ads:
Marcela Gonçalves Drummond
Dissertação de Mestrado
Caracterização da proteína SmZF1 de
Schistosoma mansoni: sua interação
com DNA e localização no parasito
Belo Horizonte, Fevereiro de 2007
ads:
Livros Grátis
http://www.livrosgratis.com.br
Milhares de livros grátis para download.
Universidade Federal de Minas Gerais
Instituto de Ciências Biológicas
Laboratório de Genética Bioquímica
Caracterização da proteína SmZF1 de
Schistosoma mansoni: sua interação
com DNA e localização no parasito
Marcela Gonçalves Drummond
Orientadora: Dra.Glória Regina Franco
Co-orientador: Dr. Carlos Eduardo Calzavara Silva
Dissertação apresentada ao
programa de Pós-Graduação
em Genética do Departamento
de Biologia Geral do Instituto
de Ciências Biológicas da
Universidade Federal de
Minas Gerais como requisito
parcial à obtenção do título de
Mestre em Genética.
Belo Horizonte, Fevereiro de 2007
ads:
3
Agradecimentos
À Professora Glória Regina Franco por minha formação científica.
Obrigada pela atenção e paciência em orientar e ensinar. Pela amizade, por
todos os conselhos e pelo grande incentivo em seguir a carreira de
pesquisadora.
Ao Kadu, por ter me passado o legado da SmZF1, por ter me ensinado
grande parte do que hoje eu sei em biologia molecular. Pela grande amizade,
por toda a paciência, pelo incrível senso de humor, sempre criticando a minha
“cara de choro”...
Aos Professores Sérgio Danilo Pena, Andréa Macedo e Carlos Renato
Machado pelas diversas sugestões dadas a este trabalho, participando
ativamente da minha formação profissional.
A todos os verdadeiros amigos que fiz no LGB. Muito obrigada pelo
companheirismo, pelas conversas fiadas, pelos almoços em conjunto, pelos
lanchinhos no meio da tarde. Além da ajuda técnica, sempre me apoiando
naquilo que foi preciso. Vocês são grande parte deste trabalho.
À Neuza, Kátia, Miriam, Rúbia e Raquel, sempre dispostas a ajudar.
Obrigada por terem feito do LGB um local bem agradável de trabalhar durante
todo este tempo.
Ao Professor Carlos Chávez por todo o apoio dado a este trabalho.
Muito obrigada pela confiança, pelas sugestões dadas e por deixar o seu
Laboratório sempre de portas abertas para mim.
A todos do Laboratório de Bioquímica e Imunologia de Parasitos pela
grande receptividade e pela enorme ajuda prestada nos experimentos com o
arranjo de peptídeos, de síntese do peptídeo e de purificação do soro anti-
SmZF1. Obrigada especialmente ao Ricardo, Clara, Diogo e Christina.
À Marcella pelos experimentos de espectrometria de massas.
4
Aos professores Gregory Kitten e Sérgio Costa pela colaboração
realizada nos experimentos de imunolocalização. À Fernanda Caldas e
Elisandra pela imprescindível ajuda na realização destes experimentos.
A todos os amigos do ICB, em especial àqueles do Departamento de
Biologia Geral (Genética) e do Departamento de Bioquímica e Imunologia.
Aos eternos, inesquecíveis e maravilhosos amigos da graduação. É
como eu já disse, formarmos uma Grande Família admirável e muito divertida,
e serei sempre grata pela presença de vocês em minha vida. Apesar da
distância física de alguns, vocês sempre estarão em meu coração. E nos
jantares de fim de ano, e nas festas juninas...
Ao Marcelão, um “achado” na minha vida. Obrigada por tudo o que você
representa hoje para mim, pela paciência, amizade e companheirismo. Por
todos os momentos maravilhosos que temos passado juntos. Amo você!
Ao meu pai, por ser para mim exemplo de responsabilidade, trabalho e
dignidade. Por ter me mostrado a vida como ela é. Pelo amor e carinho. E mais
uma vez obrigada por ter me ensinado o carinho e admiração à natureza, e,
mesmo sem querer, ter despertado em mim o amor à Biologia.
Ao meu irmão, amigo, companheiro. Por ter seu modo de vida todo
próprio, e me ensinar que não devemos temer as pessoas. Obrigada pelo seu
amor, pelo seu sorriso e pelo seu carinho.
A todos da minha maravilhosa família, colocados a dedo em meu
caminho. Um obrigado especial à Tia Janinha, Tio Evandro, Tulla e Júnior, por
acolherem a mim e ao meu irmão de uma forma inexplicável, fazendo de tudo
para o nosso sucesso. Muito obrigada pelo amor, carinho, e calor familiar. E à
Ludi, pela irmã que representa para mim.
Ao mais novo membro da família, Beatriz, e ao Marco Thúlio, meus
afilhados queridos que são as coisas mais fofas desse mundo e tanto me
fazem feliz.
Finalmente à minha mãe, guiadora de todos os meus passos. Por que
“tudo aquilo que eu sou, ou pretendo ser, eu devo ao anjo, que foi minha mãe”.
5
Te amo, e penso em você todos os dias da minha vida. Obrigada pela sua
presença, sempre.
6
Sumário
Lista de Figuras 8
Abreviaturas 11
Resumo 13
Abstract 14
1- Introdução 15
1.1 – A proteína SmZF1 15
1.2 – Os motivos dedos de zinco 15
1.3 – A regulação gênica e os fatores de transcrição em
eucariotos
29
1.4 – A esquistossomose e o ciclo de vida de Schistosoma
mansoni
32
1.5 – A importância da regulação gênica para o ciclo de vida de
Schistosoma mansoni
36
1.6 – A importância de SmZF1 para o ciclo de vida de
Schistosoma mansoni
41
2 – Objetivos 43
2.1 – Objetivo geral 43
2.2 – Objetivos específicos 43
3 – Material e Métodos 44
3.1 – Arranjo de polipeptídeos derivados de SmZF1 44
3.2 – Ensaios de ligação do oligonucleotídeo D1-3 concatâmero
biotinilado ao arranjo de polipeptídeos derivados de SmZF1
44
3.3 – Localização subcelular de SmZF1 em vermes adultos de
Schistosoma mansoni
50
3.3.1 – Localização subcelular de SmZF1 em machos 50
7
adultos de Schistosoma mansoni através de experimentos de
imunolocalização
3.3.2 – Localização subcelular de SmZF1 em vermes
adultos de Schistosoma mansoni através de ensaios de Western blot
51
3.4 – Produção de um anticorpo anti-SmZF1 de boa qualidade 52
3.4.1 – Identificação da região mais antigênica de SmZF1 52
3.4.2 – Síntese do peptídeo mais antigênico de SmZF1 53
3.4.3 – Purificação do soro anti-SmZF1 para remoção de
anticorpos não específicos contra o peptídeo mais imunogênico de
SmZF1
59
4 - Resultados 62
4.1 – Identificação dos principais aminoácidos de SmZF1
responsáveis por sua interação com o DNA
62
4.2 – Localização subcelular da proteína SmZF1 em vermes
adultos de Schistosoma mansoni
66
4.3 – Produção de um anticorpo anti-SmZF1 de boa qualidade 69
4.3.1 – Localização das principais regiões da proteína
SmZF1 capazes de reconhecer anticorpos presentes no soro policlonal
anti-SmZF1
70
4.3.2 – Síntese do peptídeo representante da região mais
imunogênica de SmZF1
72
4.3.3 – Purificação do soro “bruto” anti-SmZF1 72
4.3.4 – Nova síntese do peptídeo mais imunogênico de
SmZF1
79
5 – Discussão 85
6 – Conclusões 92
7 – Perspectivas 93
8 - Referências Bibliográficas 94
8
Lista de Figuras
Figura 1 - Seqüência de nucleotídeos do gene codificador para SmZF1
e estrutura primária deduzida da proteína SmZF1.
16
Figura 2 - Estrutura tridimensional predita da proteína SmZF1. 17
Figura 3: Esquema representativo de um dedo de zinco do tipo C
2
H
2.
19
Figura 4: Grupos responsáveis pelos padrões característicos de cada
par de bases nas fendas maior e menor do DNA.
23
Figura 5: Padrão característico de cada par de bases nas fendas maior
e menor do DNA, responsáveis pelas interações específicas entre
estes e as cadeias laterais dos aminoácidos nas proteínas.
24
Figura 6: Esquema representativo do padrão clássico de
reconhecimento de bases no DNA pela proteína murina Zif268.
26
Figura 7: Comparação entre os padrões de contato com o DNA das
formas nativa e mutada da proteína murina Zif268.
27
Figura 8: Fatores de transcrição basais e seqüência-específicos
(ativadores e repressor) ligados a elementos de regulação em cis.
33
Figura 9: Esquema representativo do ciclo de vida do gênero
Schistosoma.
35
Figura 10: Arranjo de peptídeos com 15 aminoácidos cada, derivados
de SmZF1.
45
Figura 11: Esquema representando o ensaio de ligação do
oligonucleotídeo D1-3 concatâmero marcado com biotina ao arranjo de
peptídeos derivados da seqüência primária de SmZF1.
49
Figura 12: Esquema representando o ensaio de ligação do anticorpo
anti-SmZF1 ao arranjo de peptídeos derivado da seqüência primária de
SmZF1.
54
Figura 13: Esquema representativo da síntese de peptídeos em fase
sólida.
56
9
Figura 14: Amplificações do oligonucleotídeo D1-3 concatâmero
visando sua biotinilação.
63
Figura 15: Experimento de dot blot para confirmação da biotinilação do
oligonucleotídeo D1-3 concatâmero.
64
Figura 16: Ensaio de ligação do oligonucleotídeo biotinilado D1-3
concatâmero à membrana contendo o arranjo de peptídeos derivados
da seqüência primária de SmZF1.
65
Figura 17: Esquema demonstrando, em verde, a principal região de
SmZF1 possivelmente responsável pela sua interação com o DNA.
67
Figura 18: Experimentos de determinação da localização de SmZF1
em S. mansoni.
68
Figura 19: Ensaio de ligação do soro policlonal “bruto” anti-SmZF1 à
membrana contendo o arranjo de peptídeos derivados da seqüência
primária de SmZF1.
71
Figura 20: Esquema demonstrando, em verde, a região de SmZF1
onde a ligação do anticorpo anti-SmZF1 é mais intensa.
73
Figura 21: Ensaio de imuno blot realizado para testar a capacidade do
peptídeo sintetizado em ser reconhecido pelo anticorpo anti-SmZF1.
74
Figura 22: Perfil cromatográfico parcial da coluna de imunoafinidade
com o peptídeo sintético C7.
76
Figura 23: Ensaio de ligação do anticorpo purificado ao arranjo de
peptídeos derivados de SmZF1.
77
Figura 24: Western blot utilizando o soro purificado e as proteínas
MBP e MBP-SmZF1 purificadas.
78
Figura 25: Gráfico gerado durante a purificação por HPLC de uma
alíquota do segundo peptídeo sintetizado.
80
Figura 26: Espectro de massas contidas na fração 38, originada de
cromatografia de fase reversa em HPLC.
82
Figura 27: Espectro de massas contidas na fração 39, originada de 83
10
cromatografia de fase reversa em HPLC.
Figura 28: Ensaio de imuno blot realizado para testar a capacidade do
segundo peptídeo sintetizado em ser reconhecido pelo anticorpo anti-
SmZF1.
84
11
Abreviaturas
Bio 16 – dUTP - desoxiuracila 5’ trifosfato biotinilada
BSA – soro albumina bovina
CBS – tampão salina-citrato
DMF – dimetil formamida
DIPC – diisopropilcarbodiimida
EDT – etanoditiol
EDTA – ácido etilenodiaminotetracético
EMSA – ensaios de mudança de mobilidade eletroforética
Fmoc – fluorenil metil oxicarbonila
HOBt – hidroxibenzotriazol
HPLC – cromatografia líquida de alta performance
IgG – Imunoglobulina G
MBP – proteína que se liga à maltose
MTT – 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide
NBT/BCIP – nitrobluetatrazol/5-bromo-4-cloro-3-indol fosfato
ORF – janela aberta de leitura
PBS – tampão salina-fosfato
PCR – reação em cadeia da polimerase
PMSF – fenilmetilsulfonilfluoreto
SAABs – Sítios de ligação selecionados e amplificados
SDS – dodecil sulfato de sódio
SSC – tampão salina citrato de sódio
TAE – tampão tris-acetato-EDTA
TBE – tampão tris-borato-EDTA
12
TBS – tampão salina-tris
TES – trietilsilane
TF – fator de transcrição
TFA – ácido trifluoro acético
UTR – região não traduzida
YFP – proteína fluorescente amarela
ZFP – proteína contendo dedo de zinco
ZnF – dedo de zinco
13
Resumo
SmZF1 é uma proteína de Schistosoma mansoni que contém três
motivos dedos de zinco do tipo C
2
H
2
. Proteínas contendo estes motivos são
uma classe de proteínas regulatórias que participam de processos tais como a
transcrição gênica. Durante seu ciclo de vida, S. mansoni está exposto a
diversas condições ambientais e apresenta diferentes morfologias com distintos
padrões de expressão gênica, o que faz com que suas proteínas regulatórias
sejam de extrema importância. Já foi demonstrado que SmZF1 é capaz de se
ligar a moléculas de RNA, mas se liga preferencialmente a oligonucleotídeos
específicos de DNA. Ensaios utilizando um sistema heterólogo de expressão
de SmZF1 recombinante em células COS-7 identificaram sua localização
nuclear. Além disso, estudos envolvendo a transcrição de um gene repórter,
também em células de mamíferos, demonstraram que SmZF1 é capaz de
aumentar a transcrição deste gene. Estes resultados indicam uma possível
função de SmZF1 como um fator de transcrição em S. mansoni, o que faz com
que sua caracterização seja essencial. O presente trabalho visou ampliar o
estudo da proteína e sua ligação ao DNA, bem como identificar sua localização
no próprio parasito, além de obter um anticorpo anti-SmZF1 de boa qualidade.
Um arranjo de peptídeos derivados da seqüência primária de SmZF1 foi
produzido e utilizado na identificação das regiões da proteína preferenciais
para a sua ligação ao DNA. O experimento apontou a α-hélice do terceiro dedo
de zinco da proteína como preferencial para esta interação. Ensaios de
imunolocalização em machos adultos e de Western blot em extratos de vermes
adultos mostraram a localização nuclear de SmZF1 no parasito. Finalmente, o
arranjo de peptídeos de SmZF1 foi utilizado na busca pela região mais
antigênica da proteína e identificou parte do seu segundo dedo de zinco como
preferencial para a ligação do anticorpo. O peptídeo que representa tal região
foi sintetizado e utilizado em um ensaio de purificação de um soro anti-SmZF1.
Experimentos de Western blot, porém, demonstraram que o anticorpo
purificado continua apresentando um reconhecimento inespecífico. O peptídeo
foi então novamente sintetizado e será utilizado em uma nova tentativa de
produção de um anticorpo específico contra SmZF1.
14
Abstract
SmZF1 is a Schistosoma mansoni protein that contains three C
2
H
2
type
zinc fingers. Zinc finger proteins are a class of regulatory proteins that
participate of processes such as gene transcription. During its life cycle, S.
mansoni is exposed to diverse environmental conditions and present different
morphologies with distinct patterns of gene expression, what makes its
regulatory proteins of extreme importance. It was already demonstrated that
SmZF1 can bind RNA molecules, but it specifically binds DNA oligonucleotides.
Heterologous assays with a recombinant SmZF1 protein expressed in COS-7
cells identified its nuclear localization. Beside this, studies involving the
expression of a reporter gene, again in mammalian cells, showed that SmZF1
can activate gene transcription. These results indicate the putative function of
SmZF1 as a S. mansoni transcription factor, what makes its characterization
essential. So, the present work aimed to extend the studies of the protein/DNA
binding properties, as well as to localize the protein in the parasite. Beside this,
this study intended to produce a good quality anti-SmZF1 antibody. Therefore, a
peptide array derived from the SmZF1 primary sequence was constructed and
used to identify the protein regions preferentially responsible for its DNA
binding. The experiment showed the third zinc finger α-helix as the principal
region involved in this interaction. Imunohistochemistry experiments in male
adult worms and western blot assays using extracts of adult worms showed the
localization of the protein in the parasite nucleus. Finally, the peptide array
derived from SmZF1 was used to elucidate the more antigenic region of the
protein and identified a region that involves part of the second protein zinc
finger as the preferential for the antibody binding. The peptide representing this
region was synthesized and used for an anti-SmZF1 serum purification assay.
However, western blot assays demonstrated that the purified serum was still
capable of unspecific recognition. The same peptide was subsequently
synthesized again, and will be used in a new attempt to produce a good anti-
SmZF1 antibody.
15
1 – Introdução
1.1 – A proteína SmZF1
SmZF1 é uma proteína de Schistosoma mansoni cujo cDNA de 705 pb
foi descoberto ao acaso em 2001 por Eleuterio de Souza e colaboradores a
partir da triagem de uma biblioteca de expressão de cDNA de vermes adultos
com um soro anti-tegumento. Através de análises in silico, os autores puderam
deduzir que SmZF1 possui 164 aminoácidos e uma massa molecular teórico de
18,7 kDa. O gene codificador para SmZF1 contém 2182 pb e três introns, com
uma ORF de 492 pb, uma região 5’ UTR de 52 pb e uma região 3’ UTR de 161
pb (Figura 1).
Após pesquisa de homologia em bancos de dados, constatou-se que a
proteína apresenta cerca de 47% de similaridade com outras contendo motivos
protéicos do tipo dedos de zinco. Então, através de modelagem computacional,
por comparação com a proteína murina Zif268, a estrutura tridimensional
teórica de SmZF1 foi predita, com a presença de três motivos do tipo dedos de
zinco da classe C
2
H
2
(Eleuterio de Souza et al., 2001) (Figura 2).
1.2 – Os motivos dedos de zinco
Em 1985, Miller e colaboradores, ao estudarem a estrutura primária do
fator de transcrição TFIIIA de Xenopus laevis, descreveram, pela primeira vez,
o domínio protéico por eles denominado dedos de zinco. Segundo estes
autores, tais domínios são estabilizados por um íon de zinco coordenado
tetraedricamente por dois pares de aminoácidos. Além disso, os autores
verificaram a existência, nestes domínios, de aminoácidos conservados, tais
como aminoácidos hidrofóbicos, responsáveis pela estrutura do domínio, e
outros provavelmente responsáveis pela interação da proteína com o DNA.
Sabe-se hoje que os dedos de zinco são motivos protéicos que possuem
aproximadamente trinta aminoácidos enovelados em duas fitas β anti-paralelas
(formando uma folha β) em sua porção N-terminal e uma α−hélice em sua
16
Figura 1 - Seqüência de nucleotídeos do gene codificador para SmZF1 e estrutura primária
deduzida da proteína SmZF1. Os introns estão representados em letras minúsculas. As regiões
de formação dos dedos de zinco estão em sublinhado duplo. As cisteínas e histidinas
responsáveis pela coordenação dos átomos de zinco estão em negrito. Fonte: Eleuterio de
Souza et al., 2001.
17
Figura 2 - Estrutura tridimensional predita da proteína SmZF1. A estrutura obtida
(SWISSMODEL - modelada a partir da estrutura cristalizada da proteína dedos de zinco murina
Zif268 – número de acesso no PDB 1ZAA) mostra os três motivos dedos de zinco de SmZF1 e
foi manualmente alterada (inserção de 27 aminoácidos que foram deletados automaticamente
pelo programa - em verde). Fonte: Calzavara-Silva, 2001.
18
porção C-terminal (Parraga, et al., 1988). Sua estrutura secundária é
estabilizada por um íon zinco ligado a resíduos de cisteínas e/ou histidinas que
são bastante conservados nesses motivos. Tais motivos são comumente
encontrados em proteínas ligantes de DNA, formando uma classe de proteínas
regulatórias que pode participar de diversas atividades tais como o
desenvolvimento e a diferenciação celular, através da regulação da expressão
gênica. As diferentes disposições dos resíduos coordenadores de zinco nas
folhas β e α− hélices dão origem a diversos tipos de dedos de zinco, tais como
C
2
HC, C
2
H
2,
e C
2
C
2
.
Destes, o mais comumente encontrado é o tipo C
2
H
2
(Figura 3), que possui uma seqüência de aminoácidos consenso descrita como
CX
2-4
CX
12
HX
2-6
H, mostrando os intervalos entre os resíduos ligantes de zinco,
sendo X qualquer aminoácido. Por sua vez, as proteínas contendo motivos
dedos de zinco do tipo C
2
H
2
podem ser classificadas em três grupos principais:
dedos C
2
H
2
múltiplos e adjacentes, triplos e separados ou pareados (revisão
em Iuchi, 2001).
Desde a descoberta dos motivos dedos de zinco, é crescente o número
de proteínas contendo tais motivos identificadas nos diversos organismos.
Segundo Luscombe e colaboradores (2000) as proteínas contendo dedos de
zinco constituem o maior grupo de fatores de transcrição em eucariotos.
Recentemente, Andreini e colaboradores (2006a) propuseram, através de
ferramentas de bioinformática, que 10% do proteoma humano é composto por
proteínas potencialmente ligantes de zinco. Destas, aproximadamente 40%
podem ser classificadas como proteínas contendo dedos de zinco, grande
parte delas exercendo a função de fatores de transcrição. Segundo os mesmos
autores (Andreini et al., 2006b), estes percentuais podem ser estendidos para
os eucariotos de uma maneira geral. Tal abundância pode ser explicada pelo
fato de cada proteína constituir um arranjo de dedos independentes
(classificados por Klug, em 1999, como “blocos” para a construção de grandes
proteínas) que, diferencialmente combinados, podem reconhecer uma grande
variedade de seqüências de DNA (Mackay & Crossley, 1998). Além disso, tais
motivos possuem estruturas bastante estáveis, características de motivos
contendo íons metálicos (Luscombe et al., 2000).
