( PDF ) Classificacão estrutural de famílias de proteínas com base em mapas de contatos

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RAQUEL CARDOSO DE MELO MINARDI

CLASSIFICAC¸

AO ESTRUTURAL DE FAM

ILIAS

DE PROTE

INAS COM BA SE EM MAPAS D E

CONTATOS

Belo Horizonte

04 de junho de 2008

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Universidade Federal de Minas Gerais

Instituto de Cincias E xatas

Programa de Ps-Graduao e m Bioinform

atica

CLASSIFICAC¸

AO ESTRUTURAL DE FAM

ILIAS

DE PROTE

INAS COM BA SE EM MAPAS D E

CONTATOS

Tese apresentada ao Curso de P´os-

Gradua¸c˜ao em Bioinform´atica da Univer-

sidade Federal de Minas Gerais como req-

uisito parcial para a obten¸c˜ao do grau de

Doutor em Bioinform´atica.

RAQUEL CARDOSO DE MELO MINARDI

Belo Horizonte

04 de junho de 2008

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS

FOLHA DE APROVAC¸

Classiﬁca¸c˜ao Estrutural de Fam´ılias de Prote´ınas com Base em

Mapas de Contatos

RAQUEL CARDOSO DE MELO MINARDI

Tese defendida e aprovada pela banca examinadora constitu´ıda por:

Prof. Ph. D. Marcelo Matos Santoro – Orientador

Universidade Federal de Minas Gerais

Prof. Ph. D. Wagner Meira Jr. – Co-orientador

Universidade Federal de Minas Gerais

Prof. Ph. D. J

ulio C

esar Dias Lopes – Co-orientador

Universidade Federal de Minas Gerais

Ph. D. Goran Neshich – Co-orientador

Empresa Brasileira de Pesquisa Agropequ

A¡ria

Prof. Ph. D. J

unior Barrera

Universidade de S˜ao Paulo

Prof Ph. D. Rodrigo Weber dos Santos

Universidade Federal de Ju´ız de Fora

Prof. Ph. D. W

alter Filgueira de Azevedo J

unior

Pontif´ıcia Universidade Cat´olica do Rio Grande do Sul

Profa. Ph. D. Glaura da ConceiC¸ c

ao Franco

Universidade Federal de Minas Gerais

Belo Horizonte, 04 de junho de 2008

Resumo Estendido

O objetivo deste trabalho ´e veriﬁcar se ´e poss´ıvel classiﬁcar estruturas de cadeias

proteicas utilizando apenas os dados das intera¸c˜oes qu´ımicas entre os seus res´ıduos

de amino´acidos. Atrav´es de mapas de contatos gerados a partir de dados do STING

e a utiliza¸c˜ao de trˆes diferentes m´etricas baseadas em t´ecnicas de processamento de

imagens somos capazes de classiﬁcar tais estruturas em fam´ılias de similar estrutura e

fun¸c˜ao.

Fizemos alguns ensaios de varia¸c˜ao de atributos no intuito de encontrar poss´ıveis

componentes de assinaturas estruturais de cada uma dessas fam´ılias. Veriﬁcamos que

existem alguns tipos de contatos mais relevantes na discrimina¸c˜ao das fam´ılias (pontes

de hidrogˆenio sem intermedia¸c˜ao de mol´eculas de ´agua, contatos hidrof´obicos e liga¸c˜oes

´ıon-´ıon) e outros menos relevantes (pontes de hidrogˆenio intermediadas por mol´eculas

de ´a gua). Mostramos tamb´em que contatos entre res´ıduos muito pr´oximos na seq¨uˆencia

(menos de 30 res´ıduos de distˆancia) n˜ao s˜ao muito ´uteis na classiﬁca¸c˜ao, sendo aparente-

mente ru´ıdos nesse processo. Al´em disto, pelos resultados preliminares, nem s´o os

res´ıduos que formam um grande n´umero de contatos s˜ao importantes. Res´ıduos com

poucos contatos aparentemente s˜ao imprescind´ıveis na deﬁni¸c˜ao da fam´ılia estrutural.

Mostramos que uma das t´ecnicas de compara¸c˜ao de mapas de contatos desenvolvida

pode ser ´util, adicionalmente, no alinhamento de contatos. Atrav´es destes alinhamen-

tos podemos, por exemplo, veriﬁcar as altera¸c˜oes conservativas nos contatos de uma

prote´ına mutante em rela¸c˜ao `a selvagem. Pode-se tamb´em, estudar comparativamente

uma mesma prote´ına de diversas espe´ecies animais.

Isto gerou ferramentas muito ´uteis na compara¸c˜ao de prote´ınas de uma mesma

topologia e diferentes esp´ecies e tamb´em no entendimento das varia¸c˜oes de estabilidade

de uma prote´ına selvagem e seus mutantes.

As t´ecnicas desenvolvidas parecem ser ´uteis tamb´em no estudo de padr˜oes de in-

tera¸c˜oes entre diferentes cadeias pro t eicas. Em ensaios com serino- proteases e seus

inibidores, os BPTIs, mostramos ser poss´ıvel deﬁnir um padr˜ao de contatos potencial-

mente importantes na complexa¸c˜ao do inibidor `a protease.

Alguns dos resultados deste trabalho foram implementados e est˜ao dispon´ıveis na

ferramenta STING (http://www.cbi.cnptia.embrapa.br/SMS/). Participamos da con-

cep¸c˜ao e implementa¸c˜ao de trˆes diferentes m´odulos: PCD (( Protein Contacts Dif-

ference)), TopSiMap (Topolog y S i milarity Map) e Topologs (um banco de dados de

estruturas similares tomando-se como base apenas contatos).

Abstract

The objective of this work was to verify if it is possible to classify protein chain

structures using only the chemical interactions between its residues. Through con-

tact maps and using three diﬀerent metrics based on image processing techniques we

have showed that we are able to classify such structures in families of similar structure

and function with precision up to 99%. We have performed some experiments with at-

tributes variation to ﬁnd possible comp onents of the structural signatures of each of the

studied protein families. We have veriﬁed that some types of interactions are more dis-

criminator then others (they are hydrogen bonds without water molecules in the middle

of residues, hydrophobic contacts and ion-ion linking) and that other are less discrim-

inator (hydrogen bo nds intermediated by water molecules). We also have showed that

contacts between residues which are sequentially close (less than 30 residues of dis-

tance) are not very discriminator attributes for classiﬁcation, apparently being noises

in the process. Moreover, for the preliminary results, the residues that form a great

number of contacts are not more important that the less connected ones as one should

previously think. Residues with few contacts apparently are essential in the deﬁnition

of the structural signature of a fa mily. We have showed that one of the t echniques for

contact maps comparison can additionally be useful as an heuristic for the contact map

overlap problem. It can be used to align contact maps and through these alignments

we can, for example, study mutations in residues that does not aﬀect the pattern of

contacts. We can compare mutant and wild prot eins and also, comparatively study a

protein of diverse animal species. Another important tested use of the technique is in

the discovery of a pattern of interactions between diﬀerent protein chains in complexes.

In assays with serine-proteases and its inhibitors, the BPTIs, we have showed that it is

possible to deﬁne a set of potentially impor tant contacts in the binding and stabiliza-

tion of the complexes. Some of the results of this work had been implemented and are

available, beyond this site, in t he STING (http://www.cbi.cnptia.embrapa.br/SMS).

We participate o f the conception and implementation of three diﬀerent modules: PCD

(Protein Contacts Diﬀerence), TopSiMap (Topology Similarity Map) a nd Topologs (a

data base of similar structures being overcome as base only contacts).

iii

Dedico este trabalho primeiramente a Deus pois sem Ele nada seria poss´ıvel e n˜ao

estar´ıamos aqui d e sfrutando destes t˜ao importantes momentos.

Dedico, tamb´em, ´as pessoas mais importantes da minh a vida. Estas pe ssoas que

n˜ao s´o me apresentaram os projetos dos sonhos, co mo desaﬁaram-me a constru´ı-los e

que tamb´em foram me ajudando nesta constru¸c˜ao dia ap´os dia

• A minha m˜ae Maria Jos´e, por sempre acreditar em mim mais do que eu mesma,

pelo carinho e inﬁnita dedica¸c˜ao.

• Ao meu pai J´ulio, autodidata e meu maior exemplo de que podemos aprender e

fazer muito mais do que imaginam.

• Ao meu marido

Angelo por acreditar e compartilhar comigo todos os sonhos e

pelo seu eno rme amor.

• E ´a minha av´o Con cei¸c˜ao , meu primeiro modelo de professor. Por sua culpa,

vislumbrei um ideal nesta proﬁss˜ao...

Agradecimentos

A Deus, `a minha fam´ılia e aos professores Marcelo Santoro, Wagner Meira Jr., J´ulio

C´esar Dias Lopes e ao Dr. Goran Neshich e Dr. Carlos Herique da Silveira.

Sum´ario

1 Introdu¸c˜ao 1

1.1 Diversidade funcional e estrutural de pro t e´ınas . . . . . . . . . . . . . . 1

1.2 Amino´a cidos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1

1.3 Liga¸c˜ao pept´ıdica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3

1.4 Estruturas prim´aria , secund´aria, terci´aria e quatern´aria de prote´ınas . . 5

1.5 Restri¸c˜oes conformacionais da cadeia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6

1.5.1 Paradoxo de Levinthal . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6

1.5.2 Planaridade da liga¸c˜ao pept´ıdica . . . . . . . . . . . . . . . . . 6

1.5.3

Angulos φ (phi) e ψ (psi) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6

1.5.4 Intera¸c˜oes n˜ao-Covalentes entre os res´ıduos de amino´acidos . . . 8

1.5.5 Estruturas secund´arias . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9

1.6 Especiﬁcidades dos res´ıduos de amino´acidos no enovelamento e atividade

de prote´ınas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11

1.7 Fam´ılias de prote´ınas modelo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14

1.7.1 Globinas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14

1.7.2 Outras fam´ılias . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15

1.7.3 Complexos Serino-protease - BPTI . . . . . . . . . . . . . . . . 15

1.8 Dados dispon´ıveis sobre prote´ınas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16

1.9 Seq¨uˆencia × estrutura × fun¸c˜ao de prote´ınas . . . . . . . . . . . . . . . 17

1.10 Importˆancia de se classiﬁcar estruturas . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17

1.11 Assinaturas estruturais . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19

1.12 Mapas de contatos e sua rela¸c˜ao com a estrutura . . . . . . . . . . . . . 19

1.13 Motiva¸c˜ao . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22

1.13.1 Trabalhos relacionados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22

1.14 Objetivo geral . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23

1.15 Objetivos espec´ıﬁcos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24

2 Materiais e m´etodos 25

2.1 Reposit´or io s p´ublicos de dados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25

2.1.1 PDB . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25

2.1.2 SCOP . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25

2.1.3 ASTRAL . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26

2.1.4 STING . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26

2.2 Metodologia para c´alculo dos contatos . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27

2.3 Sele¸c˜ao das bases de dados para os exp erimentos . . . . . . . . . . . . . 29

2.3.1 Sele¸c˜ao das Globinas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30

2.3.2 Sele¸c˜ao das prote´ınas de enovelamentos variados . . . . . . . . . 32

2.4 M´etricas para compara¸c˜ao dos mapas de contatos . . . . . . . . . . . . 32

2.4.1 A abordagem de recupera¸c˜ao de imagens com base no conte´udo 33

2.4.2 A abordagem de registro de imagens . . . . . . . . . . . . . . . 36

2.5 Algoritmo para deﬁni¸c˜ao de assinaturas estruturais . . . . . . . . . . . 40

2.5.1 Determina¸c˜ao dos agrupamentos de contatos . . . . . . . . . . . 40

2.5.2 Separa¸c˜ao dos clusters deﬁnidos incorretamente . . . . . . . . . 41

2.5.3 Deﬁni¸c˜ao dos vetores caracter´ısticos dos agrupamentos . . . . . 41

2.5.4 M´etrica para compara¸c˜ao das assinaturas . . . . . . . . . . . . . 42

2.6 Estrat´egia de ava lia¸c˜ao dos classiﬁcadores utilizando curvas ROC . . . 42

3 Publica¸c˜oes 44

3.1 An image - matching ap proach to protein similarity analysis . . . . . . . 44

3.2 A contact-map matching approach to protein structure similarity analysis 4 5

3.3 Similarity-based versus feature-based analysis of structural protein simi-

larity . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46

3.4 Mining structural signatures of proteins . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47

3.5 Finding protein-protein interaction patterns by contact map matchin g . 48

3.6 The STAR sting server: a multiplatform environment for protein struc-

ture analysis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49

4 Resultados e discuss˜oes 50

4.1 Calibra¸c˜ao dos classiﬁcadores . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50

4.1.1 Correlogramo de cores . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50

4.1.2 Earth mover’s distance . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50

4.2 An´alise dos atributos dos contatos usados na classiﬁca¸c˜ao . . . . . . . 52

4.2.1 Tipos de contatos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52

4.2.2 Elimina¸c˜ao dos contatos de curta distˆancia seq¨uencial . . . . . . 56

4.2.3 Elimina¸c˜ao dos contatos com res´ıduos pouco conectados . . . . 56

4.3 Resultados ﬁnais com a melhor conﬁgura¸c˜ao dos sistemas de classiﬁca¸c˜ao 57

4.4 Contribui¸c˜oes deste trabalho no software STING . . . . . . . . . . . . . 58

vii

4.4.1 PCD . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59

4.4.2 TopSiMap . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59

4.4.3 Topologs ASTRAL 40 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 60

4.5 Sistema de compara¸c˜a o de mapas de contatos dispon´ıvel na internet . . 61

5 Conclus˜oes 66

5.1 Perspectivas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67

A Seq¨uˆencias das Prot e´ınas Usadas nos Experimentos 69

A.1 Globinas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 69

A.2 Mioglobinas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 74

B Publica¸c˜oes 79

Referˆencias Bibliogr´aﬁcas 80

viii

Lista de Figuras

1.1 Variedade estrutural e funcional das prote´ınas . . . . . . . . . . . . . . . . 2

1.2 Estrutura b´asica de um amino´acido. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3

1.3 20 amino´acidos mais comumente encontrados nos seres vivos . . . . . . . . 4

1.4 Liga¸c˜ao pept´ıdica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5

1.5

Atomos componentes do plano da liga¸c˜ao pept´ıdica . . . . . . . . . . . . . 7

1.6 Planos consecutivos da cadeia polipept´ıdica . . . . . . . . . . . . . . . . . 7

1.7 α-h´elice . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10

1.8 Folha-β . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12

1.9 Folhas-β para lelas e anti-paralelas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12

1.10 Posicionamento das cadeias laterais em folhas-β . . . . . . . . . . . . . . . 13

1.11 Mioglobina de Baleia (PDB id 1a6m) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15

1.12 Complexo Serino-protease - BPTI (Quimotripsina (PDB id 1cho)) . . . . . 16

1.13 Alinhamento das seq¨uˆencias das Mioglobinas de baleia (PDB id 1a6m) e de

ciliado (PDB id 1dlw). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18

1.14 Um exemplo de mapa de contatos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20

1.15 Contatos respons´a veis pela forma¸c˜ao de α- h´elices. . . . . . . . . . . . . . . 21

1.16 Um exemplo da associa¸c˜ao entre os contatos de um mapa e uma estrutura. 21

2.1 Tipos de enovelamentos utilizados nos testes deste trabalho: (a) G lobina

(PDB id 1a6mA) ( b) Apolipoprote´ına (PDB id 1nfnA) (c) Plastocianina

(PDB id 1plcA) (d) RBP (PDB id 1rbpA) (e) Tioredoxina (PDB id 2trxA). 30

2.2 F lavohemoglobina: exemplo de cadeia de prote´ına com dom´ınio Globina

jutamente com outro dom´ınio. Prote´ınas multi-dom´ınio, tais como esta,

foram exclu´ıdas da nossa base de dados. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31

2.3 Alinhamento estrutural dos 50 exemplares de Globinas utilizados neste tra-

balho. Para obter maior clareza, exibimos apenas os ´atomos da cadeia

principal das prote´ınas. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31

2.4 Alinhamento estrutural dos 50 exemplares de Mioglobinas utilizados neste

trabalho. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32

2.5 Mapas de contatos hipo t´eticos a serem comparados nos exemplos. . . . . . 35

4.1 Curvas ROC do Correlogramo de cores com a varia¸c˜ao do parˆametro de raio

m´aximo de varredura d. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51

4.2 Varia¸c˜ao da precis˜ao do classiﬁcador baseado no CC com o aumento do

parˆametro d. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51

4.3 Varia¸c˜ao da precis˜ao do classiﬁcador baseado na m´etrica com o aumento do

parˆametro d

max

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52

4.4 An´alise comparativa da precis˜ao da classiﬁca¸c˜ao de Mioglobinas utilizando

a m´etrica CC com a conﬁgura¸c˜ao inicial e com os contatos hidrof´obicos,

pontes de hidrogˆenio (sem mol´eculas de ´agua) e contatos carregados atra-

tivos separadamente. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53

4.5 An´alise comparativa da precis˜ao da classiﬁca¸c˜ao de Mioglobinas utilizando

a m´etrica CC com pontes de hidrogˆenio ( sem mol´eculas de ´agua), con-

tatos hidrof´obicos, contatos carregados atrativos e r epulsivos, empilhamen-

tos arom´aticos e pontes dissulfeto. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 54

4.6 An´alise comparativa da precis˜ao da classiﬁca¸c˜ao de Mioglobinas utilizando

a m´etrica CC com diferenres tratamentos de pontes de hidrogˆenio. . . . . . 54

4.7 An´alise comparativa da precis˜ao da classiﬁca¸c˜ao de Mioglobinas utilizando

a m´etrica CC com pontes de hidrogˆenio com e sem interm´edio de mol´eculas

de ´agua. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55

4.8 An´alise comparativa da precis˜ao da classiﬁca¸c˜ao de Mioglobinas utilizando

a m´etrica CC com todas as varia¸c˜oes de tipos de contatos. . . . . . . . . . 55

4.9 Varia¸c˜ao da precis˜ao da classiﬁca¸c˜ao utilizando intera¸c˜o es hidrof´obicas com

a varia¸c˜ao do valor de corte para deﬁni¸c˜ao dos contatos hidrof´obicos. . . . 56

4.10 Freq¨uˆencia dos valores de distˆa ncia seq¨uencial de res´ıduos em contato em

todo o PDB. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 57

4.11 Varia¸c˜ao da precis˜ao com a elimina¸c˜ao de contatos pr´oximos seq¨uencialmente. 57

4.12 Freq¨uencia dos n´umeros de contatos de um res´ıduo com outros res´ıduos em

todo o PDB. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 58

4.13 Varia¸c˜ao da precis˜ao com a elimina¸c˜ao de contatos com res´ıduos que fazem

contatos com po ucos res´ıduos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 58

4.14 Precis˜ao dos classiﬁcadores com a melhor conﬁgura¸c˜ao utilizando contatos

hidrof´obicos e pontes de hidrogˆenio sem ´agua para variadas fam´ılias de

prote´ınas. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59

4.15 Relat´orio da diferen¸ca de contatos entre duas cadeias do m´odulo PCD do

STING. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 60

4.16 Interface do m´odulo TopSiMap do STING. (a) Telas de alinhamento de

seq¨uˆencia e de estruturas e mapa de contatos preservados nas duas cadeias

comparadas. (b) Contatos presentes apenas na primeira cadeia. (c) Con-

tatos presentes a penas na segunda cadeia. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61

4.17 Banco de dados Topologs do STING. (a) Tela de ids PDB de cerca de

4.000 cadeias do ASTRAL 40. (b) Lista de hom´ologos da cadeia com base

nos contatos com lin ks para an´alise comparativa das seq¨uˆencias, estruturas

e mapas de contatos. S˜ao exibidas as 100 cadeias mais parecidas dentre

as cerca de 4.000 da base. (c), (d) e (e) Primeira, d´ecima e vig´esima

estruturas mais parecidas com a mioglobina usada no exemplo. . . . . . . . 62

4.18 Web site com os resultados deste trabalho. Tela de visualiza¸c˜ao de base de

dados. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 63

4.19 Web site com os resultados deste trabalho. Tela de visualiza¸c˜ao de rank de

cadeias ordenadas po r similaridade em rela¸c˜ao `a uma cadeia consultada. . 64

4.20 Web s i te com os resultados deste trabalho. Tela de visualiza¸c˜ao dos detalhes

e compara¸c˜ao entre cadeia da consulta e cadeia do rank. . . . . . . . . . . 65

Lista de Tabelas

1.1 Nomenclatura e abrevia¸c˜oes utilizadas para os a mino´a cidos comumente en-

contrados em pro t e´ınas. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3

2.1 Tipos de contatos e seus valores de corte. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28

2.2 Distˆancias entre os pixels vermelhos de cada imagem no exemplo. . . . . . 35

2.3 Distˆancias entre os pixels verdes de cada imagem no exemplo. . . . . . . . 35

2.4 Distˆancias entre os pixels azuis de cada imagem no exemplo. . . . . . . . . 35

2.5 Distˆancias entre os pixels vermelhos entre o par de imagens no exemplo. . 37

2.6 Distˆancias entre os pixels verdes entre o par de imagens no exemplo. . . . . 37

2.7 Distˆancias entre os pixels azuis entre o par de imagens no exemplo. . . . . 37

xii

Cap´ıtulo 1

Introdu¸c˜ao

1.1 Diversidade funcional e estrut ural de prote´ınas

A palavra prote´ına vem do grego protas que signiﬁca ”de muita importˆancia”.

Prote´ınas s˜ao compostos orgˆanicos complexos que consistem em res´ıduos de amino´acidos

unidos por liga¸c˜oes pept´ıdicas. Fo r am descobertas em 1.838 por J¨ons Jakob Berzelius

e s˜ao as mais ativamente estudadas mol´eculas na Bioqu´ımica, sendo essenciais para as

estruturas e fun¸c˜oes das c´elulas vivas e v´ırus.

Diferentes prote´ınas desempenham uma ampla variedade de fun¸c˜oes biol´ogicas. Al-

gumas prote´ınas s˜ao enzimas (Fig ura 1.1a), catalizadoras de rea¸c˜oes qu´ımicas. Geral-

mente aumentam a velocidade de uma rea¸c˜ao em pelo menos 1 milh˜ao de vezes. Outras

tˆem papel essencial nos processos de resposta imunol´ogica. Os anticorpos (Figura 1 .1b)

s˜ao prote´ınas altamente espec´ıﬁcas que reconhecem e se combinam com substˆancias es-

tranhas como v´ırus, bact´erias e c´elulas de outros o r ganismos. H´a tamb´em aquelas

que tˆem papel estrutural e mecˆanico como, por exemplo, as prote´ınas constituintes

do citoesqueleto. A alta fo r¸ca de tens˜ao da nossa pele e ossos ´e devida `a presen¸ca

do Col´ageno (Figura 1.1c), uma prote´ına ﬁbrosa. O armazenamento e transporte de

substˆancias tamb´em s˜ao feitos por prote´ınas. A Hemoglobina (Figura 1.1d), por ex-

emplo, transporta o oxigˆenio nas hem´acias, enquanto a Mioglobina o armazena nos

m´usculos. O ferro ´e transporta do no plasma sang¨uineo pela Transferrina e ´e ar-

mazenado no f´ıgado na fo r ma de um complexo com a Ferritina. A Insulina (Figura

1.1e) ´e o hormˆonio respons´avel pela redu¸c˜ao da taxa de glicose no sangue.

1.2 Amino´acidos

Os amino´acidos s˜ao as unidades estruturais b´asicas das prote´ınas (Figura 1.2). Eles

s˜ao constitu´ıdos por um grupamento amina (−NH

), uma carboxila (−COOH), um

1. Introduc¸

ao 2

(a) (b)

Figura 1.1: Variedade estrutural e funcional das prote´ınas

(a) Src Tyrosine Quinase, enzima de sinaliza¸c˜ao. Localizada na membrana celular,

auxilia na passagem de sinais que regulam a s´ıntese de prote´ınas e o crescimento celu-

lar. (b) Anticorpo IgG1, um ligante neutralizador do v´ırus HIV-1. (c) Col´ageno,

de papel essencialmente estrutural, ´e a principal prote´ına presente em nosso tecido

conjuntivo e a mais abundante de nosso organismo. (d) Hemog l o bina, a prote´ına dos

gl´obulos vermelhos resp ons´avel pelo armazenamento e transporte do oxigˆenio em nosso

organismo. (e) I nsulina, hormˆonio polipept´ıdico sintetizado no pˆa ncreas.

´atomo de H e um grupamento R diferenciado, todos eles liga dos a um ´atomo de C

denominado Cα. O grupamento R ´e conhecido como ca deia lateral (CL).

As prote´ınas s˜ao compostas por um repert´orio de 20 tipos de amino´acidos mais

comument e encontrados nos seres vivo s e esse alfabeto ´e conservado h´a bilh˜oes de

anos. Os nomes destes amino´a cidos bem como suas abrevia¸c˜oes s˜ao apresentados na

Tabela 1.1.

O que diferencia estes 20 amino´acidos s˜ao suas diversas cadeias laterais (Figura

1.3). Estas variam em tamanho, forma, carga, capacidade de forma¸c˜ao de pontes de

1. Introduc¸

ao 3

Figura 1.2: Estrutura b´asica de um amino´acido.

Em azul, o ´atomo de N da amina; em vermelho, os ´atomos de O da carboxila; em verde, os

´atomos de C; em branco, os ´atomos de H e em violeta o radical vari´avel p rasente em todos

os amino´acidos.

Tabela 1.1: Nomenclatura e abrevia¸c˜oes utilizadas para os amino´acidos comumente

encontrados em prote´ınas.

Nome do amino´acido Abrevia¸c˜ao Abrevia¸c˜ao

de 3 letras de 1 letra

Alanina ALA A

Arginina ARG R

Asparagina ASN N

Aspartato ASP D

Ciste´ına CYS C

Glutamato GLU E

Glutamina GLN Q

Glicina GLY G

Histidina HIS H

Isoleucina ILE I

Leucina LEU L

Lisina LYS K

Metionina MET M

Fenilalanina PHE F

Prolina PRO P

Serina SER S

Treonina THR T

Triptofano TRP W

Tirosina TYR Y

Valine VAL V

hidrogˆenio, car´ater hidrof´obico e reatividade qu´ımica.

