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INSTITUTO OSWALDO CRUZ
Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular
Caracterização de Tripsinas em Lutzomyia
longipalpis – Principal Vetor da Leishmaniose
Visceral no Brasil
Erich Loza Telleria
Orientadora: Dra. Yara Maria Traub-Csekö
Dissertação apresentada ao Instituto Oswaldo Cruz
como parte dos requisitos para obtenção do título de
Mestre em Ciências - Área de Concentração: Biologia
Celular e Molecular
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Ficha catalográfica elaborada pela
Biblioteca de Ciências Biomédicas/ ICICT / FIOCRUZ - RJ
T274
Telleria, Erich Loza
Caracterização de tripsinas em Lutzomyia longipalpis – principal vetor
da leishmaniose visceral no Brasil / Erich Loza Telleria. – Rio de Janeiro,
2007.
xiii, 78 f. : il. ; 30 cm.
Dissertação (mestrado) – Instituto Oswaldo Cruz, Biologia Celular e
Molecular, 2007.
Bibliografia: f. 60-66
1. Lutzomyia longipalpis. 2. Flebotomíneo. 3. Digestão - insetos. 4.
Tripsina. 5. Transcrição de gene. 6. Expressão de proteína. 7. Atividade
enzimática. 8. Imunolocalização. I. Título.
CDD
616.9364
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ii
INSTITUTO OSWALDO CRUZ
Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular
Erich Loza Telleria
Caracterização de Tripsinas em Lutzomyia longipalpis – Principal Vetor da Leishmaniose
Visceral no Brasil
Dissertação apresentada ao Instituto Oswaldo Cruz
como parte dos requisitos para obtenção do título de
Mestre em Ciências - Área de Concentração: Biologia
Celular e Molecular
Orientadora: Dra. Yara Maria Traub-Csekö
RIO DE JANEIRO
2007
iii
INSTITUTO OSWALDO CRUZ
Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular
AUTOR: Erich Loza Telleria
Caracterização de Tripsinas em Lutzomyia longipalpis – Principal Vetor da
Leishmaniose Visceral no Brasil
ORIENTADORA: Dra. Yara Maria Traub-Csekö
Aprovada em: 23 / 03 / 2007
EXAMINADORES:
Profa. Dra. Elizabeth Ferreira Rangel - Presidente
Profa. Dra. Sirlei Daffre
Prof. Dr. Marcos Henrique Ferreira Sorgine
Rio de Janeiro, 23 de março de 2007
iv
INSTITUTO OSWALDO CRUZ
DISSERTAÇÃO DE MESTRADO
Erich Loza Telleria
CARACTERIZAÇÃO DE TRIPSINAS EM LUTZOMYIA LONGIPALPIS – PRINCIPAL VETOR DA
LEISHMANIOSE VISCERAL NO BRASIL
RESUMO
A Leishmaniose Visceral é um importante problema de saúde pública. No Novo Mundo é causada por
Leishmania infantum chagasi e seu principal vetor no Brasil é Lutzomyia longipalpis. A atividade enzimática do
tubo digestivo durante a digestão do inseto é um dos principais obstáculos que L. i. chagasi deve superar para
estabelecer a infecção. Tripsinas são as principais proteases secretadas no intestino do inseto e sua transcrição
pode variar a longo do processo digestivo.
Nós estamos interessados em estudar aspectos moleculares da alimentação sangüínea, para caracterizar
moléculas específicas que possam ter uma participação significativa na interação parasita-vetor e que possam ser
usadas no desenvolvimento de potenciais alvos para novas estratégias a serem usadas no controle da
leishmaniose.
Nós isolamos e sequenciamos completamente dois cDNAs (Lltryp1 e Lltryp2) a partir de uma biblioteca
de expressão de tubo digestivo de L. longipalpis alimentada com sangue, e suas seqüências são semelhantes a
outras tripsinas de insetos. Iniciadores específicos foram desenhados para serem usados em RT-PCR semi-
quantitativo para estudar sua expressão diferencial.
Nossos experimentos mostram que a transcrição de Lltryp1 tem um pico em aproximadamente 12 horas
após a ingestão de sangue, e desaparece após 48 horas, parecendo ser uma tripsina induzida por sangue. Lltryp2
tem alta transcrição em fêmeas não alimentadas e em machos, semelhante a uma enzima constitutiva. Entretanto
sua transcrição diminui após a alimentação. Uma alta transcrição deste mesmo gene é detectada em 96 horas,
quando o processo digestivo está finalizado e não há mais conteúdo a ser digerido.
Estamos estudando a imunolocalização de tripsinas no tubo digestivo do inseto, usando um anticorpo
anti-tripsina produzido por nosso grupo. Nossos resultados preliminares indicam um reconhecimento do
anticorpo distribuído pelo citoplasma. Este anticorpo também foi usado para determinar o aparecimento desta
enzima ao longo do processo digestivo por Western blot. Por esta abordagem foi detectada a presença de
tripsina em fêmeas entre 6 e 48 horas após a ingestão de sangue e após este período não é mais possível detectá-
la.
Ensaios de atividade enzimática sugerem que possa haver menor atividade de tripsinas em tubo
digestivo de L. longipalpis infectada por L. i. chagasi em 48 horas após a ingestão de sangue infectado, se
comparada à atividade presente em insetos alimentados apenas com sangue
v
INSTITUTO OSWALDO CRUZ
DISSERTAÇÃO DE MESTRADO
Erich Loza Telleria
CARACTERIZAÇÃO DE TRIPSINAS EM LUTZOMYIA LONGIPALPIS – PRINCIPAL VETOR DA
LEISHMANIOSE VISCERAL NO BRASIL
ABSTRACT
Visceral Leishmaniasis is a major public health problem. In the New World it is caused by Leishmania
infantum chagasi, and in Brazil Lutzomyia longipalpis is the main vector. Insect midgut enzymatic activity
during blood digestion is one of the main obstacles which L. i. chagasi must surpass to succeed in establishing
infection. Trypsins are the main proteases secreted in this insect gut, and transcription may vary along the blood
digestion process.
We are interested in studying molecular aspects of blood feeding, to characterizing specific molecules
that might have a significant role in parasite-vector interaction, which might be used as potential targets for new
strategies in the fight against the spreading of leishmaniasis. We have isolated and fully sequenced two trypsin
cDNAs (Lltrip1 and Lltrip2) from an expression library of blood-fed L. longipalpis midgut and their sequences
are similar to other insect trypsins. Specific primers were designed in order to be used in RT-PCR to investigate
trypsin differential expression.
Our experiments using semi-quantitative RT-PCR showed that Lltrip1 transcription has a peak at
approximately 12 hours after blood ingestion, and disappears after 48 hours, resembling bloodmeal induced
trypsins from other insects. Lltrip2 has a high transcription in non-fed female and in male insects, much likely to
be a constitutive enzime. Nevertheless its transcription decreases after blood ingestion. High transcription is
also observed in females after 96 hours, when digestive process is finalized and there is no more blood in the gut.
We are presently studying trypsin immuno-localization in the insect gut, using an anti-trypsin antibody
produced by our group, and our preliminary results indicate that the enzyme distributes through the cytoplasm.
We have also used this antibody to determine the appearance of the enzyme over time, through western blots. A
band of the expected size is detectable between 6 and 48 hours after bloodmeal and after that, it is no longer
detected. Preliminary enzyme activity assays sugests that L. longipalpis adults infected with L. i. chagasi at 48
hours after infective meal, have lower trypsin activity than non-infected bloodfed insects at the same time.
Agradecimentos
Telleria EL
vi
Esta dissertação de mestrado é fruto de uma parceria que iniciou em 1999, ainda na
época de iniciação científica no Laboratório de Biologia Molecular de Tripanosomatídeos e
Flebotomíneos, como aluno do então doutorando José Marcelo Ramalho Ortigão. Por seu
intermédio conheci uma linha de pesquisa que intensificou meu desejo de vivenciar a ciência
e aprendi os primeiros conceitos de Biologia Molecular. Por ter me apresentado um novo e
promissor campo de trabalho, e por ter dedicado seu tempo a desenvolver meu interesse,
preservo uma grande gratidão.
Neste mesmo laboratório tive colegas de trabalho com os quais desenvolvi mais do
que vínculos profissionais, eu tive a felicidade de desenvolver laços de amizade. Sou grato a
todos aqueles que compartilharam seus conhecimentos, prestaram ajuda, trouxeram alegria e
ofereceram-me seu companheirismo. Dentre tantos, destaco meus agradecimentos a Dra.
Diamar Costa-Pinto, Dra. Maria da Conceição Sampaio, Dra. Renata Mellon Barroso, Patrícia
Temporal, Christiane Marques, Luanda Marcelino Nascimento, Letícia Moulin Batista, que
passaram pelo laboratório de deixaram valorosas contribuições com seus trabalhos. Destaco
ainda meus agradecimentos àqueles que ainda estão presentes em nossas atividades: Dra.
Juliana Dutra, de quem recebi fundamental ajuda e realização de experimentos de
imunofluorescência, Dra. Patrícia Fampa Negreiros, Ana Cristina Bahia, André Nóbrega
Pitaluga, João Ramalho Ortigão-Farias, Adriana Pereira Oliveira de Araújo, Amanda
Revoredo Lobo, Vicente Araújo Beteille, Silvana Sant’Anna de Souza, Kary Soriano Del
Carmen Ocaña de quem recebi as instruções para construir árvores filogenéticas, Priscila
Monerat Costa, Luana Tatiana Guerreiro, Igor Cestari, Anissa Daliry. Estes colaboradores,
enquanto compenetrados em desenvolver seus próprios projetos no laboratório, nunca se
negaram a interrompê-los e prestarem-me algum auxílio.
Sou grato também aos novos alunos, especialmente ao Gustavo Amaral, Anderson
Fragoso dos Santos e Gláucio de Assis Mattos, que me avivam diariamente a idéia de que a
cadeia de transmissão de conhecimentos é infinita, e de que reestruturar meus conceitos e
retransmiti-los a estes jovens estudantes é uma responsabilidade contínua e necessária.
Esta equipe foi coordenada pela nossa chefe Dra. Yara Maria Traub Cseko, pelos
pesquisadores Dr. Alberto Dávila e Dr. Marcel Ramirez, aos quais eu devo meus sinceros
agradecimentos pelo tempo a mim dedicado, pelos conhecimentos compartilhados e por
apresentarem novos pontos de vista. Da mesma forma sou grato ao Dr. Antonio Tempone,
novo pesquisador em nossa equipe, pois colaborou diretamente com as análises de intensidade
de produtos de PCR e com resultado de Western blot.
Agradecimentos
Telleria EL
vii
Agradeço também aos nossos colaboradores, pesquisadores do Laboratório de
Entomologia Médica, Centro de Pesquisas René Rachou (CPqRR) – Fiocruz – MG, Dr. Paulo
F. Pimenta e Dra. Nágila Secundino, pela contribuição com insetos, infecções, análises em
microscopia confocal e também pelo material para ensaios enzimáticos, cujos conhecimentos
práticos me foram passados pelo nosso colega Herbert Guedes, do Laboratório de Bioquímica
de Peptídeos, DBBM, IOC.
Durante parte de minha iniciação científica e por todo o período de mestrado tive o
privilégio de ser orientado pela Dra. Yara Traub Cseko, que, com propriedade e sabedoria,
conduz a orientação de seus projetos equilibrando sua supervisão segura e a liberdade
necessária para que seus alunos tornem-se independentes. Sua inteligência, competência,
responsabilidade e austeridade são características marcantes de sua conduta. Estas qualidades
estão cunhadas em seu trabalho e estão semeadas em seus alunos como um forte modelo a ser
seguido. A esta admirável pesquisadora, sou imensamente grato pelo seu exemplo
profissional, pelos incontáveis momentos em que pude esclarecer minhas dúvidas e discutir
idéias, por todos os resultados comemorados com entusiasmo e pelo estímulo e apoio
fundamentais para eu superar minhas dificuldades.
Ao cumprir os créditos de disciplinas necessárias a minha formação na pós-graduação
também estive em contato com outros tantos pesquisadores exemplares. Entretanto sinto-me
no dever de ressaltar minha admiração e gratidão a dois deles: Dra. Elizabeth Ferreira
Rangel, que, em sua disciplina de Ecologia das Leishmanioses, motivou-me, com a
abrangência de seus estudos em nosso país, a ver novos horizontes; e Dr. Henrique Leonel
Lenzy, que, em uma palestra extraordinária durante a disciplina de Produção e Tratamento de
Imagem Científica, sem qualquer pretensão, apresentou a grandeza da ciência e a grandeza de
seu espírito, sua cultura e seu conhecimento, mostrando-me que há muito mais a ser almejado.
Para a realização deste projeto também obtive auxílio administrativo oferecido pela
equipe da Secretaria do Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular (DBBM – IOC):
Elisângela Guimarães da Costa, Patrícia Gonçalves Eliseu, Alberto Silva Rodrigues, e pela
equipe da Secretaria do Departamento de Ensino (DEPAE – IOC): Cleide de Almeida Souza,
Eliete Teixeira Perez, Daniele Alves Lobato, Fabíola Simões Ferrari e Carlos Eduardo
Portugal. O DBBM-IOC também forneceu o serviço de seqüenciamento de DNA pela
Plataforma de Sequenciamento PDTIS; e o DEPAE-IOC forneceu diárias para a realização de
experimentos em colaboração com o CPqRR e disciplina no Instituto de Biologia Molecular
do Paraná (IBMP). Por esses auxílios manifesto aqui meus agradecimentos.
Ao Instituto Oswaldo Cruz devo também meus agradecimentos pela bolsa de estudos a
mim concedida e por toda a infraestrutura. Meus agradecimentos estendem-se aos programas
Agradecimentos
Telleria EL
viii
PDTIS, PAPES-IV, ambos administrados pela Fiocruz, e aos órgãos financiadores CNPq e
Faperj, pois todos forneceram auxílio financeiro ao nosso laboratório ou à nossa equipe.
Enquanto os apoios profissional, financeiro e administrativo foram fundamentais para
o desenvolvimento deste trabalho, o apoio emocional que desfrutei fora do ambiente
acadêmico-científico foi tão indispensável como primordial para meu crescimento pessoal.
Qualquer demonstração de afeto seria insuficiente para representar a gratidão que devo aos
meus pais Emilio e Sonia Telleria, e ao meu irmão Rainer Telleria, que sempre e
incansavelmente estavam dispostos a ouvirem-me falar sobre meus experimentos e a
brindarem qualquer tipo de sucesso atingido. Agradeço profundamente aos meus amigos,
quase irmãos, Marcelo Luis Fonseca de Araújo e Salomão Lima Guimarães por serem
“doutores” em amizade, por serem capazes de preocuparem-se com meu caminho, por serem
incisivos e verdadeiros; e aos demais queridos amigos que, de uma forma ou de outra, ainda
quando não soubessem como contribuir, ainda que fosse com um olhar atento ou preocupado,
mostraram-me que eu nunca estive só neste percurso.
Obrigado meu Deus, por me possibilitar conviver com tantas pessoas brilhantes em
minha vida.
Abreviaturas Telleria EL
ix
Abreviaturas
Ac 1
ario
anticorpo primário
Ac 2
ario
anticorpo secundário
BAρNA Benzoil-arginina-ρ-nitroanilida
BSA albumina sérica bovina
cDNA ácido desoxirribonucléico complementar
DAPI 4’,6-diamidino-2-fenilindole diidrocloreto
DDRT-PCR expressão diferencial por trascriptase reversa - PCR
DMSO dimetilsulfóxido
DNA ácido desoxirribonucléico
EDTA ácido etilenodiaminotetracético
EST etiquetas de seqüências expressas (expressed sequence tags)
FUNASA Fundação Nacional de Saúde
gDNA ácido desoxirribonucléico genômico
HIV Vírus da Imunodeficiência Humana
IgG imunoglobulina G
IUBMB International Union of Biochemistry and Molecular Biology
Lltryp1 tripsina 1 de Lutzomyia longipalpis
Lltryp2 tripsina 2 de L. longipalpis
LPG lipofosfoglicano
LVA leishmaniose visceral americana
LTA leishmaniose tegumentar americana
OD
λ
densidade ótica no comprimento de onda (λ) especificado em nanômetros
OMS Organização Mundial de Saúde
pb pares de bases
PBS salina tamponada com fosfato
PIC coquetel inibidor de proteases: 4-(2-aminoetil) bensenosulfonil fluoreto
(AEBSP), E-64, bestaina, leupeptina, aprotinina e EDTA sódico
p / v peso por volume
PCR Reação em cadeia da polimerase
Abreviaturas Telleria EL
x
RNA ácido ribonucléico
RT-PCR PCR com transcrição reversa
SDS dodecil sulfato de sódio
SDS-PAGE eletroforese em gel de poliacrilamida com SDS
TBS salina tamponada com Tris
Tris Tris (hidroximetil) aminometano
Triton X 100 polietileno glicol p-(1,1,3,3-tetrametilbutil)-fenil eter
Tween - 20 polioxietileno (20) sorbitan monolaurato
Lista de Ilustrações Telleria EL
xi
Lista de Tabelas
Tabela 4.1 – Clones de tripsinas identificados em EST ...............................................................
25
Tabela 4.2 – Clones de cDNA obtidos de PCR para completar a seqüência de Lltryp1 ..............
27
Tabela 4.3 – Iniciadores e produtos obtidos em PCR com gDNA ...............................................
31
Tabela 4.4 – Tripsinas de insetos descritas como constitutiva (E) ou induzida por sangue (L) ...
34
Tabela 4.5: Média e desvio padrão de intensidade de produtos de RT-PCR com cDNAs de
insetos adultos e fator de correção para padrão de gene constitutivo ...........................................
41
Tabela 4.6: Média e desvio padrão de intensidade de produtos de RT-PCR com cDNAs de
estágios de desenvolvimento e fator de correção para padrão de gene constitutivo ....................
42
Tabela 4.7: Média e desvio padrão de intensidade de produtos de RT-PCR com cDNAs de
inseto infectado e fator de correção para padrão de gene constitutivo ........................................
42
Tabela 4.8: Normalização dos resultados de RT-PCR com cDNAs de insetos adultos ..............
43
Tabela 4.9: Normalização dos resultados de RT-PCR com cDNAs de estágios de
desenvolvimento ..........................................................................................................................
44
Tabela 4.10 – Normalização dos resultados de RT-PCR com cDNA de inseto infectado ......... 45
Lista de Figuras
Figura 1.1 – Distribuição de casos de Leishmaniose Visceral no mundo ....................................
2
Figura 1.2 – Distribuição de casos de Leishmaniose Tegumentar no mundo ..............................
3
Figura 1.3 – Leishmaniose Tegumentar Americana – Série histórica de casos ...........................
4
Figura 1.4 – Leishmaniose Visceral – Série histórica de casos e óbitos ......................................
4
Figura 1.5 – Estágios de desenvolvimento e adultos de Lutzomyia longipalpis ..........................
7
Figura 1.6 – Ciclo de vida da Leishmaniose Visceral ..................................................................
8
Figura 1.7 – Forma amastigota e promastigota de Leishmania ...................................................
9
Figura 3.1 – Esquema da estratégia de seqüenciamento do cDNA de Lltryp1 ............................ 16
Figura 4.1 – PCR para amplificação da porção 5’ de Lltryp1 ......................................................
26
Figura 4.2 – PCR para amplificação da porção 3’ de Lltryp1 ......................................................
