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C
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C
ENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E DA SAÚDE
P
ROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ECOLOGIA E RECURSOS NATURAIS
DEPARTAMENTO DE BOTÂNICA
LABORATÓRIO DE FICOLOGIA
Associação de Bactérias à Cápsula de Anabaena spiroides
(Cyanobacteria) em cultura
INESSA LACATIVA BAGATINI
Dissertação de Mestrado apresentada ao
Programa de Pós Graduação em Ecologia e
Recursos Naturais da Universidade Federal de
São Carlos, como parte dos requisitos para
obtenção do título de Mestre em Ecologia e
Recursos Naturais, área de concentração em
Ecologia e Recursos Naturais.
S
ÃO CARLOS
2008
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Ficha catalográfica elaborada pelo DePT da
Biblioteca Comunitária da UFSCar
B144ab
Bagatini, Inessa Lacativa.
Associação de bactérias à cápsula de Anabaena
spiroides (Cyanobacteria) em cultura / Inessa Lacativa
Bagatini. -- São Carlos : UFSCar, 2008.
70 f.
Dissertação (Mestrado) -- Universidade Federal de São
Carlos, 2008.
1. Ecologia microbiana. 2. Bactérias. 3. Cianobactérias.
4. DNAr 16S. 5. Eletroforese em gel com gradiente
desnaturante. 6. Anabaena spiroides. I. Título.
CDD: 576.15 (20
a
)
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ORIENTADOR
___________________________________
ARMANDO AUGUSTO HENRIQUES VIEIRA
CO-ORIENTADORA
____________________________________
MIRNA HELENA REGALI SELEGHIM
“A espantosa realidade das cousas
É a minha descoberta de todos os dias
E é difícil explicar a alguém quanto isso me alegra”.
(Alberto Caeiro)
AGRADECIMENTOS
Amigo é quem, conhecido ou não, vivo ou morto, nos faz pensar, agir ou se comportar no melhor de
nós mesmos... E sempre que agimos no melhor de nós mesmos, melhoramos... E certas pessoas conseguem
o milagre de potencializar esse melhor. Sentimo-nos, então, fundamente gratos... Este melhor de nós
contém sentimentos, palavras, talentos guardados, bondades exercidas ou não.
... assim é a amizade, forma especial de amor, capaz de ampliar a lucidez e os modos generosos e
compreensivos de ver, sentir, perceber o outro e sobretudo - se possível- potencializar os seus melhores
ângulos e sentimentos. (Arthur da Távola)
À UFSCar e ao PPG-ERN pela infra-estrutura fornecida e pela formação acadêmica.
À FAPESP pelo financiamento do projeto temático e à Capes pela bolsa concedida.
Ao professor Dr. Armando Augusto Henriques Vieira pelos ensinamentos, pela
oportunidade, pela confiança e estímulo (mesmo nos períodos em que a frase que eu
mais dizia era “não deu certo!”), pela paciência e amizade.
À professora Dra. Mirna Helena Regali Seleghim por ter me ensinado a dar os
primeiros passos e ter continuado ao meu lado, mostrando caminhos, me apoiando...
e pela enorme paciência que isso exige! Pelo estímulo e, especialmente, pela
amizade!
À professora Dra. Odete Rocha pelas importantes sugestões para este trabalho, pela
disponibilidade de sempre em ajudar e esclarecer as mais diversas dúvidas e por
aceitar compor esta banca de mestrado.
À professora Dra. Ana Teresa Lombardi pelas valiosas contribuições para este
trabalho, pela ajuda com metodologias, com os resumos e traduções.
À professora Dra. Cristina de Souza Freire Nordi por aceitar compor a banca do
mestrado, pelas conversas enriquecedoras sobre temas diversos e por me ensinar a
usar a centrífuga!
À professora Dra. Keico O. Nonaka (Departamento de Fisiologia) pela leitura das
amostras no cintilador.
Ao professor Dr. Flávio Henrique da Silva (Departamento de Genética e Evolução)
por disponibilizar equipamentos fundamentais para a execução do trabalho e pelo
esclarecimento de dúvidas. A todos os alunos do Laboratório de Biologia Molecular,
pela ajuda com os equipamentos e pelas dicas para aperfeiçoar alguns passos do
trabalho, em especial: Raquel e Rosseli (também pela amizade!), Fernando, Kesser,
Márcia, Simone, Andréa, Andréia, César. Ainda à Raquel e ao Fernando pela ajuda
essencial com a PCR e com o seqüenciamento, respectivamente.
À professora Dra. Maria Bernadete A. Varesche (Departamento de Hidráulica e
Saneamento – USP/São Carlos) por ter aberto as portas do seu laboratório para que
eu pudesse aprender a fazer DGGE. Às suas alunas Nora Kátia e Iolanda pelas dicas
imprescindíveis para que eu conseguisse desenvolver a técnica aqui no laboratório de
ficologia, por terem me recebido tão bem e por me fazerem acreditar que o DGGE
daria certo!
Ao professor Dr. Pedro Manuel Galleti Jr. por disponibilizar o sistema de
documentação fotográfica para os géis de DGGE e aos seus alunos pela ajuda com o
equipamento.
À professora Dra. Maria Inês Salgueiro Lima por me deixar usar o forno de
microondas do seu laboratório!
À Dra. Heliana de Azevedo Gomes (CNEN) pelo fornecimento da timidina tritiada.
Ao professor Dr. Reinaldo Brito e ao Dr. Fábio Chinalia pelas explicações
fundamentais para que eu conseguisse construir as árvores filogenéticas.
Aos professores e funcionários (João, Renata, Graça e Roseli) do PPG-ERN e aos
funcionários Marco (Botânica) e Edna (DEBE).
Ao Otávio Lino e Silva por me ensinar a usar os programas empregados na
construção das árvores filogenéticas.
Ao Iderval da Silva Junior Sobrinho pelo fornecimento da metodologia de
purificação do DNA e dicas para as análises filogenéticas.
Ao Luis e ao Airton pelas coletas, que sem eles não seriam realizadas!
Ao Djalma e ao Ademir por me socorrerem quando algo quebrava e por darem forma
a algumas idéias minhas.
Aos colegas e amigos do Laboratório de Ecologia de Microrganismos Aquáticos:
Carol, Raquel, Marília, Eli e principalmente à Darci, por ter fornecido algumas
bactérias usadas neste trabalho e por esclarecer dúvidas em vários momentos, e ao
Fernando, pelas dicas sobre contagem bacteriana, por emprestar os filtros para
contagem de flagelados, artigos e discussões. Ainda à Darci e ao Fernando pelo
carinho, preocupação, palavras de estímulo e amizade!
A todos os amigos e colegas do laboratório de Ficologia: Alessandra, Aline, Ana
Teresa, Cristina, Danilo Bertoletti, Danilo Giroldo, Fabrício, Helena, Ingritt, Letícia,
Luiz, Sandra, Patrícia, Thais, Vanessa e Zezé. A alguns um agradecimento especial,
pois foram essenciais durante o mestrado, contribuindo diretamente para o trabalho,
ou indiretamente, por deixarem meus dias mais divertidos, pela troca de experiências
e pelas palavras de consolo e estímulo quando as coisas não iam bem (rs): Ale, Ana,
Cris, Danilo B., Fá, Lê, Luiz, Sandra, Patrícia, Thais, Vanessa e Zezé.
Ainda à Ale pelas análises de nitrato, ao Fá e à Lê pelas análises de clorofila e à Lê
pela tradução do artigo, ao Luiz pela ajuda em inúmeros momentos no laboratório, à
Patrícia pelas dicas com contagem de bactérias e PCR, à Vanessa pela ajuda
fundamental com a PCR, à Zezé por me ensinar a fazer clorofila e pela oportunidade
de aprender com outro projeto.
À Thais! Não sei o que eu teria feito sem a sua ajuda... desde me apresentar quase
tudo no laboratório, até a ajuda com várias análises, ajustes de metodologias e em
momentos de extremo desespero meu, como a impressão da qualificação!rs.
Ao Danilo Giroldo pela ajuda com o DGGE e importantes sugestões para alguns
experimentos.
Ao José Valdecir de Lucca (Zezinho) pelo empréstimo da tela de nylon, que foi
importantíssima para a execução do trabalho. A ele e à Néia pela ajuda com assuntos
extra-acadêmicos.
Ao Pedro Ivo pelos artigos.
À Cris Alves pelas conversas, cafezinhos e bolos!
À Ná Allenspach, Ingrid, Julia, Manu, Katiuscia, Rose, Du, Roberta, Carol Mizuno,
Fer Fernandes e Mari Gonzaga pela troca de experiências, pelo apoio, conversas e
amizade.
Às minhas queridas amigas: Li, Má e Nath por estarem sempre presentes, pelo apoio,
pelas conversas e risadas (mesmo que por e-mail!).
À Alê Arce e à Virginia, pela amizade e pelo exemplo!
À Aline e ao Murilo, à Gi Duarte, à Gi de Lucca, à Ju, à Naty e à Pri e ao Bruno
pelas conversas, pela amizade, pelo carinho, especialmente à Pri, à Naty e à Gi de
Lucca pela companhia e apoio essenciais (também) nesses últimos anos.
À Carol, Bárbara, Ritinha e Sol pelas risadas, conversas e convivência agradável
durante parte do mestrado.
Aos meus avós (especialmente ao vovô Vicente, pelo exemplo), tios, tias, primos e
primas, pela presença constante, apoio, carinho, preocupação e estímulo. Também ao
Sam, pelas caronas e amizade, e ao Lincoln.
A quem nenhuma palavra de agradecimento será suficiente: minha mãe (Izildinha),
meu pai (Wilson) e minha irmã (Inara). Mesmo que vocês não entendam nada sobre
o que faço (rs), sem o amor, apoio, confiança e estímulo incondicionais de vocês,
certamente eu não teria chegado até aqui!
A todos os meus familiares e amigos que contribuíram direta ou indiretamente para a
conclusão de mais essa etapa!
I
L
ISTA DE ABREVIATURAS
3
H-Tim Timidina tritiada (radioativa)
BA Bactérias aderidas
BL Bactérias livres
BLAST Basic Local Alignment and Search Tool
COAs Carbono orgânico das células de A. spiroides (com a cápsula e as
bactérias aderidas)
COB Carbono orgânico da fração menor do que 12-20µm (que contém as
células de bactérias livres, partículas da cápsula e carbono dissolvido)
COT Carbono orgânico total
CPS Polissacarídeo capsular
DAPI 4’-6-diamidino-2-fenilindol
DGGE Denaturing gradient gel electrophoresis
dNTPs Desoxinucleotídeos trifosfatados, onde N = adenosina, citidina,
guanosina ou timidina
DP Desvio padrão
EDTA Ácido etilenodiamino tetra-acético
EPS Exopolissacarídeo ou polissacarídeo extracelular
MOD Matéria orgânica dissolvida
NFHs Nanoflagelados heterotróficos
PB Produção bacteriana
PCR Polymerase chain reaction
PEG Polietilenoglicol
R1 Réplica 1
R2 Réplica 2
rDNA Ácido desoxirribonucleico ribossomal
RDP II Ribosomal Database Project II
TCA Ácido tricloroacético
UTOs Unidades taxonômicas operacionais
II
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Reservatório de Barra Bonita com a localização da estação onde foram
coletados os inóculos bacterianos e a espécie fitoplanctônica (coordenadas do ponto de
coleta 22°32'50,98"S e 48°29'28,23"W). (modificado de Giroldo 2003) 6
Figura 2. Filamentos de Anabaena spiroides (BB007). (A) Microscopia óptica de
campo claro utilizando nanquim (coloração negativa) para melhor observação da
cápsula de A. spiroides e do exopolissacarídeo desprendendo-se para o meio. (B)
Filamento de cultura com 49 dias sem a adição de inóculo bacteriano de Barra Bonita,
mas com bactérias contaminantes aderidas à cápsula (microscopia de contraste de fase).
(C) Filamento de cultura com 18 dias, adicionada do inóculo bacteriano de Barra
Bonita, com bactérias aderidas à cápsula (microscopia de contraste de fase). 7
Figura 3. Esquema do sistema de amostragem utilizado para a coleta da água do
reservatório de Barra Bonita para compor o inóculo bacteriano. A entrada de água
permanece tampada e é aberta apenas dentro da água; o algodão, autoclavado com o
sistema, é colocado na mangueira ligada à bomba para evitar contaminação por
bactérias aéreas. 8
Figura 4. Diagrama do Experimento 1. As amostragens para as análises foram feitas em
duas culturas (réplicas) durante o crescimento de A. spiroides. BA: bactérias aderidas a
A. spiroides. BL: bactérias livres na cultura. NFHs: nanoflagelados heterotróficos. O
inóculo de A. spiroides foi fracionado (entre bactérias livres e aderidas) e submetido à
análise de diversidade bacteriana para monitoramento das bactérias contaminantes. 10
Figura 5. Imagem obtida por microscopia de epifluorescência de amostra de uma
cultura, no início da fase estacionária, de A. spiroides inoculada com bactérias do
reservatório de Barra Bonita, após filtração em tela de nylon (12-20µm) e lavagem com
água ultrapura. 11
Figura 6. Concentração de clorofila a (µg.L
-1
) em função do tempo (em dias), para as
duas culturas. R1, réplica 1; R2, réplica 2. A barra de erros corresponde ao desvio
padrão, que foi calculado com n=2 (réplicas de amostragem). 21
III
Figura 7. Concentrações (mg.L
-1
) de carbono orgânico total (COT) e carbono orgânico
das células de A. spiroides (COAs) em função do tempo (em dias) para as duas réplicas
(R1 e R2). As linhas representam os valores médios entre as réplicas. 22
Figura 8. Concentração (mg.L
-1
) de carbono orgânico da fração menor do que 20µm
(COB) em função do tempo (em dias), para as duas réplicas. Réplica 1 (▲); Réplica 2
(■). A linha representa os valores médios entre as réplicas. 23
Figura 9. Densidade (células.mL
-1
x 10
6
) das bactérias aderidas a Anabaena spiroides
(BA) e das bactérias livres na cultura (BL) em função do tempo (em dias), para as duas
réplicas. R1, réplica 1; R2, réplica 2. As linhas representam os valores médios entre as
réplicas. 24
Figura 10. Produção (ngC. L
-1
.h
-1
) e biomassa (ngC. L
-1
)
das bactérias aderidas a
Anabaena spiroides em função do tempo (em dias), para as duas réplicas. R1, réplica 1;
R2, réplica 2. As linhas representam os valores médios entre as réplicas. 26
Figura 11. Produção (ngC. L
-1
.h
-1
) e biomassa (ngC. L
-1
)
das bactérias livres na cultura
em função do tempo (em dias), para as duas réplicas. R1, réplica 1; R2, réplica 2. As
linhas representam os valores médios entre as réplicas. 27
Figura 12. Proporção de morfotipos das bactérias livres na cultura 1 em diferentes dias
de cultivo. 28
Figura 13. Proporção de morfotipos das bactérias livres na cultura 2 em diferentes dias
de cultivo. 28
Figura 14. Fotomicrografia de células bacterianas coradas com DAPI. (A) bactérias
livres na cultura 1 no 29º dia de cultivo. (B) bactérias livres na cultura 2 no 29º dia de
cultivo. (C) bactérias aderidas a Anabaena spiroides na cultura 1 no 35º dia de cultivo.
