreqüencial de 3,0-3,5 MHZ, com registro eletrocardiográfico

simultâneo.

Utilizou-se a técnica convencional de exame, empregando-se as diversas

modalidades do exame ecocardiográfico acima descritas. Os cortes ecocardiográficos

foram realizados com o paciente posicionado em decúbito lateral esquerdo, inicialmente

na posição paraesternal, onde foram obtidos os cortes longitudinais do ventrículo

esquerdo e cortes transversais ao nível da valva mitral e músculos papilares e, em

seqüência, na posição apical, onde foram obtidos os cortes de quatro, duas e cinco

câmaras.

Através da análise combinada das técnicas Unidimensional, Bidimensional e

Doppler foram avaliadas as dimensões cardíacas, as funções sistólica e diastólica

ventricular esquerda e a contratilidade global e segmentar do ventrículo esquerdo. Ao

longo da sistemática do exame, procurou-se identificar a presença de trombos,

aneurismas, regurgitações valvares, hipertensão pulmonar e alterações pericárdicas.

3.6 Avaliação parasitológica

3.6.1 Hemocultura

A avaliação parasitológica foi realizada através da técnica de hemocultura

segundo a metodologia de CHIARI et al. (1989) com modificações introduzidas por

LUZ et al. (1994).

Os pacientes foram inicialmente pesados antes da coleta de sangue, para seguir

a proporção estabelecida de 30mL de sangue por 60Kg de peso corporal. As coletas de

sangue foram feitas em tubos Vacutainer® de 10mL estéreis e heparinizados.

O sangue foi centrifugado logo após a coleta, por 10 minutos a 3.000 rpm,

realizando a seguir a retirada do plasma em câmara de fluxo laminar. Aos sedimentos

foi acrescentado um volume de cerca de 5,0 mL de meio LIT para lavagem das células

por homogeneização. Uma nova centrifugação foi realizada com a retirada dos

sobrenadantes. As camadas de leucócitos foram semeadas separadamente em um tubo

Falcon de 15,0 mL contendo 3,0 a 5,0 mL de meio LIT e as papas de hemácias

semeadas em dois tubos Falcon de 15,0 mL contendo o mesmo volume do meio de

cultura.

No laboratório do hospital de Berilo, os tubos foram mantidos á temperatura

ambiente, transportados em caixas de isopor para o Laboratório de doença de Chagas da

Universidade Federal de Ouro Preto, até serem acondicionados em estufa a 28ºC. Desde

o processamento até o último dia de cultivo, todos os tubos foram homogeneizados a

cada 48h. A leitura das hemoculturas foi realizada no 30º, 60º, 90º e 120º dia após a

coleta, com a observação ao microscópio óptico, de uma gota da camada superior de

células sanguíneas ou do sedimento de cada tubo entre lâmina e lamínula.

3.7 Análise de IgG e subclasses de IgG por meio do ensaio imunoenzimático não

comercial

Esta análise foi feita pela técnica de ELISA não comercial (ou convencional)

desenvolvida no Laboratório de doença de Chagas da Universidade Federal de Ouro

Preto, segundo a metodologia de VOLLER et al. (1976) descrita anteriormente para o

diagnóstico sorológico da doença de Chagas. A diferença entre essa técnica e a

anteriormente descrita está na utilização de conjugados biotinilados, o que exige uma

etapa suplementar para o acréscimo da estreptavidina antes da adição do substrato. Os

conjugados utilizados para a dosagem da quantidade total de IgG e de suas subclasses

IgG1, IgG2 e IgG3 foram anti-imunoglobulinas humanas, obtidas de camundongo e

marcadas com biotina (SIGMA, St. Louis, EUA).

3.7.1 Padronização do ensaio imunoenzimático não comercial para dosagem de

IgG total, IgG1, IgG2 e IgG3

A padronização dos conjugados anti-IgG total, anti-IgG1, anti-IgG2, anti-IgG3

e da HRP-estreptavidina (Streptavidin and horseradish peroxidase) foi realizada

segundo as recomendações do fabricante (SIGMA, St. Louis, EUA).

Para anti-IgG total as diluições do conjugado testadas foram 1:2.500, 1:7.500,

1:10.000, 1:15.000 e 1:25.000.

Para anti-IgG1 as diluições do conjugado testadas foram 1:500 e 1:1.000.

Para anti-IgG2 as diluições do conjugado testadas foram 1:1.500, 1:2.500,

1:5.000 e 1:7.500.

Para anti-IgG3 as diluições do conjugado testadas foram 1:1.000 e 1:2.000.

Para a HRP-estreptavidina as diluições testadas foram 1:500, 1:1.000 e 1:2.500.

As diluições selecionadas na padronização de cada imunoglobulina e da HRP-

estreptavidina para a realização dos testes de ELISA não comercial estão na Figura 2.

A diluição utilizada de conjugado anti-IgG total foi de 1:10.000; anti-IgG1

1:500, anti-IgG2 1:2.500 e anti- IgG3 1:1.000.

Para a HRP-estreptavidina a diluição utilizada em todas as

imunoglobulinas foi de 1:1.000 (Figura 2).

Figura 2 - Padronização da técnica de ELISA não comercial para a pesquisa de IgG total, IgG1, IgG2 e

IgG3, utilizando antígeno alcalino de epimastigotas da cepa Y de T. cruzi, conjugado anti-IgG total nas

diluições de 1:2.500, 1:7.500, 1:10.000, 1:15.000 e 1:25.000, anti-IgG1 nas diluições de 1:500, 1:1.000,

1:2500, 1:5000 e 1:10.000, anti-IgG2 nas diluições de 1:1.500, 1:2.500, 1:5.000, 1:7.500, anti-IgG3 nas

diluições de 1:1.000, 1:2.000, HRP-estreptavidina diluída a 1:1.000 e leitura em filtro de 490nm de

absorbância. Foram testados três soros padrões reativos (1+, 2+ e 3+) e dois não reativos (4- e 5-) na

diluição de 1:80. A seta vermelha indica a diluição selecionada para o teste em cada imunoglobulina.

3.7.2 Detecção da reatividade de IgG e subclasses de IgG anti-T. cruzi por meio do

ensaio imunoenzimático não comercial aplicado ao diagnóstico sorológico da

doença de Chagas.

3.7.2.1 Seleção inicial das diluições de soro para IgG e subclasses de IgG capazes de

discriminar indivíduos com infecção chagásica dos não infectados

A técnica de ELISA não comercial foi realizada nos soros de todos os

pacientes com infecção chagásica e no grupo controle nas diluições de soro de 1:10,

1:20, 1:40, 1:80, 1:160, 1:320, 1:640 e 1:1.280, de acordo com as condições obtidas na

padronização dos conjugados e da HRP-estreptavidina descrita anteriormente (item

3.7.1 Padronização do teste de ELISA para dosagem de IgG total, IgG1, IgG2 e IgG3).

Média soro 3+

2.500

10.000

15.000

25.000

7.500

Inverso da diluição do soro

Média soro 1+

Média soro 2+

Média soro 4-

Média soro 5-

1.500

2.500

5.000

7.500

1.000

2.000

Média soro 3+

IgG3

0,2

0,4

1.000

500

2.500

5.000

10.000

IgG1

0,5

IgGtotal

0,75

1,5

IgG2

Média soro 3+

2.500

10.000

15.000

25.000

7.500

Inverso da diluição do soro

Média soro 1+

Média soro 2+

Média soro 4-

Média soro 5-

1.500

2.500

5.000

7.500

1.000

2.000

Média soro 3+

IgG3

0,2

0,4

0,2

0,4

1.000

500

2.500

5.000

10.000

IgG1

0,5

IgGtotal

0,75

1,5

IgG2

A análise estatística realizada por meio do teste de Mann-Whitney selecionou

as diluições de soro para cada imunoglobulina em que houve diferença significativa

entre as medianas de densidade óptica (DO) do grupo de indivíduos com infecção

chagásica e do grupo controle. As diluições selecionadas foram utilizadas na próxima

etapa do estudo para a construção das curvas ROC (Receiver Operating Characteristic

Curve).

3.7.2.2 Avaliação do desempenho da técnica de ELISA não comercial por meio da

construção das curvas ROC de IgG e subclasses de IgG nas diluições previamente

selecionadas

As curvas ROC das diluições selecionadas pela análise estatística no item

anterior (3.7.2.1 Seleção inicial das diluições de soro para IgG e subclasses de IgG

capazes de discriminar indivíduos com infecção chagásica dos não infectados) foram

construídas e nelas estão apresentados para cada diluição de soro os valores dos pontos

de corte, de sensibilidade, especificidade, Razão de Verossimilhança (RV) positiva e

negativa e área sob a curva (ASC). Foi realizada uma nova seleção a partir dos valores

de sensibilidade, especificidade e ASC. O critério de seleção das diluições de soro mais

adequadas para segregar indivíduos com infecção chagásica dos não infectados

considerou os valores de sensibilidade e especificidade acima de 90 e ASC (área sob a

curva) acima de 0,9

A curva ROC indica a diluição do soro que possui maior distanciamento entre

o ponto de corte indicado pela curva e seus valores superiores e inferiores, fornecendo

também a sensibilidade, especificidade, área sob a curva (ASC) e Razão de

Verossimilhança (RV), esta última, sugerindo quantas vezes é mais ou menos provável

encontrar um dado resultado na população doente em relação à não doente. A curva

ROC apresenta em seu eixo vertical a sensibilidade (verdadeiro-positivo) da técnica

utilizada e o complemento da especificidade (falso-positivo) no eixo horizontal. A

sensibilidade de um teste sorológico está relacionada à porcentagem de resultados

positivos dada pelo teste na população de doentes, indicando a proporção de resultados

verdadeiramente positivos. A especificidade de um teste sorológico é definida pela

porcentagem de resultados negativos na população não-doente, sendo a proporção de

verdadeiros negativos. Cada ponto no gráfico representa os valores dos referidos índices

em diferentes pontos de corte, determinando assim a área sob a curva (ASC). A ASC é

o indicador de acurácia global do teste, e quanto mais próximo de 1 for o seu valor,

melhor é o desempenho da técnica avaliada. Para ASC existe a seguinte classificação:

ASC=0,5 (sem valor), 0,5<ASC≤0,7 (baixa acurácia), 0,7< ASC≤0,9 (moderada

acurácia), 0,9<ASC<1,0 (elevada acurácia) e ASC=1 (teste perfeito). O valor

correspondente ao ponto situado mais próximo do ângulo superior esquerdo da curva

será o ponto de corte associado a um menor número de resultados falso-positivos e

falso-negativos.

A figura 3 mostra uma curva ROC esquemática, representando duas diluições

de soro analisadas para a pesquisa de IgG1. A avaliação da ASC permite concluir que a

ASC da diluição de soro 1:40 (ASC=0,975) é maior que a da diluição 1:160

(ASC=0,731), o que significa dizer que a diluição de soro 1:40 apresenta melhor

desempenho que a diluição 1:160, isto é, maior capacidade em discriminar duas

populações distintas (doente e não doente). As setas fora do gráfico demonstram de

forma esquemática o sentido que aumenta a sensibilidade e a especificidade. Cada ponto

do gráfico representa os índices sensibilidade e 100 - especificidade de um ponto de

corte estabelecido. O teste diagnóstico ideal seria aquele cujo ponto de corte estivesse o

mais próximo da intercessão sensibilidade/especificidade.

Figura 3 - Curva ROC das diluições de soro 1:40 (linha verde) e 1:160 (linha roxa) para a

pesquisa de IgG1, construídas a partir dos índices de desempenho, sensibilidade e 100-

especificidade, utilizando a técnica de ELISA não comercial. Os resultados estão expressos

pelos pontos dos gráficos que representam os valores dos respectivos índices determinando

assim a área sob a curva para a diluição 1:40 e para 1:160.

Razões de Verossimilhança superiores a 10 (ou tendendo ao infinito) ou

inferiores a 0,1 originam grandes mudanças e geralmente conclusivas de uma

probabilidade pré-teste a uma probabilidade pós-teste da doença. RVs de 5 a 10 e de 0,1

a 0,2 originam mudanças moderadas, mas às vezes significativas. RVs de 2 a 5 e de 0,2

a 0,5 geram mudanças pequenas, mas ás vezes significativas, e RVs de 1 a 2 e 0,5 a 1

geram mudanças muito pequenas e raramente significativas.

3.7.2.3 Seleção das diluições mais aplicáveis na distinção entre indivíduos com

infecção chagásica e não infectados através do cálculo da diferença entre a

mediana de DO do grupo com infecção chagásica e a DO do grupo controle

Foram construídos os gráficos de dispersão das diluições de soro para cada

imunoglobulina que apresentou valores de sensibilidade e especificidade acima de 90, e

ASC acima de 0,9 na análise das curvas ROC.

Na análise dos gráficos de dispersão, apenas as diluições de soro em que

∆DO

mediana,

(diferença entre a mediana de DO do grupo com infecção chagásica e a DO

do grupo controle) apresentaram valor igual ou superior a 0,2 foram selecionadas como

capazes de discriminar indivíduos com infecção chagásica dos indivíduos não

infectados. O valor de 0,2 foi sugerido, pois ele exibe uma margem de distância entre

100 – Especificidade

Sensibilidade

0 20 40 60 80

100

ASC: 0,975

ASC: 0,731

100 – Especificidade

Sensibilidade

0 20 40 60 80

100

ASC: 0,975

ASC: 0,731

infectados e não infectados que garante a segurança mínima na segregação destes

(Figura 4).

Figura 4 – Gráfico de dispersão para IgG1 na diluição de 1:10, construído a partir da técnica de

ELISA não comercial, utilizando antígeno alcalino de cepa Y de Trypanosoma cruzi, conjugado

anti-IgG1 diluído a 1:500 e HRP-estreptavidina a 1:1.000. ∆DO

mediana,

= diferença entre mediana

de DO do grupo com infecção chagásica e a DO do grupo controle, CONT (grupo não infectado),

CH (pacientes com infecção chagásica).

3.7.3 Detecção da reatividade de IgG e subclasses de IgG anti-T. cruzi por meio do

ensaio imunoenzimático não comercial aplicado ao diagnóstico sorológico da

doença de Chagas em uma população que inclui portadores de outras doenças

infecto-parasitárias de interesse médico

Para essa etapa do estudo foram utilizados soros de indivíduos de origem

desconhecida portadores de outras doenças infecto-parasitárias, cedidos pelo Dr. Olindo

Assis Martins Filho do Laboratório de Biomarcadores de Diagnóstico e de

Monitorização (LADOC) do Centro de Pesquisa René Rachou. A dosagem de IgG total,

IgG1, IgG2 e IgG3 foi realizada nos soros de oito indivíduos com HIV, oito com HCV,

oito com sífilis (SIF), sete com leishmaniose visceral (LV) e oito com leishmaniose

tegumentar (LT) nas diluições 1:10, 1:20, 1:40, 1:80, 1:160, 1:320, 1:640 e 1:1.280, nas

mesmas condições padronizadas anteriormente (item 3.7.1 Padronização do teste de

ELISA para dosagem de IgG total, IgG1, IgG2 e IgG3). As diluições de soro

selecionadas para cada imunoglobulina descritas no item 3.7.2 Detecção da reatividade

de IgG e subclasses de IgG anti-T. cruzi por meio do ensaio imunoenzimático não

comercial aplicado ao diagnóstico sorológico da doença de Chagas, foram aplicadas na

amostragem de soros de indivíduos portadores de outras doenças infecto-parasitárias.

CONT CH

0.0

0.500

1.000

∆DO

mediana=0,293

*p<0,0001

0.103

CONT CH

0.0

0.500

1.000

∆DO

mediana=0,293

*p<0,0001

0.103

As curvas ROC para as diluições previamente selecionadas foram construídas

considerando todos os indivíduos com infecção chagásica (CH) e todos não infectados e

com outras infecções (NCH), ajustando os pontos de corte para cada diluição de soro.

Os valores dos pontos de corte, da sensibilidade, especificidade, RV positiva e negativa

e ASC foram apresentados para cada diluição de soro.

A partir da análise dos índices de desempenho (sensibilidade, especificidade e

ASC) e do índice de reatividade cruzada para cada imunoglobulina foram selecionadas

as diluições que apresentavam os melhores índices para segregar os indivíduos com

infecção chagásica dos demais.

3.8 Pesquisa de IgG e subclasses de IgG anti-T. cruzi por meio do ensaio

imunoenzimático não comercial aplicado a monitoração de morbidade da doença

de Chagas

3.8.1 Análise da reatividade de IgG e subclasses de IgG por meio da mediana de

DO de cada grupo clínico nas diluições de soro avaliadas

A reatividade de IgG e subclasses de IgG foi analisada por meio da técnica de

ELISA não comercial em soros de pacientes com infecção chagásica separados em

quatro grupos de formas clínicas distintas (IND, CARD 1, CARD 2 e DIG/MIS), nas

diluições de 1:10, 1:20, 1:40, 1:80, 1:160, 1:320, 1:640 e 1:1.280, nas mesmas

condições obtidas na padronização descrita anteriormente (item 3.7.1 Padronização do

teste de ELISA para dosagem de IgG total, IgG1, IgG2 e IgG3). As análises da

reatividade de IgG e subclasses de IgG permitiram selecionar as diluições nas quais foi

possível verificar diferença significativa entre os pacientes com diferentes formas

clínicas da doença de Chagas.

3.8.2 Análise individual da reatividade de IgG e subclasses de IgG em pacientes

com diferentes formas clínicas da doença de Chagas

Os gráficos de dispersão de cada imunoglobulina nas diluições que

apresentaram diferença significativa entre as medianas das DOs dos pacientes com

diferentes formas clínicas da doença de Chagas foram construídos, demonstrando quais

grupos apresentavam diferença significativa entre si.

3.8.2.1 Análise de correlação entre as formas clínicas da doença de Chagas e as

imunoglobulinas

Para verificar a existência de correlação entre o perfil sorológico de pacientes

com as quatro formas clínicas da doença de Chagas, os valores de densidade óptica

obtidos por meio da técnica de ELISA não convencional para IgG total, IgG1, IgG2 e

IgG3 dos sessenta pacientes com infecção chagásica, foram analisados no programa

PRISMA, pelo teste de Spearman. O coeficiente de Spearman varia entre -1 e 1, e

quanto mais próximo estiver destes extremos, maior será a associação entre as variáveis.

O sinal negativo da correlação significa que as variáveis variam em sentido contrário,

isto é, as categorias mais elevadas de uma variável estão associadas a categorias mais

baixas da outra variável. O sinal positivo por sua vez indica que as variáveis variam no

mesmo sentido. Valores de r de Spearman mais próximos de 1 apresentam uma

correlação positiva mais forte, assim como valores mais próximos de -1 apresentam

correlação negativa mais forte. Valores de r de Spearman iguais a zero indicam ausência

de correlação, e aqueles próximos de zero (sejam positivos ou negativos) indicam fraca

correlação positiva ou negativa.

Para a construção dos gráficos de correlação foi realizada a análise de

regressão linear, que ajusta graficamente as retas mais adequadas aos gráficos de

dispersão, apresentando correlação positiva ou negativa, a partir dos valores de r de

Spearman.

3.9 Análise Estatística

As taxas de hemoculturas positivas entre os diferentes grupos de pacientes

foram comparadas pelo teste de Qui-quadrado. Em todos os casos, as diferenças foram

consideradas significativas quando o valor de p < 0,05.

Os dados sorológicos foram avaliados por testes não paramétricos. As

diferenças entre as medianas das densidades ópticas das imunoglobulinas avaliadas em

cada diluição do soro entre o grupo de pacientes com infecção chagásica e o grupo

controle foram avaliadas pelo teste de Mann Whitney. Para comparar o grupo controle

com os grupos de pacientes com diferentes formas clínicas da doença de Chagas e com

outras doenças infecto-parasitárias foi utilizado o teste de Kruskal-Wallis. Para a

verificação da existência de correlação estatística entre os grupos com diferentes formas

clínicas e o perfil das imunoglobulinas avaliadas foi utilizado o programa estatístico

PRISMA, aplicando-se o teste de SPEARMAN em um intervalo de 95% de confiança, e

análise de regressão linear para construção dos gráficos de dispersão.

Os pontos de corte para distinguir os soros dos pacientes com infecção

chagásica e dos pacientes com outras infecções, e o grupo controle foram obtidos

através da construção da ‘Receiver Operating Characteristic curve’ – curva ROC,

utilizando o programa estatístico ‘Medcalc Statistical’.

Em nosso estudo a avaliação do desempenho da técnica em cada diluição de

soro avaliada foi realizada utilizando os índices de especificidade, sensibilidade e ASC.

As diluições de soro que apresentaram valores de especificidade e sensibilidade acima

de 90 e ASC superior a 0,9 foram as selecionadas como as mais indicadas para a

segregação entre indivíduos infectados e não infectados. Os valores de RV foram

incluídos no estudo como uma análise complementar, mas não fundamental para a

escolha da diluição selecionada.

4. RESULTADOS

4.1 Diagnóstico sorológico da população estudada

Ao longo do período deste estudo foram examinados 390 moradores do

Município de Berilo, dos quais 175 apresentaram sorologia reativa para antígeno de T.

cruzi nas duas técnicas utilizadas (ELISA e HAI) e 214 foram não reativos em ambas.

Dos indivíduos reativos, 59 são do sexo masculino e 116 são do sexo feminino, com

idades variando entre 13 a 83 anos.

4.2 Avaliação epidemiológica

Alguns aspectos epidemiológicos dos 60 pacientes com infecção chagásica e

15 do grupo controle selecionados para o estudo, foram avaliados através do

questionário aplicado (Anexo II). Foram considerados a qualidade da moradia,

antecedentes familiares de doença de Chagas, condição sócio-econômica, grau de

escolaridade, ocorrência ou não de aborto e o reconhecimento do triatomíneo (Tabela

II).

Tabela II - Aspectos epidemiológicos avaliados dos pacientes com infecção

chagásica (CH) e grupo controle não infectado (CONT) do município de Berilo,

Vale do Jequitinhonha, Minas Gerais.

Aspectos avaliados CH CONT

Reconhecem o triatomíneo 58/60 (96,7%) 13/15 (86,7%)

Viram rato em casa 54/60 (90%) 10/15 (66,7%)

Nasceram em casa de adobe 53/60 (88,3%) 12/15 (80%)

Galinheiro no peridomicílio 47/60 (78,3%) 9/15 (60%)

Familiares vivos com doença de Chagas 47/60 (78,3%) 8/15 (53,3%)

Morte súbita na família 46/60 (76,7%) 9/15 (60%)

Cão ou gato em casa* 42/60 (70%) 5/15 (33,3%)

Viram gambá em casa 42/60 (70%) 9/15 (60%)

Agricultores* 40/60 (66,7%) 4/15 (26,7%)

Moram em casa de adobe 40/60 (66,7%) 6/15 (40%)

1º grau incompleto 38/60 (63,3%) 5/15 (33,3%)

Analfabetos 14/60 (23,3%) 0/15

Mulheres que tiveram abortos 20/40 (50%) 1/8 (12,5%)

O * assinala os dados que apresentaram diferença significativa entre os dois grupos

avaliados.

A avaliação dos dados epidemiológicos possibilitou a verificação de alguns

dados discrepantes quando foram comparados os pacientes com infecção chagásica e os

não infectados. Ressalta-se, por exemplo, o grau de escolaridade. Nos indivíduos não

infectados não havia analfabetos, enquanto essa porcentagem nos infectados foi de

23,3%. Outro fator interessante foi o número de abortos encontrado nos dois grupos.

Nos indivíduos infectados ocorreram 20 abortos nas 40 mulheres avaliadas (50%),

enquanto no grupo não infectado ocorreu apenas um aborto nas oito mulheres (1/8),

correspondendo a 12,5% das mulheres, sendo essa diferença, entretanto, não

significativa.

As diferenças foram significativas apenas em relação a duas variáveis:

presença de cão ou gato em casa (70% e 33,3% das residências dos infectados e não

infectados respectivamente) e percentual de agricultores (66,7% dos infectados e 26,7%

dos não infectados).

Pode ser observado que os não infectados apresentavam e apresentam melhores

condições de moradia, escolaridade e trabalho. Entretanto, alguns fatores de grande

relevância como o reconhecimento do inseto e o tipo de moradia quando crianças,

pouco diferem entre os dois grupos.

Apesar de uma porcentagem ainda significativa de pessoas viverem em casas

com revestimento de adobe, atualmente essas habitações são rebocadas e pintadas, o que

no passado não era regularmente feito. Isso representou uma melhoria nas condições de

habitação de todos os indivíduos entrevistados.

4.3 Avaliação clínica

Para a obtenção dos quatro grupos (IND, CARD 1, CARD 2 e DIG/MIS)

foram avaliados clinicamente 134 indivíduos com sorologia reativa. Os quatro grupos

de estudo selecionados foram compostos por vinte homens e quarenta mulheres, com

idades variando entre 14 e 60 anos. O grupo IND foi composto por nove homens e seis

mulheres; o CARD 1 por dois homens e treze mulheres, o CARD 2 por três homens e

doze mulheres, e o DIG/MIS por seis homens e nove mulheres (Tabela III). O grupo

controle foi compreendido por sete homens e oito mulheres, com idades entre 17 e 58

anos.

