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REGIANE DEGAN FÁVARO
ANÁLISE BIOQUÍMICA, ESTUDOS DA RELAÇÃO
ESTRUTURA-FUNÇÃO E DE EXPRESSÃO DA
PROTEÍNA DESACOPLADORA MITOCONDRIAL DE
PLANTAS
Botucatu-SP
2008
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REGIANE DEGAN FÁVARO
ANÁLISE BIOQUÍMICA, ESTUDOS DA RELAÇÃO
ESTRUTURA-FUNÇÃO E DE EXPRESSÃO DA
PROTEÍNA DESACOPLADORA MITOCONDRIAL DE
PLANTAS
Tese apresentada ao Instituto de Biociências
da Universidade Estadual Paulista - Campus
de Botucatu (SP), para a obtenção do título de
Doutor em Ciências Biológicas (Genética).
Orientador: Prof. Dr. Ivan de Godoy Maia
Botucatu-SP
2008
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FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA SEÇÃO TÉCNICA DE AQUISIÇÃO E TRATAMENTO
DA INFORMAÇÃO
DIVISÃO TÉCNICA DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO - CAMPUS DE BOTUCATU - UNESP
BIBLIOTECÁRIA RESPONSÁVEL: SELMA MARIA DE JESUS
Favaro, Regiane Degan.
Análise bioquímica, estudos da relação estrutura-função e de expressão da
proteína desacopladora mitocondirial de plantas / Regiane Degan Fávaro. –
Botucatu : [s.n.], 2008.
Tese (doutorado) – Universidade Estadual Paulista, Instituto de Biociências
de Botucatu 2008.
Orientador: Ivan de Godoy Maia
Assunto CAPES: 20204000
1. Genética vegetal 2. Plantas - Genética
CDD 581.3
Palavras-chave: Expressão gênica; Propriedades bioquímicas; Proteínas
desacopladoras; Relação estrutura-função
i
Dedico essa tese a minha mãe, meu pai (in memoriam), meu irmão
(obrigada pelas horas de sono perdidas) e meus avós;
ii
AGRADECIMENTOS
À DEUS;
À Universidade Estadual Paulista, pela sua estrutura e oportunidade;
À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo, pelo suporte
financeiro;
Ao Prof. Dr. Ivan de Godoy Maia, pela orientação dedicada;
Ao Prof. Dr. Jiri Borecký, pela grande colaboração nesse trabalho e pelos muitos
ensinamentos;
Ao Prof. Dr. Aníbal Eugênio de Vercesi, pela atenção e estrutura disponibilizadas;
Ao Profa. Dra. Iolanda Midea Cuccovia, pelo apoio no desenvolvimento dos
ensaios;
A Menina Akemi por ser uma amiga sempre presente e pelas discussões que muito
acrescentaram em minha vida e na tese;
Aos meus queridos amigos e companheiros de tese, Adriana, Ana Teresa, Antonio,
Bob, Bonsa, Débora, Desiré, Fábio, Negin e Thaís, pelos ótimos anos de
convivência;
As minhas amigas de Campinas Ana Luiza, Daniela, Elane, Heidi, Kívia, e Paula,
pela convivência;
Ao Marco Figueiredo pelo exemplo de vida, ensinamentos, carinho e
companheirismo;
Muito Obrigada!!!
iii
“A vida é a arte de tirar conclusões suficientes
de dados insuficientes.”
Luiz Fernando Veríssimo (1936 - )
“Se, a princípio, a idéia não é absurda,
então não há esperança para ela.”
Albert Einstein (1879 - 1955)
iv
RESUMO
Proteínas desacopladoras (UCPs; do inglês uncoupling proteins) são proteínas
especializadas no transporte mitocondrial que desacoplam a respiração da síntese de
ATP. UCPs geram um fluxo de prótons através da membrana mitocondrial interna,
dependente de ácidos graxos e sensível a nucleotídeos purínicos (PN). No presente
trabalho, foram realizados vários estudos empregando UCPs de plantas (pUCP).
Inicialmente, foi empreendida a caracterização bioquímica de uma UCP de milho
(Zea mays; ZmUCP), representativa de espécies monocotiledôneas. Essa proteína,
quando expressa em Escherichia coli e reconstituída em lipossomos, foi capaz de
induzir um fluxo de prótons dependente de ácido linoléico (LA) e sensível a ATP com
valores de K
m
, V
max
e K
i
similares àqueles observados para pUCPs de espécies
dicotiledôneas. A ZmUCP foi utilizada para investigar a importância de um par de
histidinas presente no segundo loop matricial da UCP1 de mamíferos e ausente nas
pUCPs. A introdução do referido par de histidinas na ZmUCP (Lys155His e
Ala157His) provocou um aumento na afinidade por LA enquanto que a sua atividade
permaneceu inalterada. Em um estudo mais abrangente de estrutura-função, mutações
pontuais nos resíduos Lys147, Arg155 e Tyr269, localizados nas chamadas
assinaturas das UCPs, e Cys28 e His83, específicos para pUCPs, foram introduzidas
na proteína AtUCP1 de Arabidopsis. Os efeitos de tais mutações nas propriedades
bioquímicas da AtUCP1 foram examinados usando sistema de reconstituição em
lipossomos. O resíduo Arg155 parece ser crucial para a afinidade da AtUCP1 por LA
enquanto que His83 tem importante função na atividade de transporte. Os resíduos
Cys28, Lys147, e também Tyr269, são importantes para a correta funcionalidade da
AtUCP1, já que suas substituições afetaram, ou a afinidade por LA e a atividade de
transporte da proteína, ou a sensibilidade a inibidores PN. Além disso, analisou-se o
v
perfil de expressão dos seis genes que codificam pUCPs em Arabidopsis thaliana
(AtUCP1-6) em resposta a tratamentos geradores de estresse salino (NaCl) e osmótico
(manitol), e aos fito-hormônios ácido 1-carboxílico 1-aminocliclopropano (ACC) e
ácido abscísico (ABA). Nossos resultados demonstraram uma inibição significativa na
expressão do gene AtUCP4 em resposta a todos os tratamentos. A expressão dos
genes AtUCP5 e AtUCP6 foi induzida em resposta ao tratamento com manitol, sendo
o mesmo efeito observado para os genes AtUCP2, AtUCP5 e AtUCP6 mediante
tratamento com ABA e AtUCP2 para o tratamento com NaCl. Em um estudo
complementar, os promotores dos genes AtUCP1 e AtUCP2 foram isolados e
fusionados ao gene repórter que codifica a β-glucuronidase. Os cassetes de expressão
resultantes foram introduzidos em Nicotiana tabacum SR1, por processo de
transformação mediado por Agrobacterium tumefaciens, e análises histoquímicas
subseqüentes indicaram um padrão de expressão ubíquo ou preferencialmente em
raízes, para os promotores dos genes AtUCP1 e AtUCP2, respectivamente.
Palavras-chave: Proteínas desacopladoras, propriedades bioquímicas, relação
estrutura-função, expressão gênica.
vi
ABSTRACT
Uncoupling proteins (UCPs) are specialized mitochondrial transporter proteins, which
uncouple respiration from ATP synthesis. UCPs mediate a fatty acid (FA)-dependent,
purine nucleotide (PN)-inhibitable proton flux across the inner membrane
mitochondrial. In the present study, several assays on plant UCPs (pUCP) were
performed. Firstly, we biochemically characterized an UCP from maize (Zea mays;
ZmUCP), a representative uncoupling protein from monocot species. This protein was
expressed in Escherichia coli and reconstituted in liposomes. ZmUCP was fully active
and induced a linoleic acid-dependent proton flux that was sensitive to ATP. The
obtained K
m
, V
max
and K
i
values were similar to those observed for dicot pUCPs.
ZmUCP was also used to investigate the importance of a histidine pair present in the
second matrix loop of mammalian UCP1 and absent in pUCPs. ZmUCP with the
introduced histidine pair (Lys155His and Ala157His) displayed increased LA-affinity
while its activity remained unchanged. In a subsequent study using AtUCP1, point
mutations were introduced in amino acid residues Lys147, Arg155 and Tyr269,
located inside the so-called UCP-signatures, and Cys28 and His83, specific for
pUCPs. The effects of amino acid replacements on AtUCP1 biochemical properties
were examined using reconstituted liposomes. Residue Arg155 appears to be crucial
for AtUCP1 affinity to LA whereas His83 plays an important role in transport
activity. Residues Cys28, Lys147, and also Tyr269 are important for correct AtUCP1
function, as their substitutions affected either the AtUCP1 affinity to LA and its
transport activity, or sensitivity to PN inhibitors. Furthermore, we analyzed the
expression profiles of the six genes encoding pUCP in Arabidopsis thaliana
(AtUCP1-6) in response to salt (NaCl) and osmotic (mannitol) stress treatments, and
to the fitohormones 1-aminoclyclopropane 1- carboxylic acid (ACC) and abscisic acid
vii
(ABA). Our results demonstrated a significant inhibition in the AtUCP4 gene
expression in response to all treatments. The AtUCP5 and AtUCP6 gene expression
was induced in response to the treatment with mannitol, being the same effect
observed for the genes AtUCP2, AtUCP5 and AtUCP6 in response to the treatment
with ABA and AtUCP2 in the treatment with NaCl. In a complementary study, the
promoters of AtUCP1 and AtUCP2 genes were isolated and transcriptionally fused to
the β-glucuronidase reporter gene. The resulting expression cassettes were introduced
into Nicotiana tabacum SR1 by Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation.
Subsequent histochemical analysis indicated that AtUCP1is ubiquitously expressed
while AtUCP2 is expressed preferentially in roots.
Keywords: Uncoupling protein, biochemical properties, structure function
relationships, gene expression.
viii
SUMÁRIO
Resumo .................................................................................................................. iv
Abstract................................................................................................................... vi
1. Introdução ........................................................................................................... 11
1.1. A importância da mitocôndria.....................................................................11
1.2. A proteína desacopladora mitocondrial.......................................................14
1.3. Modelos do mecanismo de transporte de prótons ........................................22
1.4. Atividade bioquímica de UCPs mutantes....................................................26
1.5. Proteínas desacopladoras mitocondriais de plantas......................................28
1.6. Desacoplamento mitocondrial em plantas ...................................................34
2. Objetivos............................................................................................................. 37
Capítulo I. Caracterização Bioquímica das pUCPs e estudos de estrutura-função..... 38
I.1. Artigo 1: ZmPUMP encodes a fully functional monocot plant uncoupling
mitochondrial protein whose affinity to fatty acid is increased with the
introduction of a His pair at the second matriz loop
I.2. Artigo 2: Mutational analysis of Arabidopsis thaliana plant uncoupling
mitochondrial protein
Capítulo II. Estudos de expressão gênica em Arabidopsis e de caracterização
funcional de promotores.......................................................................................... 42
II.1. Material e Métodos....................................................................................42
II.1.1. Análises de expressão gênica em Arabidopsis thaliana .....................42
II.1.1.1. Cultivo das sementes de A. thaliana....................................... 42
II.1.1.2. Extração de RNA total e análise da expressão gênica por qPCR
(quantitative Polymerase Chain Reaction............................................ 43
II.1.2. Análise das regiões promotoras dos genes AtUCP1 e AtUCP2 .........48
II.1.2.1. Amplificação e clonagem das referidas regiões promotoras....48
ix
II.1.2.2. Transformação de Nicotiana tabacum ................................... 50
II.1.2.3. Análise histoquímica da atividade β-Glucuronidase (GUS) nas
linhagens transformadas..................................................................... 52
II.1.2.4. Quantificação da expressão relativa do gene repórter uidA nas
plantas transgênicas transformadas com os cassetes de expressão....... 53
II.2. Resultados e Discussão ............................................................................. 54
II.2.1. Extração de RNA total e análise da expressão gênica por qPCR....... 54
II.2.2. Amplificação e clonagem das regiões promotoras............................ 59
II.2.3. Análises moleculares das plantas transformadas............................... 59
II.2.4. Análise histoquímica da atividade GUS nas linhagens transformadas
.................................................................................................................. 60
Conclusões Gerais................................................................................................... 64
Referências.............................................................................................................. 65
Apêndice 1.............................................................................................................. 79
Apêndice 2.............................................................................................................. 80
11
1. INTRODUÇÃO
1.1. A IMPORTÂNCIA DA MITOCÔNDRIA
A energia necessária para a manutenção da estrutura e função celular provém
do catabolismo de carboidratos, lipídeos e aminoácidos. Estas fontes de energia
passam por uma série de rotas metabólicas, iniciando-se no compartimento citosólico.
Nas células procarióticas devido à ausência de organelas, o processo de produção de
energia biológica fica restrito ao citosol, enquanto que nas células eucarióticas ele tem
continuidade nas mitocôndrias.
As mitocôndrias são organelas formadas por duas membranas, interna e
externa. A membrana mitocondrial externa controla o acesso de íons e metabólitos
para o espaço intermembranas, sendo que o canal de ânion voltagem dependente
(VDAC; do inglês Voltage-Dependent Anion Channel) é a proteína mais abundante
nessa membrana (corresponde a mais de 50% do total de proteínas da membrana
mitocondrial externa; Mannela, 1998). O VDAC está envolvido numa ampla gama de
processos, como a passagem de ATP para fora da mitocôndria, liberação de ânions
superóxido, além de uma função no processo de apoptose (revisado em Gonçalves et
al., 2007).
A organização estrutural da membrana mitocondrial interna permite
distinguir três componentes básicos: a membrana interna propriamente dita, a
membrana da crista e o espaço intercrista (revisado em Logan, 2006). A membrana
mitocondrial interna é rica em proteínas (80% de proteínas e 20% de lipídeos), sendo
estas proteínas componentes da cadeia respiratória e proteínas transportadoras de
metabólitos como, citrato, oxoglutarato, malato, ATP, ADP, piruvato, Ca
+2
e fosfato.
A membrana mitocondrial interna é permeável a O
2,
ao CO
2
, e H
2
O.
12
Na matriz mitocondrial estão localizadas as enzimas responsáveis pelo
metabolismo oxidativo, bem como substratos, co-fatores, nucleotídeos, íons
inorgânicos, e a maquinaria genética mitocondrial (DNA, RNA e ribossomos). O
DNA mitocondrial (mtDNA) é “empacotado” com proteínas formando complexos
DNA-proteína chamados nucleóides, por analogia com a organização do DNA em
células procariontes. Cada nucleóide, considerado uma unidade hereditária do
mtDNA, contém diversas cópias do genoma mitocondrial e diferentes proteínas
(Kucej et al., 2007).
A oxidação de combustíveis (glicídeos, lipídeos e às vezes aminoácidos) no
metabolismo celular libera energia (elétrons) que é conservada nos compostos
reduzidos NADH (nicotinamida-adenina-dinucleotídeo) e FADH
2
(flavina-adenina-
dinucleotídeo). O NADH (um carreador de elétrons) e o FADH
2
(o qual funciona
como um grupo prostético de um grande número de enzimas) são produzidos na
mitocôndria, ou então no citosol. NADH e FADH
2
doam elétrons para a cadeia
transportadora de elétrons, uma série de complexos protéicos que são localizados,
como mencionado anteriormente, na membrana mitocondrial interna. O movimento
dos elétrons entre os componentes da cadeia transportadora é dirigido pelo potencial
redox. O destino final dos elétrons é o oxigênio molecular, em organismos aeróbicos,
o qual é reduzido para H
2
O no último passo da cadeia transportadora de elétrons,
sendo desta forma, o processo de oxidação dos substratos e redução do oxigênio
denominado de respiração celular (Voet et al., 2002).
Durante a respiração celular, o movimento dos elétrons ao longo da cadeia
transportadora de elétrons [Complexo I (NADH-desidrogenase); Complexo II
(succinato desidogrenase); Complexo III (citocromo bc
1
) e IV (citocromo c oxidase)]
gera um bombeamento de prótons (H
+
) por alguns dos componentes da cadeia
13
(Complexos I, III e IV). Estes irão bombear os prótons da matriz mitocondrial (região
com baixa [H
+
]) para o espaço intermembrana da mitocôndria (região com alta [H
+
]),
o qual estabelece um gradiente de prótons através da membrana mitocondrial interna.
A medida termodinâmica quantitativa para o gradiente de prótons é um gradiente
eletroquímico, o qual tem dois componentes: uma diferença na concentração de
prótons, e uma diferença no potencial elétrico através da membrana. Como convenção
em bioenergética, o gradiente eletroquímico de prótons é frequentemente convertido
em unidades de potencial elétrico (o qual tipicamente varia de 150-200 mV) e é
referido como uma força prótonmotriz (fmp) (Krauss et al., 2005).
A energia que é conservada no gradiente de prótons através da membrana
mitocondrial interna é usada pela ATP-sintase (complexo V), um complexo protéico
da membrana mitocondrial interna que sintetiza ATP a partir de ADP mais fosfato
inorgânico (P
i
), processo denominado de fosforilação. A síntese de ATP está acoplada
ao gradiente de prótons, isto é, ela necessita da descarga do gradiente de prótons, ou
seja, o retorno dos mesmos para a matriz mitocondrial via ATP-sintase. Tal
acoplamento depende da impermeabilidade da membrana interna aos prótons, que
permite o estabelecimento de um gradiente eletroquímico através da membrana. No
estado de repouso, quando a fosforilação oxidativa é mínima, o gradiente
eletroquímico na membrana mitocondrial interna acumula-se e impede a continuidade
do bombeamento de prótons, inibindo, portanto, o transporte de elétrons. Quando a
síntese de ATP aumenta, o gradiente eletroquímico é utilizado, permitindo o reinício
do transporte de elétrons.
O gradiente eletroquímico de prótons gerado pela cadeia transportadora de
elétrons não é totalmente acoplado com a síntese de ATP, já que os prótons podem
retornar para a matriz mitocondrial por intermédio de uma proteína presente na
14
membrana mitocondrial interna, a proteína desacopladora mitocondrial (UCP; do
inglês Uncoupling Protein). Como conseqüência, o potencial de membrana é
ligeiramente reduzido e a energia derivada da oxidação dos substratos é dissipada na
forma de calor.
1.2. A PROTEÍNA DESACOPLADORA MITOCONDRIAL
O transporte de metabólicos (nucleotídeos, fosfatos, piruvato etc.) através da
membrana mitocondrial interna é essencial para o metabolismo dos eucariontes. A
maioria dos carreadores são transportadores de ânions (ânions de ácidos-graxos, ADP,
ATP, fosfato, malato, aspartato, glutamato, citrato ou piruvato), mas alguns
transportam substratos (ornitina, carnitina ou glutamato) (Borecký et al., 2001a). A
família dos carreadores mitoncodriais (MCF; do inglês Mitochondrial Carrier
Family) (revisado em Haferkamp, 2007) é composta por proteínas com peso
molecular entre 28-34 kDa (Borecký et al., 2001a) codificadas exclusivamente por
genes nucleares. Em plantas, Millar e Heazlewood (2003) identificaram 45 genes que
codificam para proteínas da MCF em Arabidopsis, enquanto que numa análise in
silico realizada em 2004, o número de membros dessa família subiu para
aproximadamente 60 genes (preditos na sua maioria) (Picault et al., 2004).
Até o presente momento, o carreador ADP/ATP é o único membro da família
que teve a sua estrutura resolvida por difração de raios X em resolução de 2,2 Å
(Pebay-Peyroula et al., 2003), sendo a mesma depositada no Protein Data Bank. Os
carreadores mitocôndrias apresentam uma estrutura tripartida que consiste em três
repetições, cada qual contendo duas regiões hidrofóbicas que formam α-hélices
transmembranas (Figura 1). As α-hélices de cada repetição são conectadas por loops
hidrofílicos localizados no espaço intermembrana (Figura 1). Todas as proteínas
15
carreadoras mitocondriais apresentam um motivo altamente conservado denominado
Energy Transfer Proteins Signature (ETPS) – P-x-[DE]-x-[LIVAT]-[RK]-x-[LRH]-
[LIVMFY] (Borecký et al., 2001a).
Figura 1. Modelo topológico dos carreadores mitocondriais. As α-hélices e os loops localizados na
matriz mitocondrial estão representados pelas letras H e h, respectivamente. A estrutura tripartida está
dividida em cores, azul (M1), verde (M2) e vermelho (M3). As regiões N- e C-terminal da proteína
estão localizadas no espaço intermembranas. Adaptação do modelo proposto a partir da estrutura
tridimensional do carreador ATP/ADP (Pebay-Peyroula et al., 2003).
As proteínas desacopladoras mitocondriais formam uma subfamília dentro da
família dos carreadores aniônicos mitocondriais (MACF; do inglês Mitochondrial
Anion Carrier Family). As proteínas desacopladoras possuem três cópias do motivo
ETPS, enquanto que os outros membros da MACF possuem somente uma ou duas
cópias do mesmo (Borecký et al., 2006). As proteínas desacopladoras mitocondriais
foram inicialmente denominadas de termogenina ou proteína de ligação ao GDP
(Nicholls, 2001). Porém, após a sua devida descoberta e caracterização em tecido
adiposo marrom de camundongos por Ricquier e Kader em 1976, a sigla UCP passou a
ser empregada. A descoberta de diferentes isoformas de UCPs em mamíferos fez com
que essas fossem numeradas de acordo com a ordem de suas descobertas. A função
fisiológica do tecido adiposo marrom, termogênese (produção de calor sem requerer
contração muscular), está diretamente relacionada com a atividade da UCP1 presente nas
Matriz
Mitocondrial
Membrana
Interna
Espaço
16
numerosas mitocôndrias deste tecido. Nesse caso, a UCP1 corresponde até 10% do total
das proteínas da membrana mitocondrial interna dos adipócitos (Esteves e Brand, 2005).
