( PDF ) Construção de uma biblioteca genômica de Corynebacterium pseudotuberculosis e sua caracterização através de Genomic Survey Sequence (GSS)

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS

INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA GERAL

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA

DISSERTAÇÃO DE MESTRADO

VÍVIAN D’AFONSECA DA SILVA

ORIENTADOR: Prof. Dr. Vasco Ariston de Carvalho Azevedo

CO-ORIENTADOR: Prof. Dr. Anderson Miyoshi

BELO HORIZONTE

Fevereiro – 2008

Construção de uma biblioteca genômica de

Corynebacterium

pseudotuberculosis e sua caracterização através de

Genomic Survey Sequence (GSS).

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VÍVIAN D’AFONSECA DA SILVA

ORIENTADOR: Prof. Dr. Vasco Ariston de Carvalho Azevedo

CO-ORIENTADOR: Prof. Dr. Anderson Miyoshi

Universidade Federal de Minas Gerais

Instituto de Ciências Biológicas

Belo Horizonte - MG

Fevereiro - 2008

Construção de uma biblioteca genômica

Corynebacterium

pseudotuberculosis e sua caracterização através de

Genomic Survey Sequence (GSS).

Dissertação apresentada como requisito parcial

para obtenção do grau de Mestre pelo programa

de Pós-Graduação em Genética do Departamento

de Biologia Geral do Instituto de Ciências

Biológicas da Universidade Federal de Minas

Gerais.

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Dedico esta dissertação ao meu lindo filho Marcus

Vinícius, meu orgulho, à minha irmã Thaís Cláudia,

melhor amiga, ao meu cunhado Luis Alberto, a minha

madrinha Abadia e ao meu tio preferido, Jordão, que

partiu, durante a escrita desse trabalho.

AGRADECIMENTOS

Família:

• À Deus primeiramente, fonte de toda luz, amor e paz que encontrei sempre nos caminhos

que trilhei. Deus sempre esteve comigo!;

• Aos meus pais Haroldo e Eloísa, que não mediram esforços para que esse trabalho

pudesse ser realizado e sempre me apoiaram em todas as decisões;

• Ao meu filho Marcus Vinícius, por todas as horas de descontração, de brincadeiras,

cumplicidade, amizade e amor. Pela primeira vez senti meu coração pulsar fora de mim!!!;

• À minha querida irmã Thaís e ao meu cunhado Luis Alberto, que me acolheram e foram

os meus alicerces, meu porto seguro durante todo o tempo que precisei;

• À minha linda afilhada, Maria Luisa, minha princesinha!!!

• Aos meus irmãos Guilherme e Rodrigo, pelo companheirismo e vibrações positivas

sempre;

• A toda minha família, tios, primos, padrinhos, por toda ajuda, por tanto carinho;

• Ao pai do meu filho, Vinícius, pela ajuda, por ter acreditado tanto em mim, pelo amor

verdadeiro;

• A toda minha segunda família, Tânia, Ricardo, Vanessa e Wagner, tios, primos, pelo

apoio, amizade e carinho;

• A toda minha terceira família Rosemary, Lúcio, Júnia e Giullia, pelo acolhimento;

• Aos novos amigos e aos antigos pela grande amizade;

Trabalho:

• Ao Prof. Dr. Vasco Azevedo, pelas enormes oportunidades, pela orientação, por ter

sempre acreditado em mim e no meu trabalho, por todos os ensinamentos, ensinamentos

fundamentais na minha formação;

• Ao Prof. Dr. Anderson Miyoshi, pela orientação, por tantos conselhos, pelos ensinamentos,

pela ajuda na elaboração de todos os trabalhos, na bancada ou na escrita, por me ajudar na

minha formação;

• Ao Prof. Dr. José Miguel Ortega, Dr. Francisco Prosdocimi e sua equipe pela ajuda na

elaboração do trabalho;

• Ao Dr. Guilherme Oliveira, pela atenção e por viabilizar a realização de parte do trabalho;

• Às queridas amigas Luciana Oliveira e Elisângela Coser (Renée Rachou), por todaaaaa

ajuda!;

• Ao meu ‘IC’ preferido, Pablo Moraes, por ter sido tão aplicado, interessado, por ter

tornado as tardes mais agradáveis, pela amizade e claro pelo trabalho confiável, realizado

com responsabilidade;

• À Gabriela Burle, NAGE, por sempre me ajudar principalmente na bancada e pela sua

amizade;

• À Pós-Graduação em Genética, a Todos os professores da nossa pós-graduação;

• À Marina, por toda paciência, pelas grandes ajudas ao longo do curso e pela amizade;

• À minha nova e querida amiga Síntia Almeida, pela força incomensurável para a elaboração

da dissertação e pela amizade;

• Aos colegas de curso, pelas idéias e energia positiva;

• E claro ao Laboratório de Genética Celular e Molecular, sinônimo de trabalho,

competência, amizade e companheirismo. A todos vocês membros do LGCM o meu

especial muito obrigado por toda nossa história em comum:

- Alessandra - Núbia Seyffert

- Clarissa Rocha - Pablo Moraes

- Eduardo Capanema - Paula Gonçalves

- Fernanda Dorella - Sarah Viguetti

- Fernanda Lima - Síntia Almeida

- Kátia Morais - Siomar Soares

- Luis Gustavo Pacheco - Tarciana Teixeira

- Marcela Pacheco - Thiago Castro

- Marcelle Almeida

• A todos vocês o meu MUITO OBRIGADO!!!!!!!

“Somos uma temível mistura de ácidos nucléicos

e lembranças, de desejos e de proteínas. O

século que termina ocupou-se muito de ácidos

nucléicos e de proteínas. O seguinte vai

concentrar-se sobre as lembranças e os desejos.

Saberá ele resolver essas questões?”

(Jacob)

SUMÁRIO

vii

viii

LISTA DE ABREVIATURAS ............................................................................................

LISTA DE FIGURAS ........................................................................................................

LISTA DE TABELAS .......................................................................................................

RESUMO...........................................................................................................................

ABSTRACT.......................................................................................................................

I. APRESENTAÇÃO..........................................................................................................

I.1. Colaboradores ...........................................................................................................

I.2. Introdução geral ........................................................................................................

I.3. Estrutura do manuscrito ...........................................................................................

II. REVISÃO DE LITERATURA ........................................................................................

II.1. Etiologia ....................................................................................................................

II.1.1. O grupo CMN ..............................................................................................

II.1.2. Gênero Corynebacterium..........................................................................

II.1.3. Corynebacterium pseudotuberculosis ....................................................

II.1.4. Aspectos microbiológicos ........................................................................

II.1.5. Propriedades Bioquímicas .......................................................................

II.1.6. Taxonomia de C. pseudotuberculosis .....................................................

II.2. Linfadenite Caseosa ................................................................................................

II.2.1. A doença .....................................................................................................

II.2.2. Impactos sócio-econômico da LC

............................................................

II.2.3. Epidemiologia ............................................................................................

II.2.4. Transmissão ...............................................................................................

II.2.5. Relatos de casos em humanos .................................................................

II. 2.6. Determinantes da virulência de C. pseudotuberculosis .......................

II.2.6.1. Fosfolipase D................................................................................

II.2.6.2. Lipídeos tóxicos da parede celular ...........................................

II.2.6.3. Novos genes candidatos ............................................................

II.2.7. Diagóstico ..................................................................................................

II.2.8. Tratamento e profilaxia .............................................................................

II.2.9. Vacinas contra LC....................................................................................

II.2.9.1. Vacinas comerciais ...................................................................

II.2.9.2. Vacinas de subunidade protéica e gênica ..............................

II.2.10. Geração de mutantes atenuados ...........................................................

II.3. Genômica ..................................................................................................................

II.3.1. Genômica no Brasil ...................................................................................

II.3.2.Genomas seqüenciados de Corynebacterium........................................

II.3.3. Genômica comparativa entre espécies do gênero Corynebacterium ..

II.3.3.1. Características gerais .................................................................

II.3.3.2. Compartilhamento de genes entre as espécies do gênero ....

II.3.4. Estratégias moleculares baseadas na geração de GSSs para

identificação gênica ...............................................................................................

II.3.5. Pangenômica ...............................................................................................

III.OBJETIVOS .......................………………………………………………………………….

III.1. Objetivos gerais ......................................................................................................

III.2. Objetivos específicos .............................................................................................

IV.RESULTADOS E DISCUSSÃO ...................................................................................

IV.1. ARTIGO: Genome organization and gene content of C.

pseudotuberculosis …………………………………………………………………………...

V.CONCLUSÕES E PERSPECTIVAS .............................................................................

V.1. Conclusões ...............................................................................................................

V.2. Perspectivas .............................................................................................................

VI. REFERÊNCIAS BIBLIOGRAFICAS ...........................................................................

VII. ANEXOS .....................................................................................................................

VII.1. MATERIAIS E MÉTODOS .......................................................................................

VII.1. 1.Equipamentos utilizados ........................................................................

VII.1.2. Reagentes e soluções .............................................................................

VII.1.2.1. Reagentes químicos e analíticos ............................................

VII.1.2.2. Soluções ....................................................................................

VII.1.3. Meios de cultura ......................................................................................

VII1.4. Linhagens bacterianas, plasmídeos e condições de cultivo ...............

VII.1.5. Extração de DNA genômico bacteriano ................................................

VII.1.6. Resolução eletroforética ........................................................................

VII.1.7. Construção da biblioteca genômica de C. pseudotuberculosis ........

VII.1.7.1. Fragmentação do DNA genômico por nebulização ...............

VII.1.7.2. Obtenção de fragmentos de DNA com “pontas “cegas (Blunt-

end repair) ..................................................................................................

VII.1.7.3. Desfosforilação dos fragmentos de DNA ...............................

VII.1.7.4. Confecção de E. coli eletrocompetente ..................................

VII.1.7.5. Ligação dos insertos genômicos no vetor .............................

VII.1.7.6. Transformação de E. coli ..........................................................

VII.1.7.7. Estocagem dos clones positivos .............................................

IV.7.8. Extração do DNA plasmidiano de E. coli ....................................

VII.1.7.9. Confirmação da presença e tamanho do insertos genômicos

de C. pseudotuberculosis no vetor ........................................................

VII.1.8. Geração de Genomic Survey Sequence (GSS) .....................................

VII.1.8.1.Reação de sequenciamento ......................................................

VII.1.8.2. Precipitação de nucleotídeos não incorporados ...................

VII.1.8.3. Sequenciamento das amostras ................................................

VII.1.9. Análises in silico das GSS geradas ........................................................

VII.1.9.1. Remoção de seqüências de baixa qualidade ..........................

VII.1.9.2. Remoção de região com similaridade a vetores .....................

VII.1.9.3. Montagem de “contigs” e alinhamento das GSS ...................

VII.1.9.4. Análises de similaridade ..............……………………................

VII.1.9.5. Caracterização gênica in silico de grupos biológicos funcionais

.......................................................................................................................

VII.1.9.6. Análises comparativas utilizando o UNIPROT ........................

VII.1.10. Genômica comparativa ............................................................................

VII.1. 10.1. Análises de similaridade entre C. pseudotuberculosis e

outras quatro espécies do gênero ...............................................................

VII.1.10.2. Uso de banco de dados para inferências de novas prováveis

exclusivas proteínas de C. pseudotuberculosis ........................................

VII.1.10.3. Análise de sintenia entre C. pseudotuberculosis e outras

quatro espécies do gênero ........................................................................

VII.1.10.4. Confirmação por PCR de prováveis genes exclusivos de C.

pseudotuberculosis ...................................................................................

VII.3. ARTIGO: Mini Review ……………………………………………………………………

VII.3.1. A description of genes of Corynebacterium pseudotuberculosis

useful in diagnostics and vaccine applications…………………………………..

VII.4. Currículo ……….…………………………………………………………………………..

LISTA DE ABREVIATURAS

INSTITUIÇÕES

CNPq Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico

EMBRAPA Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária

FAPEMIG Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais

FIOCRUZ Fundação Osvaldo Cruz

ICB - UFMG Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Minas Gerais

ICS - UFBA Instituto de Ciências da Saúde da Universidade Federal da Bahia

TERMOS TÉCNICOS

BHI “Brain Heart Infusion” – Infusão Cérebro Coração

CIP Coleção Instituto Pasteur

DNA Ácido Desoxirribonucléico

dNTPs Desoxirribonucleotídeos trifosfato

EDTA Ácido etilenodiaminotetracético

g Grama

GET Solução Glicose:EDTA:Tris-base

GSS “Genome Survey Sequence”

HCl Ácido Clorídrico

Kb Mil pares de bases

µFD Capacitância por unidade

µg Micrograma

µl Microlitro

µM Micromolar

LB Meio Lúria-Bértani

LC Linfadenite Caseosa

mg Miligrama

MgCl

Cloreto de Magnésio

min Minutos

mL Mililitro

mM Milimolar

M Molar

NaOAc Acetato de Sódio

NaCl Cloreto de Sódio

NaOH Hidróxido de Sódio

ng Nanograma

OHMS Unidade de Resistência elétrica

O.N. “Overnight” – durante a noite

pb Pares de bases

PCR “Polymerase Chain Reaction” – Reação em Cadeia da Polimerase

PEG Polietileno glicol

Psi “Pound per square inch”-

Libra-força por polegada quadrada

RPM Rotações por minuto

seg Segundos

U Unidades

UFC Unidades formadoras de colônia

V Voltagem

LISTA DE FIGURAS

FIGURA 1: Panorama mundial dos projetos genomas ............................................ 02

FIGURA 2: Distribuição filogenética de projetos genomas bacterianos .................. 03

FIGURA 3: Teste bioquímico das linhagens de C. pseudotuberculosis realizado no

sistema Api Coryne................................................................................................... 11

FIGURA 4: Classificação dos países envolvidos em projetos Genomas................. 21

FIGURA 5: Imagem esquemática da estrutura de um pangenoma.......................... 29

FIGURA 6: Aparelho nebulizador para fragmentação mecânica do DNA................ 82

FIGURA 7: Construção da biblioteca genômica de C. pseudotuberculosis.

Transformação de E. coli com os fragmentos genômicos de C. pseudotuberculosis e

seleção dos clones positivos..................................................................................... 85

vii

LISTA DE TABELAS

TABELA 1: Propriedades bioquímicas de C. pseudotuberculosis............................ 09

TABELA 2: Projetos genomas do grupo CMN........................................................ 23

TABELA 3: Linhagens bacterianas utilizadas no trabalho. .................................................. 80

TABELA 4: Oligonucleotídeos utilizados na reação de PCR das 4 GSS´s

provavelmente exclusivas de C. pseudotuberculosis................................................ 93

viii

RESUMO

O gênero Corynebacterium consiste em um grande número de bactérias Gram-

positivas que são pleomórficas, não esporulam e com um alto conteúdo. Este gênero

incluem também espécies patogênicas de plantas e animais, bactérias do solo não-

patogênicas e espécies saprófitas. Um dos membros mais importantes deste gênero é

a bactéria Corynebacterium pseudotuberculosis, um patógeno intracelular, o qual

causa a doença denominada Linfadenite Casoesa (LC) em cabras e ovelhas. A ampla

ocorrência e a importância econômica dessa doença têm impulsionado os estudos da

sua patogênese. Entretanto, as bases genéticas da virulência de C.

pseudotuberculosis ainda são pouco caracterizadas. Neste contexto, para obter mais

informação sobre o patógeno aproximadamente 1.440 GSSs (Genomic Survey

Sequence) de C. pseudotuberculosis linhagem T2 foram geradas e então submetidas

a análises computacionais. As análises resultaram em aproximadamente 1.000 GSSs

com os tamanhos entre 100 a 790 nucleotídeos. Utilizando seqüências não-

redundantes foi demonstrada uma sintenia conservada entre C. pseudotuberculosis e

C. diphtheriae. Quando as seqüências obtidas foram comparadas as outras quatros

espécies do gênero Corynebacterium, C. pseudotuberculosis apresentou maior

similaridade ao nível de aminoácido do que ao nível de DNA. Foram também

demonstradas a presença de genes como oppD e PIP que provavelmente codificam a

proteína Dipeptídeo/ABC transportador e Iminopeptidase, respectivamente. Análises

filogenéticas mostraram que C. pseudotuberculosis apresenta estreita relação com o

patógeno humano, C. diphtheriae.

ABSTRACT

The Corynebacterium genus consists of a large number of Gram-positive bacteria that

are pleiomorphic, non-sporeforming with high GC contents. This genus also included

plant-pathogenic, animal-pathogenic, nonpathogenic soil bacteria and saprophytic

species. One of the most important members of this genus is the bacteria

Corynebacterium pseudotuberculosis, an intracellular pathogen which causes the

illness called Caseous Lymphadenitis (CL) in sheeps and goats. The widespread

occurrence and the economic importance of this disease have prompted investigation

of its pathogenesis. However, the genetic basis of C. pseudotuberculosis virulence is

still poorly characterized. In this context, in order to obtain more information about it,

approximately 1,440 GSS’s (Genomic Survey Sequences) of C. pseudotuberculosis T2

strain were generated and then submitted to computational analyses. Therefore, these

analyses resulted in 1,000 GSS’s with a length between 100 to 790 nucleotides. Using

non-redundant sequences was desmonstrated a conserved sintenia between C.

pseudotuberculosis and C. diphtheriae. When the sequences obtained were compared

to the others four species of the Corynebacterium genus, C. pseudotuberculosis

shown to have more similarity at the amino acid level than the DNA level. It was also

demonstrated the presence of the oppD and PIP genes which codes for Dipeptide/ABC

protein and the Proline Iminopeptidase respectively. Phylogenetic analysis showed

that C. pseudotuberculosis presents, a close relationship with the human pathogen,

C. diphtheriae.

APRESENTAÇÃO

I.1. Colaboradores

Este trabalho foi realizado no Laboratório de Genética Celular e Molecular

(LGCM) do Instituto de Ciências Biológicas (ICB) da Universidade Federal de Minas Gerais

(UFMG); e contou com as seguintes colaborações:

 Prof. Dr. Guilherme Corrêa de Oliveira, chefe do Laboratório de Parasitologia

Celular e Molecular do Centro de Pesquisa Renée Rachou, FIOCRUZ e

coordenador da Rede Genoma de Minas Gerais (RGMG);

 Prof. Dr. Sérgio Costa Oliveira, chefe do Laboratório de Imunologia das

Doenças Infecciosas do Departamento de Bioquímica e Imunologia da UFMG;

 Prof. Dr. José Miguel Ortega do Laboratório de Biodados do Departamento de

Bioquímica e Imunologia da UFMG;

 Prof. Dr. Roberto Meyer, chefe do Laboratório de Imunologia e Biologia

Molecular do Instituto de Ciências da Saúde da UFBA;

 Prof. Dr. Ricardo Wagner Portela,

Pesquisador e Professor do Departamento

de Biointeração da UFBA;

O mesmo teve o apoio financeiro das seguintes instituições: Fundação de

Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG REDE-2829/05) e Conselho

Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq).

I.2. Introdução Geral

A genômica, ciência que estuda a estrutura, função e evolução de genomas e

genes, é uma fonte valiosa de ferramentas que contribuem para um melhor conhecimento

das funções gênicas, principalmente quando se trata de microrganismos (SALZANO et al.,

2004). Tal área gera uma quantidade imensa de informações e os bancos de dados, que

não param de crescer, fornecem um avanço no entendimento dos mais vastos e importantes

temas, tais como: (i) diversidade e características populacionais; (ii) estrutura de operons;

(iii) elementos genéticos móveis (EGM); (iv) transferência lateral de genes (TLG) e (v)

informações sobre as complexas relações entre o patógeno e o hospedeiro (BINNEWINES

et al., 2006).

Há uma grande quantidade de projetos genoma sendo realizados na atualidade

(figura 1). A razão é que seus genomas são compactos e altamente informativos, ou seja,

com maior porcentagem de regiões codificadoras. Em se tratando de bactérias patogênicas,

o interesse aumenta, pois podem-se salientar mudanças, ou seja, plasticidade, no mapa

genômico como a aquisição de ilhas de patogenicidade (SCHWARTZ, 2000), genes de

resistência a antibióticos e implicados na virulência e patogenicidade; os quais podem

constituir bons alvos de terapias mais eficazes, desenvolvimento de kits de diagnósticos e

vacinas.

FIGURA 1: Panorama mundial dos projetos genomas, no período de 1995 a

2008. Adaptado de GOLD (Genomes Online Databases). [site acessado em 30/01/2008]

No Brasil, a era genômica teve início em 1998, com o seqüenciamento da Xylella

fastidiosa, primeiro fitopatógeno a ser seqüenciado no mundo (SIMPSON et al., 2000),

dentro de uma rede de pesquisa estadual. Esse projeto contribuiu para que os grupos de

pesquisa voltados para a genômica, distribuídos pelo território nacional, se organizassem

em uma rede. Assim, o primeiro organismo a ser seqüenciado por uma estrutura de rede

nacional, foi o Chromobacterium violaceum, em 2001. Já em 2002, a Rede Nacional

seqüenciou o genoma de Mycoplasma synoviae, agente causador de doenças endêmicas

em aves (LOBO et al., 2007); o que fomentou a criação das redes regionais.

Atualmente existem nove destas redes de pesquisa, localizadas em várias

regiões brasileiras. Uma delas, a Rede Genoma de Minas Gerais (RGMG) deu início aos

seus trabalhos com o transcriptoma do Schistossoma mansoni, parasita humano. Em agosto

de 2006, a RGMG iniciou mais um projeto genoma de relevância, o seqüenciamento de

Corynebacterium pseudotuberculosis linhagem 1002. Essa bactéria, Gram-positiva, é um

patógeno intracelular facultativo com alto conteúdo G+C (DORELLA et al., 2006a) que

infecta geralmente pequenos ruminantes, causando a doença denominada linfadenite

caseosa (LC). Dados da literatura confirmam também a infecção humana (MILLS et al.,

1997; PEEL et al., 1997; LIU et al., 2005).

