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Tese submetida ao Programa
de Pós-Graduação em Genética
e Biologia Molecular da
Universidade Federal do Rio
Grande do Sul como requisito
parcial para a obtenção do grau
de Doutor em Ciências.
Ana Cristina Lauer Garcia
Orientadora: Dra. Vera Lúcia da Silva Valente Gaiesky
Co- Orientadora: Dra. Cláudia Rohde
Evolução cromossômica da superespécie
Drosophila paulistorum e ecologia
de populações marginais
Porto Alegre, Março de 2006
Universidade Federal do Rio Grande do Sul
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Livros Grátis
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Milhares de livros grátis para download.
Este trabalho foi realizado no Laboratório de Drosophila do
Departamento de Genética da Universidade Federal do Rio
Grande do Sul (UFRGS), sendo financiado com recursos do
Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e
Tecnológico (CNPq), pela Coordenação de Aperfeiçoamento de
Pessoal de Nível Superior (CAPES) e pela Fundação de Amparo
à Pesquisa do Estado do Rio Grande do Sul (FAPERGS).
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Ao meu amor Martín, por estar sempre
ao meu lado e por tornar a minha vida
mais feliz.
AGRADECIMENTOS
À minha querida orientadora Dra. Vera Lúcia Valente. Vera, é sempre com enorme
carinho e profunda gratidão que me recordo do dia em que me recebeste para fazer parte do
teu grupo de pesquisa. Na época eu estava começando meu curso de graduação em Ciências
Biológicas na UFRGS e mal sabia quem eram as “drosófilas” e muito menos qual era a sua
importância de estudo. Logo o teu jeito apaixonado de fazer pesquisa me contagiou, o tempo
foi passando, conclui minha graduação, meu mestrado e agora, finalmente meu doutorado,
sempre sob a tua tutela. Hoje entendo bem a frase do professor Dr. A. R. Cordeiro quando ele
se refere as drosófilas como as “cinderelas da genética”. Obrigada Vera, por me fazer crescer
como pessoa durante todos esses anos de convívio, pela tua intuição visionária, teu incentivo
incansável, enfim, pelos teus ensinamentos de vida.
À minha querida co-orientadora, Dra. Cláudia Rohde. Cláudia, trabalhar contigo é uma
honra em todos os sentidos, é a garantia do trabalho maduro, da crítica correta, do elogio
sincero, do caminhar contínuo, da orientação humana e amiga. Obrigada por seres uma pessoa
tão especial na minha vida e por teres trabalhado sempre junto. Deixo expresso meu desejo de
que nossa parceria nunca acabe e que eu possa continuar crescendo sempre espelhada no teu
modelo de profissionalismo e competência.
Ao meu nobre amigo e batalhador incansável, Dr. Victor Hugo Valiati. Obrigada
Victor por nossa parceria ter dado tão certo e por nos entendermos tão bem, agradeço por teres
partilhado teus conhecimentos comigo durante nossas incansáveis discussões científicas ao
longo de tantos sábados, domingos, feriados e também ao longo de alguns dias de semana.
Que nós continuemos a dar certo!
Ao meu amor Martín Montes, minha alegria maior, minha certeza de apoio. Obrigada
por desfrutar comigo das minhas alegrias e por nunca me deixar cair perante as minhas
dificuldades. Agradeço a enorme ajuda técnica e sentimental para a conclusão desse trabalho.
Obrigado por tudo que tens feito por minha causa, desde aprender a repicar mosquinhas até a
parte mais cansativa do trabalho de campo onde me ajudaste a colocar as iscas nos pontos de
coleta e a processar o material no laboratório. Agradeço o esforço sem medidas, o carinho com
que sempre me trazias chimarrão e bolachinhas quando eu precisava de “energia” para
continuar a trabalhar. A tua enorme paciência quando nem mesma eu me agüentava, por
procurares soluções para os meus problemas, pela palavra sempre amiga, por dares sentido a
minha vida e por me fazeres tão feliz ao teu lado. Por tudo isso as palavras mais simples
parecem serem agora as melhores: te amo!
Ao meu amigo Marco Gottschalk, que se destaca por ser um grande colega de
laboratório em duplo sentido: físico e de trabalho propriamente dito. Obrigada pela
identificação dos drosofilídeos coletados e pela enorme colaboração na parte ecológica dessa
Tese. Foi um grande privilégio poder contar contigo.
Às alunas de Iniciação científica Grazia Fagundes Audino e Juliana Kreling, obrigada
pelo precioso auxílio em muitos momentos desse trabalho.
A minha colega Lizandra Robe, uma pessoa a quem admiro muito por sua maturidade
profissional e extrema competência científica. Obrigada Liz por me ajudar em algumas das
minhas análises.
Às colegas Marindia Deprá e Juliana Cordeiro, obrigada pelas inúmeras vezes em que
vocês gentilmente me cederam meios de cultura para que eu pudesse repicar meus estoques.
Valeu pela força!
Ao pessoal do laboratório de Drosophila da UFRGS: Adriana, Cláudia, Fabiano,
Grazia, Hermes, Jonas, Juliana, Lizandra, Luis, Marco, Marícia, Maríndia, Monica Ronaldo,
Rosane, Sabrina, pelo convívio de todos os dias.
A Berê e companhia LTDA (Marcelo, Dani, Jane e Helena) obrigada pelo apoio
técnico e também por me permitirem dar tanta risada (as histórias que conheço já dariam outra
Tese!) Obrigada pelo carinho com que sempre me trataram e por serem pessoas tão legais.
Ao Luciano pelo processamento do material fotográfico.
Aos meus pais, Casimiro García Fernández e Sonia Lauer Garcia, a quem agradeço não
só os genes que me deram, mas também o fato de terem buscado com que seus filhos os
expressassem com liberdade e responsabilidade. Também sou grata a grande filosofia de vida
que me ensinaram “o viver sendo para o outro” e o “viver em função dos filhos”. Pai e mãe,
obrigada pelo amor incondicional e por me influenciarem positivamente pelo gosto em estudar
a vida e os mecanismos envolvidos na sua complexidade.
Aos meus irmãos Ricardo, Sofia e Carlos Frederico por torcerem pela minha
felicidade.
À professora Dra. Helga Winge pela atenção com que sempre me recebeu em sua sala
e por disponibilizar a sua residência para as coletas de drosofilídeos.
Aos coordenadores do Parque Gabriel Knijnik, Jardim Botânico e Parque Farroupilha
pela disponibilidade desses locais para estudo.
Aos pesquisadores Margaret Kidwell, Joana Silva, Lee Ehrman, Yong Kyu Kim,
Marlúcia Martins, Carlos Vilela, Hermes Medeiros, Beatriz Goñi, Daniela De Toni, Marco
Gottschalk, Hermes Schmmitz e André Schnorr, por cederem gentilmente algumas das
linhagens utilizadas no presente estudo.
Ao Elmo e a Ellen pela disponibilidade para solucionar problemas e dúvidas.
SUMÁRIO
CAPÍTULO I
INTRODUÇÃO
1. Importância dos cromossomos politênicos em estudos evolutivos...................................1
2. O subgrupo da Drosophila willistoni...............................................................................12
2.1 Aspectos taxonômicos e históricos.......................................................................12
2.2 Importância do estudo das espécies crípticas.......................................................16
2.3 Distribuição geográfica.........................................................................................18
2.4 Identificação das espécies.....................................................................................22
3. A superespécie Drosophila paulistorum..........................................................................24
3.1 Aspectos gerais.....................................................................................................24
3.2 Aspectos cromossômicos.....................................................................................30
3.2.1 Polimorfismo cromossômico dentro das semi-espécies.............................31
3.2.2 Polimorfismo cromossômico entre as semi-espécies.................................35
3.3 Relações evolutivas entre as semi-espécies de D. paulistorum............................36
3.4 Aspectos ecológicos..............................................................................................37
3.5 Populações ecológica e geograficamente marginais............................................39
3.6 Polimorfismo cromossômico em populações marginais......................................41
OBJETIVOS..............................................................................................................................45
CAPÍTULO II
A Photomap of polytene chromosomes and inversion polymorphism in Andean-Brazilian
semispecies of Drosophila paulistorum ………………………………………………....46
CAPÍTULO III
Evolução cromossômica dos autossomos das semi-espécies de Drosophila paulistorum:
elementos B, C e E de Muller………………………………………................................72
CAPÍTULO IV
Chromosomal evolution of sibling species of the Drosophila willistoni group.
I. Chromosomal arm IIR (Muller’s element B) ........................................................……90
CAPÍTULO V
Identification of the sibling species of the Drosophila willistoni subgroup through
electrophoretical mobility of Acid phosphatase-1……………………………………...103
CAPÍTULO VI
Vinte anos de colonização do ambiente urbano de Porto Alegre, Sul do Brasil, pela Drosophila
paulistorum (Diptera, Drosophilidae)………………………………….......120
CAPÍTULO VII
First evidence of Drosophila malerkotliana in the extreme South of Brazil (Porto
Alegre, Rio Grande do Sul, Brazil).................................................................................151
CAPÍTULO VIII
DISCUSSÃO GERAL, CONCLUSÕES E PERSPECTIVAS........................................155
RESUMO e ABSTRACT..................................................................................................162
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.............................................................................168
1
CAPÍTULO I
INTRODUÇÃO
1. Importância dos cromossomos politênicos em estudos evolutivos
Entre as vantagens da escolha da Drosophila como um organismo modelo para estudos
de citogenética e evolução cromossômica destaca-se a presença, nesse díptero, dos chamados
cromossomos politênicos. Esses cromossomos gigantes, como são também chamados, foram
visualizados pela primeira vez em 1881 por E. G. Balbiani que observou que os núcleos de
algumas células secretoras do mosquito Chironomus pareciam estar preenchidos por uma
estrutura distintamente longa, larga e em forma de fita com tumefações e bandas transversas, a
qual ele denominou de “cordas nucleares”. Balbiani (1890) voltou a ver a mesma estrutura em
macronúcleos de uma espécie de protozoário. Embora muitos outros registros tenham sido
feitos acerca destas “cordas nucleares”, o seu reconhecimento como estruturas cromossômicas
aconteceu somente 30 anos após a sua primeira descrição (revisão em Sorsa 1988).
Estudos realizados principalmente a partir da década de 50, propiciaram importantes
achados a respeito dos cromossomos politênicos. Foi verificado, por exemplo, que eles
consistem de um arranjo linear e independente de unidades gênicas, sendo formados em
núcleos interfásicos como produtos de sucessivos ciclos de replicação, sem a conseqüente
2
separação das cromátides filhas (endomitose ou endoploidia). Dessa forma, esses
cromossomos resultam em uma grande estrutura, que apresenta um bandamento natural,
formado pela sinapse precisa dos cromômeros paralelos das cromátides politenizadas. Para
cada espécie de Drosophila, o padrão de bandas ao longo do comprimento dos cromossomos
politênicos é único, sendo possível, também, distinguir cada um dos diferentes cromossomos,
que têm uma seqüência das bandas e de regiões marcadoras típicas. O padrão de distribuição
dessas bandas pode ser comparado às organizações apresentadas pelas etiquetas de “código de
barras”, presentes em produtos comerciais (revisão em Ashburner 1976).
Na espécie Drosophila melanogaster, os cromossomos politênicos são formados após
10 ciclos de replicação, que geram 1024 (=2
10
) filamentos por par cromossômico, por núcleo
diplóide (Swift 1962), oferecendo uma resolução sem igual, quando comparados aos
cromossomos mitóticos da mesma espécie. Isto reflete, claramente, as vantagens que os
cromossomos politênicos representam para o estudo de pequenos detalhes da organização
estrutural do genoma. A abundância de marcas estruturais relevantes e constantes faz desses
cromossomos uma excelente ferramenta para estudos citológicos de evolução.
Painter (1933) foi o primeiro pesquisador a desenvolver uma técnica para a obtenção
de preparados de cromossomos politênicos, a partir da glândula salivar de larvas de D.
melanogaster. Ele demonstrou que as bandas desses cromossomos seguem precisamente a
seqüência de genes mutantes, conhecidos através da técnica tradicional de mapeamento gênico
em Drosophila. A alta qualidade dos preparados cromossômicos do tecido da glândula salivar
larval, obtido mais tarde por Tan (1935) e Koller (1936), permitiu, pela primeira vez, a
identificação de alças de inversões em heterozigotos de D. pseudoobscura, D. persimilis e em
seus híbridos. Quase ao mesmo tempo, Pataü (1935) observou que as espécies crípticas D.
3
melanogaster e D. simulans diferem uma da outra, em seu cariótipo, apenas por um segmento
invertido fixado no braço direito do terceiro cromossomo (3R). Um cromossomo invertido é
gerado por duas quebras cromossômicas e conseqüente rotação de 180° do segmento
envolvido. Dos dois diferentes tipos de inversões, a forma mais encontrada em Drosophila é
aquela que se restringe a um único braço do cromossomo e não inclui o centrômero, sendo
chamada de inversão paracêntrica. O outro tipo de inversão é chamada de pericêntrica e inclui
os dois braços de um mesmo cromossomo, juntamente com o centrômero.
Existem diferenças importantes em relação às conseqüências genéticas dos dois tipos
de inversões, quando permutações ocorrem dentro dos segmentos invertidos, durante a meiose
de indivíduos heterozigotos (Figura 1). A ocorrência de recombinação (crossing over) dentro
da alça de inversão tende a diminuir a freqüência de gametas cromossomicamente normais e
funcionais porque gera produtos meióticos não viáveis, com cromátides dicêntricas e
acêntricas, portadoras de duplicações e deleções (Figura 1A). Hinton e Lucchesi (1960) foram
os primeiros a verificar que em fêmeas de D. melanogaster ocorre um mecanismo bastante
refinado contra a produção de gametas não-balanceados, resultantes de recombinação dentro
da alça de inversão. Esses autores observaram que as divisões meióticas no ovário ocorrem
junto a uma das extremidades do oócito e o fuso é orientado de tal forma que, em fêmeas
heterozigotas, o produto meiótico, eliminado como primeiro corpúsculo polar, é sempre uma
das cromátides balanceadas (com a ordem gênica normal ou invertida). Como segundo
corpúsculo polar, é sempre eliminada a cromátide dicêntrica, formada quando ocorre
recombinação dentro da região invertida. A cromátide que permanece na célula é sempre uma
das cromátides balanceadas (com a ordem gênica inversa à primeira que foi eliminada), e essa
irá formar o núcleo funcional do gameta. O fragmento acêntrico, também formado como
4
Figura 1. Representação esquemática das conseqüências genéticas esperadas após a ocorrência
de um único evento de recombinação dentro de uma alça de inversão paracêntrica (A) e
pericêntrica (B). As letras A a J, representam ordens gênicas.
A
B
5
decorrência do mesmo processo recombinacional, não pode se orientar no fuso e é,
consequentemente, perdido e degradado no citoplasma. O fato desse mecanismo também ter
sido identificado em Sciara impatiens (Carson 1946), que também explora polimorfismos
cromossômicos para inversões paracêntricas, permite supor a sua generalidade em insetos que
exploram esse tipo de polimorfismo.
Em machos de Drosophila, o mecanismo de proteção contra a formação de gametas
não-balanceados, resultantes de um evento de permuta dentro da alça de inversão paracêntrica
em heterozigotos, é explicado pela eliminação ou redução considerável da recombinação
(Stevens 1908, Morgan 1912, 1914), embora ainda não se conheçam as causas deste
fenômeno.
O refinamento desses mecanismos de proteção durante a formação dos gametas reflete
tanto a antigüidade do sistema quanto a adaptabilidade do polimorfismo para inversões
paracêntricas em Drosophila, e também explica porque muitas espécies deste gênero são
naturalmente polimórficas para este tipo rearranjo.
A grande quantidade de polimorfismos de inversões paracêntricas no gênero
Drosophila contrasta com a raridade das inversões pericêntricas. Talvez isso se deva ao fato
de que um único evento de recombinação dentro da região invertida de um heterozigoto, gere
também cromátides duplicadas e deficientes em seu conteúdo gênico (Figura 1B).
Diferentemente do que ocorre com os heterozigotos para inversões paracêntricas, as
cromátides recombinantes não-balanceadas formadas pelas inversões pericêntricas são
monocêntricas e podem atingir núcleos funcionais, já que não ocorre a formação de uma ponte
dicêntrica. Neste caso, se o núcleo portador de um cromossomo recombinado for fertilizado, o
zigoto morre devido ao desequilíbrio do seu conteúdo gênico (Griffiths et al. 1998). Assim, a
6
fecundidade de fêmeas heterozigotas para inversões pericêntricas diminui pela metade e não
está protegida pela eliminação preferencial dos gametas não-balanceados. Provavelmente,
devido a este quadro, o polimorfismo para inversões pericêntricas é pouco explorado em
Drosophila. Entretanto, as inversões pericêntricas descritas por Miller (1939) em D.
algonquin, por Carson e Stalker (1949) em D. robusta, por Freire Maia (1960) para D.
ananassae e por Rohde et al. (2005) para D. willistoni sugerem que mecanismos, ainda não
conhecidos, possam estar envolvidos na desestabilização do pareamento entre os homólogos, o
que evitaria a recombinação dentro da região invertida.
Graças à fidelidade com que as cromátides intimamente pareadas dos cromossomos
politênicos refletem a natureza estrutural do cariótipo de seu portador, e ao fato de que uma
grande quantidade de espécies de Drosophila é naturalmente polimórfica para inversões
paracêntricas, a investigação desse tipo de rearranjo nos cromossomos politênicos é uma
importante ferramenta para a determinação das relações filogenéticas dentro deste gênero
(Sturtevant e Dobzhansky 1936a, b, Wasserman 1963). Assim, a comparação do padrão de
bandas dos cromossomos politênicos entre espécies próximas fornece um registro da sua
história evolutiva, possibilitando a determinação do número e dos tipos de rearranjos
cromossômicos fixados durante a sua divergência, a partir de seu último ancestral comum
(revisões em Ehrman e Powell 1982, Krimbas e Powell 1992).
É amplamente aceito que o cariótipo primitivo (ancestral) de Drosophila consiste de
cinco pares de cromossomos acrocêntricos e um par de cromossomos pontuais, sendo esta
configuração encontrada em muitas espécies não relacionadas de grupos e diferentes
subgêneros (Patterson e Stone 1952, Stone 1955, Clayton e Wheeler 1975, Sperlich e Pfriem
1986). De acordo com esta visão, todos os outros cariótipos que ocorrem em Drosophila são
7
derivados deste complemento ancestral, que sofreu fusões Robertsonianas e/ou translocações
ocasionais. Muller (1940) chamou os cromossomos acrocêntricos do cariótipo ancestral de
Drosophila de “elementos cromossômicos” e nomeou-os pelas letras A, B, C, D, E, F.
A Tabela 1 apresenta a correspondência entre os elementos de Muller e os braços
cromossômicos da espécie D. willistoni e da espécie modelo D. melanogaster.
Tabela 1. Correspondência entre os elementos cromossômicos de Muller
e os braços cromossômicos das espécies.
Elementos de Muller
Espécie A B C D E
D. willistoni X
L
IIR IIL XR III
D. melanogaster X2L2R 3L 3R
A tendência evolutiva predominante tem sido a de uma redução no número
cromossômico. Por conseqüência, as espécies com menor número de cromossomos são
consideradas mais recentes sob o ponto de vista evolutivo, do que aquelas com um número
maior de cromossomos (Sturtevant e Novitski 1941). Embora o número de elementos
cromossômicos tenha se mantido no gênero Drosophila, devido à relativa raridade das
inversões pericêntricas e das translocações, os genes que eles contém podem ser encontrados
em ordens lineares bem diferentes entre as espécies, uma conseqüência do predomínio de
inversões paracêntricas, que se fixaram ao longo da evolução (Dobzhansky 1970), dentro dos
braços cromossômicos.
Sturtevant e Dobzhansky (1936a) foram pioneiros nos estudos dos cromossomos para
inferir relações filogenéticas entre espécies proximamente relacionadas. Pelo método dos
8
autores é possível a construção de árvores filogenéticas, sem indicação temporal, para
qualquer organismo com cromossomos politênicos e com um certo número de inversões no
mesmo braço cromossômico. A análise das tríades de inversões sobrepostas, como é chamado
o método, permite que arranjos perdidos ou hipotéticos sejam inferidos. A validade do método
já foi comprovada no estudo comparativo entre as espécies D. pseudoobscura e D. azteca
(Dobzhansky e Sturtevant 1938, Dobzhansky 1941), quando a análise posterior de indivíduos
coletados na natureza, revelou a presença de inversões previamente sugeridas. A Figura 2
apresenta um esquema que ilustra o princípio do método, através de três cromossomos que se
diferenciaram por meio de sucessivas inversões, as quais se sobrepuseram umas às outras.
Três possibilidades poderiam explicar o caminho evolutivo das seqüências gênicas: I→II→III,
ou III→II→I ou I←II→III. Em função das quebras necessárias para sua formação, seria
impossível que o arranjo I tivesse dado origem diretamente ao arranjo III, sendo necessária a
ocorrência intermediária do arranjo II.
Uma das regras básicas da análise filogenética que utiliza a sobreposição de inversões
paracêntricas, é a que prediz que o caminho evolutivo a ser escolhido deve ser aquele que
pressupõe a ocorrência de um número menor de inversões, ou seja, a rota mais parcimoniosa
(Ruiz e Wasserman 1993). Através desse método, diversos autores têm construído filogenias
para diferentes grupos do gênero Drosophila, incluindo o da fauna havaiana (Carson e
Kaneshiro 1976), e os grupos: virilis (Throckmorton 1982), repleta (Wasserman 1954, 1982,
Wasserman e Wilson 1957, Diniz 1998), saltans (Bicudo 1973), melanogaster (Lemeunier e
Ashburner 1976, 1984), tripunctata (Kastritsis 1966a), guarani (Salzano 1954, Kastritsis
1969a), guaramunu (Brncic 1953), pachea e espécies relacionadas (Ward e Heed 1970, Ward
et al. 1975), bipectinata (Jha e Rahman 1972, 1973), nasuta (Lambert 1978, Baldwin 1982),
9
robusta (Narayanan 1973), cardini (Heed e Russell 1971). Considerando o grupo obscura,
filogenias baseadas na sobreposição de inversões têm sido construídas para o cluster
pseudoobscura (Dobzhansky 1970), para o cluster bifasciata (Yamaguchi 1973) e para o
subgrupo affinis (Miller 1977). Finalmente, Krimbas e Loukas (1984) e Brehm e Krimbas
(1990a) estudaram as espécies do grupo subobscura e Brehm e Krimbas (1990b, 1991) as
espécies do grupo obscura.
Como já comentado, a proposta da singularidade da origem das inversões se constitui
no princípio fundamental para a validade do método de construção de filogenias por meio da
análise de inversões sobrepostas. De acordo com essa proposta, e sob o ponto de vista
tradicional, as inversões são geradas por duas quebras independentes e simultâneas no
Figura 2. Esquema de três diferentes cromossomos (I, II e III) relacionados entre si pela
ocorrência de inversões paracêntricas (representadas pelas linhas cruzadas, que indicam seus
pontos de quebra). As letras A a I, representam ordens gênicas hipotéticas. cent =
centrômero.
10
cromossomo, seguidas pela re-ligação das partes quebradas em orientação invertida (Krimbas
e Powell 1992). As múltiplas inversões sobrepostas, encontradas em muitas espécies de
Drosophila, e que servem de base para a construção de filogenias, teriam ocorrido
seqüencialmente, e não pela ocorrência simultânea de múltiplas quebras. Quanto às inversões
in tandem (inversões lado a lado), a coincidência dos pontos de quebra de mais de uma
inversão, é atribuída ao acaso, devido a eventos que ocorreram em tempos diferentes. Desse
modo, cada inversão teria uma origem única, e inversões idênticas seriam réplicas de um
rearranjo único, surgido no passado, em um determinado indivíduo. Entre as razões que
fundamentam a origem única das inversões salientam-se: a) o fato de que, em condições
naturais, a geração de inversões é um evento raro; b) a probabilidade de que dois de tais
eventos raros ocorram no mesmo braço cromossômico é ainda mais rara e existe a
possibilidade de seleção e eliminação do indivíduo portador do rearranjo mesmo que estes
dois eventos ocorram e, desse modo, não seria estabelecida na população a nova ordem
gênica.
Wasserman (1963) propôs que cada inversão poderia não ter sido causada,
obrigatoriamente, por um evento único, e que quebras e inversões nos mesmos pontos
poderiam ter ocorrido mais de uma vez, em mais de uma população. Entretanto, o autor
argumenta que a probabilidade da ocorrência e sobrevivência da mesma inversão em duas
linhas evolutivas independentes é mínima, de tal forma que se pode assumir que cada inversão
é única e que quaisquer duas espécies que a compartilhem, são mais intimamente relacionadas
entre si, do que a uma terceira espécie na qual falta esta inversão.
Embora a visão clássica indique que as inversões em Drosophila são conseqüência de
duas quebras resultantes de eventos independentes e não recorrentes, evidências vêm sendo
11
produzidas, nas últimas duas décadas, indicando que os elementos transponíveis (TEs) podem
desempenhar um papel ativo na gênese dos polimorfismos para inversões paracêntricas em
populações naturais. Evidências experimentais para a origem das inversões mediadas por TEs
são encontradas em organismos como milho, bactéria e levedura (Berg e Howe 1989). Em
populações de laboratório de Drosophila, muitos TEs têm sido relacionados à geração de
inversões cromossômicas (Lim 1981, Colins e Rubin 1984, Biémont e Aouar 1987). Dois
desses elementos, P e hobo têm sido implicados como causadores de inversões em populações
naturais de D. willistoni e D. melanogaster, respectivamente, devido às suas posições
coincidirem com pontos de quebra de inversões (Kusakabe et al. 1990, Lyttle e Haymer 1992,
Regner et al. 1996). O elemento hobo tem sido encontrado nos pontos de quebra de três
inversões endêmicas em populações naturais de D. melanogaster do Hawai (Lyttle e Haymer
1992). Esse elemento também está envolvido em rearranjos cromossômicos de linhagens de
laboratório da mesma espécie (Lim 1988, Sheen et al. 1993, Ho et al. 1993, Hatzopoulos et al.
1987, Eggleston et al. 1996). O trabalho de Cáceres et al. (1999), entretanto, foi o primeiro a
comprovar o envolvimento de um elemento transponível com a geração de inversões
segregantes em populações naturais de D. buzzatii, ao invés de só apresentar evidências
circunstanciais. Os autores demonstraram que os dois pontos de quebra da inversão 2j
apresentam largas inserções, correspondentes a um novo elemento transponível denominado
Galileo. Cáceres et al. (2001) através de uma análise molecular detalhada continuaram a
estudar as regiões correspondentes aos pontos de quebra da inversão 2j de D. buzzatii,
demonstrando um grau jamais visto de reestruturação do genoma associado com elementos de
transposição. Estas alterações foram verificadas somente nos cromossomos com a inversão 2j.
