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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto
Estudo da reatividade vascular e atividade oscilatória em aortas
isoladas de ratos após desnervação sino-aórtica
Matheus Lavorenti Rocha
Ribeirão Preto
2008
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Matheus Lavorenti Rocha
Estudo da reatividade vascular e atividade oscilatória em aortas
isoladas de ratos após desnervação sino-aórtica
Tese apresentada à Faculdade de Medicina de
Ribeirão Preto da Univerdade de São Paulo
para obtenção do título de Doutor em Ciências.
Área de Concentração: Farmacologia
Orientadora: Profª. Drª. Lusiane Maria Bendhack
Ribeirão Preto
2008
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Pelos valores que me ensinaram, todas as
conquistas da minha vida sempre serão
dedicadas aos meus pais, Luiz Carlos e Regina.
4
AGRADECIMENTOS
A Profa. e amiga Dra. Lusiane M. Bendhack, pela conduta profissional
exemplar, pela dedicação, orientação experiente e acima de tudo, pela sua
confiança.
Aos membros da banca examinadora, por terem aceitado o convite, pela
análise do trabalho e grande colaboração.
Aos Profs. do ICB/USP Dr. Roberto Britto e Dra. Luciana Rossoni que
possibilitaram realizar algumas técnicas experimentais que enriqueceram este
trabalho.
À Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto por ter fornecido
todas as condições para que este trabalho pudesse ter sido realizado.
Ao corpo docente e funcionários do Laboratório de Farmacologia da FCFRP,
pela amizade, apoio e carinho.
A todos os colegas do laboratório de Farmacologia, pelo apoio, auxílio e por
tornarem os dias de experimentos menos cansativos.
Às minhas irmãs, Rachel, Marina e Maíra, pelo carinho, apoio e incentivo, sem
os quais este trabalho não teria real valor.
Aos amigos Fábio, Homer, Sandro e Gugui, pela importante fase em que
passamos juntos, pela amizade, convivência e por tornarem meus dias mais
agradáveis.
A todos aqueles que apesar de não citados, tiveram muita importância e
ajudaram de alguma forma a realizar este trabalho.
À FAPESP, pelo apoio financeiro (Processo: 04/09739-0).
5
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Registro representativo da pressão arterial média e da freqüência
cardíaca em ratos DSA e SO........................................................40
Figura 2. Efeito contrátil da fenilefrina em aortas de ratos DSA e SO..........42
Figura 3. Efeito contrátil da fenilefrina em aortas de ratos DSA e SO..........43
Figura 4. Efeito do L-NAME sobre a resposta contrátil da fenilefrina em
aortas de ratos DSA e SO.............................................................44
Figura 5. Efeito do L-NAME sobre a resposta contrátil da fenilefrina em
aortas de ratos DSA e SO.............................................................45
Figura 6. Efeito da indometacina sobre a resposta contrátil da fenilefrina em
aortas de ratos DSA e SO.............................................................46
Figura 7. Efeito da indometacina sobre a resposta contrátil da fenilefrina em
aortas de ratos DSA e SO. ...........................................................47
Figura 8. Efeito do 18β-GA sobre a resposta contrátil da fenilefrina em aortas
de ratos DSA e SO. ......................................................................48
Figura 9. Efeito do 18β-GA sobre a resposta contrátil da fenilefrina em aortas
de ratos DSA e SO. ......................................................................49
Figura 10. Efeito contrátil da serotonina em aortas de ratos DSA e SO.......50
Figura 11. Efeito contrátil da serotonina em aortas de ratos DSA e SO.......51
Figura 12. Efeito de incrementos na concentração de CaCl
2
sobre a resposta
contrátil de aortas de ratos DSA e SO. ........................................52
Figura 13. Efeito de incrementos de CaCl
2
sobre a resposta contrátil à
fenilefrina em aortas de ratos DSA e SO. ....................................53
Figura 14. Efeito contrátil do KCl em aortas de ratos DSA e SO..................54
Figura 15. Efeito contrátil do KCl em aortas de ratos DSA e SO..................55
Figura 16. Efeito contrátil do TEA em aortas de ratos DSA e SO.................56
Figura 17. Efeito contrátil do TEA em aortas de ratos DSA e SO.................57
Figura 18. Efeito contrátil do BaCl
2
em aortas de ratos DSA e SO...............58
Figura 19. Efeito relaxante do pinacidil em aortas sem endotélio de ratos
DSA e SO......................................................................................59
Figura 20. Efeito relaxante da isoprenalina em aortas de ratos DSA e SO..60
Figura 21. Efeito relaxante da isoprenalina em aortas de ratos DSA e SO..61
6
Figura 22. Efeito relaxante da forscolina em aortas com e sem endotélio de
ratos DSA e SO.............................................................................62
Figura 23. Efeito relaxante da forscolina em aortas de ratos DSA e SO......63
Figura 24. Efeito relaxante do nitroprussiato de sódio em aortas sem
endotélio de ratos DSA e SO........................................................64
Figura 25. Efeito relaxante da acetilcolina em aortas de ratos DSA e SO....65
Figura 26. Efeito do heptanol sobre o relaxamento estimulado pela
acetilcolina em aortas de ratos DSA e SO. ..................................66
Figura 27. Efeito do heptanol sobre a resposta relaxante da acetilcolina em
aortas de ratos DSA e SO.............................................................67
Figura 28. Efeito do 18β-GA sobre o relaxamente estimulado pela
acetilcolina em aortas de ratos DSA e SO....................................68
Figura 29: Efeito do 18β-GA sobre a resposta relaxante da acetilcolina em
aortas de ratos DSA e SO.............................................................69
Figura 30. Expressão do RNA mensageiro (mRNA) para conexina 43 em
aortas de ratos DSA e SO.............................................................71
Figura 31. Imagem representativa dos experimentos de western blot (topo) e
analise quantitativa (gráfico) para conexina 43 em aortas isoladas
de ratos DSA e SO........................................................................72
Figura 32. (a) Traçado representativo mostrando as contrações oscilatórias
em aortas de ratos DSA................................................................74
Figura 33. Contrações oscilatórias em anéis de aortas isoladas de ratos DSA
e os parâmetros avaliados. ..........................................................75
Figura 34. Efeito contrátil da Fenilefrina em aortas de ratos DSA................77
Figura 35. Traçado representativo mostrando o registro de contrações
oscilatórias em aorta isoladas de ratos DSA.................................78
Figura 36. Traçado representativo das contrações oscilatórias em aortas de
ratos DSA em 3 diferentes condições...........................................80
Figura 37. Traçado representativo das contrações oscilatórias em aortas (E
+
)
isoladas de ratos DSA...................................................................81
Figura 38. Traçado representativo das contrações oscilatórias em aortas E
+
isoladas de ratos DSA...................................................................82
Figura 39. Traçado das contrações oscilatórias em aorta de rato DSA........85
7
Figura 40. Efeitos de 4-AP sobre as contrações oscilatórias em anéis de
aortas isoladas de ratos DSA. ......................................................86
Figura 41. Efeitos do cloreto de bário sobre as contrações oscilatórias em
aortas isoladas de ratos DSA. ......................................................87
Figura 42. Efeitos da glibenclamida sobre as contrações oscilatórias em
aortas isoladas de ratos DSA. ......................................................89
Figura 43. Efeitos dos moduladores de canais para K
+
ativados por Ca
2+
sobre as contrações oscilatórias em anéis de aortas isoladas de
ratos DSA. ....................................................................................91
Figura 44. Efeitos do 2-APB sobre as contrações oscilatórias induzidas por
fenilefrina em aortas isoladas de ratos DSA.................................94
Figura 45. Traçado representativo mostrando os efeitos da rianodina sobre
as contrações oscilatórias em aorta E
-
isoladas de ratos DSA.....96
Figura 46. Traçado representativo mostrando o efeito da tapsigagina sobre
as contrações oscilatórias em aortas isoladas de rato DSA.........98
Figura 47. Efeito do Bay K 8644 sobre as contrações oscilatórias induzidas
por fenilefrina em aortas de ratos DSA.......................................100
Figura 48. Traçado representativo mostrando o registro de contrações
oscilatórias em aortas isoladas de rato DSA...............................101
Figura 49. Traçado representativo mostrando os efeitos do heptanol sobre
as contrações oscilatórias em aorta isoladas de rato DSA.........103
Figura 50. Traçado representativo mostrando o efeito do 18β-GA sobre as
contrações oscilatórias em aortas isoladas de rato DSA............104
8
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Valores de freqüência e amplitude das contrações oscilatórias em
aortas isoladas de ratos DSA em situações controles e após
incubação com drogas..................................................................83
Tabela 2. Efeitos dos bloqueadores de canais para K
+
sobre as contrações
oscilatórias em aortas de ratos DSA.............................................92
9
LISTA DE ABREVIATURAS
[Ca
2+
]
c
- Concentração Citoplasmática de Ca
2+
18β-GA - Ácido 18β-Glicirretínico
2-APB – 2-Aminoetil Ester Difenil-borato
4-AP – 4-Aminopiridina
Cx - Conexina
DAG – Diacilglicerol
DMB – Dimetil-benzil Amilorida
DSA – Desnervação Sino-aórtica
EC
50
– Concentração que promove 50% da resposta máxima
E
max
- Efeito Máximo
GMPc – Guanosina Monofosfato Cíclico
IP
3
– Inositol 1,4,5 trifosfato
K
ATP
- Canais para Potássio dependentes de ATP
K
ca
– Canais para Potássio Ativados por Ca
2+
KCl – Cloreto de Potássio
K
ir
- Canais para Potássio do Tipo Retificador
K
v
- Canais para Potássio dependentes de Voltagem
L-NAME – N
G
-nitro-L-arginina Metil Ester
LPA – Labilidade da Pressão Arterial
MLV – Músculo Liso Vascular
NO – Óxido Nítrico
NPPB - 5-nitro-2-(3-phenilpropilamino) ácido benzóico
NPS – Nitroprussiato de Sódio
ODQ – 1H-[1,2,4]oxidazol[4,3-a]quinoxaline1-one
PAM – Pressão Arterial Média
pD
2
– Potência (-log EC
50
)
PGF
2α
– Prostaglandina F
2α
RS – Retículo Sarcoplasmático
SO – Sham-Operados
TEA – Tetraetilamônio
10
RESUMO
ROCHA ML. Estudo da reatividade vascular e atividade oscilatória em
aortas isoladas de ratos após desnervação sino-aórtica. 2008. 170p. Tese
(doutorado) – Faculdade de Madicina de Ribeirão Preto, Universidade de São
Paulo, Ribeirão Preto, 2008.
Animais submetidos à desnervação sino-aórtica (DSA), secção das
aferências dos pressorreceptores aórticos e carotídeos, caracterizam-se por
apresentar intensa variabilidade da pressão arterial e ausência de hipertensão
severa. No presente trabalho, verificamos o aparecimento de atividade
oscilatória em aortas de ratos DSA e investigamos alguns mecanismos que
poderiam influenciar a manutenção/gênese das oscilações. Também
analisamos possíveis alterações na reatividade vascular em aortas de ratos
DSA e SO. Para isto, analisamos a resposta contrátil e relaxante da aorta de
ratos DSA e comparação com aortas de ratos Sham-operados (SO), utilizando
agentes promotores de contração (fenilefrina, serotonina, KCl, tetraetilamônio e
BaCl
2
) e relaxamento vascular (pinacidil, isoprenalina, forscolina, nitroprussiato
de sódio e acetilcolina). Analisamos a participação das junções do tipo gap
utilizando os bloqueadores heptanol e ácido 18β-glicirretínico (18β-GA), sobre
a reatividade vascular e sobre as contrações oscilatórias em aortas de ratos
DSA. Também foi verificada a participação dos diferentes tipos de canais para
K
+
, a influência da fonte extra e intracelular de Ca
2+
e a influência do endotélio
sobre as contrações oscilatórias. Foram feitos ensaios de biologia molecular
(PCR-RT e Western Blot) para detecção de conexina 43 em aortas de ratos
DSA e SO. Como resultados, verificamos que aortas de ratos DSA possuem
maior expressão protéica de conexina 43 do que aortas de ratos SO. Aortas de
ratos DSA apresentaram maior resposta contrátil para fenilefrina e serotonina,
11
além de menor sensibilidade ao TEA e menor relaxamento para isoprenalina do
que aortas de ratos SO. A resposta aumentada para fenilefrina em aortas de
ratos DSA foi normalizada pelo bloqueio das junções do tipo Gap com 18β-GA.
O 18β-GA diminuiu o relaxamento causado pela acetilcolina em aortas de ratos
SO como maior magnitude do que em aortas de ratos DSA, enquanto o
heptanol não afetou a resposta relaxante para acetilcolina em aortas de ratos
DSA, mas diminuiu o relaxamento em aortas de ratos SO. Sobre as contrações
oscilatórias que ocorrem em aortas de ratos DSA, o óxido nítrico (NO)
endotelial tem efeito modulador negativo sobre as oscilações, e exerce este
efeito através da ativação de guanilato ciclase. Os canais para K
+
parecem ser
importantes para as oscilações, principalmente os K
ATP
e K
Ca
, uma vez que as
oscilações foram afetadas por seus bloqueadores específicos. Além disto, as
contrações oscilatórias mobilizam tanto Ca
2+
externo como do retículo
sarcoplasmático. As junções do tipo gap parecem ser fundamentais para a
manutenção das oscilações, uma vez que o heptanol e o 18β-GA aboliram este
fenômeno. Como conclusão, demonstramos que aortas isoladas de ratos DSA
apresentam maior resposta contrátil para agonistas contráteis, além prejuízo no
relaxamento via ativação de β-adrenoreceptores. Parte destes resultados
podem ser explicados pelo aumento no número de conexina 43 em aortas de
ratos DSA. O estudo das contrações oscilatórias revelou que as oscilações são
moduladas negativamente pelo endotélio, são dependentes do Ca
2+
extra e
intracelular e das junções gap. Ainda, os canais para K
+
(K
ATP
e K
Ca
) são
importantes para manutenção da atividade oscilatória.
12
ABSTRACT
ROCHA ML. Study of vascular reactivity and oscillatory contractions in
sinoaortic denervated rat aortas. 2008. 170p. Tese (doutorado) – Faculdade
de Madicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto,
2008.
The spontaneous variation of blood pressure is defined as arterial
pressure lability. Sinoaortic denervation (SAD) is characterized by arterial
pressure lability without sustained hypertension. In this work, we have
investigated some of the mechanisms that could influence the
maintenance/genesis of the oscillations observed in SAD rat aortas, as well as
alterations in the vascular reactivity in isolated aortas of those animals.
Therefore, we analyzed the contractile and relaxing responses of the SAD rat
aortas as compared to Sham-operated (SO) rat aortas by using constrictor
(phenylephrine, serotonin, KCl, tetraetylammonium (TEA) and BaCl
2
) and
relaxant substances (pinacidil, isoprenaline, forskolin, sodium nitroprusside and
acetylcholine). We investigated the participation of the gap junctional
communications using the gap junction blocker heptanol and 18β-acid
glicirretinic (18β-GA), on the vascular reactivity and on the oscillatory
contractions in SAD rat aortas. The contribution of the different types of K
+
channels, the influence of the extra and intracellular Ca
2+
sources and the
influence of the endothelium on the oscillatory contractions were also verified.
Additionally, we have used molecular biology techniques (PCR-RT and Western
Blot) for detection of connexin 43 in isolated aortas of both animal groups. We
have verified that SAD rat aortas possess larger connexin 43 expression than
SO rat aortas. SAD rat aortas exhibited higher contractile responses for
13
phenylephrine and serotonin, besides smaller sensitivity to TEA and lower
relaxation to isoprenaline than SO rat aortas. The increased phenylephrine-
induced contractions in SAD rat aortas were normalized by the gap junction
blockade with 18β-GA. This inhibitor also reduced the relaxation caused by
acetylcholine in SO rat aortas with larger magnitude than in SAD rat aortas,
while heptanol failed to affect the relaxant response to acetylcholine in SAD rat
aortas, but it was reduced in SO rat aortas. In relation to the oscillatory
contractions in SAD rat aortas, our results indicate that the endothelium-
derived NO (and not prostanoids), through cGMP pathway, has inhibitory effect
on the oscillations. The K
+
channels K
ATP
and BK
Ca
play the predominant role
on the regulation of oscillatory contractions, although we did not discard the
influence of K
ir
channels on these oscillations. Drugs that impaired intracellular
Ca
2+
release from sarcoplasmic reticulum interrupted the oscillations. The
oscillations also depend on the extracellular Ca
2+
entry through L-type Ca
2+
channel. Moreover, the oscillations seem to be dependent of the gap junctional
communication, since heptanol and 18β-GA completely blocked them.
14
SUMÁRIO
1 - INTRODUÇÃO..............................................................................................16
2 - OBJETIVOS..................................................................................................27
3 - MATERIAL E MÉTODOS.............................................................................28
3.1 - Animais experimentais e desnervação Sino-Aórtica.................................28
3.2 – Medida da pressão arterial média e labilidade da pressão arterial...........29
3.3 - Montagem de preparações de aortas isoladas..........................................29
3.4 - Análise Estatística.....................................................................................30
4. PROTOCOLOS EXPERIMENTAIS...............................................................32
4.1 - Curvas concentração-efeito cumulativas em anéis de aortas de ratos
DSA e SO para agentes contráteis....................................................................32
4.2 – Curvas concentração-efeito cumulativas em anéis de aortas de ratos
DSA e SO para agentes relaxantes..........................................................32
4.3 – Estudo da resposta contrátil estimulada com fenilefrina frente a
concentrações crescentes de cálcio extracelular..............................................32
4.4 – Influência do endotélio vascular sobre as contrações oscilatórias em
aortas de ratos DSA...........................................................................................33
4.5 – Efeitos dos moduladores de canais para K
+
sobre as contrações
oscilatórias em aortas de ratos DSA..................................................................34
4.6 – Participação do Ca
2+
intra e extracelular e junções gap sobre as
contrações oscilatórias em aortas de ratos DSA...............................................34
4.7 - Quantificação da expressão gênica de conexina 43 por PCR Real-
Time...................................................................................................................35
4.8 - Expressão protéica (western-blot) para conexina 43.............................37
5 – RESULTADOS.............................................................................................38
5.1 - Pressão arterial média, freqüência cardíaca e labilidade da pressão
arterial................................................................................................................39
5.2 – Reatividade vascular a agentes contráteis............................................41
5.3 - Reatividade vascular a agentes relaxantes............................................59
15
5.4 - Expressão gênica da conexina 43..........................................................70
5.5 - Expressão protéica (western-blot) para conexina 43.............................72
5.6 - Características das contrações oscilatórias e sua análise.....................73
5.7 - Influência do endotélio sobre as contrações oscilatórias.......................76
5.8 - Efeitos dos moduladores de canais para K
+
sobre as contrações
oscilatórias em aortas de ratos DSA..................................................................84
5.9 - Participação do Ca
2+
intra e extracelular nas contrações oscilatórias....93
5.10 - Participação das junções intercelulares do tipo GAP sobre as
contrações oscilatórias....................................................................................102
6 – DISCUSSÃO..............................................................................................105
7 – SUMÁRIO E CONCLUSÕES.....................................................................144
8 – REFERÊNCIAS BLIOGRÁFICAS..............................................................146
9 – ANEXO......................................................................................................174
16
1. INTRODUÇÃO
Os barorreceptores arteriais localizados na região de bifurcação das
artérias carótidas comuns e no arco aórtico, são estruturas nervosas sensíveis
à variação na pressão arterial. Através da regulação reflexa, eles são
responsáveis pela manutenção dos níveis de pressão arterial dentro de uma
estreita faixa de variação (Jacob et al., 1988). Após estimulados por alterações
da pressão arterial, esses barorreceptores conduzem informações por suas
aferências até o sistema nervoso central, mais especificamente no núcleo do
trato solitário, onde essas informações são integradas e reflexamente dirigidas
ao coração e vasos sanguíneos por eferências que se encontram no tronco
cerebral e medula espinhal (Palkovits & Zaborszky, 1977). Através desse
mecanismo reflexo, os barorreceptores proporcionam um controle da pressão
arterial momento-a-momento.
A secção das aferências dos barorreceptores, através da desnervação
sino-aórtica (DSA), realizada em várias espécies de animais e particularmente
em ratos (Krieger, 1964), deu origem a um modelo de hipertensão
experimental, considerado inicialmente como modelo de hipertensão
neurogênica. Porém, a principal função dos barorreceptores é minimizar
variações instantâneas na pressão arterial e não controlar cronicamente a
mesma. Sendo assim, alguns estudos demostraram que a DSA caracterizava-
se principalmente por induzir uma exagerada variabilidade nos valores de
pressão arterial e não propriamente pelos altos níveis de pressão arterial
(Norman et al., 1981; Saito et al., 1986; Alper et al., 1987; Eto et al., 2003).
17
A variabilidade aumentada nos valores de pressão arterial ou labilidade
da pressão arterial (LPA), característica marcante deste modelo experimental
tem sido observada em varias espécies animais (Norman et al., 1981; Saito et
al., 1986; Shade et al., 1990) e inclusive no homem (Aksmit et al., 1987). Os
mecanismos relacionados à LPA não estão totalmente esclarecidos. Jacob et
al. (1989) apresentaram evidências para participação de dois mecanismos que
poderiam contribuir para a LPA: um componente neurogênico, relacionado à
descarga central mediada pelo sistema nervoso simpático e um componente
periférico que envolve a ativação do músculo liso vascular (MLV) por vários
agentes vasoconstritores endógenos, o que poderia causar alterações na
concentração intracelular de Ca
2+
.
A pressão arterial é uma bem conhecida determinante para lesões a
órgãos alvos (coração, rins, vasos) em pacientes e animais hipertensos e a
redução da pressão arterial tem sido enfatizada por ser muito importante para
proteção desses órgãos (Staessen et al., 2001). Porém, os altos níveis de
pressão arterial certamente não são os únicos determinantes para os danos
observados nos órgãos alvos do sistema circulatório. Algumas drogas anti-
hipertensivas efetivamente reduzirem a pressão arterial, mas falham em
prevenir estas lesões (Teisman et al., 1998), que vão desde hipertrofia das
veias e artérias, lesões glomerulares e hipertrofia e dano do miocárdio. Vários
estudos clínicos demonstraram a associação entre LPA e lesões no coração,
rins e vasos, além de demonstrarem que tais prejuízos foram mais severos em
pacientes hipertensos com elevados valores de LPA (Parati et al., 1987,
Frattola et al., 1993; Mancia et al., 2001). Ainda mais, estudos em animais
mostraram que a LPA é mais prejudicial que a própria hipertensão aos órgãos
18
alvos do sistema circulatório (Shan et al., 2001; Zhang et al., 2003; Miao et al.,
2006). A DSA é um modelo exemplar para tratar do assunto, uma vez que
causa intensa LPA, sem aumentar os níveis pressóricos.
O tônus do MLV é modulado por vários mecanismos. É influenciado por
sistemas extrínsecos aos vasos sanguíneos como a inervação recebida por
diferentes vasos, interação com vários hormônios ou peptídeos vasoativos,
fatores locais gerados pelo metabolismo celular e o endotélio vascular.
Também é modulado por fatores intrínsecos ao MLV como potencial de
membrana e sistemas moleculares de regulação como canais iônicos,
mensageiros secundários e proteínas contráteis.
Dentro do limitado número de sinais intracelulares, o íon Ca
2+
constitui um
segundo mensageiro muito importante que controla uma ampla variedade de
processos celulares, em particular a modulação de vias metabólicas, síntese de
hormônios e contração muscular (Carafoli, 1987). Em particular para contração
muscular, as fontes de Ca
2+
podem ser de origem intracelular, extracelular ou
ambas. Dessa forma, os íons Ca
2+
são encontrados em quatro diferentes
estoques: extracelular, citoplasmático, mitocondrial e não mitocondrial (retículo
sarcoplasmático). O retículo sarcoplasmático (RS) é considerado o principal
estoque intracelular de Ca
2+
. Porém, além do retículo, a mitocôndria também
participa no tamponamento destes íons (Thomas et al., 1996).
O processo de contração do MLV se dá por uma cascata de eventos
intracelulares. Os músculos lisos podem apresentar um padrão bifásico ou
monofásico de contração, dependendo do estímulo recebido. No padrão
bifásico, inicialmente observa-se um rápido e transitório aumento no tônus
contrátil seguido pelo desenvolvimento lento e mantido da contração. Este
19
padrão de resposta geralmente acontece com a ativação de receptores, como
por exemplo, pela fenilefrina ou serotonina. No padrão monofásico, a resposta
contrátil desenvolve-se gradualmente até atingir o platô e este tipo de resposta
é observada, por exemplo, com a despolarização de membrana com altas
concentrações de KCl. Ambos os tipos de contração envolve aumento nos
níveis citoplasmáticos de Ca
2+
que ativam uma proteína citoplasmática
chamada miosina quinase de cadeia leve. A ativação desta enzima promove a
fosforilação da cadeia leve da miosina, que quando fosforilada, interage com os
filamentos de actina causando a contração do MLV. Uma segunda enzima, a
miosina fosfatase da cadeia leve, ativa em baixas concentrações de Ca
2+
,
desfosforila a cadeia leve da miosina, retornando ao seu estado inativo,
fazendo o MLV relaxar (Adelstein et al., 1982; Somlyo & Somlyo, 1986).
