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PATRÍCIA MACCHIAVERNI
Caracterização quantitativa e funcional da transferência
de anticorpos anti-Dermatophagoides pteronyssinus via
placenta e colostro materno
SÃO PAULO
2008
Dissertação
apresentada ao
Programa de
Pós-Graduação em Imunologia do
Instituto de Ciências Biomédicas da
Universidade de São Paulo, para obtenção
do título de Mestre em Imunologia.
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1
PATRÍCIA MACCHIAVERNI
Caracterização quantitativa e funcional da transferência de
anticorpos anti-Dermatophagoides pteronyssinus via placenta e
colostro materno
SÃO PAULO
2008
Dissertação
apresentada ao
Programa de Pós
-
Graduação em Imunologia do Instituto de
Ciências Biomédicas da Universidade de São
Paulo, para obtenção do título de Mestre em
Imunologia.
Área de Concentração: Saúde Materno-infantil
Orientador: Prof. Dr. Antônio Condino Neto
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Dedicatória
Aos meus pais, Nelson e Luzita, que
sempre foram modelo de dedicação à
profissão, de justiça e honestidade.
Obrigada por todo amor dedicado à
família, pelo apoio, compreensão e
incentivo constante para realização
dos meus sonhos.
3
Ao meu filho Pedro, pelo amor, sorrisos
e abraços, que me abastecem para
prosseguir caminhando. Obrigada por
não permitir minha ausência.
Te amo pipoquinha!!!
4
Ao meu querido namorado Walter,
maravilhoso companheiro de todas as
horas a mais de uma década, pelo amor
e compreensão dedicados a mim. Pela
presença constante, compartilhando
com paciência e conforto o final desta
etapa importante em minha vida.
5
Aos meus queridos irmãos Nelson,
Luciana e Juliana, que me ajudaram e
apoiaram cada um a seu modo,
permitindo que eu fosse atrás dos
meus sonhos e concretizasse meus
objetivos.
6
Agradecimentos
Ao professor Antônio Condino Neto, pela dedicação ao ensino e pesquisa, por acreditar
em mim e pela oportunidade da execução desta tese.
À Carolina Prando, por me apresentar a Imunologia de uma maneira encantadora.
Mesmo distante, a amizade estará sempre ao meu lado.
À Christina Kubo Arslanian, por sua infinita paciência, atenção, orientações e
incansável disposição em colaborar na realização dos testes de ELISA.
À Patrícia Palmeira e Dora Lisa Friedländer Del Nero, pelas opiniões valiosas e
construtivas e pelo interesse em me ajudar.
À Maternidade de Campinas por permitir a coleta de colostro e sangue das doadoras.
Às mães que prontamente se dispuseram a doar seu sangue e colostro.
Aos médicos, residentes e enfermeiras da obstetrícia da Maternidade de Campinas,
pelo auxilio na coleta e triagem das voluntárias.
À Rosana, pela colaboração na análise estatística.
Ao Dr João Carlos Mori IPI-ASAC Brasil que forneceu o extrato de ácaro para
realização dos testes.
À Silvana, aos funcionários da secretaria do Departamento de Imunologia: Jotelma, Eni
e Amarildo e do CIPED: Milton e Simone, pelo desempenho e dedicação em todos os
momentos em que precisei.
Às professoras Dra Maria Sato, Dra Solange Carbonari e Dra Sônia Jancar, por
examinarem este trabalho e pelas valiosas sugestões que fizeram no exame de
qualificação.
Aos colegas e professores do programa de pós-graduação em Imunologia, essenciais
em minha formação como pesquisadora. De todos levarei exemplos para minha vida,
seja de como agir ou como nunca fazer.
Aos amigos pós-graduandos: Julieta, Thais, Érica, Rafael, Juciane, Débora, Layra,
Andréia, Daniel, Tatiana, Natália, Carolina, Stefaniee, Ana, Elaine, Camila, Rosana,
Soraya, Marília, Walmir, Otávio, Carolina (Caru) Paulo, Ângela e Paulo-Gabriel (a
caminho!), pelos dias compartilhados (sempre muito divertidos) dentro e fora do
laboratório!
7
Aos amigos de hoje e sempre: Edgar, Josias, Juliana, Daniela e Mateo, pelo apoio,
auxílio, incentivo e amizade construída. Cuja companhia pude contar da mesma forma
nos momentos de dificuldade e me confortar nos momentos de desespero...
- Acalma-te!!!
À Jussara pela prontidão e em resolver os “pepinos” inevitáveis do laboratório.
À Silvana pela eficiência e descontração na coleta das amostras de sangue e colostro.
À FAPESP, pela Bolsa de Mestrado e Auxílio concedido a este trabalho (processo n
o
05/57593-7).
E, de forma sincera, a todos aqui não citados, mas que de alguma forma contribuíram
para realização deste trabalho.
8
Tenho aprendido...
Que se aprende errando;
Que crescer não significa fazer aniversário;
Que o silêncio, às vezes, é a melhor resposta;
Que trabalhar significa não só ganhar dinheiro;
Que dinheiro não compra classe;
Que amigos a gente conquista mostrando o que somos;
Que os verdadeiros amigos sempre ficam até o fim;
Que a maldade se esconde atrás de uma bela face;
Que quando penso saber tudo ainda não aprendi nada;
Que a natureza é a coisa mais bela da vida;
Que amar significa se dar por inteiro;
Que ninguém é perfeito, até que você se apaixone por esta pessoa;
Que um só dia pode ser muito importante que muitos anos;
Que a vida é dura, mas eu sou mais ainda;
Que ouvir uma palavra de carinho faz bem à saúde;
Que dar carinho também faz;
Que ser gentil é mais importante que estar sempre certo;
Que sonhar é preciso;
Que se deve ser criança a vida toda;
Que não importa a seriedade que a vida exija de você, precisamos de um amigo
brincalhão;
Que o julgamento alheio não é importante;
Nem sempre posso escolher como me sinto, mas posso escolher o que fazer a respeito;
Que se precisa morrer para aprender a viver;
Quanto menos tempo tenho, mais coisas consigo fazer;
E, finalmente, tenho aprendido que...
Todos querem viver no topo da montanha, mas toda felicidade e crescimento ocorrem
quando você está escalando-a.
(adaptado de Willian Sheakspeare)
Resumo
9
Macchiaverni P. Caracterização quantitativa e funcional da transferência de anticorpos
anti-Dermatophagoides pteronyssinus via placenta e colostro materno [Dissertação
Mestrado em Imunologia]. São Paulo: Instituto de Ciências Biomédicas Universidade de
São Paulo; 2008.
Sabemos a incidência de doenças alérgicas vem crescendo rapidamente nas ultimas
décadas e atualmente afetam milhares de crianças no mundo inteiro. Por esta razão, é
de grande interesse que estratégias eficazes de prevenção da atopia sejam aplicadas
logo nos primeiros anos de vida ou mesmo antes do nascimento. Existem fortes
evidências de que a supressão da hipersensibilidade nos recém nascidos pode ser
mediada pela transferência de anticorpos maternos, dependendo de sua concentração
e especificidade, no entanto carece estudos sobre a eficácia em humanos. Realizamos
este estudo a fim de caracterizar qualitativa e quantitativamente a transmissão de
anticorpos direcionados ao principal alérgeno da poeira domiciliar (Dermatophagoides
pteronyssinus; Der p), via passagem transplacentária e aleitamento materno, assim
como investigar o efeito da sensibilização materna ao Der p na transferência passiva
destes anticorpos. Para tais objetivos, quantificamos por ELISA, IgG anti-Der p em
amostras pareadas de sangue materno e cordão umbilical e S-IgA anti-Der p no
colostro de puérperas sensibilizadas (n=13) e não sensibilizadas (n=26), e analisamos a
atividade funcional dos mesmos anticorpos por ensaio de avidez. Determinou-se a
sensibilidade no soro materno, através de RAST específico (Cap System® Pharmacia).
Demonstramos pela primeira vez que S-IgA anti-Der p pode ser transferida ao lactente
em concentrações bastante variáveis e com alto índice de avidez, independente da
sensibilização materna ao mesmo ácaro. Acreditamos assim, que a amamentação é
importante, pois fornece S-IgA com potencial para neutralizar de maneira específica e
impedir a entrada do Der p através da mucosa, tanto em lactentes de mães RAST+
como de mães RAST-. Demonstramos também que o nível de IgG total e específica ao
Der p é mais elevado em recém nascidos de mães sensibilizadas ao mesmo ácaro
quando comparado aos de mães não sensibilizadas, indicando que a sensibilização
materna pode influenciar a resposta imune fetal. Já a avidez específica da IgG anti-Der
p foi muito semelhante entre as amostras pareadas de cordão umbilical e soro materno,
assim como em amostras do grupo estudo e grupo controle, sugerindo que não há
seleção quanto à avidez destes anticorpos durante a passagem transplacentária. Uma
vez que a transferência de anticorpos maternos representa importante mecanismo para
imunomodulação das respostas alérgicas, ansiamos que o melhor entendimento da
influência da sensibilização materna na transferência passiva de anticorpos específicos
ao bebê contribua com os avanços na elaboração de estratégias adequadas de
prevenção da sensibilização alérgica logo no início da vida.
Palavras-chave: Ácaro; Colostro; Hipersensibilidade; Imunoglobulinas; Gravidez.
10
A
A
b
b
s
s
t
t
r
r
a
a
c
c
t
t
Macchiaverni P. Quantitative and functional characterization of antibodies anti-
Dermatophagoides pteronyssinus transference through placenta and maternal
colostrum [Master thesis Immunology]. São Paulo: Biomedical Science Institute,
University of São Paulo; 2008.
It is known that the incidence of allergic disease has been rising very fast in the last
decade and nowadays affects thousands of children worldwide. For this reason, it is of
great interest that efficient strategies of prevention of atopy should be applied in the first
years of life or even before birth. The are strong evidences that the suppression of
hypersensitivity in newborn can be mediated by the transference of maternal antibodies,
depending on their concentration and specificity, however still little is known about the
mechanisms involving, in special in humans. We made this study aiming to characterize
qualitatively and quantitatively the antibodies transmission directed to the main home
dust allergen (Dermatophagoides pteronyssinus; Der p) through placental transference
and maternal breastfeeding as well as to investigate the maternal sensitizing effect
against to Der p in passive transference of these antibodies. For those objectives, we
quantified by ELISA, IgG anti-Der p in paired samples of maternal blood and umbilical
cord and anti-Der p S-IgA in colostrums of sensitized mother (n=13) and not sensitized
(n=26); and we analyzed the functional activity of the same antibodies by avidity assays.
The sensibility was determined in maternal sera by specific RAST (Cap System®
Pharmacia). We show by the first time that anti-Der p S-IgA is transferred to the infant in
very variable concentrations and with high levels of avidity, but is not dependent of
maternal sensitization. We believe that breastfeeding is important, because it supplies
S-IgA with the capacity to neutralize in a specific manner and block the entrance of Der
p through mucosa, in infant of RAST+ mothers as well as of RAST-. We also
demonstrate that total and specific to Der p IgG levels are more elevated in newborns of
sensitized mothers when compared to of those of control mothers and non-sensitized
indicating that the maternal sensitizing can influence the fetal immune response. In the
other hand, the specific avidity of anti-Der p IgG was very similar between paired
samples of umbilical cord and maternal sera, as well as in samples of study group and
control group, suggesting thar the avidity index of IgG does not influence on placental
transfer of specific antibodies. Once that the maternal antibody transference represent a
important mechanism for immunomodulation of allergic response, we expect that a
better understanding of the influence of maternal sensitivity on passive transfer of
specific antibodies to babies will contribute with advances in the elaboration of adequate
strategies of prevention of allergic sensitivity with more efficient therapeutic results.
Key words: Mite; Colostrum; Hypersensitivity; Immunoglobulin; Pregnancy.
11
Lista de Ilustrações
Figura 1. Mecanismos da alergia................................................................... 21
Figura 2.
Dermatophagoides pteronyssinus macho e fêmea ........................
22
Figura 3.
Passagem transplacentária de IgG.................................................
26
Figura 4.
Estímulos envolvidos no desenvolvimento da imunossupressão da
IgE no início da vida ..........................................................
30
Figura 5.
Circulação enteromamária de linfócitos...........................................
33
Figura 6.
Algoritmo da seleção e análise das amostras.................................
42
Figura 7.
Esquema da placa utilizada no ensaio de ELISA para determinação
dos índices de avidez...............................................
50
Figura 8.
Mães com RAST+ (score ≥3) apresentaram concentração de IgE
sérica significativamente mais elevada que às de RAST- (score 0).
Kruscal-Wallis, p=0,003; Mann Whitney, *p=0,0008..................
53
Figura 9.
Recém nascidos apresentaram maior concentração de IgG total
quando comparados à suas respectivas mães (n=74). Mann
Whitney *p<0,0001..........................................................................
55
Figura 10.
Recém nascidos apresentaram níveis de IgG anti-Der p fortemente
correlacionados aos de suas respectivas mães. (n=74). Spearman
r = 0,92; *P<0,0001...........................................
55
Figura 11.
Recém nascidos apresentaram níveis de IgG anti-Der p
estatisticamente semelhantes aos de suas respectivas mães.
(n=74). Mann Whitney p>0,05.........................................................
56
Figura 12.
Nível de S-IgA anti-Der p apresentou correlação com o nível de S-
IgA total, ambas quantificadas no colostro. (n=71). Spearman r =
0,8; *P<0,0001............................................................................
57
Figura 13.
A IgG dos recém nascidos apresentou índice de avidez específico
ao Der p fortemente correlacionado ao de suas respectivas mães
(n=74). Spearman r=0,91; *p<0,0001..............................................
58
Figura 14.
A IgG dos recém nascidos apresentou índice de avidez específico
ao Der p estatisticamente igual ao de suas respectivas mãe (n=74).
Mann Whitney, p>0,05........................................................
59
12
Figura 15. A S-IgA de colostro (n=71) apresentou índice de avidez específico
ao Der p maior que o da IgG materna (n=74) e maior que o índice
da IgG do recém nascido (n=74). A barra horizontal indica a
mediana obtida por cada grupo. Kruskal-Wallis, P<0,0001; Mann
Whitney, *p=0,0006 e *p<0,001......................................................
60
Figura 16.
O nível de IgG sérica encontrado em mães do grupo estudo (n=13)
foi estatisticamente igual ao do grupo controle (n=26). A barra
horizontal indica a mediana obtida por cada grupo (Mann Whitney
p>0,05................................................................................
61
Figura 17.
O nível de IgG total foi mais elevado em recém nascidos do grupo
estudo (n=13) quando comparado aos do grupo controle (n=26). A
barra horizontal indica a mediana obtida por cada grupo (Mann
Whitney p=0,006..............................................................................
63
Figura 18.
O nível de IgG anti- Der p foi mais elevado em mães do grupo
estudo (n=13) quando comparado às do grupo controle (n=26). A
barra horizontal indica a mediana obtida por cada grupo (Mann
Whitney, *p=0,04.............................................................................
63
Figura 19.
O nível de IgG anti-Der p foi mais elevado em recém nascidos do
grupo estudo (n=13) quando comparado aos do grupo controle
(n=26). A barra horizontal indica a mediana obtida por cada grupo
(Mann Whitney, *p=0,03). ...............................................................
64
Figura 20.
O nível de S-IgA total (A) e anti Der-p (B), ambas de colostro, foi
estatisticamente igual entre puérperas do grupo estudo (n=13) e do
grupo controle (n=23). A barra horizontal indica a mediana obtida
por cada grupo. Mann Whitney, p>0,05................................
66
Figura 21.
A S-IgA de puérperas do grupo estudo (n=13) apresentou índice de
avidez específico ao Der p estatisticamente igual ao do grupo
controle (n=23). A barra horizontal indica o valor médio obtido por
cada grupo. Teste T, p>0,05...........................................................
67
Figura 22.
A IgG sérica de puérperas do grupo estudo (n=13) apresentou
índice de avidez específico ao Der p estatisticamente igual ao do
grupo controle (n=26). A barra horizontal indica o valor médio
obtido por cada grupo. Teste T, p>0,05..........................................
67
Figura 23.
A IgG de recém nascidos do grupo estudo (n=13) apresentou
índice de avidez específico ao Der p estatisticamente igual ao do
grupo controle (n=26). A barra horizontal indica o valor médio
obtido por cada grupo. Teste T, p>0,05..........................................
68
13
Lista de Tabelas
Tabela 1. Alérgenos do Dermatophagoides pteronyssinus.............................
23
Tabela 2.
Classificação das concentrações de IgE anti-Der p segundo
CapSystem
®
Pharmacia..................................................................
45
Tabela 3.
Valores do anticorpo IgE total e anti-Der p no soro materno....................
54
Tabela 4.
Valores dos anticorpos IgG e IgA, total e anti-Der p................................
57
Tabela 5.
Valores dos índices de avidez da IgG anti-Der p em amostras pareadas
de soro materno e cordão umbilical e da S-IgA anti Der p no colostro..
60
Tabela 6.
Taxa de passagem transplacentária de IgG total no grupo estudo e
grupo controle...........................................................................................
62
Tabela 7.
Valores dos anticorpos IgG, total e anti-Der p..........................................
64
Tabela 8.
Taxa da passagem transplacentária de IgG anti Der p no grupo estudo
e grupo controle.......................................................................................
65
Tabela 9.
Valores dos anticorpos S-IgA, total e anti-Der p.......................................
66
Tabela 10.
Valores dos índices de avidez da IgA de colostro e IgG de amostras
pareadas de soro materno e cordão umbilical..........................................
68
14
Lista de abreviaturas e siglas
APCs Células apresentadoras de antígeno
Amb 1
Alérgeno grupo 1 do pólen da herbácea Ambrosia artemisiifolia
Bl t
Blomia tropicallis
Bet v 1
Alérgeno grupo 1 do pólen da árvore Betula verrucosa.
CD (ex.21)
Grupo (cluster) de diferenciação
CD45RO+
Isoforma do CD45 que não contém os éxons A,B e C.
Der f 1 Alérgeno 1 do ácaro Dermatophagoides farinae
Der p Dermatophagoides pteronyssinus
Der p 1 Alérgeno 1 do ácaro Dermatophagoides pteronyssinus
ELISA
Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay
FcεRI Receptor I para porção Fc da imunoglobulina E
FcγRIIb
Receptor II tipo b para porção Fc da imunoglobulina G
FcRn Receptor do recém-nascido para porção Fc
Fel d 1
Alérgeno 1 do pelo de gato
GATA3 Proteína 3 ligante da seqüencia: guanina adenina, timina e adenina
HIV Vírus da Imunodeficiência Humana
BSA Albumina de soro bovino
Ig (ex.A)
Imunoglobulina A
OVA Albumina da clara do ovo
ISAAC International Study of Asthma and Allergies in Childhood
IL (ex.3) Interleucina 3
IFN-γ
Interferon-gama
KU/l Kilounidades por litro
MHC II Molécula do complexo de histocompatibilidade principal tipo II
KSCN Tiocianato de potássio
LB Linfócito B
LT Linfócito T
OVA Ovalbumina
p24 Proteína de 24kD
15
pIgR Receptor de imunoglobulina polimérica
rBet v 1 Recombinante do alérgeno 1 do pólen da árvore Betula verrucosa.
RN Recém nascido
SC Componente secretor
SIgA Imunoglobulina A secretória
TCR Receptor de célula T
TGF-β Fator de crescimento tumoral-beta
T
H
2 Linfócitos T tipo 2
T
H
17 Linfócitos T tipo 17
TNF-α
Fator de necrose tumoral-alfa
T reg Linfócitos T regulatórios
UA Unidade arbitrária
UI Unidade internacional (1UI=2,42ng)
16
Sumário
1 Introdução .............................................................................................
19
1.1 REAÇÕES DE HIPERSENSIBILIDADE E ALÉRGENOS AMBIENTAIS ......................
20
1.2 INFLUÊNCIAS DA GESTAÇÃO NA SENSIBILIZAÇÃO DA CRIANÇA..........................
25
1.3 INFLUÊNCIA DA AMAMENTAÇÃO NA SENSIBILIZAÇÃO DA CRIANÇA.....................
32
1.4 PAPEL “ATIVO” DOS ANTICORPOS MATERNOS NO DESENVOLVIMENTO DO SISTEMA
IMUNE DA CRIANÇA................................................................................
