( PDF ) Estudo fitoquímico e avaliação do potencial antimicrobiano de espécies de hortia (rutaceae): h. oreadica, h. brasiliana e h. superba

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO CARLOS

CENTRO DE CIÊNCIAS EXATAS E DE TECNOLOGIA

DEPARTAMENTO DE QUÍMICA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO

“ESTUDO FITOQUÍMICO E AVALIAÇÃO DO POTENCIAL

ANTIMICROBIANO DE ESPÉCIES DE HORTIA (RUTACEAE):

H. OREADICA, H. BRASILIANA E H. SUPERBA”

VANESSA GISELE PASQUALOTTO SEVERINO *

Dissertação apresentada ao

Programa de Pós-Graduação em

Química como parte dos

requisitos para obtenção do título

de MESTRE EM QUÍMICA, na

área de concentração QUÍMICA

ORGÂNICA.

Orientadora: Profa. Dra. Maria Fátima das Graças Fernandes da Silva

*Bolsista: FAPESP

São Carlos-SP

2008

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Ficha catalográfica elaborada pelo DePT da

Biblioteca Comunitária da UFSCar

S498ef

Severino, Vanessa Gisele Pasqualotto.

Estudo fitoquímico e avaliação do potencial

antimicrobiano de espécies de Hortia (Rutaceae) : H.

oreadica, H. brasiliana e H. superba / Vanessa Gisele

Pasqualotto Severino. -- São Carlos : UFSCar, 2008.

191 f.

Dissertação (Mestrado) -- Universidade Federal de São

Carlos, 2008.

1. Produtos naturais. 2. Fitoquímica. 3. Atividade

biológica. 4. Substâncias químicas. I. Título.

CDD: 547.3 (20

)

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Dedico…

Ao meu marido Maico Roris Severino,

meu eterno amor, pelo carinho, amizade, companherismo, atenção,

paciência, incentivo e amor em todos os momentos.

Aos meus pais, Celso e Conceição, e

ao meu irmão Vinicius, pelo amor e dedicação e por nunca medirem

esforços para que eu consiga alcançar meus objetivos.

AGRADECIMENTOS

À Deus pelas oportunidades concedidas a mim, por me fazer acreditar que tudo é

possível e por estar sempre iluminando a minha vida.

À minha orientadora Profa. Dra. Maria Fátima das Graças Fernandes da Silva

pela confiança, paciência, excelente convívio e estímulo à pesquisa e pelo seu

modo especial de ver a vida e as pessoas.

Aos professores que participaram da banca de defesa, Dra. Alessandra Alves de

Souza e Dr. Luciano Moraes Lião, muito obrigado pelas considerações e

contribuições para melhoria da versão final de minha dissertação.

Aos professores João Batista Fernandes, Paulo Cezar Vieira e Edson Rodrigues

Filho que direta ou indiretamente participaram da evolução deste trabalho e pela

ótima convivência durante todos esses anos.

À Profa. Dra. Alessandra Alves de Souza e toda a equipe do Centro de Citricultura

pela orientação, ensinamentos, ajuda e contribuição nos ensaios biológicos.

Ao Prof. Carlos Henrique Gomes Martins e aos alunos da UNIFRAN pela

receptividade, ensinamentos, carinho e contribuição nos ensaios biológicos.

À todos os amigos do Laboratório de Produtos Naturais da UFSCar que não

citarei nomes por serem muitos, pela amizade, ensinamentos, apoio,

prestatividade e colaboração neste trabalho e por proporcionarem um ambiente

de trabalho prazeroso e familiar. Um agradecimento especial ao Dr. Sebastião da

Cruz Silva e à Dra. Patrícia A. C. Braga que me forneceram algumas de suas

substâncias para a realização dos ensaios biológicos.

À Profa. Arlene e às alunas Juciane e Patrícia por terem cedido suas substância

para serem ensaiadas.

Aos amigos dos laboratórios de CLAE, LSPN, MASSAS, RMN e SÍNTESE.

Aos professores do DQ-UFSCar pela contribuição na minha formação.

Aos técnicos Luciana, Paulo, Valdir e Doraí por terem contribuído imensamente

com esta dissertação através da realização de seus trabalhos.

Aos meus pais Celso e Conceição e ao meu irmão Vinicius, pelas orações,

incentivo, educação e amor dado ao longo da minha vida.

Ao Maico, pelo incentivo, amor e por estar sempre ao meu lado durante todos

estes anos.

À minha segunda família, família Severino, pelo amor, carinho e por estarem

sempre torcendo por mim.

À FAPESP pela concessão da bolsa.

À todos que contribuíram de alguma forma para a realização deste trabalho.

vii

ABREVIATURAS E SÍMBOLOS

ACN acetonitrila

AcOEt acetato de etila

BOD biological oxigen demand

CC cromatografia em coluna

CCDA cromatografia em camada delgada analítica

CCDP cromatografia em camada delgada preparativa

CDCl

clorofórmio deuterado

CG-EM cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massas

APCI atmosferic pressure chemical ionization

CIM concentração inibitória mínima

CLAE cromatografia líquida de alta eficiência

COSY correlation spectroscopy

CVC clorose variegada dos citros

duplo dubleto

ddd

duplo duplo dubleto

DEPT distortionless enhancement by polarization transfer

Dicl. diclorometano

DMSO dimetilsulfóxido

ED extrato diclorometano

EH extrato hexânico

EM extrato metanólico

EMA extrato hidrometanólico

EtOH etanol

Fundecitrus fundo de defesa da citricultura

h altura da sílica na coluna

Hex. hexano

HMBC heteronuclear multiple bond correlation

HSCCC high speed countercurrent chromatography

HSQC heteronuclear single quantum coherence

Hz hertz

IAC instituto agronômico de Campinas

J constante de acoplamento

multipleto

m/z

relação massa/carga

MeOH metanol

MHz mega-hertz

NOE nuclear Overhouser effect

OD optics density

RMN

C ressonância magnética nuclear de carbono -13

RMN

H ressonância magnética nuclear de hidrogênio

rpm rotações por minuto

singleto

SAM adenosil metionina

singleto largo

tripleto

δ deslocamento químico

UV ultravioleta

Φ diâmetro

viii

LISTA DE TABELAS

TABELA 1.1. Bactérias predominantes na placa bacteriana........................... 12

TABELA 3.1. Massas obtidas de material vegetal e extratos.......................... 25

TABELA 3.2. Dados de RMN de

H e de

C de 01 e comparação com a

literatura .......................................................................................................... 40

TABELA 3.3. Dados de RMN de

H e de

C de 02 e comparação com a

literatura .......................................................................................................... 46

TABELA 3.4. Dados de RMN de

H e de

C de 03 e comparação com a

literatura .......................................................................................................... 51

TABELA 3.5. Dados de RMN de

H de 04 e comparação com a literatura...... 56

TABELA 3.6. Dados de RMN de

H e de

C de 05 e comparação com a

literatura ........................................................................................................... 61

TABELA 3.7. Dados de RMN de

H e de

C de 06 e comparação com a

literatura .......................................................................................................... 67

TABELA 3.8. Dados de RMN de

H e de

C de 07 e comparação com a

literatura ........................................................................................................... 72

TABELA 3.9. Dados de RMN de

C e de HMBC de 08............................ 79

TABELA 3.10. Dados de RMN de

H de 09 e comparação com a literatura.... 87

TABELA 3.11. Dados de RMN de

C de 09 e comparação com a literatura.. 88

TABELA 3.12. Dados de RMN de

H e de

C de 10 e comparação com a

literatura............................................................................................................ 95

TABELA 3.13. Dados de RMN de

H e de

C de 11 e comparação com a

literatura............................................................................................................ 102

TABELA 3.14. Dados de RMN de

H e de

C de 12 e comparação com a

literatura............................................................................................................ 106

TABELA 3.15. Dados de RMN de

H de 13 e comparação com a literatura.... 115

TABELA 3.16. Dados de RMN de

C de 13 e comparação com a literatura.. 116

TABELA 3.17. Dados de RMN de

H e de

C de 14 e comparação com a

literatura............................................................................................................ 126

TABELA 3.18. Dados de RMN de

C e de HMBC de 15.......................... 135

TABELA 4.1. Reagentes e quantidades necessárias para preparar o meio

PW.................................................................................................................... 146

TABELA 4.2. Concentração ensaiada e volume retirado da solução estoque 152

TABELA 4.3. Proporções de DMSO:H

O......................................................... 153

TABELA 4.4. Colônias observadas nos controles negativos para as

diferentes concentrações de substâncias ensaiadas....................................... 154

TABELA 4.5. Colônias observadas nas diferentes concentrações de

substâncias ensaiadas frente X. fastidiosa...................................................... 156

TABELA 4.6. CIM dos extratos ensaiados (µg/mL).......................................... 165

TABELA 4.7. CIM dos derivados do ácido diidrocinâmico (µg/mL).................. 166

TABELA 4.8. CIM dos limonóides (µg/mL)....................................................... 167

TABELA 4.9. CIM dos alcalóides (µg/mL)........................................................ 167

TABELA 4.10. CIM das substâncias quinolinônicas sintéticas (µg/mL)........... 168

TABELA 4.11. CIM das substâncias ensaiadas frente à V. cholerae (µg/mL) 175

TABELA 4.12. CIM das substâncias ensaiadas frente à S.choleraesuis

(µg/mL)............................................................................................................. 175

TABELA 4.13. CIM das substâncias ensaiadas frente à B.cereus (µg/mL)..... 175

LISTA DE FIGURAS

FIGURA 1.1. Sintomas típicos de CVC em folhas de laranja doce................... 06

FIGURA 1.2. Plantas com sintomas de CVC ................................................... 07

FIGURA 1.3. Vasos do xilema obstruídos por células e células de X.

fastidiosa .......................................................................................................... 08

FIGURA 1.4. Zoneamento citrícola considerado no levantamento de CVC

em 2005 no estado de São Paulo e parte do triângulo mineiro .......................

FIGURA 1.5. Micrografia eletrônica de varredura de microrganismos

compondo uma placa dental ............................................................................

FIGURA 1.6. Micrografia eletrônica de transmissão de S. sobrinus sobre a

superfície dental ...............................................................................................

FIGURA 1.7. Fases de formação da placa ...................................................... 14

FIGURA 1.8. Colônias de Salmonella............................................................... 17

FIGURA 1.9. Colônias de Bacillus cereus ........................................................ 17

FIGURA 3.1. Espécies de Hortia (H. brasiliana, H. oreadica e H. superba)..... 24

FIGURA 3.2. Espectro de RMN de

H de 01 (CDCl

, 400 MHz) ...................... 41

FIGURA 3.3. Espectro de RMN de

C de 01 (CDCl

, 100 MHz) .................... 41

FIGURA 3.4. Mapa de contorno de g-HSQC de 01 (CDCl

, 400 MHz) ............ 42

FIGURA 3.5. Mapa de contorno de g-HMBC de 01 (CDCl

, 400 MHz) ........... 42

FIGURA 3.6. Espectro de massas de 01 (IE-70 eV) ........................................ 43

FIGURA 3.7. Espectro de RMN de

H de 02 (CDCl

, 400 MHz) ...................... 47

FIGURA 3.8. Espectro de RMN de

C de 02 (CDCl

, 100 MHz) .................... 47

FIGURA 3.9. Mapa de contorno de g-HSQC de 02 (CDCl

, 400 MHz) ............ 48

FIGURA 3.10. Mapa de contorno de g-HMBC de 02 (CDCl

, 400 MHz).......... 48

FIGURA 3.11. Espectro de RMN de

H de 03 (CDCl

, 400 MHz) .................... 52

FIGURA 3.12. Espectro de RMN de

C de 03 (CDCl

, 100 MHz) .................. 52

FIGURA 3.13. Mapa de contorno de g-HMBC de 03 (CDCl

, 400 MHz) ......... 53

FIGURA 3.14. Mapa de contorno de g-HSQC de 03 (CDCl

, 400 MHz) .......... 53

FIGURA 3.15. Espectro de RMN de

H de 04 (CDCl

, 400 MHz) .................... 57

FIGURA 3.16. Mapa de contorno de g-HMBC de 04 (CDCl

, 400 MHz) ......... 57

FIGURA 3.17. Espectro de RMN de

H da mistura de 01 e 05 (CDCl

, 400

MHz) ................................................................................................................. 62

FIGURA 3.18. Espectro de RMN de

C da mistura de 01 e 05 (CDCl

, 100

MHz) ................................................................................................................. 62

FIGURA 3.19. Mapa de contorno de g-HSQC da mistura de 01 e 05 (CDCl

400 MHz) .......................................................................................................... 63

FIGURA 3.20. Mapa de contorno de g-HMBC da mistura de 01 e 05 (CDCl

400 MHz) .......................................................................................................... 64

FIGURA 3.21. Espectro de RMN de

H de 06 (CDCl

, 400 MHz) .................... 68

FIGURA 3.22. Espectro de RMN de

C de 06 (CDCl

, 100 MHz) .................. 68

FIGURA 3.23. Mapa de contorno de g-HSQC de 06 (CDCl

, 400 MHz) ......... 69

FIGURA 3.24. Mapa de contorno de g-COSY de 06 (CDCl

, 400 MHz) .......... 69

FIGURA 3.25. Mapa de contorno de g-HMBC de 06 (CDCl

, 400 MHz) ......... 70

FIGURA 3.26. Espectro de RMN de

H da mistura 03 e 07 (CDCl

, 400 MHz) 73

FIGURA 3.27. Espectro de RMN de

C da mistura 03 e 07(CDCl

,100 MHz) 73

FIGURA 3.28. Correlações observadas no HMBC para 08 ............................. 76

FIGURA 3.29. Espectro de RMN de

H de 08 (CDCl

, 400 MHz) .................... 80

FIGURA 3.30. Espectro de RMN de

C de 08 (CDCl

, 100 MHz) .................. 80

FIGURA 3.31. Mapa de contorno de g-HSQC de 08 (CDCl

, 400 MHz) .......... 81

FIGURA 3.32. Mapa de contorno de g-COSY de 08 (CDCl

, 400 MHz) .......... 81

FIGURA 3.33. Mapa de contorno de g-HMBC de 08 (CDCl

, 400 MHz) ......... 82

FIGURA 3.34. Espectro de massas de 08 (IE-70 eV) ...................................... 82

FIGURA 3.35. Correlações observadas no HMBC para 09 ............................. 86

FIGURA 3.36. Espectro de RMN de

H de 09 (CDCl

, 400 MHz) .................... 89

FIGURA 3.37. Espectro de RMN de

C de 09 (CDCl

, 100 MHz) .................. 89

FIGURA 3.38. Mapa de contorno de g-COSY (e ampliação) de 09 (CDCl

400 MHz) .......................................................................................................... 90

FIGURA 3.39. Mapa de contorno de g-HSQC de 09 (CDCl

, 400 MHz) .......... 91

FIGURA 3.40. Mapa de contorno de g-HMBC de 09 (CDCl

, 400 MHz) ......... 91

FIGURA 3.41. Correlações observadas no HMBC para 10 ............................. 93

FIGURA 3.42. Espectro de RMN de

H de 10 (CDCl

, 400 MHz) .................... 96

FIGURA 3.43. Espectro de RMN de

C de 10 (CDCl

, 100 MHz) .................. 96

FIGURA 3.44. Mapa de contorno de g-COSY de 10 (CDCl

, 400 MHz) .......... 97

FIGURA 3.45. Mapa de contorno de g-HSQC de 10 (CDCl

, 400 MHz) .......... 98

FIGURA 3.46. Mapa de contorno de g-HMBC de 10 (CDCl

, 400 MHz) ......... 99

FIGURA 3.47. Espectro de massas de 10 .......................................................

100

FIGURA 3.48. Espectro de RMN de

H de 11 (CDCl

, 400 MHz) .................... 103

FIGURA 3.49. Espectro de RMN de

C de 11 (CDCl

, 100 MHz) ................. 103

FIGURA 3.50. Mapa de contorno de g-HSQC de 11 (CDCl

, 400 MHz) .......... 104

FIGURA 3.51. Mapa de contorno de g-HMBC de 11 (CDCl

, 400 MHz) ......... 104

FIGURA 3.52. Espectro de RMN de

H de 12 (CDCl

, 400 MHz) .................... 107

FIGURA 3.53. Espectro de RMN de

C de 12 (CDCl

, 100 MHz) .................. 107

FIGURA 3.54. Correlações observadas no HMBC para 13 ............................. 113

FIGURA 3.55. Espectro de RMN de

H de 13 (CDCl

, 400 MHz) .................... 117

FIGURA 3.56. Espectro de RMN de

C de 13 (CDCl

, 100 MHz) .................. 117

FIGURA 3.57. Mapa de contorno de g-HSQC de 13 (CDCl

, 400 MHz) ........ 118

FIGURA 3.58. Mapa de contorno de g-HMBC de 13 (CDCl

, 400 MHz) ......... 119

FIGURA 3.59. Espectro de g-COSY de 13 (CDCl

, 400 MHz) ......................... 120

FIGURA 3.60. Correlações observadas no HMBC para 14 ............................. 122

FIGURA 3.61. Espectro de RMN de

H de 14 (CDCl

, 400 MHz) .................... 127

FIGURA 3.62. Espectro de RMN de

C de 14 (CDCl

, 100 MHz) .................. 127

FIGURA 3.63. Espectro de RMN de DEPT 135º de 14 (CDCl

, 400 MHz) ...... 128

FIGURA 3.64. Mapa de contorno de g-HSQC de 14 (CDCl

, 400 MHz) .......... 128

FIGURA 3.65. Mapa de contorno de g-HMBC de 14 (CDCl

, 400 MHz) ......... 129

FIGURA 3.66. Mapa de contorno g-COSY de 14 (CDCl

, 400 MHz)................ 129

FIGURA 3.67. Correlações observadas no HMBC para 15 ............................. 133

FIGURA 3.68. Espectro de RMN de

H de 15 (CDCl

, 400 MHz) .................... 136

FIGURA 3.69. Espectro de RMN de

C de 15 (CDCl

, 100 MHz) .................. 136

FIGURA 3.70. Espectro de RMN de DEPT 135º de 15 (CDCl

, 400 MHz).. .... 137

FIGURA 3.71. Mapa de contorno de g-HSQC de 15 (CDCl

, 400 MHz).. ........ 137

FIGURA 3.72. Mapa de contorno de g-HMBC de 15 (CDCl

, 400 MHz) ........ 138

FIGURA 3.73. Espectro de g-COSY de 15 (CDCl

, 400 MHz) ......................... 138

FIGURA 4.1. Estruturas das substâncias ensaiadas .......................................

150

FIGURA 4.2. Eppendorfs com a solução de X. fastidiosa e as substâncias

ensaiadas nas diferentes concentrações ......................................................... 153

FIGURA 4.3. Placas de Petri com substâncias ensaiadas ..............................

155

FIGURA 4.4. CIM das substâncias ensaiadas frente à X. fastidiosa ...............

157

FIGURA 4.5. Estruturas das substâncias naturais ensaiadas .........................

161

FIGURA 4.6. Estruturas das substâncias sintéticas ensaiadas .......................

162

FIGURA 4.7. Metodologia do ensaio biológico ................................................

164

FIGURA 4.8. CIM das substâncias ensaiadas frente à patógenos bucais .......

169

FIGURA 4.9. Estruturas das substâncias ensaiadas frente à patógenos de

origem alimentar ............................................................................................... 172

FIGURA 4.10. Microplaca após revelação com resazurina .............................

174

FIGURA 4.11. CIM da lasiodiplodina, 2-metil-6-fluor-4-quinolona (S2), 2-

metil-5,7-dimetoxi-4-quinolona (S4), 2-metil-7-hidroxi-4-quinolona (S6) frente

à patógenos de origem alimentar ..................................................................... 176

xii

LISTA DE FLUXOGRAMA

FLUXOGRAMA 3.1. Preparação dos extratos das espécies de Hortia .......... 25

FLUXOGRAMA 3.2. Fracionamento do extrato EHTSHB .............................. 26

FLUXOGRAMA 3.3. Resumo do fracionamento do subextrato EHTSHB(D).. 27

FLUXOGRAMA 3.4. Fracionamento do extrato EDTSHB ..............................

FLUXOGRAMA 3.5. Resumo do fracionamento do subextrato EDTSHB(A)

e de sua fração 15-17 ..................................................................................... 29

FLUXOGRAMA 3.6. Resumo do fracionamento do subextrato EDTSHB(A)

e de suas frações 18-19 e 20 ......................................................................... 30

FLUXOGRAMA 3.7. Resumo do fracionamento do subextrato EDTSHB(A)

e de suas frações 23 e 25-26 ......................................................................... 30

FLUXOGRAMA 3.8. Resumo do fracionamento do subextrato EDTSHB(A)

e de sua fração 28-30 ..................................................................................... 31

FLUXOGRAMA 3.9. Resumo do fracionamento do subextrato EDTSHB(A)

e de sua fração 32-34 ..................................................................................... 31

FLUXOGRAMA 3.10. Resumo do fracionamento do subextrato EDTSHB(A)

e de sua fração 35-37 ..................................................................................... 32

FLUXOGRAMA 3.11. Resumo do fracionamento do subextrato EDFHB e

de suas frações 15-19, 23-26 e 31-34 ............................................................ 33

FLUXOGRAMA 3.12. Resumo do fracionamento do subextrato EDFHA e

de suas frações 10-14 e 24-26 ....................................................................... 34

FLUXOGRAMA 3.13. Particionamento do extrato EMTHS ............................

FLUXOGRAMA 3.14. Resumo do fracionamento do extrato EMTHS-D e de

suas frações 3-5, 6-7 e 11-14 ......................................................................... 36

xiii

LISTA DE ESQUEMAS

ESQUEMA 3.1. Proposta de fragmentação para 01....................................... 43

ESQUEMA 3.2. Proposta biogenética para os derivados do ácido

diidrocinâmico ................................................................................................. 74

ESQUEMA 3.3. Proposta de fragmentação para 08 ...................................... 83

ESQUEMA 3.4. Proposta biogenética para 08............................................... 83

ESQUEMA 3.5. Proposta de fragmentação para 10 ...................................... 100

ESQUEMA 3.6. Proposta de fragmentação para os alcalóides

indolopiridoquinazolínicos ............................................................................... 108

ESQUEMA 3.7. Proposta biogenética para os alcalóides furoquinolínicos .... 109

ESQUEMA 3.8. Proposta biogenética para os alcalóides 2-quinolona .......... 110

ESQUEMA 3.9. Biogênese dos limonóides.................................................... 139

ESQUEMA 3.10. Proposta biogenética para 10............................................. 140

ESQUEMA 3.11. Proposta biogenética para 14............................................. 141

ESQUEMA 3.12. Proposta biogenética para 15............................................. 142

xiv

LISTA DE GRÁFICOS

GRÁFICO 1.1. Comparação da incidência de CVC no período de 1996 a

2005 no estado de São Paulo e parte do triângulo mineiro ............................ 10

SUBSTÂNCIAS ISOLADAS

Derivados do Ácido Diidrocinâmico:

OCH

2''

3''

4''

2''

3''

4''

OCH

2''

3''

4''

OCH

2''

3''

4''

Procedência: H. oreadica (T. Subterrâneo)

H. brasiliana (Folhas)

Isolamento: pgs 26, 29 e 34

Identificação: pgs 37 e 58

Procedência: H. oreadica (T. Subterrâneo e

Folhas)

Isolamento: pgs 26, 28, 29 e 33

Identificação: pgs 49 e 72

Procedência: H. oreadica ( T. Subterrâneo)

H. brasiliana (Folhas)

Isolamento: pgs 26, 28 e 34

Identificação: pg 54

Procedência: H. oreadica ( T. Subterrâneo)

Isolamento: pg 29 ( em mistura com 01)

Identificação:

Procedência: H. oreadica (T. Subterrâneo)

H. brasiliana (Folhas)

Isolamento: pgs 26 e 34

Identificação: pgs 44

Procedência: H. oreadica (T. Subterrâneo)

Isolamento: pg 30

Identificação: pg 66

2''

3''

4''

OCH

2''

3''

4''

xvi

Cumarina:

Derivado do Ácido Cinâmico:

Alcalóides:

14a

13a

12a

13a

14a

Procedência: H. oreadica (T. Subterrâneo)

Isolamento: pgs 26, 28 e 29 ( em mistura com 03)

Identificação: pg 72

Procedência: H. oreadica(T.Sub. e Folhas)

H. brasiliana (Folhas)

H. superba ( Tronco)

Isolamento: pgs 29, 33, 34 e 36

Identificação: pg 86

Procedência: H. oreadica (T. Subterrâneo)

Isolamento: pgs 28 e 29

Identificação:

Procedência: H. oreadica (T. subterrâneo)

Isolamento: pg 31

Identificação: pg 77

OCH

xvii

OCH

2'3'

Limonóides:

Procedência: H. oreadica (T.Sub. e Folhas)

H. superba (Tronco)

Isolamento: pgs 29, 33 e 36

Identificação: 103

Procedência: H. superba (Tronco)

Isolamento: pg 36

Identificação: 107

Procedência: H. oreadica (T.Sub. e Folhas)

Isolamento: pgs 30 e 33

Identificação: pg 113

xviii

Procedência: H. oreadica (T. Subterrâneo)

H. superba (Tronco)

Isolamento: pgs 31 e 36

Identificação: pg 123

Procedência: H. oreadica (T. Subterrâneo)

Isolamento: pg 31

Identificação: pg 132

xix

RESUMO

ESTUDO FITOQUÍMICO E AVALIAÇÃO DO POTENCIAL ANTIMICROBIANO DE

ESPÉCIES DE HORTIA (RUTACEAE): H. OREADICA, H. BRASILIANA E H.

SUPERBA – O estudo fitoquímico de Hortia descrito neste trabalho visa contribuir

com a quimiossistemática da família Rutaceae e também com a melhor

classificação do gênero dentro da mesma. O estudo das espécies H. oreadica, H.

brasiliana e H. superba levou ao isolamento de 15 substâncias, sendo, derivados

do ácido diidrocinâmico ácido 3-fenil-[2’,6’-dimetoxi-(3’,4’-O:5’’,6’’)-2’’,2’’-

dimetilpirano]propiônico (01), 3-fenil-[2’-metoxi-(3’,4’-O:5’’,6’’)-2’’,2’’-

dimetilpirano]propionato de metila (02), 3-fenil-[2’,6’-dimetoxi-(3’,4’-O:5’’,6’’)-2’’,2’’-

dimetilpirano]propionato de metila (03), 3-fenil-[2’,5’-dimetoxi-(3’,4’-O:5’’,6’’)-2’’,2’’-

dimetilpirano]propionato de metila (04), ácido 3-fenil-[2

’

-metoxi-(3

’

-O:5

’’

’’’

)-2

’’

dimetilpirano]propiônico (05), ácido 3-fenil-[2’,5’-dimetoxi-(3’,4’-O:5’’,6’’)-2’’,2’’-

dimetilpirano]propiônico (06), sendo que a estrutura 06 parece ser nova para a

espécie H. oreadica; a cumarina 5-metoxiseselina (07); o derivado do ácido

cinâmico E-ácido 3,4-dimetoxi-α(3-hidroxi-4-carbometoxifenil)cinâmico (08), novo

na literatura; os alcalóides rutaecarpina (09), 7,8-desidrorutaecarpina (10) inédita

no gênero Hortia, dictamina (11) e N-metilflindersina (12) e os limonóides guianina

(13), hortiolida E (14) e hortiolida G (15), dos quais a estrutura 14 está sendo

descrita pela primeira vez na espécie H. oreadica e 15 na literatura. O estudo

fitoquímico das espécies do gênero Hortia ainda não permite classificá-la

corretamente dentro da família. Hortia apresenta limonóides com anéis C e D

modificados, característicos de Meliaceae. No entanto a presença de metabólitos

como alcalóides, cumarina, derivados do ácido diidrocinâmico e cinâmico vêm

confirmar que Hortia pertence à família Rutaceae, embora não esteja claro seu

exato posicionamento dentro da mesma. A presença de limonóides bastante

modificados para Hortia poderia indicar que o gênero não pertença à Todallieae

ou Cusparieae, podendo estar posicionado separadamente dentro da família

Rutaceae. Vários ensaios biológicos foram realizados com os extratos e

compostos isolados, com uma coleção de compostos sintéticos e a lasiodiplodina,

composto isolado de um fungo patogênico. São relatadas as Concentrações

Inibitórias Mínimas de diversas substâncias frente a bactéria causal da Clorose

Variegada dos Citros, Xylella fastidiosa. As substâncias promissoras foram as

quinolinônicas sintéticas 2-metil-6-flúor-4-quinolona (S2) e 2-metil-5-metoxi-7-

hidróxi-4-quinolona (S4) e o alcalóide rutaecarpina (09), com CIM entre 0,5 e 1,0

mg/mL. Foi realizado a investigação do potencial antimicrobiano in vitro frente a

alguns patógenos bucais que permitiu determinar o extrato hexânico como o mais

promissor frente a todas as cepas ensaiadas e o limonóide guianina (13) e o

alcalóide dictamina (11) com os melhores valores de CIM, sendo 200 e 100

µg/mL, respectivamente. Os ensaios frente à patógenos de origem alimentar

revelaram que as substâncias lasiodiplodina e as sintéticas 2-metil-6-flúor-4-

quinolona (S2) e 2-metil-5,7-dimetoxi-4-quinolona (S4) foram as mais eficazes

dentre todas as ensaiadas. Portanto, a partir deste trabalho verificou-se que

algumas substâncias com propriedades antibacterianas revelaram importantes

fontes na descoberta de novos produtos com potencial antimicrobiano.

xxi

ABSTRACT

PHYTOCHEMICAL STUDY AND EVALUATION OF THE ANTIMICROBIAL

ACTIVITY OF SPECIES FROM HORTIA (RUTACEAE): H. OREADICA, H.

BRASILIANA E H. SUPERBA – The phytochemical study of Hortia in this work

aims to contribute with the chemosystematics of the Rutaceae and with the best

classification of the genus inside the family. The study of the species H. oreadica,

H. brasiliana and H. superba led us to isolate 15 compounds, such as the

dihydrocinnamic acids derivatives 3-phenyl-[2’,6’-dimethoxy-(3’,4’:5’’,6’’)-2’’,2’’-

dimethylpirano]propionic acid (01), methyl 3-phenyl-[2’-methoxy-(3’,4’:5’’,6’’)-2’’,2’’-

dimethylpirano]propionate (02), methyl 3-phenyl-[2’,6’-dimethoxy-(3’,4’:5’’,6’’)-

2’’,2’’-dimethylpirano]propionate (03), methyl 3-phenyl-[2’,5’-dimethoxy-

(3’,4’:5’’,6’’)-2’’,2’’-dimethylpirano]propionate (04), 3-phenyl-[2’-methoxy-

(3’,4’:5’’,6’’)-2’’,2’’-dimethylpirano]propionic acid (05), 3-phenyl-[2’,5’-dimethoxy-(3’,

4’-O:5’’,6’’)–2’’,2’’-dimethylpyrano]propionic acid (06), being structure 06 new for

specie H. oreadica; coumarin 5-methoxyseselin (07); cinnamic acid derivative E-

3,4-dimethoxy-α(3-hydroxy-4-carbomethoxyphenyl)cinnamic acid (08), new in

literature, the alkaloids rutaecarpine (09), 7,8-dehydrorutaecarpine (10) new in the

genus Hortia, dictamine (11), N-methylflindersine (12) and the limonoids guyanin

(13), hortiolide E (14) and hortiolide G (15), being structure 14 described for the

first time in the specie H. oreadica and 15 in literature. The phytochemical study of

the species from Hortia genus still not allow classify correctly it inside the family.

Hortia presents limonoids with C and D rings modified, characteristic of Meliaceae.

However the presence of metabolites such as alkaloids, coumarins,

dihydrocinnamic and cinnamic acids derivatives confirm that Hortia belongs the

Rutaceae family, even so are not clear its accurate positioning. The presence of

limonoids highly modified could indicated that genus can not belong nor to the

Todallieae and nor the Cusparieae, being located separately inside of the

Rutaceae family. Several biological assays had been performed with crude

extracts and compounds isolated from Hortia, with a collection of the synthetic

compounds and the lasiodiplodin, compound isolated from the pathogenic fungus.