O MLV está constantemente em interação com vários hormônios e
peptídeos que possuem receptores específicos na superfície da membrana
plasmática, como vasopressina, adrenalina, angiotensina II, bradicinina e
histamina (Murphy & Mras, 1983). Estes hormônios e peptídeos também
podem alterar o tônus vascular indiretamente, por agirem em terminações
nervosas e no endotélio vascular (Regoli et al., 1990).
O endotélio tem função essencial na regulação do tônus e das respostas
contráteis do MLV pela liberação de fatores relaxantes e contráteis em
condições basais e em resposta a estímulos agonistas ou alterações no fluxo
sanguíneo (Furchgott, 1984; Bullock et al., 1986; Rees et al., 1989). O
relaxamento dependente do endotélio vascular é resultado da liberação de
substâncias vasodilatadoras que incluem o óxido nítrico (NO), fator
20
hiperpolarizante derivado do endotélio (EDHF) e prostaciclinas (Furchgott &
Zawadzki, 1980; Palmer et al., 1987; Félétou & Vanhoutte, 1988).
A participação do endotélio vascular também é observada na resposta
relaxante induzida por agonistas vasodilatadores como a isoprenalina. Este
agonista, interagindo com receptores β-adrenérgicos no MLV, ativa a adenilato-
ciclase e aumenta os níveis de AMPc, induzindo relaxamento independente do
endotélio (Kukovetz et al., 1981). Entretanto, receptores β-adrenérgicos
também estão presentes em células endoteliais (Stephenson & Summers,
1987; Molenaar et al., 1988). A inibição da síntese de NO ou a remoção do
endotélio diminuem o relaxamento induzido pelos agonistas de β-
adrenoreceptores em aortas de ratos (White et al., 1986; Gray & Marshall,
1992). Além disto, esta resposta é inibida por oxihemoglobina, um seqüestrador
de NO, ODQ, inibidor da guanilato ciclase e por inibidores da NO sintase.
Neste sentido, a ativação de β-adrenereceptores nas células endoteliais com
isoprenalina, induz formação de AMPc promovendo síntese de NO, e
consequentemente relaxamento do MLV via GMPc (Grece et al., 1988; Iranami
et al., 1996; Toyoshima et al., 1998; Ferro et al., 1999).
A partir da década de 80, quando Furchgott & Zawadzki (1980)
descreveram o relaxamento dependente do endotélio, a participação do
endotélio vascular passou a ser verificada em estudos da reatividade vascular
a agentes vasocontrictores. A remoção do endotélio vascular promove aumento
da sensibilidade vascular a agonistas α-adrenérgicos (Martin et al., 1986;
Kaneko & Sunano, 1993). Portanto, a liberação de fatores endoteliais
relaxantes e contráteis, modula o efeito de agentes vasoconstrictores.
21
Atualmente se sabe que o endotélio vascular tem função essencial na
regulação do tônus do MLV. Dentre os fatores relaxantes derivados do
endotélio destaca-se o NO (Ignarro et al., 1987; Palmer et al.,1987) e sua
liberação das células endoteliais é observada em condições basais, como
também após a estimulação com várias substâncias (acetilcolina, hormônios
como catecolaminas e vasopressina, autacóides como bradicinina e histamina
e mediadores derivados das plaquetas como serotonina e adenosina, via
ativação mediada por receptores ligados à proteína G) (Boulanger & Vanhoutte,
1997).
Uma vez sintetizado pelas células endoteliais, o NO migra facilmente
para células do MLV subjacente promovendo relaxamento. O NO é
considerado o ativador endógeno da enzima guanilato ciclase solúvel (GCs) e
ativando-a, promove aumento da síntese e conseqüente acúmulo de guanosina
monofostado cíclico (GMPc), formado a partir da degradação de guanosina
trifosfato (GTP). O GMPc promove relaxamento por ativar uma cascata de
eventos intracelulares, que envolvem a ativação de proteína quinase
dependente do GMPc, a PKG, a qual atuará levando à redução da
concentração citoplasmática de íons Ca
2+
(MacDaniel et al., 1992),
desfosforilação da cadeia leve de miosina (Murad, 1986) e interação com o
aparato contrátil, desativando o complexo Ca
2+
-calmodulina (Karaki et al.,
1988), além da ativação dos canais para K
+
, levando à hiperpolarização e
inibição de canais para Ca
2+
dependentes de voltagem (Miyoshi et al., 1994).
Junções do tipo Gap são expressos em quase todos os tecidos de
mamíferos. Nos vasos, estas junções facilitam a comunicação química e
elétrica entre o endotélio e o músculo liso, e entre as células adjacentes do
22
MLV, ligando diretamente a região citoplasmática de duas células vizinhas.
Metabólitos, íons, segundos mensageiros (incluindo IP
3
, AMPc, GMPc, etc.),
Ca
2+
entre outras moléculas ≤ 1kDa são capazes de passar através das
junções gap de uma célula para outra (Kumar & Gilula, 1996), dessa forma,
habilitando a produção coordenada de múltiplas respostas celulares. A
coordenação da resposta entre todas as células do MLV é fundamental para a
modulação do tônus vascular. Vários estudos indicam que nem a inervação
perivascular, nem a propagação do potencial de ação são suficientes para
garantir a ativação uniforme da camada muscular em muitos tipos de vasos
sanguíneos (Hirst & Edwards, 1989; Christ et al., 1993). Estudos demonstraram
que é improvável que a difusão de substâncias como neurotransmissores e
outras moléculas vasoativas ocorra através da camada média dos vasos de
forma suficiente para ativar todas as células (Burnstock et al., 1970). Nessa
direção, recentes estudos destacam a importância das junções do tipo Gap na
modulação da resposta contrátil e relaxante, tornando possível que um maior
número de células sejam recrutadas uniformemente para participar da
contração e do relaxamento (Christ et al., 1993; Hill et al., 2002)
A atividade contrátil espontânea foi demonstrada em vasos de ratos com
hipertensão experimental (Holloway & Bohr, 1973). Lamb e colaboredores
(1985), demonstraram a presença de oscilações na fase tônica da contração
estimulada pela noradrenalina em vasos isolados de ratos hipertensos. Poucos
estudos foram realizados em vasos isolados de ratos submetidos à DSA para
verificar a presença de atividade oscilatória espontânea ou outras alterações
que pudessem explicar a LPA observada nesses animais.
23
Contrações oscilatórias em vasos sanguíneos sob condições fisiológicas
ou patológicas têm sido descritas em inúmeros tipos de MLV e não vascular
como traquéia de cobaia (Yagi et al., 2002), veia porta de rato (Burt, 2005),
bexiga de rato (Imai et al., 2001), ducto torácico de porco (Moffatt et al., 2004),
brônquios (Perez & Sanderson, 2005), artéria subcutânea de cão (Johanson &
Bohr, 1966), artéria mesentérica bovina (Roddie & Scott, 1969), entre outros.
Segundo Hayashida e colaboradores (1986), estas contrações oscilatórias
ocorrem devido à sincronia entre a atividade elétrica e mecânica na parede
celular de muitas células d o MLV. Porém, em grandes artérias as contrações
oscilatórias ocorrem ocasionalmente ou são induzidas por aplicações de algum
estímulo químico como altas concenrações de ínos potássio, catecolaminas,
baixa concentração de magnésio, serotonina, bloqueadores de canais iônicos,
etc. (Biamino & Kruckenberg, 1969; Altura & Altura, 1974; Yagi et al., 2003).
Os efeitos das contrações oscilatórias presentes em leitos vasculares e
não vasculares são correntemente controversas e por isto, sua significância
fisiológica ainda não está corretamente definida. Na tentativa de explicar estes
mecanismos, muitos estudos têm descrito um crítico papel dos canais para
cálcio dependentes de voltagem (Hayashida et al., 1986; Omote & Mizusawa,
1996) e também mostram que as oscilações no tônus vascular são precedidas
por oscilações no potencial de membrana (Hashitani et al., 1996; Gokina et al.,
1996; Oishi et al., 2002). Porém, estudos recentes têm mostrado que
oscilações na concentração intracelular de cálcio envolvendo principalmente o
RS também precedem as contrações oscilatórias (Mauban et al., 2001;
Haddock & Hill, 2002; Takenaka et al., 2003; Burt, 2003).
24
Estas flutuações na tensão vascular podem estar relacionadas às
oscilações na concentração citoplasmática de Ca
2+
([Ca
2+
]
c
), descritas por
Berridge (1990). De acordo com este autor, as flutuações na [Ca
2+
]
c
poderiam
ser causadas tanto pelo influxo de Ca
2+
extracelular quanto pela liberação de
Ca
2+
de estoques intracelulares. Nelson et al. (1995), demonstraram que
drogas que depletam o Ca
2+
do RS, como a tapsigargina, abolem as flutuações
da [Ca
2+
]
c
.
Em células musculares de mamíferos, o influxo transarcolemal de cálcio,
através da troca Na
+
/Ca
2+
e de canais voltagem-dependentes do tipo L (Bers,
2002), dispara a liberação de uma quantidade ainda maior deste íon do RS,
através de canais para cálcio denominados canais de rianodina, mecanismo
denominado liberação de cálcio cálcio-induzida. Estudos sobre oscilações na
concentração intracelular de cálcio também destacam a função dos canais de
rianodina do RS na manutenção das oscilações (Kiyoshi et al., 2003; MacMillan
et al., 2005).
O endotélio pode modular respostas nas células do MLV subjacente
para uma variedade de estímulos (Toda, 1980; Furchgott, 1983; Blanco-Rivero
et al., 2005). Neste sentido, tem sido demonstrado que contrações oscilatórias
em artérias de algumas espécies são dependentes do endotélio, assim como
aortas de hamsters (Jackson, 1988) e artéria auricular de coelhos (Omote &
Mizusawa, 1993). Além disso, contrações oscilatórias são mediadas por
contínua liberação de NO do endotélio e elevação de GMPc no MLV dessas
espécies (Jackson et al., 1991). Por outro lado, o endotélio exerce efeito
inibitório sobre as contrações oscilatórias em aortas de ratos SHR (Sunano et
al., 1994). Em artéria basilar canina, a remoção do endotélio reduz, mas não
25
abole completamente as oscilações (Katusic et al., 1988). Portanto, a influência
do endotélio sobre as contrações oscilatórias pode variar dependendo do leito
e do animal estudado.
Canais para K
+
presentes na membrana do MLV regulam o potencial de
membrana. Neste sentido, ativação de canais para K
+
leva ao efluxo de K
+
e
hiperpolarização da membrana do MLV promovendo a inativação dos canais
para Ca
2+
sensíveis à voltagem e consequentemente vasodilatação. No
sistema vascular, diferentes substâncias endógenas interferem com a função
dos canais para K
+
, entre elas os fatores endoteliais e segundos mensageiros
intracelulares como GMPc e AMPc. A inibição dos canais para K
+
determina
despolarização de membrana promovendo vasoconstricção e favorecendo a
despolarização induzida por agentes contráteis (Nelson & Quayle, 1995).
Vários tipos de canais para K
+
têm sido identificados na membrana do
MLV. Estes canais têm um papel crucial na manutenção dos potenciais
elétricos através da superfície da membrana do músculo liso (Nelson & Quayle,
1995; Standen & Quayle, 1998). O potencial de membrana da célula é um
importante regulador da força de contração, controlando a entrada de íons Ca
2+
e também, em certas ocasiões, a liberação de Ca
2+
intracelular (Standen &
Quayle, 1998). Por esta razão, os canais para K
+
no músculo liso estão ligados
à regulação do tônus contrátil, e fatores que regulam a atividade dos canais
para K
+
podem ter efeitos importantes sobre o tônus e também sobre o
diâmetro dos vasos e dessa forma, sobre a resistência vascular, fluxo
sangüíneo e pressão arterial.
Na tentativa de explorar os mecanismos envolvidos na manutenção das
contrações oscilatórias em preparações isoladas de músculo liso, numerosos
26
estudos têm mostrado a importância dos diferentes tipos de canais para K
+
.
Porém, muitas informações são conflitantes a respeito da participação destes
canais sobre as contrações oscilatórias. Por exemplo, canais para K
+
ativados
por Ca
2+
(K
ca
) têm importante papel na manutenção das oscilações e seu
bloqueio inibe as contrações oscilatórias em artéria basilar de rato (Omote &
Mizusawa, 1996), artéria mesentérica de rato (Okazaki et al., 2003) e artéria
auricular de coelhos (Omote & Mizusawa, 1993). Porém, o bloqueio de K
ca
não
tem efeito sobre as oscilações em artéria caudal de ratos hipertensos (Lamb &
Webb, 1989) e aumenta as oscilações em bexiga isolada de cobaia (Imai et al.,
2001). Dessa forma, a participação dos diferentes tipos de canais para K
+
pode
variar, dependendo do leito e do animal estudado.
Recentemente, trabalhos vêm mostrando a função das junções
intercelulares do tipo Gap sobre as contrações oscilatórias (Griffith et al., 2004).
Muitos autores relacionam o fenômeno de contrações oscilatórias com a
participação das junções intercelulares do tipo gap. De fato, o bloqueio das
junções gap abole as oscilações em músculos lisos vasculares e não
vasculares (Watts et al., 1994; Tsai et al., 1995; Watts & Webb, 1996; Palani &
Manchanda, 2006).
Considerando esta série de aspectos comuns entre o controle das
funções cardiovasculares, nossa hipótese é que a labilidade da pressão arterial
causada pela DSA em ratos poderia gerar atividade oscilatória nos vasos
isolados desses anmais. Esta atividade oscilatória poderia estar relacionada
com flutuações na concentração citosólica de Ca
2+
nas células do MLV. Ainda,
a DSA poderia acarretar algumas variações nas respostas vasculares frente a
estímulos de contração e relaxamento em artérias aortas isoladas.
27
2. OBJETIVOS
O presente estudo foi desenvolvido com o objetivo de investigar a
influência da DSA sobre o efeito de agentes contráteis e relaxantes na aorta
isolada de ratos DSA e sham-operados. Além disto, investigamos os
mecanismos envolvidos na gênese/manutenção das contrações oscilatórias
ocorridas em aortas de ratos DSA.
Os seguintes parâmetros foram analisados:
1 – Ocorrência de alterações na reatividade vascular em aortas de ratos
submetidos à DSA;
2 – Influência do endotélio sobre as contrações oscilatórias em aortas isoladas
de ratos DSA;
3 – Contribuição de diferentes tipos de canais para K
+
sobre as oscilações
contráteis em aortas isoladas de ratos DSA;
4 – Participação do Ca
2+
intra e extracelular sobre as contrações oscilatórias
em aortas isoladas de ratos DSA;
5 – O papel das junções intercelulares do tipo GAP sobre a reatividade
vascular e sobre as contrações oscilatórias em aortas de ratos DSA.
28
3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 - Animais experimentais e desnervação Sino-Aórtica
Neste trabalho foram utilizados ratos Wistar machos, com peso variando
entre 180 e 210g. A cirurgia foi realizada sob anestesia com ketamina
(50mg/Kg/i.p) e xilazina (5mg/Kg/i.p.). De acordo com a técnica descrita por
Krieger (1964), foram seccionadas bilateralmente, as aferências dos
barorreceptores aórticos e carotídeos (DSA). Os animais foram acomodados
em posição supina e submetidos a uma incisão de 3 cm na linha média do
pescoço. Após cuidadosa dissecação do local, os nervos e a musculatura
vizinha foram expostos e a desnervação dos barorreceptores aórticos foi
realizada pela secção do nervo laríngeo superior no ponto mais próximo do
nervo vago e ressecção do tronco simpático, caudal ao gânglio cervical
superior, também foi removido. Após este procedimento, os seios carotídeos
foram desnervados pela remoção dos nervos da região da bifurcação da artéria
carotídea comum. Em ratos Sham-operados (SO) foi feita a desnervação
fictícia.
A pressão arterial foi aferida por método direto, canulando-se a
veia e a artéria femoral com cânula de polietileno conectada a transdutor de
pressão. A freqüência cardíaca foi obtida pelas próprias cânulas através dos
registros de pressão arterial pulsátil. A eficácia da DSA foi avaliada com
intervenção de injeção intravenosa de fenilefrina (3-4 µg/Kg), sendo
considerados como modelos de DSA os animais que responderam com
bradicardia não inferior a 20 bpm frente a aumento mínimo da pressão arterial
29
de 40 mmHg, provocadoi pela injação de fenilefrina. Também foi analisada a
pressão arterial média dos animais e a ocorrência de LPA.
3.2 – Medida da pressão arterial média e labilidade da pressão arterial
Registros da pressão arterial foram realizados por um período mínimo de
30 min. A pressão arterial e a freqüência cardíaca foram digitalizados para um
computador onde os dados foram medidos e analisados.
A determinação da labilidade da pressão arterial foi realizada através do
cálculo do desvio padrão da pressão arterial continuamente medido por certo
período de tempo (Blanc et al., 1999; Miao et al., 2001; Eto et al., 2003). A
labilidade da pressão arterial foi expressa como desvio padrão da média dos
valores de pressão arterial.
3.3 - Montagem de preparações de aortas isoladas
Decorridos 3 dias após a cirurgia, animais DSA e SO tiveram as aortas
isoladas, dissecadas de tecidos conjuntivos e gordurosos logo após o sacrifício
por decapitação. Anéis de 3 mm de comprimento foram preparados e
montados entre ganchos de metal inseridos no lúmem dos vasos e acoplados a
transdutores de registro de tensão isométrica. As artérias foram preparadas
com ou sem endotélio vascular, sendo este removido por ação mecânica. O
sistema foi montado em câmara própria para órgão isolado contendo solução
de Krebs, com a seguinte composição (em mM): NaCl 118,0; KCl 4,7; KH
2
PO
4
1,2; CaCl
2
1,6; MgSO
4
1,2; NaHCO
3
25,0; glicose 11,2; pH 7,4, borbulhado
30
com mistura carbogênica (95% O
2
e 5% CO
2
) em temperatura constante de
37ºC.
Após decorridos 60 minutos de repouso e sob tensão basal de 1,0 g, as
preparações foram submetidas aos protocolos experimentais descritos a
seguir.
Em todos os protocolos, a verificação da integridade ou remoção do
endotélio foi realizada com adição de acetilcolina (1 µM) em preparações pré-
contraídas com fenilefrina (0,1 µM). Foram consideradas com endotélio íntegro
as preparações isoladas de ratos DSA e SO, que apresentaram relaxamento ≥
80%.
3.4 - Análise Estatística.
Os resultados das medidas de pressão arterial média (PAM) e labilidade
de pressão arterial (LPA) foram analisados estatisticamente por teste t de
Student.
Os resultados de tensão isométrica foram expressos como a média ±
erro padrão da média (E.P.M.) de experimentos em preparações de aorta
obtidas de diferentes animais. Os gráficos foram realizados através do
programa GraphPad Prism (GraphPad Software Corporation, versão 2.0,
1997).
As determinações da EC
50
, concentração que produz 50% da
resposta máxima, que foi expressa em valores de pD
2
(-log EC
50
) e efeito
máximo (E
max
) foram realizadas utilizando o método de regressão não-linear
31
dos mínimos quadrados utilizando-se o programa GraphPad Prism (graphPad
software, versão 2.00, 1997). A análise estatística utilizada para comparação
entre os valores de pD
2
ou efeito máximo foi a análise de variância (ANOVA)
one-way, seguido do pós-teste de Newman Keuls, pelo programa GraphPad
Prism (graphPad software, versão 2.00,1997) e Teste t de Student, pelo
programa GraphPad Prism (GraphPad Software Corporation, versão 2.0,1997).
32
4. PROTOCOLOS EXPERIMENTAIS
4.1 - Curvas concentração-efeito cumulativas em anéis de aortas de ratos
DSA e SO para agentes contráteis:
Após estabilização, as preparações foram estimuladas com fenilefrina
(EC
50
) até que as amplitudes das contrações se reproduzissem. A seguir, foram
realizadas curvas concentração-efeito cumulativas em preparações com (E
+
)
ou sem (E
-
) endotélio para fenilefrina (0,1 nM a 10 µM), serotonina (10 nM a
100 µM) ou KCl (4,7 a 120 mM) e em preparações E
-
para tetraetilamônio (10
µM a 100 mM) ou cloreto de bário (10 µM a 100 mM). Em outras séries de
experimentos, foram realizadas curvas concentração-efeito cumulativas para
preparações E
-
para fenilefrina (0,1 nM a 10 µM) após pré-incubação (30 min)
das preparações com inibidor da NO sintase, L-NAME (100 µM), inibidor da
ciclo-oxigenase, indometacina (10 µM) ou bloqueador das junções do tipo Gap,
ácido 18β-glicirretínico (18β-GA, 100 µM).
4.2 - Curvas concentração-efeito cumulativas em anéis de aortas de ratos
DSA e SO para agentes relaxantes:
Após estabilização, as preparações foram estimuladas com fenilefrina
(EC
50
) até que as amplitudes das contrações se reproduzissem. Sobre a pré-
contração com fenilefrina (EC
50
) foram realizadas curvas concentração-efeito
cumulativas em preparações E
-
para pinacidil (10 nM a 1 µM), nitroprussiato de
sódio (0,1 nM a 1 µM) ou acetilcolina (0,1 nM a 10 µM) em preparações E
+
.
33
Também foram realizadas curvas concentração-efeito cumulativas para
acetilcolina (0,1 nM a 10 µM) após pré-incubação por 15 min com heptanol (1
mM) ou 30 min com 18β-GA (75 µM).
Em outras séries de experimentos, após 30 min de incubação com
prazosim (1 µM), as preparações foram contraídas com PGF
2α
(EC
50
) e foram
realizadas curvas concentração-efeito cumulativas em preparações E
+
ou E
-
para isoprenalina (0,1 nM a 10
µM) ou forscolina (10 nM a 10 µM).
4.3 – Estudo da resposta contrátil estimulada com fenilefrina frente a
concentrações crescentes de cálcio extracelular:
Após estabilização, as preparações foram estimuladas com fenilefrina
(EC
50
) até que as amplitudes das contrações se reproduzissem. As
preparações foram estimuladas com fenilefrina (EC
50
), em solução de Krebs
zero-Ca
2+
contendo EGTA 1mM até o desaparecimento da resposta, ou seja, a
depleção dos estoques intracelulares de Ca
2+
sensíveis à fenilefrina. A seguir,
as aortas foram mantidas em solução de Krebs zero-Ca
2+
sem EGTA e foram
realizadas curvas concentração-efeito cumulativas para Ca
2+
(0 a 3 mM) sob
estimulo com fenilefrina (10 µM), em aortas E
+
e E
-
isoladas de ratos DSA e
SO.
4.4 – Influência do endotélio vascular sobre as contrações oscilatórias em
aortas de ratos DSA
Após estabilização, as preparações foram estimuladas com fenilefrina
(EC
50
) até que as amplitudes das contrações se reproduzissem. As contrações
oscilatórias foram induzidas com fenilefrina em aortas E
+
e E
-
. Em aortas com
34
endotélio vascular íntegro, o efeito de drogas que interferem com a cascata do
relaxamento via NO: a) L-NAME (100 µM); b) L-Arginina (1 mM); c) ODQ (1
µM) e d) oxihemoglobina (10 µM), além do inibidor da ciclo-oxigenase
indometacina (10 µM) foram incubados por 30 min antes da indução das
contrações oscilatórias com fenilefrina. Os parâmetros como frequência de
contração (ciclos/tempo), amplitude (g) e tensão basal (g) foram avaliados.
4.5 – Efeitos dos moduladores de canais para K
+
sobre as contrações
oscilatórias em aortas de ratos DSA:
Após estabilização, as preparações foram estimuladas com
fenilefrina (EC
50
) até que as amplitudes das contrações se reproduzissem. As
contrações oscilatórias em preparações E
-
foram induzidas com fenilefrina e os
moduladores dos canais para K
+
foram adicionados ao banho: a)
tetraetilamônio (5 mM); b) 4-aminopiridina (100 µM); c) cloreto de bário (30
µM); d) pinacidil (0,2 µM); e) glibenclamida (1 µM); f) apamina (1 µM); g)
iberiotoxina (0,1 µM). Os parâmetros como frequencia de contração
(ciclos/tempo), amplitude (g) e tensão basal (g) foram avaliados antes
(controle) e após a adição dos compostos sobre as contrações oscilatórias.
