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Universidade Federal do Rio Grande do Sul
Instituto de Ciências Básicas da Saúde
Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas:
Bioquímica
Aumento da Atividade da MMP-2 Induzido por Tratamento com
Retinol e Ácido Retinóico em Células de Sertoli Cultivadas
Rodrigo Juliani Siqueira Dalmolin
Orientador: Prof. Dr. José Cláudio Fonseca Moreira
Dissertação apresentada ao
programa de Pós-Graduação em
Ciências Biológicas: Bioquímica da
Universidade Federal do Rio
Grande do Sul como requisito para
a obtenção do Grau de Mestre em
Ciências Biológicas – Bioquímica.
Porto Alegre
2008
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Retinol, Ácido Retinóico e MMP-2
Aos meus pais, com carinho e saudades.
I
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Retinol, Ácido Retinóico e MMP-2
Agradecimentos
Aos meus familiares, que são o que tenho de mais sólido.
Ao meu orientador, pela amizade, pela infinita paciência e pelos impagáveis
ensinamentos.
A todos os colegas do laboratório 32, pelas diversas contribuições ao longo destes anos
de convívio.
Aos professores do Departamento de Bioquímica da UFRGS, pelos valiosos
ensinamentos.
Aos funcionários do Departamento de Bioquímica, pela sempre prestativa ajuda.
À Universidade Federal do Rio Grande do Sul e ao Departamento de Bioquímica, pela
formação proporcionada.
Ao Prof. Dr. José Carlos Germani, pela compreensão durante meu primeiro ano de
mestrado.
Ao CNPq, CAPES, FAPERGS, PROPESQ-URGS, pelo apoio financeiro.
Especialmente à minha esposa Joana, pela compreensão, carinho, amor, paciência e
discussões bioquímicas proporcionadas.
II
Retinol, Ácido Retinóico e MMP-2
Índice
PARTE I......................................................................................................................................................1
RESUMO ....................................................................................................................................................2
ABSTRACT................................................................................................................................................3
LISTA DE ABREVIATURAS...................................................................................................................4
INTRODUÇÃO..........................................................................................................................................6
VITAMINA A.............................................................................................................................................6
Retinol.................................................................................................................................................7
Ácido Retinóico...................................................................................................................................8
ESPÉCIES REATIVAS DE OXIGÊNIO ...........................................................................................................9
METALOPROTEINASES DE MATRIZ .........................................................................................................11
CÉLULA DE SERTOLI...............................................................................................................................13
OBJETIVOS.............................................................................................................................................14
OBJETIVO GERAL ...................................................................................................................................14
OBJETIVOS ESPECÍFICOS.........................................................................................................................14
PARTE II..................................................................................................................................................15
RETINOL AND RETINOIC ACID INCREASE MMP-2 ACTIVITY BY DIFFERENT
PATHWAYS IN CULTURED SERTOLI CELLS................................................................................16
PARTE III.................................................................................................................................................27
DISCUSSÃO.............................................................................................................................................28
CONCLUSÕES ........................................................................................................................................36
REFERÊNCIAS.......................................................................................................................................37
Retinol, Ácido Retinóico e MMP-2
PARTE I
Retinol, Ácido Retinóico e MMP-2
Resumo
Espécies reativas de oxigênio (ROS) têm sido descritas como potenciais causadoras de
doenças como aterosclerose, artrite e câncer. Falhas na regulação das metaloproteinases
de matriz (MMP), uma família de proteases que degradam matriz extracelular, parecem
estar intimamente relacionadas com essas mesmas doenças. Além disso, autores
sugerem uma relação entre a atividade das MMPs e ROS. Em trabalhos anteriores,
nosso grupo de pesquisa demonstrou que o tratamento com retinol 7 µM foi capaz de
induzir mudanças no metabolismo de células de Sertoli cultivadas, como o aumento da
atividade de enzimas antioxidantes, aumento do dano oxidativo a biomoléculas,
ativação de ERK1/2 MAPK, alteração do ciclo celular e transformação pré-neoplásica,
ligando o tratamento com retinol ao estresse oxidativo. No presente trabalho, nós
utilizamos a técnica de zimografia para verificar a atividade da MMP-2 em células de
Sertoli tratadas com retinol e ácido retinóico. Nós encontramos que tanto o tratamento
por 24 horas com retinol 7 μM, quanto o tratamento por 24 horas com ácido retinóico 1
nM, aumentaram a atividade da MMP-2 em células de Sertoli cultivadas. O co-
tratamento com diferentes antioxidantes reverteu o aumento da atividade da MMP-2
induzido por retinol, mas não por ácido retinóico. Além disso, o tratamento com retinol,
mas não com ácido retinóico, foi capaz de aumentar a produção de ROS quantificada
pela oxidação de DCFH-DA. Nós encontramos também que tanto o tratamento com
retinol quanto com ácido retinóico foram capazes de aumentar a fosforilação de
ERK1/2. Entretanto, somente o aumento da atividade da MMP-2 induzido por
tratamento com retinol foi inibido por co-tratamento com UO126, um potente inibidor
de fosforização de ERK1/2. Nossos resultados sugerem que o aumento da atividade da
MMP-2 induzido por retinol, mas não por ácido retinóico, está relacionado com a
fosforilação de ERK1/2 e com a geração de ERO.
2
Retinol, Ácido Retinóico e MMP-2
Abstract
Reactive oxygen species (ROS) have been hypothesized to play a causative role in
numerous diseases such as atherosclerosis, arthritis and cancer. Failures in the
regulation of the matrix metalloproteinases (MMP), a family of extracellular matrix-
degrading proteases, appear to be intimately involved in these diseases. In addition,
authors suggest a relationship between MPP activity and ROS. In early reports our
research group has demonstrated that 7 μM retinol was able to induce changes in Sertoli
cell metabolism, such as up-regulation of antioxidant enzyme activities, increase in
oxidative damage to biomolecules, activation of ERK1/2 MAPK, cell-cycle alteration
and pre-neoplasic transformation, linking retinol treatment and oxidative stress. Here,
we verify the MMP activity in cultured Sertoli cells treated with vitamin A using gelatin
zymography. We found that both retinol (7 μM by 24 hours) and retinoic acid (1 nM by
24 hours) treatments induces MMP-2 activity in cultured Sertoli cells. Antioxidants co-
treatment reversed retinol-induced but not retinoic acid-induced MMP-2 activity.
Moreover, retinol but not retinoic acid treatment increased ROS production quantified
by DCFH-DA oxidation. We found that both retinol and retinoic acid treatment induced
ERK1/2 phosphorylation. However, only retinol-increased MMP-2 activity was
inhibited by UO126, a potent ERK1/2 phosphorylation inhibitor. Our results suggested
that the increase on MMP- 2 activity induced by retinol, but not by retinoic acid, was
related to ERK1/2 phosphorylation and ROS production.
3
Retinol, Ácido Retinóico e MMP-2
Lista de abreviaturas
ADH: álcool desidrogenase
ALDH: aldeído desidrogenases
AP-1: proteína ativadora-1
AR: ácido retinóico
CAT: catalase
CREB: proteína de ligação ao elemento responsivo a AMP cíclico
DCFH-DA: 2’,7’-diclorodihidrofluoresceina diacetato
DTT: ditiotreitol
ECM: matriz extracelular
EGF: fator de crescimento da epiderme
ERK1/2: cinases extracelulares reguladas por sinal 1 e 2
FGF2: fator de crescimento de fibroblastos 2
GPx: glutationa peroxidase
GSH: glutationa reduzida
MAPK: proteína cinase ativadora de mitógeno
MMP: metaloproteinases de matriz
MMP-2: metaloproteinase de matriz do tipo 2
NAC: N-acetil-cisteina
O
2
•-
: radical superóxido
ODC: ornitina decarboxilase
OH
•
: radical hidroxil
PDGF: fator de crescimento derivado de plaquetas
RAR: receptor de ácido retinóico
4
Retinol, Ácido Retinóico e MMP-2
RARE: elemento responsivo a ácido retinóico
ROS: espécies reativas de oxigênio
RXR: receptor de retinóides x
SOD: superóxido dismutase
5
Retinol, Ácido Retinóico e MMP-2
Introdução
Vitamina A
O termo vitamina A é usado genericamente para descrever os retinóides que apresentam
qualitativamente atividade biológica semelhante ao retinol (all-trans retinol), incluindo
este. A vitamina A controla a diferenciação de várias células epiteliais além de ser
fundamental para diversos processos celulares, como visão, crescimento e reprodução.
As principais fontes dietéticas de retinóides naturais são encontradas na forma de
ésteres de retinol, presentes no tecido adiposo e no fígado de animais. Além disso, os
carotenóides (principalmente o β-caroteno) presentes em grandes quantidades nós
vegetais amarelos e verdes, atuam como provitamina A. Os ésteres de retinol ingeridos
são hidrolizados a retinol por uma enzima hidrolase presente na luz do intestino. Tanto
o retinol quanto os carotenóides são prontamente absorvidos pela mucosa intestinal.
