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KARLA ZANINI KANTORSKI
CORRELAÇÃO ENTRE RUGOSIDADE SUPERFICIAL E ADERÊNCIA
IN VITRO DE Streptococcus mutans EM MATERIAIS
RESTAURADORES ESTÉTICOS INDIRETOS
Tese apresentada à Faculdade de Odontologia de
São José dos Campos, Universidade Estadual
Paulista, como parte dos requisitos para a obtenção
do título de DOUTOR do Programa de Pós-graduação
em BIOPATOLOGIA BUCAL, Área BIOPATOLOGIA
BUCAL.
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2
KARLA ZANINI KANTORSKI
CORRELAÇÃO ENTRE RUGOSIDADE SUPERFICIAL E ADERÊNCIA
IN VITRO DE Streptococcus mutans EM MATERIAIS
RESTAURADORES ESTÉTICOS INDIRETOS
Tese apresentada à Faculdade de Odontologia de São José dos
Campos, Universidade Estadual Paulista, como parte dos requisitos
para a obtenção do título de DOUTOR do Programa de Pós-
graduação em BIOPATOLOGIA BUCAL, Área BIOPATOLOGIA
BUCAL.
Orientador: Prof. Titular Antonio Olavo Cardoso Jorge
São José dos Campos
2006
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3
Apresentação gráfica e normalização de acordo com:
BELLINI, A. B.; SILVA, E. A. Manual para elaboração de
monografias: estrutura do trabalho científico. São José dos Campos:
FOJSC/UNESP, 2002. 82p.
KANTORSKI, K. Z. Correlação entre rugosidade superficial e
aderência in vitro de Streptococcus mutans em materiais
restauradores estéticos indiretos. 2006. 105f. Tese (Doutorado em
Biopatologia Bucal, Área Biopatologia Bucal) – Faculdade de Odontologia
de São José dos Campos, Universidade Estadual Paulista, São José dos
Campos, 2006.
4
DEDICO ESTE TRABALHO:
Aos meus pais: pelo apoio incondicional, pelo amor, incentivo e confiança
que me fizeram seguir firme nesta difícil jornada.
Ao meu irmão, companheiro zeloso e amigo leal.
Aos meus avós, Lídia e Antônio: pelo exemplo de perseverança.
À minha afilhada Eduarda: convívio que só de alegrias preencheu minha
vida.
Ao meu marido Luiz Felipe Valandro Soares: pela paciência; sua amizade,
suas palavras de carinho e motivação, seu apoio irrestrito são
inegavelmente responsáveis por esta conquista.
5
AGRADECIMENTOS ESPECIAIS
Ao meu orientador Professor Titular Antonio Olavo Cardoso Jorge, pela
confiança e oportunidade que concedeu. Pelo tratamento dispensado durante nossa
convivência, pela sabedoria e amizade.
À Professora Dra. Rosilene Fernandes da Rocha, pessoa especial que foi
capaz de modificar o rumo de uma vida e de uma carreira profissional.
Ao Professor Adjunto Marco Antônio Bottino, presença amiga e constante que
dirimiu todas as dificuldades.
Ao Professor Dr. Roberto Scotti do Departamento de Prótese Dental da
Universidade de Bolonha (Itália) (Riparto di Protesi del Dip. di Scienze
Odontostomatologiche dell’Alma Mater Studiorum Università di Bologna), pela
oportunidade de convívio e trabalho, pela forma amiga e carinhosa que nos recebeu e pelo
exemplo de competência.
6
AGRADECIMENTOS
À Faculdade de Odontologia de São José dos Campos – Universidade Estadual
Paulista “Julio de Mesquita Filho” na pessoa de seu digníssimo Diretor Professor Adj.
Paulo Vilella Santos Jr.
Ao Programa de Pós-graduação em Biopatologia Bucal, Área: Biopatologia Bucal,
dessa Faculdade pela importante oportunidade concedida.
Aos Professores Rosilene Fernandes da Rocha, Yasmin Rodarte Carvalho, Adriana
Aigotti Haberbeck Brandão, Luiz Eduardo Blumer Rosa, pela contribuição na minha
formação acadêmica e científica.
Às Professoras Cristiane Yumi Koga Yto e Juliana Campos Junqueira, pela
amizade e contribuição importante na realização deste trabalho.
À Professora Maria Nadir Gasparoto Mancini, pela contribuição na realização da
espectrofotometria realizada nesta pesquisa.
Ao Professor Dr. Roberto Fraga Moreira Lotufo, por ter guiado com amizade e
competência meus primeiros passos na pesquisa odontológica.
À minha colega de Pós-graduação Daniela Martins de Souza pela amizade, por
dividir experiências, trocar idéias e sonhos. Espero que possamos seguir no caminho
acadêmico obtendo sempre novas conquistas.
Aos amigos do laboratório de microbiologia desta instituição, Sílvia M. R.
Querido, Graziela N. Back, Patrícia Monteiro Ribeiro, Francine Cristina da Silva Rosa,
Edson Yukio Komiyama, Luciane Dias de Oliveira pela fraterna amizade e convivência, e
pelas palavras de apoio e incentivo nos momentos mais difíceis.
À todos os amigos e colegas da Pós-Graduação que fizeram mais branda esta etapa
de nossa vida, pela amizade e carinho.
7
À Dra. Silvia Marcchioni do Departamento de Ciências Orais da Universidade de
Bolonha (Itália) pela valiosa e precisa contribuição na análise microscópica realizada
neste estudo.
Ao Prof. Dr. Ivan Balducci (Faculdade de Odontologia de São José dos Campos,
UNESP) pela cordial amizade e fundamental contribuição na análise estatística dos dados
deste trabalho.
À secretária do Departamento de Biociências e Diagnóstico Bucal dessa Faculdade
Sílvia Scarpel, pelo apoio e disponibilidade que sempre nos atendeu.
Às secretárias da secção de pós-graduação Erena Michie Hasegawa, Rosemary de
Fátima Salgado Pereira e Maria Aparecida Consiglio de Souza.
À Diretora Técnica de Serviços de Biblioteca e Documentação Ângela de Brito
Bellini, da Faculdade de Odontologia de São José dos Campos – UNESP, pelas correções
normativas.
À Fundunesp, pelo apoio financeiro concedido para execução desta pesquisa.
À empresa Mitutoyo do Brasil (São Paulo, SP), por possibilitar o uso do
rugosímetro necessário para a realização desta pesquisa.
Às empresas Vita Zahnfabrik (Bad Sackingen, Alemanha) e Wilcos do Brasil
(Petrópoles, RJ), pela doação da cerâmica VM7 e resina composta Vita VMLC, à
3M/Espe (Brasil), pela doação da resina composta Sinfony.
A todos os professores e funcionários da Faculdade de Odontologia de São José
dos Campos – UNESP pelo convívio e amizade.
8
SUMÁRIO
RESUMO..............................................................................................
08
1 INTRODUÇÃO...................................................................................
09
2 REVISÃO DE LITERATURA.............................................................
12
2.1 Estreptococos do grupo mutans e cárie dentária...........................
12
2.2 Adesão bacteriana as superfícies sólidas.................................
15
2.2.1 Influências das propriedades das superfícies sólidas e das
bactérias na adesão.....................................................................
21
2.3 Película adquirida...........................................................................
26
2.4 Aderência in vitro de estreptococos bucais....................................
29
2.5 Formação in situ de biofilme dentário.............................................
38
3 PROPOSIÇÃO...................................................................................
49
4 MATERIAIS E MÉTODO...................................................................
50
4.1 Preparação das amostras...............................................................
51
4.2 Análises realizadas.........................................................................
55
4.2.1 Análise da rugosidade superficial................................................
55
4.2.2 Aderência in vitro de S. mutans aos materiais.............................
56
4.2.2.1 Teste de aderência na ausência de saliva...............................
56
4.2.2.2 Teste de aderência na presença de saliva...............................
60
4.2.3 Análise in situ do biofilme dentário inicial formado sobre
materiais.......................................................................................
60
4.2.3.1 Seleção dos participantes........................................................
60
4.2.3.2 Dispositivo bucal.......................................................................
61
4.2.3.3 Análise em microscopia eletrônica de varredura (MEV)...........
62
4.3 Análise estatística...........................................................................
63
9
5 RESULTADOS..................................................................................
64
5.1 Rugosidade superficial...................................................................
64
5.2 Aderência in vitro de S. mutans......................................................
65
5.3 Correlação entre rugosidade superficial e aderência in vitro de S.
mutans............................................................................................
68
5.4 Biofilme dentário inicial in situ........................................................
69
6 DISCUSSÃO......................................................................................
77
7 CONCLUSÃO....................................................................................
87
8 REFERÊNCIAS.................................................................................
89
ANEXOS...............................................................................................
100
APÊNDICES.........................................................................................
101
ABSTRACT...........................................................................................
105
10
KANTORSKI, K.Z. Correlação entre rugosidade superficial e
aderência in vitro de Streptococcus mutans em materiais
restauradores estéticos indiretos. 2006. 105f. Tese (Doutorado em
Biopatologia Bucal, Área Biopatologia Bucal) – Faculdade de Odontologia
de São José dos Campos, Universidade Estadual Paulista, São José dos
Campos, 2006.
RESUMO
O objetivo do presente estudo foi avaliar materiais restauradores estéticos indiretos
quanto à rugosidade superficial e aderência in vitro de Streptococcus mutans na
ausência e presença de saliva, bem como, ilustrar, por meio de microscopia eletrônica de
varredura, as características do biofilme dentário inicial formado in situ sobre os
materiais. Foram avaliados: cerâmica feldspática, cerâmica feldspática reforçada por
leucita, resina composta micro-híbrida e micro-particulada. Esmalte dentário humano foi
utilizado como controle. Amostras padronizadas dos materiais foram confeccionadas, e
análise da rugosidade foi realizada. Para os ensaios de aderência, as amostras foram
imersas em cultura de S. mutans GS-5 em caldo sacarosado e incubadas a 37ºC por 24h
em 5% de CO
2
. A seguir, os espécimes foram inseridos em tubos de ensaio, agitados, e
diluições decimais foram semeadas em meio de cultura (agar BHI). Após 48h (37ºC e 5%
de CO
2
), foi realizada contagem de unidades formadoras de colônias (UFC/mL). Para o
teste de aderência na presença de saliva, as amostras foram previamente imersas em
saliva filtrada. Médias de rugosidade superficial e UFC/mL foram submetidas à Análise
de Variância e teste Tukey. Coeficiente linear de Pearson foi usado para verificar
correlação entre rugosidade e aderência (α=5%). O esmalte foi o material com maior
rugosidade. A cerâmica feldspática/leucita foi mais rugosa que a feldspática. As resinas
compostas não apresentaram diferenças entre si e apresentaram rugosidades
intermediárias sendo similares tanto à cerâmica feldspática/leucita quanto à cerâmica
feldspática. Nas duas condições experimentais (presença e ausência de saliva) o
esmalte apresentou maior aderência de S. mutans. A cerâmica feldspática/leucita
apresentou maior aderência que a cerâmica feldspática, não houve diferença entre as
resinas, que apresentaram aderência intermediária sendo semelhantes tanto à cerâmica
feldspática/leucita quanto à cerâmica feldspática.
PALAVRAS CHAVE: Streptococcus mutans, biofilmes, propriedades superficiais, resinas
compostas, cerâmicas.
11
1 INTRODUÇÃO
A adesão de bactérias bucais às estruturas dentárias ou
materiais restauradores é considerada fundamental para a formação do
biofilme e, posteriormente, possível ocorrência de lesões de cárie,
gengivite e doença periodontal (LÖE et al.
47
, 1965; GIBBONS &
NYGAARD
27
, 1968).
O processo de adesão bacteriana às superfícies sólidas
no ambiente bucal parece ocorrer, inicialmente, de forma inespecífica,
sendo mediado pela ação das forças de Van der Waals e forças
eletrostáticas (ROSENBERG et al.
65
, 1983; GIBBONS
25
, 1989;
QUIRYNEN & BOLLEN
57
, 1995). Todavia, estas interações são fracas e
não permitem efetiva adesão e os microrganismos podem ser removidos
pelos mecanismos de regulação e controle da microbiota bucal
(GIBBONS
25
, 1989; BUSSCHER & VAN DER MEI
8
, 1997).
Deste modo, para completar a adesão inicial, bactérias
podem expressar adesinas na sua parede celular que se ligam a sítios
complementares específicos (CURTISS III
16
, 1986; GIBBONS
25
, 1989;
QUIRYNEN & BOLLEN
57
, 1995; NASSAR et al.
50
, 1995; BUSSCHER &
VAN DER MEI
8
, 1997). Estes sítios complementares são proteínas
salivares que adsorvem as superfícies formando a película adquirida
(DAWES et al.
17
, 1963).
Algumas bactérias podem ainda sintetizar, a partir de
carboidratos da dieta, polissacarídeos extracelulares (glicanos) que
proporcionam firme adesão, considerada irreversível, promovendo
condições favoráveis para a participação de outros microrganismos que
12
não possuem capacidade de adesão direta às superfícies (CURTISS III
16
,
1986).
Entre as várias bactérias que podem colonizar o ambiente
bucal, estreptococos do grupo mutans são reconhecidos como principais
agentes etiológicos da cárie dentária de superfícies lisas (IKEDA et al.
34
,
1973; HAMADA & SLADE
30
, 1980). A adesão inicial de S. mutans parece
ocorrer por interações eletrostáticas (SATOU et al.
67
, 1988; SATOU et
al.
68
, 1991) e a adesão mais forte parece ser mediada pela ação de
glicanos aderentes sintetizados por enzimas extracelulares
(glicosiltransferases) (CURTISS III
16
, 1986).
A formação do biofilme dentário pode ocorrer sobre todas
as superfícies sólidas no ambiente bucal, independente de serem
superfícies naturais, como esmalte e cemento, ou artificiais, como
materiais restauradores (CHAN & WEBER
13
, 1986; TANNER et al.
74
,
2005).
Estudos in vivo e in vitro, utilizando variadas
metodologias, têm demonstrado diferenças no biofilme formado sobre
diferentes materiais restauradores (ADAMCZYK & SPIECHOWICZ
1
, 1990;
HAHN et al.
29
, 1993; TAKATSUKA et al.
72
, 2000; AUSCHILL et al.
2
, 2002;
RIMONDINI et al.
62
, 2002; KONISHI et al.
42
, 2003). Estas variações
podem ser conseqüência das propriedades dos materiais como energia
livre superficial (ELS) e rugosidade superficial (JENDRESEN &
GLANTZ
35
, 1981; PRATT-TERPSTRA et al.
55
, 1989; QUIRYNEN et al.
59
,
1990; QUIRYNEN et al.
60
, 1993; GATEWOOD et al.
24
, 1993; QUIRYNEN
& BOLLEN
57
, 1995; NASSAR et al.
50
, 1995).
Materiais odontológicos indicados para coroas, inlays e
onlays devem evitar a adesão bacteriana, pois podem servir como nichos
para microrganismos que colonizam a interface material restaurador /
estrutura dentária desempenhando papel importante no desenvolvimento
de lesões secundárias de cárie e doença periodontal (GONZALEZ-
CABEZAS et al.
28
, 1999). Neste contexto, maior interesse tem surgido
13
para o desenvolvimento de materiais que acumulem menor número de
microrganismos ou até mesmo que inibam a adesão, e ao mesmo tempo
apresentem ótima resistência e durabilidade e satisfaçam as
necessidades estéticas.
Inseridos nesta realidade, diversos tipos de materiais
estéticos indiretos como resinas compostas e cerâmicas odontológicas
vêm sendo desenvolvidos para as mais variadas indicações clínicas.
Assim sendo, o presente estudo avaliou materiais
restauradores estéticos indiretos (metal-free) quanto à rugosidade
superficial e aderência in vitro de Streptococcus mutans na ausência e
presença de saliva, bem como, ilustrou as características do biofilme
dentário inicial formado in situ sobre os materiais.
14
2 REVISÃO DA LITERATURA
Este capítulo foi dividido em tópicos com a finalidade de
tornar sua leitura mais didática.
2.1 Estreptococos do grupo mutans e cárie dentária
Estreptococos do grupo mutans são microrganismos de
grande interesse na odontologia devido sua associação com etiologia da
cárie dentária. Apresentam-se em altas proporções na microbiota total
cultivável das superfícies dentárias com lesões de cárie coronárias iniciais
e cavitadas. Em contrapartida, ocorrem em baixas proporções nas
superfícies dentárias livres de cárie (VAN HOUTE
76
, 1980; LOESCHE
48
,
1986). No caso de cárie rampante em crianças, o biofilme coletado das
lesões, pode constituir-se quase totalmente de estreptococos do grupo
mutans (VAN HOUTE et al.
78
, 1982).
Também existem evidências do seu papel na etiologia das
lesões de cárie radiculares. Maior ocorrência de estreptococos do grupo
mutans foi observada no biofilme sobre superfícies radiculares que
desenvolveram cárie quando comparado ao biofilme de superfícies que se
mantiveram hígidas. Maior ocorrência destes microrganismos também foi
verificada no biofilme de superfícies radiculares hígidas de indivíduos
cárie-ativos quando comparada às superfícies hígidas de indivíduos livres
de cárie (ELLEN et al.
22
, 1985; VAN HOUTE
et al.
79
, 1990).
Cárie secundária pode ser definida como diagnóstico
positivo de uma nova lesão de cárie que ocorre na margem de uma
15
restauração existente (BAUME
3
, 1962) e constituem a principal causa de
substituição de restaurações (KIDD et al.
41
, 1992). Segundo Kidd et al.
40
(1993), não há diferenças na etiologia microbiana entre lesões de cárie
primárias e secundárias. Desta forma, pode-se concluir que os
estreptococos do grupo mutans estão implicados na sua etiologia.
Para ocorrência da cárie dentária, classicamente, a
presença de três fatores é necessária: biofilme dentário, carboidratos da
dieta e hospedeiro (KEYES & JORDAN
39
, 1963, citado por VAN
HOUTE
77
, 1994). Segundo Van Houte
77
(1994), a saliva deveria ser
incluída aos três fatores. Após a ingestão do açúcar, este é metabolizado
pelos microrganismos bucais produzindo ácidos (principalmente ácido
lático) que conduzem a uma queda do pH no biofilme promovendo
desmineralização dos tecidos dentários (HERZBERG
33
, 2000; CURTISS
III
16
, 1986). Na presença de fluxo salivar reduzido, esta redução do pH do
biofilme ocorre mais intensamente quando comparado à presença de
fluxo salivar normal. Adicionalmente, quando o fluxo salivar é estimulado,
ocorre elevação do pH no biofilme, indicando que a saliva, a curto tempo,
pode alterar a resposta do pH do biofilme sem alterar a composição
microbiana. Já os efeitos da saliva, em longo prazo, podem levar a
mudanças na composição da microbiota. Em pacientes com xerostomia
pode ocorrer cárie rampante envolvendo aumento do número de
lactobacilos e estreptococos do grupo mutans (VAN HOUTE
77
, 1994).
