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INDUÇÃO E IDENTIFICAÇÃO DE
POLIPLOIDIA EM BANANEIRA (Musa
acuminata, Colla)
LEILA APARECIDA SALLES PIO
2008
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LEILA APARECIDA SALLES PIO
INDUÇÃO E IDENTIFICAÇÃO DE POLIPLOIDIA EM BANANEIRA
(Musa acuminata, Colla)
Tese apresentada à Universidade Federal de Lavras
como parte das exigências do Programa de Pós-
Graduação em Agronomia, área de concentração
Fitotecnia, para a obtenção do título de “Doutor”.
Orientador
Prof. Dr. Moacir Pasqual
LAVRAS
MINAS GERAIS – BRASIL
2008
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Ficha Catalográfica Preparada pela Divisão de Processos Técnicos da
Biblioteca Central da UFLA
Pio, Leila Aparecida Salles.
Indução e identificação de poliploidia em bananeira (Musa acuminata,
Colla) / Leila Aparecida Salles Pio. – Lavras : UFLA, 2008.
72 p. : il.
Tese (Doutorado) – Universidade Federal de Lavras, 2008.
Orientador: Moacir Pasqual.
Bibliografia.
1. Duplicação de cromossomos. 2. Bananicultura. 3. Citometria de
fluxo. 4. Caracterização anatômica. 5. Análise citogenética. I.
Universidade Federal de Lavras. II. Título.
CDD – 634.7723
LEILA APARECIDA SALLES PIO
INDUÇÃO E IDENTIFICAÇÃO DE POLIPLOIDIA EM BANANEIRA
(Musa acuminata, Colla)
Tese apresentada à Universidade Federal de Lavras
como parte das exigências do Programa de Pós-
Graduação em Agronomia, área de concentração
Fitotecnia, para a obtenção do título de “Doutor”.
APROVADA em 21 de fevereiro de 2008
Profa. Dra. Lisete Chamma Davide UFLA
Pesq. Dr. Sebastião de Oliveira e Silva Embrapa/CNPMF
Prof. Dr. Adriano Bortolotti da Silva Unifenas
Prof. Dr. Evaristo Mauro de Castro UFLA
Prof. Dr. Moacir Pasqual
UFLA
(ORIENTADOR)
LAVRAS
MINAS GERAIS – BRASIL
2008
Aos meus pais,
Alaôr e Joana, pelo carinho eterno e apoio incondicional;
Esposo,
Marcelo Pio, pelo amor que nos une;
Filho,
Felipe Salles Pio, a luz da minha vida!
DEDICO E OFEREÇO
AGRADECIMENTOS
A Deus e à Virgem Maria, por guiarem meus passos, iluminarem meu
caminho e abençoarem minha vida.
À Universidade Federal de Lavras (UFLA) e ao Departamento de
Agricultura (DAG), pela oportunidade da realização da pós-graduação e pela
contribuição para a minha formação acadêmica.
À Coordenadoria de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior
(Capes), pela concessão da bolsa de estudos.
Ao professor Dr. Moacir Pasqual, pela orientação e ensinamentos,
importantes para a minha formação profissional.
Aos pesquisadores Dr. Sebastião de Oliveira e Silva e Dra. Janay de
Almeida Santos-Serejo, pela co-orientação e apoio nos momentos em que
precisei.
Aos professores Dra. Lisete Chamma Davide, Dr. Eduardo Alves, Dr.
Evaristo de Castro e Dr. Adriano Bortolotti, pela amizade e pelos ensinamentos.
Aos amigos e colegas Hermínio, Fabíola, Grazielle, Márcia, Claudinéia,
Fred, Luzia, Cida, Filipi, José Marcelo, Caio, Ana Luiza, Juliane, Patrícia,
Letícia, Fabiano e Saulo, pela ajuda e companheirismo em todos os momentos.
Aos meus amigos Vantuil Rodrigues, Antônio Clarete e Antônio Carlos,
funcionários do Laboratório de Cultura de Tecidos, e Eloísa, funcionária do
Laboratório de Microscopia Eletrônica, pelo convívio e ensinamentos.
A minha família, a minha sogra, Dona Maura; minhas cunhadas; Sandra
e Andréa; aos sobrinhos; Vinícius, Vivian, Otávio, Vitor, Mariana, José Otávio e
Ágata; que me apoiaram em todos os momentos.
Enfim, a todos aqueles que contribuíram, de alguma forma, para a
realização deste trabalho.
MUITO OBRIGADA!
SUMÁRIO
RESUMO...............................................................................................................i
ABSTRACT .........................................................................................................ii
CAPÍTULO I. INTRODUÇÃO GERAL..............................................................1
1 INTRODUÇÃO.................................................................................................2
2 REFERENCIAL TEÓRICO...............................................................................3
2.1 Considerações gerais sobre a bananeira..........................................................3
2.1.1 Aspéctos sócio-econômicos.........................................................................3
2.1.2 Doenças e pragas .......................................................................................5
2.2 Origem e disseminação...................................................................................6
2.3 Citogenética ....................................................................................................7
2.4 Melhoramento genético da bananeira.............................................................8
2.4.1 Melhoramento genético por hibridação .......................................................9
2.4.2 Autotetraplóides.........................................................................................10
2.4.3 Obtenção dos poliplóides artificiais...........................................................11
2.4.3.1 Efeito da poliploidia sobre as bananeiras................................................13
2.4.3.2 Verificação de ploidia.............................................................................14
3 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.............................................................17
CAPÍTULO II. INDUÇÃO E IDENTIFICAÇÃO DE POLIPLOIDIA EM Musa
acuminata, Colla.................................................................................................23
1 RESUMO.........................................................................................................24
2 ABSTRACT ....................................................................................................25
3 INTRODUÇÃO...............................................................................................26
4 MATERIAL E MÉTODOS.............................................................................27
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO.....................................................................32
6 CONCLUSÕES ...............................................................................................50
7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.............................................................51
CAPÍTULO III. ANÁLISES DE CARACTERÍSTICAS ANATÔMICAS E
ULTRAESTRUTURAIS DE PLANTAS MIXOPLÓIDES E
AUTOTETRAPLÓIDES DE BANANEIRA......................................................56
1 RESUMO.........................................................................................................57
2 ABSTRACT ....................................................................................................58
3 INTRODUÇÃO...............................................................................................59
4 MATERIAL E MÉTODOS.............................................................................60
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO.....................................................................62
6 CONCLUSÕES ...............................................................................................71
7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.............................................................71
i
RESUMO
PIO, Leila Aparecida Salles. Indução e identificação de poliploidia em
bananeira (Musa acuminata, Colla). 2008. 72 p. Tese (Doutorado em
Agronomia/Fitotecnia) - Universidade Federal de Lavras, Lavras, MG.
*
O presente trabalho foi realizado com o objetivo de estudar a indução e a
identificação de poliplóides por meio de análise estomática, da contagem de
cromossomos e da citometria de fluxo, bem como o efeito da poliploidia e da
mixoploidia nas características anatômicas e ultra-estruturais das cultivares de
bananeira Malbut, Ouro, Lidi e Thong Dok Mak. Na indução de poliplóides, os
explantes foram tratados com colchicina, nas concentrações de 0, 2,5; 7,5 e
12,5mM, por 24 e 48 horas e com oryzalina, nas concentrações de 0, 10, 30 e
50μM, por 4 e 7 dias. Para a identificação de poliplóides via análise estomática,
amostras de folhas jovens de cada planta foram eletromicrografadas em
microscopia eletrônica de varredura (MEV). Foram avaliados o tamanho
(diâmetro polar x diâmetro equatorial) e a densidade de estômatos. Para análise
de citometria de fluxo, foi retirada uma pequena porção de tecido foliar de cada
planta, triturada, para a liberação de núcleos e corada com iodeto de propídeo.
Para cada amostra, 10 mil núcleos foram analisados. Para análise citogenética,
ápices radiculares foram pré-tratados com solução de 8-HQ 500 mg L
-1
, por 3
horas e fixados em solução de Carnoy por 24 horas e submetidos a técnicas de
esmagamento convencional. A coloração foi feita com solução de Giemsa a
10%. Para a realização da contagem do número de cloroplastídeos por células,
do comprimento e da largura dos cloroplastídeos e área dos cloroplastídeos,
foram feitas análises de características anatômicas e ultra-estruturais de plantas
diplóides, mixoplóides e tetraplóides de três cultivares de bananeira: Lidi, Ouro
e TDM. Fragmentos retirados de folhas jovens foram submetidos às técnicas de
preparação tradicionais para análise em microscopia eletrônica de transmissão.
Foram realizados os cortes em seções semifinas (>100nm) e ultrafinas
(<100nm). Os cortes semifinos foram analisados em microscópio de luz. Foram
avaliados comprimento e largura de células do parênquima paliçádico e
lacunoso, epidermes adaxial e abaxial, espessura do limbo e número de
cloroplastídeos. Os cortes ultrafinos foram examinados em microscópio
eletrônico de transmissão e foram observadas características ultra-estruturais dos
cloroplastos. O trabalho permitiu a identificação de 4 plantas e 6 mixoplóides
pelas três técnicas de identificação utilizadas. As análises estruturais e ultra-
estruturais permitem a separação dos diplóides, mas não apresentam diferenças
entre tetraplóides e mixoplóides.
*
Orientador: Moacir Pasqual – UFLA.
ii
ABSTRACT
PIO, Leila Aparecida Salles. Autotetraploidy induction and identification in
banana (Musa spp.). 2008. 72p. Thesis (Doctorate in Agronomy/Crop Science)
– Federal University of Lavras, Lavras, Minas Gerais, Brazil.
*
The aimed study to induct and to identify polyploidys identification through
stomatal analysis, chromosome counting and flow cytometry, as well
polyploidys and mixoploids effects on the structural and ultrastructural
characteristics in banana varieties: Malbut, Ouro, Lidi e Thong Dok Mak. In
polyploidys induction, explants were treated with concentrations of colchicine
(0, 2.5; 7.5 and 12,5mM) for 24 and 48 hours and with oryzalin (0, 10, 30 and
50μM) for 4 and 7 days. Toward polyploidys identification through stomatal
analysis, samples of young leaves from every plant were evaluated by scanning
electron microscopy size (polar diameter x equatorial diameter) and stomatal
density were evaluated. Toward analysis in flow cytometry, quantity of leave
tissue from each plant was cuted and after, triturated (aiming a nucleus liberate)
and redden with propidium iodide. A number of 10,000 events was evaluated.
Toward cytogenetics analysis, types roots were previous treated with 8-HQ
500 mg L
-1
solution for 3 hours and fixed in Carnoy solution for 24 hours and
submitted to the conventional crushing techniques. Staining was done with
solution of Giemsa (10%). Towards second experiment, analysis of structural
and ultrastructural characteristics of diploids plants, mixoploids and tetraploids
in 3 banana cultivars: Lidi, Ouro e TDM were carried out. Fragments from
young leaves were submitted to the conventional techniques for analysis in
transmition electron microscopy. Thick (>100nm) and thin (<100nm) sections
were evaluated in light and transmition electron microscopy, respectively.
Length and breadth of cells from palyçadic and spongy parenchyma, adaxial and
abaxial epidermis, leave thickness were measured and chloroplasts numbers
were estimated. While to thin sections ultrastructural characteristics of
chloroplasts were examined. It was concluded that 4 plants were identified as
tetraploids and 6 as mixoploids through three identification techniques. No
differences between tetraploids and mixoploids was produced, only structural
and ultrastructural characteristics of diploids.
*
Adviser: Moacir Pasqual – UFLA.
CAPÍTULO I
INTRODUÇÃO GERAL
2
1 INTRODUÇÃO
A cultura da bananeira assume importância social e econômica em mais
de 80 países, principalmente em pequenas propriedades (Silva et al., 2002). O
Brasil é o segundo maior produtor mundial de bananas, com 11,7 milhões de
toneladas em 2007 e área cultivada de 504,074 mil hectares (11% de toda a área
cultivada no Brasil). Em termos de produção, o Brasil perde apenas para a Índia,
que produz 70,7 milhões de toneladas (Anuário da Agricultura Brasileira, 2008).
Associado à falta de resistência às principais doenças e pragas, a maioria
das variedades comerciais é pouco produtiva e tem porte alto. A cultivar tipo
Cavendish (Grande Naine - AAA) é a única de importância para o mercado
internacional e ainda não existem variedades comerciais desse tipo que sejam
resistentes às sigatokas amarela e negra, doenças que podem causar perdas na
produção de até 100%, a depender das condições de cultivo.
Uma das estratégias para a solução dos problemas mencionados é a
criação de novas variedades, mediante o cruzamento de diplóides AA com
triplóides comerciais, gerando híbridos tetraplóides. Esta tarefa, no entanto, é
dificultada pela esterilidade constatada em alguns diplóides e triplóides. As
dificuldades resultantes da baixa e, em alguns casos, da ausência da produção de
sementes em cruzamentos de bananeira, podem ser contornadas mediante a escolha
adequada dos genitores e o uso de tecnologias não convencionais de
melhoramento. Estratégias alternativas de melhoramento genético da bananeira,
fundamentadas na duplicação de cromossomos, induzidas por tratamentos com
agentes antimitóticos (colchicina e orizalina) têm sido propostas como forma de
introduzir resistência a doenças, nos híbridos gerados pelos programas de
melhoramento genético da cultura (Stover & Buddenhagen, 1986). Acrescenta-
se, ainda, que a geração de cultivares com resistência às sigatokas causará
3
grandes impactos econômicos e ambientais. Esta tecnologia viabilizará a
bananicultura nas regiões pobres e promoverá grandes impactos econômicos
(redução do custo de produção em aproximadamente 25%) e ambientais ao
dispensar o uso de fungicidas, podendo contribuir para o aumento da
produtividade em, aproximadamente, 25%.
O presente estudo faz parte de um programa de melhoramento genético
da Embrapa Mandioca e Fruticultura Tropical, de Cruz das Almas, na Bahia, que
visa à obtenção de triplóides secundários AAA, mediante a indução da
duplicação dos cromossomos de bananeiras diplóides que produzem frutos de
sabor agradável e o posterior cruzamento do autotetraplóide obtido com um
diplóide elite, objetivando futuros lançamentos de novas cultivares no mercado
nacional. Com esse intuito, objetivou-se induzir e identificar autotetraplóides nas
cultivares Ouro, Lidi, Malbut e Thong Dok Mak de Musa spp.
2 REFERENCIAL TEÓRICO
2.1 Considerações gerais sobre a bananeira
2.1.1 Aspectos sócio-econômicos
No Brasil, a bananeira é a segunda frutífera de maior importância,
depois da laranja, sendo utilizada por milhões de pessoas para vários fins, e é
classificada entre as cinco maiores culturas no comércio internacional. Além
disso, seu apelo social é de grande relevância, quando comparada com outras
frutíferas. É a cultura mais explorada, em termos de pequena propriedade rural,
por isso tem grande importância social como fixadora de mão-de-obra no campo
e fonte de renda contínua para o pequeno agricultor (Silva et al., 2002).