4.6 – Participação do Ca
2+
intra e extracelular e junções gap sobre as
contrações oscilatórias em aortas de ratos DSA:
Após estabilização, as preparações foram estimuladas com fenilefrina
(EC
50
) até que as amplitudes das contrações se reproduzissem. As contrações
oscilatórias foram induzidas com fenilefrina em aortas E
-
e drogas que
interferem com a disponibilidade de Ca
2+
intra e extracelular foram testadas: a)
35
antagonista de receptores de IP
3
do RS (2-APB, 20 e 50 µM); b) antagonista de
receptores de riandina do RS (rianodina, 1 a 5 µM); c) inibidor da Ca
2+
ATPase
do RS (tapsigargina, 1 µM); d) ativador dos canais de Ca
2+
do tipo “L” (Bay K
8644, 10 a 100 nM); f) bloqueador dos canais de Ca
2+
do tipo “L” (verapamil,
0,2 µM e 1 µM); g) inibidor do trocador Na
+
/Ca
2+
(DMB, 5 µM) ou h) bloqueador
dos canais de cloreto ativados por Ca
2+
(NPPB, 50 µM). Também foram
testados os bloqueadores das junções do tipo GAP heptanol (5 µM a 0,3 mM)
ou 18β-GA (50 µM). Em alguns protocolos, estas substâncias foram
adicionadas na cuba para orgãoes isolados quando as oscilações induzidas por
fenilefrina já estavam estáveis. Outras vezes, estas substâncias foram
incubadas no banho antes das oscilações serem estimuladas com fenilefrina.
4.7 - Quantificação da expressão gênica de conexina 43 por PCR Real-
Time
A extração do RNA total foi realizada pelo método do TRIzol
, seguindo as
instruções do fabricante. Segmentos de artéria aorta (10-15 mm) foram
isolados de ratos DSA e SO e imediatamente congeladas em nitrogênio líquido.
A seguir, estes tecidos foram homogenizados em 1 ml de TRIzol (Invitrogen,
Carlsbad, CA, USA) e o RNA total foi extraído conforme instruções do
fabricante (Kihara et al., 2006). Resumidamente, após 2 etapas de extração
com clorofórmio, o RNA foi precipitado com isopropanol e os “pellets” de RNA
lavados 2 vezes com solução de etanol 70%. Após secagem, os “pellets” de
RNA foram resuspensos em água tratada com DEPC e a concentração de
cada amostra foi medida. DNA residual foi removido usando DNase I
36
(Amersham, Piscataway, NJ, USA). Para cada 20 µl de reação de transcriptase
reversa, 4 µg de RNA total foram misturadas com 1 µl de oligodT primer (0.5
µg; Invitrogen) e incubados por 10 min a 65ºC. A seguir, efetuou-se o protocolo
padrão de transcrição reversa, utilizando a enzima SuperScript III: após
resfriamento em gelo, a solução foi misturada com 4 µl do primeiro tampão, 2 µl
de 0.1 M DTT, 1 µl de dATP, dTTP, dCTP and dGTP (10 mM cada), e 1 µl
SuperScript III transcriptase reversa (200 U; Invitrogen) e incubados por 60 min
a 50ºC. A reação foi inativada por aquecimento por 15 min a 70ºC. Para os
estudos de quantificação de expressão gênica realizamos experimentos
utilizando o PCR Real-Time (Applied Biosystems- GeneAmp 5700). Neste
sistema, a amplificação da seqüência alvo é detectada em tempo real pela
emissão de fluoróforo, que ocorre quando há formação de dupla fita na região
codificada pelo par de primers: Cx43 (forward: 5’-TTCCTCGTGCCGCAATTAC-
3’, reverse: 5’-CGATTTTGCTCTGCGCTGTA-3’) e GAPDH (forward: 5'-
GATGCTGGTGCTGAGTATGTCG-3', reverse: 5'-
GTGGTGCAGGATGCATTGCTGA-3').
O PCR Real-Time foi realizado por meio do sistema SYBR Green, onde
o fluoróforo se encontra no tampão do PCR: em cada fase de anelamento, o
fluoróforo se intercala na dupla fita, liberando a fluorescência que é
proporcional ao número de cópias. Neste sistema, a validação do resultado
passa por um processo chamado de curva de dissociação: o produto do PCR é
aquecido de 60 até 90
0
C, o que leva à separação da dupla fita, com
conseqüente diminuição da fluorescência. Com a curva de dissociação, é
possível determinar a especificidade da amplificação.
37
4.8 - Expressão protéica (western-blot) para conexina 43
As artérias aortas de ratos DSA e SO foram isoladas, homogeneizadas e
a concentração de proteína total foi quantificada pelo método descrito por
Bradford (1976). Os homogenatos de artérias foram eletroforeticamente
separados por SDS-PAGE gel a 10% (Bio-Rad; Hercules, CA) e então
transferidos, durante 12 h a 4°C, para membranas de PVDF (Amersham
Biosciences) em solução contendo 25 mM Tris, 190 mM glicina, 20% metanol e
0,05% SDS. As membranas foram bloqueadas por 60 min em temperatura
ambiente em solução Tris tamponada (10 mM Tris, 100 mM NaCl e 0,1 tween
20) com leite me pó desnatado (5%). Então, as membranas foram incubadas
por 4 horas com o anticorpo primário para detecção de conexina 43 (diluição
1:1500). Após lavagem, as membranas foram incubadas com anticorpo
secundário anti-coelho (diluição 1:1000) conjugado a peroxidase de rábano
(Bio-Rad; Hercules, CA, USA). Os imunocomplexos foram detectados por um
sistema de detecção de quimioluminescência para peroxidase (ECL Plus,
Amersham International; Little Chalfont, UK) seguida de autoradiografia
(Hyperfilm ECL, Amersham International). Os “blots” de proteínas foram
quantificados pelo programa Scion Image. As mesmas membranas foram
usadas para determinar a expressão protéica de α-actina usando anticorpo
monoclonal anti-α-actina (diluição 1:1500). A expressão da proteína α-actina foi
usada para normalização da expressão protéica de conexina 43 em cada
amostra.
38
5 - RESULTADOS
Os resultados deste trabalho estão apresentados em duas partes distintas para
facilitar o entendimento e a compreensão dos dados. Na primeira parte, estão
apresentados os resultados de reatividade vascular a agentes contráteis e
relaxantes e os dados obtidos nos ensaios de biologia molecular. Na segunda
parte, estão apresentados os resultados sobre o estudo das contrações
oscilatórias.
39
Parte I
Reatividade Vascular em aortas isoladas de ratos após a DSA
5.1 - Pressão arterial média, freqüência cardíaca e labilidade da pressão
arterial
Os registros de pressão arterial média (PAM) de ratos após DSA (n=40)
e SO (n= 32) estão representados na figura 1 e os valores da PAM, freqüência
cardíaca e labilidade da pressão arterial podem ser vistos nas figuras 1a,b,c
respectivamente. Não houve variação da PAM quando comparados os dois
grupos de animais. Não houve diferença entre a média da pressão arterial e da
freqüência cardíaca dos ratos DSA (112,9 ± 8,2 mmHg, 484 ± 21 bpm,
respectivamente) e os ratos SO (103,6 ± 5,4 mmHg, 461 ± 17 bpm,
respectivamente). Porém, animais DSA apresentaram maior labilidade na
pressão arterial (DSA: 17,3 ± 2,8 mmHg; SO: 3,9 ± 1,4 mmHg) (Fig. 1c),
caracterizada por picos de alterações na pressão arterial média, como pode ser
visualizados na figura 1.
40
Figura 1. Registro representativo da pressão arterial média e da
freqüência cardíaca em ratos DSA e SO.
(a) Pressão arterial média (PAM), (b)
freqüência cardíaca (FC) e (c) variabilidade da pressão arterial (desvio padrão da
pressão arterial média). Diferença estatística * P<0,01.
a) b)
50
60
70
80
90
100
110
120
SO DSA
Pressão arterial média
(mmHg)
0
5
10
15
20
25
SO DSA
Variabilidade da pressão
arterial (mmHg)
*
0
200
400
600
SO DSA
Frequência cardíaca (bpm)
c)
41
5.2 – Reatividade vascular a agentes contráteis
5.2.1 – Reatividade vascular à fenilefrina
A fenilefrina induziu contração de forma concentração-dependente dos
anéis de aorta de ratos DSA e SO. Os valores de força de contração (em
gramas) estão representados graficamente nas figuras 2 e 3. As respostas
contráteis mostraram ser diferentes quanto à presença ou ausência de
endotélio nos dois grupos de animais estudados, sendo o efeito máximo da
fenilefrina (E
max
) sempre menor em preparações com endotélio (E
+
). Não houve
diferença significante entre os grupos DSA e SO no que se refere à potência
contrátil da fenilefrina (pD
2
), tanto em preparações E
+
(pD
2
DSA: 7,41 ± 0,12,
n=6; SO: 7,50 ± 0,10, n=7) como em preparações E
-
(pD
2
DSA: 7,80 ± 0,09,
n=9; SO: 7,76 ± 0,08 n=13). Porém, a fenilefrina mostrou ter maior eficácia
(E
max
) em aortas de animais DSA do que em aortas de animais SO, tanto em
preparações E
-
(E
max
DSA: 1,89 ± 0,12g, n=9; SO: 1,42 ± 0,06g, n=12) como
em preparações E
+
(E
max
DSA: 1,44 ± 0,12g, n=6; SO: 1,02 ± 0,09g, n=7).
42
Figura 2. Efeito contrátil da fenilefrina em aortas de ratos DSA e SO.
Curvas concentração-efeito cumulativas para fenilefrina (Fe) em aortas com (E
+
) e
sem (E
-
) endotélio. Os pontos representam médias ± EPM. das respostas contráteis
expressas em g de tensão.
-10 -9 -8 -7 -6 -5
0
1
2
DSA E-
DSA E+
SO E-
SO E+
Fe Log [M]
Tensão (g)
43
Figura 3. Efeito contrátil da fenilefrina em aortas de ratos DSA e SO. Barras
verticais representam a média ± E.P.M. A) representa os valores obtidos no efeito
máximo (E
max
) nas curvas concentração-efeito cumulativas da fenilefrina em
preparações E
+
e E
-
; B) representa os valores de
potência (pD
2
). Diferença estatística *
P<0,05; ** P<0,01.
DSA E- DSA E+ SO E- SO E+
0
1
2
*
*
**
*
A
E
max
(Tensão, g)
DSA E- DSA E+ SO E- SO E+
0
4
5
6
7
8
9
10
B
pD
2
Fe (-log EC
50
)
44
5.2.2 – Efeito do L-NAME sobre a resposta contrátil à fenilefrina
Os valores de força de contração para aortas E
-
isoladas de ratos DSA e
SO na presença (30 min) ou na ausência de L-NAME (100 µM) estão
representados graficamente nas figuras 4 e 5. As respostas contráteis
mostraram ser indiferentes quanto à presença ou ausência de L-NAME nos
dois grupos de animais estudados, sendo o efeito máximo da fenilefrina (E
max
)
inalterado pela presença do inibidor. Não houve diferença significante na
potência contrátil da fenilefrina (pD
2
) entre os grupos DSA e SO tratados com
L-NAME (7,46 ± 0,09, n=5; e 7,43 ± 0,025, n=6, respectivamente) ou na
ausência do inibidor (7,80 ± 0,09, n=9; e 7,76 ± 0,08, n=13, respectivamente).
De modo semelhante às preparações não tratadas, a presença de L-NAME não
alterou o E
max
para fenilefrina nos dois grupos estudados. Em presença de L-
NAME, o efeito da fenilefrina foi maior em aortas de ratos DSA (1,87 ± 0,06g,
n=5) do que e aortas de ratos SO (1,33 ± 0,10g, n=6).
Figura 4. Efeito do L-NAME sobre a resposta contrátil da fenilefrina em
aortas de ratos DSA e SO.
Curvas concentração-efeito cumulativas para fenilefrina
(Fe) em aortas sem endotélio, antes após prévia incubação (30 min) com L-NAME
(100 µM). Os pontos representam médias ± EPM. das respostas contráteis expressas
em g de tensão.
-10 -9 -8 -7 -6 -5
0
1
2
DSA
SO
DSA + L-NAME
SO + L-NAME
Fe Log [M]
Tensão (g)
45
Figura 5. Efeito do L-NAME sobre a resposta contrátil da fenilefrina em
aortas de ratos DSA e SO. Barras verticais representam a média ± E.P.M. A)
representa os valores obtidos no efeito máximo (E
max
) nas curvas concentração-efeito
cumulativas da fenilefrina em aortas sem endotélio, antes e após incubação (30 min)
com L-NAME (100 µM) B) representa os valores de potência
(pD
2
). Diferença
estatística ** P<0,01.
DSA SO
D
SA+L-NAM
E
SO+L-NAME
0
4
5
6
7
8
9
10
B
pD
2
Fe (-log EC
50
)
DS
A
SO DSA+L-NAME SO+L-NAME
0
1
2
**
**
E
max
(tensão, g)
A
46
5.2.3 – Efeito da indometacina sobre a resposta contrátil à fenilefrina
Os valores de força de contração estão representados graficamente nas
figuras 6 e 7, para aortas E
-
isoladas de ratos DSA e SO na presença (30 min)
ou na ausência de indometacina (10 µM). As respostas contráteis para ambos
os grupos estudados mostraram ser indiferentes quanto à presença ou
ausência de indometacina. Na presença desse inibidor, o grupo DSA
apresentou maior eficácia (E
max
) para fenilefrina (1,67 ± 0,12g, n=6) quando
comparado ao grupo SO (1,21 ± 0,15g, n=6). A incubação com indometacina
alterou significantemente a potência contrátil da fenilefrina (pD
2
). Os valores de
pD
2
foram alterados pela presença de indometacina tanto em preparações
isoladas de ratos DSA (na ausência: 7,80 ± 0,09, n=9; e na presença do
inibidor: 7,45 ± 0,05, n=6) quanto SO (na ausência: 7,76 ± 0,08, n=13; e na
presença do inibidor 7,41 ± 0,03, n=6). Não houve diferença no valor de pD
2
entre os grupos DSA e SO tratados com indometacina.
Figura 6. Efeito da indometacina sobre a resposta contrátil da fenilefrina
em aortas de ratos DSA e SO.
Curvas concentração-efeito cumulativas para
fenilefrina (Fe) em aortas sem endotélio, antes e após incubação (30 min) com
indometacina (10 µM). Os pontos representam médias ± EPM. das respostas
contráteis expressas em g de tensão.
-10 -9 -8 -7 -6 -5
0
1
2
DSA
SO
DSA + Indo
SO + Indo
Fe Log [M]
Tensão (g)
47
Figura 7. Efeito da indometacina sobre a resposta contrátil da fenilefrina
em aortas de ratos DSA e SO. Barras verticais representam a média ± E.P.M. A)
representa os valores obtidos no efeito máximo (E
max
) nas curvas concentração-efeito
cumulativas da fenilefrina em aortas sem endotélio, antes e após prévia incubação (30
min) com indometacina (Indo, 10 µM). Diferença estatística * P<0,05; ** P<0,01. B)
representa os valores de
potência (pD
2
). Diferença estatística * P<0,05 em relação aos
controles (sem indometacina).
DSA SO DSA + Indo SO + Indo
0
1
2
*
**
E
max
(Tensão, g)
A
DS
A
SO DSA + Indo SO + Indo
0
4
5
6
7
8
9
10
*
*
B
pD
2
Fe (-log EC
50
)
48
5.2.4 – Efeito do 18β-GA sobre a resposta contrátil à fenilefrina
Os valores de força de contração estão representados graficamente nas
figuras 8 e 9, para aortas E
-
isoladas de ratos DSA e SO na presença (30 min)
ou na ausência de 18β-GA (100 µM). As respostas contráteis foram
semelhantes na presença ou na ausência de 18β-GA no grupo de animais SO.
Os valores de pD
2
e efeito máximo (E
max
) da fenilefrina não foram alterado pela
presença do bloqueador. Porém, a presença de 18β-GA alterou
significantemente o efeito máximo (E
max
) da fenilefrina no grupo de animais
DSA (na ausência: 1,89 ± 0,12g, n=9, e na presença do bloqueador: 1,47 ±
0,10g, n=13). Os valores de pD
2
não foram alterados pela presença de 18β-GA
tanto em preparações de ratos DSA (7,80 ± 0,09, n=9, vs. 7,66 ± 0,09, n=16)
como SO (7,76 ± 0,08, n=13, vs. 8,04 ± 0,12, n=8). Não houve diferença nos
valores de pD
2
entre os grupos DSA e SO tratados com 18β-GA.
Figura 8. Efeito do 18β-GA sobre a resposta contrátil da fenilefrina em
aortas de ratos DSA e SO.
Curvas concentração-efeito cumulativas para fenilefrina
(Fe) em aortas sem endotélio, antes e após incubação (30 min) com 18β-GA (100 µM).
Os pontos representam médias ± EPM. das respostas contráteis expressas em g de
tensão.
-10 -9 -8 -7 -6 -5
0
1
2
DSA
DSA + 18β-GA
SO
SO + 18β-GA
Fe Log [M]
Tensão (g)
49
Figura 9. Efeito do 18β-GA sobre a resposta contrátil da fenilefrina em
aortas de ratos DSA e SO.
Barras verticais representam a média ± E.P.M. A)
representa os valores obtidos no efeito máximo (E
max
) nas curvas concentração-efeito
cumulativas da fenilefrina em aortas sem endotélio, antes e após incubação (30 min)
com 18β-GA (100 µM). B) representa os valores de potência
(pD
2
). Diferença
estatística ** P<0,01.
DS
A
SO
DSA+18
β
-GA SO+18
β
-GA
0
1
2
Emax (Tensão, g)
**
A
DS
A
SO
DSA+18
β
-GA SO+18
β
-GA
0
4
5
6
7
8
9
10
B
pD
2
Fe (-log EC
50
)
50
5.2.5 – Resposta contrátil à serotonina
A serotonina induziu contração de forma concentração-dependente nos
anéis de aorta de ratos DSA e SO. Os valores de força de contração (em
gramas) estão representados graficamente nas figuras 10 e 11. As respostas
contráteis mostraram ser diferentes quanto à presença ou ausência do
endotélio, somente em aortas de ratos DSA, havendo diferença tanto no efeito
máximo (Emax: E
+
: 1,39 ± 0,10g, n=8 vs. E
-
: 1,82 ± 0,11g, n=10) quanto nos
valores de pD
2
(E
+
: 5,05 ± 0,09, n=8 vs. E
-
: 5,86 ± 0,13, n=10). No grupo SO,
houve apenas diferença estatística nos valores de pD
2
(E
+
: 4,76 ± 0,14, n=6 vs.
E
-
: 5,33 ± 0,16, n=7). Houve diferença significante entre o grupo DSA e SO no
que se refere à potência contrátil da serotonina (pD
2
) somente nas preparações
E
-
(DSA: 5,86 ± 0,13, n=10 vs. SO: 5,33 ± 0,16, n=7). Em preparações E
-
, o
efeito máximo (E
max
) foi maior em aortas de ratos DSA (1,82 ± 0,11g) em
comparação ao grupo SO E
-
(1,29 ± 0,08g).
Figura 10. Efeito contrátil da serotonina em aortas de ratos DSA e SO.
Curvas concentração-efeito cumulativas para serotonina (Ser) em aortas com (E
+
) ou
sem (E
-
) endotélio. Os pontos representam médias ± EPM. das respostas contráteis
expressas em g de tensão.
-8 -7 -6 -5 -4
0
1
2
DSA E-
DSA E+
SO E-
SO E+
Ser Log [M]
Tensão (g)
51
Figura 11. Efeito contrátil da serotonina em aortas de ratos DSA e SO.
Barras verticais representam a média ± E.P.M. A) representa os valores obtidos no
efeito máximo (E
max
) nas curvas concentração-efeito cumulativas da serotonina em
aortas com (E
+
) e sem (E
-
) endotélio. B) representa os valores de
(pD
2
). Diferença
estatística * P<0,05; ** P<0,01.
DSA E- DSA E+ SO E- SO E+
0
3
4
5
6
7
8
*
**
**
B
pD
2
Ser (-log EC
50
)
DSA E- DSA E+ SO E- SO E+
0
1
2
**
*
A
E
max
(Tensão, g)
52
5.2.6 – Aumento progressivo na concentração extracelular de cálcio
A resposta contrátil aos incrementos de CaCl
2
na solução de Krebs em
aortas estimuladas com fenilefrina (1 µM) pode ser vista nas figuras 12 e 13. As
respostas contráteis mostraram não haver diferença quanto à presença ou
ausência de endotélio nos dois grupos de animais estudados. Não houve
diferença significante entre os grupos DSA e SO no que se refere à potência do
CaCl
2
(pD
2
), tanto em preparações E
+
(pD
2
DSA: 0,69 ± 0,10, n=5; SO: 0,51 ±
0,04, n=6) como em preparações E
-
(pD
2
DSA: 0,68 ± 0,10, n=7; SO: 0,56 ±
0,13, n=7). Porém, a contração foi maior (E
max
) em aortas de animais DSA do
que em aortas de animais SO em preparações E
-
(E
max
DSA: 1,71 ± 0,11g, n=6;
SO: 1,25 ± 0,08g, n=7). Não houve diferença entre os dois grupos em
preparações E
+
(E
max
DSA: 1,39 ± 0,14g, n=5; SO: 1,23 ± 0,10g, n=6).
Figura 12. Efeito de incrementos na concentração de CaCl
2
sobre a
resposta contrátil de aortas de ratos DSA e SO. A figura representa a resposta
contrátil ao CaCl
2
em aortas estimuladas com fenilefrina (1 µM) em preparações com
ou sem endotélio. Os pontos representam média ± EPM.
0 1 2 3
0
1
2
DSA E-
DSA E+
SO E-
SO E+
CaCl
2
(mM)
Tensão (g)
53
Figura 13. Efeito de incrementos de CaCl
2
sobre a resposta contrátil à
fenilefrina em aortas de ratos DSA e SO.
Barras representam a média ± EPM.
A) representa os valores obtidos no efeito máximo (E
max
) da resposta contrátil ao
CaCl
2
em aortas pré-incubadas com fenilefrina (1 µM) em preparações com ou sem
endotélio; B) representa os valores de pD
2
. Diferença estatística * P<0,05;
DSA E- DSA E+ SO E- SO E+
0.0
0.2
0.3
0.6
0.9
1.2
1.5
pD
2
(-log EC
50
)
B
DSA E- DSA E+ SO E- SO E+
0
1
2
A
*
*
E
max
(Tensão, g)
54
5.2.7 – Resposta contrátil ao KCl
O KCl induziu contração de forma concentração-dependente dos anéis
de aorta de ratos DSA e SO (figuras 14 e 15). As respostas contráteis
mostraram-se semelhantes quanto à presença ou ausência do endotélio, tanto
no grupo DSA (E
max
: E
+
: 1,71 ± 0,14 n=5 vs. E
-
: 1,43 ± 0,22 n=6) quanto no
grupo SO (E
max
: E
+
: 1,57 ± 0,11, n=6 vs. E
-
: 1,19 ± 0,10, n=7). Não houve
diferença na eficácia do KCl quando comparados os dois grupos DSA e SO,
tanto em preparações E
+
ou E
-
.
Em relação à potência do KCl, não houve diferença quando comparados
os dois grupos DSA e SO, tanto em preparações E
+
ou E
-
. Porém, a presença
do endotélio reduziu a potência do KCl tanto no grupo DSA (pD
2
: E
+
: 1,64 ±
0,02, n=6 vs. E
-
: 1,89 ±0,09, n=5) quanto no grupo SO (pD
2
: E
+
: 1,58 ± 0,02,
n=7 vs. E
-
: 1,77 ± 0,03, n=7).
Figura 14. Efeito contrátil do KCl em aortas de ratos DSA e SO. Curvas
concentração-efeito cumulativas para KCl em aortas com (E
+
) e sem (E
-
) endotélio. Os
pontos representam médias ± EPM. das respostas contráteis expressas em g de
tensão.
-2.5 -2.0 -1.5 -1.0
0
1
2
DSA E+
DSA E-
SO E+
SO E-
KCL Log [M]
Tensão (g)
55
Figura 15. Efeito contrátil do KCl em aortas de ratos DSA e SO. Barras
representam a média ± EPM. A) representa os valores obtidos no efeito máximo (E
max
)
da resposta contrátil ao KCl em preparações com (E
+
) ou sem (E
-
) endotélio; B)
representa os valores de pD
2
. Diferença estatística * P<0,05; *P<0,01.
