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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
INSTITUTO DE QUÍMICA
Programa de Pós-Graduação em Química
ROBERTO SUSUMU UTSUNOMIYA
Biorreciclagem de hexano e estudo de reações
de óxido-redução usando plantas comestíveis
São Paulo
Data do depósito na SPG:
11/02/2008
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ROBERTO SUSUMU UTSUNOMIYA
Biorreciclagem de hexano e estudo de reações de
óxido-redução usando plantas comestíveis
Dissertação apresentada ao Instituto
de Química da Universidade de São
Paulo para obtenção do Título de
Mestre em
Química (Química Orgânica)
Orientador: Prof. Dr. Leandro Helgueira de Andrade
São Paulo
2008
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DEDICATÓRIA
Especialmente à minha família, pelo apoio incondicional e por ter compreendido a
minha ausência em muitos momentos especiais.
4
AGRADECIMENTOS
Ao professor orientador Dr. Leandro Helgueira de Andrade pela dedicada e
primorosa orientação, pelos inestimáveis conselhos e ensinamentos e pela serenidade
mantida durante todo o trabalho.
Aos professores Dr. João Valdir Comasseto e Dr. André Luis Meleiro Porto pelas
preciosas discussões, sugestões e essenciais contribuições.
À Dra. Patrícia Busko Di Vitta, que nos auxiliou nas análises cromatográficas;
Ao professor Dr. Cassius Vinicius Stevani, que nos possibilitou a quantificação das
proteínas e a determinação da atividade enzimática relacionadas ao fungo A. terreus; ao
professor Dr. Paulo Roberto Hrihorowitsch Moreno, que nos auxiliou com importantes
discussões durante o estudo das reações de óxido-redução mediadas pelas plantas; à
professora Dra. Liliana Marzorati pelas ricas discussões e sugestões.
Aos amigos Dr. Álvaro Takeo Omori e Dr. Artur Franz Keppler, Adriana O. Pacheco e
Edna Kagohara, que sempre mantiveram uma atitude solícita, auxiliando-nos efetivamente
durante todo o estudo e proporcionaram discussões imprescindíveis, momentos de
descontração e um ambiente de trabalho agradável e organizado.
Aos amigos, colegas e funcionários do grupo do professor Leandro e do professor
Comasseto: Adriana O. Pacheco, Alcindo A. dos Santos, Alexandre S. Guarazemini, Alícia
M. Tatar, Álvaro T. Omori, Artur F. Keppler, Bruno K. Bassora, Carlos E. Costa, Cristiano
Raminelli, Dennis G. Diego, Edna Kagohara, Fabiano T. Toledo, Giuliano Clososki, Leandro
Piovan, Leonardo F. Assis, Luis C. Ricci, Priscila Castelani, Roberta Polak, Rodrigo L. O. R.
Cunha, Thais Martins, Rosa M. Nascimento.
Ao CNPq pela Bolsa de Mestrado concedida.
5
SUMÁRIO
RESUMO................................................................................................................................10
ABSTRACT.............................................................................................................................12
PARTE 1 - BIORRECICLAGEM DE HEXANO
CAPÍTULO 1 - BIORRECICLAGEM DE HEXANO – INTRODUÇÃO E OBJETIVOS............15
1.1 Introdução..........................................................................................................................15
1.1.1
A reciclagem de hexano.....................................................................................17
1.1.2 As lipases......................................................................................................17
1.1.3 Mecanismo das reações de hidrólise mediadas pelas lipases ....................20
1.1.4 Fatores que interferem na atividade enzimática...........................................21
1.1.5 Objetivos do estudo......................................................................................23
CAPÍTULO 2 - BIORRECICLAGEM DE HEXANO - RESULTADOS E DISCUSSÃO............25
2.1 Determinação de uma curva-padrão para as reações de biorreciclagem...................25
2.2 Biorreciclagem usando microrganismos......................................................................26
2.2.1 Estudo do efeito da variação da quantidade de açúcar no meio de cultura de
crescimento do A. terreus......................................................................................................................27
2.2.2 Estudo do efeito da variação do pH inicial da biorreciclagem utilizando A. terreus....28
2.2.3 Determinação do rendimento da biorreciclagem utilizando A. terreus........................29
2.2.4 Estudo da cinética da biorreciclagem utilizando A. terreus.........................................29
2.2.5 Determinação da concentração de proteínas e atividade enzimática.........................31
2.3 Biorreciclagem usando enzimas comerciais................................................................32
2.4 Biorreciclagem em reator tubular de leito fixo.............................................................3
5
2.4.1 Estudo do efeito da variação do pH na biorreciclagem em reator de leito fixo...........37
2.4.2 Estudo do efeito da variação do tipo de solução tampão na biorreciclagem em reator
de leito fixo.............................................................................................................................................38
2.4.3 Estudo do efeito da variação da vazão da solução tampão na biorreciclagem em reator
de leito fixo.............................................................................................................................................38
2.4.4 Avaliação da estabilidade da CAL-B na biorreciclagem em reator de leito fixo............39
CAPÍTULO 3 - BIORRECICLAGEM DE HEXANO - CONCLUSÕES.....................................41
6
PARTE 2 - REAÇÕES DE ÓXIDO-REDUÇÃO USANDO PLANTAS COMESTÍVEIS
CAPÍTULO 4 - REAÇÕES DE ÓXIDO-REDUÇÃO USANDO PLANTAS COMESTÍVEIS –
INTRODUÇÃO E OBJETIVOS...............................................................................................44
4.1 Introdução...................................................................................................................................44
4.1.1 O Conceito de química verde.......................................................................................45
4.1.2 Principios da química verde..........................................................................................46
4.1.3 Importância dos álcoois quirais....................................................................................48
4.1.4 Álcool desidrogenases.................................................................................................49
4.1.5 Reação de resolução enzimática..................................................................................50
4.1.6 Reação de desracemização.........................................................................................52
4.2 Objetivos do Estudo....................................................................................................................53
CAPÍTULO 5 - REAÇÕES DE ÓXIDO-REDUÇÃO USANDO PLANTAS COMESTÍVEIS –
RESULTADOS E DISCUSSÃO
........................................................................................................54
5.1 Reações de redução ...................................................................................................................54
5.1.1 Redução de 1-feniletanona (1a)....................................................................................54
5.1.2 Redução de 1-(4-bromofenil)etanona (1b)....................................................................56
5.1.3 Redução de 1-(4-metilfenil)etanona (1c) ......................................................................58
5.1.4 Redução de 1-(4-nitrofenil)etanona (1d).......................................................................60
5.1.5 Redução de 1-(4-metilselanil-fenil)etanona (1e)...........................................................62
5.2 Reações de oxidação..................................................................................................................64
5.2.1 Oxidação do (RS)-1-feniletanol (2a) .............................................................................64
5.2.2 Oxidação de (RS)-1-(4-bromofenil)etanol (2b) .............................................................67
5.2.3 Oxidação de (RS)-1-(4-metilfenil)etanol (2c) ..............................................................689
5.2.4 Oxidação de (RS)-1-(4-nitrofenil)etanol (2d).................................................................71
5.2.5 Oxidação de (RS)-1-(4-metilselanil-fenil)etanol (2e).....................................................73
5.3 Reações em escala preparativa.................................................................................................75
CAPÍTULO 6 – REAÇÕES DE ÓXIDO-REDUÇÃO USANDO PLANTAS COMESTÍVEIS –
CONCLUSÕES.......................................................................................................................
78
7
CAPÍTULO 7 - PARTE EXPERIMENTAL
7.1 Biorreciclagem de hexano..........................................................................................................79
7.1.1 Materiais e Métodos.....................................................................................................79
7.1.2 Preparação dos meios de cultura.................................................................................81
7.1.3 Procedimento das reações de hidrólise com microrganismos.....................................81
7.1.4 Prodedimento das reações de hidrólise com enzimas isoladas...................................82
7.1.5 Métodos para análise no cromatógrafo a gás..............................................................82
7.1.6 Quantifição das proteínas totais dos microrganismos..................................................83
7.1.6.1 Crescimento dos fungos..............................................................................83
7.1.6.2 Preparação do homogeneizado de células.................................................83
7.1.6.3 Curva-padrão usando albumina..................................................................84
7.1.7 Determinação da atividade enzimática de lipase.........................................................85
7.2 Reações de óxido-redução usando plantas comestíveis............................................................85
7.2.1 Métodos e Métodos......................................................................................................86
7.2.2 Plantas usadas como fontes de enzimas.....................................................................87
7.2.3 Preparação dos substratos...........................................................................................87
7.2.3.1 Preparação da 1-(4-metilselanil-fenil)etanona (1e).....................................88
7.2.3.2 Preparação dos alcóois racêmicos..............................................................90
7.2.4 Procedimento para as reações com as plantas............................................................90
7.2.5 Reações em escala preparativa...................................................................................91
7.2.6 Métodos para as análises no cromatógrafo a gás........................................................92
7.2.7 Atribuição da configuração absoluta dos álcoois...........................................................97
SÚMULA CURRICULAR........................................................................................................9
8
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.......................................................................................99
8
Lista de figuras
Figura 1. Hidrólise da triacil-glicerol mediada por lipase......................................................................18
Figura 2. Reações catalisadas por lipases...........................................................................................19
Figura 3. Mecanismo de ação da tríade catalítica de uma lipase.........................................................21
Figura 4. Biotransformação do acetato de etila....................................................................................23
Figura 5. Biorreciclagem de hexano.....................................................................................................24
Figura 6. Sistema contínuo com reator PBR........................................................................................35
Figura 7. Possíveis configurações de múltiplos reatores......................................................................36
Figura 8. Produtos obtidos a partir do álcool (R)- ou (S)-3-hidroxibutanoato de etila (I)......................48
Figura 9. Forma reduzida de Nicotinamida-adenina-dinucleotídeo (NADH) e Nicotinamida-adenina-
dinucleotídeo-fosfato (NADPH).............................................................................................................49
Figura 10. Mecanismo de ação do NADH em um composto carbonílico.............................................50
Figura 11. Reação de resolução enzimática.........................................................................................51
Figura 12. Diagrama de energia de uma reação enantiosseletiva catalisada por enzima...................51
Figura 13. Reação de desracemização................................................................................................52
Figura 14. Redução da 1-feniletanona (1a)..........................................................................................54
Figura 15. Redução da 1-(4-bromofenil)etanona (1b)..........................................................................56
Figura 16. Redução da 1-(4-metilfenil)etanona (1c).............................................................................58
Figura 17. Redução da 1-(4-nitrofenil)etanona (1d).............................................................................60
Figura 18. Formação da 1-(4-aminofenil)etanona................................................................................60
Figura 19. Redução da 1-(4-metilselanil-fenil)etanona (1e)..................................................................62
Figura 20. Oxidação da (RS)-1-feniletanol (2a)....................................................................................64
Figura 21. Oxidação do (RS)-1-(4-bromofenil)etanol (2b)....................................................................67
Figura 22. Oxidação da (RS)-1-(4-metilfenil)etanol (2c).......................................................................69
Figura 23. Oxidação do (RS)-1-(4-nitrofenil)etanol (2d).......................................................................71
Figura 24. Redução do nitrobenzeno pela B. vulgaris..........................................................................71
Figura 25. Oxidação do (RS)-1-(4-(metilselanil)fenil)etanol (
2e)..........................................................73
Figura 26. Redução da 1-feniletanona (1a) em escala preparativa......................................................75
Figura 27. Cromatograma da reação da 1-feniletanona (1a) com A. xanthorrhiza...............................76
Figura 28. Oxidação do (RS)-1-(4-metilfenil)etanol (2c) em escala preparativa..................................76
Figura 29. Cromatograma da reação de oxidação do (RS)-1-(4-metilfenil)etanol (2c).........................77
Figura 30. Síntese da 1-(4-metilselanil-fenil)etanona (1e) ...................................................................88
Figura 31. Cromatogramas do (RS)-1-feniletanol (2a) e 1-feniletanona (1a).......................................92
Figura 32. Cromatogramas do (RS)-1-(4-bromofenil)etanol (2b) e 1-(4-bromofenil)etanona (1b).......93
Figura 33. Cromatogramas do (RS)-1-(4-metilfenil)etanol (2c) e 1-(4-metilfenil)etanona. (1c)............94
Figura 34. Cromatogramas do (RS)-1-(4-nitrofenil)etanol (2d), da 1-(4-nitrofenil)etanona (1d) e da 1-(4-
aminofenil)etanona................................................................................................................................95
Figura 35. Cromatogramas do (RS)-1-(4-(metilselanil)feniletanol (2e) e da 1-(4-
metilselanil)fenil)etanona (1e).................................................................................................................96
9
Lista de gráficos
Gráfico 1. Curva-padrão para quantificação do AcOEt........................................................................25
Gráfico 2. Variação da concentração de AcOEt ao longo do tempo....................................................30
Gráfico 3. Estabilidade da Novozyme 435 em processo contínuo.......................................................40
Lista de tabelas
Tabela 1. Triagem dos microrganismos para biorreciclagem de hexano...................................................27
Tabela 2. Variação da concentração de açúcar no meio de crescimento do A. terreus.......................28
Tabela 3.
Variação de pH da biorreciclagem utilizando A. terreus..............................................................29
Tabela 4. Concentração de proteínas e atividade enzimática do A. terreus.........................................31
Tabela 5.
Hidrólise de acetato de etila presente no resíduo (Hexanos/acetato de etila) usando água destilada
(pH = 5,7)...............................................................................................................................................................
.33
Tabela 6.
Hidrólise de acetato de etila presente no resíduo (Hexano/acetato de etila) usando solução tampão
com pH = 7,0
.......................................................................................................................................................33
Tabela 7.
Hidrólise de acetato de etila presente no resíduo (Hexano/acetato de etila) usando solução tampão
com pH = 10,0
..................................................................................................................................................34
Tabela 8.
Efeito da variação do pH na taxa de hidrólise de acetato de etila mediada por CAL-B em reator de
leito fixo.
..................................................................................................................................................37
Tabela 9.
Efeito da variação do tipo de solução tampão na reação de hidrólise de acetato de etila mediada por
CAL-B em reator de leito fixo.
....................................................................................................................38
Tabela 10.
Efeito da variação da vazão do tampão durante a biorreciclagem de hexano em reator de
leito fixo.................................................................................................................................................39
Tabela 11. Redução da 1-feniletanona (1a)..........................................................................................55
Tabela 12. Redução da 1-(4-bromofenil)etanona (1b)..........................................................................57
Tabela 13. Redução da 1-(4-metilfenil)etanona (1c).............................................................................59
Tabela 14. Redução da 1-(4-nitrofenil)etanona (1d).............................................................................61
Tabela 15. Redução da 1-(4-metilselanilfenil)etanona (1e)..................................................................63
Tabela 16. Oxidação do (RS)-1-feniletanol (2a)....................................................................................66
Tabela 17. Oxidação do (RS)-1-(4-bromofenil)etanol (2b)....................................................................68
Tabela 18. Oxidação do (RS)-1-(4-metilfenil)etanol (2c)......................................................................70
Tabela 19. Oxidação do (RS)-1-(4-nitrofenil)etanol (2d)......................................................................72
Tabela 20. Oxidação do (RS)-1-(4-metilselanil-fenil)etanol (2e)...........................................................74
Tabela 21. Volumes usados para traçar a curva-padrão para quantificação de proteínas...................84
Tabela 22. Nome das plantas usadas nas reações de óxido-redução.................................................87
10
RESUMO
Utsunomiya, R. S. Biorreciclagem de hexano e estudo de reações de óxido-redução usando
plantas comestíveis. 2008. 102p. Dissertação (Mestrado). Programa de Pós-Graduação em
Química. Instituto de Química, Universidade de São Paulo, São Paulo.
O presente trabalho teve como objetivos principais utilizar reações enzimáticas para
a degradação de resíduos de laboratório e na síntese de álcoois quirais. Na primeira parte
foi realizada uma triagem de microrganismos e enzimas hidrolíticas, objetivando a
biorreciclagem de hexano presente no resíduo contendo uma mistura hexano-acetato de
etila. Esta mistura é largamente utilizada para purificação de compostos químicos por
cromatografia líquida. O método de biorreciclagem, em sistema bifásico, consistiu na
hidrólise enzimática do acetato de etila, viabilizando, dessa forma, a recuperação do hexano
puro de forma simples e rápida, pois os produtos dessa reação são altamente solúveis na
fase aquosa (Esquema 1).