Na presença de dieta rica em sacarose, estreptococos do
grupo mutans podem produzir, além de ácidos, polímeros de carboidratos
(CURTISS III
16
, 1986; ROSAN
64
, 1997). S. mutans produzem
glicosiltransferases (GST) que sintetizam polímeros de glicanos a partir da
sacarose (ROLLA
63
, 1989). A GST-I produz glicanos insolúveis em água;
a GST-SI produz glicanos solúveis e insolúveis em água; e a GST-S
produz somente glicanos solúveis em água. Tamesada et al.
73
(2004)
verificaram que estreptococos que hiper expressaram a GST-SI
apresentaram firme adesão na presença de sacarose, ao passo que
16
aqueles que hiper expressaram a GST-I não apresentam firme adesão.
Além disso, os autores verificaram que co-culturas de estreptococos hiper
expressando GST-SI com Streptococcus sanguinis sintetizando glicanos
solúveis em água obtiveram firme adesão. Os resultados sugeriram que
GST-SI exerce importante efeito na adesão na presença de sacarose em
cooperação com glicanos solúveis em água.
O mais importante polímero, denominado mutano, é
caracterizado por ramificações na cadeia molecular que proporcionam
insolubilidade. Sua presença na superfície bacteriana a torna aderente
favorecendo agregação entre bactérias. Mutano parece ser importante na
etiologia da cárie, pois estudos com espécies mutantes, com baixa
capacidade de produzir mutano, revelaram baixa cariogenicidade
(ROSAN
64
, 1997).
S. mutans também produzem frutosiltransferases,
enzimas que sintetizam polímeros de frutano a partir da sacarose, que
podem servir de reservatórios de carboidratos extracelulares para serem
metabolizados nos períodos de baixa disponibilidade de açúcares. A
frutose liberada a partir da hidrólise destes frutanos pode ser utilizada
para a produção de ácido lático que causa desmineralização dos tecidos
dentários contribuindo para a patogênese da cárie dentária (ROZEN et
al.
66
, 2004). Polissacarídeos intracelulares, também podem ser
produzidos e metabolizadas posteriormente, nos períodos de baixa
disponibilidade de sacarose (CURTISS III
16
, 1986).
Segundo Rozen et al.
66
(2004), as enzimas
frutosiltransferases não ligadas às células, e que estão livres na saliva,
podem apresentar sítios de ligação específicos para glicanos. Glicanos
podem estar presentes na superfície de S. mutans, bem como, podem
estar adsorvidos nas superfícies sólidas no ambiente bucal. Assim,
frutosiltransferases podem aumentar a retenção de S. mutans às
superfícies por formar uma ponte de ligação. Desta forma, glicanos e
17
frutanos podem ser parte integral da matriz de polissacarídeos dos
biofilmes bucais.
2.2 Adesão bacteriana as superfícies sólidas
A adesão bacteriana às superfícies sólidas na cavidade
bucal vem sendo descrita na literatura de formas variadas. Curtiss III
16
(1986) a descreveu em duas fases:
a) uma fase sacarose independente, mas dependente da
presença de proteínas salivares;
b) outra fase sacarose dependente.
Quirynen
56
(1994) a descreveu em quatro fases distintas:
a) transporte das bactérias em direção à superfície;
b) adesão inicial, mediada por forças de curta e longa
distância;
c) adesão mediada por interações específicas;
d) colonização.
Para o entendimento da adesão mediada por forças de
curta e longa distância deve-se considerar que bactérias comportam-se
como partículas coloidais e como tais obedecem as leis físico-químicas.
Assim, se uma partícula coloidal aproxima-se de uma superfície, ocorre
uma interação com esta superfície por meio de duas forças: forças de Van
der Waals (ativas a uma distância de 50 nm) e forças eletrostáticas (ativas
a menores distâncias).
Nas forças de Van der Waals, quando duas moléculas se
aproximam, elas se atraem pela formação de dipolos, ocorrendo no
interior da molécula uma mudança na posição dos elétrons em relação
aos nêutrons, criando em uma extremidade da molécula um pólo positivo
e em outra um pólo negativo, o mesmo ocorre na molécula vizinha,
gerando forças atrativas entre elas. As forças eletrostáticas são
18
explicadas por outro mecanismo. Quando uma partícula carregada está
em meio líquido, ela é neutralizada por uma camada contra-carregada
que se distribui em torno da partícula. Quando a contra-camada de uma
partícula se sobrepõe a contra-camada de outra partícula, as interações
eletrostáticas são criadas. A energia da interação eletrostática é
determinada pelo potencial zeta (QUIRYNEN & BOLLEN
57
, 1995).
Segundo Rosan
64
(1997), as superfícies bacterianas carregadas
negativamente e constituintes das superfícies sólidas, também negativos,
são ligados por meio de cátions divalentes tais como cálcio.
A adesão inicial mediada pelas forças de Van der Waals e
eletrostáticas é fraca e não permite verdadeira colonização, sendo que os
microrganismos podem ser facilmente removidos pelos mecanismos de
regulação e controle da microbiota bucal (GIBBONS
25
, 1989; BUSSCHER
& VAN DER MEI
8
, 1997). Para possibilitar a colonização bacteriana nas
superfícies, ocorre a adesão mediada por interações específicas,
promovendo ancoragem mais forte entre microrganismos e superfícies por
meio de contato direto ou por verdadeiras pontes, como apêndices
filamentosos extracelulares. Neste ambiente, o líquido (saliva) presente
entre as superfícies que interagem (célula bacteriana e superfície sólida)
deve ser removido. Pode-se considerar que esta remoção de líquido entre
as superfícies aderentes seja o mecanismo pelo qual a hidrofobicidade da
superfície celular e a hidrofobicidade da superfície sólida influenciam o
processo de adesão (QUIRYNEN & BOLLEN
57
, 1995).
As interações específicas entre bactéria e superfícies são
mediadas por componentes protéicos extracelulares específicos
(adesinas) presentes na parede celular das bactérias e receptores
complementares sobre as superfícies. Estes sítios complementares
parecem ser proteínas e outras macromoléculas salivares (HERZBERG
33
,
2000; CURTISS III
16
, 1986; GIBBONS
25
, 1989; QUIRYNEN & BOLLEN
57
,
1995; BUSSCHER & VAN DER MEI
8
, 1997) que adsorvem as superfícies
no ambiente bucal formando a película adquirida (DAWES et al.
17
, 1963).
19
Esta película é composta por várias proteínas salivares, componentes do
fluído gengival e produtos bacterianos (GIBBONS
25
, 1989).
Entre as proteínas salivares identificadas como sítios
complementares para a adesão bacteriana são importantes a IgA
secretora, mucina e proteínas ricas em prolina. Proteínas salivares ricas
em prolina quando adsorvidas às superfícies sólidas sofrem alterações
conformacionais tornando-se receptores para a adesão (HERZBERG
33
,
2000; QUIRYNEN & BOLLEN
57
, 1995). Algumas bactérias reconhecem
estas proteínas como receptores específicos somente quando adsorvidas
às superfícies. Isto pode explicar, a nível molecular, o tropismo de certas
bactérias ao dente (QUIRYNEN & BOLLEN
57
, 1995). S. mutans, por
exemplo, é encontrado na cavidade bucal principalmente após a erupção
dos dentes. Portanto, deve-se considerar que espécies bacterianas
parecem não somente colonizar preferencialmente a superfície dentária,
mas necessitar, da presença das mesmas para colonizar a cavidade bucal
(GIBBONS
25
, 1989).
Diversos genes que promovem a expressão de adesinas
têm sido identificados em estreptococos. Adesinas constituem-se em
proteínas, lipoproteínas, glicoproteínas e polissacarídeos e estão
freqüentemente associadas com a presença de fímbrias na superfície
celular (GIBBONS
25
, 1989; HERZBERG
33
, 2000).
As adesinas que melhor caracterizam os estreptococos
bucais são proteínas da família de antígenos I/II (ROSAN
64
, 1997;
HERZBERG
33
, 2000), que contribuem para a hidrofobicidade da superfície
celular e facilitam a co-agregação com Actinomyces spp. Contudo, como
adesinas da família de antígenos I/II também podem ser expressas por
espécies pioneiras na colonização, estas podem preencher os sítios
complementares específicos nas superfícies. Assim, estreptococos
cariogênicos podem utilizar estratégias adicionais para a adesão como a
produção de dextranos solúveis (glicanos) que se incorporam e modificam
a película adquirida. Da mesma forma, podem expressar proteínas que se
20
ligam a sítios complementares nesta película modificada. Portanto,
estreptococos do grupo mutans parecem ser capazes de produzir
adesinas, bem como determinar sítios complementares utilizados para a
adesão (HERZBERG
33
, 2000).
Muitos estreptococos bucais podem aumentar a adesão
colonizando superfícies embebidas em matriz extracelular de
polissacarídeos, processo favorecido pela presença de dieta rica em
sacarose (CURTISS III
16
, 1986; ROSAN
64
, 1997; HERZBERG
33
, 2000). A
presença de matriz de polissacarídeos parece ser considerada importante
para a adesão bacteriana ser considerada irreversível. Esta adesão
sacarose dependente é mediada pela síntese de glicanos insolúveis em
água (mutano) que permitem não somente uma forte adesão às
superfícies, mas também promovem agregação de células de S. mutans
uma vez que estes apresentam sítios de ligação na sua superfície celular
para glicanos. A enzima glicosiltransferase parece ser responsável pela
produção de glicanos solúveis e insolúveis em água, bem como, das
proteínas da superfície celular bacteriana que funcionam como sítios de
ligação para estes glicanos. Como conseqüência desta adesão sacarose
dependente ocorre a formação inicial do biofilme dentário criando
condições favoráveis para a adesão de outros microrganismos que não
tem habilidade de se aderir diretamente às superfícies (CURTISS III
16
,
1986; ROSAN
64
, 1997).
Embora a literatura, geralmente, avalie a adesão
bacteriana em uma fase inespecífica, mediada pela ação de forças, e
outra fase específica, mediada pela expressão de adesinas, deve-se
considerar que evolutivamente, um microrganismo colonizando uma
superfície ainda desconhecida precisa interagir por meio de forças
inespecíficas para explorar as características químicas da superfície, e
então, desenvolver adesinas específicas ao material. Assim, na adesão
específica, somente interações entre adesinas e sítios complementares
vêm sendo consideradas, mas na realidade estas sempre atuam em
21
conjunto com forças de interações inespecíficas (BUSSCHER & VAN
DER MEI
8
, 1997).
Com a formação do biofilme dentário, começam a ocorrer
interações entre bactérias. Alguns microrganismos podem produzir
biosurfactantes que atuam reduzindo a energia livre superficial das
superfícies sólidas a que estão aderidos, tornado-as mais hidrofóbicas.
Este aumento da hidrofobicidade interfere na película adquirida adsorvida
reduzindo sua resistência coesiva o que favorece a remoção do biofilme
frente aos mecanismos de regulação e controle da microbiota bucal.
Biosurfactantes podem ser liberados por bactérias para estimular sua
própria remoção quando as condições do micro-ambiente tornam-se
desfavoráveis. Presença de pequenas quantidades de biosurfactantes no
biofilme pode exercer efeito drástico na sua composição, produzindo
interações negativas entre tipos bacterianos competitivos (BUSSCHER &
VAN DER MEI
8
, 1997).
Contrariamente, vantagens metabólicas podem ocorrer
entre microrganismos pelos processos de co-agregação (interação entre
um microrganismo séssil aderido e um organismo planctônico de espécie
diferente). Co-agregação de estreptococos bucais com Actinomyces pode
criar um micro-ambiente de anaerobiose que favorece o crescimento de
Actinomyces (BUSSCHER & VAN DER MEI
8
, 1997).
O crescimento do biofilme dentário parece ocorrer
principalmente pela multiplicação de células aderidas (BRECX et al.
5
,
1983; QUIRYNEN & BOLLEN
57
, 1995). Contudo, a multiplicação não pode
ser considerada como o único processo responsável pelo crescimento
sendo também associado com a adesão de novas bactérias provenientes
da saliva (BRECX et al.
5
, 1983).
Listgarten
46
(1994) relatou que as primeiras bactérias que
colonizam as superfícies sólidas no ambiente bucal formando o biofilme
supragengival são cocos facultativos Gram-positivos e bacilos curtos,
principalmente espécies de Streptococcus e Actinomyces,
22
respectivamente. Cocos anaeróbios Gram-negativos, como Veillonella,
também podem ser observados. Durante o primeiro dia, a superfície é
gradualmente coberta por agregados de bactérias que estão se
multiplicando e expandindo-se lateralmente. Por volta do terceiro dia,
bactérias filamentosas podem ser visualizadas sobre a superfície do
biofilme predominantemente formado por cocos. Diversas espécies de
cocos podem se agregar com algumas bactérias filamentosas formando
“espigas de milho”. Em uma semana, colônias de cocos ainda
predominam. Com o decorrer do tempo, bactérias filamentosas começam
a aumentar no biofilme, substituindo gradualmente o predomínio de cocos
por filamentosos. Contudo, a estrutura do biofilme pode variar de acordo
com a condição clínica do paciente.
No estudo do biofilme dentário, os eventos iniciais de sua
formação devem ser considerados de importância, uma vez que a
resistência de adesão, entre biofilme e superfícies sólidas, parece ser
estabelecida unicamente por meio das ligações entre as proteínas da
película adquirida e a superfície sólida (BUSSCHER et al.
9
, 1995).
Durante os eventos iniciais, observou-se que o
agrupamento das moléculas das proteínas salivares que ocorre sobre
uma superfície sólida durante a formação da película adquirida parece
variar de acordo com o tipo de superfície. Assim, esta disposição do
agrupamento de moléculas parece variar entre os materiais. O resultado
final é que a composição e retenção de ambos, película adquirida e
biofilme pode ser diferente de material para material. A energia livre
superficial da superfície sólida parece ser a propriedade determinante nas
características da película salivar adsorvida (JENDRESEN & GLANTZ
35
,
1981; VAN DIJK et al.
75
, 1987; NASSAR et al.
50
, 1995). Esta propriedade
também se torna importante quando a saliva presente entre as superfícies
que estão interagindo deve ser removida para que bactérias ou seus
apêndices (fímbrias) possam entrar em contato direto com a superfície
sólida (QUIRYNEN
56
, 1994).
23
As irregularidades nas superfícies protegem bactérias dos
mecanismos de regulação e controle da microbiota bucal durante a fase
inicial e reversível da adesão, de forma que a adesão irreversível possa
ocorrer mais rapidamente nestas regiões.
Neste contexto, se torna fundamental ponderar a respeito
das propriedades das superfícies sólidas e suas influências no processo
de adesão bacteriana.
2.2.1 Influência das propriedades das superfícies sólidas e das
bactérias na adesão
A energia livre superficial (ELS) das superfícies parece
ser uma propriedade importante para formação do biofilme dentário. Pode
ser determinada por medidas de ângulo de contato e indicam se a
superfície avaliada é hidrofílica ou hidrofóbica (SATOU et al.
69
, 1988;
BUSSCHER & VAN DER MEI
8
, 1997).
A energia livre de adesão (EA) é determinada pela
fórmula: EA = ELS da bactéria – Tensão superficial da saliva – ELS da
superfície sólida, sendo que a adesão é favorecida quando a EA é
negativa. A maioria dos microrganismos bucais apresenta alta ELS, sendo
esta maior que a tensão superficial da saliva. Assim, a subtração entre
ELS da bactéria e tensão superficial da saliva resultará em um valor
positivo. Para que a EA seja negativa favorecendo a adesão, a ELS da
superfície sólida deve ser alta (WEERKAMP et al.
80
, 1985; QUIRYNEN &
BOLLEN
57
, 1995). Esta fórmula também sugere que bactérias com alta
ELS preferencialmente aderem a superfícies com alta ELS, por outro lado,
bactérias com baixa ELS aderem mais facilmente a superfícies com baixa
ELS (QUIRYNEN & BOLLEN
57
, 1995).
Weerkamp et al.
80
(1985) verificaram que vários
estreptococos bucais apresentam alta ELS. S. mutans, Streptococcus
24
sanguis e Streptococcus salivarius foram similares entre si. Streptococcus
mitis apresentou ELS mais baixa que os demais. A presença da saliva
não afetou a ELS da maioria dos estreptococos com inicialmente alta
ELS, mas significativamente aumentou a ELS dos microrganismos com
valores iniciais mais baixos. Vários componentes salivares podem ligar-se
aos estreptococos bucais, desta forma, considera-se a hipótese que
bactérias com baixa ELS podem adsorver componentes salivares
diferentes das bactérias com alta ELS.
Para as superfícies sólidas, a presença de saliva faz com
que materiais com alta ELS inicial tenham sua energia diminuída e
materiais com baixa ELS inicial tenham sua energia aumentada
(JENDRESEN & GLANTZ
35
, 1981; VAN DIJK et al.
75
, 1987; QUIRYNEN et
al.
58
, 1989; NASSAR et al.
50
, 1995; QUIRYNEN & BOLLEN
57
, 1995).
Assim, materiais com diferentes propriedades têm suas ELS conduzidas a
valores similares após a adsorção da película adquirida (JENDRESEN &
GLANTZ
35
, 1981; VAN DIJK et al.
75
, 1987; TAKATSUKA et al.
72
, 2000).
Contudo, estudos in vivo, em humanos e em cães,
demonstraram que, significativamente, menos biofilme foi formado sobre
materiais com baixa ELS inicial (VAN DIJK et al.
75
, 1987; QUIRYNEN et
al.
58
, 1989; QUIRYNEN et al.
59
, 1990). O mesmo foi observado in vitro
sobre diferentes materiais cobertos com saliva (PRATT-TERPSTRA et
al.
55
, 1989). Portanto, a ELS inicial dos materiais parece influenciar na
adesão bacteriana. Explicação para este fato seria a menor força de
ligação entre bactérias e superfícies com baixa ELS inicial, devido à
influência desta no tipo de proteína salivar adsorvida durante a formação
da película adquirida, e/ou na conformação e quantidade de moléculas
protéicas adsorvidas (VAN DIJK et al.
75
, 1987; QUIRYNEN et al.
58
, 1989).
