( PDF ) Estudo químico e atividades biológicas de Ouratea hexasperma var. planchonii Engl. (Ochnaceae)

UFRRJ

INSTITUTO DE CIÊNCIAS EXATAS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA

DISSERTAÇÃO

Estudo Químico e Atividades Biológicas de Ouratea

hexasperma var. planchonii Engl. (Ochnaceae).

RENATA DUARTE FERNANDES

2008

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ii

UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DO RIO DE JANEIRO

INSTITUTO DE CIÊNCIAS EXATA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA

ESTUDO QUÍMICO E ATIVIDADES BIOLÓGICAS DE

Ouratea hexasperma var. planchonii Engl. (Ochnaceae).

RENATA DUARTE FERNANDES

Sob a Orientação do Professor

Dr. Mário Geraldo de Carvalho

Dissertação submetida como requisito

parcial para a obtenção do grau de

Mestre em Ciências, no Programa de

Pós-Graduação em Química, Área de

Concentração em Química de Produtos

Naturais

Seropédica, RJ

Julho de 2008

iii

UFRRJ / Biblioteca Central / Divisão de Processamentos Técnicos

547

F363e

T

Fernandes, Renata Duarte, 1977-

Estudo químico e atividades

biológicas de Ouratea hexasperma

var. planchonii Engl. (Ochnaceae) /

Renata Duarte Fernandes – 2008.

118f. : il.

Orientador: Mário Geraldo de

Carvalho.

Dissertação (Mestrado) –

Universidade Federal Rural do Rio

de Janeiro, Programa de Pós-

Graduação em Química.

Bibliografia: f. 93-101.

1. Química orgânica - Teses. 2.

Ouratea - Análise – Teses. 3.

Ochnaceae – Análise - Teses. 4.

Produtos naturais – Teses. I.

Carvalho, Mário Geraldo de, 1952- .

II. Universidade Federal Rural do

Rio de Janeiro. Programa de Pós-

Graduação em Química. III. Título.

Bibliotecário: _______________________________ Data: ___/___/______

iv

v

Ao meu marido Cristiano de Deus Correa e

À minha mãe Fátima Maria Duarte.

vi

AGRADECIMENTOS

A Deus;

Ao meu marido Cristiano pelo amor, compreensão, incentivo, paciência e carinho;

À minha mãe Fátima por acreditar em meus sonhos e me incentivar sempre;

Aos meus irmãos Rodrigo e Robson pelo incentivo e ajuda;

À minha vovó Maria dos Anjos, aos meus tios pelo carinho e alegria em cada vitória

minha, aos meus primos e meu afilhado;

À minha amiga de todas as horas Juliana Moura;

Ao Professor Dr. Mário Geraldo de Carvalho pela orientação, ensinamentos, atenção e

paciência;

Aos amigos do LQPN-UFRuralRJ: Eduardo (Ceará), Delcí, Marcelo, Maritza,

Virgínia, Luciano, Luiz Roberto (Pilha), Mário Sérgio, pela amizade e pelos momentos de

descontração que passamos juntos e à nova integrante da equipe Roberta pelas palavras de

incentivo;

Aos alunos de iniciação científica e estagiários do LQPN-UFRuralRJ: Luciane,

Claudiana, Daniel, Letícia, Raquel, Tatiane, Verônica, Débora, Ana Paula, Aline e Aline’ pela

amizade, convivência agradável e auxílio durante a realização deste trabalho.

A todos os colegas do PPGQO, sem exceção, pelo bom relacionamento durante este

período; em especial aos amigos Ari, Cláudio, Janaína, Kênia, Ana Paula, Andréa Janaína,

Andréa Rose, Willian, Camilla, Alessandra, André Vinícius, Letícia, Vinícius, Suzana e

Raquel; e à Regina pela amizade, incentivo e apoio;

Aos professores do PPGQO pela formação e evolução profissional;

À professora Dra. Rosane Nora Castro pelos ensinamentos e auxílio nas análises no

HPLC;

Aos funcionários do ICE-UFRRJ, Maurício, Welisson, Carlão, Eli, Fábio, Francês,

Osmar, Rui, Aldir e André;

À professora Dra. Maria de Fátima Agra (LTF-UFPB) pela coleta e identificação do

material vegetal;

Ao Prof Dr. Edilberto Rocha Silveira do (CENAUREMN/UFC), pela obtenção dos

espectros a 500 MHz;

À professora Dra. Alceni Augusta Werle (UFOP) pelas análises no CLAE-EM;

Aos professores Dra. Miliane Moreira Soares de Souza e Dr. Francisco de Assis

Baroni (IV/UFRRJ) pelos ensaios de atividade antibacteriana e antifúngico;

Aos professores Dr. Fábio Fagundes Rocha e Frederico Argollo Vanderlinde do

Departamento de Ciências Fisiológicas (IB/UFRRJ) pelo teste de toxicidade;

Ao mestrando Élio Barbieri Departamento de Parasitologia Animal-UFRRJ pelo

ensaio de atividade inseticida;

À professora Denise Monte Braz do Departamento de Botânica da UFRRJ, pela

atenção e auxílio na classificação botânica;

Às meninas do alojamento da graduação F1-32 Tati, Marcele, Dailane, Camila,

Wilma, Germana, Joyce e Geovana pela amizade, momentos de estudos e de descontração;

Às meninas do alojamento da Pós-graduação Janaína, Vanessa, Renata, Michelle,

Daniele, Patrícia, Sabrina, Silvana, Eliane, Kênia, Fabiana, Fernanda, Daniela, Fabíola, Ana

Luisa, e Veridiana pelo acolhimento, amizade e bons momentos;

Desde já, à banca examinadora, pelas sugestões e correções sugeridas a este trabalho;

À UFRRJ, por mais uma oportunidade e acolhimento;

A CNPQ pela concessão da bolsa de estudos;

A todos que, de algum modo, me ajudaram na realização deste trabalho.

vii

Quando alguém encontra seu caminho,

precisa ter coragem suficiente

para dar passos errados.

As decepções, as derrotas, o desânimo

são ferramentas que Deus

utiliza para mostrar a estrada.

Paulo Coelho

viii

RESUMO

FERNANDES, Renata Duarte. Estudo Químico e Avaliação de Atividades

Biológicas de Ouratea hexasperma var. planchonii Engl. 2008 101f. Dissertação (Mestrado

em Química Orgânica). Instituto de Ciências Exatas, Departamento de Química, Universidade

Federal Rural do Rio de Janeiro, Seropédica, RJ, 2008.

Os metabólitos especiais isolados de galhos de Ouratea hexasperma var. planchonii

Engl., permitiram a comparação com os constituintes de O. hexasperma (St. Hil.) para

confirmar a classificação botânica da mesma. Neste trabalho também foram avaliadas

algumas atividades biológicas.

As analises das frações obtidas do fracionamento com partição com solventes e

técnicas cromatográficas dos extratos preparados com diclorometano e metanol dos galhos de

Ouratea hexasperma var. planchonii Engl. conduziu à identificação de alguns constituintes

químicos. Identificaram-se misturas de hidrocarbonetos alifáticos, ácidos alilfáticos, de

esteróides (sitosterol, estigmasterol e campesterol), além de três triterpenos, lupeol, α e β

amirina, e os flavonóides (7”-O-metilagatisflavona e agatisflavona) e sitosterol-3-O-β-D-

glicopiranosideo. As estruturas foram determinadas através de análise dos dados

espectrométricos de IV, RMN de

1

H e

13

C uni e bidimensional e massas, além de comparação

com dados da literatura. A técnica CLAE-EM foi utilizada na análise adicional de duas

frações contendo dois biflavonóides e alguns constituintes adicionais. Esta análise permitiu

propor a presença de metil-vitexina, orientina, metil-diidroxiflavona, glicopiranosil-flavonas,

dimetilagatisflavona, glicopiranosil-prenil-flavonol além da confirmação das duas biflavonas

identificadas inicialmente.

Os extratos dos galhos de Ouratea hexasperma var. planchonii Engl. foram

submetidos à avaliação de atividade antibacteriana, antifúngica, inseticida e de toxidez. O

crescimento de Escherichia coli e Staphylococcus aureus reduziu com extrato metanólico. As

frações contendo as biflavonas foram parcialmente ativas como inseticida contra Musca

domestica. Os extratos apresentaram baixa toxicidade em dose única.

Palavras–chave: Ouratea hexasperma, flavonóides, atividades biológicas.

ix

ABSTRACT

FERNANDES, Renata Duarte. Phytochemical Study and Biological Activities

extracts from the branches of Ouratea hexasperma var. planchonii Engl. 2008 103f.

Dissertation (Magister Scientiae in Organic Chemistry), Instituto de Ciências Exatas,

Departamento de Química, Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, Seropédica, RJ,

2008.

The specials metabolites isolated from the branches of the Ouratea hexasperma var.

planchonii Engl., allowing to the comparison with the chemical constituents from variety

Ouratea hexasperma (St. Hil.) to confirm the botanical classification. Some biological

activities were evaluated.

The analysis of the fractions from solvents and chromatographic fractionation of the

dichloromethane and methanolic extracts from the branches of Ouratea hexasperma var.

planchonii Engl. led to the identification of some chemical constituents. This procedure led to

identification of aliphatics compounds mixture, aliphatic alcohol mixture, steroids mixture

(sitosterol, stigmasterol and campesterol), three triterpenes, lupeol e α-amiryn e β-amiryn, and

the biflavonoids (7”-O-methylagathisflavone and agathisflavone) and sitosterol-3-O-β-D-

glycopyranoside. The structures were determined by IR, de

1

H (1D e 2D) e

13

C (BBD e

DEPT) NMR spectral data analysis and comparison with literature values. The HPLC-MS

were used in the analysis of two fractions containing the these two biflavones and some

additional compounds. This analysis led us to identify the presence of methyl-vitexin,

orientin, methyl-dihydroxyflavone, glycopiranosil-flavones, dimethylagathisflavone and

glycopyranosil-prenyl-dihydroxyflavonol besides the confirmation of these two biflavonoids.

The extracts from the branches of Ouratea hexasperma var. planchonii Engl. were

submitted on evaluations of the antibacterial, antifungal, insecticide and toxicity activities.

The Escherichia coli and Staphylococcus aureus growth was inhibited with methanolic

extract. The fractions containing the biflavonoids were partially active as insecticide against

Musca domestica. The extracts presented low toxicity on unique dose.

Key words: Ouratea hexasperma, flavonoids, biologicals activities.

x

LISTA DE FIGURAS

Figura 1: Triflavonóides isolados no Gênero Ochna 3

Figura 2: Biflavonóides e dímeros de chalconas isolados dos Gêneros Ochna e Lophira. 4

Figura 3: Flavonóides e chalconas isolados do gênero Luxemburgia 5

Figura 4: Flavonóides isolados do Gênero Ouratea 7

Figura 5: Outras classes de substâncias isoladas nos gêneros Ouratea. 9

Figura 6: Diferenças morfológicas entre as folhas de Ouratea hexasperma. 10

Figura 7: Dímeros de flavonóides 11

Figura 8: Constituintes químicos isolados neste trabalho 17

Figura 9: Mecanismo proposto da reação de metilação com diazometano.

23

Figura 10: Espectro de IV do material alifático de O. hexasperma var. planchonii Engl.. 25

Figura 11: Espectro de RMN de

1

H (200 MHz, CDCl

3

) do material alifático. 26

Figura 12: Espectro de IV de 1 27

Figura 13: Espetro de RMN de

1

H (200 MHz, CDCl

3

) de 1. 28

Figura 14: Cromatograma de 1. 28

Figura 15: Espectro de massas de 1 29

Figura 16: RMN de

1

H (200 MHz, CDCl

3

) da mistura de esteróides, 2 (a, b e c) 30

Figura 17: Cromatograma da mistura dos esteróides 2 (a, b e c) 30

Figura 18a : Espetro de massas de 2 (a) comparado com a biblioteca do aparelho. 31

Figura 18b : Espetro de massas de 2 (b) comparado com a biblioteca do aparelho. 32

Figura 18c : Espetro de massas de 2 (c) comparado com a biblioteca do aparelho. 33

Figura 19: Espectro de RMN de

1

H (200 MHz, CDCl

3

) de 3 (a, b e c). 34

Figura 20: Espetro de massas de 3 (a) comparado com a biblioteca do aparelho. 35

Figura 21: Espetro de massas de 3 (b e c) comparado com a biblioteca do aparelho 35

Figura 22: Espectro de IV de 4 37

Figura 23: Espectro de RMN de

1

H (500 MHz , D

3

CCOCD

3

) de 4 39

Figura 24: Espectro de

1

H-

1

H-COSY - (500 MHz, D

3

CCOCD

3

) de 4. 40

Figura 25: Espectro de

1

H-

1

H-NOESY - (500 MHz, D

3

CCOCD

3

) de 4. 41

xi

Figura 26: Ampliação do Espectro de

1

H-

1

H-NOESY - (500 MHz, D

3

CCOCD

3

) de 4. 42

Figura 27: Ampliação do Espectro de

1

H-

1

H-NOESY - (500 MHz, D

3

CCOCD

3

) de 4. 43

Figura 28: RMN de C (125 MHz, D

3

CCOCD

3

) da substância 4 44

Figura 29: Ampliação(180-187 ppm) do Espectro de RMN de

13

C (125 MHz,

D

3

CCOCD

3

) da substância 4

44

Figura 30: Ampliação (156-166 ppm) do Espectro de RMN de

13

C (125 MHz,

D

3

CCOCD

3

) da substância 4

45

Figura 31: Espectro de HMBC (D

3

CCOCD

3

) da substância 4. 45

Figura 32: Ampliação do espectro de HMBC (D

3

CCOCD

3

) da substância 4. 46

Figura 33: Ampliação do espectro de HMBC (D

3

CCOCD

3

) da substância 4 46

Figura 34: Ampliação do espectro de HMBC (D

3

CCOCD

3

) da substância 4. 47

Figura 35: Ampliação do espectro de HMBC (D

3

CCOCD

3

) da substância 4. 47

Figura 36: Ampliação do espectro de HMBC (D

3

CCOCD

3

) da substância 4 48

Figura 37: Ampliação do espectro de HMBC (D

3

CCOCD

3

) da substância 4 48

Figura 38: Ampliação do espectro de HMBC (D

3

CCOCD

3

) da substância 4 49

Figura 39: Espectro de HSQC (D

3

CCOCD

3

) da substância 4 50

Figura 40: Espectro de IV de 5. 51

Figura 41: Espectro de RMN de

1

H (200MHz, D

3

CCOCD

3

) da mistura dos biflavonóides

4 e 5.

53

Figura 42: Ampliação do espectro (6.0-8.5 ppm) de RMN de

1

H (200MHz, D

3

CCOCD

3

)

da mistura dos biflavonóides 4 e 5.

53

Figura 43: Espectro de RMN de

13

C (50 MHz, D

3

CCOCD

3

) da mistura dos biflavonóides

4 e 5.

54

Figura 44: Ampliação do espectro de RMN de

1

H (500 MHz , D

3

CCOCD

3

) do derivado

4a.

54

Figura 45: Cromatograma obtido em CLAE de 4 55

Figura 46: Cromatograma obtido em CLAE da mistura 4 e 5. 55

Figura 47: Espectro de RMN de

1

H (500 MHz , D

3

CCOCD

3

) do derivado 4a. 58

Figura 48: Ampliação do espectro de RMN de

1

H (500 MHz , D

3

CCOCD

3

) do derivado

4a.

59

Figura 49: Ampliação do espectro de RMN de

1

H (500 MHz , D

3

CCOCD

3

) do derivado

4a..

59

xii

Figura 50: Espectro de

1

H-

1

H-COSY (500MHz, D

3

CCOD

3

) de 4a 60

Figura 51: Espectro de NOESY de 4a. 60

Figura 52: Ampliação do espectro de NOESY de 4a. 61

Figura 53: Espetro de

13

C (125MHZ, D

3

CCOD

3

) de 4a. 61

Figura 54: Ampliação do espectro de

13

C (125MHZ, D

3

CCOCD

3

)de 4a. 62

Figura 55: Espectro de HMBC (D

3

COD

3

) da substância 4. 63

Figura 56: Espectro de HSQC (D

3

COD

3

) da substância 4. 64

Figura 57: Espectro de IV da substância 6 66

Figura 58: RMN de

1

H da substância 6 68

Figura 59: RMN de

13

C da substância 6 69

Figura 60: Ampliação do RMN de

13

C(125 Hz, DMSO-d

6

) da substância 6 70

Figura 61: CLAE da fração OSPGMC. 71

Figura 62: CLAE da fração OSPMC1-6p 72

Figura 63: RMN de

1

H (200MHz, D

3

CCOCD

3

) da fração OSPGMC 73

Figura 64: RMN de

1

H (200MHz, D

3

CCOCD

3

) da fração OSPGMC1.6p 73

Figura 65: Identificação dos valores de m/z para os picos detectados no CLAE-EM da

fração OSPGMC

74

Figura 66: Estruturas propostas através da análise CLAE-EM na fração OSPGC. 76

Figura 67: Identificação dos valores de m/z para os picos detectados no CLAE-EM da

fração OSPGMC1.6p

77

Figura 68: Estruturas propostas através da análise CLAE-EM na fração OSPGCM1.6p. 79

xiii

LISTA DE TABELAS

Tabela 1: Ocorrência de Agatisflavonas e derivados em espécies vegetais. 12

Tabela 2: Divisões Botânicas das espécies que onde há ocorrência de agatisflavonas e

derivados.

15

Tabela 3: Registro dos resultados da prospecção química do extrato metanólico de O.

hexasperma var. planchonii Engl.

24

Tabela 4. Dados de RMN

1

H e

13

C (D

3

CCOCD

3

,

1

H e D

3

CSOCD

3

,

13

C) da substâncias 4.

38

Tabela 5. Dados de RMN

1

H (200 MHz) e

13

C (50 MHz) em Metanol-D, (AGRAWAL,

1989) da substância 5 (agatisflavona).

52

Tabela 6: Dados de RMN

1

H (200 MHz) e

13

C (50 MHz) da substância 4 (MOREIRA et

al., 1999) com o derivado 4a.

57

Tabela 7: Dados de RMN de

1

H e

13

C da substância 6 67

Tabela 8 – Mortalidade (%) de amostras vegetais sobre Musca domestica após 24 horas

da aplicação.

90

Tabela 9 – Mortalidade (%) de amostras vegetais sobre Musca domestica após 48 horas

da aplicação.

90

xiv

LISTA DE ESQUEMAS

Esquema 1: Marcha para o isolamento das substâncias dos galhos de Ouratea

hexasperma var. planchonii engl.

21

Esquema 2: Propostas de estruturas compatíveis com os valores de m/z detectados na

análise de CLAE-EM

75

Esquema 3: Propostas de estruturas compatíveis com os valores de m/z detectados na

análise de CLAE-EM

78

Esquema 4: Biossíntese de ácidos graxos (adaptado de DEWICK, 2002) 80

Esquema 5: Proposta de a-oxidações em aácidos graxos (HARWOOD, 1997).

81

Esquema 6: Proposta biogenética para os esteróides (Adaptado de MANN, 1994). 82

Esquema 7: Proposta biogenética para os terpenos lupeol e α-amirina. (Adaptado de

MANN, 1994; DEWICK, 2002).

83

Esquema 8: Proposta biogenética para as flavonas (DEWICK, 2002) e biflavonas

(MOREIRA, 1994)

84

xv

LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS

1D Unidimensional

2D Bidimensional

δ

Η

Deslocamento Químico de Hidrogênio (ppm)

δ

C

Deslocamento Químico de Carbono (ppm)

ν Estiramento

δ Deslocamento químico

Acetona-D

6

Acetona deuterada

CCDA Cromatografia em Camada Delgada Analítica

CCF Cromatografia em Camada Fina

CCP Cromatografia em Camada Preparativa

CG-EM Cromatografia em Fase Gasosa Acoplada a Espectrometria de Massas

CLAE Cromatografia Líquida de Alta Eficiência

cm Centímetro

COSY COrrelation SpectroscopY

d Dubleto

dd Duplo Dubleto

DMSO-d

6

Dimetilsulfóxido deuterado

EM Espectrometria de Massas

HMBC Heteronuclear Multiple-Bond Correlation

HSQC Heteronuclear Single Quantum Coherence

Hz Hertz

IV Infravermelho

J Constante de acoplamento em hertz

λ comprimento de onda

µm micrômetro

m multipleto

M

+.

pico do íon molecular positivo

MHz Mega Hertz

m/z relação massa/carga

nm nanómetro

OspGD Extrato diclometano dos galhos de O. hexasperma var. planchonii Engl.

OspGM Extrato metanólico dos galhos de O. hexasperma var. planchonii Engl.

NOESY Nuclear Overhauser Experiment Spectroscopy

P.F. ponto de fusão

ppm parte por milhão

q quarteto

RF Fator de Retenção

RMN

1

H Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio

RMN

13

C Ressonância Magnética Nuclear de Carbono-13

s singleto

sl singleto largo

t tripleto

TR Tempo de Retenção

TMS tetrametilsilano

OBS: As abreviaturas e símbolos utilizados neste trabalho e que não constam nesta relação,

encontram-se descritas no texto ou são convenções adotadas universalmente.

xvi

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO 1

Objetivos 2

2. REVISÃO DE LITERATURA 3

2.1. Generalidades Sobre a Família Ochnaceae e o Gênero Ouratea 3

2.2 Classificação botânica de O. hexasperma (St. Hill) Bail var. hexasperma e O.

hexasperma var. planchonii Engl.

9

2.3. Estudo Químico Realizado com Ouratea hexasperma (St. Hil.) Bail 10

2.4. Biflavonóides 10

2.4.1. Agatisflavona e derivados 12

3. CONSTITUINTES QUÍMICOS ISOLADOS DE O. hexasperma var. planchonii Engl. 16

4. PARTE EXPERIMENTAL 18

4.1. Equipamentos e Reagentes 18

4.2. Material vegetal 18

4.3. Obtenção dos extratos brutos 19

4.4. Prospecção Química do Extrato Metanólico 19

4.5. Isolamento e Purificação dos Constituintes dos Galhos de O. hexasperma var.

planchonii Engl.