A escolha deste patógeno foi baseada na sua grande importância econômica e

veterinária e, aliado a este fato, anualmente há um crescimento de cerca de 4% em projetos

Genoma de Actinobacterias no mundo (figura 2); o que se deve ao fato deste grupo

englobar diversos gêneros com grande relevância médica, biotecnológica e veterinária, tais

como Mycobacterium, Corynebacterium, Nocardia e Rhodococcus.

FIGURA 2: Distribuição filogenética de projetos Genoma bacterianos. Adaptado

de GOLD (Genomes Online Databases). [site acessado em 30/01/2008]

Dentro do gênero Corynebacterium existem quatro espécies com o genoma

totalmente seqüenciado: C. diphtheriae, C. jeikeium, C. efficiens e C. glutamicum. Sabe-se

que esses organismos apresentam genomas circulares, com o tamanho entre 2,3 Mpb e 3

Mpb, com ou sem a presença de plasmídeos. Os conteúdos de G+C são altos, variando em

torno de 58% e há uma alta freqüência de eventos de transferência horizontal de genes,

presença de ilhas de patogenicidade e de fatores clássicos de virulência, como genes de

aquisição de ferro. Dessa forma, a genômica comparativa pôde evidenciar que dentro deste

gênero a bactéria C. jeikeium compartilha muito do seu genoma com todas as outras

espécies e apresenta alta plasticidade genômica como, por exemplo, inversões, presentes

apenas nessa espécie (DORELLA et al., 2007).

Aliada às informações disponíveis sobre várias espécies do gênero

Corynebacterium, com os genomas já seqüenciados, torna-se relevante a caracterização e

obtenção de dados sobre o genoma de C. pseudotuberculosis, o que fornecerá dados para

análises de genômica comparativa. O sequenciamento de C. peudotuberculosis 1002

fornecerá o mapa genético modelo para estudo de genômica comparativa com bactérias de

outras espécies.

A pângenomica, o estudo da plasticidade entre genomas de vários isolados da

mesma espécie, tem sido atualmente utilizada para análise comparativas entre linhagens.

Tais estudos averiguam diferenças e semelhanças entre elas, para estabelecer mudanças

no mapa genômico. Para esse fim, a caracterização do genoma de outras linhagens se faz

necessário, e foi realizado no presente trabalho, o qual caracteriza um isolado diferente da

utilizada no projeto genoma, a C. pseudotuberculosis T2.

A caracterização concomitante de várias linhagens de C. pseudotuberculosis

ainda não foi possível, pois os métodos atuais disponíveis para isso, como o

pirosequenciamento, (tecnologia que utiliza “slides” de fibra ótica com aproximadamente 2

milhões de poços, com detecção nucleotídica realizada pela geração de fótons de luz

visível) ainda é de custo elevado (MARGULIES et al., 2005) e ainda não está disponível na

Rede Genoma de Minas Gerais.

Outro método disponível é o Multi Locus Sequence Type (MLST), o qual realiza

uma abordagem pangenômica que tem como objetivo identificar isolados bacterianos com

estreita relação filogenética e permitir a reconstrução de eventos de evolução e análises de

epidemiologia molecular. Tal técnica é baseada na comparação de seqüências de

aproximadamente nove loci genéticos, buscando diferenças marcantes entre elas, que

distingüa as linhagens (ARVAND et al., 2007). Porém, análises utilizando MLST entre C.

pseudotuberculosis e C. ulcerans não foram satisfatórios (Francis Bolt- comunicação

pessoal) pois os loci escolhidos na maioria das vezes são genes “housekeeping”,

apresentando muita conservação, inviabilizando assim a diferenciação entre as bactérias

suas linhagens.

Por estas razões, realizar uma abordagem genômica utilizando Genome Survey

Sequence (GSSs - seqüências nucleotídicas parciais provenientes de DNA genômico) que

permite a identificação e caracterização de genes (BHATIA et al., 2004), continua ainda

sendo a melhor técnica ligada à genômica utilizada no Brasil antes de lançar um projeto

genoma. As GSSs são similares às Expressed Sequence Tag (ESTs - seqüências geradas

pelo seqüenciamento único das extremidades dos insertos de interesse) porém diferem

entre si, pois as GSSs são oriundas de DNA genômico, enquanto as ESTs provém de cDNA

(DNA complementar) originado de um mRNA (RNA mensageiro). A geração de GSSs, traz

outras vantagens como: (i) é uma técnica de baixo custo e alta acurácia; (ii) permite a

geração de seqüências genômicas aleatórias; (iii) as seqüências geradas podem então ser

oriundas dos mais diversos modelos de clonagens (plasmídeos, cosmídeos, BACs,YACs) e

(iv) auxilia na rápida predição gênica auxiliada por análises computacionais.

Com isso, a geração de GSSs para caracterização genômica de C.

pseudotuberculosis T2 torna possível os estudos de genômica comparativa tanto entre

espécies do gênero, quanto entre a linhagem 1002 e outras linhagens que poderão vir a ser

seqüenciadas, podendo, assim, auxiliar nos estudos de plasticidade e evolução do genoma

de C. pseudotuberculosis e auxiliar na identificação de possíveis genes alvos para novas

terapias no combate à LC.

I.3. Estrutura do manuscrito

O presente manuscrito de dissertação inicia-se com uma revisão da literatura que

foi dividida em três partes. A primeira parte descreve os aspectos gerais do gênero

Corynebacterium, dando um enfoque sobre a espécie C. pseudotuberculosis, descrevendo

suas características bioquímicas, microbiológicas e fisiológicas. A segunda parte trata da

doença causada por este patógeno, a LC, onde são abordados assuntos como:

características gerais da doença, importância e epidemiologia, modo de transmissão,

tratamento e profilaxia e a descrição de alguns casos em humanos. A terceira parte,

denominada genômica, aborda esta área no Brasil, o andamento de projetos genomas de

actinobactérias e trata de algumas características das quatro espécies do gênero

Corynebacterium que a presentam os genomas já seqüenciados e seus estudos de

genômica comparativa. Em seguida, são apresentados os objetivos do trabalho. Os

resultados e a discussão encontram-se sob a forma de um artigo científico onde estão

descritos todos os resultados obtidos com a construção da mini-biblioteca genômica e as

análises in silico das GSSs geradas utilizando algoritmos de bioinformática. Por fim, são

apresentadas as considerações finais e as perspectivas deste trabalho. Nos anexos,

encontram-se todas as metodologias utilizadas no trabalho, de forma mais detalhada; um

artigo, em forma de revisão, apresentando uma lista de genes descritos e suas aplicações;

além do currículo, onde estão destacadas as atividades e os trabalhos realizados durante o

mestrado.

REVISÃO DE LITERATURA

II.1. Etiologia

II.1.1. O grupo CMN

O grupo CMN é um grupo pertencente à família dos actinomicetos e

heterogêneo, que apresenta muitas espécies de interesse médico, veterinário e

biotecnológico e, por isso, assumem um papel relevante no cenário mundial. Entre elas,

destacam-se Mycobacterium tuberculosis e Mycobacterium leprae, os agentes etiológicos da

tuberculose e da hanseníase, respectivamente.

Este grupo inclui também diversos outros gêneros como Corynebacterium,

Nocardia e Rhodococcus. Tais bactérias Gram-positivas constituem o grupo denominado

CMN, que apresentam muitas características em comum, tais como: (i) presença de ácidos

micólicos na parede celular e (ii) alto conteúdo G+C. Os genomas de diversas espécies

CMN já foram completamente seqüenciados; este fato reflete a importância médica,

veterinária e biotecnológica destes organismos (HARD et al. 1969; PAULE et al., 2004;

SONGERr et al., 1997).

Quanto ao gênero Corynebacterium, destacam-se também C. diphteriae, C.

jeikeium, os agentes causadores de difteria e infecções nosocomiais (TAUCH et al., 2005); e

C. glutamicum, altamente utilizada na produção de aminoácidos, como L-aspartato e L-lisina

(KOFFAS & STEPHANOPOULOS, 2005).

Para correlacionar microorganismos do gênero Corynebacterium com outras

bactérias pertencentes à família dos Actinomicetos, foram realizados estudos baseados nas

seqüências da subunidade 16S do rRNA ou no gene rpoB, que confirmam uma relação inter

e intra-específica com outros gêneros, tais como Rhodococcus, Mycobacterium e Nocardia.

A importância destes microrganismos, pertencentes ao grupo CMN, está ligada

ao fato de que representam graves problemas de saúde pública (infectam milhares de seres

humanos e animais por ano), pois não possuem um método de controle eficaz e causam

grandes perdas sócio-econômicas como é o caso da bactéria patogênica C.

pseudotuberculosis.

II.1.2. Gênero Corynebacterium

O gênero Corynebacterium pertence à família dos Actinomicetos e foi

originalmente criado por Lehmann & Neumann (1896) para acomodar o bacilo C. diphtheriae

e algumas outras espécies patogênicas. Mais tarde, o grupo passou a acomodar diversas

outras espécies de bactérias que diferiam em forma, patogenicidade e esporulação

(PASCUAL et al., 1995). Este gênero compreende espécies os quais apresentam muitas

características peculiares tais como: (i) serem bactérias Gram-positivas; (ii) apresentarem

parede celular com quimiotipos IV (ácido meso-diaminopimélico, arabinose e galactose); (iii)

ácidos corineformes; (iv) ácidos graxos de cadeia curta saturados e monosaturados e (v)

alto conteúdo G+C (47-74%).

II.1.3. Corynebacterium pseudotuberculosis

O microorganismo C. pseudotuberculosis, é uma bactéria Gram-positiva, parasita

intracelular facultativa, pleomórfica, com um tamanho de 0,5-0,6 µm de diâmetro e 1,0 a 3,0

µm de comprimento. Não apresenta capacidade de esporular, possui fímbrias e alto

conteúdo G+C. É o agente etiológico causador da patologia conhecida como linfadenite

caseosa (LC) ou mal do caroço em pequenos ruminantes (WILLIAMSON, 2001).

Tal microorganismo foi isolado pela primeira vez em 1888, de uma linfagite

bovina pelo médico veterinário francês, Edmound Nocard. Em 1891, Hugo von Preisz, isolou

uma bactéria similar de um abscesso renal de ovino, daí o nome “enfermidade de Preisz-

Nocard”. Em 1918, Eberson a classificou como difteróide e então a chamou de

Corynebacterium pseudotuberculosis (CORRÊA & CORRÊA, 1992).

II.1.4. Aspectos microbiológicos

C. pseudotuberculosis é um microorganismo anaeróbio facultativo que apresenta

bom crescimento à 37ºC em um ambiente com pH 7,0 - 7,2 (SELIM, 2001). É um patógeno

que exibe formas cocóides e bastões filamentosos, não forma cápsula, não esporula e é

imóvel, porém, apresenta fímbrias, tem crescimento espaçado em meio ágar e se organiza

em colônias opacas de crescimento concêntrico e coloração creme-alaranjado. O

crescimento em meio líquido desenvolve-se como depósitos granulares (MERCHANT &

PACKER, 1967; BUXTON & FRASER, 1977; MUCKLE & GYLES, 1982; DORELLA et al.,

2006a).

Outro aspecto microbiológico de relevância é a hemólise variável que ocorre

quando a bactéria é crescida em meio ágar-sangue, onde, na presença de Rhodococcus

equi, apresenta uma hemólise sinérgica. Já na presença de Sthaphylococcus aureus, a

toxina produzida por C. pseudotuberculosis inibe a ação β -hemolítica estafilocócica (JONES

& COLLINS, 1986).

II.1.5. Propriedades Bioquímicas

C. pseudotuberculosis apresenta na parede celular o peptideoglicano do tipo

meso-diaminopimélico (meso-DAP). Os açúcares mais abundantes são a arabinose e a

galactose e há a presença de ácidos micólicos de cadeia curta, denominados ácidos

corineformes (JOLLY, 1965; PUECH et al., 2001; SELIM, 2001). Além disso, as reações

bioquímicas dos isolados de C. pseudotuberculosis variam consideravelmente,

principalmente no que diz respeito à habilidade de fermentação.

TABELA 1: Propriedades bioquímicas de C. pseudotuberculosis.

Características Bioquímicas

Produção de ácido Hidrólise

Glicose + Esculina -

Arabinose d Hipurato -

Xilose - Uréia +

Raminose - Tirosina -

Frutose + Caseína -

Galactose +

Manose + Fosfatase +

Lactose - Pirazinamidase -

Maltose + Vermelho Metil +

Sacarose d Redução de Nitrato d

Trealose - Catalase +

Rafinose - Oxidase -

Salicina - Lipofilismo -

Dextrina d

+: maior que 90% são positivas; d: entre 21-89% são positivas;

-: maior que 90% são negativas ou resistentes.

Ref: Modificado de Dorella et al. 2006 a.

Todas as linhagens de C. pseudotuberculosis produzem ácido, mas não

produzem gás, provenientes de muitas fontes de carbono tais como: glicose, frutose,

maltose, manose e sacarose (MERCHANT & PACKER, 1967; BUXTON & FRASER, 1977;

JONES & COLLINS, 1986; HOLT et al., 1994). C. pseudotuberculosis é fosfolipase e

catalase positiva, oxidase negativa e é beta-hemolítica (MUCKLE & GYLES, 1982; JONES &

COLLINS, 1986; SONGER et al., 1988; DORELLA et al., 2006a). Linhagens isoladas de

pequenos ruminantes geralmente não reduzem nitrato (MERCHANT & PACKER, 1967;

BUXTON & FRASER, 1977; DORELLA et al., 2006a).

Um teste bioquímico bem estabelecido para identificação de bactérias

corineformes é o API Coryne System (API-bioMérieux, Inc., La Balmes Le Grottes, França).

Esse método consiste de uma bateria de 21 testes bioquímicos, que podem ser realizados

de 24 a 48 horas. O sistema contém 20 tubos com substratos que permitem testes para a

presença de 11 enzimas (pirazinamidase, pirrolidonil, arilamidase, β-galactosidase, fosfatase

alcalina, α-glucosidase, N-acetilglucosaminidase, β-glucoronidase, redução de nitrato e

hidrólise de esculina e uréia) e oito testes de fermentação de carboidratos (glicose, ribose,

D-xilose, manitol, maltose, lactose, sacarose e glicogênio) (DORELLA et al., 2006a) (figura

3).

FIGURA 3: Teste bioquímico de uma linhagem de C. pseudotuberculosis

realizado no sistema Api Coryne. Procedimento realizado no nosso laboratório.

II.1.6. Taxonomia de C. pseudotuberculosis

Originalmente, a classificação de C. pseudotuberculosis foi baseada em

características bioquímicas e morfológicas (MUCKLE & GYLES, 1982; JONES & COLLINS,

1986). A produção de nitrato redutase foi utilizada por Biberstein et al. (1971) para distinguir

o biovar equi (isolado de eqüinos e bovinos que apresenta reação positiva para redução de

nitrato) do biovar ovis (isolado de caprinos e ovinos que apresenta reação negativa para

redução de nitrato). Posteriormente, Songer et al. (1988) chegaram à mesma conclusão

através de análises do DNA cromossômico por endonucleases de restrição, tais como

EcoRV e PstI.

Mais recentemente, os mesmos resultados foram observados, utilizando

polimorfismo de tamanho de fragmento de restrição (RFLP) do rRNA 16S

(VANEECHOUTTE et al., 1995; SUTHERLAND et al., 1996; COSTA et al., 1998). Connor et

al. (2000) utilizaram eletroforese em gel submetido à corrente em campo pulsátil (PFGE;

Pulse Field Gel Electrophoresis) associado a análises bioquímicas para a caracterização de

isolados de C. pseudotuberculosis e chegaram às mesmas conclusões.

Outra característica é a estreita relação entre C. pseudotuberculosis e

C.ulcerans, sugerida pelo fato de ambas apresentarem produção de fosfolipase D

(GROMAN et al., 1984; BUCK et al., 1985), presente apenas nas duas espécies em todo o

gênero. Além disso, algumas espécies de C. pseudotuberculosis e C. ulcerans

apresentaram a propriedade de produzir a toxina diftérica (TD) e possuem as seqüências

nucleotídicas da subunidade 16S do rRNA quase idênticas.

Métodos moleculares como hibridização de ácidos nucléicos e análises de

seqüências do gene rRNA 16S foram utilizados para determinar o grau de relação de muitas

bactérias corineformes (RIEGEL et al., 1995; TAKAHASHI et al., 1997; HOU et al., 1997;

KHAMIS et al., 2005). Utilizando as seqüências das subunidades menores deste rRNA,

presentes apenas no grupo CMN, Riegel et al. (1995) sugeriram que algumas linhagens de

C. pseudotuberculosis e C. ulcerans pertenciam a um grupo monofilético, e pôde também

concluir que os biovares equi e ovis não deveriam ser classificados como subespécies, pois

compartilhavam de alta similaridade no DNA ribossomal.

Mais recentemente, análises utilizando pequenas seqüências da subunidade β da

RNA polimerase (rpoB) tem mostrado mais acurácia na identificação de espécies do gênero

Corynebacterium do que análises baseadas no gene rRNA 16S (KHAMIS et al., 2004,

2005). Vários estudos sugerem que os dois métodos devam ser empregados em estudos

filogenéticos de espécies de Corynebacterium e Mycobacterium (MOLLET et al., 1997; KIM

et al., 1999; KHAMIS et al., 2004, 2005). Dorella et al. (2006b), ao construírem uma árvore

filogenética baseada na seqüência do gene rpoB, também demonstraram a clara relação

filogenética existente entre C. pseudotuberculosis e C. ulcerans.

II.2. Linfadenite caseosa

II.2.1. A doença

A Linfadenite Caseosa (LC) é uma doença infecto-contagiosa crônica que se

caracteriza pelo desenvolvimento de abscessos em nódulos linfáticos superficiais e em

tecidos subcutâneos – a LC externa – e/ou em órgãos internos, tais como pulmões, rins,

fígado e baço, caracterizando a LC visceral (MERCHANT & PACKER, 1967,

PIONTKOWSKI & SHIVVERS, 1998), principalmente em caprinos e ovinos. O conteúdo dos

abscessos é rico em material caseoso ou purulento contendo C. pseudotuberculosis que

pode infectar diretamente outros animais, bem como solo, água e alimentos (GOUVEIA,

1986).

Apesar de C. pseudotuberculosis ter sido originalmente identificada como

microorganismo causador da LC em caprinos e ovinos, essa bactéria foi também isolada

de outras espécies, incluindo eqüinos (causando a linfagite ulcerativa), pombos, bovinos,

camelídeos, suínos, bufalinos e humanos (DORELLA et al., 2007).

II.2.2. Impactos sócio-econômicos da LC

A linfadenite caseosa causa anualmente perdas econômicas significativas,

principalmente para os produtores de rebanhos caprinos e ovinos. Uma vez infectado, o

animal apresenta perda de peso, lã, carne e leite, além de, em muitos dos casos ocorrer a

condenação da carcaça e a deterioração da pele (PATON et al., 1994; ARSENAULT et al.,

2003).

II.2.3. Epidemiologia

Além de ser um problema econômico de relevância, a LC é uma enfermidade

de ocorrência mundial, ocorrendo principalmente em países como: Austrália, Argentina,

Nova Zelândia, África do Sul e Estados Unidos da América (AL-RAWASHDEH & AL-

QUDAH, 2000; CONNOR et al., 2000; BEN SAID et al., 2002; BINNS et al., 2002;

ARSENAULT et al., 2003; PATON et al., 2003).

No Brasil, estima-se que a maioria dos rebanhos caprinos esteja infectada. Os

estados da região Nordeste são os mais afetados, em razão de possuírem a maior

concentração de rebanhos caprinos do país (RIBEIRO et al., 2001). No Ceará, Pinheiro et

al. (2000) relataram 66,9% de sinais clínicos de LC. No Rio de Janeiro, a incidência variou

entre 3,6 a 10% (LANGENEGGER & LANGENEGGER, 1991). Minas Gerais, estado que

ainda possui um rebanho reduzido, porém, tem apresentado significativo crescimento na

atividade de caprinocultura. Estudos epidemiológicos da LC foi realizado em 97

propriedades, através da técnica de ELISA indireto de antígenos secretados de C.

pseudotuberculosis (CARMINATTI, 2003). Foi observada uma prevalência da doença de

75,8% em caprinos e 79,7% em ovinos (NÚBIA SEYFFERT - comunicação pessoal).

II.2.4. Transmissão

A habilidade de C. pseudotuberculosis sobreviver por várias semanas no

ambiente parece contribuir para a sua resistência às condições ambientais encontradas nos

criadouros (AUGUSTINE & RENSHAW, 1986; YERUHAM et al., 2004). A transmissão entre

os animais ocorre principalmente através do contato direto com secreções ou por materiais

contaminados. A entrada da bactéria no organismo se dá principalmente por feridas na pele;

contudo, pode penetrar até mesmo pela pele intacta (WILLIAMSON, 2001).

Os fatores de risco incluem a falta de higiene das instalações, o contato direto

entre animais infectados e a tosquia. No caso da caprino e ovinocultura brasileira, um

importante fator de risco é a vegetação presente no nordeste brasileiro (ALVES et al., 1997),

caracterizada pela presença de espinhos que podem provocar lesões na pele dos animais.

Em bovinos e bufalinos, há evidências de transmissão da bactéria por mosca doméstica e

por outros dípteros (YERUHAM et al., 1996; SELIM, 2001; YERUHAM et al., 2004).

II.2.5. Relatos de casos em humanos

A infecção em humanos parece ser um evento raro e em todos os casos

relatados tem sido ligada a exposição à C. pseudotuberculosis no trabalho pecuário.

Cerca de 25 casos de infecção humana já foram descritas na literatura (MILLS et al.,

1997; PEEL et al., 1997; LIU et al., 2005) e um caso relatado em 1988, devido à ingestão

de carne caprina crua e leite bovino contaminados (PEEL et al., 1997), sendo que a

sintomatologia envolve a presença de linfadenite, abscessos e outros sintomas

característicos (PEEL et al., 1997). Na maioria dos casos de infecção em humanos os

linfonodos afetados foram retirados e os pacientes receberam tratamento a base de

antibióticos.

