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UNIVERSIDADE DO EXTREMO SUL CATARINENSE – UNESC
UNIDADE ACADÊMICA DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE
ADALBERTO ALVES DE CASTRO
ESTUDO DOS EFEITOS DO NEUROPEPTÍDEO S NA ATIVIDADE
LOCOMOTORA E EM PARÂMETROS DE ESTRESSE OXIDATIVO EM
CAMUNDONGOS
CRICIÚMA, JULHO DE 2008
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1
ADALBERTO ALVES DE CASTRO
ESTUDO DOS EFEITOS DO NEUROPEPTÍDEO S NA ATIVIDADE
LOCOMOTORA E EM PARÂMETROS DE ESTRESSE OXIDATIVO EM
CAMUNDONGOS
Dissertação apresentada ao curso de pós-graduação em
ciências da saúde, como requisito parcial à obtenção do
título de mestre em Ciências da Saúde.
Orientador(a): Profª. Drª. Elaine C. Gavioli
Co-orientador: Prof. Dr. João Quevedo
CRICIÚMA, JULHO DE 2008
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AGRADECIMENTOS
À Prof(a). Dr(a). Elaine Cristina Gavioli minha orientadora, pelos ensinamentos deixados
em minha memória durante toda orientação do trabalho, os quais podem ser traduzidos em
palavras simples como respeito, dedicação e amizade; e que com certeza irei carregar ao longo
de minha vida.
Ao Prof. Dr. João Luciano de Quevedo meu co-orientador, pelo apoio, caráter, amizade e
principalmente por ter aberto as portas do Laboratório de Neurociências para que pudesse dar
início ao desenvolvimento em uma nova etapa de minha vida.
À Prof(a). Dr(a). Tatiana Barichello, uma das grandes incentivadoras para o meu ingresso
no âmbito da pesquisa.
À Prof(a). Dr(a). Carina Rodrigues Boeck e Prof(a). Dr(a). Alexandra Ioppi Zugno pelo
conhecimento, sinceridade e amizade depositados sobre a minha pessoa; exemplos estes que
guardarei e procurarei seguir durante todos os dias.
À minha família, meu pai Airto Antonio de Castro, minha mãe Maria Gorete Alves de
Castro, e minha irmã Katiuce Alves de Castro, os meus maiores incentivadores. Pelos momentos
que não estive presente, devido á correria de experimentos durante a semana e inclusive finais de
semana.
À minha querida namorada Marcela F. Lichtenfels, que por muitas vezes me escutou e
incentivou nos momentos críticos com muitas palavras amigas.
Aos meus excelentes colegas de laboratório Morgana Moretti, Tiago Casagrande e Gisele
de Chaves os quais acabei aprendendo e socializando conhecimentos novos.
Aos demais professores e colegas do Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde
(PPGCS), pelo conhecimento e amizade que serão levados ao longo da vida.
Muito Obrigado a todos!!!
3
RESUMO
O neuropeptídeo S (NPS) é um peptídeo composto por 20 aminoácidos. Este é o ligante
endógeno de um receptor acoplado à proteína G, denominado de NPSR. O NPS produz um
comportamento com propriedade única: efeito do tipo estimulante e ansiolítico. O objetivo deste
estudo é comparar os efeitos comportamentais e bioquímicos do NPS com a anfetamina
(AMPH), um fármaco psicoestimulante, o diazepam (DZP), um ansiolítico clássico. Além disso,
este estudo comparou os efeitos da administração de NPS com o lítio (100 mg/kg, IP) e/ou
valproato (200 mg/kg, IP), fármacos estabilizadores do humor e com reconhecida atividade
neuroprotetora. Para atingir este objetivo, camundongos foram tratados agudamente com NPS
(0,01; 0,1 e 1 nmol, ICV), AMPH (2 mg/kg, IP) e DZP (1 mg/kg, IP) os efeitos comportamentais
foram avaliados na caixa de monitoramento da atividade locomotora. A administração de NPS
0,1 nmol e AMPH, mas não o DZP, aumentou a distância percorrida pelos animais comparada ao
grupo controle, sugerindo que o NPS produz um efeito comportamental semelhante à AMPH.
Em parâmetros bioquímicos de dano oxidativo, tais como peroxidação lipídica (TBARS) e
carbonilação de proteínas os dados mostraram que a AMPH aumentou a formação de proteínas
carbonil no cerebelo e estriado, mas não causou alteração significativa na peroxidação lipídica
nas estruturas cerebrais analisadas. A administração de DZP elevou os níveis de TBARS no
córtex e cerebelo, mas não afetou a formação de proteínas carboniladas no cérebro dos
camundongos. Ao contrário da AMPH e do DZP, o NPS em diferentes doses reduziu a formação
de proteínas carbonil no cerebelo e estriado. Adicionalmente, redução nos níveis de TBARS
também foi observada no córtex de camundongos tratados com NPS. No segundo estudo,
visando fazer uma comparação entre os efeitos bioquímicos produzidos pelo lítio, valproato e
NPS observou-se que o NPS e o lítio reduziram os níveis de TBARS no cerebelo, estriado e
hipocampo, além de reduzirem os níveis de proteínas carboniladas no cerebelo. O valproato, por
sua vez, reduziu os níveis de TBARS e proteínas carboniladas apenas no cerebelo. Por fim,
visando estudar os mecanismos pelos quais o NPS produz este efeito protetor contra danos em
lipídeos e proteínas neuronais, o presente estudo avaliou a atividade das enzimas antioxidantes
(catalase, CAT e superóxido dismutase, SOD) em diferentes estruturas cerebrais (córtex,
cerebelo e estriado) de camundongos tratados com NPS, AMPH e DZP. O tratamento com
AMPH aumentou significativamente a atividade da SOD no estriado, porém nenhuma alteração
foi observada na atividade da CAT. O DZP não alterou a atividade da CAT e SOD nas estruturas
cerebrais analisadas. O tratamento com NPS em baixas doses (0.01 e 0.1 nmol) reduziu a
atividade da SOD no córtex e cerebelo e aumentou a atividade da CAT (somente 0.01 nmol) no
córtex. Esses dados sugerem que apesar das semelhanças comportamentais existentes entre a
AMPH e o NPS, o NPS reduziu o dano oxidativo em lipídeos e proteínas no cérebro, semelhante
ao lítio, enquanto a AMPH causou elevação dos parâmetros analisados. Os efeitos aqui relatados
para o NPS constituem-se as primeiras evidências sobre um possível papel desempenhado por
este novo sistema peptidérgico na modulação do estresse oxidativo e dos danos neuronais.
Palavras-chaves: Neuropeptideo S (NPS), atividade locomotora, estresse oxidativo, catalase,
superóxido dismutase, estabilizadores do humor
4
ABSTRACT
Neuropeptide S (NPS) is a 20 amino acid peptide which is the endogenous ligand of a G protein-
coupled receptor named NPSR. NPS produces quite unique behavioral properties: stimulant and
anxiolytic-like effects. On this base, current study aimed to compare behavioral and biochemical
effects of NPS with a standard psychostimulant drug amphetamine (AMPH), and with a classical
anxiolytic drug diazepam (DZP). To this aim, the effects of acute treatment with NPS (0.01, 0.1
and 1 nmol, ICV), AMPH (2 mg/kg, IP) and DZP (1 mg/kg, IP) was assessed on spontaneous
locomotor activity, and on oxidative stress parameters, such as lipid peroxidation (TBARS),
protein carbonyl formation, and antioxidant enzymes activity (catalase, CAT, and superoxide
dismutase, SOD) in distinct mouse brain structures (i.e. cortex, cerebellum, and striatum). The
effects of NPS, lithium and valproate on lipid peroxidation and protein carbonyl formation were
assessed in distinct mouse brain structures: cerebellum, striatum, cortex and hippocampus. The
administration of 0.1 nmol NPS and AMPH, but not DZP, increased distance traveled compared
to control group assessed for 30 min. Biochemical analyzes revealed that AMPH increased
protein carbonyl formation in cerebellum and striatum, but no signs of lipoperoxidation was
observed in the brain structures analyzed in this study. The administration of DZP induced lipid
peroxidation in cortex and cerebellum, but it did not affect protein carbonyl formation in mouse
brain. In contrast with AMPH and DZP, NPS at distinct doses reduced protein carbonyl
formation in the cerebellum and striatum. Additionally, a reduction of lipid peroxidation levels
was also observed in the cortex of mice treated with NPS. Biochemical analyzes revealed that
NPS and lithium reduced thiobarbituric reactive species (TBARS) formation in cerebellum,
striatum and hippocampus. Valproate reduced TBARS levels only in cerebellum. No alterations
in lipid peroxidation were observed in the cortex after all treatments. Additionally, the treatment
with NPS, lithium and valproate reduced proteins carbonyl formation in cerebellum. Neither
NPS nor valproate altered carbonylated protein content in cortex, hippocampus and striatum.
Regarding the antioxidant enzymes activity, the treatment with AMPH significantly increased
SOD activity in the striatum, while no alterations were observed for CAT activity. DZP did not
affect CAT and SOD activity in any brain structure analyzed. The treatment with NPS at low
doses (0.01 and 0.1 nmol) reduced SOD activity in the cortex and cerebellum, and increased
CAT activity (at 0.01 nmol) in the cortex. These data suggest that besides behavioral similarities
between AMPH and NPS, NPS reduced oxidative stress damage in the brain. However, these
protective effects of NPS do not appear to be related to the reduction of SOD activity since
inhibition of this enzyme contributes to generation of free-radical species. These observations
provide the first evidence of a putative role played by this novel neuropeptidergic system in
oxidative stress and brain injury.
KEY-WORDS: neuropeptide S; locomotor activity; oxidative stress; catalase; superóxido
dismutase; mood stabilizers
5
LISTA DE ABREVIATURAS
AMPH – D-Anfetamina
ATP – Adenosina Tri-fosfato
CAT – Catalase
DNA – Ácido Desoxirribonucléico
DZP – Diazepam
ERO – Espécies Reativas ao Oxigênio
ERN – Espécies Reativas ao Nitrogênio
GPx – Glutationa peroxidase
GABA – Ácido γ - aminobutírico
H
2
O
2
– Peróxido de Hidrogênio
I.C.V. – Intracerebroventricular
I.P. – Intraperitonial
NPS – Neuropeptídeo S
NPSR – Receptor do Neuropeptídeo S
NMDA – N-metil-D-aspartato
MDMA - Metilenodioximetanfetamina
O
2
· - Ânion Superóxido
O
2
- Oxigênio
OH· – Radical Hidroxil
RNAm – Ácido Ribonucléico Mensageiro
SNC – Sistema Nervoso Central
SOD – Superóxido Dismutase
TBARS – Espécies Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico
6
SUMÁRIO
AGRADECIMENTOS ................................................................................................ 2
RESUMO ...................................................................................................................... 3
ABSTRACT .................................................................................................................. 4
LISTA DE ABREVIATURAS .................................................................................... 5
1. INTRODUÇÃO ........................................................................................................ 7
Neuropeptídeo S (NPS) ................................................................................................ 7
Drogas neurodegenerativas e neuroprotetoras ....................................................... 10
Relação entre Espécies Reativas ao Oxigênio e Dano Oxidativo ........................... 14
2. OBJETIVOS: ......................................................................................................... 18
Objetivo Geral: ........................................................................................................... 18
Objetivos Específicos: ................................................................................................ 19
3. ARTIGOS ............................................................................................................... 20
ARTIGO 1 - (Pharmacology, Biochemistry and Behavior) ........................................ 20
ARTIGO 2 - (Neuroscience Letters)............................................................................ 45
4. DISCUSSÃO ........................................................................................................... 57
5. CONCLUSÃO ........................................................................................................ 67
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................. 68
7
1. INTRODUÇÃO
Os neurotransmissores são moléculas químicas liberadas pela terminação nervosa que
tem por função promover a comunicação entre as células neuronais. Na célula pós-sináptica, o
neurotransmissor alcança seus receptores e interage com eles, estimulando ou inibindo essa
segunda célula. Desde a descoberta da transmissão sináptica química, os estudos tem se voltado
para a identificação de neurotransmissores no sistema nervoso. A compreensão atual é de que a
maioria dos neurotransmissores situa-se em três categorias: (1) aminoácidos, (2) aminas e (3)
peptídeos. Os neurotransmissores aminoácidos e aminas são pequenas moléculas orgânicas com
pelo menos um átomo de nitrogênio armazenado e liberado de vesículas sinápticas. Os
neurotransmissores peptídicos constituem-se de grandes moléculas armazenadas e liberadas de
grânulos secretores. Os grânulos secretores e as vesículas sinápticas são observados com
freqüência nos mesmos terminais axonais. Os neurotransmissores peptídicos são comumente
encontrados em terminais axonais que contêm neurotransmissores aminas ou aminoácidos (Bear,
2002). Atualmente, são conhecidos mais de 100 peptídeos endógenos, sendo que muitos destes
possuem função biológica ainda pouco elucidada, dentre estes se destaca o neuropeptídeo S
(NPS).
