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TESE DE DOUTORADO
ESTUDO DA ATIVIDADE DAS ENZIMAS NTPDase E
5’-NUCLEOTIDASE E DO PERFIL OXIDATIVO EM
PACIENTES COM INSUFICIÊNCIA RENAL
CRÔNICA
Adriane Cismoski da Silva
PPGCBB
Porto Alegre, RS, Brasil
2008
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ii
ESTUDO DA ATIVIDADE DAS ENZIMAS NTPDase E
5’-NUCLEOTIDASE E DO PERFIL OXIDATIVO EM
PACIENTES COM INSUFICIÊNCIA RENAL
CRÔNICA
por
Adriane Cismoski da Silva
Tese apresentada ao Curso de Doutorado do Programa de Pós – Graduação em
Ciências Biológicas - Bioquímica, da Universidade Federal do Rio Grande do Sul
(UFRGS, RS), como requisito parcial para a obtenção do grau de DOUTORADO
em Ciências Biológicas – Bioquímica
PPGCBB
Porto Alegre, RS, Brasil
2008
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iii
Universidade Federal do Rio Grande do Sul
Instituto de Ciências Básicas da Saúde
Curso de Pós-Graduação em Ciências Biológicas: Bioquímica
A Comissão Examinadora, abaixo assinada, aprova a Tese de
DOUTORADO
ESTUDO DA ATIVIDADE DAS ENZIMAS NTPDase E
5’-NUCLEOTIDASE E DO PERFIL OXIDATIVO EM
PLAQUETAS DE PACIENTES COM INSUFICIÊNCIA
RENAL CRÔNICA
Elaborada por
Adriane Cismoski da Silva
Como requisito parcial para obtenção do grau de DOUTORADO em
Ciências Biológicas – Bioquímica
COMISSÃO EXAMINADORA:
__________________________________________
Profª. Dra. Maria Rosa Chitolina Schetinger
(Presidente/Orientador)
___________________________________________
Profª. Dra. Carla Bonan
______________________________________________
Profº. Dr. Mauricio Reis Bogo
_________________________________________
Prof.º Dr. Felix Antunes Soares
Porto Alegre, 23 de Abril de 2008.
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iv
"É melhor tentar, ao invés de sentar-se
e nada fazer; é melhor falhar, mas não
deixar a vida passar; eu prefiro na
chuva caminhar, do que em dias tristes
em casa me esconder; prefiro ser feliz,
embora louco, do que viver infeliz em
são conformismo." (Martin Luther
King)
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v
AGRADECIMENTOS
À professora Dra. Maria Rosa Chitolina Schetinger pela sua forma de
orientar, seu carinho e dedicação à arte de ensinar. À professora Dra. Vera Maria
Morsch pela revisão dos trabalhos científicos.
Aos doutores Luís Cláudio Arantes e Luís Alberto Silva.
Aos professores do programa em Pós-Graduação, pelo enriquecimento
científico acumulado durante o desenvolvimento das disciplinas.
Aos alunos André Luís Morsch e Rafael Zanin, e a amiga Maria do Carmo
Araújo.
À minha família que soube respeitar os longos momentos de ausência.
Aos pacientes que participaram como voluntários nesse trabalho e ao grupo
controle que espontaneamente colaboraram para que eu pudesse desenvolver
este trabalho.
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vi
ÍNDICE
LISTA DE ABREVIATURAS .................................................................................VIII
RESUMO................................................................................................................ XI
ABSTRACT.......................................................................................................... XIII
PARTE I
1. Introdução
1.1 Insuficiência renal crônica .........................................................................1
1.2 Dados epidemiológicos ..............................................................................2
1.3 Diagnóstico da doença renal crônica .........................................................4
1.4 Progressão da doença renal crônica ..........................................................5
1.5 Quadro bioquímico e hematológico da insuficiência renal .........................6
1.6 Técnicas dialíticas na insuficiência renal crônica ...................................... 9
1.7 Doenças cardiovasculares na doença renal crônica ............................... 10
1.8 Plaquetas ..................................................................................................12
1.9 Alterações da função plaquetária na doença renal crônica .....................13
1.10 Hemostasia ...............................................................................................16
1.11 Nucleosídeos e nucleotídeos extracelulares e purinoreceptores ............ 18
1.12 E-NTPDase ..............................................................................................22
1.13 5’ – Nucleotidase.......................................................................................26
1.14 Estresse Oxidativo ....................................................................................27
1.15 Enzima ácida aminolevulínico deidratase ................................................32
2.Objetivos ............................................................................................................35
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vii
Parte II
Apresentação dos Artigos ..................................................................................36
Capítulo 1: Enzymes that hydrolyze adenine nucleotides in chronic renal failure:
Relationship between hemostatic defects and renal failure severity ...……...……37
Capítulo 2: Oxidative stress and δ-ALA-D activity in chronic renal failure
patients………………..…………………………………………....................…………45
Parte III
1. Discussão .........................................................................................................52
1.1 Perfil bioquímico e hematológico ................................................................53
1.2 Atividade das enzimas NTPDase e 5’- nucleotidase em plaquetas de
pacientes com DRC ..........................................................................................55
1.3 Estresse oxidativo.......................................................................................59
1.4 Atividade da enzima delta aminolevulinato deidratase ..............................61
2. Conclusões .......................................................................................................64
3. Perspectivas..................................................................................................... 66
4. Bibliografia .......................................................................................................68
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viii
LISTA DE ABREVIATURAS
OH
.
– Radical hidroxil
ACR – Regiões conservadas da apirase
ADP – Adenosina difosfato
AMP - Adenosina monofosfato
ANOVA – Análise de variância
ATP - Adenosina trifosfato
CAPD – Diálise peritonial ambulatorial contínua
CAT – Catalase
DCV – Doença cardiovascular
DNA – Ácido desoxirribonucléico
DP – Diálise peritonial
DPA – Diálise peritonial automática
DPAC – Diálise peritonial ambulatorial contínua
DPIN – Diálise peritonial intermitente noturna
DRC – Doença renal crônica
DTNB – Ácido – 5’5-ditio-bis-2-nitrobenzóico
E-NTPDase – Ecto-nucleosídeo trifosfato difosfoidrolase
FG – Filtração glomerular
GM-CSF – Fator estimulante de colônia
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ix
GPI – Glicosil fosfatidil inositol
HD – Hemodiálise
HDL - Lipoproteína de alta densidade
IDL - Lipoproteína de densidade intermediária
IL – 6 – Interleucina 6
IL –1 – Interleucina 1
LDL - Lipoproteína de baixa densidade
MCP - Proteína de quimiotaxia de monócitos 1
MDA – Malondialdeído
ND – Não hemodialisados
NFKB – fator nuclear KB
NMPP – 5’- Nucleosídeo monofosfato fosfoanidrolase fosfodiesterase
NO - Óxido Nítrico
O
2
.-
- Ânio superóxido
ONOO
-
- Peroxinitrito
PLC – fosfolipase C
PMSF – Fluoreto de fenilmetil sulfonil
PTH - Paratormônio
RLP – Remanescentes de lipoproteína
ROS – Espécies reativas de oxigênio
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xi
RESUMO
As anormalidades hemostáticas são comumente encontradas em pacientes
com doença renal. Ambos, sangramento e estados pró-trombóticos, podem ser
observados em pacientes com doença renal crônica (DRC). O principal papel das
plaquetas é assegurar a hemostasia primária, a manutenção da integridade do
vaso e cessar o sangramento após uma injúria. As plaquetas também estão
envolvidas na trombose arterial aguda, na inflamação, na aterosclerose, e na
angiogênese. Quando as plaquetas são ativadas elas se aderem à matrix
endotelial onde ocorre a ativação e a liberação de agonistas secundários tais
como o ATP, ADP, tromboxano A2, serotonina e outras substâncias
biologicamente ativas. O ADP possui um papel crucial na ativação plaquetária,
atuando em receptores P2. Está liberação pode ser responsável pela ativação,
recrutamento e indução da agregação adicional de plaquetas no microambiente de
lesão no vaso. Assim, o metabolismo do ADP no sangue é um importante
mecanismo de regulação da função plaquetária. A NTPDase (ecto-CD39) hidrolisa
o ATP e ADP extracelulares formando monofosfato de adenosina (AMP), que é
subseqüentemente convertido para adenosina pela ação da enzima 5’-
nucleotidase (CD73).
O objetivo deste estudo foi explorar a relação entre a disfunção plaquetária
na uremia com as anormalidades hemostáticas e a severidade na doença renal
em pacientes com insuficiência renal crônica sob tratamento conservador ND
(pacientes que não realizam hemodiálise) e HD (pacientes que realizam
hemodiálise) comparando com indivíduos normais de mesma faixa etária. Os
resultados demonstraram um aumento na atividade da NTPDase em plaquetas de
pacientes HD (52,88%) com o substrato ATP. A hidrólise do ADP apresentou-se
diminuída (33,68% e 39,75%) em HD e ND pacientes, respectivamente. Além
disso, a atividade da 5’-nucleotidase mostrou-se elevada em HD (160%) e ND
(81,49%) quando comparado com o grupo controle. Correlações significativas
foram encontradas entre a hidrólise do ATP, ADP e AMP e os níveis plasmáticos
de creatinina e uréia. Foram realizadas comparações entre o tempo de
hemodiálise a que os pacientes estavam submetido e a alterações na hidrólise dos
nucleotídeos ATP, ADP e AMP. Encontrou-se aumento na atividade da NTPDase
com substrato ATP, diminuição com o substrato ADP e aumento da atividade da
5´-nucleotídase entre 49 e 72 meses em paciente HD. Os resultados sugeriram
que as alterações na hidrólise dos nucleotídeos em plaquetas podem contribuir
para anormalidades hemostáticas em pacientes com DRC, podendo realçar o
risco de complicações tromboembólicas e aterosclerose acelerada em pacientes
com DRC. Podemos inferir que tanto a uremia como a hemodiálise têm influência
nas desordens hemostáticas apresentadas nesses pacientes, e descritas nesse
trabalho.
Os conhecimentos sobre estresse oxidativo e seu papel como importante
cofator contribuindo para disfunção endotelial, inflamação, aterosclerose e
glomeruloesclerose têm substancialmente aumentado nos últimos anos. A doença
cardiovascular (DCV) é a maior causa de morte em pacientes com insuficiência
renal, sendo que cerca de 50% de todas as mortes em pacientes com terapia
substitutiva e que receberam transplante renal estão relacionadas a DCV. A
mortalidade por DCV em pacientes com insuficiência renal é aproximadamente 9%
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xii
por ano, o que chega a ser 30 vezes maior do que da população em geral.
O estresse oxidativo é definido como um desequilíbrio entre a formação de
espécies reativas de oxigênio (ROS) e os mecanismos de defesa antioxidante.
Nos últimos anos, foi estudado o efeito biológico das ROS, e, em estudos clínicos
e experimentais recentes, foram notados sinais de estresse oxidativo em
pacientes renais. No entanto, a influência da uremia e do procedimento de
hemodiálise não foi elucidada.
Nesse estudo, avaliou-se a influência da uremia e da hemodiálise sobre o
estresse oxidativo e a atividade da enzima delta aminolevulinato deidratase (δ-
ALA-D) em pacientes com DRC em HD e ND comparando com o grupo controle.
Observou-se um aumento na peroxidação lipídica em soro de pacientes HD e ND.
O nível de TBARS em hemácias foi elevado somente em pacientes HD. A
atividade da catalase mostrou-se aumentada (83,56% e 61,23%) em pacientes HD
e ND, respectivamente. Neste estudo, demonstrou-se a inibição da atividade da δ-
ALA-D em pacientes HD e ND quando comparado ao grupo controle. Observou-
se, uma correlação positiva entre δ-ALA-D e δ-ALA-D/DTT com a quantidade de
hemoglobina (r= 0.55, r= 0.42), respectivamente, e também observou-se uma
correlação entre δ-ALA-D e δ-ALA-D/DTT e o nível de TBARS em eritrócitos (r= -
0.54, r= -0.51), respectivamente. Além disso, uma correlação negativa foi
encontrada entre δ-ALA-D ou δ-ALA-D/DTT e a atividade da enzima CAT (r= -
0.63, r= -0.5), respectivamente.
Nesse trabalho, demonstrou-se que a uréia pode ser o principal fator na
geração de estresse oxidativo em pacientes com DRC. Além disso, a inibição da
atividade δ-ALA-D foi positivamente correlacionada com níveis de hemoglobina,
demonstrando o papel fundamental da enzima δ-ALA-D na biossíntese do heme e
no desenvolvimento de anemia em pacientes com CRF. Estudos descreveram que
o acúmulo de δ-ALA pode levar ao aumento do estresse oxidativo, e a diminuição
da eficiência nos mecanismos de defesa celular contra as espécies reativas de
oxigênio pode levar a peroxidação lipídica e também a inibição da atividade da δ-
ALA-D, com concomitante alteração na síntese do heme, formando assim um
ciclo de destruição.
