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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL
ESTUDOS BIOQUÍMICOS EM MODELO
EXPERIMENTAL DE DEFICIÊNCIA DE SULFITO
OXIDASE
FÁBRIA CHIARANI
ORIENTADORA
Prof
a
. Dr
a
. Angela Teresinha de Souza Wyse
CO-ORIENTADOR
Prof. Dr. Carlos Alexandre Netto
Dissertação apresentada ao Curso de Pós-Graduação em Ciências Biológicas-
Bioquímica da Universidade Federal do Rio Grande do Sul como requisito parcial à
obtenção do grau de Mestre em Bioquímica.
Porto Alegre, 2008
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Livros Grátis
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Milhares de livros grátis para download.
II
Dedicação
Dedico esta dissertação de mestrado a
uma pessoa muito especial, Leonardo,
pelo apoio, companheirismo e dedicação.
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III
Agradecimentos
• À professora orientadora Angela T. S. Wyse pela orientação, oportunidade e
incentivo.
• Ao professor Carlos Alexandre Netto pela co-orientação
• Aos colegas e professores dos laboratórios 34, 36 e 38 , em especial ao professor
Clóvis M. D. Wannmacher pela amizade e ensinamentos e às doutorandas Caren
S. Bavaresco, Cristiane Matté, Daniela Delwing e Débora Delwing.
• Ao curso de Pós-graduação
• Aos funcionários, professores e amigos do departamento de Bioquímica.
• Aos meus pais, Ivo Chiarani e Marisa T. Chiarani.
• Aos colegas de trabalho da farmácia do Hospital Nossa Senhora da Conceição
pelo incentivo.
• À todos os amigos que torceram por mim.
• À Deus por ter me dado forças para alcançar meus objetivos.
IV
Resumo
A deficiência de sulfito oxidase é uma doença autossômica recessiva que afeta o
metabolismo da metionina e cisteína. Os indivíduos afetados comumente apresentam,
no período neonatal, convulsões refratárias, retardo mental e desordens do movimento
cuja fisiopatologia é desconhecida. Os distúrbios no desenvolvimento e o dano cerebral
podem ocorrer como resultado do acúmulo tecidual de sulfito no cérebro. Os objetivos
deste estudo foram verificar os efeitos in vitro e in vivo do sulfito sobre alguns
parâmetros de estresse oxidativo (avaliação de lipoperoxidação e capacidade
antioxidante tecidual) e sobre a atividade da Na
+
, K
+
-ATPase em córtex cerebral,
estriado e hipocampo de ratos. Primeiramente, verificamos o efeito in vitro do sulfito
sobre o estresse oxidativo e a Na
+
, K
+
-ATPase em cérebro de ratos de 10 e 60 dias.
Posteriormente, nos estudos in vivo, investigamos o efeito da administração
intracerebroventricular de sulfito sobre os parâmetros estudados in vitro. Os estudos in
vitro demonstraram uma ação direta do sulfito (500µM) na indução de estresse
oxidativo verificada pela redução na atividade da catalase e aumento da peroxidação
lipídica, enquanto que nos estudos in vivo o sulfito não alterou a atividade das enzimas
antioxidantes, TRAP ou TBARS. Tanto nos estudos in vitro como in vivo, o sulfito
mostrou-se incapaz de alterar a atividade da Na
+
,K
+
-ATPase. Nossos resultados, em
conjunto, não excluem o potencial efeito neurotóxico do sulfito na fisiopatologia da
doença. O conhecimento dos níveis deste composto no cérebro pode evidenciar além da
condição de estresse oxidativo, o comprometimento de outras vias metabólicas
importantes no funcionamento cerebral e podem apontar estratégias terapêuticas na
prevenção dos efeitos neurológicos da deficiência de sulfito oxidase.
V
Abstract
The sulfite oxidase deficiency is a rare autosomal recessive disorder affecting
the metabolism of methionine and cysteine. Affected individuals commonly present in
the neonatal period intractable seizures, mental retardation and movement disorder
which the physiopathology is unknown. The disturbed development and damage to the
brain might occur as a result of tissue accumulation of sulfite in the cerebro. The
objectives of this study was to investigate the in vitro and in vivo effects of sulfite on
some parameters of oxidative stress (lipoperoxidation and antioxidant capacity) and on
Na
+
, K
+
-ATPase activity in cerebral cortex, striatum and hippocampus from rats.
Firstly, we verified the in vitro effects of sulfite on oxidative stress and Na
+
, K
+
-
ATPase in brains from 10 and 60 days old rats. In the subsequent events, in the in vitro
studies, we investigated the effect of intracerebroventricular injection of sulfite on the
same parameters studied in vitro. The in vitro studies showed a direct action of sulfite
(500 µM) in the induction of oxidative stress through the decrease of catalase activity
and increase of peroxidation lipid, while the in vivo studies didn’t alter the antioxidants
enzyme activity, TRAP or TBARS. Both in vitro and in vivo studies, showed that sulfite
was incapable to disturb the Na
+
,K
+
-ATPase activity. Our results, together, don’t
exclude the potencial neurotoxic effect of sulfite in the physiopathology of disease. The
kwonledge of levels from this compound in the brain can show over there the oxidative
stress, the compromise of others metabolic patways important to the brain function and
can to lead to strategies therapeutics in the prevention of neurologic effects on sulfite
oxidase deficiency.
VI
Lista de Abreviaturas
ATP - Adenosina trifosfato
CAT - Catalase
Cys - Cisteína
DNA - ácido desoxirribonucléico
EIM - Erros inatos do metabolismo
GSH - Glutationa
GSH-Px - Glutationa peroxidase
Met - Metionina
NO - Óxido nítrico
ROS - espécies reativas de oxigênio
SNC - sistema nervoso central
SOD - Superóxido dismutase
SOX - Sulfito oxidase
TBARS - substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico
TRAP - capacidade antioxidante tecidual não enzimática
1
Sumário
Pág.