Neuropeptídeo S (NPS)
O NPS é um peptídeo composto por 20 aminoácidos. Este peptídeo foi recentemente
reconhecido como o ligante endógeno de um receptor acoplado à proteína G, do tipo Gq,
denominado de receptor NPSR, que anteriormente era conhecido como receptor órfão GPR154
(Sato et al., 2002). Concentrações nanomolares de NPS produzem um aumento no trânsito
intracelular de Ca
2+
livre, aumento nos níveis de cAMP e estimulam a fosforilação de proteínas
8
quinases (Xu et al., 2004; Reinscheid et al., 2005a,b). Tanto o peptídeo NPS quanto o seu
receptor são expressos no cérebro de várias espécies de mamíferos (homem, chipanzé, cachorro,
rato, camundongo), apresentando homologia estrutural (SFRNGVGTGMKKTSFQRAKS)
elevada entre as espécies analisadas, o que indica a conservação deste sistema peptidérgico
durante a evolução das espécies (Reinscheid, 2007). Com o uso da técnica de hibridização in situ
foram reconhecidos os locais de expressão do NPS e do seu receptor NPSR no cérebro de ratos
(Xu et al., 2004). O RNAm do NPSR se expressa principalmente em áreas cerebrais envolvidas
com a modulação da ansiedade (complexo amigdalóide e hipotálamo), sono (tálamo, hipotálamo
e núcleo pré-óptico) e memória (regiões parahipocampais e córtex entorrinal) (Xu et al., 2004).
Por outro lado, o peptídeo NPS se encontra expresso em uma área muito mais restrita no SNC
comparado ao seu receptor NPSR, limitando-se praticamente ao lócus ceruleus, hipotálamo e
amígdala (Xu et al., 2004). A expressão de NPS e do seu receptor NPSR particularmente intensa
em áreas do sistema límbico aponta para a participação deste sistema peptidérgico na modulação
de transtornos afetivos.
Somente em 2004, foi publicado o primeiro estudo relatando os efeitos comportamentais
do NPS em camundongos. Neste estudo, Xu e colaboradores (2004) demonstraram que o
tratamento agudo com NPS em doses nanomolares induziu hiperlocomoção nos camundongos,
redução do tempo de sono e aumento do tempo de vigília, além de um efeito do tipo ansiolítico
avaliado em diversos testes comportamentais, tais como exploração ao campo aberto, caixa
claro-escuro, labirinto em cruz elevado e teste de esconder esferas (Xu et al., 2004).
De fato, estudos in vivo têm demonstrado que o sistema NPS-NPSR está envolvido no
controle de diferentes funções centrais que incluem estado de alerta (Xu et al., 2004), ansiedade
(Xu et al., 2004; Leonard et al., 2008; Rizzi et al., 2008), e drogas de abuso (Ciccocioppo et al.,
9
2007; Paneda et al., 2007). Diversos estudos mostraram que o tratamento com NPS reduziu a
ingestão de alimentos em ratos (Smith et al., 2006; Beck et al., 2005; Ciccocioppo et al., 2006) e
galinhas (Cline et al., 2007; Cline et al., 2008). No entanto, um único estudo demonstrou que em
ratos saciados, a administração I.C.V. de NPS aumentou a ingestão de alimentos comparados
com os animais controles (Niimi, 2006).
Recentemente, diferentes laboratórios demonstraram que a administração aguda de NPS
aumentou a locomoção de ratos e camundongos habituados e não habituados ao ambiente do
teste (Smith et al., 2006; Roth et al., 2007; Rizzi et al., 2008). De fato, Rizzi e colaboradores
(2008) mostraram que a administração I.C.V. de NPS na mesma faixa de dose (nmol) descrita
nos outros estudos causou hiperlocomoção em camundongos Swiss habituados e não-habituados
ao ambiente (Xu et al., 2004; Smith et al., 2006; Roth et al., 2007).
Poucos estudos estão disponíveis sobre os mecanismos pelos quais o NPS medeia os
efeitos comportamentais em roedores. Lage e colaboradores (2006; 2007) demonstraram que o
sistema NPS-NPSR pode ser regulado em resposta ao tratamento agudo e repetido com nicotina
e cafeína. Diante dos efeitos comportamentais induzidos pelo NPS, Koob e Greenwell, 2004
sugeriram que o NPS produz um padrão comportamental único, que associa efeito
psicoestimulante e ansiolítico. Estimulantes clássicos como anfetamina e cocaína induzem um
estado de atenção e causam supressão do sono, mas, ao mesmo tempo, promovem efeito
ansiogênico em roedores (Hascoet e Bourin, 1998; Paine et al., 2002). Por outro lado, fármacos
ansiolíticos clássicos como as benzodiazepinas (ex.: diazepam, alprazolam, etc) não afetam a
locomoção dos animais em doses ansiolíticas, mas tendem a inibir a atividade motora em doses
maiores (Chaouloff et al., 1997). Deste modo, pode-se concluir que o NPS produz um efeito
10
comportamental em roedores que é complexo e exclusivo, pois envolve a ação ansiolítica e
psicoestimulante (Reinscheid et al., 2005a).
Drogas neurodegenerativas e neuroprotetoras
Os psicoestimulantes do tipo anfetamínico são utilizados abusivamente no mundo inteiro,
e acabam trazendo enormes problemas econômicos e sociais. O uso desses agentes está
associado a numerosos problemas médicos e psicológicos, incluindo anormalidades
cardiovasculares e psicoses. Especificamente, estudos em roedores e primatas têm demonstrado
um déficit a longo-prazo de funções dopaminérgicas e serotonérgicas, incluindo transporte de
monoaminas, tirosina, na atividade da enzima triptofano hidroxilase, além de promover
degradação do terminal nervoso (Villemagne et al., 1998).
A anfetamina (AMPH) e seu isômero dextrógiro, ativo, dextroanfetamina, juntamente
com a metanfetamina e o metilfenidato, formam um grupo de fármacos com propriedades
farmacológicas muito semelhantes, que incluem as “drogas de rua”, como a MDMA ou
“ecstasy”. Todos esses fármacos atuam por liberar monoaminas das terminações nervosas no
cérebro. A noradrenalina e a dopamina constituem os mediadores mais importantes nesta
conexão (Rang et al., 2004).
A AMPH aumenta os níveis de dopamina na fenda sináptica através de um incremento na
liberação dos neurotransmissores pelos terminais dos neurônios pré-sinápticos (Jones et al.,1998;
Kokosha et al., 1998). A administração de AMPH aumenta a concentração de dopamina
intracelular via inibição da enzima transportadora (Brown et al. 2003). Com o aumento de
dopamina citoplasmática, a mesma é rapidamente metabolizada pela enzima monoaminoxidase
(MAO), resultando no aumento da produção de peróxido de hidrogênio (H
2
O
2
) e outras espécies
11
reativas de oxigênio (ERO) (Jones et al.,1998; Yamamoto e Zhu, 1998). Estudos indicam que a
AMPH também promove peroxidação lipídica e alteração na atividade das enzimas CAT e SOD
em estruturas cerebrais de ratos (Frey et al., 2006a,b). Por outro lado, o pré-tratamento com
antioxidantes atenuam os danos a macromoléculas induzidos pela AMPH (Shankaran et al.,
2001; Valvassori et al., 2008). Diante destes e outros achados da literatura, Brown e Yamamoto
(2003) postularam que o efeito neurodegenerativo causado pela AMPH resulta do metabolismo
da dopamina, mas também da ativação de vias glutamatérgicas, que dão origem as ERO e ERN,
que por sua vez inibem a função mitocondrial e, posteriormente, causam ulterior aumento na
produção de EROs, diminuindo assim a produção celular de ATP. Estas alterações bioquímicas
decorrentes da exposição à AMPH seriam responsáveis pelos danos em macromoléculas e pelos
processos neurodegenerativos associados.
As benzodiazepinas são drogas clássicas psicotrópicas mais freqüentemente prescritas,
possivelmente no mundo todo. Benzodiazepinas, tais como o diazepam (DZP), são utilizados
comumente por produzirem efeito sedativo e ansiolítico, que decorre da alta afinidade que estas
moléculas possuem pelos sítios benzodiazepínicos associados aos receptores GABA
A
(Stiefel et
al., 1999).
Diferente do foi observado para a AMPH, poucos estudos foram realizados visando
investigar o papel dos radicais livres na mediação de processos pró-oxidantes como causadores
de danos neuronais produzidos pela administração de DZP. De fato, Musavi e Kakkar (1998 e
2003) demonstraram que a administração aguda e crônica (3 semanas) de DZP em ratos causou
aumento da peroxidação lipídica em regiões mitocondriais, além de alterar a atividade das
enzimas antioxidantes SOD e GPx em regiões específicas do cérebro, tais como córtex cerebral,
cerebelo e tronco cerebral de ratos. Assim, apesar da pouca informação disponível, pode-se
12
perceber que o mesmo causa alterações bioquímicas em estruturas neuronais semelhante às
drogas psicoestimulantes. De maneira geral, pode-se concluir que drogas psicoestimulantes,
assim como o diazepam, promovem estresse oxidativo o que leva aos danos em macromoléculas
e que muitas vezes acabam por causar a morte celular.
Os fármacos estabilizantes do humor, tais como o lítio e o valproato, são utilizados para
controlar as oscilações de humor, características do transtorno afetivo bipolar (Rang et al., 2004).
Apesar do vasto emprego na clínica, os mecanismos pelos quais o lítio e o valproato exercem
seus efeitos ainda não estão completamente esclarecidos (Rowe e Chuang, 2004). Sabe-se que o
lítio atua em uma série de sistemas de neurotransmissores e de mecanismos de transmissão de
sinais, tais como a hidrólise de fosfoinositol, adenilato ciclase, proteínas G, glicogênio sintase
quinase (GSK-3β) e proteína quinase C (PKC) (Wang et al., 2003). A GSK-3β está envolvida no
processo de formação das lesões neuropatológicas, depleção colinérgica e morte celular
associadas à doença de Alzheimer (Bijur et al., 2000). Acredita-se que tais efeitos sejam
responsáveis pelas mudanças em longo prazo na transmissão neural que levam aos efeitos
profiláticos do lítio no tratamento do transtorno bipolar. Por meio de seus efeitos na GSK-3β e
proteína quinase C, o lítio pode alterar também a fosforilação de proteínas do citoesqueleto, o
que leva a mudanças neuroplásticas (Lenox e Hahn, 2000).
Os efeitos neuroprotetores característicos dos estabilizadores do humor (lítio e valproato)
podem ser observados em diversas condições, tais como o tratamento agudo e crônico com
AMPH (Frey et al., 2006b,c), na excitotoxicidade glutamatérgica (Wang et al., 2003; Hashimoto
et al., 2002) e na neurotoxicidade causada pelo acúmulo de proteína β-amilóide (Alvarez et al.,
1999). De fato, estudos demonstraram que o lítio e o valproato possuem a capacidade de atenuar
determinadas ações neurodegenerativas, como a peroxidação lipídica e a oxidação de proteínas
13
induzidas por glutamato (Jakopec et al., 2008; Shao et al., 2005), o estresse oxidativo induzido
por FeCl
3
(Wang et al., 2003), o dano cerebral induzido por isquemia (Bian et al., 2007). Além
disso, o tratamento com lítio antagoniza a ativação de JNK e p38 quinase e a ligação de AP-1
induzidos por glutamato (Rowe e Chuang, 2004). Por fim, foi demonstrado que o tratamento
crônico com lítio induz a expressão de neurotrofinas, como o BDNF (fator neurotrófico derivado
do cérebro) em neurônios corticais de ratos em cultura (Chuang, 2004; Vajda, 2002).
O valproato parece ter, ações semelhantes as do lítio no que diz respeito à neuroproteção.
Por exemplo, ambos aumentam a atividade de ligação do DNA e a atividade dos fatores de
transcrição da família 1 de proteínas ativadoras por meio da quinase reguladora de sinal (ERK).
A ERK é utilizada por diversos mediadores químicos (neurotrofinas e neurotransmissores) para
sinalizar intracelularmente seus efeitos, incluindo diferenciação neuronal, sobrevivência
neuronal, neuroplasticidade de longa duração, aprendizado e memória. O valproato aumenta a
expressão de genes relacionados à via da ERK, tais como a proteína 43 associada ao crescimento
de cone e Bcl-2. Além disso, promove crescimento de neuritos, sobrevivência celular e aumento
de captação e liberação de noradrenalina (Yuan et al., 2001). Da mesma forma que o lítio, o
valproato, em doses terapêuticas, tem efeito inibitório sobre a GSK-3β. A associação do
valproato com o lítio tem efeitos aditivos nessa inibição (Chen et al. 1999; Stambolic et al.,
1996).
O desenvolvimento de novos fármacos ou drogas com caráter neuroprotetor se faz
necessário devido ao crescente número de doenças relacionadas ao processo de
neurodegeneração, tais como Alzheimer e o Parkinson e Transtorno Afetivo Bipolar. O estudo
mais aprofundado dos fármacos já conhecidos também é de fundamental importância, pois estes
poderão em futuro serem empregados no tratamento de doenças neurodegenerativas.