19

4.5.1. Extrato com diclorometano 19

4.5.2. Extrato com metanol 20

4.6. Derivação 22

4.6.1. Metilação com diazometano 22

5. R

ESULTADOS E

D

ISCUSSÃO

24

5.1. Prospecção Química do extrato metanólico 24

5.2. Determinação Estrutural dos Constituintes Isolados de Ouratea hexasperma var

.

planchonii Engl.

25

5.2.1. Alcanos 25

5.2.2 Substância 1 27

5.2.3. Substâncias 2 (a, b e c) 29

xvii

5.2.4. Substâncias 3 (a, b e c) 33

5.2.5. Substância 4 36

5.2.6. Substância 5 50

5.2.7 Derivado 4a 56

5.2.8. Substância 6 65

5.3. ANÁLISE COM CLAE DAS FRAÇÕES OSPGMC E OSPMC-16P. 71

5.4. Propostas Biossintéticas para os constituintes isolados de Ouratea hexasperma var.

planchonii Engl.

80

5.4.1. Ácidos graxos 80

5.4.2. Esteróides

82

5.4.3. Terpenos 83

5.4.4. Biflavonóides

84

5.5. ENSAIOS BIOLÓGICOS 85

5.5.1. Avaliação da Atividade Antimicrobiana do Extrato Metanólico de Ouratea

hexasperma var. planchonii Engl.

85

5.5.2. Verificação de atividade antifúngica do Extrato Metanólico de Ouratea

hexasperma var. planchonii Engl.

86

5.5.3. Avaliação da Atividade Inseticida contra Musca doméstica 88

5.5.4. Avaliação da toxidez do extrato metanólico em Mus musculus. 90

6. CONCLUSÕES 92

7. REFERÊNCIAS 93

1

1. INTRODUÇÃO

Os produtos naturais vêm sendo utilizados pela humanidade como remédio desde os

primórdios. A busca por alívio e cura de doenças pela ingestão de ervas e folhas talvez tenha

sido uma das primeiras formas de utilização dos produtos naturais.

O profundo conhecimento do arsenal químico da natureza, pelos povos primitivos e

pelos indígenas, pode ser considerado fator fundamental para o descobrimento de substâncias

tóxicas e medicamentosas ao longo do tempo. A convivência e o aprendizado com os mais

diferentes grupos étnicos trouxeram valiosas contribuições para o desenvolvimento da

pesquisa sobre utilização de substâncias naturais para a cura de doenças ou criar produtos em

benefício do bem estar do homem. Há relatos, por exemplo, do uso de plantas com

finalidades terapêuticas por volta de 3.000 a.C. na obra Pen Ts’ao do chinês Shen Nung

(VEIGA JR. et al, 2005). As pesquisas na área da química de produtos naturais permitiram a

descoberta de muitos modelos moleculares que fundamentaram estudos de relação estrutura-

atividade (SAR) e inspiraram o desenvolvimento da síntese orgânica clássica. (VIEGAS JR.

et al, 2006).

No início, os químicos estudavam plantas consagradas pelo uso popular, geralmente

incorporadas às farmacopéias da época, limitando-se ao isolamento e à determinação

estrutural de substâncias ativas (YUNES & CECHINEL FILHO, 2001). Dada a importância

das plantas para a medicina da época, a Química e a Medicina passaram a ter uma estreita

relação, o que permitiu um rápido desenvolvimento de seus campos específicos (YUNES &

CECHINEL FILHO, 2001). Desta forma, muitas substâncias ativas foram conhecidas e

introduzidas na terapêutica, permanecendo até hoje como medicamentos. Um exemplo

importante do desenvolvimento dos fármacos a partir de produtos naturais de plantas foi o

descobrimento dos salicilatos obtidos de Salix alba.

A natureza sempre despertou no homem um fascínio encantador, não só pelos recursos

oferecidos para sua alimentação e manutenção, mas por ser sua principal fonte de inspiração e

aprendizado. A busca incessante pela compreensão das leis naturais e o desafio de transpor

barreiras à sua sobrevivência, como o clima e as doenças, levaram o homem ao atual estágio

de desenvolvimento científico, mesmo após o avanço tecnológico observado nos dias de hoje.

(VIEGAS JR et al. 2006).

Pesquisadores da área de produtos naturais mostram-se impressionados pelo fato

desses produtos encontrados na natureza revelarem uma gama quase que inacreditável de

diversidade em termos de estrutura, propriedades físico-químicas e biológicas (WALL &

WANI, 1996). Diversos autores têm apontado a importância dos estudos químicos e

farmacológicos de várias espécies vegetais pela intensa produção de metabólitos especiais,

principalmente, nas espécies dos ecossistemas tropicais (BRITO & BRITO, 1993). Nesta

perspectiva, a botânica, a química e a farmacologia abrangem conhecimentos indispensáveis

para a utilização segura de plantas medicinais, mostrando que a busca sistemática de novos

medicamentos tem sido realizada por inúmeras abordagens de estudo. Desta forma, uma

abordagem interdisciplinar, na pesquisa de novos medicamentos, representa, de modo

inegável, a alternativa mais eficaz e promissora para o alcance deste objetivo (Di STASI,

1996).

Nas últimas décadas o estudo de plantas medicinais evoluiu muito, principalmente, do

ponto de vista químico. Esta evolução deve-se ao desenvolvimento de técnicas analíticas que

corroboram para a determinação estrutural. Os produtos naturais vêm recuperando espaço e

importância na indústria farmacêutica como fonte inspiradora de novos padrões moleculares

bioativos (VIEGAS JR et al. 2006)

. Cerca de 25% das prescrições dispensadas nos Estados

Unidos durante os últimos 25 anos estavam relacionadas a medicamentos que com princípios

2

ativos de origem natural ou semi-sintéticos, oriundos normalmente de plantas superiores.

Além de cerca de 13% relativas a medicamentos de fontes microbianas e 2,7% de origem

animal (CRAGG, et. al., 2003). Resultados de análise de novos fármacos aprovados pelo FDA

(Food and Drug Administration) e por entidades reguladoras de outros países, no período de

1981 a 2006, indicaram que os medicamentos recomendados para tratamento de doenças

infecciosas atingiram 230 novos medicamentos, dos quais 5,2% eram de produtos naturais e

32,3% eram de derivados de produtos naturais (NEWMAN & CRAGG, 2007). Para o

tratamento do câncer cerca de 175 novos medicamentos tem sido aprovados, dos quais 14%

são de produtos naturais e 28% de derivados de produtos naturais. (NEWMAN & CRAGG,

2007).

O Brasil, com a grandeza de seu litoral, de sua flora e, sendo o detentor da maior

floresta equatorial e tropical úmida do planeta, não pode abdicar de sua vocação para os

produtos naturais. A Química de Produtos Naturais (QPN) é, dentro da Química brasileira, a

área mais antiga e a que, talvez, congregue o maior número de pesquisadores (PINTO et al.,

2002).

O grupo de pesquisa em química de produtos naturais da UFRRJ tem registrado,

dentre outros trabalhos, estudos com a família Ochnaceae, principalmente com espécies do

gênero Ouratea e Luxemburgia, dando valiosas contribuições para o conhecimento da

química dessa família, propiciando subsídios para avaliações quimiotaxonômicas, além de

apresentar substâncias com importantes atividades biológicas contribuindo para busca de

novos fármacos (SUZART, et. al.2007).

Objetivos

Os objetivos do presente trabalho são:

• Isolar e identificar os principais metabólitos especiais dos galhos de Ouratea

hexasperma var. planchonii Engl.;

• Verificar se há semelhanças químicas entre as variedades de Ouratea hexasperma (O.

hexasperma (A. St.-Hil.) Bail. var. hexasperma e O. hexasperma var. planchonii

Engl.);

• Avaliar atividades biológicas de extratos e/ou frações dos galhos de Ouratea

hexasperma var. planchonii Engl., como atividades antibacteriana, antifúngica,

inseticida e de toxicidade;

• Preparar derivados dos constituintes isolados;

• Fazer a atribuição de dados espectrométricos das substâncias naturais isoladas e

derivados;

• Utilizar CLAE-EM para identificar componentes minoritários que são difíceis de

identificar pelas técnicas usuais;

• Realizar um estudo de informações relacionadas aos biflavonóides considerados como

marcadores sistemáticos do gênero Ouratea.

3

2. REVISÃO DE LITERATURA

2.1. Generalidades Sobre a Família Ochnaceae e o Gênero Ouratea

A família Ochnaceae

pertence à ordem Theales e compreende cerca de 28 gêneros e

400 espécies, de ampla distribuição nas regiões tropicais e subtropicais de todo o mundo. No

Brasil ocorrem aproximadamente 9 gêneros com 105 espécies (BARROSO, 1986). Essas são

plantas essencialmente arbóreas ou arbustivas, raramente herbáceas (Sauvagesia), folhas em

geral inteiras, de distribuição alterna e com estípulas. Apresentam flores amarelas, alvas ou

avermelhadas. (BARROSO et. al, 2002).

A família Ochnaceae é pouco conhecida do ponto de vista químico e biológico.

Estudos químicos demonstram que são capazes de biossintetizar flavonóides e biflavonóides,

sendo os gêneros Ochna, Lophira, Luxemburgia e Ouratea os mais estudados. Investigações

sobre a composição química de espécies do gênero Ouratea, levaram ao isolamento de vários

biflavonóides (SIMONI et al., 2002). A freqüência e a diversidade estrutural dos

biflavonóides em espécies desses gêneros permitem que sejam utilizados como marcadores

taxonômicos (SUZART et al., 2007).

O gênero Ochna consiste em mais de 85 espécies distribuídas por toda África

(PEGNYEMB et al., 2003), principalmente na região de Camarões. O estudo de algumas

espécies desse gênero forneceu triflavonóides: caloflavanas A e B (figura 1, pág. 3).

(MESSANGA et al., 2002); biflavonóides (KAMIL et al., 1987): calodeninas A e B e

lophironas K e C (figura 2, pág. 4). (MESSANGA et al., 1994; PEGNYEMB et al., 2001).

Biflavonóides, isoflavona e flavona C-glicosilada foram isolados de O. squarrosa. Esta

espécie é utilizada no tratamento de indigestão, complicações menstruais e contra asma (RAO

& GUNASEKAR, 1989). O extrato etanólico e os biflavonóides isolados do caule de O.

macrocalyx mostraram atividades citotóxicas e antibacterianas (TANG et al., 2003).

O gênero Lophira é comumente encontrado na região tropical da África, onde é

conhecido pelos seus usos medicinais (GHOGOMU et al., 1987). As espécies mais estudadas

são L. alata e L. lanceolata. Desses gêneros foram isolados flavonóides, biflavonóides e

dímeros de chalconas (lophironas F, G e H) (figura 2, pág. 4). (TIH GHOGOMU et al.,

1989a; TIH GHOGOMU et al., 1989b; TIH GHOGOMU et al., 1990; TIH et al., 1992a; TIH

et al., 1992b; TIH et al., 2003).

Figura 1: Triflavonóides isolados no Gênero Ochna

OH

HO

OH

HO

CO

OH

O

OH

HO

O

OH

HO

OH

HO

CO

OH

O

OH

HO

O

OH

Caloflavana A

Caloflavana B

4

O Gênero Luxemburgia ocorre somente no Brasil e suas espécies são encontradas

principalmente nos campos rupestres da Cadeia do Espinhaço, em Minas Gerais e na Bahia

(FERES, 2006). Estas espécies são capazes de biossintetizar flavonóides e biflavonóides com

esqueleto próximo a chalconas (OLIVEIRA et al., 2002; CARVALHO et al., 2004) e a

bichalcona luxenchalcona (I-3-O-II-4

”

) (figura 3, pág. 5) (CARVALHO et al., 2004). A

rutina (3-O-rutinosídeo-quercetina) foi isolada de Luxemburgia nobilis (OLIVEIRA et al.,

2002) e das flores de Luxemburgia octandra foram isolados dois flavonóides 8-C-glicosilados

(figura 3) (ALVES et al., 2003).

HO

OH O

O

OH

CO

HO OH

OH

lophirona K

HO

OH

O

CO

CO(CH

2

)

2

OH

HO OH

OH

Calodenina A

OH

lophirona C

HO

OH

HO

lorophirona F e G

HO

O

OH

CO

HO

OH O

O

OH

O

OH

HO

O

OH

HO

OH

HO

Calodenina B

HO

OH O

O

OH

CO

HO OH

OH

lophirona K

Figura 2: Biflavonóides e dímeros de chalconas isolados dos Gêneros Ochna e Lophira.

5

O gênero Ouratea ocorre em todo território Nacional, destacando-se no Rio de

Janeiro, Minas Gerais, Paraíba, Bahia e Pernambuco. Algumas espécies do gênero Ouratea

incluindo a O. grandifolia, ocorrem na Restinga da Marambaia, Corcovado e Campo Grande

(Limeirão)/RJ. (BARROSO, 1986).

As espécies de Ouratea são caracterizadas pelas flores geralmente vistosas,

freqüentemente de coloração amarela. No Nordeste as espécies de Ouratea são conhecidas

como batiputá, as sementes de batiputá fornecem a “Manteiga de batiputá”, óleo adocicado e

aromático, utilizado em conservas e temperos, tornando-se rançoso com facilidade. As

espécies de Ouratea espalhadas pelo país recebem designações específicas como Angelim

R

HO

OH

R

1

O

R=R

1

=OH 3-hidroxiisoliquiritigenina

R= OH; R

1

=H isoliquiritigenina

1

'

4

'

1

'"

4

'"

O

OH

HO

OH

O

OH

O

3

4

"

I

II

Luxenchalcona

O

OH

HO

O

OH

O

HO

OH

O

OH

1

"

1

"'

8

5

3

Rutina

8

R=H

R=CH

3

Flavonóides glicosilados

O

OH

RO

OH

O

OH

1

"

2

"

3

"

4

"

5

"

6

"

O

OH

HO

OH

O

OH

ocnaflaflova

Figura 3: Flavonóides e chalconas isolados do gênero Luxemburgia

6

(Ouratea vaccinoides), Caju Bravo (Ouratea floribunda e Ouratea salicifolia) e Coração de

Bugre (Ouratea parviflora).

As

Ouratea floribunda e Ouratea castanaefolia são empregadas

em ornamentação urbana (SUZART et al., 2007). São utilizadas na medicina popular como

adstringentes, tônicas, estomáquicas, vermífugas (BRAGA, 1960), em distúrbios gástricos e

reumatismo (MBING et al., 2003a) e útil na cura de paralisias, erisipela, feridas no útero e

úlceras, distúrbios gástricos e na cicatrização de feridas (BARROSO, 1986).

Em estudos com espécies do gênero Ouratea, podemos destacar os que mostraram

atividade antitumoral contra células do carcinoma Ehrlich (CARVALHO et al., 2002),

inibição das DNA topoisomerases (GRYNBERG et al., 2002), efeitos antiproliferativos e

ativação da apoptose em células de tumor Ehrlich (GRYNBERG et al., 1998). O extrato

hidroetanólico e a fração acetato de etila de Ouratea semisserrata apresentaram efeito

vasodilatador dependente do endotélio (CORTES et al., 2002) e atividade anti-hipertensiva,

inibindo a conversão da enzima angiotensina I (ACE) (CASTRO et al., 2000). O extrato

metanólico de Ouratea elongata, Ouratea flava e Ouratea sulcata, demostrou atividade

antimicrobiana contra Staphylococcus aureus, S. epidermidis, Enterococcus hirae e Candida

albicans (GANGOUE-PIEBOJI et al., 2006). Também apresentou atividade antimicrobiana o

óleo da fruta de Ouratea parviflora Baill extraído com hexano (PAULO, et al., 1986).

O

extrato metanólico das folhas de Ouratea cuspidata revelou atividade antiparasitária frente a

Leishmania braziliensis, biopoteção contra radicais livres e ação antiinflamatória. (SUZART,

2007).

Estudos químicos realizados em espécies deste gênero revelaram que são

bioprodutores de flavonóides, flavonóides glicosilados (SUZART et al., 2007) e biflavonóides

(SUZART et al., 2007; CARVALHO et al., 2008). Na figura 4, págs. 7 e 8, são mostradas

estruturas químicas de substâncias deste gênero. De Ouratea sp. (MONACHE et al., 1967)

foram isolados a protocianidina (1) e catequina (2); de O. affinis Engl. e O. calantha Gilg.

(GARTLAN et al., 1980) foi isolado a cianidina (3); de O. spectabilis (Mart.) Engl.

(FELÍCIO et al., 1995) foram isolados bigenkanina (4) e 7,7”- O-dimetilagatisflavona (5); de

O. multiflora Pohl (FELÍCIO et al., 2001) foram isolados amentoflavona (6) e , 3-OH-4’,5,7-

OMe-flavona-(6→8”)- 3”-OH -3’”,4’”,5”,7”-OMe flavona (7); de O. semisserata (Mart.)

Engl. (VELANDIA et al., 2002) foram isolados 3',6,8-cloro-4’,5-OH-7-OMe isoflavona (8),

3',5',6,8-cloro-4’,5-OH-7-OMe isoflavona (9), 5,7-OH-flavona-(4’→O→8”)- 4′′′,5′′,7′′-OH

flavona (10), 5-OH -7- OMe-flavona-(4′→O→8′′)- 4′′′, 5′′,7′′-OH flavona (11), 5-OH-7-OMe-

flavona-(4′→O→8′′)-5′′,7′′-OH-4′′′-OMe flavona (12), amentoflavona (6), podocarpusflavona

(13) e rutina, (14); De O. flava Schum e Thon (MBING et al., 2003a) foram isolados

calodenina B (15), flavumona A (16), flavumona B (17), calodenina C (18), lophirona A (19)

e 4′,5-OMe-6,7-metilenodioxi-isoflavona (20); de Ouratea hexasperma (St. Hil.) Bail.

(MOREIRA et al., 1994; DANIEL et al., 2005) foram isolados Hexaspermona A (21),

Hexaspermona B (22), Hexaspermona C (23), 5,7,4’-OMe-isoflavona (24), 7′′-O-

metilagatisflavona (25), 7,7′′-O-dimetillanaraflavona (26), agastiflavona (27), epicatequina

(28), 6-C-glicopiranosil-luteolina (29), 3-O-glicopiranosil-quercetina (30), 2′′-O-β-D-

glicopiranosil-8-C-β-D-glicopiranosil luteolina (31); de O. microdonta (CARVALHO et al.,

2008) foram isolados agatisflavona (27), 7”-O-metilagatisflavona (25) e amentoflavona (6).

(Figura 4, págs. 7 e 8).

Além de flavonóides e biflavonóides, ocorrem no gênero outras classes de subsâncias

como norisoprenóides (VELANDIA et al., 1998), diterpenos (VELANDIA et al., 1998;

FELÍCIO et al., 2004), triterpenos, (MBING et al., 2003b; CARVALHO et al., 2008),

esteróides (CARVALHO et al., 2008), lignanas (VELANDIA et al., 1998), hidrocarbonetos e

ésteres alifáticos

(MOREIRA et al., 1994; PAULO et al., 1986; ESTEVAM et al., 2005) além

de derivado do ácido benzóico (CARVALHO et al., 2008). As estruturas químicas de alguns

representantes desta classe são mostrados na figura 5, pág. 9.

7

OHO

OH

OMe

OH

2

OHO

OH

+

3

O

MeO

OH

HO

O

OMeO

OH

O

4

ORO

OH

O

OR

1

O

OH

HO

5: R=R

1

=Me

25: R=H, R

1

=Me

27: R=R

1

=H

OHO

OH

O

OR

O

HO

OH

6: R=H

13: R=Me

OMeO

OH

OMe

O

OH

O

MeO

HO

OMe

OH

7

Cl

OH

R

OMeO

OH O

Cl

8: R=H

9: R=Cl

O

OR

RO

O

R

1

OR

RO

OR

RO

15: R=R

1

=H

16: R=OH, R

1

=H

O

OMe

O

OMe

20

OH

O

HO

O

OHHO

17

Figura 4: Flavonóides isolados do Gênero Ouratea

OHO

OH

OHO

OH

1

ORO

OH

O

HO

OH

OR

1

10: R=R

1

=H

11: R=Me,R

1

=H

12: R=R

1

=Me

O

OH

HO

O

OH

O

HO

OH

O

OH

14

8

O

HO

O

O OH

OH

H

OHHO

19

O

MeO

OMe

24

O

OMe

OR

H

R

1

O

MeO

OH

H

OMe

21: R=H, R

1

=Me

22: R=Me, R

1

=H

23: R=R

1

=H

O

MeO

OH

O

MeO

OH

26

O

OH

HO

OH

28

OHO

OH

O

OH

O

HO

29

OHO

OH

O

OH

O

OH

30

OHO

OH

O

OH

O

HO

O

HO

OH

HO

OH

31

Continuação da Figura 4: Flavonóides isolados do Gênero Ouratea.

O

H

HO

OH

H

O

H

HO

OH

H

18

9

2.2 Classificação botânica de O. hexasperma (St. Hill) Bail var. hexasperma e O.

hexasperma var. planchonii Engl.

Ouratea hexaperma foi classificada pela primeira vez como Ghomphia hexasperma A.

St. Hil. (Flora Brasiliae Meridionalis (quarto ed.) 1: 61. 1824), posteriormente a classificação

botânica foi modificada para Ouratea hexasperma (A. St.-Hill.) Bail. (Histoire des Plantes 4:

366. 1873) e após verificar diferenças morfológicas dentro na prórpria espécie, classificou-se

em duas variedades, a típica, O. hexasperma (A. St. Hill.) Bail var. hexasperma e uma nova

variedade O. hexasperma var. planchonii Engl. (Flora Brasiliensis 12(2):321. 1876).

A variedade típica (A. St.-Hill.) Bail, apresenta folhas lanceoladas, provida de

acúmem de 1 cm de comprimento e a variedade planchonii Engl. apresenta folhas oblongas

ou oblonga-ovadas, raramente acuminada aguda. (Flora Brasiliensis). (Figura 6, pág. 10).

