UNIVERSIDADE DO EXTREMO SUL CATARINENSE

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE

GABRIELA ACORDI DA SILVA

CRICIÚMA, JUNHO DE 2008.

http://www.livrosgratis.com.br

GABRIELA ACORDI DA SILVA

Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa

de Pós-Graduação em Ciências da Saúde para

obtenção do título de Mestre em Ciências da Saúde.

Orientadora: Prof.ª Dr. Vanessa Moraes Andrade

Co-orientador:P Prof. Dr. Emílio Luiz Streck

RESUMO

Desde os tempos imemoráveis, os homens buscam na natureza recursos para melhorar

suas próprias condições de vida, tornando-se a utilização de plantas medicinais uma

prática generalizada na medicina popular. Vários estudos já demonstraram importantes

efeitos biológicos da Mikania laevigata, popularmente conhecida como guaco e utilizada

na medicina popular brasileira para o tratamento de doenças respiratórias. No entanto,

pouco se sabe sobre seus efeitos em nível genético. Dessa forma, estudos de

antigenotoxicidade podem ajudar a avaliar a segurança e a efetividade desta planta.

Nesse trabalho, foi avaliado o efeito antigenotóxico do pré-tratamento com extrato de

Mikania laevigata (MLE) em ratos submetidos a uma instilação traqueal aguda de pó de

carvão. Para esta avaliação foram utilizados os testes de Micronúcleos e Ensaio Cometa

(0,3mL) diretamente nos pulmões (grupos 1 e 3). Quinze dias após a instilação do pó de

carvão mineral, os animais foram sacrificados e tiveram o fêmur, o fígado e sangue

apresentou atividade antigenotóxica neste modelo experimental de inflamação pulmonar

induzida pelo carvão mineral. Posteriores investigações farmacológicas e bioquímicas

bem como investigações sobre a antigenotoxicidade numa exposição crônica devem ser

feitas com o intuito de elucidar os mecanismos de ação do extrato desta planta.

Palavras- Chave: carvão mineral, Mikania laevigata, guaco, dano em DNA, Ensaio

Cometa, Teste de Micronúcleos.

In memorable times, men seek in nature resources to improve their conditions of life,

becoming the use of herbal medicine in a popular widespread practice. Several studies

report important biological effects of Mikania laevigata, popularly known as “guaco”, used

in Brazilian folk medicine for respiratory diseases. However, little is known about its

genetic effects. In this manner, anti-genotoxicity studies can help assess the safety and

effectiveness of this plant. In this work, the antigenotoxic pre-treatment effect of Mikania

dust (3 mg/0.3 mL saline) (groups 2 and 4) or saline solution (0.3 mL) (groups 1 and 3)

were administered directly in the lung by intratracheal administration. Fifteen days after

coal dust or saline instillation, the animals were killed and have the femur, liver and

peripheric blood removed. The results shown that MLE have not present antigenotoxic

activity in this animal model of lung inflammation induced by coal dust exposure. Further

pharmacological and biochemical investigations as well as antigenotoxic studies after

chronic exposition to coal mineral dust are necessary to elucidate the mechanisms of

action of this extract.

Key-words: coal dust; Mikania laevigata; Guaco; DNA damage, Comet assay,

1INTRODUÇÃO…………………………………………………………………........................6

1.1 Carvão …………………………………………………………….....................…………….6

1.2 Impactos Sócio-ambientais.........................................................................................7

1.3 Carvão e Doenças Pulmonares...................................................................................8

1.4 Etnofarmacologia........................................................................................................10

1.6 Genotoxicidade e Mutagênese..................................................................................14

1.6.1 Genotoxicidade Associada ao Uso do Carvão ....................................................15

2 OBJETIVOS....................................................................................................................20

2.1 Objetivo geral..............................................................................................................20

2.2 Objetivo específico.....................................................................................................20

3 RESULTADOS …………………………………………………………………………….......21

ARTIGO: Antigenotoxic investigation of Mikania laevigata extract on DNA damage

caused by acute coal dust exposure ………….……………………….……………………22

4 DISCUSSÃO....................................................................................................................43

REFERÊNCIAS BIBLIOGRAFICAS…………………………………………………………...50

1 INTRODUÇÃO

1.1 Carvão

A formação do carvão se dá pela transformação da parte celulósica da

vegetação que sofre a ação do tempo, pressão, de agentes anaeróbicos e bactérias

(Silva, 1999).