14
Relação entre Espécies Reativas do Oxigênio e Dano Oxidativo
Quando um desequilíbrio ocorre entre a produção de oxidantes e as defesas antioxidantes,
cria-se um estado que se denomina de estresse oxidativo. Assim, o termo estresse oxidativo é
usado para se referir a uma situação na qual a geração de espécies reativas ultrapassa a
capacidade de reparo das defesas antioxidantes disponíveis (Halliwell e Gutteridge, 2006).
Para evitar a formação de ERO, assim como reparar os danos oxidativos em tecidos e
macromoléculas, todos os organismos possuem um complexo sistema de defesa antioxidante
(Molina et al., 2003). Algumas destas defesas são enzimas: superóxido dismutase (SOD),
catalase (CAT) e glutationa peroxidase (GPx), mas existem também as defesas antioxidantes
não-enzimáticas, como as vitaminas A, C, E, e a glutationa (Ames et al., 1993).
Como ilustrado na figura 1, a enzima SOD converte o ânion superóxido (O
2
·) em
peróxido de hidrogênio (H
2
O
2
) e oxigênio molecular. Todos os subtipos de SOD apresentam,
pelo menos, um metal de transição em seu sítio ativo. A manganês-SOD é localizada na
membrana mitocondrial interna, sendo sua expressão regulada por EROs. O cobre, zinco-SOD,
por outro lado, apresenta uma localização citosólica (Halliwell e Gutteridge, 2006). A elevação
da atividade da SOD está envolvida com o aumento de estresse oxidativo, provavelmente devido
ao aumento da produção de H
2
O
2
, que é um dos substratos desta enzima e um dos responsáveis
pela modulação da sua atividade (Berg et al., 2004).
A CAT tem o H
2
O
2
como único substrato, sendo sua atividade intimamente relacionada
com a concentração das ERO. A catalase tem como função principal dismutar o H
2
O
2
, formando
H
2
O e oxigênio molecular (figura 1). Esta enzima atua complementarmente à GPx, não
permitindo a produção de radical hidroxil (OH
•
) a partir do H
2
O
2,
que ocorre
na presença de Fe
+2
(Reação de Fenton; Halliwell e Gutteridge, 2006). A GPx, uma enzima selênio-dependente, é
15
importante para a proteção contra peróxidos orgânicos e H
2
O
2
. Para a sua atividade a GPx
necessita da presença de glutationa reduzida (Halliwell e Gutteridge, 2006).
Fig. 1: Sistema de defesa antioxidante (Adaptado de Smith, 2004).
Uma vez formadas, as EROs são capazes de reagir indiscriminadamente com qualquer
tipo de molécula orgânica, extraindo elétrons e gerando novos radicais livres em reações em
cadeia altamente citotóxicas (Middleton et al., 2000; Coleman, 2001; Yen et al., 2003; Aldred e
Griffts, 2004). As proteínas ao sofrerem a ação dos radicais livres sofrem danos na estrutura e,
conseqüentemente, no estado conformacional, perdendo assim a sua função biológica (Aldred e
Griffts, 2004).
A carbonilação de proteínas é muito usada como biomarcador de dano oxidativo em
proteínas, pois reflete o dano celular induzido por várias formas de ERO (Dalle-Donne et al.,
2005; Stadtman e Levine, 2003). O grupo carbonil pode ser introduzido nas proteínas por várias
sinalizações oxidativas. As ERO podem reagir diretamente com proteínas ou reagir com
16
moléculas como açúcares e lipídeos, gerando produtos, como espécies reativas ao carbonil
(ERC), que reagem com proteínas (Stadtman, 1990).
A peroxidação de lipídeos é definida como uma deterioração oxidativa de lipídeos
poliinsaturados. Tanto as membranas celulares quanto às organelas, como as mitocôndrias,
contêm ácidos graxos que podem sofrer oxidação, podendo haver modificação em suas
propriedades, como alteração na estrutura e na permeabilidade (Wozniak et al., 2002; Blokhina
et al., 2003; Mursu et al., 2004).
O desequilíbrio gerado em uma situação de estresse oxidativo pode resultar da
diminuição das defesas antioxidantes, ou da produção aumentada de oxidantes, ou da liberação
de metais de transição ou da combinação de qualquer desses fatores (Halliwell, 2001). Este
desequilíbrio pode causar dano em todos os tipos de biomoléculas, incluindo DNA, proteínas e
lipídeos, e em situações severas, pode levar à morte celular por necrose ou por apoptose
(Halliwell e Gutteridge, 2006).
O estresse oxidativo é um evento importante que tem sido implicado em diversas
neuropatologias, tais como epilepsia, esclerose múltipla, demência (Halliwell, 2006a), transtorno
afetivo bipolar (Andreazza et al., 2007; Frey et al., 2007), doença de Alzheimer (Calabrese et al.,
2003), isquemia cerebral, doença de Parkinson, esclerose lateral amiotrófica familiar, transtorno
degenerativo dos neurônios motores (Moosmann e Behl, 2002), doença de Huntington e
esquizofrenia (Rao e Balachandran, 2002), entre outras.
Evidências apontam para o fato de que o grande número de doenças degenerativas que
acometem o cérebro pode ocorrer devido aos danos causados pelas ERO. O cérebro é
particularmente susceptível aos danos oxidativos e isso se deve a diversos fatores, dentre eles:
17
1) As defesas antioxidantes no cérebro são modestas. Os níveis de catalase, enzima que
detoxifica peróxido de hidrogênio, são baixos na maior parte das regiões cerebrais (Halliwell,
2001).
2) Muitos neurotransmissores são auto-oxidantes: dopamina, serotonina e noradrenalina
podem reagir com O
2
e gerar não somente O
2
·, mas também quinonas/semiquinonas que podem
ligar-se à glutationa (anti-oxidante endógeno) e grupos SH de proteínas (Spencer et al., 1998).
3) Desequilíbrio mitocondrial pode levar a um aumento de Ca
2+
intracelular, aumentando
a produção de espécies reativas de oxigênio (Halliwell, 2006a).
4) As mitocôndrias neuronais geram O
2
·, principalmente no Complexo I (Kudin et al.,
2005).
5) As membranas neuronais são especialmente ricas em ácidos graxos poliinsaturados
(Halliwell e Gutteridge, 1997) e os produtos de peroxidação lipídica podem causar dano cerebral
(Ong et al., 2000).
6) O cérebro contém grandes quantidades de Ferro e danos cerebrais podem liberar íons
Ferro capazes de catalisar reações produzindo ERO (Halliwell, 2001a).
7) Desequilíbrio energético mitocondrial pode interromper mecanismos antioxidantes
uma vez que a glutationa é sintetizada no citoplasma e seu transporte para o interior
mitocondrial é um mecanismo dependente de ATP (Banaclocha, 2001).
Diante deste contexto, diversas substâncias com atividade no sistema nervoso central
podem alterar o equilíbrio existente entre a geração de radicais livres e as defesas antioxidantes
cerebrais gerando ou prevenindo dano a biomoléculas e, dependendo da extensão destes danos,
levando à morte celular.
18
2. OBJETIVOS:
Atualmente, pouca informação está disponível na literatura sobre as ações do NPS no
comportamento geral de roedores. Além disso, muito pouco é sabido sobre as alterações
neuroquímicas decorrentes da exposição ao peptídeo NPS, o que ressalta a importância da
realização deste estudo. Assim, considerando a semelhança entre os efeitos comportamentais
induzidos pela AMPH, DZP e NPS em roedores, este estudo visa comparar os efeitos
comportamentais e bioquímicos induzidos pelo tratamento agudo com estas drogas. Diferente da
AMPH e do DZP, que parecem estar envolvidos na geração de dano oxidativo, evidências
apontam para um efeito neuroprotetor induzido pelo lítio e valproato (Rowe e Chuang, 2004;
Jakopec et al., 2008; Shao et al., 2005; Wang et al., 2003). Neste contexto, o presente estudo
também comparou o efeito do tratamento agudo com NPS, lítio e valproato nos parâmetros de
dano oxidativo de lipídeos e proteínas de estruturas cerebrais de camundongos.
Objetivo Geral:
O presente estudo tem como objetivo investigar os efeitos da administração
intracerebroventricular de NPS na atividade locomotora espontânea e em parâmetros de estresse
oxidativo avaliados em estruturas cerebrais de camundongos. Este estudo visa também comparar
as ações do NPS com as de drogas com potencial neurodegenerativo e neuroprotetor, a fim de
investigar o papel deste novo sistema neuropeptidérgico na modulação do dano tecidual.
19
Objetivos Específicos:
- Determinar os efeitos da administração aguda de NPS, anfetamina e diazepam na
locomoção espontânea de camundongos submetidos à caixa de monitoramento da atividade
locomotora;
- Avaliar as concentrações de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico e de proteínas
carboniladas em diversas estruturas cerebrais de camundongos tratados com NPS e comparar
com as ações produzidas por anfetamina, diazepam, lítio e o valproato;
- Verificar a atividade das enzimas superóxido dismutase e catalase em estruturas
cerebrais de camundongos tratados com NPS e comparar com os efeitos produzidos pela
anfetamina e diazepam.
20
3. ARTIGOS
ARTIGO 1 - (Pharmacology, Biochemistry and Behavior)
NEUROPEPTIDE S PRODUCES HYPERLOCOMOTION AND PREVENTS
OXIDATIVE STRESS DAMAGE IN THE MOUSE BRAIN: A COMPARATIVE STUDY
WITH AMPHETAMINE AND DIAZEPAM
Castro, A.A.
1
; Moretti, M.
1
; Casagrande, T.S.
1
; Martinello, C.
1
; Petronilho, F.
2
; Sterckert, A.V.
2
;
Dal-Pizzol, F.
2
; Calo’, G.
3
; Guerrini, R.
4
; Quevedo, J.
1
; Gavioli, E.C.
1
1
Laboratório de Neurociências, Programa de Pós-graduação Ciências da Saúde, Universidade do
Extremo Sul Catarinense, Criciúma, SC, Brazil;
2
Laboratório de Fisiopatologia Experimental, Programa de Pós-Graduação em Ciências da
Saúde, Universidade do Extremo Sul Catarinense, Criciúma, SC, Brazil;
3
Department of Experimental and Clinical Medicine, Section of Pharmacology, University of
Ferrara, Ferrara, Italy;
4
Department of Pharmaceutical Science and Biotechnology Center, University of Ferrara,
Ferrara, Italy.
Corresponding author:
Prof. Elaine C Gavioli, M.Sc., Ph.D.
Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde
Universidade do Extremo Sul Catarinense (UNESC)
88806-000 Criciúma - SC - Brazil
Phone: +55 48 3431 2759
Fax: : +55 48 3443 4817
E-mail: [email protected]
21
ABSTRACT
Neuropeptide S (NPS) is a 20 amino acid peptide which is the endogenous ligand of a G protein-
coupled receptor named NPSR. In vivo studies revealed that NPS increases locomotion, reduces
anxiety-related behaviors and produces wakefulness. Interestingly, NPS produces quite unique
behavioral properties: stimulant and anxiolytic-like effects. On this based current study aimed to
compare behavioral and biochemical effects of NPS with a standard psychostimulant drug
amphetamine (AMPH), and with a classical anxiolytic drug diazepam (DZP). To this aim, the
effects of acute treatment with NPS (0.01, 0.1 and 1 nmol, ICV, 5 min), AMPH (2 mg/kg, IP, 30
min) and DZP (1 mg/kg, 30 min) was assessed on spontaneous locomotor activity, and on
oxidative stress parameters, such as lipidic peroxidation, protein carbonyl formation, and
antioxidant enzymes activity (catalase, CAT, and superoxide dismutase, SOD) in distinct mouse
brain structures (i.e. cortex, cerebellum, and striatum). The administration of 0.1 nmol NPS and
AMPH, but not DZP, increased distance traveled compared to control group assessed for 30 min.
Biochemical analyzes revealed that AMPH increased protein carbonyl formation in cerebellum
and striatum, but no signs of lipoperoxidation was observed in the brain structures analyzed in
this study. The administration of DZP induced lipid peroxidation in cortex and cerebellum, but it
did not affect protein carbonyl formation in mouse brain. In contrast with AMPH and DZP, NPS
at distinct doses reduced protein carbonyl formation in the cerebellum and striatum.
Additionally, a reduction of lipid peroxidation levels was also observed in the cortex of mice
treated with NPS. Regarding the antioxidant enzymes activity, the treatment with AMPH
significantly increased SOD activity in the striatum, while no alterations were observed for CAT
activity. DZP did not affect CAT and SOD activity in any brain structure analyzed. The
treatment with NPS at low doses (0.01 and 0.1 nmol) reduced SOD activity in the cortex and
cerebellum, and increased CAT activity (at 0.01 nmol) in the cortex. Taken together, these data
suggest that besides behavioral similarities between AMPH and NPS, NPS reduced oxidative
stress damage in the brain. However, these protective effects of NPS do not appear to be related
to the reduction of SOD activity since inhibition of this enzyme contributes to generation of free-
radical species. These observations provide the first evidence of a putative role played by this
novel neuropeptidergic system in oxidative stress and brain injury.