1. Introdução............................................................................................3
1.1 Erros Inatos do Metabolismo...............................................................3
1.2 Erros Inatos do Metabolismo dos Aminoácidos..................................4
1.2.1 Metabolismo dos Aminoácidos Sulfurosos ..................................5
1.3 Deficiência de sulfito Oxidase.............................................................7
1.3.1 Conceitos.......................................................................................7
1.3.2 Sinais e Sintomas...........................................................................7
1.3.3 Achados Laboratoriais...................................................................8
1.3.4 Patogênese.....................................................................................9
1.3.5 Tratamento....................................................................................10
1.4 Sulfito..................................................................................................10
1.5 Sulfito e danos cerebrais......................................................................11
1.6 Proteína Na
+
, K
+
- ATPase..................................................................15
1.7 Estresse Oxidativo...............................................................................17
2. Objetivos Gerais..................................................................................19
3. Cápitulo I – Artigo ..............................................................................20
4. Cápitulo II – Resultados não submetidos à publicação.......................30
4.1 Objetivos..............................................................................................30
4.2 Materiais e Métodos........................................................................... 30
4.2.1 Preparação Tecidual......................................................................31
4.2.2 Preparação da membrana plasmática sináptica.............................31
4.2.3 Dosagem da atividade da Na
+
, K
+
- ATPase.................................31
4.2.4 Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico (TBARS).............32
4.2.5 Capacidade Antioxidante Total não-enzimática (TRAP).............32
4.2.6 Determinação das enzimas antioxidantes.....................................33
4.2.7 Determinação das proteínas..........................................................34
2
4.2.8 Análise estatística........................................................................34
4.3 Resultados..........................................................................................34
5. Discussão...........................................................................................37
6. Conclusões..........................................................................................42
7. Perspectivas........................................................................................43
8. Referências Bibliográficas..................................................................44
9. Lista de Figuras e Tabelas..................................................................55
3
1. INTRODUÇÃO
1.1 Erros Inatos do Metabolismo
O termo Erros Inatos do Metabolismo (EIM) foi introduzido em 1908 por Achibald
Garrot. Os EIM representam um subgrupo de doenças genéticas de herança autossômica
recessiva caracterizadas por disfunção de uma proteína, geralmente uma enzima, envolvida
no metabolismo celular. Até o momento, aproximadamente 500 doenças diferentes foram
identificadas, representando um terço das doenças genéticas (El Husny & Fernandes-
Caldato, 2006). Os EIM apresentam-se relativamente freqüentes em seu conjunto, podendo
atingir 1 em 100 nascidos vivos (Scriver et al., 2001). Estes números podem representar
não só a raridade dos distúrbios, mas também, a subestimação dos diagnósticos. Estas
doenças podem afetar muitos órgãos, incluindo fígado, rim, coração e músculo, entretanto,
na maioria dos casos envolvem o sistema nervoso central e podem apresentar desordens
neurológicas. Os primeiros sintomas clínicos normalmente se manifestam na infância, mas
em alguns casos podem aparecer na adolescência ou idade adulta (Giugliani, 1988).
Os EIM podem ser classificados em três grupos:
Grupo I – Erros inatos do metabolismo intermediário que culminam com intoxicação aguda
ou crônica. Neste grupo estão incluídos os erros inatos do catabolismo dos aminoácidos e
as acidúrias orgânicas.
Grupo II – Deficiência na produção e utilização de energia pelos tecidos. Este grupo pode
ser dividido em defeito da cadeia respiratória mitocondrial e acidemias lácticas congênitas.
4
Grupo III – Distúrbios de síntese e catabolismo de moléculas complexas. Todas as doenças
de armazenamento lisossomal, doenças peroxissomais são enquadradas neste grupo
(Saudubray et al., 2006)
O tratamento dos EIM pode ser abordado de diferentes formas:
• reposição enzimática para substituir a enzima deficiente;
• estimulação da atividade enzimática residual ou caminhos alternativos através de
cofatores ou sobrecarga de substratos;
• redução da concentração do composto tóxico através de restrição dietética ou por
inibição da síntese deste composto ou ainda pelo uso de quelantes ou drogas;
• reposição do composto metabólico deficiente (Sedel et al., 2007).
1.2 Erros Inatos do Metabolismo dos Aminoácidos
As aminoacidopatias são distúrbios do metabolismo dos aminoácidos que
repercutem na sua degradação, síntese ou transporte. Estes distúrbios são causados pelo
funcionamento deficiente de uma enzima envolvida na conversão de um aminoácido em
outro ou na via catabólica desse aminoácido. Como conseqüência, há aumento da
concentração do precursor situado antes do bloqueio da via metabólica e diminuição da
concentração do produto após o bloqueio. Os mecanismos de produção das doenças podem
ser devido ao acúmulo de substrato ou à falta do produto. Essas doenças quando não
diagnosticadas e tratadas precocemente causam seqüelas graves (Scriver et al., 2001).
Dentre as aminoacidopatias, encontram-se as desordens metabólicas dos
aminoácidos contendo enxofre, que compreendem defeitos relacionados à rota de
metabolização da metionina.
5
1.2.1 Metabolismo dos Aminoácidos Sulfurosos
Os aminoácidos contendo enxofre, metionina (Met) e cisteína (Cys), são
normalmente consumidos como componentes da dieta protéica. Esses amimoácidos são
utilizados para síntese de proteínas e glutationa (GSH) ou catabolizados a taurina e sulfato.
A quantidade de aminoácidos sulfurosos catabolizados diariamente é essencialmente
equivalente a ingesta diária (Stipanuk, 2004).
O metabolismo da Met envolve duas vias: remetilação e transsulfuração. A via da
remetilação utiliza metilenotetrahidrofolato ou betaína como doadores de metila formando
o ciclo da metionina que tem a função de manter os níveis de metionina. Entretanto, a
seqüência de transsulfuração - cistationina sintase e cistationase - serve para catabolizar
irreversivelmente a metionina sintetizando cisteína. Os mecanismos de regulação dessas
vias dependem das propriedades cinéticas e do conteúdo tecidual enzimático, bem como da
concentração dos substratos e de outros efetores metabólicos (Finkelstein, 2007).
Várias doenças metabólicas da via de transsulfuração são conhecidas, entre elas
hipermetioninemia, homocistinúria, cistationinúria, beta-mercaptolactato cisteína
dissulfideúria e deficiência de sulfito oxidase (Haraguchi, 1992).
Este trabalho enfoca um EIM de aminoácidos sulfurosos denominado deficiência
de sulfito oxidase.
A sulfito oxidase (EC 1.8.2.1) (SOX) catalisa a reação de sulfito a sulfato, reação
terminal na degradação oxidativa dos aminoácidos contendo enxofre. A sulfito oxidase é
uma enzima intracelular localizada no espaço intermembrana da mitocôndria. O gene da
sulfito oxidase está localizado no cromossomo 12 na região 12q13.2-12q13.3. Essa enzima,
uma molibdohemoproteína de 466 aminoácidos, está envolvida na transferência de elétrons
6
do sulfito para a cadeia de transporte de elétrons via citocromo C (Johnson et al, 2002).
Dezesseis diferentes mutações patogênicas e 1 polimorfismo já foram identificados no gene
da sulfito oxidase (Tan et al, 2005).
A enzima sulfito oxidase exibe uma larga distribuição em tecidos de mamíferos, e
mostra diferenças significantes na atividade em uma mesma espécie. Tecidos como fígado,
rim e coração possuem alta atividade da sulfito oxidase, enquanto que o cérebro e o baço
apresentam atividade muito baixa dessa enzima. As células neuronais podem, portanto, ser
consideradas especialmente vulneráveis ao sulfito devido à baixa atividade da sulfito
oxidase (Woo et al., 2003).
Figura 1. Representação esquemática da reação catalisada pela enzima sulfito oxidase.
(Adaptado de Garret e colaboradores, 1998).
Existem diferenças significantes na atividade da sulfito oxidase entre as espécies. A
atividade da sulfito oxidase em fígado de ratos é aproximadamente vinte vezes maior que a
enzima hepática humana (Tejnorová, 1978).
Citocromo c
(oxidado)
Citocromo c
(reduzido)
Citocromo c
(oxidado)
Citocromo c
(reduzido)
7
1.3 Deficiência de Sulfito Oxidase
1.3.1 Conceitos
A deficiência de sulfito oxidase é uma doença autossômica recessiva rara que se
manifesta por deterioração neurológica severa e morte na infância. O primeiro caso dessa
doença foi descrito em 1967 (Mudd et al, 1967).
