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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL
E
SCOLA DE ENGENHARIA
D
EPARTAMENTO DE ENGENHARIA QUÍMICA
P
ROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ENGENHARIA QUÍMICA
Concentração, Purificação e Fracionamento
das Proteínas do Soro Lácteo através da
Tecnologia de Separação por Membranas
DISSERTAÇÃO DE MESTRADO
Camila Baldasso
Porto Alegre
2008
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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL
E
SCOLA DE ENGENHARIA
D
EPARTAMENTO DE ENGENHARIA QUÍMICA
P
ROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ENGENHARIA QUÍMICA
Concentração, Purificação e Fracionamento
das Proteínas do Soro Lácteo através da
Tecnologia de Separação por Membranas
Camila Baldasso
Dissertação de Mestrado apresentada como
requisito parcial para obtenção do título de
Mestre em Engenharia
Área de concentração: Fenômenos de Transporte
e Operações Unitárias
Orientadora: Profª Dra. Isabel Cristina Tessaro
Porto Alegre
2008
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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL
E
SCOLA DE ENGENHARIA
D
EPARTAMENTO DE ENGENHARIA QUÍMICA
P
ROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ENGENHARIA QUÍMICA
A Comissão Examinadora, abaixo assinada, aprova a Dissertação
Concentração, Purificação e Fracionamento das Proteínas do Soro Lácteo através
da Tecnologia de Separação por Membranas , elaborada por Camila Baldasso como
requisito parcial para obtenção do Grau de Mestre em Engenharia.
Comissão Examinadora:
Profª. Dra. Lígia Damasceno Ferreira Marczak
Prof. Dr. João Henrique Corrêa Kanan
Prof. Dr. Plinho Francisco Hertz
iv
Agradecimentos
À Professora Isabel Cristina Tessaro, pelo apoio, atenção, orientação,
confiança, paciência, compreensão e acima de tudo amizade desenvolvida
durante estes dois anos de mestrado.
Ao Programa de Pós Graduação em Engenharia Química pela
oportunidade.
À Capes pela oportunidade e apoio financeiro.
À Elegê Alimentos pela doação do soro em pó para execução do trabalho.
Aos Professores: Lígia Damasceno Ferreira Marczak (Departamento de
Engenharia Química), João Henrique Corrêa Kanan (ICBS), Plinho Francisco
Hertz (ICTA), e aos laboratórios de Biotecnologia (BIOTEC) por
compartilharem seus conhecimentos e experiências científicas.
Aos funcionários e professores do Departamento de Engenharia Química,
especialmente à Sirley e ao Fernando, pela paciência, cooperação e agilidade
nos momentos necessários.
À bolsista Tatiana de Castro Barros pela colaboração, disponibilidade e
amizade.
Aos colegas pelo apoio e amizade.
E finalmente, agradeço aos pilares de minha vida: a Deus, à minha família
e em especial, ao meu amor Carlos Eduardo, sem os quais a realização deste
trabalho não seria possível.
v
Resumo
O soro lácteo é produzido pela indústria de laticínios durante a fabricação de queijos e
caseína. Como matéria-prima pode conferir à tecnologia alimentar novas potencialidades
devido às propriedades funcionais e nutricionais das suas proteínas. Porém, muitas
indústrias ainda consideram o soro como um efluente, o qual quando não devidamente
tratado gera um sério problema ambiental por causa da sua elevada carga orgânica. Estes
fatores tornam importante o desenvolvimento de alternativas para um adequado
aproveitamento do soro, porque ao mesmo tempo em que a transformação do soro em
produtos diversos diminui o problema ambiental, proporciona ganhos às indústrias de
laticínios, através do desenvolvimento de novos produtos. A tecnologia de separação por
membranas, especialmente a ultrafiltração (UF), vem sendo empregada pelas indústrias
de laticínios para obter concentrados protéicos a partir do soro, pois este processo permite
a concentração seletiva das proteínas em relação aos outros componentes de natureza não
protéica. Além disto, devido às propriedades específicas de cada proteína do soro, tem
havido um crescente interesse no fracionamento destas proteínas, porque muitas vezes
estas características não são realçadas nos concentrados protéicos devido a interações
com outros componentes. A UF e a microfiltração (MF) vêm sendo testadas para se obter
frações distintas das proteínas do soro. Dentro deste contexto, utilizando processos de
separação por membranas, os objetivos deste trabalho são: (i) concentrar e purificar as
proteínas do soro, (ii) a partir do concentrado protéico obtido em (i) obter duas frações,
uma rica em β-lactoglobulina e a outra em α- lactoalbumina (as proteínas mais
abundantes no soro). A etapa de concentração (i) foi realizada utilizando membranas de
UF com massa molar de corte de 10 kDa, o sistema foi operado no modo batelada
associado a diafiltração (DF), permitindo, desta forma, uma maior remoção de sais e
lactose, conduzindo simultaneamente a uma maior concentração de proteínas no retido.
As condições de operação mantidas constantes foram: temperatura de 50 °C, pressão
transmembrana de 2 bar e vazão de alimentação de 840 L.h
-1
. Foram testadas quatro
estratégias variando o fator de concentração volumétrico (FC); o volume e o número de
DF que deveriam ser realizadas para obtenção do concentrado protéico mais puro. Na
etapa de fracionamento (ii) o concentrado protéico obtido em (i) foi tratado por diferentes
processos de separação com membranas a fim de fracionar as proteínas majoritárias.
Nesta etapa membranas de UF e MF foram testadas: HN06 (20 kDa), RZ04 (70 kDa),
VCWP (0,1 µm), MF-7002 (0,1 µm), UF-C50 (50 kDa) e UF-C20 (20 kDa). Para realizar
a separação foram consideradas características como: massa molar e pH da solução de
alimentação. A eficiência de cada processo foi avaliada pela determinação da
concentração de proteína, lactose, sólidos totais, pH e condutividade elétrica das
correntes de permeado e de retido. Os resultados obtidos em (i) indicaram que o
processo é adequado para obtenção de concentrados protéicos com diferentes graus de
pureza, podendo chegar a uma pureza protéica de 70 % em base seca. Em (ii) os
resultados indicam que algum tipo de agregação e desnaturação pode ocorrer com as
proteínas nas condições em que os experimentos foram realizados, pois as tentativas de
fracionamento não apresentaram resultados satisfatórios. Entre as membranas utilizadas
as que apresentaram os resultados mais promissores foram a MF-7002 e a VCWP, com
um fracionamento parcial das proteínas majoritárias presentes no soro.
vi
Abstract
Whey is the liquid byproduct produced by the dairy industry during the
manufacture of cheeses and casein. As a raw material it can provide in the food
technology new potentialities due to the functional and nutritional properties of its
proteins. However, many industries still consider the whey as waste material, which if not
properly disposed creates a very severe environmental problem due to its high organic
load. These factors led to the development of important alternatives to the right utilization
of the whey, therefore solving the pollution problem and providing economical
advantages to the dairy industries. Membrane technology, especially ultrafiltration (UF),
has been used in the dairy industries to produce whey protein concentrates, because this
process allows the selective concentration of the proteins in relation to the other
components. Moreover, due to the specific properties of each whey protein, the interest in
fractionating these proteins has been increased, since their properties could not be
enhanced in the protein concentrates due to the interactions between the different
components. The UF and microfiltration (MF) have being tested to simultaneously
fractionate, purify and concentrate the whey thus improving its utilization. In this
context, by using membrane separation process, the objectives of this work are: (i) to
concentrate and to purify the whey proteins, (ii) from the protein concentrate obtained in
(i) to fractionate the main whey proteins, the β-lactoglobulin and the α-lactoalbumin. The
concentration step (i) was performed with UF membranes with a molecular weight cut-
off of 10 kDa, the system was operated in batch mode associate with discontinuous
diafiltration (DF), in order to remove salts and lactose simultaneously, leading to a whey
protein concentrate above 50% protein (dry basis). The experiments were carried out
with the following operating conditions: temperature of 50 °C, transmembrane pressure
of 2 bar and cross flow rate of 840 L.h
-1
. Four strategies have been tested by changing the
volumetric concentration factor (FC) and the volume and the number of DF. In the
fractionation stage (ii) the protein concentrate obtained in (i) was processed with different
UF and MF membranes in order to separate the two main proteins present in the whey.
The following UF and MF membranes have been tested: HN06 (20 kDa), RZ04 (70 kDa),
VCWP (0,1 µm), MF-7002 (0,1 µm), UF-C50 (50 kDa) and UF-C20 (20 kDa). To
achieve the separation, characteristics such as molecular weight of the proteins and pH of
the solution had been considered. The efficiency of each process was evaluated by
determining the concentration of proteins and lactose, total solids contend, the pH and the
electrical conductivity for both streams, the permeate and the concentrate. The results
have shown that the UF process is adequate for production of protein concentrates with
different degrees of purity; in the best experimental strategy, the protein concentrate
obtained had 70 % protein, dry basis. In the protein fractionating stage the results indicate
that some kind of aggregation and denaturation is occurring with the proteins in the
operating conditions tested in this work, therefore the fractionation process did not show
satisfactory results until now. Amongst the membranes used the results showed that the
most promising were the MF-7002 and VCWP membranes, with a partial separation.
vii
Sumário
Resumo ............................................................................................................... v
Abstract .............................................................................................................. vi
Sumário ............................................................................................................. vii
Introdução ........................................................................................................... 1
Fundamentos Teóricos e Revisão Bibliográfica .............................................. 4
2.1 Soro Lácteo .............................................................................................................. 4
2.2 Produção do Soro .................................................................................................... 6
2.3 Principais Componentes do Soro Lácteo ................................................................. 8
2.3.1 Lactose ............................................................................................................ 9
2.3.2 Sais minerais e vitaminas ............................................................................... 9
2.3.3 Proteínas ....................................................................................................... 10
2.4 Propriedades das Proteínas do Soro ...................................................................... 16
2.4.1 Propriedades Nutricionais............................................................................. 16
2.4.2 Propriedades Funcionais ............................................................................... 18
2.5 Produtos Derivados do Soro de Queijo ................................................................. 19
2.5.1 Soro em pó .................................................................................................... 20
2.5.2 Produtos Protéicos do Soro (Concentrados e Isolados Protéicos) ................ 23
2.5.2.1 Processos de Recuperação das Proteínas do Soro ............................... 25
2.5.3 Frações Purificadas das Proteínas Majoritárias do Soro .............................. 26
2.5.3.1 Processos de Fracionamento das Proteínas Majoritárias do Soro ....... 28
2.6 Aproveitamento do Soro – Situação Mundial ....................................................... 29
2.7 Processos de separação por membranas ................................................................ 31
2.7.1 Membranas ................................................................................................... 31
2.7.2 Microfiltração (MF) ...................................................................................... 33
2.7.3 Ultrafiltração (UF) ........................................................................................ 34
2.7.4 Módulos ........................................................................................................ 35
2.7.4.1 Módulo Placa e Quadro ....................................................................... 35
2.7.4.2 Módulo Fibra-oca ................................................................................ 35
2.7.4.3 Módulo Espiral .................................................................................... 36
2.7.4.4 Módulo Tubular ................................................................................... 36
2.8 Princípios dos PSM ............................................................................................... 37
2.8.1 Fluxo Permeado ............................................................................................ 37
2.8.2 Seletividade .................................................................................................. 38
2.8.3 Fator de Concentração .................................................................................. 39
2.9 Problemas que afetam os PSM .............................................................................. 39
2.10 Aplicação dos PSM na Indústria Alimentícia ..................................................... 42
2.10.1 Aplicação dos PSM na Indústria de Laticínios ........................................... 46
Materiais e Métodos ......................................................................................... 56
3.1 Preparação do soro................................................................................................. 56
3.2 Reagentes Analíticos ............................................................................................. 57
3.3 Membranas ............................................................................................................ 59
3.4 Equipamento .......................................................................................................... 61
viii
3.5 Metodologia Experimental .................................................................................... 63
3.5.1 Compactação das Membranas e Medidas de Fluxo de Água ...................... 63
3.5.2 Concentração e Purificação das Proteínas do Soro ...................................... 64
3.5.3 Fracionamento das proteínas do soro ........................................................... 67
3.6 Métodos Analíticos ............................................................................................... 70
3.6.1 Análise de Extrato Seco Total - Método Gravimétrico ............................... 70
3.6.2 Análise de pH ............................................................................................... 70
3.6.3 Análise de Condutividade Elétrica ............................................................... 70
3.6.4 Análise de Lactose - Método do Ácido Dinitrossalicílico - DNS ................ 71
3.6.5 Análise de Açúcar - Método Fenol Sulfúrico .............................................. 71
3.6.6 Determinação da Proteína Total - Método de Lowry .................................. 71
3.6.7 Análise de Proteína - Eletroforese SDS – PAGE ......................................... 72
3.6.8 Cromatografia gel ........................................................................................ 73
3.7 Limpeza do Sistema de Membranas ..................................................................... 74
Resultados e Discussão .................................................................................. 76
4.1 Concentração e Purificação das proteínas ............................................................. 76
4.1.1 Seleção da membrana .................................................................................. 76
4.1.2 Fluxos permeados para a água e para o soro ................................................ 78
4.1.3 Comparação das estratégias para concentração e purificação protéica ....... 80
4.1.4 Resultados para a melhor estratégia de purificação protéica ....................... 83
4.2 Fracionamento das Proteínas Majoritárias ............................................................ 89
4.2.1 Membranas HN06, RZ04 e VCWP ............................................................. 90
4.2.2 Membrana MF - 7002 .................................................................................. 94
4.2.3 Membrana UF - C50 .................................................................................... 99
4.2.4 Membrana UF – C20 ................................................................................. 104
4.2.5 Comentários gerais sobre o fracionamento das proteínas .......................... 107
4.3 Limpeza das membranas ..................................................................................... 111
Conclusões e Sugestões para trabalhos futuros ........................................ 115
Referências Bibliográficas ............................................................................ 121
Apêndice A ...................................................................................................... 131
A.1.1 Análise de Extrato Seco Total - método gravimétrico .............................. 131
A.1.2 Análise de Lactose - Método do ácido dinitrossalicílico - DNS ............... 132
A.1.3 Análise de açúcar - Método fenol sulfúrico .............................................. 133
A.1.4 Determinação da proteína total - Método de Lowry ................................. 133
A.1.5 Análise de proteína - Eletroforese SDS – PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate –
Polyacrylamide Gel Electrophoresis of Proteins) ............................................... 134
A.1.6 Análise de Proteína – Cromatografia Gel ................................................. 135
Apêndice B ...................................................................................................... 137
B.1 Concentração e Purificação de Proteínas - tabelas ............................................. 137
B.2 Fracionamento das Proteínas – tabelas ............................................................... 146
B.3 Limpeza das membranas - tabelas ...................................................................... 163
Lista de figuras .................................................................................................. ix
Lista de tabelas ................................................................................................. xii
Lista de Abreviaturas e Símbolos .................................................................. xvi
ix
Lista de figuras
Figura 2.1: Fluxograma simplificado da produção de queijo. ............................................. 7
Figura 2.2: Variação da conformação da β–Lg em função do pH . ................................... 12
Figura 2.3:Fluxograma do processamento do soro de queijo em pó.. ............................... 21
Figura 2.4: Representação esquemática do modo de operação tangencial . ...................... 37
Figura 3.1: Fotografias das membranas: espiral (A), tubular(B) e plana (C). ................... 60
Figura 3.2: Representação esquemática simplificada da unidade piloto de UF. ............... 61
Figura 3.3:Fotografias dos tanques de alimentação (A) e (B). .......................................... 62
Figura 3.4: Fotografias das carcaças para módulos de membrana. ................................... 62
Figura 3.5: Representação esquemática do processo de UF. ............................................. 65
Figura 3.6: Representação esquemática do processo de DF. ............................................. 66
Figura3.7: Resumo esquemático das estratégias utilizadas para concentração e purificação
das proteínas do soro. .......................................................................................... 67
Figura 3.8: Representação esquemática do processo de fracionamento desejado. ............ 67
Figura 3.9: Representação esquemática das estratégias utilizadas para fracionamento das
proteínas do concentrado protéico obtido do soro. ................................................ 70
Figura 4.1: Fluxo de água vs pressão transmembrana, para as membranas UF-6001, UF-
6002 e UF-7001, a 30 °C e vazão de alimentação média de 700 L.h
-1
. ................ 77
Figura 4.2: Retenção de dextrana vs pressão transmembrana, para as membranas UF-
6001, UF-6002 e UF-7002, a 30 °C e vazão de alimentação média de 700 L.h
-1
.
............................................................................................................................... 78
Figura 4.3: Fluxo de água e de soro vs pressão transmembrana para a membrana UF-
6001, T=50 °C, vazão de alimentação média de 840 L.h
-1
. .................................. 79
Figura 4.4: Percentual protéico no concentrado (base seca) vs etapas do processo para os
experimentos 1, 2, 3 e 4, membrana UF-6001, T=50 °C, ΔP=2 bar, vazão de
alimentação média de 840 L.h
-1
. ............................................................................ 80
Figura 4.5: Percentual de lactose no concentrado (base seca) vs etapas do processo para
os Experimentos 1, 2, 3 e 4, membrana UF-6001, T=50 °C, ΔP=2 bar, vazão de
alimentação média de 840 L.h
-1
. ............................................................................ 81
Figura 4.6: Percentual de sais no concentrado (base seca) vs etapas do processo para
experimento 1, 2, 3 e 4, para a membrana UF-6001, T=50 °C, ΔP=2 bar, vazão de
alimentação média de 840 L.h
-1
. ............................................................................ 82
Figura 4.7: Fluxo permeado vs fator de concentração volumétrico para Experimento 4 na
etapa de UF, membrana UF-6001, T=50 °C, P=2 bar, vazão de alimentação média
de 840 L.h
-1
. ........................................................................................................... 83
Figura 4.8: Fluxo permeado vs tempo para o Experimento 4, para a membrana UF-6001,
T=50 °C, P=2 bar, vazão de alimentação média de 840 L.h
-1
. .............................. 84
Figura 4.9: Concentração de sólidos totais das amostras de permeado e concentrado vs
tempo para o Experimento 4, membrana UF-6001, T=50 °C, P=2 bar, vazão de
alimentação média de 840 L.h
-1
. ............................................................................ 85
Figura 4.10: Concentração de proteína das amostras de permeado e concentrado vs tempo
para o Experimento 4, membrana UF-6001, T=50 °C, P=2 bar, vazão de
alimentação média de 840 L.h
-1
. ............................................................................ 86
Figura 4.11: Concentração de lactose para as amostras de permeado e concentrado vs
tempo para o Experimento 4, membrana UF-6001, T=50°C, P=2 bar, vazão de
alimentação média de 840L.h
-1
. ............................................................................. 87
Figura 4.12: pH para as amostras de permeado e concentrado vs tempo para Experimento
4, membrana UF-6001, T=50 °C, P=2 bar, vazão de alimentação média de 840
L.h
-1
. ...................................................................................................................... 88
x
Figura 4.13: Condutividade elétrica das amostras de permeado e concentrado vs tempo
para Experimento 4, membrana UF-6001, T=50 °C, P=2 bar, vazão de
alimentação média de 840 L.h
-1
. .......................................................................... 88
Figura 4.14: Retenção de proteína, lactose e sólidos totais em função do tempo para o
Experimento 4, membrana UF-6001, T=50 °C, P=2 bar, vazão de alimentação
média de 840 L.h
-1
. ............................................................................................... 89
Figura 4.15: Fluxo permeado em função do tempo para os experimentos de compactação
das membranas VCWP, HN06 e RZ04, vazão de alimentação 620 L.h
-1
, ΔP =
3,25 bar, T = 25 °C. ............................................................................................. 91
Figura 4.16: Fluxo permeado de água (esquerda) e de fluxo permeado de concentrado
protéico (direita) em função da pressão transmembrana para as membranas
VCWP, HN06 e RZ04, vazão de alimentação 620 L.h
-1
, T = 40 °C e pH = 4,6
(VCWP e RZ04) e T = 25 °C e pH = 6,3 (HN06). ............................................... 91
Figura 4.17: Fotografia dos géis de eletroforese SDS-PAGE (poliacrilamida 15 %) para
as amostras de concentrado e permeado da membrana HN06, RZ04, VCWP (100
V e 30 mA).. .......................................................................................................... 93
Figura 4.18: Compactação da membrana MF-7002, vazão de alimentação 700 L.h
-1
, ΔP =
3,25 bar, T = 25 °C. ............................................................................................. 95
Figura 4.19: Fluxo de água e de concentrado protéico em função da pressão
transmembrana para a membrana MF-7002, vazão 700 L.h
-1
, T = 40 °C, pH = 4,6
(concentrado). ....................................................................................................... 95
Figura 4.20: Fluxo permeado de concentrado protéico em função do tempo para a
membrana MF-7002 , vazão de alimentação 700 L.h
-1
, T = 40 °C, pH = 4,6 e P =
1,75 bar. ................................................................................................................ 96
Figura 4.21: Fotografia dos géis de eletroforese SDS-PAGE (poliacrilamida 15 %) para
as amostras de concentrado e permeado da membrana MF-7002 (100 V e 30
mA)....................... ................................................................................................ 97
Figura 4.22: Fluxo permeado de água versus tempo do experimento de compactação da
membrana UF-C50; vazão de alimentação 400 L.h
-1
, ΔP = 3,75 bar, T = 25 °C. 99
Figura 4.23: Fluxos permeados de água (esquerda) e de concentrado protéico (direita) em
dois pHs (4,6; 6,3) em função da pressão transmembrana para a membrana UF-
C50, vazão de alimentação 400 L.h
-1
, T = 40 e 25 °C (concentrado). ................ 100
Figura 4.24: Fluxo permeado de concentrado protéico em pHs e temperaturas diferentes
em função do tempo para a membrana UF-C50, vazão de alimentação 400 L.h
-1
e
ΔP =, 2,25 bar. .................................................................................................... 101
Figura 4.25: Fotografias dos géis de eletroforese SDS-PAGE (poliacrilamida 15 %) para
as amostras de concentrado e permeado obtidos nos experimentos com a
membrana UF-C50 (100 V e 30 mA).. ............................................................... 103
Figura 4.26: Compactação da membrana UF-C20, vazão de alimentação 620 L.h
-1
, ΔP =
3,75 bar, T = 25 °C. ........................................................................................... 104
Figura 4.27: Fluxo permeado de água (esquerda) e de concentrado protéico e de soro
(direita) em função da pressão transmembrana para a membrana UF-C20, vazão
de alimentação 620 L.h
-1
, T = 25 °C, pH = 6,3. .................................................. 105
Figura 4.28:Fluxo permeado de soro diluído e de concentrado protéico em função do
tempo para a membrana UF-C20; condições de operação: vazão de alimentação =
620 L.h
-1
, T = 25 °C, pH = 6,3 e ΔP = 2,25 bar. ................................................. 105
Figura 4.29:Fotografias dos géis de eletroforese SDS-PAGE (poliacrilamida 15 %) para
as amostras de concentrado e permeado da membrana UF-C20 (100 V e 30
mA)................... .................................................................................................. 107
xi
Figura 4.30: Cromatografia gel em coluna de 10 x 300 mm empacotada com a resina
Superose
TM
12, equilibrada com tampão fosfato de sódio 10 mM, pH 7,0; vazão
de eluição = 0,5 mL.min
-1
; amostras monitoradas pela absorbância a 280 nm. .. 108
Figura 4.31: Cromatografia gel em coluna de 10 x 300 mm empacotada com a resina
Superose
TM
12, equilibrada com tampão acetato de sódio 10 mM, pH 4,6; vazão
de eluição = 0,5 mL.min
-1
, amostras monitoradas pela absorbância a 280 nm.. . 108
Figura 4.32:Fotografias dos géis de eletroforese SDS-PAGE (poliacrilamida 15 %) para a
amostra de soro analisada por cromatografia gel (100 V e 30 mA). ................... 109
Figura 4.33: Fluxos de água após realização dos experimentos e em cada etapa da
limpeza química para a UF-6001, ΔP = 2 bar e T = 50 °C, vazão de alimentação
840 L.h
-1
.............................................................................................................. 112
Figura 4.34: Fluxos de água após realização dos experimentos e em cada etapa da
limpeza química para a MF-7002, ΔP = 1,75 bar e T = 40 °C, vazão de
alimentação 700 L.h
-1
.......................................................................................... 113
Figura 4.35: Fluxos de água após realização dos experimentos e em cada etapa da
limpeza química para a UF-C20, ΔP = 2,25 bar e T = 25 °C, vazão de alimentação
620 L.h
-1
. ............................................................................................................. 114
Figura 4.36: Fluxos de água após realização dos experimentos e em cada etapa da
limpeza química para a UF-C50, ΔP = 2,25 bar e T = 25 °C, vazão de alimentação
400 L.h
-1
. ............................................................................................................. 114
Figura A.1: Esquema da preparação do sistema de eletroforese. ................................... 135
Figura B.1: Fotografias dos géis de eletroforese SDS-PAGE (poliacrilamida 15 %) do
experimento de duplicata para as amostras de concentrado e permeado da
membrana HN06, RZ04, VCWP (100 V e 30 A).. .............................................. 148
Figura B.2: Fotografias dos géis de eletroforese SDS-PAGE (poliacrilamida 15 %) para
as amostras do expermimento de duplicata para o concentrado e o permeado da
membrana MF-7002 (100 V e 30 A).. ................................................................. 152
Figura B.3: Fotografias dos géis de eletroforese SDS-PAGE (poliacrilamida 15 %) para
as amostras de concentrado e permeado da membrana UF-C50.. ....................... 155
Figura B.4: Fotografias dos géis de eletroforese SDS-PAGE (poliacrilamida 15 %) para
as amostras de concentrado e permeado da membrana UF-C20............ ............. 159
Figura B.5: Curva de calibração da coluna de cromatografia gel. .................................. 160
Figura B.6: Cromatografia gel em coluna de 10 x 300 mm empacotada com a resina
Superose
TM
12, equilibrada com tampão fosfato de sódio 10 mM, pH 7,0; vazão
de eluição = 0,5 mL.min
-1
; amostras monitoradas pela absorbância a 280 nm. .. 161
Figura B.7: Duplicata da cromatografia gel em coluna de 10 x 300 mm empacotada com
a resina Superose
TM
12, equilibrada com tampão fosfato de sódio 10 mM, pH 7,0;
vazão de eluição = 0,5 mL.min
-1
; amostras monitoradas pela absorbância a 280
nm. ....................................................................................................................... 161
Figura B.8: Cromatografia gel em coluna de 10 x 300 mm empacotada com a resina
Superose
TM
12, equilibrada com tampão acetato de sódio 10 mM, pH 4,6; vazão
de eluição = 0,5 mL.min
-1
, amostras monitoradas pela absorbância a 280 nm. .. 162
Figura B.9: Duplicata da cromatografia gel em coluna de 10 x 300 mm empacotada com
a resina Superose
TM
12, equilibrada com tampão acetato de sódio 10 mM, pH 4,6;
vazão de eluição = 0,5 mL.min
-1
, amostras monitoradas pela absorbância a 280
nm. ....................................................................................................................... 162
xii
Lista de tabelas
Tabela 2.1: Concentração e tamanho dos componentes do leite, e distribuição média
destes componentes no coalho e no soro. ............................................................... 5
Tabela 2.2: Composição aproximada do soro doce. ........................................................... 8
Tabela 2.3: Quantidades médias de vitaminas e minerais em 100 g de soro doce em pó. . 9
Tabela 2.4: Propriedades e concentração das proteínas do soro. ...................................... 11
Tabela 2.5: Concentração de aminoácidos essenciais na proteína de referência, nas
proteínas do soro, na β-Lg e na α-La. ................................................................... 16
Tabela 2.6: Valores que representam a qualidade nutricional do leite e das suas frações
protéicas. ............................................................................................................... 17
Tabela 2.7: Caracterização dos principais produtos derivados do soro de queijo. ........... 22
Tabela2.8:Propriedades funcionais que os concentrados protéicos conferem aos alimentos
............................................................................................................................... 24
Tabela 2.9:Composição de frações industriais de α-La e β-Lg. ........................................ 26
Tabela 2.10:PSM relacionados pelo tamanho de poros das membranas e respectivas
pressões de operação. ............................................................................................ 33
Tabela 3.1: Características físico-químicas do soro em pó. .............................................. 57
Tabela 3.2: Características nutricionais do soro em 100 g. .............................................. 57
Tabela 3.3: Reagentes utilizados, fórmula, grau de pureza e fornecedor. ........................ 58
Tabela 3.4: Características das membranas utilizadas nos experimentos. ........................ 60
Tabela 4.1: Dados de concentração de proteína e lactose para as amostras de concentrado
e permeado das membranas VCWP, HN06 e RZ04. ............................................ 92
Tabela 4.2: Dados de concentração de proteína e lactose para as amostras de concentrado
e permeado da membrana MF-7002. .................................................................... 97
Tabela4.3: Dados de intensidade relativa (em porcentagem) correspondendo a quantidade
de proteína em cada banda eletroforética das amostras de concentrado e
permeado da membrana MF-7002. ....................................................................... 98
Tabela 4.4: Dados de concentração de proteína, lactose e pH das amostras de permeado e
concentrado para o experimento com concentrado protéico para a membrana UF-
C50, ΔP = 2,25 bar, vazão de alimentação = 400 L.h
-1
. ..................................... 102
Tabela 4.5: Dados de concentração de proteína, lactose e pH das amostras de permeado e
concentrado para o experimento com concentrado protéico e para o soro diluído
para a membrana UF-C20, T = 25 °C, ΔP = 2,25 bar, vazão de alimentação = 620
L.h
-1
. .................................................................................................................... 106
Tabela A.1: Componentes das Soluções para preparação dos géis de eletroforese ........ 135
Tabela B.1: Dados de fluxo médio de água e retenção média de dextrana em função da
ΔP, para as membranas UF-6001, UF-6002 e UF-7001, a 30 °C. ...................... 137
Tabela B.2: Dados de fluxo médio de soro em função da ΔP, para a membrana UF-6001,
a 50 °C e vazão de alimentação de 840 L.h
-1
. ..................................................... 137
Tabela B.3: Resumo dos dados médios de concentração, massa e percentual (*base seca)
de proteína, lactose e sais para o concentrado dos Experimentos 1, 2, 3,e 4 em
função da etapa do processo utilizando a membrana UF-6001, T= 50 °C, ΔP= 2
bar e vazão de alimentação média de 840 L.h
-1
. ................................................. 138
Tabela B.4: Resumo dos dados médios de concentração, massa e percentual (*base seca)
de proteína, lactose e sais para o concentrado dos Experimentos 2’ e 4’ em função
da etapa do processo utilizando a membrana UF-6001, T= 50 °C, ΔP= 2 bar e
vazão de alimentação média de 840 L.h
-1
(duplicatas dos experimentos 2 e 4). 139
Tabela B.5: Dados detalhados do Experimento 1, incluindo concentrações de sólidos
totais, proteína, lactose, condutividade elétrica, pH para as amostras de
xiii
concentrado e permeado monitoradas conforme o tempo e etapa dos processos de
concentração e purificação do soro utilizando a membrana UF-6001, T= 50 °C,
ΔP= 2 bar e vazão de alimentação média de 840 L.h
-1
. ....................................... 140
Tabela B.6: Dados detalhados do Experimento 2, incluindo concentrações de sólidos
totais, proteína, lactose, condutividade elétrica, pH para as amostras de
concentrado e permeado monitoradas conforme o tempo e etapa dos processos de
concentração e purificação do soro utilizando a membrana UF-6001, T= 50 °C,
ΔP= 2 bar e vazão de alimentação média de 840 L.h
-1
. ....................................... 141
Tabela B.7: Dados detalhados do Experimento 3, incluindo concentrações de sólidos
totais, proteína, lactose, condutividade elétrica, pH para as amostras de
concentrado e permeado monitoradas conforme o tempo e etapa dos processos de
concentração e purificação do soro utilizando a membrana UF-6001, T= 50 °C,
ΔP= 2 bar e vazão de alimentação média de 840 L.h
-1
. ....................................... 142
Tabela B.8: Dados detalhados do Experimento 4, incluindo concentrações de sólidos
totais, proteína, lactose, condutividade elétrica, pH para as amostras de
concentrado e permeado monitoradas conforme o tempo e etapa dos processos de
concentração e purificação do soro utilizando a membrana UF-6001, T= 50 °C,
ΔP= 2 bar e vazão de alimentação média de 840 L.h
-1
. ....................................... 143
Tabela B.9: Dados detalhados da duplicata do Experimento 2, incluindo concentrações de
sólidos totais, proteína, lactose, condutividade elétrica, pH para as amostras de
concentrado e permeado monitoradas conforme o tempo e etapa dos processos de
concentração e purificação do soro utilizando a membrana UF-6001, T= 50 °C,
ΔP= 2 bar e vazão de alimentação média de 840 L.h
-1
. ....................................... 144
Tabela B.10: Dados detalhados da duplicata do Experimento 4, incluindo concentrações
de sólidos totais, proteína, lactose, condutividade elétrica, pH para as amostras de
concentrado e permeado monitoradas conforme o tempo e etapa dos processos de
concentração e purificação do soro utilizando a membrana UF-6001, T= 50 °C,
ΔP= 2 bar e vazão de alimentação média de 840 L.h
-1
. ....................................... 145
Tabela B.11: Dados de fluxo permeado de água em função do tempo para compactação
das membranas VCWP, HN06 e RZ04 vazão de alimentação 620 L.h
-1
, T = 25 °C
, ΔP =3,25 bar. ..................................................................................................... 146
Tabela B.12: Dados de fluxo permeado de água para as membranas VCWP, HN06 e
RZ04 vazão de alimentação 620 L.h
-1
, T = 40 °C (VCWP e RZ04) e 25 °C
(HN06). ................................................................................................................ 146
Tabela B.13: Duplicata dos dados de fluxo permeado de água para as membranas VCWP,
HN06 e RZ04 vazão de alimentação 620 L.h
-1
, T = 40 °C (VCWP e RZ04) e 25
°C (HN06). .......................................................................................................... 146
Tabela B.14: Dados de fluxo permeado de concentrado protéico para as membranas
VCWP, HN06 e RZ04 vazão de alimentação 620 L.h
-1
, T = 40 °C, pH = 4,6
(VCWP e RZ04) e 25 °C, pH = 6,3 (HN06). ...................................................... 147
Tabela B.15: Duplicata dos dados de fluxo permeado de concentrado protéico para as
membranas VCWP, HN06 e RZ04 vazão de alimentação 620 L.h
-1
, T = 40 °C, pH
= 4,6 (VCWP e RZ04) e 25 °C, pH = 6,3 (HN06). ............................................. 147
Tabela B.16: Dados de concentração de proteína e lactose para as amostras de
concentrado e permeado das membranas VCWP, HN06 e RZ04 (duplicata). .... 147
Tabela B.17: Dados de fluxo permeado de água em função do tempo para compactação
da membrana MF-7002 vazão de alimentação 700 L.h
-1
, T = 25 °C , ΔP =3,25 bar.
............................................................................................................................. 148
xiv
Tabela B.18: Dados de fluxo permeado de água e de concentrado protéico em função da
pressão transmembrana para a membrana MF-7002, vazão 700 L.h
-1
, T = 40 °C,
pH = 4,6 (concentrado). ...................................................................................... 148
Tabela B.19: Duplicata dos dados de fluxo permeado de água e de concentrado protéico
em função da pressão transmembrana para a membrana MF-7002, vazão 700 L.h
-
1
, T = 40 °C, pH = 4,6 (concentrado). ................................................................. 149
Tabela B.20: Dados de fluxo permeado de concentrado protéico em função do tempo para
a membrana MF-7002, vazão 700 L.h
-1
, T = 40 °C, pH = 4,6, ΔP = 1,75 bar. .. 149
Tabela B.21: Dados de intensidade do modelo (pixel) e de intensidade relativa,
correspondendo a quantidade de proteína em cada banda eletroforética das
amostras de concentrado e permeado da membrana MF-7002. .......................... 150
Tabela B.22: Dados do experimento de fluxo permeado de concentrado protéico em
função do tempo para a membrana MF-7002, vazão 700 L.h
-1
, T = 40 °C, pH =
4,6, ΔP = 1,75 bar (duplicata). ............................................................................ 151
Tabela B.23: Dados de concentração de proteína e lactose para as amostras de
concentrado e permeado da membrana MF-7002 (duplicata). ........................... 152
Tabela B.24: Dados de fluxo permeado de água em função do tempo para compactação
da membrana UF-C50 vazão de alimentação 400 L.h
-1
, T = 25 °C , ΔP =3,75 bar.
............................................................................................................................. 152
Tabela B.25: Dados de fluxo permeado de água em função da pressão transmembrana
para a membrana UF-C50, T = 40 °C, vazão de alimentação = 400 L.h
-1
. ......... 153
Tabela B.26: Dados de fluxo permeado de concentrado em pH 6,3 em função da pressão
transmembrana para a membrana UF-C50, T =25 °C, vazão de alimentação = 400
L.h
-1
. .................................................................................................................... 153
Tabela B.27: Dados de fluxo permeado de concentrado em pH 4,6 em função da pressão
transmembrana para a membrana UF-C50, T = 40 °C, vazão de alimentação = 400
L.h
-1
. .................................................................................................................... 153
Tabela B.28: Dados de fluxo permeado de concentrado protéico em função do tempo para
a membrana UF-C50, pH= 6,3; T = 25 °C, ΔP = 2,25 bar, vazão de alimentação =
400 L.h
-1
. ............................................................................................................. 154
Tabela B.29: Dados de fluxo permeado de concentrado protéico em função do tempo para
a membrana UF-C50, pH= 6,3; T = 25 °C, ΔP = 2,25 bar, vazão de alimentação =
400 L.h
-1
(duplicata). ........................................................................................... 154
Tabela B.30: Dados de concentração de proteína, lactose e pH das amostras de permeado
e concentrado para o experimento com concentrado protéico para a membrana
UF-C50, pH =6,3, T = 25 °C, ΔP = 2,25 bar, vazão de alimentação = 400 L.h
-1
(duplicata). .......................................................................................................... 154
Tabela B.31: Dados de fluxo permeado de concentrado protéico em função do tempo para
a membrana UF-C50, pH= 4,6; T = 40 °C, ΔP = 2,25 bar, vazão de alimentação =
400 L.h
-1
. ............................................................................................................. 154
Tabela B.32: Dados de fluxo permeado de concentrado protéico em função do tempo para
a membrana UF-C50, pH= 4,6; T = 40 °C, ΔP = 2,25 bar, vazão de alimentação =
400 L.h
-1
(duplicata). ........................................................................................... 155
Tabela B.33: Dados de concentração de proteína, lactose e pH das amostras de permeado
e concentrado para o experimento com concentrado protéico para a membrana
UF-C50, pH =4,6, T = 40 °C, ΔP = 2,25 bar, vazão de alimentação = 400 L.h
-1
(duplicata). .......................................................................................................... 155
Tabela B.34: Dados de fluxo permeado de água em função do tempo para compactação
da membrana UF-C20 vazão de alimentação 620 L.h
-1
, T = 25 °C , ΔP =3,75 bar.
............................................................................................................................. 156
xv
Tabela B.35: Dados de fluxo permeado de água em função da pressão transmembrana
para a membrana UF-C20, T = 25 °C, vazão de alimentação = 620 L.h
-1
. ......... 156
Tabela B.36: Dados de fluxo permeado de concentrado protéico em função da pressão
transmembrana para a membrana UF-C20, T = 25 °C, vazão de alimentação = 620
L.h
-1
. .................................................................................................................... 156
Tabela B.37: Dados de fluxo permeado de concentrado protéico em função do tempo para
a membrana UF-C20, T = 25 °C, ΔP = 2,25 bar, vazão de alimentação = 620 L.h
-
1
. ........................................................................................................................... 157
Tabela B.38: Dados de fluxo permeado de concentrado protéico em função do tempo para
a membrana UF-C20, T = 25 °C, ΔP = 2,25 bar, vazão de alimentação = 620 L.h
-1
(duplicata). ........................................................................................................... 157
Tabela B.39: Dados de concentração de proteína, lactose e pH das amostras de permeado
e concentrado para o experimento com concentrado protéico para a membrana
UF-C20, T = 25 °C, ΔP = 2,25 bar, vazão de alimentação = 620 L.h
-1
(duplicata).
............................................................................................................................. 158
Tabela B.40: Dados de fluxo permeado de soro diluído em função da pressão
transmembrana para a membrana UF-C20, T = 25 °C, vazão de alimentação = 620
L.h
-1
. .................................................................................................................... 158
Tabela B.41: Dados de fluxo permeado de soro diluído em função do tempo para a
membrana UF-C20, T = 25 °C, ΔP = 2,25 bar, vazão de alimentação = 620 L.h
-1
.
............................................................................................................................. 158
Tabela B.42: Dados de fluxo permeado de soro diluído em função do tempo para a
membrana UF-C20, T = 25 °C, ΔP = 2,25 bar, vazão de alimentação = 620 L.h
-1
(duplicata). ........................................................................................................... 159
Tabela B.43: Dados de concentração de proteína, lactose e pH das amostras de permeado
e concentrado para o experimento com soro diluído para a membrana UF-C20, T
= 25 °C, ΔP = 2,25 bar, vazão de alimentação = 620 L.h
-1
(duplicata). .............. 159
Tabela B.44: Dados para construção da curva de calibração da coluna de cromatografia
gel. ....................................................................................................................... 160
Tabela B.45: Médias dos fluxos de água após realização dos experimentos e em cada
etapa da limpeza química para a UF-6001, ΔP = 2 bar e T = 50 °C, vazão de
alimentação 840 L.h
-1
. ......................................................................................... 163
Tabela B.46: Médias dos fluxos de água após realização dos experimentos e em cada
etapa da limpeza química para a MF-7002, ΔP = 1,75 bar e T = 40 °C, vazão de
alimentação 700 L.h
-1
. ......................................................................................... 163
Tabela B.47: Médias dos fluxos de água após realização dos experimentos e em cada
etapa da limpeza química para a UF-C50, ΔP = 2,25 bar e T = 25 °C, vazão de
alimentação 400 L.h
-1
. ......................................................................................... 163
Tabela B.48: Médias dos fluxos de água após realização dos experimentos e em cada
etapa da limpeza química para a UF-C20, ΔP = 2,25 bar e T = 25 °C, vazão de
alimentação 620 L.h
-1
. ......................................................................................... 163
xvi
Lista de Abreviaturas e Símbolos
PSM processo de separação por membranas
MF microfiltração
UF ultrafiltração
NF nanofiltração
OI osmose inversa
ED eletrodiálise
DF diafiltração
IP isolado protéico de soro
CP concentrado protéico de soro
pI ponto isolétrico
α-La α-lactoalbumina
β-Lg β-lactoglobulina
Ig imunoglobulina
BSA albumina do soro bovino
NPN nitrogênio não protéico
MMC massa molar de corte (kDa)
FC fator de concentração
ST sólidos totais ( g. L
-1
)
DBO demanda bioquímica de oxigênio (mg O
2
. L
-1
)
J
p
fluxo permeado (L. m
-2
. h
-1
)
Δp pressão transmembrana
V volume (L)
A área da membrana (m
2
)
P permeabilidade
t tempo (min)
R coeficiente de retenção (%)
C
P
concentração de soluto no permeado ( g. L
-1
)
C
f
concentração de soluto na alimentação ( g. L
-1
)
V
o
volume inicial da solução (L)
V
R
volume do retido (L)
V
F
volume permeada da solução (L)
dt
dV
variação do volume com tempo (L. h
-1
).
Capítulo 1
Introdução
O soro lácteo é a porção aquosa do leite que se separa do coágulo durante a fabricação
convencional de queijos ou da caseína. É um subproduto de importância relevante na indústria
de laticínios, tendo em vista o volume produzido e sua composição nutricional; 10 litros de
leite produzem cerca de 1 quilograma de queijo e 9 litros de soro; neste volume encontra-se
cerca da metade dos sólidos do leite, sobretudo lactose, proteínas solúveis e sais minerais.
Estima-se que a produção mundial de soro seja de 180 a 190 milhões de toneladas por
ano. Cerca da metade do soro produzido é eliminado como efluente em sistemas hídricos ou
como adubo diretamente no solo, resultando numa perda importante de energia alimentar, e,
ao mesmo tempo, uma grande perda econômica. Quando incorporado às águas residuais dos
laticínios, sem tratamento, o soro constitui a principal fonte poluidora do meio ambiente
gerada por esse setor, a carga poluente, representada pela Demanda Bioquímica de Oxigênio
(DBO) pode chegar a 60.000 mg.O
2
.L
-1
; este poder poluente é cerca de 100 vezes maior que o
de um esgoto doméstico. A outra metade do soro produzido no mundo é processada em vários
produtos alimentícios retornando, desta forma, como alimentação animal ou humana, ou ainda
para a produção de medicamentos e outros produtos.
A indústria de alimentos investe no desenvolvimento de produtos novos e inovadores
para satisfazer as necessidades dos consumidores. A conscientização crescente dos
consumidores da importância de alimentos ao mesmo tempo nutritivos e saudáveis, motiva
pesquisadores a concentrar esforços nos estudos dos efeitos do soro e suas frações. Há cada
vez mais evidências de que o soro contém uma variedade de compostos capazes de gerar
impacto favorável sobre a saúde. Além do mais, a utilização não racional do soro constitui
prática antieconômica e até mesmo anti-social, devido à carência mundial de alimentos e
também pelo caráter sazonal da produção de leite e oscilações desta.
O desenvolvimento de novas tecnologias capazes de solucionar o problema do soro de
queijo pode trazer benefícios econômicos e ambientais, pois o soro é considerado uma
2 INTRODUÇÃO
importante fonte de proteína a ser utilizada para consumo. Assim, justificam-se estudos sobre
a possibilidade de utilizá-lo comercialmente.
As proteínas do soro possuem valor nutricional elevado, conferido pela presença de
alto teor de aminoácidos essenciais. O perfil destes aminoácidos atende ou supera todas as
exigências qualitativas e quantitativas estabelecidas pela FAO/WHO (Organização das
Nações Unidas para a Agricultura e Alimentação/Organização Mundial da Saúde). Devido à
quantidade de aminoácidos essenciais e da elevada qualidade protéica, as proteínas do soro
podem aumentar o valor nutricional dos alimentos usados na dieta humana. Além das
propriedades nutricionais, as proteínas do soro possuem propriedades funcionais e
tecnológicas versáteis quando utilizadas como ingredientes em produtos alimentícios.
Industrialmente, o soro pode ser processado mediante diversas técnicas, tais como a
filtração, centrifugação, evaporação, secagem, ultrafiltração, osmose inversa, tratamento
térmico, fermentação, desmineralização e cristalização, entre outras.
O método convencional de concentração de soro mais utilizado é a evaporação
térmica. As principais desvantagens deste método são o elevado consumo energético e o
elevado teor de sais e açúcares no produto concentrado. Os fatores que determinam a
dificuldade no aproveitamento das proteínas do soro de queijo são os elevados teores de água,
de sais e de lactose.
A ultrafiltração (UF) se apresenta como um método alternativo bastante atraente, uma
vez que não faz uso do calor e não envolve mudança de fase, o que torna o processo de
concentração mais econômico. A UF é um Processo de Separação por Membranas (PSM)
tipicamente usada para reter macromoléculas permitindo que moléculas de baixa massa molar
atravessem a membrana. A UF vem sendo empregada na indústria de laticínios,
principalmente na recuperação de produtos como as proteínas do soro de queijo e no seu
fracionamento. A UF permite uma variação na relação de concentração entre os vários
componentes do soro, devido à retenção seletiva de proteína e da permeação da lactose, sais
minerais, água e compostos de baixa massa molar.
A fração protéica do soro contém: β-lactoglobulina (β-Lg), α-lactoalbumina (α-La),
Albumina do soro bovino (BSA), Imunoglobulinas (Ig), Glicomacropeptídeos e alguns
polipeptídios resultantes da proteólise das caseínas por enzimas do leite. Devido às
propriedades específicas de cada uma das proteínas do soro, tem havido um crescente
interesse no fracionamento das proteínas. As características nutricionais, terapêuticas e
funcionais únicas nestas proteínas isoladas não se manifestam em concentrados protéicos
devido a interações entre componentes e a degradação durante o processamento. Aumentou,
portanto, o interesse comercial na produção de proteínas de soro isoladas com propriedades
funcionais e biológicas bem caracterizadas. Atualmente estuda-se o possível papel da α-La na
formulação de agentes antitumorais. Uma das funções in vivo da β-Lg parece ser a fixação de
retinol e seu transporte ao intestino delgado. A β-Lg também pode fixar ácidos graxos. Além
disso, a β-Lg tem maior capacidade de gelificação que a α-La. Por outro lado, o leite humano
não contém β-Lg (é a proteína do leite bovino que causa mais reações alérgicas), e por esse
INTRODUÇÃO 3
motivo a α-La é mais adequada para a formulação de alimentos para lactentes, do que os
concentrados protéicos do soro.
Dentro deste contexto, este trabalho visa aproveitar um subproduto da indústria de
laticínios, o soro lácteo, e transformá-lo em produtos com alto valor nutritivo e funcional para
serem utilizados nas indústrias de alimentos e farmacêutica. O trabalho divide-se em duas
etapas: na primeira etapa, o objetivo é concentrar e purificar as proteínas do soro de queijo
através da UF procurando aumentar ainda mais o valor agregado ao produto. A diafiltração é
usada com o intuito de eliminar do concentrado os componentes de baixa massa molar (sais e
lactose) o que propícia a purificação das proteínas. Os experimentos foram realizados em uma
unidade piloto de UF, utilizando-se membranas poliméricas com massa molar de corte de 10
kDa em módulo em espiral. Estratégias modificando o fator de concentração volumétrico e o
volume e o número de DF foram testadas, para se obter a melhor purificação protéica.
A segunda etapa tem como objetivo fracionar as proteínas em maior concentração no
soro (α-La e β-Lg) processando o concentrado obtido na primeira etapa. Para isto, utilizou-se
a ultrafiltração e a microfiltração, associadas a propriedades como: massa molar e pH da
solução de alimentação.
A partir dos produtos obtidos em cada uma das etapas, foi necessário avaliar através
de métodos analíticos, as concentrações de proteína, lactose, sólidos totais, pH e
condutividade elétrica obtidas nas correntes de permeado e concentrado.