O
O
lipases
H
2
O
OH
O
HO
Fase orgânica
Fase aquosa
Hexano
Acetato de etila
Ácido acético Etanol
Esquema 1. Hidrólise do acetato de etila para a biorreciclagem de hexano.
Para avaliar a possibilidade de se tratar grandes quantidades de efluentes, foram
realizados também alguns ensaios em um sistema contínuo com reator tubular de leito fixo
usando a lipase imobilizada de Candida antartica (CAL-B, Novozyme 435), a qual mostrou
ser bastante promissora para essa finalidade. Nesse sistema alcançaram-se taxas de
hidrólise em torno de 70%, sem perda da estabilidade enzimática durante 6 horas de
trabalho.
11
Na segunda parte do trabalho, avaliamos o potencial catalítico de diversas plantas
comestíveis em reações orgânicas de óxido-redução visando à síntese enantiosseletiva de
álcoois quirais. As reações escolhidas, para tal propósito, foram a redução de cetonas pró-
quirais e a resolução cinética de álcoois via oxidação enantiosseletiva (Esquema 2).
O
R
OH
R
planta
32
o
C / H
2
O
R = H; Br; Me; NO
2
; MeSe.
Esquema 2. Reações de óxido-redução catalisadas por plantas.
Em muitos casos, os enantiômeros foram obtidos, separadamente, com pureza
enantiomérica de até 99% dependendo da planta utilizada como biocatalizador. Por
exemplo, a Arracacia xanthorrhiza B. (mandioquinha) promoveu uma eficiente redução
enantiosseletiva da 1-(4-bromofenil)etanona, fornecendo o (S)-1-(4-bromofenil)etanol com
98% de e.e. (excesso enantiomérico), enquanto que a Manihot esculenta (mandioca)
forneceu o (R)-1-(4-bromofenil)etanol com 90% de e.e. Algumas plantas mostraram uma
boa capacidade oxidativa. Por exemplo, o Coriandrum sativum L. (coentro) levou a oxidação
quantitativa do 1-(4-metilfenil)etanol a 1-(4-metilfenil)etanona.
Palavras-chave: Biorreciclagem, hexano, lipases, oxidação, redução, plantas comestíveis.
12
ABSTRACT
Utsunomiya, R. S. Biorecycling of hexane and study of oxido-reduction reactions using edible
plants. 2008. 102p. Masters Thesis – Graduate Program in Chemistry. Instituto de Química,
Universidade de São Paulo, São Paulo.
The present work had as main goals the use of enzymatic reactions to degrade
laboratory residues and to synthesize chiral alcohols. In the first part, it was carried out a
screening of microorganisms and hydrolytic enzymes aiming the biorecycling of hexane from
laboratory residues (a mixture of hexane-ethyl acetate). This misture is widely employed to
purify chemicals by liquid chromatography. The biorecycling consists of enzymatic hydrolysis
of ethyl acetate in a biphasic system. Due to the high solubility of the undesired products
from this reaction in the aqueous phase, the hexane was easily recovered (Scheme 1).
O
O
lipases
H
2
O
OH
O
HO
Organic phase
Aqueous phase
Hexane Ethyl acetate
Acetic acid
Ethanol
Scheme 1. Hydrolysis of ethyl acetate to biorecycling of hexane.
To evaluate the possibility of treatment of effluents in a high amount, we carried out
the biorecycling in a continuous system with tubular reactor using immobilized lipase
(Novozyme 435). By the use of this system, the hydrolysis ratio was around 70% with no lost
of enzyme stability along 6 hours work.
13
In the second part of the work, we evaluated the catalytic potential of several edible
plants in oxido-reduction reactions aiming the enantioselective synthesis of chiral alcohols.
The chosen reactions were the reduction of prochiral ketones and the kinetic resolution by
enantioselective oxidation (Scheme 1).
O
R
OH
R
plant
32
o
C / H
2
O
R = H; Br; Me; NO
2
; MeSe.
Scheme 2. Oxido-reduction reaction catalyzed by plants.
In several cases, depending of the plant employed as biocatalyst, the (R) or (S)-
enantiomer were obtained in high enantiomeric purity (up to 99%). For example, the
Arracacia xanthorrhiza B. (mandioquinha) performed an efficient enantioseletive reduction of
1-(4-bromophenyl)ethanone to the (S)-1-(4-bromophenyl)ethanol with 98% e.e.
(enantiomeric excess), while the a Manihot esculenta (mandioca) gave the (R)-1-(4-
bromophenyl)ethanol with 90% e.e. Some plants showed a good oxidative performance. For
example, Coriandrum sativum L. (coentro) gave the quantitative oxidation of 1-(4-
methyphenyl)ethanol to the 1-(4-metilphenyl)ethanona.
Keywords: Biorecycling, hexane, lipases, oxidation, reduction, edible plants.
14
PARTE 1: BIORRECICLAGEM DE
HEXANO
15
CAPÍTULO 1 – BIORRECICLAGEM DE HEXANO – INTRODUÇÃO E
OBJETIVOS
1.1 Introdução
Nos últimos cem anos, o padrão de desenvolvimento que foi escolhido
começou a provocar devastadoras mudanças ambientais no fino e delicado habitat
da terra, ameaçando o futuro do planeta e do homem. O modelo de acumulação que
rege o capitalismo global exige contínuo aumento de consumo e sucateamento de
produtos, acelerando brutalmente o uso de recursos naturais escassos. A queima de
petróleo, carvão e gás elevaram a concentração de CO
2
(dióxido de carbono) na
atmosfera de 280 ppm (partes por milhão) em 1860 para 365 ppm em 1990; é
provável que atinja 700 ppm em 2100. Assim, os solos ficarão mais secos e as fortes
estiagens serão em maiores número e intensidade. A temperatura média global pode
subir até 6 ºC nos próximos 100 anos. O gelo polar derreterá e poderá elevar o nível
dos oceanos em até 94 cm, o que exigiria a remoção de mais de 90 milhões de
pessoas. Na Europa e nos Estados Unidos, por volta de 50% dos lagos e rios estão
gravemente poluídos. De todos os ecossistemas mundiais, pelo menos 60% estão
sendo explorados de maneira não-sustentáveis ocasionando um processo de
degradação, que pode ser irreversível em 50 anos. A expansão agrícola de 1945 até
2004 foi superior à soma dos séculos 18 e 19; a destruição ambiental resultante
agrava o percentual de plantas, mamíferos, aves e anfíbios em extinção; algumas
dessas espécies nem sequer foram catalogadas
1
. Em vista disso, a maioria da
comunidade mundial tem dado atenção à proteção ambiental.
A implementação de soluções necessárias à minimização do uso dos
recursos não renováveis e da geração de resíduos no processo produtivo é de
16
grande importância e, usualmente, são empregadas as seguintes ações ordenadas
de maior a menor hierarquia, denominado “3R”: Reduzir, Reutilizar e Reciclar.
Reduzir é a ação mais importante, entretanto ela está fortemente ligada à
conscientização da sociedade como um todo, desde a necessidade de produção de
um determinado produto até seu consumo adequado. Dentro do contexto de
processos industriais, a redução deve ser empregada fortemente, pois com isso é
possível aplicar tecnologia limpa, por exemplo, para evitar o uso de energia, excesso
de reagentes, solventes e reagentes tóxicos.
Uma preocupação natural da sociedade é que se o consumo de bens e
serviços regredir, apenas como hipótese, precisamos refletir o que isto significaria
em termos de redução adicional de postos de trabalho, além dos que já estão sendo
cortados pela racionalização proporcionada pelo desenvolvimento tecnológico e que
a competição e a busca permanente de ganhos de produtividade promovem. Quanto
aos dois outros “R”, na verdade podem ser tratados como um só: reciclagem.
A reciclagem é um conceito promissor e um fato importante que surgiu no
setor de meio ambiente nos últimos anos. Visto de forma pragmática, é a forma de
conciliar as tendências mundiais de globalização, que embute a tendência de
universalização da sociedade de consumo e, por via de consequência, a ampliação
da geração de resíduos, com a atividade econômica do processamento de
resíduos
2
.
Em termos de sustentabilidade, processos de tratamento de resíduos que
empregam microrganismos e enzimas isoladas têm recebido grande atenção
3,4,5
.
17
1.1.1 A reciclagem de hexano
As misturas compostas de hexano e acetato de etila são usadas nas
indústrias farmacêuticas, químicas e em instituições de ensino e pesquisa para
purificação de compostos através de técnicas cromatográficas. As misturas
produzidas usando essas técnicas são compostas majoritariamente de hexano, que
não é facilmente separado do acetato de etila (AcOEt) através de destilação devido
à pequena diferença nos seus pontos de ebulição (acetato de etila: p
e
= 77 °C;
hexano: p
e
= 69°C) e à formação de mistura azeotrópica (n-hexano: x
i
= 0,657; T =
64,85 °C; P = 101,3 kPa)
6
.
Algumas alternativas foram propostas a fim de evitar o descarte dessa
mistura. Wilkinson
7
propôs a sua reutilização apenas efetuando uma destilação para
eliminar as impurezas e, em seguida, quantificando via cromatografia a sua
composição. Mais recentemente, a possibilidade de separação do n-hexano do
acetato de etila foi estudada usando a técnica de destilação azeotrópica, um
processo de difícil controle e, ainda, usa um terceiro composto como auxiliar de
destilação
8
.
1.1.2 As lipases
Dentre as enzimas hidrolíticas de maior interesse estão as lipases, que
podem ser encontradas em tecidos de vários animais e plantas, e podem ser
produzidas por fermentação usando várias espécies de microrganismos, tais como
os fungos Aspergillus mucor, Rhizopus penicillium, Geotrichum sp., por leveduras de
Tulopis sp. e Candida sp. e bactérias como Pseudomonas sp., Achromobacter sp. e
Staphylococcus sp.
9
18
Do ponto de vista econômico e industrial, os fungos são especialmente
valorizados porque as enzimas hidrolíticas por eles produzidas normalmente são
extracelulares
10
., o que facilita sua recuperação do meio de fermentação e apresenta
menor custo de isolamento.
Originalmente, as lipases são enzimas responsáveis por catalisar reações de
hidrólise de acilgliceróis em ácidos graxos, monoacilgliceróis, diacilgliceróis e glicerol
(Figura 1).
OH
OH
OH
O
O
O
R
1
R
2
O
O
R
3
O
R
1
O
OH
R
3
O
OH
R
2
O
OH
LIPASE
H
2
O
Ácido graxo
Glicerol
Triacil- glicero l
Figura 1. Hidrólise da triacil-glicerol mediada por lipase.
No entanto, além da hidrólise, as lipases possuem a habilidade de catalisar
reações de esterificação, transesterificações, interesterificação, alcoólise, acidólise,
aminólise e lactonização (Figura 2). O deslocamento do equilíbrio na reação, no
sentido direto (hidrólise) ou inverso (síntese), pode ser controlado pela quantidade
de água presente na mistura reacional papel
11
.
19
R
1
OH
+
HO
OR
1
O
n
O
O
n
Lactonização
+
+
R
1
OH
R
O
NR
2
H
R
2
NH
2
R
O
OR
1
Aminólise
R
2
O
OR
1
R
2
O
OH
R
O
OR
1
R
O
OH
+
+
Acidólise
R
O
OR
1
R
2
OH
R
O
OR
2
H
2
O
+
+
Alcóolise
+
+
R
O
OR
2
R
O
OR
1
R
2
O
OR
3
R
3
O
OR
1
Interesterificação
+
+
H
2
O
R
O
OR
1
R
1
OH
R
O
OH
Esterificação
R
O
OR
1
H
2
O
R
O
OR
1
R
1
OH
+
+
Hidrólise
Figura 2. Reações catalisadas por lípases.
As lipases não requerem cofatores, atuam em uma faixa de pH relativamente
grande, são muito estáveis neste meio, têm grande disponibilidade a baixo custo, e
apresentam especificidade, regiosseletividade, quimiosseletividade e
enantiosseletividade. Devido a esses fatores, elas têm sido extensivamente
investigadas e utilizadas em uma variedade de segmentos biotecnológicos, como em
indústrias de alimentos (desenvolvimento de aromas e maturação de queijos), de
detergentes, oleoquímica (hidrólise de óleos e gorduras, síntese de biosurfactantes)
e para tratamento de resíduos oleosos provindos da indústria do couro e de papel
12
.
20
1.1.3 Mecanismo das reações de hidrólise mediadas pelas lipases
O sítio catalítico de uma lipase é formado pela tríade catalítica, composta por
resíduos de aminoácidos de serina, histidina e aspartato (Ser-His-Asp) ou glutamato,
que se repete em todas as estruturas e é, freqüentemente, protegido na molécula
por uma “tampa” hidrofóbica ou “lid” que ao interagir com a interface lipídeo/água
sofre uma mudança conformacional, expondo o sítio ativo. A presença da “tampa” na
estrutura da enzima e a propriedade de ativação interfacial passaram a ser fatores
determinantes para a caracterização de lipases. Estudos de raios-X
13
com a lipase
da Candida antarctica revelou a existência de uma “tampa” recobrindo a tríade
catalítica Ser-His-Asp. Mais recentemente, entretanto, observou-se que a presença
da “tampa” não está necessariamente correlacionada com a ativação interfacial,
sendo que as lipases de Pseudomonas aeruginosa, Burkholderia glumae e Candida
antarctica (fração B), que apresentam a “tampa” em suas estruturas, não sofrem
ativação interfacial. Por outro lado, as cutinases, enzimas consideradas lipases
“verdadeiras”, não apresentam a “tampa” e não precisam da interface para exercer a
atividade hidrolítica
14
.
A Figura 3 ilustra o mecanismo de ação da tríade catalítica de uma lipase em
um éster.
Pelo mecanismo, o grupo carboxilato do ácido aspártico atua de modo a
estabilizar a histidina e esta se liga ao álcool da serina por ligação hidrogênio,
tornando-o mais nucleofílico. Isso possibilita o ataque nucleofílico do oxigênio da
serina ao carbono acílico do éster formando um intermediário tetraédrico (A). Com a
convergência dos elétrons do oxiânion formado para o carbono carbonílico e a
transferência do próton situado na histidina ocorre a liberação do primeiro produto, o
álcool, e forma-se a enzima acilada (complexo acil-enzima). Em seguida a água age
21
como nucleófilo e, de modo análogo à formação do complexo acil-enzima, completa-
se a hidrólise, passando pelo intermediário tetraédrico (B) e liberando o ácido
carboxílico e a enzima.
N
NH
CH
2
CH
2
OH
C
O
R
1
O
R
2
CH
2
C
O
O
CH
2
C
O
O
N
NH
CH
2
H
CH
2
C
O
O
N
NH
CH
2
H
CH
2
O
CO
R
1
O
R
2
+
CH
2
O
C
R
1
O
O
H
+
CH
2
C
O
O
N
NH
CH
2
CH
2
O
CO
R
1
O
H
H
R
2
OH
C
HO
O
R
1
Intermediário
tetraédrico B
Complexo acil-enzima
Ácido carboxílico
Álcool
Intermediário
tetraédrico A
Substrato (éster)
HOH
Figura 3. Mecanismo de ação da tríade catalítica de uma lipase.
1.1.4 Fatores que interferem na atividade enzimática
15
A estrutura e a forma do centro ativo são decorrências da estrutura
tridimensional da enzima e pode ser afetada por quaisquer agentes capazes de
provocar mudanças conformacionais na proteína. Isto torna a atividade enzimática
dependente das características do meio onde ela se encontra, notadamente do pH e
da temperatura.