The Minimum Inhibitory Concentration of many substances was related against

the bacteria Xylella fastidiosa that causes Citrus Variegated Chlorosis. The

promising substances were synthetic quinolinones 2-methyl-6-fluor-4-quinolone

xxii

(S2) and 2-methyl-5-methoxy-7-hydroxy-4-quinolone (S4) and the alkaloid

rutaecarpine (09) with MIC from 0.5 to 1.0 mg/mL. We have studied the in vitro

antimicrobial activity against oral pathogens that permitted to determine hexane

extract such as successful against all microorganisms assayed and limonoid

guyanin (13) and alkaloid dictamine (11) with the best MIC, being 200 and 100

µg/mL, respectively. The assays against alimentary pathogens revealed that

lasiodiplodin, 2-methyl-6-fluor-4-quinolone (S2) and 2-methyl-5,7-dimethoxy-4-

quinolone (S4) synthetics as the more effective among all substances. Therefore,

this work showed that several substances with properties antibacterial constitute

an important source for the discovery of new antimicrobial products.

xxiii

SUMÁRIO

1. Introdução................................................................................................. 01

1.1. Família Rutaceae..................................................................................... 02

1.2. Produtos Naturais com Potencial Antimicrobiano .................................... 03

1.3. Doenças Citrícolas................................................................................... 04

1.3.1. Clorose Variegada dos Citros (CVC) .................................................... 05

1.3.1.1 Xylella fastidiosa................................................................................. 07

1.3.2. Incidência da CVC................................................................................ 08

1.4. Doenças Bucais....................................................................................... 10

1.4.1. Patógenos Bucais................................................................................. 11

1.5. Doenças de Origem Microbiana Transmitidas Por Alimentos ................. 15

1.5.1. Bactérias de Origem Alimentar............................................................. 16

2. Objetivos................................................................................................... 19

3. Capítulo 1: Estudo Fitquímico das Espécies de Hortia ........................ 21

3.1. Procedimento Experimental..................................................................... 22

3.1.1. Materiais e Métodos............................................................................. 22

3.1.1.1. Métodos utilizados para o fracionamento e isolamento das

substâncias ..................................................................................................... 22

3.1.1.2. Métodos instrumentais utilizados para a identificação e elucidação

das estruturas ................................................................................................. 23

3.1.2. Preparação dos Extratos Brutos........................................................... 24

3.1.3. Fracionamento dos Extratos e Isolamento das Substâncias de H.

oreadica .......................................................................................................... 26

3.1.3.1. Fracionamento do Extrato Hexânico do Tronco Subterrâneo ........... 26

3.1.3.2. Fracionamento do Extrato Diclorometano do Tronco Subterrâneo ... 27

3.1.3.3. Fracionamento do Extrato Diclorometano das Folhas ....................... 33

3.1.4. Fracionamento do Extrato e Isolamento das Substâncias de H.

brasiliana ........................................................................................................ 34

3.1.4.1. Fracionamento do Extrato Diclorometano das Folhas ....................... 34

3.1.5. Fracionamento do Extrato e Isolamento das Substâncias de H.

superba ........................................................................................................... 35

3.1.5.1. Fracionamento do Extrato Metanólico do Tronco .............................. 35

3.1.5.2. Fracionamento da Fração Diclorometano do Extrato Metanólico do

Tronco ............................................................................................................. 35

3.2. Resultados e Discussão.......................................................................... 37

3.2.1. Derivados do Ácido Diidrocinâmico...................................................... 37

3.2.1.1. Determinação estrutural da substância 01........................................ 37

3.2.1.2. Determinação estrutural da substância 02........................................ 44

3.2.1.3. Determinação estrutural da substância 03........................................ 49

3.2.1.4. Determinação estrutural da substância 04........................................ 54

3.2.1.5. Determinação estrutural das substâncias 01 e 05 ............................. 58

3.2.1.6. Determinação estrutural da substância 06........................................ 65

3.2.1.7. Determinação estrutural das substâncias 03 e 07 ............................. 71

3.2.1.8. Biogênese dos Derivados do Ácido Diidrocinâmico .......................... 74

3.2.2. Derivados do Ácido Cinâmico............................................................... 75

3.2.2.1. Determinação estrutural da substância 08........................................ 75

3.2.2.2. Biogênese da substância 08.............................................................. 83

xxiv

3.2.3. Alcalóides............................................................................................. 84

3.2.3.1. Determinação estrutural da substância 09........................................ 84

3.2.3.2. Determinação estrutural da substância 10........................................ 92

3.2.3.3. Determinação estrutural da substância 11........................................ 101

3.2.3.4. Determinação estrutural da substância 12........................................ 105

3.2.3.5. Biogênese dos alcalóides.................................................................. 108

3.2.3.5.1. Alcalóides indolopiridoquinazolínicos............................................. 108

3.2.3.5.2. Alcalóides furoquinolínicos e 2-quinolonas..................................... 109

3.2.4. Limonóides........................................................................................... 111

3.2.4.1. Determinação estrutural da substância 13........................................ 111

3.2.4.2. Determinação estrutural da substância 14........................................ 121

3.2.4.3. Determinação estrutural da substância 15........................................ 130

3.2.4.4. Biogênese dos Limonóides................................................................ 139

4. Capítulo 2: Ensaios Biológicos............................................................... 145

4.1. Ensaios Bactericidas Frente a Xylella fastidiosa ..................................... 146

4.1.1. Procedimento Experimental.................................................................. 146

4.1.1.1. Preparação dos meios de cultivo ....................................................... 146

4.1.1.2. Crescimento de X. fastidiosa em Citrus sinensis................................ 149

4.1.1.3. Preparo do Inóculo para ensaio.......................................................... 149

4.1.1.4. Ensaios das Substâncias frente a X. fastidiosa ................................. 150

4.1.2. Resultados e Discussões ..................................................................... 155

4.2. Ensaios Bactericidas Frente à Patógenos Bucais ................................... 160

4.2.1. Procedimento Experimental.................................................................. 160

4.2.1.1. Substâncias Ensaiadas Frente à Patógenos Bucais ......................... 160

4.2.1.2. Metodologia dos Ensaios frente à Patógenos Bucais ....................... 162

4.2.2. Resultados e Discussões..................................................................... 165

4.2.2.1. Extratos de H. oreadica..................................................................... 165

4.2.2.2. Substâncias isoladas de H. oreadica ................................................. 166

4.2.2.3. Substâncias Quinolinônicas Sintéticas.............................................. 168

4.3. Ensaios Bactericidas Frente à Patógenos de Origem Alimentar ............. 172

4.3.1. Procedimento Experimental.................................................................. 172

4.3.1.1. Substâncias Ensaiadas Frente à Patógenos de Origem Alimentar ... 172

4.3.1.2. Metodologia dos Ensaios frente à Patógenos de Origem

Alimentar ......................................................................................................... 173

4.3.2. Resultados e Discussões..................................................................... 174

5. Conclusão................................................................................................. 179

6. Referências Bibliográficas....................................................................... 183

1. INTRODUÇÃO

_____________________________________________________

Introdução

1.1- Família Rutaceae

A ordem Sapindales, composta pelas famílias Rutaceae, Meliaceae,

Burseraceae, Simaroubaceae, Bierbersteiniaceae, Kirkiaceae, Anacardiaceae,

Sapindaceae e Nitrariaceae, é rica em diversas classes de metabólitos

secundários, sendo de maior ocorrência cumarinas, alcalóides, flavonóides,

quassinóides e limonóides.

A família Rutaceae caracteriza-se por uma grande diversidade de

metabólitos secundários não comuns nas demais famílias da ordem (DA SILVA et

al. 1987; WATERMAN, 1983) e é composta por muitos gêneros, dos quais

destaca-se o gênero Hortia, que compreende 12 espécies distribuídas desde o

Panamá e norte da América do Sul (em especial Amazônia) até o centro leste do

Brasil (JACOBS et al., 1987). Segundo levantamento bibliográfico há relatos de

estudo fitoquímico de 8 espécies de Hortia, sendo elas H. arborea (ANTONACCIO

et al., 1956; PACHTER et al., 1957; PACHTER et al., 1960; FERRACIN, 1992;

MONACHE et al., 1976; MONACHE et al., 1977), H. badinii (CORRÊA et al.,

1975; CORRÊA et al., 1979), H. longifolia (CORRÊA et al., 1976; PÁDUA, 1976),

H. brasiliana (PACHTER et al., 1961, BRAGA, 2005), H. colombiana (SUAREZ et

al., 1998, CUCA et al., 1998, SUAREZ et al., 2002), H. regia (JACOBS et al.,

1986; JACOBS et al., 1987; TINTO, 1992), H. oreadica (BRAGA, 2005) e H.

superba (BRAGA, 2005). São relatados para este gênero metabólitos secundários

como derivados do ácido diidrocinâmico, alcalóides (furoquinolínicos, 2-

quinolonas e β-indolopiridoquinazolínicos), cumarinas (simples, furanocumarinas

e piranocumarinas), terpenóides (sesquiterpenos, triterpenos e limonóides),

amidas e flavonóides ( flavonas e flavanona).

No entanto, o posicionamento taxonômico do gênero Hortia, revela

contradições entre os antigos botânicos. De Candolle dividiu a família Rutaceae

em duas tribos, Diosmeae e Cusparieae, posicionando o gênero Hortia nesta

última (DE CANDOLLE, 1824). Bentham & Hooker em 1862 propuseram

modificações taxonômicas, tornando a família Rutaceae um pouco mais

abrangente. Sete tribos foram formadas, adotando-se Cusparieae de onde o

gênero Hortia foi excluído e posicionado na tribo Toddalieae, mas com

comentários de que a classificação era duvidosa (BENTHAM e HOOKER, 1862).

O sistema de Engler proposto em 1931, com as modificações de Scholz é o mais

Introdução

aceito pelos atuais botânicos. Este é bastante semelhante àquele de Bentham &

Hooker, e também não esclarece a classificação de Hortia, mantendo-a em

Toddalieae (ENGLER, 1931; SCHOLZ, 1964). Dados de diversas fontes têm

mostrado que a divisão das subfamílias de Engler (1931) é superficial,

especialmente quanto ao reconhecimento de Toddalioideae.

A similaridade química entre as subfamílias Rutoideae e

Toddalioideae é tão pronunciada que levou Silva et al. (1988) a uní-las em uma

única subfamília, Rutoideae, subdividindo-a em 17 tribos.

Os gêneros americanos

de Toddalioideae vieram a constituir três tribos dentro de Rutoideae e Hortia foi

reposicionada em Cusparieae como fez anteriormente De Candolle (1824).

Porém, as justificativas para isto não foram novamente convincentes, mostrando

que os dados químicos revelam a mesma dificuldade para o posicionamento de

Hortia. A única justificativa plausível para reclassificá-la seria que Hortia é o único

representante americano na subtribo Toddaliinae. Na classificação de Silva et

al.(1988), Cuspariea (tribo informal “Cusparia”) engloba, além de Hortia, o gênero

Galipea, também neotropical. Engler em 1931 alocou em Toddaliinae gêneros da

África, Austrália e América que eram filogeneticamente menos relacionados entre

si do que com gêneros de outras tribos e até mesmo de outras subfamílias. Desta

forma, Hortia estaria mais próxima dos gêneros de Cusparieae do que dos

membros de Toddaliinae.

1.2- Produtos Naturais com Potencial Antimicrobiano

Não há dúvidas de que as plantas são fontes promissoras de

metabólitos secundários ativos (GELB et al., 2002) e fornecem muitos modelos

moleculares para o desenvolvimento de novas substâncias com atividades

biológicas. Assim sendo, no Brasil e no mundo buscam-se alternativas para o

desenvolvimento de uma cultura ecologicamente correta e que seja sustentável.

Para tal, um dos aspectos é o controle de doenças com o uso de extratos e

compostos biologicamente ativos isolados de espécies de plantas.

Investigações científicas relatam que cada vez mais microrganismos

patogênicos e fitopatogênicos desenvolvem resistência frente à antimicrobianos

comerciais. Neste aspecto antimicrobianos de origem natural, embora apresentem

efeitos nocivos como os sintéticos, podem também ser considerados eficazes no

Introdução

tratamento de doenças por apresentarem em sua composição substâncias

efetivas. De uma forma geral, substâncias naturais com potencial biológico

também são consideradas praticamente inofensivas ao meio ambiente pois

degradam-se com maior velocidade que as sintéticas; não deixando resíduos no

meio ambiente (DENNIS, 1987).

Entretanto, apesar das vantagens que produtos naturais

desempenham como possíveis antimicrobianos, o isolamento de pequena

quantidade de massa destes metabólitos das plantas faz com que se torne

necessário também a busca de compostos de partida de origem semi-sintética ou

sintética para novas substâncias antimicrobianas.

Com base nas informações acima, o grupo de Produtos Naturais

(PN) da UFSCar vem realizando ensaios biológicos com metabólitos secundários

obtidos de espécies vegetais bem como alguns compostos sintéticos frente à

bactéria fitopatogênica Xylella fastidiosa que afeta a citricultura brasileira, e frente

à patógenos bucais e de origem alimentar que representam um dos mais sérios

problemas sócio-econômicos e de saúde pública em âmbito mundial; visando a

busca de novos inibidores que sejam mais eficientes no combate destes

microrganismos.

1.3- Doenças Citrícolas

Pode-se definir doença como um distúrbio fisiológico, resultado de

uma irritação contínua causada por agentes bióticos ou abióticos e que pode levar

ao aparecimento de sintomas. Os agentes abióticos podem ser temperaturas

muito altas ou muito baixas, intoxicação por pesticidas ou minerais, falta ou

excesso de luz, umidade do solo, poluição atmosférica, acidez ou alcalinidade do

solo. Dentre os agentes bióticos, destacam-se os fungos, vírus, viróides e

bactérias (AGRIOS, 1997).

A cultura de citrus é um alvo constante de inúmeras pragas e

doenças, que encontrando condições favoráveis ao seu desenvolvimento são

capazes de causar danos irreversíveis. A quantidade e qualidade das frutas

cítricas são freqüentemente ameaçadas devido aos danos causados na planta,

que dependendo da intensidade do ataque, pode torná-la improdutiva ou levar à

sua erradicação. As principais doenças e pragas que afetam a citricultura

Introdução

brasileira são: Leprose dos Citros, Clorose Variegada dos Citros (CVC), Gomose

de Phytophthora, Greening, Cancro Cítrico, Declínio, Mancha Alternaria, Morte

Súbita dos Citros (MSC), Pinta Preta, Podridão Floral dos Citros, Rubelose,

Tristeza – Citrus Tristeza Virus (CTV) ( LARANJEIRA et al.; 1998).

1.3.1- Clorose Variegada dos Citros (CVC)

A clorose variegada dos citros (CVC), conhecida também como

“amarelinho dos citros”, é uma doença causada por uma bactéria gram-negativa

denominada Xylella fastidiosa. A CVC foi constatada pela primeira vez em 1987

em pomares da região Noroeste do Estado de São Paulo (ROSSETTI et al., 1990;

ROSSETTI & DE NEGRI, 1990) e vem se constituindo como a mais importante

doença citrícola no Brasil.

Em citros, logo após a primeira descrição da doença e antes mesmo

da causa ter sido comprovada em condições experimentais, levantamentos de

campo indicavam que todas as variedades de laranjas doces cultivadas, sendo as

principais a Pêra Rio, Natal, Hamlim e Valência, eram atacadas pela doença. As

tangerinas Ponkam e tangor Murcote, os limões e as limas ácidas Tahiti, de maior

expressão comercial, por não manisfestarem os sintomas típicos da CVC foram

caracterizados como resistentes. Estes resultados foram confirmados mais

recentemente em estudo de campo onde foram avaliados diversos híbridos e

espécies dos gêneros Citrus, Fortunela e Poncirus (LARANJEIRA et al., 1998).

Neste estudo também não foram observadas diferenças consideráveis no nível de

resistência dentro do grupo das laranjas doces, que poderia ser explorado

comercialmente. É possível que os materiais que não apresentaram sintomas da

CVC sejam tolerantes à doença, ou seja, permitindo o crescimento do patógeno

em seus tecidos, como observado com as tangerinas Cravo e Ponkan por LI et al.

(1996) e MACHADO et al. (1997), porém não expressando qualquer

sintomatologia ou perda de produção. Estas plantas poderiam, no entanto,

contribuir para o avanço da CVC nas variedades susceptíveis atuando como

fontes de inóculo veiculados pelas cigarrinhas.

Os sintomas da CVC manifestam-se apenas em ramos, folhas e

frutos. As raízes não apresentam anormalidade alguma. Inicialmente, pode-se

encontrar apenas um ou poucos ramos atacados na parte média ou superior da

Introdução

planta, mas, com o passar do tempo, toda a árvore pode apresentar os sintomas

típicos da anomalia. As plantas, quando muito afetadas, apresentam um aspecto

de debilidade geral, denotado pela coloração amarelada.

Contudo, o sintoma mais conhecido de CVC constitui-se de

pequenas manchas internervais amarelas na face superior da folha (FIGURA 1.1,

pg 06). Inicialmente, essas manchas não são muito extensas. A essas clorores

correspondem, na face inferior, manchas de coloração variando entre o vermelho

e o marrom. Em plantas muito afetadas pela CVC, é comum a presença de

desequilíbrios nutricionais, notadamente de zinco, magnésio e potássio

(ROSSETTI & DE NEGRI, 1990).

FIGURA 1.1: Sintomas típicos de CVC em folhas de laranja doce.

(Fonte: FUNDECITROS, 2008a)

Os sintomas nos frutos surgem sempre após o aparecimento dos

sintomas foliares e apenas nos ramos já afetados, havendo uma tendência à

frutificação em “pencas” ( ROSSETTI & DE NEGRI, 1990; LARANJEIRA, 1998).

Plantas afetadas apresentam sintomas de deficiência hídrica (murchamento de

folhas), principalmente nas horas mais quentes do dia e independente do nível de

encharcamento do solo, sintomas de deficiência mineral (particularmente zinco) e

redução no crescimento da copa e no tamanho dos frutos que em citros se tornam

impróprios para o consumo in natura ou comercialização. Em geral plantas de

citros afetadas pela X. fastidiosa não chegam a morrer, mas a vida útil das

plantações costuma ser bastante reduzida (FUNDECITRUS, 2008a)(FIGURA 1.2,

pg 07).

Introdução

FIGURA 1.2: Plantas com sintomas de CVC.

(Fonte: FUNDECITROS, 2008a)

1.3.1.1- Xylella fastidiosa

No Brasil, a bactéria X. fastidiosa tem causado muita preocupação,

principalmente nos últimos 15 anos, e sido alvo de vários estudos, como o que

resultou no seqüenciamento completo de seu genoma (SIMPSON et al., 2000),

por ser o agente causal de doenças que podem gerar grandes prejuízos nas

culturas de citros (CVC). Diferentemente da grande maioria das bactérias

fitopatogênicas, a bactéria X. fastidiosa é um microrganismo de difícil cultivo em

meios de cultura e que se limita ao xilema das plantas infectadas e aparelho bucal

dos insetos vetores, as cigarrinhas (PURCELL e HOPKINS, 1996). É através

desse grupo de insetos que, no campo, a bactéria é transmitida de uma planta à

outra. Sob condições experimentais, com maior ou menor eficiência, 11 espécies

transmitem o patógeno entre plantas cítricas (LOPES et al., 1996, ROBERTO et

al., 1996, FUNDECITRUS, 1999, KRÜGNER et al., 1998, YAMAMOTO et al.,

2002).

Previamente foi demonstrado que a bactéria é capaz de crescer

como um biofilme (MARQUES et al., 2002) e este biofilme poderia ser um fator

importante para a patogenecidade (SOUZA et al., 2003). Biofilmes são definidos

como uma matriz repleta de população microbiana aderidas umas às outras e nas

superfícies e interfaces (COSTERTON et al., 1995). A maneira como X. fastidiosa

coloniza o xilema, o que é facilmente observável em imagens feitas com

microscopia eletrônica (LOPES et al., 2000, CHAGAS et al., 1992, ROSSETI et

al., 1990, ALVES, 2003) e óptica, (QUEIROZ-VOLTAN e PARADELA FILHO,

1999) (FIGURA 1.3, pg 08) e as sintomatologias manifestadas por plantas

afetadas, sugerem, no entanto, que os danos resultam principalmente de um

Introdução

bloqueio no fluxo da água do solo para as partes aéreas das plantas e de um

constante desvio de nutrientes (OSIRO et al., 2004; DE SOUZA et al., 2004).

FIGURA 1.3: Vasos do xilema obstruído por células e células de X. fastidiosa

(Fonte: FUNDECITROS, 2008a)

1.3.2- Incidência de CVC

O Brasil é atualmente o maior produtor mundial de citros,

correspondendo a 25,1% da plantação mundial, seguido pelos Estados Unidos,

com 16,4% . A cultura encontra-se disseminada por todo o território nacional, com

grande importância econômica e social para diversos estados onde se situa as

dez principais culturas: São Paulo, Sergipe, Rio de Janeiro, Minas Gerais, Rio

Grande do Sul e Bahia (RODRIGUEZ et al., 1991). As maiores plantações são de

laranja (Citrus sinensis, 66%), tangerina ( C. reticulata, 15,4%), toranja ( C.

paradisi, 8,5%) e limão (C. limon, 6,8%).

O volume que representa nas exportações, a extensão em área

ocupada e o número de empregos diretos e indiretos gerados pelo setor citrícola

brasileiro, associados à rapidez com que a doença se disseminou para os

grandes centros produtores de laranja, provavelmente através de mudas

contaminadas (TUBELIS et al., 1992), têm feito da CVC um problema

preocupante e também bastante estudado. Levantamentos conduzidos pela

Fundecitrus a partir de 1996 nos meses que antecedem a colheita, mostram que

sua incidência na área nobre da citricultura, que compreende 850 mil hectares

localizados em 367 municípios das regiões sul, central, norte e noroeste de São

Paulo e sul do triângulo mineiro (AYRES, 2000), tem-se mantido em níveis

médios superiores a 30% (FUNDECITROS, 2008b). Pode-se verificar que a

região norte do Estado de São Paulo e parte do Triângulo Mineiro são as que

Introdução

apresentam maior incidência de CVC (FUNDECITROS, 2008b) (FIGURA 1.4, pg

09).

FIGURA 1.4: Zoneamento citrícola considerado no levantamento de CVC em

2005 no Estado de São Paulo e parte do Triângulo Mineiro

(Fonte: FUNDECITROS, 2008b)

Os níveis de danos econômicos da CVC, estimados em cem milhões

de dólares anuais, poderiam ser ainda maiores não fosse a adoção de medidas

conjuntas de controle pelos produtores. Estas envolvem plantio de mudas sadias,

poda de ramos sintomáticos, erradicação de plantas com sintomas generalizados

e controle químico dos vetores (FUNDECITRUS, 2008c). Atualmente existe

norma governamental que, desde janeiro de 2003, proíbe a comercialização em

todo o estado de São Paulo de mudas que não tenham sido produzidas em

viveiros telados totalmente livres de insetos (FUNDECITRUS, 2008d).

Observando o levantamento realizado pela Fundecitrus no período de 1996 a

2005 (GRÁFICO 1.1, pg 10), pode-se verificar que nos anos de 2004 a 2005,

houve um pequeno decréscimo na incidência de CVC, porém praticamente

insignificante, quando comparado com as perdas que a doença causa para os

setores envolvidos.

Introdução

Gráfico 1.1: Comparação da incidência de CVC no período de 1996 a 2005 no

Estado de São Paulo e parte do Triângulo Mineiro

(Fonte: FUNDECITROS, 2008b)

Desta forma, pode-se concluir que os métodos de manejos atuais da

CVC não são eficazes, sendo necessário portanto empreendimento de esforços

visando um conhecimento mais aprofundado de vários aspectos desses

patossistemas de forma que medidas mais apropriadas sejam desenvolvidas.

1.4- Doenças Bucais

As doenças bucais parecem ser devido a uma transição de uma

associação comensal para uma relação oportunística com o hospedeiro. As

bactérias da microbiota bucal podem sobreviver na cavidade oral por serem

menos susceptíveis aos mecanismos imunológicos ou por serem capazes de

sobrepujá-los. Desta forma, um desequilíbrio no ecossistema bucal pode acarretar

a emergência de bactérias potencialmente patogênicas. Para a compreensão dos

processos envolvidos na cariogênese e nas doenças periodontais é necessário

um entendimento da ecologia da cavidade oral e a identificação dos fatores

responsáveis pela transição da microbiota oral de uma associação comensal para

uma relação patogênica com o hospedeiro.

As características ambientais da cavidade oral, tais como alta

umidade, temperatura relativamente constante de 34 a 36°C, pH próximo da

neutralidade e disponibilidade de nutrientes (NASCIMENTO et al., 2004),

permitem o estabelecimento de uma microbiota altamente complexa, composta

Introdução

por cerca de 500 grupos bacterianos que habitam as diversas áreas da boca. Os

microrganismos que colonizam os dentes produzem uma aderência que os

capacitam a desenvolver um biofilme bacteriano que se adere à superfície dos

dentes, formando comunidades microbianas organizadas em uma matriz

complexa, composta de produtos extracelulares microbianos, constituintes

salivares, restos alimentares, células mortas e descamadas da boca. Este biofilme

é denominado placa bacteriana e é a causa principal das cáries e das doenças

periodontais (MARCOTTE & LAVOIE, 1998).

A composição da microbiota oral varia com a idade, hábitos

alimentares, hormônios, fluxo salivar, condições imunológicas e outros fatores

como higienização e alcoolismo. A colonização da cavidade oral por

microrganismos tem início de seis a dez horas após o nascimento. As espécies

pioneiras são as do gênero Streptococcus e provêm principalmente da mãe.

1.4.1- Patógenos Bucais

A distribuição das bactérias bucais varia qualitativa e

quantitativamente de acordo com o habitat. Bactérias do grupo Streptococcus

como S. mutans, S. sobrinus, S. cricetus, S. rattus e S. sanguinis são encontrados

em grandes números nos dentes enquanto que S. salivarius é isolada

principalmente da língua. As espécies S. mutans e S. sanguinis aparecem na

cavidade oral somente após a erupção dos dentes.

A complexidade das comunidades bacterianas nas placas

bacterianas torna difícil a determinação de um agente cariogênico específico. Há

fortes evidências de que bactérias tais como S. mutans, S. sobrinus e

Lactobacillus acidophilus estejam envolvidas na iniciação e progressão das

cáries, respectivamente. Estes dois grupos bacterianos são capazes de

metabolizar carboidratos em ácidos (primariamente ácido lático) e tolerar um

ambiente com pH baixo. Contudo, grandes quantidades de S. mutans podem ser

encontradas em placas bacterianas sem evidência de cáries.

Dietas ricas em sacarose contribuem para a cariação dos dentes

porque o S. mutans produz um polissacarídeo de aderência específica a partir da

sacarose que é substrato para a produção do ácido lático. Bactérias láticas como

Lactobacillus acidophilus produzem ácido lático que dissolvem o fosfato de cálcio

Introdução

do esmalte dos dentes. A S. mutans pode, também, causar endocardite

subaguda. Os microrganismos predominantes da placa bacteriana encontram-se

na TABELA 1.1 (pg 12).

TABELA 1.1: Bactérias predominantes na placa bacteriana

(Fonte: MORETTI, 2007)

Bactérias Predominantes na Placa Bacteriana

Cocos Gram-positivos

facultativos à oxigênio

Streptococcus (S. mutans; S. sobrinus; S. cricetus)

Bacilos Gram-positivos

facultativos à oxigênio

Actinomyces

Bacilos Gram-negativos

anaeróbios estritos

Porphyromonas (P. gingivalis; P. endodontalis);

Prevotella (P. melaninogenica; P. intermédia; P.

loescheii; P. denticola)

As imagens abaixo foram obtidas por micrografia eletrônica de

varredura e de transmissão, respectivamente. A FIGURA 1.5 (pg 12) mostra

bactérias orais aderidas umas sobre as outras formando filamentos de bactérias

empilhadas. Na FIGURA 1.6 (pg 13) pode-se observar a superfície do 3º molar

humano recoberta com Streptococcus sobrinus.

FIGURA 1.5: Micrografia eletrônica de varredura de microrganismos compondo

uma placa dental

(Fonte: MORETTI, 2007)

Introdução

FIGURA 1.6: Micrografia eletrônica de transmissão de S. sobrinus sobre a

superfície dental

(Fonte: MORETTI, 2007)

A placa dental pode ser prontamente visualizada logo após um ou

dois dias sem medidas de higiene bucal. A placa é branca, acinzentada ou

amarela. O movimento dos tecidos e dos alimentos sobre os dentes resulta na

remoção mecânica da placa, nos dois terços coronários da superfície do dente,

ficando a placa localizada no terço gengival da superfície dentária. A localização e

o ritmo de formação da placa variam entre os indivíduos. Na ausência de medidas

de higiene bucal, a placa continua acumulando até que seja alcançado um

equilíbrio entre as forças de remoção da placa e as forças de formação

(MESQUINI et al., 2006). O processo de formação da placa pode ser dividido em

quatro fases (FIGURA 1.7, pg 14). Na fase 1 observa-se a adsorção molecular

para a formação do biofilme; na fase 2 ocorre a adesão bacteriana de

microrganismos isolados; na fase 3 há um aumento na produção da matriz

extracelular e multiplicação das bactérias aderidas; na fase 4 a adsorção

seqüencial de novas bactérias formam um biofilme maduro e complexo

(NEWMAN et al., 2004).

Introdução

FIGURA 1.7. Fases da formação da placa

(Fonte: LINDHE et al., 2005)

Após a formação do biofilme, inicia-se um processo de propagação

sistêmica de infecções periodontais, ou o ataque da placa dental que enfatiza a

necessidade de um tratamento específico da infecção por biofilme subgengival.

As infecções contidas na cavidade bucal podem repercurtir no organismo como

um todo. Os micróbios disseminam-se sobre a superfície das mucosas úmidas e

quentes. Alguns patógenos aderem às células epiteliais ou proliferam para o

interior dos tecidos. Várias bactérias e fungos apresentam a capacidade de

invadir o interstício, em função de sua motilidade ou da produção de enzimas

líticas. Microrganismos também podem atingir os vasos linfáticos, alcançando os

linfonodos e, daí, a corrente sanguínea. Assim, as infecções estafilocócicas, ou

mesmo estreptocócicas, não tratadas podem progredir levando a uma endocardite

infecciosa. Muitas vezes, as principais manifestações de doenças infecciosas

surgem em locais distantes da entrada do agente patogênico (COTRAN et al.,

1996).

Devido à problemas conhecidos no tratamento de doenças

periodontais causadas por microrganismos resistentes a antibióticos e devido às

dificuldades encontradas por laboratórios na descoberta de novas moléculas com

propriedades antimicrobianas, pesquisas nesta área têm se mantido restrita à

poucos pesquisadores. Na realidade, algas, fungos e plantas superiores

constituem atualmente importantes fontes para a prosperação de novas

Introdução

moléculas bioativas, seja pelo uso direto de seus metabólitos secundários ou pelo

emprego de derivados biossintéticos ou semi-sintéticos, os quais são produzidos

com o objetivo de promover uma redução do número de microrganismos viáveis,

ao inibir sua proliferação ou causar sua morte celular.

1.5- Doenças de Origem Microbiana Transmitidas por Alimentos

Os alimentos de origem animal ou vegetal, frescos ou processados,

incluindo a água, podem veicular diversos microrganismos patógenos,

causadores de diversas perturbações fisiológicas nas pessoas que os consomem.

Os alimentos que, eventualmente, estejam contaminados por microrganismos

causadores de doenças, ao serem ingeridos, permitem que os patógenos ou seus

metabólitos invadam os fluídos ou os tecidos do hospedeiro potencializando

algumas doenças graves, como por exemplo, a tuberculose e a febre de Malta

também conhecida como febre ondulante, resultantes da ingestão de leite não

pasteurizado ou de queijos, em particular queijos frescos, contaminados por

populações bacterianas, de Mycobacterium bovis e M. tubercolosis, ou por

Brucella abortus, agentes respectivamente responsáveis pela doença referida

(DENNIS,1987).

As doenças de origem alimentar representam um perigo de grande

relevância para a saúde humana e para a economia dos indivíduos, famílias e

nações e podem ser provocadas por diversos grupos de microrganismos,

incluindo bactérias, fungos, protozoários e vírus. As bactérias, pela sua

diversidade e patogenia, constituem, de longe, o grupo microbiano mais

importante e vulgarmente associado às doenças transmitidas pelos alimentos e

portanto este grupo foi o foco deste estudo. Os alimentos podem ser

contaminados por bactérias patogênicas para o homem, como resultado de

deficientes condições de higiene durante o seu processamento, quer a partir de

pessoas ou animais doentes, quer a partir de fezes provenientes de indivíduos

infectados. Os alimentos podem, também, constituir um perigo para a saúde

pública, devido ao crescimento excessivo de populações bacterianas na

superfície ou no interior dos mesmos, oriundas do meio ambiente capazes de

produzir toxinas (exotoxinas), que ao serem ingeridas com o alimento podem

causar graves problemas (PELCZAR et al., 1980).

Introdução

1.5.1- Bactérias de Origem Alimentar

Os principais gêneros bacterianos envolvidos no mecanismo de

infecção alimentar são: Escherichia, Salmonella, Shigella, Vibrio e Bacillus.

O gênero Escherichia é composto por uma única espécie: E. coli, o

ser vivo mais estudado e conhecido do Homem. Praticamente todos os alimentos,

quer de origem vegetal, quer de origem animal que não tenham sido objetos de

processamento, podem veicular a E. coli, desde que, em algum momento, tenham

sido sujeitos a poluição fecal. E. coli já provocou um surto nos Estados Unidos

em 1968, devido à ingestão de água não clorada, proveniente de poço artesiano,

e provavelmente contaminada com fezes humanas. Vários surtos de origem

alimentar ocorrerram na Inglaterra. Um deles em 1967, através da ingestão de

carne de porco previamente preparada, e outro em 1973, atribuído à ingestão de

torta de carne contaminada (DOYLE E CLIVER,1990). Este tipo de microrganismo

pode se difundir através da água, alimentos e pelo contato pessoa a pessoa.

Poucos alimentos tem sido associados a surtos de toxinfecção alimentar

provocados por este grupo, mas salmão, carne de aves, leite e queijo Camembert

tem sido veículos. Um dos casos mais alarmantes de infecção alimentar por E.

coli ocorreu nos Estados Unidos em 1971, em que aproximadamente 380

pessoas ingeriram queijo Camembert contaminado. O queijo era de origem

francesa e continha E. coli O:124 em contagens de 105–107

microrganismos/grama (DOYLE e CLIVER, 1990). O período de incubação da

doença varia de 3 a 9 dias, com média de 4 dias, e duração da doença varia de 2

a 9 dias, também com média de 4 dias.

O gênero Salmonella é composto por três principais espécies que

estão associadas às infecções alimentares: S. typhimurium, S. enteritidis e S.

newport, responsáveis pelos maiores incidentes; esta última espécie produz uma

enterotoxina de natureza lipopolissacarídica com elevado peso molecular. Os

alimentos mais susceptíveis à contaminação por Salmonelas são o leite, queijos,

chocolates, carnes frescas, nomeadamente, carcaças de aves. A FIGURA 1.8 (pg

17) foi obtida via microscopia de varredura e mostra algumas colônias de

Salmonella.

As espécies do gênero Shigella são os agentes causais da

disenteria bacilar no Homem, tendo-se isolado quatro espécies associadas a esta

Introdução

doença no Homem: S. dysenteriae, S. boydii, S. flexneri e a S. sonnei. Estas

espécies são restritas aos humanos, sendo a poluição fecal a sua principal via de

contaminação e dispersão.

FIGURA 1.8: Colônias de Salmonella

(Fonte: FUNDACION ANNA VÁSQUEZ, 2007)

O gênero Vibrio inclui duas espécies patogêneas para o Homem,

denominadas, V. cholerae, responsável pela cólera, e V. parahaemoliticus, bem

adaptada aos ambientes marinhos e associada às infecções alimentares por

ingestão de peixe, moluscos e crustáceos contaminados.

O gênero Bacillus compreende uma única espécie: Bacillus cereus,

que habita preferencialmente o ar, o solo, águas e diferentes alimentos de origem

vegetal (cereais), lacticínios e produtos cárneos. A FIGURA 1.9 (pg 17) ilustra

várias colônias de B. cereus.

FIGURA 1.9: Colônias de Bacillus cereus

(Fonte: WIKIPÉDIA, 2007)

Introdução

Os sintomas causados por doenças de origem microbiana

transmitidas por alimentos podem ser simplesmente incômodos, sem gravidade

maior, ou muitas vezes levar à quadros clínicos de alto risco ou mortes. Por isso é

imprescindível a adoção de medidas que evitem o desenvolvimento dessas

doenças, como por exemplo, inibir a proliferação destes microrganismos no

ambiente, com substâncias ativas que sejam de fato eficientes e não prejudiciais

à saúde.

2. OBJETIVOS

_____________________________________________________

Objetivos

Este trabalho teve como objetivo principal o isolamento e elucidação

estrutural de metabólitos secundários de Hortia oreadica, H. brasiliana e H.

superba, visando a aplicação dos resultados na investigação de vários problemas,

entre eles:

ª Quimiossistemática do gênero Hortia: A classificação do gênero Hortia

dentro da família Rutaceae ainda é duvidosa. A avaliação de várias

espécies de Hortia teve como objetivo o isolamento de metabólitos

secundários que pudessem contribuir para o posicionamento

quimiossistemático do gênero dentro da família. Para isto várias partes

vegetais das espécies H. oreadica Groppo, Kallunki & Pirani, H. brasiliana

Vand. Ex DC e H. superba consistiram o material de estudo deste trabalho.

ª Investigar o potencial antibacteriano de substâncias isoladas de espécies

de Hortia e substâncias quinolinônicas sintéticas frente à X. fastidiosa,

visando o controle da CVC que é uma das doenças mais importantes da

citricultura brasileira.

ª Avaliar a atividade antibacteriana in vitro de extratos e substâncias isoladas

de Hortia, bem como uma série de substâncias sintéticas frente à

patógenos bucais e de origem alimentar, com o objetivo de encontrar

substâncias antibacterianas capazes de combater agentes causadores de

doenças periodontais e microrganismos presentes em alimentos,

responsáveis por inúmeras doenças no homem.