O

OH

Norisoprenóide

H

COOR

R

1

R

2

Diterpenos

HO

triterpeno

RO

Esteróides

O

OCH

3

CH

3

O

OCH

3

OCH

3

Lignana

CH

3

H

3

C

( )

n

Hidrocarboneto

( )

n'

O

( )

n

Éster alifático

HO

OH

O

OH

H

3

CO

Derivado da ácido benzóico

Figura 5:

Outras classes de substâncias isoladas nos gêneros

Ouratea.

10

Atualmente estas variedades foram sinonimizadas, especialistas da família não

consideram as variedades e apenas a espécie

Ouratea hexasperma

(A. St.-Hill.) Bail., devido

à estas pequenas diferenças morfológicas.

Figura 6:

Diferenças morfológicas marcantes entre as folhas de

Ouratea hexasperma.

2.3. Estudo Químico Realizado com Ouratea hexasperma (St. Hil.) Bail

Como citado anteriormente, estudos químicos com

Ouratea hexasperma

, coletada no

cerrado da Amazônia,

conduziu ao isolamento de hidrocarbonetos, de biisoflavonóides:

hexaspermona A, B, C, estruturas 21, 22 e 23 da figura 4, pág. 7 e 8. e da biflavona 7

’’

-

metilagatisflavona, estrutura 25 da figura 4, pág. 7 (MOREIRA

et al

., 1994; MOREIRA,

et

al

., 1999). Das folhas, inflorescência e caule de

Ouratea hexasperma,

coletadas no Município

de João Pessoa na Paraíba, foram isolados

hidrocarbonetos, esteróides, saponinas, triterpenos

(

figura 5,

pág. 10), flavonóides, epicatequina, biflavonóides (7,7

”

-

O

-dimetillanaraflavona, 7”-

O

-metilagatisflavona e Agatisflavona) além de flavonóides glicosilados,

figura 4

, pág. 8 e 9

(DANIEL, 2005; SUZART, 2007).

O grupo de pesquisa em Química de Produtos Naturais da UFRRJ tem registrado,

dentre outros trabalhos, estudos de espécies do gênero

Ouratea

e

Luxemburgia

(Ochnaceae)

dando valiosas contribuições para o conhecimento da química dessa família, propiciando

subsídios para avaliações quimiotaxonômicas, além de apresentar substâncias com

importantes atividades biológicas contribuindo para busca de novos fármacos (SUZART,

et

al

. 2007).

O levantamento na literatura sobre biflavonóides presentes na família Ochnaceae e em

espécies do gênero

Ouratea

permitiu tirar deduções e fazer considerações sobre essa classe de

substâncias, que são freqüentes no gênero, além de detectar alguns aspectos farmacológicos.

A quantidade de resultados obtidos até o momento com estudo das espécies

Ouratea

orientou-nos a fazer um estudo de informações relacionadas aos biflavonóides comumente

presentes, entre eles os mais abundantes: Agatisflavona e 7”-O-metilagatisflavona, Pode-se

aferir a estes possibilidades de marcadores quimiotaxonômicos.

2.4. Biflavonóides

Os biflavonóides constituem uma classe de flavonóides diméricos, diferenciando-se de

outros oligômeros como as proantocianidinas, devido à origem biogenética das unidades

11

constituintes. A maioria dos representantes dessa classe de produtos naturais é formada pelos

dímeros flavona-flavona, flavona-flavanona, flavanona-flavanona além de ocorrer, mais

raramente, os dímeros de chalconas e de isoflavonas. Quando as duas unidades são iguais

constituem os bisflavonóides e quando as duas unidades são diferentes são os biflavonóides.

As ligações entre as unidades flavonoídicas podem ser C-C ou C-O-C envolvendo os anéis A,

B ou C dos monômeros (

Figura 7,

pág. 11). (SUZART

et al.,

2007).

Segundo Suzart (2007) e colaboradores, seguindo a literatura (SIMÕES

et al

., 2001,

CHARI,

et. al

., 1977, DORA,

et. al

., 1991), utiliza-se a numeração dos biflavonóides

atribuindo números ordinários para os anéis

A

e

C

e primados (

′

) para o anel

B

de um dos

monômeros. Para a segunda unidade empregam-se números ordinários duplamente primados

(

′′

) para os núcleos

A

e

C

e números ordinários triplamente primados (

′′′

) para o núcleo

B

. De

acordo com os átomos de carbonos envolvidos na ligação entre as unidades, os dímeros são

classificados em grupos de biflavonóides (

figura 7,

pág. 13

)

, além dos dímeros de chalconas:

C-3

→

O-C-4''' (luxenchalconas),

figura 3

, pág. 5 (CARVALHO

et al

., 2004) e C-3'

→

C3''

(brackeninas),

figura 7,

pág. 11 (DREWES,

et al

., 1984) e dos dímeros de isoflavonas C-

2

→

C-2'' (hexaspermonas), estruturas 21, 22 e 23

da

figura 4

, pág. 7 e 8 (MOREIRA

et

al

.,1994), sem destacar os dímeros com duas ligações entre as unidades. A ligação tipo C-O-C

é característica das ochnaflavonas (C-3'

→

O-C-4’’’),

figura 3,

pág. 5 e das lanaraflavonas (C-

4'-O

→

C-8’’),

figura 7,

pág. 11. Alguns dos grupos hidroxila podem apresentar-se metilados

originando os respectivos éteres metílicos que, às vezes, recebem nomes especiais

(MOREIRA,

et. al

., 1999; FELICIO

et al

., 1995; VELANDIA

et al

., 2002; DANIEL

et al

.,

2005

O

R

O

R

O

2

3

4

5

6

7

8

9

10

2

'

3

'

4

'

5

'

6

'

Flavonas/Flavanonas

C-6 C-8": agatisflavona

C-8": cupressuflavonaC-8

C-3

C-8" amentoflavona

C-3',5' C-6": robustoflavona

C-2 C-8": garcinias

C-4'-O C-8": lanaraflavona

C-3' C-3":chamejasmina

A

B

C

OO

O O

OO

O

2

3

4

2

'

3

'

4

'

6

'

4

"

2

"

Chalconas

O

O O

O

Ar

2

3

4

5

6

7

8

9

10

2

'

3

'

5

'

6

'

2

"

3

"

4

"

5

"

7

"

9

"

Isoflavonas

Figura 7: Dímeros de flavonóides

12

Uma característica marcante dos metabólitos isolados do gênero

Ouratea

é a ligação

entre seus monômeros, sendo as mais abundantes C-3

→

C-8’’ e C-6

→

C-8’’, acrescentando

uma variação no padrão de metilação. No caso dos derivados da agatisflavona (C-6

→

C-8’’),

estruturas 25 e 27 da

figura 4

, págs. 7 e 8, a metilação é mais freqüente na posição 7”, sendo

esta a biflavona mais abundante no gênero

Ouratea

. Em 1929 foi isolada a primeira biflavona,

a gingentina, do Ginkgo Biloba (LIN

et al.

, 1997). A partir desse isolamento muitos

biflavonóides foram isolados de plantas e várias atividades biológicas têm sido relacionadas a

essa classe de substâncias (LIN

et a.,l

1999).

Os biflavonóides são geralmente encontrados em grande quantidade em diferentes

plantas e muitos tecidos vegetais. Apresentam várias propriedades, como proteção contra

raios ultravioleta nas folhas, antifúngico e alimento para insetos (SIMÕES

et al

., 2001). As

atividades farmacológicas conhecidas são: Estimulantes cardíacos, antivirais, antimicrobianas,

antiinflamatórias e anti-hepatotóxicas (SIMÕES

et al

., 2001, LIN

et al

., 1999). Em estudos de

atividades biológicas, os biflavonóides isolados de

O

.

spectabilis

,

O

.

multiflora

e

O

.

parviflora

mostraram inibição da produção de aflatoxina por

Aspergillus flavus

(GONÇALEZ

et al

., 2001), Os biflavonóides isolados das partes aéreas de

Ouratea sulcata

exibiram

significante atividade antimicrobiana

in vitro

contra

Bacillus subtilis, Escherichia coli,

Listonella anguillarum, Staphylococcus aureus

(PEGNYEMB et al., 2005)

Os dímeros de

flavonas das folhas de

O. multiflora

mostraram atividade contra as bactérias

Staphylococcus

aureus

e

Bacillus subtilis.

(

CARBONEZI et al., 2007)

,

os biflavonóides isolados de

O

.

spectabilis

inibiram a enzima aldose redutase (FELICIO

et al

., 1995), além de atividade

antitumoral detectadas para os biflavonóides isolados de

O. hexasperma

(St.Hil.) Bail

(DANIEL

et al.

2007).

2.4.1. Agatisflavona e derivados

Fazendo uma avaliação sobre os flavonóides que são mais freqüentes em espécies de

Ouratea

percebeu-se que a agatisflavona e principalmente, seu derivado 7”-metil éter são os

mais freqüentes. Resolvemos fazer um levantamento para verificar a ocorrência destes

flavonóides em outras famílias, através deste levantamento observou-se que estas substâncias

também ocorrem em outras famílias vegetais, como apresentado na tabela

1.

Tabela 1:

Ocorrência de Agatisflavonas e derivados em espécies vegetais.

BIFLAVONOIDES ESPÉCIES FAMÍLIAS REFERÊNCIAS

4”’,7-O-

dimetilagatisflavona;

7-O-metilagatisflavona

Agathis alba

Araucariaceae

(conífera)

MASHIMA et

al.,1970

4”’,7-O-

dimetilagatisflavona;

7-O-metilagatisflavona;

7,7"-O-

dimetilagatisflavona

Araucaria bidwillii and Agathis

alba

Araucariaceae KHAN et al., 1972

7-O-metilagatisflavona Araucaria rulei Araucariaceae ILYAS et al., 1977

7,7"-O-

dimetilagatisflavona

7-O-metilagatisflavona

Agathis australis Araucariaceae OFMAN et al., 1995

7-O-metilagathisflavona

Araucaria araucana Araucariaceae

PARVEEN et al.,

1987

Agatisflavona

7,7"-O-

dimetilagatisflavona

7-O-metilagatisflavona

Araucaria angustifolia

Araucaria genus

Araucariaceae ILYAS et al., 1994

13

Agatisflavona

Rhus succedanea e Garcinia

multiflora

Araucariaceae LIN et al., 1997

Agatisflavona

Rhus succedanea Anacardiaceae

CHEN, 1973

Agatisflavona

Rhus succedanea Anacardiaceae

LIN et al., 1974

Agatisflavona Rhus punjabensis Anacardiaceae

KAMIL et al., 1984

Agatisflavona

Rhus semialata Anacardiaceae

BAGCHI et al., 1985

Agatisflavona

Picea morinda Linn Anacardiaceae

AZAM et al., 1985

Agatisflavona

Rhus semialata Murr Anacardiaceae

PARVEEN et al.,

1988

Agatisflavona

Amphipterygium amplifolium;

Orthopterygium huaucui

Anacardiaceae

WANNAN et al.,

1988

Agatisflavona

Rhus coriaria Anacardiaceae

VAN LOO et al.,

1988

Agatisflavona

Anacardium occidentale Anacardiaceae

ARYA et al., 1989

Agatisflavona

Schinus terebenthefolus Anacardiaceae

KASSEM et al., 2004

Agatisflavona

Rhus pyroides, Rhus dentata and

Rhus pentheri

Anacardiaceae

SVENNINGSEN et

al., 2006

Agatisflavona

Canarium manii Burseraceae ANAND et al., 1992

Agatisflavona Juniperus virginiana

Cupressaceae

(coníferas)

ROY et al., 1984

Agatisflavona Garcinia xanthochymus Clusiaceae

PARVEEN et al.,

1994

Agatisflavona

Bauhinia vahlii Linn Leguninoceae

SULTANA et. al,

1985

Agatisflavona

Caesalpinia pyramidalis

Leguminosae

Fabaceae

MENDES et al., 2000

Agatisflavona Caesalpinia pyramidalis

Leguminosae

Fabaceae

BAHIA et al., 2005

7,7"-O-

dimetilagatisflavona

Ouratea spectabilis Ochnaceae FELÍCIO et al. 1995

7"-O-metilagatisflavona

Ouratea hexasperma Ochnaceae

MOREIRA et al.,

1999

7,7"-O-

dimetilagatisflavona

Ouratea parviflora Ochnaceae FELÍCIO et al., 2004

Agatisflavona

7"-O-metilagatisflavona

Ouratea hexasperma Ochnaceae DANIEL et al., 2005

Agatisflavona

Ouratea sulcata Ochnaceae

PEGNYEMB et al.,

2005

Agatisflavona Ouratea nigroviolacea Ochnaceae

NGO MBING et al.,

2006

Agatisflavona

Ouratea staudtii Ochnaceae

ZINTCHEM et al.,

2007

Agatisflavona;

7"-O-metilagatisflavona

Ouratea microdonta Ochnaceae

CARVALHO, et al,

2008*

14

Através da observação da

tabela 1

vemos que os biflavonóides Agatisflavona e

derivados ocorrem em diferentes espécies de diferentes famílias, gêneros e espécies vegetais.

Para verificar a ligação taxionômica desses gêneros com a ocorrência desses biflavonóides foi

realizada uma avaliação através da divisão botânica da possível ligação entre as espécies onde

foram encontradas essas substâncias. Na

tabela 2,

pág. 15,

observam-se os dados de divisão,

ordem, classe, família de cada espécie que foi isolado os biflavonóides Agatisflavona e

derivados.

A partir desses dados observa-se que há relação entre algumas espécies, como as

espécies da família Araucariaceae e Cupressaceae, que pertencem à mesma ordem, classe e

divisão botânica. As famílias Anacardiaceae, Burseraceae, Leguminosae, Clusiaceae e

Ochnaceae pertencem a ordens botânicas diferentes, mas pertencem a mesmas classes e

divisões botânicas.

Nas famílias Araucariaceae e Ochnaceae encontram-se a maior variedade de derivados

da agatisflavona, sendo que somente no gênero Ochnaceae, mas especificamente nas espécies

de

Ouratea

que foi encontrado o biflavonóide 7"-

O

-metilagatisflavona. Isso demonstra que

essa substância é um marcador quiotaxinômico da espécie

Ouratea

.

15

Tabela 2:

Divisões Botânicas das espécies que onde há ocorrência de Agatisflavonas e

derivados.

DIVISÃO CLASSE ORDEM FAMÍLIA ESPÉCIE BIFLAVONÓIDE

Pinophyta Pinopsida Pinales

Araucariaceae

(coníferas)

A. alba;

A. bidwillii;

A. rulei;

A. australis;

A. araucana;

A. angustifólia;

4”’,7-O-

dimetillagatisflavona

7-O-

metilagatisflavona

7,7"-O-

dimetilagatisflavona

Agatisflavona

Pinophyta Pinopsida Pinales

Cupressaceae

(coníferas)

J. virginiana Agatisflavona

Magnoliophyta

Magnoliopsida

Sapindales Anacardiaceae

R. succedanea;

R. punjabensis;

R. semialata;

P. morinda Linn;

R. semialata

Murr;

A. amplifolium;

O. huaucui;

R. coriaria;

A. occidentale;

S.terebenthefolus;

R. pyroides;

R. entata;

R. pentheri

Agatisflavona

Magnoliophyta

Magnoliopsida

Sapindales Burseraceae C. manii

Agatisflavona

Magnoliophyta

Magnoliopsida

Fabales

Leguminosae

Fabaceae

B. vahlii Linn;

C. pyramidalis

Agatisflavona

Magnoliophyta

Magnoliopsida

Malphiales

Clusiaceae G. xanthochymus Agatisflavona

Magnoliophyta

Magnoliopsida

Malphiales

Ochnaceae

O. spectabilis;

O. hexasperma;

O. parviflora;

O. sulcata;

O. nigroviolacea;

O. staudtii;

O. microdonta

7,7"-O-

dimetilagatisflavona

7"-O-

metilagatisflavona

Agatisflavona

16

3. CONSTITUINTES QUÍMICOS ISOLADOS DE O. hexasperma var.

planchonii Engl.

No presente trabalho,

O. hexasperma

(var.

planchonii

Engl.) foi submetida a estudo

fitoquímico para verificar a presença de marcadores taxonômicos e servir como argumento

adicional para localização da mesma na espécie. Com esse estudo, foram isolados compostos

alifáticos; ácido alifático (

1

); uma mistura de esteróides: sitoesterol (

2a

), estigmasterol (

2b

) e

campesterol (

2c

); os triterpenos lupeol (

3a

) e

α

-amirina (

3b

) e

β

-amirina (

3c

); os

biflavonóides 7”-O-metilagatisflavona (

4

) e agatisflavona (

5

) e sitosterol-3-O-

β

-D-

glicopiranosideo (

6

).

Figura 8,

pág. 17.

17

CH

3

H

3

C

( )

n

Compostos alifáticos

OH

O

( )

n

1

RO

1

2

3

4

6

5

7

9

19

11

12

14

15

16

17

18

13

20

22

23

21

24

28

29

27

25

26

2a: 22,23-diidro

2

b

:

∆

22,23

1

2

3

4

6

5

7

9

19

11

12

14

15

16

17

18

13

20

21

HO

21

22

23

24

25

2c

3a

29

30

20

28

27

3

HO

3

24 23

5

6

10

25

1

13

R

1

28

22

20

29

30

27

11

(3b) R = CH

3

, R

1

= H

(3c) R = H, R

1

= CH

3

5

6

"'

5

"'

4

"'

3

"'

2

"'

1

"'

10

"

9

"

8

"

7

"

6

"

5

"

4

"

3

"

2

"

1

"

2

'

10

6

5

4

3

2

B

'

C

'

A

'

CA

O

OH

HO

OH

HO

O

OH

O

6

'

5

'

4

'

3

'

1

'

9

8

7

1

B

4

6

"'

5

"'

4

"'

3

"'

2

"'

1

"'

10

"

9

"

8

"

7

"

6

"

5

"

4

"

3

"

2

"

1

"

2

'

10

6

5

4

3

2

B

'

C

'

A

'

CA

O

OH

HO

OMe

HO

O

OH

O

6

'

5

'

4

'

3

'

1

'

9

8

7

1

B

22

25

26

27

1

2

3

4

6

5

7

8

9

10

11

12

13

14

15

16

17

18

20

23

24

1

'

2

'

3

'

4

'

5

'

6

'

O

19

21

O

OH

HO

6

Figura 8: Constituintes químicos isolados neste trabalho

(

O. hexasperma

var

. planchonii

Engl.)

18

4. PARTE EXPERIMENTAL

4.1. Equipamentos e Reagentes

Os pontos de fusão foram determinados em placa de aquecimento MEL-TEMP II,

Laboratory Devices USA, utilizando capilar, sem correção dos valores obtidos. Os espectros

de infravermelho foram obtidos em espectrofotômetro Perkin-Elmer 1600/1605 FT-IR em

pastilha de KBr. Os espectros de Ressonância Magnética Nuclear (RMN) de

1

H e

13

C

(incluindo experimentos em 2D), foram registrados em espectrômetros Bruker AC-200

Advance (

1

H: 200 e

13

C: 50,3 MHz) e Bruker DRX-500 (

1

H: 500 MHz e

13

C: 125 MHz).

Como padrão interno foi usado tetrametilsilano ou resíduo do solvente CHCl

3

(

δ

H

7.24) e o

pico central do tripleto em

δ

C

77.00 do CDCl

3

. Os espectros de massas foram registrados em

cromatógrafo com fase gasosa acoplado a espectrômetro de massas de analisador de íons

quadrupolo e ionização por impacto de elétrons, 70 eV; marca Varian Saturn 2000 da UFRRJ.

As análises com CLAE foram realizadas com aparelho Shimadzu bomba modelo 10AS

Shimadzu 10AD/10AS com detector UV-Vis 10AD, injetor manual Rhoodune 1175 com loop

de 20

µ

L, integrador 6 CR, com coluna de fase reversa C18 (250mm x 4,6 mm x 5

µ

m) Betasil,

utilizando um sistema isocrático de metanol/H

2

O/acetonitrila/ácido acético (20:40:39:1) em

duas bombas, na bomba A foi adicionada a fase orgânica (CH

3

OH/ CH

3

CN) e na Bomba B a

fase aquosa (H

2

O/ácido acético). A fase móvel foi ajustada para A 62% e B 38% e

velocidade de fluxo 1mL.min

-1

, os extratos foram monitorados a 270 nm. As análises em

CLAE acoplado a espectômetro de massas foram feitas com o aparelho LCMS-IT_TOF

Shimadzu, foram usados quatro solventes e duas bombas A (metanol/acetonitrila, 20:34) e B

(água/ácido acético, 10:1), com sistema gradiente.

As cromatografias em coluna foram realizadas tendo como suporte gel de sílica (230-

400 e 70-230 mesh, Vetec) e Sephadex LH-20 (Sigma, USA). A cromatografia em camada

preparativa (CCP) foi feita em placas de gel de sílica 60 PF

254

, Merck e Vetec, sobre suporte

de vidro e espessura de 1mm.

As substâncias foram detectadas por irradiação na região do ultravioleta (254 e 366

nm). Foram usadas placas em folha de alumínio de gel de sílica 60 PF

254

Merck para

cromatografia em camada fina (CCF) e como reveladores foram utilizados, detecção por

irradiação ultravioleta (254 e 366 nm), e/ou reagentes cromogênicos:

•

Dragendorff (solução de nitrato básico de bismuto II em ácido acético diluído

com iodeto de potássio), reagente para alcalóides (MATOS, 1997).

•

Liebermann Burchard (20mL de anidrido acético e 20 mL de ácido sulfúrico

diluídos em 200 mL de etanol, em banho de gelo), seguido de aquecimento,

reagente para terpenos e esteróides (MATOS, 1997).

•

Soluções de AlCl

3

-EtOH (1%), seguido de aquecimento, reagente para

flavonóides. (VENNAT, B. et al, 1992)

.

•

Godin A: Solução I: vanilina etanólica 1%

Solução II: ácido perclorico 3%

Godin B: Acido sulfúrico10 % v/v

Misturar as soluções I e II em partes iguais e borrifar sobre a placa

cromatográfica, revelar com Godin B e colocar em estufa. Para identificação de

esteróides, triterpenos e flavonóides. (MARTINS, 2006).