1.3 Liga¸c˜ao pept´ıdica

Conforme dito anteriormente, as prote´ınas s˜ao pol´ımeros lineares que se formam

pela liga¸c˜ao de grupos carboxila de amino´acidos com os grupos aminas dos amino´acidos

1. Introduc¸

ao 4

ALA ARG ASN ASP CYS

GLN GLU GLY HIS

ISO LEU LYS MET

PHE PRO SER THR

TRP TYR VAL

Figura 1.3: 20 amino´acidos mais comumente encontrados nos seres vivos

seguintes. Essa liga¸c˜ao ´e denominada liga¸c˜ao pept´ıdica e ocorre com a libera¸c˜ao de uma

mol´ecula de ´agua. Ap´os a liga¸c˜ao de dois amino´acidos (com a perda de ´atomos de O

e H da carboxila que se torna um g rupo carbonila (−C = O) e de um ´atomo de H da

amina originando um grupo amida (−NH)), estes passam a ser denominados res´ıduos

de amino´acidos (Figura 1.4 d).

1. Introduc¸

ao 5

(a)

(b)

Figura 1.4: Liga¸c˜ao pept´ıdica

Em (a), `a esquerda u m Triptofano e `a direita uma Valina. Em (b), o grupo carboxila do

Triptofano se liga ao gru po amina da Valina com a libera¸c˜ao de um a m ol´ecula de ´agua.

Observe que se forma uma amida entre os res´ıduos dos 2 amino´acidos da liga¸c˜ao pept´ıdica.

1.4 Est ruturas prim´aria, secund´aria, terc i´aria e

quatern´aria de p rote´ınas

Esta seq¨uˆencia de res´ıduos ligados por liga¸c˜oes pept´ıdicas que formam uma cadeia

polipept´ıdica ´e denominada estrutura prim´aria da prote´ına. Por conven¸c˜ao devido

`a dire¸c˜ao da s´ıntese proteica, o terminal amida da cadeia ´e tomado como in´ıcio da

seq¨uˆencia (N-terminal) e o carboxila ´e o ﬁm da cadeia (C-terminal).

As partes alta-

mente repetitivas das cadeias polipept´ıdicas (formadas pelo carbono α e grupos car-

bonila e amida), damos o nome de ca d eia principal (CP), sendo as partes vari´aveis as

cadeias laterais (CL).

Existem ainda as denomina¸c˜oes estrutura secund´aria, estrutura terci´aria e estrutura

quatern´aria. As estruturas secund´arias s˜ao padr˜oes tridimensionais que ocorrem em

segmentos de prote´ınas devido a padr˜oes de pontes de hidrogˆenio e ser˜ao detalhadas

posteriormente. A estrutura terc i ´a ria ´e a estrutura tridimensional da prote´ına deﬁnida

pelas coordenadas x, y e z dos seus ´atomos. A estrutura quaten´aria ´e um n´ıvel adicional

de organiza¸c˜ao molecular que consiste no arranjo de m´ultiplas cadeias enoveladas em

1. Introduc¸

ao 6

um complexo com duas ou mais subunidades, iguais ou diferentes.

As estruturas tridimensionais das prote´ınas s˜ao constitu´ıdas de dom´ınios. A primeira

deﬁni¸c˜ao de dom´ınios foi proposta por Wetlaufer em 1973 [Wetlaufer e Ristow, 1973]

como unidades est´aveis de estruturas de prote´ınas que podem enovelarse de forma

autˆonoma. Desde ent˜ao este conceito tamb´em tem sido relacionado a unidades de

estrutura compacta, com propriedades funcionais e evolutivas.

1.5 Restr i ¸c˜oes conformacionais da c ade ia

1.5.1 Paradoxo de L evinthal

Como pode esta seq¨uˆencia linear de res´ıduos de amino´acidos se enovelar formando

estruturas tridimensionais extremamente complexas? Em 1968, Cyrus Lenvinthal

[Levinthal, 1968] levantou um paradoxo muito importante na teoria da dinˆamica de

enovelamento de prote´ınas. Ele provou que a busca de uma cadeia polipept´ıdica de-

senovelada por sua conforma¸c˜ao nativa n˜ao podia ser uma busca aleat´or ia , mas devia

ser dirigida.

Considerando uma cadeia polipept´ıdica hipot´etica de 100 r es´ıduos de a mino´acidos e,

com absurda simpliﬁca¸c˜ao, considerando ainda que cada res´ıduo pudesse se apresentar

em 3 diferentes conforma¸c˜oes, a cadeia teria 3

100

≈ 5 × 10

conﬁgura¸c˜oes. Se esta

cadeia pudesse mudar de conforma¸c˜ao 10

vezes por segundo, ou 3 × 10

por ano,

levaria 10

anos para gerar todas conforma¸c˜oes e todo este tempo ´e maior que a idade

do universo. Como as prote´ınas se enovelam em escala de segundos o u menos, buscas

aleat´orias n˜a o s˜ao efetivamente a forma como as cadeias se enovelam.

1.5.2 Planaridade da liga¸c˜ao pept´ıdica

Existem v´arios fat ores conhecidos que reduzem o astronˆomico n´umero de poss´ıveis

conforma¸c˜oes para uma cadeia de res´ıduos. O primeiro deles ´e a pr´opria natureza

qu´ımica da liga ¸c˜ao pept´ıdica que ´e, essencialmente, planar de forma que seis ´atomos

dos res´ıduos ligados est˜ao em um mesmo plano: o Cα e o grupo carbonila do primeiro

res´ıduo e o gr upo amida e o Cα do segundo (Figura 1.5).

1.5.3

Angulos φ (ph i) e ψ (psi)

A liga¸c˜ao pept´ıdica tem car´ater de liga¸c˜ao parcialmente dupla, o que impossibilita a

sua rota¸c˜ao e restringe as poss´ıveis conforma¸c˜oes da cadeia polipept´ıdica. Em contraste,

as liga¸c˜oes entre o grupo amida e o Cα, assim como entre o grupo carbonila e o Cα,

s˜ao liga¸c˜oes simples, podendo rota cionar tomando v´arias orienta¸c˜oes. Na Figura 1.6,

1. Introduc¸

ao 7

Figura 1.5:

Atomos componentes do plano da liga¸c˜ao pept´ıdica

Em amarelo, podemos ver os ´atomos do grupo carbonila e o Cα do Triptofano e os ´atomos

do grupo amida e o Cα da Valina em um plano.

podemos ver 2 planos consecutivos f ormados em uma cadeia polipept´ıdica hipot´etica

(ILE-TRP-VAL) unidos pelo Cα do res´ıduo do meio (TRP). Devido `a possibilidade de

rota¸c˜ao das liga¸c˜oes entre o Cα e os grupos a mida e carbonila do Triptofano, os planos

podem girar com certo grau de liberdade. S˜ao esses graus de liberdade que possibilitam

que a cadeia polipept´ıdica tome uma inﬁnidade de conforma¸c˜oes.

Figura 1.6: Planos consecutivo s da cadeia polipept´ıdica

Nesta ﬁgura, acrescentamos outro res´ıduo a cadeia de polipept´ıd ica hipot´etica. Observe que

temos uma Isoleucina, seguida pelo Triptofano e pela Valina. Em amarelo, podemos ver os

´atomos formando 2 planos conectados pelo Cα do Tr iptofano.

As rota¸c˜oes dessas duas liga¸c˜oes s˜ao chamadas ˆangulos diedros. O ˆangulo entre o

N da amida e o Cα ´e chamado φ (phi) e o ˆangulo entre o Cα e o C da carbonila ´e

chamado ψ ( psi). Por´em, Ramachandran mostrou atrav´es de seu mapa que nem todas

as combina¸c˜oes de ˆangulos φ e ψ s˜ao poss´ıveis devido a conﬂitos est´ericos entre os

´atomos.

1. Introduc¸

ao 8

1.5.4 Intera¸c˜oes n˜ao-Covalentes entre os res´ıduos de

amino´acidos

Conforme explicamos, as prote´ınas s˜ao cadeias de amino´acidos estruturados tridi-

mensionalmente.

E essa estrutura que possibilita a execu¸c˜ao das mais complexas e

diversas fun¸c˜oes bioqu´ımicas. A estrutura¸c˜ao da cadeia e a sua manuten¸c˜ao neste es-

tado enovelado e f uncional deve-se, em grande parte, `as intera¸c˜oes eletrost´aticas n˜ao

locais entre os res´ıduos de amino´acidos distantes na seq¨uˆencia.

A maioria dos processos qu´ımicos est´a relacionada a altera¸c˜oes na distribui¸c˜ao dos

el´etrons entre os ´atomos. Todas a s intera¸c˜oes qu´ımicas entre os res´ıduos de amino´acidos

em prote´ınas envolvem varia¸c˜oes nas distribui¸c˜oes de cargas [Lopes, 2006].

E importante considerar que a energia da intera¸c˜ao entre ´atomos varia com a

varia¸c˜ao da distˆancia entre eles. Obviamente, a grandes distˆancias, n˜ao existe qual-

quer intera¸c˜ao mas, `a medida que a distˆancia diminui, ocorrem intera¸c˜oes de crescent e

intensidade at´e que o sistema seja estabilizado na mais prov´avel distˆancia de liga¸c˜ao.

Neste ponto, temos um m´ınimo de energia, predominando a atra¸c˜ao entre os ´atomos.

Com distˆa ncias mais curtas, e a conseq¨uente aproxima¸c˜ao de suas nuvens eletrˆonicas,

o processo come¸ca a ser repulsivo .

As intera¸c˜oes n˜ao locais s˜ao quase sempre n˜ao-covalentes. Uma liga¸c˜ao covalente

´e uma liga¸c˜ao qu´ımica cara cterizada pelo compartilhamento de um ou mais pares de

el´etrons entre dois componentes, produzindo uma a t r a¸c˜ao que segura a mol´ecula re-

sultante unida. Os ´ato mos tendem a compartilhar estes el´etrons para que sua camada

de valˆencia seja preenchida. As intera¸c˜oes n˜ao-covalentes s˜ao de natureza mais fraca

que as covalentes. As covalentes n˜ao passam de 40KJ/mol enquanto as n˜ao-covalentes

podem chegar a 1.000KJ/mol.

Um tipo de intera¸c˜a o n˜ao covalente e muito importante no entendimento de es-

truturas de prote´ınas s˜ao as li ga¸c˜oes dipolo-dipolo. Elas foram inicialmente estudadas

e postuladas por Johannes Diderik van der Waals em 1.873, tendo recebido o seu

nome. Os dipolos permamentes aparecem das liga¸c˜oes qu´ımicas entre ´atomos de difer-

entes eletronegatividades. Os dipolos induzidos, por sua vez, aparecem por indu¸c˜a o de

campos el´etricos nas vizinhan¸cas, em decorrˆencia de intera¸c˜ao com cargas el´etricas e

persistem enquant o persistir a origem do campo el´etrico. Elas s˜ao tamb´em conhecidas

como for¸cas de dispers˜ao de London em homenagem a Fritz London, seu descobridor.

A intensidade das intera¸c˜o es entre dipolos permanentes depende da polaridade das

liga¸c˜oes, enquanto nos dipolos induzidos ela depende da polar izabilidade dos el´etrons,

ou seja, da suscetibilidade da nuvem eletrˆonica `a deforma¸c˜ao.

Atomos maiores e menos

eletronegativos s˜ao mais polariz´aveis e apresentam intera¸c˜oes entre dipolos induzidos

mais fortes.

1. Introduc¸

ao 9

As liga¸c˜oes de h i drogˆenio, extremamente importantes na estabiliza¸c˜ao das estru-

turas secund´arias de prote´ınas, s˜ao tamb´em intera¸c˜oes dipolo -dipolo, diferenciando-se

pela maior intensidade e direcionalidade. A for¸ca da liga¸c˜ao de hidrogˆenio depende do

alinhamento entre os ´atomos que interagem. Fl´uor, oxigˆenio e nitrogˆenio s˜ao os mais

comuns ´atomos formadores de pontes de hidrogˆenio. A exigˆencia para forma¸c˜ao de uma

ponte de hidrogˆenio ´e a liga¸c˜ao polar de um hidrogˆenio com um ´atomo eletronegativo, o

doador. O ´atomo aceptor de hidrogˆenio deve ser um ´atomo com pares de el´etrons livres.

Quanto maior a eletronegatividade do ´atomo doador mais f orte a intera¸c˜ao. Quanto

maior e eletronegatividade do ´atomo aceptor mais fraca a intera¸c˜ao. Apenas oxigˆenio,

nitrogˆenio e ﬂ´uor apresentam pares de el´etrons n˜ao ligados disp on´ıveis.

Atomos mais

pesados (tais como cloro e enxofre) tamb´em podem participar de pontes de hidrogˆenio,

assim com as menos polarizadas (como C-H por exemplo).

De grande importˆancia s˜ao, adicionalmente, as liga¸c˜oes ´ıon-´ıon. Tˆem car´ater elet-

rost´atico como as dipolo-dipolo mas ocorrem entre ´atomos com cargas formais e s˜ao

bem mais fortes. Em prote´ınas existem 3 res´ıduos carregados positivamente: Argini-

nas, Lisinas e Histidinas (sendo que esta pode ter carga parcial quando desprotonada)

e 2 negativamente: Aspartato e Glutamato.

Essenciais no enovelamento proteico s˜ao tamb´em as intera¸c˜oes hi drof´obicas uma

vez que, nas c´elulas, a s prote´ınas est˜ao em meio aquoso. O efeito hidrof´obico est´a rela-

cionado `a tendˆencia das mol´eculas apola r es sofrerem agrega¸c˜ao em ´ag ua. A forma¸c˜ao

de intera¸c˜oes dipolo permanente-dip olo induzido entre as mol´eculas de ´agua e de ram-

iﬁca¸c˜oes apolares da prote´ına s˜ao mais fortes que as liga¸c˜oes dipolo induzido-dipolo

induzido entre trechos da pr´opria prote´ına. No entanto, ocorre uma reorganiza¸c˜ao

das mol´eculas de ´agua em torno das partes ap olares da prote´ına imobilizando um

grande n´umero de mol´eculas de ´agua na solvata¸c˜ao. Isto signiﬁca perda de entropia

das mol´eculas de ´agua, o que torna o processo desfavor´avel. Desta forma, trechos

apolares tendem a se aglutinar exp ondo a m´ınima superf´ıcie po ss´ıvel para solvata¸c˜ao.

Apesar de covalentes, ´e importante mencionar as pontes dissulfeto. Elas ocorrem

quando dois ´atomos de enxofre ligam-se pela oxida¸c˜ao dos grupos sulﬁdrila (S- H )

dos res´ıduos de ciste´ına. S˜ao as ´unicas liga¸c˜o es covalentes e n˜ao locais presentes em

prote´ınas sendo tamb´em muito impo r tantes no enovelamento e estabiliza¸c˜ao de algumas

prote´ınas.

1.5.5 Estruturas secund´arias

O grupo CO (carbo nila) ´e um bom aceptor e o grupo NH (amina) ´e um bom

doador. Esses grupos interagem com outros trechos da cadeia sendo muito impor-

tantes na estabiliza¸c˜ao das estruturas de prote´ınas e reduzindo obviamente o n´umero

1. Introduc¸

ao 10

de conforma¸c˜oes poss´ıveis para esta cadeia.

Em 1.951, Linus Pauling e Robert Corey propuseram a existˆencia de dois tipo s de

estruturas muito comuns em pro t e´ınas: as α-h´elices [Pauling et al., 1951] e as folhas-

β [Pauling e Corey, 1951]. Estas descobertas foram feitas com base nos estudos das

propens˜oes de forma¸c˜ao de pontes de hidrogˆenio dos ´atomos da cadeia principal e,

posteriormente, comprovadas por difra¸c˜ao de raios X.

As α-h´elices (Figura 1.7) s˜ao estabilizadas por pontes de hidrogˆenio entre os grupos

amida (doador) e carbonila (aceptor) de res´ıduos da cadeia principal com uma rota¸c˜ao

de cerca de 10 0 graus. Isto signiﬁca uma separa¸c˜ao de, em m´edia, 3,6 res´ıduos (≈ 4)

e 1,5

A de eleva ¸c˜ao de cada volta da h´elice. Desta forma, a principal cara cter´ıstica de

uma α-h´elice ´e que entre o s res´ıduos i e i + 4 existe uma ponte hidrogˆenio.

(a)

(b) (c)

Figura 1.7: α-h´elice

(a) Nesta ﬁgura, s˜ao exibidos apenas os ´atomos da cadeia principal de uma α-h´elice. Note

que as pontes de hidrogˆenio entre os H dos grupos amida e os C dos grupos carbonilas s˜ao

destacadas com uma linha tracejada. (b) A mesma h´elice exibida em esqu ema d e cartoon.

Existem ainda outros tipos de h´elices menos comuns em prote´ınas: as h´elices-3

que apresentam pontes de hidrogˆenio entre os res´ıduos i e i + 3 e as h´elices-π, entre os

res´ıduos i e i + 5.

1. Introduc¸

ao 11

As α-h´elices s˜ao bastante compactas n˜ao restando espa¸co em seu interior de modo

que as cadeias la t erais de seus res´ıduos ﬁcam sempre a pontando para fora da h´elice.

Os res´ıduos com maior propens˜ao de forma¸c˜ao de α-h´elices s˜ao a Metionina, a Alan-

ina, a Leucina, o Glutamato e a Lisina. Por outro lado, a Prolina, a Glicina, a Tirosina

e a Serina tˆem baixa propens˜ao. A Prolina n˜ao ´e um doador de hidrogˆenio e interfere

estericamente uma vez que seu anel restringe o ˆangulo φ da cadeia principal e, por isso,

costuma ser uma iniciadora ou ﬁnalizadora de h´elices. A Glicina apresenta um prob-

lema oposto: devido a sua alta ﬂexibilidade conformacional torna cara entropicamente

a sua restri¸c˜ao `a conforma¸c˜ao de h´elice.

Como, por forma¸c˜a o, todos os dipolos dos grupos carbonil (C = O) s˜ao posicionados

em uma mesma dire¸c˜ao e sentido, a h´elice tem um momento de dipolo causado por

esse efeito agregado. Normalmente, h´elices possuem um amino´acido negativo em seu

N-terminal. Podem possuir tamb´em um positivo em seu C-terminal. O N-terminal de

h´elices pode ser usado na intera¸c˜ao com ligantes carregados negativamente uma vez

que a amida de sua cadeia principal pode servir como doadora de H.

As fo lhas-β (Figura 1.8) s˜ao outro tipo de estrutura comum em prote´ınas e s˜ao

formadas por pontes de hidrogˆenio entre gr upamentos amida e carbo nila em ﬁtas

pept´ıdicas. A distˆancia axial entre os res´ıduos adjacentes ´e de cerca de 3,5

Folhas-β podem aparecer em paralelo ou antiparalelo de acordo com as dire¸c˜oes (em

termos de N-terminal e C-terminal) das ﬁtas em contato. Veja o exemplo de folhas-β

retirado da Carboxipep tida s e A na Figura 1 .9 .

Note que quando v´arios segmentos da cadeia principal se emparelham e formam uma

rede de pontes de hidrogˆenio, as cadeias laterais ( que n˜ao for am exibidas na Fig ura

1.8) apontam uma para cima outra para baixo da rede sucessivamente, conforme Figura

1.10.

1.6 Especiﬁ cidades dos res´ıduos de amino´acidos

no enovelamento e atividade de prote´ınas

A Alanina ´e um a mino´acido apolar, ou seja, hidrof´obico.

E um dos amino´acidos

mais freq¨uentes nas prote´ınas dos seres vivos.

A Arginina ´e uma cadeia alif´atica de 4 carbonos ﬁnalizada por um grupo guanidin a

(CH

). Este grupamento ´e formado pela oxida¸c˜ao do grupo guanina. Em condi¸c˜oes

ﬁsiol´ogicas, com um pK

de aproximadamente 12, 5, ´e encontra do protonado (CH

portanto com carg a +1. Devido `a sua geometria, sua distribui¸c˜ao de carg as e sua

habilidade de formar pontes de hidrogˆenio, este amino´acido ´e usualmente encontrado

interagindo com grupamentos negativos. Por este motivo ´e, geralmente, encontrada

1. Introduc¸

ao 12

(a) (b)

Figura 1.8: Folha- β

(a) Nesta ﬁgura, s˜ao exibidos apenas os ´atomos da cadeia principal de folhas-β. As pontes

de hidrogˆenio que estabilizam esta estrutura s˜ao apresentadas em linha tracejada. (b) As

mesmas folhas-β vistas em esquema de cartoon.

Figura 1.9: Folhas-β paralelas e anti-paralelas

exposta ao solvente onde pode interagir com as mol´eculas polares da ´agua.

A Asparagina tem um grupamento carboxi-amida (R −CO −NH

) em sua cadeia

1. Introduc¸

ao 13

Figura 1.10: Posicionamento das cadeias laterais em folhas-β

Nesta ﬁgura, apr esentamos um segmento da cadeia que forma a folha-beta da Figura 1.8. Os

´atomos de H foram removidos para melhorar a clareza e os ´atomos da cadeia principal (que

forma a rede de pontes de hidrogˆenio) s˜ao exibidos em amarelo. Perceba o posiocionamente

alternando para cima e para baixo das cadeias laterais. As pontes de hid rogˆenio, netes caso,

est˜ao perpendiculares ao plano deste papel.

lateral. Devido ao seu alto potencial de forma¸c˜ao de pontes de hidrogˆenio com a cadeia

principal de prote´ınas, ´e freq¨uentemente encontrada em in´ıcios e t´erminos de α- h´elices,

al´em de voltas de folhas-β.

O Aspartato ´e o ˆanion carboxilato do ´acido asp´artico, apresentando carga −1 no

grupamento COO da cadeia lateral em pH ﬁsiol´ogico.

A Ciste´ına possui um grupamento tiol em sua cadeia la teral, o que lhe d´a car-

acter´ısticas hidrof´ılicas. Devido `a alta reatividade qu´ımica (nucleof´ılico e facilmente

oxidado) deste grupamento, este res´ıduo ´e de muita importˆancia estrutural e funcional

em muitas prote´ınas.

O Glutamato ´e o ˆanion carboxilato do ´acid o glutˆamico. Como o nome indica, ele

possui um ´acido carbox´ılico (−C(= O)OH) em sua cadeia lateral e, em pH ﬁsiol´ogico

´e encontrado desprotonado com carga −1.

A Glutamina ´e um amino´a cido for mado pela substiti¸c˜ao de um hi droxil do

Acido

Glutˆamico por um grupo funcional amina.

A Glici na ´e o amino´acido mais simples. Sua cadeia lateral ´e formada por apenas

um ´ato mo de H e seu Cα n˜ao ´e quiral.

A Histidina possui um grupo im i dazole em sua cadeia lateral. Este grupamento

possui 2 ´atomos de N: um deles ´e ligado a um H e, portanto, ´e ´acido; o outro ´e b´asico.

Estas propriedades s˜ao exploradas de formas diferentes. Em tr´ıades catal´ıticas, o N

b´asico pode abstrair um pr´oton de Serinas, Treoninas e Ciste´ınas para at iv´a-las como

um nucle´oﬁlo. Ela tamb´em pode ser ´util na transferˆencia de pr´oto n de uma mol´ecula

para outra a t r av´es da abstra¸c˜ao de um pr´oton da mol´ecula origem po r seu N b´asico e

da posterior doa¸c˜ao do pr´oton do seu N ´acido para a mol´ecula destino. A Histidina

tem grande aﬁnidade por metais.

1. Introduc¸

ao 14

A Isoleucina ´e um amino´acido, cuja cadeia la t eral ´e composta apenas de ´atomos

de C e H sendo, portanto, bastante hidrof´obica.

A Leucina tamb´em possui sua cadeia lateral composta apenas por ´atomos de C e

H e ´e hidrof´obica.

A Lisina ´e um res´ıduo de amino´acido de cadeia alif´atica e, em pH ﬁsiol´ogico, ´e

encontrada com carga +1.

A Metionina ´e um res´ıduo de amino´acido a polar e cont´em um ´atomo de S.

A Fenilalanina possui um grupamento benzil em sua cadeia lateral de forma que ´e

um res´ıduo hidrof´obico.

A Prolina ´e um dos res´ıduos mais r´ıgidos devido ao seu anel ser formado com a

inclus˜ao de ´atomos da cadeia principal. Este res´ıduo n˜ao favorece a f orma¸c˜ao de estru-

tiras secund´arias sendo muito comuns no in´ıcio de α-h´elices e folhas-β. Tamb´em ´e fre-

quentemente encontrada em voltas e exposta ao solvente. Como n˜ao tem o hidrogˆenio

do grupo amida, n˜ao serve como doador de H mas apenas aceptor.

A Serina ´e um res´ıduo polar sendo muito importante para a fun¸c˜ao catal´ılitica de

algumas enzimas.

A Treonina ´e um res´ıduo polar, semelhante `a Serina.

O Triptofano se diferencia dos demais res´ıduos, pois sua cadeia lateral ´e composta

por um grupo indol. Este grupamento ´e um composto aro m´atico bic´ıclico consistindo

de um anel de benzeno com 6 carbonos e um anel pirr´olico com 5 membros sendo um

nitrogˆenio.

E um res´ıduo apolar e bastante volumoso.

A Tirosina possui sua cadeia lateral formada por um grupo fenol que lhe confere

fun¸c˜ao especial como transpo r tadora de grupos fosfato.

E um res´ıduo polar.

A Valina ´e um res´ıduo bastante hidrof´obico.

Entender como esse alfabeto ´e usado na cria¸c˜ao das mais complexas estruturas

tridimensionais ( Figura 1.1) que possibilitam a essas mol´eculas desempenharem as

mais variadas fun¸c˜oes biol´ogicas ´e uma quest˜ao em aberto na bioqu´ımica.

1.7 Fam´ılias de prote´ınas modelo

1.7.1 Globinas

Nos tra balhos desenvolvidos ao longo desta tese, usaremos como principal fam´ılia

experimental as Globinas. Elas foram as primeiras prote´ınas a terem sua estrutura

elucidada, sendo as mais bem estudadas. Prote´ınas deste enovelamento podem ser

encontradas como monˆomeros ou em complexos. S˜ao extremamente compactas e com-

postas por cerca de 153 res´ıduos de a mino´acidos, tendo um tamanho aproximado de

45 × 35 × 25

A. Para funcionar, dependem da presen¸ca do grupo prost´etico heme que

1. Introduc¸

ao 15

coordena o oxigˆenio atrav´es de um ´atomo de ferro. Cerca de 70% de sua cadeia ´e

enovelada em forma de, em m´edia, 8 h´elices. Seu interior ´e composto basicamente por

res´ıduos apolares como leucina, valina, metionina e fenilalanina. Os res´ıduos carrega -

dos, aspartato, glutamato, lisina e arginina, est˜ao quase sempre expostos ao solvente.

