Casuística e Métodos
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Neste estudo, a metodologia de CBA foi adaptada dos
protocolos originais propostos por Chen et al. (1999) [42], como descrito a
seguir:
Alíquotas de 25µL de soro diluído 1:5 com diluente G (reagente
do kit CBA), alíquotas de 25µL dos padrões de quimiocinas, submetidos à
diluição seriada com diluente G (“Top Standard” – 5000 pg/mL, 1:2 – 2500
pg/mL, 1:4 – 1250 pg/mL, 1:8 – 625 pg/mL, 1:16 – 312,5 pg/mL, 1:32 – 156
pg/mL, 1:64 – 80 pg/mL, 1:128 – 40 pg/mL e 1:256 – 20 pg/mL) e 25mL de
diluente G apenas (Controle Negativo), foram transferidas para tubos de
poliestireno de 5mL (Falcon – BD, EUA). Posteriormente, a cada tubo foram
adicionados 15µL da mistura de esferas de captura, conjugadas com
anticorpos monoclonais anti- CCL2/MCP-1, CCL3/ MIP-1α, CCL4/MIP-1β,
CCL5/RANTES e CXCL 8/IL-8 (CBA Human Chemokine Kit II, BD, EUA), com
subseqüente incubação por 90 minutos, à temperatura ambiente, ao abrigo da
luz. Após a incubação, as esferas de captura foram lavadas com 500µL da
solução F (tampão de lavagem, reagente do kit CBA), centrifugadas a 600g,
por 10 minutos, a 18
o
C e o sobrenadante foi cuidadosamente aspirado e
descartado. As esferas foram então re-incubadas na presença de 20µL do
reagente B, que corresponde a um coquetel de anticorpos monoclonais anti-
quimiocinas humanas, conjugados com o fluorocromo PE (FL-2) por 90
minutos, temperatura ambiente, ao abrigo da luz. Após incubação, as esferas
de captura foram novamente lavadas com 500µL da solução F, centrifugadas a
600g, por 10 minutos, a 18
o
C e o sobrenadante foi cuidadosamente aspirado e
descartado. Após centrifugação, as esferas foram ressuspendidas em 250µL
de reagente F e imediatamente analisadas no citômetro de fluxo FACScan