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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
INSTITUTO DE QUÍMICA
Programa de Pós-Graduação em Química
FLORIPES FERREIRA DE OLIVEIRA
Caracterização físico-química de amostras de
óleo de pinho e estudo da ação de sistemas
tensoativos na atividade antimicrobiana de
ativos fenólicos.
SÃO PAULO
Data do Deposito na SPG:
07/05/2008
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FLORIPES FERREIRA DE OLIVEIRA
Caracterização físico-química de amostras de
óleo de pinho e estudo da ação de sistemas
tensoativos na atividade antimicrobiana de
ativos fenólicos.
Tese apresentada ao Instituto de
Química da Universidade de São
Paulo para obtenção do Título de
Doutor em Química (Química
Analítica)
Orientador: Prof. Dr. Jivaldo do Rosário Matos
SÃO PAULO
2008
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Aos meus pais,
Hilda e Olegário e a
minha irmã Fátima.
AGRADECIMENTOS
Ao Prof. Dr. Jivaldo do Rosário Matos por orientar, incentivar e valorizar a
realização deste trabalho.
À Profa. Dra. Silvia Eguchi pela total disposição em colaborar durante a
execução deste trabalho e pela satisfação da amizade criada.
À Maria Inácia e Ana Rodrigues pela satisfação em me receber e passar
valiosas informações sobre os conceitos e as práticas de um laboratório de
microbiologia e a imensa satisfação de tê-las como amigas.
À Luiza Okubo por todo apoio dado e pelas oportunidades oferecidas para
execução deste trabalho.
Ao Senhor Oleg Schevciw e Patricia Busko Di Vitta pelas colaborações dadas.
À Colgate-Palmolive por abrir as portas de seu laboratório e em especial a
Lucas Assis, Marcos Amendola, Miriam Maeda, Paulo Kolle e Ricardo Gomes.
À Raquel Silva pela colaboração na execução das análises de CG-MS e à
Márcia Longarço pelas revisões feitas.
Às empresas Dierberger, Dow, Lanxess, Mahler, Oxiteno, Rhom and Haas e
Stepan, pelo fornecimento das matérias primas ou apoio na condução de análises.
Aos colegas do LATIG, pela convivência, amizade e companheirismo.
À Luciana, Renato, Senhor Francisco, funcionários da biblioteca e da seção
de Pós-graduação pelo apoio prestado.
Ao meu amigo Ricardo, pela amizade, confiança e apoio que sempre
depositou em mim.
Aos meus colegas, amigos e companheiros de viagens Daniela, Decio, Edson,
Helena, Márcia, Maritza, Mauricio, Paulo, Virgínia.
Aos meus tios e primos por compreenderem a minha ausência.
E em especial à minha mãe, ao meu pai e à minha irmã pela confiança na
realização deste trabalho e compreensão devido à minha ausência em vários
momentos.
Gostaria de agradecer a todos os amigos e colegas que eu me esqueci de
mencionar, mas que de alguma forma contribuíram e que estiveram presentes
durante este momento da minha vida.
"Nunca se deve engatinhar quando se tem o impulso de voar."
Hellen Keller, escritora e educadora
"Nada na vida deve ser temido, somente compreendido. Agora é hora de
compreender mais, para temer menos."
Marie Curie, física
“Começai por fazer o que é necessário, depois o que é possível e, de repente,
estareis fazendo o impossível.”
Francisco de Assis
i
RESUMO
Oliveira, F. F. Caracterização físico-química de amostras de óleo de pinho e estudo da
ação de sistemas tensoativos na atividade antimicrobiana de ativos fenólicos. 2008.
191p. Tese (Doutorado) - Programa de Pós-Graduação em Química (Química Analítica).
Instituto de Química, Universidade de São Paulo, São Paulo.
Este trabalho tem como objetivo a caracterização de amostras comerciais de óleo de
pinho com o intuito de identificar outros componentes que apresentem ação antimicrobiana,
além do α-terpineol. Também, visa avaliar a influência de três tensoativos distintos na ação
antimicrobiana do o-fenil fenol, do o-benzil p-clorofenol e do p-cloro m-cresol. Os tensoativos
selecionados foram o linear alquilbenzeno sulfonato de sódio (NaLAS), uma mistura de
laurato de trietanolamina e de sódio (laurato de Na/Tea) e alfa olefina sulfonada (AOS).
Amostras comerciais de óleo de pinho e 61 frações, isoladas por destilação a pressão
reduzida de uma amostra de óleo de pinho bruto, foram avaliadas a partir de medidas de
índice de refração, curvas TG/DTG, espectroscopia no infravermelho, CG-DIC e CG-EM,
características organolépticas e atividade antimicrobiana com a determinação do halo de
inibição (contra Staphylococcus aureus ATCC 6538 e Salmonella choleraesuis ATCC
10708). Observou-se que as amostras comerciais apresentaram composições distintas,
conforme procedência. O perfil das curvas TG/DTG permitiu uma avaliação comparativa do
comportamento térmico das frações isoladas na destilação. A composição do óleo de pinho
apresenta diversidade de componentes com atividade antimicrobiana inibitória. Todas as
amostras de óleo de pinho apresentaram atividade bacteriostática para ambos os
microrganismos e as frações, na composição em que foram separadas, apresentaram
melhor atividade bacteriostática para S. aureus. Foram preparadas 42 formulações
considerando teores de biocida de 0, 0,7 e 1,0% (p/p) e de tensoativo a 1,5 e 5% (p/p). As
amostras foram acondicionadas em frascos de PET de 30 mL e avaliadas quanto ao pH,
cor, odor, aparência nas 2ª, 4ª, 8ª e 12ª semanas do teste de estabilidade, conduzido a 4, 25
e 45
o
C. O sistema tensoativo empregando o laurato de Na/TEA apresentou melhor
estabilidade. Os tensoativos estudados (AOS, NaLAS e laurato de Na/TEA), apresentaram
ação antimicrobiana e influenciaram positivamente na atividade dos ativos fenólicos. Pôde-
se identificar a influência do teor de tensoativo na estabilização do derivado fenólico em um
sistema exposto a alta temperatura (45
o
C) armazenado em embalagem de PET. Os teores
de ativos fenólicos foram determinados por CLAE empregando detector UV.
Palavras-chave: antimicrobiano, fenólicos, óleo de pinho, tensoativos, desinfetantes
ii
ABSTRACT
Oliveira, F. F. Physical-chemical characterization of pine oil samples and study
on surfactants systems action in antimicrobial activity of active phenolic. 2008. 191p.
PhD Thesis – Graduate Program in Chemistry. Instituto de Química, Universidade de São
Paulo, São Paulo.
This work aims at characterizing commercial samples of pine oil with a view at
identifying other components that present antimicrobial action besides its of α-terpineol. It
also aims at evaluating how three different surfactants influence the antimicrobial action of
the o-phenyl-phenol, of the o-benzyl-p-chlorophenol and p-chloro-m-cresol. The selected
surfactants were the sodium linear alkylbenzene sulphonate (NaLAS), a mixture of
triethanolamine and sodium laurate, in addition to sodium alpha-olefins sulfonate (AOS).
Pine oil commercial samples and 61 fractions, which were isolated by reduced pressure
distillation of a raw pine oil sample, were analyzed based on measures of index of refraction,
TG/DTG curves, infrared spectroscopy, GC-FID and GC-MS, odour characterization and
antimicrobial activity with the determination of the inhibition disc (against Staphylococcus
aureus ATCC 6538 and Salmonella choleraesuis ATCC 10708). It was observed that
commercial samples presented marked different compositions according to their origin.
TG/DTG curves profile allowed a comparative evaluation of the thermal behavior of those
fractions isolated during distillation. Pine oil composition presents a diversity of components
with antimicrobial activity. All pine oil samples presented bacteriostatic activity when tested
against the two microorganisms mentioned above, and fractions in the composition in which
they were inserted presented better bacteriostatic activity against S. aureus. Forty two
formulations were prepared taking into consideration the content of biocide of 0, 0.7 and
1.0% (w/w) levels and surfactant of 1.5 e 5% (w/w) levels. Samples were stored into PET
bottles of 30 mL and evaluated as per the pH, color, odour, appearance during 2
nd
, 4
th
, 8
th
e
12
th
weeks of the stability test, which was carried out at 4, 25 e 45
o
C. When using Na/TEA
laurate, the surfactant system presented better stability. Studied surfactants - AOS, NaLAS
and Na/TEA laurate - presented antimicrobial action and positively influenced in active
phenolics activity. It was possible to identify the influence of content of surfactant in
stabilizing the phenolic derivative while under a system exposed to high temperature (45
o
C)
inside a PET packaging. Active phenolics content was determined by HPLC using UV
detection.
Keywords: antimicrobial, phenolic, pine oil, surfactants, disinfectants.
iii
LISTAS DE FIGURAS
Figura 1. Esquema do processo de obtenção de óleo de pinho a partir da goma-resina........ 5
Figura 2. Detalhes do processo de resinagem. (a) Corte do "bigode" para fixação do saco
plástico coletor; (b) aplicação da pasta ácida; (c) vista de uma área de
resinagem; (d) detalhe do tronco de uma árvore de Pinus. .................................. 9
Figura 3. Esquema das reações envolvidas no processo de hidratação do α-pineno
(adaptada de Liu et al., 2008) ............................................................................ 14
Figura 4. Estruturas do (a) 2-benzil-4-clorofenol (OBCP), (b) 4-cloro-3-metilfenol (PCMC) e
(c) do 2-hidroxibifenilo (OPP) ............................................................................. 25
Figura 5. Representação esquemática comparando as estruturas de bactérias Gram
positivas e Gram negativas ................................................................................ 40
Figura 6. Sítios de ação dos agentes antimicrobianos ......................................................... 47
Figura 7. Curvas TG/DTG de uma amostra de CaC
2
O
4
.H
2
O, obtida na termobalança TGA-
50, sob atmosfera dinâmica de N
2
e razão de aquecimento de 10
o
C min
-1
........ 61
Figura 8. Tipo de cromatografia e relação de FM, FE e mecanismo de separação envolvido
.......................................................................................................................... 62
Figura 9. Esquema para condução do teste de suspensão .................................................. 89
Figura 10. Esquema do método de controle de contagem ................................................... 90
Figura 11. Espectro de absorção na região do infravermelho para três amostras de óleo de
pinho do fabricante S com 50, 65 e 75% de TATT ............................................. 94
Figura 12. Espectro de absorção na região do infravermelho para amostra de óleo bruto .. 94
Figura 13. Sobreposição das curvas TG/DTG obtidas a 10°C min
-1
e sob atmosfera dinâmica
de nitrogênio, de amostras de óleo de pinho 50, 65 e 75% de TATT ................. 96
Figura 14. Curva TG e detalhe da curva DTG obtidas a 10°C min
-1
, sob atmosfera dinâmica
de ar para amostras de óleos de pinho a 50% provenientes dos fabricantes B, D,
S e Y.................................................................................................................. 97
Figura 15. Diagrama de Matriz para principais componentes do óleo de pinho .................... 99
Figura 16. Cromatogramas de uma amostra de óleo de pinho bruto. a) CG-EM e b) CG-DIC
........................................................................................................................ 101
Figura 17. Curva TG e detalhe da curva DTG obtidas a 10°C min
-1
, sob atmosfera dinâmica
de ar para a amostra de óleo de pinho bruto, frações F1, F24 e F61 e o resíduo
final da destilação ............................................................................................ 105
Figura 18. Fotos ilustrativas da formação do halo de inibição para alguns óleos e frações do
óleo bruto (leituras após 24h de incubação) .................................................... 113
Figura 19. Gráfico da Percentagem de variação de pH - Teste de estabilidade a 5
o
C ....... 118
iv
Figura 20. Gráfico da Percentagem de variação de pH - Teste de estabilidade a
Temperatura Ambiente .................................................................................... 119
Figura 21. Gráfico da Percentagem de variação de pH - Teste de estabilidade a 45
o
C ..... 119
Figura 22. Cromatograma da fase móvel (acetonitrila/ água 65:35 (v/v); pH 2,6 (H
3
PO
4
)) . 121
Figura 23. Cromatograma base matriz do sistema com 5% de AOS e 15,4% de etanol .... 121
Figura 24. Cromatograma base matriz do sistema 5% de NaLAS e 15,4% de EtOH ......... 122
Figura 25. Cromatograma da base matriz do sistema 5% de laurato de Na/TEA e 15,4% de
EtOH................................................................................................................ 122
Figura 26. Cromatogramas típicos de (a) PCMC; (b) OPP e (c) OBCP .............................. 123
Figura 27. Cromatograma de uma solução contendo três derivados fenólicos (PCMC, OPP e
OBCP) na concentração de 100 mg mL
-1
, na FM acetonitrila: água (65:35 v/v, pH
2,6 (H
2
PO
3
)) ..................................................................................................... 124
Figura 28. Espectro de absorção na região do infravermelho para Fração F1 .................. 153
Figura 29. Espectro de absorção na região do infravermelho para Fração F6 .................. 154
Figura 30. Espectro de absorção na região do infravermelho para Fração F11 ................ 154
Figura 31. Espectro de absorção na região do infravermelho para Fração F13 ................ 155
Figura 32. Espectro de absorção na região do infravermelho para Fração F19 ................ 155
Figura 33. Espectro de absorção na região do infravermelho para Fração F20 ................ 156
Figura 34. Espectro de absorção na região do infravermelho para Fração F22 ................ 156
Figura 35. Espectro de absorção na região do infravermelho para Fração F23 ................ 157
Figura 36. Espectro de absorção na região do infravermelho para Fração F24 ................ 157
Figura 37. Espectro de absorção na região do infravermelho para Fração F27 ................ 158
Figura 38. Espectro de absorção na região do infravermelho para Fração F29 ................ 158
Figura 39. Espectro de absorção na região do infravermelho para Fração F31 ................ 159
Figura 40. Espectro de absorção na região do infravermelho para Fração F34 ................ 159
Figura 41. Espectro de absorção na região do infravermelho para Fração F39 ................ 160
Figura 42. Espectro de absorção na região do infravermelho para Fração F43 ................ 160
Figura 43. Espectro de absorção na região do infravermelho para Fração F47 ................ 161
Figura 44. Espectro de absorção na região do infravermelho para Fração F50 ................ 161
Figura 45. Espectro de absorção na região do infravermelho para Fração F56 ................ 162
Figura 46. Espectro de absorção na região do infravermelho para Fração F61 ................ 162
Figura 47. Espectro de absorção na região do infravermelho para o resíduo de destilação
de uma amostra retirada após a Fração F19 ................................................... 163
Figura 48. Espectro de absorção na região do infravermelho para o resíduo da destilação
amostra retirada após a Fração F28 ................................................................ 163
v
Figura 49. Espectro de absorção na região do infravermelho para uma amostra de resíduo
final de destilação amostra retirada após a Fração F61 ................................... 164
Figura 50. Halo de inibição para as frações F1, F234, α-terpineol e óleo do fabricante B
(leitura após 24h). a) Salmonella choleraesuis e b) Staphylococcus aureus .... 165
Figura 51. Halo de inibição para as frações F5, F567, F10 e F11 (leitura após 24h). a)
Salmonella choleraesuis e b) Staphylococcus aureus ..................................... 165
Figura 52. Halo de inibição para as frações F16, F17, F19 e o terpinoleno (leitura após 24h).
a) Salmonella choleraesuis e b) Staphylococcus aureus ................................. 166
Figura 53. Halo de inibição para as frações F20, F21, F22 e F23 (leitura após 24h). a)
Salmonella choleraesuis e b) Staphylococcus aureus ..................................... 166
Figura 54. Halo de inibição para as frações F28, F29, resíduo F19 e óleo bruto (leitura após
24h). a) Salmonella choleraesuis e b) Staphylococcus aureus ........................ 167
Figura 55. Halo de inibição para as frações F31, F32, F33 e resíduo F28 (leitura após 24h).
a) Salmonella choleraesuis e b) Staphylococcus aureus ................................. 167
Figura 56. Halo de inibição para as frações F39, F40, F42 e F44 (leitura após 24h). a)
Salmonella choleraesuis e b) Staphylococcus aureus ..................................... 168
Figura 57. Halo de inibição para as frações F46, F48, F50 e resíduo F44 (leitura após 24h).
a) Salmonella choleraesuis e b) Staphylococcus aureus ................................. 168
Figura 58. Halo de inibição para as frações F52, F54, F56 e F58 (leitura após 24h). a)
Salmonella choleraesuis e b) Staphylococcus aureus ..................................... 169
Figura 59. Halo de inibição para as frações F41, F45, F60 e resíduo Final (leitura após 24h).