19
Figura 3: Esquema representativo de um dedo de zinco do tipo C
2
H
2.
Fonte:
http://lecture.ecc.u-tokyo.ac.jp/~ashugo/database/lec1.html
20
Os diversos fatores de transcrição contendo dedos de zinco se ligam ao
DNA não apenas para ativar a expressão de genes, mas também para reprimi-
la, como demonstrado para as proteínas humanas KKLF (kidney-enriched
Krüppel-like factor) por Uchida e colaboradores (2000) e ZNF140 e ZNF91 por
Nishimura e colaboradores (2001). Outro exemplo é a proteína SIP1 (Smad
Interacting Protein 1), uma proteína com dois dedos de zinco cuja expressão
está associada a transições mesenquimais e epiteliais. Sua expressão em
células epiteliais humanas leva a uma clara mudança morfológica do fenótipo
epitelial para um fenótipo mesenquimal. Tal mudança é acompanhada pela
repressão de várias proteínas envolvidas funcionalmente nas junções
celulares, com concomitante diminuição nos níveis de seus mRNAs, o que
indica uma possível repressão da transcrição dos genes codificadores para tais
proteínas pelo fator de transcrição SIP1 (Vandewalle et al., 2005).
Apesar de serem conhecidos como motivos de ligação ao DNA, os
dedos de zinco são também capazes de se ligar a RNA, em processos como
empacotamento, degradação, splicing e estabilização, e a proteínas, em
processos como o enovelamento protéico, a ubiquitinização e a própria
transcrição gênica (revisão em Laity et al., 2001).
O próprio fator IIIA de X. leavis foi inicialmente identificado como uma
proteína responsável pela estabilização de RNAs 5S (Picard & Wegnez, 1979),
e só posteriormente foi caracterizado como o fator de transcrição responsável
pela expressão dos genes codificadores destes RNAs 5S (Pelham & Brown,
1980 e Honda & Roeder, 1980). Nos últimos anos, é crescente o número de
proteínas contendo dedos de zinco identificadas nos diversos organismos que
demonstram atividade de ligação a RNA. Alguns exemplos são a proteína
nuclear HUA 1 de Arabidopsis, tcZFP1 de Trypanosoma cruzi e a proteína
mitocondrial RET1 (RNA-editing terminal uridylyl transferase) de Leishmania.
Em mamíferos, hZFP100 faz parte do processamento do pré-mRNA de
histonas, e a proteína tristetraprolina TTP participa da degradação do α mRNA
codificador para o fator de necrose tumoral. Além disso, existem também
proteínas capazes de se ligar tanto a moléculas de RNA quanto a moléculas de
DNA, tais como o receptor do hormônio da tireóide e a proteína tcPZFP1 de T.
cruzi, uma proteína processadora de pré-mRNA (revisão em Brown, 2005).
21
Exemplos de proteínas dedos de zinco que se ligam a outras proteínas
de uma maneira específica são aquelas da família RING, que formam parte do
complexo E3 ubiquitina ligase e reconhecem enzimas E2 para mediar o
processo de ubiquitinação de proteínas e da família PHD (plant homeodomain),
que parecem se ligar aos nucleossomos (revisão em Matthews & Sunde, 2002
e revisão em Bienz, 2006). Outras proteínas dedos de zinco são capazes de se
ligar tanto a moléculas de DNA quanto a proteínas. A formação de homo ou
heterodímeros entre proteínas dedos de zinco ligantes de DNA pode facilitar a
comunicação entre elementos controladores distantes presentes na molécula
de DNA. Estes diversos complexos de proteínas, com distintas especificidades
de ligação, oferecem papel importante no controle da transcrição. Além disso,
esse modo de organização de proteínas dedos de zinco pode explicar o
controle da transcrição por elas exercido. A proteína se liga ao elemento
controlador do DNA através dos dedos ligantes de ácidos nucléicos, e a
cofatores ou ao complexo de iniciação da transcrição através dos dedos
ligantes de proteínas (Mackay & Crossley,1998).
Adicionalmente, ao contrário do que se pode pensar, as proteínas
contendo dedos de zinco não se encontram confinadas apenas no núcleo
celular. É interessante notar que a maioria das proteínas dedos de zinco
nucleares contém vários dedos enquanto que aquelas citoplasmáticas
possuem um ou dois dedos. Uma possível explicação para este fato é que
repetições de dedos de zinco são geralmente requeridas para ligação de alta
afinidade e especificidade ao DNA enquanto que um único dedo é suficiente
para a interação entre proteínas, que tipicamente apresentam superfícies mais
heterogêneas (Mackay & Crossley, 1998).
Desde a caracterização da primeira proteína contendo dedos de zinco,
grandes esforços têm sido realizados para a elucidação de um código de
reconhecimento do DNA por estas. Sabe-se que o reconhecimento de
seqüências específicas por proteínas ligantes de DNA ocorre na superfície das
fendas do DNA. Este reconhecimento é feito através de interações entre
regiões específicas de cada par de bases no DNA e as cadeias laterais de
aminoácidos nas proteínas. As regiões específicas dos pares de bases que são
capazes de interações são grupos doadores ou receptores para a formação de
22
ligações de hidrogênio com as proteínas, bem como grupos hidrofóbicos
(grupos metil). Há alguns hidrogênios não disponíveis para formação de ligação
de hidrogênio, e estes também podem ser utilizados na especificidade dos
pares de bases (Figura 4). Na fenda maior do DNA, cada par de bases possui
um padrão característico destes grupos, tornando o reconhecimento dos
mesmos um fenômeno específico. Porém, estas regiões não são específicas
quando o reconhecimento é feito através da fenda menor do DNA. Isso porque
os grupos presentes nos pares A-T/T-A e C-G/G-C são iguais nesta região
(Figura 5) (revisão em Branden & Tooze, 1999).
Nesse sentido, diversos estudos envolvendo proteínas dedos de zinco
têm sido realizados, empregando principalmente a cristalização de complexos
proteína-DNA (Pavletich & Pabo, 1991, Elrod-Erickson et al., 1996, Elrod-
Erickson et al., 1998), a seleção de dedos de zinco ligantes de determinadas
seqüências através da varredura de bibliotecas contendo estes domínios
randômicos expostos na superfície de bacteriófagos (Phage display) (Choo &
Klug, 1994; Segal et al., 1999 e Wolfe, 1999) e a seleção de sítios de ligação
através de ensaios como o SAABs (Selected and Amplified Binding sites). Este
último consiste em repetições de etapas seqüenciais de EMSA (ensaios de
mudança de mobilidade eletroforética) e PCR, e é capaz de selecionar, in vitro,
seqüências de oligonucleotídeos preferenciais para a ligação de uma proteína
em estudo (Blackwell & Weintraub, 1990; Swirnoff & Milbrandt, 1995; Nagaoka
et al., 2001 e Drummond, 2004).
Tais estudos, principalmente aqueles envolvendo a cristalização da
proteína Zif268, uma proteína murina contendo três dedos de zinco do tipo
C
2
H
2
, em contato com o DNA, levaram à elucidação de alguns princípios sobre
a interação e a especificidade de ligação dos dedos de zinco com o DNA. Tais
princípios foram amplamente utilizados na tentativa de elucidar um código de
reconhecimento do DNA pelos motivos dedos de zinco. Muitos deles, porém,
são hoje questionados, dada a complexidade encontrada em tais interações
(Wolfe et al., 2001).
Acredita-se, classicamente, que cada dedo de zinco se liga de maneira
antiparalela a um sítio de três bases no sulco maior do DNA (Iuchi, 2001), e
23
Figura 4: Grupos responsáveis pelos padrões característicos de cada par de bases nas fendas
maior e menor do DNA. Os grupos estão indicados: em azul, potenciais doadores para ligação
de hidrogênio; em vermelho, potenciais receptores para ligação de hidrogênio; em amarelo,
grupos metil hidrofóbicos, e em branco, hidrogênios não disponíveis para formação de ligação
de hidrogênio. Fonte: modificada de Branden & Tooze, 1999.
fenda maior
fenda menor
fenda menor
fenda maior
fenda maior fenda maior
fenda menor
fenda menor
24
Figura 5: Padrão característico de cada par de bases nas fendas maior e menor do DNA,
responsáveis pelas interações específicas entre estes e as cadeias laterais dos aminoácidos
nas proteínas. Pode-se notar a especificidade de reconhecimento dos pares de bases através
da fenda maior do DNA e sua inespecificidade através da fenda menor. Fonte: modificada de
Branden & Tooze, 1999.
Figura 5: Padrão característico de cada par de bases nas fendas maior e menor do DNA,
responsáveis pelas interações específicas entre estes e as cadeias laterais dos aminoácidos
nas proteínas. Pode-se notar a especificidade de reconhecimento dos pares de bases através
da fenda maior do DNA e sua inespecificidade através da fenda menor. Fonte: modificada de
Branden & Tooze, 1999.
fenda maio
r
fenda menor
Legenda:
= receptor para ligação de H
= doador para ligação de H
= átomo de H
= grupo metil
25
que os contatos entre aminoácidos e bases são interações estereoquímicas em
uma proporção 1:1. Estas interações podem ser do tipo pontes de hidrogênio,
interações hidrofóbicas com grupos metil no DNA ou interações com as
ligações de fosfato no DNA (Choo & Klug, 1997). Além disso, é sabido que os
aminoácidos responsáveis pela ligação ao DNA estão presentes nas α−hélices
e loops dos dedos, envolvendo principalmente os aminoácidos -1, 2, 3, e 6,
numerados de acordo com o início de cada α-hélice. Segundo o padrão de
interação resultante de estudos com a proteína Zif268, costuma-se dizer que o
resíduo na posição -1 interage com a base na posição 3’ do sítio de
reconhecimento do dedo de zinco; aquele na posição 3 freqüentemente contata
a base do meio do sítio de reconhecimento e o resíduo na posição 6 da
α−hélice interage com a base na extremidade 5’. Finalmente, o resíduo 2
algumas vezes é responsável por interações com a base exatamente antes do
início do sítio de reconhecimento na fita complementar do DNA, havendo uma
sobreposição dos sítios de reconhecimento de dois dedos adjacentes (Figura
6) (Pavletich & Pabo, 1991).
Porém, sabe-se hoje que nem sempre é esta a regra. Wolfe e
colaboradores (2001) realizaram estudos com uma proteína Zif268 mutada,
ligante de TATA box, uma região rica em bases A e T, e revelaram algumas
diferenças básicas neste padrão de reconhecimento do DNA. Por exemplo,
uma interação do aminoácido presente na posição 1 da α-hélice com o DNA, já
sugerida como possível por Pavletich & Pabo (1991), foi confirmada, e pode
ocorrer com 2 bases presentes exatamente antes do início do sítio clássico de
ligação dos dedos de zinco. Este reconhecimento é realizado na fita
complementar, formando assim um sítio de ligação de 5 pb, com 2 pb se
sobrepondo entre dedos adjacentes. Também neste estudo, o aminoácido 2 faz
contato com a base complementar àquela reconhecida pelo aminoácido -1, e
pode ou não continuar reconhecendo a base exatamente antes do clássico sítio
de ligação de três pb, também na fita complementar. E o aminoácido na
posição 6 pode algumas vezes contatar duas bases, podendo realizar, além
daquela interação já postulada, uma interação na fita secundária com a base
do meio do sítio clássico. A Figura 7 mostra as diferenças observadas entre o
26
Figura 6: Esquema representativo do padrão clássico de reconhecimento de bases no DNA
pela proteína murina Zif268. Aminoácidos representados: R, arginina; D, ácido aspártico; E,
ácido glutâmico; H, histidina; T, treonina. Fonte: Jamieson et al., 2003
.
27
Figura 7: Comparação entre os padrões de contato com o DNA das formas nativa e mutada da
proteína murina Zif268. Fonte: Wolfe et al., 2001.
28
padrão clássico de reconhecimento de seqüências ricas em GC pela proteína
Zif268 e o padrão da mesma proteína mutada, agora capaz de se ligar ao
TATA box (Wolfe et al., 2001).
Segundo Pabo & Nekludova (2000), era de se esperar que os motivos
dedos de zinco exibissem um código de reconhecimento do DNA. Isso porque
tais motivos (e em especial aqueles dedos do tipo C
2
H
2
) possuem estruturas
semelhantes e características, com relações espaciais sabidamente
conservadas, e, assim, qualquer mudança maior de estrutura poderia levar à
não formação dos contatos com o DNA como esperado. Porém, segundo os
autores, uma única mudança de aminoácido no dedo de zinco, principalmente
na região de contato com o DNA, que teoricamente levaria a uma mudança no
reconhecimento apenas daquela posição, pode levar a uma mudança estrutural
que afeta também o reconhecimento de bases por aminoácidos vizinhos. Isso
faz com que diferenças pequenas na seqüência de aminoácidos dos dedos de
zinco levem a diferenças significativas no reconhecimento de bases por estas
proteínas, dificultando bastante a postulação de um código de reconhecimento
que prediga exatamente qual aminoácido se liga especificamente a
determinada base.
Além disso, alguns autores enfatizam que o reconhecimento de
seqüências no DNA não depende apenas destas interações diretas entre bases
no DNA e resíduos de aminoácidos. Choo & Klug, em 1997, já postulavam que
o reconhecimento de seqüências de DNA depende dos resíduos de
aminoácidos presentes nas posições citadas, mas algumas vezes do contexto
destas no DNA. Outros autores ainda destacam a possibilidade de que os
resíduos presentes entre os dedos de zinco devam exercer papel importante no
reconhecimento do DNA. Sabe-se que a função de tais resíduos é a de
“encapar” a extremidade carboxila da hélice anterior a eles, e descobriu-se que
tal comportamento não é observado em proteínas livres, podendo ser induzido
pela ligação ao DNA e ter uma função de estabilizar o complexo proteína-DNA.
Além disso, resíduos presentes nesta região podem interagir com a ligação de
fosfato no DNA (revisão em Laity et al., 2001 e revisão em Iuchi, 2001). Wolfe e
colaboradores, em 2001, identificaram interações entre as cadeias laterais de
aminoácidos dentro de um mesmo dedo ou entre dedos diferentes,
29
responsáveis por estabilizar as interações destes motivos com o DNA. Paillard
e colaboradores, em 2004, dedicaram atenção especial à deformação
diferencial que cada seqüência específica de DNA adquire quando ligada a
proteínas dedos de zinco. Segundo os autores, esta deformação, juntamente
com as interações diretas entre aminoácidos e bases, é essencial ao
reconhecimento específico de seqüências de DNAs por proteínas contendo
dedos de zinco. Desta maneira, os autores enfatizam a complexidade de
reconhecimento do DNA por proteínas dedos de zinco, colocando mais uma
vez em xeque a possibilidade de existência de um código de reconhecimento.
Segundo Choo & Klug (1997), o que se pode dizer, no máximo, é que o código
de reconhecimento é um código degenerado.
1.3 – A regulação gênica e os fatores de transcrição em eucariotos
Para que os diversos organismos possam se adaptar a todas as
mudanças ambientais pelas quais passam, a expressão de seus genes deve
ser finamente regulada. Tal regulação ocorre em níveis variados, mas em
quase todos os organismos o ponto de controle da expressão gênica mais
importante é o início da transcrição (revisão em Clayton, 2002).
A transcrição dos genes eucarióticos pode ocorrer através das RNA
polimerases I, II ou III, dependendo do tipo de RNA que codificam. Os genes de
classe I, transcritos pela RNA polimerase I, compreendem aqueles que
codificam para RNAs ribossômicos grandes. Os genes de classe II são
codificadores de proteínas e de alguns RNA estruturais pequenos e são
transcritos pela RNA polimerase II. Já os genes de classe III, transcritos pela
RNA polimerase III, codificam outros RNAs estruturais pequenos, bem como
tRNAs e o RNA ribossomal 5S (revisão em Roeder, 2003 e revisão em
Roeder, 2005).
As proteínas de um organismo eucarioto são essenciais ao seu
desenvolvimento e crescimento bem como à sua interação com o ambiente.
Por ser a responsável pela transcrição das dezenas de centenas de genes
codificadores destas proteínas, a RNA polimerase II é uma enzima de grande
importância e é imprescindível que existam mecanismos elaborados que
30
controlem o padrão, no espaço e no tempo, da transcrição de tais genes por
esta enzima (revisão em Griffiths et al., 2002 e revisão em Hochheimer & Tjian,
2003).
O controle da transcrição faz-se através da ação conjunta de proteínas e
elementos de DNA. As proteínas são também denominadas fatores de ação
trans e podem ser categorizadas como fatores de iniciação basais, fatores
regulatórios gene-específicos e fatores co-regulatórios. Os elementos de DNA,
também denominados fatores de ação cis, estão presentes principalmente nas
regiões promotoras dos genes, e podem ser divididos em elementos cis-
regulatórios do promotor principal e elementos cis-regulatórios gene-
específicos. Os fatores de iniciação basais, ou fatores de transcrição basais,
são específicos para cada tipo de RNA polimerase e essenciais para a
transcrição de todos os genes eucarióticos. No caso da RNA polimerase II,
estes fatores são TFIIA, TFIIB, TFIID, TFIIE, TFIIF e TFIIH (Matsui et al., 1980).
Os fatores regulatórios gene-específicos, ou fatores de transcrição seqüência-
específicos atuam em genes alvo, ligando-se à seqüências específicas dos
promotores daqueles genes e facilitando a função das RNA polimerases. Os
elementos cis-regulatórios do promotor principal, ou elementos promotores
basais, são reconhecidos por alguns fatores de iniciação basais. Os elementos
cis-regulatórios gene-específicos podem ser classificados como proximais ou
distais (elementos promotores proximais e distais) e são reconhecidos pelos
fatores de transcrição seqüência-específicos. Os fatores co-regulatórios, ou
cofatores, são proteínas que podem atuar na modificação da cromatina para
que a transcrição ocorra ou na estabilidade do complexo formado pelos fatores
que se ligam ao DNA durante a transcrição (revisão em Roeder, 1996; revisão
em Hochheimer & Tjian, 2003 e revisão em Roeder, 2005).
Os fatores de transcrição, sejam basais ou gene-específicos, ligam-se
ao DNA de uma maneira seqüência-específica, e esta interação é a grande
responsável pela especificidade de controle nos diversos genes eucarióticos
(Kadonaga, 2004). Cada combinação entre uma seqüência de DNA e um fator
de transcrição específico para esta seqüência é chamada módulo de controle.
A essência da regulação gênica em eucariotos é usar diferentes combinações
31
de módulos controladores para regular a expressão específica de cada gene
(revisão em Branden & Tooze, 1999).
A transcrição dos genes codificadores de proteínas acontece com a
formação do complexo de pré-iniciação da transcrição, o que se inicia com a
ligação do fator de iniciação basal TFIID ao elemento promotor basal
denominado TATA box, uma região rica em bases A e T. O fator TFIID é um
complexo multimérico que contém a proteína ligadora de TATA box (TBP,
TATA binding protein) e os fatores associados ao TBP (TAFs, TBP-associated
factors). Logo após, os outros fatores de iniciação basais se ligam ao complexo
em formação, juntamente com a RNA polimerase II (revisão em Roeder, 1996 e
revisão em Nikolov & Burley, 1997). Além do TATA box, outros elementos
promotores basais podem recrutar o complexo TFIID, permitindo a formação do
complexo de iniciação da transcrição, por exemplo o elemento iniciador (INR,
initiator element) e o elemento promotor abaixo (DPE, downstream promoter
element) (revisão em Hampsey, 1998 e revisão em Levine & Tjian, 2003).
Para que a transcrição seja ativada, é necessária a participação de todo
o promotor gênico, incluindo os elementos cis-regulatórios do promotor
principal e os elementos cis-regulatórios gene-específicos proximais e distais.
Os fatores regulatórios gene-específicos regulam a eficiência de ação da RNA
polimerase II através do reconhecimento de suas seqüências alvo nos
elementos promotores proximais e distais e da interação com o complexo de
pré-iniciação da transcrição (esta última podendo ocorrer direta ou
indiretamente, através de cofatores). Desta maneira, para que a transcrição
seja ativada, é necessário que estejam presentes a proteína TBP, as demais
subunidades do fator TFIID, os diversos fatores de transcrição basais, os
fatores de transcrição seqüência específicos (aqui denominados ativadores) e
os cofatores (Figura 8) (revisão em Nikolov & Burley, 1997; revisão em Müller,
2001).
A transcrição pode também ser reprimida, como ocorre no caso de os
fatores de transcrição seqüência-específicos (aqui denominados repressores)
se ligarem aos silenciadores. Esta repressão pode ocorrer através de um fator
que se liga diretamente ao complexo de pré-iniciação e o desestabiliza,
32
reduzindo sua atividade, mas também através da interferência de um fator
negativo na ação de um ativador (Figura 8) (Latchman, 2001).
Os fatores de transcrição basais são essenciais na transcrição de
praticamente todos os genes estruturais transcritos pela RNA polimerase II,
estando assim presentes em todas as células do organismo. Já os fatores de
transcrição seqüência-específicos estão presentes apenas em determinados
tipos de células, ou em células em certas condições fisiológicas ou ambientais.
Assim, é a presença ou ausência destes fatores de transcrição seqüência-
específicos e/ou sua ativação ou inativação que determinam a maioria das
funções de determinada célula (Verrijzer & Tjian, 1996).