A sua função termogênica foi caracterizada em mamíferos hibernantes (Nicholls e Rial,
1999), em mamíferos recém-nascidos adaptados ao frio (Argyropoulos et al., 2002;
Mozo et al., 2005), e durante a termogênese induzida por dieta rica em gorduras em
pequenos roedores (Erlanson-Albertsson, 2003). A termogênese relacionada ao tecido
adiposo marrom está sob o controle hormonal da norepinefrina, ou noradrenalina, que
atua nos β-receptores induzindo a lipólise e mobilizando ácidos graxos livres (Cannon
e Nedergaard, 2004). O mecanismo pelo qual os ácidos graxos livres ativam a UCP1
ainda não é completamente compreendido (revisto em detalhe no item 1.3).
Sabe-se que o transporte de prótons mediado pela UCP1 é inibido por
nucleotídeos purínicos (PN; do inglês purine nucleotides), uma característica que
diferencia as UCPs dos outros carreadores da mesma família (Garlid et al., 2000). O
sítio de ligação da UCP1 aos PNs está voltado para o espaço intermembrana contendo
“solução citosólica”, logo, a concentração dos PNs contidos nessa solução é que irá
permitir o desacoplamento (Dlasková et al., 2006).
Os relatos recentes da expressão da UCP1 em camadas de músculo liso
longitudinal do útero (Nibbelink et al., 2001) e em células do timo geraram uma
indagação sobre as suas funções fisiológicas nesses tecidos. Evidências de que a
UCP1 era funcional em mitocôndrias do timo foram obtidas por uma análise
comparativa entre a cinética de ligação ao GDP em mitocôndrias de tecido adiposo
marrom e de timo (Caroll et al., 2005).
Em experimentos com ratos submetidos à restrição calórica, estresse
conhecido por diminuir a função do timo (Kendall et al., 1991) e também reduzir a
expressão da UCP1 em tecido adiposo marrom (Boss et al., 1998), não foi possível
17
observar uma variação significativa na abundância da UCP1 em mitocôndrias isoladas
do timo (Caroll et al., 2005), sugerindo uma nova função para a UCP1 nesse órgão.
Os autores sugerem que a UCP1 de timo esteja envolvida na regulação da produção
de espécies reativas de oxigênio (EROs) (Porter et al., 2006), hipótese apresentada em
função das evidências encontradas na literatura relatando a ativação da UCP1 por
EROs e por produtos de peroxidação lipídica (Echtay et al., 2002; Echtay et al., 2003)
(ver item 1.3).
Em adição a UCP1, quatro outros membros da subfamília foram identificados
em diferentes tecidos de mamíferos: UCP2 com distribuição ubíqua; UCP3 presente
em tecido adiposo marrom de roedores, tecidos cardíacos e músculo esquelético e
UCP 4 e 5 presentes em cérebro (revisado em Krauss et al., 2005). As funções
fisiológicas das UCP2-5 ainda não são claras, entretanto, sabe-se que estas estão
presentes nas mitocôndrias em menor quantidade do que a UCP1 presente em
mitocôndrias de tecido adiposo marrom (no caso da UCP2 e 3, representam
respectivamente, 0,1% e 1% do total das proteínas presentes na membrana
mitocondrial interna) (Esteves e Brand, 2005). Dentre as UCPs 2-5, as mais estudadas
são a UCP2 e a UCP3. Essas proteínas quando expressas em bactérias e reconstituídas
em lipossomos apresentam um comportamento similar ao da UCP1, ou seja, dissipam
o gradiente eletroquímico de prótons através do transporte de ácidos graxos e outros
ânions como undecanesulfonate, (com exceção de Cl
-
, o qual só é transportado pela
UCP1) (Echtay et al., 1999; Jabůrek et al., 1999). Essas proteínas apresentam uma
menor afinidade por PNs (K
iATP
para UCP1 = 125 µM, para a UCP2 = 0,76 mM e
UCP3 = 0,65 mM de acordo com Jabůrek et al., 1999). O envolvimento das UCP2 e
UCP3 no metabolismo de ácidos graxos foi demonstrado por Nedergaard e Cannon
(2003), sendo estes compostos responsáveis pela indução da expressão destes genes.
18
Devido à similaridade de suas seqüências com a UCP1 e semelhanças na
atividade bioquímica, as UCPs 2 e 3 foram inicialmente relacionadas com a
termogênese (Boss et al., 1997). Ao longo dos anos, entretanto, evidências
experimentais contra tal função foram surgindo. Dentre elas, observou-se que ratos
submetidos à restrição calórica, o que promove uma queda na termogênese,
apresentaram um maior acúmulo de mRNA e proteínas das UCP2 e UCP3 (Boss et
al., 1997; Samec et al., 1998). A função termogênica foi descartada quando se
demonstrou que camundongos nocautes para os genes UCP2 e UCP3, quando
expostos ao frio, apresentaram as mesmas respostas que camundongos selvagens
(Arsenijevic et al., 2000; Gong et al., 2000; Vidal-Puig et al., 2000). Adicionalmente,
UCPs homólogas foram encontradas em outros tecidos/órgãos bem como em diversos
organismos, sugerindo uma diversidade funcional. A ampla distribuição das UCPs no
reino dos eucariontes foi evidenciada pela sua presença em plantas (Vercesi et al.,
1995; Maia et al., 1998; Brandalise et al., 2003a), pássaros (Raimbault et al., 2001;
Vianna et al., 2001; Talbot et al., 2003), vertebrados exotérmicos, como Xenopus
(Keller et al., 2005) e peixes (Stuart et al., 1999), Drosophila (Fridell et al., 2004), e
em eucariontes primitivos como Caenorhabditis elegans (Vercesi et al., 2006),
Acanthamoeba castellanii (Jarmuszkiewicz et al., 1999), Dictyostelium discoideum
(Jarmuszkiewicz et al., 2002), fungos (Jarmuszkiewicz et al., 2000; Cavalheiro et al.,
2004), e no parasita Plasmodium bergbei (Uyemura et al., 2000).
Uma das funções fisiológicas da UCP2 foi demonstrada pela sua indução em
dieta rica em gordura, sugerindo a importância desta na determinação da taxa do
metabolismo basal e possivelmente resistência à obesidade. Estas conclusões foram
baseadas no fato de que a expressão do UCP2 foi induzida em camundongos A/J
(resistentes à obesidade) submetidos a uma dieta rica em gorduras, enquanto que a sua
19
expressão não foi alterada em camundongos B6 (propensos à obesidade) (Fleury et
al., 1997; Surwit et al., 1998). A função da UCP2 parece ser órgão/tecido-específica,
sendo que dietas ricas em gorduras têm promovido à indução de sua expressão em
tecido adiposo branco e marrom e em músculo esquelético (Fleury et al., 1997;
Matsuda et al., 1997; Surwit et al., 1998), mas inibido a sua expressão em estômago e
intestino (Rippe et al., 2000).
Outra função alternativa para a UCP2 está relacionada com a regulação da
secreção de insulina (Chan et al., 1999; Polonsky e Semenkovich, 2001; Zhang et al.,
2001). A superexpressão da UCP2 em células produtoras de insulina (INS-1) reduz a
secreção de insulina induzida por glicose (Chan et al., 1999). Camundongos nocautes
para o gene UCP2 secretam mais insulina em resposta à glicose do que camundongos
tipo-selvagem (Zhang et al., 2001). Esses dados sugerem que a habilidade da UCP2
em dissipar o gradiente de prótons e conseqüentemente diminuir a síntese de ATP, é
de alguma maneira capaz de inibir a capacidade das células beta em secretar insulina
(Erlanson-Albertsson, 2003).
A mais recente função proposta para a UCP2 está relacionada com a
regulação da produção de EROs na mitocôndria. A produção de EROs está
diretamente associada ao potencial de membrana mitocondrial, o qual é controlado
pelo acoplamento da respiração com a fosforilação. Assim, quando o nível de
desacoplamento mediado pela UCP aumenta, ocorre uma diminuição do potencial de
membrana, o que gera um aumento no fluxo de elétrons na cadeia transportadora de
elétrons. Nessa condição, um aumento do consumo de oxigênio molecular (diminui a
tensão do oxigênio) e uma consequentemente diminuição na produção de EROs são
observados. Corroborando tal observação, constatou-se que a interrupção do gene
UCP2 conduz a um aumento da produção de peróxido de hidrogênio em macrófagos
20
de rato (Arsenijevic et al., 2000). Em contrapartida, resultados recentes obtidos pelo
mesmo grupo falharam em constatar um aumento significativo na produção de EROs
em fibroblastos de camundongos nocautes para o gene UCP2 (Pecqueur et al., 2008).
Nesse caso, uma maior proliferação celular associada a uma redução da oxidação de
ácidos graxos e um aumento da glicólise foi observada.
O gene UCP3 foi inicialmente identificado em músculo esquelético de
roedores (Vidal-Puig et al., 1997; Boss et al., 1998) e humanos (Bao et al., 1998). A
expressão desse gene em músculo esquelético gera uma indagação sobre a sua
importância na regulação da energia gasta neste órgão. Experimentos com
camundongos nocautes para o gene UCP3 não demonstraram alterações na taxa
metabólica quando comparados com o tipo-selvagem (Vidal-Puig et al., 2000).
Exemplares dessa linhagem nocaute também não apresentaram um quadro de
obesidade quando alimentados com uma dieta rica em gorduras (Gong et al., 2000) e,
quando submetidos a baixas temperaturas, não apresentaram alterações na
termoregulação (Cline et al., 2001). Adicionalmente, esses animais nocaute não
demonstraram mudanças no peso corporal e nem aumentaram a sua tolerância aos
exercícios (Vidal-Puig et al., 2000). Entretanto, o consumo de oxigênio em
mitocôndrias isoladas de músculo esquelético de animais dessa linhagem foi
significativamente reduzido quando comparado com o tipo-selvagem, evidenciando a
atividade desacopladora da UCP3 nesse tecido (Gong et al., 2000; Cline et al., 2001).
Segundo Cline e colaboradores (2001), camundongos sem UCP3 apresentam uma
taxa de síntese de ATP quatro vezes maior do que animais tipo selvagem. Estas
evidências comprovam que o fluxo de prótons mediado pela UCP3 não afeta o
metabolismo energético e que a função dessa proteína deve ser mais específica no
metabolismo do músculo. Sua possível função pode estar relacionada à regulação do
21
fluxo de prótons e da produção de ATP no músculo esquelético durante o repouso e
durante o exercício (Erlanson-Albertsson, 2003).
Recentemente, como na maioria dos casos de UCPs com função
desconhecida, a atividade da UCP3 foi relacionada com a proteção dos tecidos contra
o dano oxidativo (Echtay et al., 2002). A evidência para tal possibilidade adveio de
experimentos que demonstraram que o desacoplamento promovido pela UCP3 na
presença de ácidos graxos era ativado por radicais superóxido. Em experimentos com
mitocôndrias isoladas de músculo esquelético de camundongos nocaute para o gene
UCP3, o superóxido não gerou desacoplamento na presença de ácidos graxos quando
comparado com o tipo selvagem (Echtay et al., 2002). A função da UCP3 no
transporte de ácidos graxos encontra suporte no fato dessa proteína ser induzida
durante situações em que os ácidos graxos são importantes como substratos
energéticos, como em processos de restrição calórica (Cadenas et al., 1999) e dietas
ricas em gorduras (Samec et al., 1999).
As UCP4 e UCP5 (Sanchis et al., 1998; Mizuno et al., 2000, Yu et al., 2000)
são as proteínas de mamíferos menos estudadas. A função dessas proteínas no
metabolismo energético é ainda desconhecida, mas os autores têm sugerido sua
influência em centros de regulação no cérebro bem como a proteção contra radicais de
oxigênio livres durante o envelhecimento (Erlanson-Albertsson, 2003).
Estudos recentes de assinaturas e motivos típicos presentes nas seqüências
deduzidas de aminoácidos de UCPs identificadas em vários organismos,
demonstraram similaridades significativas entre a UCP4 de mamíferos e as outras
UCPs descritas. Com base em tais resultados foi sugerida a hipótese de que a UCP4
seria a proteína ancestral a partir da qual teriam evoluído as demais UCPs (Hanák e
Ježek, 2001).
22
1.3. MODELOS DO MECANISMO DE TRANSPORTE DE PRÓTONS
O mecanismo de regulação da atividade bioquímica das UCPs ainda não está
claro, mas, de maneira geral, a ativação por ácidos graxos e a inibição por PNs é bem
aceita. Tem aumentado na literatura, entretanto, o número de publicações que relatam
à existência de ativadores fisiológicos alternativos ou co-fatores que seriam
necessários para a ativação destas proteínas. A necessidade de co-fatores como o 4-
hidroxi-2-trans-nonenal (HNE) para a ativação destas proteínas parece dar suporte ao
seu papel na regulação da produção de EROs mitocondrial.
Dois modelos foram propostos para explicar o mecanismo através dos quais
os ácidos graxos ativam o transporte de prótons via UCP: o modelo tamponante
(Winkler e Klingenberg, 1994) e o modelo protonoforético (Garlid et al., 1996; 1998;
2000). O modelo tamponante (Figura 2A) propõe que os ácidos graxos se ligam a
sítios localizados junto ao canal de prótons da UCP, formado por dois resíduos de
histidina, criando grupos aceptores/doadores de elétrons que facilitariam o transporte
de H
+
. Nesse contexto, mutações introduzidas nos resíduos His145 e His147
(correspondentes ao citado canal de prótons) são capazes de abolir o transporte de
prótons pela UCP1 de mamíferos (Bienengraeber et al., 1998). Existem, entretanto,
controvérsias em relação ao modelo tamponante, uma vez que as UCPs de plantas não
apresentam resíduos de histidina nessas posições e continuam capazes de realizar o
desacoplamento e o transporte de prótons dependente de ácidos graxos livres (Ježek et
al., 1996; 1997). O mesmo é verdadeiro para a UCP2 de mamíferos.
No modelo protonoforético (Figura 2B), as proteínas desacopladoras
mitocondriais funcionam como um carreador de ânions, exportando ácidos graxos
livres desprotonados para monocamada externa da membrana mitocondrial interna, os
quais posteriormente penetram na monocamada interna na forma protonada por um
23
mecanismo de flip-flop, deixando um próton na matriz mitocondrial para cada ciclo de
transporte (Garlid et al., 1996, 1998; 2000; Ježek et al., 1997). Uma forte evidência
para este modelo de flip-flop foi observada em experimentos de reconstituição da
UCP1 nativa, nos quais o undecanesulfonate (pK~2, um ânion em pH neutro) foi
transportado pela UCP1 (Garlid et al., 1996; Ježek et al., 1999). A ativação da UCP1
por undecanesulfonate também foi demonstrada em mitocôndrias isoladas, sendo que
o fluxo foi inibido por GDP (Rial et al., 2004).
Figura 2. Modelos propostos para o transporte de prótons pelas UCPs. A) O modelo Tamponante
propõe que os prótons são transportados pelas UCPs e os ácidos graxos seriam co-fatores nesse
processo. B) O modelo Protonoforético propõe o transporte de ácidos graxos na forma aniônica pelas
UCPs. Adaptado de Krauss e colaboradores (2005).
Recentes pesquisas demonstram que o fluxo de prótons mediado pelas UCP1,
UCP2 e UCP3 pode ser ativado por EROs (ou produtos de EROs) (Echtay et al.,
2002; Echtay et al., 2003). A primeira evidência de que EROs influenciam o
desacoplamento mitocondrial mediado pelas UCPs foi fornecida quando se observou
que a condutância de prótons, em presença de Coenzima-Q (Co-Q) no estado reduzido
e de ácidos graxos, era inibida pela adição da enzima superóxido dismutase (Echtay et
al., 2002). A Co-Q foi identificada como um co-fator que regula o transporte de
Espaço
intermembranas
Membrana
interna
Matriz
mitocondrial
UCP1, canal de
translocação
Ânions de
ácidos graxos
24
prótons pelas UCPs (1, 2 e 3) em sistemas reconstituídos (Echtay et al., 2000). A
inibição desse transporte pela superóxido dismutase indica que a Co-Q deve mediar o
desacoplamento através da produção de superóxido. A importância de EROs no
desacoplamento mitocondrial ficou ainda mais evidente quando se constatou o
aumento da condutância de prótons em mitocôndrias isoladas de rim na presença de
xantina plus xantina-oxidase (um sistema exógeno que gera superóxido) (Echtay et
al., 2002). Essa ativação das UCPs na presença de superóxido demonstrou ser
dependente de ácidos graxos, sendo abolida pela superóxido dismutase ou por GDP
(50 µM) (Echtay et al., 2002).
As mitocôndrias representam a principal fonte de geração de EROs
intracelular. A superprodução de EROs culmina na peroxidação de membranas
fosfolipídicas e na produção de aldeídos reativos, como HNE. O HNE pode
quimicamente modificar diversos resíduos de aminoácidos presentes nas proteínas,
como, o grupo sulfídrico da cisteína, o anel imidazol da histidina e o grupo e-amino
das lisinas. Além disso, tem ampla toxicidade biológica provocando a inibição da
síntese de DNA e proteínas, a inativação de enzimas, a modificação de lipoproteínas
de baixa densidade e a modulação da expressão de genes (Esterbauer et al., 1991).
Adicionalmente, Echtay e colaboradores (2003) demonstraram que concentrações
fisiológicas de HNE induzem o desacoplamento mitocondrial mediado pelas UCPs
(UCP1, 2 e 3) e pelo translocador de nucleotídeos adenina (ANT; do inglês adenine
nucleotide translocase). As modificações covalentes geradas por HNE nas UCPs
foram propostas como um mecanismo molecular de ativação das UCPs (Echtay et al.,
2003).
No modelo proposto por Murphy e colaboradores (2003), o superóxido
presente na matriz mitocondrial estimularia as UCPs pela inativação de enzimas que
25
contém centros ferro-enxofre (FeS) como a aconitase, promovendo a liberação de
Fe
2+
. Na presença de peróxido de hidrogênio, os íons de ferro reagem formando
radicais hidroxilas (OH
-
), os quais geram radicais no carbono central dos fosfolipídeos
iniciando o processo de peroxidação lipídica. Foi demonstrado que produtos da
peroxidação lipídica, como o HNE, podem ativar as UCPs de mamíferos e plantas
(Considine et al., 2003; Smith et al., 2004), por um mecanismo de “feedback
negativo”, diminuindo a produção de EROs. Como o HNE pode ativar diferentes
UCPs, Smith e colaboradores (2004) sugeriram que o mecanismo básico de ativação
destas proteínas é conservado.
Apesar de tais evidências, a relação entre o HNE e as proteínas
desacopladoras mitocondriais ainda permanece controversa. Evidências experimentais
obtidas por Shabalina e colaboradores (2006) demonstraram que o HNE pode induzir
um desacoplamento mitocondrial não inibido por nucleotídeos purínicos, logo,
independente da atividade da UCP1. Neste caso, os autores sugerem que a
condutância de prótons observada é na realidade estimulada pelo ácido
hidroxinonenóico gerado durante a oxidação do HNE pela aldeído-desidrogenase.
Esses resultados indicam que a UCP1 parece não estar fisiologicamente envolvida na
defesa contra o estresse oxidativo (Shabalina et al., 2006). Em concordância com os
dados de Shabalina e colaborados (2006), a proteína desacopladora mitocondrial de
Arabidopsis thaliana quando reconstituída em lipossomos promove um fluxo de
prótons induzido por ácidos graxos, o qual não é aumentado na presença de HNE
(Fávaro et al., 2007) (Ver Capítulo I).
Em um estudo recente, Cannon e colaboradores (2006) procuraram investigar
in vivo a regulação da UCP1 por EROs usando como modelo camundongos capazes
de superexpressar a superóxido dismutase. Para comprovar a hipótese de que as UCPs
26
são reguladas por superóxido in vivo como observado em sistemas isolados, esses
autores basearam-se na evidência de que a atividade da UCP1 em animais é
repercutida na forma de uma resposta metabólica específica em resposta a injeções de
norepinefrina (aumento do consumo de oxigênio). Por lógica, se a diminuição dos
níveis de superóxido provocada pela superexpressão da superóxido dismutase deve
conduzir a uma redução da atividade da UCP1 in situ, uma menor reposta à injeção de
norepinefrina nos camundongos capazes de superexpressar a superóxido dismutase
seria esperada. Entretanto, a resposta obtida foi exatamente à mesma quando
comparada com camundongos selvagens, indicando que a atividade da UCP1 não é
regulada por EROs ou por produtos de EROs. Quanto aos outros membros da família
das proteínas desacopladoras, os autores sugerem que novos estudos têm que ser
realizados para confirmar tal possibilidade.