a) Salmonella choleraesuis e b) Staphylococcus aureus ................................. 169
Figura 60. Halo de inibição para as frações F45, F51, F57 e F61 (leitura após 24h). a)
Salmonella choleraesuis e b) Staphylococcus aureus ..................................... 170
Figura 61. Halo de inibição para as frações F53, F55, F59 e terpinoleno (leitura após 24h). a)
Salmonella choleraesuis e b) Staphylococcus aureus ..................................... 170
Figura 62. Halo de inibição para as frações F39, F40, F42 e F44 (leitura após 48h). a)
Salmonella choleraesuis e b) Staphylococcus aureus ..................................... 171
Figura 63. Halo de inibição para as frações F45, F57, F58 e F61 (leitura após 48h). a)
Salmonella choleraesuis e b) Staphylococcus aureus ..................................... 171
Figura 64. Resumo ilustrando dados cromatográficos e formação de halo de inibição ...... 172
Figura 65. Fotos do teste de suspensão (a) tubos de repique das cepas, (b) acerto da escala
Mc Farland....................................................................................................... 173
Figura 66. Tubos com a amostra-teste, 2 tubos com CN + Tween 80 e 2 tubos com solução
tampão ............................................................................................................ 173
Figura 67. Teste de suspensão (a) Transferência de alíquota, (b) agitação do tubo, (c)
plaqueamento, (d) adição de Agar, (e) incubação, (f) placa com crescimento . 174
vi
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Área Brasileira com Floresta Plantada - 2006 ....................................................... 6
Tabela 2 - Composição típica de algumas resinas e terebintina de três tipos de Pinus ........ 12
Tabela 3 – Classificação dos terpenos................................................................................. 18
Tabela 4 – Principais componentes presentes no óleo de pinho e algumas de suas
propriedades físico-químicas ............................................................................. 19
Tabela 5 – Valores de pKa e log P para dez derivados fenólicos ......................................... 24
Tabela 6 - Concentração inibitória mínima (CIM) de derivados fenólicos em ágar nutriente
(mg L
-1
) .............................................................................................................. 26
Tabela 7 - Dados toxicológicos do fenol e alguns de seus derivados ................................... 29
Tabela 8 - Dados de concentrações letal (CL) e efetiva (CE) do PCMC em diferentes
organismos ........................................................................................................ 30
Tabela 9 - Dados de concentrações letal (CL) e efetiva (CE) do OBCP em diferentes
organismos ........................................................................................................ 31
Tabela 10 - Dados de concentração letal (CL) e concentração efetiva (CE) do OPP para
diferentes organismos ....................................................................................... 32
Tabela 11- Linha do tempo dos lançamentos de alguns dos principais tensoativos de uso
comercial ........................................................................................................... 35
Tabela 12 - Ações do agente antimicrobiano nas bactérias e suas conseqüências ............. 48
Tabela 13 - Classificação das principais técnicas termoanalíticas e abreviaturas aceitáveis 58
Tabela 14 - Algumas aplicações da CG na análise de óleos essenciais e terpenos............. 66
Tabela 15 - Ordem de eluição e tempo de retenção do α-pineno e seus isômeros nas
colunas capilares CP-Wax 52CB e γ-cilclodextrina ............................................ 67
Tabela 16 - Parâmetros utilizados na elaboração das formulações biocidas........................ 85
Tabela 17 - Índice de Refração de amostras de óleo de pinho (fabricantes B, D, S e Y) com
diferentes TATT*................................................................................................ 93
Tabela 18 - Caracterização olfativa de algumas frações de óleo de pinho ......................... 103
Tabela 19 - Percentagem relativa dos componentes de uma amostra de óleo de pinho e de
seis frações de destilação. Resultados obtidos por CG-EM ............................. 107
Tabela 20 - Percentagem relativa dos componentes das frações F1 a F13 obtida por CG-
DIC .................................................................................................................. 108
Tabela 21 - Percentagem relativa dos componentes das frações F14 a F26 obtida por CG-
DIC .................................................................................................................. 109
Tabela 22 - Percentagem relativa dos componentes das frações F29 a F40 ..................... 109
vii
Tabela 23 - Percentagem relativa dos componentes das frações F41 a F49 e do resíduo final
da destilação ................................................................................................... 110
Tabela 24 - Percentagem relativa dos componentes das frações F50 a F60 ..................... 112
Tabela 25 – Resultado da leitura do halo de inibição (mm) formado na avaliação qualitativa
da atividade antimicrobiana de algumas amostras de óleo de pinho e suas
frações de destilação ....................................................................................... 114
Tabela 26 – Faixa de tensão superficial e pH para os três sistemas de tensoativos
estudados ........................................................................................................ 118
Tabela 27 - Dados da curva média da calibração para PCMC, OPP e OBCP obtidas em três
dias diferentes ................................................................................................. 125
Tabela 28 - Áreas dos picos referentes a replicatas de injeção de uma amostra com PCMC,
OPP e OBCP em um sistema com 5 % de AOS .............................................. 126
Tabela 29 - Avaliação da robustez do método de dosagem de PCMC quanto variação de
FM, vazão e temperatura do forno (Área dos Picos) ........................................ 127
Tabela 30 - Avaliação da robustez do método de dosagem de OPP quanto variação de FM,
vazão e temperatura do forno (Área dos Picos) ............................................... 127
Tabela 31 - Avaliação da robustez do método de dosagem de OBCP quanto variação de
FM, vazão e temperatura do forno (Área dos Picos) ........................................ 128
Tabela 32 – Resultados das determinações do teor de ativo fenólicos por CLAE das
amostras recém-preparadas e após estabilidade e suas variações com relação
ao teor inicial ................................................................................................... 129
Tabela 33 - Resultados testes reducional para avaliação dos sistemas tensoativos (média
das leituras) ..................................................................................................... 131
Tabela 34 – Comparativo da composição de quatro óleos de pinho analisados por CG-DIC e
CG-EM ............................................................................................................ 151
Tabela 35 - Comparativo da composição de cinco óleos de pinho analisados por CG-DIC e
CG-EM ............................................................................................................ 152
viii
SIGLAS E ABREVIATURAS
ABRAF Associação dos Produtores de Florestas Plantadas
ANVISA Agência Nacional de Vigilância Sanitária e Ambiental
AOS Alfa Olefina Sulfonada
ATCC American Type Culture Collection
ATR Attenuated Total Reflection (reflectância atenuada total)
CE Concentração Efetiva
CG-DIC Cromatografia Gasosa com Detector de Chama
CG-EM Cromatografia Gasosa Acoplada ao Espectrômetro de Massa
CIM Concentração Inibitória Mínima (MIC Minimum Inhibitory Concentration)
CL Concentração Letal
CLC Cromatografia Líquida Clássica
CLSI Clinical and Laboratory Standards Institute
CMC Concentração Micelar Crítica
CN Caldo Nutriente
CRAs Chlorine-Releasing Agents (agentes liberadores de cloro)
DBO Demanda Bioquímica de Oxigênio
DC 5,5´-dicloro-2,2´-dihidroxi-difenil metano
DQO Demanda Química de Oxigênio
DTG Termogravimetria Derivada
EPA Environmental Protection Agency
FBA Fator de Bioacumulação (Bioaccumulation Factor – BCF)
FDA Food and Drug Administration
FIR Far Infrared (infravermelho afastado)
FM Fase Móvel
FTIR Fourier-Transform Infrared (Infravermelho por Transformada de Fourier)
INCQS Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde
ix
IV Espectroscopia na Região do Infravermelho
LAB Linear Alquilbenzeno
LAS Linear Alquilbenzeno Sulfonato
MIR Middle Infrared (infravermelho médio)
NIR Near Infrared (infravermelho próximo)
NCCLS National Committee for Clinical Laboratory Standards
OBCP o-benzil p-clorofenol
OECD European Organization for Economic Cooperation and Development
OPP o-fenil fenol
PCMC p-cloro m-cresol
PCMX p-cloro m-xilol (4-cloro-3,5-dimetilfenol)
PCP pentaclofenol
PET politereftalato de etila
PHMB polihexametileno Biguanida
PSC Pomares de Sementes Clonares
QACs quaternary Ammonium Compounds (compostos quaternários de amônios)
QSAR quantitative Structure-Activity Relationship (relação quantitativa entre
estrutura química e atividade)
SBS Sociedade Brasileira de Silvicultura
SDS dodecil sulfato de sódio
TEA trietanolamina
T
eb
Temperatura de Ebulição
TG Termogravimetria
TGE Tryptone Glucose Extract Ágar
TSA Teste de Sensibilidade aos Antimicrobianos (Antibiograma)
UFC Unidade Formadora de Colônia
UFC mL
-1
Unidade Formadora de Colônia por Mililitro
x
SUMÁRIO
1
INTRODUÇÃO E OBJETIVOS
................................................................
1
2
REVISÃO DA LITERATURA
..................................................
.................
4
2.1 Óleo de Pinho ...........................................................................................
4
2.1.1
O mercado de Pinus no Brasil ..................................................................
5
2.1.2 O mercado de goma-resina e da terebintina ............................................
7
2.1.3 Terebintina ................................................................................................
11
2.1.4 Produção do óleo de pinho .......................................................................
13
2.1.5 Componentes do óleo de pinho ................................................................
17
2.2 Derivados fenólicos ..................................................................................
22
2.2.1 Toxicidade e ecotoxicidade dos compostos fenólicos ..............................
28
2.2.1.1 Ecotoxicidade do PCMC ...........................................................................
29
2.2.1.2 Ecotoxicidade do OBCP ...........................................................................
30
2.2.1.3 Ecotoxicidade do OPP ..............................................................................
32
2.2.2 O mercado dos derivados fenólicos..........................................................
33
2.3 Tensoativos ..............................................................................................
33
2.3.1 Sabões de ácidos graxos .........................................................................
36
2.3.2 Linear alquilbenzeno sulfonato (LAS) 37
2.3.3 Alfa olefina sulfonada (AOS) ....................................................................
38
2.4 A morfologia das bactérias .......................................................................
38
2.5 Métodos de controle do crescimento de microrganismos ........................
41
2.5.1 Principais agentes antimicrobianos ..........................................................
44
2.5.2 Mecanismo de ação dos agentes antimicrobianos ..................................
46
2.5.3 Métodos para avaliação da atividade antimicrobiana ...............................
49
2.5.3.1 Método de eficácia para produtos desinfetantes ......................................
50
2.5.3.2 Método para avaliação da atividade bacteriostática .................................
53
2.6 Teste de estabilidade ............................................................................. 55
2.7 Análise térmica ....................................................................................... 57
2.7.1 Termogravimetria (TG)/Termogravimetria derivada (DTG) ......................
58
2.8 Cromatografia .......................................................................................... 62
xi
2.8.1 Cromatografia Gasosa (CG) .....................................................................
63
2.8.2 Cromatografia Líquida (CLAE) .................................................................
68
2.9 Espectroscopia na região do infravermelho (IV) ......................................
71
2.9.1
Espectroscopia na região do infravermelho por transformada de Fourier
(FTIR) .......................................................................................................
73
2.9.2 Espectroscopia de reflectância total atenuada (ATR) ..............................
74
3
MATERIAIS E MÉTODOS
.......................................................................
76
3.1 Materiais .................................................................................................. 76
3.2 Métodos ....................................................................................................
76
3.2.1 Avaliação organoléptica ...........................................................................
76
3.2.2 Índice de refração .....................................................................................
79
3.2.3 Espectroscopia de absorção na região do infravermelho (IV) ..................
79
3.2.4 Termogravimetria (TG) e termogravimetria derivada (DTG) ....................
79
3.2.5 Cromatografia Gasosa (CG) .....................................................................
80
3.2.5.1 Cromatografia Gasosa com detector de chama (CG-DIC) .......................
80
3.2.5.2 Cromatografia Gasosa acoplada ao espectrômetro de massa (CG-EM) .
81
3.2.6 Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) .....................................
82
3.2.7 Destilação a pressão reduzida .................................................................
83
3.2.8 Preparo das formulações biocidas ...........................................................
84
3.2.9 Determinação da tensão superficial .........................................................
85
3.2.10
Metodologia do disco de difusão para determinação da atividade
bacteriostática ...........................................................................................
85
3.2.10.1
Preparo do método de disco de difusão ...................................................
86
3.2.11 Método de suspensão para determinação da atividade bactericida ........
87
3.2.11.1
Preparo do método de suspensão ...........................................................
87
4
RESULTADOS E DISCUSSÕES
.............................................................
91
4.1 Aspectos gerais das amostras de óleo de pinho ......................................
91
4.2 Caracterização organoléptica das amostras de óleo de pinho .................
91
4.3 Determinação do índice de refração das amostras de óleo de pinho ......
92
4.4
Determinação dos espectros de absorção na região do infravermelho
das amostras de óleo de pinho ................................................................
93
4.5 Avaliação do comportamento térmico das amostras de óleo de pinho 95
4.6
Determinação da composição de algumas amostras de óleo de pinho
xii
por cromatografia a gás.............................................................................
97
4.7 Destilação de uma amostra de óleo de pinho bruto e avaliações físico-
químicas das frações ................................................................................
101
4.7.1 Avaliação olfativa das frações de destilação.............................................
102
4.7.2
Determinação dos espectros de absorção na região do infravermelho
das frações de destilação .........................................................................
103
4.7.3 Avaliação do comportamento térmico das frações de destilação ............
104
4.7.4 Determin
ação da composição de algumas frações de destilação por
cromatografia a gás ..................................................................................
106
4.8 Avaliação microbiológica de amostras de óleo de pinho e suas frações 112
4.9 Avaliação da estabilidade das formulações biocidas ...............................
116
4.10 Determinação de derivados fenólicos por CLAE ......................................
120
4.11 Estudo da ação antimicrobiana das formulações .....................................
130
5
CONSIDERAÇÕES FINAIS
.....................................................................
134
6
PERSPECTIVAS
......................................................................................
136
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .........................................................
137
GLOSSÁRIO .............................................................................................
146
APÊNDICE
...............................................................................................
151
APÊNDICE A
-
Tabelas comparat
ivas entre análise CG
-
EM e CG
-
DIC ..
151
APÊNDICE B
-
Espectros de absorção na região do infravermelho para
as frações e resíduos obtidos no processo de destilação de uma
amostra óleo de pinho bruto .....................................................................
153
APÊNDICE C
-
Fotografias das placas do teste de halo de inibição
realizado para as frações e algumas amostras de óleo de pinho e
terpinoleno. Leitura realizada após 24h. Figura com resumo dos testes..
165
APÊNDICE D
-
Detalhes do
teste de suspensão......................................
173
1
1 INTRODUÇÃO E OBJETIVOS
Com a evolução da humanidade e à medida que as pessoas passaram a viver
em casas, a procura por produtos saneantes para limpeza e higienização dessas
vem aumentando de modo que os produtos de limpeza têm participação crescente e
cativa na cesta básica dos consumidores. Fatores como o desenvolvimento de
melhores hábitos de limpeza pessoal, da casa, de ambientes de trabalho, de áreas
de lazer e com a implantação de melhorias progressivas no saneamento básico das
cidades, muitas conquistas foram atingidas nas últimas décadas na área da saúde.
Conseqüentemente, houve redução de doenças tais como diarréia infantil e viroses,
entre outras, causadas por contaminação por microrganismos.
A necessidade de produtos saneantes mais eficientes, de baixo custo e que
ofereçam maior segurança ao usuário são objetos de estudos dos pesquisadores
nesta área. Produtos saneantes que apresentam atividade antimicrobiana contra
microrganismos patogênicos, mas não necessariamente todas as formas
microbianas esporuladas em objetos e superfícies inanimadas, são denominados
produtos desinfetantes.
A Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) é o órgão no Brasil
responsável pela regulamentação das condições para notificação e registro dos
produtos saneantes. Quando o produto saneante apresenta atividade antimicrobiana
devem ser registrados na AVISA seguindo a RDC nº. 14, de 28 de fevereiro de 2007
e a Portaria nº. 15, de 23 de agosto de 1988.
Segundo a RDC n
o
14, somente são permitidas como princípios ativos de
produtos com ação antimicrobiana aquelas substâncias comprovadamente aceitas
pela Agência de Proteção Ambiental dos Estados Unidos (EPA), pelo Centro
2
Regulador de Alimentos e Drogas dos Estados Unidos (FDA) ou pela Comunidade
Européia. No caso de substâncias ativas que não atendam a esta condição, deve-se
apresentar uma série de testes toxicológicos, tais como mutagênicos, teratogênicos,
carcinogênicos, entre outros, requeridos nesta resolução.
No Brasil, os principais biocidas utilizados na composição de produtos
desinfetantes de uso doméstico são os quaternários de amônio e os derivados
fenólicos. Faz-se uso de fragrâncias com diferentes notas olfativas para se construir
uma linha de desinfetantes que atendam às exigências dos consumidores. As
fragrâncias de maior aceitação para esta aplicação são aquelas que possuem notas
de pinho, limão e lavanda em sua composição.
O óleo de pinho, sintetizado a partir da goma-resina natural do pinheiro, é
mundialmente reconhecido por suas propriedades antimicrobianas e características
olfativas. Nos produtos saneantes, ele é empregado em formulações com ação
biocida como componente ativo principal, co-ativo, como fragrância ou simplesmente
no suporte de apelo de marketing. Apresenta em sua composição uma variedade de
terpenos, sendo o α-terpineol o seu componente principal de ação biocida.
Por apresentarem ações tensoativa e antimicrobiana, os quaternários de
amônio favorecem o desenvolvimento de desinfetantes simples, encontrando-se à
venda no mercado produtos compostos apenas por quaternário, corante, fragrância,
conservante e água. Porém, no desenvolvimento de formulações mais ricas em
número de componentes e de melhor desempenho antimicrobiano, há necessidade
de se levar em consideração as interações entre componentes que possam afetar
adversamente a eficácia antimicrobiana. Os quaternários de amônio podem ser
inativados por tensoativos aniônicos e não iônicos, resíduos aniônicos e proteínas.
Algumas formulações são inativadas por água dura (FRAISE, 1999).
3
O amplo emprego dos derivados fenólicos deve-se às suas ações de caráter
bactericida (inclusive tuberculicida), viruscida, fungicida. Em geral, os derivados
fenólicos apresentam baixa solubilidade em água e recorre-se ao uso de solventes e
tensoativos para melhorar tal propriedade quando do desenvolvimento de uma
formulação estável e eficaz. Entretanto, é de grande interesse saber se, e como, os
adjuvantes de uma formulação alteram a atividade do agente antimicrobiano.
Por todas estas razões, o presente trabalho tem como objetivo geral avaliar a
influência de três tensoativos distintos na ação antimicrobiana do o-fenil fenol, do o-
benzil p-clorofenol e do p-cloro m-cresol. Visa-se também realizar a caracterização
de amostras comerciais de óleo de pinho com o intuito de identificar outros
componentes que apresentem ação antimicrobiana, além do α-terpineol.
Os tensoativos selecionados foram o linear alquilbenzeno sulfonato de sódio,
uma mistura de laurato de trietanolamina e sódio e alfa olefina sulfonada.
Para atender aos objetivos gerais, foram definidos os seguintes objetivos
específicos:
elaboração de formulações desinfetantes constituídas por um sistema com
tensoativo e agente antimicrobiano;
avaliação da estabilidade das formulações desinfetantes;
identificação do tipo e quantificação do teor de ativo fenólico nas
formulações de desinfetantes;
determinação da atividade antimicrobiana das formulações;
caracterização físico-química e analítica de amostras de óleo de pinho;
separação do óleo de pinho em frações e identificação de seus
componentes;
avaliação da atividade antimicrobiana de frações do óleo de pinho.
4
2 REVISÃO DA LITERATURA
2.1 Óleo de Pinho
Comercialmente, podem ser encontrados dois tipos de óleos de pinho; óleo
de pinho essencial e o material chamado simplesmente de óleo de pinho,
proveniente da hidratação da terebintina.
O óleo de pinho essencial é o material extraído das agulhas, ramos e brotos
do Pinus pelo processo de destilação a vapor. Segundo Motiejūnaitė e Pečiulytė
(2004) o óleo pode ser destilado a partir de diferentes espécies de Pinus
dependendo do país e da região onde este processo é feito. Na Escandinávia,
utiliza-se o P. sylvetris; na França o P. palustris; nos Alpes, Sibéria e Montes
Cápatos o óleo é destilado do P. cabrea, P. lambertiana, P. palustris, P. taeda, P.
ponderosa ou P. sabiniana.
Na aromaterapia, o óleo de pinho essencial é utilizado por suas propriedades
anti-séptica, tônica, expectorante peitoral, diurética, estimulante, depurativa,
restauradora, refrescante, desodorante, descongestionante e sudorífera, além de ser
também um estimulante da glândula adrenal. Popularmente, ele é usado no
tratamento de doenças como a asma, bronquite, laringite, gripe, infecção urinária,
hipotensão, fadiga mental, cistite, problemas da próstata, reumatismo, gota, artrite e
dores musculares.