A análise estatística revelou diferença significativa entre o número total de

homens e mulheres infectados, com p=0,0005. Quando os grupos foram avaliados

separadamente, houve diferença significativa entre o número de homens entre os grupos

IND e CARD 1, p=0,0229 e no número de mulheres entre os grupos IND e CARD 1, p=

0,0230.

Tabela III - Relação entre o número de homens e

mulheres na população estudada no município de Berilo,

Vale do Jequitinhonha, MG.

Por motivos de ausência do município no período das avaliações, não foi

possível realizar ecocardiografia em seis pacientes (pertencentes aos quatro grupos de

formas clínicas), e em um paciente do grupo IND não foram realizados os raio x

contrastado de cólon e esôfago. Entretanto, mesmo com a incompleta avaliação clínica

desse paciente, ele foi inserido no estudo devido a ausência de sintomatologia e sinais

que indicassem qualquer alteração cardíaca e/ou digestiva.

Durante esse estudo três pacientes faleceram no ano de 2007, dois deles foram

caracterizados como portadores de cardiopatia avançada, sendo classificados no grupo

CARD 2. Um deles completou todo o processo de avaliação clínica, entretanto no outro

paciente não foi possível realizar os raio x de esôfago e cólon contrastados. O terceiro

paciente falecido foi classificado no grupo DIG/MIS, e não foi submetido a realização

do raio x de cólon contrastado. Entretanto, esses pacientes apresentavam claras

manifestações cardíacas e/ou digestivas que possibilitaram sua inserção no estudo.

4.4 Avaliação parasitológica

4.4.1 Hemocultura

Nos 134 pacientes avaliados por hemocultura foi encontrada uma positividade

de 27,61% (37/134). Dentre os 60 indivíduos selecionados para o estudo clínico e

sorológico, 15 apresentaram hemocultura positiva, representando 25,0% de

Grupo clínico Nº de homens Nº de mulheres

CONT

7 8

IND

9 6

CARD 1

2 13

CARD 2

3 12

DIG/MIS

6 9

Total

27 48

positividade. Dos pacientes que tiveram hemoculturas positivas, cinco (33,33%)

estavam classificados no grupo IND, quatro (26,66%) no CARD 1, quatro (26,66%) no

CARD 2 e dois (13,33%) no DIG/MIS. A taxa de hemocultura positiva em cada grupo

avaliado está apresentada na Figura 5. Foi possível observar uma maior positividade de

hemocultura nos pacientes da forma clínica indeterminada em relação aos demais,

entretanto a análise estatística não verificou diferença significativa entre as taxas de

positividade nos diferentes grupos avaliados. Mesmo quando os pacientes cardíacos

foram avaliados como um único grupo, ou quando todos os sintomáticos foram

agrupados, a análise estatística não revelou diferença significativa entre a positividade

de hemocultura desses agrupamentos e dos pacientes da forma indeterminada.

O período de positivação das hemoculturas foi variado, com seis tubos

apresentando positividade ao 30º dia, oito ao 60º dia, quatro ao 90º e nenhum ao 120º

dia de exame (Tabela IV). Nos tubos com as camadas de leucócitos cinco pacientes

apresentaram positividade, sete foram positivos nos tubos contendo as papas de

hemácias e três em ambos os tubos. A análise estatística realizada não verificou

diferença significativa entre a positividade encontrada nos tubos contendo a papa de

hemácias e leucócitos.

100

Porcentagem de

hemocultura positiva

IND CARD 1 CARD 2 DIG/MIS

Figura 5 - Porcentagem de hemocultura positiva nos diferentes grupos clínicos

de pacientes do município de Berilo,Vale do Jequitinhonha, MG, portadores de

infecção por Trypanosoma cruzi.

Tabela IV - Relação entre número de tubos apresentando resultado positivo na hemocultura

e o período de positivação após cultivo em pacientes do município de Berilo, Vale do

Jequitinhonha, MG, portadores de infecção por Trypanosoma cruzi.

Período de leitura

(dias)

Número de tubos positivos Positividade (%) Número de

hemoculturas

positivas

30 6/180 3,33 4

60 8/180 4,44 7

90 4/180 2,22 4

120 0/180 0 0

4.5 Detecção da reatividade de IgG e subclasses de IgG anti-T. cruzi por meio do

ensaio imunoenzimático não comercial aplicado ao diagnóstico sorológico da

doença de Chagas

4.5.1 Seleção inicial das diluições de soro para IgG e subclasses de IgG capazes de

discriminar indivíduos com infecção chagásica dos não infectados

A análise da reatividade de IgG e subclasses de IgG nos soros de pacientes com

infecção chagásica e nos soros do grupo controle diluídos a 1:10, 1:20, 1:40, 1:80,

1:160, 1:320, 1:640 e 1:1.280 permitiu verificar em quais diluições de soro houve

diferença significativa entre as medianas de densidade óptica (DO) detectadas nos

pacientes infectados com T. cruzi e no grupo controle, possibilitando assim a segura

segregação entre eles.

A avaliação dos dados de DO de IgG total, IgG2 e IgG3 demonstrou que há

diferença significativa entre os valores das medianas de DO dos pacientes com infecção

chagásica em comparação ao grupo controle não infectado, em todas as diluições de

soro analisadas (1:10 a 1:1.280) (Figura 6). Os valores de p obtidos através da

aplicação do teste de Mann-Whitney são menores que 0,0001 em todas as diluições de

soro para IgG total e IgG3. A avaliação dos dados de DO de IgG1 demonstrou que há

diferença significativa entre os valores das medianas de DO dos pacientes com infecção

chagásica em comparação ao grupo controle até a diluição 1:160. Os valores de p

obtidos para as diluições de 1:10, 1:20, 1:40 e 1:80 são menores que 0,0001, e para a

diluição 1:160, p=0,006.

Para anti-IgG2 houve diferença significativa entre as medianas de DO do

grupo controle e dos pacientes com infecção chagásica com p<0,0001 nas diluições de

1:10 até 1:80, nas demais diluições os valores de p foram: a 1:160, p=0,0004, a 1:320,

p=0,0232, a 1:640, p=0,0042 e a 1:1.280, p=0,0027 (Figura 6).

Figura 6 - ELISA não comercial em soros de pacientes de Berilo, Vale do Jequitinhonha, MG, nas

diluições de 1:10, 1:20, 1:40, 1:80, 1:160, 1:320, 1:640 e 1:1.280, utilizando antígeno alcalino de

cepa Y de Trypanososma cruzi, conjugado anti-IgG total diluído a 1:10.000, anti-IgG1 diluído a

1:500, anti-IgG2 diluído a 1:2.500, anti-IgG3 diluído a 1:1.000 e HRP-estreptavidina a 1:1.000. A

linha pontilhada circunda as diluições de soro que apresentaram diferença significativa entre as

medianas das DOs do grupo controle não infectado (preto) e dos pacientes com infecção chagásica

(em vermelho).

4.5.2 Avaliação do desempenho da técnica de ELISA não comercial por meio da

construção das curvas ROC de IgG e subclasses de IgG nas diluições previamente

selecionadas

Para a determinação do desempenho da técnica de ELISA não comercial foram

construídas as curvas ROC de IgG e subclasses de IgG em todas as diluições de soro

analisadas que apresentaram diferença significativa entre as medianas de DO do grupo

de pacientes com infecção chagásica e grupo controle.

IgG total

10 20 40 80 160 320 640 1.280

0,150

0,300

0,450

0,600

0,100

0,200

0,300

0,400

10 20 40 80 160 320 640 1.280

IgG1

0,125

0,250

0,375

0,500

IgG2

0,175

0,35

0,525

0,700

10 20 40 80 160 320 640 1.280

IgG3

Inverso da diluição do soro

IgG total

10 20 40 80 160 320 640 1.280

0,150

0,300

0,450

0,600

0,100

0,200

0,300

0,400

10 20 40 80 160 320 640 1.280

IgG1

0,125

0,250

0,375

0,500

IgG2

0,175

0,35

0,525

0,700

10 20 40 80 160 320 640 1.280

IgG3

Inverso da diluição do soro

As diluições de soro cujos valores de especificidade e sensibilidade foram

acima de 90, e ASC superior a 0,9 foram selecionadas pela curva ROC como as mais

indicadas para a segregação dos pacientes com infecção chagásica do grupo controle.

Para cada diluição de soro foi estabelecido pela curva ROC o melhor ponto de

corte para distinguir os soros reativos dos não reativos, a sensibilidade, especificidade e

ASC alcançadas pela técnica que determinaram a escolha das diluições mais adequadas

e os valores de RV, que indicaram quantas vezes é mais provável um resultado positivo

ser encontrado em um indivíduo infectado e um resultado negativo ser detectado em um

indivíduo infectado.

4.5.2.1 Curvas ROC de IgG total

Para IgG total foram construídas as curvas ROC de todas as diluições

analisadas (1:10 a 1:1.280). Essa imunoglobulina apresentou valores máximos de

especificidade e sensibilidade (100,0%) e ASC (1,000) em todas as diluições de soro,

demonstrando excelente desempenho da técnica para discriminar soros de indivíduos

com infecção chagásica dos não infectados, em qualquer dessas diluições. A RV para os

resultados positivos em todas as diluições tendeu ao infinito, e para os resultados

negativos foi igual a zero. Isso indica que é infinitamente provável que um resultado

positivo seja detectado em um indivíduo com infecção chagásica, e que não há chance

de um resultado negativo advir de um indivíduo com infecção chagásica. Sendo assim,

para IgG total, todas as diluições de soro testadas foram selecionadas (cercadas por

linha vermelha) como capazes de discriminar indivíduos com infecção chagásica de

indivíduos não infectados, sendo o teste de ELISA utilizado considerado perfeito em

decorrência dos índices de ASC obtidos (Figura 7).

Figura 7 - Curvas ROC da técnica de ELISA não comercial para dosagem de IgG total

construídas a partir dos índices de sensibilidade e especificidade dos grupos CONT (não

infectado) e CH (com infecção chagásica) nas diluições de soro de 1:10, 1:20, 1:40, 1:80, 1:160,

1:320, 1:640 e 1:1.280. Os resultados estão expressos pelos pontos dos gráficos que representam

os valores dos referidos índices avaliados, determinando assim, a área sob a curva (ASC). Os

círculos determinam os melhores pontos de corte sugeridos pela curva para a técnica utilizada em

cada diluição de soro. Sens: sensibilidade; Espec:especificidade; PC: ponto de corte; RV: Razão

de Verossimilhança. O retângulo vermelho indica as diluições de soro que apresentaram o

melhor desempenho na técnica.

4.5.2.2 Curvas ROC de IgG1

Para IgG1 foram construídas as curvas ROC das cinco diluições (1:10, 1:20,

1:40, 1:80 e 1:160) que apresentaram diferença significativa entre as medianas de DO

do grupo controle e do grupo com infecção chagásica. A análise da curva ROC

demonstrou excelente desempenho da diluição de soro 1:10 com sensibilidade e

especificidade de 100,0%, e ASC igual a 1,000, garantindo nessa diluição um teste

100 – Especificidade

0 20 40 60 80 100

100

Sens: 100,0 (94,0- 100,0)

Espec: 100,0 (78,0-100,0)

ASC: 1,000

PC=0,145

0 20 40 60 80 100

100

Sens: 100,0 (94,0-100,0)

Espec: 100,0 (78,0-100,0)

ASC: 1,000

PC=0,126

0 20 40 60 80 100

100

Sens: 100,0 (94,0-100,0)

Espec: 100,0 (78,0-100,0)

ASC: 1,000

0 20 40 60 80 100

100

Sens: 100,0 (94,0-100,0)

Espec: 100,0 (78,0-100,0)

ASC: 1,000

PC=0,099PC=0,125

0 20 40 60 80 100

100

Sens: 100,0 (94,0-100,0)

Espec: 100,0 (78,0-100,0)

ASC: 1,000

0 20 40 60 80 100

100

Sens: 100,0 (94,0-100,0)

Espec: 100,0 (78,0-100,0)

ASC: 1,000

PC=0,075PC=0,091

0 20 40 60 80

100

Sens: 100,0 (94,0-100,0)

Espec: 100,0 (78,0-100,0)

ASC: 1,000

0 20 40 60 80

100

Sens: 100,0 (94,0-100,0)

Espec: 100,0 (78,0-100,0)

ASC: 1,000

PC=0,055

PC=0,062

IgG total diluição 1:10

IgG total diluição 1:20

IgG total diluição 1:40

IgG total diluição 1:80

IgG total diluição 1:160

IgG total diluição 1:320

IgG total diluição 1:640

IgG total diluição 1:1.280

Sensibilidade

RV+: ∞

RV-: 0,00

RV+: ∞

RV-: 0,00

RV+: ∞

RV-: 0,00

RV+: ∞

RV-: 0,00

RV+: ∞

RV-: 0,00

RV+: ∞

RV-: 0,00

RV+: ∞

RV-: 0,00

RV+: ∞

RV-: 0,00

100 – Especificidade

0 20 40 60 80 100

100

Sens: 100,0 (94,0- 100,0)

Espec: 100,0 (78,0-100,0)

ASC: 1,000

PC=0,145

0 20 40 60 80 100

100

Sens: 100,0 (94,0-100,0)

Espec: 100,0 (78,0-100,0)

ASC: 1,000

PC=0,126

0 20 40 60 80 100

100

Sens: 100,0 (94,0-100,0)

Espec: 100,0 (78,0-100,0)

ASC: 1,000

0 20 40 60 80 100

100

Sens: 100,0 (94,0-100,0)

Espec: 100,0 (78,0-100,0)

ASC: 1,000

PC=0,099PC=0,125

0 20 40 60 80 100

100

Sens: 100,0 (94,0-100,0)

Espec: 100,0 (78,0-100,0)

ASC: 1,000

0 20 40 60 80 100

100

Sens: 100,0 (94,0-100,0)

Espec: 100,0 (78,0-100,0)

ASC: 1,000

PC=0,075PC=0,091

0 20 40 60 80

100

Sens: 100,0 (94,0-100,0)

Espec: 100,0 (78,0-100,0)

ASC: 1,000

0 20 40 60 80

100

Sens: 100,0 (94,0-100,0)

Espec: 100,0 (78,0-100,0)

ASC: 1,000

PC=0,055

PC=0,062

IgG total diluição 1:10

IgG total diluição 1:20

IgG total diluição 1:40

IgG total diluição 1:80

IgG total diluição 1:160

IgG total diluição 1:320

IgG total diluição 1:640

IgG total diluição 1:1.280

Sensibilidade

RV+: ∞

RV-: 0,00

RV+: ∞

RV-: 0,00

RV+: ∞

RV-: 0,00

RV+: ∞

RV-: 0,00

RV+: ∞

RV-: 0,00

RV+: ∞

RV-: 0,00

RV+: ∞

RV-: 0,00

RV+: ∞

RV-: 0,00

perfeito. Para essa diluição o valor de RV para o resultado positivo tendeu ao infinito, e

do resultado negativo foi igual a zero. Isso indica que é infinitamente provável que um

resultado positivo venha de um indivíduo com infecção chagásica, e que não há chance

de um resultado negativo advir de um indivíduo com infecção chagásica.

Na diluição de soro 1:20, os valores de sensibilidade de 98,3%, especificidade

de 100,0% e ASC igual a 0,997, demonstraram elevada acurácia do teste. O valor de RV

para o resultado positivo tendendo ao infinito indicou que é infinitamente provável que

um resultado positivo venha de um indivíduo com infecção chagásica. No entanto, o

valor de RV para o resultado negativo de 0,02 indica que há uma chance mínima de

0,02 vezes de um resultado negativo advir de um indivíduo com infecção chagásica.

Na diluição de soro 1:40, os valores de sensibilidade de 93,3%, especificidade

de 93,3% e ASC igual 0,975, garantiram elevada acurácia ao teste. O valor de RV para

o resultado positivo tendendo ao infinito indica que é infinitamente provável que um

resultado positivo venha de um indivíduo com infecção chagásica. No entanto, o valor

de RV para o resultado negativo indica que há uma chance mínima de 0,07 vezes de um

resultado negativo advir de um indivíduo com infecção chagásica.

Na diluição 1:80, a sensibilidade de 80,0%, especificidade de 86,7% e ASC

igual a 0,876 garantiram moderada acurácia ao teste. A RV para o resultado positivo

indica que é seis vezes mais provável detectar um resultado positivo em um indivíduo

com infecção chagásica em relação a um indivíduo não infectado. A RV para o

resultado negativo indica que há uma chance de 0,23 vezes de um resultado negativo

advir de um indivíduo com infecção chagásica.

Na diluição 1:160, a sensibilidade de 58,3%, especificidade de 80,0% e ASC

igual a 0,731, indicam que o teste apresenta moderada acurácia nessa diluição. A RV

para o resultado positivo indica que é 2,92 vezes mais provável detectar um resultado

positivo em um indivíduo com infecção chagásica em relação a um indivíduo não

infectado. A RV para o resultado negativo indica que há uma chance de 0,52 vezes de

um resultado negativo advir de um indivíduo com infecção chagásica.

Sendo assim, para IgG1, as diluições de soro que apresentaram os melhores

índices de desempenho e que foram selecionadas foram 1:10, 1:20 e 1:40 (Figura 8).

Figura 8 - Curvas ROC da técnica de ELISA não comercial para dosagem de IgG1, construídas a

partir dos índices de sensibilidade e especificidade dos grupos CONT (não infectado) e CH (com

infecção chagásica) nas diluições de soro de 1:10, 1:20, 1:40, 1:80 e 1:160. Os resultados estão

expressos pelos pontos dos gráficos que representam os valores dos referidos índices avaliados,

determinando assim, a área sob a curva (ASC). Os círculos determinam os melhores pontos de

corte sugeridos pela curva para a técnica utilizada. Sens: sensibilidade; Espec:especificidade; PC:

ponto de corte; RV: Razão de Verossimilhança. A linha vermelha circunda as diluições de soro que

apresentaram o melhor desempenho na técnica.

4.5.2.3 Curvas ROC de IgG2

Para IgG2 foram construídas as curvas ROC das oito diluições analisadas (1:10

a 1:1.280) que apresentaram diferença significativa entre as medianas de DO do grupo

controle e do grupo com infecção chagásica. A análise da curva ROC demonstrou

excelente desempenho da diluição de soro 1:10 com especificidade de 100,0%,

sensibilidade de 100,0% e ASC igual a 1,000, garantindo nessa diluição um teste

0 20 40 60 80 100

100

Sens: 100,0 (94,0-100,0)

Espec: 100,0 (78,0-100,0)

ASC: 1,000

PC=0,103

0 20 40 60 80 100

100

Sens: 98,3 (91,0 -99,7)

Espec: 100,0

ASC: 0,997

IgG1 diluição 1:20

PC=0,107

0 20 40 60 80

100

Sens: 93,3 (83,8-98,1)

Espec: 93,3 (68,0- 98,9)

ASC: 0,975

PC=0,107

0 20 40 60 80

100

Sens: 80,0 ( 67,7- 89,2)

Espec: 86,7( 59,5- 98,0)

ASC: 0,876

PC=0,095

IgG1 diluição 1:10

100 – Especificidade

Sensibilidade

IgG1 diluição 1:40

IgG1 diluição 1:80

0 20 40 60 80 100

100

Sens: 58,3( 44,9- 70,9)

Espec: 80,0 ( 51,9- 95,4)

ASC: 0,731

PC=0,075

IgG1 diluição 1:160

RV+: ∞

RV-: 0,00

RV+: ∞

RV-: 0,02

RV+: ∞

RV-: 0,07

RV+: 6,00

RV-: 0,23

RV+: 2,92

RV-: 0,52

0 20 40 60 80 100

100

Sens: 100,0 (94,0-100,0)

Espec: 100,0 (78,0-100,0)

ASC: 1,000

PC=0,103

0 20 40 60 80 100

100

Sens: 98,3 (91,0 -99,7)

Espec: 100,0

ASC: 0,997

IgG1 diluição 1:20

PC=0,107

0 20 40 60 80

100

Sens: 93,3 (83,8-98,1)

Espec: 93,3 (68,0- 98,9)

ASC: 0,975

PC=0,107

0 20 40 60 80

100

Sens: 80,0 ( 67,7- 89,2)

Espec: 86,7( 59,5- 98,0)

ASC: 0,876

PC=0,095

IgG1 diluição 1:10

100 – Especificidade

Sensibilidade

IgG1 diluição 1:40

IgG1 diluição 1:80

0 20 40 60 80 100

100

Sens: 58,3( 44,9- 70,9)

Espec: 80,0 ( 51,9- 95,4)

ASC: 0,731

PC=0,075

IgG1 diluição 1:160

RV+: ∞

RV-: 0,00

RV+: ∞

RV-: 0,02

RV+: ∞

RV-: 0,07

RV+: 6,00

RV-: 0,23

RV+: 2,92

RV-: 0,52

perfeito. A RV para o resultado positivo indica que é infinitamente provável que um

resultado positivo venha de um indivíduo com infecção chagásica. A RV para o

resultado negativo indica que não há chance de um resultado negativo advir de um

indivíduo com infecção chagásica.

Na diluição 1:20, a especificidade de 100,0%, sensibilidade de 90,0% e ASC

igual a 0,988 garantiram a elevada acurácia da técnica. A RV para o resultado positivo

indica que é infinitamente provável que um resultado positivo venha de um indivíduo

com infecção chagásica. A RV para o resultado negativo indica que há uma chance de

0,10 vezes de um resultado negativo advir de um indivíduo com infecção chagásica.

Na diluição 1:40, a especificidade de 93,3%, sensibilidade de 96,7% e ASC

igual a 0,988, garantiram a elevada acurácia da técnica. A RV para o resultado positivo

indica que é infinitamente provável que um resultado positivo venha de um indivíduo

com infecção chagásica. A RV para o resultado negativo indica que há uma chance de

0,04 vezes de um resultado negativo advir de um indivíduo com infecção chagásica.

Na diluição 1:80, a especificidade de 80,0%, sensibilidade de 86,7% e ASC

igual a 0,901, garantem a elevada acurácia da técnica. A RV para o resultado positivo

indica que é 4,43 vezes mais provável detectar um resultado positivo em um indivíduo

com infecção chagásica. A RV para o resultado negativo indica que há uma chance de

0,17 vezes de um resultado negativo advir de um indivíduo com infecção chagásica.

Na diluição 1:160, a especificidade de 66,7%, sensibilidade de 83,3% e ASC

igual a 0,797, garantiram moderada acurácia ao teste. A RV para o resultado positivo

indica que é 2,5 vezes mais provável que um resultado positivo venha de um indivíduo

com infecção chagásica. A RV para o resultado negativo indica que há uma chance de

0,25 vezes de um resultado negativo advir de um indivíduo com infecção chagásica.

Na diluição 1:320, a especificidade de 100,0%, sensibilidade de 45,0% e ASC

igual a 0,691, demonstram que a técnica apresenta baixa acurácia. A RV para o

resultado positivo indica que é infinitamente provável que um resultado positivo venha

de um indivíduo com infecção chagásica. A RV para o resultado negativo indica que há

uma chance de 0,55 vezes de um resultado negativo advir de um indivíduo com

infecção chagásica.

Na diluição 1:640, a especificidade de 93,3%, a sensibilidade de 58,3% e ASC

igual a 0,741, garantem moderada acurácia ao teste. A RV para o resultado positivo

indica que é 8,75 vezes mais provável que um resultado positivo venha de um indivíduo

com infecção chagásica. A RV para o resultado negativo indica que há uma chance de

0,45 vezes de um resultado negativo advir de um indivíduo com infecção chagásica.

Na diluição 1:1.280, a especificidade de 100,0%, sensibilidade de 51,7% e

ASC igual a 0,752, garantem moderada acurácia ao teste. A RV para o resultado

positivo indica que é infinitamente provável que um resultado positivo venha de um

indivíduo com infecção chagásica. A RV para o resultado negativo indica que há uma

chance de 0,48 vezes de um resultado negativo advir de um indivíduo com infecção

chagásica.

A análise dos índices de desempenho das curvas ROC para IgG2 indica que as

diluições selecionadas 1:10, 1:20 e 1:40 são as mais seguras para a discriminação entre

indivíduos com infecção chagásica do grupo controle (Figura 9).

Figura 9 - Curvas ROC da técnica de ELISA não comercial para dosagem de IgG2 construídas

a partir dos índices de sensibilidade e especificidade dos grupos CONT (não infectado) e CH

(com infecção chagásica) nas diluições de soros de 1:10, 1:20, 1:40, 1:80, 1:160, 1:320, 1:640 e

1:1.280. Os resultados estão expressos pelos pontos dos gráficos que representam os valores

dos referidos índices avaliados, determinando assim, a área sob a curva (ASC). Os círculos

determinam os melhores pontos de corte sugeridos pela curva para a técnica utilizada. Sens:

sensibilidade; Espec:especificidade; PC: ponto de corte; RV: Razão de Verossimilhança. A

linha vermelha indica as diluições de soro que apresentaram o melhor desempenho na técnica.