1.4 – A esquistossomose e o ciclo de vida de Schistosoma mansoni
A esquistossomose é uma das parasitoses humanas mais comuns,
sendo endêmica em 76 países. A doença constitui um sério problema de saúde
pública, principalmente nos países em desenvolvimento onde é encontrada
(Engels et al., 2002). Estimativas do número de pessoas atualmente expostas
ou infectadas são imprecisas, devido ao fato de que os dados necessários são
raramente coletados de uma maneira padronizada. Entretanto, de acordo com
os dados mais recentes da Organização Mundial da Saúde
(http://www.who.int/tdr/diseases/schisto/files/schisto-poster.pdf), existem cerca
de 600 milhões de pessoas em risco de contaminação em todo o planeta, mais
de 200 milhões de pessoas encontram-se infectadas e cerca de 120 milhões
são pacientes sintomáticos.
A esquistossomose é uma doença helmíntica que afeta seres
humanos e animais domésticos e selvagens em diversos países tropicais e
subtropicais. É causada por trematódeos digenéticos da família
Schistosomatidae, gênero Schistosoma, e as espécies S. mansoni, S.
haematobium, S. intercalatum, S. japonicum e S. mekongi são as causadoras
das principais formas conhecidas da doença em humanos (revisão em Pessoa
& Martins, 2000). As principais formas da doença são a esquistossomose
intestinal e vesical (urinária), sendo a última causada principalmente pelo S.
33
Figura 8: Fatores de transcrição basais e seqüência-específicos (ativadores e repressor)
ligados a elementos de regulação em cis. Os fatores de transcrição basais ligam-se ao
elemento promotor basal, formando o complexo de pré-iniciação da transcrição. Os fatores de
transcrição seqüência-específicos ligam-se aos elementos promotores proximais e distais
(ativadores ou repressores), assim como ao complexo de pré-iniciação, estabilizando ou
desestabilizando o mesmo. Esta ligação pode ser direta ou indireta através de cofatores.
Fonte: modificada de Griffiths et al., 2002
34
haematobium. No Brasil, a espécie responsável pela doença é o S. mansoni,
agente da esquistossomose intestinal, também conhecida localmente como
“xistose” ou “barriga d’água” (revisão em Neves, 2000).
Todos os esquistossomos de interesse médico possuem essencialmente
o mesmo ciclo de vida, que se caracteriza pela presença de alternância de
umafase sexuada no hospedeiro vertebrado, principalmente o homem, e uma
fase assexuada no hospedeiro invertebrado. No Brasil, o principal hospedeiro
intermediário do S. mansoni é o caramujo da espécie Biomphalaria glabrata.
Durante a fase adulta, os parasitos vivem no sistema porta intra-hepático de
seu hospedeiro definitivo. Com a maturação sexual, os vermes adultos migram,
acasalados, para as veias mesentéricas inferiores. O macho possui um canal
ginecóforo longitudinal capaz de abrigar a fêmea durante toda a vida adulta. É
nas veias mesentéricas inferiores que ocorre a postura dos ovos os quais,
depois de maduros, chegam à luz intestinal e são eliminados junto com as
fezes do hospedeiro. Cada fêmea é capaz de colocar cerca de 400 ovos por
dia. Os ovos maduros contêm um miracídio já formado em seu interior, o qual é
liberado assim
que o ovo atinge a água. O miracídio penetra em seu
hospedeiro intermediário, no interior do qual se transforma em esporocisto
primário. Este, por sua vez, sofre algumas modificações e passa a ser
chamado de esporocisto secundário, contendo em seu interior cercárias
desenvolvidas ou em desenvolvimento. Estima-se que um único miracídio
possa originar cerca de 100 a 300 mil cercárias. Estas emergem dos
esporocistos e passam ao meio exterior. Já na água, nadam ativamente até
atingirem o hospedeiro definitivo, onde penetram através da pele ou mucosas.
No interior do hospedeiro definitivo os parasitos são inicialmente denominados
esquistossômulos e migram pelo tecido subcutâneo até penetrarem em um
vaso, quando então são levados até os pulmões e daí para o sistema porta,
onde amadurecem, fechando o ciclo (Figura 9) (revisão em Neves, 2000).
Estima-se que cada par de esquistossomos adultos pode, teoricamente, dar
origem a até 600 bilhões de esquistossomos (revisão em Gryseels et al., 2006).
Em alguns países onde a esquistossomose é endêmica, programas
nacionais de controle foram bem sucedidos e conseguiram reduzir a morbidade
35
Figura 9: Esquema representativo do ciclo de vida do gênero Schistosoma. Fonte:
http://www.cve.saude.sp.gov.br/gif/hidrica/ciclo_esquisto.JPG
36
da doença. Em outros, a parasitose está quase eliminada. Porém, nos países
africanos localizados abaixo do Sahara o controle é praticamente inexistente e
um grande número de pessoas está infectado ou em risco de infecção (Engels
et al., 2002, Savioli et al., 2004).
A primeira tentativa bem sucedida de controle da esquistossomose
ocorreu em meados de 1950, com o surgimento de moluscicidas efetivos, um
deles a niclosamida, hoje ainda em uso. A aplicação de moluscicidas foi
capazde minimizar a transmissão em vários locais, mas o progresso contra a
doença mostrou-se lento. O emprego da droga diminuiu e em muitos locais foi
completamente abandonado por diversas razões, dentre elas o medo por
efeitos adversos ao ambiente (Sturrock, 2001).
O surgimento de drogas contra as diferentes espécies do gênero
Schistosoma, dentre elas o praziquantel no início da década de 80, reavivou a
expectativa de eliminação da doença. Porém, os tratamentos não previnem
contra re-infecções, que invariavelmente ocorrem, principalmente quando a
transmissão não é controlada concomitantemente. Assim, programas de
controle deveriam incluir tanto o tratamento com drogas quanto algum método
de eliminação dos caramujos transmissores. O uso das drogas
quimioterápicas, principalmente a oxamniquina e praziquantel é, hoje, o
principal meio de controle da doença, mas os problemas observados ainda não
foram eliminados (Sturrock, 2001).
Segundo Gryseels e colaboradores (2006), deve ser dada maior
importância à pesquisa relacionada à epidemiologia, biologia e imunologia da
esquistossomose. Os autores enfatizam ainda que a relação entre humanos e
esquistossomos constitui um grande truque da natureza, e que a sua
elucidação pode ser um grande passo no avanço do controle da
esquistossomose.
1.5 – A importância da regulação gênica para o ciclo de vida de
Schistosoma mansoni
Os estudos iniciais do genoma de S. mansoni revelaram a presença de
sete pares de cromossomos autossomos e um par de cromossomos sexuais
37
em seu genoma diplóide. No organismo, o macho caracteriza-se por ser o sexo
homogamético (ZZ), e a fêmea, o heterogamético (ZW) (Short & Grossman,
1981; Short, 1983). Estima-se hoje que o tamanho aproximado do genoma do
parasito seja de 300 Mb, com um número de genes de aproximadamente
17250 (revisão em Wilson et al., 2007).
Segundo El-Ansary & Al-Daihan (2005), os trematódeos digenéticos
desenvolveram diversas adaptações no seu comportamento para que
pudessem completar seus ciclos de vida. O S. mansoni habita três ambientes
distintos: água, hospedeiro intermediário, e hospedeiro definitivo. Determinar
como os esquistossomos interagem com seus diferentes ambientes pode
ajudar no desenvolvimento de vacinas ou drogas quimioterapêuticas
apropriadas. Por exemplo, genes expressos de uma maneira estágio-específica
podem nos ajudar a entender os eventos moleculares que controlam o ciclo de
vida complexo dos esquistossomos, durante o qual são expressas várias
proteínas essenciais para a infecção do hospedeiro intermediário pelos
miracídios, a penetração das cercarias na pele do hospedeiro definitivo e a
evasão das respostas imunes dos dois hospedeiros, dentre outras atividades
biológicas. Verjovski-Almeida e colaboradores (2004) estimaram o número de
tais genes no parasita como sendo de mais de 1000 em cada estágio. Tudo
isso torna a regulação da expressão gênica em S. mansoni um processo de
suma importância, garantindo uma adaptação do parasita às transformações
sofridas por ele (Busek et al., 2002).
Muitos esforços têm sido empregados para a identificação destes genes
estágio-específicos, bem como genes sexo e tecido-específicos. Uma técnica
bastante difundida neste sentido é a técnica de microarranjo, que, segundo
Vermeire et al. (2006), é bastante eficaz na geração de perfis comparativos de
expressão gênica de diferentes grupos de parasitas. Estes autores utilizaram a
técnica para a comparação da expressão de genes dos estágios de miracídio e
esporocisto primário, o que os levou à identificação de vários genes expressos
especificamente em um ou outro estágio, relacionados a diversas atividades
biológicas.
Em 1999, Bickle & Oldridge caracterizaram Sm16, um gene que codifica
para uma glicoproteína de superfície presente apenas nas fases de
38
esporocisto, cercária e no início da fase de esquistossômulo. Devido ao fato de
a proteína perder sua ligação à superfície do parasito na fase de
esquistossômulo, logo após a entrada no hospedeiro definitivo, os autores
propõem um papel de interação com os tecidos do mesmo durante o processo
de penetração.
Knobloch e colaboradores (2002) identificaram um gene tecido-
específico, TK4, que codifica para uma tirosina cinase. Seus transcritos foram
encontrados em todos os estágios de vida do parasito. Nos vermes adultos,
estes transcritos foram encontrados apenas no parênquima, sub-tegumento e
principalmente nos oócitos e espermatócitos, indicando uma possível função da
proteína no desenvolvimento das células germinativas do parasito. Outro gene,
SmCB1 (endopeptidase 1 parecida com catepsina B de S. mansoni), codifica
para uma proteína presente apenas no lúmen e gastroderme do intestino de
vermes adultos. A proteína parece ter importância na alimentação do parasito
no interior do hospedeiro definitivo bem como na sua evasão do sistema imune
do mesmo, já que possui atividades exopeptídicas de degradação de
hemoglobina e outras proteínas do soro do hospedeiro, como IgG (Sajid et al.,
2003).
Exemplos bastante estudados de genes sexo-específicos são aqueles
expressos especificamente na fêmea adulta. Tais genes codificam para
proteínas extremamente importantes na diferenciação das células vitelínicas e
conseqüente produção de ovos. A regulação destes genes, muitas vezes,
ocorre através do pareamento com o macho, podendo ser interrompida quando
os parasitos adultos são separados (LoVerde, 2002). As proteínas p48, p14
(Chen et al., 1992) e p19 (Michel et al., 2003) são exemplos de proteínas cujos
genes são regulados desta maneira.
Esta expressão diferencial de genes codificadores de diversas proteínas
de S. mansoni é controlada por mecanismos moleculares que vão desde o
controle da transcrição gênica até modificações que podem ocorrer pós-
transcricionalmente. Para que possamos entender a regulação de genes do
parasito, é necessário identificar elementos regulatórios de ação cis na região
promotora de genes, bem como fatores de ação trans que controlam estes
39
processos moleculares. Grandes esforços têm sido realizados na elucidação
destes fatores em S. mansoni.
Em 2002, Busek e colaboradores estudaram o papel dos elementos de
ação cis TATA, CCAAT, E e CArG na expressão de dois genes codificadores
para actina. Os autores detectaram a ligação de extratos nucleares proteicos
aos elementos CArG e CCAAT na fase do ciclo de vida onde os genes eram
mais abundantemente expressos (macho adulto). Já na fêmea adulta, onde os
genes eram expressos em menor quantidade, os extratos de proteínas
nucleares se ligaram fracamente ao elemento E, indicando a presença de um
possível repressor. Outro estudo indicou a ligação de extratos proteicos
nucleares de vermes adultos ao elemento CCAAT, presente na região 5’ não
traduzida do gene Sm28GST (glutationa S-transferase de 28 Kda) (Zemzoumi
et al., 1995).
Entre os elementos regulatórios de ação trans mais estudados estão os
receptores nucleares da superfamília de receptores esteróides. Em S. mansoni
foram identificados membros de duas subfamílias desta superfamília: os
receptores retinóides (RXR) e os receptores fushi tarazu fator 1 (FTZ-F1) (de
Mendonça et al., 2000).
Os receptores SmRXR1 e SmRXR2 se ligam a elementos de ação cis
encontrados na região 5’ não traduzida do gene p14 do parasita e ativam a
transcrição in vivo de genes repórteres ligados a tal região. Tais receptores são
constitutivamente expressos no parasito, apresentando, porém, variações
quantitativas de transcritos e uma possível regulação pós-transcricional
(Freebern et al., 1999; de Mendonça et al., 2000 e Fantappie et al., 2001).
O receptor SmFTZ-F1 se liga especificamente a um elemento de ligação
de SF1, uma proteína presente em mamíferos. Além disso, SmFTZ-F1 é capaz
de, em linhagens celulares de mamíferos, ativar a transcrição de genes
repórteres ligados a este elemento. SmFTZ-F1 é expresso constitutivamente no
parasito e, possivelmente, é alvo de regulação pós-transcricional, estando
presente em maior quantidade nos estágios de cercária, esquistossômulo e
adulto. Tal controle indica uma função da proteína em regular processos
40
envolvidos na penetração e adaptação do parasito ao hospedeiro definitivo (de
Mendonça et al., 2002).
Em 2005, Bertin e colaboradores demonstraram uma interação entre os
receptores SmFTZ-F1 e SmRXR1. Segundo os autores, o heterodímero
formado é capaz de potencializar a ativação da transcrição conferida pelo
receptor SmFTZ-F1 ligado a diferentes promotores em um sistema heterólogo
de expressão gênica.
Outro fator de ação trans é a proteína homóloga de GCN5 (gender
control nonrepressed) de Drosophila contendo um domínio HAT (histona acetil
transferase), caracterizada por de Moraes Maciel e colaboradores (2004). Além
de ser capaz de acetilar, in vitro, as histonas H3 e H2A, atuando na
remodelação da cromatina, a proteína contém também um domínio de ligação
a receptores nucleares. Isso indica que a proteína GCN5 de S. mansoni pode
atuar como um cofator na regulação gênica, ligando a acetilação de histonas e
o controle da transcrição gênica. Recentemente, Bertin e colaboradores (2006)
clonaram e caracterizaram a proteína SmCBP1, homóloga da proteína CBP
(CREB binding protein), um coativador transcricional bastante conservado.
SmCBP1 também possui um domínio HAT, e foi capaz de acetilar histonas in
vitro, principalmente histonas H4. Além disso, SmCBP1 se liga, também in
vitro, ao receptor nuclear SmFTZ-F1, e em células de mamíferos co-
transfectadas foi capaz de potencializar a ativação da transcrição de um gene
repórter conferida pelo receptor nuclear sozinho.
Outros fatores de transcrição bem caracterizados em S. mansoni são o
HSF (fator de choque térmico) (Lantner et al., 1998) e o NF-Y, que se ligam ao
elemento CCAAT da região promotora do gene Sm28GST (Zemzoumi et
al.,1996). Nesse sentido foi caracterizado por nosso grupo o gene SmYB1, que
codifica uma proteína homóloga à proteína humana YB-1, um fator de
transcrição que se liga ao elemento Y-box presente em regiões promotoras de
genes eucariotos (Franco et al., 1997). Foi demonstrado que a proteína SmYB1
é capaz de se ligar de maneira específica à seqüência invertida CCAAT (núcleo
do elemento Y-box), presente na região promotora de Sm28GST (Valadão et
al., 2002).
41
Apesar da bibliografia já disponível acerca da regulação da expressão
gênica em S. mansoni, há muito ainda a se estudar, dada a complexidade do
ciclo de vida do parasito e a importância que tal regulação representa para que
seu ciclo possa ser completado.
1.6 – A importância de SmZF1 para o ciclo de vida de Schistosoma
mansoni
Após constatar que a proteína codificada pelo cDNA descoberto ao
acaso na biblioteca de cDNA de vermes adultos de S. mansoni possui três
dedos de zinco do tipo C
2
H
2
, nosso grupo de pesquisa vem se empenhando
em sua caracterização. Isso devido à importância de se estudar uma proteína
potencialmente reguladora da expressão gênica no parasito. Além disso,
nenhuma proteína contendo tais motivos foi descrita e estruturalmente
caracterizada no parasito até hoje, apesar da presença de aproximadamente
5% de cDNAs contendo seqüências codificantes de domínios dedos de zinco
C
2
H
2
no
transcriptoma já seqüenciado de S. mansoni (Verjovski-Almeida et al.,
2003).
Conforme já citado, a proteína SmZF1 é uma proteína que contém 164
aminoácidos com uma massa molecular teórica de 18,7 KDa. Uma análise
detalhada de sua estrutura tridimensional predita (Figura 2) mostrou que um
dos motivos dedos de zinco, o dedo N-terminal, está separado dos outros dois
por 38 aminoácidos, padrão típico de proteínas dedos de zinco ligantes de
outras proteínas (Laity et al., 2001), enquanto que os dois dedos C-terminais
estão mais próximos entre si. Isso caracteriza SmZF1 como uma proteína
estruturalmente capaz de se ligar a outras proteínas (através do dedo N-
terminal) e a ácidos nucléicos (principalmente através dos dedos C-terminais)
(Calzavara-Silva, 2001).
Amplificações de bibliotecas de cDNAs do parasito levaram à detecção
do cDNA de SmZF1 em ovos, cercária, esquistossômulos e verme adulto, o
que indica a expressão do seu mRNA nestes estágios, e aponta para uma
possível função da proteína na regulação de genes dos diversos estágios de
vida do mesmo (Eleutério de Souza et al., 2001).
42
A proteína foi também analisada quanto à sua ligação a moléculas fita
dupla e simples de DNA e RNA e mostrou se ligar de maneira específica a
estas. Porém, a afinidade de ligação ao RNA parece ser mais fraca que ao
DNA. Tais testes não só mostraram a capacidade de ligação de SmZF1 ao
DNA, como indicaram que essa ligação ocorre de maneira específica. Foi
possível ainda definir, in vitro, a melhor seqüência alvo teórica para a ligação
de SmZF1 (CGAGGGAGT, presente no oligonucleotídeo D1-3) (Calzavara-
Silva et al., 2004).
Após a caracterização de SmZF1 como uma proteína dedos de zinco
ligante de DNA, os estudos com essa proteína visaram comprovar a sua função
como um fator de transcrição no parasito.
Desta maneira, recentemente, Calzavara-Silva (2006) demonstrou,
através de ensaios de localização subcelular por microscopia de fluorescência
e de Western blot, que a proteína recombinante YFP-SmZF1 localiza-se
preferencialmente no núcleo de células de mamífero nas quais é expressa
heterologamente. Além disso, foi também demonstrado que extratos destas
células são capazes de se ligar, in vitro, a um oligonucleotídeo concatâmero de
D1-3, que contém 4 repetições da melhor seqüência teórica para a ligação de
SmZF1. Este mesmo oligonucleotídeo foi utilizado como alvo de ligação da
proteína recombinante em ensaios utilizando um sistema heterólogo que
mostraram a capacidade de YFP-SmZF1 em ativar a transcrição de um gene
repórter. Estes resultados vieram demonstrar que SmZF1 é uma proteína
nuclear capaz de ativar a transcrição de genes, indicando desta maneira a
função da proteína como um fator de transcrição do parasito.
Estudos que caracterizem melhor a interação de SmZF1 com o DNA,
tais como a seleção do melhor oligonucleotídeo alvo para sua ligação in vitro e
in vivo e a identificação das regiões da proteína responsáveis por esta
interação, são de suma importância. Desta maneira, foi realizado em 2004 um
trabalho de seleção in vitro destas melhores seqüências, através do ensaio
conhecido como o SAABs (Selected and Amplified Binding sites). Infelizmente,
este trabalho não levou a nenhuma conclusão acerca do melhor
oligonucleotídeo alvo para a ligação da proteína, mas outros estudos neste
sentido serão ainda realizados.
43
2 – Objetivos
2.1 - Objetivo geral
Ampliar os conhecimentos acerca da proteína SmZF1, estudando para
isso sua interação com o DNA e com anticorpos policlonais e pesquisando sua
localização subcelular no parasito.
2.2 – Objetivos específicos
Identificar, utilizando um arranjo de polipeptídeos sobrepostos derivados
da seqüência primária de SmZF1, os principais aminoácidos da proteína
responsáveis pela sua interação com o DNA.
Verificar, através de experimentos de imunolocalização e de ensaios de
Western blot, a localização subcelular de SmZF1 em vermes adultos de
S. mansoni.
Identificar, utilizando um arranjo de polipeptídeos sobrepostos derivados
da seqüência primária de SmZF1, os principais aminoácidos da proteína
responsáveis pela sua interação com um anticorpo policlonal anti-
SmZF1.
Sintetizar o principal polipeptído derivado de SmZF1 responsável pela
sua interação com o anticorpo policlonal anti-SmZF1.
Produzir, a partir do polipeptídeo sintético, anticorpos anti-SmZF1 de
boa qualidade para a realização de experimentos posteriores de
caracterização da proteína.
44
3 – Material e Métodos
3.1 – Arranjo de polipeptídeos derivados de SmZF1
A estrutura primária completa da proteína SmZF1 foi dividida,
sequencialmente, em peptídeos com 15 aminoácidos cada, sobrepostos por 13
deles (Figura 10). Esses peptídeos foram sintetizados diretamente em uma
membrana de celulose, através da técnica de SPOT-Synthesis, conforme
descrito por Frank (1992). A membrana contendo o arranjo (76 spots) foi
preparada pelo Centre de Pharmacologie et Biotechnologie pour la Santé, em
Montpellier, em colaboração com o professor Carlos Delfin Chávez Olortegui,
do Departamento de Bioquímica e Imunologia do ICB, UFMG, segundo o
protocolo descrito por Laune e colaboradores (2002). Neste arranjo, os
resíduos de cisteína foram substituídos por resíduos de serina, para evitar a
formação de pontes dissulfeto na estrutura linear dos peptídeos contidos nos
diversos spots.