Estudos in vitro, utilizando sistema celular de fluxo
(permite controle de forças de remoção bacteriana simulando os
mecanismos de regulação e controle da microbiota bucal), têm verificado
25
menor retenção bacteriana sobre materiais com baixa ELS inicial
(CHRISTERSSON et al.
15
, 1989; CHRISTERSSON & GLANTZ
14
, 1992).
Segundo Nassar et al.
50
(1995) a influência que um
material odontológico pode exercer sobre o biofilme refere-se, quase que
exclusivamente, às diferenças na resistência de retenção do biofilme
formado.
Alguns autores sugeriram que a remoção de bactérias
aderidas parece não ocorrer na interface proteína salivar / bactéria, mas
na interface proteína salivar / superfície, ou na massa de proteínas
salivares adsorvidas indicando resistência coesiva menor da película
adquirida formada sobre materiais com baixa ELS (BUSSCHER et al.
9
,
1995; QUIRYNEN & BOLLEN
57
, 1995; BUSSCHER & VAN DER MEI
8
,
1997). Esta hipótese foi formulada a partir do estudo de Busscher et al.
10
(1992) que avaliaram a retenção de S. mutans, Streptococcus rattus,
Streptococcus cricetus, Streptococcus sobrinus sobre o vidro em sistema
celular de fluxo. Os autores verificaram que, sem presença de saliva, os
quatro tipos bacterianos apresentaram diferentes retenções, mas, na
presença da saliva, a retenção bacteriana tornou-se similar.
Em 1995, Busscher et al.
9
testaram a hipótese que
durante a ação de determinadas forças presentes na cavidade bucal
(fluxo salivar, ação muscular), o biofilme aderido a uma superfície sólida
pode ser totalmente removido desta superfície por meio de falha coesiva
na película adquirida. Sistema celular de fluxo foi usado para avaliar a
proporção de Streptococcus oralis e A. naeslundii removidos após adesão
ao vidro, pela passagem de interface líquido-ar (bolha). Quatro
experimentos foram realizados no estudo. No primeiro experimento S.
oralis foi aderido ao vidro, na ausência de saliva, e após 3 horas a
interface líquido-ar foi usada para verificar a remoção das bactérias
aderidas. Nenhuma remoção de estreptococos foi verificada. No segundo
experimento, S. oralis foi aderido ao vidro, na presença de saliva, e após
1 hora a interface líquido-ar foi usada para verificar a remoção das
26
bactérias. Significante remoção de estreptococos foi verificada. No
terceiro experimento, na ausência de saliva, A. naeslundii foi aderido ao
vidro e a seguir, S. oralis foi aplicado nos sistema celular de fluxo de
modo que poderia aderir diretamente ao vidro ou co-aderir com A.
naeslundii. Após a passagem da interface líquido-ar no sistema, não foi
verificada remoção de estreptococos previamente aderidos ao vidro,
sendo que poucos estreptococos co-aderindo com A. naeslundii foram
removidos. O quarto experimento foi similar ao anterior, porém foi
realizado na presença de saliva. Foi verificado que todos estreptococos
aderidos diretamente ao vidro foram removidos, mas nem todos os
estreptococos co-aderindo com A. naeslundii foram removidos. Os
resultados, de forma geral, indicaram que a remoção de estreptococos
aderidos diretamente ao vidro ou co-aderindo com A. naeslundii induzida
pela passagem de interface líquido-ar com similar força de cisalhamento
observada naturalmente no ambiente bucal, parece não ocorrer. Todavia,
substancial remoção ocorre quando a adesão é mediada pelo filme
salivar, indicando que a remoção ocorra por falha coesiva neste filme.
A rugosidade superficial dos materiais parece ser outra
propriedade que desempenha papel fundamental na adesão bacteriana.
Associação entre quantidade de biofilme dentário e rugosidade superficial
foi verificada sobre diferentes materiais odontológicos como cerâmicas,
titânio e resinas acrílicas (YAMAUCHI et al.
83
, 1990; RIMONDINI et al.
61
,
1997; KAWAI et al.
38
, 2000).
Estudos com microscopia eletrônica de varredura (MEV)
revelaram que a adesão inicial de microrganismos, evidentemente,
começa sobre irregularidades e subseqüentemente expande-se por toda
superfície (LIE
43
, 1977; LIE
45
, 1979; NYVAD & FEJERSKOV
52
, 1987).
Estas irregularidades podem promover a formação do biofilme porque
aumentam a área disponível para a adesão e principalmente, porque
protegem bactérias dos mecanismos de regulação e controle da
27
microbiota bucal e também dos procedimentos de higiene bucal
(QUIRYNEN et al.
59
, 1990).
Como a adesão bacteriana teoricamente passa de uma
fase inicial reversível para uma fase de adesão mais forte, considerada
irreversível, autores sugeriram que esta mudança ocorre, primeiramente,
nas irregularidades onde os microrganismos estão protegidos das forças
de remoção (QUIRYNEN et al.
59
, 1990; QUIRYNEN et al.
60
, 1993;
GATEWOOD et al.
24
, 1993; QUIRYNEN & BOLLEN
57
, 1995).
Conseqüentemente, o biofilme pode apresentar maturação mais rápida
nestas áreas.
Rimondini et al.
61
(1997) avaliaram a colonização
bacteriana sobre amostras de titânio com diferentes rugosidades
superficiais. Nas amostras lisas, houve menor acúmulo de bactérias,
sendo que somente cocos foram verificados. Nas amostras com
rugosidade intermediária, foram encontrados bastonetes curtos e longos.
Nas amostras rugosas, caracterizadas pela presença de ranhuras e
depressões, foram observados bastonetes longos agregados ou em
camadas. Assim, como cocos são considerados espécies pioneiras, e
bastonetes espécies subseqüentes na colonização, a presença de
bastonetes longos foi considerada, pelos autores, como avanço no
estágio de maturação do biofilme sobre as superfícies rugosas.
Observações similares também foram encontradas sobre amostras de
flúor-etileno-propileno, acetato de celulose, titânio, esmalte e cemento
(NYVAD & FEJERSKOV
52
, 1987; CARRASSI et al.
11
, 1989; QUIRYNEN et
al.
59
, 1990; QUIRYNEN et al.
60
, 1993).
Quando foi avaliado, conjuntamente, energia livre
superficial e rugosidade superficial, foi verificado que a influência da
rugosidade superficial dos materiais parece ser mais relevante na adesão
bacteriana. Quirynen et al.
59
(1990) avaliaram, in vivo, o biofilme formado
sobre dois materiais com diferentes ELS. Amostras de cada material
foram divididas em uma parte lisa (Ra = 0,1 µm) e outra rugosa (Ra = 2.2
28
µm). Os autores verificaram menor quantidade de biofilme sobre a parte
lisa do material com baixa ELS, mas não encontraram diferenças na parte
rugosa das amostras entre os dois materiais. Sobre as superfícies
rugosas, maior quantidade de biofilme foi observado, caracterizado por
poucos cocos e alta proporção de bastonetes. Foi sugerido, pelos
autores, que rugosidade superficial é uma propriedade mais importante
que ELS na formação e composição do biofilme.
O potencial zeta, que influencia na energia de interação
eletrostática entre superfície e bactéria, também é importante para a
adesão bacteriana (QUIRYNEN & BOLLEN
57
, 1995). O’Brien et al.
54
(1978) avaliaram a adesão de S. mutans (potencial zeta -13,7 mV), a
hidroxiapatita (potencial zeta de -9 mV), a hidroxiapatita tratada com
clorexidine (potencial zeta de -13,4 mV), e a hidroxiapatita tratada com
dextrano (potencial zeta de -9,9 mV). Os autores verificaram que a
adesão de S. mutans foi maior na hidroxiapatita, seguida pela
hidroxiapatita tratada com dextrano e hidroxiapatita tratada com
clorexidine, observando que quanto menor potencial zeta da superfície
dos materiais, maior a repulsão eletrostática e menos favorável a adesão.
2.3 Película adquirida
Quando superfícies dentárias são limpas, ou quando
superfícies sólidas, como por exemplo, materiais restauradores são
inseridos na cavidade bucal, imediatamente a película adquirida começa a
se formar por meio da adsorção de proteínas salivares, que resulta da
interação iônica eletrostática entre íons cálcio e grupamentos fosfato na
superfície do esmalte e grupos com carga oposta nas moléculas salivares
(ROSAN
64
, 1997).
29
Embora a película adquirida proporcione adesão
específica entre adesinas bacterianas e sítios complementares nas
superfícies, vários estudos com materiais restauradores e esmalte
dentário têm demonstrado que o número de microrganismos aderidos
parece diminuir na presença da saliva (PRATT-TERPSTRA et al.
55
, 1989;
SATOU et al.
68
, 1991; SULJAK et al.
71
, 1995; TAKATSUKA et al.
72
, 2000).
A película adquirida de acordo com o tempo de formação
(PRATT-TERPSTRA et al.
55
, 1989) e heterogeneidade de proteínas
constituintes (CHRISTERSSON & GLANTZ
14
, 1992) parece influenciar na
adesão e retenção dos microrganismos.
Pratt-Terpstra et al.
55
(1989) avaliaram in vitro a influência
da película adquirida inicial e madura (formadas após 5 minutos e 2
horas, respectivamente, na presença de saliva) na adesão de
estreptococos bucais sobre diferentes superfícies. Os resultados
indicaram redução na adesão sobre todos os materiais após a cobertura
salivar, não havendo diferenças na presença de película inicial ou
madura, exceto para S. mutans que aderiu mais sobre superfícies
cobertas por película madura. Os autores ponderaram que com a
maturação da película, há aumento na presença de proteínas com alto
peso molecular como mucinas que promovem melhor adesão de S.
mutans.
Christersson & Glantz
14
(1992) avaliaram a retenção de S.
sanguis e S. salivarius, em sistema celular de fluxo, na presença de saliva
proveniente de diferentes glândulas e de solução de Ringer. Maior
retenção de microrganismos foi observada quando os materiais foram
expostos à solução de Ringer. Em geral, a retenção bacteriana foi menor
na presença da saliva das glândulas submandibular e lingual,
aumentando na presença de saliva mista proveniente de todas as
glândulas, e sendo maior na presença de saliva da parótida.
A película adquirida pode ser descrita como um filme
orgânico livre de células, transparente, liso e homogêneo (FRANK &
30
HOUVER
23
, 1970 citado por LIE
43
, 1977). Entretanto, apresenta estrutura
altamente heterogênea (LIE
43
, 1977; BRECX et al.
6
, 1981; NYVAD &
FEJERSKOV
52
, 1987; HANNIG
31
, 1997). Sua espessura, após aumento
inicial, parece permanecer constante em torno de 0,1 a 0,7 µm
(GIBBONS
25
, 1989; QUIRYNEN & BOLLEN
57
, 1995).
Utilizando microscopia eletrônica de varredura e
transmissão, Lie
43
(1977) estudou a morfologia da película adquirida
adsorvida sobre resina epóxi e hidroxiapatita, após 2, 4, 6, 12, 24 e 48
horas na cavidade bucal. Três tipos morfológicos diferentes de película
foram observados. A película globular observada nos estágios iniciais,
continha estruturas redondas e ovais em íntimo contato com a superfície
dos materiais, ou mostrando inserção por estrutura semelhante a um
pedículo. Na maioria dos casos, apresentou regularidade, mas também foi
visualizada com glóbulos apresentando diversidade de forma e dimensão.
Seu crescimento ocorreu, em alguns casos, pelo aumento da espessura,
e, em outros casos, os glóbulos foram cobertos por camada granular que
mascarava seus contornos proporcionando aparência mais densa e
homogênea. A película fibrilar foi caracterizada como uma mistura de
grandes e pequenos glóbulos conectados por uma rede fibrilar. O terceiro
tipo de película foi observado como um filme liso e homogêneo. Em
algumas amostras dos materiais, mesmo após 24 e 48 horas, a película
adquirida apresentava-se de várias formas o que justificava sua divisão
em diferentes tipos. Gradual aumento na espessura foi observado nas
primeiras 6 horas. Entre 6 e 12 horas, houve leve redução, e a partir de
12 horas, novamente foi observado aumento da espessura.
A microscopia eletrônica de transmissão foi utilizada por
Hannig
31
(1997) para estudar a formação da película adquirida in vivo,
sobre amostras de esmalte bovino e materiais restauradores (amálgama,
liga fundida, cerâmica feldspática e vítrea, resinas compostas
particuladas, resinas compostas não particuladas e resinas acrílicas).
Amostras dos materiais foram submetidas ao mesmo procedimento de
31
polimento e fixadas em dispositivos bucais usados por três indivíduos.
Não foram observadas diferenças na película adquirida formada nos
diferentes materiais. Contudo, diferenças foram verificadas entre amostras
fixadas na face vestibular e palatina do dispositivo. Após 2 horas, as
superfícies de todas as amostras fixadas na face palatina do dispositivo
estavam cobertas por fino filme micro-granular. Próximo à superfície dos
materiais foi observada uma camada basal eletro-densa e
superficialmente uma camada granular homogênea menos densa. A
espessura da película formada sobre as amostras palatinas raramente
excedia 100 nm depois de 6 horas. As amostras vestibulares foram
cobertas por camada basal granular fina de alta densidade eletrônica.
Sobre esta camada, uma segunda camada heterogênea de baixa
densidade eletrônica estava presente. Em 2 e 6 horas, a espessura variou
de 100 a 1000 nm.
2.4 Aderência in vitro de estreptococos bucais
A formação de biofilme dentário, in vitro, foi avaliada por
Dummer & Harrison
20
(1982) em materiais restauradores incluindo resina
composta e cerâmica. Amostras padronizadas dos materiais foram
confeccionadas e fixadas em fios metálicos. O conjunto foi suspenso em
meio de cultura inoculado com suspensão de S. mutans por quatro dias.
Avaliações incluíram escores referentes ao número de colônias formadas
sobre as amostras, peso seco e úmido do biofilme, e também números de
unidades formadoras de colônias (UFC). Maior quantidade de biofilme
formou-se sobre resina composta não polida, seguida pela cerâmica e
resina composta polida. Os resultados mostraram forte correlação entre
número de colônias formadas sobre as amostras e peso seco e úmido do
biofilme. Fraca correlação foi obtida entre estes dois parâmetros e o
número de UFC.
32
Em 1988, Satou et al.
67
avaliaram aderência de S. sanguis
(ATCC 10556 e ATCC 10557) e S. mutans (OMZ 176 e Ingbritt) sobre
amostras de resinas quimicamente polimerizadas, amálgama, e liga de
ouro-prata-paládio. Amostras padronizadas dos materiais foram
confeccionadas (similar rugosidade superficial), armazenadas em água a
37
o
C por 24 horas e submetidas ao teste de aderência. O número de
bactérias aderidas foi determinado por contagem direta em microscopia
de luz. Hidrofobicidade dos materiais e dos microrganismos foi
determinada através de medidas de ângulos de contato. Avaliação do
potencial zeta também foi realizada. S. sanguis apresentou ângulos de
contato maiores que S. mutans, e liga de ouro-prata-paládio apresentou o
maior ângulo de contato, seguida pelo amálgama e resinas compostas.
Quanto ao potencial zeta, S. mutans apresentou valor maior que S.
sanguis, sendo todos os valores tanto de bactérias quanto de materiais
negativos. A maior adesão de S. sanguis ATCC 10556 foi na liga de ouro-
prata-paládio, seguida pelo amálgama e resina composta. Tendência
similar foi observada com S. sanguis ATCC 10557. A adesão de S.
mutans Ingbritt foi maior no amálgama não havendo diferenças entre os
outros materiais testados. S. mutans OMZ 176 aderiu mais ao amálgama,
seguido pela liga e resinas compostas. Os resultados demonstraram forte
correlação entre ângulo de contato dos materiais e aderência dos dois
tipos de S. sanguis, indicando que interações hidrofóbicas desempenham
papel importante na adesão destes microrganismos. Aderência de S.
mutans foi relacionada às interações eletrostáticas, pois ocorreu
correlação altamente significativa entre potencial zeta dos materiais
restauradores e adesão de S. mutans. A aderência de S. sanguis ATCC
1057 mostrou correlação significante tanto com hidrofobicidade quanto ao
potencial zeta.
Satou et al.
68
(1991) testaram a aderência de S. sanguis
ATCC 10556 e ATCC 10557 e S. mutans OMZ 176 e Ingbritt aos mesmos
materiais restauradores utilizados no trabalho de 1988, sendo no presente
33
estudo os materiais cobertos por saliva. Os resultados demonstraram
redução na aderência das bactérias testadas aos materiais na presença
de saliva. S. sanguis aderiu mais na resina composta e na liga de ouro-
prata-paládio, seguidas pelo amálgama. S. mutans Ingbritt aderiu mais no
amálgama não havendo diferenças entre os demais materiais. S. mutans
OMZ 176 aderiu mais ao amálgama seguido pela liga e resinas
compostas. Com saliva, o ângulo de contato dos materiais foi reduzido e
suas cargas negativas (potencial zeta) aumentaram. Na presença da
saliva ocorreu redução da hidrofobicidade dos materiais e
conseqüentemente redução da adesão bacteriana. A aderência de S.
mutans mostrou correlação positiva com potencial zeta dos materiais na
presença e ausência de saliva, sugerindo que interações eletrostáticas
apresentaram papel importante na sua adesão. Porém, o potencial zeta
dos materiais na presença de saliva aumentou levemente quando
comparado aos materiais sem cobertura salivar. Se, somente interações
eletrostáticas tem papel na adesão desta bactéria, S. mutans deveria
aderir mais aos materiais na presença da película adquirida. Como isso
não foi observado, os autores sugeriram que interações específicas entre
componentes da película adquirida e bactérias poderiam estar envolvidas
no processo de aderência.
Adesão bacteriana ao amálgama e a três resinas
compostas (Herculite XRV, Z100, Prisma) foi estudada por Suljak et al.
71
(1995). A aderência de S. sanguis CH3, S. salivarius HB e A. viscosus
WG foram testadas na presença e ausência de saliva sobre amostras
padronizadas dos materiais. Para isso, as amostras foram imersas na
suspensão de cada microrganismo por 1 hora a 37
o
C e então, as
bactérias não aderidas foram removidas. Também foram determinados os
ângulos de contato da água sobre os materiais e sobre as bactérias como
uma medida de hidrofobicidade. As medidas dos ângulos de contato
indicaram que a resina Z100 foi mais hidrofóbica seguida pela Herculite, e
resina Prisma. O microrganismo mais hidrofóbico foi S. sanguis, seguido
34
por S. salivarius e A. viscosus. Não foram observadas diferenças quanto
ao número de microrganismos aderidos entre os diferentes materiais.