3. CAPÍTULO 1:

ESTUDO FITOQUÍMICO DAS ESPÉCIES DE HORTIA

_____________________________________________________

Estudo Fitoquímico das Espécies de Hortia

3.1- PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL

3.1.1- Materiais e Métodos

3.1.1.1- Métodos utilizados para o fracionamento e isolamento

das substâncias

a) Fracionamentos por Cromatografia em Coluna (CC), utilizando as seguintes

fases estacionárias:

 Sílica gel 60 (70-230 Mesh ASTM), MERCK

 Sílica gel (230-400 Mesh ASTM), MERCK

 Celulose microcristalina, VETEC

 Sephadex LH-20

 Florisil (230-400 Mesh ASTM)

b) Separação de misturas de substâncias via Cromatografia em Camada Delgada

Preparativa (CCDP) utilizando:

 Cromatoplaca de sílica gel 60 HF

254

em alumínio, MERCK

 Placa preparativa de sílica gel 60 HF

254

em vidro, MERCK

c) Separação de misturas de substâncias via Cromatografia Líquida de Alta

Eficiência (CLAE), utilizando os cromatógrafos:

 SHIMADZU SCL-10A, (condições preparativas);

 SHIMADZU modelo LC-6AV, (condições preparativas com válvula de

reciclo (CLAE-R) e “loop” de 2 mL)

Com os seguintes detectores:

 Espectrofotômetro UV-VIS. Modelo SPD- GAV, Shimadzu para CLAE-R;

 Detector de índice de refração Shimadzu VIR-6AV para CLAE-R.

Estudo Fitoquímico das Espécies de Hortia

d) Solventes utilizados no fracionamento e identificação dos compostos:

 Solventes comerciais MERCK, SINTH, VETEC, LABSYNTH e outros

destilados na sala de destilação do Departamento de Química da UFSCar

 Solventes grau HPLC da JTB;

 Solventes deuterados da MERCK e ALDRICH.

Evaporadores rotatórios utilizados para preparar e fracionar extratos:

 BUCHI, rotavapor R-114, equipado com banho BUCHI B-480 e recirculador

refrigerado NESLAB, modelo CFT-25 mantido a 5°C.

 BUCHI, rotavapor R-200, equipado com banho BUCHI 490 e recirculador

refrigerado NESLAB, modelo CFT-25 mantido a 5°C.

f) Liofilizador utilizado para extratos hidroalcoólicos:

 Modelo E.C. Modulyo-Pump Savant VLP 80

3.1.1.2- Métodos instrumentais utilizados para a identificação e

elucidação das estruturas

a) Ressonância Magnética Nuclear (RMN), utilizando as técnicas de RMN de

H e

C, COSY, HMBC, HSQC, g-NOESY via os seguintes aparelhos:

 BRUKER modelo DRX 400 (9,4 Tesla)

 BRUKER modelo ARX 200 (4,7 Tesla)

b) Espectrometria de massas, utilizando os seguintes aparelhos:

 Cromatógrafo de fase gasosa Shimadzu GC-17A, equipado com uma

coluna DB

L= 30m, Φ= 0,32mm e filme= 0,25µm

acoplado ao espectrômetro de

massas de baixa resolução HP-2576

 Cromatógrafo de fase gasosa acoplado ao espectrômetro de massas de

baixa resolução Shimadzu CG-EM QP5000, equipado com uma coluna HP1

25m, Φ= 0,20mm e filme= 0,25µm

 Espectrômetro de massas ESI-MS e DCI-MS de baixa resolução VG

Platform II (Fisons).

Estudo Fitoquímico das Espécies de Hortia

3.1.2- Preparação dos Extratos Brutos

A espécie H. brasiliana Vand. Ex DC foi coletada em 11 de maio de

2000, no município de Linhares, Espirito Santo. As espécies H. superba e H.

oreadica Groppo, Kallunki & Pirani foram coletas de 21 a 23 de janeiro de 2001

em uma Reserva DUCKE no município de Itacoatiara, Amazonas. Todas as

espécies foram identificadas pelo Prof. Dr. José Rubens Pirani, do Departamento

de Botânica, Instituto de Biociências da Universidade de São Paulo (USP-SP) e

as exsicatas encontram-se depositadas no mesmo instituto. A FIGURA 3.1 (pg

24) mostra três árvores de espécies de Hortia, sendo na ordem da esquerda para

a direita, H. brasiliana, H. oreadica e H. superba.

As partes vegetais das espécies de Hortia foram secas em estufa de

circulação a 40°C durante aproximadamente 10 dias e posteriormente trituradas

em moinho. O material seco e moído foi percolado com solventes para extração

de metabólitos secundários, em ordem crescente de polaridade [Hexano (EH),

Diclorometano (ED), Metanol (EM) e em alguns casos, uma mistura na proporção

1:1 de Metanol:Água (EMA)] a temperatura ambiente com três agitações por dia.

A extração para cada solvente perpassou-se três dias com uma troca de solvente

por dia, totalizando doze dias, sendo três para cada solvente. O FLUXOGRAMA

3.1 (pg 25) ilustra o procedimento de formação dos extratos. A preparação dos

extratos deu-se no período de fevereiro a maio de 2001.

FIGURA 3.1: Espécies de Hortia (H. brasiliana, H. oreadica e H. superba)

Estudo Fitoquímico das Espécies de Hortia

FLUXOGRAMA 3.1: Preparação dos extratos das espécies de Hortia

a) Extração com Hexano

b) Extração com Diclorometano

c) Extração com Metanol

d) Extração com mistura de Metanol/Água na proporção de 1:1

Os extratos foram concentrados em rotaevaporador e no caso dos

extratos hidroalcóolicos liofilizados; a seguir todos os extratos foram conservados

em refrigerador para evitar degradação dos mesmos. As massas das partes

vegetais e dos extratos obtidos a partir de cada uma delas está descrito na

TABELA 3.1 (pg 25).

TABELA 3.1 - Massas obtidas de material vegetal e extratos

H. brasiliana Massas de Extratos Obtidas (g)

Material Vegetal

Massa Vegetal

(g)

EH ED EM EMA

Tronco 938 1,6 2,9 26,2 ●

Folhas 655 16,0 21,7 25,9 ●

Casca 270 1,0 1,1 5,6 ●

H. oreadica Massas de Extratos Obtidas (g)

Tronco 2.475 8,2 8,4 50,6 ○

Tronco Subterrâneo 3.325 85,9 67,6 244,0 ●

Folhas 3.180 93,0 161,0 42,0 ○

H. superba Massas de Extratos Obtidas (g)

Tronco 2.280 0,96 8,2 18,1 ○

Casca 800 0,43 3,2 1,6 ○

● Extratos preparados somente para ensaio biológico

○ Extratos não preparados

Estudo Fitoquímico das Espécies de Hortia

3.1.3- Fracionamento dos Extratos e Isolamento das

Substâncias de H. oreadica

3.1.3.1- Fracionamento do Extrato Hexânico do Tronco

Subterrâneo

O extrato hexânico do tronco subterrâneo de H. oreadica (EHTSHB)

foi fracionado em um funil de placa sinterizada sob vácuo utilizando-se sílica gel

70-230 mesh, o que forneceu 4 subextratos (FLUXOGRAMA 3.2, pg 26). A partir

da obtenção de um espectro de RMN de

H dos 4 subextratos, o subextrato

EHTSHB(D) foi escolhido para refracionamento (FLUXOGRAMA 3.3, pg 27) por

apresentar sinais relativos à substâncias de interesse como derivados do ácido

diidrocinâmico e cumarinas.

O subextrato EHTSHB(A) proporcionou o isolamento do derivado do

ácido diidrocinâmico ácido 3-fenil-[2’,6’-dimetoxi-(3’,4’-O:5’’,6’’)-2’’,2’’-

dimetilpirano]propiônico 01. Os subextratos EHTSHB(H) e EDTSHB(M) foram

refracionados mas não forneceram nenhum metabólito de interesse.

FLUXOGRAMA 3.2: Fracionamento do extrato EHTSHB

Cromatografia à vácuo em funil de placa sinterizada

Sílica gel (70-230 mesh)

= 10

0cm

h= 20

0cm

2L Hex.

2L Dicl.

3L MeOH.

1L AcOEt.

EHTSHB

5,0 g

EHTSHB(H)

0,155 g

EHTSHB(D)

2,922 g

EHTSHB(A)

1,20 g

EHTSHB(M)

0,581 g

Substância

1,20 g

Estudo Fitoquímico das Espécies de Hortia

FLUXOGRAMA 3.3: Resumo do fracionamento do subextrato EHTSHB(D)

Do subextrato EHTSHB(D) foram isolados os derivados do ácido

diidrocinâmico 3-fenil-[2’-metoxi-(3’,4’-O:5’’,6’’)-2’’,2’’-dimetilpirano]propionato de

metila (02), 3-fenil-[2’,6’-dimetoxi-(3’,4’-O:5’’,6’’)-2’’,2’’-dimetilpirano]propionato de

metila (03), 3-fenil-[2’,5’-dimetoxi-(3’,4’-O:5’’,6’’)-2’’,2’’-dimetilpirano]propionato de

metila (04) e a mistura do derivado do ácido diidrocinâmico (03) com a cumarina

5-metoxiseselina (07).

3.1.3.2- Fracionamento do Extrato Diclorometano do Tronco

Subterrâneo

O extrato diclorometano do tronco subterrâneo de H. oreadica

(EDTSHB) foi fracionado em um funil de placa sinterizada sob vácuo utilizando-se

sílica gel 70-230 mesh, o que forneceu 5 subextratos (FLUXOGRAMA 3.4, pg 28).

A partir da obtenção de um espectro de RMN de

H dos 5 subextratos, o

subextrato EDTSHB(A) foi escolhido para ser refracionado devido a presença de

sinais interessantes que poderiam estar relacionados à substâncias de interesse.

O espectro do subextrato EDTSHB(D1) apresentou uma quantidade elevada de

material graxo e por este motivo foi reservado. O subextrato EDTSHB(D2) foi

refracionado, porém nenhuma das frações provenientes foram trabalhadas. O

subextrato EDTSHB(M) também foi refracionado, mas não forneceu nenhum

metabólito puro.

EHTSHB(D)

2,92 g

Cromatografia por adsorção

Sílica gel (230-400 Mesh)

Φ= 2,3 cm, h= 48,0 cm

Hex:AcOEt 10%

1-9

0,511 g

10-18

0,150 g

19-34

0,473 g

Substância

0,473 g

35- 40

0,710 g

0,155 g

42- 50

0,121 g

0, 039 g

52 a 56

0, 650 g

Substância

0,155 g

Substância

03 e 07

0,121 g

Substância

0,039 g

Estudo Fitoquímico das Espécies de Hortia

FLUXOGRAMA 3.4: Fracionamento do extrato EDTSHB

EDTSHB

10,0 g

EDTSHB(H)

0,923 g

EDTSHB(D2)

1,534 g

EDTSHB(A)

4,50 g

EDTSHB(M)

1,221 g

EDTSHB(D1)

1,10 g

(

)

1 a

(

)

(M)1 a (M)8

CCDP

Celulose Microcristalina

Φ= 5,3 cm, h= 20,0 cm

Hex

→ MeOH

Cromatografia à vácuo em funil de placa sinterizada

Sílica gel (70-230 Mesh)

Φ= 10,0 cm, h= 18,0 cm

1 L Hex. 1 L Dicl. 1 L Dicl. 1L AcOEt 1 L MeOH

romatogra

a por a

sorç

Sílica gel (230-400 mesh)

φ = 5,2 cm, h = 28,0cm

Hex → MeOH

Estudo Fitoquímico das Espécies de Hortia

FLUXOGRAMA 3.5: Resumo do fracionamento do subextrato EDTSHB(A) e de

sua fração 15-17

EDTSHB(A)

4,5 g

Cromatografia por adsorção

Sílica gel (70-230 Mesh)

φ = 5,3 cm, h = 41,0cm

Hex→ MeOH

(A) 12-13

0,083 g

(A)1-11

0,021 g

(A) 14

0,157 g

(A) 15-17

0,213 g

1- 2

0,004 g

0,003 g

4 - 6

0,038 g

0,039 g

8 - 9

0,087 g

10 - 11

0,038 g

CLAE-Reciclante *

Substância

0,004 g

Substância

0,039 g

Substâncias

03 e 07

0,017 g

1- 13

0,004 g

0,009

15-17

0,017

18- 25

0,030 g

38-44

0,008

Substância

0,009g

Cromatografia por adsorção

Sílica gel(70-230 Mesh)

φ = 1,0 cm, h = 14,0 cm

Hex→ MeOH

26-37

0,015 g

una

reparat

(45

cm, part

µm

)

;

oop:

500

Fase Normal com Eluição Isocrática: MeOH: Dicl. 1:1; Detector UV λ: 217 e 254 nm; Vazão: 3 mL/min.

Estudo Fitoquímico das Espécies de Hortia

FLUXOGRAMA 3.6: Resumo do fracionamento do subextrato EDTSHB(A) e de

suas frações 18-19 e 20.

FLUXOGRAMA 3.7: Resumo do fracionamento do subextrato EDTSHB(A) e de

suas frações 23 e 25-26.

EDTSHB(A)

4,5 g

Cromatografia por adsorção

Sílica gel (70-230 Mesh)

φ = 5,3 cm, h = 41,0cm

Hex→ MeOH

(A)1-17 (A)18-19

0,123 g

(A)20

0,264 g

(A)21-22

0,187 g

CLAE

ante

1-6

0,029 g

7-8

0,017 g

9-10

0,042 g

11-13

0,031 g

Substância

0,017 g

Substância

0,042g

Substância

0,031g

Substância

0,187 g

CLAE

ante

1-3

0,032 g

4-5

0,074 g

6-7

0,088 g

8-9

0,056 g

Substância

0,056 g

Substâncias

01 e 05

0,074 g

EDTSHB(A)

4,5 g

Cromatografia por adsorção

Sílica gel (70-230 Mesh)

φ = 5,3 cm, h = 41,0cm

Hex→ MeOH

(A)18-22 (A)25-26

0,136 g

Substância

0,025 g

(A)23

0,202 g

(A)24

0,025 g

1-2

0,029 g

3-4

0,042 g

5-6

0,062 g

Substância 03

0,042 g

Substâncias

03 e 07

0,062 g

1-2

0,058 g

3- 4

0,126 g

0,012 g

Substâncias

01 e 05

CLAE

ante

CLAE

una

reparat

(45

cm, part

µm

)

;

oop:

500

Fase Normal com Eluição Isocrática: MeOH: Dicl. 1:1; Detector UV λ: 217 e 254 nm; Vazão: 3 mL/min.

Estudo Fitoquímico das Espécies de Hortia

FLUXOGRAMA 3.8: Resumo do fracionamento do subextrato EDTSHB(A) e de

sua fração 28-30.

FLUXOGRAMA 3.9: Resumo do fracionamento do subextrato EDTSHB(A) e de

sua fração 32-34.

EDTSHB(A)

4,5 g

Cromatografia por adsorção

Sílica gel (70-230 Mesh)

φ = 5,3 cm, h = 41,0cm

Hex→ MeOH

(A)18-26

Substância

0,397 g

(A)28-30

0,397 g

(A)27

0,024 g

(A)31

0,110 g

EDTSHB(A)

4,5 g

Cromatografia por adsorção

Sílica gel (70-230 Mesh)

φ = 5,3 cm, h = 41,0cm

Hex→ MeOH

(A)26-31

(A)32-34

0,922 g

CLAE

1-3

0,078 g

4-6

0,135 g

7-8

0,342 g

9-12

0,329 g

Substância

0,342 g

(A)35-37

0,140 g

una

repara

(45

cm, par

tí

µm

)

oop:

500

Fase Normal com Eluição Isocrática: MeOH: Dicl. 1:1, Detector UV λ: 217 e 254 nm, Vazão: 3 mL/min.

Estudo Fitoquímico das Espécies de Hortia

FLUXOGRAMA 3.10: Resumo do fracionamento do subextrato EDTSHB(A) e de

sua fração 35-37.

EDTSHB(A)

4,5 g

Cromatografia por adsorção

Sílica gel (70-230 Mesh)

φ = 5,3 cm, h = 41,0cm

Hex→ MeOH

(A)26-34

(A)35-37

0,140 g

(A)38-39

0,123 g

1-15

0,011 g

16-19

0,006 g

0,021 g

23-25

0,009 g

Cromatografia por adsorção

Sílica gel (230-400 Mesh)

φ = 2,3 cm, h = 22,0 cm

Hex→ MeOH

CLAE-Reciclante *

4-5

0,007 g

9-10

0,006 g

Substância

0,007 g

0,039 g

0,045 g

1-3

0,015 g

6-8

0,013 g

1-3

0,002 g

4-6

0,007 g

7-9

0,003g

Substância 14

0,007 g

3-4

0,029 g

7-9

0,002 g

Substância

0,029 g

1-2

0,003 g

5-6

0,007 g

CLAE

ante

CLAE

10-11

0,006 g

Substância 08

0,006 g

una

reparat

(45

cm, part

µm

)

oop:

500

Fase Normal com Eluição Isocrática: MeOH: Dicl. 1:1, Detector UV λ: 217 e 254 nm, Vazão: 3 mL/min.

Estudo Fitoquímico das Espécies de Hortia

O subextrato EDTSHB(A) proveniente do extrato diclorometânico do

tronco subterrâneo de H. oreadica foi fracionado, assim como suas frações de

acordo com os FLUXOGRAMAS 3.5 a 3.10 (pgs 29 a 32). Deste subextrato foram

isolados os derivados do ácido diidrocinâmico ácido 3-fenil-[2’,6’-dimetoxi-(3’,4’-

O:5’’,6’’)-2’’,2’’-dimetilpirano]propiônico 01, 3-fenil-[2’,6’-dimetoxi-(3’,4’-O:5’’,6’’)-

2’’,2’’-dimetilpirano]propionato de metila 03, 3-fenil-[2’,5’-dimetoxi-(3’,4’-O:5’’,6’’)-

2’’,2’’-dimetilpirano]propionato de metila 04, a mistura ácido 3-fenil-[2’, 6’-dimetoxi-

(3’,4’-O:5’’,6’’)-2’’,2’’-dimetilpirano]propiônico 01 e ácido 3-fenil-[2

’

-metoxi-(3

’

O:5

’’

’’’

)-2

’’

-dimetilpirano]propiônico 05, ácido 3-fenil-[2’,5’-dimetoxi-(3’,4’-

O:5’’,6’’)-2’’,2’’-dimetilpirano]propiônico 06, a mistura 3-fenil-[2’,6’-dimetoxi-(3’,4’-

O:5’’,6’’)-2’’,2’’-dimetilpirano]propionato de metila 03 e cumarina 5-metoxiseselina

07; o derivado do ácido cinâmico ácido 3,4-dimetoxi-α(3-hidroxi-4-

carbometoxifenil)cinâmico 08, os alcalóides rutaecarpina 09, 7,8-

desidrorutaecarpina 10 e dictamina 11 e os limonóides guianina 13, hortiolida E

14 e hortiolida G 15.

3.1.3.3- Fracionamento do Extrato Diclorometano das Folhas

O extrato diclorometano das folhas foi fracionado via a técnica de

HSCCC (High Speed Countercurrent Chromatography) preparativa

(FLUXOGRAMA 3.11, pg 34) utilizando um sistema de solventes composto por

etanol, água, acetonitrila e hexano, sendo a fase estacionária etanol, água e

acetonitrila (8:1:1) e a fase móvel composta apenas por hexano. As frações

obtidas a partir deste extrato foram submetidas à análise por CCDA, agrupadas

de acordo com as similaridades e a seguir refracionadas.

Assim, este extrato proporcionou o isolamento do derivado do ácido

diidrocinâmico 3-fenil-[2’,6’-dimetoxi-(3’,4’-O:5’’,6’’)-2’’,2’’-dimetilpirano]propionato

de metila 03, dos alcalóides rutaecarpina 09 e dictamina 11 e do limonóide

guianina 13.

Estudo Fitoquímico das Espécies de Hortia

FLUXOGRAMA 3.11: Resumo do fracionamento do extrato EDFHB e de suas

frações 15-19, 23-26 e 31-34.

EDFHB

2,5 g

HSCCC

3 colunas; 800 rpm

Hex:EtOH:H

O:ACN (10:8:1:1)

1-7

0,248 g

12-14

0,445 g

Substância

0,04 g

15-19

0,136 g

roma

ogra

a por a

sorç

Sílica gel (230-400 mesh)

φ = 3,0 cm, h = 45,0 cm

Hex:Acetona 20%

20-22

0,148 g

1- 8

051

23-26

0,463 g

8-11

0,495 g

27-30

0,074 g

31-34

0,351 g

9- 13

14- 17

038

1- 10

0,18 g

11- 12

0,133 g

13- 16

0,11 g

Substância

0,11 g

roma

ogra

a por exc

Sephadex LH-20

φ = 2,5 cm, h = 51,0 cm

MeOH:Dicl. 40%

Substância

0,148 g

roma

ogra

a por exc

Sephadex LH-20

φ = 2,5 cm, h = 51,0 cm

MeOH:Dicl. 40%

1- 3

0,127 g

4- 5

0,088 g

6- 7

0,129 g

Substância

0,088 g

Estudo Fitoquímico das Espécies de Hortia

3.1.4- Fracionamento do Extrato e Isolamento das Substâncias

de H. brasiliana

3.1.4.1- Fracionamento do Extrato Diclorometano das Folhas

O extrato diclorometano das folhas foi estudado fitoquimicamente

utilizando diversas técnicas cromatográficas. O fracionamento levou ao

isolamento dos derivados do ácido diidrocinâmico ácido 3-fenil-[2’, 6’-dimetoxi-(3’,

4’-O:5’’,6’’)-2’’,2’’-dimetilpirano]propiônico 01, 3-fenil-[2’-metoxi-(3’,4’-O:5’’,6’’)-

2’’,2’’-dimetilpirano]propionato de metila 02, 3-fenil-[2’,5’-dimetoxi-(3’,4’-O:5’’,6’’)-

2’’,2’’-dimetilpirano]propionato de metila 04 e do alcalóide rutaecarpina 09. O

FLUXOGRAMA 3.12 (pg 34) mostra de forma resumida como este estudo foi

realizado.

FLUXOGRAMA 3.12: Resumo do fracionamento do extrato EDFHA e de suas

frações 10-14 e 24-26.

EDFHA

3,0 g

romatogra

a por a

sorç

Sílica gel (230-400 mesh)

φ = 5,3 cm, h = 32,0cm

Hex → MeOH

1-2

0,306 g

0,494 g

10-14

0,934 g

0,098 g

CCDP

Hex: AcOEt 8:2

15-20

0,188 g

24-26

0,479 g

27-30

0,085 g

4-9

0,233 g

0,11 g

0,231 g

0,307 g

Substância

0,098 g

CLAE-Reciclante *

1-3

0,005 g

4-6

0,049 g

0,087 g

8-9

0,075 g

Substância

0,087 g

21-23

0,051 g

0,087 g

2-4

0,13 g

5-7

0,149 g

8-9

0,071 g

Substância

0,087 g

Substância

0,149 g

Cromatografia por adsorção

Sílica gel (230-400 Mesh)

Φ= 2,3 cm, h= 50,0 cm

Hex:AcOEt 10%

una

repara

(45

cm, par

tí

µm

)

;

oop:

500

Fase Normal com Eluição Isocrática: MeOH: Dicl. 1:1; Detector UV λ: 217 e 254 nm.; Vazão: 3 mL/min.

Estudo Fitoquímico das Espécies de Hortia

3.1.5- Fracionamento do Extrato e Isolamento das Substâncias

de H. superba

3.1.5.1- Fracionamento do Extrato Metanólico do Tronco

O extrato metanólico do tronco foi submetido à partição líquido-líquido,

gerando quatro frações: fração hexano (EMTHS-H), fração diclorometano

(EMTHS-D), fração acetato de etila (EMTHS-A) e fração hidroalcoólica (EMTHS-

Hidro), de acordo com o FLUXOGRAMA 3.13 (pg 35). A partir da obtenção de um

espectro de RMN de

H das quatro frações, a fração EMTHS(D) foi escolhida para

refracionamento por apresentar sinais relativos à substâncias de interesse como

alcalóides e cumarinas. O espectro de EMTHS(H) apresentou quantidade

relevante de material graxo e por este motivo a fração foi reservada. As frações

EMTHS(A) e EMTHS(hidro) também foram reservadas para serem refracionadas

posteriormente.

FLUXOGRAMA 3.13: Particionamento do extrato EMTHS

3.1.5.2- Fracionamento da Fração Diclorometano do Extrato

Metanólico do Tronco

A fração diclorometano do extrato metanólico do tronco (EMTHS-D) foi

estudada fitoquimicamente utilizando diversas técnicas cromatográficas

(FLUXOGRAMA 3.14, pg 36). O fracionamento levou ao isolamento dos

EMTHS

103,0 g

EMTHS (H)

3,0 g

EMTHS (D)

10,5 g

EMTHS (A)

15,0 g

art

Lí

Hex:Dicl:AcOEt

EMTHS (Hidro)

49,0 g

Estudo Fitoquímico das Espécies de Hortia

alcalóides rutaecarpina 09, dictamina 11, N-metilflindersina 12 e do limonóide

hortiolida E 14.

FLUXOGRAMA 3.14: Resumo do fracionamento do extrato EMTHS-D e de suas

frações 3- 5, 6-7 e 11-14.

EMTHS-D

3,0 g

1-2

0,306 g

3-5

0,432 g

6-7

1,09 g

8-10

0,596 g

11-14

0,147 g

15-17

0,206 g

romatogra

a por a

sorç

Sílica gel (230-400 mesh)

φ = 5,3 cm, h = 35,0 cm

Hex→ MeOH

0,076 g

0,085 g

Substância

0,260 g

2- 4

0,260 g

romatogra

a por a

sorç

Sílica gel (230-400 mesh)

φ = 2,3 cm, h = 21,0 cm

Hex:AcOEt 10%

0,293 g

2-3

0,45 g

4-6

0,236 g

Substância

0,293 g

Substância

0,236 g

1-2

0,006 g

4-5

0,058 g

0,077 g

0,023 g

2-3

0,051 g

Substância

0,051 g

Substância

0,058 g

Cromatografia por exclusão

Sephadex LH-20

φ = 2,5 cm, h = 51,0 cm

MeOH:Dicl. 30%

romatogra

a por a

sorç

Sílica gel (230-400 mesh)

φ = 2,3 cm, h = 25,0 cm

Hex:AcOEt 10%

CLAE

ante

una

reparat

(45

cm, part

µm

)

oop:

500

Fase Normal com Eluição Isocrática: MeOH: Dicl. 1:1, Detector UV λ: 217 e 254 nm, Vazão: 3 mL/min.

Estudo Fitoquímico das Espécies de Hortia

3.2- RESULTADOS E DISCUSSÃO

3.2.1 – Derivados do Ácido Diidrocinâmico

Os derivados do ácido diidrocinâmico são de ocorrência na família

Rutaceae, sendo descritos em literatura para os gêneros Adiscanthus (VIEIRA et

al., 1980), Drummondita (RASHID et al., 1992), Geleznowia (RASHID et al.,

1991), Eriostemon (SARKER et al., 1994a, SARKER et al., 1994b, SARKER et

al., 1995a, SARKER et al., 1995b) e Micromelum (RAHMANI et al., 1994). Para o

gênero Hortia estão descritos na literatura 15 derivados do ácido diidrocinâmico,

sendo os mesmos isolados de H. badinii (CORREA et al., 1975; CORREA et al.,

1979), H. regia (TINTO, 1992), H. colombiana (SUAREZ, et al., 2002), H. oreadica

(BRAGA, 2005) e H. brasiliana (BRAGA, 2005).

Neste estudo foram isolados seis derivados do ácido diidrocinâmico,

sendo que os derivados 01 a 05 já aparecem descritos em literatura para o

gênero Hortia e o 06 parece ser inédito até o momento para a espécie H.

oreadica. Também foi isolado em mistura o derivado do ácido diidrocinâmico 03

com a cumarina 07, já conhecida na literatura como 5-metoxiseselina.

3.2.1.1- Determinação estrutural da substância 01

A substância 01 foi isolada dos extratos hexânico e diclorometano do

tronco de H. oreadica e do extrato diclorometano das folhas de H. brasiliana e sua

estrutura foi determinada com base em espectros de RMN tais como de

HMBC, HSQC; CG-EM e também por comparação com dados da literatura

(CORRÊA, et al., 1975; VIEIRA, et al., 1980).

OCH

2''

3''

4''

Estudo Fitoquímico das Espécies de Hortia

O espectro de RMN de

H de 01 (FIGURA 3.2, pg 41 ) mostra dois

sinais em δ 2,89 (2H, t) e δ 2,57 (2H, t) referentes aos hidrogênios metilênicos H-3

e H-2, respectivamente. Em δ 3,74 (3H, s) e 3,77 (3H, s) observam-se os sinais

de duas metoxilas aromáticas e em δ 1,42 (6H, s) observa-se a presença do sinal

referente as duas metilas características do anel cromeno. Em δ 6,49 (1H, d,

J=9,9 Hz) e em δ 5,48 (1H, d, J=9,9 Hz) observam-se os sinais referentes aos

hidrogênios do anel cromeno. Em δ 6,20 (1H, s) observa-se o sinal de um

hidrogênio aromático.

O espectro de RMN de

C (FIGURA 3.3, pg 41) apresenta sinais de

16 carbonos para a molécula, cujos valores podem ser observados na TABELA

3.2 (pg 40). A presença de sinal em δ 178,7 indica a presença de uma carboxila

na molécula.

O experimento de HSQC (FIGURA 3.4, pg 42) mostra a correlação a

de H-2 em δ 2,57 com C-2 em δ 33,9 e de H-3 em δ 2,89 com C-3 em δ 18,8.

As metilas do carbono C-2’’

mostram correlação com o sinal em δ 27,8 e as

metoxilas em δ 3,74 e δ 3,77 mostram correlação a J

com os carbonos em δ

62,4 e em δ 55,5, respectivamente.

No experimento de HMBC (FIGURA 3.5, pg 42) as metilas em C-2’’

mostram correlação entre si (δ 27,8), com um sinal em δ 76,1 atribuído ao carbono

carbinólico C-2’’ e com um sinal em δ 127,2, atribuído ao C-3’’. O hidrogênio H-2

(δ 2,57) mostra correlação com C-3 em δ 18,8, com a carboxila em δ 178,7 e com

um sinal de um carbono quaternário em δ 113,7 que foi atribuído ao C-1’. O

hidrogênio H-3 mostra correlação com C-2 em δ 33,9, com C-1’ em δ 113,7, com

C-1 (δ 178,7) e com dois sinais de carbono quaternário referentes aos C-2’ (δ

155,1) e C-6’ (δ 158,8).

Na estrutura

01 as metoxilas estão posicionadas nos carbonos C-6’

e C-2’, sendo o sinal de hidrogênio aromático em δ 6,20 atribuído ao H-5’. Pelo

HSQC, ao C-5’ foi atribuído o sinal em δ 96,0. No experimento de HMBC, H-5’ (δ

6,20) mostra correlação com C-1’ (δ 113,7), com C-6’ ( δ 158,8), que suporta a

metoxila em δ 3,77. O hidrogênio H-4’’ mostra correlação com C-2’’ (δ 76,1), com

C-2’(δ 155,1) e com C-4’ (δ 153,2).

O espectro de massas da substância

01 (FIGURA 3.6, pg 43)

apresentou o pico do íon molecular em m/z 292, estando compatível com a

Estudo Fitoquímico das Espécies de Hortia

fórmula molecular C

O esquema 3.1 (pg 43) mostra a proposta de

fragmentação da substância

01.

Assim, pode-se determinar que a estrutura 01 é um derivado do

ácido diidrocinâmico com função ácido carboxílico, sendo o ácido 3-fenil-[2’,6’-

dimetoxi-(3’,4’-O:5’’,6’’)-2’’,2’’-dimetilpirano]propiônico.

Estudo Fitoquímico das Espécies de Hortia

TABELA 3.2: Dados de RMN de

H e

C de 01 e comparação com a literatura

SUBSTÂNCIA

(400/100 MHz, CDCl

)

Braga, 2005

(400/100 MHz, CDCl

)

H/C

δ (ppm), J (Hz) δ (ppm) δ (ppm), J (Hz) δ (ppm)

1 - 178,7 - 178,7

2 2,57 (2H, t, J=7,6) 33,9 2,57 (2H, m) 33,9

3 2,89 (2H, t, J=7,6) 18,8 2,89 (2H, m) 18,8

1’ - 113,7 - 113,7

2’ - 155,1 - 155,1

3’ - 107,7 - 107,7

4’ - 153,2 - 153,2

5’ 6,20 (1H, s) 96,0 6,20 (1H, s) 96,0

6’ - 158,8 - 158,8

4’’ 6,49 (1H, d, J=10,0) 117,3 6,49 (1H, d, J=10,0) 117,3

3’’ 5,48 (1H, d, J=10,0) 127,2 5,48 (1H, d, J=10,0) 127,2

2’’ - 76,1 - 76,1

2’’-Me 1,42 (6H, s) 27,8 1,42 (6H, s) 27,8

2’-OMe 3,74 (3H, s) 62,4 3,74 (3H, s) 62,4

6’-OMe 3,77 (3H, s) 55,5 3,77 (3H, s) 55,5

Estudo Fitoquímico das Espécies de Hortia

FIGURA 3.2: Espectro de RMN de

H de 01 (CDCl

, 400 MHz)

FIGURA 3.3: Espectro de RMN de

C de 01 (CDCl

, 100 MHz)

H-4’’

H-5’

H-3’’

6’-OCH

2’-OCH

H-3 H-2

2’’- Me

H-3 H-2

Estudo Fitoquímico das Espécies de Hortia

FIGURA 3.4: Mapa de contorno de g-HSQC de

01 (CDCl

, 400 MHz)

FIGURA 3.5: Mapa de contorno g-HMBC de

01 (CDCl

, 400 MHz)

H-4’’ H-5’

H-3’’

6’-OCH

2’-OCH

H-3

H-2

2’’-Me

117,3

127,2

96,0

55,5

62,4

18,8

33,9

27,8

H-4’’

H-5’

H-3’’

6’-OCH

2’-OCH

H-3 H-2

2’’-Me

2’’ 2’’

3’

1’

3’

4’

2’

6’

2’

6’

2’

6’

1 1

3’’

1’

2’’

Estudo Fitoquímico das Espécies de Hortia

FIGURA 3.6: Espectro de massas de 01 (IE-70eV)

ESQUEMA 3.1: Proposta de fragmentação para

OCH

2''

3''

4''

5''

6''

m/z 217

m/z 277

OCH

m/z 292

- (CH

)

OOCH

- (H )

OCH

m/z 233

- (CO

)

OOCH

- (CH

)

m/z 218

Estudo Fitoquímico das Espécies de Hortia

3.2.1.2- Determinação estrutural da substância 02

A substância

02 foi isolada do extrato hexânico do tronco

subterrâneo de H. oreadica e do extrato diclorometano das folhas de H. brasiliana,

sendo que para esta última espécie é a primeira vez que é encontrada. Sua

estrutura foi determinada com base em espectros de RMN de

C, HMBC,

HSQC como também através da comparação com dados da literatura (SUAREZ,

et al., 2002).

2''

3''

4''

OCH

O espectro de RMN de

H de 02 (FIGURA 3.7, pg 47) mostra dois

sinais em δ 2,86 (2H, t, J=7,5 Hz) e δ 2,59 (2H, t, J=7,5 Hz) referentes aos

hidrogênios metilênicos H-3 e H-2, respectivamente. Em δ 3,67 (3H, s) e δ 3,75

(3H, s) observam-se os sinais de duas metoxilas e em δ 1,42 (6H, s) observa-se a

presença de um sinal referente as duas metilas características do anel cromeno.

Em δ 6,91 (1H, d, J=8,3 Hz) e em δ 6,52 (1H, dd, J=8,3 e 0,7 Hz) observam-se os

sinais referentes aos hidrogênios aromáticos e em δ 5,63 (1H, d, J=10,0 Hz) e em

δ 6,56 (1H, dd, J=10,0 e 0,7 Hz) observam-se a presença dos hidrogênios do anel

cromeno.