Figura 2. Deficiência de sulfito oxidase. (Adaptado de Telles Filho, 2004).
A deficiência de sulfito oxidase pode ocorrer por defeito específico da enzima ou
pela ausência do cofator funcional, molibdênio. Foram descritos aproximadamente 50 casos
de deficiência de sulfito oxidase em todo mundo, entretanto, é pequeno o número de
pacientes vivos devido à natureza letal da doença (Hobson et al, 2005).
1.3.2 Sinais e Sintomas:
Os indivíduos afetados pela deficiência de sulfito oxidase apresentam, no período
neonatal, convulsões refratárias, retardo mental e psicomotor, espasticidade, microcefalia e
8
deslocamento da lente ocular (Chan et al, 2002). Imagens de ressonância magnética em
pacientes com essa doença revelam padrão similar à encefalopatia hipóxica-isquêmica,
caracterizada por destruição progressiva do tecido cerebral. Sinais de anormalidades em
gânglios da base, tálamo, corpo caloso e córtex cerebral, além de alterações multicísticas na
substância branca, foram demonstradas nos casos reportados da doença (Dublin et al,
2002). Em exames neuropatológicos podem ser visualizados edema cerebral, perda
neuronal e desmielinização acompanhados por gliose e espongiose difusa (Johnson &
Duran, 2001).
1.3.3 Achados Laboratoriais
Na investigação dos marcadores bioquímicos em pacientes com deficiência de
sulfito oxidase, observa-se o acúmulo tecidual de sulfito e redução da produção de sulfato.
A presença de níveis elevados de sulfito ativa rotas metabólicas alternativas através da
degradação da cisteína provocando elevações plasmáticas e urinárias de S-sulfocisteína,
tiosulfato e taurina. A S-sulfocisteína é formada pela reação de oxidação direta do sulfito
com cisteína, enquanto que o tiosulfato é produto das reações de transaminação e
transsulfuração da cisteína (Johnson & Duran, 2001).
9
METIONINA
↓
CISTEÍNA
↓
ÁCIDO CISTEÍNA SULFÍNICO → TAURINA
↓
SULFINILPIRUVATO
↓
TIOSULFATO →
→→
→ SULFITO →
→→
→ S-SULFOCISTEÍNA
↓
SULFITO OXIDASE
SULFATO
Figura 3. Vias metabólicas alternativas da cisteína. (Adaptado de Edwards e colaboradores,
1999).
O diagnóstico pré-natal pode ser realizado pelo teste da atividade da sulfito oxidase
ou pela análise de mutações ao DNA em amostras de vilosidades coriônicas coletadas entre
11 -14 semanas de gestação (Hobson et al, 2005).
1.3.4 Patogênese
Não existem evidências bem documentadas as quais definam as bases bioquímicas
associadas à patologia da deficiência de sulfito oxidase. Os danos neurológicos podem ser
resultado do acúmulo de metabólitos tóxicos ou do déficit no produto da reação. Dessa
forma, tem-se postulado que o sulfito possa ser responsável pelo dano cerebral encontrado
nessa doença. A passagem do sulfito do plasma através da barreira hematoencefálica não é
10
conhecida, entretanto, sabe-se que a sulfito oxidase está presente no cérebro humano,
sugerindo que a rota de metabolização dos aminoácidos de enxofre está operante e que há
produção de sulfito cerebral (Johnson & Duran, 2001).
1.35 Tratamento
Terapias efetivas na deficiência de sulfito oxidase não estão disponíveis. A
administração de dietas restritas em aminoácidos contendo enxofre e suplementação com
sulfato ou molibdato tem produzido respostas bioquímicas positivas, mas sem melhora
clínica (Johnson & Duran, 2001).
1.4 Sulfito
O corpo humano está exposto ao sulfito (SO
3
2-
) endógeno e exógeno. Considerável
quantidade de sulfito é gerada in vivo pelo catabolismo dos aminoácidos contendo enxofre,
cisteína e metionina. Fontes exógenas de sulfito são encontradas em alimentos, bebidas e
produtos farmacêuticos onde esse age como conservante, exercendo ação antioxidante e
antimicrobiana. Cinco sais de sulfito são comumente utilizados como conservantes:
metabissulfito de sódio (Na
2
S
2
O
5
), metabissulfito de potássio (K
2
S
2
O
5
), bissulfito de sódio
(NaHSO
3
), sulfito de potássio (K
2
SO
3
) e sulfito de sódio (NaS
2
O
3
) (Elmas et al., 2005). A
toxicidade ao sulfito também pode resultar da exposição ao dióxido de enxofre, um
poluente ambiental liberado na atmosfera a partir da combustão de combustíveis fosseis. O
dióxido de enxofre é convertido a sulfito após contato com os fluidos das vias aéreas
(Harvey & Nelsestuen, 1995). A exposição ao dióxido de enxofre tem sido associada a
complicações respiratórias principalmente em pacientes asmáticos (Bascom et al., 1996).
11
Sob condições normais os organismos vivos possuem altos níveis de sulfito oxidase,
porém, a concentração ou a atividade dessa enzima pode diminuir com a idade ou em certas
doenças, como na Síndrome de Down (Constantin et al., 1996). Pacientes com insuficiência
renal crônica (CRF) apresentam níveis elevados de sulfito sérico (pacientes normais = 1,55
± 0,54 µM e pacientes com CRF = 3,80 ± 3,32 µM). A elevação crônica dos níveis de
sulfito pode contribuir para disfunção de órgãos e tecidos em pacientes com CRF
(Kajiyama et al., 2000).
A ingesta diária de sulfito estabelecida pela Joint FAO/WHO Expert Committee on
Food Additives é de 0 - 0,7 mg/Kg de peso corporal (1974).
Se ingerido ou gerado endogenamente, o sulfito deve ser detoxificado devido às
suas propriedades tóxicas.
1.5 Sulfito e danos cerebrais
Pesquisadores da Universidade Nacional de Singapura, analisando células renais de
cães (Vincent et al., 2004) e cultura de células neuronais de ratos (Zhang et al., 2004)
verificaram que concentrações micromolares de sulfito atuam negativamente sobre a
biossíntese de ATP através da inibição da enzima glutamato desidrogenase,
comprometendo, dessa forma, o complexo I da cadeia de transporte de elétrons. Esses
trabalhos corroboram com a hipótese de que o alvo de ação do sulfito pode ser a
mitocôndria.
Estudos desenvolvidos em institutos chineses de medicina ambiental e toxicologia,
verificaram que o sulfito é capaz de modular canais de K
+
em neurônios da região CA1 do
hipocampo. Esse composto aumentou o efluxo de potássio reduzindo a excitabilidade
12
neuronal e evidenciando injúria similar a hipóxia/isquemia em processo pró-apoptótico. Os
mecanismos de ação do sulfito podem estar relacionados a um aumento do número de
canais de K
+
ou a indução de mudanças no estado redox do canal (Du & Meng, 2004a e
Meng & Nie, 2005). Este grupo de pesquisadores analisou também o efeito do sulfito sobre
canais de Na
+
tetrodotoxina sensíveis e resistentes em culturas de neurônios de gânglios da
raiz dorsal, observando aumento do influxo de Na
+
, aumento do estado despolarizado da
célula e da excitabilidade e, conseqüentemente toxicidade neuronal (Du & Meng, 2004b).