Capítulo 2
Fundamentos Teóricos e Revisão Bibliográfica
Neste capítulo é apresentada uma revisão da literatura sobre as características do soro
lácteo, dando ênfase para as proteínas do soro, que contêm elevado valor nutritivo e funcional
e, por isso, vêm despertando o interesse das indústrias. Nesta etapa foi realizada uma revisão
dos trabalhos que tratam da possibilidade de concentração, purificação e fracionamento das
proteínas do soro. Também, são apresentados fundamentos teóricos sobre os Processos de
Separação com Membranas (PSM), assim como os fatores que afetam a eficiência destes
processos. E finalmente, foi realizada uma revisão de trabalhos publicados nos últimos anos
sobre a utilização dos PSM nas indústrias alimentícias e especialmente sobre o
aproveitamento do soro lácteo através do uso de microfiltração (MF) e ultrafiltração (UF).
2.1 Soro Lácteo
O soro lácteo, também conhecido como soro de leite, soro de queijo ou lacto-soro, é
um subproduto da indústria de laticínios, representa a porção aquosa do leite que se separa do
coágulo durante a fabricação convencional de queijos ou da caseína. É um líquido quase
opaco e de cor amarelo-esverdeado, que contém aproximadamente metade dos sólidos do leite
(MAWSON, 1994; ZADOW, 1992; MILLER et al., 2000).
Apesar de ser considerado um subproduto, o soro possui alto valor nutricional,
conferido pela presença de proteínas com elevado teor de aminoácidos essenciais e ainda
propriedades funcionais relevantes (WIT, 1998; NEVES, 2001). Na média, 10 litros de leite
produzem cerca de 1 quilograma de queijo e 9 litros de soro e dependendo das técnicas
utilizadas na produção, podem ser produzidos até doze litros de soro.
O leite é fonte de lipídeos, carboidratos e proteínas e apresenta estabilidade incomum
para um fluido dessa natureza. Constitui uma das principais fontes de proteínas na
alimentação de animais jovens e de humanos de todas as idades. A composição do leite, a
concentração e a massa molar dos componentes, e a distribuição destes componentes no soro
e no coalho podem ser observadas na Tabela 2.1.
FUNDAMENTOS TEÓRICOS E REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 5
Tabela 2.1: Concentração e tamanho dos componentes do leite, e distribuição média destes
componentes no coalho e no soro.
Componente Leite (g.L
-1
) Massa molar (kDa) Coalho(%)
*
Soro (%)*
Água 87,1 < 0,1 6 94
Sólidos totais 12,9 - 48 52
Caseínas 2,6 20-300 96 4
Proteínas do soro 0,7 4-160 4 96
Gordura 4,0 100-15.000 94 6
Lactose 4,6 0,35 6 94
Minerais 0,7 < 1 62 38
Outros 0,32 - - -
* percentual mássico
Fonte: adaptado de M
ILLER et al. (2000); BRANS et al. (2004).
Observa-se na Tabela 2.1 que, em média, 52 % dos sólidos totais, 94 % da lactose, 96
% das proteínas solúveis e 38 % dos minerais do leite, permanecem no soro após a fabricação
de queijo. O queijo por sua vez, retém caseínas e gorduras, que são a base do coalho.
As proteínas do leite compreendem duas frações principais: as caseínas (entre 70 e 80
% das proteínas totais) e as proteínas do soro, que estão em solução. As caseínas e as
proteínas do soro diferem em aspectos fisiológicos e biológicos. As caseínas formam com o
cálcio partículas coloidais, chamadas micelas. As proteínas do soro são de natureza globular,
mais solúveis em água que as caseínas (SGARBIERI, 1996).
As proteínas do soro se diferenciam da caseína por serem insensíveis às coagulações
ácidas assim como à ação da quimosina/renina. Portanto, durante a coagulação das caseínas
juntamente com a gordura (formação do coalho) as proteínas do soro e boa parte da lactose
permanecem em solução. O soro ainda contém minerais e traços de gordura, somando
aproximadamente 6 % de sólidos totais (SGARBIERI, 1996).
O soro é um subproduto de importância relevante tendo em vista o volume produzido
e sua composição nutricional. Com o aumento na produção de queijo ao longo do mundo e o
mais rigoroso controle da disposição de efluentes, a produção do soro é um dos problemas
mais críticos para a indústria leiteira.
O soro pode ter basicamente três destinos principais: o primeiro é o seu processamento
até produtos diversos; o segundo seria o seu uso na alimentação animal; finalmente, o terceiro
destino seria o seu tratamento para posterior despejo no esgoto (BRANDÃO, 1994; NEVES,
2001).
Segundo MARWANA & KENNEDY (1988), grande parte do soro de queijo produzido em
diversas partes do mundo ainda é incorporada as águas residuais dos laticínios, sendo a
principal fonte poluidora do meio ambiente gerada por esse setor.
Um dos principais problemas do soro é seu alto poder poluente devido à alta
quantidade de substâncias orgânicas, representadas principalmente pela lactose e pelas
proteínas. A carga poluente, representada pela Demanda Bioquímica de Oxigênio (DBO),
6 FUNDAMENTOS TEÓRICOS E REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
varia de 30.000 a 60.000 mgO
2
.L
-1
, dependendo do processo de fabricação de queijo
(BRANDÃO, 1994). Esta carga poluente é cerca de 100 vezes maior que a de um esgoto
doméstico. Uma fábrica com produção média de 10.000 L de soro por dia polui o equivalente
a uma população de 5.000 habitantes. Quando descartado diretamente no solo compromete
sua estrutura físico-química e diminui o rendimento da colheita (RICHARDS, 2002; PORTO et
al
., 2005).
Em decorrência dos problemas enfrentados pelas indústrias para efetuarem o
tratamento do soro como resíduo industrial, adequando-o às exigências dos órgãos de
inspeção e saúde pública, teve início na década de 60 testes de aproveitamento do soro de
queijo (KOSIKOWSKI, 1967).
Com o contínuo desenvolvimento de tecnologias e crescente responsabilidade
ambiental, por parte das indústrias, a imagem do soro está mudando rapidamente de efluente
para uma fonte valiosa de nutrientes.
Antes de ser considerado apenas mais um componente dos efluentes das indústrias de
laticínios, o soro pode e deve ser aproveitado como complemento na alimentação humana. A
utilização não racional do soro constitui prática anti-econômica e até mesmo anti-social,
devido à carência mundial de alimentos e também pelo caráter sazonal da produção de leite e
oscilações desta.
2.2 Produção do Soro
A fabricação de queijo é um método de transformação de componentes do leite em um
produto de fácil conservação, menor volume, alto valor nutritivo, sabor agradável e boa
digestibilidade, porém neste processo não há conversão de 100 % do leite em queijo. Seu
rendimento pode variar entre 8,5 a 20 % em função da consistência do queijo, produzindo
assim, além do queijo, um derivado denominado de soro (G
IROTO & PAWLOWSKY, 2001).
Na Figura 2.1 pode-se observar o fluxograma da produção de queijo. Em geral, a
produção de queijo é iniciada com o tratamento térmico do leite para eliminar as bactérias
patogênicas e as formas vegetativas de microrganismos prejudiciais. Este processo térmico é
denominado de pasteurização e ocorre em temperaturas entre 70 a 80 °C durante 15 a 20
segundos. Em seguida ocorre a correção do índice de gordura do leite e a adição de
ingredientes tais como: fermento lático, coalho e cloreto de cálcio. Como coagulantes podem
ser utilizados ácidos e coalhos de origem animal, coagulantes vegetais e microbianos.
A etapa seguinte é a coagulação do leite, através da precipitação das caseínas. Quando
o coágulo se encontra com a consistência desejada, é cortado ou partido, para se proceder a
remoção do soro. Para acelerar o fenômeno de sinerese o processo envolve aquecimento e
agitação. Após essa operação o queijo é enformado, esta operação consiste em moldar a
massa (ou os pedaços de coágulo) mais ou menos aglomerada, em fôrmas; a seguir o queijo é
prensado para remover o restante de soro e embalado.
FUNDAMENTOS TEÓRICOS E REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 7
Figura 2.1: Fluxograma simplificado da produção de queijo.
O soro é proveniente das operações de corte, agitação, aquecimento, enformagem e
prensagem da produção de queijo.
Há dois tipos básicos de soro fluido - o doce e o ácido - que variam de acordo com o
tipo de queijo produzido.
O tipo predominante é o soro doce, que é derivado da manufatura de queijos
amadurecidos duros, semi-duros ou macios (Cheddar, Suíço, Provolone, Mussarela, etc.). A
desestabilização das micelas de caseína é realizada por via enzimática em pH maior do que
5,6. O pH do soro doce é ligeiramente menor do que o do leite fresco, varia de 5,9 a 6,6.
(Z
ADOW, 1992; MILLER et al., 2000).
Na produção de soro ácido a precipitação das caseínas é realizada pela acidificação
não acima de pH 5,1. Na coagulação ácida, o pH abaixa devido à conversão da lactose em
ácido lático por fermentação microbiana, ou por adição direta de ácidos minerais ou
orgânicos. O soro resultante deste processo é designado de soro ácido com um pH de 4,3 a
5,1. O soro ácido provém principalmente da fabricação de queijos tipo Cottage e da
fabricação de caseína comercial. (M
ILLER et al., 2000; MIZUBUTI, 1994; BYLUND, 1995).
As diferenças na acidez e no conteúdo mineral, entre os dois tipos de soro, são as
responsáveis pelas diferentes propriedades físico-químicas que apresentam (ZADOW, 1992).
8 FUNDAMENTOS TEÓRICOS E REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
O soro doce é geralmente mais rico em lactose, enquanto que o soro ácido exibe uma
maior concentração em minerais. A composição protéica de ambos os soros é semelhante no
que se refere à maioria das proteínas. A concentração de lactose no soro ácido é menor do que
no soro doce, devido ao processo de fermentação, pois uma fração de lactose é transformada
em ácido lático, durante a formação do coalho. Por outro lado, o soro ácido contém mais
cálcio e fósforo que o soro doce, devido à solubilização do complexo cálcio-fósforo, existente
nas micelas de caseína, em pH ácido (MIZUBUTI, 1994; WONG et al., 1999).
A maior parte dos produtos de soro é derivada do soro doce (MILLER et al., 2000).
Segundo YADA (2004), aproximadamente 94 % do soro industrializado nos Estados Unidos é
proveniente do soro doce.
Neste trabalho é dado enfoque ao soro doce, já que o soro utilizado para realização dos
experimentos é proveniente do queijo tipo Mussarela.
2.3 Principais Componentes do Soro Lácteo
A composição média do soro doce é apresentada na Tabela 2.2. Os sólidos do soro são
essencialmente lactose, proteínas e minerais.
Tabela 2.2: Composição aproximada do soro doce.
Componente Soro doce (%)*
Água 93-95
Sólidos Totais (ST) 5,5-6,5
Proteína 0,7-1,2
Gordura 0,04-0,05
Lactose 3,8-5,0
Cinzas 0,5-0,8
NPN 0,15-0,18
* percentual mássico
Fonte: adaptado de M
ILLER et al. (2000); BYLUND (1995); YADA (2004).
O conteúdo em gordura pode variar dependendo do tipo de leite usado e do processo
de fabricação de queijo (ZADOW, 1992). A fração de nitrogênio não protéico (NPN) inclui
alguns componentes de baixa massa molar como uréia (30 % do NPN), amônia, ácido úrico,
creatinina, aminoácidos e produtos de degradação enzimática das caseínas (PEREIRA, 2002).
Normalmente o soro apresenta as características mostradas na Tabela 2.2, contudo, a sua
composição apresenta variações sazonais, e depende também da raça do rebanho, e varia com
o tipo de tratamento a que o leite é submetido (aquecimento, centrifugação, homogeneização).
Além disso, o processo de fabricação de queijo ou caseínas e o tratamento que o soro sofre
após estar separado do coalho (pasteurização, pré-concentração e remoção de partículas de
caseína) também influenciam nas suas características finais.
Devido a sua importância nos processos de separação as características dos principais
componentes presentes serão estudados com maiores detalhes nas seções a seguir.
FUNDAMENTOS TEÓRICOS E REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 9
2.3.1 Lactose
A lactose ou “açúcar do leite” é o carboidrato característico do leite, é um dissacarídeo
formado de galactose e glicose, que no leite cru é responsável por 40 % do total de sólidos, e
nos leites desengordurados corresponde a 54 % dos sólidos totais. No soro é o composto
sólido em maior quantidade em torno de 70 % em base seca (MATTILA-SANDHOLM &
SAARELA, 2003).
A concentração de lactose no leite e no soro de leite varia amplamente entre as
espécies. O conteúdo de lactose do leite bovino varia com a raça, fator de individualidade e
especialmente devido à fase de lactação do animal (FOX & MCSWEENEY, 1998).
Este açúcar é encontrado no leite de todos os mamíferos, em diferentes teores e é
responsável por seu sabor levemente adocicado. É essencialmente produzido por secreções
mamárias e é sintetizado da glicose absorvida pelo sangue (FOX & MCSWEENEY, 1998).
2.3.2 Sais minerais e vitaminas
O soro é portador de vitaminas e minerais. Vitaminas são substâncias químicas
orgânicas requeridas pelo organismo, mas que não podem ser sintetizadas pelo corpo (FOX &
MCSWEENEY, 1998).
O soro contém também a maioria das vitaminas presentes no leite (e solúveis em
água), como a vitamina B12, a vitamina B6, ácido pantotênico, riboflavina, tiamina, vitamina
C, retinol (vitamina A). As quantidades destes compostos presentes no soro de queijo estão
apresentadas na Tabela 2.3 (LAGRANGE & DALLAS, 1997; MILLER et al., 2000).
Tabela 2.3: Quantidades médias de vitaminas e minerais em 100 g de soro doce em pó.
Constituinte Unidades Quantidade
Vitaminas
Vitamina A IU 44
Vitamina C mg 1,5
Vitamina E mg 0,03
Tiamina (B1) mg 0,5
Riboflavina (B2) mg 2,2
Piridoxina (B6) mg 0,6
Vitamina B12 mcg 2,4
Ácido pantotênico mg 5,6
Niacina mg 1,3
Minerais
Cálcio mg 796
Fósforo mg 931
Sódio mg 1079
Potássio mg 2080
Magnésio mg 176
Zinco mg 1,97
Fonte: adaptado de MILLER et al. (2000).
10 FUNDAMENTOS TEÓRICOS E REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
Os sais de leite são principalmente fosfatos, citratos, cloretos, sulfatos, carbonatos,
bicarbonato de sódio, potássio, cálcio e magnésio. São encontrados aproximadamente 20
outros elementos no leite em quantias menores, inclusive cobre, ferro, silício, zinco e iodo.
Os elementos principais são de importância para a nutrição, na preparação, processamento e
armazenamento de produtos de leite devido à influência na conformação e estabilidade das
proteínas do leite (FOX & MCSWEENEY, 1998; BYLUND, 1995).
O soro e os concentrados de soro são primorosas fontes de cálcio, magnésio e fósforo,
como pode ser observado na Tabela 2.3. Na indústria de alimentos ingredientes de soro
podem ser incorporados a produtos fortificados, aumentando, desta forma, o teor de nutrientes
minerais do produto final (MATTILA-SANDHOLM & SAARELA, 2003).
2.3.3 Proteínas
As proteínas são polímeros constituídos por monômeros denominados aminoácidos;
cada um deles possui um grupo amina (NH
2
) e um grupo carboxila (COOH) unidos ao mesmo
átomo de carbono (SGARBIERI, 1996).
Uma molécula de proteína consiste em uma ou mais cadeias de aminoácidos
interligadas onde os aminoácidos são organizados em uma ordem específica. Uma molécula
de proteína normalmente contém ao redor de 200 aminoácidos unidos (BYLUND, 1995).
Quando a caseína é retirada do leite por algum método de precipitação, em solução
resta um grupo de proteínas que são chamadas proteínas do soro, proteínas solúveis, soro-
proteínas ou não-caseínas. A quantidade de proteínas encontradas no soro varia de 0,7 a 1,2 %
da sua composição média e equivale à cerca de 20 a 25 % do total de proteínas encontradas no
leite (MIZUBUTI, 1994; FOX & MCSWEENEY, 1998).
A fração protéica do soro contém um grupo de proteínas globulares: β-lactoglobulina
(β-Lg), α-lactoalbumina (α-La), Albumina do soro bovino (BSA), Imunoglobulinas (Ig),
Lactoferrina, Lactoperoxidase, Glicomacropeptídeos, Proteose-peptonas, entre outras.
As proteínas do soro em maior concentração são a β-Lg e α-La, elas constituem de 70
a 80 % das proteínas totais do soro (MATTILA-SANDHOLM & SAARELA, 2003).
A Tabela 2.4 apresenta as propriedades das proteínas do soro, tais como: a massa
molar, ponto isoelétrico e as concentrações médias no soro.
FUNDAMENTOS TEÓRICOS E REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 11
Tabela 2.4: Propriedades e concentração das proteínas do soro.
Proteína Massa molar (kDa) Ponto isoelétrico Concentração (g. L
-1
)
β-Lg
18,3 5,2 2,0-4,0
α-La
14,1 4,2 - 4,8 0,6-1,7
BSA 69,0 4,7 - 4,9 0,1-0,4
Ig 15,0 – 160,0 5,5 - 8,3 0,6-1,0
Proteose-Peptonas 4,1 – 80,0 3,3 - 3,7 1,4
Lactoferrina 78,0 9 0,1
Lactoperoxidase 89,0 9,5 0,02
Glicomacropeptídio 7,0 - 0,01
Fonte: adaptada de MILLER et al. (2000); ZYDNEY (1998).
Dentre todas as proteínas presentes no soro, este trabalho visa recuperar e separar as
proteínas em maior concentração, isto é, a β-lactoglobulina e a α-lactoalbumina.
β-Lactoglobulina (β-Lg)
A proteína mais abundante no soro é β-lactoglobulina, que representa 10 % da
proteína total do leite ou aproximadamente 50 % da proteína do soro. Contém 162
aminoácidos com uma massa molar de 18,362 kDa (YADA, 2004).
A β-Lg tem diferentes variantes, sendo as principais a A e a B. A β-Lg variante A
difere da variante B, em dois aminoácidos: aspartato (posição 64) e valina (posição 118).
Estes aminoácidos são substituídos na β-Lg B, pela glicina e pela alanina. Ambas têm
resíduos de cisteínas (WIT, 1998; YADA, 2004). Segundo WONG et al. (1999) existem estudos
que destacam a presença de outras variantes genéticas: C, D, E com diferentes mobilidades
eletroforéticas.
β-Lg é produzida especificamente na glândula mamária. O leite de todo ruminante
contém β-Lg enquanto que a maior parte do leite dos não ruminantes, por exemplo, o leite
humano, não possui (YADA, 2004).
A cadeia de β-Lg possui vários pontos de ligação para minerais, vitaminas
lipossolúveis e lipídios. Estes pontos de ligação podem ser usados para incorporar compostos
lipofílicos desejáveis como tocoferol e retinol (vitamina A). A β-Lg também se liga ao cálcio
e zinco (FOX & MCSWEENEY, 1998). Segundo YADA (2004) a molécula pode ligar-se a
lipídios ácidos e não polares e acontece preferencialmente em meios alcalinos.
Foram especuladas funções biológicas para a existência da β-Lg, mas nenhuma foi
aceita completamente. Alguns especulam que a ligação com a Vitamina A pode ter um papel
regulador na glândula mamária (YADA, 2004).
A β-Lg possui na sua estrutura um grupo tiol livre, que lhe permite a associação a
outras proteínas hidrofóbicas, e duas pontes dissulfeto internas. A conformação da β-Lg
depende do pH, como pode ser observado na Figura 2.2. A complexa associação-dissociação
12 FUNDAMENTOS TEÓRICOS E REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
da β-Lg tem sido objeto de diversos estudos (YADA, 2004; WONG et al., 1999). Para valores
de pH compreendidos entre 5,20 (ponto isoelétrico) e 7,50 (faixa que compreende o pH do
leite e do soro) e à temperatura ambiente, todas as variantes genéticas investigadas de β-Lg
existem principalmente como um dímero estável de dois monômeros unidos por ligações não
covalentes, com massa molar de 36,7 kDa. O dímero consiste em duas esferas com raios de
17,9 Ǻ e uma distância de centro a centro de 33,5Ǻ (WONG et al., 1999).
Figura 2.2: Variação da conformação da β–Lg em função do pH (VISSER & JERUNINK, 1997 apud RODRIGUES,
2001).
O monômero de 18,3 kDa só existe em pHs inferiores a 3,0 ou acima de 8,0. Para
valores de pH inferiores a 3,5 as estruturas quaternárias dissociam-se reversivelmente em
monômeros devido à forças eletrostáticas repulsivas muito fortes. O dímero dissocia-se em
monômeros, com uma extensão de dissociação que ocorre conforme o pH vai baixando.
Existe, portanto um rápido equilíbrio monômero-dímero. A constante de dissociação da
reação varia de acordo com a variante genética, temperatura, pH e força iônica (WONG et al.,
1999).
Em meio alcalino a dissociação dos dímeros também acontece, existe um equilíbrio
entre os pHs 6,9 e 8,8. Mudanças conformacionais reversíveis acompanham esta dissociação
indicada por mudanças da rotação e dispersão rotatória óptica (WONG et al., 1999).
Entre os pHs 3,7 e 5,1, em elevadas concentrações da proteína, os dímeros de ambos
variantes A e B associam-se para formar octômeros com polimerização máxima em pH 4,6. A
associação é rápida, conforme indicam estudos da velocidade de sedimentação, e a constante
de equilíbrio da reação diminui com o aumento da temperatura. Além de acontecer a
octomerização ocorre associação de monômero-dímero (WONG et al., 1999; YADA, 2004).
Uma dependência do pH com a octomerização máxima no pH 4,6 sugere que grupos
carboxila estão envolvidos, com uma possível formação de pontes de hidrogênio entre os
grupos carboxila protonados. É conhecido que quatro grupos carboxila do monômero são
protonados neste pH (WONG et al., 1999; YADA, 2004).
FUNDAMENTOS TEÓRICOS E REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 13
A 0 °C podem ser observados alguns intermediários como tetrâmeros e hexâmeros
(WONG et al., 1999).
Apesar deste efeito de carga, a estrutura nativa da proteína não é alterada, mesmo a
temperaturas superiores a 80 ºC até pH 8,6. Em pH neutro e temperaturas até 70 °C a
desnaturação é reversível. Para valores de pH superiores a 8,6, ocorre uma desnaturação
irreversível da proteína, devido à alterações nas propriedades físico-químicas da proteína
(WIT, 1998).
A principal proteína contendo grupos sulfídricos no leite é a β-Lg, normalmente este
grupo sulfídrico está “enterrado” dentro da molécula e não é reativo. Na desnaturação por
calor a cerca de 75
°
C, por exemplo, o grupo -SH da β-Lg é exposto e reage com a caseína (e
provavelmente com a α-La) com efeitos muito significativos em algumas das propriedades
físico-químicas tecnologicamente importantes do leite, por exemplo estabilidade do leite ao
calor e coagulação através da renina (FOX & MCSWEENEY, 1998). Devido à abundância desta
proteína no leite bovino, em uma grande extensão as propriedades dos concentrados protéicos
de soro são, na verdade, as propriedades da β-Lg (YADA, 2004).
α-lactoalbumina (α-La)
A segunda proteína mais abundante no soro é a α-lactoalbumina que inclui
aproximadamente 2 % da proteína total do leite e 15 a 25 % da proteína total do soro. A
molécula consiste em 123 aminoácidos e tem uma massa molar de 14,1 kDa, e contém quatro
ligações dissulfeto e nenhum grupo fosfato (YADA, 2004).
O local de síntese da α-La é a glândula mamária, no leite humano representa 28 % do
teor total de proteínas (YADA, 2004; FOX & MCSWEENEY, 1998).
A α-La contém 8 grupos de cisteína, todos envolvidos em pontes dissulfetos internas e
4 resíduos de triptófano, com uma estrutura secundária ordenada e uma estrutura terciária
esférica e compacta. A α-La existe principalmente como uma molécula globular quase
esférica, compacta em meio neutro e alcalino. Sugere-se também que ela tenha formato de
elipsóide com cerca de 2,2 x 4,4 x 5,7 nm a 2,5 x 3,7 x 3,2 nm (WONG et al., 1999).
Quando são comparadas as seqüências de α-La e lisozima, são encontrados 40 % dos
resíduos iguais, incluindo todos os resíduos de cisteína, outros 20 % dos resíduos têm
estruturas semelhantes; estas informações sugerem que as moléculas são fortemente
relacionadas. Na realidade, o conhecimento da estrutura tridimensional de lisozima foi
utilizado para predizer a estrutura tridimensional da α-La (YADA, 2004).
A α-La é encontrada em duas variantes genéticas A e B. A variante B consiste em 123
resíduos de aminoácido com massa molar de 14,174 kDa e a variante A difere disto tendo
glicina em vez de arginina na posição 10. A α-La é necessária para a síntese de lactose devido
a sua interação com a enzima galactosetransferase, sem a α-La, a glicose é um substrato
extremamente pobre para esta enzima (WONG et al., 1999).
14 FUNDAMENTOS TEÓRICOS E REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
A α-La é uma metalo-proteína com um átomo de cálcio que lhe possibilita a ligação a
outras proteínas, tendo por isso tendência a polimerizar. Se, por exemplo, existir um grupo -
SH livre em outra molécula (como por exemplo na β-Lg), este reage com uma das pontes S-S
presente na α-La originando assim uma associação de proteínas. Em valores de pH inferiores
a 5,0 ocorre uma mudança na estrutura da proteína, uma vez que a acidificação do meio
conduz à liberação do íon Ca
2+
, a uma desnaturação reversível e a um processo de agregação,
sendo este mais acentuado em temperaturas próximas dos 55 ºC (WIT, 1998).
A α-La é uma molécula que é mais estável ao calor na presença de cálcio, de todas as
proteínas do soro é a mais estável termicamente. A maioria das proteínas aumenta a
sensibilidade ao calor na presença de cálcio; isto ocorre provavelmente devido à habilidade do
cálcio de promover a formação de ligações iônicas intermoleculares com a maioria das
proteínas, estas ligações mantêm as moléculas próximas e aumentam a probabilidade de
agregação ao aquecer. Por outro lado, α-La utiliza o cálcio para formar laços iônicos
intramoleculares que tendem a fazer a molécula resistente ao desdobramento térmico. Em
condições favoráveis de concentrações de cálcio e pH, a α-La pode permanecer solúvel depois
de exposição a 100
o
C (YADA, 2004).
A remoção do cálcio da α-La produz mudanças conformacionais profundas
equivalentes ao que ocorre na desnaturação ácida. Em valores de pH neutro ou alcalino, e na
ausência de grupos tióis em solução, os íons OH
-
atacam as pontes S-S, levando à formação de
dihidroalanina, de H
2
S e de ácido cisteíco, os quais são responsáveis por acelerar o processo
de desnaturação da proteína (WIT, 1998).
A α-La interatua com lipídios não polares e ácidos, tal como a β-Lg, mas
preferencialmente em meios fortemente ácidos (WIT, 1998).
Em valores de pH abaixo do ponto isoelétrico é possível que α-La associe-se para
formar dímeros e trímeros. A associação é rápida e reversível, dependente da temperatura,
sendo, maior aos 10 °C do que aos 25 °C. A agregação também depende da força iônica e da
concentração, com pequena agregação abaixo de 1 % de proteína. Esta associação e agregação
é atribuída a mudança conformacional da molécula da proteína abaixo do pH 4, e ocorre
devido a uniões hidrofóbicas que é o resultado da mudança de conformação e decréscimo da
barreira eletrostática. Em valores de pH alcalinos, embora nenhuma associação observável ou
agregação aconteça, são observadas algumas mudanças na configuração, como a dispersão
óptica rotatória em pH 11,5 (WONG et al., 1999).
Segundo SMITH (2003), nas condições iônicas do leite a α-La encontra-se como um
monômero.
Outras Proteínas
Além da β-Lg e da α-La outras proteínas são encontradas no soro de leite. Estas
proteínas são consideradas proteínas minoritárias ou secundárias por estarem presentes em
quantidades pequenas.
FUNDAMENTOS TEÓRICOS E REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 15
A Albumina de Soro Bovina (BSA), isolada do leite, é idêntica à molécula do soro
sanguíneo. Assim, BSA não é sintetizada na glândula mamária, mas está presente na
circulação sangüínea. A proteína tem uma massa molar de 69 kDa, não contém fósforo,
contém 17 dissulfetos e um grupo sulfídrico livre. As moléculas têm locais de ligações
específicos para moléculas hidrofóbicas, ligam-se a ácidos graxos e outras moléculas
pequenas como metais (YADA, 2004).
As Imunoglobulinas (Ig) incluem pelo menos 2 % da proteína total do leite. Há quatro
classes de Ig encontradas em leite, devido a sua micro-heteregoneidade são caracterizadas
pelos determinantes antigênicos: IgG1, IgG2, IgA e IgM. Todas estas moléculas têm uma
estrutura básica semelhante compostas de cadeias leves com massas molares de 20 a 25 kDa e
duas cadeias pesadas, com massas molares de 50 a 70 kDa (YADA, 2004). O colostro, i.e., o
leite obtido imediatamente após o parto pode conter até 100 vezes o nível de Ig do leite do
meio da lactação. As Igs provêm imunidade para os recém nascidos através do colostro; esta
proteção ocorre até que o animal seja adulto o bastante para sintetizar seus próprios
anticorpos.
A Lactoferrina é a mais notável proteína que se liga ao ferro (2 mols de ferro / 1 mol
de proteína), mas também pode ligar-se ao Cu
2+
, Mn
3+
, Co
3+
e Zn
2+
. A Lactoferrina é
produzida na glândula mamária, mostrou-se útil para inibir o crescimento de bactérias. A
atividade bacteriostática da Lactoferrina está sendo estudada visando o uso potencial da
substância como conservante natural. Ainda possui outras características, incluindo efeitos
antioxidantes e fortalecimento do sistema imunológico (FOX & MCSWEENEY, 1998).
A Lactoperoxidase é uma enzima que degrada o peróxido de hidrogênio, é um
componente nutracêutico do leite e produtos de soro com propriedades antibacterianas. A
Lactoperoxidase tem sido objeto de vários estudos visando sua utilização como meio de
controlar o desenvolvimento da acidez e mudanças de pH durante a estocagem de produtos de
leite resfriados (MATTILA-SANDHOLM & SAARELA, 2003, USDEC, 2002).
Existem ainda alguns polipeptídios (proteose-peptonas) resultantes da proteólise das
caseínas por enzimas do leite. Aproximadamente 1,1 % da proteína do leite total consistem
em proteose-peptonas, esta fração pode ser dividida em três componentes principais: PP3,
PP5 e PP8, e ainda são reconhecidos outros componentes secundários (YADA, 2004).
Finalmente, é possível também encontrar no soro glicomacropeptídeos (apenas no soro
doce), proteína biologicamente ativa que resulta da hidrólise da k-caseína pela enzima
quimosina (ou renina) presente no soro. O glicomacropeptídeo altera a produção de pigmentos
pelos melanócitos, atua como prebiótico e tem atuação imunomoduladora (MATTILA-
S
ANDHOLM & SAARELA, 2003).
16 FUNDAMENTOS TEÓRICOS E REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.4 Propriedades das Proteínas do Soro
As proteínas do soro têm elevado valor funcional e nutricional não encontrado em
outras proteínas utilizadas como aditivos na indústria alimentícia (a proteína de soja e de ovo,
por exemplo) e por isso é relevante abordar tais aspectos.
2.4.1 Propriedades Nutricionais
A proteína é um nutriente essencial ao organismo animal e humano e como tal, deve
estar presente na alimentação em quantidades adequadas. Além do aspecto quantitativo deve-
se levar em conta o aspecto qualitativo das proteínas (SGARBIERI, 1996).
Um fato importante a respeito da nutrição é que oito (nove para crianças) dos 20
aminoácidos não podem ser sintetizados pelo organismo humano, eles são chamados
aminoácidos essenciais. Como eles são necessários para manter o metabolismo, eles têm que
ser providos através da alimentação (BYLUND, 1995). Uma proteína equilibrada, ou de alta
qualidade, contém aminoácidos essenciais em proporções correspondentes às necessidades
humanas (FENNEMA, 1989).
A Organização das Nações Unidas para a Agricultura e Alimentação (FAO) e a
Organização Mundial de Saúde (WHO) especificaram a concentração ideal de aminoácidos
essenciais que devem ser incluídos na dieta humana (FENNEMA, 1989).
A Tabela 2.5 mostra a concentração de aminoácidos essenciais na proteína de
referência e nas proteínas do soro. As proteínas do soro de leite bovino são uma fonte
excelente de aminoácidos essenciais: comparando a concentração de referência com a das
proteínas do soro, pode-se observar que a fração protéica do soro contém mais aminoácidos
essenciais do que a proteína de referência.
Tabela 2.5: Concentração de aminoácidos essenciais na proteína de referência, nas proteínas do
soro, na β-Lg e na α-La.
Aminoácido Proteína de
Referência
Proteína
do Soro
β-Lg α-La
Triptófano 1,0 2,1 2,2 6,6
Fenilalanina+tirosina 6,0 7,3 7,3 9,6
Leucina 7,0 11,1 15,3 11,6
Isoleucina 4,0 6,8 6,7 6,8
Tionina 4,0 8,0 5,4 5,5
Metionina+cisteína 3,5 4,8 5,6 6,9
Lisina 5,5 9,9 11,7 11,4
Valina 5,0 6,8 5,9 4,8
Total 36,0 56,8 60,1 63,2
Fonte: adaptado de ZADOW (1992), MILLER et al. (2000)
O perfil de aminoácidos essenciais das proteínas do soro atende ou supera todas as
exigências qualitativas e quantitativas estabelecidas pela FAO/WHO. O teor de aminoácidos
essenciais de proteínas do soro é maior do que quaisquer outras fontes e correspondem a 60 %
do valor protéico total do soro. As proteínas do soro contêm níveis elevados de leucina, lisina,
FUNDAMENTOS TEÓRICOS E REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 17
em comparação ao isolado protéico de soja e a clara de ovo desidratada, ainda possuem uma
boa fonte de aminoácidos contendo enxofre, tais como cisteína e metionina (RICHARDS, 2002).
Observando a Tabela 2.5 também é possível verificar que, isoladamente, a β-Lg e a α-
La, têm um valor nutritivo superior ao da proteína de referência.
A qualidade, o valor ou o balanço de uma proteína alimentar além de depender do tipo
e da quantidade de aminoácidos essenciais, depende da sua digestibilidade; representa a
medida da eficácia com que pode ser utilizada pelo organismo. Portanto, além da
concentração de aminoácidos, devemos ter em conta a sua disponibilidade biológica. A
qualidade da proteína pode ser expressa pelos seguintes parâmetros: Valor Biológico (VB) - é
a porção da proteína que é retida e absorvida pelo organismo; Digestibilidade Protéica (PD) -
é a porção da proteína do alimento absorvida
．．．．．．．．．
; Utilização Protéica Líquida (Net Protein
Utilization-
NPU) - é a porcentagem de nitrogênio ou proteína dietética que é retida;
Coeficiente de Eficácia Protéica (Protein Efficiency Ratio- PER) é o ganho em massa obtido
por grama de proteína consumida e PDCAAS (Protein Digestibility Corrected Amino Acid
Score)
que é a medida da digestibilidade e disponibilidade de aminoácidos essenciais. Na
Tabela 2.6 são apresentados estes parâmetros relacionados às proteínas do soro, ao leite e à
caseína.
Tabela 2.6: Valores que representam a qualidade nutricional do leite e das suas frações
protéicas
.
Componente BV* PD NPU PER PDCAAS
Leite 91 95 86 3,1 1,21
Proteínas do Soro 104 100 92 3,6 1,15
Caseínas 77 100 76 2,9 1,23
*BV da proteína do ovo é definido como 100.
Fonte: adaptado de M
ILLER et al.(2000); YADA (2004).
Como pode ser observado na Tabela 2.6, comparadas as do leite e à caseína, as
proteínas do soro têm valores de BV, PD, NPU e PER maiores e valor de PDCAAS
comparável, mostrando a elevada qualidade deste tipo de proteína. Devido ao seu elevado
valor biológico são necessárias apenas 14,5 gramas de proteínas do soro por dia para
satisfazer as necessidades diárias protéicas, em comparação com 17,4 gramas de proteína do
ovo (L
AGRANGE & DALLAS, 1997).
Assim, devido à quantidade de aminoácidos essenciais e da elevada qualidade
protéica, as proteínas do soro podem aumentar o valor nutricional dos alimentos usados na
dieta humana. Muitas proteínas do soro são associadas a funções imunes ou digestivas. Além
disso, o soro de leite é uma fonte natural de Ig e de BSA e, como tal oferece proteção contra
infecções, pois estimula a produção de linfócitos. Proteínas do soro secundárias como a
Lactoferrina e a Lactoperoxidase são consideradas proteínas antimicrobianas (YADA, 2004).
Recentemente, têm sido atribuídas às proteínas do soro propriedades funcionais
fisiológicas, capazes de produzir um importante controle na modulação do metabolismo e nos
18 FUNDAMENTOS TEÓRICOS E REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
mecanismos de defesa dos organismos animal e humano (SGARBIERI & PACHECO, 1999;
MATTILA-SANDHOLM & SAARELA,2003).
Ainda, existem estudos sobre o possível papel da α-La na formulação de agentes
antitumorais. Uma das funções in vivo da β-Lg parece ser a fixação de retinol e seu transporte
ao intestino delgado. A β-Lg e o BSA também podem fixar ácidos graxos (MATTILA-
SANDHOLM & SAARELA,2003).
2.4.2 Propriedades Funcionais
Além das propriedades nutricionais, as proteínas do soro do leite são conhecidas pela
versatilidade de suas propriedades funcionais tecnológicas como ingredientes em produtos
alimentícios.
As propriedades funcionais das proteínas do soro são as propriedades físico-químicas,
que contribuem para obter uma determinada característica no produto alimentar final em que
são inseridas (SGARBIERI, 1996).
As proteínas do soro têm propriedades físicas e funcionais no seu estado nativo e após
tratamento físico, químico ou enzimático (absorção de água, solubilidade, emulsificação entre
outras), devido às várias estruturas conformacionais que possuem e/ou adquirem. São
moléculas estruturalmente ordenadas e qualquer alteração nessa conformação leva à
desnaturação. As principais causas são: calor, mudanças de pH, radiação ultravioleta,
concentração salina, luz ou ação mecânica. A desnaturação causa uma modificação da
conformação globular ou pregueada das proteínas para a forma linear, causando, assim, um
desenrolamento da cadeia peptídica. O resultado é a formação de novos enlaces entre
moléculas, que tornam as proteínas quimicamente mais reativas (SGARBIERI, 1996; BYLUND,
1995).
Depois de uma desnaturação fraca, as proteínas às vezes podem voltar ao estado
original, com restauração das suas propriedades originais. Em muitos casos, porém, a
desnaturação é irreversível (B
YLUND, 1995).
O fenômeno da desnaturação não implica necessariamente diminuição da
digestibilidade das proteínas nem à diminuição do seu valor biológico, porque a desnaturação
promove a exposição de resíduos de aminoácidos essenciais, anteriormente protegidos da
ação gástrica. Atualmente sustenta-se a hipótese de melhor digestibilidade da proteína
desnaturada (P
EREIRA, 2002; SGARBIERI, 1996; BYLUND, 1995).
Descrevem-se a seguir outras propriedades funcionais importantes das proteínas do
soro (ZADOW, 1992; HUFFMAN, 1996; YADA, 2004).
- Solubilidade
– as proteínas do soro têm uma elevada solubilidade numa grande gama
de valores de pH, desde que não tenham sido termicamente desnaturadas. A elevada
FUNDAMENTOS TEÓRICOS E REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 19
solubilidade destas proteínas a valores de pH ácido é importante na sua aplicação em bebidas,
pois permitem um acréscimo de viscosidade e turbidez.
- Adsorção de água e viscosidade – quando comparadas com outras proteínas, as do
soro têm uma viscosidade baixa, o que permite a sua incorporação na produção de produtos
dietéticos. As proteínas concentradas do soro são geralmente muito solúveis e, portanto não
têm grande capacidade de adsorver água na sua forma nativa. O tratamento térmico causa
desnaturação aumentando a sua capacidade de retenção de água, bem como a sua viscosidade.
Assim, as aplicações de produtos protéicos do soro como retentores de água e espessantes,
restringem-se aos alimentos que recebam tratamentos térmicos, como, por exemplo, produtos
de carne, sopas, bolos, entre outros.
- Gelificação – sob condições apropriadas de aquecimento, as proteínas concentradas
do soro formam géis de uma forma irreversível, aumentando a capacidade de reter água e/ou
outras moléculas. Podem ser aplicados na indústria alimentar para aumentar a capacidade de
retenção de água e alterar a textura dos alimentos, como a elasticidade, a coesividade e a
dureza.
- Emulsificação – as proteínas do soro podem atuar como emulsificantes, pois têm
regiões hidrofóbicas e hidrofílicas. Esta propriedade, bem como o fato de se manterem
solúveis em valores de pH ácido, permite a sua aplicação em molhos para saladas, café e
formulações para crianças.
- Formação de espumas – a capacidade espumante das soluções de proteínas do soro
aumenta com o tratamento térmico, uma vez que as proteínas do soro são melhores
espumantes quando desnaturadas. A estabilidade da espuma depende do tipo de proteína,
nível de desnaturação da proteína, conteúdo em gordura, concentração de proteína e
carboidratos, concentração de cálcio e outros íons, pH, bem como do método e equipamento
de processamento do soro. Esta propriedade é desejável em alguns produtos como merengues
e sorvetes e indesejável em produtos como fiambres e sucos de fruta fortificados.
2.5 Produtos Derivados do Soro de Queijo
Um tratamento do soro do leite que alie custo e eficiência é o problema principal dos
fabricantes de queijo apesar da variedade de técnicas disponíveis. Os caminhos possíveis de
minimização deste efluente foram descritas por ZADOW (1992):
-aplicação de técnicas que minimizem a produção do soro durante fabricação de
queijo;
-uso do soro de leite como um subproduto valioso na indústria de alimentos;
-produção de petroquímicos tais como o metano e o metanol;
-produção do ácido láctico e dos seus derivados;
-produção de plásticos e de polímeros biodegradáveis;
-o tratamento do soro como um efluente.
20 FUNDAMENTOS TEÓRICOS E REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
Cerca da metade do soro produzido no mundo é eliminado como efluente ou utilizado
como adubo no solo ou em sistemas hídricos, resultando numa perda importante de energia
alimentar, bem como criando uma grande perda econômica; a outra metade é processada em
vários produtos alimentares retornando à alimentação animal ou humana, bem como para a
produção de medicamentos e outros produtos de interesse (RODRIGUES, 2001; MIZUBUTI,
1994).
As tecnologias de processamento de soro têm crescido exponencialmente nos últimos
dez anos devido ao desenvolvimento dos processos de separação com membranas e dos
métodos de troca iônica, bem como a um melhor entendimento do soro como matéria-prima.
O soro como matéria-prima pode conferir à tecnologia alimentar novas potencialidades
devido às propriedades nutricionais e funcionais das suas proteínas (HUFFMAN, 1996).
Na alimentação humana o soro pode ser utilizado na forma líquida, condensada ou em
pó. O soro líquido pasteurizado fresco é raramente usado em indústrias de alimentos, devido
ao alto custo de transporte e a suscetibilidade para deterioração durante armazenamento
(MILLER et al., 2000).
O soro líquido possui vida útil muito curta, quando não são tomadas medidas de
conservação adequadas, devido à grande proliferação microbiana. Portanto, deve-se usar
refrigeração e/ou adição de conservantes (VIEIRA et al., 1985).
Além do mais, o soro integral deve ser evitado para o consumo direto devido ao seu
alto conteúdo em lactose, que pode provocar problemas de intolerância a determinados
indivíduos, além da dificuldade de aceitação sensorial do produto que possui alto teor de
cinzas. O soro de queijo é utilizado na sua forma bruta principalmente como alimento animal
(MORESI, 1994).
Dentre as alternativas para o uso do soro líquido podem ser citadas a fabricação de
ricota e a fabricação de bebidas lácteas (W
ONG et al., 1999).
A produção de soro em pó, bem como a concentração e fracionamento das proteínas
com posterior secagem é uma das opções para utilização do soro de leite, e serão apresentadas
nas próximas seções.
2.5.1 Soro em pó
O soro em pó é a forma mais satisfatória para o uso do soro de leite em alimentos, é
obtido removendo aproximadamente 95 % da umidade do soro, mas que contém todos os
constituintes nas mesmas proporções relativas ao soro original. Desta forma o soro pode ser
armazenado por um tempo maior sem danos para suas propriedades nutricionais, além de
reduzir os custos de transporte e aumentar a qualidade do produto podendo ser modificado
e/ou misturado a outros produtos servindo a propósitos específicos (MILLER et al., 2000;
HUFFMAN, 1996).
FUNDAMENTOS TEÓRICOS E REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 21
O soro em pó pode ser usado como aditivo em vários gêneros alimentícios destinados
ao consumo humano. Soro em pó não higroscópico é um excelente veículo não-aglutinante de
fácil dispersão muito usado em misturas secas, é muito utilizado em produtos de panificação,
salgadinhos, sorvetes e sobremesas lácteas. No que se refere aos dois primeiros produtos, a
utilização do soro de leite em pó intensifica o desenvolvimento de cor durante o cozimento e
forneamento a alta temperatura, além de aumentar o volume dos pães e também é uma fonte
econômica de sólidos lácteos. Já nos sorvetes e sobremesas lácteas, o uso do soro ajuda a
formar espumas estáveis e facilita aeração (BYLUND, 1995).
Segundo CRISTIANINI & ROIG (1987), O iogurte que recebeu adição de soro em pó em
níveis de 0,7 a 1,5 % apresentou melhor viscosidade, menor tempo de coagulação, melhor
firmeza e não apresentou sinerese. E, ainda, o produto acrescido de soro é mais nutritivo
possuindo maior teor protéico e vitamínico.
Segundo USDEC (2002), melhorias em sabor são observadas quando o soro de leite
substitui amido ou outro emulsificante adicionado ao iogurte.
Existem várias metodologias para obter soro em pó. O processamento do soro líquido
para transformação em produto seco pode ser observado na Figura 2.3.
Figura 2.3:Fluxograma do processamento do soro de queijo em pó. (Fonte: BYLUND, 1995).
O soro fluido é filtrado para recuperar a gordura e a caseína residuais (a centrifugação
também pode ser utilizada). Após esta filtração inicial o soro é pasteurizado, com o objetivo
principal de destruir microrganismos patogênicos, eventualmente presentes, e interromper a
22 FUNDAMENTOS TEÓRICOS E REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
conversão da lactose em ácido láctico, todo soro para uso humano deve ser pasteurizado
(MILLER et al., 2000).
A concentração de soro acontece tradicionalmente através de evaporadores (85 °C),
mas plantas de OI (osmose inversa) também são utilizadas para a pré-concentração. Depois da
evaporação o fluido atinge 45 a 65 % de sólidos totais. O concentrado é resfriado rapidamente
para 30 °C em um trocador de calor de placas. O concentrado é transferido para um tanque de
resfriamento com agitação por 6 a 8 horas até atingir 15 a 20
o
C. O resfriamento deve ser
lento para que se formem cristais finos para evitar um produto higroscópico na etapa de
secagem (BYLUND, 1995). A operação de centrifugação é opcional. No caso de produção de
soro de leite com teor de lactose reduzido, os cristais de lactose formados são removidos por
centrifugação.
A secagem do soro é basicamente a mesma que a usada para a fabricação do leite em
pó, isto é em secadores de tambor ou spray driers. O uso de secadores de tambor envolve um
problema: a difícil raspagem da camada de soro que se adere à superfície do tambor. O spray
drier
é amplamente utilizado para este fim, porém, o elevado custo para a desidratação do
soro limita sua adoção como prática comum em pequenos estabelecimentos (MORESI, 1994;
BYLUND, 1995).
Algumas limitações nas propriedades funcionais de soro seco para uso direto em
alimentos, principalmente as altas concentrações de sais e lactose, conduziram ao seu
fracionamento. Recentes desenvolvimentos de técnicas de separação molecular como
ultrafiltração, osmose inversa, filtração gel, eletrodiálise, e troca de íons tornaram possível o
fracionamento, modificação e a utilização dos produtos derivados de soro em uma variedade
de produtos de forma mais adequada (WONG et al., 1999).
Os produtos obtidos a partir do fracionamento do soro, dependendo do processamento
a que são submetidos, geram produtos com características diferentes do soro em pó
propriamente dito. A Tabela 2.7 apresenta as características dos principais produtos derivados
do soro.
Tabela 2.7: Caracterização dos principais produtos derivados do soro de queijo.
Produto Proteína (%) Lactose (%) Gordura (%) Sais (%) Umidade (%)
Soro em pó 10-15 63-75 1,0-1,5 8,2-8,8 3,5-8,0
Soro em pó
deslactosado
18-24 52-58 1,0-4,0 11,0-22,0 3,0-4,0
Soro em pó
desmineralizado
11-15 70-80 0,5-1,8 1,0-7,0 3,0-4,0
CP 35 34-36 46-52 3,0-4,5 6,5-8,0 3,0-4,5
CP 50 50-52 33-37 5,0-6,0 7,5-8,5 3,5-4,5
CP 65 63-65 20-23 5,0-6,0 3,0-7,0 3,5-4,5
CP 80 80-82 4-8 4,0-8,0 3,0-4,0 3,5-4,5
IP > 90 0,5-1,0 0,5-1,0 2,0-3,0 3,5-4,5
Lactose - > 99 - 0,3 1
*CP – Concentrado Protéico; IP – Isolado Protéico. (%) percentual mássico em base seca
Fonte: adaptado de YADA (2004); BYLUND (1995); USDEC (2002).
FUNDAMENTOS TEÓRICOS E REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 23
Quando o conteúdo de lactose original do soro é reduzido obtém-se como produto
resultante soro em pó deslactosado ou soro em pó com teor reduzido de lactose.