O tipo de óleo de pinho de maior consumo é o material produzido a partir da
terebintina, retirada da goma-resina do Pinus, cujo processo de obtenção está
ilustrado na Figura 1 e será abordado mais detalhadamente em outra seção.
5
O óleo de pinho apresenta-se como um líquido transparente, com cor
variando de incolor a amarelo e com odor pináceo característico. Entre as diversas
aplicações pode-se citar a utilização na produção de desinfetante à base de pinho, o
uso para mascarar odor na indústria de tintas imobiliárias, como agente de flotação
na extração de minérios, veículo em produtos agro-veterinários, como umectante na
indústria têxtil, como componente em formulação de fragrâncias, entre outras.
Figura 1. Esquema do processo de obtenção de óleo de pinho a partir da goma-resina
2.1.1 O mercado de Pinus no Brasil
Segundo a Associação Brasileira de Produtores de Florestas Plantadas
(ABRAF, 2006), os Pinus, originários principalmente do sudeste dos Estados Unidos
e de alguns países tropicais, foram introduzidos no Brasil em meados do século XX
pelo filósofo alemão Hermann Bruno Otto Blumenau. Em 1959, no Estado de São
Paulo, foram plantadas mais de 800 mil mudas dando, assim, início a um plano de
produção e exploração racional de madeira de florestas plantadas. Com a introdução
de incentivos fiscais, a partir da década de 60 surgiram os primeiros pomares de
RESÍDUO
PINHEIRO
GOMA
RESINA
BREU
TEREBINTINA
ÓLEO DE
PINHO
RESINAGEM
HIDRÓLISE
ÁCIDA
LAVAGEM/
DESTILAÇÃO
6
sementes clonais (PSC) que visavam atender à demanda crescente por semente
melhorada, tanto quantitativa como qualitativamente.
Nos anos 70, no contexto da concessão de incentivos fiscais às florestas
plantadas, chegou-se à conclusão de que pelo clima, solo e condições atmosféricas
do país, o plantio de espécies produtivas como o Pinus elliottii e o Pinus taeda
seriam a melhor opção para obtenção de resultados econômicos rentáveis.
Segundo a Sociedade Brasileira de Silvicultura (SBS, 2008), a área total com
florestas plantadas em 2006 no Brasil totalizou 5,74 milhões ha, sendo: 3,55 milhões
de ha com eucalipto; 1,82 milhões de ha com Pinus; e 370,5 mil ha de outras
espécies (Tabela 1), apresentando um crescimento de pouco mais de 175 mil ha em
relação ao ano de 2005 (5,56 milhões ha).
Tabela 1 - Área Brasileira com Floresta Plantada - 2006
ESTADO EUCALIPTO PINUS TOTAL (ha)
Minas Gerais 1.083.744 152.000 1.235.744
São Paulo 816.880 146.474 963.354
Paraná 121.908 686.453 808.361
Santa Catarina 70.341 530.992 601.333
Bahia 540.172 54.820 594.992
Rio Grande do Sul 184.245 181.378 365.623
Espirito Santo 207.800 4.408 212.208
Mato Grosso do Sul 119.319 28.500 147.819
Pará 115.806 149 115.955
Maranhão 93.285 0 93.285
Amapá 58.473 20.490 78.963
Goiás 49.637 14.408 64.045
Mato Grosso 46.146 7 46.153
Outros 41.392 4.190 45.582
Total 3.549.148 1.824.269 5.373.417
Outras espécies 370.519
TOTAL 5.743.936
Fonte: Abraf, 2007
7
Minas Gerais apresenta a maior área de floresta plantada do país (1,23
milhões ha), seguido por São Paulo (963,3 mil ha), o que corresponde a 21,5% e
16,8%, respectivamente, do total.
A madeira de Pinus constitui importante fonte de matéria-prima na fabricação
de painéis reconstituídos, compensados, serrados, celulose e papel e goma-resina,
entre outras aplicações.
2.1.2 O mercado de goma-resina e da terebintina
A resinagem no Brasil teve início na década de 70, e evolui de tal forma que,
em 1989, o País passou da condição de importador para exportador deste produto e
de seus derivados. Atualmente, o Brasil é o terceiro maior produtor mundial de
goma-resina, tendo produzido mais de 106,4 mil t na safra 2006/2007, dos quais
aproximadamente 38,5 mil t são de resina proveniente do Pinus tropical e 67,9 mil
ton do Pinus elliottii.
Segundo a SBS (2008), a implantação e o manejo de florestas de Pinus para
a produção de resina constituem-se em uma alternativa social e econômica para a
fixação do homem no campo, seja pela capacidade em antecipar receitas, seja pela
criação de empregos diretos e indiretos durante o processo de extração,
processamento e beneficiamento industrial.
No estudo da avaliação econômica da resinagem em florestas tropicais de
Pinus elliotii realizado por Figueiredo Filho et al. (1992), os autores argumentam que
se a produção média de goma-resina for de 1,5 kg/árvore/ano, não é vantajoso
resinar e, caso a produção seja de 2,0 kg/árvore/ano, a resinagem torna-se
vantajosa a partir do 6º ano e ainda, considerando-se custos de produção de no
8
máximo 0,50 US$/árvore/ano, só é vantajoso resinar a partir do 8º ano. Quando se
têm médias de produção superiores a 3,0 kg/árvore/ano, o emprego da resinagem
passa a ser vantajoso no manejo, chegando a ter-se uma receita líquida por árvore
superior a US$ 8,00, dado que o custo de produção é baixo.
Segundo a Associação de Resinadores do Brasil – ARESB, a produção
nacional de goma-resina de Pinus em 2006 foi de aproximadamente 106,4 mil
toneladas, sendo o estado de São Paulo responsável por 42,3% desse total e Minas
Gerais, por 22,4%. O restante da produção distribui-se respectivamente por RS
18,4%; MS 8,4%; PR 4,6%; BA 2,1% e TO 0,9%. As exportações brasileiras de
resina, breu e terebintina totalizaram US$ 48,2 milhões em 2006 e os principais
destinos das exportações dessas matérias-primas foram, respectivamente:
a) resina: Argentina (82%), Espanha (8%), Rússia (7%);
b) breu: Países Baixos (20%), EUA (19%), Portugal (13%);
c) terebintina: França (48%), México (32%), EUA (6%).
Segundo Garrido et al. (2006) e Kronka, Bertolani e Ponce (2005), a
resinagem empregada nos últimos anos no Brasil consiste na remoção periódica de
parte da casca da árvore, sob forma de faixas ou estrias com 2 a 3 cm de altura,
dependendo do diâmetro da árvore, em intervalos de 14-15 dias. A resina encontra-
se no lenho dos pinheiros, dentro de canais resiníferos verticais e horizontais, sendo
necessária a aplicação de uma solução ácida para destruir as paredes celulósicas
destes canais, permitindo assim a livre exsudação da resina. A solução ácida
empregada pode ser o ácido sulfúrico (25%) ou uma “pasta ácida” (mistura de ácido
sulfúrico com casca de amendoim ou farelo de arroz). A safra de coleta da goma-
resina vai de setembro a abril/maio e neste período são executadas
9
aproximadamente de 18-20 estrias na árvore, resultando um painel de 50 cm por
safra. A Figura 2 ilustra o procedimento de resinagem.
Figura 2. Detalhes do processo de resinagem. (a) Corte do "bigode" para fixação do saco
plástico coletor; (b) aplicação da pasta ácida; (c) vista de uma área de resinagem; (d)
detalhe do tronco de uma árvore de Pinus.
A goma-resina obtida a partir de florestas plantadas de Pinus oferece, por
destilação, uma fração volátil denominada terebintina e uma fração fixa, o breu.
Kolicheshi (2006) descreve uma metodologia de tratamento da goma-resina
para obtenção de terebintina e breu onde o aquecimento da goma-resina é seguido
pela adição de ácido oxálico e terra diatomácea. Esta mistura é fundida entre 180 e
200
o
C e diluída com terebintina reciclada da goma-resina processada anteriormente.
O material fluido é então filtrado, lavado e deixado em decantação a 80
o
C por um
período de 4 a 8 horas. Uma nova filtração é realizada e as frações obtidas da
goma-resina são separadas por destilação, que pode ser à pressão atmosférica ou à
pressão reduzida. Os produtos obtidos após a destilação são:
10
a) 60 – 85% de breu, também chamado de “gum-resin” ou breu vivo. O breu é
um material resinoso, não volátil, composto de ácidos monocarboxílicos derivados
do ácido abiético;
b) 15 – 30% de terebintina, também chamada de “turpetine” ou óleo essencial
de terebintina, que é predominantemente uma mistura de hidrocarbonetos
monoterpênicos bicíclicos C
10
H
16
, onde os constituintes principais, na maioria das
vezes, são o α-pineno e o β-pineno.
As variações dos tipos e da concentração de terebintina dependem da origem
e do tratamento durante a refinação. Estes fatores incluem: a idade de corte da
árvore, a localização geográfica, o tipo de fragmentos coletados no processo e as
técnicas usadas na refinação.
A fim de avaliar algumas destas influências, Brito, Barrichello e Trevisan
(1978) estudaram a correlação entre a temperatura, a precipitação pluviométrica e a
produção de goma-resina de pinos tropicais (Pinus caribaea var. bahamensis, Pinus
oocarpa e Pinus kesiya) com idade de 10 anos, plantados na região de Piracicaba
no Estado de São Paulo, Brasil. Relataram que o P. caribaea var. bahamensis
apresentou maior rendimento de goma-resina que os P. oocarpa e P. kesiya, com
rendimento similares. Os autores também sugeriram que a prática de resinagem
pode ser realizada nos pinheiros tropicais estudados durante todo o ano, sob
condições de temperaturas médias quinzenais distribuídas entre 16 e 25°C e
precipitação pluviométrica com intensidades entre zero e 17 mm hora
-1
, conforme
condições utilizadas no experimento e sem prejuízo da produção média de resina.
A terebintina é utilizada como matéria-prima de indústrias químicas e
farmacêuticas, principalmente como solvente em certas tintas especiais e na
fabricação de óleo de pinho.
11
Já o breu é aplicado na fabricação de tintas, vernizes, plásticos, lubrificantes,
adesivos, inseticidas, germicidas e bactericidas. Seu principal emprego, todavia,
está na fabricação de cola de breu, de uso generalizado na indústria de papel.
2.1.3 Terebintina
Terebintina é o termo genérico usado para designar o óleo volátil presente
nas árvores, principalmente nas coníferas e o método de isolamento da terebintina
irá fornecer a sua denominação. A seguir são citadas algumas das denominações
utilizadas:
a) terebintina de goma ou de resina ou cola de terebintina (Latim: “oleum
terebinthinae”, Fr: “essence de térébinthine”, Al: “Balsamterpentinoel”, Ing.:
“gum turpentine”) – esta designação refere-se ao tipo de terebintina obtida
pela destilação por arraste a vapor d´água da goma-resina presente nas
árvores vivas.
b) terebintina destilada por vapor ou terebintina destilada de madeira (Fr.:
“essence de bois distillée à la vapeur”, Al.: “Wasserdampfdestilliertes
“Wurzelterpentinöl”, Ing.: “Steam distilled wood turpentine or wood turpentine”)
– esta designação refere-se ao tipo de terebintina obtida pelo processo de
destilação a vapor d´água ou por extração por solventes de tocos ou de
árvores velhas abatidas.
c) terebintina destilada destrutivamente (carbonização) – refere-se ao tipo de
terebintina preparada a partir do destilado obtido na carbonização da madeira.
d) terebintina sulfato ou terebintina Kraft ou terebintina sulfatada bruta (Fr.:
“essence de papeterie de sulfate brute”, Al.: “Rohsulfatterpentinöl”, Ing.:
12
“Crude sulfate turpentine”) – é um subproduto recuperado dos condensados
dos digestores de cozimento da polpa de papel pelo processo de sulfato
alcalino conhecido como processo Kraft. É uma mistura de materiais
terpênicos e compostos orgânicos de enxofre (cerca de 12%) conferem mau
odor.
e) terebintina sulfatada refinada - é obtida a partir da terebintina crua sulfatada
após refino para a retirada dos compostos orgânicos de enxofre.
f) terebintina sulfito (Ing. ”sulfite turpentine”) - esta designação refere-se ao
subproduto no processo de polpação de Pinus por sulfito na produção de
papel.
Como foi mencionando na seção 2.1.2 a composição química da goma-resina
sofre influência das condições que envolvem a resinagem, tais como o tipo de Pinus,
região de plantio, idade de corte, época de coleta e condições climáticas.
Conseqüentemente seus produtos, terebintina e breu, sofrem as modificações em
suas composições conforme exemplificado na Tabela 2.
Tabela 2 - Composição típica de algumas resinas e terebintina de três tipos de Pinus
Teores (%)
Composição da resina
Pee Pcb Po
Colofônia (Breu) 68,45 75,94 75,52
Água + Casca 11,75 8,61 10,22
Terebintina 19,40 15,44 14,25
Composição da terebintina
Alfa pineno 63,5 52,3 52,8
Beta Pineno 16,6 1,6 3,9
Beta Felandreno 8,7 17,4 13,9
Longifoleno 5,3 2,8 5,6
Limoneno - 18,0 -
Terpinoleno 1,2 3,2 20,3
Outros 4,7 4,7 3,5
Pee: P. elliottii var. elliottii; Pcb: P. caribaea var. bahamensis; Po: P. oocarpa
Fonte: Brito; Barrichelo; Gutierrez, 1980; Ramos, Garcia, 2007.
13
2.1.4 Produção do óleo de pinho
O óleo de pinho é uma mistura de alcoóis terpênicos e hidrocarbonetos. Na
literatura são encontrados estudos realizados para a investigação da hidratação de
terpenos sob catálise ácida, utilizando como material de partida a terebintina de
goma, terebintina sulfatada (PAKDEL; SARRON; ROY, 2001, SANTOS, 2005) e o α-
pineno isolado (CASTANHEIRO; RAMOS; VITAL, 2003, MOSHIDA et al., 2007, LIU
et al., 2008). Muitos dos estudos buscam não só alternativas de catalisadores como
também definições das condições de processo, visando aumentar o rendimento da
reação e a seletividade do processo de transformação do α-pineno em α-terpineol,
utilizando a quantificação deste componente como controle de rendimento e
seletividade do processo.
A Figura 3 ilustra o processo de hidratação do α–pineno e algumas reações
secundárias envolvidas. Quando em meio ácido, dá-se a transferência de próton
para a dupla ligação do alceno (1), forma-se um carbocátion intermediário (2) que
sofre um rearranjo e reage com a água do meio para formar o álcool protonado que,
na seqüência, perde H
+
formando o produto neutro (3) e regenerando o catalisador.
O α–terpineol formado pode sofrer ataque eletrofílico na dupla ligação pelos íons H
+
do catalisador, formando um cátion que se desprotona, gerando 1,8 terpine.
Todavia, a reação pode seguir por outras rotas, como o acoplamento do H
+
com o
grupo hidroxila do α–terpineol formando um cabocâtion intermediário (4), precursor
de diversos produtos secundários (ex.: limoneno, terpinoleno, α-terpineno).
Entretanto, deve-se considerar que a síntese do óleo de pinho a partir da terebintina
envolve outras reações secundárias devido à complexidade de sua composição.
14
Figura 3. Esquema das reações envolvidas no processo de hidratação do α-pineno
(adaptada de Liu et al., 2008)
Existe uma variedade de catalisadores ácidos que podem ser utilizados neste
processo, tais como os ácidos minerais (ROMÁN-AGUIRRE et al. 2005),
heteropoliácidos (GUSEVKAYA, 2001; ROBLES-DUTENHEFNER, 2001), resinas
trocadoras de cátions e zeolitas (CASTANHEIRO; RAMOS; VITAL, 2003; MOCHIDA
et al., 2007; VITAL et al., 2000). Alguns dos trabalhos encontrados na literatura
sobre a hidratação do α–terpineol estão comentados a seguir.
Em 1947, Mosher realizou a hidratação do α-pineno com ácido 1-cloro-4-
naftaleno sulfônico durante um processo de 6 horas. Obteve um rendimento de 30%
em teores de terpenos monociclos, identificou as presenças de dipenteno,
terpinoleno, α-terpeno e p-cimeno e sugeriu a presença de p-mentano e γ-terpinene.
Williams e Whittaker (1971) pesquisaram o rearranjo que ocorria na
hidratação sob catálise ácida do α-pineno e do β-pineno, empregando ácido sulfúrico
(em ácido acético aquoso 10% ou ácido acético anidro) e com ácido perclórico (em
(1)
(2)
(3)
(4)
15
ácido acético aquoso 10%). Observaram que o rendimento máximo é alcançado
após 6 horas de reação, em ambos os casos. Entretanto, o rendimento foi de 55%
para o ácido perclórico e 34% com o ácido sulfúrico. Inferiram que, com o ácido
sulfúrico em ácido acético 10%, a taxa de conversão para o β-pineno é menor que
para o α-pineno. Propuseram que a mudança de ácido acético anidro para o ácido
acético aquoso 10% reduz a distribuição de produto, aumentando assim as
seletividades.
Vital et al. (2000) compararam a seletividade e a atividade da hidratação do α-
pineno usando zeólita USY, zeólita beta ou carbono ativado de superfície
modificada, com o desempenho da membrana de polidimetilsiloxane (PDMS)
preenchida com estes catalisadores. A reação foi realizada a 50ºC, usando acetona
aquosa (na relação acetona/água, 1:1 v/v) como solvente. Para a zeólita USY, a
seletividade máxima foi de 30% para o catalisador livre e 55% para a membrana
composta. Já no caso da zeólita beta ocorreu o efeito contrário, quando a
seletividade máxima de 70% com o catalisador livre caiu para 58% na presença da
membrana. Para o carbono ativado, a membrana causou um ligeiro aumento na
seletividade. Em todos os casos a quantidade de catalisador na membrana não teve
efeito na seletividade.
Pakdell, Sarron e Roy (2001) investigaram a hidratação do α-pineno e da
terebintina crua sulfatada sob diversas condições. Neste estudo, as condições
ótimas de reação de hidratação foram obtidas utilizando uma solução 15% de ácido
sulfúrico com adição de excesso de acetona em um banho aquecido a 80-85
o
C por
um período de 4 horas. Nestas condições, o rendimento para formação de α-
terpineol foi de 67% a partir do α-pineno e 77% com relação ao teor inicial de α-
pineno contido na terebintina crua. Observaram que o tempo prolongado favorece as
16
reações secundárias da hidratação, principalmente a formação progressiva de 1,8-
terpine, após 4 horas de processo.