KEY-WORDS: neuropeptide S; locomotor activity; oxidative stress; lipid peroxidation; protein
carbonyls; catalase; superoxide dismutase
22
INTRODUCTION
Neuropeptide S (NPS) is a 20 amino-acid peptide recently identified in the brain and
peripheral tissues of distinct species of vertebrates. NPS is the endogenous ligand of a G protein-
coupled receptor named NPS receptor (NPSR) (Xu et al., 2004). Cells stably expressing NPSR
were used to characterize in vitro the pharmacological actions of NPS. Nanomolar
concentrations of NPS produce a transient increase in intracellular free Ca
2+
, increases
intracellular levels of cAMP and stimulates phosphorylation of mitogen-activated protein kinase,
thus suggesting that this receptor may be coupled with both Gq and Gs proteins (Xu et al., 2004;
Reinscheid et al., 2005b).
The NPSR is widely expressed in the mammalian brain, and higher levels were found in
the hypothalamus, amygdala, endopiriform nucleus, cortex, subiculum, and nuclei of the
thalamic midline (Xu et al., 2007). In contrast, NPS precursor mRNA is found expressed in a
cluster of neurons located between the locus coeruleus (LC) and Barrington’s nucleus (Xu et al.,
2004).
In 2004, Xu and colleagues reported for the first time that the intracerebroventricular
(ICV) injection of NPS, at nmol doses, produces hyperlocomotion, reduces anxiety-like
behaviors and increases wakeful states in rodents. Subsequently, distinct laboratories have also
demonstrated that the acute administration of NPS increases locomotion in rats and mice both
naïve or habituated to the test chamber (Smith et al., 2006; Roth et al., 2006; Rizzi et al., 2008).
Recently, several in vivo studies have demonstrated the NPS-NPSR system in the control of
distinct central functions including wakefulness (Xu et al., 2004), anxiety (Xu et al., 2004;
Leonard et al., 2008; Rizzi et al., 2008), drug abuse (Ciccocioppo et al., 2007; Paneda et al.,
23
2007), and also food intake (Cline et al., 2007; Smith et al., 2006; Beck et al., 2005; Ciccocioppo
et al., 2006; Niimi, 2006; Cline et al., 2008).
Interestingly, as cited before the supraspinal injection of NPS induces a range of effects
similar to those described by psichostimulants. Additionally, the administration of NPS, in the
same range of doses, promotes anxiolytic-like effects in distinct animal models and mice strains
(Xu et al., 2004; Leonard et al., 2008; Rizzi et al., 2008). It is worth mentioning that
psychostimulant drugs, such as amphetamine, caffeine, and modafinil, increase both locomotion
and anxiety-related behaviors. By contrast, standard anxiolytic drugs, i.e. diazepam, reduce
anxiety without altering locomotor activity in rodents (Reinscheid et al., 2005a). Thus, the
present findings corroborate the proposal of NPS as a rather unique neuropeptidergic signal
which combines activation and anxiolysis.
Previous studies performed in our labs showed that acute and repeated administration of
amphetamine increased protein damage and lipidic peroxidation (Frey et al., 2006a; Frey et al.,
2006b). Protein carbonyl formation was also detected in primary mesencephalic cells culture
exposed to amphetamine for 24 h (Lotharius and O’Malley, 2001). Literature findings point to
free radical species, particularly reactive oxygen species and reactive nitrogen species, as a
causative factor of amphetamine neuronal toxicity (for a review see: Brown and Yamamoto,
2003). In fact, changes in activity of the free radical-scavenging enzymes superoxide dismutase
and catalase were described for amphetamine in the rat brain (Frey et al., 2006a; Frey et al.,
2006b). Additionally, oxidative stress has been demonstrated to occur also in response to high
doses of substituted amphetamines such as methamphetamine (METH) and 3,4-methlyene-
dioxymethamphetamine (MDMA; for a review see: Quinton and Yamamoto et al., 2006).
24
Free radical species are also mediating prooxidative processes, and even molecular
damage, in different brain regions following the acute and repeated administration of diazepam
(Musavi and Kakkar, 1998; Musavi and Kakkar, 2000). An enhancement in the TBARS
formation was found in the mitochondrial fractions from cerebral cortex and brain stem after
single doses of diazepam (3 mg/kg). Isozymes of superoxide dismutase and glutathione reductase
displayed reduced activity, a region-dependent effect, after the administration of diazepam
(Musavi and Kakkar, 1998). Taken together, these data suggest that diazepam caused
mitochondrial lipid peroxidation due to an increase in free-radical species production by
reducing antioxidant enzymes activity.
Thus, considering that NPS alters central functions and promotes quite ambiguous
behavioral effects, i.e. anxiolysis and stimulation, the present study aimed to compare behavioral
and biochemical effects of NPS with amphetamine and diazepam, a standard psychostimulant
and anxiolytic drug, respectively. The locomotor activity assay was employed in order to
evaluate the behavioral effects of NPS, diazepam and amphetamine in mice. Biochemical
techniques were used to assess damage to proteins and lipids in homogenate tissues from
different brain areas (such as striatum, cortex and cerebellum). Additionally, free radical-
scavenging enzymes activity, i.e. catalase and superoxide dismutase, was measured in mice
brain, in order to propose a putative relationship between this novel neuropeptidergic system and
oxidative stress.
MATERIALS AND METHODS
Animals
25
Male CF-1 mice (2-3 months, 30-35 g) were obtained from our breeding colony
(UNESC). The animals were housed six to cage with food and water available ad libitum and
were maintained on a 12-h light/ dark cycle (lights on at 7:00 am). Each
animal was used only
once. All experimental procedures involving animals were performed in accordance with the
NIH Guide for the Care and Use of Laboratory Animals and the Brazilian Society for
Neuroscience and Behavior (SBNeC) recommendations for animal care. This study was
approved by the local ethics committee (Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade do
Extremo Sul Catarinense).
Drugs
The NPS was synthesized by Dr. R. Guerrini, Department of Pharmaceutical Science and
Biotechnology Center, University of Ferrara, according to published methods (Roth et al., 2006).
D-amphetamine (AMPH) was purchased from Sigma-Aldrich, St. Louis, USA, while diazepam
was purchased from Novartis Biociências AS, São Paulo, Brazil. NPS was dissolved in saline,
and stock solutions were stored at -20°C and diluted to the desired concentrations in saline just
prior to use. D-amphetamine was dissolved in saline, and diazepam was solubilized in Tween 80
(0.5%).
Treatments
Diazepam (1 mg/kg) and D-amphetamine (2 mg/kg) were administered to the mice
intraperitoneally (i.p.) and NPS (1, 0.1 and 0.01 nmol) intracerebroventricularly (H
2
O), 15 min
and 5 min before testing, respectively. I.c.v. injections
(2 µl per mouse) were given as described
by Laursen & Belknap (1986) and previously adopted in our studies (Gavioli et al., 2002;
26
Gavioli et al., 2003). Briefly, under light (just sufficient for loosing the righting reflex) ether
anesthesia, a 27-gauge needle attached to a 10 µl Hamilton syringe was inserted perpendicularly
3 mm deep through the skull, into the left ventricle, at a position 2 mm lateral from the midline
on the line drawn through the anterior base of the ears. Each animal received only one i.c.v. or
i.p. injection. I.c.v. or i.p. injections of saline, at the same volume, were adopted as control.
Locomotor activity assay
An infrared beam array cage (Insight Equipments, Ribeirao Preto, Brazil) connected to a
PC was used for assessing locomotor activity in mice. The infrared beam array cage consists of a
cubicle made of clear Perspex (48 x 50 cm) surrounded by 50 cm-high walls. Two facing blocks
containing an infrared array record the horizontal activity, and a similar system assesses the
vertical activity. The animals were gently placed on the centre of the arena and they were
allowed to explore the apparatus individually during a period of 30 min. All behavioral
experiments were conduct in an illuminated (300 lux) and quiet room. Locomotor activity was
recorded in the light cycle between 13.00 and 16.00 h. After the behavioral evaluation of each
mice, the arena was cleaned with 10% ethanol solution. Locomotor activity was assessed for
each mouse individually, during a 30-min period. The total distance travelled (cm) by each
animal was accumulated over consecutive 5 min time.
After the behavioral procedure mice were sacrificed by decapitation, and brain structures
were dissected (striatum, cerebellum and cortex), rapidly frozen, and stored at - 80
o
C until
assayed. Results from i.c.v. treated mice presenting any signs of cerebral haemorrhage were
discarded from the statistical analysis (less than 5% of the animals overall).
27
Biochemical assays
Lipid peroxidation
Lipid peroxidation was measured by formation of thiobarbituric
acid (TBA) reactive
substances (TBARS) after the method of Esterbauer and Cheeseman (1990). After brain
dissection, brain structures were
washed with PBS, harvested and lysed. Thiobarbituric reactive
species,
obtained by acid hydrolysis of 1,1,3,3-tetra-ethoxy-propane
(TEP), was used as the
standard for the quantification of TBARS.
TBA 0.67 % was added to each tube and vortexed.
The reaction mixture
was incubated at 90°C for 20 min and the reaction was stopped
by placing
samples on ice. The optical density of each solution was measured in a spectrophotometer at 535
nm. Data were expressed as pmol TBARS per mg protein.
Protein carbonyl formation
Protein carbonyl content was measured in brain homogenates using
2,4-
dinitrophenylhydrazine (DNPH) in a spectrophotometric assay
(Levine et al., 1994). Briefly,
sample tissues were sonicated
in ice-cold homogenization buffer containing phosphatase and
protease inhibitors (200 nM calyculin, 10 µg/ml leupeptin,
2 µg/ml aprotinin, 1 mM sodium
orthovanadate, and 1 µM
microcystin-LR) and centrifuged at 1000 x g for 15 min to sediment
insoluble material. Three hundred microliter aliquots of the
supernatant containing 0.7–1.5 mg of
protein were treated
with 300 µl of 10 mM DNPH, dissolved in 2 M HCl, and compared
with 2
M HCl alone (reagent blank). Samples then were incubated for 1 h at room temperature
in the
dark and stirred every 10 min. Samples were precipitated
with trichloroacetic acid (final
concentration of 20%) and centrifuged
at 16,000 x g at 4°C for 15 min. The pellet was washed
three
times with 1 ml of ethanol/ethyl acetate (1:1 v/v). Each time,
the pellet was lightly vortexed
28
and left exposed to the washing
solution for 10 min before centrifugation (16,000 x g for 5
min).
The final pellet was dissolved in 1 ml of 6 M guanidine
in 10 mM phosphate buffer–
trifluoroacetic acid, pH 2.3,
and the insoluble material was removed by centrifugation at
16,000 x
g for 5 min. Absorbance was recorded in a spectrophotometer at 370 nm for
both DNPH-treated
and HCl-treated samples. Protein carbonyl
levels were calculated as picomoles of carbonyl per
milligram
of protein.
Superoxide dismutase (SOD) activity assay
SOD estimation was performed based on its ability to spontaneously inhibit oxidation of
adrenaline to adrenochrome (Bannister and Calabrese, 1987). 2.78 ml of sodium carbonate buffer
(0.05 mM; pH 10.2), 100 µl of EDTA (1.0 mM) and 20 µl of the supernatant or sucrose (blank)
were incubated at 30ºC for 45 min. Thereafter, the reaction was initiated by adding 100 µl of
adrenaline solution (9.0 mM). The change in the absorbance was recorded at 480 nm for 8 min.
Throughout the assay procedure temperature was maintained at 30ºC. One unit of SOD produced
approximately 50% of auto-oxidation of adrenaline. Results were expressed as Units/mg protein.
Catalase (CAT) activity assay
The CAT activity was measured by the method that employs hydrogen peroxide to
generate H
2
O and O
2
(Aebi, 1984). Brain tissue was sonicated in 50 mmoL/L phosphate buffer
(pH 7.0), and the resulting suspension was centrifuged at 3.000 x g for 10 minutes. The sample
aliquot (20 µl) was added to 980 (l of the substrate mixture. The substrate mixture contained 0.3
ml of hydrogen peroxide in 50 ml of 0.05 M phosphate buffer (pH 7.0). Initial and final
29
absorbances were recorded at 240 nm after 1 and 6 min, respectively. A standard curve was
established using purified catalase (Sigma, MO, USA) under identical conditions.
Protein estimation
Protein was estimated in all the fractions according to the method of Lowry et al., (1951).
Bovine serum albumin was used as standard.
Statistical analyses
Results were analysed by INSTAT version 3.06 software. Behavioral data are presented
as the mean±S.E.M., and each value reflects the mean of 12-15 animals per group. Biochemical
data are expressed mean ±S.D., and each value reflects the mean of 4-5 animals per group.
Differences among the experimental groups were determined by one-way analysis of variance
(ANOVA) followed by the Dunnett post-hoc test. In all comparisons, statistical significance was
set at P<0.05.