•

Vapores de iodo revelam a maioria das substâncias orgânicas.

4.2.

Material vegetal

O material vegetal, galhos de

Ouratea hexasperma

var.

planchonii

Engl.,

(Ochnaceae), coletado na época de frutificação, em área de restinga, no município de Conde,

praia de Jacunã, em área de restinga e identificados pela Profa. Dra. Maria de Fátima Agra.

19

Uma excicata desta espécie (Nº6747) está depositada no herbário Prof. Lauro Pires Xavier

(JPB), Universidade Federal da Paraíba, João Pessoa, Paraíba, Brasil.

4.3

.

Obtenção dos extratos brutos

O material foi seco à temperatura ambiente, logo após a coleta e moídas em moinho de

facas. O pó dos galhos de

Ouratea hexasperma

var.

planchonii

Engl

.

(1900g) foi submetido à

extração através de maceração contínua com diclorometano e metanol. Os extratos foram

concentrados em evaporador rotatório a 40°C sob pressão reduzida e, após o uso de ar quente

para retirar o resíduo de solventes, obtiveram-se os extratos de diclorometano (OspGD, 206,5

g) e o extrato metanólico (OspGM, 190,0 g).

4.4.

Prospecção Química do Extrato Metanólico

Do extrato metanólico, aproximadamente 1,0 g, fez-se prospecção química que

permitiu o conhecimento preliminar das principais classes de substâncias naturais presentes.

Esta avaliação é freqüentemente usada para direcionar trabalhos posteriores de fracionamento

e isolamento das substâncias (MATOS, 1988). Esta abordagem foi elaborada com testes para

detectar os metabólitos especiais dos galhos da espécie, conforme metodologias descritas na

literatura. As classes de substâncias avaliadas: alcalóides, saponinas, esteróides e

triterpenóides, depsídio e depsidonas, flavonóides, catequinas, quinonas, sesquiterpenos e

outras lactonas, carotenóides e xantofilas, glicosídios cardíacos, açúcares redutores,

sacarídios, ácidos orgânicos e taninos.

4.5. Isolamento e Purificação dos Constituintes Químicos dos Extratos de Ouratea

hexasperma var. planchonii Engl.

4.5.1. Extrato com diclorometano:

O extrato

OspGD

foi filtrado em funil de separação de gel de sílica usando hexano,

clorofórmio e metanol e obtiveram-se as frações: hexano (

OspGDH

, 11,06g); Clorofórmio

(

OspGDC

, 5,43g) e metanol (

OspGDM

, 116,9g).

A partição em hexano (

OspGDH)

, foi cromatografada em coluna de gel de sílica,

usando eluentes diclorometano, diclorometano : metanol, aumentando gradativamente a

polaridade até 100% de metanol, fornecendo 15 frações, que através da análise dos dados

espetrométricos foram identificadas como uma mistura de alcanos alifáticos, ácido alifático,

(

substância 1,

57 mg

)

e uma mistura de esteóides (sitoesterol, estigmasterol e campesterol),

que foi denominada

substância 2 (a, b e c,

PF.: 120-122ºC,

84 mg

)

.

A partição clorofórmio (

OspGDC

) foi cromatografada em coluna de gel de sílica,

usando eluentes diclorometano

OspGDCD

(26 frações), acetato de etila

OspGDCA

(11

frações) e metanol

OspGDCM

(26 frações), que forneceram uma mistura de alcanos

alifáticos e álcoois alifáticos, o triterpeno lupeol (

substância 3,

PF.: 179-180ºC,

50 mg) e a

mistura de esteróides sitoesterol, estigmasterol.

A fração obtida com metanol (

OspGDM,

95g), foi fracionada através de

cromatografia em coluna de sílica gel utilizando os eluentes clorofórmio e metanol 9:1 e

aumentando gradativamente a polaridade. As frações 5-7 forneceram um material amarelo de

ponto de fusão 226/228ºC , solúvel em acetona, que após análise dos dados espectrométricos

foi identificado como o biflavonóide 7’’-O-metilagatisflavona (

substância 4,

PF.: 226-228ºC,

74 mg).

Os procedimentos relatados acima estão representados no

Esquema 1,

pág. 21.

20

4.5.2. Extrato com metanol:

O extrato metanólico (

OspGM

, 160,0g) foi submetido à partição com metanol:água

(8:2) e clorofórmio, no qual o extrato foi diluído em metanol/água 8:2 e extraído com

clorofórmio, obtendo-se as partições clorofórmio (

OspGMC

, 67,0 g) e metanol (

OspGMM

,

58,8 g). A partição clorofórmio foi dividida em duas frações, a primeira de cor esverdeada

(

OspGMC1,

23,2 g) e outra de cor marrom (

OspGMC2,

22,0 g), da segunda fração retirou-

se um precipitado (

OspGMC2p,

20,8 g

),

o qual uma parte (18,0g) foi submetida à

cromatografia em coluna de sílica gel com a mistura diclorometano/metanol com aumento

gradual de polaridade até metanol 100%. Foram coletadas 20 frações, as frações 2-4 foram

recristalizadas em metanol e forneceram um material amarelo que, apresentava 2 manchas em

cromatografia de camada fina (CCF) com o eluente CH

2

Cl

2

/CH

3

OH, 8:2. Após análise dos

dados espectrométricos, e comparação em cromatografia de camada fina com os padrões 7’’-

O-metilagatisflavona e agatisflavona, usando os eluentes CH

2

Cl

2

/CH

3

OH, 8:2;

CHCl

3

/CH

3

COCH

3

, 7:3 e AcOEt/CH

3

OH, 9,5:0,5, foram identificados como os

biflavonóides, em mistura,

4

(7’’-O-metilagatisflavona), e

5 (

agatisflavona), 103 mg, solúveis

em acetona.

A mistura dos biflavonóides

4

e

5

foi metilado com diazometano (40,0 mg). Após a

metilação foi feita a purificação do produto através de cromatrografia em camada

preparativa(CHCl

3

/CH

3

COCH

3

, 7:3), fornecendo o derivado permetilado

4a

(28,0 mg).

A fração (

OspGMC1,

20,0g) foi cromatografada em coluna de sílica gel com a

mistura diclorometano/metanol com aumento gradual de polaridade até metanol 100%. Sendo

coletadas 30 frações. As frações 5 e 6 forneceram um material amarelo, que após a

purificação e análises dos dados do RMN de hidrogênio e carbono-13, concluiu-se que

também é a 7”-

O

-metilagatisflavona (32,0 mg) e a fração 17, que foi recristalizada em

metanol forneceu um material (9,0 mg) insolúvel em acetona e metanol, e através das análises

dos dados do RMN de hidrogênio e carbono, verificou-se que que a fração contém o

sitosterol glicosilado (

6

).

Os procedimentos relatados acima também estão representados no

Esquema 1,

pág.

21.

21

Esquema 1: Fluxograma da marcha para o isolamento das substâncias dos galhos de

Ouratea

hexasperma

var

. planchonii

Engl.

Ouratea hexasperma

(Galho 1900,0 g)

1) CH

2

Cl

2

2) MeOH

-Evaporação

Ext. metanólico

OspGM

(190,0 g)

-Partição funil

sílica gel

-CHCl

3

OspGDC

(5,43 g)

Ext. diclorometano

OspGD

(206,5 g)

OspGMCp

Coluna

1) dicloro

2) acetato de etila

3) metanol

-Hexano

OspGDH

(11,06 g)

Coluna

CHCl

3

/ MeOH

OspGDCD

26 frações

OspGDCA

11 frações

OspGDCM

26 frações

- MeOH

OspGDM

116,9 g

- Partição

Líq./Líq

1) MeOH/H

2

O 8:2

2) CHCl

3

OspGMC

OspGMM

OspGMC-1

OspGMC

2

1) verde

2)H

2

O mãe

3) precip.

Coluna

(OspGMCp-2p)

125 mg

Frações 2 e 3

Coluna

OspGMC

2

A

2)

metilação

4a

Coluna

substância 5

biflavonoides

alcanos

1

2 (a,b e c)

1

4

5

4

2 (a,b e c)

3(a, b e c)

5

6

22

4.6. Derivação

A preparação do derivado metilado da agatisflavona

serviu para facilitar a análise dos

dados espectrométricos, devido ao aumento da solubilidade em clorofórmio e, fazer análises

com algumas técnicas especiais de RMN.

4.6.1. Metilação com diazometano

A solução de diazometano foi preparada de acordo com a metodologia experimental

descrita na literatura (VOGEL, 1989 e CARVALHO

et al.

2006). A mistura das substâncias

(agatisflavona e 7”-O-metilagatisflavona) foi completamente dissolvida em MeOH,

adicionou-se a solução etérea do diazometano em excesso, observando desprendimento

gasoso, a solução foi deixada em repouso para a evaporação natural dos solventes. A

ocorrência da reação foi monitorada através de comparações em CCF com as substâncias

puras, após repetições do procedimento de adição da solução de Diazometano, realizou-se

cromatografia em camada preparativa, fornecendo a substância metilada. A

figura 9

, pág. 23

apresenta um esquema da reação e o mecanismo proposto para a mesma.

23

OH

O

H

3

C N N

N

2

O

OH

O

OH

O

OH

O

OH

O H

H

2

C N N

H

2

C N N

H

2

C N N

OH

O

H

3

C N N

O

OCH

3

OCH

3

H

3

CO

O

H

3

CO

O

OCH

3

O

H

3

C

N

2

N

2

R

O

OH

HO

O

HO

O

OH

O

OCH

3

OCH

3

H

3

CO

O

H

3

CO

O

OCH

3

O

H

3

C

CH

2

N

2

MeOH

Figura 9:

Mecanismo proposto da reação de metilação com diazometano.

24

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO

5.1. Prospecção Química do extrato metanólico:

Parte do extrato metanólico foi utilizado para a realização da avaliação da classe dos

constituintes presentes, através da prospecção química, e posterior isolamento e purificação

dos principais metabólitos especiais. A

tabela 3

demonstra os resultados da prospecção

química do extrato metanólico, que revelou testes positivos para as classes de metabólitos

especiais: alcalóides, saponinas, esteróides e triterpenóides, depsídio e depsidonas,

flavonóides, catequinas, quinonas, açúcares redutores, sacarídeos e taninos. Os testes

realizados seguiram as metodologias segundo as literaturas: Alcalóides, esteróides, triterpenos

e flavonóides (WALL et al., 1954); saponinas, depsídios e depsidonas, quinonas e

sacarídios

(MATOS, 1988); catequinas,

derivados de cumarinas e açúcares redutores (COSTA, 1972);

Ácidos orgânicos (MERK, 1980); Taninos (MATOS, 1997).

Tabela 3: Registro dos resultados da prospecção química do extrato metanólico de

O.

hexasperma

var

. planchonii

Engl

.

Classes de metabólitos especiais

Extrato metanólico

Alcalóides +++

Saponinas +++

Esteróides e triterpenóides +++

Depsídio e depsidonas +++

Flavonóides +++

Catequinas +++

Quinonas +

Sesquiterpenos e outras lactonas

-

Derivados de cumarinas -

Glicosídios cardíacos -

Açúcares redutores ++

Sacarídios +

Ácidos orgânicos -

Taninos +++

- ausente + fraco ++ médio +++ forte

25

5.2. Determinação Estrutural dos Constituintes Isolados de Ouratea hexasperma

var. planchonii Engl.

O fracionamento dos extratos dos galhos

de O. hexasperma

var.

planchonii

Engl.

forneceu uma mistura de hidrocarbonetos, ácidos alifáticos, os esteróides sitoesterol,

estigmasterol e campesterol, os triterpenos

α

-amirina e

β

-amirina, os biflavonóides 7”-O-

metilagatisflavona e agatisflavona e sitosterol-3-O-

β

-D-glicopiranosideo. A identificação

através de métodos físicos desses materiais foi feita através das análises de espectros de IV,

RMN de

1

H e

13

C, massas e comparação com padrões isolados das espécies de

Ouratea

em

estudos anteriores.

5.2.1. Alcanos

O espectro de IV da mistura de alcanos (

Figura 10

, pág. 25) revela bandas de

absorção em 2918 e 2848 cm

-1

relativas a estiramentos de grupos CH

3

e CH

2

, sugerindo a

presença de uma longa cadeia carbônica. As bandas em 1466 cm

-1

(deformação angular da

ligação C-H), e 723 cm

-1

confirmam esta atribuição. O espectro de RMN

1

H (

Figura 11,

pág.

26

)

apresenta sinais em

δ

H

0,90 e 1,27ppm de cadeia normal hidrocarbônica.

4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500

Wavenumber (cm-1)

8

16

24

32

40

48

56

64

72

80

%Transmittance

2917.82

2848.39

1467.59

725.12

Figura 10

: Espectro de IV do material alifático de

O. hexasperma

var.

planchonii

Engl

.

26

8 7 6 5 4 3 2 1 0 -1

Chemical Shift (ppm)

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1.0

Intensity

7.27

1.27

0.90

Figura 11:

Espectro de RMN de

1

H (200 MHz, CDCl

3

) do material alifático.

27

5.2.2 Substância 1

O ácido alifático

1

, foi identificado através da análise dos espectros de IV, RMN

1

H e

CG-EM. O espectro de IV (

Figura

12

, pág. 27) revela bandas de absorção em 2918 e 2848

cm

-1

relativas a estiramentos de grupos CH

3

e CH

2

, sugerindo a presença de uma longa cadeia

carbônica. As bandas em 1473 cm

-1

(deformação angular da ligação C-H), 723 cm

-1

e o sinal

em 1724 cm

-1

compatível com carbonila de ácido, confirmam esta atribuição. O espectro de

RMN

1

H (

Figura 13,

pág. 28) apresenta sinais em

δ

H

0,89 e 1,26 de cadeia alifática, e 2,35

indicando a presença e de hidrogênio de carbono alfa ao grupo carbonila. O cromatograma da

amostra (

figura 14,

pág 28), demonstra os picos indicando a mistura das substâncias, tendo a

substância majoritária em TR=5,74, o CG-EM apresentou picos em

m/z

57 [C

4

H

9

]

+

,

m/z

87

[C

4

H

7

O

2

]

+

,

m/z

129 [C

7

H

13

O

2

]

+

,

m/z

185 [C

11

H

21

O

2

]

+

,

m/z

213 [C

13

H

25

O

2

]

+

, os picos em

m/z

257 (M

+.

+1) e 242 (M

+.

) (

Figura 15

,

pág. 29), permitiu identificar os ácidos hexadecanóico e

pentadecanóico presentes na mistura.

4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500

Wavenumber (cm-1)

8

16

24

32

40

48

56

64

72

80

88

%Transmittance

3461.65

2954.46

2917.82

2848.39

2728.82

1724.08

1645.01

1619.94

1473.37

1411.66

1386.59

1170.6

889.04

728.97

719.33

366.41

Figura 12: Espectro de IV de

1.

28

Figura 13: Espetro de RMN de

1

H (200 MHz, CDCl

3

) de

1

.

Figura 14: Cromatograma de

1

.

29

Figura 15: Espectro de massas de

1

.

5.2.3. Substância 2 (a, b e c)

Os esteróides

2 (a, b e c)

foram identificados respectivamente, como sitosterol,

estigmasterol e campesterol, com base na comparação com amostra autêntica, envolvendo

espectros de RMN de

1

H (

Figura 16

, pág. 30), CG-EM, além de P.F. e CCF.

O espectro de RMN de

1

H da mistura

2 (a, b e c)

mostrou sinais entre

δ

H

0,65 e

δ

H

1,23 correspondentes as metilas, multipleto em

δ

H

3,53 atribuído ao hidrogênio carbinólico H-

3, um singleto largo em

δ

H

5,31 atribuído ao hidrogênio olefínico H-6 e o multipleto em

δ

H

5,07 correspondentes aos hidrogênios H-22 e H-23 para o estigmasterol. Através do CG-EM

que se detectou a presença do terceiro componente (campesterol), através do cromatograma

(

Figura 17

, pág. 30), indicando os picos dos esteróides e comparação com padrões da

biblioteca do equipamento (

Figuras 18 a, b e c,

págs. 31, 32 e 33) permitiu confirmar a

proposta da mistura dos esteróides sitosterol (

2 a

), estigmasterol (

2 b

) e campesterol(

2 c

).

30

Figura 16:

RMN de

1

H (200 MHz, CDCl

3

) da mistura de esteróides

2

(a, b e c)

Figura

17

: Cromatograma da mistura dos esteróides

2

(a, b e c)

31

Figura 18a

: Espetro de massas de

2 (a)

comparado com a biblioteca do aparelho.

32

Figura 18b:

Espetro de massas de 2 (b) comparado com a biblioteca do aparelho.

33

Figura 18c :

Espetro de massas de 2 (c) comparado com a biblioteca do aparelho.

5.2.4. Substâncias 3: Lupeol, α-amirina e β-amirina

A mistura dos triterpenos

3 (a, b e c)

foram identificados como lupeol,

α

-amirina e

β

-

amirina, através da interprtação dos espectros de RMN de

1

H , CG-EM e CCF.

O espectro de RMN

1

H (

Figura 19,

pág. 34) mostra os sinais de metilas:

δ

H

1,26, 0,95,

0,80 e 0,77 e um sinal em

δ

H

1,69 (

s

) correspondente à freqüência de metila ligada a carbono

sp

2

. Os sinais referentes aos hidrogênios vinílicos estão representados por dois singletos

largos em

δ

H

4,57 e 4,70, o sinal em

δ

H

3,19 representa o hidrogênio do carbono metínico

oxigendo (H-3) o sinal em

δ

H

5,1 representa os hidrogênios (H-12) de

α

e

β

-amirina. Através

do CG-EM e comparação com padrões da biblioteca do equipamento (

Figuras 20 e 21,

pág.

35) e comparação com amostra padrão da mistura, permitiu identificar os três isômeros

triterpênicos lupeol (3a),

α

-amirina (3b) e

β

-amirina (3c).

34

Figura 19:

Espectro de RMN de

1

H (200 MHz, CDCl

3

) do Lupeol (

3a

),

α

-amirina (

3b

) e

β

-

amirina (

3c

).

.

35

Figura 20:

Espetro de massas de 2 (a) comparado com a biblioteca do aparelho.

Figura 21:

Espetro de massas de 2 (b e c).

36

5.2.5. Substância 4

O biflavonóide

4

foi identificado como um derivado da agatisflavona, devido a

semelhança do espectro de RMN

1

H com da substância com a isolada anteriormente

(MOREIRA et al., 1999; DANIEL et. al., 2005), além do sinal de um grupo metoxila cuja

posição foi definida através de análises com técnicas especiais de RMN.

O espectro de IV de

4

(

Figura 22,

pág. 37

)

revela bandas de absorção para grupo

hidroxila (3392 cm

-1

, estiramento O-H), grupamentos C=O (1648 cm

-1

) de carbonila

conjugada e C=C (1604 cm

-1

, 1504 cm

-1

, 1442 cm

-1

) de anel benzenóide.

O espectro de RMN

1

H (

Figura, 23,

pág. 39

)

mostra sinais de átomos de hidrogênios

atribuídos a dois sistemas AA’BB’ dos anéis C e C”

δ

H

7,98 (d, 2H,

J

= 8Hz), 7,65 (d, 2H,

J

=

8 Hz), 7,05 (d, 2H,

J

= 8 Hz) e 6,84 (d, 2H,

J

= 8 Hz), quatro singletos atribuídos a H-3, 8, 3” e

6” com

δ

H

6,70, 6,78, 6,65 e 6,56, respectivamente e uma metoxila (

δ

H

3,89,

s

, 3H). Os sinais

em

δ

H

9,37 para hidroxila livre e

δ

H

13,26 e 13,41 para os dois grupos hidroxilas em ligação

de hidrogênio com carbonila.

O espectro de

1

H,

1

H-COSY (

Figuras 24,

pág. 40) apresentou sinais de interação de

acoplamento entre H-2’,6’ (

δ

H

7,65) com H-3’,5’ (

δ

H

6,84) e H-2’”,6’” (

δ

H

7,98) com H-

3’”,5’” (

δ

H

7,50). Confirmando os pares de dubletos de cada sistema

para

substituído.

O espectro de RMN

13

C da substância

4

(

Figuras 28-30,

pág. 44 e 45) mostra os

valores de deslocamentos dos carbonos metínicos CH-8 (

δ

C

94,7) e CH-6” (

δ

C

96,4), e para os

carbonos quaternários 6 e 8” (

δ

C

104,3 e 104,0 ppm). Os valores dos deslocamentos químicos

indicam que os carbonos 6 e 8” estão envolvidos na ligação interflavonoídica, a comparação

dos deslocamentos químicos dos carbonos de

4

(

Tabela 4,

pág. 40) com agatisflavona

(CHARI

et al

., 1977; AGRAWAL, 1989) e 7”-

O

-metilagatisflavona (MOREIRA,

et al

.,

1999) confirmam a proposta de estrutura semelhante desta biflavona como 4

′

,5,7-OH-flavona-

(6

→

8

′′

)-5

′′

,4

′′′

-OH-7

′′

-OMe flavona.

Como citado anteriormente, o grupo metoxila poderia estar localizado em outra

posição sem causar alteração significativa nos espectros e, assim não garante a identificação

entre

4

como 7”-

O

-metilagatisflavona registrada na literatura. Fez-se experimentos de

NOESY (

Figuras 25, 26 e 27,

págs. 41-43), HMBC (

figuras 31-38,

págs. 45-49) e HSQC

(

figura 39,

pág. 50) e observou-se que a metoxila está próxima do singleto em

δ

H

6,57 (H-6”),

este hidrogênio está ligado ao carbono com

δ

C

= 95,7 e acopla a longa distância com H-O-

5”(J

3

H-C

)

Tabela

4,

pág. 38. Ficando, então definida sua estrutura como o previsto: 4’,5,7-

OH-flavona (6

→

8) 5”,4’”-OH-7”-OMe flavona (7”-

O

-metilagatisflavona).

37

4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500

Wavenumber (cm-1)

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

%Transmittance

3392.23

3172.38

2929.39

2850.32

1648.87

1604.51

1564.01

1504.23

1442.52

1363.45

1282.45

1214.95

1174.46

1108.89

1018.25

833.11

572.76

Figura 22: Espectro de IV de 4.