A maioria das enzimas apresenta um valor de pH para o qual a sua atividade
é máxima – a velocidade da reação diminui a medida que o pH se afasta desse valor
22
ótimo, que é característico para cada enzima mas, com freqüência, está próximo do
pH neutro. A influência do pH sobre a catálise enzimática pode ser melhor
compreendida lembrando que as enzimas apresentam grupos tituláveis nos resíduos
de arginina, aspartato, cisteína, glutamato, histidina, lisina e tirosina. Alguns destes
grupos podem fazer parte do centro ativo ou serem importantes na manutenção da
estrutura espacial da molécula. A cada valor de pH, alguns desses grupos
apresentam-se protonados ou desprotonados. Existe uma concentração
hidrogeniônica que propicia um determinado arranjo de grupos protonados e
desprotonados que leva a molécula de enzima à conformação ideal para exercer seu
papel catalítico. Este pH ótimo depende, portanto, do número e tipo de grupos
ionizáveis que uma enzima apresenta e da seqüência em que estão organizados, ou
seja, depende de sua estrutura primária. Por outro lado, quando o substrato contém
grupos ionizáveis, as variações de pH também poderão afetar suas cargas. A
eficiência da catálise dependerá, então, de encontrarem-se, enzima e substrato, com
conformação e carga adequadas para permitir a interação necessária para que a
reação ocorra.
Como ocorre com a maioria das reações químicas, a velocidade da reação
enzimática, que a 0 °C apresenta valores próximos de zero, é favorecida pela
elevação da temperatura. O gradativo aumento da velocidade só se verifica
enquanto a enzima conservar sua estrutura nativa. Acima de 50-55 °C, a maioria das
proteínas são desnaturadas. A desnaturação provoca drásticas alterações
conformacionais na molécula, acarretando a perda do poder de catálise. No intervalo
de temperatura mencionado vive a grande maioria dos seres vivos. Há, entretanto,
exceções, entre as quais a mais notável é representada por bactérias que vivem em
águas termais, com temperaturas ao redor de 100 °C.
23
A adição de solventes orgânicos polares e de compostos com grande
capacidade de formar ligações hidrogênio pode determinar a desnaturação da
proteína porque estes últimos agentes estabelecem ligações hidrogênio com radicais
da proteína, substituindo ligações que mantinham a estrutura nativa.
1.2 Objetivos do Estudo
Devido à produção constante do resíduo hexanos/acetato de etila, decidimos
nos preocupar com a biorreciclagem do hexano, um recurso não-renovável e com
isso evitar sua incineração, contribuindo, desse modo, para uma diminuição na
emissão de poluentes atmosféricos. O acetato de etila é produzido através de
matérias-primas renováveis e, especialmente no Brasil, o baixo preço do etanol torna
esse éster bastante competitivo no mercado nacional e internacional
16
. Sendo assim,
a biodegradação do acetato de etila não representa grandes custos financeiros,
tornando essa abordagem perfeitamente viável.
Nessa parte do trabalho tivemos como objetivo principal desenvolver método
de degradação enzimática do acetato de etila presente em misturas de
hexano/acetato de etila proveniente de resíduos laboratoriais. Para isso, baseado
em reações enzimáticas, o método consiste na hidrólise do acetato de etila através
da ação de enzimas hidrolíticas (lipases) isoladas ou presentes nos sistemas
enzimáticos de microrganismos
9
(Figura 4).
Figura 4. Biotransformação do acetato de etila.
O
O
lipases
H
2
O
OH
O
HO
Fase orgânica
Fase aquosa
Hexano
Acetato de etila
Ácido acético Etanol
24
Desse modo, esse éster, em uma reação inversa a de sua síntese, é
transformado em etanol e ácido acético, enquanto que o hexano é mantido
inalterado. Após essa biotransformação, uma destilação simples possibilita a
recuperação do hexano puro (Figura 5).
Figura 5. Biorreciclagem de hexano.
25
CAPÍTULO 2 - BIORRECICLAGEM DE HEXANO - RESULTADOS E
DISCUSSÃO
Neste capítulo estão apresentados os resultados e discussões sobre as
reações de hidrólise do acetato de etila, nas quais foram utilizados quatro fungos e
sete enzimas hidrolíticas comerciais. Por fim, encontra-se um estudo sobre a
possibilidade do uso da enzima Novozyme 435 em um reator tubular operando em
processo contínuo.
2.1 Determinação de uma curva-padrão para as reações de
biorreciclagem
Para a quantificação dos componentes das amostras de resíduo contendo
hexano e acetato de etila (AcOEt) foi traçada uma curva padrão (Gráfico 1). Nesse
gráfico, a abscissa (x) corresponde à área do pico obtido do cromatograma e a
ordenada (y) corresponde a concentração volumétrica real da amostra. Desse modo,
obteve-se a correlação y = 1,51x.
Gráfico 1. Curva-padrão para quantificação do AcOEt.
26
2.2 Biorreciclagem usando microrganismos
Tendo em vista a redução de custo do processo de reciclagem do hexano e,
com isso evitar o uso de enzimas purificadas, decidiu-se estudar o emprego de
fungos para efetuar a hidrólise do acetato de etila presente no resíduo.
Uma busca na literatura revelou que os fungos Aspergillus terreus, Aspergillus
niger, Emericella nidulans e Rhizopus oryzae são conhecidos como produtores de
lipases
9
. Desta forma, iniciaram-se os estudos com a avaliação da atividade
hidrolítica dos fungos disponíveis em nosso laboratório: Aspergillus terreus SSP
1498, Aspergillus niger SSP 1078, Emericella nidulans CCT 3119 e Rhizopus oryzae
CCT 4964.
Após o preparo do pré-inóculo, de acordo com o procedimento descrito na
seção 7.1.6.1, o crescimento dos fungos foi realizado diretamente em um reator do
tipo batelada com agitador tipo pá durante 48 h, a 32 °C, usando 3 L de meio de
cultura preparado a partir do extrato de batatas comestível (Solanum tuberosum),
conforme procedimento descrito na seção 7.1.2. Após essa etapa, foi adicionado no
reator 600 mL da mistura hexano-acetato de etila e acompanhou-se a reação após
24 e 48 horas. Os resultados são apresentados na Tabela 1, na qual estão
especificadas as composições do acetato de etila no início e após 24 e 48 horas de
reação.
27
Tabela 1. Triagem de microrganismos para biorreciclagem de hexano.
Concentração de AcOEt (%v/v)
Microrganismo
0 h 24 h 48 h
Aspergillus terreus
27,3 11,5 11,2
Aspergillus niger
29,2 14,5 14,4
Emericella nidulans
29,0 14,7 14,8
Rhizopus oryzae
28,3 14,7 14,5
Como podemos observar na tabela 1, entre os fungos avaliados, o A. terreus
SSP 1498 exibiu um desempenho ligeiramente superior. Com o qual, após 24 h, a
concentração do acetato de etila passou de 27,3 % para 11,5 % (v/v), enquanto que
com os outros fungos a concentração chegou a 14,5 % (v/v).
Com base nesses resultados foram realizados experimentos adicionais
somente com o fungo A. terreus SSP 1498, variando a composição do meio de
crescimento e o pH do meio reacional.
2.2.1 Estudo do efeito da variação da quantidade de açúcar no meio de cultura
de crescimento do A. terreus
A glicose é o principal substrato oxidável para a maioria dos organismos. Sua
utilização como fonte energética pode ser considerada universal e, dos
microrganismos ao homem, quase todas as células são potencialmente capazes de
atender suas demandas energéticas apenas a partir desse açúcar. Variações na
fonte de sua obtenção e na proporção entre carbono e nitrogênio no meio de cultura
podem levar a mudança no crescimento celular e na produção de enzimas
17
.
Sendo assim, para verificar a eficiência da biotransformação do acetato de
etila, o crescimento do A. terreus SSP 1498 no reator foi realizado em meios com
28
diferentes concentrações de açúcar (Tabela 2). Nesse caso foi utilizado o açúcar
refinado da marca UNIÃO
®
adquirido no comércio local.
Tabela 2. Variação da concentração de açúcar no meio
de crescimento do A. terreus.
Açúcar (g/L) Concentração de AcOEt (%v/v)
0 h 24 h 48 h
20 27,3 11,4 11,1
60 28,9 16,3 16,0
120 29,3 15,3 15,3
Como pode ser observado na tabela 2, o aumento da concentração de açúcar
no meio de crescimento não houve melhora significativa nas taxas de hidrólise. Por
exemplo, na concentração de 20 g/L obteve-se a maior taxa de hidrólise, onde a
concentração de acetato de etila diminuiu de 27,3 % (v/v) para 11,4 % (v/v), após 24
h de reação. Entretanto, com o uso de 60 g/L de açúcar, a concentração de acetato
de etila diminuiu de 28,9 % (v/v) para 16,3 % (v/v), após 24 h de reação. Com base
nesses resultados podemos concluir que o aumento da concentração de açúcar no
meio de crescimento do fungo não melhorou significativamente a taxa de hidrólise do
acetato de etila.
2.2.2 Estudo do efeito da variação do pH inicial da biorreciclagem utilizando
A. terreus
Usando o fungo A. terreus, a biorreciclagem foi avaliada em diferentes valores
de pH (Tabela 3). Foram selecionados os valores de pH 5,5, 7 e 10, pois estão
dentro da faixa considerada ótima para a estabilidade das lipases e para reação de
hidrólise.
9
Esses valores de pH foram ajustados após o tempo de crescimento do
fungo.
29
Tabela 3. Variação de pH da biorreciclagem utilizando A.
terreus.
Concentração de AcOEt (%v/v)
pH 0 h 24 h 48 h
5,5 27,3 11,4 11,1
7
28,7 14,5 14,0
10 29,2 14,4 14,4
O estudo mostrou que no valor de pH natural do meio de crescimento do A.
terreus (pH 5,5) a taxa de hidrólise de acetato de etila foi levemente melhor do que
os valores de pH igual a 7 e 10. Na condição de pH = 5,5, a concentração de acetato
de etila passou de 27,3 % (v/v) para 11,4 % (v/v), após 24 h de reação, o que
representa cerca de 65 % (v/v) de hidrólise. Nos outros valores de pH, a
concentração passou de cerca de 29 % (v/v) para 14 % (v/v) na mistura final (Tabela
3).
2.2.3 Determinação do rendimento da biorreciclagem utilizando A. terreus
Para determinar o rendimento da reação, foi realizado um novo experimento
com o A. terreus conforme procedimento descrito na seção 7.1.3. Neste caso, foi
feita a destilação no próprio reator ao final da reação de hidrólise. Com isso, dos 600
mL iniciais de mistura (hexanos/acetato de etila) com concentração de 29 % (v/v) de
acetato de etila, após reação e posterior destilação, foram recuperados 470 mL de
mistura de solvente na concentração de 18 % (v/v), o que nos forneceu uma
recuperação de 91% do hexano.
2.2.4 Estudo da cinética da biorreciclagem utilizando A. terreus
Para determinar o tempo ideal de reação, a biotransformação da mistura-
resíduo, usando o A. terreus foi realizada no reator conforme procedimento descrito
30
na seção 7.1.3 (Gráfico 2). A reação envolveu o uso de 600 mL de resíduo
(hexanos/acetato de etila) com concentração de 30 % (v/v) de acetato de etila e 3
litros de meio de cultura contendo o microrganismo.
Gráfico 2. Variação da concentração de AcOEt durante a biorreciclagem.
Como pode ser observado no Gráfico 2, a biotransformação ocorre
rapidamente, passando dos 30 % (v/v) iniciais de acetato de etila para cerca de 15 %
(v/v) em apenas 5 minutos de reação. Duas características reacionais são
observadas após os 5 minutos de reação, a mudança da coloração da mistura, que
modifica de amarela para preta, e o valor de pH que diminui de 5,4 para 4,8.
Dessa forma, são necessários estudos mais detalhados para determinar de
maneira clara os fatores que levam a reação parar tão rapidamente e muito antes de
completar a hidrólise. Os fatores mais importantes que devem ser considerados são:
adição controlada do resíduo, controle do pH ao longo da reação e a influência da
formação do etanol e do ácido acético, os quais podem estar inativando a(s)
enzima(s).
31
2.2.5 Determinação da concentração de proteínas e atividade enzimática
A quantificação da concentração de proteínas foi realizada conforme o
método de Bradford
18
, e para a medida da atividade enzimática foi usado o
procedimento adotado por Kamimura et al.
19
descrito detalhadamente nas seções
7.1.6 e 7.1.7. Esses dois ensaios foram feitos tanto para o filtrado (meio de cultura
após crescimento do fungo) quanto para as células, sendo estas homogeneizadas
em um aparelho do tipo Potter.
A atividade enzimática de lipase presente no A. terreus foi determinada pelo
método de hidrólise do azeite de oliva. Os ácidos graxos liberados foram titulados
com solução de NaOH, utilizando timolftaleína como indicador. Uma unidade de
atividade enzimática (U) é definida como a quantidade de enzima que libera um
μmol de ácido graxo por minuto de reação à 37 °C.
Desse modo, foram obtidos os resultados apresentados na Tabela 4.
Tabela 4. Concentração de proteínas e atividade enzimática do A. terreus.
Concentração de proteínas
A
tividade Enzimática
(U/ mg
proteina
)
Filtrado 24,1
μ
g/ mL
filtrado
21,6
Células 140,1
μ
g/ mL
homogenei zad o
2,5
Observa-se que apesar da concentração de proteínas nas células ser muito
maior que a do filtrado, a atividade deste é muito maior. Isso está de acordo com o
fato de que as lipases fúngicas são essencialmente extracelulares
9
.
32
2.3 Biorreciclagem usando enzimas comerciais
Nesta seção, apresentamos os resultados obtidos pelos experimentos usando
sete diferentes lipases comerciais: Lipolase 100T (lipase de Humicola lanuginosa
imobilizada), Lipozyme RM IM (lipase de Rhizomucor miehei, imobilizada),
Lipozyme TL IM (lipase de Thermomyces lanuginosus imobilizada), Novozyme 435
(CAL-B, lipase de Candida antarctica, fração B, imobilizada), Novozyme 735 (CAL-
A, lipase de Candida antarctica, fração A, imobilizada), Novozyme CALB-L (lipase
de Candida antarctica, fração B, não imobilizada) e PPL (lipase do pâncreas de
porco, bruto, Tipo II).
Os experimentos com as enzimas foram feitos em Erlenmeyers devidamente
vedados, contendo 50 mL água destilada ou solução tampão, 50 mL da mistura
hexano-acetato de etila e a enzima apropriada [3 g (sólido) ou 3 mL (líquido)]. As
reações foram realizadas a 32 °C durante 48 h, em agitador orbital a 160 rpm
(rotação por minuto).
Como a estrutura e a forma do centro ativo são uma decorrência da estrutura
primária da enzima e, podem ser afetadas por quaisquer agentes capazes de
provocar mudanças conformacionais na proteína, a atividade enzimática é
dependente das características do meio na qual ela está. Portanto, o pH, a
temperatura e a composição química do meio na qual a enzima está presente são
fatores importantes para a determinação da atividade específica de uma enzima.
Sendo assim, todas as enzimas foram submetidas a diferentes valores de pH, 5,7, 7
e 10 apresentando os resultados apresentados nas Tabelas 5, 6 e 7,
respectivamente.
33
Tabela 5. Hidrólise de acetato de etila presente no resíduo
(Hexanos/acetato de etila) usando água destilada (pH = 5,7).
Enzima Concentração de AcOEt (%v/v)
0 h 24 h 48 h
Novozyme 435
26,9 3,9 3,9
Lipozyme RM IM
26,9 18,0 16,3
Lipozyme TL
26,9 22,4 22,2
PPL
26,9 23,0 23,9
Lipolase 100T
30,5 26,4 26,3
Novozyme 735
30,5 25,2 24,0
Novozyme CALB-L
30,5 5,3 5,0
Tabela 6. Hidrólise de acetato de etila presente no resíduo
(Hexano/acetato de etila) usando solução tampão com pH = 7,0
Enzimas Concentração de AcOEt (%v/v)
0 h 24 h 48 h
Novozyme 435
30,4 6,0 5,9
Lipozyme RM IM
30,4 17,1 15,9
Lipozyme TL
30,4 19,2 18,7
PPL
30,4 23,9 23,6
Lipolase 100T
30,4 23,7 23,3
Novozyme 735
30,4 25,1 25,1
Novozyme CALB-L
30,4 5,7 5,6
34
Tabela 7. Hidrólise de acetato de etila presente no resíduo
(Hexano/acetato de etila) usando solução tampão com pH = 10,0.