4
Estima-se que as exportações mundiais de banana superem U$ 5 bilhões
por ano, o que a torna uma fonte vital de renda para muitos países (United
Nations Conference on Trade and Development, 2007).
Mesmo sendo o Brasil um dos maiores produtores mundiais de banana,
as exportações nacionais são irrisórias, comparadas às de outros países
produtores, como o Equador, que detém 8,22% da produção mundial (Food and
Agriculture Organization of the United Nations, 2007). Em 2007, os maiores
volumes de exportações de banana pelo Brasil foram de 33.715 toneladas para a
Argentina, 25.562 toneladas para o Reino Unido e 12.266 toneladas a Itália
(Agrianual, 2008). Essa baixa exportação se deve à má qualidade dos frutos,
resultante do cultivo sem tecnologia e sem execução das práticas culturais de
pós-colheita; à utilização de cultivares de baixa qualidade genética, susceptíveis
a pragas e doenças; à falta de planejamento estratégico e ao manejo inadequado
dos frutos durante o processo de desenvolvimento da cultura (Silva et al., 2002).
Consumida, quase que na totalidade das vezes, na forma in natura, a
banana é parte integrante da alimentação das populações de baixa renda, não só
pelo valor nutritivo, mas também pelo baixo custo. Uma única banana supre
cerca de um quarto da quantidade de vitamina C recomendada diariamente para
crianças. Contém, ainda, vitaminas A e B, muito potássio, pouco sódio, nenhum
colesterol e mais açúcar que a maçã (Alves et al., 1997).
Souza & Torres Filho (1997) apontam três importantes papéis
socioeconômicos desempenhados pela banana: a) fonte de alimentação, b)
fixação de mão-de-obra e c) geração de divisas. Em muitos países pobres, a
banana, como fonte de alimentação, é tão importante quanto outros produtos
amiláceos básicos, como milho, mandioca, arroz e inhame.
Economicamente, a bananeira situa-se entre os cultivos perenes que
mais rapidamente proporcionam o retorno do capital investido e apresenta fluxo
5
contínuo de produção a partir do primeiro ano. Esses aspectos a colocam em
vantagem sobre diversas outras frutíferas.
A bananicultura brasileira apresenta diferenças tanto pela diversidade
climática dos locais onde é explorada quanto pelo uso de cultivares, a forma de
comercialização e as exigências do mercado consumidor. Geralmente, os
cultivos são tradicionais, com baixos índices de capitalização e tecnologia, no
entanto, existem alguns cultivos tecnificados, em algumas regiões.
As cultivares Prata, Pacovan e Terra são mais comuns no Norte e no
Nordeste. As do subgrupo Cavendish, no qual se destacam as cultivares Nanicão
e Grande Naine, se revelam como as de maior potencial para exportação, sendo
mais cultivadas no Centro-Sul. A região Sudeste revela a presença equilibrada
dos dois grupos (Agrianual, 2008).
2.1.2 Doenças e pragas
Como em qualquer espécie cultivada em grandes áreas, a bananeira é
afetada por diversos problemas fitossanitários causados por bactérias, vírus,
nematóides, insetos e fungos.
Dentre as bacterioses, destaca-se a murcha, ou moko, cujo agente
patogênico é Ralstonia solanacearum, sobre a qual pouco se conhece em relação
a fontes de resistência (Silva et al., 2002). O “bunchy top”, designado pela sigla
BBTV, é tido como o maior problema de etiologia viral da cultura (Jones, 2000;
Silva et al., 2002; Ploetz et al., 2003), mas ainda não presente no Brasil. O
nematóide de maior importância para a bananeira é o Rodopholus similis (Silva
et al., 2002; Cares, 2003) e a broca-do-rizoma, causada pelo Cosmopolites
sordidus, é a praga que mais provoca danos (Gold et al., 2001; Silva et al.,
2002).
6
Os fungos, agentes infecciosos de maior importância, causam doenças,
como murcha-de-fusarium ou fusariose (mal-do-panamá), cujo agente
patogênico é Fusarium oxysporum f. sp. Cubense e manchas foliares, causadas
pelas sigatokas amarela (Mycosphaerella musicola) e negra (Mycosphaerella
fijiensis). A sigatoka negra é uma doença de importância mundial, por ser
extremamente agressiva, e que tem se alastrado pelo país, com focos
encontrados recentemente nas regiões produtoras do estado de São Paulo.
Doenças e pragas provocam severas perdas na produção de banana que,
a depender das circunstâncias, podem ser de até 100%. Para manter produções
razoáveis, o controle químico requer significativo gerenciamento financeiro e
investimentos que somente podem ser pagos quando em grandes plantações.
Além disso, o uso de pesticidas é inimigo da preservação ambiental e tem se
tornado politicamente inaceitável. O futuro do cultivo da bananeira será,
portanto, altamente dependente da habilidade dos melhoristas de plantas. O
principal objetivo dos maiores programas de melhoramento de bananeiras é o de
criar novas variedades com o aumento da resistência ou da tolerância a pragas e
a doenças (Persley e deLanfhe, 1987).
2.2 Origem e disseminação
A bananeira (Musa spp.) tem sua origem no Continente Asiático e esta
região pode ser considerada como centro de origem e ponto inicial de
disseminação para o resto do mundo (Stover & Simmonds, 1987). Existem,
ainda, centros secundários de origem na África Oriental e nas ilhas do Pacífico,
além de um importante centro de diversidade na África Ocidental (Swennen et
al., 1995; Dantas et al., 1997).
Stover & Simmonds (1987) afirmam que a única fonte de variabilidade
em bananeira na África e nas Américas tem ocorrido por meio de mutação
7
somática e estimam que, no continente asiático, existem em torno de 130
cultivares de bananeira, das quais aproximadamente 40 são consideradas
mutantes. Jarret et al. (1992) consideram que as maiores reservas de
germoplasma de bananas comestíveis no mundo localizam-se na Nova Guiné e
em ilhas próximas.
2.3 Citogenética
Todos os tipos de bananeiras e plátanos são derivados das espécies
selvagens diplóides Musa acuminata Colla ou de híbridos naturais entre M.
acuminata (genoma A) e M. balbisiana (genoma B), que se encontram dentro da
seção Eumusa (Simmonds, 1995). Esses híbridos podem apresentar três tipos de
ploidia: diplóide 2n = 2x =22; triplóide 2n = 3x =33 ou tetraplóide 2n = 4x =44.
Cada cultivar de bananeira deve conter uma determinada combinação de
genomas completos das duas espécies parentais. Vários grupos genômicos foram
constatados como diplóides AA, AB e BB; triplóides AAA, AAB e ABB e
tetraplóides AAAA, AAAB, AABB e ABBB (Stover & Simmonds, 1987;
Tezenas du Montcell, 1988).
A maioria das cultivares de bananeira é triplóide e, portanto, quase
completamente estéril, desenvolvendo frutos por partenocarpia e propagada
assexuadamente, tendo sido selecionadas durante o longo processo de
domesticação (Simmonds, 1995; Silva et al., 2002). A base genética desses
triplóides é estreita e uma das fontes secundárias de diversificação são as
mutações somáticas de cultivares, que são selecionadas e originam novas
cultivares (Daniells et al., 2001). Portanto, além do grupo genômico, foi
estabelecido o termo subgrupo, para denominar um complexo de cultivares
originárias de mutações de uma única cultivar original, como no caso do grupo
8
AAA, subgrupo Cavendish e subgrupos Prata e Terra, no Brasil (Silva et al.,
2002).
Na execução de trabalho de melhoramento, os estudos citogenéticos são
auxiliares básicos para a obtenção e ou a explicação de combinações
cromossômicas desejáveis, aumentando as chances de sucesso na transferência
estável de características genéticas de interesse para as diversas variedades do
gênero Musa. (Dantas et al., 1993).
2.4 Melhoramento genético da bananeira
Vários são os métodos de melhoramento conduzidos em bananeira:
introdução e seleção de clones, melhoramento por hibridação, melhoramento ao
nível diplóide, produção de triplóides a partir do cruzamento de tetraplóides com
diplóides, melhoramento por mutação, hibridação somática e uso de engenharia
genética. Independente da escolha do método adotado, o melhoramento da
bananeira busca desenvolver variedades resistentes as sigatokas amarela e negra,
ao mal-do-panamá, ao moko, aos nematóides e à broca-do rizoma, reduzir o
porte da planta, o ciclo da cultura e aumentar a produtividade (Silva et al., 2000,
2004).
As primeiras tentativas de pesquisa na área de melhoramento genético
de bananeira ocorreram no final da década de 1920, em Honduras, Trindad e
Jamaica, motivados pela murcha de Fusarium, mais conhecida como mal-do-
panamá (Shepherd, 1992). O primeiro híbrido tetraplóide (AAAA) foi obtido no
início da década de 1930. Esse híbrido foi oriundo do cruzamento de uma
cultivar triplóide (Gros Michel – AAA) com um diplóide (AA) selvagem. Tal
sistema de hibridação ainda é universalmente utilizado, com resultados
satisfatórios.
9
O melhoramento da bananeira no Brasil foi iniciado em 1982 e teve
como objetivos básicos desenvolver as características listadas anteriormente,
mediante cruzamentos de diplóides (AA) melhorados com triplóides comerciais,
avaliando e selecionando as novas variedades tetraplóides em diferentes regiões
produtoras do país.
Em 1993, no Centro Nacional de Pesquisa em Mandioca e Fruticultura
Tropical (CNPMF), da Embrapa, iniciaram-se as atividades de melhoramento
genético da bananeira, com a realização de coleta de germoplasma, em âmbito
nacional e internacional, seguida pela elaboração dos projetos, subprojetos e
ações de pesquisa pertinentes (Alves, 1997; Dantas et al., 1993).
2.4.1 Melhoramento genético por hibridação
O melhoramento convencional tem sido dificultado pela ausência de
sementes nas cultivares de bananeira, o que pode ser devido à inexistência de
pólen viável e ou de polinizadores naturais eficientes (Shepherd, 1992). As
cultivares que não produzem sementes, quando polinizadas ou aquelas que
produzem em pequena quantidade, podem ser tanto diplóides quanto triplóides,
em que a ausência desta característica está relacionada à intensa seleção
agronômica, sendo um reflexo do processo de domesticação da espécie
(Shepherd, 1992; Dantas et al., 1999; Silva et al., 2002). Para contornar esse
problema, métodos de melhoramento não convencionais, tais como hibridação
somática e duplicação do número de cromossomos dos diplóides, vêm sendo
usados (Ganry, 1993).
Já que não há incompatibilidade entre espécies de Musa, é possível usar
a hibridação em programas de melhoramento (Vuylsteke et al., 1993). A
hibridação de bananas é, no entanto, complicada pela combinação de diferentes
10
níveis de ploidia e pela restituição na macrosporogênese associada com a
formação de gametas femininos não reduzidos (Van Duren, 1996).
As cultivares de bananeiras plantadas normalmente são clones triplóides
propagados assexuadamente, com flores fêmea e macho-estéreis e frutos
partenocárpicos (Mak et al., 1996).
No melhoramento genético da bananeira, os genótipos diplóides (AA)
deverão contribuir com resistência a diversas doenças existentes, tais como, mal-
do-panamá, sigatoka amarela e negra, moko e com outras características
desejáveis. O objetivo do melhoramento do germoplasma AA é, portanto,
concentrar, em um mesmo genótipo, o maior número possível de características
favoráveis, como partenocarpia, elevado número de dedos e pencas, maior
comprimento de dedos, boa formação de cachos e resistência a pragas e doenças
e aos nematóides para, posteriormente, tentar transferi-las aos triplóides
comerciais, mediante a síntese de tetraplóides (Silva, 1996; Silva et al., 1998).
Ortiz (1997) comenta que todas as cultivares de bananeiras presentes em
plantações comerciais são, em sua maioria, materiais selecionados em campo
por agricultores ou mutantes somáticos espontâneos de cultivares antigas. Mas,
esforços recentes na tentativa de obter materiais resistentes ou tolerantes a
doenças e pragas resultam em lançamento de híbridos tetraplóides.
2.4.2 Autotetraplóides
Os autotetraplóides resultam da duplicação do número básico de
cromossomos de um diplóide, apresentando quatro genomas idênticos. Quando
desejada, a duplicação cromossômica somática pode ser induzida por
tratamentos químicos apropriados, sendo a colchicina o agente indutor que
fornece melhores resultados (Pagliarini, 2001).
11
Um dos principais aspectos somáticos que distinguem os
autotetraplóides é a mudança do tamanho celular e nuclear, resultando,
primariamente, em características “gigas”, podendo provocar também outras
mudanças na morfologia da planta (Pagliarini, 2001).
O uso de diplóides de bananeiras, resistentes a pragas e doenças, com o
genoma duplicado, pode adicionar diversidade genética numa população
melhorada. Entretanto, híbridos tetraplóides são, geralmente, inferiores aos
triplóides, em termos de resistência ao despencamento e ao arqueamento das
folhas, o que pode levar a maiores danos por ventos fortes (Stover & Smmonds,
1987).
A utilização destes tetraplóides induzidos artificialmente servirá,
portanto, para o cruzamento dos melhores, com outros diplóides, gerando
triplóides secundários que apresentem características de resistência a pragas e a
doenças e outras características agronômicas superiores.
2.4.3 Obtenção de poliplóides artificiais
Em plantas, a duplicação de cromossomos pode ser induzida de diversas
maneiras. Ferimentos de tecidos com posterior regeneração e choques térmicos
eram as técnicas mais antigas (Roth, 1984).
A partir de 1937, a colchicina, um alcalóide extraído principalmente de
bulbos da liliácea Colchiccum auntmnale, passou a ser usada na indução de
plantas poliplóides (Havas, 1937), sendo, ainda, a substância mais amplamente
empregada para a indução de poliploidia em programas de melhoramento
genético de culturas agrícolas, espécies florestais e plantas ornamentais (Sharma
& Sharma, 1999; Silva et al., 2000).
12
O mecanismo de ação da colchicina é conhecido. Ela liga-se
reversivelmente ao dímero de tubulina α e β, causando mudança conformacional
que impede a polimerização do fuso mitótico e, conseqüentemente, bloqueia a
célula em metáfase. Como os sítios específicos aos quais a colchicina se liga nos
dímeros α e β são inacessíveis quando a tubulina está polimerizada na forma de
microtúbulos, tal substância atua na tubulina solúvel, impedido-a de se
polimerizar. Em microtúbulos já formados, a colchicina impede o crescimento
destas estruturas durante a divisão celular (Morejohn et al., 1987; Sluder, 1991).