38

Tabela 4.

Dados de RMN

1

H e

13

C (D

3

CCOCD

3

,

1

H e D

3

CSOCD

3

,

13

C).da substâncias

4.

2

3

4

5

6

7

8

9

10

1

'

2

'

3

'

4

'

5

'

6

'

2

"

3

"

4

"

5

"

6

"

7

"

8

"

9

"

10

"

1

"'

2

"'

3

"'

4

"'

5

"'

6

"'

O

OH

HO

O

HO

O

OH

O

H

3

C

7”-o-metil

agatisflavona

Substância 4

1

H-

13

C-COSY

C

δ

C

δ

C

δ

H

CH

1

J

CH

2,3

J

CH

Noe

2 165,03 165,3

H-2’, H-3

3 103,22 104,4

6,70 H-2’,6’

4 183,5 183,7

5 161,3 161,6

6 104,1 104,3

H-8

7 163,1 163,3

H-8

8 94,5 94,7 6,78 (s)

9 158,2 158,5

H-8

10 105,1 105,5

H-O-5, H-3

1’ 123,2 123,6

H-3’,5’, H-3

2’,6’ 129,3 129,3

7,98 (d,8Hz)

3’,5’ 116,8 117,1

7,05 (d, 8Hz)

4’ 161,8 162,0

2” 165,2 165,5

H-2’”,6’”, H-3”

3” 103,4 103,9

6,65 (s) H-2’”,6’”

4” 183,3 183,4

5” 163,4 163,8

H-O-5”, H-6”

6” 96,0 96,4 6,57 (s) H-O-5” H

3

CO-7”

7” 164,8 165,1

H

3

C-O

8” 101,0 104,0

H-6”

9” 155,5 156,0

10” 105,6 105,9

H-O-5”, H-6”, H-3”

1’” 123,2 123,6

H-3’”,5’”, H-3”

2’”,6’” 129,1 129,5

7,65 (d,8Hz)

3’’,5’” 116,8 116,9

6,84 (d,8Hz)

4’” 161,8 162,1

H-2’”,5’”, H-3”’,5’”

OCH

3

56,7 56,9 3,89(s,3H)

H-O 5 13,4

H-O 5”

13,3

39

Figura 23

: Espectro de RMN de

1

H (500 MHz , D

3

CCOCD

3

) do biflavonóide

4

(7”-O-

metilagatisflavona)

40

Figura 24

: Espectro de

1

H-

1

H-COSY - (500 MHz, D

3

CCOCD

3

) de 4.

41

Figura 25

: Espectro de

1

H-

1

H-NOESY - (500 MHz, D

3

CCOCD

3

) de 4.

42

Figura 26:

Ampliação do Espectro de

1

H-

1

H-NOESY - (500 MHz, D

3

CCOCD

3

) de 4.

43

Figura 27:

Ampliação do Espectro de

1

H-

1

H-NOESY - (500 MHz, D

3

CCOCD

3

) de 4.

44

Figura 28:

RMN de C (125 MHz, D

3

CCOCD

3

) da substância 4

Figura 29:

Ampliação(180-187 ppm) do Espectro de RMN de C (125 MHz, D

3

CCOCD

3

) da

substância 4

45

Figura 30:

Ampliação (156-166 ppm) do Espectro de RMN de

13

C (125 MHz , D

3

CCOCD

3

)

da substância 4

Figura 31:

Espectro de HMBC (D

3

CCOCD

3

) da substância 4.

46

Figura 32:

Ampliação do espectro de HMBC (D

3

CCOCD

3

) da substância 4.

Figura 33:

Ampliação do espectro de HMBC (D

3

CCOCD

3

) da substância 4.

47

Figura 34:

Ampliação do espectro de HMBC (D

3

CCOCD

3

) da substância 4.

Figura 35:

Ampliação do espectro de HMBC (D

3

CCOCD

3

) da substância 4.

48

Figura 36:

Ampliação do espectro de HMBC (D

3

CCOCD

3

) da substância 4

Figura 37:

Ampliação do espectro de HMBC (D

3

CCOCD

3

) da substância 4

49

Figura 38:

Ampliação do espectro de HMBC (D

3

CCOCD

3

) da substância 4

50

Figura 39:

Espectro de HSQC (D

3

CCOCD

3

) da substância 4

51

5.2.6. Substância 5

O espectro no IV de

5

(

Figura 40,

pág. 51) evidencia bandas de absorção em 3425

cm

-1

(estiramento O-H), 1651 cm

-1

(estiramento de carbonila conjugada) e 1605 cm

-1

(estiramento C=C de anel aromático) e 1367 cm

-1

(estiramento C-O).

O espectro de RMN

1

H (

Figuras 41 e 42,

pág. 53) possui sinais típicos de

biflavonóide, sinais de dois sistemas AA’BB’ {(

δ

H

7,88 (2H,

J

= 7,9 Hz), 7,56 (2H, J= 7,9

Hz), 6,93 (2H,

J

= 7,9 Hz) e 6,72 (2H,

J

= 7,9 Hz)}, quatro singletos em

δ

H

6,38, 6,57, 6,62

(2x), atribuídos aos hidrogênios H-6”, 8, 3 e 3”. O sinal de

δ

C=O

(183,74 e 184,26) verificado

no espectro de

13

C (

Figuras 43 e 44,

pág. 54) estão compatíveis com os carbonos carbinólicos

em ligação de hidrogênio (

Tabela 5,

pág. 52). A análise em CCDA revelou duas manchas

próximas com R.F. 0,35 e 0,19 (CH

3

Cl/CH

3

COCH

3

7:3). O espectro de RMN

1

H apresenta

sinais com menor intensidade em

δ

H

3,89. Isso permitiu propor a mistura de Agatisflavona

5

com 7”-O-metilagatisflavona

4

.

Para confirmar essa dedução fez-se a análise em CCDA, comparando com os padrões

isolados anteriormente e a análise revelou que as substâncias possuíam o mesmo RF dos

padrões. Utilizou-se também análise em CLAE utilizando sistema isocrático de

metanol/água/acetonitrila/ácido acético (20:40:39:1) como fase móvel e velocidade de fluxo

1mL.min

-1

, no comprimento de onda 270nm, da fração contendo

4

e

5,

comparando-a

com o

padrão (7”-O-metilagatisflavona) e obteve-se os cromatogramas (

figuras 45 e 46,

pág

. 55).

O

T.R=6,79 da 7”-O-metilagatisflavona permitiu confirmar a presença de

4

e o pico em T.R. =

3,93 foi atribuída a agatisflavona.

4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500

Wavenumber (cm-1)

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

%Transmittance

3392.23

3172.38

2929.39

2850.32

1648.87

1604.51

1564.01

1504.23

1442.52

1363.45

1282.45

1214.95

1174.46

1108.89

1018.25

833.11

572.76

Figura 40

: Espectro de IV de 5.

52

Tabela 5.

Dados de RMN

1

H (200 MHz) e

13

C (50 MHz) em Acetona-D

6

, comparando com

os dados de RMN de

13

C da literatura (AGRAWAL, 1989) da substância

5

(agatisflavona).

C

δC

(Metanol-

D

4

)

δC

(literatura-

DMSO-D

6

)

δ

H

(mult, Hz)

2 167,5 164,1 -

4 184,3 182,3 -

5 162,5 160,0 -

6 103,1 103,6 -

7 165,9 162,9 -

9 160,9 157,0 -

10 103,5 103,8 -

1

’

123,4 121,5 -

4

’

162,7 161,3 -

2

”

166,3 163,9 -

4

”

183,7 182,0 -

5

”

162,5 160,9 -

7

”

166,3 162,7 -

8

”

101,1 99,4 -

9

”

159,0 155,1 -

10

”

103,5 104,0 -

1

”’

121,4 121,7 -

4

”’

162,5 161,2 -

3 103,1 103,1 6,70 (s)

8 95,9 93,7 6,81 (s)

2

’

,6

’

129,6 128,6 7,96 (d, 7,9)

3

’

,5

’

117,2 116,2 7,66 (d, 7,9)

3

”

103,5 102,8 6,67 (s)

6

”

101,1 98,9 6,57 (s)

2

”’

,6

”’

129,6 128,2 7,03 (d, 7,9)

3

”’

,5

”’

117,2 116,2 6,85 (d, 7,9)

6

"'

5

"'

4

"'

3

"'

2

"'

1

"'

10

"

9

"

8

"

7

"

6

"

5

"

4

"

3

"

2

"

1

"

2

'

10

6

5

4

3

2

B

'

C

'

A

'

CA

O

OH

HO

OH

HO

O

OH

O

6

'

5

'

4

'

3

'

1

'

9

8

7

1

B

53

Figura 41:

Espectro de RMN de

1

H (200MHz, D

3

CCOCD

3

) da mistura dos biflavonóides

4 e

5.

8.0 7.5 7.0 6.5

Chemical Shift (ppm)

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1.0

Intensity

7.99

7.95

7.68

7.64

7.06

7.02

6.87

6.81

6.70

6.65

6.57

Figura 42:

Ampliação do espectro (6.0-8.5 ppm) de RMN de

1

H (200MHz, D

3

CCOCD

3

) da

mistura dos biflavonóides

4 e 5.

54

200 180 160 140 120 100 80 60 40 20 0

Chemical Shift (ppm)

-0.05

0

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

0.30

0.35

0.40

0.45

0.50

0.55

0.60

0.65

Intensity

182.36

164.51

162.54

161.27

157.42

154.82

128.41

122.23

116.04

104.70

102.68

95.25

93.64

55.87

Figura 43:

Espectro de RMN de

13

C (50 MHz, D

3

CCOCD

3

) da mistura dos biflavonóides

4 e

5.

184 176 168 160 152 144 136 128 120 112 104 96

Chemical Shift (ppm)

-0.05

0

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

0.30

0.35

Intensity

182.36

164.51

162.54

161.27

160.40

157.42

154.82

128.41

122.23

116.04

104.70

104.23

103.11

102.68

99.98

95.25

93.64

Figura 44:

Ampliação do

espectro de RMN de

13

C (50 MHz, D

3

CCOCD

3

) da mistura dos

biflavonóides

4 e 5.

55

Figura 45:

Cromatograma obtido em CLAE de 7”-O-metilagatisflavona (

4

).

Figura 46:

Cromatograma obtido em CLAE da mistura

4 e 5.

56

5.2.7. Derivado 4a (hexametilagatisflavona).

A reação de metilação de 7”-

O

-metilagatisflavona com diazometano forneceu o

derivado hexametilado

4a

,

através da substituição dos hidrogênios das hidroxilas por grupos

metilas nas posições 7, 5, 5”, 4’, 4”’.

A mudança significativa no espectro de RMN

1

H de

4a

,

quando comparada com o biflavonóide natural

4

(7”-O-metilagatisflavona),

foi o

aparecimento de 5 sinais adicionais de metoxilas.

Os espectros de RMN

1

H (1D e 2D

1

H-

1

H-COSY) revelam sinais para os átomos de

hidrogênios H-3”’,5”’ (

δ

H

6,94,

d

,

J

=8,5) acoplando com H-2”’,6”’ (

δ

H

7,69,

d

,

J

=8,5) e H-

3’,5’ (

δ

H

7,16,

d

,

J

=8,5) acoplando com H-2’,6’ (

δ

H

8,11,

d

,

J

=8,5), correspondentes a dois

sistemas AA’BB’. Os hidrogênios H-6”,3”,3 e 8 estão representados pelos sinais simples de

δ

H

6,57,

δ

H

6,69,

δ

H

6,81 e

δ

H

6,99, respectivamente. Os sinais das metoxilas 7, 7”, 5, 5”, 4’ e

4” aparecem no espectro em

δ

H

4,07, 3,94, 3,61, 3,93, 3,88 e 3,77 ppm.

O espectro de RMN

1

H (

Figuras 47-49

, pág. 58 e 59) de

4a

mostra o desaparecimento

dos sinais dos hidrogênios em ligação de hidrogênio em torno de 13 ppm e o revelando que

ambas foram substituídas por grupos metilas. Os espectros obtidos com

1

Hx

1

H COSY

(

Figura 50,

pág. 60)

e NOESY (

Figuras 51 e 52

, págs. 60 e 61), permitiram fazer a completa

atribuição dos deslocamentos químicos dos hidrogênios de

4a

(

Tabela

6,

pág. 57). Os sinais

de interações espaciais detectados no espectro NOESY permitiram confirmar as localizações e

os respectivos deslocamentos químicos: MeO-4’ com interação espacial com H-3’,5’ (

δ

H

7,05), MeO-4”’ com interação espacial com H-3”’,5”’ (

δ

H

6,84), MeO-7 com interação

espacial com H-8 (

δ

H

7,01) e MeO-7”, pela interação espacial com H-6” (

δ

H

6,73).

O espectro de RMN

13

C de

4a

(

Figura 53 e 54,

págs. 61 e 62) foi comparado com a

literatura (MOREIRA

et al

,, 1999). O espectro de HMQC (

Figura 55,

pág. 63) permitiu

estabelecer as correlações diretas (

1

J

CH

) enquanto que os deslocamentos químicos dos

carbonos não hidrogenados deste derivado foram estabelecidos pelos espectros de HMBC

através (

2,3

J

CH

). (

Figura 56,

pág. 64).

57

2

3

4

5

6

7

8

9

10

1

'

2

'

3

'

4

'

5

'

6

'

2

"

3

"

4

"

5

"

6

"

7

"

8

"

9

"

10

"

1

"'

2

"'

3

"'

4

"'

5

"'

6

"'

O

OCH

3

OCH

3

H

3

CO

O

H

3

CO

O

OCH

3

O

H

3

C

Tabela

6:

Dados de RMN

1

H (200 MHz) e

13

C (50 MHz) da substância

4

(MOREIRA

et al

.,

1999) com o derivado

4a

.

Substância 4

Derivado 4a

HMBC

C

δC

δH

CH

1

J

CH

2,3

J

CH

Noe

2 165,03 161,8

H-3;H-2’,6’

3 103,22 107,6

6,91(s,1H)

4 183,5 177,1

H-3

5 161,3 159,7

CH

3

O- 6

6 104,1 113,8

H-8

7 163,1 163,2

H

3

CO- 7; H-8

8 94,5 95,8 7,0(s,1H) OCH

3

-7

9 158,2 160,5

H-8

10 105,1 105,9

1’ 123,2 123,7

H-3’,5’

2’,6’ 129,3 128,1

7,96(d,8Hz,2H)

3’,5’ 116,8 114,8

7,1(d,8Hz,2H) OCH

3

-4’

4’ 161,8 163,4

H

3

CO- 4’;H-2’,6’;H-3’,5’

2” 165,2 161,2

H-3”;H-2’”,6’”

3” 103,4 106,0

7,26(s,1H)

4” 183,3 178,3

5” 163,4 162,0

H

3

CO- 7”;H-6”

6” 96,0 92,4 6,6(s,1H) H-6” OCH

3

-5”,H

3

CO-7”

7” 164,8 162,8

8” 101,0 103,1

H-6”;H-3”

9” 155,5 157,3

H-3’’,5’”

10” 105,6 107,0

1’” 123,2 124,0

2’”,6’” 129,1 128,1

7,50(d,8Hz,2H)

H-2’”,6’”;H-3’”,5’”

3’’,5’” 116,8 114,9

6,86(d,8Hz) OCH

3

-4’”

4’” 161,8 163,1

OCH

3

-5 62,4 3,62

OCH

3

-7 56,5 3,88 H-8

OCH

3

-4’ 55,9 3,93 H-3’,5’

OCH

3

-5” 56,8 4,03 H-6”

OCH

3

-7” 56,7 56,4 3,95 H-6”

OCH

3

-4’”

55,7 3,82 H-3’”,5’”

58

Figura 47:

Espectro de RMN de

1

H (500 MHz , D

3

CCOCD

3

) do derivado

4a.

59

Figura 48:

Ampliação do espectro de RMN de

1

H (500 MHz , D

3

CCOCD

3

) do derivado

4a.

Figura 49:

Ampliação do espectro de RMN de

1

H (500 MHz , D

3

CCOCD

3

) do derivado

4a.

60

Figura 50:

Espectro de

1

H-

1

H-COSY (500MHz, D

3

CCOCD

3

) de

4a.

Figura 51:

Espectro de NOESY de

4a

.

61

Figura 52:

Ampliação do espectro de NOESY de

4a

.

Figura 53:

Espectro de

13

C (125MHZ, D

3

CCOCD

3

)de

4a.

62

Figura 54:

Ampliação do espectro de

13

C (125MHZ, D

3

CCOCD

3

) de

4a.

63

Figura 55

: Espectro e ampliação (3-5 ppm) de HMBC (D

3

CCOCD

3

) da substância

4a

.

64

Figura 56

: Espectro e ampliação (3,7-4,1 ppm) de HSQC (D

3

CCOCD

3

) da substância

4a

.

65

5.2.8. Substância 6

Uma fração do extrato metanólico partição clorofórmio, foi analisada em CCDA e

revelou a presença de um componente terpênico e biflavonóide.

O espectro de IV desse material (

Figura 57,

pág. 66) revelou bandas de absorção em

3408 cm

-1

de estiramento axial de O-H, bandas em 2959 e 2934 e 2870 cm

-1

de

ν

C-H

(CH

2

e

CH

3

), 1633 (

ν

C=C

); 1460,1380 (

ν

C-C

); 1164-1023 (

ν

C-O

);

1648 (

ν

C=O

);

1604,01504 e 1442

ν

C=C

(aromático); 1214 e 1174 (

ν

C-O

); 833

δ

=C-H

(2 H vizinhos). Compatíveis com o revelado em

placa.

O espectro de RMN

1

H deste material

(Figura

,

58,

pág. 68) apresenta sinais de metilas

entre

δ

H

0,63 e

δ

H

0,94, de hidrogênio alifático e em

δ

H

5,34, típico de H-6 de fitosteróides.

Além dos sinais da parte da aglicona aparecem sinais em

δ

H

3,10 (

m

, H-5´), 4,22 (

d

,

H-1’),

2,91 (

m

, H-2’), 3,02 (

m

,

H-4’) e 3,15 (

m

, H-3’) que podem ser atribuídos aos hidrogênios do

carboidrato. Esta unidade de açúcar pode ser atribuída como

β

-glicosídeo devido à presença

do dubleto em

δ

4,23 (

J

=8 Hz) que representa o hidrogênio anomérico (H-1’) acoplando com

o hidrogênio H-2’

trans

-diaxial. Os demais valores dos sinais de H-3’, 4’, 5’ e 6’ estão

assinalados na

Tabela

7,

pág. 67.

Os espectros de RMN

13

C (

Figuras, 59 e 60,

pág. 69 e 70) de

6

apresentam 4xCH e

um CH

2

do açúcar, sendo um com

δ

103,4 do CH anomérico. A comparação dos

deslocamentos químicos dos carbonos metínicos de

6

com valores da literatura, permitiu

propor a glicose como representante da unidade de açúcar ligado no C-3 do esteróide. A

comparação dos dados de

6

com valores atribuídos para o sitoesterol glicosilado permiiu

identificar como 3-

O

-

β

-D-glicopiranosilsitosterol. Na parte da aglicona temos

δ

C

70,1 do CH-

3. Os sinais dos carbonos sp

2

em

δ

C-5

140,4 e

δ

C-6

121,0, são compatíveis com os dois

carbonos sp2 (C-5 e C-6) do sitosterol de acordo com comparação dos valores de

13

C com os

da literatura (VELANDIA, 2002). Os sinais de H em anel aromático no espectro de RMN 1H,

confirmam a presença do biflavonóide agatisflavona como impureza na fração.

66

4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500

Wavenumber (cm-1)

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

%Transmittance

3392.23

3172.38

2929.39

2850.32

1648.87

1604.51

1564.01

1504.23

1442.52

1363.45

1282.45

1214.95

1174.46

1108.89

1018.25

833.11

572.76

Figura 57:

Espectro de IV da substância

6

.

67

Tabela 7:

Dados de RMN de

1

H e

13

C da substância

6

21

20

22

23

24

25

26

27

28

29

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

14

15

16

17

18

19

1

'

2

'

3

'

4

'

5

'

6

'

O

OH

HO

O

6

Substância 6 Literatura

(VELANDIA, 2002)

C

δC δH δC

1 36,7 37,3

2 32,2 31,6

3 70,1 3,47 71,8

4 41,8 42,9

5 140,4 140,7

6 121,0 5,34 121,7

7 31,2 31,9

8 31,3 31,9

9 49,5 50,1

10 36,1 36,4

11 22,6 21,1

12 39,2 39,8

13 41,7 42,9

14 56,1 56,7

15 25,5 24,3

16 27,6 28,24

17 55,4 56,0

18 11,5 0,63 11,9

19 19,5 0,94 19,4

20 35,3 32,2

21 18,8 14,0

22 33,3 33,9

23 38,2 39,1

24 45,1 45,8

25 28,7 26,0

26 18,8 0,89 18,8

27 18,9 0,78 19,0

28 23,7 0,87 23,0

29 117,7 0,82 12,0

1’ 103,4 4,23 101,4

2’ 74,8 2,91 73,3

3’ 77,8 3,15 76,5

4’ 71,9 3,02 70,3

5’ 75,4 3,10 73,7

6’ 65,0 3,71 64,4

68

Figura 58

: RMN de

1

H (400MHz, DMSO-d

6

) da fração contendo a substância

6

.

69

Figura 59

: RMN de

13

C (125MHz, DMSO-d

6

) da fração contendo a substância

6.

70

Figura 60

: Ampliação do RMN de

13

C (125 MHz, DMSO-d

6

) da fração contendo a

substância

6

.

71

5.3.

ANÁLISE COM CLAE DAS FRAÇÕES OSPGMC E OSPMC-16P.

Considerando que estas frações continham mistura de flavonóides resolveu-se fazer

análise cromatográfica. O cromatograma obtido com CLAE utilizando sistema isocrático de

metanol/água/acetonitrila/ácido acético (20:40:39:1) como fase móvel e velocidade de fluxo

1mL.min

-1

e detecção UV (

λ

máx

=270nm),

confirmaram a presença de outros componentes na

fração OSPMC (

figura 61,

pág. 71) além de agatisflavona e 7”-O-metil-agatisflavona e na

fração OSPMC-1-6P (

figura

62,

pág. 72) que continha como componente majoritário a 7”-O-

metil-agatisflavona.