Os rearranjos encontrados nos cromossomos com esta configuração incluíram 22 inserções de
12
dez TEs, 13 deleções, uma duplicação e uma pequena inversão interna. Os autores sugeriram
que todas estas alterações se acumularam depois da inserção do elemento Galileo, em um
curto espaço de tempo evolutivo. Os resultados deste trabalho reforçam a idéia de que os TEs
estão fortemente relacionados com a plasticidade do genoma, sendo de importância crucial
durante o processo de evolução. Ficou demonstrado, definitivamente, não só o envolvimento
de elementos transponíveis na geração de quebras cromossômicas, como o fato de que
inserções de certos elementos facilitam novas inserções e alterações marcantes na estrutura
cromossômica.
2. O subgrupo da Drosophila willistoni
2.1 Aspectos taxonômicos e históricos
Sob o ponto de vista taxonômico o subgrupo da D. willistoni está composto por seis
espécies crípticas que estão incluídas na seguinte classificação (de acordo com revisão em
Ehrman e Powell 1982):
Subgrupo: willistoni
Grupo: willistoni
Subgênero: Sophophora
Gênero: Drosophila
Família: Drosophilidae
Ordem: Diptera
Classe: Insecta
Phylum: Arthropoda
13
A primeira descrição de uma espécie do subgrupo willistoni ocorreu em 1896. Dentre
uma série de espécies novas coletadas por Samuel Wendell Williston na Ilha de São Vicente,
nas pequenas Antilhas, uma foi denominada de Drosophila pallida. Entretanto, como esse
nome já pertencia a outro drosofilídeo, duas décadas depois, Sturtevant (1916), corrigiu o
nome da nova espécie denominando-a de: Drosophila willistoni. Em 1943, Dobzhansky e
Pavan examinaram indivíduos resultantes de cruzamentos provenientes de descendentes de
isolinhagens (fêmeas fecundadas vindas da natureza) de moscas coletadas no Estado de São
Paulo e concluíram que naquele local ocorriam duas espécies de drosofilídeos muito
semelhantes, sendo que uma delas correspondia à descrição de D. willistoni. Impossibilitados
de compararem seu material com espécimes vivos ou mesmo preservados, a separação das
duas espécies foi feita com base na pequena diferença de tamanho corporal entre elas. Assim,
os autores supuseram que a espécie mais freqüentemente encontrada e correspondente à de
menor tamanho corporal deveria se tratar da D. willistoni. A espécie maior recebeu o nome D.
paulista. Posteriormente, coletas de D. willistoni vindas da Guatemala e do México
permitiram comparações e cruzamentos que esclareceram que D. willistoni era a espécie de
maior tamanho. Desse modo, o nome Drosophila paulista passou a ser sinônimo de D.
willistoni. A outra espécie, a de menor tamanho, somente foi descrita em 1949 e recebeu o
nome de Drosophila paulistorum Dobzhansky e Pavan (Burla et al. 1949).
Dobzhansky e Mayr (1944), através de experimentos de isolamento sexual, com
linhagens de D. willistoni oriundas de diferentes regiões geográficas, verificaram que as
moscas de Tefé (Amazonas - Brasil) apresentavam isolamento praticamente total com as
demais populações. Outros estudos, mais detalhados e de maior duração, confirmaram estes
resultados e mostraram que as moscas de Tefé eram incapazes de produzir híbridos com as das
14
demais localidades. Foram analisadas também, pequenas diferenças morfológicas e
fisiológicas entre elas. Estes achados levaram à descrição de uma terceira espécie críptica do
subgrupo da D. willistoni, a D. equinoxialis Dobzhansky (Dobzhansky 1946).
A quarta espécie críptica do grupo willistoni foi descrita por Burla et al. (1949) Trata-
se da Drosophila tropicalis, coletada originalmente em Palma, Goiás, Brasil. Em 1954,
Towsend verificou que linhagens de D. tropicalis procedentes das Grandes Antilhas geravam
descendentes machos híbridos estéreis quando eram cruzadas com linhagens vindas do
Continente Sul Americano (Belém, Pará, Içana e Amazonas). Resultados referentes a
diferenças na morfologia, citologia e isolamento sexual, além da esterilidade dos machos
híbridos sugeriram que as Grandes Antilhas eram habitadas por uma subespécie diferente da
que ocupa o continente. Essa subespécie recebeu o nome de D. tropicalis cubana Townsend
(Townsend 1954). Resultados de cruzamentos envolvendo linhagens provenientes de Palma
(Goiás), de Tefé (Amazonas), de Trinidad e de Cuba, realizados por Winge (1965), levaram a
proposta de elevação de Drosophila tropicalis cubana para o nível de espécie, devido ao grau
de isolamento reprodutivo e despareamento dos cromossomos híbridos (Winge 1965). Essa
proposta, porém, não foi formalizada por uma descrição detalhada e, assim, a D. tropicalis
cubana é considerada ainda uma subespécie de D. tropicalis.
Dobzhansky (1957), em um estudo sobre a variabilidade cromossômica de D. willistoni
da América Central e das Antilhas, apresentou um mapa da área de distribuição geográfica das
espécies crípticas do subgrupo da D. willistoni conhecidas. Nesse mesmo trabalho, também foi
descrita uma nova espécie críptica do grupo, restrita a algumas das ilhas das Pequenas
Antilhas. Esta nova espécie foi denominada de D. insularis (Dobzhansky 1957).
15
O trabalho de Dobzhansky e Spassky (1959) demonstrou que D. paulistorum, por sua
vez, é na realidade uma superespécie, constituída de pelo menos seis raças ou semi-espécies.
Durante o estudo desse complexo foi verificado que o que era considerado inicialmente “raça
Guiana”, apresentava, além de diferenças citológicas, em comparação com as demais raças,
também isolamento reprodutivo suficiente para ser elevada ao status de espécie.
Conseqüentemente, a última espécie do grupo críptico willistoni descrita recebeu o nome de
D. pavlovskiana Kastritsis e Dobzhansky (Kastritsis e Dobzhansky 1967).
Assim, o subgrupo willistoni é composto por seis espécies crípticas: Drosophila willistoni,
D. paulistorum, D. equinoxialis, D. tropicalis, D. insularis e D. pavlovskiana. Essas espécies
estão incluídas dentro do grupo willistoni de Drosophila que inclui um total de 23 espécies.
Estão listadas abaixo, aquelas de maior interesse para estudos cromossômicos, em ordem
cronológica em que foram descritas (revisão em Ehrman e Powell 1982).
• Drosophila nebulosa Sturtevant 1916.
• Drosophila willistoni Sturtevant 1921.
subespécie willistoni Ayala e Tracey 1973 (localizada a leste dos Andes e demais partes da
distribuição geográfica);
subespécie quechua Ayala e Tracey 1973 (localizada a oeste dos Andes).
• Drosophila fumipennis Duda 1925.
• Drosophila capricorni Dobzhansky e Pavan 1943.
• Drosophila succinea Patterson e Mainland 1944.
• Drosophila equinoxialis Dobzhansky 1946.
16
subespécie equinoxialis Ayala et al. 1974a (encontrada a leste do Panamá e América do
Sul continental).
subespécie caribbensis Ayala et al. 1974a (encontrada no norte da América Central e
Grandes Antilhas).
• Drosophila tropicalis Burla et al. 1949
subespécie tropicalis Townsend 1954;
subespécie cubana Townsend 1954.
• Drosophila paulistorum Dobzhansky e Pavan (Burla et al. 1949).
semi-espécie Andino-Brasileira Dobzhansky e Spassky 1959;
semi-espécie Amazônica Dobzhansky e Spassky 1959;
semi-espécie Centro Americana Dobzhansky e Spassky 1959;
semi-espécie Orinocana Dobzhansky e Spassky 1959;
semi-espécie Transicional Dobzhansky e Spassky 1959;
semi-espécie Interior Pérez-Salas et al. 1970;
• Drosophila insularis Dobzhansky et al. 1957.
• Drosophila pavlovskiana Kastritsis e Dobzhansky 1967.
2.2 Importância do estudo das espécies crípticas
Mayr (1963) define espécies crípticas como “populações naturais morfologicamente
idênticas ou muito semelhantes, mas reprodutivamente isoladas”. Essa é uma das restrições
mais sérias ao conceito morfológico de espécie. Apesar de as espécies crípticas representarem
17
um grande problema para muitos taxonomistas, principalmente para os que apóiam a idéia de
que as espécies devem ser identificadas em material preservado, a distinção dessas espécies
nos estudos evolutivos e ecológicos é vital. Vale lembrar aqui a famosa frase de Dobzhansky
(1970) que afirma que “as espécies são fenômenos da natureza que existem
independentemente da nossa capacidade para distingui-las”. A importância do estudo das
espécies crípticas tem levado aos seguintes questionamentos:
a) como explicar que durante o processo de especiação as espécies crípticas tenham
divergido geneticamente, o que é ilustrado pelo isolamento reprodutivo entre elas (em muitos
casos isolamento completo), mas não fenotipicamente?
b) as diferenças genéticas seriam limitadas a poucos genes, como aqueles envolvidos no
isolamento reprodutivo?
c) a separação das espécies crípticas teria sido um evento recente a ponto de ainda não ter
havido tempo de acumularem-se diferenças suficientes e detectáveis no fenótipo?
d) as espécies crípticas seriam iguais às outras espécies no que se refere ao grau das
diferenças genéticas e ao tempo de existência, com a diferença de apresentarem um fenótipo
capaz de conferir um valor adaptativo cujo prêmio seria a manutenção desse fenótipo?
e) sob o ponto de vista ecológico, se essas espécies são tão parecidas fenotipicamente,
como seriam seus comportamentos em relação ao aproveitamento dos recursos naturais?
f) haveria sobreposição de nichos de alimentação e criação, ou competição?
E é dentro desse contexto que as espécies crípticas do subgrupo da D. willistoni são
consideradas importantes e promissoras para estudos evolutivos. O fato desse subgrupo estar
constituído de espécies, subespécies e semi-espécies, representa uma oportunidade singular
para o estudo da evolução de espécies Neotropicais de Drosophila e, certamente, foram esses
18
motivos que instigaram o ilustre geneticista Theodosius Dobzhansky a estudar essas espécies,
quando de sua estada no Brasil entre as décadas de 1940 e 1950. O interesse despertado por
esse grupo de espécies confunde-se com o início da história da Genética Evolutiva no Brasil,
na primeira metade do século XX. Diversos estudos com variantes genéticas e cromossômicas
do subgrupo willistoni deram suporte para que Dobzhansky desse sua contribuição à Teoria
Sintética da Evolução.
Também no Departamento de Genética da UFRGS, o estudo do subgrupo da D.
willistoni despertou interesse desde a sua fundação em 1949 pelo Dr. Antônio Rodrigues
Cordeiro, ele próprio aluno e colaborador do professor Dobzhansky (Cordeiro e Dobzhansky
1954). Cordeiro e seus seguidores têm contribuído até hoje com importantes estudos com as
espécies do subgrupo da D. willistoni, buscando conhecê-las sob o ponto de vista ecológico,
molecular, comportamental, citogenético e evolutivo.
2.3 Distribuição geográfica
A distribuição geográfica das espécies que compõem o subgrupo da D. willistoni é
essencialmente Neotropical e foi revisada nos trabalhos de Winge (1971), Spassky et al.
(1971), Dobzhansky e Powell (1975), Ehrman e Powell (1982) e Santos e Valente (1990). Os
resultados desses estudos foram reunidos e estão ilustrados no mapa da Figura 3. A espécie D.
willistoni é a de maior distribuição geográfica do grupo e pode ser encontrada desde o sul da
Flórida/EUA e centro norte do México, até o norte da Argentina, em uma grande área
compreendida aproximadamente entre os paralelos 28°N e 37°S. Essa espécie também foi
encontrada nas Bahamas, em toda a América Central, inclusive Grandes e Pequenas Antilhas e
19
na América do Sul, especialmente a leste da cordilheira dos Andes, sendo talvez a espécie
mais comum em toda a região equatorial, na Bolívia, no sul do Brasil, Uruguai e norte da
Argentina.
Drosophila paulistorum tem, assim como as demais espécies crípticas, sua área de
distribuição geográfica incluída na de D. willistoni. É a segunda espécie com maior amplitude
de área geográfica ocupada, estendendo-se desde o norte da Guatemala, na localidade de
Tikal, ao sul do paralelo 18°N, até Porto Alegre no Estado do Rio Grande do Sul/Brasil, ao sul
do paralelo 30°S. Entre esses dois limites, foi coletada na América Central (istmo) e América
do Sul, principalmente a leste dos Andes, sendo muito comum em toda a região equatorial, e
também no Peru e na Bolívia. A oeste da cordilheira foi encontrada apenas na Colômbia e no
Equador. Essa espécie não habita as Antilhas, mas é encontrada na ilha de Trinidad.
A área ocupada por D. equinoxialis estende-se desde as Grandes Antilhas e sul do
México, até quase o centro do Brasil. No México essa espécie foi encontrada em Cuernavaca,
Estado de Morelos, pouco abaixo do paralelo 19°N. Nas grandes Antilhas foi encontrada em
Cuba, Jamaica, Grand Cayman, Haiti e Porto Rico. Não foi coletada nas Pequenas Antilhas.
Além de bem distribuída em toda a América Central, essa espécie é também encontrada na
América do Sul na porção oeste dos Andes, na Colômbia e Equador; tendo sido registrada em
altas freqüências a leste da Cordilheira, como na Venezuela, Guiana, ilhas de Trinidad, Peru e
Brasil, mais precisamente nos Estados do Amazonas, Acre, Roraima, Tocantins, Rondônia,
Pará, Maranhão e Norte de Goiás. O ponto mais ao sul de distribuição da espécie parece ser
um pouco abaixo do paralelo 12°S, no Estado de Tocantins.
O extremo norte de distribuição de D. tropicalis encontra-se em Tikal, Guatemala, ao
sul do paralelo 18°N. Nas Grandes Antilhas foi coletada em Cuba, Jamaica, Grand Cayman,
20
CANADÁ
ESTADOS
UNIDOS
BRASIL
MÉXICO
OCEANO
ATLÂNTICO
BAHAMAS
REPÚBLICA
DOMINICANA
PORTO
RICO
HAITI
CUBA
JAMAICA
BELIZE
GUATEMALA
EL SALVADOR
HONDURAS
NICAR
Á
GUA
COSTA RICA
PANAMÁ
COLÔMBIA
VENEZUELA GUIANA
SURINAME
GUIANA FRANCESA
EQUADOR
PERU
BOLIVÍA
PARAGUAI
ARGENTINA
URUGUAI
CHILE
Figura 3. Mapa das Américas onde estão representadas (linhas e símbolos coloridos) as áreas
de distribuição geográfica de cada uma das seis espécies do subgrupo da D. willistoni, de
acordo com os estudos de Spassky et al. (1971), Winge (1971), Dobzhansky e Powell (1975),
Eh P ll (1982) S t V l t (1990)
Espécies crípticas:
D. willistoni
D paulisto
D.
D. tropicalis
D.
D. insularis
21
Haiti, República Dominicana e Porto Rico. As Pequenas Antilhas não abrigam essa espécie. A
área ocupada também inclui a América Central, centro da América do Sul, e localidades à
oeste dos Andes como a Colômbia e o Equador. A leste dos Andes foi coletada no Peru,
Bolívia e Brasil. A localidade de Santa Cruz de La Sierra (Bolívia) representa o limite sul de
distribuição da espécie, correspondente ao paralelo 18°S. Entretanto, existem registros da
espécie na região amazônica e em muitas localidades do nordeste brasileiro.
Duas das espécies que compõem o subgrupo da D. willistoni são consideradas
endêmicas: a D. insularis e a D. pavlovskiana. A espécie D. insularis é bastante restrita
geograficamente, tendo sido encontrada apenas em quatro das Pequenas Antilhas, onde é
simpátrica com D. willistoni: St. Kitts, Montserrat, Guadalupe e Santa Lucia. A área total de
distribuição da espécie está incluída entre os paralelos 13° e 18°N e entre os meridianos 60° e
63°O. Finalmente, D. pavlovskiana é a que apresenta a menor distribuição geográfica de todas
as crípticas. Até hoje foi encontrada apenas na Guiana e em apenas duas localidades
compreendidas entre os paralelos 7° e 4°N.
A partir dos dados apresentados, é possível confirmar que o subgrupo da D. willistoni
apresenta uma extensa área de distribuição geográfica na região Neotropical. Quatro dessas
espécies (D. willistoni, D. paulistorum, D. equinoxialis e D. tropicalis) são amplamente
distribuídas e apresentam muitas áreas de simpatria, enquanto duas delas (D. insularis e D.
pavlovskiana) são endêmicas. A extrema similaridade morfológica dessas espécies e o fato de
serem abundantes na natureza e muitas vezes simpátricas dificultam enormemente o trabalho
de identificação dos espécimes. Alguns métodos utilizados para a identificação das espécies
crípticas do subgrupo da D. willistoni são comentados no próximo item.
22
2.4 Identificação das espécies
Apesar da existência de um número considerável de trabalhos sobre ecologia de
Drosophila, poucos são os estudos em que as espécies do subgrupo da D. willistoni são
identificados. Esse fato, como já salientado, é facilmente explicado pela extrema semelhança
morfológica e pela extensa área de simpatria (Figura 3). Vários métodos têm sido propostos
para a separação das espécies do subgrupo da D. willistoni. Burla et al. (1949) encontraram
várias diferenças morfológicas mínimas entre as espécies desse subgrupo, envolvendo a
estrutura do palpo maxilar, a posição orbital das cerdas, a coloração do ocelo, a forma da placa
vaginal, do hipândrio e a forma da espermateca das fêmeas. Apesar dessa cuidadosa
investigação os autores concluíram que “a variabilidade entre essas características é grande o
suficiente de modo que a identificação individual das espécies torna-se perigosa”.
Malogolowkin (1952), após um estudo detalhado da genitália dos machos do subgrupo da D.
willistoni, demonstrou que muitas características adicionais poderiam auxiliar no trabalho de
identificação. Spassky (1957) descreveu diferenças pequenas, mas consistentes, entre a
genitália externa dos machos, capazes de permitir uma identificação direta em nível individual
dessas espécies. No caso das fêmeas, embora elas não possam ser distinguidas diretamente,
sua identificação pode ser obtida através da inspeção dos machos de sua progênie. Assim, esse
método de identificação das espécies do subgrupo da D. willistoni é eficaz, mas apresenta a
desvantagem de ser limitado a um dos sexos.
A discriminação sem ambigüidade das espécies do subgrupo da D. willistoni é também
possível através da análise dos arranjos gênicos apresentados pelos cromossomos politênicos
da glândula salivar (Burla et al. 1949, Dobzhansky et al. 1950). Entretanto esse método é
23
muito laborioso para ser utilizado rotineiramente para identificação das espécies e depende da
existência de fêmeas férteis. Vários autores também alertam para outra dificuldade, ou seja, a
obtenção de bons preparados citológicos de algumas dessas espécies, principalmente no caso
da D. paulistorum e da D. equinoxialis (Dobzhansky 1946, Burla et al. 1949, Kastritsis 1967).
Outro problema em aplicar esse método é a ausência de fotomapas cromossômicos para todas
as espécies do subgrupo da D. willistoni. Alguns trabalhos desenvolvidos por nosso grupo de
pesquisa no Laboratório de Drosophila da UFRGS, vêm suprindo essas dificuldades. Esse é o
caso dos trabalhos de Rohde (2000), que elaborou um novo fotomapa para D. willistoni, e de
Garcia (2002), que elaborou um fotomapa comparativo entre a D. willistoni e a D.
paulistorum.
Testes de intercruzamento, envolvendo as espécies do subgrupo da D. willistoni, é
outra ferramenta que pode ser utilizada na identificação dessas espécies (Cordeiro e Winge
1995). Entretanto, o método está limitado à obtenção de fêmeas férteis. Do mesmo modo, o
padrão do som produzido pelas asas dos machos durante a corte sexual, também pode ser
utilizado no reconhecimento das espécies crípticas (Ritchie e Gleason 1995). Entretanto, o
tempo despendido na aplicação dessas metodologias, dificulta o seu uso na identificação de
espécies em trabalhos de coleta na região Neotropical quando, em geral, um grande número de
espécimes pertence ao subgrupo willistoni.
Muitos esforços também têm sido feitos na tentativa de encontrar um marcador
genético, em especial uma enzima, cujo padrão de mobilidade eletroforética pudesse ser
diagnóstico para as espécies do subgrupo da D. willistoni. Ayala e seus colaboradores
estudaram por muitos anos o padrão de variação geográfica de um grande número de
populações em gel de eletroforese nesse subgrupo de moscas (Ayala et al. 1970, Ayala et al.
24
1971, Ayala et al. 1972a, b, Ayala e Powell 1972a, b, Ayala e Tracey 1973, Ayala e Tracey
1974, Ayala et al. 1974a, b, c, Ayala 1975). Entretanto, entre 36 loci investigados, nenhum foi
conclusivo para a identificação das espécies. Valiati (1999), entretanto, observou que a enzima
Fosfatase ácida-1 (Acph-1) apresentava alelos diagnósticos para as espécies D. willistoni e D.
paulistorum coletadas na cidade de Porto Alegre, sul do Brasil.
3. A superespécie Drosophila paulistorum
3.1 Aspectos gerais
até o sul do Brasil levaram Dobzhansky e Spassky (1959) a concluir que esta não é uma
espécie unificada, mas um complexo de raças geográficas ou de espécies in statu nascendi que
juntas formam a superespécie D. paulistorum. O conceito de superespécie é apresentado por
Mayr (1963, 1969) e Amadon (1967) como “um grupo monofilético de espécies intimamente
relacionadas e em grande parte ou inteiramente alopátricas” ou como “um grupo de táxons
inteira ou essencialmente alopátricos que foram outrora raças de uma única espécie, mas que
Sob o ponto de vista genético e evolutivo, D.
paulistorum (Figura 4) é talvez a espécie mais
complexa e ao mesmo tempo uma das mais
interessantes do gênero Drosophila. Entre os anos de
1956 e 1958, resultados de cruzamentos entre
linhagens de moscas provenientes desde a Guatemala
Figura 4. Fêmea de
D. paulistorum
25
agora atingiram o status de espécies”. De acordo com Amadon (1967), as formas que
compõem uma superespécie devem ser denominadas “semi-espécies” quando parecem ser
subespécies, mas se aproximam ou talvez já tenham atingido o estado de espécie. Mayr
(1963), também define semi-espécies como “populações que completaram parcialmente o
processo de especiação. As trocas gênicas ainda são possíveis entre as semi-espécies, mas não
tão livremente quanto entre populações co-específicas”. Atualmente, seis semi-espécies
formam a superespécie D. paulistorum: Andino-Brasileira, Amazônica, Centro-Americana,
Orinocana, Transicional (Dobzhansky e Spassky 1959) e Interior (Pérez-Salas et al. 1970).
A distribuição geográfica das semi-espécies de D. paulistorum é apresentada na Figura
5, baseada nos mapas apresentados por Dobzhansky e Pavlovsky (1967), Dobzhansky et al.
(1969), Pasteur (1970) e Santos e Valente (1990). Cada unidade da superespécie possui uma
área geográfica própria, havendo, no entanto, ampla superposição de áreas na América do Sul,
especificamente nas proximidades da linha do Equador. A semi-espécie Centro-Americana
ocupa uma área que se estende desde a Guatemala até o Panamá. A Amazônica é encontrada
no Panamá, na Colômbia, na Guiana e na região norte do Brasil ao longo do Rio Amazonas. A
Orinocana foi coletada no Panamá, na Colômbia, na Venezuela e nas Guianas. A Andino-
Brasileira, cuja distribuição é a mais ampla entre as semi-espécies, foi encontrada desde a
Colômbia, Trinidad e Guianas, até a cidade de Porto Alegre/Rio Grande do Sul, Brasil. A
semi-espécie Interior foi citada habitando as matas superúmidas do sul da Colômbia, na região
que inclui a fronteira com o Brasil. A Transicional é encontrada em uma área em forma de lua
crescente que se estende ao longo do litoral Pacífico da Colômbia até o Maciço de Santa Marta
e daí até a cordilheira litorânea da Venezuela.
Conforme visto no mapa da Figura 5, cada semi-espécie ocupa a sua própria área
26
geográfica, mas em algumas localidades ocorre a simpatria de duas ou mais semi-espécies.
Sobre a atual distribuição das semi-espécies de D. paulistorum vale comentar os trabalhos de
Haffer (1967,1969) e Vuilleumier (1965) que forneceram uma explicação histórica para os
padrões de distribuição geográfica de alguns grupos de pássaros intimamente relacionados na
América tropical. Alguns desses padrões, como o apresentado pelo grupo da espécie Crax
rubra, parece ser similar ao que teria ocorrido com D. paulistorum. Os registros dos autores
demonstram que durante os vários períodos climáticos de seca ocorridos no Pleistoceno e pós-
Pleistoceno, a floresta Amazônica foi dividida em pequenas florestas que foram separadas
uma das outras por áreas de vegetação aberta ou com ausência de vegetação. Essas áreas
alternadas de vegetação abundante formaram refúgios para organismos dependentes das áreas
de ambientes úmidos da floresta tropical. O resultado foi uma rápida diferenciação da fauna da
floresta Amazônica em um tempo geológico muito recente. Dentro deste contexto, D.
paulistorum seria um organismo cuja ramificação em semi-espécies pode estar relacionada
com as áreas de refúgio propostas.
Cruzamentos entre as semi-espécies ocorrem com dificuldade devido ao isolamento
etológico que existe. Mesmo quando as fêmeas não têm escolha, se confinadas com machos de
uma semi-espécie diferente, elas permanecem virgens na sua maior parte até que morram,
apesar de os machos continuarem a cortejá-las diligentemente. Todavia, as poucas fêmeas que
são inseminadas produzem descendência híbrida constituída de fêmeas férteis e machos
estéreis (revisão em Dobzhansky 1970). Assim, as semi-espécies são isoladas por esterilidade
do macho híbrido e por isolamento sexual que é acentuado em áreas de simpatria.