Os ´unicos res´ıduos polares no interior da mol´ecula s˜ao duas histidinas que s˜ao essenciais

na liga¸c˜ao de ferro e oxigˆenio.

Figura 1.11: Mioglobina de Baleia (PDB id 1a6m)

1.7.2 Outras fam´ılias

Adicionalment e, utilizamos nos nossos experimentos outras fam´ılias de prote´ınas de

enovelamentos diveros:

• Apolipoprote´ınas, prote´ınas compostas por um feixe de 4 α-h´elices;

• Plastoci aninas, prote´ınas constitu´ıdas por um barril de 6 ﬁtas β;

• Retinol- binding proteins, prote´ınas consitu´ıdas por um barril de 8 ﬁtas β acom-

panhado por pequenas α-h´elices;

• Tioredoxinas prote´ınas compostas por folha α / β aberta e t orcida.

1.7.3 Complexos Serino-protease - BPTI

Durante o desenvolvimento desta tese, optamos por aplicar as t´ecnicas desenvolvidas

para classiﬁca¸c˜ao de estruturas na tentativa de se buscar padr˜oes de intera¸c˜oes entre

cadeias de prote´ınas. Para estes experimentos, o complexo modelo foi o de Serino-

proteases com seu principal inibidor, o Bovine Pancratic Tryipson Inhibtor (BPTI).

1. Introduc¸

ao 16

As Serino-proteases s˜ao peptidases, ou seja, enzimas respons´aveis pela quebra de

liga¸c˜oes pept´ıdicas e s˜ao caracterizadas pela presen¸ca de um res´ıduo de serina em seu

s´ıtio catal´ıtico (tr´ıade cata l´ıtica, uma vez que ´e constitu´ıda por 3 res´ıduos). Participam

de in´umeras fun¸c˜oes vitais nos seres vivos como, por exemplo, coagula¸c˜ao, imuniza¸c˜ao

e digest˜ao.

Estas enzimas podem ser inibidas por um g rande conjunto de outras prote´ınas.

Uma delas ´e o BPTI que ´e uma pequena prote´ına globular composta de 53 res´ıduos

e estabilizada por 3 pontes dissulfeto. Esta mol´ecula foi uma das primeiras a terem

sua estrutura resolvida por NMR (Re s sonˆancia Nuclear Magn´etica) e ´e administrada

como medica¸c˜ao para reduzir o sangramento principalmente em cirurgias de cora¸c˜ao e

f´ıgado.

Figura 1.12: Complexo Serino-protease - BPTI (Quimotripsina (PDB id 1cho))

A Serino-protease ´e apresentada em ciza e o BPTI em verde.

1.8 Dados dispo n´ıveis sobre prote´ınas

O Uniprot (Universal Protein Resource) [Bairoch et a l., 2004] do European Bioin-

formatics In stitute (EBI) ´e o maior cat´alogo de informa¸c˜oes sobre seq¨uˆencias de prote´ınas.

Na vers˜ao atual, est˜ao dispon´ıveis cerca de 350.000 seq¨uˆencias das mais variadas

fam´ılias de prote´ınas.

O EBI provˆe ainda outros 16 bancos de dados com informa¸c˜oes sobre seq¨uˆencias

anotadas de prote´ınas. Apresentam uma classiﬁca¸c˜ao das seq¨uˆencias de a cordo com

1. Introduc¸

ao 17

sua similaridade, das intera¸c˜oes entre diferentes prote´ınas, de seus s´ıtios funcionais, de

prote´ınas que s˜ao enzimas e seus s´ıtios catal´ıticos, ent r e outras.

Dentre as milh˜oes de seq¨uˆencias dispon´ıveis nos bancos de dados p´ublicos, apenas

cerca de 50 .0 00 estruturas de prote´ınas e seus complexos foram resolvidas e est˜ao

depositadas no Protein Data Bank (PDB) [Berman et al., 2000]. Cada arquivo no PDB

possui v´arias informa¸c˜oes das quais destacamos a posi¸c˜ao no espa¸co tridimensional de

cada ´atomo das mol´eculas de prote´ınas. Neste trabalho, utilizamos apenas prote´ınas e

seus complexos com estrutura resolvida, ou seja, as coordenadas de seus ´atomos.

1.9 Se q¨uˆencia × es t r utura × fun¸c˜ao de prote´ınas

Por volta de 1.955, Christian Anﬁnsen publicou seus primeiros trabalhos

[Anﬁnsen et al., 1954, Anﬁnsen et al., 1955] e duas d´ecadas depois ganhou o Premio

Nobel em Qu´ımica [Anﬁnsen, 1973] com a demonstra¸c˜ao, em experimentos com a Ri-

bon uclease, da rela¸c˜ao entre a seq ¨uˆencia e a estrutura de prote´ınas. A Ribonuclease

´e uma enzima constitu´ıda por uma ´unica cadeia de 124 res´ıduos com a forma¸c˜ao de

4 pontes dissulfeto. Ele desnaturou a prote´ına na pretens˜ao de veriﬁcar em quais

condi¸c˜oes a mesma poderia ser renaturada.

Agentes como ur´eia ou cloreto de guanidina rompem as liga¸c˜oes n˜ao cova lentes.

Pontes dissulfeto podem ser desfeitas reversivelmente atrav´es do tratamento com β-

mercaptoetanol. Anﬁnsen tratou a Ribonucleas e com essas substˆancias, desenovelando

completamente as prote´ınas. Com a posterior redu¸c˜ao na concentra¸c˜ao destes compos-

tos, veriﬁcou que a enzima pouco a pouco recuperava sua atividade enzim´atica perdida

com a desnatura¸c˜ao. Todas as propriedades f´ısicas e qu´ımicas da enzima renaturada

eram idˆenticas `as da enzima nativa. Estes experimentos mostraram que toda a in-

forma¸c˜ao necess´aria para especiﬁcar a estrutura cataliticament e ativa da Ribonuclease

estava contida na seq¨uˆencia de res´ıduos de amino´acidos que a comp˜oem.

Estudos p osteriores mostraram a generalidade desse achado que ´e um dos postulados

centrais da Bioqu´ımica: a seq¨uˆencia especiﬁca a conforma¸c˜ao, ou a estrutura. Esta

dependˆencia ´e muito importante devido `a intima rela¸c˜ao entre estrutura e fun¸c˜ao. A

fun¸c˜ao que uma prote´ına desempenha em um organismo ´e completamente dependente

de sua estrutura tridimensional uma vez que ´e essa quem confere a especiﬁcidade `a

mol´ecula.

1.10 Importˆancia de se class i ﬁcar estrutu r as

Estruturas de prote´ınas podem ser classiﬁcadas de formas variadas por:

1. Introduc¸

ao 18

1a6mA VLSEGEWQLVLHVWAKVEADVAGHGQDILIRLFKSHPETLEKFDRFKHLKTEAEMKASED 60

1dlwA ___________SLFEQLGGQAA____________VQAVTAQFYANIQADATVATFFNGID 37

:: :: .:.* :. * : : .:: * * : . *

1a6mA LKKHGVTVLTALGAILKKKGHHEAELKPLAQSHATKHKIPIKYLEFISEAIIHVLHSRHP 120

1dlwA MPNQTNKTAAFLCAALG__GPNAWTGRNLKEVHAN___MGVSNAQFT_TVIGHLRSALTG 91

: :: .. : * * * * : : * : **. : :. :* .* *: :

1a6mA GDFGADAQGAMNKALELFRKDIAAKYKELGY 151

1dlwA AGVAAALVEQTVAVAETVRGDVVTV______ 116

....* . * .* *:.:

Figura 1.13: Alinhamento das seq¨uˆencias das Mioglobinas de baleia (PDB id 1a6m) e

de ciliado (PDB id 1dlw).

Aster´ıscos indicam res´ıduos conservados em ambas as seq¨uˆencias; dois pontos, muta¸c˜oes

conservativas e ponto, muta¸c˜oes semi-conservativas.

• similaridade funcional

• similaridade evolucion´aria da seq¨uˆencia de res´ıduos de amino´acidos

• similaridade de enovelamento.

A compara¸c˜ao de seq¨uˆencias ´e um m´etodo bastante simples de se obter informa¸c˜oes

sobre a rela¸c˜ao estrutural e evolucion´aria de prote´ınas. Duas prote´ınas com cerca

de 40% de identidade entre os amino´acidos de sua seq¨uˆencia ter˜ao, com alt´ıssima

probabilidade, estruturas similares [Leach, 2001]. Quando uma seq¨uˆencia de estrutura

desconhecida tˆem alta similaridade com uma de estrutura resolvida, podemos deduzir a

nova estrutura atrav´es de modelos computacionais feitos a partir da estrutura modelo.

Por´em, considere a compara¸c˜ao entre duas Mioglobinas: a primeira de baleia e a

outra de ciliado (Figura 1.13). Apesar da alta similaridade estrutural e identidade fun-

cional, conforme pode ser comprovado no alinhamento abaixo, existe apenas 12,58% de

identidade entre seus amin´acidos no alinhamento de suas seq¨uˆencias. Mesmo se relaxar-

mos essa compara¸c˜ao considerando as muta¸c˜oes conservativas e semi-conservativas,

obtemos ´ındices de 36,42% e 47,68% respectivamente. Isto nos mostra que existem

seq¨uˆencias pouco relacionadas mesmo para prote´ınas muito similares o que enfraquece

a abordagem apenas por seq¨uˆencias.

E preciso comparar as prote´ınas estruturalmente. As estruturas das prote´ınas po-

dem elucidar sua fun¸c˜ao e sua hist´oria evolucion´aria. Qual ´e a o r ig em da semelhan¸ca

estrutural de prote´ınas, cujas seq¨uˆencias n˜ao apresentam similaridade seq¨uencial signi-

ﬁcativa? Para elucidar essa quest˜ao estudos de classiﬁca¸c˜ao de estruturas de prote´ınas

s˜ao muito importantes. Eles tˆem deﬁnido fam´ılias de prote´ınas que compartilham

1. Introduc¸

ao 19

um n´ucleo estrutural similar, ou seja, os mesmos element os de estrutura secund´aria

conectados na mesma topo logia de forma independente da variabilidade seq¨uencial.

Prote´ınas de enovelamento similar, geralmente, s˜ao relacionadas evolutivamente e de-

sempenham fun¸c˜oes similares [Brenner et al., 1995].

Em [Murzin et al., 1995], o s autor es apresentam o Structural Classiﬁcation of Pro-

teins (SCOP), um banco de dados de classiﬁca¸c˜ao estrutural de dom´ınios de prote´ınas

que foi contru´ıdo basicamente por inspe¸c˜ao visual e compara¸c˜ao de estruturas a t r av´es

de m´etodos autom´aticos. Os dom´ınios s˜ao classiﬁcados hier´arquicamente contemp-

lando relacionamentos evolucion´arios e estruturais nos seguintes n´ıveis: fam´ılias, super-

fam´ılias, enovelamento e classe conforme ser´a detalhado na Se¸c˜ao 2.1.2.

Posteriorment e, outros autores em [Pearl et al., 2003] apresent am um novo banco de

dados de estruturas de dom´ınios de prote´ınas. Nesta base, cada dom´ınio ´e classiﬁcado

em super-fam´ılias e fam´ılias de seq¨uˆencia. Os mesmos autores produziram ta mb´em um

software denominado CATHEDRAL para compara¸c˜ao de estruturas de prote´ınas. Este

sistema ´e totalmente baseado no casamento de estruturas secund´arias e tenta classiﬁcar

uma estrutura de fam´ılia desconhecida em uma das fam´ılias do CATH.

1.11 Assin atur as estruturais

Assinaturas estruturais s˜ao representa¸c˜oes, possivelmente multidimensionais e con-

cisas, das caracter´ısticas das prote´ınas de mesmo enovelamento. S˜ao um conjunto de

caracter´ısticas inerentes `as seq¨uˆencias que s˜ao determinantes do seu enovelamento e

atividade.

1.12 Mapas de contatos e sua rela¸c˜ao com a

estrutura

A conforma¸c˜ao tridimensional de uma prote´ına pode ser representada de forma bas-

tante compacta como uma matriz esparsa, quadrada, sim´etrica e bin´aria de contatos

inter-res´ıduos, ou mapa de contatos. Um mapa de contatos ´e uma representa¸c˜ao par-

ticularmente ´util da estrutura de prote´ınas provendo informa¸c˜oes sobre suas estruturas

secund´arias e capturando aspectos de sua estrutura tridimensional.

Uma prot e´ına de n res´ıduos tem um mapa de contato n × n. Se dois res´ıduos de

amino´acidos a

e a

estiverem em contato, a posi¸c˜ao (i, j) ter´a um ponto, caso contr´ario,

ﬁcar´a em branco.

Dizemos que dois res´ıduos de amino´acidos est˜ao em contato se fazem uma liga¸c˜ao

n˜ao-covalente (exceto as pontes dissulfeto). Existem v´arias metodologias propostas

1. Introduc¸

ao 20

para deﬁni¸c˜ao destes contatos. A mais simples delas consiste em utilizar um valor

de corte para a distˆancia de separa¸c˜ao no espa¸co tridimensional entre os ´atomos dos

res´ıduos (seja considerando todos os seus ´atomos ou apenas os carbonos α). Em

[Hu et al., 2002], os autores utilizam uma distˆancia de corte de 7

A. [Sobolev et al., 1999]

descrevem uma metodologia muito mais apurada para detec¸c˜ao dos contatos. Ela

considera n˜ao s´o as distˆancias inter-atˆo micas como tamb´em a natureza dos ´atomos

pr´oximos e suas liga¸c˜oes. A Figura 1.14 a seguir mostra um mapa de contatos de uma

Mioglob ina.

100

150

200

50 100 150 200

Numero de residuos

Figura 1.14: Um exemplo de mapa de contatos.

Mapa de contatos de uma Mioglobina de baleia (PDB id 1a6m).

Para mostrar como os mapas de contatos s˜ao uma boa e robusta representa¸c˜ao

da estrutura de prote´ınas, vamos detalhar este mesmo mapa de Mioglobina de baleia,

associando alguns trechos `a estrutura.

Observe que existe um grande n´umero de contatos pr´oximos `a diagonal do mapa

(Figura 1.15). Estes s˜ao contatos entre res´ıduos bastante pr´oximos na seq¨uˆencia. Geral-

mente, s˜ao pontes de hidrogˆenio respons´aveis pela fo r ma¸c˜ao das α- h´elices.

E poss´ıvel

perceber claramente interrup¸c˜oes nestes contatos da diagonal. Estas interrup¸c˜oes in-

dicam as regi˜oes de cadeia n˜ao estruturada em h´elices. Podemos observar no mapa de

contatos as 8 h´elices comumente encontradas nas Globinas (denominadas na literatura

pelas letras de A a H).

Os agrupamentos de contatos distantes da diagonal indicam contatos n˜ao locais.

Observando na estrutura da Mioglobina as h´elices que est˜ao pr´oximas (obviamente

fazendo contato umas com as outras), vamos veriﬁcar no mapa que existem contatos

entre elas. As h´elices G e H, por exemplo, est˜ao ligeiramente cruzadas e em contato, de

forma que no quadrante do mapa relativo a estas h´elices, ´e poss´ıvel ver grande n´umero

de intera¸c˜oes (em destaque na Figura 1.16). Por outro lado, as h´elices C e H est˜ao

1. Introduc¸

ao 21

140

120

100

20 40 60 80 100 120 140

Numero de residuos

Figura 1.15: Contatos respons´aveis pela forma¸c˜a o de α-h´elices.

extremamente afastadas estruturalmente de modo que ´e natural n˜ao encontrar nenhum

contato relativo a estes trechos no mapa.

Observe ainda que os grupamentos de contatos n˜ao locais podem aparecer como

retas crescentes ou descrescentes. Esta ´e uma caracter´ıstica interessante por mostrar

se os trechos da cadeia em contato tˆem ou n˜ao a mesma orienta¸c˜ao na seq¨uˆencia. Agru-

pamentos crescentes indicam que as partes est˜ao em contato paralelamente, o u seja,

seus N-terminais e C-terminais est˜ao na mesma orienta¸c˜ao (como aproximadamente

acontece com as h´elices F e H). No caso desta Mioglobina, a maioria dos agrupamen-

tos s˜ao descrescentes indicando contatos antiparalelos (como por exemplo as h´elices G

e H).

1.13 Motiva¸c˜ao

As prote´ınas s˜ao macromol´eculas essenciais n˜ao s´o na estrutura¸c˜ao como em pro-

cessos qu´ımicos das c´elulas vivas e v´ırus. O entendimento de como um repert´orio de

20 amino´acidos ´e usado na composi¸c˜ao dessas mol´eculas com t˜ao diferenciadas e com-

plexas estruturas e fun¸c˜oes biol´ogicas ´e uma quest˜ao em aberto na Bioqu´ımica moderna.

Apesar das restri¸c˜oes estruturais impostas pelas liga¸c˜oes pept´ıdicas, os ˆangulos diedrais

d˜ao `a cadeia de amino´acidos tamanha liberdade que ´e, atualmente, imposs´ıvel prever a

estrutura de uma prote´ına partindo apenas de sua seq¨uˆencia de amino´acidos. Entender

profundamente a rela¸c˜ao entre a seq¨uˆencia de amino´acidos, a estrutura e a fun¸c˜ao de

prote´ınas ´e de capital impo r tˆancia no entendimento do processo de enovelamento destas

e conseq¨uentemente, na elucida¸c˜ao de pat ologias provenientes da sua m´a-forma¸c˜ao e

poss´ıvel desenvolvimento de terapias.

O estabelecimento de assinaturas estruturais para fam´ılias de prote´ınas ´e um passo

1. Introduc¸

ao 22

(a)

140

120

100

20 40 60 80 100 120 140

Numero de residuos

(b)

Figura 1.16: Um exemplo da associa¸c˜ao entre os contatos de um mapa e uma estrutura.

(a) Mapa de contato de uma Mioglobina de baleia (PDB id 1a6m) e (b) a respectiva estrutura

da prote´ına.

essencial nesse processo de busca e conhecimento dos aspectos necess´arios para que um

grupo de prote´ınas, com seq¨uˆencias potencialmente bastante diversas, enovelem-se em

semelhantes estruturas e desempenhem fun¸c˜oes idˆenticas.

Acreditamos que existe um padr˜ao de liga¸c˜oes n˜ao-covalentes que seja preservado

para cada fam´ılia de prote´ınas funcionalmente equivalentes.

E objetivo deste trabalho

estabelecer e desenvolver metodologias para obter esse padr˜ao de contatos que deve

ser mantido mesmo com alta variabilidade na dimens˜ao seq¨uencial. Acreditamos que,

mesmo com a varia¸c˜ao do alfabeto que comp˜oe um dado conjunto de prote´ınas de

mesma fun¸c˜ao, os contatos mais preservados s˜ao respons´aveis pela estrutura¸c˜ao similar

das prote´ınas, o que lhes confere a mesma semˆantica ou funcionalidade.

1. Introduc¸

ao 23

1.13.1 Trabalhos relacionados

Ao iniciar este projeto, n˜ao foram encontrados no nosso levant amento bibliogr´aﬁco

sistemas de classiﬁca¸c˜ao de estruturas de prote´ınas com base em mapas de contatos,

mas apenas alguns m´etodos de compara¸c˜ao e an´alise desses mapas. Em

[Holm e Sander, 1991], os autores apresentam uma metodologia para encontrar sube-

struturas comuns a um conjunto de prote´ınas atrav´es da an´alise de suas matrizes de

distˆancias. As matrizes de distˆancias s˜ao matrizes quadradas e sim´etricas assim como

os mapas de contatos mas em cada posi¸c˜ao (i, j) ´e apresentada a distˆancia euclidiana

3D em

A do resi´ıduo i para o j. Em [Lancia et al., 2001], os autores mostram que o

problema da sobreposi¸c˜ao de mapas de contatos (contact map overlap) ´e NP

provando

a sua a lta complexidade computacional e apresentam um algoritmo para solu¸c˜ao ´otima

para apenas alguns mapas com restri¸c˜oes espec´ıﬁcas.

[Caprara et al., 2004] d´a continuidade ao t r abalho apresentando nova abordagem

para solu¸c˜ao que inclui outros tipos de mapas mas ainda com restri¸c˜oes. Em

[Krasnogor e Pelta, 20 04], encontramos a primeira m´etrica de similaridade baseada em

mapas de contatos entre duas prote´ınas.

Em 2007, foram publicados os dois primeiros servidores web para compara¸c˜ao es-

trutural de prote´ınas e mapas de contatos. O primeiro deles [Chung et al., 2007] ´e

uma ferramenta que detecta contatos potencialmente conservados em um conjunto de

prote´ınas atrav´es de seu alinhamento estrutural. Dessa forma, ele parte de um alin-

hamento estrutural para alinhar mapas de contatos e buscar contatos preservados. O

outro [Bart hel et al., 2007] fez um trabalho de integra¸c˜ao de v´arias m´etricas para com-

para¸c˜ao estrutural e deﬁni¸c˜ao de uma m´etrica consenso para os casos em que as v´arias

m´etricas utilizadas divergem muito. Fomos pioneiros nesta ´area uma vez que o STING,

em sua vers˜ao Star lan¸cada em 2006 [Neshich et al., 2006b] j´a apresentava os m´odulos

TopSiMap, Topologs e PCD que s˜ao resultados deste projeto e possibilitam ao usu´ario

a compara¸c˜ao de mapas contato visualmente e atrav´es de algoritmos, a recupera¸c˜ao de

prote´ınas de mapas de contatos semelhantes.

Os algoritmos de compara¸c˜ao de mapas de contatos desenvolvidos ao longo deste

trabalho baseiam-se em algoritmos de processamento digital de imagens e vis˜ao com-

putacional. At´e o momento, n˜ao encontramos outros trabalhos que os utilizem na

compara¸c˜ao de mapas de contatos.

Na teoria de complexidade computacional, a classe de complexidade NP (de n˜ao-polinomial)

´e composta por problemas que s˜ao decid´ıveis por uma m´aquina de Turing n˜ao-determin´ıstica.

[Cormen et al., 2001] Na pr´atica, problemas deste tipo s˜ao aqueles cujo trabalho computacional en-

volvido em sua resolu¸c˜ao podem ser descritos como fun¸c ˜oes n˜ao-polinomiais, ou seja, problemas de

alta complexidade e para os quais o poder computacional existente n˜ao ´e suﬁciente para solucionar

de for ma ´otima o problema principalmente para grandes entradas.

1. Introduc¸

ao 24

1.14 Objet ivo geral

Desenvolver um classiﬁcador de estruturas de prote´ınas com base nos contatos in-

tramoleculares entre os res´ıduos de amino´acidos da cadeia polipept´ıdica.

1.15 Objet ivos espec´ıﬁcos

1. Determina¸c˜ao de a t ributos que sejam componentes essenciais de assinaturas es-

truturais de prote´ınas funcionalmente idˆenticas;

2. Desenvolver um algoritmo que permita a compila¸c˜ao de assinaturas estruturais

para cada fam´ılia de prote´ınas depositadas no PDB;

3. Constru¸c˜ao de uma ferramenta, que ser´a disponibilizada publicamente, para

an´alise e compara¸c˜ao de padr˜oes de contatos entre duas prote´ınas relacionadas.

Cap´ıtulo 2

Materiais e m´etodos

Neste cap´ıtulo, apresentamos um resumo dos materiais e m´etodos apresentados

ao longo das publica¸c˜oes desta tese. Finalizamos este cap´ıtulo com explica¸c˜oes dos

procedimentos realizados na sele¸c˜ao das bases de dados utilizadas nos experimentos

apresentados no cap´ıtulo de resultados e discuss˜oes que ainda n˜a o foram publicados.

2.1 Reposit´o r i os p´ublic os de dados

2.1.1 PDB

O PDB (Protein Data Bank) [Berman et al., 2000] ´e atualmente o maior e mais

completo reposit´orio de estruturas de prote´ınas existente e vem exp erimentando um

crescimento exponencial. Ele traz mais de 46.000 arquivos com coordenadas de mol´eculas

e / ou complexos prot´eicos. Segundo estat´ısticas do pr´oprio reposit´orio, existe alta re-

dundˆancia de dados sendo aproximadamente 1 7.000 cadeias com menos de 90% de

homologia seq¨uencial. Para cada cadeia, podem existir dados de diversos mutantes

simples ou m´ultiplos al´em da existˆencia de m´ultiplos cen´arios experimentais nos quais

a estrutura foi resolvida.

As principais t´ecnicas utilizadas na resolu¸c˜ao de estruturas s˜ao a difra¸c˜ao de raios-X,

a ressonˆancia nuclear magn´etica (NMR) e a microscopia eletrˆonica. A grande maio r ia

das estruturas depositadas no PDB fora m resolvidas por difra¸c˜ao de raios-X. Em m´edia,

a resolu¸c˜ao ´e de 2,18

A com desvio padr˜ao de 1,31

2.1.2 SCOP

Muito esfor¸co tem sido feito no intuito de organizar o cat´alogo de estruturas do

PDB. Uma das iniciativas de classiﬁca¸c˜ao das cadeias do PDB foi feita pelo SCOP

(Structural Classiﬁcation of Proteins) [Brenner et al., 1995]. Na vers˜ao atual (1.71) do

2. Materiais e m

etodos 26

SCOP, 27.599 das cerca de 46.0 00 entradas do PDB foram anotadas o que signiﬁca

75.930 cadeias de 1.160 diferentes enovelamentos. Este trabalho foi realizado n˜ao s´o

atrav´es de softwares mas tamb´em de inspe¸c˜ao manual. A classiﬁca¸c˜ao deste banco de

dados se d´a em termos de fam´ılias, super- fam´ılias, enovelamentos e classes. Segundo

os a utor es, prote´ınas s˜ao de uma mesma fam´ılia se tem alta similaridade seq¨uˆencial e

estrutural. Prote´ınas da mesma super-fam´ıli a s˜ao provavelmente r elacionadas evolu-

tivamente compartilhando o mesmo enovelamento e desempenhando fun¸c˜oes bastante

similares. Prote´ınas compartilham o mesmo enovelamento se possuem o mesmo arranjo

arquitetural, ou seja, s˜ao estruturalmente muito pr´oximas. As classe s do SCOP s˜ao

deﬁnidas com base na compo si¸c˜ao das cadeias em termos de estruturas secund´arias: se

a maioria ´e α (formadas, na maioria, por α-h´elices) ou β (formadas, na maioria, por

folhas β) ou uma jun¸c˜ao delas.