Figura 61:

CLAE da fração OSPGMC.

72

Figura 62:

CLAE da fração OSPMC1-6p.

A análise CLAE-EM dessas frações, “ricas em flavonóides”, permitiu detectar os

valores de

m/z

de várias faixas de tempo de retenção reveladas pelos picos representantes dos

componentes da mistura

.

A análise desses valores, aliada às possibilidades de substituição

com grupos freqüentes em flavonóides isolados de

Ouratea hexasperma

(St. Hil.) Bail. em

trabalhos anteriores (Suzart, 2007; Suzart et al., 2007; Daniel, 2005), a análise do espectro de

RMN de

1

H (

figuras 63 e 64

, pág.

7

3) e considerando a possibilidade de formação de

“adutos” com traços dos solventes utilizados, pôde-se propor estruturas que certamente estão

presentes no material analisado. Os sinais no espectro de RMN de

1

H na região entre

δ

H

4,22ppm e

δ

H

3,10ppm podem ser atribuídos aos hidrogênios do carboidrato. Possui também

sinais típicos de biflavonóide, como os dubletos na região entre

δ

H

7,93ppm e 6,60 ppm e

singletos em

δ

H

6,57ppm e 6,39ppm. Os esquemas

2

e

3

foram utilizados para facilitar esta

interpretação. Nesses são apresentadas as estruturas dos flavonóides que incorporadas aos

substituintes (R e/ou R’) ou resíduos de solventes chega-se aos valores de

m/z

detectados.

Estas propostas dependem de análises adicionais como EM/EM dos íons detectados, o que

confirmaria a formação de “adutos” e, assim, as estruturas propostas poderão ser aceitas com

maior segurança. A análise da fração

OSPMC

permitiu a identificação dos valores de

m/z

para os picos detectados no CLAE-EM e estão representados na

Figura 65

,

pág.

74 e

Esquema 2

, pág. 75, foi possível propor a metil-vitexina e orientina (

B

), ramnosil-

triidroxiflavona (

K

), agatisflavona (

F

), metil-agatisflavona (

H

) e dimetil-agatisflavona (

G

)

cujas estruturas estão representadas na

Figura 66

, pág. 76. A análise da fração

OSPMC1-6P

(

Figura

67,

pág. 77 e

Esquema 3,

pág. 78) permitiu confirmar a metil-agatisflavona (

A1

)

como componente majoritário, além das metil-diidroxiflavonas (

B1

e

D1

), a ramnosil-

triidroxiflavona (

C2

) e a glicopiranosil-prenil-diidroxi-flavonol (

D2

) (

Figura 68,

pág. 79

).

73

8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0

Chemical Shift (ppm)

-0.02

-0.01

0

0.01

0.02

0.03

0.04

0.05

0.06

0.07

0.08

0.09

0.10

0.11

Intensity

7.93

7.58

6.97

6.78

6.71

6.58

6.39

5.95

4.91

4.54

4.20

3.87

3.80

3.53

3.45

3.32

3.18

2.31

2.08

1.58

1.28

Figura 63:

Espectro de RMN

1

H (200MHz, D

3

CCOCD

3

) da fração OSPGMC.

8.0 7.5 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0

Chemical Shift (ppm)

-0.02

-0.01

0

0.01

0.02

0.03

0.04

0.05

0.06

0.07

0.08

Intensity

2.16

2.63

3.32

3.87

4.61

6.58

6.68

6.78

6.98

7.58

7.89

Figura 64:

Espectro de RMN

1

H (200MHz, D

3

CCOCD

3

) da fração OSPGMC1-6p.

74

0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 27.5 30.0

0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

0.30

0.35

0.40

0.45

0.50

0.55

0.60

0.65

0.70

0.75

0.80

0.85

0.90

0.95

1.00

1.05

(x1,000,000)

2:362.9385 (1.00)

2:538.0868 (1.00)

2:537.5871 (1.00)

2:537.0852 (1.00)

2:625.1173 (1.00)

2:601.1201 (1.00)

2:487.1238 (1.00)

2:617.1128 (1.00)

2:498.9165 (1.00)

2:378.9185 (1.00)

1:553.1105 (1.00)

1:417.2701 (1.00)

1:318.3065 (1.00)

1:411.0863 (1.00)

1:569.1177 (1.00)

1:404.0743 (1.00)

1:539.1052 (1.00)

1:359.0735 (1.00)

1:489.1444 (1.00)

1:505.1434 (1.00)

1:477.1416 (1.00)

1:447.1322 (1.00)

1:349.1897 (1.00)

1:260.0457 (1.00)

1:241.0522 (1.00)

A-Raw Spectrum

[0.687->1.273]

Event1 (Modo +)

m/z

241.0522

260.0457

349.1897

Event2 (Modo -)

m/z

378.9185

498.9165

C-Raw Spectrum

[5.540->6.813]

Event1 (Modo +)

m/z

505.1434

Event2 (Modo -)

m/z

617.1128

B-Raw Spectrum

[3.887->4.987]

Event1 (Modo +)

m/z

447.1322

477.1416

D-Raw Spectrum

[6.813->8.013]

Event1 (Modo +)

m/z

489.1444

Event2 (Modo -)

m/z

487.1238

601.1201

625.1173

E-Raw Spectrum

[8.013->9.047]

Event1 (Modo +)

m/z

359.0735

F-Raw Spectrum

[10.427->12.113]

Event1 (Modo +)

m/z

539.1052

Event2 (Modo -)

537.0852

538.0868

G-Raw Spectrum

[12.180->13.280]

Event1 (Modo +)

m/z

404.0743

569.1177

H-Raw Spectrum

[13.313->14.487]

Event1 (Modo +)

m/z

553.1105

I-Raw Spectrum

[14.487->15.620]

Event1 (Modo +)

m/z

411.0863

J-Raw Spectrum

[19.407->20.267]

Event1 (Modo +)

m/z

318.3065

K-Raw Spectrum

[21.367->22.400]

Event1 (Modo +)

m/z

417.2701

A

B

C

D

E

F

H

G

I

J

K

A’

A”

B

C’

D’

F’

F”

D”

D’”

F’”

G

241

260

349

447

477

505

489

359

539

404

569

411

318

417

553

A

Exp 1

(modo +)

Exp 2

(modo -)

OSPMC

Figura 65:

Identificação dos valores de

m/z

para os picos detectados no CLAE-EM da fração

OSPGMC.

75

O

RO

OH O

OH

R'

C

15

H

9

O

5

(269)

R ou R'

O

OH

HO

(163)

Solventes

H

2

O (18)

H

3

CCN(41)

H

3

C-OH (32)

OH

O

(60)

Grupo

CH

3

+ 163

+ 41 + 32

505 (C)

+ 163

446 (B)

+ 163

+ 41

489 (D)

+ 163

C

5

H

9

(69)

+

4 H

505 (C)

O

OH

HO

(147)

+ H

+

417 (K)

+ 69

+ 147

O

R'

RO

OH O

O

C

15

H

9

O

6

(285)

+ 163

448 (B)

+ 32 + 18

+ H

+

318 (J)

+ 14

349 (A)

+ 32

+ 60+ 14

359 (E)

+

ou

569 (G)

+ 14 + 14

+ 3 H

+

+ 269

553 (H)

b

+ H

+

+ 269

539 (F)

b

+ H

+

+ 269

O

RO

OH O

O

+ 14

+269

+ 269

+269

269

+14

m/z [RS]

a

m/z [RS] ="Raw Spectrum", faixa do(s) picos do CLAE;

b

Detectadas na análise dos espectros de RMN

na fração deste material.

Esquema 2:

Propostas de estruturas compatíveis com os valores de

m/z

detectados na análise

de CLAE-EM (Figura 65)

76

O

OH O

OH

MeO

O

OH

O

OH O

OH

HO

O

OH

B

O

OH O

OH

HO

OH

O

OH

K

O

OH

HO

O

OH

O

OH

HO

O

OH

O

HO

F

H

O

OH

MeO

HO

O

OH

O

MeO

G

Figura 66:

Estruturas propostas através da análise CLAE-EM na fração OSPGMC.

77

0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 15.0 17.5 20.0 22.5 25.0 27.5 30.0

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1.0

1.1

1.2

1.3

1.4

1.5

1.6

(x1,000,000)

2:665.0944 (1.00)

2:551.1005 (1.00)

1:571.1379 (10.00)

1:561.4056 (1.00)

1:517.3749 (1.00)

1:473.3534 (1.00)

1:429.3240 (1.00)

1:385.2992 (1.00)

1:341.2723 (1.00)

1:417.2693 (1.00)

1:284.3329 (1.00)

1:553.1206 (1.00)

A. Raw Spectrum [13.060->15.233]

Event 1 (Modo +)

m/z Abs. Inten. Rel. Inten.

A1: 553.1206 159599 100.00

[metil-agatisflavona]

Event 2 (Modo -)

551.1005 52936 38.45 (M-2H)

665.0944 7293 5.30

[M+AcAcetico+MeOH+H

2

O]

B- Raw Spectrum [19.393->20.180]

[25->26]

Event 1 (Modo +)

m/z Abs. Inten. Rel. Inten.

B1: 284.3329 3113 5.20

[269 + 14 (metil)]

C. Raw Spectrum [21.460->22.280]

Event 1 (Modo +)

m/z Abs. Inten. Rel. Inten.

413.2763 2900 6.01

C2: 417.2693 8432 17.47

[269 + 147(ramnose) + H]

D. Raw Spectrum [22.527->23.347]

Event 1 (Modo +)

m/z Abs. Inten. Rel. Inten.

D1. 284.33774973 5.64

[269 + 14 (metil)]

341.2723 21998 24.95

385.2992 88164 100.00

429.3240 72304 82.01

473.3534 38277 43.42

D2. 517.374917511 19.86

[516 + H = Gic-Prenil-Flavonol]

561.4056 4613 5.23

A

B

C

D

Figura 67:

Identificação dos valores de

m/z

para os picos detectados no CLAE-EM da fração

OSPGMC1.6p

.

78

O

RO

O

OH

C

15

H

9

O

5

(269)

R ou R'

O

OH

HO

(163)

Solvente

H

2

O (18)

H

3

CCN(41)

H

3

C-OH (32)

OH

O

(60)

Grupo

CH

3

C

5

H

9

(69)

O

RO

OH O

OH

OHR

C

15

H

9

O

6

(285)

+ 163

517 (D2)

(269)

* Detectado na análise dos espectros de RMN na fração deste material.

+ 69

O

RO

OH O

OH

+14

284 (B1,D1)

+H

+

+18+32+60

551 (A2)

553 (A1)*

+ H

+

+ 269 + 14+ 269

+ 2H

+

+ 269 + 269

Esquema 3:

Propostas de estruturas compatíveis com os valores de

m/z

detectados na análise

de CLAE-EM (Figura 67)

79

O

OH O

OH

HO

O

OH

O

OH

HO

O

OH

O

MeO

A1

O

OH

MeO

O

B1

D1

C2

O

OH O

OH

O

OH

O

HO

OH

D2

Figura 68:

Estruturas propostas através da análise CLAE-EM na fração OSPGCM1.6p.

80

5.4. Propostas Biossintéticas para os constituintes isolados de Ouratea hexasperma var.

planchonii Engl.

Uma das principais considerações em determinação estrutural é o conhecimento da

biossíntese das diferentes classes dos metabólitos especiais, por isso incluímos este capítulo

para auxiliar na determinação das estruturas das substâncias isoladas de

Ouratea hexasperma

var

. planchonii

Engl.

As substâncias isoladas da espécie estudada neste trabalho, pertencem a classe dos

ácidos alifáticos, dos esteróides (

β

-sitosterol, estigmasterol, campesterol e 3-O-

β

-D-

glucopiranosil sitosterol); dos triterpenos (lupeol e

α

e

β

-amirina) e dos biflavonóides (7”-O-

metilagatisflavona e agatisflavona). A seguir apresenta-se algumas propostas biossintéticas.

5.4.1. Ácidos graxos

Os ácidos graxos são formados pela ligação de unidades de ácido acético (C2) via

reação de condensação. A biossíntese envolve a conversão do acetil-CoA em malonil-CoA,

que são convertidos em acetil-ACP e malonil-ACP, ocorrendo então a condensação de

Claisen e formação do

β

-ceto acil-ACP que, após reduções, formam os ácidos graxos com um

número par de átomos de carbono,

esquema 4

(DEWICK, 2002). Através de oxidações

α

ocorre a perda de um átomo de carbono, fornando ácidos graxos de cadeias com número

ímpar de carbonos,

esquema 5

(HARWOOD, 1997).

Esquema 4: Biossíntese de ácidos graxos (adaptado de DEWICK, 2002)

Biotina + ATP+CO

2

Acetil-CoA

carboxilase

ACP

CO

2

H

CH

2

CO-SCoA

malonil-CoA

CH

3

CO-SCoA

acetil-CoA

RCH

2

CO-S-ACP

acetil-ACP

CO

2

H

CH

2

CO-S-ACP

malonil-ACP

RCH

2

COCH

2

CO-S-ACP

β-ceto acil-ACP

Reação

de Claisen

NADPH

CH

2

CO-S-ACP

H

OH

R

β-hidroxil acil-ACP

E

2

eliminação

de H

2

O

- H

2

O

RCH

2

CO-S-ACP

α−β-insaturado acil-ACP

Redução de

carbonila

NADPH

Redução da

ligação dupla

RCH

2

CH

2

CH

2

CO-S-ACP

Acil-ACP graxo

Cada volta

extende

a cadeia do

grupo acil

HSCoA

R(CH

2

CH

2

)

n

CH

2

CO-S-CoA

Acil-CoA graxo

R(CH

2

CH

2

)

n

CH

2

CO

2

H

Ácido graxo

H

2

O

[malonil]

n

81

Esquema 5: Proposta de a-oxidações em aácidos graxos (HARWOOD, 1997).

2H

+

+ 2e

H

2

O

OOH

OH

C

O

C

R

H

L

H

D

C

O

C

R

H

L

-

XH

2

-

C

O

C

R

H

L

O

XH

2

O

2

-

C

O

C

R

H

L

OH

CO

2

C

R

H

O

NAD

+

O

H

R

C

O

C

R

H

L

-

82

5.4.2. Esteróides

As substâncias sitosterol, estigmasterol, campesterol e 3-O-

β

-glicosilpiranosil

sitosterol se caracterizam por ter um esqueleto básico de 27 carbonos dispostos num sistema

tetracíclico. Biogeneticamente formam-se via pirofosfato de isopentenila originando o

esqualeno, estrutura que contém duas unidades de farnesil pirofosfato ligadas cauda-cauda. O

esqualeno epoxi (óxido de esqualeno), em sua forma cadeira-bote-cadeira–bote, cicliza após

vários rearranjos do tipo 1,2 formando o cicloartenol, estrutura que contém 24 carbonos. O

cicloartenol após clivagem oxidativa de três metilas forma os esteróides (Esquema 6).

Esquema 6: Proposta biogenética para os esteróides

(Adaptado de MANN, 1994).

OPP

R

OPP

R

H

+

OPP

R

PPO

H

OPP

Esqualeno

O

2

NADPH

HO

H

HO

H

HO

H

OPP

H

NADPH

HO

H

HO

H

SITOSTEROL

ESTIGMASTEROL

HO

H

2

C

H

HO

H

OXIDO DE ESQUALENO

H

+

HO

H

CH

3

S

HO

H

HH

CH

3

S

Gli-O

H

3-O-β−GLICOSILPIRANOSIL

SITOSTEROL

GLICOSILAÇÃO

O

[O] das

metilas

83

5.4.3. Terpenos

Os terpenos constituem uma classe de substâncias provenientes da via pirofosfato de

isopentenila, que da mesma forma que os esteróides, da origem ao esqualeno pela fusão

cauda-cauda de duas unidades de farnesil. No caso dos terpenos o óxido de esqualeno em sua

forma cadeia-cadeira-cadeira-bote é ciclizado para gerar o cátion dammarenil e,

conseqüentemente, o cátion lupenil que pode ser estabilizado pela formação de um novo anel

de cinco membros gerando compostos do tipo lupeol. O cátion lupenil também pode ser

estabilizado pela formação do anel de 6 membros, gerando o cátion oleanil. Esse é

estabilizado com migração de uma metila e rearrango do tipo Wagner-Meerwein gerando o

núcleo básico

α

-amirina (Esquema 7).

Esquema 7: Proposta biogenética para os terpenos lupeol e

α

-amirina. (Adaptado de MANN,

1994; DEWICK, 2002).

PPO

H

OPP

Esqualeno

O

2

NADPH

OPP

H

HO

H

OXIDO DE ESQUALENO

H

+

O

HO

H

HO

H

-H

+

LUPEOL

HO

H

HO

H

HO

H

HO

H

CATION LUPENIL

α

αα

α - AMIRINA

CATIÓN TARAXASTERIL

W-M

REARANJO

a

H

HO

H

β

ββ

β -AMIRINA

H

84

5.4.4. Biflavonóides

Os flavonóides derivam seu esqueleto de 15 carbonos, de dois precursores básicos:

malonil-CoA e

p

-coumaroil-CoA. Na reação biossintética ocorre condensação de três

moléculas de malonil-CoA com a molécula de

p

-coumaroil-CoA formando uma chalcona

intermediaria (1,3 difenilpropano-1-ona). Da chalcona são formadas estruturas de três anéis,

as flavanonas, a partir das flavanonas formam-se todas as outras classes de flavonóides

(HARBONE & BAXTER, 1999). Através da formação de dímetos da apigenina formam-se os

biflavonóides, agtisflavona e 7”-O-metilagatisflavona (Esquema 8).

Esquema 8: Proposta biogenética para as flavonas

(DEWICK, 2002) e biflavonas (MOREIRA,

1994)

O

CoAS

OH

3 Malonil CoA

SCoA

O

O O

OH

CLAISEN

Chalcona

sinstase

O

HO

OH

O

HO

OH

4-HIDROXICINAMOIL

-

CoA

NARINGENINA

APIGENINA

OOH

HO OH

OH

O

OOH

OH

H-O

O

OOH

OH

O

HO

OH

O

OOH

OH

O

H

O

HO

OH

O

OOH

OH

HO

SAM

O

HO

OH

O

OOH

OH

OMe

HO

O

OOH

OH

H-O

AGATISFLAVONA

7"-O-METILAGATISFLAVONA

85

5.5. ENSAIOS BIOLÓGICOS

Os ensaios biológicos realizados foram de atividade antibacteriana, atividade

antifúngica, atividade inseticida e de avaliação da toxicidade. O ensaio de atividade

antibacteriana foi realizado no Laboratório de Bacteriologia Veterinária do Departamento de

Microbiologia e Imunologia Veterinária, do Instituto de Veterinária – IV da UFRRJ sob

orientação da Professora Dra. Miliane Moreira Soares de Souza

.

O ensaio de atividade

antifúngica foi realizado no Laboratório de Leveduras Patogênicas e Ambientais do

Departamento de Microbiologia e Imunologia Veterinária – IV da UFRRJ sob orientação do

Professor Dr. Francisco de Assis Baroni. A Avaliação da atividade inseticida foi realizada no

Laboratório de Miíases Tropicais do Departamento de Parasitologia Animal-UFRRJ, sob

orientação do Professor Dr. Gonzalo Efrain Moya Borja e colaboração do mestrando Élio

Barbieri Junior. A avaliação da toxicidade do extrato metanólico foi realizado no laboratório

de Farmacologia do Departamento de Fisiologia Animal IB/UFRRJ, sob orientação dos

professores Fábio Fagundes Rocha e Frederico Argollo Vanderlinde.

5.5.1. Avaliação da Atividade Antibacteriana do Extrato Metanólico de Ouratea

hexasperma var. planchonii Engl.

A metodologia utilizada foi adaptada do teste de difusão em placas desenvolvido por

Kirby-Bauer. Esta metodologia é amplamente utilizada no mundo como teste-padrão para

ensaios biológicos, devido a simplicidade e eficiência na reprodução dos resultados obtidos e

é regulamentado internacionalmente pelo Clinical Laboratory Standards Institute (WAYNE,

2005).

A

S

bactérias utilizadas para a realização deste experimento foram escolhidas por

representar os dois grandes grupos bacterianos existentes: a espécie Gram-positiva

Staphylococcus aureus

, um isolado clínico sensível e outro resistente, e a espécie Gram-

negativa

Escherichia coli

, ambas derivadas de isolados clínicos de mastite. (JAWETZ, 2000).

Staphylococcus aureus

As bactérias da espécie

Staphylococcus aureus

são cocos gram-positivos, membro da

família Micrococcaceae, habitantes naturais da pele e membranas mucosas de humanos e

animais (KONEMAN

et. al,

2001)

.

Estão envolvidas em uma série de processos infecciosos

de grande importância na clínica médica humana e veterinária. Em humanos,

S. aureus

é a

principal causa das infecções hospitalares.

Escherichia coli

A espécie

Escherichia coli

representa bactérias gram-negativas entéricas largamente

disseminadas no ambiente. Além do impacto sobre a saúde, a

E. coli

é um dos mais bem

estudados modelos bacterianos, e nos últimos anos vem apresentando uma drástica mudança

em seu perfil de sensibilidade aos antimicrobianos (JAWETZ, 2000).

Foram utilizadas 3 amostras de microrganismos, sendo duas de

Staphylococcus

aureus

, uma de

Escherichia coli.

Para

S.aureus

, foram utilizados isolados clínicos oriundos

de quadros de mastite bovina, sendo um dos isolados resistente aos antibióticos usuais. O

isolado clínico de

E. coli

, de mesma origem, foi classificado como sensível.

Os isolados bacterianos foram estocados em freezer a -20

0

C e repicados em caldo

enriquecido. Posteriormente foram incubados em estufa a 37 ºC por 24 horas, para ativação de

seu metabolismo. Após o crescimento, foi realizada uma bateria de identificação presuntiva

consistindo na coloração de Gram, realizada após o período de incubação de 24 horas, para

observação das características morfotintoriais, e no teste da catalase, para observação da

86

quebra do peróxido de hidrogênio (H

2

O

2

), pela enzima catalase (KONEMAN

et. al

, 2001).