Esse estudo demonstrou várias alterações em pacientes com insuficiência
renal crônica, sendo que muitas delas ajudam a explicar a tendência a
desenvolver doença cardiovascular precoce nesses pacientes.
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xiii
Abstract
Hemostatic abnormalities are commonly found in patients with renal failure.
Both a bleeding diathesis and the uremic prothrombotic state may be caused by
renal disease. The main role of blood platelets is to ensure primary hemostasis,
which is the maintenance of vessel integrity and cessation of bleeding upon injury.
While playing a major part in acute arterial thrombosis, platelets are also involved
in inflammation, atherosclerosis, and angiogenesis. When platelets are undergo
activation first adhere to the subendothelial matrix where they become activated
and release secondary agonists such as ATP, ADP, thromboxane A2, serotonin
and several other biologically active substances. ADP and ATP play a crucial role
in platelet activation, acting through P2 receptors. This release may be responsible
for the activation, recruitment, and induction of aggregation of additional platelets in
the microenvironment. Thus, the metabolism of ADP in the blood is important for
the regulation of platelet functions. NTPDase (ecto-CD39) is that hydrolyzes
extracellular adenosine tri- and diphosphate (ATP, ADP) to adenosine
monophosphate (AMP), which is subsequently converted into adenosine by 5’-
nucleotidase (CD73).
The objectives of this study were to explore the relations between platelet
dysfunction in uremia with hemostatic abnormalities and the severity of kidney
disease in patients with CRF under conservative treatment (nondialysed - ND) and
hemodialysis (HD) treatment companing to heathy subjects with the same age.
The activities of the enzymes NTPDase and 5´-nucleotidase were analyzed in
platelets from patients with chronic renal failure (CRF), both undergoing
hemodialysis treatment (HD) and not undergoing hemodialysis (ND), as well as
from a control group. The results showed an increase in platelet NTPDase activity
in CRF patients on HD treatment (52.88%) with ATP as substrate. ADP hydrolysis
was decreased (33.68% and 39.75%) in HD and ND patients, respectively. In
addition, 5’-nucleotidase activity was elevated in the HD (160%) and ND (81.49%)
groups when compared to the control group. Significant correlation was found
among ATP, ADP and AMP hydrolysis and plasma creatinine and urea levels.
Patients were compared statistically according the time of hemodialysis treatment.
We found enhanced NTPDase with ATP substrate and decrease with ADP
substrate, and increase in 5’-nucleotidase activity between 49 and 72 months on
HD patients. Our results suggest the existence of alterations in nucleotide
hydrolysis in platelets, which might contribute to abnormal homeostasis in renal
failure patients, thus and the enhanced risk of thromboembolic complication and
accelerated atherosclerosis in patients with renal failure.
Our knowledge about stimuli and sources of oxidative stress, and about its
role as an important cofactor contributing to endothelial dysfunction, inflammation,
atherosclerosis and glomerulosclerosis has substantially increase over the last
years. Cardiovascular disease (CVD) is the major cause of death in patients with
renal insufficiency, accounting for 50% of all deaths in renal replacement therapy
patients and in recipients of renal transplants. Mortality from CVD in patients with
renal insufficiency is approximately 9% per year, which is about 30 times the risk in
the general population.
Oxidative stress defines an imbalance between formation of reactive oxygen
species (ROS) and antioxidative defense mechanisms. In view of the profound
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xiv
biological effects of ROS, in recent years numerous clinical and experimental
studies focused on detection of signs of oxidative stress in renal patients. However,
the influence of uremia and the hemodialysis procedure, respectively, has not been
elucidated. Oxidative stress has been implicated in long-term complications
including anemia, amyloidosis, accelerated atherosclerosis, and malnutrition. In
this study, we studied the influence of uremia and hemodialysis on oxidative stress
and δ-aminolevulinic acid dehydratase (δ-ALA-D) activity in patients with CRF on
HD treatment, in patients ND and in a control group. An increased lipid
peroxidation was observed in the serum of HD and ND patients, as measured by
TBARS serum levels. However, erythrocytic TBARS was only elevated in HD
patients. The activity of catalase was increased (83.56%, 61.23%) in HD and ND
groups, respectively. This study also showed an inhibition Blood δ--ALA-D activity
of HD and ND patients was significantly lower when compared with the control
group. A positive correlation was also observed between δ-ALA-D or δ-ALA-D/DTT
with hemoglobin (r=0.55, r=0.42), respectively, and a negative correlated were
observed between δ-ALA-D or δ-ALA-D/DTT with TBARS level in erythrocytes (r= -
0.54, r=-0.51), respectively. Furthermore, a negative correlation was found
between δ-ALA-D or δ-ALA-D/DTT and CAT activity (r= -0.63, r= -0.5),
respectively.
In this study, it was shown that uremia itself could be the principal factor in
generating oxidative stress in CRF patients. Furthermore, the inhibition of δ-ALA-D
activity was positively correlated with hemoglobin levels, showing the fundamental
role of this enzyme in heme biosynthesis and the development of anemia in
patients with CRF. Studies reported that the accumulation of δ-ALA may lead to
increased oxidative stress. In addition an existence of a decreased efficiency in the
mechanisms of cellular defense against reactive oxygen species can lead to lipid
peroxidation and inhibition of the activity of δ-ALA-D with concomitant change in
the synthesis of heme, thus forming a cycle of destruction.
This study showed several changes in patients with chronic renal failure,
which may to explain the tendency to develop cardiovascular disease in these
patients early.
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1
Parte I
1. Introdução
1.1 Insuficiência renal crônica
A insuficiência renal crônica é definida como a deterioração progressiva e
irreversível da função renal. Esse conceito pode ser traduzido pela presença de
lesão renal (proteinúria persistente), associada ou não a diminuição da filtração
glomerular (FG), inferior a 60 mL/min/1,73 m
2
, persistente, durante um período
mínimo de três meses (Levey, 2002).
No curso da doença renal crônica (DRC), particularmente quando o FG
diminui a valores inferiores a 60 mL/mim/1,73m
2
, é comum o aparecimento de
complicações, tais como: anemia, doença óssea, desnutrição e acidose
metabólica (Draibe & Cendoroglo, 2001; Stigant, Stevens & Levin, 2003).
Pelo fato de ser lenta e progressiva, a perda da função dos nefróns resulta
em processos adaptativos que, até certo ponto, mantêm o paciente sem sintomas.
Normalmente, os sintomas aparecem após perda de mais de 50% da função renal.
Nesta fase, os sintomas são leves e nem sempre incomodam o paciente. Os
principais sintomas são: a anemia leve, a pressão alta, o edema dos olhos e pés,
a mudança nos hábitos de urinar (levantar diversas vezes à noite para urinar) e as
alterações da urina (urina muito clara, sangue na urina, etc.). Nesta fase, o uso de
medicamentos e dieta são suficientes para manter a qualidade de vida (Levey,
2002). Quando os rins passam a funcionar com somente 10-12% da função renal
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2
normal, torna-se necessário o uso de outros métodos de tratamento como: a
diálise ou o transplante renal (Levey, 2002).
Diversas são as doenças que levam à insuficiência renal crônica. As três
mais comuns são: a hipertensão arterial, a diabetes e a glomerulonefrite. A
incidência de DRC em hipertensos é elevada, devido ao fato que de que os rins
são responsáveis pelo controle da pressão arterial. Quando os rins não funcionam
adequadamente, ocorre uma elevação da pressão arterial que, por sua vez, leva
ao aumento da disfunção renal, fechando assim um ciclo de agressão aos rins. O
risco de desenvolvimento de nefropatia é de cerca de 30% nos diabéticos do tipo 1
e de 20% nos diabéticos do tipo 2. Outra causa, muito freqüente de insuficiência
renal é a glomerulonefrite, que resulta de uma inflamação crônica dos rins. Depois
de algum tempo, se a inflamação não é curada ou controlada, pode haver perda
da função renal (Ajzen & Schor, 2002). O risco para desenvolver doença renal
crônica é considerado elevado em pacientes com hipertensão arterial, diabetes
mellitus e histórico familiar de DRC, e é considerado médio para pacientes com
enfermidades sistêmicas, infecções urinárias de repetição, litíase urinária de
repetição, mulheres grávidas, crianças com idade inferior a cinco anos e adultos
com idade superior a sessenta anos (Junior, 2004).
1.2 Dados epidemiológicos
Segundo o censo da Sociedade Brasileira de Nefrologia (SBN), realizado em
2007, a prevalência de pacientes em programa crônico de diálise aumentou de
24.000 em 1994 para 73.605 pacientes em 2007. A figura 1 demonstra a
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3
prevalência de pacientes em programa crônico de diálise (http://www.sbn.org.br).
A variação percentual anual estimada de 2004 a 2007 foi de cerca de 8,1%
(http://www.sbn.org.br). A figura 2 demonstra a porcentagem de pacientes em
hemodiálise e de pacientes em diálise peritonial (http://www.sbn.org.br).
Em trabalho populacional, recente, realizado com os habitantes de Bambui –
MG, observou-se que a prevalência de creatinina sérica elevada foi de 0,48% em
adultos, chegando a 5,09% na população mais idosa (>60 anos), o que projetado
para a população brasileira equivale acerca de 1,4 milhões de pessoas (Junior,
2004)
Figura 1 - Prevalência de Pacientes em Diálise no Brasil (1994 a 2007) –
Censo – SBN (http://www.sbn.org.br).
120
160
200
240
280
320
360
400
1994
1995
1996
1997
1998
1999
2002
2004
2005
2006
2007
Prevalência (pmp)
DataSUS/SBN
Pacientes em
diálise
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4
Figura 2 – Distribuição de pacientes em diálise no Brasil de acordo com o
tipo de diálise - Janeiro/2007 Censo - SBN – (http://www.sbn.org.br).
1.3 Diagnóstico da doença renal crônica
A estimativa da filtração glomerular (FG) representa uma ótima maneira de
mensurar a função renal e deve ser usada no estadiamento da DRC. O quadro 1
mostra o estadiamento da DRC (Junior, 2004).
Quadro 1. Estadiamento e classificação da doença renal crônica
Estágio Filtração Glomerular
(ml/min)
Grau de Insuficiência Renal
1 >90 Lesão Renal com Função Renal Normal
2 60-89 IR Leve ou Funcional
3 30-59 IR Moderada ou Laboratorial
4 15-29 IR Severa ou Clínica
5 <15 IR Terminal ou Dialítica
No estágio 1 encontram-se pacientes com função renal normal com histórico
familiar de doença renal, no estágio 2 os pacientes possuem uma insuficiência
renal leve, os níveis de uréia e creatinina sérica encontram-se em normais,
somente a partir do estágio 3 observa-se alterações no nível de creatina e uréia
Hemodiálise
Diálise Peritonial
90,8%
(N = 66.833)
9,2%
(N = 6.772)
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5
sérica, porém os sitntomas clínicos somente apareceram no estágio 4. Como uma
queda na FG precede o aparecimento de sintomas da falência renal ao se
monitorizar mudança na FG, estima-se o ritmo de perda da função (Filho, 2004).
1.4 Progressão da doença renal crônica
A doença renal pode progredir independentemente da presença do fator
inicial. Estudos em animais de laboratório mostram que a remoção cirúrgica de
grandes porções do rim causa alterações adaptativas dos néfrons remanescentes,
aumentando o fluxo sangüíneo, a FG e o débito urinário (Bregman, 2004). Os
mecanismos exatos responsáveis por estas alterações não são bem
compreendidos, mas envolve a hipertrofia dos néfrons remanescentes, bem como
as alterações funcionais que diminuem a resistência vascular, a reabsorção
tubular nos néfrons sobreviventes e a vasodilatação de suas arteríolas aferentes
(Brenner, Meyer & Hostetter, 1982). Essa hiperperfusão leva a uma hipertensão
glomerular com conseqüente hiperfiltração glomerular e lesão das estruturas
glomerulares (Brenner, Meyer & Hostetter, 1982).
Essas alterações funcionais e morfológicas determinam o aparecimento de
proteinúria, que estimula a proliferação mesangial, ao mesmo tempo em que as
proteínas passam a ser reabsorvidas em grande escala pelo túbulo contorcido
proximal. Esse intenso tráfego de proteínas é lesivo às estruturas tubulares tanto
pelo metabolismo como por suas substâncias agregadas. Concorrem para isso a
ativação citoplasmática do sistema de estimulação gênica NFKβ (fator nuclear Kβ)
e a produção local de espécies reativas de oxigênio (OH
.