Contudo, foi verificado que o microrganismo mais hidrofóbico (S. sanguis)
foi o que se aderiu em maior número a todos os materiais testados. Com
ou sem cobertura salivar, foi verificada correlação entre aumento da
hidrofobicidade da superfície bacteriana e aumento da adesão (retenção)
bacteriana ao substrato. A presença da saliva resultou em redução da
adesão bacteriana quando comparada às superfícies não expostas.
Yamamoto et al.
82
(1996) avaliaram aderência in vitro de
S. oralis sobre resina composta e relacionaram com rugosidade superficial
do material. Amostras do material foram confeccionadas e polidas com
lixas de papel de diferentes granulações obtendo-se rugosidades
superficiais variando de 0,2 a 3,0 µm. As amostras foram imersas em
suspensão de 10
8
células/mL radiomarcadas e incubadas por 2 horas a
37ºC em condições de anaerobiose. Após avaliação da aderência de S.
oralis, as amostras foram lavadas, fixadas e desidratadas para serem
examinadas por MEV. Foi verificado que a aderência bacteriana variou de
9,85 a 9,28 x 10
6
células/amostra para as mais rugosas e menos rugosas,
respectivamente. Não foi observada relação entre aderência de S. oralis e
rugosidade superficial. Na análise com MEV, foi observado que fímbrias
facilitaram a aderência das bactérias às partículas de carga da resina
composta nas amostras com rugosidade de 0,2 µm. Assim, as partículas
de carga desempenharam papel importante na adesão bacteriana
mediada por fímbrias.
A aderência in vitro de S. mutans sobre materiais
restauradores cobertos por saliva foi avaliada por Shahal et al.
69
(1998).
Foram testadas resinas compostas híbridas, micro-particuladas,
fortemente micro-particuladas e cimentos ionoméricos. Esmalte bovino foi
utilizado como controle. Espécimes padronizados dos materiais foram
confeccionados sobre lâminas de vidro a fim de eliminar as variáveis
35
relacionadas à rugosidade superficial. Para a realização do experimento,
os espécimes foram incubados, por 60 minutos a 37
o
C, em saliva
coletada de um único doador. Em seguida, os espécimes foram expostos
a solução contendo a enzima glicosiltransferase. Após uma hora, os
espécimes foram novamente incubados em solução de sacarose para
permitir a síntese de polissacarídeos. Finalmente, os espécimes foram
expostos por 120 minutos a 37
o
C, em suspensão de S. mutans GS5
marcados com substância visível na cintilografia. O número de bactérias
aderidas foi medido por contagem cintilográfica. Não foi observada
diferença na aderência de S. mutans entre os materiais testados. Através
de técnicas de eletroforese foi verificado que não houve diferenças na
adsorção de componentes salivares nos diferentes materiais, assim a
película salivar apresentou os mesmos constituintes sobre todos os
materiais. A análise em MEV demonstrou que as superfícies do esmalte e
dos cimentos ionoméricos foram mais irregulares quando comparados às
resinas compostas. Desta forma, os resultados não indicaram relação
entre irregularidades superficiais e aderência bacteriana.
Zalkind et al.
84
(1998) avaliaram, in vitro, a aderência de
S. mutans sobre resinas compostas (micro-particuladas e macro-
particuladas) e amálgama com diferentes sistemas de acabamento e
polimento. Esmalte dentário humano foi usado como controle. Amostras
padronizadas dos materiais foram confeccionadas e colocadas em placas
de cultura de células com suspensão de S. mutans e suplemento de
sacarose e incubadas por quatro dias. Não houve diferenças na aderência
de S. mutans entre resinas compostas micro-particuladas e macro-
particuladas com igual procedimento de acabamento e polimento.
Também não foi verificada diferença quanto às resinas compostas
polimerizadas sobre matriz plástica e resinas que receberam diferentes
procedimentos de acabamento e polimento.
36
A influência da aderência de S. mutans, S. oralis e A.
naeslundii sobre resinas compostas foi avaliada por Willershausen et al.
81
(1999). Amostras dos materiais foram confeccionadas e polidas com
discos de óxido de alumínio. Após desinfecção, as amostras foram
fixadas em arames ortodônticos, que foram inseridos em tubos de ensaio
contendo caldo sacarosado e inoculo de cada microrganismo. Os
períodos de incubação foram de 20, 28, 34 e 35 dias. Diariamente, o
caldo foi substituído e alíquotas foram usadas para avaliar a quantidade
de glicose consumida e de ácido lático produzido. Tubos contendo as
amostras e caldo, mas sem inoculo de microrganismo; e tubos contendo
caldo e inoculo de bactérias, mas sem amostras foram utilizados como
controles para alterações na superfície dos materiais e consumo de
glicose e produção de ácido lático, respectivamente. Após incubação, as
amostras foram removidas e limpas em banho de ultra-som para remover
as bactérias aderidas. A seguir, foram realizadas avaliações de
rugosidade superficial. O consumo de glicose na presença das amostras
dos materiais e no controle (sem amostras dos materiais) não apresentou
diferença. Os estreptococos produziram maior quantidade diária de ácido
lático quando comparado com A. naeslundii. Antes da aderência, todos os
materiais apresentaram rugosidade superficial similar. Após a aderência
de S. mutans e A. naeslundii, a rugosidade aumentou em todos materiais.
A aderência in vitro de cepas padrão de S. mitis, S. oralis,
S. sanguis e S. sobrinus ao esmalte dentário humano, à cerâmica e ao
cimento resinoso foi avaliada por Takatsuka et al.
72
(2000). Amostras
padronizadas dos materiais foram confeccionadas e receberam os
mesmos procedimentos de acabamento e polimento. Para a realização do
teste de aderência na presença de saliva, as amostras foram imersas em
saliva filtrada por 60 minutos a 37
o
C, e a seguir lavadas em água
destilada. Também foram medidos os ângulos de contato dos
microrganismos e dos materiais como índice de hidrofobicidade. Na
ausência da saliva, o cimento resinoso foi o material mais hidrofóbico. O
37
esmalte apresentou maior valor de ELS sendo mais hidrofílico, e a
cerâmica apresentou valor intermediário. Com a cobertura da película
salivar, a ELS dos três materiais foi similar. S. sobrinus apresentou maior
ELS, não ocorrendo diferenças entre os demais microrganismos. Nas
amostras avaliadas sem presença de saliva, observou-se maior aderência
de S. mitis, S. oralis e S. sobrinus no esmalte seguido pela cerâmica e
cimento resinoso. Já para S. sanguis, ocorreu maior aderência no cimento
resinoso seguido pelo esmalte e cerâmica. A aderência dos
microrganismos testados diminuiu na presença de saliva, exceto a
aderência de S. sanguis ao esmalte, que não foi alterada.
Kawai & Urano
37
(2001) avaliaram a adesão in vitro de S.
sobrinus B13 e de glicanos sobre amálgama, liga de ouro, resina
composta, cerâmica feldspática (Vita Celay Blanks), cerâmica feldspática
reforçada por leucita (IPS Empress) e cerâmica vítrea (Dicor). Para cada
material foram confeccionados seis discos padronizados, que receberam
polimento com lixa de papel (600) e adicionalmente, três discos, ainda
receberam os procedimentos de polimento recomendados pelos
fabricantes. A rugosidade superficial entre os materiais polidos e entre os
materiais lixados foi similar. Os resultados demonstraram que, nos discos
somente lixados, a adesão bacteriana e de glicanos foi maior na resina
composta, quando comparada às cerâmicas. Nos discos polidos a adesão
bacteriana foi maior nas cerâmicas seguida pela resina composta, e a
adesão de glicanos foi maior na resina composta seguida pelas
cerâmicas. No caso da resina composta, o polimento recomendado pelo
fabricante reduziu acentuadamente a quantidade de bactérias e glicanos
aderidos. No caso das cerâmicas esta redução não foi significativa.
A colonização bacteriana sobre superfícies de cerâmica
de zirconia e titânio foi avaliada in vitro e in vivo por Rimondini et al.
62
(2002). Para o estudo in vitro, sete amostras padronizadas de cada
material foram avaliadas quanto à adesão dos seguintes microrganismos:
Porphyromonas gingivalis, S. mutans (ATCC 25175), S. sanguis, A.
38
naeslundii e A. viscosus. A adesão bacteriana aos materiais foi
quantificada através de avaliação espectrofotométrica. Para o estudo in
vivo, dez indivíduos com adequado padrão de higiene bucal foram
selecionados. Dispositivos bucais foram confeccionados e uma amostra
de cada material foi fixada na região de molares e pré-molares. O
dispositivo foi usado por período de 24 horas, sendo que nenhum
procedimento de higiene bucal foi realizado. A seguir, as amostras foram
removidas e analisadas em microscopia eletrônica de varredura. Cinco
campos (20 x 25 µm) foram randomicamente selecionados de modo que
uma área total de 100 x 125 µm foi avaliada em cada amostra. Escores
foram usados para avaliar presença e quantidade de microrganismos em
cada campo. S. mutans aderiu mais à cerâmica de zirconia quando
comparado ao titânio, enquanto S. sanguis pareceu aderir mais facilmente
ao titânio. Nenhuma diferença foi observada quanto à adesão de P.
gingivalis e Actinomyces spp. In vivo, foi observado que significativamente
menor número de bactérias aderiu à superfície cerâmica, com predomínio
de cocos e ausência de bastonetes.
Aderência de S. mutans sobre amálgama, ionômeros de
vidro, ionômeros de vidro modificados com resina, resinas modificadas
por poliácidos, resinas compostas e cerâmicas foi avaliada por Eick et
al.
21
(2004). Amostras dos materiais foram preparadas e avaliadas quanto
à rugosidade superficial. A seguir, foram colocadas em câmara de fluxo
contínuo, e cobertas por saliva artificial complementada com mucina.
Suspensão de S. mutans foi inserida no fluxo permitindo a adesão
bacteriana à película. Após 15 minutos, caldo sacarosado foi permitido
passar na câmara continuamente por todo período experimental de 48
horas. As amostras foram pesadas após a remoção da câmara e inseridas
em tubos de ensaio. Os tubos foram colocados em ultra-som e a seguir
novamente as amostras foram pesadas. A diferença das medidas foi
determinada como o peso úmido do biofilme. Para avaliar as unidades
formadoras de colônias (UFC), alíquotas foram semeadas em placas
39
contendo meio de cultura e incubadas a 37
o
C, com 10% de teor de CO
2
por 48 horas. A viabilidade de S. mutans foi determinada por coloração
com diacetato fluorescente e brometo de etídeo (técnica de coloração
vital). A menor rugosidade superficial foi observada nas cerâmicas,
seguidas pelas resinas modificadas por poliácidos e resinas compostas e
a maior foi verificada nos ionômeros de vidro. O menor peso de biofilme
foi verificado nas cerâmicas e o maior nos ionômeros de vidro. Correlação
positiva foi observada entre rugosidade superficial e peso úmido do
biofilme. O menor número de UFC foi encontrado nas cerâmicas e resinas
compostas, não havendo diferenças entre estes materiais. Não foi
verificada correlação significante entre número de UFC e rugosidade
superficial. A mais alta taxa de viabilidade de S. mutans foi observada
sobre as cerâmicas e ionômeros de vidro. O flúor presente nos materiais
ionoméricos não influenciou na adesão e viabilidade de S. mutans.
Montanaro et al.
49
(2004) avaliaram a aderência de S.
mutans a três resinas compostas micro-híbridas, três resinas fluídas, um
compômero e dois ionômeros de vidro modificados por resina. Amostras
padronizadas dos materiais foram confeccionadas conforme
especificações dos fabricantes e após quatro semanas foram submetidas
ao teste de aderência por período de 4 horas. Medidas de liberação de
flúor dos materiais em água foram realizadas nos períodos de 6 e 24
horas e 7 dias. Os resultados mostraram que com exceção de um dos
ionômeros de vidro, que apresentou maior aderência, todos os outros
materiais foram semelhantes entre si. Foi verificado que mesmo nos
materiais conhecidos pela liberação de flúor (ionômeros de vidro
modificados por resina e compômeros), esta liberação foi insignificante,
não sendo capaz de reduzir a aderência de S. mutans.
40
2.5 Formação in situ de biofilme dentário
Lie
44
(1978) estudou a morfologia do biofilme dentário
formado sobre amostras de hidroxiapatita, em seis indivíduos com
adequada higiene bucal, por meio de microscopia eletrônica de
transmissão. Após 2 horas no ambiente bucal, as amostras de
hidroxiapatita apresentaram-se cobertas por fina película. Bactérias foram
regularmente visualizadas após 4 e 6 horas, sendo células individuais ou
pequenos agregados de células com mesma morfologia. As primeiras
bactérias foram cocos Gram-positivos, mas bastonetes curtos também
foram encontrados. A película apresentou-se com aspecto globular,
granular ou fibrilar. O modo mais freqüente de adesão dos
microrganismos foi pelo contato direto da parede celular bacteriana e a
película. Bactérias também foram visualizadas a alguma distância da
superfície da película, mas com finas fibrilas entre a parede celular e a
película. Microrganismos também foram observados totalmente
embebidos na película. Pequenas irregularidades na superfície do
dispositivo de resina epóxi utilizado para a fixação das amostras de
hidroxiapatita foram rapidamente cobertos por material similar ao da
película e nas irregularidades mais amplas, colonização bacteriana foi
observada. Caracteristicamente, as bactérias apresentaram-se mais
densamente agrupadas nestes defeitos quando comparadas às áreas
lisas.
Em 1980, De Wet & Ferreira
18
, avaliaram a formação do
biofilme dentário sobre restaurações de resina composta glazeadas ou
não. Para avaliar a rugosidade superficial dos materiais, foram
confeccionadas amostras de resina composta, divididas em grupos de
acordo com o tipo de acabamento e glaze (Adaptic Glaze, Concise
Enamel Bond, Nuval-Seal, Finite). Uma amostra de cada grupo foi
submetida a ciclos de escovação manual utilizando-se escova dental nova
e dentifrício. Avaliação da formação de biofilme in vivo foi realizada em
41
cem pacientes com restaurações classe V. A superfície vestibular do
dente restaurado foi dividida em duas partes, sendo A – glazeada e B –
não glazeada. A presença e ausência de biofilme foram avaliadas em três
e seis meses e um ano. Os resultados demonstraram que amostras
glazeadas apresentaram média de rugosidades superficiais menores
quando comparada às amostras não glazeadas. Após cinco mil ciclos de
escovação, os glazes Concise Enamel Bond e Nuval-Seal apresentaram
aumento na rugosidade superficial. O mesmo foi observado na superfície
da resina composta que foi polimerizada sobre uma matriz plástica. In
vivo, foi observada pouca evidência de acúmulo de biofilme sobre
superfícies glazeadas (parte A), já sobre a parte B, a quantidade de
biofilme aderido foi significativa. Quantidades similares de biofilme
formaram-se sobre os diferentes glazes, exceto para o glaze Finite que
apresentou maior quantidade de biofilme depositado após três meses.
Em um estudo clínico, Chan & Weber
13
(1986) avaliaram
a retenção do biofilme dentário sobre dentes naturais e coroas totais de
diferentes materiais restauradores. Participaram do estudo dezenove
pacientes que haviam recebido coroas totais de cerâmica (Cerestore) nos
últimos quatorze meses. A cimentação mais recente destas coroas foi a
quatro semanas do início do estudo. Foram avaliadas coroas de
Cerestore, coroas metalo-cerâmicas, de ouro e de resina acrílica. Como
controle, dentes hígidos foram incluídos. Foi observado que no mesmo
paciente havia diferenças nos índices de placa nos quadrantes,
confirmando que algumas áreas eram higienizadas de forma mais
adequada que outras. Por este motivo o índice de placa de uma coroa foi
comparado com o índice de placa do quadrante a que estava inserida. Os
resultados demonstraram que o índice de placa da coroa em relação ao
seu quadrante foi de 32% para as coroas de Cerestore, 90% para as
metalo-cerâmicas, 148% para as de ouro e 152% para as coroas de
resina acrílica. Os dentes naturais apresentaram valores de 110%.
Segundo os autores, a alta taxa de biofilme encontrada na coroas metalo-
42
cerâmicas pode ter ocorrido devido ao fato de que a maioria apresentava
somente a face vestibular coberta por cerâmica e as demais cobertas com
metal. Coroas de ouro acumularam mais biofilme que o esperado,
provavelmente porque foram utilizadas em áreas posteriores não
estéticas e também mais difíceis de serem higienizadas. Coroas de
Cerestore foram utilizadas em regiões anteriores e posteriores e
mantiveram baixo índice de biofilme em qualquer localização.
Nyvad & Fejerskov
52
(1987) avaliaram a colonização
microbiana inicial (4 a 48 horas), sobre esmalte e superfície radicular
através de microscopia eletrônica de varredura. Amostras de esmalte e
superfície radicular (terceiros molares não erupcionados extraídos) foram
fixadas na face vestibular de dispositivos bucais confeccionados para seis
indivíduos. Nas primeiras 8 horas, os indivíduos realizaram bochechos
com solução de sacarose a 10% por 2 minutos, logo após a colocação do
dispositivo e em intervalos de uma hora e trinta minutos sendo que
nenhuma ingestão de alimentos foi realizada. Posteriormente, para
períodos breves de alimentação, o dispositivo foi removido e mantido em
umidade. Nenhum procedimento de higiene bucal foi realizado. Após o
término de cada período experimental, as amostras foram removidas e
processadas para microscopia. Em 4 horas no ambiente bucal, as
superfícies de esmalte encontraram-se parcialmente cobertas por material
granular, que foi particularmente evidente nas áreas irregulares. Poucos
cocos foram visualizados nas áreas irregulares. Após 8 horas, micro-
colônias de cocos e bastonetes foram visualizadas nas irregularidades.
Bactérias esparsas foram observadas no restante da superfície. Em 12
horas, o número de colônias bacterianas aumentou de forma significativa.
Proliferação bacteriana em monocamada foi observada, colônias vizinhas
pareciam se fundir. No período de 24 a 48 horas, foi verificado predomínio
de cocobacilos com projeções granulares múltiplas da parede celular.
Entre ilhas espalhadas de cocos, bastonetes e filamentosos estendiam-se
perpendicularmente à superfície. Ocasionalmente, depósitos bacterianos
43
foram superpostos por uma estrutura granular rugosa. Foram verificadas
projeções granulares na superfície das bactérias. Isto tem sido verificado,
in vitro, no crescimento de S. mutans em meio contendo sacarose. Estas
projeções granulares parecem indicar secreção ativa de polímeros.
