( PDF ) Características reológicas do exopolissacarídeo botriosferana produzido pelo Botryosphaeria rhodina MAMB-05 em três fontes de carbono: glucose, frutose e sacarose

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Campus de São José do Rio Preto

DEPARTAMENTO DE ENGENHARIA E TECNOLOGIA DE

ALIMENTOS

INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS, LETRAS E CIÊNCIAS EXATAS

CARACTERÍSTICAS REOLÓGICAS DO EXOPOLISSACARÍDEO

BOTRIOSFERANA PRODUZIDO PELO Botryosphaeria rhodina

MAMB-05 EM TRÊS FONTES DE CARBONO: GLUCOSE, FRUTOSE

E SACAROSE

RAPHAEL ALVES MACEDO BONGIOVANI

SÃO JOSÉ DO RIO PRETO-SP

2008

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RAPHAEL ALVES MACEDO BONGIOVANI

CARACTERÍSTICAS REOLÓGICAS DO EXOPOLISSACARÍDEO

BOTRIOSFERANA PRODUZIDO PELO Botryosphaeria rhodina

MAMB-

05 EM TRÊS FONTES DE CARBONO: GLUCOSE, FRUTOSE E

SACAROSE

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-

Graduação em Engenharia e Ciências de

Alimentos do Departamento de Engenharia e

Tecnologia de Alimentos, do Instituto de

Biociências, Letras e Ciências Exatas, UNESP,

Campus de São José do Rio Preto, como

requisito à obtenção do título de Mestre.

Orientadora:

Profa. Dra. Maria de Lourdes Corradi Custódio da Silva

(UNESP/FCT - Presidente Prudente/SP)

Co-orientadora

Profa. Dra. Ana Lúcia Barretto Penna

(UNESP/IBILCE – São José do Rio Preto/SP)

SÃO JOSÉ DO RIO PRETO-SP

2008

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RAPHAEL ALVES MACEDO BONGIOVANI

CARACTERÍSTICAS REOLÓGICAS DO EXOPOLISSACARÍDEO

BOTRIOSFERANA PRODUZIDO PELO Botryosphaeria rhodina MAMB-

05 EM TRÊS FONTES DE CARBONO: GLUCOSE, FRUTOSE E

SACAROSE

BANCA EXAMINADORA

Prof

- Ana Lucia Barretto Penna

Professora Livre-Docente

UNESP – São José do Rio Preto

Orientador

Prof

- Joana Lea Meira Silveira

Professora Associado I

Universidade Federal do Paraná - UFPR

Prof. Dr.

- Roberto da Silva

Professor Livre-Docente

UNESP – São José do Rio Preto

São José do Rio Preto, 02 de junho de 2008

Este trabalho é fruto do incentivo e

amor que recebi principalmente de

minha mãe Sonia Macedo, meus

irmãos Brunno e Leonardo,

pessoas fundamentais em minha

vida

AGRADECIMENTOS

Deus, que sempre esteve ao meu lado, guiando, sustentando e iluminando

minha vida com tantas bênçãos, permitindo a concretização de mais uma etapa da minha vida.

À minha mãe, Sonia Alves Macedo pelo amor incondicional, apoio e

compreensão. Mulher batalhadora pelos seus ideais! Você é meu principal incentivo e maior

orgulho! Amo a Senhora!

Aos meus irmãos Brunno e Leonardo, pelo companheirismo e amor

incondicional.

À minha esposa (Letícia) pelo carinho e apoio sempre. Agradeço a Deus

pela sua presença na fase final deste trabalho. Pessoa muito especial na minha vida, e que hoje

carrega nossa valiosa semente em sua barriguinha (Manuela), fonte de sonhos e de inúmeras

felicidades.

Aos meus tios Neemias e Jane, que me receberam e me acolheram como um

filho em S.J Rio Preto no início do mestrado. O meu muito obrigado!

À minha orientadora Profa.

Dra.

Maria de Lourdes Corradi Custódio da

Silva, pela confiança e pela oportunidade de realizar este trabalho. Agradeço pela sua

orientação, supervisão, incentivo, ajuda e apoio demonstrados durante a realização deste

trabalho.

À Profa. Dra. Ana Lúcia Barretto Penna pela Co-orientação deste trabalho.

À CAPES pela bolsa de mestrado.

Ao programa de Pós-Graduação em Engenharia e Ciências de Alimentos da

Unesp - São José do Rio Preto.

À Profa. Dra. Aneli de Melo Barbosa do Departamento de Bioquímica e

Biotecnologia da Universidade Estadual de Londrina-PR, pela colaboração na produção dos

exopolissacarídeos.

À Profa. Dra. Joana Lea Meira Silveira, do Departamento de Bioquímica e

Biologia Molecular da Universidade Federal do Paraná, pela colaboração na realização das

analises reológicas.

Aos colegas que fiz durante as etapas deste trabalho no Departamento de

Bioquímica e Biotecnologia da Universidade Estadual de Londrina-PR, e no

Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular da Universidade Federal do Paraná

- UFPR, que sempre se mostraram dispostos a me ajudar durante os experimentos.

Aos colegas do Laboratório de Química de Carboidratos da UNESP de

Presidente Prudente, em especial Nilson, Junior, Andreza, Técnica “Marilsa” e Profa. Ms.

Ana Flora) pelo companheirismo, incentivo e ajuda indispensável para a realização deste

trabalho. Muito Obrigado!

Tatiana “TATI” por ter me ajudado nos estudos quando estava com dúvidas,

e por sempre ser uma grande e maravilhosa amiga.

À Regina, Pesquisadora do Instituto Adolfo Lutz de Presidente Prudente,

grande incentivadora para minha entrada no Mestrado.

Ao meu amigo Paulo pelo incentivo e as inúmeras orações.

A todos aqueles que de forma direta ou indireta me ajudaram na realização

deste trabalho.

“Nunca diga a Deus o tamanho do seu

problema; diga ao seu problema o

tamanho do seu Deus”.

Autor desconhecido

Fonte: http://pensamentos.prati.com.br

RESUMO

Os exopolissacarídeos (EPS) são polímeros produzidos por uma grande variedade de

microrganismos e podem possuir propriedades físicas, estruturais e químicas diferentes.

Considerando o interesse crescente das indústrias na busca de polissacarídeos que apresentem

comportamento reológico compatível com sua aplicação, tanto nos setores de alimentos como

farmacêutico, cosmético e têxtil, pesquisas vêm sendo realizadas com a esperança da

descoberta de novas moléculas promissoras para tais aplicações. O objetivo deste trabalho foi

determinar as características reológicas do exopolissacarídeo (botriosferana) produzido pelo

Botryosphaeria rhodina MAMB-05 em três fontes de carbono: glucose (EPS

GLU)

, sacarose

(EPS

SAC

) e frutose (EPS

FRU)

. A análise da composição monossacarídica, após hidrólise ácida,

mostrou que todos os polímeros são constituídos exclusivamente por glucose e a

cromatografia de filtração em gel indicou baixo grau de polidispersividade. Experimentos

com o corante Congo Red evidenciaram a presença de tripla hélice nos três polímeros

produzidos pelo fungo B. rhodina MAMB-05. Os três polissacarídeos comportaram-se como

fluidos não-Newtoniano com características de soluções pseudoplásticas e tixotrópicas e com

diminuição da viscosidade quando em presença de NaCl. As soluções aquosas de EPS

GLU

EPS

SAC

e EPS

FRU

apresentaram comportamento viscoelástico, com características de gel forte

em 5 e 25°C, não sofrendo mudanças no comportamento, mesmo em presença de NaCl, a

25°C. As soluções polissacarídeos mantiveram as características de géis fortes, com

propriedades termoestáveis e termorresistentes, entre 5 a 95°C de temperatura. Esses

resultados permitiram concluir que os EPS produzidos pelo fungo B. rhodina MAMB-05

possuem propriedades químicas e físicas, passíveis de utilização nas indústrias de alimentos,

farmacêutica, cosmética e biomédica.

Palavras chaves: Exopolissacarídeos; Botryosphaeria rhodina MAMB-05; Botryospherana;

Análises reológicas.

ABSTRACT

Exopolysaccharides (EPS) are polymers produced by a great variety of microorganisms and

can possess different physical and chemical properties, and structural features. Considering

the growing interest in commercial applications of polysaccharides that show rheological

compatible behavior within the application, as in the food, pharmaceutical, cosmetic and

textile sectors, research have been developed in attempts to discover new promising

biomolecules for such applications. The objective of the work presented was to determine the

rheological characteristics of the exopolysaccharide botryosphaeran produced by

Botryosphaeria rhodina MAMB-05 on three different sole carbon sources: glucose (EPS

GLU

sucrose (EPS

SUC

) and fructose (EPS

FRU

). The analysis of monosaccharide composition, after

acid hydrolysis, showed glucose as the only component and the gel permeation

chromatography indicated that the EPSs have an excellent purity grade. All three biopolymers

produced by B. rhodina MAMB-05 were found to exist in the triple helix conformational

state. The three exopolysaccharides showed non-Newtonian behavior, with pseudoplastic and

thixotropic characteristics, and showed a slight decrease in viscosity in presence of NaCl. The

three biopolymer gels showed viscoelastic behavior, with characteristics of strong gelling at 5

ºC and 25 ºC, without suffering behavioral changes, even in the presence of NaCl at 25 ºC.

The polysaccharide solutions kept the strong gel characteristics possessing thermo-stable and

thermo-resistant properties when evaluating the influence of temperature (5 – 95 ºC) over the

viscoelastic behavior of solutions. The results concluded that the EPS’s produced by fungus

B. rhodina MAMB-05 have physical and chemical properties amenable for use in the food,

pharmaceutical, cosmetic and biomedical industries.

Key Words: Exopolysaccharides; Botryosphaeria rhodina MAMB-05; Botryosphaeran;

Rheological analyses.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 -

Estrutura dos heteropolissacarídeos (A e B) e homopolissacarídeos (C, D, E,

F, G)...................................................................................................................

Figura 2 -

(A) Ilustração da conformação em hélice simples da β(1→3)-D-glucanas

(B) Simulação tridimensional em tripla hélice da β(1→3) (1→6) glucan

(escleroglucana).................................................................................................

Figura 3 -

Botriosferana: β(1→3) (1→6) -D-glucana......................................................

Figura 4 -

Fluxo entre duas placas paralelas........................................

.........

......................

Figura 5 -

Representação esquemática de líquido em repouso (superior) e após a

aplicação de uma taxa de cisalhamento (inferior).............................................

Figura 6 -

Vários tipos de comportamento de fluxo..........................................................

Figura 7 -

Classificação do comportamento reológico de fluidos .....................................

Figura 8 -

Comportamento viscoso e viscoelástico............................................................

Figura 9 -

Representação gráfica genérica de sistemas polissacarídeos submetidos a

medidas reológicas dinâmicas. a) gel forte, b) solução concentrada ou gel

fraco, e c) solução diluída..................................................................................

Figura 10 -

Produção do botriosferana em três fontes de carbono. A)

Cultivo estoque do

Botryosphaeria rhodina; B) Pré-

inóculo em meio (VGA), depois de 5 dias

28 ± 2 ºC; C) Inter

rupção do cultivo para posterior centrifugação do material

“EPS mais micélio” ; D) Micélio sendo reservado após a centrifugação do

EPS; E) Sobrenadante após centrifugação, seguindo

para precipitação em

etanol; F) EPS precipitado após “overnight”em etanol;

G) EPS solubilizado

em água e resfriado; H) EPS liofilizado............................................................

Figura 11 -

A)Reômetro HAAKE RS75 Rheostress; B) Ilustração dos EPS

solubilizados; C) Amostra sendo colocada na placa estaci

onária do reômetro;

D) Exopolissacarídeo após varredura a 5°C......................................................

Figura 12 -

Ilustração do sensor cone-placa utilizado no reômetro.....................................

Figura 13 -

Cromatografia de filtração em gel de Sepharose CL –

4B dos EPS

produzidos em glucose, frutose e sacarose. Total de EPS aplicado: 2,0 mg;

fluxo: 0,3 mL/min; eluente: H

O; volume da fração: 2,6 mL para EPS

GLU

EPS

SAC

e 2,9 mL para EPS

FRU

; volume da coluna: 30,0 mL............................

Figura 14 -

Análise dos monossacarídeos provenientes da hidrólise ácida dos EPS

GLU

EPS

SAC

, EPS

FRU

e EPS

XAN

por HPAEC/PAD. Padrões de açúcares neutros

(Pd), com tempos de retenção em min: fucose (6.13); arabinose (9.76);

rha

minose (10.48); galactose (12.83); glucose (14.08); manose (15.50).

Condições da corrida: isocrática (NaOH 14mM, 25 minutos). Coluna:

CarboPac PA1. Condições de hidrólise: TFA 5M, 16 horas, 100 ºC.

Quantidade de material: 50µg...........................................................................

Figura 15 -

Análise conformacional do EPS produzido em diferentes fontes de carbono

(glucose “EPS

GLU

”, sacarose “EPS

SAC

”, frutose “EPS

FRU

” e o padrão de

goma Xantana“EPS

XAN”

)..................................................................................

Figura 16 -

Curva de fluxo, tensão de cisalhamento (τ) x taxa de cisalhamento (

) do

EPS

GLU

, nas concentrações de 1 a 6g/L. Em sistema aquoso a 25ºC................

Figura 17 -

Curva de fluxo, tensão de cisalhamento (τ) versus a taxa de cisalhamento (

)

do EPS

SAC

nas concentrações de 1 a 6g/L. Em sistema aquoso a 25º C...........

Figura 18 -

Curva de fluxo, tensão de cisalhamento (τ) x taxa de cisalhamento (

) do

EPS

FRU

, nas concentrações de 1 a 6g/L. Em sistema aquoso a 25º C...............

Figura 19 -

Viscosidade absoluta (η) em função da taxa de cisalhamento ( ) do EPS

GLU

nas concentrações de 1 a 6g/L. Em sistema aquoso a 25º C.............................

Figura 20 -

Viscosidade aparente (η) em função da taxa de cisalhamento ( ) do EPS

SAC

nas concentrações de 1 a 6g/L. Em sistema aquoso a 25º C.............................

Figura 21 -

Viscosidade aparente (

) em função da taxa de cisalhamento ( ) do EPS

FRU

nas concentrações de 1 a 6g/L. Em sistema aquoso a 25º C.............................

Figura 22 -

Soluções aquosas do EPS

GLU

á temperatura 25ºC. (a) 3g/L e (b) 6g/L...........

Figura 23 -

Viscosidade absoluta (η) em função da velocidade de cisalh

amento dos

(EPS

GLU

, EPS

SAC

e EPS

FRU

), 6g/L em solução aquosa de NaCl (1g/L) a

25ºC...................................................................................................................

Figura 24 -

Análise do comportamento viscoelástico do EPS

GLU

em 6g/L;

módulo elástico; módulo viscoso;

viscosidade

complexa. (A) em solução aquosa a 25°C; (B) em solução aquosa a 5°C; (C)

em solução aquosa de NaCl (1g/L) a 25°C.......................................................

Figura 25 -

Análise do comportamento viscoelástico do EPS

SAC

em 6g/L;

módulo elástico; módulo viscoso;

viscosidade complexa.

(A) em solução aquosa a 25°C; (B) em solução aquosa a 5°C; (C) em

solução aquosa de NaCl (1g/L) a 25°C.............................................................

Figura 26 -

Análise do comportamento viscoelástico do EPS

FRU

em 6g/L;

módulo elástico; módulo viscoso;

viscosidade complexa.

(A) em solução aquosa a 25°C; (B) em solução aquosa a 5°C; (C) em

solução aquosa de NaCl (1g/L), a 25°C............................................................

Figura 27 -

Comportamento do módulo elástico (G’) dos três exopolissacarídeos

, e

estudados a 25°C (A) e 5°C

(B)......................................................................................................................

Figura 28 -

Rampa de temperatura. Curva

ascendente

(

5 a 95°C) e descendente (95 a 5°C

com aumento de 1,5°C/min. Em

solução aquosa

(6g/L)

....................................

Figura 29 -

Tensão de cisalhamento (τ) versus a taxa de cisalhamento (

) dos três

exopolissacarídeos produzidos pelo fungo B. rhodina

, nas concentrações de

6g/L a 25°C.......................................................................................................

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 -

Fontes de origem dos “hidrocoló

ides ou gomas” com aplicações

industriais..........................................................................................................

Tabela 2 -

Ensaio analítico para a formação do complexo CR/EPS................................

Tabela 3 -

Produção final dos EPS (liofilizados) e as quantificações de açúcares totais,

açúcares redutores e proteínas dos polissacarídeos produzidos pelo

rhodina, em três fontes de carbono.................................................................

Tabela 4 -

Viscosidade absoluta das soluções aquosas e das soluções aquosa

de NaCl

dos EPS

GLU

, EPS

SAC

e EPS

FRU

, 6g/L, nas taxas de cisalhamentos 1,02,

10,59

e 99,19(1/s), à temperatura de 25°C......................................................

Tabela 5 -

Valores obtidos de (G’) nas varreduras de freqüências dos EPS

GLU,

EPS

SAC

EPS

FRU

, na freqüência da 1 Hz.....................................................................