Ehrman (1965) calculou os coeficientes de isolamento etológicos para linhagens
simpátricas de diferentes semi-espécies, e comparou os resultados obtidos com os de
27
CANADÁ
ESTADOS
UNIDOS
BRASIL
MÉXICO
OCEANO
ATLÂNTICO
BAHAMAS
REPÚBLICA
DOMINICANA
PORTO
RICO
HAITI
CUBA
JAMAICA
BELIZE
GUATEMALA
EL SALVADOR
HONDURAS
NICAR
Á
GUA
COSTA RICA
PANAMÁ
COLÔMBIA
VENEZUELA GUIANA
SURINAME
GUIANA FRANCESA
EQUADOR
PERU
BOLIVÍA
PARAGUAI
ARGENTINA
URUGUAI
CHILE
Figura 5. Mapa das Américas onde está representada (linha tracejada azul) a distribuição
geográfica da superespécie D. paulistorum. Cada um dos símbolos coloridos representa locais
onde foram encontradas cada uma da seis diferentes semi-espécies de D. paulistorum, de
acordo com os estudos de Spassky et al. (1971), Winge (1971), Dobzhansky e Powell (1975),
Semi-espécies:
AMAZÔNICA
ANDINO-BRASILEIRA
CENTRO-
INTERIOR
ORINOCANA
TRANSICIONAL
28
cruzamentos entre linhagens das mesmas semi-espécies, mas alopátricas quanto à origem. Um
coeficiente com valor zero (0) indicou a ausência de isolamento e o valor um (1) indicou
isolamento completo. O valor médio do coeficiente de isolamento para linhagens simpátricas
foi 0,85 contrastando com o obtido entre linhagens alopátricas das mesmas semi-espécies que
foi de 0,67. Deste modo, pares de semi-espécies que ocorrem em simpatria exibem maior
isolamento sexual que o apresentado por esses mesmos pares quando ocorrem em alopatria, ou
seja, semi-espécies que coexistem geograficamente tendem a ser mais isoladas
reprodutivamente que aquelas que vivem em alopatria.
Diferentes experimentos em mais de 30 anos têm sido conduzidos pela Dra. Lee
Ehrman para desvendar a problemática da esterilidade do macho híbrido em cruzamentos
envolvendo as semi-espécies de D. paulistorum. Esses estudos têm documentado o papel de
uma bactéria simbionte como agente causal dessa esterilidade (revisão em Ehrman et al.
1987). Cada uma das semi-espécies é infectada com uma linhagem de bactéria deficiente de
parede celular forma L, provavelmente Streptococcus faecalis. Em seus hospedeiros nativos a
bactéria é benigna e transmitida citoplasmaticamente através do ovo. Entretanto quando a
bactéria se desenvolve no testículo de híbridos entre as semi-espécies, ela cresce fora de
controle e acaba destruindo o tecido. A evidência para o envolvimento direto da bactéria veio
de um grande número de pesquisas. Primeiro foi verificado que o tratamento com antibióticos
poderia diminuir a presença de machos F1 estéreis (Kernaghan e Erhman 1970). Foi provado
que a bactéria S. faecalis era necessária para a sobrevivência das moscas, uma vez que
linhagens livres de bactéria morriam e tratamentos prolongados com antibióticos levavam à
extinção da linhagem. Já Williamson et al. (1971) tomaram o homogenado de uma semi-
espécie e o injetaram dentro de fêmeas de uma segunda semi-espécie. O resultado foi a
29
indução de esterilidade nos filhos resultantes do cruzamento com machos da própria semi-
espécie. Finalmente, quando culturas isoladas de uma semi-espécie estranha são injetadas nas
fêmeas, a esterilidade do macho híbrido é induzida (Ehrman et al 1987).
De acordo com Dobzhansky et al. (1969), a semi-espécie Transicional seria a
remanescente da população ancestral que originou o complexo da D. paulistorum. Isso se deve
ao fato de que algumas linhagens desta semi-espécie são capazes de produzir machos híbridos
férteis com as semi-espécies Centro-Americana e Andino-Brasileira. Segundo os autores, a
semi-espécie Transicional é mais proximamente relacionada com a Centro-Americana e, em
alguns casos, o cruzamento dessas duas semi-espécies produz machos híbridos férteis.
Embora os testes de cruzamentos tenham classificado a D. paulistorum como um
conjunto de seis semi-espécies (Dobzhansky e Spassky 1959, Pérez-Salas et al. 1970) alguns
evolucionistas têm argumentado que a complexidade das espécies incipientes poderia ser mais
facilmente tratável se cada uma das semi-espécies fosse considerada como uma espécie
críptica independente. Um dos argumentos contra essa idéia têm sido o fato de que haveria um
“potencial canalizador de fluxo gênico” entre as semi-espécies através da Transicional.
Entretanto, os dados cromossômicos (Kastritsis 1967) têm mostrado que a maioria das
linhagens consideradas anteriormente como Transicional devem, atualmente, ser consideradas
como Andino-Brasileira. Isto está de acordo com os dados genéticos publicados por
Malogolowkin (1963) que sugerem que a semi-espécie Transicional seria um apêndice da
Andino-Brasileira. Após um trabalho de reavaliação feito por Dobzhansky et al. (1969), a
única linhagem que continuou fazendo parte da semi-espécie Transicional foi àquela
procedente de Santa Marta, Colômbia (referida como linhagem Santa Marta 1). No entanto, os
dados citológicos de Kastritsis (1967) classificam “Santa Marta 1”como Centro-Americana. O
30
“novo complexo Transicional”, como definido por Dobzhansky et al. (1969) pode ser
entendido como sendo “uma população complexa, muito heterogênea para ser classificada
como uma semi-espécie unificada”. Os dados citológicos e outras informações genéticas da
época não permitiram conclusões definitivas a respeito do status taxonômico da “nova
Transicional”. Kastritsis (1967) e Dobzhansky e Powell (1975) alertam sobre a necessidade de
um estudo mais completo a fim de obter conclusões mais definitivas.
3.2 Aspectos cromossômicos
O cariótipo da D. paulistorum, assim como o das outras espécies do subgrupo da D.
willistoni, é constituído por dois pares de cromossomos metacêntricos (o par sexual e o
segundo cromossomo) e um par acrocêntrico (terceiro cromossomo) (Metz 1916, Sturtevant e
Novitski 1941, Dobzhansky 1950, Patterson e Stone 1952). A nomenclatura dos cromossomos
politênicos correspondentes foi definida pelo mapa de Dobzhansky (1950) como XL e XR
(braço esquerdo e direito do cromossomo X), IIL e IIR (braço esquerdo e direito do segundo
cromossomo) e III (o cromossomo acrocêntrico).
O primeiro estudo citológico com os cromossomos politênicos de D. paulistorum foi
realizado por Burla et al. (1949). Os autores, que na época desconheciam que D. paulistorum
era na verdade uma superespécie, realizaram um estudo comparativo entre as espécies do
subgrupo da D. willistoni conhecidas até então: D. willistoni, D. paulistorum, D. equinoxialis e
D. tropicalis. Algumas diferenças nos cromossomos politênicos dessas espécies foram
verificadas e apontadas como capazes de diferenciá-las. Dobzhansky e Pavlovsky (1962)
31
também realizaram estudos citológicos, comparando o polimorfismo cromossômico existente
entre as semi-espécies de D. paulistorum. Entretanto, somente após a confecção do mapa
citológico de Kastritsis (1966b), que serviria como padrão para D. paulistorum, é que estudos
mais detalhados e precisos puderam ser feitos. Para a confecção do mapa citológico foi
escolhida uma linhagem proveniente de Palmira, Colômbia, inicialmente considerada como
pertencente à raça Transicional, porém mais tarde reclassificada como Andino-Brasileira
(Dobzhansky et al. 1969). O conjunto dos cromossomos politênicos do mapa foi
arbitrariamente dividido em 100 seções, distribuídas de 1 a 21 no cromossomo XL, de 22 a 40
no XR, de 41 a 60 no IIL, de 61 a 80 no IIR e de 81 a 100 no III cromossomo. O mapa de
Kastritsis (1966b) é ilustrado na Figura 6.
3.2.1 Polimorfismo cromossômico dentro das semi-espécies
Kastritsis (1967) observou que o polimorfismo cromossômico dentro das diferentes
semi-espécies é bastante elevado, com a presença de 15 a 22 inversões cromossômicas
paracêntricas. Para todas as semi-espécies o cromossomo III foi o mais polimórfico. O autor
também observou a existência de um compartilhamento bastante elevado do polimorfismo
cromossômico entre as diferentes semi-espécies e descreveu três hipóteses para explicar esta
situação. A primeira delas supõe a existência de fluxo gênico entre as semi-espécies através da
raça Transicional, uma vez que essa semi-espécie é capaz de produzir híbridos férteis com
mais de uma semi-espécie. Essa hipótese é considerada pouco provável pelas evidências
acumuladas por cruzamentos entre híbridos, que indicam que as linhagens simpátricas de
32
diferentes semi-espécies apresentam sempre um isolamento reprodutivo maior do que aquele
demonstrado por linhagens alopátricas das mesmas semi-espécies. Esses fatos sugerem,
fortemente, que o polimorfismo compartilhado não é de origem secundária, ou seja, formado
por uma hibridação entre semi-espécies. Winge (1971), fazendo um re-exame dos dados até
então existentes, sugeriu que a justificativa anterior não pode ser considerada forte o suficiente
para que a hipótese de fluxo gênico através da Transicional seja rejeitada. A segunda idéia
para explicar o compartilhamento de polimorfismos cromossômicos entre as semi-espécies é a
de que elas teriam se originado de populações relativamente grandes que teriam passado por
um processo de retração. Este processo teria levado ao surgimento de "bolsões" ou refúgios
isolados, como já comentado, formados a partir da espécie original. Com o tempo, este
isolamento teria propiciado um acúmulo de diferenças genéticas, desencadeando a esterilidade
do híbrido quando estas populações novamente se expandiram e voltaram a ser simpátricas.
Essas populações não teriam passado por um estágio de acentuada homozigose, mas teriam
conservado muito da heterozigose da população original. Não há evidências que contrariem ou
favoreçam esta explicação. A terceira hipótese, sugerida por Kastritsis (1967), está baseada na
idéia de que algumas das inversões heteróticas da população ancestral teriam sido mantidas
nas populações marginais, mesmo durante o processo de especiação e, atualmente, estariam
passando por um processo de mudança gradual, sendo substituídas por novas combinações
mais bem sucedidas surgidas com o avançar do processo de especiação. Os dados citológicos
corroboram esta última proposta, pois a análise da D. pavlovskiana mostra muito menos
inversões em comum com as remanescentes semi-espécies de D. paulistorum.
33
Figura 6. Mapa de referência dos cromossomos politênicos de Drosophila paulistorum, segundo Kastritsis (1966b).
XL
XR
IIL
IIR
III
34
Estudos mais recentes, tratando do polimorfismo cromossômico da semi-espécie
Andino-Brasileira, de D. paulistorum têm sido feitos no Laboratório de Drosophila da
UFRGS. Santos e Valente (1990), trabalharam com populações urbanas da área de Porto
Alegre e verificaram a ocorrência de 18 inversões cromossômicas segregantes. Dessas
inversões, quatro ocorreram no braço XL, duas no XR, cinco no IIL, duas no IIR e cinco
no III. Valiati e Valente (1997), anos mais tarde, estudando populações de D. paulistorum
do mesmo local, encontraram 23 inversões diferentes. O braço cromossômico mais
polimórfico foi o XR, com seis arranjos, seguido pelo IIL com cinco e pelos braços XL,
IIR e III cada um com quatro inversões. Das 23 inversões descritas, 14 não
corresponderam a nenhuma daquelas previamente descritas por Kastritsis (1966b, 1967 e
1969b). Das inversões encontradas por Valiati e Valente (1997), apenas seis foram
reconhecidas como similares às já descritas por Santos e Valente (1990). No entanto, os
autores expressam a dificuldade de comparar as inversões observadas por eles com aquelas
registradas por outros autores, em trabalhos prévios. Isto demonstra a falta de
sistematização do estudo das inversões cromossômicas de D. paulistorum, que dificulta a
conclusão sobre o número exato de inversões presente na espécie.
Da mesma forma, faz-se necessária a caracterização dos arranjos cromossômicos
presentes nas diferentes semi-espécies de D paulistorum. Este panorama representa um
convite para que novos estudos sejam feitos com D. paulistorum no sentido de uniformizar
a descrição do polimorfismo e facilitar a comparação de seu complemento cromossômico
com os das outras espécies do subgrupo da D. willistoni.
35
3.2.2 Polimorfismo cromossômico entre as semi-espécies
A partir da análise do polimorfismo cromossômico de larvas híbridas, resultantes
do cruzamento entre a linhagem padrão, procedente de Palmira/Colômbia, e linhagens das
diferentes semi-espécies (Kastritsis 1966b, 1969b) e, a partir do polimorfismo observado
dentro de diferentes populações das semi-espécies (Kastritsis 1967) foram contabilizados
85 arranjos cromossômicos em D. paulistorum. Com base nesses resultados, Kastritsis
(1969b) classificou D. paulistorum como a espécie mais polimórfica do gênero
Drosophila. Os resultados obtidos no estudo do polimorfismo cromossômico levaram
Kastritsis (1969b) a propor também que a evolução cromossômica de D. paulistorum foi
até aqui conduzida pelo cromossomo X e II, nos quais são encontrados arranjos fixados,
enquanto que o cromossomo III, que hoje apresenta polimorfismo muito elevado, deveria
estar passando por diversificação semi-específica. Das 85 inversões descritas, 55 ocorrem
no III cromossomo. Como a maioria das 55 inversões é rara, é possível que tenham origem
muito recente. Conforme sugerido por Kastritsis (1969b), algumas das inversões fixadas
nos outros cromossomos tornaram-se características de certas semi-espécies. Contudo, não
é possível utilizar, com absoluta certeza, os arranjos cromossômicos para identificação
taxonômica das semi-espécies porque algumas linhagens que apresentam características
cromossômicas de uma semi-espécie deveriam ser classificadas como outra, face aos
resultados dos testes de cruzamento. Esse quadro indica a necessidade de novas e
detalhadas investigações do complemento cromossômico de todas as semi-espécies de D.
paulistorum, que desde 1969 não foram mais investigadas dentro desse contexto.
36
A carência de uma identificação citológica precisa das semi-espécies de D.
paulistorum é somada à dificuldade de identificação a partir dos traços morfológicos.
Pasteur (1970) realizou um estudo biométrico comparativo entre as semi-espécies. O autor
verificou que existem diferenças no tamanho da asa e da tíbia, no comprimento do raio
obtido da asa até a tíbia, dimorfismo sexual no tamanho da asa, número de dentes do
fórcipes dos machos e tempo de desenvolvimento. No entanto, nenhuma dessas diferenças
pode ser considerada diagnóstica. Atualmente, a única maneira de diagnosticar as semi-
espécies de D. paulistorum é através da realização de cruzamentos envolvendo todas as
semi-espécies com linhagens já identificadas, com análise posterior da fertilidade da prole
(Dobzhansky e Spassky 1959).
3.3 Relações evolutivas entre as semi-espécies de D. paulistorum
O primeiro estudo das relações evolutivas das espécies do subgrupo da D.
willistoni, incluindo as semi-espécies de D. paulistorum, foi realizado por Spassky et al.
1971 (Figura 7A). Os autores apresentaram um diagrama das relações entre as espécies
baseado em dados de biogeografia, capacidade de produção de híbridos, homologia de
inversões cromossômicas e evidências bioquímicas.
Mais recentemente, Gleason et al. (1998) analisaram nessas espécies,
dois genes nucleares, period (per) (Figura 7B) e Álcool desidrogenase (Adh), e
um gene mitocondrial, a Citocromo oxidase I (COI). A análise combinada desses
três genes sugere que D. paulistorum e D. equinoxialis são as espécies mais
relacionadas (Figura 7B), o que já havia sido indicado pelos trabalhos de Winge
(1971) a partir de testes de isolamento sexual, de medidas de pareamento
37
cromossômico e comparações morfológicas. Outro ponto em comum desses
estudos é que D. insularis é, provavelmente, a espécie mais distante das demais, sendo
muito possível que tenha se separado do tronco ancestral antes das outras espécies se
formarem. Por fim, o trabalho de Gleason et al. (1998) apresenta conflitos entre o conceito
biológico e filogenético de espécie, uma vez que os dados moleculares obtidos colocam D.
pavlovskiana como um único táxon junto com D. paulistorum.
3.4 Aspectos ecológicos
Apesar do número crescente de trabalhos ecológicos com populações de
drosofilídeos na região Neotropical, poucos são aqueles em que as espécies do subgrupo da
A
B
Figura 7. Filogenias previamente publicadas utilizando espécies do subgrupo da D. willistoni (A)
Relações derivadas de um amplo agrupamento hierárquico baseado em dados biogeográficos,
capacidade de produção de híbridos, cromossomos e evidências bioquímicas (redesenhada de
Spassky et al. 1971). (B) Árvore de máxima parcimômia baseada em dados da seqüência completa
de nucleotídeos do gene period. Os valores de bootstrap estão mostrados nas elipses. Os números
de mudanças de nucleotídeos ao longo de cada ramo estão também indicados. As letras indicam as
diferentes semi-espécies de D. paulistorum estudadas A= Amazônica, AB= Andino-Brasileira, O=
Orinocana, C= Centro-Americana, I= Interior e T= Transicional. (Árvore obtida do trabalho de
Gleason et al. 1998
)
.
38
D. willistoni são distinguidas, o que pode ser entendido facilmente pela semelhança
morfológica das espécies e pelo fato de muitas delas serem simpátricas.
Das espécies do subgrupo da D. willistoni a mais versátil ecologicamente é a D.
willistoni. Essa espécie é encontrada em uma ampla gama de ambientes, desde a floresta
tropical superúmida até as regiões quase desérticas da caatinga no Nordeste do Brasil. A
ampla distribuição geográfica dessa espécie com certeza se deve a essa versatilidade.
Drosophila paulistorum, por outro lado, apresenta capacidade de adaptação bem menor.
Essas duas espécies são as mais freqüentes na América do Sul, sendo que D. willistoni é
predominante em relação às demais nas savanas e matas de galeria de Goiás, Maranhão e
Território de Roraima, nas caatingas (onde as demais não são encontradas), nas épocas
frias na Mata Atlântica do litoral paulista e, de maneira geral, na floresta equatorial quando
esta é entremeada de savanas. Drosophila paulistorum apresenta dominância nas regiões
superúmidas e quentes do Panamá, na floresta tropical em torno de Belém, junto ao rio
Mucajaí, no Território de Roraima, e em algumas localidades em torno do rio Branco e do
rio Negro. É também a espécie mais freqüente durante os meses quentes, na Mata Atlântica
do litoral de São Paulo (revisão em Winge 1971). Drosophila willistoni e D. paulistorum
também apresentam diferenças quanto as suas preferências alimentares. Experimentos com
iscas fermentadas por diferentes linhagens de levedo, mostraram que as duas espécies são
atraídas diferencialmente pelas mesmas (Dobzhansky e Da Cunha 1955). Diferenças na
preferência alimentar entre as duas espécies também foram verificadas nas populações
urbanas de Porto Alegre, onde vivem em simpatria. Drosophila willistoni apresenta
preferência por frutos nativos e D. paulistorum por frutos exóticos (Santos e Valente 1990,
Valiati e Valente 1996).
39
3.5 Populações ecológica e geograficamente marginais
Até o estudo de Spassky et al. (1971), o limite mais ao sul da distribuição
geográfica de D. paulistorum era o município de Osório (29°54´ S; 51°16´ W), localizado
no Nordeste do Estado do Rio Grande do Sul, Brasil. Em maio de 1985 essa espécie foi
encontrada pela primeira vez no ambiente urbano da cidade de Porto Alegre (30°02´ S;
51°14´W), distante 90 km ao sul da cidade de Osório (Santos e Valente 1990). O registro
de D. paulistorum em Porto Alegre foi uma novidade, uma vez que a espécie era
considerada como ausente em ambientes perturbados pelo homem conforme as próprias
palavras de Dobzhansky (1965):
“(...) uma questão deve ser assumida, embora ainda não respondida em termos de
finalidade, se as notáveis diferenças na arquitetura genética entre D. willistoni e D.
paulistorum estariam relacionadas ao fato de que D. willistoni, mas não D. paulistorum,
evidencia algumas tendências de se tornar uma espécie com potencial colonizador”.
Assim, a ocorrência de D. paulistorum no sítio urbano de Porto Alegre sugeriu seu
potencial de colonização de novos ambientes e abriu amplas possibilidades de estudos
evolutivos com essas populações. Embora a definição de espécie colonizadora possa ser
considerada arbitrária devido ao fato de que toda espécie ocupa um território, de acordo
com Mayr (1963), esse termo tem sido usado para designar as espécies que invadem
ambientes alterados, geralmente devido à ação antrópica. Entre os anos de 1991 e 1992,
Valiati e Valente (1996) realizaram um amplo estudo ecológico na cidade de Porto Alegre
e verificaram que a freqüência da semi-espécie Andino-Brasileira havia aumentado desde
seu primeiro registro nesse tipo de ambiente (em Porto Alegre essa é a única das semi-
espécies encontrada). O cenário representado pela cidade de Porto Alegre para o estudo do
40
potencial evolutivo e colonizador de D. paulistorum é único, no momento em que essa
cidade corresponde a um ambiente geográfico e ecologicamente marginal para a espécie.
De acordo com Mayr (1963), as populações podem ser ecológica e geograficamente
marginais, ou ecologicamente marginais e geograficamente centrais. Populações marginais
diferem de outras por viverem em limites ecológicos da espécie. A urbanização é, sem
dúvida, um dos limites ecológicos para D. paulistorum na cidade de Porto Alegre. Apesar
disso, essa espécie já foi encontrada nessa cidade em três níveis distintos de urbanização,
definidos de acordo com os critérios de Ruszczyk (1984, 1986) como alto, médio e baixo
(Santos e Valente 1990, Valiati e Valente 1996). A colonização de um ambiente
urbanizado faz com que organismos que habitavam ambientes naturais sejam expostos a
novos fatores ecológicos, tanto abióticos como bióticos. Entre esses fatores está a poluição,
resultante da presença da atividade comercial e industrial do homem, que altera
significativamente o ambiente e causa grande impacto na qualidade do ar, da água e dos
recursos naturais (Marcus e Detwyler 1972), além de afetar a composição dos organismos
(Lucchese et al. 2002). Assim, a partir das alterações ambientais que são resultantes da
ação do homem, durante os processos de urbanização, são criados novos ecossistemas.
Outra conseqüência importante da urbanização é a eliminação potencial de espécies nativas
pela introdução de espécies exóticas. Sob esse aspecto, o estudo sistemático da fauna de
drosofilídeos de Porto Alegre também permitiu a detecção da colonização recente do
ambiente pela Zaprionus indianus (Castro e Valente 2001) no ano 2000. A chegada deste
drosofílídeo invasor nas nossas latitudes parece estar promovendo ajustes nas estratégias
de sobrevivência das espécies residentes, como demonstrado recentemente (Silva et al.
2005 a, b).
41
3.6 Polimorfismo cromossômico em populações marginais
O modelo central-marginal da biologia evolutiva (revisão em Brussard 1984),
prediz que populações próximas ao centro de distribuição da espécie são contíguas, estão
em alta densidade e apresentam altos níveis de variação genética e fenotípica, enquanto
que populações isoladas, localizadas além das margens da distribuição, são esparsas e
cromossomicamente monomórficas (Mayr 1963, Lewontin e Hubby 1966). Nas margens
da distribuição geográfica, onde as condições são extremamente adversas à espécie,
somente poucos indivíduos, compondo populações isoladas, conseguem se adaptar. Assim,
a colonização se dá por um pequeno número de indivíduos e, em alguns casos, apenas por
uma única fêmea fecundada, que obviamente contém somente uma pequena fração da
variabilidade genética apresentada pelas populações centrais. É nessa idéia que se
fundamenta o “princípio do fundador”.
De acordo com Carson (1958), as condições menos favoráveis existentes nas
regiões ecológicas marginais da espécie, tenderiam a reduzir o tamanho da população e
aumentar o coeficiente de endocruzamento. Por outro lado, como populações pequenas
dificilmente podem suportar a contínua produção de heterozigotos menos adaptados e
resultantes da segregação de polimorfismos balanceados, essa situação também contribui
para a seleção positiva a favor dos homozigotos bem adaptados (“homoseleção”, segundo
Carson). De acordo com Carson (1959) as inversões estariam relacionadas a diferentes
componentes ambientais, que conferem um “vigor híbrido” quando no estado heterozigoto.
Um alto número de heterozigotos estruturais seria favorecido no centro da distribuição da
espécie porque o efeito heterótico resultaria em melhor desempenho em meio à variedade
de nichos disponíveis, e populações centrais poderiam produzir menos homozigotos
42
porque teriam maior tamanho populacional e maior possibilidade de cruzamento. Por outro
lado, nas populações marginais isoladas, pequenas e endocruzadas, a adaptação do
heterozigoto seria perdida. A seleção favoreceria os homozigotos, retendo adaptações
baseadas em características específicas e geneticamente fixadas. Essa situação forneceria a
explicação para o decréscimo do polimorfismo cromossômico detectado no extremo da
distribuição em espécies que apresentam amplo polimorfismo, como ocorre com a D.
willistoni (Rohde 2000).
Vários autores, entre os quais Mayr (1963) e Brncic (1970), consideram que a
menor variabilidade genética das populações isoladas nas margens da distribuição, quando
comparadas com as populações centrais, é devida à menor variabilidade ecológica que
somente poderia ser explorada por poucos genótipos da espécie, e não pela ação da
homoseleção que favorece os homocariótipos, permitindo maior liberdade de
recombinação, como sugerido por Carson.
Da Cunha et al. (1950) e Da Cunha e Dobzhansky (1954) propuseram que o modelo
central-marginal pode ser explicado por uma hipótese ecológica: o polimorfismo é
proporcional ao número de nichos ecológicos explorados pela espécie e mais nichos são
disponíveis no centro da distribuição. Sob essa óptica, as inversões resultariam em blocos
de genes coadaptados que confeririam adaptações específicas a nichos ou a condições
ecológicas particulares.
Wallace (1984) propôs outra hipótese para explicar a variação entre populações
centrais e populações isoladas nas margens da distribuição. Assumindo que heterozigotos
estruturais têm distintas habilidades competitivas, se comparados aos homozigotos, eles
poderiam ser favorecidos em populações mais densas, próximas do centro de distribuição
da espécie. Em direção à margem de distribuição, entretanto, a probabilidade de que uma
43
fêmea encontre um sítio de ovoposição vai diminuindo, juntamente com a probabilidade de
que sua prole sobreviva em uma condição ideal. Nestas circunstâncias, a produção de prole
razoavelmente adaptada tem maior probabilidade de deixar descendência que sobreviva, do
que a produção de um número menor de indivíduos competitivamente superiores e
polimórficos para inversões.
Em vista de suas propriedades genéticas únicas, as populações isoladas nas margens
da distribuição são consideradas muito importantes nos eventos de especiação (Mayr
1963). Existem alguns poucos estudos do polimorfismo cromossômico da semi-espécie
Andino-Brasileira de D. paulistorum na cidade de Porto Alegre. Apesar dessa cidade
representar o limite sul de distribuição geográfica e ecológica de D. paulistorum, Santos e
Valente (1990) registraram a presença de 18 inversões heterozigotas nas populações
estudadas. Em um estudo posterior no mesmo local, Valiati e Valente (1997) constataram a
presença de 23 inversões heterozigotas, das quais 12 eram novas inversões. Embora os
achados dos autores fujam à regra do polimorfismo central-marginal anteriormente
discutida, a hipótese levantada por Fontdevila (1992) é sugerida para explicar o alto grau
de polimorfismo cromossômico encontrado no extremo de distribuição de D. paulistorum.