Enzimas Concentração de AcOEt (%v/v)
0 h 24 h 48 h
Novozyme 435
30,4 6,0 5,7
Lipozyme RM IM
30,4 18,9 17,2
Lipozyme TL
30,4 19,8 19,3
PPL
30,4 24,9 24,6
Lipolase 100T
30,4 22,5 22,4
Novozyme 735
30,4 23,6 24,2
Novozyme CALB-L
30,4 5,9 5,4
Como foi possível observar nas tabelas 5, 6 e 7, em todos os valores de pH, a
enzima CAL-B apresentou o melhor desempenho, tanto na forma imobilizada
(Novozyme 435) quanto na forma líquida (Novozyme CALB-L). Ambas hidrolisaram
em torno de 80% do acetato de etila, reduzindo a sua concentração de 30 para 5 %
(v/v).
Observe que, para a enzima CAL-B, não houve diferença significativa nos
resultados quando a reação foi realizada em diferentes valores de pH. Isso pode
acontecer devido à baixa concentração do tampão, o que acarreta baixo poder
tamponante e, conseqüentemente, com a formação de ácido acético, os valores de
pH alteram-se para um valor abaixo do recomendado para a enzima, tornando o pH
inicial com pouca relevância. Outro fator que pode estar levando a essa similaridade
de resultados é a ocorrência de inibição enzimática ou a desnaturação devido ao
etanol e ao ácido acético formado durante as reações. Novos ensaios reutilizando as
enzimas poderiam esclarecer melhor se a perda da atividade é definitiva ou
temporária.
35
2.4 Biorreciclagem em reator de leito fixo
Para avaliar a possibilidade de tratarmos grandes quantidades de efluentes
foram realizados alguns ensaios em um processo contínuo com reator tubular de
leito fixo. Devido aos bons resultados obtidos com o emprego da lipase Novozyme
435 durante a triagem e, por estar imobilizada, esta foi escolhida para os
experimentos em reator de leito fixo, também chamado de PBR (packed bed
reactor). Para isso foi montado o processo esquematizado na Figura 8.
Figura 6. Sistema contínuo com reator PBR.
No reator de leito fixo, a enzima imobilizada é empacotada, permanecendo
estacionária, enquanto a solução de substrato é bombeada através dela.
O reator tipo PBR apresenta diversas vantagens, por isso tem sido muito
utilizado, dentre elas podemos destacar as seguintes:
• Processo e operação simples;
• Não há necessidade de filtração de enzimas;
• Reuso da enzima;
• Menor tempo de reação;
• Reação eficiente em condições operacionais ótimas.
Reator
Termostato
Enzimas
Reservatório
Mistura Orgânica
Reservatório
Solução Tampão
Coletor
Bombas
36
Em todo o sistema são encontradas desvantagens e limitações, como por
exemplo:
• Limitações na transferência de massa;
• Queda de pressão significativa principalmente quando se usa enzimas
imobilizadas em partículas pequenas ou a grandes vazões;
• Possibilidade da ocorrência de entupimento do reator durante a operação.
Devido a essas limitações é mais vantajoso o uso de reatores pequenos e,
quando houver necessidade de expandir a capacidade, basta conectar reatores
similares em configuração paralela
20
(Figura 7).
Configuração em paralelo Configuração em série Configuração em paralelo-série
Figura 7. Possíveis configurações de múltiplos reatores.
Para evitar a necessidade de ajustar constantemente a vazão devido à perda
da atividade enzimática, podem-se usar pequenos reatores em série, de modo que a
idade da enzima seja diferente ao longo do fluxo. Assim, o reator com baixo
rendimento pode ser retirado da série e um novo deve ser inserido no final da série.
Desse modo consegue-se manter a qualidade do produto se o número de reatores
for suficiente. Também é possível combinar essas duas configurações de modo a
aproveitar as vantagens do uso de reatores pequenos para produzir maiores escalas
de produtos com nível qualidade estável.
37
No presente trabalho, a solução tampão e a mistura orgânica foram
bombeadas através de bombas peristálticas independentes e em fluxo concorrente e
ascendente. O reator, que possui diâmetro interno 10 mm, foi mantido a 32 °C.
Devido ao crescente empacotamento, ocasionando queda de pressão acentuada e,
conseqüentemente, dificultando o bombeamento através do reator, foi necessário
utilizar esferas de vidro (2 mm de diâmetro) junto com as enzimas, servindo de
suporte de modo a minimizar esses problemas. O uso de vazões relativamente altas
colaborava para que isso ocorresse. Além disso, materiais poliméricos usados para
imobilizar as enzimas aumentam de tamanho quando na presença de solventes
21
.
2.4.1 Estudo do efeito da variação do pH na biorreciclagem em reator de leito
fixo
Novamente, a enzima CAL-B foi submetida a diferentes valores de pH usando
solução tampão fosfato. Os parâmetros e os resultados estão apresentados na
Tabela 8.
Tabela 8. Efeito da variação do pH na taxa de hidrólise de acetato de etila mediada por CAL-B em
reator de leito fixo.
Conc.= Concentração
Observando a Tabela 8, verifica-se que não houve diferenças significativas na
taxa de hidrólise entre os diferentes valores de pH. Em todos os casos a hidrólise
ficou em torno de 40 % (v/v).
Vazão
mistura
(mL/h)
Vazão
tampão
(mL/h)
pH inicial
Conc.
Tampão
(mol/L)
pH final
AcOEt
inicial
(%v/v)
AcOEt
residual
(%v/v)
Hidrólise
de AcOEt
(%v/v)
105 300 7,0 1,0 6,6 19,8 11,8 40
107 320 8,1 1,0 7,3 19,6 12,0 39
100 300 9,3 1,0 7,4 19,3 11,2 42
38
2.4.2 Estudo do efeito da variação do tipo de solução tampão na
biorreciclagem em reator de leito fixo
O uso de diferentes soluções tampão pode alterar a atividade enzimática, em
alguns casos aumentando-a e, em outros, diminuindo-a.
22
Diante disso, a reação
também foi testada em dois tipos de solução tampão, fosfato (NaHPO
4
/ K
2
PO
4
) e
carbonato (NaHCO
3
/ Na
2
CO
3
), com pH inicial de 9,4 e concentração de 0,5 mol.L
-1
(Tabela 9).
Tabela 9. Efeito da variação do tipo de solução tampão na reação de hidrólise de acetato de etila
mediada por CAL-B em reator de leito fixo.
Vazão
mistura
(mL/h)
Vazão
tampão
(mL/h)
AcOEt
inicial
(%, v/v)
pH da
solução
residual
AcOEt
residual
(%, v/v)
Hidrólise
de AcOEt
(%)
Tampão fosfato 108 303 20,0 6,8 10,7 46
Tampão carbonato 100 290 19,3 7,6 7,2 63
Como podemos observar na tabela 9, o emprego de solução tampão
carbonato forneceu a maior taxa de hidrólise, alcançando 63 % (v/v), onde a
concentração de acetato de etila foi reduzida de 19,3 para 7,2 % (v/v). No caso do
uso de solução tampão fosfato a taxa de hidrólise foi de 46 % (v/v) e, a concentração
de AcOEt foi diminuída de 20,0 para 10,7 % (v/v).
2.4.3 Estudo do efeito da variação da vazão da solução tampão na
biorreciclagem em reator de leito fixo
O tempo de residência de uma reação enzimática (tempo médio gasto por um
substrato percorrer todo o reator) muito alto pode levar a inibição ou a inativação das
enzimas devido à formação de etanol e de ácido acético em maiores quantidades.
39
Aumentando a vazão temos uma diminuição no tempo de residência, o que pode
acarretar uma diminuição na taxa de hidrólise. Sendo assim, é necessário encontrar
o ponto que melhor equilibra essas duas variáveis.
O efeito da variação da vazão do tampão foi avaliado usando solução tampão
carbonato (pH = 8,3; 0,5 mol.L
-1
) em temperatura fixa de 32 °C.
Analisando os resultados apresentados na Tabela 10, conclui-se que a
proporção volumétrica tampão:mistura orgânica de 1:2 é suficiente, pois nesse caso
a taxa de hidrólise manteve-se próximo ao obtido com proporção 1:3. Além disso, o
valor de pH final ainda permanece dentro da faixa adequada para manter a
estabilidade enzimática e com isso é possível utilizar o mínimo de solução tampão
para realizar a reação de hidrólise. Usando essa proporção a concentração de
acetato de etila caiu de 18,5 para 7,9 % (v/v).
Tabela 10. Efeito da variação da vazão do tampão durante a biorreciclagem de hexano em reator de
leito fixo.
Vazão mistura
(mL/h)
Vazão tampão
(mL/h)
pH da solução
residual
A
cOEt residual
(%v/v)
Hidrólise de AcOEt
(%v/v)
100 300 7,6 6,6 64
100 200 7,2 7,9 57
100 100 5,0 9,9 46
2.4.4 Avaliação da estabilidade da CAL-B na biorreciclagem em reator de leito
fixo
Um dos maiores desafios das reações biocatalíticas é a manutenção da
atividade enzimática por longos períodos de tempo. Pensando nisso, a estabilidade
do processo foi testada mantendo-o em funcionamento durante 6 horas, com a
vazão da mistura orgânica a 100 mL/h e a vazão do tampão a 300 mL/h. Foi usado
40
tampão carbonato com pH inicial 8,3 e concentração 0,5 mol.L
-1
e a mistura orgânica
inicial contendo 19,5 % (v/v) de AcOEt.
O resultado obtido nessas condições está apresentado na figura abaixo
(Gráfico. 3).
Gráfico 3. Estabilidade da Novozyme 435 em processo contínuo.
Segundo Christensen et al.
23
a CAL-B tem o pH ótimo a 7 e em pH 10, 75%
da atividade é mantida após 20 h de incubação a temperatura ambiente.
Nas condições empregadas a enzima manteve a mesma atividade durante as
seis horas de reação. A concentração de acetato de etila caiu de 19,5 para 5,7 %v/v.
A taxa de hidrólise manteve-se em 14 mL/h (70%) e foi possível recuperar 76 mL/h
de mistura rica em hexano após passar pelo reator, o que nos fornece um
rendimento de 72% em relação ao hexano.
Com isso, vê-se que é possível utilizar a enzima dessa forma por longos
períodos de tempo, com boa taxa de reação e de reciclagem.
41
CAPÍTULO 3 – BIORRECICLAGEM DE HEXANO - CONCLUSÕES
A biotransformação do acetato de etila presente na mistura hexano-acetato de
etila é uma boa alternativa para a reciclagem do hexano. Para isso podem ser
usados fungos e enzimas hidrolíticas adquiridas comercialmente.
Todos os microrganismos (A. niger, A. terreus, R. oryzae e E. nidulans)
avaliados neste trabalho mostraram ser capazes de hidrolisar o acetato de etila de
maneira satisfatória, mas o fungo A. terreus SSP 1498 apresentou os melhores
resultados. Com o emprego desse fungo, ao final da reação, a concentração de
AcOEt foi reduzida de 18,1 % para 7,4 % (v/v), bastando para isso cerca de 5
minutos de reação. Aumento na concentração de açúcar no meio de crescimento
não provocou mudanças significativas na taxa de hidrólise do éster, tornando-se
desnecessário o emprego de maiores concentrações de açúcar.
Dentre as enzimas comerciais avaliadas, a Novozyme 435 (lipase de C.
antarctica, imobilizada) mostrou-se ser a mais eficaz. O uso de um sistema de
agitação mecânico, muito comum em diversos tipos de reatores, usualmente,
provoca a quebra do suporte polimérico usado para sua imobilização, levando a
perda de sua atividade. Uma solução encontrada para esse problema foi a utilização
de um reator tubular de leito fixo empacotado com a enzima, que pode possibilitar o
tratamento de grande quantidade de efluente sem a degradação da enzima, o que
ficou evidente devido à boa estabilidade apresentada por esse processo. Com esse
sistema foi possível reduzir a concentração de AcOEt de 19,5 para 5,7 % (v/v). Com
o uso da solução tampão carbonato/bicarbonato foi possível obter taxas de hidrólise
de até 63 %, enquanto que com a solução tampão fosfato foi alcançado a marca de
46 %, o que representa uma diferença de 37 %.
42
Diante o exposto, vê-se que não é preciso tomar medidas radicais contra o
uso do petróleo e seus derivados, basta fazer uso racional e sustentável, não
focalizando os esforços somente nos aspectos econômicos, mas também, no bem
estar ambiental e social.
43
PARTE 2: REAÇÕES DE ÓXIDO-
REDUÇÃO USANDO PLANTAS
COMESTÍVEIS
44
CAPÍTULO 4 - REAÇÕES DE ÓXIDO-REDUÇÃO USANDO PLANTAS
COMESTÍVEIS – INTRODUÇÃO E OBJETIVOS
4.1 Introdução
O tratamento de efluentes e os métodos de controle de poluição são
insuficientes na resolução dos problemas ambientais causados pelo lançamento
desses resíduos, seja no solo, na água ou no ar. Em virtude disso, surgem leis
ambientais e sanções cada vez mais restritivas, que dificultam a disposição final de
resíduos, aumentando as exigências e os custos para sua realização. Estas
restrições, juntamente com o aumento da competitividade de mercado e com a
preocupação da população com o meio ambiente, fazem com que cresça uma
consciência ambiental nas indústrias, que passam a buscar métodos mais eficazes e
econômicos para minimizar e até mesmo não gerar efluentes, eliminando assim o
problema antes que seja produzido.
Diante disso, muitos pesquisadores vêm focalizando seus esforços para o
desenvolvimento e a aplicação de métodos químicos e biológicos limpos em
substituição às reações clássicas que geram resíduos
24,25
. Dentre esses métodos a
biocatálise e a biodegradação desempenham um papel importante
26,27,28,29,30,31
.
Transformações químicas biocatalisadas são consideradas ambientalmente
amigáveis, pois obedecem aos princípios da química verde. Por isso, as enzimas
vêm sendo extensivamente estudadas em síntese química
32
e em biodegradação de
poluentes orgânicos
33
. Reações biocatalisadas podem ser realizadas por enzimas
provenientes de microrganismos ou plantas. Grande atenção vem sendo dada às
reações químicas usando culturas de células de plantas e partes de plantas como
biocatalisadores
34,35,36
. Por exemplo, as plantas estão sendo usadas para
45
degradação de poluentes orgânicos (fitorremediação)
37
, biorredução de cetonas
38
,
lactonização
39
, reações de hidrólise
40
, hidroxilação e oxidação
41
.
O uso de extratos brutos e/ou tecidos vegetais pode apresentar em alguns
casos, certa desvantagem na seletividade da reação ou a ocorrência de reações
inesperadas devido à presença de diversas enzimas, mas por outro lado o seu custo
é relativamente baixo. Além disso, essas enzimas geralmente possuem tempo de
vida superior àqueles métodos que utilizam enzimas purificadas, visto que elas
naturalmente imobilizadas nas células destes materiais biológicos (habitat natural)
são mais estáveis e, geralmente, possuem os seus cofatores, os quais possuem
custo elevado
42
.
4.1.1 O Conceito de Química Verde
43
No início da década de 90, uma nova tendência na maneira de como os
resíduos químicos devem ser tratados frente a preservação do meio ambiente
começou a ser discutida. Esta nova visão do problema levou a proposição de novas
e desafiadoras soluções. Fundamentalmente, é preciso buscar uma alternativa que
evite ou minimize a produção de resíduos, em detrimento da preocupação exclusiva
com o tratamento do resíduo no fim da linha de produção. Este novo direcionamento
na questão da redução do impacto da atividade química ao ambiente vem sendo
chamado de “Green chemistry”, ou química verde, química limpa, química
ambientalmente benigna, ou ainda, química auto-sustentável.
A química verde pode ser definida como o desenho, desenvolvimento e
implementação de produtos químicos e processos para reduzir ou eliminar o uso ou
a geração de substâncias nocivas à saúde humana e ao ambiente. Este conceito,
que também pode ser atribuído à tecnologia limpa, vem sendo implementado em
aplicações industriais, especialmente em países com indústria química bastante
46
desenvolvida e que apresentam controle rigoroso na emissão de poluentes. Além
disso, gradativamente, a química verde vem sendo incorporada ao meio acadêmico,
no ensino e na pesquisa de países em desenvolvimento.