26
Figura 4.3 – Seqüência nucleotídica e peptídica deduzida de Lltryp1 e Lltryp2 ..........................
28
Figura 4.4 – Amplificação de Lltryp1 ou Lltryp2 a partir de cDNA e gDNA .............................
30
Figura 4.5 – Estratégia de amplificação de gDNA .......................................................................
31
Figura 4.6 – Seqüência de nucleotídeos de Lltryp1 ......................................................................
32
Figura 4.7 – Seqüência de nucleotídeos de Lltryp2 ….…...……........………...…………...……
33
Figura 4.8 – Alinhamento Múltiplo de Tripsinas de Insetos Hematófagos ..................................
35
Lista de Ilustrações Telleria EL
xii
Figura 4.9 – Árvore Filogenética de Tripsinas de Insetos Hematófagos ......................................
37
Figura 4.10 – Estudo do número ideal de ciclos para PCR ..........................................................
38
Figura 4.11 – Teste de especificidade dos iniciadores para Lltryp1 e Lltryp2 .............................
39
Figura 4.12 – RT-PCR de Lltryp1 e Lltryp2 em fêmeas alimentadas com sangue e em machos 39
Figura 4.13 – RT-PCR de tripsinas em estágios de desenvolvimento de L. longipalpis ..............
40
Figura 4.14 – RT-PCR de tripsinas em fêmeas infectadas ou não, 72h após alimentação ...........
40
Figura 4.15 – Intensidade normalizada de RT-PCR com cDNAs de insetos adultos .................. 43
Figura 4.16 – Intensidade normalizada de RT-PCR com cDNAs de estágios de
desenvolvimento de L. longipalpis ...............................................................................................
44
Figura 4.17 – Intensidade normalizada de RT-PCR com cDNAs de fêmeas infectadas ou não
infectadas .....................................................................................................................................
45
Figura 4.18 – Titulação do anticorpo anti-tripsina ...................................................................... 46
Figura 4.19 – Revelação 1 de Western blot anti-tripsina ............................................................ 47
Figura 4.20 – Revelação 2 de Western blot anti-tripsina ............................................................ 47
Figura 4.21 – Atividade proteolítica de tripsina em tubo digestivo de L. longiplapis ............... 48
Figura 4.22 – Imunolocalização 1 de tripsina em tubo digestivo ................................................ 50
Figura 4.23 – Imunolocalização 2 de tripsina em tubo digestivo ................................................ 52
Telleria EL
xiii
ÍNDICE
1 – Introdução
1.1 – Histórico ………………...........……………………..……………………………..... 1
1.2 – Leishmanioses ...........…...…………....…………………… ……………………..... 2
1.3 – Flebotomíneos ............................................................................................................. 6
1.4 – Ciclo Biológico da Leishmaniose Visceral ................................................................. 8
1.5 – Digestão em Flebotomíneos ........................................................................................ 10
1.6 – Tripsinas ...................................................................................................................... 11
2 – Objetivos
2.1 – Objetivos Gerais ..........................................................................................................
13
2.2 – Objetivos Específicos ..................................................................................................
13
3 – Material e Métodos
3.1 – Flebotomíneos ............................................................................................................. 14
3.2 – Leishmania infantum chagasi ......................................................................................
14
3.3 – Infecção Artificial ........................................................................................................
14
3.4 – Seqüenciamento de Clones de EST .............................................................................
15
3.5 – Análise dos Genes de Tripsinas ...................................................................................
15
3.6 – Amplificação, Clonagem e Seqüenciamento de Fragmentos de DNA Genômico ......
18
3.7 – RT-PCR Semi-quantitativo ..........................................................................................
18
3.8 – Análise de Intensidade de Produtos de PCR ............................................................... 20
3.9 – Western Blot ................................................................................................................
21
3.10 – Atividade Enzimática ................................................................................................ 23
3.11 – Imunolocalização .......................................................................................................
24
4 – Resultados
4.1 – Clones de cDNAs de Tripsinas ....................................................................................
25
4.2 – Íntrons em Lltryp1 e Lltryp2 ........................................................................................
30
4.3 – Tripsinas Constitutivas e Induzidas por Sangue ..........................................................
34
4.4 – Árvore Filogenética .....................................................................................................
36
4.5 – Expressão Diferencial dos Genes de Tripsinas ............................................................
38
4.6 – Quantificação da Expressão dos Genes de Tripsinas .................................................. 41
4.7 – Western Blot ................................................................................................................
46
4.8 – Atividade Enzimática .................................................................................................. 48
4.9 – Imunolocalização .........................................................................................................
49
5 – Discussão ........................................................................................................................
53
6 – Conclusões .....................................................................................................................
59
7 – Referências Bibliográficas ...........................................................................................
60
8 – Anexos
8.1 – Artigo publicado em Archives of Insect Biochemistry and Physiology, 2007 ……... 67
8.2 – Artigo submetido à publicação em Memórias do Instituto Oswaldo Cruz, 2006 ........
78
1 – Introdução Telleria EL
1
1.1 – Histórico
Antigos relatos sobre as leishmanioses podem ser encontrados em registros desde o
século XVI, ainda no período inicial da colonização das Américas. Em 1533, Pedro Pizarro
relatou que povos estabelecidos nos Andes peruanos apresentavam uma doença conhecida
como mal de nariz, que depois foi associada à leishmaniose tegumentar, indicando que esta é
uma doença autóctone do continente Americano. Registros mais antigos em peças de
cerâmica conhecidas como “huacos” (Peru e Equador) ainda da época pré-colombiana,
datadas entre os séculos V e X, reproduziam figuras humanas com lesões graves na face
(Atamirano-Enciso et al., 2003).
Ainda que as leishmanioses fossem conhecidas desde o século XVI, a primeira
descrição de formas amastigotas em casos de calazar (leishmaniose visceral) foi feita por
Cunningham em 1885, na Índia. Posteriormente, em 1898 foi constatado que se tratava de um
protozoário por Borovsky. Estudos sobre calazar foram realizados por Leishman e por
Donovan em 1903, entretanto a denominação do gênero Leishmania foi feita por Ross no
mesmo ano. Ainda no mesmo ano, Laveran e Mesnil descreveram o agente etiológico do
calazar como Leishmania donovani. (Choi e Lerner, 2001).
A descrição da leishmaniose cutânea foi realizada ainda em 1903 por Wright que
descreveu um organismo semelhante a L. donovani em uma criança portadora do então
chamado “botão do Oriente”, na Síria, dando-lhe o nome de Helcosoma tropicum. Em 1909,
Gaspar Vianna, no Instituto Oswaldo Cruz, correlacionou as lesões epidérmicas da “úlcera de
Bauru” com o protozoário Leishmania, denominando este agente etiológico como Leishmania
brazilienses, renomeado L. braziliensis por Matta em 1916 (revisto por Lainson e Shaw,
1992).
1 – Introdução Telleria EL
2
1.2 – Leishmanioses
De acordo com dados da OMS (http://www.who.int/inf-fs/en/fact116.html) desde
1993 tem havido um aumento de regiões endêmicas e do número de casos de leishmanioses
no mundo. As grandes migrações de áreas rurais para urbanas e a invasão de áreas endêmicas
rurais por pessoas não imunes têm contribuído em muito para este aumento. Outro fator que
também causa o aumento da incidência é a execução de projetos com alto impacto ambiental,
como represas, áreas de irrigação e desflorestamento. As leishmanioses apresentam uma
ampla distribuição geográfica atingindo a América Latina, África, Índia, parte leste da Ásia,
Ásia Central, Mediterrâneo, e alguns países europeus. Estima-se que 12 milhões de pessoas
em 88 países estão acometidas pela enfermidade, sendo que 82 % do total de países afetados
são considerados em desenvolvimento. Os casos mundiais de leishmaniose visceral
encontram-se majoritariamente (90 %) no Brasil, Nepal, Índia, Bangladesh e Sudão (Figura
1.1). Os casos da forma cutânea estão no Afeganistão, Argélia, Irã, Arábia Saudita, República
Árabe da Síria, Brasil e Peru, representando juntos mais de 90 % de casos (Figura 1.2). No
caso de leishmaniose mucocutânea, 90% dos casos estão localizados na Bolívia, Brasil e Peru.
A partir da década de 80 foram registrados casos de co-infeção entre leishmanioses e
pacientes HIV positivos, com marcado aumento desde então, sendo que 50% dos casos de
leishmaniose visceral foram registrados no sudoeste da Europa (Gorgolas e Miles, 1994).
Distribuição de casos de Leishmaniose Visceral no mundo
Figura 1.1: Áreas em vermelho indicam as regiões acometidas. Fonte: Organização mundial
de Saúde, (http://www.who.int/leishmaniasis/ leishmaniasis_maps/en/index.html).
Distribuição de casos de Leishmaniose Visceral no mundo - 2003
1 – Introdução Telleria EL
3
No Brasil, em 1913, ocorreu o primeiro registro da ocorrência de leishmaniose
visceral, proveniente de Boa Esperança, Mato Grosso. Os fatores geográficos e de
urbanização que favorecem sua dispersão no mundo também ocorrem aqui, com marcado
aumento de número de casos em regiões peri-urbanas, e episódios recentes de casos em
regiões urbanas (http://www.funasa.gov.br/epi/pdfs/situacao_doencas.pdf).
A Leishmaniose Tegumentar Americana (LTA) está presente em todos os estados
brasileiros, sendo um dos mais importantes problemas de saúde pública, principalmente em
zonas rurais, tendo maior número de casos nos estados das regiões Norte, Nordeste e Centro-
Oeste. A Leishmaniose Visceral Americana (LVA) atinge 19 estados brasileiros, sendo a
maioria (70 %) dos casos localizada na região Nordeste. Atualmente, a doença tem sido
transmitida também em cidades do Sudeste (Belo Horizonte e Araçatuba) e do Centro-Oeste
(Fundação Nacional de Saúde - FUNASA, 2002). As Figuras 1.3 e 1.4 (SVS, 2005)
apresentam a série histórica de casos de LTA e LVA no Brasil.
Distribuição de casos de Leishmaniose Tegumentar no mundo - 2003
Figura 1.2: Áreas em vermelho indicam as regiões acometidas. Fonte: Organização mundial de
Saúde, (http://www.who.int/leishmaniasis/ leishmaniasis_maps/en/index.html).
1 – Introdução Telleria EL
4
Figura 1.3: Evolução do número de casos de LTA confirmados. Fonte: Secretaria de Vigilância em Saúde
(http://portal.saude.gov.br/portal/saude/visualizar_texto.cfm?idtxt=25372).
Figura 1.4: Evolução do número de casos confirmados e óbitos de LVA. Fonte: Secretaria de Vigilância em
Saúde (http://portal.saude.gov.br/portal/saude/visualizar_texto.cfm?idtxt=25372).
1 – Introdução Telleria EL
5
As leishmanioses são denominadas a partir de características clínicas e epidemiológicas.
A leishmaniose tegumentar compreende as formas: cutânea, mucocutânea e cutânea-difusa. A
leishmaniose cutânea (LC) produz exclusivamente lesões cutâneas limitadas, ulcerosas ou
não, que cicatrizam espontaneamente ou após medicação específica (Pirmez et al., 1993). A
leishmaniose mucocutânea (LM) produz lesões ulcerativas nas mucosas, ocorrendo num
pequeno percentual de pacientes que anteriormente manifestaram a forma cutânea,
principalmente naqueles não tratados (Pirmez et al., 1993). As lesões podem surgir nas fossas
nasais, podendo perfurar o septo nasal, permanecendo como um processo latente, ou podendo
disseminar pela região da orofaringe e da hipofaringe até a traquéia (Amato et al., 1995). A
Leishmaniose Cutânea Difusa (LCD), de difícil tratamento, produz lesões crônicas e
disseminadas por extensas regiões do corpo. L. amazonensis, L. guyanensis e L. braziliensis
são as espécies de maior importância para a LTA no Brasil.
A nomenclatura utilizada para definir o agente causador da LV no Novo Mundo tem
sido muito discutida e um dos pontos assinalados deriva da origem desta espécie. Há autores
que consideram que L. chagasi é uma sinonímia de L. infantum, que foi importada da Europa
durante o processo de colonização das Américas pelos portugueses e espanhóis (Killick-
Kendrick 1985, Rioux et al., 1990). Outros autores indicam que L. chagasi está presente nas
Américas desde antes da chegada de europeus (revisto por Lainson e Rangel, 2005). L.
chagasi, ou L. infantum chagasi, é responsável pela forma visceral no Brasil, produzindo
patologias que variam de uma infecção assintomática, a uma leishmaniose visceral
progressiva, denominada calazar, cujo sintoma principal é a dilatação do abdômen devido à
hiperplasia do fígado e do baço, associado a febre, perda de peso, anemia e aumento de
linfonodos, que ocorrem principalmente em crianças desnutridas (Badaró et al., 1986).
1 – Introdução Telleria EL
6
1.3 – Flebotomíneos
Os insetos vetores das leishmanioses são os flebotomíneos, que são dípteros da família
Psychodidae, sub-família Phlebotominae. Há cerca de 500 espécies de flebotomíneos, 350
nas Américas, sendo apenas 30 espécies consideradas como vetores de leishmaniose. Os
gêneros de flebotomíneos presentes no Velho Mundo são: Phlebotomus - Rondani e Berté,
1840, importante na transmissão humana, Sergentomyia - França e Parrot, 1920 e Chinius -
Leng, 1987. Os gêneros de flebotomíneos presentes no Novo Mundo são: Lutzomyia - França
e Parrot 1924, Brumptomyia - França e Parrot, 1921 e Warileya - Hertig, 1940 (revisto por
Galati, 2003).
Os flebotomíneos adultos são criptozoítas, ou seja, são insetos que vivem em abrigos
úmidos, em fendas de árvores, grutas, ou tocas de animais, mudando de local somente quando
ocorre alteração no ambiente. Seus habitats vão desde florestas primárias, passando por
florestas secundárias ou resíduos de matas secundárias até o ambiente urbano (Foratini, 1973).
Apenas a fêmea de flebotomíneos é hematófaga, sendo o sangue a sua fonte de proteína
necessária para produção de ovos. Quando não há oferta de sangue, a fêmea pode alimentar-
se de seiva de plantas, tal como os machos fazem naturalmente. A fêmea deposita seus ovos
nos mesmos locais onde vive, onde as larvas ao eclodirem encontram matéria orgânica, calor
e umidade necessária para seu desenvolvimento (revisto por Brazil e Brazil, 2003).
Durante sua fase adulta, a fêmea pode realizar repastos sangüíneos, nos quais pode
ingerir formas amastigotas de um mamífero infectado ou infectar um outro animal, pelo
inóculo de formas promastigotas metacíclicas de leishmania, que é a forma infectiva para o
hospedeiro vertebrado (revisto por Pimenta et al., 2003).
A leishmaniose visceral no Brasil é transmitida principalmente por L. longipalpis (Lutz
e Neiva, 1912) (Figura 1.5), encontrada em todo o continente americano, do México à
Argentina, e no Brasil é o principal transmissor para humanos, cães e raposas (Deane e
Deane, 1955), tendo, portanto, uma grande importância epidemiológica. L. longipalpis parece
adaptar-se com facilidade ao domicílio, peridomicílio e abrigos de animais, fato que
provavelmente influenciou na manutenção de seu ciclo em cidades, apresentando aumento
populacional após períodos de chuvas (Forattini, 1973).
1 – Introdução Telleria EL
7
Figura 1.5: Estágios de desenvolvimento e adultos de L. longipalpis. A: larvas L1, L2, L3, L4 e pupa; B:
adultos macho (M) e fêmea.(F). Fotos de André Pitaluga.
Lutzomyia longipalpis
1 – Introdução Telleria EL
8
1.4 – Ciclo Biológico da Leishmaniose Visceral
Os canídeos silvestres são reservatórios primários para LVA e são considerados
importantes na manutenção ciclo peridoméstico (Figura 1.6). O cão doméstico é o
reservatório para o ciclo urbano (revisto por Lainson e Rangel, 2003).
A infecção do hospedeiro vertebrado ocorre durante o repasto sangüíneo, quando o inseto
infectado, ao se alimentar, regurgita parte do sangue juntamente com as formas promastigotas
metacíclicas infectivas de leishmania. As formas promastigotas (Figura 1.7) são formas
flageladas extracelulares. Quando inoculadas no hospedeiro elas são fagocitadas pelo
macrófago onde se transformam na forma amastigota (Figura 1.7) intracelular sem
movimento. Estes amastigotas sofrem divisões binárias simples, o número de parasitas
multiplica-se no interior do macrófago. A membrana da célula hospedeira chega a romper por
efeito do aumento de volume, e assim as formas amastigotas são liberados no meio
extracelular, sendo fagocitadas por outros macrófagos, infectando-os novamente (revisto por
Pimental et al., 2003).
Figura 1.6: Figura esquemática do ciclo biológico da Leishmaniose Visceral. Adaptada de www.ivis.org.
1 – Introdução Telleria EL
9
A infecção do inseto ocorre quando uma fêmea se alimenta num hospedeiro infectado,
ingerindo o sangue e os macrófagos infectados por formas amastigotas de leishmania. Um
bolo alimentar é formado no interior do tubo digestivo e é envolvido por uma matriz (ou
membrana) peritrófica. No interior deste bolo alimentar as formas amastigotas se diferenciam
em formas promastigotas procíclicas, que são formas pequenas, ovóides e flageladas. A
matriz peritrófica é constituída por quitina e proteínas glicosiladas secretadas pelas células
epiteliais do intestino (Pimenta et al., 1997) e sua formação ocorre entre uma a quatro horas
após a ingestão de sangue. Ao final do processo digestivo, aproximadamente 72 horas, a
matriz peritrófica é degradada, o parasita migra e se adere ao epitélio intestinal evitando assim
a sua excreção e garantindo o sucesso da infecção. A adesão das leishmanias ao tubo
digestivo parece ser facilitada pela presença de lectinas no epitélio intestinal do flebotomíneo
(Dillon e Lane, 1999), capazes de reconhecer o lipofosfoglicano (LPG), que recobre todo o
corpo do parasita inclusive o flagelo (Pimenta et al. 1994). A molécula de LPG é específica
da fase promastigota e sofre modificação estrutural entre os diferentes estágios de
desenvolvimento. Leishmanias deficientes em LPG não são capazes de manter a infecção no
inseto vetor Phlebotomus (Butcher et al. 1996). No par P. papatasi - L. major foi
recentemente identificada uma galectina presente no epitélio intestinal do inseto e responsável
pelo reconhecimento do LPG e ligação do parasita (Kamhawi et al. 2004).
Quando os parasitas chegam à cárdia secretam uma quitinase, que destrói a camada de
quitina que reveste esta região do hospedeiro invertebrado, causando a regurgitação do sangue
durante a alimentação, facilitando a entrada do parasita no hospedeiro vertebrado quando
picado por um flebotomíneo infectado (Schlein et al. 1991).
Figura 1.7: Forma amastigota (A) e promastigota (P) de Leishmania. Fonte:
http://www.dbbm.fiocruz.br/tropical/leishman/leishext/html/morfologia.htm.