De acordo com essa hipótese, as populações marginais seriam mais susceptíveis ao estresse
genômico, promovendo a mobilização de elementos transponíveis, reconhecidos por sua
capacidade de produzir rearranjos cromossômicos. Tem sido consistentemente sugerida por
muitos autores a idéia de que esses elementos podem desempenhar um papel importante na
geração de inversões espontâneas em populações naturais, devido aos distúrbios
genômicos que causam (revisão em Krimbas e Powell 1992).
Desde o trabalho de Valiati e Valente (1997), entretanto, a situação de D.
paulistorum em Porto Alegre não foi mais avaliada. Novos estudos ecológicos e
44
cromossômicos de populações naturais de D. paulistorum que ocupam a margem da
distribuição geográfica e ecológica são, portanto, extremamente importantes para o
entendimento dos mecanismos implicados no processo de colonização.
45
OBJETIVOS
Considerando a experiência do grupo de pesquisadores do Laboratório de
Drosophila da UFRGS, que ao longo dos últimos 40 anos acumulou muitas informações a
respeito de citogenética e evolução do subgrupo da Drosophila willistoni, o presente
trabalho tem como objetivo geral contribuir com novos conhecimentos sobre a
superespécie D. paulistorum a partir dos seguintes objetivos específicos:
1. Elaborar o fotomapa de referência da semi-espécie Andino-Brasileira de D. paulistorum,
precisar os pontos de quebras das inversões e rearranjos encontrados e analisar o
polimorfismo cromossômico em diferentes populações geográficas (Capítulo II);
2. Caracterizar e comparar, através do padrão de bandas dos cromossomos politênicos, as
diferentes semi-espécies de D. paulistorum com a finalidade de estabelecer as relações
evolutivas entre as mesmas (Capítulo III) e estabelecer o relacionamento filogenético com
outras espécies do subgrupo da D. willistoni (Capítulo IV);
3. Estabelecer nova metodologia para identificação das espécies crípticas do subgrupo da
D. willistoni com base no padrão eletroforético da enzima Fosfatase ácida-1 (Capítulo V);
4. Estudar a colonização do ambiente urbano de Porto Alegre pela D. paulistorum, através
do monitoramento das suas populações e da composição das assembléias de drosofilídeos
dos quais ela faz parte (Capítulos VI e VII).
46
CAPÍTULO II
A photomap of polytene chromosomes and inversion polymorphism in Andean-
Brazilian semispecies of Drosophila paulistorum
Ana Cristina Lauer Garcia, Vera Lúcia da Silva Valente and Cláudia Rohde
Trabalho pronto a ser submetido à Journal of Heredity
47
A photomap of polytene chromosomes and inversion polymorphism in Andean-
Brazilian semispecies of Drosophila paulistorum
Ana Cristina Lauer Garcia, Vera Lúcia da Silva Valente and Cláudia Rohde
Departamento de Genética, Instituto de Biociências, Universidade Federal do Rio
Grande do Sul (UFRGS), Caixa Postal 15053, CEP 91501-970, Porto Alegre, RS,
Brazil.
Address correspondence to Ana C. L. Garcia at Caixa Postal 15053, CEP 91501-970,
Porto Alegre, Rio Grande do Sul Brazil. E-mail: [email protected]
ABSTRACT
In many parts of tropical South America, Drosophila paulistorum is the second
most abundant species of the D. willistoni subgroup. It comprises six semispecies: Andean-
Brazilian, Amazonian, Centro-American, Interior, Orinocan and Transitional that together
form the superspecies D. paulistorum. Recently, interest has been renewed in the
evolutionary aspects of D. paulistorum, because it is still evolving and shows considerable
variability of gene rearrangements on the chromosomes. However, few systematic studies
on the chromosomal evolution of this species complex have been made and the only
available reference map of its polytene chromosomes is a sketch map made in 1966. In the
present paper, we present the first photomap for the Andean-Brazilian semispecies of D.
paulistorum, the most widely distributed semispecies. Homozygous arrangements and
48
heterozygous inversions were scored in different populations of the Neotropical region and
the breakpoints plotted on the above-mentioned photomap thus taking the first steps
towards achievement of our primary objective - to make a detailed study of the
chromosomal evolution of D. paulistorum superspecies.
INTRODUCTION
Drosophila paulistorum Dobzhansky and Pavan (Burla et al. 1949) is a Neotropical
complex species of the Sophophora subgenus, with an area of distribution extending from
Guatemala and Trinidad to southern Brazil. It comprises six semispecies, namely: Andean-
Brazilian, Amazonian, Centroamerican, Orinocan, Transitional (Dobzhansky and Spassky
1959) and Interior (Pérez-Salas et al. 1970). In many parts of tropical South America, it is
the second most abundant species of the D. willistoni subgroup.
Until D. paulistorum was found as a cluster of semispecies or incipient species
(Dobzhansky and Spassky 1959) it did not seem a particularly interesting species for
evolutionary studies. However, it has been shown to be a rich and promising source for the
study of evolution and species formation. The semispecies show sexual (ethological)
isolation from one another, and when crosses between them do occur, male hybrids are
sterile (Ehrman 1960; 1962; Dobzhansky et al. 1969). Each semispecies has a distinct
geographic distribution, but in some places two or more overlap (Spassky et al. 1971) and
sympatric strains of two semispecies show greater isolation coefficients than do allopatric
strains of the same semispecies (Ehrman 1965). Although the semispecies of D.
paulistorum are morphologically identical it is possible to identify them by crosses with
49
known semispecies (Ehrman and Powell 1982) and by the study of polytene chromosomes
(Kastritsis 1966; 1967; 1969).
The karyotype configuration of D. paulistorum consists of three pairs of mitotic
chromosomes, two metacentric (the sexual pair and the second chromosome) and one
acrocentric (the third chromosome) (Burla et al. 1949). Kastritsis (1966) made a camera
lucida sketch map of the polytene chromosomes of Andean-Brazilian semispecies of D.
paulistorum, the most widely distributed among the semispecies, using as standard a strain
collected in Palmira, Colombia and arbitrarily divided the polytene chromosomes XL, XR,
2L, 2R and 3 into sections numbered from 1 to 100. Kastritsis (1966, 1967, 1969) also
analyzed the configurations of the polytene chromosomes of the six semispecies and of the
hybrids between them comparing the chromosomal polymorphism within the populations
of these semispecies. The author above classified D. paulistorum among the most
chromosomally polymorphic species in the genus, pointing out the existence of at least 85
chromosomal arrangements. In a further study, Santos and Valente (1990) studied the level
of chromosomal polymorphism of paracentric inversions in different populations of
Andean-Brazilian semispecies of D. paulistorum, collected in urban environment of Porto
Alegre, Brazil. These authors detected the existence of 18 chromosomal inversions, in spite
of the geographical and ecological marginality of these populations. Some years later,
Valiati and Valente (1997) re-evaluated the chromosomal polymorphism of this species in
samples from the same locality, registering 23 polymorphic inversions, six of them
corresponding to some of the 18 described by Santos and Valente (1990).
Although Kastritsis (1966) reference map has been used in more recent
chromosomal studies with D. paulistorum (Santos and Valente 1990; Valiati and Valente
1997) it can only with difficulty be used for a modern cytogenetic approach. As presented
50
by the pioneer authors the sketch map makes it very difficult to compare the exact
inversion configuration with those recorded in previously published drawings and plates so
as to determine if they are the same or new inversions.
In the present investigation we present a reference photomap of Andean-Brazilian
semispecies of D. paulistorum based on a study of 17 different geographic populations. We
also present a detailed description of homozygous and heterozygous inversions, with their
breakpoints and frequencies, and an analysis of the degree of inversion polymorphism of
populations. The present report is part of a more extensive chromosomal evolution study
designed to improve our understanding of the diversification mechanisms of the
semispecies of D. paulistorum.
MATERIALS AND METHODS
Populations analyzed– Seventeen populations from different geographical locations of the
semispecies Andean-Brazilian were analyzed (Table 1 and Figure 1). Six of them
correspond to mass mating stocks, maintained in laboratory since the date of their
collections. At least ten chromosomal arms from different larvae were analyzed per each
mass mating population. The other 11 populations were collected and maintained in the
laboratory as isofemale lines. At least five different nucleus were analyzed per isoline. All
populations were identified as D. paulistorum species by the characterization of Acid
phosphatase-1 (Acph-1) enzyme, in accordance with the protocol described by Garcia et al
(Chapter V of this Thesis).
51
Culture conditions and cytological preparations -Although good D. paulistorum
chromosomal preparations are notoriously difficult to obtain due to the thin chromosomes
that seldom spread well, we obtained satisfactory results by improving the procedures and
rearing larvae cultures at low density and feeding them with biological yeast in the culture
medium described by Marques et al. (1966) at 17°C ± 1°C chamber and 60% relative
humidity. Salivary glands of third instar female larvae were dissected in a physiological
solution (Ephrussi and Beadle 1936), fixed in acetic acid 45% during 30 seconds, stained
with aceto-lactic orcein (orcein 2% diluted in 51% of acid acetic glacial, 34% of distilled
water and 15% of lactic acid 85%) and then gently squashed under a siliconized coverslip
(dimetildiclorosilane 2% diluted in clorophormium). Well politenized chromosomes were
obtained and the best observed nuclei were photographed in a Zeiss phase-contrast
microscope. For each individual analyzed the inversion and arrangements were scored
using photomicrographs of all chromosomal arms.
Construction of the photomap - The chromosomal photomap of Andean-Brazilian
semispecies of D. paulistorum was constructed with carefully selected photos of different
chromosomes considered representative of the banding pattern. The best images were
captured with the aid of a scanner and processed with the Adobe Photoshop 5.0 program.
The chromosomal arms were divided into sections represented by numbers and into
subsections represented by capital letters (starting with A in the proximal region). The
chromosomes were divided into the 100 sections first used by Kastritsis (1966) but the
chromosomal arm descriptions were changed and adopted to conform to the system used
by Dobzhansky (1950) in his reference map of the D. willistoni species (XL, XR, IIL, IIR
and III). The different arrangements of X chromosome and the heterozygous inversions of
52
the autosomes were identified by lower case letters to distinguish our results from those of
the previously cited authors who numerate the inversions. However, wherever possible, we
established correspondence between our description and the earlier studies. All the
inversions we named (for example, XLc) represent a new configuration from the standard
order presented in the photomap (XL).
Polymorphism analysis - Four different estimates of degree of inversion polymorphism
were used: (i) the degree of heterozygosity (HZ); (ii), (iii) the hetero and homo inversions
density (ID) (both in Sperlich and Kunze-Muehl 1963); and (iv) the index of free
recombination (IFR) (Carson 1955). The HZ index can be defined as the mean number of
structurally heterozygous chromosome arms per individual and depends on the number and
relative frequencies of chromosome structures as well as on how many chromosomes of
the set are polymorphic, but it is unaffected by the complexity of gene arrangement. The
ID index measures the average number of heterozygous inversions per individual in a wild
population by counting all heterozygous in an inversion complex which contribute two,
three or more inversions. In our study we present two different ID estimates: the ID
(hetero) that correspond to the frequency of heterozygous inversions alone; and the ID
(homo) that also includes the inversions occurring in the homozygous state. To calculate
the inversion frequencies used to estimate ID (homo), we considered each inversion in the
heterozygous state once, and each inversion in the homozygous state (representing each
chromosome homologue) twice. As a consequence of this procedure the true number of
chromosomal arms analyzed was twice the number of females analyzed, since each female
has two homologous chromosomes. Inversion frequency was calculated as follows:
53
Inversion frequency = total number of inversion found in the population
total number of chromosomal arms analyzed
The IFR index refers to the effect of heterozygous inversion on recombination
reduction and considers both the frequency and the length of an inversion. It
measures all chromosome sections in the entire set of chromosome of individuals that
are not entangled in inversions loops, and represent the proportion of euchromatin
available (or free) for recombination.
RESULTS
The first photomap of the polytene chromosomes of Andean-Brazilian semispecies
of D. paulistorum is shown in Figure 2. All chromosomes were oriented in the same way,
with the proximal (centromeric) regions at the left and the distal (free) regions at the right.
In the photomap there are 16 sections on XL (1 to 16), 20 on XR (17 to 36), 19 on IIL (37
to 55), 22 on IIR (56 to 77), and 23 on III (78 to 100). The XL arm represented 17.20% of
the total chromosomal set, XR 19.20%, IIL 19.37%, IIR 19.53% and chromosome III
24.70%. These relative lengths were calculated by measuring all sections of each
chromosomal arm and relating each one with the total size of all chromosomes in the
original photomap.
Notwithstanding the difficulties in working with chromosomes of this species, each
one of the chromosomal arms can be easily identified by looking for their distal regions.
The XR arm presents a repeat region in section 24C and the IIR arm contains a repeat
54
region shown in section 64A of the photomap (Figure 2). Very distinct puffs are useful
landmarks for arm recognition, for example, the puffs of section 13B of XL, the three large
puffs in the sections 19B, 26B and 32A of XR; those in the sections 50B and 51A of IIL,
the sections 73A, B and 76B of IIR, and the sections 84A and 87A of III (Figure 2).
Frequently, the IIR arm can be found connected to the centromeric region and the
chromosome III is many times found broken in the section 88A, which seems to be a
fragile sub-replicated region (Figure 3).
The careful analysis of the banding pattern of polytene chromosomes revealed the
presence of different homozygous arrangements for XL and XR arms (Figure 4). Because
of this, we propose to use the description “XL/XL” when referring to the homozygous
arrangement of XL, as shown on the photomap; to “XLc/XLc” when referring to the
alternatively fixed homozygous arrangement present in some of the populations studied;
and to “XL/XLc” when mentioning to the heterozygous inversion (i.e. the result of the
pairing between two different arrangements in the same individual). The respective
frequencies of the homozygous arrangements in each population are presented in Table 2.
As can be seen in this table, the arrangements XL/XL and XR/XR were found most
frequently in almost all the populations we investigated. Because of their high frequency,
they were chosen as the order of reference for composition of the photomap of the Andean-
Brazilian semispecies (Figure 2). The arrangement XLc/XLc appeared most frequently
only in the BRA and RIB populations while the arrangement XRh/XRh, was the
commonest in ECU, RIB and MSA populations. Detailed description of heterozygous
inversions of XL and XR are also presented in Figure 4. Diverging from the practice of
earlier authors, we used a lower case letter to identify each inversion, because, as we are
attempting to present new descriptions for each inversion, (accompanied by a detailed
55
photomap and breakpoint descriptions) we opted to use new names for identification of all
inversions to avoid misunderstandings.
Figure 5 shows photomicrographs with the seven inversions registered in the
chromosome III, the most polymorphic chromosome in this study. The exact breakpoints
of these inversions are represented on the photomap by brackets above the chromosome
and a capital letter indicating the inversion’s name. Contrasting with the polymorphism
detected in the chromosome III, no inversion was registered in the chromosome II in all the
populations we investigated.
The frequency of all heterozygous inversions found in chromosomal arms XL, XR
and III are indicated in Table 3. The most frequent and representative inversions were
XRh, IIId and XLc, occurring in seven, eight and ten populations respectively. Four
inversions were exclusively found in one population: IIIl in BRA, IIIn and IIIo in IQG, and
IIIy in TAB. In some cases we were unable to conciliate the inversions detected in this
study with the inversion photomicrographs published by Kastritsis (1967), Santos and
Valente (1990) and Valiati and Valente (1997) who were working with the Andean-
Brazilian semispecies.
In order to permit temporal and spatial comparative analysis between our data and
previous studies for Andean-Brazilian semispecies of D. paulistorum, the inversion
frequencies of two populations obtained by the earlier authors from the same places where
the samples were collected for our own investigation, (RMT and JBO - both in the city of
Porto Alegre, South Brazil), are also shown on Table 3. When the previous registers
estimated by Santos and Valente (1990) and Valiati and Valente (1997) are compared with
our 2002/2004 data, the Andean-Brazilian semispecies in general is shown to be less
polymorphic in the later years in terms of the number and frequencies of the inversions.
In Table 4 we present for the first time four different estimates of chromosomal
polymorphism for all the populations of the Andean-Brazilian semispecies of D.
56
paulistorum we studied. None heterozygous inversions were found in populations from
PAR, JAI, MLC, ITC and in consequence these populations showed the lowest values of
ID (hetero) and the highest IFR indexes. The most polymorphic populations for
heterozygous inversions were BRA, IQG, TAB, ELD and MSA, as shown by IFR and ID
(hetero) except for MSA in the ID (hetero) index. The HZ and ID (homo) indexes were
sensitive when used to estimate the amount of homozygous arrangements in the X
chromosome and detected the highest values for the ECU, RIB, BRA, IQG and MSA
populations.
DISCUSSION
In the last few years not much cytogenetic research has been carried out with D.
paulistorum. In this article we attempt to re-awaken interest in this particular study area by
illustrating the possibilities of the cytogenetic analysis of populations of Andean-Brazilian
semispecies (which are representative of flies found in many parts of the geographical
distribution of this species) to describe its chromosomal polymorphism. The samples we
used were obtained in Ecuador and in the northern, central and southern regions of Brazil
(Figure 1). So far, a total of 10 polymorphic inversions have been identified: two on
chromosomal arm XL (inversions XLc and XLi), one on chromosomal arm XR (inversion
XRh) and seven on chromosome III (inversions IIIo, IIIl, IIIf, IIIn, IIIy, IIIe and IIId).
For the first time this study identifies homozygous inversions included in the
analysis of chromosomal polymorphism in the Andean-Brazilian semispecies of D.
paulistorum. This was possible mainly because of three factors: 1) the careful maintenance
of our fly strains, which allowed us to obtain excellent chromosomal preparations; 2) the
57
precise analysis of each inversion through the use of several different photomicrographs
representing all possible configurations and 3) the invaluable assistance of the photomap
presented here (Figure 2). Photomaps are more precise than sketch maps, and facilitate
more precise registry of every detail, and greater accuracy in the observation of the bands
and/or “marker” or “landmark” regions of the chromosomes, as well as the exact
breakpoints of all inversions detected (Figures 4 and 5). For instance, this analysis reveals
two homozygous arrangements in the chromosome X. The inversions XLc and XRh in
homozygosis yield the arrangements XLc/XLc and XRh/XRh respectively. These
inversions, together with IIId inversion, have the widest geographic distribution and
characterize the majority of the populations we studied (Table 3). With respect to the X
chromosome, Rohde (2000) observed for D. willistoni (a sibling species of D. paulistorum)
a clear discontinuity of arrangements between 22 populations analyzed. The author found a
total of eight different arrangements in the XL arm and seven in the XR. These
arrangements showed variations associated with the origin of the population. In contrast,
our data did not disclose a clear pattern of geographical distribution for the X-chromosome
in Andean-Brazilian semispecies of D. paulistorum. A possible explanation for this
difference is that our species is in a process of evolutionary diversification while D.
willistoni remains a fully developed species.
With respect to the autosomal arms IIL, IIR and chromosome III, we observed that
the populations share the same standard arrangement, within which seven inversions
segregate only in the chromosome III. In a similar manner, only one standard arrangement
was observed in each autosome arm of D. willistoni (Rohde 2000). However, in D.
willistoni, the above-mentioned author found high polymorphism in relation to all
autosomes, observing seven and nine segregating inversions in chromosomal arms IIR and
58
IIL respectively, and thirteen inversions in the chromosome III. In the Andean-Brazilian
semispecies of D. paulistorum, the III chromosome was also the most polymorphic but no
segregating inversion was found in our populations in relation to chromosome II.
According to our findings with D. paulistorum, several Drosophilidae exhibit a
considerable higher polymorphism in one of the chromosomes in comparison with the rest
of chromosomal set. Some examples are: D. mediopunctata (Ananina et al. 2002), D.
nebulosa (Da Cunha et al. 1953), D. subobscura (Krimbas 1992) and D. pseudoobscura
(Schaeffer et al. 2003).
Our records of chromosomal polymorphism of the Andean-Brazilian semispecies
of D. paulistorum are not so very different from those found by Kastritsis (1967) almost
forty years ago. After careful analysis of 29 populations of the Andean-Brazilian
semispecies, the author cited above detected three inversions in the chromosomal arm XL,
one in XR, two in IIL, no inversion in IIR and nine in the III chromosome. In the same
chromosomal arms we registered respectively, two inversions for XL, one for XR, zero for
chromosome II and seven for the III chromosome. Although the configurations of some
heterozygous inversions described by Kastritsis (1967) could not be recognized in our
micrographs, two features agrees with our data and deserve comment, the absence of
inversion in chromosomal arm IIR and the fact that the III chromosome was the most
polymorphic.
Our data of chromosomal polymorphism of populations JBO and RMT from Porto
Alegre indicated only three inversions (XLc, XRh and IIId) while Santos and Valente
(1990) detected 14 inversions and Valiati and Valente (1997) detected 22 in the same
places (Table 3). This loss of chromosomal variability may be a consequence of a
considerable reduction of the D. paulistorum populations in Porto Alegre (Chapter VI of
59
this Thesis), which has created a situation where only the three more frequent inversions
are still segregating. This assumption can be also supported by data in Table 4 where the
JBO and RMT populations in Porto Alegre city show rising IFR indexes. The rarer
inversions appear to have suffered a bottleneck effect and were probably either lost
completely or are still occurring but at very low frequencies not being sampled in our
collections of D. paulistorum.
The comparative analysis of the HZ, ID (homo), ID (hetero) and IFR indexes did
not reveal any clear association between the populations and their geographic origin on
dendrograms generated from these indexes whether taken together or individually (data not
shown). The absence of consistent geographical clustering in our analyses may perhaps be
due in part to the fact that some of the populations have been maintained as mass cultures
in the laboratory for some years, thereby possibly losing typical inversions probably still
found in natural populations. However, the indexes were very useful for comparing the
chromosomal characteristics of the populations. As a rule, HZ and ID (homo) produced
similar information as did the IFR and ID (hetero). The first two of these indexes permitted
detection of the real polymorphism expressed by homozygous arrangements which had
been undetected previously by other studies.
In conclusion, we recommend caution on two aspects of Kastritsis (1969) statement
“ … chromosomally speaking, paulistorum is by far the most polymorphic species known
in the genus Drosophila”. Firstly, the Drosophila paulistorum superspecies is still in
progress of diversification - as Spassky and Dobzhansky (1959) put it “… a cluster of
species in statu nascendi”. Secondly, Kastritsis (1969) reached his conclusion by
considering the polymorphism detected in all the semispecies and in the hybrids produced
between them. It is worth mentioning that, before the present study, no investigator had
defined the inversion breakpoints precisely, so that some inversions could have been
misinterpreted by other authors.
60
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63
Table 1. Studied populations of Andean-Brazilian semispecies of Drosophila paulistorum
Population Place of collection Collection Year Collector
ECU Jaton Sacha, Ecuador 1997 1
PAR Belém, PA, Brazil 1997 2
BRA* Brasília, DF, Brazil 2000 3
RIB Ribeirão Preto, SP, Brazil 1995 4
JAI Serra do Japi, Jundiaí, SP, Brazil 2003 5
IQG* Queimada Grande Island, SP, Brazil 2003 5
RAT Ratones Grande Island, SC, Brazil 1997 6
MLC* Morro da Lagoa da Conceição, SC, Brazil 2003 7
ITC* Itacorubi, SC, Brazil 2005 8
TAV* Tavares, SC, Brazil 2005 8
TAB* Serra do Tabuleiro, SC, Brazil 1997 6
ELD* Eldorado do Sul, RS, Brazil 1994 9
MSA Porto Alegre (Morro Santana), RS, Brazil 1995 9
JBO* Porto Alegre (Botanic Garden), RS, Brazil 2002 10
JBO* Porto Alegre (Botanic Garden), RS, Brazil 2004 11
RMT* Porto Alegre (Mário Totta Street), RS, Brazil 2002 10
RMT* Porto Alegre (Mário Totta Street), RS, Brazil 2004 11
Numbers refer to the name of flies´ collectors: (1) Margaret Kidwell and Joana Silva, (2) Marlúcia Martins, (3)
Rosana Tidon, (4) Cláudia Rohde, (5) Hermes Medeiros, (6) Daniela De Toni, (7) Marco Gottschalk, (8) Hermes
Schmitz, (9) Luciano B. da Silva, (10) André Schnorr, (11) Ana Lauer Garcia.
* indicate populations analyzed as isofemale lines.
64
Table 2. Frequencies (%) of different arrangements detected on the left arm (XL) and on
the right arm (XR) of chromosome X of Andean-Brazilian
Drosophila paulistorum
populations.
XL arrangements XR arrangements
Populatio
n
Collection
Year
N XL/XL XLc/XLc XR/XR XRh/XRh
ECU 1997 14 75.00 25.00 0 100,00
PAR 1997 5 100,00 0 100,00 0
BRA* 2000 6 33.33 66.67 50.00 50.00
RIB 1995 10 0 100,00 0 100,00
JAI 2003 6 100,00 0 83.33 16.67
IQG* 2003 10 68.18 31.82 86.36 13.64
RAT 1997 10 52.78 47.22 100,00 0
MLC* 2003 6 100,00 0 100,00 0
ITC* 2005 3 100,00 0 100,00 0
TAV* 2005 6 66.67 33.33 100,00 0
TAB* 1997 2 75.00 25.00 100,00 0
ELD* 1994 11 90.91 9.09 95.45 4.55
MSA 1995 10 60.00 40.00 20.00 80.00
JBO* 2002 7 71.43 28.57 71.43 28.57
JBO* 2004 6 83.33 16.67 91.67 8.33
RMT* 2002 15 70.00 30.00 86.67 13.33
RMT* 2004 68 75.00 25.00 71.32 28.32
N = number of analyzed individuals. * indicate populations analyzed as isofemale lines.
65
Table 3. Frequencies (%) of heterozygous inversions detected on chromosomal arms of Andean-Brazilian Drosophila paulistorum populations of this and previous studies.