LISTA DE ABREVIAÇÕES E SIGLAS

EPS - Exopolissacarídeos

EPS

FRU

- Exopolissacarídeos produzidos com frutose como forte de carbono

EPS

GLU,

- Exopolissacarídeos produzidos com glucose como forte de carbono

EPS

SAC

- Exopolissacarídeos produzidos com sacarose como forte de carbono

f - Freqüência

G* - Módulo de cisalhamento dinâmico complexo

G’ - Módulo de cisalhamento dinâmico elástico

G” - Módulo de cisalhamento dinâmico viscoso

Hz - Hertz

M - Molar

mg - Miligrama

mL - Mililitros

η - Viscosidade absoluta

η* - Viscosidade Complexa

τ - Tensão de Cisalhamento

- Taxa de Cisalhamento

kDa - Kilodaltons

m/v - Massa/volume

pH - Potencial hidrogeniônico

rpm - Rotações por minuto

TFA - Ácido trifluoracético

v/v - Volume/volume

- Alfa

- Beta

µL

- Microlitro

µm

- Micrômetro

- Amplitude Máxima de Tensão

- Amplitude Máxima de Deformação

δ - Ângulo de Mudança de Fase

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO ..................................................................................................................17

2. OBJETIVOS.......................................................................................................................19

2.1 Objetivos gerais ................................................................................................................19

2.2 Objetivos específicos.........................................................................................................19

3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA..........................................................................................20

3.1 Polissacarídeos..................................................................................................................20

3.2 Exopolissacarídeos............................................................................................................22

3.2.1 Exopolissacarídeos bacterianos....................................................................................24

3.2.2 Exopolissacarídeos fúngicos .........................................................................................27

3.2.3 Botriosferana, exopolissacarídeo produzido pelo fungo Botryosphaeria rhodina

MAMB-05................................................................................................................................30

3. 3 Reologia............................................................................................................................31

3.3.1 Reologia de fluidos.........................................................................................................32

3.3.1.1 Líquidos Newtonianos................................................................................................35

3.3.1.2 Líquidos não-Newtonianos ........................................................................................35

3.3.1.3 Comportamento viscoelástico....................................................................................38

4. MATERIAIS E MÉTODOS..............................................................................................42

4.1 Materiais............................................................................................................................42

4.1.1 Microrganismo...............................................................................................................42

4.1.2 Reagentes........................................................................................................................42

4.1.3 Equipamentos ................................................................................................................42

4.2 Métodos Gerais.................................................................................................................43

4.2.1 Manutenção do Microrganismo...................................................................................43

4.2.2 Produção do botriosferana ...........................................................................................43

4.2.3 Cultivo estoque do Botryosphaeria rhodina MAMB-05 .............................................44

4.2.4 Cultivo do Botryosphaeria rhodina MAMB-05 ...........................................................44

4.2.4.1 Pré-inóculo ..................................................................................................................44

4.2.4.2 Inóculo.........................................................................................................................44

4.2.4.3 Preparo dos meios e cultivo .......................................................................................44

4.2.4.4 Interrupção do cultivo................................................................................................45

4.2.4.5 Isolamento dos exopolissacarídeos............................................................................45

4.2.3 Análises quantitativas nos EPS

GLU

, EPS

SAC

, EPS

FRU

e padrão xantana EPS

XAN

....47

4.2.3.1 Determinação de açúcares totais - método do fenol - ácido sulfúrico....................47

4.2.3.2 Determinação dos açúcares redutores - método de Somogyi – Nelson..................47

4.2.3.3. Determinação de proteínas - método de Bradford.................................................48

4.2.4. Cromatografia de filtração em gel em coluna Sepharose CL-4B.............................48

4.2.5 Hidrólise Ácida Total ....................................................................................................49

4.2.6 Análise da composição de monossacarídeos por cromatografia líquida de alta

pressão e coluna de troca iônica (HPAEC) ..........................................................................49

4.2.4 Análise da estrutura dos EPS.......................................................................................50

4.2.5 Análises reológicas.........................................................................................................51

4.2.5.1 Métodos reológicos .....................................................................................................51

4.2.5.2 Preparo das soluções de β

ββ

β glucanas..........................................................................52

4.2.5.3 Determinação das viscosidades absolutas ................................................................53

4.2.5.4 Curvas de fluxo...........................................................................................................53

4.2.5.5 Análise oscilatória em sistema dinâmico - Varredura de tensão e Varredura de

Frequência...............................................................................................................................54

4.2.5.6 Rampa de temperatura..............................................................................................54

4.2.5.7 Tixotropia....................................................................................................................55

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO .......................................................................................56

5.1 Produção e quantificação dos exopolissacarídeos produzidos pelo Botryosphaeria

rhodina em três diferentes fontes de carbono. .....................................................................56

5.2 Verificação da homogeneidade dos exopolissacarídeos por cromatografia de filtração

em gel.......................................................................................................................................58

5.3 Hidrólise ácida total e análise por HPAEC/PAD dos exopolissacarídeos produzidos

pelo B. rhodina nas diferentes fontes de carbono ................................................................60

5.4 Análise da conformação dos exopolissacarídeos produzidos pelo B. rhodina, em

diferentes fontes de carbono..................................................................................................63

5.5 Análise Reológicas ............................................................................................................65

5.5.1 Curvas de fluxo..............................................................................................................65

5.5.2 Curvas de viscosidade ...................................................................................................67

5.5.3 Análise em sistema dinâmico........................................................................................74

5.5.4 Rampa de temperatura.................................................................................................80

5.5.5 Tixotropia.......................................................................................................................82

6. CONCLUSÃO.....................................................................................................................85

7. REFERÊNCIAS .................................................................................................................86

ANEXO....................................................................................................................................97

1. INTRODUÇÃO

Os exopolissacarídeos (EPS) são polissacarídeos extracelulares produzidos

por uma variedade de bactérias e fungos e são secretados no meio de cultivo ou ligados à

superfície das células. Essas moléculas possuem a característica de formar soluções viscosas,

mesmo em baixas concentrações. Os EPS vêm substituindo progressivamente os

polissacarídeos obtidos de fontes convencionais, como plantas e animais. Devido às suas

propriedades de geleificantes, espessantes, estabilizantes, agentes modificadores de textura,

emulsificantes e formadores de filmes de revestimento ou embalagens, têm sido aplicados nas

indústrias de alimentos, farmacêutica, cosmética, têxtil e biomédica.

O uso potencial de biopolímeros nos diferentes ramos industriais já é

consenso na literatura existente e, neste contexto, novas fontes microbianas têm sido

investigadas com o objetivo de se encontrar polissacarídeos com propriedades físicas e

químicas que permitam as suas aplicações. Essas pesquisas concentram-se nos polissacarídeos

extracelulares, pois são de fácil extração e purificação e apresentam, geralmente, um alto

rendimento na produção.

Os biopolímeros microbianos podem diferir quanto à composição

monossacarídica e, conseqüentemente, em suas propriedades físicas e químicas. Para o

polissacarídeo ser comercializado é importante que possua algumas características reológicas

interessantes, tais como: formar soluções viscosas em baixas concentrações, possuir alta

solubilidade, manter a viscosidade e estabilidade em ampla faixa de pH, temperatura e em

presença de sais.

Segundo alguns autores uma outra propriedade importante em biopolímeros

caracterizados como glucanas com ligação do tipo β, é a estrutura em tripla hélice,

fundamental tanto para a atividade biológica quanto para a manutenção da viscosidade das

soluções polissacarídicas.

O fungo ascomiceto Botryosphaeria rhodina MAMB-05 quando cultivado

em glucose como fonte de carbono produz um exopolissacarídeo denominado botriosferana,

cuja estrutura possui uma cadeia principal formada por unidades β-D-glucopiranosídicas 1,3

ligadas, com cerca de 20% de substituição em C-6, por unidades de glucose e gentiobiose.

O exopolissacarídeo botriosferana pode ser obtido, a partir do mesmo fungo,

cultivado em outras fontes de carbono tais como frutose, manose, sacarose, melaço de cana de

açúcar, entre outras. A diferença básica entre o botriosferana produzido nas diversas fontes de

carbono está no grau de ramificação.

Considerando-se a ausência de informações na literatura científica sobre

estudos reológicos dos EPS produzidos pelo Botryosphaeria rhodina MAMB-05, este

trabalho foi concebido com o objetivo de iniciar esse estudo no botriosferana produzido em

três diferentes fontes de carbono: glucose, frutose e sacarose, que já possuem sua estrutura

química, anteriormente, determinada.

2. OBJETIVOS

2.1 Objetivos gerais

O presente estudo tem por objetivo geral avaliar a conformação e algumas

propriedades reológicas do botriosferana, exopolissacarídeo produzido pelo fungo ascomiceto

Botryosphaeria rhodina MAMB-05.

2.2 Objetivos específicos

a) Produzir os exopolissacarídeos do Botryosphaeria rhodina MAMB-05 em

meio de cultivo quimicamente definido com três diferentes fontes de carbono: glucose, frutose

e sacarose.

b) Verificar a homogeneidade dos polímeros por cromatografia de filtração

em gel de Sepharose CL-4B.

c) Estudar a conformação dos exopolissacarídeos

d) Analisar o comportamento reológico dos exopolissacarídeos produzidos

nas três diferentes fontes de carbono.

3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

3.1 Polissacarídeos

Polissacarídeos são biopolímeros versáteis que podem ser encontrados na

natureza sob as mais diversas formas, exercendo diferentes funções. Nos vegetais podem ser

extraídos de raízes, tubérculos, caules e sementes, nos quais atuam como reserva de energia,

como é o caso do amido e da inulina; outras vezes, podem ser encontrados na estrutura celular

de tecidos vegetais, onde contribuem para a integridade estrutural e para a força mecânica,

formando redes hidratadas tridimensionais, como é o caso das pectinas, em plantas terrestres,

e das carragenanas, ágar e alginato, em plantas marinhas (TONELI; MURR; PARK, 2005, p.

189).

Os polissacarídeos são polímeros com massa molecular relativamente alta,

com características específicas de identidade nas suas unidades monossacarídicas, nos tipos

de ligação que as unem, no comprimento das suas cadeias e no grau de ramificação destas.

Podem ser classificados como homopolímeros ou heteropolímeros (NELSON; COX, 2000, p.

247).

Segundo Gómes e colaboradores (2007) os polímeros de carboidrato

possuem grande aplicabilidade na indústria de alimentos. O uso mais freqüente está associado

à sua capacidade de espessar, estabilizar, emulsificar e geleificar soluções, sendo aplicados

para melhorar e padronizar a qualidade dos alimentos processados, bem como o uso como

filmes comestíveis (LOPES; ANDRADE; MANO, 1991; MAIA; PORTE; SOUZA, 2000;

ARAÚJO; ALVES, 2003).

O termo “hidrocolóide ou goma” compreende todos os polissacarídeos

hidrossolúveis, que podem ser obtidos de plantas, algas marinhas e fontes microbianas

(Tabela 1), bem como gomas derivadas de exsudatos de plantas e biopolímeros produzidos

por tratamento químico ou enzimático do amido ou celulose (DICKINSON, 2003).

O uso de polissacarídeos como espessante está associado à capacidade que

possuem de aumentar a viscosidade de um líquido, resultando em características

organolépticas e texturas desejáveis nos alimentos. São freqüentemente utilizados para

eliminar efeitos indesejáveis tais como: liberação de água em alguns alimentos processados

(CEREDA; VILPOUX; DEMIATE, 2003, p.357), substitutos de gordura e integrantes na

formulação de produtos de baixa caloria light (MONTEIRO et al., 2006), uma vez que

possuem menos “calorias” quando comparados com a gordura e, em alguns casos, não são

absorvidos pelo organismo humano, promovendo efeitos benéficos à saúde (SGARBIERI;

PACHECO, 1999; ALVAREZ; SÁNCHEZ, 2006).

As β-glucanas são uma classe de polissacarídeos constituídos por unidades

repetitivas (monômeros) de glucose, unidas por ligações do tipo β, presentes nos vegetais e

microrganismos. Constituem-se como o principal tipo de expolissacarídeos produzidos por

fungos (BARBOSA et al., 2004, p.30). Lazaridou e Biliaderis (2007) relatam que esses

polímeros, quando provenientes de cereais, combinam propriedades de hidrocolóides com

propriedades fisiológicas de fibras dietéticas. Piñero e colaboradores (2004) e Monteiro e

colaboradores (2006) propõem o uso das β-glucanas de cereais, de baixo conteúdo calórico

uma vez que não são absorvidas no intestino delgado, como substitutos de gorduras em

alimentos.

Segundo Saad (2006) as β-glucanas de cereais possuem, também, a

capacidade de retardar a absorção de glucose, modulando os níveis plasmáticos de insulina e

da glucose. Ressalta ainda que o consumo desses polissacarídeos pode resultar em diminuição

de lipídeos plasmáticos, diminuindo o risco de câncer de cólon, redução da fome e/ou

aumento da saciedade e possível diminuição de pressão sanguínea.

A maioria das pesquisas na área de alimentos concentra-se na busca de

novas moléculas com propriedades para melhorar a qualidade dos alimentos, causando ainda

efeitos benéficos ao consumidor. As linhas de produtos funcionais ou nutracêuticos são bons

exemplos do crescimento científico visto nos últimos anos. Os alimentos funcionais são

definidos como compostos que oferecem vários benefícios à saúde, além do valor nutritivo

inerente à sua composição química, podem também desempenhar um papel potencialmente

benéfico na redução do risco de doenças crônico-degenerativas, quando ingerido como

alimento. Já os produtos nutracêuticos são definidos como parte de um alimento, e

proporcionam benefícios médicos e de saúde, incluindo a prevenção e/ou tratamento da

doença, podendo estar na forma de suplementos dietéticos ou na constituição de outros

alimentos. Exemplificando essas definições a aveia pode ser considerada um alimento

funcional e as β-glucans, presentes em sua constituição, como alimento nutracêutico.

Do ponto de vista dos carboidratos as fibras apresentam grandes

propriedades funcionais, sendo os oligossacarídeos e as β-glucanas bons exemplos de

ingredientes nutracêuticos.

3.2 Exopolissacarídeos

Os exopolissacarídeos (EPS) são definidos como polissacarídeos

extracelulares, produzidos por alguns fungos e bactérias, os quais são encontrados ligados à

superfície das células ou são excretados para o meio de cultivo na forma de material viscoso

(CANILHA et al., 2006, p.32). Como resultado da produção do exopolissacarídeo, ocorre

mudança na viscosidade do meio de cultivo, começando como um fluido Newtoniano de

baixa viscosidade e finalizando como um fluido não-Newtoniano, de elevada viscosidade

(MOREIRA et al., 2005; CHO et al., 2006).

Os exopolissacarídeos de origem microbiana apresentam algumas vantagens

de obtenção em relação às outras gomas, tais como: não dependência das condições

climáticas, possibilidade de utilização de matérias primas regionais, maior rapidez na

obtenção do produto acabado e necessidade de menor espaço físico das instalações fabris.

Além disso, as gomas de origem microbiana apresentam maior uniformidade em suas

propriedades físico-químicas, devido à especificidade do microrganismo utilizado e à

possibilidade de um rígido controle dos parâmetros de fermentação como pH, temperatura,

taxa de aeração, velocidade de agitação, tempo de fermentação e composição do meio de

cultivo (BARBOSA et al., 2004, p.30).

Os homopolissacarídeos (Figura 1, pg. 23) extracelulares tais como dextrana

(NAESSENS et al., 2005), curdlana (CUNHA; GÓMEZ; AMORIM, 2003), pululana (LIN;

ZHANG; THIBAULT, 2007) e levana (ERNANDES; GARCIA-CRUZ, 2005), são

constituídos por somente um tipo de monossacarídeo e, geralmente, produzidos por uma só

enzima ou por um sistema simples de enzimas, diferente dos heteropolissacarídeos (Figura 1,

pg. 23), que contêm duas ou mais unidades monoméricas diferentes, e são sintetizados por

sistemas enzimáticos mais complexos, exemplo das gomas gelana (BANIK; KANARI;

UPADHYAY, 2000) e xantana (GARCÍA-OCHOA et al., 2000).

Os exopolissacarídeos produzidos por uma grande variedade de

microrganismos possuem propriedades físicas, estruturais e químicas diferentes possibilitando

suas aplicações em indústrias de alimentos, como anteriormente citado, mas também na

indústria farmacêutica, petrolífera, cosmética, têxtil e de tintas (COLTRO, 2003, p.32) e vêm

substituindo, progressivamente, os polissacarídeos obtidos de fontes convencionais, como

plantas e animais (LIN; CHANG, 2005, p.1419).

Figura 1 - Estrutura dos heteropolissacarídeos (A e B) e homopolissacarídeos (C, D, E, F, G).

Tabela 01 – Fontes de origem dos “hidrocolóides ou gomas” com aplicações industriais.

Tipo Origem Goma

Exsudatos vegetais (terrestres) Goma arábica

Goma karaia

Sementes Goma guar

Goma Locusta ou alfarroba

Extratos de plantas Pectina

Arabinogalactana

Extratos de algas marinhas

Ágar

Alginato

Carragena

Furcelana

Natural

Grãos (milho,trigo,arroz,)

Tubérculos (batata,mandioca)

Amidos

Bacterianos

Xantana

Gelana

Dextrana

Curdlana

Levana

Natural

(Produtos

microbianos)

Fúngicos Escleroglucana

Pululana

Celulose

Carboximetilcelulose

Metilcelulose

Hidroxipropilcelulose

Metiletilcelulose

Amido

Amidos modificados com variações

de estabilidades, viscosidade e de

doçura.

Modificadas

Extratos de algas marinhas

Alginato de propileno glicol

Fonte: (LOPES; ANDRADE; MANO, 1991, p.66; KIMURA et al., 2003, p.22; NAESSENS

et al., 2005, p.845; GARCIA-OCHOA et al., 2000, CRUZ PRADELLA, 2006;

YAMAMOTO et al., 1999; ERNANDES; GARCIA-CRUZ, 2005; CUNHA; GÓMEZ;

AMORIM, 2003; CORRADI da SILVA et al., 2006)

3.2.1 Exopolissacarídeos bacterianos

A xantana (Figura 1-A, pg. 23) é um polímero formado por uma cadeia

principal constituída de unidades β-D-glucopiranosídicas 4-O substituídas, assemelhando-se à

celulose. Unidades pentassacarídicas repetitivas se dispõem ao longo da cadeia principal; elas

se constituem por unidades de glucose alternadas com substituição em O-3 por uma

ramificação trissacarídica: manose: ácido glucurônico: manose (GARCIA-OCHOA et al.,

2000, p.550). A massa molecular da xantana pode variar de 2 a 12 x 10

Da, dependendo do

processo fermentativo e linhagem utilizada (ROTTAVA, 2005, p.14): ela é solúvel em água

fria, produz soluções de elevada viscosidade em baixas concentrações e seu gel apresenta

excelente estabilidade à variação de temperatura (0 a 100ºC), mantendo as características de

gel em ampla faixa de pH (1 a 13) (LÓPEZ et al., 2004, p.115).

A xantana é produzida pelo Xanthomonas campestris em meio contendo

glucose ou sacarose como fonte de carbono e recebeu permissão de uso em alimentos pelo

“Food and Drug Administration”- FDA, em 1969. Comercialmente, a goma xantana é um dos

mais importantes polissacarídeos microbianos com uma produção mundial anual de cerca de

30.000 toneladas, movimentando um mercado de aproximadamente 408 milhões de dólares.

As principais indústrias produtoras de goma xantana são Kelco (EUA), Rhône-Poulenc

(França), Pfizer (EUA) e Mero-Rousselot-Santia (França) (CRUZ PRADELLA, 2006, p.38).