Semelhantemente, processos, como a eletrodiálise, podem ser usados pra reduzir o conteúdo
mineral do soro, obtendo como produto o soro desmineralizado (BYLUND, 1995).
O soro em pó deslactosado é empregado principalmente em queijos processados,
molhos e carnes industrializadas como alternativa para o soro em pó, nos casos em que são
desejadas concentrações mais baixas de lactose e mais elevadas de proteínas. Além do mais,
muitas pessoas estão limitando o uso de lactose devido à dificuldade para digeri-la, síndrome
conhecida como intolerância à lactose (LAGRANGE & DALLAS, 1997).
O soro em pó desmineralizado é utilizado amplamente em fórmulas infantis, bem
como em coberturas aeradas, sobremesas congeladas e em produtos de confeitaria. Nestas
aplicações o alto teor de lactose é usado como fonte conveniente de carboidratos. O soro
desmineralizado também acrescenta flavor lácteo agradável sem perturbar o equilíbrio de
minerais do produto final (L
AGRANGE & DALLAS, 1997).
Os minerais de leite são usados para fortificação de alimentos e bebidas com cálcio
(Y
ADA, 2004; MATHEWS, 1984).
A lactose por ser fonte de material energético pode ser utilizada para diversos
processos biotecnológicos e como componente utilizado na indústria alimentícia. É um
componente essencial na produção de produtos de leite fermentado, afeta a textura de certos
produtos concentrados e congelados; é altamente envolvida em mudanças de cor e sabor
induzidas pelo calor em produtos de leite aquecidos. Há ainda os fins farmacêuticos, pois a
lactose confere compressibilidade, fluidez e dureza na confecção de comprimidos,
revestimento de pílulas e na produção de cosméticos (FOX & MCSWEENEY, 1998; GIROTO &
PAWLOWSKY, 2001).
2.5.2 Produtos Protéicos do Soro (Concentrados e Isolados
Protéicos)
Os componentes mais valiosos do soro são as proteínas, mas como a sua concentração
neste líquido é muito reduzida são necessárias etapas de concentração, para que as suas
propriedades funcionais sejam realçadas (H
UFFMAN, 1996).
O desenvolvimento de técnicas de fracionamento, de modificação e de preservação
das proteínas do soro pode contribuir para a recuperação desse nutriente, assim como
melhorar a expressão de suas propriedades funcionais. O fracionamento do soro em lactose e
proteínas do leite representa um expediente que permite a utilização dos constituintes de
maior importância comercial presentes no soro de leite.
Quando um produto de soro tem 25 % ou mais de proteínas em base seca é
denominado concentrado protéico do soro (CP). Os CP podem ser classificados com base na
24 FUNDAMENTOS TEÓRICOS E REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
sua composição. Geralmente são agrupados de acordo com o seu conteúdo em proteína (em
base seca) como pode ser observado na Tabela 2.7 (LAGRANGE & DALLAS, 1997).
Os CP mais comuns têm um teor de proteína de 35, 50, 65 e 80 %, em base seca.
Quando o grau de purificação protéica é maior que 90 % (em base seca) o produto é
denominado de isolado protéico (IP) (YADA, 2004; MATHEWS, 1984).
Os CP têm uma vasta aplicação na indústria alimentar pela funcionalidade que podem
conferir aos alimentos. A Tabela 2.8 resume as propriedades funcionais e as principais
aplicações industriais dos CP. O uso de proteínas do soro como ingredientes em alimentos
funcionais lácteos e não lácteos está aumentando progressivamente conforme tem aumentado
a capacidade tecnológica da indústria para produzir CP, IP ou, mais recentemente, frações
enriquecidas em proteínas do soro individuais (R
ICHARDS, 2002).
Tabela 2.8: Propriedades funcionais que os concentrados protéicos conferem aos alimentos
Propriedade funcional Setor alimentar Percentual de proteína no
CP
Viscosidade Sobremesas CP 35
Solubilidade, estabilidade coloidal Bebidas CP 35
Emulsificação
Café, sopas, alimentos
infantis
CP 85
Formação de espumas Confeitaria CP 35
Gelificação Produtos lácteos CP 65
CP 65 Elasticidade Panificação
Coesão e adesão Produtos em pasta CP 85
Absorção de água e de gordura Produtos de carne CP 85
Fonte: adaptado de WITT (1998)
O IP possui excelentes propriedades de gelificação, aeração, emulsificação, retenção
de água e gordura. As principais aplicações de IP incluem produtos lácteos, de panificação e
de confeitaria, snacks, salgadinhos, aperitivos e carnes processadas (RICHARDS, 2002).
NIKAEDO et al. (2004) testaram o uso de concentrados protéicos de soro em
sobremesas lácteas substituindo o leite em pó. Os resultados mostram que é viável utilizar o
CP em substituição ao leite em pó, oferecendo um produto com menores teores de gordura e
de sólidos totais, e maior teor de proteínas. O produto apresentou melhor qualidade
nutricional, além da redução calórica, favorecendo seu consumo por pessoas preocupadas com
a saúde.
Segundo USDEC (2002), iogurtes produzidos com leite fortificado com CP apresentam
melhor textura e consistência. Um dos benefícios mais significativos ao substituir o leite
desnatado por CP é o resultado da redução no efeito da sinerese durante o período de
estocagem do iogurte.
Segundo NIKAEDO et al. (2004), o CP é adequado para substituir a gordura em
sobremesas lácteas congeladas (frozen yogurt), demonstrando que é possível elaborar uma
sobremesa láctea nutritiva, com substitutos de gordura e com boa aceitabilidade sensorial.
FUNDAMENTOS TEÓRICOS E REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 25
Para a produção de iogurtes light (sem gordura), um substituto de gordura é indicado
para prover a sensação de saciedade (mouthfeel), segundo USDEC (2002), iogurte com elevado
teor protéico (proteínas provenientes do soro) provoca uma diminuição do apetite quando
comparado com iogurtes com menor quantidade de proteínas, mas com igual valor calórico.
Conforme CASTRO et al. (2002), iogurtes probióticos de baixas calorias foram elaborados com
CP 35 % e CP 80 % sem prejuízos nas suas características físico-químicas e microbiológicas.
Os CPs também têm aplicação na saúde humana, uma vez que têm um elevado valor
nutritivo e, portanto, podem complementar e fortificar alguns alimentos, aumentando o valor
nutricional do produto. Assim, são muito úteis para incorporar em bebidas para esportistas,
porque ajudam no desenvolvimento ou formação de massa muscular do corpo humano. São
considerados atualmente como um dos componentes alimentícios mais adequados para as
dietas de fisiculturistas e atletas que desejam aumentar a sua massa muscular (RICHARDS,
2002; HUFFMAN,1996).
As proteínas do soro, devido aos aspectos nutricionais e fisiológicos, são amplamente
usadas em nutrição infantil; podem ser usadas em fórmulas enterais; na forma de proteínas
nativas ou pré-digeridas contribuindo com o ganho de peso em pacientes pós-cirúrgicos,
geriátricos e imobilizados; em uma dieta de alimentos de baixa caloria; e na substituição de
gordura, ou na formulação de alimentos e bebidas saudáveis (LEE, 1996; WIT, 1998;
MATTILA-SANDHOLM & SAARELA,2003).
Além do mais, o valor comercial de um concentrado protéico é de 3 a 40 vezes maior
que o do soro em pó, devido à maior especificidade do produto em nível funcional e ao
excelente valor nutritivo do mesmo (ZADOW, 1992).
2.5.2.1 Processos de Recuperação das Proteínas do Soro
Têm sido desenvolvidas metodologias que permitem a concentração de proteínas
relativamente aos outros componentes de natureza não protéica, visto que o soro não é uma
fonte equilibrada de nutrientes, contém um elevado teor de lactose e uma baixa concentração
de proteínas e cinzas, e não permite evidenciar nenhuma das propriedades das proteínas. A
seguir serão descritos os principais métodos usados atualmente para obter concentrados
protéicos e frações individuais de proteínas.
O maior desenvolvimento de tecnologias de separação sólido-líquido tem sido
utilizado pelas indústrias de laticínios para a recuperação das proteínas. Entre estas técnicas
podemos citar a adsorção em suporte insolúvel, a precipitação pelo calor, a precipitação por
agentes complexantes e os processos de separação com membranas, com especial atenção
para o processo de ultrafiltração (MIZUBUTI, 1994; MATTHEWS, 1984).
Desde 1981, a ultrafiltração se tornou a técnica mais utilizada para recuperar as
proteínas solúveis do soro. Os componentes de baixa massa molar (lactose, sais e água)
permeiam preferencialmente através das membranas de ultrafiltração, as quais retêm as
moléculas de proteína (retido). Na maioria das aplicações comerciais a ultrafiltração é
acompanhada de diafiltração, permitindo uma maior remoção de sais e lactose. O retido é
26 FUNDAMENTOS TEÓRICOS E REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
seco por spray drier. As proteínas de soro obtidas por separação de membrana possuem
propriedades funcionais boas, tais como solubilidade, capacidade de formar espuma, gel e
emulsão (FOX & MCSWEENEY, 1998).
A desnaturação térmica é um método tradicional para a recuperação de proteínas de
soro, onde a coagulação é ótima em pH 6 e aproximadamente 90 °C por 10 a 20 min. As
proteínas de soro coaguladas são recuperadas por centrifugação, porém têm baixa solubilidade
e funcionalidade limitada (FOX & MCSWEENEY, 1998; SCOPES, 1988).
As proteínas podem ser precipitadas normalmente através de polieletrólitos como
carboximetilcelulose. Processos técnicos para recuperação de proteínas de soro
freqüentemente fazem uso de tais substâncias ou de uma combinação de calor e ajuste de pH
(B
YLUND, 1995; CAPITANI et al., 2005).
Filtração por colunas cromatográficas (cromatografia de permeação gel) torna possível
o fracionamento de moléculas, inclusive proteínas. É possível separar a caseína e as proteínas
do soro através de filtração gel, mas o processo ainda é antieconômico em nível industrial
(F
OX & MCSWEENEY, 1998; YADA, 2004).
Preparações de proteína de soro altamente purificadas são industrialmente preparadas
através de cromatografia de troca iônica. As proteínas são adsorvidas em uma coluna de troca
iônica e após remoção da lactose são eluídas através do ajuste de pH. Os sais são retirados
através da osmose inversa e o produto é seco em spray drier (FOX & MCSWEENEY, 1998;
BOBRESHOVA et al., 2002).
2.5.3 Frações Purificadas das Proteínas Majoritárias do Soro
Devido às propriedades funcionais, fisiológicas e biológicas específicas de cada uma
das proteínas do soro, há um crescente interesse no fracionamento das proteínas, pois muitas
vezes estas características não se fazem notar nos CP devido às interações de outros
componentes (BRAMAUD et al, 1997 e ZYDNEY, 1998).
As duas principais proteínas do soro, α-La e β-Lg, são produzidas comercialmente
como frações de proteínas isoladas de pureza relativamente alta utilizando diversos
procedimentos patenteados ou registrados. A Tabela 2.8 mostra a composição de frações
industriais de α-La e β-Lg.
Tabela 2.9:Composição de frações industriais de α-La e β-Lg.
Proteína do Produto
Proteína bruta (%)
Produto rico em
α-La
Produto rico em
β-Lg
α-La 70,6 13,8
β-Lg 13,2 74,8
BSA + Ig 10,4 4,6
Outras proteínas 5,8 6,8
Fonte: RICHARDS (2002).
FUNDAMENTOS TEÓRICOS E REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 27
Estes tipos de produtos são utilizados como ingredientes alimentícios, tanto por
utilidade tecnológica como nutritiva, e são vendidos a preços elevados em lojas especializadas
de produtos para atletas e outras pessoas que precisam de dietas especiais (RICHARDS, 2002).
Conhece-se há muito tempo a capacidade única que tem a α-La para fixar cálcio. O
fato de que a α-La apresenta uma alta capacidade de renaturação e, em conseqüência tem uma
alta resistência ao tratamento térmico, se deve provavelmente a esta propriedade. Os
alimentos que contém α-La suficientemente pura e em uma quantidade elevada não se
coagulam por aquecimento, propriedade esta importante para o desenvolvimento de novos
produtos com alta concentração de proteínas do soro que sofram tratamento térmico
(RICHARDS, 2002).
Em nível funcional a β-Lg tem maior capacidade de gelificação que a α-La (ZYDNEY,
1998). A cadeia de β-Lg possui vários pontos de ligação para minerais, vitaminas
lipossolúveis e lipídios. Estes pontos de ligação podem ser usados para incorporar compostos
lipofílicos desejáveis como tocoferol e retinol (vitamina A) em produtos com baixo teor de
gordura. A β-Lg liga-se ao cálcio e zinco e apresenta homologia seqüencial parcial com
determinadas proteínas capazes de ligar retinol (FOX & MCSWEENEY, 1998). Segundo YADA
(2004) a molécula pode se ligar a lipídios ácidos e não polares.
A proteína do leite humano consiste em proteína do soro e caseína na proporção 70:30,
enquanto o leite de bovinos tem a proporção de 20:80. O componente protéico principal do
soro no leite humano é a α-La, o restante são BSA, Lactoferrina e Ig. A β-Lg, o componente
principal da proteína do soro de bovinos (50 %) não está presente no leite humano, porém a α-
La dos bovinos assemelha-se a do soro humano. Os substitutos de leite humano são
compostos formulados para imitar a relação soro:caseína do leite humano, quando o soro de
bovinos é adicionando na mistura resulta em elevadas concentrações de β-Lg que é um
alergênico em potencial. Assim, está crescendo o interesse de fabricar fórmulas infantis com
níveis reduzidos de β-Lg (OUTINEN et al., 1996).
Por outro lado, a fração enriquecida de β-Lg poderia ter aplicações em larga escala na
indústria de alimentos, devido a algumas excelentes propriedades funcionais, como por
exemplo, gelificação e capacidade de formar espuma (OUTINEN et al., 1996).
Entretanto, existe uma controvérsia em torno do papel da β-Lg bovina como proteína
com atividade fisiológica, já que por não estar presente no leite humano, poderia ser
alergênica para certas pessoas. Alguns indivíduos, particularmente as crianças, exibem uma
resposta alérgica às proteínas de leite bovinas ingeridas. Estudos indicam que em média 2 a 3
% da população infantil com menos de um ano de idade possui alguma alergia á proteína do
leite bovina. Esta sensibilidade não é restrita às crianças, uma pequena população de adultos
também pode ser vulnerável a esta condição (YADA, 2004).
A adição de α-La tem sido defendida como forma de “humanizar” fórmulas infantis e
criar outros produtos para pessoas que consomem ou podem ingerir apenas quantidades
limitadas de proteínas. Além do mais, a α-La tem 4 resíduos de triptófano por molécula e
28 FUNDAMENTOS TEÓRICOS E REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
devido à necessidade deste aminoácido para o desenvolvimento do organismo infantil, é mais
adequada para a formulação de alimentos para crianças do que os CPs (FOX & MCSWEENEY,
1998; ZYDNEY, 1998).
Embora quase toda publicidade em torno da alergenicidade da β-Lg tenha se
concentrado na produção de fórmulas infantis hipo-alergênicas, deve também se ter em conta
a alergenicidade que apresentam certos consumidores adultos a esta proteína, e a necessidade
de desenvolver produtos para este público (RICHARDS, 2002).
A hidrólise enzimática, a desnaturação induzida pelo calor em porções individuais das
proteínas do leite estão sendo investigadas como meios de reduzir a alergenicidade destas
proteínas (Y
ADA, 2004).
2.5.3.1 Processos de Fracionamento das Proteínas Majoritárias do Soro
Atualmente, existe um interesse comercial considerável na preparação das proteínas
individuais para alimentação e aplicações nutricionais e terapêuticas. Técnicas para isolar
proteínas de soro individuais à escala laboratorial por salting-out, permutação iônica e/ou
cristalização estão disponíveis a cerca de 40 anos. Assim, têm sido desenvolvidos vários
métodos de fracionamento de proteínas do soro, embora só alguns deles tenham aplicação em
nível industrial (ZYDNEY, 1998).
Estes produtos funcionais são fabricados mediante diversos processos, incluindo a
precipitação de ácidos ou bases, a troca iônica, ou as técnicas de separação por membranas, e
os produtos resultantes têm diferentes propriedades segundo o procedimento utilizado
(RICHARDS, 2002; GRANDISON & LEWIS, 1996).
Proteínas do soro eram originalmente isoladas pelo uso de várias técnicas de
precipitação, mas hoje em dia a tecnologia de separação por membranas e processos
cromatográficos são usados além das técnicas de precipitação com agentes complexantes
(SCOPES, 1988; ZYDNEY, 1998).
Na precipitação seletiva parâmetros como o pH, a temperatura e a concentração salina
podem ser manipulados de forma a se obter diferentes frações protéicas (ZYDNEY, 1998).
Uma estratégia para eliminar a β-Lg do soro é utilizar a baixa solubilidade da β-Lg em
valores de pH próximos do seu ponto isoelétrico. O soro sofre um pré-tratamento que inclui
ultrafiltração, desmineralização por eletrodiálise e ajuste do pH, de forma a precipitar a β-Lg,
ficando um sobrenadante rico em α-La em conjunto com outras proteínas (GRANDISON &
LEWIS, 1996).
Diversos métodos para o fracionamento da proteína do soro foram desenvolvidos,
alguns são baseados na solubilidade baixa da α-La entre os pH de 3,5 a 4,5; onde a β-Lg
permanece solúvel; outros métodos baseiam-se em precipitação pelo calor. Usando os
métodos da precipitação por calor, a β-Lg é recuperada facilmente por UF, mas a recuperação
FUNDAMENTOS TEÓRICOS E REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 29
do precipitado de α-La é difícil devido a sua baixa massa específica. Além disso, em soros
ácidos ocorre uma desnaturação significativa da α-La (OUTINEN et al., 1996).
ZYDNEY (1998) mostrou que, através de um sistema de membranas e com
modificações no pH e força iônica das soluções, é possível fracionar os constituintes protéicos
do soro, isto é, isolar β-Lg e α-La, BSA, Lactotransferrina, Lactoperoxidase e
Imunoglobulinas em frações distintas. Esta é uma técnica que poderá ter aplicação em larga
escala se as condições adequadas forem utilizadas.
BRAMAUD et al. (1997) mostrou que é possível isolar a α-La e a β-Lg de uma solução
de soro através de ajuste de temperatura e pH (pH 3,9; 55 °C por 30 min), associada a
centrifugação (4000 g, 30 min, 20 °C). Na fase solúvel permanece parte da β-Lg, lactose e
minerais e na fase precipitada α-La, BSA, Ig e β-Lg. Na fase solúvel a β-Lg é purificada
através de UF associada a DF, e a α-La é purificada por centrifugação e ressolubilização em
NaCl ou CaCl
2
obtendo, um grau de pureza de β-Lg e de α-La de 56 % e 79 %,
respectivamente.
A precipitação de α-La por acidificação de soro e proteína de soro concentrada foi
estudado por LUCENA et al. (2007). Três ácidos diferentes (HCl, ácido cítrico e ácido láctico)
foram considerados para a precipitação. Os dois ácidos orgânicos foram capazes de complexar
os íons de Ca
2+
, porém, quando ácido clorídrico foi usado, a precipitação ocorreu devido à
desnaturação irreversível das proteínas. Quando o processo de precipitação foi levado para um
valor de pH próximo ao ponto isoelétrico da α-La e foi combinado com complexação dos
íons cálcio, α-La precipitou juntamente com BSA e Ig. Enquanto, a β-Lg permaneceu em
solução devido à estabilização desta proteína em baixas concentrações de Ca
2+
.
2.6 Aproveitamento do Soro – Situação Mundial
Segundo ZADOW (1992) e BYLUND (1995), cerca de 120 a 130 milhões de toneladas de
soro de leite foram produzidas no mundo em 1990.
Nos últimos anos tem-se verificado um aumento da produção de soro devido a
produção mundial de queijo crescente, em virtude das exigências da população. Estima-se que
a produção de queijo aumente a uma taxa de 3 % ao ano (M
EIRELES, 1999 apud RODRIGUES,
2001). Como a existência de soro é fortemente condicionada pela produção de queijo, pode-se
deduzir que atualmente haja uma produção mundial de cerca de 180 a 190 milhões de
toneladas de soro.
Cerca da metade do soro produzido no mundo é eliminado como efluente em sistemas
hídricos ou como adubo no solo, resultando numa perda importante de energia alimentar, bem
como criando uma grande perda econômica (SISO, 1996; RODRIGUES, 2001; MIZUBUTI, 1994).
A outra metade é processada em vários produtos alimentares retornando à alimentação
animal ou humana, assim como para a produção de medicamentos e outros produtos. Sendo
que quase 50 % deste total são usados diretamente na forma líquida, 30 % na forma de pó, 15
30 FUNDAMENTOS TEÓRICOS E REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
% como lactose e o restante como concentrados de proteína (SISO, 1996; RODRIGUES, 2001;
MIZUBUTI, 1994).
A produção mundial estimada de proteínas de soro de elevada qualidade é de pelo
menos 600.000 toneladas (RODRIGUES, 2001).
Na Comunidade Econômica Européia aproximadamente 45 % do soro gerado é
utilizado na forma líquida, 30 % na forma de soro em pó, 15 % como lactose e derivados
desta e 10 % usado na produção de proteína concentrada (GIROTO & PAWLOWSKY, 2001). Em
1995 foram produzidas 230.000 toneladas de concentrados protéicos na Europa (MEIRELES,
1999 apud RODRIGUES, 2001).
Os Estados Unidos é o maior produtor mundial de soro em pó e derivados (GIROTO &
PAWLOWSKY, 2001). Mais de 25 % da produção mundial de soro em pó e de lactose –
800.000 toneladas – são fabricadas nas mais de 200 fábricas de processamento de soro que
existem neste país. Em conjunto, a indústria de soro dos EUA representa a maior fornecedora
de soro em pó do mundo (LAGRANGE & DALLAS, 1997).
Quase 60 % do soro e produtos de soro produzidos nos Estados Unidos em 1980 eram
usados em produtos alimentícios para humanos, mais de 80 % como soro em pó. Como
alimento animal, mais de 65 % do soro usado também era produto de soro em pó (WONG et
al
., 1999).
O uso de produtos de soro tem aumentado de maneira espetacular nos últimos anos,
uma lista feita em um supermercado de Washington, nos EUA, mostrou uma relação de mais
de 900 produtos contendo um dos vários produtos de soro que estão à disposição das
indústrias de alimentos (LAGRANGE & DALLAS, 1997).
No Brasil, segundo dados da Associação Brasileira das Indústrias de Queijo (ABIQ,
2007), anualmente tem-se produzido cerca de 450.000 toneladas de queijos. Levando em
consideração que o soro representa 90 % do volume de leite gasto para produzir 1 kg de
queijo, pode-se deduzir que são gerados, cerca de 4 milhões de toneladas de soro por ano.
No entanto, apenas parte do soro gerado é aproveitada pelas indústrias brasileiras,
principalmente na fabricação de ricota, na produção de bebidas lácteas e um pequeno
percentual é seco, porém sem a completa concentração das proteínas, sendo mais comum a
utilização do soro na alimentação de animais ou seu lançamento em rios (PORTO et al., 2005;
NEVES, 2001).
A produção de bebidas lácteas é uma das principais opções de aproveitamento do soro
lácteo no mercado brasileiro, as mais comercializadas são as bebidas fermentadas com
características sensoriais semelhantes ao iogurte, contudo, o aproveitamento desse subproduto
atinge apenas 15 % do total de soro produzido no país (NEVES, 1993; NAKAMAE, 2004).
FUNDAMENTOS TEÓRICOS E REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 31
2.7 Processos de separação por membranas
Os processos de separação por membranas (PSM) são operações que utilizam
membranas no fracionamento de misturas, soluções e suspensões envolvendo espécies de
tamanho e natureza química diferentes.
O objetivo principal de qualquer PSM é a separação, a concentração e/ou a purificação
de qualquer componente presente em solução e este pode ser alcançado devido à capacidade
da membrana de transportar um determinado componente da fase de alimentação mais
prontamente que qualquer outro componente presente. Isso ocorre devido às diferenças
existentes entre as propriedades físicas e/ou químicas da membrana e dos componentes que
permeiam (MULDER, 1996).
Os processos de filtração por permeação com membranas são usados para efetuar uma
variedade de separações e podem ser definidos como barreiras seletivas ao transporte de
massa de certos componentes de uma amostra.
Os PSM podem ser considerados processos de separação relativamente recentes, pois,
mesmo por volta de 1970, estes ainda não eram considerados processos de relevância técnica.
As membranas naturais são conhecidas desde a antiguidade, mas o desenvolvimento e
as principais aplicações de processos de separação com membranas sintéticas, em escala de
laboratório, tiveram início em 1920. Foi a partir da década de 30 que alguns PSM passaram a
ser conhecidos e utilizados em pequena escala. Estes, entretanto, acabaram não se
desenvolvendo, na época, em uma escala industrial devido aos baixos fluxos de permeado
obtidos, resultantes da elevada espessura das membranas utilizadas.
Atualmente, entretanto, os PSM são largamente utilizados para diferentes aplicações –
principalmente, como um processo alternativo aos processos de separação convencionais, tais
como a destilação, a centrifugação e a evaporação. Esse crescimento se dá devido a algumas
vantagens apresentadas pelos PSM, tais como: a economia de energia, visto que a maioria
destes ocorre sem mudança de fase; a seletividade da membrana; a separação de compostos
termolábeis (operam à temperatura ambiente) e a simplicidade de operação e escalonamento
(sistemas modulares).
2.7.1 Membranas
A membrana é definida como uma interface ou uma barreira semi-seletiva que separa
duas fases (alimentação e permeado) e restringe, total ou parcialmente, o transporte de uma ou
várias espécies químicas presentes nestas fases. Elas podem, ainda, apresentar inúmeras
características, podendo ser naturais ou sintéticas, neutras ou carregadas, espessas ou finas, de
estrutura homogênea ou heterogênea, com mecanismo de transporte ativo ou passivo, entre
outras (M
ULDER, 1996).
As membranas devem apresentar características específicas conforme a separação
desejada. As propriedades de separação das membranas dependem de fatores como: a
32 FUNDAMENTOS TEÓRICOS E REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
natureza química do material constituinte, existência ou não de poros e, no caso de
membranas porosas, o tamanho dos poros e sua distribuição.
De um modo geral, as membranas podem ser classificadas em duas grandes
categorias: densas e porosas. A membrana é denominada porosa quando o transporte através
da mesma ocorre devido à diferença de tamanhos entre as partículas e os poros da membrana.
Já as membranas densas não possuem poros onde o transporte dos componentes envolve a
sorção e a difusão através do material que constitui a membrana.
Os parâmetros de natureza morfológica envolvem a distribuição de tamanho de poros,
a porosidade superficial e a espessura, no caso de membranas porosas e a espessura do filme
polimérico e as características físico-químicas do polímero e das substâncias a serem
separadas, no caso das membranas densas. Tanto as membranas densas como as porosas
podem ser simétricas ou assimétricas, dependendo se apresentam ou não as mesmas
características morfológicas ao longo de sua espessura A escolha adequada do uso de uma
membrana, densa ou porosa, no processo de separação implica em conhecer as características
da membrana e da solução a ser separada (MULDER, 1996).
As membranas podem ser produzidas por diferentes tipos de materiais. De acordo com
tipo de material utilizado são classificadas em dois grupos; as membranas orgânicas e as
membranas inorgânicas. As membranas inorgânicas são produzidas com materiais cerâmicos,
vítreos e metálicos e as membranas orgânicas com materiais poliméricos sintéticos ou
biológicos.
As membranas poliméricas podem ser divididas em hidrofóbicas e hidrofílicas. Alguns
materiais geradores de membranas hidrofóbicas são o politetrafluoretileno (PTFE), o
polipropileno (PP), o polietileno (PE), entre outros. Os materiais geradores de membranas
hidrofílicas, por sua vez, são os ésteres de celulose, o policarbonato (PC), a polissulfona (PS)
e a polietersulfona (PES), a poliamida (PI) e a polieteramida (PEI).
As membranas inorgânicas devem ser utilizadas em processos industriais sujeitos às
condições severas de limpeza e esterilização. As membranas inorgânicas são compostas de
uma fina camada de material inorgânico sobre um suporte cerâmico ou metálico. Os materiais
para as membranas inorgânicas incluem vidro, metal sinterizado, materiais cerâmicos e ainda
os poliméricos inorgânicos. Dentre os materiais mais utilizados para fabricação de membranas
cerâmicas podem-se citar a alumina (Al
2
O
3
), o zircônio (ZrO
2
) e o titânio (TiO
2
).
As membranas cerâmicas possuem custo mais elevado o que torna o seu emprego mais
restrito. Já as membranas poliméricas dominam o mercado devido a sua diversidade quanto
aos diferentes tipos de polímeros existentes e quanto à disponibilidade no mercado, além de
apresentarem um campo de aplicação muito amplo.
Os PSM podem ser divididos em dois tipos: aqueles que envolvem a difusão do
solvente (água) e os que envolvem a difusão do soluto. Os primeiros, mais comumente
utilizados industrialmente, são denominados de processos de osmose e envolvem a
FUNDAMENTOS TEÓRICOS E REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 33
microfiltração (MF), a ultrafiltração (UF), a nanofiltração (NF) e a osmose inversa (OI); os
demais se denominam processos de diálise (D) e envolvem a eletrodiálise (ED), a
pervaporação (PV) e a permeação gasosa (PG) (MULDER, 1996).
A Tabela 2.10 apresenta a faixa de tamanhos de poros das membranas para os PSM
que envolvem a difusão do solvente e as faixas de pressão aplicáveis para cada processo.
Tabela 2.10: PSM relacionados pelo tamanho de poros das membranas e respectivas pressões de
operação.
PSM Tamanho de poros (nm) Limites de pressão (bar)
Microfiltração 50 - 10000 0,1 - 2,0
Ultrafiltração 1 - 100 1,0 - 5,0
Nanofiltração < 1 5,0 – 20
Osmose Inversa Sem poros 10 – 100
Fonte: MULDER (1996).
A NF é um processo de separação que permite separar alguns tipos de íons salinos,
como Na
+
, K
+
e Cl
-
, de moléculas orgânicas com massa molar na faixa de 100 Da a 500 Da,
com base na carga e no tamanho destas partículas. Os íons permeiam a membrana segundo
suas características de difusão e carga. A membrana de NF pode ser considerada uma
membrana de UF mais densa ou uma membrana de OI mais aberta. Assim, o diâmetro de
corte das membranas de NF situa-se entre o da OI e o da UF. As NF operam na faixa de 10 a
20 bar.
Os processos que envolvem a OI visam gerar tanto água pura (permeado) quanto
soluções aquosas ricas em sais minerais e outras moléculas de massa molar maior
(concentrado). As membranas de OI operam a uma pressão de aproximadamente de 100 bar e
retêm íons como Na
+
, K
+
e Cl
-
.
A ED é uma técnica de separação com membranas, cujo critério de separação não é o
tamanho do composto, mas sim a carga elétrica. Fundamenta-se no princípio da
movimentação de íons, sob um campo elétrico, em soluções aquosas e através de membranas
carregadas positiva ou negativamente, resultando em soluções concentradas em íons e em
soluções diluídas.
Entre os processos de separação por membranas se dará ênfase nos sub-capítulos 2.7.2
e 2.7.3 aos processos de MF e UF que foram utilizados neste trabalho, para a concentração de
proteína do soro de queijo e para o fracionamento destas proteínas.
2.7.2 Microfiltração (MF)
O processo de MF promove a separação de partículas de diferentes tamanhos através
da aplicação de um gradiente de pressão como força motriz e se caracteriza como o PSM mais
parecido com o processo convencional de filtração.
34 FUNDAMENTOS TEÓRICOS E REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
O diâmetro de poro destas membranas varia entre 10 e 0,05 μm, o que o torna um
processo capaz de reter suspensões e emulsões. Assim, as partículas retidas pelas membranas
de MF são, normalmente, maiores que as retidas nos processos de UF e OI. Além disso, nos
processos de MF, a pressão osmótica pode ser desprezada e a diferença de pressão aplicada
normalmente varia entre 0,1 e 3,5 bar.
O principal problema decorrente da utilização de membranas de MF é o declínio no
fluxo, causado pelos fenômenos de polarização por concentração e fouling, que serão
revisados no sub-capítulo 2.9 . A fim de reduzir este problema, um controle cuidadoso do
modo de operação do sistema deve ser exercido.
As principais aplicações industriais das membranas de MF envolvem a esterilização de
soluções farmacêuticas, a clarificação de bebidas, a purificação de fluidos na indústria de
semicondutores, além de algumas aplicações analíticas e biotecnológicas.
2.7.3 Ultrafiltração (UF)
A UF é um PSM usado para concentrar ou fracionar macromoléculas, onde estas são
retidas total ou parcialmente pela membrana, enquanto as pequenas moléculas atravessam a
membrana livremente. O processo de UF utiliza como força motriz a diferença de pressão.
Semelhantemente ao processo de MF, o PSM de UF é um processo baseado na
separação através da diferença de tamanho entre as partículas e na utilização do gradiente de
pressão como força motriz. Este processo é geralmente utilizado para a retenção de
macromoléculas e colóides presentes em solução e pode ser considerado como um processo
intermediário entre os processos de MF e NF, uma vez que o diâmetro de poro das
membranas de UF varia entre 0,05 μm e 0,001 μm (HO e SIRKAR, 1992; MULDER, 1996).
As membranas de UF comerciais são especificadas através da sua massa molar de
corte (MMC) cuja unidade mais utilizada é o Dalton (Da). A MMC é definida como a massa
molar para a qual a membrana apresenta uma retenção igual a 95%.
A UF é adequada à concentração de soluções, em pressões transmembranas inferiores
a 10 bar. As membranas de UF são capazes reter partículas cuja massa molar varia entre 300 e
500.000 Da. Assim, compostos tipicamente retidos neste processo incluem os açúcares,
biomoléculas, polímeros e partículas coloidais.
A principal diferença entre os processos de MF e UF situa-se na resistência
hidrodinâmica que é maior na UF, pois esta possui uma camada superior mais densa (menor
diâmetro de poro e porosidade menor na superfície) e, conseqüentemente, uma resistência
hidrodinâmica muito maior (MULDER, 1996).
As membranas de UF são comumente utilizadas na indústria alimentícia, de bebidas e
láctea, em sistemas de tratamento de efluentes, em aplicações médicas e biotecnológicas.
FUNDAMENTOS TEÓRICOS E REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 35
Uma extensão do emprego da UF é a adição de água em alguma fase durante o
processo de concentração, processo denominado de diafiltração (DF). O objetivo da DF é
lavar os componentes de mais baixa massa molar, e conseqüentemente aumentar a purificação
do retido (GRANDISON & LEWIS, 1996).
As indústrias que utilizam essa operação são as de alimentos, bebidas, biotecnológica
e farmacêutica com finalidade de purificar produtos de interesse. A DF está associada com
alto consumo de líquido diafiltrante, normalmente água, com alto teor de pureza. Na indústria
de laticínios, por exemplo, a DF é normalmente empregada após a pré-concentração do soro
por MF, UF ou NF que permite maior separação de lactose e sais minerais elevando a
proporção e conseqüentemente a pureza de proteínas no retido.
2.7.4 Módulos
As menores unidades responsáveis pelo acondicionamento das membranas de
qualquer PSM denominam-se módulos e podem ser definidas como a parte central de
qualquer sistema de membranas, ou seja, é o arranjo técnico destas (MULDER, 1996;
RAUTENBACH e ALBRECHT, 1989).
Os módulos podem apresentar basicamente quatro geometrias diferentes: placa e
quadro, tubular, fibra oca e espiral. A escolha do módulo para uma determinada separação
depende de uma série de fatores, tais como: densidade de empacotamento (m
2
.m
-3
), custo,
resistência ao fouling, considerações operacionais, características da mistura a ser fracionada,
facilidade de operação, limpeza e manutenção.
2.7.4.1 Módulo Placa e Quadro
Os módulos placa e quadro possuem configuração física similar ao filtro prensa, pois
são constituídos por sanduíches de membranas intercaladas por espaçadores e suportes, onde
as membranas estão dispostas paralelamente. Camadas do conjunto podem ser empilhadas, tal
que o concentrado de uma placa alimente a próxima, até atingir a recuperação desejada. Estes
módulos são adequados para experimentos onde o volume a ser tratado é pequeno, pois
apresentam uma densidade de empacotamento baixa e módulos com essa concepção têm
custo de fabricação elevado. Entretanto, as condições de escoamento da alimentação e do
permeado podem ser facilmente controladas, bem como as membranas que forem danificadas
durante a operação podem ser substituídas sem a perda do módulo (RAUTENBACH e
ALBRECHT, 1989).
2.7.4.2 Módulo Fibra-oca
Os módulos em fibra-oca são constituídos por um feixe de membranas poliméricas, na
forma de cilindros finos e longos, com diâmetros menores de 0,5 mm, presos nas
extremidades por placas, inseridos em um tubo maior de modo semelhante à configuração de
um trocador de calor casco e tubos. A alimentação é bombeada para o interior do tubo e o
permeado é coletado na extremidade após percorrer pelo interior das fibras ou vice-versa. As
principais vantagens desta configuração são: a alta superfície de membrana por unidade de
volume, facilidade de operação e manutenção e baixo consumo de energia (MULDER, 1996).
36 FUNDAMENTOS TEÓRICOS E REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.7.4.3 Módulo Espiral
Este módulo pode ser considerado uma evolução do módulo placa e quadro, ou seja,
nada mais é do que um módulo placa e quadro envolto, de forma espiralada, em torno de um
tubo central perfurado de coleta de permeado. Este módulo caracteriza-se por um projeto
relativamente simples e por uma elevada densidade de empacotamento (300 – 1000 m
2
.m
-3
), a
qual depende fortemente da altura do canal, determinada pelo material do espaçador utilizado
(RAUTENBACH e ALBRECHT, 1989; MULDER, 1996) .
Neste módulo, dois ou mais “envelopes”, contendo, cada um, duas membranas
separadas por um espaçador, podem estar envoltos no tubo coletor; a alimentação escoa
axialmente através do módulo cilíndrico paralelamente ao tubo central, no qual o permeado
escoa radialmente (MULDER, 1996).
Normalmente, vários módulos espirais podem ser utilizados em conjunto, em um
mesmo vaso. Estes são dispostos em série, ligados pelo tubo coletor central. Neste tipo de
módulo, a velocidade de escoamento é praticamente uniforme e mecanismos promotores de
turbulência estão presentes ao longo da superfície da membrana, reduzindo a tendência à
formação do fouling e facilitando a limpeza da mesma (MULDER, 1996).
Algumas vantagens do módulo em espiral são a boa resistência ao fouling, devido aos
canais de alimentação relativamente abertos, a facilidade de limpeza, a facilidade de
substituição, a disponibilidade do módulo com membranas de diferentes materiais e a
disponibilidade comercial de diversos fornecedores. Dentre as desvantagens, pode-se citar
uma área superficial moderada em relação ao volume da membrana, alguma tendência ao
fenômeno de polarização por concentração e a dificuldade de obtenção de altas taxas de
recuperação em sistemas pequenos.
2.7.4.4 Módulo Tubular
Nos módulos tubulares, a membrana é suportada na superfície interna ou externa de
um tubo poroso. Este tubo pode ser de material polimérico, fibra de vidro, cerâmica, carbono
ou aço inoxidável. O número de tubos em cada módulo também pode variar (entre 4 e 18),
sendo dispostos em série e ligados, um ao outro, a fim de atingir a taxa de recuperação
desejada (M
ULDER, 1996; RAUTENBACH e ALBRECHT, 1989).
A densidade de empacotamento do módulo tubular é relativamente baixa (< 300 m
2
.m
-
3
) e, embora ele se caracterize como a configuração de custo mais elevado, é bastante aplicado
nos casos de elevada tendência ao fouling, devido ao seu eficiente controle de processo e
facilidade de limpeza das membranas. Assim, suas aplicações atuais resumem-se,
praticamente, às águas de alimentação com elevado teor de sólidos suspensos, tais como
correntes de efluentes e provenientes da fabricação de produtos alimentícios (MULDER, 1996).
O módulo tubular tem como principais vantagens: a baixa tendência ao
fouling, devido
à possibilidade de operar com alta velocidade de escoamento tangencial, facilidade de limpeza
e podem operar em altas pressões. Dentre as desvantagens, podem-se citar a baixa área
FUNDAMENTOS TEÓRICOS E REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 37
superficial em relação ao volume da membrana, o custo elevado e a possibilidade mínima de
escolha do material da membrana.
2.8 Princípios dos PSM
A seguir são apresentadas algumas definições comumente utilizadas em PSM para
melhor entendimento da leitura deste trabalho. As equações apresentadas foram retiradas de
MULDER (1996).
Nos sistemas de PSM, basicamente, duas configurações de escoamento são utilizados:
o modo convencional ou dead-end e o modo tangencial ou cross-flow. No primeiro, a solução
de alimentação escoa perpendicularmente à superfície da membrana, promovendo a formação
de uma camada na superfície da membrana semelhante a uma torta, devido ao acúmulo das
partículas retidas. No modo tangencial, a alimentação escoa ao longo da superfície da
membrana, gerando o acúmulo de apenas parte das partículas retidas. Um desenho
esquemático do escoamento tangencial é apresentado na Figura 2.4 (MULDER, 1996).
Alimentação
Permeado
Retido
Membrana
Figura 2.4: Representação esquemática do modo de operação tangencial (Fonte: BRANS, 2006).
A corrente que atravessa a membrana é denominada permeado ou filtrado e a que fica
retida pela membrana, que é a corrente enriquecida em um ou mais componentes, é chamada
de retido ou concentrado.
2.8.1 Fluxo Permeado
O fluxo permeado representa a vazão (volumétrica, mássica ou molar) de permeado
por unidade de área da membrana e é determinado pela força motriz aplicada e pela
resistência apresentada pela membrana (ou por sua permeabilidade), que muitas vezes, são
proporcionais.
O movimento de qualquer espécie através da membrana é causado pela ação de uma
ou mais forças motrizes sobre os componentes da alimentação. A maioria dos processos
utiliza como força motriz, o gradiente de potencial químico – que pode ser expresso em
função do gradiente de pressão, de concentração ou de temperatura – ou o gradiente de
potencial elétrico.
A força motriz utilizada, bem como a morfologia da membrana, determinam o
mecanismo de transporte através desta, que pode ser convectivo e/ou difusivo. No caso de
38 FUNDAMENTOS TEÓRICOS E REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
membranas de MF e UF, o fluxo é essencialmente convectivo, uma vez que estas membranas
utilizam como força motriz o gradiente de pressão através da membrana.
O volume que escoa através destas membranas pode ser descrito pela Lei de Darcy,
sendo o fluxo através da membrana (J) diretamente proporcional à pressão aplicada (Δp):
J = P × Δp (2.1)
onde a constante de permeabilidade (P) engloba fatores estruturais, tais como a porosidade da
membrana, o diâmetro de poro e a distribuição destes; além disso, esta constante inclui,
também, a viscosidade do líquido que permeia.
O fluxo através da membrana pode simplesmente ser definido como o volume de
permeado que flui através da membrana por unidade de área e tempo, como mostrado na
Equação 2.2:
dt
dV
A
J
p
1
=
(2.2)
onde J
p
é o fluxo do permeado (L.m
-2
h
-1
); A é a área da membrana (m
2
); dV/dt é o volume de
permeado recolhido (L) em função do tempo para permeação (h).
O fluxo permeado depende das propriedades da membrana, do produto a ser separado
e das condições de operação tais como a pressão transmembrana, velocidade de escoamento
tangencial e fator de concentração. Também é fortemente influenciado pela temperatura da
solução de alimentação. Isso se dá, pois o fluxo é função da viscosidade dinâmica da solução
que, por sua vez, é função da temperatura. Assim, quanto maior a temperatura, menor a
viscosidade e maior o fluxo de permeado.
Outros parâmetros importantes que afetam o fluxo através da membrana são o pH e a
força iônica; o efeito de cada um deles, entretanto, varia muito em função da solução de
alimentação e da membrana utilizada. Estes parâmetros influenciam, principalmente, na
solubilidade dos componentes da alimentação, alterando as interações entre essa solução e a
membrana.
Na separação de uma solução protéica, por exemplo, quanto mais o pH da solução se
aproximar do pH isoelétrico das proteínas presentes, menos solúveis estas se encontrarão e
maior será a tendência ao fouling, diminuindo, por conseqüência, o fluxo permeado (B
ACCHIN
et al., 2006).
2.8.2 Seletividade
A seletividade de uma membrana a determinada solução pode ser expressa por dois
parâmetros: a retenção (R) ou o fator de separação (α). Para misturas aquosas diluídas, que
consistem em um solvente (água, na maioria das vezes) e um soluto, é mais conveniente
expressar a seletividade em função da retenção em relação ao soluto. Nestes casos, o soluto é
FUNDAMENTOS TEÓRICOS E REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 39
parcialmente, ou totalmente, retido pela membrana, enquanto que as moléculas de solvente
passam livremente por ela (M
ULDER, 1996; HO e SIRKAR, 1992).
A retenção observada (R
obs
) pode ser estimada pela seguinte equação:
f
p
f
pf
obs
c
c
c
cc
R −=
−
= 1
(2.3)
onde c
f
e c
p
(g.L
-1
); são, respectivamente, as concentrações de soluto na solução de
alimentação e no permeado. O valor de R varia entre 100 % – retenção completa do soluto – e
0 % – soluto e solvente atravessam livremente a membrana.
2.8.3 Fator de Concentração
O fator de concentração (FC) é uma variável limitante do processo porque está
diretamente ligado ao fluxo permeado, isto é, a medida que a solução é concentrada o fluxo
permeado diminui. O FC é definido conforme a Equação 2.4.
()
FR
VV
V
V
V
FC
−
==
0
00
(2.4)
onde FC é fator de concentração de uma dada espécie; V
0
é o volume inicial da solução (L);
V
R
é o volume do retido (L); V
F
é o volume da solução permeada (L).
No processo de concentração de um dado componente através da membrana a
concentração de um soluto durante o processo varia em função tanto da redução de volume,
como da retenção (R) do soluto pela membrana.
2.9 Problemas que afetam os PSM
As alterações no desempenho da membrana podem ser causadas por diversos fatores,
tais como a polarização por concentração e fouling. Todos estes fatores induzem a resistências
adicionais ao transporte através da membrana no lado da alimentação. A extensão deste
fenômeno é fortemente dependente do tipo de PSM e da solução de alimentação (M
ULDER,
1996).
Quando uma solução, contendo solutos dissolvidos, total ou parcialmente, e sob
pressão, entra em contato com uma membrana, o soluto é levado à superfície desta película
seletiva por transporte convectivo. O solvente e as partículas de dimensões menores do que o
diâmetro dos poros da membrana a atravessam, enquanto os macrosolutos são retidos na
superfície. Observa-se que há um aumento da concentração de solutos na região próxima à
superfície da membrana (interface membrana/solução), que é superior em relação à
concentração no seio da solução que está sendo filtrada. Este fenômeno é conhecido como
“polarização por concentração”. Isto cria um gradiente de concentração que é compensado,
40 FUNDAMENTOS TEÓRICOS E REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
em parte, por uma difusão destes solutos no sentido contrário ao do solvente que permeia a
membrana.
A seguir, são apresentadas as principais conseqüências deste fenômeno (M
ULDER,
1996; PLATT et al., 2002):
•
diminuição na retenção: devido ao aumento da concentração de soluto na
superfície da membrana a retenção observada pode diminuir; isso ocorre,
principalmente, na separação de solutos de baixa massa molar (sais);
•
aumento na retenção: isso pode ocorrer na separação de misturas contendo solutos
macromoleculares, onde a polarização por concentração pode ter influência
decisiva na seletividade do processo; ou seja, as partículas de maior massa molar,
retidas completamente, acabam por formar uma camada extra na superfície da
membrana, que acaba retendo um número maior de partículas menores;
•
diminuição do fluxo através da membrana: o fluxo é proporcional à força motriz
exercida sobre o processo, e a constante de proporcionalidade pode ser
considerada como o inverso da soma das resistências.
Pode-se considerar este fenômeno bem mais severo em membranas de MF e UF, pois
nestas, o coeficiente de difusão das macromoléculas retidas, ou das partículas suspensas, é
pequeno, quando comparado aos valores aplicados aos componentes retidos nos processos de
OI e PV. Além disso, o fluxo, através das membranas de MF e UF, é consideravelmente
maior, aumentando as conseqüências deste fenômeno (M
ULDER, 1996).
Segundo B
ACCHIN et al. (2006), a zona de polarização não pode ser evitada, mas os
seus efeitos na redução do fluxo permeado podem ser controlados através das condições
operacionais, como baixa pressão e alta turbulência junto à superfície da membrana. Este
fenômeno é particularmente importante em membranas sujeitas a alto fluxo, como aquelas
utilizadas na UF e na MF.
A polarização por concentração é um fenômeno reversível, ou seja, quando o estado
estacionário é atingido, o fluxo através da membrana é menor do que o existente inicialmente,
mas este não diminui mais com o passar do tempo e cessa quando o processo deixa de operar.
O que se observa, normalmente, em um PSM, entretanto, é um declínio contínuo do fluxo,
mesmo após o estado estacionário ser atingido. Este declínio contínuo decorre da existência
de outro fenômeno: o fouling (M
ULDER, 1996).
O fouling pode ser definido como a deposição indesejável e (ir)reversível de partículas
dissolvidas, suspensas ou coloidais na superfície da membrana. O fouling inclui os fenômenos
de adsorção, bloqueio de poros, precipitação e formação de torta e ocorre, principalmente, nos
processos de MF e UF, onde membranas porosas, mais susceptíveis ao fenômeno, são
utilizadas (M
ULDER, 1996; RAUTENBACH e ALBRECHT, 1989).