(D) bactérias aderidas a Anabaena spiroides na cultura 2 no 35º dia de cultivo. 30
Figura 15. Proporção de morfotipos das bactérias aderidas a A. spiroides na cultura 1
em diferentes dias de cultivo. 31
Figura 16. Proporção de morfotipos das bactérias aderidas a A. spiroides na cultura 2
em diferentes dias de cultivo. 31
IV
Figura 17. Freqüência relativa (%) das bactérias livres na cultura 1, separadas por
classes de comprimento celular, em 4 dias de amostragem: 0, 20, 29 e 35. 32
Figura 18. Freqüência relativa (%) das bactérias livres na cultura 2, separadas por
classes de comprimento celular, em 4 dias de amostragem: 0, 20, 29 e 35. 32
Figura 19. Freqüência relativa (%) das bactérias aderidas a Anabaena spiroides na
cultura 1, separadas por classes de comprimento celular, em 3 dias de amostragem: 0,
20 e 35. 33
Figura 20. Freqüência relativa (%) das bactérias aderidas a Anabaena spiroides na
cultura 2, separadas por classes de comprimento celular, em 3 dias de amostragem: 0,
20 e 35. 33
Figura 21. Densidade (células.mL
-1
x 10
3
) de nanoflagelados heterotróficos em função
do tempo (em dias), para as duas réplicas. Réplica 1 (▲); Réplica 2 (■). 34
Figura 22. Fotomicrografia de células bacterianas e de nanoflagelados heterotróficos
(setas vermelhas) coradas com DAPI no 29° dia de cultivo. (A) células livres na Réplica
1. (B) células livres na Réplica 2. As amostras foram filtradas em membrana de
policarbonato de 0,8 µm de poro. 35
Figura 23. Gel de DGGE das bactérias livres. IA, representa o inóculo da cultura de A.
spiroides; P, padrão. Os números acima das faixas em cada gel representam as réplicas,
1 ou 2, agrupadas por dia de amostragem (0, 2, 7, 13, 20, 26, 29, 31, e 35). A: banda
referente a A. spiroides; R: banda referente a Rhodobacter sp.; J: Banda referente à
Alphaproteobacteria clone Jul-eub3. 37
Figura 24. Géis de DGGE e desenho do padrão de bandas das bactérias aderidas. A1,
extração 1; A2, extração 2; Ac, inóculo de A. spiroides; P, padrão. Os números acima
das faixas em cada gel representam as réplicas, 1 ou 2, agrupadas por dia de
amostragem. No desenho das bandas os números representam as bandas recortadas e
seqüenciadas. L(x) são as linhas que agrupam as bandas consideradas como sendo
representativas da mesma espécie. 38
Figura 25. Árvore filogenética utilizando o modelo de máxima parcimônia, com as
bactérias associadas a A. spiroides (em negrito) e bactérias cuja filogenia foi
V
comprovada (exceto Korarchaeota e a Acidobacteria 100 M1_C7), obtidas no RDPII
(Ribossomal Database Project II) e usadas para sugerir o grupo das bactérias não
identificadas. Uma Korarchaeota foi usada como raiz. Os números nos nós representam
a porcentagem do teste de bootstrap de 1000 réplicas. 42
Figura 26. Concentrações de clorofila a (µg.L
-1
) nas culturas C2 controle (sem adição
do inóculo de Barra Bonita) e C2 inoculadas (adicionadas do inóculo de Barra Bonita)
em função do tempo de cultivo. As barras representam o desvio padrão: n=2 nas
culturas C2 controle (réplicas de amostragem) e n=4 nas culturas C2 contaminadas (2
amostragens em cada réplica de cultura). 43
Figura 27. Concentrações carbono total (mg.L
-1
) nas culturas C2 controle (sem adição
do inóculo de Barra Bonita) e C2 inoculadas (adicionadas do inóculo de Barra Bonita)
em função do tempo de cultivo. As barras representam o desvio padrão: n=2 nas
culturas C2 inoculadas (réplicas de cultura). 44
Figura 28. Concentrações de clorofila a (µg.L
-1
) nas culturas C1 controle (sem adição
do inóculo de Barra Bonita) e C1 inoculadas (adicionadas do inóculo de Barra Bonita)
em função do tempo de cultivo. As barras representam o desvio padrão n=2 nas culturas
C1 controle (réplicas de amostragem) e n=4 nas culturas C1 inoculadas (2 amostragens
em cada réplica de cultura). 45
Figura 29. Concentrações carbono total (mg.L
-1
) nas culturas C1 controle (sem adição
do inóculo de Barra Bonita) e C1 inoculadas (adicionadas do inóculo de Barra Bonita)
em função do tempo de cultivo. As barras representam o desvio padrão: n=2 nas
culturas C1 inoculadas (réplicas de cultura). 46
VI
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Concentração final dos reagentes na mistura de reação para amplificação do
16S rDNA do Domínio Bacteria. 17
Tabela 2. Concentrações de clorofila a (µg.L
-1
), desvios-padrão (DP) e os valores de
“p” (teste t de Student) nas réplicas 1 e 2. O desvio padrão foi calculado com n=2
(réplicas de amostragem). 22
Tabela 3. Média dos biovolumes celulares bacterianos (BVm em µm
3
) entre os dias de
amostragem para as bactérias livres (BL) e bactérias aderidas (BA) a células de A.
spiroides nas duas culturas (réplica 1 e réplica 2). DP é o desvio padrão, n=7. 25
Tabela 4. Média da produção bacteriana (PB) por célula (em ngC.h
-1
x 10
-6
) entre os
dias de amostragem para as bactérias livres (BL) e bactérias aderidas (BA) a células de
A. spiroides nas duas culturas (réplica 1 e réplica 2). DP é o desvio padrão, n=7. 26
Tabela 5. Bactérias aderidas à A. spiroides (incluindo a cianobactéria) identificadas
pelo seqüenciamento das bandas recortadas (Figura 24), grupo ao qual pertencem,
similaridade obtida no BLAST e fase em que foram detectadas na cultura. As
seqüências com menos de 96% não foram consideradas como espécies similares. xA
1
e
xA
2
, bandas obtidas na extração 1 e 2 respectivamente; xAc, bandas obtidas no inóculo
de A. spiroides; S, senescência; In, inóculo e início da cultura (até 13º dia). 39
Tabela 6. Concentrações de clorofila a (µg.L
-1
), desvio padrão (DP) e os valores de “p”
(teste t de Student) nas culturas C2 controle (sem adição do inóculo de Barra Bonita) e
C2 inoculadas (adicionadas do inóculo de Barra Bonita) em função do tempo de cultivo.
O desvio padrão foi calculado com n = 2 na cultura C2 controle (réplicas de
amostragem) e n=4 nas culturas C2 inoculadas (2 amostragens em cada réplica de
cultura). 44
Tabela 7. Concentrações de clorofila a (µg.L
-1
), desvio padrão (DP) e os valores de “p”
(teste t de Student) nas culturas C1 controle (sem adição do inóculo de Barra Bonita) e
C1 inoculadas (adicionadas do inóculo de Barra Bonita) em função do tempo de cultivo.
O desvio padrão foi calculado com n=2 nas culturas C1 controle (réplicas de
amostragem) e n=4 nas culturas C1 contaminadas (2 amostragens em cada réplica de
cultura). 46
VII
RESUMO
A cianobactéria Anabaena spiroides, cosmopolita em ambientes eutrofizados como o
reservatório de Barra Bonita, é recoberta por uma espessa cápsula de polissacarídeo que
fornece um microambiente para o crescimento de uma comunidade bacteriana
particular. Os objetivos deste trabalho foram: identificar as bactérias associadas à
cápsula de A. spiroides para detectar possíveis relações interespecíficas entre estas e a
cianobactéria, considerando a seletividade e a dinâmica de sucessão das bactérias
associadas; verificar o efeito da adição do inóculo bacteriano (água do reservatório de
Barra Bonita filtrada em 1,2 µm) no crescimento da cianobactéria. Para tanto, a
densidade, produção, biomassa e a diversidade das bactérias livres e aderidas à
cianobactéria, assim como a identificação das bactérias aderidas foram determinadas em
duas culturas de A. spiroides inoculadas com bactérias do reservatório de Barra Bonita.
A diversidade foi verificada pelo número de bandas obtidas em Denaturing Gradient
Gel Electrophoresis (DGGE) após a amplificação do 16S rDNA das comunidades
bacterianas das frações livre e aderida e as bactérias aderidas à cápsula foram
identificadas pelo seqüenciamento do fragmento do 16S rDNA. Em outro experimento,
o crescimento da cianobactéria foi verificado pela concentração de clorofila a e carbono
orgânico total após a adição da água de Barra Bonita (filtrada em 1,2µm) em quatro
culturas experimentais de A. spiroides. Os controles consistiram em culturas de A.
spiroides sem o inóculo de Barra Bonita. Os resultados mostraram que a densidade,
biomassa e produção total das bactérias foram sempre maiores para as bactérias livres,
no entanto, com relação à produção por célula, não houve diferença significativa entre
aderidas e livres. Este estudo também mostrou que a diversidade das bactérias aderidas
foi menor do que das livres e que três linhagens de bactérias aderidas que estavam
presentes no inóculo de A. spiroides, permaneceram até o início da fase de crescimento
exponencial. Essas bactérias foram identificadas como uma Acidobacteria e duas
Alphaproteobacteria. Na fase de senescência essas bactérias foram substituídas por
outras quatro linhagens: uma Deltaproteobacteria, uma Betaproteobacteria e uma Bacilli
(Firmicutes) e uma linhagem não identificada. No segundo experimento as
concentrações de clorofila e carbono foram menores nas culturas adicionadas do inóculo
bacteriano do que nos controles. O presente estudo demonstrou que houve seleção e
sucessão das bactérias aderidas a A. spiroides e que a adição da água de Barra Bonita
acelera a morte das culturas da cianobactéria.
VIVIII
ABSTRACT
The cyanobacterium Anabaena spiroides, a cosmopolitan species occurring in eutrophic
environments as in Barra Bonita reservoir, is covered by a thick polysaccharide capsule
that provides a microenvironment for association of bacterial communities. The aims of
this study were: to identify bacteria attached to A. spiroides capsule to evaluate
interspecific relationships among bacteria communities and A. spiroides, considering
bacteria selectivity and succession dynamics of attached bacteria; as well as the effect of
bacterial inoculum (1.2 µm filtered water from Barra Bonita reservoir) on
cyanobacterial growth. For this purpose, density, production, biomass and diversity of
bacteria attached to cyanobacteria capsules and free-living bacteria were determined in
two replicate cultures of A. spiroides inoculated with bacteria from Barra Bonita
reservoir. The diversity was verified by the number of bands obtained through
separation of PCR amplification products of 16S rDNA from free-living and attached
bacterial communities using Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE).
Bacteria attached to the capsule were identified by sequencing the fragment of 16S
rDNA. A set of cultures were performed to evaluate cyanobacterial growth as affected
by Barra Bonita filtered water. A. spiroides cultures without Barra Bonita inoculum
were used as control. The results showed that bacterial density, biomass and total
production were higher for free-living bacteria, but no significant difference was
obtained between attached and free-living bacteria regarding production per cell. The
diversity was lower for the attached bacteria than free-living ones. Three strains of
attached bacteria present in A. spiroides inoculum, identified as one Acidobacteria and
two Alphaproteobacteria, remained up to the beginning of exponential growth phase. At
the senescence phase these bacteria were replaced by four strains identified as one
Deltaproteobacteria, one Betaproteobacteria, one Bacilli (Firmicutes) and one
unidentified strain. This research demonstrated that there were selectivity and
succession in the bacterial community attached to A. spiroides, and that the addition of
the filtered water from Barra Bonita inoculum accelerates the death of cyanobacterium
cultures.
SUMÁRIO
Abreviaturas .................................................................................................................. I
Lista de Figuras ............................................................................................................. II
Lista de Tabelas ........................................................................................................... VI
Resumo ....................................................................................................................... VII
Abstract ....................................................................................................................... VIII
1. Introdução .................................................................................................................... 1
2. Objetivos ...................................................................................................................... 5
2.1. Objetivo geral ....................................................................................................... 5
2.2. Objetivos específicos ............................................................................................ 5
Experimento I ........................................................................................... 5
Experimento II ......................................................................................... 5
3. Materiais e Métodos .................................................................................................... 6
3.1. Local de estudo..................................................................................................... 6
3.2. Inóculos ............................................................................................................... 7
3.3. Experimento I ...................................................................................................... 9
3.3.1. Condições de cultivo .................................................................................. 9
3.3.2. Monitoramento das culturas ...................................................................... 9
3.3.3. Concentração de carbono orgânico .......................................................... 12
3.3.4. Clorofila a ................................................................................................ 12
3.3.5. Densidade, morfologia e biovolume bacterianos ..................................... 12
3.3.6. Densidade e biovolume de flagelados contaminantes ............................. 14
3.3.7. Produção bacteriana ................................................................................. 14
3.3.8. Diversidade bacteriana ............................................................................. 15
3.3.8.1. Extração do DNA ...................................................................... 16
3.3.8.2. Amplificação do DNA .............................................................. 16
3.3.8.3. DGGE (eletroforese em gel com gradiente desnaturante) ........ 17
3.3.8.4. Seqüenciamento e análise dos dados ........................................ 18
3.4. Experimento II .................................................................................................... 19
Condições de cultivo e monitoramento das culturas ............................. 19
4. Resultados .................................................................................................................. 21
4.1. Experimento I .................................................................................................... 21
4.1.1. Crescimento da cianobactéria .................................................................. 21
4.1.2. Crescimento bacteriano ........................................................................... 23
4.1.3. Diversidade de morfotipos bacterianos ................................................... 27
4.1.4. Freqüências relativas das bactérias separadas por classes de tamanho
(comprimento) ................................................................................................... 32
4.1.5. Crescimento de nanoflagelados heterotróficos ........................................ 33
4.1.6. Diversidade bacteriana ............................................................................. 35
Bactérias presentes no inóculo de A. spiroides ..................................... 36
Bactérias provenientes do inóculo de Barra Bonita .............................. 40
4.2. Experimento II .................................................................................................... 43
4.2.1. Crescimento da cianobactéria .................................................................. 43
5. Discussão ................................................................................................................... 47
5.1. Problemas metodológicos: amplificação do DNA e DGGE .............................. 47
5.2. Diversidade, seletividade e interações bactérias associadas-A. spiroides .......... 48
5.2.1. Seletividade das bactérias que se aderem à cápsula ................................ 48
5.2.2. Bactérias identificadas e sucessão das bactérias aderidas ....................... 49
Bactérias presentes no inóculo de A. spiroides e no início das culturas
experimentais ......................................................................................... 50
Bactérias provenientes do inóculo de Barra Bonita que sucederam
aquelas presentes inicialmente .............................................................. 51
5.2.3. Interações bactérias-A. spiroides ............................................................. 54
5.3. Produção bacteriana e a influência dos NFHs na comunidade bacteriana
(Experimento I) ......................................................................................................... 57
6. Conclusões ................................................................................................................. 61
7. Referências bibliográficas ......................................................................................... 62
Anexo 1. Tentativas de axenização de A. spiroides ...................................................... 69
Anexo 2. Purificação do DNA com Polietilenoglicol 8000 para seqüenciamento......... 70
1
1. INTRODUÇÃO
A cianobactéria Anabaena spiroides é uma espécie cosmopolita em ambientes
eutrofizados, nos quais produz, freqüentemente, grandes biomassas flutuantes devido à
presença de aerótopos em suas células. No Brasil, tem ocorrência descrita nas regiões
tropicais e subtropicais (Werner 2002) sendo muito freqüente em reservatórios
construídos para gerar energia elétrica.
Essa cianobactéria filamentosa é recoberta por uma espessa cápsula de
polissacarídeo que libera continuamente material para o meio em forma de colóides ou
pequenos fragmentos (Bittar 2005). Os polissacarídeos extracelulares (EPSs)
representam a maior fração dos excretados algais (até 90% da MOD excretada)
(Myklestad 1995), possuindo importante papel na produção dos ecossistemas aquáticos.
Quando ainda compõem a cápsula, os EPSs são mais especificamente denominados
CPSs (Capsullar Polysaccharides). A produção desse material mucóide extracelular,
enquanto fornece proteção física e química, também constitui uma matriz que suporta
micro-habitats para a colonização por bactérias e protozoários (Paerl 1992).Em diversos
habitats aquáticos e terrestres, em uma ampla variação de condições ambientais e em
vários estágios de crescimento, as cianobactérias são sítios de intensa colonização
bacteriana (Paerl 1982, Paerl 1996).
Vários trabalhos mostram que associações entre bactérias e cianobactérias são
benéficas para ambas (e.g. Paerl e Kellar 1978, Paerl e Gallucci 1985, Paerl 1992).