Um outro polissacarídeo aplicado na indústria é a dextrana constituído por

unidades α-(1→6) D-glucopiranosídicas (Figura 1-C, pg. 23). A síntese de dextrana ocorre

extracelularmente, sendo o substrato transformado em polissacarídeo sem ser interiorizado na

célula. Isso é possível graças a uma enzima denominada dextrana-sacarase (HONORATO et

al., 2005, p.02), que é excretada pelo microrganismo no meio de cultura, na presença de

sacarose. A dextrana-sacarase atua na molécula de sacarose, liberando a frutose e transferindo

a glucose a uma molécula receptora, no caso moléculas de dextrana em expansão

(NAESSENS et al., 2005, p.845).

Vários microrganismos sintetizam dextrana a partir de sacarose, destacando-

se a bactéria Leuconostoc mesenteroides, cuja produção industrial é feita a partir de uma única

linhagem NRRL B-512(F), que sintetiza um polissacarídeo com 95% de ligações α (1→6) e

5% de α (1→3) (SANTOS; RODRIGUES; TEIXEIRA, 2005, p.01).

A dextrana possui aplicação na indústria farmacêutica atuando como matriz

para imobilização de drogas e enzimas, como modificador de viscosidade e material para

suportes em cromatografia hidrofóbica (NAESSENS et al., 2005; GIL et al., 2008). É

metabolizada naturalmente, não é tóxica e não provoca reações adversas no organismo

(CRUZ PRADELLA, 2006, p.39). É utilizada na indústria de alimentos como estabilizante e

agente de viscosidade (CANILHA et al., 2006, p.36).

Levana, um exopolissacarídeo constituído por unidades de frutose β (2→6)

ligadas (Figura 1-G, pg. 23) (ARVIDSON; RINEHART; GADALA-MARIA, 2006. p.144),

pode ser sintetizado por vários grupos de bactérias, entre elas a Zymomonas mobilis; é obtido

pela transfrutosilação em meio fermentativo à base de sacarose, extrato de levedura e sais

minerais. É utilizado nas indústrias de comésticos, alimentos e farmacêutica (ERNANDES;

GARCIA-CRUZ, 2005, p.72).

Segundo Yoo e colaboradores (2004) as levanas possuem propriedades

biológicas com capacidade de melhorar e ou reparar alguns processos no organismo humano,

despertando o interesse da área médica. Podem atuar como: agentes prolongadores da ação de

fármacos, prebióticos que são definidos como substâncias que promovem o crescimento de

bifidobactérias no intestino humano (KAUR; GUPTA, 2002), agente hipocolesterolêmico

(YAMAMOTO et al., 1999), imunomodulador e anticarcinogênico (CALAZANS et al., 2000;

YOON et al., 2004). Na indústria de alimentos a levana é usada como espessante, fixador de

cores e sabores e em produtos dietéticos. Além disso, sua hidrólise produz frutose que tem

poder adoçante superior à sacarose.

Gelana é um polissacarídeo complexo cuja estrutura molecular consiste de

unidades tetrassacarídicas repetitivas: glucose, ácido glucurônico e raminose (na proporção de

2:1:1), dispostas como β (1→3)-D-glucose, β (1→4)-D-glucuronato, β (1→3)-D-glucose e α

(1→4)-L-raminose (Figura 1-B, pg. 23). É produzido pela bactéria Sphingomonas

paucimobilis, anteriormente denominada de Pseudomonas elodea, gram-negativa, aeróbia e

de pigmentação amarela (BANIK; KANARI; UPADHYAY, 2000, p.408).

Segundo Yamamoto e Cunha (2007) o polissacarídeo gelana possui boa

estabilidade em ampla faixa de pH, produzindo um gel termorreversível que vem substituindo

o ágar (SUTHERLAND, 1998). Devido à estabilidade em pH ácido, a goma gelana vem

sendo utilizada pela indústria de alimentos principalmente em produtos a base de frutas

(CANILHA et al., 2006; FREITAS et al., 2006).

As propriedades físico-químicas encontradas na gelana proporcionam sua

utilização pelas indústrias alimentícia, farmacêutica e outras, pois pode ser usada como

texturizante, estabilizante, espessante, emulsificante e agente geleificante (BANIK; KANARI;

UPADHYAY, 2000; SOUZA; GARCIA-CRUZ, 2004).

Curdlana, um polissacarídeo produzido pelas bactérias Alcaligenes faecalis

variedade myxogenes e Agrobacterium radiobacter (CUNHA; GÓMEZ; AMORIM, 2003,

p.380), faz parte do grupo de moléculas conhecidas como β (1→3)-D-glucanas (Figura 1-E,

pg. 23).

Funami e colaboradores (1999) relataram que a curdlana, em suspensão

aquosa, é capaz de formar gel por aquecimento e, de acordo com a temperatura de

aquecimento, há formação de dois tipos de géis. O gel “low-set” se forma quando a suspensão

aquosa de curdlana é aquecida entre 50 ºC a 60 ºC e, então, resfriada a temperaturas inferiores

a 40 ºC; o gel é termorreversível, similar ao ágar e à gelatina. Quando a suspensão aquosa de

curdlana é aquecida em temperaturas superiores a 80 °C, forma-se o gel “high-set”, que se

caracteriza como um gel firme, resistente, não termorreversível e bastante estável a uma

ampla faixa de temperatura de congelamento.

Segundo Cunha e colaboradores (2004) a curdlana é um hidrocolóide

microbiano que apresenta propriedades físico-químicas interessantes do ponto de vista

industrial, tendo potencial para ser utilizada como aditivo alimentar, em pequenas

quantidades, contribuindo para a melhoria da estabilidade e da qualidade de inúmeros

produtos alimentícios, podendo ser utilizada no desenvolvimento de novos produtos.

3.2.2 Exopolissacarídeos fúngicos

Existe uma variedade de polissacarídeos produzidos por fungos, porém

poucos foram adequadamente explorados, e um número pequeno tem sido produzido em

escala industrial. Segundo Barbosa e colaboradores (2004) a maioria dos exopolissacarídeos

fúngicos são β-glucanas.

As β-glucanas de fungos são polissacarídeos com função estrutural. Podem

ser encontradas na parede celular do micélio, no corpo de frutificação ou ser excretadas como

exopolissacarídeos. São estruturas altamente ordenadas, formadas principalmente por

unidades de glucose, diferenciando-se pelo tipo de ligação glicosídica e massa molecular,

características estas que conferem ações biológicas e reológicas distintas a essa classe de

biomoléculas (CALAZANS et al., 2000; CORRADI da SILVA et al., 2006; MORADALI et

al., 2007).

Os polissacarídeos fúngicos têm despertado interesse na área médica, devido

a algumas atividades evidenciadas, tais como: uso como matriz hidrofílica para a liberação

controlada de drogas (MATRICARDI et al., 2006; PALLESCHI, et al., 2006), para o

desenvolvimento de vacinas bacterianas, como um agente anti-HIV (CHEN; SEVIOUR,

2007), modulador do sistema imunológico (ZHANG et al., 2007), agente cicatrizante

(COELHO et al., 2002) e no controle de tumores (ZHANG et al., 2005a; CHEN; SEVIOUR,

2007).

Acredita-se que a atividade anti-tumor apresentada pelas β (1→3)-D-

glucanas, tais como escleroglucana (Sclerotium glucanicum), esquizofilana (Schizophyllum

commune), cinereana (Botrytis cinerea) e pestalotana (Pestalotia sp), está relacionada à

organização da estrutura em tripla hélice (Figura 2), mantida pelas ligações de hidrogênio

(ZHANG et al., 2005b), bem como pela complexidade da ramificação lateral e da massa

molecular (CORRADI da SILVA et al., 2005; PALLESCHI et al., 2005).

Dentre os EPS produzidos por fungos, os que apresentam destaque do ponto

de vista comercial e industrial são a escleroglucana, produzido por fungos do gênero

Sclerotium e a pululana, produzida pelo Aureobasidium pullulans.

Figura 2 – (A) Ilustração da conformação em hélice simples da β(1→3)-D-glucanas (TAVARES,

2006), (B) Simulação tridimensional em tripla hélice da β (1→3) (1→6) glucana

(escleroglucana) (PALLESCHI et al., 2005).

Escleroglucana é um polímero composto por unidades glucopiranosídicas

β(1→3)-substituídas com ramificações de glucose em C-6 (Figura 1-F, pg. 23), as quais

podem estar ligadas regular ou randomicamente, com freqüências diferentes. Variações no

grau de ramificação afetam a solubilidade da molécula. Possuem diversas aplicações, uma vez

que a viscosidade do EPS em solução se mantém em uma ampla faixa de temperatura e de pH

(FARIÑA et al., 2001, p.45; COLINET et al., 2007, p. 66).

Este polímero apresenta atividade antitumoral, antimicrobiana, antivirótica e

moduladora do sistema imune (ZHANG et al., 2007, p.5). Estudos mais recentes propõem a

aplicação do escleroglucana como carreadores de drogas (FRANÇOIS; ROJAS; DARAIO,

2005; MATRICARDI et al., 2006; COVIELLO et al., 2007).

Viñarta e colaboradores (2006) aplicaram o escleroglucana, produzido pelo

fungo Sclerotium rolfsii, para minimizar a sinérese (separação da fase aquosa) em soluções de

amido de milho. Após 20 dias de refrigeração, os autores observaram 91% de redução da

sinérese, ao mesmo tempo em que foram mantidas as características de gel, dureza e

coloração das misturas, indicando futuro uso do EPS para melhorar a qualidade dos alimentos,

passível de utilização pela indústria de alimentos.

Pululana é um exopolissacarídeo linear de glucose produzido pelo

Aureobasidium pullulans. É constituído por unidades de maltotriose, α (1→4), alternadas por

resíduos glucopiranosídicos α (1→6) ligados (Figura 1-D, pg. 23), cuja relação depende da

linhagem fúngica estudada (LIN; ZHANG; THIBAULT, 2007, p.820). Dependendo da

proporção dessas ligações na cadeia do polímero, as propriedades físicas da molécula variam,

tais como: flexibilidade da estrutura, aumento da solubilidade em água e capacidade de

formação de filme e fibra.

O pululana pode ser usado como aditivo em alimentos de baixa caloria. Tem

a capacidade de formar filmes solúveis em água, com baixa permeabilidade ao oxigênio,

atuando como revestimento de alimentos, apresentando capacidade de reter o sabor e

aparência. Também é utilizado como excelente adesivo, espessante e pode ser usado na

preparação de algumas fibras, sendo comestível e biodegradável (LAZARIDOU;

BILIADERIS; KONTOGIORGOS, 2003, p.152). Para o crescimento do Bifidobacterium spp,

um microrganismo benéfico da flora intestinal humana (SAAD, 2006), sugere-se a

incorporação do pululana como prebiótico, que é uma substância capaz de promover o

crescimento de bactérias desejáveis no cólon intestinal (SHIN et al., 2004).

Já é consenso entre os pesquisadores que os biopolímeros de origem fúngica

sejam alvo de investigação científica devido às suas características químicas e reológicas que

poderão possibilitar suas aplicações nas indústrias de alimentos, petrolífera, farmacêutica,

cosmética e médica, entre outras.

3.2.3 Botriosferana, exopolissacarídeo produzido pelo fungo Botryosphaeria rhodina

MAMB-05.

Fungos do gênero Botryosphaeria ssp. são ascomicetos que podem ser

encontrados em diferentes ambientes, causando doenças em várias espécies de plantas, como

eucalipto (SLIPPERS et al., 2004; BARBER et al., 2005) e, em algumas espécies de árvores

frutíferas como cacaueiro, coqueiro, mamoeiro, bananeira, abacateiro (VIANA et al., 2003),

macieiras (LUNARDI et al., 2002; VALDEBENITO-SANHUEZA et al., 2005) e videiras

(GARRIDO; SONEGO; GOMES, 2004; ÚRBEZ-TORRES, 2006).

O Botryosphaeria rhodina MAMB-05 tem sido investigado por um dos

grupos de Bioquímica Aplicada do Departamento de Bioquímica e Biotecnologia da UEL,

desde 1996. Este microrganismo foi descrito como produtor de lacases por Dekker e Barbosa

(1996). Esses autores (2001) relataram que o microrganismo também secretava no meio de

cultivo um exopolissacarídeo (EPS) do tipo β-glucana. Posteriormente foi caracterizado como

uma β (1→3;1→6)-D-glucana (Figura 3), com cerca de 22% de ramificações no carbono 6

(BARBOSA et al., 2003) e denominado de botriosferana (Figura 3).

Em 2004, Steluti e colaboradores analisaram a influência de diferentes

fontes de carbono (glucose, frutose, galactose, manose, manitol, sorbitol, lactose, sacarose,

sacarose comercial e melaço de cana de açúcar) sobre a produção de botriosferana pelo B.

rhodina, e concluíram que a sacarose comercial favorecia a formação do exopolissacarídeo

em comparação a outras fontes de carbono estudadas.

Corradi da Silva e colaboradores (2005) caracterizaram os

exopolissacarídeos quando o microrganismo foi cultivado, separadamente, em sacarose e

frutose como fonte de carbono. Verificaram que o grau de ramificação era menor no EPS

produzido em sacarose (21%) do que em frutose (31%); esta característica química conferia

diferentes viscosidades às suas soluções.

Posteriormente, Miranda (2006) demonstrou que o botriosferana não é

mutagênico, apresentando atividade hipoglicemiante e hipocolesterolêmica.

O conhecimento das propriedades reológicas bem como do peso molecular

do botriosferana, produzido em diferentes fontes de carbono, são imprescindíveis para o

emprego do polímero pelos diferentes setores da indústria.

Figura 3 - Botriosferana: β-(1→3,1→6)-D-glucana

3. 3 Reologia

Segundo Schramm (2006), a reologia descreve a deformação de um corpo

sob a influência de tensões. Corpos, neste contexto, podem ser sólidos, líquidos ou gases.

Sólidos ideais deformam-se elasticamente e a energia requerida para a deformação é

completamente recuperada quando a tensão é removida. Fluidos ideais, como os líquidos e

gases deformam-se irreversivelmente, eles escoam e, neste caso, a energia requerida para a

deformação é dissipada dentro do fluido na forma de calor e não pode ser recuperada

simplesmente pela remoção das tensões.

Nas áreas da ciência dos alimentos a reologia possui grande importância.

Segundo Haminiuk (2007) muitas das propriedades texturais que os humanos percebem

quando consomem alimentos são basicamente reológicas, isto é, cremosidade, suculência,

maciez, suavidade e dureza. Segundo Campos e colaboradores (1989), os dados reológicos em

alimentos são essenciais para:

a) Cálculos em engenharia de processos, envolvendo grande variedade de

equipamentos, tais como bombas, tubulações, extrusores, misturadores, trocadores de calor,

dentre outros;

b) Determinação da funcionalidade de ingredientes no desenvolvimento de

produtos;

c) Controle intermediário ou final da qualidade de produtos;

d) Testes de tempo de prateleira;

e) Avaliação da textura de alimentos e correlação com testes sensoriais.

A indústria de alimentos vem inovando com inúmeros produtos para atender

as necessidades do consumidor. Umas dessas inovações foi o desenvolvimento de uma linha

de produtos light e diet. Alimentos pertencentes a esta classe possuem menor quantidade de

calorias (light), ou ausência de algumas substâncias, ex: lipídeos, açúcares e sódio (diet). Com

isso cresceu a utilização dos polissacarídeos microbianos, a fim de se tentar manter as

características reológicas como viscosidade, fluidez, textura e cremosidade encontradas nos

produtos originais, geralmente mantidas pelas gorduras (BARONI; FREITAS, 1999, p.22). O

alto índice de obesidade e os possíveis distúrbios metabólicos, decorrentes do aumento de

peso, fizeram com que a indústria disponibilizasse esses novos produtos.

A reologia considera dois materiais como ideais: o sólido elástico e o líquido

viscoso. No sólido elástico a propriedade de maior interesse é a elasticidade, ou seja, um

material com forma definida, quando deformado por uma força externa, sob determinadas

condições, retornará à sua forma e dimensões originais, após a remoção dessa força. Já, no

líquido viscoso a propriedade de maior interesse é a viscosidade, que tem como característica

não possuir forma definida, escoando irreversivelmente com a aplicação de uma força externa

(BRETAS; D’ÁVILA, 2005, p.69).

3.3.1 Reologia de fluidos

Isaac Newton foi o primeiro cientista a expressar a lei básica da

viscosimetria, descrevendo o comportamento de fluxo de um líquido ideal, equação [1], onde

τ é a tensão de cisalhamento, η é a viscosidade dinâmica ou aparente e é a taxa de

cisalhamento ou deformação.

τ = η . [1]

A deformação dos fluidos pode ser estudada como a realização de uma força

contínua a uma taxa constante. Essa condição pode ser idealizada com a utilização de duas

placas paralelas com o fluido colocado no espaço entre elas, como mostra a figura 4. A placa

inferior é fixa e a superior se move a uma velocidade constante.

Tensão de cisalhamento (τ) relaciona a força F aplicada sobre a área A,

sendo que a interface entre a camada superior e inferior do líquido, leva a um fluxo na camada

líquida. A velocidade de fluxo que pode ser mantida por uma dada força é controlada pela

resistência interna do líquido, ou seja, pela sua viscosidade (NAVARRO, 1997, p.74).

Figura 4 – Fluxo entre duas placas paralelas (SCHRAMM, 2006, p.29)

A tensão de cisalhamento faz com que o líquido flua num determinado

padrão. A velocidade máxima é observada nas camadas superiores do líquido (Figura 4). A

velocidade diminui das camadas superiores para as inferiores, apresentando uma velocidade

mínima na camada mais inferior que está em contato com a superfície estacionária. Esse

gradiente de velocidade é definido como taxa de cisalhamento ( ). A é um fator decisivo

que influencia na viscosidade de muitos líquidos. O aumento da taxa de cisalhamento pode

diminuir ou aumentar a viscosidade (NAVARRO, 1997, p.78).

A tensão de cisalhamento em sólidos causa deformação, mas em líquidos

ela causa uma taxa de deformação (quadrados superior e inferior da Figura 5). Isso significa,

simplesmente, que os sólidos são elasticamente deformados, enquanto os líquidos fluem.

Com o aumento da taxa de cisalhamento (Figura 5), partículas rígidas se

orientam em direção ao fluxo. Nas moléculas poliméricas, os entrelaçamentos entre elas

podem ser desfeitos e as moléculas se orientam em direção ao fluxo. Partículas esféricas

podem ser deformadas para uma forma mais alongada e com o cisalhamento, os agregados

podem ser quebrados (BRETAS; D’ÁVILA, 2005, p.36).