Sabe-se que 90% das reservas mundiais de carvão mineral, estão localizadas

no hemisfério norte (Brack, 2003). Já no Brasil, as maiores reservas estão localizadas nos

estados do Rio Grande do Sul, Santa Catarina, Paraná e São Paulo (Brack, 2003).

O carvão é uma das matérias primas mais utilizadas como fonte de energia, o

que torna a caracterização e a estimativa de riscos de extrema importância para o seu

uso mais seguro. Os combustíveis de origem orgânica são hoje, não somente a principal

fonte de energia da moderna sociedade tecnológica (Zahrzewski, 1991), mas também a

por meio da combustão. Novas tecnologias para a utilização do carvão, mais eficientes e

ambientalmente corretas serão cada vez mais requeridas no futuro, fazendo-se

necessário um aprofundamento do conhecimento do carvão em termos de sua estrutura,

comportamento e potencialidade. Mas o problema atual e premente é determinar os riscos

decorrentes do intenso uso dos combustíveis fósseis, para que se possa minorar os seus

efeitos nocivos.

Segundo Zahrzewski (1991) o carvão é o maior poluente de todos os

combustíveis, seus agentes poluentes principais são dióxido de enxofre e particulados. A

queima do carvão, para a obtenção de energia, produz liberação de dióxido de enxofre e

outros SO

x

, os quais combinados com água da atmosfera imediatamente formam ácido

sulfúrico, a causa das chuvas ácidas. Além disto, possui efeitos danosos aos organismos,

principalmente ao sistema respiratório.

1.2 Impactos Sócio-ambientais

A mineração causa impactos socioambientais afetando o solo, o relevo e os

Neste sentido, com a drenagem das minas, realizada por bombas, são

lançadas no ambiente águas sulfurosas, que ocasionam a redução do pH do local e a

elevação nas concentrações de ferro e sulfatos (Costa, 2004). Com isto, ocorre o

acúmulo de pirita, silito e folhetos nas áreas e águas vizinhas. Os rejeitos percolados

pelas águas ocasionam a lixiviação de componentes tóxicos, contaminando os lençóis

freáticos. A coquefacção, ou seja, o aquecimento do carvão na ausência do ar a uma

temperatura acima de 900° C, com o intuito de extrair os produtos de decomposição

gasosos e líquidos, forma novos depósitos cobrindo muitos hectares de terras cultiváveis

(White e Claxton, 2004). Conforme Faccini e Leite (2001) os maiores problemas

ocasionados pelo carvão no Brasil, encontram-se na região Sul, sendo Criciúma e

da mineração. Na cidade de Siderópolis os rejeitos das minas ocupam grande parte dos

Os gases emitidos com a queima do carvão em indústria termoelétricas, dos

quais pode-se destacar dióxido de enxofre (SO2) e os óxidos de nitrogênio (NOx) além

de prejudiciais à saúde humana são responsáveis pela chuva ácida que provoca a acidez

do solo, ocasionando assim outros impactos negativos como a corrosão de estruturas

metálicas e modificações na biodiversidade do local (Silva, 1999).

1.3 Carvão e Doenças Pulmonares

15

linhagens celulares derivadas de um mesmo zigoto, sendo que o grau desse ultimo

dependerá do período de desenvolvimento em que as mutações ocorreram (Burns e

Bottino, 1991; Borges-Osório e Robinson, 2001).

Novas pesquisas sobre genotóxicidade e antigenotoxicidade poderiam vir a

corroborar na avaliação da efetividade de algumas substâncias aiticarcinogênicas,

incluindo a grande variedade encontrada em plantas usadas na medicina popular. das

várias plantas utilizadas na medicina popular. Contudo, os mecanismos específicos

propriamente ditos da ação de anticarcinógenos, como por exemplo , fitquímicos ainda

encontram-se obscuros (Paoline e Nestlé, 2003).