35
2 Objetivos...................................................................................................
38
3 Casuística e métodos..........................................................................
40
3.1 SELEÇÃO DAS PUÉRPERAS ...........................................................................
40
3.2 OBTENÇÃO DAS AMOSTRAS DE SANGUE MATERNO, SANGUE DE CORDÃO E
COLOSTRO.........................................................................................................
43
3.3 OBTENÇÃO DO SOBRENADANTE DE COLOSTRO ..............................................
43
3.4 OBTENÇÃO DO SORO DE SANGUE PERIFÉRICO E DE CORDÃO UMBILICAL...........
44
3.5 RAST ESPECÍFICO PARA O ÁCARO DERMATOPHAGOIDES PTERONYSSINUS
(CAPSYSTEM
®
PHARMACIA) ...............................................................................
44
3.6 DOSAGEM DE IgE SÉRICA TOTAL ..................................................................
45
3.7 DOSAGEM DE IgG SÉRICA TOTAL…............…………………………………….
46
3.8 DOSAGEM DE IgA TOTAL NO COLOSTRO ........................................................
46
3.9 DETECÇÃO DE IgG SÉRICA E IGA DO COLOSTRO ESPECÍFICOS PARA O D.
PTERONYSSINUS POR ENSAIO IMUNOENZIMÁTICO (ELISA) .................................
47
17
a) IgG anti-D. pteronyssinus ........................................................................ 48
b) IgA anti- D. pteronyssinus .......................................................................
49
3.10 DETERMINAÇÃO DOS ÍNDICES DE AVIDEZ DE ANTICORPOS IgA E IgG ANTI-D.
PTERONYSSINUS POR ELISA ............................................................................
49
3.11 ANÁLISE ESTATÍSTICA ......................................................................
51
4 Resultados .............................................................................................
53
4.1 CARACTERIZAÇÃO DA POPULAÇÃO ESTUDADA...............................................
53
4.2 AVALIAÇÃO QUANTITATIVA DA TRANSFERÊNCIA PASSIVA DE ANTICORPOS
ESPECÍFICOS AO DERMATOPHAGOIDES PTERONYSSINUS ......................................
54
4.3 AVALIAÇÃO QUALITATIVA DA TRANSFERÊNCIA PASSIVA DE ANTICORPOS
ESPECÍFICOS AO DERMATOPHAGOIDES PTERONYSSINUS.......................................
58
4.4 NÍVEIS DE ANTICORPOS TRANSFERIDOS PASSIVAMENTE POR MÃES RAST+ PARA
DER P (GRUPO ESTUDO) E MÃES RAST- PARA DER P (GRUPO CONTROLE)......
61
5 Discussão.................................................................................................
70
6 Conclusão..................................................................................................
83
Referências.................................................................................................
84
Anexos............................................................................................................
98
18
1 Introdução
19
O primeiro relato de doenças alérgicas aparece no início do século 19 e refere-se
à febre do feno. A doença acometia moradores da região urbana, mas não os
trabalhadores rurais que eram expostos a altas doses deste alérgeno no campo (Holt et
al., 2005).
As alergias são altamente específicas a cada paciente e dependentes do órgão
onde se manifestam. Podem se apresentar como asma, rinoconjuntivite, sinusite,
alergia alimentar, dermatite atópica, urticária, anafilaxia e alergia a insetos e drogas;
todas podendo ocorrer de forma individual ou em combinação. Embora algumas sejam
desencadeadas na ausência de atopia (predisposição genética para produzir IgE
sérica), grande parte dos pacientes que sofrem de alergias são atópicos (Holgate et al.,
2008).
A prevalência da sensibilização à alérgenos ambientais começou a crescer
paulatinamente na década de 70, juntamente com o desenvolvimento sócio econômico.
Atualmente, 25 a 30% da população geral e 10% da população infantil sofrem de
doenças alérgicas como asma e rinite (Weiss et al., 1994; Holt et al., 2005). Nas últimas
décadas, segundo dados obtidos pelo estudo ISAAC (International Study of Asthma and
Allergies in Childhood) que avaliou adolescentes entre 13-14 anos em 56 países
(n=463.801) e crianças entre 6-7 anos em 38 países (n=257.800), foi registrado
modesto aumento na prevalência de rinoconjuntivite no mundo inteiro, no entanto com
grande variação entre os países (Krause et al., 2002; Pearce et al., 2007). O maior
aumento registrado no período de um ano nos adolescentes entre 13-14 anos foi na
Argentina (60%- 65%), Paraguai (67%), França (58%) e Brasil (55%), e as mais baixas
em centros da Etiópia (3%), Índia (3–9%) e países que pertenceram à união Soviética
(9%- 10%) (Björkstén et al., 2008). O recente aumento nos níveis de rinoconjuntivite no
Brasil é ilustrado no estudo de Solé e colaboradores (2007) que registraram, no período
de 2006 a 2007, um aumento de 10,3% para 17,4% em crianças de 6-7 anos e de 8.9%
para 28.5% entre adolescentes de 13-14 anos, sendo maior entre aqueles da região
urbana.
20
1.1 REAÇÕES DE HIPERSENSIBILIDADE E ALÉRGENOS AMBIENTAIS
A reação de hipersensibilidade a aero-alérgenos inicia-se após inalação e
entrada do alérgeno através da membrana da mucosa respiratória (Schwarze et al.,
1998). Este será capturado por células dendríticas, que atuarão como apresentadoras
de antígeno profissionais (APCs), apresentando peptídeos selecionados na molécula de
MHC II aos linfócitos T naive no linfonodo. A apresentação dos alérgenos direciona a
diferenciação dos linfócitos T para subtipo T helper 2 (T
H
2), caracterizado por secretar
as citocinas IL-4, IL-5, IL-13 e IL-9, mediado pelo fator de transcrição GATA3 (Comoy et
al., 1998; Georas et al., 2005). A IL-5 atua nos eosinófilos elevando seu número e
promovendo sua ativação, a IL-9 no recrutamento de mastócitos e a IL-4 e IL-13
desempenham papel crucial na mudança de classe para IgE nos linfócitos B (Holgate et
al., 2008).
Quando um indivíduo atópico, sensibilizado a um alérgeno em particular o
reencontra, a ligação cruzada do antígeno a duas moléculas de IgE ligadas ao receptor
de alta afinidade (FcεRI) na membrana dos mastócitos desencadeia sua ativação. A
ativação dos mastócitos mediada pela IgE tem como conseqüência a degranulação e
síntese de mediadores inflamatórios poucos minutos após o contato com o alérgeno.
Entre os mediadores temos a histamina, leucotrienos e citocinas. Estes promovem a
permeabilidade vascular, contração da musculatura lisa e produção de muco. A
exposição repetida a aero-alérgenos estimula a liberação de quimiocinas por mastócitos
e outros tipos celulares, responsáveis por uma importante cascata inflamatória
caracterizada por grande número de eosinófilos, basófilos e linfócitos T
H
2 na mucosa
nasal, brônquica e tecidos marginais (Bochner et al., 2005; Gould et al., 2008). (Figura
1).
21
FIGURA 1: Mecanismos da alergia. Em indivíduos atópicos, a exposição inicial de APCs aos
alérgenos desencadeia preferencialmente ativação de linfócitos T
H
2 e síntese de
IgE; conhecida como sensibilização alérgica. Em indivíduos já sensibilizados, a
exposição secundária ao alérgeno leva ao recrutamento de células inflamatórias,
ativação e liberação de mediadores solúveis. Estes incluem: histamina, leucotrienos
e citocinas, que promovem permeabilidade vascular, contração da musculatura lisa
e produção de muco. Citocinas liberadas por mastócitos e outros tipos celulares
direcionam o recrutamento de células inflamatórias que contribuem para fase tardia
da resposta alérgica; caracterizada por influxo de eosinófilos e células Th2.
Eosinófilos liberam grande número de mediadores e citocinas pro - inflamatórias
como interleucina 3 (IL-13), interleucina 5 (IL-5) e interleucina 3 (IL-3). Células T
regulatórias (T
reg
) é outro importante subtipo de células TCD4
+
responsáveis por
suprimir a resposta de células T
H
2 envolvendo a citocina inibitória IL-10 e fator de
crescimento tumoral beta (TGF-β). T
H
17, outro subtipo de linfócito TCD4+
recentemente identificado e conhecido por secretar IL-17, parece estar associado
especificamente com eventos inflamatórios do neutrófilo que ocorrem durante a
exacerbação da resposta imune e no remodelamento tecidual. FcεRI, receptor de
alta afinidade para IgE; TCR, receptor de célula T; cell, célula.
FONTE: Holgate et al., 2008.
Está claro que uma variedade de mudanças socioeconômicas e ambientais em
curso, algumas de maneira acelerada, têm o potencial de influenciar a suscetibilidade à
alergia. Estudos mostram que a rinite alérgica, asma brônquica e dermatite atópica são
as alergias mais características de atopia (Weiss et al., 1994) e os principais agentes
Mastócito
Alérgeno
Célula epitelial
Fibroblasto
Célula da
musculatura lisa
Vaso sanguíneo
Muco
eosinófilo
Liberação de mediadores
solúveis
-
proteínas básicas
-
citocinas
-leucotrienos
Liberação de mediadores
solúveis
-Histamina
-citocinas
-leucotrienos
-prostaglandinas
Molécula
MHC classe II
22
ambientais responsáveis por tais manifestações são os presentes na poeira domiciliar
(Platts-Mills et al., 1992; Schwarze et al., 1998). Embora componentes orgânicos de
diversas origens, tais como esporos de fungos, polens, fibras vegetais, bactérias, restos
de alimentos e células epiteliais humanas sejam característicos da poeira, aqueles
derivados de artrópodes (ácaros e baratas) representam os principais fatores
etiológicos da alergia (Bronswijk et al., 1981; Chew et al., 1999; Arruda et al., 2001; Holt
et al., 2005).
A identificação de ácaros do gênero Dermatophagoides, mais conhecidos como
ácaros da poeira domiciliar, foi resultado de estudos de médicos e biólogos durante o
período que antecedeu a Segunda Guerra Mundial. O primeiro documento os
relacionando às alergias respiratórias foi publicado em 1967 e no ano seguinte, o
pesquisador Reindert Voorhorst concluiu que a espécie D. pteronyssinus (Der p) era a
principal fonte de alérgeno presente na poeira domiciliar (Spieksma et al., 2004).
FIGURA 2: Dermatophagoides pteronyssinus macho (esquerda) e fêmea (direita).
Tamanho do corpo ≈ 320µm.
FONTE: Spieksma et al., 2004.
Estudos epidemiológicos claramente indicam que o Der p pode ser identificado
no mundo todo (Fernández-Caldas et al.,1993; Montealegre et al., 1997; Rizzo et al.,
1997; Serravalle et al., 1999; Nadchatram et al., 2005) e aproximadamente 5 a 10% da
23
população em geral está sensibilizada a este ácaro (Tovey et al., 1981; Henszel et al.,
2006).
No Brasil, Arruda e colaboradores (1991) observaram que o Der p representa
50% dos alérgenos presentes na poeira domiciliar dos moradores da cidade de São
Paulo-SP e Rizzo et al. (1993), encontraram níveis maiores que 10µg Der p 1/g de
poeira em 90% das casas de crianças asmáticas. Em Salvador, Recife e Rio de Janeiro,
o mesmo ácaro representa a maior freqüência de testes cutâneos positivos, sendo
principal indutor da sensibilização alérgica (Sarinho et al., 1996; Geller et al., 1996;
Medeiros et al., 1997).
TABELA 1: Alérgenos do Dermatophagoides pteronyssinus
Grupo Função bioquímica Peso Molecular Ligação a IgE
*
1 Cisteina protease 25,000 80-100
2 Desconhecido 14,000 80-100
3 Tripsina 25,000 (30,000) 16-100
4 α- amilase 57,000 40-46
5 Desconhecido 15,000 50-70
6 Quimotripsina 25,000 40
7 Desconhecido
25,000 (31,000,
29,000, 26,000)
50
8
Glutationa S-
Transferase
26,000 40
9
Serina Protease
Colagenolitica
30,000 90
10 Tropomiosina 37,000 50-95
*Freqüência de ligação (% de pacientes)
FONTE: Adaptado de Thomas et al., 2002.
O principal alérgeno presente nas fezes do ácaro (Der p 1) é uma enzima
proteolítica homóloga a papaína (Chelw et al., 1999), capaz de clivar a ocludina,
proteína que compõe as junções compactas localizadas entre as células epiteliais das
vias aéreas. Diante da quebra desta integridade, o alérgeno aumenta a permeabilidade
brônquica, entra facilmente em contato com as APCs profissionais sendo apresentado
aos linfócitos T (LT) (Wan et al., 1999).
24
O Der p 1 também é capaz de clivar o CD40 (molécula co-estimulatória na
superfície das células dendríticas) e o CD25 (subunidade α do receptor para IL-2 na
superfície do LT), envolvidas na regulação do balanço entre IL-10 e IL-12 e portanto, na
polarização dos linfócitos T
H
2 (Schultz et al., 1998). Outra propriedade enzimática é a
clivagem do CD23 (receptor FcεRII de baixa afinidade para IgE). O CD23 tem papel
central na regulação da síntese de IgE. Em sua forma solúvel, apresenta sítio de
ligação para o receptor de membrana CD21 estimulando a síntese de IgE, mas quando
junto à membrana, inibe a síntese após ligar-se diretamente ao alérgeno (Gould et al.,
2008).
Em pacientes asmáticos, a proporção aumentada de eosinófilos em relação aos
neutrófilos no fluido bronco-alveoar está envolvida na obstrução brônquica
característica da asma (Tanizaki et al., 1992). A importância do Der p nestes pacientes
foi demonstrada em modelo murino de inflamação aérea, onde a sensibilização com
Der p levou essencialmente o influxo de eosinófilos para o pulmão na fase tardia da
inflamação, diferente da sensibilização com o ácaro Blomia tropicalis, onde o
recrutamento de neutrófilos foi maior (Carvalho et al., 2004).
Desde a primeira descrição como “reagina” em 1922 e posterior caracterização
como IgE em 1968 (Stanworth, 1993), muitos avanços contribuíram para a
compreensão dos mecanismos imunológicos responsáveis pelas reações de
hipersensibilidade, no entanto pouco se sabe sobre os mecanismos imunes que
regulam sua expressão. Frente a essa situação, há necessidade e crescente interesse
em identificar eventos que predispõem às reações alérgicas logo no início da infância e
assim desenvolver estratégias eficazes de prevenção.
Assim como em outras doenças, está claro que a manifestação alérgica é
resultado da complexa interação entre predisposição genética e influências ambientais.
Inevitavelmente os pais têm papel fundamental na predisposição à atopia da criança;
em especial a mãe, pois além dos genes, fornece o ambiente onde a criança irá se
desenvolver durante os primeiros anos de vida, fase de maior risco à sensibilização
(Thomas et al., 2003). Essa forte influência materna pode ser compreendida através de
25
estudos da transmissão de anticorpos via passagem transplacentária e aleitamento
materno.
1.2 INFLUÊNCIAS DA GESTAÇÃO NA SENSIBILIZAÇÃO DA CRIANÇA.
As primeiras evidências de transmissão de imunoglobulinas da mãe para o feto
surgiram com Brambell e colaboradores há aproximadamente sessenta anos (Brambell
et al., 1949). Hoje sabemos que das cinco classes de anticorpos (IgA, IgD, IgE, IgG,
IgM) a única capaz de ser transportada da mãe para o feto é a IgG. A passagem
transplacentária inicia-se lentamente com aproximadamente 16 semanas de gestação,
mas entre a 22ª e 26ª semana o nível de IgG fetal aumenta rapidamente e dobra de
concentração ao final da gestação (Simister, 2003).
A IgG desloca-se da circulação materna aos capilares fetais mediada pelo
receptor Fc neonatal (FcRn). Em humanos, este receptor é expresso no
sinciciotrofoblasto e liga-se com alta afinidade a IgG quando em pH ácido (<6,5), mas
não em pH fisiológico (7,4). Assim, a passagem da IgG ocorre a partir do momento em
que o sinciciotrofoblasto internaliza fluido materno em endossomos; as moléculas de
IgG ali presentes, juntamente com os receptores, são gradualmente acidificados
permitindo a forte ligação entre ambos e proteção contra a ação de enzimas
lisossomais. A vesícula se funde à membrana na face fetal do sinciciotrofoblasto, a IgG
é dissociada pela ação do pH fisiológico,caindo na circulação (Simister et al., 1997;
Moraes-Pinto et al., 2001; Radulescu et al., 2004; Roopenian et al., 2007) (Figura 3).
A quantidade de IgG transmitida depende da quantidade de receptores na
superfície celular e a taxa de transmissão depende das taxas de ligação e de liberação
de moléculas de IgG desses receptores. O caráter seletivo do processo depende de
uma ou de ambas as taxas e varia entre diferentes subclasses de IgG (Moraes-Pinto et
al., 2001).
26
FIGURA 3: Nos humanos, a passagem transplacentária de IgG ocorre através do receptor FcRn
localizado no sinciciotrofoblasto da placenta. O sinciciotrofoblasto é banhado por
sangue materno e internaliza IgG sérica. O FcRn é expresso na face interna da
vesícula do sinciciotrofoblasto. Com a acidificação dos endossomos, o FcRn se liga
a IgG materna e a transição à circulação fetal se dá em pH fisiológico.
FONTE: Adaptado de Roopenian et al., 2007.
A habilidade de outras proteínas em atravessar a barreira transplacentária não é
restrita a existência de transporte ativo, estando também associada ao seu peso
molecular, solubilidade lipídica, polaridade e ionização (Thorton et al., 2002), mas a IgG
materna também funciona como veículo ideal no transporte de antígenos em
imunocomplexos até a circulação fetal (Casas et al., 2001).
Para verificar a passagem transplacentária de alérgenos em humanos,
Szepfalusi e colaboradores (2006) utilizaram modelo ex vivo de perfusão de placenta e
observaram que tanto os alimentares como os inaláveis atravessam a barreira
transplacentária e membrana amniótica, sendo detectados na circulação fetal e líquido
amniótico, respectivamente. Metabólitos da nicotina e o antígeno p24 do vírus da
imunodeficiência humana (HIV-1) também foram encontrados no tecido placentário,
líquido amniótico e circulação fetal de recém-nascidos de mães expostas ao cigarro ou
infectadas (Vance et al., 2002). Assim, como o feto respira e ingere grandes
Sangue materno
(pH fisiológico)
Sinciciotrofoblasto
Endossomo
inicial
Endossomo
acidificado
Circulação fetal
(pH fisiológico)
Proteínas que não se
ligam aos recep
tores
sofrem degradação
lisossomal
27
quantidades do líquido amniótico, alérgenos adquiridos durante a gestação podem
estimular a imunidade do recém-nascido de forma sistêmica e em nível de mucosa, nos
tecidos linfóides associado à mucosa gastrintestinal e respiratória (Holloway et al.,
2000).
Sabemos que apenas a presença dos alérgenos na circulação ou mucosa fetal é
insuficiente para ativar a resposta imunológica; sendo necessária participação de APCs
imunocompetentes e linfócitos T diferenciados (Thorton et al., 2002).
A ontogênese do sistema imune ocorre durante o desenvolvimento fetal e logo
após a implantação do embrião já surgem linfócitos B. Um pouco mais tarde, ao final do
primeiro trimestre de gestação, linfócitos T começam a expressar seus receptores, com
intensa expansão ao final do segundo trimestre. Já os anticorpos IgM e IgE são
detectados ainda no primeiro trimestre com aproximadamente 11 semanas de
gestação, juntamente com o surgimento do timo (Hertz-Picciotto et al., 2007). Diante
dessas evidências, supomos que o feto é capaz de responder de maneira específica a
eventuais alérgenos que entrarem em contato durante seu desenvolvimento, mas na
ausência de inflamação ou outros sinais que possam induzir a maturação das células
dendríticas, o encontro com o alérgeno no período fetal pode levar preferencialmente a
tolerância que a ativação (Thorton et al., 2002), ou ainda favorecer a polarização da
resposta para Th2 (Holt et al., 2000; Jones et al., 2002).
Kondo e colaboradores (1992) foram os primeiros a observar in vitro a resposta
proliferativa alérgeno-específica de células mononucleares do cordão umbilical.