Figura 5 - Representação esquemática de líquido em repouso (superior) e após a aplicação de uma taxa

de cisalhamento (inferior) (SCHRAMM, 2006, p.30).

A viscosidade é a propriedade reológica definida como a medida da fricção

interna de um fluido, ou seja, sua resistência a fluir. Ela se torna aparente quando uma camada

de fluido move-se em relação à outra camada. Assim, à medida que aumenta a viscosidade do

fluido, aumentam as forças de atrito e é necessário mais energia para que haja escoamento.

Com isso, fluidos altamente viscosos requerem maior força para se mover do que materiais

menos viscosos (BRETAS; D’ÁVILA, 2005, p.55).

A viscosidade pode ser medida pela fórmula matemática apresentada na

equação [2] , onde η é a viscosidade dinâmica ou aparente, τ é a tensão de cisalhamento e é

a taxa de cisalhamento ou deformação.

η = τ / [ 2 ]

Entre os parâmetros que interferem na viscosidade dos polímeros, podemos

citar o tipo de estrutura molecular, a temperatura e a concentração da solução polimérica

analisada. A temperatura pode ocasionar uma diminuição da viscosidade, e soluções

poliméricas concentradas tendem a ter valores maiores de η (PINTO; MOREIRA;

VENDRUSCOLO, 2002; SILVA; GUIMARÃES; GASPARETTO, 2005; TORALLES;

VENDRUSCOLO; VENDRUSCOLO, 2006).

3.3.1.1 Líquidos Newtonianos

Newton assumiu que o gráfico equivalente à equação [1] para um líquido

ideal seria uma linha reta, com início na origem da curva de fluxo (τ x ), e que esta reta

subiria com uma inclinação de ângulo α (Figura 6). Qualquer ponto desta reta define pares de

valores para τ e . Dividindo um pelo outro se obtém o valor de η (equação [2]).

Como a curva de fluxo para um líquido ideal é uma reta, a razão de todos os

pares de valores de τ e pertencentes a essa reta é constante (Figura 6). Isso significa que a

viscosidade (η) não é afetada por mudanças na taxa de cisalhamento. Todos os líquidos para

os quais essa afirmativa é verdadeira são chamados de líquidos Newtonianos, é o caso de

líquidos puros, soluções verdadeiras diluídas e poucos sistemas coloidais. Ex: água, óleo

mineral, melaço, etc.

3.3.1.2 Líquidos não-Newtonianos

Todos os outros líquidos que não exibem esse comportamento de fluxo

‘‘ideal’’ são chamados de não-Newtonianos (Figura 6). Os líquidos não-Newtonianos são, em

número, bem maiores que os Newtonianos.

Fluidos não-Newtonianos são definidos como aqueles onde a relação τ/

não é uma constante, ou seja, quando a taxa de cisalhamento varia, a tensão de cisalhamento

não varia na mesma proporção (ou necessariamente na mesma direção) (MANO; MENDES,

1999). Assim, a viscosidade destes fluidos mudará conforme a variação da taxa de

cisalhamento (Figura 6). Os fluidos não-Newtonianos são classificados como viscoelásticos

ou inelásticos.

Figura 6 –

Vários tipos de comportamento de fluxo (SCHRAMM, 2006).

Os fluidos não-newtonianos viscoelásticos apresentam, simultaneamente,

propriedades de fluidos (viscosas) e de sólidos (elásticas) (BARNES; HUTTON; WALTERS,

1989). Já os fluidos não-Newtonianos inelásticos são classificados em independente de tempo

e dependente de tempo, conforme figura 7. Os fluidos independentes do tempo, sob condições

de temperatura e composição constantes, apresentam viscosidade aparente dependente

somente da taxa de deformação ou da tensão de cisalhamento. Nos fluidos com

comportamento dependente do tempo a viscosidade aparente também depende da duração

dessa taxa de deformação.

Dentre os fluidos não-Newtonianos independentes do tempo, temos os

pseudoplásticos, os dilatantes e os plásticos. Para os pseudoplásticos, a viscosidade diminui

com o aumento da taxa de cisalhamento (SHAW, 1975), temos como exemplos as tintas,

emulsões e dispersões de muitos tipos. Nos dilatantes a viscosidade aumenta com o aumento

da taxa de cisalhamento, exemplos caramelos e amidos de milho em água. Os fluidos

plásticos comportam-se como sólidos sob condições estáticas, apresentando forças internas

que o impedem de fluir até certa tensão de cisalhamento, quando então, começam a fluir.

Exemplos desse tipo de fluidos incluem chocolate, catchup e maionese (FARIA-TISCHER,

2006, p.43).

Os fluidos não-Newtonianos dependentes do tempo são aqueles em que

ocorrem mudanças de viscosidade com o tempo, com a taxa de cisalhamento e com a

temperatura. Podem ser divididos em tixotrópicos e reopécticos. Nos fluidos tixotrópicos, a

viscosidade diminui com o tempo para uma taxa de cisalhamento constante (COSTA, 2006,

p.10) já para os reopécticos ocorre o contrário, ou seja, a viscosidade do fluido aumenta com o

tempo para uma taxa de cisalhamento constante.

Os polissacarídeos microbianos apresentam comportamento pseudoplástico

e viscoelástico característicos (COVIELO et al., 2007; TONELI; MURR; PARK, 2005;

SUTHERLAND, 2001). Algumas características dos EPS são esperadas para sua aplicação na

indústria, tais como: formar soluções viscosas em baixas concentrações, possuir alta

solubilidade, apresentar viscosidade e estabilidade em ampla faixa de pH e temperatura e na

presença de sais.

Figura 7 - Classificação do comportamento reológico de fluidos (TONELI; MURR; PARK, 2005,

p.184).

3.3.1.3 Comportamento viscoelástico

As curvas de fluxo em regime estacionário são utilizadas para caracterizar o

comportamento reológico de fluidos. A viscosidade é a propriedade de todos os fluidos,

independentemente se eles exibem ou não comportamento elástico; no entanto, muitos

fenômenos não podem ser descritos simplesmente em função da viscosidade e o seu

comportamento elástico deve ser levado em consideração. A figura 8 apresenta o

comportamento dos fluidos viscosos e fluidos viscoelásticos (viscoso e elástico) quando

submetidos ao cisalhamento. Durante a agitação ou mistura, os fluidos viscoelásticos podem

subir no rotor impulsor num fenômeno conhecido como efeito Weissenberg (BRETAS;

D’ÁVILA, 2005, p.70).

Figura 8 –

Comportamento viscoso e viscoelástico (SCHRAMM, 2006, p.41).

O comportamento viscoelástico de uma solução polimérica pode ser

conhecido a partir de estudos reológicos com análises dinâmicas ou oscilatórias e o grau de

caráter sólido e líquido pode ser quantificado. O módulo de cisalhamento elástico (G’), diz

respeito ao caráter sólido do material, enquanto o módulo de cisalhamento viscoso (G”)

refere-se ao caráter líquido.

A energia usada na deformação de um sólido elástico é recuperada quando a

amostra retorna ao seu estado original, enquanto que para um líquido ideal não há tal

recuperação, e a energia é perdida. Assim, os módulos G’ e G” são também denominados

módulos de estocagem e de perda, respectivamente (SCHRAMM, 2006, p.143). Para um

material perfeitamente elástico toda a energia é armazenada; a tensão e a deformação

encontram-se em fase e G” é igual a zero. Para um líquido que não possui nenhuma

propriedade elástica toda a energia é dissipada como calor, G’ é igual a zero, e a tensão e a

deformação estão fora de fase (IAGHER, 2000; DOUBLIER et al., 1993; SHAW, 1975).

Os módulos de cisalhamento elástico (G’) e viscoso (G”) são dados pelas

seguintes equações:

G’= (τ

/ γ

) . cos δ [ 3 ]

G”= (τ

/ γ

) . cos δ [ 4 ]

G”/ G’ = tg δ [ 5 ]

onde:

G’ = módulo de cisalhamento dinâmico elástico

G” = módulo de cisalhamento dinâmico viscoso

= amplitude de tensão

= amplitude de deformação

δ = ângulo de fase

A resposta de uma amostra à tensão de deformação oscilatória pode ser

caracterizada pelo módulo de cisalhamento dinâmico complexo G*, que é dado pela seguinte

equação:

G* = (G’

+ G”

)

1/2

[ 6 ]

onde:

G* = módulo de cisalhamento dinâmico complexo

G’ = módulo de cisalhamento dinâmico elástico

G”= módulo de cisalhamento dinâmico viscoso

O modulo dinâmico complexo G* pode definir uma viscosidade complexa

(η*), que descreve a resistência total para uma medida dinâmica, e é expressa pela equação:

η* = G*/ f

[ 7 ]

onde:

η* = viscosidade dinâmica complexa

G* = módulo de cisalhamento dinâmico complexo

f = freqüência

A análise dinâmica de um material, através dos módulos de cisalhamento

dinâmico G’ e G” e da viscosidade dinâmica complexa, permite caracterizá-lo como sendo

mais viscoso ou mais elástico, conforme mostra figura 9 (MORRIS, 1995, p.518).

Quando a amostra polissacarídica apresenta o módulo de cisalhamento

elástico (G’) muito maior do que o módulo de cisalhamento viscoso (G”) (Figura 9-a), ambos

independentes da freqüência na região de viscoelasticidade, tem-se um material de caráter

predominantemente sólido (ZHANG et al., 2008, p.3), tratando-se, portanto, de um gel forte.

Para as soluções poliméricas concentradas ou géis fracos o espectro revela,

principalmente em baixas freqüências, valores significativamente maiores de G”, em relação a

G’(Figura 9-b). Em freqüências mais altas, entretanto, o comportamento aproxima-se daquele

gel mostrado na figura 9-a, onde a resposta elástica (G’) predomina sobre o fluxo viscoso

(G”) e a η* declina (TORRES; BEPPU; SANTANA, 2006, p.104).

Figura 9 - Representação gráfica genérica de sistemas polissacarídicos submetidos a medidas

reológicas dinâmicas. a) gel forte, b) solução concentrada ou gel fraco, e c) solução

diluída (TABILO-MUNIZAGA; BARBOSA-CÁNOVAS, 2005, p.150).

Em amostras com comportamento típico de soluções diluídas (Figura 9-a), a

viscosidade dinâmica (η*) mostra pequena variação com a freqüência (demonstrando um

comportamento essencialmente Newtoniano através da faixa de freqüência alcançada) e o

modulo de perda G” é substancialmente maior do que o módulo de estocagem G’. Em baixas

freqüências G” é maior que G’, enquanto que em freqüências mais altas G’ aproxima-se de

G”(STEFFE, 1996).

As variações de G’, G” e η* dão importantes informações para a

caracterização da escala de tempo das interações moleculares em sistemas poliméricos, e estas

medidas reológicas podem ser aplicadas para ambos os sistemas sólidos ou líquidos,

monitorando processos tais como a formação de géis físicos constituídos por polissacarídeos.

4. MATERIAIS E MÉTODOS

4.1 Materiais

4.1.1 Microrganismo

Foi utilizado o fungo ascomiceto Botryosphaeria rhodina isolado de câncro

de eucalipto por Barbosa, Dekker e Hardy (1996).

4.1.2 Reagentes

Os principais reagentes químicos utilizados para o preparo dos meios de

cultivo, das soluções e os experimentos foram de grau analítico, obtidos da Merck, Fluka ou

Sigma.

4.1.3 Equipamentos

Balanças Analíticas Mettler Toledo AB204, Micronal e em balanças semi-

analítica Gehaka BG-440; Gehaka BG-2000.

Autoclave vertical Fabbre, modelo 103.

Câmara de fluxo laminar Veco, modelo VLFS-09.

Estufa incubadora Nova Ética 411D e incubadora orbital Cientec CT-712.

Centrífuga refrigerada Boeco U-32R

Evaporador Rotativo Buchi, modelo R-114, e banho-maria Buchi, modelo

B-480.

Centrífuga Damon, modelo HT e microcentrífuga Beckman.

Espectrofotômetro Shimadzu modelo UV-1601.

Bloco de aquecimento Digi Block, Laboratory Devices INC.

Cromatógrafo Líquido de Troca Iônica (HPAEC) com detector

Eletroquímico Modelo ED 40, Bomba Gradiente Modelo GP 40 e Integrador modelo 4600; da

Dionex.

Gel de sepharose CL-4B, com auxílio de bomba peristáltica Pump P-1,

Amersham Pharmacia Biotech.

Coletor Frac-100, Amersham Pharmacia Biotech.

Liofilizador modelo E.C, da Edwards.

Agitador da Fisatom.

Destilador marca Quimis.

Deionizador Water Pro PS, Labconco.

Reômetro HAAKE RS75 Rheostress acoplado a um banho termostatizado

HAAKE K15 e termocirculador de água DC5B3

4.2 Métodos Gerais

4.2.1 Manutenção do Microrganismo

O ascomiceto Botryosphaeria rhodina foi mantido em BDA (batata-

dextrose-ágar) inclinado, a 4°C, feito repiques trimestrais.

4.2.2 Produção do botriosferana

A produção do botriosferana em glucose “EPS

GLU

”, sacarose “EPS

SAC

” e

frutose “EPS

FRU

”, como fontes de carbono, foi realizada no Departamento de Bioquímica e

Biotecnologia da Universidade Estadual de Londrina com a colaboração da professora Dra.

Aneli de Melo Barbosa. Nessa etapa da pesquisa, objetivou-se somente a produção dos EPS

segundo metodologia otimizada por Barbosa e colaboradores (2003) e STELUTI e

colaboradores (2004), para ser alvo de futuras análises propostas nos objetivos dessa

dissertação.

4.2.3 Cultivo estoque do Botryosphaeria rhodina MAMB-05

O fungo foi mantido em meio sólido de ágar-batata dextrose (BDA) a 4 ±

C com repiques trimestrais, como mostra a figura 10-A.

4.2.4 Cultivo do Botryosphaeria rhodina MAMB-05

4.2.4.1 Pré-inóculo

Uma porção pequena das hifas do cultivo estoque de Botryosphaeria

rhodina MAMB-05 foi transferida para placas de Petri contendo meio mínimo de Vogel,

glucose 10g/L e ágar 20 g/L (VGA). As placas foram incubadas por 5 dias à temperatura de

28 ± 2 ºC, conforme figura 10-B. Pequenas porções de hifas foram transferidas para frascos

de Erlenmeyer (125 mL) modificados, com quatro inserções na parede, contendo meio

mínimo de Vogel e glucose 5g/L. O pré-inóculo foi mantido sob agitação constante de 180

rpm durante 48 horas à temperatura de 28 ± 2ºC.

4.2.4.2 Inóculo

O meio líquido contendo as células foi transferido para um blender

autoclavado, onde o micélio foi homogeneizado por 30 segundos a velocidade máxima. O

homogeinato foi transferido para tubos de centrífuga de fundo cônico, estéreis, e centrifugado

durante 10 minutos a 5500 x g. O precipitado foi ressuspenso em solução salina fisiológica

estéril de NaCl 0,9 % (p/v). A suspensão de células homogeneizadas foi diluída em salina

estéril até se obter densidade óptica entre 0,4 e 0,5 a 400nm, o que corresponde a

aproximadamente 200 a 260 µg de micélio/mL (BARBOSA et al., 2003, p.1695).

4.2.4.3 Preparo dos meios e cultivo

Os cultivos líquidos foram desenvolvidos em frascos de Erlenmeyer de

2000 mL contendo 400mL de meio de Vogel (1956) e 50 g/L de glucose ou sacarose ou

frutose (individualmente), guardando a proporção ar/meio de 5:1. Para cada 100 mL de meio

de cultivo foram utilizados 4 mL de inóculo, com densidade óptica padronizada. Os cultivos

foram mantidos sob agitação constante a 180 rpm, por 72 horas, à temperatura de 28 ± 2 ºC.

4.2.4.4 Interrupção do cultivo

Cada cultivo foi interrompido através de centrifugação por 25 minutos a

5500 x g, (Figura 10-C). O sobrenadante foi coletado sob banho de gelo para obtenção dos

exopolissacarídeos (botriosferana) e o micélio foi reservado (Figura 10-D).

4.2.4.5 Isolamento dos exopolissacarídeos

O sobrenadante de cada cultivo (glucose, sacarose e frutose), conforme

figura 10-E, contendo os exopolissacarídeos, foi precipitado em etanol (3 volumes), deixado

durante 12 horas à temperatura de 4

C (Figura 10-F), separado por centrifugação,

solubilizado em água e dialisado contra água deionizada por 48 h à temperatura de 4 ºC. Em

seguida os EPS foram congelados (Figura 10-G) e liofilizados (Figura 10-H). Os liofilizados

foram utilizados para estudos propostos neste trabalho.

Uma amostra de goma xantana, doada pela empresa “CPKelco”, foi

utilizada como comparação em algumas análises efetuadas neste trabalho.

Figura 10 – Esquema de produção do botriosferana A) Cultivo estoque do B. rhodina; B) Pré-inóculo

em meio (VGA), depois de 5 dias a 28 ± 2 ºC; C) Interrupção do cultivo para posterior

centrifugação do material “EPS e micélio”; D) Micélio separado após centrifugação do EPS;

E) Sobrenadante após centrifugação, seguindo para precipitação em etanol; F) EPS

precipitado em etanol; G) EPS solubilizado em água e resfriado; H) EPS liofilizado.

4.2.3 Análises quantitativas nos EPS

GLU

, EPS

SAC

, EPS

FRU

e padrão xantana EPS

XAN

4.2.3.1 Determinação de açúcares totais - método do fenol - ácido sulfúrico

O método de fenol-ácido sulfúrico (DUBOIS; GILLES; HAMILTON, 1956)

foi utilizado para determinar a concentração de carboidrato total nos respectivos EPS (

GLU, SAC,

FRU, XAN

). O método consiste na formação do derivado furfural, na presença de H

concentrado, que reage com o fenol formando um complexo de cor amarela. Foi seguido o

protocolo original do método, conforme descrito:

Reagentes: Solução de fenol 5% (m/v), H

concentrado.

Procedimento: Foi adicionado 0,5 mL da solução de fenol em 0,5 mL da

amostra e, em um único jato, foram adicionados 2,5 mL de H

concentrado. Após 10

minutos em repouso, foi feita a leitura espectrofotométrica a 480 nm.