Como mencionado anteriormente, o controle da inibição do fluxo de prótons
por PNs é normalmente adotado como um diagnóstico da atividade das UCPs. A
perda da inibição por PNs pode estar relacionada com a presença de MgCl
2,
já que o
Mg
2+
pode formar um complexo com ATP (Ježek et al., 1988). Essa inibição parece
ser dependente do pH (Borecký et al., 2001b). Um terceiro fator regulatório refere-se
ao estado redox da ubiquinona (Co-Q), já que nenhuma inibição por PNs foi
observada quando Co-Q estava predominantemente no estado reduzido
(Jarmuszkiewicz et al., 2004).
1.4. ATIVIDADE BIOQUÍMICA DE UCPs MUTANTES
Nos últimos anos, experimentos funcionais empregando proteínas mutantes
geraram dados que foram imprescindíveis para esclarecer os mecanismos de
transporte de H
+
pelas UCPs (revisado em Klingenberg e Echtay, 2001). Utilizando a
27
UCP1 de mamíferos como modelo, importantes aminoácidos envolvidos nesse
transporte foram identificados, como por exemplo, uma cisteína C-terminal (Cys304)
capaz de modular tal atividade (González-Barroso et al., 1996).
Um ponto polêmico normalmente abordado nos ensaios de mutação sítio-
dirigida refere-se à importância de um par de histidinas no transporte de H
+
pelas
UCPs. Como mencionado anteriormente, segundo o modelo tamponante, esse par de
histidinas (H145 e H147), localizado no segundo segmento matricial da UCP1, é
postulado essencial para o transporte de H
+
(Bienengraeber et al., 1998). Entretanto,
em estudo empregando proteínas quiméricas entre a UCP1 e a UCP3, realizado por
Hagen e Lowell (2000), foi demonstrado que a ativação da UCP1 por ácidos graxos é
mediada pelo segundo domínio repetido, mesmo quando neutralizadas as cargas de
tais histidinas (H145Q e H147N). Jímenez-Jímenez e colaboradores (2006a)
identificaram que a região essencial para a alta afinidade por ácidos graxos na UCP1 é
o loop matricial contido no segundo domínio repetido. Recentemente, um trecho de
oito aminoácidos da UCP1 (incluindo o referido par de histidinas) foi substituído pelo
trecho homólogo da UCP2 (que não apresenta o par de histidinas), e nenhuma
alteração no transporte de prótons foi observada (Jímenez-Jímenez et al., 2006b).
Mostrou-se ainda que a substituição de Glu134 e Met140 aboliu a permeabilidade
basal de prótons da UCP1 enquanto que a ativação por ácidos graxos foi conservada e
sua inibição por PNs também.
Um resíduo amplamente conservado que também tem influência no
transporte de prótons é a arginina 152, com exceção da UCP3. Quando Arg152 foi
neutralizado em UCP1, uma redução de 50% na afinidade por ácidos graxos bem
como na atividade da proteína foi observada (Urbankóvá et al., 2003). No mesmo
estudo foram realizadas mutações de neutralização de alguns resíduos presentes na
28
primeira α-hélice da UCP1 (Asp27, Thr30 e Asp27), demonstrando que os mesmos
estão envolvidos na atividade de transporte dos ácidos graxos pela UCP1.
Análises de proteínas mutantes também foram fundamentais para identificar
resíduos de aminoácidos envolvidos na ligação aos PNs ou atuando como sensores de
pH durante a ligação. Três argininas conservadas (Arg83, Arg182 e Arg276;
Modrianský et al., 1997; Echaty et al., 2001) e três resíduos adicionais (Phe267,
Lys268 e Gly269; Bouillaud et al., 1994) foram identificados como essências para a
ligação com PN. Por outro lado, um ácido glutâmico em posição 190 da seqüência de
aminoácidos da UCP1
atua como sensor de pH no processo de ligação com os PNs
(Echtay et al., 1997).
Em contraste com os numerosos estudos objetivando elucidar a relação
estrutura-função das UCPs de mamíferos, em plantas, somente dois trabalhos podem
ser encontrados na literatura (ZmUCP - Fávaro et al., 2006 e AtUCP1 - Fávaro et al.,
2007) (Ver Capítulo I).
1.5. PROTEÍNAS DESACOPLADORAS MITOCONDRIAIS DE PLANTAS
A existência de uma proteína desacopladora em plantas só foi evidenciada
em mitocôndrias isoladas de tubérculos de batata (Solanum tuberosum) por Vercesi e
colaboradores em 1995, sendo a mesma denominada PUMP (do inglês plant
uncoupling mitochondrial protein). Entretanto, nos dias atuais, a comunidade
científica adotou a sigla pUCP (do inglês plant uncoupling protein). Dois anos depois,
Ježek e colaboradores (1997) realizaram os primeiros experimentos de reconstituição
em lipossomos com frações mitocondriais extraídas de tubérculos de batata e
enriquecidas com uma possível proteína desacopladora. Demonstrou-se nesse trabalho
que tal proteína era capaz de transportar H
+
por um mecanismo cíclico de ácidos
29
graxos com características bioquímicas muito semelhantes a da UCP1 de tecido
adiposo marrom de mamíferos, exceto na capacidade de transporte de íons Cl
-
.
Nos anos subseqüentes foram clonados os primeiros cDNAs que codificavam
pUCPs em batata (StUCP; Laloi et al., 1997) e em A. thaliana (AtUCP1; Maia et al.,
1998). Após esses dois relatos, diversos cDNAs que codificam para pUCPs foram
identificados e isolados em diferentes espécies vegetais (revisado em Vercesi et al.,
2006), incluindo dicotiledôneas [StUCP em batata (Laloi et al., 1997); AtPUMP1 e 2
em A. thaliana (Maia et al., 1998, Watanabe et al., 1999); SfUCP em repolho (Ito et
al., 1999) e HmUCPa em Helicodiceros muscivorus (Ito et al., 2003)], e
monocotiledôneas [WhUCP em trigo (Murayama e Handa, 2000), OsUCP em arroz
(Watanabe et al., 2002), ZmPUMP em milho (Brandalise et al., 2003a)].
Borecký e colaboradores (2001b) realizaram a mais completa caracterização
bioquímica de uma pUCP. Nesse trabalho, a AtUCP1 foi expressa em Escherichia
coli e uma fração enriquecida foi reconstituída em lipossomos. O fluxo de prótons
observado foi induzido por ácidos graxos livres e inibido por PNs de maneira
dependente do pH. O mesmo sistema de reconstituição também foi utilizado para
caracterizar bioquimicamente a primeira pUCP de uma monocotiledônea (Fávaro et
al., 2006). Nesse caso, verificou-se que o fluxo de prótons induzido por ácido
linoléico mediado pela ZmUCP apresentou valores de K
m
e V
max
próximos àqueles
descritos para outras UCPs isoladas de plantas dicotiledôneas (Borecký et al., 2001b).
A cinética de inibição para essa proteína demonstrou uma inibição mista tipo não
competitiva para PNs. Em 2007, um estudo abrangente de relação estrutura-função da
pUCP de A. thaliana foi publicado (Fávaro et al., 2007) (Ver Capítulo I).
Análises recentes in silico identificaram famílias multigênicas codificando
pUCPs em A. thaliana (seis genes denominados AtUCP1-6) e cana-de-açúcar (cinco
30
genes denominados SsUCP1-5) (Borecký et al., 2006). No estudo conduzido por
Borecký e colaboradores, o perfil de expressão desses genes em diferentes
órgãos/tecidos foi investigado. Em Arabidopsis, dos seis genes descritos, três
(AtUCP1, AtUCP4 e AtUCP5) apresentaram expressão ubíqua, um (AtUCP2) foi
expresso exclusivamente em sílica verde e raiz, e outro (AtUCP3) detectado
exclusivamente em raiz. Por outro lado, não foi possível detectar os transcritos do
gene AtUCP6, sugerindo tratar-se de um pseudogene ou de um gene com níveis muito
baixos de expressão. Os genes AtUCP2 e AtUCP6 se encontram nos segmentos
terminais opostos do cromossomo 5. Em função de tais genes estarem localizados
próximos às regiões duplicadas do genoma de Arabidopsis, foi sugerido que os
mesmos tenham surgido por eventos de duplicação. Os transcritos correspondentes
aos genes AtUCP4 e AtUCP5 foram os mais abundantes.
Em cana-de-açúcar, uma análise in silico no banco de dados do SUCEST
(http://sucest.lad.dcc.unicamp.br) mostrou um maior acúmulo de transcritos das
SsUCPs em bibliotecas de cDNA geradas a partir de tecidos proliferativos ou
altamente fotossintetizantes (gemas laterais ou flores imaturas), sugerindo uma
importância funcional das pUCPs nesses tecidos (Borecký et al., 2006).
Estudos de expressão gênica têm demonstrado que as pUCPs têm sua
expressão modulada em diversas situações ambientais. A resposta à exposição à baixa
temperatura demonstra a existência de dois grupos distintos de genes: os induzidos i.e.
StUCP em batata (Laloi et al., 1997), AtUCP1, AtUCP4 e AtUCP5 em A. thaliana
(Borecký et al., 2006), SsUCP4 e SsUCP5 em cana-de-açúcar (Borecký et al., 2006) e
SfUCP em repolho (Ito et al., 1999); e os que não respondem a este tipo de indução
i.e. WhUCP em trigo (Murayama e Handa, 2000), AtUCP2 em A. thaliana (Watanabe
et al., 1999; Borecký et al., 2006), arroz (Watanabe e Hirai, 2002), SsUCP1, SsUCP2
31
e SsUCP3 em cana-de-açúcar (Borecký et al., 2006) e ZmUCP em milho (Brandalise
et al., 2003a). A indução da expressão das pUCPs em resposta a baixas temperaturas
gera evidências de um possível envolvimento dessas proteínas com a geração de calor.
Embora a função termogênica nunca tenha sido evidenciada como no caso da UCP1
de mamíferos, um estudo recente relata que a co-expressão das proteínas dissipadoras
de energia (oxidase alternativa e UCP) nos espádices da planta termogênica
Symplocarpus seria responsável pela geração de calor nesse órgão especializado
(Onda et al., 2008).
Além da indução por baixas temperaturas, algumas pUCPs são induzidas em
diferentes situações de estresse como ferimento (Cheong et al., 2002), ataque de
patógenos (Van Wees et al., 2003; Whitham et al., 2003), estresse salino e osmótico
(Trono et al., 2006), programa de morte celular induzido por calor (Swidzinski et al.,
2002) bem como em resposta a determinados fitohormônios como por exemplo o
ácido abscísico (ABA) (Seki et al., 2002). Situações ambientais adversas como as
descritas estimulam a produção celular de EROs pelos aparatos fotossintéticos e pela
respiração mitocondrial, sendo bastante provável que os genes que codificam pUCPs
sejam induzidos em tais situações.
Corroborando tal hipótese, diversas linhas têm evidenciado que a principal
função do desacoplamento da respiração mitocondrial mediado pelas pUCPs é
relacionada à produção de EROs (Kowaltowski et al., 1998; Pastore et al., 2000). A
geração de EROs pela mitocôndria é um processo continuo e fisiológico em condições
aeróbicas. Uma pequena fração (até 2%) do oxigênio sofre redução monoeletrónica,
gerando anions de superóxido (O
⋅
2
−
) (Liu et al., 1997). Apesar de sua moderada
reatividade em solução aquosa, o O
⋅
2
−
pode gerar EROs altamente citotóxicas como
H
2
O
2
e radicais hidroxilas (OH
⋅
). Em condições fisiológicas, as mitocôndrias possuem
32
um eficiente sistema de defesa antioxidante, representado pelas enzimas superóxido
dismutase, peroxidase glutadiona, redutase glutadiona, NAD(P) transhidrogenase e
outros compostos como glutationa (GSH), NADPH, vitaminas E e C (Vercesi e
Hoffmann, 1993). Sob condições desfavoráveis, entretanto, ocorre uma maior
exigência quanto à capacidade do sistema antioxidante celular (Vercesi et al., 1997), e
na maioria das vezes, a célula é incapaz de suprir tal demanda tendo como resposta a
intolerância/impotência funcional do sistema, o que pode causar uma disfunção
mitocondrial (Vercesi e Hoffmann, 1993).
No trabalho de Dlasková e colaboradores (2006) observou-se, em sementes
de milho germinadas e submetidas a estresse salino, um aumento na transcrição do
gene ZmUCP1, cujos níveis de proteína estariam neutralizando o aumento da
produção de EROs sob condições de estresse. Em mitocôndrias isoladas de trigo a
atividade da pUCP em resposta a estresse osmótico em trigo demonstrou ser
modulada por EROs através de um mecanismo de retroalimentação, sugerindo que a
pUCP deve atuar, de forma indireta, como um sistema antioxidante de defesa (Pastore
et al., 2007). Nesse contexto, alguns genes que codificam pUCP apresentam um maior
acúmulo de transcritos em plantas expostas a agentes que geram estresse oxidativo,
como menadiona e H
2
O
2
(Brandalise et al., 2003a; Desikan et al., 2001). No trabalho
de Brandalise e colaboradores (2003a) foi observada a indução do gene ZmUCP (ou
ZmPUMP) em resposta a estresse oxidativo gerado pela aplicação exógena de
menadiona ou peróxido de hidrogênio. Em sintonia com tais observações foi
verificada que a superexpressão da AtUCP1 em plantas transgênicas de tabaco
conduziram ao aumento da tolerância ao estresse oxidativo (Brandalise et al., 2003b).
Já em um estudo com abordagem proteômica em que se avaliou o impacto de
estresses ambientais no mitoproteoma da ervilha, um aumento no conteúdo da pUCP
33
em resposta a seca, mas não a baixa temperatura e ao estresse oxidativo, foi observado
(Taylor et al., 2005).
Por outro lado, segundo Trono e colaboradores (2006), plântulas jovens de
trigo quando submetidas a estresse salino e osmótico não demonstraram um relevante
aumento no nível de expressão gênica das duas isoformas de pUCPs presentes nessa
espécie. Entretanto, um aumento na atividade desacopladora dos produtos gênicos
correspondentes foi observado, indicando que o estresse em questão deve modular a
atividade e não a expressão dos genes relacionados.
Alguns relatos da literatura demonstram também que alguns genes que
codificam pUCPs são regulados temporalmente, especialmente durante o processo de
maturação de frutos. Uma expressão fortemente aumentada desses genes foi
observada em frutos de manga em estágio de senescência (Considine et al., 2001) e
nos estágios tardios da maturação de frutos de tomate mantidos na própria planta
(Holtzapffel et al., 2002). Estes dados corroboram com o maior acoplamento
encontrado em mitocôndrias isoladas de tomates verdes quando comparado com
mitocôndrias de tomates vermelhos (Costa et al., 1999) e sugerem uma participação
dessa proteína em determinados estágios da maturação de frutos climatéricos.
Diante do exposto é possível concluir que a função fisiológica das pUCPs
ainda não está totalmente estabelecida, havendo indícios de sua participação em
diferentes processos fisiológicos que vão desde a geração de calor ao controle indireto
da produção de EROs. Recentemente uma evidência da participação da AtUCP1 na
regulação da energia metabólica in planta foi fornecida (Sweetlove et al., 2006).
Plantas de Arabidopsis onde o gene AtUCP1 foi nocauteado apresentaram restrições
fotossintéticas que resultaram em uma reduzida taxa de assimilação do carbono. A
ausência do gene AtUCP1 resultou ainda em estresse oxidativo localizado, mas não
34
afetou a capacidade da planta em tolerar determinados estresses abióticos (Sweetlove
et al., 2006).
1.6. DESACOPLAMENTO MITOCONDRIAL EM PLANTAS
A taxa de respiração e da síntese de ATP pode ser regulada pela
disponibilidade de substrato (equivalentes reduzidos, ADP e O
2
) e pela diminuição do
acoplamento entre a respiração e a fosforilação. A regulação por substratos é
complexa, desde que suas concentrações são raramente ideais, porque o metabolismo
dos eucariontes tem uma variação na demanda de energia (Borecký e Vercesi, 2005).
Em plantas, o acoplamento entre respiração e fosforilação pode ser regulado por dois
processos: pelo sistema de dissipação do potencial redox (mecanismo intrínseco)
representado pela Oxidase Alternativa (AOx) e pela NAD(P)H desidrogenase
(revisado em Rasmusson et al., 2004) ou pelo sistema de dissipação do potencial
eletroquímico (sistema extrínseco) representado pela UCP. O mecanismo de
regulação intrínseca previne a formação do gradiente eletroquímico de prótons
durante a respiração, enquanto que a regulação extrínseca é mediada pela dissipação
do gradiente eletroquímico de prótons sem a participação da ATP-sintase (Borecký e
Vercesi, 2005). Ambos os mecanismos conduzem para o mesmo efeito final, ou seja,
dissipação da energia e diminuição na eficiência de fosforilação. De maneira geral, o
desacoplamento deve ser benéfico na redução da produção de EROs pela cadeia
respiratória e prevenindo desta forma o estresse oxidativo (Maxwell et al., 1999).
As AOxs são proteínas mitocondriais de ampla distribuição nos organismos
eucariontes, como plantas (Elthon et al., 1989; Siedow e Umbach, 1995), fungos
(Lambowitz et al., 1989; Sakajo et al., 1991) e outros (Clarkson et al., 1989;
Jarmuszkiewicz et al., 1997), exceto dos animais. A AOx funciona na forma dimérica
35
e catalisa a ubiquinol-oxigênio oxidação/redução que não é ligada ao bombeamento
de prótons, logo não contribui para a formação do gradiente eletroquímico de prótons
(Milani et al., 2001). A atividade dessa proteína depende da disponibilidade da
concentração total de ubiquinona (Co-Q) na membrana bem como da concentração
atual de O
2
na célula. A AOx torna-se ativa somente quando a concentração de Co-Q
reduzida está entre 40-50%, e então sua atividade aumenta com o aumento do nível de
Co-Q reduzida (Dry et al., 1989). Além disso, a afinidade da AOx a O
2
depende da
espécie, do tecido e da idade da planta (revisado em Borecký e Vercesi, 2005). Os
dímeros da AOx podem ser covalentemente ligados por uma ponte dissulfeto e são
sensíveis às propriedades do estado redox. Quando os dímeros da AOx encontram-se
no estado reduzido, a sua atividade é de quatro a cinco vezes maior do que quando os
mesmos estão no estado oxidado (Umbach et al., 1994; Moore et al., 1995). A
atividade da AOx pode ser induzida por ácido salicílico (Maxwell et al., 2002),
cianeto e antimicina A (Vanlerberghe et al., 1994), e inibida pelos primários ácidos
hidroxâmicos (Schonbaum et al., 1971) como o benzohidroxâmico (BHAM), e por
ácidos graxos (Minagawa et al., 1992; Sluse e Jarmuszkiewicz, 2000). Uma das
funções fisiológicas bem caracterizada da AOx trata do seu papel termogênico,
descrito em espádices de Arum maculatum (Moore e Siedow, 1991), Symplocarpus
foetidus (Berthold e Siedow, 1993), e Sauromatum guttatum (Rhoads e McIntosh,
1991). A energia para a termogênese é fornecida pelo aumento da respiração
mitocondrial mediada pela AOx. Em plantas não termogênicas, como ressaltado
anteriormente, uma das supostas funções da AOx é a prevenção da formação de EROs
e a tolerância a estresses (revisado em Borecký e Vercesi, 2005; Arnholdt-Schmitt et
al., 2006).
36
A AOx e a UCP são reguladas em direções opostas por ácidos graxos livres
(Sluse et al., 1998), sendo esses indutores do sistema extrínseco e inibidores do
sistema intrínseco. Onda e colaboradores (2008) observaram que na planta
termogênica Symplocarpus renifolius a AOX encontra-se ativa em baixas
concentrações de ácido linoléico (menores que 5 µM). Nesse caso, como as UCPs e a
AOx não devem trabalhar simultaneamente com suas atividades máximas, uma
diferença fisiológica funcional entre elas fica evidente. Entretanto, em outra planta
termogênica do mesmo gênero, S. foetidus, uma pUCP naturalmente desprovida de
sua quinta região transmembrana e insensível à regulação por nucleotídeos foi descrita
(Ito, 1999; Ito et al., 2006). Recentemente, Onda e colaboradores (2008) observaram
que nos espádices de S. renifolius, a referida isoforma é co-expressa com a AOx e que
a ação cooperativa de ambas é determinante para a produção de calor nesse órgão. Da
mesma forma, na ameba de vida livre Acanthamoeba castellanii, ambas as proteínas
podem atuar simultaneamente com suas atividades máximas já que a AOx não é
inibida por ácidos graxos e a UCP é minimamente inibida por PNs (Czarna e
Jarmuszkiewicz, 2005). Nesse caso um efeito cooperativo é observado.
Diante das lacunas ainda existentes sobre as funções e propriedades
bioquímicas das pUCPs, o presente trabalho procurou investigar alguns desses
aspectos visando proporcionar um maior entendimento sobre tais proteínas.