XL heterozygous inversions XR heterozygous inversions IIL heterozygous inversions IIR heterozygous inversions III heterozygous inversions
Populati Year N XLc XLi - - - XRh - - - - - - - - - - - - - - - - - IIId IIIe IIIf III
l
IIIn IIIo IIIy - - -
(XL1) (XL6) (XL3) (XL4) (XL2) (XR1) (XR2) (XR4) (XR5) (XR6) (XR7) (IIL.1) (IIL.2) (IIL.3) (IIL.4) (IIL.5) (IIL.6) (IIL.7) (IIR.1) (IIR.3) (IIR.4) (IIR.5) (IIR.6) (3.1) (3.2) (3.4) - - - - (3.5) (3.6) (3.7)
Present study
ECU 1997
14 7.2 0 00 0 0 00000 000 0 0 0 0 0 0 0 0 0 21.4000000000
PAR 1997
5 0 000 0 0 00000 000 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0000000000
BRA* 2000
6 016.700 0 50.000000 000 0 0 0 0 0 0 0 0 0 33.316.733.316.7000000
RIB 1995
10 0 000 0 0 00000 000 0 0 0 0 0 0 0 0 0 60.0000000000
JAI 2003
6 0 000 0 0 00000 000 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0000000000
IQG* 2003
10 27.3 0 0 0 0 9.1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 20.0 0 0 0 10.0 20.0 0 0 0 0
RAT 1997
10 20.0000 0 0 00000 000 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0000000000
MLC* 2003
6 0 000 0 0 00000 000 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0000000000
ITC* 2005
3 0 000 0 0 00000 000 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0000000000
TAV* 2005
6 33.30 00 0 0 00000 000 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0000000000
TAB* 1997
2 50.00 00 0 0 00000 000 0 0 0 0 0 0 0 0 0 00000050.0000
ELD* 1994
11 18.29.100 0 9.100000 000 0 0 0 0 0 0 0 0 0 45.59.19.10000000
MSA 1995
10 10.0000 0 30.000000 000 0 0 0 0 0 0 0 0 0 40.0000000000
JBO* 2002
7 28.60 00 0 0 00000 000 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0000000000
JBO* 2004
6 0 000 0 16.700000 000 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0000000000
RMT* 2002
15 33.3000 0 13.300000 000 0 0 0 0 0 0 0 0 0 13.3000000000
RMT* 2004
68 7.4 0 00 0 4.400000 000 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1.5000000000
Other studies
JBO* 1986 (a)
41 17.10002.4 12.200000 2.44.904.97.30 0 4.90 0 0 0 24.407.30000000
JBO* 1991 (b)
62 14.5 0 0 0 0 9.7 0 1.6 1.6 4.8 1.6 4.8 0 0 24.2 11.3 6.5 1.6 0 9.7 4.8 3.2 1.6 7.9 0 0 0 0 0 0 0 9.5 1.6
JBO* 1992 (b)
42 11.9000 0 12.202.4000 6.80018.24.50 0 04.80 0 0 7.3000000000
RMT* 1987 (a)
77 22.0 0 1.3 2.6 0 5.0 3.8 0 0 0 0 0 0 2.6 2.6 10.4 0 0 3.0 0 0 0 0 40.0 2.0 5.0 0 0 0 0 3.0 0 0
RMT * 1990 (b)
17 29.4000 0 17.6005.905.95.30036.815.80 0 010.55.30 0 6.30000000000
RMT* 1991 (b)
130 25.6 0.8 0 0 0 12.6 0 0 2.4 1.6 2.4 10.9 0 0 26.4 10.9 0.8 0.8 0 3.9 0.8 0 0 9.5 0 0 0 0 0 0 0 2.4 0.8
RMT* 1992 (b)
45 13.3000 0 20.500002.3 0008.52.10 0 0 0 02.10 12.5000000000
a = Santos and Valente 1990 b = Valiati and Valente 1997
N = number of analyzed individuals . * indicate populations analyzed as isofemale lines.
Consider: XLc, XLi and XRh as a new descriptions of the inversions previously named as (XL1), (XL6) and (XR1), respectively.
In the present study we do not found inversions in the chromosome II .
Consider: IIId, IIIe and IIIf as new descriptions of the inversions previously named as 3.1, 3.2 and 3.4, respectively. Inversions III
l
, IIIn, IIIo and IIIy correspond to new configurations found for this chromosome.
66
Table 4. Characterization of the Andean-Brazilian semispecies of D. paulistorum with respect
to paracentric inversion polymorphism, estimated by different indexes. Standard deviations
are given in each case.
Population Collection
Year
N HZ ID (homo) ID (hetero) IFR
ECU 1997 14 1.5000 ±
0.7596
2.7143 ±
1.0690
0.2857 ± 0.613 0.9849 ±
0.0327
PAR 1997 5 0.0000 ±
0.0000
0.0000 ±
0.0000
0.0000 ±
0.0000
1.0000 ±
0.0000
BRA* 2000 6 1.8333 ±
0.9832
3.6667 ±
1.2110
1.6667 ±
1.2110
0.9268 ±
0.0404
RIB 1995 10 2.6000 ±
0.5164
4.6000 ±
0.5164
0.6000 ±
0.5164
0.9694 ±
0.0263
JAI 2003 6 0.1667 ±
0.4082
0.3333 ±
0.8165
0.0000 ±
0.0000
1.0000 ±
0.0000
IQG* 2003 10 1.0000 ±
0.6667
1.5000 ±
1.1785
0.9000 ±
0.8756
0.9461 ±
0.0516
RAT 1997 10 0.6000 ±
0.5164
1.0000 ±
0.9428
0.2000 ±
0.4216
0.9882 ±
0.0249
MLC* 2003 6 0.0000 ±
0.0000
0.0000 ±
0.0000
0.0000 ±
0.0000
1.0000 ±
0.0000
ITC* 2005 3 0.0000 ±
0.0000
0.0000 ±
0.0000
0.0000 ±
0.0000
1.0000 ±
0.0000
TAV* 2005 6 0.5000 ±
0.5477
0.6667 ±
0.8165
0.3333 ±
0.5164
0.9803 ±
0.0305
TAB* 1997 2 1.0000 ±
1.4142
1.0000 ±
1.4142
1.0000 ±
1.4142
0.9610 ±
0.0552
ELD* 1994 11 0.8182 ±
0.9817
1.0000 ±
1.4832
1.0000 ±
1.4832
0.9528 ±
0.0615
MSA 1995 10 1.8000 ±
0.6325
2.8000 ±
0.9189
0.8000
±0.6325
0.9543 ±
0.0357
JBO* 2002 7 0.5714 ±
0.7868
1.1429 ±
1.6762
0.2857 ±
0.4879
0.9831 ±
0.0288
JBO* 2004 6 0.3330 ±
0.5164
0.5000 ±
0.8367
0.1667 ±
0.4082
0.9892 ±
0.0266
RMT* 2002 15 0.8000 ±
0.6761
1.0000 ±
0.8452
0.6000 ±
0.7367
0.9650 ±
0.0443
RMT* 2004 68 0.6324 ±
0.6207
1.0882 ±
1.1027
0.1765 ±
0.4211
0.9885 ±
0.0257
HZ = degree of heterozigozity; ID (homo) = inversion density per female (inversions that occur
in the homozygous and heterozygous state); ID (hetero) = inversion density per female
(heterozygous inversions only); IFR = index of free recombination. N= number of individuals
analyzed. * indicate populations analyzed as isofemale lines.
67
BRAZIL
EC U
PGK, MSA, JBO, RMT
A 28, PAR
RIB, JAI, IQG
BRA
RAT, MLC, ITC, TAV, TAB
Figure 1. Map of the South America showing the original
lo cat io ns o f the
D. paulistorum
Andean-Brazilian
populations studied (see Table 1).
N
BRAZIL
EC U
PGK, MSA, JBO, RMT
A 28, PAR
RIB, JAI, IQG
BRA
RAT, MLC, ITC, TAV, TAB
Figure 1. Map of the South America showing the original
lo cat io ns o f the
D. paulistorum
Andean-Brazilian
populations studied (see Table 1).
N
68
69
Figure 3.Common configurations found in the Andean-Brazilian semispecies of
D. paulistorum
.
(A) Chromosomal arm IIR connected to the centromeric region (cent); (B) Chromosome III
broken in section 88A as indicated by an arrow.
cent
A
B
70
Figure 4. Different homozygous and heterozygous arrangements in the polytene chromosome X in the
Andean-Brazilian semispecies of D. paulistorum. (A) Homozygous arrangements XL/XL and XLc/XLc,
(B) Homozygous arrangements XR/XR and XRh/XRh. Brackets above the chromosome arms in A and B
correspond to inversion breakpoints. (C) Heterozygous inversions XLc (XL/XLc), XLi (XL/XLi) and XRh
(XR/XRh). inv= inversion.
71
Figure 5. Inversions detected on the chromosome III in the Andean-Brazilian semispecies of D. paulistorum.
(A) Inversion breakpoints represented by brackets above the III chromosome. (B) Configurations of the
heterozygous inversions IIIo, III
l
, IIIf, IIIy, IIIe, IIIn and IIId. Homozygous inversion IIIf are also presented.
Inv= inversion.
72
CAPÍTULO III
Evolução cromossômica dos autossomos das semi-espécies de Drosophila paulistorum:
elementos B, C e E de Muller
Ana Cristina Lauer Garcia, Cláudia Rohde e Vera Lúcia da Silva Valente
Trabalho em preparação, a ser submetido à Journal of Heredity
73
Evolução cromossômica dos autossomos das semi-espécies de Drosophila
paulistorum: elementos B, C e E de Muller
Ana Cristina Lauer Garcia
*
, Cláudia Rohde e Vera Lúcia da Silva Valente.
Departamento de Genética, Instituto de Biociências, Universidade Federal do Rio Grande
do Sul, Av. Bento Gonçalves, 9500, Caixa Postal 15053, 91501-970 Porto Alegre, RS,
Brasil.
*Autor para correspondência. E-mail: [email protected]
Resumo
Através do estudo do padrão de bandas dos cromossomos politênicos autossômicos
(elementos C, B e E de Muller) das semi-espécies de D. paulistorum observou-se que os
cariótipos dessas semi-espécies são pouco reorganizados, refletindo sua proximidade
evolutiva. A análise comparativa da reorganização dos blocos de homologia cromossômica
permitiu inferir o número mínimo de eventos responsáveis pela diversificação das semi-
espécies, bem como o relacionamento filogenético entre elas. As semi-espécies Andino-
Brasileira e Orinocana foram homoseqüenciais. Para o cromossomo II, foram observadas
duas inversões paracêntricas não sobrepostas envolvendo a região mediana de cada um dos
braços que parecem ter sido fixadas, gerando os padrões atuais. O cromossomo III
apresentou reorganizações nas regiões média e distal, com quatro arranjos relacionados por
três prováveis inversões fixadas.
74
Introdução
Desde a redescoberta dos cromossomos politênicos nos tecidos larvais de
Drosophila e outros dípteros, feita em 1933 (Heitz e Bauer 1933, Painter 1933), a pesquisa
na área da genética tem despontado com valiosas contribuições para estudos evolutivos. A
pressuposição da origem única das inversões em Drosophila e a riqueza de informação
obtida pela análise comparativa do padrão característico e constante das bandas dos
cromossomos politênicos levaram Sturtevant e Dobzhansky (1936) a estabelecerem um
método de uso desses cromossomos para inferir relações filogenéticas entre espécies
proximamente relacionadas. Através desse método, diversos autores têm construído
filogenias para diferentes grupos do gênero Drosophila (revisões em Carson e Yoon 1982,
Lakovaara e Saura 1982, Clayton e Guest 1986, Lemeunier et al. 1986).
Drosophila paulistorum Dobzhansky e Pavan (Burla et al. 1949), um dos
drosofilídeos integrantes do subgrupo Neotropical da D. willistoni, é uma superespécie
constituída de seis raças ou semi-espécies: Andino-Brasileira, Amazônica, Centro-
Americana, Orinocana, Transicional (Dobzhansky e Spassky, 1959) e Interior (Pérez-Salas
et al. 1970). Linhagens de diferentes semi-espécies cruzam com dificuldade e quando
híbridos são produzidos as fêmeas são férteis e os machos estéreis (Ehrman 1965). O fato
de D. paulistorum ser composta por semi-espécies revela sua importância para a realização
de estudos evolutivos, uma vez que sua diversificação em nível de espécies ainda não está
completa e mudanças envolvidas nesse processo são possíveis de serem detectadas e/ou
monitoradas.
Como primeiro passo para o estudo da evolução cromossômica da D. paulistorum,
Garcia et al. (Capítulo II desta Tese) confeccionaram o primeiro fotomapa dos
75
cromossomos politênicos da semi-espécie Andino-Brasileira, a partir do estudo de várias
populações de diferentes regiões geográficas. Esse fotomapa foi proposto como referência
no estudo da evolução cromossômica de D. paulistorum em substituição ao mapa
cromossômico confeccionado em câmara clara por Kastritsis (1966). Recentemente,
Rohde, Garcia e colaboradores (Capítulo IV desta Tese) estudaram a evolução do braço
cromossômico IIR entre as espécies do subgrupo da D. willistoni e semi-espécies de D.
paulistorum, apresentando uma filogenia cromossômica para o subgrupo. O estudo revelou
que existem poucas reorganizações cromossômicas entre as semi-espécies, de forma que a
relação evolutiva entre elas é muito mais estreita do que aquela observada entre as espécies
crípticas do subgrupo da D. willistoni. Os resultados obtidos demonstraram que os
cromossomos politênicos são excelentes marcadores, capazes de esclarecer sobre os
diferentes níveis de relacionamento filogenético entre as espécies desse subgrupo, formado
de espécies crípticas, subespécies e semi-espécies.
No presente estudo apresentamos as relações evolutivas entre as semi-espécies de
D. paulistorum obtidas a partir da análise do padrão de seqüências de bandas homólogas
dos braços cromossômicos politênicos IIL, IIR e III, correspondentes aos elementos C, B e
E, respectivamente. De acordo com Muller (1940), o cariótipo básico do gênero
Drosophila seria correspondente a cinco elementos cromossômicos principais
(cromossomos acrocêntricos), nomeados pelas letras de A a F.
Material e Métodos
Populações analisadas: As populações de D. paulistorum avaliadas no presente estudo
estão citadas na Tabela 1. Foram analisadas 16 linhagens da semi-espécie Andino-
76
Brasileira e uma de cada uma das demais semi-espécies, exceto a semi-espécie
Transicional que embora conste na Tabela 1 ainda não foi investigada.
Preparações citológicas: Para a preparação do material citológico, larvas das diferentes
linhagens investigadas foram mantidas em baixa densidade a 17°C, em tubos contendo
meio de cultura padrão (Marques et al. 1966), até atingirem o terceiro estágio de
desenvolvimento. As glândulas salivares dessas larvas foram dissecadas em solução
fisiológica (Ephrussi e Beadle 1936), fixadas em ácido acético 45% e coradas com orceína
aceto-lática (orceína 2% diluída em 51% de ácido acético glacial, 34% de água destilada e
15% de ácido lático a 85%). Os melhores núcleos foram fotografados em contraste de fase
em Fotomicroscópio Zeiss, com filme Kodak Plus X-Pan. .
Comparação das bandas dos cromossomos politênicos: Como primeiro passo para a
análise comparativa dos autossomos das semi-espécies de D. paulistorum, os cromossomos
politênicos autossômicos das semi-espécies Centro-Americana, Amazônica, Orinocana e
Interior foram fotografados e divididos em seções e subseções pelo critério de similaridade
de bandas cromossômicas, respeitando as mesmas divisões apresentadas no fotomapa da
semi-espécie Andino-Brasileira (Capítulo II desta Tese). A partir daí, foi possível
estabelecer os “blocos” de homologia cromossômica entre as semi-espécies. Esses blocos
foram delimitados por letras nos seus extremos basais e distais e coloridos diferentemente.
A cor amarela foi utilizada para representar os blocos conservados entre todas as semi-
espécies.
Resultados
A Figura 1 apresenta os resultados da análise comparativa do cromossomo II entre
as semi-espécies de D. paulistorum. Observa-se que ambos os braços IIL e IIR desse
77
cromossomo apresentam regiões conservadas, ou seja, que não sofreram reorganização
cromossômica. Essas regiões correspondem a uma grande porção da base e da região distal
(IIL e IIR) e também a uma porção da região mediana (IIR). No braço cromossômico IIL,
três blocos internos, que somados representam 73,76% do seu tamanho total, sofreram
reorganização cromossômica entre as semi-espécies. A Figura 1A apresenta o fotomapa do
braço IIL da semi-espécie Andino-Brasileira, juntamente com os blocos de reorganização
cromossômica entre as semi-espécies (em diferentes cores). A representação esquemática
dos arranjos presentes nas demais semi-espécies está também indicada, da mesma forma
que os pontos de quebra das inversões que originaram cada um dos arranjos fixados nas
semi-espécies. A análise comparativa do braço cromossômico IIL revelou que o arranjo da
semi-espécie Andino-Brasileira (AB) é o mesmo da Orinocana (ORI) e que o arranjo da
Interior (INT) é o mesmo da Centro-Americana (CA). Esses dois grupos de arranjos
(AB/ORI e INT/CA) estão relacionados entre si pelo arranjo apresentado pela semi-espécie
Amazônica (AM). O arranjo da AM é um arranjo intermediário, capaz de explicar o
relacionamento cromossômico que existe entre AB/ORI e INT/CA através da ocorrência
de duas inversões paracêntricas denominadas de inversão o (inv. IILo) e inversão n (inv.
IILn). A inv. IILo relaciona-se ao arranjo AB/ORI e a inv. IILn se relaciona ao arranjo
INT/CA.
Já o braço cromossômico IIR (Figura 1B) apresentou apenas dois blocos de
reorganização cromossômica entre as semi-espécies, que somam 40% do tamanho total
deste braço cromossômico. Do mesmo modo que o observado para o IIL, a seqüência de
bandas cromossômicas do IIR foi novamente a mesma entre a AB e ORI. A mesma
identidade também foi visualizada em relação ao padrão de bandas apresentado pelas semi-
espécies Amazônica e Interior (AM/INT). O relacionamento entre AB/ORI e AM/INT se
deve, provavelmente, à ocorrência da inversão h (inv. IIRh) no passado evolutivo das semi-
espécies. Outra inversão fixada encontrada no IIR foi denominada de inversão g (inv. IIRg)
78
que, provavelmente, está envolvida no relacionamento cromossômico entre o arranjo
AB/ORI com o arranjo CA.
Na Figura 2 está apresentada a análise da similaridade de bandas entre as semi-
espécies de D. paulistorum feita para o cromossomo III, que revela a existência de três
blocos conservados e quatro blocos de reorganização cromossômica. Três desses blocos
estão próximos da região distal desse cromossomo, compreendendo 19,38% do
cromossomo III. Conforme esquematizado na Figura 2, através da comparação do padrão
de bandas foi possível estabelecer o relacionamento do arranjo AB/ORI com o arranjo CA,
pela provável ocorrência da inversão q (inv. IIIq). O arranjo AB/ORI também está
relacionado com o arranjo da Interior (INT) pela inversão r (inv. IIIr) e com o arranjo da
Amazônica (AM) pela inversão k (inv. IIIk). Apenas no caso do cromossomo III, o arranjo
compartilhado por AB/ORI se relaciona, ao mesmo tempo, com o arranjo das outras três
semi-espécies (CA, INT e AM) sempre pela ocorrência de apenas uma inversão.
Discussão
No presente estudo, avaliamos a evolução cromossômica entre as semi-espécies de
D. paulistorum, comparando o padrão de bandas dos cromossomos politênicos
autossômicos (elementos B, C e E) que representam juntos, aproximadamente 64% do
tamanho total do genoma da espécie.
Os dados obtidos até o momento, reforçam a idéia de Dobzhansky e Spassky (1959)
de que cada semi-espécie estaria se diversificando a caminho de se tornar uma espécie
plena. Semi-espécies em estágio inicial de divergência evolutiva podem fornecer
informações cruciais sobre a base genética do isolamento reprodutivo, bem como sobre as
forças evolutivas que promovem a especiação (Koop e Frank 2005). A especiação é, na
79
maioria dos casos, um processo contínuo de acúmulo de diferenças ao nível do
desenvolvimento comportamental e/ou incompatibilidades ecológicas entre populações
divergentes (Mayr 1963, Coyne e Orr 2004). As semi-espécies podem passar por um
estágio no qual apresentam poucas diferenças genéticas e são apenas parcialmente isoladas
reprodutivamente umas em relação às outras.
A análise comparativa do padrão de bandas dos politênicos autossômicos
demonstrou que todas as semi-espécies são possíveis de serem identificadas ao nível
cromossômico. O melhor cromossomo para esse propósito foi o III, já que o braço
cromossômico IIL não permitiu diferenciar CA de INT e o braço IIR não foi capaz de
diferenciar AM de INT (Figuras 1 e 2). As semi-espécies AB e a ORI são homoseqüenciais
e não puderam ser diferenciadas ao nível dos cromossômos autossômicos (Figuras 1 e 2) e
tão pouco em relação ao cromossomo X (braços XL e XR, dados não mostrados). Daí
conclui-se que essas duas semi-espécies são homoseqüenciais. A estreita relação entre a
AB e a ORI também foi indicada no trabalho de Gleason et al. (1998). Através da análise
de 1,2 kb do gene period os autores verificaram que essas duas semi-espécies diferem por
apenas uma mutação do gene. As semi-espécies CA, INT e Transicional (TR) agruparam-
se em outro clado, sendo INT e TR as mais relacionadas, e a semi-espécie mais divergente
foi a AM. Nossos dados, em conjunto com os resultados dos autores acima citados,
apontam para a necessidade de reavaliar as semi-espécies AB e ORI, no sentido de
verificar se o isolamento reprodutivo entre elas se mantém, uma vez que as últimas
investigações nesse sentido foram realizadas na década de 1960 (Ehrman 1965). Vale
salientar que casos de espécies homoseqüenciais para todo o complemento cromossômico
já foram detectados em Drosophila, como o exemplo clássico de algumas espécies
Havaianas (Carson e Yoon 1982). Carson (1970, 1971) sugere que espécies
homoseqüenciais podem representar exemplos de uma rápida especiação alopátrica sem a
ocorrência de grandes diferenças cromossômicas.
Muitos autores têm proposto que a especiação freqüentemente ocorre quando a
população se torna fixada para um ou mais rearranjos cromossômicos que, em
heterozigose, reduzem a adaptação (White 1978, King 1993). Neste sentido, White (1978)
concluiu que os rearranjos cromossômicos “têm desempenhado um papel fundamental na
maioria dos eventos de especiação”. No entanto, a generalização dessa pressuposição exige
80
cautela. Um exemplo é o caso das drosófilas do Hawaii onde especiação explosiva é
acompanhada por uma baixa taxa de rearranjos cromossômicos (Carson et al. 1970).
Estudos recentes têm apresentado um outro enfoque para o papel dos rearranjos
cromossômicos no processo de especiação. Os rearranjos cromossômicos não seriam as
causas do surgimento de novas espécies, mas um mecanismo que reforçaria o isolamento
entre as espécies recentemente divergidas, suprimindo a recombinação e, por
conseqüência, restringindo o fluxo gênico entre elas.
Mesmo sendo diferenciadas cromossomicamente, exceção já comentada para AB e
ORI, as semi-espécies de D. paulistorum são muito menos reorganizadas do ponto de vista
cromossômico do que as espécies crípticas do subgrupo da D. willistoni do qual fazem
parte. Esse fato leva à pressuposição de que elas tenham divergido muito recentemente
e/ou continuem a trocar genes por hibridação introgressiva. Os dados do presente estudo
também foram corroborados por Rohde, Garcia e colaboradores (Capítulo IV desta Tese),
através da análise do braço cromossômico IIR (elemento B de Muller), entre as espécies do
subgrupo da D. willistoni, incluindo algumas das semi-espécies de D. paulistorum (AB,
ORI, CA, e INT). Os dados levantados pelos autores citados acima, também indicaram que
a CA seria a semi-espécie mais proximamente relacionada com as demais espécies do
subgrupo. Garcia (2002) estudou a evolução do cromossomo II da semi-espécie AB de D.
paulistorum em relação a sua críptica D. willistoni, revelando a existência de pelo menos
oito inversões fixadas no braço IIL e quatro no braço IIR. Embora nossa análise até o
momento, não tenha incluído a semi-espécie Transicional, a similaridade do padrão de
bandas cromossômicas para todo o complemento dos autossomos demonstrou que as semi-
espécies se relacionam pela ocorrência de apenas duas inversões em cada um dos dois
braços do cromossomo II e pela presença de três inversões no cromossomo III.
Na presente investigação, o arranjo cromossômico da AB/ORI foi o que se
relacionou mais diretamente com todas as demais semi-espécies de D. paulistorum, o que
81
poderia sugerir este arranjo como o mais primitivo dentre as semi-espécies. Essa
constatação, no entanto, merece algumas considerações. Como já salientado, os estudos
prévios de evolução cromossômica, envolvendo também as outras espécies do subgrupo da
D. willistoni (Capítulo IV desta Tese) indicam a CA como a portadora do arranjo mais
primitivo, ao mesmo tempo, entre as semi-espécies e entre as espécies do subgrupo
willistoni. Isso poderá ser comprovado em futuras investigações, quando a análise dos
autossomos estiver concluída para a semi-espécie Transicional, para as demais espécies do
subgrupo da D. willistoni e, especialmente, para o cromossomo X, o mais diferenciado
evolutivamente entre os cromossomos.
Os blocos de homologia detectados entre as semi-espécies para os cromossomos II
e III revelaram uma maior conservação da região basal, sendo a maioria dos pontos de
quebra das inversões localizados na região mais mediana do cromossomo no caso do II e
na região mais distal no caso do cromossomo III. A constatação de que a distribuição dos
pontos de quebra não é randômica ao longo do cromossomo foi feita por alguns autores.
Novitski (1946), estudando o elemento cromossômico C de D. pseudoobscura e D.
athabasca, verificou uma concentração de pontos de quebra de inversões na região distal
do cromossomo. Roberts (1976), por sua vez, sugere que a concentração dos pontos de
quebras das inversões cromossômicas, em várias espécies de Drosophila, seria devida,
primariamente, à seleção natural, já que inversões nessa região seriam mais eficientes
supressoras de recombinação e com isso manteriam mais fortemente unidos genes
coadaptados.
È sabido que a fertilidade dentro de uma espécie diminui acentuadamente quando
mais de um cromossomo é portador de inversões paracêntricas em estado heterozigoto
(Cooper et al. 1955, Terzaghi e Knapp 1960). Considerando as semi-espécies da D.
paulistorum, esta constatação poderia estar nos indicando a existência dessa forte barreira
entre elas, uma vez que a ordem das bandas dos cromossomos autossômicos difere entre as
semi-espécies pela presença de pelo menos uma inversão (exceto AB e ORI). Em
82
experimentos com D. melanogaster, Cooper et al. (1955) constataram um forte declínio na
postura de ovos por fêmeas portadoras de mais de uma inversão, o que foi atribuído ao
pareamento de cromossomos não homólogos seguido pela não disjunção dos cromossomos
não recombinantes e a inviabilidade dos ovos devido a aneuploidias. Estudos similares
revelaram que fêmeas de D. pseudoobscura sem inversões heterozigotas apresentaram um
sucesso na eclosão dos ovos de 95%, as portadoras de uma inversão tiveram um sucesso de
93% e as portadoras de três inversões heterozigotas não ligadas apresentaram apenas 59%
(Terzagui e Knapp 1960).