A
P
1 – Introdução Telleria EL
10
1.5 – Digestão em Flebotomíneos
Os flebotomíneos adultos utilizam carboidratos como fonte de energia, principalmente
encontrados em seiva vegetal. Em laboratório este alimento é substituído por solução
açucarada, que é armazenada num compartimento do sistema digestivo, o divertículo, e
transferida para o tubo digestivo quando necessário. As fêmeas são atraídas principalmente
pelo calor e por odores corporais liberados pelos hospedeiros, que podem ser humanos, cães
ou aves, entre outros, para se alimentarem de sangue. Durante a picada a saliva é secretada
contendo componentes anticoagulantes e vasodilatadores que facilitam a ingestão do sangue
por neutralizarem os mecanismos hemostáticos (revisto por Brazil e Brazil, 2003 em
Flebotomíneos do Brasil). A digestão do sangue ingerido se processa por aproximadamente 4
dias.
Assim como em outros insetos hematófagos da ordem Diptera, em flebotomíneos,
como mencionado anteriormente, ocorre a formação de uma estrutura membranosa que
envolve o bolo alimentar dentro do tubo digestivo, cerca de 1 a 4 horas após a ingestão de
sangue. Algumas funções estão associadas a esta matriz, tais como proteção do epitélio
intestinal contra cristais de hemoglobina ou microorganismos patogênicos presentes no
sangue, e promoção da permeabilidade de enzimas e seus produtos digestivos entre o interior
e o exterior da matriz. As proteínas presentes no sangue são inicialmente digeridas por
proteases secretadas na luz do tubo digestivo que atravessam a matriz peritrófica. Os
peptídeos produzidos pela ação das proteases, são então digeridos pela ação de amino-
carboxi- e dipeptidases, que podem estar livres ou associadas ao epitélio intestinal. Ao final
do 4
o
dia, praticamente já não é encontrado conteúdo intestinal. Esta atividade enzimática
representa também uma barreira à sobrevivência de patógenos. Leishmanias também
precisam resistir à atividade enzimática e infectar os flebotomíneos para dar continuidade a
seu ciclo de vida. As espécies que não são capazes de escapar da atividade proteolítica
existente no tubo digestivo têm poucas chances de sobreviver. Este é uma etapa que
determina a competência vetorial do inseto (revisto por Pimenta et al., 2003).
1 – Introdução Telleria EL
11
1.6 – Tripsinas
Tripsinas (E. C. 3.4.21.4 – IUBMB, 2007) são endopeptidases digestivas que
catalisam a hidrólise de ligações peptídicas no lado carboxílico de resíduos de lisina ou
arginina (Hedstrom, 2002). Sua forma secretada inativa denomina-se tripsinogênio, que pode
sofrer uma clivagem em sua porção N-terminal, tornando-se ativa. Uma vez ativada, tripsinas
podem ativar sua própria forma inativa ou outros zimogênios. Tripsinas são membros da
grande família das serino-proteases, as quais têm o aminoácido serina envolvido em catálise,
assim como histidina e ácido aspártico. Várias formas de tripsinas são encontradas na maioria
das espécies animais (Rojas e Doolittle, 2002).
A relação entre diferentes genes codificantes de serino-proteases mostrada por
similaridade de seqüências (MEROPS the Peptidase Database, Rawlings et al. 2006 -
http://merops.sanger.ac.uk/ index.htm) é refletida nas suas estruturas de éxons e íntrons.
Vários íntrons estão presentes nesses genes e têm sua posição relativamente conservada por
uma considerável distância evolutiva (Patthy, 1995). Entretanto há exceções como, por
exemplo, tripsinas de Drosophila melanogaster e Anopheles gambiae que não apresentam
íntrons (Muller et al., 1993; Wang et al., 1999).
Além da participação no processo digestivo da alimentação sangüínea estudada em
vários insetos hematófagos, estas proteases já foram relacionadas com o estabelecimento de
infecção de vários patógenos nos seus respectivos vetores. Para que a infecção por
Plasmodium gallinaceum seja bem sucedida em Aedes aegypti, é necessário que uma tripsina
do tubo digestivo ative uma quitinase secretada pelo parasita para que o oocineto escape da
matriz peritrófica (Shahabuddin et al., 1996). Também já foi visto que inibidores de tripsina
diminuem a carga infectiva do vírus da dengue em A. aegypti, indicando uma relação entre
infecção, digestão de sangue e a possibilidade de ocorrer um processamento proteolítico das
proteínas virais (Molina-Cruz et al., 2005). Em flebotomíneos, alguns dos mecanismos que
podem definir a especificidade da infecção de Leishmania foram associados à expressão de
serino-proteases no tubo digestivo do inseto vetor. Borovsky e Schlein (1987) sugeriram que
moléculas com atividade do tipo tripsina no tubo digestivo do flebotomíneo Phlebotomus
papatasi, o vetor natural de L. major, impedem a sobrevivência de L. donovani, enquanto os
mesmos componentes podem ter sua atividade reduzida por algum componente secretado por
L. major, permitindo a sua sobrevivência. Embora esteja claro que a sobrevivência de
Leishmania ao ataque proteolítico apresentado pelas proteases digestivas no tubo digestivo de
flebotomíneos é uma etapa crucial durante o desenvolvimento do parasita no vetor (Pimenta et
al., 1997; Schlein e Jacobson, 1998), pouco se sabe sobre a regulação da expressão destas
1 – Introdução Telleria EL
12
enzimas. Em P. papatasi, 4 serino-proteases do tipo tripsinas e 2 do tipo quimotripsinas já
foram clonadas e caracterizadas (Ramalho-Ortigao et al., 2003). Dentre as 4 proteases do tipo
tripsina, 2 têm sua expressão diminuída e uma terceira é aumentada após a alimentação
sangüínea, enquanto 2 proteases do tipo quimotripsina são induzidas pela ingestão de sangue.
Nosso trabalho descreve a identificação e a caracterização parcial de 2 seqüências de
cDNAs, Lltryp1 e Lltryp2, que codificam proteases do tipo tripsina em L. longipalpis, o
principal vetor da leishmaniose visceral nas Américas (Lainson e Rangel, 2005). Estes dois
novos cDNAs identificados apresentam alta similaridade com tripsinas de P. papatasi e de
outros insetos. Análises dos perfis de expressão indicam que estas moléculas são reguladas
durante os estágios de desenvolvimento do inseto e durante a alimentação sangüínea de
fêmeas. Além disso, fizemos estudos preliminares para complementar nossos estudos sobre
transcritos de tripsinas com anticorpo anti-tripsina para detectar a produção da proteína.
Extratos totais de fêmeas de L. longipalpis em vários tempos após a alimentação sanguínea
foram submetidos a experimentos de Western blot. Esse anticorpo também foi utilizado para
estudos de imunolocalização de tripsinas, em tubos digestivos dissecados, observados em
microscopia confocal a laser. Também verificamos o perfil da atividade desta protease em
ensaios de atividade enzimática contra substratos protéicos sintéticos, em insetos alimentados
com sangue, e comparamos estes resultados com os resultados obtidos para insetos
alimentados com sangue infectado por L. i. chagasi, a fim de verificar se a presença de
parasitas na alimentação poderia interferir na atividade total de tripsinas.
2 – Objetivos Telleria EL
13
2.1 – Objetivos Gerais
Um dos objetivos de nosso laboratório é identificar e caracterizar moléculas envolvidas no
processo de alimentação sangüínea e infecção por leishmania em L. longipalpis, causada por L. i.
chagasi. O presente projeto tem por objetivo caracterizar algumas das tripsinas já clonadas a
partir do RNA mensageiro do tubo digestivo de insetos adultos de L. longipalpis.
2.2 – Objetivos Específicos
Objetivo 1: Seqüenciamento completo de cDNAs de tripsinas de L. longipalpis;
Objetivo 2: Estudo semi-quantitativo da expressão de genes de tripsina de L. longipalpis por
PCR com transcrição reversa (RT-PCR);
Objetivo 3: Estudo da produção de tripsinas de L. longipalpis por Western blot;
Objetivo 4: Estudo da modulação da atividade proteolítica em tubos digestivos de L. longipalpis
infectado por L. i. chagasi em ensaios enzimáticos;
Objetivo 5: Imunolocalização de tripsinas em tubos digestivos de L. longipalpis.
3 – Material e Métodos Telleria EL
14
3.1 – Flebotomíneos
Os insetos L. longipalpis foram capturados no parque da Gruta da Lapinha, Minas
Gerais e mantidos em nosso insetário, no Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular,
Instituto Oswaldo Cruz, para a obtenção da primeira geração (F1) a ser utilizada em nossos
experimentos. Após a emergência os insetos com foram alimentados com solução de sacarose
30 % ad libitum ou em hamster anestesiado com injeção intramuscular de 300 µL de
Quetamina 10% (Francotar, Virbac do Brasil). A obtenção de insetos adultos e a colonização
em laboratório seguem o protocolo descrito por Brazil e Brazil, 2003.
3.2 – Leishmania infantum chagasi
A cultura de L. i. chagasi, cepa MHOM/BR/1974/PP75, cedida pela Coleção de
Leishmania do Instituto Oswaldo Cruz, é mantida pela equipe do nosso laboratório, no
Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular, Instituto Oswaldo Cruz. Promastigotas
são crescidas em meio M199 (SIGMA – Saint Louis, MO, EUA), adicionado de 10 % de soro
fetal bovino, a 24
o
C (Costa-Pinto et al., 2001). Para a infecção artificial são utilizados
parasitos em fase exponencial de crescimento.
3.3 – Infecção Artificial
Fêmeas de L. longipalpis com 3 dias foram infectadas através de alimentação
artificial, durante 1 hora, em um alimentador coberto com pele de pinto com um dia de vida,
contendo 1 mL de sangue de hamster desfibrinado, inativado a 65
o
C e reconstituído,
contendo cerca de 10
7
promastigotas / mL de L. i. chagasi. A temperatura do sangue foi
mantida a 37
o
C por um sistema de aquecimento e bombeamento de água em banho-maria
acoplado ao tubo de vidro do alimentador. As fêmeas foram dissecadas com 3 dias (72 h) e 7
dias (168 h) após a infecção para confirmar a presença de parasitas (Ramalho-Ortigão et al.,
2001).
3 – Material e Métodos Telleria EL
15
3.4 – Seqüenciamento de Clones de EST
Três bibliotecas de expressão foram construídas previamente em nosso laboratório,
usando cDNAs sintetizados a partir de RNAs purificados de tubo digestivo de insetos
dissecados em 6 h e 72 h após alimentação com sangue e 72 h após infecção artificial com L.
i. chagasi (Ramalho-Ortigao et al., 2001), usando Lambda Zap vector kit (Stratagene, La
Jolla, CA, EUA). As bibliotecas foram excisadas com o sistema ExAssist / SOLR seguindo
as instruções do mesmo kit. Colônias contendo vetor plasmidial pBluescript-SK com inserto
foram selecionadas para preparação de DNA plasmidial e seus insertos foram seqüenciados
pelo serviço de seqüenciamento da plataforma PDTIS/FIOCRUZ instalada no Departamento
de Bioquímica e Biologia Molecular – Instituto Oswaldo Cruz, num seqüenciador 3730 DNA
Analyser (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA). As reações de seqüenciamento foram
preparadas usando Big Dye Terminator v3.1 Cycle Sequencing kit (Applied Biosystems) e
iniciadores do plasmídeo vetor (T7-F, T3-R, M13-F ou M13-R) de acordo com as instruções
do fabricante.
3.5 – Análise dos Genes de Tripsinas
As seqüências obtidas a partir das bibliotecas de cDNA foram comparadas pela busca
de similaridade oferecida pelo programa Basic Local Alignment Search Tool-BLAST -
tblastx (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) (Gertz, 2005) e seqüências parciais de EST de
tripsinas foram identificadas. Para obter a seqüência completa dos genes, iniciadores internos
anti-senso Trip161-R 5’-CAT ATT GGG TGT AGG CCT-3’e Trip1A-R 5’-GGT CTT TGT
AAT GCC GCC-3’ foram desenhados para amplificação da extremidade 5’ por PCR em
combinação com iniciadores senso do plasmídio vetor T3-F. Para confirmar a especificidade
da região escolhida para desenho dos iniciadores e confirmar a seqüência da porção 3’ de
Lltryp1, um novo iniciador senso, Trip1A-F 5’-GGC GGC ATT ACA AAG ACC-3’ foi
desenhado na mesma posição que Trip1A-R, e foi utilizado em PCR combinado com o
iniciador T7-R do vetor plasmidial, seguindo a estratégia mostrada na Figura 3.1.
3 – Material e Métodos Telleria EL
16
As reações foram realizadas usando como DNA molde plasmídios (100 ng) excisados
da biblioteca de tubos digestivos de insetos dissecados 6 h após alimentação sangüínea, já
disponível em nosso laboratório, e 0,8 µM de iniciadores específicos, 1,5 mM de MgCl
2
, 1,25
u de GoTaq DNA polimerase (Promega Corporation, Madison, WI, EUA) em um volume
final de 25µL. As condições definidas para este experimento são: 96
o
C por 3 min, seguido
por 30 ciclos a 96
o
C por 30 seg, 55
o
C por 30 seg, 72
o
C por 1 min, e uma extensão final a 72
o
C por 7 min. O conteúdo total da reação foi aplicado e resolvido em gel de agarose 1,5 % (p
/ v) corado com brometo de etídio, em cuba de eletroforese a 100 V. Os fragmentos obtidos
foram excisados do gel, purificados com Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System e
clonados em pGEM-T Easy Vector System (ambos Promega).
Clones contendo insertos com o tamanho esperado, confirmados conforme instruções
do pGEM-T Easy Vector System, foram seqüenciados conforme indicado no item 3.4 e as
seqüências obtidas foram alinhadas e agrupadas com os segmentos da extremidade 3’ das
seqüências de tripsinas, usando o programa ClustalW – EMBL – EBI, em sua configuração
Figura 3.1: Esquema da estratégia de seqüenciamento do cDNA de Lltryp1. Retângulos coloridos em violeta
e azul representam fragmentos da porção 3’ e 5’ do gene, respectivamente. Retângulos menores escuros
representam regiões onde se localizam os iniciadores utilizados em PCR: retângulos pretos indicam
iniciadores do plasmídeo, retângulos azul escuro e roxo indicam iniciadores específicos de Lltryp1.
Retângulo branco indica região de sobreposição das seqüências analisadas. Retângulo azul marinho
representa o gene completo.
3 – Material e Métodos Telleria EL
17
padrão disponível na internet, (http://www.ebi.ac.uk/clustalw/) para compor a seqüência
completa dos cDNAs.
Foram identificados dois cDNAs de tripsinas e as seqüências completas codificantes
de cada um, denominados Lltryp1 (768pb) e Lltryp2 (762pb), foram traduzidas em
aminoácidos usando o programa “Translate Tool” disponível na página de internet ExPASy
(http://au.expasy.org/tools/dna.html) (Gasteiger et al., 2003). Os domínios conservados, sítios
ativos e assinatura de famílias de proteínas foram identificados nas seqüências de
aminoácidos, pelo programa ScanPROSITE – ExPASy (http://au.expasy.org/tools/
scanprosite/) (Gattiker et al., 2002). Peptídeos sinal foram identificados através da página de
internet do Center for Biological Sequence Analysis (http://www.cbs.dtu.dk/services). O peso
molecular estimado para as proteínas codificadas pelos cDNAs estudados foi calculado pela
página de internet “Protein Mass Calculator” – Clinical Sciences Centre (http://csc-
fserve.hh.med.ic.ac.uk/cgi-bin/masscalc).
As seqüências de aminoácidos de tripsinas similares de outros organismos identificadas
na busca por BLAST – tblastx foram alinhadas também pelo ClustalW, com o objetivo de
estudar a similaridade entre elas. O alinhamento obtido foi editado no programa Boxshade
Tool (http://bioweb.pasteur.fr/seqanal/interfaces/boxshade.html) e também foi utilizado para a
construção de uma árvore filogenética usando o programa MEGA 3.1 (Kumar et al. 1994),
pelo método de Neighbor Joining, com parâmetro de correção Poisson e “bootstrap” de
10.000.
3 – Material e Métodos Telleria EL
18
3.6 – Amplificação, Clonagem e Seqüenciamento de Fragmentos de DNA Genômico
Com o objetivo de estudar a presença de íntrons nos genes de tripsinas aqui estudados,
outros iniciadores foram utilizados (Figuras 4.6 e 4.7 e Tabela 4.3), em experimentos de
amplificação por PCR, utilizando como DNA molde o DNA genômico extraído de
aproximadamente 10
7
– 10
8
células embrionárias LL-5 de L. longipalpis (Tesh e Modi, 1983)
com “Genomic Prep Cells and Tissue DNA Isolation kit” (Amersham Biosciences, GE
Healthcare, Fairfield, CT, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. Os iniciadores
adicionais utilizados para Lltryp1 foram: Trip1C-F 5’-GCC CAA GGC TCG ATG GA-3’ e
Trip-R 5’-TTA GAA ACC AAC GAC T-3’. Aqueles utilizados para Lltryp2 foram: Trip2B-
F 5’-CGT CAA CCT ATA CAT AGG-3’, Trip2-F 5’-ATT ATC ACG TCC GTG-3’, Trip2A-
R 5’-GTT CCG AAA TGA TTG CTC C-3’ e Trip2-R 5’-AAC ATT TGA AAT TTC ACG-
3’. Todos os iniciadores utilizados neste trabalho estão apresentados, em suas posições em
relação à seqüência de cDNA correspondente, nas Figuras 4.6 e 4.7, no item 4.2. Iniciadores
específicos para os genes Lltryp1 e Lltryp2 possibilitam amplificar diferentes regiões dos
genes, a fim de que possam ser comparadas entre si.
As condições definidas para as reações de amplificação de DNA genômico, separação
em gel de agarose, excisão, purificação de fragmentos de DNA amplificados, clonagem em
vetor plasmidial e seqüenciamento foram descritas no item 3.5. O alinhamento e análise das
seqüências obtidas foram feitos no programa ClustalW incluindo as seqüências completas dos
cDNAs, para identificação dos íntrons.
3.7 – RT-PCR semi-quantitativo
O reagente TRIzol (Invitrogen Life Technologies Inc., Grand Island, NY, EUA) foi
usado, de acordo com as instruções do fabricante, para isolar RNA total de 20 fêmeas de L.
longipalpis ingurgitadas, mantidas congeladas a -70
o
C, obtidas em 2 h, 6 h, 12 h, 24 h, 48 h,
72 h, 96 h e168 h após alimentação com sangue, ou 72 horas após infecção artificial com L. i.
chagasi. Também foi extraído RNA total de fêmeas não alimentadas (0 h), machos, ovos e
estágios larvais (L1, L2, L3 e L4). O RNA total obtido foi usado na síntese de cDNA, em
quantidade não superior a 5 µg, utilizando o sistema “First-Strand cDNA Synthesis kit”
(Amersham Biosciences) seguindo as indicações do fabricante.
Foram desenhados iniciadores oligonucleotídicos capazes de discriminar e gerar
amplicons de tamanhos diferentes para cada um dos genes de tripsina. Esses iniciadores
3 – Material e Métodos Telleria EL
19
foram baseados em regiões não conservadas dos cDNAs de Llltryp1 e Lltryp2.Os iniciadores
Trip1A-F e Trip-R 5’ (Figura 4.6),específicos para Llltryp1, amplificam um fragmento de 210
pb; e os iniciadores Trip2B-F e Trip2A-R (Figura 4.7), específicos para Lltryp2, produzem
um de 500 pb. Como referência endógena da quantidade de cDNA utilizado nas reações de
RT-PCR foram empregados oligonucleotídeos iniciadores para o gene de histona (tipo H1),
seqüência obtida pelo seqüenciamento de EST (dado não publicado): His-F 5’-GAA AAG
CAG GCA AAG ACT CC-3’ e His-R 5’-GAA GGA TGG GTG GAA AGA AG-3’. O
número de ciclos correspondente à fase exponencial de amplificação para cada um dos genes
investigados, incluindo o gene constitutivo, foi previamente determinado. As reações,
realizadas em duplicatas, foram submetidas a um número diferente de ciclos (15, 20, 25, 30,
35, 40 e 45), sob as seguintes condições: desnaturação inicial a 96
o
C por 3 min, ciclos com
96
o
C por 45 seg, 56
o
C por 45 seg e 72
o
C for 45 seg, e uma extensão final a 72
o
C por 5 min.