Join-Lambert et al., (2006) relataram um caso de infecção por C.

pseudotuberculosis em uma criança francesa de apenas 12 anos, ela apresentava

quadro de febre e edemas nos linfonodos e fígado. A bactéria foi então identificada

através do teste bioquímico API Coryne e o paciente submetido a um tratamento

prolongado a base de antibióticos.

II.2.6. Determinantes da virulência de C. pseudotuberculosis

Pouco se conhece sobre os mecanismos moleculares e as bases genéticas da

virulência em C. pseudotuberculosis. Neste contexto, seqüenciamento de C.

pseudotuberculosis 1002 e a caracterização parcial do genoma da linhagem T2, poderão

auxiliar na elucidação de alguns desses mecanismos. A seguir estão descritos alguns

genes

envolvidos nesses processos.

Para saber mais sobre os genes descritos na literatura, ver artigo de revisão localizado nos anexos deste

manuscrito.

II.2.6.1. Fosfolipase D

Fosfolipase D (PLD) é uma potente exotoxina produzida por C.

pseudotuberculosis, sendo considerada o principal fator de virulência dessa bactéria

(HODGSON et al., 1999). Essa exotoxina é um fator de permeabilidade que promove a

hidrólise de ligações éster na esfingomielina da membrana celular das células de

mamíferos, possivelmente contribuindo para a dispersão da bactéria do sítio inicial de

infecção para sítios secundários dentro do hospedeiro (McNAMARA et al., 1995).

Além disso, a PLD provoca lesões dermonecróticas e em maiores doses é letal

para um número variado de cobaias e animais domésticos (SONGER, 1977; EGEN et al.,

1989). Tashjian & Campbell, (1983), por meio de ensaios in vitro, observaram a destruição

de macrófagos de caprinos durante infecção com C. pseudotuberculosis; esse efeito letal foi

devido à ação da PLD. Várias das atividades biológicas da PLD, bem como sua estrutura

molecular, foram também observadas em esfingomielinases presentes no veneno de

aranhas do gênero Loxosceles (BERNHEIMER et al., 1985; BINFORD et al., 2005).

O papel da PLD na virulência da bactéria ficou evidente após a geração de

mutantes pld. Estes são incapazes de se disseminarem e, além disso, induzem uma

resposta imunológica, embora não totalmente satisfatória, contra C. pseudotuberculosis

(HOGDSON et al., 1992). A geração de diferentes mutantes com recA (POGSON et al.,

1996) e aroQ (SIMMONS et al., 1997), tem sido interessante, já que, dependendo do tipo de

atenuação, pode-se afetar mais ou menos a imunogenicidade da linhagem. A geração de

mutantes tem como outra finalidade sua utilização como vetores de apresentação de

antígenos heterólogos para o sistema imunológico.

II.2.6.2. Lipídeos tóxicos da parede celular

Os lipídeos tóxicos da parede celular de C. pseudotuberculosis foram descritos

na década de 70 como importantes fatores que contribuem para sua patogênese (HARD,

1972). A toxicidade do material lipídico extraído da parede celular foi demonstrada pela

indução de necrose hemorrágica após injeção intradérmica em cobaias (JOLLY, 1966). Um

estudo feito em camundongos com 25 isolados de C. pseudotuberculosis propôs que existe

uma relação direta entre a porcentagem de lipídeos de superfície e a indução de abscessos

crônicos (MUCKLE & GYLES, 1982).

II.2.6.3. Novos genes candidatos

Recentemente foi demonstrado que um grupo de genes envolvidos em absorção

de ferro tem um papel relevante na virulência de C. pseudotuberculosis (BILLINGTON et al.,

2002). Os quatros genes desse provável operón foram identificados próximos ao gene pld

no genoma dessa bactéria e designados como fag A, B, C e D.

Considerando que C. pseudotuberculosis é um patógeno intracelular, essa

bactéria deve ser capaz de adquirir ferro em um ambiente onde este nutriente é escasso.

Embora não houvesse alteração na utilização de ferro por um mutante fagB, in vitro, este

teve a habilidade diminuída para sobreviver e causar abscessos em cabras infectadas

experimentalmente (BILLINGTON et al., 2002).

II.2.7. Diagnóstico

Devido à necessidade de diferenciar C. pseudotuberculosis de outros agentes

patogênicos envolvidos com a sintomatologia de LC, como Arcanobacterium pyogenes e

Pasteurella multocida, o isolamento dessa bactéria diretamente do material purulento de

linfonodos permanece como um dos procedimentos mais fidedignos de diagnóstico

(RIBEIRO et al., 2001).

Entretanto, testes mais confiáveis e acurados ainda necessitam ser

desenvolvidos. Nesse intuito, foi desenvolvida uma reação de PCR Multiplex (mPCR), para

detecção mais rápida e eficiente de C. pseudotuberculosis em amostras clínicas de animais

portadores de LC. Os genes-alvo da reação são o rRNA 16S, que é o gene de escolha na

maioria dos estudos de taxonomia bacteriana, o rpoB, um gene que vem sendo amplamente

utilizado para análises filogenéticas em microrganismos dos gêneros Mycobacterium e

Corynebacterium, e o pld (fosfolipase D), que codifica uma exotoxina associada com a

virulência tanto de C. pseudotuberculosis quanto de C. ulcerans e Arcanobacterium

haemolyticum (PACHECO et al., 2007). Através da utilização desta mPCR, associado a um

método de extração de DNA bacteriano diretamente de material caseoso, foi detectada C.

pseudotuberculosis muito mais rapidamente e de maneira mais específica que quando

utilizando cultura bacteriológica e identificação bioquímica de isolados, que é atualmente o

padrão-ouro para o diagnóstico da LC (PACHECO et al., 2007).

II.2.8. Tratamento e profilaxia

O padrão de susceptibilidade a agentes antimicrobianos encontrados em C.

pseudotuberculosis é muito variado, dependendo da fonte de onde foram obtidos. Porém,

estudos anteriores de susceptibilidade mostraram linhagens susceptíveis aos antibióticos

ampicilina, cloranfenicol, lincomicina, gentamicina, tetraciclina, penicilina G e

sulfametoxazol-trimetiloprim. Somente uns poucos isolados, apresentam susceptibilidade a

neomicina e todas as linhagens são resistentes à estreptomicina (MUCKLE & GYLES,

1982).

Diversos estudos importantes estabeleceram os valores de concentração mínima

inibitória (CMI), onde os valores foram similares para todos os isolados em relação a vários

agentes antimicrobianos. Contudo, a resistência a antibióticos difere quando a bactéria se

encontra em determinadas condições infecciosas. Fernández et al. (2001) encontraram altos

valores de CMI para vários agentes antimicrobianos em uma análise de corinebactérias

isoladas de mastite em ovelhas. Olson et al. (2002) relataram que C. pseudotuberculosis é

altamente resistente a qualquer droga quando há a formação de biofilme.

Como mencionado, o tratamento é realizado principalmente através do uso, tanto

em animais quanto em humanos, de antibióticos (STANFORD et al., 1998). Contudo, este

método não é considerado economicamente viável para uso animal pois possui um custo

elevado. O outro agravante é a formação de biofilme que impede a ação de vários

antibióticos (OLSON et al., 2002).

Outra opção de tratamento dos animais é a drenagem dos linfonodos superficiais

acometidos. Contudo, esta alternativa possui falhas relevantes. A drenagem não elimina

100% das bactérias e não é viável quando linfonodos e órgãos internos estão acometidos

(ALVES et al., 1997). Além disso, estes tratamentos podem permitir a contaminação

ambiental com o patógeno, permanecendo o controle e a prevenção como estratégias mais

viáveis.

Outras medidas são também sugeridas, como o abate de animais que

apresentem lesões aparentes ou que sejam soropositivos em testes diagnósticos. Contudo,

tais testes podem resultar na geração de falso-positivos e, portanto, no descarte de animais

não infectados (MENZIES et al., 2004). Para regiões endêmicas, se sugere o sacrifício de

todos os animais, tanto soropositivos como soronegativos (RADOSTITS et al., 2002). Diante

de medidas pouco eficazes, o controle deve se basear em estratégias que evitem a sua

disseminação e entrada nos rebanhos. Desta forma, aliado ao manejo correto, deve-se

adotar medidas preventivas eficazes, como a imunoprofilaxia.

II.2.9. Vacinas contra LC

Como descrito anteriormente, o tratamento da LC não é eficaz e é de alto custo,

por isso, a imunização seria a medida de melhor custo-benefício para erradicar essa

doença. Entretanto, ainda não existe uma vacina eficiente e protetora contra C.

pseudotuberculosis. Vários relatos na literatura mostram diferentes estratégias que vêm

sendo testadas na tentativa de desenvolver uma vacina que apresente uma imunidade

protetora ideal, mas nenhuma ainda alcançou os patamares desejáveis (STANFORD et al.,

1998; WILLIAMSON et al., 2001).

Diversas estratégias vacinais contra C. pseudotuberculosis vêm sendo testadas.

Bactérias atenuadas ou mortas, frações contendo antígenos derivados do envelope celular

ou do sobrenadante da cultura bacteriana, bem como uma mistura dos componentes

celulares já foram utilizadas (DORELLA et al., 2007). Todas apresentam proteção contra

infecções experimentais, contudo os níveis de proteção e a severidade das lesões foram

variáveis, o que demonstra a necessidade de se desenvolver uma vacina que ofereça

proteção eficiente com diminuição acentuada dos efeitos colaterais.

II.2.9.1. Vacinas comerciais

A maioria das vacinas utilizadas para fins comerciais apresenta a exotoxina

fosfolipase D inativada (WILLIAMSON, 2001). No Brasil, uma vacina viva atenuada de C.

pseudotuberculosis, linhagem 1002, foi licenciada desde 2000 e vem sendo industrializada,

em versão liofilizada, pela Empresa Baiana de Desenvolvimento Agrícola

(http://www.ebda.ba.gov.br). Entretanto, essa vacina não vem apresentando o mesmo

sucesso em testes de campo, sendo bastante variável o nível de proteção obtido, cerca de

83% (PATON et al., 2003).

II.2.9.2. Vacinas de subunidade protéica e gênica

Desde que Carne & Onon (1978) afirmaram que a exotoxina de C.

pseudotuberculosis era de fato a PLD, vários outros estudos foram então direcionados para

a identificação de novos genes candidatos a preparações vacinais contra essa bactéria e

diferentes estratégias vêm sendo testadas, como as vacinas vivas recombinantes e as

vacinas de DNA, em caprinos e ovinos.

Anticorpos com alta especificidade, produzidos por células secretoras de

anticorpos (CSA), obtidas de infecções induzidas em ovinos, foram utilizados como sonda

na procura por antígenos celulares de C. pseudotuberculosis. Nessa busca foi caracterizada

uma protease secretada de 40 quilodáltons (CP40) (WILSON et al., 1995). Porém a resposta

imune após vacinação com CP40 não foi caracterizada (WALKER et al., 1994).

II.2.10. Geração de mutantes atenuados

Várias técnicas já foram utilizadas para a geração de mutantes como

mutagênese química com ácido fórmico, realizada por Haynes et al. (1992), para produzir

PLD inativa. Uma diminuição na virulência foi observada em mutantes obtidos por

mutagênese dirigida contra pld (KIM et al., 1999). Após o isolamento dos mutantes, testes

de virulência foram realizados em camundongos; viu-se que os mutantes tinham habilidade

reduzida para estabelecer a infecção e foram incapazes de disseminar-se no hospedeiro.

Já Pogson et al. (1996), produziram um mutante para o gene recA de C.

pseudotuberculosis, utilizando mutagênese sítio-específica. O mutante teve sua eficiência

de recombinação homóloga diminuída em 8 a 10 vezes. Contudo, análises in vivo revelaram

que o gene recA mutado não afetava a virulência da bactéria durante a infecção de

camundongos. A redução da virulência através de mutantes do gene aroQ foi obtida por

Simmons et al. (1997), onde foram incapazes de causar os sintomas da LC em modelos

murinos.

Dorella et al. (2006c) identificaram 34 mutantes de C. pseudotuberculosis através

de mutagênese aleatória utilizando o sistema de transposição baseado no TNFuZ (GIBSON

& CAPARON, 2002). Este sistema funciona produzindo fusões transcricionais entre o gene

da fosfatase alcalina de Enterococcus faecalis (phoZ) e seqüências codificadoras de

proteínas exportadas presentes no genoma da bactéria. Através do seqüenciamento das

regiões flanqueadoras das inserções do transposon no DNA genômico dos 34 clones

selecionados, Dorella et al. (2006c) identificaram 21 loci que codificam subunidades

fimbriais, proteínas de transporte e também proteínas de função hipotética e/ou

desconhecida, as quais podem, ou não, estar relacionadas à virulência e à patogenicidade

deste microrganismo. Atualmente, estes mutantes vêm sendo testados em ensaios de

imunização em camundongos. Resultados recentes têm demonstrado que alguns mutantes

oferecem de 60 a 80% de proteção contra o desafio utilizando linhagem virulenta da mesma

bactéria (DORELLA - comunicação pessoal).

II.3. Genômica

A compreensão dos mecanismos moleculares, estrutura genômica, arranjo

gênico, bem como, mecanismos ligados a patogenicidade de certos microrganismos são

alvos de intenso estudo. O desenvolvimento de técnicas de biologia molecular tem levado à

identificação e caracterização de novos genes e vários fatores de virulência, bem como o

desenvolvimento de novos agentes microbianos e vacinas. Essas técnicas baseiam-se em

várias estratégias: expressão e transferência gênica, mutações aleatórias ou dirigidas e

comparação genômica.

Apesar de todos os estudos realizados em busca de terapias, profilaxias e

diagnósticos mais eficazes no controle da LC, a escassez de informação sobre as bases

moleculares e fatores de virulência tem prejudicado os avanços na área. Neste contexto,

hoje, a genômica tem-se apresentado como uma promissora e acurada alternativa para a

rápida predição gênica, e a conseqüente geração de informações de baixo custo. Com isso,

as técnicas relacionadas à obtenção de dados genômicos no Brasil tem se tornado uma

realidade cada vez mais presente em muitos laboratórios, principalmente aqueles que

buscam a identificação de genes alvos para combater doenças causadas por bactérias

patogênicas.

II.3.1. Genômica no Brasil

O grande carro-chefe do estudo de genomas foi o advento do seqüenciamento

do DNA. Com isso, milhares de organismos estão sendo ou foram estudados por

pesquisadores de uma série de países. Hoje, o Brasil já ocupa um lugar de destaque ao

lado dos Estados Unidos, França e Japão, como ilustra a figura 5. A exemplo do que é feito

em outros países, o Brasil tem colocado seus laboratórios e centros de pesquisa ligados

através de uma rede virtual para a troca de informações, compartilhamento e divisão de

tarefas.

De acordo com o banco de dados GOLD (www.genomesonline.org), o Brasil

encontra-se entre os oito países com a maior demanda de projetos Genoma. As redes de

destaque dentro da genômica brasileira são a Rede Genoma Nacional e a Rede Genoma de

Minas Gerais, a qual está atualmente seqüenciando o genoma de C. pseudotuberculosis

linhagem 1002.

Os dados gerados no projeto genoma e os dados obtidos pela geração das

GSSs, obtidas no presente trabalho, utilizando outra linhagem da mesma espécie (T2), bem

como, a utilização dos dados descritos na literatura sobre as demais espécies do gênero

que possuem o genoma já seqüenciado, poderão, então, auxiliar na elucidação dos

fenômenos de virulência e patogenicidade e no entendimento de como ocorrem eventos de

transferência horizontal de genes, perdas, ganhos, inversões, e compreender assim a

plasticidade inter e intra gênero.

FIGURA 4: Classificação dos países envolvidos em projetos Genomas no

período de 2005 a 2008. Adaptado de GOLD (Genomes Online Databases). [site acessado

em 06/02/2008]

II.3.2. Genomas seqüenciados de Corynebacterium

Como anteriormente mencionado, o gênero Corynebacterium possui organismos

de grande interesse, como C. diphtheriae, C. jeikeium e C. pseudotuberculosis, de grande

importância médica e veterinária (DORELLA et al., 2006a). Dada as justificativas e a

importância desses organismos, não é surpresa constatar grande interesse pelo

seqüenciamento de genomas desse táxon. Até o momento quatro espécies desse grupo já

foram seqüenciadas, sendo elas:

• C. diphtheriae (número de acesso: NC_002935): Esta espécie é responsável

pela difteria, doença razoavelmente controlada no passado graças a

programas de imunizações em massa, mas recentemente emergente em

alguns pontos da Europa Oriental, devido à seleção de linhagens multi-

resistentes (HADFIELD et al., 2000). Possui ainda diversas ilhas de

patogenicidade (CERDENO-TÁRRAGA et al., 2003).

• C. jeikeium (número de acesso: NC_007164): Bactéria comumente

encontrada na flora cutânea humana sendo, entretanto, reconhecida como

um importante patógeno em infecções nosocomiais, isto é, infecções

adquiridas em hospitais (TAUCH et al., 2005).

• C. glutamicum (número de acesso: NC_006958): Essa espécie é amplamente

utilizada na produção industrial de aminoácidos, como L-aspartato e L-lisina,

destacando-se assim, como organismo de interesse biotecnológico

(KALINOWSKI et al., 2003).

• C. efficiens (número de acesso: NC_004369) Também utilizada na síntese de

aminoácidos, possui a capacidade de crescer a 40ºC, o que a torna

industrialmente mais viável do que C. glutamicum (NISHIO et al., 2003).

O acesso às informações geradas pela montagem dos genomas, fornece uma

valiosa ferramenta para o melhor entendimento da organização, ordem gênica e plasticidade

do genoma bacteriano de outras espécies do gênero, principalmente de C.

pseudotuberculosis. Além disso, a proximidade filogenética entre espécies favorece ainda

mais análises de comparação gênica e identificação de características peculiares do gênero.

Além dos genomas supracitados, diversos outros membros do grupo CMN

também já tiveram o seu genoma seqüenciado ou ainda estão em andamento (tabela 2).

Tabela 2 – Projetos genomas completos e em andamento de bactérias do grupo CMN.

Espécie Status Importância Linhagem

Tamanho do

genoma (Mpb)

Porcentagem

Referência

Corynebacterium accolens Em progresso

Possivelmente relacionada com mastite

granulomatosa.

ATCC 49725 - -

BCM-HGSC

<http://www.hgsc.bcm.tmc.edu/microbiom

e-index.xsp>

Corynebacterium ammoniagenes Em progresso

Produção industrial de realçadores de

sabor nucleotídeos de purina como

inosina-5'-monofosfato e xantosina-5'-

monofosfato.

DSM 20306 - -

<http://genome.wustl.edu/hgm/display_tab

les_hgm.cgi?TABLE_TYPE=targeted_gen

omes>

Corynebacterium aurimucosum Em progresso Patógeno humano e animal. ATCC 700975 - -

Weinstock G (BCM-HGSC

<http://www.hgsc.bcm.tmc.edu/microbiom

e-index.xsp>)

Corynebacterium aurimucosum Em progresso Patógeno humano e animal. DSM 44827 2,4 58

Tauch, A (<

http://www.dsmz.de/microorganisms/html/

strains/strain.dsm044827.html >)

Corynebacterium Diphtheriae Completo Agente causador da difteria em humanos NCTC 13129 2,488 53 Cerdeno-Tarraga et al, 2005

Corynebacterium efficiens Completo

Produção industrial de glutamato, outros

aminoácidos e compostos

YS-314

3,147

63 Nishio et al., 2003

Corynebacterium efficiens Em progresso

Produção industrial de glutamato, outros

aminoácidos e compostos

- - -

Weinstock G (BCM-HGSC

<http://www.hgsc.bcm.tmc.edu/microbiom

e-index.xsp>)

Corynebacterium genitalium Em progresso

Agente causador de uretrites não-

gonocócicas em humanos

ATCC 33030 - -

Weinstock G (BCM-HGSC

<http://www.hgsc.bcm.tmc.edu/microbiom

e-index.xsp>)

Corynebacterium glucuronolyticum Em progresso

Isoladas do trato genito-urinário de

porcos e de humanos.

ATCC 51866 - -

Weinstock G (BCM-HGSC

<http://www.hgsc.bcm.tmc.edu/microbiom

e-index.xsp>)

Corynebacterium glucuronolyticum Em progresso

Isoladas do trato genito-urinário de

porcos e de humanos.

ATCC 51867 - -

Weinstock G (BCM-HGSC

<http://www.hgsc.bcm.tmc.edu/microbiom

e-index.xsp>)

Corynebacterium glutamicum Completo

Produção industrial de glutamato, outros

aminoácidos e compostos

ATCC 13032 3,309 53 Ikeda et al., 2003

Corynebacterium Jeikeium Completo

Comumente presente na pele de

humanos, pode ser um importante

agente de infecções nosocomiais

K411 2,462 61 Tauch et al., 2004

Corynebacterium kroppenstedtii Em progresso Patógeno humano DSM 44385 2,400 57.5

Tauch, A. <

http://www.dsmz.de/microorganisms/html/

strains/strain.dsm044385.html >

Corynebacterium lipophiloflavum Em progresso Isolada de swab vaginal humano. - - -

Weinstock G (BCM-HGSC

<http://www.hgsc.bcm.tmc.edu/microbiom

e-index.xsp>)

Corynebacterium pseudogenitalium Em progresso Causa infecção do trato urinário humano. ATCC 33035 - -

Weinstock G (BCM-HGSC

<http://www.hgsc.bcm.tmc.edu/microbiom

e-index.xsp>)

Corynebacterium pseudotuberculosis Em progresso

Causa lindenite caseosa em caprinos,

ovinos, eqüinos e seres humanos.

1002 - 47

Azevedo, V. (<

http://www.icb.ufmg.br/big/genomecp/ >

Corynebacterium striatum Em progresso Patógeno humano. - - -

Weinstock G (BCM-HGSC

<http://www.hgsc.bcm.tmc.edu/microbiom

e-index.xsp>)

Corynebacterium sundsvallense Em progresso

Possivelmente relacionada a doença

humana.