37
2. OBJETIVOS
A presente tese teve por objetivos:
Realizar a caracterização bioquímica da proteína desacopladora mitocondrial de
milho (ZmUCP);
Empreender estudos de relação estrutura-função em pUCPs;
Verificar a influência de HNE na atividade desacopladora de pUCPs;
Analisar a expressão dos diferentes genes que codificam pUCPs em Arabidopsis
thaliana em resposta aos estresses salino e osmótico e a fitohormônios;
Proceder à caracterização funcional das regiões promotoras dos genes AtUCP1 e
AtUCP2.
38
Capítulo I. Caracterização Bioquímica das pUCPs e Estudos de
Estrutura-função
Na presente tese foram gerados dois artigos científicos contendo resultados
referentes à caracterização bioquímica de uma UCP de milho e estudos de estrutura-
função de uma UCP de Arabidopsis.
O primeiro artigo (item I.1) intitulado ZmPUMP encodes a fully functional
monocot plant uncoupling mitochondrial protein whose affinity to fatty acid is
increased with the introduction of a His pair at the second matrix loop foi publicado
na revista Biochemical and Biophysical Research Communications em março de
2006. Nesse estudo, foi empreendida a caracterização bioquímica da proteína
mitocondrial desacopladora de milho (ZmPUMP). Neste estudo, a ZmPUMP foi
expressa em Escherichia coli e solubilizada com detergentes, e então reconstituída em
lipossomos visando estudos cinéticos. O fluxo de prótons induzido por ácido linoléico
(LA) apresentou valores de K
m
e V
max
próximos aos descritos para pUCPs isoladas de
plantas dicotiledôneas (Borecký et al., 2001b). A cinética de inibição para essa
proteína demonstrou uma inibição mista para nucleotídeos purínicos. Adicionalmente,
a fim de investigar o papel de resíduos importantes para o transporte de H
+
, um duplo
mutante de reversão (Lys147His e Ala157His) foi produzido levando-se em
consideração os estudos prévios de mutações sítio-dirigidas em UCP1 (Bienengraeber
et al., 1998). Tais estudos descrevem um importante papel de um par de histidinas
presente na UCP1 de mamíferos, mas ausentes em proteínas desacopladoras de
plantas, no transporte de prótons. Nos ensaios de reconstituição, o duplo mutante
obtido apresentou um aumento de 1,55 vezes da afinidade ao LA.
O segundo artigo (item I.2) intitulado Mutational analysis of Arabidopsis
39
thaliana plant uncoupling mitochondrial protein foi publicado na revista Biochimica
et Biophysica Acta - Bioenergetics em dezembro de 2007. Nesse trabalho foi realizada
a caracterização bioquímica de cinco mutantes da proteína desacopladora
mitocondrial de A. thaliana (AtUCP1). Para tal, mutações pontuais foram introduzidas
na região codificadora da proteína AtUCP1, um membro típico da família de proteínas
desacopladoras. Nesse caso, foram selecionados três resíduos, Lys147, Arg155 e
Tyr269, localizados nas chamadas assinaturas das UCPs (Ježek e Urbánková, 2000) e
dois resíduos, Cys28 e His83, encontrados especificamente em UCPs de plantas. As
mudanças na atividade bioquímica, provocadas pelas mutações pontuais, foram
avaliadas após reconstituição em lipossomos. O resíduo Arg155 parece ser crucial
para a afinidade ao LA, enquanto que o resíduo His83 tem uma importante função na
atividade de transporte da AtUCP1. Os resíduos Cys28, Lys147 e também Tyr269
demonstraram ser essenciais para a correta função da proteína, sendo que suas
substituições afetaram respectivamente, a afinidade ao LA e sua atividade de
transporte, ou a sensibilidade aos inibidores (nucleotídeos purínicos - ATP e GDP).
Uma observação interessante é que a substituição do resíduo Cys28 levou a uma
redução de 4,0 vezes dos efeitos inibitórios do ATP, enquanto que a proteína contendo
a mutação Tyr269Phe exibiu um aumento de 2,8 vezes para a sensibilidade a ATP,
corroborando os resultados obtidos com o mutante de reversão Phe267Tyr da UCP1
de mamíferos (Bouillaud et al., 1994). Além de avaliar os efeitos de tais mutações na
atividade bioquímica da proteína, nós decidimos investigar os efeitos do HNE como
um indutor das proteínas descopladoras mitocondriais de plantas. Em concordância
com os dados de Shabalina e colaborados (2006), foi possível observar que o HNE
não é capaz de alterar o transporte de prótons via proteína desacopladora mitocondrial
de A. thaliana em sistema reconstituído.
40
I.1. Artigo 1: ZmPUMP encodes a fully functional monocot plant uncoupling
mitochondrial protein whose affinity to fatty acid is increased with the introduction
of a His pair at the second matriz loop
ZmPUMP encodes a fully functional monocot plant
uncoupling mitochondrial protein whose affinity to fatty acid is
increased with the introduction of a His pair at the second matrix loop
Regiane Degan Fa
´
varo
a
, Jiri Borecky
´
b
,De
´
bora Colombi
a
, Ivan G. Maia
a,
*
a
Instituto de Biocie
ˆ
ncias, Departamento de Gene
´
tica, UNESP, Botucatu, SP, Brazil
b
Laborato
´
rio de Bioenerge
´
tica, Faculdade de Cie
ˆ
ncias Me
´
dicas (NMCE), UNICAMP, Campinas, SP, Brazil
Received 14 March 2006
Abstract
Uncoupling proteins (UCPs) are specialized mitochondrial transporter proteins that uncouple respiration from ATP synthesis. In this
study, cDNA encoding maize uncoupling protein (ZmPUMP) was expressed in Escherichia coli and recombinant ZmPUMP reconstitut-
ed in liposomes. ZmPUMP activity was associated with a linoleic acid (LA)-mediated H
+
efflux with K
m
of 56.36 ± 0.27 lM and V
max
of
66.9 lmol H
+
min
À1
(mg prot)
À1
. LA-mediated H
+
fluxes were sensitive to ATP inhibition with K
i
of 2.61 ± 0.36 mM (at pH 7.2), a val-
ue similar to those for dicot UCPs. ZmPUMP was also used to investigate the importance of a histidine pair present in the second matrix
loop of mammalian UCP1 and absent in plant UCPs. ZmPUMP with introduced His pair (Lys155His and Ala157His) displayed a 1.55-
fold increase in LA-affinity while its activity remained unchanged. Our data indicate conserved properties of plant UCPs and suggest an
enhancing but not essential role of the histidine pair in proton transport mechanism.
Ó 2006 Elsevier Inc. All rights reserved.
Keywords: Uncoupling mitochondrial protein; UCP; Proton transport; Functional reconstitution; Mitochondrial carriers; Plant mitochondria; Maize
Mitochondrial inner membrane uncoupling proteins
(UCP) are specialize d free fatty acid (FFA)-linked H
+
recy-
cling proteins, returning protons that have been expelled
from matrix by the respiratory chain, thus promoting a
non-phosphorylating bypass [1,2]. The first characterized
uncoupling protein from brown adipose tissues, UCP1,
promotes heat production through regulated mitochondri-
al uncoupling [3,4].
The finding of a UCP-like protein in potato [5] denoted
that all UCPs probably evolved from a common ancestral
protein preceding the divergence of animals and plants [6] .
Despite several years of biochemical and physiological
experimentation, the precise role of the uncoupling pro-
teins in plants still remains unclear. It has been proposed
that UCP-mediated mild uncoupling of mitochondrial res-
piration could regulate reactive oxygen species production
[7,8]. Indeed, over-expression of an uncoupling protein
from Arabidopsis thaliana (AtPUMP1) in transgenic plants
led to a higher tolerance to oxidative stress [9]. Further sup-
port to this antioxidant role was recently provided in mam-
mals and plants [10,11]. Energy-dissipating systems such as
the one related to uncoupling proteins could also have
important implications in general energy metabolism [1,6].
Several cDNAs encoding UCP-like proteins have been
identified in a variety of plant species, in both dicots
(AtPUMP1 and 2 in Arabidopsis [12,13], StUCP in potato
[14], SfUCP in skunk cabbage [15]) and monocots
(WhUCP in wheat [16], OsUCP in rice [17], and ZmPUMP
in maize [18]). Although the genes are widely present in
various plant species, only dicot proteins have been
biochemically and functionally characterized as uncoupling
proteins at present [14,19–22]. In fact, a survey of
the literature reveals only one report demonstrating an
activity reminiscent of UCP in a monocot species [23]. Pre-
liminary biochemical data were derived from reconstitution
0006-291X/$ - see front matter Ó 2006 Elsevier Inc. All rights reserved.
doi:10.1016/j.bbrc.2006.03.132
*
Corresponding author. Fax: +55 14 3815 3744.
E-mail address: [email protected] (I.G. Maia).
www.elsevier.com/locate/ybbrc
Biochemical and Biophysical Research Communications 344 (2006) 194–199
BBRC
experiments using UCP-enriched fractions purified from
potato and tomato [19,20]. Subsequently, the uncoupling
activity was investigated using isolated cDNAs and heter-
ologous expression systems. The uncoupling protein from
potato (StUCP) , for example, was expressed in yeast and
shown to promote proton transport [14]. A more precise
biochemical characterization was achieved using recombi-
nant AtPUMP1 expressed in Escherichia coli and reconsti-
tuted into liposomes [21]. In this regard, the major
properties of the uncoupling activity of plant UCPs
matched those described for their mammalian counterpart,
i.e., stimulation by FFA and specific inhibition by purine
nucleotides. However, more recent data suggest that super-
oxide is involved in the activation of StUCP [11].
Whereas the dicot proteins are functionally well char-
acterized, for instance there is no experimental evidence
showing whether UCPs from monocots keep the same
regulatory properties. A common feature of all known
plant UCPs is the absence of a histidine pair in the
matrix loop of the second repeat domain of the protein.
These residues have been shown, by mutagenesis studi es,
to be crucial for the FFA-activated proton transport of
mammalian UCP1 [24,25]. A Lys at position 155 and
an Ala at position 157 replace both histidines in the pri-
mary amino acid sequence of ZmPUMP.
We have recently isolated a cDNA (termed ZmPUMP)
encoding an uncoupling protein from maize (ZmPUMP)
[18]. ZmPUMP expression is induced by oxidative stress
and is cold insensitive [18]. This repres entative monocot
uncoupling protein was expressed in E. coli inclusion
bodies in order to evaluate its biochemical activity and
functional relationships with proteins from dicot plants.
Furthermore, we sought to investigate whether the intro-
duction of a histidine pair in the second matrix loop seg-
ment of ZmPUMP, as originally found in UCP1, would
affect the kinetic properties of the protein. For that, a
ZmPUMP substitution mutant carrying a His pair at the
corresponding segment was biochemically characterized.
Materials and methods
Materials. Linoleic acid (LA), nucleotides, and other chemicals were
from Sigma, undecanesulfonate from Lancaster (UK), and Bio-Beads SM2
from Bio-Rad. Fluorescent probe 6-methoxy-N-(3-sulfopropyl)quinolini-
um (SPQ) was from Molecular Probes. Hybond N membranes and
Hyperfilms MP were from Amersham and the CPSD (disodium
3-(4-methoxyspiro{1.2-dioethane-3.2
0
-(5
0
-chloro)tricyclo [3.3.1.1
3.7
] dec-
ane} -4-yl)phenyl phosphate) was from Applied Biosystems (Tropix).
Construction of the ZmPUMP expression vector. A plasmid carrying
the ZmPUMP cDNA [18] was used as template for polymerase chain
reaction (PCR) amplification. The ZmPUMP coding region was amplified
in a standard PCR using the gene-specific primers ZmNde (5
0
-GGAA
TTCCATATG
CCAGGGGACCACGGC-3
0
) and ZmBam (5
0
-CGGGA
TCCTCAGCTTGTCGCTTTCC-3
0
). The forward and reverse primers
contained NdeI and BamHI restriction sites (underlined), respectively, for
direct cloning of the PCR product. The amplified DNA fragment was
digested with NdeI/BamHI, gel purified, and cloned into identically
digested pET-28b (Novagen) for protein expression. The resulting con-
struct (pET:ZmPUMP) was sequenced in an ABI-PRISM 3100 automatic
sequencer (Perkin-Elmer).
Expression of ZmPUMP, isolation of inclusion bodies, and analysis of
the recombinant protein. Escherichia coli BL21(DE3) pLysS cells were
transformed with the vector pET:ZmPUMP. Transformed cells were
grown in Circle Grow medium containing kanamycin (20 lg/ml) and
chloramphenicol (25 lg/ml) at 37 °C and induced by 1 mM isopropyl-b-
D-
thiogalactopyranoside (IPTG) for 3 h. The cells were harvested by low-
speed centrifugation, resuspended in lysis buffer [100 mM Tris–HCl, pH 7,
0.5 mM EDTA, and 5 mM dithiothreitol (DTT)], and submitted to six
freezer-thaw cycles (liquid nitrogen/37 °C). Further lysis of the cells and
break of genomic DNA were achieved by sonication (6· 30 s). The sus-
pension was centrifuged (20,000g for 30 min), the pellets of inclusion
bodies were collected and washed three times with 1 M urea containing 1%
Triton X-100. The denaturants were washed out in final wash buffer
(50 mM Tris–HCl, pH 7.0, 1 mM EDTA, and 2 mM DTT).
The expressed protein was analyzed by SDS–PAGE (0.1% SDS, 12%
polyacrylamide) stained with Coomassie blue. Immunoblot assays were
performed according to standard protocols using anti-AtPUMP1 poly-
clonal antibodies [21] diluted 1:1000. The bands were detected by auto-
radiography using CSPD (1:2000).
Reconstitution of ZmPUMP and fluorescent monitoring of H
+
fluxes.
Reconstitution of the recombinant protein was performed essentially as
described by Borecky
´
et al. [21] with minor modifications. Four milligrams
of inclusion bodies was washed twice in 1 ml of internal medium [IM;
28.8 mM tetraethylammonium N-tris [hydroxymethyl]methyl-2-aminoe-
thanesulfonate (TEA–TES; [TES
À
]
free
= 9.2 mM), pH 7.2, 84.4 mM
TEA
2
SO
4
, and 0.6 mM TEA–EGTA]. The pellet was solubilized in 1 ml of
IM containing 1.67% sodium lauroylsarcosinate and 1% decylpolyoxy-
ethylene (decylPOE) at 4 °C for 2.5 h. The insoluble fraction was removed
by centrifugation. This procedure yielded a crude preparation (with a
negligible contamination by inclusion body proteins) used for
reconstitutions.
Lipid film was prepared from ethyl ether solution of 39 mg egg yolk
lecithin, 1.66 mg cardiolipin, and 0.66 mg phosphatidic acid by stream of
nitrogen. The film was hydrated in 875 ll of IM by vortexing at 50 °C
under nitrogen and solubilized by adding 56 mg of decylPOE. The micelles
were cooled down on ice, mixed with 2 mM SPQ probe plus solubilized
ZmPUMP (lipid/protein ratio of 410:1), and then incubated in a column
of Bio-Beads SM2 at 4 °C for 2.5 h. Proteoliposomes were recovered by
centrifugation. Traces of detergent were removed by reincubation of
proteoliposomes with fresh Bio-Beads for 10 min and recentrifugation.
External SPQ was removed by gel-filtration through Sephadex G25-300
spin column. All columns were pre-washed with IM. The resulting pro-
teoliposomes contained $100 lg of incorporated protein.
H
+
flux assays were based on the quenching of SPQ fluorescence by
TES
À
[26]. Vesicles (30 ll) were added to 1.5 ml of external medium (EM;
28.8 mM TEA–TES [9.2 mM TES
À
], pH 7.2, 84.4 mM K
2
SO
4
, and
0.6 mM TEA–EGTA). Linoleic acid was added after 20 s and, 20 s later,
an H
+
efflux was initiated by 1.3 lM valinomycin. The fluorescence was
calibrated to [H
+
] by the addition of 10 aliquots of 6 lmol of KOH in the
presence of 1.5 lM nigericin to proteoliposomes suspended in IM. Fluo-
rescent data were converted into ‘‘H
+
traces’’ by fitting with modified
Stern–Volmer equation
½H
þ
¼ð1=K
q
ÞÁðF
0
À F Þ=ðF À LÞ; ð1Þ
where F is the experimental and F
0
, the unquenched fluorescence. Param-
eters K
q
(quenching constant) and L (background, mostly light scattering)
were obtained by linear regression of F vs. (F
0
À F)/[KOH] plot.
Rates of H
+
efflux were derived from ‘‘H
+
traces’’, multiplied by the
internal proteoliposome volume (V, estimated from volume distribution of
the SPQ [2]), and corrected for protein content to yield final rates in
lmol H
+
min
À1
(mg prot)
À1
. When expressed per lmol of PUMP dimer,
rates represented the minimum values for the turnover number, since not
all of the protein was inserted into the vesicles. The inhibition kinetic of
ATP was determined by Lineweaver–Burk analysis varying both the LA
(13.31, 19.95, 33.23, and 39.87 lM) and ATP (1.0, 1.33, 2.00, and
4.00 mM) concentrations.
Mutagenesis, bacterial expression, and reconstitution of mutant
ZmPUMP. A ZmPUMP double substitution mutant (K155H/A157H)
R.D. Fa
´
varo et al. / Biochemical and Biophysical Research Communications 344 (2006) 194–199 195
was prepared using the QuickChange site-directed mutagenesis kit (Strat
agene) with pET:ZmPUMP as a template. A specific primer (5
0
CAGG
CCGAGGGCCACCTTCACCCTGGTGTGCCA3
0
) was designed to
mutate the ZmPUMP codons Lys155 and Ala157 to a His codon. The
presence of the mutations was confirmed by DNA sequencing. Expression
in E. coli and reconstitution of the mutant protein were accomplished as
described for wild type ZmPUMP.
Results
Expression of wild type ZmPUMP in E. coli
The entire reading frame of ZmPUMP was cloned into
the expression vector pET-28b under the control of an
IPTG-inducible promoter and E. coli BL21(DE3) cells
were transformed with this construct in order to generate
a recombinant protein. The induction of the cells at
37 °C for 3 h produced a polypeptide bearing a His tag
with an apparent molecular mass of 36 kDa (Fig. 1A, com-
pare lanes 1 and 2) that was present in the inclusion body
fraction (Fig. 1A, compare lanes 3 and 4). Inclusion bodies
were solubilized to obtain an enriched fraction of the
recombinant ZmP UMP (Fig. 1A, lane 5). The identity of
the recombinant protein was confirmed by immunoblot
analysis employing anti-AtPUMP1 polyclonal an tibodies
[21]. A reactive band with the expected mobility (36 kDa)
was observed (Fig. 1B, compare lanes 3 and 4). The small
amounts of protein detected in the non-indu ced bacterial
extract were attributed to the basal level of expression nor-
mally observed.
Kinetics of linoleic acid-induced ZmPUMP-m ediated H
+
efflux in proteoliposomes
Fig. 2 illustrates the H
+
fluxes in proteoliposomes con-
taining reconst ituted wild type ZmPUMP. The addition
of 33.23 lM LA caused vesicle acidification, indicating
the redistribution of LA molecules in both leaflets of the
lipid bilayer leading to internal H
+
release. H
+
efflux that
represented FA cycling [2,22,27–30] was initiated by addi-
tion of 1.3 lM valinomycin.
The kinetics of LA cycling mediated by ZmPUMP was
evaluated by varying the total LA concentration. Protein-
independent basal H
+
fluxes were simulated in protein-free
liposomes, under identical LA and valinomycin concentra-
tions and membrane potential. Data, corrected for the dif-
ferent (lower) volume of proteoliposome s, were used for a
theoretical estimation of the basal H
+
flux in proteolipo-
somes. Evaluation of the kineti cs of LA cycling mediated
by ZmPUMP produced a typical dose response (Fig. 3).
The corresponding Eadie–Hofstee plot yielded a K
m
of
56.36 ± 0.27 lM when using an iterative procedure for
evaluating the proteoliposomal basal H
+
flux (Fig. 3; inset)
giving a V
max
of 66.9 lmol H
+
min
À1
(mg prot)
À1
that cor-
responded to minimum turnover numbers of 12.6 s
À1
for
dimeric ZmPUMP.
Inhibition of fatty acid-induced ZmPUMP-mediated H
+
efflux by ATP
The inhibition kinetics for ATP in proteoliposomes
containing wild type ZmPUMP were determined in the
presence of various concentrations of LA and ATP.
Lineweaver–Burk analysis revealed a special mixed
Fig. 1. Analysis of the expression of ZmPUMP by SDS–PAGE. (A)
Coomassie blue staining. Lane M, protein markers (sizes in kDa); lanes 1
and 2, total proteins of non-induced and IPTG-induced E. coli cells,
respectively; lanes 3 and 4, total proteins of soluble and inclusion body
fractions, respectively; lane 5, ZmPUMP solubilized from inclusion
bodies. The position of ZmPUMP is indicated (arrow). (B) Immunoblot
analysis using anti-AtPUMP1 polyclonal antibodies. C, solubilized
AtPUMP1 [21] used as positive control; lanes 1 and 2, total proteins of
non-induced and IPTG-induced E. coli cells expressing AtPUMP1; lanes 3
and 4, total proteins of non-induced and IPTG-induced E. coli cells
expressing ZmPUMP as shown in (A).