Trabalhos posteriores investigaram a ação do sulfito sobre canais de cálcio e sobre o
trocador Na
+
/Ca
2+
em miócitos cardíacos de ratos. Os resultados mostraram que o sulfito é
capaz de induzir uma sobrecarga de Ca
2+
intracelular, aumentando a contratilidade cardíaca
através do aumento da amplitude da corrente de Ca
2+
e da inibição do movimento de Na
+
e
Ca
2+
via trocador (Nie & Meng, 2006; Nie & Meng, 2007).
Estudos realizados em linhagens de células neuronais, evidenciaram um efeito
tóxico sinergístico do sulfito e peroxinitrito. O sulfito em concentrações de 10 – 50 µM foi
capaz de potenciar a perda de viabilidade da célula neuronal induzida por peroxinitrito. A
reação do sulfito e peroxinitrito pode resultar na produção de radicais livres de enxofre e
oxigênio (Reist et al., 1998).
O sulfito (500 µM) adicionado às soluções de óxido nítrico (NO) e seus derivados é
capaz de reagir com esses compostos afetando a habilidade do NO em exercer suas funções
fisiológicas de segundo mensageiro, bem como sua capacidade de inibição da agregação
plaquetária. A causa da toxicidade do sulfito também pode estar relacionada às alterações
nos processos de sinalização celular via NO (Harvey & Nelsestuen, 1995).
Trabalhos realizados em cultura de células de mastócitos de ratos mostraram que o
sulfito nas concentrações de 0,5 e 5,0 mM aumentou a formação de radicais livres. Esse
13
estudo aponta a NADPH oxidase como fator chave na resposta oxidativa ao sulfito
(Christopher et al., 2006).
Evidências mostram que a ingestão subcrônica de sulfito (520 mg/Kg/dia) produz
lipoperoxidação e alterações na atividade da enzima glutationa peroxidase em fígado, rim e
cérebro de ratos. Esses resultados confirmam a atividade pró-oxidante do sulfito (Elmas et
al., 2005; Derin et al., 2006). Mecanismos de lipoperoxidação induzidos por sulfito (SO
3
2-
)
foram investigados em emulsões de propofol. O SO
3
2-
sofre oxidação a radical sulfito
(SO
3
•
) e esse, pode reagir com oxigênio para formar espécies de sulfito oxidadas, tais como
radical peroxil sulfito (SO
3
OO
•
) e o radical ânion sulfato (SO
4
- •
) que por sua vez reagem
com os lipídios. O radical sulfito também pode reagir diretamente com lipídios resultando
na formação de radical alquil lipídico (L
•
), que na presença de oxigênio pode formar
radicais peroxil lipídico (LOO
•
). O radical peroxil lipídico retira átomos de hidrogênio de
ácidos graxos insaturados para formar hidroperóxido de lipídio (LOOH) e outro radical L
•
.
A propagação da reação ocorre entre o sulfito e o radical alquil lipídico gerando mais
radicais sulfito (Baker et al., 2002).
Trabalhos realizados em membranas lipossomais sugerem a ação do sulfito nos
sítios de insaturação dos lipídios da membrana, comprometendo suas propriedades de
absorção e solubilidade (Finch & Southerland, 1988).
Dados da literatura demonstram a ação tóxica do sulfito através do ataque às pontes
dissulfeto e a reação com grupos SH livres (Johnson & Duran, 2001).
Alguns trabalhos foram desenvolvidos para avaliar o efeito do sulfito sobre a
expressão de genes relacionados à apoptose. A análise de pulmões de ratos submetidos à
inalação de dióxido de enxofre mostraram aumento dos níveis de promotores de apoptose e
14
redução dos níveis de repressores de apoptose, o aumento da atividade da caspase 3 foi
também observado (Bai & Meng, 2005).
Estudos recentes confirman a ação genotóxica do sulfito. A administração
intraperitoneal (i.p.) de sulfito (125-500 mg/kg de peso corporal) induziu dano ao DNA em
vários órgãos de camundongos, inclusive no cérebro. Sugere-se que os mecanismos
envolvidos estejam relacionados à produção de radicais livres capazes de romper as fitas do
DNA e/ou induzir mutações (Meng et al., 2004). Essas evidências corroboram com outras
pesquisas mostrando que o sulfito aumenta a freqüência de aberrações cromossômicas,
troca de cromátides irmãs e o aparecimento de micronúcleos, um indicador de perda da
capacidade de reparo do DNA (Meng et al., 1990; Meng et al., 2002).
Alguns achados indicam que baixas concentrações de sulfito estimulam neutrófilos
a produzir ânions superóxido pela ativação da NADPH oxidase através da via de
transdução de sinal envolvendo proteína cinase C e Ca
2+
/calmodulina (Beck-Speier et al.,
1993).
A administração i.p. de sulfito induziu morte neuronal e exacerbação da
neurotoxicidade por agentes excitotóxicos em cérebro de ratos (Baud et al., 2001). Altas
taxas de mortalidade foram observadas após administração i.p. de sulfito. Em todos os
casos a morte foi precedida de prostração e convulsões, indicando que o efeito imediato do
sulfito pode ser diretamente no SNC (Cohen et al., 1973).
Ozturk e colaboradores (2006) demonstraram que o sulfito pode interferir na
regulação de receptores NMDA. Além disso, alguns trabalhos mostraram que a inalação de
15
dióxido de enxofre pode prejudicar a função cognitiva em ratos jovens e sugerem como
possível mecanismo, as alterações em canais iônicos (Yargicoglu et al., 2006).
1.6 Proteína Na
+
,K
+
-ATPase
A Na
+
,K
+
-ATPase é uma proteína integral de membrana, essencial para o
funcionamento normal das células dos mamíferos. Essa enzima utiliza a energia da
hidrólise do ATP para translocar íons Na
+
e K
+
através da membrana plasmática contra o
seu gradiente eletroquímico (Kaplan, 2002). A bomba Na
+
e K
+
está presente em altas
concentrações no neurônio, onde mantém o gradiente iônico necessário para a condução do
impulso nervoso (McGrail et al., 1991). Este transporte ativo de sódio e potássio é
responsável pela diferenciação e sobrevivência celular (Yu, 2003). A Na
+
,K
+
-ATPase
consome 40 – 60 % do ATP formado no cérebro e sua atividade está relacionada à
alterações na fluidez da membrana (Ericinska & Silver, 1994).
A inibição da atividade da Na
+
,K
+
-ATPase está relacionada a diversas patologias do
sistema nervoso central, tais como isquemia (Wyse et al., 2000) epilepsia (Grisar, 1984),
Parkinson e outras doenças neurodegenerativas (Kumar & Kurup, 2002; Lee, 1993).
Pelo menos dois mecanismos podem estar envolvidos na inibição da Na
+
,K
+
-
ATPase. A enzima pode ser inativada indiretamente por alterações na microestrutura da
membrana (Jamme et al, 1995) ou diretamente por modificações da molécula polipeptídica
da proteína (Boldyrev & Bulygina, 1997).