Uma vez absorvidos, os retinóides são incorporados aos quilomicrons para serem
transportados para o fígado e, em menor grau, testículos, pulmão, rins, tecido adiposo e
músculo esquelético (Roos et al., 1998). A vitamina A é estocada principalmente na
forma de ésteres de retinol, particularmente palmitato. O fígado é o principal, porém não
necessariamente o único local de estocagem. O retinol representa o mais abundante
retinóide presente no sangue e o ácido retinóico representa o retinóide mais
hormonalmente ativo (Fig.1) (Napoli, 1999).
Estudos têm descrito uma ação protetora da vitamina A em diversas doenças,
relacionando à sua capacidade de neutralizar formas tóxicas de oxigênio e outros
radicais livres em sistemas biológicos (Palace et al., 1999). Além disso, é bem descrito a
função fisiológica dos retinóides em diversos processos celulares como divisão e
6
Retinol, Ácido Retinóico e MMP-2
diferenciação. Por outro lado, trabalhos anteriores de nosso grupo de pesquisa
demonstraram que a suplementação com retinol causa dano a biomoléculas (Dal Pizzol
et al., 2000; de Oliveira et al., 2005; Moreira et al., 1997), aumento da atividade de
enzimas antioxidantes (Dal Pizzol et al., 2001a; de Oliveira et al., 2007; Palace et al.,
1999), transformação pré-neoplásica (Klamt et al., 2003) e ativação de rotas de
sinalização (Gelain et al., 2006).
Retinol
O retinol é convertido no fígado e em outros tecidos a ácido retinóico (AR). A rota mais
bem estabelecida de metabolização envolve a conversão reversível de retinol a retinal
que, por sua vez, é irreversivelmente convertido a ácido retinóico. A conversão
oxidativa de retinol a retinal é mediada pela família de enzimas microssomais álcool
dehidrogenases (ADH), enzimas que utilizam NAD
+
como cofator, gerando NADH. O
passo subseqüente, a conversão de retinal a AR, é mediada pela ação das enzimas
aldeído dehidrogenase (ALDH) e por isoenzimas da família P450 (CYP) (Wang, 2005).
Diversos autores relacionam os efeitos biológicos dos retinóides à sua conversão
a ácido retinóico que, por sua vez, agiria através da interação com receptores nucleares,
modulando a expressão gênica. Porém, diversos trabalhos têm demonstrado que os
retinóides possuem ações biológicas que não envolvem sua interação com receptores
nucleares (Clifford et al., 1999). Nosso grupo de pesquisa tem demonstrado que o
retinol é capaz de modular rotas de sinalização redox-dependentes (Gelain et al., 2006),
bem como a atividade de diversas enzimas (Dal Pizzol et al., 2000; Dal Pizzol et al.,
2001a; Klamt et al., 2000), através de modificações no status redox celular.
7
Retinol, Ácido Retinóico e MMP-2
Ácido Retinóico
A relativamente pequena e simples molécula de ácido retinóico pode regular a
expressão de múltiplos genes de maneira específica em relação ao lócus gênico e ao
tempo de atuação, de maneira a produzir uma complexa gama de resultados. Existem
três tipos de receptores nucleares de ácido retinóico (RAR α, β e γ). Cada um deles é
codificado por genes distintos, possuindo múltiplas isoformas produzidas por
processamento (splicing) alternativo. RARs funcionam como heterodímeros com um
segundo grupo de receptores, os receptores de retinóides X (RXRs α, β e γ), os quais
também são codificados por três distintos genes e podem funcionar como homodímeros.
Assim como os RARs, os RXRs possuem diversas isoformas, de modo que 48
diferentes combinações entre RARs e RXRs são possíveis. Esses receptores ligam-se a
regiões promotoras de genes responsivos a retinóides, através dos elementos
responsivos ao receptor de AR (RARE) e dos elementos responsivos ao receptor de
retinóides X, modulando a expressão de diversos genes (Napoli, 1999).
Figura 1. Principais formas de Vitamina A. Modificado de Napoli, 1999.
8
Retinol, Ácido Retinóico e MMP-2
Espécies Reativas de Oxigênio
O oxigênio é necessário para sustentar os processos biológicos de praticamente todos os
organismos vivos e, quimicamente, para a maioria dos processos de combustão.
Entretanto, enquanto o oxigênio é indispensável para todas as formas de vida aeróbia
por servir como aceptor final de elétrons na cadeia mitocondrial, ele também pode ser
transformado em formas altamente reativas conhecidas como espécies reativas de
oxigênio (ROS) (Haddad, 2002).
ROS, como H
2
O
2
, O
2
•-
e OH
•
, são gerados em diversas rotas celulares (Kamata e
Hirata, 1999). Dentre esses, o mais danoso é o radical hidroxil, que rapidamente reage
com biomoléculas como lipídeos, proteínas e ácidos nucléicos, causando danos
oxidativos de forma irreversível (Cheng et al., 2002). A cadeia transportadora de
elétrons é conhecida como a maior responsável pela geração de ROS in vivo. Entretanto,
outros sistemas celulares, como hipoxantina/xantina oxidase e NADPH oxidase são
conhecidos por gerar ROS. Como proteção contra níveis aumentados de ROS, as células
possuem sistemas antioxidantes, que incluem antioxidantes enzimáticos e não
enzimáticos (Kamata e Hirata, 1999). Dentre as principais enzimas antioxidantes
encontram-se a catalase (CAT), as superoxido dismutases (SOD) e as glutationa
peroxidases (GPx). Dentre as defesas não enzimáticas encontram-se uma gama de
moléculas de baixo peso molecular, como o peptídeo glutationa (GSH) e vitaminas C e
E. Um desbalanço entre as defesas antioxidantes e a produção de ROS podem acarretar
diversos danos oxidativos a biomoléculas. De fato, uma produção aumentada de ROS
tem sido imputada como causal em numerosas doenças como aterosclerose, artrite e
câncer (Jackson e Loeb, 2001).
9
Retinol, Ácido Retinóico e MMP-2
Apesar de potencialmente tóxicas, espécies reativas de oxigênio podem exercer
importantes papéis em processos celulares como rotas de sinalização, desde que
mantidas em uma quantidade basal (Finkel, 2003). O termo “regulação oxidativa” tem
sido proposto para indicar a funcionalidade das modificações redox de proteínas na
regulação de suas atividades biológicas. De fato, reações de oxi-redução em
biomoléculas, quando em níveis fisiológicos, podem conter informações biológicas que
são necessárias para a manutenção da homeostase celular (Haddad, 2002). Muitas
proteínas e enzimas celulares contêm resíduos de cisteína, os quais possuem
grupamentos sulfidril em suas cadeias laterais. Tais grupamentos tiois proporcionam
uma variedade de interações químicas: formação de pontes com íons metálicos, reações
eletrofílicas e reações reversíveis de oxiredução. Devido à capacidade de responder
seletivamente ao estado redox celular de forma reversível, imagina-se que os resíduos
de cisteína sejam os principais alvos da sinalização redox em sistemas biológicos
(Biswas et al., 2006).
Baixas concentrações de ROS podem levar à progressão do ciclo celular, por
controlar diversas rotas redox-sensíveis. Têm se demonstrado que H
2
O
2
induz a
fosforilação de receptores de PDGF e de EGF, sugerindo que ROS podem iniciar
eventos de sinalização que mimetizam aqueles induzidos por fatores de crescimento.
Vários estudos têm estabelecido que espécies reativas de oxigênio possam causar a
ativação de diversas proteínas sinalizadoras como as MAPK, resultando na subseqüente
ativação de fatores de transcrição. Dessa forma, especula-se que ROS leve a diferentes
respostas adaptativas celulares, desde o estacionamento temporário ou permanente do
crescimento, a morte por apoptose ou necrose, ou o aumento na proliferação,
dependendo do tipo e da intensidade do sinal oxidativo (Boonstra e Post, 2004).
10
Retinol, Ácido Retinóico e MMP-2
Metaloproteinases de Matriz
Classicamente, as metaloproteinases de matriz (MMPs) são denominadas como
endopeptidases dependentes de cálcio, que contêm zinco, estrutural e funcionalmente
relacionadas umas às outras (Bode e Maskos, 2003). A família das MMPs contém mais
de 20 membros descritos na espécies humana, as quais são divididas em subfamílias
devido à organização dos domínios e às especificidades de substrato (Overall e Lopez-
Otin, 2002).