4.5.2.4 Curvas ROC de IgG3

Para IgG3 foram construídas as curvas ROC das oito diluições analisadas (1:10

a 1:1.280) que apresentaram diferença significativa entre as medianas de DO do grupo

controle e do grupo com infecção chagásica. A análise da curva ROC para a diluição de

soro 1:10, apresentou especificidade de 100,0%, sensibilidade de 98,3% e ASC igual a

0,993, garantindo elevada acurácia ao teste. A RV para o resultado positivo indica que é

100 – Especificidade

0 20 40 60 80

100

Sens: 100,0 ( 94,0-100,0)

PC=0,155

0 20 40 60 80 100

100

Sens: 90,0 ( 79,5-96,2)

Espec:100,0 ( 78,0-100,0)

ASC:0,988

PC=0,156

0 20 40 60 80

100

Sens: 96,7 ( 88,4- 99,5)

Espec: 93,3 ( 68,0- 98,9)

ASC: 0,988

PC=0,104

0 20 40 60 80 100

100

Sens: 86,7 ( 75,4- 94,0)

Espec: 80,0 ( 51,9- 95,4)

ASC: 0,901

PC=0,103

0 20 40 60 80 100

100

Sens: 83,3 ( 71,5- 91,7)

Espec: 66,7 ( 38,4- 88,1)

ASC: 0,797

PC=0,072

0 20 40 60 80 100

100

Sens: 45,0 ( 32,1- 58,4)

Espec: 100,0 ( 78,0-100,0)

ASC: 0,691

PC=0,091

0 20 40 60 80

100

Sens: 58,3 ( 44,9- 70,9)

Espec: 93,3 ( 68,0- 98,9)

ASC: 0,741

PC=0,079

0 20 40 60 80 100

100

Sens: 51,7 ( 38,4- 64,8)

Espec:100,0 ( 78,0-100,0)

ASC: 0,752

PC=0,08

IgG2 diluição 1:10 IgG2 diluição 1:20

IgG2 diluição 1:40

IgG2 diluição 1:80

IgG2 diluição 1:160

IgG2 diluição 1:320

IgG2 diluição 1:640

IgG2 diluição 1:1.280

Sensibilidade

Espec:100,0 ( 94,0-100,0)

ASC:1,000

RV+: ∞

RV-: 0,00

RV+: ∞

RV-: 0,10

RV+:

∞

RV-: 0,04

RV+: 4,43

RV-: 0,17

RV+: 2,50

RV-: 0,25

RV+: ∞

RV-: 0,55

RV+: 8,75

RV-: 0,45

RV+: ∞

RV-: 0,48

100 – Especificidade

0 20 40 60 80

100

Sens: 100,0 ( 94,0-100,0)

PC=0,155

0 20 40 60 80 100

100

Sens: 90,0 ( 79,5-96,2)

Espec:100,0 ( 78,0-100,0)

ASC:0,988

PC=0,156

0 20 40 60 80

100

Sens: 96,7 ( 88,4- 99,5)

Espec: 93,3 ( 68,0- 98,9)

ASC: 0,988

PC=0,104

0 20 40 60 80 100

100

Sens: 86,7 ( 75,4- 94,0)

Espec: 80,0 ( 51,9- 95,4)

ASC: 0,901

PC=0,103

0 20 40 60 80 100

100

Sens: 83,3 ( 71,5- 91,7)

Espec: 66,7 ( 38,4- 88,1)

ASC: 0,797

PC=0,072

0 20 40 60 80 100

100

Sens: 45,0 ( 32,1- 58,4)

Espec: 100,0 ( 78,0-100,0)

ASC: 0,691

PC=0,091

0 20 40 60 80

100

Sens: 58,3 ( 44,9- 70,9)

Espec: 93,3 ( 68,0- 98,9)

ASC: 0,741

PC=0,079

0 20 40 60 80 100

100

Sens: 51,7 ( 38,4- 64,8)

Espec:100,0 ( 78,0-100,0)

ASC: 0,752

PC=0,08

IgG2 diluição 1:10 IgG2 diluição 1:20

IgG2 diluição 1:40

IgG2 diluição 1:80

IgG2 diluição 1:160

IgG2 diluição 1:320

IgG2 diluição 1:640

IgG2 diluição 1:1.280

Sensibilidade

Espec:100,0 ( 94,0-100,0)

ASC:1,000

RV+: ∞

RV-: 0,00

RV+: ∞

RV-: 0,10

RV+:

∞

RV-: 0,04

RV+: 4,43

RV-: 0,17

RV+: 2,50

RV-: 0,25

RV+: ∞

RV-: 0,55

RV+: 8,75

RV-: 0,45

RV+: ∞

RV-: 0,48

infinitamente provável que um resultado positivo venha de um indivíduo com infecção

chagásica. A RV para o resultado negativo indica que há uma chance mínima de 0,02

vezes de um resultado negativo advir de um indivíduo com infecção chagásica.

Na diluição 1:20, a especificidade de 100,0%, a sensibilidade de 98,3% e a

ASC igual a 0,998, garantiram elevada acurácia ao teste. Os valores de RV para os

resultados positivo e negativo foram os mesmos detectados para a diluição 1:10.

Na diluição 1:40, a especificidade de 100,0%, a sensibilidade de 98,3% e a

ASC igual a 0,996, garantiram elevada acurácia ao teste. Os valores de RV para os

resultados positivo e negativo foram os mesmos das diluições 1:10 e 1:20.

Na diluição 1:80, a especificidade de 100,0%, a sensibilidade de 98,3% e ASC

igual a 0,999, garantiram a elevada acurácia da técnica. Os valores de RV para os

resultados positivo e negativo foram os mesmos das diluições anteriores.

Na diluição 1:160, a especificidade de 100,0%, a sensibilidade de 96,7% e

ASC igual a 0,992, garantiram a elevada acurácia da técnica. O valor de RV para o

resultado positivo indica que é infinitamente provável que um resultado positivo venha

de um indivíduo com infecção chagásica. O valor de RV para o resultado negativo

indica que há uma chance mínima de 0,03 vezes de um resultado negativo advir de um

indivíduo com infecção chagásica.

Na diluição 1:320, a especificidade de 100,0%, a sensibilidade de 91,7% e a

ASC igual a 0,971, garantiram elevada acurácia ao teste. A RV para o resultado positivo

indica que é infinitamente provável que um resultado positivo venha de um indivíduo

com infecção chagásica. A RV para o resultado negativo indica que há uma chance

mínima de 0,08 vezes de um resultado negativo advir de um indivíduo com infecção

chagásica.

Na diluição 1:640, a especificidade de 100,0%, a sensibilidade de 86,7% e

ASC igual a 0,927, garantiram elevada acurácia ao teste. A RV para o resultado positivo

indica que é infinitamente provável que um resultado positivo venha de um indivíduo

com infecção chagásica. A RV para o resultado negativo indica que há uma chance

mínima de 0,13 vezes de um resultado negativo advir de um indivíduo com infecção

chagásica.

Na diluição 1:1.280, a especificidade de 100,0%, a sensibilidade de 88,3% e

ASC igual a 0,919, garantiram elevada acurácia ao teste. A RV para o resultado positivo

indica que é infinitamente provável que um resultado positivo venha de um indivíduo

com infecção chagásica. A RV para o resultado negativo indica que há uma chance

mínima de 0,12 vezes de um resultado negativo advir de um indivíduo com infecção

chagásica.

A análise dos dados obtidos das curvas ROC para IgG3 indicam que as

diluições 1:10, 1:20, 1:40, 1:80, 1:160 e 1:320, por apresentarem os melhores índices

de desempenho foram selecionadas para discriminar indivíduos com infecção chagásica

dos não infectados (Figura 10).

Figura 10 - Curvas ROC da técnica de ELISA não comercial para dosagem de IgG3 construídas a

partir dos índices de sensibilidade e especificidade dos grupos CONT (não infectado) e CH (com

infecção chagásica) nas diluições de soros de 1:10, 1:20, 1:40, 1:80, 1:160, 1:320, 1:640 e 1:1.280.

Os resultados estão expressos pelos pontos dos gráficos que representam os valores dos referidos

índices avaliados, determinando assim, a área sob a curva (ASC). Os círculos determinam os

melhores pontos de corte sugeridos pela curva para a técnica utilizada. Sens: sensibilidade; Espec:

especificidade; PC: ponto de corte; RV: Razão de Verosimilhança. O retângulo vermelho indica as

diluições de soro que apresentaram o melhor desempenho na técnica.

100 – Especificidade

0 20 40 60 80 100

100

Sens: 98,3 ( 91,0- 99,7)

Espec: 100,0 ( 78,0-100,0)

ASC: 0,993

0 20 40 60 80 100

100

Sens: 98,3 ( 91,0- 99,7)

Espec: 100,0 ( 78,0-100,0)

ASC: 0,998

PC=0,239

PC=0,209

0 20 40 60 80 100

100

Sens: 98,3 ( 91,0- 99,7)

Espec: 100,0 ( 78,0-100,0)

ASC: 0,996

0 20 40 60 80 100

100

Sens: 98,3 ( 91,0- 99,7)

Espec: 100,0 ( 78,0-100,0)

ASC: 0,999

PC=0,145

PC=0,132

0 20 40 60 80

100

Sens: 96,7 ( 88,4- 99,5)

Espec: 100,0 ( 78,0-100,0)

ASC: 0,992

0 20 40 60 80 100

100

Sens: 91,7 ( 81,6- 97,2)

Espec: 100,0 ( 78,0-100,0)

ASC: 0,971

PC=0,117

PC=0,148

0 20 40 60 80 100

100

Sens: 86,7 ( 75,4- 94,0)

ASC: 0,927

Espec: 100,0 ( 78,0-100,0)

0 20 40 60 80 100

100

Sens: 88,3 ( 77,4- 95,2)

ASC: 0,919

Espec: 100,0 ( 78,0-100,0)

PC=0,116

PC=0,097

IgG3 diluição 1:10

Sensibilidade

IgG3 diluição 1:20

IgG3 diluição 1:1.280

IgG3 diluição 1:640

IgG3 diluição 1:320 IgG3 diluição 1:160

IgG3 diluição 1:80

IgG3 diluição 1:40

RV+: ∞

RV-: 0,02

RV+: ∞

RV-: 0,02

RV+: ∞

RV-: 0,02

RV+: ∞

RV-: 0,02

RV+: ∞

RV-: 0,03

RV+: ∞

RV-: 0,08

RV+: ∞

RV-: 0,13

RV+: ∞

RV-: 0,12

100 – Especificidade

0 20 40 60 80 100

100

Sens: 98,3 ( 91,0- 99,7)

Espec: 100,0 ( 78,0-100,0)

ASC: 0,993

0 20 40 60 80 100

100

Sens: 98,3 ( 91,0- 99,7)

Espec: 100,0 ( 78,0-100,0)

ASC: 0,998

PC=0,239

PC=0,209

0 20 40 60 80 100

100

Sens: 98,3 ( 91,0- 99,7)

Espec: 100,0 ( 78,0-100,0)

ASC: 0,996

0 20 40 60 80 100

100

Sens: 98,3 ( 91,0- 99,7)

Espec: 100,0 ( 78,0-100,0)

ASC: 0,999

PC=0,145

PC=0,132

0 20 40 60 80

100

Sens: 96,7 ( 88,4- 99,5)

Espec: 100,0 ( 78,0-100,0)

ASC: 0,992

0 20 40 60 80 100

100

Sens: 91,7 ( 81,6- 97,2)

Espec: 100,0 ( 78,0-100,0)

ASC: 0,971

PC=0,117

PC=0,148

0 20 40 60 80 100

100

Sens: 86,7 ( 75,4- 94,0)

ASC: 0,927

Espec: 100,0 ( 78,0-100,0)

0 20 40 60 80 100

100

Sens: 88,3 ( 77,4- 95,2)

ASC: 0,919

Espec: 100,0 ( 78,0-100,0)

PC=0,116

PC=0,097

IgG3 diluição 1:10

Sensibilidade

IgG3 diluição 1:20

IgG3 diluição 1:1.280

IgG3 diluição 1:640

IgG3 diluição 1:320 IgG3 diluição 1:160

IgG3 diluição 1:80

IgG3 diluição 1:40

RV+: ∞

RV-: 0,02

RV+: ∞

RV-: 0,02

RV+: ∞

RV-: 0,02

RV+: ∞

RV-: 0,02

RV+: ∞

RV-: 0,03

RV+: ∞

RV-: 0,08

RV+: ∞

RV-: 0,13

RV+: ∞

RV-: 0,12

4.5.3 Seleção das diluições mais aplicáveis a distinção entre indivíduos com

infecção chagásica e não infectados através do cálculo da diferença entre a

mediana de DO do grupo com infecção chagásica e a DO do grupo controle

As diluições de soro para IgG e subclasses de IgG que apresentaram valores de

sensibilidade e especificidade superiores a 90 e ASC superior a 0,9, como descrito no

item anterior 4.5.2 Avaliação do desempenho da técnica de ELISA não comercial por

meio da construção das curvas ROC de IgG e subclasses de IgG nas diluições

previamente selecionadas, foram submetidas a análise individual da mediana da DO. Os

gráficos de dispersão individual das DOs dos indivíduos com infecção chagásica e do

grupo controle possibilitaram a análise da diferença entre a mediana de DO

do grupo

infectado e do grupo controle, e a escolha das diluições de soro mais indicadas para

cada imunoglobulina. As diluições de soro que apresentaram ∆DO

mediana

igual ou acima

de 0,2 foram as selecionadas pois consideramos esse valor como o mínimo seguro para

a segregação entre indivíduos infectados dos não infectados.

4.5.3.1 Gráficos de dispersão de IgG total

A análise de IgG total demonstrou que nas diluições de 1:10 até 1:320 os

valores de ∆DO

mediana

foram superiores a 0,2, garantindo nessas diluições segurança

para a discriminação entre os soros dos indivíduos com infecção chagásica e o grupo

controle. Para as demais diluições (1:640 e 1:1.280), ∆DO

mediana

apresentou-se abaixo de

0,2, não sendo segura sua utilização para segregação de indivíduos com infecção

chagásica dos não infectados (Figura 11).

Figura 11 - ELISA não comercial em soros de pacientes de Berilo, Vale do Jequitinhonha,

MG, infectados ou não por Trypanosoma cruzi, nas diluições de 1:10, 1:20, 1:40, 1:80,

1:160, 1:320, 1:640 e 1:1.280, utilizando antígeno alcalino de cepa Y de Trypanosoma

cruzi, conjugado anti-IgG total diluído a 1:10.000 e HRP-estreptavidina a 1:1.000. Seleção

das diluições que apresentaram ∆DO

mediana

≥0,200. O retângulo vermelho assinala as

melhores diluições de soro para segregar indivíduos com infecção chagásica de não

infectados. ∆DO

mediana,

= diferença entre mediana de DO do grupo com infecção chagásica e

a DO do grupo controle, CONT (grupo não infectado), CH (pacientes com infecção

chagásica).

4.5.3.2 Gráficos de dispersão de IgG1

Na análise de IgG1, apenas a diluição de soro 1:10 apresentou ∆DO

mediana

superior a 0,2, indicando essa diluição como a escolhida para a segregação entre

indivíduos com infecção chagásica e não infectados pela dosagem dessa subclasse de

CONT CH

0.0

0.400

0.800

0.145

∆DO

mediana=0,387

IgG total 1:10

CONT CH

0.0

0.400

0.800

0.126

∆DO

mediana=0,346

IgG total 1:20

CONT CH

0.0

0.400

0.800

0.125

∆DO

mediana=0,338

IgG total 1:40

*p<0,0001

CONT CH

0.0

0.400

0.800

0.099

*p<0,0001

∆DO

mediana=0,333

IgG total 1:80

CONT CH

0.0

0.400

0.800

0.091

*p<0,0001

∆DO

mediana=0,308

IgG total 1:160

CONT CH

0.0

0.400

0.800

0.075

*p<0,0001

∆DO

mediana=0,209

IgG total 1:320

CONT CH

0.0

0.400

0.800

*p<0,0001

0.062

∆DO

mediana=0,156

IgG total 1:640

CONT

0.0

0.400

0.800

0.055

*p<0,0001

∆DO

mediana=0,095

IgG total 1:1280

CONT CH

0.0

0.400

0.800

0.145

∆DO

mediana=0,387

IgG total 1:10

CONT CH

0.0

0.400

0.800

0.126

∆DO

mediana=0,346

IgG total 1:20

CONT CH

0.0

0.400

0.800

0.125

∆DO

mediana=0,338

IgG total 1:40

*p<0,0001

CONT CH

0.0

0.400

0.800

0.099

*p<0,0001

∆DO

mediana=0,333

IgG total 1:80

CONT CH

0.0

0.400

0.800

0.091

*p<0,0001

∆DO

mediana=0,308

IgG total 1:160

CONT CH

0.0

0.400

0.800

0.075

*p<0,0001

∆DO

mediana=0,209

IgG total 1:320

CONT CH

0.0

0.400

0.800

*p<0,0001

0.062

∆DO

mediana=0,156

IgG total 1:640

CONT

0.0

0.400

0.800

0.055

*p<0,0001

∆DO

mediana=0,095

IgG total 1:1280

IgG. As diluições de soro 1:20 e 1:40 não permitiram esta segregação de maneira segura

(Figura 12).

Figura 12 - ELISA não comercial em soros de pacientes de Berilo, Vale do Jequitinhonha, MG,

infectados ou não por Trypanosoma cruzi, nas diluições de 1:10, 1:20 e 1:40, utilizando antígeno

alcalino de cepa Y de Trypanosoma cruzi, conjugado anti-IgG1 diluído a 1:500 e HRP-

estreptavidina a 1:1.000. Seleção das diluições que apresentaram ∆DO

mediana

≥0,200. O retângulo

vermelho assinala a melhor diluição de soro para segregar indivíduos com infecção chagásica de

não infectados. ∆DO

mediana,

= diferença entre mediana de DO do grupo com infecção chagásica e a

DO do grupo controle, CONT (grupo não infectado), CH (pacientes com infecção chagásica).

4.5.3.3 Gráficos de dispersão de IgG2

A análise de IgG2 demonstrou que as diluições de soro 1:10 e 1:20, cujos

valores de ∆DO

mediana

foram superiores a 0,2, foram as selecionadas como as mais

seguras para segregar soros de indivíduos com infecção chagásica dos não infectados

para essa subclasse de IgG (Figura 13).

CONT CH

0.0

0.500

1.000

∆DO

mediana=0,293

*p<0,0001

0.103

IgG1 1:10

CONT CH

0.0

0.500

1.000

*p<0,0001

∆DO

mediana=0,152

IgG1 1:20

0.107

IgG1 1:40

CONT CH

0.0

0.500

1.000

0.107

*p<0,0001

∆DO

mediana=0,092

CONT CH

0.0

0.500

1.000

∆DO

mediana=0,293

*p<0,0001

0.103

IgG1 1:10

CONT CH

0.0

0.500

1.000

*p<0,0001

∆DO

mediana=0,152

IgG1 1:20

0.107

IgG1 1:40

CONT CH

0.0

0.500

1.000

0.107

*p<0,0001

∆DO

mediana=0,092

Figura 13 - ELISA não comercial em soros de pacientes de Berilo, Vale do Jequitinhonha, MG,

infectados ou não por Trypanosoma cruzi, nas diluições de 1:10, 1:20 e 1:40, utilizando antígeno

alcalino de cepa Y de Trypanosoma cruzi, conjugado anti-IgG2 diluído a 1:2.500 e HRP-

estreptavidina a 1:1.000. Seleção das diluições que apresentaram ∆DO

mediana

≥0,200. O retângulo

vermelho assinala as melhores diluições de soro para segregar indivíduos infectados de não

infectados. ∆DO

mediana,

= diferença entre mediana de DO do grupo com infecção chagásica e a DO

do grupo controle, CONT (grupo não infectado), CH (pacientes com infecção chagásica).

4.5.3.4 Gráficos de dispersão de IgG3

A análise dos valores de ∆DO

mediana

para IgG3 indica que as diluições de 1:10

até 1:320 são todas indicadas para a segregação entre indivíduos com infecção

chagásica e não infectados, por apresentarem valores de ∆DO

mediana

superiores a 0,2

(Figura 14).

CONT

0.0

0.500

1.000

*p<0,0001

∆DO

mediana=0,274

IgG2 1:10

0.155

CONT CH

0.0

0.500

1.000

0.104

IgG2 1:40

*p<0,0001

∆DO

mediana=0,162

0.156

CONT CH

0.0

0.500

1.000

*p<0,0001

∆DO

mediana=0,228

IgG2 1:20

CONT

0.0

0.500

1.000

*p<0,0001

∆DO

mediana=0,274

IgG2 1:10

0.155

CONT CH

0.0

0.500

1.000

0.104

IgG2 1:40

*p<0,0001

∆DO

mediana=0,162

0.156

CONT CH

0.0

0.500

1.000

*p<0,0001

∆DO

mediana=0,228

IgG2 1:20

Figura 14 - ELISA não comercial em soros de pacientes de Berilo, Vale do Jequitinhonha, MG,

infectados ou não por Trypanosoma cruzi, nas diluições de 1:10, 1:20, 1:40, 1:80, 1:160 e 1:320,

utilizando antígeno alcalino de cepa Y de T. cruzi, conjugado anti-IgG3 diluído a 1:1.000 e HRP-

estreptavidina a 1:1.000. Seleção das diluições que apresentaram ∆DO

mediana

≥0,200. O retângulo

vermelho assinala as melhores diluições de soro para segregar indivíduos infectados de não

infectados. ∆DO

mediana,

= diferença entre mediana de DO do grupo com infecção chagásica e a DO

do grupo controle, CONT (grupo não infectado), CH (pacientes com infecção chagásica).

4.6 Avaliação da aplicabilidade do ELISA não comercial na segregação sorológica

de indivíduos com infecção chagásica e portadores de outras doenças infecto-

parasitárias de interesse médico

A análise das melhores diluições de soro de IgG total e suas subclasses IgG1,

IgG2 e IgG3 para a segregação entre indivíduos com infecção chagásica (CH) e

indivíduos portadores de HIV, HCV, SIF, LV e LT em conjunto com o grupo controle

(NCH), foi realizada por meio da construção e análise das curvas ROC. As curvas ROC

para cada imunoglobulina foram construídas de acordo com as diluições mais indicadas

*p<0,0001

∆DO

mediana=0,445

IgG3 1:10

CONT CH

0.0

0.500

1.000

0.239

CONT CH

0.0

0.500

1.000

0.209

*p<0,0001

∆DO

mediana=0,420

IgG3 1:20

CONT CH

0.0

0.500

1.000

IgG3 1:40

0.145

*p<0,0001

∆DO

mediana=0,407

CONT CH

0.0

0.500

1.000

0.132

*p<0,0001

∆DO

mediana=0,329

IgG3 1:80

CONT CH

0.0

0.500

1.000

*p<0,0001

∆DO

mediana=0,319

0.117

IgG3 1:160

CONT CH

0.0

0.500

1.000

IgG3 1:320

0.148

*p<0,0001

∆DO

mediana=0,248

*p<0,0001

∆DO

mediana=0,445

IgG3 1:10

CONT CH

0.0

0.500

1.000

0.239

CONT CH

0.0

0.500

1.000

0.209

*p<0,0001

∆DO

mediana=0,420

IgG3 1:20

CONT CH

0.0

0.500

1.000

IgG3 1:40

0.145

*p<0,0001

∆DO

mediana=0,407

CONT CH

0.0

0.500

1.000

0.132

*p<0,0001

∆DO

mediana=0,329

IgG3 1:80

CONT CH

0.0

0.500

1.000

*p<0,0001

∆DO

mediana=0,319

0.117

IgG3 1:160

CONT CH

0.0

0.500

1.000

IgG3 1:320

0.148

*p<0,0001

∆DO

mediana=0,248

para a segregação entre indivíduos com infecção chagásica e não infectados, como

descrito no item 4.5 Detecção da reatividade de IgG e subclasses de IgG anti-T. cruzi

por meio do ensaio imunoenzimático não comercial aplicado ao diagnóstico sorológico

da doença de Chagas. De acordo com essa seleção, para IgG total foram construídas as

curvas ROC nas diluições de 1:10 a 1:320, para IgG1 na diluição de 1:10, para IgG2

1:10 e 1:20 e para IgG3 1:10 a 1:320.

Foram feitos ajustes nos pontos de corte para cada diluição de soro, e a análise

de desempenho foi realizada de acordo com os valores de sensibilidade e especificidade

acima de 90, ASC superior a 0,9 e menor índice de reatividade cruzada.

4.6.1 Gráfico de dispersão de DO e curva ROC para IgG total

A análise das curvas ROC e dos gráficos de dispersão de DO para IgG total nas

diluições de soro de 1:10 a 1:320 estabelecidas no item 4.5 como as mais indicadas para

a segregação de indivíduos com infecção chagásica dos não infectados, foi realizada

com os grupos NCH e CH. Quando os valores de DO desses dois grupos foram

avaliados, verificou-se um excelente desempenho da técnica nas diluições 1:10, 1:20 e

1:40, com sensibilidade e especificidade de 100,0%, ASC igual a 1,000, e valores de

RV que indicam certeza do método para segregar os indivíduos com infecção chagásica

dos demais. Nessas diluições não foi detectada reatividade cruzada dos soros dos

indivíduos com outras infecções, e todos aqueles com infecção chagásica foram

detectados como reativos.