Esta idéia, ética e politicamente poderosa, representa a suposição de que
processos químicos que geram problemas ambientais possam ser substituídos por
alternativas menos poluentes ou não-poluentes. Tecnologia limpa, prevenção
primária, redução na fonte, química ambientalmente benigna, ou ainda “green
chemistry”, são termos que surgiram para definir esta importante idéia. “Green
chemistry”, o termo mais utilizado atualmente, foi adotado pela IUPAC, talvez por ser
o mais forte entre os demais, pois associa o desenvolvimento na química com o
objetivo cada vez mais buscado pelo homem moderno: o desenvolvimento auto-
sustentável.
4.1.2 Princípios da Química Verde
Basicamente, há doze tópicos que precisam ser perseguidos quando se pretende
implementar a química verde em uma indústria ou instituição de ensino e/ou
pesquisa na área de química:
1. Prevenção. Evitar a produção do resíduo é melhor que tratá-lo ou “limpá-lo” após
sua geração.
2. Economia de átomos. Deve-se procurar desenhar metodologias sintéticas que
possam maximizar a incorporação de todos os materiais de partida no produto
final.
3. Síntese de produtos menos perigosos. Sempre que praticável, a síntese de
um produto químico deve utilizar e gerar substâncias que possuam pouca ou
nenhuma toxicidade à saúde humana e ao ambiente.
47
4. Desenho de produtos seguros. Os produtos químicos devem ser desenhados
de tal modo que realizem a função desejada e ao mesmo tempo não sejam
tóxicos.
5. Solventes e auxiliares mais seguros. O uso de substância auxiliar (solventes,
agentes de separação, secantes, etc.) precisa, sempre que possível, tornar-se
desnecessário e, quando utilizadas, estas substâncias devem ser inócuas.
6. Busca pela Eficiência de Energia. A utilização de energia pelos processos
químicos precisa ser reconhecida pelos seus impactos ambientais e econômicos
e deve ser minimizada. Se possível, os processos químicos devem ser
conduzidos à temperatura e pressão ambiente.
7. Uso de Fontes Renováveis de Matéria-Prima. Sempre que técnica e
economicamente viável, a utilização de matérias-primas renováveis deve ser
escolhida em detrimento de fontes não-renováveis.
8. Evitar a Formação de Derivados. A derivatização desnecessária (uso de grupos
bloqueadores, proteção/desproteção, modificação temporária por processos
físicos e químicos) deve ser minimizada ou, se possível, evitada, porque estas
etapas requerem reagentes adicionais e podem gerar resíduos.
9. Catálise. Reagentes catalíticos, tão seletivos quanto possível, são melhores que
reagentes estequiométricos.
10. Desenho para a Degradação. Os produtos químicos precisam ser desenhados
de tal modo que, ao final de sua função, se fragmentem em produtos de
degradação inócuos e não persistam no ambiente.
11. Análise em Tempo Real para a Prevenção da Poluição. Será necessário o
desenvolvimento futuro de metodologias analíticas que viabilizem um
monitoramento e controle dentro do processo, em tempo real, antes da formação
de substâncias nocivas.
48
12. Química Intrinsecamente Segura para a Prevenção de Acidentes. As
substâncias, bem como a maneira pela qual uma substância é utilizada em um
processo químico, devem ser escolhidas a fim de minimizar o potencial para
acidentes químicos, incluindo vazamentos, explosões e incêndios.
4.1.3 Importância dos álcoois quirais
44
Alcoóis quirais são precursores importantes, pois servem como intermediários
ou como blocos de construção quiral (“chiral building blocks”) na síntese de diversos
compostos quirais de importância biológica. Entre vários exemplos, o (S)-(-)-3-
hidróxi-butanoato de etila (I), é um dos alcoóis quirais mais utilizados como precursor
quiral em síntese orgânica: o (S)-(+)-sulcatol (II), importante insumo para a síntese
de outros produtos naturais; (R)-(+)-recifeiolídeo (III), importante aditivo na indústria
de perfumes; (R)-lavandulol (IV), macrolídeo de atividade antibiótica reconhecida
(Figura 8).
CO
2
Et
OH
OH
(1)
(2)
OH
OO
(4)
(3)
Figura 8. Produtos obtidos a partir do álcool (R)- ou (S)-3-
hidroxibutanoato de etila (I).
I
II
III
IV
49
4.1.4 Álcool desidrogenases
45
As álcoois desidrogenases são enzimas classificadas como oxidorredutases
que catalisam a conversão reversível de compostos carbonílicos e alcoóis. Para
realizar essa tarefa essas enzimas requerem a presença de coenzimas (Figura 9,
NADH entrou NADPH).
Quando a enzima álcool desidrogenase converte uma cetona em álcool, por
exemplo, a coenzima NADH (forma reduzida da nicotinamida-adenina-dinucleotídeo)
age como um agente redutor ao transferir um hidreto do C4 do anel de nicotinamida
para o grupo carbonílico da cetona (Figura 10).
N
HH
O
NH
2
N
N
N
N
NH
2
O
OOH
HH
HH
OPO
O
-
O
PO
O
-
O
O
OHOH
HH
HH
R
R = H (NADH)
R = PO
3
2-
(NADPH)
NAD(P)H
Figura 9. Forma reduzida de Nicotinamida-adenina-dinucleotídeo
(NADH) e Nicotinamida-adenina-dinucleotídeo-fosfato (NADPH).
O nitrogênio do anel da nicotinamida facilita esse processo, cedendo seu par
de elétrons não-ligantes ao anel, o que, junto com a perda do hidreto, converte-o em
um anel mais estável energeticamente, encontrado na NAD+ (Forma oxidada da
Nicotinamida-adenina-dinucleotídeo). O ânion alcóxido, resultante da transferência
do hidreto para a cetona, é então protonado pela enzima para formar o álcool.
50
Figura 10. Mecanismo de ação do NADH em um composto carbonílico.
Apesar do carbono carbonílico da cetona ser inerentemente eletrofílico,
devido ao oxigênio eletronegativo estar ligado ao mesmo, algumas enzimas
ressaltam essa propriedade, fornecendo o íon zinco, como um ácido de Lewis, para
coordenar com o oxigênio da carbonila. O ácido de Lewis estabiliza a carga negativa
que se desenvolve no oxigênio no estado de transição. A proteína da enzima tem o
papel de andaime e deve então reter o íon zinco, a coenzima e o substrato em
ordem tridimensional necessária para diminuir a energia do estado de transição.
A NADH possui dois hidrogênios no C4, onde qualquer um poderia, em
princípio, ser transferido como um hidreto no processo de redução. Para uma dada
reação enzimática, contudo, apenas um hidreto do C4 da NADH é transferido.
4.1.5 Reação de resolução enzimática
45
A resolução cinética enzimática consiste na transformação química
preferencial de um dos enantiômeros de uma mistura racêmica catalisada por uma
enzima. Devido à quiralidade da enzima, um dos enantiômeros acomoda-se melhor
no seu sítio ativo e então este é convertido numa velocidade maior, resultando numa
resolução (Figura 11).
R
1
R
2
O
Zn
S-Cys
S-Cys
N-His
N
O
H
2
N
R
H
S
H
R
2
+
C
R
2
R
1
H
S
HO
H
+
NAD
+
Parte do NADH
H
R
N
R
O
H
2
N
51
(rápida)
(lenta)
R
1
O
R
2
R
1
OH
R
2
R
1
OH
R
2
Figura 11. Reação de resolução enzimática.
Essa enantiosseletividade pode ser explicada mais detalhadamente por
razões termodinâmicas (Figura 12).
= diferença das
energias de ativação
rápida
lenta
E = enzima
A e B = par de enantiômeros
[EA] e [EB] = complexo enzima-substrato
P e Q = produtos
+ A
+ B
E
E + Q
E + P
E + A + B
[EB]
[EA]
Coordenada de Reação
ΔG
ΔΔG
E + Q
E + P
[EB]
[EA]
ΔΔG
Figura 12. Diagrama de energia de uma reação enantiosseletiva catalisada por enzima.
A Figura 12 mostra uma reação enantiosseletiva na qual dois substratos
enantioméricos A e B competem pelo sítio ativo da enzima. Devido ao ambiente
quiral do sítio ativo da enzima, complexos diastereoisoméricos enzima-substrato
[EA] e [EB] são formados e estes contêm diferentes valores de energia livre (ΔG)
para seus respectivos estados de transição [EA]
≠
e [EB]
≠
. O resultado é uma
diferença na energia de ativação (ΔΔG
≠
) entre os enantiômeros. Como
52
conseqüência, um será transformado mais rapidamente que o outro. O valor de
ΔΔG
≠
é uma medida direta para a seletividade da reação, pois este determina a
pureza óptica do produto.
4.1.6 Reação de desracemização
O mecanismo de inversão de configuração ou de desracemização de alcoóis
secundários ainda não está claramente elucidado. Além disso, há evidências de que os
microrganismos apresentam diferentes mecanismos
46
. No entanto, uma das possibilidades é
através de duas reações de óxido-redução independentes. Por exemplo, na primeira reação
um enantiômero é seletivamente oxidado por uma enzima álcool desidrogenase (ADH
1
) à
correspondente cetona, a qual é reduzida seletivamente por outra enzima ADH
2
levando a
formação de um único enantiômero
47
(Figura 13). Isso é possível devido à presença de
diversas enzimas no meio reacional.
R
1
OH
R
2
R
1
OH
R
2
R
1
O
R
2
+
ADH
1
ADH
2
Figura 13. Reação de desracemização.
53
4.2 Objetivos do Estudo
No trabalho iniciado pelo Dr. Álvaro Takeo Omori
48
verificou-se que algumas
plantas comestíveis poderiam ser utilizadas para catalisar reações de redução
enantiosseletiva de acetofenonas para-substituídas. Com o objetivo de aumentar as
opções de catalisadores, identificando-os em outros vegetais comestíveis, decidimos
dar continuidade ao “screening” de biocatalisadores enantiosseletivos para reações
de redução de cetonas pró-quirais e, adicionalmente, estudar reações de oxidação
de alcoóis secundários racêmicos para obtenção de álcoois enantiomericamente
puros ou enriquecidos.
54
CAPÍTULO 5 - REAÇÕES DE ÓXIDO-REDUÇÃO USANDO PLANTAS
COMESTÍVEIS - RESULTADOS E DISCUSSÃO
Nessa parte do trabalho utilizamos, como fonte de enzimas e seus cofatores
para as reações de redução de cetonas pró-quirais e reações de oxidação de
álcoois, as seguintes plantas: Allium schoenoprasum (cebolina), Arctium lappa
(bardana), Arracacia xanthorrhiza (mandioquinha), Beta vulgaris (beterraba),
Brassica rappa (nabo redondo), Colocasia esculenta (inhame), Coriandrum sativum
(coentro), Dioscorea alata (cará), Ipomoea batatas (batata doce), Manihot esculenta
(mandioca), Polymnia sonchifolia (yakon), Raphanus sativus (nabo japonês),
Solanum tuberosum (batata inglesa) e Zingiber officinale (gengibre).
5.1 Reações de redução
A seguir estão apresentados os resultados obtidos com as reações de
redução de cetonas pró-quirais por diferentes plantas comestíveis.
5.1.1 Redução da 1-feniletanona (1a)
Inicialmente, realizamos o estudo de biorredução da 1-feniletanona mediada
por diversas plantas (Figura 14).
O
OH
planta
32
o
C / H
2
O
1-feniletanol (2a)
1-feniletanona (1a)
Figura 14. Redução da 1-feniletanona (1a).
55
Tabela 11. Redução da 1-feniletanona (1a).
2a
Reação Biocatalisador t (d)
c (%) e.e. (%)
1
Allium schoenoprasum
3 5 >98 (S)
6 5 >98 (S)
2
Arctium lappa
3 8 8 (S)
6 21 58 (S)
3
Arracacia xanthorrhiza
3 44 91 (S)
6 91 66 (S)
5
Colocasia esculenta
3 24 50 (S)
6 27 6 (S)
6
Dioscorea alata
3 30 94 (S)
6 47 94 (S)
7
Ipomoea batatas
3 8 69 (S)
6 18 -
8
Manihot esculenta
3 13 29 (R)
6 14 31 (R)
9
Polymnia sonchifolia
3 2 47 (R)
6 2 28 (R)
10
Raphanus sativus
3 10 15 (S)
6 4 79 (R)
11
Solanum tuberosum
3 3 24 (R)
6 5 7 (S)
12
Zingiber officinale
3 8 >98 (S)
6 8 >98 (S)
t: tempo (dias); c: conversão determinada por CG;
e.e.: excesso enantiomérico; Configuração absoluta está entre parênteses.
Como podemos observar na tabela 11, os melhores resultados de
enantiosseletividade foram apresentados pela A. xanthorrhiza e D. alata, com as
quais foi obtido o 1-feniletanol com boa conversão e bom excesso enantiomérico.
Com a primeira planta, alcançou-se 44 % de conversão e 91 % de excesso
56
enantiomérico (% e.e.) após 3 dias de reação. Já com a segunda planta, alcançou-
se 47 % de conversão e 94% e.e. depois de 6 dias (Tabela 11, Reações 3 e 6).
Com A. schoenoprasum, B. rappa e Z. officinale foram obtidos excelentes
excessos enantioméricos (>98%), no entanto, a conversão foi insatisfatória, ficando
abaixo de 10% (Tabela 11, Reações 1, 4 e 12). Provavelmente esse tipo de
adversidade pode ser contornado diminuindo a concentração do substrato a nível
comumente usado em reações biocatalisadas ou aumentando o tempo reacional.
O restante das plantas não apresentou resultados satisfatórios nessas
condições, ou seja, tanto a conversão quanto o excesso enantiomérico foram baixos.
5.1.2 Redução da 1-(4-bromofenil)etanona (1b)
Para a redução do 1-(4-bromofenil)etanona (1b) (Figura 15), todas as plantas
relacionadas na Tabela 12 apresentaram alta enantiosseletividade, com exceção do
C. sativum. No entanto, a conversão ficou baixa na maioria dos casos, pois alcançou
o máximo de 55%.
O
Br
OH
Br
planta
32
o
C / H
2
O
1-(4-bromofenil)etanona (1b)
1-(4-bromofenil)etanol (2b)
Figura 15. Redução da 1-(4-bromofenil)etanona (1b).
Como podemos observar na tabela 12, usando a A. xanthorrhiza, o (R)-1-(4-
bromofenil)etanol (2b) foi obtido com 98 %e.e. e 14 % de conversão após 3 dias de
reação (Tabela 12, Reação 3). Um resultado similar foi obtido com a B. vulgaris, com
conversão de 10% e e.e. > 98% (Tabela 12, Reação 4). Entretanto, com o emprego
57
da M. esculenta como biocatalisador, o álcool (R)-1-(4-bromofenil)etanol (2b) foi
obtido com 90 % de e.e. e conversão de 50% (Tabela 12, Reação 8). Além disso, de
maneira geral, observou-se que aumentando o tempo de reação para 6 dias não
houve melhoria na conversão e o excesso enantiomérico manteve-se no mesmo
nível.
Tabela 12. Redução da 1-(4-bromofenil)etanona (1b).
2b
Reação Biocatalisador t (d)
c (%) e.e. (%)
1
Allium schoenoprasum
3 3 >98 (S)
6 5 >98 (S)
2
Arctium lappa
3 - -
6 - -
3
Arracacia xanthorrhiza
3 14 >98 (S)
6 17 >98 (S)
4
Beta vulgaris
3 10 >99 (S)
6 12 >99 (S)
5
Colocasia esculenta
3 6 >98 (S)
6 11 >98 (S)
6
Coriandrum sativum
3 - -
6 13 66 (S)
7
Dioscorea alata
3 3 >98 (S)
6 3 >98 (S)
8
Manihot esculenta
3 50 90 (R)
6 55 89 (R)
10
Raphanus sativus
3 4 >98 (S)
6 6 >98 (S)
t: tempo (dias); c: conversão determinada por CG;
e.e.: excesso enantiomérico; Configuração absoluta está entre parênteses.