A deposição de alguns componentes da alimentação na superfície da membrana ou
dentro de seus poros acaba formando uma camada delgada. Neste estágio, geralmente a
FUNDAMENTOS TEÓRICOS E REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 41
concentração de partículas próxima à superfície filtrante não varia mais e estabelece-se, então,
a camada gel, conhecida também como “membrana dinâmica secundária”. O transporte da
solução permeante através da membrana é perturbado pelo aparecimento de uma resistência
adicional a resistência devido à camada de gel, além daquelas já oferecidas pela membrana e
pelo fenômeno de polarização por concentração. À medida que a espessura da camada de gel
aumenta esta resistência ao fluxo permeado torna-se maior (B
ACCHIN et al., 2006).
O fouling é definido como um fenômeno de camada limite em que os solutos se
depositam e/ou são adsorvidos na superfície e nos poros da membrana modificando a sua
estrutura e as propriedades de separação da mesma. Os principais fenômenos que contribuem
para o fouling estão apresentados a seguir:
adsorção das moléculas de soluto na superfície da membrana e/ou no interior de
seus poros devido à interações físico-químicas com o material da membrana;
entupimento de poros por moléculas ou partículas em suspensão, trata-se da ação
mecânica de bloqueio de poros, que pode ocorrer tanto na superfície como no
interior da membrana, dependendo de sua morfologia;
depósito de material em suspensão sobre a superfície da membrana com formação
de uma torta de filtração (camada gel).
A natureza e a extensão do fouling são influenciadas consideravelmente pela
composição química da membrana e pelas interações soluto-membrana.
Medidas que visem à redução da incidência destes fenômenos são bastante
importantes, uma vez que o declínio de fluxo pode ser responsável por perdas econômicas.
Mais importante, entretanto, é o discernimento entre o fator causador deste fenômeno,
principalmente entre os fenômenos de polarização por concentração e fouling (embora ambos
não possam ser considerados independentes, pois um fator - polarização por concentração,
pode ser o causador do outro - fouling) (M
ULDER, 1996).
A fim de reduzir o fenômeno de polarização por concentração algumas ações podem
ser tomadas, tais como a manipulação das condições de operação. Ou seja, pode-se tentar
diminuir a pressão transmembrana, aumentar a velocidade de escoamento ao longo da
membrana, alterar a configuração do módulo (diminuindo seu comprimento, aumentando o
diâmetro hidráulico ou testando uma configuração diferente, geometria dos espaçadores) ou,
até mesmo, aumentar a temperatura da alimentação (M
ULDER, 1996).
O controle da camada de gel pode ser feito através do aumento da velocidade
tangencial, provocando maior turbulência. A agitação e a mistura da solução, próxima à
superfície da membrana, arrasta parte significativa dos sólidos acumulados, na maioria das
vezes por adsorção, reduzindo a espessura da camada de gel e aumentando a taxa de
permeação. Além deste método, a aplicação de baixas pressões e a escolha do material
constituinte da membrana são outros fatores bastante efetivos, que reduzem a adsorção de
solutos (B
ACCHIN et al., 2006).
42 FUNDAMENTOS TEÓRICOS E REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
Para prevenir a formação de fouling diferentes estratégias foram avaliadas na
literatura. B
RANS et al. (2004) expõem que o método de backpulsing é mais eficiente que
outros métodos, tais como promotores de turbulência e backwashing, pois a remoção dos
componentes da superfície da membrana se mostrou mais eficiente podendo ser controlada
em larga escala.
Embora todos os métodos citados acima reduzam o fouling de alguma maneira, os
métodos que visam à limpeza da membrana devem sempre ser utilizados, porque a
diminuição do fluxo através da membrana pode ocorrer mesmo que as condições de operação
escolhido sejam apropriadas. Isso se dá, pois a diminuição do fluxo é um fenômeno inerente
ao processo, o que torna necessário uma limpeza periódica da membrana (M
ULDER, 1996).
A limpeza hidráulica, a limpeza mecânica e a limpeza química são os métodos de
limpeza que podem ser utilizados. Dentre estes métodos, a limpeza química é o mais
importante, envolvendo uma grande variedade de agentes químicos que podem ser usados
separadamente ou em conjunto. Alguns exemplos são ácidos (como o H
3
PO
4
e o ácido
cítrico), bases (NaOH), detergentes (alcalinos, não iônicos), enzimas (proteases, amilases,
glicanases), agentes complexantes (EDTA), desinfetantes (H
2
O
2
, NaOCl) e vapor de água
(M
ULDER, 1996).
Os agentes químicos utilizados na limpeza dos módulos devem ser compatíveis com o
material da membrana e devem ser escolhidos de acordo com as substâncias causadoras do
fenômeno. Os limites das condições normais de operação (pressão, temperatura e fluxo) não
devem ser excedidos durante a operação de limpeza, a fim de evitar qualquer dano irreversível
à membrana. A concentração do reagente e o tempo de limpeza são também bastante
importantes em relação à resistência química da membrana (R
AUTENBACH e ALBRECHT, 1989;
MULDER, 1996).
2.10 Aplicação dos PSM na Indústria Alimentícia
Os PSM são amplamente utilizados na indústria de alimentos em aplicações que
envolvem desde tratamento de efluentes até concentração e purificação de substâncias
presentes em solução.
G
IRALDO-ZUÑIRA et al. (2004) relatam que MF pode ser utilizada industrialmente
como uma alternativa para a pasteurização ou a esterilização (a frio) parcial de alimentos, pois
retém microrganismos durante a operação. Como não necessita de calor para a operação, não
ocorre alteração de estado físico da solução e as características sensoriais e nutricionais dos
compostos processados são mantidas.
Segundo
VAN REIS & ZYDNEY (2001), as membranas sempre foram uma parte
integrante dos processos de biotecnologia. A filtração estéril dos meios de fermentação, a
purificação de soluções tampão e a produção de produtos protéicos são praticadas na indústria
utilizando membranas. A MF é extensivamente usada para clarificação de soluções. A UF
FUNDAMENTOS TEÓRICOS E REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 43
pode ser encontrada em muitos processos biotecnológicos. As membranas também têm o seu
uso difundido para eliminar bactérias de alimentos líquidos.
A
FONSO et al. (2004) avaliaram a viabilidade econômica e técnica da utilização de
membranas de UF e NF para a recuperação da proteína presente no efluente da produção de
pescados. Os autores puderam observar que a retenção de proteína pela membrana de UF
variou entre 49 e 62 %, dependendo das condições de operação; a membrana de NF reteve em
torno de 66 % de proteína. Os autores concluíram, ainda, que a aplicação deste sistema em
nível industrial é viável economicamente.
C
HOVE et al. (2007) mostraram em seu estudo algumas propriedades funcionais de
frações de isolado de proteína de soja obtido por MF. Cinco frações de isolados de proteína de
soja (SPI) foram produzidas usando duas membranas de MF com tamanhos de poro
diferentes. A MF não é usada extensivamente para separar o SPI em frações distintas, mas isto
pode ser usado para enriquecer espécies de proteínas de altas e baixas massas molares, que
possuem propriedades, como solubilidade, emulsificação e capacidade de formar espuma,
diferentes. Membranas podem ser utilizadas como um método competitivo à precipitação
seletiva das espécies de proteína por mudanças de pH, resultando em uma fração de
determinada espécie de proteína mais pura e conseqüentemente características funcionais
realçadas.
R
EIMANN (2005) cita um processo resultante de sucessivos passos para obtenção do
ácido lático purificado após um processo fermentativo. Foram utilizados no estudo os
processos de UF, eluição em resina de troca iônica, eletrodiálise com membrana monopolar e
com membrana bipolar e evaporação, e o grau de purificação do ácido lático aumentou
quando os PSM foram empregados.
Na indústria de alimentos, segundo C
ALLE et al. (2002), a ED é largamente empregada
por possibilitar a separação de eletrólitos em processos como a desmineralização de vinhos, a
neutralização ácida de sucos de frutas. Modificada a ED também é utilizada para separar
misturas de aminoácidos e proteínas. Normalmente, os aminoácidos são obtidos por hidrólise
protéica e síntese microbiológica e química, onde são contaminados por componentes
minerais. De acordo com B
OBRESHOVA et al. (2002), uma alternativa de desmineralização e
fracionamento de aminoácidos é o processo de ED. E
LISSEEVA et al. (2002), utilizaram a ED
para separar aminoácidos, produzidos por processo biotecnológico, de sais minerais e açúcar.
Freqüentemente membranas poliméricas de UF são usadas, mas as membranas
cerâmicas estão ganhando mais atenção, por causa da melhor resistência frente à limpeza e
desinfecção. A
LICIEO et al (2002) estudaram a aplicação de membranas de UF na produção de
óleo de soja. O objetivo do trabalho foi avaliar o efeito da temperatura e do gradiente de
pressão no fluxo permeado através de dois tipos de membranas de UF: uma membrana tubular
cerâmica e uma membrana fibra-oca polimérica. Os autores perceberam que o fluxo através
da membrana tubular aumentou com o aumento da pressão, mas não variou com a
temperatura; na membrana fibra-oca, por sua vez, o fluxo aumentou com o aumento de ambos
os parâmetros.
44 FUNDAMENTOS TEÓRICOS E REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
B
ABU & GAIKAR (2001) estudaram as características de membranas de UF
determinantes de fouling. Através de experimentos de ultrafiltração de soluções de albumina
de soro bovinas utilizando membranas de triacetato de celulose (CTA) e celulose regenerada
(RC), foi demonstrado que as membranas de CTA eram mais vulneráveis ao fouling que as
membranas hidrofílicas de RC. O declínio do fluxo para ambas as membranas, mais
significante no início, foi atribuído a uma polarização por concentração próxima à superfície
da membrana e adsorção de proteína. O fouling das membranas foi caracterizado pela
resistência à permeação de água pura. A resistência dos depósitos de proteína associada com
as membranas CTA foi mais alta quando comparada com a resistência da proteína adsorvida
nas membranas RC. Outras conclusões dos autores foram que a presença de eletrólitos na
solução de alimentação (como sais, por exemplo) aumenta o fouling e ocasiona uma
conseqüente redução no fluxo permeado, enquanto o aumento da temperatura reduz a
formação deste fenômeno. Cargas elétricas introduzidas na superfície da membrana podem
reduzir a afinidade das proteínas pela superfície da membrana e, desta forma, diminuir o
fouling.
D
OYEN et al. (1996) fizeram um estudo comparativo no tratamento do leite com
membranas de polímero (PSF/PVP), cerâmico (ZrO
2
) e orgâno-mineral (ZrO
2
/PSf). Os
valores de massa molar de corte estavam entre 25 e 50 kDa. Embora a permeabilidade das
membranas fosse diferente, os fluxos eram comparáveis, porque os experimentos foram
realizados com pressões independentes do regime de fluxo. Em uma velocidade tangencial de
6 m.s
-1
, foram alcançados fluxos de 5,6×10
−5
e 6,8×10
−5
m.s
-1
, dependendo do fator de
concentração. Os autores concluíram que o fouling é o fator limitante na concentração de
proteína do leite e não a permeabilidade da membrana.
B
ACCHIN et al. (2006) fazem uma revisão sobre o fluxo crítico. Entre as suas
conclusões os autores relatam que a estabilidade da solução (envolvendo pH e força iônica),
assim como a concentração e a massa molar das partículas em solução são fatores relevantes
para determinar o fluxo crítico. Normalmente, um aumento de pH acima do ponto isoelétrico
de soluções protéicas, aumenta o fluxo crítico. Por exemplo, nas soluções de concentrados
protéicos do soro e suspensões de caseinatos de sódio há um aumento do fluxo crítico com o
aumento de pH.
C
HAN et al (2002) estudaram a determinação de um fluxo limite aparente, a partir do
qual a formação de fouling em membranas de UF, utilizadas na separação de diferentes
misturas protéicas (binárias), era relevante ao processo. O fluxo limite aparente foi
determinado através da observação da linearidade da curva entre a variação de pressão e o
fluxo aplicado, onde o último valor que mantinha a linearidade foi tomado como o fluxo
limite aparente. Os autores perceberam, durante os experimentos, que a retenção das proteínas
de maior tamanho era determinante para o fluxo limite aparente, devido à formação de uma
camada dinâmica pelas partículas retidas, que causava o aumento da pressão transmembrana
(ΔP).
C
HOI et al. (2005) executaram experimentos bem controlados de filtração para estudar
os efeitos do fluxo permeado e do escoamento tangencial no fouling de membranas no
FUNDAMENTOS TEÓRICOS E REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 45
tratamento de efluentes. Os resultados foram analisados pelo modelo de resistências-em-série
onde a razão para o declínio do fluxo foi subdividida em adsorção, polarização por
concentração, fouling reversível e irreversível. As experiências de filtração demonstraram que
o fluxo permeado decai mais rapidamente com o aumento da concentração de alimentação e
tamanho de poro de membrana, e com fluxo tangencial decrescente. Os resultados de limpeza
da membrana revelaram que o declínio do fluxo permeado era dominantemente causado pelo
fouling reversível. A autópsia das membranas sugeriu que um fouling irreversível havia sido
formado, inicialmente pelo bloqueio de poros por pequenas partículas e mais tarde pela
compactação de uma camada de incrustantes, onde a velocidade do escoamento não foi
suficiente para arrastá-la, provocando, desta forma, o acúmulo de material e a diminuição do
fluxo permeado.
Z
YDNEY & PUJAR (1998) tratam em seu trabalho do transporte de proteínas por
membranas porosas e os efeitos de interações coloidais. Eles afirmam que análises
tradicionais do transporte de solutos através da membrana geralmente consideram somente as
interações estéricas (baseadas no tamanho) entre o soluto e os poros, porém eles demonstram
a importância de considerar interações coloidais na taxa de transporte dos solutos. Estas
interações podem afetar o desempenho da membrana drasticamente, mudando as
características de retenção da membrana de completamente permeável para completamente
retentiva, para um determinado soluto. Para uma mistura de proteínas, os sistemas de
membrana devem ser operados sobre certas condições já que a magnitude das forças coloidais
é diferente para proteínas diferentes. Isto é alcançado facilmente para interações elétricas
operando no ponto isoelétrico (ou próximo deste) de uma das proteínas, isto pode ser usado,
por exemplo, na separação de BSA e IgG em soluções a pH 4,7, próximo ao pI do BSA.
Também é possível, explorar as diferenças das interações por forças de van der Waals em
sistemas de membranas devido ao diferente caráter de hidrofilicidade/hidrofobicidade das
proteínas, por exemplo, é possível aproveitar as interações entre grupos hidrofóbicos das
proteínas com grupos correspondentes nas membranas.
Y
UNOS & FIELD (2006) estudaram o efeito de membranas “empilhadas” para o
fracionamento de proteínas. O fracionamento da proteína que usa a UF é praticável após a
extensiva otimização do processo, contudo a baixa seletividade das membranas é ainda um
dos fatores críticos que limitam a aplicação de sistemas da membrana ao fracionamento da
proteína. O uso de membranas “empilhadas” visa melhorar a seletividade da separação
conseguindo um produto puro da proteína no permeado de uma mistura binária de proteínas.
Duas membranas planas são prensadas em várias combinações e configurações sem espaçador
entre elas. Foram utilizadas membranas de similares ou diferentes combinações de MMC (30,
50 e 100 kDa) em vários arranjos e proteínas com massa molar entre 10 e 70 kDa como
proteínas modelo em soluções simples ou misturas binárias. As transmissões observadas de
Lisozima (14 kDa) com membranas “empilhadas” de 30/30, 50/50, e 100/100 kDa são 78, 85
e 97 %, respectivamente; e estes valores são comparáveis à transmissão para o processo com a
única membrana, sendo ligeiramente mais baixos. Os resultados do estudo podem ser úteis
para compreender as propriedades do transporte das membranas “empilhadas” e em predizer o
efeito da massa molar da proteína e do tamanho do poro sobre transmissão e retenção da
proteína.
46 FUNDAMENTOS TEÓRICOS E REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
K
APPLER & POSTEN (2007) estudaram o fracionamento de proteínas baseado no
tamanho e na carga destas moléculas. Para tanto, fizeram uso de uma célula de eletro-
ultrafiltração, onde é alimentada a solução contendo proteínas e um campo elétrico é aplicado
visando separá-las através da carga elétrica. De certa forma é um método semelhante à
eletrodiálise, já que se pretende transportar as proteínas baseado na sua carga, mas ao invés de
se utilizar membranas de troca iônica utilizam-se membranas com MMC adequada. Esta
técnica pode ser usada para obter produtos com alto teor de pureza e tempos de separação
curtos, devendo ser mais estudada para estender sua utilização para misturas multi-
componentes e biomoléculas.
2.10.1 Aplicação dos PSM na Indústria de Laticínios
As diversas técnicas de separação por membranas existentes hoje em dia permitem
extrair do leite e/ou do soro certos componentes com atividades biológicas, funcionais e
nutricionais de interesse. Neste sub-capítulo foi realizada uma revisão bibliográfica a respeito
dos PSMs que vêm sendo aplicados na indústria de laticínios.
L
EITE et al. (2006) relatam que os PSMs estão sendo utilizados desde a década de 70
na indústria de laticínios, destacando-se a MF e a UF, mas, existe aplicação em potencial para
todos os tipos de processos com membranas. De acordo com S
MITH (2003), hoje, a separação
por membranas é uma tecnologia estabelecida. Estima-se que a área superficial de membranas
instalada mundialmente na indústria de laticínios atinja 500.000 m
2
; cerca de 70 % desta área
é usada para o tratamento de soro lácteo.
B
RANS et al. (2004) fizeram um estudo sobre o fracionamento do leite utilizando
membranas, e concluíram que esta tecnologia é uma escolha adequada para o fracionamento
do leite, pois muitos dos seus componentes podem ser separados por diferenças de tamanho.
A UF, por exemplo, é uma tecnologia que pode ser aplicada na indústria de laticínios para o
processamento do leite integral, semi-desnatado ou desnatado, sendo inclusive utilizada,
segundo E
RDEM et al. (2006), CHEANG E ZYDNEY (2004), GUADIX et al. (2004) e AKOUM et
al. (2004), na separação de lactose do leite, na padronização do valor nutricional de diferentes
tipos de leite, na concentração do leite para a fabricação de queijos, na recuperação de
proteínas e na pré-concentração do leite para a produção de iogurte.
De acordo com G
IRALDO-ZUÑIRA et al. (2004), YADA (2004) e BRANS et al. (2004), a
MF pode ser empregada na indústria de laticínios adequando-se ao fracionamento de
proteínas do soro e à separação de microorganismos e glóbulos de gordura do leite e do soro.
A MF reduz a quantidade de bactérias e esporos sem afetar o sabor do leite e promove a
durabilidade do produto tanto quanto a pasteurização do leite, além de promover a separação
dos glóbulos de gordura de leite que possuem diâmetro entre 0,1
μm a 15 μm. Segundo estes
autores, a MF em comparação com os métodos convencionais, tal como a centrifugação, para
a remoção de glóbulos de gordura, é mais eficiente, pois não ocorre a quebra de moléculas
que fornecem o sabor aos alimentos. G
IRALDO-ZUÑIRA et al. (2004) ainda relatam que no
processo de concentração por UF é conveniente remover previamente os glóbulos de gordura
por MF para evitar a obstrução dos poros das membranas de UF, e desta forma aumentar a
FUNDAMENTOS TEÓRICOS E REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 47
eficiência do processo. Segundo Y
ADA (2004), a MF também pode ser utilizada para reter as
micelas de caseína, para isto membranas cerâmicas podem ser utilizadas obtendo-se a caseína
concentrada e pura. No entanto, para se obter um concentrado com as proteínas totais do leite
membranas de UF são mais adequadas, porque retêm, além das caseínas, as proteínas
solúveis.
C
HOLLANGI & HOSSAIN (2006) examinaram o fracionamento do efluente da indústria
leiteira rico em lactose e proteína usando membranas de UF. Três membranas de MMC de 3,
5 e 10 kDa foram testadas para determinar a eficiência do processo. A recuperação da lactose
no permeado de aproximadamente 70-80 % pode ser conseguida usando a membrana de 3
kDa, 85 a 90 % com a membrana de 5 kDa e aproximadamente 100 % usando uma
membrana de 10 kDa. Segundo B
UTYLINA et al. (2006), a UF e a NF são aplicadas no
processamento de leite a fim de aumentar a quantidade de proteína no concentrado de proteína
do leite.
De acordo com B
ALANNEC et al. (2005), AKOUNM et al. (2004) e KHIDER et al.
(2004), a NF vem sendo usada no tratamento de águas residuais na indústria de laticínios.
R
EKTOR E VATAI (2004) e ATRA et al. (2005) expõem que a NF pode ser usada para
concentrar o permeado da UF do leite ou do soro. A
TRA et al. (2005) obtiveram na NF alta
concentração de lactose no concentrado com uma recuperação de 90 % e o permeado propício
para a reutilização na linha de produção. K
HIDER et al (2004) estudaram a aplicação de
membranas de UF e NF para o tratamento do efluente proveniente da indústria leiteira. Nos
experimentos de UF, os autores puderam observar que quanto maior a diferença de pressão
utilizada, maior a retenção de proteína e lactose (sendo a retenção de proteína maior que a de
lactose, para qualquer ΔP); a retenção máxima obtida ficou em torno de 80 %.
M
INHALMA et al. (2007) utilizaram a NF para a recuperar os nutrientes orgânicos do
soro do queijo Serpa. Segundo os autores, a NF tem uma vantagem quanto aos outros
processos, já que proporciona simultaneamente a concentração e desmineralização do soro,
levando a uma redução nos custos finais e à redução do desperdício de água. O experimento
de concentração mostrou que o processo permitiu uma recuperação de 80 % de água, e
concentração de nutrientes em cinco vezes em relação ao valor inicial.
Processos como eletrodiálise e osmose inversa também encontram aplicações na
indústria leiteira. Segundo S
TRATHMANN (2001), na indústria de laticínios, a ED pode ser
largamente empregada por possibilitar a separação de eletrólitos em processos como a
desmineralização do soro do leite. G
REITER et al. (2004) compararam o desempenho de uma
unidade de ED com uma de troca iônica na desmineralização do soro e relataram o melhor
desempenho da primeira técnica em relação à separação de íons e o menor consumo de
energia na operação. Uma etapa de pré-concentração do soro, anterior a desmineralização,
eleva o conteúdo de sólidos para 20 % a 30 %, como conseqüência aumenta a capacidade de
utilização da unidade e reduz o consumo de energia. Conforme Y
ADA (2004) e GRANDISON &
LEWIS (1996), uma importante aplicação da ED na indústria de laticínios é o fracionamento de
proteínas baseado no seu ponto isoelétrico.
48 FUNDAMENTOS TEÓRICOS E REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
A OI, de acordo com B
RANS et al. (2004), é usada na remoção de água do soro.
G
IRALDO-ZUÑIGA et al. (2004) indicam que a OI pode ser usada na pré-concentração ou
concentração do leite e do soro, da lactose e de proteínas do soro, e, também pode ser
utilizada no tratamento de efluentes da indústria de laticínios.
BALANNEC et al (2005)
estudaram a aplicação de membranas de NF e OI (em um único estágio) no tratamento do
efluente proveniente da indústria leiteira. Em todos os experimentos, o fluxo diminuiu
severamente logo no início da filtração, mas uma lavagem com água a 25 °C mostrou-se
eficiente para o restabelecimento do mesmo na maioria dos casos. As membranas de OI se
mostraram mais eficientes na redução da carga orgânica. A retenção de lactose ficou entre
98,2 e 99,9 %.
Parâmetros como temperatura, pressão transmembrana, fluxo e pH vem recebendo
atenção dos pesquisadores. C
HOLLANGI & HOSSAIN (2006) testaram a influência da ΔP na
retenção, em soluções contendo proteína e lactose. Constataram que para uma membrana de
UF de 10 kDa a retenção da proteína é baixa (aproximadamente 60%) em ΔP menores que 2
bar, isto pode ser melhorado para aproximadamente 95 % em ΔP de 2,5 a 3 bar. Ainda
concluem que a membrana de UF de 10 kDa é eficiente para produzir duas frações: o
permeado com teor elevado de lactose (aproximadamente 100 %) e o retido com elevado teor
de proteína (aproximadamente 95 %).
C
HEISON et al. (2007) realizaram a hidrólise com enzima protease, do isolado protéico
do soro de leite, através de escoamento tangencial utilizando um reator de membranas. Os
resultados mostraram que o fluxo permeado no reator aumentou com o aumento da
temperatura do retido e com a concentração da enzima.
S
IMMONS et al. (2007) estudaram o efeito da temperatura na agregação das proteínas
do soro e suas implicações no fouling do leite. No leite a composição e a produção da camada
de fouling são controladas pelas reações que formam os agregados das proteínas do soro. Em
temperaturas inferiores a 75 °C os agregados formados são pequenos e possuem ligações
fracas, enquanto os agregados formados em temperaturas mais elevadas são densos e mais
rígidos. Isto foi atribuído a ligações fracas, por forças de van der Waals, entre as partículas em
baixas temperaturas e ligações covalentes fortes, por pontes dissulfito, em temperaturas mais
elevadas. O crescimento dos agregados ocorre em dois estágios, primeiro ocorre a formação
de pequenas partículas devido à desnaturação da proteína nativa, depois ocorre a aglomeração
e a agregação destas partículas devido a colisões que ocorrem durante o escoamento e que
acabam formando partículas maiores. A adição de minerais em uma solução de concentrado
protéico 35 % resultou na formação de agregados menores e depósitos maiores, isto é
explicado pelos autores por ligações de cálcio com a β-Lg.
L
EITE et al. (2006) afirmam que o sistema de filtração tangencial é largamente
utilizado em processamento do leite e soro de queijo, porque facilita o arraste dos solutos,
evitando que estes se acumulem sobre a superfície da membrana.
R
AO (2002) constatou que os fluxos permeados dos soros doce e ácido foram
fortemente influenciados pelo pH. O autor descreveu que, para o soro doce, o fluxo aumenta
FUNDAMENTOS TEÓRICOS E REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 49
inicialmente com o aumento do pH, mas também aumenta o fouling posterior, provocando
uma redução posterior do fluxo. A diminuição do pH implica em uma redução do fluxo
inicial, mas também diminui o fouling posterior. O aumento no fluxo inicial em altos valores
de pH, para o soro, pode ser explicado por mudanças no estado das proteínas do soro.
M
OUROUZIS & KARABELAS (2006) estudaram o declínio do fluxo permeado de
soluções de proteínas isoladas do soro em membranas cerâmicas de MF com configuração de
escoamento transversal (dead end). Os testes envolveram cinco ciclos sucessivos de filtração,
sob pressão de filtração fixa com retro lavagem intermédiaria. A análise do declínio do fluxo
e a resistência da membrana à permeação foram utilizados para determinar mecanismos de
fouling. Há evidências de que fouling irreversível se desenvolve efetivamente durante o
primeiro ciclo de testes e aparentemente não aumenta significativamente no decorrer do
experimento, no entanto, o fouling reversível ocorre através de toda a série de filtração, sendo
mais intenso durante os primeiros minutos de cada ciclo. Os autores concluem que os
agregados de proteínas do soro presentes na solução de alimentação são responsáveis, quase
exclusivamente, pelo fouling observado na membrana. E, ainda, sugerem que ao se trabalhar
com membranas de poros grandes, como no caso da MF o processo deve ser operado em
baixas pressões.
B
RANS (2006) enfatiza em seu trabalho que na produção de CP ou de IP utilizando
PSM, o controle do fouling é crucial, porque todas as proteínas são retidas, e a formação da
“torta” e de uma camada gel ocorrem facilmente. Para isolar as proteínas do soro, a
seletividade é muito importante, porque a pureza determina o valor comercial dos produtos,
especialmente para aplicações farmacêuticas. O valor mais elevado permite o uso de módulos
mais caros, tipos de membrana e métodos de controle de fouling, para obter um máximo de
seletividade no processo do fracionamento.
V
AN REIS et al. (1999) demonstraram que uma seletividade ótima pode ser obtida na
região do fluxo dependente da pressão. A seletividade também pode aumentar escolhendo o
projeto apropriado do módulo e as condições de processo adequadas. Fatores tais como pH e
força iônica também têm um impacto significativo em sistemas de concentração e separação
de proteínas por membranas.
U
RIBE et al. (2007) realizaram um trabalho para predizer a retenção da lactose através
de dois modelos: Donnan Steric Partioning Model (DSPM) e Kedem-Spiegler Model (KSM).
A retenção e o fluxo permeado foram medidos utilizando soluções de alimentação de lactose
pura e de soro ultrafiltrado; os experimentos foram realizados em pH constante e com
membranas de NF. Os dois modelos foram capazes de prever razoavelmente bem, tanto para o
padrão quanto para o soro ultrafiltrado, as tendências de retenção da lactose em função do
fluxo permeado, porém que os melhores resultados foram previstos pelo modelo KSM. Vale
ressaltar que no modelo KSM a retenção de lactose pode ser predita na presença ou na
ausência de íons, mas não é fornecida qualquer informação sobre a estrutura da membrana. Já
o modelo DSPM fornece informações sobre a carga, a espessura, a porosidade e tamanho dos
poros das membranas. Este estudo contribui para um melhor entendimento do mecanismo de
transporte em processos de nanofiltração; por exemplo, no caso do estudo realizado os autores
50 FUNDAMENTOS TEÓRICOS E REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
concluíram que na presença de sais o valor de raio médio dos poros aumentou e que para
todas as membranas testadas a retenção de lactose foi menor no caso do soro ultrafiltrado, o
que mostra o efeito da presença de sais no desempenho da membrana.
Diversas configurações de membranas podem ser utilizadas no processamento de leite
e de soro. C
HEANG & ZYDNEY (2004) apresentaram uma proposta para obtenção de proteína
isolada de soro em uma unidade de produção com dois estágios de UF com recirculação total
do concentrado. G
UADIX et al. (2004) projetaram a instalação de uma unidade de UF de soro
de queijo em processo contínuo. A
KOUM et al. (2004) aplicaram sistemas de membranas
vibratórias de UF e OI no tratamento de águas de processos da indústria de laticínios.
B
HATTACHARJEE et al. (2006) também utilizaram sistemas de membranas vibratórias e um
aumento de 33 % do fluxo foi observado em 1 minuto com o disco da membrana girando a
300 rpm comparados ao valor correspondente da membrana estacionária. Os autores
atribuíram este resultado à redução da polarização por concentração, um dos principais fatores
limitantes dos PSM.
A tecnologia de membranas é uma aliada da indústria de laticínios porque os
componentes fracionados do leite permitem uma qualidade mais constante de produtos de
consumidor (por exemplo, queijo) e do desenvolvimento de produtos novos, tais como
revestimentos comestíves e peptídios bioativos. Conseqüentemente, o fracionamento do leite
conduz a um mais eficiente e diversificado uso do leite. As técnicas de separação com
membranas são uma parte essencial da maioria das novas técnicas desenvolvidas para a
produção de produtos lácteos funcionais como os peptídeos bioativos.
B
UTYLINA et al. (2006) afirmam que a NF, devido à MMC apropriada, é útil para
separação de peptídeos do leite com massas molares entre 1 a 2 kDa que possuem atividade
biológica (são apropriados para uso em alimentos infantis devido à ausência de
alergenicidade). As membranas negativamente carregadas foram aplicadas para enriquecer
peptídeos catiônicos com propriedades antibacterianas no soro de queijo. Os autores
concluíram que a melhor maneira de fazê-lo era pela filtração através da membrana de UF
com uma massa molar de corte razoavelmente baixa (2,5 kDa) e, então, usar a NF para a
purificação. No processo de UF ficaram retidas moléculas maiores que os peptídeos de até 2
kDa e usando a NF os peptídeos foram separados da lactose.
A NF, de acordo com M
ARTINEZ-FEREZ et al. (2006), pode ser usada na produção de
derivados de lactose como os oligossacarídeos do leite de cabra através da filtração tangencial
usando dois estágios com membranas cerâmicas de UF e NF obtendo um concentrado de mais
de 80 % em oligossacarídeos que são usados em formulações de produtos para crianças a fim
de combater doenças. R
ICHARDS (2002) relata que é possível fabricar iogurte com baixo teor
de lactose através dos PSM como UF e NF, e assim atender consumidores que apresentam má
absorção ou intolerância à lactose.
Os PSMs também podem ser utilizados na produção de queijos. Segundo C
ASTRO E
GERLA (2005) e ATRA et al. (2005) as principais vantagens atribuídas à utilização da UF para
produção de queijos, em relação ao processo tradicional, consistem em um aumento de
FUNDAMENTOS TEÓRICOS E REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 51
rendimento, possibilidade de fabricação contínua e automatizada de queijos, economia de mão
de obra e ingredientes, e a produção do soro com menor poder poluente. A UF é usada na
recuperação e no fracionamento das proteínas do soro e na produção de queijos de leite
ultrafiltrado, como Minas Frescal, Cottage, Feta e cream cheese. Segundo
LEITE et al. (2006),
o Brasil, apesar de ser um país relativamente novo, na implementação de PSM, já possui
plantas de membranas de UF, inclusive no processamento de queijos. O queijo Minas Frescal,
por exemplo, é produzido com auxílio da técnica de UF e vem sendo comercializado no Brasil
desde 1988, podendo ser encontrado na forma tradicional e também com baixo teor de
gordura. V
EIGA E VIOTTO (2001) estudaram a fabricação de queijo Petit Suisse por UF de leite
coagulado; também mencionam a produção do queijo Quark por UF, que resulta em
economia de energia, maior rendimento e maior valor nutritivo.
Existem diversos métodos que podem ser usados para o aproveitamento do soro.
Muitos destes métodos são baseados na tecnologia de separação com membranas, para
produzir novos produtos que respondam melhor às expectativas atuais dos consumidores. De
acordo com
LEITE et al. (2006) e SMITH (2003) a UF pode ser usada para se obter
concentrados de proteínas a partir do soro de queijo, que posteriormente serão adicionados a
iogurtes, queijos, carnes processadas, alimentos infantis e bebidas. A MF serve para controlar
o conteúdo de gordura do soro de queijo antes da UF, e remover microrganismos do leite e do
soro de queijo sem necessidade da alta temperatura de pasteurização.
R
EKTOR E VATAI (2004) aplicaram métodos de filtração por membranas para tratar o
soro de queijo Mussarela e encontrar uma aplicação potencial. Os autores utilizaram a MF
para remover gorduras e bactérias, a NF foi usada para a concentração do soro microfiltrado, a
UF foi usada para a concentração de proteínas e associada a DF obtiveram proteína purificada
e concentrada e, finalmente, a OI foi usada para reduzir o teor de água do soro.
Segundo S
MITH (2003), o soro em pó produzido por evaporação não possui
composição balanceada, visto que alguns componentes são degradados devido à exposição ao
calor, enquanto outros se apresentam em grandes concentrações (lactose e sais). A introdução
da tecnologia de separação por membranas, especialmente a UF e em alguns casos a NF, tem
resultado na produção de soro em pó com alto valor funcional e nutricional. De acordo com
G
IRALDO-ZUÑIRA et al. (2004) a UF não promove a desnaturação das proteínas do soro
mantendo as propriedades funcionais dos CPs inalteradas. A concentração e desmineralização
simultâneas do soro pela NF desenvolvem produtos que podem ser utilizados em várias
indústrias de alimentos, porém, neste caso, a lactose também é retida. Por este motivo, desde
1981, a UF se tornou a técnica mais utilizada para recuperar as proteínas solúveis do soro. A
vantagem de se aplicar a UF é reforçada pela sua relativa simplicidade, baixo consumo
energético e, segundo A
TRA et al. (2005) pela elevada eficácia na separação de proteínas do
soro.
A
NTUNES (2003) conclui em seu trabalho que para o processo de obtenção de CP com
80 % de proteína é necessário o emprego da DF para promover uma remoção mais eficiente
de lactose e sais minerais. A DF além de proporcionar a produção de um concentrado protéico
mais puro, permite também melhor controle da composição final do CP. C
HEANG E ZYDNEY
52 FUNDAMENTOS TEÓRICOS E REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
(2004) obtiveram uma recuperação acima de 90 % para as proteínas α-La e β-Lg quando a DF
foi utilizada; X
U et al. (2000) usaram duas etapas de DF no concentrado do soro de queijo da
UF para concentrar as proteínas como as Igs e glicomacropeptídios, esses dois compostos
passaram pelo processo de secagem por spray drier e no permeado restaram proteínas como
α-La, β-Lg e BSA.
Y
EE et al. (2007) investigaram o uso de uma planta de UF multi-estágios, com
produção contínua, para obter uma concentração de proteínas por volta de 80 %. Parte do
retido de cada estágio foi reciclada para manter a corrente de entrada desejada naquele
módulo de membrana. Os permeados de todas as correntes foram combinados e parte foi
reciclada e misturada com a corrente nova de alimentação. A proporção de permeado
reciclado foi usada para controlar a vazão do retido e a sua composição ao nível desejado. A
adição de água capacita que espécies não protéicas, que não são desejadas no retido,
permeiem pela membrana, aumentando a concentração de proteína nos sólidos totais do
retido. No entanto, quanto mais espécies não protéicas permeiam pela membrana, a
quantidade de sólidos totais presente no retido diminui.
M
ORTENSON et al. (2008) realizaram testes cromatográficos e sensoriais para
determinar se o tipo de queijo e as diferentes técnicas de processamento influenciam no flavor
de produtos derivados de soro como CPs e IPs. Segundo os autores o flavor de concentrados e
isolados protéicos tem sido considerado o principal fator limitante do uso destes produtos na
indústria alimentícia. Após a fabricação do queijo, o soro foi drenado, separado, pasteurizado
e fracionado por UF. A UF foi utilizada para reduzir a massa do produto e para remover
lactose e sais a fim de que a massa de proteínas representasse pelo menos 35 % da massa seca
do CP. Os autores encontraram que o flavor não foi afetado pelas diferentes técnicas de
processamento do CP e IP, porém, no teste sensorial as amostras de CPs foram classificadas
como mais doces do que as de IP, provavelmente devido a uma maior concentração de
lactose, por este motivo o IP foi classificado com menos flavor que o CP. Os testes
cromatográficos indicaram que o CP tem um número maior de substâncias aromáticas, em
particular moléculas de baixa massa molar, o que pode limitar a sua utilização em produtos
alimentícios, por isso uma maior purificação protéica amplia as possibilidades de utilização
deste produto.
Além de concentrar as proteínas do leite é interessante separá-las a fim de realçar as
suas propriedades funcionais. Os métodos relatados para isolar as proteínas são baseados na
agregação térmica da α-La, a cromatografia de troca iônica, a precipitação e a UF ou uma
combinação destes métodos. Usando a precipitação e a UF, G
ESAN-GUIZIOU et al. (1999)
apud B
RANS et al. (2004), relatam uma purificação de 52-83 % para α-La e 85-94 % para a β-
Lg.
B
HATTACHARJEE et al. (2006) realizaram um estudo com o objetivo de obter uma
separação relativa da β-Lg do concentrado de proteína do leite pelo fracionamento da proteína
usando a UF em dois estágios com membranas planas na forma de discos, com MMC de 30 e
10 kDa sob agitação, seguido por cromatografia de membrana de troca iônica (IEMC). Antes
do fracionamento foram realizadas uma centrifugação, MF e UF, esta última operando no
FUNDAMENTOS TEÓRICOS E REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 53
modo de DF descontínua em quatro estágios, para obter o concentrado de proteína do leite
livre de lactose. A centrifugação e a MF foram realizadas para remover os principais
poluentes como matérias coloidais, partículas suspensas de caseína e lipídios. Na DF os
autores usaram uma membrana de polietersulfona de 5 kDa, com objetivo de obter um
concentrado rico em proteínas e remover a maioria da lactose e dos minerais. Os efeitos de
vários parâmetros, como o pH da solução, a pressão transmembrana, a velocidade de agitação
e a velocidade de rotação da membrana, no fluxo permeado e na retenção da UF foram
estudados. Um fluxo 36 % mais elevado foi obtido com uma alimentação em pH 2,8
comparado àquele em pH de 5,6 com uma pressão transmembrana fixa de 5,0×10
5
Pa, este
resultado é decorrência do efeito do pH no equilíbrio do monômero-dímero da β-Lg. Uma
pureza de 87,6 % da β-Lg foi obtida no filtrado da cromatografia de membrana de troca
iônica.
C
HEANG & ZYDNEY (2004) fizeram um estudo para examinar o uso de um sistema de
filtração em dois estágios com fluxo tangencial para a purificação de α-La e β-Lg da proteína
isolada do soro. Para a separação foram usadas membranas de 100 e 30 kDa em série. Duas
estratégias de purificação foram examinadas: na primeira estratégia, uma membrana de 100
kDa foi usada na primeira etapa para remover BSA enquanto α-La e β-Lg permeavam. O
permeado desta primeira etapa foi então usado como alimentação para a etapa 2, onde a α-La
e β-Lg eram separadas usando uma membrana de 30 kDa; na segunda estratégia a
combinação de membranas foi invertida, a membrana de 30 kDa foi utilizada na etapa 1 para
obter α-La pura no permeado da solução, enquanto ficavam retidas β-Lg e BSA; o retido
coletado era, então, separado na etapa 2 usando a membrana de 100 kDa. Para alcançar
elevada purificação e rendimento, as filtrações nas etapas 1 e 2 foram operadas no modo de
DF para “lavar” a proteína mais permeável pela membrana. Como resultado foi obtido um
rendimento de α-La de 95 % na Estratégia I e 85 % na Estratégia II, porém, na Estratégia II
obtiveram um produto de α-La significativamente mais concentrado porque a α-La foi
recuperada diretamente da primeira etapa usando uma única DF. Os rendimentos para β-Lg, o
componente com massa molar intermediária, ficou em torno de 70 % em ambas as estratégias.
O rendimento menor de β-Lg foi relacionado à presença de α-La residual da primeira etapa,
juntamente com uma transmissão relativamente alta de BSA pela membrana.
Z
YDNEY & VAN REIS (2001) utilizam o conceito de fluxo tangencial de alto
desempenho (HPTFF), que é uma tecnologia emergente que possibilita a separação de
proteínas com massas molares semelhantes. HPTFF promove a separação de proteínas com
alta resolução, explorando interações estéricas (tamanho) e eletrostáticas (carga). Segundo os
autores, seletividades de mais de 100 vezes podem ser alcançadas facilmente para modelos de
sistemas binários com proteínas com cargas superficiais muito diferentes, quando
características de pH e força iônica da solução são ajustadas e usando membranas carregadas
para aumentar a retenção da proteína também carregada. O modo DF é empregado para
separação das proteínas a fim de eliminar problemas de associação em altas concentrações no
produto retido, gerando alta purificação e ao mesmo tempo bons fatores de rendimento.
Segundo
EBERSOLD & ZYDNEY (2004), estudos experimentais recentes demonstram
que sistemas de membrana podem ser usados para separar variantes de proteína que diferem
em um único resíduo de aminoácido, embora a seletividade e o fator de purificação sejam
54 FUNDAMENTOS TEÓRICOS E REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
relativamente baixos. O objetivo do trabalho foi examinar teoricamente os efeitos da carga da
membrana e a distribuição de tamanhos de poros na separação de variantes de proteína por
HPTFF. Uma seletividade significativamente maior é obtida reduzindo o tamanho de poro e
aumentando a densidade de carga da superfície da membrana. As interações eletrostáticas que
surgem fazem diferença nas pequenas mudanças de carga que ocorrem entre uma proteína
nativa e sua variante. Com a seleção das propriedades da membrana os autores conseguiram,
teoricamente, uma purificação de 100 vezes e um rendimento de 90% para a separação de
variantes que diferem em um único grupo de lisina.
A
LVAREZ et al. (2006) utilizaram um concentrado protéico de soro comercial com 65
% de proteína como matéria-prima para obtenção de uma solução enriquecida com α-La. O
processo proposto consiste das seguintes etapas: (1) precipitação, (2) centrifugação (I), (3)
lavagem do precipitado, (4) centrifugação (II) e, finalmente, (5) solubilização do precipitado.
Na etapa 1, α-La, Ig e BSA foram precipitadas simultaneamente acrescentando ácido lático
como seqüestrante do íon Ca
2+
em pH de 4,0. A precipitação de α-La neste caso é reversível,
ou seja, quando o pH original foi restabelecido a proteína tornou-se solúvel novamente. A
solução obtida nesta etapa continha basicamente α-La e β-Lg, com variações da temperatura
de lavagem (etapa 3), foi removida boa parte da β-Lg. A solução obtida no final apresentou
uma pureza de 74 % de α-La, além disso, mais de 99 % da β-Lg presente na solução de
alimentação foi removida do processo.
B
RANS et al. (2004) relatam que é possível empregar propriedades específicas da
proteína para aumentar a seletividade do processo de UF. O ajuste do pH e adição de sal
influenciam nas interações eletrostáticas e estéricas entre as proteínas e a membrana.
VAN
REIS et al. (1999) examinaram quantitativamente os efeitos de carga na membrana em
combinação com o pH, em separações de proteína, usando HPTFF. Foram realizados
experimentos de filtração com membranas de polietersulfona com MMC de 100 kDa
carregadas positiva ou negativamente, utilizando uma mistura de BSA e um fragmento de
anticorpo (Fab) derivado de DNA recombinante; estas duas proteínas têm massas molares
semelhantes (69 kDa para BSA e 45 kDa para o Fab) mas diferem significativamente nas
características elétricas (o PI do BSA é 4,8 enquanto que para o Fab é 8,5). Os autores
conseguiram, através de uma membrana carregada negativamente, e uma solução com pH 8,4,
purificação de BSA com rendimentos de 94 %..
A identificação de alternativas para um adequado aproveitamento do soro de leite é de
fundamental importância em função de sua qualidade nutricional e funcional, do seu volume e
de seu poder poluente. Ao mesmo tempo, o processamento do soro em produtos diversos
contribui para a melhoria do meio ambiente e proporciona ganhos às indústrias. O Brasil é um
país que apresenta um enorme potencial para o aproveitamento do soro lácteo. A expressiva
produção brasileira de queijo gera grande quantidade dessa matéria-prima, porém a maioria
do soro gerado ainda é indevidamente descartada. Tendo em vista a grande e recente
quantidade de trabalhos realizados visando o aproveitamento do soro, alguns com resultados
muito bons, verificam-se a importância e aplicabilidade nas mais diversas áreas da indústria
de alimentos e farmacêutica dos concentrados e isolados protéicos obtidos a partir do soro de
queijo. A tecnologia de membranas associada a outros processos de separação representa uma
FUNDAMENTOS TEÓRICOS E REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 55
estratégia promissora para aproveitar os componentes do soro, gerar produtos de elevada
qualidade, e ainda, diminuir o problema ambiental das indústrias de laticínios.
Capítulo 3
Materiais e Métodos
Neste capítulo são apresentados os equipamentos, as membranas e os reagentes
químicos utilizados na realização dos experimentos. Ainda, são descritos os métodos
analíticos para análise das amostras e a metodologia experimental para a realização dos
experimentos de concentração, purificação e fracionamento das proteínas.
3.1 Preparação do soro
O soro de queijo em pó utilizado neste trabalho foi doado pela Elegê Alimentos
(Teutônia, RS), proveniente da fabricação do queijo Mussarela com um teor de sólidos totais
de aproximadamente 6 %.
O soro de leite em pó é a fase líquida resultante da produção de queijo que é
concentrado em evaporadores e posteriormente, seco em spray drier (torre de secagem) sendo
envasado em embalagens de 25 kg.
O soro em pó foi utilizado por ser a forma mais estável e homogênea para o uso do
soro de leite, pois contém todos os constituintes nas mesmas proporções relativas ao soro
original; desta forma podemos garantir uma homogeneidade inicial em todos os experimentos,
sem contar com variabilidades que ocorreriam se trabalhássemos com amostras in natura e,
portanto heterogêneas de soro. Além disso, pode ser armazenado por um tempo maior (12
meses) sem danos para suas propriedades físicas ou nutricionais, minimizando, desta forma, o
fator microbiológico, e reduzindo os custos de transporte e armazenamento.
O soro de queijo em pó se caracteriza por ser um pó fino e homogêneo de cor
amarelada, sabor suave e odor próprio do produto. As características físico-químicas e
nutricionais do soro são mostradas na Tabela 3.1 e na Tabela 3.2, respectivamente, segundo a
especificação técnica do produto fornecida pela empresa.
MATERIAIS E MÉTODOS 57
Tabela 3.1: Características físico-químicas do soro em pó.
Análises
Unidade
Mínimo Máximo
Umidade % - 3
Acidez % 0,02 0,1
pH - 6 6,6
Massa específica g. cm
-3
0,5 0,61
% percentual mássico
Fonte: a tabela adaptada de Elegê Alimentos (2007)
Tabela 3.2: Características nutricionais do soro em 100 g.
Composição Unidade Valores
Carboidratos (lactose) g 77
Proteínas g 12
Gorduras Totais g < 1
Colesterol mg < 5
Fibra Alimentar g 0
Cálcio mg 440
Sódio mg 675
Valor energético kcal 350
Fonte: Elegê Alimentos (2007)
De acordo com a Tabela 3.2 os carboidratos correspondem à quantidade total de
lactose presente no soro.
Para a realização dos experimentos, o soro foi reconstituído dissolvendo manualmente
o soro em pó em água destilada na temperatura de 50 °C.
Na etapa de concentração do soro o volume inicial a ser ultrafiltrado foi de
aproximadamente 30 L (27 L de água no tanque + 2,6 L de água de volume morto + 1,86 kg
de soro em pó). As concentrações médias iniciais e o percentual em base seca de lactose e de
proteína foram iguais a 42 g.L
-1
(72,4 %) e 9 g.L
-1
(15,6 %), respectivamente, tomando a
massa específica do soro reconstituído como 1,04 g.L
-1
. As quantidades de gorduras para fins
de cálculos foram consideradas desprezíveis por apresentarem valores muito baixos. Dessa
forma, considerou-se que o soro é constituído somente por proteínas, lactose e sais. Portanto,
a concentração de sais no soro reconstituído foi determinada pela diferença da concentração
de sólidos totais pelo somatório de proteínas e lactose correspondendo a 7 g. L
-1
(12 %) de
sais.
3.2 Reagentes Analíticos
Tabela 3.3 apresenta os reagentes utilizados para a realização das análises e da
limpeza das membranas. Para o preparo de todas as soluções aquosas foi utilizada água
destilada; exceto para as análises de eletroforese, onde foi utilizada água deionizada.