A importância da colchicina está relacionada com a sua ação específica,
que leva à duplicação cromossômica. Entretanto, se não for removida em tempo
oportuno, pode provocar anomalias cromossômicas, como deleção, quebras,
cromossomos atrasados e pegajosos, em conseqüência da despolimerização do
fuso. Em concentrações elevadas, a colchicina possui efeitos tóxicos, gerando
grande mortalidade nas plantas tratadas. A tolerância à colchicina varia entre as
espécies (Wan et al., 1989; Abreu, 2002; Barbosa, 2004).
O maior problema de indução via colchicina resulta do fato de que a
substância somente atua eficientemente sobre as células que estão em divisão.
Desse modo, a poliploidização, geralmente, não atinge todas as células do
material tratado, sendo comum o aparecimento de mixoplóides. Em
conseqüência, surge o problema relativo à reversão parcial ou total à condição
diplóide, após alguns ciclos de divisão, principalmente devido à proliferação das
células diplóides remanescentes que se multiplicam a taxas superiores àquelas
das células poliplóides. Por isso, tem variado bastante a forma de aplicação dos
indutores de poliploidia, buscando eficiência no tratamento.
A indução de poliplóides com colchicina é o procedimento mais
utilizado, entretanto, há poucos relatos a respeito de outros agentes antimitóticos
para a indução de poliplóides de bananeira in vitro (Hammil et al., 1992; Van
Duren et al., 1996; Ganga & Chezhiyan, 2002).
13
Outro composto à base de herbicidas, como dinitrianilina, proporcionou
elevada taxa de poliploidização com menor toxicidade (Wan et al., 1991). Um
desses compostos é a orizalina (3,5 dinitro N4, N – dipropylsulphate). Este
agente antimitótico induz tetraploidia em concentrações muito menores que as
utilizadas para a colchicina (Sree Ramulu et al., 1991; Wan et al., 1991) devido à
alta afinidade das dinitroanilinas pela tubulina e à estabilidade do complexo
orizalina-tubulina (Hart & Sabins, 1976; Okamura, 1980). Além disso, a
interferência da orizalina no sistema de transporte de Ca
+2
nas organelas afeta a
função deste íon na formação do microtúbulo (Weisenberg, 1972), o que pode
ser responsável pela eficiência deste antimitótico.
Os dois modos de ação da orizalina, formação do complexo orizalina-
tubulina e a interferência no sistema de transporte de Ca
+2
, devem promover
maior despolimerização do microtúbulo, resultando em maiores taxas de indução
de tetraploidia em relação à colchicina, que atua somente formando um
complexo colchicina-tubulina. A necessidade de utilização de concentrações
mais baixas de orizalina é uma vantagem devido ao menor custo envolvido e
também à baixa fitotoxicidade, refletida em termos de ocorrência de outras
ploidias mais altas que tetraploidia e mixoploidia (Ganga & Chezhiyan, 2002).
2.4.3.1 Efeito da poliploidia sobre as bananeiras
Uma série de efeitos morfofisiológicos é esperada pela poliploidização.
O efeito imediato é o aumento do tamanho das células, devido ao volume
nuclear maior, levando a uma redução do número de divisões celulares durante o
desenvolvimento. O conhecido efeito “gigas” encontra-se comumente em órgãos
de padrão de crescimento altamente determinado, como flores e sementes. As
características gerais apresentadas por plantas poliplóides incluem folhas e
pétalas mais grossas, firmes e de coloração mais escura, estômatos maiores e
14
menos freqüentes, menor ramificação, retardamento no ciclo mitótico e
conseqüente retardamento na floração e na frutificação (Brieger, 1992;
Dressler,1993; Takamura & Miyajima, 1996).
Geralmente, a poliploidização é induzida para contornar a esterilidade
cromossômica dos híbridos interespecíficos. Entretanto, ela pode também ser
utilizada para induzir a esterilidade. Nesse caso, são induzidos níveis de
poliploidia ímpar, em geral triplóides ou pentaplóides. Indivíduos com
poliploidia ímpar são normalmente estéreis (Guerra, 1989).
As plantas de bananeiras com um nível de ploidia não muito elevado
(até 6x) são mais interessantes por serem férteis e apenas um pouco mais tardias
no desenvolvimento. Isso porque, apesar de as plantas tri e tetraplóides serem
mais vigorosas que as diplóides normais, ocorre o “efeito de dose” dos genes,
em que, até um determinado momento, ganham-se vigor e precocidade, mas,
passado este limite, gastam-se muita energia e tempo na duplicação do próprio
DNA. Isso retarda os ciclos vitais, que expressa em menor produção de
biomassa por unidade de tempo (Dressler,1993).
Vakili (1962) utilizou colchicina para induzir a poliploidia em bananeira
e observou que a droga aumentou a mortalidade, retardou o crescimento das
plantas e induziu a duplicação do número cromossômico. Plantas tetraplóides
ficaram mais altas e mais robustas que as diplóides, porém, com crescimento
mais lento, folhas mais inclinadas e sistema radicular menos desenvolvido.
2.4.3.2 Verificação de ploidia
A determinação do nível de ploidia, em plantas submetidas à duplicação
cromossômica, pode ser realizada diretamente por meio da contagem do número
de cromossomos em células mitóticas e meióticas (Guerra, 1989; Villa, 1995).
15
No entanto, a análise citogenética exige muita experiência do
pesquisador, sendo o procedimento laborioso e demorado, desvantajoso quando
se trata de análises em grande número de plantas (Villa, 1995; Magalhães et al.,
1996; Sari et al., 1999).
Outro método usado para a identificação do nível de ploidia, também
conhecido como método indireto, é a caracterização citoanatômica e
morfológica, ou seja, a avaliação de determinadas características da planta, tais
como os aspectos morfológicos, diâmetro do grão de pólen, número de
cloroplastos por par de células-guarda, tamanho e densidade dos estômatos
foliares. Esse método pode ser útil para inferir o número de ploidia de plantas
submetidas à indução de poliploidia, sendo a análise estomática a mais citada na
literatura (Villa, 1995; Magalhães et al., 1996; Souza & Queiroz, 2004).
No entanto, vários autores enfatizaram que os métodos indiretos podem
ser influenciados pelo ambiente e a análise individual de algumas variáveis
poderá ocasionar a classificação equivocada de determinados genótipos em
relação ao nível de ploidia (Magalhães et al., 1996; Sari et al., 1999; Souza &
Queiroz, 2004). Além disso, os métodos indiretos possibilitam apenas distinção
entre indivíduos poliplóides e diplóides, não sendo útil para detectar, por
exemplo, triplóides de tetraplóides (Magalhães et al., 1996; Sari et al., 1999).
Mesmo assim, a aplicação de métodos indiretos é importante, uma vez que o
descarte das plantas poliplóides possibilitará considerável redução de número de
plantas a serem submetidas à análise citogenética, reduzindo custos e acelerando
o processo de seleção (Souza & Queiroz, 2004).
A verificação da ploidia pode ser feita também por meio da análise de
citometria de fluxo do conteúdo de DNA nuclear (Dolezel, 1991). Essa técnica
envolve a análise das propriedades ópticas (dispersão da luz e fluorescência) de
partículas que fluem numa suspensão líquida (Côrte-Real et al., 2002). Essas
partículas intersectam uma a uma um feixe de laser, ocorrendo um processo de
16
dispersão da luz e ou emissão de fluorescência (Dolezel & Bartos, 2005). A
intensidade de dispersão da luz, ou emissão de fluorescência, está relacionada
com as propriedades das partículas que se está analisando (Dolezel e Bartos,
2005). Esse princípio pode ser usado, por exemplo, para medir a quantidade de
DNA de uma célula (Dolezel e Bartos, 2005).
Em plantas, é possível obter milhões de núcleos em suspensão a partir
de poucas gramas de tecido foliar em um procedimento relativamente simples
que envolve a maceração desse tecido em uma solução tampão que mantém a
integridade nuclear (Galbraith et al., 1983). A coloração dessa amostra com
corantes específicos para o DNA (DAPI, iodeto de propídeo, brometo de etídeo)
permite ao aparelho estimar a quantidade de DNA. Tais estimativas apresentam
uma série de aplicações, desde a pesquisa básica até o melhoramento de plantas,
incluindo estimação do tamanho do genoma, avaliação de ploidia, detecção de
mixoploidia e aneuploidia, avaliação de ciclo celular, estudo de eliminação
cromossômica, separação de células, cromossomos ou organelas e outras
aplicações. (Dolezel e Bartos, 2005).
A análise de citometria de fluxo permite a detecção de mixoplóides
(material contando variação na quantidade de DNA). A existência de vários picos
com quantidades de DNA variáveis é um indicativo de mixoploidia.
Adicionalmente, a citometria de fluxo permite a detecção de pequenas variações
na quantidade de DNA. Trabalhando-se com um refinamento da técnica, de
histogramas com baixíssimos coeficientes de variação (entre 1% e 1,5%), é
possível detectar a perda de um único par de cromossomos e, portanto,
selecionar, entre um grande número de indivíduos, plantas aneuplóides
(variações numa pequena quantidade de cromossomos).
17
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23
CAPÍTULO II
INDUÇÃO E IDENTIFICAÇÃO DE POLIPLOIDIA EM Musa acuminata,
Colla
24
1 RESUMO
PIO, Leila Aparecida Salles. Indução e identificação de poliploidia em Musa
aciminata, Colla. 2008. Cap. 2, p. 23-55. Tese (Doutorado em
Agronomia/Fitotecnia) – Universidade Federal de Lavras, Lavras, MG
∗
.
Este trabalho foi realizado com o objetivo de induzir e identificar poliplóides por
meio de análise estomática, contagem de cromossomos e citometria de fluxo nas
cultivares de bananeira Malbut, Ouro, Lidi e Thong Dok Mak. Os explantes
foram tratados com concentrações de colchicina (0; 2,5; 7,5 e 12,5 mM), por 24
e 48 horas e orizalina (0; 10; 30 e 50 µM), por 4 e 7 dias. Para a identificação de
poliplóides via análise estomática, amostras de folhas jovens de cada planta
foram eletromicrografada em microscopia eletrônica de varredura. Foram
avaliados a área (diâmetro polar x diâmetro equatorial) e o número de estômatos.
Para análise de citometria de fluxo, foi retirada uma amostra de tecido foliar de
cada planta, triturada, para a liberação de núcleos e corada com iodeto de
propídeo. Para cada amostra, 10 mil núcleos foram analisados. Para análise
citogenética, ápices radiculares foram pré-tratados com solução de 8-HQ 500 mg
L
-1
, por 3 horas e fixadas em solução de Carnoy, por 24 horas e submetidos a
técnicas de esmagamento convencional. A coloração foi feita com solução de
Giemsa a 10%. O trabalho permitiu a identificação de 4 plantas tetraplóides e 6
mixoplóides, pelas três técnicas de identificação utilizadas.
∗
Orientador: Moacir Pasqual – UFLA.
25
2 ABSTRACT
PIO, Leila Aparecida Salles Pio. Poliploidy induction and identification in
banana (Musa acuminata, Colla), 2008. Chap. 2, p. 23-55. Thesis (Doctorate
in Agronomy/Crop Science) – Federal University of Lavras, Lavras, Minas
Gerais, Brazil.
*
The aimed study to induct and to identify polyploidys identification through
stomatal analysis, chromosome counting and flow cytometry in banana varieties:
Malbut, Ouro, Lidi e Thong Dok Mak. Explants were treated with
concentrations of colchicine (0, 2.5; 7.5 and 12,5mM) for 24 and 48 hours and
with oryzalin (0, 10, 30 and 50μM) for 4 and 7 days. Toward polyploidys
identification through stomatal analysis, samples of young leaves from every
plant were evaluated by scanning electron microscopy area (polar diameter x
equatorial diameter) and stomatal density were evaluated. Toward analysis in
flow cytometry, quantity of leave tissue from each plant was cut and after,
triturated (aiming a nucleus liberate) and redden with propidium iodide. A
number of 10,000 events were evaluated. Toward cytogenetics analysis, type’s
roots were previous treated with 8-HQ 500 mg L
-1
solution for 3 hours and
fixed in Carnoy solution for 24 hours and submitted to the conventional crushing
techniques. Staining was done with solution of Giemsa (10%). It was concluded
that 4 plants were identified as tetraploids and 6 as mixoploids through three
identification techniques.
*
Adviser: Moacir Pasqual – UFLA
26
3 INTRODUÇÃO
O plantio de variedades de bananeira tradicionais no Brasil tem sido um
fator de vulnerabilidade às principais pragas e doenças que afetam essa cultura,
tais como a sigatoka negra (Mycospharella fijiensis Morelet), a sigatoka amarela
(Mycospharella musicola Leach) e o mal-do-panamá (Fusarium oxysporum f. sp.
cubense). Estratégias alternativas de melhoramento genético da bananeira,
fundamentadas na duplicação de cromossomos, induzidas por tratamentos como
a colchicina e a orizalina, têm sido propostas como forma de induzir resistência a
pragas e a doenças nos híbridos gerados pelos programas de melhoramento
genético da cultura (Vakili, 1967; Stover & Buddenhagen, 1986). Além disso, em
Musa, o alto vigor das plantas está diretamente associado com a ploidia, já que as
variedades triplóides e tetraplóides são bem mais vigorosas que as diplóides.
Entretanto, híbridos tetraplóides são, geralmente, inferiores aos triplóides, em
termos de resistência ao despencamento e ao arqueamento das folhas, o que pode
levar a maiores danos por ventos fortes (Stover & Simmonnds, 1987).
Em adição a um eficiente sistema para a indução de poliploidização, a
produção de autotetraplóides requer um método efetivo para a verificação de
ploidia. A estimativa de ploidia baseada na análise do tamanho e na densidade
de estômatos (Hammil et al., 1992; Van Duren et al., 1996) é um método fácil e
simples, que possibilita a identificação entre supostos poliplóides e as
testemunhas diplóides de um ensaio, uma vez que a área dos mesmos,
normalmente, aumenta com o aumento do número de cromossomos. No entanto,
alguns autores enfatizam que a análise estomática nem sempre é eficiente e
segura, devido a efeitos genéticos e da análise individual de algumas variáveis,
que podem ocasionar a classificação equivocada de determinados genótipos em
relação ao nível de ploidia (Sari et al., 1999; Souza e Queiroz, 2004).
27
A contagem de cromossomos constitui um método bastante útil, embora
seja mais laborioso e demorado, sendo desvantajoso quando se trata de análises
em grande número de plantas (Hammil et al., 1992; Ganga & Chezhiyan, 2002).