DSA E+ DSA E- SO E+ SO E-
0
1
1.5
2.0
2.5
*
**
B
pD
2
KCl (-log EC
50
)
DSA E+ DSA E- SO E+ SO E-
0
1
2
A
E
max
(Tensão, g)
56
5.2.8 – Resposta contrátil ao tetraetilamônio
O tetraetilamônio (TEA) induziu contração de forma concentração-
dependente em anéis de aorta de ratos DSA e SO. Os valores de força de
contração (em gramas) estão representados graficamente nas figuras 16 e 17.
As respostas contráteis de aortas de ratos DSA e SO não apresentaram
diferença quanto ao efeito máximo (E
max
DSA: 0,98 ± 0,12g, n=6; SO: 1,07 ±
0,06g, n=7). Porém, houve diferença significante entre o grupo DSA e SO no
que se refere à potência contrátil do TEA (pD
2
DSA: 2,64 ± 0,04, n=6; SO: 3,19
± 0,11, n=7).
Figura 16. Efeito contrátil do tetraetilamônio em aortas de ratos DSA e SO.
A figura representa as curvas concentração-efeito para tetraetilamônio (TEA)
em anéis de aorta de ratos DSA e SO em preparações sem endotélio. Os
pontos representam média ± EPM.
-5 -4 -3 -2 -1
0.0
0.5
1.0
DSA
SO
TEA Log [M]
Tensão (g)
57
Figura 17. Efeito contrátil do tetraetilamônio em aortas de ratos DSA e SO.
Barras verticais representam a média ± E.P.M. A) representa os valores obtidos no
efeito máximo (E
max
) nas curvas concentração-efeito cumulativas do tetraetilamônio
(TEA) em aortas sem endotélio. B) representa os valores de
potência (pD
2
). Diferença
estatística ** P<0,01.
DS
A
SO
0.0
0.5
1.0
1.5
E
max
(Tensão, g)
A
DSA SO
0
2
**
2.5
3.0
3.5
B
pD
2
TEA (-log EC
50
)
58
5.2.9 – Resposta contrátil ao cloreto de bário
O cloreto de bário (BaCl
2
) induziu contração de forma concentração-
dependente dos anéis de aorta de ratos DSA e SO. Os valores de força de
contração (em gramas) estão representados graficamente na figura 18. As
respostas contráteis de aortas de ratos DSA e SO não apresentaram diferença
quanto ao efeito máximo (E
max
DSA: 1,11 ± 0,10g, n=7; SO: 1,20 ± 0,09g, n=
9). Os valores de pD
2
também foram semelhantes entre os dois (pD
2
DSA: 4,18 ± 0,27; SO: 3,87 ± 0,14).
Figura 18. Efeito contrátil do BaCl
2
em aortas de ratos DSA e SO. A figura
representa as curvas concentração-efeito para cloreto de bário (Ba
2+
) em anéis
de aorta de ratos DSA e SO em preparações sem endotélio. Os pontos
representam média ± EPM.
-5 -4 -3 -2 -1
0.0
0.5
1.0
1.5
DSA
SO
Ba
2+
Log [M]
Tensão (g)
59
5.3 – Reatividade vascular a agentes relaxantes
5.3.1 – Resposta relaxante ao pinacidil
O pinacidil induziu relaxamento de forma concentração-dependente dos
anéis de aorta E
-
isoladas de ratos DSA e SO pré-contraídos com fenilefrina
(EC
50
). Os valores de relaxamento (% da pré-contração) estão representados
graficamente na figura 19. As respostas de relaxamento não apresentaram
diferença significante entre os grupos DSA e SO no que se refere à potência do
pinacidil (pD
2
DSA: 6,80 ± 0,11, n=5; SO: 6,41 ± 0,15, n=8) ou ao efeito máximo
(E
max
DSA: 90,9 ± 1,7%; SO: 83,5 ± 4,4%) em aortas de ratos DSA e SO.
Figura 19. Efeito relaxante do pinacidil em aortas sem endotélio de ratos
DSA e SO. A figura representa curvas concentração-efeito cumulativas de
relaxamento estimulado com pinacidil em aortas de ratos DSA e SO em preparações
sem endotélio pré-contraídas com fenilefrina (EC
50
). Os pontos representam média ±
E.P.M.
-8.0 -7.5 -7.0 -6.5 -6.0
0
25
50
75
100
SO
DSA
Pinacidil Log [M]
% Relaxamento
60
-10 -9 -8 -7 -6 -5
0
20
40
60
80
100
DSA E+
DSA E-
SO E+
SO E-
Iso Log [M]
% Relaxamento
5.3.2 – Resposta relaxante à isoprenalina
A isoprenalina induziu relaxamento de forma concentração-dependente
nos anéis de aorta de ratos DSA e SO pré-contraídos com PGF
2α
(EC
50
) após
prévia incubação (30 min) com prazosim (1 µM). Os valores de relaxamento (%
de redução da pré-contração) estão representados graficamente nas figuras 20
e 21. As respostas relaxantes mostraram ser diferentes quanto à presença ou
ausência de endotélio em ambos os grupos SO e DSA. Em aortas E
-
, o
relaxamento máximo foi similar nos 2 grupos, sendo de 15,05 ± 2,27% no
grupo DSA (n=8) e 14,74 ± 2,04% no grupo SO (n=10).
Em aortas E
+
, o efeito máximo (E
max
) da isoprenalina foi menor no grupo
DSA (58,62 ± 6,68%, n=7) quando comparado ao grupo SO (91,75 ± 7,95%,
n=10). Não houve diferença nos valores de pD
2
em preparações E
+
entre os
grupos DSA (7,35 ± 0,18) e SO (7,48 ± 0,13).
Figura 20. Efeito relaxante da isoprenalina em aortas de ratos DSA e SO. A
figura representa curvas concentração-efeito cumulativas de relaxamento estimulado
com isoprenalina (Iso) em aortas de ratos DSA e SO em preparações com (E
+
) e sem
(E
-
) endotélio. Os pontos representam média ± E.P.M.
61
Figura 21. Efeito relaxante da isoprenalina em aortas de ratos DSA e SO.
Barras verticais representam a média ± E.P.M. A) representa os valores obtidos no
efeito máximo (E
max
) nas curvas concentração-efeito cumulativas da isoprenalina em
aortas com (E
+
) e sem (E
-
) endotélio. B) representa os valores de
(pD
2
) para
preparações com endotélio. Diferença estatística *** P<0,001.
DSA E+ DSA E- SO E+ SO E-
0
25
50
75
100
A
***
E
max
(% Relaxamento)
DSA E+ SO E+
0
4
5
6
7
8
9
10
B
pD
2
Iso (-log EC
50
)
62
5.3.3 – Resposta relaxante à forscolina
A forscolina (FSK) induziu relaxamento de forma concentração-
dependente dos anéis de aorta de ratos DSA e SO pré-contraídos com PGF
2α
(EC
50
), na presença (30 min) de prazosim (1 µM) (figuras 22 e 23). O efeito da
FSK foi semelhante nos dois grupos de animais (DSA e SO), tanto em
preparações E
+
(E
max
DSA: 106,24 ± 7,0%, n=5; e SO: 100,16 ± 5,64%, n=5)
quanto em preparações E
-
. (E
max
DSA: 98,66 ± 2,74%, n=6; e SO: 97,35 ±
1,81%, n=5). A potência da FSK também foi semelhante nos dois grupos de
animais, tanto em preparações E
+
. (pD
2
DSA: 6,98 ± 0,18, n=5; e SO: 7,35 ±
0,15, n=5) quanto em preparações E
-
(pD
2
DSA: 6,90 ± 0,17, n=6; e SO: 7,03 ±
0,22, n=5).
Figura 22. Efeito relaxante da forscolina em aortas com e sem endotélio
de ratos DSA e SO. A figura representa curvas concentração-efeito cumulativas de
relaxamento estimulado com forscolina (FSK) em aortas de ratos DSA e SO em
preparações com (E
+
) e sem (E
-
) endotélio. Os pontos representam média ± E.P.M.
-10 -9 -8 -7 -6 -5
0
20
40
60
80
100
DSA E+
DSA E-
SO E+
SO E-
FSK Log [M]
% Relaxamento
63
Figura 23. Efeito relaxante da forscolina em aortas de ratos DSA e SO.
Barras verticais representam a média ± E.P.M. A) representa os valores obtidos no
efeito máximo (E
max
) nas curvas concentração-efeito cumulativas da forscolina em
aortas com (E
+
) e sem (E
-
) endotélio. B) representa os valores de
potência
(pD
2
) para
preparações com endotélio.
DSA E+ DSA E- SO E+ SO E-
0
25
50
75
100
125
A
E
max
(Tensão, g)
DSA E+ DSA E- SO E+ SO E-
0
4
5
6
7
8
9
10
B
pD
2
FSK (-log EC
50
)
64
5.3.4 – Resposta relaxante ao nitroprussiato de sódio
O nitroprussiato de sódio (NPS) induziu relaxamento de forma
concentração-dependente dos anéis de aorta E
-
de ratos DSA e SO pré-
contraídos com fenilefrina (EC
50
). Os valores de relaxamento (% da pré-
contração) estão representados graficamente na figura 24. As respostas de
relaxamento não apresentaram diferença entre o grupo DSA e SO no que se
refere à potência do NPS (pD
2
DSA: 8,18 ± 0,10, n=5; SO: 8,18 ± 0,11, n=8) ou
ao efeito máximo (E
max
DSA: 105,04 ± 1,80%; SO: 109,08 ± 2,26) em aortas de
ratos DSA e SO.
Figura 24. Efeito relaxante do nitroprussiato de sódio em aortas sem
endotélio de ratos DSA e SO.
A figura representa curvas concentração-efeito
cumulativas de relaxamento estimulado com
nitroprussiato de sódio (NPS) em
aortas de ratos DSA e SO em preparações sem endotéli,o pré-contraídas com
fenilefrina (EC
50
). Os pontos representam média ± E.P.M.
-10 -9 -8 -7 -6
0
25
50
75
100
DSA
SO
NPS Log [M]
% Relaxamento
65
5.3.5 – Resposta relaxante à acetilcolina
A acetilcolina induziu relaxamento de forma concentração-
dependente dos anéis de aorta com endotélio de ratos DSA e SO pré
contraídos com fenilefrina (EC
50
). Os valores de relaxamento (% da pré-
contração) estão representados graficamente na figura 25. As respostas de
relaxamento não apresentaram diferença significante entre os grupos DSA e
SO no que se refere à potência da acetilcolina (pD
2
DSA: 7,53 ± 0,08, n=5; SO:
7,31 ± 0,08, n=6) e efeito máximo (E
max
DSA: 101,42 ± 1,5%, n=5; SO: 98,22 ±
3,09, n=6).
Figura 25. Efeito relaxante da acetilcolina em aortas de ratos DSA e SO. A
figura representa curvas concentração-efeito cumulativas de relaxamento
estimulado com acetilcolina em aortas de ratos DSA e SO em preparações com
endotélio pré-contraídas com fenilefrina (EC
50
). Os pontos representam média
± EPM.
-10 -9 -8 -7 -6 -5
0
25
50
75
100
DSA
SO
ACh log [M]
% Relaxamento
66
5.3.6 – Efeito do heptanol sobre a resposta relaxante à acetilcolina
Mesmo após incubação por 15 min com heptanol (1 mM), a
acetilcolina induziu relaxamento de forma concentração-dependente dos anéis
de aorta com endotélio de ratos DSA e SO pré contraídos com fenilefrina
(EC
50
) (figura 26 e 27). No grupo DSA, as respostas de relaxamento com ou
sem heptanol não apresentaram diferença significante no que se refere à
eficácia da acetilcolina (E
max
na ausência: 101,42 ± 1,5%, n=5; e na presença
de heptanol: 103,85 ± 3,73%, n=6). Porém, a potência da acetilcolina foi
alterada pelo heptanol no grupo DSA (pD
2
na ausência: 7,53 ± 0,08, n=5; e na
presença de heptanol: 7,04 ± 0,08, n=6). No grupo SO, o heptanol não alterou
os valores de pD
2
(na ausência: 7,30 ± 0,08, n=6; e na presença: 7,18 ± 0,14,
n=5). Porém, o heptanol diminuiu significativamente a eficácia da ACh no grupo
SO (E
max
na ausência: 98,22 ± 3,09%, n=6; e na presença de heptanol: 53,47 ±
6,8%, n=5).
Figura 26. Efeito do heptanol sobre o relaxamento estimulado pela
acetilcolina em aortas de ratos DSA e SO.
A figura representa curvas
concentração-efeito cumulativas de relaxamento estimulado com acetilcolina (ACh) em
aortas de ratos DSA e SO pré-contraídas com fenilefrina (EC
50
) antes ou após (20 min)
a incubação com heptanol (1 mM). Os pontos representam média ± EPM.
-10 -9 -8 -7 -6 -5
0
25
50
75
100
DSA
DSA + Hept
SO
SO + Hept
ACh Log [M]
% Relaxamento
67
Figura 27. Efeito do heptanol sobre a resposta relaxante da acetilcolina
em aortas de ratos DSA e SO.
Barras verticais representam a média ± E.P.M. A)
representa os valores obtidos no efeito máximo (E
max
) nas curvas concentração-efeito
cumulativas da acetilcolina em aortas E
+
, na ausência ou na presença (20 min) de
heptanol (1 mM). B) representa os valores de potência
(pD
2
). Diferença estatística
*P<0,05; *** P<0,001.
DS
A
DSA + He
p
t SO SO + He
p
t
0
25
50
75
100
125
***
A
E
max
(% Relaxamento)
DS
A
DSA + He
pt
SO SO + He
p
t
0.0
2.5
5.0
7.5
10.0
*
B
pD
2
ACh (-log EC
50
)
68
5.3.7 – Efeito do 18β-GA sobre a resposta relaxante à acetilcolina
O relaxamento induzido pela acetilcolina antes e após a
incubação com 18β-GA podem ser vistos nas figuras 28 e 29. O prévio
tratamento (30 min) das preparações com 18β-GA (75 µM) reduziu
significantemente o efeito da acetilcolina tanto no grupo DSA (E
max
na
ausência: 101,35 ± 1,83% n=5; e na presença de 18β-GA: 50,41 ± 5,18, n=11)
quanto no grupo SO (E
max
na ausência: 98,06 ± 3,01%, n=6; e na presença de
18β-GA: 24,74 ± 5,00%, n=7). Houve também diferença significante no efeito
da acetilcolina (E
max
) quando comparados os dois grupos de animais, na
presença de 18β-GA (Emax DSA: 50,41 ± 5,18; e SO: 24,74 ± 5,00%) . Porem,
os valores de pD2 não foram alterados pela presença de 18β-GA tanto no
grupo SO (pD
2
na ausência: 7,31 ± 0,07, n=6; e na presença de 18β-GA: 6,90 ±
0,12, n=7) quanto no grupo DSA (pD
2
na ausência: 7,32 ± 0,21, n=5; e na
presença de 18β-GA: 6,84 ± 0,10, n=12).
Figura 28. Efeito do 18β-GA sobre o relaxamente estimulado pela
acetilcolina em aortas de ratos DSA e SO.
A figura representa curvas
concentração-efeito cumulativas de relaxamento estimulado com acetilcolina (ACh) em
aortas de ratos DSA e SO pré-contraídas com fenilefrina (EC
50
) antes ou após (30 min)
a incubação com
18β-GA (75 µM). Os pontos representam média ± EPM.
-10 -9 -8 -7 -6 -5
0
25
50
75
100
SO
DSA
SO 18β-GA
DSA 18β-GA
ACh Log [M]
% Relaxamento
69
Figura 29. Efeito do 18β-GA
sobre a resposta relaxante da acetilcolina em
aortas de ratos DSA e SO.
Barras verticais representam a média ± E.P.M. A)
representa os valores obtidos no efeito máximo (E
max
) nas curvas concentração-efeito
cumulativas da acetilcolina em aortas com endotélio, na ausência ou na presença (30
min) de
18β-GA (75 µM). B) representa os valores de
potência (pD
2
). Diferença
estatística *** P<0,001.
SO DSA
SO+18
β
-GA DSA+18
β
-GA
0
25
50
75
100
125
***
A
***
***
E
max
(% Relaxamento)
SO DS
A
SO+18
β
-GA DSA+18
β
-GA
0
4
5
6
7
8
9
10
B
pD
2
ACh (-log EC
50
)
70
5.4 – Expressão gênica da conexina 43
Na tentativa de avaliar a expressão gênica para conexina 43 após a
DSA, quantificamos o RNA mensageiro por PCR-RT em tempo real, pelo uso
de “primers” especificamente designados para conexina 43 de ratos, um
método que fornece grande precisão para este tipo de dosagem (Schmittgen et
al., 2000; Kihara et al., 2005). A análise de regressão linear da amplificação
dos “plots” reveleram um alto grau de correlação, conforme a linearidade da
amplificação (Fig. 30A). As curvas de dissociação dos produtos do PCR foram
obtidos por aquecimento das amostras de 60 para 95ºC. O pico único
observado emparelhou com a teórica temperatura de dissociação calculada
previamente, indicando a especificidade do primer (Fig. 30B).
Como mostrado na figura 30C, as cópias de conexina 43 foram
imensamente “up-reguladas” após a DSA (9,85 vezes, P<0,01). Neste
experimento, a expressão gênica da GAPDH foi usada como controle interno
(Fig. 30D)
71
Figura 30. Expressão do RNA mensageiro (mRNA) para conexina 43 em
aortas de ratos DSA e SO.
(a) regressão linear do primer de Cx43; (b) curva de
dissociação, atestando a especificidade do primer de Cx43; a temperatura teórica de
dissociação para este amplicon calculada previamente ao experimento é de 81ºC; (c)
expressão relativa de Cx43 mRNA após a DSA; (d) expressão gênica de GAPDH.
72
5.5 - Expressão protéica (western-blot) para conexina 43
Um aumento na concentração da proteína conexina 43 foi detectado em
aortas de ratos DSA, comparados com os controles (SO). A expressão protéica
de conexina 43 foi detectada em ambos os grupos de animais, porém, sua
expressão foi maior (43%) em aortas de ratos DSA (Fig. 31).
Figura 31. Imagem representativa dos experimentos de western blot
(topo) e analise quantitativa (gráfico) para conexina 43 em aortas isoladas
de ratos DSA (n=5) e SO (n=5).
Os resultados (média ± E.P.M) são expressos
como taxa entre sinal para conexina 43 e sinal para α-actina na aorta
correspondente. Ventrículo esquerdo (VE) serviu como controle positivo para
expressão de conexina 43. Diferença estatística *P<0,05.
73
Parte II
Estudos das contrações oscilatórias em aortas isoladas de ratos DSA
5.6 -
Características das contrações oscilatórias e sua análise
Para excluir o papel modulador do endotélio sobre as contrações
oscilatórias, os protocolos para estudo dos moduladores de canais para K
+
sobre as oscilações foram realizados em preparações sem endotélio.
Durante o período de estabilização, a maioria das preparações isoladas
de ratos DSA exibiram contrações oscilatórias espontâneas, sem qualquer
adição de agente contrátil (Rocha & Bendhack, 2007). Porém, estas contrações
espontâneas eram menos intensas e desapareciam logo que as preparações
eram lavadas ou o teste de viabilidade das preparações (EC
50
fenilefrina + EC
50
acetilcolina) era aplicado. Desta forma, para verificar o efeito de drogas sobre
as contrações oscilatórias, pequenas concentrações de fenilefrina foram
usadas para induzir estas oscilações, que permaneciam oscilando de forma
estável por um período mínimo de 50 min (Fig. 32). Todas as preparações
isoladas de ratos DSA exibiram contrações oscilatórias. Apenas 20% das
preparações isoladas de ratos SO apresentaram algum tipo de atividade
oscilatória. Porém, quando ocorria em aortas de ratos SO, eram poucos
intensas, com baixa fraquencia e rapidamente cessavam.
Após a indução das contrações oscilatórias com fenilefrina, a freqüência
média das oscilações foi de 4.5 ± 0.5 ciclos/min, com amplitude média de 0,465
± 0,1 g e a tensão basal 0,305 ± 0,07 g (n=15). Todos estes parâmetros
74
(freqüência, amplitude e tensão) foram analisados antes e após aplicação dos
diferentes moduladores de canais para K
+
(Fig. 33).
Figura 32. (a)
Traçado representativo mostrando as contrações oscilatórias em
aortas de ratos DSA, mas não em aortas de ratos SO, ambos sem endotélio.
Fenilefrina foi adicionada cumulativamente (aproximadamente de 5 a 15 nM)
até as oscilações iniciarem (setas).
(b) Incidência de contrações oscilatórias em
aortas isolads de ratos DSA ou SO. As contrações oscilatórias foram
observadas em 100% do grupo DSA e 20% do grupo SO. Houve diferença
significanta entre os grupos (* Teste de Fisher, P<0,01).
0 20 40 60 80 100 120
SO
DSA
Razão das aortas que apresentaram
contrações osiclatórias
2/10
10/10
b)
*
75
Figura 33.
Contrações oscilatórias em anéis de aortas isoladas de ratos DSA e
os parâmetros avaliados. As oscilações foram expressas nos gráficos como
tensão, amplitude de contração e freqüência (por um período de 5 minutos) em
relação aos valores obtidos nas situações controle (antes da adição dos
compostos). As contrações oscilatórias foram induzidas por pequenas
concentrações de fenilefrina (como indicado pelas setas) até o início das
oscilações. Após o início das oscilações, estas permaneceram estáveis pelo
período mínimo de 60 min, sem alterações na freqüência e amplitude.
76
5.7. Influência do endotélio sobre as contrações oscilatórias
5.7.1. - Contrações oscilatórias em aortas com e sem endotélio
Na figura 34, podemos observar que nos estudos de reatividade vascular
em anéis de aortas de ratos DSA, fenilefrina apresentou maior eficácia (E
max
)
em preparações sem endotélio (E
-
: 1,89 ± 0,12g, n=9 comparados com E
+
: 1,44
± 0,12g, n=6), apesar de não haver diferença na potência (pD
2
) da fenilefrina.
Além disso, quando as preparações E
+
foram tratadas (30 min) com o inibidor
da óxido nítrico sintase, L-NAME (100 µM), a diferença entre os grupos E
-
e E
+
+ L-NAME deixou de existir (E
-
: 1,89 ± 0,12g, n=9 comparados com E
+
+ L-
NAME: 1,87 ± 0,06g, n=5), mostrando a influência do NO endotelial em
modular a resposta contrátil à fenilefrina (Fig. 34d). Além do mais, as curvas
concentração resposta para as preparações E
+
e E
-
revelaram que as
contrações oscilatórias são mais freqüentes em anéis de aortas E
-
(Fig. 34a) ou
em anéis de aortas E
+
+ L-NAME (Fig. 34c), quando comparados com aortas
E
+
(Fig. 34b).
A figura 35 mostra contrações oscilatórias induzidas por fenilefrina em
aortas de ratos DSA em preparações E
+
e E
-
. Para induzir contrações
oscilatórias, foram necessárias concentrações de fenilefrina 10 vezes menores
em anéis de aorta E
-
(aproximadamente 5 nM) do que em anéis de aorta E
+
(aproximadamente 50 nM). Em preparações E
-
, as oscilações permaneceram
estáveis por até 50 min, enquanto que em preparações E
+
, as oscilações não
permaneceram estáveis, necessitando de novas adições de fenilefrina (como
indicado pelas setas). Além disso, a freqüência das oscilações foi maior em
aortas E
-
(8,5 ± 0,50 ciclos/2min) do que em E
+
(4,5 ± 0,25 ciclos/2min)(Fig.
77
35c). A presença do endotélio intacto também reduziu a amplitude das
oscilações de 0,465 ± 0,1 g em preparações E
-
para 0,305 ± 0,07 g em
preparações E
+
(Fig. 35d). Estes valores também estão apresentados na
Tabela 1.
Figura 34. Efeito contrátil da Fenilefrina em aortas de ratos DSA.
A figura
representa a curva concentração-efeito para fenilefrina (0,1 nM a 10
µM) em aortas de
ratos DSA em preparações E
-
(a), E
+
(b) e E
+
na presença (30 min) de L-NAME (100
µM) (c). As setas representam os incrementos de fenilefrina sobre a curva
concentração-efeito. Notem que as contrações oscilatórias são mais abundantes em
anéis de aortas E
-
e E
+
+ L-NAME. (d) Gráfico dos pontos representando médias ±
E.P.M. (n=6 para todas as preparações). Diferença estatística *P<0,05.
78
Figura 35. Traçado representativo mostrando o registro de contrações
oscilatórias em aorta isoladas de ratos DSA.
Contrações oscilatórias induzidas
por fenilefrina (setas: incrementos de 5 nM de fenilefrina) em aortas de ratos DSA sem
(a) e com endotélio intacto (b). As barras representam média ± E.P.M. da freqüência
(c) e da amplitude (d) de anéis de aortas com (n=12) e sem endotélio (n=15).