A partir destes resultados obteve-se um intervalo do número de ciclos onde os nossos ensaios
apresentam-se em fase exponencial de amplificação.
Cada amostra de cDNA foi amplificada por PCR contendo 0,8 µM de cada par de
iniciadores específicos, 1,5 mM de MgCl
2
, 1,25 u de GoTaq DNA polimerase (Promega) em
uma reação de 25 µL. O conteúdo total da reação de PCR foi aplicado e separado em gel de
agarose 2 % corado com brometo de etídeo, em cuba de eletroforese a 100 V. Estes
experimentos de RT-PCR foram repetidos 3 vezes.
3 – Material e Métodos Telleria EL
20
3.8 – Análise de Intensidade de Produtos de PCR
A intensidade dos produtos de RT-PCR, foi medida usando o programa ImageJ 1.34s
(Wayne Rasband, NIH, EUA - http://rsb.info.nih.gov/ij) e os dados foram submetidos a uma
análise estatística, onde foram obtidos média e desvio padrão dos percentuais de intensidade.
Os cálculos de média dos valores das três repetições de cada reação foram feitos por
média aritmética, e a partir destes mesmos valores foi calculado o desvio padrão.
Para a normalização dos valores de intensidade dos diferentes amplicons obtidos, foi
estabelecido um fator de correção, que é a razão entre os valores de histona obtidos nas
reações de cada uma das amostras de cDNA. Para isso assume-se que o valor de intensidade
de uma dada reação corresponde a 100% de expressão. Esse valor será divido pelos valores
de intensidade de histona das demais reações e a razão obtida irá constituir o fator de correção
de cada reação, que será utilizado para normalizar os valores de intensidade dos demais genes
investigados. O fator de correção obtido é multiplicado pelo valor dos amplicons de Lltryp1 e
Lltryp2 de cada uma das reações de PCR. Para RT-PCR com cDNAs de fêmeas alimentadas
com sangue, assumiu-se como padrão de intensidade os valores medidos para amplificações
com iniciadores de histona com cDNA de fêmeas 24h após alimentação (59,032 = 100 %).
Para RT-PCR com cDNAs de fêmeas 72h após alimentação com sangue ou sangue infectado,
assumiu-se como padrão de intensidade os valores medidos para amplificações com
iniciadores de histona com cDNA de fêmeas 72h após alimentação com sangue (81,929 = 100
%). Para RT-PCR com cDNAs de L. longipalpis em diferentes estágios de desenvolvimento,
assumiu-se como padrão de intensidade os valores medidos para amplificações com
iniciadores de histona com cDNA de machos adultos (83,932 = 100 %). Este método de
normalização ajusta os resultados obtidos para amplificações com iniciadores de histona em
um padrão constante, e a partir deste parâmetro constante, pode-se comparar os valores
obtidos para as diferentes tripsinas.
3 – Material e Métodos Telleria EL
21
3.9 – Western Blot
O soro contendo anticorpo policlonal anti-tripsina que foi utilizado nos experimentos
de Western blot foi produzido em nosso laboratório antes do início deste trabalho (Batista,
dados não publicados). Este anticorpo foi obtido a partir da imunização de coelho com um
fragmento de tripsina recombinante, produzida a partir de um cDNA, contendo
aproximadamente 600 pb da região 3’, clonado em plasmídeo de expressão pET-28
(Novagen, Darmstadt, Alemanha). A proteína expressa foi separada em SDS-PAGE e a
região do gel correspondente à tripsina recombinante (massa molecular ~20 kDa) foi
excisada, fragmentada com pistilo e emulsificada com adjuvante completo de Freund para 1
a
inoculação em coelho. Para as 3 inoculações seguintes, feitas com intervalos de 15 dias cada,
foi utilizado adjuvante incompleto de Freund.
Para fazer a titulação deste anticorpo, foi utilizada a técnica do “Dot Blot”. Cortes de
membrana de nitrocelulose (Bio-Rad – Hercules, CA, EUA) com 1 cm
2
de área receberam 1
µL com 0,6 µg de proteína recombinante . As membranas foram bloqueadas em solução de
leite 5 % em TBS 1X – Tween-20 0,1 %, sob agitação por 1 hora. Em seguida foram lavadas
com solução de TBS 1X – Tween-20 0,1 %, para posterior incubação com anticorpo primário
(Ac 1
ario
), por 1 hora. Foram testadas três diluições de Ac 1
ario
(1:100, 1:500 e 1:1.000),
combinadas com três diluições (1:5.000, 1:10.000 e 1:20.000) do anticorpo secundário de
cabra anti-IgG de coelho conjugado com peroxidase (Ac 2
ario
) (SIGMA). Entre a incubação
do Ac 1
ario
e do Ac 2
ario
, e também depois da incubação do Ac 2
ario
, foram feitas 3 lavagens de
5 minutos cada com solução de TBS 1X – Tween-20 0,1 %. Uma última lavagem das
membranas foi feita com solução de TBS 1X por 5 minutos.
Para revelar o resultado do experimento foi utilizado o Super Signal West Pico Rabbit
IgG Detection kit (PIERCE – Rockford, IL, EUA) seguindo as indicações do fabricante. Um
filme radiográfico T-MAT G/RA (Kodak – Manaus, AM, Brasil) foi exposto às membranas
marcadas por quimio-luminescência durante 5 segundos e revelado em seguida.
A combinação ideal de diluições aqui determinada foi utilizada para detectar tripsinas
em experimentos de Western blot com extrato protéico total de L. longipalpis, sofrendo
alguns ajustes quando necessário.
O extrato protéico total foi obtido de 20 fêmeas inteiras não alimentadas (0 h) ou em
diferentes horários após alimentação sangüínea (6 h, 12 h, 24 h, 48 h, 72 h, 96 h e 192 h),
armazenadas em microtubos contendo solução de inibidores de proteases PIC, 1X (Protease
Inhibitor Cocktail, uso geral – SIGMA). Os insetos foram congelados em gelo seco e
descongelados 3 vezes, sendo macerados em seguida com pistilo para microtubos. Após
3 – Material e Métodos Telleria EL
22
centrifugação a 5.000 x g, por 15 minutos a 4
o
C, o sobrenadante livre de resíduos celulares
foi armazenado a – 20
o
C. A separação das proteínas totais foi feita em um sistema de SDS-
PAGE Mini-Protean III (Bio-Rad), com gel de acorrida com concentração de 15 % (p / v) de
poliacrilamida, conforme indicações do fabricante, sendo aplicado em cada poço de amostra
um volume equivalente a 1 inseto. Além disso, foram aplicados no gel 1,2 µg da tripsina
recombinante como controle positivo para o Ac 1
ario
e 2 µL de sangue de hamster, equivalente
ao volume de sangue que uma fêmea de L. longipalpis é capaz de ingerir, como controle
negativo de reação cruzada com algum componente do sangue ingerido pelos insetos. Após a
separação por eletroforese, as proteínas foram transferidas para membrana de nitrocelulose
(Bio-Rad) em um sistema úmido de transferência Mini Trans-Blot Cell (Bio-Rad), seguindo
indicações do fabricante. Terminada a transferência a membrana de nitrocelulose foi corada
com solução de vermelho de Ponceau S para verificar a eficiência desta última etapa.
O tratamento da membrana nas etapas de lavagem e incubação com anticorpos e
posterior revelação, são iguais às descritas acima, no processo de titulação de anticorpos.
O gel de poliacrilamida retirado da transferência foi corado com corante Coomassie
Brilliant Blue R-250 (0,25 g em 90 mL de metanol e 10 mL de ácido acético glacial) para
verificar o montante de proteína que não havia sido transferido, conforme indicado nas
instruções do fabricante Bio-Rad.
3 – Material e Métodos Telleria EL
23
3.10 – Atividade Enzimática
Para obter um extrato enzimático de tubos digestivos de L. longipalpis, 10 fêmeas
ingurgitadas foram dissecadas para cada horário (6 h, 12 h, 24 h, 48 h e 72 h) após
alimentação sangüínea ou após infecção por L. i. chagasi. Fêmeas não alimentadas (0 h)
também foram dissecadas para este experimento. Os tubos digestivos dissecados foram
armazenados em microtubos contendo solução de Tris 10 mM (pH 8,02). Foram congelados
em gelo seco e descongelados 3 vezes, macerados e homogeneizados com pistilo para
microtubos. Após centrifugação a 5.000 x g, por 15 minutos, a 4
o
C, o sobrenadante foi
armazenado a – 20
o
C.
Para testar a atividade proteolítica de tripsina, foi utilizado um substrato específico
para este grupo de proteases, o Benzoyl-arginina-ρ-nitroanilida (BAρNA) (SIGMA). O
substrato foi solubilizado em dimetilsulfóxido (DMSO) (SIGMA) a 37
o
C, por 15 minutos
para uma concentração final de 25 mM. Um volume de 16 µL da solução de BAρNA, foi
diluído em 184 µL de dimetilformamida 4 % em solução de Tris 10 mM (concentração final
de BAρNA - 2 mM). Em todos as reações enzimáticas foram utilizados 100 µL de extrato
enzimático (sobrenadante de quatro tubos digestivos homogeneizados na solução de Tris 10
mM), adicionado de substrato, num volume final de 200 µL, em poços de placas de micro
titulação. A atividade enzimática foi medida por leitura de densidade óptica, quantificando o
produto (ρNA) liberado na reação. Como controle negativo para este experimento foi
utilizada a solução de Tris 0,01 % na presença do substrato, e como controle positivo foi
utilizada tripsina bovina (1 µL a 5 %) (Amersham Biosciences) nas mesmas condições. A
densidade óptica foi medida por um espectrofotômetro automático para microplacas
SpectraMax plus 384 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, EUA) ajustado para comprimento
de onda de 410 nm ao final de 1 hora de reação transcorrida a 25
o
C. Também foi medida a
densidade óptica do extrato enzimático com leitor a 510 nm para detectar presença de
hemoglobina antes do início do ensaio enzimático. Os valores medidos de densidade óptica
foram divididos pelo coeficiente de extinção molar do BAρNA, e dividido por 4 tubos
digestivos, para calcular a concentração do produto da reação por inseto (em M e em µmol).
Os valores em µmol foram usados para cálculo de médias e desvios padrão, assim como para
compor um gráfico.
3 – Material e Métodos Telleria EL
24
3.11 – Imunolocalização
Para obter tubos digestivos de L. longipalpis, pelo menos 3 fêmeas foram dissecadas 6
h após a alimentação sangüínea. Fêmeas não alimentadas (0 h) também foram dissecadas
para serem usadas como controle neste experimento. Os tubos digestivos dissecados foram
lavados em solução de PBS-1X (137 mM de NaCl, 2,7 mM de KCl, 10 mM de Na
2
HPO
4
, 2
mM de KH
2
PO
4
) (pH 7,0) para retirar o conteúdo intestinal, e fixados em solução de
paraformaldeído 4%, e armazenados a 4
o
C.
Estes tubos dissecados foram lavados 3 vezes com solução de PBS-1X filtrado (filtro
0,45 µm, Nalgene) e depois bloqueados com solução de BSA (1 %, p / v) e Triton X 100
(0,01 %, p / v) (SIGMA) em PBS-1X. Esta última solução foi utilizada também para diluir os
Ac 1
ario
e 2
ario
.
Os ensaios de imunolocalização de tripsina foram feitos com o anti-soro anti-tripsina
(Ac 1
ario
) mencionado no item 3.8 e com anticorpo de cabra anti-IgG de coelho (Ac 2
ario
)
conjugado a Alexa 546 nm (Molecular Probes – Invitrogen). Foram usadas diluições de 1:100
para o Ac 1
ario
e 1:500 para o Ac 2
ario
. Com o objetivo de marcar estrutura celular, foi
utilizado marcador DAPI (SIGMA) para núcleo.
Os tubos digestivos marcados foram montados entre lâmina e lamínula e observados
em microscópio confocal a laser (LSM 510 META – Carl Zeiss International), no
Departamento de Patologia – IOC – Fiocruz.
4 – Resultados Telleria EL
25
4.1 – Clones de cDNAs de Tripsinas
Cinco clones de cDNA de tripsinas foram identificados em nosso laboratório antes do
início deste projeto, a partir do seqüenciamento aleatório das bibliotecas de ESTs de tubo
digestivo de L. longipalpis dissecadas após 6 horas de alimentação com sangue (EST-6h-
TDS). Estes clones continham seqüências parciais da extremidade 3’ do cDNA e foram
identificados como codificantes para proteases do tipo tripsina pela análise de similaridade
por BLAST. O primeiro clone identificado (F1A4) foi nomeado Lltryp1, enquanto a
seqüência dos outros quatro clones idênticos, porém de seqüência diferente do clone F1A4
(G1C4, F1C6, C2H2 e C2H3), foi nomeada Lltryp2 conforme indica a Tabela 4.1.
Tabela 4.1: Clones de tripsinas identificados nas bibliotecas de EST.
Clone Tamanho do
inserto (pb)
Gene
F1A4
273 Lltryp1
G1C4 429
F1C6
865
C2H2 859
C2H3 853
Lltryp2
Com o objetivo de verificar se os clones identificados continham a seqüência completa
do cDNA, foi feito o re-seqüenciamento nos dois sentidos, e foi verificado que o clone F1C6
continha a seqüência completa do cDNA de Lltryp2.
Considerando que Lltryp2 contém 865 pb de tamanho e outras tripsinas de insetos
hematófagos tem aproximadamente o mesmo tamanho, verificou-se que restava ainda
identificar uma porção 5’ do gene Lltryp1, de aproximadamente 600 pb.
Para obter a porção 5’ do cDNA de Lltryp1 foi feita uma amplificação por PCR a
partir de plasmídios pBluescript excisados da biblioteca de EST-6h-TDS, usando iniciador
senso T3-F do vetor plasmidial e dois iniciadores anti-senso internos específicos Trip1A-R e
Trip161-R, em reações distintas, ilustradas na Figura 4.1.
4 – Resultados Telleria EL
26
Os fragmentos obtidos (~ 600 pb) contendo a porção 5’ do cDNA foram clonados e
seqüenciados. Pelo menos dois clones de cada fragmento foram selecionados (clones #18 e
#64 para Trip1A-R; e #13 e #33 para Trip161-R, respectivamente).
Um outro iniciador senso, Trip1A-F, foi desenhado na mesma posição de Trip1A-R
para amplificar a porção 3’ do gene e assim confirmar a seqüência de Lltryp1. Para tanto, este
iniciador senso interno específico (Trip1A-F) e um iniciador anti-senso T7-R do vetor
plasmidial foram utilizados em mais uma amplificação por PCR ilustrada na Figura 4.2
abaixo.
Figura 4.2: PCR para amplificação da porção 3’ de
Lltryp1; Trip1A-F: reação com iniciador Trip1A-F
e T7-R;
φ
φφ
φ
x: marcador de tamanho molecular. O
fragmento de interesse está indicado por seta com
seu peso molecular estimado expresso em pares de
bases (pb).
Figura 4.1: PCR para amplificação da porção 5’ de
Lltryp1; Trip161-R: reação com iniciador Trip161-R e
T3-F; Trip1A-R: reação com iniciador Trip1A-R e T3-F;
λ
λλ
λHindIII: marcador de tamanho molecular. O fragmento
de interesse está indicado por seta com seu peso molecular
estimado expresso em pares de bases (pb).
4 – Resultados Telleria EL
27
Este fragmento foi clonado e seqüenciado (clone #11). Todos os clones para Lltryp1
obtidos por PCR estão apresentados na Tabela 4.2 abaixo.
Tabela 4.2: Clones de cDNA obtidos de PCR para completar a seqüência de Lltryp1.
Clone Tamanho (pb) Iniciador senso Iniciador anti-senso
#11 ~ 270 Trip1A-F T7-R
#13 ~ 500 T3-F Trip161-R
#33 ~ 560 T3-F Trip161-R
#18 ~ 570 T3-F Trip1A-R
#64 ~ 400 T3-F Trip1A-R
O clone #18 continha o maior fragmento da porção 5’ do cDNA e a metionina inicial.
A seqüência completa de cDNA de Lltryp1 foi montada a partir do alinhamento e
sobreposição das seqüências dos clones F1A4 e #18 (Figura 3.1).
As seqüências completas codificantes de cada um dos cDNAs dos genes Lltryp1
(768pb) e Lltryp2 (762pb) estão apresentadas na Figura 4.3, assim como as seqüências
preditas de aminoácidos para estes genes. Também são destacados domínios conservados e
aminoácidos envolvidos em catálise.
4 – Resultados Telleria EL
28
Figura 4.3: Seqüência nucleotídica e peptídica deduzida de Lltryp1 e Lltryp2. Números à direita indicam a
numeração da seqüência de aminoácidos. Resíduos sublinhados indicam peptídeo sinal predito; (∇
∇∇
∇) indica
região de clivagem do peptídeo sinal, (▼) indica arginina e região de ativação. Letras em negrito indicam
resíduos da tríade catalítica (H-D-S); (*) indicam cisteínas conservadas; (■) indicam resíduos referentes a
especificidade de tripsinas. Retângulo indica grupo conservado do sítio ativo.
4 – Resultados Telleria EL
29
Peptídeos sinal preditos contendo 16 e 17 aminoácidos foram identificados em Lltryp1
e Lltryp2 respectivamente. Em Lltryp1, a tríade catalítica (histidina – ácido aspártico –
serina) corresponde aos resíduos 69 (H), 114 (D) e 210 (S) e em Lltryp2 corresponde aos
resíduos 67 (H), 111 (D) e 207 (S). Um resíduo de arginina (R) encontrado na posição 29 em
Lltryp1 e na posição 26 em Lltryp2 representa um único provável sítio de ativação para a
proteína madura em ambas as seqüências. Em Lltryp1 os seis resíduos altamente conservados
de cisteinas (C) são encontrados nas posições 54, 70, 179, 195, 206 e 230, sítio ativo histidina
conservado (TAAHC) está localizado entre os aminoácidos 66 e 70, e o sítio ativo serina
conservado (CQGDSGGPL) está localizado entre os aminoácidos 206 e 214. Em Lltryp2 os
seis resíduos altamente conservados de cisteinas (C) são encontrados nas posições 52, 68,
176, 192, 203 e 228, sítio ativo histidina conservado está entre os aminoácidos 64 e 68, e o
sítio ativo serina está localizado entre os aminoácidos 203 e 211. No sítio ativo conservado
de Lltryp2 o resíduo leucina (L) foi substituído por valina (V). Resíduos relacionados a
especificidade de tripsina (lisina – K – e ácido aspártico – D) são encontrados nas posições
203 e 204 em Lltryp1, e nas posições 200 e 201 em Lltryp2, respectivamente.