Para a verificação de ploidia em larga escala, tem sido realizada a
análise do conteúdo de DNA nuclear, utilizando citometria de fluxo (Van Duren
et al., 1996; Dolezel et al., 1994). Em plantas, é possível obter milhões de
núcleos em suspensão a partir de poucas gramas de tecido foliar em um
procedimento relativamente simples que envolve a maceração desse tecido em
uma solução tampão que mantém a integridade nuclear (Galbraith et al., 1983).
A coloração dessa amostra com corantes específicos para o DNA permite ao
aparelho estimar a quantidade de DNA.
Este trabalho foi realizado com o objetivo de induzir duplicação
cromossômica com o uso de diferentes concentrações de dois compostos
indutores de poliploidização, a orizalina e a colchicina, em quatro cultivares
diplóides de bananeira, Lidi, Thong Dok Mak, Malbut e Ouro e identificar os
poliplóides. A verificação da ploidia, baseada na característica dos estômatos,
foi comparada com a análise em citometria de fluxo do conteúdo de DNA
nuclear e a contagem de cromossomos.
4 MATERIAL E MÉTODOS
Etapa 1 Micropropagação do material vegetal e tratamento com os agentes
antimitóticos
No Laboratório de Cultura de Tecidos do Departamento de Agricultura
da Universidade Federal de Lavras, os explantes recebidos do Centro de
Mandioca e Fruticultura da Embrapa (Cruz das Almas, BA), constituídos de
28
meristemas apicais dos diplóides Lidi, Thong Dok Mak, Ouro e Malbut. Em
estágio de estabelecimento in vitro, foram multiplicados por duas gerações em
meio de proliferação constituído de MS, suplementado com 30 g L
-1
de sacarose
e 4 mg L
-1
de benzilaminopurina (BAP), com o objetivo de obter um número
suficiente de brotações. Posteriormente, estas são submetidas aos tratamentos
com colchicina (C
22
H
25
NO
6
) e orizalina (3,5 dinitrpylsulfanilamida).
A colchicina foi utilizada nas concentrações finais de 0; 2,5; 7,5 e 12,5
mM e a orizalina, nas doses de 0; 10; 30 e 50 µM. A inoculação foi feita em
meio líquido sob agitação (60 rpm), por 24 e 48 horas, para colchicina e 4 e 7
dias, para orizalina.
Após o tratamento, os explantes foram lavados três vezes com água
destilada e transferidos para o meio de proliferação por mais um subcultivo para
reduzir a freqüência de quimeras e suas progênies. As plantas foram transferidas
para meio de enraizamento (MS suplementado com 30 g L
-1
de sacarose,
solidificado com 0,70% de ágar).
Na fase de proliferação, os explantes foram mantidos em sala de
crescimento, com intensidade luminosa de 36 μMol. m
2
. s
-1
, fotoperíodo de 16
horas e temperatura de 25±2
o
C. O tempo de cada geração foi de trinta dias. Na
fase de enraizamento, os explantes foram mantidos nas mesmas condições
anteriores por 45 dias.
As plantas enraizadas foram transferidas para estufa e colocadas em
tubetes com dimensão de 19 cm de comprimento x 5 cm de diâmetro superior,
com substrato composto de 1 parte de substrato vegetal plantmax estaca:1 parte
de pó de fibra de coco, adicionado de 150g de PG MIX (14-16-18) e de 150 g de
Osmocote (19-6-10), sendo mantidas sob regime de nebulização intermitente e
sombreamento de 50%. Após 60 dias, as plantas foram transplantadas para vasos
de plástico com capacidade para 20 litros, com o mesmo substrato.
29
O esquema fatorial foi o delineamento inteiramente casualizado, em
esquema fatorial 4x4x2, para colchicina (4 diplóides tratados com 4
concentrações de colchicina em dois períodos de exposição, 24 e 48 horas) e para
orizalina (4 diplóides tratados com 4 concentrações de orizalina em dois períodos
de exposição, 4 e 7 dias). Cada tratamento foi realizado em triplicata e o
experimento repetido duas vezes.
Etapa 2- Cálculo da área e densidade de estomática
Foi realizada a coleta de dados de área e de densidade estomática, como
forma de correlacionar o efeito da poliploidiação com esses dados. As análises
foram feitas um ano após a aclimatização das plantas.
Foram utilizados cinco explantes por tratamento. No momento da
aclimatização, foram utilizados números diferentes de plantas em cada
tratamento, devido à multiplicação ou à mortalidade das plantas tratadas. Para
obter uma amostra representativa da superfície da folha, a porção mediana
desprovida de vasos, da parte abaxial das folhas número 1 (folha mais nova
completamente aberta), foi coletada e levada para o Laboratório de Microscopia
Eletrônica e Análise Ultra-Estrutural (LME), no Departamento de Fitopatologia
da UFLA. Foi retirada uma folha de cada planta.
Foram retirados fragmentos da região mediana da folha, desprovida de
nervuras, com, aproximadamente, 0,5 mm
2
, os quais foram fixados em suporte
metálico (“stubs”) com fita adesiva de carbono e mantidos em dessecador, por 48
horas. Em seguida, foram recobertos com camada de ouro (20nm), em aparelho
BAL-TEC, SCD-050. O material foliar preparado foi observado e
eletromicrografado em microscópio eletrônico de varredura LEO-EVO 40, XVP,
com aumento de 600 vezes. Para a determinação da área (diâmetro polar x
diâmetro equatorial) e da densidade estomática foram escolhidos, aleatoriamente,
cinco campos de observações com mesma área (1 mm
2
) na epiderme da face
30
abaxial em cada amostra e, em cada uma, foram mensurados cinco estômatos.
O critério utilizado para separar as plantas tetraplóides das diplóides foi
o de que todas as plantas que diferiram das testemunhas, em tamanho de
estômatos e densidade, foram consideradas tetraplóides.
Etapa 3 - Análise de citometria de fluxo
O material utilizado para a análise foi o mais jovem possível (folhas nº
0). Foi coletada uma folha de cada planta (total de 94 plantas) e retirada uma
pequena porção na região mediana. Os fragmentos foram embalados em papel
alumínio e em sacos plásticos, identificados e enviados para a Universidade
Federal de Juiz de Fora, em caixas de isopor com gelo. As análises foram
realizadas no Laboratório de Genética, no Departamento de Biologia da
Universidade Federal de Juiz de Fora.
Para a determinação do conteúdo de DNA, aproximadamente 20-30 mg
de folhas jovens das plantas e de Pisum sativum (padrão de referência interno)
foram triturados em placa de Petri contendo 1mL de tampão LB01 gelado para a
liberação dos núcleos (Dolezel et al., 1989). A suspensão de núcleos foi aspirada
através de duas camadas de gaze, com auxílio de uma pipeta plástica e filtrada
através de uma malha de 50 μm. Os núcleos foram corados pela adição de 25 μL
de uma solução de 1mg/1mL de iodeto de propídeo, sendo adicionados, ainda, 5
μL de Rnase a cada amostra. As amostras foram armazenadas em refrigerador e
analisadas após 1-2 horas. Para cada amostra, pelo menos 10 mil núcleos foram
analisados utilizando-se uma escala logarítmica. A análise foi realizada no
citômetro Facscalibur (Becton Dickinson) e os histogramas obtidos com o
software Cell Quest e analisados estatisticamente no software WinMDI 2.8
(disponível em http://facs.scripps.edu/software.html).
O conteúdo de DNA nuclear em (pg) das plantas foi estimado utilizando-
se a fórmula a seguir:
31
Amostra, 2C = Canal do pico G1 da amostra X Conteúdo 2C de DNA
DNA Canal do pico G1 de P. sativum do padrão (9,09 pg)
Etapa 4 - Análise citogenética
A indução da duplicação cromossômica foi averiguada pela contagem do
número cromossômico em meristemas de raízes, para a detecção de poliploidia.
As raízes das plantas selecionadas foram pré-tratadas com solução de 8-
hidroxiquinoleína 500 mg L
-1
, por 3 horas. As raízes foram fixadas em solução de
Carnoy (3:1), por um período mínimo de 24 horas
.
Posteriormente, o material foi submetido à técnica de esmagamento,
sendo as raízes lavadas, por três vezes, em água deionizada por um período de 10
minutos. A hidrólise da parede celular foi feita utilizando-se ácido clorídrico
(HCl) 1N a 60ºC, por 15 minutos. Após essa etapa, as raízes foram imersas em
água deionizada gelada por 1 minuto, para a interrupção da reação de hidrólise e,
a seguir, colocadas em solução de ácido acético 45%, por 10 minutos.
A extração e a fragmentação do meristema foram feitas sob microscópio
estereoscópio e a montagem da lâmina por esmagamento em ácido acético 45%.
As lâminas foram secadas ao ar e a retirada da lamínula foi feita com nitrogênio
líquido (Barbosa et al., 2004). Em seguida, as lâminas foram imersas por 30
segundos em ácido acético 45% e coradas com Giemsa 10%, por 5 minutos.
A observação e a análise das lâminas foram feitas com uso de
microscópio com câmera de captura de imagem, utilizando objetiva de aumento
de 100 vezes (imersão em óleo).
32
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
Os dados de taxa de sobrevivência das plantas de bananeira submetidas
aos tratamentos com colchicina e orizalina são apresentados nas Tabelas 1 e 2,
respectivamente. Um ano após a aclimatização, observou-se que grande número
das plantas tratadas não sobreviveu, principalmente aquelas cujas doses dos
agentes antimitóticos foram muito elevadas.
A importância dos agentes antimitóticos está relacionada com a sua ação
específica, que é a duplicação cromossômica. Entretanto, em concentrações
elevadas ou períodos de exposição muito longos, essas substâncias possuem
efeitos tóxicos, gerando grande mortalidade nas plantas tratadas. A tolerância à
colchicina e à orizalina varia entre as espécies e as cultivares.
A aplicação dos agentes antimitóticos causou oxidações nos tecidos que
resultaram na morte dos explantes em boa parte dos genótipos, especialmente
aqueles tratados por 48 horas com colchicina (Tabela 1) e 7 dias com orizalina
(Tabela 2).
No momento da aclimatização, os diplóides Ouro e Malbut, submetidos
aos tratamentos com colchicina, apresentaram maior taxa de sobrevivência,
porém, um ano após a aclimatização, pouquíssimas plantas sobreviveram. Lidi
foi a mais tolerante aos agentes antimitóticos a longo prazo (Tabela 1). Após um
ano de aclimatização, sobreviveram 30% das plantas tratadas com colchicina.
O diplóide Malbut, submetido aos tratamentos com orizalina, apresentou
maior taxa de sobrevivência de plantas no momento da aclimatização, porém, a
longo prazo, apresentou taxa de sobrevivência muito baixa. O diplóide Malbut
foi o mais sensível e o Lidi o mais tolerante, seguido do Thong Dok Mak
(Tabela 2). Cerca de 39% das plantas tratadas com orizalina sobreviveram após
um ano de aclimatização.
33
TABELA 1 Sobrevivência de plantas de 4 diplóides de bananeira submetidas à
duplicação cromossômica com colchicina.
Genótipos Tempo Concentração N° de plantas
aclimatizadas
Nº de plantas
com 1 ano de
aclimatização
Lidi 24 h controle 4 3
Lidi 24 h 2,5 mM 6 5
Lidi 24 h 7,5 mM 4 0
Lidi 24 h 12,5 mM 4 3
Lidi 48 h controle 4 1
Lidi 48 h 2,5 mM 6 5
Lidi 48 h 7,5 mM 8 6
Lidi 48 h 12,5 mM 2 1
Subtotal 38 24
Ouro 24 h controle 17 1
Ouro 24 h 2,5 mM 14 0
Ouro 24 h 7,5 mM 2 0
Ouro 24 h 12,5 mM 5 1
Ouro 48 h controle 6 1
Ouro 48 h 2,5 mM 9 3
Ouro 48 h 7,5 mM 8 1
Ouro 48 h 12,5 mM 6 0
Subtotal 67 7
Malbut 24 h controle 4 1
Malbut 24 h 2,5 mM 23 4
Malbut 24 h 7,5 mM 14 2
Malbut 24 h 12,5 mM 15 1
Malbut 48 h controle 4 1
Malbut 48 h 2,5 mM 8 0
Malbut 48 h 7,5 mM 4 0
Malbut 48 h 12,5 mM 3 0
Subtotal 75 9
Thong Dok Mak 24 h controle 3 1
Thong Dok Mak 24 h 2,5 mM 17 7
Thong Dok Mak 24 h 7,5 mM 8 2
Thong Dok Mak 24 h 12,5 mM 2 0
Thong Dok Mak 48 h controle 4 1
Thong Dok Mak 48 h 2,5 mM 8 2
Thong Dok Mak 48 h 7,5 mM 4 4
Thong Dok Mak 48 h 12,5 mM 3 1
Subtotal 49 18
Total 189 58
34
TABELA 2. Sobrevivência de plantas de 4 diplóides de bananeira submetidas à
duplicação cromossômica com orizalina.
Genótipos Tempo Concentração N° plantas
aclimatizadas
Nº de plantas
com 1 ano de
aclimatização
Lidi 4 dias controle 5 0
Lidi 4 dias 10 µM 7 4
Lidi 4 dias 30 µM - 0
Lidi 4 dias 50 µM 3 2
Lidi 7 dias controle 6 4
Lidi 7 dias 10 µM 14 13
Lidi 7 dias 30 µM - 0
Lidi 7 dias 50 µM 3 1
Subtotal 38 24
Ouro 4 dias controle - 0
Ouro 4 dias 10 µM - 0
Ouro 4 dias 30 µM - 0
Ouro 4 dias 50 µM 6 0
Ouro 7 dias controle 4 1
Ouro 7 dias 10 µM 5 2
Ouro 7 dias 30 µM 2 2
Ouro 7 dias 50 µM 8 0
Subtotal 25 5
Malbut 4 dias controle 5 1
Malbut 4 dias 10 µM 15 1
Malbut 4 dias 30 µM 20 7
Malbut 4 dias 50 µM 1 0
Malbut 7 dias controle 9 1
Malbut 7 dias 10 µM 10 7
Malbut 7 dias 30 µM 2 0
Malbut 7 dias 50 µM - 0
Subtotal 62 17
Thong Dok Mak 4 dias controle 5 4
Thong Dok Mak 4 dias 10 µM 23 9
Thong Dok Mak 4 dias 30 µM - 0
Thong Dok Mak 4 dias 50 µM - 0
Thong Dok Mak 7 dias controle 2 0
Thong Dok Mak 7 dias 10 µM - 0
Thong Dok Mak 7 dias 30 µM 5 3
Thong Dok Mak 7 dias 50 µM 1 1
Subtotal 36 17
Total 161 63
Devido à perda de parcelas, não foi possível correlacionar as melhores
doses e tempos de exposição aos agentes antimitóticos. No entanto, o dano
causado pelas duas toxinas foi claro. A orizalina, que foi usada em baixas
35
concentrações, deveria ter sido menos tóxica que a colchicina, no entanto, as
duas substâncias apresentaram taxa de sobrevivência de plantas semelhantes.