58
5.1.3 Redução da 1-(4-metilfenil)etanona (1c)
A 1-(4-metilfenil)etanona (1c) foi enantiosseletivamente reduzida pela A.
xanthorrhiza e B. vulgaris, com as quais foi possível obter, após 3 dias de reação, o
(R)-1-(4-metilfenil)etanol com 78 % de e.e. e 86 % de e.e., respectivamente (Figura
16, Tabela 13, Reações 3 e 4).
O OH
planta
32
o
C / H
2
O
1-(4-metilfenil)etanona (1c)
1-(4-metilfenil)etanol (2c)
Figura 16. Redução da 1-(4-metilfenil)etanona (1c).
A. Schoenoprasum, A. lappa, M. esculenta e R. sativus apresentaram
excelente enantiosseletividade (e.e. maior que 98 %), mas a conversão ficou muito
baixa (menor que 3%).
O restante das plantas – C. esculenta, C. sativum e D. alata – não mostrou
capacidade redutora satisfatória.
59
Tabela 13. Redução da 1-(4-metilfenil)etanona (1c).
2c
Reação Biocatalisador t (d)
c (%) e.e. (%)
1
Allium schoenoprasum
3 1 >98 (S)
6 - -
2
Arctium lappa
3 1 >98 (S)
6 1 >98 (S)
3
Arracacia xanthorrhiza
3 32 78 (R)
6 - -
4
Beta vulgaris
3 22 86 (R)
6 27 87 (R)
5
Colocasia esculenta
3 13 38 (S)
6 18 35 (S)
6
Coriandrum sativum
3 - -
6 - -
7
Dioscorea alata
3 7 29 (S)
6 11 25 (S)
8
Manihot esculenta
3 2 >98 (S)
6 3 >98 (S)
10
Raphanus sativus
3 1 >98 (S)
6 1 >98 (S)
t: tempo (dias); c: conversão determinada por CG;
e.e.: excesso enantiomérico; Configuração absoluta está entre parênteses.
60
5.1.4 Redução da 1-(4-nitrofenil)etanona (1d)
O substrato 1-(4-nitrofenil)etanona (1d) foi enantiosseletivamente reduzido ao
(S)-1-(4-nitrofenil)etanol, pela A. xanthorrhiza e pela M. esculenta (Figura 17, Tabela
14, Reações 3 e 7). A C. sativum apresentou a melhor enantiosseletividade (maior
que 98 % e.e.), mas a conversão ficou baixa (16%).
O
O
2
N
OH
O
2
N
planta
32
o
C / H
2
O
1-(4-nitrofenil)etanona (1d)
1-(4-nitrofenil)etanol (2d)
Figura 17. Redução da 1-(4-nitrofenil)etanona (1d).
Além da reação de redução, observou-se a redução do grupamento nitro
quando usado A. schoenoprasum, A. xanthorrhiza, C. esculenta e M. esculenta
como biocatalisadores. Nesse caso, foi obtido como produto a 1-(4-
aminofenil)etanona (Figura 18). A C. esculenta levou à redução completa do grupo
nitro (―NO
2
) em amino (—NH
2
) depois de 6 dias de reação (Tabela 14, Reação 4),
transformando completamente o substrato em 1-(4-aminofenil)etanona.
O
O
2
N
O
H
2
N
planta
32
o
C / H
2
O
1-(4-nitrofenil)etanona (1d)
1-(4-aminofenil)etanona
Figura 18. Formação da 1-(4-aminofenil)etanona
61
Tabela 14. Redução da 1-(4-nitrofenil)etanona (1d).
2d
Reação Biocatalisador t (d)
c (%) e.e. (%)
1
Allium schoenoprasum
3 3 10 (R)
6 21 (31
a
) 48 (S)
2
Arracacia xanthorrhiza
3 68 (6
a
) 96 (S)
6 79 (9
a
) 95 (S)
4
Colocasia esculenta
3 73 (24
a
) -
6 (100
a
) -
5
Coriandrum sativum
3 16 >98 (S)
6 16 96 (S)
6
Dioscorea alata
3 21 87 (S)
6 24 86 (S)
7
Manihot esculenta
3 51 (19
a
) 91 (S)
6 56 (20
a
) 91 (S)
8
Raphanus sativus
3 2 >98 (S)
6 2 64 (S)
t: tempo (dias); c: conversão determinada por CG;
e.e.: excesso enantiomérico; Configuração absoluta está entre parênteses.
a
4’-aminoacetofenona
62
5.1.5 Redução de 1-(4-metilselanil-fenil)etanona (1e)
No caso da busca por biocatalisadores para redução enantiosseletiva da 1-(4-
metilselanil-fenil)etanona (1e) (Figura 19), o melhor encontrado foi a A. xanthorrhiza,
com a qual obteve-se o álcool (S)-1-(4-metilselanil-fenil)etanol (2e) com excesso
enantiomérico maior que 98% e conversão de 21% após 3 dias de reação (Tabela
15, Reação 3).
O
MeSe
OH
MeSe
planta
32
o
C / H
2
O
1-(4-metilselanil-fenil)etanona (1e)
1-(4-metilselanil-fenil)etanol (2e)
Figura 19. Redução da 1-(4-metilselanil-fenil)etanona (1e).
A. schoenoprasum, C. sativum e M. esculenta também apresentaram alta
enantiosseletividade (maior que 98%e.e.), mas, baixa conversão (menor que 9%).
O restante das plantas não apresentou resultados significantes nessas
condições.
63
Tabela 15. Redução da 1-(4-metilselanil-fenil)etanona (1e).
2e
Reação Biocatalisador t (d)
c (%) e.e. (%)
1
Allium schoenoprasum
3 1 >98 (S)
6 4 >98 (S)
2
Arctium lappa
3 - -
6 4 44 (S)
3
Arracacia xanthorrhiza
3 21 >98 (S)
6 10 >98 (S)
4
Beta vulgaris
3 - -
6 4 44 (S)
5
Colocasia esculenta
3 18 71 (S)
6 19 71 (S)
6
Coriandrum sativum
3 2 >98 (S)
6 - -
7
Dioscorea alata
3 1 27 (R)
6 3 10 (S)
8
Manihot esculenta
3 - -
6 9 >98 (S)
9
Raphanus sativus
3 - -
6 2 66 (S)
t: tempo (dias); c: conversão determinada por CG;
e.e.: excesso enantiomérico; Configuração absoluta está entre parênteses.
64
5.2 Reações de oxidação
Nesta seção estão apresentados os resultados referentes à avaliação do
potencial catalítico de diferentes plantas como agentes oxidantes, de resolução ou
desracemizantes de alcoóis secundários racêmicos. O mesmo procedimento das
reações de redução, foi empregado para as reações de oxidação, alterando-se
somente o substrato adicionado.
5.2.1 Oxidação do (RS)-1-feniletanol (2a)
Na busca por biocatalisadores para oxidação enantiosseletiva do 1-feniletanol
(Figura 20), a A. schoenoprasum e R. sativus promoveram uma resolução cinética
desse álcool (Tabela 16, Reações 1 e 12, respectivamente). Com o uso da A.
schoenoprasum, 54% do álcool foi convertido à cetona depois de 6 dias de reação,
enquanto que o (R)-1-feniletanol permaneceu com pureza enantiomérico maior que
98%. De forma similar, obteve-se com a R. sativus, após 6 dias, 26% do mesmo
enantiômero com excesso enantiomérico maior que 98% e 74 % da respectiva
cetona.
O
OH
planta
32
o
C / H
2
O
(RS)-1-feniletanol (2a)
1-feniletanona (1a)
Figura 20. Oxidação da (RS)-1-feniletanol (2a).
Por outro lado e de forma mais interessante, as plantas A. xanthorrhiza, P.
sonchifolia e Z. officinale (Tabela 16, Reações 3, 11 e 14, respectivamente) mostram
uma característica típica de uma reação de desracemização. Assim, com o P.
Sonchifolia e o Z. officinale, partindo do 1-feniletanol racêmico (2a), foi conseguido o
(S)-1-feniletanol (2a) com ótimo excesso enantiomérico (93% e >98%,
65
respectivamente) depois de 6 dias de biotransformação. Já com a A. xanthorrhiza,
após 3 dias, houve uma convergência para o álcool (S)-1-feniletanol (2a) com 97 %
e.e., mas, após 6 dias, praticamente todo o álcool havia sido oxidado para a
respectiva cetona (Tabela 16, Reação 3). Portanto, esta planta pode ser usada tanto
como agente de resolução quanto agente oxidante desse álcool.
Como agentes oxidantes, A. xanthorrhiza, C. esculenta, R. sativus e S.
tuberosum apresentaram bons resultados, com os quais obteve-se a respectiva
cetona com mais de 60 % de conversão após 6 dias de reação.
66
Tabela 16. Oxidação do (RS)-1-feniletanol (2a).
Reação Biocatalisador t (d) c (%) e.e. (%) c (%)
1
Allium schoenoprasum
3 95 7 (R) 5
6 46 >98 (R) 54
2
Arctium lappa
3 100 6 (R) -
6 100 4 (R) -
3
Arracacia xanthorrhiza
3 98 97 (S) 2
6 12 17 (S) 88
4
Beta vulgaris
3 78 21 (S) 22
6 77 32 (S) 23
5
Brassica rappa
3 100 - -
6 100 26 (S) -
6
Colocasia esculenta
3 67 36 (R) 33
6 33 41 (R) 67
7
Coriandrum sativum
3 76 25 (R) 24
6 84 19 (R) 16
8
Dioscorea alata
3 96 4 (S) 4
6 85 6 (R) 15
9
Ipomoea batatas
3 89 11 (R) 11
6 90 11 (R) 10
10
Manihot esculenta
3 90 7 (R) 10
6 87 9 (R) 13
11
Polymnia sonchifolia
3 100 11 (S) -
6 99 93 (S) 1
12
Raphanus sativus
3 51 89 (R) 49
6 26 >98 (R) 74
13
Solanum tuberosum
3 74 12 (S) 26
6 40 20 (S) 60
14
Zingiber officinale
3 93 79 (S) 7
6 100 >98 (S) -
t: tempo (dias); c: conversão determinada por CG;
e.e.: excesso enantiomérico; Configuração absoluta está entre parênteses.
O
OH
67
5.2.2 Oxidação do (RS)-1-(4-bromofenil)etanol (2b)
A D. alata é o melhor biocatalisador para a oxidação seletiva do (RS)-1-(4-
bromofenil)etanol (2b) (Figura 21), que foi oxidado para a cetona correspondente 1b
em 53% após 6 dias de reação, deixando o precursor (S)-2b com 83 % e.e. (Tabela
17, Reação 6).
O
Br
OH
Br
planta
32
o
C / H
2
O
1-(4-bromofenil)etanona (1b)
(RS)-1-(4-bromofenil)etanol (2b)
Figura 21. Oxidação do (RS)-1-(4-bromofenil)etanol (2b).
O A. schoenoprasum forneceu 37 % da cetona, mas somente após 6 dias de
reação e o álcool remanescente apresentou baixo excesso enantiomérico (Tabela
17, Reação 1). A. Xanthorrhiza, C. esculenta, S. tuberosum e Z. officinale
apresentaram um leve poder oxidante, com a conversão alcançando, no melhor dos
casos, 14%.
Em relação às outras plantas, nenhuma apresentou resultados satisfatórios
nas condições empregadas.
68
Tabela 17. Oxidação do (RS)-1-(4-bromofenil)etanol (2b).
Reação Biocatalisador t (d) c (%) e.e. (%) c (%)
1
Allium schoenoprasum
3 94 3 (S) 6
6 63 43 (S) 37
2
Arracacia xanthorrhiza
3 90 9 (R) 10
6 89 9 (R) 11
3
Beta vulgaris
3 97 6 (S) 3
6 99 3 (R) 1
4
Colocasia esculenta
3 92 - 8
6 86 11 (R) 14
5
Coriandrum sativum
4 99 - 1
6 94 3 (R) 6
6
Dioscorea alata
3 44 73 (S) 56
6 47 83 (S) 53
7
Ipomoea batatas
3 95 5 (R) 5
6 95 7 (R) 5
8
Manihot esculenta
3 100 8 (R) -
6 97 4 (R) 3
9
Raphanus sativus
3 99 - -
6 100 - -
10
Solanum tuberosum
3 99 2 (S) 1
6 90 5 (S) 10
11
Zingiber officinale
3 97 3 (R) 3
6 88 4 (S) 12
t: tempo (dias); c: conversão determinada por CG;
e.e.: excesso enantiomérico; Configuração absoluta está entre parênteses.
O
Br
OH
Br
69
5.2.3 Oxidação do (RS)-1-(4-metilfenil)etanol (2c)
A. schoenoprasum, C. sativum e S. tuberosum são excelentes agentes
oxidante do (RS)-1-(4-metilfenil)etanol (2c) (Figura 22), transformando-o na
respectiva cetona, a 1-(4-metilfenil)etanona (1c). Com essas três plantas
praticamente todo o álcool havia sido oxidado após 6 dias de reação (Tabela 18,
Reações 1, 5 e 10). Já as plantas, A. xanthorrhiza, C. esculenta, D. alata, I. batatas,
M. esculenta e Z. officinale, apresentaram moderada capacidade oxidante,
convertendo de 30 a 69 % do substrato.
O
OH
planta
32
o
C / H
2
O
1-(4-metilfenil)etanona (1c)
(RS)-1-(4-metilfenil)etanol (2c)
Figura 22. Oxidação da (RS)-1-(4-metilfenil)etanol (2c).
Em relação à enantiosseletividade desta reação, somente com o S.
tuberosum foi obtido excesso enantiomérico satisfatório, com o qual foi obtido o
álcool (R)-2c com 86% e.e. depois de 3 dias de reação (Tabela18, Reação 11).
70
Tabela 18. Oxidação do (RS)-1-(4-metilfenil)etanol (2c).
Reação Biocatalisador t (d) c (%) e.e. (%) c (%)
1
Allium schoenoprasum
3 7 90 (R) 93
6 - - 100
2
Arracacia xanthorrhiza
3 69 22 (R) 31
6 31 19 (R) 69
3
Beta vulgaris
3 - - -
6 90 10 (S) 2
4
Colocasia esculenta
3 77 4 (R) 23
6 69 14 (R) 31
5
Coriandrum sativum
4 13 49 (R) 87
6 - - 100
6
Dioscorea alata
3 70 10 (R) 30
6 73 23 (S) 27
7
Ipomoea batatas
3 80 26 (R) 20
6 72 38 (R) 28
8
Manihot esculenta
3 78 27 (R) 22
6 64 15 (R) 35
9
Raphanus sativus
3 92 - 8
6 93 - 7
10
Solanum tuberosum
3 32 86 (R) 68
6 4 >98 (R) 96
11
Zingiber officinale
3 89 - 11
6 60 53 (R) 40
t: tempo (dias); c: conversão determinada por CG; e.e.: excesso enantiomérico;
Configuração absoluta está entre parênteses.
O
OH
71
5.2.4 Oxidação de (RS)-1-(4-nitrofenil)etanol (2d)
No caso busca de biocatalisadores para oxidação enantiosseletiva do (RS)-1-
(4-nitrofenil)etanol (2d) (Figura 23), nenhuma planta apresentou resultados
satisfatórios como agente de resolução, mas, similarmente ao ocorrido quando foi
usado como substrato 1-(4-nitrofenil)etanona (Seção 5.1.4), uma inesperada reação
foi observada. Além da oxidação do álcool, observamos a redução do grupo nitro
(─NO
2
) em amino (─NH
2
). Desse modo A. xanthorrhiza e B. vulgaris transformaram
o substrato em 1-(4-aminofenil)etanona com conversão de 86 % e 92 %,
respectivamente (Tabela 19, Reações 2 e 3).
O
O
2
N
OH
O
2
N
planta
32
o
C / H
2
O
1-(4-nitrofenil)etanona (1d)
(RS)-1-(4-nitrofenil)etanol (2d)
Figura 23. Oxidação do (RS)-1-(4-nitrofenil)etanol (2d).
Em vista desses resultados, foi testada a biotransformação do nitrobenzeno
com B. vulgaris, com a qual, após 8 dias de reação, foi obtida a anilina com 52% de
rendimento isolado (Figura 26). Estudos adicionais foram realizados com outros
compostos nitrogenados
49
.