Essas associações podem estimular o crescimento da cianobactéria devido à
remineralização de nutrientes e liberação de gás carbônico por parte das bactérias,
aliados, no caso de algumas cianobactérias, ao aumento da capacidade de fixação de
nitrogênio, uma vez que as bactérias aderidas formam um microambiente com menor
concentração de oxigênio na ficosfera, próximo aos heterocitos, aumentando a atividade
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da nitrogenase (Gibson & Smith 1982, Paerl 1982, Paerl 1985). Desta forma, esses
consórcios e associações simbióticas facilitaram a superação de limitações
funcionais/estruturais nas cianobactérias (Margulis 1981 apud Paerl 1992),
principalmente após o surgimento da fotossíntese oxigênica, uma vez que o oxigênio é
tóxico para enzimas relacionadas à fotossíntese e à fixação de nitrogênio.
Por outro lado, relações antagônicas, em que diferentes linhagens de bactérias
apresentam efeitos cianobactericidas, também foram documentadas por vários autores
(Shilo 1970, Reim et al 1974, Manage et al 2000, Kim & Lee 2006). Isso por que, a
presença das bactérias associadas à ficosfera é um prelúdio para o ataque, lise ou
degradação da cianobactéria hospedeira (Paerl 1992). Esse tipo de interação tem sido
sugerida para a aplicação no controle de cianobactérias em lagos (Sigee et al 1999),
uma vez que os blooms formados pelas cianobactérias apresentam aspectos
problemáticos, como o acúmulo de biomassa flutuante, característicos dos gêneros
Anabaena, Aphanizomenon e Microcystis (Paerl 1996), e a produção de cianotoxinas
(Chorus e Bartram 1999).
Alguns gêneros de cianobactérias, como Anabaena, Aphanizomenon,
Microscystis e Nodularia, são encontrados com eubactérias associadas à camada de
polissacarídeos que recobre as células (Caldwell e Caldwell 1978, Worm e Søndergaard
1998, Kapustina 2006, Tuomainen et al 2006) ou associadas à matéria orgânica
dissolvida liberada pelas cianobactérias (Eiler e Bertilsson 2004, Kapustina 2006).
Vários autores detectaram relações interespecíficas de eubactérias com espécies do
gênero Anabaena, mas esses trabalhos se concentram nas associações de bactérias aos
heterocitos (Paerl 1977, Paerl e Kellar 1978, Lupton e Marshall 1981, Stevenson e
Waterbury 2006), e somente Caldwell e Caldwell (1978) identificaram uma espécie de
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eubactéria associada à cápsula de Anabaena flos-aquae. Entre os trabalhos com o
gênero Anabaena, apenas Stevenson e Waterbury (2006) utilizaram técnicas de genética
molecular para identificação de uma bactéria associada ao heterocito e não há trabalhos
que relatem a sucessão de espécies associadas às cianobactérias em diferentes fases de
desenvolvimento de uma cultura.
Entre as técnicas de genética molecular, uma das mais utilizadas atualmente em
ecologia microbiana para verificar a estrutura de comunidades é o DGGE (do inglês
Denaturing gradient gel electrophoresis), pois fornece um rápido padrão de bandas por
separar os produtos da reação em cadeia da polimerase (PCR) de acordo com o
comportamento de separação da dupla fita de DNA, que varia para diferentes espécies
(Muyzer & Smalla 1998). As variações na seqüência de nucleotídeos entre as linhagens
afetam a posição exata na qual os fragmentos de DNA amplificados desnaturam e
param de migrar no gel. O resultado é um padrão bem definido de bandas específicas
que fornece uma representação gráfica da composição da comunidade bacteriana. Desta
forma, esta técnica pode ser utilizada para determinar a diversidade genética de
populações microbianas complexas e permite identificar a presença e abundância
relativa de diferentes espécies (Muyzer et al 1993). Essa técnica permite ainda, posterior
seqüenciamento do fragmento de DNA de cada banda, possibilitando a identificação de
espécies.
No reservatório de Barra Bonita, onde a produção de biomassa de origem
fitoplanctônica é dominada por A. spiroides e Microcystis aeruginosa (Matsumura-
Tundisi & Tundisi 2005, Dellamano-Oliveira et al. 2007), a produção de carboidratos
na forma de EPS liberado pelo fitoplâncton foi estimada em 11.700 ton.ano
-1
(Antônio
2006). Devido às suas espessas cápsulas estima-se que A. spiroides tenha uma
contribuição importante nessa quantidade de carboidratos liberados e, uma vez que o
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polissacarídeo extracelular dessa espécie é facilmente degradado pela comunidade
bacteriana do reservatório (Colombo et al. 2004), estima-se que tenha também
importante papel no fluxo de energia pela rede trófica microbiana desse sistema. No
entanto, pouco se sabe sobre a comunidade bacteriana que vive associada ao
polissacarídeo capsular dessa cianobactéria.
Apesar da distribuição cosmopolita e da enorme quantidade de biomassa e
polissacarídeos extracelulares produzidos por Anabaena spiroides, informações sobre
associações entre eubactérias e essa cianobactéria são raros na literatura. Desta forma a
quantificação e a identificação das bactérias que vivem associadas à cápsula de A.
spiroides são importantes para o melhor entendimento da ecologia e para o
conhecimento mais profundo do ciclo biológico cianobactéria, assim como para melhor
compreensão da dinâmica dos ecossistemas aquáticos, especialmente os eutrofizados,
onde florações desta alga são comuns, como por exemplo, Barra Bonita.
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2. OBJETIVOS
2.1. Objetivo geral
Este trabalho teve o objetivo de identificar e quantificar os organismos da
comunidade bacteriana associados à cápsula polissacarídica de A. spiroides em
diferentes fases de crescimento da cultura no intuito de se detectar possíveis relações
interespecíficas e conhecer a dinâmica de sucessão das bactérias associadas, além de
verificar o efeito dessas bactérias no crescimento da cianobactéria.
2.2. Objetivos específicos
Experimento I
O experimento I teve como objetivos verificar possíveis diferenças na
diversidade, densidade e produção entre a comunidade bacteriana aderida a A. spiroides
e a livre nas culturas em diferentes fases da curva de crescimento da cianobactéria, e
identificar as bactérias aderidas.
Experimento II
O experimento II foi realizado a fim de se detectar possíveis efeitos do inóculo
bacteriano (água de Barra Bonita filtrada em 1,2 µm) sobre o crescimento da
cianobactéria quando adicionado em diferentes fases de desenvolvimento das culturas
de A. spiroides.
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3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1. Local de Estudo
O reservatório de Barra Bonita (Figura 1), originado do represamento dos rios
Tietê e Piracicaba, está localizado entre os municípios de Barra Bonita e Igaraçu do
Tietê, no Estado de São Paulo. O clima é de região subtropical, com um período seco de
maio a outubro e um período úmido de novembro a abril. Possui uma área de 310 km
2
,
um volume total de 3.2 km
3
e situa-se a uma altura de 480m acima do nível do mar. As
profundidades média e máxima são, respectivamente, 10 e 30m. No verão (estação
chuvosa) a vazão é de 1500m
3
/s e o tempo de retenção de 37 dias, e no inverno (estação
seca) esses valores são de 200 m
3
/s e 137 dias (Matsumura-Tundisi & Tundisi 2005),
mas esses valores podem variar de ano para ano, dependendo da operacionalidade da
usina.
Figura 1. Reservatório de Barra Bonita com a localização da estação onde foram
coletados os inóculos bacterianos e a espécie fitoplanctônica (coordenadas do ponto de
coleta 22°32'50,98"S e 48°29'28,23"W). (modificado de Giroldo 2003).
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3.2. Inóculos
A cianobactéria Anabaena spiroides Klebahn, mantida como linhagem BB007
(Figura 2) na coleção de culturas do Departamento de Botânica da Universidade Federal
de São Carlos, SP, Brasil, foi isolada do reservatório de Barra Bonita, Rio Tietê, SP,
Brasil. A cianobactéria não estava axênica, apesar dos esforços efetuados nesse sentido
(Anexo 1). No entanto, as células foram extensivamente lavadas com meio de cultura
estéril antes de serem utilizadas na preparação dos inóculos, para diminuir o número de
bactérias iniciais. As bactérias contaminantes foram identificadas para monitorar sua
interferência na sucessão bacteriana.
Figura 2. Filamentos de Anabaena spiroides (BB007). (A) Microscopia óptica de
campo claro utilizando nanquim (coloração negativa) para melhor observação da
cápsula de A. spiroides e do exopolissacarídeo desprendendo-se para o meio. (B)
Filamento de cultura com 49 dias sem a adição de inóculo bacteriano de Barra Bonita,
mas com bactérias contaminantes aderidas à cápsula (microscopia de contraste de fase).
(C) Filamento de cultura com 18 dias, adicionada do inóculo bacteriano de Barra
Bonita, com bactérias aderidas à cápsula (microscopia de contraste de fase).
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O inóculo bacteriano foi coletado no mesmo reservatório, no ponto de coleta
indicado na Figura 1, com um amostrador que não permite a contaminação com
organismos aéreos, previamente autoclavado (Figura 3), e de modo a obter-se uma
amostra integrada da coluna d’água (1, 5, 10 e 18 metros). A amostra foi filtrada em
condições estéreis, em filtro de fibra de vidro de 1,2µm de poro, calcinado, para a
remoção de algas, protozoários e detritos. Essa filtração mostrou-se eficiente para
remoção de algas e detritos, no entanto, apesar de não terem sido observados logo após
a filtração do inóculo, houve crescimento de nanoflagelados heterotróficos (NFHs) nas
culturas. Eles foram quantificados apenas do experimento I.
Bomba de
vácuo
água
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água
peso
Mangueira
(20m)
Corda graduada
(
20m
)
algodão
Sistema
autoclavado
Figura 3. Esquema do sistema de amostragem utilizado para a coleta da água do
reservatório de Barra Bonita para compor o inóculo bacteriano. A entrada de água
permanece tampada e é aberta apenas dentro da água; o algodão, autoclavado com o
sistema, é colocado na mangueira ligada à bomba para evitar contaminação por
bactérias aéreas.
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3.3. Experimento I
3.3.1. Condições de cultivo
Foram feitas duas culturas de A. spiroides (chamadas de réplica 1 e réplica 2),
com volume final de 8 litros, em frascos de 9 litros de capacidade, em meio ASM-1, pH
7,0 (Gorham 1964). Para iniciar o cultivo em cada frasco de cultura adicionou-se 125
mL de um inóculo de A. spiroides, que se encontrava no início da fase exponencial de
crescimento, e 375 mL de inóculo bacteriano proveniente do reservatório de Barra
Bonita. As culturas foram incubadas sob condições controladas de iluminação (80±20
μmol fótons m
-2
s
-1
), fotoperíodo (12:12 h) e temperatura (23 ± 1 ºC).
3.3.2. Monitoramento das culturas
Foram monitorados o crescimento de A. spiroides, assim como o crescimento e
mudança da composição na comunidade de bactérias heterotróficas aderidas à
cianobactéria (BA) e das bactérias livres na cultura (BL) (Figura 4). Para tanto, as
bactérias aderidas à mucilagem das células foram operacionalmente definidas como
aquelas que permaneceram com a cianobactéria depois que esta foi filtrada em tela de
nylon com poros de 12-20 µm, segundo o proposto por Worm e Søndergaard (1998) e
lavadas com água ultrapura autoclavada para melhor remoção das células livres. A
eficiência da separação das células livres foi conferida em uma amostra de uma cultura
de A. spiroides inoculada com bactérias do reservatório de Barra Bonita, no início da
fase estacionária, após filtração em tela de nylon (12-20µm) e lavagem com água
ultrapura, utilizando-se de contagem direta em microscopia de epifluorescência segundo
Porter & Feig (1980). Com este teste, concluiu-se que o método empregado foi
eficiente, pois foram observadas poucas células livres após a filtração (Figura 5).
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Figura 4. Diagrama do Experimento 1. As amostragens para as análises foram feitas em
duas culturas (réplicas) durante o crescimento de A. spiroides. BA: bactérias aderidas a
A. spiroides. BL: bactérias livres na cultura. NFHs: nanoflagelados heterotróficos. O
inóculo de A. spiroides foi fracionado (entre bactérias livres e aderidas) e submetido à
análise de diversidade bacteriana para monitoramento das bactérias contaminantes.
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O crescimento de A. spiroides nas culturas foi acompanhado pela concentração
de clorofila a e do carbono orgânico total (COT) e carbono das células (COAs), por 12
amostragens durante 35 dias de experimento.
A mudança da composição na comunidade de bactérias heterotróficas aderidas à
cianobactéria (BA) e das bactérias livres na cultura (BL) foi averiguada por meio da
técnica de DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis) durante 37 dias de cultivo
e seqüenciamento do 16S rDNA das BAs. O crescimento das bactérias nas duas frações
(aderidas e livres) foi monitorado por contagem direta em microscopia de
epifluorescência e pela produção bacteriana quantificada pela incorporação de [H
3
]-
Timidina.
Figura 5. Imagem obtida por microscopia de epifluorescência de amostra de uma
cultura, no início da fase estacionária, de A. spiroides inoculada com bactérias do
reservatório de Barra Bonita, após filtração em tela de nylon (12-20µm) e lavagem com
água ultrapura.
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3.3.3. Concentração de carbono orgânico
O carbono foi quantificado em um analisador de carbono TOC-Vcph Shimadzu.
O carbono orgânico total (COT) foi medido a partir de uma alíquota integral das
culturas. O carbono orgânico das células de A. spiroides com a cápsula e as bactérias
aderidas (COAs) foi obtido pela diferença entre o COT e o carbono orgânico da fração
menor do que 12-20µm (COB), que compreende o carbono orgânico das bactérias
livres, partículas de exopolissacarídeos e carbono orgânico dissolvido.
3.3.4. Clorofila a
A clorofila a foi extraída com etanol 90% a quente (Nusch 1980), seguindo as
recomendações de Marker et al (1980) e quantificada segundo Lorenzen (1967).
Um volume variável de acordo com o dia de amostragem (entre 25 e 70 mL) foi
filtrado em filtros de fibra de vidro de 1,2 µm de poro, em réplica. Os filtros foram
armazenados a -5ºC no escuro por no máximo 30 dias. No momento da extração, os
filtros foram acondicionados em tubos de plástico, adicionados de aproximadamente 4
mL de etanol 90% a 80ºC e macerados com um bastão de vidro. O macerado foi
deixado a 4ºC por 24 horas. Posteriormente, as amostras foram centrifugadas para a
separação da fibra de vidro e o volume de sobrenadante foi medido e armazenado em
tubos limpos para a leitura em espectrofotômetro (Hewlett Packard, Diode Array
Spectrophotometer 8452A) a 665 e 750 nm. Depois da primeira leitura as amostras
foram acidificadas com HCl 1 M (100 µL para cada 5 mL de amostra) e lidas
novamente, após 15 minutos, nos mesmos comprimentos de onda.
3.3.5. Densidade, morfologia e biovolume bacterianos
A densidade, morfologia e biovolume bacterianos do experimento foram obtidos
por microscopia de epifluorescência (microscópio Zeiss Axioplan 2, Jena, Germany)
utilizando-se imagens capturadas com uma câmera Zeiss AxioCam HRc e tratadas com
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o auxílio do software de análise de imagens Axiovision release 4.5 (Zeiss) após as
amostras serem coradas com o fluorocromo DAPI (0,5 a 1µg mL
-1
) segundo Porter &
Feig (1980) e filtradas em membranas de policarbonato de poro de 0,22 µm (Millipore)
coradas com Sudan Black.
Amostras de bactérias livres foram obtidas pela filtração de uma alíquota da
cultura (volume entre 15 e 40 mL dependendo do dia de amostragem) em tela de nylon
(12-20 µm de poro). As células de A. spiroides com as bactérias aderidas que
permaneceram na tela de nylon foram lavadas com água ultrapura autoclavada,
ressuspendidas para o volume original e sonificadas (Bransonic 1210) por 25 minutos,
ou até que se observasse o rompimento das células da cianobactéria. Ambas as frações,
bactérias aderidas e bactérias livres, foram fixadas com formalina (concentração final de
2%). Em teste realizado com um inóculo bacteriano proveniente de Barra Bonita, a
sonificação não alterou significativamente (α = 0,05) a quantidade (p = 0,0860 teste t
não pareado), o biovolume médio (p = 0,3995 teste t não pareado), nem a morfologia
das bactérias (p = 0,0905 teste t pareado).