Em geral, MMPs são enzimas extracelulares (excetuando-se as MMPs de
membrana, conhecidas como MT-MMPs), secretadas na forma de proenzimas. Todas as
MMPs são enzimas com multidomínios, contendo os domínios propeptídico, domínio
catalítico e domínio hemopexina (exceto a matrilisina, MMP-7). Um resíduo de cisteína
altamente conservado entre todas as MMPs tem sido descrito como essencial para
manter a enzima na sua forma inativa. Propõe-se que o grupamento sulfidril desse
resíduo de cisteína seja ligado ao íon zinco do domínio catalítico e que a interrupção
dessa interação cause a ativação da enzima. A ativação fisiológica das MMPs é
provavelmente iniciada por proteases que clivam locais específicos na região
propeptídica, processando a forma madura da enzima que perde totalmente o
propeptídeo (Morgunova et al., 1999).
A principal função das MMPs é promover a degradação da matriz extracelular
(ECM). Entretanto, nos últimos anos seus alvos proteolíticos específicos têm sido
expandidos para várias outras proteínas extracelulares, incluindo uma variedade de
outras proteases, inibidores de proteases, fatores de coagulação, moléculas
quimiotáticas, fatores de crescimento, proteínas ligantes de fatores de crescimento,
11
Retinol, Ácido Retinóico e MMP-2
receptores de superfície celular e moléculas de adesão (McCawley e Matrisian, 2001).
Dessa forma, as MMPs podem influenciar diversas propriedades celulares como
crescimento, morte e migração (Coussens et al., 2002).
As MMPs são precisamente reguladas em vários níveis: transcrição, ativação do
zimogênio, interação com componentes específico de matriz extracelular e inibição por
inibidores endógenos. Além disso, a perda do controle da atividade das MMPs está
envolvido em uma grande quantidade de condições patológicas (Sternlicht e Werb,
2001). Diversas rotas de sinalização envolvidas no controle da transcrição das MMPs
são redox sensíveis e autores propõe uma relação entre a atividade das MMPs e espécies
reativas de oxigênio. Sugere-se que ROS possam atuar na ativação de algumas MMPs
tanto em nível transcricional, atuando em rotas de sinalização redox-sensíveis, bem
como na ativação do zimogênio, por atuar diretamente na oxidação de um resíduo de
cisteína localizado na região de ligação ao zinco na porção pró-peptídica (Nelson e
Melendez, 2004).
MMPs são intimamente relacionadas com a progressão tumoral por mediarem a
degradação da ECM e da membrana basal durante os primeiros estágios da
tumorogênese, contribuído com a formação do microambiente que promove o
crescimento do tumor. Além disso, recentes estudos demonstraram que as MMPs
contribuem para diversos passos da progressão tumoral além da invasão, incluindo
angiogenese, estabelecimento e crescimento de lesões metastáticas em diferentes órgãos
(Noe et al., 2001). A subfamília de MMPs que degradam colágeno do tipo IV, as
gelatinases (Overall, 2002), representam uma das mais importantes MMPs associadas à
progressão tumoral. A MMP-2, também conhecida como gelatinase A, possui um alto
nível de expressão em amostras de tumores humanos (Overall e Kleifeld, 2006) e
12
Retinol, Ácido Retinóico e MMP-2
autores têm descrito sua atividade em células de Sertoli (El Ramy et al., 2005; Longin et
al., 2001; Longin e Magueresse-Battistoni, 2002).
Célula de Sertoli
Células de Sertoli são células somáticas, de origem epitelial, encontradas nos túbulos
seminíferos, essenciais para o correto desenvolvimento da espermatogênese. Elas
apresentam uma baixa taxa de proliferação durante a vida adulta, proliferando
principalmente durante a vida fetal e o período pré-puberal. As Sertoli formam uma
barreira seletiva entre a circulação sistêmica e as células germinativas. Dessa forma, as
células de Sertoli provêm um suporte estrutural e nutricional às células germinativas.
Evidencias têm se acumulado mostrando uma intrínseca relação entre células de
Sertoli e células germinativas. Um interessante aspecto dessa relação é que as células
germinativas variam durante o desenvolvimento e a vida adulta, e as células de Sertoli
sofrem drásticas mudanças estruturais e funcionais para acomodar a maturação das
células da linhagem espermatogênica. Essas mudanças são associadas com a formação
dos testículos a partir das gônadas fetais indiferenciadas sexualmente, com a
transformação dos cordões seminíferos em túbulos. Na vida adulta, as Sertoli passam
por modificações estruturais cíclicas as quais correspondem às variações no seu status
funcional durante os ciclos do epitélio seminífero. MMPs atuam como mediadores
críticos das mudanças estruturais as quais passam as células de Sertoli durante o
desenvolvimento e a vida adulta. Nos túbulos seminíferos, MMP-2 e MMP-9 são
secretadas tanto pelas células de Sertoli quanto pelas peritubulares, sendo que esses dois
tipos celulares cooperam para a deposição dos componentes de ECM na membrana
basal. Assim, qualquer remodelação ou mudança estrutural que ocorra nos túbulos
13
Retinol, Ácido Retinóico e MMP-2
seminíferos são, provavelmente, dependente das gelatinases (Longin e Magueresse-
Battistoni, 2002).
Objetivos
Objetivo Geral
Levando em conta que o tratamento com retinol sabidamente leva a um desbalanço
entre a produção de espécies reativas de oxigênio e as defesas oxidantes, induzindo uma
série de modificações no metabolismo celular, o presente trabalho tem como objetivo
principal investigar a ativação da MMP-2, uma importante enzima na regulação
funcional das células de Sertoli, induzida por tratamento com retinol e ácido retinóico
em células de Sertoli cultivadas.
Objetivos Específicos
• Avaliar a atividade da MMP-2 em células de Sertoli tratadas com retinol e ác
retinóico;
• Verificar a produção de espécies reativas de oxigênio em células de Sertoli
cultivadas tratadas com retinol e ácido retinóico;
• Verificar um possível papel de espécies reativas de oxigênio no processo de
ativação da MMP-2 induzida por tratamento com retinol e ácido retinóico;
• Identificar possíveis rotas de ativação;
• Avaliar o perfil morfológico de culturas de células de Sertoli tratadas com
retinol e ácido retinóico.
14
Retinol, Ácido Retinóico e MMP-2
PARTE II
15
Retinol, Ácido Retinóico e MMP-2
Retinol and retinoic acid increase MMP-2 activity by
different pathways in cultured Sertoli cells
Free Radical Research, December 2007; 41(12): 1338-1347.
16
Retinol and retinoic acid increase MMP-2 activity by different pathways
in cultured Sertoli cells
RODRIGO J. S. DALMOLIN
1
, ALFEU ZANOTTO-FILHO
1
, RAMATIS B. DE OLIVEIRA
1
,
ROXANE F. DUARTE
1
, MATHEUS A. B. PASQUALI
1
, & JOSE
´
C. F. MOREIRA
1
1
Centro de Estudos em Estresse Oxidativo, Departamento de Bioquı
´
mica, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto
Alegre, Rio Grande do Sul, Brasil
Accepted by Prof. Henrik Poulson
Abstract
Diseases such as atherosclerosis, arthritis and cancer have been related with imbalance in ROS production and failures in
regulation of the MMPs. Authors suggested a relationship between MPP activity and ROS. Our research group has
demonstrated that retinol 7mM induced changes in Sertoli cell metabolism linking retinol treatment and oxidative stress. We
verified MMP activity in Sertoli cells treated with vitamin A using gelatin zymography. We found that retinol (7mM) and
retinoic acid (1nM) induced MMP-2 activity in Sertoli cells. Antioxidants reversed retinol-induced but not retinoic acid-
induced MMP-2 activity. Moreover, retinol but not retinoic acid increased ROS production quantified by DCFH-DA
oxidation. We found that retinol and retinoic acid induced ERK1/2 phosphorylation, but only retinol-increased MMP-2
activity was inhibited by UO126, an ERK1/2 phosphorylation inhibitor. Our findings suggested that retinol-induced MMP-
2 activity, but not retinoic acid-induced MMP-2 activity, was related to ERK1/2 phosphorylation and ROS production.
Keywords: MMP, retinol, retinoic acid, ROS, Sertoli cells
Introduction
Reactive oxygen species (ROS) are constantly gener-
ated in aerobic metabolism and play an important
role in cellular processes, such as signaling pathways,
when in a basal rate [1]. The term ‘‘oxidative
regulation’’ has been proposed to indicate the func-
tionality of redox modifications of proteins in regula-
tion of their biological activities. Oxide-reductive
reactions of biomolecules were known as ‘‘oxidative
stress’’. Now were considered as ‘‘signals’’ and might
contain biological information that is necessary to
maintain cellular homeostasis [2]. However, an im-
balance between anti-oxidant defenses and ROS
production can lead to oxidative damages in biomo-
lecules playing a causative role in numerous diseases
such as atherosclerosis, arthritis, and cancer [3]. The
modulation of an important family of proteases,
matrix metalloproteinases (MMP), seems to be
intimately related to these diseases [4].