Na diluição de soro 1:80, a especificidade manteve-se a 100,0%, garantindo a

ausência de reatividade cruzada, e a sensibilidade de 96,7% indicou que dois pacientes

com doença de Chagas apresentaram valores de DO abaixo do novo ponto de corte

estabelecido pela curva ROC. A ASC para essa diluição de 0,999 garantiu elevada

acurácia ao teste. A RV para o resultado positivo indicou que é infinitamente provável

que um resultado positivo seja detectado em um indivíduo com infecção chagásica.

Nessa diluição valores iguais ou inferiores ao ponto de corte estabelecido pela curva

ROC apresentam uma chance mínima de 0,03 vezes de advir de um indivíduo com

infecção chagásica.

Na diluição 1:160, um paciente com doença de Chagas apresentou DO abaixo

do ponto de corte (sensibilidade de 98,3%) e dois indivíduos, um com LV e outro com

LT, apresentaram reação cruzada (especificidade 96,3%), gerando um índice de

reatividade cruzada de 3,7%. A ASC para essa diluição de 0,995 garantiu ao teste

elevada acurácia. A RV para o resultado positivo indicou que é infinitamente provável

que um resultado positivo venha de um indivíduo com doença de Chagas. Nessa

diluição, valores iguais ou inferiores ao ponto de corte apresentam uma chance de 0,02

vezes de advir de um indivíduo com infecção chagásica.

Na diluição 1:320, a sensibilidade alcançada pela técnica foi de 100,0%,

indicando que todos os indivíduos com infecção chagásica foram detectados como

infectados. A especificidade nessa diluição de 96,3% demonstrou que os mesmos dois

indivíduos com LT e LV detectados anteriormente apresentaram reação cruzada, com

índice de reatividade cruzada também de 3,7%. A ASC para essa diluição de 0,995

garantiu ao teste elevada acurácia. O valor de RV para o resultado positivo indicou que

é infinitamente provável que um resultado positivo venha de um indivíduo com

infecção chagásica. A RV para o resultado negativo indica que não há chance de um

resultado negativo advir de um indivíduo com infecção chagásica.

A análise dos valores de especificidade, sensibilidade, ASC, índice de

reatividade cruzada e RV, indica que as diluições de soro 1:10, 1:20 e 1:40 apresentam

os melhores índices, considerados como índices de teste perfeito, para assegurar uma

discriminação entre os indivíduos com infecção chagásica e os portadores de outras

infecções juntamente com o grupo controle não infectado. A diluição do soro 1:40 foi

selecionada como a indicada para a análise de IgG total em virtude da necessidade de

menor volume do soro utilizado para a execução do teste nessa diluição, quando

comparada com as diluições 1:10 e 1:20 (Figura 15).

Figura 15 - Gráficos de dispersão e curvas ROC de IgG total para os soros de indivíduos do grupo controle

não infectado e portadores de outras infecções (NCH) e indivíduos com infecção chagásica (CH) nas diluições

de soro 1:10, 1:20, 1:40, 1:80, 1:160 e 1:320, construídos a partir da técnica de ELISA não comercial

utilizando antígeno alcalino de cepa Y de Trypanosoma cruzi, IgG total diluído a 1:10.000 e HRP-

estreptavidina a 1:1.000. Sens: sensibilidade; Espec:especificidade; PC: ponto de corte; RV: Razão de

Verosimilhança. O resultado da reatividade de IgG total para cada amostra individual está expresso no gráfico

de dispersão, onde a linha pontilhada indica o ponto de corte para cada diluição. O retângulo vermelho indica

a diluição selecionada para essa imunoglobulina.

4.6.2 Gráfico de dispersão de DO e curva ROC para IgG1

Para a discriminação entre soros de indivíduos com infecção chagásica e o

grupo controle a diluição de IgG1 selecionada foi 1:10. A análise da curva ROC e do

gráfico de dispersão de DO para essa diluição de IgG1 demonstrou valores de

sensibilidade de 100,0%, indicando que todos os indivíduos com infecção chagásica

foram detectados como reativos. A especificidade de 90,7% indica que cinco indivíduos

do grupo NCH apresentaram reação cruzada. Desses cinco, quatro são portadores de LV

e um de LT, gerando um índice de reatividade cruzada de 9,25%. O valor de ASC de

0,936 garante ao teste elevada acurácia. O valor de RV para o resultado positivo indica

Sensibilidade

IgG total diluição 1:20

NCH

n=54

n=60

IgG total diluição 1:10

0.800

0.400

0.0

0.309

n=60

NCH

n=54

100

20 40 60 80

100

Sens: 100,0 ( 94,0- 100,0)

Espec: 100,0 ( 93,3-100,0)

ASC: 1,000

IgG total diluição 1:10

RV+: ∞

RV-: 0,00

PC= 0,309

100

0 20 40 60 80

Sens: 100,0 ( 94,0- 100,0)

Espec: 100,0 ( 93,3-100,0)

ASC: 1,000

RV+: ∞

RV-: 0,00

IgG total diluição 1:20

PC= 0,296

100

0 20 40 60 80 100

100

Sens: 100,0 ( 94,0- 100,0)

Espec: 100,0 ( 93,3-100,0)

ASC: 1,000

RV+: ∞

RV-: 0,00

PC= 0,272

IgG total diluição 1:40

0.800

0.400

0.0

0.296

0.800

0.400

0.0

0.272

NCH

n=54

n=60

IgG total diluição 1:40

0 20 40 60 80 100

100

Sens: 100,0 ( 94,0-100,0)

Espec: 96,3 ( 87,2-99,4)

ASC: 0,995

RV+: ∞

RV-: 0,00

PC= 0,082

IgG total diluição 1:320

0 20 40 60 80 100

100

Sens: 96,7 ( 88,4-99,5)

Espec: 100,0 ( 93,3-100,0)

ASC: 0,999

RV+: ∞

RV-: 0,03

PC= 0,232

IgG total diluição 1:80

0 20 40 60 80 100

100

Sens: 98,3 ( 91,0-99,7)

Espec: 96,3 ( 87,2-99,4)

ASC: 0,995

RV+: ∞

RV-: 0,02

PC= 0,184

IgG total diluição 1:160

n=60

0.800

0.400

0.0

NCH

n=54

0.234

IgG total diluição 1:80

0.800

0.400

0.0

0.184

NCH

n=54

n=60

IgG total diluição 1:160

0.800

0.400

0.0

NCH

n=54

n=60

IgG total diluição 1:320

0.082

100 – Especificidade

Sensibilidade

IgG total diluição 1:20

NCH

n=54

n=60

IgG total diluição 1:10

0.800

0.400

0.0

0.309

n=60

NCH

n=54

100

20 40 60 80

100

Sens: 100,0 ( 94,0- 100,0)

Espec: 100,0 ( 93,3-100,0)

ASC: 1,000

IgG total diluição 1:10

RV+: ∞

RV-: 0,00

PC= 0,309

100

0 20 40 60 80

Sens: 100,0 ( 94,0- 100,0)

Espec: 100,0 ( 93,3-100,0)

ASC: 1,000

RV+: ∞

RV-: 0,00

IgG total diluição 1:20

PC= 0,296

100

0 20 40 60 80 100

100

Sens: 100,0 ( 94,0- 100,0)

Espec: 100,0 ( 93,3-100,0)

ASC: 1,000

RV+: ∞

RV-: 0,00

PC= 0,272

IgG total diluição 1:40

0.800

0.400

0.0

0.296

0.800

0.400

0.0

0.272

NCH

n=54

n=60

IgG total diluição 1:40

0 20 40 60 80 100

100

Sens: 100,0 ( 94,0-100,0)

Espec: 96,3 ( 87,2-99,4)

ASC: 0,995

RV+: ∞

RV-: 0,00

PC= 0,082

IgG total diluição 1:320

0 20 40 60 80 100

100

Sens: 96,7 ( 88,4-99,5)

Espec: 100,0 ( 93,3-100,0)

ASC: 0,999

RV+: ∞

RV-: 0,03

PC= 0,232

IgG total diluição 1:80

0 20 40 60 80 100

100

Sens: 98,3 ( 91,0-99,7)

Espec: 96,3 ( 87,2-99,4)

ASC: 0,995

RV+: ∞

RV-: 0,02

PC= 0,184

IgG total diluição 1:160

n=60

0.800

0.400

0.0

NCH

n=54

0.234

IgG total diluição 1:80

0.800

0.400

0.0

0.184

NCH

n=54

n=60

IgG total diluição 1:160

0.800

0.400

0.0

NCH

n=54

n=60

IgG total diluição 1:320

0.082

0.800

0.400

0.0

NCH

n=54

n=60

IgG total diluição 1:320

0.082

100 – Especificidade

que é infinitamente provável que valores acima do ponto de corte sejam observados em

um indivíduo com infecção chagásica. O valor de RV negativo igual a zero indica que

não há chance de valores iguais ou inferiores ao ponto de corte advirem de indivíduos

com infecção chagásica (Figura 16).

Figura 16 - Gráfico de dispersão e curva ROC de IgG1 para os soros de indivíduos do grupo controle

não infectado e portadores de outras infecções (NCH) e indivíduos com infecção chagásica (CH)

diluídos a 1:10, construídos a partir da técnica de ELISA não comercial utilizando antígeno alcalino de

cepa Y de Trypanosoma cruzi, IgG1 diluído a 1:500 e HRP-estreptavidina a 1:1.000. Sens:

sensibilidade; Espec:especificidade; PC: ponto de corte; RV: Razão de Verosimilhança. O resultado da

reatividade de IgG1 para cada amostra individual está expresso no gráfico de dispersão, onde a linha

pontilhada indica o ponto de corte para cada diluição.

4.6.3 Gráfico de dispersão de DO e curva ROC para IgG2

O gráficos de dispersão de DO e as curvas ROC de IgG2 das diluições de soro

1:10 e 1:20 foram construídos, e sua análise permitiu verificar qual diluição de soro é

mais adequada para discriminar os grupos NCH e CH.

Na diluição de soro 1:10, a sensibilidade de 100,0% indicou que todos os

indivíduos com infecção chagásica foram detectados como reativos, e a especificidade

de 88,9% indicou que seis indivíduos, três com LV e três com LT apresentaram reação

cruzada, gerando um índice de reatividade cruzada de 11,1%. O valor de ASC de 0,976

garantiu ao teste elevada acurácia. O valor de RV do resultado positivo foi de 7,71,

demonstrando que valores acima do ponto de corte são cerca de 7,71 vezes mais

prováveis de serem observados em indivíduos com infecção chagásica. O valor de RV

0 20 40 60 80 100

100

Sens: 100,0 ( 94,0- 100,0)

Espec: 90,7 ( 79,7-96,9)

ASC: 0,936

RV+: ∞

RV-: 0,00

PC= 0,145

IgG1 diluição 1:10

1.400

0.700

0.0

0.145

NCH

n=54

n=60

IgG1 diluição 1:10

100- especificidade

Sensibilidade

0 20 40 60 80 100

100

Sens: 100,0 ( 94,0- 100,0)

Espec: 90,7 ( 79,7-96,9)

ASC: 0,936

RV+: ∞

RV-: 0,00

PC= 0,145

IgG1 diluição 1:10

1.400

0.700

0.0

0.145

NCH

n=54

n=60

IgG1 diluição 1:10

100- especificidade

Sensibilidade

para o resultado negativo igual a zero indica que não há chance de valores iguais ou

inferiores ao ponto de corte advirem de um indivíduo com infecção chagásica.

Na diluição 1:20, a sensibilidade de 96,7% indicou que dois indivíduos com

infecção chagásica apresentaram valor de DO abaixo do ponto de corte, e a

especificidade de 88,9% indicou que seis indivíduos, três com LV e três com LT

apresentaram reação cruzada, com um índice de reatividade cruzada de 11,1%. O valor

de ASC igual a 0,982, garantiu elevada acurácia ao teste. O valor de RV para o

resultado positivo demonstra que é 8,7 vezes mais provável um resultado positivo vir de

um indivíduo com infecção chagásica. O valor de RV para o resultado negativo indica

que há uma chance de 0,04 vezes de um resultado negativo advir de um indivíduo com

infecção chagásica (Figura 17).

Para IgG2 a diluição selecionada foi a 1:10, embora os valores dos índices de

desempenho tenham sido próximos para as duas diluições. A escolha da diluição 1:10

foi principalmente em decorrência da maior sensibilidade alcançada. O índice de

reatividade cruzada para as duas diluições foi o mesmo, indicando que independente da

diluição usada três indivíduos com LV e três com LT apresentariam DO acima do ponto

de corte. A sensibilidade da diluição 1:10 demonstrou que todos os indivíduos com

infecção chagásica seriam detectados como reativos, o que não ocorreu para a diluição

1:20.

Figura 17 - Gráfico de dispersão e curva ROC de IgG2 para os soros de indivíduos do grupo

controle não infectado e portadores de outras infecções (NCH) e indivíduos com infecção

chagásica (CH) diluídos a 1:10 e 1:20, construídos a partir da técnica de ELISA não

comercial utilizando antígeno alcalino de cepa Y de Trypanosoma cruzi, IgG2 diluído a

1:2.500 e HRP-estreptavidina a 1:1.000. Sens: sensibilidade; Espec:especificidade; PC: ponto

de corte; RV: Razão de Verosimilhança. O resultado da reatividade de IgG2 para cada

amostra individual está expresso no gráfico de dispersão, onde a linha pontilhada indica o

ponto de corte para cada diluição. O retângulo vermelho indica a diluição selecionada para

essa imunoglobulina.

4.6.4 Gráfico de dispersão de DO e curva ROC para IgG3

A análise das curvas ROC e dos gráficos de dispersão de DO das diluições

previamente selecionadas como as mais indicadas para a segregação entre indivíduos

com infecção chagásica e não infectados foi realizada para a determinação da diluição

mais adequada para discriminar os soros do grupo NCH e CH.

Na diluição 1:10, a sensibilidade alcançada pela técnica foi de 98,3%,

indicando que um indivíduo com infecção chagásica apresentou valor de DO abaixo do

novo ponto de corte determinado pela curva ROC. A especificidade de 96,3% indicou

que dois indivíduos com LV apresentaram reação cruzada, com um índice de

0 20 40 60 80 100

100

Sens: 100,0 ( 94,0- 100,0)

Espec: 88,9 ( 77,4-95,8)

ASC: 0,976

RV+: 7,71

RV-: 0,00

PC= 0,155

IgG2 diluição 1:10

NCH

n=54

n=60

IgG2 diluição 1:10

1.000

0.500

0.0

0.155

0 20 40 60 80 100

100

Sens: 96,7 ( 88,4-99,5)

Espec: 88,9 ( 77,4-95,8)

ASC: 0,982

RV+: 8,7

RV-: 0,04

PC= 0,114

IgG2 diluição 1:20

1.000

0.500

0.0

0.114

NCH

n=54

n=60

IgG2 diluição 1:20

100- especificidade

Sensibilidade

0 20 40 60 80 100

100

Sens: 100,0 ( 94,0- 100,0)

Espec: 88,9 ( 77,4-95,8)

ASC: 0,976

RV+: 7,71

RV-: 0,00

PC= 0,155

IgG2 diluição 1:10

NCH

n=54

n=60

IgG2 diluição 1:10

1.000

0.500

0.0

0.155

0 20 40 60 80 100

100

Sens: 96,7 ( 88,4-99,5)

Espec: 88,9 ( 77,4-95,8)

ASC: 0,982

RV+: 8,7

RV-: 0,04

PC= 0,114

IgG2 diluição 1:20

1.000

0.500

0.0

0.114

NCH

n=54

n=60

IgG2 diluição 1:20

100- especificidade

Sensibilidade

reatividade cruzada de 3,7%. A ASC de 0,991 garantiu ao teste elevada acurácia. O

valor de RV para o resultado positivo indica que é infinitamente provável que valores

acima do ponto de corte sejam observados em um indivíduo com infecção chagásica. O

valor de RV para o resultado negativo indica que valores iguais ou inferiores ao ponto

de corte apresentam uma chance de 0,02 vezes de advirem de um indivíduo com

infecção chagásica.

Na diluição 1:20, a sensibilidade alcançada pela técnica foi de 95,0%,

indicando que três indivíduos com infecção chagásica apresentaram DO abaixo do novo

ponto de corte determinado pela curva ROC. A especificidade de 98,1% indica que um

indivíduo com LV apresentou reação cruzada, gerando um índice de reatividade cruzada

de 1,85%. A ASC de 0,992 para essa diluição de soro garantiu elevada acurácia da

técnica. O valor de RV para o resultado positivo indica que é infinitamente provável que

valores acima do ponto de corte sejam observados em um indivíduo com infecção

chagásica. O valor de RV para o resultado negativo indica que valores iguais ou

inferiores ao ponto de corte apresentam uma chance de 0,05 vezes de advirem de um

indivíduo com infecção chagásica.

Na diluição 1:40, a sensibilidade de 93,3% indicou que quatro indivíduos com

infecção chagásica apresentaram DO abaixo do ponto de corte estabelecido pela curva

ROC. A especificidade de 98,1% indicou que um indivíduo com LV apresentou reação

cruzada, gerando um índice de reatividade cruzada de 1,85%. A ASC de 0,990 garantiu

elevada acurácia ao teste. O valor de RV para o resultado positivo indica que é

infinitamente provável que valores acima do ponto de corte sejam observados em um

indivíduo com infecção chagásica. O valor de RV para o resultado negativo indica que

valores iguais ou inferiores ao ponto de corte apresentam uma chance de 0,07 vezes de

advirem de um indivíduo com infecção chagásica.

Na diluição 1:80, a sensibilidade alcançada pela técnica foi de 96,7% e indicou

que dois indivíduos com infecção chagásica apresentaram DO abaixo do ponto de corte

estabelecido pela curva ROC. A especificidade de 96,3% indicou que dois indivíduos

com LV apresentaram reação cruzada, com índice de reatividade cruzada de 3,7%. A

ASC de 0,982 garantiu elevada acurácia ao teste. O valor de RV para o resultado

positivo indica que é infinitamente provável que valores acima do ponto de corte sejam

observados em um indivíduo com infecção chagásica. O valor de RV para o resultado

negativo indica que valores iguais ou inferiores ao ponto de corte apresentam uma

chance de 0,03 vezes de advirem de um indivíduo com infecção chagásica.

Na diluição 1:160, a sensibilidade de 96,7% indicou que dois indivíduos com

infecção chagásica apresentaram DO abaixo do ponto de corte. A especificidade de

94,4% indicou que três indivíduos com LV apresentaram reação cruzada, com índice de

reatividade cruzada de 5,6%. A ASC de 0,986 garantiu elevada acurácia ao teste. O

valor de RV para o resultado positivo indica que é infinitamente provável que valores

acima do ponto de corte sejam observados em um indivíduo com infecção chagásica. O

valor de RV para o resultado negativo indica que valores iguais ou inferiores ao ponto

de corte apresentam uma chance de 0,04 vezes de advirem de um indivíduo com

infecção chagásica.

Na diluição 1:320, a sensibilidade de 91,7% indicou que cinco indivíduos com

infecção chagásica apresentaram DO abaixo do ponto de corte. A especificidade de

100,0% indicou que todos os indivíduos do grupo NCH foram considerados como não

reativos, não havendo reações cruzadas nessa diluição de soro. O valor de RV para o

resultado positivo indica que é infinitamente provável que valores acima do ponto de

corte sejam observados em um indivíduo com infecção chagásica. O valor de RV para o

resultado negativo indica que valores iguais ou inferiores ao ponto de corte apresentam

uma chance de 0,04 vezes de advirem de um indivíduo com infecção chagásica.

Para IgG3 a diluição selecionada capaz de segregar com os melhores valores de

sensibilidade, especificidade, ASC e índice de reatividade cruzada em conjunto foi a

diluição 1:20 (Figura 18).

Figura 18 - Gráficos de dispersão e curvas ROC de IgG3 para os soros de indivíduos do grupo controle não

infectado e portadores de outras infecções (NCH) e indivíduos com infecção chagásica (CH) diluídos a 1:10, 1:20,

1:40, 1:80, 1:160 e 1:320, construídos a partir da técnica de ELISA não comercial utilizando antígeno alcalino de

cepa Y de Trypanosoma cruzi, IgG3 diluído a 1:1.000 e HRP-estreptavidina a 1:1.000. Sens: sensibilidade;

Espec:especificidade; PC: ponto de corte; RV: Razão de Verosimilhança. O resultado da reatividade de IgG3 para

cada amostra individual está expresso no gráfico de dispersão, onde a linha pontilhada indica o ponto de corte

para cada diluição. O retângulo vermelho indica a diluição selecionada para essa imunoglobulina.

Após análise das curvas ROC e dos gráficos de dispersão de IgG e subclasses

de IgG, foram estabelecidas as diluições de soro mais adequadas para discriminação

entre indivíduos com infecção chagásica, indivíduos não infectados e indivíduos com

outras doenças infecto-parasitárias (Figura 19).

Para IgG total a diluição de 1:40 selecionada como a mais adequada para a

segregação entre indivíduos com infecção chagásica, não infectados e portadores de

outras doenças infecto-parasitárias, não apresentou reatividade cruzada. Na pesquisa de

IgG1 verificou-se um índice de reatividade cruzada de 9,25%, sendo 7,4% de resultados

falso-positivos oriundos de indivíduos portadores de LV, e 1,85% de portadores de LT.

O índice de reatividade cruzada para IgG2 foi de 11,1%, com 5,55% de resultados falso-

positivos oriundos de LV e 5,55% de portadores de LT. A pesquisa de IgG3 apresentou

um índice de reatividade cruzada de 1,85% decorrente de um resultado falso-positivo de

0 20 40 60 80

100

Sens: 98,3 ( 91,0-99,7)

Espec: 96,3 ( 87,2-99,4)

ASC: 0,991

RV+: ∞

RV-: 0,02

PC= 0,300

IgG3 diluição 1:10

0 20 40 60 80 100

100

Sens: 95,0 ( 86,1-98,9)

Espec: 98,1 ( 90,1-99,7)

ASC: 0,992

RV+: ∞

RV-: 0,05

PC= 0,322

IgG3 diluição 1:20

1.000

0.500

0.0

0.300

NCH

n=54

n=60

IgG3 diluição 1:10

1.000

0.500

0.0

0.322

NCH

n=54

n=60

IgG3 diluição 1:20

0 20 40 60 80 100

100

Sens: 93,3 ( 83,8-98,1)

Espec: 98,1 ( 90,1-99,7)

ASC: 0,990

RV+: ∞

RV-: 0,07

PC= 0,306

IgG3 diluição 1:40

1.000

0.500

0.0

NCH

n=54

n=60

0.306

IgG3 diluição 1:40

100-especificidade

Sensibilidade

0 20 40 60 80 100

100

Sens: 96,7 ( 88,4-99,5)

Espec: 96,3 ( 87,2-99,4)

ASC: 0,982

RV+: ∞

RV-: 0,03

PC= 0,171

IgG3 diluição 1:80

1.000

0.500

0.0

0.171

NCH

n=54

n=60

IgG3 diluição 1:160

0 20 40 60 80

100

Sens: 96,7 ( 88,4-99,5)

Espec: 94,4 ( 84,6-98,8)

ASC: 0,986

RV+: ∞

RV-: 0,04

PC= 0,124

1.000

0.500

0.0

0.500

NCH

n=54

n=60

IgG3 diluição 1:160

0 20 40 60 80 100

100

Sens: 91,7 ( 81,6-97,2)

Espec: 100,0 ( 93,3-100,0)

ASC: 0,986

RV+: ∞

RV-: 0,04

PC= 0,148

IgG3 diluição 1:320

1.000

0.500

0.0

NCH

n=54

n=60

IgG3 diluição 1:320

0.148

0 20 40 60 80

100

Sens: 98,3 ( 91,0-99,7)

Espec: 96,3 ( 87,2-99,4)

ASC: 0,991

RV+: ∞

RV-: 0,02

PC= 0,300

IgG3 diluição 1:10

0 20 40 60 80 100

100

Sens: 95,0 ( 86,1-98,9)

Espec: 98,1 ( 90,1-99,7)

ASC: 0,992

RV+: ∞

RV-: 0,05

PC= 0,322

IgG3 diluição 1:20

1.000

0.500

0.0

0.300

NCH

n=54

n=60

IgG3 diluição 1:10

1.000

0.500

0.0

0.322

NCH

n=54

n=60

IgG3 diluição 1:20

0 20 40 60 80 100

100

Sens: 93,3 ( 83,8-98,1)

Espec: 98,1 ( 90,1-99,7)

ASC: 0,990

RV+: ∞

RV-: 0,07

PC= 0,306

IgG3 diluição 1:40

1.000

0.500

0.0

NCH

n=54

n=60

0.306

IgG3 diluição 1:40

100-especificidade

Sensibilidade

0 20 40 60 80 100

100

Sens: 96,7 ( 88,4-99,5)

Espec: 96,3 ( 87,2-99,4)

ASC: 0,982

RV+: ∞

RV-: 0,03

PC= 0,171

IgG3 diluição 1:80

1.000

0.500

0.0

0.171

NCH

n=54

n=60

IgG3 diluição 1:160

0 20 40 60 80

100

Sens: 96,7 ( 88,4-99,5)

Espec: 94,4 ( 84,6-98,8)

ASC: 0,986

RV+: ∞

RV-: 0,04

PC= 0,124

1.000

0.500

0.0

0.500

NCH

n=54

n=60

IgG3 diluição 1:160

0 20 40 60 80 100

100

Sens: 91,7 ( 81,6-97,2)

Espec: 100,0 ( 93,3-100,0)

ASC: 0,986

RV+: ∞

RV-: 0,04

PC= 0,148

IgG3 diluição 1:320

1.000

0.500

0.0

NCH

n=54

n=60

IgG3 diluição 1:320

0.148

um indivíduo portador de LV. Apenas para IgG3 foi observado um índice de resultados

falso-negativos de 5%, resultante de três indivíduos com infecção chagásica que

apresentaram DO abaixo do ponto de corte estabelecido.