Ao contrário do esperado, no tratamento controle, a taxa de mortalidade
das plantas foi grande. Isso pode ter ocorrido devido ao grande período que as
plantas foram mantidas em casa de vegetação, dentro de vasos. Se as plantas
tivessem sido conduzidas no campo, a taxa de sobrevivência seria maior.
A ocorrência de atraso na regeneração de plantas e de baixa taxa de
sobrevivência foi observada por Ganga & Chezhyan (2002). Estes eventos
podem estar relacionados com a ocorrência de mixoplóides e altos níveis de
ploidia.
As plantas regeneradas apresentaram crescimento mais lento, folhas
pequenas e espessas, quando comparadas com o controle, o que pode ser
indicativo da obtenção de autotetraplóides.
A duplicação dos cromossomos é resultante da afinidade dos agentes
antimitóticos com o fuso, particularmente com a tubulina, inibindo a sua
formação e, conseqüentemente, a divisão da célula. Como resultado, o número
de cromossomos por célula será duplicado a cada ciclo mitótico, na presença do
inibidor (Hugdahl & Morejohn, 1993).
A indução de poliplóides com colchicina é um procedimento utilizado
para várias espécies de plantas, entretanto, pouco tem sido relatado a respeito da
aplicação de colchicina e outros agentes antimitóticos para a indução de
poliplóides de bananeira in vitro. A aplicação de colchicina em bananeira
resultou na formação de plantas tetraplóides mais altas e mais robustas que as
diplóides, porém, com crescimento mais lento e folhas mais inclinadas, e sistema
radicular menos desenvolvido (Vakili, 1967; Hammil et al., 1992). Ganga &
Chezhiyan (2002) testaram concentrações de dois inibidores da formação do
fuso (colchicina e orizalina) e diferentes períodos de tratamentos, para a
obtenção de tetraplóides de bananeiras. Os genótipos utilizados responderam
36
diferentemente aos agentes antimitóticos testados. A capacidade de duplicação
cromossômica de ambas as substâncias foi semelhante, entretanto, a
concentração de colchicina necessária foi 125 a 200 vezes maior que a orizalina.
A avaliação da ploidia das plantas sobreviventes por meio de análises
estomáticas, citometria de fluxo e contagem de cromossomos será descrita para
cada diplóide.
Malbut
Apenas 9 (12%) das plantas do diplóide Malbut aclimatizadas
sobreviveram aos tratamentos com colchicina, Destas, três apresentaram maiores
diferenças em relação aos tratamentos controle, sendo consideradas como
possíveis tetraplóides pela análise estomática (2 com 2,5 mM de colchicina, por
24 horas e 1 com 12,5 mM, por 24 horas), conforme Tabela 3. Todas as plantas
submetidas aos tratamentos por 48 horas não sobreviveram. As três plantas
sobreviventes foram submetidas à análise por citometria de fluxo e foram
avaliadas como diplóides.
Cerca de 27% (17 plantas) do diplóide Malbut sobreviveu aos
tratamentos com oryzalina. Destas, apenas duas plantas submetidas ao
tratamento de 10μM, por 7 dias, apresentaram maior área e menor densidade
estomática, porém, foram classificadas como diplóides pela citometria,
conforme Tabela 4.
As análises de contagem de cromossomos não foram realizadas para
esse diplóide porque nenhuma planta foi considerada poliplóide pela citometria
de fluxo.
37
TABELA 3. Características anatômicas da epiderme e de citometria de fluxo
em plantas de bananeira diplóide Malbut submetidas ao
tratamento com colchicina.
Características anatômicas Citometria de fluxo Tratamento
Área (μm
2
) Densidade
estomática
(nº/mm
2
)
Ploidia Posição do pico Ploidia
0
204,1 a 30,8 c 2n - -
0
242,6 b 27,2 b 2n - -
2,5 Mm/24h
260,3 c 20,0 a
4n
- -
2,5 Mm/24h
286,1 d 25,8 b
4n
- -
2,5 Mm/24h
250,8 c 23,8 b 2n 29 2n
2,5 Mm/24h
237,4 b 21,8 a 2n - -
7,5 Mm/24h
255,5 c 30,4 c 2n - -
7,5 Mm/24h
264,1 c 25,4 b 2n 37 2n
12,5 Mm/24h
270,6 d 37,8 d
4n
37 2n
*Médias seguidas pela mesma letra na vertical pertencem ao mesmo grupo e não
diferem estatisticamente, pelo teste Scott Knott, a 5% de probabilidade.
TABELA 4. Características anatômicas da epiderme e de citometria de fluxo
em plantas de bananeira diplóide Malbut submetidas ao
tratamento com orizalina.
Características anatômicas Citometria de fluxo Tratamento
Área (μm
2
) Densidade
estomática
(nº/mm
2
)
Ploidia Posição do pico Ploidia
0
246,4 a 20,2 b 2n 35 2n
0
210,6 a 23,0 b 2n - -
10μM/4dias
285,9 a 35,4 d 2n 34 2n
30μM/4dias
235,7 a 37,8 e 2n 34 2n
30μM/4dias
292,2 a 27,8 c 2n 34 2n
30μM/4dias
239,5 a 21,4 b 2n - -
30μM/4dias
261,0 a 39,4 e 2n 33 2n
30μM/4dias
266,4 a 25,4 c 2n - -
30μM/4dias
229,9 a 43,2 e 2n 35 2n
30μM/4dias
257,3 a 28,2 c 2n - -
10μM/7dias
260,4 a 23,0 b 2n 35 2n
10μM/7dias
239,5 a 22,0 b 2n 33 2n
10μM/7dias
257,3 a 21,2 b 2n 32 2n
10μM/7dias
265,4 a 27,2 c 2n 36 2n
10μM/7dias
292,2 a 32,0 d 2n 35 2n
10μM/7dias
446,7 b 12,8 a
4n
37 2n
10μM/7dias
404,3 b 17,8 a
4n
37 2n
38
*Médias seguidas pela mesma letra na vertical pertencem ao mesmo grupo e não
diferem estatisticamente, pelo teste Scott Knott, a 5% de probabilidade.
Ouro
A cultivar Ouro foi a mais sensível aos tratamentos, sobrevivendo apenas
10 plantas tratadas com colchicina (15%) e 5 com orizalina (20%).
Uma planta do tratamento com 2,5 mM de colchicina, por 24 horas, foi
classificada como tetraplóide pela análise estomática e citometria de fluxo,
porém, pela contagem de cromossomos foi classificada como mixoplóide
(Tabela 5). Outras duas plantas foram classificadas como tetraplóides pela
análise estomática, porém, a ploidia não se confirmou pela citometria de fluxo.
TABELA 5. Características anatômicas da epiderme, citometria de fluxo e
análise citogenética em plantas de bananeira diplóide Ouro
submetidas ao tratamento com colchicina.
Características anatômicas Citometria de fluxo Análise citogenética Tratamento
Área
(μm
2
)
Densidade
estomática
(nº/mm
2
)
Ploidia Posição
do pico
Ploidia Número de
cromossomos
Ploidia
0
260,8 a 7,5 a 2n - - 22 2n
0
242,1 a 18,0 b 2n - - - -
2,5mM/24h
260,9 a 2,6 a 2n 32 2n - -
2,5mM/24h
313,7 c 15,0 b
4n
60
4n
31 Mixoplóide
2,5mM/24h
285 b 18,4 b 2n - - -
-
12,5mM/24h
289 b 15,4 b 2n 38 2n -
-
2,5mM/48h
285,3 b 16,0 b 2n 32 2n -
-
2,5mM/48h
353,3 c 7,2 a
4n
39 2n -
-
2,5mM/48h
319,9 c 13,8 b
4n
35 2n -
-
7,5mM/48h
289 b 13,5 b 2n - - -
-
*Médias seguidas pela mesma letra na vertical pertencem ao mesmo grupo e não
diferem estatisticamente, pelo teste Scott Knott, a 5% de probabilidade.
No tratamento com orizalina, uma planta diferiu da testemunha em
relação à densidade e à área de estômatos (30μM de orizalina por 7dias). A
ploidia não pôde ser confirmada pela citometria, devido à morte da planta. A
análise citogenética não foi realizada.
39
TABELA 6. Características anatômicas da epiderme e de citometria de fluxo em
plantas de bananeira diplóide Ouro submetidas ao tratamento com
orizalina.
Características anatômicas Citometria de Fluxo Tratamento
Área (μm
2
) Densidade
Estomática
(nº/mm
2
)
Ploidia Posição do pico Ploidia
0
277,7 b 12,8 a 2n - -
10μM/7 dias
280,0 b 14,8 a 2n 36 2n
10μM/7 dias
337 c 16,6 a 2n 36 2n
30μM/7 dias
324,3 c 15,6 a 2n 36 2n
30μM/7 dias
219,3 a 21 b
4n
- -
*Médias seguidas pela mesma letra na vertical pertencem ao mesmo grupo e não
diferem estatisticamente, pelo teste Scott Knott, a 5% de probabilidade.
Lidi
O diplóide Lidi foi o mais tolerante aos tratamentos, tendo maior
número de plantas sobreviventes aos dois agentes antimitóticos, sobrevivendo
28 plantas tratadas com colchicina (73%) e 24 com orizalina (63%).
Pelos dados da Tabela 7, pode-se observar que o tratamento com
colchicina foi mais eficiente, pois promoveu a poliploidia em 5 plantas (3 com a
dosagem de 12,5 mM, por 24 horas e 2 com 7,5 mM por 48 horas).
Uma planta classificada como mixoplóide pela citometria foi
confirmada pela contagem de cromossomos (12,5mM/24h), porém, outra
(12,5mM/24h) foi identificada como tetraplóide pela análise estomática e
citometria de fluxo, mas, pela análise citogenética, foi considerada mixoplóide e,
ainda, uma planta (7,5mM/48h) foi classificada como tetraplóide pelas análises
citogenética e estomática, e pela citometria de fluxo foi identificada como
mixoplóide. As outras duas (12,5mM/24h e 7,5mM/48h) tiveram a tetraploidia
confirmada pelas três técnicas, então, é possível afirmar que essas plantas são
realmente tetraplóides e as outras três mixoplóides.
40
TABELA 7. Características anatômicas da epiderme, citometria de fluxo e
análise citogenética em plantas de bananeira diplóide Lidi
submetidas ao tratamento com colchicina.
Características anatômicas
Citometria de fluxo Análise citogenética Tratamento
Área
(μm
2
)
Densidade
estomática
(nº/mm
2
)
Ploidia Posição
do pico
Ploidia Número de
cromossomos
Ploidia
0
161,1 b 60,6 e 2n - - 22 2n
0
160,3 b 49,2 d 2n - - - -
0
177,0 b 45,8 d 2n - - - -
0
161,5 b 38,2 c 2n - - -
-
2,5 mM/24h
184,1 c 52,8 e 2n 28 2n -
-
2,5 mM/24h
220,6 d 43,8 d 2n 27 2n -
-
2,5 mM/24h
193,3 c 32,8 b
4n
31 2n -
-
2,5 mM/24h
162,8 b 49,8 d 2n 30 2n -
-
2,5 mM/24h
167,7 b 47,4 d 2n 33 2n -
-
7,5 mM/24h
229,3 e 40,2 c
4n
29 2n -
-
7,5 mM/24h
175,8 b 45,8 d 2n 30 2n -
-
7,5 mM/24h
162,1 b 39,8 c 2n 29 2n -
-
7,5 mM/24h
175,1 b 54,0 e 2n 33 2n -
-
12,5 mM/24h
256,6 f 19,8 a
4n
59
4n
44
4n
12,5 mM/24h
190,2 c 32,6 b
4n
60
4n
31 Mixoplóide
12,5 mM/24h
210,8 d 33,4 b
4n
32 e 60 Mixoplóide 33 Mixoplóide
2,5 mM/48h
194,3 c 43,6 c 2n 27 2n -
-
2,5 mM/48h
171,5 b 43,4 c 2n - - -
-
2,5 mM/48h
180,5 c 37,2 c 2n 31 2n -
-
2,5 mM/48h
170,6 b 50,8 d 2n 32 2n -
-
2,5 mM/48h
183,0 c 43,2 c 2n - - -
-
7,5 mM/48h
230,5 e 39,2 c
4n
60
4n
44
4n
7,5 mM/48h
232,9 e 40,8 c
4n
30 e 60 Mixoplóide 44
4n
7,5 mM/48h
181,2 c 55,0 e 2n 33 2n -
-
7,5 mM/48h
195,4 c 41,4 c 2n - - -
-
7,5 mM/48h
177,0 b 53,4 e 2n 31 2n -
-
7,5 mM/48h
202,3 d 38,6 c 2n - - -
-
12,5 mM/48h
104,1 a 39,6 c 2n 30 2n -
-
*Médias seguidas pela mesma letra na vertical pertencem ao mesmo grupo e não
diferem estatisticamente, pelo teste Scott Knott, a 5% de probabilidade.
Conforme dados da Tabela 8, uma planta tratada com 10μM de
orizalina, por 7 dias, foi identificada como tetraplóide pelas análises estomática,
citometria e de contagem de cromossomos, apresentando maior densidade de
estômatos e maior área, contrariando os resultados obtidos até o momento, em
que as tetraplóides e as mixoplóides apresentaram maior área de estômatos e
menor densidade.
41
TABELA 8. Características anatômicas da epiderme, citometria de fluxo e
análise citogenética em plantas de bananeira diplóide Lidi
submetidas ao tratamento com orizalina.
Características anatômicas Citometria de fluxo Análise citogenética Tratamento
Área
(μm
2
)
Densidade
estomática
(nº/mm
2
)
Ploidia Posição
do pico
Ploidia Número de
cromossomos
Ploidia
0
128,3 a 28,8 b 2n 30 2n 22 2n
0
182,7 c 28,8 b 2n 33 2n - -
0
197,1 c 23 a 2n - - - -
0
213,8 c 24,2 a 2n - - - -
10μM/4dias
163,3 b 26,2 b 2n 30 2n -
-
10μM/4dias
284,5 e 19,8 a 2n 28 2n -
-
10μM/4dias
234,5 d 43,4 d
4n
29 2n -
-
10μM/4dias
201,9 c 53,4 e 2n 31 2n -
-
50μM/4dias
156,6 b 31 b 2n - - -
-
50μM/4dias
281,2 e 27,2 b 2n - - -
-
10μM/7dias
202,2 c 22,4 a 2n 29 2n -
-
10μM/7dias
182,4 c 38 c 2n 31 2n -
-
10μM/7dias
161,4 b 43 d 2n 29 2n -
-
10μM/7dias
194,8 c 37 c 2n 30 2n -
-
10μM/7dias
187,8 c 44 d 2n 33 2n -
-
10μM/7dias
185,3 c 43,2 d 2n 31 2n -
-
10μM/7dias
214,6 c 22,8 a 2n 33 2n -
-
10μM/7dias
193,8 c 37,8 c 4n 32 2n -
-
10μM/7dias
217,3 c 42,2 d 4n 34 2n -
-
10μM/7dias
195,8 c 37,6 c 2n 32 2n -
-
10μM/7dias
233,5 d 30,8 b 2n 34 2n -
-
10μM/7dias
199,4 c 36 c
4n
34 2n -
-
10
μM/7dias
237,7 d 45 d
4n
61
4n
44
4n
50μM/7dias
188,7 c 22,4 a 2n 27 2n -
-
*Médias seguidas pela mesma letra na vertical pertencem ao mesmo grupo e não
diferem estatisticamente, pelo teste Scott Knott, a 5% de probabilidade.