O peso molecular calculado a partir das seqüências de cDNA de tripsinas foi obtido
pelo programa “Protein Mass Calculator”. Para Lltryp1 foi calculado peso de 24,6 kDa para
proteína madura e 27,8 kDa para o zimogênio. Para Lltryp2 foi calculado peso de 24,7 kDa
para proteína madura e 27,6 kDa para o zimogênio. Para ambas as seqüências não houve
sítios preditos de glicosilação.
4 – Resultados Telleria EL
30
4.2 – Íntrons em Lltryp1 e Lltryp2
Para pesquisar a existência de íntrons nos genes de tripsinas foram realizadas
amplificações por PCR a partir de DNA genômico (gDNA) de L. longipalpis. A separação
dos produtos das amplificações, por eletroforese em gel de agarose está apresentada na Figura
4.4 abaixo.
Depois da eletroforese, excisão, purificação e clonagem, alguns produtos de PCR
foram seqüenciados. As seqüências obtidas foram alinhadas com as seqüências de cDNA
destes genes e as regiões que não estavam presentes nos cDNA foram evidenciadas e
identificadas como as regiões de íntrons. Os iniciadores utilizados e seus respectivos clones
estão apresentados na Tabela 4.3 e Figura 4.5 abaixo.
Figura 4.4: Amplificação de Lltryp1 ou Lltryp2 a partir de cDNA e gDNA:
1
,
2
,
3
e
4
: iniciadores específicos para
Lltryp1; 5, 6, 7 e 8: iniciadores específicos para Lltryp2; c: reações com cDNA; g: reações com gDNA; 50 pb e 100 pb:
marcadores de tamanho molecular. Os fragmentos de interesse estão indicados por setas.
3
33
3
2
22
2
4 – Resultados Telleria EL
31
Tabela 4.3: Iniciadores e produtos obtidos em PCR com gDNA.
Gene Iniciador Clone
Produto de gDNA Produto de cDNA
Íntron
Trip1C-F (
1
) eTrip-R (
4
)
-------
< 1000 pb ~ 800 pb < 200 pb
Trip1C-F (
1
) eTrip1A-R (
2
)
#31 ~ 600 pb > 500 pb < 100 pb
Lltryp1
Trip1A-F (
3
) e Trip-R (
4
)
-------
< 300 pb ~ 200 pb < 100 pb
Trip2B-F (
5
) e Trip2A-R (
6
)
#3 ~ 600 pb > 500 pb < 100 pb
Trip2B-F (5) e Trip2-R (
6
)
#39 ~ 900 pb > 700 pb < 200 pb
Lltryp2
Trip2-F (
7
)e Trip2-R (
8
)
#62 < 400 pb ~ 300 pb < 100 pb
Os produtos de PCR da primeira e terceira reações listadas na tabela acima, referentes
ao gene Lltryp1, com os iniciadores Trip1C-F (1) + Trip-R (4) e Trip1A-F (3) + Trip-R (4),
não foram seqüênciados. Entretanto, pelo gel de agarose (Fig. 4.4) pode-se verificar que a
diferença de tamanho entre os produtos amplificados a partir de gDNA e cDNA, usando o par
de iniciadores Trip1C-F + Trip-R, é de pouco menos de 200 pb. Uma vez que a diferença de
tamanhos entre os produtos de PCR com gDNA e cDNA da segunda reação listada, com
Figura 4.5: Estratégia de amplificação de gDNA. Barras vermelhas indica
m íntrons; barras cinzas
representam cDNA, barras pretas representam gDNA; linhas pontilhadas representam produtos de PCR,
números dentro de retângulos indicam o tamanho aproximado dos produtos de PCR, setas e seus
números correspondentes indicam iniciadores utilizados em PCR.
4 – Resultados Telleria EL
32
iniciadores Trip1C-F (1) + Trip1A-R (2), tem pouco menos de 100 pb, supõe-se que o
produto de gDNA da primeira reação (Trip1C-F (1) + Trip-R (4)) tem mais de um íntron.
Este resultado é confirmado ao constatar-se que na terceira reação, com iniciadores Trip1A-F
(3) + Trip-R (4), também há uma diferença de pouco menos de 100 pb entre os produtos
amplificados com gDNA e com cDNA.
A análise dos clones referentes ao gene Lltryp2 é mais facilmente apresentada pelo
estudo das seqüências obtidas, uma vez que todos os seus clones foram seqüenciados.
Alinhamentos foram feitos com as seqüências dos clones obtidos para Lltryp1, Lltryp2
e seus respectivos cDNAs. O resultado consenso do alinhamento para cada gene está
apresentado nas Figuras 4.6 e 4.7. Estas imagens representam íntrons presentes nos clones
que continham o maior fragmento (clone #31 para Lltryp1 e clone #39 para Lltryp2).
Figura 4.6: Seqüência de nucleotídeos de
Lltryp1
. Números à direita e à esquerda
da figura indicam o
número de pares de bases da seqüência. Letras em preto indicam nucleotídeos da seqüência de cDNA
(cDNA_Lltryp1), letras em vermelho indicam íntron presente na seqüência do clone de DNA genômico
(gDNA_Lltryp1), setas indicam iniciadores utilizados nas amplificações por PCR. Triângulo vermelho
indica a provável posição do segundo íntron.
4 – Resultados Telleria EL
33
Pelo estudo apresentado referente à região amplificada por PCR com os iniciadores
indicados na Tabela 4.2.1 e com gDNA, constata-se que os genes Lltryp1 e Lltryp2 têm ao
menos dois íntrons de tamanho inferior a 100 pb cada. Os resultados de seqüenciamento
mostram que em Lltryp1 o primeiro íntron tem 65 pb e encontra-se após o nucleotídeo 215 da
seqüência de seu cDNA. Em Lltryp2 o primeiro íntron tem 72 pb e o segundo tem 70 pb e
encontram-se, respectivamente, após os nucleotídeos 209 e 615 da seqüência de seu cDNA.
Figura 4.7: Seqüência de nucleotídeos de Lltryp2. Números à direita e à esquerda da figura indicam o
número de pares de bases da seqüência. Letras em preto indicam nucleotídeos da seqüência de cDNA
(cDNA_Lltryp2), letras em vermelho indicam íntrons presentes na seqüência do clone de DNA genômico
(gDNA_Lltryp2), setas indicam iniciadores utilizados nas amplificações por PCR.
4 – Resultados Telleria EL
34
4.3 – Tripsinas Constitutivas e Induzidas por Sangue
Várias seqüências nucleotídicas e de aminoácidos de tripsinas constitutivas e
induzidas por sangue de diferentes insetos hematófagos, foram identificadas numa busca por
similaridade (BLAST) no banco de dados GeneBank. Aquelas que foram utilizadas no
alinhamento múltiplo são mostradas na Tabela 4.4 abaixo.
Tabela 4.4: Seqüências de tripsinas descritas como Constitutiva ou Induzida por Sangue
Organismo Gene Classificação Número de Acesso
no GeneBank
Pptryp1 Constitutiva AAM96940
Pptryp2 Constitutiva AAM96941
Pptryp3 Induzida por sangue AAM96942
Phlebotomus papatasi
Pptryp4 Induzida por sangue AAM96943
Aedes aegypti Aatryp1 Constitutiva AAM34268
Cctryp1 Constitutiva AAK50138 Culex pipiens quinquefasciatus
Cctryp2 Induzida por sangue AAB37261
Antryp1 Induzida por sangue CAA80512
Antryp2 Induzida por sangue CAA80518
Antryp3 Constitutiva CAA80517
Antryp4 Constitutiva CAA80515
Antryp5 Constitutiva CAA80514
Antryp6 Constitutiva CAA80513
Anopheles gambiae
Antryp7 Constitutiva CAA80517
O alinhamento de seqüências de aminoácidos destes insetos com aquelas de L.
longipalpis mostram regiões conservadas na Figura 4.8. As regiões conservadas sem
interrupções (em preto) são compostas por menos do que nove aminoácidos e as pequenas
substituições podem configurar a especificidade das diferentes tripsinas.
4 – Resultados Telleria EL
35
Figura 4.8: Tripsinas de mosquitos e de
flebotomíneos descritas como constitutiva (E)
ou induzida por sangue (L) foram selecionadas e alinhadas. As seqüências são de: L.
longipalpis (marcada com retângulo negro): Lltryp1-L, e Lltryp2-E; de P. papatasi:
Pptryp1-E, Pptryp2-E, Pptryp3-L e Pptryp4-L; A. aegypti: Aatryp1-E; Aatryp2-L; C. p.
quinquefasciatus: Cptryp1-E; Cptryp2-L; A. gambiae: Antryp1-L, Antryp2-L, Antryp3-E,
Antryp4-E, Antryp5-E, Antryp6-E e Antryp7-E. Aminoácidos altamente conservados
estão marcados em preto e os menos conservados em cinza. Sítios ativos estão marcados
com retângulo vermelho. (▼) indica resíduo e região de ativação, (*) indicam cisteínas
conservadas, (##) indica resíduos de especificidade.
Alinhamento Múltiplo de Tripsinas de Insetos Hematófagos
4 – Resultados Telleria EL
36
4.4 – Árvore Filogenética
No intuito de comparar as seqüências de aminoácidos de tripsinas descritas como
constitutivas ou induzidas por sangue de três mosquitos diferentes (A. gambiae, C.
quinquefaciatus e A. aegypti) e de duas espécies de flebotomíneos (P. papatasi e L.
longipalpis), foi construída uma árvore filogenética (Figura 4.9) utilizando o programa
MEGA.
Os resultados mostram que as seqüências de flebotomíneos estão separadas em dois
grupos. Um grupo inclui seqüências dos genes PpTryp1, PpTryp2 e Lltryp2, todas expressas
constitutivamente. Um outro grupo inclui os genes Lltryp1, PpTryp3 e PpTryp4, que têm sua
transcrição aumentada após a ingestão de sangue. Estes dois grupos apresentam valores de
“bootstrap” bem altos. Lltryp1 apresenta uma relação mais direta com PpTryp3 e PpTryp4,
que são genes que apresentam um alto nível de transcrição ao final do processo de digestão,
30 horas após alimentação sangüínea (Ramalho-Ortigao et al., 2003). O gene Lltryp2 está
diretamente relacionado aos genes Pptryp1 e Pptryp2 que são provavelmente tripsinas iniciais
ou constitutivas, que apresentam alto nível de transcrição no início da digestão, entre o início
(inseto não alimentado) e 6 horas após a ingestão de sangue. O gene de tripsina constitutiva
de A. aegypti (Aetryp1) também foi agrupado com os genes de tripsinas constitutivas de
flebotomíneos analisados neste estudo. Tripsinas de outras duas espécies de mosquitos,
incluindo quatro constitutivas e duas induzidas por sangue de A. gambiae (Giannoni et al.,
2001), e uma constitutiva e uma induzida por sangue de C. p. quinquefasciatus formaram um
grupo separado, apesar de apresentarem um valor de “bootstrap” baixo.
4 – Resultados Telleria EL
37
Antryp7 C
Antryp4 C
Antryp1 I
Antryp2 I
Antryp5 C
Antryp6 C
Cptryp1 C
Cptryp2 I
Pptryp3 I
Pptryp4 I
Lltryp1 I
Aatryp1 C
Lltryp2 C
Pptryp1 C
Pptryp2 C
Fctryp
100
100
53
44
88
99
80
99
95
56
23
37
61
0.1
Figura 4.9: Análise filogenética com tripsinas de mosquitos A. gambiae, C. p. quinquefaciatus e A.
aegypti, comparando-as com tripsinas de flebotomíneos P. papatasi e L. longipalpis. Tripsinas
constitutivas são indicadas com a letra C e as induzidas por sangue pela letra I. (
▲) Seqüências de L.
longipalpis. Valores de “bootstrap” estão indicados em cada ramo.
Árvore Filogenética de Tripsina de Insetos Hematófagos
4 – Resultados Telleria EL
38
4.5 – Expressão Diferencial dos Genes de Tripsinas
Com o objetivo de amplificar especificamente por PCR os cDNAs de tripsina de L.
longipalpis, pares de iniciadores para Lltryp1 e Lltryp2 foram desenhados em regiões não
conservadas. As condições das reações foram estabelecidas na fase exponencial da
amplificação, entre 25 e 35 ciclos, conforme indicam os dados apresentados na Figura 4.10
abaixo.
De acordo com os resultados obtidos, foi estabelecido o número de 30 para os ciclos
de PCR a serem usados nos experimentos de expressão diferencial. E em reações para
Lltryp1 foi aumentado 4 vezes a quantidade de DNA molde.
Os controles para especificidade dos iniciadores estão indicados na Figura 4.11, feitos
com reações em 30 ciclos e mostram que o par de iniciadores específicos para Lltryp1
(Trip1A-F e Trip-R) amplifica somente DNA do clone de Lltryp1, assim como o par de
iniciadores específicos para Lltryp2 (Trip2B-F e Trip2A-R) amplifica apenas DNA do clone
de Lltryp2.
Estudo do número ideal de ciclos para PCR
0
20.000
40.000
60.000
80.000
100.000
120.000
140.000
15 20 25 30 35 40 45
Núm ero de ciclos
Intensidade do produto
amplificado
Lltryp1 Lltryp2 Histona
Figura 4.10: Intensidade de produtos amplificados em função do
número de ciclos de PCR. Barras indicam a intensidade do produto
amplificado, vermelho para Lltryp1, amarelo para Lltryp2 e azul para
histona.
4 – Resultados Telleria EL
39
Nos estudos de RT-PCR semi-quantitativo com cDNAs de fêmeas, foram obtidos
resultados que mostram que os dois tipos de tripsina estudados parecem ser regulados pela
ingestão de sangue (Figura 4.12). A expressão de Lltryp1 está diretamente relacionada à
alimentação sangüínea, uma vez que Lltryp1 está ausente em fêmeas não alimentadas e passa
a ser expresso em níveis altos a partir de 2 a 48 horas após a ingestão de sangue. Ao final do
processo digestivo, aproximadamente 72 horas após a alimentação sanguínea, Lltryp1 não é
mais detectada. É interessante notar que níveis baixos de Lltryp1 também foram detectados
em machos.
De forma contrastante, a transcrição de Lltryp2 é elevada em fêmeas não alimentadas
e decresce discretamente após a alimentação sangüínea. Os níveis de expressão de Lltryp2
permanecem baixos até que o processo digestivo se complete e retorna a um nível alto
semelhante a fêmea não alimentada após 96 horas e a macho (Figura 4.12).
Figura 4.12: RT
-
PCR de
Lltryp1
e
Lltryp2
. Foram usados cDNAs de fêmeas
alimentadas com açúcar (0h), em diferentes tempos após alimentação com
sangue, conforme indicado, e de machos. Reações com iniciadores de histona
foram usadas como controle constitutivo.
Figura 4.11: Teste de especificidade dos
iniciadores para Lltryp1 e Lltryp2. 100 pb,
marcador de tamanho molecular.
4 – Resultados Telleria EL
40
Os perfis de expressão entre Lltryp1 e Lltryp2 também são diferentes quando
analisados em estágios de desenvolvimento de L. longipalpis. Níveis baixos de expressão de
Lltryp2 são encontrados em ovos e nos três primeiros estágios larvares, com aumento de
expressão no último estágio larvar, semelhante ao obtido em machos e com declínio em pupa
(Figura 4.13). A expressão de Lltryp1 não foi detectada em nenhum desses estágios de
desenvolvimento.
Levando em consideração a descrição feita por Dillon e Lane (1993b) sobre a
diminuição da atividade proteolítica no tubo digestivo de P. papatasi infectado por L. major,
foi estudado o efeito da infecção por L. i. chagasi sobre o perfil de expressão de tripsinas de
L. longipalpis (Figura 4.14). Não foi verificada diferença significativa nos níveis de
expressão de Lltryp2 em fêmeas alimentadas com sangue ou sangue infectado 72 horas após
alimentação. A expressão de Lltryp1 permanece indetectável ao final da digestão,
aproximadamente 72 horas após a alimentação infectiva, apesar da presença do parasito
(Figura 4.14).
Figura 4.13: Expressão de genes de tripsinas em diferentes estágios de
desenvolvimento de L. longipalpis. L1 a L4, larvas em diferentes estágios; P,
pupa; ♂, machos adultos. Reações com iniciadores de histona foram usadas
como controle constitutivo.
Figura 4.14: Expressão de tripsinas em fêmeas 72h
após alimentação com sangue (72h S) ou 72h após
infecção artificial (72h I). Reações com iniciadores
de histona foram usadas como controle constitutivo.
4 – Resultados Telleria EL
41
4.6 – Quantificação da Expressão dos Genes de Tripsina
Os experimentos de RT-PCR descritos anteriormente foram repetidos 3 vezes. Os
produtos de PCR, separados por eletroforese em gel de agarose, tiveram a intensidade
mensurada usando o programa ImageJ. Valores de intensidade já subtraídos do valor de
fundo (background) medidos para amplicons de Lltryp1, Lltryp2 e histona são apresentados
por suas médias aritméticas e desvio padrão nas Tabelas 4.5, 4.6 e 4.7.
Também foram calculados os fatores de correção para os resultados das outras reações
de amplificações de histona (0 h, 6 h, 12 h, 48 h, 72 h, 96 h, 168 h, e Macho), com base no
valor da média de intensidade do resultado da amplificação de cDNA de 24h com iniciadores
de histona (59.032), evidenciado em negrito na Tabela 4.5, para os experimentos de RT-PCR
com cDNA de insetos adultos. Outro grupo de fatores de correção foi calculado com base no
valor da média de intensidade do resultado da amplificação de cDNA de macho com
iniciadores de histona (83.932), evidenciado em negrito na Tabela 4.6, para os experimentos
de RT-PCR com cDNA de estágios de desenvolvimento. Mais um fator de correção foi
calculado para os experimentos de RT-PCR com cDNA de inseto infectado, com base no
valor da média de intensidade do resultado da amplificação de cDNA de 72 h Sangue com
iniciadores de histona (81.929), evidenciado em negrito na Tabela 4.7.
Tabela 4.5: Média e desvio padrão de intensidade de produtos de RT-PCR com cDNAs de
insetos adultos e fator de correção para padrão de gene constitutivo.
cDNA Lltryp1 (x 10
3
) Lltryp2 (x 10
3
) histona (x 10
3
) Fator de correção
0 h
7 ± 1
71 ± 1 45 ± 5
1,31
2 h
47 ± 8
28 ± 7 59 ± 4
1,00
6 h
71 ± 2
39 ± 6 43 ± 4
1,38
12 h
83 ± 2
30 ± 6 34 ± 5
1,72
24 h
56 ± 9
42 ± 9
59 ±
±±
± 2
1,00
48 h
23 ± 6
43 ± 7 58 ± 6
1,02
72 h
4 ± 3
50 ± 8 55 ± 4
1,07
96 h
3 ± 1
21 ± 8 23 ± 3
2,57
168 h
1 ± 2
57 ± 5 47 ± 4
1,25
Macho
6 ± 2
94 ± 11 44 ± 8
1,34
4 – Resultados Telleria EL
42
Tabela 4.6: Média e desvio padrão de intensidade de produtos de RT-PCR com cDNAs de
estágios de desenvolvimento e fator de correção para padrão de gene constitutivo.
cDNA Lltryp2 (x 10
3
) histona (x 10
3
) Fator de correção
Ovo
14,9 ± 0,9
79 ± 1
1,06
L1
13 ± 1
78 ± 2
1,08
L2
14 ± 1
83 ± 2
1,01
L3
12,8 ± 0,9
79 ± 1
1,06
L4
86 ± 1
80 ± 2
1,05
Pupa
40,4 ± 0,9
76 ± 3
1,10
Macho
82 ± 1
84 ±
±±
± 3
1,00
Tabela 4.7: Média e desvio padrão de intensidade de produtos de RT-PCR com cDNAs de
inseto infectado e fator de correção para padrão de gene constitutivo.
cDNA 72 h
Lltryp1 (x 10
3
) Lltryp2 (x 10
3
) histona (x 10
3
) Fator de correção
Sangue
0,5 ± 0,2 24 ± 6
82 ±
±±
± 6
1,00
Infecção
0,3 ± 0,2 17 ± 6 60 ± 9
1,36
A normalização foi feita multiplicando cada valor de intensidade das amplificações
com os iniciadores de Lltryp1 e Lltryp2 pelo seu fator de correção correspondente. Também
foi calculada a proporção, em percentual, da intensidade dos amplicons em comparação ao
resultado do primeiro valor de cada tabela (Tabelas 4.8, 4.9 e 4.10). Os dados são também
apresentados em gráficos (Figuras 4.15, 4.16 e 4.17).