O biovolume de cada célula foi calculado segundo Sun & Liu (2003) assumindo-
se as fórmulas de esferóide prolato para coco e cocobacilo e de cilindro com duas hemi-
esferas para os demais morfotipos: bacilo, espirilo (células espiraladas ou em forma de
S), víbrio (bacilos ou filamentos curvados, em forma de C) e filamento. Os morfotipos
foram obtidos segundo a razão comprimento/largura proposta por Racy et al. (2005). A
partir da densidade bacteriana e do biovolume, calculou-se a biomassa por meio da
multiplicação do número de células em cada amostragem pelo biovolume médio e pelo
fator de conversão de 0,12 pg C.µm
3
(Nagata & Watanabe 1990).
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3.3.6. Densidade e biovolume de flagelados contaminantes
Os flagelados foram quantificados a partir da fração utilizada para contagem de
bactérias livres empregando-se a mesma metodologia de contagem de bactérias (Porter
& Feig 1980), porém, utilizando-se membranas de policarbonato de 0,8 µm de poro. O
biovolume médio foi calculado assumindo-se morfologia celular elipsóide rotacional
(Weisse 1997).
3.3.7. Produção bacteriana
A produção bacteriana foi quantificada com base na metodologia da
incorporação da timidina tritiada (
3
H-Tim) pelo DNA (Fuhrman & Azam 1980) com
modificações (Regali-Seleghim 2001). Utilizou-se timidina radioativa (atividade
específica de 86 Ci mmol
-1
- Amersham Biosciences) a uma concentração final de 17,4
nM.
Uma amostra de 25 mL de cada cultura (réplicas) foi retirada, dividida em 5
alíquotas de 5 mL e incubadas, por no máximo 1 hora, nas mesmas condições das
culturas. Das cinco alíquotas, uma foi utilizada como controle (fixada com formaldeído
antes da adição da timidina radioativa), uma para quantificar a produção total e três para
verificar a produção, separadamente, das bactérias aderidas e das bactérias livres. Após
a incubação as amostras foram fixadas com 0,5 mL de formaldeído, adicionadas de 0,3
mL de ácido tricloroacético (TCA) 100% e deixadas em banho a 0ºC. As frações de
bactérias livres e bactérias aderidas foram separadas por filtração em tela de nylon com
poros de 12-20µm. O que passou pela tela foi diretamente recolhido em um copo de
outro sistema de filtração e filtrado em membrana Millipore de Acetato de Celulose de
0,22 μm de porosidade. Após o término dessa primeira filtração, as células presas à tela
de nylon foram lavadas duas vezes com 5mL de TCA 5% gelado, que também foi
recolhido e filtrado na mesma membrana de acetato da filtração anterior. A membrana
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de acetato com as bactérias livres foi lavada uma última vez com a solução de TCA 5%.
As células de A. spiroides com bactérias aderidas, que ficaram presas ao nylon, foram
ressuspendidas em água ultrapura, filtradas em outra membrana de acetato de celulose
de poro 0,22 µm e lavadas com 5 mL de TCA 5%. As membranas de acetato de celulose
foram colocadas em ampolas de vidro adicionando-se em seguida 0,5 mL de acetato de
etila e 3,5 mL de coquetel de cintilação (Optiphase ‘Hisafe’ 3 PerkinElmer) para a
radioanálise (cintilador Tri-Carb 2100TR Packard).
O cálculo de produção bacteriana foi obtido a partir das taxas de incorporação de
timidina tritiada (Wetzel & Likens 1991). Os valores obtidos nos controles foram
subtraídos das amostras considerando-se a proporção de incorporação entre aderidas e
livres. Após o cálculo da incorporação de timidina, a produção bacteriana (PB) foi
estimada a partir do biovolume obtido por meio das lâminas feitas para contagem de
bactérias, como descrito anteriormente, com o fator de conversão para carbono de 0,12
pgC.µm
3
(Nagata & Watanabe 1990).
3.3.8. Diversidade bacteriana
Nas amostragens para análises de diversidade microbiana, alíquotas da cultura
(entre 30 e 150mL, volume variável de acordo com o dia de amostragem) foram
filtradas em filtros para seringa, previamente autoclavados com as telas de nylon (12-20
µm), e lavadas após a filtração com 20 mL de água ultrapura autoclavada para melhor
remoção das células bacterianas livres. A tela, com as células da cianobactéria e
bactérias aderidas, foi armazenada em tubos de 1,5 mL com etanol absoluto a -5ºC até o
momento das análises. As células de bactérias livres foram recuperadas do filtrado em
outro filtro para seringa, com membrana de policarbonato (Millipore) com poro de 0,22
µm, acoplado ao filtro com a tela de nylon. Após alguns dias de cultivo, a quantidade de
material particulado que passava pela tela de nylon tornou impossível a filtração em
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membrana de poro de 0,22 µm e as células bacterianas livres foram, então, coletadas por
centrifugação a 16.000 xg por 20 minutos (centrífuga Sorvall, rotor SS-64). Os filtros e
as células recuperadas por centrifugação foram armazenados em tubos de 1,5 mL em
etanol absoluto a -5ºC.
3.3.8.1. Extração do DNA
A extração e a lavagem do DNA foram realizadas de acordo com Colombo
(2006) modificada pela adição de extração mecânica por meio da utilização de pérolas
de vidro.
As amostras foram centrifugadas a 16.000 xg para retirada do etanol e lavadas
com água autoclavada. Após a obtenção do pellet adicionou-se 100 µL de solução de
lise (50 ng μL
-1
de proteinase K em tampão TE – Tris 10mM, EDTA pH 8,0) e 0,2g de
pérolas de vidro (150-212 µm, Sigma-Aldrich). As amostras foram levadas ao “vortex”
por 30 segundos e tratadas com banhos térmicos: 55ºC por 15 minutos e mais 15
minutos a 80ºC.
Após a extração, foi realizada a lavagem do material para a retirada da
proteinase K e purificação do lisado, uma vez que sob esta forma o DNA não é estável
por muito tempo devido à ação de nucleases (Oliveira et al. 2000). O material extraído
foi lavado com fenol:clorofórmio:álcool isoamílico (25:24:1), clorofórmio, etanol 70%
e acetato de sódio (concentração final 1M) e etanol 100% (Colombo 2006). O DNA
obtido foi ressuspendido em 20µL de água ultrapura autoclavada
3.3.8.2. Amplificação do DNA
Foram realizadas amplificações da região 16S rDNA por meio da técnica da
Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) utilizando os primers 968f com grampo CG e
1401r, para o Domínio Bacteria (Heuer et al. 1997), que amplificam as regiões variáveis
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V6, V7 e V8 do 16S rDNA . Os reagentes e suas concentrações utilizadas na mistura de
reação da PCR encontram-se especificados na Tabela 1.
O programa de amplificação utilizado foi: desnaturação inicial a 94ºC por 4
minutos; 10 ciclos de 94ºC por 1 minuto, 65 ºC por 1 minuto e 72 ºC por 2 minutos e 25
ciclos de 94ºC por 1 minuto, 54ºC por 45 segundos e 72 ºC por 2 minutos; extensão
final a 72ºC por 5 minutos e finalização com resfriamento a 4ºC. A amplificação foi
verificada por eletroforese em gel de agarose 1% em tampão Tris-Borato-EDTA 1x
(TBE). O restante do material amplificado foi utilizado para a realização do DGGE.
Tabela 1 – Concentração final dos reagentes na mistura de reação para amplificação do
16S rDNA do Domínio Bacteria.
Reagentes Estoque
Concentração final
por reação
Volume por reação
(50 µL)
Primer 968f 10 µM 0,3 µM 1,5 µL
Primer 1401r 10 µM 0,3 µM 1,5 µL
Tampão da Taq
1
10x 1x 5 µL
MgCl
2
50 mM 1,5 mM 1,5 µL
dNTPs
2
1,25mM* 200 µM 8 µL
Taq-polimerase 5U/µL 2U 0,4 µL
DNA --- --- 4 µL
Água --- --- 28,1 µL
1
Solução tampão da Taq 10X (200mM Tris-HCl pH 8,4, 500 mM KCl).
2
Solução de dNTPs (desoxinucleotídeos trifosfatados, onde N = adenosina, citidina, guanosina
ou timidina). * Concentração final de cada dNTP.
3.3.8.3. DGGE (eletroforese em gel com gradiente desnaturante)
O DNA amplificado foi utilizado para eletroforese em gel de poliacrilamida 6%
(acrilamida:bisacrilamida 37,5:1) com gradiente desnaturante (DGGE) (equipamento da
Scieplas). Os reagentes foram preparados de acordo com Oliveira et al. (2000) exceto as
concentrações utilizadas de TEMED (N,N,N’,N’ – tetrametiletilenodiamina) e
Persulfato de Amônio 10% que foram respectivamente de 11 e 111µL para cada 14mL
de gel (Dra. Nora K. D’Águila Saavedra, comunicação pessoal). Utilizou-se um
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gradiente de 40 a 60% de desnaturante (100% de desnaturante definido como 7 M de
uréia e 40% [v/v] de formamida deionizada) e a eletroforese foi realizada a 65ºC por 15
horas a 60V em tampão TAE 1x (0,04M de Tris; 0,02M de ácido acético glacial e 1mM
de EDTA). Depois da eletroforese os géis foram corados por 30 minutos com brometo
de etídio (1µg /mL de tampão TAE 1x). As imagens foram capturadas com uma câmera
DC 290 Kodak com o auxílio do software Kodak 1D V.3.5.0.
Para que fosse possível comparar diferentes géis de DGGE, foram utilizados
como padrões os produtos de PCR de espécies conhecidas de bactérias: Staphylococcus
epidermidis (ou Serratia marcescens), Proteus vulgaris, Micrococcus luteus e
Mycobacterium stigmatis. As respectivas bandas ocorrem nesta mesma ordem nos géis,
da menor concentração (40%) à maior concentração (60%).
3.3.8.4. Seqüenciamento e Análise dos dados
Após a obtenção da imagem, as bandas do gel de DGGE foram recortadas com
lâmina estéril e colocadas em tubos com 20µL de água ultrapura autoclavada, deixadas
por aproximadamente 15 horas 4ºC para a eluição do DNA e congeladas até a realização
da PCR para seqüenciamento (Dra. Nora K. D’Águila Saavedra, comunicação pessoal).
Para esta amplificação utilizou-se o mesmo par de primers, sem o grampo de CG e o
seguinte programa de amplificação: desnaturação inicial a 94ºC por 5 minutos, 35 ciclos
de 94ºC por 1 minuto, 49 ºC por 1 minuto e 72 ºC por 2 minutos, extensão final a 72ºC
por 5 minutos e finalização com resfriamento a 4ºC.
Após a amplificação o DNA foi precipitado acrescentando-se igual volume de
solução de PEG 8000 (Polietilenoglicol) 20% e NaCl 1M (Lis e Schleif 1975) ao
produto da PCR e lavado duas vezes com 125 µL de etanol 80%. O protocolo de
purificação do DNA para seqüenciamento está descrito no Anexo 2 e foi fornecido pelo
Dr. Iderval da Silva Junior Sobrinho. O material purificado foi amplificado utilizando-
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se o primer 968f junto ao DYEnamic ET Dye Terminator Kit e seqüenciado com
MegaBACE 500 Flex, de 48 capilares (GE Healthcare) de acordo com as instruções dos
fabricantes. A análise das seqüências foi feita pelo software Sequence Analyser, Base
Caller Cimarron 3.12.
As seqüencias obtidas, cujo fragmento com boa qualidade foi maior do que
200pb e com índice de qualidade (determinado pelo software) maior do que 85, foram
procuradas no GenBank por meio do BLAST (Basic Local Alignment and Search Tool -
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi). Foram consideradas espécies análogas
àquelas do BLAST, as seqüências cuja similaridade foi maior do que 96%.
A árvore filogenética foi construída utilizando-se as seqüências das linhagens
análogas obtidas no BLAST e as seqüências não identificadas. Para melhor inferir os
grupos dessas últimas, foram inseridas na árvore seqüências cuja filogenia já foi
averiguada, obtidas no RDP II (Ribosomal Database Project II -
http://rdp.cme.msu.edu). As seqüências foram alinhadas com o programa BioEdit
versão 7.0.9.0 (Hall 1999) utilizando o ClustalW multiple alignment (Thompson et al
1994) com gap penalties de 15 (gap open) e 6,66 (gap extend). A árvore foi gerada pelo
programa MEGA versão 4 (Tamura et al. 2007) empregando-se o método de máxima
parcimônia com valores de bootstrap determinados usando 1000 réplicas.
3.4. Experimento II
Condições de cultivo e monitoramento das culturas
Foram feitas 6 culturas com volume final de 1,6 litros, em frascos de 2 litros de
capacidade, em meio ASM-1, pH 7,0 (Gorham et al 1964) que foram incubadas sob
condições controladas de iluminação (100±15 μmol fótons m
-2
s
-1
), fotoperíodo (12:12
h) e temperatura (23 ± 1 ºC).
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Essas culturas foram divididas em 2 grupos de 3 culturas, sendo que em cada
grupo uma cultura permaneceu como controle, ou seja, sem a adição do inóculo de
bactérias e as outras duas culturas receberam 80mL de inóculo bacteriano, obtido como
descrito para o experimento I.
O primeiro grupo de culturas (C1) foi inoculado com A. spiroides 18 dias antes
de ser acrescentado o inóculo de bactérias de Barra Bonita, para que este fosse
adicionado quando a cultura estivesse no final da fase de crescimento exponencial ou
início da fase de senescência; o outro grupo (C2) foi inoculado ao mesmo tempo com A.
spiroides e as bactérias.
As amostragens foram feitas nos dias 1 (18 horas), 4, 7, 10 e 16 após a adição do
inóculo de bactérias para todas as culturas e ainda no 21º dia para as culturas C2. Uma
vez que as culturas C1 já estavam crescendo quando o inóculo bacteriano foi
adicionado, a primeira amostragem foi no 18º dia de cultivo, não havendo dados da
curva de crescimento da cianobactéria até esse dia. As culturas foram monitoradas por
meio das concentrações de clorofila a e carbono total. A metodologia empregada está
descrita nos tópicos 3.3.3 (COT) e 3.3.4 (clorofila a).
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4. RESULTADOS
4.1. Experimento I
4.1.1. Crescimento da cianobactéria
O crescimento da cianobactéria quantificado pela concentração de clorofila foi bastante
semelhante entre as réplicas com exceção do 29º dia de cultivo (Figura 6, Tabela 2).
Embora o carbono orgânico total (COT) acompanhe o mesmo padrão obtido para
clorofila-a, tanto o COT como o COAs foram maiores para a réplica 1 a partir do 26º
dia (exceto no 37º dia) como pode ser visto na Figura 7.
0
50
100
150
200
250
0 5 10 15 20 25 30 35 40
Clorofila a (µg.L-¹)
Dias
R 1
R 2
Figura 6. Concentração de clorofila a (µg.L
-1
) em função do tempo (em dias), para as
duas culturas. R1, réplica 1; R2, réplica 2. A barra de erros corresponde ao desvio
padrão, que foi calculado com n = 2 (réplicas de amostragem).
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Tabela 2. Concentrações de clorofila a (µg.L
-1
), desvios-padrão (DP) e os valores de
“p” (teste t de Student) nas réplicas 1 e 2. O desvio padrão foi calculado com n=2
(réplicas de amostragem).
Concentração de Clorofila a (µg.L
-1
) Teste t de Student
Dia R1 DP R2 DP P
0 5,41 1,49 4,23 1,12 0,465
2 6,96 0,37 8,88 4,38 0,600
4 5,84 3,11 9,70 0,20 0,222
7 9,42 0,00 10,64 4,19 0,720
10 21,36 2,30 21,13 2,40 0,931
13 29,65 0,10 42,28 --- ---
15 54,71 12,91 49,61 10,99 0,720
20 85,98 15,45 88,32 13,99 0,888
23 116,11 10,81 108,21 --- ---
26 140,26 6,81 153,48 1,89 0,118
29 212,40 11,45 159,42 8,29 0,034*
35 146,60 13,87 165,48 1,66 0,196
* significativo; --- dados não existentes
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
22
0 10203040
Carbono orgânico (mg.L-¹)
Dias
COT R1
COT R2
COT
COAs R1
COAs R2
COAs
Figura 7. Concentrações (mg.L
-1
) de carbono orgânico total (COT) e carbono orgânico
das células de A. spiroides (COAs) em função do tempo (em dias) para as duas réplicas
(R1 e R2). As linhas representam os valores médios entre as réplicas.