MMPs are traditionally denominated as calcium-
dependent zinc-containing endopeptidases, structu-
rally and functionally related [5]. The main function
of the MMPs is to promote the extracellular matrix
(ECM) degradation. In the past years, their specific
proteolytic targets have expanded to several other
extracellular proteins, including an assortment of
other proteinases, proteinase inhibitors, clotting fac-
tors, chemotactic molecules, latent growth factors,
growth factor binding proteins, cell surface receptors,
and adhesion molecules [6]. Thus, MMP can influ-
ence directly or indirectly several cellular properties
such as growth, death and migration [7].
MMPs activity is precisely regulated at different
levels: transcription, activation of the precursor
Correspondence: Rodrigo J. S. Dalmolin. Centro de Estudos em Estresse Oxidativo, lab 32, Departamento de Bioquı´mica, ICBS-UFRGS.
Rua Ramiro Barcelos, 2600, anexo. Porto Alegre, RS, Brazil. Phone: '55 51 33085578. Fax: '55 51 33085540. Email: rodrigo.dalmolin
@ufrgs.br
ISSN 1071-5762 print/ISSN 1029-2470 online # 2007 Informa UK Ltd.
DOI: 10.1080/10715760701717427
Free Radical Research, December 2007; 41(12): 1338Á1347
zymogens, interaction with specific ECM compo-
nents, and inhibition by endogenous inhibitors. The
loss of control of the MMP activity is involved in a
large range of diseases [8]. Numerous signaling
pathways involved in the control of MMP transcrip-
tion are redox-responsive and authors have proposed
a relationship between MPP activity and ROS [9]. An
important member of MMP family is MMP-2, also
known as gelatinase-A [10]. MMP-2 is expressed at
high levels in several human tumour samples [11] and
authors have described their activity in Sertoli cells
[12Á14].
Sertoli cells are epithelial cells that provide struc-
tural and nutritional support to developing germinal
cells and participate in the architecture of seminifer-
ous tubules, establishing interactions with peritubular
cells and ECM in a MMP-dependent process
[13,14]. Our group has used Sertoli cells as a model
to study oxidative stress and redox signaling induced
by vitamin A. Researchers have described a protective
role of vitamin A in several diseases, which was
related to its ability to scavenge toxic forms of oxygen
and other free radicals in living systems [15]. In
addition, the physiological function of retinoids in
several cellular processes, such as division and
differentiation, is well-known. On the other hand,
our previous results have demonstrated that retinol
supplementation induces oxidative damage in biom-
elecules, [16Á18] upregulation of antioxidant en-
zymes, [19,20] preneoplasic transformation, [21]
and activation of phosphorylation signaling pathways
[22]. In this work, we investigated the MMP-2
activation by treatment with retinol and retinoic
acid in cultured Sertoli cells. We evidenced that
both retinol and retinoic acid increased MMP-2
activity. We also investigated the role of ROS in this
activation. As described before, retinol treatment is
able to cause ERK1/2 MAPK phosphorylation by
radical overproduction [22]. We confirmed these
results and verified a retinoic acid-dependent
ERK1/2 MAPK phosphorylation, as well as the
relationship between ERK1/2 MAPK phosphoryla-
tion and MMP-2 upregulation. Eventually, we ana-
lyzed the morphological aspect of Sertoli cell cultures
for five days after the onset of retinol or retinoic acid
treatment.
Materials and methods
Animals and chemicals
Type I collagenase, hyalorunidase, medium 199,
HBSS, all-trans retinol and all-trans retinoic acid
were purchased from Sigma, St. Louis, MO, US.
Trypsin was purchased from Difco, Detroit, MI, US.
Anti-phospho-ERK1/2 (Thr202/Tyr204) was ob-
tained from Cell Signaling Technology (Beverley,
MA, US). Horseradish peroxidase-coupled anti-IgG
antibody was from Amersham Pharmacia Biotech
(Piscataway, NJ, US). The West Pico chemilumines-
cent kit was obtained from Pierce (Rockford, IL,
US). Pregnant Wistar rats were housed individually
in Plexiglas cages. The animals were maintained in a
12h light/dark cycle at a constant temperature of
238C, with free access to commercial food and water.
Sertoli cell culture and treatment
Sertoli cells from 15-days-old Wistar rats were
isolated and cultured as described before [17,20].
In short, animals were killed by ether asphyxiation,
testes were removed, decapsulated, washed in saline
pH 7.4, digested enzymatically with trypsin (30min at
348C), and centrifuged (750)g for 5min). After, the
trypsin was inhibited, the sample was centrifuged
(750)g for 5 min), the supernatant was discarded,
the pellet incubated with collagenase and hyaluroni-
dase (30min at 348C), and once more centrifuged (10
min at 40)g). Isolated cells were counted by Tripan
blue exclusion probe in Neubauer chamber and
maintained at 348C in a humidified atmosphere of
5% CO
2
in air, growing in a plating density of 3.2)
10
5
cells/cm
2
in medium 199 (pH 7.4) supplemented
with 1% fetal bovine serum (v/v) in the first 24h.
After that, the medium was replaced by serum free
medium and cells were maintained for more 24h.
Experiments were performed on cells treated with
retinol (7mM), retinoic acid (1nM), and retinol
vehicle (ethanol 0.1% v/v), or co-treated with
Trolox
†
(a hydrophilic analogue of vitamin E,
100mM), the ×OH radical scavenger mannitol
(1mM), the thiol antioxidants dithiothreitol (DTT;
1mM) and N-acetyl-cysteine (NAC, 1mM), and
UO126 (inhibitor of ERK1/2 phosphorylation) for
24h, except in the ERK1/2 phosphorylation and
DCFH-DA experiments. All treatments were per-
formed in a light-protected environment.
Gelatin zymography
Zymography was performed as previously described
[12]. In brief, culture media were removed, centri-
fuged (1000)g for 5min) to eliminate cell debris,
and concentrated ten times using Centricon (cut-off
at 30kDa; Millipore, Bedford, MA, US). Equal
amounts of cell proteins (approximately 40 mg/lane)
were electrophoresed (120V) at 48C on 8% poly-
acrylamide gels containing 0,2% gelatin (Sigma
Chemical Co.) in the absence of reducing agent.
Following electrophoresis, gel was washed in Triton
X-100 2.5% pH 7.5 (three times of 30min at room
temperature) to remove SDS and washed again in
distilled water (three times of 30min at room tem-
perature). The gel was subsequently incubated at
378C for 16h in reaction buffer (50mM TrisÁbase,
NaCl 150mM, ZnCl
2
1mM, sodium azide 0.02%,
CaCl 10mM, pH 8). In these conditions, gelatinases
present in the samples is renatured and autoactivated.
Retinol and retinoic acid increase MMP-2 activity 1339
White zones of lysis indicating gelatin-degrading
activity were revealed by staining with Coomassie
Brillant blue R-250 0.1%. Densitometric analyses of
the gels were performed with the ImageJ
†
software.
Data were normalized by mean of control and
expressed in arbitrary units.
Determination of intracellular ROS production
Intracellular ROS production was detected using
2?,7?-dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-
DA). This reagent is known to enter the cells and
react predominantly with highly oxidizing species of
ROS, producing the fluorophore dichlorofluorescein
(DCF) [23]. Briefly, cells were seeded in 96-well
plates and cultured for 48h. 100mM DCFH-DA
dissolved in medium containing 1% FBS was added
to the cell culture 30min before retinol or retinoic
acid incubation to allow cellular incorporation. Then,
the medium was discarded and cells treated for
40min. The DCFH-DA oxidation was monitored
with 10min interval at 378C from the fluorescence
emission intensity in a 96-well plate fluorescence
reader (model F2000, Hitachi Ltd., Tokyo, Japan)
with an emission wavelength set at 535nm and an
excitation wavelength set at 485nm. Data were
expressed in arbitrary fluorescence units.
Western blotting
SDS-PAGE and Western blotting were carried out as
before reported [22]. Sertoli cells were previously
cultured by 48h and retinol or retinoid acid treat-
ments were added in culture media. After different
times of treatment (15, 30, 60 and 120 minutes for
retinoic acid and 1, 5, 10, 15 and 30 minutes for
retinol), culture media was removed and cells were
lysed in Laemmli-sample buffer (62.5 mM TrisÁHCl,
pH 6.8, 1% (w/v) SDS, 10% (v/v) glycerol) and equal
amounts of cell proteins (approximately 35 mg/lane)
were fractionated by SDSÁpolyacrylamide gel elec-
trophoresis (PAGE) and electroblotted onto polyvi-
nyledilene difluoride (PVDF) membranes. Protein
loading and electrobloting efficiency were verified by
Ponceau S staining, and the membrane was then
blocked in TweenÁTris buffered saline (TTBS;
100mM TrisÁHCl, pH 7.5, containing 0.9% NaCl
and 0.1% Tween-20) containing 5% albumin and
incubated overnight with the primary antibody to be
tested. The membrane was washed in TTBS and
incubated with horseradish peroxidasecoupled anti-
IgG antibody, washed again and the immunoreactiv-
ity was detected by enhanced chemiluminescence.