32
o
C / H
2
O
B. vulgaris
NH
2
NO
2
Figura 24. Redução do nitrobenzeno pela B. vulgaris.
72
Tabela 19. Oxidação do (RS)-1-(4-nitrofenil)etanol (2d).
Reação Biocatalisador t (d) c (%) e.e. (%) c (%)
1
Allium schoenoprasum
3 99 - 1
6 99 - 1
2
Arracacia xanthorrhiza
3 67 9 (R) 33
a
6 14 18 (R) 86
a
3
Beta vulgaris
3 77 18 (S) 23
a
6 - - 92
a
4
Colocasia esculenta
3 99 - 1
6 93 4 (R) 6
a
5
Coriandrum sativum
4 100 - -
6 100 - -
6
Dioscorea alata
3 97 - 2
a
6 97 - 3
a
7
Ipomoea batatas
3 99 - 1
6 99 - 1
8
Manihot esculenta
3 97 - 3
6 97 - 3
9
Raphanus sativus
3 99 - 1
a
6 97 - 3
a
10
Solanum tuberosum
3 98 - 1
a
6 97 - 2
a
11
Zingiber officinale
3 99 - 1
6 98 3 (S) 1
t: tempo (dias); c: conversão determinada por CG;
e.e.: excesso enantiomérico; Configuração absoluta está entre parênteses.
a
4’-aminoacetofenona
O
NO
2
OH
NO
2
73
5.2.5 Oxidação de (RS)-1-(4-metilselanil-fenil)etanol (2e)
Para a oxidação enantiosseletiva do (RS)-1-(4-metilselanil-fenil)etanol (2e)
(Figura 25), os melhores biocatalisadores são: A. schoenoprasum, B. vulgaris, C.
sativum (Tabela 20, Reações 1, 3 e 5). Com a B. vulgaris e o C. sativum obteve-se,
depois de 3 dias de reação, o (R)-2e com 79 e 77% e.e., respectivamente (Tabela
20, Reações 3 e 6). Observe que com C. sativum houve, durante os 3 primeiros dias,
uma oxidação enantiosseletiva, caracterizando uma resolução cinética e, aos 6 dias,
todo o álcool havia sido transformado na respectiva cetona. Já com a A.
schoenoprasum obteve-se, após 6 dias de reação, o (S)-2e com 76% e.e.
O
MeSe
OH
MeSe
planta
32
o
C / H
2
O
1-(4-metilselanil-fenil)etanona (1e)
(RS)-1-(4-metilselanil-fenil)etanol (2e)
Figura 25. Oxidação do (RS)-1-(4-metilselanil-fenil)etanol (2e).
O Z. officinale mostrou ser um excelente agente oxidante, tendo em vista a
oxidação quantitativa do álcool em questão (Tabela 20, Reação 12).
74
Tabela 20. Oxidação do (RS)-1-(4-metilselanil-fenil)etanol (2e).
Reação Biocatalisador t (d) c (%) e.e. (%) c (%)
1
Allium schoenoprasum
3 85 11 (R) 15
6 12 76 (S) 88
2
Arracacia xanthorrhiza
3 79 25 (R) 21
6 60 53 (R) 40
3
Beta vulgaris
3 55 79 (R) 45
6 56 76 (R) 44
4
Colocasia esculenta
3 96 4 (R) 4
6 95 4 (R) 5
5
Coriandrum sativum
4 54 77 (R) 46
6 1 - 99
6
Dioscorea alata
3 91 12 (R) 9
6 92 15 (R) 8
7
Ipomoea batatas
3 94 10 (R) 6
6 89 14 (R) 11
8
Manihot esculenta
3 68 19 (R) 32
6 58 23 (R) 42
10
Raphanus sativus
3 100 7 (R) -
6 99 8 (R) 1
11
Solanum tuberosum
3 99 7 (R) 1
6 95 9 (R) 5
12
Zingiber officinale
3 97 8 (R) 3
6 - - 100
t: tempo (dias); c: conversão determinada por CG;
e.e.: excesso enantiomérico; Configuração absoluta está entre parênteses.
O
Se
OH
Se
75
5.3 Reações em escala preparativa
Em vista dos bons resultados para alguns substratos e plantas em reações de
biorredução enantiosseletiva de acetofenonas e oxidação enantiosseletiva de
feniletanóis, decidimos avaliar dois biocatalisadores em reações com escala
preparativa. As reações escolhidas foram a redução da acetofenona com A.
xanthorrhiza e a oxidação do (RS)-1-(4-metilfenil)etanol (2c) com C. sativum. Para
isso, foram utilizadas 1 g de substrato, 200 g de planta e 800 mL de água destilada.
Os produtos dessas reações foram isolados e purificados fornecendo os seguintes
resultados:
- Biorredução da cetona 1a usando A. xanthorrhiza (Figura 26): Produto (S)-2a
(Rendimento: 43%, 470 mg), [α]
D
25
= -58,7
o
(c 3,1; CHCl
3
), e.e. >99%). 1a
recuperado: 46% (434 mg).
O
OH
A. xanthorrhiza
32
o
C / H
2
O
t = 3 dias
(
S)-1-feniletanol (2a)1-feniletanona (1a)
Figura 26. Redução da 1-feniletanona (1a) em escala preparativa.
Na Figura 27, apresentamos o cromatograma dessa reação. Observe que a
A. xanthorrhiza é um bom redutor enantiosseletivo da acetofenona, pois foi possível
obter o álcool (S)-(-)-1-feniletanol (2a) com excelente excesso enantiomérico (maior
que 99%) e com bom rendimento isolado (43%).
76
Figura 27. Cromatograma da reação do 1-feniletanona (1a) com A. xanthorrhiza.
- Bio-oxidação do álcool (RS)-2c usando C. sativum (Figura 28): composto (R)-2c
(34%, 346 mg), [α]
D
25
= +35,6
o
(c 3,6; CHC l
3
), e.e. 64%), composto 1c: 26% (257
mg).
O
OH
C. sativum
1-(4-metilfenil)etanona (1c)
(
RS)-1-(4-metilfenil)etanol (2c)
32
o
C / H
2
O
t = 6 dias
Figura 28. Oxidação do (RS)-1-(4-metilfenil)etanol (2c) em escala preparativa.
A seguir, na Figura 29, está o cromatograma da reação do (RS)-1-(4-
metilfenil)etanol (2c) com C. sativum, que mostrou ser um melhor agente oxidante
do que um agente de resolução cinética. O álcool recuperado apresentou somente
64 % de excesso enantiomérico. Conforme observado durante a triagem, esperava-
se a oxidação completa deste álcool, no entanto, essa reação apresentou
rendimento isolado de 26 % de cetona. Talvez isso se deve à possível inibição
▬▬ 1-feniletanol racêmico (padrão)
▬▬ Reação com A. xanthorrhiza após purificação
OH
77
enzimática causada pela adição de grande quantidade do composto orgânico usado
como reagente.
Figura 29. Cromatograma da reação de oxidação do (RS)-1-(4-metilfenil)etanol (2c) com C. sativum.
O
OH
(R)
OH
(S)
78
CAPÍTULO 6 – REAÇÕES DE ÓXIDO-REDUÇÃO USANDO PLANTAS
COMESTÍVEIS - CONCLUSÕES
O uso de plantas é uma boa ferramenta não só para a química auto-
sustentável, mas também para a química economicamente viável, pois faz uso de
procedimento experimental seguro e com baixo custo.
As plantas podem ser usadas para a redução enantiosseletiva de cetonas
pró-quirais, possibilitando a obtenção de álcoois enantiomericamente puros tanto de
configuração (R) quanto de configuração (S).
As plantas podem ser usadas como agentes oxidantes durante a resolução
cinética de alcoóis secundários.
A bio-oxidação quantitativa observada com os alcoóis 1-(4-metilfenil)etanol e
1-(4-(metilselanil)fenil)etanol nos fornece um protocolo ambientalmente amigável
para reações de oxidação.
De modo a transformar-se numa ferramenta sintética útil para outros
compostos químicos, torna-se necessário estudos adicionais, como por exemplo,
determinação das condições ótimas de pH e tempo de reação.
79
CAPÍTULO 7 – PARTE EXPERIMENTAL
7.1 BIORRECICLAGEM DE HEXANO
7.1.1 Materiais e Métodos
Nesta parte do trabalho foram usados os seguintes microrganismos e
enzimas:
- Fungos: Os fungos foram adquiridos da Fundação Tropical André Tosello –
Campinas – SP ou da Coleção de Culturas de Fungos do Instituto de Botânica – São
Paulo – SP. Neste laboratório (Laboratório de Química Fina e Biocatálise - IQ/USP)
as cepas são conservadas em tubos de ensaio contendo ágar (20 g/L) e extrato de
malte (20 g/L) sob refrigeração (4ºC).
Aspergillus terreus SSP 1498
Aspergillus niger SSP 1078
Emericella nidulans CCT 3119
Rhizopus oryzae CCT 4964
- Enzimas: As enzimas foram doadas pela empresa NOVOZYMES
(http://www.novozymes.com.br/), filial localizada em Araucária/PR, exceto a PPL
adquirida da empresa Sigma-Aldrich.
Lipolase 100T (lipase do Humicola lanuginosa, imobilizada)
Lipozyme RM IM (lipase do Rhizomucor miehei, imobilizada)
Lipozyme TL IM (lipase do Thermomyces lanuginosus, imobilizada)
Novozyme 435 (CAL-B, lipase B da Cândida antarctica, imobilizada)
Novozyme 735 (CAL-A, lipase A da Candida antarctica, imobilizada)
Novozyme CALB-L (lipase B da Candida Antarctica)
PPL (lipase do pâncreas de porco, extrato bruto, Tipo II)
80
A mistura de acetato de etila e hexano foi coletada em nosso laboratório após
seu uso na purificação de compostos em coluna cromatográfica de sílica gel.
Os solventes puros, usados como padrão, foram adquiridos da Synth.
As análises de cromatografia gasosa foram realizadas em um Cromatógrafo a
Gás (CG) CG-17A da Shimadzu com detector por Ionização em Chama (DIC ou
FID), equipado com coluna J & W Scientific DB-624 (30m x 0,53 mm) usando
hidrogênio como gás de arraste.
As reações de hidrólise usando microrganismos foram realizadas em reator
tipo batelada, encamisado, com capacidade de 10 L da QVF-Engineering GMBH,
PILOTEC-TEC MINIPLANT com agitador mecânico do tipo pá equipado com
termostato da LAUDA RK8 KP 2000.
As medições dos valores de pH foram feitas usando pHmetro Quimis Q400A.
As reações de hidrólise em processo contínuo foram feitas em reator tubular
encamisado de fabricação própria. As bombas peristálticas modelo IPC 4 vias da
marca ISMATEC. O termostato usado foi da marca Büchi modelo B-490.
81
7.1.2 Preparação dos meios de cultura
50
O crescimento dos microrganismos foi feito em duas etapas e foram
usados dois meios de cultura, nomeados A e B.
Meio de cultura A: Em um Erlenmeyer de 500 mL adicionou-se água
destilada (200 mL), dextrose (4 g) e peptona (2 g). Em seguida, a mistura foi
esterilizada (120
o
C; 15 min). Esse meio foi usado durante o crescimento do fungo
em agitador orbital.
Meio de cultura B: Em um Erlenmeyer de 4 L adicionou-se água destilada
(3L) e batata (S. tuberosum L.) (600 g). Foi realizado o cozimento durante uma hora.
Em seguida, a mistura foi filtrada e adicionou-se açúcar (60 g) seguido de
esterilização em autoclave (120 ºC; 15 min). Esse meio foi usado durante o
crescimento do fungo no reator.
7.1.3 Procedimento das reações de hidrólise com microrganismos
Inicialmente, o fungo apropriado foi inoculado em dois Erlenmeyers de
500 mL contendo meio de cultura A (200 mL), seguido de incubação em agitador
orbital a 160 rpm e a 32 ºC durante 48h. Passado esse período, o inóculo foi
transferido ao reator contendo o meio de cultura B (3 L). O reator foi mantido a 100
rpm e a 32 ºC durante 48 h. Após esse período, o pH (valor inicial 5,6) do meio foi
corrigido adicionando-se solução aquosa de NaOH 1N (correção do pH conforme
indicada no texto). Em seguida, 600 mL da mistura hexano-acetato de etila
(concentração de AcOEt conforme indicada no texto) foi adicionada ao reator. A
82
partir desse momento, o reator foi mantido a 160 rpm e a 32 ºC. A reação foi
monitorada via cromatografia gasosa.
7.1.4 Procedimento das reações de hidrólise usando enzimas isoladas
Em um Erlenmeyer de 250 mL contendo água destila (50 mL) ou solução
tampão (50 mL) foram adicionadas a mistura hexano-acetato de etila (50 mL) e a
enzima apropriada [3 g (sólido) ou 3 mL (líquido)]. O Erlenmeyer foi devidamente
vedado e mantido em agitador orbital (160 rpm, 32 ºC) durante 48 h. As alíquotas (1
mL) foram retiradas após 24 e 48 h de reação e analisadas via cromatografia
gasosa.
7.1.5 Métodos para análise no cromatógrafo a gás
Para as análises cromatográficas, as amostras (100 μL) foram diluídas em
tolueno (500 μL) a fim de minimizar os erros sistemáticos.
Gás de arraste: Hidrogênio, 16 kPa.
Coluna: J & W Scientific DB-624 (30 m x 0,53 mm)
Temperatura:
Injetor: 220 ºC.
Detector: 220 ºC.
Coluna: isoterma a 40 ºC, 8 min; 20 ºC/min até 180 ºC.
83
7.1.6 Quantificação das proteínas totais
18
A quantificação de proteínas totais foi feita usando o método de Bradford,
com albumina de soro bovino como padrão.
A leitura da absorbância foi feita em um espectrofotômetro HITACHI U-
2010 ROM v 2550 02.
7.1.6.1 Crescimento dos fungos
O fungo A. terreus SSP 1498 foi incubado em dois frascos Erlenmeyer de
500 mL contendo 200 mL do meio de cultura A (Seção 7.1.2). Este crescimento foi
realizado em um agitador orbital (160 rpm, 32 ºC, 48 h). Depois de 48 h de
incubação, este inóculo e o meio de cultura B (3 L), foram acrescentados ao reator e
mantido por um período de incubação extra (60 h, 32 ºC, 100 rpm).
O filtrado da cultura e as células úmidas foram usados como fonte de
enzima para determinar a quantidade de proteínas e a respectiva atividade
enzimática.
7.1.6.2 Preparação do Homogeneizado de células
No caso das células úmidas, foi realizada a sua homogeneização. Células
úmidas (3,0 g) acrescido de solução tampão de extração (27 mL) foram processadas
em um aparelho tipo Potter, sempre resfriado com gelo. Em seguida, o
homogeneizado foi levado para a centrifugação (10000 rpm, 8 min, 5 ºC). O
sobrenadante foi usado como fonte de enzima.
Solução Tampão de Extração:
• Tampão fosfato 20 mM;
• 0,1%w Triton-X;
84
• 150 mM NaCl;
• pH = 7,4.
7.1.6.3 Curva-padrão usando albumina
Para traçar a curva padrão foram utilizados os seguintes volumes.
Tabela 21. Volumes usados para traçar a curva-padrão para
quantificação de proteínas.
Volume (
μ
L)
Albumina (0,1 mg/mL) Água Reagente de Bradford
0 800 200
20 780 200
40 760 200
60 740 200
80 720 200
100 700 200
Para a quantificação das proteínas do filtrado foram misturados, 700 μL de
água destilada, 200 μL de Reagente de Bradford e 100 μL de filtrado.
Para a quantificação das proteínas do homogeneizado foram misturados 795
μL de água destilada, 200 μL de Reagente de Bradford e 5 μL de homogeneizado.
O padrão e as amostras foram deixados em local isento de iluminação por 5
minutos. Após esse tempo, foi feita a leitura da absorbância a 595 nm.
85
7.1.7 Determinação da atividade enzimática de lipase
A atividade enzimática foi determinada por titulometria conforme descrito por
Kamimura et al
19
.