Para calcular a concentração de carboidratos, foi realizada uma curva padrão

de glucose (0,1 %), com faixa de sensibilidade de 10 a 100 µg.

4.2.3.2 Determinação dos açúcares redutores - método de Somogyi – Nelson

A presença de açúcar redutor nas amostras foi determinada pelo método de

Somogyi (1945) e Nelson (1944). Neste método, os açúcares redutores reduzem o reativo

cupro-alcalino de Somogyi formando óxido cuproso, que na presença do reativo arseno-

molíbdico de Nelson forma um complexo de óxido de molibdênio de cor azul estável.

Reagentes: reativo arseno-molíbdico de Nelson (NELSON, 1944) e reativo

de Somogyi (SOMOGYI, 1945).

Procedimento: Em 0,5 mL da amostra contendo de 10 a 80 µg de açúcares

redutores foi acrescentado 0,5 mL do reativo de Somogyi. Os tubos foram cobertos com

pérolas de vidro, para evitar a evaporação do reativo, e levados a aquecimento em banho

fervente por 10 minutos. Após, foi resfriado e adicionado 0,5 mL do reagente de Nelson e

acrescentado 3,5 mL de água destilada. Os tubos foram agitados e lidos em espectrofotômetro

em 540 nm.

Para calcular a concentração de açúcares redutores nas amostras foi utilizada

uma curva padrão de glucose a 0,1%. A curva de calibração foi desenvolvida na faixa de

concentração de 10 a 100 µg, de acordo com a estimativa do teor de carboidratos da amostra.

4.2.3.3. Determinação de proteínas - método de Bradford

A determinação da concentração de proteínas nas amostras foi realizada

pelo método de Bradford (1976) que se baseia na ligação do corante (Coomassie Blue G-250)

com a proteína, formando um complexo de cor azul. O corante reage preferencialmente com

resíduos de arginina e, em menor extensão, com resíduos de histidina, lisina, tirosina,

triptofano e fenilalanina.

Solução estoque de corante: 40 mg de Coomassie Blue G-250 foram

dissolvidos em 20 mL de etanol absoluto. Foram adicionados 40 mL de ácido fosfórico 85% e

água destilada para completar 100 mL de solução.

Solução de uso: foi feita uma diluição (1:4, v/v) da solução estoque de

corante em água destilada e, em seguida, filtrada em papel de filtro.

Procedimento: foi adicionado 1 mL da solução com o corante em 100 µL da

amostra e em seguida foi feita a leitura em espectrofotômetro a 595 nm.

A concentração de proteína foi calculada através de uma curva de calibração

com albumina bovina (BSA), na faixa de concentração de 10 a 50 µg.

4.2.4. Cromatografia de filtração em gel em coluna Sepharose CL-4B

O gel Sepharose CL-4B é formado por agarose, numa concentração

aproximada de 4%, estabilizado por pontes de hidrogênio. Possui faixa de fracionamento de

6x10

– 2x10

para proteínas e 10

– 1x10

para polissacarídeos.

Condição da coluna: A coluna de vidro (1,5x30 cm), preenchida com gel

apresentou volume de 47 mL. Água destilada foi utilizada como eluente, sendo o fluxo de 0,5

mL/min e o volume coletado, por fração, de 1,5 mL.

Procedimento: 500 µg do material solubilizados em 1 mL de água destilada

foram aplicados à coluna. O volume morto da coluna foi determinado pela aplicação do Blue

dextran.

Para evitar contaminações entre os diferentes EPS analisados, foram

utilizadas colunas exclusivas para cada amostra, procurando reproduzir as mesmas condições.

O experimento ocorreu em ambiente climatizado (25±2°C) e as frações

coletadas foram transferidas à temperatura de 4°C. Logo após foi determinado a quantidade

de açúcar total de cada fração das amostras, assim montou-se o gráfico da corrida

cromatográfica onde identificou o perfil da amostra.

4.2.5 Hidrólise Ácida Total

Preparo da Amostra: Alíquotas das amostras, contendo 50µg de açúcares

totais, foram distribuídas em tubos próprios para hidrólise, congeladas e liofilizadas.

Hidrólise: A hidrólise ácida total foi efetuada pela adição de 300 µl de ácido

trifluoracético (TFA) 5M à amostra seca, a seguir cada amostra foi solubilizados e o tubo foi

selado e aquecido a 100°C por 16 horas (CORRADI da SILVA et al., 2005, p.12). O ácido foi

removido por evaporação em evaporador rotativo (BUTCHI – R 114), com consecutivas

trocas de H

O deionizada até a evaporação total do ácido, e então solubilizadas em 500µl de

O deionizada, sendo posteriormente analisadas por cromatografia líquida de alta pressão e

coluna de troca iônica (HPAEC).

4.2.6 Análise da composição de monossacarídeos por cromatografia líquida de alta pressão e

coluna de troca iônica (HPAEC)

Para análise de monossacarídeos foi utilizado um sistema Dionex DX500

(cromatografia líquida de íons) e um detector de amperometria integrada (IAD). Os

cromatogramas foram registrados em um integrador modelo 4600. Os açúcares neutros na

forma de íons poliálcoxis, gerados na presença de solução aquosa de NaOH, foram separados

isocraticamente, usando uma coluna analítica CarboPac PA1 (4x250 mm) equipada com

guarda coluna PA1, ao fluxo de 1 mL/min. As condições de eluição foram produzidas

utilizando H

O deionizada (eluente 1) e NaOH 200 mM (eluente 2) preparada a partir de uma

solução de NaOH 50%.

A coluna foi regenerada após 25 min de corrida com 100% do eluente 2, por

10 min, seguida pelo retorno às condições da corrida, por 15 minutos (para equilibrar a

coluna), antes da injeção da amostra.

Procedimento: 25 µL de solução contendo 1 µg do material foi injetado no

cromatógrafo, marca Dionex.

Padrões: Foi utilizado como padrão uma mistura de açúcares neutros

contendo 200 ng/25 µL de cada um dos seguintes monossacarídeos: L-fucose, L-ramnose, D-

galactose, D-glucose e D-manose totalizando 1µg/25µL de açúcares totais.

4.2.4 Análise da estrutura dos EPS

A verificação da conformação em tripla hélice nos EPS pode ser realizada

através da complexação com o corante Congo Red, conforme descrito por Ogawa e

colaboradores (1972).

Padrão utilizado: dextrana (65 a 74 kDa)

Procedimento: Preparou-se uma solução denominada CR/EPS misturando-

se a solução de Congo Red e a solução de EPS na proporção de 1:10. Dez alíquotas de 1mL

foram separadas e adicionou-se à solução CR/EPS, NaOH 5M e H

O deionizada a fim de

variar a concentração de NaOH de 0 a 0,4M em um volume final de 1,1 mL por tubo, como

observado na tabela 2. A solução final resultante permaneceu em repouso por 3 horas: após

esse tempo fez-se a varredura do espectro no intervalo de 470 a 540 nm.

Tabela 2 - Ensaio analítico para a formação do complexo CR/EPS.

4.2.5 Análises reológicas

As análises reológicas foram efetuadas em colaboração com a Profa. Dra.

Joana Léa Meira Silveira do Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular da

Universidade Federal do Paraná.

4.2.5.1 Métodos reológicos

Os testes foram conduzidos à temperatura de 25°C para as análises em

sistema estático e 5°C e 25°C para as análises em sistema dinâmico; o sensor utilizado foi o

cone-placa (C60/2Ti°) (Figura 11-A).

Antecedendo as análises reológicas, foi efetuada a determinação da inércia

do aparelho com o sensor em posição de análise, a fim de descontar os valores das forças

centrífuga e centrípeta, geradas durante os experimentos. Este procedimento se repetiu a cada

troca de amostra. Os testes foram executados em triplicata e durante as análises a temperatura

ambiente foi mantida a 22± 1°C.

TUBO EPS/Congo

Red

[NaOH]

V(µL) de

NaOH

Água (µL)/

ensaio

1 1 mL 0 0 0

2 1 mL 0,05 10 90

3 1 mL 0,10 20 80

4 1 mL 0,15 30 70

5 1 mL 0,19 38 62

6 1 mL 0,21 42 58

7 1 mL 0,23 46 54

8 1 mL 0,25 50 50

9 1 mL 0,30 60 40

10 1 mL 0,40 80 20

4.2.5.2 Preparo das soluções de β glucanas

Para os experimentos de reologia, os biopolímeros (EPS

GLU

, EPS

SAC

EPS

FRU

) foram solubilizados (6g/L) em água deionizada aquecida (60°C) e mantidos nessa

temperatura por um período de 15 minutos. Em seguida as amostras foram levadas à

temperatura de 22°C, sob agitação mecânica constante, em velocidade média, por 18 horas.

Durante esse período foram realizados mais dois ciclos de aquecimentos a 60°C, por 15

minutos. Após solubilização completa dos EPS (Figura 11-B), foram realizadas diluições

para iniciar os experimentos.

Figura 11 – (A) Reômetro HAAKE RS75 Rheostress; (B) Ilustração dos EPS solubilizados;

varredura, a 5°C.

4.2.5.3 Determinação das viscosidades absolutas

O sensor cone-placa (C60/2Ti°) foi utilizado para analisar as soluções

poliméricas em concentrações de 1, 2, 3, 4, 5 e 6 g/L. Este instrumento consiste de uma placa

plana inferior estacionária e um cone rotatório superior com diâmetro de 60nm e ângulo de 2º

(α), como mostra a figura 12. O fluido permanece entre a placa e o cone sem espalhar-se,

devido à tensão superficial, preenchendo inteiramente o espaço entre eles, de modo que as

medições não sejam alteradas.

O cone atua em velocidades de cisalhamento ( ) controladas, e o arraste

viscoso sob o cone rotativo exerce uma força de rotação que é proporcional à tensão de

cisalhamento (τ).

Figura 12 – Ilustração do sensor cone-placa utilizado no reômetro.

4.2.5.4 Curvas de fluxo

As curvas de fluxo (tensão de cisalhamento x taxa de cisalhamento) e de

viscosidade (viscosidade x taxa de cisalhamento) foram realizadas em modo CR (Controlled

Rate Rheometers) a 22 ± 1 ºC, com variação da taxa de cisalhamento ( ) entre 0,001 s

-1

até

500,0 s

-1

, no intervalo de tempo de 600 s, dessa forma foram medidas as mudanças na tensão

de cisalhamento ( ) e na viscosidade ( ) durante o fluxo. As análises foram realizadas em

triplicata onde os dados foram coletados e tratados pelo software RHEOWIN.

4.2.5.5 Análise oscilatória em sistema dinâmico - Varredura de tensão e Varredura de

Freqüência

Esta análise foi realizada com a solução polissacarídica na concentração de

6g/L, sensor do tipo cone-placa (C60/2Ti°) em modo CS (Controlled Stress Rheometers),

com variação da amplitude da tensão de 0,01 Pa até 10,0 Pa.

Devido à faixa de viscoelasticidade linear ser dependente da freqüência,

inicialmente o teste foi realizado três vezes com a freqüência fixada em 0,1 Hz, 1 Hz e 10 Hz

a fim de se determinar a região viscoelástica linear das amostras, isto é, a região em que os

módulos elástico (G’) e viscoso (G”) permanecem lineares e paralelos, sem variação com o

aumento da deformação ( ). Esta condição foi estabelecida para que não ocorram desvios dos

modelos que descrevem o comportamento dos materiais, e para que a deformação causada

não destrua as ligações internas temporárias de moléculas ou agregados, gerando perda de

viscosidade e perda irreversível de parte da energia em forma de calor (MALKIN, 1994;

SCHRAMM, 2006).

Após determinar a deformação dentro da região viscoelástica linear das

amostras, foram realizadas as análises oscilatórias dinâmicas, por varredura de freqüência,

numa amplitude de 10

−2

a 10 Hz. Foram medidos os valores dos módulos elástico (G’) e

viscoso (G”) em função da freqüência. Todas as análises foram efetuadas em triplicatas, nas

temperaturas de 5°C e 25°C.

4.2.5.6 Rampa de temperatura

Para conhecer a influência da temperatura sobre o comportamento

reológico das amostras, foram realizadas medidas no sistema oscilatório, com variações de

temperatura entre 5 a 95°C (1,5 °C / min) por 60’e de 95°C para 5°C, também por 60

minutos, na freqüência de 1 Hz e tensão de 1,0 Pa. Para essa análise utilizou-se o reômetro

citado no item (4.4.1), acoplado a um sistema controlador de temperatura, denominado

sistema Peltier (TC81). Todas as análises foram realizadas em triplicatas na concentração de

6 g/L, para cada EPS.

4.2.5.7 Tixotropia

A determinação da tixotropia foi efetuada em sensor cone-placa (C60/2Ti°)

na concentração de 6 g/L, para cada EPS. Foi realizada a curva de histerese (τ x ) com

variação da taxa de cisalhamento de 10

-1

a 10

-1

, no intervalo de tempo de 300 s, então a

taxa de cisalhamento foi mantida no limite superior durante 60s para quebra da estrutura

tixotrópica, seguido da variação da taxa de cisalhamento ( ) de 10

-1

a 10

-1

, em 300 s.

onde

se verificou a subida (ascendente) e a descida (descendente) da curva. As análises foram

realizadas em triplicata à temperatura de 25°C.

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO

5.1 Produção e quantificação dos exopolissacarídeos produzidos pelo Botryosphaeria

rhodina em três diferentes fontes de carbono.

A produção de polissacarídeos por microrganismos pode ser influenciada

por alguns parâmetros tais como: temperatura, fonte de carbono, fonte de nitrogênio, aeração,

agitação e a presença de micro elementos. Esses parâmetros podem determinar diferenças no

rendimento da produção dos exopolissacarídeos (EPS) bem como nas características químicas

e reológicas dessas moléculas (BARBOSA et al., 2004).

No trabalho efetuado por Steluti e colaboradores (2004) o fungo ascomiceto

Botryosphaeria rhodina MAMB-05 foi cultivado para produção de um exopolissacarídeo

denominado botriosferana, em diferentes fontes de carbono. Dentre as fontes utilizadas

aqueles produzidos em glucose, frutose e sacarose, foram selecionados para a determinação

de suas estruturas químicas. A melhor produção de botriosferana foi utilizando a sacarose

comercial como fonte de carbono.

Corradi da Silva e colaboradores (2005) caracterizaram o botriosferana

produzido em sacarose e frutose como fonte de carbono e o compararam àquele anteriormente

estudado por Barbosa e colaboradores (2003). De acordo com esses autores,

independentemente da fonte de carbono utilizada, a cadeia principal do botriosferana é

constituída por unidades glucopiranosídicos β(1→3) ligados com substituição em C-6 por

unidades glucopiranosídicas e/ou gentiobiosídicas (glucose β1→6 glucose). A principal

diferença encontrada entre os três EPS está no grau de ramificação e/ou na proporção relativa

desses substituintes. O EPS produzido em glucose apresentou um percentual de ramificação

de 22%, o qual foi semelhante àquele produzido em sacarose (21%). A diferença básica

observada entre eles foi uma maior proporção de unidades gentiobiosídicas no EPS

GLU

. O

EPS produzido em frutose foi o mais ramificado (31%), apresentando uma ramificação a cada

três unidades de glucose da cadeia principal e uma proporção de unidades de gentiobiose

semelhante àquela encontrada no EPS

GLU

. Esses resultados demonstram que modificações no

meio de cultivo não alteram a cadeia principal do polímero, mas possibilitam mudar o grau de

substituição da unidade repetitiva e provavelmente, da massa molecular.

Considerando os resultados da caracterização química do botriosferana

nessas três fontes de carbono e a possibilidade de aplicação dessas moléculas nos diferentes

setores da indústria, esse trabalho tem como meta efetuar alguns estudos físico-químicos das

soluções polissacarídicas dos EPS produzidos em glucose, frutose e sacarose, como fontes de

carbono, denominados de EPS

GLU

, EPS

FRU

e EPS

SAC

As macromoléculas foram produzidas e separadas do meio de cultivo de

acordo com a metodologia estabelecida por Steluti e colaboradores (2004). Após diálise

exaustiva os EPS foram liofilizados e pesados (Tabela 3). Para confirmar a massa real em

carboidratos, alíquotas foram retiradas e quantificadas para açúcares totais pelo método de

Dubois (1956). A ausência do açúcar utilizado com fonte de carbono foi confirmada pelo

baixo teor de açúcar redutor, obtido pelo método de Somogy (1945) e Nelson (1944). Apesar

dos resultados dessa análise não contribuírem para o EPS produzido em sacarose, pois é um

açúcar não redutor, ela também foi efetuada (Tabela 3). A quantificação de proteínas pelo

método de Bradford (1976) foi realizada para determinar a presença de um provável

contaminante do exopolissacarídeo, de origem protéica, excretado pelo fungo no meio de

cultivo.

Os resultados para açúcares totais e proteínas encontrados no EPS cultivado

em glucose (95,5% e 4,5%) foram, respectivamente, superior e inferior àqueles (86% e 14%)

descritos por Barbosa e colaboradores (2003). Isto se deve, provavelmente, a concentração de

glucose utilizada (5%) neste trabalho que pode ter atuado como repressor catabólico da

enzima lacase, secretada no meio de cultivo (DEKKER et al., 2001). Esta hipótese pode ser

aceita desde que a redução de proteína acompanha o aumento da concentração de fonte de

carbono.

Para os EPS produzidos em frutose e sacarose os resultados de açúcares

totais e proteínas (Tabela 3) foram similares àqueles descritos por Corradi da Silva e

colaboradores (2005) e, neste caso, as condições de cultivo foram exatamente iguais.

Tabela 03 – Produção final dos EPS (liofilizados) e as quantificações de açúcares totais,

açúcares redutores e proteínas dos polissacarídeos produzidos pelo B. rhodina, em três fontes

de carbono.

Açúcar

Total

(g)

Açúcar

Redutor

(g)

Proteínas

(g)

Açúcar

Total (%)

Proteínas

(%)

EPS

GLU

2,71 0,052 0,127 95,50 4,50

EPS

SAC

2,03 0,010 0,174 92,80 7,20

EPS

FRU

3,40 0,013 0,116 96,60 3,40

*EPS

XAN

0,75 0,010 0,045 94,25 5,75

*EPS

XAN –

valores das quantificações de açúcares totais, proteína e açúcares redutores em 1g do

padrão de goma xantana.