RESULTS
Locomotor activity assay. Naïve mice i.c.v. or i.p. injected with saline did not display any
statistical significant differences in the distance traveled (cumulative distance moved in 30 min:
5191±701 vs. 3928±481 cm, respectively). D-amphetamine (2 mg/kg) administration promoted a
robust increase in the distance traveled compared to control group (figure 1, top panels;
F(2,32)=4.98; P=0.013). The maximum stimulatory effect of D-amphetamine was equal to 203
% of control mice. By contrast, mice injected with diazepam (1 mg/kg) did not display any
change in the cumulative distance traveled compared to saline, however an increase in
30
locomotion during the first 5 min was registered for diazepam (figure 1, top panels). Similar to
D-amphetamine, the i.c.v. injection of NPS 0.01 – 1 nmol/mouse induced an increase in
spontaneous locomotion compared to control (figure 1; bottom panels). A statistical significant
increase of cumulative distance traveled in 30 min was detected in mice treated with NPS 0.1
nmol compared to control group (F(3,43)=4.24; P=0.010). The stimulatory effect of NPS was not
a dose-dependent response, since the i.c.v. injection of NPS at 0.1 nmol produced a higher
stimulatory effect compared to the 1 nmol dose (156 % vs. 139%, respectively). Additionally, the
i.c.v. injection of NPS 0.1 nmol caused a statistical significant increase of animal locomotion
only at the first 10 min of observation (figure 1, bottom panels).
Biochemical assays. As illustrated in figure 2 (left panel), the administration of D-amphetamine
and diazepam increased carbonylated proteins in the mouse striatum compared to saline
(F(2,11)=7.74; P=0.008). In the cerebellum and cortex, the injection of D-amphetamine and
diazepam did not modify the amount of carbonylated proteins compared to control (P>0.05). By
contrast, mice i.c.v. treated with NPS, at distinct doses, displayed a statistical significant
reduction of protein carbonyl formation in the cerebellum and striatum compared to control
(figure 2, right panel). In fact, in the cerebellum, NPS at all doses tested reduced significantly the
content of carbonylated proteins (figure 2, right panel; F(3,15)=17.90; P<0.0001). In the
striatum, the treatment with NPS also reduced protein carbonyl formation, however the statistical
significance was observed only at higher (0.01 nmol) and lower (1 nmol) doses (figure 2, right
panel; F(3,15)=9,29; P=0.001). In the cortex, distinctly from other brain areas, the administration
of NPS only at the higher dose increased protein carbonyl content (figure 2, right panel;
F(3,15)=5.96; P=0.007).
31
As showed in figure 3, a single dose of diazepam (1 mg/kg), but not D-amphetamine (2
mg/kg), caused an increase in peroxidation of polyunsaturated fatty acids in distinct mouse brain
structures. An increase in thiobarbituric acid reactive substance (TBARS) levels was detected in
the cortex (F(2,11)=4,41; P=0.039) and cerebellum (F(2,11)=5.81; P=0.017) of diazepam-treated
mice compared to control. On the other hand, the acute injection of D-amphetamine did not
modify the TBARS formation into the brain structures analyzed in this study. The treatment with
NPS at 0.1 and 1 nmol reduced TBARS levels in cerebral cortex of mice in comparison with
saline (figure 3, right panel, F(3,15)=11.06; P=0.0004). However, no changes in TBARS
formation were observed in cerebellum and striatum of NPS-treated mice (figure 3, right panel;
P>0.05).
The changes in the activity of the free radical-scavenging enzymes superoxide dismutase
(SOD) and catalase (CAT) were also evaluated in this study (figure 4). The single injection of D-
amphetamine strongly increased SOD activity only in the striatum (figure 4, top panels;
F(2,11)=130.05; P<0.0001). However, no changes in CAT activity were observed after the
treatment with D-amphetamine (P>0.05). Diazepam did not change the activity of both enzymes
SOD and CAT in all the three brain areas analyzed in this study (P>0.05).
Quite distinct from D-amphetamine and diazepam, the supraspinal injection of NPS
significantly changed the activity of free radical-scavenging enzymes superoxide SOD and CAT
assessed in different brain structures homogenates in mice (figure 4; right panels). In fact, NPS
inhibited in a statistical significant manner SOD activity in the cortex and cerebellum compared
to control group. SOD activity in the cortex was 68.8%, 81.3% and 56.3% less active in mice
treated with NPS at the doses of 0.01, 0.1 and 1 nmol, respectively, than that of saline-treated
mice (figure 4, top panels; F(3,15)=9.67; P=0.008). In the cerebellum, the treatment with NPS
32
0.01, 0.1 and 1 nmol inhibited SOD activity in 50%, 92.5% and 87.5% of control, respectively
(figure 4, top panels; F(3,15)=9.73, P=0.0008). No alterations in the striatum were detected in
those mice treated with NPS at any dose tested as compared to control (P>0.05). Considering
CAT activity, in the mouse cortex the treatment with NPS, only at the lower dose (0.01 nmol),
increased CAT activity in 1000% of control group (figure 4, bottom panels; F(3,15)=5.84;
P=0.0075). No alterations in the activity of this enzyme were observed in striatum and
cerebellum homogenates of those mice injected with NPS (P>0.05).
DISCUSSION
The present findings demonstrate that both NPS and D-amphetamine, under our
experimental conditions, were able to stimulate locomotion in CF-1 mice in an unfamiliar
environment. It should be mentioned that similar studies have already described an increase in
locomotion induced by NPS in mice (Xu et al., 2004; Roth et al., 2006; Rizzi et al., 2008) and in
rats (Smith et al., 2006). Thus, suggesting that the effects of NPS are highly consistent among
experimental conditions and animal species. Interestingly, current data demonstrated that the
injection of NPS in mice did not produce a dose-dependent effect, since the dose of 1 nmol
displayed lower stimulatory effects compared to 0.1 nmol. This phenomenon has already been
described before for NPS-treated mice (Roth et al., 2006; Rizzi et al., 2008), and it could be
explained by the fact that the onset of stimulatory action of NPS 1 nmol is slightly delayed.
Longer periods of observation, for example one hour, can be enough to detect the
hyperlocomotion induced by NPS 1 nmol (Roth et al., 2006).
Under our experimental conditions, D-amphetamine induced a robust and long-lasting
stimulatory effect, whereas diazepam did not alter spontaneous activity in CF-1 mice compared
33
to control. Our behavioral findings are in agreement with literature and suggest that in the
locomotor activity assay NPS mimicked the stimulatory effects of D-amphetamine.
Psychostimulant drugs, such as D-amphetamine, cocaine, and MDMA, and also
anxiolytic compounds, i.e. diazepam, increase carbonylated proteins and lipid peroxidation in the
rodent brain (Quinton and Yamamoto et al., 2006; Brown and Yamamoto, 2003; Musavi and
Kakkar, 2000; Musavi and Kakkar, 1998; Yamamoto and Zhu, 1998). Considering this, the
present study aimed to evaluate the effects of distinct doses of NPS on protein carbonylation and
lipid peroxidation levels in the striatum, cortex and cerebellum homogenates. The present
findings demonstrated that a single administration of D-amphetamine increased protein
carbonylation content in cerebellum and striatum of mice. However, no alterations in TBARS
levels were detected in brain structures of D-amphetamine-treated mice. The acute injection of
diazepam increased protein carbonyl formation in the striatum, and it caused a significant
increase in TBARS formation in the cortex and cerebellum of mice. Opposite to D-amphetamine
and diazepam, the i.c.v. injection of NPS reduced protein carbonylation levels in striatum and
cerebellum and decreased lipid peroxidation in the mouse cortex. These effects of NPS against
macromolecular damage (i.e. proteins and lipids) were dose and brain area dependent, and it
could be due to variation in the constitutive antioxidant defenses of each area.
Protein carbonylation is the most widely used biomarker for oxidative damage to proteins
(Dalle-Donne et al., 2006). Carbonyl groups are introduced into proteins by a variety of
oxidative pathways. Reactive oxygen species can react directly with the protein or they can react
with molecules such as sugars and lipids, generating products (reactive carbonyl species) which
react with proteins. A large number of neurodegenerative diseases are directly associated with
the accumulation of carbonylated proteins in neuronal tissues (Dalle-Donne et al., 2006).
34
Lipid peroxidation is one of the major consequences of free radical-mediated injury to the
brain. Lipid peroxidation changes fluidity and permeability of the cell membranes and,
consequently, impairs the activity of membrane-bound enzymes, the binding of molecules to
receptors, cellular interactions, nutrient transport, and the function of second messengers systems
(Meagher and FitzGerald, 2000). Lipid peroxidation leads to the production of conjugated dienic
hydroperoxides. These unstable substances decompose into various aldehydes, which react with
thiobarbituric acid, and then producing TBARS that can be measured by a spectrophotometric
assay. This approach has some methodological limitations, such as overestimation of TBARS
levels due to unspecific reactions of thiobarbituric acid with damaged lipids (Dotan et al., 2004).
However, the results presented herein suggested that NPS reduced lipid peroxidation. Thus, it is
unlikely that those methodological limitations of this assay could produce a false protective
effect for NPS on lipid peroxidation.
Another point to be considered is that a substantial increase in the carbonylated proteins
and TBARS contents was observed in i.c.v. compared to i.p. saline-treated mice. These
biochemical alterations could be probably due to little, but significant, brain injury caused by
saline administration directly into the ventricle. These distinct experimental conditions (i.p. vs.
i.c.v. injections) possible provided an ideal background to assess these protective effects of NPS.
However, further studies aiming to evaluate the role of NPS treatment in distinct stimulus-
induced neuronal injury, such as chemical (i.e. chronic administration of psychostimulants or
convulsive drugs) and physical (i.e. stressful situations) stimulus are worthy of doing.
Considering that carbonyled proteins and lipid peroxidation may reflect the effects
induced by multiple forms of free radical species, current study aimed to measure the activity of
two free radical-scavenging enzymes: superoxide dismutase and catalase, in diazepam-, D-
35
amphetamine-, and NPS-treated mice. Diazepam, under our experimental conditions, did not
modify SOD and CAT activity. Present data also revealed that D-amphetamine increased SOD
activity only in the striatum, while no alterations in CAT activity were observed. Only one study
is still available in the literature about the effects of a single administration of D-amphetamine in
SOD and CAT activity. Frey and colleagues (2006b) reported that D-amphetamine
administration increased SOD activity in the rat prefrontal cortex, while no changes have been
described for CAT activity in distinct brain structures. During physiological states, SOD
metabolizes superoxide anion (O
2
-
), producing hydrogen peroxide (H
2
O
2
), which can react with
iron to generate highly reactant hydroxyl radicals via the Fenton reaction. CAT is the most
important peroxidase in detoxifying excess hydrogen peroxide to prevent hydroxyl production.
Alterations on the redox state can lead to an imbalance between SOD and CAT activities and to
oxidative stress (Matés and Sánchez-Jiménez, 1999). Thus, in situations which SOD levels are
increased without a concomitant CAT increase, the intermediate product H
2
O
2
may accumulate
and generate hydroxyl radicals, which may lead to lipid and protein oxidation, and consequently
neuronal damage. This is possibly the mechanisms by which diazepam and D-amphetamine
causes damage to lipid and proteins.
In contrast to amphetamine and diazepam, the present study reported for the first time
that NPS can modulate indirectly, possibly via intracellular-activated signaling, free-radical
scavenging-enzymes activity in the mouse brain. Current findings revealed that NPS reduced
SOD activity in the cortex and cerebellum (at all doses tested), and increased CAT activity (at
the lower dose) in the mouse cortex. Among various biochemical events associated with
neurological damage, such as stroke, Parkinson’s disease and Alzheimer’s dementia, emerging
evidence suggests the formation of superoxide anion and reduction in expression/activity of SOD
36
as a common denominator of these events (Maier and Chan, 2002). These observations showed
that acute administration of NPS reduces SOD activity in cortex and cerebellum, and then it
could contribute to the accumulation of radical superoxide in neurons. Further studies aiming to
investigate the participation of antioxidant enzymes, such as glutathione peroxidase, and other
non-enzymic antioxidant scavengers should be performed in order to investigate the mechanisms
of the putative neuroprotective effect of NPS
Taken together, present findings suggest, for the first time, a neuroprotective role played
by NPS, since a significant reduction in lipid peroxidation and protein carbonylated formation
was observed in the brain of those mice treated with NPS. Our data also revealed that distinct
from amphetamine, NPS inhibited SOD activity, and such action has been implicated in the
generation of free-radical species (for a review see: Maier and Chan, 2002). Thus, the reduction
of SOD activity does not probably support the protective effect of NPS on lipids and proteins.
Altogether, these observations contribute to provide the first evidence of a putative role played
by this novel neuropeptidergic system in oxidative stress and brain injury.
Acknowledgments: This work was supported by funds from the IBRO Return Home Fellowship
(ECG) and Brazilian National Council Research (to ECG - project n. 479760/2007-1).
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40
0 5 10 15 20 25 30
0
500
1000
1500
2000
Control
AMPH
time (min)
*
*
*
*
*
DZP
*
Distance travelled (cm)
0
2000
4000
6000
8000
10000
*
Control DZP AMPH
Total distance travelled
(cm)
0 5 10 15 20 25 30
0
500
1000
1500
2000
2500
Control
NPS 0.01 nmol
NPS 0.1 nmol
NPS 1 nmol
*
*
time (min)
Distance travelled (cm)
0
2000
4000
6000
8000
10000
Control
0.01
0.1
1
*
NPS (nmol)
Total distance travelled
(cm)
Figure 1 – Castro et al., 2008
.