Thong Dok Mak
O diplóide Thong Dok Mak obteve valores intermediários de taxa de
sobrevivência, sobrevivendo 18 plantas tratadas com colchicina (36%) e 17 com
orizalina (47%).
Pelos dados da Tabela 9, pode-se observar que uma planta tratada com
7,5 mM de colchicina por 48 horas foi classificada como tetraplóide pela análise
estomática e contagem de cromossomos, porém, foi considerada como
mixoplóide pela citometria de fluxo. Essa planta apresentou grande densidade e
pequena área de estômatos, contrariando os demais resultados obtidos.
42
TABELA 9. Características anatômicas da epiderme, citometria de fluxo e
análise citogenética em plantas de bananeira diplóide Thong
Dok Mak, submetidas ao tratamento com colchicina.
Características anatômicas
Citometria de fluxo Análise citogenética Tratamento
Área
(μm
2
)
Densidade
estomática
(nº/mm
2
)
Ploidia Posição
do pico
Ploidia Número de
cromossomos
Ploidia
0
282,5 c 12,4 a 2n - - 22 2n
0
258,9 b 17,8 b 2n - - - -
2,5mM/24h
214,4 a 29,6 d 2n 29 2n - -
2,5mM/24h
267,7 b 25,2 c 2n 36 2n - -
2,5mM/24h
252,5 b 26,6 c 2n 31 2n -
-
2,5mM/24h
264,6 b 25,0 c 2n 35 2n -
-
2,5mM/24h
236,8 a 29,8 d 2n 36 2n -
-
2,5mM/24h
230,4 a 29,8 d 2n 41 2n -
-
2,5mM/24h
226,0 a 29,0 d 2n 38 2n -
-
7,5mM/24h
346,6 d 11,6 a 2n - - -
-
7,5mM/24h
220,4 a 23,4 c 2n - - -
-
2,5mM/48h
263,4 b 30,4 d 2n - - -
-
2,5mM/48h
270,2 b 17,0 b 2n - - -
-
7,5mM/48h
326,1 d 14,6 a
4n
36 2n -
-
7,5mM/48h
237,3 a 37,8 e
4n
49 Mixoplóide 44
4n
7,5mM/48h
198,4 a 27,8 d 2n - - -
-
7,5mM/48h
241,0 a 26,0 c 2n - - -
-
12,5mM/48h
283,6 c 19,8 b 2n 35 2n -
-
*Médias seguidas pela mesma letra na vertical pertencem ao mesmo grupo e não
diferem estatisticamente, pelo teste Scott Knott, a 5% de probabilidade.
Nos tratamentos com orizalina, uma planta submetida ao tratamento
10μM por 4 dias apresentou grande densidade de estômatos e pequena área e foi
classificada como tetraplóide pela análise estomática e confirmada pela
citometria de fluxo e pela contagem de cromossomos. Outra planta submetida ao
tratamento 10μM/4dias, foi classificada como diplóide pelas análises
estomáticas e de citometria de fluxo, porém, pela contagem de cromossomos foi
classificada como tetraplóide, conforme Tabela 10.
43
TABELA 10. Características anatômicas da epiderme, citometria de fluxo e
análise citogenética em plantas de bananeira diplóide Thong
Dok Mak, submetidas ao tratamento com orizalina.
Características anatômicas
Citometria de fluxo Análise citogenética Tratamento
Área
(μm
2
)
Densidade
estomática
(nº/mm
2
)
Ploidia Posição
do pico
Ploidia Número de
cromossomos
Ploidia
0
273,2 e 32,4 b 2n - - 22 2n
0
202,3 c 27,6 b 2n - - - -
0
209,1 c 35,2 c 2n - - - -
0
372 g 15,2 a 2n - - - -
10μM/4dias
235,9 d 27,6 b 2n 34 2n -
-
10μM/4dias
302,8 f 27,2 b 2n 36 2n -
-
10μM/4dias
215,1 c 30,4 b 2n 30 2n -
-
10μM/4dias
258,0 d 31,8 b 2n - - -
-
10μM/4dias
253,8 d 31,4 b 2n 31 2n 44
4n
10μM/4dias
206,8 c 30,0 b 2n - - -
-
10μM/4dias
241,3 d 30,0 b 2n 32 2n -
-
10μM/4dias
172,4 b 38,2 c
4n
- - -
-
10μM/4dias
127,9 a 58,0 d
4n
60
4n
44
4n
30μM/7dias
244,0 d 29,0 b 2n 30 - -
-
30μM/7dias
242,6 d 19,2 a 2n - - -
-
30μM/7dias
228,4 c 36,4 c 2n 34 2n -
-
50μM/7dias
226,3 c 18,2 a 2n 37 2n -
-
*Médias seguidas pela mesma letra na vertical pertencem ao mesmo grupo e não
diferem estatisticamente, pelo teste Scott Knott, a 5% de probabilidade.
Van Duren et al. (1996) induziram duplicação cromossômica em um
diplóide de Musa acuminata e verificou que 56,2% de plantas com estômatos de
29-40 mm de comprimento e densidade de menos de 60 estômatos por mm
2
eram
tetraplóides.
Conforme diversos autores, o aumento do nível de ploidia é diretamente
proporcional ao número e ao tamanho de estômatos (Valkili,1962; Wan et al.,
1991; Souza & Queiroz, 2004). Porém, neste trabalho, foi verificado que, na
maioria das vezes, plantas que apresentaram maior área e menor densidade de
estômatos em relação à testemunha foram consideradas como possíveis
poliplóides. No entanto, foi observado também plantas do diplóide Lidi, com
maior área e maior densidade de estômatos (Tabela 8) e o diplóide Thong Dok
Mak com maior densidade estomática e área igual ao da testemunha (Tabela 9) e
ainda com menor área e maior densidade de estômatos (Tabela 10) também
44
foram pré-selecionadas como poliplóides. Devido a essa variação, o critério
utilizado para a classificação de poliplóides pela análise estomática foi que
plantas diferentes da testemunha, tanto para mais quanto para menos, foram
classificadas como poliplóide por essa análise. Além disso, todas as plantas
foram analisadas por citometria de fluxo para confirmar a ploidia e aquelas que
foram classificadas como poliplóides pelas análises anteriores foram ainda
analisadas citogeneticamente.
Na Figura 1 estão representadas eletromicrografias de varredura da
superfície abaxial de uma planta diplóide e uma tetraplóide.
FIGURA 1. Eletromicrografia de varredura da superfície abaxial, mostrando
estômatos de folhas de bananeira, cultivar Lidi, submetidas ao
tratamento com colchicina, diplóide (A e C) e tetraplóide (B e D).
45
Motonobu et al. (1997) e Kim & Kim (2003) observaram que o número
de estômatos em crisântemo e Cymbidium, respectivamente, foi diretamente
proporcional ao nível de ploidia e que o tamanho dos estômatos não variou entre
as plantas de diferentes níveis de ploidia. Porém, Vichiato (2005) detectou que
plantas tetraplóides de Dendrobium nobile apresentaram maior freqüência
estomática porque o tamanho de suas células epidérmicas foi menor em relação
às diplóides.
Alguns autores enfatizam que a análise estomática nem sempre é
eficiente e segura, devido aos efeitos genéticos e da análise individual de
algumas variáveis, que podem ocasionar a classificação equivocada de
determinados genótipos em relação ao nível de ploidia (Vandenhout et al., 1995;
Magallanes et al., 1996; Van Duren et al., 1996; Souza e Queiroz, 2004; Madon
et al., 2005). Apesar disso, a pré-verificação, baseada em características de
estômatos, foi muito útil na identificação de uma população formada por
mixoplóides e tetraplóides para reduzir o tamanho da população após a
passagem in vitro (Van Duren et al., 1996).
Pela análise de citometria de fluxo, a ploidia de grande quantidade de
plantas (várias centenas) pode ser medida por dia, produzindo resultados
confiáveis porque o conteúdo de DNA não é influenciado por fatores externos,
tais como intensidade luminosa, desenvolvimento de lâmina foliar e conteúdo de
água no tecido da planta.
Os gráficos com as posições dos picos de uma planta diplóide e uma
tetraplóide podem ser vistos na Figura 2. Conhecendo-se a posição relativa entre
os picos de um material diplóide em relação a um padrão de referência, podem-se
detectar materiais poliplóides.
A maioria das plantas classificadas como tetraplóides pela análise
estomática foi confirmada pela citometria, outras também com características de
tetraplóides foram confirmadas como mixoplóides. Ao todo, 6 plantas foram
46
classificadas como tetraplóides e 3 como mixoplóide, pela citometria de fluxo.
Nenhuma planta diplóide pela análise estomática foi considerada como
tetraplóide pela citometria. Isso é importante porque é possível separar as plantas
em dois grupos: diplóides e mixoplóides + tetraplóides.
FIGURA 2. Detecção de poliploidia por citometria de fluxo. Em (A) a posição
do pico do material analisado no canal 300 e o padrão de
referência está no canal 30. Isso é um diagnóstico de que esse
material é poliplóide, ou seja, possui o dobro da quantidade de
DNA do material diplóide, sendo, portanto tetraplóide. Em (B), o
pico do material analisado (diplóide) posiciona-se no canal 300
em relação ao pico do padrão de referência no canal 70.
A
B
Padrão de
referência
Padrão de
referência
Material
di
p
lóide
Material
tetraplóide
47
A quantidade de DNA tem sido estudada em vários gêneros de
importância econômica, como Zea (Rayburn et al., 1989), Pennisetum (Passos et
al., 1994; Martel et al., 1997), Hordeum (Vogel et al., 1999), Oryza (Buso et al.,
2000), Brachiaria (Pinheiro et al., 2000) e Triticum (Kubalakova et al., 2002).
Van Duren et al. (1996) utilizaram a citometria de fluxo para a
identificação de bananeiras autotetraplóides induzidas por duplicação
cromossômica a partir de materiais diplóides. O fenômeno de mixoploidia foi
comum neste trabalho.
Outros exemplos da aplicação da citometria de fluxo na indução de
duplicação cromossômica podem ser encontrados em diversos trabalhos
(Thibault, 1998; Pinheiro et al., 2000; Roy et al., 2001; Petersen et al., 2002).
A contagem de cromossomos foi realizada em 15 plantas, sendo 5
diplóides e 10 poliplóides. Um resumo dos resultados de todas as análises
realizadas encontra-se na Tabela 11.
TABELA 11. Análise citogenética, estomática e de citometria de fluxo de
diplóides de bananeira Thong Dok Mak, Ouro e Lidi, com
diferentes ploidias.
Tratamento Análise
citogenética
Citometria de
fluxo
Análise
estomática
TDM –colchicina - controle 2n 2n 2n
TDM – orizalina - controle 2n 2n 2n
Lidi – colchicina - controle 2n 2n 2n
Lidi – orizalina - controle 2n 2n 2n
Ouro – colchicina - controle 2n 2n 2n
TDM – colchicina- 7,5mM/48h Mixoplóide Mixoplóide 4n
Lidi – colchicina- 12,5mM/24h Mixoplóide Mixoplóide 4n
Ouro – colchicina- 2,5mM/24h Mixoplóide 4n 4n
Lidi – colchicina- 12,5mM/24h Mixoplóide 4n 4n
Lidi – colchicina- 7,5mM/48h 4n Mixoplóide 4n
TDM – orizalina- 10μM/4 dias 4n 2n 2n
Lidi – colchicina- 12,5mM/24h 4n 4n 4n
TDM – orizalina- 10μM/4 dias 4n 4n 4n
Lidi – colchicina- 7,5mM/48h 4n 4n 4n
Lidi – orizalina- 10μM/4 dias 4n 4n 4n
48
Uma metáfase de células de um autotetraplóide com cromossomos de
plantas de bananeira Thong Dok Mak pode ser vista na Figura 3.
FIGURA 3 Metáfase mitótica de bananeira, Thong Dok Mak, com 44
cromossomos
.
Pelos dados da Tabela 11 é possível observar que houve algumas
variações de ploidia pelos três métodos utilizados. A análise citogenética foi feita
utilizando-se meristemas de raízes, enquanto que as análises estomáticas e de
citometria de fluxo foram feitas em folhas jovens das plantas. Como são tecidos
diferentes, é comum que plantas tratadas com agentes antimitóticos apresentem
células com ploidia diferentes, em locais diferentes na planta. Esse material é
considerado mixoplóide (material com variação no número cromossômico).
Vários autores (Binsfeld et al., 2000; Barbosa, 2004; Koutolis et al., 2005;
Poutaraud & Girardin, 2005) relataram o efeito diferencial de antimitóticos,
quando diferentes tecidos alvo e períodos de tratamentos são utilizados.
Como o crescimento e o desenvolvimento de uma folha são comandados
por vários meristemas funcionando simultânea ou seqüencialmente, em
49
trabalhos de poliploidização, é evidente a dificuldade em se fazer com que a
colchicina ou a orizalina afete todos esses meristemas, localizados em diferentes
pontos topográficos da gema e funcionando em momentos diferentes, mesmo
considerando apenas uma gema isolada (Rhoth 1984). Além disso, essas
substâncias agem de forma eficiente somente em células que estão em divisão,
portanto, a duplicação dos cromossomos pode não acontecer em todas as células
do material tratado, sendo comum o aparecimento de mixoplóides (Dolezel et
al., 1994; Wan et al., 1989; Carvalho et al., 2005). Por esse motivo, a planta
tratada poderá sofrer reversão parcial ou total da condição diplóide, após alguns
ciclos de divisão, principalmente devido à proliferação às células diplóides
remanescentes que se multiplicam a taxas superiores àquelas células poliplóides.