Fig. 2. Typical H
+
fluxes in proteoliposomes reconstituted with wild type
ZmPUMP. The H
+
traces are depicted for a H
+
efflux in proteoliposomes
containing ZmPUMP induced by 53.12 lM linoleic acid (A), 33.23 lM
linoleic acid (B), and 33.23 lM linoleic acid plus 4 mM ATP (C), in the
presence of 1.3 lM valinomycin at approximately 179.5 mV.
196 R.D. Fa
´
varo et al. / Biochemical and Biophysical Research Communications 344 (2006) 194–199
inhibition known as noncompetitive inhibition where a is
equal to a
0
, since the K
i
values were virtually unchanged
in the range of LA concentrations used. Therefore, the
inhibitory eff ect of ATP yielded a dynamic K
i
of
2.61 ± 0.36 mM at pH 7.2 (Fig. 4), when considered the
even or random orientation of ZmPUMP molecules
[2,19,27,30].
Effect of the K155H/A157H mutation on ZmPUMP activity
The K155H/A157H double mutant was over-expressed
in inclusion bodies in E. coli, purified and reconstituted in
proteoliposomes as described for wild type ZmPUMP.
Kinetic analyses (Fig. 3) showing that the doubly mutated
protein exhibited 1.55-fold higher LA-affinity (K
m
=
36.32 ± 0.51 lM) than wild type ZmPUMP (K
m
=
56.36 ± 0.27 lM) while its corresponding V
max
value was
not altered (Table 1). Thus, a clear increase in the relative
efficiency of H
+
transport of the mutant protein as com-
pared to wild type ZmPUMP was observed (Table 1). The
K155H/A157H mutant also displayed a modest increase
in sensitivity to ATP inhibition (about 1.3-fold; Table 1).
Discussion
In a previous study, we identified a gene coding for a
maize uncoupling protein [18]. In contrast to genes
Fig. 4. Lineweaver–Burk plots for the mixed ATP inhibition of FA-induced H
+
fluxes mediated by wild type ZmPUMP (A) or the K155H/A157H mutant
(B) at pH 7.2. The employed ATP concentrations were: 0 (h,j), 1.0 (s,d), 1.33 (n,m), 1.99 (,,.), and 3.99 mM (Æ,Ç). Inhibition kinetic analysis of wild
type ZmPUMP yielded a derived K
i
of 2.61 ± 0.36 mM. Inhibition kinetic analysis of the K155H/A157H double mutant yielded a derived K
i
of
2.03 ± 0.19 mM.
Table 1
Kinetic parameters for H
+
flux in proteoliposomes containing wild type and mutant ZmPUMP
Protein K
m
(lM) V
max
lmol
H
+
min
À1
(mg prot)
À1
K
i
(mM) Relative efficiency lmol H
+
min
À1
(mg prot)
À1
lM
À1
Wild type 56.36 ± 0.27 66.9 2.61 ± 0.36 1.19
K155H/A157H 36.32 ± 0.51 66.83 2.03 ± 0.19 1.84
Fig. 3. Kinetics of LA-induced H
+
fluxes in protein-free liposomes (n)
and proteoliposomes with reconstituted wild type (j) and mutant
ZmPUMP (d). Measurements were conducted in the presence of
1.3 lM valinomycin. The fluxes were calculated per lg of protein to yield
final rates in lmol H
+
min
À1
(mg prot)
À1
. Inset shows Eadie–Hofstee plot
for the kinetics of LA cycling with the kinetic data for H
+
fluxes induced
by LA in proteoliposomes with wild type (j) and mutant (d) ZmPUMP.
R.D. Fa
´
varo et al. / Biochemical and Biophysical Research Communications 344 (2006) 194–199 197
encoding two isoforms of PUMP in rice [17], ZmPUMP
expression resulted in full-length protein product,
ZmPUMP, as detected immunogenetically [18]. In the pres-
ent study, we biochemically charact erized ZmPUMP as a
recombinant protein expressed in E. coli. ZmPUMP was
solubilized from inclusion bodies and the authenticity of
the recombinant protein confirmed using polyclonal anti-
bodies directed against AtPUMP1 [21]. Solubilized
ZmPUMP was reconstituted into liposomes and shown
to be fully active; it induced a saturable FFA-dependent
proton flux across the liposomal membrane that exceeded
the non-specific and unsaturable H
+
flux observed in pro-
tein-free liposomes under the same conditio ns (Fig. 3).
Kinetic analysis of LA-dependent H
+
fluxes yielded a
K
m
= 56.36 ± 0.27 lM, a value that is close to those found
for dicot PUMP from Arabidopsis and potato [20,21].
Moreover, the proton transport capacity of ZmPUMP
was estimated as 66.9 lmol H
+
min
À1
(mg prot)
À1
, which
is similar to those reported for mammalian and plant UCPs
[20,21,28,31].
The LA-dependent ZmPUMP-mediated H
+
flux was
sensitive to inhibition by purine nucleotides. Kinetic analy-
sis revealed inhibition constant K
i
= 2.61 ± 0.36 mM for
ATP, a value that falls into the physiol ogical range of con-
centrations of intracellular ATP (2–15 mM) [32]. The inhi-
bition constant observed is slightly higher than those
estimated for recombinant AtPUMP1 (0.85 mM) [21] and
native potato UCP (0.78 mM) [20] reconstituted in lipo-
somes. Furthermore, the kinetic analysis of ZmPUMP
inhibition by ATP revealed a special type mixed inhibition
(noncompetitive, where a = a
0
hence inhibitor binds either
to free or substrate-occupied ZmPUMP with the same rate)
that contrasts the competitive inhibition of the LA-depen-
dent potato PUMP-mediated H
+
flux by undecanesulfo-
nate [20]. Altogether, these data confirmed that
ZmPUMP behaves as a typical uncoupling protein.
A close analysis of the deduced amino acid sequences of
the maize and Arabidopsis [12] uncoupling proteins revealed
only 83 non-identical resi dues (over 310), including a mono-
cot-specific alanine motif [18]. Nonetheless, the dicot and
monocot uncoupling proteins exh ibit almost the same bio-
chemical properties. In this regard, our data suggest that
the uncoupling activity catalyzed by PUMPs from monocot
and dicot plants shares common regulatory mechanisms.
Contradictory results have been published concerning
the role of a His pair located in the second matrix loop
in modulating UCP activity. Replacement of these histi-
dines with neutral groups (H145Q/H147N) in UCP1 recon-
stituted in proteoliposomes had a knockout effect on FA-
dependent H
+
transport, whereas the single mutants
H145Q and H147N still retained some activity (about
10%), indicating a key role of these residues in proton
transport by UCP1 [24]. The results from Urba
´
nkova
´
et al. [25] corroborated this observation demonstrating
halved FA-affinity and a 70% reduction of V
max
for an
equivalent double mutant (H145L plus H147L).
Discordant results were obtained when the mentioned
H145Q/H147N mutant of UCP1 was expressed in yeast
mitochondria. Under these conditions, replacement of this
His pair had no effect on uncoupling activity [33]. More-
over, introduction of the His pair and adjacent amino acids
found in UCP1 into UCP3 (that lacks the second His) was
not sufficient to promote FA activation [34], indicating that
these resid ues are not required for FA stimulation.
The existing differences prompted us to investigate the
effect of these residues on the catalytic activity of a plant
uncoupling mitochondrial protein. It is worth to note that
all plant UCPs lack both histidines, having lysine and apo-
lar or serine resi dues at positions of the first and second his-
tidine, respectively. The presence of a strong base (Lys) in
PUMPs that substitutes two weak bases (histidines) in
UCP1 could be a reason why plant UCPs are able to medi-
ate FA-induced uncoupling. We assumed that if the His
pair is functionally important, it would improve proton
transport when placed in a plant UCP context. The charac-
terization of the K155H/A157H double mutant of
ZmPUMP has shown a 1.55-fold increase in the affinity
of the mutant to LA, while its activity remained
unchanged. From a mechanistic standpoint, the observed
increase in LA-affinity could be a consequence of the better
positive charge distribution provided by two weak histidine
bases than by one strong lysine base and supports the
hypothesis that the His pair is important but not essential
for UCP activity. Increased affinity to LA could also be a
result of a local conformational change in the second
matrix loop caused by the introduced histidines.
To our knowledge, this is the first study reporting the
direct functional characterization of a PUMP from a mono-
cot species describing the kinetic of its activation by one of
FAs, i.e., linoleic acid, and the kinetic of its sensitivity to inhi-
bition by a classic UCP inhibitor, ATP . Furthermore, this
study reports a first mutational analysis of plant uncoupling
proteins, describing biochemical kinetic analysis of a protein
with introduced His pair. Up to now, the only occurrence of
PUMP activity was reported indirectly in isolated durum
wheat mitochondria [23]. The authors attributed the LA-
induced purine nucleotide-sensitive DW decrease to PUMP,
although they did not exclude a possible involvement of
ADP/ATP antiporter in this process. Our study prevents
such fact, using recombinant PUMP isolated from bacteria
and characterized in liposomes, therefore the experimental
set-up free of any mitochondrial protein contamination.
Hence, our results suggest that the uncoupling activity in
monocots can be attributed to PUMP.
More-in-depth molecular and biochemical analyses of
uncoupling proteins from different plant species will not
only improve our knowledge of their functional properties
but also give new insights of their physiol ogical role in the
plant kingdom.
Acknowledgments
We are extremely grateful to Dr. P. Arruda and Anı
´
bal
E. Vercesi for the laboratory facilities and encouragement.
198 R.D. Fa
´
varo et al. / Biochemical and Biophysical Research Communications 344 (2006) 194–199
Phosphatidylcholine was a generous gift from Dr. I.M.
Cuccovia (IQ/USP/Brazil). This work was funded by FA-
PESP (Processo 01/08726-3). R.D.F. and D.C. are sup-
ported by FAPESP. J.B. was a recipient of a
postdoctoral fellowship from FAPESP. I.G.M. is a recipi-
ent of a research fellow ship from CNPq.
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R.D. Fa
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varo et al. / Biochemical and Biophysical Research Communications 344 (2006) 194–199 199
41
I.2. Artigo 2: Mutational analysis of Arabidopsis thaliana plant uncoupling
mitochondrial protein
Mutational analysis of Arabidopsis thaliana plant
uncoupling mitochondrial protein
Regiane Degan Fávaro
a
, Jiri Borecký
b
, Débora Colombi
a
, Aníbal E. Vercesi
b
, Ivan G. Maia
a,
⁎
a
Departamento de Genética, Instituto de Biociências, UNESP, Botucatu, SP, Brazil
b
Laboratório de Bioenergética, Núcleo de Medicina Experimental, FCM, UNICAMP, Campinas-SP, Brazil
Received 28 June 2007; received in revised form 5 September 2007; accepted 20 September 2007
Available online 29 September 2007
Abstract
In this study, point mutations were introduced in plant uncoupling mitochondrial protein AtUCP1, a typical member of the plant uncoupling
protein (UCP) gene subfamily, in amino acid residues Lys147, Arg155 and Tyr269, located inside the so-called UCP-signatures, and in two more
residues, Cys28 and His83, specific for plant UCPs. The effects of amino acid replacements on AtUCP1 biochemical properties were examined
using reconstituted proteoliposomes. Residue Arg155 appears to be crucial for AtUCP1 affinity to linoleic acid (LA) whereas His83 plays an
important role in AtUCP1 transport activity. Residues Cys28, Lys147, and also Tyr269 are probably essential for correct protein function, as their
substitutions affected either the AtUCP1 affinity to LA and its transport activity, or sensitivity to inhibitors (purine nucleotides). Interestingly,
Cys28 substitution reduced ATP inhibitory effect on AtUCP1, while Tyr269Phe mutant exhibited 2.8-fold increase in sensitivity to ATP, in
accordance with the reverse mutation Phe267Tyr of mammalian UCP1.
© 2007 Elsevier B.V. All rights reserved.
Keywords: Uncoupling protein; Arabidopsis thaliana; Site-direct mutagenesis; Proteoliposome; Structure–function relationship
1. Introduction
The uncoupling protein (UCP) is an integral protein of the
mitochondrial inner membrane that uncouples oxidative phos-
phorylation. UCP mediates a fatty acid (FA)-dependent, purine
nucleotide (PN)-inhibitable proton leak across the inner mem-
brane [1] that was reported to be activated by superoxide and/or
products of lipid peroxidation, such as 4-hydroxy-2-nonenal
(HNE) [2,3]. This effect, however, is sti ll controversial since a
more recent study provided experimental evidence that HNE can
only induce mitochondrial uncoupling via its oxidative product,
a hydroxynonenoic acid, in a UCP-independent pathway [4].
The first uncoupling protein (UCP1) was discovered in mice
brown adipocytes mitochondria [5] and was shown to be highly
tissue specific. UCP1 has a specialized physiological role in
generation of metabolic (non-shivering) thermogenesis in hiber-
nating mammals [6], in cold-adaptation of newborn mammals
[7,8], and in diet-induced thermogenesis in small rodents [9].
Homologues of UCP1 were subsequently identified in different
tissues and the actual known mammalian UCP genes constitute
a multigene family composed by five members (UCP1–5) (re-
viewed in [10]). The physiological roles of UCP2–5 are still
under debate; however, given that they are present in mitochon-
dria in much lower amounts than UCP1, their participation in
thermogenesis is practically discarded [7,8].
The existence of UCP-like proteins in plants (pUCP), initially
referred to as PUMPs (P lant Uncoupling Mitochondrial Pro-
tein), was firstly demonstrated in potato tuber mitochondria [11].
Thereafter, several genes encoding pUCP have been identified in
different plant species (reviewed in [12]). Similar to UCP2–5,
pUCPs are presen t in plant mitochondria in low amounts and are
probably not able to promote thermogenesis [13,14]. The phy-
siological roles of pUCPs are most likely related to the control
of reactive oxygen species overproduction or to the regulation of
mitochondrial energy flow at some stages of plant tissue/organ
development (reviewed in [12]).
A
vailable online at www.sciencedirect.com
Biochimica et Biophysica Acta 1767 (2007) 1412 – 1417
www.elsevier.com/locate/bbabio
⁎
Corresponding author. Departamento de Genética, Instituto de Biociências,
Universidade Estadual Paulista ‘Júlio de Mesquita Filho’, 18.618-000, Botucatu,
SP, Brazil. Tel.: +55 14 3811 6229; fax: +55 14 3815 3744.
E-mail address: [email protected] (I.G. Maia).
0005-2728/$ - see front matter © 2007 Elsevier B.V. All rights reserved.
doi:10.1016/j.bbabio.2007.09.005
In the last years, useful information concerning the mecha -
nism of H
+
transport by mammalian UCP1 has been provided
by site-directed mutagenesis experiments (reviewed in [15]).
Important amino acid (aa) residues involved in this process have
been identified, in particular a C-terminal cysteine (Cys304)
that modulates UCP1 proton-translocating activity [16]. More-
over, a critical role for a histidine pair, present in the second
matrix loop, in the FFA-activated proton transport of UCP1 was
demonstrated [17]. Although not presented in PUMPs, the
introduction of such a pair at equivalent positions of a UCP
from maize (ZmPUMP; Lys155His/Ala157His) increased 1.55-
fold its affinity to linoleic acid (LA) [18]. In contrast, when a
patch of 8 amino acid residues (including the His pair) of UCP1
was replace d by the homologous region of UCP2, no alteration
in UCP 1 proton transport was observed [19].
Mutations compromising PN binding have been also de-
scribed, namely those affecting three conserved intrahelical
arginines (Arg83, Arg182, Arg276) [20,21] ( Fig. 1A). In this
context, a UCP1 mutant carrying a deletion of residues Phe267,
Lys268, and Gly269 was described as being insensitive to
nucleotide inhibition [22]. In addition, the intrahelical Glu190
was pointed out as important for the pH regulation of PN
binding in UCP1 [23].
In contrast to numerous studies elucidating the structure–
function relationships of mammalian UCP1, only one report
regarding these aspects within pUCPs has been provi ded to date
[18]. In this respect, UCP1 appears to be the last evolutionary
event within uncoupling protein gene fami ly with highly spe-
cialized function and therefore cannot be considered as the
representative member of this family. For this reason, studies
employing other UCPs/pUCPs are important to advance our
understanding of the mechanistic and structural properties of
uncoupling proteins in general.
In this study, five different aa residues (Cys28, His83, Lys147,
Arg155, and Tyr269; Fig. 1) of AtUCP1 (originally called At
PUMP1) potentially important for protein activity were selected
and mutagenized. Among them, Cys28 and His83 are exclu-
sively found in pUCPs and were chosen to study possible pUCP-
specific structure–function relationships. Lys147 occupies the
position of the first residue (His147) of an essential His pair
present in mammalian UCP1 [17] and was mutated to determine
the significance of a positive charge at this location on LA-
mediated uncoupling protein activity. The mutation Tyr269Phe
was selected as reversal to a Phe267Tyr mutation studied in
UCP1 and associated with a decrease of PN inhibition efficiency
[22]. Arg155 corresponds to Arg152 in UCP1, a residue known
to be crucial for its activation by FA [24], and was investigated to
probe common structure–activity relationships among members
of the UCP/pUCP family. The biochemical activities and kinetic
parameters of these pUCP mutants were examined using recom-
binant proteins reconstituted in proteoliposomes to avoid pos-
sible interferences of other mitochondrial carriers.
2. Materials and methods
2.1. Materials
Bio-Beads SM2 were from Bio-Rad. The fluorescence probe SPQ [6-methoxy-
N-(3sulfopropyl) quiminolinium] was from Molecular Probes. Lecithin was a
special gift of Dr. Iolanda Cuccovia (Department of Biochemistry, University of
São Paulo, Brazil). Nucleotides, LA and other chemicals were from Sigma. HNE
was from Cayman Chemical (Ann Arbor, MI).
2.2. Mutagenesis and expression of AtUCP1 mutants
A plasmid pET3d with an inserted AtUCP1 cDNA under the control of the T7
promoter [25] was used to introduce the site-directed mutations. Mutagenesis
was conducted using a QuickChange Site-Directed Mutagenesis Kit (Strata-
gene). Oligonucleotides were designed to alter AtUCP1 codons for Cys28 (TGC)
to Ala (GCC), His83 (CAT) to Leu (CTT), Lys147 (AAA) to His (CAC), Arg155
(CGG) to Leu (CTG) and Tyr269 (TAC) to Phe (TTC). All recovered mutants
were verified by DNA sequencing in an ABI-PRISM 3100 automatic sequencer
(Perkin-Elmer).
Escherichia coli BL21(DE3) pLysS cells were transformed with the plas-
mids containing the wt AtUCP1 or corresponding mutants. Expression of the
Fig. 1. (A) Schematic transmembrane folding of AtUCP1 showing the positions of the amino acid (aa) residues mutated in this study (Cys28Ala, His83Leu,
Lys147His, Arg155Leu and Tyr269Phe). Numbers (1 to 306) represent the positions of the aa residues starting from the initial methionine. The transmembrane
domains are labeled by Roman numerals (I–VI). Solid circles represent three conserved intrahelical arginines. IMS — intermembrane space. (B) Selected aligned
segments of the aa sequences of AtUCP1 (AtPUMP1; At3g54110), StUCP (CAA72107), hamster UCP1 (P04575) and human UCP3 (P55916) encompassing the
mutated residues in AtUCP1 (in bold). Accession numbers were taken from GenBank or Tair database.
1413R.D. Fávaro et al. / Biochimica et Biophysica Acta 1767 (2007) 1412–1417
genes was induced with 1 mM IPTG (isopropyl-β-D- thiogalactopyranoside) as
described previously [25]. The presence of recombinant proteins was analyzed
by SDS-PAGE (0.1% SDS, 12% polyacrylamide) stained with Coomassie Blue.
2.3. Reconstitution
Wild type (wt) and mutant AtUCP1 proteins were isolated as described
previously [25] and reconstituted (100 μg each) in proteoliposomes consisting of
39 mg lecithin, 1.66 mg cardiolipin, and 0.66 mg phosphatidic acid at lipid/
protein molar ratio of 410:1. The proteoliposomes internal medium (IM) con-
tained 28.8 mM tetraethylamonium N-tris [hydroxymethyl]methyl-2-amino-
ethanesulfonate (TEA-TES; [TES
−
]
free
= 9.2 mM), pH 7.2, 84.4 mM TEA
2
SO
4
and 0.6 mM TEA-EGTA, 2 mM SPQ probe and 84.4 μMK
2
SO
4
to set the
potassium diffusion potential across the liposomal membrane to ∼ 180 mV [25].