Diferença significante entre preparações * P<0,05.
79
5.7.2 - Participação do NO endotelial e dos prostanóides nas contrações
oscilatórias
As contrações oscilatórias induzidas por fenilefrina foram rapidamente
inibidas por acetilcolina (0,5 µM) somente em preparações com endotélio
vascular. Após a remoção do endotélio ou pré tratamento com L-NAME (100
µM) as oscilações não apresentaram nenhuma mudança em resposta à adição
de acetilcolina. Nitroprussiato de sódio (NPS, 0,1 µM) foi capaz de inibir as
oscilações em todas as preparações, causando relexamento e retornando a
tensão para a linha de base (Fig. 36).
A figura 37 mostra um registro representativo das contrações oscilatórias
induzidas por fenilefrina em aortas E
+
em preparações controle (sem adição de
droga; Fig. 37a), em preparações tratadas por 30 min com indometacina (10
µM), inibidor não seletivo da ciclo-oxigenase (Fig. 37b), e em preparações
tratadas por 30 min com L-NAME (100 µM), inibidor da óxido nítrico sintase
(Fig. 37c). O tratamento com indometacina não teve efeito sobre as contrações
oscilatórias induzidas por fenilefrina em aortas E
+
, nem sobre a concentração
de fenilefrina necessária para iniciar as oscilações. Porém, o tratamento com L-
NAME aumentou tanto a freqüência como a amplitude das oscilações (Fig.
37d,e), além de reduzir a concentração de fenilefrina necessária para induzir as
oscilações. Estes valores podem ser verificados na Tabela 2.
Em outra série de experimentos, L-Arginina (1 mM), foi adicionado ao
banho das preparações (30 min) na tentativa de fornecer mais substrato para
síntese de NO. Interessantemente, L-Arginina não alterou os padrões
analisados das contrações oscilatórias, nem alterou a concentração de
fenilefrina necessária para induzir estas oscilações (Fig. 38b,e,f.).
80
Diferentemente disto, a incubação com inibidor da guanilato ciclase (ODQ, 1
µM) e oxihemoglobina (10 µM), seqüestrador de NO, ambos causaram
aumento na freqüência (de 4,5 ± 0,25 para 7.33 ± 0.80 e 6.75 ± 0.70 ciclos/2
min, respectivamente) e na amplitude (de 0,311 ± 0,04g para 0,445 ± 0,03g e
0,425 ± 0,04g, respectivamente) (Fig. 38e,f). Os valores de freqüência e
amplitude estão apresentados também na Tabela 1.
A adição de ODQ, L-NAME ou oxihemoglobina não teve efeito
significante sobre as contrações oscilatórias sem endotélio vascular.
Figura 36. Traçado representativo das contrações oscilatórias em aortas
de ratos DSA em 3 diferentes condições: (
a) com endotélio intacto (E
+
; n=6); (b)
sem endotélio (E
-
; n=7); e (c) endotélio intacto e incubação (30 min) com L-NAME 100
µM (E
+
+LNAME; n=6). As artérias isoladas exibiram contrações oscilatórias e foram
inibidas por acetilcolina (ACh, 0,5 µM) somente em preparações E
+
. A remoção do
endotélio ou incubação com L-NAME aboliu o efeito da ACh. Nitroprussiato de sódio
(NPS, 0,1 µM) causou relaxamento e inibição das oscilações.
81
Figura 37. Traçado representativo das contrações oscilatórias em aortas
(E
+
) isoladas de ratos DSA. Contrações oscilatórias induzidas por fenilefrina (Fe,
setas) em aortas de ratos DSA com endotélio intacto em preparações controle (sem
adição de drogas) (a; n=7), após incubação por 30 min com 10 µM de indometacina
(b; n=5) ou 100 µM de L-NAME (c; n=6). As barras representam média ± E.P.M. da
freqüência (d) e da amplitude (e) de anéis de aortas controle e após a adição dos
inibidores enzimáticos. Diferença estatística *P<0,05.
82
Figura 38. Traçado representativo das contrações oscilatórias em aortas
E
+
isoladas de ratos DSA. Contrações oscilatórias induzidas por fenilefrina (setas)
em aortas de ratos DSA com endotélio intacto em preparações controle (sem adição
de drogas) (a; n=8), após incubação por 30 min com 1 mM de L-Arginina (b; n=6), 1
µM de ODQ (c; n=6) ou 10 µM de Oxihemoglobina (d; n=5). As barras representam
média ± E.P.M. da freqüência (e) e da amplitude (f) de anéis de aortas controle e após
a adição das drogas. Diferença estatística *P<0,05.
83
Tabela 1. Valores de freqüência e amplitude das contrações oscilatórias em
aortas isoladas de ratos DSA em situações controles e após incubação com
drogas.
n
Freqüência
(ciclos x 2 min)
Amplitude (g)
E
-
7 8,5 ± 0,50 0,485 ± 0,03
E
+
7 4,5 ± 0,25
‡
0,311 ± 0,04
‡
E
+
com Indomet 5 4,0 ± 0,50
‡
0,306 ± 0,02
‡
E
+
com L-NAME 6 7,5 ± 0,40 * 0,450 ± 0,02 *
E
+
com L-Arg 6 4,0 ± 0,50
‡
0,314 ± 0,01
‡
E
+
com ODQ 6 7,33 ± 0,80 * 0,445 ± 0,03 *
E
+
com OxiHb 5 6,75 ± 0,70 *
‡
0,425 ± 0,04 *
Resultados estão representados como media ± E.P.M. (n) se refere ao
número de animais em todos os experimentos. *P < 0,05 vs. E
+
;
‡
P < 0,05 vs.
E
-
.
84
5.8 - Efeitos dos moduladores de canais para K
+
sobre as contrações
oscilatórias em aortas de ratos DSA.
5.8.1 - Efeitos do bloqueador não seletivo de canais para K
+
Para investigar o papel dos canais para K
+
sobre a atividade oscilatória,
analisamos o efeito do tetraetilamônio (TEA 5mM), bloqueador não seletivo de
canais para K
+
. O TEA aumentou a tensão de 0,312 ± 0,03 g para 1,250 ± 0,25
g (Fig. 39). Ainda mais, o TEA causou aumento na freqüência de 28,5 ± 3,5
para 41,5 ± 4,5 ciclos/5 min. A amplitude das oscilações também foi aumentada
de 0,435 ± 0,07 para 0,630 ± 0,05 g (n=7). Os efeitos do TEA sobre a tensão,
freqüência e amplitude das contrações oscilatórias foram sumarizados como
valores relativos em relação à situação controle (antes da droga) nas figuras
39b,c,d. Os valores absolutos podem ser vistos na Tabela 2.
Na tentativa de verificar o papel dos canais para Ca
2+
de tipo L,
adicionamos verapamil sobre as contrações oscilatórias. A menor concentração
de verapamil (0,3 µM) interrompeu as oscilações, apesar de não ser capaz de
reduzir a tensão. A tensão aumentada pelo TEA foi revertida pelo aumento na
concentração de verapamil para 1 µM, retornando a tensão para linha de base.
A figura 18a mostra um traçado representativo e os resultados obtido com o
verapamil sobre a tensão, freqüência e amplitude podem ser vistos nas figuras
39b,c,d.
85
Figura 39. Traçado representativo das contrações oscilatórias em aorta de
rato DSA.
(a) TEA (5 mM) aumentou a tensão, freqüência e amplitude das
contrações oscilatórias. As oscilações foram completamente bloqueadas com
verapamil (0,3 µM). (b,c,d) Gráficos comparativos dos efeitos de TEA antes e após
adição de verapamil (0,3 µM e 1 µM) sobre as contrações oscilatórias. As barras
representam média ± E.P.M. de 7 experimentos. * P<0,05 significa diferença em
relação às situações controles;
‡
P<0,05 significa diferença em relação ao grupo TEA.
5.8.2 - Efeito do bloqueador seletivo de canais para K
+
dependentes de
voltagem (K
v
)
Em outra série de experimentos, verificamos o possível papel dos K
v
sobre as contrações oscilatórias. A figura 40a mostra um traçado
representativo dos efeitos do bloqueador seletivo de K
v
, 4-Aminopiridina (4-AP;
n=5). 4-AP (100 µM) não alterou a freqüência nem a amplitude das oscilações.
Porém, após adição de 4-AP, houve um aumento na tensão de 0,305 ± 0,03
para 0,515 ± 0,07 g (n=5). Os efeitos de 4-AP sobre a tensão, freqüência e
amplitude das contrações oscilatórias estão sumarizados como valores
86
relativos das situações controle (antes da droga) na figura 40b,c,d e os valores
absolutos estão apresentados na Tabela 2.
Figura 40. Efeitos de 4-AP sobre as contrações oscilatórias em anéis de
aortas isoladas de ratos DSA
. (a) Registro representativo ilustrando os efeitos de
4-AP sobre as oscilações. (b,c,d) Gráficos comparativos dos efeitos de 4-AP sobre a
tensão, freqüência e amplitude das oscilações. As barras representam média ± E.P.M.
de 5 experimentos. * P<0,05 representa diferença significante entre os grupos.
5.8.3 - Efeitos do bloqueador de canais para K
+
do tipo retificador (K
ir
)
A figura 41 mostra os efeitos do bloqueio de K
ir
pelo cloreto de bário
sobre as contrações oscilatórias. Após adição de BaCl
2
(30 µM) houve um
rápido e sustentado aumento na tensão de 0,290 ± 0,04 para 1,080 ± 0,15 g
(n=5), convertendo as flutuações na tensão para uma contração tônica. Esta
elevação na tensão foi acompanhada pela inibição das contrações oscilatórias.
A tensão retornou para a linha de base somente após a lavagem das
87
preparações com nova solução nutriente (Fig. 41a). A tensão e freqüência
relativas estão mostradas nas figuras 41b,c e os valores absolutos podem ser
vistos na Tabela 2.
Figura 41. Efeitos do cloreto de bário sobre as contrações oscilatórias em
aortas isoladas de ratos DSA.
(a) Registro representativo ilustrando os efeitos do
cloreto de bário (Bário) sobre as oscilações. (b,c) Gráficos comparativos dos efeitos do
cloreto de bário sobre a tensão e freqüência das contrações oscilatórias. As barras
representam média ± E.P.M. de 5 experimentos. * P<0,01 diferença significante entre
os dois grupos.
88
5.8.4 - Efeito do bloqueador de canais para K
+
sensíveis ao ATP (K
ATP
)
Para investigar o papel dos K
ATP
sobre a atividade oscilatória,
analisamos os efeitos do pinacidil (0,2 µM), ativador de canais para K
ATP
. O
pinacidil inibiu as contrações oscilatórias e retornou a tensão para linha de
base (n=5)(Fig. 42b). Após a adição de pinacidil, incrementos na concentração
de fenilefrina não foram capazes de restaurar as oscilações, apesar de causar
elevação na tensão. Ainda mais, adicionamos glibenclamida (1 µM),
bloqueador seletivo de K
ATP
, ao banho de incubação após as oscilações
tornarem-se estáveis. Após adição da droga, houve aumento significante na
tensão (de 0,285 ± 0,03 para 0,755 ± 0,09 g) e uma significante redução na
amplitude das oscilações (de 0,410 ± 0,07 para 0,180 ± 0,06 g). Porém, o
bloqueio de K
ATP
não alterou a freqüência das oscilações (Fig. 42c). As figuras
42d,e,f mostram os parâmetros analisados (tensão, freqüência e amplitude)
como valores relativos das situações controle (antes da droga) (n=7). Os
valores absolutos estão apresentados na Tabela 2.
89
Figura 42.
Efeitos da glibenclamida sobre as contrações oscilatórias em
aortas isoladas de ratos DSA.
(a) Registro representativo ilustrando os efeitos da
glibenclamida sobre as oscilações induzidas por fenilefrina (setas). (b,c,d) Gráficos
comparativos dos efeitos da glibenclamida (Gliben) sobre a tensão, freqüência e
amplitude das contrações oscilatórias. As barras representam média ± E.P.M. de 7
experimentos. * P< 0,05 diferença significante entre os dois grupos.
5.8.5 - Efeito dos moduladores dos canais para K
+
ativados por Ca
2+
(K
Ca
)
Na próxima série de experimentos, o papel dos diferentes tipos de K
ca
sobre as contrações oscilatórias foram examinados. A figura 43a mostra o
efeito da apamina, substância que bloqueia seletivamente os canais para K
ca
de baixa condutância (SK). O bloqueio de SK
Ca
com apamina (1 µM) não
alterou as contrações oscilatórias (n=4).
90
Outra droga testada foi a iberiotoxina (0,1 µM), uma toxina conhecida por
bloquear seletivamente K
ca
de alta condutância (BK
Ca
). O bloqueio de BK
Ca
aumentou consideravelmente a tensão basal (0,300 ± 0,06 para 0,910 ± 0,25 g)
e a freqüência das oscilações (de 28,0 ± 3,5 para 51,5 ± 7,5 ciclos/5 min).
Apesar do aumento da tensão e freqüência, a amplitude das oscilações foi
significativamente atenuada de 0,410 ± 0,08 para 0,195 ± 0,05 g (Fig. 43c).
Finalmente, a tensão foi revertida após a lavagem da preparação com nova
solução nutriente. Os efeitos da iberiotoxina (n=6) sobre a tensão, freqüência e
amplitude das contrações oscilatórias estão sumarizados como valores
relativos aos das preparações controle (antes das drogas) e estão
apresentados nas figuras 43c,d,e. Os valores absolutos podem ser
encontrados na Tabela 2.
91
Figura 43.
Efeitos dos moduladores de canais para K
+
ativados por Ca
2+
sobre as contrações oscilatórias em anéis de aortas isoladas de ratos
DSA.
(a) Registro representativo mostrando o efeito da apamina (1 µM) sobre as
oscilações. (b) Traço representativo mostrando os efeitos da iberiotoxina (IbTX, 0,1
µM) sobre as contrações oscilatórias. (d,e,f) Gráficos comparativos dos efeitos da
iberiotoxina sobre a tensão, freqüência e amplitude das contrações oscilatórias. As
barras representam média ± E.P.M. de 6 experimentos. * P<0,01 diferença significante
em relação ao controle.
92
Tabela 2. Efeitos dos bloqueadores de canais para K
+
sobre as contrações
oscilatórias em aortas de ratos DSA.
n
Tensão (g)
Frequência
(ciclos x 5 min)
Amplitude (g)
TEA (5 mM)
Controle
Tratado
7
0,312 ± 0,03
1,250 ± 0,25**
28,5 ± 3,5
41,5 ± 4,5*
0,435 ± 0,07
0,630 ± 0,05*
4-AP (100 µM)
Controle
Tratado
5
0,305 ± 0,03
0,515 ± 0,07*
26,0 ± 3,0
30,5 ± 4,0
0,410 ± 0,09
0,530 ± 0,08
BÁRIO (30 µM)
Controle
Tratado
5
0,290 ± 0,04
1,080 ± 0,15**
----
----
----
----
GLIBENCLAMIDA (1µM)
Controle
Tratado
7
0,285 ± 0,03
0,755 ± 0,09**
27,5 ± 4,0
31,5 ± 3,5
0,410 ± 0,07
0,180 ± 0.06*
APAMINA (1 µM)
Controle
Tratado
4
0,308 ± 0,03
0,312 ± 0,04
28,0 ± 3,5
29,5 ± 4,0
0,395 ± 0,05
0,405 ± 0,05
IbTX (0.1 µM)
Controle
Tratado
6
0,300 ± 0,06
0,910 ± 0,25*
28,0 ± 3,5
51,5 ± 7,5*
0,410 ± 0,08
0,195 ± 0,05*
Resultados estão representados como media ± E.P.M. n se refere ao
número de animais para todos os experimentos. Diferença significante em
relação ao controle (ausência dos bloqueadores) *P < 0,05 **P < 0,01.
93
5.9 - Participação do Ca
2+
intra e extracelular nas contrações oscilatórias
5.9.1 - Efeito do antagonista de receptores de IP
3
no retículo
sarcoplasmático
A figura 44 mostra um registro representativo das contrações oscilatórias
induzidas por fenilefrina em aortas E
-
e os efeitos causados pelo antagonista de
receptores de IP
3
, 2-APB. As oscilações foram rapidamente inibidas pela
adição de 2-APB (20 µM). Na maior concentração, 2-APB reduziu a tensão até
a linha de base (Fig. 44c). As contrações oscilatórias induzidas pela fenilefrina
(Fig. 27b) desapareceram após incubação (20 min) das preparações com 20
µM de 2-APB (Fig. 27c). Além disso, a concentração de fenilefrina necessária
para aumentar o tônus vascular foi aumentada, após incubação com 2-APB
(como indicado pelas setas na figura 44).
94
Figura 44.
Efeitos do 2-APB sobre as contrações oscilatórias induzidas
por fenilefrina em aortas isoladas de ratos DSA
. Cada seta representa
aumento de 5 nM na concentração de fenilefrina (Fe). (a) Traçado representativo
ilustrando as contrações oscilatórias em preparações controle (n=6). (b) Incubação
com 2-APB (20 µM, 30 min) inibiu o aparecimento das contrações oscilatórias (n=5).
Note que a concentração de fenilefrina (setas) necessária para causar aumento na
tensão foi maior que em preparações sem 2-APB. (c) Traçado representativo
mostrando o efeito do 2-APB sobre as oscilações (n=5). 2-APB foi adicionado após a
estabilização das oscilações induzidas por fenilefrina.
95
5.9.2 - Papel dos receptores de rianodina sobre as contrações oscilatórias
Para investigar o papel dos receptores de rianodina sobre as contrações
oscilatórias, testamos concentrações crescentes de rianodina adicionados ao
banho de incubação após as oscilações induzidas por fenilefrina tornarem-se
estáveis.
A figura 45 mostra o efeito da rianodina, um alcalóide conhecido por
bloquear os canais de rianodina do RS. A rianodina inibiu de forma
concentração-dependente as oscilações em aortas E
-
de ratos DSA (Fig. 45c).
As contrações oscilatórias induzidas pela fenilefrina (Fig. 45a) desapareceram
após a pré-incubação (30 min) das preparações com 5 µM de rianodina (Fig.
45b). Esta inibição não é revertida mesmo após a lavagem das preparações
várias vezes, por 30 min, com nova solução nutriente. A rianodina inibiu as
oscilações de maneira concentração-dependente. Quando rianodina foi
adicionada cumulativamente (1 a 5 µM) sobre as oscilações, estas foram
inibidas e desapareceram totalmente na concentração de 5 µM. A figura 45d
mostra o efeito inibitório da rianodina sobre as oscilações. A partir de 2 µM, a
freqüência das oscilações foi inibida e 5 µM bloqueou completamente as
oscilações.
96
Figura 45. Traçado representativo mostrando os efeitos da rianodina
sobre as contrações oscilatórias em aorta E
-
isoladas de ratos DSA. (a)
Preparações controle mostrando as típicas contrações oscilatórias estimuladas com
fenilefrina (Fe) (n=6). (b) A pré-incubação com rianodina (5 µM, 30 min) inibiu o
aparecimento das oscilações (n=5). (c) Traçado mostrando o efeito da rianodina sobre
as contrações oscilatórias (n=5). Rianodina foi adicionada cumulativamente (setas no
traçado “c”) após a estabilização das oscilações induzidas por fenilefrina. (d) Gráfico
mostrando efeito inibitório da rianodina sobre as oscilações. Diferença significativa
*P<0,01, ** P<0,001 entre a freqüência das oscilações na ausência de rianodina.
97
5.9.3 - Papel da Ca
2+
ATPase do retículo sarcoplasmático sobre as
contrações oscilatórias
Para avaliar a função da Ca
2+
ATPase reticular sobre as contrações
oscilatórias, testamos o efeito da tapsigargina, um inibidor seletivo da
Ca
2+
ATPase reticular.
A figura 46 mostra o efeito da tapsigargina sobre as contrações
oscilatórias. As contrações oscilatórias induzidas pela fenilefrina (Fig. 46a)
desapareceram após a pré-incubação (30 min) das preparações com 1 µM de
tapsigargina (Fig. 46b). Esta inibição não se reverteu mesmo após várias
lavagens das preparações por 30 min com nova solução nutriente e nova
tentativa de indução das oscilações com fenilefrina. Quando adicionada ao
banho de incubação sobre as contrações oscilatórias, tapsigargina (1 µM)
causou uma breve contração tônica, seguida da inibição das oscilações (Fig.
46c).
98
Figura 46. Traçado representativo mostrando o efeito da tapsigagina
sobre as contrações oscilatórias em aortas isoladas de rato DSA.
Cada
seta presenta aumento de 5 nM na concentração de fenilefrina no banho de
incubação. (a) Preparações controle mostrando um exemplo típico de contrações
oscilatórias (n=6). (b) A incubação com tapsigargina (1 µM, 30 min) inibiu de forma
irreversível o aparecimento das oscilações (n=5). (c) Traçado representativo ilustrando
o efeito da taspsigargina (1 µM) sobre as oscilações (n=6). Apesar do aumento no
tônus vascular, tapsigargina inibiu as oscilações causadas por fenilefrina.
99
5.9.4 - Papel do Ca
2+
Extracelular sobre as contrações oscilatórias
Para avaliar a participação do Ca
2+
extracelular sobre as contrações
oscilatórias em aortas E
-
de ratos DSA, verificamos os efeitos do Bay K 8644,
ionóforo de Ca
2+
verapamil, bloqueador de canais para Ca
2+
do tipo L; DMB,
inibidor do trocador Na
+
/Ca
2+
e NPPB, inibidor seletivo dos canais de Cl
-
.
A figura 47 mostra o efeito do Bay K 8644 sobre as oscilações. O
aumento na concentração de Bay K 8644 no banho de incubação aumentou a
freqüência das oscilações alcançando freqüência máxima com 50 nM de Bay K
8644 (18,0 ± 2,5 ciclos/min). Por outro lado, a amplitude das oscilações foi
deprimida com o aumento na concentração de Bay K 8644. Na maior
concentração do ionóforo, as oscilações foram inibidas e convertidas em
contração tônica.
As oscilações não ocorreram quando as preparações foram estimuladas
com fenilefrina em meio Zero-Ca
2+
(Fig. 48a). Este agonista produziu somente
uma contração fásica, que rapidamente retornou à linha de base. Da mesma
maneira, as oscilações foram totalmente inibidas com verapamil (0,2 µM),
mesmo sem causar redução na tensão da preparação. Na maior concentração
de verapamil (1 µM), houve uma rápida perda de tensão, que retornou para a
linha de base (Fig. 48b).
Em outra série de experimentos, testamos o efeito do DMB sobre a
indução das oscilações com fenilefrina. A prévia incubação por 30 min com
DMB (5 µM) não alterou os padrões das contrações oscilatórias, não alterando
a freqüência nem a amplitude das oscilações (Fig. 48c). Como pode ser visto
na figura 48d, a prévia incubação das preparações com NPPB (50 µM) não
alterou a indução das contrações oscilatórias causadas pela fenilefrina.
100
Figura 47. Efeito do Bay K 8644 sobre as contrações oscilatórias
induzidas por fenilefrina em aortas de ratos DSA.
(a) Traçado representativo
das oscilações em aortas isoladas de ratos DSA em concentração basal de CaCl
2
(1,6
mM) e após incrementos crescentes de Bay K 8644 (10 a 100 nM), causando aumento
na tensão basal e na freqüência das oscilações (b), além de reduzir a amplitude (c).
As barras representam média ± E.P.M. para 5 experimentos realizados em aortas de
diferentes animais. Diferença estatística *P<0,05; **P<0,001.
101
Figura 48. Traçado representativo mostrando o registro de contrações
oscilatórias em aortas isoladas de rato DSA.
Contrações oscilatórias induzidas
por fenilefrina em aortas de ratos DSA foram rapidamente inibidas pela adição de 0,3
µM de verapamil (n=7). (a) Em solução Zero-Ca
2+
, fenilefrina não foi capaz de induzir
as contrações oscilatórias, causando somente contração fásica (n=8). (b) As
oscilações foram totalmente inibidas com verapamil (0,2 µM) e verapamil (1 µM)
retornou a tensão para linha de base (n=5). (c) Traçado representativo mostrando o
efeito do DMB (dimethylbenzyl amiloride, n=5) e (d) NPPB (5-nitro-2-(3-
phenylpropylamino) benzoic acid, n=4) sobre as contrações oscilatórias. DMB e NPPB
não alteraram a freqüência e amplitude das oscilações.
102
5.10 - Participação das junções intercelulares do tipo GAP sobre as
contrações oscilatórias
Para investigar o papel das junções intercelulares do tipo GAP sobre a
atividade oscilatória, analisamos os efeitos do heptanol e do 18β-GA, drogas
conhecidas por bloquearem este tipo de comunicação intercelular.