O espectro de RMN de

C (FIGURA 3.8, pg 47) apresenta sinais de

16 carbonos para a molécula, cujos valores podem ser observados na TABELA

3.3 (pg 46).

O espectro de HSQC (FIGURA 3.9, pg 48) mostra a correlação a J

de H-2 em δ 2,59 com C-2 em δ 34,8 e de H-3 em δ 2,86 com C-3 em δ 24,9. As

metilas ligadas ao carbono C-2’’ mostram correlação com o sinal em δ 27,6 e as

metoxilas em δ 3,68 e em δ 3,75 mostram correlação a J

com os carbonos em δ

51,4 e em δ 61,9, respectivamente.

Estudo Fitoquímico das Espécies de Hortia

No espectro de HMBC (FIGURA 3.10, pg 48) as metilas do anel

cromeno mostram correlação entre si (δ 27,6), com um sinal em δ 75,4 atribuído

ao carbono carbinólico C-2’’ e com um sinal em δ 130,3, podendo somente ser

atribuído ao C-3’’. O hidrogênio H-2 (δ 2,59) mostra correlação com C-3 em δ

24,9, com a carboxila do éster em δ 173,5 e com um sinal em δ 125,0 que foi

atribuído ao C-1’. O hidrogênio H-3 mostra correlação com C-2 em δ 34,8, com C-

1’ em δ 125,0, com um sinal relativo a um carbono de CH em δ 129,3, podendo

somente ser atribuído ao C-6’.

Ainda é possível observar para H-3 a correlação com um sinal em δ

154,2 atribuído ao C-2’ e com C-1 em δ 173,5. A metoxila em δ 3,67 mostra

correlação com C-1 em δ 173,5 e a outra em δ 3,75 mostra correlação com C-2’

em δ 154,2, o que permite atribuir a segunda ao anel aromático. Além disso,

sugere-se a correção da atribuição feita na literatura onde os valores de C-4’ e C-

2’ estão trocados (SUAREZ et al., 2002)

Através da análise do HSQC, sabendo-se o valor de C-6’ (δ 129,3),

pode-se atribuir o dubleto em δ 6,91 ao H-6’. No HMBC, H-6’ mostra correlação

com C-3 (δ 24,9), com C-2’ (δ 154,2) e com um sinal em δ 152,5 atribuído ao C-4’.

No HMBC H-5’ mostra correlação com C-1’ (δ 125,0), com C-3’ (δ 152,5) e com

um sinal de carbono quaternário em δ 114,7 atribuído ao C-3’. O hidrogênio H-4’’,

atribuído ao sinal em δ 6,56, mostra correlação com C-2’’ (δ 75,4), C-4’ (δ 152,5),

com C-2’ (δ 154,3) e com C-3’ (δ 114,7).

Desta forma foi possível determinar a estrutura

02 como sendo o 3-

fenil-[2’-metoxi-(3’,4’-O:5’’,6’’)-2’’,2’’-dimetilpirano]propionato de metila.

Estudo Fitoquímico das Espécies de Hortia

TABELA 3.3: Dados de RMN de

H e

C de 02 e comparação com a literatura

SUBSTÂNCIA

(400/100 MHz, CDCl

)

SUAREZ, 2002

(300/75 MHz, CDCl

)

H/C

δ (ppm), J (Hz)

(ppm)

δ (ppm), J (Hz) δ (ppm)

1 - 173,5 - 173,7

2 2,59 (2H, t, J=7,5) 34,8 2,59 (2H, t, J=7,5) 34,9

3 2,86 (2H, t, J=7,5) 24,9 2,86 (2H, t, J=7,5) 24,9

1’ - 125,0 - 125,1

2’ -

154,2

152,5

3’ - 114,7 - 114,8

4’ -

152,5

154,3

5’ 6,52 (1H, dd, J=8,3 e 0,7) 112,2 6,52 (1H, d, J=8,3) 112,3

6’ 6,91 (1H, d, J=8,3) 129,3 6,92 (1H, d, J=8,3) 129,4

4’’ 6,56 (1H, dd, J=10,0 e 0,7) 117,2 6,56 (1H, d, J=10,0) 117,2

3’’ 5,63 (1H, d, J=10,0) 130,3 5,63 (1H, d, J=10,0) 130,4

2’’ - 75,4 - 75,6

2’’-Me 1,42 (6H, s) 27,6 1,42 (6H, s) 27,7

1-OMe 3,67 (3H, s) 51,4 3,68 (3H, s) 51,6

2’-OMe 3,75 (3H, s) 61,9 3,75 (3H, s) 62,1

Estudo Fitoquímico das Espécies de Hortia

FIGURA 3.7: Espectro de RMN de

H de O2 (CDCl

, 400 MHz)

FIGURA 3.8: Espectro de RMN de

C de 02 (CDCl

, 100 MHz)

H-6’

H-4’’ H-5’

H-3’’

2’-OCH

1-OCH

H-3

H-2

2’’- Me

H-3 H-2

Estudo Fitoquímico das Espécies de Hortia

FIGURA 3.9: Mapa de contorno de g-HSQC de 02 (CDCl

, 400 MHz)

FIGURA 3.10: Mapa de contorno de g-HMBC de

02 (CDCl

, 400 MHz)

H-6’

H-4’’

H-5’

H-3’’

2’-OCH

1-OCH

H-3

H-2

125,0

130,3

117,2

112,2

61,9

51,4

24,9

34,8

27,6

2’’- Me

H-6’

H-5’

H-4’’

H-3’’

H-3 H-2

2’- OCH

1- OCH

2’’- Me

2’’

3’

1’

2’

4’

2’

3’’

2’’

2’’- Me

1’

6’

4’’

Estudo Fitoquímico das Espécies de Hortia

3.2.1.3- Determinação estrutural da substância 03

A substância

03 foi isolada dos extratos hexânico e diclorometano do

tronco subterrâneo e do extrato diclorometano das folhas de H. oreadica e a sua

estrutura foi determinada com base em experimentos de RMN de

C, HMBC

e HSQC e por comparação com dados da literatura (SUAREZ, et al., 2002).

2''

3''

4''

OCH

OOCH

O espectro de RMN de

H de 03 (FIGURA 3.11, pg 52) mostra dois

sinais em δ 2,87 (2H, t, J=7,6) e δ 2,51 (2H, t, J=7,6) referentes aos hidrogênios

metilênicos H-3 e H-2, respectivamente. Em δ 3,68 (3H, s), δ 3,73 (3H, s) e 3,76

(3H, s) observa-se os sinais de três metoxilas e em δ 1,42 (6H, s) observa-se à

presença do sinal referente as duas metilas características do anel dimetilpirano.

Em δ 6,48 (1H, dd, J=9,9 e 0,6 Hz) e em δ 5,48 (1H, d, J=9,9 Hz) observa-se os

sinais referentes aos hidrogênios do anel cromeno e em δ 6,19 (1H, sl) observa-

se o sinal de um hidrogênio aromático.

O espectro de RMN de

C (FIGURA 3.12, pg 52) apresenta sinais

de 17 carbonos para a molécula, cujos valores podem ser observados na

TABELA 3.4, pg 51).

O experimento de HSQC (FIGURA 3.14, pg 53) mostra a correlação

à J

de H-2 em δ 2,51 com C-2 em δ 34,0 e de H-3 em δ 2,87 com C-3 em δ 19,0.

As metilas ligadas ao carbono C-2’’ mostram correlação a J

com o sinal em δ

27,6 e as metoxilas em δ 3,73 e δ 3,76 com os carbonos em δ 62,4 e em δ 55,4,

respectivamente. No experimento de HMBC (FIGURA 3.13, pg 53) as metilas do

anel cromeno mostram correlação entre si (δ 27,6), com um sinal em δ 75,9

atribuído ao carbono carbinólico C-2’’ e com um sinal em δ 127,0, atribuído ao C-

3’’. O hidrogênio H-2 (δ 2,51) mostra correlação com C-3 em δ 19,0, com a

carboxila em δ 173,9 e com um sinal de um carbono quaternário em δ 113,8 que

Estudo Fitoquímico das Espécies de Hortia

foi atribuído ao C-1’. A correlação do sinal em δ 3,68 com o carbono em δ 173,9,

atribuído ao C-1, indica a presença da função éster na estrutura. O hidrogênio H-3

mostra correlação com C-2 em δ 34,0 com C-1’ em δ 113,8, com C-1 (δ 173,9) e

com dois sinais de carbono quaternário referentes aos C-2’ (δ 155,0) e C-6’ (δ

158,7).

De acordo com as correlações observadas para H-3 pode-se sugerir

que as metoxilas estão posicionadas nos carbonos C-6’ e C-2’. Desta forma, o

hidrogênio aromático em δ 6,19 foi atribuído ao H-5’. Pelo HSQC, C-5’ foi

atribuído ao sinal em δ 95,8. No experimento de HMBC, H-5’ (δ 6,19) mostra

correlação com C-1’ (δ 113,8) e com o carbono em δ 158,7 (carbono que suporta

a metoxila em δ 3,76) que somente pode ser atribuído ao C-6’. Desta maneira

pode-se atribuir o valor de δ 155,0 ao C-2’.

O hidrogênio H-5’ mostra no HMBC correlação com um sinal em δ

117,2 referente a um carbono que suporta um dos hidrogênios do anel cromeno,

podendo somente ser atribuído ao H-4’’ (δ 6,48). A multiplicidade observada para

H-4’’ (dd, J=9,9 e 0,6 Hz) sugere que o mesmo esteja acoplando a longa distância

com H-5’ (sl) com constante bastante pequena. O hidrogênio H-4’’ mostra

correlação com C-2’’ (δ 75,9), com C-2’ (δ 155,0) e com C-5’ (δ 95,8). Além disso,

tanto H-4’’ como H-5’ mostram correlação com dois carbonos quaternários em δ

153,0 e 107,6 que foram atribuídos aos carbonos C-4’ e C-3’, respectivamente.

Esta atribuição foi confirmada com base na correlação observada para H-3’’ com

o carbono em δ 107,6 que pode somente correlacionar com C-3’ a três ligações. A

correlação de H-4’’ com C-2’ garante o anel cromeno na posição indicada e desta

forma pode-se determinar a estrutura

03 como sendo o derivado 3-fenil-[2’,6’-

dimetoxi-(3’,4’-O:5’’,6’’)-2’’,2’’-dimetilpirano]propionato de metila.

Estudo Fitoquímico das Espécies de Hortia

TABELA 3.4: Dados de RMN de

H e

C de 03 e comparação com a literatura

SUBSTÂNCIA

(400/100 MHz, CDCl

)

SUAREZ, 2002

(300/75 MHz, CDCl

)

H/C

δ (ppm), J (Hz) δ (ppm) δ (ppm), J (Hz) δ (ppm)

1 - 173,9 - 174,1

2 2,51 (2H, t, J=7,6) 34,0 2,50 (2H, t, J=7,5) 34,1

3 2,87 (2H, t, J=7,6) 19,0 2,87 (2H, t, J=7,5) 19,0

1’ - 113,8 - 113,9

2’ -

155,0

153,0

3’ - 107,6 - 107,6

4’ -

153,0

155,1

5’ 6,19 (1H, sl) 95,8 6,19 (1H, s) 95,8

6’ - 158,7 - 158,7

4’’ 6,48 (1H, dd, J=9,9 e 0,6 ) 117,2 6,49 (1H, d, J=10,0) 117,2

3’’ 5,48 (1H, d, J=9,9) 127,0 5,48 (1H, d, J=10,0) 127,1

2’’ - 75,9 - 76,0

2’’-Me 1,42 (6H, s) 27,6 1,41 (6H, s) 27,7

1-OMe 3,68 (3H, s) 51,3 3,68 (3H, s) 51,5

2’-OMe 3,73 (3H, s) 62,3 3,73 (3H, s) 62,4

6’-OMe 3,76 (3H, s) 55,4 3,76 (3H, s) 55,5

Estudo Fitoquímico das Espécies de Hortia

FIGURA 3.11: Espectro de RMN de

H de 03 (CDCl

, 400 MHz)

FIGURA 3.12: Espectro de RMN de

C de 03 (CDCl

, 100 MHz)

H-4’’

H-5’

H-3’’

6’- OCH

2’- OCH

1- OCH

H-3 H-2

2’’-Me

Estudo Fitoquímico das Espécies de Hortia

FIGURA 3.13: Mapa de contorno de g-HMBC de

03 (CDCl

, 400 MHz)

FIGURA 3.14: Mapa de contorno de g-HSQC de 03 (CDCl

, 400 MHz)

H-4’’ H-5’

H-3’’

H-3 H-2

2’’- Me

6’- OCH

2’- OCH

1- OCH

2’’- Me 2’’- Me

2’’ 2’’

3’

1’

4’

2’

4’

6’

2’

6’

1’

3’’

2’’

2’’- Me

H-4’’

H-5’

H-3’’

6’- OCH

2’- OCH

1- OCH

H-2

H-3

2’’- Me

95,8

117,2

127,0

62,3

55,4

51,3

19,4

34,0

27,6

Estudo Fitoquímico das Espécies de Hortia

3.2.1.4- Determinação estrutural da substância 04

A substância

04 foi isolada dos extratos hexânico e diclorometano do

tronco subterrâneo de H. oreadica e do extrato diclorometano das folhas de H.

brasiliana, onde sua ocorrência se deu pela primeira vez. A sua estrutura foi

determinada com base em experimentos de RMN de

H e HMBC como também

através da comparação com dados da literatura (SUAREZ, et al., 2002).

OCH

2''

3''

4''

O espectro de RMN de

H de 04 é bastante parecido com o espectro

do derivado

03 discutido anteriormente, diferenciando-se pela desblindagem de

H-5’, observada em δ 6,19 (

03) e em δ 6,59 (04).

O espectro de RMN de

H de 04 (FIGURA 3.15, pg 57) mostra dois

sinais em δ 2,87 (2H, t, J=7,5) e δ 2,61 (2H, t, J=7,5) referentes aos hidrogênios

metilênicos H-3 e H-2, respectivamente. Em δ 3,68 (3H, s), δ 3,71 (3H, s) e 3,81

(3H, s) observa-se os sinais de três metoxilas e em δ 1,47 (6H, s) observa-se a

presença do sinal referente as duas metilas características do anel cromeno. Em

δ 6,55 (1H, d, J=9,9 Hz) e em δ 5,65 (1H, d, J=9,9 Hz) observa-se os sinais

referentes aos hidrogênios do anel cromeno. Em δ 6,59 (1H, s) observa-se o sinal

de um hidrogênio aromático.

No experimento de HMBC (FIGURA 3.16, pg 57) as metilas em C-2’’

mostram correlação entre si (δ 27,4), com um sinal em δ 75,6 atribuído ao carbono

carbinólico C-2’’ e com um sinal em δ 130,4, atribuído ao C-3’’. O hidrogênio H-2

(δ 2,61) mostra correlação com C-3 em δ 25,0, com a carboxila do éster em δ

173,4 e com um sinal de um carbono quaternário em δ 124,0 que foi atribuído ao

C-1’. O hidrogênio H-3 mostra correlação com C-2 em δ 34,9, com C-1’ em δ

124,0, com C-1 (δ 173,4), com um sinal de carbono quaternário em δ 147,7 e com

Estudo Fitoquímico das Espécies de Hortia

um sinal referente a CH em δ 113,1. A metoxila em δ 3,68 mostra correlação com

um sinal em δ 173,4, sendo atribuída, então, a função éster. As outras duas

metoxilas em δ 3,81 e em δ 3,71 mostram correlação com sinais em δ 144,6 e em

δ 147,7, respectivamente.

O sinal referente ao hidrogênio aromático mostra correlação com C-

3 (δ 25,0), com os sinal em δ 147,7 e em δ 144,6, cujos carbonos suportam as

duas metoxilas. Desta maneira, o hidrogênio aromático em δ 6,59 foi atribuído ao

H-6’ e o carbono em δ 147,7 ao C-2’. Conseqüentemente, o sinal em δ 144,6 foi

atribuído ao C-5’ e o sinal em δ 141,1 ao C-4’. Ainda é possível observar a

correlação de H-4’’ (δ 6,55) com C-2’’ (δ 75,6) e de H-3’’ (δ 5,65) com C-2’’ (δ 75,6)

e com um sinal referente a um carbono quaternário o qual pode ser atribuído ao

C-3’.

Desta forma pôde-se concluir que a substância

04 é referente ao

derivado 3-fenil-[2’,5’-dimetoxi-(3’,4’-O:5’’,6’’)-2’’,2’’-dimetilpirano]propionato de

metila.

Estudo Fitoquímico das Espécies de Hortia

TABELA 3.5: Dados de RMN de

H de 04 e comparação com a literatura

SUBSTÂNCIA

(400 MHz, CDCl

)

SUAREZ, 2002

(300 MHz, CDCl

)

δ (ppm), J (Hz) δ (ppm), J (Hz)

1 - -

2 2,61 (2H, t, J=7,5) 2,62 (2H, t, J=7,5)

3 2,88 (2H, t, J=7,5) 2,88 (2H, t, J=7,5)

1’ - -

2’ - -

3’ - -

4’ - -

5’

6’ 6,59 (1H, s) 6,59 (1H, s)

4’’ 6,55 (1H, d, J=9,9) 6,55 (1H, d, J=10,0)

3’’ 5,65 (1H, d, J=9,9) 5,65 (1H, d, J=10,0)

2’’ - -

2’’-Me 1,47 (6H, s) 1,47 (6H, s)

1-OMe 3,68 (3H, s) 3,68 (3H, s)

2’-OMe 3,71 (3H, s) 3,71 (3H, s)

5’-OMe 3,81 (3H, s) 3,82 (3H, s)

Estudo Fitoquímico das Espécies de Hortia

FIGURA 3.15: Espectro de RMN de

H de 04 (CDCl

, 400 MHz)

FIGURA 3.16: Mapa de contorno de g-HMBC de

04 (CDCl

, 400 MHz)

H-6’

H-4’’ H-3’’ H-3 H-2

5’- OCH

2’- OCH

1- OCH

2’’- Me

H-4’’

H-6’

H-3’’

H-3 H-2

5’- OCH

2’- OCH

1- OCH

2’’- Me

3 3

2’’- Me

2’’ 2’’ 2’’

3’

6’

3’’

1’

2’

5’

2’

4’

1 1

Estudo Fitoquímico das Espécies de Hortia

3.2.1.5- Determinação estrutural das substâncias 01 e 05

As substâncias

01 e 05 foram obtidas em mistura do extrato

diclorometano do tronco subterrâneo de H. oreadica. Não foi realizado nenhum

refracionamento em busca da separação destas substâncias, pois ambas já se

encontram descritas em literatura. As estruturas foram determinadas com base

em espectros de RMN em uma dimensão tais como de

H e

C, experimentos em

duas dimensões como HMBC e HSQC e também através da comparação com

dados da literatura (BRAGA, 2005 e SUAREZ, 2002).

2''

3''

4''

2''

3''

4''

OOCH

OCH

O espectro de RMN de

H (FIGURA 3.17, pg 62) mostra dois sinais

em δ 2,87 ( 2H, m) e δ 2,52 (2H, t, J=7,6 Hz) referentes aos hidrogênios

metilênicos H-3 e H-2, respectivamente, de

01. Da mesma forma, este mostra

dois sinais em δ 2,86 (2H, m) e δ 2,61 (2H, t, J=8,0 Hz) referentes aos hidrogênios

metilênicos H-3 e H-2, respectivamente, de

05. Em δ 3,73 (3H, s) e 3,76 (3H, s)

observam-se os sinais das duas metoxilas de

01 e em δ 3,75 (3H, s) observa-se o

sinal da metoxila de

05, e em δ 1,42 ( 12H, s) a presença do sinal referente as

quatro metilas características do anel cromeno de ambas as substâncias. Em δ

6,49 (1H, d, J=10,0 Hz) e em δ 5,49 (1H, d, J= 10,0 Hz) observam-se os sinais

referentes aos hidrogênios H-4

’’

e H-3

’’

do anel cromeno de 01 e em δ 5,64 (1H, d,

J=10Hz) e δ 6,56 (1H, d , J=10Hz ) observam-se a presença dos hidrogênios H-4

’’

e H-3

’’

do anel cromeno de 05. Ainda é possível observar em δ 6,20 (1H, s) o sinal

relativo a um hidrogênio aromático de

01 e em δ 6,94 (1H, d, J=8,4Hz) e δ 6,53

(1H, d, J=8,4Hz) observam-se os sinais referentes aos hidrogênios aromáticos H-

’

e H-5

’

, respectivamente, de 05.

Estudo Fitoquímico das Espécies de Hortia

O espectro de RMN de

C (FIGURA 3.18, pg 62) apresenta sinais

de 16 carbonos para a molécula

01 e 15 carbonos para a molécula 05. Os valores

H e

C da substância 05 e comparação com a literatura podem ser

observados na TABELA 3.6 (pg 61). Os sinais característicos das carboxilas não

aparecem no espectro de

C, e por isso o deslocamento das mesmas ficou

estabelecido como o valor encontrado na literatura.

Os experimentos de HSQC e HMBC foram discutidos para a substância

01 e

para a substância

05, respectivamente.

Desta forma, o experimento de HSQC (FIGURA 3.19, pg 63) para

01 mostra

correlação de H-2 em δ 2,52 com C-2 em 33,8 e de H-3 em 2,87, com C-3 em δ

18,6. As metilas do carbono C-2

’’

mostram correlação com o sinal em δ 27,3 e as

metoxilas em δ 3,73 e δ 3,76 mostram correlação com os carbonos em δ 62,0 e

em δ 55,1, respectivamente. Para a substância

05, o experimento de HSQC

mostra correlação de H-2 em δ 2,61 com C-2 em 34,6 e de H-3 em 2,86 com C-3

em δ 24,5. As metilas do carbono C-2

’’

mostram correlação com o sinal em δ 27,3

e a metoxila em δ 3,75 mostra correlação com o carbono em δ 61,7.

No experimento de HMBC (FIGURA 3.20, pg 64), para a substância

01 as

metilas em C-2

’’

mostram correlação entre si (δ 27,3), com um sinal em δ 75,7

atribuído ao carbono carbinólico C-2

’’

e com um sinal em δ 126,9 atribuído ao C-3

’’

O hidrogênio H-2 (δ 2,52) mostra correlação com C-3 em δ 18,6 e com um sinal

de um carbono quaternário em δ 113,6 que foi atribuído ao C-1

’

. O hidrogênio H-3

mostra correlação com C-2 em δ 33,8, com C-1

’

em δ 113,6 e com dois sinais de

carbono quaternário referentes aos carbonos C-2

’

(δ 154,6) e C-6

’

(δ 158,4). As

metoxilas estão posicionadas nos carbonos C-2

’

e C-6

’

sendo o sinal de

hidrogênio aromático em δ 6,20 atribuído ao sinal em δ 95,7. Pelo HSQC, C-5

’

foi

atribuído ao sinal em δ 95,7. No experimento de HMBC, H-5

’

(δ 6,20) mostra

correlação com C-1

’

(δ 113,6) e com C-6

’

(δ 158,4), que suporta a metoxila em δ

3,76. O hidrogênio H-5’ mostra no HMBC correlação a J

com um sinal em δ 116,8

atribuído ao C-4’’. O hidrogênio H-4’’ mostra correlação com C-2’’ (δ 75,7) e com

C-2’ (δ 154,6). Além disso, tanto H-4’’ como H-5’ mostram correlação com dois

carbonos quaternários em δ 152,7 e 107,3 que foram atribuídos aos carbonos C-

4’ e C-3’, respectivamente. Esta atribuição foi confirmada com base na correlação

Estudo Fitoquímico das Espécies de Hortia

observada para H-3’’ com o carbono em δ 107,3 que pode somente correlacionar

com C-3’ a três ligações.

No experimento de HMBC para a substância

05, as metilas em C-2

’’

mostram correlação entre si (δ 27,3), com um sinal em δ 75,3 atribuído ao carbono

carbinólico C-2

’’

e com um sinal em δ 130,1 atribuído ao C-3

’’

. O hidrogênio H-2 (δ

2,61) mostra correlação com C-3 em δ 24,5 e com um sinal de um carbono

quaternário em δ 124,8 que foi atribuído ao C-1

’

. O hidrogênio H-3 mostra

correlação com C-2 em δ 34,6, com C-1

’

em δ 124,8 e com dois sinais de carbono

referentes aos carbonos C-2

’

(δ 152,1) e C-6

’

(δ 129,1). Da mesma forma, H-5

’

(δ

6,53) mostra correlação com C-1

’

(δ 124,8) e com C-6

’

(δ 129,1).

Assim, pôde-se determinar a estrutura

01 como sendo o ácido 3-fenil-[2’, 6’-

dimetoxi-(3’,4’-O:5’’,6’’)-2’’,2’’-dimetilpirano]propiônico, e a estrutura

05 como

sendo o derivado ácido 3-fenil-[2

’

-metoxi-(3

’

-O:5

’’

’’’

)-2

’’

dimetilpirano]propiônico.

Estudo Fitoquímico das Espécies de Hortia

TABELA 3.6: Dados de RMN de

H e

C de 05 e comparação com a literatura

SUBSTÂNCIA

(400/100 MHz, CDCl

)

Braga, 2005(

H, CDCl

) 200 MHz

Suarez, 2002 (

C, CDCl

) 75 MHz

H/C

δ (ppm), J (Hz) δ (ppm) δ (ppm), J (Hz) δ (ppm)

1 - 178,7 - 178,7

2 2,61(2H, t, J=8,0) 34,6 2,61 (2H, t, J=7,4) 34,9

3 2,89 (2H, m) 24,5 2,87 (2H,t, J=7,4) 24,9

1’ - 124,8 - 125,1

2’ - 152,1 - 152,5

3’ - 114,5 - 114,8

4’ - 153,8 - 154,3

5’ 6,53 (1H, d, J=8,4) 112,0 6,52 (1H, d, J=8,4) 112,3

6’ 6,94 (1H, d, J=8,4) 129,1 6,93 (1H, d, J=8,4) 129,4

4’’ 5,64 (1H, d, J=10,0) 116,8 5,63 (1H, d, J=10,0) 117,2

3’’ 6,56 (1H, d, J=10,0) 130,1 6,56 (1H, d, J=10,0) 130,4

2’’ - 75,3 - 75,6

2’’-Me 1,42 (6H, s) 27,3 1,42 (6H, s) 27,7

2’-OMe 3,75 (3H, s) 61,7 3,75 (3H, s) 62,1

Estudo Fitoquímico das Espécies de Hortia

FIGURA 3.17: Espectro de RMN de

H da mistura de 01 e 05 (CDCl

, 400 MHz)

FIGURA 3.18: Espectro de RMN de

C da mistura de 01 e 05 (CDCl

, 100 MHz)

H-2

H-3

05 e 01

’’

- Me

’’

-OMe

’’

- OMe

’’

-OMe

H-3

’’

H-3

’’

H-5

’

H-4

’’

H-5

’

H-4’’

H-6

’

Estudo Fitoquímico das Espécies de Hortia

FIGURA 3.19: Mapa de contorno de g-HSQC da mistura de

01 e 05

(CDCl

, 400 MHz)

27,3

18,8

24,5

33.8

34,6

55,1

62,4

95,7

112,0

116,8 127,2

129

1 130,1

Estudo Fitoquímico das Espécies de Hortia

FIGURA 3.20: Mapa de contorno de g-HMBC da mistura de 01 e 05

(CDCl

, 400 MHz)

’’

-Me

’’

(05)

’’

(01)

’’

(05)

3 (01)

3 (05)

5’ (05)

’

(05)

’

(05)

’

(01)

’

(01)

’

(01)

’

(01)

’’

-Me (01)

’’

-Me (05)

’’

(01)

’’

(05)

’

(01)

’

(05)

3 (01)

’

(01)

’

(01)

’

(01)

’

(01)

’’

-Me

’’

’

(01)

’

(05)

’

(05)

’

(01)

’

(01)

’

(05)

’

(05)

5’ (05)

3 (05)

Estudo Fitoquímico das Espécies de Hortia

3.2.1.6- Determinação estrutural da substância 06

A substância 06 foi isolada do extrato diclorometano do tronco

subterrâneo de Hortia oreadica e sua estrutura foi determinada com base em

experimentos de RMN de

C, COSY, HSQC, HMBC como também através

da comparação com dados da literatura (SUAREZ, et al, 2002).

OCH

2''

3''

4''

O espectro de RMN de

H de 06 é bastante parecido com o espectro

do derivado do ácido diidrocinâmico

04, exceto que o espectro de 06 não

apresenta a metoxila referente à função éster. Desta maneira, podemos concluir

que trata-se do derivado do ácido diidrocinâmico com a função ácido carboxílico.

O espectro de RMN de

H de 06 (FIGURA 3.21, pg 68) mostra dois

sinais em δ 2,81 (2H, m) e δ 2,60 (2H, m) referentes aos hidrogênios metilênicos

H-3 e H-2, respectivamente. Em δ 3,63 (3H, s) e δ 3,76 (3H, s) observa-se os

sinais de duas metoxilas e em δ 1,43 (6H, s) observa-se a presença do sinal

referente às duas metilas do anel cromeno. Em δ 6,49 (1H, d, J= 10 Hz) e em δ

5,60 (1H, d, J= 10 Hz) observa-se os sinais referentes aos hidrogênios do anel

cromeno. Em δ 6,58 (1H, s) observa-se o sinal de um hidrogênio aromático.

O espectro de

C (FIGURA 3.22, pg 68) apresenta sinais de 16

carbonos para a molécula, cujos valores podem ser observados na Tabela 3.7 (pg

67).

O experimento de HSQC (FIGURA 3.23, pg 69) mostra a correlação

a J

de H-2 em δ 2,60 com C-2 em δ 36,3 e de H-3 em δ 2,81 com C-3 em δ 25,2.

As metilas do carbono C-2’’ mostram correlação com o sinal em δ 27,6 e as

metoxilas em δ 3,63 e δ 3,76 mostram correlação com os carbonos em δ 62,3 e

em δ 56,7, respectivamente.

Estudo Fitoquímico das Espécies de Hortia

No espectro de COSY (FIGURA 3.24, pg 69), pode-se observar o

acoplamento entre H-4’’ (δ 6,49) e um sinal em δ 5,60 atribuído ao H-3’’ (C-3’’ em

δ 130,6 pelo HSQC). Outra correlação observada ainda é de H-3 em δ 2,81 com

um sinal em δ 2,60 atribuído ao H-2.

No espectro de HMBC (FIGURA 3.25, pg 70), as metilas em C-2’’

mostram correlação entre si (δ 27,6), com um sinal em δ 75,7 atribuído ao

carbono carbinólico C-2’’ e com um sinal em δ 130,6 atribuído ao C-3’’. As

metoxilas em δ 3,63 e δ 3,76 mostram correlação com C-2’ em δ 147,7 e C-5’ em

δ 144,9, respectivamente. O sinal referente ao hidrogênio aromático mostra

correlação com C-3 (δ 25,2) e com os sinais em δ 147,7 e em δ 144,9, cujos

carbonos suportam as duas metoxilas. Desta maneira, o hidrogênio aromático em

δ 6,58 foi atribuído ao H-6’.

Ainda é possível observar a correlação de H-4’’ (δ 6,49) com C-2’’ (δ

75,7) e C-2’ (δ 147,7) e de H-3’’ (δ 5,60) com C-2’’ (δ 75,7) e com um sinal

referente a um carbono quaternário em δ 115,5, o qual somente pode ser

atribuído ao C-3’.

Desta forma, pode-se concluir que a substância

06 é referente ao

ácido 3-fenil-[2’,5’-dimetoxi-(3’,4’-O:5’’,6’’)-2’’,2’’-dimetilpirano]propiônico.

Estudo Fitoquímico das Espécies de Hortia

TABELA 3.7: Dados de RMN de

H e

C de 06 e comparação com a literatura.

Substância

( 400/100 MHz, CDCl

)

SUAREZ, 2002

(300/75 MHz, CDCl

)

H/C δ (ppm), J (Hz) δ (ppm) δ (ppm), J (Hz) δ (ppm)

1 - 177,9 - 178,7

2 2,60 (2H, t, J= 7,5 Hz) 36,3

2,65 (2H, t, J= 7,5 Hz)

35,0

3 2,81 (2H, t, J= 7,5 Hz) 25,2

2,88 (2H, t, J= 7,5 Hz)

24,9

1’ - 124,6 - 123,8

2’ - 147,7 - 147,8

3’ - 115,5 - 115,6

4’ - 141,1 - 141,2

5’ - 144,9 - 144,7

6’ 6,58 (1H, s) 113,5 6,60 (1H, s) 113,0

2’’ - 75,7 - 75,8

3’’

5,60 (1H, d, J=10,0 Hz)

130,6

5,65 ( 1H, d, J= 10 Hz)

130,6

4’’

6,49 (1H, d, J= 10,0 Hz)

117,5

6,55 ( 1H, d, J= 10 Hz)

117,3

2’’-Me 1,43 (6H, s) 27,6 1,47 (6H, s) 27,5

2’-Ome 3,63 (3H, s ) 62,3 3,71 ( 3H, s ) 62,2

5’-Ome 3,76 ( 3H, s ) 56,7 3,82 ( 3H, s ) 56,5

Estudo Fitoquímico das Espécies de Hortia

FIGURA 3.21: Espectro de RMN de

H de 06 (CDCl

, 400 MHz)

FIGURA 3.22: Espectro de RMN de

C de 06 (CDCl

, 100 MHz)

H-6’

H-4’’

H-3’’

5’-OMe

2’-OMe

H-3 H-2

2’’-Me

Estudo Fitoquímico das Espécies de Hortia

FIGURA 3.23: Mapa de contorno de g-HSQC de

06 (CDCl

, 400 MHz)

FIGURA 3.24: Espectro de g-COSY de 06 (CDCl

, 400 MHz)

H-4’’ ↔ H-3’’

H-3 ↔ H-2

27,6

25,2

36,3

56,7

62,3

130,6

117,5

113,5

Estudo Fitoquímico das Espécies de Hortia

FIGURA 3.25: Mapa de contorno de g-HMBC de

06 (CDCl

, 400 MHz)

2’’-Me

2’’

3’’

2’

5’

2’’

3’

2’’

5’

2’

Estudo Fitoquímico das Espécies de Hortia

3.2.1.7- Determinação estrutural das substâncias 03 e 07

As substâncias 03 e 07 foram isoladas em mistura dos extratos

hexânico e diclorometano do tronco subterrâneo de H. oreadica. Ambas já se

encontram descritas em literatura. As estruturas foram determinadas com base

em espectros de RMN de

H e

C e por comparação com dados da literatura

(SUAREZ, 2002; BRAGA, 2005).

OCH

OOCH

4''

3''

2''

OCH

O espectro de RMN de

H (FIGURA 3.26, pg 73) mostra dois sinais

em δ 2,87 ( 2H, t, J=7,6 Hz) e δ 2,51 (2H, t, J=7,6 Hz) referentes aos hidrogênios

metilênicos H-3 e H-2, respectivamente, de

03. Em δ 3,68 (3H, s), δ 3,73 (3H, s) e

δ 3,76 observa-se os sinais das três metoxilas de

03 e em δ 3,87 (3H, s) observa-

se o sinal da metoxila de

07. Em δ 1,41 ( 6H, s) nota-se a presença do sinal

referente as duas metilas características do anel cromeno de

03 e em δ 1,46 ( 6H,

s) observa-se as duas metilas do anel cromeno de

07. Em δ 6,49 (1H, d, J= 9,2

Hz) e em δ 5,48 (1H, d, J= 9,2 Hz) observa-se os sinais referentes aos

hidrogênios H-4

’’

e H-3’’ do anel cromeno de 03 e em δ 5,57 (1H, d, J=10Hz) e δ

6,78 (1H, d , J=10Hz ) observa-se a presença dos hidrogênios H-2

’

e H-1

’

de 07.