- - -

Weinstock G (BCM-HGSC

<http://www.hgsc.bcm.tmc.edu/microbiom

e-index.xsp>)

Corynebacterium

thermoaminogenes

Em progresso Importância biotecnológica FERM9246 - -

Gojobori T (< http://genamics.com/cgi-

bin/genamics/genomes/genomesearch.cgi

?field=ID&query=478 >

Corynebacterium urealyticum Em progresso Patógeno do trato urinário DSM 7109 2,300 64

Tauch, A. (<

http://www.dsmz.de/microorganisms/html/

strains/strain.dsm007109.html >)

Corynebacterium urealyticum Em progresso Patógeno do trato urinário DSM 7111 2,300 -

Tauch, A. (<

http://www.dsmz.de/microorganisms/html/

strains/strain.dsm007111.html >)

Mycobacterium avium Em progresso

Agente causador de tuberculose em aves e

humanos imunocpmprometidos (crianças,

idosos e especialmente pacientes protadores

de HIV)

104 5,480 68

http://www.tigr.org/tdb/mdb/mdbinprogress

.html

Mycobacterium avium subsp.

paratuberculosis

Completo

Agente causador da doença de Johne, também

conhecida como paratuberculose, uma severa

infecção crônica intestinal. Esta doença afeta

ruminantes domésticos e selvagens, tendo sido

também reportada em primatas, coelhos e

raposas.

k10 4,829 69 Paustian et al., 2004

Mycobacterium abscessus Em progresso

patógeno humano;

causadora de infecções

bronco-pulmonares e

respiratórias.

CIP 104536 - -

Barbe, V. (< http://genamics.com/cgi-

bin/genamics/genomes/genomesearch.cgi

?field=ID&query=1058 >

Mycobacterium africanum Em progresso

Principal causador de tuberculose pulmonar,

em seres humanos e animais, na África sub-

Sahara.

GM041182 4,441 -

Parkhill J. (<

http://www.sanger.ac.uk/sequencing/Myco

bacterium/africanum/ >

Mycobacterium bovis Completo

Agente causador da tuberculose bovina

clássica, podendo causar também doenças em

humanos, especialmente após a ingestão de

leite contaminado não pasteurizado. Cepa

completamente virulenta.

AF2122/97 4,345 65 http://www.sanger.ac.uk/Projects/M_bovis/

Mycobacterium bovis Em progresso

Agente causador da tuberculose bovina

clássica, podendo causar também doenças em

humanos. Linhagem utilizada para a produção

da vacina BCG, provavelmente a mais

conhecida das vacinas contra essa doença.

BCG 4,400 57

http://www.pasteur.fr/recherche/unites/Lg

mb/mycogenomics.htm

Mycobacterium canetti Em progresso

Agente causador de linfadenite em humanos e

animais.

CIPT140010059 - -

Parkhill J <

http://www.sanger.ac.uk/sequencing/Myco

bacterium/canetti/ >

Mycobacterium canetti Em progresso

Agente causador de linfadenite em humanos e

animais.

K116 - - http://www.broad.mit.edu/seq/msc/

Mycobacterium chelonae Em progresso Patógeno humano CIP 104535 - -

Barbe V. (< http://genamics.com/cgi-

bin/genamics/genomes/genomesearch.cgi

?field=ID&query=1063 >

Mycobacterium chlorophenolicum Em progresso Importância biotecnológica - - -

JCVI

<http://www.hgsc.bcm.tmc.edu/microbiom

e-index.xsp>

Mycobacterium intracellulare Esboço Patógeno humano ATCC 13950 5,328 67 Dewar, K. ( McGill Univ)

Mycobacterium leprae Completo Agente causador da hanseníase em humanos. TN 3,268 57 Fsihi et al., 1995

Mycobacterium liflandii Em progresso Causa doença em anuros. 128FXT - -

Stinear, T. (<

http://www.broad.mit.edu/annotation/geno

me/tbdb/SequencingInfo.html >)

Mycobacterium marinum Em progresso

Patógeno de animais e humanos; causadora de

tuberculose.

DL240490 - - Monash Univ

Mycobacterium marinum Completo

Patógeno de animais e humanos; causadora de

tuberculose.

M 6,637 65

Parkhill J (<

http://www.sanger.ac.uk/Projects/M_marin

um/ >)

Mycobacterium microti Em progresso

Causa tuberculose em roedores e tem sido avaliada

como vacina para humanos.

OV254 4,300 -

http://www.sanger.ac.uk/Projects/M_microt

Mycobacterium

parascrofulaceum

Em progresso

Causa doença pulmonar em humanos e em

imunodeprimidos.

ATCC BAA-614 - -

Weinstock G. (BCM-HGSC

<http://www.hgsc.bcm.tmc.edu/microbiom

e-index.xsp>)

Mycobacterium smegmatis Em progresso

Micobactéria geralmente não-patogênica, capaz de

causar lesões em tecidos moles. Isolada

inicialmente do esmegma humano.

MC2 155 7,040 57

http://www.tigr.org/tdb/mdb/mdbinprogress

.html

Mycobacterium sp. Em progresso Agente causador da tuberculose humana. Spyr1 - -

Richardson P ( Joint Genome Institute

Univ of Ioannina)

Mycobacterium tuberculosis Completo

Agente causador da tuberculose humana.

Altamente contagiosa, capaz de infectar 80% dos

contatos sociais do portador.

CDC1551 4,403 65 Fleischmann et al., 2002

Mycobacterium tuberculosis Completo

Agente causador da tuberculose humana. Ao

contrário de alguns isolados, retém toda a sua

virulência em modelos animais, sendo susceptível a

drogas e passível de manipulação genética

H37Rv 4,411 65 Cole et al., 1998

Mycobacterium tuberculosis Completo

Agente causador da tuberculose humana. Essa

linhagem possui uma grande distribuição e

virulência se comparada à outras linhagens.

210 4,447 57

http://www.tigr.org/tdb/mdb/mdbinprogress

.html

Mycobacterium tuberculosis

40 linhagens

em progresso

Causa tuberculose pulmonar em seres humanos,

essa linhagem é resistente à rifmpicina e isoniazida.

40 linhagens - - http://www.broad.mit.edu/seq/msc/

Mycobacterium ulcerans Em progresso Patógeno humano, causadora de úlcera de Buruli. 1615 - -

Monash Univ (<

http://www.monash.edu.au/ >)

Mycobacterium ulcerans Em progresso Patógeno humano, causadora de úlcera de Buruli. - 4,400 - http://www.genome.clemson.edu/

Nocardia farcinica Completo

Agente causador da nocardiose, doença que afeta

os pulmões, sistema nervoso central e pele de

humanos e animais.

IFM 10152

6,021 (Chromosome)

0,184 (Plasmid pNF1)

0,087

(Plasmid pNF2)

Ishikawa et al., 2004

Rhodococcus sp. Em progresso

Organismo capaz de degradar uma grande

variedade de bifenis policlorados, um conhecido

poluente químico.

RHA1 9,700 -

http://www.rhodococcus.ca

Rhodococcus equi Em progresso Causa Pneumonia em animais ATCC 33701 - - http://www.uoguelph.ca/

Rhodococcus equi Em progresso

Bactéria Gram-positiva que causa

broncopneumonia em cavalos

103S 4,500 68

Parkhill J. (<

http://www.sanger.ac.uk/Projects/R_equi/

Rhodococcus erythropolis Em progresso Importância biotecnológica RR4 - -

Fujita N. (<

http://www.bio.nite.go.jp/ngac/e/project-

e.html >)

Rhodococcus opacus Em progresso Importância biotecnológica B4 - -

Fujita N. (<

http://www.bio.nite.go.jp/ngac/e/project-

e.html >)

Rhodococcus sp. Em progresso Importância biotecnológica I24 5,487 - http://www.integratedgenomics.com/

II.3.3. Genômica comparativa entre espécies do gênero Corynebacterium

II.3.3.1. Características gerais

Os organismos deste gênero possuem genomas circulares, contendo em

média 3 megabases e conteúdo médio de C+G de 58% podendo ou não possuir

plasmídeos. Observam-se ilhas genômicas nos genomas de todas as Corynebacterium já

seqüenciadas, o que ressalta o grande número de eventos de transferência horizontal de

genes em procariotos (DE LA CRUZ et al., 2000).

O conteúdo gênico médio destas Corynebacterium por volta de 2.600 genes, e

aparentemente existe tendência à perda de genes em espécies patogênicas: C.

diphtheriae e C. jeikeium possuem 2.389 e 2.165 genes, respectivamente; o que

contrasta com a maior abundância de genes em C. glutamicum e C. efficiens, com 3.057

e 2.950, respectivamente (NAKAMURA et al., 2003).

Uma possível explicação para esse fato é a necessidade das espécies não-

patogênicas sobreviverem em ambientes bem mais diversos em termos metabólicos e de

estresse, sendo necessária uma gama maior de genes para responder satisfatoriamente

a esses fatores. Já as bactérias patogênicas vivem em ambientes que proporcionam uma

homeostase mais facilmente alcançada, o que possibilita a perda de diversas funções

gênicas não utilizadas (NAKAMURA et al., 2003). Um bom exemplo disso é a

incapacidade de crescimento de C. jeikeium em meios não-suplementados com lipídeos

(TAUCH et al., 2004). Após o seqüenciamento do genoma desse microrganismo,

verificou-se a perda do gene da síntese de ácidos graxos do tipo I, o que explica

satisfatoriamente o fenótipo observado.

Pode-se observar também a presença de diversos fatores de virulência

clássicos encontrados nos membros patogênicos já seqüenciados, como, por exemplo,

genes responsáveis pela formação de fímbrias, sistemas de aquisição de ferro, sistema

de síntese de sideróforos, entre outros (CERDEÑO-TÁRRAGA et al., 2003).

II.3.3.2. Compartilhamento de genes entre as espécies do gênero

Após o seqüenciamento de C. jeikeium por Tauch et al., em 2005, diversas

análises referentes ao compartilhamento de genes entre as outras três espécies do

gênero que possuem o genoma já seqüenciado foram realizadas. Essas análises

demonstraram que aproximadamente 52% dos genes deste organismo (1.089) possuem

prováveis ortólogos nos três outros organismos seqüenciados, podendo ser considerados

como a espinha dorsal do gênero.

Além disso, 17% dos genes (367) são compartilhados por um ou dois dos

organismos. Análises de sintenia dos possíveis ortólogos revelam também uma estrutura

genômica notadamente conservada, com apenas 10 pontos de perda de sintenia, sendo

que C. jeikeium ainda apresenta aparente rearranjo gênico com algumas inversões.

II.3.4. Estratégias moleculares baseadas na geração de GSSs para a

identificação gênica

O NCBI – “National Center of Biotechnology Information” criou um banco de

dados destinado ao depósito de GSSs. A criação deste banco de GSSs foi muito

importante no sentido de aproveitar a grande produção de seqüências produzidas

aleatoriamente que podem conter informações valiosas principalmente para a predição

gênica. Essas informações são provenientes do seqüenciamento de bibliotecas de

plasmídeos, cosmídeos, BACs (Bacterial Artificial Chromossome) ou YACs (Yeast

Artificial Chromossome) (FANCHIN et al., 2002).

As GSSs são similares à ESTs (Expressed Sequence Tags). A diferença entre

elas é que a GSS é oriunda de DNA genômico e as ESTs são originadas a partir de

cDNA proveniente de um mRNA.

A relevância de se utilizar GSSs para a predição gênica é o seu baixo custo e,

tratando-se de microrganismos, tais seqüências são muito informativas. Utilizando-as em

análises in silico, podem-se verificar, através de similaridade com outras seqüências

depositadas, possíveis genes ligados ou não à virulência, além de gerar um catálogo de

genes que permitem ampliar o conhecimento biológico sobre o organismo estudado.

Dorella et al. (2006b), construíram uma biblioteca genômica de C.

pseudotuberculosis com insertos em torno de 24,5 a 121 Kb, utilizando BACs como

vetores. Foi obtida uma biblioteca de alta qualidade, com aproximadamente 18.000

clones, os quais uma pequena amostra dos mesmos foram analisadas, totalizando em

215 GSSs depositadas no GenBank. A alta qualidade da biblioteca, com baixa

redundância e sem a presença de background, aliada ao grande número de clones, pôde

então servir de mapa físico na caracterização final do genoma de C. pseudotuberculosis.

Outra vantagem do uso das GSSs, é que ela é uma técnica que permite a rápida

identificação de genes que podem ser utilizados em análises comparativas entre

linhagens diferentes, auxiliando assim, estudos de epidemiologia molecular. Atualmente a

técnica de MLST (Multi Locus Sequence Type) realiza uma abordagem pangenômica de

isolados bacterianos muito próximos filogeneticamente e tenta, então, permitir a

identificação de micro eventos de evolução e diferenças sutis entre cada isolado. Isso

acontece através de análises de mudanças na seqüência gênica de aproximadamente

nove loci de escolha, que geralmente são genes housekeepings. Porém, esses genes

apresentam um alto grau de conservação entre as espécies, o que constitui um ponto

negativo da utilização do MLST, pois geralmente não permite a realização de análises

comparativas entre linhagens, devido à dificuldade de separar as linhagens por

mudanças nas seqüências gênicas escolhidas. Francis Bolt (comunicação pessoal) não

encontrou diferenças alélicas entre espécies de Corynebacterium utilizando o MLST

utilizando oito seqüências de genes housekeeping, devido a grande conservação entre os

loci.

II.3.5. Pangenômica

Até o momento, poucas são as seqüências de C. pseudotuberculosis

depositadas em bancos de dados, e de acordo com o NCBI, para essa bactéria, existem

até o momento aproximadamente 1230 GSSs. Dessa forma pode-se observar que é

altamente importante a identificação, categorização de genes, principalmente dos que

codificam proteínas-chave envolvidas em processos de patogenicidade e virulência; as

quais são potenciais alvos para o desenvolvimento de vacinas vivas atenuadas.

Atualmente, os laboratórios envolvidos com testes diagnósticos e imunoprofilaxia

voltadas para o combate de bactérias patogênicas, estão utilizando uma nova

abordagem: a pangenômica. Essa área visa então o seqüenciamento do genoma de

inúmeros isolados de um mesmo patógeno para gerar informações para a compreensão

de eventos de micro evolução entre as espécies. Porém, não só isso, mas ainda,

auxiliado os pesquisadores a decifrar mecanismos de virulência. A comparação de várias

linhagens de uma única espécie tem auxiliado na identificação de genes pertencentes a

um dado microrganismo, o que pode explicar não só o estudo da diversidade entre as

espécies, mas também, fornecer a oportunidade de usar o conhecimento adquirido das

comparações entre linhagens para o desenvolvimento de novas vacinas e uma nova

geração de alvos antimicrobianos (MUZZI et al., 2007).

Muzzi et al. (2007) ao realizarem análises comparativas entre o genoma de oito

linhagens de Streptococcus agalactiae (grupo B Streptococcus) representativas da

diversidade genética da espécie, afirmaram que, o pangenoma entre elas, apresentava

um repertório global pertencente às espécies, ou seja, peculiar do grupo. Em geral, esse

repertório pode ser dividido em três partes: o “genoma compartilhado”, os quais incluem

genes invariáveis presentes em todos os isolados; o “genoma dispensável”, que

compreende genes em algumas, mas não todas as linhagens, e os “genes linhagem-

específicos”, os quais estão presentes em apenas um único isolado, como ilustra a figura

FIGURA 5: Imagem esquemática da estrutura de um pangenoma. Modificado de

Muzzi et al., 2007.

Genes linhagem-específicos

Genes presentes apenas em uma

linhagem e ausente em todas as

outras.

Genes dispensáveis

Genes compartilhados por algumas

mas não todas as linhagens.

Genes compartilhados

Genes presentes em todos

os isolados.

Neste contexto, a construção e caracterização de uma biblioteca genômica de

C. pseudotuberculosis linhagem T2, aliada aos resultados obtidos através do projeto

genoma da linhagem 1002 podem favorecer o entendimento de arranjo gênico,

plasticidade genômica, como perda, ganho, inversões no genoma, bem como, fornecer

informações valiosas de epidemiologia molecular, micro evolução, genes linhagem-

específicos e genes comuns entre os isolados. Enfim, contribuem com informações para

o desenvolvimento de novas terapias mais eficazes para o controle da LC.

III

OBJETIVOS

III.1. Objetivo geral

Construção de uma biblioteca genômica de Corynebacterium

pseudotuberculosis da linhagem T2 e caracterização da mesma através de análises de

GSS.

III.2. Objetivos específicos

 Construir uma biblioteca genômica de Corynebacterium

pseudotuberculosis.

 Seqüenciar as extremidades dos insertos da biblioteca genômica.

 Realizar análises in silico das seqüências:

o Analisar similaridade genômica entre C. pseudotuberculosis e

outras espécies do gênero Corynebacterium.

o Confirmar a sintenia entre C. pseudotuberculosis e outras espécies

do gênero Corynebacterium.

o Utilizar os dados gerados para inferência de plasticidade genômica

entre diferentes linhagens da espécie C. pseudotuberculosis.

o Identificar novos genes.

o Propor um conjunto de genes para ser utilizado (testado) para o

MLST.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

IV.1. ARTIGO

Genome organization and gene content characterization of Corynebacterium

pseudotuberculosis.

Vivian D’Afonseca, Francisco Prosdocimi, Fernanda Alves Dorella, Luis Gustavo

Pacheco, Pablo Matias Moraes, Izabella Pena, José Miguel Ortega, Santuza

Teixeira, Sérgio Costa Oliveira, Elisângela Monteiro Coser, Luciana Márcia

Oliveira, Guilherme Correa Oliveira, Roberto Meyer, Anderson Miyoshi, Vasco

Azevedo

Este manuscrito será submetido para publicação em um periódico científico

internacional, na área de genômica de microorganismos.

Genome organization and gene content characterization of Corynebacterium

pseudotuberculosis.

Vívian D’Afonseca

, Francisco Prosdocimi

, Fernanda A. Dorella

, Luis Gustavo C.

Pacheco

, Pablo M. Moraes

, Izabela Pena

, José Miguel Ortega

, Santuza Teixeira

Sérgio Costa Oliveira

, Elisângela Monteiro Coser

, Luciana Márcia Oliveira

, Guilherme

Oliveira

, Roberto Meyer

, Anderson Myioshi

** & Vasco Azevedo

- Laboratório de Genética Celular e Molecular, Depto. Biologia Geral, ICB-UFMG

- Laboratório de Biodados, Depto. Bioquímica e Imunologia, ICB-UFMG

- Laboratório de Imunologia e Bioquímica Celular de Parasitas, Depto. Bioquímica e

Imunologia, ICB-UFMG

- Laboratório de Imunologia de Doenças Infecciosas, Depto. Bioquímica e Imunologia,

ICB-UFMG

- Laboratório de Parasitologia Celular e Molecular, Centro de Pequisa Reneé Rachou –

FIOCRUZ

- Laboratório de Biointeração, Instituto de Ciências da Saúde, ICB - UFBA

Vasco Azevedo* and Anderson Miyoshi** (share credit in this work for senior

authorship)

[email protected]

Laboratório de Genética Celular e Molecular. Sala Q3-259.

Departamento de Biologia Geral, ICB, UFMG

Av. Antônio Carlos, 6627 C.P. 486

31.270-010 Belo Horizonte, MG, Brazil

Tel: +55 31 3499-2778

Fax: +55 31 3499-2610

Running Head

Partial-identification of the gene content of C. pseudotuberculosis

* To whom correspondence should be addressed

Abbreviations: CLA, Caseous Lymphadenitis; GSS, Genome Survey Sequences; BLAST,

Basic Local Alignment Search Tool; COG, Clusters of Orthologous Groups; Cd,

Corynebacterium diphtheriae; Ce, Corynebacterium efficiens; Cg, Corynebacterium

glutamicum; Cj, Corynebacterium jeikeium; Cp, Corynebacterium pseudotuberculosis.

ABSTRACT

Corynebacterium pseudotuberculosis is an intracellular pathogen that infects

sheep and goats. The widespread occurrence and the economic importance of

Caseous Lymphadenitis Disease (CLA) have prompted investigation of its

pathogenesis. However, the genetic basis of C. pseudotuberculosis virulence is still

poorly characterized. A genomic library constructed from C. pseudotuberculosis

was used for the generation of 1440 Genomic Survey Sequences (GSSs), which

were submitted to in silico analysis using bioinformatics tools and public

databases for comparative analyses. Non-redundant unique sequences were used

as a query for BLAST searches against the genome, translated genome and

proteome of four other complete-genome Corynebacterium species. We were able

to characterize approximately 8% of the genome of C. pseudotuberculosis, along

with not-previously-described functional group genes, based on the COG database,

which the GSSs classification in categories resulted: 13% in Information Storage

and Processing, 14% in Cellular Process and 23% in Metabolism. We found a close

relation between C. pseudotuberculosis and C. diphteriae conserved genes synteny

in Corynebacteria species.

Keywords: Corynebacterium genus, Corynebacterium pseudotuberculosis, Genome

Survey Sequence (GSS), microbial genome sequencing, comparative genomic.

INTRODUCTION

The decade of 1990 was the starting point of the genomic era, with the sequencing

of the first microbial genome, a free-living organism - the bacterium Haemophilus

influenzae [1,2]. Since then, genomic research has generated considerable information,

which is available in public databases [3]. This information has helped scientists discover

genes and their functionality, and consequently proteins that they encode, by comparing

genomes of evolutionary related species [4]. Although prokaryotic microorganisms

account for the greatest proportion of the planet’s total biomass [5] much more still needs

to be understood about them. Thus, the massive accumulation of prokaryotic DNA

sequences generated by microbial genome projects can provide great advances in our

understanding in various fields, including bacterial diversity, mobile genetic elements

(MGE) and horizontal gene transfer (HGT) [6]. Furthermore, genome sequencing has

provided important insights concerning deduced genes and proteins of pathogens,

including biological features, putative virulence factors and potential targets that might be

useful for the development of immunological or chemotherapeutic reagents against

specific organisms [4,7]. At present, around 570 microbial genome projects are already

finished and published, and there are more than 1,100 active sequencing projects

(Genomes OnLine Database, http://www.genomesonline.org/).