O SCOP ´e muito ´util na valida¸c˜ao dos resultados deste trabalho uma vez que ´e

uma excelente anota¸c˜ao das cadeias depositadas no PDB. Adicionalmente, s˜ao disponi-

bilizados arquivos texto facilmente leg´ıveis por scri p ts nos quais pode-se obter, n˜ao

s´o a classiﬁca¸c˜ao em termos de classes, enovelamentos, fam´ılias e super-fam´ılias mas

tamb´em a descri¸c˜ao da cadeia e do organismo (nomenclatura cient´ıﬁca e comum) do

qual a prote´ına foi extra´ıda. Neste trabalho, utilizamos a sua classiﬁca¸c˜ao com base

no enovelamento.

2.1.3 ASTRAL

O PDB ´e um reposit´orio de dados muito completo e ´util para diversas ´areas de

pesquisa o que tamb´em faz com que ele seja muito redundante. Para este trabalho,

muitas vezes foi necess´ario trabalhar com um conjunto n˜ao redundante de prote´ınas.

Essa sele¸c˜ao ´e bastante trabalhosa e deveria excluir seq¨uˆencias muito similares, es-

truturas muito redundantes, considerar o organismo da qual ela f oi extra´ıda, entre

outros aspectos a avaliar. Quando precisamos diminuir a redundˆancia no conjunto de

dados recorremos `a sele¸c˜ao do ASTRAL [Brenner et al., 2000, Chandonia et al., 2002,

Chandonia et al., 2004]. Este banco de dados ´e parcialmente derivado do SCOP e

provˆe prote´ınas n˜ao redundantes com base em um valor de corte para a similaridade

seq¨uencial das cadeias.

2.1.4 STING

O STING [Neshich et al., 2006b, Neshich et al., 2005, Neshich et al., 2003] ´e um

completo banco de dados acompanhado de v´arias ferramentas para an´alise estrutural

de prote´ınas. Seu m´odulo de contatos [Mancini et a l., 2004] possibilita a deﬁni¸c˜ao e

2. Materiais e m

etodos 27

an´alise de intera¸c˜oes n˜ao covalentes (considerando adicionalmente as pontes dissulfeto).

Os autores dividiram as p oss´ıveis intera¸c˜oes em 14 tipos:

• Contatos hidrof´obicos;

• Contatos carregados atra t ivos (intera¸c˜oes ´ıon-´ıon);

• Contatos carregados repulsivos (intera¸c˜oes ´ıon-´ıon);

• Pontes de hidrogˆenio entre cadeia principal e cadeia principal (sem ou com uma

ou duas mol´eculas de ´agua);

• Pontes de hidrogˆenio entre cadeia principal e cadeia lateral (sem ou com uma ou

duas mol´eculas de ´agua);

• Pontes de hidrogˆenio entre cadeia lateral e cadeia lateral (sem ou com uma ou

duas mol´eculas de ´agua);

• Empilhamento arom´atico (intera¸c˜oes dipolo induzido-dipolo induzido entre an´eis

arom´aticos);

• Pontes dissulfeto

O STING utiliza a deﬁni¸c˜ao de contatos proposta em [Sobolev et al., 1999]. Ele con-

sidera pontes de hidrogˆenio os contatos entre 2,0 e 3,2

A atribuindo a elas 2,6kcal/mol

de energia, contatos hidrof´obicos de 2,0 a 3,8

A e 0,6kcal/mol, carregados entre 2,0 e

6,0

A e 10,0kcal/mol, po ntes dissulfeto entre 1,5 e 2,8

A e 85,0kcal/mol. Para os em-

pilhamentos arom´aticos a energia ´e 0,5kcal/mol e a distˆancia n˜a o foi encontrada na

literatura.

2.2 Metodolo gia para c´alculo dos contatos

Nossa metodologia para c´alculo dos contatos foi parcialmente baseada em

[Sobolev et al., 1999, Neshich et al., 2006b, Neshich et al., 2005, Neshich et al., 2003].

Todos os ´atomos de cada um dos 20 res´ıduos de amino´acidos mais comumente encon-

trados em prote´ınas fora m classiﬁcados em uma ou mais das seguintes classes:

• Hidrof´obicos

• Positivos

• Negativos

2. Materiais e m

etodos 28

• Aceptores de ponte de hidrogˆenio

• Doadores de ponte de hidrogˆenio

• Arom´aticos

• Enxofres

Seguem as classes dos ´atomos:

• Hidrof´obicos: ALA(CB), ARG(CB, CG, CD), ASN(CB), ASP(CB), CYS(CB),

GLN(CB, CG), GLU(CB, CG), HIS(CB, CG, CD2, CE1), ILE(CB, CG1, CG2,

CD1), LEU(CB, CG, CD1, CD2), LYS(CB, CG, CD), MET(CB, CG, CE),

PHE(CB, CG, CD1, CD2, CE1, CE2, CZ), PRO(CB, CG, CD), THR(CG2),

TRP(CB, CG, CD1, CD2, CE2, CE3, CH2, CZ, CZ2, CZ3), TYR(CB, CG,

CD1, CD2, CE1, CE2, CZ), VAL(CB, CG1, CG2)

• Positivos: ARG(NH1, NH2), HIS(ND1, NE2), LYS(NZ)

• Negativos: ASP(OD1, OD2), GLU(OE1, OE2)

• Aceptores: ALA(O), ARG(O), ASN(O, OD1), ASP(O, OD1, OD2), CYS(O),

GLN(O, OE1), GLU(O, OE1, OE2), GLY(O), HIS(O), ILE(O), LEU(O), LYS(O),

MET(O), PHE(O), PRO(O), SER(O), THR(O), TRP(O), TYR(O), VAL(O)

• Doadores: ALA(N), ARG(N, NE, NH1, NH2), ASN(N, ND2, OD1), ASP(N),

CYS(N), GLN(N, NE2), GLU(N), GLY(N), HIS(N, ND1, NE2), ILE(N), LEU(N),

LYS(N, NZ), MET(N), PHE(N), PRO(N), SER(N, OG), THR(N, OG1), TRP(N,

NE1), TYR(N, OH), VAL(N)

• Arom´aticos: HIS(CG, ND1, CD2 , CE1, NE2), PHE(CG, CD1, CD2, CE1, CE2,

CZ), TRP(CG, CD1, CD2, NE1, CE2, CE3, CZ2, CZ3, CH2), TYR(CD1, CD2,

CE1, CE2, CG, CZ)

• Enxofre: CYS(S), MET(SD)

Consideramos que dois r es´ıduos de amino´acidos fazem algum tipo de contato se, e

somente se:

1. A distˆancia seq¨uencial entre eles for de, no m´ınimo, 3 res´ıduos;

2. Algum dos ´ato mos de um dos res´ıduos estiver a uma distˆancia tridimensional

dentro dos intervalos de corte pr´e-deﬁnidos para suas classes de algum ´atomo do

outro res´ıduo;

3. Os ˆangulos entre os ´atomos n˜ao s˜ao considerados no cˆomputo dos contatos.

2. Materiais e m

etodos 29

Deﬁnimos entre ´atomos dessas classes os seguintes tipos de contatos:

Tipo de contato Classes de ´atomos Valor de corte (

Hidrof´obicos ambos hidrof´obicos entre 2 e 3 ,8

Carregados atrativos positivos e negativos entre 2 e 6

Carregados repulsivos ambos positivos ou negativos entre 2 e 6

Pontes de hidrogˆenio aceptores e doadores entre 2 e 3,2

Empilhamentos arom´aticos ambos arom´aticos entre 3 e 8

Pontes dissulfeto ambos enxofre entre 1,5 e 2,8

Tabela 2.1: Tipos de contatos e seus valores de corte.

2.3 Se l e¸c˜ao das bases de dados para os

experimentos

Para veriﬁcar a precis˜ao dos classiﬁcadores propostos foi necess´ario selecionar um

conjunto de prote´ınas de um enovelamento espec´ıﬁco e outro conjunto de enovelamentos

diferentes e variados. O objetivo dos experimentos fo i calcular a precis˜ao dos classi-

ﬁcadores na recupera¸c˜ao de element os da fam´ılia espec´ıﬁca misturados com outras de

enovelamentos diferentes. Utilizamos o banco de dados SCOP na sele¸c˜ao das prote´ınas

uma vez que ele as divide de acordo com o enovelamento.

Selecionamos as Globinas como enovelamento modelo e, adicionalmente, veriﬁcamos

a precis˜ao dos classiﬁcadores com outras fam´ılias diferentes. Seguem as fam´ılias tra-

balhadas:

• Globinas

• Apolipoprote´ınas

• Plastocianinas

• RBPs (Retinol b i nding proteins)

• Tioredoxinas

As Globinas (Figura 2.1(a)) s˜ao as prote´ınas respons´aveis pelo t r ansporte de mol´eculas

de oxigˆenio nos m´usculos e no sangue e est˜ao entre as mais b em estudadas prote´ınas.

S˜ao compostas exclusivamente por α-h´elices. As Apolipoprote´ınas (Figura 2.1 (b)),

tamb´em compostas exclusiva mente por α- h´elices, s˜ao prote´ınas que ligam lip´ıdios e

constituem as Lipoprote´ınas do plasma. S˜ao importantes no t ransporte dos lip´ıdios

ingeridos atrav´es do ﬂuxo sang¨uineo do intestino para o f´ıgado e de lip´ıdios sintetiza-

dos pelo orga nismo para os tecidos que o s armazenam, metabolizam e secretam. As

Plastocianinas (Figura 2.1(c)) s˜a o prote´ınas envolvidas no transporte de el´etrons na

2. Materiais e m

etodos 30

fotoss´ıntese. Contˆem um ´atomo de cobre e s˜ao compostas basicamente po r folhas-

β em um arra njo em forma de barril. As RBPs (Figura 2.1(d)), tamb´em prote´ınas

predominantemente compostas por fo lhas-β, tˆem fun¸c˜ao relacionada com o transporte

de Retinol e s˜ao respons´aveis por solubilizar e estabilizar ligantes hidrof´obicos em

solu¸c˜ao aquosa. Tioredoxinas (Figura 2.1(e)) s˜ao prote´ınas compostas por uma mis-

tura de α-h´elices e folhas-β. Atuam como anti-oxidantes facilitando a redu¸c˜ao de o utras

prote´ınas.

(a)

(b) (c)

(d) (e)

Figura 2.1: Tipos de enovelamentos utilizados nos testes deste trabalho: (a) Globina

(PDB id 1a6mA) (b) Apolipoprote´ına (PDB id 1nfnA) (c) Plastocianina (PDB id

1plcA) (d) RBP (PDB id 1rbpA) (e) Tioredoxina (PDB id 2trxA).

2.3.1 Sele¸c˜ao das Globinas

A consulta pelo enovelamento Globina na vers˜ao atual do banco de dados SCOP re-

tornou 1.356 exemplares de Globinas. Percebemos que algumas dessas cadeias possu´ıam

dom´ınios Globina juntamente com outros tipos de dom´ınios, como ´e o caso da Flavo-

hemoglobina ilustrada na Figura 2.2. Por esse motivo, ﬁzemos uma veriﬁca¸c˜ao manual

veriﬁcando se cada cadeia de Globina indicada r epresentava mesmo apenas o dom´ınio

Globina.

2. Materiais e m

etodos 31

Figura 2.2: Flavohemoglobina: exemplo de cadeia de prote´ına com dom´ınio Glo bina ju-

tamente com outro dom´ınio. Prote´ınas multi-dom´ınio, tais como esta, foram exclu´ıdas

da nossa base de dados.

Do conjunto curado de Globinas f oram selecionados 50 exemplares que foram alin-

hados utilizando o software PriSM [Yang e Honig, 1 999] e s˜ao apresentados na Figura

2.3. O PriSM ´e um software para an´alise e modelagem de prote´ınas que tem duas

vantagens em rela¸c˜ao a outros pacotes: suporta o alinhamento de um grande n´umero

de cadeias e n˜ao utiliza nenhum parˆametro para realizar os alinhamentos.

Figura 2 .3 : Alinhamento estrutural dos 50 exemplares de Globinas utilizados neste

trabalho. Para obter maior clareza, exibimos apenas os ´atomos da cadeia principal das

prote´ınas.

Exibimos, no Anexo A, os alinhamentos das seq¨uˆencias dos 50 exemplares de Globi-

nas utilizados neste trabalho.

2.3.1.1 Sele¸c˜ao das Mioglobinas

Al´em de selecionar prote´ınas variadas do enovelamento Globina, optamos po r sele-

cionar um subconjunto bastante homogˆeneo deste enovelamento. Selecionamos outra

2. Materiais e m

etodos 32

base de dados composta pelas Mioglobinas. Na vers˜ao atual do SCOP (1.71), h´a 217

cadeias destas prote´ınas. S˜ao 151 provenientes de baleia, 7 de cavalo marinho, 1 de

foca, 33 de porco, 20 de cavalo, 1 humana, 1 de elefante, 2 de tartaruga e 1 de atum.

Selecionamos mais uma vez 50 exemplares de Mioglobinas de forma a manter os ex-

emplares de esp´ecies menos comuns no PDB e balanceando a escolha de esp´ecies mais

comuns, eliminando alguns deles.

Figura 2.4: Alinhamento estrutural dos 50 exemplares de Mioglobinas utilizados neste

trabalho.

No Anexo A, apresentamos o a linhamentos das seq¨uˆencias destas Mioglobinas.

2.3.2 Sele¸c˜ao das prote´ınas de enovelamentos variados

Como as Globinas tˆem cerca de 150 res´ıduos de amino´acidos, as Ap olipoprote´ınas

190, as Plastocianinas 100, as RPBS 180 e as Tioredoxinas 110, selecionamos do SCOP

50 cadeias aleat´oriamente dentre aquelas cujo n´umero de res´ıduos de amino´a cidos es-

tava dentro do intervalo [100,200]. Nesse conjunto temos prote´ınas α, β, α/ β e α + β.

Acreditamos que pro te´ınas com n´umeros de res´ıduos muito diferentes diﬁcilmente se-

riam confundidas uma vez que o n´umero de contatos a comparar seria tamb´em muito

diferente.

2.4 M´etricas para compara¸c˜ao dos mapas de

contatos

Nesta se¸c˜ao, mostraremos como a abordagem de casamento de imagens ´e utilizada

para medir a similaridade estrutural de duas prote´ınas com base em seus mapas de

contato. Em particular, exploramos 2 diferentes paradigmas no tratamento deste prob-

lema:

2. Materiais e m

etodos 33

• O paradigma de recupera¸c˜ao de imagens com base no conte´udo (RIBC) resolvido

com uma m´etrica baseada nas carater´ısticas das imagens, o correlogramo de cores

(CC);

• O paradigma de registro de imagens (RI) que solucionamos com duas t´ecnicas

baseadas na similaridade das imagens: raio m´edio de dispers˜ao ( RMD) e earth

mover’s distance (EMD).

A RIBC ´e uma disciplina cient´ıﬁca amplamente baseada na no¸c˜ao de que ´e poss´ıvel

comprimir imagens preservando sua semˆantica [Pentland et al., 1994]. As imagens s˜ao

comprimidas em um vetor assinatura de menor tamanho poss´ıvel, visando a eﬁciˆencia

de poss´ıveis consultas `as bases de assinaturas. Usualmente, esses vetores assinatura s˜ao

computados com base em atributos de baixo n´ıvel extra´ıdos diretamente das imagens

tais como cores, texturas ou primitivas geom´etricas e seus relacionamentos espaciais

na imagem que provˆem informa¸c˜oes semˆanticas de alto n´ıvel [Mojsilovic et al., 2004].

Uma forte motiva¸c˜ao para aplica¸c˜ao deste tipo de t´ecnica ´e o crescimento das bases

de prote´ınas como o pr´oprio PDB. A indexa¸c˜ao dessas bases de dados ´e uma opera¸c˜ao

computacionalmente cara mas, uma vez criados os vetores assinatura, a pesquisa ´e

bastante eﬁciente.

O paradigma de RI [Brown, 1992] ´e usualmente utilizado na compara¸c˜ao de imagens

de um mesmo objeto que sofre transforma¸c˜oes n˜ao r´ıgidas

[Maintz e VIergever, 1998]. Um custo ´e at ribu´ıdo para cada deforma¸c˜ao que o objeto

precisa sofrer e a dissimilaridade entre as imagens ´e computada como sendo o m´ınimo

custo para deformar uma imagem na outra.

A motiva¸c˜ao pela qual aplicamos este tipo de t´ecnica ´e que prote´ınas de seres

distintos evolu´ıram de mol´eculas ancestrais e suas distˆancias ﬁlogen´eticas devem estar

fortemente correlacionadas com a dissimilaridade estrutural. Assim, se pud´essemos,

de alguma forma, modelar as deforma¸c˜oes necess´arias para tra nsformar um mapa de

contatos de uma primeira prote´ına em um mapa de uma outra prote´ına como uma

seq¨uˆencia de transforma¸c˜oes que imitariam os efeitos da evolu¸c˜ao na sua estrutura, a

similaridade estrutural entre essas prote´ınas poderia ser calculada como a seq¨uˆencia de

transforma¸c˜oes de custo m´ınimo.

Existe um compromisso na escolha desses diferentes paradigmas. As t´ecnicas de

RIBC tendem a ser mais eﬁcientes em grandes conjuntos de dados mas, por outro lado,

as t´ecnicas de RI tendem a ser mais acuradas, pelo menos na compara¸c˜ao de imagens

pr´oximas.

2. Materiais e m

etodos 34

2.4.1 A abordagem de recupera¸c˜ao de imagens com base no

conte´udo

Para especiﬁcar completamente o funcionamento do algoritmo de RIBC, ´e necess´ario

deﬁnir como o vetor assinatura de cada po ss´ıvel imagem ´e gerado e como a similaridade

entre tais vetores ´e computada [Del-Bimbo, 1999].

O CC [Huang et al., 1997] expressa como a correla¸c˜ao de pares de cores se altera

com a distˆancia. Especiﬁca a probalidade de se encontrar um pixel de cor j a uma

distˆancia k de outro pixel de cor i. Seja I uma imagem n × n com espa¸co de cores

quantizado em m cores c

, ..., c

. Seja a distˆancia d ≤ n um parˆametro de entrada

para o sistema. Assim, o correlogramo de I ´e deﬁnido pa ra i, j ∈ [m], k ∈ [d] como

(k)

(I)  P rob

∈I



∈ I

| |p

− p

| = k



, (2.1)

onde a nota ¸c˜ao p

∈ I

signiﬁca que a cor do pixel p

na imagem I ´e c

, isto ´e, que

∈ I, I(p

) = c

Para computar o correlogramo, temos que avaliar a seguinte equa¸c˜ao:

(k)

(I) =

(k)

(I)

· 8k

, (2.2)

onde h

´e o valor do histograma de cores de c

(k)







∈ I

, p

∈ I

| |p

− p

|= k





. (2.3)

O algoritmo mais ingˆenuo para calcular esta express˜ao ´e de O(n

). Por´em, us-

ando a vers˜ao com pro grama¸c˜ao dinˆamica, tamb´em proposta em [Huang et al., 1997] o

algoritmo seria O(n

d). Note que, como o n´umero de cores em nossas imagens ´e muito

reduzido, n˜ao avaliamos o custo do algoritmo com base no n´umero de cores.

A m´etrica do correlogramo ´e relativamente insens´ıvel a elementos individuais do

vetor. Ela corresponde, entretanto, a uma m´edia ponderada das discrepˆancias de todo o

conjunto de caracter´ısticas das assinaturas das imagens. No caso de dois correlogramos

das imagens I e I

′

, estes pesos s˜ao inversamente proporcionais a γ

(k)

(I) + γ

(k)

′

isto ´e, quanto maior este termo ´e, menor a inﬂuˆencia do par de cores (c

, c

) na medida

ﬁnal. Mais especiﬁcamente, a m´etrica d para os correlogramos das imagens I e I

′

´e:

|I − I

′

γ,d





i,j∈[m],

k∈[d]

|γ

(k)

(I) − γ

(k)

′

1 + γ

(k)

(I) + γ

(k)

′

)

, (2.4)

onde o 1 no denominador evita a divis˜oes por zero. No t e que, depois de constru´ıdos

2. Materiais e m

etodos 35

os correlogramos, o c´alculo da m´etrica ´e O(n), o que garante a eﬁciˆencia na resposta a

consultas mesmo em grandes bases de dados.

Mostraremos um exemplo de aplica¸c˜ao da t´ecnica com a utiliza¸c˜ao de dois mapas de

contatos hipot´eticos. Na Figura 2.5, apresentamos 2 mapas de contatos 5×5 e contendo

3 tip os de contatos: vermelhos, verdes e azuis. Queremos computar a dissimilaridade

entre eles atrav´es do CC de forma bastante simpliﬁcada.

(a) (b)

Figura 2.5: Mapas de contatos hipot´eticos a serem comparados nos exemplos.

Para computar a dissimilaridade entre os mapas de contato ´e necess´ario , primeira-

mente, computar os histogra mas de distribui¸c˜ao espacial das cores. Para tal, medimos

a distˆancia de todos os pixels coloridos a todos os outros pixels da mesma cor (con-

forme Tabelas 2.2, 2.3 e 2.4). As tabelas de distˆancias s˜ao, obviamente, sim´etricas de

forma que consideremos apenas uma das metades. Como a imagem tem tamanho 5x5,

a maior distˆancia po ss´ıvel seria

√

18 ou 4,24, uma vez que n˜ao consideramos a diagonal

que ´e sempre 0. O histograma vai ter ent˜ao 4 posi¸c˜oes sendo que a primeira signiﬁca

o n´umero de pixels que distam de 1 a 2 (exclusive), a segunda de 2 a 3 (exclusive) e

assim por diante.

Tabela 2.2: Distˆancias entre os pixels vermelhos de cada imagem no exemplo.

A B C

A 0 2 1

B 2 0 1

1 1 0

H I J

H 0 1 1

I 1 0 1

1 1 0

D G

D 0 2

2 0

L 0

Tabela 2.3: Distˆancias entre os pixels verdes de cada imagem no exemplo.

Para a cor vermelha, temos o seguinte vetor de freq¨uˆencias F

vermelho

= (2; 1; 0; 0)

que resulta nas seguintes probabilidades P

vermelho

≈ (0, 66; 0, 34; 0; 0) e F

vermelho

2. Materiais e m

etodos 36

D G

D 0 2

G 2 0

L 0

E F

E 0 1

F 1 0

K M

K 0 1

M 1 0

Tabela 2.4: Distˆancias entre os pixels azuis de cada imagem no exemplo.

(3; 0; 0; 0) que r esulta em P

vermelho

= (1; 0; 0; 0). Somando os m´odulos das diferen¸cas

entre cada p osi¸c˜ao dos vetores obtemos 0, 34+0, 34 = 0, 68. Para normalizar, dividimos

este valor pelo n´umero de pixels vermelhos nos dois mapas obtendo 0, 68/6 ≈ 0, 11.

De forma similar teremos F

verde

= (0; 1; 0; 0) e F

verde

= (0; 0; 0; 0) uma vez que n˜ao

existem pares de contatos verdes no mapa B. Teremos P

verde

= (0; 1; 0; 0) e P

verde

(0; 0; 0; 0) resultando em dissimilaridade 1. Teremos tamb´em F

azul

= ( 1; 0; 0; 0) e

azul

= (1; 0; 0; 0), resultando em vetores de probabilidade idˆenticos e dissimilaridade

0. Dividindo pelo n´umero de contatos verdes 1/3 ≈ 0, 33. O resultado ﬁnal ´e a soma

das dissimilaridades para todas as cores e, nesse caso, seria 0, 11 + 0 + 0, 33 = 0, 44.

2.4.2 A abordagem de registro de imagens

2.4.2.1 O raio m´edio de disp ers˜ao

Esta t´ecnica ´e baseada em [Kutulakos, 2000], onde ´e introduzido o conceito de trans-

forma¸c ˜o e s de em baral hamento. Estas s˜ao transforma¸c˜oes geom´etricas onde embaralha-

se pixels por no m´aximo um ra io de dispers˜ao r.

O uso deste tipo de transforma¸c˜ao na an´alise da dissimilaridade estrutural de

prote´ınas ´e atraente porque sua natureza espacialmente localizada preserva carac-

ter´ısticas geom´etricas de alto n´ıvel, assim como as transforma¸c˜oes evolucion´arias na

estrutura prim´aria das prote´ınas fazem na estrutura.

Neste trabalho, ﬁzemos uma adapta¸c˜ao desta ideia e deﬁnimos o conceito de raio

m´edio de dispers˜ao, ˆr

disp

, entre duas imagens como a distˆancia Euclidiana entre pix-

els em uma imagem e o pixel da mesma cor mais pr´oximo na outra imagem. Mais

formalmente, o raio m´edio de dispers˜ao entre duas imagens n × n ´e dado por:

ˆr

disp

(I, I

′

) 

2 n



i,j∈[n]

r(I, I

′

, i, j) + r(I

′

, I, i, j), (2.5)

onde

r(I, I

′

, i, j)  min

x,y∈[n],

I(i,j)=I

′

(x,y)





(x −i)

+ (y − j)



. (2.6)

O algoritmo ingˆenuo para esta computa¸c˜ao tem custo O(n

). Entretanto, pr´e-

computando, para cada cor c

, i ∈ [m], a transformada de distˆancia relativa aos pixels

2. Materiais e m

etodos 37

da imagem I de cor c

usando o algoritmo de Chamfer (que ´e O(n

)) e repetindo esse

procedimento para a imagem I

′

, reduzimos este custo para O(n

). Ap´os essa pr´e-

computa¸c˜ao, cada termo r(I, I

′

, i, j) na Equa¸c˜ao (2.5) ´e processado em O(1), apenas

pela busca na posi¸c˜ao (i, j) na transformada de distˆancia relativa aos pixels de I

′

que

tˆem a cor I(i, j).

Na pr´atica, todos os pixels brancos foram exclu´ıdos dos c´alculos uma vez que rep-

resentam ausˆencia de contatos. Como os mapas de contatos s˜ao matrizes bastante

esparsas, criamos listas auxiliares de O(n) elementos de forma a responder as consultas

em tempo O(n).