Com isso o presente estudo buscou elucidar certamente esses mecanismos

verdadeiros agentes terapêuticos eliminando assim estudos controversos e vieses sobre

Devido a sua composição, o carvão e derivados bem como atividades

correlacionadas vêm sendo alvo de muitas pesquisas. Em estudo realizado com

trabalhadores de minas de carvão a céu aberto, bem como com aqueles de escavações,

se demonstrou aumento no índice de aberrações cromossômicas nos linfócitos da

corrente sanguínea (Srám et al., 1985; Agostini et al., 1996). Também foi observada

indução de aberrações cromossômicas em trabalhadores de usinas termelétricas, que

utilizam o carvão como fonte de energia (Srám et al., 1985). Neste mesmo ambiente da

16

obtendo resultado positivo em relação a danos no DNA (Verschaeve & Gilles, 1995).

Assim como estes trabalhos, muitos outros vêm demonstrando o efeito danoso do carvão

e seus derivados, nas mais diversas linhagens de células (Léonard et al., 1984; Granella

& Clonfero, 1992; Gu et al., 1992; Stierum et al., 1993).

1.7 Metodologias Utilizadas neste Estudo para Avaliação Genotóxica

de quebras no DNA com a utilização de poucas células e corresponde a um ensaio

citogenético. As vantagens dessa técnica incluem a sensibilidade na detecção de dano no

17

A técnica do Ensaio Cometa consiste em obter, a partir de células

individualizadas, colocadas em agarose, lisadas, submetidas à eletroforese e coradas,

uma matriz com um halo fluorescente, formado por DNA não danificado e que não migrou.

Células com DNA danificado formam um cometa, consistindo de uma cabeça (matriz

nuclear) e uma cauda (DNA quebrado). A extensão do DNA que migrou está

correlacionado com o dano ocorrido (Tice et al., 2000) (Figura 2).

1.7.2 Teste do Micronúcleo

Os micronúcleos (MN) são pequenos corpúsculos similares em estrutura ao núcleo

18

para se formar um completo envelope nuclear em torno dele (Alberts e cols., 1989). Por

esta característica, qualquer fragmento ou cromossomo(s) inteiro(s) separados do núcleo

principal, formam um pequeno núcleo, que é denominado de micronúcleo. Os eritrócitos,

células abundantes na medula óssea e sangue periférico de mamíferos, são

particularmente propícios por sua alta rotatividade, ausência de núcleo e possibilidade de

diferenciar eritrócitos jovens pela presença de RNA (Wild, 1978). O eritrócito recém-

formado contém RNA ribossomal, responsável pela síntese das hemoglobinas. Devido a

isso, pode ser corado diferencialmente com corante para ácidos nucléicos, como por

exemplo, o Giemsa, sendo desta forma, denominados de eritrócitos policromáticos (EPC).

Este tipo celular jovem pode permanecer estável por mais ou menos 24 horas após a

denominados de normocromáticos (ENC), por apresentarem quase apenas hemoglobina

A análise de EPC tanto na medula óssea como no sangue periférico é igualmente

aceita para as espécies nas quais o baço não remova os eritrócitos micronucleados

(Asanami et al., 1995). Como conseqüência para as espécies onde isto ocorre, pode-se

visualizar MNs no baço, cujo tecido para os testes de MNs é tão efetivo quanto o da

medula óssea (Krishna et al., 1994). Os ENC são também aceitos para análise de MN

quando a duração da exposição aos agentes excede quatro semanas, uma exposição

crônica (Hayashi et al., 1994).

19

detectar danos citogenéticos por testes convencionais é a dietilnitrosamina. Esta droga

produz aberrações cromossômicas, micronúcleos e câncer no fígado, mas não é

detectada pelo Teste de Micronúcleos na medula óssea (Heddle et al., 1983; Tates et al.,

1980). Com base na insuficiente sensibilidade do Teste de Micronúcleos na medula

óssea, é cada vez mais freqüente o número de trabalhos que realizam juntamente a este

teste outras avaliações adicionais em tecidos específicos, considerados tecidos alvos.

Classificações histológicas das lesões também vem sendo freqüentemente utilizadas, no

intuito de correlacionar a genotoxicidade e a carcinogenicidade.

20

doenças relacionadas ao pulmão, objetivando a melhoria da qualidade de vida dos

pacientes.

2 OBJETIVOS

2.2 Objetivo específico

aguda de carvão através dos testes de Micronúcleos e Ensaio Cometa.