The Corynebacterium genus consists of a large number of Gram-positive bacteria

that are pleiomorphic, asporogenous and possess high G + C content in their genomes

[8]. Originally, the genus Corynebacterium had only diphtheria bacilli and some other

animal-pathogenic species [9,10]. Later, other microorganisms were added, including

plant and animal pathogens, nonpathogenic soil bacteria and saprophytic species [10-12].

Members of the genus Corynebacterium are closely related to Mycobacterium species,

and both are classified in the taxonomic order Actinomycetales [13]. At present, the

National Center for Biotechnology Information (NCBI) genomes database contains the

complete genome of four different species of the Corynebacterium genus:

Corynebacterium diphtheriae, Corynebacterium efficiens, Corynebacterium glutamicum

and Corynebacterium jeikeium [14-17].

One of the most important members of this genus, and the focus of this paper, is

the bacterium C. pseudotuberculosis, a facultative intracellular pathogen that infects

sheep and goats, causing caseous lymphadenitis (CLA). Occasionally human infections

are also diagnosed. This disease is spread worldwide, and its considerable economic

importance has prompted investigation of its pathogenesis. However, the genetic

determinants of C. pseudotuberculosis virulence are still poorly characterized [3].

Furthermore, this species has only 19 proteins identified in the GenPept database.

In this context, the partial C. pseudotuberculosis genome sequence analysis that we

provide in this work may help improve our understanding of the molecular and genetic

basis of this bacterium’s virulence, and also may be useful for the development of novel

diagnostic methods and vaccines, contributing to the control of CLA.

METHODOLOGY

Bacterial strains and growth conditions

Corynebacterium pseudotuberculosis wild-type strain T2 was isolated from a

caseous granuloma found in a CLA-affected goat in Bahia state (Brazil) and identified with

the API CORYNE battery bacterial identification diagnostic kit (Biomerieux, France). This

bacterium was aerobically grown in Brain Heart Infusion (BHI, Acumedia) broth at 37ºC

under agitation [18]. To obtain recombinant clones, we used the DH5α strain of

Escherichia coli, aerobically grown at 37ºC in Luria Bertani medium (LB, Difco

Laboratories, Detroit, USA), supplemented with ampicillin (100 µg mL

-1

) and X-Gal (40 µg

-1

Genomic DNA extraction and construction of a genomic library

Genomic DNA extraction was performed according to a previously-described

protocol [19]. DNA integrity was confirmed through electrophoresis in 0.8% agarose gels

and visualization with ethidium bromide staining. We used spectrophotometer analysis to

evaluate the DNA and to test its quality. Total genomic DNA was submitted to two

minutes of nebulization to obtain differently-sized C. pseudotuberculosis DNA fragments

[20].

Fragmentation was confirmed by electrophoresis in 0.8% agarose gels and DNA

fragments ranging from 500 – 1000 bp were obtained. These fragments were cloned in

the PCR

4 Blunt-TOPO vector using the TOPO

Shotgun Subcloning KIT (Invitrogen) and

transformed into E. coli DH5α by electroporation [21]. Blue-white screening was

performed to select for positive clones, and PCR with M13 universal primers was used to

confirm insert presence (TOPO

Shotgun Subcloning KIT (Invitrogen)).

GSS sequencing

Plasmid extraction was performed directly on plates using a standardized protocol

[22]. The plasmids that were obtained were analyzed in 0.8% agarose gels and the

concentrations were determined spectrophotometrically. The plasmid DNA, around 200

ng µL

-1

, was submitted to sequencing reactions in a Mastercycler gradient thermocycler

(Eppendorf), using a DYEnamic ET Dye Terminator Cycle Sequencing Kit (GE

Healthcare) and universal primers M13 F and M13 R, according to manufacturer’s

instructions. Sequences were generated in a MegaBACE

1000 apparatus (GE

Healthcare).

GSS amplification by PCR

For confirmation of the presence of putative exclusive gene in Corynebacterium

pseudotuberculosis and to exclude contamination, we designed forward and reverse

primers for each genes that did not have any similarities in the search databases of other

sequenced Corynebacterium spp:

Putative Oligopeptide/dipeptide ABC transporter primers:

Forward: 5´-CCTTACCGAGACAACGTCAT-3´

Reverse: 5´-GCCTGGTGCTTATCATTGAT-3´

NADP oxidoreductase, coenzyme F420-dependent primers:

Forward: 5´-CTGCGACATAGCTAGGCACT-3´

Reverse: 5´-CCGCCAGACTTTTCTCTACA-3´

Proline iminopeptidase (PIP) primers:

Forward: 5´-AACTGCGGCTTTCTTTATTC-3´

Reverse: 5´ -GACAAGTGGGAACGGTATCT-3´.

Saccharomyces cerevisiae 60S ribosomal subunit primers:

Forward: 5’ ATTCTTAACGGGAAGTGACG 3’

Reverse: 5’ AAGTTGATTCCTTTTCCGG 3’

Generated amplicons with lengths of: 285 bp, 382 bp, 551 bp e 462bp respectively.

Base-calling, sequence filtering and clustering

Base-calling was performed using the PHRED algorithm [23-24] with trim_alt and

trim_cutoff parameters set at 0.16, as suggested by Prosdocimi et al. [25].

In order to filter sequences for low quality and vector contamination, we used the

algorithms SeqClean (http://compbio.dfci.harvard.edu/tgi/software/) and PHRAP’s

package cross_match (http://www.phrap.org). SeqClean was first used to remove low

quality from PHRED base-called sequences. Then the cross_match algorithm was run

against the sequence of the cloning vector used in this analysis; finally, SeqClean was run

again to remove the cross_match. Sequence clustering was performed using TIGR

software TGICL [26], with default parameters.

Comparative BLAST analysis against Corynebaterium complete genomes

Non-redundant unique sequences clustered with TGICL were used as a query for

BLAST searches [27], against other species of the Corynebacterium genus, to look for

similarities between these species and C. pseudotuberculosis. We ran BLASTs on the

DNA (BLASTn) and the protein levels (BLASTx, tBLASTx) to look for nucleotide and

amino acid conservation among species.

Theses complete genomes are available in the NCBI site and their accession

numbers are: C. diphtheriae (NC_002935); C. efficiens (NC_004369); C. glutamicum

(NC_006958) and C. jeikeium (NC_007164)

COG functional categories inference through Blast best-hit analysis

Unique sequences from C. pseudotuberculosis were also used as query for

BLASTx searches in the COG database [28]. The NCBI COG database clusters genes

from 66 microbial species into orthologous groups and classifies the corresponding

protein clusters into biological process categories. We used a best-hit inference approach

to classify this organism’s sequences into COG-functional categories [28]. The BLASTx

algorithm was run using a 10e

-5

cut-off value, and C. pseudotuberculosis partial genome

sequences were classified into COG categories based on the best-hit match of each

sequence against COG-classified proteins.

Comparative BLAST analyses of the UNIPROT database

The most recent version of the UNIPROT curated protein database at the time

(Feb 13, 2007) [29,30] was downloaded from the EBI website (ftp://ftp.ebi.ac.uk/pub/

databases/uniprot/knowledgebase/uniprot_sprot.fasta.gz).UNIPROT was used as a

database subject for BLASTx searches using C. pseudotuberculosis unique sequences as

a query. The number of protein hits was recorded, as well as the number of unique

sequences matching UNIPROT proteins and not Corynebacterium-genus or COG

proteins.

Gene synteny analysis with Corynebacterium genomes

Synteny analysis of C. pseudotuberculosis non-redundant GSSs was also

performed to determine if the gene order is conserved in C. pseudotuberculosis compared

to other Corynebacterium species. Using tBLASTx best-hits data of C. pseudotuberculosis

unique sequences against C. diphtheriae, C. efficiens, C. glutamicum and C. jeikeium

genomes, we calculated the putative average position of each protein-coding gene

(subject end minus subject init), compared to other Corynebacterium spp. complete

genomes. The putative gene position results were plotted and ordered based on C.

diphtheriae hits.

Raw data filtering ,processing and Clustering analysis

Base called sequences were first filtered to remove vector regions, short (<100 bp)

and low quality regions. Filtering removed more than 30% of the bases and sequences.

Larger sequences were also reduced due to vector regions and/or low quality

contamination.

C. pseudotuberculosis GSS were clustered using TIGR TGICL software. This software

uses Megablast [31] to cluster sequences and CAP3 [32] to further assemble the

sequences from each cluster. As expected, we observed a large number of singlets and

clusters with a small number of sequences, demonstrating the quality of the library (Fig.

1). The 466 non-redundant unique sequences span approximately 184,000 bases (Table

1).

BLAST against complete genome of Corynebacterium species

Using the data given above, all the analyses were made using the non-redundant

set of C. pseudotuberculosis sequences (uniques). C. pseudotuberculosis GSS unique

sequences were then used as a query for BLAST searches against the genome

(BLASTn), the translated genome (tBLASTx) and the proteome (BLASTx) of other

Corynebacterium species complete-genome (Table 2).

RESULTS

Were obtained about 1,440 GSS and after sequence processing, resulted in about

1,000 sequences. In present work were used all GSS’s biggest that 100bp presenting

average wenght of 360bp. The longest sequence presents wenght of 792bp that resulted

in 346,869 residues generated.

As expected, C. pseudotuberculosis is more similar to other Corynebaterium spp.

at the protein level than at the DNA level [13]. Based on BLAST analysis of C.

pseudotuberculosis uniques against other Corynebacterium species (Table 2), C.

pseudotuberculosis is most similar to C. diphtheriae, followed by C. glutamicum, C.

efficiens and C. jeikeium. These results also were previously reported by Khamis [33],

which using rpoB and 16S rRNA analysis suggested these phylogenetic relations.

All GSS unique sequences were used as a query for BLASTx searches of the

COG database. We used a 10

-5

BLAST e-value cut-off, and the C. pseudotuberculosis

translated partial protein sequences were classified into functional categories based on

the category of their best hit in the COG database. Therefore, C. pseudotuberculosis

proteins were classified into major (Fig. 2) and minor (Table 3) COG-functional categories.

Almost half of the C. pseudotuberculosis GSS uniques did not hit to any protein in

the COG database, even with the low weakly-stringent BLAST cut-off that we used. We

found metabolism to be the category within which most of genes were classified;

Information Storage and Processing, Cellular Processes and Poorly Characterized all had

about the same percentage of genes classified (~10%, Fig. 2). To put these percentages

into perspective, we calculated the expected percentage of genes classified in

Corynebacterium, based on the COG classification of the four bacteria of this genus

whose complete genome had already been sequenced (Table 3).

Most GSS uniques classified data fits the expected percentage of classification

into the Corynebacterium genus if we consider this is only a partial analysis of C.

pseudotuberculosis genome and proteome (Table 3). We found an excess of not-

classified sequences (see also Fig. 2).

Shared hits against different databases

In order to search for putative C. pseudotuberculosis genes originated by lateral

transfer, we compared BLAST results against various databases. It was expected that

most of C. pseudotuberculosis genes derived from GSS would be found in other

Corynebacterium species if they had been present in the common ancestor of all species

in this genus. This expectation was confirmed (Fig. 3). However, we observed four

putative C. pseudotuberculosis proteins (translated uniques) that had similarities to COG

and UNIPROT proteins but without similarities to other Corynebacterium species proteins.

Therefore, we consider these four proteins to be putative candidates for analysis of lateral

transfer into the C. pseudotuberculosis genome.

The putative genes that might have become established in the C.

pseudotuberculosis genome by lateral transfer were identified as: (1) an

oligopeptide/dipeptide ABC transporter, an ATPase subunit with best hit in the NR

database against another bacteria (Arthrobacter sp. FB24) from the same order as C.

pseudotuberculosis (Actinomycetales) (e-value 2e

-19

); (2) an NADP oxidoreductase, an

F420-dependent coenzyme from Chloroflexus aurantiacus, a bacterium in the Chloroflexi

phylum (e-value 4e

-10

); (3) a proline iminopeptidase (PIP) from Xanthomonas axonopodis

of the Proteobacteria phylum (e-value 1e

-55

); and (4) a high-similarity (99% identity) to the

complete sequence of a ribosomal protein, L30, of the large (60S) ribosomal subunit of

baker’s yeast, Saccharomyces cerevisiae (e-value 2e

-61

Confirmation of the putative genes of C. pseudotuberculosis

By PCR analysis, we found three putative exclusive genes of C.

pseudotuberculosis. For this amplification, we used genomic DNA of 1002 and T2 strains

of C. pseudotuberculosis, along with C. pseudotuberculosis equi, C. ulcerans, C. renale,

which has not yet been sequenced, C. diphteriae and C. jeikeium. As a negative control,

we used the vector TOPO alone and as positive control, we used the clone that contained

the fragment that originated the GSS (Fig. 4).

For contamination exclusion was also done PCR analysis of the of the large (60S)

ribosomal subunit of baker’s yeast, Saccharomyces cerevisiae (data not shown), which

not amplified of C.. pseudotuberculosis genome and occurred the amplification in positive

control (S. cerevisiae DNA), suggesting the contamination.

Gene order analysis

I n order to determine whether gene order is conserved in Corynebacterium

species, in comparison with the C. pseudotuberculosis partial genome analysis that we

had made, we used tBLASTx best-hit results against C. diphteriae, C. glutamicum, C.

efficiens and C.jeikeium genomes to define the position where all the GSS C.

pseudotuberculosis putative genes have been mapped in those genomes.

All of the C. pseudotuberculosis GSS putative genes were mapped against other

Corynebacterium genomes (Fig. 5), ordered by the C. diphteriae genome. All the

genomes were found to have a high degree of gene order conservation when the C.

pseudotuberculosis GSSs were used for mapping C. jeikeium had a clear inversion in the

exact center of its genome when compared to others. Moreover, the symbols representing

the C. efficiens and C. glutamicum genomes were often seen together, showing the

similarity between these genomes. We did not see any evidence of similarity between C.

pseudotuberculosis and C. diphteriae genes outside of the main diagonal line, suggesting

considerable conservation of gene order in these two species.

DISCUSSION

We have analysed the C. pseudotuberculosis genome based on ~1,000 genome-

survey sequences. DNA clustering of these data produced 466 sequences, involving

183,692 base pairs in this organism’s genome. Another four Corynebacterium species

from this same genus had already been sequenced and their genomes varied from 2.4 to

3.2 megabases.

We analyzed between 5.6 to 7.5% of the C. pseudotuberculosis genome. Since we found

C. pseudotuberculosis to be most similar to C. diphtheriae, a species with a 2.4 megabase

genome, at both the nucleotidic and the amino-acid levels (Table 3), we probably

analyzed closer to 7.5% of the C. pseudotuberculosis genome.

We performed many similarity analyses, comparing C. pseudotuberculosis GSS

genome data with the genomes and proteomes of four other Corynebacterium species

that already have been completely sequenced. Similarity was greatest at the protein level.

This may indicate that these species diverged evolutionarily a long time ago. This also

may be due to random, neutral mutations that did not affect the phenotype. We found C.

pseudotuberculosis to have more nucleotide and amino acid similarities with C.

diphhteriae than with other species (Table 3). We found that after C. diphtheriae, C.

pseudotuberculosis was most similar to C. efficiens and C. glutamicum. In contrast, C.

jeikeium was most distant from the C. efficiens and C. glutamicum. Khamis [33] found the

same species relationships based on 16S rRNA and rpoB data.

After the GSS’s clusterization was found an interesting cluster that present 25

sequences. Similarities analyses showed this contig have similarity to subunit 23S rRNA

of C. diphtheriae gravis NCTC13129, present 96% of identities and e-value of 0.0 (Fig.1).

The very high number of “no hits” seen in Fig. 2 can be almost totally explained by

considering both the size of the non-coding regions in the Corynebacterium genomes. A

third of the genes of C. pseudotuberculosis were not classified into COG categories of the

other species in the Corynebacterium genus (Table 3). Also, we found that 40.6% of the

non-redundant unique sequences of C. pseudotuberculosis fell into this non-classified

category.

However, the figure of one third of the genes (Table 3) only indicates the

percentage of genes not classified as COGs, while the unique sequences include both

genes and intergenic regions. We found that the proportions of the genomes of C.

diphtheriae, C. glutamicum, C. efficiens and C. jeikeium that were composed of non

protein-coding regions were 11.7, 6.7, 12.7 and 8.4%, respectively. Therefore, if we

consider an average putative value of 9.9% for C. pseudotuberculosis genome non-coding

regions, plus 33.3% putative C. pseudotuberculosis proteins not classified as COGs, we

obtain a value of 43.2% uniques that are expected not to be not classified as COGs; this

number is close to the numbers seen in Fig. 2 (40.6%).

Comparing the number of uniques found as BLAST hits against Corynebacterium

proteins that have significant similarities with proteins in two different curated protein

databases (COG and UNIPROT), we found three C. pseudotuberculosis genes that could

have been incorporated through lateral gene transference. Among the four genes found in

this category, a proline iminopeptidase (PIP) and a ribosomal protein had high similarity

indexes with other species proteins. Presence of the three GSS was confirmed by PCR in

C. pseudotuberculosis (Fig. 4), suggesting that PIP, putative oligopeptide/dipeptide ABC

transporter and NADP oxireductase actually are present in the genome of C.

pseudotuberculosis. Furthermore, it is also present in C. ulcerans (putative

dipeptide/oligopeptide ABC transporter), C. renale (all three GSS) and not present in C.

diphtheriae and C. jeikeium, as we report here. The presence of these genes in C.

pseudotuberculosis as well as C. renale and C. ulcerans can be explained as previously

reported by Dorella et al [34] which based on analysis of the rpoB gene, suggested a

strong relationship between C. pseudotuberculosis and C. ulcerans.

We also evaluated the synteny of C. pseudotuberculosis putative genes and genes

from other Corynebacterium genomes (Fig. 5). An almost straight line was seen when C.

pseudotuberculosis putative gene positions were mapped against the C. diphtheriae

genome this finding demonstrated that our analysis was efficient in this sample of

randomly-located genes in the C. pseudotuberculosis genome, and also attesting to the

quality of our genomic library. A broken line would indicate that some regions had been

preferentially sampled. Moreover, all the C. pseudotuberculosis GSS uniques, examining

the main diagonals in Fig. 5, could probably be used as anchors to produce a final version

of a future C. pseudotuberculosis genome initiative.

Many C. pseudotuberculosis genes mapped in different positions when compared

to C. efficiens and C. glutamicum genomes. Nevertheless, we found many filled and not-

filled triangles in similar positions (off the diagonal), also evidencing similarity between C.

efficiens and C. glutamicum genomes and differences compared to C. diphtheriae and C.

pseudotuberculosis. C. jeikeium genome was found to be, as expected, the most

divergent species based on gene order. Synteny analysis suggests that Corynebacteria

has rarely undergone genome rearrangements and has maintained ancestral genome

structures, even after the divergence of Corynebacteria and Mycobacteria [13].

Thus, based on our analysis of ~1,000 C. pseudotuberculosis GSS sequences, we

produced an overview of this bacterium’s genome. The sequence of ~8% of its genome

allowed us to determine its evolutionary position among other Corynebacterium spp. for

which we have the complete genome, and to classify putative proteins into COG

functional Categories. The results indicate that the library constructed will be useful in

future whole genome shotgun sequencing efforts.

ACKNOWLEDGEMENTS

This work received funding from FAPEMIG REDE-2829/05.

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Fig. 1. Number of clusters by class of clustered sequences, as defined by

TGICL/Megablast.

Fig. 2. GSS classification into major COG categories.

Fig. 3. Distribution of Corynebacterium pseudotuberculosis GSS uniques’ BLAST hits

against three databases: COG, UNIPROT and a built-in Corynebacterium protein

database containing the proteomes.

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9

285 bp

382 bp

M 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Fig. 4: PCR confirmation of the presence of the putative genes in C pseudotuberculosis.

(A) putative dipeptide/oligopeptide ABC transporter. (B) NADP oxidoreductase. (C) PIP –

proline iminopeptidase. (M) Molecular marker (1Kb Ladder Plus); (1) Negative control; (2)

Positive control; (3) C. pseudotuberculosis 1002; (4) C. pseudotuberculosis T2; (5) C.

renale; (6) C. ulcerans; (7) C. diphteriae; (8) C. jeikeium; and (9) C. pseudotuberculosis

equi.

551 bp

Fig. 5: Gene synteny analysis of C. pseudotuberculosis GSS uniques based on tBLASTx

genome mapping against other Corynebaterium genomes.

Table 1. Clustering results

Unique data (except for longest and shortest sequences) are the sum of singlets plus

clusters data.

Sequence Class

Number

of bases

Number of

Sequences

Average

Size (bp)

Longest

Sequence

Shortest

Sequence

Singlets 91,047 276 331 792 100

Sequences

clustered

255,813 687 372 786 100

Clusters 92,645 190 490 1248 121

GSS Uniques*

(non-redundant set)

183,692 466 395 1248 100

Table 2. BLAST analysis of Corynebacterium pseudotuberculosis uniques

against other Corynebacterium species

* Number of C. pseudotuberculosis uniques hits against other species’ genomes;

Percentage of searches with Genome and tBLASTx; cd: Corynebacterium diphtheriae,

ce: Corynebacterium efficiens; cg: Corynebacterium glutamicum; cj: Corynebacterium

jeikeium.

BLAST

program

Subject E-value

cutoff

cd*

ce*

cg*

cj*

tBLASTx Genome

-10

300

(100%)

244

(100%)

247

(100%)

198

(100%)

BLASTn Genome

-10

106

(35%)

42 (17%) 46 (19%) 31 (16%)

BLASTx Proteome

-10

268

(89%)

224

(92%)

221

(90%)

182 (92%)

BLASTx Proteome 10

-5

305 274 275 235

Cat: Caterories; Cp: Corynebacterium pseudotuberculosis

*Description of column data: Inf (information storage and processing), pCel (cellular

processes), Met (metabolism), Poor (poorly characterized).

**Number of genes found (and partial percentages) in the cp genome. The absolute

number is larger than 514, since some genes were classified into more than one category.