Finalmente, observe que dois mapas de contatos a serem comparados tem na grande

maioria das vezes tamanhos diferentes. Para superar este problema, reescalamos todos

os mapas de contatos para o tamanho 1 000 × 1000.

Mostraremos um exemplo de aplica¸c˜ao do RMD com os mapas da Figura 2.5. Para

computar a dissimilaridade entre dois mapas devemos encontrar pixels de cada cor nos

mais pr´oximos na segunda imagem (conforme Tabelas 2.5, 2.6 e 2.7).

H I J

A 0 1 1

2 1 1

C 1 1 0

Tabela 2.5: Distˆancias entre os pixels vermelhos entre o par de imagens no exemplo.

D 1

G 1

Tabela 2.6: Distˆancias entre os pixels verdes entre o par de imagens no exemplo.

K M

E 0 1

1 1

Tabela 2.7: Distˆancias entre os pixels azuis entre o par de imagens no exemplo.

Os custos computados ser˜a o dados pelas distˆancias entre os pixels casados. Assim,

teremos A → H com custo 0, B → I com custo 1, C → J com custo 0. Como o ´ındice

deve ser sim´etrico, fazemos na ordem inversa e obtemos os seguintes mapeamentos

H → A com custo 0, I → A com custo 1 e J → C com custo 0. Note que quando

2. Materiais e m

etodos 38

existem duas op¸c˜oes de mesmo custo, escolhemos ar bitrar iamente entre as op¸c˜oes.

Somando todos estes custos e dividindo pelo n´umero de contatos vermelhos nos dois

mapas obtemos ( 1 + 1)/6 ≈ 0, 33. Para o tipo verde, teremos D → L com custo

1 e G → L com custo 1. No sentido inverso, L → D com custo 1. Normalizando,

teremos (1 + 1 + 1)/3 = 1. Os mapeamentos do tipo azul ser˜ao E → K com custo 0,

F → K com custo 1 e no sentido inverso K → E com custo 0 e M → E com custo 1.

Normalizando, teremos (1 + 1)/4 = 0, 5. Totalizando, 0, 33 + 0, 5 + 1 = 1, 83.

2.4.2.2 O earth mover’s distance

Uma poss´ıvel limita¸c˜ao da m´etrica descrita na subse¸c˜ao anterior ´e que ela permite

que m´ultiplos contatos em um mapa casem com o mesmo contato do outro . Assim, a

m´etrica n˜ao ´e capaz de diferenciar entre grupamentos densos e espar¸cos de contatos.

Esta limita¸c˜ao pode ser evitada com o uso da m´etrica earth mo ver’s distance (EMD).

A utiliza¸c˜ao desta m´etrica em bases de imagens foi inicialmente propo sta em

[Rubner et al., 1998]. Especiﬁcamente, o trabalho sugere o uso da m´etrica em assinat-

uras de images com base em intensidade ou histograma de cores, por exemplo. Neste

trabalho, aplicamos a t´ecnica diretamente nos mapas de contato o que faz com que a

t´ecnica seja baseada em similaridade e n˜ao caracter´ıstica.

A ideia por tr´as do EMD ´e tratar cada pixel colorido em uma mapa de contato

como uma unidade de terra espalhada por um espa¸co de tamanho conhecido e os pixels

em um segundo mapa de contato como buracos com capacidade para uma unidade de

terra no mesmo espa¸co. A cor de cada unidade de terra ou buraco ´e dada de acordo

com a cor dos pixels. O EMD mede a quantidade de trabalho necess´ario para preencher

os buracos com terra, com a restri¸c˜ao de que buracos de uma cor podem ser apenas

preenchidos com terra da mesma cor.

Como proposto em [Rubner et al., 1998], a computa¸c˜ao do EMD ´e equivalente a

resolver o fa moso problema do transporte. Mais especiﬁcamente, o EMD ´e obtido

encontrando o conjunto de ﬂuxos n˜ao-negativos f

i,j,x,y

, g

x,y

que minimize o trabalho

total do carregador de terra, w, deﬁnido como:

w (I, I

′

) 



i,j,x,y∈[n]

i,j,x,y

d(i, j, x, y) +



x,y∈[n]

x,y

max

, (2.7)

onde

d(i, j, x, y) 





(x − i)

+ (y − j)

, if I(i, j) = I

′

(x, y),

∞, caso contr´a rio,

(2.8)

2. Materiais e m

etodos 39

sujeito `as seguintes restri¸c˜oes:

∀

x,y∈[n]







i,j∈[n]

i,j,x,y

+ g

x,y

= 1





, (2.9)

∀

i,j∈[n]







x,y∈[n]

i,j,x,y

= 1





. (2.10)

Na Equa¸c˜ao (2.7), o fator d(i, j, x, y) corresponde a o custo de mover uma unidade

de massa do local (i, j) na imagem I para a posi¸c˜ao (x, y) na imagem I

′

. Na mesma

equa¸c˜ao, d

max

´e uma penalidade para cada buraco deixado vazio devido ao n´umero de

pixels daquela cor na imagem I ser menor que na imagem I

′

. Este ´e um parˆametro de

entrada para o algo r itmo. A Equa¸c˜ao (2.9) garante que todo buraco ser´a preenchido

com uma unidade de massa ou uma penalidade d

max

ser´a aplicada. Finalmente, a

Equa¸c˜ao (2.10) garante que cada pixel na imagem I ser´a fornecedor de apenas uma

unidade de terra.

A m´etrica ﬁnal ´e normalizada em rela¸c˜ao ao ﬂuxo total:

(I, I

′

) 

(I, I

′

) . (2.11)

A solu¸c˜ao padr˜ao para o problema do transporte envolve o uso do m´etodo simplex

[Dantzig, 1951] no qual, no pior caso, o custo computacional ´e expo nencial. Felizment e,

este caso ´e extremamente raro e, no caso m´edio, o custo ´e proporcional ao n´umero de

restri¸c˜oes [Wagner, 1986]. Se consider´a ssemos todos os pixels de cada mapa de contato,

o custo seria O(n

). Desconsiderando novamente os pixels brancos, o custo m´edio seria

O(n

Mostraremos, agor a, o exemplo da aplica¸c˜ao do EMD para os mesmos mapas de

contatos da Fig ura 2.5. Como nossos mapas tem 3 tipos de contatos, devemos resolver

3 modelos do problema do transporte separadamente.

Fa¸camos os c´alculos para os pixels vermelhos. Considerando que o custo de pontos

n˜ao casados ´e 3, teremos que minimizar a seguinte equa¸c˜ao: w

vermelho

(I, I

′

) = 0F

+ 1f

+ 2f

+ 1f

+ 0f

+ 3g

. Os

coeﬁcientes s˜ao os custos de se mapear um pixel no outro, ou seja, as distˆancias entre

eles. A minimiza¸c˜ao ´e sujeita `as seguintes restri¸c˜oes:

+ f

+ g

= 1

+ f

+ g

= 1

+ f

+ g

= 1

+ f

= 1

2. Materiais e m

etodos 40

+ f

= 1

+ f

= 1

Estas restri¸c˜oes indicam que cada ponto da imag em (a) pode cair em, no m´aximo,

um ponto da imagem (b). Caso n˜ao exista ponto em (b) para receber um ponto de (4),

um custo adicional ´e aplicado. Al´em disto, cada ponto da imagem (b) pode receber,

no m´aximo, um ponto de (a). Minimizando a express˜a o, veriﬁcamos as seguintes

correspondˆencias: A → H com custo 0, B → I com custo 1 e C → J com custo 0.

Observe que w

vermelho

(I, I

′

) = 1/6 ≈ 0, 16.

Para os pixels verdes minimizamos W

verde

(I, I

′

) = 1f

D L

+ 1f

+ 3g

com as

seguintes restri¸c˜oes:

D L

+ g

= 1

+ g

= 1

D L

+ f

= 1

Obtemos G → L com custo 1 e D ﬁca sem mapeamento gerando um custo 3. Logo,

verde

(I, I

′

) = 4/3 ≈ 1, 33.

Para os pixels azuis minimizamos w

azul

(I, I

′

) = 0f

+ 1f

F K

+ 1f

F M

+ 3g

com as seguintes restri¸c˜oes:

+ f

+ g

= 1

F K

+ f

F M

+ g

= 1

+ f

F K

= 1

+ f

F M

= 1

Obtemos E → K com custo 0 e F → M com custo 1, logo w

azul

(I, I

′

) = 1/4 = 0, 25.

A dissimilaridade ﬁnal ser´a dada por w(I, I

′

) = w

vermelho

(I, I

′

) + w

verde

(I, I

′

) +

azul

(I, I

′

) = 0, 16 + 1, 33 + 0, 25 = 1, 74.

2.5 Alg oritmo para deﬁni¸c˜ao d e assinaturas

estruturais

2.5.1 Determina¸c˜ao dos agrupamentos de contatos

De acordo com [Guting, 1994], as info r ma¸c˜o es sobre os contatos com as quais trabal-

hamos nos mapas de contatos s˜ao dados espaciais. No intuito de deﬁnir as assinaturas

estruturais da fam´ılias de prote´ınas, precisamos ser capazes de identiﬁcar auto matica-

mente agrupamentos de contatos em cada mapa.

2. Materiais e m

etodos 41

Para tal tarefa, existem in´umeros algoritmos descritos na literatura de minera¸c˜ao

de dados. H´a basicamente dois tipos de algor itmos [Kaufman e Rousseeuw, 1990]: os

de particionamento e os hier´arquicos. Os algoritmos de particionamento constroem

parti¸c˜oes da base de dados D que possui n objetos em um conjunto de k agrupa-

mentos. Normalmente k ´e um parˆametro de entrada para estes algoritmos o que ´e

indesej´avel no nosso caso. O algoritmo come¸ca com uma parti¸c˜ao arbitr´aria e vai re-

ﬁnando esta de forma a otimizar a fun¸c˜ao objetivo. Os algoritmos hier´arquicos criam

uma decomposi¸c˜ao hier´arquica de D. Esta decomposi¸c˜ao ´e representada por um den-

dograma, uma ´arvore resultante da divis˜ao iterativa de D. Neste caso, n˜ao existe o

parˆametro de entrada k mas ´e necess´ario deﬁnir a condi¸c˜ao de parada nas divis˜oes da

´arvore.

Optamos por utilizar o DBSCAN [Ester et al., 1996] que ´e um algoritmo de parti-

cionamento baseado em densidade. A vantagem deste m´etodo ´e a capacidade de iden-

tiﬁcar n˜ao somente agrupamentos tipicamente esf´ericos mas sim de qualquer forma.

A id´eia principal do m´etodo consiste no c´alculo da densidade que implica que cada

ponto de um cluster precisa ter um n´umero m´ınimo de pontos a um raio r deﬁnido

arbitrariamente, ou seja, sua densidade precisa superar um determinado valor de corte.

Assim, o algoritmo implementado consiste em sortear um contato aleatoriamente no

mapa e, dado o raio r, incluir os contatos que se encontram a uma distˆa ncia euclidiana

menor ou igual a este raio. O processo segue iterativamente com a adi¸c˜ao dos pontos

que est˜ao dentro do raio r dos pontos rec´em-adicionados at´e que n˜ao r estem pontos

a adicionar. Neste caso, um novo contato n˜ao pertencente ao agrupamento deﬁnido ´e

sorteado para iniciar um novo agrupamento. O processo se repete at´e que n˜ao existam

pontos fora dos agrupamentos. Obviamente, h´a que se deﬁnir uma densidade m´ınima

para deﬁni¸c˜ao dos agrupamentos.

2.5.2 Separa¸c˜ao dos clusters deﬁnidos incorretamente

A transformada de Hough [Hough, 1962] foi desenvolvida em 1962 para detectar car-

acter´ısticas analiticamente represent´aveis em imagens binarizadas, assim como linhas,

c´ırculos e elipses. Para detectar uma linha, Hough utilizou a equa¸c˜a o decilive-intercepto

deﬁnida por y = ax + b. Usando uma matriz acumuladora, examina-se cada ponto e

calcula-se os parˆametros da equa¸c˜ao a e b. Incrementa-se, ent˜ao, o acumulador refer-

ente aos parˆametros (A[a, b]). Ap´os o processamento de todos os pontos, procura-se os

picos da matriz acumuladora sendo estes os indicadores de poss´ıveis linhas na imag em.

Neste trabalho, utilizamos esta transformada para dividir ag r upamentos que s˜ao

unidos pelo D BSCAN, mas na verdade s˜ao linhas perependiculares entre si. Neste

caso, atrav´es dos picos, somos capazes de veriﬁcar se um agrupamento cont´em a penas

2. Materiais e m

etodos 42

uma ou se ´e a uni˜ao de v´arias linhas. Sendo a uni˜ao, fazemos a separa¸c˜ao dos pontos

com base nas suas distˆancias `as poss´ıveis retas reveladas pela transformada.

2.5.3 Deﬁni¸c˜ao dos vetores caracter´ısticos dos agrupamentos

Uma vez deﬁnidos os agrupamentos e sendo eles lineares, nomeamos cada cluster

por um vetor que o caracteriza. Os vetores s˜ao deﬁnidos de forma simpliﬁcada por

um ponto origem e um ponto destino. O ponto or ig em ´e o ponto de menor x e o de

destino, o de maior x.

2.5.4 M´etrica para compara¸c˜ao das assinaturas

Para comparar os conjuntos de vetores caracter´ısticos de um mapa (assinatura)

com os de outros utilizamos a mesma m´etrica EMD deﬁnida na se¸c˜ao 2.4.2.2 por´em

ao inv´es de usar os pontos r eferentes aos contatos utilizamos os pontos representativos

dos vetores da assinatura.

2.6 Est rat´egia de avalia¸c˜ao dos classiﬁcadores

utilizando curvas ROC

Nesta se¸c˜ao, apresentamos os conceitos necess´arios para o entendimento de nossa

estrat´egia de avalia¸c˜ao das m´etricas propostas.

Matrizes de confus˜ao [Kohavi, 2004] contˆem informa¸c˜ao sobre as classes reais e

preditas dos objetos e possibilitam avaliar o desempenho de sistemas de classiﬁca¸c˜ao.

As curvas ROC (Receiv e r Operating Characteristics) [Fawcett, 2006] s˜ao uma outra

forma de avalia¸c˜ao destes sistemas. Em uma curva ROC, plotamos no eixo x a taxa

de falsos positivos e, no eixo y a taxa de verdadeiros positivos. A taxa de falsos posi-

tivos consiste no n´umero de instˆancias negativa s preditas como positivas dividido pelo

n´umero de instˆa ncias negativas, a taxa de verdadeiros positivos o n´umero de instaˆancias

positivas preditas como positivas dividido pelo n´umero de instˆancias p ositivas.

No espa¸co da curva, o ponto (0, 1) indica n´umeros de um classiﬁcador perfeito:

classiﬁca todas as instˆancias positivas e negativas corretamente. Neste ponto a ta xa

de falsos positivos ´e 0 e a de verdadeiros positivos ´e 1. O ponto (0, 0) representa o

classiﬁcador que prediz todas as instˆancias como negativas e o ponto (1, 1), positiva s.

J´a o ponto (1, 0) ´e o classiﬁcador que erra todas as predi¸c˜oes.

Em muitos casos, os classiﬁcadores possuem parˆametros que precisam ser estimados

para elevar a taxa de verdadeiros positivos (`as vezes com o custo de se elevar tamb´em a

taxa de falsos positivos) ou diminuir a taxa de falsos negativos (possivelmente reduzindo

2. Materiais e m

etodos 43

tamb´em a taxa de verdadeiros positivos). Cada conjunto de valores selecionados para os

parˆametros geram um ponto (taxa de falsos positivos, taxa de verdadeiros positivos)

e uma s´erie destes pontos ´e usada para plotar a curva ROC. Neste trabalho, o parˆametro

que precisa ser estimado ´e o valor de corte usado na decis˜ao se uma instˆancia pertence

ou n˜ao a uma fam´ılia de prote´ınas.

Uma vantagem desta abordagem ´e que as curvas ROC s˜ao independentes da dis-

tribui¸c˜ao das classes e encapsulam toda a informa¸c˜ao contida nas matrizes de confus˜ao

uma vez que a taxa de falsos negativos ´e complementar `a taxa de verdadeiros positivos

e a de verdadeiros negativos `a de falsos positivos. Estas curvas provˆem uma ferra-

menta visual para avalia¸c˜ao do compromisso entre a identiﬁca¸c˜ao correta de todas as

instˆancias positivas e as instˆancias negativas incorretamente classiﬁcadas. Outra carac-

ter´ıstica muito interessante ´e que a ´area sob a curva pode ser usada como uma medida

de precis˜ao dos sistemas de classiﬁca¸c˜ao. Outra m´etrica de precis˜ao muito utilizada ´e

a distˆancia de um ponto ao po nto (0, 1) (representativo do classiﬁcador perfeito).

Neste trabalho, todas as medidas de precis˜ao dos classiﬁcadores com as fam´ılias

estudadas baseiam-se na ´area sob a curva ROC m´edia entre todas as curvas para

prote´ınas da fam´ılia.

Cap´ıtulo 3

Publica¸c˜oes

Neste cap´ıtulo, apresentamos as publica¸c˜oes geradas com resultados desta tese.

Uma c´opia dos artigos ´e apresentada no Anexo B.

3.1 An image-matching approach to protein

similarity analysis

O artigo [Fernandes-Jr. et al., 2004] ´e o primeiro trabalho integrante desta tese.

Foi apresentado em 2004 no XVII Simp´osio Brasileiro de Processamento de Imagens e

Computa¸c˜ao Gr´aﬁca que aconteceu em Curitiba.

Neste tra balho, apresentamos a id´eia de modelar o problema de compara¸c˜ao estru-

tural de prote´ınas como um problema de compara¸c˜ao entre imagens coloridas. Para

cada prote´ına, produzimos o mapa de contatos utilizando os c´alculos de intera¸c˜oes n˜ao-

covalentes do STING [Neshich et al., 2003]. Estes mapas de contatos s˜ao compo stos

por pontes de hidrogˆenio, intera¸c˜oes hidrof´obicas e contatos carregados atrativos.

Inicialmente, implementamos um algoritmo de processamento de imagens baseado

no paradigma de recupera¸c˜ao de image ns com base no conte´udo. Segundo este paradigma,

´e poss´ıvel comprimir imagens e uma base de dados preservando sua semˆantica. Para

cada imagem, uma assinatura ´e constru´ıda de forma que a base resultante indexada ´e

pesquisada de fo rma bastante eﬁciente. Esta compress˜ao ´e feita atrav´es da extra¸c˜ao

de caracter´ısticas como cores, texturas e primitivas geom´etricas (linhas, segmentos,

curvas, fronteiras, jun¸c˜oes, etc.). Na modelagem proposta, cada tipo de intera¸c˜ao n˜ao

covalente ´e modelada como uma cor na imagem de forma que analisamos a distribui¸c˜ao

espacial das cores da imagem. Este algoritmo ´e denominado Correlogramo de Cores e

foi considerado bastante interessante dado o tamanho das bases de dados de estruturas

de prote´ınas existentes at ualmente.

Em seguida, implementamos outro algoritmo baseado no paradigma de registro de

3. Publicac¸

oes 45

imagens. Ele mede qu˜ao similares duas prote´ınas s˜ao calculando o custo de se defor-

mar os mapas de contatos de uma convertendo-a no mapa da outra. Chamamos esta

m´etrica de Raio M´edio de Dispers˜ao. Este par adigma ´e muito utilizado no casamento

de um mesmo objeto que sofre deforma¸c˜oes n˜ao-r´ıgidas em diversas imagens. Uma forte

motiva¸c˜ao para a aplica¸c˜ao deste id´eia ´e que prote´ınas evolu´ıram de ancestrais comuns

e a sua distˆancia ﬁlogen´etica ´e for temente correlacionada com a sua dissimilaridade

estrutural. Dessa forma tentamos modelar as altera¸c˜oes necess´arias para transformar

uma prote´ına em outra pelas deforma¸c˜oes necess´arias para ajustar um mapa de contato

a outro.

Para testar esta meto dologia utilizamos um conjunto de 28 prote´ınas de diferentes

enovelamentos entre prote´ınas α, β e αβ. Usamos como fam´ılia modelo as Mioglobinas,

coletadas de 9 diferentes esp´ecies: baleia, cavalo, elefante, tartaruga, cavalo marinho,

foca, porco, ser humano e atum. Comparando todas as prote´ınas da base com a

Mioglobina humana, veriﬁcamos que a m´etrica baseada no Correlogramo de Cores

recuperou 6 das 8 Mioglobinas (dentre a s 8 prote´ınas consideradas mais parecidas

com a query) enquanto a baseada no Raio M´edio de Dispers˜ao recuperou todos os

exemplares.

Este trabalho apresentou como principal resultado a possibilidade de se comparar

estruturas de prote´ınas atrav´es de seus mapas de contatos. Tivemos uma primeira

indica¸c˜ao de que existe um padr˜ao de contatos em cadeias de prote´ınas de uma fam´ılia

e que este deve ser um importante componente da assinatura estrutural desta fam´ılia.

3.2 A contact-map matching approach to protein

structure similarity analysis

No artigo anterior [Fernandes-Jr. et al., 2004], propusemos uma modelagem baseada

em casamento de imagens para analisar a similaridade entre estruturas de prot e´ınas

atrav´es de seus mapas de contatos. Os resultados foram promissores apesar de os ex-

perimentos terem sido feitos com poucos exemplares de Mioglobinas e de pro t e´ınas de

outras fam´ılias diversas.

Neste trabalho [Melo et al., 2006], montamos uma base de dados mais apropriadas

para conﬁrmar os resultados do artigo anterior. Selecionamos todos os monˆomeros de

prote´ınas de enovelament os diversos:

• 224 Globin as, as prote´ınas respons´aveis pelo transporte de oxigˆenio no sangue e

m´usculos;

• 13 Apo l i poprote´ınas, lipoprote´ınas compostas por um conjunto de 4 α-h´elices;

3. Publicac¸

oes 46

• 15 Plastocianinas, pro t e´ınas transportadoras de el´etrons compostas, na maior

parte, por folhas-β;

• 18 Retinol-Binding Proteins (R.B.P.s), comp osta por um barril de folhas-β;

• 8 Tioredoxinas, compostas por uma mistura de α-h´elices e folhas-β.

Nosso objetivo foi tentar recuperar prote´ınas de cada uma destas cinco fam´ılias

misturadas a uma base de 187 outros monˆomeros selecionados do PDB.

O classiﬁcador baseado no Correlogramo de Cores apresentou precis˜o es entre 89,12%

e 98,44% enquanto o baseado no Raio M´edio de Dispers˜ao, entre 8 1,69% e 99,84%.

Al´em destas an´alises de precis˜ao na recupera¸c˜ao de prote´ınas de uma mesma fam´ılia

dentre outras de fam´ılias diversas, analisamos a habilidade dos classiﬁcadores em or-

denar as prote´ınas da mesma fam´ılia em termos de dissimilaridade de estruturas. Alin-

hamentos estruturais entre as prote´ınas query e outras prote´ınas da fam´ılia mostraram

que os ´ındices de dissimilaridade calculados pelas m´etricas propostas possuem alta

correla¸c˜ao com o R.M.S.D. dos alinhamentos estruturais.

Com este trabalho, mostramos que as m´etricas propostas apresentaram excelentes

resultados na recup era¸c˜ao de prote´ınas de diversas fam´ılias e composi¸c˜oes em termos de

estruturas secund´arias assim como na ordena¸c˜ao de prote´ınas de mesmo enovelamento

em termos da similaridade estrutural.

3.3 Similarity-based versus feature-based analysis

of structural protein similarity

Neste manuscrito [Melo et al., 2008], introduzimos uma nova t´ecnica que acredi-

tamos poder elevar as precis˜oes dos nossos classiﬁcadores. A t´ecnica de registro de

imagens apresent ada em [Fernandes-Jr. et al., 2004] possibilita que mais de um con-

tato de um primeiro mapa seja casado com um contato do segundo mapa. Por acreditar

que isto poderia causar algum problema na medi¸c˜ao da dissimilaridade entre o s mapas,

propusemos neste trabalho uma m´etrica baseada no Earth Mover’s Distance.

Esta m´etrica mo dela o primeiro mapa como um conjunto de montes de terra a ser

movido para buracos, que s˜ao os contatos do segundo mapa. A dissimilaridade dos

mapas ´e dada pelo trabalho de se mover os montes de terra do primeiro mapa para

o segundo. O trabalho ´e medido pela distˆancia entre os pontos onde se localizar os

contatos nos dois mapas. Cada monte de terra pode ser movido para um, e somente

um, buraco. Cada buraco, por sua vez, pode receber um, e somente um, monte de terra.

Este ´e um famoso problema de o timiza¸c˜ao que consiste em escolher quais montes ser˜ao

movidos para buraco de forma a realizar o m´ınimo de trabalho poss´ıvel.

3. Publicac¸

oes 47

Para nossa surpresa, observamos que o s resultados da nova m´etrica proposta foram

pouco superiores que as da m´etrica do Raio M´edio de Dispers˜ao. De fato, para fam´ılias

mais conservadas estruturalmente, a m´etrica a nterior j´a tinha excelentes resultados na

recupera¸c˜a o das Apolipoprote´ınas e R.B.P.s. Para as outras fam´ılias, conseguimos uma

melhoria com a nova m´etrica.

3.4 Mining structural signatures of proteins

Neste trabalho [Melo et al., 20 07a], apresentamos uma metodologia para busca de

assinaturas estruturais em prote´ınas baseada no padr˜ao de contatos em cada cadeia.

Utilizando t´ecnicas de minera¸c˜ao de dados, exploramos uma base de mapas de contatos

no aspecto de localiza¸c˜ao espacial dos contatos no intuito de evidenciar uma assinatura

estrutural que deﬁna a fam´ılia de prote´ınas.

Nos experimentos, foram usados exemplares de Mioglobinas, Apolipoprote´ınas,

Plastocianinas, R.B.P.s e Tioredoxinas. Visualizando os mapas de contatos de prote´ınas

de uma mesma fam´ılia, veriﬁcamos que os padr˜oes de contatos apresentados por cada

fam´ılia, s˜ao agrupamentos de contatos hidrof´obicos (os grup os s˜ao formados por con-

tatos n˜ao-locais) ou pontes de hidrogˆenio (os grupos s˜ao formados por contatos locais).

Optamos assim por testar nossa abordagem com estes dois tipos de contatos inicial-

mente.