Morphological aspect of Sertoli cell cultures
Sertoli cells were cultured as described. After 24h, the
treatments were removed and cultures received media
199 pH 7.4 supplemented with 10% fetal bovine
serum. Supplemented medium was replaced every
two days. Before medium replacement, the cultures
were observed and photographed under a phase-
contrast microscopy.
Protein quantification
All the results were normalized by protein content,
measured as described by Lowry [24].
Statistic analysis
Data are expressed as means9S.E.M. Differences
were considered to be significant at the pB0.05 and
were analyzed by one-way ANOVA followed by
Duncan’s post hoc test.
Results
Retinoic acid and retinol increase MMP-2 activity
Sertoli cells were treated with retinoic acid or retinol
in different concentrations and gelatin zymography
assay was carried out as described in Materials and
Methods. MMP-2 migrates as a triplet around 72, 66
and 62 kDa (Figure 1.B) [12]. However, bands
can appear fused and/or incompletely identifiable
(Figure 1.A) as a result of gelatinolytic activity of
the enzyme. We observed an increased enzyme
activity in retinoic acid 1nM treatment as well as
retinol 7mM treatment (Figure 1). This increase is not
detected in higher concentrations indicating a no
dose-dependent relationship leading us to choose
these concentrations for further experiments.
Antioxidant treatment reverses MMP-2 activation
induced by retinol but not by retinoic acid
Sertoli cells received Trolox
†
100mM, mannitol
1mM, DTT 1mM or NAC 1mM in co-treatment
with retinoic acid 1nM or retinol 7mM (Figure 2).
The elevation on MMP-2 activity induced by retinoic
acid was reversed only by DTT (Figure 2.A). DTT
was also capable to reverse MMP-2 activation in-
duced by retinol treatment. In addition, both
Figure 1. Retinoic acid and retinol induced MMP-2 activity.
Concentrated media of cultured Sertoli cells treated for 24 hours
with retinoic acid or retinol were analyzed by gelatin zymography.
White lytic bands correspond to MMP-2 activity. Experiments
were repeated three times and representative experiments are
shown.
1340 R. J. S. Dalmolin et al.
Figure 2. MMP-2 activity in cultured Sertoli cells treated with retinoic acid or retinol and co-treated with antioxidants. Gelatin
zymography of concentrated culture media of Sertoli cells treated for 24 hours with: retinoic acid 1nM and co-treated with dithiothreitol
1mM, N-acetyl-cysteine 1mM, or Trolox
†
100mM (A); retinol 7mM and co-treated with dithiothreitol 1mM, N-acetyl-cysteine 1mM, or
Trolox
†
100mM (B); retinol 7mM or retinoic acid 1nM and co-treated with mannitol 1mM (C). Experiments were repeated four times and
representative experiments are shown. (
*
) different of control, (§) different of retinoic acid and (') different of retinol. p B0.05. C0control,
Ra0retinoic acid 1nM, R0retinol 7mM, T0Trolox
†
100mM, D0dithiothreitol 1mM, N 0N-acetyl-cysteine 1mM and M0mannitol
1mM.
Retinol and retinoic acid increase MMP-2 activity 1341
Trolox
†
and NAC were able to attenuate retinol-
induced MMP-2 activation (Figure 2.B). Mannitol
was incapable of reversing the MPP-2 activation
induced by both retinoids (Figure 2.C) suggesting
that ×OH radical does not seem to be involved in this
MPP-2 activation.
Retinol but not retinoic acid treatment induces ROS
production
Figure 3 shows that retinol 7mM enhanced intracel-
lular ROS production during 40min period evaluated
and Trolox
†
100mM co-treatment blocked this effect.
In contrast, retinoic acid 1nM did not increase ROS
production. In DCF assay, we used hydrogen perox-
ide 100mM as positive control for ROS production
(not shown).
Retinoic acid and retinol increase ERK1/2
phosphorylation
We perform a Western blotting with a specific anti-
body able to detect ERK1/2 only when dually
phosphorylated (i.e. when activated; pERK1/2
[25]). Both retinoic acid and retinol induced an
increase in ERK1/2 phosphorylation (Figure 4.A).
A peak was identify around 15 minutes of treatment
and decreasing at 30 minutes in both treatments,
suggesting a rapid and transient activation of these
members of MAPK family.
ERK1/2 inhibitor reverses MMP-2 activity induced by
retinol but not by retinoic acid
Figure 4.B shows that the co-treatment with UO126,
a classical inhibitor of ERK1/2 which impedes
MEK1/2 to act in ERK1/2 phosphorylation, [26,27]
reversed MMP-2 activity induced by retinol. UO126
did not reverse MMP-2 activity induced by retinoic
acid (Figure 4B).
Modifications on morphological aspect of Sertoli cell
cultures treated with vitamin A
Figure 5 demonstrated that cell cultures treated with
retinol or retinoic acid for 24 hours presented lower
density compared to control cells. After three days,
cells established a monolayer and there was a
similarity in the morphological aspect among the
three groups (retinoic acid, retinol and control). High
cell density was observed after five days and, at this
time, we could observe cell agglomeration over the
monolayer.
Discussion
The activity of MMPs is regulated at several levels
and the loss of control of their activity leads to a
breakdown in tissue homeostasis. Unregulated con-
trol of MMP activities changes tissue functionality
and seems to be deleterious in biological systems [4].
Nelson and Melendez (2004) proposed an oxidative
activation of pro-MMP-1 [9]. MMPs are secreted as
inactive zymogens and its catalytic domain contains a
highly conserved zinc-binding site bound by a
cysteine residue within the propeptide region. This
folded conformation is required to keep the MMP in
its inactive proform. Oxidants may react and oxida-
tively modify the thiol residue releasing the zinc-
binding domain and turning an unstable MMP-1
intermediate susceptible to cleavage by autocatalytic
processing, therefore activating MMP-1. Proteolytic
cleavage of MMPs is an important mechanism of
zymogen activation. Given the conserved cysteine-
switch domain and the general activation mechanism
of most MMP family members, the activation by
oxidation may regulate several MMPs [9,28].
We and others have demonstrated that retinol 7mM
might induce oxidative stress in different cell systems
[21,29]. Figure 3 confirms that retinol 7mM treat-
ment generated ROS in Sertoli cells and Trolox
†
co-
treatment decreased ROS production. Figure 2.B
shows that both Trolox
†
and NAC were able to
reverse retinol-induced MMP-2 activity at control
levels and DTT decreased enzyme activity to lower
levels than baseline. Altogether, these results sug-
gested that ROS were involved in MMP-2 activity
induced by retinol. In contrast, Figure 2.C shows that
mannitol co-treatment was unable to reverse retinol-
induced MMP-2 activity. This result contrasted to
previous reports that showed mannitol preventing
some of retinol biological effects [22,30].
Under normal metabolic conditions, 1Á2% of the
oxygen consumed by the cell is converted to
(
O
2
by
electron leakage at mitochondrial complex I and
complex III [31] and other sites of ROS production
Figure 3. Intracellular ROS production determined by DCFH-
DA (2?,7?-dichlorodihydrofluorescein diacetate) oxidation in cul-
tured Sertoli cells treated with retinoic acid 1nM and retinol 7mM
for different times. The DCFH-DA oxidation was monitored with
10min interval at 378C from the fluorescence emission intensity.
Data were expressed in arbitrary fluorescence units. (
*
) different of
control and (§) different of retinoic acid. pB0.05. R0retinol 7mM,
C0control, Ra 0retinoic acid 1nM and T0Trolox
†
100mM.
1342 R. J. S. Dalmolin et al.
such as hypoxanthine/xanthine oxidase and NADPH
oxidase are known. Majority of ROS generated in
these cellular systems are only moderately reactive
(e.g.
(
O
2
and H
2
O
2
) with other biological molecules
[32]. At normal levels, reactive species can execute an
important function in the regulation of the signaling
pathways [1] acting in proteins, lipids, and nucleic
acids by modifications in ROS-sensitive domains
[33]. The most important redox-sensitive domain in
proteins are cysteine residues, which can be modu-
lated by alterations in their redox state, acting as
redox sensor [34]. In recent years it has become clear
that ROS regulate several genes, modulating process
such as cell proliferation and differentiation as well as
cell death and life machinery, acting as second
messengers in signaling cascades [32].