A supressão de recombinação, ocasionada pelos rearranjos cromossômicos, e o
significado desse evento na especiação, apesar do fluxo gênico inter-específico, têm sido
testada por Brown et al (2004). Esses autores avaliaram a base genética da esterilidade do
híbrido em um par de subespécies simpátricas D. pseudoobscura pseudoobscura e D.
persimilis e em um par de subespécies alopátricas D. pseudoobscura bogotana e D.
persimilis. Todos os fatores de esterilidade apresentaram associação com três regiões
invertidas no primeiro par de espécies e em regiões colineares no último par, indicando que
a recombinação e a seleção natural podem ter eliminado fatores de esterilidade fora das
regiões invertidas entre D. p. pseudoobscura e D. persimilis. Isso apoia a idéia de que os
rearranjos cromossômicos podem facilitar a persistência da espécie apesar da ocorrência de
hibridação. Uma vez que as relações dos rearranjos cromossômicos entre as semi-espécies
de D. paulistorum estão sendo estabelecidas, o estudo dos fatores de esterilidade nesse
contexto deve ser objeto de futuras investigações.
83
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86
87
Populaçã
o
Semi-espécie Local da coleta Coletor
ECU Andino-
Brasileira
Jaton Sacha, Equador 1
MÊS Andino-
Brasileira
Mesitas, Colômbia 2
MAN Andino-
Brasileira
Manaus, AM, Brasil 3
PAR Andino-
Brasileira
Belém, PA, Brasil 3
IQG Andino-
Brasileira
Ilha da Queimada Grande , SP, Brasil 4
RIB Andino-
Brasileira
Ribeirão Preto, SP, Brasil 5
JAI Andino-
Brasileira
São Paulo, SP, Brasil 4
MLC Andino-
Brasileira
Morro da Lagoa da Conceição, SC, Brasil 6
RAT Andino-
Brasileira
Ilha de Ratones Grande, SC, Brasil 7
ITC Andino-
Brasileira
Itacorubi, SC, Brasil 8
TAV Andino-
Brasileira
Tavares, SC, Brasil 8
TAB Andino-
Brasileira
Serra do Tabuleiro, SC, Brasil 7
MSA Andino-
Brasileira
Porto Alegre (Morro Santana), RS, Brasil 9
RMT Andino-
Brasileira
Porto Alegre (Rua Mário Totta), RS, Brasil 9
PGK Andino-
Brasileira
Porto Alegre (Parque Gabriel Knijnik), RS,
Brasil
9
JBO Andino-
Brasileira
Porto Alegre (Jardim Botânico), RS, Brasil 9
C2 Centro-
Americana
Lancetilla, Honduras 2
T1 Transicional Santa Marta, Colômbia 2
A28 Amazônica Belém, PA, Brasil 2
O11 Orinocana Georgetown, Guyana 2
I1 Interior Llanos, Colômbia 2
Coletores: (1) Margaret Kidwell e Joana Silva, (2) Lee Ehrman and Yong Kyu Kim, (3)
Marlúcia Martins, (4) Hermes Medeiros, (5) Cláudia Rohde, (6) Marco Gottschalk, (7)
Daniela De Toni, (8) Hermes Schmitz, (9) Ana Lauer Garcia.
Tabela 1. Populações e semi-espécies de Drosophila paulistorum investigadas.
88
Figura 1. Evolução do cromossomo II de cinco semi-espécies de
D. paulistorum
. Sobre o fotomapa do braço
IIL (A) e IIR (B) da Andino-Brasileira estão representados, com diferentes cores, os blocos de homologi
a
cromossômica entre as cinco semi-espécies. O início e o fim de cada bloco estão indicados por letras. As
linhas cruzadas entre os diferentes arranjos referem-se à ocorrência de inversões paracêntricas. As flechas
indicam as direções das inversões res
p
onsáveis
p
ela reor
g
anização dos arran
j
os cromossômicos. Os blocos
A
B
Andino-Brasileira
Amazônica
Andino-Brasileira
e Orinocana
Centro-Americana
e Interior
Andino-Brasileira
e Orinocana
Andino-Brasileira
Amazônica
e Interior
Centro-Americana
89
Andino-Brasileira
Amazônica
Andino-Brasileira
e Orinocana
Interior
Centro-Americana
Figura 2. Evolução do cromossomo III de cinco semi-espécies de D. paulistorum. Sobre o fotomapa do braço III da
Andino-Brasileira estão representados, com diferentes cores, os blocos de homologia cromossômica entre as cinco
semi-espécies. O início e o fim de cada bloco estão indicados por letras. As linhas cruzadas entre os diferentes
a
rr
a
n
jos
r
e
f
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m-
se
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c
i
a
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cas.
A
s
fl
ec
h
as
in
d
i
ca
m
as
d
ir
eções
das
in
ve
r
sões
90
CAPÍTULO IV
Chromosomal evolution of sibling species of the Drosophila willistoni
group. I. Chromosomal arm IIR (Muller’s element B)
Cláudia Rohde*, Ana Cristina Lauer Garcia*, Victor Hugo Valiati
and Vera Lúcia da Silva Valente
* Estas autoras contribuíram igualmente para a realização desse trabalho
Trabalho publicado na revista Genética
103
CAPÍTULO V
Identification of the sibling species of the Drosophila willistoni subgroup through
electrophoretical mobility of Acid phosphatase-1
Ana Cristina Lauer Garcia, Cláudia Rohde, Grazia Fagundes Audino,
Vera Lúcia da Silva Valente and Victor Hugo Valiati
Trabalho no prelo, a ser publicado na revista
Journal of Zoological Systematics and Evolutionary Research
104
105
1
Departamento de Genética, Instituto de Biociências, Universidade Federal do Rio Grande
do Sul (UFRGS), Porto Alegre, RS, Brazil;
2
Laboratório de Biologia Molecular, Ciências
da Saúde, Universidade do Vale do Rio dos Sinos (UNISINOS), São Leopoldo, RS, Brazil.
Identification of the sibling species of the Drosophila willistoni subgroup through
electrophoretical mobility of Acid phosphatase-1
A. C. L. GARCIA
1
, C. ROHDE
1
, G. F. AUDINO
1
, V. L. S. VALENTE
1
and V. H.
VALIATI
2
Abstract
The Drosophila willistoni group consists of twenty three species of which six are sibling
species and belong to the D. willistoni subgroup: D. willistoni, D. equinoxialis, D.
tropicalis, D. insularis, D. pavlovskiana and D. paulistorum. These sibling species are
abundant in the Neotropical region and can hardly be differentiated by the usual taxonomic
traits. Four of them (D. willistoni, D. equinoxialis, D. tropicalis and D. paulistorum) cover
extensive geographic distribution areas overlapping in places while two of them are
endemic (D. insularis and D. pavlovskiana). In this study we are presenting a method for
the identification of five sibling species of the D. willistoni subgroup based on allozyme
variation of Acid phosphatase-1 (Acph-1) in polyacrilmide gel electrophoresis. Our work
showed that Acph-1 allozyme differences can be used for species-diagnostic
characterization. This method is shown to be a more efficient tool for species identification
than others until now available because it is both quicker and produces reliably result in a
shorter time. Key words: Acid phosphatase-1 – sibling species - Drosophila willistoni.
106
Introduction
The Drosophila willistoni group consists of twenty three species of which six are
sibling and belong to the D. willistoni subgroup: D. willistoni Sturtevant 1921, D.
equinoxialis Dobzhansky 1946, D. tropicalis Burla et al. 1949, D. insularis Dobzhansky et
al. 1957, D. pavlovskiana Kastritsis and Dobzhansky 1967 and D. paulistorum
Dobzhansky and Pavan (in Burla et al. 1949) which include six semispecies. This subgroup
is one of the most outstanding and widespread groups of drosophilids in the Neotropical
region and the cytological, morphological and behavioral aspects have been extensively
studied. The species are so similar in their morphology that it is difficult to tell them apart
by studying only the external morphology (Burla et al. 1949).
The geographic distribution of the species of D. willistoni subgroup overlaps in
extensive areas but D. pavlovskiana and D. insularis are endemic in small defined places
as shown by Kastritsis and Dobzhansky (1967) for D. pavlovskiana and Dobzhansky et al.
(1957) for D. insularis – the former in Guyana and the latter on some islands of Lesser
Antilles. The other four sibling species are sympatric from Guatemala, through Central
America and northern of South America, down to central Peru and Brazil (Spassky et al.
1971; Dobzhansky and Powell 1975). Drosophila willistoni presents the widest
geographical distribution in Neotropical regions. It is the dominant species in most hot and
humid forests, despite the considerable seasonal fluctuations (Dobzhansky 1957; Da Cunha
et al. 1959; Spassky et al. 1971). Its ecological versatility is clearly shown by the variable
range of breeding sites successfully exploited, the most important of which are fermented
fruits (Carson 1965; Valente and Araújo 1986). The D. paulistorum is in fact, a
superspecies, comprising six morphologically indistinguishable semispecies: Andean-
Brazilian, Centroamerican, Orinocan, Amazonian, Transitional (Dobzhansky and Spassky
1959) and Interior (Pérez-Salas et al. 1970). In many parts of tropical South America it is
the second most abundant species of the D. willistoni subgroup. Individuals of different
semispecies do not cross in nature when sympatric, thus behaving as completely isolated
species. In the laboratory, however, they may, in some cases, produce hybrids. Drosophila
107
equinoxialis extends from central Mexico through Central America, the Greater Antilles,
and the northern half of continental South America. Drosophila tropicalis is found from
Central America to the center of South American continent. Although in recent years many
authors have published a reasonable number of ecological studies with the D. willistoni
subgroup (Tidon et al. 1994; De Toni and Hofmann 1995; Saavedra et al. 1995; Vilela and
Mori 1999; Valiati and Valente 1996; Martins 2001; Medeiros and Klaczko 2004; Silva et
al. 2005) only a few of these studies present the identification at the species level (Vilela
and Mori 1999; Valiati and Valente 1996; Medeiros and Klaczko 2004). This fact is
explained by the abundance of the sibling species in the collections, their extreme
morphological similarity and the lack of a practical method for identification of the
species. The methods currently used to separate the species of the D. willistoni subgroup
are the inspection of external genitalia of males (Burla et al. 1949; Malogolowkin 1952;
Spassky 1957), the detailed study of the band patterns of polytene salivary gland
chromosomes (Rohde et al. 2006), intercrossing tests (Cordeiro and Winge 1995) and the
analyses of the song produced by males during the courtship (Ritchie and Gleason 1995).
However, these methods are very laborious to identify a large numbers of flies.
Here we present a method for the identification of five species of D. willistoni
subgroup which is much more efficient than those traditionally used. This involves
determining the allozyme variation of Acid phosphatase-1 (Acph-1, EC3.1.3.2) locus in
polycrilamide gel electrophoresis in a representative number of individuals. The results
obtained prove that such measurements of Acph-1 can distinguish between these sibling
species in spite their great morphological similarity.
108
Materials and Methods
Fifty-three population samples of the D. willistoni subgroup (Table 1) were analyzed. Of
these, 26 were of D. willistoni (including 5,148 individuals), 21 of D. paulistorum (904
individuals), four of D. equinoxialis (699 individuals), one of D. tropicalis (127
individuals) and one of D. insularis (132 individuals). Unfortunately we could not include
D. pavlovskiana in the study because no sample strain was available from any of the
suppliers of Drosophila stock. However, this has no great effect on the study results
because this species is a rare endemic in Guyana. As indicated in Table 1, eight
populations of D. willistoni and eight of D. paulistorum correspond to recently collected
samples that were analyzed as isofemale lines making a total of 5,059 and 842 individuals
of each species, respectively. The other populations correspond to laboratory stocks
maintained as mass cultures for varying periods of time. There is no doubt about the
identification of the species investigated. They were confirmed by the analysis of the
banding patterns of the polytene chromosomes, examination of the genitalia and outcrosses
with known species strains (data not shown).
Adult individuals of both sexes were submitted to horizontal electrophoresis for
Acph-1 enzyme. Each fly was individually macerated with a drop of distillated water.
Electrophoresis of Acph-1 in acrylamide slab gels was carried out by adjusting the method
described by Hüettel and Bush (1972). The 6% polyacrilamide gels, containing 95% of
acrylamide and 5% bisacrylamide, were prepared with 80 ml buffer (composed by 0.038 M
Tris and 0.0025 M citric acid pH 7.5.), 0.8 ml APS (Ammonium persulphate) and 0.08 ml
TEMED (Sigma). The buffer in the electrode chamber contained 0.34 M Tris and 0.078 M
TABLE 1
109
citric acid pH 7.5. The gel was subject to an electrophoretical run for approximately 4 hr at
20 V/cm and was stained with 0.05 g Fast Blue RR stain and 0.05 g Na α-naphtyl acid
phosphate, diluted in 100 ml of 0.2 M acetate buffer pH 5.0, during 1.5 hr, at 37°C. The gel
was pre-soaked in 0.25 M boric acid for 1 hr prior to staining. After the appearance of the
enzyme bands, the reaction was stopped by washing the gel with water and adding the
fixing solution of 5:5:1, methanol, water and acetic acid, respectively.
In each gel were used a minimum of three control flies of two species: D. willistoni,
strain wilSPE, and D. paulistorum, strain pauRMT. They were used as a positive control of
the gel conditions and as controls for the two more frequent homozygous allelic forms of
Acph-1. Numbers were used to identify the different alleles and the Acph-1 form for D.
willistoni was considered the species standard and its allele was denominated Acph-1
1.00
.
The alleles of other species were designated by their relative mobility in relation to the
standard Acph-1
1.00
.
Results
Electrophoretic variations in the protein encoded by Acph-1 locus were detected in
2,415 individuals, representing 53 populations of five sibling species of the D. willistoni
subgroup. The optimal conditions for separation of the different alleles of Acph-1 were
obtained by adjusting the pH to 7.5 and the gel concentration to 6%. The genotypic
variants detected for Acph-1 and characteristic for the species studied were: Acph-1
0.54/0.54
,
Acph-1
1.08/0.54
and Acph-1
1.08/1.08
for D. equinoxialis, Acph-1
0.64/0.64
for D. tropicalis, Acph-
1
1.00/1.00
for D. willistoni, Acph-1
1.31/1.31
for D. insularis and Acph-1
1.42/1.42
for D.
paulistorum. All phenotypes are showed in the Figure 1. Uniquely, D. equinoxialis
110
presented two segregating alleles, Acph-1
1.08
(fast) and Acph-1
0.54
(slow). None of the
allelic forms here described was shared with other species indicating that Acph-1 can be
used as a species-diagnostic enzyme. We found pairs of species with near migration alleles
for Acph-1 enzyme such as (i) D. paulistorum (Acph-1
1.42
) and D. insularis (Acph-1
1.31
) (ii)
D. tropicalis (Acph-1
0.64
) and D. equinoxialis (Acph-1
0.54
). Drosophila willistoni (Acph-
1
1.00
) and D. equinoxialis (Acph-1
1.08
) were the species with the closest migration of their
allelic forms. However, even there the difference is still more than sufficient to clearly
identify each species (see Figure 2).
The efficiency of our diagnostic method to identify species of the D. willistoni
subgroup was also confirmed by the absence of intraspecific variation of the Acph-1 allelic
forms in each species. The two most exhaustively investigated species were D. willistoni
and the Andean-Brazilian semispecies of D. paulistorum. For D. willistoni, for example,
we find the same allele Acph-1
1.00
in all twenty six geographic populations studied,
including 8 that were recently collected: wilIQG, wilMLC, wilRMT, wilPGK, wilJBO,
wilPFA, wilITA, wilTER (see Table 1). In all, 5,059 individuals from parental or F1
generation were Acph-1
1.00/1.00
(98.3% of all the D. willistoni samples). In the same way,
between twenty one populations for Andean-Brazilian semispecies of D. paulistorum, all
were homozygous for Acph-1
1.42
. Eight of these populations corresponded to recently
collected strains (pauIQG, pauALC, pauMLC, pauITC, pauRMT, pauPGK, pauJBO,
pauITA, see Table 1) or to 842 parental or F1 individuals.
Discussion
Despite the expressive number of individuals belonging to D. willistoni subgroup in
Neotropical drosophilid communities, not much data is found in the literature about the
frequency and the ecology of each of the species. Recent studies on population structure
FIGURES 1 and 2
111
and ecology of Drosophila species have demonstrated that the D. willistoni subgroup can
represent up to 80% of collected specimens from the Amazon area (Martins 2001). In this
way, methodologies that make it possible to distinguish rapidly between a large number of
individuals of D. willistoni subgroup at the species level can be extremely important for a
fuller comprehension of the ecological affinities of each species in particular.
The present study suggests a new methodology to identify species of D. willistoni
subgroup based on the pattern of Acph-1 enzyme because each sibling species has its own
specific allelic form. This method has the advantage of being faster than other known
methods permitting analysis of a larger number of individuals. The localization of the
Acph-1 gene in an autosomal chromosome is also favorable for species-specific
identification in both sexes.
For many years, researchers have sought investigative methods to separate the
sibling species of the D. willistoni subgroup. In this sense, Burla et al. (1949) found several
minute morphological differences between sibling species and concluded that “the
variability is great enough to make identification of species in single individuals
hazardous”. A more detailed study of the genitalia of males of the D. willistoni subgroup
was made by Malogolowkin (1952) that revealed several additional characteristics which
help to differentiate the sibling species. Spassky (1957) described slight but consistent
difference between the external male genitalia that allows a direct identification of single
male individuals. Although the females are not themselves distinguishable, they can be
identified by inspection of their male progenies. Nowadays this is a helpful auxiliary
method in spite of being limited to one sex.
Since 1969, efforts have been made to detect one enzyme that could be used as
species diagnostic for species of the D. willistoni subgroup. Ayala and his coworkers
112
studied for several years the pattern and the geographical variation of a large number of
enzymes by electrophoresis starch gels in this subgroup of flies (review in Ayala 1975).
However, between 36 loci investigated none conclusively identified the species. The Acph-
1 enzyme was also investigated for this purpose, but in contrast with our results the authors
found in this loci alleles shared between more than one species of the D. willistoni
subgroup. We believe that the reason of our success in conclusively distinguishing species
using Acph-1 enzyme can be explained by differences in our methodology as compared to
that used by the former authors. For example, we used polyacrlamide gel and electrode
buffers conditions adjusting the method describe by Hüetell and Bush (1972) while the
earlier investigators used starch gel with the methods ascribed to Poulik (1957) (see Ayala
et al. 1972).
In relation to D. paulistorum, Richmond (1972a, b) found differences of Acph-1
alleles between the semispecies and between different populations of each one. At this
interspecific level, we always found the same allelic form (Acph-1
1.42
) in all populations
and semispecies tested. The best studied semispecies was the Andean-Brazilian with 904
individuals, 93% recently collected and analyzed as isofemale lines. Although only one
sample of each Amazonian, Centroamerican, Interior, Orinocan and Transitional
semispecies were studied here we are convinced that Acph-1
1.42
is the pattern for D.
paulistorum. Considering that semispecies of D. paulistorum are populations in the process
of speciation, our results indicate that Acph-1 enzyme diverged between the species of the
D. willistoni subgroup but not at semispecies level.
113
Acknowledgments
This research was supported by grants and fellowships from Conselho Nacional de
Desenvolvimento Científico e Tecnológico/CNPq, Fundação de Amparo à Pesquisa do
Estado do Rio Grande do Sul/FAPERGS and PROPESQ/UFRGS.
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117
Authors´adress:
Ana Cristina Lauer Garcia (for correspondence, [email protected]), Cláudia
Rohde ([email protected]), Grazia Fagundes Audino ([email protected]) and
Vera Lúcia da Silva Valente (vera.gaiesky@ufrgs.br), Departamento de Genética, Instituto
de Biociências, Universidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS), Porto Alegre, RS,
91501-970, Brazil. Victor Hugo Valiati (valia[email protected]) Laboratório de Biologia
Molecular, Ciências da Saúde, Universidade do Vale do Rio dos Sinos (UNISINOS), São
Leopoldo, RS, 93022-000, Brazil.
118
Table 1. Species and populations of the Drosophila willistoni .subgroup studied
Species Semispecies Population sample Place of collection Source
D. willistoni
wilAPA Apazapan, Veracruz, Mexico 1
wilPAR Belém, PA, Brazil 2
wilWIP Salvador (Ipitanga), BA, Brazil 3
wilCIP Serra do Cipó, Santana do Riacho, MG, Brazil 4
wilIQG* Queimada Grande Island, SP, Brazil 5
wilRIB Ribeirão Preto, SP, Brazil 6
wilMEL Ilha do Mel Island, PR, Brazil 6
wilISC Santa Catarina Island, SC, Brazil 7
wilARV Arvoredo Island, SC, Brazil 7
wilMLC* Morro da Lagoa da Conceição, SC, Brazil 8
wilCMP Campeche Island, SC, Brazil 7
wilRAT Ratones Grande Island, SC, Brazil 7
wilBEN Bento Gonçalves, RS, Brazil 9
wilDLA Dois Lajeados, RS, Brazil 6
wil17A2 Eldorado do Sul, RS, Brazil 9
wilMSA Porto Alegre (Morro Santana), RS, Brazil 10
wilRMT* Porto Alegre (Mário Totta Street), RS, Brazil 10
wilPGK* Porto Alegre (Gabriel Knijnik Park), RS, Brazil 10
wilJBO* Porto Alegre (Botanic Garden), RS, Brazil 10
wilPFA* Porto Alegre (Farroupilha Park), RS, Brazil 10
wilITA* Itapuã Park, Viamão, RS, Brazil 11
wilSPE São Pedro, Osório, RS, Brazil 3
wilLAG Laguna Negra, Rocha, Uruguay 12
wilCOR Coronilla, Uruguay 12
wilTER* National Park Santa Teresa, Rocha, Uruguay 6
wilGUA Guadeloupe Island, Lesser Antilles 13
D. paulistorum
Andean Brazilian pauECU Jaton Sacha, Ecuador 1
Andean-Brazilian pauMES Mesitas, Colombia 14
Andean-Brazilian pauMAN Manaus, AM, Brazil 2
Andean-Brazilian pauPAR Belém, PA, Brazil 2
Andean-Brazilian pauIQG* Queimada Grande Island, SP, Brazil 5
Andean-Brazilian pauRIB Ribeirão Preto, SP, Brazil 9
Andean-Brazilian pauJAI São Paulo, SP, Brazil 5
Andean-Brazilian pauALC* Alcatrazes Island, SP, Brazil 5
Andean-Brazilian pauMLC* Morro da Lagoa da Conceição, SC, Brazil 8
Andean-Brazilian pauRAT Ratones Grande Island, SC, Brazil 7
Andean-Brazilian pauITC* Itacorubi, SC, Brazil 15
Andean-Brazilian pauMSA Porto Alegre (Morro Santana), RS, Brazil 16
Andean-Brazilian pauRMT* Porto Alegre (Mário Totta Street), RS, Brazil 10
Andean-Brazilian pauPGK* Porto Alegre (Gabriel Knijnik Park), RS, Brazil 10
Andean-Brazilian pauJBO* Porto Alegre (Botanic Garden), RS, Brazil 10
Andean-Brazilian pauITA* Itapuã Park, Viamão, RS, Brazil 11
Centroamerican pauC2 Lancetilla, Honduras 14
Transitional pauT1 Santa Marta, Colombia 14
Amazonian pauA28 Belém, PA, Brazil 14
Orinocan pauO11 Georgetown, Guyana 14
Interior pauI1 Llanos, Colombia 14
D. equinoxialis
equAPA Apazapan, Veracruz, Mexico 14
equPAN Panama 6
equTEF Tefé, AM, Brazil 3
equHON Honduras 13
D. tropicalis
tro0801.0 San Salvador, El Salvador 13
D. insularis
insSTK Saint Kitts, Lesser Antilles 3
Number refer to the name of flies´collectors: (1) Margaret Kidwell, (2) Marlúcia Martins, (3) Antonio Cordeiro
and Helga Winge, (4) Carlos Vilela, (5) Hermes Medeiros, (6) Claudia Rohde, (7) Daniela De Toni , (8) Marco
Gottschalk, (9)Vera Valente, (10) Ana Lauer Garcia, (11) André Schnorr, (12) Beatriz Goñi, (13) Tucson Stock
Center, (14) Lee Ehrman and Yong Kyu Kim, (15) Hermes Schmmitz, (16) Victor Hugo Valiati. * recently
collected population samples.
119
Figure legends:
Figure 1. Zymogram of the phenotypic patterns of Acph-1 found in each one of the five
species of D. willistoni subgroup. Different homozygous and heterozygous genotypes are
indicated. The direction of migration of the protein is up toward the anode according to the
arrow.
Figure 2. Differences in the phenotypic patterns of Acph-1 found in two species of the D.
willistoni subgroup: Acph-1
1.08/0.54
for D. equinoxialis and Acph-1
1.00/1.00
for D. willistoni. The
direction of migration of the protein is up toward the anode according to the arrow.
Figure 1
Figure 2
120
CAPÍTULO VI
Vinte anos de colonização do ambiente urbano de Porto Alegre, Sul do Brasil, pela
Drosophila paulistorum (Diptera, Drosophilidae)
Ana Cristina Lauer Garcia, Vitor Hugo Valiati, Marco Silva Gottschalk,
Cláudia Rohde & Vera Lúcia da Silva Valente
Trabalho concluído, a ser submetido à Biological Journal of the Linnean Society
121
Vinte anos de colonização do ambiente urbano de Porto Alegre, Sul do Brasil, pela
Drosophila paulistorum (Diptera, Drosophilidae)
Ana Cristina Lauer Garcia
1*
, Victor Hugo Valiati
2
, Marco Silva Gottschalk
3
, Cláudia
Rohde
1
& Vera Lúcia da Silva Valente
1,3
1. Departamento de Genética, Instituto de Biociências, Universidade Federal do Rio
Grande do Sul, Av. Bento Gonçalves, 9500, Caixa Postal 15053, 91501-970, Porto Alegre,
RS, Brasil.
2. Laboratório de Biologia Molecular, Universidade do Vale do Rio dos Sinos, Caixa
Postal 275, 93022-000, São Leopoldo, RS, Brasil.
3. Programa de Pós-Graduação em Biologia Animal, Instituto de Biociências,
Universidade Federal do Rio Grande do Sul.
*Autor para correspondência. E-mail: [email protected]
Resumo
Embora Drosophila paulistorum não houvesse sido encontrada inicialmente em
ambientes com interferência antrópica, a ocorrência dessa espécie no sítio urbano de Porto
Alegre em 1985 sugeriu seu potencial de colonização de novos habitats e abriu amplas
possibilidades para estudos evolutivos com essas populações. Nesse estudo foram realizadas
coletas de Drosophila com o objetivo de acompanhar as variações nas populações de D.
paulistorum nessa cidade, em pontos com diferentes níveis de urbanização, quase 20 anos
depois de seu primeiro registro nesse ambiente. Os resultados apontam para uma diminuição
122
da capacidade colonizadora de D. paulistorum em Porto Alegre, evidenciada por uma queda
da freqüência desta espécie nos últimos anos. Este fato pode estar relacionado com o
crescimento da cidade, assim como às retrações naturais que podem ocorrer no tamanho das
populações relacionadas a mudanças climáticas, como por exemplo, variações nas
temperaturas mínimas e máximas. Ainda, a recém introdução de espécies exóticas, como
Zaprionus indianus, parecem contribuir com esse quadro, uma vez que estariam modificando
as interações entre as espécies residentes e, como conseqüência, aumentando o contato e uma
possível competição entre D. willistoni e D. paulistorum, que anteriormente utilizavam
recursos tróficos diferenciados.