Como as amostras já haviam sido previamente identificadas, estes procedimentos foram

realizados para garantir que não houve contaminação das amostras.

As amostras bacterianas foram inoculadas em caldo enriquecido, e incubadas em

estufa a 37 ºC por 24 horas antes da realização dos ensaios, para que todas estivessem em fase

exponencial de crescimento durante o experimento. Após o período de incubação, o

crescimento deveria ser equivalente ao tubo 0,5 da escala de MacFarland, correspondendo a

uma concentração de 1,5 x 10

8

UFC/mL, ideal para os ensaios de avaliação de

antimicrobianos, obedecendo às recomendações do órgão responsável pela aceitação de testes

como padrão, o Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI).

O extrato metanólico de

Ouratea hexasperma

var.

planchonii

Engl. foi utilizado na

concentração de 500mg/mL. Para realização do ensaio de difusão, 50

µ

L de uma solução do

material-teste na concentração de 500mg/mL foi inoculada em um poço feito no centro da

placa contendo o ágar Mueller Hinton, como postulado pelo CLSI, semeado com 100

µ

L de

caldo de cultura do microorganismo previamente identificado. Na incubação, o extrato se

difunde radialmente em todo o ágar em volta do poço enquanto o microorganismo está

crescendo no ágar. Isto resulta em uma zona de inibição de crescimento ao redor de cada

disco de aplicação (TRUJILLO, 2002).

O dimeltilsulfóxido (DMSO), veículo utilizado nas amostras-testes, foi testado

separadamente para verificação de uma possível atividade antimicrobiana. Após realização

dos ensaios com o veículo, foi comprovada sua inatividade sobre o crescimento bacteriano,

permitindo o prosseguimento dos testes com as diluições do extrato. Foi possível detectar a

formação de halo de inibição nos ensaios frente ao isolado testado de

Escherichia coli

e a um

isolado de

Staphylococcus aureus

que já se mostrara resistente aos antibióticos de eleição. No

entanto, o outro isolado testado de

Staphylococcus aureus

não apresentou halo de inibição

nos ensaios realizados. Avaliações adicionais devem ser feitas para confirmar a atividade

antibacteriana.

5.5.2. Verificação de atividade antifúngica do Extrato Metanólico de Ouratea

hexasperma var. planchonii Engl.

Para a verificação de atividade antifúngica, foram realizados dois experimentos, o

primeiro com o extrato metanólico bruto de

Ouratea hexasperma

var.

planchonii

Engl

.

e o

segundo com a fração clorofórmica do extrato metanólico. A metodologia utilizada para o

primeiro experimento, com o extrato metanólico bruto, foi utilizando o meio Sabouraud

dextrose a 3% acrescido do extrato da planta, em tubos de ensaios. Para o segundo

experimento, utilizando a fração clorofórmica do extrato metanólico, em placas de Petri com

o meio Sabouraud dextrose a 3% e discos de papel, a partir de círculos de pré-filtros

semelhantes aos discos empregados nas provas de antibiograma, embebidos com a fração do

extrato da palnta. A avaliação foi realizada com os seguintes microrganismos:

Candida

albicans

,

Cryptococcus neoformans

,

Malassezia pachydermatis

,

Rhodotorula spp

e

Aspergillus niger

.

Candida albicans

está freqüentemente relacionada às micoses mais comuns que

acometem os seres humanos, é um habitante normal do trato gastrointestinal e regiões

mucocutâneas, incluindo boca e vagina. Milhares de células da levedura podem estar

presentes em um indivíduo, sem qualquer efeito danoso, entretanto,

C. albicans

é também,

dentre os fungos, o de maior patogenicidade aos humanos (SCHMID, 2003).

87

Cryptococcus neoformans

é um basidiomiceto, que se apresenta na forma tecidual

como levedura encapsulada, corresponde a duas variedades fúngicas, com quatro sorotipos:

var.

neoformans

(sorotipos A e D) e var

gattii

(sorotipos B e C). É fungo que vive em solos

contaminados com fezes de pombos (var.

neoformans)

e junto a eucaliptos (var.

gattii

). A

infecção criptococócica mais freqüentemente ocorre em pacientes imunodeprimidos (var.

neoformans

, fungo oportunista), mas pode ocorrer no hospedeiro normal (var. gattii, patógeno

primário) (KWON-CHUNG et al., 1992).

Malassezia pachydermatis

se apresenta de forma isolada ou em grupo, faz parte da

microbiota da pele e quando ocorrem alterações no microambiente local como aumento da

umidade, da temperatura e do substrato, estimulam o aumento do número de células desta

levedura, fazendo-a passar da forma comensal para o parasitismo. (NOBRE et al., 1998).

Rhodotorula spp

Leveduras do gênero

Rhodotorula

são produtoras de pigmentos carotenóides de

pigmentação amarela ou vermelha, têm sido associados a alterações de cor dos alimentos.

(FRANCO E LANDGRAF, 2004). Embora infecções sérias devido a

Rhodotorula spp

em

humanos são raras, foram informados septicemia, endocarditis, meningites, ventriculitis,

peritonitis, keratitis, endophthalmitis, dacryocystitis, e pneumonia. (RUSTHOVEN et al.,

1984).

Aspergillus niger

Os

aspergillus

tem ampla distribuição geográfica, e encontram-se no solo, ar, plantas e

matérias orgânicas em geral, sendo contaminantes comuns em laboratórios e hospitais

(MINOMI, 2003).

Aspergillus niger

geralmente está associado nos casos de otomicose,

aspergilomas e infecções dos seios nasais. (FISHER, 2001)

Primeiro Experimento

Para o primeiro experimento utilizou-se o meio Sabouraud dextrose a 3%, acrescido

do extrato da planta. A fórmula do Sabouraud, normalmente feita para 100mL foi preparada

para 60mL e os 40mL restantes de H

2

O destilada que completariam o volume foram

esterilizados em autoclave e usados para diluir 3g do extrato. Este após a diluição foi

submetido a exposição a ultra-violeta em capela de segurança biológica nível II. O meio

Sabouraud (60mL) foi esterilizado por autoclavação (120ºC por 20 minutos). Após

esterilização o meio foi resfriado a 50ºC e misturado com o extrato diluído. Desta forma, foi

obtida um meio com concentração de 3% de extrato.

Do frasco com a concentração 3%, foram retirados metade do volume que foi

imediatamente distribuída em tubos de ensaio previamente esterilizados. Estes tubos foram

dispostos de modo que o meio solidificasse no modo “inclinado”. A outra metade do meio

Sabouraud contida em frasco de Erlenmeyer foi acrescida de mais 50mL de Sabouraud puro,

tornando a concentração de 1,5%. O material foi homogeneizado, separando-se 50mL que

foram imediatamente distribuídos em tubos de ensaio que também foram inclinados. Os 50mL

restantes foram acrescidos de 50mL de Sabouraud puro fazendo com que a concentração

ficasse a 0,75%. Este procedimento foi continuado, sempre se separando 50mL de meio para

distribuir em tubos de ensaios adicionando-se 50mL de Sabouraud puro ao restante para

reduzir a concentração à metade. Desta forma obtivemos cerca de 12 tubos de ensaio

contendo meio Sabouraud de cada uma das concentrações do extrato (3%, 1,5%, 0,75%,

0,375%, 0,187% e 0,093%).

88

As suspensões salinas (NaCl em água destilada, 0,9%, estéril) de

Candida albicans

,

Cryptococcus neoformans

(fungos unicelulares) foram padronizadas de acordo com o grau 3

da escala de Mc Farland e suspensão padronizada de

Aspergillus niger

(fungo filamentoso).

Uma alíquota de 100

µ

L de cada uma destas suspensões foi semeada nos tubos com as

concentrações diferentes. Foram empregados quatro tubos de cada concentração para cada

suspensão microbiana. Os tubos correspondentes às leveduras foram incubados em estufa

microbiológica a 37ºC enquanto os tubos correspondentes ao fungo filamentoso foram

incubados em temperatura ambiente. O tempo de observação foi de 5 dias. Todo o

procedimento foi realizado em capela, em ambiente estéril.

Segundo Experimento

O extrato da planta (1g) foi diluído em 25mL de etanol. Foram preparados discos de

papel, a partir de círculos de pré-filtros semelhantes aos discos empregados nas provas de

antibiograma. O diâmetro foi de 1cm.

Cada disco foi embebido várias vezes com 50

µ

l do extrato em etanol. Grupos de 5 a

10 discos foram separados e receberam cargas diferentes de aplicações do extrato.

Considerando que cada alíquota de 50

µ

l corresponde a 2mg do extrato, os discos receberam

desde 4 aplicações (correspondente a 8mg) até 30mg.

Numa segunda etapa, foram preparadas placas de Petri contendo meio Sabouraud

dextrose (3%). As placas em quadruplicata foram semeadas com suspensões salinas

preparadas como no experimento anterior para os seguintes microrganismos:

Candida

albicans

,

Cryptococcus neoformans

,

Malassezia pachydermatis

,

Rhodotorula spp

e

Aspergillus niger

. A suspensão de cada um destes microrganismos foi semeada na superfície

das placas de Petri, utilizando-se um swab estéril para cada uma das amostras, embebido nas

mesmas. Após esta etapa, os discos foram aplicados na superfície, utilizando-se uma pinça

estéril. Todo o procedimento foi realizado em capela de segurança, na proximidade de bico de

Bunsen.

As placas foram incubadas em temperatura de 37ºC (exceção para

Aspergillus niger

)

por cinco dias com observações a partir das primeiras 24 horas.

Para o primeiro experimento, os crescimentos foram evidentes já nas primeiras horas.

Observou-se o crescimento de todos os fungos submetidos ao teste em todos os tubos de todas

as concentrações após o tempo de observação de cinco dias.

No segundo experimento ocorreu crescimento em todas as placas e em nenhuma delas

foi observado qualquer halo que demonstrasse efeito inibitório do extrato aplicado nos discos

sobre os microrganismos cultivados. Os resultados obtidos devem ser aprofundados através de

diferentes métodos de avaliação.

5.5.3. Avaliação da Atividade Inseticida contra Musca domestica

Para este experimento utilizou-se a espécie

Musca domestica

(Diptera: Muscidae), que

é uma espécie de grande importância médico sanitária, pois atua como vetor mecânico e/ou

biológico de diversos agentes patogênicos, incluindo parasitos do homem e de animais

domésticos (BERNARDI

et al

., 2006). Estes insetos, por manterem um alto grau de

associação com o ambiente modificado pelo homem, são amplamente relacionados na

literatura como causadores de diversos danos e graves prejuízos, principalmente na pecuária

(GUIMARÃES

et al.

, 1983). Estes dados têm motivado diversos grupos pela busca de novos

métodos aplicáveis ao controle químico como alternativo aos inseticidas sintéticos

comumente utilizados no controle destas pragas.

Os insetos utilizados neste experimento foram oriundos de colônia formada por

moscas coletadas no Campus da UFRRJ, e seu desenvolvimento pré-embrionário ocorreu em

um meio composto por ração concentrada contendo 23% de proteína bruta, farelo de arroz e

89

água, na relação 1:1:2. Os insetos tratados representam o nível de resistência da comunidade a

inseticidas comumente utilizados no controle desta mosca. Os insetos avaliados foram da

geração F1 a espécie

Musca domestica

.

Após o nascimento os testes foram feitos em até 48 horas da emergência dos insetos.

As frações e extratos foram diluídos em 1 ml de Acetona PA. Foram utilizados 20 mg da

fração OSPGMCp-2a e aproximadamente 50mg dos demais extratos e frações. Os insetos

foram retirados das gaiolas e anestesiados com CO

2

para manipulação e separação de machos

e fêmeas, e realização da aplicação de 0,5

µ

l da solução estoque formada de cada amostra. A

aplicação foi feita sobre o tórax com auxílio de uma micro-seringa automática de 25

µ

l. Após

a aplicação os insetos foram transferidos para frascos forrados com papel filtro, fechados com

gaze estéril presa com liga elástica. Cada frasco recebeu 20 insetos, sendo cada amostra

avaliada em 20 machos e 20 fêmeas. Também foram realizados testes controle com a

aplicação somente do solvente. A leitura foi realizada em 24 horas (

tabela 8,

pág. 90) e 48

horas (

tabela 9,

pág. 90), e nestas são contados os insetos mortos. Durante as avaliações os

insetos foram alimentados com solução de glicose a 20% através de algodão embebido sobre

a gaze.

Considerando os resultados apresentados, observa-se que o extrato metanólico bruto

(

OspGM

) e frações do extrato,

OSPGMCp

e

OSPGMM

apresentaram pouca atividade

inseticida frente a

Musca domestica

. As frações

OSPGMCp2a

e

OSPGMC

apresentaram

maior atividade inseticida. Estas frações são ricas em flavonóides, no qual foram isoladas a

7”-O-metilagatisflavona e agatisflavona. Essas observações foram feitas em 24h (

tabela 8

) e

48h (

tabela 9

). De acordo com a maior atividade inseticida presente nas frações ricas em

flavonóides, sugerimos que estas sejam as substâncias responsáveis por esta atividade.

90

Tabela 8 – Mortalidade (%) de amostras vegetais sobre Musca domestica após 24 horas da

aplicação.

Mortalidade Substância

♀ ♂ ♀ + ♂

OSPGD 0% 0% 0%

OSPGDH 0% 0% 0%

OSPGDC 0% 0% 0%

OSPGDM 0% 0% 0%

OSPGM 0% 10% 5%

OSPGMC

0% 20% 10%

OSPGMCp 10% 0% 5%

OSPGMCp2a 10% 20% 15%

OSPGMM 0% 0% 0%

OSPGMMp 10% 0% 5%

CONTROLE 0% 0% 0%

Tabela 9 – Mortalidade (%) de amostras vegetais sobre Musca domestica após 48 horas da

aplicação.

Mortalidade Substância

♀ ♂ ♀ + ♂

OSPGD 10% 10% 10%

OSPGDH 10% 20% 15%

OSPGDC 0% 10% 5%

OSPGDM 0% 0% 0%

OSPGM 10% 10% 10%

OSPGMC

10% 20% 15%

OSPGMCp 10% 0% 5%

OSPGMCp2a 20% 30% 25%

OSPGMM 0% 10% 5%

OSPGMMp 10% 0% 5%

CONTROLE 0% 0% 0%

a) Peso médio de machos e fêmeas de M. domestica: 0,0105 e 0,0158 gramas.

b) OSPGD = Ouratea sp galhos dicloro; OSPGDH = Ouratea sp galhos dicloro hexano;

OSPGDC=Ouratea sp galhos dicloro clorofórmio; OSPGDM = Ouratea sp galhos dicloro metanol;

OSPGM = Ouratea sp galhos metanol; OSPGMC = Ouratea sp galhos metanol clorofórmio;

OSPGMCp = Ouratea sp galhos metanol clorofórmio precipitado; OSPGMCp2a = Ouratea sp galhos

metanol clorofórmio precipitado fração 2 a; OSPGMM = Ouratea sp galhos metanol metanol;

OSPGMMp = Ouratea sp galhos metanol metanol precipitado.

5.5.4. Avaliação da toxidez do extrato metanólico em Mus musculus.

Foram utilizados camundongos (

Mus musculus)

albinos

swiss

machos e fêmeas

pesando entre 30 e 35 g fornecidos pelo Biotério do Departamento de Ciências Fisiológicas

(IB) da Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro. Os animais foram mantidos em

condições controladas de temperatura (23 ± 2

o

C) e iluminação (ciclo claro/escuro de 12 horas)

com livre acesso à água e ração.

Determinação da Dose Letal Aproximada (DLA)

Neste ensaio foi utilizado apenas um animal tratado com o extrato a cada dose

conforme proposto por Kennedy et al em 1986. O extrato metanólico de

O. hexasperma

var.

planchonii

Engl. foi solubilizado em solução salina 0,9 % acrescido de 1% de Tween 80 e

administrado nos camundongos pelas vias oral ou subcutânea. O teste se iniciou com uma

91

dose bastante baixa (10 mg/kg) e a próxima dose foi adicionada de 50% do valor da anterior e

assim sucessivamente (o que na prática corresponde a uma chance muita remota de que uma

determinada dose mate um animal e sua subseqüente falhe em fazê-lo), até que a menor dose

na seqüência considerada, induzisse a morte do animal. Os animais foram observados nos

tempos de 15 min, 30 min, 60 min, 24 h e 1 semana após a administração do extrato.

A administração do extrato tanto pelas vias oral quanto subcutânea não gerou sinais de

toxicidade aguda nos camundongos. Doses de até 5g/kg não ocasionaram a morte dos animais

em até uma semana após a administração em dose única do extrato, demonstrando a baixa

toxicidade aguda do extrato.

O extrato apresenta baixa toxicidade quando administrado em dose única. Estudos

com doses repetidas, subcrônicos e crônicos são necessários para complementar a avaliação

toxicológica em função do potencial antitumoral da planta e conseqüente necessidade de uso

crônico. Estudos para avaliar a toxicidade

in vivo

da fração enriquecida com biflavonóides

também são necessários em função dos relatos de toxicidade destas substâncias.

92

CONCLUSÕES

A prospecção química do extrato metanólico de

Ouratea hexasperma

var.

planchonii

Engl.

revelou testes positivos para as classes de substâncias: alcalóides, saponinas, esteróides,

depsídio e depsidonas, flavonóides, catequinas, quinonas, açúcares redutores, sacarídeos e

taninos.

Com os extratos obtidos dos galhos de

Ouratea hexasperma

var

. planchonii

Engl

.

foi

realizado o fracionamento, a partir dessas frações foram isolados compostos alifáticos, ácidos

alifáticos, esteróides (sitoesterol, estigmasterol e campesterol), terpenos (lupeol e

α

-amirina e

β

-amirina) e biflavonas (7”-O-metilagatisflavona e agatisflavona) e sitoesterol glicosilado.

Através de análise utilizando CLAE-EM permitiu-se detectar a presença de outros

compostos presentes no extrato, como metil-vitexina, orientina, ramnosil-triidroxiflavona,

agatisflavona, metil-agatisflavona, dimetil-agatisflavona, metil-diidroxiflavon, e

glicopiranosil-prenil-diidroxi-flavonol, embora necessitem de confirmação.

Através dos resultados obtidos neste trabalho e levantamento de dados da literatura

sobre as substãncias encontradas no gênero Ouratea, foi possível concluir que o biflavonóide

7”-O-metilagatisflavona serve como um marcador quimiossistemático do Gênero Ouratea e

que as variedades de

O. hexasperma

(St. Hil.) Bail e

O. hexasperma

var.

planchonii

Engl. tem

poucas diferenças morfológicas e quimicamente podem ser incluídas como uma única

espécie.

Os testes de atividades biológicas realizados foram os de atividade antibacteriana,

antifúngica, inseticida e de toxicidade utilizando os extratos e frações de

Ouratea hexasperma

var.

planchonii

Engl

.

Com os ensaios de atividade antimicrobiana, o extrato metanólico inibiu

o crescimento de

Escherichia coli

e

Staphylococcus aureus

. Este extrato e a fração

clorofórmica do extrato metanólico foi inativo para os fungos avaliados. Com os ensaios de

atividade contra

Musca doméstica

, os extratos e frações não apresentaram atividade

significativa, as frações que apresentaram maior atividade foi a fração que contém a mistura

dos biflavonóides 7”-O-metilagatisflavona e agatisflavona e as frações metanólicas que

também contém essas substâncias. Ensaios adicionais deverão ser realizados afim de

confirmar esses resultados.

Com os ensaios de toxicidade, o extrato apresentou baixa toxicidade quando

administrado em dose única. Estudos para avaliar a toxicidade

in vivo

da fração enriquecida

com biflavonóides também são necessários em função dos relatos de toxicidade destas

substâncias.

93

REFERÊNCIAS

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(Ochnaceae).

Department of Organic Chemistry, Faculty of Science, University of

Yaounde I, Yaounde, Cameroon.

Biochemical Systematics and Ecology

(2007), 35(4),

255-256.

UFRRJ

INSTITUTO DE CIÊNCIAS EXATAS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA

DISSERTAÇÃO

Estudo Químico e Atividades Biológicas de Ouratea

hexasperma var. planchonii Engl. (Ochnaceae).

RENATA DUARTE FERNANDES

2008

ii

UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DO RIO DE JANEIRO

INSTITUTO DE CIÊNCIAS EXATA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA

ESTUDO QUÍMICO E ATIVIDADES BIOLÓGICAS DE

Ouratea hexasperma var. planchonii Engl. (Ochnaceae).

RENATA DUARTE FERNANDES

Sob a Orientação do Professor

Dr. Mário Geraldo de Carvalho

Dissertação submetida como requisito

parcial para a obtenção do grau de

Mestre em Ciências, no Programa de

Pós-Graduação em Química, Área de

Concentração em Química de Produtos

Naturais

Seropédica, RJ

Julho de 2008

iii

UFRRJ / Biblioteca Central / Divisão de Processamentos Técnicos

547

F363e

T

Fernandes, Renata Duarte, 1977-

Estudo químico e atividades

biológicas de Ouratea hexasperma

var. planchonii Engl. (Ochnaceae) /

Renata Duarte Fernandes – 2008.

118f. : il.

Orientador: Mário Geraldo de

Carvalho.

Dissertação (Mestrado) –

Universidade Federal Rural do Rio

de Janeiro, Programa de Pós-

Graduação em Química.

Bibliografia: f. 93-101.

1. Química orgânica - Teses. 2.

Ouratea - Análise – Teses. 3.

Ochnaceae – Análise - Teses. 4.

Produtos naturais – Teses. I.

Carvalho, Mário Geraldo de, 1952- .

II. Universidade Federal Rural do

Rio de Janeiro. Programa de Pós-

Graduação em Química. III. Título.