, H
2
O
2
), hormônios,
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6
fatores de crescimento e citocinas. A presença de hipertensão arterial sistêmica
constitui fator importante de progressão, somando-se sinergicamente à
hipertensão glomerular (Levey et al., 1999).
A taxa de declínio da FG está relacionada com a doença de base (Levey,
1990; Walser, 1990; Austin et al., 1993; Ruggenenti et al., 2000), e, também, a
fatores modificáveis e não modificáveis (Hannedouche et al., 1993; Hunsicker et
al., 1997; Hovind et al., 2001). O quadro 2 apresenta os fatores relacionados à
evolução da DRC (Bregman, 2004).
Quadro 2. Fatores relacionados à evolução da DRC
Evoluem mais rapidamente
Nefropatia diabética, doenças glomerulares, doença renal policística, doença
renal do rim transplantado.
Evoluem mais lentamente
Nefroesclerose hipertensiva, doenças renais tubulointersticiais.
Fatores não modificáveis (evolução mais rápida)
Sexo masculino, idade avançada.
Fatores modificáveis (evolução mais rápida)
Maior proteinúria, hipoalbuminia, hipertensão arterial, controle glicêmico
ineficaz, fumo.
1.5 Quadro bioquímico e hematológico da insuficiência renal
Durante o curso da insuficiência renal, os pacientes apresentam incrementos
discretos, mas constantes de uréia e de creatinina plasmáticas. No início da
doença, as concentrações plasmáticas de sódio, potássio e fósforo permanecem
normais ou muito próximas do normal, com manutenção do pH em níveis
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7
fisiológicos e queda progressiva do bicarbonato plasmático (acidose metabólica
compensada) (Kamel et al., 2000; Hsu & Chertow, 2002).
Diariamente, um indivíduo normal gera de 13.000 a 20.000 mmol de ácido
volátil (ácido carbônico) e 40 a 60 mmol de ácidos fixos resultantes do seu
metabolismo. Esta carga ácida é eliminada através da integração entre os
sistemas de tampões, respiratório e renal (Gyton & Hall, 2006). Com a redução do
número de néfrons, os rins não conseguem exercer de maneira adequada esta
função. Assim, os pacientes portadores da DRC passam a apresentar acidemia
metabólica. A queda do pH para níveis acidóticos (pH < 7,32) ocorre em fases
mais avançadas da insuficiência renal (acidose descompensada) (Helou, 2004).
A manutenção do potássio corpóreo depende de um balanço integrado entre
a ingestão e a absorção do potássio pelo intestino e a sua eliminação pela urina e
fezes (Kamel et al., 2000). Na DRC observam-se mecanismos adaptativos para
aumentar a excreção de íons potássio pelos néfrons remanescentes, assim como
pelo intestino. Esses mecanismos possuem um limite e assim, a hipercalemia
poderá ser observada quando a FG atingir valores menores do que 10 ml/min
(Kamel et al., 2000). Com a progressão da doença, o nível plasmático de potássio
tende a se elevar e o cálcio mostra tendência à queda (Helou, 2004).
A insuficiência renal crônica está associada a alterações do metabolismo
ósseo, do cálcio e do fósforo. A osteodistrofia renal pode ser definida como uma
síndrome composta de uma variedade de alterações ósteo-articulares que
acometem a quase totalidade dos pacientes com DRC. As doenças ósseas da
DRC são decorrentes de um conjunto de alterações do metabolismo mineral que
provocam alterações hormonais dentre elas o desenvolvimento de
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8
hiperparatireoidismo secundário (Kates, Sherrard & Andress, 1997; Hsu &
Chertow, 2002).
O paratormônio regula os níveis séricos de cálcio e fósforo e em decorrência
da perda da função renal ocorre alteração na produção desse hormônio na
tentativa de manter os níveis adequados dos íons cálcio e fósforo. O
hiperparatireoidismo secudário decorre da retenção de fósforo, da hipocalcemia e
da deficiência de calcitriol, da proliferação autônoma de células da paratireóide, da
resistência óssea à ação do PTH, da alteração no controle da transcrição do gene
do PTH, das anormalidades nos receptores de cálcio e vitamina D das
paratireóides e alterações na degradação do PTH Hsu & Chertow, (2002).
Os pacientes portadores de DRC apresentam um perfil lipídico tipicamente
trombogênico. O tipo e a severidade da dislipidemia nesta população dependem
da doença de base e a ocorrência de doença coronariana freqüentemente se dá
com níveis normais de LDL-colesterol, concentrações plasmáticas elevadas de
triglicérides e níveis reduzidos de HDL-colesterol. Os níveis de VLDL e IDL-
colesterol apresentam-se elevados, juntamente com a elevação das
concentrações da apolipoproteína C-III e apolipoproteína E nestas frações
lipoprotéicas (Nestel, Fidge & Tan, 1982; Attman, Samuelsson & Alaupovic, 1993;
Lindner et al., 1974).
Os pacientes com DRC apresentam o exame de urina com hematúria,
leucocitúria e proteínúria. A proteinúria é um marcador de doença renal e constitui
um fator de risco independente para a sua progressão (Alves, 2004).
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9
A insuficiência renal determina o aparecimento de anemia e essa está
relacionada a diversas causas, tais como: deficiência de ferro, deficiência de ácido
fólico e vitamina B12, perdas sangüíneas, hemólise e inflamação (Hutchinson &
Jones, 1997) e sendo a deficiência relativa de eritropoetina o fator mais importante
(Radtke et al., 1979; McGonigle et al., 1984).
1.6 Técnicas dialíticas na insuficiência renal crônica
A diálise é um processo físico-químico pelo quais duas soluções separadas
por uma membrana semipermeável influenciam na composição uma da outra
(Fisbane & Paganini, 2001). Devem ser encaminhados à diálise pacientes com
insuficiência renal crônica, que apresentam sintomas de uremia, e aqueles em que
o tratamento conservador não é capaz de manter a qualidade de vida sem
prejuízo do seu estado nutricional ou agravamento de complicações crônicas da
uremia (Ajzen & Schor, 2002). Não existe um valor exato de uréia e creatinina que
determine o início do programa de diálise, mas, pode-se utilizar a média aritmética
dos clearences de uréia e creatinina. Quando essa média for menor ou igual a
10,5 ml/min/1.73m
2
, ou seja, os pacientes com clearence de cretinina entre 9 a 14
ml/min/1.73m
2
e clearence de uréia entre 6 e 7 ml/min/1.73m
2
devem ser
encaminhados a diálise (Held et al., 2004; Voneshe & Moran, 1999).
Na hemodiálise, o sangue obtido de um acesso vascular é impulsionado por
uma bomba para um sistema de circulação extracorpórea onde se encontra um
filtro (dialisador). No filtro, através de uma membrana semipermeável, ocorrem as
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10
trocas entre o sangue e o banho de diálise (dialisato). A hemodiálise crônica
normalmente é realizada três vezes por semana por quatro horas com fluxo de
sangue de 250-300 ml/min e fluxo de dialisato de 500 ml/min (Ajzen & Schor,
2002). Existem vários tipos de membranas: as de celulose (ex. cuprofano), de
celulose modificada (ex. acetato de celulose) e as sintéticas (ex. poliacrilonitrila,
polissulfona). As membranas sintéticas são menos bioincompatíveis (Burkart,
1999).
A diálise peritonial consiste no transporte de solutos e água através do
peritônio (membrana semipermeável) entre dois compartimentos: sangue nos
capilares peritoniais e solução de diálise na cavidade peritonial (d’Avila &
Figueredo, 1996).
A diálise peritonial crônica pode ser: DPAC (diálise peritonial ambulatorial
contínua) e DPA (diálise peritonial automática). A DPAC habitualmente envolve a
realização de quatro trocas por dia de 2,0 a 2,5 litros, permanecendo cada troca
cerca de 4-8 h na cavidade peritonial. Na DPA, de 3 a 10 trocas são realizadas
através de cicladora automática à noite. A DPA pode ser de dois tipos: DPCC
(diálise peritonial cíclica contínua), quando o paciente mantém solução de diálise
na cavidade peritonial durante o dia, e a DPIN (diálise peritonial intermitente
noturna) quando não ocorre diálise durante o dia (Fisbane & Paganini, 2001).
1.7 Doenças cardiovasculares na doença renal crônica
A doença cardiovascular (DCV) é a principal causa de morbidade e
mortalidade em pacientes com DRC (Appel, 1991; Attman & Alaupovic, 1991). Os
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11
fatores de risco para o desenvolvimento de doença cardíaca coronariana
aterosclerótica, são os tradicionais, como: a hipertensão arterial sistêmica, o
diabetes mellitus, a obesidade e a dislipidemia (Longenecker, Coresh & Powe,
2002; Bayés et al., 2005). São, também, fatores de riscos associados à uremia, a
hipervolemia, a anemia e o hiperparatireoidismo, os níveis séricos de cálcio e
fósforo, e a inflamação (Anavekar & Pfeffer, 2004; Bayés et al., 2005). A
mortalidade por DCV nesses pacientes é 10 a 30 vezes maior do que na
população em geral (Levey et al., 1998).
No entanto, o conjunto destes fatores não explica totalmente a alta incidência
de doença cardiovascular em pacientes com DRC (Bayés al., 2005). Outros
fatores de risco, conhecidos como novos ou não clássicos, são a homocisteína e o
estresse oxidativo (Kaysen, 2002; Koenig. 2003; Busch, Franke & Muler, 2004).
Mais recentemente, constatou-se que os pacientes urêmicos apresentam atividade
inflamatória aumentada e que essa atividade altera o colesterol HDL e o colesterol
LDL oxidado (Kaysen, 2002; Koenig, 2003).
Os pacientes urêmicos apresentam um estado micro-inflamatório crônico,
especialmente aqueles em tratamento dialítico (Wanner et al., 1999; Arici & Walls,
2001; Bellomo et al., 2003; Thomé et al., 2005). As proteínas de fase aguda
positiva, como a proteína C-reativa e outras, têm seus níveis aumentados (Arici &
Walls, 2001; Kaysen, 2002; Thomé et al., 2005). As citocinas também estão
elevadas, tais como: a interleucina-6, a interleucina-1, o fator de necrose tumoral
alfa, entre outras (Arici & Walls, 2001; Kaysen, 2002; Thomé et al., 2005). As
causas da estimulação dessas citocinas não são conhecidas, mas várias
possibilidades são propostas, tais como: a uremia, as infecções (HCV, infecções
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12
estafilocócicas ou fúngicas, periodontites e outras), o contato com o sistema
extracorpóreo de diálise, como linhas e filtros capilares com membranas não
idealmente compatíveis e a contaminação por resíduos da água usada no
dialisato, principalmente o pirogênio (Tetta et al., 2001; Thomé et al., 2005). Além
disso, a desnutrição, a doença renal de base e as co-morbidades ajudam no
processo de inflamação (Arici & Walls, 2001; Tetta et al., 2001; Thomé et al.,
2005).
1.8 Plaquetas
As plaquetas são fragmentos de células anucleadas ovais ou redondas com 2
a 4 μm de diâmetro. São formadas na medula óssea a partir de precursores
hematopoiéticos chamados megacariócitos, e são eliminadas da circulação pelo
sistema de macrófagos teciduais e do baço (Lee et al., 1998).
As plaquetas possuem muitas características funcionais. O seu citoplasma
possui moléculas e organelas, tais como: moléculas de miosina e actina, similares
àquelas encontradas nas células musculares; a trombostenina, uma proteína
contrátil; resíduos de retículo endoplasmático e aparato de Golgi, que sintetizam
várias enzimas e armazenam significativa quantidade de íons cálcio; mitocôndrias
e sistemas enzimáticos, que sintetizam ATP, ADP, prostaglandinas, um fator
estabilizador da fibrina e o fator de crescimento (Lee et al., 1998).
As plaquetas secretam proteínas que são estocadas nos grânulos α, grânulos
densos e lisossomos. As proteínas dos grânulos α incluem fatores específicos
(fator plaquetário 4) e proteínas comuns ao plasma (fibrinogênio, fibronectina). As
plaquetas sintetizam proteínas, tais como: trombospodina, fator von Willebrand,
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13
enzimas lisossomais, como: N-acetilglucosaminidases, β-galactosidases,
catepsinas e colagenases. Os grânulos densos contêm ATP, ADP, Ca
++
e
serotonina (Wu, 1996).