One of the most important ROS that act in redox
signaling is H
2
O
2
, that can be spontaneously or
enzymaticaly generated from
(
O
2
and is highly
diffusible into cells [35]. However,
(
O
2
and H
2
O
2
can be converted into ×OH by Fenton or Haber-Weiss
reactions [36]. ×OH seems inappropriate to act as a
second messenger in signaling pathways as it is a
high-reactive short-life radical that quickly induce
irreversible damages to biomolecules [36]. The fact of
the well-established hydroxyl radical scavenger man-
nitol [37] has not reversed MMP-2 activity induced
by retinol suggest that other reactive species than ×
OH mediated MMP-2 upregulation. Retinol treat-
ment seems to generate
(
O
2
and H
2
O
2
as previous
works showed increased activity of the antioxidant
enzymes superoxide dismutase, catalase, and glu-
tathione peroxidase [19]. In addition, previous works
have shown that an iron chelator (1,10-phenantro-
line) reversed oxidative damage induced by retinol
[16], suggesting that Fenton reaction was involved in
retinol-induced oxidative damage. However, retinol-
induced MMP-2 activity seems to be independent of
hydroxyl radical, in spite of it probably has been
generated.
The extracellular signal-regulated kinases 1 and 2
(ERK1/2) are members of the superfamily of mitogen-
activated protein kinases (MAPK). These kinases are
important regulatory proteins through which extra-
Figure 4. (A) ERK1/2 phosphorylation determined by Western blotting in cultured Sertoli cells treated with retinoic acid 1nM and retinol
7mM for different times. Sertoli cell treated with retinol or retinoid acid for different times (15, 30, 60 and 120 minutes for retinoic acid and
1, 5, 10, 15 and 30 minutes for retinol), culture media was removed, cells were lysed and immunoblot was performed. (B) Gelatin
zymography of concentrated culture media of Sertoli cells treated for 24 hours with retinoic acid 1nM or retinoic acid 7mM and co-treated
with UO126. Experiments were repeated three times and representative experiments are shown. (
*
) different of control, (§) different of
retinoic acid and (') different of retinol. p B0.05. R 0retinol 7mM, Ra0retinoic acid 1nM, C0control and UO0UO126.
Retinol and retinoic acid increase MMP-2 activity 1343
cellular signals are translated into intracellular events
[38,39] and are related to MMP expression [40].
Gelain (2006) demonstrated that retinol treatment
induced CREB phosphorylation mediated by ROS-
dependent ERK1/2 activation [22]. CREB, once
activated by phosphorylation at Ser-133, modulates
cell cycle/apoptosis regulation genes, and also other
transcription factors, such as different members of the
AP-1 family, among others. One of the genes that
CREB has been associated is MMP-2 [41]. In the
Figure 4.A we show that retinol led to ERK1/2
activation. Generally, ERKs are mainly involved in
anabolic processes, such as cell division and growth
and can be activated by ROS such as oxygen peroxide
[42,43]. Figure 4.B shows that UO126 co-treatment
reverse totally retinol-induced MMP-2 activity, indi-
cating that ERK1/2 pathway was involved in this
increased enzyme activity.
Altogether, these results suggest that retinol 7mM
treatment increased ROS production, which activates
ERK1/2 signaling pathway, increasing MMP-2 activ-
ity. It is rational to think that higher retinol concen-
trations would increase ROS production. However,
elevated ROS generation can damage cellular systems
to react with biomolecules in unspecific sites instead
of acting in signaling pathways. This may explain why
higher concentrations of retinol did not induce an
increase in MMP-2 activity (Figure 1.B).
Despite retinol and its derivatives, the retinoids, are
recognized as key regulators of cell growth and
Figure 5. Morphological aspect of Sertoli cell cultures treated with retinol 7mM or retinoic acid 1nM. Sertoli cells were cultured and
treated as described in Material and Methods. After 24 hours of treatment culture medium was replaced for 199 medium supplemented with
10% fetal bovine serum and fresh supplemented medium was added every two days. Before each medium replacement, the cultures were
photographed under a phase-contrast microscope. Arrows indicate areas of low density. Ellipses indicate areas of over monolayer density.
The experiments were repeated three times with nearly identical results. Representative photographs are shown. C-1 day0control after one
day of culture, C-3 days0control after three days of culture, C-5 days0control after five days of culture, R-1 day0retinol 7mM after one
day of culture, R-3 days0retinol 7mM after three days of culture, R-5 days 0retinol 7mM after five days of culture, Ra-1 day0retinoic acid
1nM after one day of culture, Ra- 3 days0retinoic acid 1nM after three days of culture and Ra-5 days0retinoic acid 1nM after five days of
culture.
1344 R. J. S. Dalmolin et al.
differentiation, their exact mechanisms of action
remain unknown [44]. Retinol represents the most
abundant retinoid in blood and can be conversed to
retinal and subsequently to retinoic acid by dehydro-
genases. Retinoic acid is the most hormonally active
retinoid and is not re-conversed to retinol in biologi-
cal systems [45]. Figure 1 shows that retinoic acid
1nM increased MMP-2 activity. Only DTT co-
treatment reversed retinoic acid-induced MMP-2
activity, as indicated in Figure 2.A. Treatment with
potent thiol reducer DTT was able to decrease
MMP-2 activity lower than control group changing
enzyme baseline, as discussed above. NAC, Trolox
†
and mannitol (Figure 2.A and C) were unable to
reverse retinoic acid-dependent MMP-2 activity sug-
gesting that ROS were not involved in this activation.
Indeed, DCF assay shows that retinoic acid did not
produce ROS in Sertoli cells (Figure 3). These results
contrasted to findings with retinol treatment suggest-
ing that these two retinoids acted through different
pathways in MMP-2 induction. In addition, a curious
data was notorious: in spite of retinoic acid induced
ERK1/2 phosphorylation Á similarly to retinol-
induced ERK1/2 phosphorylation Á the UO126 co-
treatment was unable to reverse MMP-2 activity
induced by retinoic acid treatment (Figure 4). In
fact, authors have related that retinoic acid induced
ERK1/2 phosphorylation [46,47] and Can
˜
o´n (2004)
demonstrated that retinoic acid played rapid effects
on CREB phosphorylation by ERK activation in
neuronal cells [48]. On the other hand, the fact of
the co-treatment with UO126 did not alter retinoic
acid-induced MMP-2 activity suggest that ERK1/2
pathway seems not to be the major pathway involved
in this activation. The most important targets of
retinoic acid are the retinoic acid receptors (RARs
and RXR) which are nuclear receptors that regulate
several genes in response to retinoic acid [45].
Watson (2004) demonstrated that an increased
amount of RAR-a was involved in MMP-1 over-
expression in cutaneous ageing [49]. In this way,
MMP-2 activity induced by retinoic acid in Sertoli
cells may be related to direct activation of RARs.
However, more studies are necessary to elucidate this
fact, as well as to investigate the reason by which
higher concentrations of retinoic acid did not increase
MMP-2 activity (Figure 1.A).
Altogether, these data support that retinol and
retinoic acid induced MMP-2 by different pathways
in cultured Sertoli cells. Morphogenesis of seminifer-
ous tubules depends upon interactions among Sertoli
cells, peritubular cells and ECM (which is secreted by
both cells types). In the adult life, Sertoli cells
undergo cyclic structural modifications correspond-
ing to a variation of their functional state during the
cycle of the seminiferous epithelium according to
maturation level of the germinal cells, leading to
alterations on ECM mainly mediated by MMPs
regulation [12Á14,50]. Thus, alterations in MMP-2
activity can impair semniferous homeostasis. Longin
(2002) suggested that MMP-2 was involved in
FSH-induced changes in Sertoli cells [14] and El
Ramy (2005) identify increased MMP-2 in Sertoli
cells activity treated with FGF2, showing this treat-
ment mediating interactions between peritubular and
Sertoli cells [12]. Figure 5 shown that both retinoic
acid and retinol changed morphological aspect of
Sertoli cell cultures. Decreased density observed in
both treated groups after 24h of treatment agrees with
a recent work that demonstrated that retinol induced
ROS-dependent apoptosis in Sertoli cells [51]. In
addition, our previous papers showed that retinol
treatment induced cellular proliferation, [52] cell
cycle progression [21] as well as ERK1/2-dependen
focus formation in Sertoli cells, [22] all in a ROS-
dependent manner. These can explain the over-
monolayer growth observed after five days in cells
treated with retinol. However, retinoic acid did not
generate ROS and also was able to induce morpho-
logic changes in Sertoli cell cultures. Thus, in some
extent, MMP-2 activity can be involved in morpho-
logic alterations induced by retinoic acid and retinol.