Fariña e colaboradores (2001) quantificaram açúcares totais, açúcares

redutores e proteínas da escleroglucana, uma β(1→3; 1→6)-D-glucana excretada pelo fungo

Sclerotium rolfsii. Os resultados encontrados para essas análises foram 98% de açúcares totais

e 2% de proteínas. Esses valores estão muito próximos aos encontrados nos

exopolissacarídeos produzidos pelo Botryosphaeria rhodina MAMB-05.

5.2 Verificação da homogeneidade dos exopolissacarídeos por cromatografia de

filtração em gel

A análise da homogeneidade dos EPS foi realizada por cromatografia de gel

permeação. Os métodos cromatográficos são os mais utilizados para esse fim e, em particular,

a cromatografia de filtração em gel, que separa as moléculas de acordo com a sua massa

molecular aparente. Este processo baseia-se na ordem de eluição que é diretamente

proporcional ao tamanho das moléculas (BOYER, 1993).

O perfil de eluição da amostra na corrida cromatográfica nos informa a

pureza do material bem como peso molecular aparente. Isto porque, dependendo da forma do

polissacarídeo, se em hélice tripla, hélice simples ou conformação ao acaso (randômica), ele

pode ou não entrar nos poros do gel e retardar ou acelerar o seu percurso na fase móvel, dando

a impressão que a molécula tem determinado peso molecular.

Figura 13 - Cromatografia de filtração em gel de Sepharose CL – 4B dos exopolissacarídeos

produzidos em glucose, frutose e sacarose. Total de EPS aplicado: 2,0 mg; fluxo: 0,3

mL/min; eluente: H

O; volume da fração: 2,6 mL para EPS

GLU

e EPS

SAC

e 2,9 mL para

EPS

FRU

; volume da coluna: 30,0 mL.

Portanto, nos métodos cromatográficos à pressão normal, para os

polissacarídeos, podemos apenas inferir sobre o grau de pureza da amostra (homogeneidade)

pelo número de picos e sobre a polidispersividade do material, através da forma do pico.

De acordo com essa informação os resultados encontrados na cromatografia

de filtração em gel de Sepharose CL-4B mostram que os EPS produzidos nas três fontes de

carbono estão aparentemente homogêneos, embora polidispersos (Figura 13). A

polidispersividade é uma característica das macromoléculas cujo processo de síntese não

obedece a um molde genético, como é o caso dos polissacarídeos. Além disso, a possibilidade

de grandes e diferentes arranjos macromoleculares transforma esses biopolímeros em famílias

de elevadas massas moleculares e consequentemente, polidispersas.

Uma forma mais apropriada e, relativamente, atual para determinar o grau

de homogeneidade e polidispersividade é a utilização da cromatografia por exclusão estérica

de alta pressão (HPSEC) acoplada a detectores de índice de refração e espalhamento de luz

laser de multi-ângulos (MALLS). A utilização de colunas seqüenciadas com géis de diferentes

porosidades, pressão elevada e detectores sensíveis permitem, pela mudança da fase móvel

O; solução de NaCl; solução diluída de NaOH e dimetil sulfóxido - DMSO), se chegar ao

peso molecular absoluto bem como a soluções poliméricas de menor grau de

polidispersividade (WYATT, 1993).

Após a obtenção e a determinação da homogeneidade, dos

exopolissacarídeos a próxima etapa é determinar a composição monossacarídica da

macromolécula, que tanto pode ser efetuada por hidrólise enzimática quanto por hidrólise

ácida (PAZUR, 1994).

5.3 Hidrólise ácida total e análise por HPAEC/PAD dos exopolissacarídeos produzidos

pelo B. rhodina nas diferentes fontes de carbono

A estrutura primária de um EPS é definida pela composição

monossacarídica, conformação, posição da ligação glicosídica, entre outras características

(RAO et al., 1998).

A determinação da estrutura primária consiste na despolimerização total ou

parcial, por hidrólise ácida ou enzimática, e estes tratamentos produzem, respectivamente,

monossacarídeos ou oligossacarídeos que são posteriormente analisados por cromatografia

líquida de íons em alta presssão (HPAEC – high performance anionic exchange

chromatography) acoplada a um detector de óxido-redução (amperometria integrada ou

pulsada – PAD).

Para a determinação da composição monossacarídica, os EPS produzidos

pelo Botryosphaeria rhodina MAMB-05 e o padrão de xantana foram submetidos à hidrólise

ácida total (TFA 5M, 100ºC, 16 h) e analisados por HPAEC. Os hidrolisados dos três EPS

eluíram como um único pico com tempo de retenção (R

) de 14,08 minutos semelhante à

glucose contida numa mistura de monossacarídeos, denominada mistura padrão (Figura 14).

A goma xantana, que será utilizada como padrão, após hidrólise em condições semelhantes

aos EPS, apresentou dois picos com tempos de retenção de 14,08 e 15,50 minutos

equivalentes aos R

dos padrões de glucose e manose, respectivamente (Figura 14). Segundo

Garcia-Ochoa e colaboradores (2000) a goma xantana é um heteropolímero constituído por

glucose, manose e ácido glucurônico. O ácido glucurônico, presente no polissacarídeo

xantana, não foi detectado na análise porque para ser liberado do polímero há necessidade de

condições mais severas de hidrólise, experimento não efetuada neste trabalho (PAZUR,

1994).

O polissacarídeo xantana passará a ser utilizado como padrão para

comparação de seus resultados àqueles encontrados para os exopolissacarídeos produzidos

pelo B. rhodina, nas diferentes fontes de carbono. A escolha do heteropolímero se deve,

principalmente, às inúmeras informações disponíveis na literatura científica tanto em relação

à reologia quanto à sua aplicação (DIAZ; VENDRUSCOLO; VENDRUSCOLO; 2004;

HIGIRO; HERALD; ALAVI, 2006).

Figura 14 - Análise dos monossacarídeos provenientes da hidrólise ácida dos EPS

GLU

, EPS

SAC

, EPS

FRU

e EPS

XAN

por HPAEC/PAD. Padrões de açúcares neutros (Pd), com tempos de retenção

em minutos: fucose (6,13); arabinose (9,76) rhaminose (10,48); galactose (12,83); glucose

(14,08); manose (15,50). Condições da corrida: isocrática (NaOH 14mM, 25 minutos).

Coluna: CarboPac PA1. Condições de hidrólise: TFA 5M, 16 horas, 100 ºC. Quantidade

de material: 50 µg.

5.4 Análise da conformação dos exopolissacarídeos produzidos pelo B. rhodina, em

diferentes fontes de carbono

Algumas características físico-químicas das glucanas β-

-(1→3) e β-

(1→3:1→6) estão relacionadas com a estrutura em hélice tripla, importantes para a atividade

biológica (ZHANG et al., 2007) e para a viscosidade (DONG; JIA; FANG, 2006). A

manutenção dessa estrutura se deve às ligações de hidrogênio existentes inter e intra

molecularmente (PALLESCHI et al., 2005, p.2154). A hélice tripla pode variar pelo aumento

da força iônica, da alcalinidade do meio e da temperatura ou através do uso de um solvente

aprótico como o DMSO. Essas alterações enfraquecem as ligações de hidrogênio e

determinam uma mudança na conformação de tripla hélice para hélice simples ou ao acaso

(randômica) (FALCH et al., 2000, p.588).

Segundo Ogawa e colaboradores (1972) a mudança da conformação pode

ser acompanhada pela formação de um complexo entre o corante Congo Red e o

polissacarídeo, em diferentes concentrações de NaOH. A relação entre o complexo (CR/EPS),

a conformação e o pH pode ser acompanhada pela mudança do comprimento de onda máximo

(λ

MAX

) em cada uma das concentrações de NaOH. Para concentrações entre 0,1 e 0,19M de

NaOH ocorre a perda gradual da rigidez da estrutura, reduzindo a viscosidade e facilitando a

complexação com o Congo Red. Em concentrações superiores, entre 0,19 a 0,24M inicia-se a

quebra das ligações de hidrogênio dando início a transição da conformação helicoidal para

randômica, perdendo assim a capacidade de formar complexos com o corante. Em

concentrações acima de 0,24M há predominância da conformação randômica.

A complexação com o Congo Red, específica para glucanas β-D-(1→3) e β-

D-(1→3:1→6) pode ser visualizada para os EPS produzidos pelo B. rhodina nas três

diferentes fontes de carbono, indicando a presença de conformação em hélice tripla com os

maiores deslocamentos de λ

MAX

(Figura 15). A goma xantana que é uma β(1→4)-D-glucana

com ramificação em O-3 por resíduos de manose e ácido glucurônico e a dextrana, que é um

α(1→6)-D-glucana têm estruturas químicas incompatíveis com a formação da hélice tripla

(RINAUDO et al., 1999) e, portanto, não há formação do complexo e, consequentemente, do

deslocamento do λ

MAX

(Figura 13).

Segundo alguns autores (GARCIA-OCHOA et al., 2000; DIAZ;

VENDRUSCOLO; VENDRUSCOLO, 2004) a goma xantana pode ser encontrada como

hélice simples, dupla ou tripla, entretanto em nossos experimentos não houve formação do

complexo Congo Red/Xantana indicando a inexistência de estrutura em tripla hélice para esse

polissacarídeo.

Para os exopolissacarídeos estudados, concentrações entre 0,1 e 0,19M de

NaOH mostraram que a quantidade de hélice é maior para o EPS

SAC

seguida do EPS

GLU

. Esses

resultados são coerentes quando comparados àqueles encontrados na caracterização química

dessas moléculas (BARBOSA et al., 2003, CORRADI da SILVA et al., 2005) que têm 21 e

22% de ramificação, respectivamente; além disso, o EPS obtido em glucose tem uma maior

quantidade de unidades gentiobiosídicos ligados à cadeia principal, os quais podem impedir

estericamente a proximidade das cadeias polissacarídicas para efetuarem as ligações de

hidrogênio e consequentemente formarem a hélice tripla (Figura 15 ).

Figura 15 - Análise conformacional do EPS produzidos em diferentes fontes de carbono (glucose

“EPS

GLU

”, sacarose “EPS

SAC

”, frutose “EPS

FRU

” e o padrão de goma Xantana “EPS

XAN

”)

Para a mesma faixa de concentração de NaOH, o EPS

FRU

, com maior grau

de ramificação (31%) formou um complexo de cor menos intensa indicando que,

provavelmente, a presença das ramificações impede a hélice tripla bem como a formação do

complexo CR/EPS. Esse argumento pode ser aceito uma vez que a transição da conformação

helicoidal para randômica ocorre em menores concentrações de NaOH, quanto maior o grau

de ramificação, menor a quantidade de hélice tripla.

0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5

480

481

482

483

484

485

486

487

488

489

490

491

492

493

494

495

496

MAX

Concentração de NaOH (Mol/L)

EPS

FRU

- 31% de ramificação

EPS

SAC

- 21% de ramificação

EPS

GLU

- 22% de ramificação

EPS

XAN

Padrão de Dextrana

64-75 kDa

Controle

Congo red

Uma variedade de B. rhodina DABAC P82 produtora de β-glucana, foi

investigada por Moresi e colaboradores (2003). Nos experimentos efetuados com o complexo

Congo Red e o EPS foi confirmada a presença de tripla hélice pela formação do complexo

entre 0,05 – 0,20M de NaOH. A grifolana, uma β(1→3)-D-glucana produzida pelo fungo

Grifola frondosa apresentou tripla hélice, quando se avaliou a relação complexo Congo Red/

EPS (MAO; HSU; HWANG, 2007). Outros autores também confirmam a presença de tripla

hélice em β-D-glucanas pela formação do complexo com o corante Congo Red (RAMESH;

THARANATHA, 1998; CHENGHUA et al., 2000; DONG; JIA; FANG, 2006; ROUT et al.,

2008).

5.5 Análise Reológicas

Após caracterização química dos exopolissacarídeos produzidos pelo fungo

ascomiceto Botryosphaeria rhodina MAMB-05 (BARBOSA et al., 2003; CORRADI da

SILVA et al., 2005), foram efetuados estudos reológicos dos polissacarídeos considerando-se

a viscosidade relativamente elevada de suas soluções, mesmo em baixas concentrações. O

conhecimento das propriedades reológicas dos polissacarídeos é importante, uma vez que eles

se apresentam como fonte potencial para futuras aplicações em diferentes setores da indústria.

5.5.1 Curvas de fluxo

A curva de fluxo, definida a partir das medidas de tensão de cisalhamento

(τ) x taxa de cisalhamento ( ) permite verificar o comportamento de fluxo das soluções

polissacarídicas. A partir da construção do reograma é possível estabelecer se um líquido

apresenta um comportamento de fluxo Newtoniano ou não Newtoniano, em determinadas

condições de tensão ou taxa de cisalhamento. Um líquido Newtoniano é representado,

graficamente, por uma reta com início na origem da curva de fluxo. Os líquidos que não

exibem esse comportamento de fluxo são chamados de não Newtonianos. A análise de

reogramas com diferentes concentrações poliméricas permite evidenciar a transição de um

comportamento Newtoniano para não-Newtoniano.

-1

[Pa]

[1/s]

EPS

GLU

1g/L

EPS

GLU

2g/L

EPS

GLU

3g/L

EPS

GLU

4g/L

EPS

GLU

5g/L

EPS

GLU

6g/L

Figura 16 – Curva de fluxo, tensão de cisalhamento (τ) x taxa de cisalhamento ( ) do EPS

GLU

, nas

concentrações de 1 a 6g/L. Em sistema aquoso a 25ºC.

-1

τ [Pa]

γ [1/s]

EPS

SAC

1g/L

EPS

SAC

2g/L

EPS

SAC

3g/L

EPS

SAC

4g/L

EPS

SAC

5g/L

EPS

SAC

6g/L

Figura 17 – Curva de fluxo, tensão de cisalhamento (τ) versus a taxa de cisalhamento ( ) do EPS

SAC

nas concentrações de 1 a 6g/L. Em sistema aquoso a 25ºC.

-1

τ [Pa]

γ [1/s]

EPS

FRU

1g/L

EPS

FRU

2g/L

EPS

FRU

3g/L

EPS

FRU

4g/L

EPS

FRU

5g/L

EPS

FRU

6g/L

Figura 18 – Curva de fluxo, tensão de cisalhamento (τ) x taxa de cisalhamento ( ) do EPS

FRU

, nas

concentrações de 1 a 6g/L. Em sistema aquoso a 25ºC.

O perfil encontrado nas figuras 16, 17 e 18 permite estabelecer que as

soluções polissacarídicas têm comportamento de fluxo de líquidos não Newtonianos. Mais

ainda, o aumento da tensão de cisalhamento, a partir do aumento progressivo da taxa de

cisalhamento, caracteriza as soluções como fluidos pseudoplásticos (NAVARRO, 1997).

Rottava (2005) observou comportamento semelhante de pseudoplasticidade

para a goma xantana, produzida por diferentes espécies da bactéria Xanthomonas sp. Bae e

colaboradores (2008) estudaram o comportamento reológico das soluções do

exopolissacarídeo levana, produzido pela Microbacterium laevaniformans, e os resultados

encontrados permitiram concluir que essas soluções também apresentavam comportamento

pseudoplástico.

5.5.2 Curvas de viscosidade

A viscosidade, que descreve a propriedade física de um líquido em resistir

ao fluxo induzido pelo cisalhamento, pode depender de alguns parâmetros tais como

temperatura, a natureza física da substância, pressão, taxa de cisalhamento, entre outros. Os

diferentes tipos de curva de fluxo têm seus correspondentes tipos de curvas de viscosidade,

que no caso dos líquidos Newtonianos, são representadas por uma reta paralela à abscissa,

indicando que independente da taxa de cisalhamento, a viscosidade não se modifica. Fluídos

que sofrem diminuição da viscosidade, quando a taxa de cisalhamento aumenta, são

chamados pseudoplásticos (SCHRAMM, 2006).

As curvas de viscosidade para os EPS produzidos nas diferentes fontes de

carbono, estão apresentadas nas figuras 19, 20 e 21. As medidas da viscosidade absoluta (η) x

taxa de cisalhamento ( ) efetuadas em concentrações de 1 a 6 g/L foram reunidas em um

único gráfico, para cada um dos EPS estudados.

A partir das figuras 19, 20 e 21 é possível observar que a viscosidade

aumenta com o aumento da concentração dos polímeros, esse comportamento foi notado

visualmente nos três exopolissacarídeos produzidos pelo B. rhodina, conforme figura 22.

Também, de acordo com as curvas de viscosidade, os três polissacarídeos estudados

apresentaram comportamento pseudoplástico, ou seja, as viscosidades das soluções

polissacarídicas em todas as concentrações analisadas decresceram de maneira substancial

com o aumento da taxa de deformação.

-2

-1

[mPas]

γ [1/s]

EPS

GLU

1g/L

EPS

GLU

2g/L

EPS

GLU

3g/L

EPS

GLU

4g/L

EPS

GLU

5g/L

EPS

GLU

6g/L

Figura 19 – Viscosidade absoluta (η) em função da taxa de cisalhamento ( ) do EPS

GLU

, nas

concentrações de 1 a 6g/L. Em sistema aquoso a 25ºC.

-2

-1

[mPas]

[1/s]

EPS

SAC

1g/L

EPS

SAC

2g/L

EPS

SAC

3g/L

EPS

SAC

4g/L

EPS

SAC

5g/L

EPS

SAC

6g/L

Figura 20

– Viscosidade aparente (η) em função da taxa de cisalhamento ( ) do EPS

SAC

, nas

concentrações de 1 a 6g/L. Em sistema aquoso a 25ºC.

-3

-2

-1

[mPas]

[1/s]

EPS

FRU

1g/L

EPS

FRU

2g/L

EPS

FRU

3g/L

EPS

FRU

4g/L

EPS

FRU

5g/L

EPS

FRU

6g/L

Figura 21

– Viscosidade aparente (η) em função da taxa de cisalhamento ( ) do EPS

FRU

, nas

concentrações de 1 a 6g/L. Em sistema aquoso a 25ºC.

Figura 22 - Soluções aquosas do EPS

GLU

á temperatura de 25ºC. (a) 3g/L e (b) 6g/L.

De acordo com Schramm (2006) soluções poliméricas com longas cadeias

entrelaçadas e enoveladas quando em repouso, têm suas moléculas numa ordem interna

irregular que se caracteriza por uma considerável resistência interna ao fluxo, ou seja, uma

elevada viscosidade. Com o aumento das taxas de cisalhamento, há uma ordenação ou

alinhamento das partículas, na direção do fluxo, provavelmente por ter as interações desfeitas.