Nyvad & Fejerskov
53
(1987) utilizando a mesma
metodologia descrita na pesquisa anterior, avaliaram o biofilme dentário
formado sobre amostras de esmalte e cemento por meio de microscopia
eletrônica de transmissão. No período de 4 horas, as superfícies de
esmalte e cemento apresentaram-se cobertas por material granular de
baixa densidade eletrônica com bactérias isoladas. Grupos ocasionais de
microrganismos também foram visualizados. Bactérias presentes foram
cocos e bastonetes curtos Gram-positivos. Microrganismos maiores
contendo vacúolos de variados tamanhos também foram visualizados. A
maioria das bactérias conectou-se à película por meio de fímbrias, porém
bactérias com parede celular espessa não apresentaram esta
característica. Poucos microrganismos apresentaram septo indicativo de
divisão celular. Após 12 horas, o número de bactérias aumentou
significativamente. Vários microrganismos apresentam septo indicativo de
divisão celular. No esmalte, áreas com micro-colônias alternadas por
áreas pouco colonizadas foram observadas. Freqüentemente, as micro-
colônias foram associadas com depressões na superfície do esmalte. Em
contrapartida, a superfície do cemento pareceu completamente coberta
por microrganismos. Em 48 horas, as superfícies de esmalte e cemento
foram completamente cobertas por espessos depósitos bacterianos.
Sobre o esmalte, a espessura da cobertura bacteriana variou dentro da
mesma superfície e entre superfícies de diferentes indivíduos. Sobre o
cemento, a espessura dos depósitos bacterianos foi homogênea, sendo
que quantitativamente, o cemento foi mais intensamente colonizado
quando comparado ao esmalte. Independente do material, a estrutura dos
depósitos bacterianos foi similar. Pequenas colônias de microrganismos
Gram-positivos e negativos foram observadas na porção mais interna.
44
Microrganismos coco-bacilos Gram-positivos foram visualizados em áreas
com uma fina borda de material granular representando a película. Na
porção mais externa, grupos de pequenas bactérias Gram-positivas com
parede celular extremamente fina foram visualizados. Eventualmente,
filamentos Gram-negativos perpendiculares à superfície também foram
observados. A microbiota mais superficial apresentou-se coberta por fino
material granular.
A avaliação de biofilme dentário formado sobre coroas
totais de diferentes materiais restauradores foi realizada por Adamczyk &
Spiechowicz
1
(1990). Inicialmente, vinte pacientes que precisavam de
tratamento restaurador receberam coroas totais de resina acrílica, liga de
prata-paládio e cerâmica (Vita VMK 68). Através do índice de placa e
técnica de visualização fluorescente, foi avaliada a quantidade de biofilme
formado sobre toda a dentição em vários períodos após a cimentação (1,
3, 24, 48 horas, três e sete dias). Raspagem e limpeza foram realizadas
após cada avaliação. Na segunda parte do estudo, três tipos de
restaurações (metálica, resina acrílica, cerâmica) foram realizadas em dez
pacientes e cimentadas provisoriamente. A quantidade de biofilme
formado sobre as coroas provisórias foi avaliada nos períodos de 1, 3 e
24 horas através de MEV. Amostras de biofilme coletadas em 24 horas
foram avaliadas quanto a sua composição química. Os resultados
demonstraram que superfícies dentárias naturais de pacientes que
receberam restaurações cerâmicas apresentaram menos biofilme em
todos os períodos. Os achados com MEV confirmaram os resultados
clínicos. Coroas metálicas apresentaram maior quantidade de biofilme
distribuído de forma densa. Coroas de resina acrílica também
apresentaram grande quantidade de biofilme, mas frouxamente
distribuído. Nas coroas cerâmicas, o biofilme apresentou-se mais
frouxamente distribuído e em menor quantidade. Foi verificado que a
variável paciente também influenciou no resultado, pois durante o mesmo
período experimental e sobre o mesmo material, diferentes pacientes
45
acumularam diferentes quantidades de biofilme. Análise da composição
química verificou biofilme constituído de substância orgânica composta
principalmente de carbono, hidrogênio, nitrogênio e oxigênio.
Remanescentes inorgânicos também foram detectados.
A formação de biofilme dentário in vivo sobre vários
materiais restauradores foi avaliada por Siegrist et al.
70
(1991). Três
indivíduos, que necessitavam de tratamento protético (prótese fixa com
pôntico) foram selecionados. Facetas de ligas de prata-paládio (AgPd), de
cromo-cobalto (CrCo), de cromo-cobalto-titânio (CrCoTi), de ouro a 50% e
85%, amálgama, cerâmica, esmalte e dentina foram fixadas da face
vestibular dos pônticos. Foram realizadas avaliações microbiológicas e
MEV do biofilme formado sobre as facetas após 4 e 24 horas. Durante
estes períodos, nenhum procedimento de higiene bucal foi realizado e os
pacientes seguiram suas dietas normais. Os resultados microbiológicos
indicaram que de 4 para 24 horas houve aumento de trinta vezes na
contagem total de bactérias. Em ambos os tempos e para todos os
materiais, a microbiota consistiu principalmente de cocos e bacilos
facultativos. Os bacilos facultativos Gram-positivos encontrados foram
principalmente espécies de Actinomyces. Microrganismos anaeróbios
foram detectados em porcentagens muito baixas. Após 4 horas, a dentina
apresentou mais alta contagem total de bactérias seguida pelo amálgama.
No MEV, foi observado que o amálgama e o esmalte acumularam mais
biofilme, seguidos pela cerâmica e ligas. Em 24 horas, o amálgama foi o
material que acumulou a maior quantidade de biofilme, seguido pela liga
de AgPd, esmalte, dentina, cerâmica e liga de ouro a 85%. As ligas de
ouro a 50%, de CrCo e de CrCoTi acumularam a menor quantidade de
biofilme. Foi concluído que a cerâmica, a liga de AgPd e as duas ligas de
ouro foram os materiais que acumularam menor número de células
bacterianas com valores próximos aos verificados no esmalte e dentina.
46
Hahn et al.
29
(1993) avaliaram a formação do biofilme
dentário e a vitalidade de bactérias sobre materiais restauradores.
Facetas de cerâmicas, cimento resinoso e esmalte dentário humano,
foram fixadas na área interproximal de inlays de dez pacientes. A
extensão vertical das facetas foi padronizada para terminar a 1 mm
coronal a gengiva interproximal e a extensão horizontal foi determinada
pela extensão da cada inlay individual. Após três dias de acúmulo de
biofilme, amostras dos materiais foram removidas e o biofilme foi coletado
com cureta estéril. Uma alíquota foi utilizada para avaliar a contagem total
de bactérias em microscopia de campo escuro e outra para avaliar as
unidades formadoras de colônias (UFC). Por meio da técnica de
fluorescência vital, foi avaliada a contagem total de bactérias viáveis
sobre os materiais. Os resultados mostraram que ambas as cerâmicas
avaliadas apresentaram valores significativamente mais baixos de UFC e
contagem total de bactérias quando comparadas ao esmalte ou cimento
resinoso.
Castellani et al.
12
(1996) estudaram a formação do
biofilme dentário inicial sobre cerâmica feldspática (Vita Zahnfabrik
GmbH) e cerâmica vítrea (Dicor). Dez indivíduos sem sinais de doenças
bucais foram selecionados para o estudo. Amostras padronizadas,
glazeadas e não glazeadas da cerâmica feldspática, e caracterizada e
não caracterizada da cerâmica vítrea, foram confeccionadas. Estas
amostras foram seccionadas em duas partes iguais e fixadas na face
vestibular de um dispositivo bucal individualizado. Os indivíduos usaram
o dispositivo por períodos de 4, 12, 24 e 48 horas, nos quais nenhum
procedimento de higiene bucal foi realizado. A seguir, amostras do
biofilme foram obtidas da superfície das amostras e também do esmalte
de dentes hígidos. Cultura bacteriana foi realizada para determinar o
número de bactérias aeróbias e anaeróbias presentes. Os resultados
indicaram que incluindo o esmalte, todos os materiais mostraram um
aumento progressivo de microrganismos aeróbios e anaeróbios. As
47
superfícies mais rugosas apresentaram maior número de bactérias
quando comparadas as superfícies mais lisas dos materiais
correspondentes (cerâmicas vítrea caracterizada e cerâmica feldspática
glazeada) no intervalo de 12 e 24 horas. Nenhuma diferença foi
encontrada entre o número de bactérias aeróbias e anaeróbias sobre
cerâmica vítrea caracterizada e cerâmica feldspática glazeada ou entre a
cerâmica vítrea não caracterizada e cerâmica feldspática não glazeada
neste mesmo intervalo. Maior número de microrganismos foi relacionado
à rugosidade superficial e não ao tipo de material.
A primeira pesquisa que avaliou biofilme dentário,
utilizando a técnica de fluorescência vital, em conjunto com análise em
microscópio confocal laser, foi realizada em 1998 por Netuschil et al.
51
Amostras de vidro e de esmalte dentário foram fixadas em dispositivos
bucais confeccionados para seis indivíduos com adequado padrão de
higiene bucal. Após um, dois, e três dias o biofilme formado sobre as
amostras foi corado e avaliado em microscópio confocal laser. O valor
máximo da espessura do biofilme formado sobre o esmalte dentário foi de
8, 35 e 45 µm para os períodos de um, dois e três dias, respectivamente.
Já para o vidro, a espessura variou de sete a 32 µm após três dias.
Mesmo em uma única amostra a espessura do biofilme foi variável, com
valores de zero a 32 µm. Foi verificada baixa viabilidade das bactérias
nesta fase inicial de formação do biofilme. As análises revelaram que
microrganismos viáveis localizavam-se no topo de uma camada de
células mortas.
A formação de biofilme dentário inicial sobre esmalte e
materiais restauradores foi avaliada, por meio de microscopia eletrônica
de transmissão por Hannig
32
(1999). Amostras de esmalte, amálgama,
ligas fundidas, titânio, cerâmicas feldspáticas, cerâmica vítrea, resinas
compostas e resinas não particuladas foram fixadas na área vestibular e
palatina de dispositivos bucais confeccionados para três indivíduos com
48
adequado padrão de higiene bucal. O dispositivo foi usado por 24 horas,
sendo removido durante as refeições e armazenado em ambiente com
umidade. Após as refeições, os indivíduos realizaram higiene bucal sem
dentifrício, e nenhum procedimento de limpeza foi realizado no
dispositivo. Após 24 horas, as amostras foram removidas e processadas
para microscopia eletrônica de transmissão. Os resultados não indicaram
diferenças quanto ao biofilme inicial nos diferentes materiais. Contudo,
foram observadas diferenças no biofilme entre amostras fixadas na
vestibular e palatina do dispositivo. Amostras palatinas apresentaram-se
completamente cobertas por película granular homogênea (20 a 250 nm
de espessura). Próximo a superfície das amostras, uma camada eletro-
densa foi observada. A colonização bacteriana esteve relacionada com
irregularidades nas superfícies. A colonização pareceu não se estender
para as áreas lisas. Poucos cocos isolados foram verificados nestas
áreas. Amostras vestibulares apresentaram película com estrutura
globular. A espessura da película adquirida, livre de bactérias, foi de 100
nm a 2 a 3 µm. Próximo a superfície do material havia uma camada
eletro-densa de 10 a 20 nm. Em todas as amostras vestibulares, havia
multi-camadas de microrganismos que cobriam parcialmente ou
totalmente a superfície. Cocos predominaram. Agregação bacteriana ou
adesão às superfícies foi mediada por fímbrias ou filamentos da parede
celular. Foi concluído que a formação inicial do biofilme parece ser
influenciada mais pelo ambiente bucal do que pelas propriedades dos
materiais.
Auschill et al.
2
(2002) avaliaram o biofilme dentário
formado sobre diferentes materiais restauradores. Amostras padronizadas
dos materiais foram fixadas em dispositivos bucais confeccionados para
três indivíduos com adequado padrão de higiene bucal. Após cinco dias
no ambiente bucal, as amostras foram removidas e o biofilme formado foi
corado com diacetato fluorescente e brometo de etídeo (técnica de
coloração vital), para visualizar a porcentagem de bactérias viáveis e não
49
viáveis. Em seguida, foi realizada análise em microscópio confocal laser.
Amostras de resina composta (Pertac II) e cerâmica (IPS Empress)
apresentaram proporção de bactérias viáveis em torno de 4 a 21% e de
34 a 86%, respectivamente. Espessura do biofilme variou de 1 a 6 µm
sobre a cerâmica e resina composta, respectivamente. A área da
superfície da amostra coberta por biofilme também variou de acordo com
os materiais. Quando foi comparada a espessura, a vitalidade das
bactérias e a área coberta por biofilme nenhum modelo pode ser
estabelecido. Contudo, as cerâmicas mostraram uma menor área coberta
com a mais alta taxa de vitalidade bacteriana. Quando a vitalidade das
bactérias foi comparada com a espessura verificou-se que as cerâmicas
apresentaram o biofilme mais fino, mas com maior taxa de vitalidade
bacteriana.
A formação do biofilme dentário inicial sobre resina
composta (Clearfil AP-X) e esmalte dentário foi analisada por Konishi et
al.
42
(2003). Amostras dos materiais foram fixadas na face vestibular dos
primeiros molares superiores de três indivíduos e mantidas por 4, 8 e 24
horas. Durante o experimento, higiene bucal não foi realizada. A seguir,
as amostras foram removidas e processadas para análise em microscópio
confocal laser. A espessura e a densidade bacteriana no biofilme formado
sobre os materiais aumentaram com o tempo. Não foi observada
diferença na espessura do biofilme entre esmalte e resina composta.
Contudo, após 24 horas, a área ocupada por bactérias foi maior na resina
composta. Além disso, os microrganismos na superfície do esmalte foram
predominantemente cocos, enquanto sobre a resina composta bastonetes
também foram observados. Os resultados indicaram maior densidade de
bactérias sobre a resina composta e sugerem uma composição
microbiana diferente sobre os materiais durante a formação do biofilme
dentário inicial.
50
Tanner et al.
74
(2005) avaliaram o biofilme dentário inicial
formado in situ sobre compósito reforçado por fibras de vidro, compósito
reforçado por fibras de polietileno, cerâmicas e resinas compostas em 14
indivíduos. Espécimes padronizados dos materiais foram fixados nos
molares superiores e após 24 horas, amostras do biofilme foram
coletadas. Estreptococos do grupo mutans e microbiota facultativa total foi
avaliada. O biofilme sobre compósito reforçado por fibras de polietileno
apresentou significativamente mais estreptococos do grupo mutans
quando comparados às cerâmicas, às resinas compostas e ao compósito
reforçado por fibras de vidro. Para a microbiota facultativa total, compósito
reforçado por fibras de polietileno apresentou os valores mais altos, e as
cerâmicas os valores mais baixos.
51
PROPOSIÇÃO
A proposição do presente trabalho foi:
a) avaliar a rugosidade superficial de diferentes materiais
restauradores estéticos indiretos;
b) avaliar a aderência in vitro de Streptococcus mutans
aos materiais restauradores estéticos indiretos, na
presença e ausência de saliva;
c) correlacionar rugosidade superficial dos materiais
restauradores estéticos indiretos e aderência de S.
mutans;
d) ilustrar e descrever o biofilme dentário inicial formado in
situ sobre materiais restauradores estéticos indiretos,
por meio de análise em microscopia eletrônica de
varredura.
52
4 MATERIAIS E MÉTODOS
Duas cerâmicas odontológicas e duas resinas compostas
indiretas foram utilizadas para os experimentos (Quadro 1). Esmalte
dentário humano foi usado como controle.
Este projeto de pesquisa foi aprovado pelo Comitê de
Ética em Pesquisa da Faculdade de Odontologia, Campus São José dos
Campos, Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” –
UNESP (protocolo 038/2003-PH/CEP) (Anexo A).
53
Quadro 1 – Materiais avaliados no presente estudo, segundo sua
constituição, produto e indicações.
Grupos
Constituição
Produto
Indicações
Feldspática/
leucita
Cerâmica feldspática
reforçada por leucita
(prensada)
IPS Empress
(Ivoclar-Vivadent,
Schaan,
Liechtenstein)
Coroas totais, inlays,
onlays
Feldspática
Cerâmica feldspática
50% de fase
cristalina (óxido de
alumínio), 50% de
fase vítrea
VM7
(Vita Zahnfabrikd,
Bad Sackingen,
Alemanha)
Coroas totais, inlays,
onlays
RC micro-
híbrida
Resina composta
micro-híbrida
Sinfony
(3M – Espe, St
Paul, EUA)
Coroas totais, inlays,
onlays
RC micro-
particulada
Resina composta
micro-particulada
(nano partículas)
VMLC
(Vita Zahnfabrik,
Bad Sackingen,
Alemanha)
Coroas totais, inlays,
onlays
Esmalte
Esmalte humano
--------------
---------------
RC: resina composta
4.1 Preparação das amostras
Trinta amostras padronizadas (forma de disco) de cada
material foram confeccionadas. Para o teste de rugosidade superficial e
aderência in vitro de S. mutans as amostras apresentaram 5 mm de
54
diâmetro e 2,5 mm de espessura. Para avaliar o biofilme dentário inicial
formado in situ sobre os materiais, as amostras apresentaram 5 mm de
diâmetro e 1 mm de espessura. Todas as amostras foram confeccionadas
conforme as recomendações dos respectivos fabricantes.