Uma hipótese para se explicar a ocorrência de mixoploidia, neste
trabalho, pode ser a eliminação cromossômica. Abreu (2002, 2006) e Barbosa
(2004), trabalhando com a indução de duplicação cromossômica em híbridos
triplóides de capim-elefante e milheto observaram o fenômeno de mixoploidia
na maioria das plantas analisadas. Segundo estes autores, houve grande variação
no número cromossômico nas metáfases analisadas. As conclusões foram de que
estas variações eram provenientes de eliminação cromossômica. Algumas
alterações na mitose são características de eliminação cromossômica, tais como
não orientação de cromossomos na metáfase, segregação tardia na anáfase,
degradação de cromatina ou fragmentação de cromossomos e formação de
micronúcleos (Singh, 2002).
A maioria das plantas classificadas como tetraplóides foi submetida ao
tratamento com colchicina. Petersen et al. (2003) e Maldon et al. (2005) também
verificaram que a colchicina foi mais eficiente que a orizalina na indução de
duplicação cromossômica em Miscanthus sinensis e Elaeis guineensis,
respectivamente.
50
Assim, a possibilidade de indução de autotetraplóides na cultura da
bananeira tem um impacto significativo em programas de melhoramento,
objetivando a transferência de valiosas características presentes em acessos
diplóides e não facilmente disponíveis devido à natureza genômica de bananeiras
cultivadas.
Neste trabalho, não foi possível definir os métodos de duplicação
cromossômica. Devido ao grande número de plantas perdidas na fase de
aclimatização, não foi possível comparar as dosagens e os tempos de exposição
dos agentes antimitóticos e a interação com os diplóides estudados.
O maior problema observado durante a condução dos experimentos foi a
morte da maioria das plantas, causada por vários motivos: toxidez dos agentes
antimitóticos; longo tempo em casa de vegetação (mais de 2 anos), até a
realização de todas as análises e poda drástica do material para a indução de
rejuvenescimento, já que, para a análise de citometria de fluxo, foi necessária a
utilização de folhas jovens.
Para a continuação deste trabalho, é recomendável que a análise de
citometria de fluxo seja realizada na fase in vitro, na qual o material estará bem
jovem. A partir desses resultados, poderá descartar as plantas diplóides,
diminuindo a população para análises posteriores.
6 CONCLUSÕES
Pelas análises citogenética, estomática e de citometria de fluxo, são
confirmadas 4 plantas tetraplóides e 6 mixoplóides.
O maior número de plantas tetraplóides e mixoplóides é obtido
utilizando-se colchicina.
51
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56
CAPÍTULO III
ANÁLISES DE CARACTERÍSTICAS ANATÔMICAS E ULTRA-
ESTRUTURAIS DE PLANTAS MIXOPLÓIDES E
AUTOTETRAPLÓIDES DE BANANEIRA
57
1 RESUMO
PIO, Leila Aparecida Salles. Análises de características anatômicas e ultra-
estruturais de cultivares de bananeira mixoplóides e autotetraplóides. In:
______. Indução e identificação de poliploidia em Musa acuminata Colla.
2008. Cap. 3, p. 57-72. Tese (Doutorado em Agronomia/Fitotecnia) -
Universidade Federal de Lavras, Lavras, MG.
*
O presente estudo foi realizado com o objetivo de verificar o efeito da
autotetraploidia e da mixoploidia nas características anatômicas e ultra-
estruturais das cultivares de bananeira Malbut, Lidi e Thong Dok Mak. Foram
feitas análises em plantas diplóides, mixoplóides e tetraplóides. Fragmentos
retirados de folhas jovens foram submetidos às técnicas de preparação
tradicionais para análise em microscopia eletrônica de transmissão. Foram
realizados os cortes em seções semifinas (>100nm) e ultrafinas (<100nm).
Foram avaliados comprimento e área de células do parênquima paliçádico e
lacunoso, epidermes adaxial e abaxial, espessura do limbo e o número de
cloroplastídeos. Os cortes ultrafinos foram examinados em microscópio
eletrônico de transmissão e foram observadas características ultra-estruturais dos
cloroplastídeos. Observou-se que diferentes características anatômicas da
epiderme foliar, assim como do mesofilo e da ultra-estrutura dos cloroplastídeos,
sofreram modificações que permitam a separação dos diplóides, mas não
apresentam diferenças entre tetraplóides e mixoplóides.
*
Orientador: Moacir Pasqual – UFLA.
58
2 ABSTRACT
PIO, Leila Aparecida Salles. Analysis structural and ultrastructural characteristics
in mixoploids and autotetraploidy banana varieties. In: ______. Autotetraploidy
induction and identification in banana (Musa spp.). 2008. Chap. 3, p. 57-72.
Thesis (Doctorate in Agronomy/Crop Science) – Federal University of Lavras,
Lavras, Minas Gerais, Brazil.
*
The aimed study to induct and to verification in autotetraploidys and mixoploids
effects on the structural and ultrastructural characteristics in banana varieties:
Malbut, Lidi e Thong Dok Mak. Were analyzed diploids, mixoploids and
tetraploids plants. Fragments from young leaves were submitted to the
conventional techniques for analysis in transmition electron microscopy. Thick
(>100nm) and thin (<100nm) sections were evaluated in light and transmition
electron microscopy, respectively. Length and area of cells from palyçadic and
spongy parenchyma, adaxial and abaxial epidermis, leave thickness were
measured and chloroplasts numbers were estimated. While to thin sections
ultrastructural characteristics of chloroplasts were examined. It was concluded
that differences between tetraploids and mixoploids was produced, only
structural and ultrastructural characteristics of diploids.
*
Adviser: Moacir Pasqual – UFLA
59
3 INTRODUÇÃO
A determinação do nível de ploidia em plantas submetidas à duplicação
cromossômica pode ser realizada diretamente por meio da contagem dos
cromossomos em células mitóticas e meióticas (Guerra, 1989; Villa, 1995).
No entanto, a análise citogenética exige muita experiência do
pesquisador, sendo um procedimento laborioso e demorado, desvantajoso
quando se trata de análises em grande número de plantas (Magallanes et al.,
1996; Sari et al., 1999).
Outro método usado para a identificação do nível de ploidia, também
conhecido como método indireto, é a caracterização citoanatômica e
morfológica, como diâmetro do grão de pólen, número e tamanho de
cloroplastídeos, tamanho de células, espessura das folhas, etc. (Villa, 1995;
Magalhães et al., 1996; Souza & Queiroz, 2004).
Trata-se de métodos relativamente rápidos e fáceis para a avaliação do
nível de ploidia e permitem estimativas de correlações estatísticas (Souza &
Queiroz, 2004). A associação entre o nível de ploidia e as características
morfológicas pode auxiliar na separação de plantas poliplóides, principalmente
porque essas características estão relacionadas com o aumento do tamanho das
células, como resultantes da poliploidização (Lleras & Medri, 1978; Medri &
Lleras, 1981; Villa, 1995; Magallanes et al., 1996; Souza & Queiroz, 2004).
No entanto, vários autores enfatizam que os métodos indiretos podem ser
influenciados pelo ambiente e a análise individual de algumas variáveis poderá
ocasionar a classificação equivocada de determinados genótipos em relação ao
nível de ploidia (Magallanes et al., 1996; Sari et al., 1999; Souza & Queiroz,
2004). Além disso, os métodos indiretos possibilitam apenas distinção entre
indivíduos poliplóides e diplóides, não sendo útil para separar, por exemplo,
60
triplóides de tetraplóides (Magallanes et al., 1996; Sari et al., 1999). Mesmo
assim, a aplicação dos métodos indiretos é importante, uma vez que o descarte
das plantas diplóides possibilitará considerável redução do número de plantas a
serem submetidas à análise citogenética, reduzindo custos e acelerando o
processo de seleção (Souza & Queiroz, 2004).
Este trabalho foi realizado com o objetivo de comparar plantas diplóides,
mixoplóides e tetraplóides induzidos em três cultivares de bananeira (Lidi,
Thong Dok Mak e Ouro), mediante análises de características anatômicas e
ultra-estruturais.
4 MATERIAL E MÉTODOS
Este trabalho foi realizado no Laboratório de Microscopia Eletrônica e
Análise Ultra-Estrutural (LME), no Departamento de Fitopatologia da
Universidade Federal de Lavras (UFLA).
Plantas de bananeira, cultivares Lidi, Ouro e Thong Dok Mak, diplóides,
tetraplóides e mixoplóides, já identificadas quanto ao nível de ploidia, via
análise estomática, citometria de fluxo e citogenética foram obtidas no
Departamento de Agricultura da UFLA. Os experimentos foram realizados dois
anos após a indução da poliploidia com colchicina e orizalina.
Fragmentos de 0,5 cm
2
foram retirados da folha nº 1 (folhas mais jovens
completamente abertas) de cada material analisado e fixados em uma solução
composta de glutaraldeído (2,5%) e paraformaldeído (2,0%), em tampão
cacodilato, pH 7,2, 0,05M + CaCl
2
0,001M por, aproximadamente, quatro horas
em temperatura ambiente.
Posteriormente, esses fragmentos foram lavados em tampão cacodilato
61
0,05M (três vêzes por 10 minutos) e pós-fixados em tetróxido de ósmio 1% em
tampão cacodilato 0,05 M, por 4 horas. Em seguida, iniciou-se a desidratação
em gradiente de acetona (25%, 50%, 75% e 90%, por 10 minutos e 3 vezes, por
10 minutos, em 100%). Logo depois, o material foi incluído em gradiente
crescente de acetona e resina Spurr 30%, por 8 horas, a 70%, por 12 horas e 2
vezes a 100%, em intervalos de 24 horas, sendo os tecidos emblocados em
resina pura e colocados em estufa, a 70ºC, por 48 horas, para a polimerização.
Os blocos obtidos foram desbastados com lâminas de aço, para a retirada da
resina excedente.
Foram realizados os cortes em seções semifinas (>100nm) e ultrafinas
(<100nm), em ultramicrótomo Reichrt-Jung, utilizando navalha de diamante. Os
cortes semifinos foram coletados com anel de ouro, colocados em lâminas de
vidro, coloridos com azul de toluidina (1g azul de toluidina, 1g borato de sódio e
100mL de água purificados por meio de filtro Millipore 0,2μm) e montados
permanentemente em meio Permaut. Essas lâminas foram analisadas em
microscópio com sistema de captura de imagem no Laboratório de Citogenética
da UFLA e as medições foram realizadas por meio do softwer Sigma Scan Pro 5
em 10 células da primeira camada do parênquima paliçádico e lacunoso. Foram
avaliados área (comprimento x largura) e comprimento das células do
parênquima paliçádico e lacunoso, área e comprimento das células das
epidermes adaxial e abaxial, espessura do limbo e o número de cloroplastídeos.
Os cortes ultrafinos foram coletados em grades de ouro (golden slot
grids) e secos em raques de alumínio cobertos com formvar (Rowley & Moran,
1975). As seções foram pós-contrastadas em acetato de uranila, seguido por
acetato de chumbo por 3 minutos cada e, em seguida, examinadas em
microscópio eletrônico de transmissão Zeiss, modelo EM 102 a 80Kv.
As características observadas para as análises ultra-estruturais dos
cloroplastídeos foram realizadas em 10 células da primeira camada do
62
parênquima paliçádico e lacunoso, em todos os tratamentos estudados.
Os ensaios foram conduzidos seguindo o delineamento inteiramente
casualizado, com 5 repetições. Os tratamentos foram representados por 3
cultivares: Lidi, 6 plantas (1 diplóide, 2 mixoplóides e 3 tetraplóides); Thong
Dok Mak, 5 plantas (1 diplóide, 3 mixoplóides e 1 tetraplóide) e Ouro, 2 plantas
(1 diplóide e 1 mixoplóide).
Os dados obtidos foram submetidos à análise de variância utilizando o
programa estatístico Sisvar 4.3. As médias entre os tratamentos foram
comparadas pelo teste de Scott Knott, a 5% de probabilidade.
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
Houve diferenças significativas, a 5% de probabilidade, entre a maioria
dos tratamentos, tanto para as características anatômicas como para as ultra-
estruturais estudadas. Observou-se que diferentes características anatômicas da
epiderme foliar, assim como do mesofilo e da ultra-estrutura dos cloroplastídeos,
sofreram variações em função dos diferentes níveis de ploidia, tanto no
parênquima paliçádico quanto no lacunoso.
Para a cultivar Lidi, houve diferenças significativas nas variáveis área
das células do parênquima paliçádico, epiderme adaxial, espessura do limbo e
comprimento de células dos parênquimas e das epidermes (Tabela 1). Foi
observado que a planta diplóide apresentou menor área de células e menor
espessura do limbo e menor comprimento de células do parênquima lacunoso,
paliçádico e das epidermes em relação às poliplóides.
63
TABELA 1. Área e comprimento de células dos parênquimas paliçádico e
lacunoso, epidermes abaxial e adaxial e espessura do limbo foliar
de plantas de bananeira, cultivar Lidi com diferentes níveis de
ploidia.
Médias seguidas pela mesma letra na vertical não diferem entre si, pelo teste de médias
Scott-Knott, a 5% de probabilidade.
Para a cultivar Thong Dok Mak, todas as variáveis analisadas
apresentaram diferenças significativas entre as plantas estudadas. Nas variáveis
área das células do parênquima paliçádico e espessura de limbo, foi possível
separar as plantas diplóides, que apresentaram menor tamanho de células e de
espessura de limbo e menor número de cloroplastídeos. As plantas mixoplóides
apresentaram valores intermediários para essas características e a tetraplóide
apresentou valores mais elevados. O comprimento das células das plantas
diplóides foi menor em todos os tratamentos (Tabela 2) e, para as variáveis
comprimento de células do parênquima paliçádico e epiderme adaxial, também
foi possível separar as mixoplóides da tetraplóide.
Células do
parênquima
paliçádico
Células do
parênquima
lacunoso
Células da
epiderme abaxial
Células da
epiderme adaxial
Ploidia
área
(μm
2
)
comp.
(μm)
área
(μm
2
)
comp.
(μm)
área
(μm
2
)
comp.
(μm
2
)
área
(μm
2
)
comp.
(μm)
Espes-
sura do
limbo
(μm)
2n 228,9 a 19,2 a 171,7 a 10,7 a 123,9 a 10,5 a 69,5 a 11,6 a 162,4 a
Mixopl 272,9 a 32,5 b 182,1 a 16,5 b 162,4 a 17,1 c 117,7 b 18,1 c 188,2 b
Mixopl 322,9 a 30,1 b 221,0 a 17,3 b 131,0 a 14,4 b 121,5 b 17,4 c 170,3 a
4n 359,1 b 36,1 c 294,7 a 19,8 b 123,0 a 14,8 b 107,3 b 15,6 b 169,4 a
4n 414,1 b 35,2 c 201,7 a 17,2 b 100,1 a 19,8 c 101,1 b 15,2 b 194,9 b
4n 305,8 a 29,1 b 247,1 a 17,7 b 118,9 a 18,2 c 103,7 b 17,5 c 257 c
64
TABELA 2. Área e comprimento de células dos parênquimas paliçádico e
lacunoso, epidermes abaxial e adaxial e espessura do limbo foliar
de plantas de bananeira, cultivar Thong Dok Mak com diferentes
níveis de ploidia.