Além disso, ainda segundo o mesmo autor, o cisalhamento também pode induzir a quebra de

agregados, auxiliando o material a escoar mais rapidamente.

O comportamento de pseudoplasticidade também foi encontrado em

soluções de outros polissacarídeos microbianos (COVIELO et al., 2007; TONELI; MURR;

PARK, 2005; SUTHERLAND, 2001).

A pseudoplasticidade dos polissacarídeos em estudo permite antever a

possibilidade de aplicação industrial à semelhança da goma xantana, que é o biopolímero

mais utilizado pela indústria, pois apresenta propriedades de espessante e estabilizante, com

comportamento pseudoplástico estável em uma larga faixa de pH, concentração iônica e

temperatura (GARCIA-OCHOA et al., 2000).

Marcotte e colaboradores (2001) realizaram estudos das propriedades

reológicas de alguns hidrocolóides (carragenana, pectina, gelatina, amido e xantana), sob

diferentes concentrações (1 a 6%, dependendo do tipo de hidrocolóide) e temperaturas (20,

40, 60 e 80ºC). Os autores verificaram a dependência das características reológicas com a

concentração e a temperatura, que se mostrou variável de um hidrocolóide para o outro.

Entretanto, para todos os hidrocolóides, a pseudoplasticidade aumentou com o aumento da

concentração. Resultados semelhantes foram encontrados para as soluções polissacarídicas do

B. rhodina.

Soluções de goma com valores elevados de η (TONELI; MURR; PARK,

2005), ou seja, com comportamento altamente pseudoplásticos, imprimem uma sensação de

viscosidade na boca. Desse modo, características de elevada viscosidade proporcionam uma

sensação de maciez e umidade ao paladar “mouthfeel”, que podem ser desejáveis em algumas

formulações alimentícias. A escolha da goma para utilização industrial deve ser, portanto, de

um sistema que possua um comportamento altamente pseudoplástico (CORRÊA et al., 2005).

A presença de sais inorgânicos é um fator modificador da viscosidade nas

soluções polissacarídicas, ou seja, a adição de sais pode incrementar ou diminuir a

viscosidade da solução (DIAZ; VENDRUSCOLO; VENDRUSCOLO, 2004). Com intuito de

avaliar o comportamento reológico dos três exopolissacarídeos na presença de solução salina,

foi realizado uma curva de viscosidade dos EPS, solubilizados em solução de NaCl (1g/L). As

curvas de viscosidade foram realizadas com as soluções na concentração de 6g/L, à

temperatura de 25ºC (Tabela 4 e Figura 23).

Tabela 4 – Viscosidade absoluta das soluções aquosa e salina dos EPS

GLU

, EPS

SAC

e EPS

FRU

6g/L, nas taxas de cisalhamentos ( ) 1,02; 10,59

e 99,19(1/s), à temperatura de

25°C.

Viscosidade (mPas)

1,02(1/s)* 10,59(1/s)* 99,59(1/s)*

EPS

GLU

NaCl (1g/L) em

6,70

1,40

0,74

0,11

0,04

EPS

SAC

NaCl (1g/L) em

3,56

2,35

0,44

0,29

0,07

0,04

EPS

FRU

NaCl (1g/L) em

3,64

1,54

0,43

0,22

0,07

0,04

* taxa de cisalhamento

Comparando-se os resultados da viscosidade dos biopolímeros em solução

aquosa (6g/L), é possível observar que os maiores valores encontrados são para o EPS

GLU

(Tabela 4),

independente da taxa de cisalhamento aplicada. O EPS

FRU

apresentou maiores

valores de viscosidade que o EPS

SAC

na taxa de cisalhamento 1,02 (1/s), observando uma

inversão em 10,59 (1/s).

É também possível observar, a partir da tabela 4, que os EPS solubilizados

em solução aquosa de NaCl (1g/L) apresentaram menor viscosidade quando comparados com

os respectivas polímeros dissolvidos apenas em água. Resultados semelhantes foram

encontrados por BERWANGER (2005), quando estudou a viscosidade do biopolímero

produzido pela bactéria Sphingomonas capsulata em solução salina. Apesar de ser o EPS

GLU

mais viscoso em meio aquoso, foi o menos viscoso em solução aquosa contendo NaCl,

provavelmente devido ao maior percentual de resíduos gentiobiosídicos (16%) em sua

estrutura, seguido dos EPS

FRU

(15%) e EPS

SAC

(9%) (Figura 23).

Figura 23 – Viscosidade absoluta (η) em função da velocidade de cisalhamento ( ) dos (EPS

GLU

EPS

SAC

e EPS

FRU

), 6g/L em sistema aquoso e NaCl (1g/L) à temperatura de 25ºC.

Polissacarídeos com carácter de polieletrólitos são afetados pela adição de

sais, como é o caso da goma xantana. Soluções de baixas concentrações de goma xantana têm

a viscosidade diminuída pela adição de pequena quantidade de sais. Segundo García-Ochoa e

colaboradores (2000) esse efeito pode ser atribuído à redução nas dimensões moleculares,

proveniente da diminuição das forças eletrostáticas intermoleculares, evitando a formação de

grandes agregados. Entretanto, a viscosidade de suas soluções tende a aumentar em

concentrações mais elevadas ou quando uma grande quantidade de sais é adicionada. Segundo

Diaz e colaboradores (2004) esse efeito é devido, provavelmente, ao aumento da interação

entre as moléculas de polímeros.

PINTO e colaboradores (2002) também estudaram a viscosidade do

biopolímero acídico produzido pela bactéria Beijerinckia sp em solução de CaCO

e KCl

diferentes valores de pH. Na maior parte dos resultados houve uma diminuição da

viscosidade.

FARIÑA e colaboradores (2001) estudaram as propriedades reológicas da

escleroglucana, um polissacarídeo neutro que possui a estrutura semelhante as β-D-glucanas

produzidas pelo fungo B. rhodina. Os resultados indicaram uma diminuição da viscosidade

nas soluções de escleroglucana 2g/L, em presença de diferentes concentrações de NaCl. Os

autores não conseguiram encontrar uma explicação química para esse fenômeno, porém

acreditam que a qualidade do solvente poderia ser responsável pela diminuição da

viscosidade.

5.5.3 Análise em sistema dinâmico

As medidas reológicas dinâmica ou oscilatória apresentam a vantagem de

permitir a utilização de amplitudes de tensão muito pequenas, minimizando os efeitos de

ruptura sobre a estrutura do polímero. São realizadas em géis, que são definidos como

materiais com aspecto de sólido ou quase-sólido apresentando elevadas concentrações de

polímeros, de modo que os polímeros enovelem-se ao acaso e atuem como redes elásticas

quando submetidos à pressão, por um pequeno intervalo de tempo. Assim, quando as

medidas dinâmicas são realizadas em amplitudes de oscilação suficientemente pequenas,

encontram-se dentro do limite viscoelástico linear da amostra, onde não há perturbação

significativa do sistema durante a realização do experimento (SCHRAMM, 2006).

Considerando-se que os polissacarídeos atuam como materiais

viscoelásticos (apresentam características de sólidos e líquidos simultaneamente) e que os

módulos G’ e G” referem-se ao caráter elástico e viscoso, respectivamente, é possível

quantificar a predominância do caráter sólido ou líquido de uma amostra, através das medidas

dinâmicas.

Os valores de tensão para os testes de varreduras de freqüência para os

EPS

GLU

e EPS

FRU

foi de 1 Pa e para o EPS

SAC

foi de 0,7 Pa. Nesta condição, os polímeros

apresentaram comportamento viscoelásticos linear, ou seja, a tensão ou deformação aplicada

não alterou a estrutura física dos EPS.

Após determinar a deformação dentro da região viscoelástica linear das

amostras, foram realizadas as análises dinâmicas por varredura de freqüência numa amplitude

de 10

−

a 10 Hz. Foi observado também a influência da adição de NaCl (1g/L) sobre a força

do gel à temperatura de 25ºC (Figuras 24, 25 e 26).

Figura 24 - Análise do comportamento viscoelástico do EPS

GLU

em 6g/L; módulo elástico;

módulo viscoso; viscosidade complexa. (A) em solução aquosa a

25°C; (B) em solução aquosa a 5°C; (C) em solução de NaCl (1g/L) a 25ºC.

Figura 25

- Análise do comportamento viscoelástico do EPS

SAC

em 6g/L; módulo elástico;

módulo viscoso; viscosidade complexa. (A) em solução aquosa a

25°C; (B) em solução aquosa a 5°C; (C) em solução de NaCl (1g/L) a 25°C.

Figura 26

- Análise do comportamento viscoelástico do EPS

FRU

em 6g/L; módulo elástico;

módulo viscoso; viscosidade complexa. (A) em solução aquosa a

25°C; (B) em solução aquosa a 5°C; (C) em solução aquosa de NaCl (1g/L), a 25°C.

É possível observar (Figuras 24, 25 e 26) que todos os biopolímeros

estudados apresentaram valores de G’ superiores aos de G” em todas a faixas de freqüência

analisadas. Os resultados dessas análises permitiram concluir que os polímeros EPS

GLU

EPS

SAC

e EPS

FRU

apresentam comportamento viscoelástico com caráter sólido ou seja, com

características de géis fortes.

Esse comportamento já foi observado em outros polissacarídeos em solução

como a goma xantana, gelana, carragenana (RODRÍGUEZ–HERNANDEZ; TECANTE,

1999), curdlana (HIRASHIMA; TAKAYA; NISHINARI, 1997), scleroglucana (MORESI et

al., 2001), amido de milho e misturas de amido de milho com goma xantana e goma guar

(ACHAYUTHAKAN; SUPHANTHARIKA, 2008).

François e colaboradores (2003) estudaram as características reológicas

dinâmicas em matrizes de géis do exopolissacarídeo fúngico escleroglucana, para liberação da

droga teofilina. Os pesquisadores observaram que diferentes concentrações do EPS e da droga

influenciavam na liberação do fármaco, porém, independente da concentração utilizada para

os experimentos, todos os géis possuíram características de gel forte, indicando possíveis

aplicações na liberação controlada de fármaco. Mais recentemente, Viñarta e colaboradores

(2007) também confirmaram a liberação controlada de teofilina em matrizes de géis do

polissacarídeo escleroglucana, os mesmos mostraram caráter viscoelástico, com G’ superior a

G”.

Zang e colaboradores (2007) e Xu e colaboradores (2007) observaram o

comportamento de viscoelasticidade do exopolissacarídeo lentinana uma β-(1→3)-D-glucana

extraída do corpo de frutificação do Lentinus edodes. Os pesquisadores concluíram que o

comportamento viscoelástico dos géis de lentinana exibia forte dependência da concentração

do polímero. Em baixas concentrações os géis se comportaram como gel fraco, com módulo

G’inferior a G” em baixas freqüências, ocorrendo uma inversão em altas freqüências. Com o

aumento da concentração, o gel de lentinana se mostrou com caráter sólido, ou seja, G’

superior a G”. Esses resultados indicam que a concentração polissacarídica dos géis está

fortemente ligada ao comportamento viscoelástico.

A tabela 5 mostra os valores do modulo elástico (G’) obtidos na freqüência

de 1 Hz para os três exopolissacarídeos produzidos pelo B. rhodina nas temperaturas de 25° e

5°C na presença ou ausência de NaCl.

Tabela 5. Valores obtidos de (G’) nas varreduras de freqüências dos EPS

GLU,

EPS

SAC

EPS

FRU

, na freqüência da 1 Hz.

A partir da análise do módulo G’ na freqüência de 1 Hz (Tabela 5), para os

três exopolissacarídeos produzidos pelo fungo B. rhodina, pode-se observar que o módulo

elástico apresentou um aumento dos valores quando a análise foi efetuada em temperatura

mais baixa, 9,9 Pa (25° C) para 12,8 Pa (5° C) para o EPS

GLU

;

11,7 Pa (25° C) para 16,8 Pa

(5° C) para o EPS

SAC

e 8,9 Pa (25° C) para 22,7 Pa (5° C) para o EPS

FRU

, sinalizando que a

força do gel é maior em temperaturas baixas do que em temperaturas mais altas. O EPS

SAC

apresentou-se como o gel mais forte a 25° C seguido do EPS

GLU

e EPS

FRU

(Figura 27-A). Esse

comportamento não se manteve a temperatura de 5° C, pois de acordo com os experimentos

EPS

FRU

foi o gel mais forte (Figura 27-B).

Os três polímeros quando solubilizados em NaCl (1g/L) apresentaram uma

leve diminuição do módulo elástico (G’) (tabela 5), provavelmente pela diminuição das forças

eletrostáticas em meio salino.

Amostras

NaCl

(1g/L)

Temperatura

(ºC)

[Pa]

0 5 12,8

EPS

GLU

0 25 9,9

1 25 7,7

0 5 16,8

EPS

SAC

0 25 11,7

1 25 8,2

0 5 22,7

EPS

FRU

0 25 8,9

1 25 5,9

Figura 27

– Comportamento do módulo elástico (G’) dos três exopolissacarídeos produzidos pelo

fungo B. rhodina MAMB-05 em glucose

( ), sacarose ( ) e

frutose ( )

estudados a 25°C (A) e 5°C (B).

5.5.4 Rampa de temperatura

A rampa de temperatura é um experimento que tem como objetivo estudar o

comportamento viscoelástico do gel, utilizando um gradiente linear, crescente e decrescente,

de temperatura. Os três géis elaborados com os exopolissacarídeos produzidos pelo fungo B.

rhodina foram analisados em uma varredura de freqüência à temperatura de 5 a 95°C

(ascendente) e de 95 a 5°C (descendente), com um aumento de 1,5°C/min.

Os resultados encontrados (Figura 28) permitiram concluir que todos os três

polissacarídeos formam soluções de géis fortes, pois os valores de G’ se mostraram superiores

aos de G” em todas as faixas de temperatura, independente de ser a rampa ascendente ou

descendentes.

Figura 28 –

Rampa de temperatura. Curva

ascendente

(

5 a 95°C) e descendente (95 a 5°C), com

aumento de 1,5°C/min., em

solução aquosa

(6g/L)

Dentro da faixa de temperatura analisada (5 a 95°C) o EPS

FRU

mostrou

aumento significativo nos valores de G’ nas temperaturas inferiores a 20ºC (linha azul). Uma

dependência menos pronunciada foi observada para os EPS

SAC

e EPS

GLU

. Acima de 20°C

houve uma estabilização dos valores de G’ e G” para EPS

SAC

, podendo-se sugerir um

comportamento termo-estável na faixa de 20 a 95°C. No entanto para EPS

GLU

e EPS

FRU

vemos um pequeno decréscimo nos valores de G’ e G” faixa de 20 a 95°C. O mesmo

comportamento foi observado na rampa descendente (95 a 5°C), caracterizando-os como géis

termo resistentes. Este comportamento pode estar relacionado com as diferenças estruturais

das amostras de EPS e as conformações adotadas nas diferentes temperaturas.

5.5.5 Tixotropia

A tixotropia é um fenômeno reológico característico de substâncias cuja

viscosidade depende do tempo de cisalhamento. Ela descreve o comportamento de

substâncias que passam do estado gel de alta viscosidade para o estado de solução com

viscosidade muito baixa, como resultado de um alto cisalhamento por um período de tempo

relativamente longo (SCHRAMM, 2006, p.215). Um importante critério da tixotropia é o

processo reversível de reespessamento da substância, quando deixada em repouso.

Testes reológicos em que a amostra é submetida ao aumento da taxa de

cisalhamento seguido pela diminuição da taxa servem para observar a tixotropia do material,

cuja ocorrência é verificada quando a curva de aumento da taxa não coincide com a curva de

decréscimo da taxa no gráfico de τ x . O diagrama resultante é denominado de curva de

histerese (ARAÚJO, 2007).

A curva de histerese (tensão de cisalhamento x taxa de deformação) dos três

polissacarídeos estudados mostrou que todos apresentam comportamento tixotrópico (Figura

29).

Mao e colaboradores (2007) estudaram o comportamento tixotrópico do

grifolana, uma β-(1,3)-D-glucana, realizando análises reológicas em sistema estacionário e a

conformação em tripla hélice pela formação do complexo entre o polímero e o corante Congo

Red. Considerando esses dois resultados os pesquisadores inferiram que o comportamento

tixotrópico do gel de grifolana poderia se atribuído à ruptura de agregados da tripla hélice, sob

cisalhamento. Considerando-se que os EPS

GLU

, EPS

SAC

e EPS

FRU

também apresentaram

conformação em tripla hélice, nos experimentos com o Congo Red (Figura 15, pg. 64), a

desagregação de suas cadeias, sob alto cisalhamento, poderia ser a causa do comportamento

tixotrópico desses polissacarídeos.

Figura 29 – Tensão de cisalhamento (τ) versus a taxa de cisalhamento ( ) dos três exopolissacarídeos

produzidos pelo fungo B. rhodina, nas concentrações de 6g/L a 25°C.

Grassi e colaboradores (1996) observaram o fenômeno da tixotropia no

escleroglucana, um polissacarídeo natural produzido extracelularmente pelos fungos do

gênero Sclerotium. Posteriormente, Fariña e colaboradores (2001) verificaram a conformação

do escleroglucana em tripla hélice utilizando experimento de complexação com o corante

Congo Red. Esta molécula é, hoje, o polímero de origem fúngica com maior aplicação e

comercialização industrial, principalmente nas áreas farmacêutica e alimentícia.

Os produtos tixotrópicos possuem algumas vantagens tecnológicas, pois

tendem a apresentar maior vida de prateleira (“shelf-life”) durante o armazenamento,

mantendo a viscosidade constante, o que dificulta a separação dos constituintes da formulação

(CORRÊA et al., 2005).

A obtenção de formulações de uso tópico com caráter tixotrópico é bastante

almejada, pois elas se deformam durante a aplicação tornando-se mais fluídas e,

consequentemente, facilitando o espalhamento e recuperam a viscosidade inicial no momento

que se encerra a aplicação, evitando que o produto escorra (GASPAR, MAIA CAMPOS,

2003).

Podemos observar que os materiais tixotrópicos possuem inúmeras

aplicações tecnológicas, portanto o comportamento tixotrópico apresentado pelos

exopolissacarídeos produzidos pelo fungo B. rhodina, nos faz inferir que esse material possui

características reológicas que permitem sua utilização em diversos setores industriais. O

emprego industrial destes exopolissacarídeos se torna apenas uma questão de tempo, uma vez

que inúmeras linhas de pesquisas vêm se abrindo, e atualmente os EPS vêm despertando o

interesse da indústria.

