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UNIVERSIDADE FEDERAL DO TRIÂNGULO MINEIRO
ANATOMIA ULTRAESTRUTURAL DO NERVO FRÊNICO DE RATOS:
ALTERAÇÕES DECORRENTES DO DIABETE EXPERIMENTAL CRÔNICO
OMAR ANDRADE RODRIGUES FILHO
UBERABA
AGOSTO DE 2008
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OMAR ANDRADE RODRIGUES FILHO
ANATOMIA ULTRAESTRUTURAL DO NERVO FRÊNICO DE RATOS:
ALTERAÇÕES DECORRENTES DO DIABETE EXPERIMENTAL CRÔNICO
TESE DE DOUTORADO APRESENTADA AO
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PATOLOGIA,
ÁREA DE CONCENTRAÇÃO “PATOLOGIA GERAL”
DA UNIVERSIDADE FEDERAL DO TRIÂNGULO
MINEIRO COMO REQUISITO PARCIAL PARA A
OBTENÇÃO DO TÍTULO DE DOUTOR.
ORIENTADORA: Prof. Dra. VALÉRIA PAULA SASSOLI FAZAN
UBERABA
AGOSTO DE 2008
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- Laboratório Experimental da Disciplina de Anatomia Humana da Universidade Federal do
Triângulo Mineiro
- Laboratório Experimental da Disciplina de Fisiologia da Universidade Federal do Triângulo
Mineiro
- Laboratório de Neurologia Aplicada e Experimental da Faculdade de Medicina de Ribeirão
Preto – USP
- Central Microscopy Research Facility – University Of Iowa-USA
APOIO FINANCEIRO:
- UFTM
- FUNEPU
- CAPES
- PRONEX I
Para ser grande, sê inteiro: nada
Teu exagera ou exclui.
Sê todo em cada coisa. Põe quanto és
No mínimo que fazes.
Assim em cada lago a lua toda
Brilha, porque alta vive.
Fernando Pessoa (Ricardo Reis)
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Mas quem, de repente, aprende.
João Guimarães Rosa
Aos meus queridos pais, Fani e Omar, hoje ausentes
Por terem me dado a vida, amor, carinho e muito mais:
muito apoio.
À minha querida esposa, Sheila,
Por tudo que passamos juntos, pelo carinho, pela perseverança, grande incentivo e apoio
dedicado. Com certeza, sem ela, não estaria aqui.
Às minhas filhas, Stael, Stella e Esther,
Pelo grande incentivo, compreensão e amor dedicados.
Ao meu genro, Rúbio,
Pela amizade e apoio.
Aos meus netos, Felipe e Mateus
Pela grande mudança provocada.
AGRADECIMENTO ESPECIAL
À Professora Doutora Valéria Paula Sassoli Fazan, meus sinceros agradecimentos pela
orientação da Tese, pela amizade, confiança demonstrada na minha capacidade e seriedade no
trabalho. Seu grande empenho e força na realização desse trabalho, sua convicção de que tudo
vai dar certo e sua grande força interior.
AGRADECIMENTOS
• Ao meu secretário Rui Marcos da Silva pelo seu empenho e ajuda constantes.
• Aos professores da Banca de Qualificação:
o Profª Dra. Maria Laura Pinto Rodrigues
o Profª Dra. Marly Aparecida S. Balarin
o Profª Dra. Virgínia Oliveira Crema
• Aos funcionários da Pós-Graduação.
• Dr. Kenneth C. Moore da Universidade de Iowa-USA pela valiosa contribuição
relativa a microscopia eletrônica (JEM 1230 – JEOL).
• A todos aqueles que não foram citados nominalmente, mas que contribuíram nessa
minha trajetória.
SUMÁRIO
1 . INTRODUÇÃO ………………………………………………………………...............................
10
1.1. Nervo Frênico em Humanos …………………………………………………................................
11
1.2. Nervo Frênico no Rato …………………………………………………………............................
14
1.3. Neuropatia e Diabete ……………………………………………………………...........................
19
1.4. Diabete Experimental …………………………………………………………..............................
22
1.5. Tratamento com Insulina ……………………………………………………….............................
26
2. OBJETIVOS …………………………………………………………………….............................
28
3. MATERIAL E METÓDOS …………………………………………………….............................
30
3.1. Animais …………………………………………………………………………............................
31
3.2. Grupos Experimentais ………………………………………………………….............................
31
3.3. Indução do Diabete ……………………………………………………………..............................
32
3.4. Tratamento com Insulina ……………………………………………………….............................
32
3.5. Procedimentos Histológicos ……………………………………………………............................
33
3.6. Análise Morfométrica e Morfológica …………………………………………..............................
39
3.7. Análise Estatística ………………………………………………………………...........................
43
4. RESULTADOS ………………………………………………………………….............................
45
4.1. Dados Ponderais ………………………………………………………………........................................
46
4.1.1. Grupo Controle ……………………………………………………………….............................
46
4.1.2. Grupo Diabético Crônico …………………………………………………….............................
46
4.1.3. Grupo Diabético Crônico Tratado com Insulina ……………………………..............................
47
4.1.4. Comparação entre os Grupos …………………………………………………............................
47
4.2. Estrutura e Ultraestrutura do Nervo Frênico Normal …………………………................................
50
4.2.1. Comparação dos Aspectos Ultraestruturais entre os Grupos Experimentais …...........................
53
4.3. Morfometria das Fibras Amielínicas ……………………………………………..................................
59
4.3.1. Ratos Controles ………………………………………………………………............................
59
4.3.2. Ratos Diabéticos Crônicos ……………………………………………………...........................
61
4.3.3. Ratos Diabéticos Crônicos Tratados com Insulina ……………………………...........................
64
4.3.4. Comparação entre os Diferentes Grupos Experimentais ……………………..............................
67
4.4. Histogramas de Distribuição de Frequência de Diâmetro das Fibras Amielínicas ………………..
74
4.4.1. Comparação Entre os Diferentes Grupos Experimentais ……………………………………….
78
5. DISCUSSÃO ……………………………………………………………………………………….
80
5.1. Dados Ponderais …………………………………………………………………………………..
81
5.2. Diabete Experimental ……………………………………………………………………………..
81
5.3. Ultraestrutura do Nervo Frênico …………………………………………………………………..
85
5.4.. Ultraestrutura no Diabete Crônico ………………………………………………………………..
89
5.5. Papel do Tratamento com Insulina na Ultraestrutura do Nervo Frênico no Diabético Crônico ….
92
6. RESUMO …………………………………………………………………………………………
95
7. ABSTRACT ………………………………………………………………………………………..
98
8. CONCLUSÃO ……………………………………………………………………………………
100
9. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS …………………………………………………………...
102
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Introdução ___________________________________________________________________________ 11
Tese de Doutorado Omar Andrade Rodrigues Filho
1.1.Nervo Frênico em humanos
O nervo frênico em humanos é o único suprimento motor do diafragma, contendo
também fibras sensitivas e autonômicas difusas. Ele surge principalmente do quarto nervo
cervical, podendo receber também contribuições do terceiro e do quinto nervos cervicais.
Formado na parte superior da margem lateral do músculo escaleno anterior, assume direção
caudal, quase verticalmente, posterior à fáscia paravertebral, na superfície anterior desse
músculo. Desce posterior ao músculo esternoclidomastóideo, ao ventre inferior do músculo
omo-hióideo (próximo ao seu tendão intermediário), à veia jugular interna, às artérias cervical
transversa e supraescapular e, no lado esquerdo, ao ducto torácico. Corre anterior à artéria e
posterior à veia subclávia, e entra no tórax, cruzando medialmente por sobre a artéria torácica
interna, após o qual desce anterior ao hilo pulmonar, entre o pericárdio fibroso e a pleura
mediastinal para o diafragma, acompanhado pelos vasos pericardicofrênicos. Os nervos
frênicos direito e esquerdo diferem em suas relações intratorácicas.
O nervo frênico direito, mais curto e mais vertical, está separado na raiz do
pescoço, da segunda parte da artéria subclávia direita, pelo músculo escaleno anterior. Situa-
se, em seguida, lateralmente à veia braquiocefálica direita, à veia cava superior e ao pericárdio
fibroso, que reveste a superfície direita do átrio direito e veia cava inferior.
O nervo frênico esquerdo, na raiz do pescoço, deixa a margem medial do músculo
escaleno anterior para passar anteriormente à primeira parte da artéria subclávia esquerda, e
posteriormente ao ducto torácico. Embora essa seja uma descrição geral, Quist (1977) afirma
que ambos os nervos frênicos direito e esquerdo são simétricos em seu curso cervical e que,
no curso torácico, o esquerdo atravessa anteriormente a segunda parte da artéria subclávia
esquerda, separado pelo músculo escaleno anterior. Depois disso, o nervo frênico esquerdo
Introdução ___________________________________________________________________________ 12
Tese de Doutorado Omar Andrade Rodrigues Filho
segue anterior à artéria torácica interna, descendo através da face medial do ápice do pulmão
esquerdo e sua pleura, para a primeira parte da artéria subclávia, a qual cruza obliquamente,
para alcançar um encaixe entre a artéria carótida comum esquerda e a artéria subclávia.
Ele segue, medialmente e em direção anterior, superficial ao nervo vago esquerdo,
superiormente ao arco aórtico e posterior à veia braquiocefálica esquerda. O nervo frênico
esquerdo então, passa superficial ao arco aórtico e à veia intercostal superior esquerda,
anterior ao hilo pulmonar esquerdo, para situar-se entre este e o pericárdio fibroso, que cobre
a superfície esquerda do ventrículo esquerdo, e a pleura mediastinal.
No pescoço, cada nervo recebe filamentos variáveis do gânglio simpático cervical
ou de seus ramos, podendo conectar-se com o plexo simpático torácico interno. Essas
conexões podem representar um desvio do curso das fibras simpáticas do nervo para esses
plexos. Em seu curso torácico, cada nervo frênico emite ramos sensitivos para a pleura
mediastinal, pericárdio fibroso e pericárdio seroso parietal.
Na sua porção terminal, o nervo frênico direito atravessa o tendão central do
diafragma, tanto posterior ao orifício da veia cava, como lateralmente a ele. O nervo frênico
esquerdo atravessa a parte muscular do diafragma anteriormente ao tendão central e lateral à
superfície cardíaca esquerda, estando um pouco mais anterior que o frênico direito. No
diafragma ou ligeiramente sobre ele, cada nervo frênico emite finos ramos para a pleura
parietal acima, e peritônio parietal inferiormente ao diafragma central. O tronco de cada nervo
então se divide à medida que atravessa o diafragma em três ramos comumente organizado
como segue, com algumas variações:
1. um ramo anterior (esternal) que corre anteromedialmente em direção ao
esterno, conectando-se com o mesmo ramo contralateral,
Introdução ___________________________________________________________________________ 13
Tese de Doutorado Omar Andrade Rodrigues Filho
2. um ramo anterolateral que corre lateralmente, para a folha lateral do tendão
central,
3. um ramo posterior curto que se divide em um ramo posterolateral, correndo
posterior à folha lateral, e um ramo posterior suprindo as fibras dos pilares do diafragma.
Estes ramos principais estão freqüentemente imersos na parede muscular do
diafragma ou localizados abaixo dele, suprindo as fibras motoras para o músculo
diafragmático e fibras sensoriais para o peritônio e pleura, relacionados à parte central do
diafragma. Esses ramos contêm, também, fibras sensitivas proprioceptivas da musculatura do
diafragma.
Na superfície inferior do diafragma, um ou dois ramos do nervo frênico conectam-
se com um gânglio pequeno (gânglio frênico), com ramos descendendo para o plexo celíaco e
distribuídos para os ligamentos falciforme e coronário do fígado, a veia cava inferior, o átrio
direito e, possivelmente, a vesícula biliar. No lado esquerdo, filamentos do nervo frênico
também se unem aos ramos do plexo celíaco, entretanto, sem haver nenhuma comunicação
ganglionar. Esses suprem a glândula supra-renal esquerda.
Fibras para o nervo frênico, provenientes do ramo ventral do quinto nervo
cervical, freqüentemente passam em um ramo do nervo para o subclávio, formando o nervo
frênico acessório. Esse se situa lateralmente ao nervo frênico principal e desce posterior, ou
algumas vezes anterior à veia subclávia. Esse nervo frênico acessório se junta geralmente ao
nervo principal, próximo à primeira costela, embora possa fazer próximo ao hilo pulmonar ou
inferiormente a ele. Um nervo frênico acessório pode derivar do quarto ou sexto ramos
cervicais ou da alça cervical. Esta descrição anatômica do nervo frênico de humanos foi
fundamentada pelas descrições de GRAY (1918); WILLIAMS et al. (1995); NETTER (1996);
GARDNER; GRAY; O’RAHILLY (1967).
Introdução ___________________________________________________________________________ 14
Tese de Doutorado Omar Andrade Rodrigues Filho
Figura 1: Origem, trajeto, distribuição e ramificação terminal dos nervos frênicos direito e esquerdo em
humanos, segundo NETTER (1996).
1.2. Nervo Frênico no rato
GREENE (1963) descreve a origem macroscópica do nervo frênico de ratos
Wistar como sendo um ramo medial do grupo profundo (muscular), com origem nos ramos
Introdução ___________________________________________________________________________ 15
Tese de Doutorado Omar Andrade Rodrigues Filho
ventrais do quarto e quinto nervos cervicais (Figura 2). Embora essa seja uma extensa
referência sobre anatomia normal dos ratos, a descrição do nervo frênico é muito limitada.
Figura 2: Ilustração do plexo cervical esquerdo do rato Wistar, segundo GREENE (1963).
Notar a origem do nervo frênico a partir dos ramos ventrais dos quarto e quinto nervos
espinais cervicais e seu curso descendente, cervical e torácico, até o músculo diafragma. A
seta vermelha indica o trajeto intra-torácico do nervo.
GOTTSCHAL E GRUBER (1977), confirmam a descrição da origem do nervo
frênico de ratos feita por GREENE (1963) e descrevem uma contribuição adicional para este
Introdução ___________________________________________________________________________ 16
Tese de Doutorado Omar Andrade Rodrigues Filho
nervo, o qual se denominou nervo frênico acessório. Este nervo deixa o plexo braquial ao
nível do sexto segmento cervical, relativamente distante lateralmente. Após percorrer uma
curta distância na mesma direção ao nervo para o tronco principal superior, o nervo frênico
acessório volta em direção à abertura torácica superior e se une ao nervo frênico do lado da
adventícia da grande veia subesternal, exatamente inferior ao nível da primeira costela.
SONG et al. (1999) descrevem o nervo frênico do rato como o mais importante
nervo periférico na manutenção da ventilação. Entretanto, alguma dúvida persistia sobre o
papel exclusivo do nervo frênico na inervação motora do diafragma, pois embora um
suprimento puramente do nervo frênico estivesse implícito na maioria dos achados sobre a
fisiologia diafragmática, uma contribuição dos nervos intercostais foi postulada para coelhos e
roedores (WILSON, 1968; HOWARTH E ROBINSON-RINTOUL, 1983, HOWARTH,
1984).
De acordo com as observações de GOTTSCHAL E GRUBER (1977) no rato, não
houve indicação de uma inervação motora adicional para o diafragma pelos nervos
intercostais.
Posteriormente, resultados de COMERFORD E FITZGERALD (1986)
confirmam o pensamento geral de que a inervação motora do diafragma no rato é
completamente promovida pelos nervos frênicos e que os feixes de fibras finas que entram no
plexo frênico na periferia do diafragma não apresentam nenhuma contribuição motora para o
diafragma.
Estudos do desenvolvimento do nervo frênico mostram que, no rato, as raízes
espinais do terceiro, quarto e quinto segmentos cervicais começam a formar o tronco do nervo
frênico aos 12 dias após a fecundação e crescem em direção as células pré-musculares do
diafragma aos 14 dias (NOAKES et al., 1983).
Introdução ___________________________________________________________________________ 17
Tese de Doutorado Omar Andrade Rodrigues Filho
Entretanto, a ramificação intramuscular do nervo frênico e a concomitante
formação dos miotubos diafragmáticos continuam em progresso até o 17º dia após a
fecundação, tempo no qual os padrões de amadurecimento da inervação e da arquitetura
muscular estão próximas. Este é também o início da transmissão da condução inspiratória
para os neurônios motores do frênico e a chegada dos aferentes do diafragma para o feixe dos
neurônios motores. Durante o período do 17º dia pós fecundação até o nascimento (período de
gestação de aproximadamente 21 dias), há uma mudança na morfologia dos neurônios
motores do nervo frênico com a reorganização da ramificação dendrítica dentro dos feixes
rostrocaudais, característicos da maturação dos neurônios motores. (GREER et al, 1999).
SONG et al. (1999), relatam que a formação dos fascículos do nervo frênico inicia
no 15º dia após a fecundação, enquanto as células de Schwann penetram o nervo no 17º dia. A
mielinização deste nervo tem início somente no dia do nascimento e a diferenciação do nervo
frênico está praticamente completa nesta época.
Estudos morfológicos de nervos no período neonatal e pós-natal imediato são
escassos, embora existam várias descrições morfológicas de nervos fetais. WOSNIAK et al.
(1982) estudaram o nervo frênico de fetos humanos em nível de microscopia eletrônica e
observaram que na 15ª semana pós-ovulatória a mielinização já estava em processo e que o
nervo frênico é composto por feixes de axônios circundados por neurolemócitos (células de
Schwann). Na 17ª semana pós-ovulatória o nervo frênico caracteriza-se por um aumento no
número de fibras mielínicas, com a formação de mielina compacta e pela formação de um
perineuro laminar. O nervo frênico na sua forma madura aparece na 23ª semana e uma grande
quantidade de fibras mielinizadas podem ser vistas neste período, embora fibras em várias
fases de mielinização foram evidenciadas. Estudos semelhantes ainda não foram realizados
em ratos.
Introdução ___________________________________________________________________________ 18
Tese de Doutorado Omar Andrade Rodrigues Filho
GOTTSCHAL (1981) descreve o núcleo motor do nervo frênico de ratos Wistar
nas porções caudais do segmento medular de C3 até as porções rostrais de C6, sendo a
maioria dos corpos neuronais (72%) localizados em C4. Neurônios sensitivos tiveram seus
corpos celulares presentes nos gânglios espinais de C3 a C6, sendo a maioria (68%)
localizados em C5. Relata ainda, que 71% das fibras mielínicas do nervo frênico são motoras
e que 29% das fibras são sensitivas.
LANGFORD E SCHMIDT (1983) examinaram o componente axonal do nervo
frênico de ratos e sua entrada em direção ao diafragma e concluíram que 43% dos axônios são
de origem sensorial. GOSHGARIAN E ROUBAL, (1986) observaram que os corpos celulares
dos neurônios sensoriais do nervo frênico no rato estão situados nos gânglios de C4 e C5
(88%).
Em ratos adultos, FRAHER (1992) descreve uma assimetria lateral do nervo
frênico de ratos adultos e relata ainda que este nervo é apropriado para este tipo de estudo por
não evidenciar no seu trajeto torácico comunicações ou ramos importantes contendo números
significantes de fibras mielinizadas. Este autor refere ainda que o número total de fibras
mielínicas do lado direito excede o lado esquerdo em 6%.
Estudos morfológicos e morfométricos, em nível de microscopia de luz, do nervo
frênico foram realizados por RODRIGUES FILHO & FAZAN (2006) para investigar a
presença de neuropatia desse nervo devido ao diabete experimental, induzido por
estreptozotocina (STZ). Os autores mostraram, em ratos controles, uma assimetria
significativa nos parâmetros de área e diâmetro fascicular, entre os segmentos proximal e
distal do nervo frênico esquerdo e que o número de fibras e a densidade das fibras mielínicas
não diferiram entre os segmentos e entre os lados. Mais ainda, os autores também
Introdução ___________________________________________________________________________ 19
Tese de Doutorado Omar Andrade Rodrigues Filho
demonstraram que as fibras mielínicas, principalmente as de grande calibre, são afetadas pelo
diabete crônico experimental.
JERONIMO et al. (2005) em um estudo de variação longitudinal e simetria lateral
utilizou nervos frênicos de ratos da linhagem Wistar, fêmeas, recém-desmamadas (30 dias de
vida), e não evidenciou diferenças morfológicas e morfométricas entre os segmentos
estudados.
Entretanto, em um estudo anterior, LUBINSKA & WARYSZEWSKA (1974)
sugere que a diferença seja de 15% e que o nervo frênico é longo, constante em sua
morfologia e relativamente protegido de traumas em decorrência da sua localização
intratorácica, contém um número significativo de fibras mielínicas e que esse número varia
muito pouco ao longo de seu percurso, sendo um bom modelo para estudos de regeneração
nervosa.
Apesar de um certo número de estudos morfológicos e, mais recentemente
morfométricos dos nervos frênicos em ratos, estudos em nível de microscopia eletrônica de
transmissão desses nervos são escassos na literatura e muitos parâmetros das fibras
amielínicas desses nervos ainda não são descritos em ratos.
1.3 Neuropatia e Diabete
A freqüência pela qual o sistema nervoso é acometido pelo diabete foi, sem
dúvida, o responsável pela idéia inicial de que o diabete era causado por uma doença do
sistema nervoso. Apenas em 1864, foi reconhecido que o contrário é verdadeiro (THOMAS &
ELIASSON, 1984). A partir de então, as características clínicas marcantes da neuropatia
diabética foram acuradamente delineadas, com descrições de perda dos reflexos tendinosos
Introdução ___________________________________________________________________________ 20
Tese de Doutorado Omar Andrade Rodrigues Filho
nos membros inferiores, semelhanças clínicas com alguns casos de tabes dorsalis, e a
ocorrência de dor espontânea, particularmente noturna, e parestesias. Manifestações motoras
nos membros inferiores foram também documentadas, bem como o envolvimento de nervos
cranianos. A natureza altamente variável da neuropatia no diabete foi então apreciada em
1893 (THOMAS & ELIASSON, 1984) e surgiram classificações para padronizar todos os
eventos nessa direção.