Castanheiro et al. (2003) estudaram a hidratação do α-pineno a α-terpineol
utilizando uma membrana polimérica catalítica, consistindo de HPMo (ácido
dodecamolibdofosfórico) imobilizado em polivinilálcool (PVA), com ligações cruzadas
com 10, 20 e 30% de ácido succínico e HPMo imobilizado em zeólita USY dispersa
em uma matriz de PDMS. A atividade da membrana HPMo/PVA aumenta com as
ligações cruzadas de polímero devido ao aumento na hidrofobicidade da membrana.
Todavia, este aumento é limitado pelo avanço das restrições de mobilidade da
molécula. A membrana HPMo-USY/PDMS mostrou alta seletividade para a
hidratação do pineno, maior que aquela observada com HPMo presa apenas em
USY. Entretanto, a seletividade para o α-terpineol (65% a uma conversão de 80%) é
pouco maior que a observada com HPMo/PVA com 20 a 30% de ácido succínico (70
a 75% para conversão de 90%). Para ambas as membranas catalíticas, a
estabilidade da membrana é razoavelmente boa e a atividade catalítica da
membrana aumenta com usos subseqüentes, provavelmente devido à interação
entre o α-terpineol retido e a matriz polimérica.
Román-Aguirre et al.(2005) estudaram o uso do ácido cloroacético como
agente catalisador da hidratação do α-pineno, utilizando água como doador de
hidroxila. A maior seletividade atingida foi de 95,5% com taxa de conversão de 10%.
Por outro lado, a maior conversão foi de 99% com seletividade de 70% após 4 horas
de reação.
A procura do mercado consumidor por produtos naturais vem impulsionando
nos últimos tempos o desenvolvimento de processos biotecnológicos na produção
de aromas naturais, também chamados de “bioaromas”. Maróscatica Júnior e
17
Pastore (2007) apresentaram uma seleção de trabalhos envolvendo a
biotransformação de limoneno em treze substâncias distintas, entre elas o R-(+)-α-
terpineol. Os autores pontuam como pioneiro o estudo feito por Kraidman et al.
1
, em
1969, no qual a transformação do limoneno a α-terpineol foi catalisada por uma
linhagem de Cladosporium sp. Os autores citam que, desde 1985, vários trabalhos
têm abordado o relevante potencial de linhagens de Penicillium sp ao converter R-
(+)-limoneno em R-(+)-α-terpineol, mencionando especificamente o trabalho de Tan
et al.
2
, no qual a linhagem utilizada demonstrou enantiosseletividade e
enantioespecificidade ao converter a mistura racêmica de limoneno a R- (+)-α-
terpineol. A atividade aumentou mais de 12 vezes após indução por meio da adição
seqüencial do substrato, o que proporcionou um rendimento de 3,2 g L
-1
de α-
terpineol após 96 h de reação em escala laboratorial.
2.1.5 Componentes do óleo de pinho
Os compostos terpênicos que constituem o óleo de pinho são encontrados na
natureza como componentes dos óleos essenciais de muitas plantas. Os terpenos
podem ser hidrocarbonetos ou compostos com oxigênio, tais como álcoois, aldeídos
ou cetonas que são chamados de terpenóides. Antigamente eles eram considerados
como derivados do isopreno (CH
2
=C(CH
3
)-CH=CH
2
), mas em seguida descobriu-se
que seu precursor é o ácido mevalónico, o qual provém da acetil coenzima A. A
partir da utilização da regra do isopreno (Wallach 1887) que considera a divisão da
estrutura dos terpenos em unidades de isopreno (C
5
H
8
)
n
, pode-se atualmente,
estudá-los, conforme classificação apresentada na Tabela 3.
1
Kraidman, G.; Mukherjee, B. B.; Hill, I. D.; Bacteriol. Proc. 1969, 69, 63.
2
Tan, Q.; Day, D. F.; Cadwallader, K. R.; Process Biochem. 1998, 33, 29.
18
Tabela 3 – Classificação dos terpenos
Unidade de
Isoprenos
Número de
carbonos
Classificação Exemplo
1 5 Hemiterpeno
2 10 Monoterpeno Pineno, limoneno, citral, nerol, mentol
3 15 Sesquiterpeno Nerolidol, farnesol, cedrol
4 20 Diterpeno Vitamina A, estevioside, isofitol
5 25 Sesterpeno
6 30 Triterpeno Esqualeno, lanosterol
8 40 Tetraterpeno Caroteno
>8 >40 Politerpeno Clorofila
Fonte: KIRK-OTHMER Encyclopedia of chemical technology, 1983
Na Tabela 4 são apresentados os principais componentes presentes no óleo
de pinho, terpenos e terpenóides, e algumas de suas propriedades físico-químicas.
19
Tabela 4 – Principais componentes presentes no óleo de pinho e algumas de suas propriedades físico-químicas
Terpeno
CAS Reg.
No.
Fórmula
Molecular
Massa
Molar
Estrutura T
eb760
ºC
logP
ACD/LoD
CLog P
Solubilidade
α-pineno 80-56-8 C
10
H
16
136,23
CH
3
CH
3
CH
3
156,2 4,37 4,741
i H
2
O(18 mg L
-1
); msc EtOH,
eth, chl
canfeno, (+)
(+)1422321
(-)1422353
C
10
H
16
136,23
CH
3
CH
3
CH
2
161,0 4,37 4,182 vs eth
β-pineno 127-91-3 C
10
H
16
136,23
166,0 4,37
i H
2
O(23 mg L
-1
); s bz, EtOH,
eth, chl
α-felandreno 99-83-2 C
10
H
16
136,23
CH
3
CH
3
CH
3
171,0 4,43 4,412 i H
2
O; msc eth
1,4 - cineol 470-67-7 C
10
H
18
O 154,25
CH
3
CH
3
C
H
3
O
172,0 2,58 2,736 i H
2
O (153 mg L
-1
); s EtOH
Careno-2 554-61-0 C
10
H
16
136,23
167,5 4,20
(+)R- limoneno 5989-27-5 C
10
H
16
136,23
CH
2
CH
3
CH
3
175,0 4,45 4,352
i H
2
O (14 mg L
-
1
), pg; s
querosene, EtOH, óleo de
parafina,óleo fixo
continua
20
Terpeno
CAS Reg.
No.
Fórmula
Molecular
Massa
Molar
Estrutura T
eb760
ºC
logP
ACD/LoD
CLog P
Solubilidade
S(-)- limoneno 5989-54-8 C
10
H
16
136,23
CH
2
CH
3
CH
3
176,0 4,45 4,352
i H
2
O (3 mg L
-1
); s EtOH, óleo
fixo,
eucaliptol 470-82-6 C
10
H
18
O 154,25
CH
3
O
CH
3
CH
3
176,3 2,82 2,756 2,63 g L
-1
em H
2
O
α-terpineno 99-86-5 C
10
H
16
136,23
CH
3
CH
3
CH
3
173,5 4,52 4,412 i H
2
O; msc EtOH, eth
terpinoleno 586-62-9 C
10
H
16
136,23
CH
3
CH
3
CH
3
186,0 4,67 4,352 i H
2
O; msc EtOH, eth; s bz, ctc
fenchol 1632-73-1 C
10
H
18
O 154,25
CH
3
CH
3
CH
3
OH
200,0 2,71 2,579
863 mg L
-1
em H
2
O;s EtOH
1-terpinenol 586-82-3 C
10
H
18
O 154,25
215,0 2,99
β-terpineol
138-87-4 C
10
H
18
O 154,25
CH
2
CH
3
CH
3
OH
210,0 3,02 2,749
continua
Tabela 4 - continuação
21
Terpeno
CAS Reg.
No.
Fórmula
Molecular
Massa
Molar
Estrutura T
eb760
ºC
logP
ACD/LoD
CLog P
Solubilidade
borneol, (±)
6627-72-1 C
10
H
18
O 154,25
CH
3
CH
3
CH
3
O
H
Sub 2,71 2,720 i H
2
O; vs EtOH, eth, bz
4 – terpinenol 562-74-3 C
10
H
18
O 154,25
CH
3
CH
3
CH
3
OH
209,0 2,99 2,749 2,94 mg L
-1
em H
2
O
α-terpineol 196838 C
10
H
18
O 154,25
CH
3
CH
3
CH
3
O
H
220,0 2,79 2,629 sl H
2
O;vs ace,bz,eth, EtOH
γ-terpineol 586-81-2 C
10
H
18
O 154,25
CH
3
CH
3
CH
3
OH
218,0 3,14 2,749
hidrato de terpin 2451-01-6
C
10
H
20
O
2
.H
2
O
190,28 265,0 1,07
terpin 80-53-5 C
10
H
20
O
2
172,27
258 1,60
1g dissolve em 250mL H2O,
77 mL bz, 140 mL eth
i= insolúvel; sl= solúvel; vs= muito solúvel; msc= miscível; ace= acetona; bz= benzeno; EtOH= etanol; eth= éter; chl= clorofórmio; teb= temperatura de ebulição
Fonte: Chemspider; CRC Handbook of Chemistry and Physics; NIST Livro de Química na Web.
Tabela
4
-
conclusão
22
2.2 Derivados fenólicos
A maior importância do uso do fenol (ácido carbólico) deve-se ao fato de
Joseph Lister tê-lo utilizado em seu trabalho pioneiro sobre anti-sepsia cirúrgica,
publicado em 1867 na revista inglesa Lancet sob o título “On the antiseptic principle
in the practice of surgery”, dando assim início à história dos germicidas. Lister tomou
conhecimento dos estudos de Pasteur sobre a teoria microbiana das doenças e a
partir deste conhecimento encontrou uma forma de combater as infecções. Uma
extraordinária redução na incidência de infecções pós-operatória foi alcançada ao se
utilizar um spray com solução de fenol na desinfecção de salas cirúrgicas e ao se
adotar a prática de cobrir as feridas com ataduras embebidas em solução diluída de
fenol. O fenol, por outro lado, é também utilizado como composto padrão para
comparar a atividade antimicrobiana de um desinfetante, como será descrito
posteriormente neste trabalho. Ele apresenta ação bactericida (inclusive
tuberculicida), viruscida e fungicida comprovadas, tendo sido usado amplamente
como agente desinfetante por muitos anos. Porém, mais recentemente, devido à sua
toxicidade e ao seu característico odor desagradável, o fenol propriamente dito não
é muito utilizado como desinfetante ou anti-séptico e, para muitas aplicações, tem
sido substituído por vários derivados químicos ou compostos químicos relacionados
que são menos tóxicos para o tecido, menos irritante para a pele e mais ativos
contra os microrganismos.
Por muitos anos, o principal processo de obtenção do fenol e de seus
derivados foi por meio da destilação destrutiva do carvão de hulha, sendo possível
se obter, a partir deste processo, mais de 50 substâncias fenólicas que são
separadas por apresentarem diferentes pontos de ebulição. A primeira substância a
23
ser separada é o fenol (T
eb
= 182
o
C), seguida dos cresóis (T
eb
= 189-205
o
C), xilenóis
(T
eb
= 210-230
o
C) e, por fim, uma mistura de ácidos pesados (T
eb
= 230-310
o
C) que
compreende propilfenol, tetrametilfenol, dietilfenol, naftol entre outros (GODDARD;
McCUE, 2000).
Nos dias atuais, os compostos fenólicos são produzidos em larga escala por
meio de processos industriais eficientes e que geram produtos com alto teor de
pureza.
Os processos mais empregados para a síntese de fenol são: Processo Dow-
Bayer; Processo Dow Califórnia Research; Processo Scientific Design e Processo
Hock. Este último foi desenvolvido em 1944 por Hock e Lang e é o mais usado
atualmente. Consiste na alquilação do benzeno a iso-propril benzeno (cumeno) o
qual é oxidado a hidroperóxido de cumeno que, posteriormente, sofre clivagem em
meio ácido para produzir fenol e acetona (PASSONI, 1998).
O processo de síntese mais importante para a produção de 2-fenil-fenol inicia-
se com o ciclohexano que é condensado a 2-ciclohexenil-cicloexanona que em
seguida, por meio de desidratação catalítica, proporciona o 2-fenil-fenol com ótima
pureza e alto rendimento de reação. Com o aquecimento de cloreto de benzilo em
excesso de fenol é possível obter as formas 2- e 4- benzil-fenol. Estes produtos
podem formar os correspondentes cloro-benzil-fenóis pela adição de SO
2
Cl
2
, sendo
o 2-benzil-4-clorofenol a mais importante forma dentro deste grupo. Os clorofenóis,
por sua vez, são materiais de partida para produção de diclorofenóis e
hexaclorofenóis que são formados durante a reação irreversível do formaldeído com
4-clorofenol ou 2,4,5-triclorofenol (PAULUS, 2005).
O fenol e seus derivados atacam a parede celular provocando danos
generalizados nesta e induz uma progressiva perda de constituintes intracelulares.
24
Em altas concentrações ocorre coagulação intracelular. Em baixas concentrações,
por outro lado, a adsorção do fenólico na membrana citoplasmática da célula e os
danos relacionados a esta adsorção são reversíveis, o que confere caráter
bacteriostático. Pelo exposto, dependendo da concentração utilizada, a ação dos
derivados fenólicos pode ser bacteriostática ou bactericida (PAULUS, 2005;
RUSSEL, 2003).
A capacidade de penetração de um fenólico na célula depende da sua
hidrofobicidade, que é quantificada pelo coeficiente de partição octanol/água (log
POW; log P ou log POA). A melhor ação antimicrobiana de um dado derivado
fenólico é obtida quando este está na sua forma não dissociada, isto é, em meio
ácido ou neutro. Por outro lado, os fenolatos apresentam maior solubilidade em
água. Desta maneira, é de relevante importância o conhecimento dos valores de
pKa e log P para seleção do ativo fenólico adequado. A Tabela 5 apresenta estes
valores para alguns derivados fenólicos.
Tabela 5 – Valores de pKa e log P para dez derivados fenólicos
Derivado Fenólico pKa Log P
2-fenilfenol (OPP) 11,6 3,090
benzilfenol 11,6 3,40
a
3-metil-6-isopropilfenol 10,6 3,28
a
2-benzil-4-clorofenol (OBCP) 9,7 4,40
b
4-cloro-3,5-dimetilfenol (PCMX) 9,7 3,483
4-cloro-3-metilfenol (PCMC) 9,6 2,985
5,5´-dicloro-2,2´-dihidroxidifenilmetano 8,7/12,6 -
2,4,6-triclorofenol 8,5 2,326
Metil-4-hidroxibenzoato 8,5 1,985
Ácido salicílico 3,0 2,183
Fonte: Paulus, 2005;
a
Chemspider, 2008;
b
Lanxess, 2008
A introdução no anel fenólico de grupos com efeito indutivo atraentes de
elétrons, como halogênios e em especial o Cl, confere um caráter mais ácido ao anel
25
e conseqüentemente maior ação antimicrobiana. Quando a substituição do
halogênio ocorre na posição 4 (p-) a eficiência antimicrobiana é maior que na
posição 2 (m-).
Os alquil fenóis são menos solúveis e menos ácidos que o fenol, porém
apresentam maior capacidade para reduzir a tensão superficial, melhorando assim a
ação antimicrobiana da substância. Quanto maior a cadeia linear, maior será a ação
antimicrobiana, atingindo um máximo para cadeia linear C
6
na posição p-. Cadeias
ramificadas com o mesmo número de carbono de uma cadeia linear apresentam
menor ação antimicrobiana. A Figura 4 ilustra a estrutura do 2-benzil-4-clorofenol
(o-benzil-p-clorofenol) que apresenta substituição de grupo benzil na posição 2 e Cl
na posição 4, a do 4-cloro-3-metilfenol e do 2-hidroxibifenilo.
a)
b)
c)
Figura 4. Estruturas do (a) 2-benzil-4-clorofenol (OBCP), (b) 4-cloro-3-metilfenol (PCMC) e
(c) do 2-hidroxibifenilo (OPP)
A Tabela 6 apresenta um pequeno painel das diferenças de concentração
inibitória mínima para diferentes derivados fenólicos.
Um recurso para melhorar a solubilidade dos compostos fenólicos, e
conseqüentemente aumentar a sua atividade antimicrobiana no sistema, é o uso de
tensoativos.
26
Tabela 6 - Concentração inibitória mínima (CIM) de derivados fenólicos em ágar nutriente
(mg L
-1
)
OPP
BP
OBCP
PCMC
PCMX
DC
PCP
Bactérias
Escherichia coli 200
500
3500
250
200
100
500
Pseudomonas aeruginosa 1500
5000
5000
800
1000
>5000
500
Staphylococcus aureus 100
100
20
200
100
5
10
Bactérias resistentes ao
formaldeído
750
4000
>5000
250
300
300
250
Leveduras
Candida albicans 100
100
50
200
75
50
35
Torula rubra 100
100
50
50
100
50
100
Saccharomyces cerevisiae 200
50
50
200
Fungos
Aspergillus niger 75
100
100
100
100
100
50
Penicillium citrinum 35
100
75
100
50
50
50
Rhizopus nigricans 50
100
50
100
100
35
15
Trichophyton mentagrophytes
5-10
50-100
Trichophyton pedis 20
20
10
100
50
10
10
OPP=2-fenilfenol; BP=benzilfenol; OBCP=o-benzil-p-clorofenol;PCMC=p-cloro-m-cresol; PCMX=p-cloro-m-xilol;
DC=5,5´-dicloro-2,2´-dihidroxi-difenil metano; PCP=pentaclofenol.
Fonte: Paulus, 2005; Lanxess, 2007a, 2007b
Segundo Paulus (1993), em concentrações baixas de tensoativo, nas quais
não há formação de micelas, a disponibilidade do derivado fenólico é maior. Porém,
em concentrações altas de tensoativos (em especial tensoativos não-iônicos, mas
em menor grau também para os aniônicos), deve-se aumentar a concentração de
derivados fenólicos para manter-se a ação biocida. Isto se deve ao fato de ocorrer a
inclusão do biocida nas micelas formadas quando o tensoativo apresenta
concentrações acima da sua concentração micelar crítica (cmc), reduzindo a
adsorção do biocida às bactérias.
Já Bean e Berry (1951) estudaram a atividade antimicrobiana do OBCP em
uma solução de laurato de potássio e concluíram que tanto a concentração de sabão
e a de biocida, quanto a relação destas, influenciam na atividade antimicrobiana do
27
OBCP, apresentando relações favoráveis e desfavoráveis para atividade
antimicrobiana. E ainda, que a atividade antimicrobiana está diretamente relacionada
com a concentração de OBCP na micela e independe da concentração na solução.
Os tensoativo não-iônicos como, por exemplo, o Tween 80, são utilizados
como inibidores da atividade antimicrobiana, quando da execução de ensaios
microbiológicos como será apresentado na seção 3.2.11.1 .