Bibliotecário: _______________________________ Data: ___/___/______

iv

v

Ao meu marido Cristiano de Deus Correa e

À minha mãe Fátima Maria Duarte.

vi

AGRADECIMENTOS

A Deus;

Ao meu marido Cristiano pelo amor, compreensão, incentivo, paciência e carinho;

À minha mãe Fátima por acreditar em meus sonhos e me incentivar sempre;

Aos meus irmãos Rodrigo e Robson pelo incentivo e ajuda;

À minha vovó Maria dos Anjos, aos meus tios pelo carinho e alegria em cada vitória

minha, aos meus primos e meu afilhado;

À minha amiga de todas as horas Juliana Moura;

Ao Professor Dr. Mário Geraldo de Carvalho pela orientação, ensinamentos, atenção e

paciência;

Aos amigos do LQPN-UFRuralRJ: Eduardo (Ceará), Delcí, Marcelo, Maritza,

Virgínia, Luciano, Luiz Roberto (Pilha), Mário Sérgio, pela amizade e pelos momentos de

descontração que passamos juntos e à nova integrante da equipe Roberta pelas palavras de

incentivo;

Aos alunos de iniciação científica e estagiários do LQPN-UFRuralRJ: Luciane,

Claudiana, Daniel, Letícia, Raquel, Tatiane, Verônica, Débora, Ana Paula, Aline e Aline’ pela

amizade, convivência agradável e auxílio durante a realização deste trabalho.

A todos os colegas do PPGQO, sem exceção, pelo bom relacionamento durante este

período; em especial aos amigos Ari, Cláudio, Janaína, Kênia, Ana Paula, Andréa Janaína,

Andréa Rose, Willian, Camilla, Alessandra, André Vinícius, Letícia, Vinícius, Suzana e

Raquel; e à Regina pela amizade, incentivo e apoio;

Aos professores do PPGQO pela formação e evolução profissional;

À professora Dra. Rosane Nora Castro pelos ensinamentos e auxílio nas análises no

HPLC;

Aos funcionários do ICE-UFRRJ, Maurício, Welisson, Carlão, Eli, Fábio, Francês,

Osmar, Rui, Aldir e André;

À professora Dra. Maria de Fátima Agra (LTF-UFPB) pela coleta e identificação do

material vegetal;

Ao Prof Dr. Edilberto Rocha Silveira do (CENAUREMN/UFC), pela obtenção dos

espectros a 500 MHz;

À professora Dra. Alceni Augusta Werle (UFOP) pelas análises no CLAE-EM;

Aos professores Dra. Miliane Moreira Soares de Souza e Dr. Francisco de Assis

Baroni (IV/UFRRJ) pelos ensaios de atividade antibacteriana e antifúngico;

Aos professores Dr. Fábio Fagundes Rocha e Frederico Argollo Vanderlinde do

Departamento de Ciências Fisiológicas (IB/UFRRJ) pelo teste de toxicidade;

Ao mestrando Élio Barbieri Departamento de Parasitologia Animal-UFRRJ pelo

ensaio de atividade inseticida;

À professora Denise Monte Braz do Departamento de Botânica da UFRRJ, pela

atenção e auxílio na classificação botânica;

Às meninas do alojamento da graduação F1-32 Tati, Marcele, Dailane, Camila,

Wilma, Germana, Joyce e Geovana pela amizade, momentos de estudos e de descontração;

Às meninas do alojamento da Pós-graduação Janaína, Vanessa, Renata, Michelle,

Daniele, Patrícia, Sabrina, Silvana, Eliane, Kênia, Fabiana, Fernanda, Daniela, Fabíola, Ana

Luisa, e Veridiana pelo acolhimento, amizade e bons momentos;

Desde já, à banca examinadora, pelas sugestões e correções sugeridas a este trabalho;

À UFRRJ, por mais uma oportunidade e acolhimento;

A CNPQ pela concessão da bolsa de estudos;

A todos que, de algum modo, me ajudaram na realização deste trabalho.

vii

Quando alguém encontra seu caminho,

precisa ter coragem suficiente

para dar passos errados.

As decepções, as derrotas, o desânimo

são ferramentas que Deus

utiliza para mostrar a estrada.

Paulo Coelho

viii

RESUMO

FERNANDES, Renata Duarte.

Estudo Químico e Avaliação de Atividades

Biológicas de Ouratea hexasperma var. planchonii Engl

. 2008 101f. Dissertação (Mestrado

em Química Orgânica). Instituto de Ciências Exatas, Departamento de Química, Universidade

Federal Rural do Rio de Janeiro, Seropédica, RJ, 2008.

Os metabólitos especiais isolados de galhos de

Ouratea hexasperma

var

. planchonii

Engl., permitiram a comparação com os constituintes de

O. hexasperma

(St. Hil.) para

confirmar a classificação botânica da mesma. Neste trabalho também foram avaliadas

algumas atividades biológicas.

As analises das frações obtidas do fracionamento com partição com solventes e

técnicas cromatográficas dos extratos preparados com diclorometano e metanol dos galhos de

Ouratea hexasperma

var

. planchonii

Engl. conduziu à identificação de alguns constituintes

químicos. Identificaram-se misturas de hidrocarbonetos alifáticos, ácidos alilfáticos, de

esteróides (sitosterol, estigmasterol e campesterol), além de três triterpenos, lupeol,

α

e

β

amirina, e os flavonóides (7”-O-metilagatisflavona e agatisflavona) e sitosterol-3-O-

β

-D-

glicopiranosideo. As estruturas foram determinadas através de análise dos dados

espectrométricos de IV, RMN de

1

H e

13

C uni e bidimensional e massas, além de comparação

com dados da literatura. A técnica CLAE-EM foi utilizada na análise adicional de duas

frações contendo dois biflavonóides e alguns constituintes adicionais. Esta análise permitiu

propor a presença de metil-vitexina, orientina, metil-diidroxiflavona, glicopiranosil-flavonas,

dimetilagatisflavona, glicopiranosil-prenil-flavonol além da confirmação das duas biflavonas

identificadas inicialmente.

Os extratos dos galhos de

Ouratea hexasperma

var

. planchonii

Engl. foram

submetidos à avaliação de atividade antibacteriana, antifúngica, inseticida e de toxidez. O

crescimento de

Escherichia coli

e

Staphylococcus aureus

reduziu com extrato metanólico. As

frações contendo as biflavonas foram parcialmente ativas como inseticida contra

Musca

domestica

. Os extratos apresentaram baixa toxicidade em dose única.

Palavras–chave: Ouratea hexasperma,

flavonóides, atividades biológicas.

ix

ABSTRACT

FERNANDES, Renata Duarte.

Phytochemical

Study and Biological Activities

extracts from the branches of Ouratea hexasperma var. planchonii Engl.

2008 103f.

Dissertation (Magister Scientiae in Organic Chemistry), Instituto de Ciências Exatas,

Departamento de Química, Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, Seropédica, RJ,

2008.

The specials metabolites isolated from the branches of the

Ouratea hexasperma

var.

planchonii

Engl., allowing to the comparison with the chemical constituents from variety

Ouratea hexasperma

(St. Hil.) to confirm the botanical classification. Some biological

activities were evaluated.

The analysis of the fractions from solvents and chromatographic fractionation of the

dichloromethane and methanolic extracts from the branches of

Ouratea hexasperma

var

.

planchonii

Engl. led to the identification of some chemical constituents. This procedure led to

identification of aliphatics compounds mixture, aliphatic alcohol mixture, steroids mixture

(sitosterol, stigmasterol and campesterol), three triterpenes, lupeol e

α

-amiryn e

β

-amiryn, and

the biflavonoids (7”-O-methylagathisflavone and agathisflavone) and sitosterol-3-O-

β

-D-

glycopyranoside. The structures were determined by IR, de

1

H (1D e 2D) e

13

C (BBD e

DEPT) NMR spectral data analysis and comparison with literature values. The HPLC-MS

were used in the analysis of two fractions containing the these two biflavones and some

additional compounds. This analysis led us to identify the presence of methyl-vitexin,

orientin, methyl-dihydroxyflavone, glycopiranosil-flavones, dimethylagathisflavone and

glycopyranosil-prenyl-dihydroxyflavonol besides the confirmation of these two biflavonoids.

The extracts from the branches of

Ouratea hexasperma

var

. planchonii

Engl. were

submitted on evaluations of the antibacterial, antifungal, insecticide and toxicity activities.

The

Escherichia coli

and

Staphylococcus aureus

growth was inhibited with methanolic

extract. The fractions containing the biflavonoids were partially active as insecticide against

Musca domestica

. The extracts presented low toxicity on unique dose.

Key words

:

Ouratea hexasperma,

flavonoids, biologicals activities.

x

LISTA DE FIGURAS

Figura 1: Triflavonóides isolados no Gênero

Ochna

3

Figura 2: Biflavonóides e dímeros de chalconas isolados dos Gêneros

Ochna e Lophira

. 4

Figura 3: Flavonóides e chalconas isolados do gênero

Luxemburgia

5

Figura 4:

Flavonóides isolados do Gênero

Ouratea

7

Figura 5:

Outras classes de substâncias isoladas nos gêneros Ouratea. 9

Figura 6:

Diferenças morfológicas entre as folhas de

Ouratea hexasperma.

10

Figura 7: Dímeros de flavonóides 11

Figura 8: Constituintes químicos isolados neste trabalho 17

Figura 9:

Mecanismo proposto da reação de metilação com diazometano.

23

Figura 10: Espectro de IV do material alifático de

O. hexasperma

var.

planchonii

Engl

.

. 25

Figura 11: Espectro de RMN de

1

H (200 MHz, CDCl

3

) do material alifático. 26

Figura 12: Espectro de IV de

1

27

Figura 13: Espetro de RMN de

1

H (200 MHz, CDCl

3

) de

1

. 28

Figura 14: Cromatograma de

1

. 28

Figura 15: Espectro de massas de

1

29

Figura 16: RMN de

1

H (200 MHz, CDCl

3

) da mistura de esteróides,

2

(a, b e c) 30

Figura 17: Cromatograma da mistura dos esteróides

2

(a, b e c) 30

Figura 18a : Espetro de massas de

2 (a)

comparado com a biblioteca do aparelho. 31

Figura 18b : Espetro de massas de

2 (b)

comparado com a biblioteca do aparelho. 32

Figura 18c : Espetro de massas de

2 (c)

comparado com a biblioteca do aparelho. 33

Figura 19: Espectro de RMN de

1

H (200 MHz, CDCl

3

) de

3

(a, b e c). 34

Figura 20: Espetro de massas de

3

(a) comparado com a biblioteca do aparelho. 35

Figura 21: Espetro de massas de

3

(b e c) comparado com a biblioteca do aparelho 35

Figura 22: Espectro de IV de

4

37

Figura 23: Espectro de RMN de

1

H (500 MHz , D

3

CCOCD

3

) de

4

39

Figura 24: Espectro de

1

H-

1

H-COSY - (500 MHz, D

3

CCOCD

3

) de

4

. 40

Figura 25: Espectro de

1

H-

1

H-NOESY - (500 MHz, D

3

CCOCD

3

) de

4.

41

xi

Figura 26: Ampliação do Espectro de

1

H-

1

H-NOESY - (500 MHz, D

3

CCOCD

3

) de

4.

42

Figura 27: Ampliação do Espectro de

1

H-

1

H-NOESY - (500 MHz, D

3

CCOCD

3

) de

4.

43

Figura 28: RMN de C (125 MHz, D

3

CCOCD

3

) da substância

4

44

Figura 29: Ampliação(180-187 ppm) do Espectro de RMN de

13

C (125 MHz,

D

3

CCOCD

3

) da substância

4

44

Figura 30: Ampliação (156-166 ppm) do Espectro de RMN de

13

C (125 MHz,

D

3

CCOCD

3

) da substância

4

45

Figura 31: Espectro de HMBC (D

3

CCOCD

3

) da substância

4.

45

Figura 32: Ampliação do espectro de HMBC (D

3

CCOCD

3

) da substância

4.

46

Figura 33: Ampliação do espectro de HMBC (D

3

CCOCD

3

) da substância

4

46

Figura 34: Ampliação do espectro de HMBC (D

3

CCOCD

3

) da substância

4.

47

Figura 35: Ampliação do espectro de HMBC (D

3

CCOCD

3

) da substância

4.

47

Figura 36: Ampliação do espectro de HMBC (D

3

CCOCD

3

) da substância

4

48

Figura 37: Ampliação do espectro de HMBC (D

3

CCOCD

3

) da substância

4

48

Figura 38: Ampliação do espectro de HMBC (D

3

CCOCD

3

) da substância

4

49

Figura 39: Espectro de HSQC (D

3

CCOCD

3

) da substância

4

50

Figura 40: Espectro de IV de

5.

51

Figura 41: Espectro de RMN de

1

H (200MHz, D

3

CCOCD

3

) da mistura dos biflavonóides

4 e

5.

53

Figura 42:

Ampliação do espectro (6.0-8.5 ppm) de RMN de

1

H (200MHz, D

3

CCOCD

3

)

da mistura dos biflavonóides

4 e 5.

53

Figura 43:

Espectro de RMN de

13

C (50 MHz, D

3

CCOCD

3

) da mistura dos biflavonóides

4 e 5.

54

Figura 44: Ampliação do espectro de RMN de

1

H (500 MHz , D

3

CCOCD

3

) do derivado

4a.

54

Figura 45:

Cromatograma obtido em CLAE de

4

55

Figura 46:

Cromatograma obtido em CLAE da mistura

4 e 5.

55

Figura 47: Espectro de RMN de

1

H (500 MHz , D

3

CCOCD

3

) do derivado

4a.

58

Figura 48: Ampliação do espectro de RMN de

1

H (500 MHz , D

3

CCOCD

3

) do derivado

4a.

59

Figura 49: Ampliação do espectro de RMN de

1

H (500 MHz , D

3

CCOCD

3

) do derivado

4a.

.

59

xii

Figura 50: Espectro de

1

H-

1

H-COSY (500MHz, D

3

CCOD

3

) de

4a

60

Figura 51: Espectro de NOESY de

4a.

60

Figura 52: Ampliação do espectro de NOESY de

4a.

61

Figura 53: Espetro de

13

C (125MHZ, D

3

CCOD

3

) de

4a

. 61

Figura 54:

Ampliação do espectro de

13

C (125MHZ, D

3

CCOCD

3

)de

4a.

62

Figura 55: Espectro de HMBC (D

3

COD

3

) da substância

4

. 63

Figura 56: Espectro de HSQC (D

3

COD

3

) da substância

4.

64

Figura 57: Espectro de IV da substância

6

66

Figura 58: RMN de

1

H da substância

6

68

Figura 59: RMN de

13

C da substância

6

69

Figura 60: Ampliação do RMN de

13

C(125 Hz, DMSO-d

6

) da substância

6

70

Figura 61: CLAE da fração OSPGMC. 71

Figura 62: CLAE da fração OSPMC1-6p 72

Figura 63: RMN de

1

H (200MHz, D

3

CCOCD

3

) da fração OSPGMC 73

Figura 64: RMN de

1

H (200MHz, D

3

CCOCD

3

) da fração OSPGMC1.6p 73

Figura 65: Identificação dos valores de

m/z

para os picos detectados no CLAE-EM da

fração OSPGMC

74

Figura 66: Estruturas propostas através da análise CLAE-EM na fração OSPGC. 76

Figura 67: Identificação dos valores de

m/z

para os picos detectados no CLAE-EM da

fração OSPGMC1.6p

77

Figura 68: Estruturas propostas através da análise CLAE-EM na fração OSPGCM1.6p. 79

xiii

LISTA DE TABELAS

Tabela 1: Ocorrência de Agatisflavonas e derivados em espécies vegetais. 12

Tabela 2:

Divisões Botânicas das espécies que onde há ocorrência de agatisflavonas e

derivados.

15

Tabela 3: Registro dos resultados da prospecção química do extrato metanólico de

O.

hexasperma

var.

planchonii

Engl.

24

Tabela 4. Dados de RMN

1

H e

13

C (D

3

CCOCD

3

,

1

H e D

3

CSOCD

3

,

13

C) da substâncias 4.

38

Tabela 5. Dados de RMN

1

H (200 MHz) e

13

C (50 MHz) em Metanol-D, (AGRAWAL,

1989) da substância 5 (agatisflavona).

52

Tabela 6: Dados de RMN

1

H (200 MHz) e

13

C (50 MHz) da substância 4 (MOREIRA

et

al

., 1999) com o derivado 4a.

57

Tabela 7: Dados de RMN de

1

H e

13

C da substância 6 67

Tabela 8 – Mortalidade (%) de amostras vegetais sobre

Musca domestica

após 24 horas

da aplicação.

90

Tabela 9 – Mortalidade (%) de amostras vegetais sobre

Musca domestica

após 48 horas

da aplicação.

90

xiv

LISTA DE ESQUEMAS

Esquema 1: Marcha para o isolamento das substâncias dos galhos de

Ouratea

hexasperma

var.

planchonii

engl.

21

Esquema 2: Propostas de estruturas compatíveis com os valores de

m/z

detectados na

análise de CLAE-EM

75

Esquema 3: Propostas de estruturas compatíveis com os valores de

m/z

detectados na

análise de CLAE-EM

78

Esquema 4: Biossíntese de ácidos graxos (adaptado de DEWICK, 2002) 80

Esquema 5: Proposta de a-oxidações em aácidos graxos (HARWOOD, 1997).

81

Esquema 6: Proposta biogenética para os esteróides

(Adaptado de MANN, 1994). 82

Esquema 7: Proposta biogenética para os terpenos lupeol e

α

-amirina. (Adaptado de

MANN, 1994; DEWICK, 2002).

83

Esquema 8: Proposta biogenética para as flavonas

(DEWICK, 2002) e biflavonas

(MOREIRA, 1994)

84

xv

LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS

1D Unidimensional

2D Bidimensional

δ

Η

Deslocamento Químico de Hidrogênio (ppm)

δ

C

Deslocamento Químico de Carbono (ppm)

ν

Estiramento

δ

Deslocamento químico

Acetona-D

6

Acetona deuterada

CCDA Cromatografia em Camada Delgada Analítica

CCF Cromatografia em Camada Fina

CCP Cromatografia em Camada Preparativa

CG-EM Cromatografia em Fase Gasosa Acoplada a Espectrometria de Massas

CLAE Cromatografia Líquida de Alta Eficiência

cm Centímetro

COSY COrrelation SpectroscopY

d Dubleto

dd Duplo Dubleto

DMSO-d

6

Dimetilsulfóxido deuterado

EM Espectrometria de Massas

HMBC Heteronuclear Multiple-Bond Correlation

HSQC Heteronuclear Single Quantum Coherence

Hz Hertz

IV Infravermelho

J

Constante de acoplamento em hertz

λ

comprimento de onda

µ

m micrômetro

m

multipleto

M

+.

pico do íon molecular positivo

MHz Mega Hertz

m/z

relação massa/carga

nm nanómetro

OspGD Extrato diclometano dos galhos de

O. hexasperma

var.

planchonii

Engl.

OspGM Extrato metanólico dos galhos de

O. hexasperma

var.

planchonii

Engl.

NOESY Nuclear Overhauser Experiment Spectroscopy

P.F. ponto de fusão

ppm parte por milhão

q

quarteto

RF Fator de Retenção

RMN

1

H Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio

RMN

13

C Ressonância Magnética Nuclear de Carbono-13

s

singleto

sl

singleto largo

t

tripleto

TR Tempo de Retenção

TMS tetrametilsilano

OBS: As abreviaturas e símbolos utilizados neste trabalho e que não constam nesta relação,

encontram-se descritas no texto ou são convenções adotadas universalmente.

xvi

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO 1

Objetivos 2

2. REVISÃO DE LITERATURA 3

2.1. Generalidades Sobre a Família Ochnaceae e o Gênero

Ouratea

3

2.2 Classificação botânica de

O. hexasperma

(St. Hill) Bail

var.

hexasperma e O.

hexasperma

var

.

planchonii

Engl

.

9

2.3. Estudo Químico Realizado com

Ouratea hexasperma

(St. Hil.) Bail 10

2.4. Biflavonóides 10

2.4.1. Agatisflavona e derivados 12

3. CONSTITUINTES QUÍMICOS ISOLADOS DE

O. hexasperma

var.

planchonii

Engl. 16

4. PARTE EXPERIMENTAL 18

4.1. Equipamentos e Reagentes 18

4.2. Material vegetal 18

4.3. Obtenção dos extratos brutos 19

4.4. Prospecção Química do Extrato Metanólico 19

4.5. Isolamento e Purificação dos Constituintes dos Galhos de

O. hexasperma

var.

planchonii

Engl.

19

4.5.1. Extrato com diclorometano 19

4.5.2. Extrato com metanol 20

4.6. Derivação 22

4.6.1. Metilação com diazometano 22

5.

R

ESULTADOS E

D

ISCUSSÃO

24

5.1. Prospecção Química do extrato metanólico 24

5.2. Determinação Estrutural dos Constituintes Isolados de O

uratea hexasperma

var

.

planchonii

Engl.

25

5.2.1. Alcanos 25

5.2.2 Substância

1

27

5.2.3. Substâncias

2 (a, b e c)

29

xvii

5.2.4. Substâncias

3 (a, b e c)

33

5.2.5. Substância

4

36

5.2.6. Substância

5

50

5.2.7 Derivado

4a

56

5.2.8. Substância

6

65

5.3. ANÁLISE COM CLAE DAS FRAÇÕES

OSPGMC

E

OSPMC-16P.

71

5.4. Propostas Biossintéticas para os constituintes isolados de

Ouratea hexasperma

var

.

planchonii

Engl.

80

5.4.1. Ácidos graxos 80

5.4.2. Esteróides

82

5.4.3. Terpenos 83

5.4.4. Biflavonóides

84

5.5. ENSAIOS BIOLÓGICOS 85

5.5.1. Avaliação da Atividade Antimicrobiana do Extrato Metanólico de

Ouratea

hexasperma

var

. planchonii

Engl

.

85

5.5.2. Verificação de atividade antifúngica do Extrato Metanólico de

Ouratea

hexasperma

var.

planchonii

Engl.

86

5.5.3. Avaliação da Atividade Inseticida contra

Musca doméstica

88

5.5.4. Avaliação da toxidez do extrato metanólico em

Mus musculus.