As décadas subseqüentes testemunharam avanços consideráveis nessa área, com a
definição de novas síndromes e um melhor entendimento da história natural dessa variedade
de neuropatia diabética. Na literatura sobre neuropatia diabética, uma distinção entre
neuropatia “periférica” e “autonômica” tem sido feita, sem o reconhecimento de que a palavra
“periférica” se refere ao sistema nervoso periférico e não à distribuição da neuropatia. O
sistema nervoso periférico apresenta ambos os componentes: somático e autonômico.
Alterações no sistema nervoso periférico em animais geneticamente diabéticos, ou
com diabete induzido experimentalmente, tem sido amplamente investigadas. Achados de
interesse e relativa importância tem sido obtidos, porém, alterações morfológicas comparáveis
àquelas que ocorrem na neuropatia diabética humana não tem sido reproduzidas (SHARMA
& THOMAS, 1999). A relevância dos achados em animais continua incerta. Por outro lado,
espera-se que as alterações encontradas em modelos animais possam reproduzir algumas das
alterações da neuropatia diabética humana precoce, levando a esclarecimentos sobre o
mecanismo da doença (SHARMA & THOMAS, 1999).
O diabetes mellitus é descrito como prevalente em 1 % a 4 % da população. As
duas desordens principais são o diabete tipo I ou insulino-dependente (uma condição na qual
as células beta do pâncreas não produzem ou produzem muito pouco insulina) e o diabete tipo
Introdução ___________________________________________________________________________ 21
Tese de Doutorado Omar Andrade Rodrigues Filho
II ou não insulino-dependente (uma condição na qual existe uma deficiência das células beta
ou uma resistência periférica à insulina) (DYCK & GIANNINI, 1996).
As complicações do diabetes mellitus podem ser classificadas naquelas
decorrentes de aterosclerose (cardiovascular, cérebrovascular e vascular periférica) a nas
decorrentes de outros mecanismos (DYCK & GIANNINI, 1996). A retinopatia, a nefropatia e
a polineuropatia (“triopatia” diabética), ocorrem nos dois tipos de diabete. A hiperglicemia
crônica, associada às alterações metabólicas, e as alterações microvasculares parecem estar
implicadas na patogênese da triopatia diabética (DYCK & GIANNINI, 1996).
Existem, pelo menos, quatro razões porque estudar as alterações patológicas na
neuropatia diabética (DYCK & GIANNINI, 1996):
1) para caracterizar as alterações patológicas intersticiais do nervo, que não podem
ser inferidas por estudos clínicos ou eletrofisiológicos;
2) para inferir mecanismos ou causas;
3) para correlacionar anormalidades morfométricas com mudanças na velocidade
de condução nervosa, testes sensoriais quantitativos e testes quantitativos de anormalidades
autonômicas;
4) para correlacionar achados neuropatológicos com as alterações metabólicas.
Comumente, a neuropatia diabética se apresenta como uma neuropatia
sensoriomotora distal, bilateral e simétrica, com distribuição em bota e luva (Vinik &
Mehrabyan, 2004). Entretanto, existem muitas outras variedades de lesões em pacientes
diabéticos, incluindo neuropatias focais decorrentes de compressão ou alterações vasculares
em um fascículo nervoso. Neuropatias focais usualmente afetam nervos isolados, geralmente
os pares cranianos III, IV, VI e VII bem como os nervos, mediano, ulnar, fibular, plantar
medial e frênico (Vinik e cols., 2004). Existem casos documentados de desmielinização de
Introdução ___________________________________________________________________________ 22
Tese de Doutorado Omar Andrade Rodrigues Filho
fibras originárias de neurônios cervicais dos níveis C3-C5, os quais inervam o diafragma,
causando completa ou parcial paralisia diafragmática (De Carvalho e cols., 1996). A
“neuropatia frênica” tem sido cada vez mais reconhecida dentre as neuropatias periféricas
(Fisher e cols., 1997) e tanto paralisias isoladas do nervo frênico, em decorrência de
mononeuropatia diabética (Tang e cols., 2003), quanto paralisia bilateral do diafragma (Fisher
e cols., 1997; Tang e cols., 2003) em pacientes diabéticos já foram descritas na literatura.
Entretanto, dos casos descritos, a análise morfológica do nervo frênico foi realizada somente
por Tang e cols. (2003), que demonstrou perda de fibras mielínicas em um dos fascículos
analisados. Esse estudo foi realizado somente em nível de microscopia de luz e os autores
afirmam que a patologia da mononeuropatia diabética do nervo frênico ainda não está bem
compreendida. Assim, existe uma necessidade de se investigar melhor os aspectos
morfológicos e morfométricos do nervo frênico em pacientes diabéticos. Por outro lado,
sabendo das dificuldades com o estudo de material humano, principalmente no caso do nervo
frênico, que pode dificilmente ser biopsiado sem deixar seqüelas, a proposta de se realizar um
estudo experimental parece ser promissora, uma vez que animais podem ser utilizados como
modelos de doenças humanas.
1.4 Diabete Experimental
Grande número de agentes químicos é citotóxico para as células beta do pâncreas,
porém, apenas o aloxane e a estreptozotocina (STZ) têm sido sistematicamente investigados e
são amplamente empregados para induzir diabete nos animais. Aloxane é uma pirimidina com
estrutura semelhante ao ácido úrico e a glicose. Em 1943 a propriedade diabetogênica do
aloxane foi descoberta e o diabete foi induzido com sucesso em coelhos (BAILEY &
Introdução ___________________________________________________________________________ 23
Tese de Doutorado Omar Andrade Rodrigues Filho
BAILEY, 1943), ratos (DUNN & MCLETCHI, 1943; GOMORI & GOLDNER, 1943) e cães
(LUKENS, 1948). Diabete aloxânico foi induzido em outras espécies animais, incluindo
gatos, ovelhas, macacos, porcos e camundongos (LAZAROW, 1947; LUKENS, 1948),
porém, cobaias se mostraram completamente resistentes (JOHNSON, 1950). Durante décadas
subseqüentes, a literatura sobre o aloxane como agente diabetogênico tornou-se ampla e
extensivamente revisada (LAZAROW, 1949; MORDES & ROSSINI, 1981; RERUP, 1970).
A estreptozotocina (STZ), isolada do Streptomyces achromogenes é efetivo contra
organismos gram-positivos e gram-negativos e sua ação anti-tumoral foi descrita por EVANS
e colaboradores (1965). RAKIETEN e colaboradores em 1963 relataram que a injeção
intravenosa de soluções de STZ induzia diabete em ratos e cães. Desde então, o diabete
passou a ser induzido com sucesso em ratos (EVANS e cols., 1965; JUNNOD e cols., 1967;
FAZAN JR e cols., 1997; SALGADO e cols., 2001; RODRIGUES FILHO & FAZAN, 2005;
FAZAN e cols., 2006), cobaias (BROSKY & LOGOTHETOPHOULOS, 1969),
camundongos (BROSKY & LOGOTHETOPHOULOS, 1969; EVANS e cols., 1965),
macacos (PITKIN & REYNOLDS, 1969), e cães (RAKIETEN e cols., 1963). Coelhos se
mostraram resistentes à ação diabetogênica da STZ (KUSHNER e cols., 1969).
Os mecanismos de ação do aloxane e da STZ não são ainda completamente
compreendidos (MALAISSE, 1982; MORDES & ROSSINI, 1981), porém, algumas
características gerais podem ser aferidas. O local de sua ação diabetogênica é a célula beta do
pâncreas, sendo a ligação dessas substâncias muito rápida. A STZ destrói seletivamente as
células beta do pâncreas, causando fragmentação do DNA (YAMAMOTO, 1997). Ambos,
aloxane e STZ podem ser seletivamente direcionados para as células produtoras de insulina
devido à especial capacidade dessas células em reconhecer e metabolizar glicose rapidamente.
Estruturalmente, aloxane é similar à glicose e a STZ é uma molécula de glicose com uma
Introdução ___________________________________________________________________________ 24
Tese de Doutorado Omar Andrade Rodrigues Filho
cadeia lateral altamente reativa. Parece então razoável que, alguns açúcares transportáveis,
interfiram com a toxicidade de ambos agentes. Glicose e manose, mas não a frutose ou a
galactose, bem como outros nutrientes, protegem contra o dano induzido pelo aloxane, mas,
análogos da glicose, capazes de proteger contra a STZ diferem significativamente daqueles
efetivos contra o aloxane (SHARMA & THOMAS, 1999). Ácido nicotínico tem sido descrito
como eficiente em suprimir a atividade diabetogênica do aloxane, embora ele seja ineficaz
contra a STZ. A nicotinamida mantém atividade protetora considerável quando injetada entre
30 minutos até 2 horas após a injeção de STZ, mas essa ação pós-aloxane não foi observada.
Evidências de danos pelo aloxane aparecem 2 a 5 minutos e danos estruturais irreversíveis são
observados após 1 hora da administração. Evidências de danos pela STZ aparecem entre 30
minutos e 2 horas (SHARMA & THOMAS, 1999). Em geral, a STZ é mais eficaz e mais
específica para as células beta do pâncreas que o aloxane (RAKIETEN e cols., 1963).
As alterações metabólicas que seguem a administração da STZ ou aloxane foram
comparadas por MANSFORD & OPIE (1968) que relataram que os animais injetados com
STZ, apesar de apresentarem pronunciada hiperglicemia, apresentam níveis normais de
corpos cetônicos sangüíneo, ácidos graxos livres plasmáticos e níveis normais de
intermediários glicolíticos, glicogênio e citrato no coração perfundido. Nos animais injetados
com aloxane, todos esses parâmetros se apresentaram aumentados quando comparados aos
controles. JUNNOD e cols., (1969) estenderam e confirmaram essas observações e também
demonstraram que a cetonúria só aparece após a injeção de uma alta dose de STZ. Entretanto,
VELEMINSKY e cols., (1970) não encontraram diferenças qualitativas na glicose plasmática,
ácidos graxos livres e triglicérides após a administração de aloxane e STZ, sugerindo que
esses efeitos metabólicos seriam decorrentes primariamente da destruição das células beta do
pâncreas e não de um efeito tóxico extra-pancreático.
Introdução ___________________________________________________________________________ 25
Tese de Doutorado Omar Andrade Rodrigues Filho
Aloxane e STZ têm sido de grande interesse porque eles mimetizam a lesão
pancreática decorrente da destruição das células beta, que ocorre no diabete insulino-
dependente dos humanos. Mais ainda, esses agentes químicos causam um diabete
relativamente permanente, útil para estudos eletrofisiológicos e morfológicos longitudinais de
nervos periféricos no diabete experimental. A dose diabetogênica efetiva do aloxane ou da
STZ é normalmente 4 ou 5 vezes menor que a dose letal. Entretanto, as doses efetivas ou
letais do aloxane ou da STZ variam consideravelmente entre as espécies e são altamente
sensíveis à idade, sexo e estado nutricional dos animais (GOLD e cols., 1981). Uma injeção
única, intraperitoneal ou intravenosa de aloxane ou STZ, preferencialmente com os animais
em jejum, induz diabete experimental em ratos, que pode ser mantida sem tratamento com
insulina por um ou dois anos (POWEL e cols., 1977; SHARMA & THOMAS, 1974; ZEMP e
cols., 1981).
Embora estudos morfológicos tenham sido realizados em vários nervos periféricos
de ratos diabéticos induzidos com STZ, tais como sural (SHARMA e cols., 1985; SHARMA
& THOMAS; 1974; SUGIMURA e cols., 1980), fibular (JAKOBSEN, 1979), tibial
(BROWN e cols., 1980; SHARMA e cols., 1981; SHARMA & THOMAS, 1974), frênico
(RODRIGUES FILHO & FAZAN, 2006) e nervo depressor aórtico (SALGADO e cols.,
2001; FAZAN e cols., 2006) informações sobre alterações morfométricas das fibras
amielínicas nesse modelo de diabete experimental são escassas.
Introdução ___________________________________________________________________________ 26
Tese de Doutorado Omar Andrade Rodrigues Filho
1.5 Tratamento com Insulina
A literatura documenta, amplamente, que em alguns casos é possível prevenir, ou
até mesmo, reverter as alterações metabólicas e morfológicas provocadas pelo diabete, com o
tratamento insulínico.
Jakobsen em 1979 demonstrou que é possível corrigir a redução do calibre das
fibras mielínicas observada em ratos diabéticos induzidos pela STZ, comparado com
controles da mesma idade. Avanços no conhecimento dos sistemas liberadores de insulina
renovaram o interesse na possibilidade da prevenção de anormalidades morfológicas em
nervos periféricos no diabete experimental. Foi demonstrado que uma injeção diária de
insulina subcutânea por dois meses normalizou o peso corporal e melhorou o crescimento de
ratos diabéticos induzidos com STZ, mas não corrigiu o déficit no tamanho das fibras
(SHARMA e cols., 1985). Subseqüentemente, foi demonstrado que o tratamento
convencional, por 16 semanas, corrigiu a área axonal, embora a área total da fibra não tenha
sido normalizada, sugerindo a possibilidade de que a célula de Schwann responda mais
lentamente ao tratamento com insulina (OCHODNICKA e cols., 1995).
Posteriormente foi demonstrado que o tratamento contínuo, por 8 semanas, com
infusão de insulina subcutânea, corrigiu completamente o peso corporal, o crescimento do
animal e o tamanho da fibra (McCALLUM e cols.,1986). Entretanto, um número aumentado
de figuras de degeneração Walleriana foi encontrado em ratos diabéticos, induzidos com
aloxane ou STZ, tratados com insulina, em comparação com os diabéticos não tratados ou
com animais controles (SHARMA e cols., 1985; WESTFALL e cols., 1983). Esse achado foi
mais evidente em animais que sofreram o tratamento convencional que aqueles que receberam
Introdução ___________________________________________________________________________ 27
Tese de Doutorado Omar Andrade Rodrigues Filho
infusão subcutânea contínua de insulina (McCALLUM e cols., 1986; WESTFALL e cols.,
1983).
Recentemente, Rodrigues Filho e Fazan (2006) demonstraram redução do
diâmetro axonal do nervo frênico de ratos diabéticos crônicos induzidos pela STZ, com
redução significativa da razão G das fibras mielínicas nesses animais. O tratamento
convencional desses animais, com uma dose diária, subcutânea, de insulina, foi capaz de
prevenir e/ou reverter essas alterações, sendo que os autores não observaram aumento no
número de figuras de degeneração Walleriana, como sugerido por Sharma e cols. (1985) e
Westfall e cols. (1983). Entretanto, um estudo ultraestrutural desse nervo não foi realizado,
para que se possa investigar o papel da neuropatia diabética nas fibras amielínicas do nervo
frênico, bem como o efeito do tratamento com insulina nessas fibras.
Diante da falta de investigações morfométricas e ultraestruturais da neuropatia
diabética causada pela STZ, das condições favoráveis de investigação oferecidas pelo nervo
frênico e da raridade de investigações morfológicas ultraestruturais desse nervo, tanto em
condições normais quanto em modelos experimentais de doenças, nossa proposta é de estudar
morfológica e morfometricamente, em nível de microscopia eletrônica de transmissão, o
nervo frênico no modelo de diabete crônico induzido pela STZ e os efeitos do tratamento com
insulina nas fibras amielínicas desse nervo.
O
O
B
B
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J
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V
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S
Objetivos ____________________________________________________________________________ 29
Tese de Doutorado Omar Andrade Rodrigues Filho
Diante do exposto, os objetivos do presente trabalho são:
1. Investigar os aspectos morfológicos e morfométricos das fibras amielínicas do
nervo frênico de ratos Wistar machos, comparando segmentos proximal e
distal dos mesmos nervos, bem como lados direito e esquerdo dos mesmos
animais;
2. Investigar a ocorrência de alterações dos aspectos morfológicos e
morfométricos das fibras amielínicas no nervo frênico de ratos Wistar machos,
decorrentes do diabete crônico, induzido experimentalmente.
3. Investigar o papel do tratamento com insulina, nas eventuais alterações
observadas nos aspectos morfológicos e morfométricos das fibras amielínicas,
no nervo frênico de ratos Wistar machos, decorrentes do diabete crônico,
induzido experimentalmente.
M
M
A
A
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Material e Métodos ______________________________________________________________________ 31
Tese de Doutorado Omar Andrade Rodrigues Filho
3.1. Animais
Foram utilizados ratos albinos da linhagem Wistar, machos, provenientes do
Biotério Central da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo.
Os animais foram mantidos aos trios em gaiolas plásticas grandes (34 x 42 x 37 cm), em
ambiente com ventilação forçada, com temperatura controlada entre 21 e 23
o
C, umidade
relativa do ar entre 40 e 70% e ciclo claro/escuro de 12 horas, com início do ciclo às 7:00
horas. Até o dia do experimento os animais tiveram livre acesso à água e a ração padrão para
pequenos roedores (Nuvilab CR1-Nuvital®). A composição da ração encontra-se em anexo.
Todos os procedimentos experimentais foram realizados de acordo com as Normas Éticas
para experimentação em Animais de Laboratório, aprovadas pela Congregação da Faculdade
de Medicina de Ribeirão Preto, em sua 667
a
reunião ordinária. Todos os esforços foram
realizados no sentido de reduzir o número de animais utilizados.
3.2. Grupos experimentais
Grupo I: Animais com 12 semanas de indução do diabete pela STZ, sem
tratamento com insulina. Neste grupo foram utilizados 6 ratos.
Grupo II: Animais com 12 semanas de indução do diabete pela STZ que
receberam tratamento com insulina. Neste grupo foram utilizados 5
ratos.
Grupo III: Animais controles dos grupos I e II. Neste grupo foram utilizados 4
ratos.
Material e Métodos ______________________________________________________________________ 32
Tese de Doutorado Omar Andrade Rodrigues Filho
3.3. Indução do diabete
Após 8 a 12 horas de jejum alimentar, os animais, com peso corporal entre 185 e
210 g, foram anestesiados com éter etílico e receberam STZ (40 a 60 mg/Kg), em dose única,
intravenosa, utilizando a veia peniana. Após a indução do diabete, foram tomados cuidados
especiais com a higiene dos animais, em decorrência da grande diurese e da diarréia
desenvolvida pelos mesmos. A efetividade da indução do diabete foi atestada pelo excessivo
consumo diário de água e aumento no volume urinário dos animais e confirmada pela
determinação da glicemia no 3º dia após a injeção da STZ e no dia do experimento, pelo
analisador de glicose Beckman, Glucose Analyser 2. Apenas os animais com níveis
glicêmicos acima de 300 mg/dl foram utilizados no presente estudo.
Os animais controles receberam, endovenosamente, o mesmo volume do veículo
utilizado para a diluição da STZ (tampão citrato, 0,05M, pH 4,5), após equivalente período de
jejum alimentar.
3.4. Tratamento com insulina
Os animais que apresentaram glicemia superior a 350 mg/dl, evidenciada no 3
o
dia
após a injeção da STZ receberam, durante 12 semanas, por via subcutânea na região dorsal do
pescoço, 9 unidades internacionais (UI) por Kg de peso corporal, de insulina NPH (mista
altamente purificada- Biolin U-100 Biobrás), ao anoitecer, período no qual os animais
começam a se alimentar. A cada 3 dias, os animais eram pesados, e se necessário era realizado
o ajuste da dose de insulina.
Material e Métodos ______________________________________________________________________ 33
Tese de Doutorado Omar Andrade Rodrigues Filho
3.5. Procedimentos histológicos
Após 12 semanas da indução do diabete, os animais foram pesados e depois
anestesiados com pentobarbital sódico (Nembutal, Abott, AS) por via intraperitoneal, na dose
de 40 mg/Kg. Foi realizada uma ampla incisão abdominal para secção do diafragma junto a
sua origem esternocostal. A cavidade torácica foi exposta após secção lateral das costelas e o
ventrículo cardíaco esquerdo puncionado, concomitantemente à secção do átrio direito. Os
animais foram perfundidos sistemicamente, com auxílio de bomba peristáltica (Figura 3).
Mostrar área de trabalho.scf
Figura 3: Foto ilustrativa da bomba de perfusão, instrumental cirúrgico e posicionamento do
animal anestesiado para o início da perfusão cardíaca.
Material e Métodos ______________________________________________________________________ 34
Tese de Doutorado Omar Andrade Rodrigues Filho
O leito vascular foi lavado com salina tamponada (PBS 0,05 M, pH 7,4) e, a
seguir, com a solução fixadora. Esta última foi composta de glutaraldeído a 2,5% em tampão
cacodilato de sódio 0,1 M, pH 7,2. A perfusão de ambas as soluções foi realizada na
proporção de 1 mL de solução para cada 1 g de peso corporal do animal. Concluída a
perfusão, os nervos frênicos direito e esquerdo foram cuidadosamente dissecados, desde sua
origem cervical, até a entrada no diafragma, e retirados em bloco (Figura 4).
Figura 4: Dissecação dos nervos frênicos (setas) desde sua origem cervical até o seu
desaparecimento no nível do diafragma. A: Nervo frênico direito reparado por uma pinça. B:
Nervo frênico esquerdo dissecado como em A. O coração apresenta-se deslocado para a direita.
Em seguida, os nervos foram esticados sobre uma tira de papel filtro para evitar
retração e manter a posição de orientação, nas suas porções proximais e distais. A seguir, os
nervos foram colocados em frascos acrílicos transparentes e mantidos em imersão na mesma
solução fixadora utilizada na perfusão, por pelo menos 12 horas, a 4
o
C.