Figura 19 - Análise da reatividade de IgG e subclasses de IgG por meio da técnica de ELISA não comercial para

a pesquisa de IgG total na diluição 1:10.000, IgG1 1:500, IgG2 1:2.500, IgG3 1:1.000, HRP-estreptavidina a

1:1.000, utilizando antígeno alcalino de cepa Y de Trypanosoma cruzi, em soros de pacientes não infectados

(CONT), e com infecção chagásica (CH) do município de Berilo, Vale do Jequitinhonha, MG, e outras doenças

infecto-parasitárias: HIV, hepatite C (HCV), sífilis (SIF), leishmaniose visceral (LV) e leishmaniose tegumentar

(LT).

4.7 Análise da reatividade de IgG e subclasses de IgG em pacientes portadores de

infecção chagásica com diferentes formas clínicas

4.7.1 Análise da reatividade de IgG e subclasses de IgG por meio da mediana de

DO de cada grupo clínico nas diluições de soro avaliadas

A análise da reatividade de IgG e subclasses de IgG nos pacientes com doença

de Chagas agrupados em diferentes formas clínicas, possibilitou identificar em quais

diluições de soro é possível verificar diferença significativa entre as medianas de DO

dos pacientes com diferentes formas clínicas para cada imunoglobulina.

CONTCH HIV HCV SIF LV LT

0.0

0.500

1.000

0.750

IgG total 1:40

0% de reatividade cruzada

IgG1 1:10

9,25% de reatividade cruzada

1,85%

7,4%

CONT CH HIV HCV SIF LV LT

0.0

0.750

1.500

0.145

CONT CH HIV HCV SIF LV LT

0.0

0.500

1.000

0.155

5,55%5,55%

11,1% de reatividade cruzada

IgG2 1:10

CONT CH HIV HCV SIF LV LT

0.0

0.500

1.000

0.322

1,85% de reatividade cruzada

1,85%

IgG3 1:20

CONTCH HIV HCV SIF LV LT

0.0

0.500

1.000

0.750

IgG total 1:40

0% de reatividade cruzada

IgG1 1:10

9,25% de reatividade cruzada

1,85%

7,4%

CONT CH HIV HCV SIF LV LT

0.0

0.750

1.500

0.145

CONT CH HIV HCV SIF LV LT

0.0

0.500

1.000

0.155

5,55%5,55%

11,1% de reatividade cruzada

IgG2 1:10

CONT CH HIV HCV SIF LV LT

0.0

0.500

1.000

0.322

1,85% de reatividade cruzada

1,85%

IgG3 1:20

Para IgG total as oito diluições de soro analisadas (1:10 a 1:1.280)

apresentaram diferença significativa entre as medianas de DO dos pacientes nos quatro

grupos clínicos analisados (IND, CARD 1, CARD 2 e DIG/MIS).

A análise de IgG1 possibilitou verificar que apenas nas diluições de soro de

1:10 e 1:20 os pacientes com diferentes formas clínicas apresentaram diferença

significativa entre as medianas de DO.

Para IgG2, em nenhuma diluição de soro testada houve diferença significativa

entre as medianas de DO dos pacientes com diferentes formas clínicas da doença de

Chagas.

IgG3 apresentou diferença significativa entre as medianas de DO dos pacientes

com diferentes formas clínicas da doença de Chagas nas diluições de 1:10, 1:20, 1:40 e

1:80. As diluições que apresentaram diferença significativa entre as medianas de DO

dos pacientes com diferentes formas clínicas, estão destacadas pela linha pontilhada na

Figura 20.

Figura 20 - ELISA não comercial para a pesquisa de IgG total na diluição 1:10.000, IgG1 1:500,

IgG2 1:2.500, IgG3 1:1.000, e HRP-estreptavidina a 1:1.000, utilizando antígeno alcalino de cepa Y de

Trypanosoma cruzi, em soros de pacientes com diferentes formas clínicas da doença de Chagas do

município de Berilo, Vale do Jequitinhonha, MG: IND (azul), CARD 1 (amarelo), CARD 2

(vermelho), DIG/MIS (verde). Os gráficos de dispersão apresentam as medianas de DO dos pacientes

em conjunto para cada diluição de soro avaliada (1:10 a 1:1.280). A linha pontilhada indica as

diluições de soro que apresentaram diferença significativa para cada imunoglobulina.

4.7.2 Análise individual da reatividade de IgG e subclasses de IgG em pacientes

com diferentes formas clínicas da doença de Chagas

Os gráficos de dispersão das diluições selecionadas no item 4.7.1 Análise da

reatividade de IgG e subclasses de IgG por meio da mediana de DO de cada grupo

clínico nas diluições de soro avaliadas, foram construídos para a verificação da

reatividade individual de cada paciente dos grupos de formas clínicas da doença de

Chagas.

4.7.2.1 Pesquisa de IgG total

A análise da reatividade de IgG total nos soros de pacientes com diferentes

formas clínicas da doença de Chagas demonstrou que o grupo de pacientes classificado

na forma DIG/MIS apresentou os valores de DO mais elevados em todas as diluições

IgG total

10 20 40 80 160 320 640 1.280

0,175

0,350

0,525

0,700

0,175

0,350

0,525

0,700

10 20 40 80 160 320 640 1.280

IgG1

0,125

0,250

0,375

0,500

10 20 40 80 160 320 640 1.280

IgG2

0,200

0,400

0,600

0,800

IgG3

10 20 40 80 160 320 640 1.280

Inverso da diluição

IgG total

10 20 40 80 160 320 640 1.280

0,175

0,350

0,525

0,700

0,175

0,350

0,525

0,700

10 20 40 80 160 320 640 1.280

IgG1

0,125

0,250

0,375

0,500

10 20 40 80 160 320 640 1.280

IgG2

0,200

0,400

0,600

0,800

IgG3

10 20 40 80 160 320 640 1.280

Inverso da diluição

analisadas (1:10 a 1:1.280) em relação aos demais grupos clínicos. O grupo DIG/MIS

apresentou diferença significativa nos valores de DO em relação aos grupos IND,

CARD 1 e CARD 2 nas diluições de 1:10 a 1:320 e na diluição 1:1.280. Na diluição

1:640, o grupo DIG/MIS apresentou diferença significativa nos valores de DO em

relação aos grupos IND, CARD 1 e CARD 2, e o grupo IND apresentou diferença

significativa nos valores de DO em relação ao grupo CARD 1 (Figura 21).

Figura 21 - ELISA não comercial em soros de pacientes de Berilo, Vale do Jequitinhonha,

MG, nas diluições que apresentaram diferença significativa entre as medianas de DO dos

grupos com diferentes formas clínicas da doença de Chagas (1:10, 1:20, 1:40, 1:80, 1:160,

1:320, 1:640 e 1:1.280), utilizando antígeno alcalino de cepa Y de Trypanosoma cruzi,

conjugado anti-IgG total diluído a 1:10.000 e HRP-estreptavidina 1:1.000.

IgG total 1:10

p<0,05

IND CARD 1 CARD 2 DIG/MIS

0.0

0.500

1.000

IND CARD 1 CARD 2 DIG/MIS

0.0

0.500

1.000

p<0,05

IgG total 1:20

IND CARD 1 CARD 2 DIG/MIS

0.0

0.500

1.000

IgG total 1:40

p<0,05

IND CARD 1 CARD 2 DIG/MIS

0.0

0.500

1.000

p<0,05

IgG total 1:80

IND CARD 1 CARD 2 DIG/MIS

0.0

0.500

1.000

p<0,05

IgG total 1:160

IND CARD 1 CARD 2 DIG/MIS

0.0

0.500

1.000

p<0,05

IgG total 1:320

IND CARD 1 CARD 2 DIG/MIS

0.0

0.500

1.000

IgG total 1:640

IND CARD 1 CARD 2 DIG/MIS

0.0

0.500

1.000

p<0,05

IgG total 1:1.280

IgG total 1:10

p<0,05

IND CARD 1 CARD 2 DIG/MIS

0.0

0.500

1.000

IND CARD 1 CARD 2 DIG/MIS

0.0

0.500

1.000

p<0,05

IgG total 1:20

IND CARD 1 CARD 2 DIG/MIS

0.0

0.500

1.000

IgG total 1:40

p<0,05

IND CARD 1 CARD 2 DIG/MIS

0.0

0.500

1.000

p<0,05

IgG total 1:80

IND CARD 1 CARD 2 DIG/MIS

0.0

0.500

1.000

p<0,05

IgG total 1:160

IND CARD 1 CARD 2 DIG/MIS

0.0

0.500

1.000

p<0,05

IgG total 1:320

IND CARD 1 CARD 2 DIG/MIS

0.0

0.500

1.000

IgG total 1:640

IND CARD 1 CARD 2 DIG/MIS

0.0

0.500

1.000

p<0,05

IgG total 1:1.280

4.7.2.2 Pesquisa de IgG1

A análise da reatividade dos soros dos pacientes com diferentes formas clínicas

da doença de Chagas, demonstrou que na diluição de soro 1:10 os pacientes do grupo

IND apresentaram diferença significativa nos valores de DO em relação ao grupo

CARD 1. Na diluição de soro 1:20 os pacientes do grupo IND apresentaram diferença

significativa nos valores de DO em relação aos grupos CARD 1 e CARD 2 (Figura 22).

Figura 22 - ELISA não comercial em soros de pacientes de Berilo, Vale do Jequitinhonha,

MG, nas diluições que apresentaram diferença significativa entre as medianas de DO dos

grupos com diferentes formas clínicas da doença de Chagas (1:10 e 1:20), utilizando antígeno

alcalino de cepa Y de Trypanosoma cruzi, conjugado anti-IgG1 diluído a 1:500 e HRP-

estreptavidina 1:1.000.

4.7.2.3 Pesquisa de IgG3

A análise de IgG3 nos soros dos pacientes com diferentes formas clínicas da

doença de Chagas demonstrou que nas diluições de soro 1:10, 1:20, 1:40 e 1:80 os

pacientes do grupo clínico IND apresentaram valores de DO com diferença significativa

em relação aos grupos CARD 2 e DIG/MIS (Figura 23).

p<0,05

IgG1 1:10

IND CARD 1 CARD 2 DIG/MIS

0.0

0.500

1.000

IND CARD 1 CARD 2 DIG/MIS

0.0

0.500

1.000

p<0,05

IgG1 1:20

p<0,05

IgG1 1:10

IND CARD 1 CARD 2 DIG/MIS

0.0

0.500

1.000

IND CARD 1 CARD 2 DIG/MIS

0.0

0.500

1.000

p<0,05

IgG1 1:20

Figura 23 - ELISA não comercial em soros de pacientes de Berilo, Vale do Jequitinhonha,

MG, nas diluições que apresentaram diferença significativa entre as medianas de DO dos

grupos com diferentes formas clínicas da doença de Chagas (1:10, 1:20, 1:40 e 1:80),

utilizando antígeno alcalino de cepa Y de Trypanosoma cruzi, conjugado anti-IgG3 diluído a

1:1.000 e HRP-estreptavidina 1:1.000.

4.7.2.4 Análise de correlação entre as formas clínicas da doença de Chagas e as

imunoglobulinas

A análise de correlação entre as formas clínicas da doença de Chagas e as

imunoglobulinas demonstrou a existência de uma correlação positiva entre as formas

clínicas da doença de Chagas e os níveis de IgG total em todas a diluições de soro

avaliadas (Figura 24).

p<0,05

IgG3 1:10

IgG3 1:20

IND CARD 1 CARD 2 DIG/MIS

0.0

0.500

1.000

IND CARD 1 CARD 2 DIG/MIS

0.0

0.500

1.000

p<0,05

IND CARD 1 CARD 2 DIG/MIS

0.0

0.500

1.000

p<0,05

IgG3 1:40

IND CARD 1 CARD 2 DIG/MIS

0.0

0.500

1.000

p<0,05

IgG3 1:80

p<0,05

IgG3 1:10

IgG3 1:20

IND CARD 1 CARD 2 DIG/MIS

0.0

0.500

1.000

IND CARD 1 CARD 2 DIG/MIS

0.0

0.500

1.000

p<0,05

IND CARD 1 CARD 2 DIG/MIS

0.0

0.500

1.000

p<0,05

IgG3 1:40

IND CARD 1 CARD 2 DIG/MIS

0.0

0.500

1.000

p<0,05

IgG3 1:80

Figura 24 – Análise de correlação de IgG total e as formas clínicas IND, CARD1, CARD 2 e

DIG/MIS, nas diluições de soro 1:10, 1:20, 1:40, 1:80, 1:160, 1:320, 1:640 e 1:1.280.

Para IgG2 apenas na diluição do soro a 1:160 foi observada uma correlação

positiva com as formas clínicas da doença e a reatividade (Figura 25), enquanto para

IgG1 não foi detectada nenhuma correlação com as formas clínicas da doença.

IgG total 1:10

0.0

0.4

0.8

IND CARD 1 CARD 2 DIG/MIS

IgG total 1:20

0.0

0.4

0.8

IND CARD 1 CARD 2 DIG/MIS

IgG total 1:40

0.0

0.4

0.8

IND CARD 1 CARD 2 DIG/MIS

IgG total 1:80

0.0

0.4

0.8

IND CARD 1 CARD 2 DIG/MIS

IgG total 1:160

0.0

0.4

0.8

IND CARD 1 CARD 2 DIG/MIS

IgG total 1:320

0.0

0.4

0.8

IND CARD 1 CARD 2 DIG/MIS

IgG total 1:640

0.0

0.4

0.8

IND CARD 1 CARD 2 DIG/MIS

IgG total 1:1280

0.0

0.4

0.8

IND CARD 1 CARD 2 DIG/MIS

IgG total

IgG total 1:10

0.0

0.4

0.8

IND CARD 1 CARD 2 DIG/MIS

IgG total 1:10

0.0

0.4

0.8

IND CARD 1 CARD 2 DIG/MIS

IgG total 1:20

0.0

0.4

0.8

IND CARD 1 CARD 2 DIG/MIS

IgG total 1:40

0.0

0.4

0.8

IND CARD 1 CARD 2 DIG/MIS

IgG total 1:80

0.0

0.4

0.8

IND CARD 1 CARD 2 DIG/MIS

IgG total 1:160

0.0

0.4

0.8

IND CARD 1 CARD 2 DIG/MIS

IgG total 1:320

0.0

0.4

0.8

IND CARD 1 CARD 2 DIG/MIS

IgG total 1:640

0.0

0.4

0.8

IND CARD 1 CARD 2 DIG/MIS

IgG total 1:1280

0.0

0.4

0.8

IND CARD 1 CARD 2 DIG/MIS

IgG total

Figura 25 - Análise de correlação de IgG2 e as formas clínicas IND, CARD1, CARD 2

e DIG/MIS, na diluição de soro 1:160.

A análise de IgG3 demonstrou uma correlação negativa entre as formas

clínicas e essa imunoglobulina nas diluições de soro de 1:10 a 1:320 (Figura 26 ).

Figura 26 - Análise de correlação de IgG3 e as formas clínicas IND, CARD1, CARD 2

e DIG/MIS, na diluições de soro de 1:10 a 1:320.

IgG2 1:160

0.00

0.25

0.50

IgG2

IND CARD 1 CARD 2 DIG/MIS

IgG2 1:160

0.00

0.25

0.50

IgG2

IND CARD 1 CARD 2 DIG/MIS

IgG3 1:10

0.0

0.5

1.0

IND CARD 1 CARD 2 DIG/MIS

IgG3 1:20

0.0

0.5

1.0

IND CARD 1 CARD 2 DIG/MIS

IgG3 1:40

0.0

0.5

1.0

IND CARD 1 CARD 2 DIG/MIS

IgG3 1:80

0.0

0.5

1.0

IND CARD 1 CARD 2 DIG/MIS

IgG3 1:160

0.0

0.5

1.0

IND CARD 1 CARD 2 DIG/MIS

IgG3 1:320

0.0

0.5

1.0

IgG3

IND CARD 1 CARD 2 DIG/MIS

IgG3 1:10

0.0

0.5

1.0

IND CARD 1 CARD 2 DIG/MIS

IgG3 1:20

0.0

0.5

1.0

IND CARD 1 CARD 2 DIG/MIS

IgG3 1:40

0.0

0.5

1.0

IND CARD 1 CARD 2 DIG/MIS

IgG3 1:80

0.0

0.5

1.0

IND CARD 1 CARD 2 DIG/MIS

IgG3 1:160

0.0

0.5

1.0

IND CARD 1 CARD 2 DIG/MIS

IgG3 1:320

0.0

0.5

1.0

IgG3

IND CARD 1 CARD 2 DIG/MIS

Na Tabela V estão apresentados os valores de r de Spearman obtidos através

da análise de correlação, que indicam a ocorrência de correlação positiva, negativa ou

ausência desta.

Tabela V- Análise de correlação entre as formas clínicas da doença de Chagas e a reatividade

do soro dos pacientes para as imunoglobulinas IgG total, IgG1, IgG2 e IgG3.

Nota: Valores de r positivos associados a um intervalo de confiança positivo e a p < 0,05 indicam correlação

positiva; r positivo com intervalo de confiança negativo e p > 0,05 indicam ausência de correlação; r negativo com

intervalo de confiança negativo e p < 0,05 indicam correlação negativa. Os valores destacados em azul apresentam

as diluições de soro em que houve correlação positiva e negativa.

Diluição

de soro

IgG total (r de

Spearman/Intervalo

de confiança/p)

IgG1(r de

Spearman/Intervalo

de confiança /p)

IgG2(r de

Spearman/Intervalo

de confiança/p)

IgG3(r de

Spearman/Intervalo

de confiança/p)

1:10 0,3529/ 0,1011-

0,5623/0,0057

0,09426/-0,1711-

0,3469/0,4738

0,1567/-0,1089-

0,4014/0,2319

-0,4063/-0,6034-

0,1624/0,0013

1:20 0,4679/0,2355-

0,6497/0,0002

0,1136/-0,1520-

0,3640/0,3873

0,1403/-0,1254-

0,3873/0,2849

-0,5044/-0,6765-

0,2802/P<0,0001

1:40 0,5647/0,3561-

0,7197/P<0,0001

0,1847/-0,08037-

0,4253/0,1578

0,1902/-0,07461-

0,4300/0,1454

-0,4412/-0,6298-

0,2035/0,0004

1:80 0,5832/0,3799-

0,7328/P<0,0001

0,1253/-0,1405-

0,3742/0,3402

0,1420/-0,1237-

0,3888/0,2790

-0,5285/-0,6939-

0,3102/P<0,0001

1:160 0,6663/0,4905-

0,7900/P<0,0001

-0,03831/-0,2965-

0,2251/0,7713

0,2725/0,01218-

0,4982/0,0352

-0,2780/-0,5027-

0,01822/0,0315

1:320 0,6766/0,5046-

0,7969/P<0,0001

-0,007752/-0,2684-

0,2539/0,9531

0,1395/-0,1263-

0,3866/0,2878

-0,3517/-0,5613-

0,09966/0,0059

1:640 0,6495/0,4677-

0,7786/P<0,0001

-0,04393/-0,3016-

0,2197/0,7389

0,1193/-0,1465-

0,3689/0,3641

-0,08049/-0,3346-

0,1845/0,5410

1:1280 0,6401/0,4549-

0,7721/P<0,0001

-0,07752/-0,3320-

0,1874/0,5560

0,04348/-0,2202-

0,3012/0,7415

-0,06542/-0,3211-

0,1991/0,6194

5. DISCUSSÃO

Neste trabalho foi analisado o perfil epidemiológico, parasitológico e

sorológico, envolvendo a pesquisa de IgG total e subclasses de IgG em um grupo de

pacientes avaliados e caracterizados como portadores de diferentes formas clínicas da

doença de Chagas, em paralelo a um grupo controle não infectado.

A motivação deste estudo se deve especialmente à divergência de resultados

encontrados na literatura em relação ao perfil sorológico de pacientes com

infecção/doença de Chagas e sua correlação com a morbidade.

Adicionalmente, a metodologia empregada na avaliação sorológica dos

pacientes foi também utilizada na análise de soros de indivíduos portadores de algumas

doenças infecto-contagiosas possíveis de serem transmitidas por transfusão sanguínea

ou cujos exames sorológicos apresentam reação cruzada com T. cruzi, tais como as

leishmanioses.

5.1 Avaliação de aspectos epidemiológicos

A avaliação de alguns aspectos epidemiológicos dos pacientes participantes

do estudo, realizada através da aplicação do questionário, revelou alguns fatores de

interesse do ponto de vista epidemiológico.

A maioria dos pacientes avaliados neste trabalho é do sexo feminino, a

presença das mulheres foi marcante nos grupos CARD1, CARD 2 e DIG/MIS. Isso

pode ser justificado pela ausência temporária de muitos homens do município de

Berilo que saem em busca de trabalho em usinas de cana de açúcar do estado de São

Paulo. O período que esta população permanece em São Paulo é em geral de Fevereiro

a Dezembro, o que coincide com a época em que este trabalho foi desenvolvido no

município. Em virtude dessa variável, não podemos considerar esse resultado como

um dado epidemiológico de relevância, mas uma constatação do movimento

migracional que ocorre no município.

A análise das condições de moradia atuais e do passado dos pacientes

possibilitou verificar que a porcentagem de pessoas que nasceram em casa de adobe

sem reboco foi semelhante entre os indivíduos infectados e o grupo controle. Este é um

fato interessante, já que as paredes das casas sem reboco constituíam local de

esconderijo para os insetos triatomíneos, possibilitando sua colonização e

conseqüentemente a transmissão da infecção. No entanto, para que a infecção se

efetive é necessária a ocorrência simultânea de vários fatores. Em função disso a

literatura registra que é comum encontrarmos pessoas de uma mesma família, não

infectadas, morando juntas ao longo de toda vida com pessoas infectadas. Foi notável a

melhoria nas condições de moradia dos participantes do estudo. As casas atualmente

com paredes rebocadas e pintadas facilitam o encontro de insetos, e impedem sua

colonização. Carlos Chagas, na época dos primeiros combates à infecção, já havia

reconhecido que a melhoria nas condições de habitação constitui um importante

elemento no controle da doença de Chagas, já que os insetos podem se esconder em

rachaduras e irregularidades nas paredes das casas (DIAS et al., 2002). Essa melhoria

nas condições de moradia pode ser verificada também quando foram analisados a

presença de água encanada e o encontro de ratos e gambás nas residências. Esses

animais são utilizados pelos barbeiros como fonte alimentar, e sua instalação no

interior das casas propicia a migração dos insetos para o domicílio e posterior

colonização (DIAS, 2000). Nesse contexto, a vigilância epidemiológica deve ser

permanente, para que os insetos sejam detectados com precocidade e sejam

eliminados, impedindo a colonização das residências (MORENO & BARACHO,

2000).

A doença de Chagas ainda representa um importante problema médico e

social nos países afetados. Em alguns deles a doença segue desconhecida e sem

implantação de programas de controle (DIAS, 2000). No Brasil, mais especificamente

no município de Berilo, a infecção foi minimizada em decorrência do controle e das

mudanças sociais e econômicas, como a melhoria das habitações. Em casos como o de

Berilo, uma vigilância epidemiológica duradoura, eficiente e auto-sustentável, capaz

de controlar os triatomíneos em baixa densidade e agora presentes predominantemente

no espaço peridomiciliar tem sido fundamental para o controle da infecção.

Em relação ao reconhecimento do barbeiro no momento da entrevista, não

houve grande diferença nas porcentagens de indivíduos que reconheciam o inseto entre

o grupo controle e os infectados. Apesar de o município ter sido uma área de intensa

transmissão vetorial, sendo os barbeiros encontrados nas residências com facilidade há

cerca de 20 anos, a vigilância epidemiológica implantada no município desde 1997,

reforça o conhecimento do vetor pela população, que relata em entrevista ser

profundamente marcada pela presença da doença de Chagas entre seus familiares.