1.9 Alterações da função plaquetárias na doença renal crônica
A função plaquetária é deficiente em pacientes com insuficiência renal. Os
defeitos observados nas plaquetas incluem: diminuição de agonistas plaquetários
(Castaldi, Rozemberg & Stewart, 1966), anormalidade na aderência das plaquetas
(Salzman & Neri, 1966; Larsson, 1971), redução da ativação de pró-coagulantes
(Horowitz et al., 1970), diminuição na produção de tromboxano A
2
(Remuzzi et al.,
1983), aumento do cAMP (Matthiuas & Palinski, 1977), diminuição na retração do
coágulo (Lewis, Zucker & Ferguson, 1956), diminuição da glicoproteína de
membrana de plaqueta Ib (GPIb) (Sloand et al., 1991). O aumento na produção de
prostaglandinas pelo endotélio (Remuzzi et al., 1977), o acúmulo de várias
toxinas, tais como, o ácido guanidinosuccínico e a uréia (Cheney & Bonnin, 1962;
Horowitz et al., 1970; Gallice et al., 1980; Remuzzi et al., 1983) estão associados à
disfunção plaquetária. O tempo de coagulação e a agregação plaquetária são
anormais nesses pacientes (Remuzzi et al., 1978; Remuzi, 1989; Carvalho, 1990).
Anormalidades na adesão e na ativação plaquetária também são descritas, assim
como a trombocitopenia (Cecil & Bennett, 2001).
O sangramento devido ao quadro urêmico é usualmente mucocutâneo e
reflete anormalidade nas plaquetas e ou na função hemostática. A hemodiálise e a
diálise peritonial normalmente revertem o defeito hemostático induzido pela uremia
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14
(Lindsay et al., 1976; Nenci et al., 1979, Eknoyan & Brown, 1981; Fisbane &
Paganini, 2001). O sangramento é parcialmente explicado pelo defeito na
interação das plaquetas com a parede do vaso, e é caracterizado por um
prolongado tempo de coagulação (Remuzzi, 1989; Gordge & Neild, 1991; Rabelink
et al., 1994). A disfunção plaquetária é a principal responsável por defeitos na
hemostasia e é responsável pelas maiores alterações na coagulação nesses
pacientes (Larsson, 1971; Remuzi et al., 1978; Eknoyan & Brown, 1981).
Quando os pacientes são submetidos à diálise para corrigir a tendência ao
sangramento, observa-se uma ativação da coagulação, tais como, ativação
plaquetária e agregação como uns dos primeiros e mais importantes fenômenos
que ocorrem devido ao contato do sangue com o circuito extracorpóreo (Lindsay et
al., 1980; Buscaroli et al., 1991). Os estudos demonstram que os pacientes
submetidos à diálise apresentam um estado pró-trombótico (Lai, 1993; Sagripanti
et al., 1993). Pode ocorrer estímulo à cascata extrínseca da coagulação por
fatores teciduais (Callander & Rapaport, 1993) e observou-se também aumento da
geração de trombina in vivo (Tomura et al., 1991; Sagripanti et al., 1993; Mezzano
et al., 1996). Os pacientes com doença renal crônica possuem uma tendência
acelerada a desenvolver aterosclerose (Lindner et al., 1974).
Durante a sessão de hemodiálise, o sangue do paciente fica exposto, no
circuito extracorpóreo, a uma superfície de linhas, agulhas, filtro e ar que exibem
um variável grau de trombogenicidade, com a adesão de proteínas plasmáticas, a
aderência e a agregação de plaquetas, a geração de tromboxano A
2
, a geração e
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15
a ativação da cascata intrínseca de fatores de coagulação, levando assim a
formação de trombos no circuito extracorpóreo (Pereira et al., 1994).
A ativação plaquetária não ocorre somente devido a desgranulação dos
grânulos α, mas, também por mudanças conformacionais no complexo GP IIb/IIIa
e a outras respostas fisiológicas. Ocorre, também, uma elevação no nível de
várias proteínas plasmáticas como: o fator von Willebrand (Gordge & Neil, 1991), a
trombomodulina, que se apresenta elevada na fase avançada da doença renal
(Ishii, Uchiyama & Kazama, 1991) e o inibidor do ativador do plasminogênio 1
(PAI-1) que demonstra-se normal ou elevado em pacientes que realizam
hemodiálise (Nakamura et al., 1992; Gris et al., 1994; Hong & Yang 1994; Takagi
et al., 1994).
O tipo de membrana utilizada em hemodiálise apresenta diferentes
resultados. Pacientes que utilizam membrana de celulose apresentam maiores
alterações hemostáticas do que os que utilizam membrana de polissulfona
(Kawabata et al., 2002).
A alteração na agregação plaquetária em pacientes com insuficiência renal
crônica está caracterizada, mas os mecanismos envolvidos não estão
completamente elucidados. A ativação plaquetária durante a hemodiálise pode
ocorrer por vários fatores, incluindo ativação por contato e ativação de agonistas
como o ADP (Castaldi, Rozenberg & Stewart, 1966; Bloom & Evans, 1969; Frank
et al., 2001; Aggarwal et al., 2002). Portanto, mais estudos são necessários para
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16
elucidar os mecanismos envolvidos na ativação plaquetária em pacientes com
insuficiência renal crônica e naqueles que realizam hemodiálise.
1.10 Hemostasia
O endotélio vascular normal mantém o sangue fluido por inibição da
coagulação sangüínea, inibição da agregação plaquetária e a promoção da
fibrinólise, enquanto promove uma barreira que separa as células sangüíneas e os
fatores plasmáticos de alta reatividade dos elementos da parede do vaso (Roth,
1992; Marcus & Safier, 1993; Caen & Rosa, 1995). As células endoteliais inibem a
agregação plaquetária por vários mecanismos: liberação de prostaglandinas,
geração de óxido nítrico, manutenção de carga negativa de sulfato de heparan
que repele as cargas negativas das plaquetas e ação da enzima NTPDase que
hidrolisa o ADP (Marcus & Safier, 1993).
As plaquetas também parecem ser essenciais para a integridade da
monocamada endotelial, pois elas liberam fatores de crescimento para a
manutenção das células endoteliais. Uma coagulação rápida e eficiente é
dependente da ativação da agregação plaquetária, processo esse modulado por
outras células sangüíneas e pelo endotélio e denominado de tromboregulação
(Marcus & Safier 1993).
O reparo às lesões vasculares pelas plaquetas está baseado em várias
funções, a figura 3 demonstra o mecanismo de ativação plaquetária. Quando as
plaquetas entram em contato com a superfície vascular lesada imediatamente
mudam suas características (Wu, 1996), elas aumentam de volume, adquirem
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17
formas irregulares com numerosos pseudópodos irradiando-se pela superfície,
suas proteínas contráteis contraem-se fortemente e provocam a liberação de
grânulos que contêm múltiplos fatores ativos. Além disso, tornam-se viscosas e
aderem às fibras colágenas, secretam grande quantidade de ADP, ATP,
serotonina, epinefrina, norepinefrina, e suas enzimas sintetizam tromboxano A
2
,
que também é secretado para o sangue. O ADP é o principal responsável pela
ativação, recrutamento e indução da agregação plaquetária adicionando mais
plaquetas para esse micro-ambiente (Marcus & Safier 1993). Por conseguinte, na
área de qualquer ruptura de um vaso, a parede vascular lesada ou os tecidos
extravasculares iniciam um ciclo vicioso de ativação que atraem mais plaquetas ao
local da lesão (Siess, 1989). Esses eventos constituem o que se denomina
hemostasia primária. Posteriormente, ocorre interação entre proteínas da cascata
da coagulação e ativação plaquetária por contato, culminado na geração de
trombina, promovendo maior ativação plaquetária e recrutamento. Finalmente,
ocorre a formação de um tampão de fibrina (hemostasia secundária) (Dubyak &
Elmoatassim, 1993). Em condições normais, esse processo é regulado para
prevenir a excessiva formação de coágulos e a oclusão do vaso. Em condições
patológicas, como fissura de uma placa aterosclerórica, o processo normal de
hemostasia pode escapar do controle normal, resultando em oclusão do vaso
(Esmon, 1993).
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18
Figura 3. Mecanismo de ativação plaquetária e formação de trombos arteriais (Gachet, 2006). Primeiro as plaquetas
aderem à matrix subendotelial onde se ativam e liberam agonistas secundários como o ATP e ADP, que são
secretados dos grânulos densos, e TXA
2
que é sintetizado a partir do ácido araquidônico. Todos esses processos
levam à ativação da integrina αIIbβ3 que promove mudanças conformacionais na superfície da plaqueta, ligação do
fibrinogênio solúvel e fator de von Willebrand, e subseqüente agregação plaquetária. Por último, a trombina
desencadeia a formação de coágulo de fibrina que estabiliza o trombo.
1.11 Nucleosídeos e nucleotídeos extracelulares e purinoreceptores
Os nucleotídeos extracelulares são provenientes da ruptura celulares ou
liberados do citoplasma por meio de exocitose. As plaquetas representam uma
importante fonte de nucleotídeos que são liberados dos grânulos densos por
ativação plaquetária (Gachet, 2006). A figura 4 demonstra o modelo de ativação
dos receptores P2 em plaquetas.
O receptor P2Y
1
é amplamente distribuído nos tecidos, incluindo coração,
vasos sangüíneos, células da musculatura lisa, tecido neural, testículos, próstata e
ovários (Ralevic & Burnstock 1998). O receptor P2Y
1
está acoplado a proteína G
q
e provoca a ativação intracelular de PLC via Ca
2+
(Jin & Kunapuli, 1998). O ADP é
o agonista preferencial, já o ATP comporta-se como um antagonista em plaquetas
(Leon et al., 1997) ou como um agonista parcial, dependendo da densidade de
receptores (Filippov, Brown & Barnard, 2000; Birk et al., 2003; Waldo & Harden
2004). Os receptores P2Y
1
desencadeiam mobilização de cálcio dos estoques
internos e provocam mudanças na forma das plaquetas. A resposta ao ADP é
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19
considerada fraca e transitória, mas o receptor P2Y
1
é fundamental para iniciar a
agregação plaquetária (Hechler et al., 1998a; Hechler et al.,1998b; Jin, Daniel &
Kunapuli, 1998; Savi et al., 1998; Burnstock, 2006).
Os receptores P2Y
12
possuem distribuição limitada, embora não sejam
restritos às plaquetas, estando presentes também no cérebro, nas células
endoteliais, nas células gliais e nas células da musculatura lisa (Gachet, 2006). O
ADP é o agonista natural, ao passo que o ATP e os análogos trifosfatos são
antagonistas (Bodor et al., 2003; Kauffenstein et al., 2004). Este receptor está
acoplado a proteína G
i2
, e é responsável pela agregação plaquetária em resposta
ao ADP, possuindo assim um papel crucial na amplificação e indução da
agregação (Cattaneo et al., 2002).
O receptor P2X
1
está acoplado ao canal de cátion. O ATP ao ligar-se a esse
receptor induz um rápido influxo de cálcio (Mahaut-Smith et al., 2004), provocando
mudanças na forma das plaquetas em humanos (Rolf et al., 2001). Embora seja
incapaz de desencadear a agregação plaquetária por si só, o receptor P2X
1
tem
demonstrado participar da agregação plaquetária induzida pelo colágeno (Takano
et al., 1999; Mahaut-Smith et al., 2000; Oury et al., 2001; Cattaneo et al, 2002;
Hechler et al., 2003; Vial et al., 2003).
A adenosina é uma molécula que está envolvida em muitas respostas
fisiológicas em tecidos de mamíferos. Existem quatro receptores de adenosina
acoplados a proteína G: A
1
, A
2A
, A
2B
e A
3
, que atuam em mecanismos de
sinalização intracelulares distintos, e exibindo diversos padrões de distribuição
tecidual. Em plaquetas, os receptores A
2A
são conhecidos pela inibição da
agregação plaquetária, processo mediado pelo AMPc (Kawashima, Nagasawa &
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20
Ninomiya, 2000). Também, a adenosina atua em receptores A
2A,
causando
vasodilatação e, pode ainda, possuir uma ação antiinflamatória (Kawashima,
Nagasawa & Ninomiya, 2000).