Para detectar automaticamente os agrupamentos presentes nos mapas de contatos

de nossa base, utilizamos um algoritmo de clustering baseado em densidade, o DB-

SCAN. Este algoritmo ´e capaz de tratar uma importante caracter´ıstica dos mapas de

contatos que outros algoritmos deste t ipo n˜ao s˜ao capazes: mapas de contatos possuem

agrupamentos de f ormato linear que s˜ao sempre paralelos ou anti-paralelos `a diagonal

do mapa.

A inten¸c˜ao deste trabalho foi identiﬁcar segmentos de reta representativos de cada

agrupamento de um mapa de contato e, ﬁnalmente, veriﬁcar se estes segmentos de reta

est˜ao ou n˜ao presentes em todos os exemplares de um fa m´ılia de prote´ınas. De fato,

esta representa¸c˜ao facilita o reconhecimento de padr˜oes relevantes. Todavia, muitos

dos agrupamentos identiﬁcados pelo DBSCAN apresentavam f orma de ”L”. Isto ocorre

sempre que dois agrupamentos se tocam. Nestes casos, o segmento de reta identiﬁcado

ﬁca totalmente distorcido. Para solucionar este problema, usamos a transform ada de

Hought, que ajuda a identiﬁcar se um cluster encontrado pelo DBSCAN ´e realmente

um segmento de r eta ou v´arios.

Finalmente, obtivemos atrav´es desta metodologia assinaturas par a cada mapa de

contato. Essas assinaturas consistem de um conjunto de vetores. Estes vetores tˆem

3. Publicac¸

oes 48

sempre dire¸c˜ao paralela ou perp endicular `a diagonal do mapa e a dire¸c˜ao foi arbitr´aria

de forma que a origem esta sempre `a esquerda e o destino `a direira.

Al´em de caracterizar cada mapa de contato com uma assinatura, propusemos uma

metodologia de classiﬁca¸c˜ao de estruturas baseada nestas. Fomos capazes de recuperar

Mioglobinas de um conjunto de Mioglobinas e n˜ao-Mioglobinas com uma precis˜ao de

95%, o que mostra que cada assinatura realmente apresenta um padr˜ao para a fam´ılia.

3.5 Finding protein-protein interaction patterns

by contact map matching

Neste trabalho [Melo et al., 200 7b], apresentamos uma nova poss´ıvel aplica¸c˜ao para

as metodolo gias desenvolvidas de compara¸c˜ao e classiﬁca¸c˜ao de mapas de contatos. Ela

consiste na deﬁni¸c˜ao de padr˜oes de intera¸c˜oes entre cadeias, ou seja, na interface entre

cadeias proteicas de um complexo.

Para tal, propomos um novo tipo de mapas de contatos. Neste mapa, o eixo x

representa uma cadeia e o y, a outra. Dessa forma, os mapas representam os contatos

entre 2 cadeias, n˜ao mais sendo quadrados e sim´etricos como acontece com os mapas

de contatos tradicionais.

Para os experimentos, foram selecionadas cadeias de Serino-Proteases por serem

umas das mais estudadas prote´ınas que se apresentam complexadas com outras cadeias.

Encontramos no banco de dados SCOP essa mol´ecula complexada com 12 diferentes

tipos de inibidores. Escolhemos trabalhar com o Bovine Pan c reatic Trypsin Inhibtor

(B.P.T.I.) por ser o inibidor com mais exemplares no PDB. As Serino-Proteases que

encontramos complexadas com o B.P.T.I foram Tripsinas, Quimotripsinas, Trombinas,

Matriptases e Kalikre´ınas.

Utilizamos o algoritmo de compara¸c˜ao entre mapas de contatos para gerar os´ındices

de dissimilaridade entre as mol´eculas e posteriormente utilizamos os ´ındices para gerar

uma ´arvore na qual cada complexo Serino-Protease - B.P.T.I. ´e ligado ao complexo

mais parecido em termos de contatos de interface. Veriﬁcamos que os complexos com

o mesmo tipo de Serino-Protease tenderam a se agrupar, conforme esperado, o que nos

d´a ind´ıcios de que a metodologia utilizada para classiﬁcar cadeias tamb´em pode ser

utilizada com sucesso para classiﬁcar mapas de intera¸c˜ao prote´ına-prote´ına.

Adicionalment e, neste t rabalho propusemos uma nova utiliza¸c˜ao para o algor itmo

baseado no Earth Mover’s Distance: fazer o alinhamento dos mapas de contatos. A

id´eia consiste em considerar como alinhados os contatos que forem casados pelo al-

goritmo de otimiza¸c˜ao. Veriﬁcamos que os alinhamentos foram corretos e obtivemos

contatos conservados em todos os complexos. O algoritmo fo i capaz de identiﬁcar

3. Publicac¸

oes 49

contatos conservados entre res´ıduos bem descritos na literatura por estarem no s´ıtio

catal´ıtico da prote´ına ou no trecho conhecido como ”oxianion hole”.

3.6 The STAR sting server: a multiplatform

environment for protein structure analysis

Finalmente, a presentamos o artigo da vers˜ao STAR do pacote de programas de

an´alise estrutural de prot e´ınas Sting [Neshich et al., 2006b]. Alguns dos resultados

desta tese foram incorporados `a esta vers˜ao do programa na forma dos m´odulos: P.C.D.,

TopSiMap e Topologs.

O Protein Contacts Diﬀerence (P.C.D.) ´e um m´odulo que of erece um relat´orio

comparativo entre os contatos de duas cadeias proteicas. Ele apresenta os contatos

conservados, novos e extintos de uma cadeia para outra. Atrav´es de seu c´o digo de

cores, ´e poss´ıvel identiﬁcar os tipos de contatos.

E uma ferramenta muito ´util na

an´alise dos contatos conservado s e modiﬁcados no caso de muta¸c˜oes na seq¨uˆencia de

res´ıduos, apresentando no relat´orio a distˆancia tridimensional dos contatos ao res´ıduos

mutantes.

O TopSiMap (Topological Similarity Map) ´e uma ferramenta de a n´alise compara-

tiva entre a t opologia de prote´ınas atrav´es de mapas de contatos. Neste programa,

´e poss´ıvel ver duas cadeias proteicas alinhadas bem como comparar seus mapas de

contatos que podem ser visualizados de forma interativa. O usu´ario pode selecionar

apenas os contatos preservados entre dois mapas, os contatos que existem em apenas

um dos mapas, fazer uma ﬁltragem por contatos de cada tipo, por contatos com o in-

term´edio de mol´eculas de ´agua, podem aproximar o mapa e pode visualizar os contatos

selecionados na estrutura da prote´ına atrav´es do plug-in JMol ou Chime.

O Topologs ASTRAL 40 ´e um banco de dados de classiﬁca¸c˜ao estrutural de prot e´ınas

com base em seus padr˜oes de contatos. O subconjunto do PDB apresentado no banco de

dados ASTRAL 40 teve seus mapas de contatos computados e processados pelos nossos

algoritmos de compara¸c˜ao de mapas de contatos. Isto torna poss´ıvel, para cada cadeia

desta base, selecionar as 100 cadeias de mapas de contatos mais parecidos. Al´em disto,

´e poss´ıvel veriﬁcar os alinhamentos estruturais assim como analisar interativamente os

mapas de contatos entre uma cadeia e as 100 mais similares.

Estes sistemas foram implementados utilizando perl para os scripts de tratamento

de dados de coordenadas atˆomicas provenientes do e Java e jsp para a implementa

A§˜ao

do servidor web.

Cap´ıtulo 4

Resultados e discuss˜oes

4.1 Calib r a¸c˜ao dos cl ass i ﬁcadores

Dois dos classiﬁcadores propostos neste t r abalho (Correlogramo de cores e Earth

movers distance) s˜ao param´etricos. Por esse motivo, utilizamos a base de Mioglobinas

para calibrar estes classiﬁcadores, ou seja, obter o melhor valor aproximado para estes

parˆametros.

4.1.1 Correlogramo de cores

O parˆametro a ser calibrado no Correlogramo de cores ´e a distˆancia d. Este ´e o

valor m´aximo de distˆancia entre dois contatos do mesmo tipo que ter˜ao a sua freq¨uˆencia

computada no vetor a ssinatura. Na Figura 4.1, plotamos as curvas ROC para 5 ≤ d ≤

100. A precis˜ao de cada conﬁgura¸c˜ao ´e especiﬁcada no gr´aﬁco.

Observamos que a precis˜ao do classiﬁcador cresce a medida que o valor d aumenta.

Isto j´a era esperado uma vez que quanto maior o raio de varredura mais informa¸c˜ao

acrescenta mos ao classiﬁcador sob pena de aumentar o tempo de execu¸c˜ao, obviamente.

Como, por deﬁni¸c˜ao d ≤ n, continuamos aumentando o valor do raio at´e 2 00 que ´e o

maior tamanho de cadeia da nossa base de mapas de contatos. Apresentamos na Figura

4.2 a precis˜ao dos classiﬁcadores com o aumento do valor d. Observe que enquanto d ≤

100, a precis˜ao ´e crescente (sendo a ta xa de crescimento dessa precis˜ao descrescente).

Para d > 100, n˜ao veriﬁcamos aumento expressivo da precis˜ao. Portanto, o pta mos por

utilizar d = 100 em todos os experimentos deste trabalho.

4.1.2 Earth mover’s distance

A m´etrica EMD possui o parˆametro de entrada d

max

. Todas as vezes que compara-

mos dois mapas de contatos que tem n´umeros de contatos de um mesmo tipo diferentes,

4. Resultados e discuss

oes 51

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1

Taxa de verdadeiros positivos

Taxa de falsos positivos

d=005

d=010

d=015

d=020

d=025

d=030

d=035

d=040

d=045

d=050

d=055

d=060

d=065

d=070

d=075

d=080

d=085

d=090

d=095

d=100

Figura 4.1: Curvas ROC do Correlogramo de cores com a varia¸c˜ao do parˆametro de

raio m´aximo de varredura d.

0.84

0.86

0.88

0.9

0.92

0.94

0.96

0.98

100

120

140

160

180

200

Precisao

Parametro d

Figura 4.2: Varia¸c˜ao da precis˜ao do classiﬁcador baseado no CC com o aumento do

parˆametro d.

4. Resultados e discuss

oes 52

a penalidade d

max

ser´a somada ao custo de transformar um mapa no outro, ou seja, `a

dissimilaridade entre os mapas. Este valor foi calibrado, de forma idˆentica ao procedi-

mento aplicado para calibrar o par ˆametro da m´etrica a nterior, atrav´es de curvas ROC.

Apresentamos na Figura 4.3 a varia¸c˜ao da precis˜ao deste classiﬁcador com o aumento

do parˆametro d

max

. O ponto d

max

= 35 ´e o ponto onde obtemos maior precis˜ao na

classiﬁca¸c˜ao .

0.945

0.95

0.955

0.96

0.965

0.97

0.975

0 10 20 30 40 50 60 70 80

Precisao

Parametro dmax

Figura 4.3 : Varia¸c˜ao da precis˜ao do classiﬁcador baseado na m´etrica com o aumento

do parˆametro d

max

4.2 An´alise dos atributos dos contatos usados n a

classiﬁca¸c˜ao

4.2.1 Tipos d e contatos

Mostramos que ´e poss´ıvel classiﬁcar estruturas de prote´ınas atrav´es dos padr˜oes de

intera¸c˜oes hidrof´obicas, pontes de hidrogˆenio (sem ´agua) e contatos carregados atra-

tivos. Posteriormente, decidimos veriﬁcar se os trˆes tipos de contatos eram igualmente

conservados e portanto importantes como atributos para classiﬁca¸c˜ao estrutural de

cadeias prot´eicas. Tentamos, ent˜ao recuperar Mioglobinas dentre as prote´ınas de en-

ovelamentos variados utilizando-nos separadamente de cada um dos t rˆes tipos iniciais

trabalhados (contatos hidrof´obicos, pontes de hidrogˆenio sem ´agua e contatos carrega-

dos atr ativos). Confor me podemos ver na Figura 4.4, a precis˜ao foi maior utilizando

apenas pontes de hidrogˆenio (99,17%) ou contatos hidrof´obicos (98,80%) do que com

a conﬁgura¸c˜ao com os trˆes tipos de contatos da conﬁgura¸c˜a o propo sta inicialmente. A

classiﬁca¸c˜ao teve sua precis˜ao reduzida em 19,5%, em compara¸c˜ao com a conﬁgura¸c˜a o

inicial, quando utilizamos apenas os contatos carregados atrativos. Portanto, este tipo

4. Resultados e discuss

oes 53

de intera¸c˜ao mostra-se menos conservado que as intera¸c˜oes hidrof´obicas e pontes de

hidrogˆenio, em Mioglobinas.

0.8

0.6

Carregados atrativos

tres tipos iniciais

Hidrofobicos

Pontes de H sem agua

Precisao

Figura 4.4: An´alise comparativa da precis˜ao da classiﬁca¸c˜ao de Mioglobinas utilizando

a m´etrica CC com a conﬁgura¸c˜ao inicial e com os contatos hidrof´obicos, pontes de

hidrogˆenio (sem mol´eculas de ´agua) e contatos carregados atrativos separadamente.

Posteriorment e, a dicionamos os outros tipos de intera¸c˜oes: carregados repulsivos,

empilhamentos arom´at icos e pontes dissulfeto. A Figura 4.5 mostra que os resultados

com estes tipos de intera¸c˜oes alcan¸caram precis˜oes abaixo das obtidas pelos tipos de

contatos iniciais. Uma observa¸c˜ao importante ´e a baix´ıssima precis˜ao da s pontes dis-

sulfeto. Este tipo de intera¸c˜ao ´e inexistente em Globinas de forma que n˜a o pode ser

utilizado para r ecupera¸c˜ao de cadeias dessas prote´ınas. O que ocorre neste caso ´e que

toda cadeia que n˜ao possua ponte dissulfeto, e com qualquer enovelamento, ´e consid-

erada idˆentica a uma Globina. As precis˜oes obtidas fo r am 93,56%, 69,92% e 33,69%

com empilhamentos arom´aticos, contatos carregados repulsivos e pontes dissulfeto, re-

spectivamente.

Em rela¸c˜ao `as pontes de hidrogˆenio, sabemos que estas possuem diferentes pap´eis na

estrutura¸c˜ao das prote´ınas. Pontes de hidrogˆenio tˆem papel fundamental na forma¸c˜ao

das estruturas secund´arias. Nas α-h´elices, por exemplo, ´atomos da cadeia principal

de r es´ıduos i compartilham hidrogˆenios com ´atomos da cadeia principal de res´ıduos

i + 4. Folhas-β tamb´em s˜ao f ormadas com pontes de hidrogˆenio entre res´ıduos dis-

tantes na seq¨uˆencia. O STING computa pontes de hidrogˆenio e as dispo nibiliza aos

seus usu´arios separadamente de acordo com os ´atomos que participam da intera¸c˜ao: se

s˜ao ´a t omos da cadeia principal o u da cadeia lateral. Nos experimentos discutidos at´e o

momento utilizamos as pontes de hidrogˆenio indistintamente, ou seja, tratamos pontes

de hidrogˆeno entre ´atomos da cadeia principal (MC-MC), ´atomo da cadeia principal

e ´atomo da cadeia lateral (MC-SC) e ´atomos das cadeias laterais (SC-SC) como se

fossem o mesmo tipo de intera¸c˜ao. A Figura 4.6 mostra o que acontece com a precis˜ao

4. Resultados e discuss

oes 54

0.8

0.6

0.4

Pontes dissulfeto

Carregados repulsivos

Carregados atrativos

Aromaticos

Hidrofobicos

Pontes de H sem agua

Precisao

Figura 4.5: An´alise comparativa da precis˜ao da classiﬁca¸c˜ao de Mioglobinas utilizando

a m´etrica CC com pontes de hidrogˆenio (sem mol´eculas de ´agua), contatos hidrof´obicos,

contatos carregados atrativos e repulsivos, empilhamentos arom´aticos e pontes dis-

sulfeto.

dos classiﬁcadores se separamos as pontes de hidrogˆenios em diferentes qualidades e

as tratamos como se fossem diferentes atributos. Neste gr´aﬁco podemos observar que

a melhor conﬁgura¸c˜ao para as pontes de hidrogˆenio ´e quando as consideramos indis-

tintamente. Isto indica que este tipo de contato ´e altamente conservado espacialmente

em prote´ınas mas n˜ao ´e muito espec´ıﬁco em termos de localiza¸c˜ao atˆomica. Isto ´e, dois

res´ıduos podem fazer pontes de hidrogˆenio ent r e diferentes ´atomos (sendo eles de cadeia

principal ou lateral) e esta varia¸c˜ao da localica¸c˜ao atˆomica n˜ao parece ser t˜a o relevante

para estrutura¸c˜ao da prote´ına. Observamos tamb´em que as pontes envolvendo ´atomos

da cadeia principal s˜ao bem mais conservados que aqueles envolvendo ´atomos da cadeia

lateral. Possivelmente isto ´e explicado pelo f ato de a cadeia principal ter bem menos

graus de liberdade que a cadeia lateral.

0.9

0.8

0.7

CL-CL sem agua

CP-CL sem agua

CP-CP sem agua

Todas sem agua separadas

Todas sem agua

Precisao

Figura 4.6: An´alise comparativa da precis˜ao da classiﬁca¸c˜ao de Mioglobinas utilizando

a m´etrica CC com diferenres tratamentos de po ntes de hidrogˆenio.

4. Resultados e discuss

oes 55

Finalmente, calculamos a precis˜ao do classiﬁcador utilizando pontes de hidrogˆenio

com interm´edio de uma mol´ecula de ´agua, conforme pode ser veriﬁcado na Figura

4.7. Observamos que a precis˜ao caiu em 24,48%. Isto mostra que provavelmente as

mol´eculas de ´agua aprisionadas nos cristais de prote´ınas n˜ao s˜ao muito conservadas na

fam´ılia das Globinas.

0.9

0.8

0.7

Com agua

Sem agua

Precisao

Figura 4.7: An´alise comparativa da precis˜ao da classiﬁca¸c˜ao de Mioglobinas utilizando

a m´etrica CC com pontes de hidrogˆenio com e sem interm´edio de mol´eculas de ´agua.

Finalmente, apresentamos na F ig ura 4.8 as precis˜oes da classiﬁca¸c˜a o de Mioglobinas

com todas as varia¸c˜oes nos tipos de contatos.

0.8

0.6

0.4

Pontes dissulfeto

Carregados repulsivos

Pontes de H sem agua (CL-CL)

Pontes de H com agua

Carregados atrativos

Pontes de H sem agua (CP-CL)

Aromaticos

tres tipos iniciais

Pontes de H sem agua (CP-CP)

Pontes de H separadas sem agua

Hidrofobicos

Pontes de H sem agua

Precisao

Figura 4.8: An´alise comparativa da precis˜ao da classiﬁca¸c˜ao de Mioglobinas utilizando

a m´etrica CC com todas as varia¸c˜oes de tipos de contatos.

Em rela¸c˜ao aos contatos hidrof´obicos, utilizamos primeiramente o valor de corte

4. Resultados e discuss

oes 56

padr˜ao sugerido pelo STING. Posteriormente, veriﬁcamos que este valor n˜ao possibili-

tava a sele¸c˜ao de todos os contatos hidrof´obicos [Silveira et al., 2008]. Como pode ser

observado na Figura 4.9, o valor de corte para deﬁni¸c˜ao de contatos hidrof´obicos que

maximiza a precis˜ao da classiﬁca¸c˜ao ´e em torno de 7

0.2

0.4

0.6

0.8

2 4 6 8 10 12 14 16 18 20

Precisao

Valor de corte para contatos hidrofobicos (Angs.)

Mioglobinas

Globinas

Apolipoproteinas

Plastocianina

RBPs

Tioredoxinas

Figura 4.9: Varia¸c˜ao da precis˜ao da classiﬁca¸c˜ao utilizando intera¸c˜oes hidrof´obicas com

a varia¸c˜a o do valor de corte para deﬁni¸c˜ao dos contatos hidrof´obicos.

4.2.2 Elimina¸c˜ao dos contatos de c urta distˆancia seq¨uencial

A Figura 4.10(a) mostra um histograma no qual apresentamos as freq¨uencias das

distˆancias seq¨uenciais entre res´ıduos que fazem qualquer tipo de contato em todas as

cadeias presentes no PDB. Em (b), exibimos os mesmos dados, por´em para valores

de distˆancia seq¨uencial menor que 10 0 res´ıduos. Observe que a grande maioria dos

contatos s˜ao locais, ou seja, ocorrem entre res´ıduos com 10 ou menos res´ıduos de sep-

ara¸c˜ao na cadeia polipept´ıdica. Veriﬁcamos neste experimento a varia¸c˜ao da precis˜ao

com a elimina¸c˜ao de contatos pr´oximos seq¨uencialmente. Observamos na Figura 4.11

que quando desconsideramos estes contatos a precis˜ao decresce progressivamente o que

indica que os contatos locais s˜ao conservados e, portanto, importantes na deﬁni¸c˜ao do

enovelamento e da assinatura estrutural de fam´ılias de prote´ınas.

4.2.3 Elimina¸c˜ao dos contatos com res´ıduos pouco

conectados

Um res´ıduo de amino´acido pode fazer intera¸c˜oes qu´ımicas n˜ao covalentes com v´arios

outros res´ıduos da cadeia. Veriﬁcamos neste exp erimento se res´ıduos muito conectados

s˜ao mais conservados que res´ıduos pouco conectados. A Figura 4.12 mostra a freq ¨uencia

do n´umero de contatos por res´ıduo em todo o PDB. A grande maioria dos res´ıduos faz

contatos com menos de 5 outros res´ıduos.

4. Resultados e discuss

oes 57

(a)

10000

20000

30000

40000

50000

0 200 400 600 800 1000

Frequencia

Distancia Sequencial dos Residuos em Contato

(b)

100000

200000

300000

400000

500000

600000

700000

800000

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

Frequencia

Distancia Sequencial dos Residuos em Contato

Figura 4.10 : Freq¨uˆencia dos valores de distˆancia seq¨uencial de res´ıduos em contato em

todo o PDB.

0.86

0.88

0.9

0.92

0.94

0.96

0.98

5 10 15 20 25 30 35 40 45 50

Precisao

Distancia de contatos a serem eliminados

Mioglobinas

Figura 4.11: Varia¸c˜ao da precis˜ao com a elimina¸c˜ao de contatos pr´o ximos seq¨uencial-

mente.

Na Figura 4.13, constatamos que mesmo os contatos entre res´ıduos pouco conecta-

dos parecem ser importantes na deﬁni¸c˜ao do enovelamento de uma prote´ına e que, a o

considerar apenas contatos entre res´ıduos que atuam como hubs em prote´ınas, estamos

perdendo info rma¸c˜ao. Portanto, neste trabalho, n˜ao detectamos conserva¸c˜ao suﬁciente

para classiﬁcar prote´ınas apenas usando res´ıduos muito conectados.

4.3 Resu l tados ﬁnais com a melhor conﬁgu r a¸c˜ao

dos sistemas de classiﬁ ca¸c˜ao

Os melhores resultados obtidos foram com a utiliza¸c˜ao de contatos hidrof´obicos

e pontes de hidrogˆenio. Os contatos hidrof´obicos mostraram-se mais conservados no

valor de corte 7

A. J´a com as pontes de hidrogˆenio, veriﬁcamos que h´a um aumento

na precis˜ao quando consideramos indistintamente contatos de cadeia principal e lat-

eral e sem interm´edio de mol´eculas de ´agua. Testamos o classiﬁcador com Globinas e

4. Resultados e discuss

oes 58

500000

1e+06

1.5e+06

2e+06

2.5e+06

3e+06

3.5e+06

4e+06

0 5 10 15 20 25 30

Frequencia

Numero de Contatos dos Residuos

Figura 4.1 2: Freq¨uencia dos n´umeros de contatos de um res´ıduo com outros res´ıduos

em todo o PDB.

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

0 2 4 6 8 10 12 14 16

Precisao

Densidade de contatos para eleminacao de residuos

Mioglobinas

Figura 4.13: Varia¸c˜ao da precis˜ao com a elimina¸c˜ao de contatos com res´ıduos que fazem

contatos com po ucos res´ıduos.

Mioglobinas al´em de outras fam´ılias de tamanhos parecidos mas enovelamentos bas-

tante variados: Apolipoprote´ınas, Plastocianincas, RBPs e Tioredoxinas. Para todas

as fam´ılias obtivemos uma precis˜ao m´edia de 94,04% com contatos hidrof´obicos e de

97,89% com as pontes de hidrogˆenio. A menor preci˜ao obtida foi de 79,10% na recu-

pera¸c˜ao de RBPs por contatos hidrof´obicos e a maior foi de 99,20% na recupera¸c˜ao de

Plastocianinas utilizando pontes de hidrogˆenio.

4.4 Contribui¸c˜oes deste trabalho no software

STING

Nesta subse¸c˜ao, mostramos alguns softwares que foram desenvolvidos com r esulta-

dos desta pesquisa em parceria com o Dr. Gora n Neshich, do CNPTIA/EMBRAPA de

4. Resultados e discuss

oes 59

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

Hidrofobicos

Pontes de H sem agua

Hidrofobicos

Pontes de H sem agua

Hidrofobicos

Pontes de H sem agua

Hidrofobicos

Pontes de H sem agua

Hidrofobicos

Pontes de H sem agua

Hidrofobicos

Pontes de H sem agua

Precisao

Globinas

Mioglobinas

Apolipoporoteinas

Plastocianinas

RBPs

Tioredoxinas

Figura 4.14: Precis˜ao dos classiﬁcadores com a melhor conﬁgura¸c˜a o utilizando contatos

hidrof´obicos e pontes de hidrogˆenio sem ´agua para variadas fam´ılias de prote´ınas.

Campinas, co-orientador deste trabalho. Eles est˜ao hoje incorporados ao pacote Blue

Star STING [Neshich et al., 2006a].

4.4.1 PCD

No PCD ou Protein Contacts Diﬀerence os usu´arios obtˆem um relat´orio completo

comparativo das intera¸c˜oes intra-cadeia para quaisquer duas cadeias no formato PDB.

O programa retorna uma lista de intera¸c˜oes que foram preservadas nas duas cadeias

assim como uma lista daquelas que constam em apenas uma delas. O sistema tamb´em

possibilita a compara¸c˜ao de uma cadeia selvagem e sua mutante simples analisando os

contatos alterados e sua distˆancia em rela¸c˜ao ao res´ıduo mutado.