58 MATERIAIS E MÉTODOS
Tabela 3.3: Reagentes utilizados, fórmula, grau de pureza e fornecedor.
Reagente
Fórmula molecular
Pureza Fornecedor
Análise de açúcar - Método do DNS
Hidróxido de Sódio NaOH 95,0% - 100,5% CAQ
Ácido 3,5 - dinitrosalicílico C
7
H
4
N
2
O
7
Mín. 99% VETEC
Tartarato de sódio e
potássio
KNaC
4
H
4
O
6
.4H
2
O 99% - 100% VETEC
Análise de açúcar - Método de Dubois
Fenol (80%) C
6
H
5
OH Mín. 99% VETEC
Ácido Sulfúrico
H
2
SO
4
95,0% - 98% Quimex
Análise de Sólidos Totais
Ácido Nítrico HNO
3
Mín. 65% Dinâmica
Areia fina - comercial -
Análise de proteína - Método de Lowry
Sulfato de Cobre CuSO
4
.5H
2
O
Citrato de sódio C
6
H
5
Na
3
O
7
.2H
2
O 99% - 100,5% Cromato
Carbonato de sódio NaCO
3
99,5% Dinâmica
Hidróxido de Sódio NaOH 95,0% - 100,5% CAQ
Folin – Ciocalteu W + Mo + H
3
PO
4
N.I* Cromato
Análise de Proteína - Eletroforese
Acrilamida CH
2
.CHCONH
2
≥ 99%
Amersham
Biosciences
Bisacrilamida CH
2
.(CHCONH)
2
CH
2
≥ 99%
Amersham
Biosciences
Temed - ≥ 99%
Amersham
Biosciences
Persulfato de Amônio - ≥ 99%
Amersham
Biosciences
Glicina H
2
NCH
2
CO
2
H ≥ 99% USB Corporation
Tris
(Tris[hydroxymethyl]amino
methane)
NH
2
C(CH
2
OH)
3
99,8% - 100,1% USB Corporation
Sodium Dodecyl Sulfate
(SDS)
CH
3
(CH
2
)
11
OSO
3
Na ≥ 99% USB Corporation
Ácido acético CH
3
COOH P.A Merck
Metanol CH
3
OH P.A. Sigma
Comassie blue R250 - - Sigma
β-mercaptoetanol HS-CH2-CH2-OH P.A.
Amersham
Biosciences
MATERIAIS E MÉTODOS 59
Tabela 3.3: Reagentes utilizados, fórmula, grau de pureza e fornecedor (cont.).
Reagente
Fórmula molecular
Pureza Fornecedor
Cromatografia Gel
Fosfato de sódio
monobásico
NaH
2
PO
4
P.A. Merck
Fosfato de sódio dibásico Na
2
HPO
4
P.A. Merck
Acetato de sódio anidro CH
3
COONa
P.A. Merck
Ácido acético CH
3
COOH P.A Merck
Blue Dextran 2000 - -
Amershan
Biosciences UK
Limited
Coluna Superose
TM
12 - - General Eletric
Limpeza
Hidróxido de Sódio NaOH 95,0% - 100,5% CAQ
Ácido Cítrico C
6
H
8
O
7
99,5% VETEC
Hipoclorito de sódio NaOCl Comercial ALZ
Kit p/ determinação de
Cloro
- Comercial Lamotte Company
Padrões moleculares
Lactose C
12
H
22
O
11
H
2
O P.A CAQ
β - lactoglobulina β-Lg 99 % Sigma
α – lactoalbumina α-La 99 % Sigma
Albumina do soro bovina
(BSA)
BSA Mín. 96% Sigma
Ferritina
- 99 % General Eletric
Aldolase
- 99 % General Eletric
Conalbumina
- 99 % General Eletric
Ovalbumina
- 99 % General Eletric
Anidrase Carbônica
- 99 % General Eletric
3.3 Membranas
A Tabela 3.4 apresenta as membranas utilizadas durante os experimentos, juntamente
com suas respectivas características. Cada uma delas recebeu uma sigla para facilitar a citação
no decorrer do trabalho.
60 MATERIAIS E MÉTODOS
Tabela 3.4: Características das membranas utilizadas nos experimentos.
Membrana
Tamanho
de poro/
MMC
Material
Área
(m²)
Espaça-
dor
(mil)
Módulo
T
máxima
(°C)
Faixa
de pH
Fabricante
UF - 6001 5.000 Da
Polieter-
sulfona
0,28 80 Espiral 55 1,8-11
Koch
membrane
Systems
UF - 6002 5.000 Da
Polieter-
sulfona
0,22 43 Espiral 55 1,8-11
Koch
membrane
Systems
UF - 7001 10.000 Da
Polieter-
sulfona
0,28 80 Espiral 55 1,8-11
Koch
membrane
Systems
MF - 7002 0,1 µm
Polieter-
sulfona
0,22 80 Espiral 55 1,8-11
Koch
membrane
Systems
RZ04 70.000 Da NI 0,0061 - Plana 100 0,5-13
Sepa
membranes
HNO6 20.000 Da NI 0,0061 - Plana 100 0,5-13
Sepa
membranes
VCWP 0,1 µm NI 0,0061 - Plana NI NI -
UF - C20 20.000 Da
ZrO
2
–
TiO
2
0,0047 - Tubular 120 1-14
Andritz
Separation
UF - C50 50.000 Da
ZrO
2
–
TiO
2
0,0047 - Tubular 120 1-14
Andritz
Separation
*NI - não informada pelo fabricante.
A Figura 3.1 mostra as fotografias dos três módulos de membranas utilizados para
realização dos experimentos.
Figura 3.1: Fotografias das membranas: espiral (A), tubular(B) e plana (C).
Para o processo de concentração e purificação (UF e DF) das proteínas do soro foram
testadas três membranas: UF-7001, UF-6001 e UF-6002.
A
C
B
MATERIAIS E MÉTODOS 61
Para as tentativas de fracionamento foram utilizadas as membranas: MF-7002, RZ04,
HN06, VCWP, UF-C20 e UF-C50.
3.4 Equipamento
O processo de UF foi realizado numa planta piloto WGM-KOCH PROTOSEP IV
localizada no Laboratório de Tecnologia Química – LATEQ da UFRGS. A unidade piloto de
UF/MF está esquematizada na Figura 3.2.
Figura 3.2: Representação esquemática simplificada da unidade piloto de UF.
A unidade piloto possui os seguintes equipamentos, de acordo com a Figura 3.2:
•
tanque de alimentação (1) - dois tanques foram usados dependendo do volume de
soro a ser tratado, a Figura 3.3 apresenta as fotografias dos tanques utilizados.
o (A) tanque de alimentação encamisado de aço inoxidável 304, com volume
de 75 L, fabricado pela SULINOX; possui um agitador e um sistema de
controle de temperatura que opera na faixa de temperatura de 25 a 150°C;
o (B) tanque de alimentação de aço inox com capacidade de 12 L; possui
uma serpentina de aquecimento ligada a um banho termostático, marca
Lauda, o qual possui controle analógico de temperatura;
62 MATERIAIS E MÉTODOS
Figura 3.3:Fotografias dos tanques de alimentação (A) e (B).
• bomba pneumática (2) tipo diafragma, modelo VERSAMATIC VM.50, opera com
ar comprimido que passa pelo sistema composto por um Kit FLR (filtro,
lubrificador e regulador de ar);
•
pré-filtro de cartucho (3), fabricado pela CUNO, constituído de uma carcaça de
PVC e elemento filtrante de polipropileno com tamanho de poro nominal de 1µm;
•
manômetros (4) e (6) de aço inoxidável 316, que estão instalados num tê Sanitech
com uma câmara com diafragma, que evita contato do manômetro com o fluido de
processo. Os manômetros possuem escala de 0 a 10,5 kgf. cm
-2
;
•
carcaça para módulo da membrana (5), três carcaças diferentes foram usadas,
dependendo do tipo de membrana requerida para o processo. A Figura 3.4
apresenta as fotografias das carcaças utilizadas neste trabalho.
o (A) carcaça para módulo espiral, com 30 cm de comprimento e 5,8 cm de
diâmetro, feito em aço inoxidável 316;
o (B) carcaça para módulo de membrana cerâmica cilíndrica com 25 cm de
comprimento, 10 e 25 mm de diâmetro interno e externo, respectivamente,
feito em aço inoxidável 340;
o (C) carcaça para membrana plana, construída de aço inoxidável 316,
permite a instalação de membranas com área útil de 61 cm
2
.
Figura 3.4: Fotografias das carcaças para módulos de membrana: (A) espiral, (B) tubular e
(
C) plana.
A B C
A B
MATERIAIS E MÉTODOS 63
A utilização de uma bomba pneumática tipo diafragma VERSAMATIC tem como
objetivo evitar o contato do fluido com as partes metálicas da bomba, reduzindo a
possibilidade de contaminação do fluido.
O ar comprimido para o acionamento da bomba foi fornecido por um compressor
SCHULZ com capacidade de 175 L e potência de 2 hp com vazão volumétrica de 0,00472
m
3
.s
-1
. A pressão no equipamento foi ajustada, primeiramente, na válvula reguladora de ar da
bomba pneumática e, após, através da válvula de contrapressão com diafragma que se localiza
na saída do concentrado do módulo de UF.
As pressões nas extremidades do módulo de UF foram medidas pelos manômetros
instalados na entrada (4) e na saída (6).
O pré-filtro (3), instalado antes do módulo de UF, tem o objetivo de reter as impurezas
em suspensão da corrente de alimentação, evitando o entupimento do módulo e,
conseqüentemente, aumentando a sua durabilidade.
3.5 Metodologia Experimental
Os ensaios são constituídos inicialmente por testes de compactação e medidas de fluxo
permeado de água, com o objetivo de preparar e caracterizar as membranas para os ensaios de
UF e MF para permeação do soro. Todos os experimentos foram realizados, no mínimo, em
duplicata.
3.5.1 Compactação das Membranas e Medidas de Fluxo de Água
Os testes de compactação são executados através da imposição de uma pressão maior
do que a de operação até que o fluxo permeado de água torne-se constante com o tempo. O
objetivo é realizar o adensamento da microestrutura das membranas, para que durante os
ensaios posteriores tal fenômeno não aconteça (ou ocorra de forma insignificante), o que
poderia levar a conclusões errôneas sobre fouling, por exemplo.
Foram colocados no tanque de alimentação aproximadamente 10 litros de água
destilada na temperatura de 25
o
C. A bomba foi acionada e regulou-se a válvula de contra
pressão até alcançar a maior ΔP possível a fim de que o adensamento da microestrutura fosse
garantido. A água ficou recirculando de 10 a 150 minutos (dependendo da membrana) para
estabilizar o sistema, ou seja, para que o sistema entrasse em equilíbrio operacional. A
compactação era encerrada quando o fluxo de água tornava-se constante.
Medidas de fluxo de água foram realizadas antes e após cada experimento com o
objetivo de avaliar a permeabilidade hidráulica da membrana. Testes de permeação hidráulica
têm como enfoque principal avaliar o comportamento das membranas em relação à água com
respeito aos valores de fluxo de permeado, obtidos em diferentes pressões. Além disso, serve
de referência para a avaliação do estado das membranas após a passagem do efluente pelas
mesmas.
64 MATERIAIS E MÉTODOS
As medidas de fluxo de permeado foram realizadas através do método volumétrico
direto. O método consiste em calcular os dados de fluxo a partir da medida do tempo que um
fluido leva para preencher o volume fixo de uma proveta.
3.5.2 Concentração e Purificação das Proteínas do Soro
Três membranas foram testadas para utilização nos experimentos de concentração e
purificação das proteínas do soro: a UF-7001, a UF-6001 e a UF-6002. A escolha da
membrana depende da qualidade do fluxo permeado e das características de retenção, porque
a membrana deve reter todas as proteínas e ser permeável à lactose e aos sais.
Membranas de ultrafiltração são comercializadas pela sua massa molar de corte
(MMC), a qual é geralmente definida, como a massa molar do menor componente que será
retido pela membrana com uma eficiência de 95 %. Assim uma membrana com MMC de
10.000 Da deve reter pelo menos 95 % das moléculas com esta massa molar. A massa molar
de corte de uma membrana é normalmente determinada através de medidas de rejeição
utilizando-se soluções homogêneas de solutos (por exemplo, polietilenoglicol – PEG ou
dextranas) com massa molar variada e conhecida.
Para avaliar a retenção realizamos uma caracterização das membranas verificando a
retenção da membrana para moléculas com massa molar conhecida (dextranas) e superior a
MMC informada pelo fabricante. Passamos pelas membranas uma solução de 0,15 % ou 1,5
g/L de dextrana com massa molar de 15 a 20 kDa nas membranas UF-7001, UF-6001 e UF-
6002. A concentração de dextrana foi avaliada no permeado e no concentrado através do
método fenol sulfúrico, e realizamos o cálculo de retenção da membrana através destes dados.
A melhor membrana é aquela que apresentar 100 % ou a maior retenção possível para as
moléculas de dextrana, que possuem massa molar similar a menor proteína de interesse neste
trabalho (α-La, 14 kDa).
Após a escolha da melhor membrana iniciaram-se os testes de concentração e
purificação das proteínas propriamente ditas. O primeiro passo foi realizar a compactação e
medidas de fluxo de água em diversas pressões transmembrana.
A seguir, dissolveu-se soro em pó em água destilada, obtendo-se 30 L de solução de
soro, conforme explicado na seção 3.1 Preparação do soro.
A solução de soro foi colocada no tanque de alimentação da unidade, e então foram
realizados testes de permeação do efluente; estes testes foram realizados da mesma forma que
os testes de permeação hidráulica, porém o fluido é o soro. O objetivo é analisar a influência
da pressão no fluxo de permeado e verificar a existência ou não de um fluxo limite dentro do
intervalo de pressões testado.
Os experimentos realizados na unidade piloto de UF foram efetuados em duas etapas
distintas. A primeira etapa teve como objetivo concentrar as proteínas do soro de queijo
através do processo de UF e a segunda etapa consiste em purificar estas proteínas usando a
MATERIAIS E MÉTODOS 65
DF. Para cada uma destas etapas foram obtidos concentrados com características diferentes,
os quais possuem aplicações de acordo estas características.
A pressão transmembrana foi mantida em 2 bar e a vazão da corrente de alimentação
do soro de queijo foi de aproximadamente 840 L.h
-1
, condições determinadas em trabalhos
anteriores (B
OSCHI, 2006) e confirmadas neste trabalho. A temperatura do soro foi mantida
constante em 50 °C, tendo em vista a temperatura de saída do soro do processo de fabricação
do queijo (~ 60 °C) e a temperatura máxima admissível para a membrana (~ 55 °C).
Nos primeiros dez minutos, o sistema operou em reciclo total, isto é, as correntes de
permeado e concentrado retornavam para o tanque de alimentação, para homogeneizar a
solução e para o sistema entrar em equilíbrio térmico: após, somente a corrente concentrada
retornava ao tanque, e o permeado foi sendo recolhido até que se obtivesse a concentração
desejada. Medidas diretas de fluxo permeado foram realizadas a cada 15 minutos. A cada
meia hora de operação foram coletadas, simultaneamente, amostras das correntes de
permeado e de concentrado em frascos de vidro âmbar. As análises feitas nas amostras foram:
pH, condutividade elétrica, extrato seco total e as concentrações de lactose e de proteína.
Para a concentração das proteínas do soro de queijo o seguinte processo pode ser
visualizado: o soro flui, sob pressão, através da membrana, a qual permite a passagem de
água, sais e lactose, que irão constituir a solução chamada de permeado cujas partículas são de
tamanho inferior aos poros da membrana; as proteínas são partículas de tamanho superior em
relação aos outros constituintes mencionados do soro, logo, são retidos pela membrana e esta
solução é denominada de concentrado. A Figura 3.5 apresenta, de forma esquematizada, o
processo de concentração do soro por UF.
Figura 3.5: Representação esquemática do processo de UF.
A UF foi operada associada a DF que consiste em adicionar água durante o processo
de concentração, para lavar os componentes de mais baixa massa molar (lactose e sais), e
conseqüentemente aumentar a purificação do retido (proteínas), o mesmo volume de água que
é adicionado na DF é retirado no permeado. A Figura 3.6 apresenta de forma esquematizada
os processos de DF no concentrado da UF.
S
ORO
Permeado
Concentrado
UF
Le
g
enda:
P
roteína
L
actose
Sais
66 MATERIAIS E MÉTODOS
Figura 3.6: Representação esquemática do processo de DF.
Quatro experimentos diferentes foram realizados para verificar quais condições
permitiriam uma maior purificação das proteínas, os quais estão descritos a seguir.
Experimento 1
a solução inicial foi concentrada até um volume final de 6 L no tanque
de alimentação (FC = 5); a seguir duas DF foram realizadas utilizando-se 6 L de água para
cada uma (DF1 e DF2).
Experimento 2
a solução inicial foi concentrada até um volume final de 6 L no tanque
de alimentação (FC = 5); a, seguir cinco DF foram realizadas: as duas primeiras ( DF1 e DF2)
com 6 L cada e mais três (DF3, DF4 e DF5) com 3 L cada.
Experimento 3
a solução de soro foi concentrada até um volume final de 5 L (FC = 6);
em seguida realizaram-se duas DF (DF1 e DF2) com 5 L de água para cada uma.
Experimento 4
a solução de soro foi concentrada até um volume final de 5 L (FC = 6).
Em seguida realizaram-se quatro DF: a DF1 e a DF2 de 5 L e a DF4 e a DF5 de 2,5 L.
Vale ressaltar que entre a etapa de concentração e as DFs não foi realizado enxágüe
nem limpeza da membrana, isto é, o processo foi contínuo. A Figura 3.7 traz o esquema geral
das etapas de concentração e purificação das proteínas do soro realizadas neste trabalho.
Concentrado Protéico
Purificado
Permeado
DF
água
Concentrado 1
+
MATERIAIS E MÉTODOS 67
Figura 3.7: Resumo esquemático das estratégias utilizadas para concentração e purificação das proteínas do
soro.
3.5.3 Fracionamento das proteínas do soro
O concentrado protéico obtido foi separado em alíquotas para a realização dos
experimentos com membranas de UF e de MF, em módulos plano, espiral e tubular, com
tamanho de poro nominal ou MMC selecionados para a separação.
Nesta etapa foram monitorados o pH e a temperatura, fatores importantes para que
ocorram mudanças conformacionais na molécula de β–Lg, ou seja, para que esta molécula
forme dímeros e octômeros e assim ocorra o fracionamento, com a β-Lg ficando retida,
enquanto a α–La passa para o permeado. O esquema para o fracionamento pode ser observado
na Figura 3.8.
Figura 3.8: Representação esquemática do processo de fracionamento desejado.
Concentrado
Protéico
Purificado
Permeado
Concentrado
UF / MF
β
-Lg
α
-La
L
actose
CONCENTRADO
P
ROTÉICO
P
URIFICADO
68 MATERIAIS E MÉTODOS
Todas as membranas testadas para a separação de proteínas foram compactadas, e
caracterizadas em relação ao fluxo permeado de água e de soro em no mínimo quatro pressões
transmembrana. A pressão transmembrana de operação foi determinada fazendo a curva J
p
vs
ΔP; a vazão de alimentação utilizada foi a vazão correspondente ao melhor ΔP. Os
experimentos de separação das proteínas para cada membrana foram realizados conforme o
descrito a seguir.
Membrana MF-7002
Quando o módulo utilizado era o MF-7002 devido à maior taxa de permeado, o
volume inicial de concentrado protéico usado foi de 6 L no tanque de alimentação.
Um volume inicial de 6 L de concentrado protéico, obtido nas etapas anteriores, foi
adicionado ao tanque de alimentação, aquecido a 40 °C. A temperatura foi reduzida, porque
em concentrados protéicos, em temperaturas próximas a 55 °C existe uma tendência das
moléculas de α-La polimerizarem (F
OX & MCSWEENEY, 1998; WIT, 1998). O pH da solução
foi ajustado para 4,6 (pH onde a β-Lg forma octômero) com a adição de uma solução 20 % de
ácido cítrico. O volume inicial de 6 L foi reduzido a 3 L, e em seguida quatro DFs de 3 L
foram realizadas com água destilada pré-aquecida a 40 °C, acidificada ao pH de 4,6 através da
solução de ácido cítrico; a vazão de alimentação foi mantida em 700 L.h
-1
; a pressão
transmembrana utilizada para a separação foi de 1,75 bar; o fluxo permeado foi medido a cada
15 minutos e amostras foram coletadas ao final de cada etapa.
Membranas VCWP, RZO4 e HN06
Os testes com estas membranas foram realizados com o módulo plano (61 cm
2
de área
útil) e com dois litros de concentrado protéico purificado obtido na etapa de concentração e
purificação.
Para as membranas VCWP e RZ04 o concentrado foi aquecido a 40 °C, e acidificado
ao pH de 4,6 com ácido cítrico 20 %, assim como o realizado para a MF-7002.
Para a membrana HN06, optou-se por realizar o experimento a temperatura ambiente
(25 °C). Nesta membrana também não foi necessário adicionar ácido, pois a solução se
encontrava no pH 6,3. Segundo W
ONG et al. (1999), para valores de pH compreendidos entre
5,20 e 7,50 (faixa que compreende o pH do soro) e à temperatura ambiente, todas as variantes
genéticas de β-Lg existem principalmente como um dímero estável de dois monômeros
unidos por ligações não covalentes.
Os experimentos foram realizados com uma vazão de alimentação de 620 L.h
-1
, e
pressão transmembrana de 1,75 bar. Inicialmente, o sistema operou em modo de reciclo total,
durante 20 minutos, para garantir homogeneidade na concentração e equilíbrio de
temperatura, somente então, passou-se a operar em modo batelada com retorno para o tanque
de alimentação apenas da corrente retida, sendo o permeado recolhido em outro tanque. Após
MATERIAIS E MÉTODOS 69
30 minutos de operação em modo batelada amostras de permeado e concentrado foram
coletadas.
Para estas membranas, não foi possível reduzir o volume inicial à metade ou realizar
DF devido a limitações do equipamento tais como: volume insuficiente no tanque de
alimentação, área de membrana limitada, conduzindo a uma taxa de permeado muito baixa.
Foram analisados apenas o fluxo permeado e as concentrações de proteína na corrente
permeada e concentrada.
Membranas UF-C20 e UF-C50
Para a membrana UF-C20 (tubular) o volume inicial de concentrado protéico
purificado no tanque de alimentação foi igual a 3 L. O fluxo permeado foi medido a cada 100
mL de permeado coletados, e amostras retiradas a cada 500 mL. O experimento foi conduzido
até que 1000 mL de permeado fossem coletados. O pH da solução foi mantido em 6,3 e a
temperatura em 25 °C; a ΔP foi mantida em 2,25 bar e a vazão de alimentação em 620 L.h
-1
.
Para a membrana UF-C20 ainda foi testada a tentativa de fracionamento com a
solução do soro reconstituído, i.e., antes da concentração e purificação das proteínas , para
verificar se não havia interferências no fracionamento devido ao processo de concentração e
purificação. O pH da solução foi mantido em 6,3; a temperatura em 25 °C, a ΔP foi mantida
em 2,25 bar e a vazão de alimentação em 620 L.h
-1
; o volume inicial no tanque de
alimentação foi de 3 L e amostras foram coletadas a cada 500 mL de permeado recolhido e o
experimento foi conduzido até que 1000 mL de permeado houvessem sido recolhidos.
Para a membrana UF-C50 foram realizadas duas estratégias. Na estratégia 1 o pH da
solução foi mantido em 6,3; a temperatura em 25 °C. Na estratégia 2 o pH da solução foi
acidificado até 4,6; e a temperatura utilizada foi de 40 °C. Para ambas estratégias a ΔP foi
mantida em 2,25 bar e a vazão de alimentação em 400 L.h
-1
, o volume inicial no tanque era de
3 L e o experimento era interrompido no momento que 1000 mL de permeado tivessem sido
coletados. O fluxo permeado era medido a cada 250 mL e amostras coletadas a cada 500 mL.
A Figura 3.9 traz o resumo das estratégias utilizadas para o fracionamento das
proteínas do soro a partir do concentrado protéico obtido do soro.
70 MATERIAIS E MÉTODOS
Figura 3.9: Representação esquemática das estratégias utilizadas para fracionamento das
proteínas do concentrado protéico obtido do soro.
3.6 Métodos Analíticos
As características das amostras do concentrado e do permeado dos processos da UF,
DF e fracionamento foram analisadas conforme descrito nos procedimentos a seguir.
Informações mais detalhadas das técnicas utilizadas estão apresentadas no Anexo A.
3.6.1 Análise de Extrato Seco Total - Método Gravimétrico
O valor de extrato seco total ou de sólidos totais (ST) é o parâmetro adotado para a
verificação da concentração total de matéria seca não volátil das amostras de concentrado e
permeado de soro de queijo. A medida de sólidos totais foi realizada através da técnica
gravimétrica de acordo como método apresentado pelo Laboratório Nacional de Referência
Animal (L
ANARA, 1981), Portaria 001/81; a precisão do método é de ± 5 %.
3.6.2 Análise de pH
Este parâmetro é importante como medida de precaução em relação à faixa de pH
permitida pelas membranas. Além disso, proporciona a observação do comportamento do
soro, em relação ao pH, durante os experimentos.
As análises de pH foram realizadas através do pHmetro DIGIMED, modelo DM20. O
eletrodo utilizado é do tipo DME CV4 com ponte eletrolítica de KCl e é provido de termo-
compensador DMF-NI. As medidas de pH foram realizadas na preparação de soluções de
limpeza da membrana e das amostras de concentrado e permeado. A precisão da medida
apresenta incerteza de ± 0,1 e confiança de 95 %. O equipamento foi calibrado regularmente
com padrões de pH 4 e 6,86 conforme as instruções do fabricante.
MF-7002
pH=4,6
T=40 °C
Vazão=700 L.h
-1
ΔP=1,75 bar
4 DF de 3L
HN06
pH=6,3
T=25 °C
Vazão=620 L.h
-1
ΔP=1,75 bar
RZ04
pH=4,6
T=40 °C
Vazão=620 L.h
-1
ΔP=1,75 bar
VCWP
pH=4,6
T=40 °C
Vazão=620 L.h
-1
ΔP=1,75 bar
UF-C50
1.
pH=6,3
T=25 °C
2.
pH=4,6
T=40 °C
Vazão=400 L.h
-1
ΔP=2,25 bar
UF-C20
pH=6,3
T=25 °C
Vazão=620 L.h
-1
ΔP=2,25 bar
CONCENTRADO
PROTÉICO
P
URIFICADO
MATERIAIS E MÉTODOS 71
3.6.3 Análise de Condutividade Elétrica
A presença de substâncias com carga nas amostras líquidas é detectada pela medida de
condutividade elétrica. Soluções que apresentam grande quantidade de compostos inorgânicos
conduzem eletricidade, enquanto que substâncias orgânicas não dissociadas conduzem
pobremente a corrente elétrica. Sendo assim, a análise de condutividade elétrica auxiliou na
avaliação da retenção de sais na UF do soro.
A medida da condutividade elétrica é uma medida indireta da concentração de íons na
solução. A condutividade elétrica foi determinada para as soluções de alimentação e de
permeado. O equipamento utilizado para esta análise foi o condutivímetro DIGIMED DM-31,
com eletrodo modelo DMC-010M e K=1 cm
-1
. A precisão da medida tem uma incerteza de ±
3,16 %, sendo que o equipamento era calibrado com uma solução padrão de 1413 µS a 25ºC,
fornecida pela OAKTON.
3.6.4 Análise de Lactose - Método do Ácido Dinitrossalicílico - DNS
As análises de lactose foram realizadas segundo MILLER (1959). Os açúcares redutores
foram quantificados por espectrofotometria com comprimento de onda de 570 nm, utilizando-
se uma curva padrão de lactose cuja concentração varia no intervalo de 1 a 5 mg.mL
-1
.
O método do DNS pode ser usado para determinação de açúcares totais devido ao seu
dinamismo, pois permite analisar várias amostras ao mesmo tempo.
3.6.5 Análise de Açúcar - Método Fenol Sulfúrico
As análises de concentração de dextrana nas amostras de concentrado e de permeado
para caracterização das membranas, da etapa de concentração e purificação do soro, foram
realizadas pelo método fenol sulfúrico.
Este método consiste na determinação espectrofotométrica de açúcares através da
reação com o fenol em meio ácido e baseia-se na determinação de açúcares simples,
polissacarídeos e seus derivados incluindo os metil-ésteres com grupos redutores livres, após
a desidratação dos mesmos pelo ácido sulfúrico e subseqüente complexação dos produtos
formados com o fenol. A mudança da cor da solução é medida na região do visível e é
proporcional à quantidade de açúcares presentes na amostra. A reação é sensível e de cor
estável. As análises foram feitas de acordo com D
UBOIS et al. (1956). Os teores de dextrana
foram determinados por espectrofotometria em um comprimento de onda de 490 nm
utilizando uma curva padrão de dextrana (1%) no intervalo de 10 a 70 mg.
De acordo com D
UBOIS et al. (1956), o método é simples, rápido e sensitivo
fornecendo resultados com uma boa reprodução.
O reagente é estável, porém a solução necessita de uma curva padrão para cada açúcar
a ser analisado (S
ILVA et al., 2003).
72 MATERIAIS E MÉTODOS
3.6.6 Determinação da Proteína Total - Método de Lowry
O método de Lowry (LOWRY et al. 1951) é um método colorimétrico para estimação
quantitativa de proteínas totais. O princípio do método baseia-se numa mistura contendo
molibdato, tungstato e ácido fosfórico, (reagente Folin-Ciocalteau), que sofre uma redução
quando reage com proteínas, na presença do catalisador cobre (Cu
+2
), e produz um composto
com absorção máxima em 750 nm.
O mecanismo de redução do reagente de Folin-Ciocalteau por proteínas ocorre
diretamente através das cadeias laterais de alguns aminoácidos (tirosina, triptófano, cisteína,
asparagina e histidina), que contribuem com quatro elétrons, ou através da retirada de dois
elétrons de cada unidade tetrapeptídica dos peptídeos e proteínas, que é facilitada pela
formação do quelato entre o cobre e os peptídeos/proteínas.
O método de Lowry é empregado por se tratar de um método de leitura direto e, por
isso, expedito. Opta-se por um método de leitura direta, porque nas experiências com as
proteínas comerciais se tem de lidar com um elevado número de amostras. Os teores de
proteínas totais foram determinados por espectrofotometria em um comprimento de onda de
750 nm utilizando uma curva padrão de BSA no intervalo de 0,1 a 0,5 mg.mL
-1
.
A principal vantagem do método de Lowry é a sua alta sensibilidade e, por isto, tem
sido utilizado para a determinação da concentração de proteínas totais em diversos meios,
sendo eles: plasma sangüíneo, saliva humana, tecido animal, plantas, suco biliar, membranas,
leite, derivados do leite e produtos alimentícios (Z
AIA et al., 1998).
Segundo os mesmos autores, o método de Lowry é recomendado, pois no estudo
comparativo de metodologias o mesmo mostrou-se sensível, com melhor exatidão, menor
consumo de amostra e, dependendo do caso, menos suscetível a alguns tipos de interferentes.
3.6.7 Análise de Proteína - Eletroforese SDS – PAGE (Sodium
Dodecyl Sulfate – Polyacrylamide Gel Electrophoresis of
Proteins)
A eletroforese é uma técnica que se baseia no fato de todas as proteínas apresentarem
carga quando colocadas a um pH diferente do seu ponto isoelétrico, permitindo deste modo
analisar amostras protéicas heterogêneas. Devido à carga que possuem, as proteínas migram
por ação de um campo elétrico; esta migração é diferente para cada proteína sendo função da
respectiva densidade de carga (razão carga/massa).
A eletroforese é normalmente efetuada num suporte que pode ser sílica gel, géis de
amido, ágar, papel de filtro, acetato de celulose, poliacrilamida, etc. Os géis apresentam
vantagens em relação a outros suportes porque são meios porosos em que o tamanho dos
poros é da mesma ordem de grandeza do tamanho das moléculas de proteína. Assim, eles
funcionam como uma peneira molecular e a separação acontece em função da massa molar.
MATERIAIS E MÉTODOS 73
O gel de poliacrilamida é o mais utilizado não só porque a sua porosidade permite uma
melhor separação relativamente a outros géis, como também por ser um polímero sintético,
preparado a partir de reagentes de elevado grau de pureza. Este tipo de gel tem também a
vantagem de ser quimicamente inerte, estável numa gama extensa de pH, temperatura e força
iônica (S
AMBROOK et al., 1989).
A polimerização da acrilamida inicia-se pela adição de persulfato de amônio ou
riboflavina. O TEMED (N, N, N´,N´-tetrametiletilenodiamina) é adicionado para acelerar o
processo de polimerização. No sistema persulfato de amônio - TEMED, este último catalisa a
formação de radicais livres no persulfato e este por sua vez inicia a polimerização da
acrilamida (S
AMBROOK et al., 1989).
A maior parte das eletroforeses de proteínas em géis de acrilamida é efetuada em
condições desnaturantes (SDS-PAGE). Utiliza-se uma solução tamponada para dissolver a
amostra conseguindo-se deste modo a dissociação de todas as proteínas nas suas sub-unidades
polipeptídicas. O composto utilizado para efetuar a dissociação é o detergente iônico dodecil
sulfato de sódio (SDS). A amostra é desnaturada por aquecimento, cerca de 95ºC durante 10
minutos, na presença de um excesso de SDS e de reagente tiólico (β-mercaptoetanol) para
quebrar as ligações dissulfeto. Assim, nestas condições o SDS liga-se aos polipeptídios
segundo uma razão de massas constante (1,4 gramas de SDS por grama de polipeptídio). As
cargas intrínsecas do polipeptídio tornam-se insignificantes quando comparadas com as
cargas negativas provenientes das moléculas de detergente ligadas. Desta forma, todos os
complexos SDS - polipeptídio possuem densidades de carga idênticas e migram em géis de
poliacrilamida com porosidade adequada estritamente em função da sua massa molar
(S
AMBROOK et al., 1989).
A revelação dos géis pode ser feita pelo método de coloração utilizando Coomassie
blue.
Esta técnica foi utilizada para verificar a eficiência dos experimentos de fracionamento
das proteínas na última etapa do trabalho.
3.6.8 Cromatografia gel
A cromatografia gel é também conhecida como cromatografia de exclusão em gel,
cromatografia de filtração em gel e filtração gel. O princípio do método baseia-se na partição
de moléculas entre a fase móvel e uma fase estacionária. A fase estacionária tem o efeito de
uma peneira molecular, é um método usado para a separação de substâncias de acordo com o
tamanho e forma moleculares. Estas peneiras moleculares são redes porosas tridimensionais,
constituídas por cadeias lineares de polímeros que se entrecruzam e formam a matriz do gel.
Os géis mais usados são os obtidos pela polimerização de cadeias de polissacarídeos ou os
constituídos pela polimerização de cadeias de poliacrilamida. As partículas que formam o gel
têm poros e o tamanho dos poros é função do grau de entrecruzamento das cadeias de
polímeros. A possibilidade de variar o tamanho do poro torna este método útil para a
74 MATERIAIS E MÉTODOS
separação de diferentes substâncias e a sua utilização na determinação das massas molares das
mesmas (Y
ADA, 2004).
A facilidade de uma molécula de soluto penetrar na rede do gel é função do seu
tamanho e forma molecular: as moléculas menores penetram nos poros da matriz, tendo um
movimento mais lento através da coluna; enquanto as moléculas maiores passam pela coluna
juntamente com a fase móvel e são eluídas primeiro. Quando uma mistura de macromoléculas
é colocada na parte superior de uma coluna de gel, ao se adicionar uma solução tampão para
provocar a eluição, as moléculas começam a sair da coluna com o tampão em frações
diferentes e por ordem decrescente da sua massa molar. Podem ser estabelecidas relações
empíricas entre o volume de solvente necessário para a sua eluição e a respectiva massa
molar; estas relações variam para as diferentes classes de macromoléculas (polissacarídeos,
proteínas globulares, etc).
A filtração em gel é uma técnica bastante utilizada na separação de misturas de
macromoléculas de massas molares diferentes e também para o isolamento e purificação de
proteínas. Este método foi utilizado para verificar a agregação da β-Lg em dímeros e
octômeros nas amostras de soro, para as condições dos experimentos.
3.7 Limpeza do Sistema de Membranas
Um procedimento de limpeza foi utilizado para restituir as características de fluxo e
retenção da membrana e prevenir o desenvolvimento de microrganismos no sistema. A
limpeza química consistiu nas seguintes etapas: enxágüe com água destilada, limpeza alcalina,
limpeza cloro alcalina (somente no caso das membranas poliméricas: UF-7001, UF-6001, UF-
6002, MF-7002) e limpeza ácida. Estas etapas foram realizadas sempre respeitando os limites
de pH e temperatura da membrana recomendados pelo fabricante.
A limpeza realizada ao final de cada experimento, conforme a recomendação do
fabricante consistiu de sete etapas conforme descrito a seguir.
1.
Enxágüe do sistema com água destilada: após a remoção do concentrado do
sistema, água destilada entre 45 a 50
o
C e 0,5 bar na entrada, em pequenos
volumes (5 L), foi adicionada e rapidamente recirculada. Este procedimento foi
efetuado 6 a 7 vezes com o objetivo de remover a solução residual do processo de
concentração de uma maneira rápida e eficiente. A seguir foi adicionada água
destilada, nas mesmas condições descritas acima, porém com intervalos maiores
de recirculação. Este procedimento é realizado até o momento em que o permeado
se apresente visualmente limpo.
2.
Limpeza alcalina: nesta etapa o sistema é preenchido com água destilada
ajustando-se o pH entre 10 e 10,5 com hidróxido de sódio (NaOH) na temperatura
de aproximadamente 50
o
C; esta solução é recirculada no sistema sob ausência de
pressão manométrica por 15 a 20 minutos.
MATERIAIS E MÉTODOS 75
3.
Enxágüe com água destilada: água é recirculada no sistema por 20 minutos para
remoção da solução alcalina, mantendo-se a temperatura de 50 °C e sob ausência
de pressão.
4.
Limpeza cloro-alcalina: o sistema é preenchido com água destilada, ajustando-se o
pH entre 10 e 10,5 com hidróxido de sódio (NaOH) e adicionando-se de modo
controlado hipoclorito de sódio (NaOCl) até, no máximo, 200ppm de cloro. Para
verificar a concentração de cloro durante a limpeza, foi usado um kit La Motte
mod. PCT-DR com escala 0 a 200 ppm.
5.
Enxágüe com água destilada água é recirculada no sistema por 20 minutos para
remoção da solução cloro-alcalina, mantendo-se a temperatura de 50 °C e sob
ausência de pressão.
6.
Limpeza ácida: o sistema é preenchido com água destilada, adicionando-se ácido
cítrico até atingir pH 2, esta solução é mantida no sistema por 10 minutos na
temperatura de aproximadamente 50°C a uma pressão de 0,5 a 1,5 bar.
7.
Enxágüe com água destilada e medida de fluxo de água para verificar se as
condições iniciais foram restituídas.
Capítulo 4
Resultados e Discussão
Neste capítulo são apresentados e discutidos os resultados da etapa experimental onde
primeiramente foram realizados testes para determinar a membrana adequada para ser
utilizada nos experimentos de UF e DF nos testes de concentração e purificação das proteínas
do soro de queijo. Na segunda etapa verificou-se a melhor estratégia em termos de FC e
quantidade e volume de DF para se obter a maior concentração e purificação protéica. Por
fim, foram testadas as membranas para o fracionamento das proteínas. Todos os dados
experimentais apresentados neste capítulo encontram-se tabelados no Apêndice B.
4.1 Concentração e Purificação das proteínas
Esta seção é divida em quatro partes: seleção da membrana; apresentação dos
resultados de medidas do fluxo de água e de soro para a membrana selecionada; resultados
dos experimentos de UF e DF para obter a maior purificação protéica; resultados detalhados
da estratégia que apresentou melhores resultados para os parâmetros analisados.
4.1.1 Seleção da membrana
No primeiro momento realizamos a escolha da membrana apropriada para realização
dos experimentos de concentração e purificação de proteínas, ou seja, uma membrana que
apresentasse uma retenção alta para as proteínas, e baixa para a lactose e os sais. Além do
mais, era necessário que o fluxo de permeado fosse adequado para realização dos
experimentos de concentração. As membranas disponíveis no laboratório para esta etapa
foram: UF-7001, UF-6001 e UF-6002.
O primeiro procedimento foi realizar as medidas de fluxo permeado (J
p
) de água pura.
Este experimento foi realizado a temperatura de 30 °C. A vazão de alimentação média para as
membranas testadas foi 700 L.h
-1
. O modo de operação foi o reciclo total, buscando manter as
propriedades do sistema constantes. Começamos empregando a ΔP mais alta, deixamos o
sistema estabilizando térmica e hidrodinamicamente por 25 minutos e a seguir medimos o
fluxo de água nas seguintes pressões transmembrana: 4, 3, 2, 1 bar; os resultados obtidos
estão apresentados na Figura 4.1.
RESULTADOS E DISCUSSÃO 77
0
100
200
300
400
500
600
700
800
012345
J
p
(L.m
-2
.h
-1
)
ΔP(bar)
UF-6001
UF-6002
UF-7001
Figura 4.1: Fluxo de água vs pressão transmembrana, para as membranas UF-6001, UF-6002 e UF-7001, a 30
°C e vazão de alimentação média de 700 L.h
-1
.
Pela análise da Figura 4.1 observa-se que o fluxo de água para as três membranas tem
um comportamento semelhante, quanto maior a ΔP maior é o fluxo de água. Porém, a UF-
7001 e a UF-6002, possuem fluxos de água semelhantes para todas as ΔP, mesmo possuindo
MMC diferentes (10 e 5 kDa, respectivamente). A UF-6001 possui fluxos de água menores
que as outras duas membranas em todas as ΔP, mesmo possuindo MMC igual a da UF-6002.
Esta grande diferença de fluxo permeado tem a ver com modificações que a membrana do
módulo UF-6002 sofreu na sua estrutura devido a uso intensivo ou limpezas químicas
agressivas.
Neste primeiro momento o que ficou evidente é que o fluxo de água na pressão
transmembrana de 2 bar estava acima do valor médio declarado pelo fabricante que era de 100
L.m
-2.
h
-1
para UF-7001 e 80 L.m
-2.
h
-1
para a UF-6001 e para a UF-6002, porém para a UF-
6002 esta diferença foi muito mais expressiva do que para a UF-6001. Este fato foi um alerta
para uma possível degradação das membranas UF-7001 e UF-6002.
Após a medida de fluxo de água, foram realizados testes com soluções de dextrana
com massa molar na faixa de 15 a 20 kDa e percentual mássico de 0,15 %. Utilizou-se o
modo de operação de reciclo total, temperatura de 30 °C, mediu-se o fluxo e amostras de
permeado e concentrado em quatro pressões: 1, 2, 3 e 4 bar foram coletadas. O fluxo
permeado da solução com dextrana foi semelhante ao fluxo de água para todas as membranas
em todas as pressões, uma vez que a solução de alimentação estava bastante diluída.
A partir das amostras coletadas em cada pressão realizou-se a análise de concentração
de dextrana através do método de fenol sulfúrico e avaliou-se a retenção da membrana,
obtendo os resultados que estão apresentados na Figura 4.2.
78 RESULTADOS E DISCUSSÃO
0
20
40
60
80
100
120
012345
Retenção (%)
ΔP(bar)
UF-6001
UF-6002
UF-7001
Figura 4.2: Retenção de dextrana vs pressão transmembrana, para as membranas UF-6001, UF-6002 e UF-
7002, a 30 °C e vazão de alimentação média de 700 L.h
-1
.
Pode-se observar no gráfico que para a membrana UF-6001 a retenção foi de 100 %,
porém para a UF-7001 não foi superior a 30 %, e não houve retenção de dextrana para a UF-
6002, este resultado evidencia que estas duas últimas membranas não são adequadas para a
realização dos experimentos de concentração, pois apresentaram baixa retenção para
moléculas com massa molar de 15 a 20 kDa, que é superior a MMC das membranas, e por
isso, deveriam ficar retidas.
Após estes experimentos de caracterização, a membrana UF-6001 que reteve 100 %
das moléculas de referência, foi selecionada para a realização dos experimentos de
concentração e purificação protéica. A membrana devido a usos anteriores pode encontrar-se
com MMC superior a original (5 kDa), mas este fato não interfere na realização dos
experimentos, porque a menor proteína de interesse tem 14 kDa e como foi demonstrado esta
membrana é capaz de reter moléculas com massa molar semelhante.
4.1.2 Fluxos permeados para a água e para o soro
Primeiramente foram realizados experimentos medindo-se o fluxo permeado em
diferentes pressões transmembranas com água e, posteriormente, com soro. A pressão
transmembrana corresponde à diferença entre a média aritmética das pressões de entrada e
saída do módulo de membrana e a pressão da corrente permeada.
A Figura 4.3
apresenta o fluxo permeado para a água e para o soro em função da
pressão transmembrana.
RESULTADOS E DISCUSSÃO 79
0
10
20
30
40
50
60
70
80
0
50
100
150
200
250
01234
J
p
soro (L.m
-2
.h
-1
)
J
p
água (Lm
-2
h
-1
)
ΔP (bar)
água
soro
Figura 4.3: Fluxo de água e de soro vs pressão transmembrana para a membrana UF-6001, T=50 °C, vazão de
alimentação média de 840 L.h
-1
.
Através da Figura 4.3 observa-se que o fluxo de água aumentou linearmente com a
pressão transmembrana, enquanto que o fluxo para o soro não possui comportamento tão
linear. Além disso, para as mesmas condições operacionais ocorreu uma diferença
significativa nos fluxos permeados do soro e da água. Esse mesmo comportamento foi
encontrado por R
EKTOR & VATAI (2004), ATRA et al. (2005) e CHOLLANGI & HOSSAIN (2006)
e BUTYLINA et al. (2006) em seus trabalhos, isto é, os fluxos da solução do soro eram mais
baixos do que os fluxos da água pura em todas as pressões; possíveis causas para este fluxo
mais baixo incluem a interações entre a membrana e a solução, efeitos de viscosidade
cinemática e difusividade mássica.
O fluxo permeado do soro menor do que o fluxo de água evidencia que o efeito de
polarização por concentração é bastante significativo para o soro na concentração inicial e
este efeito tende a se agravar à medida que o soro vai sendo concentrado. Neste caso pode-se
afirmar que o aumento de fluxo é limitado pelo aumento da camada polarizada, isto é, o
aumento de pressão transmembrana é contra balanceado pelo aumento da resistência total.
Cabe ressaltar que devido a limitações do equipamento, não foi possível operar em pressões
superiores a 3,75 bar.
Como resultado destas medidas e tendo em vista trabalhos anteriores (B
OSCHI, 2006)
decidiu-se trabalhar na pressão de 2 bar. Sabe-se que quanto maior a pressão aplicada maior a
quantidade de soluto que chega à superfície da membrana o que pode intensificar ainda mais o
fenômeno de polarização por concentração e a tendência de formação de fouling na
membrana. Segundo B
RANS (2006), o aumento de ΔP acarreta em um aumento inicial do
fluxo, entretanto, acelera a formação de fouling, prejudicando o fluxo em operações de longa
duração.
80 RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1.3 Comparação das estratégias para concentração e purificação
protéica
Nesta seção são apresentados os resultados para as quatro estratégias de concentração
e purificação testadas, levando-se em conta o FC inicial e o número e os volumes para cada
DF.
Nos experimentos 1 e 3 foram testados os fatores de concentração (FC) 5 e 6,
respectivamente. Em cada um dos experimentos realizaram-se duas DF, para o Experimento 1
a DF1 e a DF2 com volumes iguais a 6 litros cada uma e a para o Experimento 3 a DF1 e a
DF2 o volume foi de 5 litros para cada uma. Estes dois experimentos iniciais foram
exploratórios, para que conseguíssemos programar experimentos mais longos, ou seja, com
mais etapas de DF, mas que pudessem ser realizados em um único dia, devido a problemas de
deterioração do soro; além do mais, precisávamos identificar qual seria o menor volume que
poderia ficar no sistema, sem prejudicar o funcionamento da bomba. Em trabalhos anteriores
o volume havia sido determinado igual a 6 litros (B
OSCHI, 2006). Os experimentos 2 e 4 são
idênticos ao 1 e 3, respectivamente, porém, realizaram-se mais etapas de DF, no Experimento
2 além da DF1 e DF2 de 6 L, foram realizadas a DF3, a DF4 e a DF5 com volumes iguais a 3
L para cada; no Experimento 4 além da DF1 e DF2 de 5 L, realizaram-se a DF3 e a DF4 com
2,5 L para cada uma. Portanto, os Experimentos 1 e 2 possuem semelhança nos resultados até
a segunda diafiltração, assim como os Experimentos 3 e 4.
A Figura 4.4 apresenta o percentual de proteína em base seca em função da etapa do
processo. Nos gráficos o início da ultrafiltração é identificado por UFi, e o final por UFf. As
diafiltrações são identificadas por DF e pela etapa que correspondem (1, 2, 3, 4 ou 5).
0
10
20
30
40
50
60
70
80
UF i UF f DF1 DF2 DF3 DF4 DF5
Proteína (%)
Etapas
1
2
3
4
Figura 4.4: Percentual protéico no concentrado (base seca) vs etapas do processo para os experimentos 1, 2, 3 e
4, membrana UF-6001, T=50 °C, ΔP=2 bar, vazão de alimentação média de 840 L.h
-1
.
O percentual mássico inicial de proteína para os quatro experimentos é o mesmo,
cerca de 15 %, ao final da UF este valor atinge 35 % para os Experimentos 1 e 2. Para o
RESULTADOS E DISCUSSÃO 81
Experimento 1, ao final da DF1, chegou-se a 40 % de proteína, e no Experimento 2 o
percentual protéico atingiu 37 %. Ao final da DF2 o concentrado atingiu 43 e 41 % de
proteína, para os Experimentos 1 e 2 respectivamente. O Experimento 1 foi encerrado nesta
etapa. Enquanto para o Experimento 2 foram realizadas as DF3, DF4 e DF5 de 3 L cada,
obtendo-se 46, 52 e 62 % de proteína, respectivamente.