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Retinol and retinoic acid increase MMP-2 activity 1347
Retinol, Ácido Retinóico e MMP-2
PARTE III
27
Retinol, Ácido Retinóico e MMP-2
Discussão
A atividade das MMPs é regulada em diversos níveis e a perda do controle de suas
atividades leva a uma quebra na homeostase tecidual. Problemas na regulação da
atividade das MMPs pode mudar a funcionalidade tecidual e parece ser deletério em
sistemas biológicos (Visse e Nagase, 2003). Nelson e Melendez (2004) propuseram um
processo oxidativo de ativação da pro-MMP1 (Nelson e Melendez, 2004). MMPs são
secretadas como um zimogênio inativo e o seu domínio catalítico contém uma região
altamente conservada contendo um íon zinco, ligado à região propeptídica da enzima
por um resíduo de cisteína. Essa conformação é necessária para manter a enzima em sua
forma inativa. Espécies reativas podem modificar oxidativamente o resíduo tiol ligado
ao íon zinco, tornando um intermediário instável de MMP-1 susceptível à clivagem por
um processo autocatalítico e, por fim, ativando a enzima. A clivagem proteolítica
constitui um importante mecanismo de ativação do zimogênio. Levando em conta que o
resíduo de cisteína da região propeptídica ligado ao íon zinco é altamente conservado, e
que o processo geral de ativação dos diferentes membros da família das MMPs é
semelhante, a ativação por oxidação pode regular diversas MMPs (Morgunova et al.,
1999; Nelson e Melendez, 2004).
Nosso grupo de pesquisa, bem como outros autores, tem demonstrado que o
tratamento com retinol 7 µM pode induzir estresse oxidativo em diferentes sistemas
celulares (Klamt et al., 2003; Murata e Kawanishi, 2000). Nossos resultados do ensaio
de oxidação de DCFH-DA mostraram que 7 µM de retinol gera espécies reativas de
oxigênio a partir de 10 min de tratamento, e que o co-tratamento com Trolox
®
, um
análogo sintético de vitamina E, diminui a produção de ROS. Além disso, tanto o co-
tratamento com Trolox
®
como com NAC, que atua como antioxidante per se, alem de
28
Retinol, Ácido Retinóico e MMP-2
estimular a síntese de GSH, foram capazes de reverter a atividade da MMP-2 induzida
por tratamento com retinol 7 µM a níveis de controle. O co-tratamento com DTT, um
potente antioxidante de tiois que protege os grupamentos sulfidril de proteínas contra
oxidação, diminuiu a atividade da enzima abaixo dos níveis do controle. Juntos, esses
resultados sugerem que espécies reativas de oxigênio estão envolvidas no aumento da
atividade da MMP-2 induzida por tratamento com retinol em células de Sertoli
cultivadas. Controversamente, o co-tratamento com manitol, um conhecido seqüestrador
(escavenger) de radical hidroxil, foi incapaz de reverter o aumento da atividade da
enzima. Esse resultado contrasta com estudos anteriores que mostraram o manitol
prevenindo alguns efeitos oxidativos do retinol (Gelain et al., 2006; Klamt et al., 2000).
Em condições metabólicas normais, de 1 a 2% do oxigênio consumido pela
célula é convertido em O
2
•-
nos complexos I e III da cadeia transportadora de elétrons.
Além disso, outros sistemas celulares, como hipoxantina/xantina oxidase e NADPH
oxidase, produzem ROS. A maioria das ROS geradas nesses sistemas celulares são
apenas moderadamente reativas (i.e. O
2
•-
e H
2
O
2
) (Kamata e Hirata, 1999). Em níveis
fisiológicos, as espécies reativas podem executar importantes funções na regulação de
rotas de sinalização (Finkel, 2003) agindo em proteínas, lipídeos e ácidos nucléicos,
modificando domínios redox sensíveis (Aikawa et al., 1997). O mais importante
domínio redox sensível presente em proteínas são os resíduos de cisteína, que podem
ser modulados por alterações no seu estado de oxidação, agindo como sensores redox
celulares (Biswas et al., 2006). Recentemente tem se discutido que ROS regulam
diversos genes, modulando processos como proliferação celular e crescimento, bem
como a maquinaria de morte e vida celular, agindo como segundo mensageiro em
cascatas de sinalização (Kamata e Hirata, 1999).
29
Retinol, Ácido Retinóico e MMP-2
Uma das mais importantes espécies reativas as quais agem na sinalização redox
é o peróxido de hidrogênio, que é altamente difusível no ambiente celular e pode ser
espontânea ou enzimaticamente ser gerado a partir de O
2
•-
(Rhee et al., 2005).
Entretanto, tanto O
2
•-
como o H
2
O
2
podem ser convertidos a OH
•
por reação de Fenton
ou de Haber-Weiss (Cheng et al., 2002).
OH
•
parece ser inapropriado para agir como
segundo mensageiro em rotas de sinalização devido ao fato de ser um radical altamente
reativo de curta meia-vida que, uma vez gerado, rapidamente reage com moléculas
biológicas, levando a danos oxidativos irreversíveis (Cheng et al., 2002). O fato de um
bem estabelecido escavenger de radical hidroxil, como o manitol (Goldstein e Czapski,
1984), não ter revertido a atividade da MMP-2 induzida por retinol, sugere que outra
espécie reativa que não este radical, está atuando no aumento observado da atividade da
enzima. O tratamento com retinol parece gerar O
2
•-
e H
2
O
2
, como mostrado
anteriormente em trabalhos que observaram o aumento da atividade das enzimas
antioxidantes catalase, superóxido dismutase e glutationa peroxidase (Dal Pizzol et al.,
2001a). Além disso, trabalhos anteriores mostraram que o quelante de ferro 1,10-
fenantrolina, reverteu o dano oxidativo induzido por retinol (Dal Pizzol et al., 2000),
sugerindo que a reação de Fenton está envolvida no dano oxidativo induzido por retinol.
Entretanto, o aumento da atividade da MMP-2 induzido por retinol aqui observado
parece ser independente do radical hidroxil, apesar deste provavelmente estar sendo
gerado, já que o co-tratamento com manitol não reverteu o aumento da atividade
enzimática. De fato, pelas razões discutidas acima, a participação do danoso OH
•
iria de
encontro com a idéia aqui defendida, de que o processo do aumento da atividade da
enzima observado está ocorrendo através da ativação de uma via de sinalização redox-
sensível.
30
Retinol, Ácido Retinóico e MMP-2
As cinases extracelulares reguladas por sinal 1 e 2 (ERK1/2) são membros da
superfamília das proteínas cinases ativadas por mitógeno (MAPK). Essas cinases são
importantes proteínas regulatórias através das quais sinais extracelulares são traduzidos
em eventos intracelulares (Davis, 1994;Robinson e Cobb, 1997). Essas cinases são
sabidamente ativadas por ROS, como o peróxido de hidrogênio (Boonstra e Post, 2004;
Clerk et al., 1998). As MAPK atuam na ativação de fatores de transcrição que são
relacionadas à expressão de diversos genes, dentre eles, os genes das MMPs
(Westermarck et al., 2001).
Gelain (2006) demonstrou que o tratamento com retinol
induz a fosforilação de CREB, mediada pela ativação oxidativa de ERK1/2 (Gelain et
al., 2006). CREB, uma vez ativado por fosforilação da Ser-133, modula os genes de
regulação do ciclo celular e apoptose entre outros fatores de transcrição, como
diferentes membros da família AP-1, entre outros. Um dos genes aos quais CREB tem
sido associado é o MMP2 (Overall e Lopez-Otin, 2002). No presente trabalho, nós
confirmamos dados anteriores que mostraram que o tratamento com retinol 7 µM é
capaz de ativar ERK1/2. De uma forma geral, ERKs são principalmente envolvidas em
processos anabólicos, como divisão celular e crescimento (Clerk et al., 1998;
Kefaloyianni et al., 2006). A fim de verificar se a ativação da MMP-2 induzida por
retinol aqui observada está relacionada à ativação de ERK1/2, nós co-tratamos as
células com o inibidor UO126, um clássico inibidor de ERK1/2, o qual impede MEK1/2
de agir na fosforilação de ERK1/2, bloqueando assim a cascata de sinalização (Favata et
al., 1998). Nós evidenciamos que o co-tratamento com o inibidor reverteu totalmente o
aumento na atividade da MMP-2 induzido por retinol, indicando que a rota da ERK1/2
está envolvida no processo. Tomados em conjunto, nossos resultados sugerem que o
tratamento com retinol 7 µM aumenta a produção de espécies reativas de oxigênio, as
quais ativam a rota de sinalização das ERK1/2, aumentando a atividade da MMP-2 em
31
Retinol, Ácido Retinóico e MMP-2
células de Sertoli cultivadas. Seria racional pensar que concentrações maiores de retinol
poderiam aumentar a produção de ROS e, conseqüentemente, aumentar a atividade da
MMP-2. Entretanto, elevadas concentrações de ROS podem danificar os sistemas
celulares por reagirem inespecificamente com biomoléculas, ao invés de agir em rotas
de sinalização. Isso pode explicar o porquê de não termos encontrado um aumento na
atividade da MMP-2 em concentrações mais altas de retinol, reforçando mais uma vez a
hipótese da ativação da MMP-2 induzida por retinol via uma rota redox sensível.