A mistura reacional consiste de 5 mL de emulsão azeite de oliva/goma
arábica (25% azeite de oliva e 75% goma arábica) e 2 mL de solução tampão fosfato
10 mM, pH = 7,0. Essa mistura foi emulsionada mecanicamente por 3 min. A reação
foi iniciada adicionando-se 1 mL de filtrado enzimático (seção 7.1.6.1) ou células
homogeneizadas (seção 7.1.6.2) e mantida em agitador orbital durante 30 min a 37
°C e a 200 rpm. Após esse período, a reação foi parada adicionando 15 mL de
solução acetona:etanol (1:1) e a quantidade de ácidos graxos produzidos foi
determinada por titulação que foi realizada com solução NaOH 0,05N usando como
indicador 4 gotas de solução de timolftaleína da Sigma Diagnostics (0,9%
timolftaleína em etanol)
86
7.2 REAÇÕES DE ÓXIDO-REDUÇÃO USANDO PLANTAS
COMESTÍVEIS
7.2.1 Materiais e Métodos
Os reagentes: 1-feniletanona e 1-(4-nitrofenil)etanona foram adquiridos da
Merck. Selênio, 1-(4-bromofenil)etanona, 1-(4-metilfenil)etanona e o padrão 1-(4-
aminofenil)etanona foram adquiridos da Aldrich.
Todas as vidrarias e a água destilada utilizada nas reações de biocatálise
foram devidamente esterilizadas em autoclave a 120 ºC durante 15 min. Após essa
etapa, toda manipulação das plantas foi realizada em capela de fluxo laminar
devidamente esterilizada.
As análises de cromatografia gasosa foram realizadas em um Cromatógrafo a
Gás (CG) CG-17A da Shimadzu com detector por Ionização em Chama (DIC ou
FID), equipado com coluna quiral β-ciclodextrina Chirasil-DEX CB 25 m (Varian) e
usando hidrogênio como gás de arraste (Pressão = 100kPa).
Os espectros de massas foram obtidos num espectrômetro Shimadzu GC-MS
(Cromatógrafo a Gás acoplado ao espectrômetro de massas) QP5050A (70 eV)
usando coluna J & W Scientific DB-5 (30m x 0,25mm).
Os valores de rotação óptica foram determinados usando um polarímetro
JASCO DIP-370 com lâmpada de mercúrio (546 – 578 nm).
As cromatografias em camada delgada (CCD) foram feitas em placas de
sílica-gel (Folha de alumínio, sílica-gel 60 F254 Merck, 0,25mm).
As cromatografias em coluna foram feitas usando sílica gel (Merck 60, 230 –
400 mesh).
87
7.2.2 Plantas usadas como fonte de enzimas
As plantas foram adquiridas em “feiras-livres” do município de São Paulo de
modo a assegurar que fossem recém colhidas e saudáveis.
Tabela 22. Nome das plantas usadas nas reações de óxido-redução.
Nome científico Nome popular
Allium schoenoprasum L. cebolinha
Arctium lappa L. bardana
Arracacia xanthorrhiza B. mandioquinha
Beta vulgaris
L. beterraba
Brassica rapa
L. nabo redondo
Colocasia esculenta (L.) S. inhame
Coriandrum sativum L. coentro
Dioscorea alata L. cará
Ipomoea batatas Lam. batata doce rosada
Manihot esculenta C. mandioca
Polymnia sonchifolia yakon
Raphanus sativus L. nabo japonês
Solanum tuberosum L. batata inglesa
Zingiber officinale R. gengibre
7.2.3 Preparação dos substratos
Todas as cetonas foram adquiridas da Merck ou da Aldrich, exceto a 1-(4-
metilselanil-fenil)etanona, a qual foi sintetizada em cooperação com o Dr. Álvaro
Takeo Omori
48
.
88
7.2.3.1 Preparação da 1-(4-metilselanil-fenil)etanona (1e)
A síntese da cetona (1e) envolveu as etapas descritas na Figura 30.
O
Br
Br
OO
O
Se
(1) t-BuLi / THF
(2) Se / CH
3
I
(3) H
3
O
+
Etilenoglicol
p-TsOH / benzeno
1-(4-metilselanil-fenil)etanona (1e)
1-(4-bromofenil)etanona
Figura 30. Síntese da 1-(4-metilselanil-fenil)etanona (1e).
(A) Preparação do 2-(4-bromofenil)-2-metil-1,3-dioxolano
51
Em um balão de 100 mL sob agitação magnética foram adicionados a p-
bromoacetofenona (10 mmol), etilenoglicol em excesso (40 mmol), benzeno (50 mL)
e ácido p-tolueno sulfônico (10 mg). O sistema foi acoplado a um Dean-Stark e
refluxado até que não fosse mais observada a formação de água (5h). O solvente foi
evaporado e o produto bruto foi solubilizado em diclorometano (20 mL) e lavado com
solução saturada de NaCl. A fase orgânica foi separada, seca com MgSO
4
, o
solvente foi evaporado no rotaevaporador. Após identificação do produto obtido por
89
Espectrometria de Massas e Ressonância Magnética Nuclear,
48
o óleo obtido foi
utilizado diretamente na reação seguinte.
(B) Preparação da cetona
52
Em um balão de duas bocas de 100 mL sob atmosfera inerte (N
2
) e a –78 ºC
foram adicionados o bromoacetal (10 mmol; 2,43 g) e THF seco (50mL). Em seguida
foi adicionado, gota a gota, t-BuLi (10,5 mmol; 11 mL de uma solução 0,92M em n-
hexano). A temperatura da reação foi elevada a 0
o
C e o sistema foi agitado por mais
30 minutos. Após adição de selênio (12,5 mmol; 988 mg), o sistema foi mantido sob
agitação por mais 3 horas a 25ºC. Após esse tempo, iodometano (20 mmol; 2,84 g)
foi adicionado, mantendo a agitação por mais 10 minutos. No fim, a reação foi lavada
com solução aquosa saturada de cloreto de amônio (10 mL) e de cloreto de sódio
(10 mL). A fase aquosa foi extraída com acetato de etila (3 x 15 mL). As fases
orgânicas foram combinadas e secas com MgSO
4
. O solvente foi evaporado em
rotaevaporador. O produto bruto obtido foi hidrolisado com uma mistura de ácido
clorídrico 1 M (15 mL) e acetona (35 mL) num balão de 100 mL sob refluxo por uma
hora. Após a evaporação da acetona, o produto foi extraído com diclorometano (3 x
20 mL). As fases orgânicas foram combinadas e secas com MgSO
4
. O solvente foi
evaporado em rotaevaporador e o produto foi isolado após cromatografia em coluna
com sílica gel usando uma mistura de hexano/acetato de etila (95:5) como eluente.
O produto obtido foi identificado por Espectrometria de Massas e Ressonância
Magnética Nuclear
48
.
90
7.2.3.2 Preparação dos alcoóis racêmicos
Todos os álcoois racêmicos, 1-feniletanol, 1-(4-bromofenil)etanol, 1-(4-
metilfenil)etanol, 1-(4-nitrofenil)etanol e 1-(4-metilselanil-fenil)etanol, foram obtidos a
partir da redução das respectivas cetonas com boroidreto de sódio (NaBH
4
).
Procedimento geral
48
Num balão de 250 mL, foram adicionados metanol (50mL) e a respectiva
cetona 1a-e (10 mmol). O boroidreto de sódio (11 mmol) foi adicionado a essa
solução, em pequenas porções, à temperatura ambiente e sob agitação magnética.
Após 2h, solução aquosa de HCl (0,1N) foi adicionado à mistura. O excesso de
metanol foi evaporado em um rotaevaporador e em seguida, ao produto bruto foi
adicionada solução aquosa saturada de NH
4
Cl (50ml). Extraiu-se a mistura com
acetato de etila (3 x 50 mL). As fases orgânicas foram combinadas e secas com
MgSO
4
. O solvente foi evaporado em rotaevaporador e o produto foi purificado por
cromatografia em coluna com sílica gel usando mistura adequada de hexano e
acetato de etila como eluente.
Os produtos foram identificados por Espectrometria de Massas e Ressonância
Magnética Nuclear
48
.
7.2.4 Procedimento para as reações com as plantas
Após uma pré-lavagem com água, a planta foi mantida submersa em solução
aquosa de hipoclorito de sódio (5%) durante 20 minutos. Em seguida, a planta foi
lavada com etanol e a sua manipulação seguiu em uma capela de fluxo laminar.
Para aumentar o contato entre o biocatalizador e o substrato, a casca da planta foi
removida e o restante foi cortado em fatias. A um Erlenmeyer de 250 mL foi
91
adicionado a planta fatiada (20 g), a água destilada (80 mL) e por fim o substrato
(100 mg) previamente solubilizado em DMF (Dimetilformamida, 1 mL). Essa mistura
foi levada a um agitador rotativo (160 rpm, 32 ºC). Após 3 e 6 dias, foram coletadas
pequenas alíquotas (1 a 2 mL) e os produtos extraídos com acetato de etila (0,5 mL)
em tubos para centrífuga. Os tubos foram agitados em agitador de tubos e
centrifugados (5 min., 6000 rpm, temperatura ambiente). A fase orgânica foi levada
para análise em cromatografia gasosa.
A utilização dos vegetais em pedaços facilita o work up, filtração e extração
do produto, além disso, o uso na forma “ralada” a fim de aumentar a superfície de
contato do biocatalizador com o substrato não apresentou aumento significativo da
atividade enzimática
48
.
7.2.5 Reações em escala preparativa
A planta em pedaços (200 g), água destilada (800 mL) e a 1-feniletanona (1 g)
ou o (RS)-1-(4-metilfenil)etanol (1 g) foram adicionados num Erlenmeyer de 2 L e
mantidos em um agitador orbital a 160 rpm e 32 °C. Depois do tempo de reação
apropriado (3 – 6 dias), a mistura foi filtrada e a suspensão foi lavada com acetato de
etila (100 mL). A fase aquosa foi submetida a uma extração com acetato de etila (5 x
100 mL). A fase orgânica foi seca com MgSO
4
. O solvente foi removido no
rotaevaporador e o resíduo foi purificado em coluna cromatográfica com sílica gel e
usando uma mistura de hexano e acetato de etila (4:1) como eluente.
92
7.2.6 Métodos para as análises no cromatógrafo a gás
Gás de arraste: Hidrogênio, 100 kPa.
Coluna quiral: Chirasil-Dex CB β-ciclodextrina (25m x 0,25mm).
Injetor: 220 ºC
Detector: 220 ºC
MÉTODO 1: Este método foi empregado para a identificação dos compostos (RS)-1-
feniletanol e 1-feniletanona (Figura 31).
Temperatura da coluna: 110ºC, 3 ºC/min até 180 ºC.
Tempos de retenção: 1-feniletanona = 2,45 min
(R)-1-feniletanol = 4,56 min
(S)-1-feniletanol = 4,82 min
Figura 31. Cromatogramas do (RS)-1-feniletanol (2a) e 1-feniletanona (1a).
O
OH
(R)
OH
(S)
93
MÉTODO 2: Este método foi empregado para a identificação dos compostos (RS)-1-
(4-bromofenil)etanol e 1-(4-bromofenil)etanona (Figura 32).
Temperatura da coluna: 110 ºC, 3 ºC/min até 180ºC.
Tempos de retenção: 1-(4-bromofenil)etanona = 9,38 min
(R)-1-(4-bromofenil)etanol = 12,64 min
(S)-1-(4-bromofenil)etanol = 13,30 min
Figura 32. Cromatogramas do (RS)-1-(4-bromofenil)etanol (2b) e 1-(4-bromofenil)etanona (1b).
O
Br
OH
Br
(S)
OH
Br
(R)
94
MÉTODO 3: Este método foi empregado para a identificação dos compostos (RS)-1-
(4-metilfenil)etanol e 1-(4-metilfenil)etanona (Figura 33).
Temperatura da coluna: 110 ºC, 1 ºC/min até 180 ºC.
Tempos de retenção:
1-(4-metilfenil)etanona = 4,31 min
(R)-1-(4-metilfenil)etanol = 7,45 min
(S)-1-(4-metilfenil)etanol = 8,31 min
Figura 33. Cromatogramas dos (RS)-1-(4-metilfenil)etanol (2c) e 1-(4-metilfenil)etanona (2c).
OH
(R)
OH
(S)
O
95
MÉTODO 4: Este método foi empregado para a identificação dos compostos (RS)-1-
(4-nitrofenil)etanol, 1-(4-nitrofenil)etanona e 1-(4-aminofenil)etanona (Figura 34).
Temperatura da coluna: 150 ºC, 1 ºC/min até 180 ºC.
Tempos de retenção: 1-(4-nitrofenil)etanona = 5,38 min
(R)-1-(4-nitrofenil)etanol = 12,94 min
(S)-1-(4-nitrofenil)etanol = 14,13 min
1-(4-aminofenil)etanona = 7,43 min
Figura 34. Cromatogramas do (RS)-1-(4-nitrofenil)etanol (2d), 1-(4-nitrofenil)etanona (1d) e
da 1-(4-aminofenil)etanona.
OH
NO
2
(R)
OH
O
2
N
(S)
O
NO
2
O
NH
2
96
MÉTODO 5: Este método foi empregado para a identificação dos compostos (RS)-1-
(4-(metilselanil)fenil)etanol e 1-(4-metilselanil-fenil)etanona (Figura 35).
Temperatura da coluna: isoterma a 140 ºC, 25 min de espera, 20 ºC/min até
180 ºC.
Tempos de retenção: 1-(4-metilselanil-fenil)etanona = 11,95 min
(R)-1-(4-metilselanil-fenil)etanol = 18,22 min
(S)-1-(4-metilselanil-fenil)etanol = 19,94 min
Figura 35. Cromatogramas do (RS)-1-(4-metilselanil-fenil)etanol (2e) e 1-(4-metilselanil-fenil)etanona
(1e).
OH
Se
(R)
OH
Se
(S)
O
Se
97
7.2.7 Atribuição da configuração absoluta dos alcoóis.
As configurações absolutas dos produtos das reações biocatalisadas foram
atribuídas por correlação através dos picos dos cromatogramas com padrões
enantiomericamente puros de: (S)-1-feniletanol, (S)-1-(4-bromofenil)etanol,
(S)-1-(4-metilfenil)etanol, (S)-1-(4-nitrofenil)etanol e (S)-1-(4-metilselanil-fenil)etanol.
As configurações absolutas dos padrões foram atribuídas comparando-se
valores de rotação óptica dos produtos obtidos com os valores da literatura
48,53, 54, 55,
56
.
98
SÚMULA CURRICULAR
DADOS PESSOAIS
Nome: Roberto Susumu Utsunomiya
Local de nascimento: Santópolis do Aguapeí – SP – Brasil
Data de nascimento: 10.06.1978
EDUCAÇÃO
Ensino Médio: EEPSG Fernão Dias Pais, São Paulo - SP, 1996
Graduação: Escola Politécnica (USP), São Paulo – SP, 2003
OCUPAÇÃO
Bolsista de Mestrado 2005/2006, CNPq.
PARTICIPAÇÃO EM CONGRESSOS
1. 2º Simpósio Internacional sobre Gerenciamento de Resíduos nas Universidades,
UFSM, Santa Maria – RS – Novembro de 2004. Trabalho apresentado:
Biodegradation of ethyl acetate present in laboratory wastes (ethyl acetate-
hexanes).
2. Biocatálisis y Biotransformaciones 2004, 1er Encuentro Regional, Montevideo –
Uruguai – Dezembro de 2004. Trabalho apresentado: Redução de
nitrocompostos aromáticos em aminas por nitrorreductases de Arracacia
xanthorrhiza.
PUBLICAÇÕES
1. Leandro H. Andrade, Patrícia B. Di Vitta, Roberto S. Utsunomiya, Iracema H.
Schoenlein-Crusius, André L. M. Porto, João V. Comasseto, Applied Catalysis
B: Environmental 2005, 59, 201-207.
2. Leandro H. Andrade , Roberto S. Utsunomiya, Alvaro T. Omori, André L. M.
Porto, João V. Comasseto, J. Mol. Catal. B: Enzym. 2006, 38, 84–90.
99
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