COG Category Cat* Cp**

% in

genus***

(J) Translation, ribosomal structure and biogenesis

Inf 21 (4.2%) 3.9

(K) Transcription

Inf 23 (4.6%) 5.4

(L) DNA replication, recombination and repair

Inf 23 (4.6%) 5.2

(D) Cell division and chromosome partitioning

pCel 1 (0.2%) 0.5

(O) Posttranslational modification, protein turnover,

chaperones

pCel 8(1.6%) 2.2

(M) Cell envelope biogenesis, outer membrane

pCel 19 (3.8%) 3.1

(N) Cell motility and secretion

pCel 0 0.0

(U) Intracellular trafficking and secretion

pCel 1 (0.2%) 0.7

(V) Defense mechanisms

pCel 8 (1.6%) 1.3

(P) Inorganic ion transport and metabolism

pCel 21 (4.2%) 4.9

(T) Signal transduction mechanisms

pCel 11 (2.2%) 2.3

Met 14 (2.8%) 3.9

(H) Coenzyme metabolism

Met 19 (3.8%) 3.4

(I) Lipid metabolism

Met 14 (2.8%) 2.4

(G) Carbohydrate transport and metabolism

Met 21 (4.2%) 3.6

(E) Amino acid transport and metabolism

Met 28 (5.6%) 5.8

(F) Nucleotide transport and metabolism

Met 18 (3.6%) 2.1

(Q) Secondary metabolites biosynthesis, transport

and catabolism

Met 3 (0.6%) 1.7

(R) General function prediction only

Poor 29 (5.8%) 8.0

(S) Function unknown

Poor 17 (3.4%) 5.0

Not in COG

------ 204 (40.6%) 33.3

***Percentage in the genus Corynebacterium according to COG data

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sutils/coxik.cgi?gi=375)

CONCLUSÕES E PERSPECTIVAS

V.1. Conclusões

A utilização das GSSs aqui obtidas poderão auxiliar na melhor compreensão

do genoma de C. pseudotuberculosis baseando-se, principalmente, em genômica

comparativa utilizando bactérias filogeneticamente próximas. Considerando que pouco se

sabe sobre o conteúdo gênico deste patógeno, conseqüentemente, pouco se

compreende sobre os mecanismos moleculares de virulência e patogenicidade deste

microrganismo, este trabalho pode, também, auxiliar o melhor entendimento de tais

questões. Através das inferências e predições, in silico, sobre prováveis genes e grupos

gênicos funcionais, bem como sua relação filogenética a outras bactérias do gênero,

pode-se então classificar diversas regiões do seu genoma.

Das 1440 GSSs geradas de C. pseudotuberculosis T2, cerca de 966 GSSs

foram depositadas no banco de dados GenBank (NCBI), com os números de acesso de

ER770684 à ER771646. Após o processamento, foram obtidas 500 seqüências não

redundantes, que foram analisadas e apresentaram tamanho médio de 400 pb,

perfazendo um total de 200.000 bases geradas. Comparando-se esse resultado aos

resultados de obtidos de outras bactérias do gênero com os genomas completamente

seqüenciados, foi representado quase 10% do genoma de C. pseudotuberculosis através

das GSSs geradas.

Genomas microbianos são constituídos de pouca região não codificadora, com

isso, a predição gênica torna-se mais fácil. A biblioteca construída mostrou

aproximadamente 10% de representação do genoma, uma ampla representatividade das

mais variadas categorias funcionais celulares, sem muita redundância. Os resultados

obtidos nessas análises serão usados em genômica comparativa entre as duas linhagens

de C. pseudotuberculosis.

Os resultados obtidos no presente trabalho permitiram chegar às seguintes

conclusões:

- As proteínas produzidas pelas bactérias do gênero Corynebacterium

(levando em consideração as espécies que já tiveram seu genoma seqüenciado)

apresentam uma maior similaridade ao nível aminoacídico do que ao nível gênico.

- Nas análises de similaridades feitas através das GSSs, C.

pseudotuberculosis T2 apresentou maior similaridade à C. diphteriae do que às demais

espécies já sequenciadas desse gênero, o que reafirma os dados contidos em trabalhos

anteriores da estreita relação filogenética entre os dois patógenos.

- Na análise de sintenia gênica, pode-se perceber que a ordem gênica do

gênero provalvelmente é conservada, exceto pela observação de alguns rearranjos,

como inversões gênicas em C. jeikeium, reforçando dados da literatura, que descrevem

essas mudanças no seu arranjo genômico.

- Foi detectada a presença de três genes provavelmente exclusivos de

algumas espécies do gênero como C. pseudotuberculosis e C. ulcerans (PIP; oppD e

NADPH), levantando a hipótese de perda gênica desses genes ou evento de

transferência horizontal nas demais espécies cujo genoma foi seqüenciado.

- O conjunto de genes identificados no trabalho será testado em análises

comparativas de linhagens utilizando a técnica MLST.

V.2. Perspectivas

No contexto de genômica comparativa, os dados aqui obtidos podem ser

também utilizados para análises de plasticidade genômica, uma vez que para a

construção da biblioteca foi utilizada a linhagem de C. pseudotuberculosis T2, diferente

da linhagem que está sendo seqüenciada pela RGMG. Isso vai permitir analisar

diferenças sutis entre os genomas das linhagens, tais como perda ou ganho gênico,

duplicações e inversões, fazendo compreender como determinadas diferenças podem

atuar nas linhagens e fazer com que cada linhagem bacteriana apresente aspectos

diferentes como, por exemplo, uma ser mais ou menos virulenta em relação a outra.

Poderá auxiliar também em estudos de epidemiologia molecular, uma vez que pode

fornecer informações sobre as características de determinadas linhagens e sua

ocorrência em determinadas regiões. Com isso, pode ser realizados a prevenção e o

tratamento da LC não só nos rebanhos caprinos e ovinos, mas também utilizando outros

isolados.

Outra perspectiva que o trabalho fornece é a utilização dos novos genes aqui

identificados como alvo para novas terapias e diagnósticos. Esses genes codificam as

proteínas Iminopeptidase (PIP), NADP oxiredutase (NADPH) e o oppD que codifica um

dipeptídeo transmembrânico – ABC transportador.

Estudos com esses três genes descritos na literatura fornecem dados sobre

seus possíveis papeis, que muitas vezes estão ligados à virulência. Em Mycobacterium

bovis o gene oppD está ligado a nutrição e crescimento celular e organizado em um

operon oppBCDA. Em Streptococcus sp. esse mesmo operon regula negativamente

genes ligados à virulência. Já o PIP, que codifica uma prolina iminopeptidase em

Xanthomonas campestris está envolvida com sinalização célula-célula, dentro de um

processo denominado quorum sensing. Em Helicobacter pylori o NADPH está envolvido

com a persistência do patógeno dentro do hospedeiro. Estudos com mutantes de tais

genes podem elucidas possíveis mecanismos de virulência e auxiliar no controle da LC.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

VI.1.REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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VII

ANEXOS

VII. ANEXOS

VII.1. MATERIAIS E MÉTODOS

VII.1.1. Equipamentos utilizados

 Agitador magnético de soluções (TradeLab)

 Aparato para eletroforese horizontal (Gibco BRL Horizon® 58)

 Balança de precisão (Marte)

 Banho-maria (Precision)

 Capela de exaustão (Permution)

 Micro Centrífuga (Eppendorf 5417C)

 Centrífuga refrigerada (Jouan MR 23i)

 Equipamento de fotodocumentação (Kodak DC40)

 Espectrofotômetro (Bio-Rad)

 Estufa microbiológica (Nova Ética)

 Fluxo laminar (Veco)

 Forno Microondas (CCE)

 Freezer -20ºC (Electrolux)

 Freezer -80ºC (Sanyo)

 Micropipetas (Gilson Pipetman®)

 pHMETRO (Digimed)

 Seqüenciador automático (Amersham MegaBACE 1000)

 Shaker incubador (Nova Ética)

 Termociclador (MJ Research, Inc. PTC-100)

 Transiluminador (BioSystematica)

 Vortex (IKA)

VII.1.2. Reagentes e soluções

VII.1.2.1. Reagentes químicos e analíticos

 Acetato de Potássio (Synth)

 Acetato de Amômio (Amersham Biosciences)

 Ampicilina (Sigma)

 Ácido Bórico (Cirq)

 Ácido Acético (Synth)

 Agarose (Eurobio)

 Água ultra-pura

 Álcool isoamílico (Synth)

 Álcool isopropilico (Merck)

 Álcool etílico (Merck)

 Azul de bromofenol (Synth)

 Brometo de etídio (Eurobio)

 Clorofórmio (Cirq)

 EDTA (Synth)

 Fenol UltraPure

Buffer-Saturated (Invitrogen)

 Glicerina (Synth)

 Glicose (Merck)

 Glicogênio (Gibco)

 HCl (Merck)

 IPTG (Gibco BRL)

 Lisozima (USB)

 Matriz de poliacrilamida (Ge)

 MgCl (Invitrogen)

 NaAc (Synth)

 NaCl (Cirq)

 NaOH (Cin. Química)

 SDS (Synth)

 Sódio-N-lauroilsarcosina (USB)

 Tris-base (Invitrogen)

 X-gal (USB)

VII.1.2.2. Soluções

 Acetato de Potássio (5M): 246,87 g de acetato de potássio em 500

mL de água destilada.

 Acetato de Potássio (3M): 60 mL de acetato de potássio (5M); 11,5

mL de Ácido acético glacial e 28,5 mL de água ultra pura autoclavada.

 Acetato de Sódio (3M): 246 g acetato de sódio em 1 L água destilada.

 Ampicilina (100 mg/mL): 1 g da solução de ampicilina em 10 mL de

água ultra-pura autoclavada.

 Brometo de etídio: Solução 0,1-0,5 µg/mL.

 Cloreto de Sódio (5M): 14,51 g de cloreto de sódio em 50 mL de água

destilada.

 Etanol 70%: 70 mL de etanol absoluto e 30 mL de água destilada.

 EDTA (0,5M): 18,61 g em 100 mL de água destilada. pH 8,0.

 Fenol:Clorofórmio:Álcool Isoamílico: 25 mL de solução saturada de

fenol; 24 mL de clorofórmio; e 1 mL de álcool isoamílico.

 GET: 23 mL de glicose 20%; 10 mL de EDTA 0,5M pH 8,0 autoclavado;

13 mL de Tris-HCl 1M pH 7,4 em 500 mL de água ultra pura.

 Glicerol 10%: 100 mL de Glicerina em 1L de água destilada

 Glicerol 50%: 50 mL de Glicerina em 50 mL de água destilada.

 Glicogênio (20mg/ml): 100 mg de glicogênio em 5 mL de água

destilada.

 Glicose 20%: 20 g de glicose em 100 mL de água ultra pura.

 Hidróxido de Sódio (4M): 8 g em 40 mL de água ultra pura.

 Sarcosil 30%: 30 g de sódio-N-lauroilsarcosina em 100 mL de água

destilada.

 Tampão de Depósito (5X): Glicerol a 50%; Azul de bromofenol a

0,20%; e solvente TBE a 2,5X.

 TBE: 500 mM de Tris-HCl; 60 mM de ácido bórico; 83 mM de EDTA; pH

8,0 - 8,5.

 Tris-EDTA-RNAse (Solução I – Extração de DNA genômico): Tris-

HCl (10 mM); EDTA (10 mM); NaCl (300 mM); RNase A (50 µg/mL).

 Tris-EDTA-lisozima (Solução II – Extração de DNA genômico): Tris-

HCl (10 mM); EDTA (10 mM); NaCl (300 mM); lisozima (10 mg/mL).

 Tris-HCl (1M): 12,11 g em 100 mL de água destilada. pH 7,4.

 Tris-EDTA: 10 mM Tris-HCl; 10 mM EDTA; 300 mM NaCl.

 SDS 10%: 10 g de Dodecil sulfato de sódio em 100 mL de água

destilada.

VII.1.3. Meios de cultura

 Luria-Bertani (LB): Peptona 10 g/L; Extrato de levedura 5 g/L; NaCl 5

g/L. pH 7,8.

 LB-ágar: Peptona 10 g/L; Extrato de levedura 5 g/L; NaCl 5 g/L e 15 g

de ágar bacteriológico. pH 7,8.

 LB-ágar-X-gal- Ampicilina: Meio LB-ágar acrescido de ampicilina (100

µg/mL) e X-Gal (40 µg/mL).

 Caldo “Infusão Cérebro-Coração” (Brain Heart Infusion- BHI): 37 g

de BHI em pó em 1 L de água destilada; pH 7,4.

 BHI – ágar sangue: BHI acrescido de ágar bacteriológico (1,5%) e

sangue de carneiro na concentração (5%).

 BHI – ágar-canamicina: BHI – ágar acrescido de canamicina (25

µg/mL).

VII.1.4. Linhagens bacterianas, plasmídeos e condições de cultivo

As linhagens bacterianas empregadas neste trabalho estão listadas na tabela

3. Os meios de cultivo utilizados foram o LB para Escherichia coli e o BHI para C.

pseudotuberculosis. Tanto a cultura de E. coli quanto a de C. pseudotuberculosis foram

crescidas a 37°C sob agitação. O cultivo de E. coli foi realizado entre 16-22 horas e de C.

pseudotuberculosis foi de 48-72 horas. Além dos meios de cultivo, as bactérias, quando

necessário, foram crescidas em presença dos antibióticos adequados, sendo ampicilina

utilizada para E. coli e canamicina para C. pseudotuberculosis.

TABELA 3: Linhagens bacterianas utilizadas no trabalho.

Espécie Linhagem Fonte

E. coli

DH5α

[sup44 ∆lacU169 (Φ80 lacZ∆M15)

hsdR17 recA1 endA1 gyrA96 thi-1 relA1]

Invitrogen

C.pseudotuberculosis

C. pseudotuberculosis

C. ulcerans

C. diphteriae

C. jeikeium

C. renale

linhagem T2

linhagem 1002

CIP 5927

isolado

ULCA3. 675,1

CIP6937

UFBA – Instituto de Ciências da Saúde

UFBA - Instituto de Ciências da Saúde

França – Instituto Pasteur

FIOCRUZ

Bélgica – Hospital Universitário Ghet

França - Instituto Pasteur

: linhagem selvagem de C. pseudotuberculosis biovar ovis pertencente à coleção de microorganismos do

Instituto de Ciências da Saúde da Universidade Federal da Bahia (UFBA), Brasil.

: linhagem atenuada de C. pseudotuberculosis biovar ovis pertencente à coleção de microorganismos do

Instituto de Ciências da Saúde da Universidade Federal da Bahia (UFBA), Brasil.

: linhagem virulenta de C. ulcerans pertencente à coleção de microorganismos do Instituto Pasteur, França.

: linhagem virulenta de C. renale pertencente à coleção de microorganismos do Instituto Pasteur, França.

: bactéria isolada de paciente com difteria, FIOCRUZ, Brasil.

bactéria isolada de paciente no Hospital Universitário Ghet, Bélgica.

VII.1.5. Extração de DNA genômico

A extração de DNA genômico foi realizada da mesma forma para todas as

linhagens bacterianas de C. pseudotuberculosis utilizadas neste estudo. Culturas de 20

mL foram centrifugadas a 5.000 rpm, por 10 min., a 4ºC. O sobrenadante foi descartado e

o precipitado ressuspenso em 1 mL de solução I (item VII.1.2.2). Após homogeneizada, a

mistura foi novamente centrifugada, desta vez, a 13.000 rpm, por 10 min., à temperatura

ambiente. O sobrenadante foi novamente descartado, 1 mL de solução II (item VII.1.2.2)

foi adicionado. Após ressuspender o precipitado, a amostra foi incubada em banho-maria

por 30 min. a 37ºC. Foram adicionados 30 µL de sarcosil 30%; a amostra foi

homogeneizada por 15 min. e então deixada em banho-maria a 65ºC por 5 min., seguido

por incubação a 4ºC por 5 min.

Para purificação do DNA extraído, foi utilizado um protocolo padrão de

fenol:clorofórmio:álcool isoamílico (SAMBROOK et al., 1989). Em resumo, 1 mL da

solução de fenol:clorofórmio:álcool isoamílico (item VII.1.2.2) foi adicionado à amostra.

Após homogeneização, as amostras foram centrifugadas a 13.000 rpm por 7 min. A fase

superior da amostra foi retirada e transferida para um novo microtubo de 2 mL. Esse

processo foi repetido mais uma vez e em seguida adicionou-se 2,5 vol. de álcool etílico,

NaOAC (3M) e glicogênio (20mg/mL) numa quantidade equivalente a 10% e 1%,

respectivamente, do sobrenadante. O DNA foi precipitado O.N. a -20ºC. Após

centrifugação a 13.000 rpm por 10 min., o DNA foi lavado com álcool etílico a 70% e

ressuspenso em água ultra pura.

VII.1.6. Resolução eletroforética

Após a extração, o DNA genômico foi dosado e teve sua qualidade analisada

através de resolução eletroforética. As amostras de DNA acrescida de 1:5 do volume de

tampão de amostra (item VII.1.2.2) foram fracionados em gel de agarose a 0,8% em

tampão TBE 1X (item VII.1.2.2), contendo brometo de etídio (0,5 µg/mL). As corridas

foram realizadas a 90 Volts durante aproximadamente 1 hora. O DNA foi visualizado e o

gel fotografado sobre um transluminador de luz ultravioleta (320nm) através do sistema

de documentação fotográfica “Kodak Digital Science

DC40 câmera” (Kodak) e a foto

processada pelo programa “Eletrophoresis Documentation and Analysis System” (Kodak).

VII.1.7. Construção da biblioteca genômica de C. pseudotuberculosis

VII.1.7.1. Fragmentação do DNA genômico por nebulização

O DNA genômico obtido de C. pseudotuberculosis T2 foi fragmentado através

de nebulização (de acordo com o manual do kit TOPO® shotgun - Invitrogen) de maneira

que resultasse em fragmentos entre 1000 – 2000 pb.

O DNA genômico foi centrifugado a 13.000 rpm por 10 minuto resultando

numa solução de DNA (60 ng/µL), onde foi inserido dentro do nebulizador (Figura 6)

juntamente com 750 µL de Shearinhg Buffer e incubado no gelo. Após a incubação por

10 minutos, o DNA foi nebulizado a 9-10 psi por 30, 60 e 90 segundos respectivamente.

Após a nebulização, a solução foi aliquotada em 3 microtubos de 0,5 mL onde cada

microtubo continha 300 µL da solução de DNA fragmentado.

Cada alíquota, referente aos tempos supracitados, foi transferida para novos

microtubos de 1,5 mL e para cada 250 µL de solução de DNA fragmentado adicionou-se:

20 µL de acetato de sódio 3M pH = 8,0; 625 µL de álcool etílico absoluto e 2 µL de

glicogênio (20 mg/mL). As amostras foram incubadas no freezer (-20º C) por 40 minutos e

após, foram centrifugada por 15 minutos a 12.000 rpm. Os sobrenadantes foram

homogeneizados por inversão e ressuspensos com 800 µL de álcool etílico 80% e

centrifugados por mais 5 minutos. Os precipitados foram incubados na estufa a 50 ºC e

ressuspensos em 30 µL de água ultra pura.

FIGURA 6: Aparelho nebulizador para fragmentação mecânica do DNA.

Pressão de

Tubo de vinil

Canaleta

Solução de DNA

VII.1.7.2. Obtenção de fragmentos de DNA com “pontas cegas”

Após o processo de fragmentação, as amostras de DNA genômico de C.

pseudotuberculosis T2 foram submetidas ao reparo das extremidades 5’ e 3’ para que as

pontas se tornassem cegas (blunt-end). O processo foi realizado de acordo com o

manual do fabricante. As amostras foram acrescidas 30 µL de DNA (100ng/µL), 5 µL de

Blunting Buffer 10X, 1 µL de BSA (1mg/mL), 5 µL de dNTP’s (250 µM), 2 µL de T4 DNA

polimerase, 2 µL de Klenow DNA polimerase e água deionizada para um volume final de

50 µL. As amostras foram homogeneizadas e incubadas por duas horas à temperatura

ambiente, após esse período foram centrifugadas por 10 segundos à 13.000 rpm. Após

centrifugação as reações foram incubadas no banho-maria a 75ºC por 20 minutos e após

a incubação, armazenadas no freezer a -20ºC.

VII.1.7.3. Desfosforilação dos fragmentos de DNA

Após o procedimento de reparo nas pontas cegas, foi necessário desfosforilá-

los para que os fragmentos se tornassem apropriados para a ligação no vetor pCR®-

4Blunt -TOPO shotgun (Invitrogen). Para tanto, às amostras obtidas no item VII.1.7.2, os

fragmentos de DNA nebulizados e com as extremidades cegas obtidos do DNA

nebulizado foram desfosforilados. A reação de 50 µL foi incubada no gelo e foi adicionado

40 µL de água ultra pura, 5 µL de Blutting Buffer 10X e 5 µL de CIP (calf intestinal

phosphatase), totalizando 100 µL de volume final de reação. A mesma foi incubada no

banho-maria à 37ºC por 1 hora. Após esse período, foram acrescidos 50 µL de

fenol:clorofórmio, homogeneizada a amostra e finalmente centrifugada a 14.000 rpm por

5 minutos. Em seguida, o sobrenadante coletado em um novo microtubo.

Para purificação do produto desfosforilado, adicionou-se às reações 10 µL de

acetato de sódio 3M pH = 5,2, 1 µL de Glicogênio (20 mg/mL) e 300 µL de álcool etílico

80% gelado. A reação incubada no freezer à -80ºC por 15 minutos, foi centrifugada por

14 minutos a 12.000 rpm à 4ºC.

Ao precipitado foram adicionados 500 µL de álcool etílico 80% gelado. Após

esse passo, o precipitado foi centrifugado por 5 minutos a 12.000 rpm, em seguida

secado na estufa à 60ºC, finalmente o DNA foi ressuspenso em 20 µL de água ultra pura

estéril.