Apesar do retinol e seus derivados, os retinóides, serem reconhecidos como
moléculas chave na regulação do crescimento e diferenciação celular, o exato
mecanismo da sua ação permanece pouco conhecido (Klamt et al., 2005). O retinol
representa o mais abundante retinóide presente no sangue, podendo ser convertido a
retinal e, subseqüentemente, a ácido retinóico, através ação de desidrogenases. O ácido
retinóico é o retinóide mais hormonalmente ativo, não sendo reconvertido a retinol em
sistemas biológicos (Napoli, 1999). Nossos resultados mostraram que o tratamento com
ácido retinóico 1 nM aumenta a atividade da MMP-2 em células de Sertoli cultivadas.
Entretanto, ao contrário do tratamento com retinol, o tratamento com AR não gerou
ROS, segundo o ensaio de oxidação de DCFH-DA. NAC, Trolox
®
e manitol não
reverteram o aumento da atividade da MMP-2 induzido por ácido retinóico, sugerindo
que ROS não estão envolvidos no processo de aumento da atividade induzidos por esse
forma de vitamina A. Somente co-tratamento com DTT reverteu a atividade da MMP-2
induzida por ácido retinóico. O potente antioxidante DDT provavelmente atua
mantendo reduzido o resíduo de cisteína o qual mantém a enzima em seu estado inativo,
inibindo sua ativação. De fato, o grupo o qual recebeu somente o tratamento com DTT,
teve a atividade da enzima diminuída abaixo dos níveis de controle.
32
Retinol, Ácido Retinóico e MMP-2
Esses resultados contrastam com os encontrados para o tratamento com retinol,
sugerindo que esses dois retinóides agem através de diferentes rotas na ativação da
MMP-2 em células de Sertoli cultivadas. Além disso, apesar do AR induzir a
fosforilação de ERK1/2 – de forma similar à indução de ERK1/2 promovida pelo
tratamento com retinol – o co-tratamento com o inibidor UO126 não reverteu a
atividade da MMP-2 induzida por tratamento com AR. É bem descrito que ácido
retinóico é capaz de induzir a fosforilação de ERK1/2 (Bost et al., 2002; Yen et al.,
1998). Cañón (2004) demonstrou que o ácido retinóico exerce um rápido efeito na
fosforilação de CREB pela ativação de ERK em células neuronais (Canon et al., 2004).
Por outro lado, o fato do co-tratamento com UO126 não ter alterado atividade da MMP-
2 induzida por AR sugere que a cascata de sinalização das ERK1/2 parece não ser a
principal rota envolvida nessa ativação.
Os alvos celulares mais importantes do ácido retinóico são os receptores RARs e
RXRs, os quais são receptores nucleares que regulam diversos genes em resposta a
retinóides (Napoli, 1999). Watson (2004) demonstrou que uma quantidade aumentada
de RAR-α está envolvida em uma expressão aumentada de MMP-1 no envelhecimento
cutâneo (Watson et al., 2004). Dessa forma, a atividade da MMP-2 induzida por ácido
retinóico em células de Sertoli cultivadas pode estar relacionado com uma ativação
direta dos RARs. Entretanto, mais estudos são necessários para elucidar esse fato, bem
como investigar as razões pelas quais concentrações mais altas de ácido retinóico não
aumentam a atividade da MMP-2.
No presente trabalho, nós mostramos que tanto o tratamento com retinol quanto
o tratamento com ácido retinóico alteram o aspecto morfológico de culturas de células
de Sertoli. A diminuição de densidade observada após 24 horas no grupo tratado com
retinol vem ao encontro de um recente trabalho de nosso grupo, o qual mostrou indução
33
Retinol, Ácido Retinóico e MMP-2
à apoptose induzida por tratamento com retinol, dependente de ROS, em células de
sertoli cultivadas (Klamt et al., 2007). A diminuição na densidade da cultura observada
pós 24 horas de tratamento com RA sugere que tal tratamento provoque morte celular.
Entretanto, uma análise mais profunda se faz necessária para averiguar tal afirmação.
Klamt (2000) demonstrou que o tratamento com retinol induziu a atividade da
enzima ornitina decarboxilase (ODC) e esse efeito foi atenuado por scavengers de
radicais livres (Klamt et al., 2000). A ODC é a enzima limitante da biosíntese das
poliaminas positivamente carregadas, as quais exercem um papel chave na síntese de
DNA, RNA e proteínas. Devido a sua importância para a célula, os níveis de ODC
devem ser estritamente regulados. Aumento na atividade da ODC e elevados índices de
poliaminas são notados sob estimulação de crescimento, bem como em células
transformadas por vários oncogenes ou agentes virais, ocorrendo naturalmente em
tumores. Dessa forma, a ODC é considerada uma enzima marcadora de proliferação
celular (Kahana et al., 2005). Trabalhos anteriores de nosso grupo de pesquisa
demonstraram que o tratamento com retinol induz a proliferação celular a qual pode ser
revertida com a utilização de antioxidantes, como Trolox
®
e NAC (Dal Pizzol et al.,
2001b). Em trabalho recente, nós demonstramos que o tratamento com retinol induz a
progressão no ciclo celular, levando a formação de focos proliferativos através da
geração de ROS (Klamt et al., 2003). Além disso, Gelain (2006) demonstrou que a
formação de focos proliferativos induzidos por tratamento com retinol é revertida pela
utilização de antioxidantes e UO126, indicando uma relação entre ROS, ERKs e
proliferação celular (Gelain et al., 2006). O aumento na atividade da ODC e a ativação
das ERK1/2 induzidos por tratamento com retinol parecem estar relacionados com um
desbalanço entre a produção de ROS e as defesas antioxidantes, mudando o destino
celular, tornando proliferativa a não-proliferativa célula de Sertoli. Isso pode explicar o
34
Retinol, Ácido Retinóico e MMP-2
crescimento acima da monocamada observado após cinco dias de cultura no grupo
tratado com retinol.
Entretanto, o tratamento com ácido retinóico não gerou ROS, mas também foi
capaz de induzir mudanças morfológicas nas culturas de células de Sertoli em um perfil
semelhante ao observado no grupo tratado com retinol. A morfologia dos túbulos
seminíferos depende da interação entre células de Sertoli, células peritubulares e matriz
extracelular, a qual é secretada por ambos os tipos celulares. Durante a vida adulta, as
células de Sertoli passam por modificações estruturais cíclicas as quais correspondem às
variações de seu status funcional durante o ciclo do epitélio seminífero, de acordo com
o nível de maturação das células germinativas, levando a alterações na matriz
extracelular, em um processo mediado principalmente pela modulação da atividade das
MMPs (El Ramy et al., 2005; Longin et al., 2001; Longin e Magueresse-Battistoni,
2002; Ulisse et al., 1998). Assim, alterações na atividade da MMP-2 podem danificar a
homeostase dos túbulos seminíferos. Longin (2002) sugeriu que MMP-2 está envolvida
nas mudanças morfológicas induzidas por FSH em células de Sertoli (Longin e
Magueresse-Battistoni, 2002) e El Ramy (2005) identificou que a atividade aumentada
de MMP-2 em células de Sertoli tratadas com FGF2, mostrando que tal tratamento
medeia interações entre células peritubulares e células de Sertoli (El Ramy et al., 2005).
Com base nesses estudos, portanto, acreditamos que de certa forma o aumento
da atividade da MMP-2 pode estar envolvido nas alterações morfológicas induzidas por
retinol e ácido retinóico em culturas de células de Sertoli.
35
Retinol, Ácido Retinóico e MMP-2
Conclusões
A partir dos dados obtidos na presente dissertação, podemos concluir que:
• Tanto o tratamento por 24 horas com retinol 7 µM quanto o tratamento por 24
horas com ácido retinóico 1 nM foram capazes de aumentar a atividade da
MMP-2 em células de Sertoli cultivadas;
• O tratamento com retinol 7 µM foi capaz de aumentar a produção de ROS em
células de Sertoli cultivadas, ao contrário do tratamento com ácido retinóico 1
nM;
• O aumento da atividade da MMP-2 induzido pelo tratamento com retinol 7 µM
parece ser dependente da produção de ROS, ao contrário do tratamento com
ácido retinóico 1 nM;
• O aumento da atividade enzimática induzida pelo tratamento com retinol 7 µM
parece ser dependente ativação oxidativa de ERK1/2. Já o tratamento com ácido
retinóico 1 nM parece induzir a atividade da MMP-2 por uma rota independente,
sem o envolvimento de ROS;
• Ambos os tratamentos foram capazes de modificar o aspecto morfológico da
cultura de células de Sertoli.
36
Retinol, Ácido Retinóico e MMP-2
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