O 4-cloro-3-metil-fenol (p-cloro m-cresol, PCMC) apresenta um amplo e
equalizado espectro de ação antimicrobiana, que abrange bactérias, leveduras e
fungos, sendo eficaz também contra os vírus da hepatite B, herpes e HIV, mesmo na
presença de contaminação de matérias orgânicas como proteínas. Em geral, altas
concentrações são necessárias para atingir eficiência contra micobactérias (1500-
5000 ppm para Mycobacterium tuberculosis ATCC 25618). Sua eficiência é maior
entre pH 4 e 8 e apresenta grande solubilidade em água (580 g L
-1
a 20
o
C)
(PAULUS, 2005). Por todos estes atributos, o PCMC e o seu sal sódico são
utilizados como conservante em tintas, adesivos, pigmentos, aditivos para concreto,
nos produtos têxteis e artefatos de couro, como também em uma variada gama de
formulações de desinfetantes hospitalares, podendo estar associado a uma pequena
quantidade de glutaraldeído, a fim de atingir maior eficiência viruscida (PAULUS,
2005, LANXESS, 2007a).
Outro importante representante deste grupo é o 2-benzil-4-cloro-fenol (o-
benzil –p-clorofenol, OBCP). O espectro de atividade do OBCP é amplo para fungos
e leveduras, mas apresenta falhas para bactérias, como Pseudomonas. Em
formulações de desinfetantes, pode ser usado em combinação com outros ativos
fenólicos, melhorando o espectro de ação antimicrobiana do produto e podendo-se
também diminuir a concentração de OBCP, o que minimiza o risco de aparecimento
28
de irritação da pele. O OBCP atua melhor em pH entre 4 e 8, porém é estável em
toda faixa de pH entre 1 e 14. Devido à sua baixa solubilidade em água (0,5 g L
-1
a
20
o
C) em muitas formulações, está associado aos tensoativos uma vez que é
compatível com tensoativos aniônicos, sabões e, em certas condições, com não
iônicos, porém não é compatível com catiônicos. Apresenta aplicações em
formulações desinfetantes para uso hospitalar, doméstico, industrial e veterinário
(PAULUS, 2005; LANXESS, 2008).
O 2-fenil-fenol (o-fenil-fenol, OPP) apresenta um amplo espectro de atividade
antimicrobiana, valores favoráveis de toxicidade e é completa e rapidamente
biodegradado. Sua solubilidade em água é baixa (0,5-0,6 g L
-1
a 20
o
C), mas é
facilmente solúvel em etanol (5900 g L
-1
a 20
o
C). É empregado em formulações
desinfetantes para uso hospitalar, doméstico, veterinário, ambientes públicos,
indústria de madeira, papel, couro, têxtil, colas e adesivos e preservação de frutas
entre outras aplicações, podendo ser associado a outros derivados fenólicos como o
OBCP e o PCMC (PAULUS, 2005; LANXESS, 2007b).
2.2.1 Toxicidade e ecotoxicidade dos compostos fenólicos
O conhecimento da toxicidade e da ecotoxicidade dos fenólicos é de grande
importância e deve ser levado em consideração quando da seleção e decisão de
uso destes como agentes biocidas ou bacteriostáticos.
Apesar de alguns derivados fenólicos apresentarem alta toxicidade e baixa
biodegradabilidade e, por isso, apresentarem alto índice de rejeição quanto ao seu
uso, há um vasto número de derivados fenólicos que apresentam características
toxicológicas e ecotoxicológicas que permitem seu uso de forma segura.
29
A Tabela 7 apresenta valores de toxicidade de alguns dos fenólicos mais
consumidos mundialmente. Pode-se observar que apesar do fenol propriamente dito
apresentar baixo valor de DL
50
(317 mg kg
-1
), os derivados fenólicos aludidos na
tabela possuem altos valores de DL
50
com exceção do pentaclorofenol (150 mg kg
-1
).
Tabela 7 - Dados toxicológicos do fenol e alguns de seus derivados
Fenólicos DL
50
oral, rato
(mg kg
-1
)
Irritação Toxicidade
Percutânea
Pele Mucosa
Fenol 317 ++ ++ ++
OPP 2.700 + ++ -
BP 3.360 ++ ++ -
PCMC 1.830 ++ ++ -
OBCP >5.000 ++ ++ -
PCMX 3.830 + + -
DC 3.310 - + -
PCP 150 ++ ++ ++
b
Triclosan 4.530->5.000 - -
-, sem efeito; +, moderado; ++, forte; OPP, o-fenilfenol; BP, benzilfenol; PCMC, p-cloro-m-cresol; OBCP, o-benzil-
p-clorofenol;PCMX, p-cloro-m-xilol; DC, 5,5´-dicloro-2,2´-dihidroxi-difenil metano; PCP, pentaclorofenol;
a
DL
50
=
325 mg/kg, rato
Fonte: GODDARD, P.A., McCUE, K.A. (2000), PAULUS, W. (2005)
2.2.1.1 Ecotoxicidade do PCMC
A biodegradabilidade do PCMC foi avaliada por meio da metodologia OECD
(European Organization for Economic Cooperation and Development) Guideline
301C e os resultados obtidos conferiram uma classificação de material facilmente
biodegradável (>90%), formando quantidade estequiométrica de íons cloretos e
sugerindo uma completa mineralização do material (PAULUS, 2005).
Lanxess (2003) apresenta dados da literatura que indicam a total
mineralização do PCMC, em concentrações até 100 mg L
-1
, pelas bactérias naturais
do Rio Reno em um período de 7-14 dias, quando a substância era oferecida como
única fonte de carbono. Neste estudo, a biodegradabilidade foi também avaliada por
30
meio do monitoramento do teor de cloreto formado. A Tabela 8 apresenta dados de
concentração letal (CL) e concentração efetiva (CE), determinados por estudos de
ecotoxicidade aguda.
Tabela 8 - Dados de concentrações letal (CL) e efetiva (CE) do PCMC em diferentes
organismos
Concentração Valor (mg L
-
1
). h
CE
50
para lodo ativado 60
CE
50
para algas (
Scenedesmus subs.
) >10
(96h)
CE
50
para microcrustácio (
Daphnia magna
) 2,29 (48h)
CL
50
para microcrustácio (Daphnia magna) 3,90
(48h)
CL
50
para peixes (Leuciscus idus ) 1,20
(48h)
CL
50
para truta arco-íris (
Onchorhynchus mykiss
) 0,92
(96h)
CL
50
para peixes (
Pimephales promelas)
7,60 (96h)
Fonte: Paulus (2005) e Lanxess (2003)
A bioacumulação do PCMC foi investigada de acordo com o Guideline OECD
305 C, durante um período de teste de seis semanas, utilizando-se o peixe Oryzae
latipes, como organismo teste. O fator de bioacumulação (FBA) obtido foi 10
(LANXESS, 2003).
2.2.1.2 Ecotoxicidade do OBCP
No estudo de toxicidade e ecotoxicidade do OBCP apresentado por Lanxess
(2006a), a biodegradabilidade deste material foi testada seguindo diferentes
metodologias:
a) Empregando-se a OECD 301 D (frasco fechado): relativa a uma demanda
química de oxigênio (DQO) de 2170 mg g
-1
obteve-se, uma demanda
31
bioquímica de oxigênio (DBO) de 30-40% (5 dias), 40-50% (10 dias) e 45-
55% (20 dias) determinados após adaptação da bactéria;
b) Em condições não climatizadas em água de rios, 0,1 mg L
-1
de OBCP foi
degradado em 6 dias. Em esgoto 0,5 e 1,0 mg L
-1
degradou em 1 dia;
c) Na presença de lodo ativado em sistema climatizado, 1 mg L
-1
de OBCP
atingiu grau de degradação de 80% em 1 hora e 100% em 24 horas.
A Tabela 9 apresenta os dados de CL e CE determinados por estudos de
ecotoxicidade aguda.
Tabela 9 - Dados de concentrações letal (CL) e efetiva (CE) do OBCP em diferentes
organismos
Concentração Valor (mg L
-
1
). h
CE
50
para lodo ativado
9,60
CE
50
para algas (Pseudokirchneriella subcapitata) 0,13 (72h)
CE
50
para microcrustácio (
Daphnia magna
)
1,50 (24h)
CL
100
para peixes (Leuciscus idus ) 1,20 (48h)
CL
50
para peixe em método estático 1,00
(96h)
Fonte: Paulus (2005) e Lanxess (2006a)
A bioacumulação do OBCP foi determinada por meio de estudo conduzido
para amostras de OBCP intactas e radioativadas por um período de 8 dias,
utilizando-se o peixe Lepomis macrochirus como organismo teste. Determinou-se
FBA de 75 para o material intacto e 460 para o material radioativado. (LANXESS,
2006a).
Estudos de fotólise do OBCP foram realizados de acordo com a ASTM Draft
N
o
6, “Proposed Standard Practice for Conducting Aqueus Photolysis Test (1980)”,
obtendo-se meia vida (t
1/2
) de 5 dias quando utilizado água milli-Q e 16,8 h com água
natural (LANXESS, 2006a).
32
2.2.1.3 Ecotoxicidade do OPP
Lanxess (2006b) apresenta um resumo da literatura dos resultados de
biodegradabilidade do OPP obtidos a partir do emprego de diferentes metodologias:
a) empregando-se a OECD 301 D (frasco fechado): trabalhando-se em
condições adaptadas, obteve-se DBO de 50-60% (5 dias), 60-70% (10
dias) e 70-80% (20 dias);
b) nas águas do Rio Reno, sem a inoculação, a biodegradabilidade atingiu
89% depois de 3 dias e 100% depois de 6 dias;
c) na presença de lodo ativado, o OPP é totalmente degrado após um
período de 10-14 dias.
A Tabela 10 apresenta os dados de CL e CE do OPP determinados por
estudos de ecotoxicidade aguda.
Tabela 10 - Dados de concentração letal (CL) e concentração efetiva (CE) do OPP para
diferentes organismos
Concentração Valor (mg L
-
1
). H
CE
50
para lodo ativado 62,20
CE
50
para algas (
Scenedesmus subspicatus
) 0,85
(72h)
CE
0
para microcrustácio (
Daphnia magna
) 0,75 (24h); 0,38 (48h)
CE
50
para microcrustácio (Daphnia magna) 2,1(24h);1,50 (48h)
CL
0
para peixes (Leuciscus idus ) 20,00(96h)
CL
0
para truta arco-íris (
Salmo gairdneri
) 5,00
(48h)
CL
100
para peixes (
Salmo gairdneri)
10,00 (48h)
Fonte: Paulus (2005) e Lanxess (2006b)
LANXESS (2006b) cita que o fator de bioacumulação encontra-se numa faixa
de 70 a 100, calculado por meio da metodologia QSAR. Considera que, devido à
metabolização da substância (por exemplo, sulfatação) o valor real do FBA deve
33
estar abaixo desta faixa e, desta forma, o OPP não apresentando risco de
bioacumulação.
2.2.2 O mercado dos derivados fenólicos
De acordo com um estudo realizado por Kline & Company (2006) sobre o
mercado americano de biocidas fenólicos, estima-se crescimento médio de consumo
de derivados fenólicos de 1,7% entre 2004-2009, com uma previsão de atingir um
consumo total de 14,2 Mil t em 2009.
O mercado de preservação de madeira é o maior consumidor de PCP, o que
classifica o PCP como líder no mercado de fenólicos com uma participação 85% em
volume e 61% em valor. Considerando o mercado brasileiro de produtos saneantes,
o maior consumo é do OBCP.
2.3 Tensoativos
Tensoativos são substâncias capazes de reduzir a tensão superficial do meio
no qual estão dissolvidas, podendo também reduzir ou não a tensão interfacial entre
o meio no qual estão dissolvidas e outro meio condensado.
Outras denominações para tensoativos são detergentes ou surfatantes (do
termo em inglês surfactant – surface active agent).
Uma singularidade presente nas moléculas tensoativas é a presença de duas
porções estruturais distintas: uma cauda hidrofóbica e uma cabeça hidrofílica,
mostrando tendências opostas de solubilidade.
34
Na região denominada “cabeça”, há um grupamento polar que possui
afinidade por água ou por outros compostos polares e é denominado grupo
hidrofílico. Como exemplo, pode-se citar os grupos carboxilato, sulfato, sulfonato,
amônio quaternário, betaínicos ou cadeias polioxietilênicas, como no caso dos
tensoativos não-iônicos etoxilados. Na mesma molécula, na região denominada
“cauda”, há o chamado grupo hidrofóbico que, por sua natureza apolar, não possui
afinidade por água, mas a possui por substâncias apolares, sendo chamado muitas
vezes de grupamento lipofílico. É, normalmente, constituída por cadeias de
hidrocarbonetos alifáticos ou de aromáticos, ou de ambos (FALBE, 1987).
Os primeiros tensoativos sobre os quais se têm relatos são os sabões de
ácidos graxos. Acredita-se que o sabão tem sido usado há mais de 2.300 anos e
que os primeiros produtores usavam gordura animal e cinzas. À medida que se
fervia a mistura (composta de gordura, cinzas e água), ocorria a saponificação e
neutralização, originando assim o sabão.
Os primeiros tensoativos sintéticos surgiram da necessidade de se suprir a
falta de matérias-primas naturais (óleos e gorduras animais e vegetais) existente
durante a Primeira Guerra Mundial. A Tabela 11 apresenta cronologicamente o
aparecimento dos diversos tensoativos usualmente comercializados para aplicações
na área de higiene e limpeza.
35
Tabela 11- Linha do tempo dos lançamentos de alguns dos principais tensoativos de uso
comercial
Data de lançamento Tensoativo introduzido
0 a.C. Sabões de ácidos graxos
Anos 20 Alquil sulfatos
Dodecilbenzeno sulfonatos
Anos 30 Alquifenóis etoxilados
Amidas
Quaternários
Anos 40 Óxidos de aminas
Linear alquilbenzeno sulfonatos
Alcoóis etoxiladosCopolímeros EO/PO
Anos 50 Alquil éter sulfatos
Alcano sulfonatos
Alfa olefina sulfonadas
Poliaminas
Anos 60 Betaínas
Anos 70 Alquil poliglicosídeos
Ésteres metílicos sulfonados
Anos 80 Glucamidas
anos 90 Ésteres metílicos etoxilados
>2000 Monoglicerídeos sulfatados
Tensoativos geminados
Fonte: Pedro, 2008
Outra classificação empregada para os tensoativos é feita segundo a
natureza da cabeça polar, ou seja, grupo hidrofílico:
a) Aniônicos: tensoativos que em solução aquosa apresentam carga negativa
em seu grupo polar. Os principais representantes desta classe são os
sabões de ácidos graxos, os alquil sulfatos, os alquil éter sulfatos e os
alquil sulfossuccinatos;
b) Catiônicos: tensoativos que em solução aquosa apresentam carga positiva
em seu grupo polar. São exemplos os sais de aminas primárias,
secundárias e terciárias, sais quaternários de amônio.
36
c) Não iônicos: são assim caracterizados por possuírem grupos hidrofílicos
sem cargas ligados à cadeia graxa. Sua solubilidade em água é devida à
hidratação dos grupos hidrófilos, via ponte de hidrogênio. Como exemplos
podem ser citados os alquilaril e alcoóis etoxilados e etoxilados-
propoxilados, ésteres de alcoóis poli-hídricos, amidas e aminas etoxiladas.
d) Anfóteros: são caracterizados por apresentarem, na mesma molécula,
grupamentos positivo e negativo. O grupamento positivo é, normalmente,
representado por um grupo de nitrogênio quaternário, enquanto que o
negativo por um grupo carboxilato ou sulfonato. O grupo polar positivo é
mais pronunciado em pH menor que 7 ao passo que o grupo polar negativo
é mais pronunciado em pH maior que 7.
2.3.1 Sabões de ácidos graxos
Os ácidos graxos são ácidos carboxílicos de cadeia longa, variando de 10 a
30 carbonos (os mais usuais são de 12 a 18). Em moléculas com tamanho de cadeia
graxa pequena, o grupo funcional ácido é dominante, o que confere um caráter polar
à molécula. Por outro lado, em ácidos graxos de cadeia longa, esta atribui um
caráter apolar à molécula.
O sabão é produzido pela saponificação ou reação de hidrólise alcalina de
gorduras e óleos. De forma geral, são utilizados hidróxido de sódio ou carbonato de
sódio para converter o ácido graxo em seu sal.
A reação de hidrólise pode ser representada como:
Triglicerídeo+ NaOH → Glicerol + Sabão
37
As cadeias graxas mais usadas na produção de sabão são: C12 (láurico)
ácido saturado, C14 (mirístico) ácido saturado, C18 (esteárico) ácido saturado e C18
(oléico) ácido monoinsaturado. Sabões com cadeia menores que C8 são totalmente
solúveis em água enquanto que, entre C8-C18, são parcialmente solúveis e acima
de C20 são insolúveis em água (GALVAÑ, 1996).
A solubilidade do sal de sabão também é regida pelo neutralizante
empregado. Os sabões de sal de potássio são mais solúveis que aqueles à base de
sódio. As etanolaminas (monoetanolamina, dietanolamina e trietanolamina)
apresentam sais mais solúveis e com melhores propriedades espumantes.
2.3.2 Linear alquilbenzeno sulfonato (LAS)
O tensoativo mais utilizado em formulações detergentes no mundo é o LAS,
comumente chamado de ácido sulfônico. Sua alta aplicação se deve tanto ao baixo
custo de produção como à sua excelência como detergente, promotor de espuma e
poder de molhabilidade, apresentando uma elevada capacidade de remoção da
gordura de constituição das mãos.
O LAS é produzido a partir da sulfonação do linear alquilbenzeno C
10
-C
13
(LAB) com trióxido de enxofre ou com oleum (ácido sulfúrico fumegante), resultando
no ácido dodecilbenzeno sulfônico, que pode ser neutralizado com hidróxido de
sódio e trietanolamina, entre outros (FALBE, 1997).
Segundo Almeida et al. (1994), as propriedades físico-químicas do LAS
dependem essencialmente da estrutura do LAB (comprimento e grau de ramificação
da cadeia carbônica e posição do grupo fenil), do teor de subprodutos da reação de
obtenção do LAB e dos agentes de neutralização empregados.
38
2.3.3 Alfa olefina sulfonada (AOS)
As AOS´s foram comercialmente difundidas nos Estados Unidos após 1965.
No Japão, entre 1980-81, o uso da AOS em produtos domissanitários ultrapassou
aquele do LAS. As AOS´s são freqüentemente escolhidas como substitutas ao linear
alquilbenzeno sulfonato devido às suas propriedades de biodegradação, espuma,
detergência, resistência a dureza da água e suavidade. Estas diferenças de eficácia
se devem ao fato das cadeias carbônicas das alfa-olefinas variarem de C12 a C18.
Segundo boletim técnico da Stepan Company (2001), a biodegradação
primária das AOS´s comercializadas por esta empresa pode chegar a 100% em 3 a
5 dias, sob condições de laboratório. O material BIO-TERGE AS40 apresenta os
seguintes dados toxicológicos e ecotoxicológicos (STEPAN, 2006):
Não listado como carcinogênico de acordo com IARC, NTP ou OSHA.