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A concentração de COB manteve-se estável até o 20º dia de cultivo (Figura 8)
com valores médios de 3,26 e 2,88 mg C.L
-1
nas réplicas 1 e 2, respectivamente. A
partir do 26º dia, a concentração de COB foi maior para a réplica 1, assim como os
valores de COT e COAs.
0
2
4
6
8
10
12
0 10203040
Carbono orgânico (mg.L-¹)
Dias
Figura 8. Concentração (mg.L
-1
) de carbono orgânico da fração menor do que 20µm
(COB) em função do tempo (em dias), para as duas réplicas. Réplica 1 (▲); Réplica 2
(■). A linha representa os valores médios entre as réplicas.
4.1.2. Crescimento bacteriano
Em qualquer fase das culturas, a densidade de bactérias aderidas foi menor do
que as de bactérias livres (Figura 9). A densidade de bactérias aderidas manteve-se
praticamente constante até o 20º dia com média de 5,87 x 10
5
células.mL
-1
. A partir
desse dia, até o final do experimento, houve um crescimento exponencial. As
densidades máximas de bactérias aderidas foram de 1,45 x 10
7
células.mL
-1
para a
réplica 1 e 1,35 x 10
7
células.mL
-1
para a réplica 2.
A partir do 20º dia até o 35º dia ocorreu um aumento médio (entre as réplicas) de
13,6 vezes na densidade de bactérias aderidas, enquanto o aumento médio entre as livres
no mesmo período foi de aproximadamente 4 vezes.
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30
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40
45
50
0 5 10 15 20 25 30 35 40
células.mL-¹ (10
6
)
Dias
BL R1
BL R2
BL
BA R1
BA R2
BA
Figura 9. Densidade (células.mL
-1
x 10
6
) das bactérias aderidas a Anabaena spiroides
(BA) e das bactérias livres na cultura (BL) em função do tempo (em dias), para as duas
réplicas. R1, réplica 1; R2, réplica 2. As linhas representam os valores médios entre as
réplicas.
Com relação às bactérias livres a densidade variou um pouco mais entre as
réplicas, com maiores diferenças nos dias 20 e 29, nos quais a densidade de bactérias
livres na cultura 1 foi aproximadamente o dobro daquela da cultura 2. No entanto, ao
final do experimento as densidades das duas réplicas foram praticamente iguais (Figura
9).
O crescimento das bactérias aderidas não acompanhou o crescimento da
cianobactéria até o 20º dia de cultivo. Os tempos de duplicação (G) das bactérias
aderidas e da cianobactéria, calculadas a partir das médias de densidade bacteriana e de
concentração de clorofila das duas culturas, mostram que entre os dias 7 e 20 de cultivo
o tempo de duplicação para A. spiroides (4,17 dias) foi menor do que o tempo de
duplicação das BAs (7,01 dias). No entanto, entre o 20º e o 29º dias a duplicação foi
mais rápida para as bactérias aderidas (3,26 dias), do que para a cianobactéria (8,23
dias).
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O biovolume celular médio considerando-se o biovolume médio de cada dia de
amostragem, embora não tenha sido estatisticamente diferente entre as réplicas (p=0,81
entre as livres e p=0,94 entre as aderidas – teste de Wilcoxon pareado) e entre aderidas e
livres (p=0,39 na réplica 1 e p=0,68 na réplica 2 – teste de Wilcoxon pareado) foi
ligeiramente maior para as bactérias aderidas (Tabela 3).
Tabela 3. Média dos biovolumes celulares bacterianos (BVm em µm
3
) entre os dias de
amostragem para as bactérias livres (BL) e bactérias aderidas (BA) a células de A.
spiroides nas duas culturas (réplica 1 e réplica 2). DP é o desvio padrão, n=7.
Réplica 1 Réplica 2
BA BL BA BL
BVm 0,131 0,108 0,129 0,113
DP 0,088 0,040 0,066 0,028
As bactérias livres apresentaram maior biomassa (valores máximos de 4,19 x 10
2
ngC/L para a réplica 1 e 8,23 x 10
2
ngC/L para a réplica 2) do que as aderidas (valores
máximos de 1,25 e 1,51 x 10
2
ngC/L para as réplicas 1 e 2 respectivamente) como
mostrado nas Figuras 10 e 11, em concordância com as curvas de densidade.
A produção bacteriana absoluta das bactérias livres foi maior do que das
aderidas (Figuras 10 e 11) e embora a produção por célula também tenha sido, em
média, maior para as bactérias livres (Tabela 4) estatisticamente não houve diferenças
significativas entre as aderidas e livres da réplica 1 (p = 0,5625 teste de Wilcoxon
pareado) nem entre as mesmas frações na réplica 2 (p = 0,4688 teste de Wilcoxon
pareado). Em relação à réplica 2, a diferença na média de produção por célula (Tabela
4), que foi maior para as bactérias livres, deveu-se principalmente à produção nos dois
últimos pontos amostrados (29 e 35º dias).
Quando comparadas ponto a ponto, por dia de amostragem, foram encontradas
diferenças significativas na produção por célula entre aderidas e livres apenas no 20º dia
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na réplica 1 (p = 0,0043 teste t de Student) e nos dias 7 e 29 na réplica 2 (p = 0,06 e
p>0,0001, respectivamente, teste t de Student). Nas análises estatísticas utilizando as
médias entre as culturas não houve diferença significativa na produção bacteriana por
célula entre aderidas e livres em nenhum dia de amostragem.
Para o cálculo da produção das bactérias aderidas da réplica 1 no 29º dia de
cultivo, utilizou-se o biovolume obtido nas bactérias do 31º dia, uma vez que não há
esse dado para o 29º dia.
Tabela 4. Média da produção bacteriana (PB) por célula (em ngC.h
-1
x 10
-6
) entre os
dias de amostragem para as bactérias livres (BL) e bactérias aderidas (BA) a células de
A. spiroides nas duas culturas (réplica 1 e réplica 2). DP é o desvio padrão, n=7.
Réplica 1 Réplica 2
BA BL BA BL
PB/célula 2,98 3,60 4,16 7,75
DP 2,25 2,63 2,88 8,75
0
20
40
60
80
100
120
140
160
0
10
20
30
40
50
60
70
80
0 10203040
Biomassa bacteriana (ng.L-¹)
PB (ug C.L-¹.h-¹)
Dias
PB R1
PB R2
PB
Biomassa R1
Biomassa R2
Biomassa
Figura 10. Produção (ngC. L
-1
.h
-1
) e biomassa (ngC. L
-1
)
das bactérias aderidas a
Anabaena spiroides em função do tempo (em dias), para as duas réplicas. R1, réplica 1;
R2, réplica 2. As linhas representam os valores médios entre as réplicas.
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As curvas representando os valores de biomassa e produção, tanto em aderidas
como em livres, acompanharam o mesmo padrão das curvas de densidade bacteriana e
são condizentes com os parâmetros de crescimento de A. spiroides.
0
100
200
300
400
500
600
700
800
900
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
500
010203040
Biomassa bacteriana (ng.L-¹)
PB (ug C.L-¹.h-¹)
Dias
PB R1
PB R2
PB
Biomassa R1
Biomassa R2
Biomassa
Figura 11. Produção (ngC. L
-1
.h
-1
) e biomassa (ngC. L
-1
)
das bactérias livres na cultura
em função do tempo (em dias), para as duas réplicas. R1, réplica 1; R2, réplica 2. As
linhas representam os valores médios entre as réplicas.
4.1.3. Diversidade de morfotipos bacterianos
Uma vez que os flagelados podem influenciar os morfotipos bacterianos
encontrados, e as densidades e biovolumes dos flagelados foram diferentes entre as
culturas (seção 4.1.5), a diversidade de morfotipos e de tamanhos das bactérias serão
apresentados separadamente para as réplicas.
Em ambas as culturas, houve ocorrência de todos os morfotipos entre as
bactérias livres no primeiro dia de cultivo (Figuras 12 e 13), sendo que o morfotipo
predominante inicialmente foi “bacilo”. Até o 13º dia de cultivo houve uma diminuição
na porcentagem de bacilos e um aumento de cocobacilos, principalmente, e também de
cocos. A partir do 20º dia houve um aumento na porcentagem de filamentos entre as
bactérias da réplica 1 (Figuras 12 e 14), enquanto que na réplica 2 percebe-se um
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aumento na proporção de víbrios acompanhado de um pequeno aumento da
porcentagem do morfotipo “espirilo” no 35º dia.
Figura 12. Proporção de morfotipos das bactérias livres na cultura 1 em diferentes dias
de cultivo.
Figura 13. Proporção de morfotipos das bactérias livres na cultura 2 em diferentes dias
de cultivo.
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A
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S
29
Entre as bactérias aderidas a A. spiroides o morfotipo predominante inicialmente
foi também de “bacilo” (Figuras 15 e 16). Além desse morfotipo, no primeiro dia de
experimento foram observados cocos e cocobacilos aderidos às células da cianobactéria
em ambas as culturas. Na réplica 2 foram observados também os morfotipos
“filamento” e “víbrio”, sendo que cada um correspondeu a apenas 2% do total de
bactérias aderidas. No entanto, após o 13º dia a diversidade de morfotipos entre as
bactérias aderidas foi menor na réplica 2 do que na réplica 1.
Comparando-se o número de morfotipos das bactérias aderidas no primeiro e no
último dia de amostragem, não houve diferenças na réplica 2, no entanto, na réplica 1
ocorreu maior número de morfotipos ao final do experimento.
R
R
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S
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A
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S
30
Figura 14. Fotomicrografia de células bacterianas coradas com DAPI. (A) bactérias
livres na cultura 1 no 29º dia de cultivo. (B) bactérias livres na cultura 2 no 29º dia de
cultivo. (C) bactérias aderidas a Anabaena spiroides na cultura 1 no 35º dia de cultivo.
(D) bactérias aderidas a Anabaena spiroides na cultura 2 no 35º dia de cultivo.
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31
Figura 15. Proporção de morfotipos das bactérias aderidas a A. spiroides na cultura 1
em diferentes dias de cultivo.
Figura 16. Proporção de morfotipos das bactérias aderidas a A. spiroides na cultura 2
em diferentes dias de cultivo.
R
R
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S
32
4.1.4. Freqüências relativas das bactérias separadas por classes de tamanho
(comprimento).
Uma vez que a principal diferença entre bacilos e filamentos é a razão
comprimento/largura das células, o aumento de filamentos na fração das bactérias livres
na réplica 1 também pode ser visto por meio da separação das bactérias por classes de
comprimento. Com essa separação, observou-se que desde o início até o final do
experimento houve uma diminuição da freqüência relativa das bactérias com
comprimento maior ou igual a 0,8 µm entre as bactérias livres, exceto na classe maior
do que 2,4 µm na réplica 1 (Figuras 17 e 18). Concomitantemente ocorreu aumento nas
classes entre 0 e 0,8 µm.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
0-0,4 0,4-0,8 0,8-1,2 1,2-1,6 1,6-2,4 >2,4
Frequência relativa (%)
comprimento (µm)
Bactérias Livres R1
Dia 0
Dia 20
Dia 29
Dia 35
Figura 17. Freqüência relativa (%) das bactérias livres na cultura 1, separadas por
classes de comprimento celular, em 4 dias de amostragem: 0, 20, 29 e 35.
0
10
20
30
40
50
60
70
0-0,4 0,4-0,8 0,8-1,2 1,2-1,6 1,6-2,4 >2,4
Frequência relativa (%)
comprimento (µm)
Bactérias Livres R2
Dia 0
Dia 20
Dia 29
Dia 35
Figura 18. Freqüência relativa (%) das bactérias livres na cultura 2, separadas por
classes de comprimento celular, em 4 dias de amostragem: 0, 20, 29 e 35.
R
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A
A
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O
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S
33
As mudanças de classes de tamanho foram mais acentuadas na réplica 1 do que
na réplica 2 tanto nas bactérias livres como nas aderidas. Entre as bactérias aderidas foi
verificada uma menor proporção das bactérias de maior comprimento (Figuras 19 e 20).
0
10
20
30
40
50
60
70
0-0,4 0,4-0,8 0,8-1,2 1,2-1,6 1,6-2,4 >2,4
Frequência relativa (%)
comprimento (µm)
Bactérias Aderidas R1
Dia 0
Dia 20
Dia 35
Figura 19. Freqüência relativa (%) das bactérias aderidas a Anabaena spiroides na
cultura 1, separadas por classes de comprimento celular, em 3 dias de amostragem: 0,
20 e 35.
0
10
20
30
40
50
60
70
0-0,4 0,4-0,8 0,8-1,2 1,2-1,6 1,6-2,4 >2,4
Frequência relativa (%)
comprimento (µm)
Bactérias Aderidas R2
Dia 0
Dia 20
Dia 35
Figura 20. Freqüência relativa (%) das bactérias aderidas a Anabaena spiroides na
cultura 2, separadas por classes de comprimento celular, em 3 dias de amostragem: 0,
20 e 35.
4.1.5. Crescimento de nanoflagelados heterotróficos
No 7º dia foi constatada a presença de NFHs contaminantes, que foram
inoculados juntamente com as bactérias por não terem sido retidos nos filtros de fibra de
vidro de 1,2 µm de poro. A densidade dos NFHs manteve-se estável até o 20º dia de
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A
A
D
D
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34
cultivo, a partir do qual o número aumentou consideravelmente (Figura 21), alcançando
os valores de 7,73 x 10
4
NFH x mL
-1
na réplica 1 e 5,38 x 10
4
NFH x mL
-1
na réplica 2
no final do experimento (35º dia).
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
0 10203040
NFHs.mL-¹ (10³)
Tempo (dias)
Figura 21. Densidade (células.mL
-1
x 10
3
) de nanoflagelados heterotróficos em função
do tempo (em dias), para as duas réplicas. Réplica 1 (▲); Réplica 2 (■).
O biovolume médio dos NFHs (média ponderada, considerando-se a densidade
dos flagelados nos diferentes dias de amostragem) foi significativamente maior
(p=0,0288 teste t de Student) na réplica 1 do que na réplica 2, com valores de 26,00 e
18,53 µm
3
respectivamente. A Figura 22 mostra uma fotomicrografia das lâminas
preparadas para contagem de flagelados em ambas as culturas no 29º dia cultivo.
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35
Figura 22. Fotomicrografia de células bacterianas e de nanoflagelados heterotróficos
(setas vermelhas) coradas com DAPI no 29° dia de cultivo. (A) células livres na Réplica
1. (B) células livres na Réplica 2. As amostras foram filtradas em membrana de
policarbonato de 0,8 µm de poro.
4.1.6. Diversidade bacteriana
Embora Stackebrandt & Goebel (1994) tenham encontrado que espécies
similares compartilham pelo menos 97% de similaridade, neste trabalho foram
consideradas espécies análogas àquelas do BLAST, as seqüências cuja similaridade foi
maior do que 96%, uma vez que algumas bandas que representam a mesma seqüência
de acordo com a altura no gel de DGGE foram similares à mesma linhagem cadastrada
no BLAST, porém com semelhança variável: uma com 96% e outra(s) com mais de
97% de similaridade (Figura 24, Tabela 5).
A análise dos géis de DGGE mostra que há um maior número de unidades
taxonômicas operacionais (UTOs) nas amostras de bactérias livres, em qualquer fase da
cultura (Figuras 23 e 24). As bandas do gel de bactérias livres não foram seqüenciadas,
sendo que este está sendo apresentado apenas para comparação do número de UTOs
com as bactérias aderidas.