3.2 – Ensaios de ligação do oligonucleotídeo D1-3 concatâmero
biotinilado ao arranjo de polipeptídeos derivados de SmZF1
O oligonucleotídeo D1-3 concatâmero foi utilizado em um ensaio de
ligação ao arranjo de peptídeos derivados da seqüência primária de SmZF1.
Este oligonucleotídeo é composto por 4 repetições (em sublinhado) do alvo
teórico preferencial de ligação da proteína SmZF1 ao DNA, o oligonucleotídeo
D1-3, flanqueadas pelas seqüências dos iniciadores PGLD13F e PGLD13R
(em negrito) (5’ –
CAGGAAACAGCTATGACCGGCGAGGGAGTGATCGGCGAGGGAGTGATC
GGCGAGGGAGTGATCGGCGAGGGAGTGTCGTGACTGGGAAAACCCTGG
CG – 3’), e encontra-se clonado no vetor pGL3 basic (Promega) (pGL3-zf-tk-
luc) (Calzavara-Silva, 2006).
A biotinilação do oligonucleotídeo D1-3 foi realizada através de PCR.
Para isso, o vetor pGL3-zf-tk-luc foi submetido a uma reação de PCR utilizando
45
A
B
Figura 10: Arranjo de peptídeos com 15 aminoácidos cada, derivados de SmZF1. A -
Membrana contendo o arranjo composto por 76 spots. B - Seqüências dos peptídeos contidos
em cada um dos spots.
Spot
Seqüência do
peptídeo
Spot
Seqüência do
peptídeo
Spot
Seqüência do
peptídeo
A1
MEFYFTLTKKLSKYT
B3
FSSQSLLHKHFELMH
C5
NSAFSNKVFTKHSNL
A2
FYFTLTKKLSKYTWS
B4
SQSLLHKHFELMHEG
C6
AFSNKVFTKHSNLNT
A3
FTLTKKLSKYTWSVQ
B5
SLLHKHFELMHEGTE
C7
SNKVFTKHSNLNTHI
A4
LTKKLSKYTWSVQTF
B6
LHKHFELMHEGTEID
C8
KVFTKHSNLNTHIKA
A5
KKLSKYTWSVQTFKM
B7
KHFELMHEGTEIDTE
C9
FTKHSNLNTHIKAVH
A6
LSKYTWSVQTFKMNE
B8
FELMHEGTEIDTEQY
C10
KHSNLNTHIKAVHKG
A7
KYTWSVQTFKMNEPT
B9
LMHEGTEIDTEQYDL
C11
SNLNTHIKAVHKGVK
A8
TWSVQTFKMNEPTGV
B10
HEGTEIDTEQYDLSG
C12
LNTHIKAVHKGVKPF
A9
SVQTFKMNEPTGVGP
B11
GTEIDTEQYDLSGFA
C13
THIKAVHKGVKPFES
A10
QTFKMNEPTGVGPTF
B12
EIDTEQYDLSGFAAM
C14
IKAVHKGVKPFESTY
A11
FKMNEPTGVGPTFAD
B13
DTEQYDLSGFAAMGN
C15
AVHKGVKPFESTYSY
A12
MNEPTGVGPTFADAS
B14
EQYDLSGAAMGNEQ
C16
HKGVKPFESTYSYKG
A13
EPTGVGPTFADASDD
B15
YDLSGFAAMGNEQGR
C17
GVKPFESTYSYKGFT
A14
TGVGPTFADASDDGE
B16
LSGFAAMGNEQGRKS
C18
KPFESTYSYKGFTRN
A15
VGPTFADASDDGELI
B1
7
GFAAMGNEQGRKSNG
C19
FESTYSYKGFTRNSD
A16
PTFADASDDGELISI
B18
AAMGNEQGRKSNGEE
C20
STYSYKGFTRNSDLH
A17
FADASDDGELISISS
B19
MGNEQGRKSNGEEDA
C21
YSYKGFTRNSDLHKH
A18
DASDDGELISISSLS
B20
NEQGRKSNGEEDANF
C22
YKGFTRNSDLHKHID
A19
SDDGELISISSLSGK
B21
QGRKSNGEEDANFRV
C23
GFTRNSDLHKHIDAV
A20
DGELISISSLSGKTF
B22
RKSNGEEDANFRVLN
C24
TRNSDLHKHIDAVHK
A21
ELISISSLSGKTFSS
B23
SNGEEDANFRVLNSA
D1
NSDLHKHIDAVHKGL
A22
ISISSLSGKTFSSQS
B24
GEEDANFRVLNSAFS
D2
DLHKHIDAVHKGLKP
A23
ISSLSGKTFSSQSLL
C1
EDANFRVLNSAFSNK
D3
HKHIDAVHKGLKPFR
A24
SLSGKTFSSQSLLHK
C2
ANFRVLNSAFSNKVF
D4
KHIDAVHKGLKPFRM
B1
SGKTFSSQSLLHKHF
C3
FRVLNSAFSNKVFTK
B2
KTFSSQSLLHKHFEL
C4
VLNSAFSNKVFTKHS
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24
A
B
C
D
46
dUTP ligado a uma molécula de biotina (Bio 16-dUTP) e os iniciadores
PGLD13F (5’ – CAGGAGCTCCAGGAAACAGCTATGACC – 3’) e PGLD13R (5’
– CAGAGATCTCGCCAGGGTTTTCCCA – 3’) . Cada reação continha um
volume final de 20 µL, com 0,2 µM dos iniciadores, 200 µM de cada dNTP, 60
µM do Bio16-dUTP, 1 U de Taq DNA polimerase (Phoneutria) em tampão de
reação 1B (50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl pH 8,4, 0,1% Triton X-100, 1,5 mM
MgCl
2
) e 180ng do plasmídeo. Um total de 10 reações nestas condições foi
utilizado para amplificação. Para comparação entre oligonucleotídeos
biotinilados e não biotinilados, foi também realizada uma amplificação do
mesmo sem a presença de Bio 16-dUTP, utilizando as mesmas condições
acima mencionadas. Para cada amplificação (utilizando ou não Bio 16-dUTP)
foi realizado um controle negativo, no qual não foi colocado DNA. As reações
foram realizadas em termocicladores PT-100 (MJ Research) de acordo com o
seguinte programa:
- primeira desnaturação a 94
o
C por 6 min e 35 ciclos de:
• desnaturação a 94
o
C por 1 min;
• anelamento dos iniciadores a 56
o
C por 1 min;
• extensão a 72
o
C por 2 min;
- extensão final a 72
o
C por 8 min
Após a PCR, 3µL dos produtos amplificados foram submetidos a uma
eletroforese em gel de poliacrilamida não-desnaturante 6% em tampão TBE (89
mM Tris borato pH 8,0, 2 mM EDTA). A corrida eletroforética foi efetuada a 120
V por 2 horas. Os fragmentos amplificados foram visualizados por coloração
em nitrato de prata, de acordo com o protocolo descrito por Santos et al.
(1993): o gel foi fixado em temperatura ambiente durante 10 minutos em
solução contendo 10% de etanol absoluto e 0,5% de ácido acético, seguido de
uma incubação de 10 minutos em solução contendo 0,17% de nitrato de prata.
A revelação foi feita em solução contendo 3% de NaOH (p/v) e 0,1% de
formaldeído 37% (p/v) e o gel foi novamente transferido para solução fixadora.
O tamanho dos fragmentos gerados foi analisado por comparação com padrão
de peso molecular de 25 pb (Invitrogen).
47
Os amplicons gerados nas 10 reações de amplificação contendo dUTP
biotinilado foram utilizados na formação de um pool, que teve seu DNA
precipitado. Para isso, foram a ele adicionados acetato de sódio 0,3M e 0,25%
LPA (solução 5% acrilamida). O pool foi agitado vigorosamente em vórtex,
deixado em repouso a 4ºC durante a noite e então centrifugado por 15 minutos
a 13000 rpm, 4ºC e o precipitado resultante foi resuspendido em 500 µL etanol
70%. Essa etapa de centrifugação e ressuspenção foi repetida e, após isso, o
pool foi novamente centrifugado. O tubo contendo o DNA precipitado foi então
deixado aberto à temperatuta ambiente por 2 horas, para que a solução fosse
totalmente seca, e o precipitado foi ressuspendido em 15 µL de H
2
O
deionizada. Finalmente, a ressuspenção foi deixada por 1 hora em banho a
37ºC para completa homogeneização. O amplicon gerado na reação de
amplificação sem dUTP biotinilado passou também pelo mesmo processo de
precipitação de DNA, porém sem a formação prévia do pool.
Após isso, os DNAs ressuspendidos foram dosados em placa contendo
gel de agarose 1% em tampão TAE (40 mM Tris base pH 7,2, 20 mM acetato
de sódio, 1mM EDTA) corado com brometo de etídio. A quantificação do DNA
foi feita por comparação da intensidade dos pontos com padrão de
concentração contendo DNA genômico bacteriano.
Para confirmação da biotinilação do oligonucleotídeo D1-3 concatâmero,
foi realizado um ensaio de dot blot. Para isso, aproximadamente 100 ng dos
oligonucleotídeos D1-3 concatâmero biotinilado e não biotinilado foram ligados
a uma membrana de nylon (GE Healthcare) por meio de um crosslink de
duração de 1 minuto em luz U.V curta (transiluminador Ultra Lum). Após isso, a
membrana foi bloqueada por 1 hora em DNA block (1% (p/v) leite em pó
desnatado dissolvido em NaOH concentrado, 3% (p/v) gelatina de pele de
peixe (Sigma), 20% neutralization buffer (0,5M Tris HCl pH7,5, 2,5M NaCl,
0,05% Tween-20), lavada em SSC 2X (0,3M NaCl, 30mM citrato tri-sódio pH
7,0) por 2 minutos e em complex dilution buffer (27% neutralization buffer, 7%
Tween-20) por 20 minutos. A membrana foi então incubada com um complexo
de estreptavidina conjugada à fosfatase alcalina (1:1000 - GE Healthcare)
diluído em complex dilution buffer, por 1 hora, lavada por 4 vezes de 10
minutos em wash buffer (20% neutralization buffer), e 4 vezes de 10 minutos
48
em stain buffer (0,1M Tris HCl pH 9,1, 0,1M NaCl, 5mM MgCl
2
).
Subsequentemente, a membrana foi revelada em solução de 0,33 µg/µL NBT e
0,165 µg/µL BCIP em stain buffer.
Para a realização do ensaio de ligação do oligonucleotídeo biotinilado
D1-3 concatâmero ao arranjo de polipeptídeos derivados de SmZF1 (Figura
11), a membrana contendo tal arranjo foi preparada utilizando tampão TBS
(NaCl 0,14M, KCl 2 mM, Tris HCl 50mM, pH 7,0) por 3 vezes de 10 minutos
cada. Logo após, a membrana foi bloqueada durante a noite em solução de
bloqueio (tampão TBS contendo 3,35% blocking buffer (Sigma Genosys) e 5%
(p/v) sacarose). A membrana foi então lavada por 10 minutos em tampão TBS
com 0,1% Tween-20 (TBS-T 0,1%) e incubada com 0,19 µg/mL do
oligonucleotídeo D1-3 concatâmero biotinilado diluído em solução de bloqueio
durante a noite. Após a incubação, a membrana foi lavada 3 vezes por 10
minutos cada em tampão TBS-T 0,1% e incubada com o complexo
estreptavidina-fosfatase alcalina (1:1000) diluído em solução de bloqueio por 1
hora. A membrana foi lavada 2 vezes de 10 minutos em tampão TBS-T0,1% e
mais 2 vezes de 10 minutos em tampão CBS (NaCl 0,14M, KCl 2mM, ácido
cítrico monohidratado 10mM, pH 7,0). Então procedeu-se com a revelação,
utilizando para isso uma solução de 0,6% MTT, 0,5% BCIP e MgCl
2
4mM
em
tampão CBS. A membrana foi deixada na solução de revelação até a
observação de spots reativos, em um tempo máximo de 20 minutos. Após a
revelação, a membrana foi lavada brevemente em H
2
O deionizada para
interrupção da reação e então regenerada para utilização em experimentos
posteriores. Para isso, ela foi banhada em DMF (dimetil formamida) por 3
vezes de 10 minutos cada, em seguida lavada em H
2
O deionizada por 3 vezes
de 2 minutos cada e então tratada com reagente A (uréia 8M, SDS 30mM) por
3 vezes de 10 minutos cada e reagente B (50% etanol, 10% ácido acético),
também por 3 vezes de 10 minutos cada. Finalmente, a membrana foi tratada
com metanol por 3 vezes de 10 minutos cada e então seca e guardada a –
20°C. Como controle negativo deste ensaio, foi realizado um experimento no
qual foi utilizado somente o complexo estreptavidina-fosfatase alcalina.
49
Figura 11: Esquema representando o ensaio de ligação do oligonucleotídeo D1-3 concatâmero
marcado com biotina ao arranjo de peptídeos derivados da seqüência primária de SmZF1. O
ensaio foi realizado para detecção das regiões da proteína preferenciais em sua ligação ao
DNA.
+
+
+
Array de peptídeos
Oligonucleotídeo
biotinilado
Estreptavidina –
fosfatase alcalina
Substratos para fosfatase alcalina
Peptídeos selecionados
50
3.3 - Localização subcelular de SmZF1 em vermes adultos de
Schistosoma mansoni
Para a verificação da localização subcelular de SmZF1 no parasito,
foram realizados dois tipos de experimentos: experimentos de
imunolocalização utilizando cortes de machos adultos de S. mansoni, e
experimentos de Western blot, utilizando extratos de vermes adultos.
3.3.1 – Localização subcelular de SmZF1 em machos adultos de
Schistosoma mansoni através de experimentos de imunolocalização
Para a realização dos experimentos de imunohistoquímica foram
utilizadas secções parafinizadas de vermes adultos machos de S. mansoni
fixados com Omnifix (An-Con Genetics Inc. Melville, NY, Usa). Os vermes
utilizados foram gentilmente cedidos pelo Dr. Rodrigo Corrêa Oliveira, do
Laboratório de Imunologia do centro de Pesquisas René Rachou, Fundação
Oswaldo Cruz. Estes experimentos foram realizados em colaboração com os
professores Dr. Gregory Thomaz Kitten do Departamento de Morfologia e Dr.
Sérgio Costa Oliveira do Departamento de Bioquímica e Imunologia do ICB,
UFMG, com o auxílio das alunas Elisandra Gava e Fernanda Caldas Cardoso.
Estas secções foram desparafinizadas em séries de xilol, lavadas 3
vezes com PBS e incubadas por 1 hora em solução de bloqueio (PBS contendo
0,05% Tween-20, e 10% BSA). As amostras foram então incubadas por 1 hora
com um anticorpo anti-SmZF1 produzido em coelho e tratado para retirada de
anticorpos anti-MBP presentes devido à metodologia utilizada em sua produção
(1:20 obtido por Calzavara-Silva, 2001) diluído em solução de bloqueio diluída
10x (para o controle negativo do experimento, apenas a solução de bloqueio foi
utilizada). Após isso, as amostras foram lavadas 4 vezes em PBS (0,13 M
NaCl, 7 mM Na
2
HPO
4
, 3 mM NaH
2
PO
4
) e incubadas com um anticorpo anti-IgG
de coelho conjugado com Cy-5 (1:400 - Jackson Immunoresearch Laboratories,
Inc – USA) diluído em solução de bloqueio diluída 10x contendo faloidina Alexa
Fluor 488 (1:300 - Invitrogen) para marcar os microfilamentos de actina. Em
seguida, as amostras foram lavadas 4 vezes em PBS, incubadas por 10
minutos com iodeto de propídio (1:3000 - Sigma) diluído em solução de
51
bloqueio diluída 10x para visualizar o núcleo das células, lavadas mais 4 vezes
com PBS e então montadas com agente anti-descorante (Prolong gold –
Molecular Probes). A fluorescência foi diretamente observada em um
microscópio confocal Zeiss 510 Meta utilizando lentes objetivas de imersão
com um aumento de 63x. Todos os parâmetros (abertura, ganho e potência do
laser) foram determinados no começo da sessão de imagens e não foram
mudados até o final.
3.3.2 – Localização subcelular de SmZF1 em vermes adultos de
Schistosoma mansoni através de ensaios de Western blot
Para a produção dos extratos total, citoplasmático e nuclear de vermes
adultos de S. mansoni foram utilizados parasitos congelados, gentilmente
cedidos pelo Dr. Alfredo M. Góes, do Departamento de Bioquímica e
Imunologia da Universidade Federal de Minas Gerais. Os extratos foram
produzidos de acordo com Elton & Reeves (1985), com adaptações. Para isso,
os parasitos foram lavados por três vezes em PBS contendo inibidores de
proteases (0,5 µg/ml leupeptina, 170 µg/ml PMSF e 0,7 µg/ml pepstatina). A
suspensão foi então macerada manualmente em banho de gelo a 4 ºC e
submetida a três ciclos de congelamento em nitrogênio líquido e
descongelamento em banho a 37 ºC, produzindo assim o extrato total. Uma
alíquota desse extrato foi centrifugada a 100,000 × g por 1 h, e o sobrenadante
foi filtrado (0,22 µm), produzindo o extrato citoplasmático. O precipitado
contendo os núcleos celulares foi lisado em tampão da amostra contendo 0,5%
de SDS e fervido por 15 minutos para destruição do DNA genômico, dando
origem ao extrato nuclear. As concentrações protéicas dos extratos foram
medidas e normalizadas de acordo com o método de Bradford (1976).
Para a realização dos ensaios de Western blot, 70 µg de cada um dos
extratos do parasito foram submetidos à eletroforese em gel desnaturante 10%
(Sambrook, 1989) e transferidos por 2 horas sob amperagem constante de 20
mA para uma membrana de nitrocelulose (BA85, Schleicher & Schuell)
utilizando um sistema semi seco (GE Healthcare). A membrana foi então
bloqueada durante a noite em PBS-Tween 20 0,5% com 1% (p/v) de leite em
52
pó desnatado, lavada por 3 vezes em PBS, e então incubada por 2 horas com
o anticorpo anti-SmZF1 tratado (conforme descrito no item 3.3.1) (1:500 –
obtido por Calzavara-Silva, 2001). A membrana foi lavada por 3 vezes em PBS
e em seguida incubada por 1 hora com anticorpo anti-IgG de coelho conjugado
com fosfatase alcalina (1:2000 - GE Healthcare). Foi então realizada a
revelação com solução de 0,33 µg/µL NBT e 0,165 µg/µL BCIP em tampão da
fosfatase alcalina (100 mM NaCl, 5 mM MgCl
2
, 100 mM Tris-HCl pH 9,5). A
proteína histona H4, detectada por anticorpos anti-histona H4 de coelho
(1:2000 – Santa Cruz Biotechnologies) foi utilizada para verificar a qualidade
dos extratos do parasito. Como controles negativos do experimento, o
anticorpo secundário anti-IgG de coelho e o soro pré-imune do coelho foram
utilizados nas reações com extratos totais do S. mansoni. Como controle de
reconhecimento da proteína pelo anticorpo anti-SmZF1 foi utilizada a proteína
recombinante SmZF1-MBP, após ter sua porção MBP (proteína que se liga à
maltose) clivada com a enzima Genenase I (New England Biolabs).
3.4 – Produção de um anticorpo anti-SmZF1 de boa qualidade
Para a produção de anticorpos anti-SmZF1 de boa qualidade que
possam ser utilizados em experimentos posteriores de caracterização da
proteína, foram realizados experimentos de identificação e síntese do peptídeo
mais antigênico de SmZF1.
A partir do peptídeo sintetizado, foi realizado um experimento visando
purificar um soro policlonal anti-SmZF1 de qualquer anticorpo que
reconhecesse outros peptídeos que não aquele identificado como o mais
antigênico de SmZF1.
3.4.1 - Identificação da região mais antigênica de SmZF1
Para que a região mais antigênica de SmZF1 pudesse ser identificada, o
anticorpo policlonal anti-SmZF1 obtido em coelho (Calzavara-Silva, 2001) foi
utilizado em ensaios de ligação ao arranjo de peptídeos derivados da
seqüência primária da proteína.
53
Estes ensaios foram realizados da mesma maneira descrita para os
ensaios de ligação do oligonucleotídeo biotinilado D1-3 concatâmero a este
arranjo (item 3.2). O anticorpo anti-SmZF1 foi utilizado nas diluições de 1:500 e
1:250. Após a ligação do anticorpo à membrana, um anticorpo secundário anti-
IgG de coelho conjugado com fosfatase alcalina (1:2000 - Sigma) foi incubado
com a mesma (Figura 12). Como controle negativo deste ensaio foi utilizado
somente o anticorpo secundário anti-IgG de coelho conjugado com fosfatase
alcalina.
Estes experimentos, bem como aqueles descritos anteriormente de
incubação do arranjo com o oligonucleotídeo D1-3 concatâmero, foram
realizados em colaboração com o professor Dr. Carlos Delfin Chávez Olortegui,
do Laboratório de Bioquímica e Imunologia de Parasitos do Departamento de
Bioquímica e Imunologia do ICB, UFMG, inicialmente com o auxílio da aluna
Christina Monerat Toledo Machado.
3.4.2 - Síntese do peptídeo mais antigênico de SmZF1
O peptídeo mais antigênico de SmZF1, identificado pelos ensaios de
ligação do anticorpo anti-SmZF1 ao arranjo de peptídeos derivados da
proteína, foi sintetizado utilizando em fase sólida. A síntese foi realizada em
colaboração com o professor Dr. Carlos Delfin Chávez Olortegui no Laboratório
de Bioquímica e Imunologia de Parasitos do Departamento de Bioquímica e
Imunologia do ICB, UFMG, com o auxílio dos alunos Ricardo Andrez Machado
de Ávila e Clara Guerra.