A Na
+
,K
+
-ATPase representa um alvo importante de radicais livres. O efeito
inibitório dos radicais livres sobre a atividade dessa enzima tem sido associado ao dano
neuronal (Dobrota et al, 1999).
16
Estudos realizados em nosso laboratório têm demonstrado o efeito inibitório de
alguns aminoácidos na atividade da Na
+
,K
+
-ATPase em membrana sináptica cerebral
(Pontes et al., 1999; Streck et al., 2002; Franzon et al., 2003; Wyse et al., 1995). Neste
contexto, alguns autores têm demonstrado o efeito de aminoácidos contendo enxofre; tais
como: metionina (Stefanello et al, 2005) e homocisteína (Wyse et al, 2002), sobre a
redução da atividade da Na
+
,K
+
-ATPase. Além disso, se tem verificado a correlação desse
efeito inibitório ao aumento do estresse oxidativo.
Figura 4. Ciclo catalítico da enzima Na+,K+-ATPase. (Adaptado de Lehninger e colaboradores, 1999).
1.7 Estresse Oxidativo
A ligação do Na
+
citoplasmático à proteína
estimula a fosforilação por
ATP.
A fosforilação provoca
alteração conformacional
da proteína.
Após a
alteração conformacional
da proteína ocorre a liberação de
Na
+
para o meio extracelular e a
ligação de k
+
.
A ligação de k
+
à
proteína provoca a
liberação do grupo
fosfato
.
A perda do
fosfato
restaura a
conformação
original da
proteína.
Quando o K+, é liberado os
sítios de ligação do Na
+
ficam
disponíveis; o ciclo se repete.
FLUIDO EXTRACELULAR
Alta [Na
+
]
Baixa
[K
+
]
Baixa [Na
+
]
Alta [K
+
]
17
As espécies reativas de oxigênio (ERO) podem ser geradas de forma endogéna
durante o metabolismo celular, ou de forma exógena, como por exposição a drogas
(Beckman & Ames, 1998). As ERO podem interagir diretamente com a maquinaria
molecular com subseqüentes modificações químicas e funcionais destas moléculas ou
podem interagir indiretamente através de modificação oxidativa do ambiente da
macromolécula (Stark, 2005). As ERO têm sido associadas aos danos à estrutura das
biomoléculas DNA, lipídios, carboidratos e proteínas, além de outros componentes
celulares.
O estresse oxidativo, o qual é decorrente de um desequilíbrio entre as defesas
antioxidantes e os radicais livres, pode estar relacionado a inúmeras doenças; tais como:
aterosclerose, câncer, doença de Alzheimer e outras doenças neurodegenerativas crônicas.
Um número crescente de situações patológicas envolvendo o SNC, incluindo
doenças neurodegenerativas, convulsões, isquemia/reperfusão e demência, têm sido
associadas ao estresse oxidativo (Halliwell, 2006a).
18
Figura 5. Estresse oxidativo - desequilíbrio pró-oxidante-antioxidante. (Adaptado de Garrido e
colaboradores, 2004).
Estresse
Oxidativo
ROS
α
αα
α
-
T
ocoferol
Taurina / Hipotaurina
Epinefrina
Piruvato / Lactato
GSH Redutase
GSH
Peroxidase
Superóxido Dismutase
Catalase
Radicais Hidroxil
Ânion Superóxido
Peróxido de Hidrogênio
Antioxidante
s
19
2. OBJETIVOS GERAIS
Partindo da observação de que os pacientes com deficiência de sulfito oxidase
apresentam sintomatologia neurológica severa e considerando as evidências da literatura
apontando o sulfito como principal candidato ao dano neural, decidimos avaliar o
envolvimento do sulfito sobre alguns parâmetros bioquímicos em cérebro de ratos.
Esse trabalho teve como objetivos:
1 - Verificar o efeito in vitro do sulfito sobre a atividade da Na
+
,K
+
-ATPase e sobre
alguns parâmetros de estresse oxidativo em cérebro de ratos jovens e adultos.
2 - Verificar o efeito da administração intracerebroventricular de sulfito em cérebro de
ratos adultos.
Este trabalho está dividido em dois capítulos:
Cápitulo I – Resultados apresentados como artigo científico
Cápitulo II – Resultados não submetidos a publicação
20
3. CAPÍTULO I – ARTIGO
Sulfite increases lipoperoxidation and decreases the activity of
catalase in the brain of rats
Fábria Chiarani, Caren S. Bavaresco, Carlos S. Dutra-Filho, Carlos Alexandre Netto and
Angela T.S. Wyse
Departamento de Bioquímica, Instituto de Ciências Básicas da Saúde, Universidade Federal
do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, RS, Brazil
Status: aceito
Periódico: Metabolic Brain Disease
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
4. CAPÍTULO II- RESULTADOS NÃO SUBMETIDOS À PUBLICAÇÃO
4.1 Objetivos
Considerando nossos resultados da avaliação dos efeitos in vitro do sulfito sobre a
Na
+
,K
+
-ATPase e a indução de estresse oxidativo (redução da capacidade antioxidante
enzimática e aumento da peroxidação lipídica) em diferentes tecidos cerebrais de ratos,
resolvemos ampliar nossa investigação para a análise dos mesmos parâmetros dos estudos
in vitro após a administração intracerebroventricular (i.c.v.) de sulfito.
4.2 Material e Métodos
Ratos Wistar de 60 dias foram anestesiados com ketamina e xilazina (75 e 10 mg/kg
i.p.). Estes animais foram submetidos à cirurgia em aparelho estereotáxico, onde foi
inserida e fixada uma cânula no ventrículo lateral direito de acordo com as coordenadas de
bregma (AP 0,9 mm, ML 1,5 mm e V 2,6 mm) (Paxinos, 1986).
Dois dias após a cirurgia, uma agulha de 30G foi inserida para administração de
sulfito (500 µM) ou veículo no ventrículo lateral direito durante o intervalo de 1 minuto.
Os animais foram divididos em três grupos: grupo controle – animais não
submetidos à cirurgia, grupo sham – animais que receberam salina i.c.v. e grupo sulfito –
animais que receberam sulfito 500 µM i.c.v. O volume administrado (salina ou sulfito) foi
5 µL. Os ratos foram sacrificados 30 min ou 7 dias após a injeção de sulfito ou salina.
31
4.2.1 Preparação tecidual
Os animais foram mortos por decapitação sem anestesia, o cérebro foi removido e o
córtex cerebral, estriado e hipocampo foram dissecados.
4.2.2 Preparação da membrana plasmática sináptica
Para a preparação da membrana plasmática sináptica e determinação da atividade da
Na
+
,K
+
-ATPase, as estruturas cerebrais foram homogeneizadas na proporção de 1:10
(massa/volume) em tampão pH 7,4 contendo sacarose 0,32 mM, HEPES 5,0 mM e EDTA
1,0 mM. As membranas plasmáticas sinápticas foram preparadas de acordo com Jones e
Matus (1974) com algumas modificações (Wyse et al., 1995). Os homogeneizados foram
centrifugados a 1.000 g por 10 min, o sobrenadante foi removido e centrifugado a 12.000 g
por 20 min. O sedimento foi suspenso em tampão hipotônico (tampão Tris-HCl 5 mM, pH
8,1) a 0ºC por 30 min, e aplicado num gradiente descontínuo de sacarose nas densidades
0,3; 0,8 e 1,0 M. Após a centrifugação de 69.000 g por 120 min, a fração entre as camadas
mais densas de sacarose (0,8 e 1,0 M) foi coletada e utilizada para dosagem da atividade da
Na
+
,K
+
-ATPase.