Toxicidade oral DL
50
(ratos) = >500 - 5000 mg/kg
Toxicidade dérmica DL
50
(coelhos) = >400 < ou igual a 2000 mg/kg
Ecotoxicidade aquática CL
50
= >1.0-10 mg/L
2.4 A morfologia das bactérias
O conhecimento da morfologia dos microrganismos é uma ferramenta de
auxílio para compreensão da interação entre estes com um dado agente
atimicrobiano, levando à compreensão do mecanismo de ação desta interação e da
seletividade microbiana.
Neste trabalho, os microrganismos alvo de estudo foram as bactérias. A
seguir são apresentadas algumas considerações sobre a morfologia destas.
39
Entre as principais características das células bacterianas estão suas
dimensões, forma, estrutura e arranjo. Estes elementos constituem a morforfologia
da célula, no entanto, são consideradas características morfológicas grosseiras das
bactérias. Com o refinamento das técnicas de microscopia eletrônica se faz possível
o maior conhecimento sobre a célula bacteriana e sua anatomia intracelular típica.
Além do conhecimento das estruturas intracelulares, deve-se ter ciência de suas
propriedades estruturais e funcionais na célula bacteriana.
a) Estruturas externas: é constituída de glicocálice, cápsula, flagelos,
filamentos axiais (endoflagelos), fíbrias e/ou pili, endosporo (esporos) e
parede celular.
Parede celular: estrutura complexa, semi-rígida, cuja principal função é
dar forma e rigidez à célula. De acordo com a estrutura e a organização
da parede celular, as bactérias podem ser divididas em dois grupos:
Gram positivas e Gram negativas.
Os constituintes básicos da parede celular de bactérias Gram positivas e
Gram negativas estão ilustrados na Figura 5 e as diferenças na sua composição
estão descritas a seguir:
Bactérias Gram positivas: apresentam uma parede celular relativamente
simples, sendo constituída por uma membrana citoplasmática, uma
camada espessa de peptidoglicano (ou mureína) e uma camada externa,
que pode ou não estar presente, denominada cápsula. Contém ainda os
ácidos teicóicos que quando ligados ao peptidoglicano ou a lipídeos da
membrana citoplasmática são denominados ácidos lipoteicóicos. Entre 40
a 90 % do seu peso são formados de peptidoglicano, sendo que esta
constituição não proporciona um grande obstáculo para a penetração de
40
pequenas moléculas como, por exemplo, um agente antimicrobiano
(SCHMITT, 1986).
Fonte: MORETTI, 2008; E-ESCOLA: UNIVERSIDADE TÉCNICA DE LISBOA, 2008
Figura 5. Representação esquemática comparando as estruturas de bactérias Gram
positivas e Gram negativas
Bactérias Gram negativas: sua parede celular apresenta uma estrutura
mais complexa constituída de uma membrana citoplasmática (também
chamada de membrana interna) circundada por uma fina camada de
peptidoglicano (a quantidade de peptidoglicano não excede a 10% do seu
peso seco). Presa à camada de peptidoglicano está a membrana externa,
que é formada por uma dupla camada lipoprotéica constituída de
proteínas, lipoproteínas, lipopolissacarídios, porina e fosfolipídios. A
complexidade da membrana externa oferece um maior impedimento de
ação dos agentes antimicrobianos (SCHMITT, 1986).
Detalhe da Parede
celular Gram Positiva
Gram positiva
citoplasma citoplasma
Membrana
citoplasmática
Gram Negativa
Detalhe da
Parede celular
Gram Negativa
Membrana
Externa
Peptidoglicano
Espa
ço
Periplásmico
41
b) Estruturas internas: São as membranas internas (ou citoplasmáticas),
citoplasma, nucleóide (ou região nuclear), ribossomos, glânulos (ou
corpúsculos de inclusão) e vacúolos gasosos.
2.5 Tipos de tratamento para o controle de crescimento de microrganismos
Os microrganismos são as formas de vida mais difundida na natureza. Sua
presença tem efeitos positivos e negativos na vida do homem e, portanto, seu
controle é fundamental para evitar que estes produzam conseqüências indesejáveis
para a saúde, ao meio ambiente e aos bens que compõem a qualidade de vida do
ser humano.
Os tratamentos para o controle de crescimento de microrganismos podem ser
realizados por meio físico ou químico, os quais devem ser específicos para a ação
desejada e não devem produzir efeitos colaterais indesejáveis.
Entre os agentes físicos mais utilizados podemos citar o calor seco (estufa,
incineração, aquecimento ao rubro, flambagem), a pressão, calor úmido (autoclave,
água em ebulição, pasteurização), a radiação (radiação gama, raios X e ultravioleta),
os filtros e dessecação (liofilização).
Quando do emprego de controle químico, faz-se uso de agentes
antimicrobianos, os quais podem ser divididos, entre os que matam os
microrganismos, que são os microbicidas, e aqueles que inibem seu crescimento, os
chamados microbiostáticos. Algumas substâncias químicas antimicrobianas são
bactericidas em uma determinada concentração e bacteriostática em concentrações
menores (PELCZAR JUNIOR et al., 1996).
O agente antimicrobiano “ideal” deve possuir características que lhe
proporcionem eficiência sob todas as condições de uso. A seguir estão listadas as
42
propriedades principais que o agente antimicrobiano deve possuir. Essa lista pode
ser usada como um guia na seleção do melhor agente para a aplicação à que se
destina (PELCKZAR JUNIOR et al., 1996):
a) atividade antimicrobiana de amplo espectro - esta é sempre a primeira
exigência e deve ser atendida com o uso de baixa concentração do
material e ter ação eficaz sobre uma grande variedade de microrganismos;
b) solubilidade - a substância deve ser solúvel em água ou outros solventes
(álcool) em quantidades necessárias ao seu uso efetivo;
c) compatibilidade com outros componentes da formulação - deve ser
compatível com sabões, detergentes e outros produtos químicos presentes
na fórmula a fim de manter sua atividade, como também ser ainda
minimamente afetado a fim de garantir ação antimicrobiana;
d) estabilidade - o armazenamento da substância durante um período
razoável (shelf life/prazo de validade ou tempo de prateleira), sob variações
climáticas, não deve resultar em uma perda significativa de ação
antimicrobiana; a estabilidade também deve ser mantida quando diluído;
e) ausência de toxicidade - não deve prejudicar o homem nem os animais;
f) homogeneidade - as preparações devem ser uniformes em sua
composição;
g) inativação mínima por material estranho - alguns compostos químicos
antimicrobianos são facilmente combináveis com proteínas, diminuindo
assim a quantidade de substância química disponível na ação contra os
microrganismos;
43
h) atividade em temperatura ambiente - não deve ser necessário aumentar a
temperatura, além daquela normal encontrada no ambiente, onde os
compostos químicos são utilizados;
i) poder de penetração - a ação antimicrobiana é limitada ao local de
aplicação. Entretanto, a ação na superfície faz-se algumas vezes
necessária;
j) ausência de poderes corrosivos e tintoriais - os componentes não devem
corroer ou desfigurar metais, corar ou danificar os tecidos ou causar
deterioração de borrachas, plásticos e outros materiais;
k) poder desodorizante – o produto deve ser inodoro ou apresentar um odor
agradável.
l) capacidade detergente - um agente antimicrobiano que tem propriedades
detergentes tem a vantagem de ser capaz de remover mecanicamente os
microrganismos da superfície que está sendo tratada;
m) disponibilidade a baixo custo - o produto deve ser facilmente encontrado e
de baixo custo;
n) biodegradabilidade – quando disposto ao meio ambiente, o produto deve
ser biodegradável e não acumulativo;
o) atendimento à legislação vigente – o agente antimicrobiano deve ter seu
uso aprovado para a aplicação à que se destina pela legislação vigente.
A utilização de um único agente antimicrobiano em determinados
desenvolvimentos de formulações de desinfetantes não se mostra suficiente e
utiliza-se a combinação de dois ou mais agentes para aumentar o espectro de
atuação e as condições de uso.
44
Alguns elementos-chave que devem ser compreendidos no estudo da seleção
e combinações de agentes antimicrobianos são:
a) o mecanismo de ação do agente antimicrobiano;
b) os fatores que influenciam este mecanismo;
c) a adição no produto;
d) as condições de uso do produto como: diluição de uso, materiais que
podem inativar o agente antimicrobiano, materiais orgânicos, etc.
2.5.1 Principais agentes antimicrobianos
A aplicação do óleo de pinho, do fenol e seus derivados como agentes
antimicrobianos já foi abordada previamente. Entretanto, outros compostos merecem
destaque em virtude de sua ampla aplicação no controle de microrganismos:
Alcoóis. No Brasil o mais utilizado é o álcool etílico (etanol), mas pode-se
citar também o álcool isopropílico (isopropanol) e o n-propanol (as propriedades
bactericidas aumentam com o aumento do tamanho da cadeia). Os alcoóis
apresentam rápido e amplo espectro de ação contra bactérias vegetativas (inclusive
micobactérias), vírus e fungos, não sendo, porém, esporicidas. Todavia, são
conhecidos por inibir a esporulação e a germinação de esporos, mas este efeito é
reversível. Bactérias Gram negativas são mais sensíveis aos alcoóis que as
bactérias Gram positivas. São largamente aplicados como anti-sépticos de pele, e
desinfetantes de superfícies, em baixas concentrações podem ser usados como
conservantes e para potencializar outros biocidas. A atividade antimicrobiana dos
alcoóis é significativamente baixa em concentrações menores que 50%, tornando-se
ótima na faixa de 60 a 90% (FRAISE, 1999; PELCKZAR JUNIOR et al., 1996,
PENNA; MAZZOLA; MARTINS, 2001).
45
Cloro e agentes liberadores de cloro. O cloro, quando na forma gasosa (Cl
2
)
é de difícil manipulação e requer equipamentos especializados e, por isso, seu uso é
limitado a aplicações de larga escala como, por exemplo, no tratamento de água. Os
liberadores de cloro como o hipoclorito de sódio são mais empregados por
apresentarem maior facilidade no manuseio. Apresentam ação rápida como
bactericida (inclusive tuberculicida), viruscida. São corrosivos e, por isso, sua
aplicação em superfícies metálicas deve ser evitada. Sua ação pode ser reduzida
quando na presença de matéria orgânica e são incompatíveis com detergentes
catiônicos (FRAISE, 1999; PELCKZAR JUNIOR et al., 1996).
Peróxido de hidrogênio. O peróxido de hidrogênio é um forte agente
oxidante, apresenta ação bactericida, viruscida, tuberculicida, esporocida e
fungicida. Na concentração de 3 a 6%, apresenta ótimo desempenho e em
concentrações mais elevadas, entre 6 e 25%, tem propriedades esterilizantes. É
facilmente decomposto em água e oxigênio, tornando seu uso ambientalmente
correto. (McDONNELL; RUSSELL, 1999, PENNA; MAZZOLA; MARTINS, 2001).
Quaternários de Amônio (QAC´s). O maior exemplo deste tipo de compostos
para esta aplicação é o cloreto de benzalcônio. De uma maneira geral, os QAC´s
são muito efetivos contra bactérias Gram positivas e efetivos em menor grau para as
Gram negativas, sendo a do Gênero Psedomonas especialmente mais resistente.
São ativos contra alguns fungos e contra vírus com envoltório lipídico. Não
apresentam ação letal contra esporos bacterianos, vírus sem envoltório e
micobactérias. Os QAC´s são fortemente inativados pelas proteínas por meio de
processo de adsorção, como também por uma variedade de materiais naturais e
sintéticos e por detergentes não-iônicos, sabões. São influenciados negativamente
pela presença de íons cálcio e magnésio presentes na água dura. Podem danificar
46
borrachas sintéticas e alumínio. A faixa de pH entre 9 e 10 mostra-se ideal,
enquanto que, valores abaixo de 7,0 são desfavoráveis (FRAISE, 1999;
McDONNELL; RUSSELL, 1999; MERIANOS, 2000; PELCZAR JUNIOR et al., 1996;
PENNA; MAZZOLA; MARTINS, 2001).
Clorhexidina: É um biocida amplamente utilizado em produtos anti-sépticos
(em particular para mãos e bocas) como ingrediente ativo ou conservante, fato este
que se deve ao seu largo espectro de ação antimicrobiana e por provocar baixa
irritação na pele. Sua atividade depende do pH do meio e é fortemente reduzida na
presença de material orgânico (McDONNELL; RUSSELL, 1999).
Biguanidas poliméricas: As biguanidas poliméricas vêm sendo aplicadas
como agente desinfetante na indústria de alimentos e bebidas e na desinfecção de
piscinas. A PHMB (polihexametileno biguanida) é ativa contra bactérias Gram
positivas e Gram negativas, vírus, não sendo esporicida. Apresenta boa estabilidade
térmica, baixa corrosividade e alta solubilidade em água. Por apresentar alta
atividade antimicrobiana contra Pseudomonas aureginosa, é utilizada em
formulações desinfetantes associada a compostos quaternários de amônio e
derivados fenólicos (McDONNELL; RUSSELL, 1999).
2.5.2 Mecanismo de ação dos agentes antimicrobianos
Os agentes antimicrobianos atuam de várias maneiras para inibir ou matar os
microrganismos e considerável progresso tem sido obtido na compreensão dos seus
mecanismos de ação (CLOETE, 2003; DENYER, 1995; DENYER; RUSSELL, 2003;
MCDONNELL; RUSSELL, 1999; STEWART, 1998; SCHMITT, 1986). A partir deste
conhecimento é possível predeterminar-se as condições sob as quais o biocida
47
atuará mais efetivamente e revelar quais microrganismos serão mais susceptíveis ao
seu ataque.
A Figura 6 ilustra as regiões de ataque do biocida na bactéria e a Tabela 12
apresenta informação adicional sobre o dano provocado ao sítio atacado e suas
conseqüências para o microrganismo.
Figura 6. Sítios de ação dos agentes antimicrobianos
Fonte: Cloete, 2003; IFH, 2000
Liberação de
componentes
intracelular
Fenóis
Etanol
SDS
Clorhexidina
QAC´s
Triclosan
Citoplasma
Fenóis
QAC´s
Clorhexidina
Sais de Cu
II
Sais de Ag
Sais de Hg
II
Glutaraldeído
H
2
O
2
Organomercu-
riais
Hexaclorofeno
Parede Celular
Fenóis
Óleo de Pinho
CRA´s
Formaldeído
Sais de Hg
II
Organomercuriais
EDTA
SDS
Membrana
Interna
Fenóis
Parabenos
Ácidos fracos
(acético, sórbico,
benzóico)
Anilidas
Clorhexidina
48
Tabela 12 - Ações do agente antimicrobiano nas bactérias e suas conseqüências
Sítio de Ação Dano Provocado Conseqüência Agente Antimicrobiano
Parede Celular Mudança estrutural e funcional;
liberação de componentes da parede
celular; iniciação de autólise.
Anomalias na morfologia e construção,
aumento da não especificidade na
permeabilidade celular, ruptura.
Fenol e seus derivados, óleo de pinho, hipoclorito
de sódio, formaldeíd
o, liberadores de formaldeído,
mercuriais, CTAB, alcoóis alifáticos, 2-
feniletanol,
EDTA, SDS, ácido benzóico.
Membrana
Citoplasmática
Perda da organização estrutural e
integridade.
Progressiva liberação de material
intracelular (ex.: íons de potássio, fosfatos
inorgânicos, aminoácidos, pentoses,
nucleotídeo, proteína); iniciação de
autólise.
QAC´s, fenol e seus derivados, fenticloro, etanol,
clorhexidina, biguanida polimérica, 2-
feniletanol,
n-dodecildietanolamina, polietoxialquilfenol, SDS.
Membrana
Citoplasmática
Aumento seletivo da permeabilidade a
prótons e outros íons.
Dissipação da força próton motora;
desacoplamento da fosforilação oxidativa;
inibição do transporte ativo; perda das
substâncias intracelulares vitais.
Ácidos fracos lipofílicos (ex.:
acético, propiónico,
sórbico, benzóico), parabenos, alquilfenois,
clorocresol, 2-fenoxietanol, fenticloro, 1-
dodecilpiperidine n-óxido, tetraclorosalicilanilida.
Membrana
Citoplasmática
Inibição da ligação membrana enzima Inibição da respiração e transferência de
energia; inibição de síntese de ATP;
inibição substrato de oxidação; inibição do
processo de transporte
Clorhexidina, 2-
fenoxietanol; azida, bronopol,
CTAB, isotiazolinona (ex.: 5-cloro-2-metil-4-
isotiazolin-3-ona; 1,2-benzisotazolin-3-
ona),
aceta
to de iodo, organomercuriais, sais de metais
pesados (ex.: prata, cobre e mercúrio)
Citoplasma Inibição de enzimas citoplasmáticas;
interação com biomoléculas funcionais
(ex.: DNA, RNA)
Inibição de processo catabólico e anabólico
Formaldeído e liberadores
de formaldeído,
agentes oxidantes (ex.: peróxido de hidrogênio,
ácido peracético), parabenos, cloroacetamida,
Citoplasma Coagulação e precipitação de
constituintes citoplasmáticos
(usualmente sob alta concentração de
biocida)
Desnaturação de enzimas; destruição de
biomoléculas
Clorhexidina e outras biguanidas, QACs, alguns
fenólicos e alguns metais pesados
Fonte: Denyer,1995
49
2.5.3 Métodos para avaliação da atividade antimicrobiana
O estudo para o desenvolvimento de métodos possíveis de serem
empregados na avaliação da ação antimicrobiana de uma substância teve início logo
após a descoberta de que as bactérias eram causadoras de infecções e
deteriorações. Em 1881, Robert Koch publica um artigo descrevendo um teste
precursor do atual teste carreador. Em 1890, Geppert aprimora o método de Koch
ao introduzir o conceito de neutralização do antimicrobiano após o tempo de
exposição. Ridel e Walker, em 1903, descrevem a primeira metodologia aplicada na
determinação do coeficiente fenólico (REYBROUCK, 1998). Muitos outros trabalhos
têm sido desenvolvidos, aprimorados e padronizados, todos objetivando a avaliação
da atividade bacteriostática ou bactericida, inclusive com simulação de condições de
uso ou testes desafios da robustez do antimicrobiano em um produto. Entre estes
métodos, seis são amplamente aplicados e recomendados pela legislação vigente
quando da avaliação de agentes antimicrobianos em aplicações específicas:
a) Concentração Inibitória Mínima (CIM ou MIC);
b) Coeficiente Fenólico;
c) Teste de Suspensão (Time Kill);
d) Halo de inibição (poços ou discos);
e) Teste de Cilindros Carreadores;
f) Teste de Desafio (Challenge Test).