VII.1.7.4. Confecção de E. coli eletrocompetente

Uma colônia de E. coli DH5α foi inoculada em 5 mL de meio LB e incubada a

37°C durante 18 horas sob agitação de 150 rpm. Uma alíquota (3 mL) desta cultura foi

então inoculada em 300 mL de LB e incubada a 37°C sob agitação até atingir

absorbância (OD

600nm

) entre 0,2 e 0,3. Uma vez alcançado este valor, a cultura foi

centrifugada a 10.000 rpm durante 18 minutos a 4°C. O sobrenadante foi descartado e o

precipitado ressuspenso em 300 mL de uma solução de glicerol 10% estéril; processo

que foi repetido 4 vezes mais. Após a última lavagem, as bactérias foram ressuspensas

em 1mL de solução de glicerol 10%. Esse 1 mL foi dividido em alíquotas de 100 µL que

foram estocadas à -70°C.

Para análise da eficiência de transformação, uma alíquota com células

eletrocompetentes estocadas à -70°C, foi colocada no gelo durante 5 minutos. Em

seguida adicionou-se 10 ng/µL do plasmídeo pUC18 (controle positivo). Como controle

negativo, foi utilizado apenas uma alíquota de células, às quais nenhum DNA foi

adicionado. Ambas as amostras foram transferidas para cubetas de eletroporação,

previamente resfriadas e foram submetidas a um pulso de 2.5 V, capacitância 25 µFD e

resistência de 200 OHMS utilizando um eletroporador CelljecTUno (Thermo Electro

Corporation).

Imediatamente após o pulso, foi adicionado 1 mL de meio LB às células e

estas foram incubadas à 37º C por uma hora. Diluições de 10

-1

, 10

-2

, 10

-3

foram

semeadas em meio LB ágar suplementado com ampicilina (100 µg/ml) e incubadas a

37°C durante 18 horas. A eficiência de transformação obtida foi de 8,7 x 10

unidades

formadoras de colônia (UFC) por micrograma de DNA.

VII.1.7.5. Ligação dos insertos genômicos no vetor

A ligação dos fragmentos de DNA genômico de C. pseudotuberculosis T2

processados no iten VII.1.7.1, seguiu-se os procedimentos recomendados no manual do

fabricante. A reação de ligação conteve: 4 µL do DNA genômico, 1 µL de Salt Solution, 1

µL do vetor pCR®-4Blunt -TOPO® shotgun; e então a mistura foi incubada à 37ºC por 1

hora.

VII.1.7.6. Transformação de E. coli

Após a ligação dos insertos no vetor pCR®-4Blunt -TOPO ® shotgun, foi

realizada a transformação de E. coli DH5α (Figura 7). A utilização das células

eletrocompetentes confeccionadas de acordo com o item VII.1.7.4 ocorreu da seguinte

maneira: foi adicionado 4µL da ligação de cada DNA (vetor: insertos genômicos) às

células (100 µL) que foram incubadas no gelo por 10 minutos.

Após a incubação, a mistura foi transferida para as cubetas de eletroporação.

Como “controle negativo” do experimento foi utilizado 4 µL de água ultra pura.

Imediatamente após a eletroporação foi adicionado 1 mL de meio LB previamente

aquecido à 37ºC para a ressuspensão das células e estas foram incubadas no banho-

maria à 37º C por 2 horas.

O processo de seleção dos transformantes consistiu em transferir uma

alíquota de 100 µL da suspensão de células eletroporadas para placas de Petri contendo

meio LB ágar suplementado com 100 µg/mL de ampicilina. As culturas foram mantidas a

37°C por aproximadamente 16 horas. Após este período as placas foram avaliadas

quanto à presença de colônias.

A etapa seguinte consistiu na seleção de clones de cada uma das placas para

proceder com a estocagem dos clones positivos em placas de polipropileno de 96 poços.

FIGURA 7: Construção da biblioteca genômica de C. pseudotuberculosis.

Transformação de E. coli com os fragmentos genômicos de C. pseudotuberculosis e

seleção dos clones positivos.

SELEÇÃO CLONES - ANTIBIÓTICO

VII.1.7.7. Estocagem dos clones positivos

Após seleção dos clones brancos, os mesmos foram individualmente

crescidos nos poços de placas de polipropileno. Oito placas completas foram obtidas no

final da seleção. Para o crescimento da cultura de células foi utilizado 200 µL de meio LB

líquido suplementado com ampicilina (100 µg/mL) e 40% de glicerol. As placas foram

então incubadas no agitador por 16-18 horas a 37ºC sob agitação de 120 rpm e após o

crescimento as placas foram armazenadas no freezer a -80ºC.

VII.1.7.8. Extração do DNA plasmidiano de E. coli

Trinta microlitros do cultivo de cada clone foram utilizados para a extração de

DNA plasmidiano. Em microplacas de crescimento de cultura novas, foram adicionados

1,2 mL de meio LB suplementado com 100 µg/mL de ampicilina. As culturas foram

incubadas a 37°C por aproximadamente 18 horas sob agitação (200 rpm).

Após este período, foram feitas novas culturas estoques em glicerol de cada

uma das oito placas (100 µL da cultura + 100 µL de glicerol 50%) sendo estas seladas

com um adesivo e armazenadas a -80º C. Com o restante da cultura (1,1 mL) foi

realizada a extração de plasmídeos pelo método de lise alcalina como descrito por

Sambrook et al. (1989) com algumas modificações.

Após a centrifugação das microplacas contendo as culturas, por 6 minutos a

4.000 rpm, foi descartado o sobrenadante e após esse procedimento as células foram

ressuspensas em 240 µL da solução GET (item VII.1.2.2). Os passos acima foram

repetidos, onde foi adicionado 80 µL de solução GET e homogenizado no vortex por 2

minutos. Toda a suspensão de células foi transferida para uma nova placa de

polipropileno contendo 2,5 µL de RNAse A (10 mg/mL). Foi adicionado a cada poço 80

µL de NaOH 0,2 N/SDS 1%. (1 mL de NaOH 4M + 17 mL H

0 mili-Q + 2 mL de SDS

10%), misturado por inversão (30 vezes) e incubado à temperatura ambiente por 10

minutos.

Após esse período, foi adicionado ainda 80 µL de acetato de potássio (3M)

previamente resfriado, onde foi misturado por inversão e seguida por três incubações: à

temperatura ambiente, por 10 minutos na estufa à 90ºC por 30 minutos e no gelo por 10

minutos. Depois, foram centrifugadas por 9 minutos a 4000 rpm e transferida a fase

aquosa para placas milipore com filtro anexado a placas com fundo em V. Foi

centrifugada por mais 6 minutos a 4000 rpm e adicionado ao filtrado, 100 µL de álcool

isopropílico e centrifugado por 45 minutos à 4000 rpm.

Após a centrifugação, o sobrenadante foi descartado, e a ele foi adicionado

200 µL de álcool etílico 70% previamente resfriado e centrifugado por 15 minutos à 4000

rpm. Foi adicionado a cada amostra 60 µL de água ultra pura estéril e o DNA

plasmidiano foi ressuspenso O.N. A presença e qualidade dos plasmídeos foi verificada

através de eletroforese seguindo os mesmos parâmetros já descritos no item VII.1.6.

VII.1.7.9. Confirmação da presença e tamanho do insertos genômicos de C.

pseudotuberculosis no vetor

Para verificar a presença do inserto e o peso molecular dos fragmentos de

DNA clonados no vetor pCR®-Blunt II-TOPO®, os insertos dos DNA plasmidianos foram

amplificados por PCR utilizando iniciadores: senso (5´ CTGGCCGTCGTTTTAC 3´) e

antisenso (5´ CAGGAAACAGCTATGAC 3´) do vetor. As reações de amplificação foram

feitas em um volume final de 50 µL, contendo 2 pmoles/µL de cada iniciador; 0,25 mM de

dNTPs; 0,1 unidade de Taq DNA polimerase (Invitrogen); 2mM de MgCl

, tampão da

enzima 1X concentrado (Invitrogen) e 50 ng/µL dos plasmídeos extraídos (item

VII.1.1.7.8).

A amplificação por PCR foi realizada sob as seguintes condições: primeira

desnaturação a 94°C durante 3 minutos, seguida por 25 ciclos de desnaturação a 94°C

durante 1 minuto; anelamento durante 1 minuto a 53ºC; extensão a 72°C durante 2

minutos; e extensão final por 7 minutos a 72°C. Apó s a reação, todo o volume foi aplicado

em gel de agarose a 1% e a resolução eletroforética realizada sob as mesmas condições

descritas no item VII.1.6.

VII.1.8. Geração de Genomic Survey Sequence (GSS)

VII.1.8.1. Reação de seqüenciamento

O DNA plasmidiano contendo os insertos genômicos de C. pseudotuberculosis

T2 foi submetido a reação de seqüenciamento. Nesta reação, para um volume final de 10

µL, utilizou-se 4 µL de DYEnamic ET-Kit Terminator (Amersham Biosciences), 1µL de

iniciador (10 µM) (senso ou antisenso; de acordo com item VII.1.7.9) e 2 µL de água ultra

pura estéril. A reação de seqüenciamento seguiu as seguintes condições: a primeira

desnaturação ocorreu à 95ºC por 40 segundos; seguida por 30 ciclos de desnaturação a

95ºC por 20 segundos; anelamento a 55ºC por 15 segundos e extensão a 60ºC por 1

minuto.

VII.1.8.2. Precipitação

Para a precipitação dos nucleotídeos incorporados, foi utilizado o seguinte

protocolo: às amostras de DNA supracitadas, adicionou-se 1µL de acetato de Sódio 7,5

M para cada reação de 10 µL, 30 µL de etanol 95% gelado e foram incubadas a

temperatura ambiente por 15 minutos. Após a incubação, centrifugou-se a placa por 45

minutos a 5000 rpm, e após esse passo o sobrenadante foi descartado. Foram

adicionados 100 µL de etanol 70% gelado em cada amostra e centrifugada por 15

minutos a 5000 rpm, o sobrenadante foi descartado e o precipitado ressuspenso com 10

µL de tampão 10X de ressuspensão do seqüenciador, as amostras foram protegidas da

luz e armazenadas à -20ºC.

VII.1.8.3. Seqüenciamento das amostras

O processo de seqüenciamento seguiu os seguintes parâmetros de corrida:

para injeção das amostras nos capilares do seqüenciador utilizou-se a voltagem de 6 KV

durante 100 segundos. Após a injeção das amostras, a voltagem da corrida foi de 9 KV

por 240 minutos. Após a leitura do DNA pelo seqüenciador foi gerada para cada amostra

de cada placa um arquivo, no formato *.esd que contém a seqüência nucleotídica

resultante e o cromatograma com todos os perfis nucleotídicos obtidos durante a corrida.

VII.1.9. Análises in silico das GSS´s geradas

VII.1.9.1. Remoção das seqüências de baixa qualidade

Uma vez que uma amostra é processada no seqüenciador, geram-se arquivos

contendo as seqüências nucleotídicas de cada amostra contida nas placas. Porém, na

maioria das vezes o sinal dos nucleotídeos ainda é fraco no começo do processo de

seqüenciamento. Forma-se então uma curva gaussiana, onde a seqüência do interior tem

uma melhor qualidade. Utilizando o algorítmo PHRED (EWING & GREEN, 1998; EWING

et al., 1998) com o parâmetro trim_alt e trim-cutoff no valor de 0,16, cada base recebeu

um valor de qualidade e após essa nomeação foi utilizado o algorítmo SeqClean

(http://compbio.dfci.harvard.edu/tgi/software/) e baseado nos valores de cada base

fornecido pelo PHRED, seqüências de baixa qualidade foram retiradas.

VII.1.9.2. Remoção das regiões com similaridade a vetores

Para remover seqüências com similaridade a vetores, foi utilizado o algoritmo

Cross_match (http://www.phrap.org). No programa foram adicionadas previamente as

seqüências correspondente aos iniciadores M13 senso e M13 anti-senso do item

VII.1.7.9. Quando as mesmas foram encontradas nas GSS geradas, elas foram

substituídas por um X. Novamente foi utilizado o programa Seqclean para retirar tais

marcações.

VII.1.9.3. Montagem de “contigs” e alinhamento das GSS´s

Foram geradas aproximadamente 1440 GSSs e para melhor aproveitamento

das mesmas, bem como geração de seqüências maiores, foi utilizado o algoritmo TGICL

(PERTEA et al., 2003), o qual é um programa do tipo “Megablast” (ZHANG et al., 2000),

que sobrepõe seqüências que apresentam similaridade formando os contigs (seqüências

consenso comuns à todas as amostras). Vários singlets também foram gerados. Os

contigs e os singlets não redundantes foram então utilizados para várias análises in silico

e de genômica comparativa e seqüências menores de 100 pb foram retiradas,

temporariamente, do estudo.

VII.1.9.4. Análises de similaridade

As seqüências não-redundantes geradas no item VII.1.9.3, foram utilizadas em

buscas de similaridades no programa BLAST (Basic Local Alignment and Search Tool)

contidas no banco de dados público National Center for Biotechnology Information

(NCBI). Dentro desse programa foram utilizadas três categorias específicas: BLASTn que

avalia similaridade a nível de nucleotídeos entre as GSS’s (query) e seqüências já

depositadas (subject) no banco de dados; BLASTx que avalia a similaridade a nível de

aminoácidos e prediz uma provável proteína de acordo com o grau de similaridade e

tBLASTx que traduz tanto as seqüências (GSS’s) que estão sendo submetidas a análise

quanto as seqüências previamente depositadas no banco de dados e a similaridade entre

elas. Cada GSS não redundante gerou um resultado.

O melhor resultado gerado, ou best hit, foi então utilizado em todas as

análises feitas posteriormente. Um valor de e maior que 10

-5

foi utilizado nas análises

com

o programa BLAST, abaixo disso, as demais seqüências foram descartadas.

VII.1.9.5. Caracterização gênica in silico de grupos biológicos funcionais

Utilizando o banco de dados de categorias biológicas funcionais - Clusters of

Orthologous Group (COG) - que contém aproximadamente 66 genomas microbianos,

foram feitas buscas de similaridades para caracterizar in silico prováveis grupos

funcionais para as GSSs de C. pseudotuberculosis em estudo. Esse programa é dividido

em duas categorias, uma maior e uma menor. Na maior, ele categoriza as seqüências em

grandes grupos tais como: processamento e armazenagem de informação, metabolismo

celular e transporte de nutrientes. Já na categoria menor, ela subdivide os grupos

maiores em funções como: transporte de aminoácidos, respiração celular, transcrição,

tradução. Utilizando esse banco de dados, as GSSs foram um provável grupo funcional

nas categorias descritas acima.

VII.1. 9.6. Análises comparativas utilizando o UNIPROT

Utilizando a versão mais recente do banco de dados protéico UNIPROT

(ftp://ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/uniprot/knowledgebase/uniprot_sprot.fasta.gz) as GSS

não redundantes (query) foram confrontadas contra as seqüências presentes no banco

de dados protéico (subject) a fim de predizer prováveis proteínas que estão presentes em

C. pseudotuberculosis T2.

VII.1.10. Genômica comparativa

VII.1.10.1. Análises de similaridade entre C. pseudotuberculosis e outras

quatro espécies do gênero

Os resultados das buscas de similaridade, utilizando os BLAST citados

(BLASTn, BLASTx e TBLASTx) no item VII.1.9.4, foram utilizadas para uma análise de

genômica comparativa. Essas análises tiveram como objetivo, averiguar possível

observação de conservação gênica entre C. pseudotuberculosis T2 e outras quatro

espécies de Corynebacterium (C. diphtheriae, C. jeikeium, C. efficiens e C. glutamicum)

que já possuem o genoma seqüenciado. Para isso foram utilizados os best hits das

GSS’s, nas quais foram averiguadas similaridade nucleotídica e em nível de aminoácido.

O menor valor de e aceitável foi de 10

-10

VII.1.10.2. Uso de bancos de dados para inferências de novas prováveis

exclusivas proteínas de C. pseudotuberculosis

Os resultados gerados nos itens VII.1.9.5, VII.1.9.6 e VII.1.10.1, foram

confrontados contra eles mesmos num dendograma para se obter seqüências que

estivessem presentes apenas em C. pseudotuberculosis T2 e não nas demais

Corynebacterium, predizendo assim talvez eventos de perda gênica na espécie.

VII.1.10.3. Análise de sintenia entre C. pseudotuberculosis e outras quatro

espécies de Corynebacterium

Para determinar se a ordem gênica entre as espécies de Corynebacterium,

aqui estudadas é conservada, foi feita uma análise de sintenia. Para isso, foi construído

um gráfico onde foram plotados os best hits do tBLASTx supracitados mapeados de

acordo com a similaridade entre C. pseudotuberculosis e C. diphtheriae, espécie

filogeneticamente mais próxima.

VII.1.10.4. Confirmação por PCR de prováveis genes exclusivos de C.

pseudotuberculosis

Para averiguar a hipótese de que os três genes que codificam as proteínas

(PIP, NADPH e oppD), estão presentes em apenas algumas espécies do gênero

Corynebacterium, foram desenhados iniciadores (tabela 4) a partir das GSS’s não-

redundantes, e realizadas reações de PCR com o objetivo de isolar tais seqüências

diretamente do genoma de C. pseudotuberculosis T2 e algumas outras espécies do

gênero tais como: C. pseudotuberculosis 1002, C. pseudotuberculosis equi, C. renale, C.

ulcerans, C. diphteriae e C. jeikeium.

As reações foram realizadas como segue: volume final de 50 µL, contendo 2

pmoles/µL de cada iniciador; 0,25 mM de dNTPs; 0,1 unidade de Taq DNA polimerase

(Invitrogen); 2mM de MgCl

, tampão da enzima 1X concentrado (Invitrogen) e 3 µL dos

DNA genômicos (50mg/µL) de cada espécie citada acima. A amplificação por PCR, foi

realizada sob as seguintes condições: primeira desnaturação a 94°C durante 3 minutos,

seguida por 29 ciclos de desnaturação a 94°C durant e 1 minuto; anelamento a 63ºC

durante 1 minuto; extensão a 72°C durante 2 minutos; e extensão final por 7 minutos a

72°C. Após a reação, as amostras foram aplicadas em gel de agarose a 1% e a

resolução eletroforética realizada sob as mesmas condições descritas no item VII.1.6.

TABELA 4: Oligonucleotídeos utilizados na reação de PCR das 4 GSS´s,

provavelmente, exclusivas de C. pseudotuberculosis.

PCR Oligonucleotídeos iniciadores

Iniciador “forward” da GSS oppD

Iniciador “reverse” da GSS oppD

Iniciador “forward” da GSS PIP

Iniciador “reverse” da GSS PIP

Iniciador “forward” da GSS

NADPH

Iniciador “reverse” da GSS NADPH

5´ CCTTACCGAGACAACGTCAT 3´

5´ GCCTGGTGCTTATCATTGAT 3´

5´ AACTGCGGCTTTCTTTATTC 3´

5´ GACAAGTGGGAACGGTATCT 3´

5´ CTGCGACATAGCTAGGCACT 3´

5´ CCGCCAGACTTTTCTCTACA 3´

: Dipeptídeo/Oligopepetídeo ABC transporter.

: Prolina Iminopeptidase.

: NADP oxirredutase.

VII.3. ARTIGO: Mini Review

VII.3.1. A description of genes of Corynebacterium

pseudotuberculosis useful in diagnostics and vaccine applications.

Vívian D’Afonseca

, Pablo Matias Moares

, Fernanda Alves Dorella

, Luis

Gustavo Pacheco

, Roberto Meyer

, Ricardo Wagner Portela

, Anderson

Miyoshi

**, Vasco Azevedo

1 – Laboratório de Genética Celular e Molecular, Dept. De Biologia Geral, ICB –

UFMG.

2- Laboratório de Imunologia e Biologia Molecular, Dept. De Bioteração, ICS-

UFBA.

Vasco Azevedo* and Anderson Miyoshi** (share credit in this work for senior

authorship)

[email protected]fmg.br

miyoshi@icb.ufmg.br

Laboratório de Genética Celular e Molecular, sala Q3 259.

Departamento de Biologia Geral, ICB, UFMG.

Avenida Antônio Carlos, 6627 CP 486.

CEP: 31.270-010 Belo Horizonte – MG, Brazil.

Tel: +55 31 3499-2778

Fax: +55 31 3499-2610

* To whom correspondence should be addressed.

Running Head: Applications of Corynebacterium pseudotuberculosis genes.

ABSTRACT

Corynebacterium pseudotuberculosis, a gram-positive intracellular

pathogen, is the etiological agent of caseous lymphadenitis or CLA. This

bacterium infects goats and sheep and causes great economic losses

worldwide annually, mainly for goat producers. Despite its importance, CLA

is still poorly characterized. However, with advances in the genomic field,

many C. pseudotuberculosis genes have already been characterized, mainly

those related to virulence such as phospholipase D. Here, we examined the

use of the several available genes of C. pseudotuberculosis and reviewed

their applications in vaccine construction, more efficient diagnostics for

CLA, and control of this disease, among other applications.

Key words: PLD (phospholipase D), RecA, CLA (caseous lymphadenitis)

INTRODUCTION

The genus Corynebacterium belongs to the group of actinomycetes that includes

the CMN group (Corynebacterium, Mycobacterium, Nocardia and Rhodococcus species)

(Hard et al. 1969; Songer et al., 1988; Songer et al., 1997; Paule et al., 2004; Dorella et

al., 2006a). These gram-positive bacteria constitute a very heterogeneous group that

shares particular characteristics, such as a specific cell wall organization, (Hard, 1975;

Collins et al., 1982; Funke et al., 1995; Collins et al., 1998; Connor et al., 2000; Bayan et

al., 2003; Hall et al., 2003; Dorella et al., 2006a) and high G+C content (47–74%) (Garg et

al., 1985; Goodfellow, 1989; Funke et al., 1995; Navas, 1996; Dorella et al., 2006a).

Belonging to this group is Corynebacterium pseudotuberculosis, an important animal

pathogen and the etiological agent of a disease called caseous lymphadenitis (CLA)

(Williamson, 2001).

This disease is spread worldwide, and its considerable economic importance

(Williamson, 2001; Paton et al., 2003) has prompted investigation of its pathogenesis.