Para o início da inclusão, os nervos foram identificados com números, dissecados
para a secção das extremidades proximais e distais, as quais foram lavadas em tampão
Material e Métodos ______________________________________________________________________ 35
Tese de Doutorado Omar Andrade Rodrigues Filho
cacodilato de sódio 0,1 M, pH 7,2, durante 1 hora. O restante do nervo foi estocado como
material reserva, na mesma solução tampão e armazenado a 4
o
C.
Os segmentos proximal e distal dos nervos frênicos foram pós fixados em solução
composta de tetróxido de ósmio (OsO
4
) aquoso a 4 %, tampão cacodilato de sódio 0,2 M, pH
7,2 e ferrocianeto de potássio aquoso (K
4
Fe(CN)
6
.3H
2
O) a 6 %, na proporção 1:2:1, durante 2
horas, em temperatura ambiente, em agitação orbital contínua.
Novamente lavados, por 3 vezes de 20 minutos, com tampão cacodilato 0,1 M,
também em agitação, os segmentos foram desidratados em concentrações crescentes de etanol
(25, 35, 50, 70, 75, 80, 95 %) por 5 minutos cada e duas vezes em etanol absoluto. Após a
desidratação, os fragmentos foram infiltrados em duas misturas de resina e etanol absoluto,
durante duas horas cada. A primeira, mistura de resina epóxi EMBed 812® (Electron
Microscopy Sciences) e etanol absoluto foi preparada na proporção 1:2 e a segunda mistura
na proporção inversa. Ao final dessas últimas 2 horas os fragmentos foram infiltrados em
resina plena e mantidos por 18 horas em temperatura ambiente, e agitação contínua.
Passado o período de infiltração, os segmentos proximais e distais foram
colocados em moldes de silicone (Figura 5) previamente identificados e preenchidos com
nova resina, orientados com auxílio de lupa estereoscópica e levados à estufa a 60
o
C, por 72
horas, para polimerização da resina. Depois de polimerizados, os blocos foram removidos dos
moldes, trimados com lâminas descartáveis e levados para microtomia (Figura 6).
Material e Métodos ______________________________________________________________________ 36
Tese de Doutorado Omar Andrade Rodrigues Filho
Figura 5: Moldes de silicone utilizados na confecção dos blocos de resina, onde são incluídos
os fragmentos de nervo.
Figura 6: A: Blocos com os nervos incluídos em resina, identificados através de números. B:
Blocos trimados manualmente e prontos para a microtomia.
Os nervos tiveram secções transversais semifinas (0,2 a 0,3 µm de espessura)
obtidas com navalhas de vidro em um ultramicrótomo MT 6000 - XL (RMC Inc.) (Figura 7),
transferidas para lâminas de vidro com uma gota de água destilada, secadas em platina
aquecida a 60
o
C e coradas com azul de toluidina a 1 % em ácido bórico saturado. Tais
A
B
Material e Métodos ______________________________________________________________________ 37
Tese de Doutorado Omar Andrade Rodrigues Filho
secções foram utilizadas para estudos de microscopia de luz, realizados anteriormente
(Rodrigues Filho e Fazan, 2006) e para verificar a qualidade do material para realização de
cortes ultra-finos (Figura 8).
Após a seleção dos nervos em nível de microscopia de luz, os blocos foram
trimados novamente, sob lupa estereoscópica, para remoção do excesso de resina ao redor do
material. Em seguida, os nervos tiveram secções transversais ultra-finas (40 nm de espessura)
obtidas com navalhas de diamante (Ultra 45 º, Diatome) em um ultramicrótomo MT 6000-
XL (RMC Inc.) (Figura 9).
Figura 7: Ultra-micrótomo MT 6000- XL (RMC Inc.), utilizado na obtenção dos cortes
semifinos e ultrafinos utilizados na análise morfológica e morfométrica dos nervos frênicos do
presente estudo.
Material e Métodos ______________________________________________________________________ 38
Tese de Doutorado Omar Andrade Rodrigues Filho
Figura 8: Lâminas de vidro com cortes semifinos dos nervos frênicos, corados com azul de
toluidina a 1%, utilizados na seleção dos nervos em nível de microscopia de luz.
Novamente lavados, por 3 vezes de 20 minutos, com tampão cacodilato 0,1 M,
também em agitação, os segmentos foram desidratados em concentrações crescentes de etanol
(25, 35, 50, 70, 75, 80, 95 %) por 5 minutos cada e duas vezes em etanol absoluto. Após a
desidratação, os fragmentos foram infiltrados em duas misturas de resina e etanol absoluto,
durante duas horas cada. A primeira, mistura de resina epóxi EMBed 812® (Electron
Microscopy Sciences) e etanol absoluto foi preparada na proporção 1:2 e a segunda mistura
na proporção inversa. Ao final dessas últimas 2 horas os fragmentos foram infiltrados em
resina plena e mantidos por 18 horas em temperatura ambiente, e agitação contínua.
Passado o período de infiltração, os segmentos proximais e distais foram
colocados em moldes de silicone (Figura 5) previamente identificados e preenchidos com
nova resina, orientados com auxílio de lupa estereoscópica e levados à estufa a 60
o
C, por 72
horas, para polimerização da resina. Depois de polimerizados, os blocos foram removidos dos
moldes, trimados com lâminas descartáveis e levados para microtomia (Figura 6).
Material e Métodos ______________________________________________________________________ 39
Tese de Doutorado Omar Andrade Rodrigues Filho
Figura 9: Navalhas de diamante Ultra 45 º, Diatome, utilizada na realização dos cortes
ultrafinos utilizados no presente estudo.
Tais secções foram transferidas para grades de cobre (DOT 2x1 mm slot, Electron
Microscopy Sciences Inc.), cobertas com uma película de Formvar a 0,5% (Formvar Solution
in Ethylene Dichloride, Electron Microscopy Sciences, Inc., 30 – 50 nm de espessura) e
contrastadas com acetato de uranila 5% aquosa por 11 minutos e citrato de chumbo por 6
minutos.
3.6. Análise morfológica e morfométrica
Inicialmente, as secções transversais semifinas dos segmentos proximais e distais,
dos nervos retirados, foram observadas num fotomicroscópio Axioimager M1 (Carl Zeiss)
usando as objetivas 40 e/ou 100 vezes, com imersão em óleo. Quando necessário, lentes
auxiliares (optovar de 1,25 ou 1,6 vezes) foram utilizadas para proporcionar um ganho na
ampliação das imagens. As imagens dos fascículos nervosos foram digitalizadas através de
uma câmera de alta resolução Axiocam MR5 (Carl Zeiss) para um microcomputador
(IBM/PC – AT Pentium
III) onde foram armazenadas no disco rígido para posterior
Material e Métodos ______________________________________________________________________ 40
Tese de Doutorado Omar Andrade Rodrigues Filho
análise.Tais imagens foram utilizadas para a para a verificação da qualidade dos nervos a
serem processados para a análise em nível de microscopia eletrônica de transmissão. Quando
necessário, os nervos que apresentavam artefatos de processamento, foram submetidos ao
aprofundamento do bloco e re-corte. Após a confirmação da qualidade ideal das imagens para
realização da morfometria, secções ultrafinas foram obtidas, como descrito acima, e as
mesmas foram observados em um microscópio eletrônico de transmissão (JEM-1230, JEOL
Ltda.) (Figura 10), acoplado a uma câmera digital de alta resolução (Gatan UltraScan 1000 2k
x 2k CCD, Gatan Inc.).
Figura 10: Microscópio eletrônico de transmissão (JEM-1230, JEOL Ltda.) acoplado a uma
câmera digital de alta resolução (Gatan UltraScan 1000 2k x 2k CCD, Gatan Inc.), utilizados no
presente estudo.
Material e Métodos ______________________________________________________________________ 41
Tese de Doutorado Omar Andrade Rodrigues Filho
Neste trabalho foi estudado 100 % da área fascicular, não tendo sido realizada
morfometria amostral. O aumento final das imagens fotografadas e utilizadas na morfometria
foi padronizado para 2000 vezes. Assim, campos adjacentes da área endoneural dos fascículos
foram obtidos manualmente, com o cuidado de não haver sobreposição dos campos
microscópios. Cada campo microscópico deu origem a uma imagem de 14,39 µm de largura
por 14,39 µm de altura, com 2048 x 2048 pixels no formato “Indexed Colour”, arquivadas no
formato DM3 (“Digital Micrograph 3”, 8 bits, com tamanho de 16 mega Bytes ), com
calibração automática indicada pelo microscópio eletrônico, gerando uma barra de escala de 1
µm em cada imagem. Após o término do processo de fotografia de cada nervo, as imagens no
formato DM3 foram convertidas para o formato TIFF (“Tagged Image File Format”, 8 bits,
com tamanho de 4 mega Bytes), através do programa computacional Digital Micrograph
(Gatan Inc.), para que pudessem ser identificadas por qualquer programa de análise de
imagens, incluindo o utilizado o presente estudo. As imagens obtidas geraram entre 10 e 23
campos (dependendo do tamanho do fascículo) que, montados seqüencialmente da forma
como foram obtidos, geram a imagem da secção transversal do fascículo correspondente.
Para o processamento das imagens, o programa KS 400, versão 2.0, foi
programado para obter as variáveis desejadas para análise em questão. A área e o diâmetro
mínimo de cada fibra amielínica foram obtidos circundando manualmente a superfície externa
do axônio, identificado visualmente. Ao término do processo, o programa elaborou uma lista
das fibras medidas e dos valores correspondentes para cada parâmetro. Em seguida, as fibras
amielínicas que não puderam ser medidas, pois tocavam as margens dos campos
microscópicos, foram contadas, excetuando as que cortavam as laterais superior e direita de
cada campo, evitando a contagem duplicada de fibras. Ao término desse processo de
contagem, o programa permitiu a medida de uma área qualquer, que devesse ser descontada
Material e Métodos ______________________________________________________________________ 42
Tese de Doutorado Omar Andrade Rodrigues Filho
da área total do nervo (área de desconto), como por exemplo, uma área externa ao perineuro
do fascículo, caso houvesse na imagem (Figura 11). A soma dos valores de área de cada
campo microscópico, subtraídas as áreas de desconto, gerou o valor da área total do
endoneuro. Finalmente, com o número total de fibras e da área do endoneuro, obtivemos a
densidade das fibras amielínicas (fibras / mm
2
).
Os resultados dessas medidas geraram planilhas eletrônicas utilizadas para a
modelagem de representações gráficas e na análise estatística dos dados. A porcentagem da
área fascicular total ocupada pelas fibras amielínicas foi calculada manualmente a partir
dessas planilhas. Histogramas de distribuição de tamanho das fibras amielínicas foram
construídos com intervalos de classe de 0,1 µm. Esses histogramas foram construídos com
auxílio do aplicativo Sigma Plot, versão 8.0 (SPSS inc.).
Figura 11: Exemplo de imagem com uma área externa ao perineuro do fascículo, considerada
“área de desconto” para a realização da morfometria. As setas indicam o limite interno do
perineuro.
Material e Métodos ______________________________________________________________________ 43
Tese de Doutorado Omar Andrade Rodrigues Filho
3.7. Análise estatística
O teste de Kolmogorov-Smirnov foi aplicado para testar a normalidade da
distribuição dos dados obtidos (ponderais, bioquímicos e morfométricos) através do aplicativo
Sigma Stat, versão 3.01 (Jandel Scientific). Em seguida a equivalência das variâncias foi
testada automaticamente, através do teste de medianas de Levene, por esse mesmo programa,
antes de prosseguir com o teste desejado.
Na análise dos dados ponderais e bioquímicos (peso corporal e glicemia), todos os
parâmetros analisados apresentaram uma distribuição normal. Assim, os valores médios entre
os grupos foram comparados através de uma análise de variância para fator único (one way
ANOVA), seguida de um pós-teste de Holm-Sidak.
Para a análise dos dados morfométricos, os parâmetros que passaram no teste de
normalidade e no teste de equivalência das variâncias, tiveram seus valores médios
comparados pelo teste t de Student, pareado (entre os segmentos proximal e distal) ou não
pareado (entre os lados direito e esquerdo).
Os parâmetros morfométricos que não apresentaram distribuição normal ou os que
apresentaram distribuição normal, mas não passaram no teste de equivalência das variâncias,
foram comparados entre os segmentos proximal e distal, através do teste não paramétrico de
Wilcoxon e, entre os lados direito e esquerdo, através do teste não paramétrico de Mann-
Whitney.
Para a comparação dos valores médios entre os diferentes grupos, foi realizada
análise de variância para fator único (one Way ANOVA), seguida de um pós-teste de Holm-
Sidak. Quando os parâmetros morfométricos não apresentavam distribuição normal, foi
utilizada uma análise de variância on Ranks, seguida de um pós-teste de Dunn.
Material e Métodos ______________________________________________________________________ 44
Tese de Doutorado Omar Andrade Rodrigues Filho
Os histogramas de distribuição do tamanho das fibras amielínicas, foram
comparados entre os segmentos, entre os lados e entre os grupos, através de uma análise de
variância para fator único (one Way ANOVA), on Ranks, uma vez que todos os dados não
apresentaram uma distribuição normal, quando testados através do teste de Kolmogorov-
Smirnov.
Diferenças foram consideradas significativas quando p < 0,05.
R
R
E
E
S
S
U
U
L
L
T
T
A
A
D
D
O
O
S
S
Resultados ______________________________________________________________________________ 46
Tese de Doutorado Omar Andrade Rodrigues Filho
4.1. Dados ponderais e bioquímicos
4.1.1 Grupo controle
O peso corporal dos ratos do grupo controle variou de 185 g a 210 g, com média
de 198 ± 7 g, no início do experimento. Ao final das 12 semanas o peso corporal variou de
530 g a 563 g com média de 544 ± 7 g. As glicemias dos ratos do grupo controle, no 3º dia
após a injeção do veículo, variaram de 102 g/dl a 124 g/dl com média de 115 ± 5 g/dl. Ao
final das 12 semanas, as glicemias variaram de 100 g/dl a 117 g/dl com média de 108 ± 4 g/dl.
Foi observada diferença significativa quando comparamos os pesos corporais dos
ratos do grupo controle, no início do experimento e na 12ª semana. Não observamos
diferenças significativas quando comparamos as glicemias dos ratos do grupo controle, no 3º
dia e na 12ª semana do experimento.
4.1.2 Grupo diabético crônico
O peso corporal dos ratos diabéticos crônicos variou de 189 g a 200 g, com média
de 197 ± 7 g, no início do experimento. Ao final das 12 semanas o peso corporal variou de
162 g a 340 g, com média de 234 ± 32 g. As glicemias dos ratos do grupo diabético crônico,
no 3º dia após injeção da STZ, variaram de 319 g/dl a 375 g/dl, com média de 347 ± 9 g/dl.
Ao final das 12 semanas, as glicemias variaram de 325 g/dl a 368 g/dl, com média de 343 ± 7
g/dl.
Resultados ______________________________________________________________________________ 47
Tese de Doutorado Omar Andrade Rodrigues Filho
Não houve diferença significativa quando comparamos os pesos no início do
experimento e ao final da 12ª semana, bem como quando comparamos as glicemias do 3º dia
após a injeção de STZ e da 12ª semana pós-injeção.
4.1.3 Grupo diabético crônico tratado com insulina
O peso corporal dos ratos do grupo diabético crônico, tratado com insulina, variou
de 184 g a 202 g, com média de 193 g ± 4 g, no início do experimento. Ao final das 12
semanas o peso corporal variou de 508 g a 582 g, com média de 537 ± 13 g. As glicemias dos
ratos do grupo diabético crônico, tratado com insulina, no 3º dia após injeção da STZ
variaram de 341 g/dl a 389 g/dl, com média de 366 g ± 9 g/dl. Ao final das 12 semanas as
glicemias variaram de 101 g/dl a 127 g/dl, com média de 116 ± 6 g/dl.
Foi observada diferença significativa quando comparamos os pesos corporais dos
ratos do grupo diabético crônico, tratado com insulina, no início do experimento e na 12ª
semana. Também observamos diferença significativa quando comparamos as glicemias do 3º
dia e da 12ª semana do experimento, nesse grupo.
4.1.4 Comparação entre os grupos
Não houve diferença significativa quando comparamos os pesos corporais entre
grupos, no início do experimento. Ao final das 12 semanas, os ratos do grupo diabético
crônico apresentaram peso corporal significativamente menor que dos ratos do grupo
controle, bem como dos ratos do grupo diabético crônico tratado com insulina (Figura 12).
Resultados ______________________________________________________________________________ 48
Tese de Doutorado Omar Andrade Rodrigues Filho
Não houve diferença significativa quando comparamos as glicemias entre grupos,
no início do experimento. Ao final das 12 semanas, os ratos do grupo diabético crônico
apresentaram glicemias significativamente maiores que dos ratos do grupo controle, bem
como dos ratos do grupo diabético crônico tratado com insulina (Figura 13).
Peso Corporal (g)
Controle STZ STZ+Insulina
Peso corporal (g)
0
100
200
300
400
500
600
Injeção
Experimento
*
*
#
+
Figura 12. Peso corporal (expresso em gramas) dos animais controles, diabéticos e diabéticos tratados
com insulina no início do experimento e 12 semanas após a injeção. Notar que os animais controles e os
animais tratados ganharam peso de forma significativa em relação ao início do experimento. Notar
também que, embora os animais diabéticos tenham ganho peso ao longo das 12 semanas, esse ganho não
foi significativo. Assim, o peso final dos animais diabéticos foi significativamente menor, quando
comparado aos controles e aos tratados.
* indica diferença significativa comparada ao início do experimento, # indica diferença significativa
comparado ao grupo controle e + indica diferença significativa comparada ao grupo tratado.
Resultados ______________________________________________________________________________ 49
Tese de Doutorado Omar Andrade Rodrigues Filho
Glicemia (mg/dl)
Controle STZ STZ+Insulina
Glicemia (mg/dl)
0
100
200
300
400
3 dias
12 semanas
*
#
#
+
#
Figura 13. Glicemia (expressa em mg/dl) dos animais controles, diabéticos e diabéticos tratados com
insulina, 3 dias e 12 semanas após a injeção de tampão (nos controles) ou STZ (nos diabéticos). Notar
que os animais diabéticos apresentaram níveis glicêmicos significativamente elevado em relação aos
controles, ao longo de todo experimento. Notar também, que os animais tratados apresentaram correção
dos níveis glicêmicos para valores próximos dos animais controles com o tratamento com insulina. *
indica diferença significativa comparada ao início do experimento, # indica diferença significativa
comparado ao grupo controle e + indica diferença significativa comparada ao grupo tratado.
Resultados ______________________________________________________________________________ 50
Tese de Doutorado Omar Andrade Rodrigues Filho
4.2. Estrutura e Ultraestrutura do Nervo Frênico Normal
A análise das secções transversais semifinas dos nervos frênicos, à microscopia de
luz, mostra que este nervo é, em geral, constituído por apenas um fascículo nos segmentos
estudados. Assim pode ser classificado como monofasciculado, sendo circundado por um
perineuro bem definido, de espessura constante, formado por camadas celulares que possuem
núcleos fusiformes. Esse nervo é constituído por fibras mielínicas e amielínicas, com
diâmetros variados, espalhadas no espaço endoneural, com disposição longitudinal,
acompanhando o longo eixo do fascículo. Os axônios das fibras mielínicas são envolvidos por
uma bainha de mielínica típica, que mantém sua espessura relativa conforme aumenta o
calibre das fibras. Nota-se a presença de fibras mielínicas de grande calibre em número maior
que as de pequeno calibre. Nesse estudo pode-se observar no espaço endoneural, a presença
de elementos celulares comuns, como núcleos das células de Schwann associados a fibras
mielínicas e amielínicas, núcleos de fibroblastos, células de capilares endoteliais, pericitos e
mastócitos. Quando presentes, os vasos capilares, em número de um ou dois, geralmente
apresentam localização central no fascículo. Estes capilares são responsáveis pela
vascularização do nervo. Tais características já foram descritas anteriormente, em um estudo
prévio (Rodrigues Filho & Fazan, 2006) e os dados aqui apresentados são confirmatórios.
Imagens representativas dessas características estão apresentadas nas figuras 14 e 15. Não
foram observadas diferenças morfológicas entre os grupos experimentais, nesse nível de
resolução.
Resultados ______________________________________________________________________________ 51
Tese de Doutorado Omar Andrade Rodrigues Filho
Figura 14: Secção transversal do nervo frênico esquerdo, segmento proximal, de um rato controle. É um
nervo constituído por um único fascículo, sendo, portanto, monofasciculado. A letra M, de cor vermelha,
mostra uma fibra mielínica grande. A seta vermelha aponta para uma fibra mielínica pequena. As
cabeças de setas indicam o perineuro. A seta verde mostra a luz de um vaso capilar. As letras E
maiúsculas, indicam o epineuro. Coloração = Azul de Toluidina a 1%. Barra de escala = 50 µm.
Resultados ______________________________________________________________________________ 52
Tese de Doutorado Omar Andrade Rodrigues Filho
Figura 15: A: Secção transversal do nervo frênico direito, segmento proximal, de um rato do grupo
controle. As cabeças de setas pretas indicam o perineuro. A cabeça de seta vermelha indica o núcleo da
célula perineural. As setas vermelhas mostram as fibras mielínicas pequenas. As setas pretas apontam os
grupamentos de fibras amielínicas. As letras M indicam as fibras mielínicas grandes. O asterisco
vermelho indica o núcleo de uma célula de Schwann. Coloração = Azul de Toluidina a 1%, Barra de
escala = 15µm. B: Secção transversal do nervo frênico direito, segmento proximal, de um rato do grupo
diabético crônico tratado. As cabeças de seta verdes apontam o núcleo de célula endotelial. A seta fina
verde mostra a luz de um vaso capilar endoneural. A seta preta indica o núcleo de uma célula de
Schwann ao redor do qual identificam-se várias fibras amielínicas. A seta vermelha aponta um mastócito
com grânulos escuros no seu citoplasma. Coloração = Azul de Toluidina a 1%, Barra de escala = 15µm.