50
2.5.3.1 Método de eficácia para produtos desinfetantes
Segundo a RDC n
0
14 (BRASIL, 2007), produtos com ação antimicrobiana
deverão ter sua eficácia comprovada mediante a aplicação de metodologia da AOAC
- Association of Official Analytical Chemists ou métodos adotados pelo CEN - Comitê
Europeu de Normatização. Caso não haja métodos disponíveis e recomendados
pelas instituições acima citadas, a Autoridade Sanitária competente analisará caso a
caso os métodos apresentados.
Segundo VAN KLINGEREN et al. (1998), um produto desinfetante deve ter
sua eficácia testada em três fases distintas:
Fase 1: Testes preliminares para confirmar que o produto possui ação
desinfetante. Emprega-se o teste de suspensão;
Fase 2: Testes para avaliar a ação antimicrobiana sob diversidade de uso,
como o teste de suspensão que é realizado sob diferentes substratos e em
diferentes concentrações de uso;
Fase 3: Teste “in loco”, no qual as medidas de desempenho são feitas sob
condições reais de uso.
Normalmente, os produtos são avaliados durante as etapas de
desenvolvimento (amostras recém-preparadas e envelhecidas no teste de
estabilidade sob condição de temperatura elevada) e ainda em controles periódicos,
que são realizados em amostras de prateleiras até o final de seu prazo de validade.
O método de suspensão pode ser qualitativo (coeficiente fenólico) ou
quantitativo (teste em suspensão). Em ambos, um volume apropriado de uma
suspensão de bactéria (o inóculo) é adicionado em um volume de desinfetante na
51
concentração a ser testada. Depois de um tempo de exposição, uma alíquota é
retirada a fim de verificar-se o número de microrganismos sobreviventes. No teste do
coeficiente fenólico (método qualitativo), uma alçada da suspensão bacteriana é
adicionada ao antimicrobiano e, depois do tempo de contato, uma nova alçada é
transferida para um tubo contendo meio de cultura e então incubada. O resultado é
expresso como crescimento positivo (+) ou crescimento negativo (-). Nos métodos
quantitativos, os volumes da suspensão bacteriana e da solução biocida teste são
definidos. Após o tempo de contato e de incubação é feita uma contagem do número
de microrganismos sobreviventes e a redução decimal é avaliada quando
comparada com a contagem inicial do inóculo. Subtraindo-se o logaritmo da
contagem inicial da população do logaritmo da contagem final obtém-se a redução
logarítmica decimal, ou efeito microbicida (EM ou ME), expresso na Equação 1.
log (P
i
) – log (P
f
) = EM (Equação 1)
[(P
i
-P
f
)/P
i
] x 100 = % de Morte ou de redução (Equação 2)
Onde: P
i
= população inicial; P
f
= população final; EM= efeito microbicida.
Um EM de 1 significa que 90% da população inicial foi morta (ver Equação 2),
para um EM de 2 por sua vez, significa que ocorreu morte de 99%. Em geral, se
trabalha com EM 3, isto é morte de 99,9% da população inicial e, em casos ideais,
pode se trabalhar com valores de EM acima de 5. Ou seja, eliminação maior que
99,999% da contagem microbiana inicial (REYBROUCK, 1998; AOAC, 1998a).
52
No presente trabalho utilizou-se como referência o método da AOAC 960.09
(AOAC, 1998a), empregado para avaliação de desinfetantes. Esta metodologia é
aplicada na comprovação de apelos de marketing onde se lê “mata 99,9% dos
germes e bactérias testados”.
No teste carreador, ou diluição de uso, a peça carreadora (cilindro de aço
inoxidável são empregados para o teste de produtos saneantes) é contaminada pela
imersão em uma cultura líquida do microrganismo teste e, quando seca, é
introduzida em um tubo contendo o desinfetante teste na diluição de uso. Após o
tempo de exposição, o carreador é transferido para um tubo de subcultura (o
objetivo desta transferência é remover o excesso do desinfetante carreado) e em
seguida é feita outra transferência para um novo tubo de subcultura quando, só
então, pode ser incubado e realizada a avaliação final. O não crescimento de
microrganismo indica a eficiência do agente antimicrobiano. No Brasil, a metodologia
utilizada é a da AOAC última edição, utilizando-se 60 tubos de aço inoxidável de
dimensões padronizadas, como carreadores. A aprovação só ocorre quando da
ausência de crescimento microbiano em, pelo menos, 59 tubos testados.
São encontradas na literatura algumas aplicações destas metodologias na
avaliação de produtos desinfetantes. Timenetsky e Alterthum (1989) determinaram o
coeficiente fenólico de 24 desinfetantes comercializados em São Paulo. Seis destes
produtos eram de uso hospitalar e os demais de uso doméstico. Os compostos
ativos eram formados à base de fenóis, quaternário de amônio, formaldeído, etanol e
cloro, sendo que alguns estavam associados. Os microrganismos utilizados foram o
Staphylococcus aureus ATCC 6538, a Pseudomonas aeruginosa ATCC 15442 e a
Salmonella choleraesuis ATCC 10708. Os valores dos coeficientes fenólicos
variaram de 58,3 a 0,1. Os desinfetantes hospitalares apresentaram valores
53
superiores aos de uso doméstico, mas os autores não atribuíram estas diferenças a
uma melhor qualidade dos produtos. A metodologia adotada neste estudo mostrou
que alguns produtos de uso doméstico, aparentemente, possuíam atividade
antibacteriana baixa ou inexistente uma vez que o coeficiente fenólico não pôde ser
obtido a partir das diluições utilizadas na avaliação.
Timenetsky, Yanaguita e Silva (1992) avaliaram a eficácia de 19 produtos
desinfetantes contra o Vibrio chlolerae por meio do método de diluição de uso com
10 carreadores. Os compostos ativos dos produtos incluíam formaldeído, fenóis,
cresóis, quaternário de amônio, cloro e etanol, sendo que sete destes produtos eram
de composição associada. Outros sete produtos mostraram-se ineficazes mesmo
quando aplicados puros. Dos 12 que foram eficazes puros, 8 tornaram-se ineficazes
na diluição 1:2. A água sanitária (2,8% de cloro ativo) apresentou eficácia até na
diluição 1:200.
Holah et al. (1998) fizeram uma revisão das metodologias de avaliação de
eficácia antimicrobiana que poderiam ser aplicadas para produtos usados na
indústria de alimentos, sendo que algumas avaliações puderam ser feitas in situ.
2.5.3.2 Método para avaliação da atividade bacteriostática
O método de disco-difusão foi idealizado por Bauer e colaboradores em 1966
e, desde então, é amplamente empregado para verificar se uma substância teste
tem alguma ação inibitória sobre um determinado microrganismo. Também foi
possível determinar a menor concentração da substância teste que é capaz de inibir
o crescimento, ou seja, a concentração inibitória mínima (CIM). Neste método a
substância pesquisada é colocada em um reservatório, podendo este ser um disco
54
de papel ou uma cavidade no meio de cultura ou ainda um cilindro sobre a
superfície, em contato com meio de cultura sólido previamente inoculado com o
microrganismo teste. A leitura, que é qualitativa, é realizada após o período de
incubação, medindo-se o diâmetro do halo de inibição de crescimento microbiano
formado. O diâmetro é inversamente proporcional à concentração inibitória mínima
(CIM). Esse método permite classificar a amostra bacteriana em suscetível (S),
intermediária (I) ou resistente (R) ao antimicrobiano.
O teste de disco-difusão é um método prático, de fácil execução e idealizado
para bactérias de crescimento rápido. Os reagentes são relativamente econômicos e
não há necessidade de equipamentos especiais, além de apresentar grande
flexibilidade na escolha do número e tipo de antimicrobiano a ser testado.
Outra metodologia utilizada para a determinação da CIM é o método de
diluição. Uma quantidade de amostra é dissolvida homogeneamente em um meio e
são feitas diluições sucessivas da amostra original, inoculando-se no
microorganismo teste. A leitura é realizada após o período de incubação
considerando-se a primeira diluição em que não se observa turvação.
Aplicando o método de ágar em placa com orifício modificado, Paker e Luz
(2007) avaliaram os seguintes óleos: copaíba, alecrim, melaleuca, alho, andiroba;
própolis, e dois ingredientes de origem natural (um extraído de folhas de oliva e o
farnesol). As cepas selecionadas foram Staphylococcus aureus (ATCC 6538),
Escherichia coli (ATCC 8739), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 9027) e Candida
albicans (ATCC 10231). Os autores comprovaram que dentre as amostras
analisadas, os melhores resultados foram obtidos com os óleos de melaleuca e
alecrim por apresentarem atividade bacteriostática e fungistática para as quatro
cepas em questão.
55
Sabulal et al. (2006), avaliaram a atividade antimicrobiana do óleo essencial
da fruta da Amomum cannicarpum, empregando o método de disco de difusão. Os
microrganismos testes foram bactérias Gram positivas e Gram negativas e alguns
fungos. O óleo apresentou atividade bacteriostática contra Salmonella typhi,
Pseudomonas aeruginosa e Proteus vulgaris e ótima ação fungistática para Candida
albicans e Candida glabrata.
Já Yu et al. (2004) empregaram o método de disco de difusão para determinar
a atividade antimicrobiana do óleo essencial Scutellaria barbata. Primeiramente, a
suspensão teste de microrganismo (2x10
8
UFC mL
-1
) foi espalhada sobre o meio
sólido em placas de Petri. Discos de papel de filtro (6 mm de diâmetro) foram
individualmente impregnados com 15 µL do óleo diluído (180 mg mL
-1
), e, então,
colocados sobre o inóculo. As bactérias Gram positivas, inclusive o Staphylococcus
aureus, se mostraram mais sensíveis ao óleo do que as Gram negativas e as
leveduras.
2.6 Teste de estabilidade
A estabilidade de um produto depende de fatores ambientais tais como
temperatura, umidade, luz e de outros fatores inerentes ao produto, tais como
propriedades físicas e químicas de substâncias ativas e dos demais componentes
da formulação, forma de apresentação, tipo e propriedades dos materiais de
embalagem.
Pode-se chamar de teste de estabilidade o conjunto de testes projetados para
obter informações sobre a estabilidade de produtos quanto aos limites previamente
especificados, visando estabelecer seu prazo de validade e período de utilização em
56
embalagem e condições de estocagem determinadas. Existem dois tipos de estudos
de estabilidade aplicados aos produtos saneantes (ANVISA, 2008c):
Estabilidade acelerada - estudos projetados para acelerar a degradação
química ou mudanças físicas de um produto em condições de estocagem
forçadas. Os dados assim obtidos, combinados com aqueles dos estudos de
longa duração, podem ser usados na avaliação não só das alterações que
ocorrem em longo prazo quando em condições não aceleradas, como
também do impacto de curtas exposições às condições fora daquelas
estabelecidas em rotulagem.
Estabilidade de longa duração - estudos projetados para verificação das
características físicas, químicas, biológicas e microbiológicas de um produto
durante o prazo de validade preconizado, sendo usado para estabelecer ou
confirmar o prazo de validade projetado, além de estabelecer as
recomendações para as condições de estocagem.
Os estudos de estabilidade devem ser executados com o produto em sua
embalagem primária original, ou em outra com a mesma composição química e em
escala.
A ANVISA (2008c) elaborou um guia de estabilidade para produtos saneantes
e, segundo este, as condições para realização dos testes são:
- o estudo de estabilidade acelerada deve ser realizado a 40 ± 2ºC. Todos os
testes descritos na monografia analítica de cada produto deverão ser cumpridos no
início (mês 0) e depois em 3 meses e em 6 meses. Quando a temperatura do teste
for de 50 ± 2ºC, todos os testes descritos na monografia analítica de cada produto
deverão ser cumpridos em avaliações conduzidas no início (mês 0) e depois em 3
meses;
57
- no estudo de estabilidade de longa duração, a amostra é armazenada à
temperatura ambiente. Todos os testes descritos na monografia analítica de cada
produto deverão ser realizados no início (mês 0), em 6 meses e em 12 meses e
anualmente, após o primeiro ano até o prazo de validade declarado no registro;
- para produtos que requeiram preparação para uso, todos os testes descritos
na monografia analítica deverão ser realizados após a preparação, no mínimo no
início e no fim do prazo de validade preconizado pela empresa.
2.7 Análise térmica
A análise térmica é um conjunto de técnicas que permitem medir as
mudanças de uma propriedade física de uma substância (e /ou de seus produtos de
reação) em função da temperatura e/ou tempo, enquanto a substância é submetida
a uma programação controlada de temperatura (GIOLITO & IONASHIRO, 1988).
Entre estas técnicas a termogravimetria/termogravimetria derivada (TG/DTG), a
análise térmica diferencial (DTA) e a calorimetria exploratória diferencial (DSC) são
as mais amplamente difundidas e utilizadas. No entanto, outras técnicas para
medida de outras propriedades físicas podem ser empregadas.
Segundo a definição, para que uma técnica térmica seja considerada
termoanalítica é necessário, que esta inclua a medição de uma propriedade física,
expressa direta ou indiretamente em função da temperatura e executada sob um
programa controlado desta variável (WENDLANDT, 1986; MACHADO; MATOS,
2004). A classificação dos métodos termoanalíticos em relação a uma propriedade
física medida em função da temperatura e as abreviaturas empregadas nas técnicas
termoanalíticas estão apresentadas na Tabela 13.
58
Tabela 13 - Classificação das principais técnicas termoanalíticas e abreviaturas aceitáveis
Propriedade
Principais Técnicas
Abreviatura
Aceitável
Massa
Termogravimetria
Detecção de gás desprendido
Análise de gás desprendido
Análise térmica por emanação
TG
EGD
EGA
ETA
Temperatura Determinação da curva de aquecimento
(*)
Análise térmica diferencial
DTA
Entalpia Calorimetria exploratória diferencial
(**)
DSC
Dimensões Termodilatometria TD
Características mecânicas Análise termomecânica
Análise termomecânica dinâmica
TMA
DMA
Características acústicas Termossonimetria
Termoacustimetria
TS
Características ópticas Termoptometria TO
Emissão de luz Termoluminescência TL
Características elétricas Termoeletrometria TE
Características magnéticas Termomagnetometria TM
(*) Quando o programa de temperatura for pelo modo resfriamento, torna-se: determinação da curva de
resfriamento.
(**) Ocorre confusão sobre este termo, sendo conveniente a sua separação em duas modalidades: DSC com
compensação de potência e DSC com fluxo de calor.
Fonte: GIOLITO, IONASHIRO (1988); MACHADO, L.D.B.; MATOS, J.R. (2004)
2.7.1 Termogravimetria (TG)/termogravimetria derivada (DTG)
A termogravimetria é uma técnica termoanalítica na qual a variação (perda ou
ganho) de massa (m) da amostra (sólida ou líquida) é determinada em função da
temperatura (T) e/ou do tempo (t), enquanto a amostra é submetida a uma
programação controlada de temperatura (Equação 3).
59
m = f (T ou t) (Equação 3)
A termogravimetria pode ser classificada em isotérmica, quase-isotérmica e
dinâmica. Na TG isotérmica, a massa da amostra é registrada como uma função do
tempo à temperatura constante. Na TG quasi-isotérmica, a amostra é aquecida a
uma razão de aquecimento linear enquanto não ocorrer variação de massa. A partir
do momento em que a balança detecta a variação de massa, o aquecimento é
mantido isotérmico. E, finalmente, na TG dinâmica há um acompanhamento das
variações de massa sofridas pela amostra quando esta é submetida a um
resfriamento ou aquecimento linear.
De modo geral a TG é usada para:
a) avaliar a estabilidade térmica de materiais diversos;
b) obter parâmetros cinéticos das reações de decomposição térmica;
c) controlar e conhecer o estado de hidratação dos sais;
d) isolar fases intermediárias que possam surgir durante a decomposição
térmica da amostra;
e) elucidar fenômenos de dessolvatação, desidratação e eflorescência;
f) determinar pureza de reagentes padrões em química analítica;
g) identificar de forma funcional os compostos orgânicos, etc.
Como em qualquer técnica instrumental, existe na termogravimetria um
grande número de fatores que afetam a natureza, precisão e exatidão dos
resultados experimentais. Estes fatores podem ser divididos em duas categorias:
a) fatores instrumentais:
razão de aquecimento;
atmosfera do forno;
60
geometria do cadinho e da amostra;
sensibilidade do mecanismo de registro;
material do cadinho.
b) características da amostra:
massa da amostra;
solubilidade dos gases libertados;
tamanho das partículas;
compactação da amostra;
calor da reação;
natureza da amostra;
condutividade térmica.
A termogravimetria derivada (DTG) é o registro da curva TG, na qual se
deriva a massa em relação ao tempo (dm/dt), em função da temperatura (T) ou do
tempo (t), ou seja:
dm/dt = f (T ou t) (Equação 4)
A curva DTG apresenta informações de uma forma que é mais acessível
visualmente (maior resolução): a área do pico apresenta relação direta à variação de
massa (m); com base na altura do pico, a qualquer temperatura, se obtém a
variação de massa e ainda, permite a pronta determinação da temperatura de pico
máximo (T
máx.
) na qual m ocorre mais rapidamente.
A Figura 7 ilustra as curvas TG/DTG do processo de decomposição térmica
do oxalato de cálcio monoidratado (CaC
2
O
4
.H
2
O), que é uma substância padrão
utilizada na verificação das condições da instrumentação. A curva TG apresenta
“degraus” atribuídos a cada etapa de decomposição térmica do material. Estes
61
degraus são substituídos por picos na curva DTG. A partir da altura dos picos da
curva DTG é possível:
- obter a razão de Δm (variação de massa) na temperatura selecionada;
- obter as temperaturas correspondentes ao início e final da decomposição com
maior exatidão;
- e, para outros materiais onde ocorrem sobreposições de reações é possível
calcular a Δm.
Em caso de reações de decomposição térmica que ocorrem lenta e
gradativamente, a curva DTG não mostrará um pico, mas se aproximará de um
patamar dificultando a avaliação dos eventos térmicos, uma vez que a derivada de
uma constante é nula.
Figura 7. Curvas TG/DTG de uma amostra de CaC
2
O
4
.H
2
O, obtida na termobalança TGA-50,
sob atmosfera dinâmica de N
2
e razão de aquecimento de 10
o
C min
-1
A partir das curvas TG/DTG, observa-se que os percentuais de variação de
massa correspondente à cada etapa de decomposição térmica são concordantes
com os valores obtidos pelo cálculo teóricos, isto é, na 1
a
etapa o teor de H
2
O é de
Temperatura (
o
C)
Massa (%)
Derivada primeira (mg min
-
1
)
62
12,33%, na 2
a
etapa a percentagem de CO é de 19,1 e na 3
a
etapa a percentagem
de CO
2
é de 30,12.