Médias seguidas pela mesma letra na vertical não diferem entre si, pelo teste de médias
Scott-Knott, a 5% de probabilidade.
Para a cultivar Ouro, as variáveis área de células do parênquima
paliçádico e epiderme abaxial, e espessura do limbo apresentaram diferenças
significativas entre os tratamentos, tendo o material diplóide apresentado valores
inferiores para essas características. Também foi possível separar comprimento
de células do parênquima paliçádico e epiderme abaxial, em que as plantas
diplóides também apresentaram valores inferiores (Tabela 3).
TABELA 3. Área e comprimento de células dos parênquimas paliçádico e
lacunoso, epidermes abaxial e adaxial e espessura do limbo foliar
de plantas de bananeira, cultivar Ouro, com diferentes níveis de
ploidia.
Médias seguidas pela mesma letra na vertical não diferem entre si, pelo teste de médias
Scott-Knott, a 5% de probabilidade.
Células do
parênquima
paliçádico
Células do
parênquima
lacunoso
Células da
epiderme abaxial
Células da
epiderme adaxial
Ploidia
área
(μm
2
)
comp.
(μm)
área
(μm
2
)
comp.
(μm)
área
(μm
2
)
comp.
(μm
2
)
área
(μm
2
)
comp.
(μm)
Espes-
sura do
limbo
(μm)
2n 148,8 a 23,8 a 98,7 a 12,9 a 75,7 a 11,6 a 77,4 a 9,4 a 119,0 a
Mixopl. 259,4 b 28,7 b 115,2 a 15,9 b 99,7 a 14,2 b 60,5 a 13,8 b 155,8 b
Mixopl. 245,4 b 33,5 b 199,5 b 16,0 b 97,8 a 20,3 c 129,9 b 15,6 b 162,4 c
Mixopl. 238,9 b 32,6 b 212,1 b 18,2 b 141,5 b 16,8 c 87,5 a 15,9 b 176,3 d
4n 347,3 c 35,2 c 324,4 c 16,8 b 143,5 b 17,3 c 135,8 b 20,7 c 190,8 c
Células do
parênquima
paliçádico
Células do
parênquima
lacunoso
Células da
epiderme abaxial
Células da
epiderme adaxial
Ploidia
área
(μm
2
)
comp.
(μm)
área
(μm
2
)
comp.
(μm)
área
(μm
2
)
comp.
(μm
2
)
área
(μm
2
)
comp.
(μm)
Espes-
sura do
limbo
(μm)
2n 158,2 a 24,1 a 138,2 a 14,6 a 104,5 a 14,8 a 67,1 a 15,1 a 128,6 a
Mixopl. 206,8 b 29,3 b 162,7 a 14,6 a 131,7 a 16,6 b 115,3 b 15,0 a 146,6 b
65
Por meio da análise de área e de comprimento de células de folha e
espessura do limbo em plantas com diferentes níveis de ploidias, foi possível
separar diplóides de poliplóides e, para a cultivar TDM, também foi possível
separar as mixoplóides da tetraplóide, em relação ao tamanho das células dos
parênquimas.
Nas análises ultra-estruturais dos cloroplastídeos, para a cultivar Lidi,
houve diferença significativa para diâmetro vertical e área dos cloroplastídeos
em células do parênquima paliçádico e diâmetro horizontal e vertical de
cloroplastídeos de células do parênquima lacunoso. Os cloroplastídeos de células
do parênquima paliçádico das plantas diplóides apresentaram menor tamanho
em relação ás demais, porém, o número de cloroplastídeos no parênquima
lacunoso não apresentou diferenças significativas (Tabela 4).
TABELA 4 Características dos cloroplastídeos de células dos parênquimas
paliçádico e lacunoso de folhas de plantas de bananeira, cultivar
Lidi, com diferentes níveis de ploidia.
Parênquima paliçádico
Parênquima lacunoso Ploidia
Ø
horizontal
(μm)
Ø vertical
(μm)
Área
(μm
2
)
Nº
clorop./
célula
Ø
horizontal
(μm)
Ø
vertical
(μm)
Área
(μm
2
)
Nº
cloropl
/célula
2n 6,4 a 1,9 a 9,9 a 4,9 a 5,5 a 2,6 a 13,5 a 3,4 a
Mixopl. 5,4 a 3,3 c 15,9 b 8,4 c 6,9 b 3,3 a 16,7 a 4,0 a
Mixopl. 7,5 a 2,8 b 16,4 b 6,9 b 5,9 a 3,2 a 14,7 a 5,0 a
4n 6,8 a 2,5 b 14,7 b 6,2 b 5,5 a 2,5 b 11,1 a 3,7 a
4n 6,6 a 2,9 b 14,3 b 9,0 c 6,1 b 2,9 a 12,5 a 4,4 a
4n 7,6 a 2,7 b 13,8 b 5,5 a 6,6 b 3,5 a 15,8 a 4,4 a
Médias seguidas pela mesma letra não diferem entre si, pelo teste de médias Scott-Knott,
a 5% de probabilidade.
Para a cultivar Thong Dok Mak, houve diferença significativa entre os
tratamentos em todas as varáveis analisadas. As células dos parênquimas
paliçádico e lacunoso apresentaram cloroplastídeos menores em relação às
demais. O número de cloroplastídeos foi menor na planta diplóide, maior na
66
tetraplóide e apresentou valores intermediários nas mixoplóides, nos dois
parênquimas, sendo possível separar diplóides, tetraplóides e mixoplóides por
essa característica (Tabela 5).
TABELA 5 Características dos cloroplastídeos de células dos parênquimas
paliçádico e lacunoso de folhas de plantas de bananeira, cultivar
Thong Dok Mak, com diferentes níveis de ploidia.
Parênquima paliçádico
Parênquima lacunoso Ploidia
Ø
horizontal
(μm)
Ø
vertical
(μm)
Área
(μm
2
)
Nº
clorop/
célula
Ø
horizontal
(μm)
Ø
vertical
(μm)
Área
(μm
2
)
Nº
clorop./
célula
2n 4,7 a 1,7 a 5,2 a 5,2 a 3,3 a 1,8 a 7,4 a 2,4 a
Mixopl. 6,8 b 1,9 a 9,8 b 6,1 b 5,5 b 3,2 b 7,7 a 3,4 b
Mixopl 7,0 b 2,5 b 12,3 b 6,6 b 6,1 c 4,9 c 12,6 b 4,5 b
Mixopl 7,8 b 3,3 c 19,6 c 7,5 b 5,5 b 3,6 b 13,7 b 3,8 b
4n 7,8 b 2,6 b 16,04 c 8,5 c 5,0 b 3,2 b 12,5 b 6,9 c
Médias seguidas pela mesma letra não diferem entre si, pelo teste de médias Scott-Knott,
a 5% de probabilidade.
Para a cultivar Ouro, apenas o diâmetro horizontal e a área dos
cloroplastídeos do parênquima paliçádico e o diâmetro horizontal de
cloroplastídeos do parênquima lacunoso apresentaram diferenças significativas.
Para essas variáveis, a planta diplóide também apresentou cloroplastídeos
menores em relação à mixoplóide. O número de cloroplastídeos foi menor na
planta diplóide no parênquima paliçádico (Tabela 6).
TABELA 6. Características dos cloroplastídeos de células dos parênquimas
paliçádico e lacunoso de folhas de plantas de bananeira, cultivar
Ouro, com diferentes níveis de ploidia.
Parênquima paliçádico
Parênquima lacunoso Ploidia
Ø
horizontal
(μm)
Ø
vertical
(μm)
Área
(μm
2
)
Nº
cloropl/
célula
Ø
horizontal
(μm)
Ø
vertical
(μm)
Área
(μm
2
)
Nº
cloropl
/célula
2n 4,4 a 2,6 a 8,7 a 3,0 a 4,9 a 2,6 a 10,1 a 2,1 a
Mixopl. 6,2 b 3,0 a 16,0 b 4,4 b 7,1 b 2,7 a 15,1 a 3,0 a
Médias seguidas pela mesma letra não diferem entre si, pelo teste de médias Scott-Knott,
a 5% de probabilidade.
67
Em todas as cultivares, o tamanho dos cloroplastídeos sofreu variações
em função dos diferentes níveis de ploidia, tanto no parênquima paliçádico
quanto no lacunoso. Plantas tetraplóides e mixoplóides apresentaram
cloroplastídeos maiores em relação às diplóides.
Segundo Pagliarini (2001), um dos principais aspectos somáticos que
distinguem os autotetraplóides é a mudança do tamanho celular e nuclear,
resultando, primariamente, em características “gigas”. Esse efeito
morfofisiológico se deve, provavelmente, à dosagem gênica dobrada das células.
Devido ao efeito gigas, pode haver também aumento do tamanho de
organelas celulares, como os cloroplastídeos, podendo provocar também outras
mudanças na morfologia da planta. A morfologia dos cloroplastídeos também
sofreu variações em relação aos diferentes níveis de ploidia. As plantas
tetraplóides e mixoplóides apresentaram mudanças no tamanho e na estrutura
dos cloroplastídeos, como pode ser observado na Figura 1. Na Figura 1C estão
representados cloroplastídeos de uma planta diplóide, com tamanho e formato
normais, enquanto que as Figuras 1A e B representam cloroplastídeos de plantas
mixoplóides e 1D tetraplóide, com maior tamanho e morfologia diferenciada.
68
FIGURA 1. Eletromicrografia de transmissão de cloroplastídeos presentes em
células do parênquima paliçádico mostrando diferentes tamanhos
em folhas de bananeira, cultivar TDM A e B - mixoplóide, C -
diplóide e D- tetraplóide
.
Pela Figura 2 é possível observar as diferentes formas dos
cloroplastídeos em plantas mixoplóides das três cultivares estudadas.
69
FIGURA 2. Eletromicrografia de transmissão mostrando diferentes formas dos
cloroplastídeos nas células do parênquima paliçádico de lâminas
foliares de bananeira, cultivares Lidi (A), Ouro (B) e TDM (C)
mixoplóides.
Foi verificado também que as mudanças que ocorreram no número de
cromossomos proporcionam alterações não só no tamanho e na morfologia dos
cloroplastídeos, mas também no arranjo dos mesmos nas células. Em plantas
normais, no parênquima paliçádico, os cloroplastídeos podem estar
aglomerados, formando uma haste próxima às paredes periclinais ou podem
estar aderidos longitudinalmente às paredes anticlinais, funcionando como um
tubo para passagem da luz para o parênquima lacunoso situado logo abaixo do
parênquima paliçádico, isso em uma folha dorsiventral. Os cloroplastídeos no
parênquima lacunoso podem, também, se orientar de acordo com a quantidade e
a qualidade de luz penetrada. Em todos os tratamentos, os cloroplastídeos foram
70
observados próximos à parede celular (Figura 3B). Somente em algumas plantas
mixoplóides observaram-se alguns cloroplastídeos dispersos no meio
intracelular (Figura 3A).
Nas Figuras 3C e 3D, foi possível observar que ocorreu também um
aumento na espessura da parede celular de uma planta tetraplóide (C) em relação
à diplóide (D).
FIGURA 3. Eletromicrografia de transmissão mostrando cloroplastídeos no
meio intracelular, de uma planta mixoplóide (A) e junto à parede
celular, planta diplóide (B) e espessura da parede em célula
tetraplóide (C) e diplóide (D) do parênquima paliçádico de lâminas
foliares de bananeira, cultivar Lidi.
Foram observadas vesículas de lipídeos, caracterizadas por círculos
escuros nos cloroplastídeos de plantas em todos os níveis de ploidia, porém, eles
são maiores e em maior número em poliplóides, como pode ser observado nas
Figuras 1, 2 e 3.
71
A morfologia e o tamanho e o número dos cloroplastídeos, bem como a
espessura e da parede celular, variaram em função dos diferentes níveis de
ploidia, em todas as cultivares estudadas, podendo, então, separar diplóides de
poliplóides pelas características analisadas e, em algumas delas, também é
possível separar mixoplóides de tetraplóides.
6 CONCLUSÕES
As plantas mixoplóides e tetraplóides de Musa spp possuem maior
espessura do limbo foliar, maior área e comprimento de células do parênquima
paliçádico e lacunoso em relação às diplóides.
Os cloroplastídeos das células do parênquima paliçádico e lacunoso variam
quanto à morfologia, ao número e ao tamanho, em função dos diferentes níveis
de ploidia. Plantas tetraplóides apresentam maior tamanho de cloroplastídeos.
A parede celular de plantas tetraplóides e mixoplóides é mais espessa.
7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
GUERRA, M. Introdução a citogenética geral. Rio de Janeiro: Guanabara
Koogan, 1989. 142p.
LLERAS, E.; MEDRI, M. E. Comparação anatômica entre folhas diplóides e
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Manaus, v. 8, n. 4, p. 565-575, dez. 1978.
MAGALLANES, M. G. R.; PINTO, C. A. B. P.; DAVIDE, L. C. Determinação
cito-morfológica do nível de ploidia de clones de batata (Solanum tuberosum L.)
72
obtidos por cruzamentos interespecíficos. Ciência e Agrotecnologia, Lavras, v.
20, n. 4, p. 480-484, out./dez. 1996.
PAGLIARINI, S. M. Citogenética Aplicada ao Melhoramento. In: NASS, L.
L.; VALOIS, A. C. C.; MELO, I. S.; INGLIS, M. C. V. (Eds.) Recursos
Genéticos e Melhoramento de plantas. [S.l.:s.n.], 2001. p. 971-910.
ROWLEY, C. R.; MORAN, D. T. A simple procedure for mounting wring
wrinkle – free sections on formvar – coated slot grids. Ultramicrotomy,
Amsssterdam, v. 1, n. 1, p. 151-155, 1975.
SARI, N.; ABAK, K,; PITRAT, M. Comparison of ploidy level screening
methods in watermelon: Citrullus lanatus (Thunb.). Scientia Horticulturae,
Amsterdam, v. 82, n. 3-4, p. 265-277, Dec. 1999.
SOUZA, F. F.; QUEIRÓZ, M. A. Avaliação de caracteres morfológicos úteis na
identificação de plantas poliplóides de melancia. Horticultura Brasileira,
Brasília, v. 22, n. 3, p. 516-520, 2004.
VILLA, V. B. Análise citomorfoanatômica e eletroférica de híbridos de
Solanum tuberosum L. X. (Solanum Tuberosum L. X Solanum chacoense
Bitt). 1995. 76 p. Dissertação (Mestrado em Genética e Melhoramento de
Plantas) – Universidade Federal de Lavras, Lavras.
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