H
+
flux assays were based on the quenching of SPQ fluorescence by TES
−
[26]. Vesicles (30 μl; 0.24 mg lipids, ∼ 25 μg protein) were added to 1.5 ml of
external medium (EM; 28.8 mM TEA-TES [9.2 mM TES
−
], pH 7.2, 84.4 mM
K
2
SO
4
, and 0.6 mM TEA-EGTA). Fatty acids were added after 20 s and the H
+
efflux was initiated by 1.3 μM valinomycin 20 s later. In selected experiments,
10, 30, 60 or 100 μM HNE was added before vesicle addition. The fluorescence
was calibrated to [H
+
] by the addition of 6 μmol of KOH aliquots in the presence
of 1.5 μM nigericin to proteoliposomes suspended in IM. Fluorescent data were
converted into “H
+
traces”, that correspond to H
+
efflux, by fitting with modified
Stern–Volmer equation, [H
+
] = (1/K
q
). (F
0
− F)/(F − L), where F is the experi-
mental and F
0
the unquenched fluorescence. Parameters K
q
(quenching con-
stant) and L (background, mostly light scattering) were obtained by linear
regression of F vs. (F
0
− F) / [KOH] plot. Rates of H
+
efflux were derived from
“H
+
traces”, multiplied by the internal proteoliposome volume (V, estimated
from volume distribution of the SPQ; [1]), and corrected for protein content
(9.9 mg lipids corresponding to 1 mg of protein in case of protein-free lipo-
somes) to yield final rates in μmol H
+
min
− 1
(mg prot)
− 1
. When expressed per
μmol of AtUCP1 dimer, rates represented the minimum values for the turnover
number, since not all of the protein was inserted into the vesicles. The kinetic
constants were calculated as the mean ±SD of the values determined by Line-
weaver–Burk and/or Hill plot analyses from three independent experiments.
3. Results
Sequencing confirmed the correctness of clones with intro-
duced point mutations. All mutant proteins were successfully
produced in E. coli BL21(DE3) and originated polypeptides
with an apparent molecular mass of 32 kDa that were present in
the inclusion body fraction (data not shown).
3.1. H
+
efflux in proteoliposomes containing AtUCP1 mutants
The proton fluxes mediated by AtUCP1 mutants in recon-
stituted syst em were assayed by K
+
diffusion potential (created
by [K
+
] gradient plus valinomycin) in the presence of LA and
the internal [H
+
] changes were monitored as SPQ fluorescence
[25]. The measurem ents were performed with initial membrane
potential set to ∼ 180 mV. An important property of the system,
the basal H
+
permeability of lipid bilayer, was assayed in
protein-free vesicles (liposomes). Afte r the addition of LA, an
internal acidification of the liposomes was observed, indicating
the redistribution of the LA molecules in both leaflets of the
lipid bilayer. The addition of 1.3 μM valinomycin caused no
significant H
+
movement (data not shown), demonstrating a low
H
+
permeability of lipid membrane itself. In contrast, proteo-
liposomes containing wt and AtUCP1 mutants exhibited a sig-
nificant H
+
efflux in the presence of valinomycin. Fig. 2A
illustrates H
+
fluxes in proteoliposomes containing Cys28Ala
mutant in the absence and at three different concentrations of
LA. The LA-concentration dependence of H
+
efflux represents
protein-mediated H
+
transfer. Interestingly, when LA was re-
placed by HNE, no significant H
+
efflux was observed in the
presence of valinomycin in proteoliposomes containing wt
AtUCP1 (data not shown).
3.2. Kinetic of LA transport by AtUCP1 mutants
The kinetic of H
+
efflux mediated by the AtUCP1 mutants
was evaluated by varying the total LA concentration. Low
protein-independent basal H
+
fluxes simulated in protein-free
liposomes, under identical LA and valinomycin concentrations
and membrane potential showed linear, non-saturable profile
(Fig. 3). Data, corrected for the different (lower) volume of
proteoliposomes and different protein concentrations were used
for estimation of the basal H
+
flux in proteoliposomes. Evalu-
ation of the kinetics of LA-induced H
+
efflux mediated by the
mutants u nder study p rodu ced a conc entration -de penden t,
saturable response that exceeded the H
+
fluxes in liposomes
(Fig. 3A). The corresponding Eadie–Hofstee plot (Fig. 3B)
yielded an apparent K
m
for these mutants 1.3- to 2.6-fold higher
than for the wt (Table 1). In comparison to wt AtUCP1, the
apparent LA-affinity was strongly reduced for mutants Cys
28Ala (2.6-fold), Lys147His (1.8-fold), and Tyr269Phe (2.4-
fold) while the affinity of His83Leu and Arg155Leu mutants to
Fig. 2. Representative protein-mediated H
+
efflux in reconstituted proteolipo-
somes. The measurements were conducted in the presence of 1.3 μM valino-
mycin (Val) at pH 7.2 at room temperature. (A) Traces show H
+
efflux mediated
by the Cys28Ala mutant in the absence or induced by LA at indicated con-
centrations. (B) Traces show H
+
efflux mediated by wt AtUCP1 in the presence
of LA and in the absence (gray trace) or presence (black trace) of HNE.
1414 R.D. Fávaro et al. / Biochimica et Biophysica Acta 1767 (2007) 1412–1417
LA decreased 1.3-fold and 1.4-fold, respectively. The derived
V
max
values were lower for mutants His83Leu and Lys147His
(∼ 50% reduction) with respect to the wt protein (Table 1) while
no or a slight change in V
max
was observed with Cys28Ala,
Arg155Leu, and Tyr269Phe mutants. The maximum relative
efficiency ( V
max
/K
m
ratio) of AtUCP1 mutants reached
0.18 μmol H
+
min
− 1
(mg prot)
− 1
μM
− 1
(Arg155Leu) that
represents only 62% of the value found for wt AtUCP1
[0.29 μmol H
+
min
− 1
(mg prot)
− 1
μM
− 1
].
In order to investigate the responses of the studied mutants to
HNE, we first determined the kinetics of LA-induced H
+
efflux
mediated by wt AtUCP1 in the presence of 10, 30, 60, and
100 μM of HNE. Interestingly, the values of K
m
and V
max
did
not alter within the whole range of tested HNE concentrations
(Fig. 2B), yielding the single values of 43.8 ± 2.3 μM and 14.5 ±
2.0 μmol H
+
min
− 1
(mg prot)
− 1
, respec tively.
3.3. Inhibition of H
+
efflux by PN in proteoliposomes
containing AtUCP1 mutants
The inhibitory effects of PN on LA-mediated H
+
efflux in
proteoliposomes containing the AtUCP1 mutants were evalu-
ated in the presence of ATP or GDP. The protein-independent,
non-specific inhibitory effects of ATP on basal H
+
fluxes were
simulated in protein-free liposomes. Under identical LA and
valinomycin concentrations and membrane potential, 3 mM
ATP had no effect on basal H
+
fluxes (data not shown). The
concentration dependence curve for externally added ATP
(Fig. 4 ) at pH 7.2 yielded an apparent K
i
of 0.83 mM for wt
AtUCP1 as found previously [25]. The dynamic K
i
values for
ATP obtained for the studied mutants by Lineweaver–Burk
analysis are listed in Table 1 and the corresponding concentra-
tion dependence curves represented in Fig. 4. The His83Leu and
Arg155Leu mut ants exhibited ATP inhibition characteristics
similar to wt AtUCP1. In contrast, the sensitivity to inhibition
by ATP of Tyr269Phe mutant was increased 2.8-fold, whereas
Cys28Ala and Lys147His mutants were 4.0-fold and 1.6-fold
less sensitive, respectively. The K
i
values obtained with GDP
were practically the same as found for ATP (data not shown).
Fig. 4. Inhibition of LA-induced H
+
efflux in proteoliposomes containing AtUCP1
mutants. The Hill plots (solid and dashed lines) represent the concentration
dependence of the inhibition of AtUCP1 (only the molecules with the outwardly
oriented ATP binding sites were considered [25]). K
i
measurements for ATP were
performed at pH 7.2 at room temperature with Hill coefficients in the range of
0.95–1.05. Wild type AtUCP1 (□) and mutants Cys28Ala (♦); His83Leu (▾);
Lys147His (
▪
); Arg155Leu (
•
) and Tyr269Phe (▴).
Table 1
Kinetic parameters for H
+
efflux and ATP inhibition for wild type (WT) and
AtUCP1 mutants
a
V
max
(μmol
H
+
min
− 1
(mg prot)
− 1
K
m
(μM)
Relative efficiency
(μmol H
+
min
− 1
(mg prot)
− 1
μM
−1
)
K
i,ATP
(mM)
WT 13.2± 1.7 46.1 ± 3.5 0.29 0.83± 0.04
Cys28Ala 13.0± 0.4 118.0 ±7.9 0.11 3.31± 0.18
His83Leu 6.9± 0.2 58.4 ± 4.4 0.12 0.93± 0.05
Lys147His 6.6± 0.2 85.0 ± 5.9 0.08 1.35± 0.09
Arg155Leu 11.3±0.9 64.4± 4.0 0.18 0.91± 0.04
Tyr269Phe 11.4±0.4 109.5 ±6.5 0.10 0.30± 0.02
a
The values represent the mean± SD from three independent experiments.
Fig. 3. (A) Kinetics of LA-induced H
+
fluxes in protein-free liposomes (○) and
proteoliposomes reconstituted with wt AtUCP1 (□) and mutants Cys28Ala (♦);
His83Leu (▾); Lys147His (
▪
); Arg155Leu (
•
) and Tyr269Phe (▴). Mea-
surements were conducted in the presence of 1.3 μM valinomycin at pH 7.2 at
room temperature. The fluxes were calculated per mg of protein (or mg lipids
corresponding to 1 mg of protein in case of protein-free liposomes) to yield final
rates in μmol H
+
min
− 1
(mg prot)
− 1
. Rates of H
+
transport (J ) were measured
using different concentrations of LA. (B) Eadie–Hofstee plot for kinetics of LA-
induced H
+
fluxes in protein-free liposomes and proteoliposomes reconstituted
with wt AtUCP1 and mutants (the symbols are according to Panel A). The
derived kinetic parameters are listed in Table 1, where the basal flux J
B
was
subtracted.
1415R.D. Fávaro et al. / Biochimica et Biophysica Acta 1767 (2007) 1412–1417
4. Discussion
In this study, point mutations were introduced in AtUCP1 aa
residues Lys147, Arg155 and Tyr269, located in the so-called
UCP-signatures [27], and in two more residues (Cys28 and His83)
found exclusively in pUCP sequences (Fig. 1AandB)[28].
Similar to wt AtUCP1, its mutants mediated H
+
transport across
the liposomal membrane that was activated by LA and sensitive to
inhibition by PN. Interestingly, AtUCP1 and its mutants were
insensitive to activation by up to 100 μM HNE that corroborate
the recent findings obtained with mammalian UCP1 [4].
4.1. Arg155Leu mutant
The Arg152 residue is widely conserved in UCPs unless
UCP3 (Fig. 1B). The charge neutralization of this residue in
mammalian UCP1 led to a ∼ 50% reduct ion of FA-affinity as
well as of its activity [24]. The replacement of the analogous
residue in AtUCP1 (Arg155) led to a similar reduction of LA-
affinity (by approximately 40%), however, with a slight alter-
ation of V
max
value, suggesting that a positive charge at this
position is crucial for LA-affinity but not for activity of AtUCP1.
In line with a mutagenesis study in UCP1 [24], the Arg155Leu
mutation did not affect the K
i
value for ATP and GDP.
4.2. Lys147His mutant
Previous site-dir ected mutagenesis experiments in UCP1
revealed that the His pair, His145 and His147, is essential for
UCP1-mediated H
+
transport [17,24]. Contrasting with the
postulated essentiality of these residues for proton transport, all
other UCPs contain only one (UCP3) or no His residues of this
pair in its primary aa sequence, although being able to mediate
FA-induced uncoupling [29]. Typically, pUCPs have a strong
base (Lys) and hydrophobic (Ala or Pro) amino acid residues in
the positions corresponding to His pair in UCP1. The presence
of Lys residue appears to be crucial for pUCP transport activity,
since when a His residue replaced Lys147 present at an equi-
valent position in AtUCP1, a ∼ 1.8 fold reduction in LA-affinity
and ∼ 50% reduction of V
max
value was observed with an
alteration in ATP or GDP inhibition. Therefore, the attenuation
of the strong positive charge of Lys147 to His was sufficient to
lower 3.6-fold the mutant relative efficiency. On the other hand,
a double ZmPUMP mutant containing a complete His pair
presented only 1.55-fold higher affinity to LA than the wt
protein and no change in its activity [18]. These results are
consistent with a key role of Lys147 (a strong base) in pUCP-
mediated FA-induced uncoupling being able to replace the two
histidines (weak bases) present in mammalian UCP1. Despite
these evidences, one cannot exclude the possibility that this
residue is intolerant to any amino acid substitution as already
suggested [19].
4.3. Tyr269Phe mutant
Residue Phe267 has been previously suggested as being
fundamental for PN binding to heterologous UCP1 expressed in
yeast. Although its single mutation did not promote qualitative
changes in activity of UCP1 in isolated mitochondria, corres-
ponding flow cytometry analyses suggested that this mutation
increased the uncoupling of yeast mitochondria in situ [22] .
Contrary to UCP1, all other UCPs have Tyr residues in the
homologous position. This fact led us to further investigate the
suggested importance of this Tyr/Phe residue for PN inhibition.
The quantitative kinetic characterization of the revertant Tyr
269Phe mutant revealed that its sensitivity to ATP increased
almost 3-fold over wt AtUCP1 (Table 1). This finding indicates
that the mutation effect is reversible and hence actually con-
firmed for the first time the very importance of this Tyr/Phe
residue for inhibition mechanism of UCPs by PN. Furthermore,
about 6-fold lower affinity of AtUCP1 (K
i
,
ATP
= 0.82 mM; [25]),
UCP2, and UCP3 (K
i
,
ATP
= 0.76 and 0.65 mM, respectively;
[30]) for PN in comparison to mammalian UCP1 (K
i
,
ATP
=
125 μM; [30]) could be also related to this residue. In addition,
the results from mutational analyses of this residue in UCP1 and
AtUCP1 corroborate the hypothesis suggesting UCP1 as the
evolutionary newest member of the UCP subfamily [29]. UCP1
seems to be the only member of uncoupling protein family
involved in thermogenesis [31]. Thus the tight regulation of
UCP1 activity should be critical for proper function of this tissue.
4.4. Cys28Ala and His83Leu mutants
The Cys28 and His83 residues, located in the first and second
transmembrane domains (Fig. 1A), respectively, were identified
as candidates due to their unique conservation in plant UCPs.
Residue His83 is exclusively presen t in pUCPs and is placed in
the vicinity of an invariant Arg residue (Arg83 in UCP1)
important for PN binding [21] (Fig. 1A). The replacement of
His83 (weak base) by a hydrophobic residue (Leu) in AtUCP1
decreased the LA-affinity (by approximat ely 27%) and the V
max
(by approximately 52%) but had no effect on ATP inhibition,
indicating that the provided positive charge is of significance for
optimal proton transport but not for its regulation by purine
nucleotides.
The Cys28 residue was found to be probably one of the
residues that are crucial for the proper function of pUCPs. The
replacement of Cys28 residue for Ala promoted a large decrease
of AtUCP1 affinity for both LA (by 61%) and ATP (by 75%).
Thus, this residue should be involved in the proper folding of the
pUCPs playing a structural rather than functional role. However,
no intramolecular S–S bridge within any UCP monomer mole-
cule has been reported. It is also known that the functional unit of
uncoupling proteins is a dimer but no involvement of any S–S
bridge in monomer interaction was proved so far.
This study brings the first deeper site-directed mutational
analysis of a pUCP aimed to reveal the structure–function
relationships that might be involved in the mechanism of its
uncoupling activity. The AtUCP1 residues His83, Lys147, and
Arg155 appear to be associated preferentially with LA-activated
proton transport mediated by pUCP whereas Tyr269 residue is
important for inhibition of its activity by PN. The plant UCP-
specific residue Cys28 should be one of the residues that are
essential for proper functioning of pUCPs at all.
1416 R.D. Fávaro et al. / Biochimica et Biophysica Acta 1767 (2007) 1412–1417
Acknowledgments
We are grateful to Dr. P. Arruda for the laboratory facilities.
This work is funded by FAPESP (Processo 06/59912-5). R.D.F.,
J.B. and D.C. are recipients of fellowships from FAPESP.
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+
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1417R.D. Fávaro et al. / Biochimica et Biophysica Acta 1767 (2007) 1412–1417
42
Capítulo II. Estudos de Expressão Gênica em Arabidopsis e de
Caracterização Funcional de Promotores
Em paralelo aos experimentos de reconstituição descritos anteriormente,
estudos visando analisar de forma detalhada a expressão dos genes que codificam as
seis isoformas de UCPs em A. thaliana em resposta a estresse salino (NaCl) e
osmótico (manitol), e a fitohormônios (ácido abiscísico - ABA e ácido 1- carboxílico
1-aminocliclopropano - ACC) foram iniciados. Concomitantemente, iniciou-se a
caracterização funcional das regiões promotoras dos genes AtUCP1 e AtUCP2. Os
dados obtidos com este trabalho serão apresentados a seguir.
II.1. Material e Métodos
II.1.1. Análises de expressão gênica em Arabidopsis thaliana
II.1.1.1. Cultivo das sementes de A. thaliana
Sementes de A. thaliana (ecótipo Columbia)
foram embebidas em água Milli-
Q por 1 hora. Em seguida, foram esterilizadas em etanol 70% por 1 minuto, água
sanitária 50% por 20 minutos com posterior lavagem (5x) com água Milli-Q
autoclavada. Após esterilização, as sementes foram dispostas em placas de Petri
contendo meio MS (Murashige e Skoog, 1962) e 0,23% de Phytagel (Sigma). As
placas foram mantidas em câmara climatizada com fotoperíodo de 16 horas/dia de luz
artificial e temperatura entre 20-22ºC. Três semanas após a germinação as plântulas
foram transferidas para novas placas contendo meio MS adicionado dos diferentes
tratamentos: NaCl 125 mM; manitol 250 mM; ABA 0,1 mM e ACC 0,1 mM. As
43
referidas concentrações foram definidas em testes preliminares empregando meios
com diferentes concentrações desses agentes, sendo estas concentrações consideradas
moderadas (Husseini, 2008). As plântulas tratadas foram amostradas em diferentes
tempos (0, 12, 24 e 48 h) para posterior extração de RNA total. O ensaio biológico foi
realizado em duplicata para confiabilidade dos dados.
II.1.1.2. Extração de RNA total e análise da expressão gênica por qPCR
(quantitative Polymerase Chain Reaction).
Para a extração de RNA total utilizou-se o reagente Trizol (Invitrogen)
segundo protocolo descrito pelo fabricante, mas com pequenas modificações.
Plântulas de A. thaliana submetidas aos diferentes tratamentos foram maceradas em
nitrogênio líquido. Um mililitro de Trizol foi então adicionado à cerca de 100-200 mg
do tecido macerado e procedeu-se a homogeneização em agitador. Após incubação
por 5 minutos a temperatura ambiente as amostras foram centrifugadas a 12000xg por
15 minutos a 4°C e o sobrenadante foi coletado seguido da adição de 200 µl de
clorofórmio. A mistura foi homogeneizada em agitador e após incubação por mais 3
minutos a temperatura ambiente foi centrifugada a 12000xg por 15 minutos a 4ºC. A
fase aquosa foi transferida para um novo tubo e adicionou-se 500 µl de isopropanol.
Após incubação por 60 minutos a -20°C e centrifugação por 10 minutos a 4ºC, o
sobrenadante foi removido e o sedimento lavado com 1 ml de etanol 70 %. Após uma
nova centrifugação a 7500xg por 5 minutos a 4°C o sedimento foi seco e ressuspenso
em 30 µl de H
2
O tratada com DEPC.
A integridade do RNA total extraído foi determinada por eletroforese em gel
desnaturante (1,85% de formaldeído) de agarose 1% corado com brometo de etídeo.
Amostras de RNA total (~2 µg) tratadas com DNAseI (Fermentas) foram
44
submetidas a transcrição reversa utilizando-se oligo dT17VN
(2 µM) e SuperScript
TM
III Reverse Transcriptase (Invitrogen), segundo as informações do fabricante. O
produto da transcrição reversa foi quantificado utilizando-se o ND-1000
Spectrophotometer (NanoDrop Technologies).
Para a quantificação da expressão gênica por qPCR, amostras de cDNA na
concentração de 60 ng/µl foram diluídas 10x. Os oligonucleotídeos gene-específicos
listados na Tabela 1 foram desenhados no programa Primer Express com base na
seqüência depositada no banco de dados Tigr (http://www.tigr.org).
Considerando a
alta identidade existente entre as isoformas da AtUCP (1-6), os oligonucleotídeos
gene-específicos foram posicionados na região 5’UTR (região não traduzida) para
discriminar cada uma delas.
Os componentes da reação de amplificação estão listados na Tabela 2 sendo
utilizado um ciclo prévio de 50°C por 2 minutos e 95°C por 10 minutos, seguido de
um ciclo de desnaturação a 95°C por 15 segundos, anelamento e extensão a 62°C por
1 minuto, repetido por quarenta vezes. Após a reação foi adicionado um passo de
dissociação através da elevação da temperatura de 60°C para 95°C, subindo 1°C por
minuto. Este procedimento serviu para verificar a especificidade dos
oligonucleotídeos utilizados ou a formação de primers-dimers. A eficiência de reação
(E) foi calculada para cada par de oligonucleotídeos utilizando-se o programa
LingRegPCR (Ramakers et al., 2003), considerando um intervalo ótimo de eficiência
entre 1,8-2,2. O modelo matemático (1) utilizado para a análise da expressão relativa
foi baseado em Pfaffl (2001). Para a utilização deste modelo é necessária a
determinação do crossing point (CP) para cada transcrito. O CP é definido como o
ponto no qual a emissão da fluorescência é superior ao background.