A produção das amostras de cada material, em particular,
é descrita abaixo:
a) Feldspática/leucita: foram inicialmente confeccionadas
amostras em acrílico calcinável nas dimensões pré-
estabelecidas. Estas amostras foram fixadas na
extremidade de condutos de alimentação, que foram
incluídos em revestimento IPS Empress 2 Special
(Ivoclar-Vivadent), em cilindro IPS Empress 2 Paper Ring
(Ivoclar-Vivadent). Os conjuntos foram levados ao forno
juntamente com a haste do êmbolo de óxido de alumínio a
fim de eliminar o material calcinável. Em seguida, o
cilindro foi removido do forno e a pastilha cerâmica IPS
Empress foi introduzida. Sobre esta, a haste de óxido de
alumínio foi posicionada e o conjunto foi transportado ao
forno de injeção EP500 (Ivoclar-Vivadent) para fundição, a
temperatura de 920
o
C e pressão de 5 bar. Após o
processo de injeção da cerâmica, o forno abriu-se
automaticamente e o cilindro de revestimento foi removido
para resfriamento a temperatura ambiente. Inicialmente, o
revestimento foi removido com jato abrasivo Ivoclar Jet
Medium (Ivoclar-Vivadent), com pressão de 4 bar e
próximo às amostras cerâmicas com pressão de 2 bar. Os
discos cerâmicos foram glazeados com IPS Glaze
(Ivoclar-Vivadent);
b) Feldspática: para a produção das amostras com as
dimensões pré-estabelecidas, uma matriz metálica com
dimensões aumentadas em aproximadamente 12% (5,6
55
mm de diâmetro e 3 mm de espessura) foi utilizada a fim
de compensar a contração de sinterização da cerâmica
(Figura 1). A matriz foi posicionada sobre uma base de
gesso refratário e o pó e o líquido modelador da cerâmica
VM7 foi misturado e aplicado nos espaços da matriz. As
amostras foram, então, sinterizadas no forno Vacumat 40
(Vita Zahnfabrik) seguindo as recomendações do
fabricante com ciclo de sinterização no programa 44
(Apêndice A). A seguir, as amostras foram glazeadas, no
forno Vacumat 40 no programa 9 (Apêndice A), usando
glaze Vita Akzent 25 (Vita Zahnfabrik);
c) RC micro-híbrida: as amostras foram confeccionadas
utilizando-se matriz metálica com espaços de 5 mm de
diâmetro e 3 mm de espessura (Figura 1). Esta matriz foi
colocada sobre uma placa de vidro e o material foi
inserido nos espaços da matriz de forma incremental (três
camadas de 1 mm) recebendo cada camada uma
polimerização inicial por 5 segundos (lâmpada de
polimerização Visio™ Alfa, 3M-Espe). Em seguida, as
amostras receberam a polimerização final em forno
específico (lâmpada de polimerização Visio™ Beta Vario,
3M-Espe) utilizando-se 15 minutos a vácuo e acabamento
e polimento com discos de óxido de alumínio (Sof-lex, 3M-
Espe);
d) RC micro-particulada: as amostras foram
confeccionadas de modo idêntico às amostras da RC
micro-híbrida. Contudo, receberam a polimerização final
(lâmpada de polimerização Visio™ Beta Vario, 3M-Espe)
utilizando-se 15 minutos sem vácuo. Após, receberam
acabamento e polimento com discos de óxido de alumínio
(Sof-lex, 3M-Espe);
56
e) Esmalte: amostras de esmalte foram obtidas a partir de
dentes humanos extraídos. Foram selecionados dentes
que sob observação em lupa, não apresentavam trincas.
A forma e tamanho padronizados foram obtidos usando
broca diamantada cônica número 4137 (KG Sorensen,
Barueri, SP, Brasil) montada em aparelho de alta rotação
(EXTRAtorque
®
603, Kavo do Brasil, Joinville, SC, Brasil)
sob constante refrigeração em água destilada.
Antes da aplicação do glaze nos materiais cerâmicos e
antes do polimento nos materiais resinosos, as amostras foram
desgastadas com broca diamantada cilíndrica número 1092 (KG
Sorensen) montada em aparelho de alta rotação (EXTRAtorque
®
603) sob
constante refrigeração em água até a obtenção das espessuras
estabelecidas (2,5 mm para o teste de rugosidade superficial e aderência
in vitro de S. mutans e 1 mm para a avaliação do biofilme dentário in situ).
As superfícies desgastadas não foram avaliadas no estudo sendo que
cada amostra apresentou apenas uma superfície teste. As superfícies
testes receberam acabamento com lixa papel de granulação 1000 µm
(3M) a fim de obter uma superfície mais plana, e a seguir receberam a
aplicação do glaze (cerâmica feldspática/leucita e cerâmica feldspática)
ou o polimento (RC micro-híbrida e RC micro-particulada).
FIGURA 1 – Matrizes metálicas utilizadas para confecção das amostras de cerâmica
feldspática, RC micro-híbrida e RC micro-particulada.
57
4.2 Análises realizadas
Foram realizadas as análises presentes na Tabela 1,
descritas a seguir.
Tabela 1 – Análises realizadas no estudo, para cada material restaurador
e esmalte dentário.
Tipo de Análise
Número de amostra / grupo
Rugosidade superficial
10
na ausência de saliva
10
Aderência in vitro
de S. mutans
na presença de saliva
10
Biofilme dentário inicial in situ
8
4.2.1 Análise da rugosidade superficial
Dez amostras de cada material foram avaliadas (n=10). A
análise quantitativa da rugosidade superficial foi realizada em rugosímetro
(Mitutoyo SJ 400, Tóquio, Japão) utilizando-se o parâmetro Ra (µm), que
corresponde à média aritmética dos valores absolutos das ordenadas de
afastamento (picos e vales) em relação à linha média dentro do percurso
de medição. Quatro medidas foram realizadas sobre a superfície das
amostras: duas medidas em uma direção, e duas medidas em direção
perpendicular as primeiras (aproximadamente 1 mm de distância entre
cada medida). A ponta do rugosímetro realizou percurso de 3 mm. Um
valor médio para cada amostra foi obtido a partir das quatro medidas. A
seguir, foi obtida a média para cada grupo.
58
4.2.2 Aderência in vitro de S. mutans aos materiais
Para verificar aderência de S. mutans na ausência de
saliva foram utilizadas as mesmas amostras utilizadas na análise da
rugosidade superficial (n=10), o que possibilitou verificar a correlação
entre rugosidade e aderência para cada material. Para o teste de
aderência de S. mutans na presença da saliva foram utilizadas outras
amostras (n=10).
Antes dos experimentos de aderência, somente a
superfície teste de cada amostra permaneceu exposta, sendo as demais
superfícies recobertas com esmalte de unha (Colorama Maybelline, São
Paulo, SP, Brasil). As amostras foram limpas em aparelho ultra-som
(Vitasonic, Vita Zahnfabrik, Bad Säckingen, Alemanha) com água
destilada por cinco minutos. A seguir, foram imersas em água destilada no
interior de tubos de ensaios e autoclavadas a 121ºC por 15 minutos.
4.2.2.1 Teste de aderência na ausência de saliva
Inicialmente, amostra de cepa padrão de S. mutans GS-5
(ATCC 35688) pertencente ao laboratório de microbiologia da Faculdade
de Odontologia da Universidade Estadual Paulista, Campus de São José
dos Campos foi semeada em meio de cultura BHI (Brain Heart Infusion,
Merck, Whitehouse Station, NJ, EUA). As placas foram incubadas a 37ºC
e 5% de CO
2
por 48 horas. Após, as colônias formadas foram transferidas
com alça de platina para tubo de ensaio contendo 10 mL de solução
salina (NaCl 0,9%) esterilizada. A suspensão obtida foi de 10
6
células/mL
de S. mutans padronizada em espectrofotômetro (Shimadzu UV-1203,
Kyoto, Japão). Os parâmetros de densidade óptica e de comprimento de
59
onda utilizados para padronização foram de 0,620 e 398 nm,
respectivamente.
A seguir, as amostras dos materiais foram colocadas em
placas estéreis de cultura de células contendo 24 poços (TPP
®
, Suíça).
Uma placa foi utilizada para cada material, sendo que cada amostra foi
colocada em um dos poços da placa. A cada poço, foi adicionado 2 mL de
caldo sacarosado (GIBBONS & NYGAARD
27
, 1968) (Apêndice B), e 0,2
mL de suspensão padronizada com 10
6
células/mL de S. mutans (Figura
2).
FIGURA 2 – Placa de cultura de células contendo as amostras, 2 mL de caldo
sacarosado e 0,2 mL de suspensão de S. mutans (ATCC 35688).
A placa foi fechada e mantida em estufa a temperatura de
37ºC e 5% de CO
2
pelo período de 24 horas. Decorrido este período, os
espécimes foram retirados das placas em ambiente estéril (câmara de
fluxo laminar) e lavados em 5 mL de solução salina esterilizada (NaCl
0,9%) por duas vezes e imediatamente inseridos, individualmente, em
tubos de ensaio contendo 1,5 mL de solução salina (NaCl 0,9%)
60
esterilizada e pérolas de vidro (solução inicial). Os tubos foram agitados
em agitador de tubos (Vortex modelo AP 56, Phoenix, Araraquara, SP,
Brasil) por 30 segundos, a fim de destacar as bactérias aderidas.
A partir da solução inicial foram obtidas diluições decimais
(10
-1
a
10
-3
) em tubos de ensaio contendo 9 mL de solução salina (NaCl
0,9%) esterilizada. Uma alíquota de 0,1 mL das diluições
10
-2
e 10
-3
foram
semeadas em duplicata em placas contendo meio de cultura BHI.
As placas foram incubadas a 37ºC e 5% de CO
2
por 48
horas. A seguir, foram selecionadas placas em que o número de colônias
formadas situou-se entre 30 e 300 UFC/mL (JORGE
36
, 1997), (Figura 3).
A contagem das colônias foi realizada em aparelho
contador de colônias (Phoenix CP-600, Phoenix, Araraquara, SP, Brasil).
Foi obtida a média aritmética do número de UFC das duas placas
semeadas com a mesma diluição, números que foram convertidos para
logaritmo (base 10) de UFC/mL.
61
Espécimes dos diferentes materiais.
Pérolas de vidro.
Colônias de S. mutans.
FIGURA 3 – Fluxograma representativo da realização das contagens de UFC/mL
realizadas para cada espécime dos diferentes materiais.
Solução
inicial
Solução 10
-1
Solução 10
-2
Solução 10
-3
retira-se 1 mL
agitador de tubos
retira-se 1 mL
agitador de tubos
retira-se 1 mL
agitador de tubos
tubos com 9 mL de solução salina esterilizada
tubo com 1,5 mL de
solução salina
esterilizada +
pérolas de vidro
0,1 mL
0,1 mL
Incubação 37
o
C, 5%
CO
2
por 48 horas
Contagem de
UFC/mL
62
4.2.2.2 Teste de aderência na presença da saliva
Saliva humana não estimulada foi coletada de um grupo de
seis indivíduos, de ambos os sexos e com saúde bucal. Imediatamente
após a coleta, a saliva foi agrupada e inibidor de protease PMSF (fenil
metil sulfonil fluoridro) e azida sódica foram adicionados (20 µL de PMSF
e azida sódica para cada 1 mL de saliva). A seguir, a saliva foi
centrifugada por 20 minutos a 4ºC a 20.000 X g para remover debris e
congelada até o momento do experimento. Antes do uso, a saliva foi
filtrada a vácuo em membrana de éster celulose com poros de 0,45 µm de
diâmetro (Millipore, São Paulo, SP, Brasil) para remover bactérias.
Amostras dos materiais foram totalmente imersas na saliva
filtrada por 60 minutos a 37
o
C e então lavadas em água destilada
esterilizada para imediatamente serem submetidas ao teste de aderência
de S. mutans (TAKATSUKA et al.
72
, 2000). Os procedimentos seguintes
foram idênticos aos descritos no item anterior (4.2.2.1).
4.2.3 Análise in situ do biofilme dentário inicial formado sobre materiais
4.2.3.1 Seleção dos participantes
Dois indivíduos com adequado padrão de higiene bucal
foram selecionados para o estudo. Os indivíduos concordaram em
participar da pesquisa e assinaram termo de consentimento livre e
esclarecido (Apêndice C).
Foram excluídos indivíduos que apresentavam hábitos
relacionados com fumo e álcool, portadores de distúrbios nas glândulas
salivares, lesões de cárie, doença periodontal ou outro tipo de infecção
bucal, usuários de medicamentos que interferem na secreção salivar e
63
ainda, indivíduos que fizeram uso de antibióticos nos três meses prévios
ao início do estudo (HANNIG
31
, 1997).
4.2.3.2 Dispositivo bucal
Os indivíduos foram submetidos ao procedimento de
moldagem da arcada superior utilizando-se a técnica da dupla-mistura
com elastômero do tipo poliéter. Usando o sistema Pentamix
(3M-Espe,
Seefeld, Alemanha) de auto-mistura, o material de consistência pesada
(Permadine
TM
Penta
TM
H, 3M-Espe, Seefeld, Alemanha) foi aplicado em
moldeira metálica de estoque, enquanto o material de consistência leve
(Permadine
TM
Garant
TM
2:1, 3M-Espe, Seefeld, Alemanha) foi manipulado
com pistola para auto-mistura, e aplicado sobre o material pesado.
Um modelo de gesso (Herostone, Vigodent, Bonsucesso,
RJ, Brasil) foi obtido, a partir do qual o dispositivo bucal personalizado de
resina fotopolimerizável (Elite LC Tray, Zhermack
®
, Rovigo, Itália), foi
confeccionado. Este dispositivo recobriu a coroa dos molares e pré-
molares superiores.
Uma amostra de cada material foi fixada na face
vestibular e palatina do dispositivo (Figura 4). O conjunto dispositivo /
amostras foi desinfetado em glutaraldeído por 30 minutos. A seguir, o
conjunto foi lavado em água destilada esterilizada por cinco vezes.
Para avaliar o biofilme dentário inicial formado sobre os
diferentes materiais, os participantes usaram o dispositivo bucal por
períodos de 1 e 4 horas. Antes do experimento, os indivíduos realizaram
higiene bucal como de costume, sem o uso de dentifrício.
Nenhuma ingestão de líquido ou alimentos foi realizada
durante o período experimental.
64
FIGURA 4 – Dispositivo bucal do experimento.
4.2.3.3 Análise em microscopia eletrônica de varredura (MEV)
Decorridos os períodos experimentais de 1 e 4 horas, os
espécimes foram cuidadosamente removidos e processados para análise
em microscópio eletrônico de varredura (Jeol 5400, Jeol Ltda, Japão) do
Departamento de Ciências Orais, Alma Mater Studiorum – Universidade
de Bologna, Itália.
Inicialmente, os espécimes foram imersos em solução de
glutaraldeído 4% tamponado com solução de cacodilato de sódio (0,2 M)
(pH = 7,3) por 24 horas a temperatura ambiente. A seguir, foram lavados
em tampão cacodilato (0,1 M) e foram desidratados subseqüentemente,
por uma série de passagens em concentrações crescentes de álcool
etílico (50%, 70%, 80%, 90%, 95% e 100%, por 20 minutos cada).
Após 24 horas em temperatura ambiente, os espécimes
foram fixados em stubs, usando fita adesiva dupla-face de carbono (SPI,
West Chester, PA, USA), para serem metalizados com liga de ouro-
paládio (Polaron SC 7620 Sputter Coater, Quorum Technologies,
Newhaven, UK) (tempo: 130 segundos, corrente de 10-15 mA, vácuo de
130 mTorr, taxa de metalização: 3,5 nm / minuto, camada de Pd-Au de
aproximadamente 80 Å). O microscópio eletrônico de varredura foi
operado em 10 e 15 kV.
65
Uma análise descritiva do material formado sobre as
amostras dos materiais foi realizada. Cada espécime foi avaliado de modo
a verificar todas as características do material depositado, como presença
de bactérias isoladas e/ou agregados, morfologia bacteriana e
características do material acelular presente.
Amostras dos materiais não expostas ao ambiente bucal
também foram avaliadas com MEV a fim de verificar a topografia
superficial dos materiais.
4.3 Análise estatística
Os valores médios obtidos de rugosidade superficial (µm)
para cada material foram submetidos à Análise de Variância um fator e
teste Tukey.
Nos experimentos de aderência de S. mutans, na
presença e ausência de saliva, foram analisados dois fatores sendo o
fator “material” em cinco níveis (esmalte, cerâmica feldspática reforçada
por leucita, cerâmica feldspática, resina composta micro-híbrida e resina
composta micro-particulada) e o fator “saliva” em dois níveis (presença e
ausência de saliva). Assim, o estudo apresentou esquema fatorial 5 X 2,
de modo que os dados de UFC/mL foram submetidos à Análise de
Variância dois fatores e teste Tukey.
O coeficiente linear de Pearson foi usado para verificar se
existia correlação entre rugosidade superficial (µm) e aderência de S.
mutans (UFC/mL) na ausência e presença de saliva.
Nível de significância de 5% foi utilizado em todos testes
estatísticos.
66
5 RESULTADOS
5.1 Rugosidade Superficial
Os dados de rugosidade superficial (µm) dos materiais
foram submetidos à Análise de Variância um fator e estão apresentados
na Tabela 2. Para avaliar as diferenças de rugosidade superficial entre os
materiais foi aplicado o teste Tukey (Tabela 3). Pode-se observar na
Tabela 3 que o esmalte dentário foi o material mais rugoso. A cerâmica
feldspática/leucita apresentou rugosidade significativamente maior que a
cerâmica feldspática. As resinas compostas, micro-particulada e micro-
híbrida não apresentaram diferenças entre si e foram semelhantes às
cerâmicas.
As médias e desvios padrões dos dados de rugosidade
superficial nos diferentes materiais estão apresentados na Tabela 3.
Tabela 2 – Análise de Variância (um fator) dos dados de rugosidade
superficial
Fonte de Variação
gl
SQ
QM
F
p
Material
4
22,8065
5,70163
65,7
<0,0001
Resíduo
45
3,9056
0,08679
Total
49
26,7121
gl: grau de liberdade; SQ: soma dos quadrados; QM: quadrado médio.
67
Tabela 3 – Médias e desvio padrão dos valores de rugosidade superficial
(µm) nos diferentes materiais
Material
Rugosidade superficial
*
Feldspática/leucita
0.7950 ± 0.1391
a
Feldspática
0.4100 ± 0.0587
b
RC micro-híbrida
0.4380 ± 0.1658
ab
RC micro-particulada
0.4820 ± 0.0999
ab
Esmalte
2.1840 ± 0.6113
c
* Letras iguais representam semelhança estatística, letras distintas representam
diferença estatística. Valor crítico para contraste = 0,374
5.2 Aderência in vitro de S. mutans
Para avaliar a aderência de S. mutans, relacionando o fator
material (em cinco níveis) e o fator saliva (em dois níveis) os dados foram
submetidos à Análise de Variância dois fatores, cujo resultado está
apresentado na Tabela 4.
Tabela 4 – Análise de Variância (dois fatores) dos dados de aderência de
S. mutans (log UFC/mL)
Fonte de Variação
gl
SQ
QM
F
p
Material
4
10,4025
2,60061
134,25
< 0,0001
Saliva
1
0,1910
0,19097
9,86
0,0023
Interação
4
0,0214
0,00536
0,28
0,8925
Resíduo
90
1,7435
0,01937
Total
59
12,358
gl: grau de liberdade; SQ: soma dos quadrados; QM: quadrado médio.
Por meio da Análise de Variância foi observado que:
a) o fator saliva foi estatisticamente significante
(p=0,0023). A média de log UFC/mL da aderência de S.
68
mutans na ausência de saliva (5,89±0,359) foi
estatisticamente mais alta que a média na presença de
saliva (5,80±0,345). Desta forma, a aderência de S.
mutans foi significativamente maior na ausência de saliva.
b) o fator material foi estatisticamente significante
(p=0,0023). O teste Tukey foi aplicado para verificar as
diferenças na aderência de S. mutans entre os materiais
(Tabela 5).