Ainda é possível observar em δ 6,19 (1H, s) o sinal relativo a um hidrogênio

aromático de

03; em δ 7,94 (1H, d, J= 10,0 Hz) e δ 6,12 (1H, d, J= 10,0 Hz)

observa-se os sinais característicos do esqueleto cumarínico relativo aos

hidrogênios H-4 e H-3 e em δ 6,23 (1H, s) um sinal relativo ao hidrogênio

aromático de

07.

Estudo Fitoquímico das Espécies de Hortia

O espectro de RMN de

C ( FIGURA 3.27, pg 73) apresenta sinais

de 17 carbonos para a molécula

03 e 15 carbonos para a molécula 07, cujos

valores para

07 podem ser observados na TABELA 3.8 (pg 72).

TABELA 3.8: Dados de RMN de

H e

C de 07 e comparação com a literatura

SUBSTÂNCIA

(400/100 MHz, CDCl

)

BRAGA, 2005

(400/50 MHz, CDCl

)

H/C

δ (ppm), J (Hz)

(ppm)

δ (ppm), J (Hz)

(ppm)

2 - 161,2 - 161,2

3 6,12 (1H, d, J= 10,0 Hz) 110,3 6,13 (1H, d, J= 9,6 Hz) 110,3

4 7,94 (1H, d, J= 10,0 Hz) 138,8 7,96 (1H, d, J= 9,6 Hz) 138,9

5a - 103,6 - 103,6

5 - 156,5 - 156,5

6 6,23 (1H, s) 95,3 6,23 (1H, sl) 95,3

7 - 157,4 157,4

8a - 151,0 151,0

8 - 102,5 102,5

1’ 6,78 (1H, d, J= 10,0 Hz) 114,9 6,79 (1H, dd, J= 10,0 e 0,5 Hz) 114,9

2’ 5,57 (1H, d, J= 10,0 Hz) 127,5 5,57 (1H, d, J= 10,0 Hz) 127,5

3’ - 77,9 - 77,9

4’, 5’-Me 1,46 (6H, s) 28,0 1,46 (6H, s) 28,1

5-OMe 3,87 (3H, s) 55,9 3,88 (3H, s) 55,9

Estudo Fitoquímico das Espécies de Hortia

FIGURA 3.26: Espectro de RMN de

H da mistura de 03 e 07 (400 MHz, CDCl

)

FIGURA 3.27: Espectro de RMN de

C da mistura de 03 e 07 (100 MHz, CDCl

)

H-4

(07)

H-1’

(07)

H-4’’

(03)

H-6

(07)

H-5’

(03)

H-3

(07)

H-2’

(07)

H-3’’

(03)

5-OMe

(07)

6’-OMe

(03)

2’-OMe

(03)

1-OMe

(03)

H-3

(03)

H-2

(03)

4’,5’-Me

(07)

2’’-Me

(03)

Estudo Fitoquímico das Espécies de Hortia

3.2.1.8- Biogênese dos Derivados do Ácido Diidrocinâmico

A L-fenilalanina e a L-tirosina são precursores de uma grande

variedade de produtos naturais. Nas plantas, o passo inicial é a eliminação da

amônia da cadeia lateral para gerar o ácido cinâmico trans (E). No caso da

fenilalanina, tem-se o ácido cinâmico, enquanto que a tirosina produz o ácido 4-

cumárico ou ácido p-cumárico (ESQUEMA 3.2, pg 74) .

Todas as plantas têm habilidade para promover a desaminação da

fenilalanina via a enzima fenilalanina amônia liase (PAL), porém a correspondente

transformação da tirosina é restrita a algumas famílias e ainda não é bem

esclarecida. As plantas que não são capazes de transformar a tirosina, sintetizam

o ácido p-cumárico através da hidroxilação direta do ácido cinâmico (DEWICK,

2002).

ESQUEMA 3.2: Proposta biogenética para os derivados do ácido diidrocinâmico

OCH

TIROSINA

ÁCIDO P-CUMÁRICO

HIDROXILAÇÃO

/ NADPH

ÁCIDO CINÂMCIO

PAL

FENILALANINA

[ O ]

DMAPP

SUBSTÂNCIA 06 ( R= H )

SUBSTÂNCIA 04 ( R= CH

)

SAM

- H

SUBSTÂNCIA 03 ( R= CH

)

SUBSTÂNCIA 01 ( R= H )

SUBSTÂNCIA

05 ( R= H )

SUBSTÂNCIA

02 ( R= CH

)

SAM

- H

SAM

- H

EPOXIDAÇÃO

[ H

]

[ O ]

Estudo Fitoquímico das Espécies de Hortia

3.2.2 – Derivado do Ácido Cinâmico

3.2.2.1- Determinação estrutural da substância 08

A substância 08 foi isolada do extrato diclorometano do tronco

subterrâneo de H. oreadica e sua estrutura foi determinada com base em

experimentos de RMN de

C, COSY, HSQC, HMBC e através de

experimento de CG-EM. Esta estrutura parece ser inédita na literatura até o

momento.

O espectro de RMN de

H de 08 (FIGURA 3.29, pg 80) mostra sinais

para sete hidrogênios em região espectral desblindada, sendo quatro dubletos em

δ 8,22 (1H, J= 8,4 Hz) , δ 7,22 (1H, J= 2,0 Hz), δ 6,93 (1H, J= 8,4 Hz) e δ 6,87

(1H, J= 2,0 Hz) referentes aos hidrogênios H-5’, H-2, H-5 e H-2’, respectivamente;

um singleto em δ 7,95 de H-β e dois duplo dubletos, sendo um de H-6 em δ 7,06

(1H, J= 8,4 e 2,0 Hz) e o outro de H-6’ em δ 6,99 (1H, J= 8,4 e 2,0 Hz). Além

disso, observa-se ainda três singletos em δ 3,92, δ 3,93 e δ 3,94 característicos

de metoxilas.

O espectro de RMN de

C (FIGURA 3.30, pg 80) apresenta sinais

de 19 carbonos para a molécula, cujos valores podem ser observados na

TABELA 3.9 (pg 79).

O experimento de HSQC (FIGURA 3.31, pg 81) mostra a correlação

a J

de H-5’ em δ 8,22 com C-5’ em δ 127,8, de H-6’ em δ 6,99 com C-6’ em δ

114,6 e de H-2’ em δ 6,87 com o sinal em δ 100,1 de C-2’. Outras correlações

observadas pelo HSQC foram do H-6 em δ 7,06 com o C-6 em δ 121,1; H-5 em δ

6,93 com o C-5 em δ 111,3 e de H-2 em δ 7,22 com o C-2 em δ 112,6, atribuindo

OCH

Estudo Fitoquímico das Espécies de Hortia

assim todas as correlaçõe para os dois anéis aromáticos trissubstituídos. Ainda foi

possível observar a correlação do singleto em δ 7,95 referente ao H-β com C-β

em δ 152,2.

No espectro de COSY (FIGURA 3.32, pg 81), pode-se observar o

acoplamento entre H-6 (δ 7,06) e um sinal em δ 6,93 atribuído ao H-5. Outra

correlação observada ainda foi de H-6’ em δ 6,99 com um sinal em δ 8,22

atribuído ao H-5’.

No espectro de HMBC (FIGURA 3.33, pg 82), o sinal referente ao H-

β (δ 7,95) mostra correlação com C-1 (δ 124,7), com o sinal em δ 158,0 referente

ao C-α e com o sinal em δ 176,0 do carbono da carboxila. Ainda é possível

observar a correlação de H-2 (δ 7,22) com C-6 (δ 121,1) e C-3 (δ 149,2); H-6 (δ

7,06) com C-2 (δ 112,6) e com um sinal referente a um carbono quaternário em δ

148,9, o qual foi atribuído ao C-4 e H-5 (δ 6,93) com C-1 (δ 124,7) e com C-4 (δ

148,9) (FIGURA 3.28 (1), pg 76).

FIGURA 3.28: Correlações observadas no HMBC para

Pelo espectro de HMBC observa-se que duas metoxilas possuem o

mesmo deslocamento químico (δ 3,92) e apresentam correlações com C-3 e C-4.

Desta forma, conclui-se que uma delas está ligada ao C-3 e a outra a C-4, e o

valor de carbono para ambas é δ 55,8.

6,93

7,06

7,22

7,95

152,2

176,0

158,0

124,7

121,1

111,3

148,9

149,2

112.6

OCH

164,1

135,0

134,3

100,1

118,5

127,8

158,0

176,0

6,99

8,22

6,87

114,6

Estudo Fitoquímico das Espécies de Hortia

O hidrogênio H-6’ (δ 6,99) apresentou apenas uma correlação via

HMBC, com um sinal em δ 118,5 que foi atribuído ao C-1’. O H-5’ (δ 8,22)

apresentou correlação com C-α em δ 158,0, com um sinal em δ 118,5 atribuído ao

C-1’e com um carbono em δ 164,1 que suporta a terceira metoxila; o sinal em δ

6,87 (H-2’) correlacionou-se com C-α (δ 158,0) e com um sinal em δ 118,5

referente ao C-1’ (FIGURA 3.28 (2), pg 76).

A configuração da substância

08 (E ou Z) foi realizada com base na

literatura ( JANUÁRIO et al., 1992; JACKMAN, et al., 1960; GERIG, et al., 1970).

Estudos relatam que o deslocamento de um hidrogênio β-olefínico Z a um grupo

aldeído ou carboxílico é significantemente mais desblindado que um hidrogênio E.

Segundo POPLE e McCONNEL citado por JACKMAN (1960), o deslocamento

químico de um hidrogênio na molécula dependerá da relação espacial entre o

hidrogênio e vários grupos de elétrons que circulam ao seu redor. Estas correntes

de elétrons podem arbitrariamente atuarem de 3 maneiras, seja pela circulação

diamagnética local, circulação paramagnética ou circulação diamagnética

interatómica e são elas que promovem a diferenciação de deslocamento químico

entre um hidrogênio e um determinado grupo.

Abaixo é mostrado uma substância similar à

08 nas duas

configurações possíveis e seus respectivos deslocamentos químicos:

Portanto, comparando estes deslocamentos químicos com aquele

obtido via RMN de

H para o hidrogênio na posição β com um valor de δ 7,95, é

possível propor que a configuração da substância

08 seja E.

O espectro de massas (FIGURA 3.34, pg 82) obtido por CG-EM da

substância

08 não detectou o pico do íon molecular; entretanto aparece o íon [M]

em m/z 312 que indica possivelmente a perda de ácido fórmico da molécula. O

ESQUEMA 3.3 (pg 83) mostra a proposta de fragmentação.

7,11

OCH

7,70

OCH

Estudo Fitoquímico das Espécies de Hortia

Desta forma, pode-se determinar a estrutura em qüestão como

sendo E-ácido 3,4-dimetoxi-α(3,hidroxi-4-carbometoxifenil)cinâmico.

Estudo Fitoquímico das Espécies de Hortia

TABELA 3.9: Dados de RMN de

C e HMBC de 08

Substância

( 400/100 MHz, CDCl

)

H/C δ (ppm), J (Hz) δ (ppm)

Correlações observadas

no HMBC

124,7 -

2 7,22 (1H, d, J= 2,0) 112,6 C-3, C-6

3 149,2

148,9 -

5 6,93 (1H, dl, J= 8,4) 111,3 C-1, C-4

7,06 ( 1H, dd, J= 8,4;2,0)

121,1 C-2, C-4

1’ - 118,5 -

2’ 6,87 (1H, d, J= 2,0) 100,1 C-1’, C-α

3’ - 134,3 -

4’ - 135,0 -

5’ 8,22 (1H, d, J= 8,4) 127,8 C-1’, C

OOCH

C-α

6’ 6,99 (1H, dd, J= 8,4; 2,0) 114,6 C-1’

COOH - 176,0 -

OOCH

- 164,1 -

COOCH

3,933 (3H, s) 56,0 -

3-OCH

3,917 (3H, s) 55,8 C-4, C-3

4-OCH

3,926 (3H, s) 55,8 C-3, C-4

H/C- β 7,95 (1H, s) 152,2 C-1, C-α, C

OOH

C- α 158,0 -

Estudo Fitoquímico das Espécies de Hortia

FIGURA 3.29: Espectro de RMN de

H de 08 (CDCl

, 400 MHz)

FIGURA 3.30: Espectro de RMN de

C de 08 (CDCl

, 100 MHz)

H-5’

H-α

H-2

H-6

H-6’

H-5

H-2’

COOCH

3-OCH

4-OCH

Estudo Fitoquímico das Espécies de Hortia

FIGURA 3.31: Mapa de contorno de g-HSQC de 08 (CDCl

, 400MHz)

FIGURA 3.32: Espectro de g-COSY de

08 (CDCl

, 400 MHz)

H-5’

H-α

H-2

H-6 e H-6’

H-5 e H-2’

152,2 C-α

127,8 C-5’

121,1 C-6

114,6 C-6’

112,6 C-2

111,3 C-5

100,1 C-2’

55,8 3- OCH

55,8 4- OCH

0 COOCH

H-5’ ↔ H-6’

H-6 ↔ H-5

Estudo Fitoquímico das Espécies de Hortia

FIGURA 3.33: Mapa de contorno de g-HMBC de

08 (CDCl

, 400MHz)

FIGURA 3.34: Espectro de massas de 08 (IE-70eV)

3; 4

OOCH

COOCH

C-α

COOH

C-α

1’

5’

3 e 4

OOCH

COOH

C-α

3 4 4

1’

C-α

Estudo Fitoquímico das Espécies de Hortia

ESQUEMA 3.3: Proposta de fragmentação para

3.2.2.2- Biogênese da Substância 08

ESQUEMA 3.4: Proposta biogenética para 08

- (CH

)

m/z 297

m/z 312

(H-C-OH)

m/z 358

OCH

[ O ]

NADPH

ÁCIDO P-CUMÁRICO

FENILALANINA

PAL

ÁCIDO CINÂMCIO

/ NADPH

HIDROXILAÇÃO

SAM

OCH

ÁCIDO FERÚLICO

ÁCIDO 3,4-DIMETOXI-(3,HIDROXI-4-CARBOMETOXIFENIL)CINÂMICO

COOH

SAM

HOOC

Estudo Fitoquímico das Espécies de Hortia

3.2.3 – Alcalóides

Os alcalóides constituem um vasto grupo de metabólitos

secundários com grande diversidade estrutural, representando cerca de 20% das

substâncias naturais descritas (HENRIQUES et al, 2001). As plantas da família

Rutaceae são capazes de produzir uma grande variedade de alcalóides derivados

do ácido antranílico, tais como alcalóides furoquinolínicos, 2-quinolona, 4-

quinolona, piranoquinolonas e acridônicos, dentre outros (WATERMAN, 1999).

Alguns alcalóides são descritos para o gênero Hortia, dentre eles os

furoquinolínicos (PACHTER, et al., 1960; BRAGA, 2005), 2-quinolona (PÁDUA,

1976; FERRACIN, 1992; BRAGA, 2005), piranoquinolonas (CUCA, 1998; BRAGA,

2005) e os indolopiridoquinazolínicos (PACHTER, 1957; CUCA, 1998; BRAGA,

2005).

Neste estudo foram isolados quatro alcalóides, sendo dois

indolopiridoquinazolínicos (rutaecarpina e 7,8-desidrorutaecarpina), um

furoquinolínico (dictamina) e um piranoquinolona (N-metilflindersina). O alcalóide

7,8-desidrorutaecarpina ainda não havia sido relatado para o gênero Hortia.

3.2.3.1- Determinação estrutural da substância 09

O alcalóide do tipo indolopiridoquinazolínico 09 foi isolado dos

extratos diclorometano do tronco subterrâneo e das folhas de H. oreadica, extrato

diclorometano das folhas de H. brasiliana e extrato metanólico do tronco de H.

superba. Sua estrutura foi determinada com base em espectros de RMN de

C, COSY, HSQC e HMBC e por comparação com dados da literatura

(RIBEIRO, 2006).

14a

13a

12a

Estudo Fitoquímico das Espécies de Hortia

O espectro de RMN de

H de 09 (FIGURA 3.36, pg 89) mostra

sinais de 8 hidrogênios aromáticos na região de δ 8,32 a 7,17 e um outro sinal em

δ 9,22 (1H, s) relativo ao hidrogênio ligado ao nitrogênio (H-13). Os dois sinais em

δ 4,59 (2H, t, J=7,2 Hz) e δ 3,24 (2H, t, J=7,2 Hz) são relativos aos hidrogênios H-

7 e H-8, respectivamente. É possível observar H-4 em δ 8,32 (1H, ddd, J=8,0; 1,2

e 0,4 Hz), acoplando com constantes orto

, meta e para com H-3, H-2 e H-1

respectivamente.

O espectro de RMN de

C (FIGURA 3.37, pg 89) mostra sinais para

18 carbonos, cujos valores encontram-se na TABELA 3.11 (pg 88).

Analisando o espectro de COSY (FIGURA 3.38, pg 90), H-4 em δ

8,32 mostra correlação com um sinal em δ 7,43 atribuído a H-3. O sinal atribuído

ao H-3 (δ 7,43) mostra correlação com um sinal em δ 7,73 atribuído ao H-2.

Através do espectro de HSQC (FIGURA 3.39, pg 91) pode-se atribuir C-4 em δ

127,3, C-3 em δ 126,3, C-2 em δ 134,4 e C-1 em δ 126,3.

Outros valores atribuídos via HSQC são para C-7 em δ 41,2 e C-8

em δ 19,6. Pelo espectro de HMBC (FIGURA 3.40, pg 91) observa-se correlações

de H-7 (δ 4,59) com C-8 (δ 19,6), com um sinal em δ 118,7 atribuído ao C-8a, com

um sinal em δ 145,0 atribuído ao C-14a e com C-5 em δ 161,4; o H-8 (δ 3,24)

mostra correlações com C-7 (δ 41,2), com C-8a (δ 118,7) e com um sinal em δ

125,7 atribuído ao C-9a (FIGURA 3.35 (1), pg 86).

Estudo Fitoquímico das Espécies de Hortia

FIGURA 3.35: Correlações observadas no HMBC para

Pelo HMBC, H-4 (δ 8,32) correlaciona-se com C-2 (δ 134,4) e com

C-1a (δ 147,0); H-2 (δ 7,73) mostra correlação com C-4 (δ 127,3) e com C-1a (δ

147,0) e H-3 (δ 7,43) mostra correlação com C-4a (δ 121,0) e com C-1 (δ 126,3)

(FIGURA 3.35 (2), pg 86).

Ainda pelo espectro de HMBC observa-se que um sinal em δ 7,19

mostra duas correlações, sendo uma com C-12 (δ 112,2) e a outra com C-9a (δ

125,7), e foi atribuído ao H-10 que pelo espectro de HSQC mostra correlação com

um carbono em δ 120,7, atribuído ao C-10. O sinal em δ 7,65 atribuído ao H-9

mostra correlação com C-11 (δ 125,8) e com um sinal em δ 138,4 atribuído ao C-

126,2

118,7

19,6

41,2

145,0

125,7

161,4

4,59

3,24

8,32

7,43

7,73

7,65

121,0

127,3

126,3

134,4

126,3

147,0

138,4

112,2

7,43

125,8

7,34

120,7

7,19

120,1

7,65

125,7

Estudo Fitoquímico das Espécies de Hortia

12a; H-11 em δ 7,34 mostra correlação com C-9 (δ 120,1), além da correlação

com C-12a (FIGURA 3.35 (3), pg 86).

No espectro de COSY, podemos observar dois acoplamentos de H-

10 (δ 7,19), sendo um com o sinal em δ 7,34 atribuído ao H-11 (C-11 em δ 125,8

pelo HSQC) e outro em δ 7,65 atribuído ao H-9 (C-9 em δ 120,1 pelo HSQC). O

espectro de COSY mostra ainda correlação de H-11 com um sinal em δ 7,43

atribuído ao H-12.

Desta forma, através da análise dos espectros da substância

09 a

estrutura foi determinada como sendo a rutaecarpina.

TABELA 3.10: Dados de RMN de

H de 09 e comparação com a literatura

SUBSTÂNCIA

(400 MHz, CDCl

)

RIBEIRO, 2006

(400 MHz, CDCl

)

δ (ppm), J (Hz) δ (ppm), J (Hz)

1 7,65 (1H, ddd, J=7,0;1,2 e 0,5) 7,69 (1H, dl, J=8,0)

2 7,73 (1H, ddd, J=8,4; 7,0 e 1,2) 7,71 (1H, dd, J=7,0 e 1,5)

3 7,43 (1H, ddd, J=8,4; 8,0 e 1,2) 7,46 (1H, dd, J=1,5 e 8,0)

4 8,32 (1H, ddd, J=8,0; 1,2 e 0,5) 8,31 (1H, ddd, J=8,0; 1,5 e 0,6)

7 4,59 (2H, t, J=7,2) 4,58 (2H, t, J=7,0)

8 3,24 (2H, t, J=7,2) 3,23 (2H, t, J=7,0)

9 7,65 (1H, dd, J=8,0 e 1,2) 7,62 (1H, dd, J=8,0 e 1,0)

10 7,19 (1H, ddd, J=8,0;7,2 e 1,2) 7,17 (1H, ddd, J=8,0; 7,0 e 1,0)

11 7,34 (1H, ddd, J=8,4;7,2 e 1,2) 7,32 (1H, ddd, J=8,0; 7,0 e 1,0)

12 7,43 (1H, dd, J=8,4 e 1,2) 7,42 (1H, ddd, J=8,0 e 1,0)

13-NH 9,22 (1H, s) 9,49 (1H, s)

Estudo Fitoquímico das Espécies de Hortia

TABELA 3.11: Dados de RMN de

C de 09 e comparação com a literatura

SUBSTÂNCIA

(100 MHz, CDCl

)

RIBEIRO, 2006

(100 MHz, CDCl

)

δ (ppm) δ (ppm)

1 126,3 126,4

1a 147,0 146,7

2 134,4 138,4

3 126,3 126,9

4 127,3 127,2

4a 121,0 121,0

5 161,4 161,4

7 41,2 41,1

8 19,6 19,6

8a 118,7 118,6

9 120,1 120,1

9a 125,7 125,7

10 120,7 120,6

11 125,8 126,2

12 112,2 112,1

12a 138,4 138,4

13a 126,2 126,9

14a 145,0 145,0

Estudo Fitoquímico das Espécies de Hortia

FIGURA 3.36: Espectro de RMN de

H de 09 (CDCl

, 400 MHz)

FIGURA 3.37: Espectro de RMN de

C de 09 (CDCl

, 100 MHz)

H-4

H-2

H-1

H-9

H-3

H-12

H-11

H-10

H-7

H-8

H-13

Estudo Fitoquímico das Espécies de Hortia

FIGURA 3.38: Espectro de g-COSY (e ampliação) de

09 (CDCl

, 400 MHz)

H-7/H-8

H-4

H-2

H-11

H-10

H-4/H-3

H-9/H-10

H-10/H-11

H-2/H-3

H-12/H-11

H-1

H-9

H-3

H-12

Estudo Fitoquímico das Espécies de Hortia

FIGURA 3.39: Mapa de contorno de g-HSQC de

09 (CDCl

, 400MHz)

FIGURA 3.40: Mapa de contorno de g-HMBC de

09 (CDCl

, 400MHz)

H-4 H-2

H-1

H-9

H-11

H-10

H-7

H-8

19,6 C-8

41,2 C-7

127,3

C-4

120

1 C-9

134,4 C-2

126,3 C-1 e C-3

120

7 C-10

112

2 C-12

125

8 C-11

H-3

H-12

14a

12a

Estudo Fitoquímico das Espécies de Hortia

3.2.3.2- Determinação estrutural da substância 10

O alcalóide do tipo indolopiridoquinazolínico

10 foi isolado do extrato

diclorometano do tronco subterrâneo de H. oreadica (EDTSHB) e apresentou-se

como um cristal branco. A sua estrutura foi determinada com base em espectros

de RMN de

C, COSY, HSQC e HMBC; CG-EM e por comparação com

dados da literatura (IKUTA, et al., 1998).

8a9a

12a

13a

14a

O espectro de RMN de

H de 10 (FIGURA 3.42, pg 96) apresenta

sinais semelhantes ao da rutaecarpina (substância

09) na região espectral de

desblindagem, referentes a 10 hidrogênios aromáticos, ou seja, um tripleto largo

em δ 7,34 que correlaciona-se pelo experimento de COSY (FIGURA 3.44, pg 97)

com um sinal em δ 7,49 e com um dubleto em δ 8,04 (J= 8,0 Hz) referente a um

hidrogênio com acoplamento em orto

. O sinal em δ 7,49 correlaciona-se pelo

COSY com δ 7,34 e 7,51 . Pelo experimento de HSQC (FIGURA 3.45, pg 98),

pode ser observado as correlações de δ 7,34 com o sinal de carbono em δ 121,2;

δ 7,49 com δ 127,2; δ 7,51 com δ 112,2 e de δ 8,04 com δ 120,9, caracterizando-

se assim um anel aromático dissubstítuido.

Por meio do experimento de HMBC (FIGURA 3.46, pg 99) pode-se

verificar a correlação do sinal em δ 7,34 (atribuído ao H-10) com o δ 112,2

(atribuído ao C-12) e 122,5 (C-9a); o sinal em δ 7,49 (H-11) se correlaciona com δ

120,9 (C-9) e 139,5 (C-12a); δ 7,51 (H-12) se correlaciona com δ 139,5 (C-12a) e

121,2 (C-10) e δ 8,04 (H-9) correlaciona-se com δ 122,5 (C-9a) e 139,5 (C-12a),

além de uma correlação com um sinal em δ 120,9 atribuído ao C-8a (FIGURA

3.41 (1), pg 93).

Estudo Fitoquímico das Espécies de Hortia

FIGURA 3.41: Correlações observadas no HMBC para

O experimento de HMBC mostra também correlações do sinal em δ

7,55 (H-8) com δ 120,9 (C-8a), 134,8 (C-13a) e 118,7 (C-7). Esse sinal em δ

118,7 pelo experimento de HSQC corelaciona-se com o dubleto em δ 8,76 que foi

atribuído ao H-7. Este, por sua vez se correlaciona pelo experimento de HMBC

com δ 107,5 (C-8), 120,9 (C-8a), 134,8 (C-13a), 140,1 (C-14a) e o carbono

7,82

7,47

8,52

122,5

120,8

121,2

127,2

112,2

139,5

120,9

8,75

7,55

118,8

107,7

140,1

134,6

120,9

8,04

7,34

7,49

7,51

126,2

134,8

124,7

127,7

147,8

159,2

116,7

7,82

7,47

8,52

Estudo Fitoquímico das Espécies de Hortia

carbonílico em δ 159,2 (C-5). Essas correlações são mostradas na FIGURA 3.41

(2) (pg 93).

O espectro de RMN de

H apresenta sinais para outro anel

aromático, um multipleto em δ 7,82 (H-1 e H-2) que pelo HSQC refere-se aos

carbonos em δ 126,2 e 134,8, respectivamente. Esse sinal em δ 7,82 acopla via

COSY com um sinal em δ 7,47 (H-3) que pelo HSQC se refere ao C-3 em δ

124,7. Esse sinal em δ 7,47 acopla também via COSY com um dubleto em δ

8,52 (J= 9,2 Hz) que pelo HSQC se refere ao C-4 em δ 127,7. Esses dados

sugerem a presença de um outro anel aromático dissubstítuido na estrutura da

substância

09 (FIGURA 3.41 (3), pg 93).

O experimento de HMBC mostra ainda que os sinais em δ 7,82 (H-1)

e 8,52 (H-4) correlacionam-se com δ 147,8 (C-1a) e 116,7 (4a), respectivamente.

Sendo assim, estes sinais de carbono foram atribuídos ao anel aromático. O sinal

em δ 8,52 apresenta ainda via HMBC correlação com um sinal de carbono

carboxílico em δ 159,2. Com isso sugere-se que esta parte da estrutura seja da

seguinte forma como mostrado por meio de suas correlações via HMBC (FIGURA

3.41 (4), pg 93).

O deslocamento químico do sinal de carbono em δ 147,8 do anel

aromático sugere que esteja ligado a um nitrogênio como no caso da rutaecarpina

(substância

08). O deslocamento do carbono em δ 140,1 sugere que este esteja

ligado a dois heteroátomos. O espectro de RMN de

H apresenta ainda um

singleto largo em δ 10,2 referente à N-H na molécula.

Todos os dados de

H e

C (espectro de

C, FIGURA 3.43, pg 96)

da substância

10 são mostrados na TABELA 3.12 (pg 95).

O espectro de massas (FIGURA 3.47, pg 100) exibiu [M+H]

em m/z

286, estando compatível com a fórmula molecular C

O ESQUEMA 3.5

(pg 100) mostra a proposta de fragmentação da substância

10.

Desta forma a estrutura

10 foi determinada como sendo a 7,8-

desidrorutaecarpina.

Estudo Fitoquímico das Espécies de Hortia

TABELA 3.12: Dados de RMN de

H e

C de 10

e comparação com a literatura

SUBSTÂNCIA

(400/100 MHz, CDCl

)

IKUTA, 1998

(500/125 MHz, CDCl

H/C

δ (ppm), J (Hz) δ (ppm) δ (ppm), J (Hz) δ (ppm)

1 7,81 (sl) 126,2 7,81 126,0

147,8 - 147,5

2 7,81 (sl) 135,0 7,81 134,9

3 7,47 (m) 124,7 7,46 124,8

4 8,52 (1H, d, J= 9,2) 127,7 8,50 127,7

4a - 116,7 - 116,7

5 - 159,2 - 159,2

7 8,76 (1H, d, J=7,2) 118,7 8,75 (1H, d, J=8,0 Hz) 118,8

8 7,55 (1H, d, J=7,2) 107,5 7,55 (1H, d, J=8Hz) 107,7

8a - 120,9 - 120,9

9 8,04 (1H, d, J= 8,0) 120,9 8,02 120,9

9a - 122,6 - 122,5

10 7,34 (m) 121,2 7,33 121,3

11 7,49 (m) 127,2 7,48 127,4

12 7,51 (m) 112,2 7,52 112,3

12a - 139,5 - 139,5

13 10,2 (1H, s) 10,15 (1H, s)

13a - 134,8 - 134,6

14a - 140,1 - 140,1

Estudo Fitoquímico das Espécies de Hortia

FIGURA 3.42: Espectro de RMN de

H de 10 (CDCl

, 400 MHz)

FIGURA 3.43: Espectro de RMN de

C de 10 (CDCl

, 100 MHz)

H-7

H-4

H-9

H-1

H-2

H-8

H-12

H-11

H-3

H-10

H-13

Estudo Fitoquímico das Espécies de Hortia

FIGURA 3.44: Espectro de g-COSY de

10 (CDCl

, 400 MHz)

H-7

H-4

H-9

H-1 e H-2

H-8

H-12

H-11

H-3 H-10

Estudo Fitoquímico das Espécies de Hortia

FIGURA 3.45: Mapa de contorno de g-HSQC de

10 (CDCl

, 400 MHz)

H-7

H-4

H-9

H-1 e H-2

H-8

H-12

H-11

H-3

H-10

118,7

127,7

120,9

126,2

134,8

127,2

124,7

121,2

107,5

112,2

Estudo Fitoquímico das Espécies de Hortia

FIGURA 3.46: Mapa de contorno de g-HMBC de

10 (CDCl

, 400 MHz)

14a

5 5

13a

12a

H-7

H-4

H-9

H-1

H-2

H-8

H-12

H-11

H-3

H-10

Estudo Fitoquímico das Espécies de Hortia

100

FIGURA 3.47: Espectro de massas de 10 (APCI, [M+H]

)

ESQUEMA 3.5: Proposta de fragmentação para 10

m/z 257

m/z 258

m/z 286

- (H )

- (co)

Estudo Fitoquímico das Espécies de Hortia

101

3.2.3.3- Determinação estrutural da substância 11

O alcalóide do tipo furoquinolínico

11 foi isolado dos extratos

diclorometano do tronco subterrâneo e das folhas de H. oreadica e do extrato

metanólico do tronco de H. superba. Sua estrutura foi determinada com base em

espectros de RMN de

C, HSQC e HMBC e por comparação com dados da

literatura (BRAGA, 2005).

OCH

No espectro de RMN de

H de 11 (FIGURA 3.48, pg 103) observa-se

dois dubletos em δ 7,09 e 7,64 integrando para um hidrogênio cada, com

constante de acoplamento J= 2,8 Hz, característico de um anel furano

dissubstituído. O sinal em δ 7,09 foi atribuído ao hidrogênio na posição 3

’

e o sinal

mais desblindado em δ 7,64 foi atribuído ao H-2

’

. Observa-se ainda quatro sinais

de hidrogênios aromáticos, sendo eles duplo duplo dubleto em δ 7,45, 7,69, 8,01

e 8,28 integrando para um hidrogênio cada. Assim, o sinal em δ 7,45 foi atribuído

ao H-6 que acopla com duas constantes orto

de J= 8,4 e 6,8 com H-5 e H-7,

respectivamente. Além disso, H-6 mostra acoplamento com H-8 com constante

meta

de 1,2 Hz. O sinal em δ 7,69 foi atribuído ao hidrogênio H-7 que assim como

H-6 acopla com duas constantes orto

de 8,4 e 6,8 Hz com H-8 e H-6 ,

respectivamente e com uma constante pequena de 1,2 Hz referente ao

acoplamento meta

com H-5. O sinal observado em δ 8,28 foi atribuído ao

hidrogênio H-5 e acopla com H-6 com constante orto

de 8,4 Hz, com H-7 com

constante meta

de 1,2 Hz e com H-8 com constante para de 0,4 Hz. O sinal em δ

8,01 foi atribuído ao H-8, e este acopla com H-7 com constante orto

de 8,4 Hz,

com H-6 com constante meta

de 1,2 Hz e com H-5 com constante para de 0,4 Hz.

A análise do espectro de RMN de

C (FIGURA 3.49, pg 103) indica

a presença de 12 carbonos, sendo um relativo à metoxila em δ 59,0.

Estudo Fitoquímico das Espécies de Hortia

102

Através da análise do espectro de HSQC (FIGURA 3.50, pg 104) foi

possível atribuir os valores de δ 122,3 para C-5, δ 123,7 para C-6, δ 129,6 para

C-7, δ 127,8 para C-8, δ 143,5 para C-2

’

e δ 104,7 para C-3

’

No espectro de HMBC (FIGURA 3.51, pg 104) é possível observar

correlação de H-3

’

(δ 7,09) com C-2

’

(δ 143,5), com um sinal em δ 103,4 que foi

atribuído ao C-3 e com um sinal em δ 163,9 que foi atribuído ao C-2. O hidrogênio

H-2

’

(δ 7,64) mostra correlação com C-3

’

(δ 104,7) e com C-2 (δ 163,9).

A metoxila em δ 4,46 (δ 59,0) mostra correlação com um sinal em δ

156,8 atribuído ao C-4 e δ 104,7 que foi atribuído ao C-3. O hidrogênio H-5 (δ

8,28) mostra correlação com C-4 (δ 156,8), com C-7 (δ 129,6) e com um sinal de

carbono quaternário em δ 145,6 que foi atribuído ao C-8a. O hidrogênio H-6 (δ

7,44) mostra correlação com C-8 (δ 127,8), com C-7 (δ 129,6) e com um sinal em

δ 118,7 referente a C-5a. O hidrogênio H-7 (δ 7,68) mostra 2 correlações sendo

as mesmas com C-8a (δ 145,6) e com C-5 (δ 122,3).