However, the genetic determinants of C. pseudotuberculosis virulence are still poorly

characterized (Dorella et al., 2006a); moreover, this species has only 19 proteins

identified in the GenPept database as showed in Table 1 and about 1,230 genomic survey

sequences (GSS) (Dorella et al., 2006b) already deposited in the GenBank database.

The majority of these genes belongs to virulence factors, or modulate positively

virulence genes or encode virulence factors that confer pathogenic characteristics to

Corynebacterium pseudotuberculosis. For this reason, virulence genes are targets for the

development of new vaccines and more efficient therapies and diagnostics in the control

of illnesses, mainly CLA which is still managed by rudimentary prophylaxis. In this work,

we conducted an overview oft the cited genes, as well as their application in helping to

control CLA.

Table 1: Genes of Corynebacterium pseudotuberculosis deposited in GenPept, National

Center for Biotechnology Information – (NCBI).

Accession

Number

(GenPept)

Putative Protein

Reference

ABI29892 10 kDa chaperonin GroES Azevedo, V. et al, 2006.

AAV48830 60 kDa chaperonin 1 Azevedo, V. et al, 2004.

ABI75067 65 kDa heat shock protein Fardel, G & Flandrois, J. P., 2006.

AAB71614 AroB (3-dehydroquinate synthase) Simmons, C. P. et al, 1997.

AAB71615

AroB (3-dehydroquinase) Simmons, C. P. et al, 1997.

P96749 AroB (3-dehydroquinate synthase) Simmons, C. P. et al, 1997.

P96750 AroQ (3-dehydroquinate

dehydratase)

Simmons, C. P. et al, 1997.

AAL79811 FagA (integral membrane protein) Billington, S. J. and Jost, B. H.,

2002.

AAL79810 FagB (iron-enterobactin transporter) Billington, S. J. et al, 2002.

AAL79809 FagC (ATP binding cytoplasmic

membrane protein)

Billington, S. J. et al, 2002.

AAL79812 FagD (iron-siderophore binding

protein)

Billington, S. J. and Jost, B. H.,

2002.

P20626 Phospholipase D precursor Hodgson, A.L. et al, 1990.

AAA64910 Phospholipase D Songer, J. G. et al, 1993

AAA99867

Phospholipase D McNamara, P. J. et al, 1993.

CAA01541 Phospholipase D -----------

AAA82608 Protein recA Pogson, C. A. et al, 1995.

P48288 Protein recA Pogson, C. A. et al, 1996.

AAS89201 RpoB ( RNA polymerase subunit

beta)

Khamis, A. et al, 2004.

AAA67924 Serine proteinase precursor Wilson, M. J. et al, 1995.

GENES AND THEIR APPLICATIONS

Phospholipase D: virulence factor

After Adrian Hodgson and colleagues (1989) reported the nucleotide

sequence, cloning and expression of C. pseudotuberculosis phospholipase D

gene, several studies about this gene were conducted. Phospholipase D (PLD)

has for some years been implicated as the major virulence factor of C.

pseudotuberculosis (Adrian Hodgson et al., 1999). The pld gene encodes an

exotoxin (Burrel, 1983; Adrian Hodgson et al., 1994) that probably promotes

bacterial dissemination, increasing vascular permeability (Egen et al., 1989;

Cardenas & Clements, 1992; Adrian Hodgson et al., 1994) through the hydrolysis

of ester bonds in sphingomyelin in mammalian cell membranes following infection

(Carne et al., 1978; Lipsky et al., 1982; Coyle & Lipski, 1990; Tachedjian et al.,

1995; Navas, 1996; Tambourgi et al., 2002; Dorella et al., 2006a), beyond

enabling the bacteria to escape from neutrophils, and impairing neutrophil

chemotaxis toward the site of infection (Yozwiak & Songer, 1993).

Several studies have been carried out involving the biological activities of

C. pseudotuberculosis PLD, as well as its molecular structures, and results have

shown similarities with sphingomyelinases present in the venom of the medically

important spider genus Loxosceles (Bernheimer et al., 1985; Songer, 1997;

Tambourgi et al., 2002; van Meeteren et al., 2004; Binford et al., 2005). Unlike

diphtheria toxin, which occurs in about half of the isolates of Corynebacterium

diphtheria (Saragea et al., 1966; Toshach et al., 1977), PLD probably is

characteristic of most or almost all strains of C. pseudotuberculosis and C.

ulcerans and have not been found in any other corynebacteria (Barksdale et al.,

1981).

Due to the immunogenic characteristic of the PLD, it has often been used

as a tool in vaccine development against CLA. The vaccines that are currently

produced for control of CLA generally use formalin-inactivated PLD-rich C.

pseudotuberculosis culture supernatants because PLD is considered the major

protective antigen (Johnson & Nicholls, 1994; Pizza et al., 1995; Adrian Hodgson

et al., 1999), or they use DNA as vaccine (Rose, 2002). Although a commercial

vaccine is already available, it is thought that conventional attenuated vaccines

are still more advantageous as they offer better long-lived humoral and cytotoxic

T-lymphocyte responses (Chaplin et al., 1999; Davis et al., 1996) with only a

single dose in mice (Chaplin et al., 1999). Hodgson and colleagues (1994) used a

strain of C. pseudotuberculosis with the pld gene deleted from the chromosome

and showed that a single subcutaneous vaccination of this attenuated strain,

Toxminus, protected sheep against wild-type challenge (Hodgson et al., 1992;

Hodgson et al., 1994).

Pacheco and colleagues (2007) used the pld gene to develop a multiplex

PCR (mPCR) assay that also included the rpoB and 16S rRNA genes. This

methodology allowed to differentiate C. pseudotuberculosis from other closely

related species of Corynebacteria such as C. ulcerans and C. diphtheriae, (Dorella

et al., 2006a), thus supplying an accurate diagnostic method for CLA directly for

clinical use.

AroB and aroQ: amino acid biosynthesis

Dehydroquinases are enzymes involved in the shikimate biosynthetic

pathway. Amino acid biosynthesis was described mainly in Escherichia coli

(Kleanthous, 1990) from which the dehydroquinases have already been purified

(Chaudhuri et al., 1986), cloned, sequenced, and overexpressed (Duncan et al.,

1986). These enzymes consist of three constitutively expressed subtypes: a

monofunctional form (Berlyn & Giles, 1969; Chaudhuri et al., 1987), a bifunctional

form found in plants and a multifunctional form of dehydroquinase, which is a

large polypeptide (Kleanthous, 1990).

Kim and colleagues (2006) reported the presence in Mycobacterium

tuberculosis of such enzymes which are essential for the biosynthesis of

phenylalanine, tyrosine, tryptophan (Garbet, 1990) and other aromatic compounds

in bacteria and other organisms such as fungi, algae and plants, but they are

absent in mammals (Haslam, 1993; Kim et al., 2006). An advantage of the non-

occurrence of these enzymes in mammals is the possibility of the development of

new drugs (Camus et al., 2002; Cole et al., 1998; Kim et al., 2006).

Several pathogens have been attenuated by mutations in the aromatic

amino acid biosynthetic pathway such as some Salmonella ssp. (Hoiseth &

100

Stocker, 1981; Levine et al., 1987; Schijns et al., 1994) and other pathogenic

bacteria. Thus, Simmons and colleagues (1997) obtained C. pseudotuberculosis

strains that lack virulence through attenuation of aroB and aroQ gene, using

allelic exchange. Such strains were unable to cause CLA in murine models,

suggesting its use as vaccine vectors and a potential attenuated vaccine in the

control of CLA (Simmons et al., 1998).

FagA, fagB, fagC and fagD: iron uptake

Iron acquisition is one of the most important factors for bacterial survival

during infection in the host environment (Brown & Holden, 2002). This mechanism

has been widely described in gram-negative bacteria and also in gram-positive

bacteria, where several papers have been published on the molecular basis of iron

uptake (Heinrichs et al, 1999; Brown & Holden, 2001).

Studies in Staphylococcus aureus have reported some genes and

pathways involving iron uptake and the search for the presence of siderophores

(Courcol et al., 1997) and systems using ABC transporters of three compounds

(Heinrichs et al, 1999; Sebulsky et al., 2000; Cabrera et al., 2001; Sebulsky &

Heinrichs, 2001). A common characteristic of the occurrence of genes encoding

iron transporters is their location in pathogenicity islands (PAIs), where there is

evidence of horizontal transfer (Brown & Holden, 2002). PAIs have also been

described in gram-positive organisms such C. diphtheriae and S. pneumoniae,

where C. diphtheriae possesses a gene (IRP1) homologous to the ABC

transporter gene (pia) involved in iron uptake in S. pneumoniae, located inside a

PAI (Schmitt et al., 1997).

Wennerhold and colleagues (2005) identified a protein DtxR, which is

involved in the regulation of iron uptake, mainly in high GC gram-positive genera

[e.g., Corynebacterium, Mycobacterium and Rhodococcus (Tao et al., 1994;

Rodriguez & Smith, 2003)], and modulates the expression of siderophores and

other compounds in the iron acquisition pathway.

However, in Corynebacterium pseudotuberculosis, Billington and

colleagues (2002) described an operon (fagABC) with 32-47% identity to proteins

involved in bacterial iron uptake systems such as ABC transporters which confer

101

to C. pseudotuberculosis persistence in a goat infection model. Present in this

operon are four genes: fagA, fagB, fagC, fagD, located downstream from the pld

gene. An approach used to study such genes was the fusion of the operon to lacZ

gene to evaluate expression. It was observed that the operon was poorly

expressed in iron-rich media, and in iron-limited media, the expression of β-

galactosidase activity was increased about threefold, suggesting that the

expression of this operon appears to contribute to the virulence of bacteria.

Heat shock proteins: chaperonin immunogenicity and vaccine development

Heat shock proteins (HSPs) are one of the most highly conserved group of

proteins among organisms (Qamra et al, 2005). They were initially described as

being involved in thermal stress, but it is currently known that HSPs participate in

other events such as nutrient depletion, hypotaxia, metabolic disruption, viral

infection, transformation (Young & Elliot, 1989; Morimoto & Milarski, 1990; Young,

1990; Kultz, 2005) and other cellular processes. Chaperonin proteins are found in

almost all organisms (if not all) (Braig, 1998) and are classified into six families:

Hsp10, Hsp40, Hsp60, Hsp70, Hsp90 and Hsp100. However, in prokaryotes, the

HPSs most characterized are hsp60 (groEL), hsp70 (dnaK) and hsp10 (groES)

(Eom et al., 2005), and in the genus Corynebacterium genus two paralogue genes

of hsp60 have been described (Barreiro et al., 2004).

Studies conducted by Coelho and colleagues (unpublished data)

characterized and isolated for the first time the hsp10 and hps60 genes of

Corynebacterium pseudotuberculosis. It is known that the majority of HSPs are

able to promote a humoral and cellular response, and therefore, they have

immunogenic properties. Based on this information, the same research group

tested an hsp60 DNA vaccine and a recombinant protein subunit vaccine in

challenges in mice and obtained a significant production of specific IgG.

RecA and rpoB of C. pseudotuberculosis: diagnostics and phylogeny

The protein RecA is present in eubacteria in general and is a highly

conserved protein among bacterial organisms (Roca & Cox, 1990; Clark &

102

Sandler, 1994; Kowalczykowski et al., 1994). It participates in homologous

recombination, DNA repair, and the SOS response. Specifically, it binds stretches

of single-stranded DNA and unwinds duplex DNA (Karlim et al., 1995). In this

context, Pogson (1996) generated isogenic mutants of C. pseudotuberculosis

where the recA gene was mutated. As a result, a 10- to 12-fold reduction in

recombination was obtained in the mutants compared with the parental strain,

suggesting its use as a vaccine vector.

The rpoB gene is responsible for encoding the β-subunit of DNA-

dependent RNA polymerase (Severinov et al., 1996; Ko et al., 2002); however,

there are several lines of evidence suggesting its relation with rifampin resistance

(Kim et al., 1999). Recently, rpoB sequences were used as an alternative tool for

determining the phylogeny of some enteric bacteria (Mollet et al., 1997), Borrelia

(Lee et al., 2000; Renesto et al., 2000), Mycobacterium (Kim et al., 1999), and

Bartonella (Renesto et al., 2001). Dorella et al. (2006) used the rpoB and 16S

rRNA genes to build a phylogenetic tree of the genus Corynebacterium genus.

This work showed that C. pseudotuberculosis is more closely related to C.

ulcerans than to C. diphtheriae, suggesting that C. diphtheriae diverged from both

at some time.

Novel protein of C. pseudotuberculosis – CP40: other secreted toxin?

A novel gene of C. pseudotuberculosis discovered by Wilson (1995) CP40

encodes a protein with a molecular weight of 40 kDa and length of about 351

amino acids. Preliminary characterization of the CP40 protein revealed that it is

probably a serine protease, although it did not have any homology with motifs of

other serine proteases in database searched. Perhaps this absence of homology

has occurred because CP40 is intrinsic to C. pseudotuberculosis.

This protein showed biochemical similarities with the protein PLD. Both

are hydrophobic (von Heijne, 1983; von Heijne, 1985) and have a leader sequence

containing an Ala-x-Ala cleavage motif at the C terminus. This protein was found in

C. pseudotuberculosis culture supernatant, indicating that it is probably secreted

(Walker et al., 1994).

103

Approach of the gene content of C. pseudotuberculosis:

perspectives

Currently, there are great advances in genomics, mainly in the

optimization of sequencing techniques, which means that sequencing has become

less expensive and more accurate. A massive deposit of sequences such as GSS

(genomic sequence survey) in public databases has facilitated searches for

homology and prediction of novel genes. Through these advances in the genomic

field, we aim at to use such tool for the discovery of new genes, new diagnostics

and more efficient vaccines for CLA control. Moreover, genomes of several

Corynebacteria ssp. are widely available, where this information can be used in

comparative genomics to help gain better insight into gene content and genomic

organization of C. pseudotuberculosis.

ACKNOWLEDGEMENTS

This work received funding from FAPEMIG REDE-2829/05 and CNPq.

104

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115

VII.4. Currículo

VÍVIAN D’AFONSECA DA SILVA

CURRÍCULO VITAE

Março

2008

116

–

ADOS

ESSOAIS

Nome: Vivian D’Afonseca da Silva.

Nacionalidade: Brasileira.

Local e data de nascimento: Brasília/DF – Brasil 06/05/1983.

Filiação: Haroldo da Silva e Eloisa d'Afonseca da Silva.

Carteira de identidade: 2038285- SSP/DF - 18/02/1998.

CPF: 95311238100.

Título de eleitor:

Estado civil: Solteiro.

Endereço residencial: Rua Belterra, N°. 224, Apto. 202. Ed. Valência Bairro

Ouro Preto.

(Preferencial) Belo Horizonte – MG. CEP: 31310-480.

Fone: (31) 3347-7141.

Endereço profissional: Universidade Federal de Minas Gerais, Instituto de

Ciências Biológicas – UFMG – ICB.

Av. Antônio Carlos, 6627 Pampulha - Belo Horizonte

31270-901 Telefone: 31 34092778.

–

ORMAÇÃO

CADÊMICA

2.1 – Graduação (2001 – 2005)

Bacharelado em Ciências Biológicas.

Curso de Ciências Biológicas.

Centro Universitário de Brasília – UniCEUB Brasília/DF

117

2.2 – Mestrado (2007 – atual)

Mestrado em Genética.

Programa de Pós-Graduação em Genética.

Instituto de Ciências Biológicas/Universidade Federal de Minas Gerais.

Título da dissertação: “Construção de uma biblioteca genômica de Corynebacterium

pseudotuberculosis e sua caracterização através de Genome Survey Sequence

(GSS)”.

2.3 – Aperfeiçoamento em Bioinformática (2007)

Universidade Federal de Minas Gerais, UFMG, Belo Horizonte, Brasil.

Título: Bioinformática

3 – IDIOMAS

Inglês Compreende Bem , Fala Razoavelmente, Escreve Bem, Lê Bem

Espanhol Compreende Bem , Fala Razoavelmente, Escreve Pouco, Lê Bem

4 – ÁREA DE ATUAÇÃO

4.1 – Genética

Genética molecular:

• Genética de microrganismos procariotos.

• Genômica.

• Genômica comparativa.

–

RODUÇÃO

IBLIOGRÁFICA

5.1 – Resumos publicados em anais de eventos científicos:

5.1.1. SOARES, S. C., D'AFONSECA, V., DORELLA, F., CAPANEMA, E.R.,

AZEVEDO, V., MIYOSHI, A.

Análise de Plasticidade Genômica de linhagens de Corynebacterium

diphtheriae através de PCR (Plasticity of Cromossome Relealed by Long Range

- Polymerase Chain Reaction) In: 24º Congresso Brasileiro de Microbiologia, 2007,

Brasília.

118

5.1.2. D'AFONSECA, V., MORAES, P., PACHECO, L.G.C., DORELLA, F.,

CAPANEMA, E.R., PENA, I., PROSDOCIMI, F., ORTEGA, J. M., MEYER, R.,

OLIVEIRA, G. C., OLIVEIRA, S. C., MIYOSHI, A., AZEVEDO, V.

Partail-genome sequence through GSS analyses and comparative genomic of

Corynebacterium pseudotuberculosis the ethiological agent of Caseous

Limphadenitis Disease In: 24 º Congresso Brasileiro de Microbiologia, 2007,

Brasília.

5.1.3. D'AFONSECA, V., LISBOA, E. D., REIS, M., RESENDE, V. P., SA, M.,

TINOCO, M. L., ROMANO, E.

Silencing of SERK gene using the technique of RNA interferance in tabacco In:

34ª Reunião Anual de Bioquímica e Biologia Molecular, 2005, Águas de Lindóia - SP.

5.1.4. LISBOA, E. D., SA, M., D'AFONSECA, V., RESENDE, V. P., TINOCO, M. L.,

REIS, M.

Expression of antiquitin gene confers a salt tolerance in Arabidopsis thaliana

In: 50º Congresso Brasileiro de Genética, 2004, Florianópolis - SC.

5.2 – Artigos submetidos a periódicos científicos ou aceitos:

5.2.1. D'AFONSECA, V., MORAES,P., DORELLA, F., PACHECO, L.G.C., MEYER,

R., PORTELA, R. W., MIYOSHI, A., AZEVEDO, V.

A description of genes of Corynebacterium pseudotuberculosis useful in

diagnostics and vaccine applications. Genetics and Molecular Research, 2008.

5.2.2. CAPANEMA, E.R., ALMEIDA, B. P. X. C., RUIZ, J. C., OLIVEIRA, G. C.,

LOBO, F. P., D'AFONSECA, V., MEYER, R., MIYOSHI, A., AZEVEDO, V.

Brazilian genome sequencing projects: state of art. Bentham Science, 2008.

5.2.3. D’AFONSECA,V., PROSDOCIMI, F., DORELLA, F.A., PACHECO, L.G.C.,

MORAES, P., ORTEGA, J.M., PENA, I., TEIXEIRA, S., OLIVEIRA, S.C., OLIVEIRA,

G., OLIVEIRA, L.M., COSER, E.M., MEYER, R. MIYOSHI, A., AZEVEDO, V.

Genome organization and gene content characterization of Corynebacterium

pseudotuberculosis. Genomics, 2008.

–

XPERIÊNCIA

IDÁTICA

6.1 – Disciplinas de graduação (aulas ministradas):

6.1.1- Módulo de genética molecular da disciplina “Genética e Evolução para o curso

de Enfermagem” oferecida pelo Departamento de Biologia Geral do Instituto de

Ciências Biológicas da Universidade Federal de Minas Gerais.

Período: Agosto - Setembro de 2007.

Carga horária: 20 horas.

119

Supervisão: Prof. Dr. Vasco Azevedo.

–

ORMAÇÃO DE

ESSOAL

(

ORIENTAÇÃO

)

7.1. Anna Thereza Dias Bomfim

• Função: Iniciação Científica

• Instituição: UNA - BH

• Programa: Curso de Bacharelado em Ciências Biológicas

• Local do estágio: Laboratório de Genética Celular e Molecular do

Departamento de Biologia Geral do Instituto de Ciências Biológicas da

Universidade Federal de Minas Gerais.

• Período: Fevereiro de 2006 a Outubro de 2006 (concluído).

• Responsáveis: Dr. Vasco Azevedo (orientador) & Dr. Anderson Miyoshi (co-

orientador).

7.2. Pablo Matias de Oliveira Moraes

• Função: Iniciação Científica

• Instituição: Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Minas

Gerais.

• Programa: Curso de Bacharelado em Ciências Biológicas – Genética do

Departamento de Biologia Geral – ICB/UFMG.

• Local do estágio: Laboratório de Genética Celular e Molecular do

Departamento de Biologia Geral do Instituto de Ciências Biológicas da

Universidade Federal de Minas Gerais.

• Período: Fevereiro de 2007 a atual.

• Responsáveis: Dr. Vasco Azevedo (orientador) & Dr. Anderson Miyoshi (co-

orientador).

8 – PARTICIPAÇÃO EM EVENTOS

8.1. 24º Congresso Brasileiro de Microbiologia. Apresentação de Poster / Painel:

Análise de Plasticidade Genômica de linhagens de Corynebacterium diphtheriae

através de PCR (Plasticity of Cromossome Relealed by Long Range - Polymerase

Chain Reaction). 2007.

8.2. 24º Congresso Brasileiro de Microbiologia. Apresentação de Poster / Painel:

Partial-genome sequence through GSS analyses and comparative genomic of

Corynebacterium pseudotuberculosis the ethiological agent of Caseous

Limphadenitis Disease. 2007.

8.3. V Congresso Brasileiro de Biossegurança e V Simpósio Latino Americano

de Produtos Transgênicos. 2007.

8.4. I Simpósio Edmar Chartone de Microbiologia. 2006.

120

8.5. 50º Congresso Brasileiro de Genética. Apresentação de Poster / Painel:

Expression of antiquitin confers a salt resistance in Arabidopsis thaliana. 2004.

8.6. Estágio voluntário - Laboratório de Citogenética Clínica – Pasteur, Brasília.

2004.

8.7. II Congresso UniCEUB de Ciências da Saúde. 2003.

8.8. DNA goes to school. 2002.

8.9. XII Fórum UniCEUB de Biociências. 2001.

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