Palavras-chave: urbanização, colonização, Drosophila paulistorum, Zaprionus indianus.
INTRODUÇÃO
Drosophila paulistorum Dobzhansky & Pavan (1946) é uma superespécie constituída
de seis raças ou semi-espécies (Dobzhansky & Spassky, 1959; Pérez-Salas et al., 1970)
membro do subgrupo da D. willistoni. Sua distribuição geográfica se estende desde a
Guatemala até o sul do Brasil, onde prevalece a semi-espécie Andino-Brasileira que vive em
simpatria com a sua espécie críptica D. willistoni. Em muitas partes da América tropical, D.
paulistorum é a segunda espécie mais abundante do subgrupo da D. willistoni (Spassky et al.,
1971), composto também pelas espécies crípticas D. equinoxialis, D. tropicalis, D. insularis e
D. pavlovskiana.
123
Até o estudo de Spassky et al. (1971), o limite mais ao sul da distribuição geográfica
de D. paulistorum era o município de Osório (29°54´S; 51°16´W), Estado do Rio Grande do
Sul, Brasil. Em maio de 1985, D. paulistorum foi encontrada pela primeira vez no ambiente
urbano de Porto Alegre (30°02´S; 51°14´W), 90 km ao sul de Osório (Santos & Valente,
1990). Embora essa espécie fosse considerada como ausente em locais perturbados pelo
homem (revisão em Ehrman & Powell, 1982) a ocorrência de D. paulistorum em Porto Alegre
sugeriu seu potencial de colonização e abriu amplas possibilidades de estudos evolutivos com
essas populações. Embora a definição de espécie colonizadora possa ser considerada
arbitrária, devido ao fato de que toda espécie ocupa um território, esse termo tem sido usado
para designar as espécies que invadem ambientes alterados, geralmente devido à ação
antrópica (Mayr, 1965).
A importância dos estudos em ambientes urbanos reside no fato de que a urbanização
faz com que organismos que habitavam ambientes naturais sejam expostos a novos fatores
ecológicos. Entre esses fatores estariam a perda de áreas verdes e a poluição, resultante da
atividade industrial do homem, que altera significativamente o ambiente, diminuindo a
qualidade do ar, da água e dos recursos naturais (Marcus & Detwyler, 1972) e também
alterando a composição dos organismos (Lucchese et al., 2002). Assim, a partir das alterações
ambientais resultantes da ação antrópica, durante os processos de urbanização são criados
novos ecossistemas. Outra conseqüência importante da urbanização é a potencial eliminação
de espécies nativas e a introdução de espécies exóticas. Sob esse aspecto, o estudo sistemático
da fauna de Porto Alegre também propiciou a detecção da introdução recente do drosofilídeo
Zaprionus indianus no ano 2000 (Castro & Valente, 2002). A chegada desta espécie invasora
124
parece estar promovendo ajustes nas estratégias de sobrevivência das espécies residentes,
como sugerido recentemente por Silva et al. (2005a,b).
Existem poucos trabalhos com artrópodes no ambiente urbano, excluindo aqueles sobre
controle de pestes ou epidemias (McIntyre, 2000). Embora os drosofilídeos se prestem para
esse tipo de estudo, devido à sua abundância nas cidades, pouco ainda se conhece sobre como
esses organismos são afetados pela urbanização (Kremen et al., 1993; Valiati & Valente,
1996; Lucchese et al., 2002), embora o uso de diferentes marcadores genéticos em populações
urbanas de D. willistoni e D. paulistorum tenham revelado profundas modificações genéticas
impostas pela urbanização sobre estas populações (Regner & Valente, 1993; Valente et al.,
1993; Valiati & Valente, 1997; Saavedra et al., 2001). Tais estudos vêm contribuindo para o
entendimento da adaptação de Drosophila na resposta aos diferentes gradientes ambientais,
devido à importância do gênero como modelo para estudos do impacto da urbanização sobre a
biodiversidade de espécies nativas (Parsons, 1991; Powell 1997; Avondet et al., 2003;
Gottschalk, 2004; Ferreira & Tidon, 2005).
Entre os anos de 1991 e 1992, Valiati & Valente (1996) realizaram um amplo estudo
ecológico de D. paulistorum em Porto Alegre e verificaram que sua freqüência havia
aumentado desde seu primeiro registro nessa cidade. Tanto os trabalhos de Santos & Valente
(1990) e Valiati & Valente (1996) indicaram a preferência de D. paulistorum por frutos
exóticos como sítios de ovoposição e alimentação, enquanto D. willistoni preferia frutos
nativos, sugerindo uma estratégia para evitar a competição entre as duas espécies. Neste
trabalho, apresentamos o monitoramento da representatividade da D. paulistorum na área
urbana de Porto Alegre, 20 anos depois de seu primeiro registro neste ambiente, a fim de
contribuir para o entendimento de sua trajetória como uma espécie colonizadora.
125
MATERIAL E MÉTODOS
Moscas da família Drosophilidae foram coletadas durante o ano de 2004 em quatro
locais da cidade de Porto Alegre (30
o
02’S, 51
o
14’W) com diferentes níveis de urbanização, de
acordo com a proporção de áreas verdes e construídas estimada por Ruszczyk (1986): Parque
Farroupilha (PFA), alto nível de urbanização (menos de 20% de cobertura vegetal e ocupada,
principalmente, por edificações altas) e Jardim Botânico (JBO), Rua Mário Totta (RMT) e
Parque Gabriel Knijnik (PGK), todos com baixo nível de urbanização (mais de 40% de
cobertura vegetal e predomínio de casas e construções baixas). Foram feitas amostragens nos
diferentes locais, durante três dias consecutivos, nos meses de Fevereiro (verão), Abril
(outono), Julho (inverno) e Outubro (primavera), no período entre 8h e 11h da manhã. Dois
métodos de amostragens foram empregados: 1) moscas adultas foram capturadas com rede
entomológica sobre diferentes frutos em decomposição presentes nos locais, bem como sobre
iscas de banana e de laranja colocadas no chão e cobertas com fermento biológico, sendo
utilizados cinco quilos de cada tipo de isca; 2) frutos fermentados contendo moscas em
estágios pré-adultos foram coletados e mantidos em laboratório em vidros contendo
vermiculita, em câmara com temperatura e umidade controladas (25°C ± 1°C, 60% de
umidade relativa) por 12 a 17 dias. Depois desse período, os adultos emergidos foram
126
aspirados e transferidos para vidros com meio de cultura padrão (Marques et al 1966). A
mesma quantidade de cada tipo de fruto foi utilizada em todas as amostragens. Os espécimes
adultos foram identificados através de chaves de identificação e, em alguns casos, através da
análise da genitália masculina. As espécies crípticas D. paulistorum e D. willistoni foram
identificadas através da técnica de eletroforese da enzima Fosfatase ácida-1 (Acph-1), de
acordo com Garcia et al. (Capítulo V).
Para traçar os aspectos históricos dos 20 anos de colonização do ambiente urbano de
Porto Alegre pela D. paulistorum foram considerados os registros numéricos e de freqüências
das espécies, descritos para os anos de 1986 e 1987 por Santos & Valente (1990) para os
locais JBO e RMT, e os dados de 1991 e 1992 descritos por Valiati & Valente (1996) para
PFA, JBO e RMT. Os dados de Santos e Valente (1990) contêm apenas as freqüências de D.
paulistorum e D. willistoni, sendo que as demais espécies não foram discriminadas e não
puderam ser empregadas para algumas das análises. Para fins comparativos, também foram
considerados os dados de coletas de drosofilídeos referentes aos anos de 2001 e 2002 descritos
por Silva et al. (2005b). No entanto, como nesse último trabalho os indivíduos pertencentes ao
subgrupo da D. willistoni não foram diferenciados, somente utilizamos esses dados nas
análises em que as espécies D. willistoni e D. paulistorum foram agrupadas como subgrupo
willistoni.
Para a análise estatística foi utilizado o teste de Comparação Múltipla de Kruskal-
Wallis a fim de avaliar as variações das freqüências das espécies nos diferentes locais e
estações do ano, e o de Correlação de Spearman para verificar a influência da temperatura na
freqüência das espécies.
127
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Ao longo de 2004, foram coletados 27.985 drosofilídeos nos locais de Porto Alegre
amostrados (Tabela 1). Drosophila simulans (13.461 indivíduos), Zaprionus indianus (5.946
indivíduos) e D. willistoni (4.365 indivíduos) foram as espécies mais abundantes e, juntas,
representaram 85% dos indivíduos coletados. Drosophila paulistorum, com 246 indivíduos
capturados, representou apenas 0,9% do total de drosofilídeos.
Na Tabela 2 estão apresentados os dados das coletas de drosofilídeos realizadas em
Porto Alegre durante o ano de 2004, acrescidos dos dados obtidos por Santos & Valente
(1990) e Valiati & Valente (1996), para os locais de coletas coincidentes. As amostras foram
divididas por locais (com seus respectivos níveis de urbanização), por ano de coleta e por
estação do ano. Os recursos tróficos utilizados na captura dos indivíduos foram separados em
duas categorias: os nativos, correspondentes aos frutos de plantas neotropicais e, os exóticos.
Observa-se que nos anos anteriores a 2004, D. paulistorum sempre foi coletada em maior
freqüência que D. willistoni em frutos exóticos, como Averrhoa carambola e Maclura
pomifera, e que D. willistoni sempre foi mais coletada em frutos nativos, como Syagrus
romanzoffiana. Em 2004, observa-se que D. paulistorum praticamente não utilizou frutos
nativos e seguiu preferindo alguns frutos exóticos, como Eriobotrya japonica (primeiro
registro), onde a espécie apresentou uma freqüência superior àquela encontrada para D.
willistoni (28,4% e 5,4%, respectivamente). Entretanto, no caso do fruto exótico de A.
carambola, houve uma grande alteração em relação ao que vinha sendo registrado em anos
anteriores e as freqüências de D. paulistorum foram quase sempre inferiores às de D. willistoni
128
(exceto na primavera na RMT quando D. paulistorum chegou a 28,5%, superando levemente a
da D. willistoni, de 23,3%). É possível que esse deslocamento de D. willistoni para os frutos
exóticos tenha interferido nas freqüências observadas de D. paulistorum. Além disso, pode ser
também resultante da pressão exercida pela Z. indianus na utilização dos recursos disponíveis,
uma vez que, dos 14 recursos vegetais avaliados, a espécie só não foi encontrada em um deles
(E. japonica).
A Figura 1 apresenta um gráfico comparativo das freqüências médias de D.
paulistorum, D. willistoni, Z. indianus e demais espécies de drosofilídeos, coletados entre os
anos de 1986 e 2004 nos locais JBO e RMT, igualmente avaliados no período. O panorama
que emerge da análise dos dados sugere que D. paulistorum iniciou com sucesso a colonização
de Porto Alegre, entre os anos de 1986 e 1987, com uma freqüência média inicial de 11%,
manteve sua freqüência na amostragem feita cinco anos depois (13%), mas sofreu uma forte
retração em 2004, alcançando a freqüência de 1,4%. Também na Figura 1 pode-se notar que a
espécie Z. indianus não foi encontrada nas coletas feitas entre 1986 e 1992. Na verdade, essa
espécie foi registrada pela primeira vez em Porto Alegre somente no ano de 2000 (Castro &
Valente, 2001). Trata-se de uma espécie invasora de origem africana que vem colonizando
muito rapidamente o território brasileiro (De Toni et al., 2001; Tidon et al., 2003; Silva et al.,
2005 a,b) e a América do Sul (Goñi et al., 2001), desde sua descoberta no Estado de São Paulo
em março de 1999 (Vilela, 1999). A análise de coletas de drosofilídeos em Porto Alegre, feitas
regularmente durante os anos de 2001 e 2002, sugeriu que a chegada de Z. indianus estaria
promovendo ajustes nas estratégias de sobrevivência das espécies residentes (Silva et al.,
2005a,b). Os dados de 2004 sugerem que uma das espécies afetada pode ser a D. paulistorum,
129
já que antes do aparecimento de Z. indianus, ela era bem representada no ambiente urbano
(Valiati & Valente, 1996).
Na Figura 2 estão representadas as freqüências médias dos drosofilídeos coletados
entre os anos de 1986 e 2004 na cidade de Porto Alegre, independentemente do local, estação
do ano e recurso trófico coletado. Os subgrupos mais representativos coletados no período
foram o da D. melanogaster (representado principalmente pela D. simulans, com mais de
90%), o da D. willistoni (D. willistoni e D. paulistorum), a espécie Z. indianus e um grande
grupo formado pelas demais espécies. Chama a atenção o fato do subgrupo da D.
melanogaster apresentar uma oscilação de freqüência inversa ao da espécie Z. indianus.
Assim, em 1991, quando não havia registro de Z. indianus em Porto Alegre, esse subgrupo
representava 75,5% do número total de indivíduos coletados. Em 2001, essa freqüência foi
reduzida para 16,7%, enquanto que a freqüência da Z. indianus aumentou para 44,2%. Nova
situação de inversão de freqüências foi observada em 2004, quando ocorreu uma recuperação
da freqüência do subgrupo da D. melanogaster (49%) acompanhada da diminuição da
freqüência da Z. indianus (21%). É muito provável que ocorra forte competição entre estes
dois grupos de espécies. Por outro lado, as oscilações de freqüência do subgrupo da D.
willistoni foram pequenas quando comparadas com as do subgrupo da D. melanogaster.
A presença de Z. indianus parece não afetar a freqüência do subgrupo da D. willistoni
como um todo, uma vez a freqüência desse subgrupo em 2004 foi de 17%, muito similar
àquela registrada durante o ano de 1991, 14,2%, uma década antes da entrada da Z. indianus
em Porto Alegre. Entretanto, isso não significa que as variações das freqüências de cada uma
das espécies do subgrupo (D. willistoni e D. paulistorum) se mantiveram constantes antes e
depois da invasão de Z. indianus. Conforme demonstrado na Figura 3, D. willistoni foi mais
130
freqüente em 1986, 1987 e 2004, enquanto que D. paulistorum foi bem mais freqüente em
1991 e 1992.
Variações anuais nas freqüências de diversos grupos de insetos também foram
observadas por Wolda (1992) em um estudo de 14 anos em uma floresta no Panamá. O autor
verificou que algumas populações foram notavelmente estáveis, enquanto outras flutuaram
amplamente, sendo que algumas espécies extinguiram-se, enquanto outras, que eram
inicialmente raras ou ausentes, tornaram-se abundantes. Deste modo, o monitoramento em
longo prazo das comunidades de drosofilídeos de Porto Alegre é fundamental para a avaliação
da tendência de alternância da representatividade de D. willistoni e D. paulistorum dentro do
subgrupo D. willistoni. No presente estudo, está sendo possível detectar as oscilações da
freqüência de D. paulistorum em Porto Alegre, antes e depois da chegada da espécie invasora
Z. indianus. Entretanto, os dados permitem sugerir que a baixa freqüência de D. paulistorum
em 2004 pode ter associação indireta com a presença de Z. indianus, e interação direta (ou
competição) com a D. willistoni.
Na Figura 4 estão representadas as freqüências de D. paulistorum e de D. willistoni
durante os anos de 1986 a 1992 em três locais da cidade de Porto Alegre com diferentes níveis
de urbanização. Observamos que D. paulistorum está distribuída diferencialmente nesses
ambientes, ocupando preferencialmente os locais de baixa urbanização, principalmente RMT,
onde o número de indivíduos coletados foi significativamente maior em comparação com o
JBO (Z = 2,98, p < 0,01) e com o PFA (Z = 2,08, p < 0,05). A Figura 5 apresenta os dados de
freqüência de D. paulistorum nas coletas feitas em 2004 nos mesmos locais avaliados em anos
anteriores (PFA, JBO, RMT), incluso também o local PGK, avaliado por Silva et al (2005b).
Observamos que o padrão de distribuição das freqüências de D. paulistorum entre locais de
131
baixa urbanização tem se mantido constante durante o ano de 2004 (Figura 5). Entretanto,
depois de quase 20 anos, uma redução significativa da representatividade dessa espécie foi
observada em todos os ambientes estudados (Figuras 4 e 5). A análise estatística de Kruskal-
Wallis revela redução significativa de D. paulistorum no PFA (Z = 3,16, p < 0,01) no JBO (Z
= 3,24, p < 0,01) e na RMT (Z = 4,44, p < 0,01) ao longo de 2004. Chama a atenção que a
espécie havia sido anteriormente amostrada na RMT com freqüência de até 43,3% (Tabela 2).
A redução da freqüência de D. paulistorum pode estar associada a vários fatores, como
por exemplo, ao crescimento de Porto Alegre desde a década de 1980, o que alteraria os níveis
de urbanização desde sua primeira classificação por Ruszczyk (1986). Provavelmente, a área
onde está localizado o JBO, onde foram construídos novos prédios de grande porte e aberta
uma larga avenida, deva ser considerada atualmente, como um local de média urbanização,
enquanto os pontos RMT e PGK ainda seriam áreas de baixa urbanização.
Ao contrário do observado para D. paulistorum, entretanto, as possíveis alterações dos
níveis de urbanização em Porto Alegre não vêm afetando significativamente as freqüências de
D. willistoni (p > 0,05), uma vez que esta espécie ocupa igualmente os diferentes pontos de
coleta desde 1986. Dobzhansky (1965) havia comparado D. willistoni e D. paulistorum quanto
as suas capacidades de explorar novos ambientes, sugerindo que das duas, apenas a
D.willistoni, pelas suas características genéticas, teria algumas tendências para se tornar uma
espécie colonizadora. Embora essa idéia tenha sido contradita pelos dados de Santos &
Valente (1990) e Valiati & Valente (1996), obtidos quando D. paulistorum estava em franca
expansão, nossos achados atuais nos levam a reconsiderar a sugestão de Dobzhansky (1965),
já que D. paulistorum passou a ser encontrada apenas em ambientes pouco urbanizados.
132
Como D. willistoni, Z. indianus foi encontrada em todos os ambientes e recursos
tróficos estudados em Porto Alegre o que evidencia seu sucesso como invasora na cidade
(Figura 5). Ferreira & Tidon (2005), estudando o potencial de colonização de drosofilídeos em
ambientes com diferentes níveis de urbanização na cidade de Brasília, encontraram resultados
similares para Z. indianus.
Dentre os locais avaliados no presente estudo, merece especial atenção PGK, onde
foram registradas as menores freqüências de Z. indianus. Essa diferença, no entanto, apenas
foi estatisticamente significativa quando comparada com o local de maior urbanização, PFA
(Z= 3,06, p < 0,01). Dentre os locais estudados, PGK apresenta como diferencial algumas
zonas de mata fechada que poderiam justificar a redução de Z. indianus. No Brasil Central,
Tidon et al. (2003) encontraram maior abundância dessa espécie em ambientes perturbados,
limitados às regiões mais externas de matas de galeria. Recentemente, Döge (2006) observou
um claro efeito de borda em uma região de Mata Atlântica de Joinville, Estado de Santa
Catarina, onde Z. indianus permaneceu restrita a locais mais próximos dos limites da mata,
não se estabelecendo no interior da floresta. Ferreira & Tidon (2005) verificaram que a
maioria das espécies endêmicas de Drosophilidae não é capaz de colonizar ambientes urbanos,
concluindo, assim como Avondet et al. (2003), que algumas espécies dessa família podem
detectar não apenas alterações do ambiente, pela sua presença ou ausência, mas também o seu
grau de distúrbio, pela sua freqüência. Dessa forma, essas espécies atuam como eficientes
indicadores de mudanças ecológicas provocadas pela urbanização.
A Figura 6 apresenta as oscilações das freqüências de Z. indianus e do subgrupo da D.
willistoni, assim como as médias das temperaturas máximas e mínimas com seus respectivos
desvios padrões, durante as estações dos anos de 2001, 2002 e 2004 na cidade de Porto
133
Alegre. Nos anos de 2001 e 2002 a freqüência do subgrupo da D. willistoni diminuiu
significativamente (r = -0,91, p < 0,01) naquelas estações do ano em que a freqüência de Z.
indianus aumentou, o que não ocorreu, entretanto, em 2004 (r = 0,60, p > 0,05). O aumento de
Z. indianus correspondeu às estações do verão e primavera, quando as temperaturas médias
foram mais elevadas. Contudo, verifica-se que as maiores freqüências de Z. indianus estão
mais correlacionadas com as médias das temperaturas mínimas (r = 0,61, p < 0,01) do que
com as médias das máximas (r = 0,32, p > 0,05) e, quando são consideradas as temperaturas
médias, estas correlações nem sempre ocorrem. Por exemplo, somente em 2002 encontrou-se
uma correlação entre as temperaturas médias e as maiores freqüências de Z. indianus (r = 0,99,
p > 0,01). Tidon et al. (2003) não encontraram correlação de Z. indianus com as temperaturas
médias e Tidon (2006) encontrou correlação significativa, porém baixa, com esse fator em
alguns dos locais de estudo na região do Cerrado brasileiro. Assim, as temperaturas médias
não refletem o que ocorre com os extremos de temperatura (mínimas e máximas), os quais
podem ser mais críticos para as populações de drosofilídeos. Portanto, temperaturas baixas
seriam um fator limitante do tamanho populacional de Z. indianus, como ocorreu nos invernos
e, em especial, no ano de 2004, onde as temperaturas mínimas foram as menores registradas.
Do mesmo modo, as freqüências do subgrupo da D. willistoni também são influenciadas pela
temperatura na cidade de Porto Alegre. No entanto, diferentemente do verificado para Z.
indianus, esse subgrupo apresentou uma correlação negativa com as temperaturas máximas (r
= -0,72, p < 0,01), tendo as menores freqüências nas estações de temperaturas mais elevadas.
Comparando-se a proporção de D. paulistorum, D. willistoni, Z. indianus e das demais
espécies durante as estações do ano de 2004, independente do local de coleta (Figura 7),
observamos que as freqüências de D. paulistorum oscilaram pouco nas diferentes estações:
134
2,2% na primavera, 0,8% no outono, 0,2% no verão e 0,1% no inverno. Drosophila willistoni
e Z. indianus, por sua vez, atingiram suas menores freqüências (3,4% e 3,5%,
respectivamente) na primavera, e suas populações sofreram grande expansão no outono
(22,7% e 43,1%, respectivamente). Apesar disso, ao contrário de D. willistoni e Z. indianus,
em nenhuma estação obteve-se números expressivos de D. paulistorum. Estas flutuações
sazonais são comuns em comunidades de drosofilídeos frugívoros e já foram descritas por
vários autores (Dobzhansky & Pavan, 1950; Pavan, 1959; Saavedra et al., 1991; De Toni &
Hofmann, 1995; Tidon et al., 2002; Silva et al., 2005b).
Finalmente, a expressiva redução do tamanho populacional de D. paulistorum nos
últimos anos é refletida também em termos de polimorfismo para inversões cromossômicas.
No trabalho de Santos & Valente (1990), o número de inversões cromossômicas detectadas
nas populações de Porto Alegre foi de 18, e posteriormente, Valiati & Valente (1997)
constataram a presença de 23 arranjos em heterozigose, dos quais apenas seis foram
encontrados pelos primeiros autores. A análise atual do polimorfismo cromossômico das
amostras de D. paulistorum dessa cidade (Capítulo II desta Tese) revelou a presença de apenas
três inversões cromossômicas em heterozigose.
Nossos dados parecem estar apontando para uma diminuição do potencial colonizador
de D. paulistorum em Porto Alegre, evidenciada pela queda da freqüência desta espécie nos
últimos anos. Este fato pode estar relacionado com o crescimento da cidade, assim como às
retrações naturais que podem ocorrer no tamanho das populações. Estas retrações também
podem estar relacionadas a mudanças climáticas, como por exemplo, variações nas amplitudes
de temperaturas mínimas e máximas. Ainda, a presença de Z. indianus, parece contribuir com
esse quadro, uma vez essa espécie estaria modificando as interações entre as espécies
135
residentes e, como conseqüência, aumentando o contato e uma possível competição entre D.
willistoni e D. paulistorum.
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141
Tabela 1. Espécies e número total de indivíduos amostrados nos quatro pontos de coleta na cidade de Porto Alegre no ano de 2004.
Local
Espécie Autor e ano PFA JBO RMT PGK Total (%)
D. simulans Sturtevant, 1919 6896 4065 2128 372 13461 (48,1)
Z. indianus Gupta, 1970 1821 2637 1403 95 5956 (21,3)
D. willistoni
Sturtevant, 1921 709 1725 1412 519 4365 (15,6)
D. mercatorum Patterson & Wheller, 1942 627 614 104 4 1349 (4,8)
D. mediopunctata Dobzhansky & Pavan,
1943
66 88 79 302 535 (1,9)
D. immigrans
Sturtevant, 1921 108 216 188 6 518 (1,9)
D. cardinoides Dobzhansky & Pavan,
1943
317 8 19 0 344 (1,2)
D. maculifrons Duda, 1927 110 127 49 14 300 (1,1)
D. paulistorum Dobzhansky & Pavan,
1946
0 27 189 30 246 (0,9)
D. kikkawai
Burla, 1954 122 27 45 0 194 (0,7)
D. nebulosa Sturtevant, 1916 52 57 11 10 130 (0,5)
D. polymorpha Dobzhansky & Pavan,
1943
27 58 25 13 123 (0,4)
D. griseolineata Duda, 1927 19 53 11 20 103 (0,4)
D. neocardini Streisinger, 1946 16 14 26 1 57 (0,2)
D. paraguayensis Duda, 1927 0 11 6 34 51 (0,2)
D. sturtevanti
Duda, 1927 1 28 15 3 47 (0,2)
D. bandeirantorum Dobzhansky & Pavan,
1943
312126 33 (0,1)
D. nappae Vilela et al., 2004 0 8 3 16 27 (0,1)
D. paramediostriata Townsend & Wheller,
1955
71220 21 (0,1)
D. capricorni Dobzhansky & Pavan,
1943
0 0 1 18 19 (0,1)
D. parabocainensis Carson, 1954 0 1 1 17 19 (0,1)
D. cardini
Sturtevant, 1916 15 0 0 0 15 (0,1)
D. hydei Sturtevant, 1921 2 2 8 0 12 (*)
D. melanogaster Meigen, 1830 0 0 0 12 12 (*)
D. zottii Vilela, 1983 0 0 0 11 11 (*)
D. onca Sene et al., 1977 0 1 7 0 8 (*)
D. mediopicta Frota-Pessoa, 1954 0 3 1 3 7 (*)
D. meridionalis Wasserman, 1962 0 6 0 0 6 (*)
D. buzzatii Carson & Wasserman,
1965
2300 5 (*)
D. neoguaramunu Frydenberg, 1956 1 0 1 0 2 (*)
D. pallidipennis
Dobzhansky & Pavan,
1943
0101 2 (*)
D. roehrae Pipkin & Heed, 1964 0 0 0 2 2(*)
D. ananassae Doleschall, 1858 0 0 0 1 1 (*)
D. annulimana Duda, 1927 0 0 0 1 1 (*)
D. caponei Pavan & Da Cunha, 1947 0 1 0 0 1 (*)
D. malerkotliana Parshad & Paika, 1964 0 0 1 0 1 (*)
D. ornatifrons Duda, 1927 0 0 0 1 1 (*)
Total (%) 10921
(39,0)
9805 (35,0) 5747 (20,5) 1512
(5,4)
27985
PFA - Parque Farroupilha; JBO - Jardim Botânico; RMT - Rua Mário Totta; PGK - Parque Gabriel Knijnik.