Muitos pacientes, infectados ou não, relatavam suas experiências com os triatomíneos

vetores, tais como o fato de já terem sido picados, o encontro de barbeiros em suas

camas, nas paredes internas das casas, etc.

Mais recentemente, alguns estudos realizados em Berilo pelo nosso grupo

demonstram que a vigilância epidemiológica implantada apesar de não estar

funcionando da maneira ideal, tem mantido bons índices entomológicos na região, com

redução da infecção aguda (MONTOYA, 1998; BORGES et al., 2006; MACHADO

DE ASSIS, 2006). Atualmente os pacientes relatam que raramente encontram esse tipo

de inseto, o que corrobora os resultados de MACHADO DE ASSIS, (2006) que ao

realizar uma pesquisa integral de triatomíneos em todas as casas do município, da zona

rural e urbana, capturou 391 insetos, dos quais felizmente nenhum estava infectado

pelo T. cruzi, revelando assim o baixo risco de transmissão vetorial da doença de

Chagas na região. Como demonstrado por DIAS, (2000), a redução da transmissão

vetorial resulta a médio prazo na redução das outras principais formas de transmissão,

a transfusional e a congênita, através da diminuição da infecção entre doadores de

sangue e gestantes. A ausência de casos agudos da doença e os baixos índices

entomológicos no município de Berilo indicam a necessidade da manutenção da

vigilância para assegurar o controle da infecção.

Dos pacientes infectados 81,7% moram na zona rural, o que durante o estudo,

dificultou o acesso dessas pessoas à avaliação laboratorial e clínica, realizada na área

urbana do município. Outro fator de grande importância foi o grau de escolaridade,

23,3% dos infectados são analfabetos, o que muitas vezes dificultava o entendimento

entre paciente e entrevistador, especialmente quando eram referenciados os

medicamentos utilizados pelo paciente. Quando comparados esses dados com o grupo

controle, verifica-se que 66,7% vivem na área urbana, e que entre estes, não há

nenhum analfabeto. Apesar do pouco conhecimento dessas pessoas, elas nos

procuravam em busca de esclarecimento sobre a doença que os afeta, especificamente

em busca de tratamento e melhor qualidade de vida. LUQUETTI & RASSI, (2002),

demonstraram que o nível de conhecimento dos pacientes facilita seu

acompanhamento médico, e que muitos migram para as cidades em busca de

esclarecimento e tratamento da doença. Em Berilo em decorrência das condições

econômicas a grande maioria dos pacientes conta apenas com o atendimento do SUS

no hospital da cidade, não havendo possibilidade de procurarem tratamento em locais

mais capacitados. Isso possivelmente explica a fácil adesão dos pacientes ao nosso

estudo.

Por se tratar de uma área de intensa transmissão da infecção no passado, era

esperado que os indivíduos entrevistados apresentassem relatos de familiares com

doença de Chagas. No grupo dos infectados 78,3% têm familiares vivos com doença

de Chagas, 71,7% têm falecidos na família por doença de Chagas, e 76,7% relataram a

ocorrência de morte súbita na família. CARNEIRO et al. (2001) demonstraram que

crianças que apresentam sorologia positiva para doença de Chagas em áreas sob

vigilância epidemiológica apresentam maior probabilidade de ter mãe ou familiares

infectados. Os nossos resultados corroboram os resultados de trabalhos anteriores

realizados no município, que detectaram altas taxas de infecção na população adulta, e

baixos índices na população mais jovem e em crianças (BORGES et al., 2006;

AGUILAR, 1988; MONTOYA, 1998).

O questionário epidemiológico propiciou traçar um perfil dos pacientes

atendidos nesse estudo, demonstrando que a maioria dos infectados vive na zona rural,

com condições de moradia e trabalho mais precárias, grau de escolaridade mínimo ou

inexistente e carência de atendimento médico básico. No entanto, foi possível perceber

que se tais condições hoje são ruins, no passado eram ainda piores, e que apesar de

todas as dificuldades encontradas por essas pessoas, de certa forma elas são

conscientes da gravidade da infecção que apresentam.

5.2 Avaliação parasitológica

A análise parasitológica realizada por meio da técnica de hemocultura

demonstrou a taxa de positividade detectada para a população em estudo de 25,0%.

Outros trabalhos avaliando pacientes em diferentes regiões, encontraram taxas de

positividade próximas as nossas (CHIARI & BRENER, 1966; MOURÃO & MELO,

1975; JUNQUEIRA et al., 1996). A técnica de hemocultura pode apresentar

positividade de 0 a 94,0%, dependendo da metodologia e das modificações aplicadas

(PORTELA-LINDOSO et al., 2003). Entretanto, uma vez que o nível de parasitemia

decresce com a progressão da infecção, esta técnica torna-se menos sensível na fase

crônica da doença de Chagas (CHIARI et al., 1989; MOURÃO & MELO, 1975), o que

vai de encontro aos resultados do nosso trabalho.

Outros fatores além da sensibilidade podem justificar os índices relativamente

baixos de positividade obtidos nesse estudo como a idade avançada dos pacientes

avaliados, já que a média de idade foi de 45,5 anos. Durante o curso da infecção

chagásica, os níveis de parasitemia decrescem progressivamente, dificultando o

encontro de resultados positivos em pacientes com idade avançada e formas mais

evoluídas da doença (LUQUETTI & RASSI, 2000). Outro ponto a ser abordado refere-

se às condições locais de processamento das hemoculturas, que necessitam ser

melhoradas para a execução da técnica. A metodologia empregada foi a de CHIARI et

al. (1989), entretanto, em se tratando de um trabalho de campo, nem todas as

condições ideais foram aplicadas no processamento do sangue para hemocultura. Uma

delas foi o processamento da técnica em centrífuga não refrigerada, outra foi a

manutenção das hemoculturas à temperatura ambiente por uma semana ou mais, para

então serem transportadas para o laboratório de Doença de Chagas, e acondicionadas

em estufa na temperatura adequada. O número de coletas de sangue é outro fator que

pode influenciar diretamente na positividade da técnica. Em virtude do tempo

disponibilizado para o trabalho, e da viabilidade dos pacientes para migrarem das

comunidades rurais ao Hospital Municipal, apenas uma coleta de sangue para

hemocultura foi realizada. Possivelmente, a repetição do exame aumentaria a taxa de

positividade, já que foi demonstrado que coletas sucessivas e repetidas de um mesmo

paciente aumentam a possibilidade de positivação (PORTELA-LINDOSO et al.,

2003). Entretanto, já foi verificado que alguns pacientes com infecção chagásica não

apresentam exames parasitológicos positivos mesmo quando realizados em série

(CASTRO et al., 1999; CASTRO et al., 2002; 2006), enquanto outros apresentam

testes repetidamente positivos (CASTRO et al., 1999). As características dos parasitos

da área de estudo também podem influenciar na positividade da técnica, já que o T.

cruzi apresenta numerosas cepas de diferentes linhagens que possuem características

biológicas distintas, como por exemplo, o crescimento e diferenciação em meios de

cultura (DVORAK et al., 1980).

Nesse estudo os pacientes com a forma indeterminada da doença de Chagas

apresentaram maior taxa de positividade em relação aos grupos CARD 1, CARD 2 e

DIG/MIS respectivamente. A associação clara e linear entre morbidade e nível de

parasitemia ainda não ficou bem estabelecida, já que existe contradição neste aspecto

na literatura. Resultados semelhantes aos aqui apresentados foram encontrados por

CASTRO et al. (1980) e SCHENONE et al. (1968). CASTRO et al. (1980) avaliaram

292 pacientes, concluindo que 74,0% dos que apresentavam alta parasitemia estavam

na forma indeterminada da doença. SCHENONE et al. (1968) detectaram maior

porcentagem de xenodiagnóstico positivo em pacientes assintomáticos, em

comparação àqueles com alterações cardíacas e digestivas. Em concordância com

nossos resultados, que não encontraram associação entre parasitemia e morbidade, há

outros estudos indicando que a parasitemia detectada é independente da forma clínica

manifestada (CERISOLA et al., 1974; SILVA et al., 1995). Em um estudo clínico

avaliando 30 pacientes durante três anos, CERISOLA et al. (1974) constataram que

esses indivíduos apresentavam diversos níveis de parasitemia, porém sem relação com

as alterações clínicas encontradas. Assim SILVA et al. (1995), verificaram que a

positividade do xenodiagnóstico é também independente da forma clínica manifestada.

Entretanto, outros trabalhos revelaram uma tendência de maior positividade

de exames parasitológicos em pacientes com manifestações cardíacas e digestivas

(PEREIRA et al., 1992; COURA, 1975; PIFANO, 1977; ADAD, 1989). PEREIRA et

al. (1992) encontraram parasitemias mais elevadas em cardiopatas, embora não tenham

verificado associação entre positividade de teste parasitológico e progressão para

cardiopatia. COURA, (1975) detectou maior porcentagem de xenodiagnóstico positivo

em pacientes com cardiopatia e megaesôfago, em comparação aos que tinham apenas

sorologia reativa, assim como PIFANO, (1977) na Venezuela. ADAD, (1989),

encontrou o parasito em 50,0% dos pacientes com megaesôfago, e nenhum parasito foi

detectado em esôfagos normais de pacientes sororeativos.

A maioria das hemoculturas foi positiva entre 30 e 60 dias após a coleta, com

apenas quatro hemoculturas positivas no 90º dia. Esses dados corroboram aqueles

obtidos por outros autores (MORA, 1996; LUZ et al., 1994; CASTRO et al., 2002).

Em nosso trabalho nenhuma hemocultura apresentou positividade quando examinada

no 120ª após a coleta. Entretanto, em virtude da baixa sensibilidade da técnica de

hemocultura é importante que o exame seja realizado até o 120º dias após a coleta,

especialmente porque a demora na detecção do parasito pode estar relacionada com

diferentes características biológicas do T. cruzi como a taxa de crescimento em meios

artificiais (MINTER-GOELDBLOED et al., 1978).

A análise das hemoculturas possibilitou a observação de uma maior chance de

encontrar o parasito nos tubos que continham as hemácias, apesar da pequena

diferença entre o número de hemoculturas positivas nas camadas de hemácias e

leucócitos. Nossos dados foram discordantes dos demonstrados por Luz et al. (1994)

que observaram maior chance de encontrar o parasito em tubos que continham as

camadas de leucócitos.

5.3 Avaliação do perfil sorológico

5.3.1 Pesquisa da reatividade de IgG e subclasses de IgG anti-T. cruzi por

meio do ensaio imunoenzimático não comercial aplicado ao diagnóstico sorológico

da doença de Chagas

A infecção pelo T. cruzi induz a ativação do sistema imune humoral para a

produção de anticorpos capazes de atuar na defesa do organismo contra o parasito. O

estabelecimento de métodos de diagnóstico para a pesquisa de anticorpos anti-T. cruzi,

de diferentes classes e subclasses, que apresentem altas especificidade e sensibilidade

tem sido alvo de muitos estudos.

Um dos objetivos do nosso trabalho foi verificar o desempenho da técnica de

ELISA, desenvolvida e utilizada rotineiramente em nosso laboratório para o

diagnóstico sorológico da doença de Chagas, realizando a pesquisa de IgG total e suas

subclasses IgG1, IgG2 e IgG3 em pacientes com diferentes manifestações clínicas da

doença. A escolha da pesquisa de apenas três das quatro subclasses de IgG produzidas

por seres humanos foi baseada nos níveis desses anticorpos detectados. Como já

demonstrado por outros trabalhos, as subclasses IgG1, IgG2 e IgG3 são as de maior

representatividade no soro humano (HERNANDEZ-BECERRIL et al., 2001;

CERBAN et al., 1993; KAWANO et al., 1994).

Para a análise desses resultados não podemos deixar de considerar que os

pacientes avaliados no estudo apresentam alta reatividade sorológica, pois fizeram

parte desse trabalho aqueles cuja sorologia foi positiva na técnica de ELISA (reação de

alta sensibilidade) simultaneamente a HAI, reação de baixa sensibilidade que em nossa

experiência pessoal é positiva em apenas 80,0% dos pacientes reativos na ELISA. A

alta reatividade dos soros dos pacientes selecionados foi posteriormente confirmada

pela realização da reação de Imunofluorescência Indireta no grupo de pacientes que

não fez parte do nosso estudo e que apresentou resultados discordantes entre estes dois

testes (ELISA positiva e HAI negativa). Nesses pacientes com sorologia discordante, a

taxa da positividade da terceira técnica foi de 85,0%.

A primeira etapa da avaliação sorológica consistiu no estabelecimento de

critérios de interpretação para a reatividade de IgG e subclasses de IgG utilizando a

técnica de ELISA não comercial aplicada ao diagnóstico da doença de Chagas. Os

anticorpos IgG total e IgG3 apresentaram os maiores índices de DO para todas as oito

diluições de soro testadas (1:10 a 1:1.280), seguidos por IgG2 e IgG1. Nossos

resultados, mesmo considerando a alta reatividade de todos os pacientes avaliados,

contradizem alguns estudos que detectaram níveis mais elevados de IgG1, em soros de

pacientes com infecção chagásica testados em apenas uma diluição de soro

(HERNANDEZ-BECERRIL et al., 2001; CERBAN et al., 1993; MICHAILOWSKY

et al., 2003; MORGAN et al., 1996; CORDEIRO et al., 2001). Alguns desses estudos

detectaram IgG2 em níveis mais elevados (HERNANDEZ-BECERRIL et al., 2001;

CORDEIRO et al., 2001), seguido por IgG3. Em outros foram verificados níveis mais

elevados de IgG3 seguido por IgG2 (CERBAN et al., 1993; MICHAILOWSKY et al.,

2003; MORGAN et al., 1996). Provavelmente, as diferenças nos níveis de anticorpos

encontradas em outros trabalhos se devem a variáveis como a preparação antigênica

utilizada, a população estudada e os diferentes protocolos das técnicas sorológicas

aplicadas.

As faixas de diluição do soro capazes de discriminar as medianas de DO de

todos os pacientes com infecção chagásica e grupo controle para cada imunoglobulina

foram selecionadas por meio da análise estatística. Essas faixas de diluição foram

diferentes para cada imunoglobulina. Para IgG total e IgG3, variaram de 1:10 a

1:1.280, com uma ampla diferença nas DOs do grupo com infecção chagásica e do

grupo controle em todas as diluições testadas. A subclasse IgG2 também apresentou as

diluições de soro selecionadas de 1:10 a 1:1.280, entretanto os valores de DO do grupo

com infecção chagásica e do grupo controle foram mais próximos, especialmente nas

quatro últimas diluições de soro testadas. Para IgG1 as diluições de soro selecionadas

foram mais restritas (1:10 a 1:160), evidenciando a menor capacidade para essa

imunoglobulina em diferenciar infectados de não infectados em diluições mais altas do

soro. Esses resultados refletem os níveis de cada imunoglobulina detectada,

demonstrando que os anticorpos com mais ampla capacidade de discriminação entre

indivíduos com infecção chagásica e não infectados em nosso estudo são IgG total e

IgG3.

Para a avaliação do desempenho da técnica foram feitas as análises das curvas

ROC que possibilitaram a identificação das diluições de cada imunoglobulina que

apresentaram os maiores índices de sensibilidade, especificidade e ASC. Para IgG total

todas as diluições avaliadas pela curva ROC apresentaram excelente desempenho, com

sensibilidade e especificidade de 100,0%, e ASC igual a 1,000. Esse seria um teste

perfeito, capaz de detectar com 100,0% de certeza todos os indivíduos com infecção

chagásica como reativos, e os não infectados como não reativos. Para IgG1 e IgG2 foi

demonstrada uma limitação maior dessas imunoglobulinas para o desempenho da

técnica. As diluições 1:10 a 1:40 apresentaram os melhores valores de sensibilidade,

especificidade e ASC e apenas a diluição 1:10 apresentou valores de um teste perfeito

para ambas as subclasses de imunoglobulinas. Para a pesquisa de IgG3 os melhores

resultados foram com as diluições 1:10 a 1:320. No entanto, para IgG3, em nenhuma

dessas diluições os valores de sensibilidade, especificidade e ASC garantiram que o

teste fosse considerado perfeito, apesar do excelente desempenho da técnica.

A análise das curvas ROC verificou que na maioria das diluições utilizadas

para a pesquisa de IgG1, IgG2 e IgG3 a especificidade apresentava-se mais elevada em

relação a sensibilidade, indicando que o antígeno aplicado na técnica apresenta bom

desempenho. Até o momento, não existe um teste sorológico disponível para o

diagnóstico da doença de Chagas que apresente 100,0% de sensibilidade e

especificidade, e é exatamente em busca desse resultado que diversos estudos têm sido

realizados (MATSUMOTO et al., 1993; PRIMAVERA et al., 1990; UMEZAWA et

al., 2004; UMEZAWA et al., 2003). Os kits de diagnóstico imunoenzimáticos

disponíveis no mercado apresentam valores de especificidade de 93,3 a 100,0%, e

sensibilidade de 97,7 a 100,0%, sendo constante a elevada sensibilidade com

especificidade variável (OELEMANN et al., 1998). Em um estudo mais recente, cinco

kits de ELISA comercialmente disponíveis foram avaliados para a determinação da sua

acurácia no diagnóstico da doença de Chagas, demonstrando que os kits que usam

antígenos recombinantes ou peptídeos sintéticos são mais específicos do que aqueles

que usam antígenos íntegros, embora a sensibilidade seja variável (CABALLERO et

al., 2007).

Para a determinação final de quais diluições seriam as mais aplicáveis para o

diagnóstico sorológico da doença de Chagas utilizando a técnica de ELISA não

comercial, foi introduzida ainda a análise da variável ∆DO

mediana

A escolha dessa

variável foi baseada no fato de todas as nossas análises entre grupos de pacientes terem

sido efetuadas com a observação das medianas das DOs. Foi estabelecido o valor de

∆DO

mediana

igual ou superior a 0,200 para a seleção das diluições mais seguras para o

diagnóstico da doença de Chagas. Para IgG total e IgG3 as diluições de soro de 1:10 a

1:320 apresentaram os maiores valores de ∆DO

mediana

, possibilitando o diagnóstico

seguro da doença de Chagas. Para IgG1 apenas a diluição 1:10 apresentou segurança

para o diagnóstico, e para IgG2 foram selecionadas as diluições 1:10 e 1:20. Ressalta-

se que para IgG3 e IgG2 mesmo nas diluições selecionadas com rigor pelas análises,

houve pacientes com valores de DO abaixo do ponto de corte, o que seria um problema

para o uso dessas diluições de soro. Para essas duas imunoglobulinas poderíamos

pensar na aplicação do teste utilizando apenas a primeira diluição testada, entretanto,

foi observado que até mesmo na diluição de soro mais baixa um paciente apresentou

DO abaixo do PC para IgG3. Exatamente para uma análise mais refinada de qual seria

a diluição mais aplicável ao diagnóstico em meio a uma população que pode conter

indivíduos com diferentes características e passíveis de possuírem outras infecções, a

próxima etapa do nosso trabalho foi realizada.

A seleção de quais diluições seriam aplicadas ao diagnóstico da doença de

Chagas foi compatível com os níveis de IgG e subclasses de IgG detectados nos soros

dos pacientes com infecção chagásica. Estes apresentaram em geral altos valores de

DO para IgG total e IgG3 em toda a curva de titulação dos soros. Já IgG2 e IgG1

apresentaram valores mais baixos de DO os quais decresceram mais precocemente nas

curvas de titulação.

5.3.2 Pesquisa da reatividade de IgG e subclasses de IgG por meio do

ensaio imunoenzimático não comercial aplicado ao diagnóstico sorológico da

doença de Chagas em soro de pacientes portadores de outras doenças infecto-

parasitárias

A fase seguinte de nosso estudo foi estabelecer critérios de interpretação para

a reatividade de IgG e subclasses de IgG por meio da técnica de ELISA não comercial

aplicada ao diagnóstico da doença de Chagas em amostras de soro que incluem

pacientes portadores de outras doenças infecto-parasitárias como HIV, HCV, sífilis,

leishmaniose visceral e leishmaniose tegumentar.

Para essa etapa foram considerados dois grupos de pacientes: o NCH (grupo

controle não infectado e portadores de outras infecções), e o CH (pacientes com

infecção chagásica). A análise das curvas ROC considerando apenas os dois grupos,

possibilitou a verificação dos índices de desempenho para cada diluição de soro

selecionada previamente para IgG e suas subclasses como as mais indicadas para o

diagnóstico. Para IgG total, a diluição de soro que apresentou melhor resultado para

discriminar os indivíduos com infecção chagásica dos demais, foi a 1:40. É possível

que a alta reatividade dos soros dos pacientes com infecção chagásica examinados

neste estudo explique este resultado uma vez que a ocorrência de reações cruzadas

entre soros de pacientes com doença de Chagas, leishmaniose visceral e leishmaniose

tegumentar é um fato bem conhecido como será comentado a seguir. Para IgG1 o

desempenho da técnica na diluição 1:10 alcançou elevada acurácia, apesar do índice de

reatividade cruzada de 9,25%, representado por quatro soros de indivíduos com LV e

um soro com LT. Para IgG2 a diluição 1:10 apresentou os melhores índices de

desempenho, com uma porcentagem de reatividade cruzada de 11,1%, demonstrando

que três indivíduos com LV e três com LT apresentaram reação cruzada. Para IgG3 foi

escolhida a diluição de 1:20 com um índice de reatividade cruzada de 3,7%,

representado por um soro com LT e um soro com LV reativos.

A análise desses resultados demonstra que apenas IgG total não apresentou

reatividade cruzada com os soros dos pacientes portadores de outras infecções na

diluição selecionada e que os soros com LV e LT foram os responsáveis pela

reatividade cruzada obtida nas pesquisas de IgG1, IgG2 e IgG3.

Corroborando nossos resultados, alguns trabalhos demonstraram reatividade

cruzada em soros de indivíduos com leishmaniose visceral e tegumentar quando testes

imunoenzimáticos empregando antígenos de T. cruzi foram realizados. VEXENAT et

al. (1996) avaliaram a reatividade de soros de pacientes com doença de Chagas,

leishmaniose visceral e leishmaniose mucocutânea, verificando reações cruzadas para

essas três infecções. Os soros dos pacientes com infecção chagásica apresentaram 98,0

a 100,0% de resultados positivos quando antígenos de L. braziliensis e L. chagasi

foram usados. Os soros dos pacientes com leishmaniose visceral foram 100,0%

reativos com antígenos de T. cruzi ou L. braziliensis. Da mesma maneira, 100,0% dos

pacientes com leishmaniose mucocutânea apresentaram reatividade com antígenos de

T. cruzi ou L. chagasi.

MATSUMOTO et al. (1993) avaliaram um teste de Imunofluorescência

Indireta, empregando formas amastigostas como antígeno, em soros de indivíduos com

infecção chagásica, com leishmaniose visceral e em indivíduos não infectados

verificando 63,0% de reatividade cruzada em soros de indivíduos com leishmaniose.

Em um trabalho realizado por GOMES et al. (2001), foi avaliada a reatividade

de soros de pacientes com infecção chagásica, leishmaniose visceral e leishmaniose

tegumentar, sífilis, HTLV, HCV e HBV pela técnica de ELISA utilizando antígenos

CRA+FRA, e outra técnica sorológica convencional. O ELISA com antígenos

recombinantes apresentou 100,0% de especificidade e sensibilidade, não havendo

reações cruzadas com as outras infecções. A técnica de ELISA convencional

apresentou reações cruzadas apenas com os soros de pacientes com leishmaniose

tegumentar e visceral, não havendo reatividade cruzada nos soros de indivíduos com

sífilis, HTLV, HCV e HBV, assim como encontrado nos nossos resultados.

A técnica de ELISA é um dos métodos mais utilizados no diagnóstico da

doença de Chagas por apresentar elevadas sensibilidade e especificidade. Entretanto,

reações cruzadas com outras infecções, principalmente leishmanioses ocorrem com

alguma freqüência (ZELEDON et al., 1975). Em geral as técnicas utilizadas no

diagnóstico de rotina para a doença de Chagas são muito efetivas para detectar

indivíduos que apresentam altos títulos de anticorpos, mas os resultados são

questionáveis nos que apresentam baixos níveis (ZARATE-BLADES et al., 2006). A

busca por técnicas que exibam excelente desempenho, com altas especificidade e

sensibilidade é uma constante, uma vez que isso possibilita a exclusão de resultados

falso-positivos e falso-negativos indesejáveis.

As reações cruzadas como as que ocorreram em nosso estudo são resultadas

da existência de fatores antigênicos comuns entre o T. cruzi e a Leishmania sp

(ARAÚJO, 1986; CHILLER, 1990). A alternativa para minimizar essas reações

cruzadas seria o uso de preparações antigênicas purificadas, que garantiriam maior

especificidade na reação. No entanto, em nosso estudo, nós optamos por utilizar uma

técnica de ELISA convencional, na qual a fonte antigênica é um extrato bruto de cepa

Y de T. cruzi, amplamente utilizado no diagnóstico sorológico da doença de Chagas.

Este antígeno, possivelmente pode gerar reações cruzadas já que essa fonte é oriunda

de parasitos íntegros. Entendemos que a obtenção de preparações de antígeno

purificadas ainda é restrita à pesquisa, e para a rotina diagnóstica isso elevaria os

custos para a realização das metodologias.