Atualmente, já foi demonstrado que proliferação de linfócitos T em resposta a alérgenos
(do ácaro, do leite de vaca e do ovo), ocorrem com aproximadamente 22 semanas de
gestação (Jenmalm et al., 2000; Jones et al., 2002) e que no cordão umbilical alguns
apresentam fenótipo de célula de memória (CD45RO+), sustentando a idéia de que a
sensibilização pode ocorrer previamente intra-útero (Devereux et al., 2001).
A resposta neonatal com produção de IgM específica a agentes infecciosos
como da rubéola, do HIV, da esquistossomose e ao toxóide tetânico, só foi observada
no cordão umbilical de recém-nascidos cujas mães haviam sido infectadas ou
28
vacinadas a tais patógenos durante a gestação, indicando que o desenvolvimento da
reatividade específica depende da prévia exposição materna (Jones et al., 2002).
De maneira semelhante, resposta de células mononucleares e produção de IgG
específica a alérgenos aéreos e alimentares podem ocorrer em recém-nascidos com ou
sem história familiar de atopia, mas não aos alérgenos que a gestante freqüentemente
não é exposta (Casas et al., 2001).
A natureza bastante comum do Der p em todo mundo permite que a exposição
materna ocorra em condições normais de vida (Vance et al., 2002), mas reações
cruzadas também contribuem para o desenvolvimento da resposta imune neonatal.
Como exemplo, mães que não estiveram grávidas durante a “estação de pólen”
apresentam filhos com resposta imune específica a estes alérgenos (Jones et al.,
2002), assim como resposta de células mononucleares do cordão umbilical ao toxóide
tetânico e difteria, sem exposição materna aparente a estes antígenos durante a
gestação (Prescott, 2003).
Ainda não há estudo que mostre relação convincente entre os níveis de
exposição materna aos alérgenos (e presumidamente a exposição fetal) com a
presença, magnitude ou característica da resposta celular específica no recém-nascido
(Chan-Yeung et al., 1999; Miller et al., 2001; Smillie et al., 2001; Marks et al., 2002;
Edelbauer et al., 2004; Hagendorens et al., 2004). Embora em crianças já
sensibilizadas, reduzir a exposição aos alérgenos diminui os sintomas da doença, não
há evidências de que a própria sensibilização também seja reduzida; podendo de fato
aumentar em algumas circunstâncias. Essa observação aplica-se para alergia ao
amendoim, que quando evitado durante a gestação e primeiros anos de vida ao invés
de proteger contra sensibilização, aumenta o risco em desenvolvê-la (Turcanu et al.,
2003).
Assim, podemos pensar que a passagem transplacentária de antígenos não seja
a única responsável pela influência materna no perfil de resposta imune da criança,
existindo outros fatores de igual ou maior importância.
29
Estudos em modelos experimentais demonstraram que a proteção para
sensibilização a aero-alérgenos normalmente ocorre através de mecanismo semelhante
à tolerância oral. A principal característica de animais que se tornaram “tolerantes” após
repetidos desafios com aerosol, é a inabilidade em sintetizar IgE contra o alérgeno
inalado acompanhada por produção de IgG específica (Holt et al., 1981). Em humanos
essa resposta também é descrita, onde a presença de altos níveis de IgE específica é
característica peculiar de atopia enquanto que anticorpos IgG alérgenos específicos são
detectáveis no sangue de indivíduos atópicos e normais (Michils et al., 1999).
Em modelo murino de sensibilização materna seguido por desafio pós natal com
Der p, Victor e colaboradores (2003) observaram que há efeito inibitório da resposta IgE
e IgG1 nos recém-nascidos após desafio com o alérgeno e que este efeito é
dependente do nível de anticorpos maternos. Em estudo similar também em modelo
experimental, Uthoff e colaboradores (2003) demonstraram que a supressão da
resposta imune nos recém-nascidos mediada pela transferência de IgG materna previne
completamente a formação de IgE por mecanismo antígeno específico.
Jarrett e colaboradores (1983) foram os primeiros a chamarem a atenção sobre a
possibilidade de a IgG materna ser responsável pela supressão da produção de IgE
pelo recém-nascido através de três possíveis mecanismos: (1) formação de imune-
complexos, (2) ligação ao receptor FcγRIIb na superfície do linfócito B e (3) alterações
no repertório imune fetal através da elaboração de uma resposta anti-idiotípica aos
anticorpos maternos. Todos mecanismos são influenciados pela dose, freqüência e
forma de exposição ao antígeno; além das características genéticas da mãe e criança
(Jarrett, 1984) (Figura 4).
30
FIGURA 4: Estímulos envolvidos no desenvolvimento da imunossupressão da IgE no início da
vida (variáveis entre parênteses).
FONTE: Modificado de Jarrett, 1984.
Apesar de outros estudos confirmarem essas hipóteses (Seenger et al., 1998;
Melkild et al., 2002; Richard et al., 2006), são ainda insuficientes para esclarecer o
mecanismo de ação da IgG materna. Além disso, grande parte utilizou modelos
experimentais e os resultados não podem ser completamente transportados para a
realidade da sensibilização e reações de hipersensibilidade em humanos.
Em humanos, alguns estudos longitudinais indicam que a transferência de altas
concentrações de anticorpos maternos IgG específicos a aero-alérgenos ou alérgenos
alimentares protege contra o desenvolvimento de atopia nos primeiros meses de vida
(Dannaeus et al., 1978; Jenmalm et al., 2000; Nafstad et al., 2001). De maneira
semelhante, crianças de mães que receberam imunoterapia ao alérgeno do pólen (Bet
v 1) durante a gestação apresentaram positividade reduzida ao teste de puntura para o
mesmo alérgeno após 3-12 anos, comparados às de gestantes que interromperam o
tratamento (Glovsky et al., 1991).
Muitos pesquisadores atribuem papel protetor à subclasse IgG4 a qual não ativa
a cascata do complemento, age como uma molécula monovalente, tem capacidade
Feto ou
recém
-
Mã
e
Antígen
o
Anticorpos
IgG
(Sensibilidade ao antígeno influenciada por
fatores genéticos e estágio de maturidade)
(Qualidade da resposta materna determinada
por fatores genéticos e natureza do contato
prévio com o antígeno)
(Forma, dose, freqüência, adjuvantes)
31
reduzida de ligação aos receptores da superfície celular e assim apresenta capacidade
de neutralizar o antígeno produzindo menos inflamação que as outras subclasses de
IgG. (Gondo et al., 1987; Aalberse et al., 1993; Mori et al 2001). Este padrão de
resposta está bem estabelecido nas imunoterapias alérgeno-específicas, que
promovem aumento nos níveis de IgA e IgG específicas e queda na concentração de
IgE específica (Frew, 2007), apesar deste mecanismo protetor ainda ser questionado,
pois uma considerável porcentagem dos indivíduos com alergia respiratória apresentam
níveis séricos elevados de IgG4 (Steward et al., 1988; Okahata et al., 1990; Rizzo et al.,
1993; Jenmalm et al., 1997; Casas et al., 2001). Há evidências que quando transferida
em altas concentrações durante a gestação, a IgG evita a sensibilização a aero-
alérgenos na criança; mas não aos alérgenos alimentares (Jenmalm et al., 2000).
O fato de que nem todos os estudos observarem relação entre sensibilização da
criança e níveis de IgG no cordão umbilical (Prescott et al., 2000), sugere que a “falha”
no efeito protetor da IgG pode estar relacionada com a inabilidade que alguns recém-
nascidos têm em responder ao mecanismo regulatório.
Um dos principais determinantes para o risco à sensibilização na infância parece
ser o estado de maturação do sistema imune em relação ao balanço T
H
1/T
H
2 no
momento em que entra em contato com o alérgeno; devido à polarização generalizada
para T
H
2 do sistema imune fetal e do bebê nos primeiros anos de vida (Holt et al.,
2005). A função T
H
1 com capacidade de produzir IFN-γ tende a aumentar
progressivamente durante a infância, mas alguns grupos observaram que recém-
nascidos com alto risco em desenvolver alergia apresentam lenta polarização para
atividade T
H
1 com deficiência na resposta ao IFN-γ, quando comparados aos neonatos
de baixo risco (Kondo et al., 1992). Crianças de alto risco também manifestam
deficiência na resistência a infecções e resposta a vacinas, aparentemente relacionada
com atenuada função T
H
1 (Fallon et al., 2007). A redução da resposta T
H
1 pode ser
parcialmente atribuída à deficiência na função de linfócitos TCD4
+
durante a infância e
na capacidade das APCs em promover adequada estimulação dos linfócitos durante
sua ativação através da IL-12 e outras citocinas (Prescott, 2003).
32
Também devemos lembrar que a concentração de IgG na mucosa é baixa em
relação a encontrada no sangue e após aproximadamente dois meses, quando a
maioria da IgG materna é catabolizada, a importância da amamentação destaca-se em
relação aos antígenos que utilizam a mucosa intestinal como “porta de entrada”,
particularmente em crianças abaixo de 5 anos de idade que exploram o mundo com
suas bocas (Lawrence et al., 2007). Logo, existe a possibilidade de que outros isótipos
presentes na mucosa, especialmente a IgA, possam modular as reações de
hipersensibilidade.
1.3 INFLUÊNCIA DA AMAMENTAÇÃO NA SENSIBILIZAÇÃO DA CRIANÇA.
Embora a resposta imune específica aos alérgenos possa ser ativada antes do
nascimento, o ambiente ao qual o recém-nascido será exposto é crucial para determinar
o padrão de resposta que será estabelecido após a infância. O colostro e leite materno
constituem parte deste ambiente.
Sabemos que a amamentação fornece ao lactente além de nutriente,
componentes imunológicos que os protegem contra infecções e contribuem para
maturação do sistema imune. Estes incluem a lisozima, lactoferrina, peroxidase,
citocinas (TGF-β, IL-10 e IL-6), anticorpos específicos, leucócitos (~4x10
6
ml
-1
), como
macrófagos (55-60%), granulócitos (30-40%), linfócitos (5-10%) e os próprios antígenos
(Goldman et al., 1995; Bednar- Tantscher et al., 2001). Os anticorpos, representado por
90% de S-IgA, são os componentes cruciais para proteção do lactente (Dickinson et al.,
1998).
Aero-alérgenos como Der p, depois de ingeridos ou inalados, são capturados por
células M especializadas e apresentados por APCs aos linfócitos. A resposta resulta na
ativação de linfócitos B que migram via vasos linfáticos e sangue periférico para sítios
efetores que constituem o integrado sistema imune de mucosa (Brandtzaeg, 2003).
Durante a gestação e período de lactação, citocinas (IL-5 e IL-6) e hormônios
responsáveis pela produção do leite induzem a migração de linfócitos da placa de
Peyer, ou de outro órgão linfóide associado à mucosa (como NALT e BALT), para as
glândulas mamárias (Roux et al., 1977; Lebman et al., 1994; Brandtzaeg et al., 1995;
33
Hanson et al., 2002). Nas glândulas, se diferenciam em plasmócitos e produzem
preferencialmente dímeros ou grandes polímeros de IgA (coletivamente conhecidos
como pIgA) unidos por um polipeptídeo de 15kDa denominado cadeia J. Estes, por sua
vez, são transportados eficientemente para o colostro ou leite como anticorpos S-IgA
através de uma glicoproteína de ~ 100kDa chamada receptor de Ig polimérica (pIgR),
expresso constitutivamente por células epiteliais, que após clivagem na porção apical
da célula epitelial se tornará o componente secretor (SC) associado à IgA (Johansen et
al., 2004; Brandtzaeg et al., 2005).
Por este mecanismo, os lactentes recebem S-IgA direcionadas ao variável
repertório materno resultante de complexas interações com o meio ambiente;
principalmente a antígenos que recentemente entraram em contato com as superfícies
de mucosa do aparelho gastrintestinal ou respiratório materno (Hanson et al., 2002).
FIGURA 5: Circulação enteromamária de linfócitos. Linfócitos B ativados migram da placa de
Peyer via vasos linfáticos e sangue periférico para a glândula mamária. A
distribuição de plasmócitos secretores de IgA além do intestino é crucial para
produção de anticorpos secretores (S-IgA e SIgM) no leite. Por este mecanismo o
lactente receberá proteção específica no intestino e vias aéreas de maneira similar à
mucosa intestinal materna.
FONTE: adaptado de Brandtzaeg, 2003.
Glândula
mamária
Vaso linfático
Linfonodo
mesentérico
Ducto
torácico
Sangue
periférico
Mucosa
intestinal
Mãe
Criança
Proteção da via respiratória
superior e intestino
Microorganismos
Alimento
Leite materno
Fatores da
imunidade
inata
Células
imunes
Mediadores
imunes
34
A concentração de S-IgA total no colostro pode chegar a 5000mg/dl e no leite a
25mg/dl (Strober et al., 2000). Um lactente com amamentação exclusiva ingere cerca
de 0,5 a 1,0g de S-IgA por dia (Van-de-Perre, 2003), mas estas não entram na
circulação da criança em quantidades substanciais (Duchén et al., 2000); exceto talvez
em recém-nascido pré-termo (Weaver et al., 1991; Sanderson et al.,1993).
A rota do antígeno após administração por aerosol já foi demonstrada utilizando
125
I-BSA ou 125I-OVA marcados com radiação. Ambos os estudos mostraram que 2-4%
dos antígenos foram encontrados no pulmão enquanto 65-80% foram encontrados no
trato digestivo após 1 a 2 horas da exposição com aerosol. Além disso, muitos dos
antígenos inalados ficam aprisionados no muco nasal e são encaminhados ao trato
digestivo através dos movimentos ciliares (Willoughby, et al., 1977; Holt et al., 1981).
Assim, embora alguns aero-alérgenos penetrem através dos alvéolos distais, grande
parte irá concentrar-se na mucosa intestinal e podem ser bloqueados e eliminados por
anticorpos S-IgA específicos ali presentes, antes de iniciar a reação alérgica (Kitani et
al., 1985) e sem indução de resposta inflamatória (Brandtzaeg, 1992; Albanese et al.,
1994; Hanson et al., 1994; Maxson et al., 1995; Walker, 2002).
Estudos epidemiológicos, realizados com o objetivo de estabelecer relação entre
amamentação e risco em desenvolver alergia durante a infância, ainda mostram
resultados conflitantes, mas a maior parte dos estudos sugere que a amamentação tem
efeito protetor especialmente em crianças com hereditariedade de atopia (revisado em
Odijk et al., 2003). Em relação à alergia alimentar, baixa concentração de S-IgA
específica no colostro parece diminuir a proteção da mucosa intestinal do lactente e
facilitar a adesão dos alérgenos (Calbi et al., 1998; Järvinen et al., 2000); já para as
outras manifestações, essa relação ainda não foi estabelecida.
Apesar de algumas indicações de que a concentração de S-IgA específica a
aero-alérgenos e alérgenos alimentares é mais baixa no leite de mães atópicas quando
comparadas às sadias (Casas et al., 2000; Duchén et al., 2000), essa observação não é
constante e parece variar individualmente, assim como a concentração de citocinas
relacionadas diretamente com produção deste anticorpo durante a lactação, como a IL-
35
6 e IL-10 (estimulam a produção de IgA), TNF-α (estimula a produção do componente
secretor) e TGF-β (desencadeia o switch para IgA no linfócito B) (Van de Perre, 2003).
Recentemente, Verhasselt e colaboradores (2008) demonstraram em modelo
experimental, que aero-alérgenos podem ser transferidos através da amamentação,
resultando em tolerância antígeno específica e prevenção de danos pulmonares, como
inflamação das vias aéreas. A tolerância observada provavelmente se deve ao fato da
mãe fornecer de maneira constante ao filhote antígenos em baixa concentração, assim
como ocorre na imunoterapia, e a citocina TGF-β, relacionada com indução de células
T
reg
(Frew et al., 2007). No entanto, ainda não está determinado se a tolerância ocorre
quando a mãe é alérgica ao mesmo antígeno transferido para o recém-nascido.
1.4 Papel “ativo” dos anticorpos maternos no desenvolvimento do sistema imune
da criança.
Além dos mecanismos já mencionados, anticorpos maternos podem ativar e
modular a resposta imune específica na criança, antes dela ser exposta ao antígeno
propriamente dito. Essa afirmação partiu da observação de que recém-nascidos de
mães vacinadas com o poliovirus inativado e com possibilidade praticamente nula de
terem sido expostas a este antígeno durante a gestação, apresentaram S-IgA
específica na saliva (Mellander et al., 1986). Assim, somente os anticorpos transferidos
da mãe para o feto podem ter iniciado a resposta imune específica observada no
recém-nascido.
Essa possibilidade origina-se do fato que um anticorpo específico (por exemplo,
para o poliovirus) induz anticorpos contra seu sítio de ligação. O primeiro anticorpo
(chamado de idiotipo) e o segundo anti-anticorpo (anti-idiotipo) são parte da maioria, se
não de todas as respostas humorais (Wigzell, 1987). O efeito regulatório da interação
entre eles é geralmente curto nos adultos, mas de longa duração quando induzida no
período neonatal, podendo ser transmitida à geração seguinte (Lemke et al., 2004). Se
presentes em grandes concentrações, os anti-idiotipos tem efeito regulatório, inibindo a
produção de anticorpos da especificidade correspondente, mas se presentes em baixas
36
concentrações levam a ativação celular (Stein et al., 2007). No último caso, o indivíduo
pode adquirir maior proteção contra patógenos, mas ao mesmo tempo sensibilizar-se a
peptídeos alimentares ou alérgenos ambientais.
A observação que filhos de mães alérgicas tem maior risco de desenvolver atopia
que filhos de pais alérgicos (Jones et al., 2002), corrobora a idéia de que o rápido
aumento da incidência de atopia nas últimas décadas tem grande influência materna e
não pode ser explicada somente por fatores genéticos. Assim, diante das evidências
aqui apresentadas, podemos inferir que a transferência de anticorpos maternos, além
de fornecer proteção passiva contra patógenos, “educa” o sistema imune do recém-
nascido através de mecanismos imunossupressores e ativadores. A interferência dos
anticorpos maternos nos primeiros anos de vida é essencial, pois apesar dos recém-
nascidos já apresentarem o “aparato” celular para responderem de maneira específica
aos eventuais patógenos, ainda apresentam déficit funcional do sistema imunológico e,
a regulação inapropriada da resposta, pode desencadear doenças como a alergia (Kelly
et al., 2000).
Esta forte influência, específica e dependente das experiências imunológicas
maternas, pode ser compreendida por meio dos estudos de transmissão de anticorpos
via passagem transplacentária e aleitamento materno. Assim, é de extrema importância
caracterizarmos a transferência passiva de anticorpos específicos ao principal alérgeno
da poeira domiciliar (Dermatophagoides pteronyssinus), grande colaborador na
patogênese da asma e rinite alérgica (Rizzo et al., 1995, Rizzo et al., 1997, Sarrinho et
al., 2000, Naspitz et al., 2004), para que possamos avançar com o conhecimento das
relações materno-fetais e, mais adiante, estabelecer estratégias eficazes de prevenção
das doenças alérgicas durante o desenvolvimento fetal e primeiros anos de vida da
criança.
37
2 Objetivos
38
Geral:
Caracterizar quantitativa e qualitativamente a transferência passiva de anticorpos
específicos ao Der p durante a gestação e amamentação.
Específicos:
Analisar a concentração e os índices de avidez da S-IgA total e anti-Der p no
colostro e de IgG total e anti-Der p no soro materno e de cordão umbilical.
Investigar o efeito da sensibilização materna ao Der p na transferência passiva de
anticorpos totais e específicos.
39
3 Casuística e Métodos
40
3.1 SELEÇÃO DAS PUÉRPERAS
A população avaliada foi constituída de puérperas e seus respectivos recém-
nascidos, atendidos na Maternidade de Campinas durante os meses de fevereiro a
julho de 2006.
Estabelecemos como critérios de inclusão a idade gestacional (de 37 semanas
completas a 39 e 6/7 semanas), ausência de doenças sistêmicas como diabetes e
hipertensão, e reações sorológicas negativas para hepatite, HIV e sífilis. Não houve
restrições ao grupo étnico, idade, escolaridade, paridade, história de aleitamento
anterior, ou tipo de parto. Obtivermos estes dados na ficha de internação.
Na primeira etapa do estudo, analisamos a concentração e os índices de avidez
da S-IgA e IgG, totais e anti-Der p, em 71 amostras de colostro e 74 amostras pareadas
de soro materno e de seu respectivo recém-nascido, coletadas aleatoriamente.