45
R = (E
alvo
)
∆CPalvo (controle – amostra)
(1)
(E
referência
)
∆CPreferência (controle – amostra)
Onde:
R= razão de expressão relativa
E
alvo
= eficiência de reação de gene alvo
E
referência
= eficiência de reação de gene referência
∆CPalvo= CP controle (tempo zero) – CP tratamento (12, 24 ou 48 horas)
∆CPreferência= CP controle (tempo zero) – CP tratamento (12, 24 ou 48 horas)
46
Tabela 1. Oligonucleotídeos empregados para a análise da expressão gênica por
qPCR.
GENE
NÚMERO DE
ACESSO*
SEQUÊNCIA DOS
OLIGONUCLEOTÍDEOS (5`-3`)
TAMANHO DO
FRAGMENTO (pb)
AtUCP1 TC271062
GATGGTGGCGGCTGGTA
CGCCGACGCAAGCAG
77
AtUCP2 TC264719
CATAACAATGGCGGATTTCAAA
CGCTGCAAATGAAGGTTTCA
65
AtUCP3 TC273718
GGAGCCGAGTGACCAGAGAA
CGCAGAGAGTGAAGCAAGCA
62
AtUCP4 TC251734
TCGTTGAAGGTGGGATTGC
CTTGATTAGATCGAGAGGGTGAGT
65
AtUCP5 TC270882
CGACCCACCCGCTTGAT
GCTGGTCGGAGATTGGTTTG
82
AtUCP6 TC269710
AATCTTCCCGTGAAACCTTACC
AAGGAAATGCTGCCGATGAG
65
FDH AT5G43940
ATTGATCCTACTGCTCCTTTGG
CCAAGGCCAGTGGGAACA
67
40S AT2G09990
CGACTCTCTGCGTTAGGTTTCA
GGGTTTCTCCTTGCTTTTGCT
62
RD29A AT5G52310
TCACTTGGCTCCACTGTTGTTC
TCCAAAGTGAAACTTGAAAATCTC
79
PDF1.2 At5g44420
TCTTCGCTGCTCTTGTTCTCTTT
TTCTGTGCTTCCACCATTGC
61
AtbZip39 AT2G36270
CAGCAACAGCTTTATGGTGTGTT
GCTTGACCCGGGAATGAA
59
* O número de acesso é referente às seqüências de DNA depositadas nos bancos de dados Tair ou Tigr.
47
A fim de verificar a efetividade dos diferentes tratamentos aos quais as
plântulas foram submetidas foi realizada uma busca por genes induzidos pelos
tratamentos em estudo. Os genes RD29A (Charrier et al., 2002) demonstrou-se
induzido pelos tratamentos de NaCL e manitol, enquanto que os genes PDF1.2, que
codifica uma proteína antifúngica (Arroyo et al., 2003), e AtbZip39, que codifica um
fator de transcrição do tipo bZip (Lorenzo et al., 2003; Anderson et al., 2004), são
induzidos por ACC e ABA, respectivamente. Oligonucleotídeos para amplificação
dos transcritos correspondentes foram usados como controle positivo de indução
(Tabela 1), as seqüências de DNA utilizadas para o desenho dos oligonucleotídeos
foram localizadas no banco de dados Tair (http://www.arabidopsis.org). As amostras
de RNA foram submetidas a uma reação de amplificação para descartar a
possibilidade de contaminação com DNA genômico.
Para as análises de expressão relativa foram selecionados genes de referência
que não fossem influenciados pelos tratamentos. O gene FDH que codifica uma
formaldeído desidrogenase (Dolferus et al., 1997) foi utilizado como normalizador
para os tratamentos ABA e ACC. Como o gene FDH apresentou alterações no perfil
de expressão mediante os tratamentos com NaCl e Manitol, um novo gene endógeno,
40S ribosomal protein S16 (Kreps et al., 2002), foi selecionado para estes
tratamentos. As seqüências de DNA dos genes, FDH e 40S, foram localizadas no
banco de dados Tair.
A fim de verificar a correta amplificação de cada isoforma pelo qPCR, os
respectivos produtos de amplificação foram clonados em vetor pGEM-Teasy
(Promega) e posteriormente seqüenciados. Por se tratar de fragmentos pequenos (entre
62 e 82 pb) foram obtidos clones apenas para os genes AtUCP3 e AtUCP5. As
48
seqüências de nucleotídeos dos referidos produtos apresentaram 100% de similaridade
com as seqüências desses genes depositadas no banco de dados.
Tabela 2. Reação de qPCR utilizada nas análises de expressão gênica.
REAGENTES QUANTIDADE/CONCENTRAÇÃO
cDNA 0,48 ng/µl
SybrGreen Master Mix* 50% da reação
Oligo forward 0,4 µM
Oligo reverso 0,4 µM
H
2
O tratada com DEPC q.s.p. 12,5 µl
* Produto da Applied Biosystems.
II.1.2. Análise das regiões promotoras dos genes AtUCP1 e AtUCP2
II.1.2.1. Amplificação e clonagem das referidas regiões promotoras
As regiões promotoras dos genes AtUCP1 (2085 pb) e AtUCP2 (2016 pb)
foram amplificadas via PCR a partir de DNA genômico de A. thaliana (extraído
segundo protocolo de Ferreira e Grattapaglia, 1998), utilizando-se a enzima Pfu DNA
polimerase (Fermentas), segundo instruções do fabricante, e um par de
oligonucleotídeos específicos dotados de sítios para as enzimas de restrição BamHI na
extremidade 5’ e NcoI na extremidade 3’. A Tabela 3 mostra a seqüência dos
oligonucleotídeos sintetizados (os sítios de restrição inseridos estão sublinhados).
49
Tabela 3. Oligonucleotídeos empregados para amplificar as regiões promotoras.
REGIÃO
PROMOTORA
NÚMERO DE
ACESSO*
SEQUÊNCIA DOS
OLIGONUCLEOTÍDEOS (5`- 3`)
TAMANHO
(pb)
AtUCP1 AT3G54100
CGCGGATCCAGTAAGTCAACTAAAATGGTAGG
CATGCCATGGCTTCGATCCAGAAAACGC
2085
AtUCP2 AT5G58980
CGCGGATCCTACAATATGGTATTTAGAGAGTCAAG
CATGCCATGGTGTTATGCTATAGGAACAAGATAAG
2016
* O número de acesso é referente às seqüências depositadas no banco de dados Tair
A reação de PCR foi constituída de um ciclo prévio de desnaturação a 95°C
por 5 minutos, seguido de um ciclo de desnaturação a 95°C por 1 minuto, anelamento
a 50°C por 1 minuto e extensão a 72°C por 4 minutos, repetido por trinta e cinco
vezes, e um ciclo final de extensão a 72°C por 7 minutos.
Os produtos de amplificação foram digeridos com as enzimas de restrição
BamHI e NcoI e purificados em gel de agarose 1% utilizando-se o kit DNA and Gel
Band Purification (Amersham), sendo então inseridos no vetor de transformação de
plantas pCAMBIA-1381z (Cambia) igualmente digerido. O vetor pCAMBIA-1381z
contém o gene repórter uidA (que codifica a β-glucoronidase - GUS) e um sítio
múltiplo de clonagem que permite a inserção de seqüências promotoras. As regiões
promotoras em estudo foram, portanto inseridas em fusão transcricional com o gene
repórter dando origem a dois cassetes de expressão distintos.
Células competentes da cepa DH5α de Escherichia coli preparadas conforme
protocolo descrito (Sambrook et al., 1989) foram transformadas com os produtos da
ligação empregando choque térmico. Após a transformação, as bactérias foram
plaqueadas em placas de Petri contendo meio Luria-Bertani (LB) sólido (0,1% p/v de
triptona, 0,05% p/v de extrato de levedura, 0,1 % p/v de NaCl e 0,15% p/v de Select
50
Agar em água deionizada, com pH igual a 7,0) adicionado de 100 µg/ml de
canamicina. Clones recombinantes foram então selecionados e os plasmídeos
correspondentes isolados por lise alcalina (Sambrook et al., 1989). A seqüência de
nucleotídeos do fragmento clonado foi verificada usando BigDye™ Terminator v3.1
Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems) segundo protocolo do fabricante e um
seqüenciador automático modelo ABI PRISM 377 (Applied Biosystems).
II.1.2.2. Transformação de Nicotiana tabacum
Plantas de N. tabacum SR1 transgênicas para as regiões promotoras dos
genes AtUCP1 e AtUCP2 foram obtidas por experimentos de transformação
empregando-se Agrobacterium tumefaciens linhagem LBA 4404.
Uma colônia de agrobactéria foi inoculada em de meio LB (3 ml) contendo
os antibióticos de seleção estreptomicina 300 µg/ml e rifampicina 100 µg/ml, e
incubada sob agitação a 28°C por ~24 horas (absorbância de 600 nm entre 0,5-1,0).
Após diluição da cultura (25x) no mesmo meio de crescimento (50 ml), a mesma foi
incubada sob agitação a 28°C até atingir a absorbância de 600 nm entre 0,5-4,0. A
cultura foi mantida em gelo por 15 minutos e as células foram centrifugadas a 1000xg
por 15 minutos a 4°C. O sedimento foi ressuspenso em solução de CaCl
2
0,4 mM
gelada.
Para a transformação, alíquotas de 100 µl de células competentes acrescidas
de 1 µg de DNA plasmidial recombinante foram incubadas em gelo por 30 minutos.
Após um choque térmico, nitrogênio liquído/incubação a 37°C, foi acrescentado 1 ml
de LB e a cultura foi mantida sob leve agitação por 2 horas a 28°C. Células
transformadas foram selecionadas em placas contendo meio LB sólido adicionado dos
antibióticos, estreptomicina 300 µg/ml, rifampicina 100 µg/ml e canamicina 100
51
µg/ml. A presença do vetor de transformação contendo os respectivos insertos nas
bactérias transformadas foi confirmada por PCR em condições estringentes. Os
oligonucleotídeos utilizados em tais reações foram os citados na Tabela 3. Os
produtos de amplificação foram separados em gel de agarose 1% corado com brometo
de etídeo.
Uma colônia positiva para o fragmento clonado foi novamente inoculada em
meio LB, com os devidos antibióticos de seleção, e incubada até atingir uma
absorbância a 600 nm de ~1,5. Discos foliares estéreis de tabaco (Nicotiana tabacum
SR1) com 2 cm de diâmetro foram colocados em contato com a cultura de A.
tumefaciens diluída 10x e mantidos sob leve agitação por 5 minutos à temperatura
ambiente. O excesso de bactéria nos discos foliares foi retirado pela absorção em
papel de filtro estéril, e posteriormente os mesmos foram transferidos para placas de
Petri contendo meio MS sólido (0,23% phytagel) suplementado de ácido
naftalenoacético (ANA) 0,1 µg/ml e 6-benzilaminopurina (BAP) 2 µg/ml. As placas
foram mantidas no escuro por 48 horas a 28°C para permitir o processo de infecção.
Os discos foliares foram então transferidos para novas placas contendo meio de
regeneração (MS sólido contendo ANA 0,1 µg/ml, BAP 2 µg/ml e cefotaxima 300
µg/ml) e o antibiótico de seleção, higromicina-B (50 µg/ml), para o tecido vegetal
transformado. Após duas semanas os calos foram separados e transferidos para novo
meio de regeneração com o antibiótico de seleção. Os brotos regenerados foram
individualizados em frascos de vidro contendo meio de enraizamento (MS sólido
contendo ANA 0,1 µg/ml e cefotaxima 300 µg/ml) além do agente de seleção
higromicina-B (50 µg/ml). As plantas enraizadas foram transferidas para vasos com
terra vegetal, aclimatadas em sala de cultura e posteriormente transferidas para casa
de vegetação até a coleta das sementes.
52
As linhagens contendo os respectivos cassetes de expressão foram
identificadas por PCR e RT-PCR utilizando-se DNA genômico (extraído segundo
Konieczny e Ausubel, 1993) e RNA total (extraído como descrito no item 3.1.2),
respectivamente, obtidos a partir de tecido foliar. Os oligonucleotídeos utilizados em
tais reações foram: 5`GTAGAAACCCCAACCCGTGA3` e
5`GTCTGCCAGTTCAGTTCGTTGTTC3`, desenhados com base na região
codificadora do gene uidA (GUS).
II.1.2.3. Análise histoquímica da atividade β-Glucuronidase (GUS) nas
linhagens transformadas
Para detectar a atividade GUS nas linhagens transformadas com os cassetes
de expressão contendo os promotores em estudo foi realizado um ensaio histoquímico
conforme protocolo padrão descrito por Jefferson e colaboradores (1987). Para tal,
plântulas da geração R1 (com aproximadamente 15 dias após a germinação) e
tecidos/órgãos da geração R1 (folha, flor, fruto e raiz com aproximadamente 120
dias), foram imersas em álcool etílico 70% por 1 minuto. Após remover o álcool foi
realizada uma pré-infiltração a vácuo com tampão fosfato 1 M pH 7,0 para facilitar a
penetração do substrato. As amostras foram infiltradas a vácuo em tampão de reação
[NaH
2
PO
4
.H
2
O 100 mM, K
4
Fe(CN)
6
.3 H
2
O 0,5 mM, Na
2
EDTA.2H
2
O 10 mM, Triton
X-100 0,1% e 5-bromo-4chloro-3-indolyl-β-D-glucuronic acid (X-gluc) 1 mM] e
incubadas a 37°C por 12 horas. Para visualizar o produto da reação, a clorofila foi
removida com álcool etílico 70% e as amostras foram lavadas em H
2
O destilada e
transferidas para uma solução de glicerol 50%.
53
II.1.2.4. Quantificação da expressão relativa do gene repórter uidA nas
plantas transgênicas transformadas com os cassetes de expressão
A expressão do gene uidA em diferentes órgãos/tecidos coletados de plantas
das linhagens transformadas foi quantificada por qPCR. Os diferentes órgãos/tecidos
(folha, flor, fruto e raiz) foram coletados de plantas R1 após aproximadamente 120
dias. Para tal foram utilizados oligonucleotídeos específicos para o gene repórter
(GUS F- 5’TTGCCAACGAACCGGATAC3’ e GUS R-
5’GCCAGTGGCGCGAAATATT3’) e para o gene normalizador 18S (18S F-
5’AGGAATTGACGGAAGGGCA3’ e 18S R-
5’GTGCGGCCCAGAACATCTAAG3’) (Levy et al., 2004), todos desenhados no
programa Primer Express. Os parâmetros utilizados na reação de qPCR foram os
mesmo do item II.1.1.2, sendo a utilização do modelo matemático 2
-∆CT
a única
modificação introduzida (Livak et al., 2001).
54
II.2. Resultados e Discussão
II.2.1. Extração de RNA total e análise da expressão gênica por qPCR
A fim de obter informações relevantes sobre a expressão dos genes que
codificam as diferentes isoformas de UCP em A. thaliana (AtUCP1-6), uma análise
detalhada usando a técnica de qPCR foi empreendida. Para tal, amostras de RNA total
de plântulas submetidas a diferentes tratamentos (ACC, ABA, NaCl e manitol) foram
extraídas e a integridade do RNA total verificada em gel desnaturante de agarose
corado com brometo de etídeo. Após a síntese de cDNA, as amostras foram
quantificadas utilizando-se um aparelho Nanodrop visando as análises de expressão
relativa. Cabe ressaltar que os dados foram coletados a partir de um único evento
biológico, exceção feita aos tratamentos com NaCl e manitol que correspondem a
duas repetições biológicas, respectivamente.
As análises iniciais de qPCR tiveram por objetivo verificar o perfil de
expressão dos genes que codificam as diferentes isoformas de AtUCP em resposta ao
tratamento com ACC, um precursor do fitohôrmonio etileno. O etileno é um
hormônio vegetal que atua em concentrações muito baixas e participa da regulação de
praticamente todos os processos de crescimento, desenvolvimento e senescência das
plantas. Ele é sintetizado em muitos órgãos dos vegetais superiores, sendo que tecidos
senescentes e frutos em amadurecimento produzem mais etileno que tecidos jovens
(Taiz e Zeiger, 2006). Os resultados obtidos revelaram uma variação significativa no
perfil de expressão de somente uma, AtUCP4, das seis isoformas analisadas (inibição
de até 4,1 x) (Figura 3.1), sendo que não foram observados produtos de amplificação
correspondentes ao gene AtUCP6. A confirmação dos efeitos do tratamento com ACC
55
Tratamento ACC
0,00
1,00
2,00
3,00
A
tUCP1.A
A
tU
C
P
1
.
B
A
tU
C
P
1
.
C
AtU
C
P
2
.A
A
tUCP2.
B
AtUCP2.C
AtUCP3.A
At
U
C
P
3
.
B
A
tU
C
P3.
C
A
t
U
C
P
4
.A
AtUCP4.
B
AtUCP4.
C
A
tUCP5.A
AtUC
P
5.B
A
tU
C
P
5
.
C
Expressão Relativa
Tratamento ABA
0,00
1,00
2,00
3,00
At
U
CP1.A
AtU
C
P1.
B
AtU
C
P1.
C
A
tUC
P
2
.
A
A
tU
CP
2
.B
A
t
UCP
2
.C
AtUCP3.A
AtUCP3.B
AtU
C
P3.C
AtUCP4.A
AtUCP4.B
AtU
C
P4.C
A
tU
CP
5
.A
AtU
C
P5.
B
A
tU
CP
5
.C
A
tUC
P
6
.
A
A
t
UCP
6
.B
A
t
UCP6.C
Expressão Relativa
Tratamento NaCl
0,00
1,00
2,00
3,00
AtUCP1.
A
AtUCP1.B
AtUCP1.C
AtUCP2.A
At
UCP2
.
B
At
UCP2
.
C
AtUCP3.
A
AtUCP3.B
AtUCP3.C
AtUCP4.A
At
UCP4
.B
At
UCP4
.
C
AtUCP5.
A
AtUCP5.B
AtUCP5.C
AtUCP6.A
At
UCP6
.B
At
UCP6
.
C
Expressão Relativa
Tratamento Manitol
0,00
1,00
2,00
3,00
AtUCP1.
A
At
UCP1.
B
At
U
CP1
.
C
AtUCP2.
A
AtUCP2.B
At
UCP2.C
At
UCP3.
A
At
UCP3.B
At
UCP3.
C
AtUCP4.
A
AtUCP4
.
B
AtUCP4.C
At
UCP5
.A
At
UCP5.B
At
UCP5.C
AtUCP6.
A
At
UCP
6
.
B
AtUCP6
.
C
Expressão Relativa
Figura 3. Análise da expressão relativa dos genes AtUCP1-6 após 12 (A), 24 (B) e 48 (C) horas de
tratamento. As análises da expressão relativa foram feitas usando como normalizadores, o gene
endógeno FDH1 para os tratamentos com ACC e ABA, e o gene 40S para os tratamentos com NaCl e
manitol.
1
2
3
4
56
foi validada pela indução do gene PDF1.2 que é responsivo ao etileno (após 24 h de
tratamento observou-se um aumento da expressão de ~14,5x).
Embora os nossos resultados tenham demonstrado uma inibição no perfil de
expressão de um gene em resposta ao ACC, a indução da expressão de algumas
pUCPs durante a maturação de frutos climatéricos é relatada na literatura. Segundo
Considine e colaboradores (2001), a expressão dos genes que codificam pUCPs é
fortemente aumentada nos estágios finais da maturação (senescência) de frutos de
manga. Resultados semelhantes foram observados em estágios tardios da maturação
de frutos de tomate mantidos na própria planta (Holtzapffel et al., 2002). Estes dados
corroboram o maior acoplamento observado em mitocôndrias isoladas de tomates
verdes quando comparado com o obtido com mitocôndrias de tomates vermelhos
(Costa et al., 1999).
Além do etileno, existem evidências na literatura de que a expressão dos
genes que codificam pUCPs é induzida por um outro fitohormônio, o ácido abscísico
(ABA). Análises empregando microarranjos demonstraram a indução dos genes
AtUCP4 e AtUCP5 mediante tratamento com ABA (Seki et al., 2002). O ABA
desempenha um papel importante na dormência de sementes e gemas, bem como na
resposta ao estresse hídrico (Taiz e Zeiger, 2006). Na Figura 3.2 encontram-se os
perfis de expressão dos seis genes investigados em resposta ao tratamento com ABA.
Um aumento significativo da expressão relativa, 12h após o tratamento, foi observado
para três dos seis genes investigados: AtUCP2 (2,33 x), AtUCP5 (2,02 x) e AtUCP6
(3,14 x). Dentre os genes cuja expressão foi induzida encontra-se o gene AtUCP5 que
já havia sido relacionado por Seki e colaboradores (2002) como induzido por ABA. O
único gene que demonstrou uma inibição significativa da expressão (até 5,3 x) nos
três tempos analisados foi o AtUCP4. A confirmação dos efeitos do tratamento com
57
ABA foi validada pela indução observada para o gene AtbZip39 responsivo a este
hormônio (após 12 h de tratamento observou-se um aumento da expressão de ~3,6x).