Com base na análise de todos os dados, foi possível atribuir a

substância

11 ao alcalóide furoquinolínico dictamina.

TABELA 3.13: Dados de RMN de

H e

C de 11 e comparação com a literatura

SUBSTÂNCIA 11 (400/100 MHz, CDCl

) BRAGA, 2005 (200/ 50 MHz, CDCl

)

H/C

δ (ppm), J (Hz) δ (ppm) δ (ppm), J (Hz) δ (ppm)

2 - 163,9 - 163,8

3 - 103,4 - 103,3

4 - 156,8 - 156,7

5a - 118,7 - 118,6

5 8,28 (1H, ddd,J= 8,4;1,2;0,4) 122,3 8,26 (1H, ddd, J=8,5;1,4;0,5) 122,3

6 7,45 (1H, ddd, J=8,4;6,8;1,2) 123,7 7,44 (1H, ddd, J=8,5; 6,8;1,2) 123,6

7 7,69 (1H, ddd, J=8,4;6,8;1,2) 129,6 7,69 (1H, ddd, J=8,5; 6,8;1,4) 129,5

8 8,01 (1H, ddd, J=8,4;1,2;0,4) 127,8 8,01 (1H, dl, J=8,5) 127,7

8a - 145,6 - 145,6

2’ 7,64 (1H,d,J=2,8) 143,5 7,59 (1H, d, J=2,8) 143,4

3’ 7,09 (1H, d, J= 2,8) 104,7 7,01 (1H, d, J=2,8) 104,6

4-OMe 4,46 (3H,s) 59,0 4,40 (3H, s) 58,9

Estudo Fitoquímico das Espécies de Hortia

103

FIGURA 3.48: Espectro de RMN de

H de 11 (CDCl

, 400 MHz)

FIGURA 3.49: Espectro de RMN de

C de 11 (CDCl

, 100 MHz)

8.5 8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0

ppm

3.341.10 1.041.00 0.990.94

0.000

4.463

7.091

7.098

7.263

7.450

7.455

7.475

7.636

7.642

7.691

7.694

8.003

8.024

8.272

8.276

8.293

H-5

H-8 H-7

H-2’

H-6

H-3’

4-OMe

Estudo Fitoquímico das Espécies de Hortia

104

FIGURA 3.50: Mapa de contorno g-HSQC de

11 (CDCl

, 400 MHz)

FIGURA 3.51: Mapa de contorno g-HMBC de

11 (CDCl

, 400 MHz)

104

127

123

129

143

H-7

H-2

’

H-6

H-3

’

4-OMe

H-8

H-2

’

H-6

H-3

’

Estudo Fitoquímico das Espécies de Hortia

105

3.2.3.4- Determinação estrutural da substância 12

O alcalóide do tipo piranoquinolona

12 foi isolado do extrato

metanólico do tronco de H. superba (EMTHS) e identificado através da análise de

experimentos de RMN de

C e comparação com dados da literatura

(KAMPERDICK, 1999).

5'4'

3' 2'

O espectro de RMN de

H (FIGURA 3.52, pg 107) de 12 mostra na

região desblindada do espectro um duplo dubleto em δ 7,97 ( J= 7,9 e 1,6 Hz),

dois duplo duplo dubletos em δ 7,23 (J= 8,0; 7,0 e 1,0 Hz) e δ 7,55 ( J= 8,6; 7,0 e

1,6 Hz) e um dubleto largo em δ 7,31 (J= 8,6 Hz) referentes as hidrogênios de um

anel aromático dissubstituído. A presença do anel cromeno é comprovada pela

presença de dois dubletos, sendo um em δ 6,75 (J= 9,9 Hz) e outro em δ 6,54 (J=

9,9 Hz) integrando para um hidrogênio cada referentes aos hidrogênios H-1’e H-

2’, respectivamente, além da presença de um singleto em δ 1,52 integrando para

seis hidrogênios característicos das metilas 4’e 5’de um anel 2,2-dimetilcromeno

ou anel pirano. Observa-se também um singleto em δ 3,69 integrando para três

hidrogênios, característico de hidrogênios metílicos ligados a heteroátomo,

referentes a uma N-metila.

O espectro de RMN de

C (FIGURA 3.53, pg 107) apresenta 14

sinais de carbonos, sendo que se pode destacar o sinal em δ 161,0 referente a

carboxila de lactama na posição 2, o sinal em δ 28,2 referente a uma N-metila e o

sinal em δ 29,2 referentes às metilas equivalentes do anel pirano.

Todos os sinais de hidrogênios e carbonos foram atribuídos

baseando-se em dados da literatura e são mostrados na TABELA 3.14 (pg 106).

Estudo Fitoquímico das Espécies de Hortia

106

Assim, a análise dos experimentos de RMN e comparação com os

dados da literatura permitiu atribuir a estrutura

12 ao alcalóide N-metilflindersina.

TABELA 3.14: Dados de RMN de

H e

C de 12 e comparação com a literatura

SUBSTÂNCIA 12

(200/50 MHz, CDCl

)

KAMPERDICK , 1999

(300/75 MHz, CDCl

)

H/C

δ (ppm), J (Hz)

(ppm)

δ (ppm), J (Hz)

(ppm)

161,0

105,9

155,2

116,1

7,97 (1H, dd, J= 8,0; 1,6)

123,1

7,97 (1H, dd, J=8,2; 1,5)

123,1

7,23 (1H, ddd, J= 8,0; 7,0,1,0)

121,7 7,23 (1H,ddd,J= 8,2;7,1;1,0) 121,7

7 7,55 (1H, ddd,J= 8,6; 7,0; 1,6) 130,8 7,55 (1H,ddd,J= 8,6;7,1;1,5) 130,8

7,31 (1H, dl, J= 8,6)

114,0

7,32 (1H, d, J= 8,6)

114,0

139,4

1’

6,75 (1H, d, J= 9,9)

118,0

6,76 (1H, d, J= 9,8)

118,0

2’

6,54 (1H, d, J= 9,9)

126,3

5,54 (1H, d, J= 9,8)

126,3

3’

78,7

4’

5’

1,52 (6H, s)

29,2

1,52 (6H, s)

29,2

N-Me

3,70 (3H, s)

28,2

3,70 (3H, s)

28,2

Estudo Fitoquímico das Espécies de Hortia

107

FIGURA 3.52: Espectro de RMN de

H de 12 (CDCl

, 200 MHz)

FIGURA 3.53: Espectro de RMN de

C de 12 (CDCl

, 50 MHz)

6.513.741.301.14 1.041.00

TMS

7.9429

7.5487

7.3367

7.2643

7.2262

6.7795

6.7300

5.5610

5.5112

3.6951

1.7544

1.5181

0.0000

H-5

H-7

H-8

H-6

N-METIL

H-4’

H-5’

H-1’

H-2’

Chloroform-d

161.0079

155.1654

139.3832

130.8119

126.3051

123.1175

121.6589

117.9715

116.1196

113.9809

105.8685

78.7290

77.6310

77.0000

76.3608

29.2436

28.2193

Estudo Fitoquímico das Espécies de Hortia

108

3.2.3.5- Biogênese dos Alcalóides

Os alcalóides são bases orgânicas nitrogenadas encontradas

principalmente em plantas, e em extensão menor em microrganismos e animais.

São freqüentemente classificados em pirrolidínico, piperidínico, quinolínico, indol,

etc, de acordo com a natureza da estrutura contendo o nitrogênio. Os átomos de

nitrogênio originam de poucos aminoácidos precursores, sendo os principais,

ornitina, lisina, ácido nicotínico, tirosina, triptofano, ácido antranílico, e histidina

(DEWICK, 2002).

3.2.3.5.1- Alcalóides indolopiridoquinazolínicos

A distribuição dos alcalóides indolopiridoquinazolínicos,

especialmente aqueles com estruturas mais complexas como a rutaecarpina, está

restrita apenas à família Rutaceae e ocorre em apenas poucos gêneros (IKUTA,

et al., 1998). A origem da rota biossintética é através da combinação do triptofano,

que é um aminoácido contendo um sistema indol, com o ácido antranílico. A

proposta biogenética para a formação deste tipo de alcalóide está descrita no

ESQUEMA 3.6 (pg 108)

ESQUEMA 3.6: Proposta biogenética para os alcalóides

indolopiridoquinazolínicos

ACoS

SAM

MeN O

rutaecarpina

[O]

7,8-desidrorutaecarpina

Estudo Fitoquímico das Espécies de Hortia

109

3.2.3.5.2- Alcalóides furoquinolínicos e 2-quinolonas

Os alcalóides derivados do ácido antranílico são formados através

da combinação do ácido antranílico com uma unidade de malonil-CoA pela reação

de Claisen, levando à formação do sistema heterocíclico (DEWICK, 2002).

A diversidade desses alcalóides está relacionada, em parte, com a

habilidade biogenética da família Rutaceae em incorporar unidades prenila ao

precursor, sobretudo na posição C-3 que é altamente nucleofílica e susceptível a

alquilação. A prenilação em C-3 leva à formação de alcalóides furoquinolínicos,

como a dictamina (ESQUEMA 3.7, pg 109) e 2-quinolona, como a flindersina e N-

metilflindersina (ESQUEMA 3.8, pg 110). Para os alcalóides furoquinolínicos, o

anel furano é formado através da ciclização oxidativa de uma unidade prenila,

como mostra o ESQUEMA 3.7.

ESQUEMA 3.7: Proposta biogenética para alcalóides furoquinolínicos

dictamina

OCH

SAM

[O]

epoxidação

PPO

SCoA

-CO

SCoA

OHO

SCoA

Estudo Fitoquímico das Espécies de Hortia

110

ESQUEMA 3.8: Proposta biogenética para os alcalóides 2-quinolona

PPO

SCoA

OHO

-CO

SCoA

N-metilflindersina

SAM

flindersina

Estudo Fitoquímico das Espécies de Hortia

111

3.2.4 – Limonóides

Alguns limonóides têm sido relatados no gênero Hortia, sendo que o

primeiro, chamado de guianina, foi isolado de H. regia em 1986 (JACOBS, et al.,

1986). Este limonóide por apresentar um esqueleto bastante complexo, sugeria a

presença de outros com esqueletos mais simples no gênero. Posteriormente,

foram isolados da espécie H. colombiana hortiolida A e hortiolida B, cujas

estruturas são mais simples, em relação ao primeiro isolado (SUAREZ, et al.,

1998, SUAREZ, et al., 2002). Recentemente foram isolados quatro novos

limonóides que são inéditos em literatura, sendo eles: hortiolida C, hortiolida D e

hortiolida F de H. oreadica e hortiolida E de H. superba (BRAGA, 2005).

Neste estudo foram isolados três limonóides, sendo eles: guianina

(13), já descrito em literatura; hortiolida E (14) inédito para a espécie de H.

oreadica e hortiolida G

(15) que parece ser novo na literatura.

3.2.4.1 – Determinação estrutural da substância 13

O limonóide

13 foi isolado dos extratos diclorometano do tronco

subterrâneo e das folhas de H. oreadica e teve sua estrutura determinada através

de experimento de RMN de

H e

C, HSQC, HMBC e COSY, além da

comparação com os dados existentes na literatura (JACOBS, et al., 1986)

Estudo Fitoquímico das Espécies de Hortia

112

Analisando o espectro de RMN de

H de 13 (FIGURA 3.55, pg 117) é

possível atribuir os sinais característicos dos hidrogênios do anel furânico H-21 e

H-23 em δ 7,56 (1H, m) e δ 7,42 (1H, t, J=1,7 Hz) respectivamente, e H-22 em δ

6,38 (1H, dd, J= 1,8 e 0,7 Hz).

Através dos espectros de RMN de

C (FIGURA 3.56, pg 117) e HSQC

(FIGURA 3.57, pg 118) foi possível fazer a atribuição de todos os carbonos do

esqueleto. Os valores de hidrogênio e carbono estão descritos nas TABELAS

3.15 e 3.16 (pgs 115 a 116).

O espectro de HMBC (FIGURA 3.58, pg 119) mostra a correlação de

um hidrogênio carbinólico em δ 5,91 (1H, s) com C-21 (δ 140,7) indicando a

presença do anel D lactônico, o que permite atribuí-lo ao H-17(δ 80,2). Este

hidrogênio mostra ainda correlação com C-20 (δ 121,2) e com C-22 (δ 108,9),

uma correlação a J

com uma metila em δ 19,3 (δ 1,17) que foi atribuída à Me-18

e com um sinal em δ 173,1 que pode ser atribuído ao C-14. O sinal da Me-18 (δ

1,17) mostra correlação com C-17 (δ 80,2), com o sinal em δ 173,1, com um

carbono quaternário em δ 46,7, atribuído ao C-13 e com um sinal de um carbono

metilênico em δ 34,6, atribuído ao C-12. O espectro de HSQC mostra a correlação

a J

deste sinal em δ 34,6 com sinais em δ 1,57 (m) e δ 1,70 (m) e com os sinais

em δ 2,56 (1H, dd, J=10,8 e 16,9) e 2,17 (m), indicando que este sinal em δ 34,6 é

referente a dois carbonos. Através da análise do espectro de HMBC foi possível

observar a correlação dos sinal em δ 1,57 e 1,70 com o carbono C-18 (δ 19,3), C-

13 (δ 46,7), C-17 (δ 80,2) e com o sinal em δ 173,1. Desta maneira, estes sinais

foram atribuídos aos hidrogênios H-12a e H-12b. Ainda é possível observar no

espectro de HMBC a correlação do H-12a (δ 1,57) com um sinal em δ 69,0, que

pode ser atribuído somente ao C-9, justificando a correlação do mesmo a J

. No

espectro de COSY (FIGURA 3.59, pg 120) é possível observar o acoplamento

entre os hidrogênios H-12 com um sinal em aproximadamente δ 2,15, que pode

ser atribuído somente aos hidrogênios H-11. No HSQC foi possível, então, atribuir

o sinal em δ 28,7 ao C-11. O sinal de H-11 em δ 2,27 mostra correlação no HMBC

com C-12 (δ 34,6), com C-9 (δ 69,0) e com um sinal em δ 61,7 ainda não

atribuído.

A análise do espectro de HMBC mostra a correlação de um sinal em δ

5,95 (1H, s) atribuído ao H-15, com o sinal em δ 46,7 atribuído ao C-13, com um

Estudo Fitoquímico das Espécies de Hortia

113

sinal em δ 164,6, atribuído ao C-16 e com o sinal em δ 69,0, previamente

atribuído ao C-9. Num esqueleto intacto, esta correlação seria a J

, o que não

seria justificável neste caso. Desta forma, a correlação somente pode ser

justificada a J

com a contração do anel C, como mostrado na FIGURA 3.54 (1)

(pg 113).

FIGURA 3.54: Correlações observadas no HMBC para

A presença de dois sinais em δ 3,62 (δ 51,5) e δ 3,66 (δ 52,2),

indicou que, além do anel B ser seco, alguma outra modificação tinha ocorrido no

esqueleto. O espectro de HMBC mostra a correlação do sinal já mencionado

anteriormente em δ 2,56 (1H, dd, J=10,8 e 16,9) com os sinais em δ 174,0 (cuja

metoxila em δ 3,66 também se correlaciona), indicando ser este sinal relativo a

Estudo Fitoquímico das Espécies de Hortia

114

um dos hidrogênios H-6 correlacionando com C-7. Portanto, o sinal em δ 34,6

corresponde aos carbonos C-12 e C-6. No espectro de COSY é possível observar

o acoplamento entre os hidrogênios H-6a (δ 2,56) e H-6b (δ 2,15), assim como o

acoplamento de H-6a com um sinal em δ 3,26 (1H, d, J=10,8), indicando ser o

sinal referente ao H-5. Pelo HSQC, este sinal mostra correlação a J

com o sinal

em δ 41,3; mostra correlação também via HMBC com C-7 (δ 174,0), C-6 (δ 34,6),

com sinais de duas metilas em δ 20,8 (δ 1,44) e 28,3 (δ 0,99), com o sinal de

carbono quaternário em δ 46,6, com C-9 (δ 69,0) e com o sinal ainda não

atribuído em δ 61,7. A correlação das duas metilas mencionadas acima com o

sinal do carbono em δ 46,6 indica serem as mesmas Me-28 e Me-29 e o sinal,

então, relativo ao carbono C-4.

A metila em δ 1,27 (δ 23,6), que mostra no HMBC correlação com C-

5 (δ 41,3), com C-9 (δ 69,0) e com o sinal em δ 61,7, foi atribuída a Me-19. Este

sinal em δ 61,7 pode ser atribuído somente ao C-10, justificando a correlação a J

Ainda é observado a correlação de um sinal em δ 5,90 (1H, d, J=1,3) (δ 129,4)

com dois sinais, um em δ 208,8 e outro em δ 175,2. No espectro de COSY, ainda

é possível observar que este sinal mostra um acoplamento alílico com a metila em

δ 2,03 (3H, d, J=1,3). Esta metila somente pode ser atribuída a Me-30, cujo sinal

do carbono é δ 16,5. A mesma mostra no HMBC correlação com C-9 (δ 69,0),

com C-2 (δ 129,4) e com o sinal em δ 175,2, que somente pode ser atribuído ao

C-8. Desta forma, o sinal em δ 208,8 foi atribuído ao C-1. A presença de uma

outra metoxila em δ 3,62 se correlacionando no HMBC com sinal em δ 177,4

indica que houve uma abertura também do anel A, com a quebra da ligação entre

os carbonos C-2 e C-3. A correlação de H-2 (δ 5,90) com C-8 (δ 175,2) indica que

houve a formação de um novo anel devido a formação da ligação entre os

carbonos C-2 e C-8, como pode-se observar na FIGURA 3.54 (2) (pg 113).

Portanto, a substância

13 foi identificada pela análise de

experimentos de RMN como sendo a guianina, limonóide já descrito em literatura.

Estudo Fitoquímico das Espécies de Hortia

115

TABELA 3.15: Dados de RMN de

H de 13 e comparação com a literatura

SUBSTÂNCIA 13

(400 MHz, CDCl

)

JACOBS, 1986

(400 MHz, CDCl

)

H/C

δ (ppm), J (Hz) δ (ppm), J (Hz)

2 5,90 (1H, d, J=1,3) 5,87 (q, J=1,3)

5 3,26 (1H, d, J=10,8) 3,26 (d, J=10)

2,56 (1H, dd, J=10,8 e 16,9)

2,15 (m)

2,55 (dd, J=10 e 17)

2,18 (d, J=17)

11a

11b

2,27 (m)

2,17 (m)

2,29 (m)

2,16 (dd, J=15 e 6)

12a

12b

1,70 (m)

1,57 (m)

1,55 (dd, J=13 e 6)

1,71 (td, 13 e 6)

15 5,95 (1H, s) 5,90 (s)

17 5,91 (sl) 5,94 (d, J=0,8)

Me-18 1,17 (3H, s) 1,16 (s)

Me-19 1,27 (3H, s) 1,27 (s)

21 7,56 (1H, m) 7,56 (dt, J=1,7 e 0,8)

22 6,38 (1H, dd, J=1,7 e 0,8) 6,32 (dd, J=1,7 e 0,8)

23 7,42 (1H, t, J

=1,7) 7,44 (t, J=1,7)

Me-28 1,44 (3H, s) 1,43 (s)

Me-29 0,99 (3H, s) 0,95 (s)

Me-30 2,03 (3H, s) 2,04 (s)

O-CH

3,66 (3H, s) 3,60 (s)

O-CH

3,62 (3H, s) 3,52 (s)

Estudo Fitoquímico das Espécies de Hortia

116

TABELA 3.16: Dados de RMN de

C de 13 e comparação com a literatura

SUBSTÂNCIA 13

(100 MHz, CDCl

)

JACOBS, 1986

(100 MHz, CDCl

)

H/C

δ (ppm), J (Hz) δ (ppm)

1 208,8 208,4

2 129,4 128,9

3 177,4 177,0

4 46,7 46,3

5 41,3 40,9

34,6 34,3

7 174,0 173,7

8 175,2 175,3

9 69,0 69,0

10 61,7 62,0

11a

11b

28,7 28,3

12a

12b

34,6 34,4

13 46,6 46,6

14 173,1 173,2

15 118,0 117,5

16 164,6 164,3

17 80,2 80,0

Me-18 19,3 19,0

Me-19 23,6 23,7

20 121,2 120,9

21 140,7 140,3

22 108,9 108,5

23 143,2 142,9

Me-28 20,8 20,7

Me-29 28,3 27,8

Me-30 16,5 16,4

O-CH

52,2 52,0

O-CH

51,5 51,3

Estudo Fitoquímico das Espécies de Hortia

117

FIGURA 3.55: Espectro de RMN de

H de 13 (CDCl

, 400 MHz)

FIGURA 3.56: Espectro de RMN de

C de 13 (CDCl

, 100 MHz)

H-21

H-23

H-22

H-15

H-17

H-2

H-5

H-6a

H-6b

H-11a

H-11b

7- OCH

3- OCH

Estudo Fitoquímico das Espécies de Hortia

118

FIGURA 3.57: Mapa de contorno de g-HSQC de

13 (CDCl

, 400 MHz)

H-21

H-23

H-22

H-15

H-17

H-2

H-5

H-6a

H-6b

H-11a

H-11b

H-12a

H-12b

7- OCH

3- OCH

80,2

108,9

118,0

129,4

140,6

143,2

52,2

51,5

41,3

34,3 34,4

28,3

16,5

19,3

23,6

20,8

Estudo Fitoquímico das Espécies de Hortia

119

FIGURA 3.58: Mapa de contorno de g-HMBC de

13 (CDCl

, 400 MHz)

10 10

Estudo Fitoquímico das Espécies de Hortia

120

FIGURA 3.59: Espectro de g-COSY de

13 (CDCl

, 400 MHz)

H-2 ↔ Me-30

H-5 ↔ H-6a

H-6a ↔ H-6b

H-11 ↔ H-12

Estudo Fitoquímico das Espécies de Hortia

121

3.2.4.2 – Determinação estrutural da substância 14

O limonóide

14 foi isolado do extrato diclorometano do tronco

subterrâneo de H. oreadica e do extrato metanólico do tronco de H. superba e

teve sua estrutura determinada através de experimentos de RMN de

DEPT-135°, HSQC, HMBC, COSY e por comparação com dados da literatura

(BRAGA, 2005).

A análise do espectro de RMN de

H de 14 (FIGURA 3.61, pg 127)

permitiu atribuir os sinais em δ 7,49 (1H, m), δ 7,44 (1H, t, J=1,4 Hz) e δ 6,45 (1H,

m) aos hidrogênios do anel furano H-21, H-23 e H-22, respectivamente. A análise

conjunta dos espectros de RMN de

C (FIGURA 3.62, pg 127), DEPT 135°

(FIGURA 3.63, pg 128) e HSQC (FIGURA 3.64, pg 128) permitiu atribuir todos os

carbonos do esqueleto. Os valores para hidrogênios e carbonos estão mostrados

na TABELA 3.17 (pg 126).

A presença do sinal em δ 5,31 relativo a hidrogênio carbinólico

correlacionando-se no espectro de HMBC (FIGURA 3.65, pg 129) com os sinais

de C-21 (δ 141,6), C-20 (120,3) e C-22 (δ 110,0) indicam a presença de lactona

no anel D. O sinal atribuído ao H-17 (δ 5,31; δ 79,9) ainda mostra correlações com

um sinal de carbono tetrasubstituído em δ 48,2 e com um sinal em δ 15,1 relativo

a uma metila que pode ser atribuído somente à Me-18.

O sinal da metila Me-18 (δ 1,19) mostra correlações com o sinal de

C-17 (δ 79,9) e com os sinais em δ 48,2 e δ 29,6. No espectro de HSQC observa-

Estudo Fitoquímico das Espécies de Hortia

122

se que os sinais em δ 1,60 (m) e δ 1,27 (m) mostram correlação a J

com δ 29,6,

sendo atribuído ao C-12. No espectro de COSY (FIGURA 3.66, pg 129) é possível

observar o acoplamento dos hidrogênios H-12a e H-12b com os sinais em δ 2,25

(m) e δ 2,04 (dd) atribuídos aos hidrogênios H-11a e H-11b, respectivamente.

O sinal de hidrogênio carbinólico em δ 4,40 (1H, s) foi atribuído ao

H-15 e mostra correlação via HMBC com o sinal em δ 48,2, δ 45,4 e com o sinal

em δ 171,4 atribuído à carbonila do anel lactônico D. Analisando dados da

literatura (BRAGA, 2005), observa-se a presença de um grupo hidroxila com sinal

em δ 3,03 que foi atribuído ao C-15. Na FIGURA 3.60 (1) (pg 122) pode-se

observar as principais correlações observadas no anel C e D:

FIGURA 3.60: Correlações observadas no HMBC para

A presença de um sinal em δ 3,71 (3H, s) de metoxila

correlacionando com um sinal em δ 173,8 sugere que o anel B seja seco para

14 15

Estudo Fitoquímico das Espécies de Hortia

123

este limonóide. Os sinais em δ 2,74 (1H, dd, J=17,2 e 4,7 Hz) e 2,66 (1H, dd,

J=17,4 e 4,7 Hz) mostram correlação a J

com o sinal de carbono em δ 31,8, que

pelo espectro de DEPT 135° é um metileno. Estes sinais mostram no HMBC

correlação com o sinal em δ 173,8 sugerindo atribuir estes dois sinais aos

hidrogênios H-6a e H-6b. Ainda é possível observar para os hidrogênios H-6 a

correlação com sinais em δ 47,6 (quaternário pelo DEPT 135°) e δ 45,4 que no

espectro de HSQC se correlaciona a J

com o sinal do hidrogênio em δ 2,52 (1H,

t, J=4,8 Hz).

No espectro de COSY é possível observar o acoplamento dos

hidrogênios H-6 com o sinal em δ 3,52 sugerindo que o mesmo seja atribuído ao

hidrogênio H-5. O sinal de carbono quaternário em δ 47,6, cujo H-6 se

correlaciona no HMBC poderia ser atribuído tanto ao C-10 quanto ao C-4 pelas

correlações permitidas a este hidrogênio. Porém, o sinal atribuído ao H-11b em δ

2,04 mostra correlação com o mesmo sinal em δ 47,6 que assim pode ser

atribuído somente ao C-10.

O sinal de H-5 em δ 2,52 mostra no HMBC correlações com C-7 (δ

173,8), C-10 (δ 47,6), com um sinal em δ 44,9 quaternário pelo DEPT 135°, que

foi atribuído ao C-4, e com o sinal em δ 22,8 que mostra no HSQC correlação

com o sinal em δ 1,42 (3H, s) referente a uma metila, podendo ser atribuído

somente a metila Me-19. A análise do espectro de HMBC mostra correlações do

sinal desta metila com os sinais de C-5 (δ 45,4), C-10 (δ 47,6) e com um sinal em

δ 180,6 ainda não atribuído.

A presença de um sinal em δ 201,8 indica a existência de uma

carbonila α,β-insaturada na estrutura. O espectro de HSQC mostra um sinal em δ

5,48 (1H, s) correlacionando-se com o sinal em δ 99,7. Este sinal mostra

correlação no HMBC com C-10 (δ 47,6) e com o mesmo sinal em 180,6 o qual a

Me-19 também se correlaciona. Desta forma, o singleto em δ 5,48 foi atribuído ao

H-2 e o sinal em δ 180,6 ao C-1.

O espectro de HMBC mostra duas metilas com deslocamentos

químicos de δ 1,09 (3H, s) e δ 1,19 (3H, s) correlacionando-se entre si e com o

sinal de C-3 em δ 201,8. No espectro de HSQC é possível observar a correlação

do sinal em δ 1,09 com o sinal em δ 27,6 e do sinal em δ 1,19 com o sinal em 22,8

e os mesmos foram atribuídos as metilas Me-29 e Me-28. A metila Me-29 mostra

Estudo Fitoquímico das Espécies de Hortia

124

ainda no HMBC correlação com C-5 em δ 45,4 e a metila Me-28 correlaciona-se

com um sinal de carbono quaternário em δ 44,9 que somente pode ser atribuído

ao C-4. As observações até agora mencionadas sugerem um esqueleto parcial

como mostrado na FIGURA 3.60 (2) (pg 122).

O sinal em δ 1,89 (3H, s), que pode ser atribuído somente à metila

Me-30, mostra no espectro de HSQC correlação a J

com o sinal em δ 15,1. A

análise do espectro de HMBC mostra que o sinal da mesma se correlaciona com

o sinal de C-14 em δ 48,2 e com um sinal de carbono carbinólico que está

ausente no DEPT 135°, indicando ser um carbono quaternário em δ 75,4. Pelas

possíveis correlações para Me-30, este sinal foi atribuído ao C-8. Estas

correlações indicam a união de C-14 ao C-8 e ao C-9 (δ 46,8) que também é um

carbono quaternário pelo DEPT 135º. Portanto o limonóide

14 apresenta

contração do anel C e a seguinte estrutura é proposta:

Experimentos de g-NOESY foram realizados por BRAGA (2005)

para esta estrutura. Quando o sinal referente a H-15 em δ 4,40 foi irradiado foi

possível observar NOE com o sinal de H-5 em δ 2,52 indicando que H-15 e H-5

estão na mesma face e que, portanto, a hidroxila em C-15 está na face β. Quando

a metila Me-30 foi irradiada pode-se observar NOE nos sinais relativos às metilas

Me-19 (δ 1,42), Me-18 (δ 1,19) e Me-29 (δ 1,09), o que sugere que a metila Me-30

também esteja posicionada na face α da molécula.

Estudo Fitoquímico das Espécies de Hortia

125

Desta forma, a substância

14 foi identificada como o limonóide

hortiolida E.

Estudo Fitoquímico das Espécies de Hortia

126

TABELA 3.17: Dados de RMN de

H e

C de 14 e comparação com literatura

SUBSTÂNCIA

(400/100 MHz, CDCl

)

BRAGA, 2005

(400/100 MHz, CDCl

)

H/C

δ (ppm), J (Hz)

(ppm)

δ (ppm), J (Hz) δ (ppm)

1 - 180,6 - 180,6

2 5,48 (1H, s) 99,7 5,50 (1H, s) 99,8

3 - 201,8 - 201,9

4 - 44,9 - 44,9

5 2,52 (1H, t, J=4,7) 45,4 2,52 (1H, t, J=4,7) 45,4

2,74 (1H, dd, J=17,2 e 4,7)

2,66 (1H, dd, J=17,2 e 4,7)

31,8

2,74 (1H, dd, J=17,2 e 4,7)

2,66 (1H, dd, J=17,2 e 4,7)

31,8

7 - 173,8 - 173,9

8 - 75,4 - 75,5

9 - 46,8 - 46,8

10 - 47,6 - 47,6

11a 2,25 (m) 2,25 (m) 23,2

11b 2,04 (m)

23,1

2,04 (dd, 13,3 e 8,8)

12a 1,60(m) 1,60(m) 29,7

12b 1,27 (m)

29,6

1,27 (m)

13 - 45,4 - 45,5

14 - 48,2 - 48,2

15 4,40 (s) 64,1 4,40 (1H, d, J=1,2) 64,1

16 - 171,4 - 171,5

17 5,31 (1H, s) 79,9 5,35 (1H, s) 79,9

Me18 1,19 (3H, s) 15,1 1,18 (3H, s) 15,0

Me19 1,42 (3H, s) 22,7 1,42 (3H, s) 22,8

20 - 120,3 - 120,4

21 7,49 (1H, m) 141,6 7,49 (1H, m) 141,7

22 6,45 (1H, m) 110,0 6,44 (1H, dd, J=1,8 e 1,0) 110,0

23 7,44 (1H, t, J=1,4) 143,4 7,44 (1H, t, J=1,7) 143,4

Me28 1,19 (3H, s) 22,8 1,19 (3H, s) 22,9

Me29 1,09 (3H, s) 27,6 1,11 (3H, s) 27,6

Me30 1,89 (3H, s) 15,1 1,87 (1H,

s) 15,1

OCH

3,71 (3H, s) 52,6 3,71 (3H, s) 52,6

OH * - 3,03 (1H, d, J=1,8) -

* valor não obtido nos experimentos de RMN

Estudo Fitoquímico das Espécies de Hortia

127

FIGURA 3.61: Espectro de RMN de

H de 14 (CDCl

, 400 MHz)

FIGURA 3.62: Espectro de RMN de

C de 14 (CDCl

, 50 MHz)

H-21

H-23

H-22

H-2

H-17

H-15

7-OCH

Me-30

Me-19

Me-28

Me-18

Me-29

H-6a H-6b

H-5

H-11a

H-11b

H-12a

H-12b

200 190 180 170 160 150 140 130 120 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 1

ppm

15.085

22.785

23.159

27.657

29.660

31.803

44.890

45.440

46.772

47.597

48.232

52.519

64.174

75.449

77.000

79.863

99.683

109.949

120.328

141.608

143.364

171.427

173.845

180.593

201.838

Estudo Fitoquímico das Espécies de Hortia

128

FIGURA 3.63: Espectro de RMN de DEPT 135° de

14 (CDCl

, 100 MHz)

FIGURA 3.64: Mapa de contorno de g-HSQC de

14 (CDCl

, 400 MHz)

143,4

141,6

110,0

99,7

79,9

64,1

52,6

45,4

31,8

23,1

29,6

27,6

22,7

22,8

15,1

H-21

H-23

H-22

H-2

H-17

H-15

7- OCH

H-6a/b H-15

H-11a/b

H-30

H-12a/b

H-19 H-29

Estudo Fitoquímico das Espécies de Hortia

129

FIGURA 3.65: Mapa de contorno de g-HMBC de 14 (CDCl

, 400 MHz)

FIGURA 3.66: Espectro de g-COSY de

14 (CDCl

400 MHz)

H-6 ↔ H-5

H-11a/b ↔ H-12a

H-12a ↔ H-12b

Estudo Fitoquímico das Espécies de Hortia

130

3.2.4.3 – Determinação estrutural da substância 15

O limonóide

15 foi isolado do extrato diclorometano do tronco

subterrâneo de H. oreadica e teve sua estrutura determinada através de

experimentos de RMN de

C, DEPT 135°, HSQC, HMBC e COSY.

A análise do espectro de RMN de

H de 15 (FIGURA 3.68, pg 136)

permitiu atribuir os sinais em δ 7,53 (1H, m), δ 7,46 (1H, t, J=1,8 Hz) e δ 6,47 (1H,

dd, J= 2,2 e 1,4 Hz) aos hidrogênios do anel furano H-21, H-23 e H-22,

respectivamente. A análise conjunta dos espectros de RMN de

C (FIGURA 3.69,

pg 136), DEPT 135° (FIGURA 3.70, pg 137) e HSQC (FIGURA 3.71, pg 137)

permitiu atribuir todos os carbonos do esqueleto.

Observando o espectro de HMBC (FIGURA 3.72, pg 138), a

presença do sinal em δ 5,23 relativo a hidrogênio carbinólico correlacionando-se

com os sinais de C-21 (δ 141,8), C-20 (119,9) e C-22 (δ 109,9) sugerem a

presença de lactona no anel D, assim como para os limonóides anteriormente

descritos. O sinal atribuído ao H-17 (δ 5,23; δ 81,5) mostra correlações também

com sinais de carbonos quaternários em δ 48,6 ou δ 48,4 ainda não atribuídos e δ

47,0. Ainda mostra correlação com δ 29,3, δ 29,8 que pelo DEPT é um carbono

, e com um sinal em δ 15,4 relativo a uma metila que somente pode ser

atribuído à Me-18.