Na segunda etapa do estudo analisamos menor número de pacientes, pois
focamos somente na sensibilização ao D. pteronyssinus: Através de um questionário
simples aplicado às puérperas, levantamos os antecedentes de doença alérgica
pessoal e, baseado nestes relatos e nos níveis de IgE total e específica anti-Der p,
realizamos uma segunda seleção da população estudada, subdividindo as puérperas
em dois grupos, conforme algoritmo da figura 6.
O grupo estudo foi constituído de amostras de puérperas sensibilizadas ao D.
pteronyssinus (RAST anti-Der p positivo com “score” ≥3) e o grupo controle constituído
por amostras de puérperas não sensibilizadas ao D. pteronyssinus (RAST anti-Der p
negativo com “score” =0); níveis normais de IgE sérica total (≤130UI/ml) e ausência de
história clínica de asma, dermatite e rinite alérgica.
41
FIGURA 6: Algoritmo da seleção e análise das amostras:
Foram selecionadas aleatoriamente puérperas atendidas na Maternidade de Campinas. Após
assinatura do termo de consentimento, coletou-se sangue de cordão umbilical do recém-
nascido de cada voluntária e após 48hrs, uma amostra de colostro e outra de sangue periférico
materno. Todas as amostras foram encaminhadas ao laboratório e processadas para realização
dos testes sorológicos. Verificamos as concentrações totais dos isotipos IgG, IgA e IgE e anti-
Der p, e determinamos os índices de avidez para cada isotipo. As amostras foram divididas em
dois grupos segundo questionário aplicado 48 horas após o parto: (1) Grupo estudo, em
vermelho, constituído por amostras de voluntárias sensibilizadas ao Der p (RAST positivo, com
“score” ≥3) e (2) Grupo controle, em azul, constituído por amostras de voluntárias não
sensibilizadas ao Der p (RAST negativo com “score”=0); níveis normais de IgE total (≤130UI/ml)
e sem histórico de asma, dermatite e rinite alérgica
42
Seleção das puérperas
Assinatura do termo de
consentimento
Amostras processadas em laboratório:
- Obtenção do soro e sobrenadante
- Armazenamento a -80
o
C
Soro de cordão umbilical
Soro Materno
Sobrenadante de colostro
Coleta do sangue de
cordão umbilical
Coleta do sangue
materno
Coleta do
colostro
Aplicação do
questionário
Quantificação IgG total
por nefelometria
Quantificação IgG
anti-Der p por ELISA
Análise avidez da IgG
anti- Der p por ELISA
Quantificação IgA
total por ELISA
Quantificação IgA
anti- Der p por ELISA
Análise avidez da IgA
anti- Der p por ELISA
Quantificação IgG total
por nefelometria
Quantificação IgG anti-
Der p por ELISA
Análise avidez da IgG
anti- Der p por ELISA
Quantificação IgE total
(quimioluminescência)
RAST (IgE anti-Der p)
Histórico de
alergia
(asma, dermatite
e rinite alérgica)
N
O MESMO DIA
A
PÓS
48
HORAS
GRUPO ESTUDO
GRUPO CONTROLE
A
USENTE
N
ÍVEIS NA
FAIXA DE
NORMALIDADE
N
EGATIVO
P
OSITIVO
43
3.2 OBTENÇÃO DAS AMOSTRAS DE SANGUE MATERNO, SANGUE DE CORDÃO E COLOSTRO
Após assinar o termo de consentimento livre e esclarecido, coletou-se de cada
mãe voluntária uma amostra de sangue do cordão umbilical e após 48hrs, uma amostra
de sangue venoso e outra de colostro. No caso de puérperas menores de 21 anos de
idade, o responsável legal autorizou a inclusão no estudo assinando o termo de
consentimento. As coletas foram realizadas no período de Janeiro a Julho de 2006.
Sangue de cordão: A pesquisadora ou o obstetra responsável coletaram
aproximadamente 15 ml de sangue em tubo seco, logo após sua ligadura ou após
dequitação da placenta. O sangue foi coletado, com auxílio de agulha e seringa
descartáveis. Os tubos foram identificados e armazenados a 4 °C até serem
transportadas ao laboratório.
Colostro: Aproximadamente 5 ml de colostro foram coletados manualmente, 48
horas após o parto, em tubo seco, sempre na mama oposta da última mamada, por
enfermeira qualificada. Os tubos foram identificados e armazenados a 4 °C até serem
transportados ao laboratório.
Sangue periférico: Aproximadamente 15 ml de sangue materno foram coletados
em tubo seco por meio de punção venosa periférica realizada por enfermeira
qualificada tomando-se as devidas precauções de assepsia. Os tubos foram
identificados e armazenados a 4 °C até serem transportados ao laboratório.
3.3 OBTENÇÃO DO SOBRENADANTE DE COLOSTRO
No mesmo dia da coleta as amostras foram centrifugadas por 30 minutos a
160xG sob refrigeração a 4 °C. A centrifugação permite a separação do colostro em
três fases nítidas: o “botão” celular, uma porção fluida intermediária e uma camada
superior de gordura. A camada superior de gordura e o “botão” celular foram
desprezados, e a porção fluida aliquotada e estocada a -80 °C.
44
3.4 OBTENÇÃO DO SORO DE SANGUE PERIFÉRICO E DE CORDÃO UMBILICAL
No mesmo dia da coleta, as amostras de sangue periférico e de cordão umbilical
foram centrifugadas por 15 minutos a 160xG. Os soros obtidos foram aliquotados e
estocados a - 80 °C.
TESTES LABORATORIAIS
3.5 RAST ESPECÍFICO PARA O ÁCARO DERMATOPHAGOIDES PTERONYSSINUS (CAPSYSTEM
®
PHARMACIA)
A sensibilização materna ao Der p foi determinada baseada nos níveis de IgE
específica quantificados por RAST utilizando-se o equipamento CapSystem
®
da
Pharmacia em laboratório especializado.
Neste sistema, o extrato de Dermatophagoides pteronyssinus é acoplado
covalentemente ao ImunoCAP e reage com a IgE específica da amostra de soro. Após
lavagem da IgE inespecífica, adiciona-se anticorpo-anti-IgE marcado enzimaticamente
para formação dos complexos. Após incubação o anticorpo-anti-IgE não ligado é
lavado, procedendo-se à incubação do complexo ligado ao substrato. Para avaliar os
resultados, a fluorescência é convertida em concentrações pelo Software do
equipamento, utilizando uma curva de calibração. O equipamento realiza todas as
etapas do ensaio e tem amplitude de 0,35 – 100 kU/L, onde resultados abaixo de 0,35
kU/L representam ausência ou níveis indetectáveis de anticorpos alérgeno-específicos.
Os resultados em KU/L são classificados, quanto à reatividade, em classes de 0
a 6 (Instruções de utilização ImmunoCap Specific IgE Conjugate 100 and 400 –
Fluoroenzymeimmunoassay. 52-5237-99/05:99-112). (Johansson, 1988) (Tabela1).
45
TABELA 2: Classificação das concentrações de IgE anti-Der p segundo
CapSystem
®
Pharmacia
Classes
Faixa (KU/l)
Resultado
Interpretação
0 < 0,35 Indetectável Negativo
1 0,35 – 0,70 Fraco Correlação
2 0,70 – 3,50 Moderado Duvidosa
3 3,50 – 17,50 Forte Positivo Conclusivo
4 17,50 – 50,00 Muito forte Positivo Conclusivo
5 50,00 – 100,00 Muito forte Positivo Conclusivo
6 > 100,00 Muito forte Positivo Conclusivo
3.6 DOSAGEM DE IgE SÉRICA TOTAL
Determinou-se a concentração de IgE sérica total materna através de
imunoensaio tipo sanduíche de quimioluminescência direta, utilizando quantidades
constantes de dois anticorpos contra IgE. O ensaio foi realizado por laboratório
especializado e utilizou-se o equipamento ADVIA Centaur (124666 ver. E, 2003-04: pg
1-10) (National Committee for Clinical Laboratory Standards, 1999).
Nesta técnica, o primeiro anticorpo, no reagente Lite, é um anti-IgE humano
caprino marcado com éster de acridina e o segundo, na fase sólida, é um anticorpo
anti-IgE humano de rato covalentemente ligado a partículas paramagnéticas. O sistema
realiza automaticamenrte as seguintes etapas:
- Adiciona 30 µl de amostra em uma cubeta
- Adiciona 100 µl de Reagente Lite e 450 µl de Fase Sólida e incuba durante 7,5
minutos a 37 °C.
- Separa, aspira e lava as cubetas com água
- Adiciona 300 µl de Reagente Ácido e a mesma quantidade de Reagente Básico para
iniciar a reação quimioluminescente.
- Relata os resultados para IgE total no soro em UI/ml sendo a concentração mínima
detectável é de 1,5 UI/ml e a máxima de 3.000 UI/ml.
46
3.7 DOSAGEM DE IgG SÉRICA TOTAL
Os níveis séricos de IgG total materna e do cordão umbilical foram avaliados por
nefelometria, realizado por laboratório especializado, utilizando nefelômetro Behring
(BN 100 Prospec) com padrões e controles apropriados. As dosagens de
imunoglobulinas foram efetuadas segundo protocolo de ensaio para nefelômetro
(Behringer, EUA), e as amostras de soro diluídas conforme instruções do fabricante
(Berhinger, EUA). (Dati et al., 1996). Os resultados foram expressos em mg/dl.
3.8 DOSAGEM DE IgA TOTAL NO COLOSTRO
A IgA total secretória de colostro foi medida por ensaio imunoenzimático ELISA
(método modificado de Nagao et al., 2001).
Microplacas Costar de 96 poços (Corning, NY 3590) foram revestidas com
5µg/ml de anti-IgA humana (I-0884, Sigma) em PBS pH7,4, incubadas overnight em
câmara úmida a 4 °C e lavadas 4 vezes com solução de PBS – Tween 20 0,1%. Logo
após, diluiu-se as amostras em 1:100.000 em tampão PBS NaCL 0,35M-Tween 0,2% e
as adicionou à placa em duplicatas de quatro diluições seriadas de 1:2, onde
permaneceram incubadas por duas horas a 37 °C. Em todos os ensaios, juntamente
com as amostras, utilizou-se uma curva padrão constituída de IgA de colostro (I-2636,
Sigma) nas concentrações de 3,9 ng/ml a 250 ng/ml e dois controles (“pool de colostro”)
com concentrações já conhecidas. Sendo assim, o limite inferior de sensibilidade
correspondeu a 3,9 ng/ml.
Após novas lavagens, adicionamos 100 µl de conjugado anti-IgA humano
marcado com peroxidase (α-chain specific, Sigma A0295), na diluição de 1:20.000 no
mesmo tampão de diluição das amostras. A placa foi então incubada novamente por 1
hora e trinta minutos a 37 °C. O substrato constituído por 10mg de ortofenilenodiamina
(OPD) dissolvida em 25 ml de tampão citrato fosfato pH 5.0 e 10 µl de água oxigenada
(H
2
O
2
), foi acrescentado no volume de 100 µl /poço e as placas mantidas no escuro a
temperatura ambiente por 30 minutos. Após este período, adicionamos 50 µl em cada
[Digite uma citação do documento
ou o resumo de uma questão
interessante. Você pode posicionar
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Ferramentas de Caixa de Texto
para alterar a formatação da caixa
de texto da citação.]
47
poço de solução “stop”, que consiste em ácido sulfúrico a 2,5 N. Realizou-se a leitura
da placa em leitor de ELISA em 492nm.
Para o cálculo das concentrações de IgA total em todas as amostras, utilizamos
os resultados da leitura em densidade óptica da amostra referência e o programa
GraphPad Prism para a construção da curva padrão.
3.9 DETECÇÃO DE IgG SÉRICA E IGA DO COLOSTRO ESPECÍFICOS PARA O D. PTERONYSSINUS
POR ENSAIO IMUNOENZIMÁTICO (ELISA)
Em todos os ensaios utilizou-se o “Extrato total de Dermatophagoides
pteronyssinus liofilizado” (Lote X-1” da IPI-ASAC Brasil), ressuspendido em 7,5 ml de
água bidestilada e purificada em sistema de filtragem mili-Q na concentração de 58500
UBE/ml, aliquotado e mantido a -80 °C. A concentração total de proteínas do extrato foi
de 4mg/ml, determinada através do “BCA Protein Assay Reagent Kit” (Pierce, 23227)
que contém formulação baseada em ácido bicinconínico (BCA), para detecção
colorimétrica e quantificação total de proteína. Como não possuíamos soro padrão com
concentração conhecida de IgG e IgA anti-Der p, houve a necessidade de se utilizar um
pool de soro e um de colostro como amostra referência, atribuindo-se aos mesmos um
valor arbitrário de 1.000 unidades por mililitro (1.000 UA/ml). A partir destes pools
(denominados pools curva) pudemos determinar os níveis de anticorpos específicos
presentes nas amostras.
Para o preparo dos dois pools, selecionamos 24 puérperas com histórico de
alergia respiratória relacionada à poeira domiciliar e coletamos amostras pareadas de
sangue periférico e colostro apenas para a preparação dos pools, ou seja, estas
amostras não foram incluídas no estudo. Submetemos cada soro ao teste de
alergenicidade (RAST) e misturamos 2ml de cada amostra que apresentava RAST≥ 4
(n=8) para construção da curva. Da mesma maneira, também fizemos um pool
utilizando as amostras com RAST = 3 (n=6) e RAST = 0 (n=5) que serviram como
controles alto (pool A) e baixo (pool B) do ensaio, respectivamente. As amostras com
RAST 1 e 2 foram descartadas.
O mesmo foi efetuado com o colostro, utilizando-se as mesmas doadoras e o
mesmo volume de amostra.
48
Para todos os ensaios, dois poços foram “brancos”, nos quais se adicionou
somente o extrato e o anticorpo conjugado, não sendo adicionada amostra de soro ou
colostro. O “branco” foi empregado para avaliar a ligação inespecífica entre o anticorpo
conjugado e as proteínas do extrato. O valor da densidade óptica dos poços “brancos”
de cada placa foi sempre subtraído da densidade óptica das amostras, referências e
controles.
a) IgG anti-D. pteronyssinus
Utilizamos o método modificado de Prescott et al., 2000. Primeiramente
adicionou-se às placas (COSTAR-96 poços, Corning, NY 3590) 5µg/ml do extrato
diluído em PBS pH 7,4, permanecendo “overnight” a 4 °C em câmara úmida. No dia
seguinte, estas foram lavadas (sempre quatro vezes com solução tampão fosfato
contendo Tween 0,1% - Denley, EUA) e bloqueadas com solução Molico
®
(leite de vaca
em pó desnatado) 5% em PBS – Tween 20 0,1% por uma hora, em câmara úmida, a
37°C.
Após novas lavagens, as amostras de soro (cordão umbilical e sangue periférico)
e os controles (“pool A” e “pool B”) foram testados em duplicatas diluídos em Molico 5%
em PBS-T 0,1%, em quatro diluições seriadas, a partir de uma diluição inicial de 1:100.
As amostras de soro da mãe e do RN (cordão umbilical) foram analisadas no mesmo
dia e no mesmo ensaio. O “pool curva” (usado para a construção da curva padrão dos
ensaios) foi testado em sete diluições seriadas de 1:2 a partir de 1:100. As placas
permaneceram em incubação durante 2 horas em câmara úmida a 37°C.
A seguir, foram lavadas e adicionou-se o anticorpo anti-IgG humana marcado
com peroxidase (A8419- Sigma), diluído 1:4000 em leite Molico
®
5% PBS-T 0,1%). As
placas permaneceram em incubação durante 1hora e 30 minutos em câmara úmida a
37°C.
Após novas lavagens, foi adicionada solução de tampão citrato fosfato 0,1M
pH=5,0 contendo substrato ortofenilenodiamina (OPD, Sigma, EUA) 0,4mg/ml e
peróxido de hidrogênio (Merck, Alemanha) a 0,01% de concentração final. As placas
permaneceram em incubação à temperatura ambiente durante 30 minutos protegidas
da luz. A reação foi interrompida adicionando-se 50µl de ácido sulfúrico 2,5N. A leitura
49
colorimétrica foi realizada em leitor de placas de ELISA (Labsystems, EUA) no
comprimento de onda de 492nm. Os gráficos e cálculos foram realizados com o
programa GraphPad Prism e os resultados expressos em UA/ml.
b) IgA anti-D. pteronyssinus
Utilizamos o método modificado de Prescott et al., 2000. Resumidamente, com
base no “ELISA para IgG específica”, 5µg/ml do extrato de Dermatophafagoides
pteronyssinus foi adsorvido às placas (COSTAR-96 poços, Corning, NY 3590)
permanecendo “overnight” a 4 °C em câmera úmida. No dia seguinte, as placas foram
lavadas e bloqueadas com solução Molico 5% PBS-T 0,1% por uma hora, em câmara
úmida, a 37°C.
Após novas lavagens, as amostras, os controles e o “pool curva” foram
adicionados na diluição inicial de 1:50, 1:100 e 1:50 respectivamente; e após 2 horas,
incubadas com anticorpo anti-IgA humana marcada com peroxidase (A0295-Sigma),
diluído 1:6.000 por 1 hora e 30 minutos. Após novas lavagens, a placa foi revelada com
substrato em ortofenilediamina (OPD, Sigma, EUA) e a leitura realizada em 492nm. Os
resultados também foram expressos em UA/ml.
3.10 DETERMINAÇÃO DOS ÍNDICES DE AVIDEZ DE ANTICORPOS IgA E IgG ANTI-D.
PTERONYSSINUS POR ELISA
A avidez dos anticorpos foi determinada utilizando-se tiocianato de potássio
(KSCN) para eluir os complexos formados pela ligação do anticorpo ao alérgeno (Jones
et al., 1987). Primeiramente, o extrato comercial de D. pteronyssinus foi diluído em PBS
pH 7,4 e adsorvido às placas (COSTAR-96 poços, Corning, NY 3590) na concentração
de 5µg/ml, permanecendo “overnight” a 4 °C em câmara úmida. No dia seguinte, as
placas foram lavadas quatro vezes com solução tampão fosfato contendo Tween 20
0,1% (Denley, EUA) e bloqueadas com solução Molico 5% PBS-T 0,1% por uma hora,
em câmara úmida, a 37°C.
50
Em seguida, as amostras foram diluídas em Molico 5% PBS-T 0,1% e
adicionadas às placas, uma amostra em cada coluna e com mesma concentração em
todos poços. Permaneceram à 37 °C por 1hora e 30 minutos em câmara úmida e, após
novas lavagens, adicionaram-se 100 µl do KSCN nas concentrações de 0 M; 0,25 M;
0,5 M; 1 M; 2 M; 3 M; 4 M e 5 M, sendo uma fileira para cada molaridade, começando
da menor (figura 6). As placas permaneceram incubadas por 30 minutos em
temperatura ambiente e depois foram lavadas 6 vezes.
Logo em seguida, as placas permaneceram por 1 hora à 37 °C com anticorpo
conjugado. Utilizamos anti-IgG humana marcada com peroxidase (A8419- Sigma) a
1:4.000 ou anti-IgA humana marcada com peroxidase (A0295-Sigma) a 1:6.000, ambas
diluídas no mesmo tampão das amostras. Após 4 lavagens, as placas foram reveladas
e lidas em 492nm como já descrito. O índice relativo de avidez foi considerado como a
molaridade de KSCN necessária para eluir 50% dos complexos antígeno-anticorpo
ligados.
Concentração
de KSCN
1
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
0M
(PBS-T 0,1%)
A
Molico
®
5%
(Branco)
Pool
Controle
Amostra Amostra Amostra Amostra
0,25M B
0,5M C
1M D
2M E
3M F
4M G
5M H
FIGURA 7: Esquema da placa utilizada no ensaio de ELISA para determinação dos índices de
avidez.
1
Molaridade do Tiocianato de Potássio adicionada em cada fileira da placa.
Estabelecemos a diluição inicial de cada amostra através das absorbâncias
obtidas nos ensaios de ELISA para IgG e IgA específica ao D. pteronyssinus e
utilizamos a diluição da amostra cuja absorbância estivesse entre 0,8 e 1,2 nm. As
51
amostras de soro de cada mãe com seu respectivo RN (cordão umbilical) foram
analisadas no mesmo dia e no mesmo ensaio.