A seqüência do peptídeo foi acrescida dos aminoácidos Cys – Tyr – Gly
em sua região amino terminal. A cisteína foi acrescentada para que o peptídeo
pudesse ser imobilizado em uma coluna Thiopropyl Sepharose 6B, necessário
à realização do experimento descrito abaixo. A tirosina foi acrescentada para
que o peptídeo pudesse ser quantificado em um comprimento de onda de 280
nm. A glicina foi acrescentada como espaçador.
Para a síntese, é necessária uma resina à qual os aminoácidos são
acoplados um de cada vez. Os aminoácidos utilizados, bem como a resina,
54
Array de peptídeos
Peptídeos
selecionados
+
+
Anticorpo anti
-
SmZF1
Substratos para fosfatase
alcalina
Anticorpo anti
-
IgG de
coelho conjugado
com fosfatase alcalina
Figura 12: Esquema representando o ensaio de ligação do anticorpo anti-SmZF1 ao
arranjo de peptídeos derivado da seqüência primária de SmZF1. O ensaio foi realizado para
detecção das regiões lineares mais reativas da proteína com o anticorpo.
55
possuem seu grupamento amino protegido pelo grupamento Fmoc (fluorenil
metil oxicarbonila), que pode ser removido através do uso de piperidina. As
cadeias laterais dos aminoácidos, caso sejam reativas, são também protegidas.
O grupamento protetor varia de acordo com a cadeia lateral do aminoácido,
mas deve ser um grupo apto a ser clivado pelo ácido trifluoro acético (TFA). O
grupamento Fmoc de cada aminoácido deve ser retirado após seu
acoplamento ao peptídeo (etapa de desproteção). Desta forma, a síntese
consiste em adicionar aminoácidos protegidos ao peptídeo em expansão
formando ligações peptídicas (etapa de acoplamento) e desprotegê-los logo
após (etapa de desproteção). É importante notar que os aminoácidos devem
ser acoplados obedecendo a uma ordem inversa àquela presente na seqüência
original. Isso significa que a síntese deve ser iniciada pelo aminoácido C-
terminal. Após a síntese, as cadeias laterais dos aminoácidos são também
desprotegidas e o peptídeo é finalmente clivado da resina (Figura 13).
Antes do início da síntese, o teste do azul de bromofenol (1%) foi
realizado em todo o DMF a ser utilizado, para a verificação da presença de
aminas na solução. Para o início da síntese, a resina (73 mg), em um tubo de
síntese, foi lavada em DMF por 1 hora sob agitação e então desprotegida de
seu grupamento Fmoc, tendo sido para isso mantida sob agitação por 30
minutos em solução contendo 25% piperidina diluída em DMF. A resina foi
então lavada por 2 vezes em DMF, 2 vezes em metanol e mais 1 vez em DMF,
seca em bomba de vácuo e então submetida ao teste de Kaiser.
O teste de Kaiser (ou teste da ninhidrina) é realizado para verificar se o
desbloqueio do grupamento amina (no caso, da resina) foi bem sucedido. Para
a realização do teste, são necessárias três soluções: solução 1, ninhidrina 5%
em etanol cromatográfico; solução 2, fenol 80% em etanol cromatográfico,
solução 3, KCN 0,001M em piridina. O teste é realizado em alguns grãos de
resina, que são retirados do tubo de síntese e aos quais são acrescentadas 1
gota da solução 1, 2 gotas da solução 2 e 1 gota da solução 3. A reação é
então deixada em aquecedor por 3 minutos a 110ºC. A análise da cor da
reação e dos grãos de resina indica a ausência (coloração laranja-amarelada)
ou presença (coloração azulada) de grupamentos amina. Neste caso, a
coloração azulada indica uma desproteção bem sucedida.
56
Figura 13: Esquema representativo da síntese de peptídeos em fase sólida.
resina
Grupo F-moc
Desproteção
(piperidina)
resina
desprotegida
Aminoácido C-terminal ligado à
resina
O
Ligação
peptídica
O
NH
2
Aminoácido
desprotegido
+
O
OH
Próximo
aminoácido
acoplamento
O
Ligação
peptídica
O
Aminoácido
C-terminal
O
OH
Grupo F-moc
Grupo protetor
da cadeia lateral
acoplamento
Clivagem
(TFA)
O
OH
NH
2
Desproteção
(piperidina)
peptídeo
x
x
x
Várias etapas de
acoplamento
+
NH
2
Aminoácidos
acoplados
x
57
Após a desproteção da resina, deu-se início ao acoplamento dos
aminoácidos, que se iniciou com a ligação do aminoácido C-terminal do
peptídeo à resina. Para isso, o aminoácido foi diluído em DMF para uma
concentração de 40 mM com um excesso molar de 3x. A ele foram
acrescentados os reagentes de acoplamento HOBt (hidroxibenzotriazol) (40
mM com um excesso molar de 3x) e DIPC (diisopropilcarbodiimida) (40 mM
com um excesso molar de 3x). O aminoácido, juntamente com estes reagentes,
foi então incubado com a resina por 50 minutos sob agitação. Em seguida foi
realizado um segundo ciclo de acoplamento, da mesma maneira que o
primeiro, por mais 50 minutos. A resina foi então lavada por 3 vezes com DMF,
e o teste de Kaiser foi realizado como descrito acima para verificação da
eficiência do acoplamento. Neste caso, a coloração laranja-amarelada indica
um acoplamento bem sucedido. A resina foi então incubada por 20 minutos
com uma solução de anidrido acético 10% diluído em DMF, para acetilação dos
aminoácidos. Procedeu-se então com mais 3 lavagens da resina em DMF, e a
desproteção do grupo amina do aminoácido foi realizada através da incubação
da resina com solução de 25% piperidina em DMF por 15 minutos sob
agitação. Esta incubação foi repetida e em seguida prosseguiu-se com a
lavagem da resina por 2 vezes em DMF, 2 vezes em metanol e mais 1 vez em
DMF. A resina foi seca em bomba de vácuo e submetida ao teste de Kaiser.
Aqui, uma coloração azulada no teste indica uma desproteção bem sucedida.
Este ciclo foi realizado para cada aminoácido subseqüente, sempre
respeitando os resultados obtidos com o teste de Kaiser. Isso significa que as
etapas de acoplamento e de desproteção foram repetidas quantas vezes
necessárias para a confirmação do sucesso da etapa. Algumas vezes, foi
necessário que determinado aminoácido permanecesse na segunda etapa de
acoplamento durante a noite.
Após o acoplamento de todos os aminoácidos, a resina foi lavada com
diclorometano por 4 vezes de 5 minutos cada, sob agitação. Procedeu-se a
clivagem do peptídeo da resina e desproteção das cadeias laterais dos
aminoácidos. Para isso, foi utilizada uma solução contendo 2,5% de EDT
(etanoditiol), 2,5% de TES (trietilsilane) e 2,5% de H
2
O em 5 mL de TFA. A
resina foi incubada com esta solução por 3 horas sob agitação.
58
A solução contendo o peptídeo livre de resina foi coletada, e o peptídeo
foi incubado com éter etílico gelado e deixado a 4ºC durante a noite para que
pudesse ser precipitado. A solução foi então submetida a uma centrifugação a
3000 rpm (Centrífuga Himac CR 21-R20 A2), 4ºC por 30 minutos. O
sobrenadante foi descartado e ao precipitado (contendo o peptídeo) foi
acrescentado éter etílico. A solução foi centrifugada mais uma vez. Esta
lavagem foi repetida por mais 2 vezes e o peptídeo foi ressuspendido em água
deionizada e liofilizado. O peptídeo liofilizado foi novamente ressuspendido em
água deionizada e então quantificado em espectrofotômetro (Shimadzu) em um
comprimento de onda de 280 nm.
Para confirmar se a síntese ocorreu corretamente e se o peptídeo obtido
corresponde ao desejado, foi realizado um experimento de imuno blot para
verificar o reconhecimento do peptídeo pelo anticorpo anti-SmZF1. Este ensaio
foi realizado em aparelho de spot acoplado a uma bomba de vácuo,
possibilitando assim a sucção das soluções após sua utilização. Inicialmente,
200 µg do peptídeo foram adsorvidas em membrana de nitrocelulose (Gelman
Sciences) previamente hidratada em PBS. Para que o peptídeo pudesse se
ligar de maneira efetiva à membrana, esta foi incubada com o mesmo durante
a noite a 37ºC. Após isto, a membrana foi lavada por 3 vezes de 10 minutos em
PBS à temperatura ambiente e bloqueada com PBS – Tween 20 0,3% por 1
hora a 37ºC. A membrana foi então lavada por mais 3 vezes de 10 minutos em
PBS-Tween 20 0,05%, incubada com o anticorpo anti-SmZF1 (1:300) por 1
hora e 30 minutos a 37°C e novamente lavada por 3 vezes de 10 minutos em
PBS-tween 0,05%. A membrana foi incubada com um anticorpo anti-IgG de
coelho conjugado com fosfatase alcalina (1:2000 - Sigma) por 1 hora a 37ºC,
lavada por 2 vezes de 10 minutos em PBS-Tween 20 0,05% e 1 vez de 10
minutos em tampão da fosfatase alcalina. A revelação foi então realizada com
solução de NBT/BCIP em tampão da fosfatase alcalina. Como controle positivo
de reconhecimento do anticorpo, foram utilizadas 100 µg da proteína
recombinante MBP-SmZF1.
O peptídeo foi sintetizado duas vezes. Na segunda vez, uma alíquota de
1 mL do peptídeo foi purificada por HPLC (High Performance Liquid
Chromatography) (ÄKTA explorer 100 – GE Healthcare), utilizando para isso
59
uma coluna C18 Vydac (2x25 cm, sendo o diâmetro das partículas de 12 µm).
As frações foram eluídas em um gradiente linear de 0-100% de acetonitrila em
0,1% de ácido trifluoroacético, com um fluxo de 5mL.min
-1
. O eluato foi
monitorado através da medição de sua absorbância nos comprimentos de onda
de 214 e 280 nm, e as amostras coletadas, correspondentes aos picos de
absorbância, foram analisadas através de espectrometria de massas. Esta
análise foi realizada no Laboratório de Biomoléculas do departamento de
Bioquímica e Imunologia do ICB, UFMG, com o auxílio da bolsista DTI Marcella
Nunes Melo. Para tanto, foi utilizado o aparelho Q-TOF MicroTM (Micromass,
Manchester, UK) equipado com uma fonte de eletrospray ionizante no modo
iônico positivo. A voltagem utilizada do capilar foi de 3.0–3.5 kV e as voltagens
dos cones das amostras foram de 40–60 V. As calibrações do espectrômetro
de massas foram realizadas utilizando iodeto de sódio juntamente com iodeto
de césio, em uma escala de 100-2000Da. As amostras foram introduzidas
utilizando uma seringa com um fluxo de 5–10 ml min
-1
.
Além disso, o peptídeo sintetizado não purificado foi também analisado
quanto ao seu reconhecimento pelo anticorpo anti-SmZF1 através de ensaio de
imuno blot, realizado como descrito anteriormente. O primeiro peptídeo
sintetizado foi utilizado no experimento de purificação do anticorpo anti-SmZF1
descrito no item 3.4.3.
3.4.3 - Purificação do soro anti-SmZF1 para remoção de anticorpos não
específicos contra o peptídeo mais imunogênico de SmZF1
Para a purificação do anticorpo policlonal anti-SmZF1 e conseqüente
remoção de anticorpos não específicos contra o peptídeo mais imunogênico de
SmZF1, foi realizada uma cromatografia de afinidade, utilizando para isso uma
coluna de Thiopropyl Sepharose 6B, à qual o peptídeo foi imobilizado por
ligação covalente através de sua cisteína amino-terminal. A cromatografia foi
realizada em colaboração com o professor Dr. Carlos Delfin Chávez Olortegui,
no Laboratório de Bioquímica e Imunologia de Parasitos do Departamento de
Bioquímica e Imunologia do ICB, UFMG, com o auxílio do aluno Diogo Garcia
Valadares.
60
Para a realização deste experimento, as imunoglobulinas presentes no
soro anti-SmZF1 foram previamente precipitadas. Com esta finalidade, 5 mL de
sulfato de amônio saturado foram gotejados em 5 mL do soro sob agitação. O
soro foi deixado sob agitação durante a noite a 4ºC, e então centrifugado por
30 minutos a 5000 rpm, 4ºC. O precipitado foi coletado e ressuspendido em 5
mL de PBS e então dialisado em PBS diluído 10x durante 9 horas, com troca
de solução realizada de 3 em 3 horas.
Na preparação da resina cromatográfica foi utilizada 1 grama de
Thiopropyl Sepharose 6B. O gel foi inicialmente lavado com 40 mL de PBS pH
7,4 e centrifugado por 5 minutos a 1000 rpm. Essa lavagem foi repetida por
mais 4 vezes e então foram realizadas mais 2 lavagens em tampão acetato de
amônia pH 5,0 (0,1M acetato de amônia, 33% ácido acético, 0,001M EDTA). A
partir daí, procedeu-se com a ligação do peptídeo, e para isso 4 mg do mesmo
foram deixados incubando com a Thiopropyl Sepharose 6B durante a noite sob
agitação a 4ºC. A solução foi então centrifugada por 8 minutos a 3000 rpm e o
sobrenadante foi retirado. Em seguida, a Sepharose contendo o peptídeo
ligado foi lavada por 2 vezes com PBS pH 7,4 e 5 mL do soro anti-SmZF1
precipitado foram a ela adicionados, sendo a incubação deixada durante a
noite sob agitação à temperatura ambiente. Finalmente, a coluna foi montada
em seringa de 5 mL e lavada com PBS pH 7,4. A absorbância da solução
coletada na lavagem foi monitorada em espectrofotômetro (Shimadzu UV-
1203) em um comprimento de onda de 280 nm e a lavagem foi prosseguida até
absorbância zero. Os anticorpos específicos contra o peptídeo imobilizado
foram eluidos da coluna com uma solução de 0,1M glicina pH 2,8 e 0,15M
NaCl. Foram coletadas 20 frações de 1,5 mL, que foram lidas em
espectrofotômetro. A coluna foi então lavada com PBS pH 7,4 e neutralizada
com tampão 1,0 M fosfato de potássio pH 7,4 e 0,05% azida sódica para
armazenamento.
Para verificar a especificidade de ligação do anticorpo purificado ao
peptídeo sintetizado foi realizado um experimento de ligação deste ao array de
peptídeos derivados de SmZF1. O mesmo protocolo utilizado para a ligação do
soro total anti-SmZF1 a este arranjo foi empregado (item 3.4.1), mas o
anticorpo purificado foi utilizado na concentração de 1:100.
61
Após a purificação, a capacidade do anticorpo purificado em reconhecer
as proteínas MBP e MBP-SmZF1 purificadas foi testada em ensaios de
Western blot. O experimento seguiu basicamente o mesmo protocolo descrito
para a localização subcelular de SmZF1 nos extratos de vermes adultos (item
3.3.2). Aqui, aproximadamente 20 µg das proteínas foram utilizadas na
eletroforese em gel desnaturante. Além disso, a transferência para membrana
de nitrocelulose (Gelman Sciences) foi realizada em um aparelho de
eletrotransferência Mini Transblot (BioRad) a 80 V por duas horas a 4
o
C em
tampão de transferência (Tris 25 mM, glicina 192 mM, metanol 20%), de acordo
com Towbin et al. (1979), com algumas modificações. O soro purificado foi
utilizado na concentração de 1:50.
62
4 – Resultados
4.1 – Identificação dos principais aminoácidos de SmZF1 responsáveis
pela sua interação com o DNA
Para a identificação dos aminoácidos de SmZF1 preferencialmente
envolvidos em sua interação com o DNA, foi realizado um ensaio onde o
oligonucleotídeo D1-3 concatâmero biotinilado, contendo o sítio teórico
preferencial para a ligação de SmZF1 no DNA, foi incubado com a membrana
contendo o arranjo de peptídeos derivados da seqüência primária de SmZF1.
A Figura 14 mostra a qualidade das reações de amplificação realizadas
para a marcação do oligonucleotídeo, com a confirmação do tamanho
esperado do amplicon, de aproximadamente 118 pb. Pode-se notar também
bandas espúrias e de seqüência desconhecida de tamanho superior, e em
alguns casos de tamanho inferior, exceto nas canaletas que representam os
controles negativos das reações (BB e NB).
Um experimento de dot blot foi então realizado com o intuito de
confirmar a biotinilação do oligonucleotídeo D1-3 concatâmero. Neste
experimento, foi utilizado o complexo estreptavidina/fosfatase alcalina, capaz
de se ligar às biotinas contidas no oligonucleotídeo. Substratos para a enzima
fosfatase alcalina foram então empregados em uma reação que gera produtos
coloridos, sendo desta forma possível perceber os locais aos quais o complexo
estretptavidina/fosfatase alcalina se ligou, e, portanto onde o oligonucleotídeo
biotinilado está presente. Com a realização do ensaio, foi possível perceber
que apenas o oligonucleotídeo D1-3 concatâmero biotinilado, mas não o
oligonucleotídeo D1-3 concatâmero não biotinilado, pôde ser reconhecido pelo
complexo estreptavidina/fosfatase alcalina, o que confirma o sucesso da
biotinilação do mesmo (Figura 15).
No ensaio de ligação do oligonucleotídeo D1-3 concatâmero biotinilado
ao arranjo de polipeptídeos derivados da seqüência primária de SmZF1 pôde
ser observada uma ligação deste oligonucleotídeo ao spot D2 (Figura 16A),
cuja seqüência de aminoácidos é Asp – Leu – His – Lys – His – Ile – Asp – Ala
– Val – His – Lys – Gly – Leu – Lys – Pro.
63
Figura 14: Amplificações do oligonucleotídeo D1-3 concatâmero visando sua biotinilação. Para
a marcação do oligonucleotídeo D1-3 concatâmero, foram realizadas amplificações do mesmo
em reações contendo dUTPs biotinilados. Como controle da biotinilação, foi também realizada
uma amplificação em reação onde os dUTPs biotinilados não estão presentes. PM indica a
canaleta contendo o padrão de peso molecular de 25 pb (Invitrogen), BB indica a canaleta
contendo o controle negativo da reação de amplificação utilizando dUTP biotinilado, B1 a B10
indicam as canaletas contendo as reações 1 a 10 de amplificação utilizando dUTP biotinilado
(D1-3 concatâmero biotinilado), N1 indica a canaleta contendo a amplificação sem a presença
de dUTP biotinilado (D1-3 concatâmero não biotinilado), e NB indica o controle negativo desta
última reação. Gel de acrilamida 6% corado com solução de prata.
PM BB B1 B2 B3 B4 B5 B6 B7 B8 B9 B10 N1 NB
125 pb
64
Figura 15: Experimento de dot blot para confirmação da biotinilação do oligonucleotídeo D1-3
concatâmero. A coloração gerada pela atividade da enzima fosfatase alcalina marca os locais
onde o complexo estrepatavidina/fosfatase alcalina se ligou. Para a realização do ensaio
aproximadamente 100 ng de cada oligonucleotídeo foram adsorvidas em membrana de nylon
(GE Healthcare).
D1-3 concatâmero biotinilado
D1-3 concatâmero não biotinilado
65
A
B
Figura 16: Ensaio de ligação do oligonucleotídeo biotinilado D1-3 concatâmero à membrana
contendo o arranjo de peptídeos derivados da seqüência primária de SmZF1. A – Incubação
com o oligonucleotídeo D1-3 concatâmero biotinilado. Pode-se perceber uma ligação do
oligonucleotídeo ao spot D2 (seta). B – Incubação sem o oligonucleotídeo D1-3 concatâmero
biotinilado. Controle negativo do ensaio de ligação do oligonucleotídeo ao arranjo.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24
B
A
C
D
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24
A
B
C
D
66
A seqüência de aminoácidos acima descrita compreende a região entre
os aminoácidos 147 a 161 da proteína. Desta maneira, a principal região
responsável pela interação de SmZF1 com o oligonucleotídeo D1-3
concatâmero pode ser definida como a α-hélice do dedo 3 da proteína, mais
especificamente a região que compreende os aminoácidos 3 a 13 da α-hélice
contados a partir do início da mesma, e uma pequena região situada na porção
C-terminal da proteína (Figura 17).
No controle negativo deste experimento, onde somente o complexo
estreptavidina-fosfatase alcalina foi incubado com o arranjo de peptídeos, não
foi observada reação de nenhum spot com o complexo (Figura 16B). Isto
comprova que a reação observada no spot D2 quando o oligonucleotídeo D1-3
concatâmero biotinilado é incubado com a membrana é devida exclusivamente
à ligação deste oligonucleotídeo ao peptídeo contido neste spot.
4.2 – Localização da proteína SmZF1 em vermes adultos de Schistosoma
mansoni
Com o objetivo de confirmar os resultados obtidos por Calzavara-Silva
(2006) que indicaram a localização nuclear de SmZF1 em um sistema
heterólogo de expressão da proteína, foram realizados experimentos de
localização de SmZF1 no próprio parasito. Estes experimentos envolveram
ensaios de imunolocalização em cortes de machos adultos e de Western blot
em extratos de vermes adultos, utilizando para isto um anticorpo policlonal anti-
SmZF1 já obtido em coelho e tratado para retirada de anticorpos anti-MBP por
Calzavara-Silva (2001). Através dos ensaios de imunolocalização foi possível
visualizar, por microscopia confocal, a presença da proteína SmZF1 no núcleo
das células de machos adultos de S. mansoni. Como controle negativo do
experimento, foi utilizado um corte de macho adulto com o qual foi incubado
apenas o anticorpo secundário utilizado no experimento de imunolocalização.