4.4.2 TopSiMap

O TopSiMap ´e um m´odulo que tamb´em possibilita a compara¸c˜ao entre os contatos

de duas cadeias PD B. Ele plota as ﬁguras dos mapas de contatos de cada cadeia e ´e

bastante interativo possibilitando a sele¸c˜ao de tipos de contatos, varia¸c˜ao das distˆancias

dos contatos e sele¸c˜ao daqueles que s˜ao preservados ou n˜ao. Este m´odulo tamb´em pos-

sibilita a visualiza¸c˜ao dos contatos selecionados nas duas mol´eculas alinhadas atrav´es

do plugin chime ou JMol. Existe tamb´em um relat´orio das energias envolvidas nos

contatos.

4. Resultados e discuss

oes 60

Figura 4.15 : Relat´orio da diferen¸ca de contatos entre duas cadeias do m´odulo PCD do

STING.

4.4.3 Topologs ASTRAL 40

E um banco de dados de cadeias PD Bs hom´ologas com base nas intera¸c˜oes intra-

cadeia. Para todo o ASTRAL 40, computamos uma lista das cadeias mais parecidas

com base em seus mapas de contatos. O banco pode ser consultado por cadeia es-

pec´ıﬁca, mas tamb´em possibilitamos a navega¸c˜ao pela lista de todas as 4.911 cadeias

representa tivas do PDB (Figura 4.20).

4. Resultados e discuss

oes 61

(a)

(b) (c)

Figura 4.16: Interface do m´odulo TopSiMap do STING. (a) Telas de alinhamento de

seq¨uˆencia e de estruturas e mapa de contatos preservados nas duas cadeias comparadas.

(b) Contatos presentes apenas na primeira cadeia. (c) Contatos presentes apenas na

segunda cadeia.

4.5 Sistema de compara¸c˜ao de mapas de contatos

dispon´ıvel na internet

Projetamos e implementamos um banco de dados relacional utilizando o MySQL

para armazenar todos os resultados do s experimentos. Al´em disto, para fa cilitar e

publicar os resultados deste projeto, modelamos e implement amos com o uso de jsp

um web site

(bioinfo.speed.dcc.ufmg.br/3dbio/raquelcm) com os resultados dos experimentos apre-

sentados nesta tese.

Neste site, a t ualmente ´e poss´ıvel visualizar os resultados das bases utilizadas nesta

tese, mas pretendemos englobar todo o PDB. O usu´ario pode, depois de selecionar

uma das bases de dados, buscar por prote´ınas de mapas de contatos semelhantes `a

uma cadeia de consulta.

E poss´ıvel visualizar as estruturas e comparar os mapas de

contatos.

4. Resultados e discuss

oes 62

(a)

(b)

Figura 4.17: Banco de dados Topo lo gs do STING. (a) Tela de ids PDB de cerca de

4.000 cadeias do ASTRAL 40. (b) Lista de hom´ologos da cadeia com base nos contatos

com links para an´alise comparativa das seq¨uˆencias, estruturas e mapas de contatos.

S˜ao exibidas as 100 cadeias mais parecidas dentre as cerca de 4.000 da base. (c), ( d)

e (e) Primeira, d´ecima e vig´esima estruturas mais parecidas com a miog l obina usada

no exemplo.

4. Resultados e discuss

oes 63

Figura 4.18: Web site com os resultados deste trabalho. Tela de visualiza¸c˜ao de base

de dados.

Nesta tela, os usu´arios podem visualizar as cadeias de prote´ınas de cada uma das cinco

fam´ılias que ﬁzeram parte dos nossos experimentos. Cada cadeia possui um link que leva ao

rank de todas as prote´ınas da base ordenadas pela dissimilaridade entre os seus mapas de

contatos.

4. Resultados e discuss

oes 64

Figura 4.19: Web site com os resultados deste trabalho. Tela de visualiza¸c˜ao de ra nk

de cadeias ordenadas po r similaridade em rela¸c˜ao `a uma cadeia consultada.

Uma vez s elecionada a cadeia da base de d ados, o usu´ario pode visualizar nesta tela o rank

de todas as prote´ınas da base experimental ordenadas pela dissimilaridade entre os seus

mapas de contatos. Nesta tela, cada cadeia possui um link que leva a visualiza¸c˜ao da cadeia

da consulta e a cadeia selecionada do rank.

E poss´ıvel ver os detalhes sobre cada cadeia,

visualizar e interagir com as estruturas, al´em das ﬁguras dos m ap as de contatos.

4. Resultados e discuss

oes 65

Figura 4.20: Web site com os resultados deste trabalho. Tela de visualiza¸c˜ao dos

detalhes e compara¸c˜ao entre cadeia da consulta e cadeia do rank.

Uma vez feita uma consulta e tendo-se selecionado um a cadeia d o rank, o usu´ario pode

visualizar nesta tela a cadeia da consu lta e a cadeia selecionada.

E poss´ıvel ver os detalhes

sobre a cadeia, visualizar e interagir com a estrutura atrav´es de um plug-in do software JMol

mais a M´aquina Virtual Java, al´em dos mapas de contatos.

Cap´ıtulo 5

Conclus˜oes

Neste trabalho, modelamos o problema de comparar estruturalmente duas cadeias

proteicas como o problema de compara¸c˜ao entre seus mapas de contatos.

Inicialmente, propusemos uma metodologia de compara¸c˜ao estrutural de prote´ınas

baseada em t´ecnicas de processamento digital de imagens. Propusemos uma m´etrica

baseada no paradigma de recupera¸c˜ao de imagens com base no conte´udo, usando como

carater´ıstica principal da imagem a distribui¸c˜ao de contatos (modelados como cores de

acordo com a natureza da intera¸c˜ao qu´ımica) no espa¸co. Comparamos esta abordag em

com outras m´etricas baseadas no registro de imagens. A primeira delas foi denominada

raio m´edio de dispers˜ao, por computar a m´edia dos custos de se deslocar os contatos

de um mapa pa ra ser transformado em outro. A outra foi baseada no earth mover’s

distance e foi resolvida com base no famoso problema do transporte. Todas estas

m´etricas propostas mostraram excelentes resultados na recupera¸c˜ao de prote´ınas de 5

fam´ılias testadas (Globinas, Apolipoprote´ınas, Plastocianinas, R.B.P.s e Tioredoxinas)

misturadas a prote´ınas de topologias diversas.

Com isto, mostramos ser os mapas de contatos bastante conservados em cada fam´ılia

de prote´ınas o que serve de ind´ıcio de que o padr˜a o de contatos em uma cadeia proteica

deve ser um importante componente da assinatura estrutural de cada fa m´ılia.

Propusemos ent˜ao uma metodologia baseada em algoritmos de agrupamento com

base na densidade dos pontos (DBSCAN) para obter automaticamente os gr upos de

contatos de cada mapa e caracterizar cada grupo como um vetor. Posteriormente,

utilizamos um modelo de otimiza¸c˜ao para casar os vetores de dois mapas de contatos

e contabilizar a dissimilaridade entre eles. Mostramos que, utilizando os contatos

hidrof´obicos e pontes de hidrogˆenio (tipos de contatos mais freq¨uˆentes e os ´unicos que

formam clusters nos mapas), fomos capazes de deﬁnir um padr˜ao de vetores represen-

tativos da fam´ılia Globina. Mostramos, inclusive que este padr˜ao pode ser usado para

recupera¸c˜a o de Globinas misturadas a prote´ınas de enovelamentos diversos com alta

5. Conclus

oes 67

precis˜ao.

Finalmente, constru´ımos e disponibilizamos uma ferramenta na internet que possi-

bilita a consulta a v´arias bases de cadeias de prote´ınas e a visualiza¸c˜ao de compara¸c˜ao

de estruturas de pro t e´ınas e seus mapas de contatos.

Como um trabalho a parte, mostramos o potencial dos algoritmos desenvolvidos

na identiﬁca¸c˜ao de padr˜oes de contatos entre interfaces de cadeias de complexos de

prote´ınas. Mostramos que o alg oritmo foi capaz de identiﬁcar diferentes padr˜oes de

intera¸c˜oes entre diversas sub-fam´ılias de Serino-Proteases ( Tripsinas, Q uimotripsinas,

Trombinas, Matriptases e Kalikre´ınas) e seu inibidor BPTI.

5.1 Perspectivas

Nesta se¸c˜ao levantamos algumas quest˜oes sobre o futuro dos trabalhos desenvolvidos

nesta tese. Primeiramente, discutimos itens que gostar´ıamos de ter implementado e

n˜ao foi poss´ıvel principalmente por quest˜oes de tempo. A seguir, ser˜ao apresentados

poss´ıveis rumos para o trabalho.

A primeira quest˜ao relaciona-se com a calibra¸c˜ao de do is dos nossos classiﬁcadores.

Utilizamos a base de Mioglobinas misturadas a outras prot e´ınas de enovelamentos

variados no processo de calibra¸c˜ao, ou seja, deﬁni¸c˜ao dos valores de parˆametros que

maximiza a precis˜ao dos classiﬁcadores. Conforme explicado na Se¸c˜ao 4.1, utilizamos o

SCOP como banco de dados padr˜ao ouro, ou seja, ele nos fornece a classiﬁca¸c˜ao correta

para cada cadeia proteica. Com base nesta classiﬁca¸c˜ao correta, calculamos a precis˜ao

dos classiﬁcadores propostos com diversas conﬁgura¸c˜oes de parˆametros de entrada e

escolhemos o valor de parˆametro que maximiza a preci˜ao do sistema de classiﬁca¸c˜ao.

Um poss´ıvel vi´es na escolha deste parˆametro ´e que ele foi selecionado com base em

apenas uma fam´ılia de prote´ınas. Gostar´ıamos de repetir estes experimentos com

fam´ılias variadas e estudar a inﬂuˆencia da fam´ılia no valor ´otimo deste parˆametro. O

intuito de tais estudos seria o de entender melhor os parˆametros deﬁnindo se existe ou

n˜ao um parˆametro ´unico que possa ser utilizado para todas as fam´ılias ou se existe um

valor espec´ıﬁco para cada fam´ılia.

Outro item que go star´ıa mos de t er implementado neste trabalho ´e uma an´alise

comparativa e criteriosa entre a nossa metodologia e outras propostas na literatura. O

principal problema que enfrentamos foi conseguir programas de uso aberto para que

pud´essemos fazer os testes com as mesmas bases de dados que apresentamos. A maioria

dos autores n˜ao disponibiliza o software e apresenta os resultados em ba ses espec´ıﬁcas

e pr´e-computadas em interfaces web. Nesses casos, ´e bastante complicado conseguir

dados em larga escala e de forma autom´atica para nossa an´alise comparativa. Acred-

5. Conclus

oes 68

itamos que para esta an´alise seria necess´ario eleger algumas das metodologias mais

interessantes e tentar conseguir os softwares dos autores ou, no pior caso, r eimple-

ment´a-los.

Uma meta tamb´em muito importante e que ainda n˜ao conseguimos ﬁnalizar foi o

cˆomputo das nossas m´etricas para todo o PDB. Isto n˜ao foi poss´ıvel devido a restri¸c˜oes

de recursos computacionals principalmente, apesar de nossos algoritmos n˜ao terem

alta complexidade computacional e volume de dados a processar ´e bastante grande. O

algoritmo de maior complexidade ´e O(n

) onde n ´e o n´umeros de contatos. Para uma

globina de cerca de 150 res´ıduos, usando o valor de corte de 7

A o btemos cerca de 300

contatos hidrof´obicos. Assim a compara¸c˜ao entre duas globinas teria que fa zer c´alculos

proporcionais a 300

. Imagine como seria a compara¸c˜ao a n´ıvel de todo o PDB. Seriam

necess´arias [k ∗ (k − 1)]/2 ≈ 3.2 00.000.000 compara¸c˜oes onde k ´e o n´umero de cadeias

do PDB. Mesmo uma compara¸c˜ao a n´ıvel de ASTRAL 40 (um sub conjunto do PDB no

qual n˜ao existem cadeias com mais de 40% de similaridade) seria bastante demorada.

Estamos fazendo estes c´alculos do intuito de disponibilizar estes resultados em nosso

servidor web. Uma das maiores diﬁculdades que estamos encontrando ´e que existe um

pequeno n´umero de cadeias muito gra ndes e estas cadeias s˜ao extremamente demoradas

tanto de se calcular os contatos quanto de serem comparadas com cada uma das outras

milhares de cadeias do PDB.

Dando continuidade ao tema de estudo desta pesquisa, gostar´ıa mos de nos apro-

fundar na elucida¸c˜ao de assinaturas estruturais com base em contatos preservados.

Neste tra balho, provamos ser poss´ıvel classiﬁcar fam´ılias de prote´ınas com base ape-

nas na localiza¸c˜ao espacial dos contatos. Mostramos ainda que existem agrupamen-

tos de contatos conservados na fam´ılia de globinas e que devem ser uma componente

importante de sua assinatura estrutural, ou seja, s˜ao um conjunto de caracter´ısticas

respons´aveis pela estrutura e fun¸c˜ao da fam´ılia. Gostar´ıamos de deﬁnir os contatos

preservados de forma mais precisa identiﬁcando os contatos que se preservam ou os

contatos que, mesmo n˜ao preservados, sejam equivalentes em prote´ınas de mesma es-

trutura e seq¨uˆencias diversas. Estamos iniciando nossos trabalhos nesta ´area atrav´es

da modelagem de prote´ınas como g r afos e de algoritmos de isomorﬁsmo de subgrafos.