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A
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B
36
Um problema encontrado nesta etapa foi a documentação dos géis, uma vez que
algumas bandas com intensidade menor, que eram observadas diretamente, não
apareciam nas imagens capturadas, devido à limitação do sistema de documentação
utilizado. Para contornar esse problema, o gel foi desenhado antes de proceder-se à
retirada das bandas, respeitando as distâncias entre elas. Estão apresentadas aqui as
fotos dos géis sem as bandas mais fracas e não alinhadas e o desenho dos géis das
bactérias aderidas com essas bandas já adicionadas e alinhadas utilizando como
referência a linha de bandas que representam A. spiroides (linha 6, Figura 24) e
bactérias utilizadas como padrões (seção 3.3.8.3. e Figura 24).
Na Figura 24 estão apresentados dois géis, o primeiro feito a partir do DNA
extraído como descrito na metodologia (A
1
) e o segundo com o DNA re-extraído a
partir do material restante da primeira extração (A
2
). A realização de uma segunda
extração deveu-se ao fato de que o polissacarídeo capsular de A. spiroides pudesse ter
dificultado a extração do material genético das bactérias aderidas, além do que a grande
quantidade de DNA da cianobactéria pudesse estar prejudicando a amplificação do
DNA das bactérias heterotróficas presentes em menor número. Uma vez que nem todas
as bandas foram retiradas para posterior seqüenciamento, aquelas que se encontravam
na mesma altura nos três géis (A
1
, A
2
e Inóculo) foram consideradas como sendo
representantes do mesmo microrganismo.
Os padrões de bandas das bactérias presentes no inóculo de A. spiroides estão
apresentados nas Figuras 23 e 24 indicados pelas legendas BA (bactérias aderidas)
(Figura 24) e BL (bactérias livres) (Figura 23).
Bactérias presentes no inóculo de A. spiroides
As bactérias aderidas presentes no inóculo de A. spiroides foram detectadas nas
culturas inoculadas até o 13º dia de cultivo (Tabela 7, Figura 24). A bactéria de solo não
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37
identificada clone 24, uma Acidobacteria (bandas 30A
1
, 13A
2
, 14Ac e 15Ac) foi
detectada até o 13º dia de cultivo. As outras espécies presentes no inóculo são da
subdivisão Alphaproteobacteria: Rhodobacter sp. não cultivada clone PSB-M-1 (bandas
15A
2
e 18Ac, linha 8 Figura 24), detectada somente até o 7º dia de cultivo nas culturas
inoculadas e uma bactéria não cultivada clone Jul-eub3 (bandas 20Ac e 17A
2
),
detectada apenas na réplica 2 nos dias 7 e 13. Ambas Alphaproteobacteria ocorreram
também entre as bactérias livres do inóculo (Figura 23).
Figura 23 – Gel de DGGE das bactérias livres. IA, representa o inóculo da cultura de A.
spiroides; P, padrão. Os números acima das faixas em cada gel representam as réplicas,
1 ou 2, agrupadas por dia de amostragem (0, 2, 7, 13, 20, 26, 29, 31, e 35). A: banda
referente a A. spiroides; R: banda referente a Rhodobacter sp.; J: Banda referente à
Alphaproteobacteria clone Jul-eub3.
R
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L
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A
A
D
D
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O
S
S
A
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Desnaturantes
60%
40%
J
38
Figura 24 – Géis de DGGE e
desenho do padrão de bandas das
bactérias aderidas. A1, extração 1;
A2, extração 2; Ac, inóculo de A.
spiroides; P, padrão. Os números
acima das faixas em cada gel
representam as réplicas, 1 ou 2,
agrupadas por dia de amostragem.
No desenho das bandas os números
representam as bandas recortadas e
seqüenciadas. L(x) são as linhas que
agrupam as bandas consideradas
como sendo representativas da
mesma espécie.
Desnaturantes
60%
40%
1 2 1 2 1 2 1 2 P 1 2 1 2 1 2 1 2 1 P 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 1 2 BA P
0 2 7 13 20 26 29 35 31 0 2 7 13 20 26 29 35 37 In
A2
Ac
5
17
4
3
15
13
9
11
7
18
20
15
14
27 17
18
25
10
8
3
9
30
4
32
L1
L2
L3
L4
L5
L6
L7
L8
L9
L10
L11
L12
L13
A1
39
Tabela 5 - Bactérias aderidas a A. spiroides (incluindo a cianobactéria) identificadas pelo seqüenciamento das bandas recortadas (Figura 24),
grupo ao qual pertencem, similaridade obtida no BLAST e fase em que foram detectadas na cultura. As seqüências com menos de 96% não
foram consideradas como espécies similares. xA
1
e xA
2
, bandas obtidas na extração 1 e 2 respectivamente; xAc, bandas obtidas no inóculo de A.
spiroides; S, senescência; In, inóculo e início da cultura (até 13º dia).
Eubacteria identificada (número de acesso
no BLAST)
Bandas seqüenciadas Grupo Similaridade Fase
Anabaena spiroides linhagem PMC9702
(AJ293118)
5A
2
, 10A
1
Cyanobacteria; Nostocales; Nostocaceae 97-98% -
Anabaena spiroides LMECYA 161
(EU078524)
4A
1
, 4A
2
, 9A
1
, 9A
2
,
17A
1
, 18A
1
, 25A
1
,
27A
1
, 42A
1
Cyanobacteria; Nostocales; Nostocaceae 96-99% -
Bactéria não cultivada clone CJRC133
(DQ202186)
7A
2
Proteobacteria; Deltaproteobacteria * 96% S
Bactéria não cultivada clone Jul-eub3
(DQ363601)
17A
2
, 20Ac Proteobacteria; Alphaproteobacteria 96-98% In
Uncultured Rhodobacter sp. clone PSB-M-1
(AY128090)
18Ac, 15A
2
Proteobacteria; Alphaproteobacteria;
Rhodobacterales; Rhodobacteraceae
96-97% In
Bactéria de solo não identificada clone 24
(AM168160)
13A
2
, 14Ac, 15Ac,
30A
1
Acidobacteria 97-99% In
Bactéria não cultivada clone RL304_aal73h02
(DQ824276)
3A
1
, 3A
2
Firmicutes; Bacilli; Lactobacillales * 88% S
Lactobacillus equi (AB048833) 8A
1
Firmicutes; Bacilli; Lactobacillales * 88% S
Dechloromonas sp. EMB 50 (DQ413149) 32A
1
Proteobacteria; Betaproteobacteria * 89% Após 7º
dia** e S
não identificado 11A
2
não identificado S
* sugerido também pela construção da árvore filogenética
**apenasnacultura2
40
Bactérias provenientes do inóculo de Barra Bonita
Observa-se para as bactérias aderidas uma mudança na composição bacteriana
que se inicia no 7º dia com o aparecimento da UTO 32A
1
(banda 32 – gel referente à
extração 1 – Figura 24). No entanto, esta UTO aparece apenas na réplica 2, e nos dias 7
e 13. Este microrganismo corresponde, provavelmente, a uma Betaproteobacteria
(Figura 24). Outras bandas em altura bastante próxima a esta aparecem na cultura 2 no
29º dia e nas duas culturas no 37º dia de cultivo, no entanto, não foi possível o
seqüenciamento para verificar se correspondem à mesma bactéria. Apesar disso, existe a
possibilidade de que esta UTO não tenha sido detectada entre nos dias 20 e 26 devido a
vieses da amplificação, como será discutido posteriormente.
Entre os dias 20 e 26 não foram observadas bandas correspondentes a bactérias
associadas, provavelmente, devido à limitação da técnica. Verificou-se após o
seqüenciamento que as diferentes bandas que ocorreram nesses dias de amostragens são
todas de A. spiroides. No entanto, os vieses do DGGE, como a ocorrência de mais de
uma banda para o mesmo indivíduo, podem ser esclarecidos com o seqüenciamento das
bandas (Boutte et al. 2006), não atrapalhando a análise dos resultados.
A partir do 29º dia, quando as culturas entraram em fase
estacionária/senescência, notou-se uma mudança da comunidade bacteriana associada a
A. spiroides, em ambas as culturas. Na linha 4 da Figura 24, cujas bandas seqüenciadas
foram 3A
1
, 8A
1
e 3A
2
, constatou-se que o material genético pertence a uma espécie não
cadastrada no Genbank, mas pela construção da árvore filogenética (Figura 25) foi
comprovado que correspondem à mesma espécie, que é provavelmente uma bactéria do
filo Firmicutes, classe Bacilli, ordem Lactobacillales. Nesta fase de crescimento da
cianobactéria ocorreram ainda outras duas UTOs (linhas 12 e 13, Figura 24). A
primeira, 7A2, foi identificada como bactéria não cultivada clone CJRC133 (número de
R
R
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T
A
A
D
D
O
O
S
S
41
acesso no BLAST: DQ202186), pertencente, segundo a árvore construída, ao Filo
Proteobacteria, classe Deltaproteobacteria, provavelmente ordem Myxococcales. A
segunda, 11A2, não apresentou similaridade da seqüência de nucleotídeos com
seqüências cadastradas no BLAST. No RDP II esta seqüência, de 396pb, apresentou
baixa similaridade (entre 67 e 68%) com três grupos: Betaproteobacteria, Acidobacteria
e Actinobacteria. No entanto, na maioria das árvores construídas (dados não
apresentados), ficou como um grupo externo, assim como na árvore apresentada (Figura
25).
No 35º notou-se a presença de agregados sem células de A. spiroides nas
culturas, que poderiam ficar retidos nos filtros utilizados para separar os filamentos da
cianobactéria e bactérias aderidas. Alguns agregados foram isolados da cultura 1 neste
dia e submetidos à análise de diversidade bacteriana para verificar possíveis
interferências nos resultados obtidos para as bactérias aderidas. A separação do produto
da PCR deste material em gel de DGGE forneceu apenas três bandas (dados não
apresentados), sendo que duas foram seqüenciadas e identificadas como: A. spiroides e
uma bactéria do Filo Verrucomicrobia não cultivada. Esta bactéria apresentou 98% de
similaridade a 6 clones de Verrucomicrobia. A outra banda não seqüenciada ocorreu na
mesma posição da bactéria encontrada no inóculo: Rhodobacter sp.
As linhagens cadastradas no GenBank com similaridade mais próxima às
seqüências obtidas neste trabalho, seus respectivos grupos, similaridade e bandas cujo
DNA foi seqüenciado estão apresentadas na Tabela 5.
R
R
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S
S
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U
L
L
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A
A
D
D
O
O
S
S
42
Figura 25 – Árvore filogenética utilizando o modelo de máxima parcimônia, com as bactérias associadas a A. spiroides (em negrito) e bactérias
cuja filogenia foi comprovada (exceto Korarchaeota e a Acidobacteria 100 M1_C7), obtidas no RDPII (Ribossomal Database Project II) e usadas
para sugerir o grupo das bactérias não identificadas. Uma Korarchaeota foi usada como raiz. Os números nos nós representam a porcentagem do
teste de bootstrap de 1000 réplicas.
Dechloromonas denitrificans (AJ318917)
Nitrosomonas oligotropha (AJ298736)
32A1
Bactéria não cultivada CJRC133
Polyangium thaxteri (AJ233943)
Bactéria não cultivada Jul-eub3 (DQ363601)
Rhodobacter sp. não cultivada PSB-M-1 (AY128090)
Rhodobacter capsulatus (D16428)
Bactéria de solo não cultivada, clone 24 (AM168160)
Acidobacteria não cultivada 100M1_C7 (DQ513986)
Streptococcus thermophilus ( X68418)
Lactobacillus equi (AB048833)
3A2
3A1
8A1
11A2
Korarchaeota não cultivada Kor9NEPR (DQ470015)
100
100
52
98
81
97
73
50
50
43
32
25
34
95
β
δ α
Bacilli
não identificada
Proteobacteria
Acidobacteria
43
4.2. Experimento II
4.2.1. Crescimento da cianobactéria
Tanto as curvas de concentração de clorofila como de carbono total mostram
maiores diferenças entre os tratamentos e o controle no final do experimento, para os
dois grupos de culturas: C2, inoculado com água de Barra Bonita (filtrada em 1,2 µm)
desde o início das culturas (Figuras 26 e 27) e C1, inoculado com água de Barra Bonita
(filtrada em 1,2 µm) quando as culturas de A. spiroides estavam em fase estacionária de
crescimento (Figuras 28 e 29).
As culturas C2 apresentaram diferenças significativas (p = 0,0307 teste t de
Student), com maior concentração de clorofila a no controle do que nas culturas
inoculadas, apenas no último dia de amostragem (21º dia de cultivo) (Tabela 6).
0
50
100
150
200
250
0 5 10 15 20 25
Clorofila a (µg.L-¹)
dias
C2 controle
C2 inoculada
Figura 26. Concentrações de clorofila a (µg.L
-1
) nas culturas C2 controle (sem adição
do inóculo de Barra Bonita) e C2 inoculadas (adicionadas do inóculo de Barra Bonita)
em função do tempo de cultivo. As barras representam o desvio padrão: n=2 nas
culturas C2 controle (réplicas de amostragem) e n=4 nas culturas C2 inoculadas (2
amostragens em cada réplica de cultura).
R
R
E
E
S
S
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U
L
L
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A
A
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D
O
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L
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A
A
D
D
O
O
S
S
44
Tabela 6. Concentrações de clorofila a (µg.L
-1
), desvio padrão (DP) e os valores de “p”
(teste t de Student) nas culturas C2 controle (sem adição do inóculo de Barra Bonita) e
C2 inoculadas (adicionadas do inóculo de Barra Bonita) em função do tempo de cultivo.
O desvio padrão foi calculado com n=2 nas culturas C2 controle (réplicas de
amostragem) e n=4 nas culturas C2 inoculadas (2 amostragens em cada réplica de
cultura).
Tempo
Concentração de Clorofila a (µg.L
-1
)
teste t de Student
Dias
C2 controle DP C2 inoculada DP
P
1
32,23 0,00 31,08 5,74 0,93
4
57,97 0,76 55,77 2,61 0,32
7
121,68 5,09 108,78 15,31 0,33
10
200,19 5,07 158,42 29,00 0,13
16
187,18 3,54 128,03 86,33 0,41
21
100,05 14,14 43,32 2,70 0,03*
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
0 5 10 15 20 25
carbono total (mg.L-¹)
dias
C2 controle
C2 inoculada
Figura 27. Concentrações carbono total (mg.L
-1
) nas culturas C2 controle (sem adição
do inóculo de Barra Bonita) e C2 inoculadas (adicionadas do inóculo de Barra Bonita)
em função do tempo de cultivo. As barras representam o desvio padrão: n=2 nas
culturas C2 inoculadas (réplicas de cultura).
Já nas culturas C1, que receberam o inóculo com idade de 18 dias, e foram
amostradas no 19º dia de cultivo (18 horas após receberem o inóculo), as diferenças na
concentração de clorofila a entre as culturas inoculadas e o controle foram
estatisticamente significativas apenas nos dois últimos dias de cultivo (Tabela 7),
quando também foram observadas maiores diferenças nas concentrações de carbono
R
R
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S
S
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A
A
D
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O
O
S
S
45
total (Figura 29). Embora as diferenças estatísticas não tenham sido significativas até a
idade de 25 dias das culturas (7 dias após a adição do inóculo), a partir da inoculação da
água de Barra Bonita houve sempre um decaimento da concentração de clorofila a nas
culturas inoculadas, evidenciando que este inóculo acelera a morte das culturas, quando
comparadas aos controles.
Nas culturas C1 o efeito do inóculo bacteriano de Barra Bonita foi significativo
9 dias após a adição deste, enquanto que nas culturas C2 o efeito no crescimento da
cianobactéria foi evidente apenas 21 dias após a adição do inóculo. Esses resultados
mostram maior susceptibilidade das culturas mais velhas de A. spiroides ao inóculo de
Barra Bonita.
0
20
40
60
80
100
120
140
160
18 23 28 33 38
Clorofila a (µg.L-¹)
dias
C1 controle
C1 inoculada
Figura 28. Concentrações de clorofila a (µg.L
-1
) nas culturas C1 controle (sem adição
do inóculo de Barra Bonita) e C1 inoculadas (adicionadas do inóculo de Barra Bonita)
em função do tempo de cultivo. As barras representam o desvio padrão n=2 nas culturas
C1 controle (réplicas de amostragem) e n=4 nas culturas C1 inoculadas (2 amostragens
em cada réplica de cultura).