Nenhuma marcação da proteína foi observada neste controle (Figura 18A). Nos
experimentos de Western blot a proteína SmZF1 (de peso molecular
aproximado de 19 Kda) foi observada principalmente na fração nuclear dos
67
Figura 17: Esquema demonstrando, em verde, a principal região de SmZF1 possivelmente
responsável pela sua interação com o DNA. Esta região compreende uma porção da α-hélice
componente do terceiro dedo da proteína e uma pequena região da porção C-terminal de
SmZF1. Os quatro aminoácidos C-terminais que fazem parte desta última região, juntamente
com outros três não contidos no spot selecionado, foram automaticamente deletados pelo
programa na modelagem da proteína, e, portanto não estão aqui representados. A figura foi
gerada através de modelagem computacional utilizando o programa SWISS-MODEL e
modificada utilizando o programa RasMol. Em azul estão representadas as α-hélices, e em
vermelho, as fitas-β não identificadas como preferenciais na ligação de SmZF1 ao DNA.
Dedo 1
Dedo 3
Dedo 2
N
C
68
Figura 18: Experimentos de determinação da localização de SmZF1 em S. mansoni. A – O
ensaio de imunolocalização revelou, através de microscopia confocal (Zeiss 510 META, 63x), a
localização nuclear da proteína nas células de cortes de machos adultos de S. mansoni. Os
microfilamentos de actina, representando o citoesqueleto, estão corados em verde. Em azul,
estão marcados os núcleos das células e em vermelho, a proteína SmZF1. A sobreposição das
cores azul e vermelho produz uma coloração rosa. Os quadrados mostram, em um zoom, a co-
localização dos núcleos celulares e da proteína SmZF1 nas células. Á direita, o controle
negativo do experimento, mostrando os filamentos de actina corados em verde e nenhuma
coloração vermelha indicativa do reconhecimento da proteína SmZF1 pelo anticorpo
secundário. B – O ensaio de Western blot confirmou a localização nuclear da proteína SmZF1
endógena. A histona H4, exclusivamente nuclear, foi utilizada como controle da qualidade dos
extratos produzidos. Como controles negativos, foram utilizados o soro pré-imune e o anticorpo
secundário sozinho. A proteína recombinante SmZF1-MBP, clivada pela Genenase I de sua
porção MBP, foi utilizada como controle de reconhecimento do anticorpo anti-SmZF1. Na
figura, TE, NE e CE indicam extratos total, nuclear e citoplasmático respectivamente.
B
63x
63x
A
69
extratos de vermes adultos do parasito, confirmando mais uma vez a
localização nuclear de SmZF1 (Figura 18B). Como controle da qualidade dos
extratos, a proteína histona H4, exclusivamente nuclear, foi testada com um
anticorpo anti-histona H4, e foi detectada apenas na porção nuclear dos
extratos, validando desta maneira o fracionamento dos mesmos. Ainda, a
capacidade de reconhecimento de SmZF1 pelo anticorpo anti-SmZF1 foi
comprovada através da detecção da proteína recombinante purificada MBP-
SmZF1, clivada de sua porção MBP após tratamento com a protease
Genenase I. Pode-se observar, neste controle positivo, o reconhecimento pelo
anticorpo anti-SmZF1 de uma segunda banda de tamanho menor à esperada
para SmZF1. Isso pode ser explicado por uma digestão inespecífica da
proteína SmZF1 pela enzima Genenase 1, produzindo desta forma um
fragmento da proteína de tamanho um pouco menor que aquele esperado para
a proteína inteira. Além disso, pode também ser observado que o tamanho da
banda reconhecida pelo anticorpo anti-SmZF1 é um pouco menor no controle
positivo que aquela reconhecida nos extratos. Isso por que, nos extratos, a
proteína está fosforilada, fazendo com que sua migração seja retardada, o que
não ocorre quando esta é expressa heterologamente em bactérias, como foi o
caso da proteína purificada uitilizada no controle do experimento. Como
controles negativos deste experimento, foram utilizados o soro pré-imune do
coelho imunizado na produção do anticorpo e o anticorpo secundário sozinho.
Desta maneira, foi possível confirmar, através das duas técnicas, que a
proteína SmZF1 endógena está presente principalmente no núcleo das células
dos vermes adultos do parasito, indicando mais uma vez sua possível função
como um fator de transcrição em S.mansoni.
4.3 – Produção de um anticorpo anti-SmZF1 de boa qualidade
Um anticorpo capaz de reconhecer a proteína SmZF1 foi anteriormente
produzido em coelho por Calzavara-Silva. Para isso, foi utilizada a proteína
recombinante SmZF1-MBP purificada e digerida com a enzima Genenase I
para retirada da sua porção MBP. O anticorpo produzido reconhece muito bem
70
a proteína recombinante SmZF1-MBP, mas reage também quando incubado
com a proteína MBP sozinha. Este fato pode ser explicado por uma digestão
não muito eficiente com a enzima Genenase I, gerando assim uma imunização
com pequenas quantidades residuais de MBP. Além disso, a proteína MBP é
uma proteína altamente imunogênica, fato já observado por diversos
pesquisadores em nosso laboratório.
Nos experimentos iniciais de localização da proteína SmZF1 em S.
mansoni, este soro “bruto” foi utilizado. O soro, porém, gerou diversas reações
cruzadas, mostrando-se ineficiente (dados não mostrados). Desta maneira,
para a realização dos experimentos descritos, foi utilizado um soro anti-SmZF1,
também produzido por Calzavara-Silva, a partir deste primeiro, mas livre de
anticorpos anti-MBP. Porém, para experimentos futuros de caracterização da
proteína, tais como sua localização nos demais estágios do ciclo de vida de S.
mansoni, é necessário produzir, em grandes quantidades, um soro de boa
qualidade como este. Para isso, foram realizados experimentos de identificação
da região mais antigênica de SmZF1 e síntese do peptídeo que representa tal
região para, a partir daí, realizar uma tentativa de purificação do soro.
4.3.1 – Localização das principais regiões da proteína SmZF1 capazes de
reconhecer anticorpos presentes no soro policlonal anti-SmZF1
Para a identificação da região mais antigênica de SmZF1, foram
realizados ensaios de ligação do soro anti-SmZF1 “bruto” à membrana
contendo um arranjo de polipeptídeos derivados da seqüência primária da
proteína. Nestes ensaios, o soro foi utilizado nas diluições de 1:250 e 1:500 e
foi capaz de reconhecer diversos spots representativos de alguns peptídeos
derivados da proteína. O reconhecimento mais intenso, nas duas
concentrações do anticorpo utilizadas, ocorreu no spot C7 (Figura 19), cuja
seqüência de aminoácidos é Ser – Asn – Lys – Val – Phe – Thr – Lys – His –
Ser – Asn – Leu – Asn – Thr – His – Ile, representando os aminoácidos 109 a
123 da proteína. Assim, a região à qual o anticorpo anti-SmZF1 se liga com
maior afinidade, candidata a ser a mais antigênica da proteína SmZF1, parece
ser aquela que compreende a segunda fita β e parte da α−hélice (aminoácidos
71
Figura 19: Ensaio de ligação do soro policlonal “bruto” anti-SmZF1 à membrana contendo o
arranjo de peptídeos derivados da seqüência primária de SmZF1. A - O anticorpo foi utilizado
em uma diluição de 1:250. B – O anticorpo foi utilizado em uma diluição de 1:500. Pode-se
observar que o anticorpo anti-SmZF1 foi capaz de se ligar a diversos spots, com uma maior
reatividade àquele presente na posição C7 (seta).
B
A
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24
A
B
C
D
A
B
1 2
3 4 5 6 7 8
9
10
11 12 13 14 15
16 17
1
8 19
20
21 2 2 23
24
C
D
72
1 a 7, contados a partir do primeiro aminoácido da mesma) do segundo dedo
de zinco da proteína (Figura 20).
No controle negativo deste experimento, somente o anticorpo secundário
foi incubado com o arranjo de peptídeos e não foi observada reação de
nenhum spot (dados não mostrados). Isto comprova que a reação observada
no spot C7 e, mais fracamente, nos outros spots, quando o anticorpo anti-
SmZF1 é incubado com a membrana, é devida exclusivamente à ligação do
anticorpo aos peptídeos contidos nestes spots.
4.3.2 – Síntese do peptídeo representante da região mais imunogênica de
SmZF1
O peptídeo reconhecido pelo anticorpo anti-SmZF1 nos ensaios de
ligação deste com a membrana contendo o arranjo de peptídeos derivados de
SmZF1, nomeado peptídeo C7, foi considerado o mais antigênico da proteína e
foi sintetizado em fase sólida. Conforme já descrito, à região N-terminal deste
peptídeo foram adicionados os aminoácidos Cys – Tyr – Gly. Deste modo, o
peptídeo sintetizado, contendo 18 aminoácidos, possui a seqüência Cys – Tyr –
Gly – Ser – Asn – Lys – Val – Phe – Thr – Lys – His – Ser – Asn – Leu – Asn –
Thr – His – Ile e uma massa molecular teórica de 2063,3 Da.
Após sua síntese, o peptídeo foi analisado quanto à sua capacidade em
ser reconhecido pelo anticorpo anti-SmZF1 através de um ensaio de imuno
blot. O ensaio confirmou este reconhecimento (Figura 21), demonstrando desta
maneira que o peptídeo sintetizado provavelmente contém a seqüência
daquele peptídeo contido no spot
C7 do arranjo de peptídeos derivados da
seqüência primária de SmZF1, o qual foi reconhecido pelo anticorpo policlonal
anti-SmZF1 no ensaio de ligação deste anticorpo ao arranjo, e pode, desta
forma, estar envolvido na interação que o anticorpo realiza com a proteína
SmZF1.
4.3.3 – Purificação do soro “bruto” anti-SmZF1
Após a síntese do peptídeo mais antigênico da proteína SmZF1, foi
73
Figura 20: Esquema demonstrando, em verde, a região de SmZF1 onde a ligação do anticorpo
anti-SmZF1 é mais intensa. Pode-se perceber que esta região compreende a segunda fita-β e
parte da α-hélice do segundo dedo de zinco da proteína. A figura foi gerada através de
modelagem computacional utilizando o programa SWISS-MODEL e modificada utilizando o
programa RasMol. Em azul estão representadas as α-hélices, e em vermelho, as fitas-β não
identificadas como preferenciais na ligação do anticorpo anti-SmZF1 à proteína.
Dedo 1
Dedo 3
Dedo 2
N
C
74
Figura 21: Ensaio de imuno blot realizado para testar a capacidade do peptídeo sintetizado em
ser reconhecido pelo anticorpo anti-SmZF1. A figura mostra uma membrana de nitrocelulose
contendo dois spots nos quais a proteína MBP-SmZF1 e o peptídeo sintetizado foram
imobilizados. A membrana foi incubada com o anticorpo anti-SmZF1 e revelada com solução
de NBT/BCIP.
MBP
-
SmZF1
peptídeo
75
realizado um experimento no qual o soro “bruto” anti-SmZF1 produzido por
Calzavara-Silva (2001) foi purificado através de uma cromatografia por
imunoafinidade na tentativa de eliminar qualquer anticorpo que não fosse
específico ao peptídeo. As frações cromatográficas foram lidas em
espectrofotômetro em comprimento de onda de 280 nm (Figura 22). Pode-se
perceber que a alíquota de número 2 apresenta o pico máximo de absorbância,
indicando que o anticorpo purificado, eluído com êxito, pode estar contido nesta
amostra.
Com o objetivo de verificar a capacidade do anticorpo purificado em
reconhecer o peptídeo sintético C7, este anticorpo foi incubado com o arranjo
de peptídeos. Conforme esperado, apesar de fracamente, o anticorpo
purificado foi capaz de interagir apenas com o peptídeo contido no spot C7
(Figura 23), demonstrando que o soro purificado é capaz de se ligar ao
peptídeo utilizado em sua purificação.
Após a purificação do anticorpo, foi então realizado um ensaio de
Western blot para verificar sua reatividade contra as proteínas MBP e MBP-
SmZF1 purificadas. A massa molecular esperada para a proteína de fusão
MBP-SmZF1 é de ~62 kDa (MBP 42,7 kDa + SmZF1 ~18,7 kDa), enquanto a
massa molecular para MBP é de ~51 kDa, pois no sistema de expressão
utilizado, o gene malE, que codifica para a proteína MBP, é contínuo ao gene
lacZ, que codifica o fragmento N-terminal da enzima β-galactosidase de ~8,8
kDa. Assim, a proteína MBP é expressa em fusão com uma porção da β-
galactosidase, tornando-se um pouco maior que quando expressa em fusão
com uma proteína de interesse. Pode-se observar, pela Figura 24, que o
anticorpo purificado continua apto a reconhecer a proteína recombinante MBP-
SmZF1, demonstrando a presença anticorpos responsáveis pelo
reconhecimento de SmZF1 no mesmo. Porém, foi também observado que a
fração de imunoglobulinas teoricamente específicas para o peptídeo C7
continua também reconhecendo a proteína MBP sozinha. Isso demonstra que a
eliminação do soro de anticorpos não específicos não foi tão eficaz como o
esperado. Também pode ser observado o reconhecimento de diversas outras
proteínas pelo anticorpo. Isso pode ser devido a uma provável degradação da
76
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
nº da fração
A
280nm
Figura 22: Perfil cromatográfico parcial da coluna de imunoafinidade com o peptídeo sintético
C7. Amostra: soro “bruto” anti-SmZF1. Estão representadas apenas as frações eluídas em pH
ácido, contendo os anticorpos específicos para o peptídeo (1,5 mL/fração).
77
Figura 23: Ensaio de ligação do anticorpo purificado ao arranjo de peptídeos derivados de
SmZF1. O anticorpo purificado é capaz de se ligar, apesar de fracamente, principalmente ao
spot C7 (seta), que contém o peptídeo sintetizado utilizado em sua purificação.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24
A
B
1 2
3 4 5 6 7 8
9
10
11 12 1 3 14 15
16 17
1
8 19
20
21 22 23
24
C
D
78
Figura 24: Western blot utilizando o soro purificado e as proteínas MBP e MBP-SmZF1
purificadas. A figura mostra uma membrana de nitrocelulose contendo as proteínas MBP
(canaleta 1) e MBP-SmZF1 (canaleta 2) após incubação com o anticorpo purificado em uma
diluição de 1:50.
62 kDa
51 kDa
1 2
79
proteína (para as bandas presentes abaixo da banda esperada). Além disso, o
grande tamanho da banda referente ao reconhecimento da proteína MBP deve-
se possivelmente ao uso de um excesso de proteína para a realização deste
experimento.
4.3.4 – Nova síntese do peptídeo mais imunogênico de SmZF1
O fato de o soro “bruto” anti-SmZF1 não ter sido purificado da maneira
esperada, levou à adoção de outra técnica para a produção de um bom
anticorpo anti-SmZF1, que consiste em imunizar camundongos utilizando o
peptídeo mais antigênico de SmZF1 sintetizado e posteriormente ligado à
proteína ovalbumina.
Com este objetivo, o peptídeo contido no spot C7 do arranjo de
peptídeos derivados de SmZF1 foi novamente sintetizado, nas mesmas
condições já descritas para a primeira síntese. Durante os experimentos de
síntese, porém, o acoplamento de quatro aminoácidos (a serina N-terminal do
peptídeo e os três aminoácidos - Cys – Tyr – Gly - acrescentados a esta região
no primeiro peptídeo) não foi possível, devido à falhas ocorridas no processo.
Assim, este segundo peptídeo sintético, contendo agora 14 aminoácidos,
possui a seqüência Asn – Lys – Val – Phe – Thr – Lys – His – Ser – Asn – Leu
– Asn – Thr – His – Ile e uma massa molecular teórica de 1652,8 Da.
Após a síntese, uma alíquota de 1 mL deste novo peptídeo foi purificada
por HPLC (High Performance Liquid Chromatography). As absorbâncias das
eluições obtidas na cromatografia foram medidas nos comprimentos de onda
de 214 e 280 nm (Figura 25) e as frações eluidas de número 37 a 42 e 55 e 56,
correspondentes a picos nestas absorbâncias, foram então selecionadas para
serem analisadas por espectrometria de massas, para que a presença do
peptídeo sintetizado pudesse ser confirmada. Neste experimento, as moléculas
contidas na amostra são ionizadas pela adição de átomos de hidrogênio
carregados positivamente (H
+
), e suas massas são dadas em uma proporção
m/z, massa/carga, somadas de um dalton para cada hidrogênio que possuem.
Desta maneira, a espectrometria de massas aqui realizada identificou, nas
80
Figura 25: Gráfico gerado durante a purificação por HPLC de uma alíquota do segundo
peptídeo sintetizado. Para a realização da cromatografia uma coluna C18 Vydac foi utilizada, e
as frações foram eluídas em um gradiente linear de 0-100% de acetonitrila em 0,1% de ácido
trifluoroacético
.
Pode-se visualizar diversos picos de absorbâncias das amostras eluidas
durante a cromatografia, medidas nos comprimentos de onda de 214 e 280 nm. As frações 37
a 42 e 55 e 56, cujos picos de absorbância estão indicados pelas setas, foram selecionadas
para análise individual em espectrômetro de massas.
81
frações de número 38 e 39 eluídas durante a cromatografia, massas
aproximadas (1692,9 Da) àquela esperada (1652,8 Da), estimada para o
peptídeo sintetizado (Figuras 26 e 27), o que demonstra que o peptídeo foi
corretamente sintetizado. Essa massa pode ser observada em diversos picos
para cada fração, de acordo com o número de prótons
as moléculas adquiriram
durante o processo. Assim, o pico denominado A foi ionizado apenas uma vez,
possui apenas um H
+
, e portanto uma massa de 1693,9. O pico A2 foi ionizado
duas vezes, possui dois H
+
e uma razão m/z de 847,4 Da, dando origem a uma
massa de 1694,8, e assim por diante.
Mais uma vez com o intuito de comprovar a qualidade do peptídeo
sintetizado, foi realizado um experimento de imuno blot nas mesmas condições
do ensaio realizado com o primeiro peptídeo, utilizando para isto o soro “bruto”
anti-SmZF1 (Figura 28). Como controle positivo do reconhecimento do
anticorpo foi utilizada a proteína recombinante MBP-SmZF1 purificada. Como
controle negativo deste reconhecimento, um spot ao qual não foi ligado
nenhuma proteína ou peptídeo foi utilizado no experimento. O ensaio foi capaz
de demonstrar que o segundo peptídeo sintetizado pode ser reconhecido pelo
anticorpo policlonal anti-SmZF1, comprovando mais uma vez a eficácia da
síntese. Desta forma, este novo peptídeo sintético será utilizado para posterior
imunização de camundongos, em outra tentativa de produção de um anticorpo
anti-SmZF1 de boa qualidade, sem o reconhecimento inespecífico da proteína
MBP, que possa ser utilizado em experimentos futuros de caracterização de
SmZF1.
82
Figura 26: Espectro de massas contidas na fração 38, originada de cromatografia de fase
reversa em HPLC. Os compostos presentes na amostra estão identificados pela sua razão m/z,
massa/carga. Uma massa de 1692,9 Da, aproximada àquela estimada para o peptídeo
sintetizado (1652,8 Da) pode ser derivada das razões m/z presentes nos picos denominados A,
A2 e A3 (setas).
83
Figura 27: Espectro de massas contidas na fração 39, originada de cromatografia de fase
reversa em HPLC. Os compostos presentes na amostra estão identificados pela sua razão m/z,
massa/carga. Uma massa de 1692,9 Da, aproximada àquela estimada para o peptídeo
sintetizado (1652,8 Da) pode derivada das razões m/z presentes nos picos denominados A2 e
A3 (setas).
84
Figura 28: Ensaio de imuno blot realizado para testar a capacidade do segundo peptídeo
sintetizado em ser reconhecido pelo anticorpo anti-SmZF1. A figura mostra uma membrana de
nitrocelulose contendo dois slots nos quais a proteínas MBP-SmZF1 e o peptídeo sintetizado
de SmZF1 foram imobilizados. Além disso, como controle negativo deste reconhecimento,
apenas PBS foi utilizado no primeiro slot. A membrana foi incubada com o soro anti-SmZF1 e
revelada com solução de NBT/BCIP.
PBS peptídeo MBP-SmZF1
85
5 - Discussão
O S. mansoni possui um ciclo de vida bastante complexo, alternado
entre formas livres, que vivem na água, e formas parasitas, que podem viver no
interior de dois hospedeiros, vertebrado ou invertebrado. Cada estágio do seu
ciclo de vida envolve diversas transformações, tanto morfológicas quanto
fisiológicas, necessárias para a apropriada adaptação do parasito a estes
diferentes ambientes.
A identificação de proteínas estágio-específicas no parasito pode ser
uma boa estratégia para o desenvolvimento de novos agentes quimioterápicos
contra a esquistossomose. Isso por que tais proteínas são essenciais para os
processos envolvidos no sucesso do ciclo de vida do parasito, tais como a
infecção do hospedeiro intermediário pelos miracídios, a penetração das
cercárias na pele do hospedeiro definitivo e a evasão da resposta imune deste
hospedeiro, garantindo desta forma uma adaptação do parasito às
transformações por ele sofridas (Busek et al., 2002 e El-Ansary & Al-Daihan,
2005).
Tão importante quanto identificar as proteínas estágio-específicas em S.
mansoni, é estudar os mecanismos moleculares envolvidos no controle da
expressão destas proteínas (Ram et al., 2004). Desta maneira, faz-se essencial
a pesquisa envolvendo a caracterização de fatores de transcrição no parasito,
proteínas potencialmente controladoras da expressão dos genes específicos
em um ou outro estágio.