A análise do perfil de produção de anticorpos em soros de pacientes com

leishmaniose tegumentar realizada por SOUZA et al. (2005), demonstrou através da

utilização de uma técnica de ELISA, usando antígeno solúvel de Leishmania

(Leishmania) amazonensis, a predominância de IgG1 seguido de IgG3, IgG2 e IgG4

respectivamente. A demonstração da presença dessas subclasses de IgG em soros de

indivíduos com leishmaniose corrobora o encontrado em nosso estudo. Em nosso

trabalho, mesmo com a utilização de antígenos de extrato bruto de T. cruzi, foi

detectada também a presença IgG1, IgG2 e IgG3, nos soros com leishmaniose, não

havendo porém, diferenças entre os níveis detectados dessas subclasses.

Provavelmente a detecção das subclasses de IgG nos soros com leishmaniose em nosso

trabalho se deve ao reconhecimento de epitopos de carboidratos compartilhados pelo

T. cruzi e Leishmania sp por essas subclasses de anticorpos, como já demonstrado por

outros estudos (ROCHA et al., 2002; LEMOS et al., 2007).

Considerando as diluições de soro finais selecionadas para cada

imunglobulina, podemos inferir que os resultados falso-positivos para IgG1, IgG2 e

IgG3 detectados nos soros com LV e LT e os resultados falso-negativos detectados

para IgG3, não indicariam a pesquisa dessas subclasses por essa metodologia.

Entretanto, em nossas condições de trabalho e considerando a alta reatividade dos

pacientes triados para este estudo, a pesquisa de IgG total poderia ser utilizada com

segurança, pois a técnica de ELISA não comercial garantiu ausência de reatividade

cruzada e a identificação de todos os indivíduos com infecção chagásica na diluição de

soro selecionada.

5.3.3 Aplicabilidade da pesquisa de IgG e subclasses de IgG anti-T. cruzi

detectada por meio do ensaio imunoenzimático não comercial na monitoração de

morbidade da doença de Chagas

A tentativa de associação entre perfil imunológico e manifestações clínicas

em pacientes com doença de Chagas apresentando formas clínicas distintas, tem sido

objeto de estudo em diferentes grupos de pesquisa. A busca de um marcador que

possibilite a distinção entre indivíduos com diferentes manifestações clínicas, e até

mesmo que indique uma possível evolução para formas mais graves da doença é de

grande importância, considerando que intervenções podem ser feitas para retardar a

progressão da doença (CORDEIRO et al., 2001; SOLANA, et al., 1995).

Os fatores responsáveis pelos padrões distintos de imunoglobulinas

produzidos são importantes para o esclarecimento dos mecanismos humorais indutores

de proteção ou patogênese na doença de Chagas. Entretanto, estudos associando o

perfil de anticorpos produzidos e as manifestações clínicas desenvolvidas na doença de

Chagas ainda são restritos.

Feitas estas considerações a última etapa do nosso estudo foi avaliar a

aplicabilidade da pesquisa de IgG e subclasses de IgG anti-T. cruzi realizada pela

técnica de ELISA não comercial aplicada a monitoração de morbidade da doença de

Chagas.

A análise dos soros dos pacientes com diferentes formas clínicas em todas as

diluições testadas possibilitou verificar que os níveis de IgG total e IgG3 foram os

mais elevados e próximos entre si, seguidos por IgG2 e IgG1, respectivamente. A

análise das medianas de DO dos quatro grupos com diferentes formas clínicas (IND,

CARD 1, CARD 2 e DIG/MIS) possibilitou verificar que IgG total apresentou

diferença significativa entre os diversos grupos clínicos nas diluições de 1:10 a

1:1.280, IgG1 nas diluições 1:10 e 1:20, IgG3 nas diluições 1:10 a 1:80 e que IgG2

não apresentou diferença significativa entre os grupos clínicos em nenhuma diluição de

soro.

Para IgG total o grupo DIG/MIS apresentou valores de DO mais elevados,

sendo esse grupo diferente estatisticamente de IND, CARD 1 e CARD 2 em todas as

oito diluições testadas. Apenas na diluição 1:640 o grupo IND foi também diferente

estatisticamente de CARD 1. Sendo assim nossos resultados indicam uma relação entre

níveis mais elevados de IgG total em pacientes com manifestações digestivas puras ou

mistas. A análise estatística aplicando o teste de correlação demonstrou que a

correlação positiva encontrada entre as diferentes formas clínicas e IgG total em todas

as diluições de soro indica que os dois fenômenos variam no mesmo sentido sendo

possível associar níveis elevados dessa imunoglobulina em pacientes com diferentes

manifestações clínicas da doença de Chagas, independente da gravidade da forma

clínica, apesar dos valores de DO mais elevados no grupo DIG/MIS. Assim, foi

possível verificar que a correlação positiva encontrada em todas as diluições de soro

indica uma associação progressiva entre níveis mais elevados de IgG total e formas

mais graves da doença de Chagas, como evidenciado nos gráficos de dispersão, que

apresentam retas crescentes em direção ao grupo DIG/MIS. Entretanto, essa análise

não nos permite afirmar a existência de uma correlação entre níveis progressivamente

mais elevados de IgG total e evolução clínica da doença de Chagas, já que para o

grupo CARD 2 os valores de DO foram em sua maioria inferiores aos valores de DO

do grupo CARD 1 em todas as diluições de soro.

Alguns estudos avaliaram níveis de IgG total e outros anticorpos, na tentativa

de associar elevação dessas imunoglobulinas e gravidade da forma clínica manifestada

pelos indivíduos com infecção chagásica, identificando associação entre IgG e

manifestações clínicas. Assim, GUSMÃO et al. (1982) avaliaram os níveis de IgG de

217 pacientes com diferentes formas clínicas da doença de Chagas de Goiás, divididos

em quatro grupos clínicos distintos. Os testes sorológicos utilizados foram a reação de

fixação do complemento, hemaglutinação indireta e ELISA. A média dos níveis de

anticorpos na ELISA e na fixação do complemento entre os grupos distintos não

demonstrou diferença significativa. Entretanto, através da hemaglutinação indireta foi

possível verificar títulos ligeiramente mais elevados de anticorpos em pacientes

apresentando alterações digestivas e cardiomiopatia severa, quando comparados com

os pacientes nas formas indeterminada e cardíaca moderada. Em um estudo seccional

ZAUZA, (2000) avaliou 835 pacientes com infecção chagásica do município de

Virgem da Lapa, vizinho de Berilo, verificando níveis mais elevados de IgG por meio

das técnicas de Imunofluorescência Indireta e hemaglutinação indireta nos indivíduos

apresentando forma cardíaca da doença de Chagas. ZAUZA et al. (2001), avaliando

140 pacientes com infecção chagásica do mesmo município em um período de dez

anos, verificaram um aumento estatisticamente significativo dos níveis de IgG no

grupo de pacientes com evolução progressiva de cardiopatia. Esses resultados

indicaram uma associação direta entre os níveis séricos desses anticorpos e a evolução

da cardiopatia chagásica.

Em outro estudo a associação entre níveis de IgG e formas clínicas não foi

evidenciada. PRIMAVERA et al. (1990) avaliaram os níveis de IgG, IgM e IgA em

506 soros de pacientes apresentando infecção chagásica aguda e crônica com

diferentes manifestações clínicas (formas indeterminada, cardíaca e digestiva), soros

de pacientes com outras infecções não relacionadas e soros de indivíduos saudáveis.

Duas preparações antigênicas distintas (formas amastigotas e tripomastigotas) foram

testadas em comparação aos antígenos de epimastigotas de extrato bruto utilizados

convencionalmente na imunofluorescência indireta, demonstrando as formas

amastigotas serem as melhores fontes de antígenos para a detecção desses anticorpos.

Nesse estudo, anticorpos IgG anti-amastigota foram detectados em todos os indivíduos

com infecção chagásica sem diferença entre os pacientes apresentando diferentes

formas clínicas. Entretanto, IgA e IgM foram encontrados predominantemente em

pacientes com manifestações digestivas e na fase aguda.

Provavelmente, a discordância entre esses resultados possa ser atribuída em

parte aos diferentes intervalos de tempo estabelecidos para cada estudo, ao número de

pacientes avaliados e sua origem, às diferenças de população de T. cruzi neles

encontradas, e as variações das diferentes técnicas sorológicas empregadas.

A pesquisa das subclasses de IgG em nosso estudo revelou que para IgG1 na

diluição de soro 1:10 os pacientes do grupo IND apresentaram diferença significativa

na DO em relação ao grupo CARD 1, e na diluição 1:20 o grupo IND foi diferente

estatisticamente de CARD 1 e CARD 2. IgG3 foi a subclasse de anticorpo que

apresentou os maiores valores de DO para todos os pacientes avaliados. A análise de

IgG3 revelou ainda que pacientes do grupo IND apresentaram diferença significativa

em relação aos grupos CARD 2 e DIG/MIS nas diluições de soro 1:10 a 1:80. A

subclasse IgG2 não demonstrou diferença nos níveis de DO obtidos para os quatro

grupos de formas clínicas avaliados.

Alguns trabalhos também sugerem níveis mais elevados de IgG1 e IgG3, sem

associação direta com formas clínicas. CERBAN et al. (1993) avaliaram 28 pacientes

assintomáticos e com manifestações cardíacas provenientes de uma área endêmica na

Argentina, que apresentavam idades entre 20 a 40 anos. Nesse estudo foi testada a

reatividade de IgG1, IgG2 e IgG3, por ELISA e immunobloting, com a utilização de

dois tipos de antígenos, a fração acídica do citosol e formas epimastigotas. Foram

encontrados níveis mais elevados de todas as subclasses de IgG nos pacientes com

manifestações cardíacas mais graves. Nesse estudo foi detectada uma alta prevalência

de IgG1 e IgG3, com níveis mais baixos de IgG2 e IgG4, quando formas epimastigotas

foram usadas como antígeno. Quando a fração acídica do citosol foi empregada, IgG1

foi a principal subclasse detectada em todos os pacientes avaliados como já

demonstrado por vários autores e diferentemente de nossos resultados. Apesar de os

pacientes cardíacos apresentarem níveis mais elevados de todos os anticorpos testados,

nesse trabalho não houve associação de nenhuma subclasse de IgG com o grupo de

pacientes cardíacos.

MICHAILOWISKY et al. (2003), e SOLANA et al. (1995) corroboraram os

resultados de CERBAN et al. (1993) ao detectarem níveis mais elevados de IgG1 e

IgG3 em todos os pacientes avaliados. No primeiro estudo, pacientes assintomáticos e

com manifestação cardíaca, oriundos de Minas Gerais, apresentaram níveis de IgG1 e

IgG3 mais elevados na técnica de ELISA, porém utilizando antígenos paraflagelares

derivados de T. cruzi. SOLANA et al. (1995) avaliaram a reatividade de 100 pacientes

100

com diferentes formas clínicas, provenientes da Argentina e do Brasil para essas

subclasses de imunoglobulinas, utilizando a técnica de ELISA com uma fração

ribossomal de epimastigotas como antígeno. A distribuição dos isotipos de anticorpos

revelou que 100,0% dos pacientes apresentavam IgG1, 85% IgG3 e 50% IgG2. Mais

uma vez, nenhuma associação entre as diferentes manifestações clínicas e o perfil de

subclasses foi encontrada.

A dosagem das subclasses de IgG de duas populações indígenas (Mataco e

Toba) portadoras de infecção chagásica da Argentina através da técnica de ELISA

demonstrou níveis similares de IgG1 para ambas, com diferença na produção de IgG2,

IgG3 e IgG4, sendo entretanto, mais elevados os níveis de IgG1 e IgG3 nas duas

populações (MOTRAN et al., 1994).

Em outros trabalhos, a associação entre a subclasse IgG2 e cardiopatia foi

observada. Assim como nos estudos anteriores, MORGAN et al. (1996), detectaram

níveis mais elevados de IgG1 e IgG3 em todos os pacientes avaliados. Entretanto, foi

observada uma associação entre níveis de IgG2 mais elevados e formas cardíaca e

cardio-digestiva não observada em nossos estudos e em vários outros citados

anteriormente. Nesse trabalho de MORGAN et al., foram utilizadas formas

epimastigotas como antígeno na técnica de ELISA, para avaliar 73 pacientes de uma

área endêmica de Minas Gerais, que apresentavam as formas clínicas indeterminada,

cardíaca, digestiva e mista, com idades variando entre 20 e 84 anos. Os níveis de IgG1

foram mais elevados em todos os pacientes, mas sem diferença entre os níveis de IgG1

e IgG3 nos diferentes grupos clínicos avaliados. Este mesmo grupo de pesquisa,

avaliou ainda a especificidade das diferentes subclasses de IgG por meio da técnica de

western blot em relação a diferentes antígenos em pacientes com formas clínicas

distintas da doença de Chagas. Foi observado que algumas subclasses de anticorpos

ligavam prevalentemente a alguns antígenos em determinados grupos de formas

clínicas quando comparados com outros. Isto é, independentemente do grupo clínico,

os perfis de antígenos reconhecidos por cada isotipo de anticorpo diferiam entre si.

Esse resultado indicou correlação entre níveis de subclasses de IgG e forma clínica, já

que bandas de IgG3 foram encontradas predominantemente em pacientes na forma

indeterminada e digestiva, enquanto bandas de IgG2 foram predominantes em

pacientes na forma cardíaca (MORGAN et al., 1998).

VERÇOSA et al. (2007) utilizaram antígenos flagelares (FRA) e

citoplásmicos (CRA) para analisar o perfil de subclasses de IgG de pacientes

101

apresentando diferentes manifestações clínicas, através da técnica de ELISA,

verificando que IgG2 anti-FRA foi a subclasse detectada em níveis mais elevados nos

pacientes com acometimento cardíaco. As outras subclasses foram detectadas em

quase todos os pacientes avaliados, sendo que apenas IgG2 apresentou níveis

significativamente mais elevados no grupo cardíaco em relação às outras formas

clínicas. Foi sugerido pelo estudo que IgG2 poderia ser um bom marcador para

monitoração da progressão da doença, assim como fator preditivo para risco cardíaco.

Entretanto, outros grupos encontraram diferentes resultados quando avaliaram

a produção dessas subclasses de IgG. HERNANDEZ-BECERRIL et al. (2001)

avaliaram 12 pacientes com idades entre 34 e 67 anos, que apresentavam cardiopatia,

provenientes de áreas rurais do México, através da técnica de ELISA, empregando

antígenos íntegros de T. cruzi. Esses autores verificaram que os níveis de IgG1 e IgG2

foram mais elevados que IgG3 em todos os pacientes analisados. Nesse estudo,

constatou-se que os pacientes com cardiomegalia severa apresentavam níveis mais

elevados de IgG2, produzindo uma associação direta entre essa forma clínica e a

subclasse IgG2, como já demonstrado por MORGAN et al. (1996), fato este não

verificado em nosso estudo.

CORDEIRO et al. (2001) descreveram o predomínio de IgG1 e IgG2 nos

anticorpos da sorologia convencional, enquanto IgG1 e IgG3 predominaram na

pesquisa de anticorpos líticos quando foi utilizada a técnica de citometria de fluxo e

epimastigotas fixados e tripomastigotas vivos como antígenos. Anticorpos IgG3 foram

também predominantes em nosso estudo embora a metodologia empregada por nós

tenha sido a técnica de ELISA. Os anticorpos líticos são considerados os responsáveis

pelo mecanismo de lise mediada pelo Complemento. A estes anticorpos é atribuído

importante papel no controle da parasitemia em pacientes com infecção chagásica

crônica (KRETLLI e BRENER, 1982) além de mediarem o fenômeno de ADCC

(antibody-dependent-citotoxic cell) que ocorre na infecção chagásica (LIMA-

MARTINS et al., 1985). Segundo estes autores os anticorpos líticos presentes no soro

humano seriam IgG1 e IgG2, entretanto ainda há controvérsia sobre o papel de IgG1

na lise mediada pelo Complemento.

O mecanismo de lise mediada pelo Complemento pode ser observado por

experimentação “in vitro” apenas quando tripomastigotas vivos são empregados como

antígenos, não sendo detectado quando são utilizados antígenos de formas

epimastigotas do parasito morto ou fixado, íntegro ou não, comumente empregadas no

102

diagnóstico sorológico da doença de Chagas (KRETLLI e BRENER, 1982). Desta

forma constatou-se que existe uma dissociação entre os anticorpos detectados no

diagnóstico da infecção chagásica e os anticorpos protetores e responsáveis pela

resistência ao parasito. Tais evidências levaram esses autores a sugerir o emprego de

metodologias que pesquisam os anticorpos líticos como um importante critério de cura,

sendo sua presença indicadora de infecção ativa, ou seja, presente em pacientes

tratados não curados. O trabalho de CORDEIRO et al. (2001), indicou o uso potencial

de IgG1 anti-epimastigotas para o diagnóstico da infecção e revelou uma maior

reatividade de IgG2 anti-epimastigotas nos pacientes com a forma indeterminada e

cardíaca.

Em um estudo realizado com camundongos imunizados com frações FRA e

CRA de antígenos de T.cruzi, foram testadas as reatividades das subclasses IgG1,

IgG2a, IgG2b e IgG3. Níveis mais elevados de IgG3 e IgG1 foram detectados na

imunização com antígenos CRA, em contraste, a imunização com FRA resultou em

mais altos níveis de IgG1, sem a detecção de IgG2 e IgG3 (PEREIRA et al., 2003).

A ausência de associação entre níveis das diferentes subclasses de IgG e as

distintas formas clínicas pode ter sido influenciada diretamente pela alta reatividade

sorológica apresentada pelos pacientes do nosso estudo. É provável que se os pacientes

avaliados no nosso trabalho apresentassem grandes diferenças de reatividade,

evidenciada pela necessidade de uma terceira ou quarta técnica sorológica de

diagnóstico, essas diferenças na produção de IgG1, IgG2 e IgG3 seriam detectadas

entre os grupos de pacientes com formas clínicas distintas.

Nossos dados demonstraram baixos níveis de IgG1 em todos os pacientes

avaliados, independente da forma clínica apresentada e da diluição do soro testada.

Uma vez que esses indivíduos apresentam alta reatividade, seria esperado que os níveis

de IgG1 fossem os mais elevados em todos os pacientes, independente de forma

clínica, pois a literatura indica essa subclasse como a mais predominante no soro

humano. Sendo assim, os baixos níveis de IgG1 detectados na população do nosso

estudo não seriam justificados pela triagem dos pacientes com elevada reatividade,

mas talvez devido a menor produção dessa subclasse por parte desses pacientes. Esses

resultados para a pesquisa de IgG1 encontrados em nosso trabalho contradizem todos

os estudos realizados e já comentados anteriormente (CERBAN et al., 1993;

MICHAILOWISKY et al., 2003; SOLANA et al., 1995; MORGAN et al., 1996;

HERNANDEZ-BECERRIL et al., 2001; CORDEIRO et al., 200), que detectaram

103

IgG1 como a principal subclasse de IgG produzida por pacientes com diferentes

manifestações clínicas da doença de Chagas. Em todos esses trabalhos, a produção de

níveis elevados dessa subclasse apresentou-se como fator comum nos diferentes

grupos clínicos. IgG1 é uma imunoglobulina cuja produção é regulada por citocinas

caracterizadas como anti-inflamatórias, e que indica um balanço mais eficiente entre

citocinas inflamatórias e anti-inflamatórias. Essa subclasse poderia estar relacionada

com um melhor controle da resposta imune, daí sua associação com a forma

indeterminada da doença, indicando que indivíduos que não apresentem alterações

cardíacas ou digestivas teriam níveis mais elevados de IgG1, fato esse não observado

em nosso estudo. Pelo contrário, em nosso trabalho os pacientes do grupo CARD 1 e

CARD 2 apresentaram níveis ligeiramente mais elevados dessa imunoglobulina, não

estatisticamente significativos em relação aos outros grupos clínicos.

A produção mais elevada da subclasse IgG2 tem sido associada com

alterações cardíacas em humanos, essa subclasse tem sua produção regulada por

citocinas pro-inflamatórias, o que estaria relacionado com uma resposta imune mais

exacerbada e destruição tecidual. Baseado na regulação de citocinas para induzir a

produção de imunoglobulinas, IgG2 seria regulada por IL-12, INF-γ e TNF-α,

citocinas que caracterizam o perfil de resposta Th1, em geral predominante nos

indivíduos com as manifestações graves da doença. Em contrapartida, IgG1 e IgG3

seriam reguladas por citocinas anti-inflamatórias, como IL-4, IL-5, IL-10 e TGF-β, que

caracterizam o perfil de resposta Th2 (BRIERE et al., 1994) predominante em

pacientes assintomáticos. Isso explicaria em parte a associação encontrada entre IgG2

e cardiopatia chagásica observada em alguns trabalhos (VERÇOSA et al., 2007;

CORDEIRO et al., 2001; MORGAN, et al., 1996; HERNANDEZ-BECERRIL et al.,

2001). Consequentemente IgG1 e IgG3 que não se associam às formas graves da

doença de Chagas estariam presentes em todos os pacientes independentemente da

forma clínica.

Em nosso estudo os níveis de IgG2 não foram associados a manifestações

cardíacas, sejam leves ou graves. Foi possível verificar que em todas as diluições de

soros trabalhadas, a produção de IgG2 não apresentou diferença significativa entre os

diferentes grupos de formas clínicas, sendo possível observar essa diferença apenas

entre os infectados e o grupo controle. Verificamos apenas que os pacientes com as

formas CARD 1, CARD 2 e DIG/MIS apresentaram níveis ligeiramente mais elevados

em relação ao grupo IND. O teste de correlação demonstrou a ocorrência de correlação

104

positiva entre as diferentes formas clínicas e IgG2 apenas na diluição 1:160, indicando

que somente nessa diluição os dois fenômenos variam no mesmo sentido sendo

possível associar níveis elevados de IgG2 em pacientes com diferentes manifestações

clínicas da doença de Chagas, independente da gravidade da forma clínica.

A subclasse IgG3 apresentou os maiores níveis detectados para todos os

pacientes. Isso em parte estaria em concordância com trabalhos de CERBAN, et al.

(1993), SOLANA et al. (1995), MORGAN et al. (1996) e MICHAILOWISKY et al.

(2003), que detectaram níveis dessa subclasse mais elevados em todos os pacientes

avaliados, porém associado a IgG1. Foi também possível observar que os pacientes do

grupo IND produziram os mais altos níveis dessa subclasse em comparação aos outros

grupos clínicos. Sendo a produção dessa subclasse induzida por citocinas anti-

inflamatórias, esse resultado estaria de acordo com a associação entre ausência de

manifestações clínicas e níveis mais elevados de IgG3. A análise de correlação para a

subclasse IgG3 demonstrou uma correlação negativa com as formas clínicas da doença

de Chagas indicando que as duas variáveis variam em sentido inverso, ou seja, quanto

menos grave a manifestação da doença, maiores são os níveis de IgG3. Este resultado

está de acordo com o demonstrado pela técnica sorológica empregada que verificou

valores mais elevados de DO em pacientes com a forma indeterminada da doença,

sugerindo que essa subclasse de imunoglobulina possa ser empregada como indicador

de prognóstico.

Já para IgG1 não foi encontrada correlação estatística significativa entre as

formas clínicas e essa subclasse de anticorpo, diferentemente do que já foi citado na

literatura, quando foi sugerida a importância de IgG1 como marcador de prognóstico

da forma indeterminada da doença de Chagas (CORDEIRO et al., 2001).

A seleção dos pacientes de alta reatividade sorológica em nosso estudo pode

ser um dos principais fatores responsáveis pelos resultados obtidos. Outras

considerações podem ser feitas já que os trabalhos citados anteriormente foram

realizados em diferentes países (Brasil, México e Argentina). A origem e genética da

população de pacientes estudada e o tipo de parasito predominante em cada área

poderiam interagir na dinâmica da complexa relação parasito-hospedeiro,

influenciando a resposta imune humoral da doença de Chagas. Já é bem estabelecido

que o T. cruzi apresenta uma grande variabilidade genética e essa pode estar

correlacionada a várias de suas propriedades (TOLEDO et al., 2002), inclusive na

indução de produção de anticorpos (SANTOS, 2007). Em um estudo recente, realizado

105

por SANTOS, (2007) níveis de IgG e suas subclasses IgG1, IgG2a e IgG2b foram

pesquisados em camundongos infectados com diferentes linhagens genéticas de T.

cruzi. Foi verificado que a variabilidade genética do parasito não apenas influencia as

manifestações patológicas, como o tropismo por órgãos e tecidos, nos hospedeiros

vertebrados, mas também interfere na produção de IgG e suas subclasses durante as

fases aguda e crônica da infecção. A infecção com T. cruzi I induziu altos níveis de

todas as subclasses de IgG em ambas as fases da doença quando comparado a T.cruzi

II e T.cruzi.