Estudo Fitoquímico das Espécies de Hortia

131

O sinal da metila Me-18 (δ 1,24) mostra correlações com o sinal de

C-17 (δ 81,5) e com os sinais em δ 48,6 ou δ 48,4 e δ 29,8. No espectro de HSQC

observa-se que os sinais em δ 1,65 (m) e δ 1,30 (m) mostram correlação a J

com

δ 29,8, sendo atribuído ao C-12.

Os sinais de hidrogênios em δ 2,23 (1H, m) e δ 2,02 (1H, m)

mostram correlações via HMBC com o sinal em δ 47,0 que foi atribuído ao C-13 e

com o sinal em δ 170,4 atribuído à carboxila do anel lactônico D. Desta forma,

estes sinais foram atribuídos ao H-15a e H-15b que mostram correlação via

HSQC com um carbono em δ 23,8. Na FIGURA 3.67 (1) (pg 133) pode-se

observar as principais correlações observadas no anel C e D.

A presença de um sinal em δ 3,71 (3H, s) de metoxila

correlacionando com um sinal em δ 169,6 sugere que o anel B seja seco também

para este limonóide. O sinal em δ 5,82 (1H, d, J= 2,4 Hz) mostra correlação a J

com o sinal de carbono em δ 71,5 e via HMBC mostra correlação com o sinal em

δ 169,6 sugerindo atribuir este sinal ao hidrogênio H-6. Ainda é possível observar

para o hidrogênio H-6 a correlação com sinais em δ 46,0, δ 48,6 ou δ 48,4

(quaternários pelo DEPT 135°) e δ 50,3 que no espectro de HSQC se correlaciona

a J

com o sinal do hidrogênio em δ 2,53 (1H, d, J=3,2 Hz). A correlação da

metoxila em δ 3,71 com δ 169,6 e o sinal em δ 5,82 com δ 169,6 sugere que o

grupo hidroxila esteja em C-6. No espectro de COSY (FIGURA 3.73, pg 138) é

possível observar o acoplamento do hidrogênio H-6 com o sinal em δ 2,53

sugerindo que o mesmo seja atribuído ao hidrogênio H-5.

O sinal de carbono quaternário em δ 46,0, cujo H-6 se correlaciona

no HMBC poderia ser atribuído tanto ao C-10 quanto ao C-4 pelas correlações

permitidas a este hidrogênio. Porém, o sinal atribuído ao H-11 em δ 4,39 não

mostra correlação com o mesmo sinal em δ 46,0 que então não poderia ser

atribuído ao C-10 e por isso foi atribuído ao C-4.

O sinal de H-5 em δ 2,53 mostra no HMBC correlações com C-10

em δ 48,6 ou δ 48,4 (valores de δ intercambiáveis), com C-7 (δ 169,3), com um

sinal em δ 45,3, quaternário pelo DEPT 135° e foi atribuído ao C-9 e com o sinal

em δ 23,7 que mostra no HSQC correlação com o sinal em δ 1,47 (3H, s)

referente a uma metila, podendo ser atribuído somente a metila Me-19. A análise

do espectro de HMBC mostra correlações do sinal desta metila com os sinais de

Estudo Fitoquímico das Espécies de Hortia

132

C-5 (δ 50,3), C-9 (δ 45,3), C-10 (δ 48,6 ou δ 48,4) e com um sinal em δ 181,5

atribuído à carbonila.

A presença de um sinal em δ 202,1, assim como para os limonóides

discutidos anteriormente, indica a existência de uma carbonila α,β-insaturada na

estrutura. O espectro de HSQC mostra um sinal em δ 5,42 (1H, s) se

correlacionando com o sinal em δ 98,5. Este sinal mostra correlação no HMBC

com C-10 (δ 48,6 ou δ 48,4) e com o mesmo sinal em 181,5 o qual a Me-19

também se correlaciona. Desta forma, o singleto em δ 5,42 foi atribuído ao H-2 e

o sinal em δ 181,5 ao C-1.

O espectro de HMBC mostra duas metilas com deslocamentos

químicos de δ 1,09 (3H, s) e δ 1,50 (3H, s) correlacionando-se entre si e com o

sinal de C-3 em δ 202,1. No espectro de HSQC é possível observar a correlação

do sinal em δ 1,09 com o sinal em δ 29,3 e do sinal em δ 1,50 com o sinal em 23,7

e os mesmos foram atribuídos às metilas Me-28 e Me-29. A metila Me-29 mostra

ainda no HMBC correlação com C-5 em δ 50,3 e a metila Me-28 correlaciona-se

com um sinal de carbono quaternário em δ 46,0 que somente pode ser atribuído

ao C-4. As observações até agora mencionadas sugerem um esqueleto parcial

como mostrado na FIGURA 3.67 (2) (pg 133)

O sinal em δ 1,87 (3H, s), que pode ser atribuído somente à metila

Me-30, mostra no espectro de HSQC correlação a J

com o sinal em δ 14,6. A

análise do espectro de HMBC mostra que o sinal da mesma se correlaciona com

o sinal de C-14 em δ 48,6 ou δ 48,4 (valores de δ intercambiáveis com C-10) e

com um sinal de carbono que está ausente no DEPT 135°, indicando ser um

carbono quaternário em δ 77,0. Pelas possíveis correlações para Me-30, este

sinal foi atribuído ao C-8. O sinal atribuído ao H-11 em δ 4,39 (1H, s) mostrou

correlação com C-13 (δ 47,0), C-10 (δ 48,6 ou δ 48,4), C-9 (δ 45,3) e com um sinal

em δ 170,7 que sugere um carbono carboxílico. O sinal em δ 2,27 referente à uma

metila também se correlacionou com δ 170,7, indicando a presença de um grupo

acetato que foi atribuído ao C-11.

A análise do HMBC permitiu observar também que H-5 (δ 2,53), H-

11 (δ 4,39) e a Me-19 (δ 1,47) correlacionam-se com C-9 (δ 45,3); Me- 30 (δ

1,87), Me- 18 (δ 1,24) e H-17 (δ 5,23) correlacionam-se com C-14 (δ 48,6 ou δ

48,4) que pelo DEPT 135º são carbonos quaternários. Desta forma, estas

Estudo Fitoquímico das Espécies de Hortia

133

correlações indicam a união de C-9 ao C-8 e ao C-14 e portanto o limonóide

15,

assim como o limonóide 14, apresenta contração do anel C.

A FIGURA 3.67 (3) (pg 133)

apresenta as principais correlações

observadas para a estrututra em qüestão.

FIGURA 3.67: Correlações observadas no HMBC para

OCH

Estudo Fitoquímico das Espécies de Hortia

134

Experimentos de g-NOESY serão realizados para esta estrutura,

visando definir a correta estereoquímica dos grupos hidroxila, acetoxila e Me-30.

Desta forma, a substância

15 foi identificada como um novo limonóide

denominado hortiolida G e a seguinte estrutura é então proposta:

Estudo Fitoquímico das Espécies de Hortia

135

TABELA 3.18: Dados de RMN

C e g-HMBC de 15

SUBSTÂNCIA 15

(400 MHz, CDCl

)

SUBSTÂNCIA 15

(100 MHz,CDCl

)

Principais Correlações

Observadas

H/C

δ (ppm), J (Hz) δ (ppm)

HMBC

1 - 181,5 -

2 5,42 (1H, s) 98,5 C-1, C-10

3 - 202,1 -

4 - 46,0 -

5 2,53 (1H, d, J= 2,8) 50,3 C-7, C-9, C-10, C-19

6 5,82 (1H, d, J= 2,8) 71,5 C-4, C-5, C-7, C-10

7 - 169,6 -

8 - 77,0 -

9 - 45,3 -

10 - 48,6/48,4* -

11 4,39 (1H, s) 64,7 C-9, C-10, C-13

12a 1,65 (m)

12b 1,30 (m)

29,8

C-13, C-14, C-17

13 - 47,0 -

14 - 48,6/48,4* -

15a 2,23 (1H, d, J= 10)

15b 2,02 (1H, d, J= 10)

23,8 C-13, C-16

16 - 170,4 -

17 5,23 (1H, s) 81,5 C-14, C-18, C-20, C-21

Me-18 1,24 (3H, s) 15,4 C-12, C-13, C-14, C-17

Me-19 1,47 (3H, s) 23,7 C-1, C-5, C-10

20 - 119,9 -

21 7,53 (1H, m) 141,8 C-20, C-22, C-23

22 6,47 (1H, dd, J=2,2 e 1,4) 109,9 C-20, C-21, C-23

23 7,46 (1H, t, J=1,8) 143,6 C-20, C-22, C-21

Me-28 1,09 (3H, s) 29,3 C-3, C-4

Me-29 1,50 (3H, s) 23,7 C-3, C-5

Me-30 1,87 (1H, s) 14,6 C-8, C-14

OCH

3,71 (3H, s) 52,9 C-7

OCH

- 170,7 -

OCOCH

2,27 (3H, s) 21,0 OCOCH

* valores intercambiáveis

Estudo Fitoquímico das Espécies de Hortia

136

FIGURA 3.68: Espectro de RMN

H de 15 (CDCl

, 400 MHz)

FIGURA 3.69: Espectro de RMN

C de 15 (CDCl

, 100 MHz)

H-23

H-21

H-22

H-6

H-2

H-17

7-OCH

H-11

H-5

OCOCH

15a 15b

Me-30

12a

12b

Me-29

Me-19

Me-18

Me-28

Estudo Fitoquímico das Espécies de Hortia

137

FIGURA 3.70: Espectro de RMN DEPT 135° de 15 (CDCl

, 100 MHz)

FIGURA 3.71: Mapa de contorno de g-HSQC de 15 (CDCl

, 400 MHz)

21 22 6

17 11

7-OCH

OCOCH

15a

15b

12a

12b

141,6

143,4

109,9

71,5

98,5

81,5

64,7

52,9

50,3

21,0

23,8

14,6

23,7

29,8

15,4

29,3

Estudo Fitoquímico das Espécies de Hortia

138

FIGURA 3.72: Mapa de contorno de g-HMBC de 15 (CDCl

, 400 MHz)

FIGURA 3.73: Espectro de g-COSY de 15 ( CDCl

, 400 MHz)

17 11

7-OCH

OCOCH

15a

15b

12a

12b

Me-18

OCH

Me-19

Me-29

Me-28

Me-30

8 8

Me-18

Me-29

Me-28

H-23 ↔ H-22

H-6 ↔ H-5

H-15a ↔ H-15b

H-12a ↔ H-12b

Estudo Fitoquímico das Espécies de Hortia

139

3.2.4.4- Biogênese dos Limonóides

Os limonóides têm sua origem biogenética nos triterpenos do tipo

tirucalanos (H-20/C-20 R) ou eufanos (H-20/C-20 S). De acordo com a biogênese

geralmente descrita, há formação de epóxido entre C-7 e C-8 que abre levando a

uma hidroxila na posição C-7 e induzindo a migração da Me-30 de C-14 para C-8

e C-15. Em seguida há a ciclização da cadeia lateral, com perda de 4 unidades de

carbono levando a formação do anel 17β furano, como mostra o ESQUEMA 3.9

(pg 139). Comumente o anel D é oxidado a lactona, processo envolvendo a

introdução de uma carbonila em C-16 seguida de uma oxidação Baeyer-Villager

(CHAMPAGNE et. al., 1992). Todos os limonóides descritos para o gênero Hortia,

inclusive os isolados neste trabalho, apresentam o anel D lactonizado assim como

o anel B seco.

Baeyer-Villiger

[O]

oxidação degradativa

da cadeia lateral

eufano/tirucalano

rearranjo apo-eufol

ou apo-tirucalol

RO OR

Tetranorterpenóide

ORO

ESQUEMA 3.9: Biogênese dos limonóides

Estudo Fitoquímico das Espécies de Hortia

140

O limonóide 13, primeiro limonóide isolado de Hortia (JACOBS et.

al.,1986), é bastante modificado e por este motivo esperava-se encontrar outros

esqueletos mais simples no gênero, como de fato aconteceu. A proposta

biogenética para a guianina (13) está no ESQUEMA 3.10 (pg 140) e sua formação

envolve, além da contração do anel C, a abertura do anel A.

ESQUEMA 3.10: Proposta biogenética para 13

OCH

[O]

SAM

OCH

Estudo Fitoquímico das Espécies de Hortia

141

O limonóide 14 parece ser o precursor para os demais limonóides

descritos para Hortia, com formação de um anel de três membros entre os

carbonos C-8, C-9 e C-14 (BRAGA, 2005). A biogênese proposta para o

limonóides 14 está descrita no ESQUEMA 3.11 (pg 141). A presença do epóxido

entre C-14 e C-15 justifica a presença da hidroxila em C-15 para o limonóide 14.

ESQUEMA 3.11: Proposta biogenética para 14

OCH

epoxidação

OCH

[O]

- H

Estudo Fitoquímico das Espécies de Hortia

142

A biogênese proposta para o limonóides 15 está descrita no

ESQUEMA 3.12 (pg 142).

ESQUEMA 3.12: Proposta biogenética para 15

OCH

( CH

COSCoA)

OCH

[O]

OCH

[O]

OCH

Estudo Fitoquímico das Espécies de Hortia

143

O estudo fitoquímico realizado com as espécies de Hortia conduziu

ao isolamento de algumas classes de metabólitos secundários como derivados do

ácido diidrocinâmico e cinâmico, cumarina, alcalóides e limonóides, sendo as

estruturas 06 e 14 inéditos em H. oreadica, 10 para o gênero Hortia e 08 e 15 na

literatura.

Entretanto, ainda não é possível propor a classificação correta do

gênero Hortia dentro da família Rutaceae. Hortia, que já foi posicionada em

Cusparieae por De Candolle em 1824, na mais recente classificação morfológica

de Engler em 1931 pertence a Toddalieae (DE CANDOLLE, 1824; ENGLER,

1931). A proposta de Silva e colaboradores (DA SILVA et. al.,1988), que sugere a

união das subfamílias Rutoideae e Toddalioideae por suas similaridades

químicas, volta a propor Hortia em Cusparieae. Hortia é o único representante

americano na subtribo Toddaliinae. Na classificação de SILVA et. al. (1988)

Cuspariea (Cusparia) engloba, além de Hortia, o gênero Galipea, que também é

um gênero neotropical. Desta forma, Hortia estaria mais próxima destes gêneros

do que dos membros de Toddaliinae. Este posicionamento está de acordo com os

resultados obtidos por GROPPO (2004) em um trabalho utilizando análise

macromolecular, em que os dados obtidos pelo autor sugerem um relacionamento

mais próximo entre Hortia e outros gêneros de Cusparieae, como Adiscanthus.

Além disso, outro dado muito relevante para o posicionamento é que

Hortia apresenta limonóides com anéis C e D modificados, muito característicos

de Meliaceae, embora a presença de metabólitos como alcalóides, cumarinas,

derivados do ácido diidrocinâmico e cinâmico vêm a confirmar que Hortia

pertence à família Rutaceae. Como exemplo de reposicionamento relatado em

literatura (ENGLER, 1931), pode-se citar Flindersioideae, que por apresentar

limonóides altamente rearranjados já pertenceu à Meliaceae e na classificação de

Engler é um grupo isolado dentro de Rutaceae. A presença de limonóides

bastante modificados para Hortia poderia indicar que o gênero pode não

pertencer nem a Todallieae e nem a Cusparieae, podendo estar posicionado

separadamente dentro da Família Rutaceae, como aconteceu com

Flindersioideae.

Neste estudo não foi possível estudar todos os extratos das

espécies de Hortia devido ao fato que para executar um trabalho fitoquímico

completo faz-se necessário um tempo maior que o proposto para o mestrado.

Estudo Fitoquímico das Espécies de Hortia

144

Acredita-se que Hortia apresente outros limonóides complexos, como os isolados

anteriormente.

Portanto, o estudo dos extratos será realizado durante o doutorado

para então concluir melhor sobre o posicionamento quimiossistemático de Hortia.

4. CAPÍTULO 2:

ENSAIOS BIOLÓGICOS

_____________________________________________________

Ensaios Biológicos

146

4.1- ENSAIOS BACTERICIDAS FRENTE A Xylella fastidiosa

Os ensaios foram realizados no Centro APTA Citros “Sylvio Moreira”,

situado na cidade de Cordeirópolis-S.P., com a colaboração da professora Dra.

Alessandra Alves de Souza. Utilizou-se meio PW líquido (DAVIS et al., 1981) para

o cultivo da bactéria e realizou-se experimentos com esta no início da fase

estacionária, ou seja, após 10 dias de crescimento. A solução preparada

contendo bactéria e substância ensaiada foi plaqueada em placas de Petri

contendo meio PW sólido. A determinação da Concentração Inibitória Mínima

(CIM) foi determinada visualmente quando, no máximo, uma colônia foi obtida

após plaqueamento da cultura não diluída (BROOUN et al., 2000).

4.1.1- Procedimento Experimental

4.1.1.1- Preparação dos meios de cultivo

Inicialmente preparou-se o meio de cultura PW (líquido e sólido)

para X. fastidiosa, segundo o protocolo de DAVIS et al., 1981 (TABELA 4.1, pg

146). Adicionou-se a quantidade específica de cada reagente de acordo com a

quantidade total de meio necessário.

TABELA 4.1: Reagentes e quantidades necessárias para preparar o meio PW

Reagentes

Para 1000 mL

de meio

Para 200 mL

de meio

Para 150 mL

de meio

Para 100 mL

de meio

Phytone Peptone 4,00 g 0,80 g 0,60 g 0,40 g

Trypticase Peptone

1,00 g 0,20 g 0,15 g 0,10 g

Hemin Chloride

(0,1%)

10,00 mL 2,00 mL 1,50 mL 1,00 mL

Phenol Red (0,2%) 10,00 mL 2,00 mL 1,50 mL 1,00 mL

HPO

1,20 g 0,24 g 0,18 g 0,12 g

PO 1,00 g 0,20 g 0,15 g 0,10 g

MgSO

O 0,40 g 0,08 g 0,06 g 0,04 g

Agar 12,00 g 2,40 g 1,80 g 1,20 g

água destilada 800 mL 164 mL 125 mL 92 mL

Ensaios Biológicos

147

Preparou-se Phenol Red 0,2% a partir da adição de 0,2 g de Phenol

Red e 10 gotas de NaOH 20% em 100 mL de água; e Hemin Chloride 0,1 % a

partir da adição de 0,1 g de Hemin Chloride (Sigma H-1652) e 0,2 g de NaOH em

100 mL de água. Os outros reagentes foram obtidos comercialmente. Autoclavou-

se a mistura por 20 minutos a 120ºC e adicionou-se Glutamina 4% e BSA 10%

por filtração.

Foi necessário a utilização de grande quantidade de meio líquido e

sólido para a realização dos experimentos. Desta forma, preparou-se 1000 mL de

cada um toda vez que realizava-se os ensaios.

Preparo de 1000 mL de meio sólido:

Em um frasco grande, adicionou-se primeiramente 400 mL de água

destilada. Em seguida, colocou-se 4,00 g de Phytone Peptone (BBL 4311906),

1,00 g de Trypticase Peptone (BBL 4311921), 1,20 g de K

HPO

, 1,00 g de

, 0,40 g de MgSO

O e 12,0 g de Agar. Então, sob agitação mecânica,

adicionou-se 10 mL de Hemin Chloride (0,1%) e 10 mL de Phenol Red (0,2%).

Após a solução ter ficado homogênea, completou-se até 800 mL com água

destilada. Autoclavou-se o meio e paralelamente preparou-se a solução de BSA e

Glutamina.

Para o preparo da Glutamina 4% adicionou-se em um erlenmeyer

4,00 g de Glutamina (Sigma G-5763) e 100 mL de H

O autoclavada e deixou-se

em banho-maria (50-55

C) até que toda a Glutamina se dissolvesse. Para o BSA,

adicionou-se em outro erlenmeyer 6,00 g de BSA fração V (Sigma A-9418) e 100

mL de água autoclavada e deixou-se sob agitação até que todo reagente se

dissolvesse.

Após autoclavado o meio sólido, resfriou-se um pouco e depois

inseriu-se o BSA e a Glutamina através de um filtro. Por fim, verteu-se o meio em

placas de Petri deixando-as abertas por alguns minutos para que o vapor liberado

do meio PW evaporasse. Não se pode resfriar muito o meio sólido antes de

verter, pois este se solidifica rapidamente. As placas foram fechadas e vedadas

(1000 mL de meio resulta em aproximadamente 30 Placas de Petri).

Ensaios Biológicos

148

Preparo de 1000 mL de meio líquido:

Os reagentes utilizados para o preparo do meio líquido foram os

mesmos utilizados para preparar o meio sólido, porém no meio líquido não se

utiliza o Agar que é responsável por solidificar o meio. O procedimeto realizado foi

praticamente o mesmo, porém em vez de autoclavar em um único frasco como no

meio sólido, dividiu-se a solução em 10 erlenmeyers contendo 80 mL e depois

que todos foram autoclavados, adicionou-se 10 mL de BSA e 10 mL de Glutamina

em cada erlenmeyer.

Ambos os meios foram preparados com o máximo de cautela, ou

seja, toda vidraria usada e o meio foram autoclavados e toda preparação do meio

foi executada dentro de um fluxo próprio e próximo ao fogo, uma vez que este

meio é facilmente contaminado devido ao fato de ser um meio rico em nutrientes.

No entanto, o meio líquido é mais facilmente contaminado em relação ao meio

sólido, pois há maior manuseio e transferência de vidrarias.

Após este procedimento os meios ficaram em repouso por

aproximadamente 14 dias para verificar se não houve contaminação. O meio

líquido foi utilizado para cultivar a bactéria, enquanto que o meio sólido foi

utilizado para plaquear a solução contendo meio X. fastidiosa e a substância a ser

ensaiada, e portanto verificar se bactéria se desenvolveu com a substância em

questão.

Preparados os meios de cultivo, colocou-se a bactéria para crescer

no meio líquido. Um trabalho citado na literatura (CAMPANHARO, et al., 2003)

compara o crescimento da bactéria em diferentes meios e demonstra que,

independente deste, a X. fastidiosa possui três fases de crescimento: Fase lag, na

qual a bactéria ainda não se multiplica; Fase log (exponencial), em que a bactéria

se multiplica, aumentando sua população; e Fase estacionária, na qual pára de se

multiplicar e conseqüentemente começa a morrer.

Ensaios Biológicos

149

4.1.1.2- Crescimento de X. fastidiosa em Citrus sinensis

A linhagem de X. fastidiosa 9a5c foi utilizada neste estudo. Células

bacterianas foram inoculadas em Citrus sinensis e estas plantas foram reservadas

na casa de vegetação do Centro de Citricultura APTA Citros Sylvio Moreira,

Instituto Agronômico, Cordeirópolis-SP. Aproximadamente seis meses após a

inoculação, quando sintomas de CVC eram visíveis nas plantas, as folhas foram

coletadas e as células bacterianas presentes nas mesmas foram isoladas de

pecíolos e hastes. A seiva resultante foi assepticamente mantida em tampão

fosfato salino (PBS) e esta suspensão foi distribuída em placas de Petri contendo

meio líquido PW (SOUZA et al., 2005). Para confirmar a linhagem de X. fastidiosa

nesta suspensão, uma alíquota foi submetida à ensaios de RT-PCR utilizando

dois conjuntos de primers específicos para a detecção de X. fastidiosa

(MISSANVAGE et al., 1994; POOLER & HARTUNG, 1995).

4.1.1.3- Preparo do Inóculo para Ensaio

A cultura de X. fastidiosa foi crescida em placas de Petri com meio

sólido PW e após 10 a 15 dias do plaqueamento as primeiras colônias foram

observadas. Para a obtenção de células aderidas à superfície do vidro, diversas

colônias foram transferidas para tubos de polipropileno contendo 3 mL de meio

líquido PW. Quando a OD

600nm

atingiu 0,3 (correspondendo a 10

unidades

formadoras de colônias (CFU)/ml) os tubos foram colocados para centrifugar e as

células foram transferidas para um frasco de 1 litro contendo 300 mL de meio

líquido PW. Após 3 dias de crescimento a 28ºC no agitador giratório a 120 rpm,

um fino biofilme foi observado aderido ao vidro na interface meio-ar (SOUZA et

al., 2005) e estas culturas foram então utilizadas para realizar os ensaios

biológicos frente a determinadas substâncias.

Ensaios Biológicos

150

4.1.1.4- Ensaios das Substâncias frente a X. fastidiosa

Foram ensaiados frente à X. fastidiosa dois alcalóides (rutaecarpina

(09) e N-metil-4-metoxi-2-quinolona, um derivado do ácido diidrocinâmico {ácido

3-fenil-[2’,6’-dimetoxi-(3’,4’-O:5’’,6’’)-2’’,2’’-dimetilpirano]propiônico (01)} e um

limonóide guianina (13) isolados de espécies de Hortia e quatro substâncias

quinolinônicas sintéticas: 2-carbometoxi-6-metoxi-4-quinolona (S1), 2-metil-6-

fluor-4-quinolona (S2), 2-metil-5,7-dimetoxi-4-quinolona (S3) e 2-metil-5-metoxi-7-

hidroxi-4-quinolona (S4), apresentados na FIGURA 4.1 (pgs 150 a 151).

FIGURA 4.1: Estruturas das substâncias ensaiadas

N-METIL-4-METOXI-2-QUINOLON

OCH

RUTAECARPINA (09)

ÁCIDO 3-FENIL-[2', 6'-DIMETOXI-(3', 4'-O:5'',6'')

2'',2''-DIMETILPIRANO]PROPIÔNICO (01)

OCH

GUIANINA (13)

Ensaios Biológicos

151

SÉRIE SINTÉTICA

2-METIL-6-FLUOR-4-QUINOLONA (S2)

2-METIL-5,7-DIMETOXI-4-QUINOLONA (S3)

2-METIL-5-METOXI-7-HIDROXI-4-QUINOLONA (S4)

OCH

2-CARBOMETOXI-6-METOXI-4-QUINOLONA (S1)

OCH

FIGURA 4.1: Estruturas das substâncias ensaiadas (continuação)

Primeiramente, preparou-se uma solução estoque (5mg/mL) de cada

substância teste. Calculou-se o volume de solução estoque necessário para a

obtenção da concentração final, utilizando-se 100 µL da bactéria. Iniciou-se os

experimentos utilizando-se concentrações finais de 0,5 mg/mL, 1,0 mg/mL, 1,5

mg/mL e 2,0 mg/mL, uma vez que não havia descrito na literatura ensaios com

este tipo de substâncias frente à X. fastidiosa e a partir dos resultados iniciais

obtidos foi alterando-se estas concentrações de 0,4 à 2,0 mg/mL até a

determinação da CIM de cada substância.

Ci.Vi = Cf.Vf

• C

i .

= C

f .

5 mg/mL. V

= 0,4 mg/mL.(0,1mL+V

)

= 8,7 µL  Para uma concentração de 0,4 mg/mL deve-se usar 8,7 µL da

solução estoque (5mg/mL)

Ensaios Biológicos

152

• C

i .

= C

f .

5 mg/mL. V

= 0,5 mg/mL.(0,1 mL+ V

)

= 11,1 µL  Para uma concentração de 0,5 mg/mL deve-se usar 11,1 µL

da solução estoque (5mg/mL)

Os cálculos para as demais concentrações foram semelhantes ao

descrito acima e estão indicados na TABELA 4.2 (pg 152).

TABELA 4.2: Concentração ensaiada e volume retirado da solução estoque

Concentração ensaiada

(mg/mL)

Volume da Solução Estoque

(µL)

0,4 8,7

0,5 11,1

1,0 25,0

1,2 31,6

1,3 35,0

1,4 39,0

1,5 43,0

1,6 47,0

1,7 51,0

1,8 56,0

2,0 67,0

Utilizou-se um eppendorf para cada volume pipetado da solução

estoque. Adicionou-se em cada eppendorf 100 µL do meio líquido contendo a X.

fastidiosa e posteriormente inseriu-se o volume necessário da solução estoque

para atingir as concentrações finais desejadas, como mostrado para algumas

concentrações na FIGURA 4.2 (pg 153).

Ensaios Biológicos

153

0, 5 mg/mL 1, 0 mg/mL 1, 5 mg/mL 2, 0 mg/mL

11,1 µL de slç estoque 25 µL de slç estoque 43 µL de slç estoque 67 µL de slç estoque

+ + + +

100 µL de bactéria 100 µL de bactéria 100 µL de bactéria 100 µL de bactéria

FIGURA 4.2: Eppendorfs com as substâncias ensaiadas nas diferentes

concentrações e a solução de X. fastidiosa.

Em relação ao controle negativo, composto de DMSO:H

O e

necessário para verificar se o solvente não inibe o crescimento da bactéria, foi

necessário vários estudos de otimização para que a menor proporção de DMSO

fosse utilizado nos ensaios. Isso porque este solvente é muito tóxico e seu uso

em altas doses poderia levar a inibição de X. fastidiosa. Desta forma, os primeiros

ensaios foram realizados com uma proporção de 1:1 DMSO: H

O tanto para

solubilizar as amostras quanto para o controle negativo, onde observou-se que o

crescimento da bactéria era muito baixo. Assim, foi proposto um estudo com

proporções de DMSO: H

O que variassem de 1:1 à 1:4, respectivamente. A

TABELA 4.3 (pg 153) ilustra como foi preparado os controles negativos e as

soluções estoques (5 mg/mL) a partir das proporções propostas:

TABELA 4.3: Proporções de DMSO: H

PROPORÇÕES

DMSO:H

O (mL)

(volume final de 1,0 mL)

1:1 0,5:0,5

1:2 0,33:0,67

1:3 0,25:0,75

1:4 0,2:0,8

Na TABELA 4.4 (pg 154) são apresentados os resultados dos testes

com as quatro proporções de solventes, respeitando os cálculos citados acima

que fornece o volume de solventes necessários para atingir as concentrações de

solução estoque desejadas.

Ensaios Biológicos

154

TABELA 4.4: Colônias observadas nos controles negativos para as diferentes

concentrações de substâncias ensaiadas

SOLVENTE 1,0 mg/mL 1,2 mg/mL 1,4 mg/mL 1,6 mg/mL

DMSO: H

O 1:1 - - - -

DMSO: H

O 1:2 ++ ++ + -

DMSO: H

O 1:3 +++ ++ ++ ++

DMSO: H

O 1:4 ++++ ++++ ++++ +++

++++: Crescimento de muitas colônias

+++: Crescimento de aproximadamente 70 colônias

++: Crescimento de 40 colonias

+: Crescimento de poucas colonias

-: não houve crescimento de colônias

Após este estudo foi observado que quando foi utilizada a proporção

de 1:4 de DMSO:H

O o controle negativo apresentou um crescimento

considerável de X. fastidiosa e portanto em todos os ensaios realizados utilizou-se

esta proporção de solventes.

Assim, para o preparo do controle negativo foi aplicado em

eppendorfs 100 µL do meio de X. fastidiosa e o valor de cada volume pipetado da

solução estoque, porém apenas com DMSO:H

O (1:4). Em outro eppendorf,

adicionou-se apenas 100 µL do meio da X. fastidiosa para confirmar a viabilidade

celular.

Colocou-se todos os eppendorfs na estufa a 28ºC por 24 horas para

que houvesse interação entre as substâncias ensaiadas e a bactéria. Após este

período, plaqueou-se 100 µL de cada solução em placas de Petri e guardou-as na

estufa novamente. A partir de 20 dias observou-se se a bactéria cresceu na

concentração correspondente ou se esta foi inibida. Quando a bactéria foi

totalmente inibida determinou-se a CIM para a substância ensaiada.

Os experimentos foram realizados em triplicata para a obtenção de

um resultado confiável e reprodutivo.

Quando há inibição da bactéria ocorre algumas mudanças na placa

de Petri (FIGURA 4.3, pg 155), como por exemplo, a ausência de colônias e a

permanência da coloração amarelada. No entanto, quando há o crescimento de

X. fastidiosa a placa se torna avermelhada, ou seja, o meio sólido muda de cor

Ensaios Biológicos

155

devido a presença do reagente Phenol Red que é um indicador de pH. À medida

que as células estão crescendo, elas produzem substâncias alcalinas que na

presença de Phenol Red provoca a mudança de coloração na placa.

Presença de colônias Ausência de colônias

FIGURA 4.3: Placas de Petri com as substâncias ensaiadas

4.1.2- Resultados e Discussão

Não há atualmente um método eficaz e comercial disponível para o

controle da bactéria X. fastidiosa, agente causal da Clorose Variegada dos Citros

(CVC) e de outras doenças, como por exemplo, a Doença de Pierce. Esta

bactéria tem causado enormes prejuízos tanto para a citricultura brasileira, como

para outras diversas culturas distribuídas mundialmente (FUNDECITRUS, 2008a)

Iniciou-se, então, estudos para a obtenção de substâncias naturais

com alto potencial bactericida, as quais não são agressoras ao meio ambiente e

ao ser humano. Entretanto, como estas substâncias são obtidas em pequena

quantidade das plantas, ensaiou-se primeiramente substâncias sintéticas

baseadas em produtos naturais, as quais estavam disponíveis em grande

quantidade caso houvesse a necessidade de massa adicional das mesmas para

otimizar os ensaios, e posteriormente partiu-se para os ensaios com metabólitos

secundários obtidos de plantas.

Diversas concentrações das substâncias foram aplicadas, as quais

estão descritas na TABELA 4.5 (pg 156), até que a bactéria fosse totalmente

inibida.

Ensaios Biológicos

156

Como relatado no procedimento experimental, foi observado que os

solventes DMSO:H

O na proporção de 1:4 não interferiram nos ensaios, havendo

crescimento satisfatório de X. fastidiosa.

A avaliação da inibição do crescimento bacteriano foi realizada

visualmente, por comparação das placas contendo substâncias teste e X.

fastidiosa, com o controle negativo apenas com os solventes (DMSO:H

O) e

controle onde plaqueou-se apenas X. fastidiosa. A CIM foi considerada quando,

no máximo, uma colônia foi obtida após plaqueamento da cultura não diluída

(BROOUN et al., 2000).

TABELA 4.5: Colônias observadas nas diferentes concentrações de substâncias

ensaiadas frente X. fastidiosa

Concentração

(mg/mL)

N-metil-4-

metoxi-2-

quinolina

01 13 S1 S2 S3 S4

0,4 +++ +++ +++ +++ ++ +* +++ ++

0,5 ++ +++ +++ +++ ++ _ +++ +

0,7 +* +++ +++ +++ ++ _ +++ +*

1,0 _ ++ +++ +++ ++ _ +++ _

1,2 _ ++ +* ++ + _ + _

1,4 _ + _ +* +* _ +* _

1,5

_ _ _ _ _ _ _

1,7

_ _ _ _ _ _ _

1,8

_ _ _ _ _ _ _

2,0

_ _ _ _ _ _ _

+++: crescimento intenso, semelhante ao controle

++: redução parcial de crescimento, comparado ao controle

+: redução do crescimento com visualização de colônias isoladas

+*: redução quase total do crescimento

- : não houve crescimento da bactéria

Ensaios Biológicos

157

A partir destes resultados pode-se determinar a CIM de cada

substância (FIGURA 4.4, pg 157).