41
0
10
20
30
40
50
Control
*
*
NPS 1 nmol
NPS 0.1 nmol
*
cortex
cerebellum
striatum
NPS 0.01 nmol
*
*
*
Protein carbonyls
(nmol/mg protein)
0
10
20
30
40
50
Control
AMPH
DZP
cortex
cerebellum striatum
*
*
Protein carbonyls
(nmol/mg protein)
Figure 2 – Castro et al., 2008
42
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
*
*
Control
cortex
cerebellum
striatum
AMPH
DZP
TBARS equivalents
(nmol/mg protein)
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
NPS 0.01nmol
NPS 0.1 nmol
Control
NPS 1 nmol
cortex
cerebellum striatum
*
*
TBARS equivalents
(nmol/mg protein)
Figure 3 – Castro et al., 2008
43
0.00
0.01
0.02
0.03
0.04
0.05
0.06
*
cortex
cerebellum
striatum
Control
AMPH
DZP
SOD activity
(U/mg protein)
0.00
0.01
0.02
0.03
0.04
0.05
0.06
Control
NPS 0.01 nmol
NPS 1 nmol
cortex
cerebellum
striatum
NPS 0.1 nmol
*
*
*
*
*
SOD activity
(U/mg protein)
0.000
0.001
0.002
0.003
0.004
0.005
0.006
0.007
0.008
0.009
Control
AMPH
DZP
cortex
cerebellum striatum
CAT activity
(U/mg protein)
0.000
0.001
0.002
0.003
0.004
0.005
0.006
0.007
0.008
0.009
Control
NPS 0.01 nmol
NPS 0.1 nmol
NPS 1 nmol
cortex
cerebellum
striatum
*
CAT activity
(U/mg protein)
Figure 4 – Castro et al., 2008
44
Legends
Figure 1 – Effects of the i.p. administration of amphetamine (2 mg/kg; AMPH), and diazepam (1
mg/kg; DZP; top panels), and the i.c.v. injection of neuropeptide S (0.01, 0.1 and 1 nmol; NPS;
bottom panels) on the spontaneous locomotor activity assessed in infrared beam array cages in
mice for 30 min. Data are shown as mean ± S.E.M. *p<0.05 vs. control group according to
ANOVA followed by the Dunnett’s test.
Figure 2 – Effects of the i.p. administration of amphetamine (2 mg/kg; AMPH), and diazepam (1
mg/kg; DZP; left panel), and the i.c.v. injection of neuropeptide S (0.01, 0.1 and 1 nmol; NPS;
right panel) on protein carbonyl content in the cortex, cerebellum, and striatum homogenates in
mice assessed by a spectrophotometric assay. Data are shown as mean ± S.D. *p<0.05 vs. control
group according to ANOVA followed by the Dunnett’s test.
Figure 3 – Effects of the i.p. administration of amphetamine (2 mg/kg; AMPH), and diazepam (1
mg/kg; DZP; left panel), and the i.c.v. injection of neuropeptide S (0.01, 0.1 and 1 nmol; NPS;
right panel) on thiobarbituric acid reactive species (TBARS) formation in the cortex, cerebellum,
and striatum homogenates in mice assessed by a spectrophotometric assay. Data are shown as
mean ± S.D. *p<0.05 vs. control group according to ANOVA followed by the Dunnett’s test.
Figure 4 – Effects of the i.p. administration of amphetamine (2 mg/kg; AMPH), and diazepam (1
mg/kg; DZP; left panels), and the i.c.v. injection of neuropeptide S (0.01, 0.1 and 1 nmol; NPS;
right panels) on superoxide dismutase (SOD) and catalase (CAT) activity in the cortex,
cerebellum, and striatum homogenates in mice assessed by a spectrophotometric assay. Data are
shown as mean ± S.D. *p<0.05 vs. control group according to ANOVA followed by the
Dunnett’s test.
45
ARTIGO 2 - (Neuroscience Letters)
NEUROPEPTIDE S REDUCES OXIDATIVE DAMAGE IN PROTEIN AND LIPIDS IN
THE MOUSE BRAIN
Castro, A.A.
a
; Casagrande, T.S.
a
; Petronilho, F.
b
; Constantino, L.
b
; Dal-Pizzol, F.
b
; Calo’, G.
c
;
Guerrini, R.
d
; Quevedo, J.
a
; Gavioli, E.C.
a*
a
Laboratório de Neurociências, Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde,
Universidade do Extremo Sul Catarinense, Criciúma, SC, Brazil;
b
Laboratório de Fisiopatologia Experimental, Programa de Pós-Graduação em Ciências da
Saúde, Universidade do Extremo Sul Catarinense, Criciúma, SC, Brazil;
c
Department of Experimental and Clinical Medicine, Section of Pharmacology,
University of Ferrara, Ferrara, Italy;
d
Department of Pharmaceutical Science and Biotechnology Center, University of Ferrara,
Ferrara, Italy.
*Corresponding author:
Prof. Elaine C Gavioli, M.Sc., Ph.D.
Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde
Universidade do Extremo Sul Catarinense (UNESC)
88806-000 Criciúma - SC - Brazil
Phone: +55 48 3431 2759
Fax: : +55 48 3443 4817
E-mail: [email protected]
46
Abstract
Neuropeptide S (NPS) and its receptor NPSR comprise a recently deorphaned G protein-coupled
receptor system. This peptide has been implicated in modulating several brain functions such as
wakeful, anxiety, food intake and locomotion. This study aimed to compare the effects of NPS
with lithium or valproate on lipid and protein oxidative damage. To this aim, the effects of NPS,
lithium or valproate on lipid peroxidation and protein carbonyl formation were assessed in
distinct mouse brain structures: cerebellum, striatum, cortex and hippocampus. Biochemical
analyzes revealed that NPS and lithium reduced thiobarbituric reactive species (TBARS)
formation in cerebellum, striatum and hippocampus. Valproate reduced TBARS levels only in
cerebellum. No alterations in lipid peroxidation were observed in the cortex after all treatments.
Additionally, the treatment with NPS, lithium or valproate reduced proteins carbonyl formation
in cerebellum. By contrast, lithium increased carbonylated proteins in the hippocampus
compared to control. Neither NPS nor valproate altered carbonylated protein content in cortex,
hippocampus and striatum. Altogether, these preliminary data provide the first evidence of a
neuroprotective role played by NPS in attenuating oxidative damage to lipids and proteins in the
mouse brain.
Keywords: Neuropeptide S; Oxidative Stress; Lipid Peroxidation; Protein Carbonyls; Lithium;
Valproate; Mood Stabilizers; Brain Structures.
47
Neuropeptide S (NPS) is a 20 amino-acid peptide recently identified in the brain and
peripheral tissues of distinct species of vertebrates [28]. NPS has a high sequence homology
among mammalian species, including a highly conserved N-terminal serine [19]. NPS is the
endogenous ligand of a G protein-coupled receptor named NPS receptor (NPSR) [28]. The
NPSR is widely expressed in the discrete regions of mammalian brain, and higher levels were
found in hypothalamus, amygdala, endopiriform nucleus, cortex, subiculum, and nuclei of the
thalamic midline [27]. In contrast, NPS precursor mRNA is found expressed in a cluster of
neurons located between the locus coeruleus (LC) and Barrington’s nucleus [28]. This pattern of
expression is consistent with the role proposed for NPS in the modulation of distinct behavioral
responses.
Several in vivo studies have demonstrated that the intracerebroventricular (i.c.v.)
injection of NPS induces hyperlocomotion [28, 21, 23, 20], reduces anxiety [28, 20, 14],
produces arousal [28], and alters food consumption [1, 4, 23, 5, 18].
Numerous studies have demonstrated that the most commonly used mood-stabilizing
drugs, lithium and valproate, exert neuroprotective effects in distinct experimental conditions,
such as brain damage induced by glutamate, oxidative damage elicited by psychostimulants
chronic administration, ischemia-induced brain injury and others (for a review see: [22, 25]).
Despite the variety of biomarkers used to identify and quantify brain injury, lipid
peroxidation and protein carbonyl formation are widely employed as an index of damage to
molecular components of cells usually observed during oxidative stress [7, 17]. It is known that
oxygen metabolism is essential for life, but it also generate damage to cells, due to the
production of reactive oxygen species (ROS), which react with many biological molecules such
48
as essential proteins and membrane lipids, causing protein cleavage and loss of membrane
integrity, which finally induce cell death [10].
Based on the facts described above, the present study was aimed to evaluate the effects of
the i.c.v. injection of NPS on lipid and protein oxidative damage in distinct mouse brain
structures, such as cerebellum, striatum, cortex and hippocampus. This study also evaluated the
acute effects of lithium and valproate, two neuroprotective compounds, on lipid peroxidation and
protein carbonyl formation in the mouse brain, in order to compared with the effects of NPS.
Naïve male CF-1 mice weighting 30-35 g obtained from FEPPS (Porto Alegre, Brazil)
were kept under our animal house at least one week before testing. The animals were housed six
per cage with food and water available ad libitum and were maintained on a 12-h light/ dark
cycle (lights on at 7:00 am). All experimental procedures involving animals were performed in
accordance with the National Institute of Heath’s Guide for the Care and Use of Laboratory
Animals and the Brazilian Society for Neuroscience and Behavior (SBNeC) recommendations
for animal care. This study was approved by the local ethics committee (Comitê de Ética em
Pesquisa da Universidade do Extremo Sul Catarinense). Experimental groups consisted of 5-6
animals per each drug and all mice were used only once.
The following drugs were used: NPS (synthesized by Dr. R. Guerrini, Department of
Pharmaceutical Science and Biotechnology Center, University of Ferrara, according to published
methods; [21], lithium chloride (VETEC QUÍMICA FINA Ltda, Rio de Janeiro – RJ, Brazil),
and valproate (Valpakene
®
- Aventis Pharma Ltda, São Paulo – SP, Brazil). All drugs were
dissolved in saline (NaCl 0.9%). Mice were injected by both via i.p. (10 ml/kg) and i.c.v. (2
µl/mouse) as follows, in order to mimic a similar experimental condition: saline (saline i.p. +
saline i.c.v.); NPS (saline i.p. + NPS 0.1 nmol i.c.v.); lithium (lithium 100 mg/kg i.p. + saline
49
i.c.v.); valproate (valproate 200 mg/kg i.p. + saline i.c.v.). The dose of NPS employed in the
present study is able to induce hyperlocomotion in mice as described elsewhere [20, 28]. Lithium
and valproate at 100 mg/kg and 200 mg/kg, respectively, prevented the hyperlocomotor effect of
amphetamine without inducing toxicity in mice [9, 12]. The i.c.v. injections were given under
light (just sufficient to produce a loss of the righting reflex) ether anaesthesia into the left
ventricle according to the procedure described by [13]. One hour after treatment the animals had
cerebellum, hippocampus, striatum and cortex dissected for thiobarbituric acid reactive species
(TBARS) and protein carbonyl contents.
To determine oxidative damage, we measured the formation of thiobarbituric acid
reactive species (TBARS) during an acid-heating reaction, as previously described [8]. The
samples were mixed with 1 mL of trichloroacetic acid (TCA) 10% and 1 mL of thiobarbituric
acid (TBA) 0.67% and were then heated in a boiling water bath for 15 minutes. TBARS were
determined by the absorbance at 535 nm. Oxidative damage to proteins was measured by the
quantification of carbonyl groups based on the reaction with dinitrophenylhidrazine (DNPH), as
previously described [15]. Proteins were precipitated by the addition of 20% trichloroacetic acid
and were redissolved in DNPH, and the absorbance was read at 370 nm. Protein was estimated in
all the fractions according to the method of [16]. Bovine serum albumin was used as standard.
Results (nmol/mg protein) were expressed as mean ± S.D. of 5-6 animals/group. Statistical
analyses were estimated using one-way ANOVA followed by Dunnett test. In all comparisons,
statistical significance was set at P<0.05.
The content of TBARS equivalents in the striatum, cortex, cerebellum and hippocampus
of mice treated with lithium, valproate and NPS was illustrated in figure 1 (top panel). The acute
administration of lithium and NPS reduced peroxidation of polyunsaturated fatty acids in distinct
50
mouse brain structures. A decrease in TBARS equivalents levels was detected in the cerebellum
(F(3,19)=6.55; P=0.003), hippocampus (F(3,19)=6.44; P=0.003), and striatum (F(3,19)=8.52;
P=0.009) of lithium and NPS-treated mice compared to control. The administration of valproate
reduced TBARS levels in the cerebellum, but it did not affect TBARS contents in the striatum
and hippocampus. No alterations in lipid peroxidation were observed in the cortex after all
treatments (P>0.05).
The effects of lithium, valproate and NPS administration on carbonylated protein levels
in the mouse brain are shown in figure 1 (bottom panel). A single administration of lithium,
valproate and NPS reduced protein carbonyl formation in the cerebellum compared to control
(F(3,18)=34.26; P<0.0001). By contrast, the treatment with lithium increased carbonylated
protein contents in the hippocampus, while valproate and NPS did not affect this biochemical
parameter (F(3,18)=8.26; P=0.001). In the cortex and striatum, no alterations were observed in
protein carbonyl formation after the administration of lithium, valproate and NPS (P>0.05).