4.2.3 Dosagem da atividade da Na
+
,K
+
-ATPase
A mistura reacional para dosagem da atividade da Na
+
,K
+
-ATPase continha MgCl
2
5,0 mM, NaCl 80,0 mM, KCl 20,0 mM e Tris-HCl 40,0 mM, pH 7,4, num volume final de
200 µL. A reação foi iniciada pela adição de ATP para uma reação final de 3,0 mM. Os
controles foram incubados nas mesmas condições, diferenciando-se pela adição de
ouabaína 1,0 mM, um inibidor específico da Na
+
,K
+
-ATPase. A atividade enzimática foi
calculada pela diferença entre os ensaios com e sem adição de ouabaína, como descrito por
32
Wyse e colaboradores (1995). O fosfato inorgânico (Pi) liberado foi medido pelo método de
Chan e colaboradores (1986). A atividade específica da Na
+
,K
+
-ATPase foi expressa como
nmol Pi liberado por min por mg de proteína.
4.2.4 Substâncias Reativas ao Ácido Tiobarbitúrico - (TBARS)
Para o ensaio do TBARS, as estruturas cerebrais foram homogeneizadas na
proporção 1:10 (massa/volume) de tampão fosfato de sódio 20 mM contendo KCl 140 mM,
pH 7,4.
O TBARS, uma medida de lipoperoxidação, foi determinada de acordo com
Esterbauer and Cheeseman (1990). Ao homogeneizado foram adicionados ácido
tricloroacético 10% e ácido tiobarbitúrico 0,8%. Os tubos foram aquecidos em banho
fervente por 60 min. TBARS foi determinado em espectrofotômetro a 535 nm. Os
resultados são expressos como nmol de malondialdeído por mg de proteína.
4.2.5 Capacidade antioxidante total não-enzimática - (TRAP)
Para determinação do TRAP, as estruturas cerebrais foram homogeneizadas na
proporção 1:10 (massa/volume) em tampão glicina pH 8,6.
O TRAP mede a capacidade antioxidante não enzimática do tecido e foi
determinada pela medida da intensidade de luminescência do luminol induzida por 2,2’-
azo-bis (2-aminopropano) (ABAP) através do método de Evelson et al., 2001.
A quimiluminescência basal foi determinada na presença de ABAP e luminol (nível
inicial). Dez microlitros de trolox 0.2 µM ou amostra foram adicionados ao meio de
incubação os quais reduzem a quimiluminescência. O tempo necessário para retornar aos
33
níveis de quimiluminescência iniciais é definido como tempo de indução. O tempo de
indução é diretamente proporcional à capacidade antioxidante do tecido e é comparada ao
tempo de indução do trolox. Os resultados foram expressos como nmol trolox/mg proteína.
4.2.6 Determinação da atividade das enzimas antioxidantes
As estruturas cerebrais foram homogeneizadas na proporção 1:10 (massa/volume)
em tampão fosfato de potássio 10 mM pH 7,6.
- Catalase
A atividade da catalase (CAT) foi determinada pelo método de Aebi (1984), o qual
é baseado no desaparecimento do H
2
O
2
em 240 nm. Uma unidade de catalase é definida
como 1 µmol de peróxido de hidrogênio consumido por minuto e a atividade específica foi
expressa em unidades por mg de proteína.
- Glutationa peroxidase (GSH-Px)
A atividade da GSH-Px foi medida pelo método de Wendel (1981). Tert-butil-
hidroperóxido foi usado como substrato da reação. O desaparecimento de NADPH do meio
reacional foi monitorado com espectrofotômetro a 340 nm. Uma unidade de GSH-Px é
definida como 1 µmol de NADPH consumido por minuto por mg de proteína. A atividade
específica foi expressa em unidades por mg de proteína.
34
- Superoxide dismutase (SOD)
A atividade da SOD foi avaliada pelo método de Maklund (1985). Este método é
baseado na autooxidação do pirogalol, o qual é altamente dependente de oxigênio. Uma
unidade de SOD é definida como a quantidade de SOD necessária para inibir 50% da
autooxidação do pirogalol e a atividade específica foi reportada como unidades por mg de
proteína.
4.2.7 Determinação de Proteínas
A dosagem de proteínas foi realizada pelo método de Lowry (1951), utilizando
albumina bovina sérica como padrão.
4.2.8 Análise estatística
Os dados foram analisados pelo teste t de Student.
4.3 Resultados
A tabela 1 mostra que o sulfito (500 µM) não alterou a atividade da Na
+
,K
+
-
ATPase, a peroxidação lipídica (TBARS) e a capacidade antioxidante tecidual não-
enzimática (TRAP) em córtex cerebral, estriado e hipocampo de ratos de 60 dias
após 30
min e 7 dias da administração i.c.v.
As tabelas 2 e 3 mostram que a atividade das enzimas antioxidantes (CAT, SOD e
GSH-Px) não sofreram alterações em nenhuma das estruturas cerebrais testadas, 30 min e 7
dias, após a administração i.c.v. de sulfito (500 µM), respectivamente.
35
Tabela 1. Efeito do sulfito (500 µM) sobre a atividade da Na
+
,K
+
-ATPase, TBARS, TRAP em
córtex cerebral, estriado e hipocampo de ratos adultos.
30 min
7 dias
Controle
Sulfito 500 µM Controle Sulfito 500 µM
Córtex
1320,50 ± 59,12
1255,75 ± 74,47 1194,00 ± 174,93 1011,00 ± 154,28
Estriado
1411,50 ± 77,53
1301,25 ± 107,82 1216,00 ± 151,64 1104,50 ± 40,35
Na
+
,K
+
-ATPase
(nmol Pi/min.mg proteína)
Hipocampo
1353,25 ± 222,84
1250,00 ± 141,21 1286,50 ± 117,48 1093,50 ± 153,83
30 min
7 dias
Controle
Sulfito 500 µM Controle Sulfito 500 µM
Córtex
13,08 ± 2,87
12,92 ± 3,26 8,21 ± 1,05 9,30 ± 1,40
Estriado
14,12 ± 1,56
15,55 ± 1,47 9,54 ± 1,09 9,79 ± 1,09
TBARS
(nmol TBA/min.mg proteína)
Hipocampo
12,91 ± 1,75
11,29 ± 1,04 6,68 ± 1,11 7,28 ± 1,02
30 min
7 dias
Controle
Sulfito 500 µM Controle Sulfito 500 µM
Córtex
138,84 ± 26,20
129,70 ± 19,28 75,69 ± 13,18 69,20 ± 7,86
Estriado
119,62 ± 8,78
113,09 ± 10,97 78,89 ± 4,28 72,16 ± 1,70
TRAP
(nmol Trolox/min.mg proteína
)
Hipocampo
92,78 ± 12,86
91,54 ± 9,00 134,77 ± 13,90 138,12 ± 27,75
Os resultados estão expressos como média ± desvio padrão para um n = 4 ou 6.