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Tabela 7. Concentrações de clorofila a (µg.L
-1
), desvio padrão (DP) e os valores de “p”
(teste t de Student) nas culturas C1 controle (sem adição do inóculo de Barra Bonita) e
C1 inoculadas (adicionadas do inóculo de Barra Bonita) em função do tempo de cultivo.
O DP foi calculado com n=2 nas culturas C1 controle (réplicas de amostragem) e n=4
nas culturas C1 contaminadas (2 amostragens em cada réplica de cultura).
Tempo
Concentração de Clorofila a (µg.L
-1
) Teste t de Student
dias
C1 controle DP C1 inoculada DP P
19
78,50 7,42 118,10 21,17 0,0709
22
105,84 0,48 85,02 45,81 0,5478
25
95,18 13,10 67,61 38,48 0,4016
28
106,63 24,88 17,27 10,37 0,0025**
34
119,08 11,67 10,57 4,04 < 0.0001***
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
18 23 28 33 38
carbono total (mg.L-¹)
dias
C 1 controle
C1 inoculada
Figura 29. Concentrações carbono total (mg.L
-1
) nas culturas C1 controle (sem adição
do inóculo de Barra Bonita) e C1 inoculadas (adicionadas do inóculo de Barra Bonita)
em função do tempo de cultivo. As barras representam o desvio padrão: n=2 nas
culturas C1 inoculadas (réplicas de cultura).
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5. DISCUSSÃO
5.1. Problemas metodológicos: amplificação do DNA e DGGE
O excesso de DNA de A. spiroides pode ter prejudicado a amplificação do
material genético das bactérias aderidas que estavam em menor densidade em todos os
dias de amostragem, mas especialmente nos dias 20 e 26 em que o crescimento da
cianobactéria não foi acompanhado por aumento na densidade bacteriana aderida.
Zhang et al. (2007b) mostraram que o DGGE detecta principalmente as linhagens
dominantes nas comunidades bacterianas. Desta forma, é possível que o número de
espécies aderidas tenha sido subestimado, uma vez que nos trabalhos com outras
cianobactérias a quantidade de espécies de bactérias aderidas foi maior do que a
encontrada neste trabalho (Eiler et al. 2006, Salomon et al. 2003) e que algumas
espécies de bactérias, embora não detectadas durante toda a curva de crescimento,
estivessem constantemente associadas à cápsula de A. spiroides. Sugere-se como
medida para amenizar este problema, a sonificação das amostras para rompimento das
células da cianobactéria, como realizado para proceder às contagens das bactérias
aderidas, e lavagem das células restantes (bactérias) por centrifugação antes de iniciar a
extração do material genético.
A grande quantidade de material genético da cianobactéria pode também ter
contribuído para obtenção de seqüências idênticas a partir de bandas diferentes, uma vez
que amplicons dominantes podem estar distribuídos em diferentes posições com o
mesmo padrão (Nikolausz et al. 2005). Além disso, a distribuição de bandas referentes à
mesma espécie em diferentes posições no gel pode dever-se à presença de single-
stranded DNA (Jensen & Strauss 1993) e também tem sido bastante relatada em
trabalhos de diversidade microbiana devido à formação de heteroduplex (Boutte et al.
2006, Jensen & Straus 1993, Muyzer & Smalla 1998, Nikolausz et al. 2005), que pode
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ser formada pelo anelamento de produtos de PCR de diferentes organismos (Muyzer &
Smalla 1998). Para verificar a formação de heteroduplex faz-se necessário o
seqüenciamento bidirecional dos fragmentos obtidos em cada banda, mas neste trabalho
foi realizado o seqüenciamento utilizando-se apenas o primer forward (968f). Contudo,
uma vez que pelo menos uma banda de cada linha foi seqüenciada, a possível formação
de heteroduplex não prejudicou a análise dos resultados.
5.2. Diversidade, seletividade e interações bactérias associadas-A. spiroides.
5.2.1. Seletividade das bactérias que se aderem à cápsula
Comparando-se os padrões de bandas dos géis de bactérias aderidas e do gel de
bactérias livres é possível perceber a grande diferença na diversidade encontrada entre
essas duas frações, evidenciando uma seleção das bactérias que se associam à cápsula
de A. spiroides. Alguns trabalhos apontam diferenças na diversidade entre o
bacterioplâncton livre e o aderido a cianobactérias ou agregados (DeLong et al. 1993,
Riemann & Winding 2001, Eiler et al. 2006). Essa seletividade das bactérias aderidas a
cianobactérias ou agregados pode dever-se à quimiotaxia que determina associações
específicas entre cianobactérias e bactérias (Paerl & Gallucci 1985, Lupton & Marshall
1981), à quantidade e tipos de açucares que podem servir de sítios de ligação para
bactérias (Hori et al 1996, Tien et al. 2005), à capacidade de metabolizar
polissacarídeos de alta massa molecular (DeLong et al. 1993) e à produção de
compostos antimicrobianos pela cianobactéria, uma vez que se sabe que A. spiroides
produz compostos tóxicos a outras cianobactérias (Kaya et al. 2002) e bactérias
(Kreitlow et al. 1999).
49
Em concordância com os argumentos acima apresentados, as curvas de
crescimento da cianobactéria (clorofila e carbono – Figuras 6 e 7) e das bactérias
aderidas (densidade e produção – Figuras 9 e 10) no experimento I, assim como seus
tempos de duplicação calculados pela curva de clorofila e de densidade bacteriana,
mostram que o início da fase exponencial de crescimento de A. spiroides não é
acompanhado por aumento na densidade ou produção das bactérias aderidas que
aumentam a partir do 20º dia. Além disso, há um aumento na densidade de bactérias
livres a partir do 12º dia, mesmo sem um aumento da concentração de carbono orgânico
maior do que 20µm (COB – Figura 7), que só ocorre a partir do 20º dia, mostrando que
a inibição no crescimento ocorreu principalmente nas bactérias aderidas. As possíveis
explicações para essa inibição seriam a produção de antibióticos pela cianobactéria ou
pelas bactérias aderidas a A. spiroides.
5.2.2. Bactérias identificadas e sucessão das bactérias aderidas
Os estudos de bactérias associadas ao gênero Anabaena, que são direcionados
principalmente àquelas aderidas aos heterocitos, citam: Zoogloea sp. Pseudomonas sp e
Pseudomonadidos (Caldwell & Caldwell 1978, Lupton & Marshall 1981, Paerl &
Gallucci 1985) cuja classificação foi baseada em características morfológicas e
fisiológicas, e Rhizobium sp (Stevenson e Waterburry 2006) baseado em análises
moleculares. No presente trabalho, dentre as bactérias aderidas não foram detectados os
gêneros citados acima. Supõe-se que a comunidade bacteriana inoculada, o local de
isolamento da cianobactéria e a espécie e/ou linhagem de Anabaena utilizada sejam os
motivos principais desses resultados. Além disso, Pseudomonas sp. e Rhizobium sp.
foram encontrados associados aos heterocitos, e neste estudo foram observados poucos
filamentos com heterocitos e apenas na fase final do experimento, uma vez que o meio
de cultura utilizado contém elevada concentração de nitrato. A espécie Zoogloea sp,
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citada acima, foi obtida por cultivo em meio sólido, que é mais seletivo do que os
métodos de estudo de diversidade por análises genéticas, mas que pode também
selecionar espécies mais raras, não detectadas pelas técnicas moleculares (Pedrós-Alió
2006).
Bactérias presentes no inóculo de A. spiroides e no início das culturas experimentais -
Neste trabalho, a única bactéria identificada em nível de gênero foi uma Rhodobacter
não cultivada, clone PSB-M-1 (Tabela 5), que pode realizar fotossíntese em condições
de anaerobiose (Kersters et al. 2006). O gênero Rhodobacter foi encontrado também
associado a agregados da cianobactéria Nodularia sp. (Tuomainen et al. 2006). Esta
espécie pertence ao grupo das bactérias púrpuras não-sulfurosas, subdivisão
Alphaproteobacteria que tem ampla ocorrência em ambientes aquáticos (DeLong et al.
1993, Simon et al. 2002, Zhang et al. 2007a, Grossart et al. 2008) e é encontrada com
bastante freqüência associada a florações de cianobactérias (Eiler et al. 2006, Kolmonen
et al. 2004, Maruyama et al. 2003, Salomon et al. 2003, Stevenson e Waterbury 2006,
Tuomainen et al. 2006).
Além de Rhodobacter sp. a espécie de bactéria não cultivada, clone Jul-eub3
(DQ363601) pertence também ao grupo das Alphaproteobacteria. A seqüência de
nucleotídeos obtida que apresentou similaridade a este clone, apresentou similaridade de
94% com os clones LIUU-11-267 e LIUU-1-169 (número de acesso no BLAST
AY509420 e AY509419 respectivamente) que foram identificados em florações de
cianobactérias (Eiler e Bertilsson 2004). Devido à grande diversidade metabólica do
grupo (Kersters et al. 2006) não é possível inferir possíveis papéis da associação deste
clone com a cianobactéria. Esta Alphaproteobacteria foi detectada apenas na cultura 2 e
nos dias 7 e 13, mas é possível que estivesse presente desde o início da cultura, uma vez
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que também ocorreu no inóculo de A. spiroides e que não tenha sido detectada devido
aos artefatos metodológicos discutidos anteriormente.
Outra espécie que ocorreu no inóculo da cianobactéria e esteve presente até o
início da fase exponencial de crescimento foi a bactéria de solo não cultivada, clone 24
(AM168160), uma Acidobacteria. Este grupo é bastante comum em solo, mas poucas
colônias foram isoladas, por isso, pouco se sabe sobre a fisiologia dessas bactérias
(Janssen 2006, Lim et al. 2005). Ocorre também em ambientes de água doce (Barns et
al 1999), no entanto, existem poucos relatos de Acidobacteria associada a blooms de
Cyanobacteria (Eiler e Bertilsson 2004, Eiler et al. 2006).
Bactérias provenientes do inóculo de Barra Bonita que sucederam aquelas presentes
inicialmente - Uma bactéria não identificada, 32A
1
, membro das Betaproteobacteria,
ocorreu nos dias 7 e 13 da Réplica 2 do primeiro experimento e possivelmente em
ambas as réplicas na fase de senescência. Esta classe de bactérias também é bastante
comum em florações de cianobactérias, juntamente com as Alphaproteobacteria (Eiler
et al. 2006, Kolmonen et al. 2004, Maruyama et al. 2003, Salomon et al. 2006,
Tuomainen et al. 2006). Maruyama et al. (2003) relataram que as Betaproteobacteria
foram o grupo dominante de bactérias aderidas às células de Microcystis durante um
bloom dessa cianobactéria. Dentro desta classe encontra-se a espécie Alcaligenes
denitrificans que causa lise e morte de Microcystis spp. (Manage et al. 2000), assim
como espécies que não apresentam efeitos significativos sobre o crescimento de
Nodularia spumigena (Salomon et al. 2003).
É possível que a bactéria 32A
1
ocorra também nas duas culturas durante a fase
de senescência, no entanto é necessário realizar novamente o seqüenciamento dessas
bandas nesta fase para confirmar tal fato, uma vez que as seqüências obtidas não eram
de boa qualidade.
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Membros dos grupos Cytophaga-Flavobacterium-Bacteroides (CFB) e
Gammaproteobacteria, que comumente acompanham blooms de cianobactérias ou
encontram-se associados a elas (Eiler et al. 2006, Kolmonen et al. 2004, Maruyama et
al. 2003, Salomon et al. 2003, Tuomainen et al. 2006), não foram detectados associados
a A. spiroides. Contudo, foi identificada uma bactéria do grupo Firmicutes,
provavelmente da ordem Lactobacillales que não havia sido encontrada ainda associada
a Cyanobacteria. Entre os trabalhos citados acima apenas uma espécie de Firmicutes, da
classe Clostridia ocorreu associada à cianobactéria Gloeotrichia echinulata (Eiler et al.
2006) e entre os estudos sobre efeitos de bactérias em cianobactérias, Reim et al. (1974)
encontraram uma bactéria do gênero Bacillus (classe Bacilli, ordem Bacillales) com
atividade cianobactericida. A bactéria do grupo Firmicutes, encontrada no presente
trabalho, foi detectada apenas no final da fase de crescimento exponencial e na fase de
senescência da cianobactéria.
Outras bactérias foram encontradas apenas no final da fase de crescimento
exponencial e durante a fase estacionária/senescência em ambas as culturas,
evidenciando uma mudança na comunidade bacteriana entre as fases de crescimento de
A. spiroides. As demais bandas que ocorrem na fase de senescência são referentes à
linhagem não identificada 11A
2
e à bactéria não cultivada clone CJRC133 (DQ202186),
que é uma Deltaproteobacteria, provavelmente da ordem Myxococcales. Analisando o
eletroferograma da seqüência 11A
2
, supõe-se que a não identificação deveu-se, mais
provavelmente, à mistura de duas espécies na mesma banda do gel, sendo necessária
outra corrida de DGGE para verificar tal fato; ou pode tratar-se de uma nova espécie
pertencente a uma divisão bacteriana ancestral, uma vez que na maioria das árvores
construídas (utilizando diferentes métodos) ficou como um grupo externo às Eubacteria
utilizadas.
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Na literatura, registros de Deltaproteobacteria não são tão comuns em florações
de cianobactérias, como são os de Alpha e Betaproteobacteria. Kolmonen et al. (2004)
detectaram 2 espécies pertencentes à classe Deltaproteobacteria associadas a bloom de
cianobactérias. Quando ocorrem associadas às Cyanobacteria, parecem estar vinculadas
à lise das células por degradarem a camada de peptideoglicano, como descrito para
Microcystis (Maruyama 2003). As Deltaproteobacteria da ordem Myxococcales são
encontradas principalmente em solo e todas são capazes de degradar macromoléculas
biológicas, além de usar ectoenzimas para lisar bactérias e leveduras (Dawid 2000). São
conhecidas por produzirem compostos bioativos (Gerth et al. 2003) e há relatos de
mixobactérias capazes de produzir lise celular em Nostoc sp. (Shilo 1970). É bastante
provável, deste modo, que a presença desta Deltaproteobacteria nesta fase acelere a
morte das células de A. spiroides.
A bactéria pertencente ao Filo Verrucomicrobia encontrada em material
particulado no 35º dia, porém não aderida à cianobactéria, apresentou similaridade a 6
clones de Verrucomicrobia, entre eles, o clone Jo119-01 (número de acesso no BLAST
AJ620838) encontrado por Kolmonen et al (2004) no lago Joutikas (Finlândia) em
bloom de cianobactérias. Neste mesmo trabalho os autores encontraram que o grupo
Verrucomicrobia foi o mais abundante em dois anos de amostragens. Eiler & Bertilson
(2004), Eiler et al (2006) e Pope & Patel (2008) também encontraram Verrucomicrobia
em florações de cianobactérias. Segundo Woese (2006) e Schlesner et al (2006) embora
o conhecimento sobre esse grupo seja limitado devido à existência de poucas linhagens
isoladas a aplicação de técnicas de biologia molecular mostrou que este grupo tem
ampla ocorrência em habitats aquáticos e terrestres e é claramente um grupo
ecologicamente muito importante.
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Os resultados mostraram uma sucessão das bactérias aderidas a A. spiroides
com duas populações distintas: uma com as bactérias presentes no inóculo de A.
spiroides que ocorreram até o 13º dia e outra na fase de senescência da cianobactéria.
Diferenças na matéria orgânica excretada nas diferentes fases de desenvolvimento da
cultura (Tien et al. 2005), assim como menor seletividade dos filamentos senescentes
em relação aos saudáveis, devido, por exemplo, à menor produção de substâncias
inibidoras (Suikkanen et al 2004, Kreitlow et al 1999) são possíveis explicações para tal
observação. Além disso, interações entre as espécies de bactérias aderidas, como a
produção de compostos antimicrobianos por essas bactérias, podem também explicar a
sucessão, assim como a seletividade observada.