Tabela 5 – Médias e desvio padrão dos valores de aderência de S.
mutans (log UFC/mL) nos diferentes materiais
Material
Aderência de S. mutans
*
Feldspática/leucita
5,83 ± 0,095
a
Feldspática
5,56 ± 0,177
b
RC micro-híbrida
5,67 ± 0,137
bc
RC micro-particulada
5,69 ± 0,148
c
Esmalte
6,47 ± 0,146
d
* Letras iguais representam semelhança estatística, letras distintas representam
diferença estatística. Valor crítico para contraste = 0,122
O esmalte dentário foi o material que apresentou maior
aderência de S. mutans. A cerâmica feldspática/leucita apresentou maior
aderência que a cerâmica feldspática. As resinas compostas foram
semelhantes entre si.
Para avaliar a aderência de S. mutans nos diferentes
materiais nas condições experimentais de ausência e presença de saliva
o teste Tukey foi aplicado (Tabela 6). As médias e desvios padrões dos
dados de aderência de S. mutans (log UFC/mL) nos diferentes materiais,
na ausência e presença de saliva são apresentados na Tabela 6.
69
Tabela 6 – Médias e desvio padrão dos dados de aderência de S. mutans
(log UFC/mL) das condições experimentais estabelecidas em
função dos fatores material e saliva
Saliva
Material
Ausência
Presença
Feldspática/leucita
5,85 ± 0,079
a
5,80 ± 0,107
ac
Feldspática
5,60 ± 0,156
bc
5,52 ± 0,195
b
RC micro-híbrida
5,72 ± 0,064
abc
5,62 ± 0,173
bc
RC micro-particulada
5,72 ± 0,155
ac
5,65 ± 0,142
abc
Esmalte
6,53 ± 0,172
d
6,40 ± 0,074
d
Total
5,89 ± 0,359
5,80 ± 0,345
* Letras iguais representam semelhança estatística, letras distintas representam
diferença estatística. Valor crítico para contraste = 0,202.
O esmalte dentário apresentou maior aderência de S.
mutans, tanto na ausência quanto na presença de saliva. A cerâmica
feldspática/leucita apresentou, na ausência e presença de saliva, maior
aderência quando comparada à cerâmica feldspática. As resinas
compostas, micro-particulada e micro-híbrida, não diferiram entre si, e
apresentaram valores intermediários de aderência sendo semelhantes à
cerâmica feldspática/leucita e à cerâmica feldspática nas duas condições
experimentais.
Avaliando cada material, individualmente, na presença e
ausência de saliva, foi verificado que não houve diferença significativa na
aderência de S. mutans entre essas condições experimentais, embora
tenha sido verificado para todos os materiais valores médios menores de
log UFC/mL na presença de saliva, indicando uma tendência de redução
da aderência, o que está representado nas Figuras 5.
70
5.3 Correlação entre rugosidade superficial e aderência in vitro
de S. mutans
Inicialmente, por meio do coeficiente linear de Pearson, a
correlação entre rugosidade superficial (µm) e aderência de S. mutans
(log UFC/mL) na ausência e presença de saliva independente do material
foi analisada. Os valores obtidos na ausência (0,891) e presença de saliva
(0,830) indicaram correlação positiva com significância estatística nas
duas condições avaliadas (p<0,0001) (Tabela 7, Figura 5).
Posteriormente, foi verificado se havia correlação entre
rugosidade superficial (µm) e aderência de S. mutans (log UFC/mL) na
ausência e presença de saliva para cada material (Tabela 7). Na ausência
de saliva, somente as resinas compostas apresentaram correlação
significante. Na presença de saliva, esta correlação não foi observada em
nenhum material.
Tabela 7 – Valores de correlação de Pearson (p valor) entre rugosidade
superficial (µm) e aderência de S. mutans (log UFC/mL) na
ausência e presença de saliva para cada material
MATERIAIS
Rugosidade superficial
(µm) x aderência de S.
mutans (log UFC/mL) na
ausência de saliva
Rugosidade superficial
(µm) x aderência de S.
mutans (log UFC/mL) na
presença de saliva
Esmalte
0,239 (0,505)
-0,552 (0,098)
Feldspática/leucita
- 0,311 (0,382)
0,185 (0,609)
Feldspática
0,572 (0,084)
0,111 (0,759)
RC micro-particulada
0,723 (0,018)
*
-0,243 (0,499)
RC micro-híbrida
0,761 (0,011)
*
0,392 (0,262)
Total
0,891 (< 0,0001)
*
0,830 (< 0,0001)
*
*
Significância estatística.
71
FIGURA 5 – Representação gráfica dos valores médios de rugosidade superficial (µm) e
aderência de S. mutans (log UFC/mL) na ausência e presença de saliva nos
materiais. ESM = esmalte; FL = cerâmica feldspática reforçada por leucita;
MP = resina composta micro-particulada; MH = resina composta micro-
híbrida; F = cerâmica feldspática.
5.4 Biofilme dentário inicial in situ
Após 1 hora no ambiente bucal, bactérias isoladas e em
pequenos agregados foram visualizadas sobre as amostras dos materiais.
Os tipos morfológicos predominantes foram cocos e bastonetes curtos
(Figura 6). Nos dois indivíduos avaliados, tanto para as amostras fixadas
na face vestibular quanto lingual do dispositivo, as superfícies dos
materiais apresentaram-se parcialmente ou totalmente cobertas por
material com características granulares apresentando-se de forma mais
densa sobre o esmalte e resinas compostas quando comparados aos
materiais cerâmicos (Figura 7).
Um dos indivíduos analisados apresentou, após 1 hora,
maior colonização bacteriana caracterizada pela presença de agregados
72
bacterianos, formando biofilme em multicamadas sobre a superfície dos
materiais. Bastonetes longos foram visualizados (Figura 8).
A
B
C
FIGURA 6 – Micrografias representativas da presença de bastonetes aderidos à
superfície da resina composta micro-particulada por meio de fímbrias (A,
20.000x). Presença de coco isolado e em agregados sobre a superfície
do esmalte (B, 20.000x e C, 5.000x).
73
A
B
C
D
E
FIGURA 7 – Micrografias representativas das superfícies da cerâmica feldspática/leucita
(A), cerâmica feldspática (B), resina composta micro-híbrida (C), resina
composta micro-particulada (D) e esmalte (E), após 1 hora no ambiente
bucal (5.000x). Nota-se presença de material granular distribuído mais
densamente sobre as superfícies do esmalte, resina composta micro-híbrida
e resina composta micro-particulada.
74
A
B
C
FIGURA 8 – Micrografias representativas da presença de bastonete longo sobre a
superfície da cerâmica feldspática (A, 10.000x), de agregados bacterianos
interpostos a material fibrilar sobre a superfície da cerâmica feldspática (B,
20.000x), e do biofilme de cocos e bastonetes em várias camadas
recobrindo a superfície da resina composta micro-híbrida (C, 10.000x).
Amostras do indivíduo que apresentou maior colonização bacteriana após
1 hora.
Após 4 horas no ambiente bucal, as amostras de todos os
materiais encontraram-se totalmente cobertas por denso material que
dificultou a visualização de bactérias isoladas ou agregadas,
provavelmente por estarem imersas no biofilme. Este material apresentou
características granulares e fibrilares (Figura 9) parecendo ser mais
densamente distribuído sobre o esmalte dentário e resinas compostas
quando comparados às cerâmicas. Cocos em cadeia foram visualizados
75
(Figura 10). Contudo, os tipos morfológicos bacterianos predominantes
foram cocos e bastonetes agregados e em camadas (Figura 11 e 12).
A
B
FIGURA 9 – Micrografia representativa de material com aspecto granular (A) e material
de aspecto fibrilar (B) recobrindo a superfície da cerâmica feldspática e
resina composta micro-híbrida, respectivamente (20.000x).
A
B
FIGURA 10 – Micrografia representativa da presença de cocos em cadeia sobre a
superfície da resina composta micro-particulada. O quadrado em A
(5.000x) está aumentado em B (20.000x).
76
A
B
C
D
FIGURA 11 – Micrografias representativas da presença de bastonete imerso em material
de aspecto fibrilar sobre a resina composta micro-híbrida (A, 20.000x),
agregados de cocos e bastonetes curtos sobre a resina composta micro-
particulada (B, 10.000X), cerâmica feldspática (C, 20.000X), e resina
composta micro-híbrida (D, 20.000x).
77
A
B
FIGURA 12 – Micrografias representativas de agregados de cocos sobre cerâmica
feldspática/leucita. O quadrado em A (10.000x) está aumentado em B
(20.000x).
As análises em microscopia eletrônica de varredura das
amostras não expostas no ambiente bucal mostraram que:
a) a topografia das superfícies cerâmicas glazeadas
pareceu similar (Figura 13);
b) a superfície da resina composta micro-híbrida
apresentou-se mais irregular quando comparada à resina
composta micro-particulada (Figura 14);
c) a superfície do esmalte apresentou trincas (Figura 15).
78
A
B
FIGURA 13 – Micrografias representativas das superfícies glazeadas das cerâmicas
feldspática/leucita (A) e feldspática (B) (750x). Observa-se, similaridade
das superfícies cerâmicas.
A
B
FIGURA 14 – Micrografias representativas das superfícies da resina composta micro-
híbrida (A), resina composta micro-particulada (B) (2.000x). Nota-se a
superfície mais irregular da resina composta micro-híbrida.
A
B
79
FIGURA 15 – Micrografias representativas da superfície de esmalte dentário (A, 100x),
(B, 750x). Verifica-se a presença de trincas (A) e irregularidades (B).
6 DISCUSSÃO
Adesão bacteriana aos materiais restauradores
desempenha papel fundamental na patogênese da cárie e doença
periodontal. Características da superfície dos materiais, como rugosidade,
energia livre superficial (ELS) e potencial zeta, podem exercer importante
influência no processo de adesão (O’BRIEN et al.
54
, 1978; QUIRYNEN et
al.
59
, 1990, RIMONDINI et al.
61
, 1997).
Segundo Kidd et al.
40
(1993) não há diferenças entre a
etiologia da cárie primária e secundária; desta forma, é necessária a
presença de hospedeiro, biofilme dentário e carboidratos (KEYES &
JORDAN
39
, 1963, citado por VAN HOUTE
77
, 1994). Streptococcus mutans
parece estar associado ao biofilme de lesões de cárie coronária e
radicular (VAN HOUTE
76
, 1980; LOESCHE
48
, 1986; ELLEN et al.
22
, 1985;
VAN HOUTE et al.
79
, 1990). Assim, tornou-se relevante estudar a
aderência deste microrganismo a materiais restauradores considerando-
se que a formação de biofilme na interface estrutura dentária / material
restaurador pode atuar como nicho bacteriano proporcionando o
desenvolvimento de lesões de cárie e doença periodontal.
A metodologia empregada para avaliar a aderência in vitro
de S. mutans no presente estudo, contemplou análises na ausência de
saliva permitindo avaliar propriedades adesivas intrínsicas dos materiais
restauradores, mas também possibilitou avaliar a adesão bacteriana aos
materiais na presença de proteínas salivares conhecidas por mediar
80
interações específicas entre bactérias e superfícies, simulando, em parte,
condições de adesão bacteriana in vivo.
Na presente pesquisa, o esmalte dentário foi o material
que apresentou maior rugosidade superficial e maior aderência de S.
mutans (tanto na ausência como na presença de saliva). Outros autores
também observaram a presença de mais irregularidades na superfície do
esmalte quando comparado a materiais restauradores como resinas
compostas (SHAHAL et al.
69
, 1998). Takatsuka et al.
72
(2000) verificaram
que a aderência de S. mitis, S. oralis, S. sobrinus e S. sanguis, na
ausência e presença de saliva, foi significativamente maior no esmalte
que na cerâmica. In vivo, maior formação de biofilme foi observada sobre
o esmalte dentário quando comparado aos materiais cerâmicos (CHAN &
WEBER
13
, 1986; SIEGRIST et al.
70
, 1991; HAHN et al.
29
, 1993).
Resinas compostas micro-híbridas são constituídas de
uma mistura de partículas de carga micro métricas (0,04 µm) e partículas
pequenas (1 a 4 µm). Resinas micro-particuladas contém partículas de
carga de 0,04 µm, e resinas nano-particuladas possuem partículas em
torno de 20 a 75 nm. Assim, resinas compostas micro e nano-particuladas
parecem apresentar polimento e brilho superiores aos obtidos na resina
micro-híbrida (BUSATO
7
, 2005).
A resina micro-particulada avaliada no presente estudo é
constituída, segundo o fabricante, de nano partículas, contudo,
apresentou rugosidade semelhante à da resina micro-híbrida. Este
resultado pode se explicado pelo fato dos dois tipos de resina terem
recebido o mesmo procedimento de acabamento e polimento (discos de
óxido de alumínio). Inicialmente, resinas compostas podem apresentar
alto índice de polimento, mas com o tempo, a ação da mastigação,
escovação, produtos químicos e bacterianos podem provocar abrasão ou
erosão resultando em exposição das partículas inorgânicas produzindo
uma superfície mais rugosa (DE WET & FERREIRA
18
, 1980; DUMMER &
HARRISON
20
, 1982; WILLERSHAUSEN et al.
81
, 1999).
81
Na presente pesquisa, as amostras dos materiais não
foram submetidas a nenhum tipo de desgaste clínico ou degradação
química. Contudo, pode-se ponderar que as superfícies de resinas micro-
híbridas submetidas a condições clínicas, possam apresentar com o
decorrer do tempo maior rugosidade superficial quando comparadas às
resinas nano-particuladas, em função da exposição de partículas maiores
de carga (WILLERSHAUSEN et al.
81
, 1999).
A rugosidade superficial das resinas compostas avaliadas
apresentaram valores intermediários, sendo semelhantes tanto à
cerâmica feldspática/leucita quanto à cerâmica feldspática. Como
mencionado, as resinas compostas podem apresentar alto polimento
inicial (DE WET & FERREIRA
18
, 1980), todavia, em longo prazo, após
alterações associadas às condições clínicas, podem tornar-se mais
rugosas devido à exposição das partículas de carga. Contudo, as
cerâmicas parecem ser mais resistentes à degradação superficial sob
condições clínicas.
As diferenças quanto à rugosidade observadas entre as
cerâmicas podem ser, provavelmente, atribuídas às características micro-
estruturais dos materiais como tamanho e forma dos cristais (NASSAR et
al.
50
, 1995; DELLABONA
19
, 2005). Kawai & Urano
37
(2001) relataram que
a cerâmica feldspática reforçada por leucita apresenta cristais de quartzo
e leucita da vários tamanhos e formas que influenciam na rugosidade
superficial e formação de biofilme. Além disso, o fabricante da cerâmica
feldspática avaliada no presente estudo ressaltou que sua micro-estrutura
apresenta distribuição mais homogênea das fases vítreas possibilitando
superfícies mais lisas e homogêneas e conseqüentemente, apresentando
elevada resistência à formação de biofilme quando comparada às
cerâmicas convencionais. Isso poderia explicar a rugosidade
significativamente mais alta da cerâmica feldspática/leucita em relação à
cerâmica feldspática.
82
A aderência de S. mutans foi semelhante entre as resinas
compostas na ausência e presença de saliva. Zalkind et al.
84
(1998)
também não verificaram diferenças na aderência deste microrganismo
entre resina composta micro-particulada e macro-particulada quando foi
utilizado o mesmo sistema de acabamento e polimento. Shahal et al.
69
(1998) não observaram diferenças na aderência de S. mutans entre
resinas compostas micro-híbridas e micro-particuladas que apresentavam
a mesma rugosidade superficial. Montanaro et al.
49
(2004) observaram
aderência similar de S. mutans entre resinas compostas micro-híbridas e
resinas fluídas. Suljak et al.
71
(1995) não encontraram diferenças na
aderência de S. sanguis, S. salivarius e A. viscosus, na presença e
ausência de saliva, entre resinas compostas híbridas e micro-híbridas.
A aderência de S. mutans, na presença e ausência de
saliva, foi maior na cerâmica feldspática/leucita quando comparada à
cerâmica feldspática. Esse resultado pode ser conseqüência das
diferenças de rugosidade superficial entre estes materiais, provavelmente,
devido às diferenças na micro-estrutura (DELLABONA
19
, 2005).
Vários estudos, utilizando microscopia eletrônica de
varredura e transmissão, têm demonstrado que a adesão bacteriana
começa pelas irregularidades e subseqüentemente expande-se para o
restante da superfície (LIE
43
, 1977; LIE
44
, 1978; LIE
45
, 1979; NYVAD &
FEJERSKOV
52
, 1987). Segundo Quirynen et al.
59
(1990) a rugosidade
superficial favorece a adesão porque aumenta a área disponível para que
a mesma ocorra e proporciona nichos onde bactérias aderidas podem
permanecer protegidas dos mecanismos de regulação e controle da
microbiota bucal e dos procedimentos de higiene bucal.
Assim como ocorrido para rugosidade superficial, a
aderência de S. mutans, na presença e ausência de saliva, das resinas
compostas avaliadas no presente estudo, apresentaram valores
intermediários sendo assim, semelhantes tanto à cerâmica
feldspática/leucita quanto à cerâmica feldspática. Resultados similares
83
foram encontrados por Eick et al.
21
(2004), que não observaram
diferenças quanto ao número de UFC de S. mutans aderidas entre
cerâmicas e resinas compostas. O mesmo foi observado por Kawai &
Urano
37
(2001) com relação à aderência de S. sobrinus a cerâmicas e
resinas compostas polidas. Em contrapartida, outros autores verificaram
in vitro que a aderência de S. mutans foi maior na cerâmica quando
comparada à resina composta polida (DUMMER & HARRISON
20
, 1982).
In situ, Tanner et al.
74
(2005) não verificaram diferenças na contagem de
estreptococos dos grupos não mutans entre cerâmica com alto conteúdo
de leucita e resinas compostas. Contudo, a contagem de estreptococos
do grupo mutans foi maior nas resinas compostas quando comparadas à
cerâmica.
Associação entre quantidade de biofilme dentário e
rugosidade superficial foi verificada sobre diferentes materiais
odontológicos como cerâmicas, titânio e resinas acrílicas (DE WET &
FERREIRA
18
, 1980; YAMAUCHI et al.
83
, 1990; CASTELLANI et al.
12
,
1996; RIMONDINI et al.
61
, 1997; KAWAI et al.
38
, 2000).