Para os Experimentos 3 e 4 ao final da UF atingiu-se 42 % de proteína, para ambos
experimentos. No Experimento 3 e 4 após as DF1 atingiu-se 53 e 51 % e após a DF2 atingiu-
se 59 e 57 % de proteína, respectivamente. O Experimento 3 foi encerrado nesta etapa, no
Experimento 4 foram realizados a DF3 e DF4 obtendo-se 61 e 70 % de proteína.
Em geral o que se observa é que para os experimentos com maior FC (Experimentos 3
e 4) foram obtidos percentuais protéicos ligeiramente maiores ao final da UF; esta diferença é
acentuada com as DF, sendo expressivas tanto para as DF de volume maior, quanto para as de
menor volume.
As Figuras 4.5 e 4.6 apresentam o percentual mássico de lactose e sais, em base seca,
no concentrado em função das etapas do processo.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
UF i UF f DF1 DF2 DF3 DF4 DF5
Lactose (%)
Etapas
1
2
3
4
Figura 4.5: Percentual de lactose no concentrado (base seca) vs etapas do processo para os Experimentos 1, 2, 3
e 4, membrana UF-6001, T=50 °C, ΔP=2 bar, vazão de alimentação média de 840 L.h
-1
.
No início dos experimentos o percentual mássico (base seca) de lactose é em torno de
72 a 73 %; ao final da UFf, para os Experimentos 3 e 4 os percentuais de lactose caem para 57
%, enquanto que para os Experimentos 1 e 2 para 64 %. Durante as diafiltrações estes
percentuais vão sendo reduzidos chegando a 57 % para o Experimento 1 e 42% para o
Experimento 3, onde foram realizadas apenas duas DFs. Para os experimentos 2 e 4 foram
alcançados valores bem mais baixos, de 35 e 29 %, respectivamente.
82 RESULTADOS E DISCUSSÃO
Em relação ao teor salino, observa-se na Figura 4.6 que nos Experimentos as amostras
iniciam com 12 % de sais. Para todos os quatro experimentos o processo mostra-se eficiente
na remoção de sais, sendo que ao final da UF, o percentual se aproxima de zero, mostrando
que boa parte do sal havia sido removida do concentrado protéico.
0
5
10
15
20
25
30
UF i UF f DF1 DF2 DF3 DF4 DF5
Sais (%)
Etapas
1
2
3
4
Figura 4.6: Percentual de sais no concentrado (base seca) vs etapas do processo para experimento 1, 2, 3 e 4,
para a membrana UF-6001, T=50 °C, ΔP=2 bar, vazão de alimentação média de 840 L.h
-1
.
Percebe-se que no Experimento 4 os resultados de concentração protéica são melhores
do que os obtidos para os experimentos 1, 2 e 3. Vale ressaltar que no Experimento 4 o
concentrado da UF, antes da DF, foi de 5 L, e esta diminuição de volume implicou em uma
maior concentração protéica final e em um menor volume de água para a etapa de DF. Para o
Experimento 2 utilizou-se 21 L de água para a etapa de DF e obteve-se um concentrado
protéico com 62 % em base seca; enquanto que para o Experimento 4 foram utilizados 15 L
de água para a DF e o percentual protéico foi de 70 % em base seca.
Verificou-se que as DF de volumes menores são bastante efetivas na remoção de sais e
lactose, para o Experimento 4, por exemplo, houve uma grande redução da concentração dos
outros elementos, em relação à quantidade de proteína, nas últimas duas DFs de 2,5 L.
Com base nestes resultados, as condições de trabalho do Experimento 4 foram
escolhidas como sendo a melhor estratégia a ser utilizada para se obter uma maior purificação
protéica. Neste experimento se obteve um concentrado com70 % de proteína em base seca,
com um teor de lactose inferior a 30 %, e livre de sais, com menos etapas de DF e com menor
volume de água.
RESULTADOS E DISCUSSÃO 83
4.1.4 Resultados para a melhor estratégia de purificação protéica
Nesta seção são apresentados os resultados obtidos para o Experimento 4, já que os
resultados para os outros três experimentos apresentaram o mesmo comportamento, apenas
atingindo concentrações finais diferentes.
A Figura 4.7 mostra o comportamento do fluxo permeado de soro em função do fator
de concentração volumétrico para a etapa de UF.
0
5
10
15
20
25
30
35
40
1234567
J
p
(L.m
-2
h
-1
)
FC
Figura 4.7: Fluxo permeado vs fator de concentração volumétrico para Experimento 4 na etapa de UF,
membrana UF-6001, T=50 °C, P=2 bar, vazão de alimentação média de 840 L.h
-1
.
Observa-se que o fluxo permeado diminui à medida que o fator de concentração
aumenta até o FC de 3,5; em FCs maiores há uma tendência do fluxo permeado se manter
constante. O fator de concentração volumétrico máximo alcançado de 6 foi em função das
limitações da unidade experimental (soma do volume mínimo de soro no tanque de
alimentação com o volume morto, perfazendo um volume de aproximadamente 5 L).
Os dados do gráfico confirmam o que alguns autores já haviam observado. Segundo
S
MITH (2003), geralmente o fluxo permeado diminui com o aumento do FC. Segundo
A
FONSO et al (2004), REKTOR & VATAI (2004) e BACCHIN et al. (2006) quanto mais
concentrada a solução de alimentação, menor o fluxo permeado; isso se deve à pressão
osmótica mais elevada e ao maior acúmulo de moléculas do soluto na camada polarizada,
aumentando sua espessura e, por conseqüência, sua resistência à permeação. Segundo A
TRA et
al.
(2005), em fatores de concentração mais elevados há um depósito maior e mais denso da
camada que reduz o fluxo permeado até que ele alcance a condição de estado estacionário.
A Figura 4.8 apresenta o fluxo permeado de soro em função do tempo; observa-se que
o fluxo diminui com o tempo de operação sendo que estes resultados estão de acordo com os
apresentados nos trabalhos de V
EIGA & VIOTTO (2001), RAO (2002), CASTRO E GERLA (2004),
REKTOR & VATAI (2004) e KHIDER et al. (2004).
84 RESULTADOS E DISCUSSÃO
O fluxo permeado inicia em 35 L.m
-2
.h
-1
e após os primeiros 80 minutos vai
diminuindo até atingir 18 Lm
-2.
h
-1
, e assim permanece até os 170 minutos, quando, então,
decai para aproximadamente 15 L.m
-2
.h
-1
e se mantém assim até o final da UF (~ 265
minutos). A queda inicial mais acentuada foi devida à formação da camada de polarização por
concentração e ao fouling; o decaimento final se deve ao aumento da concentração e
conseqüentemente às mudanças nas propriedades de transporte e nas propriedades da solução,
tais como massa específica e viscosidade dinâmica. Vale ressaltar que a redução de fluxo
permeado é um dos fatores limitantes do processo, do ponto de vista técnico e econômico.
0
5
10
15
20
25
30
35
40
0 100 200 300 400 500
Jp (Lm
-2
h
-1
)
Tempo (min)
UF
DF1
DF2
DF3
DF4
Figura 4.8: Fluxo permeado vs tempo para o Experimento 4, para a membrana UF-6001, T=50 °C, P=2 bar,
vazão de alimentação média de 840 L.h
-1
.
CHOLLANGI & HOSSAIN (2006), fizeram experimentos com soluções de lactose com e
sem proteína e observaram que com o aumento da pressão transmembrana o fluxo permeado
aumentou para ambas as soluções, entretanto, o fluxo para a solução sem proteína foi maior
do que a com proteína em todas as pressões. A presença da proteína aumenta o potencial para
fouling e em conseqüência diminui o fluxo permeado.
Para a produção de CP com alto teor de proteína utilizou-se a DF; segundo
EBERSOLD
& ZYDNEY (2004), o modo DF é empregado para separações de proteína para eliminar
problemas de associação em concentrações altas no produto retido, gerando alta purificação e
ao mesmo tempo bons fatores de rendimento. Este processo promove a produção de um
concentrado protéico mais puro, pois remove sais e lactose que são permeáveis à membrana.
Nas DF o fluxo permeado ficou abaixo do fluxo inicial da UF, devido ao fouling formado na
etapa de concentração das proteínas e ao fator de diluição que não é muito elevado, e, após
diminuiu com o tempo. No momento em que iniciamos as DF o fluxo permeado aumenta para
cerca de 18 L.m
-2.
h
-1
, devido ao efeito de diluição, e ao final da DF volta para os 15 L.m
-2
h
-1
obtidos no final da etapa de concentração. É importante salientar que não foi realizada
limpeza química, nem tampouco enxágüe com água após o experimento de concentração.
RESULTADOS E DISCUSSÃO 85
Como a proteína é totalmente retida pela membrana, o aumento da concentração de
proteína exerce um efeito maior sobre o fluxo (polarização). Além disso, a polarização por
concentração tem um efeito sobre o fouling, quanto maior a polarização por concentração
maior a tendência de ocorrer fouling.
A Figura 4.9 apresenta o teor de sólidos totais (ST) em função do tempo de
experimento para o concentrado e para o permeado das etapas de concentração e diafiltração.
Observa-se que houve um aumento de ST na corrente de concentrado durante a UF devido
principalmente ao aumento de concentração de proteína. No permeado a concentração de ST é
aproximadamente constante até o final da UF, aumentando ligeiramente na última hora de
experimento. O retido possui concentrações mais elevadas de ST tanto para a etapa de UF
quanto na etapa de DF. Durante as DF ocorreu a redução de ST para ambas correntes, no
concentrado devido à remoção de lactose e sais no permeado devido à diluição.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 100 200 300 400 500
Sólidos totais (g.L
-1
)
Tempo (min)
Permeado UF
Concentrado UF
Permeado DF
Concentrado DF
Figura 4.9: Concentração de sólidos totais das amostras de permeado e concentrado vs tempo para o
Experimento 4, membrana UF-6001, T=50 °C, P=2 bar, vazão de alimentação média de 840 L.h
-1
.
86 RESULTADOS E DISCUSSÃO
A Figura 4.10 apresenta a concentração de proteína em função do tempo de
experimento para o concentrado e para o permeado das etapas de concentração e diafiltração.
Analisando os resultados apresentados observa-se que a concentração de proteínas no retido
aumenta ao longo do experimento de UF. A concentração inicial de proteínas é de cerca de
9,5 g.L
-1
e no final da UF é cerca de 36 g.L
-1
.
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
0 100 200 300 400 500
Proteína (g.L
-1
)
Tempo (min)
Permeado UF
Concentrado UF
Permeado DF
Concentrado DF
Figura 4.10: Concentração de proteína das amostras de permeado e concentrado vs tempo para o Experimento
4, membrana UF-6001, T=50 °C, P=2 bar, vazão de alimentação média de 840 L.h
-1
.
Nota-se que a concentração de proteína durante as DF não sofre grande variação
(inicia com aproximadamente 36,8 g.L
-1
e termina com 36,9 g.L
-1
), no entanto o teor de
contaminantes, sais e lactose, diminui significativamente nas DF, o que resulta em uma
purificação das proteínas. Comportamento similar é apresentado por L
EITE et al. (2006).
Em alguns casos, foram detectadas, no início dos experimentos, baixas concentrações
de proteína no permeado (< 1 g.L
-1
), que devem corresponder a resíduos protéicos derivados
da ação da renina nas moléculas de caseína durante a fabricação de queijo. Mas, a presença de
proteína no permeado é insignificante quando comparada à concentração protéica no
concentrado, e ocorreu somente nos primeiros momentos da UF, indicando que a retenção
protéica foi de aproximadamente 100 %.
RESULTADOS E DISCUSSÃO 87
A variação da concentração de lactose em função do tempo pode ser observada na
Figura 4.11. A curva mostra um comportamento similar ao encontrado para os sólidos totais,
porque a lactose, sendo o componente mais abundante no soro, e com massa molar menor que
a MMC da membrana, apresenta uma retenção baixa deve permear e ter impacto decisivo no
comportamento dos sólidos totais ao longo do tempo tanto no permeado quanto no
concentrado.
0
10
20
30
40
50
60
0 100 200 300 400 500
Lactose (g.L
-1
)
Tempo (min)
Permeado UF
Concentrado UF
Permeado DF
Concentrado DF
Figura 4.11: Concentração de lactose para as amostras de permeado e concentrado vs tempo para o Experimento
4, membrana UF-6001, T=50°C, P=2 bar, vazão de alimentação média de 840L.h
-1
.
No permeado, durante a etapa de UF, a concentração de lactose permanece ao redor de
40 g.L
-1
; no retido inicia com 42 g.L
-1
e atinge 50 g.L
-1
ao final da etapa de UF. Quando é
iniciada a DF a concentração de lactose diminui significativamente tanto no retido quanto no
permeado. Ao final das quatro DF a concentração de lactose no retido atinge 15 g.L
-1
,
enquanto que no permeado a concentração de lactose fica em torno de 10 g.L
-1
, quase o
mesmo valor da concentração de sólidos totais, evidenciando que praticamente todo sal é
removido, e todos os sólidos que estão sendo retirados no permeado correspondem à lactose.
O pH do soro de queijo foi monitorado com o intuito de verificar possíveis alterações
ocasionadas durante o processo de concentração e purificação do soro. Conforme os
resultados mostrados na Figura 4.12 verifica-se que o pH não sofreu alterações significativas
durante todo o processo. O pH das amostras de concentrado e permeado permaneceu em 6,4
durante todo tempo do experimento baixando ligeiramente para 6,3 nos últimos minutos; este
comportamento foi um bom indicativo de que a solução não foi degradada durante o tempo de
duração do experimento.
88 RESULTADOS E DISCUSSÃO
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
0 100 200 300 400 500
pH
Tempo (min)
Permeado UF
Concentrado UF
Permeado DF
Concentrado DF
Figura 4.12: pH para as amostras de permeado e concentrado vs tempo para Experimento 4, membrana UF-
6001, T=50 °C, P=2 bar, vazão de alimentação média de 840 L.h
-1
.
A medida da condutividade elétrica no concentrado do soro de queijo foi realizada
para verificar se houve alteração das espécies eletricamente ativas, que, em sua grande
maioria, compreendem os sais de cálcio e sódio dissolvidos. Pode-se observar na Figura 4.13
que a condutividade elétrica permaneceu praticamente a mesma para o permeado e o
concentrado durante toda a etapa de UF, pois a membrana não é seletiva para os sais, que são
os compostos que mais contribuem para a condutividade elétrica; durante a etapa de DF a
condutividade elétrica do concentrado e do permeado foi decaindo após a adição da água
destilada em cada DF (efeito de diluição).
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
0 100 200 300 400 500
Condutividade elétrica (mS.cm
-1
)
Tempo (min)
Permeado UF
Concentrado UF
Permeado DF
Concentrado DF
Figura 4.13: Condutividade elétrica das amostras de permeado e concentrado vs tempo para Experimento 4,
membrana UF-6001, T=50 °C, P=2 bar, vazão de alimentação média de 840 L.h
-1
.
RESULTADOS E DISCUSSÃO 89
Os resultados encontrados estão de acordo com os apresentados na literatura; Z
YDNEY
(1998),
CHOLLANGI & HOSSAIN (2006), BUTYLINA et al. (2006), REKTOR E VATAI (2004)
realizaram trabalhos mostrando que os componentes de baixa massa molar (lactose e sais)
permeiam preferencialmente as membranas de UF, as quais retêm as moléculas de proteína.
A Figura 4.14 mostra o gráfico da retenção de sólidos totais, lactose e proteína com o
tempo para a membrana UF-6001.
0
20
40
60
80
100
120
0 100 200 300 400 500
Retenção (%)
Tempo (min)
Proteína
Lactose
Sólidos totais
Figura 4.14: Retenção de proteína, lactose e sólidos totais em função do tempo para o Experimento 4,
membrana UF-6001, T=50 °C, P=2 bar, vazão de alimentação média de 840 L.h
-1
.
Os resultados apresentados no gráfico da Figura 4.14 indicam que a retenção das
proteínas é total, enquanto que a retenção de sólidos totais aumenta com tempo de
experimento, e este aumento é mais expressivo depois do início das DF (após os 265 minutos
iniciais). O aumento da retenção de sólidos ocorre porque os componentes permeáveis vão
sendo removidos e as proteínas que são completamente retidas passam a ter um peso maior na
retenção. Em relação à lactose, observa-se que a retenção oscila em torno de 0 e 20 % até os
265 minutos (etapa de UF), no momento que iniciam as DF a retenção de lactose aumenta.
Isto leva a crer que a membrana apresenta uma retenção parcial a lactose o que propicia uma
maior dificuldade na purificação das proteínas, principalmente ao final do experimento.
Segundo R
EKTOR & VATAI (2004), a retenção da lactose pela membrana de UF ocorre devido
à camada gel formada durante o processo.
90 RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.2 Fracionamento das Proteínas Majoritárias
A partir do concentrado obtido na etapa anterior (4.1 Concentração e Purificação das
proteínas) tentativas de fracionar as proteínas majoritárias do soro foram testadas. Os
primeiros procedimentos realizados foram as medidas de fluxo de água e do concentrado
protéico em cada membrana testada. A compactação da membrana foi realizada previamente a
fim de evitar um declínio de fluxo permeado devido ao adensamento da microestrutura da
membrana durante o processo UF; este procedimento foi realizado à pressão superior a de
operação, com água pura até o fluxo de permeado se estabilizar.
Após a identificação da melhor pressão para se realizar o experimento, e ajustes de pH
e temperatura da solução de alimentação realizou-se o experimento de fracionamento onde
amostras de permeado e concentrado foram coletadas para análise de proteína através do
método de Lowry e por eletroforese, para verificar se houve a separação das proteínas. Os
resultados desta etapa serão mostrados conforme a semelhança de geometria: as membranas
planas (HN06, RZ04 e VCWP), a membrana espiral (MF-7002) e as membranas tubulares
(UF-C20 e UF-C50).
4.2.1 Membranas HN06, RZ04 e VCWP
Em cada experimento foram utilizados dois litros de concentrado protéico purificado
obtido na etapa de concentração e purificação. Nos testes com as membranas VCWP e RZ04
o concentrado foi aquecido a 40 °C, e acidificado ao pH de 4,6; para a membrana HN06,
realizou-se o experimento a temperatura ambiente (25 °C) e pH de 6,3, nestas condições,
segundo W
ONG et al. (1999), todas as variantes genéticas de β-Lg existem principalmente
como um dímero estável de dois monômeros unidos por ligações não covalentes.
Os experimentos com as membranas RZ04, VCWP e HN06 foram realizadas com uma
vazão de alimentação de 620 L.h
-1
, e pressão transmembrana de 1,75 bar. A solução
recirculou pelo sistema durante 20 minutos em modo de reciclo total, para garantir
homogeneidade na solução e equilíbrio de temperatura então, a corrente de permeado foi
retirada para outro tanque, e, após 30 minutos amostras de permeado e concentrado foram
coletadas. Não foi possível reduzir o volume inicial à metade ou realizar DF devido às
limitações do equipamento tais como: volume insuficiente no tanque de alimentação, área de
membrana pequena, conduzindo a uma taxa de permeado muito baixa. Para estas membranas
foram analisados apenas o fluxo permeado e a retenção.
Em um primeiro momento realizou-se a compactação das membranas com água
destilada, os resultados estão apresentados na Figura 4.15. A pressão transmembrana utilizada
foi de 3,25 bar, que foi a maior pressão que se conseguiu atingir para as três membranas. A
compactação ocorreu durante o tempo suficiente para que as membranas apresentassem fluxo
permeado constante: a membrana VCWP iniciou com um fluxo de 365 L.m
-2
h
-1
e após 25
minutos o fluxo baixou para 350 L.m
-2
h
-1
, e assim permaneceu até o tempo de 40 minutos,
onde foi considerado que a compactação havia ocorrido. A HN06 iniciou com um fluxo de 72
L.m
-2
h
-1
e após 30 minutos estabilizou-se em torno de 50 L.m
-2
h
-1
. A RZ04 iniciou com um
RESULTADOS E DISCUSSÃO 91
fluxo de 250 L.m
-2
h
-1
e após 20 minutos estabilizou-se em 210 L.m
-2
h
-1
, e assim permaneceu
até os 30 minutos onde, a compactação para esta membrana foi dada como encerrada.
Houve uma redução de fluxo inicial de 4; 30 e 16 % para as membranas VCWP,
HN06 e RZ04, respectivamente. Este resultado evidencia diferenças na estrutura de cada
membrana, que de certa forma influenciam os resultados de separação.
0
100
200
300
400
500
0 1020304050
Jp (Lm
-2
h
-1
)
Tempo (min)
VCWP
HN06
RZ04
Figura 4.15: Fluxo permeado em função do tempo para os experimentos de compactação das membranas
VCWP, HN06 e RZ04, vazão de alimentação 620 L.h
-1
, ΔP = 3,25 bar, T = 25 °C.
A Figura 4.16 apresenta os resultados dos fluxos permeados da água e do concentrado
protéico em função da pressão transmembrana para as membranas HN06, RZ04 e VCWP.
Observa-se uma redução significativa do fluxo de concentrado protéico em relação ao fluxo
de água pura para todas as membranas nas condições de operação empregadas, devido aos
efeitos de polarização por concentração e fouling.
0
50
100
150
200
250
300
350
400
0,0 1,0 2,0 3,0 4,0
J
p
(Lm
-2
h
-1
)
ΔP(bar)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
0,0 1,0 2,0 3,0 4,0
J
p
(Lm
-2
h
-1
)
ΔP(bar)
VCWP
HN06
RZ04
Figura 4.16: Fluxo permeado de água (esquerda) e de fluxo permeado de concentrado protéico (direita) em
função da pressão transmembrana para as membranas VCWP, HN06 e RZ04, vazão de
alimentação 620 L.h
-1
, T = 40 °C e pH = 4,6 (VCWP e RZ04) e T = 25 °C e pH = 6,3 (HN06).
92 RESULTADOS E DISCUSSÃO
Os fluxos permeados de concentrado protéico foram semelhantes para as membranas
RZ04 e VCWP, sendo ligeiramente maior para a RZ04, em pressões mais elevadas; a
membrana HN06 apresentou os menores fluxos permeados. Pode-se perceber a partir destes
resultados, que apesar da membrana de MF apresentar maior tamanho de poro que a RZ04,
para esta o fluxo permeado atingido foi relativamente elevado, ainda mais quando comparado
com a membrana HN06. Estes resultados mostram que, além da geometria do módulo, do
tamanho de poro nominal e MMC, outros fatores como o material da membrana, a
distribuição dos tamanhos de poros, a porosidade, a espessura e a morfologia da membrana
exercem uma grande influência sobre o fluxo permeado.
O fluxo permeado de água, após a realização dos experimentos, ou seja, com as
membranas sujas, foi de 6,9; 40,4 e 51,6 L.m
-2
.h
-1
para a HN06, RZ04 e VCWP,
respectivamente; como o objetivo destes experimentos foi apenas verificar a retenção, não foi
realizada limpeza nestas membranas.
A
Tabela 4.1, apresenta os dados de concentração de lactose e proteína para as
amostras de concentrado e permeado recolhidas dos experimentos com as membranas HN06,
VCWP e RZ04. As amostras são identificadas com o nome da membrana seguida da letra “C”
de concentrado e “P” de permeado. A amostra inicial é comum para todos os experimentos.
Tabela 4.1: Dados de concentração de proteína e lactose para as amostras de concentrado e
permeado das membranas VCWP, HN06 e RZ04.
Amostras
Concentração de
Lactose (g.L
-1
) *
Concentração de
Proteína (g.L
-1
) *
Inicial 17,8 30,9
HN06 C 15,4 29,9
HN06 P 13,4 0,5
VCWP C 16,5 26,5
VCWP P 7,6 5,7
RZ04 C 16,9 28,4
RZ04 P 15,9 1,5
*precisão das medidas = ± 6 %.
Observa-se na Tabela 4.1 que as concentrações de lactose nas amostras de concentrado
e permeado para a membrana HN06, são semelhantes e levemente inferiores ao teor da
amostra inicial (que pode ser explicado pela precisão das medidas) mostrando que a
membrana não é seletiva para a lactose - a retenção fica em torno de 13 %. A RZ04 apresenta
uma retenção de aproximadamente 6 % para a lactose. Enquanto a VCWP, apesar de ter maior
tamanho de poro nominal entre as três membranas testadas, é aquela que apresenta maior
retenção para a molécula de lactose, cerca de 50 %; este resultado pode indicar que alguma
interação membrana-lactose, possa estar ocorrendo. A influência do pH da solução poderia ser
levantada como causa provável, no entanto a solução utilizada nos experimentos com a RZ04
também foi acidificada e a retenção para a lactose foi baixa.
RESULTADOS E DISCUSSÃO 93
Quanto às proteínas, as membranas HN06 e RZ04 mostraram alta retenção de
proteínas mesmo possuindo MMC diferentes. Para a HN06 a retenção foi de 98 %, mas como
a membrana possuía MMC de 20 kDa e a menor proteína que deveria permear possuía massa
molar de 14 kDa, pode ter ocorrido fouling (bloqueio de poros, adsorção). Para a RZ04 apesar
desta possuir MMC de 70 kDa, também houve retenção elevada para as proteínas, 94 %,
evidenciando que, além do fouling, ainda podem estar ocorrendo interações entre os
diferentes solutos presentes na solução, isto é, uma agregação das diferentes moléculas de
proteína entre si ou com a lactose, o que impede a sua passagem para o permeado. A VCWP
mostrou uma retenção de proteína um pouco inferior às outras duas membranas, 78 %. Esta
era a membrana com maior tamanho de poro cerca de 0,1 μm (equivalente a 100 kDa), o que
pode explicar a diferença de retenção. Assim como para as outras membranas planas, o
experimento não foi levado por longo tempo, pois esta membrana apesar de ter tamanho de
poro maior teve fluxos de permeado comparáveis a RZ04, mostrando que pode ter ocorrido
alguma interação do material da membrana com a solução.
Todas as amostras de permeado e concentrado foram analisadas qualitativamente,
através de eletroforese, para verificar se havia ocorrido separação das proteínas, mesmo que
esta fosse mínima, os dados de concentração de proteína no permeado indicaram que o teor
deste componente era baixo nesta fração. A Figura 4.17, mostra a fotografia do gel de
eletroforese para as membranas planas, juntamente com a amostra inicial e ainda com uma
amostra contendo os padrões protéicos (BSA, β-Lg e α-La) em quantidades conhecidas (50 µg
por banda).
Figura 4.17: Fotografia dos géis de eletroforese SDS-PAGE (poliacrilamida 15 %) para as amostras de
concentrado e permeado da membrana HN06, RZ04, VCWP (100 V e 30 mA). Legenda: (1)
Inicial; (2) HNO6C; (3) HN06P, (4) RZ04C, (5) RZ04P, (6) VCWPC, (7) VCWPP, (8) padrão.
Todas as amostras foram dissolvidas em tampão de corrida na proporção de 2:1, e
foram realizadas diluições para que todas as canaletas tivessem a mesma quantidade de
proteína. Por isso, as amostras de concentrado tiveram que ser diluídas para não saturar as
canaletas da eletroforese em volume, e nem as bandas da canaleta em quantidade protéica, o
que impediria a visualização das diferentes regiões onde cada proteína fixa-se no gel de
eletroforese. Várias tentativas foram realizadas e concluiu-se que a melhor quantidade de
proteína para visualização no gel seria de 50 µg e que o melhor volume a ser aplicado por
canaleta seria de 15 µL, neste volume estão inclusos os 5 µL de tampão de corrida, portanto, o
1 2 3 4 5 6 7 8
BSA - 69kDa
β Lg - 18 kDa
α La - 14 kDa
94 RESULTADOS E DISCUSSÃO
volume de amostra aplicado por canaleta foi de 10 µL. Então, se a concentração de proteína
na amostra era de 30 g.L
-1
ou 30 µg.µL
-1
, a amostra deveria ser diluída 6 vezes, para se obter
uma concentração de 5 µg.µL
-1
, ou 50 µg de proteína em um volume de 10 µL. As amostras
de permeado não precisaram ser diluídas porque se encontravam nesta faixa de concentração,
ou abaixo desta.
A concentração do gel de poliacrilamida permite visualização das proteínas na faixa
de interesse (14 a 80 kDa), as proteínas com massa molar maior que esta faixa são
empilhadas no início do gel (parte superior), por isto, além do sinal do BSA, percebe-se
outros sinais bem próximos indicando a existência de outras proteínas conforme foi
apresentado na revisão bibliográfica; como neste trabalho o interesse era identificar
preferencialmente as proteínas α-La e β-Lg o fato de proteínas maiores apresentarem-se
acumuladas não interfere nos resultados, mas no caso de separações de todas as proteínas, as
amostras devem ser analisadas em géis com concentrações menores.
Observa-se no gel de eletroforese da Figura 4.17 que a amostra HN06P apresenta um
sinal fraco para ambas as proteínas, β-Lg e α-La, indicando que não ocorreu uma separação
efetiva destas, ou seja, as duas proteínas permearam pela membrana. Este sinal fraco também
pode ocorrer devido a contaminação lateral das amostras das diferentes canaletas. A amostra
RZ04P não apresenta sinal de nenhuma das proteínas de interesse, apesar de ter apresentado
concentração de proteínas total levemente maior que a HN06 na quantificação pelo método de
Lowry. Nenhuma destas duas membranas foi permeável ao BSA visto que a membrana HN06
possui MMC (20 kDa) inferior a massa molar da molécula de BSA (69 kDa); mas para a
membrana RZ04 este resultado não é tão óbvio, pois a membrana possui MMC praticamente
igual a massa molar do BSA, este resultado pode indicar que nos experimentos com a RZ04
todas as moléculas de proteína interagiram com a membrana ou entre si, já que nenhuma das
três foi detectada no permeado, por esta análise. A membrana VCWP mostrou-se permeável
as três proteínas, porém para a proteína BSA o sinal foi fraco quando comparado ao da
amostra inicial, as outras duas moléculas mostraram concentrações semelhantes na amostra
VCWPP. Mas como a β-Lg é duas vezes mais abundante que a α-La no concentrado, e isto
pode ser visualizado no VCWPC, pode haver uma retenção menor da molécula de α-La pela
membrana. Vale relembrar que o objetivo era que a retenção da β-Lg pela membrana fosse
superior a da α-La, e que, portanto, a α-La predominasse no permeado, porém houve uma
passagem de uma quantidade considerável da molécula de β-Lg, indicando que estas
moléculas não estão se agregando em octômeros nas condições do experimento.
4.2.2 Membrana MF - 7002
Inicialmente realizou-se a compactação da membrana com água destilada, e como
mostra a Figura 4.18, a pressão transmembrana utilizada foi de 3,25 bar, a maior pressão de
operação que se conseguiu atingir para a MF-7002. A compactação ocorreu durante tempo
suficiente para que a membrana apresentasse fluxo permeado constante. O experimento
começou com um fluxo permeado de aproximadamente 640 L.m
-2
h
-1
e após 100 minutos o
fluxo baixou para 530 L.m
-2
h
-1
, e assim permaneceu até os 140 minutos, onde assumiu-se que
não haveria diminuições significativas do fluxo, e que portanto a membrana estava
compactada.
RESULTADOS E DISCUSSÃO 95
200
300
400
500
600
700
0 20406080100120140160
J p(Lm
-2
h
-1
)
Tempo (min)
Figura 4.18: Compactação da membrana MF-7002, vazão de alimentação 700 L.h
-1
, ΔP = 3,25 bar, T = 25 °C.
A Figura 4.19 apresenta o gráfico do fluxo permeado da água e do concentrado
protéico em função da pressão transmembrana para a membrana MF-7002. Observa-se que o
fluxo de concentrado protéico é menor do que o fluxo de água pura para todas as pressões.
Ainda é possível verificar comparando a Figura 4.16 e a Figura 4.19 que os fluxos de água da
MF-7002 são comparáveis a VCWP - as duas membranas são de MF com tamanho de poro
nominal de 0,1 μm, apresentando diferenças na geometria do módulo, no material e na
estrutura. Segundo
ATRA et al. (2005), as membranas com MMC maior dão um fluxo mais
elevado, porém são mais suscetíveis à polarização por concentração.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
500
550
01234
J
p
concentrado (Lm
-2
h
-1
)
J
p
água (Lm
-2
h
-1
)
ΔP(bar)
água
concentrado
Figura 4.19: Fluxo de água e de concentrado protéico em função da pressão transmembrana para a membrana
MF-7002, vazão 700 L.h
-1
, T = 40 °C, pH = 4,6 (concentrado).
96 RESULTADOS E DISCUSSÃO
Um volume inicial de 6 L de concentrado protéico foi adicionado ao tanque de
alimentação, aquecido a 40 °C e o pH ajustado para 4,6; o volume inicial de 6 L foi reduzido
a 3 L, e em seguida quatro DFs de 3 L foram realizadas. A vazão de alimentação foi mantida
em 700 L.h
-1
e ΔP em 1,75 bar, região em que podíamos garantir que o fluxo limite não havia
sido atingido. O resultado de fluxo permeado em função do tempo está apresentado na Figura
4.20.
0
5
10
15
20
25
30
35
40
0 50 100 150 200 250
Jp (Lm
-2
h
-1
)
Tempo (min)
MF
DF1
DF2
DF3
DF4
Figura 4.20: Fluxo permeado de concentrado protéico em função do tempo para a membrana MF-7002 , vazão
de alimentação 700 L.h
-1
, T = 40 °C, pH = 4,6 e P = 1,75 bar.
Este foi um experimento rápido, sendo que em menos de 40 minutos havíamos
reduzido o volume do tanque a metade. Durante as DF o fluxo inicial não foi restituído e o
decréscimo permaneceu e se acentuou a cada etapa do processo. No final do experimento o
fluxo de permeado caiu à metade do fluxo inicial, o que ocorre devido à formação de fouling e
ainda devido a mudanças de propriedades da solução. Estes resultados podem ser atribuídos à
deposição gradual de proteína e de moléculas similares na superfície da membrana que
diminuem a transferência de massa através da membrana. As maiores moléculas podem ter
adsorvido na superfície da membrana e proteínas menores podem ter adsorvido dentro dos
poros, todos estes fatores podem modificar a retenção do processo.
A Tabela 4.2 apresenta os dados de concentração de lactose e proteína para a MF-
7002, para a etapa de concentração MF e de DF. As amostras MFC1 e MFP1 correspondem,
respectivamente, as amostras de concentrado e permeado no início da MF e as amostras
MFC2 e MFP2 correspondem às amostras de concentrado e de permeado ao final da MF
(quando haviam sido recolhidos 3 L de pemeado). As amostras DFnC e DFnP, com n
variando de 1 a 4, correspondem as amostras de concentrado e de permeado obtidas nas
diafiltrações.
RESULTADOS E DISCUSSÃO 97
Tabela 4.2: Dados de concentração de proteína e lactose para as amostras de concentrado e
permeado da membrana MF-7002.
Amostras
Concentração de
Lactose (g.L
-1
)*
Concentração de
Proteína (g.L
-1
)*
MFC1 17,5 21,4
MFP1 12,3 7,6
MFC2 19,6 22,4
MFP2 3,6 6,9
DF1C 18,1 22,1
DF1P 9,4 6,7
DF2C 11,6 19,8
DF2P 7,1 7,3
DF3C 9,5 18,2
DF3P 5,0 4,9
DF4C 6,7 12,6
DF4P 4,6 5,6
*precisão das medidas = ± 6 %.
Na Tabela 4.2 observa-se que há retenção parcial de lactose, tanto nas amostras da
MF, quanto da DF, variando de 80 %, na MF até 30 % ao final da DF4. Quanto à proteína na
MF há retenção de 65 %, nas DFs a retenção diminui gradativamente atingindo ao final destas
etapas 55 %.
A Figura 4.21 mostra a fotografia do gel de eletroforese feito para analisar a presença
das diferentes proteínas nas amostras de concentrado e permeado do experimento com a
membrana MF-7002. A exemplo do que foi realizado para as membranas planas, as amostras
tiveram que ser diluídas para se obter uma boa visualização das proteínas no gel. A canaleta 1
corresponde ao padrão, formado por 50 μg das proteínas BSA, β-Lg e α-La em cada banda
correspondente.
Figura 4.21: Fotografia dos géis de eletroforese SDS-PAGE (poliacrilamida 15 %) para as amostras de
concentrado e permeado da membrana MF-7002 (100 V e 30 mA). Legenda: (1) padrão; (2)
MFC1, (3) MFP1, (4) MFC2, (5) MFP2, (6) DF1C, (7) DF1P, (8) DF2C, (9) DF2P, (10) DF3C,
(11) DF3P, (12) DF4C, (13) DF4P.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
BSA - 69 kDa
β Lg - 18 kDa
α La - 14 kDa
98 RESULTADOS E DISCUSSÃO
As canaletas 2 a 13 mostram as amostras obtidas no experimento, mostrando as etapas
de concentração e de DF. Em um primeiro momento, em alguns casos, tem-se a impressão de
que as concentrações das duas proteínas estão iguais, porém analisando cuidadosamente
observa-se que as quantidades estão variando. O software do programa Kodak 1D
®
para
análise de géis eletroforéticos foi utilizado para realizar a densitometria de cada banda, e
assim obter uma noção de quanto de cada proteína estava presente no permeado. O princípio
do programa baseia-se em transformar a intensidade de cor de cada banda em uma curva
gaussiana, e a partir do cálculo da área desta curva, permite identificar qual é a proteína que
predomina em cada canaleta. Os resultados de intensidade do modelo e intensidade relativa
encontram-se no Anexo B. Os resultados da densitometria realizada no gel de eletroforese
encontram-se na Tabela B.21.
Tabela 4.3: Dados de intensidade relativa (em porcentagem) correspondendo a quantidade de
proteína em cada banda eletroforética das amostras de concentrado e permeado da membrana
MF-7002.
Proteínas Intensidade Relativa (%)
MFC1 MFP1 MFC2 MFP2
outras proteínas 16 3 14 3
β-Lg 51 47 53 39
α-La 33 50 33 58
DF1C DF1P DF2C DF2P
outras proteínas 8 4 9 8
β-Lg 56 65 70 73
α-La 36 31 21 19
DF3C DF3P DF4C DF4P
outras proteínas 8 5 19 4
β-Lg 73 66 58 70
α-La 19 29 23 25
A amostra MFC1 apresentou os seguintes percentuais: 51 % de β-Lg; 33 % de α-La e
16 % de outras proteínas, representadas no gel de eletroforese pelo BSA. Estes valores estão
próximos ao da teoria, pois segundo M
ILLER et al. (2000) metade das proteínas totais do soro
correspondem a β-Lg, e 25 % correspondem a
α-La. Na amostra MFP1, que é o primeiro
permeado recolhido da MF-7002, encontramos 47 % de β-Lg; 50 % de α-La e 3 % de outras
proteínas, mostrando que a α-La apesar de estar presente em menor concentração no retido,
teve sua passagem preferencial para o permeado no início do experimento, indicando que a
mudança de pH beneficiou a agregação da β-Lg mesmo que esta agregação tenha sido parcial,
porque esta proteína também foi encontrada no permeado.
Comportamento semelhante ao anterior foi encontrado para amostra MFC2 (53 % de
β-Lg; 33 % de α-La e 14 % de outras) e para a amostra MFP2 (38 % de β-Lg; 58 % de α-La e
3 % de outras).
RESULTADOS E DISCUSSÃO 99
Quando iniciaram as diafiltrações, porém observou-se que a passagem de β-Lg
aumentou no permeado: na DF1P encontramos 65 % de β-Lg; 31 % de α-La e 43 % de outras
proteínas; enquanto na DF1C temos 56 % de β-Lg; 36 % de α-La e 8 % de outras proteínas.
Observa-se que a β-Lg está em maior quantidade no permeado do que a α-La, mostrando que
a partir deste momento a membrana não retém nenhuma das duas proteínas o que torna o
processo de fracionamento ineficiente. Para as diafiltrações 2, 3 e 4 o mesmo comportamento
é observado chegando-se a encontrar no permeado mais de 70 % de β-Lg.
Este fato pode ter ocorrido devido ao efeito de diluição, porque enquanto estávamos
apenas concentrando a solução havia uma passagem maior de α-La. Alguns mecanismos da
agregação da β-Lg em octômeros podem sofrer interferência devido à adição de água.
4.2.3 Membrana UF - C50
Inicialmente realizou-se a compactação da membrana com água destilada, como
mostra a Figura 4.22, a pressão transmembrana utilizada foi de 3,75 bar, a maior pressão que
se conseguiu atingir para a UF-C50. Após os primeiros 15 minutos o fluxo permeado inicial
de 2.200 L.m
-2
h
-1
, baixou para 2.100 L.m
-2
h
-1
, e assim permaneceu até os 35 minutos,
considerou-se que o fluxo permeado era constante e que a compactação havia ocorrido.
1000
1200
1400
1600
1800
2000
2200
2400
2600
2800
0 10203040
J (Lm
-2
h
-1
)
Tempo (min)
Figura 4.22: Fluxo permeado de água versus tempo do experimento de compactação da membrana UF-C50;
vazão de alimentação 400 L.h
-1
, ΔP = 3,75 bar, T = 25 °C.
A Figura 4.23 apresenta os gráficos do fluxo permeado da água e o gráfico do fluxo de
concentrado protéico (em dois pHs diferentes) em função da pressão transmembrana para a
membrana UF-C50.
100 RESULTADOS E DISCUSSÃO
0
20
40
60
80
100
120
01234
Jp (Lm
-2
h
-1
)
ΔP (bar)
pH 6,3
pH 4,6
0
500
1000
1500
2000
2500
01234
Jp (Lm
-2
h
-1
)
ΔP (bar)
Figura 4.23: Fluxos permeados de água (esquerda) e de concentrado protéico (direita) em dois pHs (4,6; 6,3)
em função da pressão transmembrana para a membrana UF-C50, vazão de alimentação 400 L.h
-1
,
T = 40 e 25 °C (concentrado).
Para a membrana UF-C50 foram realizadas duas estratégias: na estratégia 1 o pH da
solução foi mantido em 6,3; a temperatura em 25 °C; na estratégia 2 o pH da solução foi
acidificado até 4,6; e a temperatura utilizada foi de 40 °C.
Pela comparação dos resultados apresentados na Figura 4.23 observa-se que o fluxo de
concentrado protéico é menor do que o fluxo de água pura para todas as pressões e para as
duas soluções de concentrado protéico; além disso, o fluxo permeado de água tem valor
superior ao fluxo de todas outras membranas testadas, mesmo das membranas de MF,
indicando que esta membrana possui uma porosidade elevada. Os fluxos permeados de
concentrado protéico são muito menores que os fluxos de água, cerca de 20 vezes menores
para o concentrado com pH 4,6 (40 °C) e 50 vezes menores para o pH 6,3 (25° C).
A diferença de fluxo entre as soluções de concentrado protéico, que são idênticas nas
concentrações iniciais dos seus componentes sólidos, se deve ao pH e à temperatura, que
ocasionam um fluxo no mínimo duas vezes maior da solução de pH mais ácido e temperatura
mais elevada. Esta diferença pode ser explicada pelo efeito combinado de pH e temperatura
que implica em diferentes interações entre os componentes do soro e entre os componentes do
soro e a membrana, além de influenciar também nas propriedades físicas (viscosidade
dinâmica, massa específica) e nas características reológicas da solução (propriedades de
transporte como a viscosidade cinemática e a difusividade mássica).
C
HOLLANGI & HOSSAIN (2006) encontraram em seu trabalho que o fluxo permeado a
40 °C é ligeiramente mais elevado do que o fluxo permeado na temperatura ambiente. O
efeito da temperatura no fluxo permeado pode ser compreendido avaliando-se as propriedades
da alimentação. Aumentando-se a temperatura há uma diminuição na viscosidade dinâmica do
soro, tendo por resultado um aumento no fluxo de permeado, além disso, a temperatura exerce
um efeito sobre a difusividade mássica do soluto e a taxa do transporte dos solutos da
superfície da membrana para o seio da solução.
RESULTADOS E DISCUSSÃO 101
Ainda é possível perceber que para a solução com pH 4,6 (40°C) a partir da pressão
transmembrana de 3,25 bar, e para a solução com pH 6,3 (25°C) a partir da pressão de 2,75
bar, um aumento na pressão não ocasiona aumento do fluxo permeado indicando que o fluxo
limite pode ter sido atingido. Este fenômeno está no acordo com dados da literatura, A
TRA et
al.
(2005), nas suas pesquisas, observaram que acima de uma pressão transmembrana limite (2
- 4 bar) o fluxo tornou-se independente da pressão. Segundo estes autores, as moléculas da
proteína depositadas na superfície da membrana causaram uma concentração de polarização
controlada por dois fatores: tipo de membrana e velocidade do fluxo de alimentação.
C
HOLLANGI & HOSSAIN (2006) observaram que o fluxo permeado aumentou até uma pressão
transmembrana de 2 bar, em seguida diminuiu quando a pressão aumentou de 2 para 3 bar.
O gráfico de fluxo permeado em função do tempo é apresentado na Figura 4.24. Para
ambas as estratégias a ΔP foi mantida em 2,25 bar e a vazão de alimentação em 400 L.h
-1
. A
pressão transmembrana de operação foi escolhida de forma a garantir que o fluxo limite não
seja atingido. O volume inicial no tanque era de 3 L e o experimento foi encerrado quando um
litro de permeado foi coletado.
0
20
40
60
80
100
120
140
160
0 100 200 300 400
Jp (Lm
-2
h
-1
)
Tempo (min)
pH 4,6
pH 6,3
Figura 4.24: Fluxo permeado de concentrado protéico em pHs e temperaturas diferentes em função do tempo
para a membrana UF-C50, vazão de alimentação 400 L.h
-1
e ΔP =, 2,25 bar.
O fluxo para a solução com pH 6,3 (25°C) é menor que o fluxo da solução com pH 4,6
(40°C) durante todo período do experimento. A solução com pH 6,3, mantém o fluxo entre 50
e 35 L.m
-2
.h
-1
, e o experimento foi mantido durante cerca de 350 minutos, o tempo necessário
para que se coletasse o volume de permeado pré-estabelecido. A solução ácida, iniciou o
experimento com fluxo de 145 L.m
-2
.h
-1
e após 210 minutos, ao coletarmos um litro de
amostra, o fluxo decaiu para 90 L.m
-2
.h
-1
, mostrando que apesar de o fluxo ser maior neste
pH, os fenômenos de fouling e concentração por polarização foram mais acentuados
provocando o decaimento de fluxo permeado mais expressivo.
A Tabela
4.4 apresenta os dados de pH, temperatura, concentração de lactose e
proteína para a UF-C50.
102 RESULTADOS E DISCUSSÃO
Tabela 4.4: Dados de concentração de proteína, lactose e pH das amostras de permeado e
concentrado para o experimento com concentrado protéico para a membrana UF-C50, ΔP =
2,25 bar, vazão de alimentação = 400 L.h
-1
.
Tempo de
experimento(min)
Amostras
Concentração de
Proteína (g.L
-1
)*
Concentração de
Lactose (g.L
-1
)*
pH T (°C)
0 50 inicial 1 27,6 10,1 6,3 25
175 50 C11 27,2 12,4 6,2 25
175 50 P11 1,5 4,8 6,3 25
355 50 C12 28,1 13,0 6,3 25
355 50 P12 1,4 5,4 6,3 25
0 50 inicial 2 28,2 14,3 4,6 40
98 50 C21 28,2 12,1 4,6 40
98 50 P21 1,2 10,5 4,8 40
221 50 C22 28,9 14,5 4,6 40
221 50 P22 1,1 11,9 4,6 40
*precisão das medidas = ± 6 %.
Legenda: 50 inicial 1- amostra inicial em pH 6,3; 50C11 e 50P11 – primeiras amostras de concentrado e
de permeado coletadas em pH 6,3; 50C12 e 50P12 – últimas amostras de concentrado e de permeado
coletadas em pH 6,3; 50 inicial 2- amostra inicial em pH 4,6; 50C21 e 50P21– primeiras amostras de
concentrado e de permeado coletadas em pH 4,6; 50C22 e 50P22– últimas amostras de concentrado e de
permeado coletadas em pH 4,6.
Observa-se na Tabela 4.4 que a concentração de lactose no permeado das soluções a
pH 6,3 (50P11 e 50P12) é de cerca de 5 g.L
-1
, enquanto no retido (50C11 e 50 C12) e na
amostra inicial (50 inicial 1), a concentração é cerca de 12 g.L
-1
, indicando uma retenção de
cerca de 60 %. Nas amostras em pH 4,6 a lactose encontra-se igualmente distribuída entre o
retido (50C21 e 50C22) e permeado (50P21 e 50P22), mostrando que a retenção para esta
molécula está próxima de zero. Quanto à concentração de proteínas, tanto para a solução a pH
4,6 quanto para a solução a pH 6,3, a concentração no permeado ficou em torno de 1,5 g.L
-1
,
enquanto nas amostras iniciais e de concentrado ela é cerca de 28 g.L
-1
.
A Figura 4.25 mostra a fotografia do gel de eletroforese das amostras de concentrado e
permeado para a UF-C50. Assim como foi realizado para as outras membranas, as amostras
de concentrado foram diluídas para melhor visualização das proteínas no gel. A canaleta 1
corresponde ao padrão, formado por 50 μg de cada uma das três proteínas, as canaletas 2, 3 e
4 correspondem às amostras da solução com pH 6,3 e as canaletas 5, 6 e 7 correspondem às
amostras da solução com pH 4,6.
RESULTADOS E DISCUSSÃO 103
Figura 4.25: Fotografias dos géis de eletroforese SDS-PAGE (poliacrilamida 15 %) para as amostras de
concentrado e permeado obtidos nos experimentos com a membrana UF-C50 (100 V e 30 mA).
Legenda: (1) padrão; (2) 50 inicial 1, (3) 50C12, (4) 50P12, (5) 50 inicial 2, (6) 50C22, (7)
50P22.