5.2.3. Interações bactérias- A. spiroides
É possível que as bactérias associadas a A. spiroides no início da cultura,
presentes desde o inóculo, sejam benéficas para o seu crescimento, uma vez que,
segundo revisão realizada por Paerl (1996), com poucas exceções, os gêneros de
cianobactérias de água doce não axênicas apresentam taxas de crescimento maiores e
são mais fáceis de serem mantidas em cultura do que as linhagens axênicas (e.g. Gibson
e Smith 1982). Este fato explica também a grande dificuldade e as tentativas, sem
resultados positivos, de obtenção de uma linhagem axênica durante a fase inicial deste
trabalho (Anexo 1).
A hipótese de que essas associações sejam benéficas para a cianobactéria
suporta-se ainda nas teorias evolutivas, como discutido por Giroldo (2003). É pouco
provável que tal gasto energético na produção de EPS pelas cianobactérias seja uma
característica neutra para o desenvolvimento e reprodução das espécies. Desta forma, a
produção de EPS, principalmente na forma de CPS em A. spiroides, se não traz
benefícios por meio das associações com as bactérias, deve trazer benefícios de outras
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formas, de modo a superar o risco e o prejuízo causado pela colonização de bactérias
com efeitos antagônicos à cianobactéria, como observado neste trabalho. No entanto,
não foi possível verificar esse fato devido à falta de um controle axênico.
Apesar disso, os resultados do experimento II mostram efeitos negativos do
inóculo de Barra Bonita no crescimento de A. spiroides. Uma vez que no experimento I
ocorreram bactérias que potencialmente têm efeitos antagônicos às cianobactérias na
fase de senescência de A. spiroides e que o número de bactérias aderidas aumentou
principalmente no final da fase de crescimento exponencial da cianobactéria,
possivelmente essas bactérias aceleram sua morte. Um resultado que nos permite ainda
inferir sobre o efeito antagônico das bactérias sobre a cianobactéria é que o crescimento
exponencial das bactérias aderidas se inicia entre os dias 20 e 29 e em uma taxa muito
superior ao das bactérias livres e culmina com o início da fase estacionária/senescência
das culturas. Uma vez que esse período corresponde também à mudança na diversidade
das bactérias aderidas, é bastante provável que parte das bactérias livres tenham passado
à fração aderida.
No entanto, a adesão das bactérias pode ter ocorrido devido à senescência e
morte da cianobactéria, acelerada por outro fator que não a interação com as bactérias.
Simon & Tilzer (1982) encontraram baixa densidade de bactérias aderidas durante um
bloom fitoplanctônico no lago Constance, sendo que após a morte do fitoplâncton e a
degradação da matéria orgânica dissolvida lábil, as bactérias começaram a se aderir às
partículas, sugerindo que células algais saudáveis são menos susceptíveis à adesão de
bactérias.
Além das bactérias associadas à cápsula de A. spiroides, a matéria orgânica
excretada pela cianobactéria e liberada para o meio suporta uma alta densidade e grande
diversidade de bactérias livres, que provavelmente também desempenham papéis
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importantes para o crescimento da cianobactéria, como regeneração de nutrientes, mas
também antagônicos a ela. Embora Bershova et al. (1968 apud Paerl 1982) tenham
encontrado que várias linhagens de bactérias isoladas de lagos que continham
cianobactérias apresentavam capacidades antagônicas, enquanto aquelas isoladas da
mucilagem da cianobactéria apresentavam pouca tendência antagônica, alguns trabalhos
relatam a necessidade de contato direto da bactéria à cianobactéria para que ocorra a lise
celular (Shilo 1970, Manage et al. 2000). As divergências entre esses estudos podem
dever-se à fase do ciclo de vida da cianobactéria em que as bactérias foram isoladas,
uma vez que, baseando-se nos resultados obtidos no presente trabalho, as bactérias
aderidas a A. spiroides que poderiam ser isoladas seriam diferentes em diferentes fases
da cultura (ou do bloom), alterando desta forma, seus efeitos potenciais sobre a
cianobactéria.
Apesar dos vários relatos de linhagens de bactérias com efeitos antagônicos
diretos à cianobactérias, existe uma complicação em interpretar essas relações
antagônicas, principalmente tratando-se de culturas do tipo batch acompanhadas por
longos períodos, uma vez que, segundo Paerl (1982) há dificuldade em diferenciar o
ataque bacteriano direto (lise) da competição bacteriana por nutrientes e fatores de
crescimento como a causa da morte da cianobactéria.
Juntamente à ação das bactérias, a presença potencial de cianófagos pode
também explicar as diferenças encontradas entre as curvas de crescimento das culturas
controle e inoculadas com amostras de Barra Bonita, obtidas no experimento II. No
entanto, não é possível inferir sobre o efeito desses vírus a partir dos resultados obtidos,
uma vez que no controle não foi inoculada uma fração da água de Barra Bonita menor
do que 0,22µm, e o tempo de ação do vírus, as taxas de infecção e lise das
cianobactérias parecem depender de muitos fatores, como densidade de células,
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densidade de partículas virais, tipo de vírus, e quantidade de partículas nas quais os
vírus podem ficar adsorvidos e, portanto, inócuos (Padan & Shilo 1973, Manage et al.
1999, Suttle 2000)
5.3. Produção bacteriana e influência dos NFHs na comunidade bacteriana
(Experimento I)
A manutenção da similaridade de réplicas de culturas que contam com a
interação de diferentes populações de microrganismos torna-se bastante complexa por
longos períodos. Embora não muito relevantes, as diferenças observadas entre as
réplicas do experimento 1 podem dever-se a vários fatores, um deles, possivelmente, é a
presença de maior número de NFHs na réplica 1, principalmente a partir do 20º dia de
cultivo, e maior biovolume médio dos NFHs nessa réplica. Sabe-se que os flagelados
são importantes predadores do bacterioplâncton, controlando as densidades bacterianas
nos ambientes aquáticos e assim, atuando significativamente na regeneração de
nutrientes (e.g. Azam et al. 1983, Porter et al. 1985, Boenigk e Arndt 2002, Pernthaler
2005).
A predação por NFHs explica também, em parte, os valores menores de
biomassa bacteriana do que o esperado pelos altos valores de produção encontrados em
ambas as culturas. Outro importante fator para o controle da produção bacteriana em
ambientes aquáticos é a lise causada pelo ataque de vírus (Weinbauer & Höfle 1998,
Zhang et al 2007a), no entanto, não temos dados sobre bacteriófagos neste trabalho. No
caso das bactérias aderidas, além da predação por NFHs e o possível ataque de
bacteriófagos, o desprendimento das células bacterianas para o meio também pode ser
responsável por essa diferença (Worm e Søndergaard 1998).
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Os valores de produção, assim como as densidades obtidas para bactérias livres
foram maiores do que aqueles obtidos para as aderidas. Contudo, com relação à
produção por célula não foram encontradas diferenças significativas entre aderidas e
livres, o que indica que não há diferenças significativas na taxa de crescimento entre as
bactérias dessas duas frações. Isso se deve provavelmente ao fato de que na cultura não
há limitação de nutrientes para as bactérias livres, o que é normalmente sugerido como
um dos fatores responsáveis pela menor produção destas em relação às bactérias
aderidas no ambiente (Azam et al. 1993, Regali-Seleghim 2001). Alldredge et al.
(1986) também não encontraram diferenças na produção entre células bacterianas livres
e aderidas a agregados marinhos, quando ocorreram diferenças, a incorporação de
timidina foi maior para as livres.
Entre as bactérias livres, a densidade foi bastante alta mesmo em baixas
concentrações de COB (fração do carbono orgânico menor do que 20µm), por exemplo,
3mg de C/L até o 20º dia de cultivo, foi capaz de suportar o crescimento, em média, de
1,23 x 10
7
bactérias/mL (e de 3,95 x 10
3
flagelados/mL), que em ambiente natural
seriam consumidos por níveis tróficos superiores, o que demonstra a importância da
excreção desses carboidratos para a rede trófica microbiana nesses sistemas.
Paerl (1992) relata que há uma grande variedade de protozoários colonizadores
em agregados e colônias durante os períodos de crescimento máximo de algumas
cianobactérias (Microcystis, Gloeotrichia e Anabaena) e que na maioria dos casos, esses
protozoários parecem consumir exaustivamente as bactérias epibiontes. No entanto, ao
estimarmos o consumo de biomassa bacteriana (dados não apresentados) assumindo
uma taxa de predação por nanoflagelados para bactérias aderidas de 15
células.flagelado
-1
.hora
-1
para agregados saturados de bactérias (Kiørboe et al. 2003) e
uma taxa de filtração para bactérias livres de 10
5
unidades de volume celular do NFH
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por hora (Boenigk & Arndt 2000, Boenigk & Arndt 2002) que considera a densidade de
bactérias e o biovolume dos flagelados nas culturas, os resultados revelam que o
impacto da predação sobre as bactérias aderidas é significativamente menor do que
sobre as bactérias livres no presente trabalho. Artolozaga et al. (2002) mostraram que há
menor influência da predação de NFHs sobre bactérias aderidas do que sobre as
bactérias livres.
Além disso, a menor influência dos NFHs sobre as bactérias aderidas pode ser
apoiada pelos dados de densidade bacteriana, uma vez que as diferenças entre as
réplicas foram menores entre as aderidas do que entre as livres e pelos dados de
mudanças morfológicas, apresentados nos gráficos de morfotipos e separação das
bactérias por classes de tamanho (seções 4.1.3 e 4.1.4). Entre as várias mudanças
fenotípicas nas populações bacterianas submetidas à predação por flagelados é freqüente
a redução e/ou aumento no tamanho das células (Pernthaler 2005, Hahn et al. 1999,
Hahn & Höfle 1999) levando a uma seleção disruptiva, ou seja, com fenótipos
extremos.
Os dados mostram ainda a maior influência dos flagelados na réplica 1, com
aumento da freqüência de bactérias livres filamentosas, característica observada por
Hahn et al. (1999) em bactérias sob predação por flagelados, e com diminuição na
freqüência das classes de tamanho intermediário (Pernthaler et al. 1996). Pernthaler et
al. (1996) sugeriram que as bactérias com comprimento menor do que 0,4µm são
fracamente afetadas pela predação de protistas, enquanto que bactérias entre 0,4 e
1,6µm de comprimento são vulneráveis, entre 1,6 e 2,4µm são suprimidas e as maiores
do que 2,4µm são resistentes à predação por protistas. Essa seleção disruptiva ficou
evidente apenas entre as bactérias livres da réplica 1 (Figura 15), na qual pôde ser
observado também que há diferenças na predação das bactérias dentro da classe de
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comprimento de 0,4 a 1,6µm proposta por Pernthaler et al. (1996). Na réplica 1 as
bactérias de tamanho entre 1,2 e 1,6 µm tiveram menor freqüência ao final do
experimento, enquanto a freqüência das bactérias entre 0,4 e 1,2µm aumentou.
Na cultura 2 as diferenças nos tamanhos ao longo tempo foram mais discretas do
que na cultura 1, possivelmente devido à menor densidade de flagelados e menor
biovolume destes, mas as bactérias podem ter também usado de outros mecanismos de
proteção contra a predação dos NFHs, como mudança nos padrões de mobilidade,
excreção de compostos tóxicos (Pernthaler 2005) que não puderam ser detectados neste
trabalho.
Apesar das diferenças entre as réplicas nas curvas produção e biomassa
bacterianas e das diferenças nos morfotipos e tamanhos (comprimento) das bactérias,
não houve diferenças significativas na diversidade das bactérias associadas à cápsula de
A. spiroides entre as duas réplicas. Ocorreram apenas diferenças pontuais, ou seja,
quando comparadas amostras do mesmo dia, mas não quando comparadas as fases de
crescimento da cianobactéria. Desta forma, se a presença desses predadores alterou
quantitativamente a diversidade bacteriana (Jürgens & Matz 2002), isso ocorreu de
forma semelhante nas duas culturas.
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6. Conclusões
A partir do pool de bactérias presentes na cultura há uma seleção das bactérias
que se associam à cápsula de A. spiroides, uma vez que foi observado menor número de
espécies entre as bactérias aderidas do que entre as livres. Além disso, ocorreu uma
sucessão das bactérias aderidas, com mudança da comunidade bacteriana no final da
fase de crescimento exponencial e início da fase de senescência das culturas de A.
spiroides.
Em relação à produção bacteriana por célula, não houve diferenças significativas
entre bactérias livres e aderidas em cultura, possivelmente devido à alta concentração de
nutrientes disponível nas duas frações (livre e aderida).
A fração menor do que 1,2µm da água de Barra Bonita (ou seja, o inóculo
bacteriano, que possivelmente inclui cianófagos), acelera a morte da cultura de A.
spiroides. O efeito do inóculo é mais rápido quando este é adicionado em culturas na
fase estacionária de crescimento do que no início do cultivo, mostrando maior
susceptibilidade de células mais velhas.
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richness and reduce biomass accumulation of bacterioplankton in coastal marine
waters. Environ Microbiol 9:3008-3018
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ANEXO 1. Tentativas de axenização de A. spiroides
Foram realizadas quatro tentativas de axenização de A. spiroides, no entanto,
não obtivemos o resultado esperado. Foram testados os seguintes métodos:
A. Obtenção de acinetos por sonificação (35 minutos) e congelamento dos
filamentos, múltiplas lavagens por centrifugação e exposição das células lavadas à
solução de Dakin (1mL para 40 mL de cultura) em diferentes tempos (1, 12, 15 e 17
minutos). Não foi observado crescimento após a inoculação de frações das suspensões
dos acinetos em tubos de ensaio com meio de cultura.
B. Isolamento de células vegetativas após leve sonificação (2 minutos) para
retirada da cápsula seguida de lavagens por centrifugação. Foram isolados 30
células/fragmentos de filamentos em 30 tubos com meio ASM-1, apenas 3 cresceram,
não axênicos. Foram feitas lâminas utilizando coloração de Gram com as bactérias
livres no meio e foram identificadas bactérias Gram-positivas e Gram-negativas.
C. Utilização de antibiótico para bactérias Gram-positivas. As células foram
lavadas por centrifugação, inoculadas em tubos com diferentes concentrações do
antibiótico despacilina (16; 7,25; 3,8; 2 e 0,05 U/mL). Não foi observado crescimento
de A. spiroides.
D. Isolamento de colônias em meio sólido (ASM1 + Tris pH 7,0 com 1,5% de
Agar). A partir de células lavadas por centrifugação, foram feitas várias diluições em
tubos de ensaio. Uma pequena alíquota foi inoculada e espalhada sobre meio em placa
de Petri. Não houve crescimento de colônias de A. spiroides.
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ANEXO 2. Purificação do DNA com Polietilenoglicol (PEG) 8000 para
seqüenciamento (Dr. Iderval da Silva Junior Sobrinho, comunicação pessoal).
Solução de PEG : 20% de Polietilenoglicol 8000 e NaCl com concentração final de 1M
Precipitação do DNA
1. Acrescentar igual volume de solução de PEG e amostra. Homogeneizar
imediatamente.
2. Levar a banho-maria por 37-40ºC por 15 minutos.
3. Centrifugar a 16000 xg por 15 minutos.
Lavagem do material
4. Retirar o sobrenadante com uma pipeta. Descartar o sobrenadante.
Obs.: cuidado para não tocar o fundo ou as laterais do tubo. Retirar lentamente.
5. Adicionar lentamente, escorrendo pela parede do tubo, 125 µL de etanol 80%
gelado.
6. Centrifugar a 16000 xg por 2 minutos
7. Retirar lentamente o sobrenadante com uma pipeta. Descartar o sobrenadante.
Obs.: mesmos cuidados tomados no passo 4.
8. Repetir passos 5 a 7.
Nota: no último passo (retirada do sobrenadante) deixar aproximadamente 5-10
µL do sobrenadante (etanol 80%), pois neste ponto o precipitado está mais solto.
Secagem
9. Secar em estufa a 37ºC por aproximadamente 30 minutos à 1 hora. Olhar
periodicamente para não deixar os tubos secarem em excesso. Ou
9’. Secar em banho-maria aberto a 50ºC por 5 minutos.
10. Adicionar água ou tampão. Sugestão 12 a 20 µL.
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