Atualmente, cerca de 70 publicações direta ou indiretamente descrevem
ou identificam fatores de transcrição em S. mansoni
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?CMD=search&DB=pubmed) e
menos ainda caracterizam de forma satisfatória essa classe de proteínas no
parasito, o que torna ainda mais importante o seu estudo.
SmZF1 é uma proteína de S. mansoni contendo três motivos dedos de
zinco do tipo C
2
H
2
. É sabido que os motivos dedos de zinco são comumente
encontrados em proteínas ligantes de DNA (Iuchi, 2001), constituindo o maior
grupo de fatores de transcrição em eucariotos (Luscombe et al., 2000). Estudos
86
anteriores caracterizaram SmZF1 como uma proteína ligante de DNA capaz de
ativar a transcrição gênica em um sistema heterólogo. Além disso, evidências
também obtidas através de um sistema heterólogo demonstraram a localização
nuclear da proteína. Tais observações apontam fortemente para uma possível
função de SmZF1 como um fator de transcrição de S. mansoni.
Assim, torna-se de extrema importância uma ampla caracterização da
proteína, envolvendo, por exemplo, o estudo de sua interação com o DNA (o
que abrange a pesquisa por regiões da proteína preferenciais para esta ligação
e por sítios no DNA preferenciais para esta ligação in vivo), a pesquisa por
genes por ela controlados, a busca por outras proteínas que possam com ela
interagir, a sua localização no próprio parasito e os efeitos de sua deleção ou
inativação no mesmo.
Desta maneira, o presente estudo visou, em primeiro lugar, a
identificação das regiões da proteína SmZF1 preferenciais para a sua interação
com o DNA. Para isso, um oligonucleotídeo contendo quatro repetições do
provável melhor sítio de ligação para SmZF1, denominado D1-3 concatâmero,
foi marcado e incubado com um arranjo de peptídeos derivados da seqüência
primária da proteína, produzido através da técnica de SPOT-synthesis. Ensaios
utilizando este tipo de arranjo vêm sendo realizados com sucesso no
mapeamento de diversas interações, tais como aquelas do tipo proteína-
proteína, proteína-anticorpo, peptídeo-metal e enzima-substrato (revisão em
Reineke et al., 2001). Mas somente Reuter e colaboradores, em 1999,
utilizaram esta técnica para o estudo de interações proteína-DNA e obtiveram
sucesso na elucidação das regiões da endonuclease EcoRII envolvidas no
reconhecimento de um oligonucleotídeo alvo para sua ligação.
Assim, a técnica foi adaptada no presente estudo para identificar as
regiões mais importantes de SmZF1 envolvidas em sua interação com o DNA.
Apesar de haver uma sugestão de que a conformação tridimensional dos
dedos de zinco seria extremamente importante na sua ligação ao DNA, e que a
conformação linear dos peptídeos neste arranjo poderia atrapalhar este
reconhecimento, a técnica mostrou-se eficaz, pelo menos na identificação de
uma região essencial para tal ligação. Desta maneira, no ensaio realizado, foi
observada uma interação entre o oligonucleotídeo e o spot D2 do arranjo, que
87
contém aminoácidos derivados do início da α-hélice do terceiro dedo de zinco
da proteína. Sabe-se que as interações realizadas entre proteínas contendo
motivos dedos de zinco e o DNA ocorrem nas α-hélices e loops destes motivos.
Assim, era de se esperar que a interação da proteína SmZF1 com o DNA
ocorresse em regiões formadoras de α-hélices dos dedos de zinco da proteína,
conforme foi observado.
Alguns estudos envolvendo a cristalização de proteínas contendo
motivos dedos de zinco ligadas ao DNA demonstraram que os principais
aminoácidos envolvidos em tal interação são aqueles presentes nas posições -
1, 2, 3 e 6, numeradas de acordo com o início de cada α-hélice (Pavletich &
Pabo, 1991). A região da α-hélice do terceiro dedo de zinco de SmZF1
identificada pelo experimento como principal na interação da proteína com o
oligonucleotídeo D1-3 concatâmero, porém, não englobou os aminoácidos
presentes nas posições -1 e 2 desta estrutura, mas apenas aqueles presentes
nas posições 3 e 6 da mesma. Desta maneira, os aminoácidos 3 e 6 da α-
hélice do terceiro dedo de zinco de SmZF1 parecem ser mais importantes na
interação da proteína com o DNA que aqueles presentes nas posições -1 e 2.
Apesar de não estar perfeitamente de acordo com os dados da literatura, este
fato pode indicar que outros aminoácidos presentes na α-hélice do terceiro
dedo de zinco de SmZF1, que não os classicamente apontados, possuem
grande importância em sua ligação ao DNA ou que o contexto biológico é de
grande influência para a ligação específica da proteína em seu alvo.
Além disso, era também de se esperar que o oligonucleotídeo D1-3
concatâmero se ligasse a mais de um dedo da proteína SmZF1, o que não foi
observado. Isso por que apenas um dedo de zinco pode não ser suficiente para
que esta interação ocorra in vivo, sendo necessários no mínimo dois dedos.
Conforme discutido por Calzavara-Silva e colaboradores (2004), a proteína
SmZF1 possui um padrão típico de proteínas capazes de se ligar tanto a
moléculas de DNA quanto a outras proteínas, devido ao fato de o seu primeiro
dedo de zinco se encontrar separado dos outros dois dedos. Desta maneira,
SmZF1 deveria teoricamente interagir com o DNA através dos dedos 2 e 3, e
com proteínas através do seu dedo 1, conforme já foi observado para outras
proteínas. Porém, experimentos na busca de interações de SmZF1 com outras
88
proteínas ou com ela mesma (formação de homodímeros) já foram realizados,
e nenhuma interação conclusiva foi ainda encontrada. Assim, era esperado que
o oligonucleotídeo D1-3 concatâmero biotinilado se ligasse à proteína pelo
menos através dos dedos 2 e 3. Por outro lado, o oligonucleotídeo D1-3 foi
inicialmente desenhado por Calzavara-Silva (2001) de acordo com o possível
código de reconhecimento entre o DNA e a proteína murina Zif268, sendo que
D1-3 contém bases específicas para sua interação com os dedos 1 e 3 de
SmZF1. Desta maneira, supostamente o oligonucleotídeo D1-3 deveria se ligar
aos dedos 1 e 3, e com menor afinidade ao dedo 2. De fato, estes
experimentos confirmaram que o D1-3 é específico para o dedo 3. Porém, não
podemos descartar a hipótese de que ele também se ligue ao dedo 2 com uma
menor afinidade, sendo provável que o ensaio, na condição utilizada, não tenha
tido sensibilidade suficiente pra detectar esta interação. Adicionalmente,
Calzavara-Silva desenhou um segundo oligonucleotídeo específico para o dedo
2, que foi denominado D2, e em ensaios de EMSA reconheceu SmZF1 com
menor afinidade que D1-3 (Calzavara-Silva et al., 2004). Este oligonucleotídeo
pode então ser futuramente utilizado para comprovar sua especificidade pelo
dedo 2 utilizando a metodologia do arranjo de peptídeos. Além disso, apesar de
o experimento com o arranjo de peptídeos ter se mostrado apto na
identificação da α-hélice do terceiro dedo de zinco de SmZF1, o fato de utilizar
peptídeos derivados de SmZF1 em uma forma linear e não em sua forma
nativa, como ocorre na proteína, conforme já discutido, pode ter alterado a
ligação do oligonucleotídeo com outras regiões da proteína importantes para
esta interação. Desta forma, deve-se chamar a atenção para o fato de que a
região da α-hélice do terceiro dedo de zinco da proteína identificada no ensaio
realizado para a interação de SmZF1 com o DNA, deve ser considerada
apenas como a preferencial, mas não a única responsável por tal interação.
Como um segundo passo na caracterização da proteína SmZF1, foram
realizados experimentos visando identificar sua localização no parasito.
Análises da seqüência primária da proteína já revelaram a ausência de um
sinal de localização nuclear (Calzavara-Silva, 2001). Porém, segundo Israeli e
colaboradores (1997) e Görner e colaboradores (1998), diversas proteínas
contendo motivos do tipo dedos de zinco, tais como a proteína p53, são
89
capazes de se dirigirem ao núcleo por elas mesmas, sem a necessidade de um
sinal de localização nuclear em sua seqüência de aminoácidos. Além disso,
Yamasaki e colaboradores (2005) foram capazes de demonstrar que os
próprios motivos dedos de zinco são suficientes para a localização de
pequenas proteínas dedos de zinco no núcleo das células.
Conforme já citado, Calzavara-Silva (2006) realizou experimentos que
mostraram que SmZF1, quando ectopicamente expressa em células de
mamíferos, localiza-se principalmente no núcleo das mesmas. Como estes
ensaios fizeram uso de um sistema heterólogo de expressão da proteína, em
uma simulação do que realmente ocorre no parasito, faz-se necessário a
condução de novos experimentos que comprovem a localização da proteína
endógena, conforme tem sido amplamente realizado (He et al., 2000 e Schulz
et al., 2005).
Desta maneira, foram realizados experimentos de Western blot em
extratos fracionados de vermes adultos e de imunolocalização em cortes de
machos adultos do parasito, ambos utilizando um anticorpo policlonal anti-
SmZF1. Os dois experimentos confirmaram os resultados já obtidos em células
de mamífero, identificando a proteína SmZF1 no núcleo das células do
parasito.
É importante salientar que estes experimentos de localização da
proteína SmZF1 endógena foram conduzidos, no caso do Western blot, em
extratos de vermes adultos, sem distinção entre macho e fêmea, e no caso da
imunolocalização, apenas em machos adultos. Desta forma, pode-se concluir
apenas que SmZF1 é uma proteína nuclear em machos adultos de S. mansoni,
mas ainda não é possível afirmar que é uma proteína nuclear presente nos
outros estágios de desenvolvimento do parasito ou na fêmea adulta, apesar de
seu cDNA ter sido detectado nos estágios de ovo e cercaria, além de verme
adulto (Eleutério de Souza et al., 2001).
Devido à suposta importância que a proteína SmZF1 representa como
um provável fator de transcrição para o ciclo de vida de S. mansoni, faz-se
necessária sua ampla caracterização. Para a realização de vários dos
experimentos pretendidos por nosso grupo nesta caracterização, é necessária
90
a utilização de um anticorpo anti-SmZF1 de boa qualidade, e em grandes
quantidades. Desta maneira, este trabalho teve como um dos seus objetivos a
produção deste anticorpo, como um passo para os futuros experimentos de
caracterização da proteína.
Para a produção deste anticorpo, primeiramente foram realizados
experimentos visando a determinação do peptídeo mais antigênico da proteína.
Para isso, a membrana contendo o arranjo de peptídeos derivados da
seqüência primária de SmZF1 foi utilizada para a identificação daqueles
peptídeos aos quais o anticorpo policlonal anti-SmZF1 se liga
preferencialmente. Conforme já discutido, tais arranjos têm sido amplamente
empregados na busca de sítios preferenciais para a interação proteína-
anticorpo (Ferreira et al., 2006; Felicori et al.,2006). Estes experimentos são
capazes de identificar epítopos lineares de uma proteína, aqueles formados por
aminoácidos adjacentes, mas não epítopos conformacionais, formados por
aminoácidos distantes na seqüência primária da proteína e justapostos em sua
estrutura tridimensional (Abbas et al., 1997; Reineke et al., 2001).
Desta maneira, os experimentos aqui realizados apontaram uma região
presente no interior do segundo dedo de zinco da proteína SmZF1 como a
principal envolvida na interação entre esta e o anticorpo policlonal anti-SmZF1.
Vale lembrar que esta região pareceu ser apenas a principal, mas não a única
responsável por tal interação.
Uma análise mais detalhada desta região revela características
favoráveis à sua atuação como uma região de alta antigenicidade da proteína
in vivo. Isso por que grande parte desta região está teoricamente envolvida na
ligação da proteína ao DNA (apesar de este dedo não ter sido indicado para
esta interação nos experimentos aqui realizados) e claramente deve consistir
de uma região exposta ao solvente na proteína nativa. Entretanto,
contrariamente ao observado, a análise do peptídeo representante desta região
indica uma grande quantidade de aminoácidos hidrofóbicos, o que não seria
desejado em uma região antigênica, já que os epítopos de uma proteína são
em geral regiões expostas ao meio, o que leva à necessidade de serem
regiões altamente hidrofílicas (Hopp e Woods, 1981).
91
Uma região de SmZF1 que possui características que a fazem candidata
a ser um importante epítopo da proteína é aquela compreendida entre os
dedos 1 e 2 da mesma. Segundo já sugerido, ela possuiria apenas a função de
espaçar o dedo 1 dos demais dedos da proteína, já que estes exerceriam
papéis diferentes na mesma. Esta região parece estar bastante exposta ao
meio, já que possui um grande número de aminoácidos hidrofílicos.
Fortalecendo esta hipótese, pode ser verificado que o spot que a representa
(A5) parece possuir o segundo sinal mais forte observado nos ensaios de
ligação do anticorpo policlonal anti-SmSF1 ao arranjo de peptídeos derivados
da seqüência primária de SmZF1 (Figura 19).
O peptídeo representante da região identificada como a principal na
ligação do anticorpo ao arranjo de peptídeos derivados da seqüência primária
de SmZF1 (contido no spot C7) foi então eleito como o mais antigênico de
SmZF1 e sintetizado para ser usado na purificação do anticorpo anti-SmZF1
obtido por Calzavara-Silva, 2001. De fato, o peptídeo sintetizado foi
reconhecido por este anticorpo, o que comprova a qualidade da sua síntese e
dos experimentos de ligação do anticorpo ao arranjo. Porém, o isolamento a
partir do soro bruto de anticorpos anti peptídeo não ocorreu de maneira
satisfatória, o que pode ser explicado por algumas hipóteses, tais como: uma
ligação não eficiente do peptídeo sintetizado à coluna utilizada na purificação, o
que diminui a quantidade de epítopos reconhecedores dos anticorpos, ou uma
lavagem não suficiente na etapa de eliminação de anticorpos inespecíficos
durante a purificação, dentre outras.
92
6 – Conclusões
O presente trabalho foi eficaz na ampliação dos conhecimentos já
obtidos acerca da proteína SmZF1:
- A interação entre a proteína e o DNA foi melhor caracterizada, no
sentido de que a região da α-hélice do terceiro dedo de zinco da proteína foi
identificada como a principal responsável por esta interação.
- A proteína endógena do parasito foi localizada, através de duas
técnicas diferentes, no núcleo das células de vermes adultos de S. mansoni,
confirmando os resultados já obtidos em células de mamífero e apontando
mais uma vez para a possível função da proteína como um fator de transcrição
no parasito.
- A interação entre SmZF1 e o anticorpo policlonal anti-SmZF1 foi
caracterizada, sendo que a principal região da proteína responsável por esta
ligação localiza-se no segundo dedo de zinco. O peptídeo correspondente a
esta região foi sintetizado e será utilizado para a produção de anticorpos
policlonais específicos para SmZF1.
93
7 – Perspectivas
- Produção de um anticorpo anti-SmZF1 de alta qualidade, utilizando
para isto o peptídeo mais imunogênico da proteína, já sintetizado, em
experimentos de imunização de camundongos.
- Localização de SmZF1 nos demais estágios do ciclo de vida de S.
mansoni, através de ensaios de imunolocalização por microscopia confocal.
- Detecção in vivo dos sítios alvo no DNA preferenciais para a ligação de
SmZF1, através de ensaios de imunoprecipitação de cromatina.
- Determinação de parceiros protéicos para SmZF1 por ensaios de co-
imunoprecipitação e espectrometria de massas ou eletroforese 2D dos imuno-
complexos .
- Caracterização da importância da proteína SmZF1 para o parasito, em
experimentos de inibição de sua expressão através da técnica de RNAi.
94
8 - Referências Bibliográficas
ABBAS, A.K., LICHTMAN, A.H., POBER, J.S. Cellular and Molecular
Immunology. 3ª edição. United States of America: W.B. Saunders Company,
1997.
ANDREINI, C., BANCI, L., BERTINI, I., ROSATO, A. Counting the zinc-proteins
encoded in the human genome. Journal of Proteome Research. 2006, 5 (1):
196-201.
ANDREINI, C., BANCI, L., BERTINI, I., ROSATO, A. Zinc through the three
domains of life. Journal of Proteome Research. 2006, 5 (11): 3173-3178.
BERTIN, B., CABY, S., OGER, F., SASORITH, S., WURTZ, J.M., PIERCE, R.J.
The monomeric orphan nuclear receptor Schistosoma mansoni Ftz-F1
dimerizes specifically and functionally with the schistosome RXR homologue,
SmRXR1. Biochemical and Biophysical Research Communications. 2005,
327 (4): 1072-1082.
BERTIN, B., OGER, F., CORNETTE, J., CABY, S., NOEL, C., CAPRON, M.,
FANTAPPIE, M.R., RUMJANEK, F.D., PIERCE, R.J. Schistosoma mansoni
CBP/p300 has a conserved domain structure and interacts functionally with the
nuclear receptor SmFtz-F1. Molecular and Biochemical Parasitology. 2006,
146 (2): 180-191.
BICKLE, Q.D. & OLDRIDGE, J. Characterization of a stage-specific Mr16000
schistosomular surface glycoprotein antigen of Schistosoma mansoni.
Molecular and Biochemical Parasitology. 1999, 100 (1): 85-94.
95
BIENZ, M. The PHD finger, a nuclear protein-interaction domain. Trends in
Biochemical Sciences. 2006, 31 (1): 35-40.
BLACKWELL, T.K. & WEINTRAUB, H. Differences and similarities in DNA-
binding preferences of MyoD and E2A protein complexes revealed by binding
site selection. Science. 1990, 250 (4984): 1104-1110.
BRADFORD, M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of
microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.
Analytical Biochemistry. 1976, 72: 248-254.
BRANDEN, C. & TOOZE, J. Introduction to Protein Structure. 2ª edição.
Nova York: Garland Publishing, 1999.
BROWN, R.S. Zinc finger proteins: getting a grip on RNA. Current Opinion in
Structural Biology. 2005, 15 (1): 94-98.
BUSEK, S.U., FANTAPPIE, M., MALAQUIAS, L.C., WILSON, R.A., CORREA-
OLIVEIRA, R., OLIVEIRA, G.C. Cis-acting elements, CArG-, E-, CCAAT- and
TATA-boxes may be involved in sexually regulated gene transcription in
Schistosoma mansoni. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz. 2002, 97 (Suppl
1): 85-90.
CALZAVARA-SILVA, C.E. Estudos funcionais moleculares de SmZF1, uma
proteína de Schistosoma mansoni contendo motivos do tipo dedos de
zinco. Dissertação de mestrado 2001, Departamento de Bioquímica e
Imunologia, ICB-UFMG.
CALZAVARA-SILVA, C.E., PROSDOCIMI, F., ABATH, F.G., PENA, S.D.,
FRANCO, G.R. Nucleic acid binding properties of SmZF1, a zinc finger protein
96
of Schistosoma mansoni. International Journal for Parasitology. 2004, 34
(11): 1211-1219.
CALZAVARA-SILVA, C.E. Caracterização funcional da proteína dedos de
zinco SmZF1 de Schistosoma mansoni como um possível fator de
transcrição. Tese de doutorado 2006, Departamento de Bioquímica e
Imunologia, ICB-UFMG.
CHEN, L.L., REKOSH, D.M., LOVERDE, P.T. Schistosoma mansoni p48
eggshell protein gene: characterization, developmentally regulated expression
and comparison to the p14 eggshell protein gene. Molecular and Biochemical
Parasitology. 1992, 52 (1): 39-52.
CHOO, Y. & KLUG, A. Toward a code for the interactions of zinc fingers with
DNA: selection of randomized fingers displayed on phage. Proceedings of the
National Academy of Sciences of the United States of America. 1994, 91
(23): 11163-11167.
CHOO, Y. & KLUG, A. Physical basis of a protein-DNA recognition code.
Current Opinion in Structural Biology. 1997, 7 (1): 117-125.
CLAYTON, C.E. Life without transcriptional control? From fly to man and back
again. The EMBO Journal. 2002, 21 (8): 1881-1888.
DE MENDONÇA, R.L., ESCRIVA, H., BOUTON, D., ZELUS, D., VANACKER,
J.M., BONNELYE, E., CORNETTE, J., PIERCE, R.J., LAUDET, V. Structural
and functional divergence of a nuclear receptor of the RXR family from the
trematode parasite Schistosoma mansoni. European Journal of Biochemistry
/ FEBS. 2000, 267 (11): 3208-3219.
97
DE MENDONÇA, R.L., BOUTON, D., BERTIN, B., ESCRIVA, H., NOEL, C.,
VANACKER, J.M., CORNETTE, J., LAUDET, V., PIERCE, R.J. A functionally
conserved member of the FTZ-F1 nuclear receptor family from Schistosoma
mansoni. European Journal of Biochemistry / FEBS. 2002, 269 (22): 5700-
5711.
DE MORAES MACIEL, R., DE SILVA DUTRA, D.L., RUMJANEK, F.D.,
JULIANO, L., JULIANO, M.A., FANTAPPIE, M.R. Schistosoma mansoni histone
acetyltransferase GCN5: linking histone acetylation to gene activation.
Molecular and Biochemical Parasitology. 2004, 133 (1): 131-135.
DRUMMOND, M.G. Estudos in vitro e in silico das interações seqüência-
específicas entre o possível fator de transcrição de Schistosoma
mansoni, SmZF1, e o DNA. Monografia de Bacharelado 2004, Departamento
de Biologia Geral, ICB-UFMG.