Segue em anexo o artigo submetido à revista Revista Brazilian Journal of Food

Technology.

6. CONCLUSÃO

De acordo com os dados relatados neste trabalho, observou-se que a

metodologia adotada para produção de β(1→3;1→6)D-glucanas pelo fungo B. rhodina

MAMB-05, em três diferentes fontes de carbono, foi eficiente para obtenção de

exopolissacarídeos, homogêneos, de acordo com a cromatografia de filtração em gel à pressão

normal.

A análise da conformação pela complexação dos EPS com o Congo Red

indicou a presença de tripla hélice nas β-glucanas produzida pelo fungo B. rhodina,

provavelmente, responsável pela viscosidade das soluções polissacarídicas.

Conforme as curvas de fluxo e de viscosidades os biopolímeros em solução

apresentaram comportamento não-Newtoniano, com características de soluções

pseudoplásticas e tixotrópicas.

Os resultados das análises dinâmicas confirmaram a formação de um gel

forte em 5 e 25°C, não sofrendo mudanças no comportamento, mesmo em presença de 0,1%

NaCl, à temperatura de 25°C. Ao analisar a influência de uma ampla faixa de temperatura (5 a

95°C) sobre o comportamento viscoelástico dos géis, observou-se que as soluções

apresentaram características de gel forte, com propriedades termo-estável e termo-reversível.

Os resultados encontrados neste trabalho nos permitem concluir que os EPS

produzidos pelo fungo B. rhodina possuem propriedades químicas e físicas, com potencial

para utilização nas indústrias de alimentos, farmacêutica, cosmética e biomédica.

Trata-se de um trabalho inédito, pois pela primeira vez estudos reológicos

foram realizados nos exopolissacarídeos produzidos pelo B. rhodina MAMB-05.

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doi:10.1016/j.carbpol.2007.10.020.

ANEXO

Artigo encaminhado a Revista Brazilian Journal of Food Technology.

ARACTERIZAÇÃO REOLÓGICA DOS BOTRIOSFERANAS PRODUZIDOS PELO

OTRYOSPHAERIA

RHODINA

MAMB-05

EM GLUCOSE

SACAROSE E FRUTOSE COMO FONTES DE CARBONO

RHEOLOGICAL CHARACTERIZATION OF BOTRYOSPHAERANS PRODUCED BY

OTRYOSPHAERIA

RHODINA

MAMB-05

IN GLUCOSE

SUCROSE AND FRUCTOSE AS CARBON SOURCE

Raphael Alves Macedo Bongiovani

, Joana Lea Meira Silveira

, Ana Lúcia

Barretto Penna

, Robert Frans Huibert Dekker

, Aneli de Melo Barbosa

, Maria

de Lourdes Corradi da Silva

Dept

de Engenharia e Tecnologia de Alimentos – Programa de Pós-graduação em

Engenharia e Ciências de Alimentos –

IBILCE -

Universidade Estadual Paulista, São

José do Rio Preto, São Paulo, Brasil.

Dept

de Bioquímica e Biologia Molecular, Universidade Federal do Paraná,

Curitiba, Paraná, Brasil.

Universidad de Castilla-La Mancha, Instituto de Regional Investigación Científica

Aplicada (IRICA), Ciudad Real, Spain.

Dept

de Bioquímica e Biotecnologia - CCE, Universidade Estadual de Londrina,

Londrina, Paraná, Brasil.

Dept

de Física, Química e Biologia, Faculdade de Ciências e Tecnologia,

Universidade Estadual Paulista, Caixa Postal 467, CEP 19060-900, Presidente

Prudente, São Paulo, Brasil. E-mail: [email protected]

RESUMO

O fungo ascomiceto Botryosphaeria rhodina MAMB-05 secreta no meio líquido de

cultivo um exopolissacarídeo (EPS), botriosferana, caracterizado como uma β(1→3;

1→6)-D-glucana, com aproximadamente 22% de ramificações em C-6, constituídas

por unidades glucosídicos e gentiobiosídicos β1→6 ligados à cadeia principal. A

comparação da produção do botriosferana em três diferentes fontes de carbono

mostrou maior rendimento em sacarose, seguido de glucose e frutose. A diferença

na estrutura química desses EPSs foi relacionada ao grau de ramificação. As

soluções aquosas dessa família de biopolímeros apresentaram diferentes

viscosidades e consequentemente algumas de suas características reológicas foram

examinadas. As análises reológicas dos polissacarídeos apresentaram

comportamento não-Newtoniano, com características de soluções pseudoplásticas.

O comportamento tixotrópico, confirmado pela curvas de histerese, foi apresentado

pelas soluções dos polissacarídeos obtidos nas três diferentes fontes de carbono.

Os resultados obtidos sugerem que esta família de botriosferanas, produzida pelo

fungo B. rhodina MAMB-05, tem propriedades físico-químicas adequadas para uso e

aplicações comerciais.

Palavras-chaves: Comportamento reológico; Botriosferana; Caráter Pseudoplástica;

Comportamento tixotrópico.

SUMMARY

The ascomyceteous fungus Botryosphaeria rhodina MAMB-05 secretes into

the liquid culture medium an exopolysaccharide (EPS), botryosphaeran,

characterized as a β(1→3; 1→6)-D-glucan with approximately 22 % side-branching

at C-6 constituted by glucose and gentiobiose units, which are β1→6-linked to the

backbone chain. The comparison of botryosphaeran produced by growing the fungal

100

isolate on three different carbon sources showed higher yields on sucrose followed

by glucose and fructose. The difference in chemical structure of these EPS’s was

related to the degree of branching. The aqueous solutions of this family of

biopolymers presented different viscosities, and consequently some rheological

properties were examined. The analyses rheological of polysaccharides presented a

Non-Newtonian behaviour with characteristics of the pseudoplastic solutions. The

thixotropic behaviour was confirmed by hysteresis curves of the polysaccharide

solutions obtained with the three different carbon sources. The findings give support

that this family of botryosphaerans produced by the fungus B. rhodina MAMB-05

have physicochemical properties suitable for use in commercial applications.

Key Words: Rheological behaviour; Botryosphaeran; Character Pseudoplastic;

Thixotropic behaviour.

1. INTRODUÇÃO

Os exopolissacarídeos (EPS) são polímeros extracelulares produzidos por

algumas bactérias e fungos e, alguns, são capazes de formar soluções viscosas,

mesmo em baixas concentrações. Esses biopolímeros vêm substituindo

progressivamente os polissacarídeos obtidos de fontes convencionais, como plantas

e animais, devido à facilidade de obtenção e possibilidade de aplicação nas

indústrias de alimentos, farmacêutica, cosmética e têxtil (METHACANON et al.,

2005; SUTHERLAND, 1998). Dentre os inúmeros biopolímeros, os de origem

bacteriana como a goma xantana e gelana são os que possuem as maiores

aplicações e já são produzidas em escala industrial (COVIELLO et al., 2007; ZHANG

et al., 2007).

101

Polissacarídeos de origem fúngica como lentinana, escleroglucana e

esquizofilana são aplicados como aditivos em diferentes indústrias, em particular

alimentícia e farmacêutica por, principalmente, não apresentarem toxicidade

(ZHANG et al., 2007).

O botriosferana, um exopolissacarídeo produzido pelo fungo ascomiceto

Botryospharia rhodina MAMB-05, quando cultivado em glucose como fonte de

carbono, é formado por uma cadeia principal de unidades glucosídicas em ligação

do tipo β-(1,3), com aproximadamente 22% de ramificação em C-6 por resíduos

glucosídicos e gentiobiosídicos (Figura 1) (BARBOSA et al., 2003). Forma soluções

aquosas viscosas, mesmo em baixas concentrações. Esta β-glucana pode ser

produzida em outras fontes de carbono (STELUTI et al., 2004) constituindo-se como

uma família de exopolissacarídeos e, embora a cadeia principal seja a mesma, o

grau de ramificação do EPS sofre variações (CORRADI DA SILVA et al., 2005). Em

estudos realizados com animal de experimentação in vivo, o botriosferana produzido

em glucose, apresentou atividade hipoglicemiante e hipocolesterolêmica não sendo

observada nenhuma ação mutagênica (MIRANDA et al., 2008).

Para aplicação industrial de um polissacarídeo o mesmo deve apresentar

características reológicas interessantes tais como formar soluções viscosas em

baixas concentrações, possuir alta solubilidade, manter a viscosidade e estabilidade

em ampla faixa de pH, temperatura e na presença de sais. Além disso, para

consumo humano como alimento, fármaco e/ou cosmético deve ser metabolizado

pelo organismo humano e ter aprovação prévia dos órgãos competentes (MOREIRA

et al, 2005).

Embora as análises reológicas sejam utilizadas para estudar o

comportamento reológico das soluções formadas pelos polissacarídeos de origem

102

bacteriana e fúngica, nenhum trabalho foi realizado com os géis formados pelos

exopolissacarídeos produzidos pelo fungo Botryosphaeria rhodina MAMB-05. Até o

momento, as investigações estão relacionadas com a produção, estrutura e

atividade biológica do botriosferana. Portanto, o objetivo deste trabalho foi realizar

análises reológicas com as soluções dos exopolissacarídeos produzidos pelo B.

rhodina MAMB-05, quando cultivado em três diferentes fontes de carbono: glucose,

sacarose e frutose. Espera-se que os resultados aqui obtidos possam contribuir

futuramente para o emprego destes exopolissacarídeos nas indústrias de alimentos,

cosmética e farmacêutica.

Figura 1. Botriosferana: β-(1→3,1→6)-D-glucana

2. MATERIAIS E MÉTODOS

2.1. Preparo das soluções de exopolissacarídeos

Os exopolissacarídeos foram obtidos de acordo com a metodologia descrita

por Steluti e colaboradores (2004), a partir do cultivo do fungo Botryosphaeria

rhodina MAMB-05 nas fontes de carbono glucose (EPS

GLU

), sacarose (EPS

SUC

) e

frutose (EPS

FRU

). Os EPS foram solubilizados em água deionizada à temperatura de

± 60°C, na concentração de 6g/L. As amostras foram mantidas sob agitação

mecânica constante, em velocidade média, à temperatura de 22°C por 18 horas.

Durante esse período foram realizados três ciclos de aquecimentos a 60° C, por 15

103

minutos. Após solubilização completa dos EPS, foram realizadas diluições para

condução dos experimentos.

2.2. Curvas de Fluxo

As propriedades reológicas das soluções polissacarídicas, em diferentes

concentrações, foram determinadas através de ensaios com cisalhamento

constante. Foi utilizado um reômetro HAAKE RS75 Rheostress acoplado a um

banho termostatizado HAAKE K15 e termocirculador de água DC5B3. Foi utilizado o

sensor cone-placa com diâmetro de 60nm e ângulo de 2º (α). Foi aplicada uma taxa

de cisalhamento (γ) variando de 10

-1

a 10

1 com um tempo de 300s para

realização das curvas de fluxo. A amostragem foi realizada em triplicata à

temperatura 25°C.

2.3. Tixotropia

A determinação da tixotropia foi efetuada em sensor cone-placa (C60/2Ti°) na

concentração de 6 g/L, para cada EPS. Foi realizada a curva de histerese (tensão

de cisalhamento x taxa de cisalhamento) com taxa de cisalhamento de 10

-1

a 10

onde se verificou a subida (ascendente) e a descida (descendente) da curva. As

análises foram realizadas em triplicata à temperatura de 25°C.

3. RESULTADOS E DISCUSSÃO

3.1 Comportamento reológico das soluções formadas pelos

exopolissacarídeos produzidos pelo B. rhodina MAMB-05 nas três diferentes

fontes de carbono

A curva de fluxo, definida a partir das medidas de tensão de cisalhamento (τ)

x taxa de cisalhamento ( ), permite verificar o comportamento de fluxo das soluções

polissacarídicas. A partir da construção do reograma é possível estabelecer se um

104

líquido apresenta um comportamento de fluxo Newtoniano ou não Newtoniano, em

determinadas condições de tensão ou taxa de cisalhamento.

As soluções aquosas dos botriosferanas obtidos nas três diferentes fontes de

carbono apresentaram elevada viscosidade mesmo em baixas concentrações e

observou-se um aumento da viscosidade com o aumento da concentração de

polissacarídeos (Figura 2).

Figura 2. Soluções aquosas do EPS

GLU

á temperatura 25ºC. (a) 3g/L e (b) 6g/L.

De acordo com os reogramas apresentados na figura 3 as soluções

polissacarídicas têm comportamento de fluxo de líquidos não Newtonianos e o

aumento da tensão de cisalhamento, a partir do aumento progressivo da taxa de

cisalhamento, caracteriza as soluções como fluidos pseudoplásticos (NAVARRO,

1997).

105

Figura 3. Curvas de Fluxo (tensão de cisalhamento x taxa de cisalhamento) das

soluções polissacarídicas dos (a) EPS

GLU

, (b) EPS

SAC

e (c) EPS

FRU

, nas

concentrações de 1g/L a 6g/L, à temperatura de 25ºC.

Rottava (2005) observou comportamento semelhante de pseudoplasticidade

para a goma xantana, produzida por diferentes espécies da bactéria Xanthomonas

sp, que é, atualmente, o polímero mais utilizado pela indústria, apresentando

106

propriedades de espessante e estabilizante, com comportamento pseudoplástico

estável em uma larga faixa de pH, concentração iônica e temperatura (GARCIA-

OCHOA et al., 2000). Bae e colaboradores (2008) estudaram o comportamento

reológico das soluções do exopolissacarídeo levana, produzido pela Microbacterium

laevaniformans, e os resultados encontrados demonstraram que as soluções de

levana também apresentavam comportamento pseudoplástico.

A característica pseudoplástica vista nas glucanas produzidas pelo fungo

Botryosphaeria rhodina MAMB-05, também foi observada nos estudos reológicos da

escleroglucana, uma β-(1→3,1→6)-D-glucana, produzida por fungos do gênero

Sclerotium (GRASSI et al., 1996). Já se propõe a utilização de escleroglucana para

diminuir a sinerese (exsudação espontânea da água), melhorando a qualidade dos

alimentos (VIÑARTA et al., 2006).

3.2 Tixotropia

A tixotropia descreve o comportamento de substâncias que passam do estado

gel de alta viscosidade para o estado de solução com viscosidade muito baixa, como

resultado de um alto cisalhamento por um período de tempo relativamente longo.

Um importante critério da tixotropia é o processo reversível de reespessamento da

substância, quando deixada em repouso. Testes reológicos em que a amostra é

submetida ao aumento da taxa de cisalhamento, seguida pela diminuição da taxa,

servem para observar a tixotropia do material, cuja ocorrência é verificada quando a

curva de aumento não coincide com a curva de decréscimo da taxa e o diagrama

resultante é denominado de curva de histerese (BARNES, 1997).

As curvas de histerese dos exopolissacarídeos estudados neste trabalho

mostraram que todos apresentam comportamento tixotrópico (Figura 4). Amido de

107

milho e combinações de amido de milho com gomas xantana, arábica e guar

(KORUS et al., 2004) apresentam comportamento semelhante.

Figura 4. Curvas de Histerese (tensão de cisalhamento x taxa de deformação) das

soluções polissacarídicas dos (a) EPS

GLU

, (b) EPS

SAC

e (c) EPS

FRU

na concentração

de 6g/L, à temperatura de 25ºC. Curva ascendente (símbolos preenchidos), curva

descendente (símbolos abertos).

108

Mao e colaboradores (2007) estudaram o comportamento tixotrópico e a

conformação em tripla hélice do exopolissacarídeo grifolana, uma β-(1,3)-D-glucana,

produzida pelo fungo Grifola frondosa. Considerando os resultados encontrados os

pesquisadores inferiram que o comportamento tixotrópico do gel de grifolana poderia

ser atribuído à ruptura de agregados da tripla hélice, sob cisalhamento. EPS

GLU

EPS

SAC

e EPS

FRU

também apresentam conformação em tripla hélice, nos

experimentos com Congo Red (dados não apresentados), portanto, a desagregação

de suas cadeias, sob alto cisalhamento, poderia ser a causa do comportamento

tixotrópico dessa família de polissacarídeos. O mesmo fenômeno foi observado para

o escleroglucana (GRASSI et al., 1996), também um polímero que apresenta

conformação em tripla hélice (FARIÑA et al., 2001). O escleroglucana é, hoje, o

polímero de origem fúngica com maior aplicação industrial, principalmente nas áreas

farmacêutica e alimentícia (COVIELLO et al., 2007).

Os produtos tixotrópicos possuem algumas vantagens tecnológicas, pois

tendem a apresentar maior vida de prateleira (shelf-life) durante o armazenamento,

mantendo a viscosidade constante, o que dificulta a separação dos constituintes da

formulação (CORRÊA et al., 2005). A obtenção de formulações de uso tópico com

caráter tixotrópico é bastante almejada, pois se deformam durante a aplicação

tornando-se mais fluídas e, consequentemente, facilitando o espalhamento e

recuperando a viscosidade inicial no momento em que se encerra a aplicação,

evitando que o produto escorra (GASPAR, MAIA CAMPOS, 2003).

Os materiais tixotrópicos possuem inúmeras aplicações tecnológicas,

portanto a manifestação desse comportamento nos exopolissacarídeos produzidos

pelo B. rhodina nos permite acreditar que uma investigação mais minuciosa no

109

campo da reologia poderá prover informações valiosas para aplicação do

botriosferana nos diferentes setores industriais.

4. CONCLUSÕES

As soluções aquosas dos exopolissacarídeos produzidos pelo fungo Botryosphaeria

rhodina MAMB-05, nas três diferentes fontes de carbono, apresentaram

comportamento de fluxo de líquidos não Newtonianos, com características de fluidos

pseudoplásticos. O comportamento tixotrópico foi identificado nas três soluções.

Resultados semelhantes foram encontrados nos estudos de alguns polissacarídeos

microbianos, que hoje são amplamente utilizados pela indústria.

AGRADECIMENTOS

À Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP processo

05/53879-3) e à Coordenadoria de Aperfeiçoamento do Pessoal de Ensino Superior

(CAPES, bolsa de mestrado ao aluno RAMB), UFPR, Pronex-Carboidratos e Rede

Nanoglicobiotecnologia-CNPq, Fundação Araucária (Projeto Nº 5777) e ao CNPq

(Projeto Nº 474340/2006-6).

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