4 – Resultados Telleria EL
43
Tabela 4.8: Normalização dos resultados de RT-PCR com cDNAs de insetos adultos.
Valores de intensidade multiplicados pelo fator de correção
cDNA Lltryp1 (x 10
3
) % Lltryp2 (x 10
3
) %
0 h
10 ± 1
100
93 ± 1
100
2 h
47 ± 8
470
28 ± 7
30
6 h
99 ± 2
990
54 ± 6
58
12 h
142 ± 2
1420
53 ± 6
57
24 h
56 ± 9
560
42 ± 9
45
48 h
24 ± 6
240
44 ± 7
47
72 h
5 ± 3
50
54 ± 8
58
96 h
7 ± 1
70
55 ± 8
59
168 h
2 ± 2
20
71 ± 5
76
Macho
8 ± 2
80
126 ± 11
135
RT-PCR de Tripsinas em Insetos Adultos
Normalizado
-20000
0
20000
40000
60000
80000
100000
120000
140000
160000
0 h
2
h
6 h
1
2 h
24 h
48 h
72 h
96 h
168 h
Macho
cDNA
Intensidade
Lltryp1 Lltryp2 Histona
Figura 4.15: Intensidade normalizada de produtos amplificados em função do cDNA
utilizado em PCR. Barras indicam a intensidade do produto amplificado, laranja para
Lltryp1, verde para Lltryp2 e azul para histona.
4 – Resultados Telleria EL
44
Tabela 4.9: Normalização dos resultados de RT-PCR com cDNAs de estágios de
desenvolvimento.
cDNA Lltryp2 (x 10
3
) %
Ovo
15,7 ± 0,9
100
L1
15 ± 1
96
L2
14 ± 1
89
L3
13,6 ± 0,9
87
L4
90 ± 1
573
Pupa
44,5 ± 0,9
283
Macho
82 ± 1
522
RT-PCR de Tripsina em Estágios de
Desenvolvimento Normalizado
0
20000
40000
60000
80000
100000
Ovo L1 L2 L3 L4 Pupa Macho
cDNA
Intensidade
Lltryp2 Histona
Figura 4.16: Intensidade normalizada de produtos amplificados em função do cDNA
utilizado em PCR. Barras indicam a intensidade do produto amplificado, verde para
Lltryp2 e azul para histona.
4 – Resultados Telleria EL
45
Tabela 4.10: Normalização dos resultados de RT-PCR com cDNA de inseto infectado.
cDNA 72 h
Lltryp1 (x 10
3
) % Lltryp2 (x 10
3
) %
Sangue
0,5 ± 0,2
100
24 ± 6
100
Infecção
0,4 ± 0,2
80
23 ± 6
96
RT-PCR de Tripsinas sangue x infecção
Normalizado
0
10000
20000
30000
40000
50000
60000
70000
80000
90000
100000
Lltryp1 Lltryp2 Histona
Genes
Intensidade
cDNA 72h sangue cDNA 72h infecção
Figura 4.17: Normalização de intensidade de produtos amplificados em
função do iniciador utilizado em PCR. Barras indicam a intensidade do
produto amplificado, verde para cDNA 72h Sangue e azul para cDNA
72h Infectado.
4 – Resultados Telleria EL
46
4.7 – Western Blot
O anti-soro contendo anticorpo policlonal anti-tripsina, já disponível em nosso
laboratório, foi titulado testando três diluições do anticorpo primário (Ac 1
ario
), combinadas
com três diluições do anticorpo secundário (Ac 2
ario
) de cabra anti-IgG de coelho (Figura
4.18).
Os resultados acima indicam que a combinação das diluições 1 : 500 do Ac 1
ario
com a
diluição de 1 : 20.000 do Ac 2
ario
fornece uma marcação considerável da proteína
recombinante sem apresentar marcação de fundo (background) na membrana de nitrocelulose.
Os experimentos realizados com este anti-soro, com o objetivo de localizar tripsinas tanto por
Western blot como em Imunolocalização em tubos digestivos, foram baseados nesta titulação,
apenas com aumento da concentração do Ac 1
ario
quando era necessária uma marcação mais
forte.
Para o Western blot, a separação de proteínas totais de L. longipalpis foi feita em
SDS-PAGE com o gel de corrida a uma concentração de 15 % (p/v) de poliacrilamida. Em
cada poço de amostra foi aplicado um volume de extrato protéico total equivalente a 1 inseto
inteiro. As amostras aplicadas são de insetos não alimentados e insetos obtidos em diferentes
horários após alimentação sangüínea (Figuras 4.19 e 4.20).
Fig. 4.18: Titulação do anticorpo anti
-
tripsina. Diluições dos Ac 1
ario
e Ac 2
ario
variam conforme indicado na figura. As
diluições escolhidas para Western blots é
indicada pelo retângulo vermelho.
4 – Resultados Telleria EL
47
Os resultados sugerem que de 6 até 48 horas após a alimentação sangüínea é possível
detectar proteínas com peso molecular semelhante ao peso calculado a partir das seqüências
de cDNA de Lltryp1 e Lltryp2 (24,7 kDa da proteína madura a 27,8 kDa do zimogênio).
Pode-se ainda sugerir que haja formação de agregados não naturais para estas tripsinas, pois
estes experimentos mostram uma marcação para proteínas com peso molecular aproximado de
50 kDa nas amostras de insetos com 6 a 48h após alimentação. Sangue de hamster não
apresenta reação com o anticorpo utilizado.
Fig. 4.20: Revelação 2 de Western blot
anti-tripsina. M: marcador de peso
molecular; 0h: inseto não alimentado;
6h, 12h, 24h, 48h, 72h, 96h e 192h:
insetos obtidos em diferentes horários
após alimentação sangüínea; S: sangue
de hamster.
Fig. 4.19: Revelação 1 de Western blot
anti-tripsina. M: marcador de peso
molecular; Tr: tripsina recombinante; 0h:
inseto não alimentado; 6h, 12h, 24h, 48h,
72h, 96h e 192h: insetos obtidos em
diferentes horários após alimentação
sangüínea..
4 – Resultados Telleria EL
48
4.8 – Atividade Enzimática
A atividade enzimática presente no homogenado protéico de tubo digestivo de L.
longipalpis sobre o substrato BAρNA, que é específico para enzimas do tipo tripsina, foi
mensurada a partir da densidade óptica medida na reação de degradação do substrato. Os
valores apresentados na Figura 4.21 abaixo são as médias aritméticas de um experimento feito
em duplicata.
Controle negativo (branco) não apresentou atividade.
Os valores de atividade enzimática obtidos para os insetos alimentados com sangue
são muito próximos àqueles de insetos infectados artificialmente entre 0h e 24h após
alimentação. Entretanto é verificado que em insetos 48h após a infecção, a atividade de
tripsina é menor, aproximadamente metade, se comparada a insetos alimentados apenas com
sangue.
Sangue
Infectado
Figura 4.21: Atividade proteolítica de tripsina presente em tubo digestivo de
L. longiplapis
. eixo horizontal
representa amostras de tubos digestivos dissecados em 0h, 2h, 6h, 12h, 24h, 48h e 72h após alimentação;
eixo vertical representa atividade enzimática (µmol / tubo digestivo / minuto) calculada a partir da densidade
óptica da reação medida em espectrofotômetro. Em preto, insetos alimentados com sangue; em vermelho,
insetos infectados artificialmente com L. i. chagasi.
4 – Resultados Telleria EL
49
4.9 – Imunolocalização
Os estudos preliminares em colaboração com o Laboratório de Entomologia Médica –
CPqRR – Fiocruz, realizados pela equipe do Dr. Paulo Pimenta, evidenciaram regiões do tubo
digestivo de L. longipalpis reconhecidas pelo anticorpo policlonal anti-tripsina. A revelação
indica a presença de tripsina distribuída pelo citoplasma das células intestinais (Figura 4.22).
Fig. 4.22: Imunolocalização de tripsina em tubo digestivo: Em azul: marcação específica para núcleo com
DAPI; em verde marcação para tripsinas. A: tubo digestivo dissecado após 6h de alimentação (aumento de
63 x); B: detalhe de tubo digestivo dissecado após 6h de alimentação (aumento de 100 x); C: tubo digestivo
dissecado após 24h de alimentação (aumento de 100 x).
4 – Resultados Telleria EL
50
4 – Resultados Telleria EL
51
Os estudos realizados em colaboração com a Dra. Juliana Dutra, pesquisadora
visistante em nosso laboratório, utilizando o serviço de microscopia confocal no
Departamento de Patologia – IOC – Fiocruz, também evidenciaram regiões do tubo digestivo
de L. longipalpis reconhecidas pelo anticorpo policlonal anti-tripsina, distribuída pelo
citoplasma das células (Figura 4.23).
A D C B F E
Fig. 4.23: Imunolocali
zação de tripsina em tubo digestivo por microscopia confocal a laser. Coluna da
esquerda: tubos digestivos de insetos não alimentados (0 h); coluna da direita: tubos digestivos dissecados
após 6h de alimentação sangüínea. A e D: marcação em vermelho específica para tripsina; B e E: marcação
em azul específica para núcleo; C e F: sobreposição de marcações de tripsina e núcleo.
4 – Resultados Telleria EL
52
5 – Discussão Telleria EL
53
5 – Discussão
Considerando-se a falta de vacinas eficientes e os sérios efeitos colaterais de terapias
tradicionais, novas abordagens para o controle das leishmanioses são de grande necessidade.
A perspectiva de controlar doenças transmitidas por insetos depende grandemente de nossa
capacidade em controlar o inseto vetor ou interferir nas interações parasito-vetor. As
limitações de métodos tradicionais de controle de vetores, como resistência a inseticidas,
custos elevados e grande impacto ecológico devido aos resíduos tóxicos e agressão a outras
espécies, indicam a necessidade de serem incrementadas novas técnicas baseadas em Biologia
Molecular. Por exemplo, a manipulação genética de insetos vetores com a intenção de alterar
sua capacidade vetorial é uma abordagem alternativa para combater doenças infecciosas
transmitidas por insetos, que visa interferir em alvos moleculares em órgãos ou tecidos onde
ocorre a interação parasito-vetor.
A transgênese tornou possível gerar insetos geneticamente modificados alterando sua
habilidade em transmitir parasitos. Isso foi possível em parte devido ao estudo de regiões
promotoras de genes órgão-específicos, que permitiu produzir proteínas de ação citotóxica em
regiões e momentos bem definidos.
Um exemplo foi a ativação da imunidade sistêmica em A. aegypti pela expressão de
peptídeo antimicrobiano (defensina-A), que normalmente é regulado por uma resposta
imunológica. Neste caso a produção de defensina foi ativada pela digestão, pela associação
do gene à região promotora do gene de vitelogenina e sua presença foi detectado na
hemolinfa, num pico máximo em 24 horas após a alimentação com sangue (Kokoza et al.,
2000). Outro exemplo foi a expressão de fosfolipase-A de veneno de abelha no tubo
digestivo de A. stephensi. Este gene foi associado à região promotora do gene de
carboxipeptidase e teve pico de expressão a partir de 4 horas após a ingestão de sangue,
inibindo o desenvolvimento de Plasmodium berghei e sua transmissão (Moreira et al. 2002).
No caso de mosquitos transmissores da malária, a identificação de promotores específicos foi
fundamental para o desenvolvimento de insetos transgênicos incapazes de transmitir a doença
(revisto por Jacobs-Lorena, 2003).
Em nosso laboratório estamos interessados em identificar e caracterizar moléculas
moduladas a partir da alimentação sangüínea de L. longipalpis e na interação L. i. chagasi –
vetor. Nossa equipe realizou estudos de expressão diferencial de genes, principalmente
comparando tubos digestivos de insetos alimentados ou não com sangue, ou infectados ou não
com leishmanias. A partir destes estudos foram identificados vários genes de potencial
interesse e na eventualidade do desenvolvimento de flebotomíneos transgênicos, a
5 – Discussão Telleria EL
54
disponibilidade de promotores úteis também será fundamental. Dois genes foram
identificados em L. longipalpis que poderão fornecer esses promotores candidatos. Foi
identificada uma quitinase específica de tubo digestivo expressa diferencialmente em
condição de alimentação sangüínea. Essa quitinase possui pico de expressão 72 horas após
alimentação sangüínea, momento no qual a matriz peritrófica está em processo de degradação
(Ramalho-Ortigão e Traub-Cseko, 2003). Uma vez que este é o momento crítico para a
adesão dos parasitas ao tubo digestivo do inseto, o promotor deste gene poderá ser útil na
expressão de moléculas anti-leishmania. Nossos resultados de expressão de genes de tripsina
em L. longipalpis também apontam para a utilidade em potencial de promotores destes genes
no desenvolvimento de abordagens moleculares de controle do parasita. Assim como em
outros insetos hematófagos da ordem Diptera, as proteases digestivas tais como tripsinas e
quimotripsinas são as principais enzimas responsáveis pela digestão de sangue em
flebotomíneos. Tais proteases são consideradas com uma das barreiras cruciais que as
leishmanias devem superar para sobreviver no tubo digestivo de flebotomíneos e a morte
antecipada de formas amastigotas em processo de diferenciação pela ação de enzimas
proteolíticas podem causar um impacto significativo na eficiência da infecção em
flebotomíneos (Pimenta et al., 1997).
Ao contrário de P. sergenti ou P. papatasi, que são considerados vetores restritivos, L.
longipalpis é geralmente retratada como vetor permissivo, que se infecta com várias espécies
de Leishmania (revisto por Kamhawi, 2006). Em P. papatasi, um vetor restritivo que
apresenta apenas infecção por L. major, Schlein e Jacobson (1998) indicaram que
componentes do sangue podem modular a resistência à infecção com L. donovani. Borovsky
e Schlein (1987) e Dillon e Lane (1993) indicaram que em infecções em P. papatasi com L.
major, é detectado uma diminuição significativa na atividade proteolítica.
Em P.papatasi, seis proteases digestivas foram caracterizadas (Ramalho-Ortigao et al.,
2003) mas ainda não foram feitos estudos mostrando se a alimentação com sangue infectado
seria capaz de interferir no perfil de expressão de RNA ou na atividade destas enzimas. Em
flebotomíneos do Novo Mundo, um trabalho recente identificou a presença de cDNAs de três
tripsinas e três quimotripsinas em bibliotecas de expressão de L. longipalpis (Dillon et al.,
2006). Nossos resultados de seqüencimento de ESTs identificaram dois tipos de tripsinas.
Enzimas digestivas têm sido amplamente estudadas em mosquitos. Em A. aegypti,
tripsinas iniciais e tardias já foram caracterizadas (Barrilas-Mury e Wells, 1993; Noriega et
al., 1994; Noriega et al., 1996a; Noriega et al., 1996b; Noriega e Wells 1999; Lu et al., 2006).
A enzima inicial é expressa em baixas quantidades imediatamente após a alimentação
5 – Discussão Telleria EL
55
sangüínea, enquanto a tardia é expressa em grandes quantidades 8 a 36 horas após a ingestão
de sangue (revisto em Noriega e Wells, 1999). Dados anteriores (Barillas-Murry et al., 1995)
sugeriam que a tripsina inicial poderia ter um papel na ativação da transcrição do gene da
tripsina tardia. Entretanto, recentemente, Lu et al. (2006) demonstraram que apesar da
expressão diferencial dos dois genes em A. aegypti, a tripsina inicial não regula a expressão da
tripsina tardia, uma vez que a alimentação de insetos com sangue contendo inibidor específico
para a tripsina inicial não interferiu na expressão da tripsina tardia.
Nós descrevemos dois cDNAs, Lltryp1 e Lltryp2, identificados a partir de bibliotecas
de cDNA de tubos digestivos de L. logipalpis alimentados com sangue. Apresentamos, para
estes dois genes, a seqüência nucleotídica codificante completa e a seqüência de aminoácidos
deduzida. Identificamos também a presença de dois íntrons, com localização preservada entre
os dois genes, e suas seqüências serão usadas para compor a seqüência completa de cada
gene. Mostramos que sua transcrição é regulada durante as fases de desenvolvimento do
inseto e com a digestão de sangue. Lltryp1, que parece ser idêntica à tripsina identificada por
Dillon et al. (2006) (número de acesso ao GeneBank: AM108824.1) é induzida pela
alimentação sangüínea, apresentando início de transcrição logo após a ingestão de sangue,
com um pico em 12 horas, e finalizando em 48 horas após a alimentação. Lltryp1 não foi
detectada em ovos, larvas ou pupas. Entretanto, uma baixa expressão de Lltryp1 foi detectada
em machos adultos. Lltryp2, idêntica a outra tripsina de L. longipalpis identificada por Dillon
et al. 2006 (número de acesso ao GeneBank AM101483.1), é expressa constitutivamente, está
presente em todos os estágios de desenvolvimento do inseto, e sua expressão parece ser
modulada. Durante os estágios de desenvolvimento, Lltryp2 atinge um máximo de expressão
durante o último estágio larvar (L4) quando a larva não se alimenta. No estágio de pupa, a
expressão de Lltryp2 é novamente reduzida a níveis semelhantes àqueles detectados em
embriões e em L1 até L3. Curiosamente, Lltryp2 está mais expressa em fêmeas não
alimentadas com sangue e ao final da digestão sangüínea, assim como em machos, e apresenta
níveis baixos de expressão quando as fêmeas estão com conteúdo sangüíneo no tubo
digestivo. Mais estudos serão necessários para esclarecer se a expressão de Lltryp2 é regulada
por um mecanismo de alimentação ou por um outro fator presente em um ou mais estágios de
desenvolvimento do flebotomíneo. Não foi detectada uma diferença no perfil de expressão de
transcritos de Lltryp2 após 72 horas de alimentação sangüínea quando comparamos a
alimentação com ou sem L. i. chagasi. Lltryp1 não é expressa após 72 horas da alimentação
sangüínea, e ao ser alimentada com sangue infectado, não ocorre expressão visivelmente
aumentada. Entretanto, como as infecções foram feitas com parasitas promastigotas, é
5 – Discussão Telleria EL
56
possível que sejam encontrados resultados diferentes se as infecções forem feitas com formas
amastigotas de L. i. chagasi, como na natureza.