36
Tabela 2. Efeito do sulfito 500 µM sobre a atividade das enzimas antioxidantes, CAT, SOD e
GSH-Px após 30 min em córtex cerebral, estriado e hipocampo de ratos adultos.
Córtex cerebral Estriado Hipocampo
Controle
4,88 ±0,79 7,94 ± 1,10 4,91 ± 0,38
CAT
(U/mg proteína)
Sulfito
3,46 ± 0,32 6,24 ± 0,66 4,22 ± 0,28
Controle
4,81 ± 0,75 5,31 ± 1,27 4,96 ± 1,06
SOD
(U/mg proteína)
Sulfito
5,06 ± 0,76 4,69 ± 0,93 4,17 ± 1,08
Controle
45,22 ± 3,40 62,58 ± 4,25 58,70 ± 4,99
GSH-Px
(U/mg proteína)
Sulfito
39,52 ± 5,32 62,30 ± 5,19 49,96 ± 8,37
Os resultados estão expressos como média ± desvio padrão para um n = 4 ou 6.
Tabela 3. Efeito do sulfito 500 µM sobre a atividade das enzimas antioxidantes, CAT, SOD e
GSH-Px após 7 dias em córtex cerebral, estriado e hipocampo de ratos adultos.
Córtex cerebral Estriado Hipocampo
Controle
3,87 ± 0,48 4,06 ± 0,63 4,79 ± 0,25
CAT
(U/mg proteína)
Sulfito
3,14 ± 0,39 3,14 ± 0,48 4,38 ± 0,97
Controle
5,82 ± 0,50 8,26 ± 1,26 4,97 ± 0,71
SOD
(U/mg proteína)
Sulfito
5,22 ± 0,86 7,05 ± 0,89 5,49 ±0,70
Controle
52,87 ± 4,60 57,54 ± 10,46 42,50 ± 5,04
GSH-Px
(U/mg proteína)
Sulfito
43,72 ± 3,42 57,87 ± 7,61 45,69 ± 4,83
Os resultados estão expressos como média ± desvio padrão para um n = 4 ou 6.
37
5. DISCUSSÃO
A deficiência de sulfito oxidase é uma doença autossômica recessiva na qual o
caminho de degradação oxidativa dos aminoácidos sulfurosos está comprometido. A
conversão de sulfito a sulfato está prejudicada, resultando no acúmulo de metabólitos
tóxicos e na deficiência de sulfato. Essa doença é caracterizada por disfunções neurológicas
severas, convulsões refratárias, espasticidade, movimentos coreatetósicos, deslocamento da
lente ocular, e acúmulo e excreção de sulfito, tiosulfato e S-sulfocisteína (Chan et al.,
2002). Embora a fisiopatologia da deficiêncisa de sulfito oxidase não seja conhecida,
estudos sugerem que o distúrbio do desenvolvimento e o dano cerebral podem ocorrer
como resultado de níveis tóxicos de sulfito no cérebro (Johnson & Duran et al., 2001).
Dessa forma, nossos objetivos iniciais foram avaliar os possíveis mecanismos
envolvidos nos danos neurotóxicos mediado pelo sulfito. As concentrações de sulfito
utilizadas nesse estudo foram definidas com base nos trabalhos de Zhang e colaboradores
(2004). As estruturas cerebrais estudadas foram escolhidas considerando os estudos
neuroradiológicos dos pacientes afetados pela deficiência de sulfito oxidase, os quais
mostram atrofia cerebral difusa com extensa perda de neurônios e mielina, calcificações em
gânglios da base e ventriculomegalia. Esses achados histológicos são acompanhados por
disfunções neurológicas severas caracterizadas por retardo mental, convulsões e retardo
psicomotor (Chan et al., 2002).
Primeiramente, investigamos os efeitos in vitro do sulfito nas concentrações 1 – 500
µM em córtex cerebral, hipocampo e estriado de ratos de 10 e 60 dias. Os resultados desse
estudo demonstraram que o sulfito (500 µM) alterou parâmetros de estresse oxidativo
38
(reduziu a atividade da CAT e aumentou o TBARS), implicando num possível
envolvimento do sulfito na formação de radicais livres. Por outro lado, o sulfito, nas
concentrações testadas, não foi capaz de alterar a atividade da Na
+
,K
+
-ATPase
em
membranas plasmáticas sinápticas.
Partindo-se da hipótese de indução de estresse oxidativo nas condições in vitro pelo
sulfito (500 µM), avaliamos os efeitos in vivo, 30 min e 7 dias, após a administração i.c.v.
desse composto. Nos estudos in vivo, entretanto, o sulfito (500 µM) não foi capaz de
interferir na capacidade antioxidade enzimática (CAT, SOD e GSH-Px) e não-enzimática
(TRAP) em cérebro de ratos adultos. Além disso, não foram observadas alterações na
peroxidação lipídica (TBARS) ou na atividade da Na
+
,K
+
-ATPase.
O dano oxidativo é um desequilíbrio no balanço pró-oxidante-antioxidante (Sies,
1991). O ataque de espécies reativas pode causar dano a biomoléculas, falha no reparo e
substituição de biomoléculas danificadas ou mesmo propagação do estresse oxidativo
(Halliwell, 2006b).
A Na
+
,K
+
-ATPase
é um sistema de transporte ativo presente na membrana da célula
e é particularmente importante no cérebro uma vez que, aproximadamente dois terços da
demanda de energia deste órgão é utilizada para manter o potencial transmembrana
neuronal (Kumar & Kurup, 2002). A inibição desta enzima por ERO foi demonstrada em
cérebro de animais (Rauchová et al., 1999). A neurotoxicidade provocada pela inibição da
atividade da Na
+
,K
+
-ATPase
está associada a várias patologias neurológicas; tais como;
epilepsia, isquemia cerebral, esquizofrenia e doença de Parkinson e de Alzheimer (Kumar
& Kurup, 2002, Kurup & Kurup, 2002).
39
O sulfito é uma espécie iônica com alta reatividade, a qual interage com moléculas
de importância biológica em reações potencialmente tóxicas (Izgut-Uysal et al., 2005).
Várias hipóteses têm sido propostas para explicar os mecanismos envolvidos no dano
cerebral presente na deficiência de sulfito oxidase. O efeito tóxico do sulfito tem sido
demonstrado em muitos componentes celulares, incluindo DNA (Southerland et al., 1982,
Rencuzogullari et al., 2001, Meng et al., 2002).
Dados da literatura mostram que o sulfito pode sofrer oxidação de um elétron
formando um radical ânion sulfito (SO
3
-
•) e este pode reagir com oxigênio molecular
formando radical peroxil sulfite (SO
3
OO•) e o radical ânion sulfato (SO
4
-
•) (Mottley &
Mason et al., 1988).