21

3 RESULTADOS

Artigo

Antigenotoxic investigation of Mikania laevigata extract on DNA damage caused by acute

T.P. Freitas

a

, V.D. Heuser

b

, P. Tavares

c

, D.D. Leffa

c

c

, E.L. Streck

a

, V.M. Andrade

c*

Enviado para publicação na revista Archives of Environmental Contamination and

22

Antigenotoxic investigation of Mikania laevigata extract on DNA damage caused by acute

a

Laboratório de Fisiopatologia Experimental,

Universidade do Extremo Sul Catarinense, Criciúma, SC, Brazil;

b

Institute of Environmental Medicine, Division of Biochemical Toxicology, Karolinska

Institutet, Box 210, S-17177 Stockholm, Sweden;

c

Laboratório de Imunologia e Mutagênese, Programa de Pós-Graduação em

Ciências da Saúde, Universidade do Extremo Sul Catarinense, 88806-000 Criciúma, SC,

Universidade do Extremo Sul Catarinense, Criciúma, SC, Brazil.

*Corresponding author

E-mail address: vmoraesdeandrade@yahoo.com.br

23

In the present paper, we report data on the possible antigenotoxic activity of

Comet assay and Micronucleus test in peripheral blood, bone marrow and liver cells of

Wistar rats. The animals were pre-treated for two weeks with saline solution (groups 1 and

2) or MLE (100 mg/kg) (groups 3 and 4). On the 15

day, the animals were anesthetized

with ketamine (80 mg/kg) and xylazine (20 mg/kg) and gross mineral coal dust (3 mg/0.3

mL saline) (groups 2 and 4) or saline solution (0.3 mL) (groups 1 and 3) were administered

directly in the lung by intratracheal administration. Fifteen days after coal dust or saline

Micronucleus test.

24

1. INTRODUCTION

Significant exposure to coal dust may occur especially during underground coal

mining. Inhalated coal dust can deposit in lungs and can lead to the development of

several diseases in exposed workers (Donbak et al. 2005). The coal dust exposure can

cause coal workers’ pneumoconiosis, a disease characterized by coal dust deposition in

the lungs, massive mononuclear cells infiltration and progressive fibrosis induced by

activated cells (Cohen and Velho, 2002). Pleural abnormalities, emphysema, chronic

bronchitis, silicosis, and accelerated lung function loss in ex-coal-workers have also been

reported (Meijers et al. 1997, Ross, 2004).

parameters of oxidative damage in pulmonary function of rats are altered following

for lung cancer in coal miners (Borm and Tran, 2002). Concerning the genotoxic effect of

coal dust, numerous in vivo and in vitro investigations have been carried out. A cytogenetic

study was carried out on a group of workers from a coal mine in Turkey to investigate the

genotoxic risk of occupational exposure to coal mine dust. The results of this study

demonstrated that occupational exposure to coal mine dust leads to a significant induction

of cytogenetic damage in peripheral lymphocytes of workers engaged in underground coal

mining (Donbak et al. 2005). Furthermore, other studies using rodents as bioindicators

have also shown positive results regarding genotoxicity of coal (Silva et al. 2000a, 2000b,

Leon et al. 2007).

31

breaks on the first post-operative hours could be related to the early phase of cell death. It

is clear that surgical stress is associated with a greatly enhanced of burst oxidative activity

of neutrophils which, during the inflammatory response, leads to further production of ROS

(Simms and D’Amico, 1997). In general way, 24h after the treatment was observed a

decrease in DNA damage values detected by Comet assay, and this value decrease even

more after 14 days after the instillation. So we can think that the real basal DNA damage

could be observed at 14 days after treatment, because no surgery or anaesthesia was

made (Table 1, Fig. 1). Probably the coal was removed shortly from the blood like

suggested in Fig. 2.

In the present work we also measured DNA damage in blood leukocytes, bone

just the DF in liver cells obtained from saline + coal and MLE + saline groups has shown

as bone marrow 14 days after intratracheal instillation of coal dust. This observation agree

with the fact that the liver is one of the principal sites of mixed-function oxygenases, which

metabolize a variety of organic compounds to more polar by-products that can either react

with macromolecules or be eliminated. Higher levels of organic contaminants, such as

polycyclic aromatic hydrocarbons, have been associated with higher enzymatic activity in

these tissues (Zitko et al, 1998; Silva et al., 2000c).

Smears for the MN assay were made with the same blood samples used for the

Comet assay. The MN data are also summarized in Table 1. No significant differences

between treatment groups were observed. However, a little but not significant decrease

32

was observed in the PCE/NCE ratio at 14 days in the groups that have received coal dust