A primeira observação que pode ser feita é que há uma passagem de proteína
irrelevante nas amostras de permeado tanto para a solução com pH 6,3 (canaleta 4 – 50P12)
quanto para o permeado da solução a pH 4,6 (canaleta 7 – 50P22), mostrando que a mudança
de pH combinada com a temperatura não influenciou a passagem de proteína, ocorrendo em
ambos os casos retenção protéica total. Este fato é comprovado, comparando a canaleta 2 com
a 3, observa-se que as bandas das duas canaletas referidas possuem grande semelhança apesar
de representarem amostras diferentes, uma é a amostra inicial de concentrado protéico, antes
de ser iniciado o experimento, e a outra representa a amostra de retido ao final do experimento
onde haviam sido coletados 1000 mL de permeado. O mesmo comentário é válido para as
amostras 50inicial2 e 50C22 (canaletas 5 e 6).
Um fato interessante a respeito das amostras em pH ácido é que no gel de eletroforese
entre as bandas correspondentes ao BSA e a β-Lg não são observados sinais de outras
proteínas como é observado no pH 6,3. Como as amostras para ambos os pHs foram
analisadas no mesmo gel e, portanto, com condições idênticas de corrente e voltagem, além de
mesmo tempo de corrida; de revelação com o mesmo corante e ao mesmo tempo; amostras
iniciais para os dois experimentos idênticas em composição, diferenciadas apenas pela
mudança de pH (realizada para acidificar uma delas a 4,6), verifica-se que existe uma
mudança da conformação protéica entre as amostras devido a influência do pH. H
ONG et al.
(2002) também encontraram estes sinais intermediários entre as bandas do BSA e da β-Lg no
pH de 6,3, e consideraram que eles correspondem a conformações que as proteínas adquirem
no soro, como por exemplo, os dímeros da β-Lg, que possuem estabilidade maior do que o
monômero e que mesmo sob condições desnaturantes, como no caso do gel com SDS,
permanecem em forma de dímeros neste pH. Por isso, no gel de eletroforese a molécula de β-
Lg forma um rastro na região correspondente a 30 e 40 kDa, porque os dímeros possuem
massa molar de 36 kDa. Em pHs ácidos (abaixo de 5,0) as moléculas tendem a se agrupar em
octômeros que são menos estáveis e, por isso, tornam-se mais suscetíveis a se romperem, o
que faz com que no gel de eletroforese haja poucos sinais entre a banda do BSA e da β-Lg,
porque neste caso a desnaturação do gel SDS é suficiente para que as moléculas de β-Lg
fiquem na forma de monômeros e, portanto, empacotadas na região correspondente a esta
molécula.
1 2 3 4 5 6 7
BSA - 69 k Da
β Lg - 18 kDa
α La - 14 k Da
30 a 40
kDa
104 RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.2.4 Membrana UF - C20
Na membrana UF-C20 a exemplo das outras membranas realizou-se a compactação da
membrana com água destilada, os resultados estão apresentados na Figura 4.26, a pressão
transmembrana utilizada foi de 3,75 bar. Após 20 minutos o fluxo permeado inicial de 750
L.m
-2
h
-1
, baixou para 690 L.m
-2
h
-1
, permanecendo assim até os 40 minutos, quando assumiu-
se que a compactação havia ocorrido.
Para a membrana UF-C20 o volume inicial de concentrado purificado no tanque de
alimentação foi igual a 3 L e o experimento foi conduzido até que 1 L de permeado fosse
coletado. O pH da solução foi mantido em 6,3 e a temperatura em 25 °C, a ΔP foi mantida em
2,25 bar e a vazão de alimentação em 620 L.h
-1
. Para verificar se não havia interações que
interfeririam no fracionamento devido ao fator de concentração foi testada ainda na
membrana UF-C20 a tentativa de fracionamento com a solução do soro diluída, (sem ser soro
concentrado e purificado). Os parâmetros operacionais de pH, temperatura da solução, ΔP,
vazão de alimentação, volume inicial e quantidade permeado coletado utilizados nesta
estratégia foram idênticos aos usados no experimento com concentrado protéico.
500
550
600
650
700
750
800
0 1020304050
Jp (Lm
-2
h
-1
)
Tempo (min)
Figura 4.26: Compactação da membrana UF-C20, vazão de alimentação 620 L.h
-1
, ΔP = 3,75 bar, T = 25 °C.
Os gráficos de fluxo de água e fluxo de soro e concentrado protéico em função da
pressão transmembrana são apresentados na Figura 4.27. Pela análise da figura observa-se que
o fluxo de água é maior que o fluxo de soro e de concentrado protéico para todas as pressões,
além disso, o comportamento do fluxo de soro e de concentrado protéico é o mesmo, porém o
fluxo de soro é maior que o de concentrado protéico em todas as pressões transmembranas
testadas. Este fato pode ser explicado pelas diferenças de propriedades, como viscosidade
dinâmica e massa específica existentes entre estas duas soluções.
RESULTADOS E DISCUSSÃO 105
0
100
200
300
400
500
600
700
800
01234
Jp (Lm
-2
h
-1
)
ΔP (bar)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
01234
Jp (Lm
-2
h
-1
)
ΔP (bar)
Concentrado
Soro
Figura 4.27: Fluxo permeado de água (esquerda) e de concentrado protéico e de soro (direita) em função da
pressão transmembrana para a membrana UF-C20, vazão de alimentação 620 L.h
-1
, T = 25 °C,
pH = 6,3.
O gráfico de fluxo permeado em função do tempo é apresentado na Figura 4.28. Os
experimentos foram conduzidos nas mesmas condições de operação: 620 L.h
-1
, T = 25 °C, pH
= 6,3 e ΔP = 2,25 bar.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 100 200 300 400
Jp (L.m
-2
.h
-1
)
Tempo (min)
Concentrado
Soro
Figura 4.28: Fluxo permeado de soro diluído e de concentrado protéico em função do tempo para a membrana
UF-C20; condições de operação: vazão de alimentação = 620 L.h
-1
, T = 25 °C, pH = 6,3 e ΔP =
2,25 bar.
É possível observar que o fluxo de concentrado protéico é menor que o de soro em
todo o experimento, portanto para coletar um litro de permeado o experimento com soro
demorou menos de 200 minutos, já para o concentrado durou cerca de 350 minutos. O fluxo
permeado de soro variou bastante entre 60 e 70 L.m
-2
.h
-1
, e não apresentou o comportamento
que vinha sendo observado para os outros casos. Este fato pode ser explicado porque a
solução de soro possui viscosidade dinâmica menor que a do concentrado. A solução de
106 RESULTADOS E DISCUSSÃO
concentrado apresenta fluxo inicial de 45 L.m
-2
h
-1
, este fluxo vai diminuindo e no final do
experimento este fluxo decai para 30 L.m
-2
h
-1
.
A Tabela 4.5 apresenta os dados de pH e concentração de lactose e proteína para as
amostras de concentrado e permeado da solução de concentrado protéico e da solução de soro,
para a membrana UF-C20.
Tabela 4.5: Dados de concentração de proteína, lactose e pH das amostras de permeado e
concentrado para o experimento com concentrado protéico e para o soro diluído para a
membrana UF-C20, T = 25 °C, ΔP = 2,25 bar, vazão de alimentação = 620 L.h
-1
.
Tempo de
experimento (min)
Amostras
Concentração de
Proteína (g.L
-1
)
Concentração de
Lactose (g.L
-1
)
pH
Concentrado protéico
0 C01 15,5 9,6 6,28
172 CC1 18,7 11,8 6,28
172 CP1 0,1 7,2 6,28
360 CC2 17,7 13,1 6,28
360 CP2 0,7 8,2 6,16
Soro diluído
0 UFC01 10,7 58,3 6,28
75 UFC1 10,5 59,3 6,26
75 UFP1 0,1 51,2 6,26
175 UFC2 11,7 57,4 6,29
175 UFP2 0,2 47,9 6,21
*precisão das medidas = ± 6 %.
Legenda: C01- amostra inicial de concentrado protéico; CC1 e CP1 – primeiras amostras de concentrado
e de permeado coletadas do concentrado protéico; CC2 e CP2 – últimas amostras de concentrado e de
permeado coletadas do concentrado protéico; UFC01- amostra inicial de soro diluído; UFC1 e UFP1–
primeiras amostras de concentrado e de permeado coletadas do soro diluído; UFC2 e UFP2– últimas
amostras de concentrado e de permeado coletadas do soro diluído.
Observa-se, quanto à lactose, para o concentrado protéico, que a concentração no
permeado e no retido é semelhante, mostrando que a membrana não é seletiva para esta
substância. O mesmo é observado para o soro, ou seja, a retenção da lactose é baixa, porém
esta concentração é mais elevada que na solução de concentrado, pois esta solução não passou
pelas etapas de purificação. Quanto à proteína, para ambos os casos, observamos que no
permeado a concentração é muito baixa, menor que 1 g.L
-1
, indicando que não houve a
passagem significativa de proteína para esta corrente.
A Figura 4.29 apresenta a fotografia do gel de eletroforese das amostras de
concentrado e permeado da membrana UF-C20. Assim como foi realizado para as outras
membranas, as amostras de concentrado foram diluídas. A canaleta 1 corresponde ao padrão,
a canaleta 2 refere-se à amostra inicial de concentrado protéico (C01) e as canaletas 3 e 4
correspondem às amostras de concentrado (CC2) e permeado (CP2) ao fim do experimento; a
canaleta 5 corresponde à amostra inicial de soro (UFC01) e as canaletas 6 e 7 correspondem
RESULTADOS E DISCUSSÃO 107
às amostras de concentrado (UFC2) e permeado (UFP2) desta solução. Como não houve
passagem expressiva de proteína durante o experimento optou-se por apresentar apenas nos
géis de eletroforese as amostras inicial, da solução original, e as finais de concentrado e
permeado omitindo as análises eletroforéticas das amostras intermediárias (CC1 e CP1; UFC1
e UFP1).
Figura 4.29: Fotografias dos géis de eletroforese SDS-PAGE (poliacrilamida 15 %) para as amostras de
concentrado e permeado da membrana UF-C20 (100 V e 30 mA). Legenda: (1) padrão; (2) C01,
(3) CC2, (4) CP2, (5) UFC01, (6) UFC2, (7) UFP2.
Pela análise da Figura 4.29 observa-se que não ocorreu a passagem das proteínas β-Lg
e α-La, indicando que o fracionamento não ocorreu nesta membrana. Estes dados corroboram
os resultados apresentados na Tabela 4.5.
4.2.5 Comentários gerais sobre o fracionamento das proteínas
Como pôde ser observado anteriormente o processo de fracionamento não ocorreu
para as membranas HN06, RZ04, UF-C50 e UF-C20, e ocorreu parcialmente para as
membranas MF-7002 e VCWP. Como o fracionamento esperado era baseado na
polimerização da β-Lg em dímeros no pH neutro e em octômeros no pH ácido (4,6), fez-se
necessário a confirmação desta hipótese pela análise das amostras de soro por cromatografia
gel. A Figura 4.30 apresenta o resultado da cromatografia gel para a amostra de soro em pH
7,0, enquanto a Figura 4.31 apresenta o resultado da cromatografia gel em pH 4,6.
1 2 3 4 5 6 7
β Lg - 18 kDa
α La - 14 kDa
BSA - 69 kDa
108 RESULTADOS E DISCUSSÃO
Figura 4.30: Cromatografia gel em coluna de 10 x 300 mm empacotada com a resina Superose
TM
12,
equilibrada com tampão fosfato de sódio 10 mM, pH 7,0; vazão de eluição = 0,5 mL.min
-1
;
amostras monitoradas pela absorbância a 280 nm. Legenda: (1) BSA. (2) β-Lg, (3) β-Lg, (4) α-
La
Figura 4.31: Cromatografia gel em coluna de 10 x 300 mm empacotada com a resina Superose
TM
12,
equilibrada com tampão acetato de sódio 10 mM, pH 4,6; vazão de eluição = 0,5 mL.min
-1
,
amostras monitoradas pela absorbância a 280 nm. Legenda: (1) β-Lg, (2) β-Lg, (3) α-La.
Devido à baixa força iônica do eluente usado, interações hidrofóbicas significativas
ocorreram entre a matriz da coluna e as proteínas, tendo por resultado um tempo mais longo
de eluição e menor massa molar observada. Não foi possível obter a massa molar exata pela
cromatografia gel, por isso, as frações obtidas nesta técnica foram analisadas por eletroforese
como mostra a Figura 4.32.
1
2
3
4
1
2
3
RESULTADOS E DISCUSSÃO 109
Figura 4.32: Fotografias dos géis de eletroforese SDS-PAGE (poliacrilamida 15 %) para a amostra de soro
analisada por cromatografia gel (100 V e 30 mA). Legenda: (1) padrão; (2) pico 1, (3) pico 2, (4)
picos 3 e 4 (referentes à Figura 4.30).
A Figura 4.30 e a Figura 4.31 possuem o mesmo comportamento, porém ocorre na
última um deslocamento dos sinais, que se deve aos diferentes tampões utilizados em cada
corrida e as diferentes interações destes com a resina da coluna cromatográfica, por este
motivo, na eletroforese só foi analisado uma das amostras. Na Figura 4.30 o pico 1
corresponde ao BSA, os picos 2 e 3 podem corresponder à β-Lg em forma de dímero e
monômero, respectivamente, e o pico 4 pode corresponder à α-La, resultado que é
corroborado na eletroforese mostrada na Figura 4.32. Na Figura 4.31, os picos 1 e 2
possivelmente correspondam à β-Lg em forma de dímero e monômero, respectivamente, e o
pico 3 à α-La.
Segundo C
HEANG & ZYDNEY (2004), o duplo pico da β-Lg (que pode ser observado
no sinal 2 da Figura 4.30 e no sinal 1 da Figura 4.31) acontece devido à pequena diferença das
duas variantes desta proteína.
No pH 7,0, Figura 4.30, observa-se que possivelmente a β-Lg se apresente parte em
dímeros e parte em monômeros, ou seja, uma parte desta proteína pode estar desnaturada, e,
por isso, nem todas as suas moléculas encontram-se em dímeros (a sua configuração mais
estável neste pH).
No pH 4,6, Figura 4.31, observa-se que não foram registrados octômeros da proteína
β-Lg pela análise da cromatografia gel assim como no pH 7,0 esta provavelmente se encontra
em forma de dímeros e monômeros. Também é possível observar que não existe o pico do
BSA, que deve ter precipitado neste pH, que é próximo ao seu ponto isoelétrico e
adicionalmente, segundo K
EHOE et al. (2007) a taxa de desnaturação do BSA aumenta com o
aumento da concentração das proteínas do soro.
No entanto, alguma agregação das proteínas de β-Lg deve ocorrer no pH 4,6, porque
as membranas MF-7002 e VCWP apresentaram retenção parcial para esta molécula. A
ausência de octômeros na cromatografia gel pode indicar que esta conformação é menos
estável que a de dímeros, fato que foi observado anteriormente na análise do gel da Figura
4.25. Portanto, efeitos de diluição e aumento da concentração de proteínas na solução podem
ter ocasionado a desagregação da β-Lg, pois após o início da DF foi observado um aumento
BSA - 69 k Da
β Lg - 18 kDa
α La - 14 kDa
1 2 3 4
110 RESULTADOS E DISCUSSÃO
da concentração de β-Lg no permeado, para os experimentos com a membrana MF-7002.
Caso não ocorra a formação de octômeros, podem ocorrer interações entre os diferentes
componentes da solução provocando retenção maior de um ou outro componente.
O que de fato pode ser observado na cromatografia gel, é que parte da β-Lg pode
encontrar-se em forma de monômeros, o que indica que uma prévia desnaturação protéica
irreversível das moléculas de β-Lg pode ter ocorrido em algum momento do processamento
do soro em pó. Mudanças físico-químicas nas diferentes frações protéicas são conduzidas por
tratamentos térmicos, o soro em pó sofre três tipos de tratamento de calor: pasteurização,
concentração por evaporação e secagem por spray drier. Segundo S
GARBIERI (1996), as
proteínas são relativamente termolábeis, mas a pasteurização não desnatura as proteínas, pois
o leite é aquecido a 72
o
C por apenas 15 segundos. Porém, provavelmente algumas proteínas
são inativadas e desnaturadas por tratamentos de calor mais severos, como por exemplo, a
concentração por evaporação e a secagem por spray drier.
KEHOE et al. (2007), afirmam que
as proteínas devem ser liofilizadas ao invés de secas em spray drier, porque este processo
evita qualquer desnaturação das proteínas.
Se algumas moléculas estavam desnaturadas, elas poderiam passar para o permeado
das membranas investigadas com MMC menores, como a UF-C20 e a UF-C50, por exemplo,
mas, segundo K
EHOE et al. (2007), as moléculas desnaturadas tem maior possibilidade de
formar aglomerados de proteínas, impedindo a passagem destes monômeros para o permeado.
Conforme W
IT (1998), a α-La é uma proteína com forte ligação ao cálcio, porém há baixas
concentrações deste elemento, como no caso do concentrado protéico deste trabalho, pode
polimerizar com outras proteínas formando aglomerados. Se, por exemplo, existir um grupo -
SH livre em outra molécula (como por exemplo em monômeros desnaturados de β-Lg), este
reage com uma das pontes S-S presente na α-La originando uma associação de proteínas.
W
ONG et al. (1999) afirmam que associação entre duas proteínas de α-La deve ocorrer abaixo
do pH 4, fato atribuído a mudança conformacional da molécula da proteína, mas este não foi
o caso deste trabalho. F
OX & MCSWEENEY (1998) relatam que com a desnaturação por calor,
o grupo -SH da β-Lg é exposto e reage com a caseína (e provavelmente com a α-La) com
efeitos muito significativos em algumas das propriedades físico-químicas tecnologicamente
importantes do leite e do soro. Ainda, é possível acrescentar, segundo H
AVEA et al. (2001),
que o BSA pode formar pontes intermoleculares dissulfito com moléculas de β-Lg e a α-La,
quando estas não se encontram nas suas formas mais estáveis. Para evitar a desnaturação das
proteínas o ideal seria utilizar o soro in natura, porém haveria variabilidade das amostras
iniciais, dificultando experimentos comparativos.
Alguns autores relatam em seus estudos a dificuldade de fracionar proteínas através de
sistemas de membranas.
Segundo LEITE et al., 2006 a eficiência da separação de proteínas
por sistemas de membranas é limitada pela polarização por concentração. No fracionamento
de proteínas, a permeabilidade de uma proteína aumenta com a sua concentração à superfície
da membrana. A proteína menos permeável é rejeitada e forma-se uma camada limite de
transferência de massa. A permeabilidade da proteína menos permeável aumenta com a sua
concentração e a seletividade da membrana diminui. De acordo com F
OX & MCSWEENEY
(1998) duas principais razões ainda impedem o uso de técnicas de ultrafiltração para obtenção
RESULTADOS E DISCUSSÃO 111
de frações puras de proteínas do soro: valores próximos dos tamanhos de proteínas do soro e,
distribuição larga dos tamanhos dos poros das membranas.
Segundo S
MITH (2003), vários processos foram desenvolvidos para se obter frações
das proteínas α-La e β-Lg. Em alguns casos ocorre a purificação de somente uma das frações.
Para a produção de duas fases purificadas podem ser distintas duas categorias de processo de
produção: uma que usa transição de fase (precipitação de α-La e β-Lg), e outra sem transição
de fase.
Um processo de separação das proteínas sem transição de fase tem a vantagem de
reduzir a probabilidade de desnaturação das proteínas. O uso de membranas para este
processo foi estudada extensivamente por T
IMMER & VAN DER HORST (1998) apud SMITH
(2003). Os autores concluíram que a filtração com membranas não resulta em um produto
com alto grau de pureza. Isto ocorre devido a diferenças relativamente pequenas das massas
molares das proteínas e dos seus pI. Então, a diferença por exclusão de tamanho e/ou por
exclusão de Donnan para estes componentes é muito pequena para obter eficiência de
separação suficiente e produção de frações com alto grau de pureza das duas frações, α-La e
β-Lg, simultaneamente. Segundo estes autores, membranas de filtração podem ser usadas
como parte do processo de separação em combinação com um processo de precipitação, por
exemplo, para se obter frações de proteína com elevado teor de pureza.
Alguns estudos demonstram a viabilidade de utilizar membranas para separações de
proteínas, os dados são obtidos com sistemas que consistem em uma mistura artificial de duas
proteínas previamente purificadas. C
HEANG E ZYDNEY (2003) apud BHATTACHARJEE et al.
(2006), por exemplo, obtiveram uma recuperação de 90 % da β-Lg de uma mistura binária
com α-La. Estudos experimentais com misturas multi-componentes complexos na
alimentação mostram-se muito mais limitados, e o desempenho total destes sistemas é muito
menos impressionante. Por exemplo, com o objetivo de purificar α-La do soro ácido de
caseína, M
ULLER et al. (1999) utilizaram processo de UF combinando os modos de operação
concentração batelada e DF, e como resultado, obtiveram uma pureza de somente 50 % de α-
La no permeado final. B
OTTOMLEY (1991) apud CHEANG & ZYDNEY (2004), descreveu um
processo de membrana em dois estágios para a purificação de α-La do soro do queijo
Cheddar, mas o produto final continha apenas 25 % de β-Lg. Segundo Z
YDNEY (1998), o
fracionamento protéico pode ocorrer utilizando membranas carregadas, assim como, associar
separação com membranas com outras metodologias como cromatografia e precipitação
seletiva.
4.3 Limpeza das membranas
Após cada um dos experimentos 1, 2, 3 e 4 de concentração e purificação das
proteínas, o equipamento foi higienizado de acordo com o item 3.6.4. O procedimento foi
realizado em três etapas de limpeza química e após cada uma dessas etapas a membrana foi
submetida ao enxágüe com água destilada. O objetivo foi restituir o fluxo de água inicial, e
observar o comportamento do fluxo ao final de cada etapa da limpeza química.
112 RESULTADOS E DISCUSSÃO
A Figura 4.33 apresenta a média aritmética das medidas do fluxo permeado de água
após os experimentos 1, 2, 3 e 4 ao final de cada etapa do tratamento químico em que a
membrana UF-6001 foi submetida. Essas medidas de fluxo foram realizadas na pressão
transmembrana média de 2 bar e na temperatura de 50
°C.
0
20
40
60
80
100
120
UF-6001
Jp (L.m
-2
h
-1
)
Inicial Após enxágüe com água
Após limpeza alcalina Após limpeza cloro-alcalina
Após limpeza ácida
Figura 4.33: Fluxos de água após realização dos experimentos e em cada etapa da limpeza química para a UF-
6001, ΔP = 2 bar e T = 50 °C, vazão de alimentação 840 L.h
-1
Através da Figura 4.33 pode-se observar que após o enxágüe com água para remoção
do restante de soro do sistema o fluxo ficou bastante baixo (21,3 L.m
-2
.h
-1
) cerca de 20 % do
fluxo inicial de água, mas com as etapas de limpeza alcalina e cloro-alcalina ocorreu uma
recuperação expressiva (38 e 72 %) no fluxo de água. Após a limpeza ácida, o fluxo de água
inicial foi quase completamente restituído, que nestas condições de operação era de 102,7
L.m
-2
.h
-1
. Somente a limpeza alcalina e cloro-alcalina não foram suficientes para restituir o
fluxo permeado, o fluxo foi restituído em 96 % após a limpeza ácida. Os valores obtidos
foram utilizados como referência para cada início de um novo experimento de concentração
do soro.
Após cada experimento de fracionamento das proteínas, em cada uma das membranas
testadas realizou-se o procedimento de limpeza. O procedimento foi realizado em três etapas
de limpeza química para a MF-7002 e em duas etapas de limpeza para as UF-C50 e UF-C20,
segundo indicações do fabricante, e após cada uma dessas etapas a membrana foi submetida
ao enxágüe com água destilada.
RESULTADOS E DISCUSSÃO 113
A Figura 4.34 apresenta as medidas do fluxo permeado de água para a MF-7002 após
o final de cada etapa do tratamento químico. Essas medidas de fluxo foram realizadas na ΔP
de 1,75 bar e na temperatura de 40
°C.
0
50
100
150
200
250
300
MF-7002
Jp (L.m
-2
h
-1
)
Inicial Após enxágüe com água
Após limpeza alcalina Após limpeza cloro-alcalina
Após limpeza ácida
Figura 4.34: Fluxos de água após realização dos experimentos e em cada etapa da limpeza química para a MF-
7002, ΔP = 1,75 bar e T = 40 °C, vazão de alimentação 700 L.h
-1
Na Figura 4.34 pode-se observar que o fluxo permeado de água após o enxágüe, foi de
70,3 L.m
-2
.h
-1
cerca de 26 % do fluxo inicial. Após as etapas de limpeza alcalina e cloro-
alcalina ocorreu uma recuperação de 37 e 71 % no fluxo de água. Após a limpeza ácida, o
fluxo de água inicial foi restituído em 96 %.
A Figura 4.35 apresenta as medidas do fluxo permeado de água para a UF-C20 e a
Figura 4.36 para a membrana UF-C50, após o final de cada etapa do tratamento químico.
Essas medidas de fluxo foram realizadas na pressão transmembrana de 2,25 bar e na
temperatura de 25
°C.
114 RESULTADOS E DISCUSSÃO
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
UF-C50
Jp (L.m
-2
h
-1
)
Inicia
l
Após enxágüe com água
Após limpeza alcalina Após limpeza ácida
Figura 4.35: Fluxos de água após realização dos experimentos e em cada etapa da limpeza química para a UF-
C20, ΔP = 2,25 bar e T = 25 °C, vazão de alimentação 620 L.h
-1
.
0
100
200
300
400
500
UF-C20
Jp (L.m
-2
h
-1
)
Inicia
l
Após enxágüe com água
Após limpeza alcalina Após limpeza ácida
Figura 4.36: Fluxos de água após realização dos experimentos e em cada etapa da limpeza química para a UF-
C50, ΔP = 2,25 bar e T = 25 °C, vazão de alimentação 400 L.h
-1
.
Para a membrana UF-C20, na Figura 4.35, observa-se que o fluxo após o enxágüe com
água, foi de 56 L.m
-2
.h
-1
, cerca de 12 % do fluxo de água inicial. Após a limpeza alcalina
houve uma recuperação de 48 % do fluxo e ao final da limpeza ácida o fluxo foi
completamente restituído. Já, para a membrana UF-C50, na Figura 4.36 pode-se observar que
o fluxo permeado de água após o enxágüe, foi de 40,4 L.m
-2
.h
-1
, o que corresponde a 3,5 % do
fluxo inicial. Após as etapas de limpeza alcalina ocorreu uma recuperação de 76 % no fluxo
de água. Após a limpeza ácida, o fluxo de água inicial foi restituído em 100 %.
Capítulo 5
Conclusões e Sugestões para trabalhos
futuros
Com base nos resultados obtidos no desenvolvimento deste trabalho, pôde-se formular
as conclusões listadas a seguir.
Concentração e Purificação Protéica
O fluxo de água aumenta linearmente com o aumento da pressão transmembrana para
todas as membranas testadas, isto é, quanto maior a pressão transmembrana, maior o fluxo
permeado. Para as mesmas condições operacionais, ocorre uma diferença significativa nos
fluxos permeados do soro e da água; para todas as membranas testadas o fluxo de água foi
maior que o fluxo permeado de soro.
O fluxo permeado de soro diminui com o tempo de operação devido à formação da
camada de polarização por concentração e fouling, e ainda, devido ao aumento da
concentração da solução e conseqüentemente às mudanças nas propriedades de transporte,
difusividades mássica e de transferência de quantidade de movimento e nas propriedades
da solução, tais como massa específica e viscosidade dinâmica.
Nas DF o fluxo permeado fica abaixo do fluxo inicial da UF, devido ao fouling já formado
na etapa de concentração das proteínas e, também, devido ao baixo fator de diluição.
Quanto maior o FC na etapa de concentração melhores resultados de purificação protéica
são obtidos. Para o Experimento 2 com FC igual a 5 após as cinco DFs atingiu-se 62 %
em massa de proteína (base seca), enquanto que para o Experimento 4 com FC igual a 6
após as quatro DFs o percentual mássico de proteína em base seca foi de 70 %. É
importante ressaltar que o fluxo permeado, no Experimento 4 não diminuiu com o
aumento do FC de 5 para 6.
Na etapa de DF, a quantidade de lactose e sais no concentrado diminui significativamente.
O percentual de lactose no concentrado, em base seca, para o Experimento 2 ao final das
DFs atingiu 35 %, enquanto, para o Experimento 4 atingiu 29 %. Para todos os quatro
116 CONCLUSÕES E SUGESTÕES PARA TRABALHOS FUTUROS
experimentos de concentração, o processo mostra-se eficiente na remoção de sais, pois, ao
final da UF o percentual se aproxima de zero, ou seja, boa parte do sal havia sido
removida do concentrado.
No Experimento 4 o concentrado da UF, antes da DF, foi de 5 L, e esta diminuição de
volume implicou em uma maior concentração protéica final e em um menor volume de
água para a etapa de DF. Para o Experimento 2 utilizou-se 21 L de água para a etapa de
DF e obteve-se um concentrado protéico com 62 % em base seca; enquanto que para o
Experimento 4 foram utilizados 15 L de água para a DF e o percentual protéico foi de 70
% em base seca.
A diafiltração é mais eficiente quando realizada com pequenos volumes e em um número
maior de vezes; verificou-se que as DFs com volumes menores são bastante efetivas na
remoção de sais e lactose, para o Experimento 4, por exemplo, houve uma grande redução
da concentração dos outros elementos, em relação à quantidade de proteína, nas últimas
duas DFs de 2,5 L.
Os resultados obtidos no Experimento 4 de concentração protéica são melhores do que os
obtidos para os experimentos 1, 2 e 3, e, portanto, as condições de trabalho do
Experimento 4 foram escolhidas como sendo a melhor estratégia a ser utilizada para se
obter uma maior purificação protéica.
Há um aumento de ST na corrente de concentrado durante a UF devido principalmente ao
aumento de concentração de proteína; no permeado a concentração de ST é
aproximadamente constante até o final da etapa de concentração.
O retido possui concentrações mais elevadas de ST tanto na etapa de concentração quanto
na etapa de DF; durante as DF ocorreu a redução de ST para ambas as correntes, no
concentrado devido à remoção de lactose e sais, no permeado devido à diluição.
A concentração de proteínas no retido aumenta ao longo da etapa de concentração;
durante as DFs não sofre grande variação, no entanto o teor de contaminantes, sais e
lactose, diminui significativamente nas DFs, o que resulta na purificação do concentrado
protéico.
O aumento da concentração de proteína exerce um efeito maior sobre o fluxo do que a
remoção de lactose e sais. A concentração de lactose possui comportamento similar ao de
ST e apresenta baixa retenção; ao final das DFs a concentração de lactose no permeado
fica próxima a concentração de sólidos totais, ou seja, todo sal foi removido, e todos os
sólidos que estão sendo retirados no permeado correspondem à lactose.
O pH das amostras de concentrado e permeado permanece constante, ou seja, a solução
não é degradada durante o tempo de duração do experimento.
CONCLUSÕES E SUGESTÕES PARA TRABALHOS FUTUROS 117
A condutividade elétrica permanece praticamente a mesma para o permeado e o
concentrado durante toda a etapa de UF, durante a etapa de DF a condutividade elétrica do
concentrado e do permeado foi decaindo após a adição da água destilada em cada DF.
A retenção das proteínas é total, a retenção de sólidos totais aumenta com tempo de
experimento, e este aumento é mais expressivo depois do início das DFs; a membrana
apresenta uma retenção parcial a lactose o que ocasiona uma maior dificuldade na
purificação das proteínas.
Fracionamento das Proteínas Majoritárias
O fluxo de concentrado protéico é menor que o fluxo de água pura para todas as todas as
membranas nas condições de operação empregadas, devido aos efeitos de polarização por
concentração e fouling.
Os fluxos permeados de concentrado protéico foram semelhantes para as membranas
RZ04 e VCWP, sendo ligeiramente maior para a RZ04, em pressões mais elevadas; a
membrana HN06 apresentou os menores fluxos permeados.
O fluxo permeado do concentrado protéico foi semelhante para as membranas de MF e
para a RZ04; à medida que a pressão transmembrana aumentou o fluxo permeado da
RZ04 foi maior, mostrando que além da geometria do módulo, do tamanho de poro
nominal e da MMC, o material da membrana, a distribuição dos tamanhos de poros, a
porosidade, a espessura e a morfologia da membrana exercem uma grande influência
sobre o fluxo permeado.
A retenção de lactose para a membrana HN06 fica em torno de 13 %; a RZ04 apresenta
uma retenção de aproximadamente 6 % para a lactose, enquanto a VCWP apresenta
retenção de 50 %; este resultado pode indicar que interações membrana-solução possam
estar ocorrendo.
A membrana VCWP reteve 78 % das proteínas, enquanto a HN06 e a RZ04 mostraram
alta retenção protéica, 98 % e 94 %, respectivamente. Como as membranas mencionadas
possuem MMC maiores que as proteínas, pode ter ocorrido fouling (bloqueio de poros,
adsorção) e interações entre os diferentes solutos presentes na solução, isto é, uma
agregação das diferentes moléculas de proteína entre si ou com a lactose, o que impediu a
sua passagem para a corrente permeada.
Para a membrana HN06 não ocorreu separação efetiva da β-Lg e da α-La, as duas
proteínas permearam pela membrana.
No permeado da RZ04 não foi detectada nenhuma das proteínas de interesse, este
resultado pode indicar que nos experimentos com a RZ04 todas as moléculas de proteína
interagiram com a membrana ou entre si, pois nenhuma das três foi detectada no
permeado.
118 CONCLUSÕES E SUGESTÕES PARA TRABALHOS FUTUROS
A membrana VCWP mostrou-se permeável às duas proteínas, a β-Lg e a α-La, mostraram
concentrações semelhantes na amostra de permeado, e como a β-Lg é duas vezes mais
abundante que a α-La no concentrado pode haver uma retenção menor da molécula de α-
La pela membrana.
O fluxo de água da MF-7002 é comparável ao da VCWP, apesar das duas membranas
possuirem diferenças na geometria do módulo, no material e na estrutura.
Há retenção parcial de lactose para a membrana MF-7002, tanto nas amostras da MF,
quanto da DF, variando de 80 % na MF até 30 % ao final da DF4; quanto à proteína na
MF há retenção de 65 %, nas DFs a retenção diminui gradativamente atingindo ao final
destas etapas 55 %.
No permeado recolhido da MF-7002 na etapa de concentração, encontrou-se mais de 50 %
de α-La, apesar desta estar presente em menor concentração no retido apresentou
passagem preferencial para o permeado, ou seja, a mudança de pH beneficiou a agregação
da β-Lg mesmo que esta agregação tenha sido parcial, pois esta proteína também foi
encontrada no permeado.
No permeado das DFs da MF-7002 a β-Lg está em maior quantidade no permeado do que
a α-La, ou seja, a membrana não retém nenhuma das duas proteínas, este fato pode ter
ocorrido devido ao efeito de diluição.
O fluxo permeado de água para a UF-C50 tem valor superior ao fluxo de todas outras
membranas testadas, provavelmente esta membrana possui uma porosidade elevada.
Para a membrana UF-C50, os experimentos com a solução de concentrado protéico em pH
4,6 (40 °C) apresentam fluxos no mínimo duas vezes maior que aqueles obtidos em pH
6,3 (25° C). Acredita-se que o efeito combinado de pH e temperatura deve ocasionar
diferentes interações entre os componentes do soro e entre os componentes do soro e a
membrana, além de influenciar também nas propriedades físicas (viscosidade dinâmica,
massa específica) e nas características reológicas da solução (propriedades de transporte
como a viscosidade cinemática e a difusividade mássica). Para a solução com pH ácido os
fenômenos de fouling e concentração por polarização foram mais acentuados, quando
comparados ao pH 6,3, provocando o decaimento de fluxo permeado maior. Para a
membrana UF-C50 a retenção de lactose no pH 6,3 é de 60 %; e no pH 4,6 é praticamente
nula.
Quanto as proteínas, na UF-C50, para ambos pHs, a retenção foi quase de 100 %,
indicando que não ocorreu fracionamento das proteínas.
Para a membrana UF-C20 o comportamento do fluxo de soro e de concentrado protéico é
o mesmo, porém o fluxo de soro é maior que o de concentrado protéico em todas as
pressões transmembrana testadas devido a diferenças de propriedades, como viscosidade
dinâmica e massa específica existentes entre estas duas soluções.
CONCLUSÕES E SUGESTÕES PARA TRABALHOS FUTUROS 119
A membrana UF-C20 não é seletiva para a lactose, e reteve toda a proteína, mostrando-se
ineficiente para o fracionamento.
Os resultados da cromatografia gel revelaram que, tanto no pH 7,0 quanto no pH 4,6 as
moléculas de β-Lg podem estar se apresentando parte em dímeros e parte em monômeros,
ou seja, parte destas moléculas pode estar desnaturada, fato que pode ter ocorrido devido
aos tratamentos térmicos empregados durante o processamento do soro, como
concentração por evaporação e secagem por spray drier.
Alguma agregação das proteínas de β-Lg deve ocorrer no pH 4,6, porque as membranas
MF-7002 e VCWP apresentaram retenção parcial a esta molécula; os octômeros tem uma
conformação menos estável que os dímeros, e devem perder facilmente esta configuração.
Limpeza
Os fluxos permeados de todas as membranas que sofreram limpeza química foram
recuperados após os procedimentos de limpeza.
Sugestões para trabalhos futuros
Testes com o soro in natura, para verificar se ocorrem diferenças nas propriedades do soro
seco que interfiram no fracionamento das proteínas.
Fracionamento das principais proteínas do soro através de técnicas de separação com
membranas, como: MF, UF, NF e ED - gerar produtos com alto teor protéico que possam
ser utilizados para fortificar produtos alimentícios;
Combinação de pH, força iônica e temperatura para maximizar diferenças do volume
hidrodinâmico do produto (proteína de interesse) e impurezas;
Recuperação da lactose do permeado da UF - gerar produto com elevada concentração e
pureza de lactose, para ser usada em indústrias de alimentos, biotecnológica e
farmacêutica;
Recuperação de sais e da água do soro do permeado do soro livre de lactose e proteínas;
Utilizar os processos de separação com membranas associados entre si ou com outras
técnicas de separação para aproveitar todos os componentes do soro.
Comparação das técnicas com membranas com outras tecnologias de separação
tradicionais.
Estudo da viabilidade econômica para construção de uma planta industrial;
120 CONCLUSÕES E SUGESTÕES PARA TRABALHOS FUTUROS
Modelagem e otimização do processo de concentração, purificação e fracionamento dos
componentes do soro.
Testes de diferentes técnicas de limpeza, com diferentes concentrações de reagentes e
utilização de ultrassom.
Avaliação de técnicas para minimizar fouling e polarização por concentração: aplicação de
ultra-som, emprego de membranas carregadas positiva ou negativamente.
Capítulo 6
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Apêndice A
A.1 Métodos Analíticos
Neste anexo estão descritos os métodos analíticos utilizados para a realização das
análises das amostras do concentrado e do permeado dos processos da UF, DF e
fracionamento do soro de leite.
A.1.1 Análise de Extrato Seco Total - método gravimétrico
Materiais:
• cápsula de fundo chato de porcelana;
•
areia tratada;
•
dessecador com sílica gel ou cloreto de cálcio;
•
pipeta volumétrica de 10 mL;
•
banho-maria;
•
estufa a 85 °C;
•
balança analítica.
Procedimento
1. Cobrir as cápsulas de fundo chato com 10 g de areia tratada;
2.
Levar a estufa a 105
o
C por 1 hora;
3.
Esfriar em dessecador por 45 minutos e pesar;
4.
Pipetar volumetricamente 10 mL de amostra distribuindo a solução em toda a
superfície da areia;
5. Levar ao banho-maria por 30 minutos;
6.
Secar em estufa a 85
o
C por 2 horas;
7.
Esfriar em dessecador e pesar;
8.
Repetir os procedimentos 6 e 7 até peso constante ou mínimo.
Obs.: Quando a quantidade de sólidos totais é muito pequena aconselha-se tomar 20
mL de amostra.
132 A.1 MÉTODOS ANALÍTICOS
Cálculo do extrato seco total:
V
m
ST
Δ
=
(A1.1)
onde: ST = sólidos totais (g.L
-1
); Δm = diferença de massa antes e após a secagem (g); V =
volume da amostra (L).
A.1.2 Análise de Lactose - Método do ácido dinitrossalicílico - DNS
Materiais:
• estufa a 85 °C;
•
reagente DNS;
•
tubos de ensaio;
•
lactose (padrão).
Método
1. Preparar uma solução de DNS:
a.
0,25 gramas de Ácido 3,5-dinitrosalicílico
b.
75,0 gramas de Tartarato de sódio e potássio dissolvidos em 50 mL de NaOH 2
M.
c. 250 mL de água.
2.
Adicionar 200 μL de padrão, amostra ou controle a 2 mL de solução DNS.
3.
Aquecer a mistura em banho-maria a 100
o
C por 10 min.
4.
Esperar esfriar e ler a absorbância à temperatura ambiente e a 570 nm.
5.
Aplicar o valor da leitura na respectiva equação da curva-padrão previamente
elaborada para o aparelho.
Obs: Sensibilidade do método de 0,3 a 30 mM de lactose.
Metodologia para obtenção da curva-padrão para açúcares redutores
1.
Preparar uma solução de lactose 5 g.L
-1
.
2.
Diluir para concentrações desejadas (Ex: 0,5; 1,0; 2,0; 3,0; 4,0 e 5,0 g.L
-1
).
3.
Colocar em tubo de ensaio: 200 μL da solução contendo o açúcar + 2 mL do reagente
DNS.
4. Preparar uma solução sem lactose, contendo H
2
O e DNS para zerar o aparelho.
5.
Deixar em banho-maria a 100
o
C por 10 minutos.
6.
Esperar esfriar até atingir a temperatura ambiente.
7.
Ler a absorbância em espectrofotômetro a 570 nm.
Obs: A curva-padrão somente se aplica para leituras no aparelho em que foi
estabelecida.
A.1 MÉTODOS ANALÍTICOS 133
A.1.3 Análise de açúcar - Método fenol sulfúrico
Materiais:
• ácido sulfúrico 95,5;
•
fenol 80 % em peso;
•
micropipetas;
•
tubos de ensaio;
•
vórtex.
Método analítico
1. Diluir amostras (normalmente entre 100 e 500 x)
2.
Preparar amostras de açúcar (lactose, glicose, dextrose) com concentrações entre 10 e 70
mg.L
-1
3.
Em tubos de ensaio adicionar 50 µL de amostra e 450 µL de água destilada.
4.
Preparar um tubo com 500 µL de água destilada (branco).
5.
Adicionar 500 µL de fenol 5 %.
6.
Adicionar 2,5 mL de ácido sulfúrico. Deixar escorrer lentamente pela parede do tubo.
7.
Agitar o tubo e esperar esfriar por aproximadamente 30 minutos.
8.
Medir a absorbância a 490 nm em cubeta de quartzo, mantendo cuidado na manipulação
das amostras devido ao alto teor ácido.
Pontos críticos: diluição, homogeneização, não deve-se expor todo conteúdo do ácido
à umidade ambiente devido a característica higroscópica do ácido.
A.1.4 Determinação da proteína total - Método de Lowry
Reagentes:
• reagente A: dissolver 0,5 g de sulfato de cobre (CuSO
4
.5H
2
O) e 1,0 g de citrato de sódio
em 100 mL de água destilada; (esta é uma solução estável e pode ser preparada com
antecedência);
•
reagente B: dissolver 20,0 g de carbonato de sódio (Na
2
CO
3
) e 4,0 g de hidróxido de sódio
(NaOH) em 1,0 L de água destilada; (esta solução não é estável e deve ser preparada na
hora da análise);
•
reagente C: misturar 1 mL do reagente A e 50 mL do reagente B;
•
reagente D: Reagente Folin-Ciocalteus 2 N e água destilada preparados na proporção 1:1;
(solução estável);
•
solução padrão de BSA (0,5 mg.mL
-1
).
Procedimentos
1. Para determinar a concentração de proteínas da amostra, construir uma curva padrão
de calibração com cinco concentrações diferentes de proteína, BSA – 0; 0,1; 0,2; 0,3;
0,4; 0,5 mg.mL
-1
.
134 A.1 MÉTODOS ANALÍTICOS
2.
Adicionar 2,5mL do reagente C a um tubo de ensaio contendo 500 mL de amostra
diluída apropriadamente (contendo até 0,5mg.mL
-1
) de proteínas e misturar bem. A
amostra deve ser diluída de forma que sua concentração fique dentro da amplitude da
curva de calibração. Normalmente, diluições de 40 vezes são suficientes (50 mL de
amostra + 1950 mL de água destilada);
3.
Incubar a temperatura ambiente por 5-10 minutos;
4.
Adicionar a seguir 250mL do reagente D, misturar bem e incubar novamente por 30
minutos;
5. Ler a absorbância à 750 nm.
6.
A concentração das amostras é determinada pela interpolação dos valores de
absorbância na curva padrão.
Obs.: A curva de calibração deve ser feita todas as vezes em que a metodologia for
utilizada, já que alguns reagentes não são estáveis e devem ser preparados no momento da
análise.
A.1.5 Análise de proteína - Eletroforese SDS – PAGE (Sodium
Dodecyl Sulfate – Polyacrylamide Gel Electrophoresis of Proteins)
Materiais:
• “resolving gel” 10 % (Gel fracionador, de separação, resolução ou corrida);
•
“stacking gel” 5 % (Gel de entrada, concentrador ou empilhamento);
•
tampão para aplicação da amostra (Tris-HCl pH 6,8, contendo SDS, glicerol, corante
Comassie Blue e β-mercaptoetanol);
•
tampão de corrida (Tris-Glicina-SDS pH 8,3);
•
solução corante Comassie Blue R250;
•
solução descorante (Metanol 20%; Ácido acético glacial 30% e 50% água deionizada).
Procedimentos
As amostras devem ser diluídas até que se encontrem na concentração ideal para fazer
a aplicação no gel, ou seja, se for aplicado 10 µL de amostra deve-se ter uma concentração de
5 µg.µL
-1
, o que vai resultar em 50 µg de proteína por banda eletroforética.
Deve-se adicionar a cada eppendorf 5 µL de tampão para aplicação da amostra. As
amostras devem ser aquecidas a 90 °C por 5 minutos e centrifugadas a 10.000 rpm por 5
minutos.
Os géis stacking e resolving devem ser preparados conforme mostra a
Tabela A.1. O
sistema de eletroforese deve ser montado como mostra a Figura A.1, e as amostras devem ser
aplicadas.
A eletroforese deve ser iniciada aplicando uma voltagem de 80 V até a frente de
corrida atingir o gel de migração, então se deve aumentar a voltagem para 120 V. Quando a
migração das amostras atinge o fim do gel de resolução, deve-se desligar a fonte e retirar o gel
da câmara, despejar a solução de eletroforese e remover o gel, que deve ser corado.
A.1 MÉTODOS ANALÍTICOS 135
Para corar o gel deve-se utilizar uma mistura de Comassie Blue com metanol, ácido
acético e água, o gel deve permanecer durante aproximadamente 12 horas nesta solução. Após
este período, deve-se descorar o gel com a solução descorante, até que o gel apresente as
bandas protéicas bem definidas, enquanto o restante do gel deve ficar o mais transparente
possível.
A Tabela A.1 mostra a quantidade de cada componente utilizado para preparação dos
géis de eletroforese. A Figura A.1 mostra o esquema de montagem da unidade de eletroforese.
Tabela A.1: Componentes das Soluções para preparação dos géis de eletroforese
Componentes da Solução *
Resolving gel - 15%
(mL)
Stacking gel - 5%
(mL)
Solução Acrilamida/Bis-Acrilamida (30 %) 5,00 1,30
Solução Tampão Tris HCl 0,5 M, pH 6,8 - 2,00
Solução tampão Tris HCl 1,5 M, pH 8,8 2,50 -
SDS 10 % 0,10 0,08
Água Deionizada 2,30 4,50
TEMED 0,004 0,008
Persulfato de amônio - APS 10 % 0,10 0,08
Volume total (mL) 10,00 8,00
* Quantidades suficientes para 2 géis.
Figura A.1: Esquema da preparação do sistema de eletroforese.
A.1.6 Análise de Proteína – Cromatografia Gel
Materiais:
• coluna Superose
TM
12;
•
tampão fosfato pH 7.0;
•
tampão acetato pH 4,6;
•
proteínas com massa molar conhecida (Ferritina – 440 kDa, Aldolase – 158 kDa,
Conalbumina – 75 kDa, Ovalbumina - 43 kDa, Anidrase Carbônica – 29 kDa);
136 A.1 MÉTODOS ANALÍTICOS
•
solução de soro com concentração protéica de 9 µg.µL
-1
.
Procedimentos
A etapa de gel filtração foi realizada em coluna de 10 x 300 mm (General Eletric
Company) empacotada com a resina Superose
TM
12 (General Eletric Company) e equilibrada
com tampão acetato de sódio 10 mM pH 3,5 (8,203 g de acetato de sódio anidro, 100 mL de
ácido acético e água destilada) e o pH foi acertado para 4,6 com NaOH. Para o pH 7,0 a
coluna foi equilibrada tampão fosfato de sódio 10 mM (0,38 g de fosfato monobásico, 0,51 g
de fosfato dibásico e água destilada) o pH foi acertado para 7,0 com NaOH.
A coluna é equilibrada com solução tampão, primeiro a uma vazão de 60 mL.min
-1
durante 1h e, depois de ajustado o leito, a uma vazão de 20 mL.min
-1
até completa
estabilização (12h). A coluna é calibrada com blue dextran de 2 kDa. Em seguida, realiza-se o
perfil de eluição da coluna com as proteínas de massa molar conhecida. São aplicados 200 µL
da amostra de soro e após a entrada da amostra, a eluição das proteínas é feita com tampão
fosfato ou acetato com uma vazão de 0,5 mL.min
-1
. As leituras da absorbância em 280 nm são
realizadas para a avaliação do perfil de eluição das proteínas.
Apêndice B
Dados Experimentais
Neste apêndice estão documentadas as tabelas de dados dos experimentos realizados
ao longo deste trabalho, assim como, as duplicatas de todos os experimentos.
B.1 Concentração e Purificação de Proteínas - tabelas
Tabela B.1: Dados de fluxo médio de água e retenção média de dextrana em função da ΔP, para
as membranas UF-6001, UF-6002 e UF-7001, a 30 °C.