EL-ANSARY, A. & AL-DAIHAN, S. Stage-specifically expressed schistosome
proteins as potential chemotherapeutic targets. Medical Science Monitor:
International Medical Journal of Experimental and Clinical Research. 2005,
11 (3): RA94-103.
ELEUTERIO DE SOUZA, P.R., VALADAO, A.F., CALZAVARA-SILVA, C.E.,
FRANCO, G.R., DE MORAIS, M.A., JR., ABATH, F.G. Cloning and
characterization of SmZF1, a gene encoding a Schistosoma mansoni zinc finger
protein. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz. 2001, 96 (Suppl): 123-130.
ELROD-ERICKSON, M., ROULD, M.A., NEKLUDOVA, L., PABO, C.O. Zif268
protein-DNA complex refined at 1.6 Ä: a model system for understanding zinc
finger-DNA interactions. Structure. 1996, 4 (10): 1171-1180.
98
ELROD-ERICKSON, M., BENSON, T.E., PABO, C.O. High-resolution
structures of variant Zif268-DNA complexes: implications for understanding zinc
finger-DNA recognition. Structure. 1998, 6 (4): 451-464.
ELTON, T.S. & REEVES, R. Microheterogeneity of the mammalian high
mobility group (HMG) proteins 1 and 2 investigated by reverse-phase high
performance liquid chromatography. Analytical Biochemistry. 1985, 144 (2):
403-416.
ENGELS, D., CHITSULO, L., MONTRESOR, A., SAVIOLI, L. The global
epidemiological situation of schistosomiasis and new approaches to control and
research. Acta Tropica. 2002, 82 (2): 139-146.
FANTAPPIE, M.R., FREEBERN, W.J., OSMAN, A., LADUCA, J., NILES, E.G.,
LOVERDE, P.T. Evaluation of Schistosoma mansoni retinoid X receptor
(SmRXR1 and SmRXR2) activity and tissue distribution. Molecular and
Biochemical Parasitology. 2001, 115 (1): 87-99.
FELICORI, L., ARAUJO, S.C., DE AVILA, R.A., SANCHEZ, E.F., GRANIER, C.,
KALAPOTHAKIS, E., CHAVEZ-OLORTEGUI, C. Functional characterization
and epitope analysis of a recombinant dermonecrotic protein from Loxosceles
intermedia spider. Toxicon. 2006, 48 (5): 509-519.
FERREIRA, R.N., MACHADO DE AVILA, R.A., SANCHEZ, E.F., MARIA, W.S.,
MOLINA, F., GRANIER, C., CHAVEZ-OLORTEGUI, C. Antibodies against
synthetic epitopes inhibit the enzymatic activity of mutalysin II, a
metalloproteinase from bushmaster snake venom. Toxicon. 2006, 48 (8): 1098-
1103.
FRANCO, G.R., GARRATT, R.C., TANAKA, M., SIMPSON, A.J., PENA, S.D.
99
Characterization of a Schistosoma mansoni gene encoding a homologue of the
Y-box binding protein. Gene. 1997, 198 (1-2): 5-16.
FRANK, R. Spot-synthesis: an easy technique for the positionally addressable,
parallel chemical synthesis on a membrane support . Tetrahedron. 1992, 48
(42): 9217-9232.
FREEBERN, W.J., OSMAN, A., NILES, E.G., CHRISTEN, L., LOVERDE, P.T.
Identification of a cDNA encoding a retinoid X receptor homologue from
Schistosoma mansoni. Evidence for a role in female-specific gene expression.
The Journal of Biological Chemistry. 1999, 274 (8): 4577-4585.
GÖRNER, W., DURCHSCHLAG, E., MARTINEZ-PASTOR, M.T., ESTRUCH,
F., AMMERER, G., HAMILTON, B., RUIS, H., SCHULLER, C. Nuclear
localization of the C2H2 zinc finger protein Msn2p is regulated by stress and
protein kinase A activity. Genes & Development. 1998, 12 (4): 586-597.
GRIFFITHS, A.J.F., MILLER, J.H., SUZUKI, D.T., LEWONTIN, R.C.,
GELBART, W.M. Introdução à Genética. 7ª edição. Tradução de Paulo
Armando Motta. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2002. Título original: An
Introduction to Genetic Analysis.
GRYSEELS, B., POLMAN, K., CLERINX, J., KESTENS, L. Human
schistosomiasis. Lancet. 2006, 368 (9541): 1106-1118.
HAMPSEY, M. Molecular genetics of the RNA polymerase II general
transcriptional machinery. Microbiology and Molecular Biology Reviews.
1998, 62 (2): 465-503.
HE, W., IKEDA, S., BRONSON, R.T., YAN, G., NISHINA, P.M., NORTH, M.A.,
100
NAGGERT, J.K. GFP-tagged expression and immunohistochemical studies to
determine the subcellular localization of the tubby gene family members. Brain
Research. 2000, 81 (1-2): 109-117.
HOCHHEIMER, A. & TJIAN, R. Diversified transcription initiation complexes
expand promoter selectivity and tissue-specific gene expression. Genes &
Development. 2003, 17 (11): 1309-1320.
HONDA, B.M. & ROEDER, R.G. Association of a 5S gene transcription factor
with 5S RNA and altered levels of the factor during cell differentiation. Cell.
1980, 22 (1): 119-126.
HOPP, T.P. & WOODS, K.R. Prediction of protein antigenic determinants from
amino acid sequences. Proceedings of the National Academy of Sciences
of the United States of America. 1981, 78 (6): 3824-3828.
ISRAELI, D., TESSLER, E., HAUPT, Y., ELKELES, A., WILDER, S., AMSON,
R., TELERMAN, A., OREN, M. A novel p53-inducible gene, PAG608, encodes
a nuclear zinc finger protein whose overexpression promotes apoptosis. The
EMBO Journal. 1997, 16 (14): 4384-4392.
IUCHI, S. Three classes of C2H2 zinc finger proteins. Cellular and Molecular
Life Sciences. 2001, 58 (4): 625-635.
JAMIESON, A.C., MILLER, J.C., PABO, C.O. Drug discovery with engineered
zinc-finger proteins. Nature Reviews. 2003, 2 (5): 361-368.
KADONAGA, J.T. Regulation of RNA polymerase II transcription by sequence-
specific DNA binding factors. Cell. 2004, 116 (2): 247-257.
101
KLUG, A. Zinc finger peptides for the regulation of gene expression. Journal of
Molecular Biology. 1999, 293 (2): 215-218.
KNOBLOCH, J., WINNEN, R., QUACK, M., KUNZ, W., GREVELDING, C.G. A
novel Syk-family tyrosine kinase from Schistosoma mansoni which is
preferentially transcribed in reproductive organs. Gene. 2002, 294 (1-2): 87-97.
LAITY, J.H., LEE, B.M., WRIGHT, P.E. Zinc finger proteins: new insights into
structural and functional diversity. Current Opinion in Structural Biology.
2001, 11 (1): 39-46.
LANTNER, F., ZIV, E., RAM, D., SCHECHTER, I. Different forms of the mRNA
encoding the heat-shock transcription factor are expressed during the life cycle
of the parasitic helminth Schistosoma mansoni. European Journal of
Biochemistry / FEBS. 1998, 253 (2): 390-398.
LATCHMAN, D.S. Transcription factors: bound to activate or repress. Trends in
Biochemical Sciences. 2001, 26 (4): 211-213.
LAUNE, D., MOLINA, F., FERRIERES, G., VILLARD, S., BES, C., RIEUNIER,
F., CHARDES, T., GRANIER, C. Application of the Spot method to the
identification of peptides and amino acids from the antibody paratope that
contribute to antigen binding. Journal of Immunological Methods. 2002, 267
(1): 53-70.
LEVINE, M. & TJIAN, R. Transcription regulation and animal diversity. Nature.
2003, 424 (6945): 147-151.
LOVERDE, P.T. Presidential address. Sex and schistosomes: an interesting
102
biological interplay with control implications. The Journal of Parasitology.
2002, 88 (1): 3-13.
LUSCOMBE, N.M., AUSTIN, S.E., BERMAN, H.M., THORNTON, J.M. An
overview of the structures of protein-DNA complexes. Genome Biology. 2000,
1 (1): 1-37.
MACKAY, J.P. & CROSSLEY, M. Zinc fingers are sticking together. Trends in
Biochemical Sciences. 1998, 23 (1): 1-4.
MATSUI, T., SEGALL, J., WEIL, P.A., ROEDER, R.G. Multiple factors required
for accurate initiation of transcription by purified RNA polymerase II. The
Journal of Biological Chemistry. 1980, 255 (24): 11992-11996.
MATTHEWS, J.M. & SUNDE, M. Zinc fingers - folds for many occasions.
IUBMB Life. 2002, 54 (6): 351-355.
MICHEL, A., KNOBLOCH, J., KUNZ, W. P19: a female and tissue specifically
expressed gene in Schistosoma mansoni, regulated by pairing with the male.
Parasitology. 2003, 127 (Pt 6): 519-524.
MILLER, J., MCLACHLAN, A.D., KLUG, A. Repetitive zinc-binding domains in
the protein transcription factor IIIA from Xenopus oocytes. The EMBO Journal.
1985, 4 (6): 1609-1614.
MÜLLER, C.W. Transcription factors: global and detailed views. Current
Opinion in Structural Biology. 2001, 11 (1): 26-32.
NAGAOKA, M., SHIRAISHI, Y., SUGIURA, Y. Selected base sequence outside
103
the target binding site of zinc finger protein Sp1. Nucleic Acids Research.
2001, 29 (24): 4920-4929.
NEVES, D.P. Parasitologia Humana. 8ª edição. Rio de Janeiro e São Paulo:
Livraria Ateneu, 2000.
NIKOLOV, D.B. & BURLEY, S.K. RNA polymerase II transcription initiation: a
structural view. Proceedings of the National Academy of Sciences of the
United States of America. 1997, 94 (1): 15-22.
NISHIMURA, T., NARITA, T., MIYAZAKI, E., ITO, T., NISHIMOTO, N.,
YOSHIZAKI, K., MARTIAL, J.A., BELLFROID, E.J., VISSING, H., et al.
Characterization of the human Fc gamma RIIB gene promoter: human zinc-
finger proteins (ZNF140 and ZNF91) that bind to different regions function as
transcription repressors. International Immunology. 2001, 13 (8): 1075-1084.
PABO, C.O. & NEKLUDOVA, L. Geometric analysis and comparison of protein-
DNA interfaces: why is there no simple code for recognition? Journal of
Molecular Biology. 2000, 301 (3): 597-624.
PAILLARD, G., DEREMBLE, C., LAVERY, R. Looking into DNA recognition:
zinc finger binding specificity. Nucleic Acids Research. 2004, 32 (22): 6673-
6682.
PARRAGA, G., HORVATH, S.J., EISEN, A., TAYLOR, W.E., HOOD, L.,
YOUNG, E.T., KLEVIT, R.E. Zinc-dependent structure of a single-finger domain
of yeast ADR1. Science. 1988, 241 (4872): 1489-1492.
PAVLETICH, N.P. & PABO, C.O. Zinc finger-DNA recognition: crystal structure
of a Zif268-DNA complex at 2.1 A. Science. 1991, 252 (5007): 809-817.
104
PELHAM, H.R. & BROWN, D.D. A specific transcription factor that can bind
either the 5S RNA gene or 5S RNA. Proceedings of the National Academy of
Sciences of the United States of America. 1980, 77 (7): 4170-4174.
PESSOA, S.B. & MARTINS, A.V. Parasitologia Médica. 11ª edição. Rio de
Janeiro: Guanabara Koogan, 2000.
PICARD, B. & WEGNEZ, M. Isolation of a 7S particle from Xenopus laevis
oocytes: a 5S RNA-protein complex. Proceedings of the National Academy
of Sciences of the United States of America. 1979, 76 (1): 241-245.
RAM, D., ZIV, E., LANTNER, F., LARDANS, V., SCHECHTER, I. Stage-specific
alternative splicing of the heat-shock transcription factor during the life-cycle of
Schistosoma mansoni. Parasitology. 2004, 129 (Pt 5): 587-596.
REINEKE, U., VOLKMER-ENGERT, R., SCHNEIDER-MERGENER, J.
Applications of peptide arrays prepared by the SPOT-technology. Current
Opinion in Biotechnology. 2001, 12 (1): 59-64.
REUTER, M., SCHNEIDER-MERGENER, J., KUPPER, D., MEISEL, A.,
MACKELDANZ, P., KRUGER, D.H., SCHROEDER, C. Regions of
endonuclease EcoRII involved in DNA target recognition identified by
membrane-bound peptide repertoires. The Journal of Biological Chemistry.
1999, 274 (8): 5213-5221.
ROEDER, R.G. The role of general initiation factors in transcription by RNA
polymerase II. Trends in Biochemical Sciences. 1996, 21 (9): 327-335.
105
ROEDER, R.G. Lasker Basic Medical Research Award. The eukaryotic
transcriptional machinery: complexities and mechanisms unforeseen. Nature
Medicine. 2003, 9 (10): 1239-1244.
ROEDER, R.G. Transcriptional regulation and the role of diverse coactivators in
animal cells. FEBS Letters. 2005, 579 (4): 909-915.
SAJID, M., MCKERROW, J.H., HANSELL, E., MATHIEU, M.A., LUCAS, K.D.,
HSIEH, I., GREENBAUM, D., BOGYO, M., SALTER, J.P., et al. Functional
expression and characterization of Schistosoma mansoni cathepsin B and its
trans-activation by an endogenous asparaginyl endopeptidase. Molecular and
Biochemical Parasitology. 2003, 131 (1): 65-75.
SAMBROOK, J., FRITSCH, E.F., MANIATIS, T. Molecular cloning a
laboratory manual. 2ª edição. United States of America: Cold Spring Harbor
Laboratory Press, 1989.
SANTOS, F.R., PENA, S.D., EPPLEN, J.T. Genetic and population study of a
Y-linked tetranucleotide repeat DNA polymorphism with a simple non-isotopic
technique. Human Genetics. 1993, 90 (6): 655-656.
SAVIOLI, L., ALBONICO, M., ENGELS, D., MONTRESOR, A. Progress in the
prevention and control of schistosomiasis and soil-transmitted helminthiasis.
Parasitology International. 2004, 53 (2): 103-113.
SCHULZ, I., ZEITSCHEL, U., RUDOLPH, T., RUIZ-CARRILLO, D., RAHFELD,
J.U., GERHARTZ, B., BIGL, V., DEMUTH, H.U., ROSSNER, S. Subcellular
localization suggests novel functions for prolyl endopeptidase in protein
secretion. Journal of Neurochemistry. 2005, 94 (4): 970-979.
106
SEGAL, D.J., DREIER, B., BEERLI, R.R., BARBAS, C.F., 3RD. Toward
controlling gene expression at will: selection and design of zinc finger domains
recognizing each of the 5'-GNN-3' DNA target sequences. Proceedings of the
National Academy of Sciences of the United States of America. 1999, 96
(6): 2758-2763.
SHORT, R.B. & GROSSMAN, A.I. Conventional giemsa and C-banded
karyotypes of Schistosoma mansoni and S. rodhaini. The Journal of
Parasitology. 1981, 67 (5): 661-671.
SHORT, R.B. Presidential address: Sex and the single schistosome. The
Journal of Parasitology. 1983, 69 (1): 3-22.
STURROCK, R.F. Schistosomiasis epidemiology and control: how did we get
here and where should we go? Memórias do Instituto Oswaldo Cruz. 2001,
96 (Suppl): 17-27.
SWIRNOFF, A.H. & MILBRANDT, J. DNA-binding specificity of NGFI-A and
related zinc finger transcription factors. Molecular and Cellular Biology. 1995,
15 (4): 2275-2287.
TOWBIN, H., STAEHELIN, T., GORDON, J. Electrophoretic transfer of proteins
from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some
applications. Proceedings of the National Academy of Sciences of the
United States of America. 1979, 76 (9): 4350-4354.
UCHIDA, S., TANAKA, Y., ITO, H., SAITOH-OHARA, F., INAZAWA, J.,
YOKOYAMA, K.K., SASAKI, S., MARUMO, F. Transcriptional regulation of the
CLC-K1 promoter by myc-associated zinc finger protein and kidney-enriched
Kruppel-like factor, a novel zinc finger repressor. Molecular and Cellular
107
Biology. 2000, 20 (19): 7319-7331.
VALADÃO, A.F., FANTAPPIE, M.R., LOVERDE, P.T., PENA, S.D.,
RUMJANEK, F.D., FRANCO, G.R. Y-box binding protein from Schistosoma
mansoni: interaction with DNA and RNA. Molecular and Biochemical
Parasitology. 2002, 125 (1-2): 47-57.
VANDEWALLE, C., COMIJN, J., DE CRAENE, B., VERMASSEN, P.,
BRUYNEEL, E., ANDERSEN, H., TULCHINSKY, E., VAN ROY, F., BERX, G.
SIP1/ZEB2 induces EMT by repressing genes of different epithelial cell-cell
junctions. Nucleic Acids Research. 2005, 33 (20): 6566-6578.
VERJOVSKI-ALMEIDA, S., DEMARCO, R., MARTINS, E.A., GUIMARAES,
P.E., OJOPI, E.P., PAQUOLA, A.C., PIAZZA, J.P., NISHIYAMA, M.Y., JR.,
KITAJIMA, J.P., et al. Transcriptome analysis of the acoelomate human
parasite Schistosoma mansoni. Nature Genetics. 2003, 35 (2): 148-157.
VERJOVSKI-ALMEIDA, S., LEITE, L.C., DIAS-NETO, E., MENCK, C.F.,
WILSON, R.A. Schistosome transcriptome: insights and perspectives for
functional genomics. Trends in Parasitology. 2004, 20 (7): 304-308.
VERMEIRE, J.J., TAFT, A.S., HOFFMANN, K.F., FITZPATRICK, J.M.,
YOSHINO, T.P. Schistosoma mansoni: DNA microarray gene expression
profiling during the miracidium-to-mother sporocyst transformation. Molecular
and Biochemical Parasitology. 2006, 147 (1): 39-47.
VERRIJZER, C.P. & TJIAN, R. TAFs mediate transcriptional activation and
promoter selectivity. Trends in Biochemical Sciences. 1996, 21 (9): 338-342.
WILSON, R.A., ASHTON, P.D., BRASCHI, S., DILLON, G.P., BERRIMAN, M.,
108
IVENS, A. 'Oming in on schistosomes: prospects and limitations for post-
genomics. Trends in Parasitology. 2007, 23 (1): 14-20.
WOLFE, S.A., GREISMAN, H.A., RAMM, E.I., PABO, C.O. Analysis of zinc
fingers optimized via phage display: evaluating the utility of a recognition code.
Journal of Molecular Biology. 1999, 285 (5): 1917-1934.
WOLFE, S.A., GRANT, R.A., ELROD-ERICKSON, M., PABO, C.O. Beyond the
"recognition code": structures of two Cys2His2 zinc finger/TATA box complexes.
Structure. 2001, 9 (8): 717-723.
YAMASAKI, H., SEKIMOTO, T., OHKUBO, T., DOUCHI, T., NAGATA, Y.,
OZAWA, M., YONEDA, Y. Zinc finger domain of Snail functions as a nuclear
localization signal for importin beta-mediated nuclear import pathway. Genes
Cells. 2005, 10 (5): 455-464.
ZEMZOUMI, K., DISSOUS, C., COCHU, A., TROLET, J., CAPRON, A.,
MCNAIR, A. Schistosoma mansoni: interaction of nuclear extracts with the
CCAAT-binding site revealed by the gel shift assay. Experimental
Parasitology. 1995, 80 (1): 149-154.
ZEMZOUMI, K., SERRA, E., MANTOVANI, R., TROLET, J., CAPRON, A.,
DISSOUS, C. Cloning of Schistosoma mansoni transcription factor NF-YA
subunit: phylogenic conservation of the HAP-2 homology domain. Molecular
and Biochemical Parasitology. 1996, 77 (2): 161-172.
Livros Grátis
( http://www.livrosgratis.com.br )
Milhares de Livros para Download:
Baixar livros de Administração
Baixar livros de Agronomia
Baixar livros de Arquitetura
Baixar livros de Artes
Baixar livros de Astronomia
Baixar livros de Biologia Geral
Baixar livros de Ciência da Computação
Baixar livros de Ciência da Informação
Baixar livros de Ciência Política
Baixar livros de Ciências da Saúde
Baixar livros de Comunicação
Baixar livros do Conselho Nacional de Educação - CNE
Baixar livros de Defesa civil
Baixar livros de Direito
Baixar livros de Direitos humanos
Baixar livros de Economia
Baixar livros de Economia Doméstica
Baixar livros de Educação
Baixar livros de Educação - Trânsito
Baixar livros de Educação Física
Baixar livros de Engenharia Aeroespacial
Baixar livros de Farmácia
Baixar livros de Filosofia
Baixar livros de Física
Baixar livros de Geociências
Baixar livros de Geografia
Baixar livros de História
Baixar livros de Línguas
Baixar livros de Literatura
Baixar livros de Literatura de Cordel
Baixar livros de Literatura Infantil
Baixar livros de Matemática
Baixar livros de Medicina
Baixar livros de Medicina Veterinária
Baixar livros de Meio Ambiente
Baixar livros de Meteorologia
Baixar Monografias e TCC
Baixar livros Multidisciplinar
Baixar livros de Música
Baixar livros de Psicologia
Baixar livros de Química
Baixar livros de Saúde Coletiva
Baixar livros de Serviço Social
Baixar livros de Sociologia
Baixar livros de Teologia
Baixar livros de Trabalho
Baixar livros de Turismo