As purinas e as pirimidinas controlam o tônus vascular através dos
receptores P2. O ATP, juntamente com a noradrenalina e neuropeptídeo Y, liga-se
a receptores P2X
1
, assim como em P2X
2
e P2X
4
na musculatura lisa do vaso,
resultando em vasoconstrição. A adenosina liberada pela hidrólise enzimática do
ATP liga-se a receptores P1(A
1
), e inibe a liberação de transmissores. Em
condições de injúria e hipóxia, as células endoteliais liberam ATP e UTP, que se
ligam a receptores P2Y
1
e P2Y
2,
levando a produção de óxido nítrico, o qual
promove a vasodilatação (Burnstock, 2006). Yamamoto et al. (2006)
demonstraram que receptores P2X
4
medeiam a liberação de óxido nítrico em
alguns vasos em resposta ao ATP.
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21
Figura 4. Modelo atual dos três receptores P2 em plaquetas (Gachet, 2006). O receptor P2X
1
é responsável pelo
rápido influxo de cálcio e mudanças conformacionais em plaquetas, em resposta ao ATP, e contribui para ativação
plaquetária induzida pela baixa concentração de colágeno. Os receptores P2Y
1
e P2Y
12
são essenciais para
agregação em resposta ao ADP: P2Y
1
é responsável pela mobilização de cálcio intracelular, pelas mudanças
conformacionais das plaquetas e inicia a agregação plaquetária, a ativação do receptor P2Y
12
completa a agregação
induzida pelo ADP e a potencializa, e induz a secreção de outros agentes através de várias rotas intracelulares.
Antagonistas seletivos permitem a discriminação dos papéis dos três receptores. O P2Y12 é alvo de drogas anti-
trombóticas como o ticlopidine e o clopidogrel, enquanto P2Y1 e P2X1são potenciais alvos de novos compostos
anti-agregantes.
As catecolaminas não podem ser consideradas verdadeiros mediadores da
agregação plaquetária. A serotonina, atuando em receptores 5-HT
2
, não pode
induzir agregação plaquetária em humanos, embora possa potencializar a
agregação induzida por noreprinefrina (Shah et al., 1999). Ambos, epinefrina e
norepinefrina, atuando em receptores α
2A
têm demonstrado induzir agregação e
potencializar a agregação em resposta ao ADP, trombina e tromboxano (Olbrich,
Aepfelbacher & Siess, 1989). O ATP pode potencializar a agregação plaquetária
induzida pela norepinefrina (Birk et al., 2002). Em contraste, a interação entre
serotonina e ATP não tem efeito sobre a agregação plaquetária, sugerindo que a
interação entre ATP e norepinefrina é específica (Birk et al., 2003).
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22
A sinalização purinérgica também controla mudanças nas células como a
proliferação, a diferenciação, a migração e a morte celular, estando envolvida em
várias patologias, tais como: restenose, hipertensão, aterosclerose e isquemia
(Burnstock, 2006). Existem estudos que evidenciam o papel da sinalização
purinérgica na regeneração de músculos, no controle do crescimento das células
vasculares, na formação da neoíntima associada à hipertensão. Também, vários
estudos relatam o papel da sinalização purinérgica no desenvolvimento e na
remodelação óssea (Hoebertz, Arnett & Burnstock, 2003, Burnstock, 2006).
1.12 E-NTPDase
A E-NTPDase 1-8 (Ecto-nucleosídeo trifosfato difosfoidrolase) é uma família
de ectonucleotidases, previamente classificada como ATPases do tipo E,
ATPDases, ecto-ATPases ou ecto-apirases. Essas enzimas caracterizam-se pela
hidrólise de resíduos de fosfato γ e β terminal de nucleotídeos formando
difosfonucleotídeos e/ou monofosfonucleotídeos, são dependentes de cátions
divalentes e insensíveis a inibidores clássicos de ATPases tipo P, F e V (Plesner,
1995).
A presença de enzimas que hidrolisam o ATP e/ou o ADP na superfície
celular foi descrita há décadas (Pearson, 1985; Plesner,1995; Zimmermann &
Pearson,1998). No entanto, a identificação molecular do primeiro membro da família
das NTPDases somente ocorreu em meados da década de noventa. O protótipo
dessa família foi clonado e seqüenciado em linfócitos e foi descrito como um
antígeno de membrana (CD39/NTPDase) (Maliszewski et al., 1994).
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23
Mas somente a partir de três abordagens independentes é que
conseguiram caracterizar as NTPDases (Robson, Sévigny & Zimmermann, 2006).
Handa e Guidotti (1996) purificaram e clonaram uma ATP difosfoidrolase solúvel
(apirase) de Sollanum tuberosum e clonaram o seu cDNA. A análise da seqüencia
revelou 25% de identidade na sua seqüência de aminoácidos e 48% de homologia
na sua seqüência de aminoácidos com o NTPDase descrito em humanos (Handa
& Guidotti, 1996). Em paralelo, ectonucleotidases (denominado ATP
difosfoidrolases) de pâncreas de suínos e aorta bovina foram purificados. As
seqüências parciais de aminoácido para ambas ATP difosfoidrolases revelaram a
identidade com a seqüência do CD39 (Kaczmarek et al., 1996). Os estudos
funcionais e de tromboregulaçao a partir do cDNA isolado de células endoteliais
humanas confirmaram que as ectonucleotidase vasculares (ATP difosfoidroalse)
eram idênticas as descrita anteriormente em linfócitos denominadas de CD39
(Kaczmarek et al.,1996). Quando se pensava que existia uma única
ectonucleotidase do tipo NTPDase com potencial modificações pós-traducionias (
Wang, Rosenberg & Guidotti,1997) foi clonado uma NTPDase que revelava
propriedades funcionais de uma ecto-ATPase (atualmente denominada
NTPDase2) em vez de uma ecto-ATP difosfoidrolase (Kegel et al.,1997; Kirley,
1997).
A partir da análise de seqüências expressas ou ESTs (Expressed Sequence
Tags) do genoma humano permitiu-se a identificação adicional dos genes dos
membros da família NTPDase (Chadwick & Frischauf, 1997; Chadwick &
Frischauf,1998; Chadwick et al.,1998). Esses genes foram originalmente
chamados de CD39L (ike) 1 a CD39L4. Após seguiram se a identificação, a
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24
clonagem e a expressão de todos os membros da família E-NTPDase, sendo a
última destas a NTPDase8 (Bigonnesse et al., 2004).
As NTPDases são originárias de um ancestral comum (Handa & Guidotti,
1996; Zimmermann & Braun, 1999; Paez et al., 2001; Bigonnesse et al., 2004;
Kukulski et al., 2005) e possuem cinco domínios de sucessão altamente
conservados denominados de ACR (regiões conservadas de apirase) (Handa &
Guidotti, 1996; Esch, Lemmon & Banker, 1999; Burnstock & Williams, 2000;
Communi et al., 2000; Kugelgen & Wetter, 2000; Abo-Salem et al., 2004) que são
partilhados e que se tornaram uma característica desta família (Zimmermann,
2001).
As NTPDases (1,2,3,8) são ancoradas a superfície celular possuem os
domínios C e N terminal transmembranicos, e possuem seus sítios catalíticos
localizados na porção extracelular, diferenciando-se pela capacidade de hidrolisar
nucleotídeos da adenina (Schulte et al.,1999; Grinthal & Guidotti, 2002; Arakaki et
al., 2003). A NTPDase 1 hidrolisa os substratos ATP e ADP com a mesma
velocidade, a NTPDase 3 e 8 demonstraram uma preferência pela hidrolisa do
ATP em relação ao ADP, a NTPDase 2 hidrolisa preferencialmente o substrato
ATP (Zimmermann, 2001; Kukulski et al., 2005). As NTPDases 5 e 6 exibem
localização na superfície intracelular e são secretadas após expressão heterologa,
hidrolisam preferencialmente o ADP. As NTPDases 4 e 7 são de localização
inteiramente intracelular (Robson, Sévigny & Zimmerman, 2006).
A NTPDase1 é uma proteína de massa molecular entre 70-100 kDa,
altamente glicosilada com seis sítios potenciais para glicosilação e outros
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25
domínios onde modificações pós-traducionais podem ocorrer (Maliszewski et al.,
1994; Esch, Lemmon & Banker, 1999; Zimmermann, 2001).
As NTPDases são expressas no endotélio vascular e estão associadas a
regulação dos nucleotídeos extracelulares e plasmáticos (Marcus et al., 1991;
Kaczmarek et al., 1996, Robson et al.,1997; Marcus et al., 2003; Robson et al.,
2005). Os nucleotídeos extracelulares são importantes mediadores de uma
variedade de processos incluindo inflamação e trombose (Robson et al., 2001). A
adenosina e o ATP medeiam mecanismos implicados no controle do tônus
vascular, assim como migração, proliferação e diferenciação das células
vasculares (Robson, Sévigny & Zimmerman, 2006).
A NTPDase 1 é a nucleotidase mais importante na tromboregulação (Enjyoji
et al., 1999; Sévigny et al., 2002). Porém, outras NTPDases também
desempenham papel importante nesse controle, recentemente estudos revelaram
a presença da NTPDase 2 em endotélio vascular e da NTPDase 5 em monócitos
(Chadwick & Frischauf,1998; Mulero et al., 1999; Zimmermann, 1999). A
NTPDase1 limita a ativação plaquetária por hidrolisar o ADP (Robson et al., 1997,
Marcus et al., 1991, Robson et al., 2000). Em contraste, a NTPDase 2,
hidrolisando preferencialmente o ATP e formando o ADP, teria um importante
papel na ativação plaquetária (Sévigny et al., 2002)
A solução purificada de NTPDase 1 bloqueou in vitro a agregação plaquetária
induzida por ADP (Enjoji et al., 1999). Acredita-se que isto se deva ao fato de a
hidrólise do nucleotídeo ADP, um agregante plaquetário, constituir uma importante
via para limitar a agregação plaquetária e a formação de trombos (Pilla et al.,
1996). Trabalhos atuais descrevem alterações na hidrólise do ATP, ADP e AMP
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26
em plaquetas de pacientes com diabetes, câncer de mama e níveis elevados de
colesterol (Lunkes et al., 2003; Araújo et al., 2005; Duarte et al., 2007). Estudo
recente, utilizando NTPDase 1 em formulação lipossomal, mostrou a amplificação
da atividade dessa enzima e o seu potencial para uso terapêutico para tratamento
de síndromes vasculares agudas (Haller et al., 2006).
1.13 Ecto-5’- Nucleotidase
A 5’-nucleotidase (CD73, EC 3.1.3.5) é uma enzima de 70 kDa (Lai & Wong,
1991; Zimmermann, 1992), que está presente em inúmeros tecidos como o
nervoso, o renal, o hepático, a placenta, o endotélio vascular e as plaquetas. Esta
enzima catalisa a hidrólise de AMP a adenosina (Barman, 1969), conforme o
esquema 1, abaixo:
AMP + H
2
O Adenosina + Pi
Esquema 1. Hidrólise do AMP (monofosfato de adenosina).
A 5’-nucleotidase é ativada por magnésio e participa da cadeia de hidrólise
dos nucleotídeos ATP e ADP até a formação de adenosina, atuando em conjunto
com enzimas que hidrolisam ATP e ADP, formam uma cascata hidrolítica (Shryock
& Belardinelli, 1997).
A enzima ecto 5’-nucleotidase está ancorada na superfície celular via glicosil
fosfatidil inositol (GPI) (Zimmermann, 2001), está presente em membrana de
plaquetas humanas e pode estar relacionada ao processo de agregação
plaquetária (Bergamani & Grazi, 1980). Alguns estudos também relacionam
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27
alterações da atividade da ecto-5’-nucleotidase a situações patológicas, como
isquemia (Schetinger et al., 1994; Frasseto et al., 2000). Também, recentes
estudos relacionam alterações da atividade em plaquetas de humanos com
diabetes e câncer de mama (Lunkes et al., 2003; Araújo et al., 2005).
1.14 Estresse oxidativo
As moléculas de oxigênio diatômico na atmosfera terrestre são as maiores
promotoras de reações celulares. Exceto aqueles organismos que são
especialmente adaptados para viver sob condições anaeróbicas, todos os animais
e plantas requerem oxigênio para uma eficiente produção de energia (Halliwell &
Gutteridge, 1989; Halliwell & Gutteridge, 2006). Normalmente, em torno de 95 a
98% do oxigênio absorvido pelos organismos aeróbicos é reduzido, formando-se
água na cadeia respiratória através do transporte de elétrons na mitocôndria, bem
como no retículo endoplasmático, onde o sistema enzimático citocromo, no
processo de fosforilação oxidativa, procede a redução tetravalente do O
2
pelo
sistema citocromo oxidase, fornecendo simultaneamente quatro elétrons para o
oxigênio, que se reduz diretamente à água (Halliwell & Gutteridge, 2006),
conforme esquema 2:
O
2
-.
+ 4H
.
+ 4 e
-
2H
2
O
Esquema 2. Redução do oxigênio.