A figura 49 mostra um registro representativo das contrações oscilatórias
induzidas por fenilefrina em aortas sem endotélio isoladas de ratos DSA e os
efeitos causados pelo heptanol. As oscilações foram rapidamente inibidas pela
adição de 0,3 mM de heptanol (n=5). Porém, após a remoção do heptanol do
banho de incubação, as oscilações retornaram tão rápido quanto foram
estimuladas pela fenilefrina (Fig. 49a). Na presença de heptanol (0,3 mM), as
contrações oscilatórias não ocorerram, mesmo após o tônus vascular ser
aumentado com adição de fenilefrina (Fig. 49b) (n=7). Ainda na figura 49,
podemos verificar que o heptanol inibiu de forma concentração-dependente as
oscilações em aortas de ratos DSA. Estes dados demonstram que a
concentração de 0,3 mM é suficiente para causar total inibição das oscilações
(Fig. 49c,d).
A figura 50 mostra um registro representativo das contrações oscilatórias
induzidas por fenilefrina em aortas sem endotélio isoladas de ratos DSA e os
efeitos causados pelo 18β-GA. Após a adição de 18β-GA (50 µM), houve uma
elevação do tônus, que lentamente retornou para a linha de base e inibiu
completamente as oscilações. As oscilações também foram inibidas pela pré-
incubação com 18β-GA (50 µM). Na presença de 18β-GA, as contrações
oscilatórias não ocorreram, mesmo após o tônus vascular ser aumentado pela
adição de fenilefrina (Fig. 50c) (n=7).
103
Figura 49. Traçado representativo mostrando os efeitos do heptanol sobre
as contrações oscilatórias em aorta isoladas de rato DSA.
(a) Efeito do
heptanol (0,3 mM) sobre a contração oscilatória induzida por fenilefrina em aorta de
rato DSA. Após a lavagem do heptanol, nova adição de fenilefrina (seta) foi capaz de
induzir as oscilações (n=4). Em presença de heptanol, a inibição das oscilações
persiste mesmo após aumentos da tensão causados por fenilefrina (n=6) (b).
Concentrações crescentes de heptanol (0,005 a 0,3 mM) exercem efeito inibitório
concentração-dependente sobre as oscilações (c). Pontos do gráfico (d) representam
média ± E.P.M. (n=5). Diferença estatística **P<0,01; ***P<0,001.
-0.0 0.1 0.2 0.3
-100
-80
-60
-40
-20
0
***
***
***
Heptanol (mM)
Atividade Oscilatória
(% de inibição)
d)
**
104
Figura 50. Traçado representativo mostrando o efeito do 18β-GA sobre as
contrações oscilatórias em aortas isoladas de rato DSA.
(a) traçado
representativo ilustrando o efeito do
18β-GA (50 µM) sobre as oscilações (n=6).
Apesar do aumento no tônus vascular,
18β-GA inibiu as oscilações causadas por
fenilefrina. (b) Preparações controle mostrando um exemplo típico de contrações
oscilatórias induzidas por baixas concentrações de fenilefrina (▼); (c) A incubação
com
18β-GA (50 µM, 30 min) previne o aparecimento das oscilações causadas por
fenilefrina (▼) em aortas de ratos DSA (n=5).
105
6 – DISCUSSÃO
Assim como realizado na parte de resultados, a discussão deste trabalho será
dividida em duas partes distintas para facilitar o entendimento e a
compreensão. Na primeira parte, serão discutidos os resultados de reatividade
vascular a agentes contráteis e relaxantes, e os dados obtidos com os ensaios
de biologia molecular. Na segunda parte, serão discutidos os resultados sobre
o estudo das contrações oscilatórias em aortas de ratos DSA.
106
6.1 – Estudo da reatividade vascular em aortas de ratos DSA e SO
A pressão arterial é constantemente monitorada pelos baroreceptores,
que são estruturas nervosas localizadas na região da bifurcação carotídea e no
arco aórtico. Esses receptores sensíveis à pressão, são responsáveis por
regular a pressão arterial através de aferências nervosas até o sistema nervoso
central (Jacob et al., 1988). A secção dessas aferências (desnervação sino-
aórtica) originou um modelo de estudo da pressão arterial não propriamente
por causar hipertensão, mas por induzir exagerada variabilidade nos valores de
pressão arterial, sem elevar os níveis de pressão arterial.
Em nossos estudos, após 3 dias da cirurgia, os ratos de ambos os
grupos (DSA e SO) apresentam-se normotensos. Porém, o grupo DSA
apresentou intensa variabilidade da pressão arterial, característica típica deste
modelo experimental. Esses resultados estão de acordo com aqueles descritos
anteriormente por outros autores (Normam et al., 1981; Saito et al., 1986; Alper
et al., 1987; Eto et al., 2003), reforçando o fato de que os ratos que sofrem
DSA não apresentam elevação da pressão arterial, mas sim, apresentam
constante LPA caracterizada por picos espontâneos de alteração da pressão
arterial (figura 1).
Embora a literatura seja extensa a respeito dos estudos das mudanças
nos parâmetros arteriais de animais após a DSA (Saito et al., 1986; Shade et
al., 1990), os mecanismos relacionados à LPA não estão totalmente
esclarecidos. Segundo Jacob et al. (1989), pelo menos dois mecanismos
poderiam participar da LPA: um componente neurogênico, relacionado à
descarga central mediada pelo sistema nervoso simpático e um componente
107
periférico que envolveria a ativação do MLV por vários agentes
vasoconstritores endógenos, o que alteraria a concentração citosolica de Ca
2+
,
alterando o tônus vascular.
A pressão arterial é uma bem conhecida determinante para lesões a
órgãos alvos (por ex.: coração, rins, vasos) em pacientes e animais
hipertensos. Desse modo, a redução da pressão arterial tem sido enfatizada
por ser muito importante para proteção desses órgãos (Staessen et al., 2001).
Porém, os altos níveis de pressão arterial certamente não constituem o único
determinante para os danos observados nos órgãos alvos do sistema
circulatório. Algumas drogas anti-hipertensivas efetivamente reduzem a
pressão arterial, mas falham em prevenir estas lesões (Teisman et al., 1998),
que vão desde hipertrofia das veias e artérias, lesões glomerulares e hipertrofia
e dano do miocárdio. Vários estudos clínicos demonstraram a associação entre
LPA e lesões no coração, rins e vasos, além de demonstrarem que tais
prejuízos foram mais severos em pacientes hipertensos com elevados valores
de LPA (Parati et al., 1987, Frattola et al., 1993; Mancia et al., 2001). Ainda
mais, estudos em animais mostraram que a LPA é mais prejudicial que a
própria hipertensão aos órgãos alvos do sistema circulatório (Shan et al., 2001;
Miao et al., 2006). A DSA é um modelo exemplar para tratar do assunto, uma
vez que causa intensa LPA, sem aumentar os níveis pressóricos.
São poucos os estudos que mostram a relação entre a desnervação
causada pela interrupção do barorreflexo e alterações nos vasos desses
animais “in vitro”. Os resultados de reatividade vascular obtidos no presente
estudo mostram alterações causadas pelos agentes relaxantes e contráteis,
108
além da participação das junções Gap em aortas de ratos DSA frente à
reatividade vascular a alguns desses agentes.
A reatividade vascular ao estímulo contrátil também representa
importante aspecto para o controle do tônus vascular e vários estudos
demonstram alterações na vasoconstrição em diferentes modelos
experimentais de diabetes, hipertensão, desnutrição, etc.
O aumento da concentração intracelular de Ca
2+
é um sinal essencial
para a resposta contrátil do MLV que ocorre como resultado da liberação de
Ca
2+
dos estoques intracelulares, influxo de Ca
2+
extracelular ou ambos
(Somlyo & Somlyo, 1994). Em ausência de Ca
2+
extracelular, a contração
induzida pela noradrenalina é diminuída, enquanto que a resposta contrátil
induzida por KCl é completamente abolida, o que indica que a mobilização das
fontes de Ca
2+
é dependente do tipo de estímulo (Hinke et al., 1964; Hudgins &
Weiss, 1968).
A relação entre ativação de receptores e liberação de cálcio intracelular
recebeu maior atenção com os estudos de mobilização de cálcio via trifosfato
de inositol (IP
3
) e diacilglicerol (DAG) (Berridge, 1987; Carafoli, 1987; Putney,
1986). Estes outores propuseram um modelo envolvendo mecanismos e vias
de influxo de Ca
2+
pela ativação dos receptores por agonistas seletivos. O
influxo de cálcio pode ocorrer por canais operados por receptores, canais
operados por receptores acoplados à proteína G e/ou ativado por liberação de
cálcio (Carafoli, 1987). A contração do MLV em resposta à ativação de
adrenoceptores alfa-1 pode ser explicada pelo aumento na concentração
intracelular de Ca
2+
, devido ao influxo de Ca
2+
e/ou liberação do Ca
2+
intracelular. A ativação dos receptores alfa 1-adrenérgicos promove ativação da
109
proteína Gq que ativa a fosfolipase C (PLC). A ativação da PLC promove
hidrólise de fosfolipídeos de membrana dando origem a dois mensageniros
secundários: fosfatidilinositol 1,4,5 trifosfato (IP
3
) e diacilglicerol (DAG),
responsáveis pelo aumento dos níveis intracelulares de Ca
2+
.
Com o intuito de verificar se a reatividade vascular estaria alterada por
agonistas contráteis, avaliamos as respostas contráteis para fenilefrina e
serotonina. Utilizamos também o KCl com a finalidade de avaliar a resposta
contrátil independente de receptores. A serotonina, via ativação de receptores
5-HT
2A
, produz contração do MLV pelos mesmos mecanismos que a fenilefrina,
atuando em receptores α1-adrenérgicos, ou seja, são receptores ligados à
ativação da fosfolipase C, que catalisa a hidrólise do fosfatidilinositol, como
citado acima. Já a contração causada pelo aumento dos níveis de KCl no
líquido extracelular leva a uma contração independente de ativação de
receptores, causando uma despolarização da membrana plasmática da célula
muscular, elevando o potencial de membrana para valores mais eletropositivos,
causando influxo de Ca
2+
e originando a contração.
Os resultados de reatividade vascular obtidos no presente estudo
mostram alterações causadas pelos agonistas contráteis fenilefrina e
serotonina. O efeito máximo para estes agonistas foi maior em aortas de ratos
DSA. Nossos resultados demonstram que os anéis de aorta de ratos DSA
apresentaram maior efeito máximo à fenilefrina e à serotonina, mostrando uma
maior resposta contrátil para esses agentes em anéis aórticos de ratos DSA em
comparação ao grupo SO.
Segundo Lograno et al. (1989), o endotélio vascular tem efeito inibitório
sobre a resposta contrátil estimulada com vários agentes vasoconstritores. No
110
presente trabalho, também investigamos o efeito da remoção do endotélio
vascular sobre a resposta contrátil. A remoção do endotélio vascular aumentou
significativamente a resposta contrátil máxima para fenilefrina tanto no grupo
DSA quanto em SO, diminuindo o efeito máximo em aortas com endotélio,
quando comparadas com preparações sem endotélio. Em relação à serotonina,
a presença do endotélio parece ser mais importante em modular a
sensibilidade do agonista, deslocando a curva de contração para a direita em
preparações com endotélio íntegro. Estes resultados estão de acordo com
Lues & Shuman (1984), que demonstraram redução da tensão desenvolvida
por agonistas contráteis em aortas de ratos com endotélio comparadas com
aortas de ratos sem endotélio.
O endotélio vascular desempenha papel importante na regulação do
tônus vascular pela liberação não apenas de agentes vasodilatadores como
também vasoconstritores. Desta forma, podemos sugerir que a presença do
endotélio alterou a resposta contrátil em anéis de aortas de ratos DSA e SO por
liberação de fatores relaxantes que estariam sendo estimulados pela fenilefrina
e serotonina, uma vez que a retirada do endotélio provoca um aumento da
resposta contrátil.
A resposta contrátil para fenilefrina foi maior em aortas de ratos DSA
tanto na presença quanto na ausência de endotélio. Então, fica claro que a
causa dessa resposta aumentada em aortas de ratos DSA é de origem não
endotelial. É importante notar que, além das células endoteliais, os
prostanóides, produtos derivados da via ácido araquidônico/ciclo-oxigenase
são também produzidos nas células do MLV de aorta de ratos (Stanke-
Labesque et al., 2004), e podem modular a resposta contrátil em aortas sem
111
endotélio (Tirapelli et al., 2006). Porém, a incubação das preparações sem
endotélio com indometacina não alterou a resposta máxima em aortas de ratos
DSA e SO. A indometacina somente diminuiu a sensibilidade das preparações
à fenilefrina, deslocando a curva de contração para a direita, tanto em
preparações DSA, quanto SO. Estes resultados indicam que a maior resposta
contrátil em preparações isoladas de ratos DSA não envolve a via dos
prostanóides.
Além da produção de prostanóides pelo MLV, alguns autores mostram a
produção NO, que pode também ocorrer nas células musculares (Vetrovsky et
al., 2002). Para excluir a possibilidade de que o NO de origem não endotelial
seja a causa da diferença de resposta para fenilefrina, realizamos curvas-
concentração efeito cumulativas para fenilefrina em preparações sem endotélio
e após incubação com L-NAME. O tratamento com o inibidor da NO sintase
não alterou as respostas observadas para fenilefrina em prepações DSA e SO,
excluindo a participação do NO nesta resposta.
A reatividade vascular para muitos agonistas contráteis (fenilefrina,
angiotensina II, noradrenalina, serotonina, etc.) está aumentada em artérias de
animais hipertensos (Bohr et al., 1991). Embora algumas mudanças na via de
sinalização para algum agonista em particular possa acontecer, uma mudança
global na via de transdução de sinal poderia ocorrer, e seria a melhor
explicação para a aparente mudança na reatividade vascular nestes casos
(Watts & Webb, 1996). De fato, alguns autores apontam para um aumentado
número de junções do tipo Gap, facilitando e aumentando a comunicação
intercelular em artérias nos casos de hipertensão (Kansui et al., 2004). Neste
sentido, este aumento nas junções Gap é que levariam ao maior efeito dos
112
agonistas contráteis em preparações vasculares isoladas (Watts & Webb,
1996). Além do maior efeito de agonistas contráteis em artérias isoladas de
animais hipertensos, a incidência de contrações oscilatórias também esta
aumentada. Isto tem sido observado tanto em animais quanto em humanos
portadores de hipertensão (Myers et al., 1985; Webb et al., 1992; Tsai et al.,
1995).
Recentes estudos mostram fortes evidências da importância das junções
do tipo Gap na modulação da resposta contrátil e relaxante em vasos isolados.
O maior número dessas comunicações intercelulares tornaria possível que um
maior número de células sejam recrutadas uniformemente para participar da
contração e do relaxamento (Christ et al., 1993; Hill et al., 2002). As junções do
tipo Gap são formadas por proteínas estruturais denominadas conexinas (Cx).
Cada grupo de 6 Cx formam um conexon ou hemicanal, que junto com o
hemicanal da célula adjacente forma uma junção Gap. Esta junção é um canal
que liga diretamente a região citoplasmática de duas células vizinhas células.
Metabólitos, íons, segundos mensageiros (incluindo IP
3
, AMPc, GMPc, etc.),
Ca
2+
entre outras moléculas ≤ 1kDa são capazes de passar através das
junções Gap de uma célula para outra (Kumar & Gilula, 1996), e desta forma,
habilitar a produção coordenada de múltiplas respostas celulares. A
coordenação da resposta entre todas as células do MLV é fundamental para a
modulação do tônus vascular. Apesar de aproximadamente 14 tipos de Cx
terem sido identificadas em mamíferos (Loewenstein, 1981), apenas 4
isoformas dessas proteínas são importantes no sistema cardiovascular (Cx37,
Cx40, Cx43, Cx45) (Haefliger et al., 1992). Dentre estas, a concentração de
113
Cx43 é particularmente a maior em tecidos vasculares (Bennett et al., 1991;
Yeh et al., 1998).
Apesar dos ratos DSA não apresentarem hipertensão, verificamos que
suas aortas isoladas exibem padrão de resposta semelhante ao de animais
hipertensos, como aumento da resposta para agonistas contráteis e
principalmente, a presença de contrações oscilatórias (Lamb & Webb 1989;
Tsai et al., 1995; Watts & Webb, 1996). Ainda mais, alguns estudos com
artérias de ratos simpatectomizados com reserpina demonstraram aumento da
sensibilidade a agonistas contráteis e intensas contrações oscilatórias (Slovut
et al., 2004). Segundo os autores, estas condições eram causadas pelo grande
aumento da expressão de Cx43 nos vasos desses animais. Dessa forma, as
alterações observadas em aortas de ratos DSA poderiam ser explicadas por
um aumento das junções comunicantes do tipo Gap.
De fato, as análises do RT-PCR mostraram haver um grande aumento
na quantidade de RNA mensageiro para Cx43 em aortas de ratos DSA. Dados
complementares obtidos pela técnica de Western blot mostraram que a Cx43
realmente está aumentada em aortas de ratos DSA. Um aumento no nível
dessa proteína poderia levar a um aumento na comunicação intercelular via
junções Gap; com mais proteína presente, mais hemicanais poderiam estar
sendo formados.
O aumento das junções do tipo Gap é apontado como um mecanismo
ideal para a sincronização de atividade elétrica e resposta contrátil coordenada
em artérias de animais hipertensos (Watts & Webb, 1996). No presente
trabalho, a possível causa para o aumento da resposta a agonistas contráteis
observadas em aortas de ratos DSA, pode ser o aumento das junções Gap,
114
como mostrado para aortas de ratos hipertensos DOCA-Sal (Watts & Webb,
1996) e para artérias caudais de ratos simpatectomizados com reserpina
(Slovut et al., 2004).
Os resultados de reatividade vascular obtidos no presente estudo
mostram alterações causadas pelos agonistas contráteis fenilefrina e
serotonina. O efeito máximo para estes agonistas foi maior em aortas de ratos
DSA. Vários autores demonstraram que nem a inervação perivascular, nem a
propagação do potencial de membrana são suficientes para garantir a ativação
uniforme das células mais profundas da camada muscular em muitos tipos de
vasos sanguíneos, principalmente de grande calibre (Hirst & Edwards, 1989;
Christ et al., 1993). Ainda, estudos mostram que é improvável que a difusão de
substâncias como neurotransmissores e outras moléculas vasoativas ocorra
através da camada média dos vasos de forma suficiente para ativar todas as
células (Burnstock et al., 1970; Christ, 1995). O aumento da resposta contrátil
máxima para fenilefrina e serotonina poderia ser resultado do maior número de
junções do tipo Gap ligando o citoplasma das células do MLV. Assim, mais
células poderiam ser recrutadas para participar da contração, resultando em
uma contração mais uniforme e uma maior força motriz (Christ et al., 1993). De
fato, o bloqueio das junções do tipo Gap com 18β-GA normalizou a resposta
aumentada para fenilefrina observada em aortas de ratos DSA. Estes
resultados corroboram com achados de Watts & Webb (1996), onde a
reatividade para serotonina é maior em ratos hipertensos, porém foi
normalizada pelo bloqueio das junções Gap com heptanol.
O influxo de Ca
2+
do meio extracelular para o meio intracelular pode
ocorrer segundo o modelo de influxo capacitivo, onde o influxo de Ca
2+
é
115
ativado pelo esvaziamento dos estoques intracelulares estimulados com
agonistas ou pela depleção dos estoques após inibição da Ca
2+
-ATPase do
retículo sarcoplasmático (Putney, 1986; Randriampita & Tsien, 1993).
Alterações neste mecanismo podem estar associadas com alterações na
função do MLV em diferentes modelos de hipertensão experimental. Dados da
literatura demonstram que em aortas de ratos normotensos, após depleção de
estoques intracelulares de Ca
2+
, durante o período de reestocagem do Ca
2+
, é
observado um desenvolvimento espontâneo de contração que independe da
interação com agentes vasoconstritores. Em nossos experimentos, houve
aumento na resposta contrátil estimulada por concentrações crescentes de
CaCl
2
e ativada com fenilefrina em aortas de ratos DSA, mostrando mais uma
vez que a resposta contrátil de aortas de ratos DSA está aumentada.
A contração causada pelo aumento da concentração de KCl no liquido
extracelular é independente de ativação de receptores. O KCl despolarização
da membrana plasmática das células do MLV, o que leva a abertura de canais
para Ca
2+
dependentes da voltagem causando a contração. Ao contrário dos
resultados obtidos para a contração induzida pelos agonistas fenilefrina e
serotonina, verificamos que a contração induzida por KCl foi semelhante em
aortas de ratos DSA quando comparadas com ratos SO. Este fato pode ser
explicado a partir dos achados de Christ e colaboradores (1993). Estes autores
encontraram que a contração induzida por agonistas depende das junções do
tipo Gap, uma vez que os bloqueadores dessas comunicações intercelulares
reduzem a resposta contrátil. Porém, o KCl, devido ao seu baixo peso
molecular e por estar em altas concentrações (aproximadamente 600.000
vezes maior que a fenilefrina) é capaz de se difundir pelos tecidos e penetrar
116
pela camada muscular em quantidade suficiente para contrair todas as células,
independentemente do trânsito através das junções do tipo Gap (Christ et al.,
1993; Christ, 1995). Por isso, o aumento das conexinas visto em aortas de
ratos DSA em nada facilitaria o efeito do KCl, que como mostrado nos
resultados, tem a eficácia semelhante em aortas de ratos DSA e SO.
No sistema vascular, canais para K
+
presentes na membrana do
músculo liso regulam o potencial de membrana. Sendo assim, a ativação de
canais para K
+
leva ao efluxo de K
+
e hiperpolarização da membrana das
células do MLV, promovendo a inativação dos canais para Ca
2+
sensíveis à
voltagem e conseqüentemente vasodilatação. No sistema vascular, diferentes
substâncias endógenas interferem com a função dos canais para K
+
, entre elas
os fatores endoteliais e segundos mensageiros intracelulares como GMPc e
AMPc. A inibição dos canais para K
+
determina a despolarização de membrana
promovendo vasoconstricção e favorecendo a despolarização induzida por
agentes contráteis (Nelson & Quayle, 1995).
Vários tipos de canais para K
+
têm sido identificados na membrana do
MLV. Estes canais têm um papel crucial na manutenção dos potenciais
elétricos através da superfície da membrana do músculo liso (Nelson & Quayle,
1995; Standen & Quayle, 1998). O potencial de membrana da célula é um
importante regulador da força de contração, controlando a entrada de íons Ca
2+
e também a liberação de Ca
2+
intracelular (Standen & Quayle, 1998). Por esta
razão, os canais para K
+
nas células do músculo liso estão ligados à regulação
do tônus contrátil e fatores que regulam a atividade dos canais para K
+
podem
influenciar de forma importante o tônus e também o diâmetro dos vasos e,
portanto, tem importante papel na resistência vascular.
117
Com o intuito de verificar possíveis alterações funcionais dos canais
para K
+
no MLV de aortas de ratos DSA e SO, realizamos curvas
concentração-resposta para o ativador de canais de K
+
sensíveis ao ATP
(K
ATP
), pinacidil, para o bloqueador seletivo para canais de K
+
do tipo retificador
(K
ir
), bário, e para o bloqueador não seletivo de canais para K
+
, tetraetilamônio
(TEA). Neste estudo, verificamos que o relaxamento provocado pela
hiperpolarização da membrana das células do MLV causada pela ativação dos
K
ATP
não está alterado em aortas de ratos DSA comparados com SO, uma vez
que o pinacidil apresentou potência e eficácia semelhantes em ambos os
grupos estudados.
A contração causada pela despolarização da membrana do MLV
provocada pelo TEA foi diferente entre os dois grupos estudados, no que se
refere à potencia da droga. Houve um desvio para direita em aortas do grupo
DSA, mostrando uma diferença nos valores de pD
2
, em relação ao grupo SO.
Sendo assim, talvez possa existir alguma diferença no que concerne à
integridade dos canais para K
+
sensíveis ao TEA em aortas de ratos DSA. Ou
ainda, estudos mostram que o TEA é também um ativador direto das junções
Gap em diferentes tecidos inclusive em MLV (Kannan & Daniel, 1978; Watts et
al., 1994). Como existe uma diferença em relação às junções do tipo Gap em
aortas de ratos DSA, este fato poderia explicar as diferentes respostas causada
pelo TEA, já que este composto também ativa com muita especificidade as
junções Gap. Provavelmente, deve ser este o motivo do efeito do TEA ser
diferente nos dois grupos de animais, uma vez que o cloreto de bário, que
também provoca despolarização de membrana (Quayle et al., 1997), mas não
afeta as junções Gap, teve efeito semelhante em aortas de ratos DSA e SO.