Apˆendice A

Seq¨uˆencias das Prote´ınas Usadas

nos Experimentos

A.1 Globinas

1FAW B VHWSAEEKQLITGLWGKVN VADCGA 25

1HBR

B VHWTAEEKQLITGLWGKVN VAECGA 25

1WMU B VHWTSEEKQYITSLWAKVN VGEVGG 25

1A9W

E VHFTAEEKAAVTSLWSKMN VEEAGG 25

1IRD

B VHLTPEEKSAVTALWGKVN VDEVGG 25

2PGH B VHLSAEEKEAVLGLWGKVN VDEVGG 25

1G08

B MLTAEEKAAVTAFWGKVK VDEVGG 24

1JEB B VHLTDAEKAAVSGLWGKVN ADEVGG 25

1S5X

B VEWTDKERSIISDIFSHMD YDDIGP 25

1XQ5

B VVWTDFERATIADIFSKLD YEAVGG 25

1SPG B VDWTDAERAAIKALWGKID VGEIGP 25

1GCV

B VHWTQEERDEISKTFQGTD MKTVVT 25

1CG5 B VKLSEDQEHYIKGVWKDVD HKQITA 25

1CG5

A VLSSQNKKAIEELGNLIKANAEAWGA 26

1GCV

A AFTACEKQTIGKIAQVLAKSPEAYGA 26

1G08 A VLSAADKGNVKAAWGKVGGHAAEYGA 26

1IRD

A VLSPADKTNVKAAWGKVGAHAGEYGA 26

1FAW A VLSAADKTNVKGVFSKIGGHAEEYGA 26

1JEB

A SLTKTERTIIVSMWAKISTQADTIGT 26

1HBR

A MLTAEDKKLIQQAWEKAASHQEEFGA 26

1WMU

A MLTEDDKQLIQHVWEKVLEHQEDFGA 26

A. Seq

encias das Prote

ınas Usadas nos Experimentos 70

1S5X A SLSDKDKAAVRALWSKIGKSADAIGN 26

1XQ5 A SLSSKDKDTVKALWGKIADKAEEIGS 26

1MWC

A GLSDGEWQLVLNVWGKVEADVAGHGQ 26

2MM1

A GLSDGEWQLVLNVWGKVEADIPGHGQ 26

1GJN A GLSDGEWQQVLNVWGKVEADIAGHGQ 26

1EMY

A GLSDGEWELVLKTWGKVEADIPGHGE 26

1BZ6 A VLSEGEWQLVLHVWAKVEADVAGHGQ 26

1LHT

A GLSDDEWNHVLGIWAKVEPDLSAHGQ 26

1MYT

A ADFDAVLKCWGPVEADYTTMGG 22

1OJ6 A MERPEPELIRQSWRAVSRSPLEHGT 25

1Q1F

A MERPESELIRQSWRVVSRSPLEHGT 25

1HBG A GLSAAQRQVIAATWKDIAGADNGAGVGK 28

1JL7

A GLSAAQRQVVASTWKDIAGADNGAGVGK 28

3SDH

A PSVYDAAAQLTADVKKDLRDSWKVIGSDKKGNGV 34

5HBI A PSVYDAAAQLTADVKKDLRDSWKVIGSDKKGNGV 34

1DLW

A SLFEQLGG QAAVQAVT 16

1UVY A SLFEQLGG QAAVQAVT 16

1DLY

A MMRTVQLRTLRPCIRAQQQPVRPSTSATAAAATAPAPARKCPSSLFAKLGG REAVEAAV 59

1IDR

A MGLLSRLR KREPISIYDKIGG HEAIEVVV 29

1RTE A MGLLSRLR KREPISIYDKIGG HEAIEVVV 29

1MOH

A SLEAAQKSNVTSSWAKASAAWGTAGP 26

1MBA A SLSAAEADLAGKSWAPVFANKNANGL 26

1IT2

A PIIDQGPLPTLTDGDKKAINKIWPKIYKEYEQYSL 35

1ITH

A GLTAAQIKAIQDHWFLNIKGCLQAAAD 27

2GDM A GALTESQAALVKSSWEEFNANIPKHTH 27

1KR7

A MVNWAAVVD 9

1UX8 A MGQSFNAPYEAIG EELLSQLV 21

1H97

A TLTKHEQDILLKELGPHVDTPAHIVETGL 29

1ASH

A ANKTRELCMKSLEHAKVDTSNEARQDGI 28

1FAW

B EALARLLIVYPWTQRFFSSFG NLSSPTAILGNPMVRAHGKKVLTSFGDAVKNLDN 80

1HBR

B EALARLLIVYPWTQRFFASFG NLSSPTAILGNPMVRAHGKKVLTSFGDAVKNLDN 80

1WMU B EALARLLIVYPWTQRFFASFG NLSSANAILHNAKVLAHGQKVLTSFGEAVKNLDN 80

1A9W

E EALGRLLVVYPWTQRFFDSFG NLSSPSAILGNPKVKAHGKKVLTSFGDAIKNMDN 80

1IRD B EALGRLLVVYPWTQRFFESFG DLSTPDAVMGNPKVKAHGKKVLGAFSDGLAHLDN 80

2PGH

B EALGRLLVVYPWTQRFFESFG DLSNADAVMGNPKVKAHGKKVLQSFSDGLKHLDN 80

1G08

B EALGRLLVVYPWTQRFFESFG DLSTADAVMNNPKVKAHGKKVLDSFSNGMKHLDD 79

1JEB B EALGRLLVVYPWTQRYFDSFG DLSSASAIMGNAKVKAHGKKVITAFNDGLNHLDS 80

A. Seq

encias das Prote

ınas Usadas nos Experimentos 71

1S5X B KALSRCLIVYPWTQRHFSGFG NLYNAEAIIGNANVAAHGIKVLHGLDRGVKNMDN 80

1XQ5 B ATLARCLIVYPWTQRYFGNFG NLYNAAAIMGNPMIAKHGTTILHGLDRAVKNMDN 80

1SPG

B QALSRLLIVYPWTQRHFKGFG NISTNAAILGNAKVAEHGKTVMGGLDRAVQNMDN 80

1GCV

B QALDRMFKVYPWTNRYFQKRT DFRSS IHAGIVVGALQDAVKHMDD 70

1CG5 B KALERVFVVYPWTTRLFSKLQ GLFSANDIG VQQHADKVQRALGEAIDDLKK 76

1CG5

A DALARLFELHPQTKTYFSKFS GFEACNE QVKKHGKRVMNALADATHHLDN 76

1GCV A ECLARLFVTHPGSKSYF EYK DYSAAGA KVQVHGGKVIRAVVKAAEHVDD 75

1G08

A EALERMFLSFPTTKTYFPHF DLSHGSA QVKGHGAKVAAALTKAVEHLDD 75

1IRD

A EALERMFLSFPTTKTYFPHF DLSHGSA QVKGHGKKVADALTNAVAHVDD 75

1FAW A ETLERMFTAYPQTKTYFPHF DLQHGSA QIKAHGKKVAAALVEAVNHIDD 75

1JEB

A ETLERLFLSHPQTKTYFPHF DLHPGSA QLRAHGSKVVAAVGDAVKSIDD 75

1HBR A EALTRMFTTYPQTKTYFPHF DLSPGSD QVRGHGKKVLGALGNAVKNVDN 75

1WMU

A EALERMFIVYPSTKTYFPHF DLHHDSE QIRHHGKKVVGALGDAVKHIDN 75

1S5X

A DALSRMIVVYPQTKTYFSHWP DVTPGSP HIKAHGKKVMGGIALAVSKIDD 76

1XQ5 A DALSRMLAVYPQTKTYFSHWK DLSPGSA PVNKHGKTIMGGIVDAVASIDD 76

1MWC

A EVLIRLFKGHPETLEKFDKFK HLKSEDEMKASEDLKKHGNTVLTALGGILKKKGH 81

2MM1 A EVLIRLFKGHPETLEKFDRFK HLKSEDEMKASEDLKKHGATVLTALGGILKKKGH 81

1GJN

A EVLIRLFTGHPETLEKFDKFK HLKTEAEMKASEDLKKHGTVVLTALGGILKKKGH 81

1EMY

A TVFVRLFTGHPETLEKFDKFK HLKTEGEMKASEDLKKQGVTVLTALGGILKKKGH 81

1BZ6 A DILIRLFKSHPETLEKFDRFK HLKTEAEMKASEDLKKHGVTVLTALGAILKKKGH 81

1LHT

A EVIIRLFQLHPETQERFAKFK NLTTIDALKSSEEVKKHGTTVLTALGRILKQKNN 81

1MYT A LVLTRLFKEHPETQKLFPKFA GIA QADIAGNAAISAHGATVLKKLGELLKAKGS 76

1OJ6

A VLFARLFALEPDLLPLFQYNGRQFSSPEDSLSSPEFLDHIRKVMLVIDAAVTNVEDL S 83

1Q1F

A VLFARLFALEPSLLPLFQYNGRQFSSPEDSLSSPEFLDHIRKVMLVIDAAVTNVEDL S 83

1HBG A KCLIKFLSAHPQMAAVFGFSG ASDPGVAALGAK VLAQIGVAVSHLGDE G 77

1JL7

A ECLSKFISAHPEMAAVFGFSG ASDPGVAELGAK VLAQIGVAVSHLGDE G 77

3SDH A ALMTTLFADNQETIGYFKRLG NVSQGMANDKLRGHSITLMYALQNFIDQLDNP D 88

5HBI

A ALMTTLFADNQETIGYFKRLG DVSQGMANDKLRGHSIILMYALQNFIDQLDNP D 88

1DLW

A AQFYANIQADATVATFFNGID MPNQTNKTAAFLCAALGGPNA 58

1UVY A AQFYANIQADATVATFFNGID MPNQTNKTAAFLCAALGGPNA 58

1DLY

A DKFYNKIVADPTVSTYFSNTD MKVQRSKQFAFLAYALGGASE 101

1IDR

A EDFYVRVLADDQLSAFFSGTN MSRLKGKQVEFFAAALGGPEP 71

1RTE A EDFYVRVLADDQLSAFFSGTN MSRLKGKQVEFFAAALGGPEP 71

1MOH

A EFFMALFDAHDDVFAKFSGLF SGAAKGTVKNTPEMAAQAQSFKGLVSNWVDNLDNA G 83

1MBA A DFLVALFEKFPDSANFFADFK GKSVADIKASPKLRDVSSRIFTRLNEFVNNAANA G 82

1IT2

A NILLRFLKCFPQAQASFPKFS TKKSNLEQDPEVKHQAVVIFNKVNEIINSMDNQ E 90

1ITH

A SIFFKYLTAYPGDLAFFHKFS SVPLYGLRSNPAYKAQTLTVINYLDKVVDALGG 81

2GDM A RFFILVLEIAPAAKDLFSFLK GTSEVPQNNPELQAHAGKVFKLVYEAAIQLEVTGVV 84

A. Seq

encias das Prote

ınas Usadas nos Experimentos 72

1KR7 A DFYQELFKAHPEYQNKFGFKG VALGSLKGNAAYKTQAGKTVDYINAAIGGSAD 62

1UX8 A DTFYERVASHPLLKPIFPSDL TETARKQKQFLTQYLGGPPLYT 64

1H97

A GAYHALFTAHPQYISHFSRLE GHTIENVMQSEGIKHYARTLTEAIVHMLKEISN DA 85

1ASH

A DLYKHMFENYPPLRKYFKSRE EYTAEDVQNDPFFAKQGQKILLACHVLCATYDDR E 84

1FAW

B IKNTFAQLSELHC DKLHVDPENFRLLGDILIIVLAAHFA KEFTPECQAAWQKLVRV 136

1HBR B IKNTFSQLSELHC DKLHVDPENFRLLGDILIIVLAAHFS KDFTPECQAAWQKLVRV 136

1WMU

B IKKTFAQLSELHC EKLHVDPENFKLLGNILIIVLATHFP KEFTPASQAAWTKLVNA 136

1A9W

E LKPAFAKLSELHC DKLHVDPENFKLLGNVMVIILATHFG KEFTPEVQAAWQKLVSA 136

1IRD B LKGTFATLSELHC DKLHVDPENFRLLGNVLVCVLAHHFG KEFTPPVQAAYQKVVAG 136

2PGH

B LKGTFAKLSELHC DQLHVDPENFRLLGNVIVVVLARRLG HDFNPDVQAAFQKVVAG 136

1G08 B LKGTFAALSELHC DKLHVDPENFKLLGNVLVVVLARNFG KEFTPVLQADFQKVVAG 135

1JEB

B LKGTFASLSELHC DKLHVDPENFRLLGNMIVIVLGHHLG KDFTPAAQAAFQKVVAG 136

1S5X

B IAATYADLSTLHS EKLHVDPDNFKLLSDCITIVLAAKMG HAFTAETQGAFQKFLAV 136

1XQ5 B IKATYAELSVLHS EKLHVDPDNFKLLSDCLTIVVAAQLG KAFSGEVQAAFQKFLSV 136

1SPG

B IKNVYKQLSIKHS EKIHVDPDNFRLLGEIITMCVGAKFGPSAFTPEIHEAWQKFLAV 137

1GCV B VKTLFKDLSKKHA DDLHVDPGSFHLLTDCIIVELAYLRK DCFTPHIQGIWDKFFEV 126

1CG5

B VEINFQNLSGKH QEIGVDTQNFKLLGQTFMVELALHYK KTFRPKEHAAAYKFFRL 131

1CG5

A LHLHLEDLARKHG ENLLVDPHNFHLFADCIVVTLAVNL QAFTPVTHCAVDKFLEL 131

1GCV A LHSHLETLALTHG KKLLVDPQNFPMLSECIIVTLATHL TEFSPDTHCAVDKLLSA 130

1G08

A LPGALSELSDLHA HKLRVDPVNFKLLSHSLLVTLASHLP SDFTPAVHASLDKFLAN 131

1IRD A MPNALSALSDLHA HKLRVDPVNFKLLSHCLLVTLAAHLP AEFTPAVHASLDKFLAS 131

1FAW

A IAGALSKLSDLHA QKLRVDPVNFKFLGHCFLVVVAIHHP SALTPEVHASLDKFLCA 131

1JEB

A IGGALSKLSELHA YILRVDPVNFKLLSHCLLVTLAARFP ADFTAEAHAAWDKFLSV 131

1HBR A LSQAMAELSNLHA YNLRVDPVNFKLLSQCIQVVLAVHMG KDYTPEVHAAFDKFLSA 131

1WMU

A LSATLSELSNLHA YNLRVDPVNFKLLSHCFQVVLGAHLG REYTPQVQVAYDKFLAA 131

1S5X A LKTGLMELSEQHA YKLRVDPANFKILNHCILVVISTMFP KEFTPEAHVSLDKFLSG 132

1XQ5

A LNAGLLALSELHA FTLRVDPANFKILSHCILVLLAVKFP KDFTPEVHISYDKFFSA 132

1MWC

A HEAELTPLAQSHA TKHKIPVKYLEFISEAIIQVLQSKHP GDFGADAQGAMSKALEL 137

2MM1 A HEAEIKPLAQSHA TKHKIPVKYLEFISEAIIQVLQSKHP GDFGADAQGAMNKALEL 137

1GJN

A HEAELKPLAQSHA TKHKIPIKYLEFISDAIIHVLHSKHP GDFGADAQGAMTKALEL 137

1EMY

A HEAEIQPLAQSHA TKHKIPIKYLEFISDAIIHVLQSKHP AEFGADAQGAMKKALEL 137

1BZ6 A HEAELKPLAQSHA TKHKIPIKYLEFISEAIIHVLHSRHP GDFGADAQGAMNKALEL 137

1LHT

A HEQELKPLAESHA TKHKIPVKYLEFICEIIVKVIAEKHP SDFGADSQAAMKKALEL 137

1MYT A HAAILKPLANSHA TKHKIPINNFKLISEVLVKVMHEKAG LDAGGQTALRNVMGI 130

1OJ6

A SLEEYLASLGRKHR AVGVKLSSFSTVGESLLYMLEKSLG PAFTPATRAAWSQLYGA 139

1Q1F

A SLEEYLTSLGRKHR AVGVRLSSFSTVGESLLYMLEKSLG PDFTPATRTAWSRLYGA 139

1HBG A KMVAQMKAVGVRHKGYGNKHIKAQYFEPLGASLLSAMEHRIG GKMNAAAKDAWAAAYAD 136

A. Seq

encias das Prote

ınas Usadas nos Experimentos 73

1JL7 A KMVAEMKAVGVRHKGYGNKHIKAEYFEPLGASLLSAMEHRIG GKMNAAAKDAWAAAYGD 136

3SDH A DLVCVVEKFAVNHI TRKISAAEFGKINGPIKKVLASKN FGDKYANAWAKLVAV 141

5HBI

A DLVCVVEKFAVNHI TRKISAAEFGKINGPIKKVLASKN FGDKYANAWAKLVAV 141

1DLW

A WTGRNLKEVHANMG VSNAQFTTVIGHLRSALTGAGVAAALVEQTVAVAETVRGD 112

1UVY A WTGRNLKEVHANMG VSNAQFTTVIGHLRSALTGAGVAAALVEQTVAVAETVRGD 112

1DLY

A WKGKDMRTAHKDLVP HLSDVHFQAVARHLSDTLTELGVPPEDITDAMAVVASTRTE 157

1IDR A YTGAPMKQVHQGRG ITMHHFSLVAGHLADALTAAGVPSETITEILGVIAPLAVD 125

1RTE

A YTGAPMKQVHQGRG ITMHHFSLVAGHLADALTAAGVPSETITEILGVIAPLAVD 125

1MOH

A ALEGQCKTFAANHK ARGISAGQLEAAFKVLSGFMKSYGG DEGAWTAVAGA 133

1MBA A KMSAMLSQFAKEHVG FGVGSAQFENVRSMFPGFVASVAA PPAGADAAWTKLFGL 136

1IT2

A EIIKSLKDLSQKHK TVFKVDSIWFKELSSIFVSTIDGGAE FEKLFSI 137

1ITH A NAGALMKAKVPSHD AMGITPKHFGQLLKLVGGVFQEEFS ADPTTVAAWGDAAGV 135

2GDM

A VTDATLKNLGSVHVS KGVADAHFPVVKEAILKTIKEVVG AKWSEELNSAWTIAYDE 140

1KR7

A AAGLASRHK GRNVGSAEFHNAKACLAKACSAHGA PDLGHAIDDILSH 109

1UX8 A EEHGHPMLRARHLP FPITNERADAWLSCMKDAMDHVGLEGEIREFLFGRLELTARH 120

1H97

A EVKKIAAQYGKDHT SRKVTKDEFMSGEPIFTKYFQNLVK DAEGKAAVEKFLKH 138

1ASH A TFNAYTRELLDRHAR DHVHMPPEVWTDFWKLFEEYLGKKTT LDEPTKQAWHEIGRE 140

1FAW

B VAHALARKYH 146

1HBR B VAHALARKYH 146

1WMU

B VAHALALGYH 146

1A9W E VAIALAHKYH 146

1IRD

B VANALAHKYH 146

2PGH

B VANALAHKYH 146

1G08 B VANALAHRYH 145

1JEB

B VAAALAHKYH 146

1S5X B VVSALGKQYH 146

1XQ5

B VVSALGKQYH 146

1SPG

B VVSALGRQYH 147

1GCV B VIDAISKQYH 136

1CG5

B VAEALSSNYH 141

1CG5

A VAYELSSCYR 141

1GCV A ICQELSSRYR 140

1G08

A VSTVLTSKYR 141

1IRD A VSTVLTSKYR 141

1FAW

A VGTVLTAKYR 141

1JEB

A VSSVLTEKYR 141

1HBR A VSAVLAEKYR 141

A. Seq

encias das Prote

ınas Usadas nos Experimentos 74

1WMU A VSAVLAEKYR 141

1S5X A VALALAERYR 142

1XQ5

A LARALAEKYR 142

1MWC

A FRNDMAAKYKELGFQG 153

2MM1 A FRKDMASNYKELGFQG 153

1GJN

A FRNDIAAKYKELGFQG 153

1EMY A FRNDIAAKYKELGFQG 153

1BZ6

A FRKDIAAKYKELGYQG 153

1LHT

A FRNDMASKYKEFGFQG 153

1MYT A IIADLEANYKELGFSG 146

1OJ6

A VVQAMSRGWDGE 151

1Q1F A VVQAMSRGWDGE 151

1HBG

A ISGALISGLQS 147

1JL7

A ISGALISGLQS 147

3SDH A VQAAL 146

5HBI

A VQAAL 146

1DLW A VVTV 116

1UVY

A VVTV 116

1DLY

A VLNMPQQ 164

1IDR A VTSGESTTAPV 136

1RTE

A VTSGESTTAPV 136

1MOH A LMGEIEPDM 142

1MBA

A IIDALKAAGA 146

1IT2

A ICILLRSAY 146

1ITH A LVAAMK 141

2GDM

A LAIVIKKEMDDAA 153

1KR7 A L 110

1UX8

A MVNQTEAEDRSS 132

1H97

A VFPMMAAEI 147

1ASH A FAKEINKHGR 150

A.2 Miogl obinas

103M A MVLSEGEWQLVLHVWAKVEADVAGHGQDILIRLFKSHPETLEKFDRFKHLKTEAEMKASE 60

2MGF

A MVLSEGEWQLVLHVWAKVEADVAGHGQDILIRLFKSHPETLEKFDRFKHLKTEAEMKASE 60

1CH2

A MVLSEGEWQLVLHVWAKVEADVAGHGQDILIRLFKSHPETLEKFDRFKHLKTEAEMKASE 60

A. Seq

encias das Prote

ınas Usadas nos Experimentos 75

1J52 A MVLSEGEWQLVLHVWAKVEADVAGHGQDILIRLFKSHPETLEKFDRFKHLKTEAEMKASE 60

1CPW A MVLSEGEWQLVLHVWAKVEADVAGHGQDILIRLFKSHPETLEKFDRFKHLKTEAEMKASE 60

1MLL

A MVLSEGEWQLVLHVWAKVEADVAGHGQDILIRLFKSHPETLEKFDRFKHLKTEAEMKASE 60

1MLN

A MVLSEGEWQLVLHVWAKVEADVAGHGQDILIRLFKSHPETLEKFDRFKHLKTEAEMKASE 60

1A6M A VLSEGEWQLVLHVWAKVEADVAGHGQDILIRLFKSHPETLEKFDRFKHLKTEAEMKASE 59

1SPE

A VLSEGEWQLVLHVWAKVEADVAGHGQDILIRLFKSHPETLEKFDRFKHLKTEAEMKASE 59

1L2K A VLSEGEWQLVLHVWAKVEADVAGHGQDILIRLFKSHPETLEKFDRFKHLKTEAEMKASE 59

1YOI

A VLSEGEWQLVLHVWAKVEADVAGHGQDILIRLFKSHPETLEKFDRFKHLKTEAEMKASE 59

1UFP

A MVLSEGEWQLVLHVWAKVEADVAGHGQDILIRLFKSHPETLEKFDRFKHLKTEAEMKASE 60

1UFJ A MVLSEGEWQLVLHVWAKVEADVAGHGQDILIRLFKSHPETLEKFDRFKHLKTEAEMKASE 60

1IRC

A MVLSEGEWQLVLHVWAKVEADVAGHGQDILIRLFKSHPETLEKFDRFKHLKTEAEMKASE 60

1DWT A GLSDGEWQQVLNVWGKVEADIAGHGQEVLIRLFTGHPETLEKFDKFKHLKTEAEMKASE 59

1XCH

A GLSDGEWQQVLNVWGKVEADIAGHGQEVLIRLFTGHPETLEKFDKFKHLKTEAEMKASE 59

1DWS

A GLSDGEWQQVLNVWGKVEADIAGHGQEVLIRLFTGHPETLEKFDKFKHLKTEAEMKASE 59

1GJN A GLSDGEWQQVLNVWGKVEADIAGHGQEVLIRLFTGHPETLEKFDKFKHLKTEAEMKASE 59

1WLA

A GLSDGEWQQVLNVWGKVEADIAGHGQEVLIRLFTGHPETLEKFDKFKHLKTEAEMKASE 59

1YMC A GLSDGEWQQVLNVWGKVEADIAGHGQEVLIRLFTGHPETLEKFDKFKHLKTEAEMKASE 59

1YMB

A GLSDGEWQQVLNVWGKVEADIAGHGQEVLIRLFTGHPETLEKFDKFKHLKTEAEMKASE 59

1AZI

A GLSDGEWQQVLNVWGKVEADIAGHGQEVLIRLFTGHPETLEKFDKFKHLKTEAEMKASE 59

1NZ3 A GLSDGEWQQVLNVWGKVEADIAGHGQEVLIRLFTGHPETLEKFDEFKHLKTEAEMKASE 59

1NZ4

A GLSDGEWQQVLNVWGKVEADIAGHGQEVLIRLFTGHPETLEKFDEFKHLKTEAEMKASE 59

1NZ5 A GLSDGEWQQVLNVWGKVEADIAGHGQEVLIRLFTGHPETLEKFDEFKHLKTEAEMKASE 59

1BJE

A GLSDGEWQQVLNVWGKVEADIAGHGQEVLIRLFTGHPETLEKFDKFKHLKTEAEMKASE 59

1EMY

A GLSDGEWELVLKTWGKVEADIPGHGETVFVRLFTGHPETLEKFDKFKHLKTEGEMKASE 59

1MDN A GLSDGEWQLVLNVWGKVEADVAGHGQEVLIRLFKGHPETLEKFDKFKHLKSEDEMKASE 59

1MNO

A GLSDGEWQLVLNVWGKVEADVAGHGQEVLIRLFKGHPETLEKFDKFKHLKSEDEMKASE 59

1M6C A GLSDGEWQLVLNVWGKVEADVAGHGQEVLIRLFKGHPETLEKFDKFKHLKSEDEMKASE 59

1MNJ

A GLSDGEWQLVLNVWGKVEADVAGHGQEVLIRLFKGHPETLEKFDKFKHLKSEDEMKASE 59

1MNK

A GLSDGEWQLVLNVWGKVEADVAGHGQEVLIRLFKGHPETLEKFDKFKHLKSEDEMKASE 59

1YCA A GLSDGEWQLVLNVWGKVEADVAGHGQEVLIRLFKGHPETLEKFDKFKHLKSEDEMKASE 59

1YCB

A GLSDGEWQLVLNVWGKVEADVAGHGQEVLIRLFKGHPETLEKFDKFKHLKSEDEMKASE 59

1MWC

A GLSDGEWQLVLNVWGKVEADVAGHGQEVLIRLFKGHPETLEKFDKFKHLKSEDEMKASE 59

1MWD A GLSDGEWQLVLNVWGKVEADVAGHGQEVLIRLFKGHPETLEKFDKFKHLKSEDEMKASE 59

1MYG

A GLSDGEWQLVLNVWGKVEADVAGHGQEVLIRLFKGHPETLEKFDKFKHLKSEDEMKASE 59

1MYI A GLSDGEWQLVLNVWGKVEADVAGHGQEVLIRLFKGHPETLEKFDSFKHLKSEDEMKASE 59

2MM1

A GLSDGEWQLVLNVWGKVEADIPGHGQEVLIRLFKGHPETLEKFDRFKHLKSEDEMKASE 59

1MBS

A GLSDGEWHLVLNVWGKVETDLAGHGQEVLIRLFKSHPETLEKFDKFKHLKSEDDMRRSE 59

1LHS A GLSDDEWNHVLGIWAKVEPDLSAHGQEVIIRLFQLHPETQERFAKFKNLTTIDALKSSE 59

A. Seq

encias das Prote

ınas Usadas nos Experimentos 76

1LHT A GLSDDEWNHVLGIWAKVEPDLSAHGQEVIIRLFQLHPETQERFAKFKNLTTIDALKSSE 59

1MYT A ADFDAVLKCWGPVEADYTTMGGLVLTRLFKEHPETQKLFPKFAGIA QADIAGNA 54

1MBA

A SLSAAEADLAGKSWAPVFANKNANGLDFLVALFEKFPDSANFFADFKGKS VADIKASP 58

2FAL

A XSLSAAEADLAGKSWAPVFANKNANGLDFLVALFEKFPDSANFFADFKGKS VADIKASP 59

3MBA A SLSAAEADLAGKSWAPVFANKNANGLDFLVALFEKFPDSANFFADFKGKS VADIKASP 58

4MBA

A SLSAAEADLAGKSWAPVFANKNANGLDFLVALFEKFPDSANFFADFKGKS VADIKASP 58

5MBA A SLSAAEADLAGKSWAPVFANKNANGLDFLVALFEKFPDSANFFADFKGKS VADIKASP 58

2FAM

A XSLSAAEADLAGKSWAPVFANKNANGLDFLVALFEKFPDSANFFADFKGKS VADIKASP 59

1DM1

A SLSAAEADLAGKSWAPVFANKNANGDAFLVALFEKFPDSANFFADFKGKS VADIKASP 58

103M

A DLKKAGVTVLTALGAILKKKGHHEAELKPLAQSHATKHKIPIKYLEFISEAIIHVLHSRH 120

2MGF A DLKKQGVTVLTALGAILKKKGHHEAELKPLAQSHATKHKIPIKYLEFISEAIIHVLHSRH 120

1CH2

A DLKKHGVTVLTALGAILKKKGHHEAELKPFAQSHATKHKIPIKYLEFISEAIIHVLHSRH 120

1J52

A DLKKHGVTVLTALGAILKKKGHHEAELKPLAQSHATKHKIPIKYLEFISEAIIHVLHSRH 120

1CPW A DLKKHGVTVLTALGAILKKKGHHEAELKPLAQSHATKHKIPIKYWEFISEAIIHVLHSRH 120

1MLL

A DLKKHGVTFLTALGAILKKKGHHEAELKPLAQSHATKHKIPIKYLEFISEAIIHVLHSRH 120

1MLN A DLKKHGVTILTALGAILKKKGHHEAELKPLAQSHATKHKIPIKYLEFISEAIIHVLHSRH 120

1A6M

A DLKKHGVTVLTALGAILKKKGHHEAELKPLAQSHATKHKIPIKYLEFISEAIIHVLHSRH 119

1SPE

A DLKKHGVTVLTALGAILKKKGHHEAELKPLAQSHATKHKIPIKYLEFISEAIIHVLHSRH 119

1L2K A DLKKHGVTVLTALGAILKKKGHHEAELKPLAQSHATKHKIPIKYLEFISEAIIHVLHSRH 119

1YOI

A DLKKHGVTVLTALGAILKKKGHHEAELKPLAQSHATKHKIPIKYLEFISEAIIHVLHSRH 119

1UFP A DLKKHGVTVLTALGAILKKKGHHEAELKPLAQSHATKHKIPIKYLEFISEAIIHVLHSRH 120

1UFJ

A DLKKHGVTVLTGLGAILKKKGHHEAELKPLAQSHATKHKIPIKYLEFISEAIIHVLHSRH 120

1IRC

A DLKKHGVTVLTALGAILKKKGHHEAELKPLAQSGATKHKIPIKYLEFISEAIIHVLHSRH 120

1DWT A DLKKHGTVVLTALGGILKKKGHHEAELKPLAQSHATKHKIPIKYLEFISDAIIHVLHSKH 119

1XCH

A DLKKHGTVVLTALGGILKKKGHHEAELKPLAQSHATKHKIPIKYNEFISDAIIHVLHSKH 119

1DWS A DLKKHGTVVLTALGGILKKKGHHEAELKPLAQSHATKHKIPIKYLEFISDAIIHVLHSKH 119

1GJN

A DLKKHGTVVLTALGGILKKKGHHEAELKPLAQSHATKHKIPIKYLEFISDAIIHVLHSKH 119

1WLA

A DLKKHGTVVLTALGGILKKKGHHEAELKPLAQSHATKHKIPIKYLEFISDAIIHVLHSKH 119

1YMC A DLKKHGTVVLTALGGILKKKGHHEAELKPLAQSHATKHKIPIKYLEFISDAIIHVLHSKH 119

1YMB

A DLKKHGTVVLTALGGILKKKGHHEAELKPLAQSHATKHKIPIKYLEFISDAIIHVLHSKH 119

1AZI

A DLKKHGTVVLTALGGILKKKGHHEAELKPLAQSHATKHKIPIKYLEFISDAIIHVLHSKH 119

1NZ3 A DLKEHGTVVLTALGGILKKKGHHEAELKPLAQSHATKHKIPIKYLEFISDAIIHVLHSKH 119

1NZ4

A DLKEHGTVVLTALGGILKKKGHHEAELKPLAQSHATKHKIPIKYLEFISDAIIHVLHSKH 119

1NZ5 A DLKEHGTVVLTALGGILKKKGHHEAELKPLAQSHATKHKIPIKYLEFISDAIIHVLHSKH 119

1BJE

A DLKKTGTVVLTALGGILKKKGHHEAELKPLAQSHATKHKIPIKYLEFISDAIIHVLHSKH 119

1EMY

A DLKKQGVTVLTALGGILKKKGHHEAEIQPLAQSHATKHKIPIKYLEFISDAIIHVLQSKH 119

1MDN A DLKKHGNTNLTALGGILKKKGHHEAELTPLAQSHATKHKIPVKYLEFISEAIIQVLQSKH 119

A. Seq

encias das Prote

ınas Usadas nos Experimentos 77

1MNO A DLKKHGNTNLTALGGILKKKGHHEAELTPLAQSHATKHKIPVKYLEFISEAIIQVLQSKH 119

1M6C A DLKKHGNTNLTALGGILKKKGHHEAELTPLAQSHATKHKIPVKYLEFISEAIIQVLQSKH 119

1MNJ

A DLKKVGNTILTALGGILKKKGHHEAELTPLAQSHATKHKIPVKYLEFISEAIIQVLQSKH 119

1MNK

A DLKKVGNTTLTALGGILKKKGHHEAELTPLAQSHATKHKIPVKYLEFISEAIIQVLQSKH 119

1YCA A DLKKHGNTTLTALGGILKKKGHHEAELTPLAQSHATKHKIPVKYLEFISEAIIQVLQSKH 119

1YCB

A DLKKHGNTTLTALGGILKKKGHHEAELTPLAQSHATKHKIPVKYLEFISEAIIQVLQSKH 119

1MWC A DLKKHGNTVLTALGGILKKKGHHEAELTPLAQSHATKHKIPVKYLEFISEAIIQVLQSKH 119

1MWD

A DLKKHGNTVLTALGGILKKKGHHEAELTPLAQSHATKHKIPVKYLEFISEAIIQVLQSKH 119

1MYG

A DLKKHGNTVLTALGGILKKKGHHEAELTPLAQSHATKHKIPVKYLEFISEAIIQVLQSKH 119

1MYI A DLKKHGNTVLTALGGILKKKGHHEAELTPLAQSHATKHKIPVKYLEFISEAIIQVLQSKH 119

2MM1

A DLKKHGATVLTALGGILKKKGHHEAEIKPLAQSHATKHKIPVKYLEFISEAIIQVLQSKH 119

1MBS A DLRKHGNTVLTALGGILKKKGHHEAELKPLAQSHATKHKIPIKYLEFISEAIIHVLHSKH 119

1LHS

A EVKKHGTTVLTALGRILKQKNNHEQELKPLAESHATKHKIPVKYLEFICEIIVKVIAEKH 119

1LHT

A EVKKHGTTVLTALGRILKQKNNHEQELKPLAESHATKHKIPVKYLEFICEIIVKVIAEKH 119

1MYT A AISAHGATVLKKLGELLKAKGSHAAILKPLANSHATKHKIPINNFKLISEVLVKVMHEKA 114

1MBA

A KLRDVSSRIFTRLNEFVNNAANAGKMSAMLSQFAKEHVGFGVGSAQFENVRSMFPGFVAS 118

2FAL A KLRDVSSRIFTRLNEFVNNAANAGKMSAMLSQFAKEHVGFGVGSAQFENVRSMFPGFVAS 119

3MBA

A KLRDVSSRIFTRLNEFVNNAANAGKMSAMLSQFAKEHVGFGVGSAQFENVRSMFPGFVAS 118

4MBA

A KLRDVSSRIFTRLNEFVNNAANAGKMSAMLSQFAKEHVGFGVGSAQFENVRSMFPGFVAS 118

5MBA A KLRDVSSRIFTRLNEFVNNAANAGKMSAMLSQFAKEHVGFGVGSAQFENVRSMFPGFVAS 118

2FAM

A KLRDVSSRIFTRLNEFVNNAANAGKMSAMLSQFAKEHVGFGVGSAQFENVRSMFPGFVAS 119

1DM1 A KLRDHSSTIFTRLNEFVNNAANAGKMSAMLSQFAKEHVGFGVGSAQFENVRSMFPGFVAS 118

103M

A PGNFGADAQGAMNKALELFRKDIAAKYKELGYQG 154

2MGF A PGNFGADAQGAMNKALELFRKDIAAKYKELGYQG 154

1CH2

A PGNFGADAQGAMNKALELFRKDIAAKYKELGYQG 154

1J52 A PGNFGADAQGAMNKALELFRKDIAAKYKELGYQG 154

1CPW

A PGNFGADAQGAMNKALELFRKDIAAKYKELGYQG 154

1MLL

A PGNFGADAQGAMNKALELFRKDIAAKYKELGYQG 154

1MLN A PGNFGADAQGAMNKALELFRKDIAAKYKELGYQG 154

1A6M

A PGDFGADAQGAMNKALELFRKDIAAKYKELGY 151

1SPE

A PGDFGADAQGAMNKALELFRKDIAAKYKELGYQG 153

1L2K A PGDFGADAQGAMNKALELFRKDIAAKYKELGYQG 153

1YOI

A PGDFGADAQGAMNKALELFRKDIAAKYKELGYQG 153

1UFP A PGDFGADAQGAMNKALELFRKDIAAKYKELGYQG 154

1UFJ

A PGDFGADAQGAMNKALELFRKDIAAKYKELGYQG 154

1IRC

A PGDFGADAQGAMNKALELFRKDIAAKYKELGYQG 154

1DWT A PGDFGADAQGAMTKALELFRNDIAAKYKELGFQG 153

A. Seq

encias das Prote

ınas Usadas nos Experimentos 78

1XCH A PGDFGADAQGAMTKALELFRNDIAAKYKELGFQG 153

1DWS A PGDFGADAQGAMTKALELFRNDIAAKYKELGFQG 153

1GJN

A PGDFGADAQGAMTKALELFRNDIAAKYKELGFQG 153

1WLA

A PGDFGADAQGAMTKALELFRNDIAAKYKELGFQG 153

1YMC A PGDFGADAQGAMTKALELFRNDIAAKYKELGFQG 153

1YMB

A PGDFGADAQGAMTKALELFRNDIAAKYKELGFQG 153

1AZI A PGDFGADAQGAMTKALELFRNDIAAKYKELGFQG 153

1NZ3

A PGDFGADAQGAMTKALELFRNDIAAKYKELGFQG 153

1NZ4

A PGDFGADAQGAMTKALELFRNDIAAKYKELGFQG 153

1NZ5 A PGDFGADAQGAMTKALELFRNDIAAKYKELGFQG 153

1BJE

A PGDFGADAQGAMTKALELFRNDIAAKYKELGFQG 153

1EMY A PAEFGADAQGAMKKALELFRNDIAAKYKELGFQG 153

1MDN