Resultados ______________________________________________________________________________ 53
Tese de Doutorado Omar Andrade Rodrigues Filho
Em nível ultraestrutural, detalhes das características descritas acima podem ser
observados, sendo o epineuro constituído de tecido conjuntivo com fibras colágenas
orientadas longitudinalmente, com diâmetros maiores que aquelas do perineuro e endoneuro,
além de vasos sanguíneos. O perineuro dos fascículos está contituído por 5 a 6 camadas de
células fusiformes, com lâmina basal proeminente, interpostas por fibras colágenas orientadas
longitudinalmente, acompanhando a orientação das fibras nervosas no endoneuro (Figura 16
A, E e F). No espaço endoneural, esse mesmo tipo de fibras colágenas esteve presente,
ocupando espaço entre as fibras mielínicas e amielínicas, além das outras estruturas
normalmente encontradas nesse espaço. Mastócitos, tanto próximos ao perineuro (Figura 16
F) quanto imersos no espaço endoneural (Figura 16 D) foram facilmente identificados pela
presença de grânulos citoplasmáticos. Fibroblastos e seus prolongamentos foram identificados
e diferenciados dos das células de Schwann, pela ausência de lâmina basal em sua membrana
(Figura 16 B). Vasos capilares com seus respectivos pericitos foram facilmente identificados
(Figura 16 C).
4.2.1. Comparação dos Aspectos Ultraestruturais entre os Grupos Experimentais
Ao analisarmos qualitativamente os aspectos ultraestruturais entre os diferentes
grupos experimentais, observamos a presença de alterações das fibras mielínicas de grande e
pequeno calibre, bem como das fibras amielínicas e das células de Schwann nos nervos dos
animais diabéticos crônicos e dos diabéticos crônicos tratados com insulina. As principais
alterações observadas nas fibras mielínicas de grande calibre dos nervos dos animais
diabéticos crônicos foram atrofia axonal, com afrouxamento da bainha de mielina (Figura 17
A, C, D ) e, muitas vezes, a formação de bolas de mielina. Nas fibras mielínicas de menor
Resultados ______________________________________________________________________________ 54
Tese de Doutorado Omar Andrade Rodrigues Filho
calibre, observamos a presença tanto de sinais de atrofia axonal, com fibras de bainha muito
espessa em relação ao tamanho do axônio (Figura 17 C), bem como fibras com sinais de
desmielinização (Figura 17 B). Nas fibras amielínicas, muitas vezes, observamos células de
Schwann com vacúolos citoplasmáticos (Figura 17 F) e, algumas vezes, a presença de
prolongamentos de células de Schwann, sem envolver fibras amielínicas.
Figura 16. Detalhes representativos do espaço endoneural dos nervos frênicos dos animais controles. A: Perineuro,
formado por céulas achatadas, com núcleo fusiforme, revestidas por lâmina basal proeminente. Notar, no espaço
endoneural, grupamento de fibras amielínicas típicas. B: Detalhe dos fibroblastos endoneurais. C: Capilar
endoneural normal, com endotélio, lâmina basal e pericito. D: Detalhe de um mastócito no espaço endoneural. E:
Fibras mielínicas de grande e pequeno calibre, bem como fibras amielínicas típicas no espaço endoneural. Notar
detalhe do perineuro. F: Detalhe de um mastócito endoneural, com núcleo central, e próximo ao perineuro.
Resultados ______________________________________________________________________________ 55
Tese de Doutorado Omar Andrade Rodrigues Filho
Figura 17. Detalhes representativos do espaço endoneural dos nervos frênicos dos animais diabéticos crônicos. A:
Fibra mielínica de grande calibre, com axônio atrófico (seta) e a bainha de mielina frouxa. B: Detalhe de fibras
mielínicas finas, com sinais de desmielinização (cabeças de seta). C: Fibra mielínica de grande calibre, com axônio
atrófico (seta) e a bainha de mielina frouxa. Notar uma fibra mielínica de grande calibre, normal (M), e uma fibra
mielínica de pequeno calibre, com bainha de mielina espessa (m). D: Bainhas de mielina frouxa (*) em fibras
mielínicas de grande calibre. As setas indicam fibras mielínicas finas e as cabeças de seta indicam fibras
amielínicas. E: Fibra mielínica de grande calibre, com atrofia axonal e bainha de mielina frouxa (seta), ao lado de
uma macrófago endoneural (Mc). Uma fibra mielínica fina normal está identificada por m. F: Detalhe de uma
célula de Schwann repleta de vacúolos citoplasnáticos (cabeças de setas) e não associada a nenhuma fibra
amielínicas.
Resultados ______________________________________________________________________________ 56
Tese de Doutorado Omar Andrade Rodrigues Filho
Nos animais diabéticos crônicos, tratados com insulina, as principais alterações
observadas estiveram presentes nas fibras mielínicas de pequeno calibre. Entretanto, fibras de
grande calibre e fibras amielínicas também apresentaram lesão. Nas fibras mielínicas de
pequeno calibre observamos destuição da bainha de mielina e degeneração do axônio (Figura
18 A, D e F).
Figura 18. Detalhes representativos do espaço endoneural dos nervos frênicos dos animais diabéticos crônicos
tratados com insulina. A, D e F: Fibra mielínica de pequeno calibre, com axônio atrófico (seta) e a bainha de
mielina frouxa. B e C: Célula fagocítica com grandes vacúolos citoplasmáticos e restos de bainha de mielina no
interior (cabeças de seta). E: Fibras amielínicas em degeneração. * indica área de fibras amielínicas com
morfologia normal. Barras de escala = 1 µm.
Resultados ______________________________________________________________________________ 57
Tese de Doutorado Omar Andrade Rodrigues Filho
Não foi possível determinar qual evento ocorreu primeiro: se a atrofia axonal ou
se a destruição da bainha de mielina. Imagens de restos de mielina no interior de células
fagocíticas estiveram presentes (Figura18 B e C), ao lado de fibras com morfologia normal.
Nas fibras amielínicas, foi possível observar a presença de vacúolos e degeneração das
mesmas (Figura 18 E).
Alterações dos capilares endoneurais também foram evidentes nos animais
diabéticos crônicos, bem como nos animais diabéticos crônicos, tratados com insulina. As
alterações mais evidentes foram espessamento da membrana basal e sinais de proliferação
endotelial (Figuras 19 e 20). Vasos capilares colabados estiveram presentes em ambos os
grupos diabéticos.
Figura 19. Detalhes representativos dos vasos endoneurais dos nervos frênicos dos animais diabéticos crônicos.
Notar o espessamento da membrana basal, bem como de sinais de hiperplasia endotelial, com a presença de
múltiplos núcleos endoteliais. As setas indicam pericitos. As cabeças de seta indicam prolongamentos de
fibroblastos. * indicam atrofia axonal. Notar em C a presença de duas fibras mielínicas finas, de aproximadamente
mesmo tamanho e diferença de espessura da bainha de mielina. Barras de escala = 1 µm.
Resultados ______________________________________________________________________________ 58
Tese de Doutorado Omar Andrade Rodrigues Filho
Figura 20. Detalhes representativos dos vasos endoneurais dos nervos frênicos dos animais diabéticos crônicos
tratados com insulina. Notar o espessamento da membrana basal (cabeças de setas), bem como de sinais de
hiperplasia endotelial, com a presença de múltiplos núcleos endoteliais. A seta indica um pericito. Notar em C a
presença de várias fibras mielínicas com sinais de degeneração, ao redor de uma vaso colabado. Barras de escala =
2 µm.
Resultados ______________________________________________________________________________ 59
Tese de Doutorado Omar Andrade Rodrigues Filho
4.3. Morfometria das Fibras Amielínicas
4.3.1. Ratos controles
Os valores médios dos parâmetros morfométricos das fibras amielínicas do nervo
frênico do grupo controle, (número, densidade, área média, diâmetro mínimo médio,
porcentagem da área fascicular ocupada pelas fibras amielínicas e relação entre o número de
fibras mielínicas e fibras amielínicas) estão demonstrados na tabela 1.
Tabela 1: Parâmetros morfométricos médios das fibras amielínicas dos nervos frênicos dos ratos do grupo controle.
Densidade expressa em número de fibras/mm
2
. % ocupação = porcentagem da área fascicular ocupada pelas fibras
amielínicas. Miel/Amiel = relação entre o número de fibras mielínicas e o número de fibras amielínicas. * indica diferença
significativa entre segmentos do mesmo lado. Valores expressos em média ± EPM.
Proximal
Distal
Proximal
Distal
Número
192 ± 6
187 ± 30
202 ± 39
141 ± 40
Densidade
6279 ± 46
6565 ± 1118
6492 ± 1340
5597 ± 1474
Área
0,26 ± 0,02
0,27 ± 0,03
0,36 ± 0,05
0,24 ± 0,04
Diâmetro mínimo
0,47 ± 0,02
0,39 ± 0,07
0,51 ± 0,02
0,42 ± 0,04
% Ocupação
8,4 ± 0,9
6,9 ± 0,6
10,4 ± 0,8
5,5 ± 0,9*
Miel/Amiel
2,2 ± 0,03
2,5 ± 0,5
2,5 ± 0,4
3,8 ± 0,8
Direitos
Esquerdos
Controles
Resultados ______________________________________________________________________________ 60
Tese de Doutorado Omar Andrade Rodrigues Filho
O número das fibras amielínicas dos nervos frênicos dos ratos controles, lado
direito, segmento proximal variou de 183 a 207, com média de 192 ± 6. No segmento direito
distal, essa número variou de 100 a 233, com média de 187 ± 30. Nos nervos esquerdos
proximais, o número das fibras amielínicas variou de 148 a 314, com média de 202 ± 39. Para
o segmento distal esquerdo, essa variação foi de 100 a 260, com média de 141 ± 40.
A densidade (número de fibras/mm
2
) média das fibras amielínicas do nervo
frênico dos ratos controles, lado direito, segmento proximal variou de 6202 a 6388 fibras/µm
2
,
com média de 6279 ± 46 fibras/µm
2
. No segmento direito distal, essa densidade variou de
3280 a 8005 fibras/µm
2
, com média de 6565 ± 1118 fibras/µm
2
. Nos nervos esquerdos
proximais, a densidade média das fibras amielínicas variou de 4392 a 10014 fibras/µm
2
, com
média de 6492 ± 1340 fibras/µm
2
. Para o segmento distal esquerdo, essa variação foi de 3755
a 10001 fibras/µm
2
, com média de 5597 ± 1474 fibras/µm
2
.
A área média das fibras amielínicas do nervo frênico dos ratos controles, lado
direito, segmento proximal variou de 0,22 a 0,31 µm
2
, com média de 0,26 ± 0,02 µm
2
. No
segmento direito distal, essa área variou de 0,19 a 0,31 µm
2
, com média de 0,27 ± 0,03 µm
2
.
Nos nervos esquerdos proximais, a área média das fibras amielínicas variou de 0,25 a 0,47
µm
2
, com média de 0,36 ± 0,05 µm
2
. Para o segmento distal esquerdo, essa variação foi de
0,12 a 0,29 µm
2
, com média de 0,24 ± 0,04 µm
2
.
O diâmetro mínimo médio das fibras amielínicas do nervo frênico do grupo
controle do lado direito, segmento proximal, variou de 0,44 a 0,51 µm, com média de 0,47 ±
0,02 µm. No segmento direito distal, esse diâmetro variou de 0,20 a 0,50 µm, com média de
0,39 ± 0,07 µm. No lado esquerdo, segmento proximal, o diâmetro mínimo médio das fibras
amielínicas variou de 0,46 a 0,58 µm, com média de 0,51 ± 0,02 µm. No segmento distal
esquerdo, esse diâmetro variou de 0,30 a 0,48 µm, com média de 0,42 ±0,04 µm.
Resultados ______________________________________________________________________________ 61
Tese de Doutorado Omar Andrade Rodrigues Filho
A porcentagem da área fascicular ocupada pelas fibras amielínicas, no nervo
frênico dos ratos controles, segmento proximal direito, variou de 6,3 a 10,8 %, com média de
8,4 ± 0,9 %. No segmento direito distal, essa porcentagem diâmetro variou de 5,7 a 8,2 %,
com média de 6,9 ± 0,6 %. No lado esquerdo, segmento proximal, a porcentagem da área
fascicular ocupada pelas fibras amielínicas variou de 9,3 a 12,6 %, com média de 10,4 ± 0,8
%. No segmento distal esquerdo, essa porcentagem variou de 3,0 a 7,1 %, com média de 5,5
±0,9 %.
A relação entre o número de fibras mielínicas e o número de fibras amielínicas
(Miel/Amiel) no nervo frênico dos ratos controles, segmento proximal direito, variou de 2,2 a
2,3, com média de 2,2 ± 0,03. No segmento direito distal, essa porcentagem diâmetro variou
de 2,0 a 4,0, com média de 2,5 ± 0,5. No lado esquerdo, segmento proximal, essa relação
variou de 1,5 a 3,4 %, com média de 2,5 ± 0,4. No segmento distal esquerdo, essa relação
variou de 1,5 a 4,9, com média de 3,8 ±0,8 %.
Para os dados morfométricos médios das fibras amielínicas dos animais controles,
não foram observadas diferenças significativas nas comparações entre lados. Na comparação
entre segmentos do mesmo lado, somente a porcentagem da área fascicular ocupada pelas
fibras amielínicas mostrou diferença significativa, sendo essa porcentagem maior no
segmento proximal esquerdo, comparado ao distal.
4.3.2. Ratos diabéticos crônicos
Os valores médios dos parâmetros morfométricos das fibras amielínicas do nervo
frênico do grupo diabético crônico, (número, densidade, área média, diâmetro mínimo médio,
Resultados ______________________________________________________________________________ 62
Tese de Doutorado Omar Andrade Rodrigues Filho
porcentagem da área fascicular ocupada pelas fibras amielínicas e relação entre o número de
fibras mielínicas e fibras amielínicas) estão demonstrados na tabela 2.
O número das fibras amielínicas dos nervos frênicos dos ratos controles, lado
direito, segmento proximal variou de 193 a 378, com média de 308 ± 35. No segmento direito
distal, esse número variou de 156 a 466, com média de 339 ± 59. Nos nervos esquerdos
proximais, o número das fibras amielínicas variou de 144 a 653, com média de 347 ± 87. Para
o segmento distal esquerdo, essa variação foi de 210 a 377, com média de 305 ± 27.
Tabela 2: Parâmetros morfométricos médios das fibras amielínicas dos nervos frênicos dos ratos do grupo diabético crônico.
Densidade expressa em número de fibras/mm
2
. % ocupação = porcentagem da área fascicular ocupada pelas fibras
amielínicas. Miel/Amiel = relação entre o número de fibras mielínicas e o número de fibras amielínicas. Valores expressos
em média ± EPM.
A densidade (número de fibras/mm
2
) média das fibras amielínicas do nervo
frênico dos ratos controles, lado direito, segmento proximal variou de 8675 a 14696
Proximal
Distal
Proximal
Distal
Número
308 ± 35
339 ± 59
347 ± 87
304 ± 27
Densidade
11805 ± 1061
12652 ± 1799
15152 ± 5849
14129 ± 1709
Área
0,42 ± 0,03
0,39 ± 0,02
0,45 ± 0,05
0,40 ± 0,03
Diâmetro mínimo
0,57 ± 0,02
0,55 ± 0,02
0,58 ± 0,04
0,55 ± 0,02
% Ocupação
4,7 ± 0,5
4,0 ± 0,6
6,1 ± 1,9
4,6 ± 0,6
Miel/Amiel
1,5 ± 0,12
1,5 ± 0,3
1,5 ± 0,5
1,4 ± 0,1
Direitos
Esquerdos
Diabéticos Crônicos
Resultados ______________________________________________________________________________ 63
Tese de Doutorado Omar Andrade Rodrigues Filho
fibras/µm
2
, com média de 11805 ± 1060 fibras/µm
2
. No segmento direito distal, essa
densidade variou de 6276 a 14913 fibras/µm
2
, com média de 12652± 1799 fibras/µm
2
. Nos
nervos esquerdos proximais, a densidade média das fibras amielínicas variou de 4559 a 37514
fibras/µm
2
, com média de 15152 ± 5849 fibras/µm
2
. Para o segmento distal esquerdo, essa
variação foi de 7659 a 16755 fibras/µm
2
, com média de 14129 ± 1709 fibras/µm
2
.
A área média das fibras amielínicas do nervo frênico dos ratos controles, lado
direito, segmento proximal variou de 0,35 a 0,50 µm
2
, com média de 0,42 ± 0,03 µm
2
. No
segmento direito distal, essa área variou de 0,33 a 0,42 µm
2
, com média de 0,39 ± 0,02 µm
2
.
Nos nervos esquerdos proximais, a área média das fibras amielínicas variou de 0,33 a 0,59
µm
2
, com média de 0,45 ± 0,05 µm
2
. Para o segmento distal esquerdo, essa variação foi de
0,33 a 0,50 µm
2
, com média de 0,40 ± 0,03 µm
2
.
O diâmetro mínimo médio das fibras amielínicas do nervo frênico do grupo
controle do lado direito, segmento proximal, variou de 0,51 a 0,62 µm, com média de 0,57 ±
0,02 µm. No segmento direito distal, esse diâmetro variou de 0,51 a 0,59 µm, com média de
0,55 ± 0,02 µm. No lado esquerdo, segmento proximal, o diâmetro mínimo médio das fibras
amielínicas variou de 0,49 a 0,71 µm, com média de 0,58 ± 0,04 µm. No segmento distal
esquerdo, esse diâmetro variou de 0,51 a 0,62 µm, com média de 0,55 ±0,02 µm.
A porcentagem da área fascicular ocupada pelas fibras amielínicas, no nervo
frênico dos ratos controles, segmento proximal direito, variou de 3,7 a 6,2 %, com média de
4,7 ± 0,5 %. No segmento direito distal, essa porcentagem diâmetro variou de 3,1 a 5,6 %,
com média de 4,0 ± 0,6 %. No lado esquerdo, segmento proximal, a porcentagem da área
fascicular ocupada pelas fibras amielínicas variou de 3,4 a 11,5 %, com média de 6,0 ± 1,9 %.
No segmento distal esquerdo, essa porcentagem variou de 3,7 a 6,1 %, com média de 4,6 ±0,6
%.
Resultados ______________________________________________________________________________ 64
Tese de Doutorado Omar Andrade Rodrigues Filho
A relação entre o número de fibras mielínicas e o número de fibras amielínicas
(Miel/Amiel) no nervo frênico dos ratos controles, segmento proximal direito, variou de 1,2 a
1,8, com média de 1,5 ± 0,1. No segmento direito distal, essa porcentagem diâmetro variou de
0,9 a 1,4, com média de 1,5 ± 0,3. No lado esquerdo, segmento proximal, essa relação variou
de 0,6 a 1,7 %, com média de 1,4 ± 0,5. No segmento distal esquerdo, essa relação variou de
1,2 a 1,8, com média de 1,4 ±0,1 %.
Para os dados morfométricos médios das fibras amielínicas dos animais diabéticos
crônicos, não foram observadas diferenças significativas nas comparações entre lados bem
como entre segmentos do mesmo lado.
4.3.3. Ratos diabéticos crônicos tratados com insulina
Os valores médios dos parâmetros morfométricos das fibras amielínicas do nervo
frênico do grupo diabético crônico tratado com insulina, (número, densidade, área média,
diâmetro mínimo médio, porcentagem da área fascicular ocupada pelas fibras amielínicas e
relação entre o número de fibras mielínicas e fibras amielínicas) estão demonstrados na tabela
3.
O número das fibras amielínicas dos nervos frênicos dos ratos diabéticos crônicos
tratados com insulina, lado direito, segmento proximal variou de 313 a 578, com média de
391 ± 50. No segmento direito distal, esse número variou de 104 a 379, com média de 279 ±
60. Nos nervos esquerdos proximais, o número das fibras amielínicas variou de 260 a 642,
com média de 372 ± 70. Para o segmento distal esquerdo, essa variação foi de 155 a 398, com
média de 309 ± 47.
Resultados ______________________________________________________________________________ 65
Tese de Doutorado Omar Andrade Rodrigues Filho
A densidade (número de fibras/mm
2
) média das fibras amielínicas do nervo
frênico dos ratos diabéticos crônicos tratados com insulina, lado direito, segmento proximal
variou de 8430 a 16973 fibras/µm
2
, com média de 12217 ± 1717 fibras/µm
2
. No segmento
direito distal, essa densidade variou de 3926 a 13132 fibras/µm
2
, com média de 9569 ± 1998
fibras/µm
2
. Nos nervos esquerdos proximais, a densidade média das fibras amielínicas variou
de 6099 a 18473 fibras/µm
2
, com média de 10955 ± 2157 fibras/µm
2
. Para o segmento distal
esquerdo, essa variação foi de 5168 a 18865 fibras/µm
2
, com média de 12196 ± 2435
fibras/µm
2
.
Tabela 3: Parâmetros morfométricos médios das fibras amielínicas dos nervos frênicos dos ratos do grupo diabético crônico
tratado com insulina. Densidade expressa em número de fibras/mm
2
. % ocupação = porcentagem da área fascicular ocupada
pelas fibras amielínicas. Miel/Amiel = relação entre o número de fibras mielínicas e o número de fibras amielínicas. Valores
expressos em média ± EPM.