Alguns trabalhos mostram que o radical sulfito, é capaz de causar hidroxilação da
deoxiguanosina gerando 8-hidroxi-2’-deoxiguanosina e também de danificar a dupla fita de
DNA (Shi & Mao, 1994). Além disso, estudos demonstram que sulfito pode agir como
agente neurotóxico através da interação com peroxinitrito (ONOO
-
) (Reist et al., 1998). O
radical sulfato também apresenta reatividade semelhante ao radical hidroxil podendo reagir
com outros radicais (Mottley & Mason et al., 1988).
Analisando nossos resultados em conjunto, pode-se verificar, nas condições in vitro,
um efeito direto do sulfito sobre as estruturas cerebrais avaliadas. Entretanto, quando
administramos sulfito através de injeção i.c.v., o metabolismo celular parece atuar no
sentido de neutralizar os efeitos do sulfito, e desta forma impedir o dano neurotóxico.
Apesar disso, a possibilidade de citotoxicidade induzida pelo sulfito não pode ser
excluída, uma vez que, não se tem registros exatos da concentração de sulfito em cérebro
de pacientes afetados pela deficiência de sulfito oxidase e não se conhecem os tecidos
cerebrais alvos nessa doença.
40
Algumas considerações devem ser feitas em relação aos resultados in vivo, se
considerarmos a impossibilidade de predizermos a quantidade de sulfito capaz de se
difundir em cada tecido cerebral após a administração i.c.v. de sulfito 500 µM e a
influência do tempo de exposição à droga sobre os achados bioquímicos.
Os estágios de desenvolvimento do animal também podem implicar em variações
nos efeitos do sulfito. Nesse contexto, embora não tenham sido observadas diferenças
estatisticamente significativas nos estudos in vitro, os animais neonatos parecem apresentar
uma tendência à maior suscetibilidade ao dano oxidativo pelo sulfito comparada aos
animais adultos. Esta diferença em relação ao estágio de desenvolvimento do animal não
foram avaliadas nos estudos in vivo.
Diferenças na atividade da enzima sulfito oxidase interespécies são bem
documentadas. A atividade dessa enzima tem-se mostrado 20 vezes maior em fígado de
ratos comparada ao fígado humano (Johnson & Rajagopalan, 1976). Essas considerações
apontam um catabolismo do sulfito muito mais eficiente em ratos e, portanto, nosso modelo
animal pode não reproduzir os efeitos tóxicos do sulfito no homem. Modelos animais
apropriados para estudar a toxicidade do sulfito pressupõem uma atividade hepática da
enzima de aproximadamente 5% da de ratos normais (Johnson et al., 1974).
Concluindo, nossos resultados mostram que a indução de estresse oxidativo pode
estar envolvida no potencial neurotóxico do sulfito e corroboram para hipótese da
participação desse composto na fisiopatologia da deficiência de sulfito oxidase. Além disso,
nossos resultados reforçam a importância da determinação dos níveis de sulfito alcançados
em cérebro de pacientes, o que pode evidenciar, além da condição de estresse oxidativo, o
comprometimento de outras vias metabólicas importantes no funcionamento cerebral e
41
podem apontar estratégias terapêuticas na prevenção dos efeitos neurológicos da deficiência
de sulfito oxidase.
42
6. CONCLUSÕES
• O sulfito in vitro na concentração 500 µM reduziu a atividade da catalase e
aumentou a lipoperoxidação em córtex cerebral, estriado e hipocampo de ratos
jovens e adultos.
• Após 30 min e 7 dias da administração i.c.v. de sulfito 500 µM em ratos de 60 dias,
não foram observadas alterações nas atividades das enzimas antioxidantes CAT,
SOD e GSH-Px em córtex cerebral, estriado e hipocampo. Nestas mesmas
condições, o sulfito não foi capaz de interferir na capacidade antioxidante tecidual
não enzimática (TRAP inalterado) e na peroxidação lipídica (TBA inalterado).
• A atividade da enzima Na
+
,K
+
-ATPase não mostrou-se susceptível à ação in vitro
e in vivo do sulfito (500 µM) em córtex cerebral, estriado e hipocampo de ratos nos
tempos de exposição avaliados.
• Em resumo, o sulfito (500 µM) foi capaz de induzir estresse oxidativo in vitro,
entretanto nas condições in vivo, não se observou alteração tanto na capacidade
antioxidante tecidual quanto na peroxidação lipídica em cérebro de ratos.
43
7. PERSPECTIVAS
Adotar o modelo desenvolvido por Johnson e colaboradores (1974), de indução da
deficiência da enzima sulfito oxidase experimental em ratos para mimetizar a atividade
dessa enzima em humanos. Esse modelo baseia-se na dieta com baixas concentrações
de molibdênio e tratamento com tungstênio (antagonista competitivo do molibdênio).
Usando este modelo avaliaremos os seguintes parâmetros:
• estresse oxidativo
• metabolismo energético
• comprometimento à lipídios, proteínas e DNA
• comportamentais (esquiva inibitória e campo aberto)
44
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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2. Bai, J. & Meng, Z. Effects of sulfur dioxide on apoptosis-related gene
expressions in lungs from rats. Regul Toxicol Pharmacol 2005, 43: 272-279.
3. Baker, M. T., Dehring, D. J., Gregerson, M. S. Sulfite supported lipid
peroxidation in Propofol emulsions. Anesthesiology 2002, 97: 1162-1167.
4. Bascom, R., Bromberg, P. A., Costa, D. A. Health effects of outdoor air
pollution. Am J Respir Crit Care Med 1996, 153: 3-50.
5. Baud, O., Laudenbach, V., Evrard, P., Gressens, P. Neurotoxic effects of
fluorinated glucocorticoid preparations on the developing mouse brain: Role of
preservatives. Pediatr Res 2001, 50:706-711.
6. Beck-Speier, I., Liese, J. G., Belohradsky, B. H., Goldleski, J. J. Sulfite
stimulates NADPH oxidase of human neutrophils to produce active oxygen
radicals via protein Kinase C and Ca2+/calmodulin pathways. Free Radic Biol
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7. Beckman, K. B. & Ames, B. N. The free radicals theory of aging matures.
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55
9. Lista de Figuras e Tabelas.
Pág.
Figura 1. Representação esquemática da reação catalisada pela enzima sulfito
oxidase
6
Figura 2. Deficiência de sulfito oxidase 7
Figura 3. Vias metabólicas alternativas da cisteína 9
Figura 4. Ciclo catalítico da Na+, K+-ATPase 16
Figura 5. Estresse oxidativo – desequilíbrio entre pró-oxidantes e antioxidantes 18
Tabela 1. Efeito do sulfito (500 µM) sobre a atividade da Na
+
,K
+
-ATPase,
TBARS, TRAP, após 30min e 7 dias da administração intracerebroventricular
em córtex cerebral, estriado e hipocampo de ratos adultos.
35
Tabela 2. Efeito do sulfito (500 µM) sobre a atividade das enzimas
antioxidantes, CAT, SOD e GSH-Px após 30min da administração
intracerebroventricular em córtex cerebral, estriado e hipocampo de ratos
adultos.
36
Tabela 3. Efeito do sulfito (500 µM) sobre a atividade das enzimas
antioxidantes, CAT, SOD e GSH-Px após 7 dias da administração
intracerebroventricular em córtex cerebral, estriado e hipocampo de ratos
adultos.
36
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