The results of the present study demonstrated that the acute administration of NPS
reduced, mainly lipid peroxidation, but also carbonylated proteins generation in the mouse brain.
These findings herein presented suggest that NPS mimics the effects of lithium on protein and
lipid damage. Our findings also demonstrated that the acute administration of valproate reduces
TBARS equivalent levels and protein carbonyl formation in a smaller extension compared to
lithium and NPS. This decrease in lipid peroxidation and protein carbonyl formation reflects a
possible antioxidant or even a neuroprotective effect of NPS.
As extensively reported for lithium and valproate, neuroprotective effects elicited by
mood stabilizers have been postulated in several conditions, such as acute and chronic treatment,
distinct noxious stimuli, and in vivo or in cells culture. In fact, lithium and valproate attenuated
51
these following neurodegenerative actions: glutamate-induced lipid peroxidation and protein
oxidation [24, 11], oxidative stress damage induced by FeCl
3
[26], ischemia-induced cerebral
damage [2], ethanol-induced apoptosis [29], and others.
Lipid peroxidation and carbonylated proteins are the major consequences of free radical-
mediated injury to the brain. Damage to both protein and lipid alters fluidity and permeability of
cell membranes, and impairs the activity of enzymes and receptors. A large number of
neurodegenerative diseases are directly associated with lipid peroxidation; additionally, the
accumulation of carbonylated proteins in neuronal tissues is also implicated in many
neurological diseases [17, 7]. Thus, considering the importance of attenuating neuronal injury
promoted by prooxidant and/or excitotoxic stimuli, many studies are pointing to novel
antioxidant and/or neuroprotective compounds in order to investigate the putative mechanisms of
neuroprotection (for a review see: [3]).
Lithium and valproate are two drugs used to treat bipolar disorder. Interestingly, literature
information suggests a neuroprotective role for lithium and valproate, which is usually elicited
by chronic treatment and evokes a frame of intracellular mechanisms commonly shared by both
drugs. In fact, it has been reported that lithium inhibits NMDA-receptor-mediated calcium
influx, upregulate anti-apoptotic Bcl-2, downregulate pro-apoptotic p53 and Bax, and activate
cell survival factors. Additionally, lithium treatment antagonizes glutamate-induced activation of
c-Jun-N-terminal kinase (JNK), p38 kinase, and AP-1 binding, which has a major role in
cytotoxicity, and suppresses glutamate-induced loss of phosphorylated cAMP responsive
element binding protein (CREB). It has been described also that lithium also induces the
expression of brain-derived neurotrophic factor (BDNF) in cortical neurons (for a review see: [6,
52
25]). Thus, these quite complex and integrated actions cited above are on the base of the
neuroprotective effects of lithium and valproate.
Distinct from mood stabilizer drugs, there is no literature information which could
support this neuroprotective effect of NPS. However, considering that oxidative stress results
from an overproduction of reactive oxygen species that overwhelms the cellular antioxidant
capacity. Either overproduction of reactive oxygen species or insufficient endogenous
antioxidant defense can cause oxidative damage. We believe that this acute effect of NPS in
preventing lipid and protein damage could be due to an effect on antioxidant enzymes activities,
such as superoxide dismutase, catalase, glutathione peroxidase and glutathione redutase.
Additionally, a reduction of glutamate signaling, via ionotropic receptors (i.e. NMDA and
AMPA/kainate receptors), could also attenuate lipid peroxidation and protein carbonylation in
neuronal tissue. Thus, further studies aiming to investigate the mechanisms of these effects
elicited by NPS are worth of doing.
Another point to be considered is that we did not employ in this study any noxious
stimulus, except the i.c.v. injection, in order to evaluate the effects of NPS, lithium and valproate
on lipid and protein oxidative damage. In fact, all mice were subjected to the same experimental
conditions: i.p. and i.c.v. injections. NPS is a peptide quite unable to cross the blood brain
barrier, thus i.c.v. injection is absolutely required for NPS achieving the brain. By contrast,
several studies support the neurochemical effects of lithium and valproate systemically
administered in rodents. Collectively, present study was performed in absence of a well-
characterized noxious stimulus. However, further studies aiming to evaluate the effect of NPS
treatment in distinct stimulus-induced neuronal injury, such as administration of
psychostimulants or convulsive drugs are absolutely required.
53
In conclusion, our findings demonstrated for the first time an important role played by the
recently identified neuropeptidergic system (NPS-NPSR receptor) in attenuating lipid and
protein oxidative damage in the mouse brain. Under the same experimental conditions, NPS
elicited neuroprotective effects similar to that described for lithium. Taken together, these
observations contribute to provide the first evidence of a putative role played by NPS in
attenuating brain injury.
Acknowledgments: This work was supported by funds from the IBRO Return Home Fellowship
(ECG) and Brazilian National Council Research (to ECG - project n. 479760/2007-1).
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56
0.0
1.0
2.0
3.0
4.0
5.0
6.0
cerebellum hippocampus striatum cortex
Saline
NPS
Lithium
Valproate
*
*
*
*
*
*
*
TBARS equivalents
(nmol/mg protein)
0.0
5.0
10.0
15.0
20.0
cerebellum hippocampus
striatum
cortex
Saline
NPS
Lithium
Valproate
*
*
*
*
Protein carbonyls
(nmol/mg protein)
Figure 1 – Castro et al., 2008.
Figure 1 – Lipid peroxidation and carbonylated proteins contents in the mouse brain. All
animals were treated by both via i.p. (10 ml/kg) and i.c.v. (2 µl/mouse) as follows: saline (saline
i.p. + saline i.c.v.); NPS (saline i.p. + NPS 0.1 nmol i.c.v.); lithium (lithium 100 mg/kg i.p. +
saline i.c.v.); valproate (valproate 200 mg/kg i.p. + saline i.c.v.). One hour after treatment the
animals had cerebellum, hippocampus, striatum and cortex dissected for thiobarbituric acid
reactive species (TBARS) (top panel) and protein carbonyl contents (bottom panel)
determination. Each bar represents mean ± S.D. *P<0.05 vs. control group according to ANOVA
followed by the Dunnett’s test.
57
4. DISCUSSÃO
Considerando que o NPS foi recentemente descoberto e que existem poucos estudos
sobre as funções biológicas e neuroquímicas exercidas por este sistema peptidérgico, o presente
estudo objetivou comparar os efeitos da administração de NPS com os efeitos de drogas que
induzem ações comportamentais semelhantes as já mencionadas em outros estudos para o NPS
(Reinscheid et a., 2005a), tais como efeito ansiolítico e ação psioestimulante. Além disso,
considerando as ações bioquímicas descritas na primeira parte deste estudo para o NPS, na
segunda parte visou-se principalmente comparar os efeitos neuroquímicos do NPS com fármacos
com ação neuroprotetora conhecida.
No presente estudo verificou-se que, em um ambiente não-familiar, camundongos CF-1
tratados com 0,1 nmol de NPS e 2 mg/kg de AMPH apresentaram aumento na atividade
locomotora comparado ao grupo controle quando avaliados por um período de 30 minutos. O
tratamento com NPS nas doses de 0,01 e 1 nmol, assim como o DZP, não causaram alterações
significativas na atividade locomotora dos animais. Este estudo está de acordo com outros
achados da literatura que mostram que o NPS promove hiperlocomoção em camundongos (Xu et
al., 2004; Roth et al., 2006; Leonard et al., 2008; Rizzi et al., 2008) e ratos (Smith et al., 2006).
De fato, em 2004, Xu e colaboradores publicaram, pela primeira vez, que o NPS causava
aumento na atividade locomotora em camundongos da linhagem C57Bl/6. Neste estudo, as doses
de NPS 0,01 e 0,1 nmol promoveram efeito hiperlocomotor em camundongos submetidos a um
ambiente não-familiar, sendo que este efeito mantido por até 1 hora após a administração do
peptídeo. Em outro estudo, Leonard e colaboradores (2008) demonstraram que o NPS na dose
de 0,2 e 2 µg (cerca de 0,1 e 1 nmol) causou efeito hiperlocomotor em camundongos C57Bl/6
avaliados por 70 minutos na caixa de monitoramento da atividade locomotora.
58
Roth e colaboradores (2006) também relataram efeito hiperlocomotor para o NPS nas
doses de 0,1 e 1 nmol em camundongos Swiss. Smith e colaboradores, no mesmo ano (2006),
relataram que o NPS em concentrações 3 a 10 vezes maiores das empregadas em outros estudos
(3 e 10 nmol) causou efeito hiperlocomotor em ratos Wistar. No entanto, recentemente, Rizzi e
colaboradores (2008) observaram que o NPS atenuou o efeito hipolocomotor causado pela
administração prévia de diazepam em camundongos, sugerindo que o NPS produz um efeito
psicoestimulante genuíno por promover aumento da locomoção em animais sedados.
Convém notar que no presente estudo, a administração de NPS não causou um efeito do
tipo dose-resposta, pois a ação estimulatória do NPS na dose de 1 nmol foi inferior ao efeito
causado pela administração de NPS 0,1 nmol. Este fenômeno foi também descrito previamente
para camundongos tratados com NPS (Roth et al., 2006; Rizzi et al., 2008). No entanto, nestes
estudos os autores observaram que o efeito estimulatório induzido pelo NPS 1 nmol aparece um
pouco mais tarde do que o efeito induzido pelo NPS 0,1 nmol. Assim, faz-se necessário períodos
mais longos de observação dos camundongos, de pelo menos uma hora, a fim de registrar este
aumento da atividade locomotora induzido pela dose de 1 nmol de NPS.
Com relação à AMPH, os achados aqui apresentados apontam para um efeito
hiperlocomotor robusto induzido pela AMPH em camundongos CF-1. Dados da literatura
também mostram um efeito hiperlocomotor produzido pela AMPH em camundongos e ratos
(Gould et al., 2007; Frey et al., 2006a).
Em relação ao DZP, os dados do presente estudo demonstraram que a administração de 1
mg/kg de DZP não alterou a atividade locomotora total dos camundongos observada durante um
período de 30 min. Choleris e colaboradores (2001) realizaram uma análise detalhada do
comportamento de camundongos tratados com benzodiazepínicos, entre eles DZP, na caixa de
59
monitoramento da atividade. Estes autores observaram que o tratamento com DZP 1,5 mg/kg não
alterou a atividade locomotora total dos camundongos, mas causou modificações
comportamentais condizentes com um efeito do tipo ansiolítico (Choleris et al., 2001). Os dados
da literatura juntamente com os resultados do presente trabalho contribuem para fortalecer a
hipótese de que o DZP, em doses não sedativas, não modifica a atividade locomotora de
roedores.
Considerando os achados comportamentais aqui apresentados pode-se concluir que a
administração de NPS, especialmente na dose de 0,1 nmol, induz alterações comparáveis com as
ações observadas pela administração aguda de AMPH, mas não de DZP. Como exposto acima, a
administração de AMPH, mesmo que aguda, promove alterações bioquímicas compatíveis com
um estado de estresse oxidativo, visto que são descritas mudanças na atividade de enzimas
antioxidantes, além de dano oxidativo em lipídeos e proteínas (Frey et al., 2006a,b,c; Brown e
Yamamoto, 2003). Deste modo, o presente estudo tem como objetivo avaliar o efeito do
tratamento com NPS em parâmetros bioquímicos relacionados ao dano oxidativo em proteínas e
lipídeos em estruturas cerebrais de camundongos, a fim de compará-los com os resultados
obtidos pela administração aguda de AMPH e o DZP.
No primeiro artigo do presente estudo demonstrou-se que a administração aguda de
AMPH produziu aumento nos níveis de proteínas carboniladas no cerebelo e estriado, mas não
alterou os níveis de TBARS em diferentes regiões do cérebro de camundongos. O tratamento
com DZP elevou os níveis de proteínas carboniladas no estriado e aumentou a peroxidação
lipídica no córtex e cerebelo quando comparados ao grupo controle. Diferente dos resultados
encontrados com AMPH e DZP, o NPS reduziu a formação de proteínas carboniladas no estriado
60
e cerebelo em diferentes doses (0,01, 0,1 e 1 nmol), e ainda reduziu os níveis de peroxidação
lipídica no córtex dos camundongos tratados com NPS nas doses de 0,1 e 1 nmol.
No segundo artigo do presente estudo, a administração aguda de lítio, valproato e NPS
(0,1 nmol) reduziu a formação de proteínas carboniladas somente no cerebelo de camundongos
quando comparado ao grupo controle. Além disso, a administração de lítio e NPS (0,1 nmol)
reduziu os níveis de TBARS em cerebelo, hipocampo e estriado, exceto no córtex de
camundongos. O valproato também diminuiu os níveis de TBARS no cerebelo, porém nenhuma
alteração foi encontrada no estriado, hipocampo e córtex. Os resultados do presente estudo
sugerem que apesar da semelhança entre os efeitos comportamentais produzidos pelo NPS e
AMPH, o NPS reduziu o dano oxidativo no cérebro de camundongos de maneira semelhante ao
lítio, pois diminuiu a formação de proteínas carboniladas e a peroxidação lipídica em diferentes
áreas cerebrais comparado ao grupo controle.