Proximal
Distal
Proximal
Distal
Número
391 ± 50
279 ± 60
372 ± 70
309 ± 47
Densidade
12217 ± 1717
9569 ± 1889
10955 ± 2157
12196 ± 2435
Área
0,45 ± 0,03
0,40 ± 0,05
0,48 ± 0,04
0,43 ± 0,06
Diâmetro mínimo
0,58 ± 0,03
0,56 ± 0,03
0,61 ± 0,02
0,56 ± 0,02
% Ocupação
4,7 ± 0,8
2,1 ± 0,7*
5,2 ± 1,2
6,4 ± 2,6
Miel/Amiel
1,2 ± 0,2
1,9 ± 0,6
1,4 ± 0,2
1,6 ± 0,3
Direitos
Esquerdos
Diabéticos Crônicos Tratados com Insulina
Resultados ______________________________________________________________________________ 66
Tese de Doutorado Omar Andrade Rodrigues Filho
A área média das fibras amielínicas do nervo frênico dos ratos diabéticos crônicos
tratados com insulina, lado direito, segmento proximal variou de 0,36 a 0,53 µm
2
, com média
de 0,45 ± 0,03 µm
2
. No segmento direito distal, essa área variou de 0,33 a 0,54 µm
2
, com
média de 0,40 ± 0,05 µm
2
. Nos nervos esquerdos proximais, a área média das fibras
amielínicas variou de 0,41 a 0,62 µm
2
, com média de 0,48 ± 0,04 µm
2
. Para o segmento distal
esquerdo, essa variação foi de 0,32 a 0,64 µm
2
, com média de 0,43 ± 0,06 µm
2
.
O diâmetro mínimo médio das fibras amielínicas do nervo frênico do grupo
diabéticos crônicos tratados com insulina do lado direito, segmento proximal, variou de 0,50 a
0,67 µm, com média de 0,58 ± 0,03 µm. No segmento direito distal, esse diâmetro variou de
0,51 a 0,64 µm, com média de 0,56 ± 0,03 µm. No lado esquerdo, segmento proximal, o
diâmetro mínimo médio das fibras amielínicas variou de 0,58 a 0,71 µm, com média de 0,61 ±
0,02 µm. No segmento distal esquerdo, esse diâmetro variou de 0,51 a 0,60 µm, com média
de 0,56 ±0,02 µm.
A porcentagem da área fascicular ocupada pelas fibras amielínicas, no nervo
frênico dos ratos controles, segmento proximal direito, variou de 3,5 a 9,1 %, com média de
4,7 ± 0,8 %. No segmento direito distal, essa porcentagem diâmetro variou de 0,6 a 3,5 %,
com média de 2,1 ± 0,7 %. No lado esquerdo, segmento proximal, a porcentagem da área
fascicular ocupada pelas fibras amielínicas variou de 3,3 a 9,1 %, com média de 5,2 ± 1,2 %.
No segmento distal esquerdo, essa porcentagem variou de 3,0 a 15,5 %, com média de 6,4
±2,6 %.
A relação entre o número de fibras mielínicas e o número de fibras amielínicas
(Miel/Amiel) no nervo frênico dos ratos controles, segmento proximal direito, variou de 0,7 a
1,5, com média de 1,2 ± 0,2. No segmento direito distal, essa porcentagem diâmetro variou de
1,2 a 3,7, com média de 1,9 ± 0,6. No lado esquerdo, segmento proximal, essa relação variou
Resultados ______________________________________________________________________________ 67
Tese de Doutorado Omar Andrade Rodrigues Filho
de 0,7 a 1,9 %, com média de 1,4 ± 0,2. No segmento distal esquerdo, essa relação variou de
1,1 a 2,4, com média de 1,6 ±0,3 %.
Para os dados morfométricos médios das fibras amielínicas dos animais diabéticos
crônicos tratados com insulina, não foram observadas diferenças significativas nas
comparações entre lados. Na comparação entre segmentos do mesmo lado, somente a
porcentagem da área fascicular ocupada pelas fibras amielínicas mostrou diferença
significativa, sendo essa porcentagem maior no segmento proximal direito, comparado ao
distal.
4.3.4. Comparação entre os diferentes grupos experimentais
Como muitas comparações foram feitas, entre lados, segmentos e grupos,
descreveremos apenas os parâmetros que se mostraram significativamente diferentes. Para
melhor visualização das diferenças, os dados estão apresentados de forma gráfica nas figuras
21 a 26.
Nos segmentos proximais direitos, o grupo diabético apresentou maior área e
diâmetro mínimo médio das fibras amielínicas, maior densidade das fibras mielínicas e menor
porcentagem da área fascicular ocupada por essas fibras, comparado ao grupo controle. O
grupo diabético crônico tratado com insulina apresentou maior número de fibras amielínicas,
maior área e diâmetro mínimo médios dessas fibras, maior densidade das mesmas e menor
porcentagem da área fascicular ocupada pelas fibras amielínicas, bem como menor relação
entre o número de fibras mielínicas/número de fibras amielínicas, comparado ao grupo
controle. Não foram observadas diferenças entre os dois grupos diabéticos.
Resultados ______________________________________________________________________________ 68
Tese de Doutorado Omar Andrade Rodrigues Filho
Nos segmentos distais direitos, o grupo diabético apresentou maior área e
diâmetro mínimo médios das fibras amielínicas, e menor porcentagem da área fascicular
ocupada por essas fibras, comparado ao grupo controle. As mesmas diferenças foram
observadas entre os grupos controle e diabético crônico tratado com insulina. Também houve
diferença significativa entre os grupos diabéticos para a porcentagem da área fascicular
ocupada pelas fibras amielínicas, sendo essa porcentagem maior no grupo tratado com
insulina.
Nos segmentos proximais esquerdos, apenas a porcentagem da área fascicular
ocupada pelas fibras amielínicas se mostrou diferente entre os grupos, sendo essa
porcentagem maior no grupo controle, comparado aos dois grupos diabéticos, sem diferença
entre os últimos.
Nos segmentos distais esquerdos, o grupo diabético crônico apresentou maior
número e densidade de fibras amielínicas e maior área e diâmetro mínimo médios dessas
fibras. O grupo diabético crônico tratado com insulina apresentou maior número de fibras
amielínicas e maior área e diâmetro mínimo médio dessas fibras comparado ao grupo
controle. Não foram observadas diferenças entre os grupos diabéticos.
Resultados ______________________________________________________________________________ 69
Tese de Doutorado Omar Andrade Rodrigues Filho
Proximal Direito
Número de fibras amielínicas
0
100
200
300
400
500
Proximal Esquerdo
Distal Direito
Controle STZ STZ+Ins
Número de fibras amielínicas
0
100
200
300
400
500
Controle
Diabético crônico
Diabético crônico tratado com insulina
Distal Esquerdo
Controle STZ STZ+Ins
*
*
*
Figura 21: Comparação do número médio das fibras amielínicas entre os grupos experimentais. Notar o aumento
progressivo do número de fibras amielínicas nos grupos diabéticos com (STZ+Ins) e sem tratamento (STZ) pela
insulina. * indica diferença significativa comparado ao grupo controle.
Resultados ______________________________________________________________________________ 70
Tese de Doutorado Omar Andrade Rodrigues Filho
Proximal Direito
Densidade de fibras amielínicas (fibras/mm
2
)
0
5000
10000
15000
20000
25000
Proximal Esquerdo
Distal Direito
Controle STZ STZ+Ins
Densidade de fibras amielínicas (fibras/mm
2
)
0
5000
10000
15000
20000
25000
Controle
Diabético crônico
Diabético crônico tratado com insulina
Distal Esquerdo
Controle STZ STZ+Ins
*
*
*
Figura 22: Comparação da densidade média das fibras amielínicas entre os grupos experimentais. Notar o
aumento dessa densidade no grupo diabético crônico (STZ) e posterior redução no grupo diabético crônico tratado
com insulina (STZ+Ins). * indica diferença significativa comparado ao grupo controle.
Resultados ______________________________________________________________________________ 71
Tese de Doutorado Omar Andrade Rodrigues Filho
Proximal Direito
Área média das fibras amielínicas (µm
2
)
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
Proximal Esquerdo
Distal Direito
Controle STZ STZ+Ins
Área média das fibras amielínicas (µm
2
)
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
Controle
Diabético crônico
Diabético crônico tratado com insulina
Distal Esquerdo
Controle STZ STZ+Ins
*
*
*
*
*
*
Figura 23: Comparação da área média das fibras amielínicas (expressa em µm
2
) entre os grupos experimentais.
Notar aumento dessa área nos grupos diabéticos com (STZ+Ins) e sem tratamento (STZ) pela insulina. * indica
diferença significativa comparado ao grupo controle.
Resultados ______________________________________________________________________________ 72
Tese de Doutorado Omar Andrade Rodrigues Filho
Proximal Direito
Diâmetro mínimo médio das fibras amielínicas (µm)
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
Proximal Esquerdo
Distal Direito
Controle STZ STZ+Ins
Diâmetro mínimo médio das fibras amielínicas (µm)
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
Controle
Diabético crônico
Diabético crônico tratado com insulina
Distal Esquerdo
Controle STZ STZ+Ins
*
*
*
*
*
*
Figura 24: Comparação do diâmetro mínimo médio das fibras amielínicas (expresso em µm) entre os grupos
experimentais. Notar aumento desse diâmetro nos grupos diabéticos com (STZ+Ins) e sem tratamento (STZ) pela
insulina. * indica diferença significativa comparado ao grupo controle.
Resultados ______________________________________________________________________________ 73
Tese de Doutorado Omar Andrade Rodrigues Filho
Proximal Direito
Porcentagem da área fascicular
ocupada pelas fibras amielínicas (%)
0
2
4
6
8
10
12
Proximal Esquerdo
Distal Direito
Controle STZ STZ+Ins
Porcentagem da área fascicular
ocupada pelas fibras amielínicas (%)
0
2
4
6
8
10
12
Controle
Diabético crônico
Diabético crônico tratado com insulina
Distal Esquerdo
Controle STZ STZ+Ins
*
*
*
*
#
*
*
Figura 25: Comparação da porcentagem da área fascicular ocupada pelas fibras amielínicas entre os grupos
experimentais. Notar a redução dessa porcentagem nos grupos diabéticos com (STZ+Ins) e sem tratamento (STZ)
pela insulina. * indica diferença significativa comparado ao grupo controle. # indica diferença compara ao grupo
diabético crônico.
Resultados ______________________________________________________________________________ 74
Tese de Doutorado Omar Andrade Rodrigues Filho
Proximal Direito
Relação mielínica/amielínica
0
1
2
3
4
5
Proximal Esquerdo
Distal Direito
Controle STZ STZ+Ins
Relação mielínica/amielínica
0
1
2
3
4
5
Controle
Diabético crônico
Diabético crônico tratado com insulina
Distal Esquerdo
Controle STZ STZ+Ins
*
Figura 26: Comparação da relação entre o número de fibras mielínicas e o número de fibras amielínicas entre os
grupos experimentais. * indica diferença significativa comparado ao grupo controle.
4.4. Histogramas de distribuição de freqüência de diâmetro das fibras amielínicas
Os histogramas de distribuição do diâmetro mínimo das fibras amielínicas do
nervo frênico dos ratos controles, lados direito e esquerdo, segmentos proximais e distais,
mostraram-se com distribuição unimodal (Figura 27). Entretanto, nos segmentos proximais, o
pico do histograma esteve mais distribuído em forma de platô, enquanto que nos segmentos
distais, o pico em uma freqüência isolada foi mais evidente. Em todos os segmentos e lados,
os diâmetros variaram entre 0,2 e 1,6 µm. No lado direito, proximal, o pico de freqüência se
distribuiu entre os diâmetros 0,3 e 0,6 µm enquanto que no lado esquerdo proximal, esse platô
apresentou-se entre os diâmetros 0,4 e 0,6 µm. Nos segmentos distais em ambos os lados, um
pico único em 0.3 µm de diâmetro esteve presente.
Resultados ______________________________________________________________________________ 75
Tese de Doutorado Omar Andrade Rodrigues Filho
Figura 27: Histogramas de distribuição de freqüência do diâmetro mínimo das fibras amielínicas do nervo frênico
dos animais controles. Painel superior esquerdo – lado direito segmento proximal. Painel superior direito – lado
esquerdo, segmento proximal. Painel inferior esquerdo – lado direito, segmento distal. Painel inferior direito –
lado esquerdo, segmento distal. Não foram observadas diferenças significativas, nem entre segmentos, nem entre
lados.
Os histogramas de distribuição do diâmetro mínimo das fibras amielínicas do
nervo frênico dos ratos diabético crônicos, lados direito e esquerdo, segmentos proximais e
distais, mostraram-se com distribuição unimodal (Figura 28). Assim como no grupo controle,
nos segmentos proximais, o pico do histograma esteve mais distribuído em forma de platô,
enquanto que nos segmentos distais, o pico em uma freqüência isolada foi mais evidente. Em
Controle Proximal Direito
Diâmetro (µm)
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0
Freqüência (%)
0
5
10
15
20
25
30
35
Controle Distal Direito
Diâmetro (µm)
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0
Freqüência (%)
0
5
10
15
20
25
30
35
Controle Proximal Esquerdo
Diâmetro (µm)
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0
Freqüência (%)
0
5
10
15
20
25
30
35
Controle Distal Esquerdo
Diâmetro (µm)
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0
Freqüência (%)
0
5
10
15
20
25
30
35
Resultados ______________________________________________________________________________ 76
Tese de Doutorado Omar Andrade Rodrigues Filho
todos os segmentos e lados, os diâmetros variaram entre 0,2 e 1,6 µm. Nos lados direito e
esquerdo proximais, o pico de freqüência se distribuiu entre os diâmetros 0,5 e 0,6 µm. Nos
segmentos distais em ambos os lados, um pico único em 0.4 µm de diâmetro esteve presente.
Figura 28: Histogramas de distribuição de freqüência do diâmetro mínimo das fibras amielínicas do nervo frênico
dos animais diabético crônicos. Painel superior esquerdo – lado direito segmento proximal. Painel superior direito
– lado esquerdo, segmento proximal. Painel inferior esquerdo – lado direito, segmento distal. Painel inferior
direito – lado esquerdo, segmento distal. Não foram observadas diferenças significativas, nem entre segmentos,
nem entre lados.
Diabético Crônico Distal Esquerdo
Diâmetro (µm)
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0
Freqüência (%)
0
5
10
15
20
25
30
35
Diabético Crônico Proximal Esquerdo
Diâmetro (µm)
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0
Freqüência (%)
0
5
10
15
20
25
30
35
Diabético Crônico Distal Direito
Diâmetro (µm)
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0
Freqüência (%)
0
5
10
15
20
25
30
35
Diabético Crônico Proximal Direito
Diâmetro (µm)
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0
Freqüência (%)
0
5
10
15
20
25
30
35
Resultados ______________________________________________________________________________ 77
Tese de Doutorado Omar Andrade Rodrigues Filho
Os histogramas de distribuição do diâmetro mínimo das fibras amielínicas do
nervo frênico dos ratos diabéticos crônicos tratados com insulina, lados direito e esquerdo,
segmentos proximais e distais, mostraram-se com distribuição unimodal (Figura 29).
Figura 29:. Histogramas de distribuição de freqüência do diâmetro mínimo das fibras amielínicas do nervo
frênico dos animais diabéticos crônicos tratados com insulina. Painel superior esquerdo – lado direito segmento
proximal. Painel superior direito – lado esquerdo, segmento proximal. Painel inferior esquerdo – lado direito,
segmento distal. Painel inferior direito – lado esquerdo, segmento distal. Não foram observadas diferenças
significativas, nem entre segmentos, nem entre lados.
Diabético Tratado Proximal Direito
Diâmetro (µm)
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0
Freqüência (%)
0
5
10
15
20
25
30
35
Diabético Tratado Distal Direito
Diâmetro (µm)
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0
Freqüência (%)
0
5
10
15
20
25
30
35
Diabético Tratado Proximal Esquerdo
Diâmetro (µm)
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0
Freqüência (%)
0
5
10
15
20
25
30
35
Diabético Tratado Distal Esquerdo
Diâmetro (µm)
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0
Freqüência (%)
0
5
10
15
20
25
30
35
Resultados ______________________________________________________________________________ 78
Tese de Doutorado Omar Andrade Rodrigues Filho
Assim como nos nervos dos animais controles bem como dos animais diabéticos
crônicos, nos segmentos proximais, o pico dos histogramas esteve mais distribuído em forma
de platô, enquanto que nos segmentos distais, o pico em uma freqüência isolada foi mais
evidente. Em todos os segmentos e lados, os diâmetros variaram entre 0,1 e 1,7 µm. No lado
direito, proximal, o pico de freqüência se distribuiu entre os diâmetros 0,5 e 0,6 µm enquanto
que no lado esquerdo proximal, esse platô apresentou-se entre os diâmetros 0,6 e 0,7µm. No
segmento distal direito, um pico único em 0,4 µm foi identificado enquanto que no segmento
distal esquerdo, o pico de freqüência se apresentou em 0,5 µm.
Não foram observadas diferenças significativas nas distribuições dos diâmetros
das fibras mielínicas dos NF nem entre segmentos e lados em um mesmo grupo, nem entre os
grupos experimentais.
4.4.1. Comparação entre os diferentes grupos experimentais
A figura 29 mostra uma representação gráfica comparativa entre as distribuições
de freqüência dos diâmetros das fibras amielínicas dos nervos frênicos dos três grupos
experimentais. Apesar do desvio dos histogramas dos grupos diabéticos crônicos, com e sem
tratamento pela insulina, para a direita, a análise estatística não mostrou diferença
significativa entre essas distribuições.
Resultados ______________________________________________________________________________ 79
Tese de Doutorado Omar Andrade Rodrigues Filho
Distal Esquerdo
Diâmetro (µm)
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0
Freqüência (%)
0
5
10
15
20
25
30
35
Controle
STZ
STZ+Ins
Proximal Esquerdo
Diâmetro (µm)
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0
Freqüência (%)
0
5
10
15
20
25
30
35
Controle
STZ
STZ+Ins
Distal Direito
Diâmetro (µm)
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0
Freqüência (%)
0
5
10
15
20
25
30
35
Controle
STZ
STZ+Ins
Proximal Direito
Diâmetro (µm)
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0
Freqüência (%)
0
5
10
15
20
25
30
35
Controle
STZ
STZ+Ins
Distal Esquerdo
Diâmetro (µm)
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0
Freqüência (%)
0
5
10
15
20
25
30
35
Controle
STZ
STZ+Ins
Proximal Esquerdo
Diâmetro (µm)
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0
Freqüência (%)
0
5
10
15
20
25
30
35
Controle
STZ
STZ+Ins
Distal Direito
Diâmetro (µm)
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0
Freqüência (%)
0
5
10
15
20
25
30
35
Controle
STZ
STZ+Ins
Proximal Direito
Diâmetro (µm)
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0
Freqüência (%)
0
5
10
15
20
25
30
35
Controle
STZ
STZ+Ins
Figura 30:. Histogramas de distribuição de freqüência do diâmetro mínimo das fibras amielínicas do nervo
frênico dos animais controles (marrom), diabéticos crônicos (STZ, laranja) e diabéticos crônicos tratados com
insulina (STZ+Ins, verde). Painel superior esquerdo – lado direito segmento proximal. Painel superior direito –
lado esquerdo, segmento proximal. Painel inferior esquerdo – lado direito, segmento distal. Painel inferior direito
– lado esquerdo, segmento distal. Não foram observadas diferenças significativas entre os grupos.
DISCUSSÃO
Discussão ______________________________________________________________________________ 81
Tese de Doutorado Omar Andrade Rodrigues Filho
5.1 Dados ponderais
Nossos resultados reproduzem dados prévios do nosso laboratório (RODRIGUES
FILHO, 2003; MIGLIACCIO, 2003; SATO, 2005, CARMO, 2006; OLIVETI, 2007) e de
outros (BESTETTI e cols., 1981; LEE e cols., 2001; REGALIA e cols., 2002), quando
observamos que os ratos diabéticos crônicos não ganham peso como os ratos controles. Existe
uma certa preocupação de alguns autores (SHARMA e cols., 1980) com relação a essa
diferença do ganho de peso, conseqüente a uma menor taxa de crescimento, observada nos
animais diabéticos crônicos, no que diz respeito ao estudo das neuropatias. Esses autores
argumentam que, se o diabete for induzido em animais com idades muito jovens, eles
deixarão de crescer, o que certamente influenciará no crescimento dos nervos e das fibras.
Entretanto, resultados prévios do nosso laboratório, onde investigamos a neuropatia diabética
em nervos somáticos (RODRIGUES FILHO, 2003; CARMO, 2006; OLIVETI, 2007) e
autonômicos (MIGLIACCIO, 2003, Sato, 2005) em ratos diabéticos crônicos, induzidos
exatamente da mesma forma que no presente estudo, mostram que os fascículos crescem
normalmente, atingindo o mesmo tamanho dos fascículos dos ratos controles.
5.2. Diabete experimental
O diabete é uma doença metabólica crônica, que causa complicações secundárias,
das quais a neuropatia periférica é uma das mais comuns. As alterações dos nervos
periféricos, descritas nos humanos, são perda de fibras nervosas, degeneração axonal e
desmielinização segmentar (BEHSE e cols., 1977; DYCK e cols., 1980; DYCK e cols., 1986;
THOMAS & LASCELLES, 1996). Em modelos experimentais, evidências funcionais e
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Tese de Doutorado Omar Andrade Rodrigues Filho
morfológicas de neuropatia periférica têm sido demonstradas (ROBERTSON & SIMA, 1980;
YAGIHASHIY e cols., 1982, OZAKI e cols., 1996).
Animais diabéticos podem ser utilizados como modelos da doença humana.