FIGURA 4.4: CIM das substâncias ensaiadas frente à X. fastidiosa

O fato de a bactéria na fase estacionária ser mais resistente à

antibióticos que as células em crescimento exponencial (fase log) já é bem

retratado na literatura (GILBERT et al., 1990); assim, os ensaios foram realizados

CIM = 0,5 mg/mL

CIM = 1,5 mg/mL

OCH

RUTAECARPINA (09)

N-METIL- 4-METOXI- 2-QUINOLONA

OCH

GUIANINA (13)

CIM = 1,0 mg/mL

CIM = 1,5 mg/mL

CIM = 1,4 mg/mL

CIM = 1,5 mg/mL

ÁCIDO 3-FENIL-[2', 6'-DIMETOXI-(3', 4'-O:5'',6'')

2'',2''-DIMETILPIRANO]PROPIÔNICO (01)

CIM = 1,0 mg/mL

OCH

2-CARBOMETOXI-6-METOXI-4-QUINOLONA (S1) 2-METIL-6-FLUOR-4-QUINOLONA (S2)

2-METIL-5,7-DIMETOXI-4-QUINOLONA (S3)

2-METIL-5-METOXI-7-HIDROXI-4-QUINOLONA (S4)

Ensaios Biológicos

158

com células de X. fastidiosa na fase estacionária. Para confirmar se a bactéria

estava realmente nesta fase, mediu a densidade óptica (OD

600nm

)

do meio antes

de iniciar o ensaio, o qual apresentou OD

600nm

igual a 0,281 que segundo a

literatura (CAMPANHARO et al., 2003) indica a fase estacionária.

Observa-se nos resultados apresentados acima para compostos

naturais que na concentração de 1,0 mg/mL a rutaecarpina efetivamente inibiu a

proliferação de células de X. fastidiosa, enquanto que N-metil-4-metoxi-2-

quinolona, ácido 3-fenil-[2’,6’-dimetoxi-(3’-4’O:5’’,6’’)2’’,2’’-dimetilpirano]propiônico

e o limonóide guianina mostraram atividade antibacteriana na faixa de 1,5 mg/mL.

A CIM de rutaecarpina pode ser explicada devido aos elétrons π que

estão delocalizados nos dois anéis aromáticos. Esta delocalização é reduzida em

N-metil-4-metoxi-2-quinolona e ácido 3-fenil-[2’,6’-dimetoxi-(3’-4’O:5’’,6’’)2’’,2’’-

dimetilpirano]propiônico, e ausente na guianina, indicando que a conjugação

apresenta um importante efeito na atividade frente à X. fastidiosa, visto que as

CIMs foram aumentando de 1,0 mg/mL para a rutaecarpina, 1,4 mg/mL para ácido

3-fenil-[2’,6’-dimetoxi-(3’-4’O:5’’,6’’)2’’,2’’-dimetilpirano]propiônico e 1,5 mg/mL

para N-metil-4-metoxi-2-quinolona e guianina.

Para os compostos sintéticos, nota-se que o composto 2-metil-6-

fluor-4-quinolona é o mais efetivo frente à bactéria, inibindo seu crescimento na

concentração de 0,5 mg/mL. Ainda não claramente esclarecido na literatura o

efeito que o flúor provoca frente à determinados microrganismos como por

exemplo bactérias, mas observa-se nestes ensaios que quando o mesmo

encontra-se ligado ao anel aromático, confere a mesma maior potencial

antibacteriano, quando comparada às demais que possuem outros substituintes

no anel.

Uma outra característica importante em uma molécula é o fato de

grupos como hidroxila ou metoxila ligados ao anel aromático favorecerem um

sistema conjugado extendido, conduzindo a melhores atividades biológicas. Desta

forma observa-se para as substâncias sintéticas, que 2-metil-5-metoxi-7-hidroxi-4-

quinolona possuindo ambos os grupos citados acima apresenta uma CIM de 1,0

mg/mL enquanto que 2-metil-5,7-dimetoxi-4-quinolona que possue dois grupos

metoxílicos e 2-carbometoxi-6-metoxi-4-quinolona que possue apenas um grupo

metoxílixo apresentam atividade na concentração de 1,5 mg/mL. Entretanto, o

papel do sistema conjugado extendido ainda não é claro e características

Ensaios Biológicos

159

estruturais necessárias para a atividade frente à X. fastidiosa permanecem pouco

conhecidas.

De forma geral, os resultados dos ensaios biológicos indicaram que

a maioria dos compostos testados in vitro frente a linhagem de X. fastidiosa 9a5c

foram ativos na faixa de concentração de 1,0 a 1,5mg/mL, enquanto que os

antibióticos ampicilina (10 µg/mL), kanamicina (2 µg/mL), neomicina (5 µg/mL),

penicilina (50 µg/mL), streptomicina (10 µg/mL) e tetraciclina (1 µg/mL) foram

ativos em concentrações abaixo de 50 µg/mL

-1

quando plaqueados utilizando

métodos tais como difusão em disco de agar e CIM (linhagem 9a5c, isolada de

laranja doce, LACAVA et al., 2001).

Assim, se for assumido que a CIM requerida para continuar as

investigações pode ser ≤ 1.50 mg/mL, as CIMs de alguns compostos são

significativas. Futuramente então, pretende-se dar seqüência à estes ensaios com

os mesmos compostos e outros similares, porém com a bactéria também na fase

exponencial e não apenas na fase estacionária, pois acredita-se que a fase

exponencial pode ser útil na estimativa de CIMs e com a vantagem da redução do

tempo necessário para o crescimento bacteriano.

Sabe-se que na fase estacionária a bactéria encontra-se em sua

maior densidade celular. Assim sendo, para inibir o crescimento de X. fastidiosa

nesta fase seria necessário a aplicação de doses contínuas de substância teste e

não apenas uma única dose como foi executado até o momento; assim,

futuramente pretende-se empregar esta metodologia com o objetivo de inibir seu

crescimento mesmo quando a mesma encontra-se muito resistente.

Portanto, claramente observa-se que este estudo necessita de

maiores investigações para se obter modelos moleculares que possam ser

considerados como efetivos agentes antibacterianos.

Ensaios Biológicos

160

4.2- ENSAIOS BACTERICIDAS FRENTE À PATÓGENOS BUCAIS

Os ensaios biológicos foram realizados na Universidade de Franca

(UNIFRAN), sob a colaboração do professor Dr. Carlos Henrique Gomes Martins.

Os valores de CIM dos extratos brutos e suas frações foram determinados

aplicando a técnica de microdiluição em caldo em microplacas de 96 poços. As

seguintes cepas padrões da ATCC (American Type Culture Collection) foram

utilizadas: Enterococcus faecalis (ATCC 4082), Streptococcus salivarius (ATCC

25975), S. sobrinus (ATCC 33478), S. mutans (ATCC 25175), S. mitis (ATCC

49456), S. sanguinis (ATCC 10556) and Lactobacillus casei (ATCC 11578). A CIM

foi determinada como a menor concentração capaz de inibir o crescimento visível

do microrganismo ensaiado, após 24 horas de incubação.

4.2.1- Procedimento Experimental

4.2.1.1- Substâncias Ensaiadas Frente à Patógenos Bucais

Os ensaios frente à patógenos bucais foram realizados utilizando-se

dois extratos de H. oreadica, os extratos hexânico e diclorometano do tronco

subterrâneo e as substâncias isoladas dos mesmos, sendo quatro derivados do

ácido diidrocinâmico (DAD 01 a DAD 04), quatro limonóides sendo, hortiolida C,

hortioloda D, hortioloda E (14) e guianina (13) e dois alcalóides, rutaecarpina (09)

e dictamina (11)(FIGURA 4.5, pgs 161 a 162). Também foram ensaiadas quatro

substâncias quinolinônicas sintéticas sendo, 2-metil-6-fluor-4-quinolona (S2), 2-

metil-5,7-dimetoxi-4-quinolona (S4), 2-metil-4-quinolona (S5) e 2-metil-7-hidroxi-4-

quinolona (S6) (FIGURA 4.6, pg 162).

Ensaios Biológicos

161

FIGURA 4.5: Estruturas das substâncias naturais ensaiadas

OCH

DAD 01

DAD 02

OCH

DAD 03

OCH

DAD 04

HORTIOLIDA D HORTIOLIDA E (14)

OOH

OCH

GUIANINA (13) HORTIOLIDA C

Ensaios Biológicos

162

FIGURA 4.5: Estruturas das substâncias naturais ensaiadas (continuação)

FIGURA 4.6: Estruturas das substâncias sintéticas ensaiadas

4.2.1.2- Metodologia dos Ensaios frente à Patógenos Bucais

Os procedimentos para determinar a concentração inibitória podem

ser realizados tanto pelas técnicas de diluição em caldo quanto em ágar. Os

agentes antimicrobianos são geralmente testados em diluições consecutivas, e a

menor concentração capaz de inibir o crescimento de um organismo é

considerada como a CIM. Segundo ANDREWS (2001), as CIMs são consideradas

excelentes ferramentas para determinar a susceptibilidade dos microrganismos

aos antimicrobianos e portanto usadas para julgar a performance de todos os

outros métodos de susceptibilidade. Neste experimento utilizou-se a técnica de

OCH

RUTAECARPINA (09)

DICTAMINA (11)

2-METIL-5,7-DIMETOXI-4-QUINOLONA (S4)

2-METIL-7-HIDROXI-4-QUINOLONA (S6)2-METIL-4-QUINOLONA (S5)

2-METIL-6-FLUOR-4-QUINOLONA (S2)

OCH

Ensaios Biológicos

163

microdiluição em caldo proposta pelo NCCLS (2003) e chamada assim devido ao

uso de pequenos volumes de meio líquido colocados em microplacas com fundo

em “U” esterilizadas com 96 orifícios (TPP

, EUA), próprias para microdiluição.

Inicialmente foi preparada soluções estoque com os extratos brutos

e substâncias, solubilizando 1 mg de cada amostra em 125 µL de DMSO.

Posteriormente, cada solução estoque foi diluída em 1875 µL de meio líquido

(meio tryptone soya) originando assim a solução mãe e posteriormente pôde-se

obter concentrações na faixa de 20 a 400 µg/mL nas microplacas.

A proporção de DMSO aplicada no experimento para solubilizar as

amostras foi de 5% (v/v) e esta proporção foi utilizada nos orifícios das

microplacas como controle negativo, para confirmar se o solvente não estava

inibindo o crescimento dos microrganismos.

A clorexidina, antibiótico comercial, foi utilizado como controle

positivo para verificar a viabilidade dos microrganismos, e seu preparo foi feito da

seguinte forma: pegou-se 10 mL de água autoclavada e 1 mg da clorexidina para

obter uma concentração de 0,1 mg/mL. Posteriormente pipetou-se 1 mL desta

solução em 4 mL de meio de cultura (meio líquido) para uma concentração final

de 0,02 mg/mL. Diluições em série nas microplacas foram realizadas em meio

líquido para obter concentrações na faixa de 0,0115 µg/mL a 5,9 µg/mL,

perfazendo 100µL de volume final.

A densidade do inóculo influencia no resultado dos experimentos, e

portanto padronizou-se a solução de inóculo a ser utilizada, a fim de assegurar a

reprodutibilidade dos ensaios. Inicialmente preparou-se a escala de 0,5 de Mc

Farland segundo BIER

(1981). Para isso, adicionou-se 0,5 mL de cloreto de bário

a 1% em 99,5 mL de ácido sulfúrico a 1%. Em seguida transferiu-se 2 mL dessa

suspensão para uma cubeta espectrofotométrica. Para calibrar a transmitância a

100% em um espectrofotômetro a um comprimento de onda de 530 nm, utilizou-

se água destilada. Em seguida colocou-se a suspensão de 0,5 de Mc Farland

(1,5x10

CFU/mL), obtendo a transmitância de 88%. Todas as suspensões

bacterianas foram ajustadas na mesma transmitância.

Posteriormente, cada orifício da microplaca recebeu um determinado

volume de inóculo, meio de cultura líquido e as soluções das amostras em

concentrações finais que variaram de 20 a 400 µg/mL, sendo o volume final de

100 µL. Um orifício foi utilizado como controle do crescimento dos microrganismos

Ensaios Biológicos

164

no meio e outro orifício apenas com o meio líquido, livre de agentes

antimicrobianos, foi usado para assegurar a esterilidade do meio. Logo após a

micropipetagem, as microplacas foram tampadas e incubadas a 35ºC por 24

horas, sem agitação. Terminado o período de incubação, foram adicionados em

cada orifício das microplacas, 30 µL de resazurina a 0,02% em solução aquosa

esterilizada e após alguns minutos a leitura foi realizada. A resazurina facilita

verificar a presença de crescimento microbiano, a coloração azul indica ausência

de crescimento microbiano, enquanto a cor vermelha indica a presença de células

viáveis em crescimento. Dessa maneira foi possível determinar a menor

concentração de cada amostra capaz de inibir o crescimento dos microrganismos

indicadores diluídos.

Um resumo da metodologia empregada no ensaio biológico está

representado na FIGURA 4.7 (pg 164).

FIGURA 4.7: Metodologia do ensaio biológico

AMOSTRA

DILUENTE

PREPARO DA AMOSTRA

SOLUBILIZA

ÃO

MEIO LÍQUIDO

SOLU

ÃO MÃE

1875

125

1mg

125

1000

SALINA

CULTURA DE

24 HORAS

DENSIDADE DO

INÓCULO

PREPARO DO INÓCULO

SALINA

2000

CALDO

DISTRIBUIÇÃO

DAS AMOSTRAS

INIBIÇÃO DO CRESCIMENTO

BACTERIANO

NÃO INIBIU O CRESCIMENTO

BACTERIANO

DETERMINAÇÃO DA CIM

REVELADOR - RESAZURINA

Incubar

por 24 horas

CONCENTRAÇÕES

400…50

Ensaios Biológicos

165

4.2.2 Resultados e Discussão

O solvente DMSO, utilizado como controle negativo na técnica de

microdiluição em caldo, não apresentou atividade antimicrobiana frente a todos os

microrganismos testados. A clorexidina, utilizada como controle positivo, foi capaz

de inibir o crescimento de todas as bactérias em baixas concentrações,

demonstrando a efetividade da técnica.

Os valores de CIM foram determinados em triplicata pela leitura

visual após revelação com resazurina, a qual é um indicador de oxido-redução

que tem sido utilizado para avaliar a viabilidade de células microbianas

(MONTEJANO et al., 2005). A resazurina (7-hidroxi-3H-fenoxazina-3-ona-10-

óxido) de cor azul é reduzida na presença de células viáveis a resofurina,

substância de coloração vermelha (PALOMINO et al., 2002).

4.2.2.1- Extratos de H. oreadica

Os resultados da CIM do extrato hexânico (EHTSHB), do extrato

diclorometano (EDTSHB) de H. oreadica e do controle positivo são apresentados

na TABELA 4.6 (pg 165).

TABELA 4.6: CIM dos extratos ensaiados (µg/mL)

Microrganismos EHTSHB EDTSHB clorexidina

S. mitis

300

>400 0,3688

S. mutans

300

>400 0,0922

S. sobrinus

300

>400 0,0922

S. sanguinis

200 >400 0,3688

S. salivarius

200 300 0,0922

Lactobacillus casei

400

>400 0,0922

Enterococcus faecalis

> 400 > 400 0,3688

Ensaios Biológicos

166

Nas concentrações de 200 a 300 µg/mL, o extrato hexânico

apresentou atividade frente a maioria dos patógenos bucais testados, exceto para

E. faecalis e L. casei. Os microrganismos mais sensíveis ao extrato foram S.

salivarius e S. sanguinis (concentração do extrato= 200 µg/mL).

O extrato diclorometano apresentou atividade em concentrações

maiores que o extrato hexânico, como evidenciado pelos valores de CIM. Para

alguns microrganismos este extrato não exibiu atividade interessante, com valores

de CIM maiores que 400 µg/mL.

O fato do extrato hexânico ter sido mais ativo frente aos

microrganismos, pode ser explicado pela presença de compostos lipofílicos,

principalmente ácidos graxos, que são os constituintes majoritários deste extrato.

Lipofilicidade está intimamente ligada a permeação através da camada lipídica

das bactérias (TOKUYAMA et al. 2001). Entretanto, o efeito destes constituintes

são potencializados por efeitos de sinergismo e aditivo de outros constituintes

químicos minoritários presentes também no extrato.

4.2.2.2- Substâncias isoladas de H. oreadica

O efeito das substâncias químicas isoladas de H. oreadica no

crescimento dos patógenos bucais estão mostradas na TABELA 4.7, 4.8 e 4.9

(pgs 166 a 167).

TABELA 4.7: CIM dos derivados do ácido diidrocinâmico (µg/mL)

Microrganismos DAD 01 DAD 02 DAD 03 DAD 04 clorexidina

S. salivarius

300 300 400 400 0,0922

S. sanguinis

> 400 > 400 > 400 > 400 0,3688

S. mitis

> 400 > 400 > 400

> 400

0,3688

S. mutans

> 400 > 400

> 400 > 400 0,0922

S. sobrinus

> 400 > 400

> 400 > 400 0,0922

L. casei

> 400 > 400

> 400 > 400 0,0922

E. faecalis

> 400

> 400 > 400 > 400 0,3688

Ensaios Biológicos

167

TABELA 4.8: CIM dos limonóides (µg/mL)

Microrganismos

guianina

(13)

hortiolida

E (14)

clorexidina

S. salivarius

> 400 400 400 > 400 0,0922

S. sanguinis

> 400 > 400 400 400 0,3688

S. mitis

300 > 400 > 400

> 400

0,3688

S. mutans

400 > 400

> 400 > 400 0,0922

S. sobrinus

300 > 400

> 400 > 400 0,0922

L. casei

200 > 400

> 400 > 400 0,0922

E. faecalis

> 400

> 400 > 400 > 400 0,3688

TABELA 4.9: CIM dos alcalóides (µg/mL)

Microrganismos rutaecarpina (09) dictamina (11) clorexidina

S. salivarius

> 400 > 400 0,0922

S. sanguinis

400 400 0,3688

S. mitis

> 400 > 400 0,3688

S. mutans

> 400 400

0,0922

S. sobrinus

> 400 > 400

0,0922

L. casei

> 400 100

0,0922

E. faecalis

> 400

0,3688

Os valores similares de CIM atribuídos aos derivados do ácido

diidrocinâmico são possivelmente explicados pela semelhança das estruturas

químicas, que apresentam diferenças apenas na posição da metoxila e na função

ácido ou éster da cadeia lateral, mantendo seu esqueleto básico intacto. Em

relação ao limonóides avaliados, guianina (13) apresentou o mais alto nível de

inibição quando comparado aos demais limonóides. A presença de duas funções

éster na molécula pode ter contribuído para a atividade inibitória deste limonóide.

Os alcalóides rutaecarpina (09) e dictamina (11), embora com estruturas químicas

muito diferentes, apresentaram valores de CIM semelhantes, exceto para o

patógeno L. casei, em que dictamina mostrou maior atividade inibitória.

Ensaios Biológicos

168

4.2.2.3- Substâncias Quinolinônicas Sintéticas

Os valores de CIM para as substâncias quinolinônicas sintéticas são

mostrados na TABELA 4.10 (pg 168).

TABELA 4.10: CIM das substâncias quinolinônicas sintéticas (µg/mL)

Microrganismos S2 S4 S5 S6 clorexidina

S. salivarius

400 > 400 > 400 > 400 0,0922

S. sanguinis

> 400 400 400 400 0,3688

S. mitis

> 400

> 400 > 400 0,3688

S. mutans

> 400

> 400 0,0922

S. sobrinus

> 400

> 400 0,0922

L. casei

> 400

400

> 400

> 400 0,0922

E. faecalis

> 400

> 400 > 400 > 400 0,3688

Ao se analisar as estruturas sintéticas, percebe-se que a substância

2-metil-4-quinolona (S5) é a molécula padrão na qual foram realizadas reações

para introduzir substituintes diferentes. Ao se ensaiar estas substâncias, o

objetivo foi averigüar a atividade antibacteriana das mesmas e verificar se os

substituintes presentes aumentaria ou diminuiria a atividade. Entretanto, a análise

dos resultados obtidos, apresentados na tabela acima, mostra que as substâncias

em questão apresentaram atividades antibacteriana similares frente a todos os

microrganismos testados, com a maioria dos valores de CIM sendo superior a 400

µg/mL. Porém, comparando as estruturas e resultados, percebe-se que a

substância 2-metil-5,7-dimetoxi-4-quinolona (S4) foi a mais efetiva dentre todas,

inibindo o crescimento de dois microrganismos, S. sanguinis e L. casei. Este

resultado sugere que a presença de dois grupos polares no anel aromático é

benéfico para a atividade antimicrobiana.

A partir destes resultados pode-se determinar a CIM de algumas

substâncias frente à determinados patógenos (FIGURA 4.8 , pgs 169 a 171),

sendo que para outros patógenos certas substâncias apresentaram potencial de

inibição acima de 400 µg/mL, não sendo interessante então ensaios adicionais em

uma faixa de concentração maior, como por exemplo de 400 a 800 µg/mL, para a

Ensaios Biológicos

169

determinação exata da CIM, pois o que se busca numa substância é eficácia em

inibir um microrganismo à concentrações cada vez menores.

S. salivarius → CIM: 300 µg/mL S. salivarius → CIM: 300 µg/mL

S. salivarius → CIM: 400 µg/mL S. salivarius → CIM: 400 µg/mL

FIGURA 4.8: CIM das substâncias ensaiadas frente à patógenos bucais

DAD 01

OCH

DAD 02

OCH

DAD 03

OCH

DAD 04

Ensaios Biológicos

170

S. mitis → CIM: 300 µg/mL S. salivarius → CIM: 400 µg/mL

S. mutans → CIM: 400 µg/mL

S. sobrinus → CIM: 300 µg/mL

L. casei → CIM: 200 µg/mL

S. salivarius → CIM: 400 µg/mL S. sanguinis → CIM: 400 µg/mL

S. sanguinis → CIM: 400 µg/mL

FIGURA 4.8: CIM das substâncias ensaiadas frente à patógenos bucais

(continuação)

OOH

HORTIOLIDA C

GUIANINA (13)

HORTIOLIDA E (14)

HORTIOLIDA D

Ensaios Biológicos

171

S. sanguinis → CIM: 400 µg/mL S. mutans → CIM: 400 µg/mL

S. sanguinis → CIM: 400 µg/mL

L. casei → CIM: 100 µg/mL

S. salivarius

→ CIM: 400 µg/mL S. sanguinis → CIM: 400 µg/mL

L. casei

→ CIM: 400 µg/mL

S. sanguinis

→ CIM: 400 µg/mL S. sanguinis → CIM: 400 µg/mL

FIGURA 4.8: CIM das substâncias ensaiadas frente à patógenos bucais

(continuação)

2-METIL-6-FLUOR-4-QUINOLONA (S2)

2-METIL-5,7-DIMETOXI-4-QUINOLONA (S4

)

OCH

2-METIL-4-QUINOLONA (S5)

2-METIL-7-HIDROXI-4-QUINOLONA (S6)

RUTAECARPINA (09)

OCH

DICTAMINA (11)

Ensaios Biológicos

172

4.3- ENSAIOS BACTERICIDAS FRENTE À PATÓGENOS DE

ORIGEM ALIMENTAR

Os ensaios biológicos foram realizados na Universidade de Franca

(UNIFRAN), com a colaboração do professor Dr. Carlos Henrique Gomes Martins.

As seguintes cepas padrões da ATCC (American Type Culture Collection) foram

utilizadas: Vibrio cholerae (ATCC 9458), Salmonella choleraesuis (ATCC 10708) e

Bacillus cereus (ATCC 14579).

4.3.1- Procedimento Experimental

4.3.1.1- Substâncias Ensaiadas Frente à Patógenos de Origem

Alimentar

Os ensaios frente à patógenos de origem alimentar foram realizados

utilizando-se uma substância isolada de H. oreadica, o limonóide guianina; um

policetídeo isolado de um fungo patogênico, a lasiodiplodina , e quatro

substâncias quinolinônicas sintéticas, sendo 2-metil-6-fluor-4-quinolona (S2), 2-

metil-5,7-dimetoxi-4-quinolona (S4), 2-metil-4-quinolona (S5) e 2-metil-7-hidroxi-4-

quinolona (S6) (FIGURA 4.9, pgs 172 a 173).

FIGURA 4.9: Estruturas das substâncias ensaiadas frente à patogénos de origem

alimentar

GUIANINA (13)

LASIODIPLODINA

OCH

Ensaios Biológicos

173

FIGURA 4.9: Estruturas das substâncias ensaiadas frente à patogénos de origem

alimentar (continuação)

4.3.1.2 Metodologia dos Ensaios frente à Patógenos de

Origem Alimentar

O procedimento para determinar a CIM dos patógenos de origem

alimentar foi o mesmo utilizado para patógenos bucais, ou seja, utilizou-se a

técnica de diluição em caldo em microplacas de 96 poços. Entretanto, ao invés de

utilizar a clorexidina como controle positivo, utilizou-se a gentamicina para Vibrio

cholerae e Salmonella choleraesuis e a vancomicina para Bacillus cereus,

utilizando um procedimento experimental semelhante ao da clorexidina para

prepará-las.

2-METIL-4-QUINOLONA (S5)

2-METIL-6-FLUOR-4-QUINOLONA (S2)

HO CH

2-METIL-7-HIDROXI-4-QUINOLONA (S6)

OCH

2-METIL-5,7-DIMETOXI-4-QUINOLONA (S4)

Ensaios Biológicos

174

4.3.2- Resultados e Discussão

Assim como para os patógenos bucais, o solvente DMSO utilizado

como controle negativo não apresentou atividade antimicrobiana frente aos

microrganismos testados.

Em relação aos controles positivos, a gentamicina inibiu o

crescimento das bactérias em baixas concentrações, sendo 0,3688 µg/mL para V.

cholerae e 1,475 µg/mL para S. choleraesuis e a vancomicina inibiu o crescimento

de Bacillus cereus na concentração de 0,0922 µg/mL, demonstrando a efetividade

da técnica.

Os valores de CIM foram determinados em triplicata pela leitura

visual, após revelação com 30 µL de solução de resazurina. A FIGURA 4.10 (pg

174) ilustra uma microplaca contendo duas das substâncias ensaiadas e o

patógeno B. cereus. A coloração rosa indica que não houve inibição da bactéria e

a coloração azul indica inibição do crescimento de bactéria.

FIGURA 4.10: Microplaca após revelação com resazurina

SUBSTÂNCIAS

ENSAIADAS

CONTROLE

POSITIVO

CONTROLE

NEGATIVO

MEIO

LÍQUIDO

INÓCULO

400 300

CONCENTRAÇÕES

µg/mL

200 100

80 70 60 50 40 30 20

Ensaios Biológicos

175

Os resultados da CIM das substâncias ensaiadas e dos controles

positivos são apresentados nas TABELAS 4.11, 4.12 e 4.13 (pg 175).

TABELA 4.11: CIM das substâncias ensaiadas frente à V. cholerae (µg/mL)

Substâncias

V. cholerae

(gentamicina 0,3688)

guianina (13) > 400

lasiodiplodina 200

S2 300

S4 > 400

S5 > 400

S6 > 400

Tabela 4.12: CIM das substâncias ensaiadas frente à S. choleraesuis (µg/mL)

Substâncias

S. choleraesuis

(gentamicina 1,475)

guianina (13) > 400

lasiodiplodina 400

S2 400

S4 300

S5 > 400

S6 > 400

TABELA 4.13: CIM das substâncias ensaiadas frente à B. cereus (µg/mL)

Substâncias

B. cereus

(vancomicina 0,0922)

guianina (13) > 400

lasiodiplodina 400

S2 > 400

S4 > 400

S5 > 400

S6 400

Ensaios Biológicos

176

Portanto, com este experimento determinou-se a CIM de

determinadas substâncias (FIGURA 4.11, pg 176).

V. cholerae → CIM: 200 µg/mL V. cholerae → CIM: 300 µg/mL

S. choleraesuis → CIM: 400 µg/mL S. choleraesuis → CIM: 400 µg/mL

B. cereus → CIM: 400 µg/mL

S. choleraesuis → CIM: 300 µg/Ml B. cereus → CIM: 400 µg/mL

FIGURA 4.11: CIM da lasiodiplodina, 2-metil-6-fluor-4-quinolona (S2), 2-metil-5,7-

dimetoxi-4-quinolona (S4) e 2-metil-7-hidroxi-4-quinolona (S6) frente à patógenos

de origem alimentar

HO CH

2-METIL-7-HIDROXI-4-QUINOLONA (S6)

OCH

2-METIL-5,7-DIMETOXI-4-QUINOLONA (S4)

OCH

LASIODIPLODINA

2-METIL-6-FLUOR-4-QUINOLONA (S2)

Ensaios Biológicos

177

De acordo com os valores de CIM, nota-se que a lasiodiplodina foi a

substância mais eficaz dentre todas as ensaiadas frente aos patógenos de origem

alimentar, sendo que a melhor CIM obtida foi para V. cholerae (200 µg/mL).

Possivelmente, uma justificativa que confere a esta substância maior atividade

que as demais, é o fato de ela ser um metabólito isolado de fungo. Estudos

relatam que fungos produzem substâncias potencialmente capazes de inibir o

crescimento de outros microrganismos.

Em contraste com o que ocorre para os patógenos bucais, o

limonóide guianina (13) isolado de H. oreadica, não apresentou resultados

interessantes frente às bactérias ensaiadas, sendo que os valores de CIM foram

maiores que 400 µg/mL.

Para as substâncias quinolinônicas sintéticas, o melhor valor de CIM

foi atribuído às substâncias 2-metil-6-fluor-4-quinolona (S2) e 2-metil-5,7-dimetoxi-

4-quinolona (S4) (CIM= 300 µg/mL). A substância 2-metil-5,7-dimetoxi-4-

quinolona (S4) destacou-se também para os patógenos bucais S. sanguinis e L.

casei (CIM= 400 µg/mL), como apresentado anteriormente. Estes resultados

reforçam o fato que a presença de grupos polares no anel aromático, como

metoxilas, possivelmente contribui para a atividade antimicrobiana.

Verificou-se que para algumas substâncias a concentração de

inibição é superior a 400 µg/mL, não sendo interessante portanto realizar ensaios

adicionais com uma faixa de concentração mais ampla como por exemplo de 400

a 800 µg/mL para determinar a CIM exata, pois o que se busca neste ensaio é

encontrar substâncias com CIM cada vez menores, ou seja, compostos com

potenciais elevados de inibição frente à patógenos de origem alimentar.

As substâncias que proporcionaram a determinação da CIM com

valores entre 100 e 300 µg/mL em ensaios com patógenos bucais ou de origem

alimentar, serão selecionadas para dar continuidade aos estudos realizando

modificações estruturais nas mesmas ou então buscando novos modelos

moleculares similares aos já ensaios, visando a descoberta de compostos com

alto potencial antibacteriano frente à estes microrganismos.

Ensaios Biológicos

178

5. CONCLUSÃO

_____________________________________________________

Conclusão

180

O estudo fitoquímico das espécies de H. oreadica, H. brasiliana e H.

superba proporcionou o isolamento e identificação de 15 metabólitos secundários

sendo seis derivados do ácido diidrocinâmico {ácido 3-fenil-[2’,6’-dimetoxi-(3’,4’-

O:5’’,6’’)-2’’,2’’-dimetilpirano]propiônico 01, 3-fenil-[2’-metoxi-(3’,4’-O:5’’,6’’)-2’’,2’’-

dimetilpirano]propionato de metila 02, 3-fenil-[2’,6’-dimetoxi-(3’,4’-O:5’’,6’’)-2’’,2’’-

dimetilpirano]propionato de metila 03, 3-fenil-[2’,5’-dimetoxi-(3’,4’-O:5’’,6’’)-2’’,2’’-

dimetilpirano]propionato de metila 04, a mistura de 01 e o ácido 3-fenil-[2

’

-metoxi-

’

-O:5

’’

’’’

)-2

’’

-dimetilpirano]propiônico 05, ácido 3-fenil-[2’,5’-dimetoxi-(3’,4’-

O:5’’,6’’)-2’’,2’’-dimetilpirano]propiônico 06}; a mistura de 03 e a cumarina 5-

metoxiseselina 07; um derivado do ácido cinâmico [ácido 3,4-dimetoxi-α(3-hidroxi-

4-carbometoxifenil)cinâmico 08]; quatro alcalóides, sendo dois do tipo β-

indoloquinazolínicos (rutaecarpina 09 e 7,8-desidrorutaecarpina 10), um

quinolínico (dictamina 11) e um 2-quinolônico (N-metilflindersina 12) e três

limonóides ( guianina 13, hortiolida E 14 e hortiolida G 15). Segundo o estudo

fitoquímico realizado, os derivados do ácido diidrocinâmico estão presentes

preferencialmente nas espécies H. oreadica e H. brasiliana, enquanto que o

alcalóide do tipo β-indoloquinazolínico rutaecarpina está presente em todas as

espécies estudadas. A guianina, primeiro limonóide descrito em literatura para o

gênero Hortia, foi isolado apenas dos extratos de H. oreadica; já o limonóide

hortiolida E foi encontrado tanto em H. superba como em H. oreadica, sendo

inédito para esta última espécie. Como mencionado no capítulo 3, ainda não é

possível propor a classificação correta do gênero Hortia dentro da família

Rutaceae, pois faz-se necessário o estudo de todos os extratos do gênero para

então concluir melhor sobre o seu exato posicionamento quimiossistemático.

Os ensaios biológicos frente à bactéria X. fastidiosa, agente causal

da CVC, possibilitou a determinação da CIM de algumas classes de substâncias

naturais bem como de uma série sintética, as quais ainda não haviam sido

ensaiadas. As substâncias com maior potencial inibitório foram as quinolinônicas

sintéticas 2-metil-6-fluor-4-quinolona (S2) e 2-metil-5-metoxi-7-hidroxi-4-quinolona

(S4) e o alcalóide rutaecarpina, com CIMs entre 0,5 e 1,0 mg/mL. Desta forma,

este trabalho indicou novas perspectivas para o controle da CVC até então não

utilizadas, como a inibição direta e ecologicamente correta do microrganismo

causal da doença a partir de produtos naturais e derivados dos mesmos.

Conclusão

181

A investigação do potencial antimicrobiano de extratos e substâncias

isoladas de Hortia bem como substâncias sintéticas permitiu a determinação da

CIM frente a alguns patógenos bucais. Dentre os extratos testados, o extrato

hexânico foi o mais promissor frente às cepas ensaiadas. Todas as substâncias

naturais ensaiadas apresentaram atividade inibitória frente a pelo menos um

microrganismo. Os melhores valores de CIM foram obtidos para o limonóide

guianina e o alcalóide dictamina, sendo 200 e 100 µg/mL respectivamente, frente

ao patógeno L. casei. O patógeno E. faecalis foi o que apresentou maior

resistência, não sendo inibido na faixa de concentração ensaiada por nenhuma

substância. Entre as substâncias sintéticas, a 2-metil-5,7-dimetoxi-4-quinolona

(S4) foi a mais efetiva, inibindo o crescimento dos microrganismos S. sanguinis e

L. casei em 400 µg/mL.

Os ensaios frente à patógenos de origem alimentar revelaram que

as substâncias lasiodiplodina, 2-metil-6-fluor-4-quinolona (S2) e 2-metil-5,7-

dimetoxi-4-quinolona (S4) foram as mais eficazes dentre todas as ensaiadas. Já o

limonóide guianina não apresentou resultados interessantes frente às bactérias

ensaiadas, sendo que os valores de concentração inibitória foram maiores que

400 µg/mL.

Como conclusão geral dos ensaios realizados com patógenos e

fitopatógeno, observa-se que bactérias resistentes a antibióticos continuam

emergindo rapidamente, constituindo um problema de elevada significância no

Brasil. Assim, plantas nativas, produtos naturais e substâncias sintéticas com

propriedades antibacterianas constituem uma importante e valiosa fonte na

descoberta de novos produtos com potencial antimicrobiano.

Conclusão

182

6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

_____________________________________________________

Referências Bibliográficas

184

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