Os dados do presente estudo apontam para um efeito danoso induzido em algumas das
estruturas cerebrais pela administração de DZP e a AMPH, isto pode ser sugerido pelo fato de
que a AMPH e o DZP causaram dano oxidativo avaliado através da elevação dos níveis de
peroxidação lipídica e carbonilação de proteínas em estruturas cerebrais de camundongos. Por
outro lado, os resultados deste estudo apontam para um efeito protetor para o NPS, semelhante
ao que foi observado para o tratamento com o lítio, visto que tanto o lítio quanto o NPS
reduziram o dano oxidativo em proteínas e lipídeos avaliados em estruturas cerebrais de
camundongos. Estes dados também demonstram que o valproato reduziu os níveis de TBARS e
de proteínas carboniladas, porém essa redução foi menor quando comparada ao efeito produzido
pelo lítio e o NPS. Deste modo, os resultados aqui apresentados para o lítio e valproato reforçam
61
os dados da literatura que sugerem efeito neuroprotetor para estas drogas em diversas condições
experimentais.
A peroxidação lipídica e a carbonilação de proteínas são as maiores conseqüências dos
danos teciduais mediados por radicais livres. Os danos em proteínas e lipídeos alteram a
permeabilidade da membrana celular e prejudicam a atividade de enzimas e receptores. Várias
doenças neurodegenerativas estão diretamente ligadas com a peroxidação lipídica (Meagher e
Fitzgerald, 2000). Adicionalmente, a acumulação de proteínas carboniladas em tecidos neuronais
tem implicado em muitas doenças neurológicas (Dalle-Donne, 2006).
Particularmente, a AMPH e os seus análogos aumentam a formação de radicais livres
(Yamamoto e Zhu, 1998). Estes radicais são quimicamente instáveis e, portanto muito reativos, e
por isso podem provocar danos em moléculas, como lipídios, proteínas e DNA (Halliwell,
2006b). As espécies reativas de oxigênio podem reagir diretamente com as proteínas ou com
moléculas como açúcares e lipídios, gerando subprodutos que reagem com as proteínas (grupos
carbonil). Assim, a perda de função das proteínas que foram carboniladas pode ser a causa da
subseqüente disfunção celular e danos aos tecidos (Dalle-Donne, 2006). De fato estudos mostram
que drogas psicoetimulantes tais como, D-anfetamina, cocaína, MDMA e também algumas
drogas ansiolíticas, como por exemplo o DZP aumentam a produção de proteínas carboniladas e
lipoperoxidação em cérebro de roedores (Quinton et al., 2006; Brown e Yamamoto, 2003;
Musavi e Kakkar, 2000; Musavi e Kakkar, 1998; Yamamoto e Zhu, 1998).
Bashkatova e colaboradores (2005) estudaram o papel do óxido nítrico nos efeitos
induzidos pela administração repetida de AMPH na liberação de neurotransmissores, como
glutamato, GABA, aspartato e acetilcolina no núcleo accumbens de ratos, e nos níveis de
peroxidação lipídica e óxido nítrico após o pré-tratamento com inibidor de óxido nítrico sintase.
62
A AMPH aumentou a liberação dos neurotransmissores e também de óxido nítrico e a
lipoperoxidação no estriado e córtex. Porém, o pré-tratamento com o inibidor de óxido nítrico
sintase reduziu a geração de óxido nítrico e a liberação de aminoácido, mas não atenuou o
aumento da peroxidação lipídica após o uso da AMPH, o que sugere que o dano oxidativo não é
mediado pelo oxido nítrico.
Evidências da literatura têm sugerido que o lítio e o valproato produzem efeitos
neuroprotetores em situações de estresse oxidativo. O tratamento crônico com essas drogas
inibiu a excitotoxicidade induzida por glutamato e FeCl
3
, atenuando o dano oxidativo em
culturas corticais primárias de ratos (Wang et al., 2003; Shao et al., 2005). Outros estudos
também têm demonstrado ação protetora do lítio e do valproato no dano oxidativo induzido pela
inibição da atividade do complexo I em células SH-SY5Y (King e Jope, 2005; Lai et al., 2006).
Entre os mecanismos pelos quais se sugere efeito neuroprotetor induzido particularmente
pelo tratamento crônico com fármacos estabilizadores do humor, lítio e valproato, destaca-se a:
estimulação da sinalização do BDNF e da atividade das proteínas quinases (ERK/MEK e
PI3K/Akt), a inibição da GSK3-β e do seu papel relacionado aos fatores pró-apoptóticos (CREB,
HSF-1, NF-κB, β-catenina) e a inibição da atividade dos receptores NMDA (Rowe e Chuang,
2004).
Deste modo, considerando o efeito neuroprotetor do lítio (dados da literatura) e as
semelhanças entre os efeitos bioquímicos induzidos pelo NPS e pelo lítio nos níveis de
peroxidação lipídica e de carbonilação de proteínas (presente estudo), pode-se sugerir, pela
primeira vez, um efeito protetor no cérebro induzido pelo NPS. Tornando assim o presente
estudo como fundamental no desenvolvimento e na validação de um possível papel neuroprotetor
para este novo sistema neuropeptidérgico.
63
Vários estudos apontam para os danos em proteínas e lipídeos como conseqüência do
estresse oxidativo (Andreazza et. al., 2007; Frey et al., 2007; Calabrese et al., 2003; Moosmann e
Behl, 2002; Rao e Balachandran, 2002; Halliwell, 2006a). Considerando que diversas são as vias
que modulam os efeitos neuroprotetores e neurodegenerativos, o que incluem vias de sinalização
intracelulares, e que os efeitos observados para o NPS, assim como para a AMPH, DZP, lítio e
valproato, foram todos oriundos da administração aguda, o presente trabalho visa investigar a
atividade de enzimas SOD e CAT, tendo em vista que estas enzimas estão entre as defesas
antioxidantes agudamente recrutadas e, que muitas vezes se encontram afetadas, em uma
situação de estresse oxidativo.
Em relação às enzimas antioxidantes, este estudo demonstrou que a AMPH aumentou a
atividade da enzima SOD somente no estriado. Porém, a atividade da enzima CAT não foi
alterada após o tratamento com AMPH. O DZP não alterou a atividade das enzimas
antioxidantes (SOD e CAT) nas diferentes áreas cerebrais analisadas neste estudo. Por outro
lado, o NPS reduziu a atividade da enzima SOD no córtex e cerebelo de camundongos. A
atividade da CAT apresentou um aumento significativo no córtex apenas na menor dose de NPS
(0,01 nmol). Nas outras regiões analisadas este aumento não foi significativamente diferente do
grupo controle.
Frey e colaboradores (2006ab) observaram que o tratamento com AMPH, além de
produzir elevação da peroxidação lipídica, alterou a atividade das enzimas antioxidantes CAT e
SOD em ratos. Após a administração i.p. aguda e crônica (7 dias) de AMPH em diferentes
concentrações, os níveis de SOD se elevaram no pré-frontal (tratamento agudo), hipocampo e
estriado (tratamento crônico), assim como os níveis de CAT no pré-frontal, hipocampo e estriado
64
após o tratamento crônico, enquanto que não foram observadas alterações na atividade da CAT
após a administração aguda (Frey et al., 2006a).
Carvalho e colaboradores (2001) mostraram que a AMPH diminuiu a atividade da SOD
no estriado e aumentou a atividade da CAT no córtex pré-frontal de ratos. A exposição aguda e
crônica à AMPH modulou a atividade das enzimas SOD e CAT de maneira diferente para todas
as regiões cerebral analisada. Esses resultados podem sugerir, em parte, que diferentes áreas do
cérebro são suscetíveis aos efeitos tóxicos causados pela AMPH (Ryan et al. 1990; Eisch et al.
1992). Comparando os resultados do presente estudo com os dados da literatura (Frey et al.,
2006a) pode-se observar que a administração aguda de AMPH elevou a atividade da SOD, mas
não causou modificações na atividade da CAT. Estes resultados sugerem que, especialmente, a
enzima SOD sofre modulação da sua atividade diante de uma situação de estresse oxidativo.
Musavi e Kakkar (1998; 2003) demonstraram que o DZP após exposição aguda e crônica
promoveu alteração nas enzimas SOD e glutationa redutase em nível mitocondrial e citosólico,
respectivamente. De fato, a atividade da Mn-SOD, ambos citosólico e mitocondrial, apresentou-
se diminuída no córtex cerebral e tronco cerebral após o tratamento agudo com DZP, enquanto
que a glutationa redutase, nesta mesma condição, apresentou redução da atividade nas três
estruturas cerebrais analisadas. Mesmo após a exposição crônica (21 dias) com DZP, os níveis de
glutationa redutase mantiveram-se reduzidos nas mesmas estruturas cerebrais estudadas,
enquanto que para a Cu/Zn-SOD e Mn-SOD não houve diferença na atividade comparada ao
grupo controle. Com relação à CAT, apesar desta ser considerada uma enzima antioxidante
importante, não foi encontrado na literatura nenhum estudo envolvendo a atividade da enzima
CAT no cérebro de roedores após a administração de DZP. Por outro lado, o presente estudo
demonstrou que o tratamento com DZP 1 mg/kg não alterou a atividade das enzimas SOD e
65
CAT. As diferenças na atividade da enzima SOD observadas entre o presente trabalho e o estudo
de Musavi e Kakkar (1998) podem ser devido às diferenças de dosagens, de espécie de animais e
de teste bioquímico empregados.
Para evitar a formação de estresse oxidativo assim como reparar os danos oxidativos em
tecidos e macromoléculas, todos os organismos possuem um sistema de defesa antioxidante
(Molina et al., 2003). Algumas destas defesas que fazem parte do processo enzimático são as
enzimas SOD e CAT (Ames et al., 1993). Estudos têm demonstrado que alterações no estado
redox podem produzir uma alteração no balanço entre a atividade da SOD e CAT, gerando
assim, o estresse oxidativo (Klamt et al., 2001; Andrades et al., 2005). A ação da SOD é
metabolizar o excesso de geração do ânion superóxido (O
2
*
¯ ), produzindo assim peróxido de
hidrogênio (H
2
O
2
). A CAT metaboliza o excesso de H
2
O
2
produzindo O
2
+ H
2
O, porém o redox
intracelular é diminuído.
Vários estudos bioquímicos associados com danos neurológicos tais como, doença de
Parkinson e Alzheimer, têm sugerido que a formação do ânion superóxido e redução da
expressão/atividade da enzima SOD, são um dos fatores determinantes para o aparecimento
destas patologias (Maier e Chan, 2002). Assim, o presente estudo sugere que apesar do
tratamento com NPS causar redução da atividade da SOD, que parece estar implicada em
situações de dano neuronal, o efeito do tipo protetor do NPS sobre os lipídeos e proteínas pode
ser devido a outros mecanismos que incluem a redução na geração de radicais livres.
Estudos adicionais fazem-se necessários para investigar o efeito do NPS na geração de
radicais livres e também na atividade de enzimas antioxidantes, citosólicas e mitocondriais, além
de determinar as concentrações de outras espécies antioxidantes não enzimáticas como as
vitaminas A, C e E, e a glutationa. Por fim, estudos crônicos com o NPS que visem investigar as
66
ações sobre o sistema glutamatérgico, assim como os efeitos intracelulares sobre as vias
apoptóticas e de expressão de neurotrofinas, também são de grande importância para o
entendimento das ações deste novo sistema peptidérgico na proteção contra o dano tecidual.
67
5. CONCLUSÃO
• O NPS apresentou um efeito hiperlocomotor semelhante à ação induzida pela AMPH;
• Os dados deste estudo demonstraram que o NPS reduziu os níveis de peroxidação lipídica
e carbonilação de proteínas, enquanto que a administração aguda de AMPH e DZP elevou estes
parâmetros bioquímicos que estão associados ao dano oxidativo;
• A redução nos níveis de peroxidação lipídica e de carbonilação de proteínas observada
com o tratamento com NPS confirmou-se em um segundo estudo (2ª. artigo). Neste caso, sob as
mesmas condições experimentais, o NPS, na dose capaz de causar efeito hiperlocomotor,
produziu um padrão de resposta semelhante ao lítio;
• Por fim, visando avaliar o papel das enzimas antioxidantes SOD e CAT no efeito
induzido pelo NPS, o presente estudo mostrou que o NPS reduziu de forma significativa a
atividade da SOD, mas pouco alterou a atividade da CAT. Por outro lado, tanto a AMPH quanto
o DZP não alteraram substancialmente a atividade das enzimas SOD e CAT. Estes achados
sugerem que, apesar do tratamento com NPS causar redução da atividade da SOD, o que poderia
contribuir para o dano neuronal, o efeito do tipo protetor do NPS sobre os lipídeos e proteínas
pode ser devido a outros mecanismos que incluem a redução na geração de radicais livres.
68
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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