3.11 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Após análise descritiva dos dados incluindo o cálculo de médias, desvio
padrão, medianas e quartis e teste de normalidade, utilizamos os seguintes testes:
Correlação de Spearman e Pearson para correlacionar as concentrações de
anticorpos e avidez do soro materno e respectivo recém-nascido; Teste de Mann-
Whitney e Teste T para comparar a avidez e níveis de anticorpos entre amostras
do grupo estudo e controle, assim como amostras maternas e dos recém-
nascidos; Teste Kruskal-Wallis para comparar avidez da IgA, IgG materna e IgG
do recém-nascido.Para análise dos dados, utilizamos alfa de 0,05 ou 5% do nível
de rejeição da hipótese de nulidade (Levin, 1987).
52
4 Resultados
53
4.1 CARACTERIZAÇÃO DA POPULAÇÃO ESTUDADA
Participaram deste estudo 74 puérperas com idade média de 26,4 anos, sendo a
mais nova com 15 e a mais velha com 40 anos (anexo A). Detectamos sensibilização
alérgica ao ácaro Dermatophagoides pteronyssinus, definida como nível de IgE anti-Der
p maior que 3,5 KU/l (RAST≥3), em 13 das 74 mães selecionadas. Destas, apenas 3
negaram manifestação clínica de alergia e 10 referiram-se como alérgicas (anexo B).
Constatamos níveis de IgE total extremamente variáveis entre as amostras, com
mínimo de 1,5 UI/ml e máximo de 3.910 UI/ml (Tabela 3). Também observamos que a
concentração sérica de IgE total correlaciona-se com os níveis de IgE anti-Der p
(Spearman r= 0,4; p= 0,001; n=74) e como o esperado, mães com RAST+
apresentaram níveis séricos de IgE total significativamente mais elevados quando
comparadas as com RAST- (Mann Whitney, p=0,0008, n=74. Figura 8).
RAST
≥
3 RAST=2 RAST = 0
0
500
1000
1500
* p=0,0008
n=6n=13
n=55
IgE sérica (UI/ml)
FIGURA 8: Mães com RAST+ (score ≥3) apresentaram concentração de IgE sérica
significativamente mais elevada que às de RAST- (score 0). Os resultados são
mostrados como valores da mediana ± erro padrão da mediana. *p=0,0008.
54
TABELA 3: Valores do anticorpo IgE total e anti-Der p no soro materno
IgE total (UI/ml)
IgE anti-Der p (KU/l)
N
74 74
Mínimo
1,5 0,35
%25
16,5 0,35
Mediana
79,5 0,35
%75
258,2 0,71
Máximo
3910 99,5
Média
308,4 6,6
4.2 AVALIAÇÃO QUANTITATIVA DA TRANSFERÊNCIA PASSIVA DE ANTICORPOS ESPECÍFICOS AO
DERMATOPHAGOIDES PTERONYSSINUS
Nesta primeira etapa do estudo, verificamos a transferência passiva de
anticorpos específicos ao Der p para o feto e recém-nascido.
Iniciamos pela quantificação dos anticorpos maternos. Detectamos IgG anti-Der
p em 100% das puérperas em concentrações que variaram de 69 UA/ml à 6.968 UA/ml.
A concentração de IgG total foi mais constante entre as amostras analisadas (Tabela 4)
e não apresentou correlação com os níveis de IgG específica.
A seguir analisamos quantitativamente a passagem transplacentária destes
anticorpos. Verificamos que a taxa média de transferência da IgG total foi de 144%,
podendo chegar a 377%, onde detectamos no cordão umbilical mais que o triplo da
concentração sérica materna (384 mg/dl no soro materno e 1450mg/dl no recém-
nascido). Logo, como podemos observar na Figura 09, recém-nascidos apresentaram
maior concentração de IgG total quando comparados à suas respectivas mães (Mann
Whitney, P<0,0001, n=74).
55
Mãe Recém Nascido
400
600
800
1000
1200
1400
1600
1800
*p<0,0001
IgG total (mg/dl)
FIGURA 9: Recém-nascidos apresentaram maior concentração de IgG total quando comparados
à suas respectivas mães (n=74). O resultado foi analisado com valores da mediana
*p<0,0001.
Em relação à passagem transplacentária da IgG específica, verificamos que
independente da sensibilização materna, IgG anti-Der p foi transferida à todos recém-
nascidos e detectada no cordão umbilical em concentrações fortemente relacionadas
aos níveis maternos (Spearman test, r = 0.9, P<0,0001; n=74. Figura 10).
0 2000 4000 6000 8000
0
2000
4000
6000
8000
IgG anti-Der p materna (UA/ml)
IgG anti-Der p do RN (UA/ml)
FIGURA 10: Recém-nascidos apresentaram níveis de IgG anti-Der p fortemente correlacionados
aos de suas respectivas mães. (n=74). Spearman r = 0,92; *P<0,0001.
56
A taxa média de transferência da IgG específica foi 103%, um pouco abaixo da
encontrada para IgG total. Além disso, a maioria dos recém-nascidos apresentaram
níveis de IgG anti-Der p semelhantes aos de suas respectivas mães e nenhuma
amostra de cordão umbilical excedeu o dobro da concentração de IgG específica do
soro materno. (Figura 11 e Tabela 4).
FIGURA 11: Recém-nascidos apresentaram níveis de IgG anti-Der p estatisticamente
semelhantes aos de suas respectivas mães. (n=74). O resultado foi analisado com
valores da mediana. p>0,05.
Uma vez constatada a presença de anticorpos específicos ao Der p no cordão
umbilical, analisamos se estes também ocorrem no colostro.
Um dado interessante é que, de maneira semelhante a IgG, demonstramos que
S-IgA anti-Der p esteve presentes em 100% das amostras de colostro analisadas. O
nível de S-IgA anti-Der p detectado foi extremamente variável entre as mães, com
mínimo de 21,5 UA/ml e máximo de 9925 UA/ml (Tabela 4). Este, não apresentou
correlação com o nível de IgE e IgG, tanto total como específico, entretanto
57
correlacionou-se com a concentração de S-IgA total, também quantificada no colostro
(Spearman test r=0,8; *p<0,0001, n=71. Figura 12).
10 100 1000 10000 100000
0.1
1
10
100
1000
Log 10
S-IgA de colostro anti-Der p (UA/ml)
S-IgA de colostro total (mg/ml)
FIGURA 12: O nível de S-IgA anti-Der p apresentou correlação com o nível de S-IgA total, ambas
quantificadas no colostro. (n=71). r = 0,8; *P<0,0001.
T
ABELA
4:
Valores dos anticorpos IgG e IgA, total e anti-Der p.
IgG total (mg/dl) IgG anti-Der p (UA/ml) IgA total (mg/l) IgA anti-Der p (UA/ml)
Mãe RN Mãe RN Colostro Colostro
N 74 74 74 74 71 71
Mínimo 384,0 665,0 69,00 67,00 0,6 21,5
%25 743,5 1038 240,5 269,5 8,3 222
Mediana 845,5 1155 495,5 491,0 19,9 503
%75 934,5 1323 1277 1158 46,9 1272
Máximo 1540 1790 6968 6456 264,5 9925
Média 850 1183 883,1 904 37 1060
58
4.3 AVALIAÇÃO QUALITATIVA DA TRANSFERÊNCIA PASSIVA DE ANTICORPOS ESPECÍFICOS AO
DERMATOPHAGOIDES PTERONYSSINUS
Uma vez quantificado os anticorpos IgG anti-Der p no sangue de cordão
umbilical e S-IgA anti-Der p no colostro, investigamos o índice relativo de avidez.
Verificamos que as IgGs detectadas no cordão umbilical apresentaram índices
de avidez ao Der p fortemente correlacionados aos determinados no soro materno
(Spearman r=0,91; p<0,0001; n=74. Figura 13), apresentando valores praticamente
iguais entre as amostras pareadas, com média de 2,27 na mãe e 2,20 no recém-
nascido (Figura 14; Tabela 5).
0 1 2 3 4 5
0
1
2
3
4
5
Mãe
(Molaridade KSCN)
Recém nascido (Molaridade KSCN)
FIGURA 13: A IgG dos recém-nascidos apresentou índice de avidez ao Der p fortemente
correlacionado ao de suas respectivas mães (n=74). r=0,91; *p<0,0001.
59
mãe recém nascido
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
4.5
Avidez IgG anti-Der p (Molaridade KSCN)
FIGURA 14: A IgG dos recém-nascidos apresentou índice de avidez ao Der p estatisticamente
semelhante ao de suas respectivas mães (n=74). O resultado foi analisado com
valores da mediana. p>0,05.
No soro materno, a concentração de IgG mostrou ser inversamente
correlacionada com o índice de avidez ao Der p (Pearson, p=0,03). No entanto, esta
correlação foi baixa (r= - 0,2) e não observamos correlação entre concentração de IgG
materna e índice de avidez do recém-nascido.
A seguir, avaliamos o índice de avidez da S-IgA do colostro e verificamos que
este apresenta maior índice relativo quando comparado a IgG sérica, tanto materna
como do recém-nascido (Kruskal-Wallis, p<0,0001 e Figura 15). O índice de avidez
específica da S-IgA não se correlacionou com a concentração de S-IgA no colostro.
60
IgG materna IgG RN S-IgA
0
1
2
3
4
5
*p<0,0001
*p=0,0006
n=74 n=74 n=71
molarirade KSCN
FIGURA 15: A S-IgA de colostro (n=71) apresentou índice de avidez maior que o da IgG materna
(n=74) e maior que o índice da IgG anti-Der p do recém-nascido (n=74). A barra
horizontal indica a mediana obtida por cada grupo.
TABELA 5: Valores dos índices de avidez da IgG anti-Der p em amostras pareadas de soro
materno e cordão umbilical e da S-IgA anti Der p no colostro
Índice de avidez da IgG Índice de avidez da S-IgA
Mãe RN
N 74 74 71
Mínimo 0,745 1,032 0,825
%25 1,892 1,707 2,178
Mediana 2,218 2,111 2,627
%75 2,642 2,619 3,085
Máximo 4,159 3,991 4,651
Média 2,274 2,201 2,659
O índice relativo de avidez foi considerado como a molaridade de KSCN necessária para eluir
50% dos complexos antígeno-anticorpo ligados, utilizando extrato total do Dermatophagoides
pteronyssinus.
61
4.4 NÍVEIS DE ANTICORPOS TRANSFERIDOS PASSIVAMENTE POR MÃES RAST+ PARA DER P
(GRUPO ESTUDO) E MÃES RAST- PARA DER P (GRUPO CONTROLE)
Nesta segunda etapa do estudo, investigamos a transferência passiva de
anticorpos por mães sensibilizadas, ou seja, IgE específica positiva ao Der p,
comparando puérperas do grupo estudo (definido como RAST anti-Der p ≥3; n=13) e do
grupo controle (definido como RAST anti-Der p =0, IgE sérica ≤130 UI/ml e ausência de
auto-relato de história clínica de alergia; n=26) conforme algoritmo da Figura 6.
Ao compararmos a concentração da IgG sérica entre mães do grupo estudo e
controle, observamos que apresentam níveis estatisticamente semelhantes (Figura 16)
(Tabela 7).
estudo controle
0
500
1000
1500
2000
IgG sérica materna (mg/dl)
FIGURA 16: O nível de IgG sérica encontrado em mães do grupo estudo (n=13) foi
estatisticamente igual ao do grupo controle (n=26). A barra horizontal indica a
mediana obtida por cada grupo. p>0,05
Em relação à passagem transplacentária de IgG total, a taxa de transferência foi
praticamente a mesma observada entre os dois grupos (Tabela 06), mas ao
compararmos a concentração de anticorpos dos recém-nascidos, observamos que os
do grupo estudo apresentaram níveis significativamente mais elevados de IgG total que
os do grupo controle (Mann Whitney, p=0,006; Figura 17 e Tabela 7).
62
T
ABELA
6:
Taxa de passagem transplacentária de IgG total
IgG Total
-
mg/dl
(mãe)
IgG Total- mg/dl
(cordão umbilical)
Taxa de
transferência
(%)
860 1050 122
Grupo Estudo
- mínima =94%
- média = 134%
- mediana = 129%
- máxima = 214%
1280 1730 135
725 1150 158
698 1500 214
1050 1140 108
809 1390 161
776 1220 157
1540 1540 100
903 1170 129
884 1300 144
1040 983 94
887 1130 127
891 871 97
860 1030 119
Grupo Controle
- mínima = 64%
- média = 133%
- mediana = 120%
- máxima = 377%
746 896 120
982 1170 119
923 1070 116
754 1190 158
797 1070 134
684 1020 150
736 1270 170
489 920 188
384 1450 377
1140 1390 122
1150 1050 91
912 1100 120
846 1060 125
797 876 110
831 855 103
1040 665 64
991 911 92
896 1110 123
822 1330 161
710 939 132
778 986 127
808 917 113
1050 984 94
813 974 120
837 1010 120
* Taxa de transferência calculada dividindo a concentração séria de IgG do cordão umbilical pela
concentração do soro materno. Grupo estudo e grupo controle foram estabelecidos conforme
explicado na casuística do trabalho. (Mann Whitney p > 0,05)
63
Grupo estudo Grupo controle
500
800
1100
1400
1700
2000
*p=0,006
IgG total do cordão umbilical
(mg/dl)
FIGURA 17: O nível de IgG total foi mais elevado em recém-nascidos do grupo estudo (n=13)
quando comparado aos do grupo controle (n=26). A barra horizontal indica a
mediana obtida por cada grupo. p=0,006
A seguir, analisamos a concentração de anticorpos específicos no soro materno
e verificamos, conforme ilustrado na Figura 18, que mães do grupo estudo
apresentaram níveis mais elevados de IgG anti-Der p quando comparadas às do grupo
controle (Mann Whitney, p=0,04) (Tabela 7).
Mãe Mãe
0
1000
2000
3000
4000
*p=0,04
Grupo estudo
Grupo controle
IgG anti-Der p (UA/ml)
FIGURA 18: O nível de IgG anti-Der p foi mais elevado em mães do grupo estudo (n=13) quando
comparado às do grupo controle (n=26). A barra horizontal indica a mediana obtida
por cada grupo *p=0,04
64
Assim como no soro materno, verificamos que recém-nascidos do grupo estudo
apresentam concentrações significativamente mais elevadas de IgG anti-Der p quando
comparados aos do grupo controle (Mann Whitney, p=0,03, Figura 19 e Tabela 7).
RN RN
0
1000
2000
3000
4000
*p=0,03
Grupo estudo
Grupo controle
IgG anti-Der p (UA/ml)
FIGURA 19: O nível de IgG anti-Der p foi mais elevado em recém-nascidos do grupo estudo
(n=13) quando comparado aos do grupo controle (n=26). A barra horizontal indica a
mediana obtida por cada grupo. *p=0,03.
TABELA 7: Valores dos anticorpos IgG, total e anti-Der p.
IgG anti
-
Der p
IgG total
Mãe RN Mãe RN
RAST+
RAST-
RAST+
RAST-
RAST+
RAST-
RAST+
RAST-
N 13 26 13 26 13 26 13 26
Mínimo 130 69 220 67 698 384 871 665
%25 233,5 222,3 260,5 194 792,5 752 1090 919,3
Mediana 1000 550 1121 471,5 887 826 1170 1025
%75 2230 1167 2239 1119 1045 937,8 1445 1125
Máximo 3321 2078 3704 1893 1540 1150 1730 1450
Média 1271 722,6 1362 671,5 949 837 1244 1048
P *p= 0,04 *p= 0,03 p>0,05 *p= 0,006
Apesar de não ser uma diferença estatisticamente significativa, o p de 0,05 é um
indicativo de que a taxa de transferência transplacentária de IgG anti-Der p também
pode ser maior no grupo estudo (Tabela 8).
65
T
ABELA
8:
Taxa da passagem transplacentária de IgG anti Der p .
IgG anti Der p- UA/ml
(mãe)
IgG anti Der p- UA/ml
(cordão umbilical)
Taxa de transferência
(%)
1266 989 78
Grupo Estudo
- mínimo= 70%
- média = 113%
- mediana=
129%
- máximo =182%
220 292 132
3321 3704 111
130 220 169
247 250 101
1000 1188 118
2620 3498 133
1839 1686 91
215 234 108
368 271 73
800 1457 182
1503 1121 70
2999 2791 107
78 67 85
Grupo Controle
- mínimo= 60%
- média = 94%
- mediana= 90%
- máximo =150%
487 414 85
692 435 60
1451 1204 80
224 226 100
150 150 100
234 331 140
645 733 113
752 973 130
111 84 75
1698 1776 100
525 508 96
1397 1094 78
69 91 131
1849 1535 83
2078 1893 91
262 167 64
390 347 89
779 1205 150
575 419 73
756 548 72
199 203 100
1561 1071 68
217 137 63
519 654 120
1090 1193 109
* Taxa de transferência calculada dividindo a concentração séria de IgG do
cordão umbilical pela concentração do soro materno. Grupo estudo e grupo
controle foram estabelecidos conforme explicado na casuística do trabalho.
(Teste T, p= 0,05)
66
Por fim, analisamos os níveis de S-IgA total e anti-Der p no colostro. Diferente do
observado em relação à IgG sérica, não encontramos diferença significativa na
concentração de S-IgA anti-Der p detectada no colostro de puérperas do grupo estudo
quando comparadas às do grupo controle. (Figura 20 e Tabela 9).
Grupo estudo Grupo controle
0
50
100
150
200
250
300
A)
IgA total (mg/ml)
Grupo estudo Grupo controle
500
1500
2500
3500
B)
IgA anti-Der p (UA/ml)
FIGURA 20: O nível de S-IgA total (A) e anti Der-p (B), ambas de colostro, foi estatisticamente
igual entre puérperas do grupo estudo (n=13) e do grupo controle (n=23). A barra
horizontal indica a mediana obtida por cada grupo. p>0,05.
TABELA 9: Valores dos anticorpos S-IgA, total e anti-Der p.
S-IgA total S-IgA anti-Der p
RAST+ RAST - RAST+ RAST-
N
13 23 13 23
Mínimo
2,8 3 66 21,5
%25
10,6 9,5 201,5 179
Mediana
24 14,4 483 309
%75
41,2 49,7 958 1105
Máximo
264,5 185 2289 3161
Média
44,3 32,5 682,3 785,4
P
p>0,05 p>0,05
Após analisar a concentração dos anticorpos, comparamos o índice de avidez
dos mesmos entre grupo estudo e controle.
67
Verificamos que anticorpos anti- Der p, detectados em amostras do grupo
estudo e grupo controle apresentaram índices de avidez semelhantes, tanto com
relação à S-IgA, e à IgG materna como a IgG do RN (Figura 26-28 e Tabela 10).
Grupo estudo Grupo controle
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
4.5
Avidez S-IgA
Molaridade KSCN
FIGURA 21: A S-IgA de puérperas do grupo estudo (n=13) apresentou índice de avidez
específico ao Der p estatisticamente igual ao do grupo controle (n=23). A barra
horizontal indica o valor médio obtido por cada grupo. p>0,05.
Grupo estudo Grupo controle
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
4.5
Avidez IgG materna
Molaridade KSCN
FIGURA 22: A IgG sérica de puérperas do grupo estudo (n=13) apresentou índice de avidez
específico ao Der p estatisticamente igual ao do grupo controle (n=26). A barra
horizontal indica o valor médio obtido por cada grupo. p>0,05.
68
Grupo estudo Grupo controle
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
4.5
Avidez IgG RN
n=13 n=26
Molaridade KSCN
FIGURA 23: A IgG de recém-nascidos do grupo estudo (n=13) apresentou índice de avidez
específico ao Der p estatisticamente igual ao do grupo controle (n=26). A barra
horizontal indica o valor médio obtido por cada grupo. p>0,05.
T
ABELA
10:
Valores dos índices de avidez da IgA de colostro e IgG de amostras pareadas de
soro materno e cordão umbilical.
Índice de avidez da IgG Índice de avidez da S-IgA
Mãe RN Colostro
RAST+ RAST - RAST+ RAST - RAST+ RAST-
N 13 26 13 26 13 23
Mínimo 1,12 1,14 1,14 1,03 0,82 1,56
%25 2,11 1,96 1,96 1,70 2,12 2,02
Mediana 2,45 2,24 2,37 2,13 2,59 2,45
%75 2,89 3,05 2,72 2,87 2,95 2,94
Máximo 3,55 3,94 3,31 3,99 3,22 3,59
Média 2,46 2,37 2,32 2,26 2,47 2,46
P p=0,37 p=0,43 p=0,49
O índice relativo de avidez foi considerado como a molaridade de KSCN necessária para eluir
50% dos complexos antígeno-anticorpo ligados, utilizando extrato total do Dermatophagoides
pteronyssinus.