As fontes que cedem os cátions de hidrogênio e os elétrons para a reação
são, basicamente, o NADH, o FADH e a ubiquinona ou coenzima Q (Halliwell &
Gutteridge, 1989; Halliwell, 2006). Todavia, de 2 a 5% do O
2
é reduzido
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28
univalentemente, processo em que uma molécula recebe apenas um elétron, o
qual vai ocupar um dos orbitais externos, ao mesmo tempo em que o outro
continua não parelhado, produzindo intermediários altamente reativos,
denominados espécies reativa de oxigênio (ROS), que constituem os radicais
livres (Halliwell, 2006). Forma-se então a primeira espécie tóxica reativa de
oxigênio, o superóxido, conforme esquema 3:
O
2
+ e
-
O
2
-.
Esquema 3. Formação do superóxido.
O radical livre nada mais é do que qualquer átomo, molécula ou íon que
possuem um ou mais elétrons livres na sua órbita externa. Essas partículas,
formadas por elétrons livres ou não pareadas têm uma instabilidade elétrica muito
grande, e por esta razão, mesmo tendo meia vida muito curta, apresentam grande
capacidade reativa, o que pode acontecer com qualquer composto que esteja
próximo, a fim de captar um elétron desse composto para sua estabilização,
independente de ser uma molécula, uma célula, ou tecido do organismo, a partir
do que, acontecem reações em cadeia de lesão celular. Devido a esta
característica, é denominado de substância oxidante. O oxigênio tem a sua
atividade fundamental no metabolismo celular aeróbico. Desta forma, a formação
de radicais livres pelo organismo em condições normais é inevitável, pois são
necessários no processo de respiração celular são produzidos pelos macrófagos e
neutrófilos utilizados na defesa do organismo contra invasores (Halliwell &
Gutteridge, 2006).
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29
O estresse oxidativo é definido como o excesso de formação e ou remoção
insuficiente de moléculas reativas, tais como: espécies reativas de oxigênio (ROS)
e espécies reativas de nitrogênio (RNS) (Turko, Marcondes & Murad, 2001;
Whaieb, 2001; Maritim, Sanders & Watkings, 2003). As ROS incluem radicais
livres, tais como: superóxido (O
2
.-
), hidroxil (OH
.
), peroxil (
.
RO
2
), hidroperoxil
(
.
HRO
2
-
), assim como espécies não radicais, que apesar de não possuírem
elétrons desemparelhados são muito instáveis, tais como: peróxido de hidrogênio
(H
2
O
2
) e ácido hidrocloroso (HOCL) (Turko, Marcondes & Murad, 2001; Evans et
al., 2002). As RNS incluem radicais livres, como: óxido nítrico (
.
ON) e dióxido de
nitrogênio (
.
NO
2
-
), assim como espécies não radicais, tais como: peroxinitrito
(ONOO
-
), óxido nitroso (HNO
2
) e peroxinitrato (RONOO) (Turko, Marcondes &
Murad, 2001; Evans et al., 2002).
O radical superóxido (O
2
-.
) é formado quando o O
2
sofre uma redução.
Isoladamente, esse radical é pouco reativo. Porém, os efeitos deletérios vêm da
habilidade deste em gerar radicais secundários, extremamente tóxicos como o
radical OH
.
(Halliwell, 2006).
O radical hidroxil (OH
.
) é um dos mais reativos e é capaz de retirar átomos
de hidrogênio do grupo metileno de ácidos graxos poliinsaturados, dando início à
peroxidação lipídica que acaba provocando a lise da membrana celular. Este
radical pode ser formado in vivo através de reações de íons de metais de
transição (Fé
++
) com peróxido de hidrogênio, através da reação de Fenton e de
Haber-Weiss (Halliwell, 2006).
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30
O óxido nítrico é normalmente produzido durante a conversão de arginina
para citrulina pela enzima óxido nítrico sintetase (Turko, Marcondes & Murad,
2001). O
.
ON regula o vasorelaxamento do endotélio por atuar na guanilato ciclase
nas células musculares lisas, iniciando uma cascata que leva ao vasorelaxamento
(Beckman & Koppenol, 1996; Vasquez-Vivar, Kalyanaraman & Martasek, 2003). O
.
ON possui também propriedades antiproliferativas e inibe a adesão vascular de
plaquetas e leucócitos (Turko, Marcondes & Murad, 2001).
O
.
ON reage com o superóxido, gerando moléculas altamente reativas como
ONOO
-
, que desencadeiam uma cascata de eventos prejudiciais à célula (Turko,
Marcondes & Murad, 2001; Evans et al., 2002). Portanto, a presença de O
2
.-
determina se
.
ON exerce um efeito de proteção ou de prejuízo. Estudos relatam
que o aumento de O
2
.-
possui um papel importante na patogênese da
aterosclerose (Stocker & Keaney, 2004). O O
2
.-
pode inativar o óxido nítrico e
diminuir a biodisponibilidade induzindo à disfunção endotelial. Alternativamente,
O
2
.-
pode promover oxidação do cofator da
.
ON sintetase, levando a diminuição da
produção de
.
ON e ao aumento de O
2
.-
(Vasquez-Vivar, Kalyanaraman &
Martasek, 2003). A reação produzida entre O
2
.-
e
.
ON forma uma molécula
oxidante forte, que é capaz de oxidar proteínas, lipídios e ácidos nucléicos,
causando dano às células vasculares (Beckman & Koppenol, 1996; Halliwell,
2006). Finalmente, O
2
.-
pode provocar modificações oxidativas em lipoproteínas de
baixa densidade que possuem um papel importante na formação de lesões
ateroscleróticas (Stocker & Keaney, 2004).
A peroxidação lipídica é um processo fisiológico contínuo que ocorre nas
membranas celulares. Além de ser um fator de renovação da membrana, este
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31
processo é essencial na síntese de prostaglandinas e leucotrienos, bem como na
fagocitose e na pinocitose (Gutteridge & Halliwell, 2000; Halliweell, 2002). No
entanto, a peroxidação lipídica também pode ser um indicador de processos
deletérios que envolvem a participação de radicais livres, podendo ser utilizado
para determinar efeitos citotóxicos (Ohkawa, Ohishi & Yagi, 1979). O estresse
oxidativo está implicado na alteração da atividade de muitas enzimas, como a
NTPDase 1, essa enzima está sujeita a alterações na sua forma sob condições de
estresse oxidativo que levam a inibição da atividade enzimática (Robson et
al.,1997; Fürstenau et al., 2004). Os seres vivos dispõem de mecanismos
protetores para evitar o acúmulo de espécies ativas de oxigênio e de seus efeitos
deletérios (Halliwell, 1994).
Os sistemas de defesa primários estão relacionados com as enzimas
removedoras de radicais livres. A superóxido dismutase remove o superóxido (O
2
.-
), enquanto que a glutationa peroxidase e a catalase removem o peróxido de
hidrogênio (H
2
O
2
) A atividade catalásica é a principal reguladora dos níveis
intracelulares de H
2
O
2
(Gaetani et al.,1989). Assim, a catalase pode responder às
condições que aumentam o estresse oxidativo, aumentando sua atividade (Jorns
et al., 1999).
O H
2
O
2
, quando presente, reage como o Fe
+2
ou Cu
+2
produzindo radicais
hidroxil (OH
.
) altamente reativos, contra o qual não existe nenhum sistema
enzimático de defesa (Jorns et al., 1999; Whaieb, 2001). Quando a atividade da
superóxido dismutase é baixa, o OH
.
pode ser produzido a partir de O
2
.-
pela
reação de Haber Weiss (Whaieb, 2001).
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32
Recentemente, vários estudos detectaram a presença de estresse oxidativo
em pacientes com doença renal. Existem algumas evidências que indicam que a
uremia está relacionada ao estresse oxidativo (Ichikawa, Kiyama & Yoshioka,
1994) e o tratamento de pacientes urêmicos com hemodiálise ou diálise peritonial
contribuiria para o estresse oxidativo e para a redução do nível de antioxidantes
nesses pacientes (Toborek et al., 1992; Epperlein, Nourooz-Zadeh &
Yayasena,1998). Existem estudos indicando que a membrana de hemodiálise
poderia ativar macrófagos durante as sessões de hemodiálise (Galle &
Quaschning, 2001). Porém, não existe um consenso na literatura sobre o papel da
uremia e da diálise sobre o estresse oxidativo.
1.15 Atividade da enzima delta aminolevulinato (δ-ALA-D)
A delta aminolevulinato deidratase (δ- ALA-D, E.C.4.2.1.24) é uma enzima
essencial para os organismos aeróbicos, ela participa da via biossintética do
heme, catalisando a condensação de duas moléculas de ácido aminolevulínico (δ-
ALA) produzindo proforbilinogênio (Gibson, Neuberger & Scott, 1955).
A δ-ALA-D é uma enzima sulfidrílica (Gibson et al., 1955) formada por oito
subunidades idênticas apresentando o zinco como cofator (Shemim, 1976;
Tsukamoto, Yoshinaga & Sano, 1979). Os resíduos de cisteína são sensíveis a
metais pesados (Farina et al., 2003; Nogueira et al., 2003; Perottoni et al., 2005),
moléculas de oxigênio e outros agentes oxidantes que induzem a formação de
ligações dissulfeto e levam a inibição enzimática (Spencer & Jordan, 1994 e
1995). Trabalhos recentes têm indicado que estados pró-oxidantes, podem causar
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33
inibição da δ-ALA-D in vivo (Flora & Seth, 1999; Folmer, Soares & Rocha, 2002;
Folmer et al., 2003; Soares, Folmer & Rocha, 2003). Além da insuficiente
produção de heme, a inibição da δ-ALA-D pode resultar no acúmulo do substrato
ácido aminoleulínico (δ-ALA) no sangue, que está relacionado com a
superprodução de espécies reativas de oxigênio (Monteiro et al., 1989).
O δ-ALA, substrato da enzima δ-ALA-D, sofre enolização e maior oxidação
aeróbica na presença de metais em pH fisiológico, produzindo radical superóxido
(O
2
.-
), peróxido de hidrogênio (H
2
O
2
) e radical hidroxila (OH
.
) (Oteiza et al., 1995).
Rocha et al. (2003) propuseram um modelo de dano oxidativo que ocorre
com a ferritina induzido pelo δ-ALA (Rocha et al., 2003). O δ-ALA é convertido
para enol formando (ALA
enol
) que catalisa o núcleo da ferritina pela presença de
fosfato. O enol formado mais o ferro reagem com o oxigênio, produzindo ânio
superóxido (O
2
.-
) e radical (ALA
.
), que reduzem o ferro e reagem com o oxigênio
produzindo ácido dioxovalérico (DOVA). Enquanto a oxidação do δ-ALA produz
ferro livre (Oteiza et al., 1995), o radical ALA e ânion superóxido, diretamente e/ou
pela reação Haber-Weiss e Fenton, produzem modificações sítio específicos nos
resíduos de triptofano e cisteína na ferritina.
A apoproteína da ferritina é um possível alvo para dano oxidativo catalisado
pelo Fe
2+
induzido pelo δ-ALA, levando a diminuição da habilidade para seqüestrar
o ferro. Além da ação do ferro sobre a ferritina, existem estudos que indicam que o
fosfato presente na ferritina pode contribuir para a oxidação do δ-ALA, facilitando a
sua enolização (deSilva, Guo & Aust, 1993).
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34
A insuficiência renal crônica é uma síndrome metabólica decorrente da perda
progressiva, irreversível e geralmente lenta da função dos rins (glomerular, tubular
e endócrina). Na doença renal crônica, observa-se uma complexa desordem
hemostática (Mezzano et al., 1996), essas alterações podem estar relacionadas a
atividade de enzimas que hidrolisam o ATP, o ADP e o AMP, devido à importância
desses nucleotídeos no controle da agregação plaquetária e da vasodilação.
Observa-se nesses pacientes um quadro inflamatório crônico, com elevação da
produção de citocinas. Além disso, estudos indicam que esses pacientes têm uma
produção alterada de radicais livres e/ou alterações nos sistemas antioxidantes. O
aumento do estresse oxidativo pode influênciar a atividade de algumas enzimas,
assim como, a inibição da atividade de algumas enzimas pode exarcebar a
produção de radicais livres. Esse estudo pretende ajudar a caracterizar essas
alterações e interligar-lás com o objetivo de elucidar os mecanismos envolvidos.