118
Em 1980, Furchgott & Zawadzki descreveram a função das células
endoteliais no relaxamento induzido por acetilcolina. O endotélio é importante
regulador do tônus vascular devido à síntese e liberação de substâncias
vasodilatadoras e vasocontrictoras. Além do NO (Palmer et al., 1987), outros
fatores relaxantes são liberados de células endoteliais, incluindo o EDHF (Chen
et al., 1988; Félétou & Vanhoutte, 1988) e prostaciclinas (Moncada & Vane,
1979). Fatores contráteis como prostanóides vasoconstrictores, espécies
reativas de oxigênio, endotelina e angiotensina também são liberados pelas
células endoteliais (Mombouli & Vanhoutte, 1999).
Os dados da literatura a respeito da participação do endotélio vascular
na resposta relaxante induzida por agonistas vasodilatadores como a
isoprenalina é conflitante. De acordo com White e colaboradores (1986), e
Brawley e colaboradores (2000), a resposta vasorelaxante da isoprenalina está
diminuída em aortas submetidas à remoção mecânica do endotélio. Segundo
Stephenson & Summers (1987) e Molenaar et al. (1988), existe uma importante
população de receptores β-adrenérgicos em células endoteliais. A ativação
desses receptores em células endoteliais induz a formação de AMPc
promovendo síntese de NO, o qual causa relaxamento do MLV via ativação de
GMPc, uma vez que esta resposta é inibida por seqüestradores de NO e
inibidores de GMPc (Greece et al., 1988; Toyoshima et al., 1988; Iranami et al.,
1996). Por outro lado, em nosso laboratório (Rascado & Bendhack, 2005) a
remoção do endotélio não alterou a resposta relaxante induzida pela
isoprenalina em aortas pré-contraídas com noradrenalina ou fenilefrina.
Resultados semelhantes foram relatados por outros autores (Konishi & Su,
1983; Satake et al., 1996).
119
Há algum tempo, pesquisadores demonstraram uma diminuição nas
respostas cardiovasculares a agonistas β-adrenérgicos após a DSA. Estudos in
vivo mostraram uma significante diminuição do efeito hipotensor causado pela
administração de doses crescentes de isoprenalina em cães (Damase et al.,
1987) e ratos (Vasquez & Krieger, 1982; Taira & Enero, 1990) que sofreram
DSA. Em nossos estudos, observamos menor relaxamento induzido pela
isoprenalina, em aortas de ratos DSA. Este é um fato nunca antes mostrado
em animais que apresentam LPA, apesar de ser evidenciado em muitos
trabalhos em animais hipertensos (Cauvin & Pegram, 1983; Dohi et al., 1991;
Bennet et al., 1993; Callera et al., 2004).
Considerando que mecanismos distintos em células endoteliais estão
envolvidos na síntese de fatores endoteliais, a participação do endotélio pode
ser diferente, dependendo de qual agente estimulante é aplicado nessas
células. Neste sentido, estudamos os efeitos relaxantes em aortas de ratos
DSA e SO com ou sem endotélio, pré-contraídas com PGF
2α
e sob prévio
bloqueio dos receptores α
1
-adrenérgicos com prazosim. Estes estudos
possibilitaram comparar a participação dos fatores endoteliais nessa resposta,
sem interferência de uma possível ativação de receptores α
1
-adrenérgicos pela
isoprenalina. Isto poderia ocorrer pelo fato da isoprenalina ser uma
catecolamina e em altas concentrações ativar receptores tanto β- como α-
adrenérgicos. A ativação de receptores α-adrenérgicos em células do MLV
poderia interferir na resposta relaxante da isoprenalina (Rascado & Bendhack,
2005).
Em aortas de ratos DSA e SO, a remoção do endotélio reduz o efeito
vasorelaxante da isoprenalina, indicando a importância do endotélio vascular
120
para esta resposta. Também observamos que o relaxamento máximo para
isoprenalina foi menor em aortas de ratos DSA comparados aos ratos SO.
O relaxamento induzido pelo agonista de β-adrenoreceptores
isoprenalina em aortas com endotélio, também é mediado por fatores
intrínsecos à musculatura lisa do vaso, uma vez que a retirada da camada
endotelial diminui, mas não abole por completo a resposta relaxante causada
pelo agonista. No entanto, as alterações na resposta máxima observadas em
aortas de ratos DSA envolvem mecanismos inerentes ao endotélio. Isto porque
apesar de diminuída a resposta para aortas sem endotélio, não foram
observadas diferenças em relação ao grupo DSA comparado ao grupo SO em
aortas sem endotélio vascular, que apresentou relaxamento similar nos dois
grupos, embora prejudicado pela falta da camada endotelial.
Em animais hipertensos, o relaxamento causado por ativação de β-
adrenoreceptores pode estar alterado por uma disfunção endotelial nos
diferentes mecanismos de sinalização intracelular que participam das respostas
induzidas por estes agonistas em aortas de animais hipertensos. Esta
afirmação é baseada no fato de que agentes estimulantes da cascata de
relaxamento via AMPc-PKA, como por exemplo forscolina e 8-Br-AMPc,
também está prejudicada em ratos hipertensos (Callera et al., 2004).
As diferenças observadas em animais DSA no que se refere ao
relaxamento ativado por agonista de β-adrenoreceptor, não se deve às
alterações nos mecanismos ativados pela isoprenalina para indução da síntese
de NO e outros fatores de relaxamento derivados do endotélio vascular. Nossa
afirmação tem como base a observação de que a forscolina, ativador direto da
adenilato-ciclase (Seamon & Daly, 1983), promove relaxamento semelhante
121
em aortas de ratos DSA e SO, mesmo em preparações com e sem endotélio
vascular. Além disso, a síntese de NO em células endoteliais e o relaxamento
dependente da via NO-GMPc está preservada em animais DSA, como
pudemos observar nos estudos de relaxamento induzido por acetilcolina e
nitroprussiato de sódio em aortas de ratos DSA e SO. Portanto, acreditamos
que a deficiência no relaxamento ativado por agonistas de β-adrenoreceptores
em aortas de ratos DSA se dá numa etapa anterior à ativação da adenilato
ciclase (que converte ATP em AMPc), já que não houve diferença no
relaxamento estimulado com forscolina.
Tanto a forscolina como a isoprenalina aumentam os níveis de AMPc,
porém as respostas a estes agentes parecem envolver diferentes mecanismos.
A forscolina promove relaxamento em aortas sem endotélio vascular, enquanto
que nestas condições, o relaxamento para o agonista isoprenalina foi muito
reduzido. Portanto, o relaxamento induzido pela forscolina é mediado por
mecanismos independentes do endotélio.
O relaxamento e a hiperpolarização de membrana via ativação de β-
adrenoreceptores envolvem a ativação de canais para K
+
(Randal & Mcculloch,
1995; Kitazono et al., 1997; Fujii et al., 1999; Callera et al., 2004) e a
deficiência nesses canais vem sendo considerada uma hipótese para explicar a
deficiência no relaxamento via β-adrenoreceptores. Em nossos estudos, o
prejuízo no relaxamento somente ocorreu quando o estímulo relaxante foi via
agonista e não ocorreu quando utilizamos o ativador direto de adenilato-ciclase.
Dessa forma, tentamos relacionar o prejuízo no relaxamento via ativação de β-
adrenoreceptores em aortas de ratos DSA, com alterações nos próprios
receptores, quer seja em relação à proteína G específica, quer seja sobre
122
população desses receptores. Estudos mais amplos, como de imuno-
histoquímica e análises de biologia molecular devem ser realizados para
podermos confirmar esta hipótese.
Como dito acima, a síntese de NO em células endoteliais mediada pela
estimulação colinérgica e o relaxamento dependente da via NO-GMPc está
inalterada em aortas de ratos DSA, como pudemos observar nos experimentos
de relaxamento induzidos por acetilcolina e nitroprussiato de sódio. Pórem,
estudos mostram que as junções do tipo Gap são fundamentais para o
relaxamento estimulado pelo acetilcolina. O bloqueio das junções do tipo Gap
com heptanol diminui aproximadamente 50% do relaxamento induzido pela
acetilcolina em aortas de ratos (Javid et al., 1996) e artéria mesentérica
superior de ratos (Watts et al., 1994). O bloqueador de junções Gap 18β-GA
também reduz o relaxamento dependente do endotélio em aortas de cobaia
(Fukuta et al., 1999).
Os resultados do presente estudo realizados com animais SO
corroboram com estes antigos achados, onde o heptanol e o 18β-GA reduzem
o relaxamento dependente do endotélio em artérias de ratos.
Interessantemente, em preparações de ratos DSA, o heptanol não causa
redução no efeito máximo estimulados com acetilcolina. O efeito do heptanol
nestas preparações foi apenas de deslocar a curva de relaxamento para direita,
mas não alterou o efeito máximo. Nós acreditamos que a quantidade
aumentada das junções Gap, estaria envolvida nesta resposta diferente obtida
em aortas de ratos DSA e SO em relação ao efeito do heptanol sobre o
relaxamento induzido pela acetilcolina.
123
O bloqueio das junções Gap com 18β-GA causou inibição ainda mais
acentuada do relaxamento induzido pela acetilcolina. Isto talvez deva ocorrer
devido à sua maior especificidade em bloquear as junções do tipo Gap do que
o heptanol. Porém, um fato importante é de que o 18β-GA quase
completamente aboliu o relaxamento causado pela acetilcolina em aortas de
ratos SO, enquanto que esta inibição do relaxamento causado por este
bloqueador das junções gap foi menos aparente em aortas de ratos DSA.
Apesar de muitos autores mostrarem a dependência das junções do tipo
Gap para o relaxamento dependente do endotélio em grandes vasos, o
mecanismo de como esta modulação ocorre não é claro. Uma explicação é que
a dependência da via NO/GMPc sobre as junções Gap existe em um estágio
anterior à ativação da guanilato ciclase pelo NO. Porém, é duvidoso que o NO
atravesse por meio das junções Gap, visto que este radical livre é marcado
pela sua alta solubilidade e livre difusão entre as membranas (Wanstall et al.,
2001). Christ e colaboradores (1994), demonstraram em tecidos periféricos que
o relaxamento induzido pelo NO é dependente, sobretudo da difusão do GMPc
através das junções Gap. Ainda, muitos trabalhos têm mostrado um importante
fluxo de íons como Ca
2+
e segundos mensageiros como IP
3
das céluas do MLV
para as células do endotélio através das junções do tipo gap, e que o IP
3
formado nas células do MLV seria também responsável por aumentar Ca
2+
e
induzir a formação de NO nas células endoteliais (Dora et al., 1997; Budel et
al., 2001; Lamboley et al., 2005). Com o bloqueio das junções gap, o fluxo de
Ca
2+
e IP
3
do MLV para o endotélio estaria prejudicado, o que levaria a perda
de eficácia dos agentes vasorelaxantes dependentes do endotélio. Apesar de
achar estas hipóteses razoáveis, não queremos especular sobre o mecanismo
124
pelo qual a inibição das junções Gap reduz o relaxamento para acetilcolina.
Consideramos importante salientar que nossos experimentos mostraram que
em aortas de ratos DSA esta inibição é atenuada, possivelmente devido à
maior expressão de Cx43 nestes vasos.
125
6.2 – Estudo das contrações oscilatórias em aortas de ratos DSA
Os ratos são muito utilizados em estudos do sistema circulatório e
muitas informações são disponíveis sobre o comportamento de grandes vasos
como aorta, nesta espécie animal. No nosso laboratório, iniciamos estudo com
aortas isoladas de ratos DSA para exploração farmacológica das funções
contráteis e relaxantes nesses vasos, de forma que comparações pudessem
ser feitas na reatividade vascular. Durante o curso destes estudos, foi
observado que aortas de ratos DSA exibem contrações oscilatórias
espontâneas ou que este comportamento oscilatório pode ser iniciado com
estímulo contrátil por vários agentes. Este comportamento oscilatório
raramente ocorria em aortas de ratos SO.
O efeito das contrações oscilatórias em artérias e veias é atualmente
controverso e conseqüentemente seu significado fisiológico ainda deve ser
definido corretamente. Na tentativa de explicar estes mecanismos, muitos
estudos descreveram um papel crítico dos canais para Ca
2+
voltagem-
dependente (Hayashida et al. 1986; Omote & Mizusawa, 1996) e também
mostraram que contrações oscilatórias foram precedidas por oscilações no
potencial de membrana (Hashitani et al., 1996; Gokina et al., 1996; Oishi et al.,
2002). Porém, outros autores demonstraram que oscilações na concentração
de Ca
2+
intracellular, envolvendo principalmente a liberação do retículo
sarcoplasmático (RS), precedem as contrações rítmicas (Mauban et al., 2001;
Haddock & Hill, 2002; Takenaka et al., 2003; Burt, 2003).
O primeiro relato de atividade oscilatória em MLV foi feito há mais de
150 anos atrás por Jones (1852). Neste estudo, o autor verificou que veias da
126
asa de morcegos apresentam contrações rítmicas. Apesar desta antiga
descoberta, ainda não sabemos a real razão pelas quais alguns leitos
vasculares apresentam contrações oscilatórias e qual seu significado
fisiológico.
Oscilações no tônus ou diâmetro vascular podem ser vistas em muitos
segmentos vasculares. Estes eventos freqüentemente registrados in vitro,
também podem acontecer in vivo (Bartlett et al., 2000; Fujii et al., 1990; Meyer
et al., 1987) em alguns leitos vasculares e este fenômeno oscilatório não é
conseqüência da contração cardíaca, respiração ou descargas neuronais
(Schechner & Braverman, 1992; Porret et al., 1995). Outros investigadores
relatam que a incidência de eventos contráteis espontâneos esta aumentada
em preparações vasculares isoladas de animais hipertensos (Holloway & Bohr,
1973; Shimamura et al., 1999; Myers et al., 1985; Sunano et al., 1994).
Desnervação sino-aórtica é freqüentemente realizada para explorar as
funções fisiológicas ou patológicas dos baroreceptores arteriais no controle da
pressão arterial. Como já discutido, os ratos DSA não apresentam hipertensão
a longo prazo (Saito et al., 1986; Alper et al., 1987; Eto et al., 2003). Em nossos
estudos, um fato curioso é que aortas isoladas de ratos após a cirurgia de DSA,
apresentam contrações oscilatórias. Ainda não podemos afirmar se estas
oscilações são responsáveis pela LPA observada in vivo, mas os achados
principais desse estudo indicam que os ratos com LPA apresentam contrações
oscilatórias na aorta isolada, mesmo na ausência de estímulos químicos.
Muitos estudos analisaram oscilações rítmicas em grandes artérias como aorta.
Porém, estes autores tiveram que induzir as oscilações com a aplicação de
estímulos químicos como altas concentrações de K
+
, catecolaminas, baixas
127
concentrações de magnésio ou bloqueio de canais iônicos (Biamino &
Kruckenberg, 1969; Altura & Altura, 1974; Myers et al., 1985; Wu et al., 2000).
Em nosso estudo, freqüentemente as contrações oscilatórias em aortas
isoladas de ratos DSA começavam logo após a aplicação de algum agente
contrátil, como fenilefrina, angiotensina II, KCl, serotonina ou PGF
2α
. Ainda, a
maioria das preparações exibiram contrações oscilatórias espontâneas durante
o período de estabilização, sem qualquer adição de agente contrátil. Porém,
estas contrações espontâneas eram menos intensas e desapareciam logo que
as preparações eram lavadas ou o teste de viabilidade das preparações
(fenilefrina EC
50
+ Acetilcolina EC
50
) era aplicado.
De acordo com nossos testes, de todos os agentes contráteis usados
para induzir as oscilações, fenilefrina foi o mais apropriado, uma vez que as
contrações oscilatórias permaneciam estáveis por mais tempo. Então, para
indução de contrações oscilatórias, foi utilizado fenilefrina em pequenas
alíquotas, chegando a uma faixa de concentração de 2 a 15 nM, até que as
oscilações permanecessem estáveis. Em aortas de ratos DSA, a atividade
oscilatória era potencializada pela remoção do endotélio. Além disso, a
concentração de fenilefrina capaz de induzir as oscilações foi sempre maior em
preparações com endotélio vascular íntegro.
Como discutido anteriormente, o endotélio pode modular as respostas
do músculo liso subjacente a uma variedade de estímulos (Toda, 1980;
Furchgott, 1983; Blanco-Rivero et al., 2005). Também foi demonstrado que
contrações oscilatórias em artérias de algumas espécies dependem da
integridade do endotélio, como aortas de hamster (Jackson, 1988) e artéria
auricular de coelhos (Omote & Mizusawa, 1993). Além disso, contrações
128
oscilatórias em aortas de hamster são mediadas pela liberação contínua de NO
endotelial e de elevações nas concentrações de GMP cíclico no MLV (Jackson
et al., 1991). Diferentemente disto, o endotélio intacto tem efeitos inibitórios
sobre as contrações oscilatórias em aortas de ratos de SHR (Sunano et al.,
1994) e em artéria basilar canina, onde a remoção de endotélio reduz, mas não
abole as oscilações (Katusic et al., 1988). Com base nestas contraditórias
observações, podemos analisar que o endotélio tem efeitos distintos sobre as
oscilações em artérias isoladas, dependendo do leito e do animal estudado.
O aumento na sensibilidade para agonista de α
1
-adrenoreceptores
observada em preparações sem endotélio verificada no presente trabalho,
corrobora com relatos de outros autores que utilizaram várias espécies
animais. Alguns trabalhos mostram a liberação tônica de NO e de EDHF, além
de prostanóides (Bullock et al., 1986; Martin et al., 1986; Jackson, 1988). O
endotélio é conhecido por produzir e liberar substâncias contráteis e relaxantes
em condições basais (Griffith et al., 1984; Vanhoutte et al., 1986) e em resposta
a uma variedade de estímulos químicos (Furchgott, 1984; Peach et al., 1985;
Bullock et al., 1986). Assim, há várias possíveis vias que um fator derivado do
endotélio poderiam afetar a tensão e também as contrações oscilatórias em
preparações de músculo liso.
A literatura nos fornece informações contraditórias a respeito do papel
do endotélio sobre contrações oscilatórias, devido ao grande número de
resultados conflitantes de diferentes grupos de pesquisa, e às vezes,
envolvendo o mesmo leito vascular. A influência do endotélio diverge entre as
preparações. Em algumas artérias, a eliminação do endotélio ou o bloqueio da
produção de NO com análogos da L-Arginina, inibe as contrações oscilatórias,
129
como no caso de aortas de hamsters (Jackson, 1988), artéria basilar de cão
(Katusic et al., 1988), circulação cutânea humana (Kvandal et al., 2003),
artérias mesentéricas de coelhos e ratos (Omote et al., 1993; Akata et al.,
1995; Gustafsson, 1993; Huang & Cheung, 1997; Mauban et al., 2001; Peng et
al., 2001; Okazaki et al., 2003) e artérias coronárias de coelhos (Akata et al.,
1995). Estes trabalhos evidenciam o importante papel do NO em induzir as
contrações oscilatórias. Porém, em alguns leitos vasculares isolados o NO
endotelial tem efeito inibitório sobre as contrações oscilatórias e sob estas
condições, é improvável que seja o NO o responsável pelas contrações
oscilatórias (Watts et al. 1994; Tsai et al. 1995; Huang & Cheung, 1997; Hill et
al. 1999, 2004; Sell et al. 2002; Okazaki et al. 2003; Mauban & Wier, 2004).
Ainda mais, em algumas situações, a presença ou ausência do endotélio se
mostra indiferente, quanto à presença de contrações oscilatórias, como é o
caso de artérias mesentéricas de coelhos (Omote et al., 1993) e artérias
coronárias de porcos (der Weid & Beny, 1993).
Em nosso trabalho verificamos que o NO endotelial exerce um efeito
inibitório sobre as contrações oscilatórias, uma vez que L-NAME, inibidor da
NO sintase, e a oxihemoglobina, seqüestrador de NO, causaram aumento da
freqüência e amplitude das oscilações, elevando-as a níveis semelhantes aos
observados em aortas sem endotélio. Ainda mais, o papel do NO como
modulador negativo sobre as oscilações ficou evidenciado pelo uso de ODQ,
inibidor específico da guanilato-ciclase solúvel. Após adição de ODQ, aortas
com endotélio intacto passam a exibir freqüência e amplitude de oscilações de
forma semelhante às preparações sem endotélio, mostrando que esta resposta
inibitória do NO se dá via ativação de guanilato ciclase.
130
O NO derivado do endotélio tem sido apontado como o responsável por
mediar as contrações oscilatórias em vários leitos vasculares. O NO aumenta
os níveis de GMPc como resultado da ativação da guanilato-ciclase (Ignarro &
Kadowitz, 1985). A elevação dos níveis de GMPc promove eventos afim de
diminuir a concentração citoplasmática de Ca
2+
, aumentando o armazenamento
no RS e causando o efluxo deste íon através da membrana plasmática
(Popescu et al., 1985; Twort & Van Breeemen, 1988). Apesar destes
mecanismos estarem muito bem descritos, o mecanismo pelo qual o NO induz
as contrações oscilatórias em alguns leitos, enquanto em outros tem efeito
inibitório, ainda deve ser desvendado.
Em nosso trabalho, a remoção do endotélio aumentou tanto a amplitude
quanto a freqüência das oscilações. Este efeito parece não ser devido à
liberação dos prostanóides endoteliais, uma vez que a indometacina não
alterou os padrões de oscilação presentes em preparações com endotélio
íntegro. Embora nossos dados sugiram que o endotélio é capaz de inibir as
oscilações de forma independente dos prostanóides, é interessante o fato de
que alguns trabalhos demonstrem que a atividade oscilatória parece ser
causada pela contínua liberação de substâncias derivadas do endotélio e isto
está ligado fortemente ao efeito dos prostanóides sobre as contrações
oscilatórias (Miller & Vanhoutte, 1985; Luscher & Vanhoutte, 1986; Auch-
Schwelk et al., 1989; Pagano et al., 1991; Chemtob et al., 1992). Porém, em
alguns leitos vasculares a indometacina não tem efeito sobre as contrações
oscilatórias, como em artérias da orelha de coelhos (Omote & Mizusawa,
1993). Com nossos experimentos, podemos afirmar que os prostanóides não
131
participam da modulação negativa do endotélio sobre as contrações
oscilatórias em aortas de ratos DSA.
A importância dos diferentes tipos de canais para K
+
é freqüentemente
relatada em estudos de reatividade vascular. Estes canais exercem um papel
crucial na manutenção das propriedades elétricas através da superfície da
membrana plasmática das células musculares. Além disso, o potencial de
membrana regula a força de contração por meio de controle do fluxo iônico
através da membrana plasmática (Nelson & Quayle, 1995; Standen & Quayle,
1998). Em células de MLV, os canais para K
+
estão ligados à regulação do
tônus contrátil e drogas que interferem na atividade desses canais podem
controlar o tônus muscular.
No presente trabalho, examinamos a contribuição dos diferentes tipos de
canais para K
+
, através do uso de diferentes moduladores desses canais sobre
a regulação das contrações oscilatórias em aortas isoladas de ratos DSA.
Nossos resultados indicam que os diferentes tipos de canais para K
+
contribuem para a geração das oscilações por afetar a tensão basal das
preparações, freqüência e amplitude das contrações oscilatórias. Alguns
estudos indicam que as contrações oscilatórias refletem alterações nas
propriedades da membrana que podem tornar as células do músculo liso mais
excitáveis que o normal. É bem descrito que tanto a permeabilidade iônica
quanto o gradiente de concentração iônica são importantes determinantes do
potencial de membrana e nível de excitação no MLV (Benham & Bolton, 1986;
Peng et al., 2001; Oishi et al., 2002). Ainda, os canais para K
+
podem exercer
um papel importante, como já discutido, sobre as contrações oscilatórias. Além
disso, para as oscilações no tônus vascular causadas pela liberação de Ca
2+
132
do RS, os canais para K
+
podem estar envolvidos, visto que as oscilações são
freqüentemente afetadas por bloqueadores dos canais para K
+
(Huang &
Cheung, 1997; Wu et al., 2000; Imai et al., 2001; Kiyoshi et al., 2003). Embora
isto demonstre a influência dos canais para K
+
, também indica que estes canais
não são elementos essenciais na manutenção das oscilações, uma vez que a
maioria dos bloqueadores de canais de K
+
são incapazes de inibir as
contrações oscilatórias (Omote & Mizusawa, 1993; Huang & Cheung, 1997;
Kiyoshi et al., 2003).