69
5 Discussão
70
Sabe-se que em pacientes atópicos ocorre exuberante produção de anticorpos da
classe IgE específicos para antígenos comuns do meio ambiente, mas a maior parte
fixa-se aos receptores de alta afinidade presentes na membrana celular de mastócitos e
basófilos. O nível de IgE no soro reflete a quantidade de IgE disponível nos tecidos,
freqüentemente encontrada nas barreiras naturais do organismo como a pele, a
mucosa gastrintestinal e respiratória (Holgate et al., 2008). Assim, no presente estudo,
determinamos sensibilização alérgica ao ácaro Dermatophagoides pteronyssinus
através da quantificação sérica de IgE anti-Der p, definida como nível maior que 3,5
KU/l (RAST≥3).
Estudo anterior na região de Campinas-SP, com pacientes atópicos atendidos no
ambulatório de Imunologia Clínica e Alergia da UNICAMP, demonstrou alta prevalência
de sensibilidade imediata ao ácaro D. pteronyssinus (65,4%), quando avaliados por
meio do teste de puntura (Oliveira et al., 1996). Por outro lado, Soliman e Rosenstreich
(1986) detectaram, em uma população de 63 adultos com diagnóstico clínico de asma,
positividade ao teste de puntura específico ao De p em 68% dos pacientes, mas
somente 38% apresentaram altos níveis de IgE específica.
A literatura aponta o teste de puntura, ensaio biológico que avalia a sensibilidade a
nível celular, como mais sensível e menos especifico comparado ao RAST, teste que
avalia somente a concentração sérica de IgE específica (Lopes et al., 2006). Como
nosso objetivo foi analisar aspectos quantitativos e funcionais dos anticorpos, optamos
por usar o RAST, pois este além de específico, assegurou a seleção de amostras
positivas para IgE especifica no soro.
Ao analisarmos os níveis séricos de IgE total nesta população, observamos que as
concentrações variaram bastante, sendo detectado altos níveis em algumas mães com
RAST - , assim como níveis normais em mães com RAST +.
Esta observação, de certa forma, já era esperada uma vez que vários estudos
mostram que há considerável sobreposição de valores de IgE sérica entre atópicos e
não atópicos (Bousquet et al., 1982; Hamilton et al., 1996; Kerkhof et al., 2003). Além
disso, não analisamos a reatividade a outros alérgenos comuns (pólen, pelo de gato,
71
barata e outras espécies de ácaro, como Blomia tropicalis) nem realizamos exames
parasitológicos para verificar demais fatores envolvidos na produção total de IgE.
Assim, a simples detecção de altos níveis de IgE sérica não discrimina indivíduos
atópicos e não atópicos, mas segundo a literatura, pode levar a quadros mais intensos
ou graves de atopia e aumentar acentuadamente o risco de sensibilização (Kerkhof et
al., 2003). De acordo com esta observação, verificamos que mães sensibilizadas
(RAST+) apresentaram maior concentração de IgE total quando comparada às não
sensibilizadas (RAST -) e que os níveis de IgE anti-Der p correlacionaram-se
positivamente com a concentração de IgE total.
Enquanto altos níveis de IgE alérgeno-específica diferenciam indivíduos
atópicos, a IgG específica a alérgenos pode ser detectada tanto no soro de indivíduos
atópicos como de não atópicos (Steward et al., 1988; Okahata et al., 1990; Rizzo et al.,
1993; Jenmalm et al., 1997; Michils et al., 1999 ; Jenmalm et al., 2000; Casas et al.,
2001). No presente estudo, verificamos que 100% das mães analisadas apresentaram
níveis séricos detectáveis de IgG específica ao Der p, independente da sensibilização
ao mesmo ácaro.
Outros estudos detectaram IgG alérgeno específica em uma porcentagem menor
de indivíduos: Soliman e Rosenstreich (1986) estudaram 63 adultos com diagnóstico de
asma crônica, e demonstraram que 24% apresentaram altos níveis de IgG específica na
ausência de reatividade aos ácaros (determinada por teste de puntura). Rizzo (1993) ao
estudar a resposta humoral aos ácaros da poeira domiciliar em crianças asmáticas,
detectou IgG específica em 90% dos pacientes asmáticos, mas em apenas 15% dos
pacientes controle, portanto não sensibilizados. Por outro lado, Kemeny (1989),
demonstrou que a maioria dos indivíduos, sendo estes atópicos ou não, após exposição
natural aos ácaros da poeira domiciliar ou pólen, respondem de maneira específica aos
alérgenos através da síntese de anticorpos IgG1. Recentemente, Pereira e
colaboradores (2005) avaliaram pacientes com rinite alérgica e detectaram IgG anti-Bl t
em 100% dos indivíduos, independente da sensibilização ao ácaro, determinada por
teste de puntura. Por fim, Bahrainwala e colaboradores (2005) estudaram 98 puérperas
e detectaram IgG anti-Der p 1 no soro de 86% delas.
72
Uma observação que poderia explicar nosso índice de 100% é a alta exposição a
ácaros da poeira domiciliar pelos moradores da região de Campinas-SP. Avaliação das
espécies acarinas em poeira de cortinas (Binotti et al., 2005) e colchões (Oliveira et al.,
2003) de domicílios da cidade de Campinas, mostra que o ácaro D. pteronyssinus é a
espécie mais observada e geralmente encontrada em grandes concentrações. A
segunda observação pode ser exemplificada com o estudo de Oliveira e colaboradores
(1999) que avaliaram 124 moradores de Campinas com quadro clínico sugestivo de
atopia e encontraram em média 3.254 ácaros de poeira fina na parte inferior dos
colchões, sendo o Der p a principal espécie. Além da freqüente exposição ao ácaro,
outra variável a ser considerada é a metodologia, pois quantificamos IgG específica ao
extrato total do ácaro e não somente ao principal alérgeno.
Ao analisarmos a IgG anti-Der p no soro materno observamos que a concentração
detectada variou mais de 25 vezes, tanto entre mães RAST+ como entre às de RAST-,
ou seja, o nível de IgG específica difere muito de indivíduo para indivíduo, independente
da reatividade ao mesmo ácaro. De maneira semelhante, estudo com o ácaro
Dermatophagoides farinae mostrou que 24% dos pacientes asmáticos apresentavam
altas concentrações na ausência de reatividade ao mesmo ácaro e por outro lado, 27%
apresentavam reatividade alérgica, porém níveis normais de IgG específica (Soliman,
1986). Nosso estudo, por sua vez, demonstrou que mães sensibilizadas ao Der p
(RAST+), além de alta concentração sérica de IgE específica, apresentaram maior
concentração IgG anti-Der p quando comparada às de RAST-.
A literatura aponta que pacientes asmáticos e/ou com rinite alérgica apresentam
níveis elevados de IgG anti-Der p quando comparados a indivíduos não sensibilizados
(Stewart et al., 1988; Okahata et al., 1990; Rizzo et al., 1993; Aydogan, 2007), mas o
papel da IgG nos mecanismos inflamatórios da asma ou rinite alérgica ainda é uma
questão aberta na literatura. De fato, atualmente admitite-se que ocorra o envolvimento
de mecanismos outros, que não mediados pela IgE, que contribuam para a cronificação
da resposta inflamatória alérgica. O fato da IgG fixar complemento e ter grande
potencial pro-inflamatório (Abbas, 2005), assim como os níveis de IFN-γ encontrarem-
se elevados no soro e no fluído brônquio-alveolar em pacientes asmáticos durante a
73
fase aguda da reação alérgica (Busse et al., 2001), nos faz acreditar que a classificação
das inflamações alérgicas como doença mediadas somente por células Th2 é muito
simplista.
Existem evidências que a transmissão passiva de anticorpos específicos tem a
capacidade de influenciar significativamente o desenvolvimento imune da criança e o
risco para sensibilização alérgica (Jarret, 1983). Assim, analisamos a transferência
passiva destes anticorpos ao feto e lactente.
Ao analisarmos a passagem transplacentária de IgG total observamos que a taxa
média de transferência foi de 144% portanto, a concentração no cordão umbilical
superou a do soro materno, chegando a ser mais que o dobro em alguns recém-
nascidos, tanto do grupo estudo como do grupo controle.
Kohler e Farr, já em 1966, mostraram que havia, em média mais anticorpos da
classe IgG no cordão umbilical de recém-nascidos que no soro de suas respectivas
mães. No mesmo ano, Michaux e colaboradores (1966), esclareceram o fato
observando que o transporte de IgG era ativo quando os níveis séricos maternos de
IgG total encontravam-se baixos ou dentro da faixa de normalidade mas, quando esses
níveis eram altos (acima de 15 g/l), a IgG do cordão tendia a ser mais baixos que os
níveis maternos correspondentes (Moraes-Pinto et al., 2001). No presente estudo,
somente uma mãe apresentou nível de IgG total sérica um pouco acima de 15 g/l (15,4
g/l) mas, diferente da maioria, a IgG de seu respectivo recém-nascido não excedeu este
valor e apresentou exatamente a mesma concentração do soro materno.
Investigamos a seguir a passagem transplacentária de anticorpos IgG específicos
ao Der p. Verificamos que 100% das puérperas transferiram durante a gestação IgG
anti-Der p aos seus respectivos recém-nascidos, em concentrações fortemente
relacionadas aos próprios níveis séricos. Assim, demonstramos que a passagem
transplacentária de IgG anti-Der p ocorre em maior concentração em mães
sensibilizadas ao mesmo ácaro (RAST+) quando comparadas às não sensibilizadas
(RAST-).
74
IgG específica a outros alérgenos, como OVA, rBet v 1, Fel d 1 e Der f 1 já foi
detectada em níveis mais elevados no cordão umbilical de recém-nascidos de mães
atópicas (Thomas et al., 2003; Prescott et al., 2000; Jenmalm et al., 1997), apesar de
também ser encontrada em RNs de mães não atópicas freqüentemente expostas a tais
alérgenos (Mariani et al., 1992, Jenmalm et al., 1997). Baseado nos estudos da região
de campinas (Oliveira et al.1999; Oliveira et al., 2000; Binotti et al., 2005) sabemos que
provavelmente todas as mães estudadas foram expostas ao ácaro Dermatophagoides
pteronyssinus durante a gestação, sugerindo que a maior concentração de IgG
específica nos recém-nascidos de mães RAST+ não foi atribuída à maior exposição ao
antígeno.
Os estudos relacionando a presença do Der p 1 na mãe e no cordão umbilical
são muito controversos (Jenmalm et al., 2000; Marks et al., 2002; Hagendorens et al.,
2004; Schönberger et al., 2005) indicando que a mera presença deste alérgeno na
circulação materna não garante sua transmissão ao recém-nascido existindo assim,
outros mecanismos que influenciam o transporte. No entanto, a literatura mostra que há
forte correlação entre a concentração sérica de IgG materna específica e a presença de
alérgenos no recém-nascido (Bahrainwala et al., 2005) e, paradoxalmente, a exposição
materna a alérgenos parece inibir potencialmente o desenvolvimento da alergia no
respectivo filho (Jenmalm et al., 2000; Victor et al., 2003).
Camundongos têm sido usados para identificar os mecanismos de regulação da
IgE nos primeiros anos de vida e os resultados mostram que, tanto os antígenos como
a IgG materna específica, possuem grande efeito supressor da IgE do filhote, sendo
capaz de inibir a hipersensibilidade tipo 1 (Jarrett et al., 1983; Seenger et al., 1998;
Melkild et al., 2002; Victor et al., 2003).
Embora este mecanismo ainda não esteja bem estabelecido, Jarrett e
colaboradores (1983) foram os primeiros a chamar a atenção sobre a possibilidade de
que a IgG materna pudesse ser responsável pela supressão da produção de IgE pelo
RN. O efeito protetor deste mecanismo deve estar relacionado aos próprios anticorpos
ou à imunecomplexos, comumente encontrados no cordão umbilical (Hall et al., 1987).
A ligação da IgG ao alérgeno esconde seus determinantes antigênicos e permite sua
75
eliminação através da fagocitose por macrófagos, já os imunecomplexos, facilitam a
ligação cruzada do antígeno e da IgG materna ao BCR e FcγRIIb nos linfócitos B
neonatais responsável pela inibição da síntese de anticorpos (Boyle et al., 2006).
Estes mesmos mecanismos podem ocorrer nos RN humanos, uma vez que
Dannaeus e colaboradores (1978)
demonstraram que altos níveis de IgG específica
para proteínas do leite e ovo no cordão umbilical parecem proteger contra o
desenvolvimento de atopia nos primeiros 2 anos de vida. No entanto, Jenmalm e
Björkstén (2000), observaram que altos níveis de IgG específica somente a aero-
alérgenos (pêlo de gato e pólen), mas não aos alérgenos do leite e ovo, estavam
associados a um menor índice de desenvolvimento de atopia nos primeiros 8 anos de
vida.
Uma limitação de nosso estudo foi que não investigamos as subclasses dos
anticorpos. Muitos pesquisadores atribuem o papel protetor da IgG à subclasse IgG4,
que seria produzida em resposta a exposição antigênica prolongada e capaz de
neutralizar o antígeno ou bloquear o anticorpo (Gondo et al., 1987; Aalberse et al.,
1993; Mori et al., 2001), enquanto que a IgG1, seria conseqüência da exposição natural
e reflexo da resposta imune normal ao alérgeno (Almeida et al., 2006).
Há indicações de que a concentração de IgG4 encontra-se mais elevada em
indivíduos com alergia respiratória quando comparadas aos não alérgicos, enquanto
que os níveis de IgG1 parecem ser similares (Steward et al., 1988; Okahata et al., 1990;
Rizzo et al., 1993; Jenmalm & Bjorkstén, 2000; Casas et al., 2001). No entanto, em
relação ao ácaro Bl t, Pereira e colaboradores (2005) relataram que a concentração de
IgG1 específica foi maior nos indivíduos sensibilizados. Prescott (2000), ao estudar o
nível de anticorpos no cordão umbilical, observou concentrações mais elevadas de
IgG4 específica ao ácaro da poeira domiciliar nos recém-nascidos de mães com história
de atopia e verificou correlação positiva entre o nível de IgE materno.
Tais diferenças no padrão de anticorpos produzidos em resposta à exposição
antigênica poderiam ajudar a explicar a observação de que a taxa média de
transferência da IgG anti-Der p foi um pouco abaixo do encontrado para IgG total
76
(103%) e por essa razão, o nível de anticorpos específicos dos recém-nascidos foi bem
semelhante ao nível materno, sem diferença significativa entre ambos. A concentração
final de anticorpo na circulação neonatal para cada especificidade antigênica depende,
além dos níveis maternos, da classe à qual pertencem. No entanto, estudos sobre a
eficiência das IgGs em atravessarem a placenta ainda mostram resultados
controversos, provavelmente por utilizarem diferentes metodologias e limitações éticas
óbvias nos experimentos. Ensaio de perfusão in vitro da placenta indicou que a
habilidade das IgGs em transpor a interface materno-fetal é maior para
IgG4>IgG1>IgG3>IgG2 (Malek et al., 1995) mas outros autores acreditam que a IgG1 e
a IgG3 possuem maior eficiência, seguidas da IgG4 e IgG2 (Moraes-Pinto, 2001).
Outros estudos indicam que os níveis de IgG1 no recém-nascido, logo após ao
nascimento, geralmente excedem os maternos, os da IgG2 geralmente são mais
baixos, os da IgG3 são tipicamente iguais aos níveis maternos e os da IgG4 são mais
variáveis, porém geralmente se igualam aos maternos. (Simister et al., 1997 e Simister,
2003).
Baseado nas literaturas aqui descritas, mas sem levar em consideração a
predisposição genética, podemos supor que a sensibilização materna ao
Dermatophagoides pteronyssinus protege a criança contra o desenvolvimento de
doenças alérgicas, por transmitir através da placenta altas concentrações de IgG total e
específica ao mesmo ácaro, com potencial para suprimir a ação da IgE nos primeiros
anos de vida.
Sabemos que durante o primeiro ano de vida há intensa interação entre mãe e RN
durante a amamentação. Nesta fase, o sistema imune do recém-nascido não está
completamente desenvolvido e, conseqüentemente, a suscetibilidade às infecções
virais e bacterianas é maior. É também neste mesmo período, que a sensibilização aos
alérgenos ambientais ocorre mais comumente (Böttcher et al., 2000).
Ao investigarmos os níveis de S-IgA total e específica no colostro de mães
sensibilizadas não encontramos diferença significativa quando comparadas às não
sensibilizadas. Semelhante ao presente estudo, Duchén e colaboradores (2000)
detectaram S-IgA específica a alérgenos do gato em amostras de leite, mesmo de mães
77
que não eram expostas ao animal, sem haver diferença de concentração entre mães
alérgicas e não alérgicas. No entanto, grande parte dos estudos relaciona os níveis de
S-IgA de colostro com a predisposição do lactente em desenvolver alergia alimentar, e
não do estado de atopia materno.
A relação entre amamentação e alergia ainda é pouco conhecida. Muitos
pesquisadores investigam se o leite materno pode conferir proteção ao lactente contra
doenças alérgicas, mas os estudos epidemiológicos mostram resultados bastante
controversos (Järvinen et al., 2000; Odijk et al., 2003; Friedman et al., 2005). Em
relação à alergia alimentar, há indicações que quanto menor a concentração de IgA
específica no colostro, maior é a exposição da mucosa intestinal do recém-nascido ao
potencial alérgico e conseqüentemente, maior o risco das alergias como eczema
atópico (Calbi et al., 1998; Järvinen et al., 2000). Por sua vez, baixos níveis de S-IgA
total no colostro também aumentam a suscetibilidade da mucosa intestinal do recém-
nascido às infecções (Cunningham et al., 1991; Achi et al., 1992). Com base na
hipótese de que o aumento da incidência de alergias respiratórias é causado pela
diminuição nas infecções durante a infância (Renz et al., 2006), baixa concentração de
S-IgA no colostro poderia ser benéfica para prevenção da atopia no recém-nascido,
pois permitiria maior estímulo antigênico na mucosa intestinal e, conseqüentemente,
auxilia na inversão da polarização Th2, característica de todo recém-nascido, para Th1.
Nossos resultados mostraram que a concentração de S-IgA, tanto total como
específica anti-Der p, variou muito entre as mães, independente da sensibilização ao
ácaro. Além da S-IgA outros fatores imunológicos responsáveis pela imunoproteção
conferida pelo leite materno também variam bastante de mãe para mãe, como por
exemplo o TGF-β (Järvinen et al., 2000). Análises demonstraram que esta citocina do
colostro é essencial para induzir tolerância à alérgenos no lactente mediada por células
regulatórias (Verhasselt et al., 2008), além de estar envolvida na regulação negativa da
síntese de IgE e na produção de IgA (Böttcher et al., 2000). Assim, a concentração de
S-IgA anti-Der p no colostro pode ser influenciada pela produção de TGF-β que,
conseqüentemente, interfere na atopia materna e na tolerância do lactente.
Devemos também pensar que se a S-IgA exerce algum mecanismo de regulação
da alergia é de se esperar que este seja antígeno-específico como ocorre com os
78
patógenos. Uma hipótese é que a S-IgA poderia reduzir a quantidade de alérgenos
antes do contato com o lactente através da formação de imune-complexos no leite
materno e posterior fagocitose por macrófagos também presentes no leite humano
(Järvinen et al., 2000).
Fusaro e colaboradores (2007) demonstraram que camundongos imunizados com
OVA e expostos ao antígeno durante a gestação e amamentação, apresentaram 4
vezes menos OVA no leite em relação aos não imunizados, além de inibir a resposta
IgE específica da prole após exposição pós-natal ao antígeno. Okamoto (1989) também
observou que altas doses de OVA impedem a detecção de peptídeos no leite, no
entanto, sem produção de anticorpos IgA anti-OVA.
Recentemente, Valérie e colaboradores (2008) demonstraram em camundongos,
que alérgeno inalado pela mãe é transferido através da amamentação e resulta em
proteção contra inflamação das vias aéreas da prole, comprovada pela diminuição da
eosinofilia, muco, citocinas padrão Th2 e hiperreatividade brônquica. Demonstraram
também que a proteção pode ser conferida independente dos anticorpos, pois
camundongos amamentados por mães com ausência de imunoglobulina, continuaram
tolerantes ao alérgeno.