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35
2. Objetivos
A alteração na agregação plaquetária em pacientes com insuficiência renal
crônica está caracterizada, mas os mecanismos envolvidos não estão
completamente elucidados, o presente estudo pretende verificar uma possível
relação entre anormalidades hemostáticas e as alterações nas enzimas
ectonucleotidases, assim como a relação entre a uremia e a presença de estresse
oxidativo, para tanto pretende:
1 Verificar a atividade das enzimas NTPDase e 5’-nucleotidase em plaquetas
de pacientes com insuficiência renal crônica em tratamento pré-dialítico e
em tratamento regular de diálise.
2 Verificar uma possível relação entre alterações nas ectonucleotidases e a
severidade da doença renal crônica.
3 Verificar a relação entre o tempo de hemodiálise e a atividade das enzimas
NTPDase e 5´nucleotidase.
4 Verificar qual é o papel da uremia e da hemodiálise sobre o estresse
oxidativo.
5 Verificar a relação entre a atividade da enzima δ-ALA-D e a presença de
anemia em pacientes com doença renal crônica.
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36
PARTE II
Apresentação dos Artigos
Os resultados obtidos por esse trabalho deram subsídios para a publicação
de dois artigos científicos. O primeiro artigo refere-se à atividade das enzimas
NTPDase e 5’-nucleotidases em pacientes com doença renal crônica, e as
alterações na agregação plaquetária evidenciadas nesses pacientes, bem como
parâmetros bioquímicos. O segundo artigo apresenta as alterações observadas
com relação a produção de espécies reativas de oxigênio e a atividade das
enzimas catalase e δ-ALA-D.
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37
Capítulo 1:
Enzymes that hydrolyze adenine nucleotides in chronic renal failure:
Relationship between hemostatic defects and renal failure severity
Adriane C. Silva, André L.B. Morsch, Rafael F. Zanin, Maísa C. Corrêa, Luís C.
Arantes, Maria C. Araujo, Vera M. Morsch, Maria R.C. Schetinger, artigo publicado
Biochimica et Biophysica Acta, v. 1741, p. 282 – 288, 2005.
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45
Capítulo 2 :
Oxidative stress and δ-ALA-D activity in chronic renal failure patients.
Adriane C. da Silva, André L. B. Morsch, Rafael F. Zanin, Rosilene Kaizer, Luís C.
Arantes, Luís A. Silva, Vera M. Morsch, João B.T. Rocha, Maria R.C. Schetinger.
Artigo publicado pelo periódico Biomedicine & Pharmacotherapy, v. 61, p. 180-
185, 2007.
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52
PARTE III
1. Discussão
Nesse estudo, os dados obtidos resultaram de uma análise in vitro das
enzimas NTPDase e 5’-nucleotidase em plaquetas de pacientes com doença renal
crônica. As enzimas NTPDase e 5’-nucleotidase foram analisadas para verificar a
participação dos nucleotídeos da adenina na função plaquetária de pacientes com
insuficiência renal crônica que realizam hemodiálise e nos pacientes com doença
renal crônica que não fazem hemodiálise, mas realizam tratamento conservador.
Estes resultados foram comparados com o grupo controle constituído de
indivíduos saudáveis de mesma faixa etária. Esse estudo teve por objetivo
verificar uma possível relação entre as anormalidades hemostáticas e a
severidade da DRC em pacientes que realizam hemodiálise e em pacientes que
não realizam hemodiálise. Além disso, verificou-se a influência do tempo que o
paciente realiza hemodiálise sobre a atividade das enzimas NTPDase e 5’-
nucleotidase. Este trabalho foi aprovado pelo comitê de Ética da Universidade
Federal de Santa Maria, resolução nº 196/96.
Também, avaliou-se o papel da uremia e da hemodiálise sobre o estresse
oxidativo. Para tanto, foram determinados os níveis de TBARS em soro e em
hemácias de pacientes com DRC e a atividade da enzima catalase. Além disso,
analisaram-se a relação entre a atividade da δ-ALA-D e a presença de anemia em
pacientes com DRC.
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53
Foram realizadas dosagens bioquímicas de: creatinina, uréia, fósforo
inorgânico, albumina, cálcio, potássio, transferrina, ferritina, ferro, PTH e dosagens
hematológicas da hemoglobina e hematócrito.
1.1 Perfil bioquímico e hematológico
Na análise do perfil bioquímico pode-se afirmar que o grupo controle
apresentou determinações bioquímicas dentro dos valores normais quanto a
creatinina, uréia, cálcio, fósforo inorgânico, albumina, potássio, transferrina, ferro,
ferritina e PTH. Além disso, os dados demonstraram valores normais para a
hemoglobina e o hematócrito. Em conjunto, estes dados permitiram utilizar o grupo
controle como referência para as análises posteriores.
Os pacientes que realizam hemodiálise (HD) demonstraram valores elevados
para creatinina, uréia, fósforo, potássio, transferrina, ferritina e PTH. Este grupo
apresenta valores reduzidos para transferrina, hematócrito e hemoglobina. Essas
alterações apresentadas condizem com as alterações bioquímicas e
hematológicas que normalmente são encontradas nesses pacientes.
Os pacientes que realizam tratamento conservador apresentaram um quadro
bioquímico melhor do que o grupo que realiza hemodiálise, demonstrando valores
elevados para creatinina e uréia, mas inferiores aos apresentados pelo grupo HD.
Apresentaram, também, ferritina elevada, devido à presença de anemia, a qual foi
evidenciada pela diminuição da hemoglobina e do hematócrito. O PTH também
apresentou valores elevados. Normalmente, as alterações nos níveis de PTH
aparecem precoce e progressivamente à medida que a função renal se reduz
(Block & Port, 2000). Os pacientes ND apresentaram valores normais para o
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54
fósforo e cálcio. Normalmente, observam-se alterações nesses íons somente em
fases bem adiantadas da insuficiência renal crônica (Hsu & Chertow, 2002).
Na doença renal crônica, observam-se mecanismos adaptativos para
aumentar a excreção de íon potássio nos néfrons remanescentes e também no
intestino. Estes mecanismos têm limite e assim, a hipercalemia será observada
quando a filtração glomerular atingir valores menores do que 10 ml/min.
Entretanto, a hipercalemia também poderá ocorrer em certas situações em que a
redução da filtração glomerular for moderada, ou seja, a FG estiver entre 10 e 60
ml/min. Tais situações podem estar associadas ao consumo de medicamentos
que dificultam a eliminação do potássio pelos rins, a ingestão excessiva de íon
potássio, a oligúria (diminuição do volume urinário), a lise celular, como ocorrem
no caso de convulsões, traumas e hemólise (Kamel et al., 2000). Nesse estudo, o
grupo HD apresentou valores elevados para potássio, porém, o grupo ND
apresentou valores normais, porque a função renal nesses pacientes não está tão
comprometida como no grupo HD.
O tempo de agregação plaquetária apresentou-se alterado nesses pacientes,
demonstrando uma baixa capacidade de agregação plaquetária induzida pelo ADP
quando comparado ao grupo controle, sendo que esses resultados estão de
acordo com estudos prévios (Malyszko et al., 1996). Os resultados demonstraram
que a adição de apirase purificada aumentou o tempo de agregação plaquetária,
confirmando o papel anti-agregante da apirase, e ainda, a adição de serotonina
provocou uma rápida agregação seguida de desagregação. Além disso, em todos
os experimentos de agregação plaquetária realizados na presença da apirase,
observaram-se valor superior a 180s, considerado um tempo limite para
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55
agregação plaquetária, sendo que tais valores persistiram mesmo na presença de
ADP e serotonina.
1.2 Atividade das enzimas NTPDase e 5’- nucleotidase em plaquetas de
pacientes com DRC
O grupo controle apresentou valores da atividade da enzima NTPDase, para
os substratos ATP e ADP, e da enzima 5’-nucleotidase, para o substrato AMP,
dentro de valores previamente estabelecidos (Pilla et al., 1996).
A enzima NTPDase apresentou um aumento na sua atividade para os
substrato ATP e uma redução da sua atividade para o substrato ADP em
pacientes em programa regular de hemodiálise. Entretanto, os pacientes que
realizam tratamento conservador (ND) apresentaram um valor normal de hidrólise
para o substrato ATP e uma diminuição na atividade de hidrólise para o substrato
ADP. A hidrólise excessiva do ATP pela NTPDase leva a formação de ADP e,
juntamente com a inibição da hidrólise do ADP ocasiona um acúmulo de ADP, um
agregante plaquetário. Os resultados sugerem que o acúmulo de ADP poderá ser
maior em pacientes em HD, isto pode ser atribuído ao papel pontecializador da
hemodiálise sobre a agregação plaquetária. Esse acúmulo de ADP pode resultar
em ativação dos receptores P2Y
1
e P2Y
12
em plaquetas, possibilitando inferir que
esses nucleotídeos estão envolvidos no desenvolvimento precoce de DCV nesses
pacientes. O acúmulo de ADP também poderia atuar prevenindo o sangramento
que esses pacientes tendem a apresentar devido à uremia elevada.
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56
A hidrólise aumentada do ATP pode estar relacionada também à atividade de
outras ATPases que não a NTPDase1. A NTPDase 2 hidrolisa preferencialmente o
ATP (Mateo, Harden & Boyer 1999; Kegel et al., 1997), promovendo a agregação
plaquetária na presença do ATP e facilitando esse processo na presença do ADP
(Sévigny et al., 2002). Sévigny et al. (2002) descreveram o papel das NTPDases
em plaquetas e sugerem que a NTPDase1 e 2 provavelmente teriam efeitos
opostos sobre a agregação plaquetária. Outra enzima que poderia estar envolvida
na hidrólise excessiva do ATP é a NMPP (5’-Nucleosídeo monofosfato
fosfoanidrolase fosfodiesterase) descrita por Birk et al. (2001 e 2002). Na
presença dessa enzima o ATP é hidrolisado diretamente para AMP e, portanto,
teria um efeito anti-agregante, devido a subseqüente geração de adenosina.
Apesar do acúmulo do ADP o tempo de agregação plaquetária foi estendido
nesses pacientes isso pode estar relacionado a desensibilização dos receptores
P2 ou ao aumento de adenosina.
A atividade da enzima 5’-nucleotidase apresentou valores aumentados tanto
em pacientes que realizam hemodiálise como em pacientes em tratamento
conservador, que não realizam hemodiálise. O aumento da atividade da 5’-
nucleotidase promoveu um incremento na hidrólise do AMP, proporcionando uma
elevação nas concentrações de adenosina, um conhecido inibidor da agregação
plaquetária que atua em receptores A
2
inibindo a atividade do ADP. A adenosina
também é conhecida por possuir ação vasodilatadora. Esse aumento da atividade
da 5’-nucleotidase pode ser uma resposta fisiológica na tentativa de inibir a
agregação plaquetária e manter a vasodilatação (Kawashima, Nagasawa &
Ninomiya, 2000).
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57
Apesar do acúmulo do ADP o tempo de agregação plaquetária foi estendido
nesses pacientes isso pode estar relacionado a desensibilização dos receptores
P2 ou pode ser atribuído ao aumento de adenosina.
Esse estudo também avaliou a correlação entre o nível de hidrólise dos
nucleotídeos ATP, ADP e AMP, e a concentração sérica de creatinina. Os
resultados apresentados demonstraram uma correlação positiva entre o aumento
da hidrólise do ATP e do AMP com a concentração de creatinina, e uma
correlação negativa entre a hidrólise do ADP e a concentração de creatinina.
Também foi realizada uma correlação entre a hidrólise dos nucleotídeos ATP,
ADP e AMP e a concentração sérica de uréia. Foi observada uma correlação
positiva entre a hidrólise dos nucleotídeos ATP e AMP e uma correlação negativa
com a hidrólise do ADP. Esses resultados permitiram inferir que uma elevação na
uremia estaria relacionada com as anormalidades hemostáticas, como
demonstrado pela alteração das enzimas NTPDase e 5´-nucleotidase. Assim, a
hemodiálise pode ter uma ação secundária sobre a ativação plaquetária.
Para avaliar o papel da hemodiálise na degradação dos nucleotídeos ATP,
ADP e AMP foram comparados o tempo de hemodiálise e os níveis de hidrólise do
ATP, ADP e AMP. Observou-se que no período de 25 a 96 meses houve alteração
na hidrólise do ATP, sendo que houve um pico de hidrólise no tempo 49-72 meses
de hemodiálise. Tais resultados demonstram que o tempo de hemodiálise
influenciou na degradação do ATP e que a partir de 96 meses de hemodiálise
provavelmente o organismo tenha sofrido uma adaptação. Houve uma diminuição
acentuada na hidrólise do ADP no período entre 49-72 meses de tratamento com
hemodiálise. Foi observado que esse período condiz com o período em que houve
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58
maior hidrólise do ATP. Ainda, constatou-se que no período de 49-72 meses
houve maior hidrólise do AMP. Considerando que os períodos de maiores
alterações na atividade da NTPDase e 5’-nucleotidase são condizentes, pode-se
sugerir que em períodos anteriores e posteriores os mecanismos compensatórios
estariam provavelmente limitando as anormalidades hemostáticas.