Entretanto, esses animais apresentam uma grande diversidade na patologia e, de fato,
nenhuma síndrome animal corresponde, precisamente, a nenhum tipo de diabete em humanos
(MORDES & ROSSINI, 1981). Tanto as síndromes espontâneas quanto as induzidas são
extensivamente estudadas, não apenas porque são fascinantes per se, mas também porque
podem oferecer um claro entendimento da natureza do diabete humano (MORDES &
ROSSINI, 1981). Diabete espontâneo tem sido relatado para uma grande variedade de
espécies animais, incluindo bovinos, eqüinos, suínos, carneiros, cães e gatos. Relatos de
diabete espontâneo em roedores eram ausentes, até a descoberta de um tipo de diabete
hereditário de hamster chinês nativo (MEIER, 1960). Embora o diabete espontâneo em
animais seja uma ocorrência comum, a doença está bem caracterizada em apenas poucas
espécies animais, na maioria roedores. Dados de animais de grande porte são escassos; apenas
alguns cães e gatos e poucos primatas foram estudados em detalhes. Animais de laboratório
de pequeno porte, em virtude da sua alta taxa de reprodução e baixo custo, tem sido
responsáveis pela geração de uma grande quantidade de dados. A maioria das síndromes
diabéticas espontâneas em animais é caracterizada por ambos, hiperglicemia e
hiperinsulinemia, mesmo que transitória. A maioria, embora nem todos esses animais, são
obesos (MORDES & ROSSINI, 1981). Dentre os roedores espontaneamente diabéticos, não
obesos, podemos citar o rato BB, que foi descoberto em decorrência de uma mutação
espontânea do rato Wistar (NAKHOODA e cols., 1977). Esses ratos apresentam glicosúria
que se inicia entre 48 e 120 dias de vida e apresentam hiperglicemia, hipoinsulinemia e
hipercetonemia, além de uma dramática lesão inflamatória durante a fase de destruição das
Discussão ______________________________________________________________________________ 83
Tese de Doutorado Omar Andrade Rodrigues Filho
células beta do pâncreas (NAKHOODA e cols., 1977). São vários os relatos de neuropatia
diabética autonômica nessa linhagem de ratos. YAGIHASHI & SIMA (1985) demonstraram
redução do calibre axonal, sugerindo uma axonopatia, em nervos simpáticos de ratos
diabéticos espontâneos BB. Esses mesmos autores demonstraram, posteriormente, diminuição
do tamanho das fibras mielínicas e amielínicas no nervo vago dessa mesma linhagem de ratos
(YAGIHASHI & SIMA, 1986). Posteriormente, MEDORI e cols. (1988), analisando
morfometricamente secções transversais de nervos isquiáticos de ratos diabéticos espontâneos
BB, relataram que, nos segmentos proximais, houve um aumento da área dos axônios,
enquanto que nos segmentos distais, essa área se mostrou diminuída. Os autores concluem
que essas alterações dos calibres axonais estão relacionadas às alterações no transporte
axonal, nesse modelo de diabete.
Muitas técnicas experimentais estão disponíveis para a criação de síndromes
diabéticas em animais de laboratório. Pancreatectomia levando ao diabete foi, sem dúvida,
uma observação “chave” na historia da medicina mas, atualmente, técnicas muito mais
sofisticadas tem sido empregadas com sucesso (MORDES & ROSSINI, 1981). Os dois
agentes químicos mais extensamente estudados são o aloxane e a estreptozotocina (STZ).
Ambas são beta-citotóxicas em doses diabetogênicas e são relativamente livres de efeitos
tóxicos inespecíficos (MORDES & ROSSINI, 1981). Interessantemente, estudos de
neuropatias periféricas em ratos diabéticos, induzidos experimentalmente com STZ, são mais
freqüentes na literatura que aqueles com aloxane. Assim, para que nossos dados pudessem ser
comparados com o grande volume de estudos da literatura, o modelo de indução do diabete
pela injeção da STZ foi escolhido.
As neuropatias periféricas se caracterizam morfologicamente pelo
comprometimento do axônio, da mielina ou de ambos. A polineuropatia sensitiva do diabete
Discussão ______________________________________________________________________________ 84
Tese de Doutorado Omar Andrade Rodrigues Filho
se apresenta como uma síndrome de pequenas fibras, e são em geral caracterizadas por
problemas sensitivos termo-algésicos e vegetativos (CHIMELLI e cols., 1993). A mais
notável alteração foi encontrada nas fibras finas, tanto mielínicas como amielínicas do nervo
sural em humanos, onde há evidências que indicam que, na neuropatia diabética dolorosa,
ocorre diminuição de fibras finas e desordens axonais (MARK e cols., 1976). Em relação ao
sistema nervoso autônomo, HUANG & WALSH (1973) demonstraram redução na densidade
de fibras mielínicas do nervo esplâncnico maior, em pacientes com neuropatia periférica e
MIGLIACCIO (2003) e SATO (2005) observaram, respectivamente, redução de fibras
mielínicas finas nos nervos vagos e simpático-renais de ratos Wistar diabéticos crônicos,
induzidos experimentalmente com o mesmo protocolo utilizado no presente estudo.
O diabete crônico, induzido experimentalmente, pela injeção endovenosa única de
STZ, foi capaz de promover o diabete nos animais utilizados no presente estudo. Essa doença
foi caracterizada pelo aumento da glicemia, quantificada após a indução do diabete e no dia
do experimento, bem como pela observação de polidipsia e poliúria apresentada pelos animais
diabéticos, sem tratamento com insulina, ao longo de todo o experimento.
Em relação ao tratamento com insulina, pacientes com diabete insulino-
dependente, sujeitos à insulinoterapia intensiva para evitar hiperglicemia, podem apresentar
episódios hipoglicêmicos. Estudos experimentais mostram que esses episódios podem levar à
alterações patológicas em nervos periféricos (Sidenius e Jakobsen, 1983; Sidenius e Jakobsen,
1987; Sima e cols., 1993; Yasaki e Dyck, 1990; Yasaki e Dyck, 1991). Apesar de um controle
relativamente bom da glicemia, muitos pacientes diabéticos eventualmente desenvolvem
neuropatia (Biessels e Van Dam, 1997). Para mimetizar a situação humana em um modelo
experimental, o diabete deve ser tratado com insulina e flutuações bruscas da glicemia, bem
como níveis glicêmicos sustentadamente altos ou baixos devem ser evitados.
Discussão ______________________________________________________________________________ 85
Tese de Doutorado Omar Andrade Rodrigues Filho
Nosso modelo, de tratamento dos animais diabéticos com insulina, se mostrou
bastante adequado uma vez que este foi eficiente na correção dos valores de glicemia e no
ganho ponderal desses animais. Podemos afirmar que um bom controle metabólico foi obtido
em nossos animais diabéticos, tratados com insulina, uma vez que o ganho de peso desses
animais foi superponível ao ganho de peso dos animais controles, ao longo do mesmo período
de tempo experimental. Enquanto isso, nossos animais diabéticos crônicos, sem tratamento,
apresentaram ganho ponderal discreto, que, ao final do período experimental, se manifestou
como peso corporal significativamente menor que o dos ratos controles e o dos ratos tratados
com insulina. O peso corporal dos ratos controles foi estatisticamente semelhante ao peso dos
ratos diabéticos crônicos tratados. Esses resultados ponderais são semelhantes aos descritos
por Sharma e cols. (1985), McCallum e cols. (1986) e Britland e cols. (1985).
5.3. Ultraestrutura do nervo frênico
Características morfológicas e morfométricas das fibras mielínicas do nervo
frênico de ratos adultos normais já foram exploradas na literatura por nosso laboratório
(Rodrigues Filho & Fazan, 2006) e por outros (Song et al., 1999; Fraher, 1992; Comerford &
Fotzgerald, 1986), e não diferem dos achados do presente estudo. Por outro lado,
características ultraestruturais do nervo frênico de ratos foram raramente descritas e um
estudo morfométrico detalhado das fibras amielínicas desse nervo, no melhor do nosso
conhecimento, ainda não foi descrito. Song et al., (1999) estudou a ultraestrutura do segmento
distal nervo frênico de ambos os lados, no nível da junção entre a veia cava inferior e o átrio
direito, em apenas dois ratos Wistar adultos. Langford e Schmidt (1983) estudaram as fibras
amielínicas somente do segmento distal esquerdo, imediatamente antes do nervo entrar no
Discussão ______________________________________________________________________________ 86
Tese de Doutorado Omar Andrade Rodrigues Filho
diafragma. Ambos os estudos utilizaram ratos da linhagem Wistar. Dessa forma, é
interessante a discussão dos dados normais do presente estudo, antes do início da discussão
dos dados patológicos.
As características ultraestruturais do epineuro, perineuro e endoneuro descritas no
presente estudo não diferem das descritas por Langford e Schmidt (1983) para o segmento
distal esquerdo do nervo frênico de ratos adultos, com a adição de que tais características são
simétricas, tanto longitudinalmente, quando lateralmente. O epineuro é formado por tecido
conjuntivo denso, com poucos fibroblastos, e vários vasos sangüíneos. O perineuro é
constituído por células achatadas, organizadas em camadas, interconectadas por “tight
junctions”. O endoneuro é constituído de fibras colágenas finas que entremeiam elementos
celulares usuais: fibras mielínicas e amielínicas com suas células de Schwann associadas,
fibroblastos, mastócitos, capilares endoneurais e seus pericitos. Essas características são
típicas da ultraestrutura de nervos em geral (Fazan et al., 1997; Sato et al., 2006).
O número total de fibras amielínicas do nervo frênico de ratos adultos foi de
aproximadamente 200, sem diferença entre os segmentos e lados. Esse valor é semelhante ao
observado por Langford e Schmidt (1983) para o segmento distal esquerdo, em ratos Wistar
adultos, e ao observado por Smith e Rosenheimer (1984) para os segmentos distais, em ratos
Fisher 344. Entretanto, esses valores diferem consideravelmente dos valores descritos por
Song et al., (1999). Esses últimos autores descrevem valores aproximados de 500 fibras
amielínicas no segmento distal esquerdo e 700 fibras amielínicas no segmento distal direito.
Tais diferenças são explicadas pelas diferenças metodológicas entre os estudos em questão. A
metodologia empregada no presente estudo é muito semelhante à descrita por Langford e
Schmidt (1983): perfusão dos animais com solução fixadora contendo glutaraldeído em
tampão cacodilato de sódio, pós-fixação com tetróxido de ósmio em ferrocianeto de potássio,
Discussão ______________________________________________________________________________ 87
Tese de Doutorado Omar Andrade Rodrigues Filho
secção transversal ultrafina contrastada com acetato de uranila e estudo das mesmas em
grades de abertura única, cobertas com filme de formvar. Ambos os estudos utilizaram a
observação direta e contagem de 100 % das fibras presentes em cada nervo. Entretanto, no
estudo de Song et al., (1999), os autores utilizaram grades de microscopia eletrônica de
transmissão com barras, estimaram o número de fibras que estariam encobertas pelas barras, e
acrescentaram essa estimativa nas contagens. Esse procedimento deve ser a causa de um
número maior de fibras descritas por esses autores, comparado aos nossos resultados e aos de
Langford e Schmidt (1983). Os valores de densidade das fibras amielínicas dos nervos
frênicos de ratos Wistar adultos normais (em torno de 6000 fibras/mm
2
) estão sendo descritos
no presente trabalho pela primeira vez na literatura. Ratos Fisher 344 (Smith e Rosenheimer,
1984) apresentam densidade de fibras amielínicas, nos segmentos distais, em torno de 12000
fibras/mm
2
, sendo a área fascicular média desses nervos (20500 µm
2
) menor que a por nós
observada (em torno de 28000 µm
2
).
O diâmetro mínimo médio das fibras amielínicas do nervo frênico de ratos adultos
foi de aproximadamente 0,4 µm, sem diferença entre os segmentos e lados estudados. Esse
valor é semelhante ao descrito para o segmento distal direito porém está um pouco acima do
descrito para o segmento distal esquerdo por Song et al., (1999). Novamente, essas diferenças
podem se dar por causa das diferenças na metodologia de ambos os estudos. Além das
diferenças já mencionadas na análise das grades, o método morfométrico empregado na
obtenção dos diâmetros das fibras também difere substancialmente do utilizado no presente
estudo. Song et al., (1999) traçaram o perímetro da fibra com um cursor conectado a um
computador. O computador calculava o número de pontos de uma “matrix padrão” que se
localizavam no interior do traçado do perímetro da fibra. Através desse número de pontos, o
computador então calculava o diâmetro de um círculo perfeito que tivesse o mesmo número
Discussão ______________________________________________________________________________ 88
Tese de Doutorado Omar Andrade Rodrigues Filho
de pontos do interior do traçado do perímetro da fibra. Além disso, o estudo do diâmetro das
fibras foi realizado em apenas um animal. Os valores de área média das fibras amielínicas dos
nervos frênicos de ratos adultos normais (em torno de 0,28 µm
2
) estão sendo descritos no
presente trabalho pela primeira vez na literatura.
Também descrevemos pela primeira vez, os valores de porcentagem da área
fascicular ocupada pelas fibras amielínicas (em torno de 7 %), bem como a relação entre o
número de fibras mielínicas e amielínicas (em torno de 2,7) nos nervos frênicos de ratos
adultos normais.
A distribuição dos diâmetros das fibras amielínicas com valores entre 0,1 e 1,5
µm descrita por Langford e Schmidt (1983) para o segmento distal esquerdo se assemelha aos
nossos resultados para os segmentos distais. Tais autores, entretanto, não demonstraram
graficamente essa distribuição, como no presente estudo, nem relataram o pico de freqüência
mais proeminente. Por outro lado, Song et al., (1999) relataram pico de freqüência em 0,3 µm
nos segmentos distais de ambos os lados, sem relatar os valores extremos e sem demonstrar
graficamente a distribuição. O presente estudo adiciona à literatura a distribuição das fibras
amielínicas do nervo frênico de ratos adultos nos segmentos proximais e distais de ambos os
lados.
O achado ultraestrutural mais importante e totalmente original do presente estudo,
com relação aos dados de normalidade do nervo frênico de ratos adultos, é que,
morfometricamente, as fibras amielínicas são simétricas tanto longitudinalmente, quanto
lateralmente. Esse dado difere dos achados morfométricos das fibras mielínicas, que mostram
assimetria longitudinal e lateral importantes (Fraher, 1992; Rodrigues Filho e Fazan, 2006).
Discussão ______________________________________________________________________________ 89
Tese de Doutorado Omar Andrade Rodrigues Filho
5.4. Ultraestrutura do nervo frênico no diabete crônico
O presente estudo demonstrou alterações ultraestruturais importantes no nervo
frênico de ratos diabéticos crônicos induzidos pela STZ. A presença de características
ultraestruturais de atrofia axonal nas fibras mielínicas de grande calibre confirmou nossos
resultados morfométricos prévios, em nível de microscopia de luz (Rodrigues Filho e Fazan,
2006). Entretanto, alterações mais evidentes estiveram presentes nas fibras mielínicas finas e
nas fibras amielínicas. Os vasos capilares endoneurais também se apresentaram alterados em
decorrência do diabete experimental utilizado no presente estudo, com sinais importantes de
espessamento das paredes e colabamento da luz capilar.
Segundo a revisão recente de Hoitsma e cols. (2004), as neuropatias periféricas
podem ser categorizadas de acordo com o envolvimento funcional das fibras ou de acordo
com o diâmetro e a condução nervosa dessas fibras. Em relação à função, três tipos de fibras
periféricas podem ser distinguidas: somato-motoras, somato-sensitivas e fibras autonômicas.
Funções sensoriais incluem sensibilidade ao tato, vibração, temperatura e dor. Funções
autonômicas incluem sudorese, movimentos do tudo digestótrio, lacrimação, funções sexuais,
controle da pressão arterial e variabilidade da freqüência cardíaca. De acordo com o tamanho,
as fibras são distinguidas em: mielínicas de grande calibre (A-alfa e A-beta), mielínicas de
calibre intermediário (A-gama), mielínicas de pequeno calibre (A-delta) e amielínicas (fibras
C). Fibras A-alfa e A-beta carregam funções motoras e sensibilidade da vibração e do tato.
Fibras A-gama carregam função motora do fuso neuromuscular. Fibras A-delta e fibras C
carregam sensibilidade à temperatura e dor e funções autonômicas. As chamadas neuropatias
de fibras finas afetam, preferencialmetne, as fibras mielínicas de pequeno calibre e as fibras
amielínicas, mantendo as fibras mielínicas de grande calibre relativamente intactas. Em
Discussão ______________________________________________________________________________ 90
Tese de Doutorado Omar Andrade Rodrigues Filho
alguns casos de neuropatias de fibras finas, ela é parte de uma doença de base. Dentre as
causas adquiridas mais citadas, o diabete aparece sempre como primeiro na lista. Entretanto,
nenhuma etiologia específica é identificada na maioria dos pacientes, especialmente nos
idosos (Hoitsma e cols., 2004). A neuropatologia dessa entidade ainda se encontra quase que
totalmente inexplorada, mas, alguns estudos experimentais suportam o papel da isquemia
como uma das possíveis causas. Em um modelo animal de infarto arterial, Parry e Brown
(1982) demonstraram que as fibras de menor calibre são mais vulneráveis à isquemia que as
fibras de maior calibre. Nossos dados morfológicos suportam tal achado, uma vez que nos
animais diabéticos crônicos, demonstramos envolvimento das fibras mielínicas finas e das
fibras amielínicas, associadas a alterações dos vasos capilares, suficientes para causar
isquemia endoneural. Recentemente, Malik e cols. (2005) demonstrou, no nervo sural de
pacientes diabéticos com neuropatia, espessamento da membrana basal, hiperplasia endotelial
e estreitamento da luz. Todas essas alterações estiveram presentes em nosso material,
indicando semelhança do nosso modelo experimental com a doença humana.
Não encontramos relatos de literatura sobre um estudo ultraestrutural,
morfológico e/ou morfométrico, do nervo frênico quer em pacientes diabéticos, quer em
modelos experimentais de diabete. O diagnóstico neuropatológico da neuropatia de fibras
finas tem tradicionalmente sido dependente do exame ultraestrutural de biópsias de nervos
(Hoitsma e cols., 2004). Entretanto, as anormalidades podem ser súbitas e de difícil
reconhecimento, e esse estudo requer microscopia eletrônica de transmissão, com estudos de
alta demanda técnica e morfometria precisa (Hoitsma e cols., 2004). Sabe-se que técnicas
morfométricas, especialmente aquelas para a medida de fibras amielínicas, demandam um
exaustivo trabalho do pesquisador e envolvem um considerado tédio e grande consumo de
tempo (Tomasch, 1983; Auer, 1994). Talvez por essas razões, são raros os estudos
Discussão ______________________________________________________________________________ 91
Tese de Doutorado Omar Andrade Rodrigues Filho
morfométricos de fibras amielínicas, tanto em pacientes diabéticos, quanto em modelos
experimentais dessa doença.
Nossos resultados morfométricos mostraram aumento do número de fibras
amielínicas nos animais diabéticos crônicos, bem como maior área média e diâmetro mínimo
médio dessas fibras nesse grupo. Entretanto, a porcentagem da área fascicular ocupada pelas
fibras amielínicas e a relação entre o número de fibras mielínicas e amielínicas se mostrou
reduzida nos animais diabéticos crônicos. Esses resultados, associados, sugerem a presença de
degeneração das fibras amielínicas de pequeno calibre, o que desvia os valores médios para
valores maiores. O discreto desvio dos histogramas de distribuição de freqüência dessas fibras
no grupo diabético crônico, também fala a favor dessa perda das fibras de pequeno calibre. O
maior número de fibras amielínicas pode indicar tentativa de regeneração dessas fibras mas,
como não há redução do número de fibras mielínicas e há redução da relação numérica entre
as fibras mielínicas e amielínicas, essa regeneração não esta acontecendo de forma suficiente.
Bestetti e cols. (1981) estudou o nervo frênico de ratos diabéticos, 12 meses após
a indução do diabete pela STZ. Os autores descrevem a presença de lesões no citoplasma das
células de Schwann, sem alterações nos axônios. Entretanto, o autor não realizou morfometria
das fibras amielínicas. Walker e cols. (1999) realizou estudo morfométrico das fibras
amielínicas do nervo tibial de ratos Sprague-Dawley, diabéticos agudos, 27 dias após a
indução pela STZ. Esse autor não evidenciou alterações dos vasos capliares nem diferenças
significativas nos parâmetros morfométricos das fibras amielínicas entre os grupos controle e
diabético agudo. Esses resultados sugerem que as alterações descritas no presente estudo são
características do diabete experimental crônico.
Discussão ______________________________________________________________________________ 92
Tese de Doutorado Omar Andrade Rodrigues Filho
5.5. Papel do tratamento com insulina na ultraestrutura do nervo frênico no diabete
crônico
Pacientes com diabete insulino-dependente, sujeitos à insulinoterapia intensiva
para evitar hiperglicemia, podem apresentar episódios hipoglicêmicos. Estudos experimentais
mostram que esses episódios podem levar à alterações patológicas em nervos periféricos
(Sidenius e Jakobsen, 1983; Sidenius e Jakobsen, 1987; Sima e cols., 1993; Yasaki e Dyck,
1990; Yasaki e Dyck, 1991). Apesar de um controle relativamente bom da glicemia, muitos
pacientes diabéticos eventualmente desenvolvem neuropatia (Biessels e Van Dam, 1997).
Para mimetizar a situação humana em um modelo experimental, o diabete deve ser tratado
com insulina e flutuações bruscas da glicemia, bem como níveis glicêmicos sustentadamente
altos ou baixos devem ser evitados.