As mitocôndrias representam a maior fonte de geração de EROs em células
submetidas a estresse. Evidências experimentais têm demonstrado que os dois
sistemas dissipadores presentes em plantas, as UCPs e as AOxs, atuam na regulação
da produção de EROs mitocondrial, e nos últimos anos, diversos estudos têm
relacionado a função fisiológica das pUCPs com a proteção celular contra o estresse
oxidativo (Jarmuszkiewicz et al., 1998; Almeida et al., 1999; Brandalise et al.,
2003b). A fim de investigar os efeitos do estresse oxidativo na transcrição dos genes
em estudo, plântulas de Arabidopsis foram submetidas a tratamentos que promovem
estresse salino e osmótico, os quais sabidamente afetam a função mitocondrial e
acentuam o estresse oxidativo na organela.
Os dados da literatura a respeito dos efeitos potenciais de tais estresses na
expressão das pUCPs são controversos já que alguns trabalhos sugerem uma
modulação transcricional (Dlasková et al., 2006) enquanto outros indicam para uma
regulação bioquímica em nível protéico (Trono et al., 2006; Pastore et al., 2007). De
acordo com os resultados apresentados na Figura 3.3, as alterações no perfil de
expressão dos genes analisados em reposta ao estresse salino foram observadas pela
inibição (até 2,3 x) da expressão do gene AtUCP4 e pela indução do gene AtUCP2,
cuja expressão foi induzida após 12 horas com subseqüente queda. Em contrapartida,
quando as plântulas foram tratadas com manitol, um aumento significativo na
expressão relativa de dois genes, AtUCP5 e AtUCP6, com um pico de expressão no
tempo de 12 horas após o tratamento (2,55 x e 2,43 x, respectivamente), pode ser
constatado (Figura 3.4). O gene AtUCP4 apresentou uma inibição na expressão (até
2,5 x). Os efeitos dos tratamentos com NaCl e manitol foram validados pelas induções
58
observadas para o gene RD29A, com um aumento da expressão após 12 h de
tratamento de ~9,4 x e ~27 x, respectivamente.
Baseado nos dados de expressão relativa podemos sugerir que os genes
AtUCP5 e AtUCP6 podem estar envolvidos na resposta adaptativa ao estresse
osmótico sendo os mesmos responsivos ao ABA, que é um importante mediador da
resposta fisiológica da planta a determinados estresses, especialmente aqueles
envolvidos com balanço hídrico. O gene AtUCP2 foi induzido pelo estresse salino, o
que sugere sua participação nessa resposta adaptativa também. Esses dados indicam
que tais genes têm uma regulação transcricional já que foram induzidos pelos
tratamentos empregados, muito provavelmente pela acumulação de EROs geradas
durante a injúria provocada pelo estresse. As proteínas resultantes atuariam, nesse
caso, como auxiliares do sistema detoxificante, reduzindo a geração de EROs através
do desacoplamento.
Como não foram observadas mudanças na expressão relativa dos genes
investigados AtUCP1 e AtUCP3, é bastante provável que os mesmos não sejam
regulados transcricionalmente pelos fatores investigados, fato que sugere a existência
de mecanismos de regulação que não envolva a indução da expressão gênica e
conseqüente aumento no conteúdo de proteína. Nesse caso é possível que, como
resultado da ativação por EROs, a atividade desacopladora dessas isoformas seja
aumentada sem a necessidade de um aumento na quantidade de proteína total como
sugerido por Pastore e colaboradores (2007). Essa perspectiva, entretanto, necessita de
confirmação experimental.
O gene AtUCP4 demonstrou em todos os tratamentos uma inibição na sua
expressão, gerando uma indagação sobre a possível função desse gene.
59
II.2.2. Amplificação e clonagem das regiões promotoras
As regiões promotoras dos genes AtUCP1 (seqüência no Apêndice 1) e
AtUCP2 (seqüência no Apêndice 2) foram amplificadas via PCR e inseridas no vetor
pCAMBIA-1381z controlando a transcrição do gene repórter uidA (GUS; Figura 4),
que codifica a enzima β-glucoronidase de Escherichia coli. A fim de eliminar uma
possível expressão de GUS pela agrobactéria, o vetor 1381z apresenta um íntron no
inicio da região codificadora de GUS (Figura 4). Cabe ressaltar que esses genes foram
escolhidos para caracterização de suas regiões promotoras por serem aqueles melhor
caracterizados dentre os identificados em A. thaliana.
BamHI
NcoI
1º Exon
Intron catalase
2º Exon
CAMV 35S poly-A
Higromicina (R)
Promotor CAMV 35S
Promotor AtUCP
GUS
NOS poly-A
Hist tag
BamHI
NcoI
1º Exon
Intron catalase
2º Exon
CAMV 35S poly-A
Higromicina (R)
Promotor CAMV 35S
Promotor AtUCP
GUS
NOS poly-A
Hist tag
Figura 4. Desenho esquemático do cassete de expressão contendo os promotores dos genes AtUCP1 e
AtUCP2 inseridos em pCAMBIA-1381z .
II.2.3. Análises moleculares das plantas transformadas
Colônias de agrobactéria contendo o vetor recombinante foram selecionadas
por amplificação do fragmento de interesse via PCR. Colônias positivas foram então
utilizadas para a transformação de discos foliares de N. tabacum. As linhagens de
plantas regeneradas (RO) foram analisadas quanto à presença das seqüências
promotoras via PCR de DNA genômico. A presença de transcritos do gene uidA nas
linhagens positivas foi confirmada por RT-PCR empregando RNA total (Figura 5). As
60
linhagens positivas assim identificadas, originadas de diferentes eventos de
transformação, foram então utilizadas para a análise histoquímica da atividade da
proteína GUS.
Figura 5. Análise por RT-PCR da expressão do gene uidA (GUS) nas linhagens transformadas (cada
letra representa uma linhagem – a,b,c,d,e). Na figura, M representa o marcador de peso molecular; 1.(a-
e) indicam os transcritos de GUS para as diferentes linhagens de plantas transgênicas para a região
promotora do gene AtUCP1; 2.(a-e) indicam os transcritos de GUS para as diferentes linhagens de
plantas transgênicas para a região promotora de gene AtUCP2; como controle negativo foi utilizada
uma planta selvagem (ps). Gel de agarose 1% corado com brometo de etídeo.
II.2.4. Análise histoquímica da atividade GUS nas linhagens transformadas
A atividade GUS foi analisada in situ nas linhagens transformadas com as
construções contendo o gene repórter GUS sob o controle dos promotores dos genes
AtUCP1 e AtUCP2, denominadas respectivamente de AtUCP1:GUS e AtUCP2:GUS.
Como controles positivo e negativo de tais ensaios foram utilizadas plantas
transformadas com uma construção contendo o gene repórter GUS sob o controle do
promotor 35S, denominada 35S:GUS (Figura 6G-L), e plantas tipo selvagem,
respectivamente (Figura 6A-F).
Os ensaios histoquímicos realizados em plântulas transgênicas da geração
R1, 15 dias após a germinação, demonstraram que somente nas linhagens contendo o
cassete AtUCP1:GUS ocorreu a expressão da proteína GUS em níveis detectáveis
pelo ensaio (Figura 6M e S). O padrão de expressão observado nas plantas
AtUCP1:GUS apresentou consistência em quatro linhagens transformadas (de oito
M 1.a 1.b 1.c 1.d 1.e 2.a 2.b 2.c 2.d 2.e ps
400 pb ----
61
analisadas; Tabela 4). Nesse caso, a atividade enzimática de GUS foi detectada na
região do meristema apical, nos feixes vasculares dos pecíolos e em parte dos feixes
das folhas (Figura 6M).
Tabela 4. Número de linhagens transgênicas com padrão de expressão consistente
para os promotores em estudo.
TRANSGENE PLÂNTULAS R1
PLÂNTULAS R1
PLANTAS R1 PLANTAS R1
N° DE
LINHAGENS
ANALISADAS
N° DE
LINHAGENS COM
O PADRÃO
CONSISTENTE
N° DE
LINHAGENS
ANALISADAS
N° DE LINHAGENS
COM O PADRÃO
CONSISTENTE
Promotor AtUCP1 8 4 3 3
Promotor AtUCP2 10 - 4 1
As plântulas R1 foram mantidas em câmara de crescimento para que novos
ensaios fossem realizados em plantas em estágio de desenvolvimento mais avançado
(4 meses). Os órgãos/tecidos analisados em tais plantas foram: raiz, folha, flor e fruto.
Os ensaios histoquímicos para GUS demonstraram um padrão de expressão ubíquo do
repórter nas plantas AtUCP1:GUS (Figura 6M-R). Nesse caso, o padrão de expressão
observado foi consistente para as três linhagens analisadas (Tabela 4). A fim de
complementar tal informação, a expressão relativa do gene repórter em uma dessas
linhagens foi determinada por qPCR. Nesse caso, a expressão observada nos
diferentes órgãos/tecidos foi semelhante entre eles (Figura 7).
Nos ensaios histoquímicos das plantas AtUCP2:GUS, a atividade GUS foi
detectada somente na raiz de uma planta madura (Figura 4Z), sendo que nenhuma
atividade adicional pode ser observada nos demais órgãos/tecidos analisados (Figura
62
6T-X). No trabalho de Borecký e colaboradores (2006), a expressão do gene AtUCP2
em Arabidopsis foi detectada somente em silica verde e raiz. Apesar do padrão de
expressão observado nas análises histoquímicas em tabaco ser coerente com esse
resultado, novos ensaios visando quantificar e expressão relativa de GUS nas plantas
AtUCP2:GUS seriam necessários para confirmar os dados de histoquímica e
estabelecer em definitivo o padrão de expressão do promotor AtUCP2.
Figura 6. Ensaio histoquímico da atividade GUS em plântulas e plantas maduras R1 de N. tabacum
transformadas com os promotores dos genes AtUCP1 e AtUCP2 e o promotor 35S. (A-F) plantas tipo
selvagem, (G-L) plantas 35S:GUS, (M-R) plantas AtUCP1:GUS e (S-Z) plantas AtUCP2:GUS.
Plântula Folha Fruto Flor Flor Raiz
A
B
C
D
E
F
I
G
I
H
L
K
J
Q
P
O
N
M
R
V
U
T
S
Z
X
63
0,0000
0,0100
0,0200
0,0300
0,0400
0,0500
0,0600
0,0700
At
U
CP1:
GU
S
F
l
A
t
UCP1:
G
US
Fr
AtU
C
P1:GUS Fo
At
U
CP1:
GU
S R
35S:GUS Fl
35S:G
U
S Fr
35S:
GU
S Fo
35S:GUS
R
Expressão Relativa
Figure 7. Expressão relativa de GUS em diferentes órgãos/tecidos de plantas transgênicas
AtUCP1:GUS determinada por qPCR. Os órgãos analisados foram: Flor (Fl), Fruto (Fr), Folha (Fo) e
Raiz (R). Amostras retiradas de uma planta transgênica contendo o gene repórter sobre controle do
promotor 35S foram utilizadas como controle.
64
CONCLUSÕES GERAIS
A ZmUCP tem propriedades bioquímicas similares àquelas observadas para
pUCPs de espécies dicotiledôneas;
Através de estudos da relação-estrutura função em pUCPs foi possível localizar
importantes resíduos que interferem na ligação por ativadores (FA) e inibidores
(PN), além de resíduos que interferem na atividade geral destas proteínas;
De acordo com os dados obtidos para AtUCP1 reconstituída em lipossomos, a
observação de que o HNE interfere no fluxo de prótons das pUCPs não foi
consistente;
Alterações no perfil de expressão dos genes AtUCP5 e AtUCP6 mediante os
tratamentos com ABA e manitol, e do gene AtUCP2 mediante os tratamentos com
NaCl e ABA, foram constatadas;
Os promotores dos genes AtUCP1 e AtUCP2 quando fusionados ao gene repórter
GUS promovem, respectivamente, um padrão de expressão ubíquo e
preferencialmente em raízes.
65
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79
APÊNDICE 1
Seqüência do promotor do gene AtUCP1
Oligonucleotídeo Forward
AGTA AGTCAACTAA AATGGTAGGA AGGTATTATC CACACATCGA AGCCGCCTAT AATTCCATTG
ACTATATATT GCTCGTCAAA GTCTCAATCC AATAGCAAAA AAGTAAACCT CTCATAAAAA TCGCCACCGA
GATATTGATT GTTAGAAAAG CTATTATAAT TGCACAATGA TAATTCAGTT TTGCAATCAT TAAAGTTGTT
GCCAGAATTC ATCTTATTAC CTACCCCACT AGGCCACTAC TTCTTCTTCT TCGTCCCAAA AGGAGACACT
AATCCAAACA TTGCAATCTG TTTACACTAA CTTCGCAATC TTAGGATCAT TTCTAATGAA CTGTTCAACA
AAACCCTCAA ACAATTCAGC AGGAACAAAC ACATAATTAG GATTGATCCC AAGTAGTATC TAACTAACTA
AAAAAAATGC TGAATTTGAT CACAAAGATT GAATTTTTAA ATCCCTAAAT GTTTAAAGTA AAGAAGATGA
ACAAACTCAC GGGAAGCTTT TCGAGAACAC GCATTGGCTG AGAAGAAGCT TGGTTCTCTG CAACTTCACG
TTGAGCCATT GACCAATCAT CACGAAGCGT TCTAACAACA ACAAACTCCT TCAAACGAGC GTGATCCACC
ACGCGGACAC CACCCATAAG GTAGACTCTA AGGAACACAG ACGCAACCAC AAGCAACATT AGAAGACCCA
AGATCCGACG ACCCACGTTT CTCCCCGATC TAAACCCTTG ACCAATCACA ACCGTCGATG CACCACCATA
AAACGGAATC CAGAATTTTC GGAGGAGAAG GTAACGAATC ACCGGATGAC TGTAAAATCG GTGGTAGTGA
TCGTGATGGT AATGAGATCC AGTAGATGAA GCAGAGCTTT CCGAAGATGG TGACGAGTCT TGACCAGTCG
CATCTCCTCC GTCTAAATCT GTTGATCCAA CGATGGGTTG GTTAATTGTA TTGCAGTAAT CAGATGAATT
CGAGGGTCGT TCGGAGATAA CGTCTAGAGA ATCGCCAACA CGGCGGCGAG TGGTGGGTGC AATTGGTACG
GGGTTAATCG CTCCGACGAC TGACATATCG TCGCCGGTGA AATAGGGAAT TGAAGATTAG ACAAAAGGAA
AGAGATAGAG AAAGAAGAGA GAGGGTTGAT TTTTAGGTTT TGGAGGAAGT AGTTGACCAT GTATGTATCT
TCTGGTATAG TCACCGTCAC CGTGAAATTC GCCGAAGCTG AGTTTTTGTT TTCAGAATTT TTTATATTCG
CCAGTGTGTC TAATTATATA TTTATGTGAC TGTTCTAATC ATTTTTTTTG TTTAGGTTTT ACATTTTTTA
TGTATGATGT GAATGGATAA TTTTCAAGAG TTTGTCACGT TTGTAGCACA TCTTTTTATA TGAATAGTTT
TTTGGATGTT AGTGTATAAA TATAATTTGT CATATCGTTT AGATTAAACA AATATAGGCA AAAGAGTGAT
TAACGTGTTC TTTTGAAATA GCTAAGAGAT ACTAACCTAT GATGATTAAG TTTATGATAC TTAAACTTTT
TATCATCGAG GGCACTCTGC ATTGTGACGA AGATGTGAAG TAGACCTAGA AGATGACGCA CTGACTTTAT
TGCCACTGCT ACAAAGCTAA TCAACTTTGT ACCAAATATA CAAAACTTCG ACCTCTCACG ATGTTAAACT
AATGGAATTA TTAGAACTTA AAAAAATCGG ATTAGAGATT AAAAAGAAAT GAAATTATTT AGAGAGGTAG
TTAGTAAAAG TAAATTCGAT CCAGCGTGGT GCTGTGTCAT TTATTTGACT GGGAATTTTC TTCAGACAGT
GAAAGCAACA TAATCGATGG ATGATACTAT TTAACAAAAC AGGTCGTCAC ACACGTGTGT ATAAATAAGT
AAAGCGCCCA CTCCTTTCTC ATTTCGTAGC GCGCAGAGAG AGAGAGAGAG GGACGATCTT TTCTATAACT
GAAACACTAC TCGAGGCCAA GTTGCTTTAG CCGTAATCGT CGTCGTCCCT CTTCCCGATA TTATCTCTTC
TCTGTTCTTC GATTTCGAAA CCCTAACCTC CTCTCTTTAA TTCGCGTTTT CTGGATCGAA G ATG
Oligonucleotídeo Reverse
80
APÊNDICE 2
Seqüência do promotor do gene AtUCP2
Oligonucleotídeo Forward
TACAATATGG TATTTAGAGA GTCAAGCTTG
TTAGATGTAT AACTTGGCAT GACTAAATGT TTCAGCTACC CTGATGAATT TGAGAGTACC CGCATTATTG
GAGAGAGGCA GTTCAAGAAG GCTGCGGATC TTTTCACTAA AGCCTCTGAG GAGATACAAG GAAAAGTTGA
CTATCGTCAT GCATATGTTG ATTTCTCTCA GCTTGAAGTG ACGATTAATG GACAAAATGG AGGTTCCGAA
GTGGTGAAAA CATGTCCAGC TGCAATGGGT TTTGGTTTCG CTGCAGGAAC AACTGATGGA CCTGGAGCAT
TTGACTTTAA ACAAGGAGAT GATCAGGTAA AACCCAAATT CTCCTTCTAA CTTGGTAATG AAAGATGTTT
AGTACTATAC TTTATGTTGT GACTTTGTGT AAGGGAAATC CTTTCTGGAG GCTTGTAAGG AACCTTCTCA
AGAATCCAAC TGAGGAACAA GTACGATGCC AACGACCTAA ACCCATATTG CTTGATACCG GTGAAATGAA
ACAACCATAC GACTGGGCGG TGAGAGCATA ATCTTGTACT GTGATGGATA AAAATTGAAT CCCACTTAGC
TATTTGTGAT GGAAAAACTG TTTCTTAATC CATTTTCAGC CGTCGATATT ACCAGTTCAG ATCCTCCGCA
TTGGCCAGCT AGTGATTCTC TGCGTCCCCG GAGGTATTCC GGTCTCCCCC AGAACAAAAA AAATCATTTC
TAAACTGATG TAGAACATTA GTAATTTCCT TTCTCTATTG TTCTGCTTGC AAGAATTCAC AACAATGGCA
GGGAGGCGAC TACGTGATGC CGTGAAAACA GTGCTTAAAG AAGGCAGCAA TGGAAGAGAA TTCAGCGTGG
TAATAGCCGG GCTAACCAAT TCGTATTCGC AGTATATTGC CACATTTGAG GAATACCAAG TTCAGAGATA
TGAGGTCAGA GGCTTAGATA AGAAGGAAGA GCTTGTAGGA TCTTTCTTGA TTTCCTGCTC TTAAACCAAC
TCTGTTTATT CTTTCCCTCA GGGTGCATCG ACTTTGTATG GACCTCACAC GCTAAGCGGA TACATTCAAG
AATTCAAGAA ACTAGCAAAT GATCTTCTAT CTGCTCAAAC CACTGACCCG GGTCCCCAAC CACCTGACTT
ACTTCACAAG CAAATAAGCT TACTAACACC TGTTGTTGCG GATATGACAC CAATTGGAAC TGCATTCGGA
GATGTTACAT CGGATGTTCC TCGGTTATCC AAATTCAGGA AGGGAGCTGA CATAGTGAGG GTTCAATTCC
GGTCAGCTAA CCCGAGAAAC GATCTGATGA CGGAAGGAAC TTTCGCGCTT GTTGAGAGGT GGCTCGAAGG
AAGAGAGACA TGGGTACCTG TTTATGATGA TGATGACTTT TGCCTCCGGT TTAAGTGGTC AAGACCGTTT
AAACTCAGCA CGCAGAGCAC AGCAACTATC GAATGGAGAA TCCCTGAAAC CGCATCACCT GGTGTTTATA
GAATCACTCA CTTTGGTTCA GCTAAAACTC CTATAAGCTC CATTCACCAT TTCTCTGGTT CATCTAGTGC
CTTTGTTGTA TATTGAAATG TACACGTGAA TAGTCTTTAT ACGTATCCCT AGCAACACCA TCCAGTAAAT
AACCTTGTGT GTGCGAAAAA CAGTTTGTGT ACATAACCTT CCAGTGGAGG AAGAGGGTCT ATCTAATGAC
GTGTTTAGTT ACAACAAAAA CAGAGAGAAA CTTTTATAGT GAAAATAGTA ACACACAAAA GATTGAGAGA
GACTCTGTAC TTGTTCTGAA TTCGTTACGC CATTATTAAA TCTCGATCTC ACTTTTCTTC ATTACTACTC
CTAAAAACTA TAATCATTGA GAAACCCATT TTAAGATTAC ATCAATCATC ATCGCTGTTA GAGAGAAACT
GGAGCAACTT CTCAAATTTT AGCCTTTTTT TGTTTTTGCA TTTTGCCTAA TCGGTGCTTC TCCAGATTTC
GCTTATCTTG TTCCTATAGC ATAACAATG
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