Os dados de expressão de genes de tripsina publicados para o flebotomíneo do Velho
Mundo (Ramalho-Ortigao et al., 2003) diferem em alguns aspectos em relação aos nossos
resultados. Em P. papatasi foi detectada uma expressão basal em fêmeas não alimentadas
para os quatro cDNAs de tripsinas caracterizados, enquanto que em L. longipalpis, nenhuma
expressão foi detectada em Lltryp1 antes da alimentação sangüínea. Aparentemente, há uma
correlação entre a expressão de Lltryp2 (expressa constitutivamente) e Lltryp1 (induzida por
sangue), pois os níveis de expressão de Lltryp2 são reduzidos enquanto os de Lltryp1 são
aumentados, e, posteriormente, retornam a níveis semelhantes àqueles de fêmeas não
alimentadas, enquanto para Lltryp1 são interrompidos. Tal relação não foi vista entre
transcritos de tripsina caracterizados em P. papatasi. Entretanto quando as seqüências de P.
papatasi e L. longipalpis foram analisadas filogeneticamente, os cDNAs de tripsinas
expressas constitutivamente dos dois gêneros, Lltryp2, Pptryp1 e Pptryp2 foram agrupados
em um único grupo, enquanto os cDNAs regulados, Lltryp1 e Pptryp4 foram agrupados em
um novo grupo.
Em relação a outros insetos, nossos resultados têm um certo grau de similaridade com
o padrão de expressão inicial e tardia de genes de tripsina visto em A. aegypti (Barillas-Mury
and Wells, 1993; Noriega et al., 1996a; Noriega et al., 1996b) e em A. gambiae (Muller et al.,
1995). Em ambos mosquitos e em L. longipalpis, os genes de tripsinas constitutivas (iniciais)
são expressos em insetos não alimentados. Entretanto, em mosquitos a expressão destes
genes é interrompida 24 horas após a ingestão de sangue e é ausente em machos. Em L.
longipalpis, esta tripsina constitutiva nunca é completamente interrompida em fêmeas
alimentadas com sangue e está presente em machos. Em contraste, os genes induzidos por
sangue são altamente expressos 24 horas após a ingestão de sangue nos dois mosquitos
(Barillas-Mury e Wells, 1993; Muller et al., 1993; Muller et al., 1995; Noriega e Wells, 1999)
e em P. papatasi (Ramalho-Ortigao et al., 2003). Em L. longipalpis, o transcrito induzido por
sangue, Lltryp1, não é detectado em insetos não alimentados assim como o gene Antryp2 de
A. gambiae, detectável apenas após a ingestão de sangue (Muller et al., 1993).
A presença de tripsinas verificada nos resultados de Western blot indica que há maior
quantidade de enzima entre 6 e 24 horas, o que corresponde ao perfil de expressão induzido
por sangue visto em RT-PCR para Lltryp1. Entretanto as marcações observadas nos horários
de 6 a 48 h podem representar o total de tripsinas presentes. Em L. longipalpis podem ser
5 – Discussão Telleria EL
57
observadas duas marcações para proteínas com peso molecular maior do que 25 kDa, de
forma semelhante aos estudos de Western blot de proteínas de tubo digestivo do camarão
Litopenaeus vannamei, que mostra a forma ativa da tripsina com 30,2 kDa e seu zimogênio
com 32,9 kDa (Light e Janska, 1989; Wormhoundt et al., 1995; Klein et al., 1996) (revisto
por Saiz et al. 2004). Nossos cálculos de peso molecular feitos a partir das seqüências de
aminoácidos de Lltryp1 e Lltryp2, indicam que a diferença entre as duas marcações seja de
aproximadamente 3,2 kDa para a enzima induzida e 2,9 kDa para a enzima constitutiva.
O seqüenciamento por espectrometria de massas, após digestão tríptica destas
proteínas evidenciadas por Western blot possibilitaria identificar se são tripsinas codificadas
pelo cDNA de Lltryp1 ou pelo Lltryp2 e identificaria se é traduzido após a alimentação como
sugere o perfil encontrado para Lltryp1 em RT-PCR.
Nossos resultados preliminares de imunolocalização de tripsinas em L. longipalpis
apresentam marcação distribuída pelo citoplasma tanto em tubos digestivos de fêmeas não
alimentadas e em 6 horas após alimentação com sangue. Aparentemente, estas enzimas estão
sendo produzidas mesmo antes da alimentação, com um padrão constitutivo. Isto é
consistente com o resultado de expressão, ao nível de RNA, porém não é consistente com o
resultado de Western blot. Outros experimentos são necessários para esclarecer esses pontos.
No mosquito A. aegypti foi relatada a imunolocalização de tripsinas com forte
marcação por imunocitoquímica no lúmen do tubo digestivo, ao redor do bolo alimentar e
entre a membrana peritrófica em horários posteriores à alimentação com sangue (entre 8 e 24
horas). Por microscopia eletrônica foi identificada marcação em grânulos secretórios em 12
horas após ingestão. Em 18 horas foram encontrados grânulos no complexo de Golgi que
devem ser liberados por exocitose no lúmen do intestino (Graf et al. 1986).
Schlein e Jacobson (1998) mostraram que inibidores de tripsinas adicionados ao
sangue fornecido a P papatasi, favorecem o sucesso da infecção por L. donovani, que em
condições naturais não seria capaz de sobreviver nestes vetores. Em ensaios de avaliação de
atividade enzimática em tubo digestivo de P. papatasi e P. langeroni, usando substratos
específicos para proteases digestivas, Dillon e Lane (1993b) viram que a atividade de
proteases alcalinas, aminopeptidases e tripsinas podem ser alteradas por algum componente
presente no sangue ingerido contendo L. major. Nestas duas espécies, a atividade de tripsinas
detectada através da degradação de BAρNA é inferior quando os insetos estão infectados e
permanece detectável por um período mais longo, 50 a 72 horas, se comparado aos insetos
5 – Discussão Telleria EL
58
alimentados apenas com sangue. É interessante ressaltar que nos experimentos descritos por
Dillon e Lane (1993), P. langeroni, que não é o vetor natural para L. major, tem atividade de
tripsinas maior do que P. papatasi.
No único estudo de enzimas digestivas envolvendo espécies de flebotomíneos do
Novo Mundo, Mahmood e Borovsky (1993) descreveram um aumento na atividade de tripsina
durante o desenvolvimento de larva e pupa de Lutzomyia anthophora. Também foi observado
um aumento da atividade enzimática com pico em 72 horas após alimentação sangüínea
(Mahmood e Borovsky, 1993). Nossos resultados preliminares mostram que a atividade
enzimática de tripsinas está em seu pico em 12 horas após a alimentação e que em 72 horas já
não há mais atividade significativa. Em nossos estudos com L. longipalpis foi observada uma
diminuição da atividade de tripsinas em tubo digestivo de fêmeas infectadas, quando
comparada à de fêmeas alimentadas apenas com sangue em 48 horas após a alimentação. Ao
final do processo digestivo, em 72 horas, nenhuma atividade é detectada, seja em insetos
alimentados com sangue ou infectados.
Estes resultados correspondem ao perfil da enzima induzida após a alimentação. Nos
experimentos de RT-PCR observamos que Lltryp1 apresenta este tipo de perfil assim como
por Western blot onde também são vistas marcações equivalentes ao padrão de protease
induzida.
Esta é a primeira caracterização molecular de genes relacionados a digestão em L.
longipalpis. O padrão de expressão destes dois genes identificados sugere uma função
digestiva para Lltryp1, que é aumentado com a alimentação sangüínea. Para o gene Lltryp2,
expresso constitutivamente, sua função permanece ainda por ser determinada. Tripsinas
foram identificadas em ensaios preliminares de Western blot em perfil diretamente associado
à alimentação sanguínea. Estudos adicionais são necessários para investigar a importância
destes genes no desenvolvimento da Leishmania e como sua indução é modulada em resposta
à infecção em espécies diferentes de flebotomíneos.
6 – Conclusões Telleria EL
59
6 – Conclusões
- Dois cDNAs de tripsinas foram caracterizados (Lltryp1 e Lltryp2) a partir do
seqüenciamento de uma biblioteca de ESTs de L. longipalpis.
- A seqüência de aminoácidos deduzida destes dois cDNAs apresentam a tríade
catalítica característica (H D S) e resíduos conservados entre tripsinas.
- O sequenciamento de gDNA amplificado por iniciadores destas tripsinas indicam a
presença de dois íntrons em ambos os genes e em posições correspondentes.
- Na análise filogenética entre tripsinas descritas como constitutivas ou induzidas por
sangue, nossas seqüências estão mais semelhantes às de P. papatasi, sendo que Lltryp1 está
mais relacionada com a forma induzida e Lltryp2 está mais relacionada à forma constitutiva.
- Por RT-PCR verificamos que Lltryp1 apresenta um perfil de transcrição induzido por
sangue, estando ausente em fêmeas não alimentadas e aumentado a partir de 2 até 48 horas
após alimentação. Lltryp2 apresenta um perfil constitutivo, porém está ligeiramente
aumentado em fêmeas não alimentadas e ao final do processo digestivo. Em machos, a
transcrição de Lltryp1 é pequena enquanto Lltryp2 está alta.
- Em estágios de desenvolvimento não há transcrição de Lltryp1, mas Lltryp2 está
muito aumentada em larva L4, e um pouco menos em pupa.
- A infecção por L. i. chagasi não interfere na transcrição de Lltryp2 em 72 horas após
a alimentação, quando a leishmania já se encontra aderida ao epitélio intestinal do inseto.
- Por Western blot usando um anticorpo anti-tripsina identificamos aparecimento de
bandas nos horários entre 6 e 24 horas após a alimentação com sangue, o que coincide com o
padrão de expressão de Lltryp1 visto em RT-PCR.
- Resultados preliminares de imunolocalização de tripsinas em tubo digestivo de L.
longipalpis apresenta marcação citoplasmática em todo o tubo digestivo.
- Ensaios enzimáticos preliminares sugerem que a ocorrência da infecção por L. i.
chagasi diminui a atividade proteolítica detectada em tubo digestivo de L. longipalpis.
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Trypsins constitute some of the most abundant midgut digestive proteases expressed by hematophagous insects upon blood feed-
ing. In addition to their role in the digestion of the blood meal, these proteases also have been implicated in the ability of certain
pathogens to infect their natural vector. In sand flies, digestive proteases including trypsins were associated with early killing of
Leishmania and are believed to play a role in the species-specificity dictating sand fly vectorial capacity. Our group is involved in
studies of midgut digestive proteases in the sand fly Lutzomyia longipalpis, the principal vector of visceral leishmaniasis in Brazil.
Here we report on the identification of two cDNAs, Lltryp1 and Lltryp2, which code for putative midgut trypsins in L. longipalpis.
Analyses of RNA abundance using semi-quantitative RT-PCR show a different pattern of expression between the two genes. Lltryp1
expression remains undetected until blood feeding and reaches a peak at 12 h post-blood meal (PBM), returning to pre-blood
meal levels at 72 h PBM. Additionally, Lltryp1 expression is undetected during larval development. Lltryp2, on the other hand, is
constitutively expressed as high levels in the non-blood fed female, but is reduced upon blood feeding. At the end of the digestive
cycle, Lltryp2 regains its pre-blood meal levels. This cDNA also is present in all developmental stages and in adult males. This
pattern of expression is reminiscent of what is seen in mosquitoes and Old World sand flies, but has characteristics that are unique
to L. longipalpis. Arch. Insect Biochem. Physiol. 66:53–63, 2007. © 2007 Wiley-Liss, Inc.
KEYWORDS: Lutzomyia longipalpis; trypsin; differential expression
Laboratório de Biologia Molecular de Tripanosomatídeos e Flebotomíneos, Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular, Instituto Oswaldo Cruz-Fiocruz, Rio
de Janeiro, Brasil
Contract grant sponsor: PAPES-IV-FIOCRUZ.
José Marcelo Ramalho-Ortigão’s present address is
Department of Biological Sciences, University of Notre Dame, Notre Dame, IN 46556.
*Correspondence to: Yara M. Traub-Cseko, Av. Brasil 4365, Rio de Janeiro, RJ, Brazil, 21045-900. E-mail: [email protected]
Received 10 November 2006; Accepted 4 March 2007
INTRODUCTION
Serine proteases, such as trypsins and chymot-
rypsins, are the most abundant digestive enzymes
within the midgut of blood-sucking insects. In ad-
dition to their role in digesting the blood meal,
these proteases have been implicated in the estab-
lishment of infection of various pathogens in their
respective insect vector. For successful infection of
Aedes aegypti by Plasmodium gallinaceum, a mosquito
midgut trypsin is essential for the activation of a
chitinase secreted by the parasite and necessary for
ookinete escape from the peritrophic matrix (Sha-
habuddin et al., 1996). In addition, trypsin inhibi-
tors decrease the load of dengue virus in A. aegypti,
indicating a relationship between infection, blood
digestion, and possibly proteolytic processing of
viral proteins (Molina-Cruz et al., 2005). In sand
flies, some of the underlying mechanisms driving
species-specificity to Leishmania infection have been
associated with the expression of serine proteases
in the vector midgut. Borovsky and Schlein (1987)
suggested that components of the trypsin-like ac-
tivity in the midgut of the Old World sand fly P.
papatasi prevent survival of L. donovani, while the
same components could be modulated by L. ma-
jor, allowing its survival. Although it is clear that
survival of Leishmania to the proteolytic attack
67
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posed by the digestive proteases within the mid-
gut of sand flies is one of the crucial steps during
parasite development within the vector midgut
(Pimenta et al., 1997; Schlein and Jacobson, 1998),
little is known about regulation of these enzymes.
A report by Ramalho-Ortigao et al. (2003) de-
scribed the cloning and characterization of six
serine proteases from P. papatasi, four trypsin- and
two chymotrypsin-like. Of the four trypsin-like pro-
teases, two were down-regulated and a third was
up-regulated following a blood meal, while the two
chymotrypsin-like enzymes were induced by blood
feeding. Here we describe the identification and
partial characterization of two cDNAs, Lltryp1 and
Lltryp2, coding for trypsin-like proteins in Lutzomyia
longipalpis, the principal vector of visceral leishma-
niasis in the Americas (Lainson and Rangel, 2005).
The two novel cDNAs identified display high se-
quence similarities to the trypsins from P. papatasi
and also from other insects. Analyses of their ex-
pression profile indicate that these molecules are
regulated during developmental stages and also
during blood feeding by the adult female.
MATERIALS AND METHODS
Sand Flies
L. longipalpis captured at Lapinha, Minas Gerais,
Brazil, were maintained in our insectary, at the De-
partment of Biochemistry and Molecular Biology,
Oswaldo Cruz Institute, FIOCRUZ. F1 sand flies
were used in all experiments. One- to 3-day-old
sand flies were sugar-fed on 30% sucrose solution
ad libitum, or blood-fed directly on a hamster anes-
thetized by intra-muscular injection of 300 µl of
10% ketamine (Francotar, Virbac do Brasil, São
Paulo, SP, Brazil). Additionally, for artificial infection,
3-day-old female sand flies were fed through chick
skin membrane on an infective blood meal contain-
ing 10
7
promastigotes/ml of Leishmania chagasi. Flies
were dissected at days 3 (72 h) and 7 post-infection
(pi) to confirm the presence of parasites.
EST Sequencing
Three expression libraries were constructed us-
ing cDNA made with RNAs purified from midguts
dissected after 6 and 72 h post-blood meal, and
72 h after artificial infection with L. chagasi as de-
scribed previously (Ramalho-Ortigao et al., 2001)
using a Lambda Zap vector kit (Stratagene, La Jolla,
CA). After excision, inserts were sequenced at the
PDTIS/FIOCRUZ sequencing platform in an Ap-
plied Biosystems 3730 DNA Analyzer. Sequencing
reactions were prepared using BigDye Terminator
v3.1 Cycle Sequencing kit (Applied Biosystems,
Foster City, CA), and plasmid vector oligonucle-
otides (T7-F, T3-R, M13-F, or M13-R) following the
manufacturer’s instructions.
Sequencing and Analysis of Trypsin Genes
Sequences obtained from cDNA libraries were
compared by similarity BLAST searches (NCBI-
NLM-NIH web site, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
BLAST/) and partial trypsin sequences were ob-
tained. For complete sequencing of the genes, in-
ternal reverse oligonucleotides were designed for
5′-end amplification strategy (Fig. 1) by PCR. Re-
actions were performed using a 6-h post-feeding
midgut cDNA library as template. DNA (100 ng)
and 0.8 µM of specific primers were used in a 25-
µl amplification reaction using the following con-
Fig. 1. Schematic representation of 5′-end amplification.
P, plasmid segments; EST, cDNA fragment sequenced; FP,
forward primer; RP, reverse primer; AF, amplified fragment.
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ditions: 96°C for 3 min, followed by 30 cycles at
96°C for 30 s, 55°C for 30 s, 72°C for 1 min, and a
final extension of 72°C for 7 min. PCR products
were separated in a 1.5% ethidium bromide-con-
taining agarose gel. Fragments obtained were ex-
cised, purified with Wizard SV Gel and PCR Clean-Up
System, and cloned in pGEM-T Easy Vector System
(both Promega Corporation, Madison, WI). Se-
quencing was carried out at the PDTIS/FIOCRUZ
platform, and output data (5′-end segments) were
clustered with trypsin 3′-end sequences to compose
full maps of the two different cDNAs using ClustalW
(EMBL-EBI - http://www.ebi.ac.uk/clustalw/). Mul-
tiple alignment of similar trypsin sequences was per-
formed at the same site. The visual form of the
ClustalW alignments was made using the Boxshade
tool. Conserved domains, active sites, and family
signatures for our putative proteins were identified
by ScanPROSITE tool (ExPASy -http://ca.expasy.org/
tools/) and the signal peptide was identified through
the Center for Biological Sequence Analysis web site
(http://www.cbs.dtu.dk/services). A phylogenetic tree
was constructed from ClustalW alignment of trypsin-
predicted amino acid sequences published on
GenBank, and was built using MEGA 3.1 software
(Kumar et al. 1994) by the Neighbor Joining
method, with a Poisson Correction parameter, and
a bootstrap of 10,000.
RT-PCR
Total RNA was extracted with TRIzol reagent
(Invitrogen Life Technologies Inc., Grand Island,
NY) according to the manufacturer’s protocol, from
groups of 20 fully engorged females dissected at
2, 6, 12, 24, 48, 72, 96, and 168 h after blood
feeding, or 72 h after artificial L. chagasi infection,
and frozen at –70°C. Total RNA also was extracted
from unfed females (0 h), males, eggs, and larvae.
Up to 5 µg of total RNA was used for 1st strand
cDNA synthesis, performed with the First-Strand
cDNA Synthesis kit (Amersham Biosciences, GE
Healthcare, Fairfield, CT). Each cDNA was ampli-
fied during PCR reactions containing 0.8 µM of
each specific primer set in a 25-µl reaction. PCR
was carried out on the exponential segment of a
calibration curve using the following conditions:
96°C/3min, followed by 30 cycles at 96°C for 45
s, 56°C for 45 s and 72°C for 45 s, and a final
extension of 72°C for 5 min. The total volume of
PCR reactions was separated in a 2.0% ethidium
bromide-stained agarose gel. Based on non-con-
served regions of cDNAs, oligonucleotides were
designed for each trypsin cDNA: Lltryp1-F 5′-GGC
GGC ATT ACA AAG ACC 3′ and Lltryp1-R 5′-TTA
GAA ACC AAC GAC T-3′ (Fig. 2); Lltryp2-F 5′-CGT
CAA CCT ATA CAT AGG-3′ and Lltryp2-R 5′-GTT
CCG AAA TGA TTG CTC C-3′ (Fig. 3). As a consti-
tutive expression control, histone primers were
used: His-F 5′-GAA AAG CAG GCA AAG ACT CC-
3′ and His-R 5′-GAA GGA TGG GTG GAA AGA AG-
3′. Experiments for each gene mentioned above
were performed at least 3 different times with con-
sistent results. The intensity of amplified products
was measured using ImageJ 1.34s software (Wayne
Rasband, NIH, USA; http://rsb.info.nih.gov/ij) and
plotted for semi-quantitative analysis. Arithmetic
average and standard deviation were calculated for
each cDNA amplification in triplicate. Values for
each amplification were normalized against the hi-
stone reaction and the correction factor was mul-
tiplied by Lltryp1 and Lltryp2 corresponding results.