Os pacientes com doença renal crônica, quando comparados à população
geral, apresentam maior prevalência de DCV, incluindo doença coronariana,
cérebro-vascular, vascular periférica e insuficiência cardíaca (Levey et al., 1998).
Alguns estudos demonstraram que o desenvolvimento da DCV é precoce no curso
da DRC (Levin et al., 1996; Barrett et al., 1997; Culleton et al., 1999). Além disso,
as doenças cardiovasculares constituem a principal causa de óbito nos pacientes
com DRC (Shulman et al., 1989; Wannamethee, Shaper & Perry, 1997; Jungers et
al., 1999).
Quando comparados à população em geral, os pacientes com DRC
apresentaram uma maior prevalência de fatores de risco “tradicionais” para DCV
(Levey et al., 1998; Parfrey, 2000). São considerados fatores de risco “tradicionais”
aquelas variáveis definidas na população geral através de estudos, que se
associam à ocorrência de DCV, tais como a presença de hipertensão e o diabetes
mellitus. Outros fatores de risco associados à DCV são relacionados à DRC e
foram denominados fatores de risco “não tradicionais”. Estes incluíram
anormalidades hemodinâmicas e metabólicas decorrentes da disfunção renal. A
prevalência de muitos dos fatores não tradicionais aumenta à medida que a
função renal diminui. Entre eles estão a anemia, os distúrbios do metabolismo do
cálcio e do fósforo, a hipervolemia, a hiperhomocisteína, a desnutrição, a
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59
inflamação e o aumento do estresse oxidativo (Levey et al., 1998; Parfrey, 2000;
Coresh, Wei & Mcquillan, 2001). Os dados encontrados nesse trabalho vêm a
acrescentar fatores adicionais que levariam a uma DCV precoce nesses
pacientes. Pode-se inferir que tanto uremia como a hemodiálise tem influência nas
desordens hemostáticas apresentadas nesses pacientes.
1.3 Estresse oxidativo
Existem muitos estudos descrevendo o papel das espécies reativas de
oxigênio sobre o dano renal e a doença DCV precoce nesses pacientes (Annuk et
al., 2001; Morena et al., 2005; Zalba, Fortuno & Diez, 2006). As espécies reativas
de oxigênio estão envolvidas em várias alterações em nível renal como: na
glomerulonefrite, na falência renal aguda ou progressiva, na nefrite
tubulointersticial (Ichikawa, Kiyama & Yoshioka, 1994; Klahr, 1997). Além disso,
devido ao impacto sobre a regulação do ciclo celular (Shakelford, Kaufmann &
Paules, 2000), as espécies reativas de oxigênio podem contribuir para hipertrofia
das células tubulares (Hannken et al., 2000). No sistema vascular, a interação de
O
2
.-
com
.
ON parece ser muito importante. O papel do
.
ON na vasodilatação é
inativado pela presença de O
2
.-
(Rubanyi, Romero & Vanhoutte, 1986) e produtos
da sua reação (ONOO
-
) favorecendo a formação de mais ROS, tais como OH
.
(Halliwell, Zhao & Whiteman, 1999). O produto da reação entre O
2
.-
e
.
ON, o
peroxinitrito, trata-se de uma molécula fortemente oxidante, que é capaz de oxidar
proteínas, lipídios e ácidos nucléicos, causando dano à parede do vaso (Beckman
& Koppenol, 1996). As conseqüências para o sistema vascular são as disfunções
do endotélio e as alterações na renovação celular (Galle et al., 1995). O O
2
.-
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60
facilita modificações oxidativas de proteínas de baixa densidade que têm um papel
importante na formação das lesões ateroscleróticas (Galle et al., 1995; Stocker &
Keaney, 2004).
A peroxidação lípidica foi determinada em pacientes com DRC, medindo-se o
nível de produção de TBARS em soro e em hemácias de pacientes com HD e ND.
Os resultados encontrados demonstram aumento dos níveis de TBARS em soro e
hemácias de pacientes HD. Já os pacientes ND apresentaram o nível de TBARS
alterado somente em soro. Essa diferença pode estar relacionada com o quadro
bioquímico mais grave nos pacientes HD. Esses pacientes possuem um quadro
urémico mais complicado, com níveis de creatinina e uréia mais elevados que o
grupo ND. Conforme dados demonstrados, a alteração do nível de TBARS em
hemácias de pacientes HD pode estar correlacionada ao grau de anemia mais
grave nesses pacientes que no grupo ND e a alteração na atividade de ALA-D
presente nesses pacientes. Espécies reativas de oxigênio podem, parcialmente,
explicar a diminuição da sobrevida das hemácias. Outros trabalhos também
relataram uma elevação no nível de MDA, um marcador de peroxidação lipídica
(Weinstein et al., 2000) e um severo prejuízo no conteúdo da vitamina E em
eritrócitos (Cristol et al., 1997; Gallucci et al., 1999).
A atividade da catalase apresentou-se elevada nos pacientes HD e ND.
Esses resultados permitem inferir que essa ativação pode ser um mecanismo
compensatório ao elevado nível de estresse oxidativo, conforme já descrito por
outros estudos (Richard et al., 1991). Existem evidências sugerindo um aumento
das enzimas antioxidantes e da severidade da DRC (Morena et al., 2005). Estudos
indicaram que o prejuízo para o sistema enzimático antioxidante é principalmente
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devido à uremia, ao passo de que hemodiálise promoveria alterações no nível de
estresse oxidativo, principalmente devido a perdas de antioxidantes não
enzimáticos no processo de hemodiálise (Morena et al., 2005).
As alterações enzimáticas e não enzimáticas apresentadas nesse trabalho
demonstraram um quadro bioquímico que favorece o desenvolvimento de doenças
cardiovasculares precoce nesses pacientes como evidenciado pela tendência à
agregação plaquetária e à produção de espécies reativas de oxigênio. Esse
trabalho permite inferir que a uremia é o principal determinante da elevação do
estresse oxidativo apresentado por esses pacientes.
1.4 Atividade da enzima delta aminolevulinato deidratase (δ-ALA-D)
A atividade da δ-ALA-D apresentou-se diminuída, em ambos os grupos HD e
ND e esta inibição leva ao acúmulo de δ-ALA, uma substância que induz ao
estresse oxidativo, conforme estudos anteriores (Rocha et al., 2003). Os dados
desse trabalho confirmaram a relação entre o acúmulo de δ-ALA e o estresse
oxidativo, como observado pela correlação negativa entre a inibição da atividade
da δ-ALA-D e o aumento da peroxidação lipídica, e uma correlação também
negativa entre a atividade da δ-ALA-D e o aumento da atividade da catalase. O
acúmulo do δ-ALA está relacionado ao aumento de espécies reativas de oxigênio
(ROS) e pode contribuir para o estresse oxidativo causado pelo quadro urêmico.
Esse trabalho também sugere que a uremia pode estar influenciando na alteração
da atividade da δ-ALA-D.
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62
Estudo anterior propôs que o acúmulo do substrato δ-ALA é um dos
principais responsáveis pelas modificações nos resíduos de triptofano e cisteína
na ferritina e o relacionaram também à presença de estresse oxidativo. Esse
estudo apresentou também uma correlação entre o acúmulo de δ-ALA e o
aumento da ferritina (Rocha et al., 2003). Nossos resultados mostraram que
ambos pacientes apresentaram diminuição da δ-ALA-D e nível de ferritina elevado.
Esse trabalho indicou, também, uma relação entre a diminuição da atividade da δ-
ALA-D e a presença de anemia, demonstrando o papel preponderante da δ-ALA-D
na síntese do heme, como já proposto por outros autores (Zaman, Zaman &
Batcabe et al., 1993). Esse trabalho sugere que o acúmulo de δ-ALA leva a
alterações na síntese do heme e no aumento da produção de espécies reativas
de oxigênio, sugerindo também que a alteração nas defesas antioxidantes, assim
como o efeito do acúmulo de metabólicos tóxicos, estão envolvidos na alteração
da enzima δ-ALA-D e conseqüentemente na elevação do estresse oxidativo. Tais
achados sugerem que se forma um ciclo de dano celular que pode explicar a
presença de doença cardiovascular acentuada nesses pacientes com morte
prematura.
A doença renal crônica caracteriza se por alterações nas ectonucleotidases e
essas estão implicadas na hemostasia, a alteração na atividade dessas enzimas
pode estar relacionada não somente à uremia e ao efeito secundário da diálise,
mas ao aumento do estresse oxidativo, que ficou caraterizado nesse trabalho pelo
aumento da produção de malondialdéido e alterações nas enzimas catalase e δ-
ALA-D. A alteração da atividade da δ-ALA-D pode estar relacionado ao aumento
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63
do estresse oxidativo e essa alteração da atividade da δ-ALA-D pode estar
exarcebando o estresse oxidativo formando um ciclo de dano celuar, essas
alterações em conjunto explicam o desenvolmento de DCV precoce nesses
pacientes.
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2. Conclusões
Os dados obtidos no presente estudo permitem apresentar as seguintes
considerações:
1. Esses resultados permitem inferir que a uremia está relacionada às
anormalidades hemostáticas, como demonstrado pela alteração das
enzimas NTPDase e 5’-Nucleotidase, e a diálise exerceria um efeito
secundário sobre essas alterações.
2. Essas anormalidades na ativação plaquetária podem estar
relacionadas ao desenvolvimento e a elevada mortalidade por doenças
cardiovasculares apresentadas por esses pacientes.
3. Pode-se inferir que a uremia tem um papel determinante sobre a
produção de espécies reativas de oxigênio e a hemodiálise possui um
efeito pontecializador, como observado pela alteração na produção de
malondialdeído elevada em hemácias de pacientes que realizam
diálise, isso pode ser atribuído ao processo de hemodiálise e o uso de
membranas não inteiramente biocompatíveis.
4. O aumento da atividade da catalase provavelmente esta relacionada a
uma medida compensatória devido o aumento de radicais livres.
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65
5. A atividade da δ-ALA-D apresentou-se diminuída, em ambos os
grupos HD e ND. O acúmulo de ALA pode estar influenciando o
estresse oxidativo observado nesses pacientes ao mesmo tempo, que
o nível de estresse oxidativo pode estar influenciado na atividade da δ-
ALA-D, formando um ciclo de destruição.
6. A inibição da δ-ALA-D pode estar correlacionada à presença de
anemia observada nesses pacientes.
7. Os resultados apresentados por esse trabalho permitem inferir que as
alterações tanto em nível de hemostasia como a presença de estresse
oxidativo podem estar exercendo influência sobre a presença de DCV
precoce nesses pacientes.
8. Porém esse trabalho foi o primeiro a abordar as alterações apresentas
sobre a atividade de ectonucleotidases e coloborou para explicar
melhor a alterações no nível de estresse oxidativo, sendo necessários
mais estudos para compreender melhor as alterações apresentadas
por esses pacientes.
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3. Perspectivas
Esse estudo demonstrou várias alterações em pacientes com insuficiência
renal crônica. Muitas delas ajudam a explicar a tendência a desenvolver doença
cardiovascular precoce nesses pacientes e o nível inflamatório elevado. A partir
desse estudo espera-se que outros venham a agregar conhecimentos necessários
para explicar essas alterações. Com base nos resultados apresentados nesse
trabalho, faz-se necessário:
1. Verificar o efeito da administração de heparina em plaquetas de
camundongos sobre a atividade das enzimas NTPDase e 5´-nucleotidase.
2. Verificar a atividade da NTPDase e 5’-nucleotidase em pacientes que
realizam hemodiálise utilizando membrana sintética de polissulfona e
poliacrilonitrila.
3. Investigar o efeito da administração do ferro, vitamina C e eritropoetina
sobre a produção de espécies reativas de oxigênio em pacientes com
doença renal crônica.
4. Determinar a oxidação LDL.
5. Determinar a atividade da glutationa peroxidase em hemácias de pacientes
com doença renal crônica.
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6. Determinar e acompanhar a dosagem de alumínio em pacientes com
insuficiência renal crônica e correlacionar com as alterações sobre a
produção de espécies reativas de oxigênio.
7. Verificar a influência da presença de doenças infecciosas e as alterações
na produção de espécies reativas de oxigênio em pacientes com doença
renal crônica.
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4. Bibliografia
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