Nosso modelo de tratamento dos animais diabéticos, com insulina, se mostrou
bastante adequado uma vez que este foi eficiente na correção dos valores de glicemia e no
ganho ponderal desses animais. Podemos afirmar que um bom controle metabólico foi obtido
em nossos animais diabéticos, tratados com insulina, uma vez que o ganho de peso desses
animais foi superponível ao ganho de peso dos animais controles, ao longo do mesmo período
de tempo experimental. Enquanto isso, nossos animais diabéticos crônicos, sem tratamento,
apresentaram ganho ponderal discreto, que, ao final do período experimental, se manifestou
como peso corporal significativamente menor que o dos ratos controles e o dos ratos tratados
com insulina. O peso corporal dos ratos controles foi estatisticamente semelhante ao peso dos
ratos diabéticos crônicos tratados. Esses resultados ponderais são semelhantes aos descritos
por Sharma e cols. (1985), McCallum e cols. (1986) e Britland e cols. (1985).
Discussão ______________________________________________________________________________ 93
Tese de Doutorado Omar Andrade Rodrigues Filho
Existem alguns relatos que descrevem um aumento no número de axônios
degenerados nos nervos periféricos de animais diabéticos, tratados com insulina (Bhoyrul e
cols., 1988; Sharma e cols., 1985). Nossos dados não reproduziram esses achados, indo ao
encontro com os dados de McCallum e cols. (1986) que também não evidenciaram aumento
no número de axônios degenerados, em nervos tibiais de ratos diabéticos tratados com
insulina. Outros autores descrevem a perda de fibras mielínicas em alguns nervos de animais
diabéticos tratados com insulina (Sharma e cols., 1985) e, mais uma vez, nossos dados não
reproduziram essas descrições. Entretanto, tais estudos se referem às fibras mielínicas e não
encontramos na literatura, descrições de estudos que envolvem ultraestrutura de nervos e o
papel do tratamento com insulina nessa estrutura.
São vários os relatos da existência de uma neuropatia decorrente de hipoglicemia
experimental (Mohseni e Hildebrand, 1998a; Sidenius e Jakobsen, 1983; Mohseni e
Hildebrand, 1998b). Nesses estudos, os autores descrevem, como característica marcante
dessa neuropatia, uma degeneração axonal, algumas vezes acompanhada de desaranjos na
bainha de mielina. Esses dados, se somados aqueles outros relatos, de um número aumentado
de figuras de degeneração axonal em nervos periféricos de ratos diabéticos tratados com
insulina (Bhoyrul e cols., 1988; Sharma e cols., 1985), sugerem que, nos ratos tratados com
insulina, aqueles que desenvolvem hipoglicemia, podem apresentar degeneração axonal. É
importante salientar, entretanto, que Yasaki e Dyck (1990) demonstraram a ocorrência de
neuropatia hipoglicêmica experimental, com degeneração de fibras nervosas, apenas em
níveis hipoglicêmicos muito severos, mantidos por pelo menos 12 horas e em ratos jovens.
Nossos resultados morfométricos ultraestruturais não mostraram diferenças
significativas, quando comparamos os nervos frênicos dos ratos diabéticos com e sem
tratamento pela insulina. Tais resultados estão a favor das descrições de que o tratamento com
Discussão ______________________________________________________________________________ 94
Tese de Doutorado Omar Andrade Rodrigues Filho
insulina é capaz de corrigir o ganho de peso e as alterações metabólicas do animais diabéticos,
sem, entretanto, corrigir e/ou prevenir a lesão das fibras finas, causada pelo diabete induzido
pela STZ. Interessante lembrar que o tratamento com insulina corrige a lesão axonal das fibras
mielínicas de grande calibre, causada pelo diabete induzido pela STZ (Sharma e cols., 1985;
Bhoyrul E cols., 1988; Britland e cols., 1985; McCallum e cols., 1986), bem como a
distribuição do diâmetro mínimo dos axônios, uma vez que essa distribuição apresenta forma
bimodal, como a observada nos controles, diferente da distribuição unimodal que aparece nos
nervos dos ratos diabéticos crônicos, sem tratamento (Rodrigues Filho e Fazan, 2006).
RESUMO
Resumo _______________________________________________________________________________ 96
Tese de Doutorado Omar Andrade Rodrigues Filho
Estudos em nível de microscopia de luz do nervo frênico foram realizados em nosso
laboratório, para investigar a presença de neuropatia desse nervo, devido ao diabete
experimental crônico, induzido por estreptozotocina (STZ). Demonstramos que as fibras
mielínicas, principalmente as de grande calibre, são afetadas pelo diabete crônico
experimental. Entretanto, não existem relatos sobre as alterações das fibras amielínicas do
nervo frênico nesse modelo de diabete experimental. Nosso objetivo, com o presente estudo,
foi realizar uma avaliação morfométrica ultraestrutural do nervo frênico de ratos com diabete
crônico induzido experimentalmente, com e sem tratamento com insulina. Os segmentos
proximais e distais dos nervos frênicos de ratos com diabete crônico (12 semanas), induzido
pela injeção endovenosa única de STZ, foram preparados com técnicas histológicas
convencionais para a análise em nível de microscopia eletrônica de transmissão. Animais
controle receberam injeção de veículo (tampão citrato) e animais diabéticos crônicos tratados,
receberam uma dose diária de insulina subcutânea, ao anoitecer. Secções transversais
ultrafinas dos nervos frênicos foram observadas em um microscópio eletrônico de transmissão
acoplado a uma câmera digital de alta resolução. Campos microscópicos adjacentes da área
endoneural dos fascículos foram obtidos manualmente, sem sobreposição dos mesmos. As
fibras amielínicas presentes em cada campo microscópico foram identificadas visualmente e
contadas. A análise morfométrica das fibras amielínicas foi realizada com o auxílio do
programa KS 400, versão 2.0. Nossos resultados mostraram que não houve diferença
significativa entre os parâmetros morfométricos das fibras amielínicas quando comparados
segmentos de um mesmo lado ou ambos os lados, em um mesmo grupo experimental. Entre
os grupos experimentais, observamos, nos animais diabéticos de ambos os grupos, alterações
ultraestruturais significativas, tais como hiperplasia capilar e espessamento da membrana
basal dos mesmos. Tanto as fibras mielínicas quanto as amielínicas se mostraram afetadas
Resumo _______________________________________________________________________________ 97
Tese de Doutorado Omar Andrade Rodrigues Filho
pelo diabete crônico. As fibras mielínicas de grande calibre apresentaram sinais de atrofia
axonal, com afrouxamento da bainha de mielina. Nas fibras mielínicas de menor calibre,
observamos a presença tanto de sinais de atrofia axonal, com fibras de bainha muito espessa
em relação ao tamanho do axônio, bem como fibras com sinais de desmielinização. Nas fibras
amielínicas, muitas vezes, observamos células de Schwann com vacúolos citoplasmáticos e,
algumas vezes, a presença de prolongamentos de células de Schwann, sem envolver fibras
amielínicas. A morfometria mostrou aumento do numero de fibras amielínicas nos animais
diabéticos em ambos os grupos, bem como maior área média e diâmetro mínimo médio dessas
fibras nesses grupos. Entretanto, a porcentagem da área fascicular ocupada pelas fibras
amielínicas e a relação entre o número de fibras mielínicas e amielínicas se mostrou reduzida
nos animais diabéticos crônicos. Esses resultados sugerem a presença de degeneração das
fibras amielínicas de pequeno calibre, o que desvia os valores médios para valores maiores. O
maior número de fibras amielínicas pode indicar tentativa de regeneração dessas fibras, mas,
como não há redução do número de fibras mielínicas e há redução da relação numérica entre
as fibras mielínicas e amielínicas, essa regeneração não está acontecendo de forma suficiente
para manter a relação numérica entre as fibras constante. Não houve diferença entre os
animais que receberam tratamento com insulina e os que não receberam. Assim o diabete
crônico, induzido experimentalmente, foi capaz de afetar as fibras amielínicas dos nervos
frênicos de ratos e o tratamento com insulina não interferiu com esse processo.
ABSTRACT
Abstract _______________________________________________________________________________ 99
Tese de Doutorado Omar Andrade Rodrigues Filho
Streptozotocin (STZ) induced diabetes is known to cause a reduction of both conduction
velocity and axon caliber in rat nerves and also a decrease in muscle fiber size. In the present
study we investigated the phrenic nerve neuropathy, due to experimental diabetes induced by
STZ and the evolution of this neuropathy in diabetic rats treated with insulin. Proximal and
distal segments of the phrenic nerves were evaluated with the aid of a digital transmission
electron microscope (TEM), from rats rendered diabetic, for 12 weeks, by injection of STZ.
Control rats received vehicle. Treated rats received a single subcutaneous injection of insulin
on a daily basis. Our results show that the phrenic nerves of diabetic rats present lesions of the
myelinated and unmyelinated fibers, as well as the endoneural vessels and Schwann cells
nuclei. The main alterations were the presence of axonal atrophy with loose myelin sheaths on
the large caliber myelinated fiber. The small myelinated fibers presented signs of axonal
atrophy or demyelination. Basement membrane thickening and signs of endothelial
hyperplasia were present on the endoneural blood vessels of both diabetic groups but were
more sever on the untreated animals. In the insulin treated animals, most of the alterations
were seen on the small myelinated fibers and were related to demyelination signs.
Unmyelinated fibers morphometry showed a larger number of fibers as well as larger average
fiber area and diameter in both diabetic groups, compared to controls. Nevertheless, there was
a reduction on the unmyelinated fibers percentage of occupancy and the ratio between
myelinated and unmyelinated fiber numbers in both diabetic groups. No differences were
found between both diabetic groups. In conclusion, the phrenic nerve is affected by the
experimental diabetes and the conventional insulin treatment was not capable to prevent the
small fiber neuropathy identified by TEM.
CONCLUSÃO
Conclusão ______________________________________________________________________________ 101
Tese de Doutorado Omar Andrade Rodrigues Filho
Nossos resultados permitem as principais conclusões:
1- Morfometricamente, as fibras amielínicas dos nervos frênicos de ratos Wistar
adultos machos, são simétricas tanto longitudinalmente, quanto lateralmente.
2- O diabete crônico, induzido experimentalmente, pela injeção endovenosa única
de STZ, foi capaz de promover uma neuropatia de fibras finas, nos nervos
frênicos de ratos Wistar adultos machos. Essa neuropatia foi similar nos
segmentos proximais e distais, bem como nos lados direito e esquerdo desses
nervos. Além disso, os vasos capilares endoneurais foram estruturalmente
afetados nesse modelo de diabete experimental. O tratamento convencional
com insulina foi capaz de corrigir o ganho de peso e as alterações metabólicas
dos animais diabéticos, sem, entretanto, corrigir e/ou prevenir a lesão das
fibras finas e dos vasos capilares, causada pelo diabete induzido pela STZ.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Referências Bibliográficas ________________________________________________________________ 103
Tese de Doutorado Omar Andrade Rodrigues Filho
ARISON, R. M., CIACCIO, E. I., GLITZER, M. S., CASSARO, J. A., PRUSS, M.P. (1967).
Light and electron microscopy of lesions in rats rendered diabetic with streptozotocin.
Diabetes 16:51.
AUER RN. Automated nerve fiber size and myelin sheath measurement using microcomputer-
based digital image analysis: theory, method and results. J Neurosci Methods 1994, 51:
229-283.
BAILEY, C. C., BAILEY, O. T. (1943) .The production of diabetes mellitus in rabbits with
alloxan. J.A.M.A. 122:1165.
BEHSE F, BUCHTHAL F, CARLSEN F. Nerve biopsy and conduction studies in diabetic
neuropathy. J Neurol Neurosurg Psychiatry 1977, 40: 1072-1082.
BERTHOLD CH. Morphology of normal peripheral axons. In: The axon – Structure, Function
and Pathophysiology, edited by Waxman SG, Kocsis JD, Stys PK. Oxford University
Press, New York, 1995.
BESTETTI, G. AND ROSSI, G.L. (1982). Hypothalamic changes in diabetic Chinese
hamsters. A semiquantitative, light and electron microscopic study. Lab. Invest., 47, 516–
522.
BHOYRUL S, SHARMA AK, STRIBLING D, MIRRLEES DD, PETERSON RG, FARL
MO, THOMAS PK. Ultrastructural observations on myelinated fibers in experimental
Referências Bibliográficas ________________________________________________________________ 104
Tese de Doutorado Omar Andrade Rodrigues Filho
diabetes: effect of the aldose reductase inhibition ponalrestat given alone or in
conjunction with insulin therapy. J Neurol Sci 1988, 85: 131-147.
BIESSELS GJ, VAN DAM PS. Diabetic neuropathy: pathogenesis and current treatment
perspectives. Neurosci Res Commun 1997, 20: 1-10.
BRANNAGAN TH, PROMISLOFF RA, MCCLUSKEY LF, MITZ KA. Proximal diabetic
neuropathy presenting with respiratory weakness. J Neurol Neurosurg Psychiatry 1999,
67: 539-541.
BRITLAND ST, SHARMA AK, DUGUID IG, THOMAS PK. Ultrastructural observations on
myelinated fibers in the tibial nerve of streptozotocin-diabetic rats: effect of insulin
treatment. Life Support Syst 1985, 3 Suppl 1: 524-529.
BRITLAND, S. T., SHARMA, A. K., DUGUID, I. G. M., THOMAS, P. K. (1986).
Ultrastructural observations on myelinated fiber size in the tibial nerve os streptozotocin-
diabetic rats: Effects of insulin treatment. Life support Systems. Supplement. Proc. XII
Ann. Mtg. Eur. Soc. Artif. Org. (in press)
BROSKY, G., LOGOTHETOPOULOS, J. (1969). Streptozotocin diabetes in the mouse and
guinea pig. Diabetes 18:606.
BROWN, M. J., SUMNER, A. J., GREENE, D. A, DIAMOND, S. M., ASBURY, A. K.
(1980). Distal neuropathy in experimental diabetes mellitus. Ann. Neurol. 8:168.
Referências Bibliográficas ________________________________________________________________ 105
Tese de Doutorado Omar Andrade Rodrigues Filho
CAUSEY G, BARTON AA. The cellular component of the endoneurium of peripheral nerve.
Brain 1959, 82: 594-598.
CHASE MR, RANSON SW. The structure of the roots, trunk and branches of the vagus nerve.
J Comp Neurol 1914, 24: 31-37.
CHASE MR. An experimental study of the vagus nerve. J Comp Neurol 1916, 26: 421-431.
CHIMELLI L ; EMT, N. . Neuropatia Diabetica. I - Conceito, Epidemiologia, Classificação,
Quadro Clínico e Eletroneuromiográfico. Estudo de 210 Casos. REV BRAS
NEUROLOGIA, RIO DE JANEIRO, v. 28, n. 3, p. 69-73, 1992
CLARK, H. B., SCHMIDT, R. E. (1984). Identification of dystrophic sympathetic neurons in
experimental diabetic autonomic neuropathy. Brain Res 292:390.
COMERFORD T, FITZGERALD MJ. Motor innervation of rodent diaphragm. J Anat 1986,
149: 171-175.
DE CARVALHO MA, MATIAS T, EVANGELHISTA T, PINTO A, SALES LUIS ML.
Bilateral phrenic nerve neuropathy in a diabetic patient. Eur J Neurol 1996, 3:481-482.
DE SOUZA RR, WATANABE IS, CHADI G, DE ARAÚJO MV. Number and thickness of
myelinic fibers of the phrenic nerve of young and aged rats. Rev Bras Biol 1992, 52: 79-
82.
Referências Bibliográficas ________________________________________________________________ 106
Tese de Doutorado Omar Andrade Rodrigues Filho
DUCHEN, L. W., ANJORIN., WALKINS, P. J., MACKAY, J. D. (1980). Pathology of
autonomic neuropathy in diabetes mellitus. Ann Intern Med 92:301-303.
DUNN, S. J., MCLETCHI, N. G. B. (1943). Experimental alloxan diabetes in the rat. Lancet
2:348.
DYCK PJ, LAIS A, KARNES JL, O’BRIEN P, RIZZA R. Fiber loss is primary and multifocal
in sural nerves in diabetic polyneuropathy. Ann Neurol 1986, 19: 425-439.
DYCK PJ, GIANNINI C. Phatologic alteration in the diabetic neuropaties of human.
Neurophatol Exp Neurol 1996; 55: 1181-93
DYCK PJ, SHERMAN WR, HALLCHER LM, SERIVCA FJ, O’BRIEN PC, GRINA LA,
PALUMBO PJ, SWANSON CJ. Human diabetic endoneurial sorbitol, fructose, and myo-
inositol related to sural nerve morphometry. Ann Neurol 1980, 8: 590-596.
ESPIR MLE, HARDING DTC. Apparatus for measuring and counting myelinated nerve
fibers. J Neurol Neurosurg Psychiatry 1961, 24: 287-290.
EVANS, J. S., GERRITSEN, G. C., MANN, K. M., OWEN, S. P. (1965). Antitumor and
hyperglicemic activity of streptozotocin (NSC-37971) and its cofactor, U-15,744. Cancer
Chemother 48:1.
Referências Bibliográficas ________________________________________________________________ 107
Tese de Doutorado Omar Andrade Rodrigues Filho
FAZAN VPS, LACHAT JJ. Qualitative and quantitative morphology of the vagus nerve in
experimental Chagas’ disease in rats: A light microcopy study. Am J Trop Med Hyg
1997, 57: 672-677.
FAZAN VPS, SALGADO HC, BARREIRA AA. A descriptive and quantitative light and
electron microscopy study of the aortic depressor nerve in normotensive rats.
Hypertension 1997, 30: 693-698.
FAZAN VPS, SALGADO HC, BARREIRA AA. Aortic depressor nerve myelinated fibers in
acute and chronic experimental diabetes. Am J Hypertens 2006; 19: 153-60.
FERRIERE G, DENEF JF, RODRIGUEZ J, GUZZETA F. Morphometric studies of normal
sural nerves in children. Muscle & Nerve 1985, 8: 697-704.
FISHER MA, LEEHEY DJ, GANDHI V, ING T. Phrenic nerve palsies and persistent
respiratory acidosis in a patient with diabetes mellitus. Muscle & Nerve 1997, 20:900-
902.
FRAHER JP. Myelin-axon relationships in the rat phrenic nerve: longitudinal variation and
lateral asymmetry. J Comp Neurol 1992, 323: 551-557.
FRAHER JP. On methods of measuring nerve fibers. J Anat 1980, 130: 139-151.
Referências Bibliográficas ________________________________________________________________ 108
Tese de Doutorado Omar Andrade Rodrigues Filho
FRIEDE RL, SAMORAJSKI T. Relationship between the number of myelin lamellae and
axon circumference in fibers of vagus and sciatic nerves of mice. J Comp Neurol 1967,
130: 223-232.
GARDNER, E., GRAY. D. J., O’RAHILLY, R. Anatomia: estudo regional do corpo
humano. 2.ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 1967.
GOLD, G., MANNING, M., HELDT, A., NOWLAIN, R., PETTIT, J. R., GRODSKY, G. M.
(1981). Diabetes induced with multiple subdiabetogenic doses of streptozotocin. Lack of
protection by exogenous superoxide dismutase. Diabetes 30: 634.
GOMORI, G., GOLDNER, M. G. (1943). Production of diabetes mellitus in rats by alloxan.
Proc. Soc. Exp. Biol. 54:287.
GOTTSHALL J. The diaphragm of the rat and its innervation. Muslce fibers composition;
perikarya and axons of efferent and afferent neurons. Anat Embryol 1981, 161: 405-417.
GRAY, H. Anatomy of the Human Body. Philadelphia: Lea & Febiger, 1918.
GREENE EC (1963) In: Anatomy of the Rat, Vol XXVII. New York: Hafner.
GUY, R. J. C., DAWSON, J. L., GARRET, J. R., et al. (1984). Diabetic gastroparesis from
autonomic neuropathy. Surgical considerations and changes in vagus nerve morphology.
J. Neurol. Neurosurg Psychiatry 47:686.
Referências Bibliográficas ________________________________________________________________ 109
Tese de Doutorado Omar Andrade Rodrigues Filho
HEBB CO, KRNJEVIC K, SILVER A. Acetylcholine and choline acetyltransferase in the
diaphragm of the rat. J Physiol 1964, 171: 504-513.
HEDGER JH, WEBBER RH. Anatomical study of the cervical sympathetic trunk and ganglia
in the albino rat (Mus novergicus albinos). Acta Anat 1976, 96: 206-217.
HEIMER, L. (1995). The human brain and spinal cord. Functional neuroanatomy and
dissection guide. 2
nd
edition, New York Springer-Verlag, p. 241-265.
HOFFMAN HH, SCHNITZLEIN HN. The number of nerve fibers in the vagus nerve of man.
Anat Rec 1961, 139: 429-435.
HUANG C, KIM Y, CARAMORI M.L.A, FISH, A.J, RICH, S.S, MILLER M.E, RUSSELL,
G.B, MAUER, M. Cellular basis of diabetic nephropathy. II. The transforming growth
factor-_ system and diabetic nephropathy lesions in type 1 diabetes. Diabetes 51:3577–
3581, 2002
JACOBS JM, LOVE S. Qualitative and quantitative morphology of human sural nerve at
different ages. Brain 1985, 108: 897-924.
JAKOBSEN J. Axonal dwindling in early experimental diabetes. I. A study of cross sectioned
nerves. Diabetologia 1976a, 12: 539-546.
JERÔNIMO, André ; JERONIMO, Cláudia A Domingues ; RODRIGUES FILHO, O. A. ;
FAZAN, Valéria Paula Sassoli ; SANADA, Luciana Sawuri . Microscopic anatomy of
Referências Bibliográficas ________________________________________________________________ 110
Tese de Doutorado Omar Andrade Rodrigues Filho
the sural nerve in the postnatal developing rat: a longitudinal and lateral symmetry study.