UF-6001 UF-6002 UF-7001
ΔP(bar) J
p
(L.m
-2
.h
-1
) Retenção (%) J
p
(L.m
-2
.h
-1
) Retenção (%) J
p
(L.m
-2
.h
-
1
)
Retenção (%)
1 59,83 99,98 230,23 0,99 243,64 26,74
2 102,68 100,05 350,89 0,40 387,79 21,38
3 156,43 100,35 452,03 0,59 506,08 20,58
4 208,38 100,50 601,39 0,68 700,08 23,45
Tabela B.2: Dados de fluxo médio de soro em função da ΔP, para a membrana UF-6001, a 50 °C
e vazão de alimentação de 840 L.h
-1
.
ΔP(bar) J
p
(L.m
-2
.h
-1
)
3,75 45,71
3,25 39,35
2,70 33,90
2,15 26,88
1,75 22,97
1,25 18,89
0,75 11,25
138 DADOS EXPERIMENTAIS
Tabela B.3: Resumo dos dados médios de concentração, massa e percentual (*base seca) de proteína, lactose e sais para o concentrado dos
Experimentos 1, 2, 3,e 4 em função da etapa do processo utilizando a membrana UF-6001, T= 50 °C, ΔP= 2 bar e vazão de alimentação média de 840
L.h
-1
.
Etapa ST Proteína Lactose Sais
Concentração
(g.L
-1
)
Massa
(g)
Concentração
(g.L
-1
)
Massa
(g)
%*
Concentração
(g.L
-1
)
Massa
(g)
%*
Concentração
(g.L
-1
)
Massa
(g)
%*
Experimento1
UF i 58,6 1758,0 9,3 279,0 15,9 42,3 1269,0 72,2 7,0 210,0 11,9
UF f 82,8 496,8 29,0 174,0 35,0 53,6 321,6 64,7 0,1 0,6 0,1
DF1 76,3 457,8 30,6 183,6 40,1 45,6 273,6 59,8 0,1 0,6 0,1
DF2 70,8 424,8 30,5 183,0 43,1 40,3 241,8 56,9 0,0 0,0 0,0
Experimento 2
UF i 59,3 1779,0 9,1 273,0 15,3 43,2 1296,0 72,8 7,2 216,0 12,1
UF f 81,3 487,8 28,9 173,4 35,5 52,3 313,8 64,3 0,1 0,6 0,1
DF1 80,5 483,0 29,9 179,4 37,1 50,6 303,6 62,9 0,0 0,0 0,0
DF2 72,9 437,4 29,3 175,8 40,2 42,6 255,6 58,4 0,0 0,0 0,0
DF3 66,3 397,8 30,6 183,6 46,2 35,7 214,2 53,8 0,0 0,0 0,0
DF4 58,8 352,8 30,8 184,8 52,4 28,0 168,0 47,6 0,0 0,0 0,0
DF5 47,8 286,8 30,8 184,8 64,4 17,0 102,0 35,6 0,0 0,0 0,0
Experimento 3
UF i 60,3 1809,0 9,2 276,0 15,3 44,1 1323,0 73,1 7,3 219,0 12,1
UF f 86,3 431,5 36,7 183,5 42,5 49,6 248,0 57,5 0,0 0,0 0,0
DF1 69,4 347,0 36,8 184,0 53,0 32,6 163,0 47,0 0,0 0,0 0,0
DF2 62,4 312,0 36,8 184,0 59,0 25,6 128,0 41,0 0,0 0,0 0,0
Experimento 4
UF i 58,1 1743,0 9,3 279,0 16,0 41,8 1254,0 71,9 7,2 216,0 12,4
UF f 85,9 429,5 36,8 184,0 42,8 49,1 245,5 57,2 0,0 0,0 0,0
DF1 71,5 357,5 36,5 182,5 51,0 35,0 175,0 49,0 0,0 0,0 0,0
DF2 64,7 323,5 36,8 184,0 56,9 27,9 139,5 43,1 0,0 0,0 0,0
DF3 59,5 297,5 36,6 183,0 61,5 22,9 114,5 38,5 0,0 0,0 0,0
DF4 52,5 262,5 36,9 184,5 70,3 15,6 78,0 29,7 0,0 0,0 0,0
DADOS EXPERIMENTAIS 139
Tabela B.4: Resumo dos dados médios de concentração, massa e percentual (*base seca) de proteína, lactose e sais para o concentrado dos
Experimentos 2’ e 4’ em função da etapa do processo utilizando a membrana UF-6001, T= 50 °C, ΔP= 2 bar e vazão de alimentação média de 840
L.h
-1
(duplicatas dos experimentos 2 e 4).
Etapa ST Proteína Lactose
Sais
Concentração
(g.L
-1
)
Massa
(g)
Concentração
(g.L
-1
)
Massa
(g)
%*
Concentração
(g.L
-1
)
Massa
(g)
%
Concentração
(g.L
-1
)
Massa
(g)
%*
Experimento 2'
UF i 58,3 1749,0 9,1 273,0 15,6 43,2 1296,0 74,1 7,0 210,0 12,0
UF f 97,3 583,8 29,6 177,6 34,4 48,6 291,6 56,4 0,1 0,6 0,1
DF1 86,1 516,6 29,9 179,4 39,3 44,1 264,6 58,0 0,0 0,0 0,0
DF2 76,0 456,0 30,0 180,0 45,9 40,3 241,8 61,7 0,0 0,0 0,0
DF3 65,3 391,8 30,2 181,2 50,7 35,7 214,2 59,9 0,0 0,0 0,0
DF4 59,6 357,6 30,6 183,6 52,6 28,0 168,0 48,1 0,0 0,0 0,0
DF5 50,4 302,4 30,6 183,6 60,7 19,8 118,8 39,3 0,0 0,0 0,0
Experimento 4'
UF i 58,2 1746,0 9,2 276,0 15,8 42,0 1260,0 72,2 7,0 210,0 12,0
UF f 90,2 451,0 35,6 178,0 39,5 54,6 273,0 60,5 0,0 0,0 0,0
DF1 69,9 349,5 35,9 179,5 51,4 34,0 170,0 48,6 0,0 0,0 0,0
DF2 65,4 327,0 36,5 182,5 55,8 28,9 144,5 44,2 0,0 0,0 0,0
DF3 61,8 309,0 36,2 181,0 58,6 25,6 128,0 41,4 0,0 0,0 0,0
DF4 52,3 261,5 36,5 182,5 69,8 15,8 79,0 30,2 0,0 0,0 0,0
*base seca
140 DADOS EXPERIMENTAIS
Tabela B.5: Dados detalhados do Experimento 1, incluindo concentrações de sólidos totais, proteína, lactose, condutividade elétrica, pH para as
amostras de concentrado e permeado monitoradas conforme o tempo e etapa dos processos de concentração e purificação do soro utilizando a
membrana UF-6001, T= 50 °C, ΔP= 2 bar e vazão de alimentação média de 840 L.h
-1
.
Concentrado Permeado
Etapa
Tempo
(min)
Amostra
J
p
(L.m
-2
.h
-1
)
ST
(g.L
-1
)
Proteína
(g.L
-1
)
Lactose
(g.L
-1
)
Cond. Elétrica
(S.cm
-1
)
pH
ST
(g.L
-1
)
Proteína
(g.L
-1
)
Lactose
(g.L
-1
)
Condutividade
(S.cm
-1
)
pH
UF 0 1 38,5
58,6 9,3 42,3
6,78E-03 6,7 44,1 0,3 36,6 6,67E-03 6,8
UF 30 2 38,3
55,2 9,3 39,9
6,77E-03 6,7 45,3 0,3 35,7 6,69E-03 6,7
UF 60 3 33,2
57,8 11,5 41,3
6,81E-03 6,7 41,6 0,0 35,7 6,78E-03 6,7
UF 90 4 32,4
65,8 19,7 42,1
6,87E-03 6,7 47,5 0,0 40,7 6,75E-03 6,7
UF 120 5 29,0
69,5 23,8 42,7
6,88E-03 6,7 45,1 0,0 38,2 6,82E-03 6,8
UF 150 6 22,5
73,1 24,5 46,6
6,91E-03 6,7 43,5 0,0 38,2 6,98E-03 6,8
UF 180 7 18,0
76,5 26,8 48,7
6,92E-03 6,7 48,1 0,0 38,8 6,97E-03 6,8
UF 210 8 15,4
76,6 27,1 48,5
6,94E-03 6,7 42,7 0,0 39,7 7,01E-03 6,8
UF 240 9 16,2
79,7 27,8 51,4
6,95E-03 6,7 52,5 0,0 40,5 7,05E-03 6,8
UF 268 10 20,2
82,8 29 53,6
6,96E-03 6,8 52,7 0,0 40,7 7,14E-03 6,8
DF1 341 11 16,1
76,3 30,6 45,6
4,50E-03 6,9 27,9 0,0 25,9 4,50E-03 6,8
DF2 415 12 18,5
70,8 30,5 40,3
2,91E-03 6,9 15,6 0,0 14,8 2,69E-03 6,8
DADOS EXPERIMENTAIS 141
Tabela B.6: Dados detalhados do Experimento 2, incluindo concentrações de sólidos totais, proteína, lactose, condutividade elétrica, pH para as
amostras de concentrado e permeado monitoradas conforme o tempo e etapa dos processos de concentração e purificação do soro utilizando a
membrana UF-6001, T= 50 °C, ΔP= 2 bar e vazão de alimentação média de 840 L.h
-1
.
Concentrado Permeado
Etapa
Tempo
(min)
Amostra
J
p
(L.m
-2
.h
-1
)
ST
(g.L
-1
)
Proteína
(g.L
-1
)
Lactose
(g.L
-1
)
Cond. elétrica
(S.cm
-1
)
pH
ST
(g.L
-1
)
Proteína
(g.L
-1
)
Lactose
(g.L
-1
)
Cond. elétrica
(S.cm
-1
)
pH
UF 0 1 34,7
59,3 9,1 43,2
6,39E-03
6,3
36,6 1,2 33,3 5,78E-03
6,3
UF 10 2 32,8
54,8 10,3 38,5
6,36E-03
6,3
33,1 0,9 34,1 5,76E-03
6,3
UF 28 3 30,1
55,4 11,4 39
6,43E-03
6,3
39,8 0,5 37,0 5,60E-03
6,3
UF 43 4 28,6
59,6 16,8 38,8
6,40E-03
6,3
39,5 0,1 34,8 5,78E-03
6,3
UF 58 5 27,2
60,4 18,6 38,8
6,42E-03
6,3
36,0 0,0 35,6 5,78E-03
6,3
UF 73 6 26,2
63,4 21,5 39,9
6,35E-03
6,6
33,4 0,0 36,2 5,78E-03
6,6
UF 103 7 25,9
65,9 23,6 41,3
6,52E-03
6,3
38,9 0,0 36,6 5,78E-03
6,3
UF 133 8 25,3
69,3 25,8 42,5
6,54E-03
6,3
35,4 0,1 37,0 5,78E-03
6,3
UF 163 9 24,8
70,4 26,9 43
6,63E-03
6,3
37,1 0,0 38,7 6,01E-03
6,3
UF 193 10 23,9
74,5 27,6 46,7
6,60E-03
6,3
27,2 0,0 39,9 6,14E-03 6,3
UF 223 11 22,7
81,3 28,9 52,3
5,60E-03
6,3
27,9 0,0 39,8 6,04E-03 6,2
DF1 293 12 22,2
80,5 28,9 51,6
5,56E-03
6,3
25,2 0,0 27,0 4,52E-03 6,2
DF2 333 13 22,5
71,9 29,3 42,6
4,28E-03
6,3
21,0 0,0 20,0 3,20E-03 6,4
DF3 373 14 20,2
66,3 30,6 35,7
3,79E-03
6,6
16,0 0,0 17,3 3,15E-03 6,4
DF4 413 15 25,5
58,8 30,8 28
3,30E-03
6,6
14,4 0,0 16,3 2,31E-03 6,5
DF5 443 16 25,6
47,8 30,8 17
2,91E-03
6,7
13,1 0,0 11,1 1,90E-03 6,4
142 2. DADOS EXPERIMENTAIS
Tabela B.7: Dados detalhados do Experimento 3, incluindo concentrações de sólidos totais, proteína, lactose, condutividade elétrica, pH para as
amostras de concentrado e permeado monitoradas conforme o tempo e etapa dos processos de concentração e purificação do soro utilizando a
membrana UF-6001, T= 50 °C, ΔP= 2 bar e vazão de alimentação média de 840 L.h
-1
.
Concentrado Permeado
Etapa
Tempo
(min)
Amostra
J
p
(L.m
-2
.h
-1
)
ST
(g.L
-1
)
Proteína
(g.L
-1
)
Lactose
(g.L
-1
)
Cond. Elétrica
(S.cm
-1
)
pH
ST
(g.L
-1
)
Proteína
(g.L
-1
)
Lactose
(g.L
-1
)
Cond. elétrica
(S.cm
-1
)
pH
UF 0 1 28,8
60,3 9,2 44,1
6,78E-03 6,5 46,3 0,0 42,3 4,23E-02 6,4
UF 35 2 25,1
65 11,2 47,8
6,82E-03 6,5 45,9 0,3 42,4 4,24E-02 6,4
UF 65 3 20,8
68,2 16,8 48,4
6,85E-03 6,5 46,0 0,0 43,6 4,36E-02 6,4
UF 95 4 18,9
74,5 23,6 48,9
6,89E-03 6,5 0,0 0,0 44,5 4,45E-02 6,4
UF 125 5 19,1
77,6 26,8 49,8
6,91E-03 6,5 47,0 0,1 43,6 4,36E-02 6,4
UF 155 6 19,5
74,4 27,9 46
6,92E-03 6,5 48,9 0,0 45,9 4,59E-02 6,4
UF 185 7 18,4
77,7 32,5 45
6,94E-03 6,5 48,9 0,0 46,1 4,61E-02 6,4
UF 215 8 17,7
83,1 35,6 47,4
6,98E-03 6,5 0,0 0,0 45,3 4,53E-02 6,3
UF 239 9 16,6
86,3 36,7 49,6
6,97E-03 6,5 52,6 0,0 49,6 4,96E-02 6,3
DF1 356 10 19,1
69,4 36,8 32,6
3,36E-03 6,7 18,0 0,0 18,3 1,83E-02 6,5
DF2 415 11 17,5
62,4 36,8 25,6
2,23E-03 6,6 12,0 0,0 10,9 1,09E-05 6,5
DADOS EXPERIMENTAIS 143
Tabela B.8: Dados detalhados do Experimento 4, incluindo concentrações de sólidos totais, proteína, lactose, condutividade elétrica, pH para as
amostras de concentrado e permeado monitoradas conforme o tempo e etapa dos processos de concentração e purificação do soro utilizando a
membrana UF-6001, T= 50 °C, ΔP= 2 bar e vazão de alimentação média de 840 L.h
-1
.
Concentrado Permeado
Etapa
Tempo
(min)
Amostra
J
p
(L.m
-2
.h
-1
)
ST
(g.L
-1
)
Proteína
(g.L
-1
)
Lactose
(g.L
-1
)
Cond. elétrica
(S.cm
-1
)
pH
ST
(g.L
-1
)
Proteína
(g.L
-1
)
Lactose
(g.L
-1
)
Cond. elétrica
(S.cm
-1
)
pH
UF 0 1 35,2
58,1 9,3 41,8
6,45E-03 6,4 47,3 0,4 39,2 6,30E-03 6,4
UF 35 2 28,4
60,7 12,5 42,2
6,45E-03 6,4 46,7 0,0 41,9 6,29E-03 6,4
UF 65 3 24,1
62 15,6 43,4
6,49E-03 6,4 46,2 0,0 41,5 6,35E-03 6,4
UF 95 4 18,3
67,6 21,6 44
6,47E-03 6,4 45,2 0,0 39,0 6,37E-03 6,4
UF 125 5 18,5
72,3 26,8 44,5
6,49E-03 6,4 45,0 0,0 38,4 6,42E-03 6,3
UF 155 6 18,6
76,1 29,6 46
6,50E-03 6,4 45,0 0,0 41,2 6,40E-03 6,3
UF 185 7 16,5
79 31,5 47,3
6,63E-03 6,4 44,2 0,0 41,9 6,40E-03 6,3
UF 215 8 16,0
82,7 33,9 48,7
6,59E-03 6,4 49,6 0,0 41,2 6,58E-03 6,3
UF 265 9 15,4
85,9 36,8 49,1
6,64E-03 6,4 50,9 0,0 42,8 6,64E-03 6,3
DF1 329 10 16,0
71,5 36,5 35
4,63E-03 6,4 32,3 0,0 27,9 4,56E-03 6,3
DF2 395 11 16,5
64,7 36,8 27,9
3,28E-03 6,5 19,3 0,0 19,4 3,09E-03 6,3
DF3 430 12 16,6
59,5 36,6 22,9
2,68E-03 6,4 14,8 0,0 15,1 2,47E-03 6,3
DF4 465 13 15,5
52,5 36,9 15,6
2,23E-03 6,3 12,1 0,0 10,7 1,96E-03 6,2
144 2. DADOS EXPERIMENTAIS
Tabela B.9: Dados detalhados da duplicata do Experimento 2, incluindo concentrações de sólidos totais, proteína, lactose, condutividade elétrica, pH
para as amostras de concentrado e permeado monitoradas conforme o tempo e etapa dos processos de concentração e purificação do soro utilizando
a membrana UF-6001, T= 50 °C, ΔP= 2 bar e vazão de alimentação média de 840 L.h
-1
.
Concentrado Permeado
Etapa
Tempo
(min)
Amostra
J
p
(L.m
-2
.h
-1
)
ST
(g.L
-1
)
Proteína
(g.L
-1
)
Lactose (g.L
-
1
)
Cond. Elétrica
(S.cm
-1
)
pH
ST
(g.L
-1
)
Proteína
(g.L
-1
)
Lactose
(g.L
-1
)
Cond. Elétrica
(S.cm
-1
)
pH
UF 0 1
32,7 58,3 9,1 43,2 6,91E-03
6,5 44,1 0,3 35,6 6,67E-03 6,5
UF 30 2
24,4 61,6 11,4 39,0 6,92E-03
6,5 45,3 0,0 36,7 6,69E-03 6,5
UF 60 3
22,2 66,0 17,0 38,8 6,94E-03
6,5 41,6 0,0 35,7 6,78E-03 6,5
UF 90 4
21,0 68,3 19,6 38,8 6,95E-03
6,5 47,5 0,0 41,7 6,75E-03 6,5
UF 120 5
21,2 74,6 21,6 39,9 6,96E-03
6,5 45,1 0,0 38,2 6,82E-03 6,6
UF 150 6
19,4 76,9 22,6 41,3
6,78E-03 6,5 43,5 0,0 38,2 6,98E-03 6,6
UF 180 7
17,9 79,8 25,9 42,5
6,77E-03 6,5 48,1 0,0 38,8 6,97E-03 6,6
UF 210 8
19,9 80,8 27,0 43,0
6,81E-03 6,6 42,7 0,0 39,7 7,01E-03 6,6
UF 240 9
19,8 81,8 28,6 52,3
6,87E-03 6,7 52,5 0,0 41,5 7,05E-03 6,6
UF 268 10
20,1 97,3 29,6 48,6
6,88E-03 6,8 52,7 0,0 40,7 7,14E-03 6,8
DF1 341 11
20,3 86,1 29,9 44,1
4,50E-03 6,9 27,9 0,0 26,0 4,50E-03 6,8
DF2 415 12
19,7 76,0 30,0 40,3 3,79E-03
6,9 15,6 0,0 14,8 2,69E-03 6,8
DF3 443 13 20,2
65,3 30,2 35,7 3,30E-03
6,4 16,0 0,0 17,3 3,15E-03 6,4
DF4 510 14 20,5
59,6 30,6 28,0
2,91E-03 6,4 14,4 0,0 16,3 2,31E-03 6,5
DF5 549 15 19,6
50,4 30,6 19,8
2,91E-03 6,7 13,1 0,0 11,1 1,90E-03 6,4
DADOS EXPERIMENTAIS 145
Tabela B.10: Dados detalhados da duplicata do Experimento 4, incluindo concentrações de sólidos totais, proteína, lactose, condutividade elétrica,
pH para as amostras de concentrado e permeado monitoradas conforme o tempo e etapa dos processos de concentração e purificação do soro
utilizando a membrana UF-6001, T= 50 °C, ΔP= 2 bar e vazão de alimentação média de 840 L.h
-1
.
Concentrado Permeado
Etapa
Tempo
(min)
Amostra
J
p
(L.m
-2
.h
-1
)
ST
(g.L
-1
)
Proteína
(g.L
-1
)
Lactose
(g.L
-1
)
Cond. elétrica
(S.cm
-1
)
pH
ST
(g.L
-1
)
Proteína
(g.L
-1
)
Lactose
(g.L
-1
)
Cond. Elétrica
(S.cm
-1
)
pH
UF 0 1
28,8 58,2 9,2 42
6,45E-03
6,5
47,3 0,5 39,2 6,30E-03
6,4
UF 30 2
25,1 60,1 11,9 42,2
6,45E-03
6,5
46,7 0,0 41,9 6,29E-03
6,4
UF 60 3
20,8 63,2 16,8 43,4
6,49E-03
6,5
46,2 0,0 41,5 6,35E-03
6,4
UF 90 4
18,9 67,5 20,9 44,6
6,47E-03
6,5
45,2 0,0
42,3
6,37E-03
6,4
UF 120 5
19,1 69,1 23,6 44,5
6,49E-03
6,5 46,3
0,0
42,4
6,42E-03
6,4
UF 150 6
19,5 74,4 27,9 46
6,50E-03
6,5 45,9
0,0
43,6
6,40E-03
6,4
UF 180 7
18,4 79,8 31 48,6
6,63E-03
6,5 46,0
0,0
44,5
6,40E-03
6,4
UF 210 8
17,7 85,6 34,9 50,6
6,59E-03
6,5 0,0
0,0
43,6
6,58E-03
6,3
UF 260 9
16,6 90,2 35,6 54,6
6,64E-03
6,5 47,0
0,0
45,9
6,64E-03
6,3
DF1 325 10 16,0
69,9 35,9 34
4,63E-03
6,7 48,9
0,0
45,3
4,56E-03
6,5
DF2 395 11 16,5
65,4 36,5 28,9
3,28E-03
6,6 52,6
0,0
29,7
3,09E-03
6,5
DF3 430 12 16,6
61,8 36,2 25,6
2,55E-03 6,4
18,0
0,0
15,2
2,47E-03 6,3
DF4 465 13 15,5
52,3 36,5 15,8
1,98E-03 6,3
12,0
0,0 10,7 1,96E-03 6,2
146 DADOS EXPERIMENTAIS
B.2 Fracionamento das Proteínas – tabelas
Tabela B.11: Dados de fluxo permeado de água em função do tempo para compactação das
membranas VCWP, HN06 e RZ04 vazão de alimentação 620 L.h
-1
, T = 25 °C , ΔP =3,25 bar.
VCWP HN06 RZ04
tempo(min) J
p
(L.m
-2
.h
-1
)J
p
(L.m
-2
.h
-1
) J
p
(L.m
-2
.h
-1
)
0
365,56 72,40 250,68
5
362,30 71,08 243,08
10
361,70 70,60 233,60
15
360,89 65,90 225,60
20
358,32 60,99 210,80
25
355,26 52,60 210,66
30
350,20 50,38 210,80
35
350,50 50,40
40
350,60 50,60
Tabela B.12: Dados de fluxo permeado de água para as membranas VCWP, HN06 e RZ04 vazão
de alimentação 620 L.h
-1
, T = 40 °C (VCWP e RZ04) e 25 °C (HN06).
VCWP HN06 RZ04
ΔP(bar) J
p
(L.m
-2
.h
-1
) ΔP(bar) J
p
(L.m
-2
.h
-1
) ΔP(bar) J
p
(L.m
-2
.h
-1
)
3,3 354,2 3,2 38,6 3,3 212,4
2,5 294,7 2,5 30,2 2,5 181,9
2,0 252,5 2,0 26,3 2,0 148,9
1,5 200,7 1,5 20,9 1,5 112,0
1,0 156,0 1,0 15,9 1,0 73,8
Tabela B.13: Duplicata dos dados de fluxo permeado de água para as membranas VCWP, HN06
e RZ04 vazão de alimentação 620 L.h
-1
, T = 40 °C (VCWP e RZ04) e 25 °C (HN06).
VCWP HN06 RZ04
ΔP(bar) J
p
(L.m
-2
.h
-1
) ΔP(bar) J
p
(L.m
-2
.h
-1
) ΔP(bar) J
p
(L.m
-2
.h
-1
)
3,3 316,9 3,2 40,6 3,3 205,4
2,5 270,7 2,5 30,6 2,5 190,9
2,0 233,1 2,0 27,2 2,0 155,9
1,5 207,1 1,5 22,3 1,5 110,0
1,0 154,5 1,0 13,9 1,0 75,8
DADOS EXPERIMENTAIS 147
Tabela B.14: Dados de fluxo permeado de concentrado protéico para as membranas VCWP,
HN06 e RZ04 vazão de alimentação 620 L.h
-1
, T = 40 °C, pH = 4,6 (VCWP e RZ04) e 25 °C, pH =
6,3 (HN06).
VCWP HN06 RZ04
ΔP(bar) J
p
(L.m
-2
.h
-1
) ΔP(bar) J
p
(L.m
-2
.h
-1
) ΔP(bar) J
p
(L.m
-2
.h
-1
)
3,2 48,3 2,8 10,9 3,0 57,6
2,8 42,2 2,2 8,7 2,4 47,3
2,2 36,1 1,7 6,8 2,0 38,5
1,8 30,8 1,3 5,8 1,5 31,4
1,3 25,3 1,0 22,4
Tabela B.15: Duplicata dos dados de fluxo permeado de concentrado protéico para as
membranas VCWP, HN06 e RZ04 vazão de alimentação 620 L.h
-1
, T = 40 °C, pH = 4,6 (VCWP e
RZ04) e 25 °C, pH = 6,3 (HN06).
VCWP HN06 RZ04
ΔP(bar) J
p
(L.m
-2
.h
-1
) ΔP(bar) J
p
(L.m
-2
.h
-1
) ΔP(bar) J
p
(L.m
-2
.h
-1
)
3,2 69,0 2,8 10,1 3,0 55,6
2,8 61,0 2,2 8,3 2,4 45,5
2,2 53,2 1,7 6,4 2,0 35,2
1,8 48,3 1,3 5,5 1,5 30,5
1,0 32,5 1,0 20,1
Tabela B.16: Dados de concentração de proteína e lactose para as amostras de concentrado e
permeado das membranas VCWP, HN06 e RZ04 (duplicata).
Amostras
Concentração de Lactose
(g.L
-1
)
Concentração de Proteína
(g.L
-1
)
HN06 C’ 18,1 31,5
HN06 P’ 12,0 0,4
VCWP C’ 18,1 31,5
VCWP P’ 6,8 1,8
RZ04 C’ 18,1 31,5
RZ04 P’ 16,2 1,1
148 2. DADOS EXPERIMENTAIS
Figura B.1: Fotografias dos géis de eletroforese SDS-PAGE (poliacrilamida 15 %) do experimento de
duplicata para as amostras de concentrado e permeado da membrana HN06, RZ04,
VCWP (100 V e 30 A). Legenda: (1) HNO6C’; (2) HN06P’, (3) RZ04C’, (4) RZ04P’,
(5) VCWPC’, (6) VCWPP’, (7) padrão.
Tabela B.17: Dados de fluxo permeado de água em função do tempo para compactação da
membrana MF-7002 vazão de alimentação 700 L.h
-1
, T = 25 °C , ΔP =3,25 bar.
Tempo (min) J
p
(L.m
-2
.h
-1
)
0 636,7
5 642,3
10 633,0
15 634,2
20 624,6
35 628,8
45 595,6
55 597,2
65 575,0
75 575,1
85 565,3
100 555,4
115 530,2
130 531,3
140 532,6
150 531,5
Tabela B.18: Dados de fluxo permeado de água e de concentrado protéico em função da pressão
transmembrana para a membrana MF-7002, vazão 700 L.h
-1
, T = 40 °C, pH = 4,6 (concentrado).
ΔP (bar) J
p
(L.m
-2
.h
-1
)
Água Concentrado Protéico
3,25 400,09 41,98
2,75 365,26 41,68
2,25 327,27 38,11
1,75 269,14 31,17
1,25 178,64 25,99
0,75 110,27 16,33
1 2 3 4 5 6 7
DADOS EXPERIMENTAIS 149
Tabela B.19: Duplicata dos dados de fluxo permeado de água e de concentrado protéico em
função da pressão transmembrana para a membrana MF-7002, vazão 700 L.h
-1
, T = 40 °C, pH =
4,6 (concentrado).
ΔP (bar) J
p
(L.m
-2
.h
-1
)
Água Concentrado Protéico
3,25 405,91 41,99
2,75 370,03 41,05
2,25 330,73 35,44
1,75 270,98 32,17
1,25 180,80 26,70
0,75 110,17 15,40
Tabela B.20: Dados de fluxo permeado de concentrado protéico em função do tempo para a
membrana MF-7002, vazão 700 L.h
-1
, T = 40 °C, pH = 4,6, ΔP = 1,75 bar.
Etapa tempo (min) Amostra J
p
(L.m
-2
.h
-1
)
UF 0 MC1 / MP1 27,80
UF 15 25,62
UF 30 22,52
UF 35 MP2 / MC2 23,51
DF1 36 23,51
DF1 40 18,31
DF1 50 19,12
DF1 65 17,41
DF1 80 DF1C/ DF1P 17,10
DF2 81 15,85
DF2 95 16,18
DF2 110 15,27
DF2 125 15,26
DF2 130 DF2C/DF2P 13,95
DF3 131 13,40
DF3 150 13,99
DF3 170 13,96
DF3 186 13,52
DF3 187 DF3C/ DF3P 13,25
DF4 200 14,65
DF4 215 15,18
DF4 230 13,33
DF4 245 DF4C/DF4P 13,53
150 2. DADOS EXPERIMENTAIS
Tabela B.21: Dados de intensidade do modelo (pixel) e de intensidade relativa, correspondendo
a quantidade de proteína em cada banda eletroforética das amostras de concentrado e
permeado da membrana MF-7002.
Proteínas
Intensidade
Relativa
Intensidade do
Modelo (pix)
Intensidade
Relativa
Intensidade do
Modelo (pix)
MC1 MP1
outras proteínas 0,1628 62220,86 0,0303 12606,42
β-Lg 0,5065 156174,65 0,4685 125947,92
α-La 0,3307 100117,65 0,5012 219824,19
MC2
MP2
outras proteínas 0,1408 70655,24 0,0337 14024,63
β-Lg 0,5267 434248,39 0,3885 247550,38
α-La 0,3324 139611,69 0,5778 226559,39
DF1C DF1P
outras proteínas 0,0804 34974,04 0,0372 18685,97
β-Lg 0,5575 193623,66 0,6525 290561,54
α-La 0,3621 169151,96 0,3102 207654,58
DF2C
DF2P
outras proteínas 0,085 56752,83 0,0752 23515,14
β-Lg 0,7017 369991,09 0,7333 271759,08
α-La 0,2132 84666,19 0,1915 141405,32
DF3C
DF3P
outras proteínas 0,0752 57234,58 0,0498 30066,97
β-Lg 0,7333 472855,84 0,6555 220988,12
α-La 0,1915 67054,11 0,2947 96629,84
DF4C
DF4P
outras proteínas 0,193 72161,86 0,0442 27693,49
β-Lg 0,581 172613,99 0,7082 237605,86
α-La 0,2261 76670,65 0,2476 65018,94
DADOS EXPERIMENTAIS 151
Tabela B.22: Dados do experimento de fluxo permeado de concentrado protéico em função do
tempo para a membrana MF-7002, vazão 700 L.h
-1
, T = 40 °C, pH = 4,6, ΔP = 1,75 bar
(duplicata).
Etapa tempo (min) Amostra J
p
(L.m
-2
.h
-1
)
UF 0 MC1' / MP1' 30,10
UF 22 27,92
UF 37 24,82
UF 42 MP2' / MC2' 25,81
DF1 43 25,81
DF1 47 20,61
DF1 57 21,42
DF1 72 19,71
DF1 87 DF1C' / DF1P ' 19,40
DF2 88 18,15
DF2 102 18,48
DF2 117 17,57
DF2 132 17,56
DF2 137 DF2C' / DF2P' 14,25
DF3 138 13,70
DF3 157 14,29
DF3 177 14,26
DF3 193 13,82
DF3 194 DF3C' / DF3P' 13,55
DF4 207 14,95
DF4 222 15,48
DF4
237
13,63
DF4
252
DF4C' / DF4P' 13,83
152 2. DADOS EXPERIMENTAIS
Tabela B.23: Dados de concentração de proteína e lactose para as amostras de concentrado e
permeado da membrana MF-7002 (duplicata).
Amostras
Concentração de Lactose
(g.L
-1
)
Concentração de Proteína
(g.L
-1
)
MC1’ 19,6 25,2
MP1’ 14,4 8,2
MC2’ 21,7 25,4
MP2’ 5,7 7,6
DF1C’ 20,2 23,0
DF1P’ 11,5 7,7
DF2C’ 13,7 20,5
DF2P’ 9,2 8,5
DF3C’ 11,6 17,2
DF3P’ 7,1 4,4
DF4C’ 8,8 15,6
DF4P’ 6,7 8,6
Figura B.2: Fotografias dos géis de eletroforese SDS-PAGE (poliacrilamida 15 %) para as amostras do
expermimento de duplicata para o concentrado e o permeado da membrana MF-7002 (100 V e 30
A).
Legenda: (1) padrão; (2) MC1’, (3) MP1’, (4) MC2’, (5) MP2’, (6) DF1C’, (7)
DF1P’, (8) DF2C’, (9) DF2P’, (10) DF3C’, (11) DF3P’, (12) DF4C’, (13) DF4P’.
Tabela B.24: Dados de fluxo permeado de água em função do tempo para compactação da
membrana UF-C50 vazão de alimentação 400 L.h
-1
, T = 25 °C , ΔP =3,75 bar.
tempo(min) J
p
(L.m
-2
.h
-1
)
0 2250,56
5 2246,03
10 2236,32
15 2100,08
20 2120,36
25 2102,66
30 2100,56
35 2101,64
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
DADOS EXPERIMENTAIS 153
Tabela B.25: Dados de fluxo permeado de água em função da pressão transmembrana para a
membrana UF-C50, T = 40 °C, vazão de alimentação = 400 L.h
-1
.
ΔP (bar) J
p
(L.m
-2
.h
-1
) J
p
(L.m
-2
.h
-1
) J
p
médio (L.m
-2
.h
-1
)
3,75 2096,60 2246,21 2168,83
3,25 1669,97 1800,84 1732,94
2,75 1467,35 1465,48 1466,42
2,25 1094,75 1234,75 1160,54
1,75 860,95 842,64 851,69
1,25 677,24 703,36 665,05
0,75 205,13 224,23 214,25
Tabela B.26: Dados de fluxo permeado de concentrado em pH 6,3 em função da pressão
transmembrana para a membrana UF-C50, T =25 °C, vazão de alimentação = 400 L.h
-1
.
ΔP (bar) J
p
(L.m
-2
.h
-1
) J
p
(L.m
-2
.h
-1
)
J
p
médio
(L.m
-2
.h
-1
)
3,75 41,80 40,38 41,09
3,25 40,21 41,20 40,70
2,75 37,51 39,50 38,51
2,25 35,13 34,30 34,71
1,75 29,90 30,10 30,00
1,25 27,88 26,80 27,34
0,75 23,06 22,90 22,98
Tabela B.27: Dados de fluxo permeado de concentrado em pH 4,6 em função da pressão
transmembrana para a membrana UF-C50, T = 40 °C, vazão de alimentação = 400 L.h
-1
.
ΔP (bar) J
p
(L.m
-2
.h
-1
) J
p
(L.m
-2
.h
-1
)
J
p
médio
(L.m
-2
.h
-1
)
3,75 99,83 101,23 100,53
3,25 97,60 99,80 98,70
2,75 82,54 84,69 83,62
2,25 70,89 72,89 71,89
1,75 54,32 56,98 55,65
1,25 35,45 37,81 36,63
22,50 20,80 21,65 22,50
154 2. DADOS EXPERIMENTAIS
Tabela B.28: Dados de fluxo permeado de concentrado protéico em função do tempo para a
membrana UF-C50, pH= 6,3; T = 25 °C, ΔP = 2,25 bar, vazão de alimentação = 400 L.h
-1
.
Tempo
(min)
Amostra Volume coletado (mL)
J
p
médio
(L.m
-2
.h
-1
)
0 50inicial1 0 45,04
80 250 42,36
175 50C11 / 50P11 500 36,50
261 750 34,80
355 50C12 / 50P12 1000 32,11
Tabela B.29: Dados de fluxo permeado de concentrado protéico em função do tempo para a
membrana UF-C50, pH= 6,3; T = 25 °C, ΔP = 2,25 bar, vazão de alimentação = 400 L.h
-1
(duplicata).
Tempo
(min)
Amostra Volume coletado (mL)
J
p
médio
(L.m
-2
.h
-1
)
0 50inicial1' 0 48,83
77 250 46,15
172 50C11' / 50P11' 500 40,29
258 750 38,59
352 50C12' / 50P12' 1000 35,90
Tabela B.30: Dados de concentração de proteína, lactose e pH das amostras de permeado e
concentrado para o experimento com concentrado protéico para a membrana UF-C50, pH =6,3,
T = 25 °C, ΔP = 2,25 bar, vazão de alimentação = 400 L.h
-1
(duplicata).
Amostras
Concentração de
Proteína (g.L
-1
)
Concentração de
Lactose (g.L
-1
)
pH
50 inicial 1' 25,9 11,6 6,3
50 C11' 25,5 13,9 6,28
50 P11' 1,5 6,3 6,3
50 C12' 26,4 14,5 6,3
50 P12' 1,4 6,9 6,3
Tabela B.31: Dados de fluxo permeado de concentrado protéico em função do tempo para a
membrana UF-C50, pH= 4,6; T = 40 °C, ΔP = 2,25 bar, vazão de alimentação = 400 L.h
-1
.
Tempo
(min)
Amostra Volume coletado (mL)
J
p
médio
(L.m
-2
.h
-1
)
0 50inicial2 0 143,01
41 250 123,50
98 50C21/ 50P21 500 113,16
158 750 110,98
221 50C22/ 50P22 1000 91,47
DADOS EXPERIMENTAIS 155
Tabela B.32: Dados de fluxo permeado de concentrado protéico em função do tempo para a
membrana UF-C50, pH= 4,6; T = 40 °C, ΔP = 2,25 bar, vazão de alimentação = 400 L.h
-1
(duplicata).
Tempo
(min)
Amostra Volume coletado (mL)
J
p
médio
(L.m
-2
.h
-1
)
0 50 inicial2' 0 145,51
40 250 126,00
97 50C21' / 50P21' 500 115,66
157 750 113,48
220 50C22' / 50P22' 1000 93,97
Tabela B.33: Dados de concentração de proteína, lactose e pH das amostras de permeado e
concentrado para o experimento com concentrado protéico para a membrana UF-C50, pH =4,6,
T = 40 °C, ΔP = 2,25 bar, vazão de alimentação = 400 L.h
-1
(duplicata).
Amostras
Concentração de
Proteína (g.L
-1
)
Concentração de
Lactose (g.L
-1
)
pH
50 inicial 2' 29,6 13,4 4,6
50 C21' 29,6 9,2 4,6
50 P21' 1,2 7,6 4,55
50 C22' 30,3 11,6 4,69
50 P22' 1,2 9,0 4,6
Figura B.3: Fotografias dos géis de eletroforese SDS-PAGE (poliacrilamida 15 %) para as amostras
de concentrado e permeado da membrana UF-C50 (100 V e 30 A). Legenda: (1)
padrão; (2) 50inicial1’, (3) 50C12’, (4) 50P12’, (5) 50inicial2’, (6) 50C22’, (7) 50P22’.
1 2 3 4 5 6 7
156 2. DADOS EXPERIMENTAIS
Tabela B.34: Dados de fluxo permeado de água em função do tempo para compactação da
membrana UF-C20 vazão de alimentação 620 L.h
-1
, T = 25 °C , ΔP =3,75 bar.
Tempo (min) J
p
(L.m
-2
.h
-1
)
0
742,40
5
741,08
10
700,60
15
695,36
20
690,63
25
688,95
30
688,40
35
688,33
40
687,99
Tabela B.35: Dados de fluxo permeado de água em função da pressão transmembrana para a
membrana UF-C20, T = 25 °C, vazão de alimentação = 620 L.h
-1
.
ΔP (bar) J
p
(L.m
-2
.h
-1
) J
p
(L.m
-2
.h
-1
) J
p
médio (L.m
-2
.h
-1
)
3,75 683,89 688,19 686,03
3,20 553,84 555,85 554,84
2,75 491,16 507,59 499,24
2,15 375,38 372,19 373,77
1,75 299,55 305,47 302,48
1,15 163,44 160,02 161,71
0,75 123,07 106,69 114,30
Tabela B.36: Dados de fluxo permeado de concentrado protéico em função da pressão
transmembrana para a membrana UF-C20, T = 25 °C, vazão de alimentação = 620 L.h
-1
.
ΔP (bar) J
p
(L.m
-2
.h
-1
) J
p
(L.m
-2
.h
-1
)
J
p
médio
(L.m
-2
.h
-1
)
3,75 64,59 64,54 64,57
3,25 65,01 64,46 64,74
2,70 56,62 55,40 56,01
2,25 44,55 47,30 45,92
1,75 38,47 38,28 38,38
1,25 23,26 23,18 23,22
DADOS EXPERIMENTAIS 157
Tabela B.37: Dados de fluxo permeado de concentrado protéico em função do tempo para a
membrana UF-C20, T = 25 °C, ΔP = 2,25 bar, vazão de alimentação = 620 L.h
-1
.
Tempo
(min)
Amostra Volume coletado (mL)
J
p
médio
(L.m
-2
.h
-1
)
0 C01 0 44,55
35 100 44,68
68 200 45,21
97 300 42,54
130 400 42,10
172 CC1 / CP1 500 41,07
204 600 40,54
238 700 40,68
278 800 36,43
318 900 36,25
360 CC2 / CP2 1000 33,19
Tabela B.38: Dados de fluxo permeado de concentrado protéico em função do tempo para a
membrana UF-C20, T = 25 °C, ΔP = 2,25 bar, vazão de alimentação = 620 L.h
-1
(duplicata).
Tempo
(min)
Amostra Volume coletado (mL)
J
p
médio
(L.m
-2
.h
-1
)
0 C01’ 0 43,15
28 100 43,15
60 200 43,14
92 300 44,71
127 400 44,31
162 CC1’ / CP1’ 500 42,18
190 600 43,98
230 700 39,46
269 800 38,67
305 900 35,97
348 CC2’ / CP2’ 1000 32,24
158 2. DADOS EXPERIMENTAIS
Tabela B.39: Dados de concentração de proteína, lactose e pH das amostras de permeado e
concentrado para o experimento com concentrado protéico para a membrana UF-C20, T = 25
°C, ΔP = 2,25 bar, vazão de alimentação = 620 L.h
-1
(duplicata).
Amostras
Concentração de
Proteína (g.L
-1
)
Concentração de
Lactose (g.L
-1
)
pH
C01' 15,0 12,6 5,98
CC1' 17,3 12,3 5,95
CP1' 0,4 9,6 5,73
CC2' 18,2 13,8 5,93
CP2' 0,3 14,5 5,91
Tabela B.40: Dados de fluxo permeado de soro diluído em função da pressão transmembrana
para a membrana UF-C20, T = 25 °C, vazão de alimentação = 620 L.h
-1
.
ΔP (bar) J
p
(L.m
-2
.h
-1
) J
p
(L.m
-2
.h
-1
)
J
p
médio
(L.m
-2
.h
-1
)
3,75 78,96 78,60 78,78
3,20 78,56 78,50 78,53
2,75 71,20 72,23 71,71
2,15 56,17 57,61 56,89
1,60 43,68 42,50 43,09
1,00 30,72 31,56 31,14
Tabela B.41: Dados de fluxo permeado de soro diluído em função do tempo para a membrana
UF-C20, T = 25 °C, ΔP = 2,25 bar, vazão de alimentação = 620 L.h
-1
.
Tempo
(min)
Amostra Volume coletado (mL)
J
p
médio
(L.m
-2
.h
-1
)
0 UFC01 0 60,62
20 230 56,86
45 350 59,42
75 UFC1 / UFP1 500 69,24
106 700 65,80
155 900 64,63
175 UFC2 / UFP2 1000 61,76
DADOS EXPERIMENTAIS 159
Tabela B.42: Dados de fluxo permeado de soro diluído em função do tempo para a membrana
UF-C20, T = 25 °C, ΔP = 2,25 bar, vazão de alimentação = 620 L.h
-1
(duplicata).
Tempo
(min)
Amostra Volume coletado (mL)
J
p
médio
(L.m
-2
.h
-1
)
0 UFC01’ 0 65,62
25 230 61,86
50 350 64,42
80 UFC1’ / UFP1’ 500 74,24
111 700 70,80
160 900 69,63
180 UFC2’ / UFP2’ 1000 66,76
Tabela B.43: Dados de concentração de proteína, lactose e pH das amostras de permeado e
concentrado para o experimento com soro diluído para a membrana UF-C20, T = 25 °C, ΔP =
2,25 bar, vazão de alimentação = 620 L.h
-1
(duplicata).
Amostras
Concentração de Proteína
(g.L
-1
)
Concentração de Lactose
(g.L
-1
)
pH
UFC01' 11,8
53,3
6,28
UFC1' 10,6
54,3
6,26
UFP1' 0,0
46,2
6,26
UFC2' 11,7
52,4
6,29
UFP2' 0,3
42,9
6,21
Figura B.4: Fotografias dos géis de eletroforese SDS-PAGE (poliacrilamida 15 %) para as amostras
de concentrado e permeado da membrana UF-C20 (100 V e 30 A). Legenda: (1)
padrão; (2) C01’, (3) CC2’, (4) CP2’, (5) UFC01’, (6) UFC2’, (7) UFP2’.
1 2 3 4 5 6 7
160 2. DADOS EXPERIMENTAIS
Tabela B.44: Dados para construção da curva de calibração da coluna de cromatografia gel.
Padrões Moleculares MW (kDa) Ve (mL) Kav Log MW
Ferritina 440,0 8,2 0,0 2,6
Aldolase 158,0 10,8 0,2 2,2
Conalbumina 75,0 11,2 0,2 1,9
Ovalbumina 43,0 12,2 0,3 1,6
Anidrase Carbônica 29,0 13,0 0,3 1,5
Figura B.5: Curva de calibração da coluna de cromatografia gel
.
DADOS EXPERIMENTAIS 161
Figura B.6: Cromatografia gel em coluna de 10 x 300 mm empacotada com a resina Superose
TM
12,
equilibrada com tampão fosfato de sódio 10 mM, pH 7,0; vazão de eluição = 0,5
mL.min
-1
; amostras monitoradas pela absorbância a 280 nm.
Figura B.7: Duplicata da cromatografia gel em coluna de 10 x 300 mm empacotada com a resina
Superose
TM
12, equilibrada com tampão fosfato de sódio 10 mM, pH 7,0; vazão de
eluição = 0,5 mL.min
-1
; amostras monitoradas pela absorbância a 280 nm.
162 2. DADOS EXPERIMENTAIS
Figura B.8: Cromatografia gel em coluna de 10 x 300 mm empacotada com a resina Superose
TM
12,
equilibrada com tampão acetato de sódio 10 mM, pH 4,6; vazão de eluição = 0,5
mL.min
-1
, amostras monitoradas pela absorbância a 280 nm.
Figura B.9: Duplicata da cromatografia gel em coluna de 10 x 300 mm empacotada com a resina
Superose
TM
12, equilibrada com tampão acetato de sódio 10 mM, pH 4,6; vazão de
eluição = 0,5 mL.min
-1
, amostras monitoradas pela absorbância a 280 nm.
DADOS EXPERIMENTAIS 163
B.3 Limpeza das membranas - tabelas
Tabela B.45: Médias dos fluxos de água após realização dos experimentos e em cada etapa da
limpeza química para a UF-6001, ΔP = 2 bar e T = 50 °C, vazão de alimentação 840 L.h
-1
.
Limpeza química
Fluxo permeado de água
(L. m
-2
h
-1
)
Percentual equivalente do
fluxo comparado
ao inicial (%)
Após enxágüe com água 21,3 20,7
Após limpeza alcalina 38,9 37,8
Após limpeza cloro-alcalina 73,6 71,6
Após limpeza ácida 98,5 95,9
Tabela B.46: Médias dos fluxos de água após realização dos experimentos e em cada etapa da
limpeza química para a MF-7002, ΔP = 1,75 bar e T = 40 °C, vazão de alimentação 700 L.h
-1
.
Limpeza química
Fluxo permeado de água
(L. m
-2
h
-1
)
Fluxo comparado
ao inicial (%)
Após enxágüe com água 70,36 26,0
Após limpeza alcalina 101,23 37,5
Após limpeza cloro-alcalina 193,21 71,5
Após limpeza ácida 260,84 96,3
Tabela B.47: Médias dos fluxos de água após realização dos experimentos e em cada etapa da
limpeza química para a UF-C50, ΔP = 2,25 bar e T = 25 °C, vazão de alimentação 400 L.h
-1
.
Limpeza química
Fluxo permeado de água
(L. m
-2
h
-1
)
Fluxo comparado
ao inicial (%)
Após enxágüe com água
40,44
3,5
Após limpeza alcalina
881,75
76,0
Após limpeza ácida
1326,99
114,3
Tabela B.48: Médias dos fluxos de água após realização dos experimentos e em cada
etapa da limpeza química para a UF-C20, ΔP = 2,25 bar e T = 25 °C, vazão de
alimentação 620 L.h
-1
.
Limpeza química
Fluxo permeado de água
(L. m
-2
h
-1
)
Fluxo comparado
ao inicial (%)
Após enxágüe com água
56,02
12,5
Após limpeza alcalina
197,73
48,8
Após limpeza ácida
444,50
110,0
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