No presente estudo, a aderência de S. mutans na
ausência e presença de saliva, apresentou correlação positiva significante
com rugosidade superficial, independente do tipo de material. Estes
achados colaboram com resultados de estudos prévios (YAMAUCHI et
al.
83
, 1990; CASTELLANI et al.
12
, 1996; RIMONDINI et al.
61
, 1997; KAWAI
et al.
38
, 2000), contudo, há também autores que não observaram esta
correlação. Yamamoto et al.
82
(1996) não verificaram correlação entre
rugosidade e aderência de S. oralis em resina composta na ausência de
saliva. Eick et al.
21
(2004) encontraram correlação positiva entre
rugosidade e peso úmido do biofilme, mas não observaram correlação
entre rugosidade e aderência (UFC/mL) de S. mutans, na presença de
saliva, sobre cerâmicas e resinas compostas.
A película adquirida (por meio de suas proteínas salivares
que adsorvem as superfícies sólidas no ambiente bucal) fornece sítios
84
complementares para a ligação de adesinas bacterianas proporcionando
interações específicas entre bactérias e substratos, tornando a adesão
bacteriana mais forte e possibilitando a colonização. Embora a película
adquirida proporcione colonização bacteriana por tornar a adesão mais
forte, vários estudos com materiais restauradores e esmalte dentário têm
demonstrado que o número de microrganismos aderidos parece diminuir
na presença da saliva (PRATT-TERPSTRA et al.
55
, 1989; SATOU et al.
68
,
1991; SULJAK et al.
71
, 1995; TAKATSUKA et al.
72
, 2000). Os resultados
obtidos no presente estudo concordam com a literatura, pois foi verificado
que a aderência de S. mutans foi significativamente menor na presença
de saliva.
A constituição protéica da película adquirida parece
influenciar na adesão bacteriana (CRISTERSSON & GLANTZ
14
, 1992). S.
mutans, por exemplo, parece aderir mais na película constituída de
proteínas de alto peso molecular como as mucinas, que se encontram em
maior quantidade com a maturação da película (GIBBONS & HAY
26
,
1989; PRATT-TERPSTRA et al.
55
, 1989).
A análise topográfica da superfície dos materiais realizada
com MEV, na presente pesquisa, apresentou contradições em relação
aos resultados obtidos quanto à rugosidade superficial.
As micrografias representativas da superfície dos
materiais não expostos no ambiente bucal revelaram que a superfície da
resina composta micro-híbrida apresentou-se mais irregular quando
comparada à resina composta micro-particulada (Figura 14), embora não
tenha sido verificada diferença significante quanto à rugosidade
superficial. Contudo, tem-se o conhecimento de que as resinas micro-
híbridas são constituídas por partículas maiores de carga (BUSATO
7
,
2005).
Características semelhantes foram observadas nas
micrografias representativas da superfície glazeada da cerâmica
feldspática/leucita e da cerâmica feldspática (Figura 13). Contudo, a
85
rugosidade superficial foi significativamente superior na cerâmica
feldspática/leucita, que como mencionado anteriormente, pode ser devido
a diferenças na micro-estrutura dos materiais (DELLABONA
19
, 2005).
Essas observações podem indicar que a MEV não parece
representar uma avaliação precisa das características superficiais dos
materiais. Assim, análises mais sensíveis são necessárias para avaliar a
topografia dos materiais, como por exemplo, a microscopia eletrônica de
força atômica.
Condições clínicas podem ser simuladas para avaliar a
formação do biofilme dentário inicial usando-se amostras de diferentes
materiais fixadas em dispositivos bucais. Técnicas com microscopia
eletrônica de varredura e transmissão e microscopia confocal laser têm
sido utilizadas para estas análises (LIE
44
, 1978; NYVAD & FEJERSKOV
53
,
1987; HANNIG
31
, 1997; NETUSCHIL et al.
51
, 1998 RIMONDINI et al.
62
,
2002).
No presente estudo, deposição de material granular foi
verificada sobre a superfície dos materiais após 1 hora no ambiente bucal.
Após 4 horas, as amostras dos materiais encontraram-se cobertas por
material de aspecto granular ou fibrilar (Figura 9). Lie
43
(1977), utilizando
MEV, descreveu a película como agregados granulares de substância
orgânica contendo corpos ovais e redondos durante os estágios iniciais
de formação. Com maior tempo de observação descreveu uma película
constituída de material fibrilar. Contudo, mesmo após 24 e 48 horas
relatou que a película apresentava-se de diversas formas justificando sua
divisão em diferentes tipos. Lie
44
(1978), utilizando microscopia eletrônica
de transmissão, observou a película constituída de material globular,
granular ou fibrilar. Nyvad & Fejerskov
52
(1987) verificaram, após 4 horas
no ambiente bucal, amostras de esmalte cobertas por material granular
sendo particularmente evidente em áreas irregulares. Material granular de
baixa densidade eletrônica também foi observado por Nyvad &
Fejerskov
53
(1987) sobre esmalte e cemento após 4 a 12 horas no
86
ambiente bucal. Hannig
31
(1997) descreveu a película adquirida como um
filme micro-granular sobre amostras de esmalte após 2 horas.
O biofilme apresentou-se mais densamente distribuído
sobre o esmalte dentário e resinas compostas quando comparado aos
materiais cerâmicos (Figura 7). A literatura apresenta estudos realizados
in situ com diferentes materiais com variados resultados. Adamczyk &
Spiechowicz
1
(1990) observaram menor formação de biofilme sendo este
mais frouxamente distribuído sobre coroas cerâmicas. Nas restaurações
metálicas e de resina acrílica houve maior acúmulo de biofilme, o qual
apresentava-se mais densamente distribuído. Hahn et al.
29
(1993)
verificaram que o biofilme coletado de restaurações cerâmicas apresentou
valores significativamente mais baixos de UFC e contagem total de
bactérias quando comparada a esmalte ou cimento resinoso. Auschill et
al.
2
(2002) verificaram que a espessura do biofilme formado sobre
materiais cerâmicos foi menor quando comparada às resinas compostas.
Em contrapartida, Hannig
32
(1999) não observou diferenças quanto ao
biofilme formado sobre diversos materiais restauradores após 24 horas no
ambiente bucal.
No presente estudo, as observações com MEV diferem
dos resultados in vitro da aderência de S. mutans que foi similar entre as
resinas compostas e a cerâmica feldspática, e entre as resinas compostas
e a cerâmica feldspática/leucita. Deve-se considerar que in situ, diversas
espécies bacterianas estão presentes, há a presença de forças de
remoção atuando sobre o biofilme, como fluxo salivar e ação muscular.
Estudos in vitro, utilizando sistema celular de fluxo (permite controle de
forças de remoção bacteriana simulando os mecanismos de regulação e
controle da microbiota bucal), têm verificado menor retenção bacteriana
sobre materiais com baixa energia livre superficial (ELS)
(CHRISTERSSON et al.
15
, 1989; CHRISTERSSON & GLANTZ
14
, 1992).
Conseqüentemente, materiais com diferentes ELS apresentam diferentes
retenções do biofilme aderido, desta forma, maior ou menor quantidade
87
de biofilme parece ser dependente desta variável. Segundo Nassar et al.
50
(1995) a influência que um material odontológico pode exercer sobre o
biofilme refere-se, quase que exclusivamente, às diferenças na resistência
de retenção do biofilme formado.
Na presente pesquisa, os microrganismos observados
após 1 e 4 horas no ambiente bucal foram cocos e bastonetes isolados e
em agregados (Figuras 6, 11 e 12). A formação do biofilme inicia-se com
a adesão de cocos e bastonetes curtos seguidos por microrganismos
filamentosos e bastonetes (LÖE
47
, 1965; LISTGARTEN
46
, 1994). Com a
maturação do biofilme, microrganismos filamentosos e espiroquetas são
visualizados (NYVAD & FEJERSKOV
52
, 1987). Lie
44
(1978) encontrou no
biofilme formado sobre hidroxiapatita, em até 48 horas no ambiente bucal,
a presença de cocos Gram positivos e bastonetes curtos. Nyvad &
Fejerskov
53
(1987) verificaram, após 4 horas, presença de cocos e
bastonetes curtos no biofilme formado in situ sobre a superfície de
esmalte e cemento. No biofilme formado in situ sobre diferentes materiais
restauradores após 4 e 24 horas, Siegrist et al.
70
(1991) e Hannig
32
(1999)
também observaram predomínio de cocos e bastonetes.
Um dos indivíduos avaliados apresentou, após 1 hora,
colonização bacteriana mais avançada apresentando agregados
bacterianos formando camadas que se distribuíram sobre a superfície dos
materiais (Figura 8). Adamczyk & Spiechowicz
1
(1990) observaram que
durante o mesmo período experimental e sobre o mesmo material,
diferentes indivíduos acumularam diferentes quantidades de biofilme.
Em 1 e 4 horas, bactérias aderidas às superfícies por
meio de fímbrias foram visualizadas (Figura 6). Esse mesmo tipo de
estrutura foi observado em bactérias aderidas sobre vários materiais
restauradores, esmalte e cemento (NYVAD & FEJERSKOV
53
, 1987;
YAMAMOTO et al.
82
, 1996; HANNIG
31
, 1997; HANNIG
32
, 1999). Adesinas
bacterianas, que se ligam a sítios complementares específicos na película
88
adquirida, têm sido associadas com presença de fímbrias (GIBBONS
25
,
1989).
Baseado nos resultados obtidos e na literatura avaliada
sugere-se que novos estudos sejam conduzidos a fim de avaliar a
formação do biofilme sobre materiais restauradores submetidos a
condições clínicas, como ciclagem mecânica e térmica, simulação de
escovação e exposição a substâncias químicas. Além da rugosidade
superficial, avaliações de energia livre superficial e potencial zeta
parecem ser fundamentais para o entendimento da formação do biofilme
sobre diferentes materiais.
89
7 CONCLUSÃO
Com a metodologia utilizada no presente estudo parece-
nos lícito concluir que:
a) esmalte dentário humano foi o material que apresentou
maior rugosidade superficial. A cerâmica
feldspática/leucita foi mais rugosa que a cerâmica
feldspática. As resinas compostas, micro-particulada e
micro-híbrida, não apresentaram diferenças entre si e
apresentaram rugosidades intermediárias sendo
similares tanto à cerâmica feldspática/leucita quanto à
cerâmica feldspática.
b) nas duas condições experimentais (presença e
ausência de saliva), o esmalte dentário foi o material
que apresentou maior aderência de S. mutans; a
cerâmica feldspática/leucita apresentou maior
aderência que a cerâmica feldspática; as resinas
compostas, micro-particulada e micro-híbrida, não
apresentaram diferenças entre si e foram similares
tanto à cerâmica feldspática/leucita quanto à cerâmica
feldspática.
c) a presença de saliva reduziu significativamente a
aderência de S. mutans, independente do material.
90
d) correlação significante entre rugosidade superficial e
aderência de S. mutans foi verificada na presença e
ausência de saliva, independente do tipo de material.
e) o biofilme dentário inicial formado in situ sobre os
materiais, após 1 e 4 horas no ambiente bucal, foi
constituído predominantemente por cocos e
bastonetes, isolados e em agregados.
f) o biofilme formado após 1 hora, caracterizou-se pela
presença de material granular mais densamente
distribuído sobre as superfícies das resinas compostas
e esmalte quando comparados às cerâmicas.
g) o biofilme formado após 4 horas, caracterizou-se pela
presença de material com características granulares ou
fibrilares, mais densamente distribuído sobre as
superfícies das resinas compostas e esmalte quando
comparados às cerâmicas.
.
91
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v.10, n.4, p.187-90, 1998.
102
Anexo A – Parecer do Comitê de Ética e Pesquisa da Faculdade de
Odontologia, Campus São José dos Campos, Universidade
Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” – UNESP.
103
Apêndice A – Programas recomendados pela fabricante para sinterização
e aplicação do glaze na cerâmica VM7
104
A sinterização das amostras de cerâmica VM7 foi realizada no
forno Vacumat 40 (Vita Zahnfabrik) seguindo o programa 44:
Pré-secagem: 500
o
C, temperatura constante por 6 minutos;
Temperatura em elevação por 7,27 minutos, 55
o
C/minuto;
Temperatura de 910
o
C;
Temperatura constante por 1 minuto;
Vácuo por 7,27 minutos.
A aplicação do glaze Vita Akzent 25 (Vita Zahnfabrik) nas amostras
de cerâmica VM7 foi realizada no forno Vacumat 40 (Vita Zahnfabrik)
seguindo o programa 9:
Pré-secagem: 500
o
C, temperatura constante por 4 minutos;
Temperatura em elevação por 5 minutos, 80
o
C/minuto;
Temperatura de 900
o
C;
Temperatura constante por 1 minuto.
Apêndice A – Programas recomendados pela fabricante para sinterização
e aplicação do glaze na cerâmica VM7
A sinterização das amostras de cerâmica VM7 foi realizada no
forno Vacumat 40 (Vita Zahnfabrik) seguindo o programa 44:
Pré-secagem: 500
o
C, temperatura constante por 6 minutos;
Temperatura em elevação por 7,27 minutos, 55
o
C/minuto;
Temperatura de 910
o
C;
Temperatura constante por 1 minuto;
Vácuo por 7,27 minutos.
105
A aplicação do glaze Vita Akzent 25 (Vita Zahnfabrik) nas amostras
de cerâmica VM7 foi realizada no forno Vacumat 40 (Vita Zahnfabrik)
seguindo o programa 9:
Pré-secagem: 500
o
C, temperatura constante por 4 minutos;
Temperatura em elevação por 5 minutos, 80
o
C/minuto;
Temperatura de 900
o
C;
Temperatura constante por 1 minuto.
Apêndice B – Meio de cultura para placa in vitro utilizado no experimento
(GIBBONS & NYGAARD
27
, 1968):
106
Tripticase: 20 g;
Cloreto de sódio: 2 g;
Fosfato de potássio monobásico: 2 g;
Fosfato de potássio dibásico: 3 g;
Carbonato de potássio: 1 g;
Sacarose: 50 g;
Sulfato de magnésio: 120 mg;
Sulfato de manganês: 15 mg;
Água destilada: 1000 mL.
As substâncias foram pesadas e diluídas em água
destilada. A solução foi autoclavada a 121
o
C durante 15 minutos e
armazenada em geladeira até o momento do uso.
Apêndice C - Termo de consentimento livre e esclarecido
107
Prezado (a) Paciente
Eu, Karla Zanini Kantorski, RG 1034932291, aluna do Programa de Pós-
Graduação em Biopatologia Bucal da Faculdade de Odontologia da Universidade
Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Campus São José dos Campos, juntamente
com meu orientador, professor Antônio Olavo Cardoso Jorge, vamos realizar uma
pesquisa cujo título é: “Correlação rugosidade superficial e aderência in vitro de
Streptococcus mutans em materiais restauradores estéticos indiretos”.
O objetivo deste estudo é dispormos de base científica para indicar materiais
restauradores que acumulem menor número de bactérias favorecendo a saúde bucal. Para
isso, precisamos realizar uma moldagem para que possamos confeccionar uma placa
removível específica para sua arcada superior. Esta placa deverá ser usada por 1 hora e 4
horas. O uso da placa não trará nenhum prejuízo a sua saúde e em qualquer momento, o
Sr (a) terá acesso aos profissionais responsáveis pela pesquisa para esclarecimento de
eventuais dúvidas. Caso houver algum desconforto o Sr (a) poderá nos informar através
do telefone (12) 39479033. Será mantido sigilo sobre sua identidade.
Não haverá despesas pessoais para sua participação no estudo. Contudo, também
não haverá qualquer forma de remuneração.
Em caso de dúvida o Sr (a) poderá se dirigir ao Comitê de Ética em Pesquisa
(CEP) na FO UNESP – São José dos Campos, localizado a Av. José Longo 777, Jardim
São Dimas.
Autorização
Autorizo de forma livre e voluntária a realização da pesquisa apresentada.
Declaro haver recebido explicações claras e simples dos propósitos da sua realização,
além de saber que a minha participação não trará risco à minha saúde.
Declaro que fui informado de que posso desistir da pesquisa em qualquer
momento.
---------------------------------------------------------------
Assinatura do paciente ou responsável legal Data ...../...../.....
RG: ....................................................................................................
108
Nome:.................................................................................................
Endereço:............................................................................................
Fone:...................................................................................................
--------------------------------------------------------------
Assinatura do pesquisador Data ...../...../.....
KANTORSKI, K.Z. Correlation between surface roughness and
adherence in vitro of Streptococcus mutans in indirect aesthetic
restorative materials. 2006. 105f. Tese (Doutorado em Biopatologia
Bucal, Área Biopatologia Bucal) – Faculdade de Odontologia de São José
dos Campos, Universidade Estadual Paulista, São José dos Campos,
2006.
109
ABSTRACT
The current study evaluated the surface roughness of indirect aesthetic restorative
materials and the adherence in vitro of Streptococcus mutans on these materials in the
saliva-absence and -presence. Besides, the features of the early dental biofilm formed in
situ on the materials were illustrated, using a scanning electronic microscope. Two
feldspar ceramics (feldspar and leucite-reinforced feldspar) and two resin composites
(microhybrid and microfilled) were evaluated. Human dental enamel was used as control.
Standardized samples of the materials were produced, and roughness analysis was
carried out in a roughness analyzer following the R
a
(µm) parameter. For the adherence
tests, the samples were immerged in culture of S. mutans in broth with sucrose and
incubated at 37ºC for 24 hours in 5% of CO
2
. The specimens were then inserted into the
glass tubes, agitated, and decimal dilutions were plated on BHI. After 48 hours (37ºC, 5%
of CO
2
), colony forming units was evaluated (UFC/mL). For the test of adherence in the
saliva presence, the samples were previously immersed in filtrated saliva. The means of
surface roughness (µm) and of UFC/mL were submitted to the ANOVA and post hoc
Tukey test. Pearson lineal coefficient was applied to verify the correlation between
roughness and adherence (α=5%). The enamel presented the highest roughness values.
The leucite/feldspar ceramic was rougher than the feldspar ceramic. There was not
significantly difference between the roughness values of the resin composites, which
were similar to both ceramics. In the two experimental conditions (saliva-presence and -
absence): the enamel presented the highest adherence; the leucite/feldspar ceramic
presented higher adherence than the feldspar ceramic; the resin composites were similar
to each other, being similar to the leucite/feldspar and feldspar ceramics.
KEY WORDS: Streptococcus mutans, biofilm, surface properties, resin composites,
ceramics.
Autorizo a reprodução xerográfica deste trabalho.
São José dos Campos, 10 de abril de 2006.
______________________________________
Karla Zanini Kantorski
(kzkanto[email protected])
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