A inibição dos canais para K
+
com tetraetilamônio (TEA), um bloqueador
não seletivo de canais para K
+
, foi responsável por promover contrações
oscilatórias em muitas preparações isoladas (Kannan & Daniel, 1978; Watts et
al., 1994; Wu et al., 2000; Haddock & Hill, 2002; Kamouchi et al., 2002). Uma
possível explicação para isto é de que o TEA reduz a condutância da
membrana plasmática, tornando-a mais excitável que o normal. Um outro
mecanismo sugerido é que o TEA causa ativação, promovendo abertura de
junções Gap no MLV (Kannam & Daniel, 1978; Sheppard & Meda, 1981; Watts
et al., 1994) e isto poderia induzir contrações oscilatórias.
Dentre os moduladores de canais para K
+
testados no presente trabalho,
a inibição das oscilações foi mais pronunciada pelo pinacidil, uma droga
conhecida por ativar canais para K
+
sensíveis a ATP (K
ATP
). De fato, nossos
resultados indicam que as oscilações em aortas de ratos DSA são sensíveis ao
pinacidil. Por outro lado, quando testamos o TEA, as contrações oscilatórias
foram potencializadas. Dessa forma, o papel dos diferentes tipos de canais
para K
+
sobre as oscilações foi fortemente sugerido. Em nossos estudos,
também verificamos que o verapamil rapidamente aboliu as contrações
133
oscilatórias, além de abolir a fase tônica da contração causada pelo TEA,
revertendo o aumento da tensão causada pelo TEA para a linha de base. Estes
resultados apontam que o influxo de Ca
2+
via canais dependentes da voltagem
exerce papel importante na geração e manutenção das oscilações,
demonstrando a dependência do Ca
2+
extracelular.
Os canais para K
+
dependentes de voltagem (K
v
) pertencem à
superfamília dos canais iônicos dependentes de voltagem, que são ativados
pela corrente despolarizante na membrana do músculo liso. Em músculo liso
arterial, existem evidências de que este tipo de canal contribui ativamente para
manutenção da tensão de repouso da membrana plasmática (Standen &
Quayle, 1998). Em alguns tipos de músculos lisos, assim como na veia porta
(Hara et al., 1980) e bexiga urinária de cobaia (Imai et al., 2001), a 4-AP
(bloqueador seletivo de K
v
) aumenta drasticamente a freqüência das oscilações
contráteis. Por outro lado, em nossos estudos os efeitos da 4-AP sobre a
atividade oscilatória em aortas isoladas de ratos DSA foram brandos, causando
somente aumento na tensão basal sem afetar a freqüência e a amplitude das
contrações.
Os canais para K
+
do tipo retificador (K
ir
) são expressos no MLV,
sugerindo seu potencial papel na regulação do tônus (Nelson & Quayle, 1995).
K
ir
vasculares são muito sensíveis ao cloreto de bário (Imai et al., 2001; Rivers
et al., 2001; Schubert et al., 2004). Em tecidos vasculares intactos,
concentrações próximas de 30 µM de cloreto de bário inibem seletivamente
estes canais no MLV (Quayle et al., 1997; Imai et al., 2001; Tep-areenan et al.,
2003; Woodman & Boujaoude, 2004). É amplamente aceito que o bloqueio dos
canais para K
+
produz despolarização da membrana celular e contração
134
muscular. Em nossos estudos, a adição de bário causou tanto aumento na
tensão basal quanto interrupção das oscilações, mostrando que em aortas de
ratos DSA existe um possível envolvimento de K
ir
, pelo menos em relação às
contrações oscilatórias. Com os dados até aqui obtidos, não podemos ainda
inferir qual seria a contribuição dos K
ir
sobre as oscilações, uma vez que o
aumento do tônus pode ter “mascarado” as oscilações, prejudicando o período
de relaxamento de cada ciclo das contrações oscilatórias. Apesar da intensa
contração tônica causada pelo bloqueio de K
ir
, os efeitos do bário foram
rapidamente revertidos e a tensão retornou para a linha de base tão logo as
preparações foram lavadas com nova solução nutritiva.
Os K
ATP
são caracterizados pela sua sensibilidade metabólica, sendo
identificados e nomeados pelo fato de serem sensivelmente inibidos por ATP
intracelular. A ativação de K
ATP
tem pouca ou nenhuma dependência da
voltagem e a concentração de ATP citoplasmático pode modulá-lo. Porém, os
níveis de ATP em células do MLV são freqüentemente bem estáveis, na faixa
de concentração milimolar (Standen & Quayle, 1998). Pelo fato de que a
amplitude das oscilações contráteis em aortas de ratos DSA foi atenuada pela
glibenclamida (inibidor seletivo de K
ATP
) e totalmente abolida quando as
preparações foram incubadas com pinacidil (ativador de K
ATP
), o papel dos K
ATP
sobre as oscilações foi questionado.
O Ca
2+
intracelular tem um papel fundamental na regulação
eletromecânica do músculo, incluindo MLV. Além disso, a concentração
citoplasmática de Ca
2+
pode modular outros canais iônicos, como canais para
K
+
ativados por Ca
2+
(K
Ca
) (Standen & Quayle, 1998). K
Ca
também podem
contribuir para a manutenção do potencial de membrana no músculo liso. Um
135
importante alvo para o Ca
2+
pode ser os canais para K
Ca
de baixa condutância
(SK). SK
Ca
possuem propriedades dependentes do complexo Ca
2+
-calmodulina
(Standen & Quayle, 1998; Imai et al., 2001). O bloqueio de SK
Ca
com apamina
(bloqueador seletivo de SK
Ca
) não alterou os padrões analisados das
oscilações. Por este motivo, excluímos a participação desde tipo de canal
iônico na regulação das contrações oscilatórias. Estes resultados sugerem
então que SK
Ca
não devem participar das oscilações em aortas de ratos DSA.
Outro K
Ca
estruturalmente distinto é o K
Ca
de alta condutância (BK
Ca
), os
quais são bloqueados seletivamente por iberiotoxina. BK
Ca
é conhecido por
exercer importante papel fisiológico na fase de repolarização do potencial de
ação (Standen & Quayle, 1998; Imai et al., 2001). Alguns estudos mostram que
BK
Ca
exerce importante papel no controle das oscilações em algumas
preparações de músculo liso, assim como artéria auricular de coelhos (Omote
& Mizusawa, 1993), bexiga urinária de coelhos (Imai et al., 2001), traquéia de
cobaias (Yagi et al., 2002, 2003) e artéria mesentérica de ratos (Huang &
Cheung, 1997). Da mesma forma, em nosso estudo a inibição dos BK
Ca
com
iberiotoxina alterou as contrações oscilatórias, aumentando a freqüência e
diminuindo a amplitude. Dessa maneira, sugerimos que devido à importância
de BK
Ca
na manutenção da tensão de repouso da membrana plasmática, seu
bloqueio afeta as contrações oscilatórias em aortas de ratos DSA, elevando
conseqüentemente o tônus vascular.
Nossa hipótese a respeito dos K
Ca
influenciando as oscilações, é de que
após ativação do receptor pelo agonista, a concentração de Ca
2+
do citoplasma
é aumentada, causando a contração. Porém, esta elevação do Ca
2+
citoplasmático poderia ativar os BK
Ca
, promovendo efluxo de K
+
.
136
Conseqüentemente ao efluxo de K
+
, ocorreria uma fase de hiperpolarização da
membrana celular, diminuição da excitabilidade e promovendo relaxamento
pela redução do influxo de Ca
2+
via canais dependentes da voltagem (neste
período, estaríamos observando a fase ascendente da oscilação). Como a
concentração intracelular de Ca
2+
foi reduzido, os BK
Ca
deixariam de ser
ativados e voltaria para o estado inativo, o que permitiria outro ciclo de
contração e relaxamento, já que fenilefrina estaria ainda disponível na solução,
promovendo a ativação dos receptores. Com o bloqueio de BK
Ca
, o efluxo de
K
+
é inibido, o que promoveria o aumento do tônus e uma dificuldade de
estabelecer a fase de relaxamento das oscilações.
Neste trabalho, mostramos que os diferentes tipos de canais para K
+
podem exercer diferentes efeitos sobre a tensão, amplitude e freqüência das
oscilações em aortas de ratos DSA.
Dentro do ilimitado número de sinais intracelulares, o íon Ca
2+
constitui
um segundo mensageiro muito importante que controla uma ampla variedade
de processos celulares, em particular a modulação de vias metabólicas, a
síntese de hormônios e contração muscular (Carafoli, 1987). Em particular para
contração muscular, as fontes de Ca
2+
podem ser de origem intracelular,
extracelular ou ambas. Dessa forma, os íons Ca
2+
são encontrados em quatro
diferentes estoques: extracelular, citoplasmático, mitocondrial e não
mitocondrial (retículo sarcoplasmático). O RS e a mitocôndria são considerados
os principais estoques intracelulares de Ca
2+
. Assim, além do retículo, a
mitocôndria também participa no tamponamento destes íons (Thomas et al.,
1996).
137
A relação entre ativação de receptores e liberação de cálcio intracelular
recebeu maior atenção com os estudos de mobilização de cálcio via trifosfato
de inositol (IP
3
) e diacilglicerol (DAG) (Berridge, 1987; Carafoli, 1987; Putney,
1986). Estes autores propuseram um modelo envolvendo mecanismos e vias
de influxo de cálcio pela ativação dos receptores por agonistas seletivos. O
influxo de cálcio pode ocorrer por canais operados por receptores, canais
operados por receptores acoplados à proteína G e/ou ativado por liberação de
cálcio (Carafoli, 1987). A contração do MLV em resposta à ativação de
adrenoceptores alfa-1 pode ser explicada pelo aumento na concentração
intracelular de cálcio, devido ao influxo de cálcio e/ou liberação do cálcio
intracelular. A ativação dos receptores alfa 1-adrenérgicos promove ativação da
proteína Gq que ativa a fosfolipase-C (PLC). A ativação da PLC promove
hidrólise de fosfolipídeos de membrana dando origem a dois mensageiros
secundários: fosfatidilinositol 1,4,5 trifosfato (IP
3
) e diacilglicerol (DAG),
responsáveis pelo aumento dos níveis intracelulares de cálcio.
O estudo das contrações oscilatórias em preparações de MLV e não
vascular sempre dão ênfase ao papel dos estoques intracelulare de Ca
2+
e
sobre o influxo de Ca
2+
por diferentes vias, quer seja por canais iônicos,
trocadores ou bombas.
Neste estudo, evidenciamos a importante participação do RS sobre as
contrações oscilatórias. A liberação de Ca
2+
mediada por receptores de IP
3
parece ser importante via para inicio ou manutenção das oscilações, uma vez
que 2-APB, antagonista de receptores IP
3
do retículo sacoplasmático
(Mayuyama et al., 1997; Ascher-Landberg et al., 1999), aboliu as oscilações.
Alguns trabalhos em preparações de musculatura lisa mostram que as
138
contrações oscilatórias em músculo liso são mediadas pelo IP
3
e abolidas por
2-APB (McCarron et al., 2002, 2004). O IP
3
ativa os receptores de IP
3
do RS,
apesar de recentes estudos mostrarem que estes receptores podem ser
ativados pelo Ca
2+
intracelular, mesmo em ausência de IP
3
(Bootman et al.,
2002). No nosso estudo, mesmo após seu bloqueio com 2-APB, alta
concentração de fenilefrina é capaz de aumentar o tônus muscular em aortas
de ratos DSA. Porém, mesmo com aumento do tônus, as contrações
oscilatórias não ocorreram, o que demonstra que o 2-APB não inibe as
oscilações simplesmente por inibir a ação do agente contrátil sobre a
preparação. Este resultado mostra também que o 2-APB usado em
concentrações muito baixas, como no nosso estudo, provavelmente não atua
de outro modo senão pela inibição dos receptores de IP
3
de RS. Por outro lado,
vários trabalhos evidenciam seu efeito bloqueador de canais para Ca
2+
dependentes e independentes da voltagem (Asceher-Landberg et al., 1999;
Gregory et al., 2001). Porém, para o 2-APB agir de modo inibitório sobre os
canais para Ca
2+
da membrana plasmática, concentrações ≥100 µM devem ser
empregadas (Peppiat et al., 2003), o que não foi o caso do nosso estudo.
Rianodina possui efeito inibitório sobre os receptores de rianodina do RS
(Zuchi et al., 1997). Em condições normais, após estímulo contrátil, Ca
2+
intracelular parece ser mobilizado primeiramente via receptores de IP
3
, seguido
então pela liberação de Ca
2+
induzidas por Ca
2+
via receptores de rianodina
(Bers, 2002). Aqui, os receptores de rianodina mostram papel fundamental no
controle das contrações oscilatórias. Um ponto a ser discutido é se o bloqueio
dos receptores de rianodina pode inibir as oscilações simplesmente por causar
a perda do tônus contrátil necessário para manutenção das oscilações. Mais
139
uma vez, o efeito inibitório sobre os receptores de rianodina não pode ser
atribuído à simples perda de tônus causada pela droga, pois preparações
incubadas com rianodina, desencadeiam contração tônica frente ao estímulo
de receptores α
1
-adrenérgicos, porém sem apresentar oscilações, o que
fortalece a hipótese de que a liberação de Ca
2+
pelos receptores de rianodina é
de fundamental importância para a manutenção/geração das oscilações.
Além dos receptores de IP
3
e de rianodina, a Ca
2+
ATPase reticular
possui importantes funções no comportamento oscilatório em preparações de
músculo liso (Moffatt & Cocks, 2004; Kiyoshi et al., 2003). Aqui, vimos que o
armazenamento de Ca
2+
via Ca
2+
-ATPase reticular, que é inibido pela
tapsigargina, exerce forte influência sobre as oscilações em aortas de ratos
DSA, sugerindo, mais uma vez que a liberação de Ca
2+
do RS é fundamental
para o aparecimento das contrações oscilatórias. Estes resultados corroboram
com outros estudos que mostraram a interrupção das contrações oscilatórias
quando se inibe tanto a liberação de Ca
2+
quando o armazenamento de Ca
2+
pelo retículo sarcoplasmático (Griffth & Edward, 1997; Gustafsson & Nilson,
1993; Peng et al., 2001).
Como já discutimos, a inibição da Ca
2+
-ATPase reticular inibe as
oscilações em muitos tipos de preparações de músculo liso, sugerindo que o
fornecimento de Ca
2+
para as contrações é dependente do RS. Neste estudo, o
fornecimento de Ca
2+
dos estoques intracelulares é fundamental para as
oscilações. Porém, outros estudos mostraram que em algumas preparações,
as contrações oscilatórias ocorrem mesmo na ausência de Ca
2+
extracelular
(Lino et al., 1994; Ruehlmann et al., 2000; Peng et al., 2001).
140
Em nossos estudos, evidenciamos que o influxo de Ca
2+
é tão
necessário para manutenção das oscilações quando a liberação dos estoques
internos. Isto foi evidente, uma vez que o verapamil, um bloqueador de canais
para Ca
2+
dependentes da voltagem, mesmo em concentrações baixas,
bloqueou as oscilações e, ainda mais, que o Bay K 8644, ionóforo de Ca
2+
,
aumentou a freqüência das oscilações. Além disso, as contrações oscilatórias
não ocorreram em meio Zero-Ca
2+
. Estas observações estão de acordo com
outros autores que evidenciaram a contribuição fundamental do Ca
2+
extracelular para as contrações oscilatórias em diferentes tipos de leitos
vasculares (Lamb et al., 1985; Myers et al., 1985; Hayashida et al. 1986; Omote
& Mizusawa, 1996; Jaggar et al., 2000; Haddock & Hill, 2002; Kiyoshi et al.,
2003; Moffatt & Coks, 2004).
Em preparações vasculares isoadas, as oscilações no tônus são sempre
acompanhadas por um aumento seguido de declínio na concentração de Ca
2+
intracelular. A fase de declínio pode ser vista como a combinação da
diminuição da liberação e influxo de Ca
2+
somado à ativação da reestocagem
ou efluxo do Ca
2+
citoplasmático. A fase ascendente das contrações
oscilatórias sempre recebeu maior enfoque, evidenciando a participação do RS
e influxo via canais dependentes ou independentes de voltagem. O mecanismo
responsável pela ativa remoção do Ca
2+
citoplasmático tem sido menos
intensamente investigado, comparado com os mecanismos de liberação.
Segundo Lee e colaboradores (2001), os prováveis candidatos são: bomba de
Ca
2+
-ATPase tanto da membrana plasmática como do RS e o trocador
Na
+
/Ca
2+
.
141
O trocador Na
+
/Ca
2+
é constitutivamente expresso em células do MLV
(Juhaszova et al., 1994; Quednau et al., 1997) e nestas células, pode funcionar
de modo “forward” o qual transporta Ca
2+
para fora de célula e de modo
“inward”, o que transporta Ca
2+
para o interior da célula (Schneider et al.,
2002). Em nossos estudos, o trocador Na
+
/Ca
2+
parece não exercer nenhum
efeito fundamental para as oscilações, uma vez que o DMB, inibidor do
trocador Na
+
/Ca
2+
, não teve efeito sobre as oscilações.
A possibilidade de que as oscilações poderiam ser dependentes do fluxo
de cloreto através da membrana foi considerada nos experimentos usando
NPPB, o qual seletivamente bloqueia os canais de Cl
-
(Jiang et al., 2003).
Estudo mostram que em MLV os canais de Cl
-
podem ser estimulados por Ca
2+
citoplasmático e portanto, no músculo liso, os canais de Cl
-
são fundamentais
nos eventos de manutenção do potencial de membrana. Os antagonistas de
canais de Cl
-
abolem as oscilações no potencial de membrana, contrações
oscilatórias e hiperpolariza a membranas das células do MLV (Haddock & Hill,
2002). De fato, as contrações oscilatórias em respostas a agonistas contráteis
foram abolidas com o bloqueio dos canais de Cl
-
em ducto torácico de porco
(Moffatt & Cocks, 2004) e veia porta de rato (Burt, 2005). Porém, em aortas de
ratos DSA, o efluxo de Cl
-
através destes canais não parecem participar da
manutenção das oscilações, uma vez que NPPB não teve nenhum efeito
nestas preparações.
Como discutido anteriormente, heptanol exerce um efeito bloqueador e
reduz a probabilidade de que as junções do tipo Gap se mantenham no estado
aberto (Takens-Kwak et al., 1992). No presente estudo, sugerimos que as
142
junções Gap são importantes e fundamentais para a geração/manutenção das
contrações oscilatórias.
Uma variedade de substâncias que inibem as junções Gap foi mostrada
como tendo efeito inibitório em oscilações no tônus de músculo liso isolado
(Tsai et al., 1995; Chaytor et al., 1997; Sell et al., 2002; Palani & Manchanda,
2006). Ainda mais, De Wit e colaboradores (2003), demonstraram que animais
“Knockout” para conexina 40 (proteínas que formam junções Gap) não
apresentavam contrações oscilatórias em suas arteríolas isoladas, o que
ocorre em 100% dos animais selvagens.
Embora o heptanol seja relativamente confiável em bloquear as junções
do tipo Gap (Watts & Webb, 1996; Palani & Manchanda, 2006), este composto
foi apontado por ter outros efeitos sobre o sistema vascular que poderiam
influenciar as contrações oscilatórias, distintos do bloqueio das junções Gap
(Keevil et al., 2000; Rozental et al., 2000; Squires et al., 2000; Yamamoto et al.,
1998). Trabalhos mostram um possível efeito do heptanol, como por exemplo,
ativação de K
Ca
e redução do Ca
2+
intracelular (Matchkov et al., 2004),
supressão da corrente de Na
+
(Nelson & Makielski, 1991), diminuição dos
fluxos transarcolemais de K
+
e Ca
2+
dependentes da voltagem (Perez-
Armendariz et al., 1991). Porém, estudos demonstraram que em preparações
de tecidos ou células isoladas, incluindo coração de camundongos (Knapp et
al., 2005) e coelhos (Przyklenk et al., 2005), oócitos bovinos (Atef et al., 2005),
epitélio ciliar bovino (Do et al., 2004) e células HeLa de humanos (Bader &
Weingart, 2004), heptanol exerce efeito como bloqueador específico e seletivo
de junções Gap em concentrações iguais ou inferiores a 10 mM, o que é
substancialmente superior às concentrações usadas em nosso estudo (5 µM a
143
1 mM). Com base nestes estudos, sugerimos que o heptanol, atuando via
bloqueio de junções Gap, inibe as contrações oscilatórias, demonstrando a
importante participação desta estrutura sobre as oscilações.
A participação das junções Gap sobre as contrações em aortas de ratos
DSA também podem ser evidenciadas com o uso do 18β-GA, que é uma das
substâncias bloqueadoras das junções Gap mais seletivas usadas como
ferramenta farmacológica (Guan et al., 1996; Yamamoto et al., 1998). Os
efeitos do 18β-GA foram similares aos efeito do heptanol, revelando a
importante participação das junções do tipo Gap na gênese e manutenção das
contrações oscilatórias.
144
7 - SUMÁRIO E CONCLUSÕES
Os resultados obtidos no presente trabalho nos permite concluir que há
algumas diferenças nas respostas vasculares de ratos DSA comparados com
os controles, frente a estímulos relaxantes e contráteis, além dessas
preparações apresentarem contrações oscilatórias em maior porcentagem em
relação aos animais controle.
1. Estudos sobre a reatividade vascular revelaram que:
¾ Aortas de ratos DSA apresentam maior resposta para alguns agonistas
contráteis.
¾ Aortas de ratos DSA foram menos sensíveis ao tetraetilamônio,
comparados com ratos SO.
¾ Aortas de ratos DSA apresentam menor relaxamento para agonistas de
β-adrenorreceptores. Os mecanismos responsáveis por esta menor
resposta ocorrem numa fase antes da ativação da adenilato ciclase.
¾ Em relação ao efeito relaxante dependente do endotélio, aortas de ratos
DSA foram menos sensíveis frente ao bloqueio das junções do tipo Gap
do que em aortas de ratos SO, onde a resposta foi mais prejudicada
pelo bloqueador.
145
2. Estudo das contrações oscilatórias em aortas de ratos DSA
¾ Aortas de ratos DSA exibem contrações oscilatórias, o que raramente
ocorre em aortas de ratos SO.
¾ O endotélio vascular é capaz de modular negativamente as contrações
oscilatórias, via liberação de NO.
¾ Os canais para K
+
do tipo K
ATP
e K
Ca
estão envolvidos na modulação das
contrações oscilatórias em aortas de ratos DAS.
¾ O fornecimento de Ca
2+
para manutenção das contrações oscilatórias é
de origem intracelular (retículo sarcoplasmático) e extracelular (canais
de Ca
2+
do tipo “L”).
¾ As contrações oscilatórias em aortas de ratos DSA dependem da
funcionalidade das junções intercelulares do tipo Gap.
Concluímos então que aortas isoladas de ratos DSA apresentam algumas
diferenças na reatividade vascular quando comparadas com aortas de ratos
SO. Estas diferentes respostas vasculares, pelo menos em parte, podem
ocorrer devido à maior expressão de Conexina 43 em aortas de ratos DSA. As
contrações oscilatórias em aortas de ratos DSA são moduladas pelo endotélio,
dependem das fontes intra e extracelular de Ca
2+
e envolvem participação de
canais para K
+
(principalmente K
ATP
) e das junções do tipo Gap.
146
8 – REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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disease states. Pharmacol. Rev. 49:1-51, 1997.
174
9 - ANEXO
A - Artigos publicado ou aceitos para publicação em periódicos
internacionais:
1.
ROCHA, M.L.; BENDHACK, L.M. Spontaneous oscillatory contractions in aortas of rats with arterial
pressure lability caused by sinoaortic denervation. Clinical and Experimental Pharmacology &
Physiology, v. 34, p. 708-713, 2007.
2. ROCHA, M.L.; BENDHACK, LM. Endothelial nitric oxide has inhibitory effect on the rhythmic
contractions in aortas of sinoaortic deafferented rats. Journal of Cardiovascular Pharmacology, v. 50,
p.510-518, 2007.
3.
ROCHA, M.L.; BENDHACK, LM. Effects of K
+
channel modulators on oscillatory contractions in
sinoaortic denervated rat aortas. Biological & Pharmaceutical Bulletin, v. 30(11), p. 2098-2104, 2007.
4.
ROCHA, M.L.; BENDHACK, L.M. Aortas isolated from sinoaortic denervated rats exhibit rhythmic
contractions that are regulated by pharmacologically distinct calcium sources. Basic & Clinical
Pharmacology & Toxicology, v. 100, p. IN PRESS, 2007.
B - Artigos enviados para publicação ou em fase de preparação:
1.
ROCHA, M.L.; KIHARA, A.; DAVEL, A.P.C.; BRITTO, L.R., ROSSONI, L.V., BENDHACK, L.M.
Increased phenylephrine-induced contraction and connexin expression in aortas of rats with arterial
pressure lability. Cardiovascular Research.
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