Um outro fator de extrema relevância é a utilização de diferentes composições

de antígenos nos trabalhos citados. Formas íntegras de tripomastigotas e epimastigotas,

fixados ou vivos, e frações antigênicas específícas foram usadas nos estudos, o que

influencia diretamente no aumento da especificidade da técnica aplicada, como

verificado por vários trabalhos (MALCHIODI et al., 1994; SOLANA et al., 1995;

UMEZAWA et al., 1996 b; NAKAZAWA et al., 2001; PEREIRA et al., 2003;

UMEZAWA et al., 2004).

6. CONCLUSÕES

107

1- A análise de alguns aspectos epidemiológicos permitiu verificar que os

pacientes com infecção chagásica apresentam piores condições sócio-econômicas,

comparados aos pacientes do grupo controle os quais apresentaram melhores condições

de moradia atual e anteriormente a este estudo, maior grau de escolaridade, e

conseqüentemente melhores condições de trabalho.

2- A positividade da hemocultura dos pacientes foi em geral baixa, mais

elevada no grupo de pacientes com a forma indeterminada em relação às demais formas

clínicas da doença, mas sem apresentar associação com a morbidade da doença de

Chagas.

3- Quando foi avaliado o desempenho da técnica de ELISA, desenvolvida e utilizada

rotineiramente em nosso laboratório para o diagnóstico sorológico da doença de Chagas

realizando a pesquisa de IgG total e suas subclasses em pacientes com diferentes

manifestações clínicas da doença, IgG total seguida por IgG3 apresentaram os melhores

desempenhos no diagnóstico da infecção possibilitando ainda melhor distinção entre os

pacientes com as diferentes formas clínicas e o grupo controle.

4- Quando a metodologia de ELISA anterior foi aplicada ao diagnóstico

sorológico da doença de Chagas em amostras de soro que incluíram portadores de

outras doenças infecto-parasitárias (HIV, HCV, SIF, LV e LT), foram encontradas na

diluição de soro selecionada como a indicada para o seguro diagnóstico, alta

sensibilidade e especificidade para IgG total e ausência de reação cruzada. Foi

demonstrada ainda a ocorrência de resultados falso-negativos e altos índices de

reatividade cruzada na pesquisa de IgG1, IgG2 e IgG3 em soros de indivíduos com

outras infecções, não sendo então recomendada a aplicação da pesquisa destas

subclasses de IgG em triagem de doadores em bancos de sangue.

5- A pesquisa de IgG e suas subclasses pela metodologia de ELISA não

comercial na avaliação da morbidade da doença de Chagas permitiu verificar que IgG

total apresentou níveis significativamente mais elevados no grupo DIG/MIS em relação

aos demais grupos clínicos (IND, CARD 1 e CARD 2) e que IgG3 apresentou uma

108

reatividade significativamente mais elevada nos pacientes do grupo IND em relação aos

grupos CARD 2 e DIG/MIS. Os valores de DO obtidos para subclasses IgG1 e IgG2

não apresentaram uma associação com as formas clínicas da doença de Chagas.

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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8. ANEXOS

121

Anexo I

TERMO DE CONSENTIMENTO

Eu...............................................................ou meu responsável..............................................tem

conhecimento de minha participação como voluntário no projeto de pesquisa "Doença de Chagas nos

Municípios de Berilo e José Gonçalves de Minas, Vale do Jequitinhonha, MG: epidemiologia, terapêutica

e controle" desenvolvido sob a responsabilidade da Pesquisadora Dra. Marta de Lana da Universidade

Federal de Ouro Preto, do médico coordenador clínico do projeto e dos médicos atendentes no Serviço

único de Saúde (SUS) que tem como objetivo o diagnóstico e tratamento da doença de Chagas nestes

municípios e isolamento do parasita para estudos genéticos. A doença de Chagas é uma doença crônico

degenerativa que atinge especialmente o coração (aumento da área cardíaca, insuficiência cardíaca, risco

de morte súbita) e o trato gastro-intestinal (megaesôfago e megacólon) evolui lentamente, podendo

atingir, principalmente, o coração, o esôfago e intestino. O tratamento específico será feito com o

Rochagan (benznidazol), em esquema prolongado, 5 a 10mg/Kg/dia, via oral, durante 60 dias

consecutivos, sob supervisão médica e controle de leucometria.

A minha participação é voluntária e será restrita a doação de sangue e recebimento de tratamento com

benznidazol. O sangue será coletado por picada na polpa digital (inquérito sorológico em escolares), por

via endovenosa (confirmação do diagnóstico da doença de Chagas) ou para a realização da hemocultura

(diagnóstico parasitológico, isolamento do parasita antes do tratamento e controle do tratamento)

utilizando seringa e agulha estéreis e descartáveis, ou seja, de uso individual e seguro. O volume de

sangue a ser coletado poderá variar de 3mL e no caso da hemocultura, 30mL.

Fui informado que caso se confirme o meu diagnóstico para doença de Chagas me será oferecido

tratamento específico se houver indicação clínica, o qual acarretará ou não a cura da doença. Estou

também informado que o tratamento causa efeitos colaterais que devem ser comunicados ao meu médico

para o devido controle ou mesmo interrupção do tratamento, se necessário.

Tenho consciência que a minha participação como voluntário não me trará benefício financeiro. Os

exames de procedimentos aplicados serão gratuitos e receberei atenção médica adequada pelo serviço de

saúde local para o controle dos efeitos adversos do tratamento. Isto não implica na interrupção de meu

atendimento pelo SUS municipal no tocante à doença de Chagas. Tal procedimento também não

acarretará em prejuízos a outros pacientes ou membros de minha família que estejam participando do

projeto do projeto. Estou ciente que um eventual corte de recursos do projeto não acarretará interrupção

de meu tratamento e nem de meu atendimento pelo SUS no tocante à doença de Chagas.

Local e data:

Assinatura do voluntário:

Assinatura do pesquisador responsável:

Assinatura do médico responsável:

Assinatura do Secretário de Saúde municipal:

Assinatura do Coordenador Clínico do projeto:

Centro de Pesquisas René Rachou

122

Anexo II

Primeira parte

FICHA EPIDEMIOLÓGICA E CLÍNICA

Município de Berilo e José Gonçalves de Minas - MG

Nº de Registro no SUS: _______________________ Código projeto:

__________________________

Médico responsável: Dr/a. _____________________ Data: ___ / ___ / ___

DADOS PESSOAIS

Nome (completo): ____________________________________________ Apelido:

___________________

Idade: ________ Data de Nascimento: ___ / ___ / ___ Sexo: (1) Masculino

(2) Feminino

Nome do pai:

_________________________________________________________________________

Nome da mãe:

________________________________________________________________

________

Endereço/comunidade:

_________________________________________________________________

Alguma referência perto do endereço:

____________________________________________________

Profissão:

____________________________________________________________________________

Estudos: (1) analfabeto (2) 1º grau incompleto (3) 1º grau completo

(4) 2º grau incompleto (5) 2º grau completo (6) estudos superiores

Você fuma? (1) sim (2) não Quanto por semana?

__________________________________________

Você toma bebidas com álcool? (1) de alto teor (cachaça, conhaque...) (2) de baixo teor (cerveja,

vinho...) (3) nada

Quanto por semana?

__________________________________________

Você faz exercício físico? (1) Leve (andar a pé distâncias curtas sem carregar peso) (2) Moderado

(intermédio entre 1 e 3)

(3) Intenso (carregar pedras, trabalhar no machado...)

RESIDÊNCIAS ANTERIORES

Lugar de residência Anos de residência Piso Parede

Teto

Códigos da tabela: Piso: (1) alvenaria/cemento; (2) barro/adobe; (3) madeira. Parede: (1) alvenaria/cimento; (2)

barro/adobe; (3) madeira.

Teto: (4) laje; (5) telha; (6) sapé; (7) madeira/amianto/PVC

RESIDÊNCIA ATUAL

Anos de residência: ______ Casa própria: (1) sim (2) não (3) não

sei

Alugada: (1) sim (2) não (3) não sei Emprestada/cedida: (1) sim (2) não

(3) não sei

123

Piso: (1) alvenaria; (2) barro/adobe; (3) madeira Parede :(1) alvenaria; (2) barro/adobe;

(3) madeira

Teto: (4) laje; (5) telha; (6) sapé; (7) madeira/amianto/PVC

DIVERSOS

Água encanada (dentro ou fora de casa): (1) sim (2) não Água de poço: (1) sim (2) não

Água de córrego/rio: (1) sim (2) não Caminhão pipa: (1) sim (2) não

Dejetos (cocô...) vão para esgoto? (1) sim (2) não Dejetos (cocô...) vão para fossa? (1) sim

(2) não

Dejetos (cocô...) ficam ao ar livre? (1) sim (2) não

Eletricidade: (1) sim (2) não Geladeira: (1) sim (2) não

Rádio: (1) sim (2) não TV: (1) sim (2) não

Você tem horta no quintal? (1) sim (2) não Galinheiro: (1) sim (2) não

Você tem cão? (1) sim (2) não Você tem gato? (1)sim (2) não

Você viu gambá na sua casa? (1) sim (2) não Você viu sarué na sua casa? (1) sim

(2) não

Você viu ratos na sua casa? (1) sim (2) não

BARBEIRO (Realizar teste de reconhecimento com caixinha)

Reconheceu o barbeiro? (1) sim (2) não (3) não sei

Reconheceu a espécie? (1) P. megistus (2) P. geniculatus (3) T. sordida (4) T.

pseudomaculata

(5) R. neglectus (6) não sei

Onde o viu? (1) dentro de casa (2) peridomicílio (ao redor de casa) (3) longe de casa (roça, outros...)

Já foi picado por ele alguma vez? (1) sim (2) não (3) não sei

Como o viu? _______Quando o viu ?_______

HISTÓRIA CLÍNICA

ANTECEDENTES TRANSFUSIONAIS

Você já doou sangue? (1) sim (2) não

Você recebeu sangue? (1) sim (2) não (3) não sei Quantas vezes? ____ Quando (em que

ano)? _______

ANTECEDENTES OBSTÉTRICOS

Nº de gravidezes: ____ Nº de abortos (perdas com menos de 20 semanas): ____ Nº de partos:

____

Nº cesárias: ____ Nº de filhos nascidos vivos: ____

Nº de prematuros (entre 20 e 38 semanas): ____ Nº de filhos com baixo peso (< 2.500g):

____

Problemas ou doenças durante a gestação (sangramento, pressão alta, açúcar alto, infecções...):

_________________

_____________________________________________________________________________

________

Observação: Perguntar quantas consultas pré-natal fez nas gestações ou partos complicados.

ANTECEDENTES PESSOAIS RELATIVOS À DOENÇA DE CHAGAS

Você tem “doença de Chagas”? (1) sim (2) não (3) não sei

Você tem algum problema no coração? (1) sim (2) não (3) não sei

Você tem algum problema no esôfago (entalo/engasgo) ou no intestino grosso? (1) sim (2) não

(3) não sei

124

Como você descobriu que tinha “doença de Chagas”?

(1) na consulta com o médico

(2) com exame que confirmou a doença (anexar resultados) Quais?________

(3) não sei

Há quanto tempo você sabe que tem “doença de Chagas”? ____ anos

Você está em tratamento de “doença de Chagas”? (1) sim (2) não (3) não sei

Quais os medicamentos que você usa no momento para “doença de Chagas”?

(0) nenhum (1) Rochagan® (2) Lampit® (3) outro

(8) não sabe

Se outro, cite o medicamento:

___________________________________________________________

HISTÓRIA FAMILIAR DE DOENÇA DE CHAGAS

Atualmente há alguém com problema no coração na sua família? (1) sim (2) não (3) não

sei

Qual é o grau de parentesco? (1) pai (2) mãe (3) irmão (4) filho (5) tio (6) primo carnal

(7) sobrinho

(8) avô paterno (9) avó paterna (10) avô materno (11) avó materna (12) outros:

___________________

Há alguém com problema no esôfago (entalo) ou intestino grosso na família? (1) sim (2) não

(3) não sei

Qual é o grau de parentesco? (1) pai (2) mãe (3) irmão (4) filho (5) tio (6) primo carnal

(7) sobrinho

(8) avô paterno (9) avó paterna (10) avô materno (11) avó materna (12) outros:

___________________

Atualmente há alguém com outras doenças na sua família:

___________________________________

_____________________________________________________________________________

________

Atualmente você tem parentes com doença de Chagas? (1) sim (2) não (3) não sei

Qual é o grau de parentesco? (1) pai (2) mãe (3) irmão (4) filho (5) tio (6) primo carnal (7)

sobrinho

(8) avô paterno (9) avó paterna (10) avô materno (11) avó materna (12) outros:

___________________

Você tem parentes falecidos com doença de Chagas? (1) sim (2) não (3) não sei

Quantos? ______ Há quanto tempo faleceram? ____anos

Qual é o grau de parentesco? (1) pai (2) mãe (3) irmão (4) filho (5) tio (6) primo carnal (7)

sobrinho

(8) avô paterno (9) avó paterna (10) avô materno (11) avó materna (12) outros:

___________________

Você tem parentes que morreram de repente? (1) sim (2) não (8) não sei

Qual é o grau de parentesco? (1) pai (2) mãe (3) irmão (4) filho (5) tio (6) primo carnal (7)

sobrinho

(8) avô paterno (9) avó paterna (10) avô materno (11) avó materna (12) outros:

___________________

125

HISTÓRIA DE INTERNAÇÃO, TRATAMENTO E APOSENTADORIA

Você já foi internado por causa da doença de Chagas? (1) sim (2) não (8) não sei

Há quanto tempo? ____ Em que hospital ou cidade?

___________________________________

Você consultou com cardiologista devido à doença de Chagas? (1) sim (2) não (8) não sei

Em que hospital ou cidade?

_____________________________________________________________

Você já usou: (1) Rochagan® (2) Lampit® (3) nenhum (4) não sei Quantas vezes?______

Quando?_______

Você tem receitas do tratamento? (citar/anexar) (1) sim (2) não (3) não sei

Quantos comprimidos ao dia? ________ Quantos vidros? ______ Por quanto tempo?

__________

Em qual município você foi tratado?

_____________________________________________________

Você apresentou alguma reação de mal estar durante o tratamento? (1) sim (2) não (3)

não sei

Qual/quais?

Quando?

Foi preciso parar o tratamento? (1) sim (2) não (3) não sei Quando? _______________

Foi feita mudança na forma de tratamento? (1) sim (2) não (3) não sei Quando?

_______________

Você já é aposentado por Doença de Chagas? (1) sim (2) não Há quanto tempo?

______ anos

HISTÓRIA DOS EXAMES LABORATORIAIS

Quais os exames (com seus resultados) que você fez durante o tratamento?

__________________________

_____________________________________________________________________________

________

_____________________________________________________________________________

________

Você tem algum dos exames com você? (citar/anexar) (1) sim (2) não (3) não sei

DÚVIDAS SOBRE A DOENÇA E O TRATAMENTO

Você tem alguma dúvida sobre a Doença de Chagas?

_____________________________________________________________________________

________

Você tem alguma dúvida sobre o tratamento com Rochagan®?

_____________________________________________________________________________

________

Segunda parte

FICHA MÉDICA

126

Município de Berilo e José Gonçalves de Minas - MG

Nº de Registro no SUS: _______________________ Código projeto:

__________________________

Médico responsável: Dr/a. _____________________ Data: ___ / ___ / ___

ANAMNESE

Queixa principal:

______________________________________________________________________

Doenças atuais: (1) Diabete (2) Hipertensão Outras (citar):

______________________________________

_____________________________________________________________________________

________

Sintomatologia respiratória (dispnéia, quase sempre aos esforços, ortopnéia, etc.):

______________________________

_____________________________________________________________________________

________

Sintomatologia cardiovascular (fadiga aos esforços, astenia, palpitações, tonturas, vertígens, lipotimia, síncope,

escurecimento da vista, confusão mental, dor precordial de características anginóides ou não, edema de membros inferiores,

manifestações tromboembólicas pulmonares ou sistêmicas, etc.):

__________________________________________________________________________

_____________________________________________________________________________

________

_____________________________________________________________________________

________

Disfagia com comida fria? (1) sim (2) não Disfagia com comida seca? (1) sim

(2) não

Precisa água para engolir alimentos? (1) sim (2) não Regurgitação? (1) sim (2) não

Odinofagia (durante a ingestão de alimentos)? (1) sim (2) não Pirose (ardor, queimação...)? (1) sim (2) não

Dor esofagiana retroesternal (independente das refeições, espontânea, urente, constritiva...)? (1) sim (2) não

Singulto (soluço)? (1) sim (2) não Tosse? (1) sim (2) não

Náuseas? (1) sim (2) não Sialose (hipersalivação)? (1) sim (2) não

Obstipação intestinal? (1) sim (2) não Nº evacuações por mês: ___

Meteorismo? (1) sim (2) não Distensão abdominal? (1) sim (2) não

Disquezia (dificuldade para evacuar)? (1) sim (2) não

Sensação de peso no hipocôndrio direito ? (1) sim (2) não

Dores no hipocôndrio direito? (1) sim (2) não

Sensação de peso na região epigástrica? (1) sim (2) não

Dores epigástricas? (1) sim (2) não

Sintomatologia urinária (disúria, polaquiúria, tenesmo, hematúria, oligúria):

_________________________________

_____________________________________________________________________________

________

DUM: ___ / ___ / ___

EXAME FÍSICO

Peso: ____________ Altura: ____________ IMC [Kg/(altura em metros)

______________

127

Temperatura axial: (1) <37º (2) 37-38º (3) >38º Pulso: ______ bpm (1) regular (2)

irregular

PA sistólica: ______ mm Hg PA diastólica: ______ mm Hg

Estado Geral (astenia, anorexia, desnutrição, obnubilação com sudorese e pele fria...):

______________________________

_____________________________________________________________________________

________

Coloração mucocutânea: (1) Normal (2) Palidez (3) Cianose (4) Outra:

__________________________

Hidratação mucocutânea: (1) Normal (2) Deshidratação

Sinal de Romaña (edema bipalpebral unilateral elástico, indolor, de coloração róseo-violácea, com adenopatias pré-

auriculares, parotídeas ou submaxilares...) ? (1) sim (2) não

Chagoma (lesão em partes descobertas, sobrelevada, eritematosa, dura, pouco dolorosa, com linfonodos satélites, etc.)? (1)

sim (2) não

Edema subcutâneo (localizado ou generalizado, com ou sem insuf. Cardíaca)? (1) sim (2) não

Características: ______

_____________________________________________________________________________

________

Adenopatias? (1) sim (2) não Características (hipertrofia leve ou moderada, não aderentes aos planos

contíguos, isoladas, indolores...):

_____________________________________________________________________________

Hipertrofia parótidas: (1) sim (2) não

Ictus cordis: (1) desviado (2) normal Características do desvio:

_______________________________

Ingurgitação jugular (a 45º...)? (1) sim (2) não

Bulhas: (1) normofonéticas (2) hipofonéticas Desdobramento B2 (foco pulmonar): (1)

sim (2) não

Nº de extrasístoles por minuto: ________________ Sopro: (1) sim (2) não

Características do sopro (proto, meso, tele ou pan-sistólico, diastólico, focalidade mitral, tricúspide, aórtica ou

pulmonar, etc.): ___ ______________________

_______________________________________________________________

_____________________________________________________________________________

________

Sinais respiratórios (estertores finos e crepitantes nas bases, ortopnéia, etc.):

__________________________________

_____________________________________________________________________________

________

Distensão abdominal (abdome globoso, assimétrico...)? (1)sim (2)não

Timpanismo na percussão abdominal (presença de gases na alça dilatada, no hipocôndrio esquerdo se houver

retenção de gases no ângulo esplênico do colo, etc.)? (1)sim (2)não

Palpação de fecaloma (tumor inelástico, que cede à compressão sem retornar à sua forma primitiva...)? (1)sim

(2)não

Hepatomegalia? (1) sim (2) não Quantos cm abaixo da reborda costal

direita? ___

Consistência alterada? (1) sim (2) não Superfície lisa? (1) sim (2) não

Esplenomegalia? (1) sim (2) não Quantos cm abaixo da reborda costal

esquerda? ___

Consistência alterada? (1) sim (2) não Superfície lisa? (1) sim (2) não

128

Alteração do SNC? (1) sim (2) não Qual/Quais (rigidez de nuca, convulsões generalizadas,

focalidade neurológica, etc.):

__________________________________________________________________________

_____________________________________________________________________________

________

_____________________________________________________________________________

________

Alteração dos reflexos osteotendinosos? (1) sim (2) não

Alteração da sensibilidade superficial? (1) sim (2) não

Alterações do sistema neurovegetativo (obnubilação com sudorese e pele fria...)? (1) sim (2) não

Outros:

_____________________________________________________________________________

________

_____________________________________________________________________________

________

Terceira parte

FICHA DE EXAMES COMPLEMENTARES

Município de Berilo e José Gonçalves de Minas - MG

Nº de Registro no SUS: _______________________ Código projeto:

__________________________

Médico responsável: Dr/a. _____________________

Exame Data Resultado Observações

RX tórax

(1) N (2) AN

2 ECG* (1) N (2) AN

Ecocardiograma

(1) N (2) AN

Prova de esforço

(1) N (2) AN

Esofagograma

(1) N (2) AN

Colonoscopia

(1) N (2) AN

Hemaglutinação

(1) N (2) AN

ELISA

(1) N (2) AN

Imunofluorescência (IFI)

(1) N (2) AN

AATV (citometria de fluxo)

(1) N (2) AN

Hemocultura

(1) N (2) AN

PCR

(1) N (2) AN

Xenodiagnóstico

(1) N (2) AN

Perfil de citocinas

(1) N (2) AN

EPF

(1) N (2) AN

Hemograma

(1) N (2) AN

Leucograma

(1) N (2) AN

GOT/GPT

(1) N (2) AN

Bilirrubina T/C

(1) N (2) AN

Uréia/Creatinina

(1) N (2) AN

21 (1) N (2) AN

22 (1) N (2) AN

23 (1) N (2) AN

129

24 (1) N (2) AN

25 (1) N (2) AN

26 (1) N (2) AN

27 (1) N (2) AN

28 (1) N (2) AN

29 (1) N (2) AN

30 (1) N (2) AN

31 (1) N (2) AN

32 (1) N (2) AN

33 (1) N (2) AN

34 (1) N (2) AN

Código da tabela: N = resultado normal; AN = resultado anormal

Cepa Isolada: (1) sim (2) não Data: ___ / ___ / ___

* Alterações eletrocardiográficas sugestivas de cardiopatia chagásica são: bloqueio de ramo direito, hemi-bloqueio anterior esquerdo

(ou bloqueio da divisão antero-superior do ramo esquerdo), bloqueio atrioventricular, bradicardia sinusal e batimentos ventriculares

prematuros superiores a três por minuto e quando acompanhados de bradicardia.

CONCLUSÕES

Infecção chagásica: (1) sim (2) não

Forma Indeterminada (I Reunião de Pesquisa Aplicada em Doença de Chagas - 1985): (1) sim (2) não

(1) Positividade de exames sorológicos e/ou parasitológicos; ausência de sintomas e/ou sinais de doença; eletrocardiograma

convencional normal; coração, esôfago e cólon radiologicamente normais.

Forma Cardíaca (Classificação da OMS 1971): (1) (2) (3) (4)

(1) infecção sem evidência clínica, radiológica ou eletrocardiográfica.

(2) sintomatologia ausente ou discreta, área cardíaca normal ou levemente aumentada no RX, alterações no ECG: bloqueio completo

de ramo direito, distúrbios da repolarização ventricular, extrasístoles ventriculares.

(3) sintomatologia evidente, cardiomegalia moderada e alterações no ECG: bloqueiro completo de ramo direito com desvio do eixo

elétrico para a esquerda, zonas eletricamente inativas.

(4) insuficiência cardíaca, cardiomegalia nítida no RX e severas e numerosas alterações no ECG: arritmias compleas e graves,

extensas zonas eletricamente inativas.

Forma Digestiva – Esofagopatia (Classificação de Rezende et al. 1960): (0) (1) (2) (3) (4)

(0) Normalidade.

(1) Grupo I há retardo no esvaziamento esofágico, sem dilatação

(2) Grupo II, se além do retardo no esvaziamento ha dilatação leve a moderada (até 5cm).

(3) Grupo III, se dilatação é grande (> 5cm), com hipotonia no esôfago inferior.

(4) Grupo IV ou dólico-megaesôfago, se além do mais o esôfago alongado, dobrado sobre si mesmo no terço inferior.

Colonopatia: (1) (2)

(1) Dentro da normalidade.

(2) Dilatação colonoscópica no adulto > a 7cm.

Comprometimento do SNC (meningoencefalite): (1) sim (2) não

Outra(s) doença(s) concomitantes: (1) sim (2) não Citar:

___________________________________

_____________________________________________________________________________

________

_____________________________________________________________________________

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130

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_____________________________________________________________________________

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ENCAMINHAMENTOS REALIZADOS

Data: ___ / ___ / ___ Obs:

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Data: ___ / ___ / ___ Obs:

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Data: ___ / ___ / ___ Obs:

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Data: ___ / ___ / ___ Obs:

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Data: ___ / ___ / ___ Obs:

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Data: ___ / ___ / ___ Obs:

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