Nosso estudo mostrou pela primeira vez que em humanos, mães fornecem
passivamente aos seus filhos S-IgA específica ao Dermatophagoides pteronyssinus. Os
achados acima relatados e o fato de não encontramos diferença nos níveis de S-IgA
específica entre mães RAST+ e RAST-, nos leva a acreditar que se a S-IgA anti-Der p
tem o potencial de influenciar a imunossupressão da alergia no recém-nascido, este é
independente da sensibilização materna ao mesmo ácaro.
Sendo constatada a passagem transplacentária de IgG anti-Der p e a presença
de IgA anti-Der p no colostro tanto de mães atópicas como de mães normais, seria
importante verificar se a capacidade funcional dos anticorpos se comporta de maneira
semelhante entre os dois grupos e se pode influenciar na taxa de transferências dos
anticorpos. Optamos pelo método baseado no ELISA utilizando tiocianato de potássio,
pois é considerado um bom método para avaliar a avidez relativa de IgE específica à
79
epítopos de proteínas alergênicas em extrato de Dermatophagoides pteronyssinus
(Poirier et al., 1997).
O índice de avidez relativa é medida como o equilíbrio constante entre um
antígeno e o anticorpo dependendo da afinidade e da valência entre os ligantes
(Steward et al., 1985). A relevância da avidez nas doenças alérgicas é pouco conhecida
e não há trabalhos que descrevam a avidez específica à alérgenos em anticorpos
presentes no colostro e no cordão umbilical.
Sabe-se que a exposição prolongada a antígenos desencadeia mudanças
funcionais e estruturais nas imunoglobulinas através da hipermutação somática,
levando a maturação na afinidade do anticorpo, e do “switch” de classe, que promove
mudanças funcionais específicas após encontro secundário com o antígeno (Abbas,
2005). O que também se verifica, é que alta exposição antigênica ambiental pode
induzir uma grande produção de anticorpos com menor avidez comparativamente a
populações menos expostas (Hanson et al., 1990), de forma que uma alta produção de
anticorpos possa compensar a baixa avidez (Hanson et al., 1988; Nagao et al., 1995).
Já foi demonstrado, em adolescentes de 18 anos, que há aparente relação inversa
entre a concentração e a afinidade dos anticorpos em se ligarem aos alérgenos
(Pierson-Mullany et al., 2002). Assim, na presença de estímulo antigênico constante,
como ocorre com o Dermatophagoides pteronyssinus, a resposta se direciona para a
combinação mais eficiente entre concentração e afinidade operando por feed-back
negativo entre os dois (Jachola et al., 2005).
De acordo com essas observações, verificamos que a concentração sérica da IgG
anti-Der p mostrou ser inversamente relacionada com seu índice de avidez específica
(Pearson r=-0,2, p=0,03) assim, os índices relativos de avidez tenderam a ser mais
baixos em puérperas com alta concentração de IgG anti-Der p. Detectamos, por sua
vez, índices de avidez bastante similares entre as amostras pareadas indicando que
grande parte dos recém-nascidos aqui avaliados receberam através da placenta
anticorpos IgG anti-Der p com a mesma a atividade funcional específica de sua
respectiva mãe.
80
El-Khouly e colaboradores (2007), também utilizando a técnica de tiocianato de
potássio, estudaram a relação da avidez na alergia alimentar e concluíram que
aparentemente, a avidez da IgE e IgG específicas ao extrato de amendoim não
influencia na severidade da doença, nem nos resultados de teste de puntura. Já em
relação à afinidade dos anticorpos específicos ao alérgeno de grama Amb 1, Jachola e
colaboradores (2002), demonstraram que o grupo de não atópicos apresentaram IgG1
com afinidade significativamente mais elevada quando comparada aos indivíduos
atópicos que, por sua vez, apresentaram alta afinidade da IgE.
Em relação à IgG total, no presente trabalho, a avidez específica do grupo estudo
foi muito semelhante a observada no grupo controle, assim como não observamos
correlação entre avidez específica e concentração sérica de IgE, tanto total como anti-
Der p. Sabemos que o método de eluição com tiocianato tem a vantagem de ser um
método simples, que fornece uma medida geral e real do índice de avidez específica,
mas uma população pequena de anticorpos com alta avidez pode ser mascarada,
dificultando a análise.
Como a avidez dos anticorpos afeta a passagem transplacentária ainda não está
claro. Estudos mostraram que os anticorpos específicos para os antígenos da
Escherichia coli transferidos no início da gestação, portanto em concentrações mais
baixas, apresentam maior afinidade quando comparados aos do final da gestação
(Avanzini et al., 1998; Sennhauser et al., 1990). Este transporte preferencial de
anticorpos de alta afinidade em RN pré-termo seria importante para aumentar a
capacidade de proteção em relação à baixa concentração dos anticorpos.
Nossos resultados sugerem que não deve existir mecanismo de seleção de
anticorpos IgG em relação à avidez específica ao Der p. Acreditamos que uma vez que
a avidez é determinada pelo fragmento Fab, e a passagem transplacentária pelo
fragmento Fc, a seleção está relacionada com o número de receptores FcRN na
vilosidade fetal bem como à sua afinidade pelas diferentes subclasses.
Alguns autores também sugerem que exista correlação entre a avidez dos
anticorpos e sua capacidade opsonizante (Sennhauser et al., 1990; Lucas et al., 1995;
Obaro et al., 2004). O fato de demonstrarmos que a S-IgA apresenta maior índice de
81
avidez ao Der p quando comparada a IgG materna e do cordão umbilical é interessante,
pois o alto índice de avidez a torna eficaz para neutralizar e impedir a fixação e entrada
do alérgeno através da barreira mucosa. Visto que a S-IgA também exerce papel de
neutralizar enzimas (Hanson et al., 1994), sua presença na mucosa pode ser
importante para evitar que o Der p 1 clive os componentes das junções compactas
entre as células epiteliais (Wan et al., 1999). Não há estudos mostrando a relação da
avidez S-IgA anti-Der p com desenvolvimento de alergia e não se sabe a exata
afinidade necessária para neutralizar e eliminar patógenos e toxinas. No entanto,
comparações com anticorpos monoméricos (Ma et al., 1998) e anticorpos neutralizantes
de outras classes (Macpherson et al., 2008), mostram que a pIgA realiza tal função com
maior eficiência; provavelmente pela presença da cadeia J que fornece a IgA maior
avidez aos antígenos (Brandtzaeg et al., 1984).
Com base nessas observações acreditamos que a amamentação é importante,
pois além de todos os fatores nutricionais e imunológicos já conhecidos (Hanson et al.,
1988), fornece S-IgA com potencial para neutralizar de maneira específica o Der p e
impedir sua entrada através da mucosa, tanto em lactentes de mães sensibilizadas
como de mães não sensibilizadas.
Nossos resultados demonstraram que anticorpos IgG e S-IgA específicos ao
Dermatophagoides pteronyssinus são transferidos passivamente para o feto durante a
gestação e recém-nascido durante a amamentação, sem haver seleção quanto à avidez
destes anticorpos. No entanto, a passagem transplacentária de IgG total e específica foi
maior em mães sensibilizadas ao mesmo ácaro quando comparadas às não
sensibilizadas, indicando que a sensibilização materna pode influenciar a resposta
imune fetal. Uma vez que a transferência de anticorpos maternos representa um
importante mecanismo para imunomodulação das respostas alérgicas, e que esta tem o
potencial de ser modulada por intervenções neonatais, acreditamos que a
caracterização na transferência passiva de anticorpos alérgeno-específicos ao recém-
nascido contribua com os avanços na elaboração de estratégias adequadas e
específicas de prevenção da sensibilização alérgica durante o desenvolvimento fetal e
primeiros anos de vida.
82
6 Conclusão
83
• Anticorpos IgG e S-IgA anti-Der são transferidos via placenta e colostro materno,
respectivamente, em concentrações bastante variáveis entre os indivíduos.
• A concentração de IgG anti-Der p transferida ao recém-nascido apresenta
importante correlação com os níveis maternos.
• A IgG dos recém nascidos apresenta índice de avidez específico ao Der p
semelhante ao de suas respectivas mães.
• Recém-nascidos de mães sensibilizadas ao Der p apresentam maior
concentrações de IgG total e específica anti-Der p no cordão umbilical, quando
comparados aos de não sensibilizadas.
• Não há diferença nos níveis de S-IgA anti-Der p no colostro entre mães
sensibilizadas e não sensibilizadas ao mesmo ácaro.
• A sensibilização ao Der p não interfere na avidez dos anticorpos IgG e S-IgA
específica ao Dermatophagoides pteronyssinus.
84
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Anexo A – Nível e índice de avidez dos anticorpos, totais e específicos, determinados nas 74 amostras selecionadas.
IgE anti-Der p
(mãe)
IgE total (UI/ml) IgG Total (mg/dl)
IgG- anti Der p
(UA/ml)
S-IgA de colostro Índice de Avidez
(molaridade de KSCN)
Mãe Idade
RAST
(escala)
RAST
(KU/L)
Mãe RN Mãe RN Mãe RN total
(mg/l)
anti-Der
p (UA/ml)
IgG mãe IgG RN S-IgA
1
28 5 52,4 804,4 <1 860 1050 1266 989 28,2 305 1,927 1,822 2,593
2
23
5
92,4
3910
8,31
1280
1730
220
292
35,5
484
2,907
2,781
2,848
3
40 4 25 237,7 <1 725 1150 3321 3704 19,9 621 2,446 2,142 3,219
4
30 3 11,5 51,4 <1 698 1500 130 220 6 163 2,877 2,517 2,515
5
16 4 20,7 1487,3 <1 1050 1140 247 250 264,5 2289 2,422 2,371 3,053
6
26
5
99,5
422,9
<1
809
1390
1000
1188
18,4
1098
2,318
2,104
1,766
7
24
3
12,2
296,1
<1
776
1220
2620
3498
2,8
66
1,123
1,136
3,085
8
32 4 46,3 264 <1 887 1130 1839 1686 30,8 299 3,547 3,068 0,825
9
29 3 3,64 78,8 <1 1540 1540 2999 2791 78 483 2,298 2,314 1,96
10
20
3
3,78
243,7
1,39
903
1170
215
234
46,9
818
2,796
2,572
2,627
11
30 5 71,2 998,8 1,03 891 871 368 271 12 222 2,655 2,668 2,832
12
22 3 16,2 194,5 <1 884 1300 800 1457 9,3 181 1,538 1,324 2,274
13
39 3 9,4 25,1 <1 1040 983 1503 1121 24 1841 3,180 3,316 2,483
14
29
0
< 0,35
80,7
<1
860
1030
78
67
21
173
2,298
2,314
2,944
15
34 0 < 0,35 74,6 <1 746 896 487 414 33,7 600 2,137 1,449 2,948
16
18 0 < 0,35 16,7 <1 982 1170 692 435 88 3161 2,204 2,365 2,025
17
19 0 < 0,35 63,1 <1 923 1070 1451 1204 3,7 179 2,218 2,117 2,307
18
34
0
< 0,35
13
<1
754
1190
224
226
9,5
258
1,790
1,842
2,321
19
21
0
< 0,35
41,5
<1
797
1070
150
150
1
0
46
3,128
3,055
3,593
20
17 0 < 0,35 12,2 <1 684 1020 234 331 11 370 3,115 2,856 2,594
21
29 0 < 0,35 9,8 <1 736 1270 645 733 16 209 2,513 2,040 2,393
22
30
0
< 0,35
1,5
<1
489
920
752
973
185
2761
3,759
2,910
2,352
23
17 0 < 0,35 7,8 <1 384 1450 1090 1193 3,3 119 2,300 2,093 3,107
24
23 0 < 0,35 11,4 <1 1140 1390 111 84 5,6 254 1,879 1,673 1,753
25
28 0 < 0,35 36,6 <1 1150 1050 1698 1776 49,7 2969 3,042 3,454 1,903
26
20
0
< 0,35
46,4
<1
912
1100
525
508
na
na
2,012
1,545
na
27
31 0 < 0,35 24 <1 846 1060 1397 1094 69,8 1992 2,340 2,394 1,558
28
17 0 < 0,35 85,1 <1 797 876 69 91 67 429 1,525 1,401 1,859
98
IgE anti-Der p
(mãe)
IgE total (UI/ml) IgG Total (mg/dl)
IgG- anti Der p
(UA/ml)
S-IgA de colostro Índice de Avidez
(molaridade de KSCN)
Mãe Idade
RAST
(escala)
RAST
(KU/L)
Mãe RN Mãe RN Mãe RN total
(mg/l)
anti-Der
p (UA/ml)
IgG mãe IgG RN S-IgA
29
21 0 < 0,35 5 <1 831 855 1849 1535 4,5 21,5 1,350 1,032 2,449
30
23
0
< 0,35
1,5
<1
1040
665
2078
1893
14,4
224
2,009
1,742
2,76
5
31
15
0
< 0,35
129,5
<1
991
911
262
167
11
248
2,255
1,721
2,982
32
33 0 < 0,35 27,8 <1 896 1110 390 347 21,9 309 2,547 3,923 2,676
33
28 0 < 0,35 4,8 <1 822 1330 779 1205 na na 1,687 1,716 na
34
29
0
< 0,35
5
<1
710
939
575
419
62
843
3,104
3,000
1,
746
35
23
0
< 0,35
12,4
<1
837
1010
756
548
11,8
1310
1,990
2,139
2,141
36
23 0 < 0,35 1,5 <1 778 986 199 203 na na 1,145 1,128 na
37
37 0 < 0,35 8 <1 808 917 1561 1071 12,4 446 2,221 2,178 2,667
38
20 0 < 0,35 13,8 <1 1050 984 217 137 3 38 3,067 2,788 3,05
39
37
0
< 0,35
48,5
<1
813
974
519
654
34
1105
3,944
3,991
2,479
40
21 0 < 0,35 2249,5 na 894 1400 333 360 48,5 1160 3,122 3,078 3,032
41
19 0 < 0,35 254,8 na 783 1220 524 605 50,9 1904 2,637 2,385 2,67
42
25
0
< 0,35
452,4
na
969
1420
340
306
70
,7
2668
2,531
2,513
3,981
43
25
0
< 0,35
317,9
na
667
1320
310
475
39
663
1,516
1,504
2,413
44
27 0 < 0,35 165,4 na 619 1430 196 359 7,2 123 1,775 1,614 2,357
45
19 0 < 0,35 219,9 na 653 1220 169 219 120,1 1272 1,924 1,55 2,468
46
24
0
< 0,35
229,6
na
621
1310
851
1148
20,6
1926
1,896
1,679
2,783
47
17
0
< 0,35
132,9
na
857
1390
1901
1980
5,2
266
2,829
2,871
2,028
48
28 0 < 0,35 1554,8 na 974 1280 196 185 13,2 594 1,953 1,958 2,052
49
25 0 < 0,35 387,2 na 676 1010 268 309 8,3 552 2,042 1,958 2,978
50
35 0 < 0,35 266,5 na 749 1060 241 203 13,3 305 2,146 2,054 3,114
51
22
0
< 0,35
243,9
na
671
1370
314
464
7,7
135
2,534
2,602
1,867
52
31 0 < 0,35 256,3 na 1010 1620 678 664 14,6 1114 2,945 2,200 1,585
53
22 0 < 0,35 160,3 na 867 1500 252 258 5 204 1,619 1,664 3,38
54
35
0
< 0,35
478,7
na
661
1170
397
487
5,4
233
1,466
1,314
3,089
55
18
0
< 0,35
199,1
na
1090
1190
1162
876
7,5
575
2,803
3,125
2,178
56
30 0 < 0,35 669 na 809 1440 1711 2183 17,3 474 2,429 2,340 3,565
57
23 0 < 0,35 168,3 na 845 1040 134 113 0,6 46 4,159 3,977 3,632
58
35
0
< 0,35
527,7
na
1040
1500
1311
1408
39
1065
1,278
1,354
3,805
IgE anti-Der p
(mãe)
IgE total (UI/ml) IgG Total (mg/dl)
IgG- anti Der p
(UA/ml)
S-IgA de colostro Índice de Avidez
(molaridade de KSCN)
Mãe Idade
RAST
(escala)
RAST
(KU/L)
Mãe RN Mãe RN Mãe RN total
(mg/l)
anti-Der
p (UA/ml)
IgG mãe IgG RN S-IgA
59
25 2 0,71 16 na 907 1150 387 409 34,8 366 1,732 1,749 2,548
60
20
2
0,72
21,1
na
605
1310
368
495
57,7
3284
1,944
1,838
2,
29
61
29
2
0,78
227,7
na
853
1120
1365
1025
147,6
5666
2,191
1,972
1,878
62
22 2 2,35 1349,4 na 1020 1790 375 461 12,8 920 1,839 1,969 3,266
63
29 2 1,43 234 na 754 1120 179 1090 127,4 749 1,993 2,977 3,339
64
17
2
1,58
1870,6
na
700
1130
208
309
35,4
1279
2,218
1,932
4,651
65
31
0
< 0,35
127,6
na
914
1380
304
265
10,3
122
2,051
1,759
3,957
66
34 0 < 0,35 34,9 na 983 1300 456 325 44,9 1229 2,084 2,071 3,847
67
33 0 < 0,35 62 na 914 1160 595 555 6,25 88 1,923 2,197 2,532
68
21 0 < 0,35 15 na 890 1260 1038 958 4,2 112 1,966 1,883 2,698
69
38
0
< 0,35
2,2
na
820
1100
504
628
21,3
3496
1,632
1,663
3,403
70
22 0 < 0,35 51,8 na 848 1120 432 301 39 1378 2,605 2,386 2,067
71
35 0 < 0,35 25,8 na 664 1090 239 264 28,7 743 2,542 3,019 2,734
72
31
0
< 0,35
1
,5
na
778
1180
1707
1668
110,5
9925
2,525
2,161
1,96
73
34
0
< 0,35
29,1
na
724
870
3623
3923
123
3450
0,745
1,32
3,098
74
38 0 < 0,35 25,2 na 1000 1160 6968 6456 5,2 503 1,089 1,217 2,83
(RN) = soro de cordão umbilical; (mãe) = soro de sangue periférico; (na): não avaliada
amostras de 1-13 = grupo estudo
amostras de 14-39 = grupo controle
99
Anexo B: Dados da gestação, do parto, do recém nascido e histórico alérgico da família (mãe, pai e irmão (s))
Alergia dos pais Dados do irmão (se houver)
Alergia na
gestação
Dados do recém-nascido
mãe
Gesta Mãe Pai Alergia
Gestação
Sexo Trimestre
Idade
gestacional
Tipo
de
parto
Apgar
(1-5min)
Sexo
Peso
(kg)
Comprimento
(cm)
1
II gesta (2p) rinite rinite não 1º, 2º e 3º termo N 9.10 F 3,08 48
2
I gesta (1p) rinite não termo C 9.10 M 3,66 51
3
II gesta (2p) rinite não não termo C 9.10 F 3,24 47,3
4
I gesta (1p)
rinite e
dermatite
rinite termo C 6.10 F 3,76 50,5
5
I gesta (1p) não não termo N 10.10 F 3,00 47,8
6
III gesta (
3
p)
rinite
não
n
ão
3º
termo
C
10.10
M
3,15
47,7
7
I gesta (1p)
rinite
rinite
3º
termo
C
9.10
M
2,32
45
8
I gesta (1p) rinite rinite termo C 9.10 F 3,51 50
9
II gesta (2p) rinite rinite não termo C 9.10 M 3,24 49
10
I gesta (1p)
não
não
termo
C
10.10
M
3,58
50,5
11
III gesta (3p) rinite dermatite
rinite e
dermatite
1ª e 2ª F e F 3° termo C 9.10 F 2,75 47
12
I gesta (1p) não não termo N 9.10 F 2,93 47,5
13
I gesta (1p)
rinite
não
1 º
termo
C
9.10
M
4,22
51,5
14
I gesta (1p)
não
não
termo
N
8.10
F
2
,
9
49,5
15
III gesta (3p) não não rinite 1ª F termo C 8.10 M 3,48 50,5
16
I gesta (1p) não não termo C 9.10 M 3,88 50,5
17
II gesta (
2
p)
não
não
não
termo
C
9.10
F
2,6
46
18
VI gesta (3p) não não
asma e
rinite
1ª e 2ª M e M termo C 8.10 F 4,32 52,5
19
I gesta (1p) não rinite termo C 8.9 M 3,56 51
20
I gesta (1p)
não
não
termo
C
9.10
M
3,42
52,8
21
I gesta (1p)
não
não
termo
C
8.9
F
4,17
51,5
22
I gesta (1p) não
rinite e
alimentar
termo C 10.10 F 3,47 50,5
100
Alergia dos pais Dados do irmão (se houver)
Alergia na
gestação
Dados do recém-nascido
Mãe
Gesta Mãe Pai Alergia
Gestação
Sexo Trimestre
Idade
gestacional
Tipo
de
parto
Apgar
(1-5min)
Sexo
Peso
(kg)
Comprimento
(cm)
23
II gesta (1p)
não
não
não
termo
C
9.10
F
3,56
50,5
24
IV gesta (
4
p)
não
não
asma
1ª
M
termo
C
9.10
M
3,9
0
50,5
25
I gesta (1p) não não termo C 9.10 F 4,56 51,0
26
II gesrta (1p) não não não termo N 9.10 F 2,77 46,5
27
III gesta (
3
p)
não
não
não
termo
C
9.10
F
3,7
0
50,3
28
II ge
sta (
2
p)
não
não
termo
N
9.10
F
3,48
49
,0
29
I gesta (1p) não não termo C n.i M n.i n.i
30
I gesta (1p) não não termo C 9.10 F 3,38 48,5
31
I gesta (1p) não n.i termo N 10.10 F 2,62 44,5
32
IV gesta (
4
p)
não
não
rinite
2ª
F
termo
C
9.1
0
M
3,49
47
,0
33
I gesta (1p) não não termo C 9.10 M 2,89 47,0
34
I gesta (1p) não n.i não termo C 9.10 F 3,25 49,0
35
III gesta (
3
p)
não
não
não
termo
N
9.10
M
3,7
51,5
36
II gesta (
2
p)
não
não
não
termo
C
9.10
M
3,37
49
,0
37
III gesta (3p) não rinite rinite 1ª M termo C 3.10 F 2,51 46,0
38
II gesta (2p) não não não termo N n.i M 3,4 n.i
39
VI gesta (6p)
não
não
não
termo
N
9.10
M
3,19
47,5
40
II gesta (
2
p)
não
não
não
termo
N
9.10
F
2
,
58
445
41
II gesta (2p) não não não termo N 8.10 F 3,19 50,5
42
II gesta (2p) rinite n.i não 3º termo N 8.10 F 2,97 41,1
43
II gesta (2p) não não não termo C 9.10 M 3,11 49,4
44
IV gesta (
4
p)
não
não
não
termo
C
9.10
F
2,98
47,5
45
I gesta (1p) outros não termo N 8.10 M 3,2 50,0
46
I gesta (1p) dermatite não termo C 5.8 F 3,7 49,0
47
I gesta (1p)
rinite
n.i
1º
termo
N
8.9
M
2,8
46
,0
48
IV gesta (
4
p)
não
n.i
dertatite
1 ª
M
C
9.10
M
2,9
47
,0
49
VI gesta (4p) não não não termo C 9.10 M 4,05 51,0
50
II gesta (2p) não não não termo C 9.10 M 3,68 49,0
51
III gesta (
3
p)
não
não
rinite
1ª
F
termo
C
8.10
M
3,21
48
,0
101
Alergia dos pais Dados do irmão (se houver)
Alergia na
gestação
Dados do recém-nascido
Mãe
Gesta Mãe Pai Alergia
Gestação
Sexo Trimestre
Idade
gestacional
Tipo
de
parto
Apgar
(1-5min)
Sexo
Peso
(kg)
Comprimento
(cm)
52
III gesta (2p) rinite n.i não 2º termo N 9.10 M 3,31 50
53
IV gesta (4p) não não asma 2ª M termo N n.i M 2,57 45,5
54
IV gesta (4p)
não
não
não
termo
C
9.10
F
3,06
49
,0
55
I gesta (1p)
não
não
termo
N
8.10
M
3,8
0
51,5
56
II gesta (2p)
rinite e
asma
rinite não 1º, 2º e 3º termo N 9.10 F 2,49 46,0
57
I gesta (1p)
rinite
rinite
termo
C
8.10
F
3,34
48
,0
58
VII gesta (7p)
não
não
termo
N
10.10
M
2
,44
44,5
59
III gesta (3p) rinite rinite rinite 1ª M 3º termo C 9.10 F 2,84 49,0
60
I gesta (1p) rinite não 1º termo C 9.10 F 4,36 52,0
61
II gesta (2p)
dermati
te
rinite rinite 1ª M termo C 9.10 F 4,19 51,5
62
IV gesta (4p) não não termo N n.i F n.i n.i
63
IV gesta (4p) não não termo N 9,1 M 3,57 49,7
64
I gesta (1p)
não
n.i
termo
C
9.10
M
3,12
48
,0
65
II gesta (2p)
rinite
não
alimentar
1ª
F
1º, 2º e 3º
termo
N
8.10
M
3
,
60
48.7
66
III gesta (2p)
dermati
te
não 1º termo C 9.10 M 3,20 49,5
67
III gesta (3p)
rinite
não
asma
2ª
F
2º
termo
N
9.10
F
3,74
53
,0
68
I gesta (1p)
rinite
não
termo
N
9.10
F
4,5
0
52
,0
69
II gesta (2p) rinite não outros 1ª M 1º e 3º termo C 9.10 M 3,50 50,0
70
II gesta (2p) asma asma asma 1ª M 3º termo C 9.10 F 3,27 49,5
71
I gesta (1p)
rinite e
asma
não termo C 10.10 F 3,50 n.i
72
I gesta (1p) rinite não 1 º, 2 º e 3 º termo N 9.10 M 3,25 48,3
73
II gesta (2p) não não
termo C 9.10 M 3,10 49,5
74
IIII gesta (4p) não não rinite 2ª M
termo C 9.10 F 3,63 49,5
Dados obtidos através de questionário respondido pela própria voluntária 48hrs após o parto. (n.i) = não informado
Gesta: número de gestações; p= número de parto.