Journal of Anatomy, v. 206, p. 93-99, 2005.
JAKOBSEN J. Axonal dwindling in early experimental diabetes. II. A study of isolated nerve
fibers. Diabetologia 1976b 12: 547-553.
JAKOBSEN, J. (1979). Early and preventable changes of peripheral nerve structure and
function in insulin-deficient diabetic rats. J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry 42:509.
JOHNSON, D. D. (1950). Alloxan administration in the guinea pig: A study of the
histological changes in the islands of Langerhans, the blood sugar fluctuations, and
changes in the glucose tolerance. Endocrinology 46:135.
JORDAN, W. R. (1936). Neuritic manifestations in diabetes mellitus. Arch. Intern. Med. 57:
307.
JUNNOD, A., LAMBERT, A. E., ORCI, L., PICTEC, R., GONET, A. E., RENOLD, A. E.
(1967). Studies of the diabetogenic action of streptozotocin. Proc. Soc. Exp. Biol. Med.
126:201.
JUNNOD, A., LAMBERT, A. E., STAUFACHER, W., RENOLD, A. E. (1969).
Diabetogenic action of streptozotocin: Relationship of dose to metabolic response. J.
Clin. Invest. 48:2129.
Referências Bibliográficas ________________________________________________________________ 111
Tese de Doutorado Omar Andrade Rodrigues Filho
KOSTREVA DR, PONTUS SP. Hepatic vein, hepatic parenchyma and inferior vena caval
mechanoreceptors with phrenic afferents. Am J Physiol 1993b, 265: G15-G20.
KOSTREVA DR, PONTUS SP. Pericardial mechanoreceptors with phrenic afferents. Am J
Physiol 1993a, 264: H1823-H1846.
KRISTENSSON, K., NORDBORG, C., OLSSON, Y., SOURANDER, P. (1971). Cahnges in
the vagus nerve in diabetes mellitus. Acta Pathol Microbiol Scand 79A: 684-685.
KUSHNER, B., LAZAR, M., FURMAN, M., LIEBERMAN, T. W., LEOPOLD, I. H.
(1969). Resistance of rabbits and guinea pigs to the diabetogenic effect of streptozotocin.
Diabetes 18:542.
LANDFORD LA, SCHMIDT RF. An electron microscopic analysis of the left phrenic nerve
in the rat. Anat Rec 1983, 205: 207-213.
LASKOWSKI MB, NORTON AS, BERGER PK. Branching patterns of the rat phrenic nerve
during development and reinnervation. Exp Neurol 1991, 113: 212-220.
LAZAROW, A. (1947). Alloxan diabetes in the mouse. J. Lab Clin Med 32: 1258.
LAZAROW, A. (1949) Factors controlling the development and progression of diabetes.
Physiol. Rev. 28:48.
Referências Bibliográficas ________________________________________________________________ 112
Tese de Doutorado Omar Andrade Rodrigues Filho
LEE J.C, et al. Efficacy and reliability of fundus digital camera as a screening tool for
diabetic retinopathy in Kuwait . Journal of Diabetes and its Complications , Volume 17
, Issue 4 , Pages 229 - 233 K . AlSabti
LOPEZ-PLANA C, SAUTET JY, PONS J, NAVARRO G. Morphometric study of the
recurrent laryngeal nerve in young normal horses. Res Vet Sci 1993, 55: 333-337.
LUBINSKA L, WARYSZEWSKA J. Fibre population of the phrenic nerve of rat: changes of
myelinated fibre dimensions along the nerve and characteristics of axonal branching.
Acta Neurobiol Exp 1974, 34: 525-541.
LUKENS, F. D. W. (1948). Alloxan diabetes. Physiol Ver 28:304.
MALAISSE, W. J. (1982). Alloxan toxicity to the pancreatic B-cell. A new hypothesis.
Biochem Pharmacol 31:3527.
MALIK, S., et al. Cardiovascular Disease in U.S. Patients With Metabolic Syndrome,
Diabetes, and Elevated C-Reactive Protein. Diabetes Care 2005 28:690-693.
MANCINI M, FILIPPELLI M, SEGHIERI G, IANDELLI I, INNOCENTI F, DURANTI R,
SCANO G. Respiratory muscle function and hypoxic ventilatory control in patients with
type 1 diabetes. Chest 1999, 115: 1553-1562.
MANSFORD, K. R.L., OPIE, L. (1968). Comparison of metabolic abnormalities in diabetes
mellitus induced by streptozotocin or alloxan. Lancet 1:670.
Referências Bibliográficas ________________________________________________________________ 113
Tese de Doutorado Omar Andrade Rodrigues Filho
MATTINGLY GE, FISCHER VW. Peripheral nerve axonal dwindling with concomitant
myelin sheath hypertrophy in experimentally induced diabetes. Acta Neuropathol 1985,
68: 149-154.
MAYR R, GOTTSCHALL J, GRUBER H, NEUHUBER W. Internal structure of cat
extraocular muscle. Anat Embryol. 1975;1458:25–34.
MCCALLUM KN, SHARMA AK, BLANCHARD DS, STRIBLING D, MIRRLEES DJ,
DUGUID IG, THOMAS PK. The effect of continuous subcutaneous insulin infusion
therapy on morphological and biochemical abnormalities of peripheral nerves in
experimental diabetes. J Neurol Sci 1986, 74: 55-67.
MCCALLUM, K. N.C., SHARMA, A. K., BLANCHARD, D. S., STRIBLING, D.,
MIRRLEES, D.J., DUGUID, I. G. M., THOMAS, P. K. (1986). The effect of
continuous subcutaneous insulin infusion therapy on morphological and biochemical
abnormalities in peripheral nerves in experimentla diabetes. J Neurol Sci (in press)
MEDORI R, JENICH H, AUTILIO-GAMBETTI L, GAMBETTI P. Experimental diabetic
neruopathy: simila changes of slow axonal transport and axonal size in different animal
models. J. Neurosci. 1988, 8: 1814-1821.
MEIER H. Diabetes mellitus in animals. A review. Diabetes 1960, 9: 485-489.
Referências Bibliográficas ________________________________________________________________ 114
Tese de Doutorado Omar Andrade Rodrigues Filho
MEZIN P, TENAUD C, BOSSON JL, STOEBNER P. Morphometric analysis of the
peripheral nerve: advantages of the semi-automated interactive method. J Neurosci
Methods 1994, 51: 163-169.
MIGLIACCIO, V, FAZAN, V . Morphometry of the cervical vagus nerve in chronic
experimental diabetes. In: XXI Congresso da Associação Latino Americana de Ciências
Fisiológicas ALACF, 2003, Ribeirão Preto- São Paulo, 2003.
MOHSENI S, HILDEBRAND C. Hypoglicaemic neuropathy in BB/Wor rats treated with
insulin implants: electron microscopic observations. Acta Neuropathol 1998b, 96: 151-
156.
MOHSENI S, HILDEBRAND C. Neuropathy in diabetic BB/Wor rats treated with insulin
implants. Acta Neuropathol 1998a, 96: 144-150.
MORDES JP, ROSSINI AA. Animal models of diabetes. Am J Med 1981, 70: 353-360.
MORDES, J.P., ROSSINI, A. A. (1981). Animal models of diabetes. Am. J. Med. 70: 353.
NAKHOODA AF, LIKE AA, CHAPPEL CI, MURRAY FT, MARLISS EB. The
spontaneously diabetic Wistar rat. Diabetes 1977, 26:100-112.
NARAMA I, KINO I. Peripheral motor neuropathy in spontaneously diabetic WBN/Kob rats:
a morphometric and electron microscopic study. Acta Neuropathol 1989, 79: 52-60.
Referências Bibliográficas ________________________________________________________________ 115
Tese de Doutorado Omar Andrade Rodrigues Filho
NETTER, Frank H, M. D. Atlas de Anatomia Humana. Ed. Artes Médicas, 1996.
NOAKES, P.G., BENNETT, M.R., DAVEY, D.F. GROWTH OF SEGMENTAL nerves to
the developing rat diaphragm: absence of pioneer axons. The Journal of Comparative
Neurology, 1983. Volume 218, Issue 4 , 365 - 377
OCHODNICKÁ, E; OCHIDNICKÝ, M; BELEI, K; FUSEKOVÁ, E; BOLSEl’OVÁ, L.
Quantitative analysis of myelinated nerve fibers of peripheral nerve in streptozotocin-
induced diabetes mellitus. Mol Chem Neuropathol, 1995, 25(2-3) 225-233
OLIVETI, M. C. D. B. B.; DALMAZO, J.; FAZAN, V. P. S. Estudo das alterações do
nervo laríngeo recorrente decorrentes do diabete experimental crônico em ratos. O
Dendrito. v. 11, n. 02, p. 30-30, 2005.
OZAKI K, MIURA K, TSUCHITANI M, NARAMA I. Peripheral neuropathy in the
spontaneously diabetic WBN/Kob rat. Acta Neuropathol 1996, 92:603-607.
PALEARI F, GAMBA P, MAURI G, ROVARIS G, GIANNATTASIO C, PIATTI ML,
ZINCONE A, CAVALETTI G, MANCIA G. Phrenic nerve function in type 1 diabetes.
Diabetologia 1999, 42:1099.
PITKIN, R. M., REYNOLDS, W. A. (1969). Diabetogenic effects of streptozotocin in
rhesus monkeys. Diabetes 18:556.
Referências Bibliográficas ________________________________________________________________ 116
Tese de Doutorado Omar Andrade Rodrigues Filho
POWELL, H., KNOX D, LEE, S., et al. (1977). Alloxan diabetic neuropathy. Electron
microscopic studies. Neurology 27:60.
QUIST, V. and QUIST, J. (1977): Marginal Leakage along Concise in Relation to Filling
Procedure, Scand J Dent Res 85:305-3
RAKIETEN, N., RAKIETEN, M. L., NADKARNI, M. V. ( 1963). Studies on the
diabetogenic action of streptozotocin (NSC-37917). Cancer Chemother Rep 29: 91.
REGALIA J., CAI F., HELKE C. Streptozotocin-induced diabetes and the neurochemistry of
vagal afferent neurons. Brain Research, v. 938, n.1, 31, p. 7-14(8), 2002.
RERUP, C. C. (1970) Drugs producing diabetes through damage of insulin secreting cells.
Pharmacol. Rev. 22: 485.
ROBERTSON DM, SIMA AAF. Diabetic neuropathy im mutantdiabetic [C57Bl/ks(db/db)]
mouse. A morphometric study. Diabetes 1980, 29: 60-67.
RODRIGUES FILHO, O. A. ; FAZAN, V. P. S . Brachial Plexus Variation and its formation
and main branches . Acta Cirurgica Brasileira, v. 18, n. 5, p. 14-18, 2003.
RODRIGUES FILHO OA, FAZAN VPS. Streptozotocin induced diabetes as a model of
phrenic nerve neuropathy in rats. J Neurosci Meth 2006; 151: 131-8.
Referências Bibliográficas ________________________________________________________________ 117
Tese de Doutorado Omar Andrade Rodrigues Filho
RUDLES, R. W. (1945). Diabetic neuropathy. Geral review with report of 125 cases.
Medicine 24: 111.
RUSHTON, W. A. H. (1951) A theory of the effects of fiber size in medullated nerve. J
Physiol 115:101-122.
SATO K.L, MIGLIACCIO V, CARMO J.M, OLIVETI M.C.D.B.B, FERREIRA R.S,
FAZAN V.P.S. Diabete como modelo de neuropatia autonômica. Medicina (Ribeirão
Preto) 2006; 39 (1): 28-38.
SATO, K. L.; CARMO, J. M.; FAZAN, V. P. S. Estudo morfológico e morfométrico das
alterações do nervo renal em ratos diabéticos crônicos. Revista O Dendrito. v. 11, n. 02,
p. 31-31, 2005.
SCHMIDT, R. E., SCHARP, D. W. (1982). Axonal dystrophy in experimental diabetic
neuropathy. Diabetes 31:761.
SCHMIDT, R.. E., PLURAD, S. B., OLACK, B. J., SCHARP, D. W. (1983). The effect
of pancreatic islet transplantation and insulin therapy on experimental diabetic autonomic
neuropathy. Diabetes 32:532.
SCHMIDT, R. E., PLURAD, S. B., MODERT, C. W. (1983). Experimental diabetic
autonomic neuropathy characterization in streptozotocin-diabetic Sprague-Dawley rats.
Lab. Invest. 49:538.
Referências Bibliográficas ________________________________________________________________ 118
Tese de Doutorado Omar Andrade Rodrigues Filho
SCHMIDT, R. E., NELSON, J. S., JOHNSON, E. M. (1981). Experimental diabetic
autonomic neuropathy. Am J Pathol 103:210.
SCHMITT, F. O., BEAR, R. S. (1937). Optical properties of the axon sheaths of crustacean
nerves. J Cell Comp Physiol 9: 275.
SHARMA AK, DUGUID IG, BLANCHARD DS, THOMAS PK. The effect of insulin
treatment on myelinated nerve fiber maturation and integrity and on body growth in
streptozotocin diabetic rats. J Neurol Sci 1985, 67: 285-297.
SHARMA AK, THOMAS PK, DE MOLINA AF. Peripheral nerve fiber size in experimental
diabetes. Diabetes 1977, 26:689-692.
SHARMA, A. K., DUGUID, I. G. M,. BLANCHARD, D. S., THOMAS, K. (1985). The
effect of insulin treatment on myelinated nerve fibre maturation and integrity and on
body growth in streptozotocin-diabetic rats. J Neurol. Sci. 67:285.
SHARMA, A. K., THOMAS, P. K. (1999). Animal models: Pathology and
Pathophysiology. In: Diabetic Neuropathy. Eds Dyck PJ, Thomas PK. WB Saunders
Company, Philadelphia, 2
nd
edition, p 237-252.
SHARMA, A. K., THOMAS, P. K. (1974). Peripheral nerve structure and function in
experimental diabetes. J. Neurol. Sci. 23: 1.
Referências Bibliográficas ________________________________________________________________ 119
Tese de Doutorado Omar Andrade Rodrigues Filho
SHARMA, A. K., BAJADA, S., THOMAS, P. K. (1981). Influence of streptozotocin-
induced diabetes on myelinated nerve fiber maturation and on body growth in the rat.
Acta Neuropathol. 53: 257.
SIDENIUS P, JAKOBSEN J. Anterograde fast component of axonal transport during insulin-
induced hypoglicemia in nondiabetic and diabetic rats. Diabetes 1987, 36: 853-858.
SIDENIUS P, JAKOBSEN J. Peripheral neuropathy in rats induced by insulin treatment.
Diabetes 1983, 32: 383-386.
SIMA, A.A.F, ZHANG, W.X, GREENE,D.A. Diabetic and hypoglicemic neuropahy – a
comparison in the BB rat. Diabetes Res Clin Pract 1989, 6: 279-296.
SIMA, A. A. F, SUGIMOTO, K. Experimental diabetic neuropathy: an update. Springer
Berlin / Heidelberg. v. 42, n. 7 , 1999
SMITH, J.W, MARCUS, F.I, SEROKMAN, R. Prognosis of patients with diabetes mellitus
after acute myocardial infarction. Am J Cardiol. 1984 Oct 1;54(7):718-21
SMITH, B. (1974). Neuropathology of the oesophagus in doabetes mellitus. J Neurol
Neurosurg Psychiatry 37:1151-1154.
SMITH, R. S., KOLES, Z. J. (1970). Myelinated nerve fibers: computed effect of myelin
thickness on conduction velocity. Am J Physiol 219:1256-1258.
Referências Bibliográficas ________________________________________________________________ 120
Tese de Doutorado Omar Andrade Rodrigues Filho
SONG A, TRACEY DJ, ASHWELL KW. Development of the rat phrenic nerve and the
terminal distribution of phrenic afferents in the cervical cord. Anat Embryol 1999, 200:
625-643.
SOUZA, H. C. D. ; BALLEJO, G. ; SALGADO, M. C. O. ; SILVA, V. D. da ; SALGADO,
Helio Cesar . CARDIAC SYMPATHETIC OVERACTIVITY AND DECREASED
BAROREFLEX SENSITIVITY INL-NAME HYPERENSIVE RATS. American Journal
of Physiology-Heart and Circulatory Physiology, ESTADOS UNIDOS, v. 280, p. H844-
H850, 2001.
SUGIMURA, K., WINDEBANK, A. J., NATARAJAN, V., LAMBERT, E. H.,
SCHMIDT, H. H. O., DYCK, P. J. (1980). Interstitial hyperosmolarity may cause axis
cilinder shrinkage in streptozotocin-diabetic nerve. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 39: 710.
THOMAS PK, LASCELLES RG. The pathology of diabetic neuropathy. QJ Med, 1996, 69:
489-509.
THOMAS, P. K., ELIASSON, S. G. (1984). Diabetic Neuropathy. In: Peripheral Neuropathy,
eds DYCK, P. J., THOMAS, P. K., LAMBERT, E. H., BUNGE, R. W. B. Saunders
Company, Phyladelphia, 2
nd
edition, p 1773-1810.
TOMASCH J. Numerical size variability in the peripheral nerve. Acta Anat (Basel).
1983;115(1):78-90.
Referências Bibliográficas ________________________________________________________________ 121
Tese de Doutorado Omar Andrade Rodrigues Filho
TSUCHITAMI M, SAEGUSA T, NARAM I, NISHITANI T, GONDA T. A new diabetic
strain of rat (WBN/Kob). Lab Anim 1985, 19:200-207.
VELEMINSKY, J., BURR, I. M., MAUFFACHER, W. (1970). Comparative study of early
metabolic events resulting from the administration of the two diabetogenic agents alloxan
and streptozotocin. Eur. J. Clin. Invest. 1:104.
VINIK AI, MEHRABYAN A. DIABETIC NEUROPATHIES. MED CLIN NORTH AM.
2004;88:947-999
WALKER KZ, PIERS LS, PUTT RS, JONES JA, O'DEA K. Effects of regular walking on
cardiovascular risk factors and body composition in normoglycemic women and women
with type 2 diabetes. Diabetes Care. 1999 Apr;22(4):555-61
WANKE T, PATERNOSTROSLUGA T, GRISOLD W, FORMANEK D, AUINGER M,
ZWICK H, IRSIGLER K. Phrenic-nerve function in type-1 diabetic –patients with
diaphragm weakness and peripheral neuropathy. Respiration 1992, 59:233-237.
WEIS J, DIMPFEL W, SHRODER JM. Nerve-conduction changes and fine-structural
alterations of extra and intrafusa muscle and nerve-fibers in straptozotocin-diabetic rats.
Muscle & Nerve 1995, 18: 175-184.
WESTFALL, S. G., FELTEN, D. L., MANDELBAUM, J. Á., MOORE, A. S., PETERSON,
R. G. (1983). Degenerative neuropathy in insulin-treated diabetic rats. J. Neurol.
Neurosci. 61:93.
Referências Bibliográficas ________________________________________________________________ 122
Tese de Doutorado Omar Andrade Rodrigues Filho
WHITE JES, BULLOCK RE, HUDGSON P, HOME PD, GIVSON GJ. Phrenic neuropathy
in association with diabetes. Diabet Med 1992, 9:954-956.
WILLIAMS PL. WARWICK R. DYSON M. BAUNISTER LH. Grays Anatomy. 138v’
edition. Ediuburgh: Churchil Livingstone. 1995a
WILSON AS. Investigations in the innervation of the diaphragm in cats and rodents. Anat
Rec 1968, 162-425-432.
WOLF E, SHOCHINA M, GONEN B. Phrenic neuropathy in patients with diabetes mellitus.
Electromyogr Clin Neurophysiol 1983, 23:523-529.
WOSNIAK W, O’RAHILLY R, BRUSKA M. Myelination of the human fetal phrenic nerve.
Acta Anat 1982, 112: 281-196.
YAGIHASHI, S., AND A. A. SIMA. 1986. Neuroaxonal and dendritic dystrophy in diabetic
autonomic neuropathy: Classification and topographic distribution in the BB rat. J.
Neuropathol. Exp. Neurol. 45:545-565.
YAGIHASHI S, SIMA AA. Diabetic autonomic neuropathy in the BB rat. Ultrastructural and
morphometric changes in sympathetic nerves. Diabetes, 1985, 34:558-564.
YAGIHASHI S, TONOSAKI A, YAMADA K, KAKIZAKI M, GOTO Y. Pheripheral
neuropathy in selectively-inbred spontaneously diabetic rats: eletrophysiological,
morphometrical and freeze-replica studies. Tohoku J Exp Med, 1982, 138: 39-48.
Referências Bibliográficas ________________________________________________________________ 123
Tese de Doutorado Omar Andrade Rodrigues Filho
YAGIHASHI S, WADA R, KAMIJO M, NAGAI K. Peripheral neuropathy in the WBN/Kob
rat with chronic pancreatitis and spontaneous diabetes. Lab Invest 1993, 68: 296-307.
YASAKI S, DYCK PJ. Duration and severity of hypoglicemia needed to induce neuropathy.
Brain Res 1990, 531: 8-15.
YASAKI S, DYCK PJ. Spatial diatribution of fibre degeneration in acute hypoglycaemic
neuropathy in rat. J Neuropathol Exp Neurol 1991, 50: 681-692.
ZEMP, C., BESTETTI, G., ROSSI, G. L. (1981). Morphological and morphometric study of
nerves from rats with streptozotocin-induced diabetes mellitus. Acta Neuropathol 53:99.
ZIMMERMAN IR, KARNES JL, O’BRIEN PC, DYCK PJ. Imaging system for nerve fibre
tract morphometry: components, approaches, performance and results. J Neuropathol
Exp Neurol 1980, 39: 409-419.
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