(*) freqüência menor que 0,1%
142
143
144
11,0%
13,4%
1,4%
22,0%
3,3%
20,2%
26,0%
67,0%
83,0%
52,0%
**
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
100%
1986-87 1991-92 2004
N = 5644 N = 24514 N = 15552
Períodos
Freqüência
D. paulistorum
D. willistoni
Z. indianus
outras espécies de drosofilídeos
Figura 1.
Freqüências médias de
D. paulistorum
,
D. willistoni
,
Z. indianus
e demais espécies d
e
drosofilídeos coletados nos locais JBO e RMT em três períodos: de 1986 a 1987 (Santos &
Valente, 1990); de 1991 a 1992 (Valiati & Valente, 1996) e no ano de 2004 (presente estudo).
N = número total de indivíduos. * não ocorrência de
Z. indianus
no Sul do Brasil.
145
Figura 2. Freqüências médias dos subgrupos D.melanogaster e D. willistoni juntamente com Z. indianus e demais
espécies de drosofilídeos durante os anos de 1986 a 2004 na cidade de Porto Alegre, independente de local,
estação do ano e recurso trófico. N = número total de indivíduos. *não ocorrência de Z. indianus no Sul do Brasil.
** autores não identificam as espécies do subgrupo D. melanogaster.
*
*
*
**
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
100%
1986-87
N = 5644
1991
N = 28234
1992
N = 13275
2001
N = 18543
2002
N = 30066
2004
N = 27985
Períodos
Freqüência
outras espécies de drosofílideos
subgrupo D.melanogaster
subgrupo D. willistoni
Zaprionus indianus
146
Figura 3.
Freqüências médias do subgrupo da D. willistoni no período de 1986 a 2004 e as freqüências d
e
D. paulistorum e D. willistoni entre os anos de 1986 a 1992 e no ano de 2004 na cidade de Porto Alegre,
independente de local, estação do ano e recurso trófico. N = número total de indivíduos. *autores não
diferenciaram as espécies crípticas do subgrupo D. willistoni.
*
*
0%
5%
10%
15%
20%
25%
30%
35%
1986-87
N = 5644
1991
N = 28234
1992
N = 13275
2001
N = 18543
2002
N = 30066
2004
N = 27985
Períodos
Freqüênci
a
D. paulistorum
D. wilistoni
subgrupo
D. willistoni
147
Figura 4. Freqüência médias de
D. paulistorum
e
D. willistoni
durante os anos de 1986 a 1992 em três
locais (PFA, JBO e RMT) da cidade de Porto Alegre, independente de estação do ano e recurso
trófico. N.U. = nível de urbanização.
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
100%
1991 1992 1986 1991 1992 1987 1991 1992
PFA JBO RMT
Alto (N.U.) Baixo (N.U.) Baixo (N.U.)
Freqüência
D. paulistorum
D. willistoni
148
Figura 5. Médias e desvios das freqüências de
D. willistoni
,
D. paulistorum
e
Z. indianus
no ano
de 2004 em quatro locais da cidade de Porto Alegre, independentemente da estação do ano e do
recurso trófico. N.U. = nível de urbanização.
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
100%
PFA JBO RMT PGK
Alto (N.U.) Baixo (N.U.) Baixo (N.U.) Baixo (N.U.)
Freqüência e Desvio Padrão
D. paulistorum
D. willistoni
Z. indianus
149
Figura 6. Freqüências médias do subgrupo da
D. willistoni
e
da espécie
Z. indianus,
e as médias das temperaturas
máximas e mínimas, com seus desvios, em onze estações nos anos de 2001, 2002 e 2004, na cidade de Porto Alegre.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Verão Outono Inverno Primavera Verão Outono Inverno Verão Outono Inverno Primavera
2001 2002 2004
0
5
10
15
20
25
30
35
40
subgrupo D. willistoni
Zaprionus indianus
média das máximas
média das mínimas
Freqüências
Temperaturas
%
150
Figura 7. Freqüência de
D. paulistorum
,
D. willistoni
,
Z. indianus
e outras espécies durante as
quatro estações do ano de 2004 nos quatro pontos de estudos na cidade de Porto Alegre. N =
número total de indivíduos.
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
100%
Verão Outono Inverno Primavera
N = 6832 N = 8132 N = 5261 N = 7760
Estações 2004
Freqüência
outras espécies de drosofilídeos
Z. indianus
D. willistoni
D. paulistorum
151
CAPÍTULO VII
First evidence of Drosophila malerkotliana in the extreme South of Brazil (Porto Alegre,
Rio Grande do Sul, Brazil)
Ana Cristina Lauer Garcia, Marco S. Gottschalk, Grazia F. Audino, Cláudia Rohde,
Victor H. Valiati and Vera L.S. Valente
Trabalho publicado na revista Drosophila Information Sevice
152
ARTIGO EM ANEXO (PDF)
153
ARTIGO EM ANEXO (PDF)
154
ARTIGO EM ANEXO (PDF)
155
CAPÍTULO VIII
DISCUSSÃO GERAL, CONCLUSÕES E PERSPECTIVAS
Nos últimos anos, vários trabalhos têm sido feitos por nosso grupo de pesquisa no
Laboratório de Drosophila da UFRGS dentro de um projeto maior que consiste em estudar a
evolução cromossômica do subgrupo da D. willistoni. Tal projeto baseia-se no fato de que os
padrões de bandas dos cromossomos politênicos são espécie-específicos e que as diferenças
observadas entre as populações são resultantes da ocorrência de inversões cromossômicas,
consideradas eventos raros, porém bastante distribuídas em Drosophila. Nesse sentido, a
homologia cromossômica entre D. willistoni e D. paulistorum foi primeiramente avaliada por
Garcia e colaboradores (Dissertação de Mestrado, Garcia 2002), que concluíram que ambas
espécies são bastante divergentes cromossomicamente. Durante o presente trabalho, foi dada
seqüência a esses estudos, avaliando, sob o enfoque cromossômico, as divergências evolutivas
entre as semi-espécies de D. paulistorum para os autossomos (Capítulos III e IV). Nossos
resultados revelaram a proximidade evolutiva entre as semi-espécies, com poucas inversões
fixadas envolvidas na diferenciação dos arranjos cromossômicos. No entanto, esses arranjos
possibilitam que cada semi-espécie seja reconhecida pelo padrão cromossômico dos
cromossomos politênicos, exceto entre Andino-Brasileira e a Orinocana, homoseqüenciais
para todos os braços (Capítulo III). O conhecimento do padrão de bandas cromossômicas das
semi-espécies abre novas possibilidades de estudo no sentido de verificar qual o papel dos
156
rearranjos cromossômicos no processo de especiação. O estudo da evolução do braço
cromossômico IIR entre as espécies do subgrupo da D. willistoni, incluindo as semi-espécies
de D. paulistorum, foi conclusivo no sentido de apresentar uma filogenia desse subgrupo
(Capítulo IV) que se revelou compatível com estudos realizados com outros marcadores
(Spassky 1971, Ayala 1975, Gleason et al. 1998, Tarrio et al. 2000). O polimorfismo
cromossômico da semi-espécie Andino-Brasileira, a de mais ampla distribuição geográfica
dentre as semi-espécies, também foi estudado. O primeiro obstáculo enfrentado para essa
investigação foi a dificuldade de estabelecer homologia entre os arranjos detectados nos
cromossomos politênicos dos indivíduos das nossas populações, com os descritos e
disponíveis na literatura. Como único material de referência para a identificação dos
cromossomos de D. paulistorum, dispúnhamos, até então, de um mapa desenhado em câmara
clara elaborado por Kastritsis (1966b), além de algumas figuras de inversões detectadas no
estado heterozigoto (Dobzhansky e Pavlovsky 1962, Kastritsis 1966b, 1967, 1969b, Santos e
Valente 1990, Valiati e Valente 1997). Nessa etapa foi fundamental a confecção do primeiro
fotomapa para a semi-espécie Andino-Brasileira (Capítulo II). Nosso fotomapa permitiu uma
definição mais acurada das diferentes regiões cromossômicas e, com a divisão dos
cromossomos em seções e subseções, foi possível a descrição detalhada dos pontos de quebra
das inversões encontradas. A análise de diferentes populações geográficas permitiu a detecção,
pela primeira vez para D. paulistorum, de arranjos cromossômicos presentes no estado
homozigoto. Nossos resultados discordaram da observação de Kastritsis (1969b) de que a D.
paulistorum seria o drosofilídeo mais polimórfico do gênero Drosophila. Vale salientar que o
número de 85 inversões descritas pelo autor levou em consideração as configurações
cromossômicas de híbridos produzidos a partir dos cruzamentos entre as diferentes semi-
157
espécies. No entanto, quando apenas o polimorfismo da semi-espécie Andino-Brasileira foi
analisado, o autor registrou a presença de 13 inversões (Kastritsis 1967), um número próximo
das 10 encontradas durante nosso estudo. O número de inversões cromossômicas da Andino-
Brasileira, portanto, pode ser considerado baixo quando comparado às quase 50 inversões
descritas por Rohde (2000) para diferentes populações de D. willistoni. Um ponto em comum
entre nosso estudo e os trabalhos de Kastritsis (1966b, 1967, 1969b) foi o fato de detectarmos
o cromossomo III como o mais polimórfico: das dez inversões por nós encontradas, sete estão
localizadas neste cromossomo. A concentração de rearranjos em um determinado braço de um
conjunto cromossômico ocorre em populações naturais de muitas espécies, tais como a D.
pseudoobscura e D. persimilis (Dobzhansky 1944), D. nebulosa (Pavan 1946), D.
mediopunctata (Ananina et al. 2002) entre outras. Em nosso estudo não foram encontradas
inversões no cromossomo II (braços IIL e IIR), o que em parte foi também registrado por
Kastritsis (1967), que não encontrou nenhuma inversão no braço IIR e apenas duas no IIL da
semi-espécie Andino-Brasileira.
O uso conjunto dos três índices de polimorfismo cromossômico e o análise das
freqüências das inversões (tanto homozigotas quanto heterozigotas), consideradas pela
primeira vez para D. paulistorum, permitiu a detecção mais precisa das variações genéticas
entre as populações naturais avaliadas. No entanto, conclusões mais definitivas sobre o
número de inversões cromossômicas presentes em D. paulistorum, assim como novos avanços
nos estudos de evolução cromossômica, dependem da obtenção de novas populações de todas
as semi-espécies.
Apesar da existência de um número razoável de trabalhos enfocando aspectos
ecológicos com o subgrupo da D. willistoni (Tidon et al. 1994, De Toni e Hofmann 1995,
158
Saavedra et al. 1995, Vilela e Mori 1999, Valiati e Valente 1996; Martins 2001; Medeiros e
Klaczko 2004; Silva et al. 2005a,b, entre outros) poucos são aqueles em que os indivíduos
desse subgrupo são identificados ao nível de espécie (Vilela e Mori 1999, Valiati e Valente
1996, Medeiros e Klaczko 2004). Isso pode ser facilmente entendido devido à extrema
semelhança morfológica dessas espécies e ao fato de que muitas delas ocorrem em simpatria
em grande parte da sua distribuição geográfica. Outro ponto a destacar é a abundância das
espécies do subgrupo da D. willistoni na região Neotropical,. Estudos recentes referentes à
estrutura populacional e ecologia de espécies de Drosophila têm demonstrado que esse
subgrupo pode representar até 80% dos espécimes coletados na região Amazônica (Martins
2001). Em vista dessa dificuldade, apresentamos um método eficiente e rápido para a
identificação das espécies do subgrupo da D. willistoni, baseado na migração eletroforética da
enzima Fosfatase ácida-1 (Acph-1) que apresenta alelos diagnósticos para cada uma dessas
espécies (Capítulo V). Embora Ayala e seus colaboradores tenham estudado o padrão de
variação geográfica de um amplo número de enzimas, neste grupo de moscas (Ayala et al.
1970, Ayala et al. 1971, Ayala et al. 1972a, b, Ayala e Powell 1972a, b, Ayala e Tracey 1973,
Ayala e Tracey 1974, Ayala et al. 1974a, b, c, Ayala 1975), nenhum dos 36 loci investigados
foi espécie-espécifico. A enzima Fosfatase ácida-1 também foi investigada para esse
propósito, mas em contraste com nossos resultados, os autores encontraram alelos
compartilhados entre mais que uma espécie do subgrupo da D. willistoni. Acreditamos que a
razão do nosso sucesso em distinguir de maneira eficaz essas espécies, pode ser explicada pela
diferença na metodologia empregada por nós, tais como o tipo e concentração do gel, bem
como o pH do gel e do tampão. Além disso, os resultados se baseiam na análise de um
expressivo número amostral: 26 populações de D. willistoni (totalizando 5.059 isolinhagens),
159
21 populações de D. paulistorum (totalizando 842 isolinhagens) e demais populações das
espécies D. equinoxialis (699 indivíduos), D. tropicalis (127 indivíduos) e D. insularis (132
indivíduos). A identificação das espécies foi corroborada pela análise do padrão de bandas dos
cromossomos politênicos e pela análise da genitália dos machos (dados não apresentados).
Trabalhos ecológicos de identificação do subgrupo da D. willistoni, ao nível de
espécie, são fundamentais para a compreensão da dinâmica populacional desses drosofilídeos.
Um acompanhamento das oscilações da freqüência da semi-espécie Andino-Brasileira e da
espécie D. willistoni, que vivem em simpatria na cidade de Porto Alegre, sul do Brasil, vem
sendo feito nos últimos anos por nosso grupo de pesquisa. Esses trabalhos demonstraram que
D. paulistorum iniciou com sucesso a colonização do ambiente urbano a partir do ano de
1985, atingindo seu pico de freqüência no ano de 1992. Dentre as razões apontadas para tal
sucesso estaria a repartição de nichos de alimentação e ovoposição entre D. paulistorum e D.
willistoni, o que evitaria a competição entre as duas espécies (Santos e Valente 1990, Valiati e
Valente 1996). Dentro desse quadro surgiu a necessidade de traçar o panorama histórico da
ocupação de D. paulistorum na cidade de Porto Alegre, quase vinte anos depois de seu
primeiro registro nesse ambiente (Capítulo V). A partir de coletas sistemáticas de
drosofilídeos realizadas durante as quatro estações ano de 2004, em diferentes locais da
cidade, foi verificado um acentuado decréscimo na freqüência de D. paulistorum. Enquanto a
freqüência da espécie durante os anos de 1986-87 e em 1992 era de 11% e 13%
respectivamente, em 2004 esse número caiu para apenas 1,4%. A entrada da espécie invasora
Zaprionus indianus na cidade de Porto Alegre, no ano 2000 (Castro e Valente 2001), poderia
estar relacionada com esta redução de freqüência. As coletas realizadas em 2004 revelaram um
compartilhamento de recursos tróficos pela D. paulistorum e pela D. willistoni o que poderia
160
ser resultante do grande oportunismo na utilização dos recursos disponíveis pela Z. indianus.
Dentre os 14 recursos tróficos avaliados, Z. indianus apenas não foi encontrada em um deles.
O oportunismo da invasora poderia ser o responsável pelo deslocamento de D. willistoni para
nichos onde D. paulistorum apresentava preferências no passado e que teriam propiciado o
sucesso de sua colonização do ambiente urbano até a entrada de Z. indianus. Desse modo,
atualmente, Z. indianus poderia ser a responsável indireta por uma provável competição entre
D. paulistorum e D. willistoni. Nossa sugestão poderá vir a ser confirmada a partir de testes de
competição larval entre essas espécies.
Outro resultado possibilitado pela coleta de drosofilídeos na região de Porto Alegre foi
a análise do polimorfismo cromossômico da semi-espécie Andino-Brasileira e a comparação
com os estudos prévios. Durante 1986-87 foram registradas 18 inversões cromossômicas para
as populações da cidade de Porto Alegre. Alguns anos mais tarde, durante os anos de 1991-92,
esse número chegou a 23. Os resultados desses estudos contrastam com o presente trabalho
quando foram registradas apenas três inversões (Capítulo II). A expressiva redução
populacional de D. paulistorum poderia explicar a alteração desse quadro, por efeito de deriva
genética. Apenas as inversões mais freqüentes estariam ainda presentes nos cromossomos da
espécie. Nossos resultados se encaixam no modelo central-marginal da biologia evolutiva
(revisão em Brussard 1984), o qual prediz que populações marginais do ponto de vista
geográfico e ecológico, seriam isoladas, esparsas e cromossomicamente monomórficas (Mayr
1963, Lewontin e Hubby 1966), como é o caso da D. paulistorum em Porto Alegre.
Durante as coletas realizadas no outono de 2004, foi encontrada, pela primeira vez na
cidade de Porto Alegre, a espécie invasora Drosophila malerkotliana (Capítulo VII). Nosso
achado corresponde ao ponto mais meridional registrado para essa espécie. Apenas um
161
indivíduo macho emergiu de frutos de maracujá (Passiflora sp.) dentre os muitos frutos
fermentados que foram coletados. A observação de que D. malerkotliana está explorando um
recurso natural em um ambiente urbano pode ser uma evidência de que esta mosca está ainda
estendendo sua distribuição geográfica no Brasil. Até nosso estudo, o limite geográfico mais
ao sul para a espécie era o Estado de Santa Catarina, na Lagoa da Conceição (27°42`S) (De
Toni e Hofmann, 1995). O quanto as populações dessa espécie serão capazes de se
expandirem e quais as conseqüências desse drosofilídeo para as comunidade de nativas é
matéria para estudos futuros.
162
RESUMO
Drosophila paulistorum, como os outros membros do subgrupo willistoni de
Drosophila, pertence ao subgênero Sophophora, habitando uma área que se estende desde a
Guatemala e Trinidad (Antilhas) até o sul do Brasil. Em muitas partes da América sul tropical,
essa é a segunda espécie mais abundante do subgrupo da D. willistoni, composto por seis
espécies crípticas: D. willistoni, D. paulistorum, D. tropicalis, D. equinoxialis, D. insularis e
D. pavlovskiana. O trabalho de Dobzhansky e Spassky (1959) demonstrou que D. paulistorum
é, na verdade, uma superespécie composta de seis semi-espécies: Andino-Brasileira,
Amazônica, Centro-Americana, Interior, Orinocana e Transicional. Linhagens dessas
diferentes semi-espécies cruzam com dificuldade, e quando híbridos F1 são produzidos, as
fêmeas são férteis e os machos são estéreis. O fato de D. paulistorum ser composta por semi-
espécies deixa esse drosofilídeo em posição de destaque para realização de estudos evolutivos.
Nas últimas décadas, membros do nosso grupo de pesquisa têm feito vários estudos sobre a
evolução cromossômica do subgrupo da D. willistoni. Tal projeto baseia-se no fato de que o
padrão de bandas dos cromossomos politênicos é espécie-específico e que as diferenças
observadas entre as espécies são resultantes da ocorrência de inversões cromossômicas.
Através da identificação dos pontos de quebras das inversões, feito sobre os fotomapas
cromossômicos das espécies e semi-espécies, é possível estabelecer uma filogenia e inferir os
eventos de reorganização cariotípica que resultaram na evolução cromossômica entre espécies
próximas.
Inicialmente, apresentamos o primeiro fotomapa de referência dos cromossomos
politênicos da semi-espécie Andino-Brasileira de D. paulistorum, em substituição ao mapa
163
desenhado de Kastritsis (1966), juntamente com a análise do polimorfismo cromossômico de
populações de diferentes origens geográficas (Capítulo II). A partir desta investigação, foi
possível avaliar a divergência evolutiva entre as semi-espécies de D. paulistorum com base
nos arranjos e inversões presentes nos cromossomos II e III (Capítulo III). Nesse estudo foi
detectada pouca reorganização cromossômica entre as semi-espécies, o que confirma que a
relação evolutiva entre elas é mais próxima do que a encontrada nas demais espécies do
subgrupo da D. willistoni. Na seqüência, apresentamos os resultados do estudo da evolução do
braço cromossômico IIR entre as espécies do subgrupo da D. willistoni (Capítulo IV).
Todos esses resultados demonstram que os cromossomos politênicos são ainda
excelentes marcadores, capazes de esclarecer a respeito dos diferentes níveis de
relacionamento filogenético entre os membros desse subgrupo, composto por semi-espécies,
subespécies e espécies crípticas.
Embora muitos trabalhos sobre ecologia de espécies Neotropicais de Drosophila sejam
encontrados na literatura, poucos são os estudos em que indivíduos do subgrupo da D.
willistoni são distinguidos ao nível de espécie. Isso provavelmente se deve à extrema
semelhança morfológica das espécies e ao fato de que ocorrem em simpatria em grande parte
da distribuição geográfica das espécies. Nossa contribuição para superar esta dificuldade foi
estabelecer um método eficiente e rápido para a identificação das espécies do subgrupo da D.
willistoni, baseado na migração eletroforética da enzima Fosfatase ácida-1 (Acph-1), que
apresenta alelos diagnósticos para cada uma das espécies (Capítulo V).
No Capítulo VI apresentamos os resultados do estudo ecológico de alguma populações
urbanas da semi-espécie Andino-Brasileira de D. paulistorum, na cidade de Porto Alegre, Sul
do Brasil, vinte anos após a sua detecção neste tipo de ambiente. Este estudo decorreu das
164
observações feitas quando se foi a campo coletar amostras recentes de D. paulistorum e se
observou profundas modificações na fauna urbana de Drosophilidae em relação a trabalhos
feitos em décadas anteriores. Foram avaliadas as oscilações das freqüências de D.
paulistorum, das espécies nativas e das espécies de Drosophilidae invasoras, em coletas
sazonais feitas durante o ano de 2004. Os resultados indicam que D. paulistorum colonizou
com sucesso o ambiente urbano de Porto Alegre entre os anos de 1986 e 1987, atingindo um
pico de freqüência provavelmente em 1992. Entretanto, em 2004, ou em anos próximos, essa
espécie sofreu um decréscimo acentuado de sua abundância, provavelmente devido às
alterações na composição das espécies, como o caso da introdução da invasora Zaprionus
indianus. Por fim, no Capítulo VII apresentamos o registro mais meridional da espécie
invasora Drosophila malerkotliana, na cidade de Porto Alegre, sul do Brasil.
165
ABSTRACT
Drosophila paulistorum, like the other members of the subgroup willistoni of
Drosophila, forms part of the subgenus Sophophora, which flourishes in an extensive area
extending from Guatemala and Trinidad (Antilles) to the South of Brazil. In various parts of
tropical South America, it is the second most abundant species in the D. willistoni subgroup,
and includes six sibling species: D. willistoni, D. paulistorum, D. tropicalis, D. equinoxialis,
D. insularis and D. pavlovskiana. However in a study by Dobzhansky and Spassky (1959)
they demonstrated that D. paulistorum itself is, in fact, a superspecies composed by six semi-
species: Andean-Brasilian, Amazonian, Centro-American, Interior, Orinocana e Transitional.
Strains of such different semi-species rarely interbreed and on the rare occasions when hybrids
are produced, the F1 females commonly are fertile and the males are sterile. The fact that D.
paulistorum is a superspecies, makes this fly a prime candidate for evolutionary studies. In the
last few decades, members of our research group have made several studies of the
chromosomal evolution of the Drosophila willistoni subgroup, as part of a much larger
project. This project was based on the regularity and species-specificity of the banding
patterns of larval polytene chromosomes and on the fact that the differences observed between
species resulted from different chromosomal inversions. Through the identification of the
breaking points of inversions, suitably placed over polytene chromosome photomaps of the
species and semispecies, it is possible to establish a phylogeny and to deduce the putative
events of karyotype reorganization resulting in the chromosomal evolution among related
species.
166
Initially, we present the first reference photomap of the chromosomes of the Andean-
Brazilian semispecies of D. paulistorum, as an improvement over the camera lucida reference
map drawn by Kastritsis in his 1966 study, as well as the analysis of the chromosomal
polymorphism of populations from different geographic origin (Chapter II). These findings
permit evaluation of the evolutionary divergence between the semi-species of D. paulistorum
as far as the arrangements and inversions present in chromosomes II and III (Chapter III) are
concerned. In the present study we detected an occurrence of small chromosomal
reorganization between the semi-species, which confirms that the evolutionary relationship
between them is closer than those found in the sibling species of the D. willistoni subgroup.
Subsequently, we demonstrate the results of the evolution of the chromosomal arm IIR
between species of the D. willistoni subgroup (Chapter IV).
All those findings show that the polytene chromosomes are indeed excellent markers,
and can provide considerable information on all levels of phylogenetic relationships between
the members of this subgroup, and its semispecies, subspecies and sibling species.
Although many ecological studies on the neotropical species of Drosophilidae are
reported in the literature, not many distinguish the individuals of each D. willistoni subgroup
at the species level. This is most probably due to the great, morphologic similarity of the
species and to the fact that they live in sympatry in extensive areas of the geographical
distribution of this species. To assist in the resolution of this difficulty, we demonstrate a rapid
and efficient method of identifying the sibling species of the D. willistoni subgroup, based on
the electrophoretic migration of the Acid phosphatase-1 (Acph-1) enzyme, with diagnostic
alleles for each species (Chapter V).
167
In Chapter VI, we present the results of the ecological study of some urban populations
of the Andean-Brazilian semispecies of D. paulistorum collected in the city of Porto Alegre,
South Brazil, twenty years after this semi-species had first been detected in this type of
environment. This approach was taken because of observations made while endeavoring to
sample recent populations of D. paulistorum - during the process we noted that major
modifications in the urban fauna of Drosophilidae, had occurred since the first studies were
performed some decades ago. The changes of the frequency of occurrence of D. paulistorum,
of the remaining native species and of the invader species of Drosophilidae, were recorded in
seasonal samplings during 2004. The results suggested that D. paulistorum had successfully
colonized the Porto Alegre urban environment around 1986 and1987 and attained its
frequency peak probably in 1992. However, around the year of 2004, this species suffered a
marked decrease in its abundance, probably due to alterations in the make-up of the urban
assemblies of species due to events such as the introduction of the Zaprionus indianus invader.
Finally, in Chapter VII, we document the most southerly finding to date of the invader species
Drosophila malerkotliana in Porto Alegre city, South of Brazil.
168
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