102
Anexo C: Dados do quarto que a mãe dormiu durante a gestação, região da moradia e classe social.
Mãe Piso Cortina Travesseiro Colchão Idade colchão Ambiente Região Classe Social
1
frio ausente com capa* com capa* > 5 anos arejado com sol urbana C
2
tapete presente sem capa* espuma 1-4 anos arejado com sol urbana nc
3
f
rio
ausente
com capa*
espuma
> 5 anos
arejado com sol
urbana
A2
4
frio
ausente
com capa*
com capa*
> 5 anos
arejado com sol
urbana
nc
5
frio presente sem capa* espuma 1-4 anos arejado com sol urbana D
6
frio ausente sem capa* espuma 1-4 anos arejado sem sol urbana nc
7
frio
ausente
sem capa*
com capa*
1
-
4 anos
arejado com sol
urbana
D
8
frio
ausente
com capa*
espuma
< 1 ano
arejado com sol
urbana
B2
9
frio ausente sem capa* espuma < 1 ano arejado com sol urbana C
10
frio ausente sem capa* com capa* > 5 anos arejado com sol urbana B2
11
frio
presente
sem capa*
espuma
< 1 ano
arejado com sol
urbana
B2
12
frio
ausente
sem capa*
com capa*
< 1 ano
arejado com sol
urbana
B2
13
frio ausente com capa* com capa* < 1 ano arejado com sol urbana B1
14
frio ausente sem capa* espuma > 5 anos arejado com sol urbana nc
15
frio
ausente
com capa*
espuma
< 1 ano
arejado com sol
urbana
B1
16
frio
ausente
sem capa*
espuma
< 1 ano
arejado com sol
urbana
nc
17
frio presente com capa* espuma 1-4 anos arejado com sol urbana nc
18
frio ausente sem capa* espuma 1-4 anos úmido urbana nc
19
frio
presente
com capa*
com capa*
1
-
4 anos
arejado com sol
urbana
C
20
frio
ausente
sem capa*
espuma
< 1 ano
arejado com sol
urbana
nc
21
frio presente sem capa* espuma < 1 ano arejado com sol urbana nc
22
frio presente com capa* com capa* > 5 anos arejado sem sol urbana nc
23
frio
presente
sem capa*
espuma
> 5 anos
arejado com sol
rural
B2
24
frio
ausente
com capa*
com capa*
1
-
4 anos
arejado com sol
urbana
D
25
frio ausente sem capa* espuma 1-4 anos arejado com sol urbana A2
26
frio ausente sem capa* espuma 1-4 anos arejado com sol urbana nc
27
frio
ausente
sem capa*
espuma
1
-
4 anos
arejado com sol
urbana
nc
28
frio
ausente
sem capa*
com capa*
> 5 anos
arejado sem sol
urbana
nc
29
frio ausente com capa* com capa* < 1 ano arejado sem sol urbana B2
30
frio presente sem capa* espuma 1-4 anos arejado com sol urbana C
31
frio
presente
sem capa*
espuma
1
-
4 anos
úmido
urbana
D
103
Piso Cortina Travesseiro Colchão Idade colchão Ambiente Região Classe Social
32
frio
ausente
com capa*
com capa*
> 5 anos
arejado com sol
urbana
D
33
frio
presente
sem capa*
espuma
1
-
4 anos
arejado com sol
urbana
C
34
frio presente sem capa* espuma 1-4 anos arejado com sol urbana B2
35
frio presente sem capa* espuma 1-4 anos arejado com sol urbana D
36
frio
ausente
sem capa*
espuma
> 5 anos
arejado com sol
urbana
C
37
frio
ausente
sem capa*
com capa*
1
-
4 anos
arejado com sol
urbana
A2
38
frio presente sem capa* espuma 1-4 anos úmido urbana D
39
frio ausente sem capa* espuma > 5 anos arejado com sol urbana C
40
frio
presente
sem capa*
espuma
< 1 ano
arejado com sol
urbana
nc
41
tapete
ausente
sem capa*
espuma
1
-
4 anos
úmido
urbana
nc
42
carpete presente sem capa* espuma > 5 anos úmido rural D
43
frio ausente sem capa* espuma 1-4 anos arejado com sol urbana nc
44
frio
ausente
sem capa*
espuma
< 1 ano
arejado com sol
urbana
nc
45
frio
ausente
sem capa*
espuma
> 5 anos
arejado com sol
urbana
nc
46
frio ausente sem capa* espuma < 1 ano urbana nc
47
frio presente sem capa* com capa* < 1 ano arejado sem sol urbana D
48
frio
ausente
sem capa*
espuma
> 5 anos
úmido
urbana
D
49
frio
ausente
sem capa*
com capa*
1
-
4 anos
arejado com sol
urbana
D
50
frio ausente com capa* com capa* > 5 anos arejado com sol urbana nc
51
frio presente sem capa* espuma 1-4 anos arejado com sol urbana nc
52
frio
presente
sem capa*
espuma
> 5 anos
arejado com sol
urbana
nc
53
tapete
presente
sem capa*
espuma
> 5 anos
arejado com sol
urbana
nc
54
frio ausente sem capa* com capa* 1-4 anos arejado com sol urbana C
55
frio ausente sem capa* espuma < 1 ano arejado com sol urbana nc
56
frio
presente
com capa*
com capa*
rural
C
57
frio
presente
sem capa*
com capa*
1
-
4 anos
arejado com sol
urbana
C
58
frio presente com capa* com capa* > 5 anos arejado com sol urbana C
59
frio ausente com capa* com capa* > 5 anos arejado com sol urbana nc
60
frio
presente
sem capa*
espuma
< 1 ano
arejado com sol
urbana
nc
61
frio
presente
sem capa*
espuma
> 5 anos
arejado com sol
urba
na
B2
62
frio ausente sem capa* espuma < 1 ano arejado sem sol urbana D
63
frio ausente sem capa* espuma < 1 ano arejado com sol urbana C
64
frio
presente
sem capa*
espuma
1
-
4 anos
úmido
urbana
D
104
Mãe Piso Cortina Travesseiro Colchão Idade colchão Ambiente Região Classe Social
65
frio
ausente
sem capa*
espuma
< 1 ano
arejado com sol
urbana
66
frio
presente
sem capa*
espuma
> 5 anos
arejado com sol
urbana
nc
67
frio ausente sem capa* espuma > 5 anos arejado com sol urbana D
68
frio presente sem capa* espuma > 5 anos arejado com sol urbana nc
69
frio
ausente
sem capa*
espuma
1
-
4 anos
arejado com sol
urbana
A2
70
frio
ausente
sem capa*
espuma
> 5 anos
arejado com sol
urbana
C
71
frio ausente sem capa* espuma > 5 anos arejado com sol urbana B1
72
frio ausente sem capa* espuma 1-4 anos arejado com sol urbana A2
73
frio
presente
com capa*
com capa*
< 1 ano
arejado sem sol
urbana
C
74
frio
ausente
com capa*
espuma
1
-
4 anos
arejado sem sol
urbana
Dados obtidos através de questionário respondido pela própria voluntária 48hrs após o parto. (nc): não consta. Classe social
determinada por renda média familiar: classe A = R$ 6.620,00; classe B= R$ 2.236,00; classe C= R$ 927,00; classe D= R$ 424,00 e classe
E= R$207,00. www.abep.org/codigosguias/Criterio_Brasil_2008
103
105
Anexo D: Questionário aplicado
I- Identificação da mãe Leito ______ identificação
Nome:___________________________________________________________________
Data de nascimento:_____/_____/_____ Idade:______ anos
Telefone: ( )
II- Gestações anteriores:
Número de gestações: _____
Número de ordem da criança: _____
III- Quadro alérgico da mãe:
Já fez diagnóstico médico ou apresentou algum
tipo de alergia?
Sim não
Qual?
Respiratória Alimentar Ocular
Dermatite atópica Medicamentosa;
Outros
Se for respiratória, especificar:
Asma
- Tosse principalmente na metade da noite e de
manhã?
- Sente aperto no peito (“peito preso”)?
- Tem falta de ar (respiração incompleta)?
- Apresenta chiado no peito?
Rinite alérgica
- Tem vários espirros em sucessão, especialmente
pela manhã?
- Seu nariz escorre e fica obstruído?
- Ocorrem irritação e coceira no nariz, nos olhos e
no céu da boca?
- Seu olfato fica prejudicado?
-Tem dores de cabeça juntamente com outros
sintomas destes já mencionados?
Houve ocorrência de processo alérgico durante a
gestação?
Sim Não
Qual trimestre?
1° 2° 3°
Se a resposta for positiva, identificar:
Respiratória Alimentar Ocular
Dermatite atópica Medicamentosa;
Outros
Se for respiratória, especificar:
Asma Rinite alérgica
IV: Dados do recém nascido
Parto: cesárea normal fórceps
Tempo gest.: termo pré-termo pós-termo
Peso: _____ Comprimento______ Apgar 1-5____
Ficou na UTI? Sim Não
Sexo: Feminino Masculino
V- Quadro alérgico da família:
O pai da criança Já fez diagnóstico médico ou
apresentou algum tipo de alergia?
Sim Não Não sabe
Se a resposta for positiva, identificar:
Respiratória Alimentar Ocular
Dermatite atópica Medicamentosa;
Outros
Se for respiratória, especificar:
Asma Rinite alérgica
Algum irmão da criança Já fez diagnóstico
médico ou apresentou algum tipo de alergia?
sim não não sabe
Qual gestação e sexo?
1ª gestação 2ª gestação 3ª gestação
4ª gestação
Se a resposta for positiva, identificar:
Respiratória Alimentar
Ocular
Dermatite atópica Medicamentosa;
Outros
Se for respiratória, especificar:
Asma Rinite alérgica
VI- Características do quarto:
Tipo de piso
Carpete Piso frio Tapetes
Cortinas
não tem lava uma vez a cada 2 meses
demora mais de 2 meses para lavar
Tipo de travesseiro
espuma com capa adequada não sabe
Tipo de colchão:
Espuma ou mola Com capa adequada
Idade do Colchão:
menos de 1 ano 1 a 4 anos mais de 5 anos
Ambiente
arejado com sol arejado sem sol úmido
Região em que mora área rural área urbana
106
VII- Condição Sócio Econômica
Grau de instrução:
ignorada analfabeta
ensino fundamental: _____ ano
ensino médio : _____ ano
ensino superior: incompleto completo Curso ______________________
Convênio médico: sim não particular
Meio de transporte:
ônibus carro próprio outro
Rendimento familiar:
Renda mensal ________ reais
Nº moradores _______Menores 12 anos: ______
VIII- Classificação por bens:
Posse de bens 0 1 2 3 4 ou mais
TV a cores
Rádio
Banheiro
Automóvel
Empregada
Aspirador
Máquina de lavar
Videocassete
Geladeira
Freezer
Moradia:
própria
alugada________reais
financiada ______reais
agregada
cedida
Tipo de casa:
alvenaria madeira barraco (papelão,tábua...) outros
Número de cômodos:
total
quarto sala cozinha sanitário
Infra-estrutura básica:
Esgoto água encanada energia elétrica coleta de lixo asfalto
107
Anexo E: Termo de consentimento livre e esclarecido
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
Você está sendo convidado a participar de uma pesquisa. Sua participação é importante, porém, você não deve
participar contra a sua vontade. Leia atentamente as informações abaixo e faça qualquer pergunta que desejar,
para que todos os procedimentos desta pesquisa sejam esclarecidos. Responsável: Patrícia Macchiaverni
O abaixo-assinado (nome completo) _______________________________________________________________,
RG nº ___________________, nascido em (data) ____/____/_____, (cidade) ______________________________
(estado)__________, residente na Rua _________________________________________________, n°_______,
Cidade ________________________, Estado_______ declara que é de livre e espontânea vontade que está
participando como voluntário do projeto de pesquisa supracitado, de responsabilidade do médico Dr Antônio
Condino Neto, do Departamento de Imunologia do instituto de ciências biomédicas - USP. O abaixo-assinado está
ciente que:
NATUREZA E PROPÓSITO DO ESTUDO
Este projeto visa o estudo relação materno-fetal e resposta anticórpica ao Dermatophagoides pteronyssinus
considerando mães atópicas e mães normais. Serão quantificados os anticorpos da classe IgG no sangue de
cordão, IgA no colostro e IgG e IgE no sangue periférico de mães atópicas sensibilizadas ao ácaro
Dermatophagoides pteronyssinus e em mães normais. Além disso, serão analisados os padrões de reatividade dos
anticorpos da classe IgG e IgA ao antígeno Der p 1. Serão colhidos aproximadamente 5ml de colostro por ordenha
manual e 10ml de sangue por pulsão venosa, além de 10ml do sangue presente no cordão umbilical, colhido logo
após o nascimento.
A participação neste estudo, não tem objetivo de submetê-lo a um tratamento terapêutico. Conseqüentemente,
não se espera que a participação no estudo traga qualquer benefício em função do mesmo. Esse estudo não
remunerará os voluntários.
PARTICIPAÇÃO VOLUNTÁRIA
Sua participação é voluntária e você tem a liberdade de desistir ou interromper a participação neste estudo no
momento que desejar. Neste caso, você deve informar imediatamente sua decisão ao pesquisador ou a um
membro de sua equipe, sem necessidade de qualquer explicação e sem que isto venha interferir no seu
atendimento médico nesta instituição. Os registros que possam identificar sua identidade serão mantidos em
sigilo e não identificará o voluntário por ocasião da publicação dos resultados obtidos. Caso surja alguma
intercorrência, poderá contatar a Secretaria do Comitê de Ética da USP apresentar recursos ou reclamações em
relação ao estudo.
Se você concorda com o exposto acima, leia e assine o documento abaixo:
Eu declaro que li cuidadosamente todo este documento denominado Termo de Consentimento Livre e Esclarecido
e que, após, tive nova oportunidade de fazer perguntas sobre o conteúdo do mesmo o também sobre o Estudo e
recebi explicações que responderam por completo minhas dúvidas e reafirmo estar livre e espontaneamente
decidindo participar do Estudo. Ao assinar este Termo de Consentimento eu também estou certificando que toda
a informação que eu prestei, incluindo minha história médica, é verdadeira e correta até onde é de meu
conhecimento, e declaro estar recebendo uma cópia assinada deste documento. Ao assinar este Termo de
Consentimento estou autorizando o acesso às minhas informações, conforme explicitado anteriormente.
Data: _____/_____/200___.
____________________________________________
Voluntária ou responsável legal (se menor de 21 anos)
___________________________________________
Testemunha
108
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