RESULTS
Trypsin-Like cDNAs
Four trypsin-like cDNA clones were identified
from EST libraries of L. longipalpis midgut. These
clones contained partial, 3′-end sequences identi-
fied as trypsin-like proteases by BLAST analysis.
One clone was a unique transcript, named Lltryp1,
while the other three clones displayed similar se-
quences representative of a single transcript, named
Lltryp2. Complete cDNA sequences for Lltryp1 and
Lltryp2 were obtained through the sequencing of
various cDNA clones isolated from the library us-
ing the internal gene specific primers, as described
in Figure 1. Predicted amino acid sequences for
Lltryp1 and Lltryp2, obtained using ExPASy (Fig. 2),
show conserved domains and active sites. Addition-
ally, predicted signal peptides of 16 and 17 amino
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Fig. 2. L. longipalpis Lltryp1 and Lltryp2.
Nucleotide and deduced amino acid se-
quence of Lltryp1 (A) and Lltryp2 (B). Bold
uppercase letters indicate amino acids of
the catalytic triad (H-D-S) involved in en-
zyme activity; arrow and bold lowercase
letters indicate oligonucleotides used on
RT-PCR experiments; boxed sequences
show highly conserved binding pocket.
Predicted cleavage (open triangles) and
arginine activation sites (closed triangles),
as well as conserved cysteine residues (*)
and residues implicated in trypsin speci-
ficity (closed squares) are indicated. Pre-
dicted signal peptides are underlined.
Sequences were deposited under accession
numbers EF011106 (Lltryp1) and EF011107
(Lltryp2).
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Fig. 3. Multiple trypsin sequence alignment. Selected
trypsins from mosquitoes and sand flies described as early/
constitutive or late/blood-induced were aligned with
ClustalW. Sequences are, from L. longipalpis (boxed):
Lltryp1, late; and Lltryp2, early; from P. papatasi: Pptryp1
and Pptryp2, early; and Pptryp3 and Pptryp4, late); from A.
aegypti: Aatryp1, early; Aatryp2, late); from C. p. quinque-
fasciatus: Cptryp1, early; Cptryp2, late); from A. gambiae:
Antryp1 and Antryp2, late; Antryp3, Antryp4, Antryp5,
Antryp6, and Antryp7, early). Highly conserved amino ac-
ids are shaded in black, less conserved blocks are shaded
in gray. Accession numbers are provided in the text.
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acids were identified in Lltryp1 and Lltryp2, respec-
tively. In Lltryp1, the catalytic triad (histidine/as-
partic acid/serine) corresponds to residues 69 (H),
114 (D), and 210 (S) and in Lltryp2 it corresponds
to residues 67 (H), 111 (D), and 207 (S). An argi-
nine (R) residue found at position 29 in Lltryp1
and at position 26 in Lltryp2 represents a single,
putative activation site for the mature protein for
both sequences. In Lltryp1, the six highly conserved
cysteine residues (C) are found at positions 54, 70,
179, 195, 206, and 230, and the conserved bind-
ing pocket (GDSGGPL) is located between amino
acid residues 208 and 214. In Lltryp2, the six con-
served C residues are found at positions 52, 68,
176, 192, 203, and 228, and the conserved bind-
ing pocket at positions 205 to 211. In the binding
pocket of Lltryp2, the leucine (L) residue was re-
placed by valine (V). Residues implicated in trypsin
specificity (lysine (K) and aspartic acid (D)) are
found at positions 203 and 204 in Lltryp1 and at
positions 200 and 201 in Lltryp2.
Multiple Alignment
Using BLAST search for similarity in GenBank, sev-
eral trypsin sequences from different hematophagous
insects representing constitutive or blood-induced
trypsins were aligned with ClustalW. Trypsin se-
quences used for the alignment were: P. papatasi
(Pptryp1, GeneBank accession no. AAM96940;
Pptryp2, AAM96941; Pptryp3, AAM96942; Pptryp4,
AAM96943); A. aegypti (Aatryp1, AAM34268); Culex
pipiens quinquefasciatus (Cptryp1, AAK50138, Cptryp2,
AAB37261); Anopheles gambiae (Antryp1, CAA80512;
Antryp2, CAA80518; Antryp3, CAA80517; Antryp4,
CAA80515; Antryp5, CAA80514; Antryp6, CAA80513;
Antryp7, CAA80517). Multiple alignment of trans-
lated amino acid sequences from these insects and
from L. longipalpis shows conserved regions (Fig.
3). Uninterrupted conserved regions are no longer
than 9 amino acids. Short-length substitutions may
configure specificities for the differently expressed
trypsins. Conserved cysteines and highly conserved
pockets are detectable in black-shaded residues
(Fig. 3).
Phylogenetic Tree
A phylogenetic tree obtained using MEGA soft-
ware comparing the amino acid sequences from
trypsins of three different mosquitoes (A. gambiae,
C. quinquefaciatus, and A. aegypti) and that from
two sand fly species (P. papatasi and L. longipalpis)
shows that the sand flies sequences are clustered
into two groups. One cluster included the se-
quences of PpTryp1, PpTryp2, and Lltryp2, all con-
stitutively expressed. Another cluster included
PpTryp4, Lltryp1, and PpTryp3, which are up-regu-
lated by blood feeding (Fig. 4). Both clusters are
supported by high bootstrap values. Lltryp1 is
closely related to Pptryp3 and Pptryp4, two cDNA
sequences displaying high expression levels late in
the blood digestive process from P. papatasi (i.e.,
at 30 h after blood feeding) (Ramalho-Ortigao et
al., 2003). Lltryp2 is closely related to Pptryp1 and
2, both possibly early trypsins from P. papatasi, with
high expression early on during the digestion of
the blood meal between 0 and 6 h (Ramalho-
Ortigao et al., 2003). Interestingly, the A. aegypti
early trypsin (Aetryp1 E) also clustered with the
early trypsins of sand flies analyzed in this study.
Trypsins from the other two mosquito species, in-
cluding four early and two late trypsins of A.
gambiae (Giannoni et al., 2001) and one early and
one late trypsin from C. p. quinquefasciatus, formed
a separate cluster, although with low bootstrap val-
ues. The exception was the late A. aegypti sequence,
which fell quite distantly from all the others and
for that reason was not included in the tree.
Differential Expression
Specific primer sets were designed to amplify
Lltryp1 and Lltryp2 separately using RT-PCR and the
intensity of amplified products was measured and
the plotted for semi-quantitative analysis (results
not shown). Our results indicate that both tran-
scripts appear to be regulated by blood feeding
(Fig. 5A). Lltryp1 expression is tightly regulated,
being absent in non-blood-fed females and being
expressed at high levels from 2 to 48 h following
a blood meal, with a peak of approximately 3 times
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Fig. 5. Expression of Lltryp1 and Lltryp2 in L.
longipalpis. A: RT-PCR primer specificity controls
using Lltryp1 and Lltryp2 clones; B: RT-PCR us-
ing cDNA from blood-fed females at 72 h (72
h-B) and cDNA from artificially infected females
at 72 h (72 h-I). C: RT-PCR using specific prim-
ers for each trypsin and cDNAs of L. longipalpis at
different stages of development, as indicated: L1
to 4, larvae at different stages; P, pupae. D: RT-
PCR using cDNAs at indicated times post-blood-
meal. Histone was used as RNA load control.
Fig. 4. Trypsin phylogenetic
analysis. Phylogenetic analy-
sis was performed for selected
trypsins characterized from A.
gambiae, C. p. quinquefaciatus,
and A. aegypti, in addition to
four trypsins from the sand
fly P. papatasi and two from
L. longipalpis (this work). Con-
stitutive, early trypsins (E)
and sequences representing
blood-induced, late trypsins
(L) are included. L. longipalpis
sequences are indicated (tri-
angles). Bootstrap values for
each branch are shown
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higher expression at 12 h as compared to 2 h.
Upon completion of blood digestion, at approxi-
mately 72 h, Lltryp1 levels are again undetected
(Fig. 5D). Also, we detected a low level of expres-
sion of Lltryp1 in males. In contrast, Lltryp2 tran-
scription is approximately double in non-blood-fed
females as compared to levels found after blood
feeding. Lltryp2 expression levels remained low un-
til blood digestion was completed, returning to the
pre-blood feeding levels (Fig. 5D). The expression
profile between Lltryp1 and Lltryp2 also seems to
differ during L. longipalpis developmental stages. A
low level of Lltryp2 expression was observed in eggs
and the three first larval stages. In relation to these,
expression was 6 times higher in the late larval
stage and approximately 2 times higher in pupae
(Fig. 5C), whereas expression of Lltryp1 was not
detected in eggs, larvae, or pupae (data not shown).
Additionally, we investigated whether infection
with L. chagasi would have any effect on the expres-
sion profile of L. longipalpis trypsins, as a delay in
proteolytic enzymes in the midgut of L. major–
infected P. papatasi sand flies has been reported
(Dillon and Lane, 1993). No difference between
infective and non-infective blood meals was de-
tected at 72 h PBM in relation to expression of
Lltryp2 (Fig. 5B). Lltryp1 expression remained un-
detected following completion of blood digestion
at approximately 72 h regardless of the presence
of the parasite (Fig. 5B). Current studies are focus-
ing on early time points (between 1 and 16 h) fol-
lowing blood feeding, comparing non-infective and
infective meals.
DISCUSSION
As with other hematophagous Diptera, diges-
tive proteases such as trypsins and chymotrypsins
are responsible for the bulk of the blood diges-
tion in sand flies. Additionally, such proteases also
have been associated with certain underlying
mechanisms regulating species-specificity related to
sand fly/Leishmania infection. In contrast to P.
sergenti or P. papatasi, which are commonly referred
to as restrictive vectors, L. longipalpis is generally
referred to as a permissive vector, as mature infec-
tions with various Leishmania species can be ob-
tained in this sand fly (for a complete review see
Kamhawi, 2006). For P. papatasi, a restrictive vec-
tor that can harbor only L. major infections, Schlein
and Jacobson (1998) indicated that components
of the infective blood meal modulated resistance
to infection with L. donovani. Additionally, Borovsky
and Schlein (1987) and Dillon and Lane (1993)
indicated that, for infections of P. papatasi with L.
major, a delay or significant decrease in proteolytic
activity was detected. Digestive proteases are widely
accepted as one of the crucial barriers facing Leish-
mania during its development within the sand fly
midgut, and early killing of transforming amasti-
gotes by proteolytic enzymes can severely impact
the outcome of the infection within the sand fly
(Pimenta et al., 1997). Additionally, killing of para-
sites occurs in both restrictive (e.g., P. papatasi) and
permissive (e.g., L. longipalpis) vectors (Pimenta et
al., 1997; Rogers et al., 2002).
For P. papatasi, six digestive proteases have been
characterized (Ramalho-Ortigao et al., 2003) but
studies showing the effect of infective blood meals
on the RNA expression profile of these enzymes
are yet to be performed. For New World sand flies,
recent work identified the presence of three trypsin
and three chymotrypsin cDNA sequences in L.
longipalpis ESTs (Dillon et al., 2006). Here we de-
scribe two cDNAs, Lltryp1 and Lltryp2, identified
from blood-fed midgut cDNA libraries of L. longi-
palpis and show how such transcripts are regulated
during the developmental phase of the insect, and
following a blood meal. Lltryp1, which seems to
be identical to the trypsin identified previously in
L. longipalpis (Dillon et al 2006) (GeneBank acces-
sion no. AM108824.1) is induced by blood feed-
ing, and was not detected in eggs, larvae, or pupae.
However, a small amount of Lltryp1 was detected
in adult males (Fig 5D). Lltryp2, identical to an-
other L. longipalpis trypsin (GeneBank accession no.
AM101483.1), is constitutively expressed and is
present in all developmental stages, though its ex-
pression appears to be modulated. Interestingly,
during the developmental stages, Lltryp2 reaches
maximum expression during the latest larval stage
(L4) where the larvae do not feed. At the pupa
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Trypsin Genes From Lutzomyia longipalpis 61
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stage, expression of Lltryp2 is again reduced to lev-
els somewhat similar to what was detected for em-
bryo (egg) and L1 through L3 (Fig. 5C). Whether
Lltryp2 is regulated by a feeding mechanism or
whether other factors are present in one or more
stages of the sand fly development still needs to
be determined. In addition, we did not detect a
difference in the expression profiles of both tran-
scripts at 72 h PBM when comparing blood meals
with or without L. chagasi. However, as infections
were carried out with the promastigotes stage of
the parasite, it is plausible that different results may
be obtained when infections are performed using
amastigotes forms of L. chagasi.
In the only studies involving New World sand
flies, Mahmood and Borovsky (1992) reported an
increase in the synthesis of trypsin along larval and
pupae development in Lutzomyia anthophora. Ad-
ditionally, in adult females an increase in enzyme
activity, reaching a peak at 72 h PBM was observed
(Mahmood and Borovsky, 1993). These data are
in accordance with our results on the expression
of Lltryp1 and Lltryp2 in L. longipalpis.
Digestive enzymes have been intensively stud-
ied in mosquitoes. In A. aegypti, early and late
trypsins have been characterized (Barillas-Mury and
Wells, 1993; Barillas-Mury et al., 1994; Noriega et
al., 1994, 1996a,b; Noriega and Wells, 1999; Lu et
al., 2006). The early enzyme is expressed in low
amounts immediately following a blood meal,
while the late trypsin is expressed in large amounts
8 to 36 h after blood acquisition (reviewed by
Noriega and Wells, 1999). Previous data (Barillas-
Mury et al., 1995) suggested that the early trypsin
was essential for induction of expression of the late
trypsin gene. Recently, Lu et al. (2006) demon-
strated that despite the differential expression of
both genes in A. aegypti, the early trypsin does not
regulate expression of the late trypsin. In A.
gambiae, seven trypsin genes were identified (Muller
et al., 1995), with most showing constitutive ex-
pression. Additionally, Giannoni et al. (2001) in-
dicated that regulation of trypsin genes in A.
gambiae might be controlled by GATA transcription
factors and regulated by a putative trypsin regula-
tory element.
Our results in L. longipalpis showed the consti-
tutive expression of Lltryp2 and the blood-regulated
expression of Lltryp1. Lltryp1 is absent in unfed flies,
and expression begins at 2 h and peaks at 12 h
after the blood meal. A return to undetectable, pre-
blood-meal levels is seen at 72 h PBM when blood
digestion is completed. Lltryp2 expression is de-
tected in unfed flies. However, it appears to de-
crease after a blood meal. This lower level of
expression is maintained until the end of the blood
digestion, and regained the levels of unfed flies af-
ter 168 h. Interestingly, expression of Lltryp2 also
is detected in males, at levels comparable to unfed
females. The data presented here differ from the
results obtained for the Old World sand fly P.
papatasi (Ramalho-Ortigao et al., 2003). In P.
papatasi, for the four trypsin cDNAs characterized,
a basal expression of all genes in unfed females
was detected. For L. longipalpis, no expression in
Lltryp1 prior to blood feeding was detected. In ad-
dition, there appears to be a correlation between
the expression of Lltryp2 (constitutively expressed)
and Lltyrp1 (blood induced). The levels of expres-
sion of Lltryp2 are reduced as the levels of Lltryp1
are increasing, and later return to pre-blood meal
values as Lltryp1 is shut down. No such relation
was seen between the trypsin transcripts character-
ized from P. papatasi. Nevertheless, when the P.
papatasi and L. longipalpis sequences were phyloge-
netically aligned, the constitutively expressed
trypsin cDNAs from the two sand fly genera,
Lltryp2, Pptryp1, and Pptryp2 clustered within a
single group, whereas the regulated cDNAs, Lltryp1
and Pptryp4, clustered into another.
In relation to other insects, our results bear a
certain degree of similarity to the early and late
trypsin gene expression found in A. aegypti (Barillas-
Mury and Wells, 1993; Noriega et al., 1996) and
with the expression profiles found for trypsin in A.
gambiae (Muller et al., 1995). In mosquitoes and in
L. longipalpis, the constitutive (early) genes are ex-
pressed in non-blood-fed insects. However, in mos-
quitoes the expression of such genes is blocked 24
h after a blood meal and is absent also in males. In
L. longipalpis, this “early” trypsin is never completely
shut off in blood-fed females and is present in
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75
62 Telleria et al.
Archives of Insect Biochemistry and Physiology October 2007 doi: 10.1002/arch.
males. In contrast, blood upregulated (“late”) genes
are highly expressed 24 h following a blood meal
in both mosquitoes, (Barillas-Mury and Wells, 1993;
Muller et al., 1995, 1993; Noriega and Wells, 1999)
and in P. papatasi (Ramalho-Ortigao et al., 2003).
In L. longipalpis, this late Lltryp1 transcript remained
undetected until 2 h PBM (Fig. 5D), in a fashion
similar to the A. gambiae Antryp2 gene, detectable
only after blood feeding (Muller et al., 1993).
ACKNOWLEDGMENTS
We are grateful to Renata Melon Barroso and
Christiane Marques for initial experiments.
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8 - Anexos Telleria EL
77
8 – Anexos Telleria EL
78
8.2 – Artigo submetido à publicação em Memórias do Instituto Oswaldo Cruz, 2006
Cloning and characterization of a V-ATPase subunit C from the American visceral
leishmaniasis vector Lutzomyia longipalpis modulated during development and blood
ingestion.
JM Ramalho-Ortigão
++
/
+++
, AN Pitaluga
++
, EL Telleria, C Marques,
AA Souza
*
, YM
Traub-Cseko
+
Laboratório de Biologia Molecular de Tripanosomatídeos e Flebotomíneos, Departamento de
Bioquímica e Biologia Molecular, Instituto Oswaldo Cruz - Fiocruz, Av. Brasil 4365, 21045-
900 Rio de Janeiro, RJ, Brasil,
*
Instituto Evandro Chagas, Seção de Parasitologia, 66050
Belém, Pará, Brasil
Key words: Lutzomyia longipalpis - V-ATPase - metacyclogenesis - differential expression
Abstract:
Visceral leishmaniasis (VL) is a serious tropical disease that affects approximately 500
thousand people worldwide every year. In the Americas, VL is caused by the parasite
Leishmania (Leishmania) infantum chagasi mainly transmitted by the bite of the sand fly
vector Lutzomyia longipalpis. Despite recent advances in the study of interaction between
Leishmania and sand flies, very little is known about sand fly protein expression profiles.
Understanding how the expression of proteins may be affected by blood feeding and/or
presence of parasite in the vector’s midgut might allow us to devise new strategies for
controlling the spread of leishmaniasis. In this work, we report the characterization of a
vacuolar (V) ATPase subunit C from L. longipalpis by screening of a midgut cDNA library
with a 220 bp fragment identified by means of differential display (DDRT-PCR) analysis. The
expression of the gene varies along insect development and is upregulated in males and
bloodfed L. longipalpis, compared to unfed flies.
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