2.8 Cromatografia
A cromatografia pode ser definida como um método físico-químico de
separação, no qual os constituintes da amostra a serem separados são
particionados entre duas fases, uma estacionária e de grande área superficial, e a
outra um fluido que percola na primeira. Portanto, trata-se de um método que se
baseia na partição da amostra entre uma fase móvel (FM) líquida ou gasosa e uma
fase estacionária (FE) - líquida ou sólida.
Existem quatro tipos principais de cromatografia: cromatografia em papel
(CP), cromatografia de camada delgada (TLC), cromatografia gasosa ou a gás (CG)
e cromatografia líquida (CL), como é ilustrado na Figura 8.
Figura 8. Tipo de cromatografia e relação de FM, FE e mecanismo de separação envolvido
Partição
Gasosa
Gasosa
Adsorção
Líquida
Líquida
Adsorção
Troca
Iônica
Exclusão
Molecular
Tipo
Fase Móvel
(FM)
Fase
Estacionária
(FE)
Mecanismo de
separação
Líquida
(CGL)
Partição
Sólida
(CLS)
Líquida (CLL)
Sólida
(CGS)
63
A seleção do tipo de cromatografia depende do material que será isolado,
podendo recorrer-se ao uso de diversos métodos cromatográficos aplicados
seqüencialmente para obter-se um composto na forma pura.
2.8.1 Cromatografia a gás (CG)
A cromatografia a gás é um método de separação no qual os componentes de
uma mistura são separados em fases: a fase estacionária (líquida ou sólida), que
possui uma superfície de exposição muito grande e uma segunda, a fase móvel, que
é um gás que circula em contato com a fase estacionária. A amostra deve ser
suficientemente volátil a fim de que possa atravessar a coluna na forma de vapor e
ser estável termicamente para não se decompor nas condições de separação. A
vaporização da amostra ocorre em um sistema de injeção e em seguida esta é
transportada pela fase móvel gasosa (gás de arraste) ao longo da coluna. A
separação dos componentes da mistura e suas partições com a fase estacionária,
baseiam-se não só nas diferenças de solubilidades e pressão de vapor relativa, mas
também na afinidade de cada componente com a fase estacionária. Este tipo de
processo cromatográfico é chamado de eluição, no qual o material eluído passa por
um detector onde será analisado. Apresenta-se a seguir quatros tipos de detectores
utilizados na CG (PERES, 2002, SMITH, 1988, SKOOG; WEST; HOLLER, 1996):
a) Detector por condutividade térmica (DCT ou TCD) - possuem dois ou
quatro filamentos de platina (Pt), tungstênio (W), níquel (Ni) ou Pt - W,
os quais são aquecidos por corrente elétrica. Conforme o gás passa
pelos filamentos há transferência de calor e o tempo da passagem do
gás, juntamente com a condutividade térmica são registrados. Dá-se
assim, a análise. Esta análise é feita comparando-se o gás de arraste
64
puro (que passa por um conjunto de filamentos) com o gás de arraste
misturado à amostra (que passa por outro conjunto de filamentos). Este
tipo de detector não destrói a amostra e seu maior emprego ocorre em
análises de compostos orgânicos, inorgânicos, derivados de petróleo
etc.
b) Detector por ionização de chama (DIC ou FID) - consiste de um campo
elétrico (200 - 300 v) e uma chama (H
2
+ ar) onde a amostra é
queimada. A combustão resulta em radicais livres que são ionizados
pelo campo elétrico, aumentando a corrente nos eletrodos. É utilizado
apenas para compostos orgânicos e apresentam baixa sensibilidade ao
formaldeído e ácido fórmico.
c) Detector por captura de elétrons (DCE ou ECD) - Neste detector há
uma fonte de radiação beta em corrente constante. Quando o gás de
arraste (N
2
ultra puro) misturado à uma amostra passa pelo detector,
acontece a substituição de um elétron por um íon negativo, provocando
uma supressão da corrente elétrica. O gás de arraste misturado com a
amostra é comparado ao gás de arraste puro (corrente de fundo), e
quanto maior seu valor maior é a sensibilidade do detector. A
diminuição do valor da corrente de fundo indica a presença de
impureza, vazamento da fonte, sujeira ou coluna mal condicionada. É
usado, principalmente, na separação de compostos halogenados de
amostras de pesticidas e drogas.
d) Detector fotométrico de chama (DFC) – ocorre uma combustão na
região do campo elétrico com emissão de luz de diversos
comprimentos de ondas. Há um sistema de filtros que elimina as
65
radiações desnecessárias, selecionando as de interesse, em especial
as que contenham enxofre (S) e fósforo (P). O gás de arraste é o N
2
e
o da chama é o H
2
. A pureza dos reagentes deve ser da ordem de
partes por trilhão. Apresenta ainda alta estabilidade para compostos
sulfurados e fosforados.
A cromatografia a gás é muitas vezes acoplada a técnicas seletivas
espectroscópicas e eletroquímicas, originando métodos extremamente úteis na
identificação de componentes de misturas complexas. As interfaces mais utilizadas
são:
a) Cromatografia gasosa acoplada e espectrometria de massa (CG-MS
ou CG-EM).
b) Cromatografia gasosa acoplada e espectroscopia no infravermelho
com transformada de Fourier (CG-FTIR).
São encontrados na literatura vários trabalhos relativos ao emprego da CG na
elucidação da composição de óleos essenciais e do controle de processo de
transformações de terpenos. A Tabela 14 apresenta alguns exemplos destas
aplicações, discriminando o tipo de equipamento, tipo de coluna e programação de
aquecimento que são usados no experimento. Na seqüência outros exemplos são
comentados.
Robles-Dutenhefner et al. (2001) estudaram a aplicação de heteropoliácido
H
3
PW
12
O
40
suportada em sílica como catalisador na hidratação e acetoxilação de
limoneno, β-pineno e α-pineno. Neste trabalho, o desenvolvimento da reação foi
monitorado por cromatografia gasosa (Cromatógrafo Shimadzu 14 B, coluna
Carbowax 20 M e detector DIC), utilizando acetato de bornila como padrão interno. A
identificação e caracterização do produto final da reação foi realizada por meio da
66
análise por espectrometria de massas acoplada à cromatografia gasosa utilizando
equipamento Hewlett-Packard MSD 5890/série II operado a 70 eV.
Tabela 14 - Algumas aplicações da CG na análise de óleos essenciais e terpenos
Trabalho Aplicação
Equip./detector Coluna Aquecimento
Liu et al, 2008
(1) HP6890 CG/DIC
HP-5
30mX0,32mmX0,25µm
Pakdel; Sarron; Roy,
2001
(1)
HP5890 CG
HP 5970 MS
HP
-
5MS
30mX0,25mmX0,25µm
50/2/5/200/
30/29
0/10
Román-Aguirre et
al., 2005
(1)
Thermofinigan
GC
8000/Voyager
MS
All tech AT-5
30mx0,25mm
60/3/5/150/1/
10/250/1
Román-Aguirre et
al., 2005
(1)
Perkin-Elmer
Auto system XL/
DIC
PE-1
60mX0,25mm
80/1/10/150/1/15
/250/15
Velasco
-
Negueruela
et al
., 2005
(2)
Varian GC 3300/
DIC
DB1
50mX0,25mmX0,25µm
90/4/240
Velasco
-
Negueruela
et al., 2005
(2)
HP 5890/
Não informado
DB1
50mX0,25mmX0,33µm
70/4/250
Yu et al., 2004
(3)
HP5890 CG
HP 5972 MS
HP
-
5MS
30mX0,25mmX0,25µm
40/5/4/200/20
Yu et al., 2004
(3)
Younglin 680D
DIC e sniffing
porta
DB-5 MS ou DB-Wax
30mX0,25mmX0,25µm
40/5/10/200/24
(1) Controle do processo de hidratação do α-terpineol; (2) caracterização do óleo essencial extraído de duas
espécies de Pimpinella; (3) determinação de compostos voláteis das agulhas do Pinus densiflora;
Davies (1990) elaborou uma revisão da literatura quanto aos valores de
índices Kováts determinados por meio de CG-EM, utilizando-se as colunas de metil
silicone (dimetil polisiloxano) e/ou Carbowax 20M para 400 monoterpenos e
sesquiterpenos encontrados em óleos essenciais naturais ou produtos sintéticos.
Neste trabalho, listou-se em torno de 900 valores de índices Kováts.
Díaz et al., investigaram variações no tempo de retenção de seis terpenos (α-
pineno, β-pineno, canfeno, limoneno, α-felandreno e p-cimeno) empregando seis
tipos de fases líquidas com ampla faixa de diferenças de polaridades entre elas. As
análises foram conduzidas no aparelho HP Agilent PaloAlto com detector DCT. Os
67
autores concluíram que a afinidade do solvente com o terpeno está relacionada com
a presença de estruturas elétron-aceptoras (melhoram a afinidade) e a linearidade
da molécula (diminui a afinidade). Estes fatores também determinam a seletividade,
obtendo-se melhores resultados quando do emprego de fases líquidas não lineares
com grupos elétron-aceptores.
Allahverdiev, Irandoust e Andersson (1999), usaram uma coluna capilar de γ–
ciclodextrina (Octakis(6-O-metil-2,3-di-O-pentil)-γ ciclodextrina com OV 1701, 60:40)
para separar os enantiômeros do α-pineno e do limoneno, comparando as ordens de
eluição e tempo de retenção com a coluna capilar CP-Wax 52 CB. A ordem de
eluição e o tempo de retenção obtidos para os isômeros de terpenos estudados são
apresentados na Tabela 15. A aplicação da γ-ciclodextrina demonstrou ser uma
ótima ferramenta no controle da formação de enantiômeros durante o processo de
isomerização.
Tabela 15 - Ordem de eluição e tempo de retenção do α-pineno e seus isômeros nas
colunas capilares CP-Wax 52CB e γ-ciclodextrina
Ordem
Componente Ponto de
Ebulição,
o
C
Tempo de retenção
Coluna CP
-
Wax 52
CB
γ
-
ciclod
extrina
1
tricileno
153
8,125
8,075
2 (±) α-pineno 156 8,730
2a (+)α-pineno 154-156 9,350
2b
(
-
)α
-
pineno
156
-
158
9,570
3 fencheno 139-148 - -
4 (±) canfeno 159-160 10,906 10,422
5
α
-
terpineno
175
18,503
14,755
6 (±) α-limoneno 176 19,333
6a (+)α-limoneno 176-177 15,159
6b
(
-
)
α
-
limoneno
176
-
177
15,353
7
p
-cimeno 176-178 21,042 15,462
8 γ-terpineno 182 21,797 15,849
9 terpinoleno 184 22,167 15,968
Fonte: Allahverdiev, Irandoust e Andersson (1999)
68
Quanto à aplicação da CG na determinação de componentes fenólicos pode
ser citado o trabalho de Coelhan et al. (2006) no qual foi feita a determinação do teor
de OPP em 61 amostras de cerveja enlatada provindas de 27 países.
Primeiramente, as amostras sofreram um pré tratamento por meio de uma extração
líquido-líquido (com dietil éter e acetonitrila, 20:25 v/v) e em seguida, determinou-se
o teor de OPP por CG-EM. O método apresentou limite de detecção na ordem de
0,1x10
-6
mg mL
-1
e faixa de linearidade entre 0,4 e 40x10
-6
mg mL
-1
quando
utilizados 50 mL de amostra para análises.
2.8.2 Cromatografia líquida
A Cromatografia líquida em coluna se divide em cromatografia líquida clássica
(CLC) e cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE ou HPLC). Na CLC são
utilizadas colunas de vidro sob pressão atmosférica e a vazão da fase móvel ocorre
devido à força da gravidade, por outro lado na CLAE a vazão ocorre pela aplicação
de uma alta pressão. As separações na cromatografia líquida são alcançadas por
partição, adsorção, troca iônica, exclusão por tamanho ou interações
estereoquímicas (gel permeação e gel filtração), dependendo do tipo da fase
estacionária utilizada. A CLAE é um método de separação de ampla aplicação.
Sistemas que consistem de fases estacionárias polares e fases móveis
apolares são definidos como cromatografia em fase normal. Quando a fase
estacionária é apolar e a fase móvel é polar os sistemas são denominados como
cromatografia em fase reversa. A afinidade de uma substância pela fase
estacionária e conseqüentemente seu tempo de retenção na coluna e sua ordem de
eluição são controlados pela polaridade da fase móvel.
69
A fase móvel deve dissolver a amostra sem qualquer interação química entre
ambas. Esta fase deve apresentar alto grau de pureza ou ser de fácil purificação,
para que se possam fazer análises de alta sensibilidade, uma vez que as impurezas
podem interferir na detecção do analito. Deve ser compatível com o detector
empregado e possuir polaridade adequada para permitir uma separação
conveniente dos componentes da amostra.
A cromatografia de fase reversa é a mais empregada e embora existam vários
solventes que possam ser utilizados, a água, metanol e acetonitrila são os mais
usados.
Os detectores usados na CLAE são (PERES, 2002, SMITH, 1988, SKOOG;
WEST; HOLLER, 1996):
a) Detector por absorção no ultra-violeta e no visível – neste detector a
amostra recebe uma radiação eletromagnética, normalmente no
ultravioleta ou até no infravermelho e a absorção da luz por parte da
amostra é medida em um dado comprimento de onda. Existem dois
tipos de detectores de luz ultravioleta: o de comprimento de fixo
(fotômetro) e o de comprimento de onda variável (espectrofotômetro
UV-VIS). Em condições ótimas, pode-se atingir sensibilidades de até
0,001 unidades de absorvância e, se o composto absorve
intensamente na faixa de UV, é possível detectar quantidades de
amostras da ordem de nanogramas (10
-9
g).
b) Detectores por índice de refração – estes detectores acompanham
continuamente a diferença no índice de refração entre a fase móvel
pura e o efluente que sai da coluna contendo os componentes da
amostra. Pode ser usado para amostras que não absorvem no
70
ultravioleta. A resposta deste detector é moderada, geralmente de
ordem micrograma (10
-6
g).
c) Detectores de fluorescência - utilizados como método de detecção
específica, são sensíveis para substâncias que fluorescem ou que
podem ser convertidas em derivados fluorescentes, por transformação
química ou adicionando reagentes fluorescentes a grupos funcionais
específicos. Este tipo de detector pode detectar quantidades de ordem
picograma (10
-12
g).
d) Outros detectores - detectores no infravermelho, eletroquímicos,
baseados em outras propriedades do soluto (como constante dielétrica,
densidade, pressão de vapor, viscosidade, etc.) e acoplamento com
espectrômetros de massa têm sido apresentados para serem usados
na CLAE.
Thompson (2001) determinou por CLAE o teor de ativo fenólico de 19
produtos desinfetantes. As amostras continham de 1 a 4 tipos de derivados
fenólicos. A metodologia aplicada empregou bomba modelo 510, controlador modelo
680, detector UV modelo 590E a 280 nm, injetor modelo 7125 ajustado com volume
de alça de 20 µL, coluna Zorbaz SB-C18 (250 mm x 4,6 mm x 5 µm), fase móvel
com acetonitrila/água (55:45 v/v), pH 3 (0,05 M de KH
2
PO
4
) e vazão de 1,0 mL min
-1
.
Este método demonstrou ser um eficiente meio de isolamento e quantificação dos 6
tipos de fenólicos investigados (fenol, 2-fenilfenol, 4-t-amilfenol, 4-cloro-3,5-
dimetilfenol, 2-benzil-4-clorofenol e triclosan) com faixas de limite de quantificação
variando entre 5,58x10
-5
e 2,5x10
-4
mg mL
-1
e limite de detecção entre 1,76x10
-5
e
0,67x10
-4
mg mL
-1
.
71
Yang et al. (2004) empregou a µHPLC-ECD para determinar OPP presente
em casca de limão. Nesta metodologia foram usados: degaseificador LC26; bomba
LC-100; injetor 7125 ajustado com volume de alça de 5 µL; coluna CAPCELL PAK
C-18 UG 120 microbore ODS (150 mm x 1,0 mm x 3 µm); fase móvel com 17 mM de
tampão (pH 4,0) de ácido acético e acetato de sódio em acetonitrila (60:40 v/v);
vazão de 15 µL min
-1
e aplicação de um potencial de +0,9V vs. Ag/AgCl. Este
método apresentou alta sensibilidade e seletividade na determinação de OPP, sendo
necessária apenas uma amostra de 2,5 mg de casca de laranja para análise. O
limite de detecção atingiu valores de 6,8x10
-7
mg mL
-1
.
2.9 Espectroscopia na região do infravermelho (IV)
A espectroscopia estuda a interação da radiação eletromagnética com a
matéria. Dependendo da energia de radiação incidente, um ou mais dos seguintes
processos podem ocorrer: absorção, reflexão, fluorescência/fosforescência,
espalhamento ou reação fotoquímica.
O movimento dos átomos que constituem as moléculas resulta em rotações e
vibrações moleculares. Portanto, além das transições entre níveis eletrônicos, deve-
se também levar em consideração as transições devidas às rotações e vibrações.
No entanto, apenas as vibrações são geralmente consideradas, pois as energias
envolvidas nas diferentes formas de rotação são muito semelhantes (a diferença
entre dois níveis rotacionais é tipicamente algo em torno de 5x10
-5
eV) e, portanto,
negligenciadas. Em relação às vibrações moleculares, é importante lembrar que
todos os átomos da molécula se movem periodicamente e em fase, que o centro de
72
massa da molécula permanece inalterado e que a molécula não muda de orientação
ou posição com a vibração.
Cada ligação química possui uma freqüência natural e para que ocorra uma
absorção na região do infravermelho a radiação incidente deve estar nesta mesma
freqüência. Outro fator para que ocorra a absorção é a ocorrência de variação do
momento de dipolo elétrico da molécula como conseqüência de seu movimento
vibracional ou rotacional (o momento de dipolo é determinado pela magnitude da
diferença de carga e a distância entre dois centros de carga). E somente nessas
circunstâncias que o campo elétrico alternante da radiação incidente interage com a
molécula, originando os espectros.
A região do infravermelho pode ser divida em três partes:
Infravermelho próximo (NIR): 13300 a 3000 cm
-1
(750 a 3300 nm)
Infravermelho médio (MIR): 4000 a 400 cm
-1
(2,5 µm a 25 µm)
Infravermelho distante (FIR): abaixo de 400 cm
-1
O espectro vibracional característico de moléculas, na maior parte das
substâncias orgânicas, situa-se na região do MIR. A radiação nesta faixa (2,5 a 25
µm) é responsável pelas transições vibracionais do estado fundamental para o
primeiro estado excitado, enquanto no NIR são transições do estado fundamental
para o segundo e terceiro estados excitados.
O espectro no infravermelho de um composto químico é considerado uma de
suas propriedades físico-químicas mais características, podendo ser considerado
sua “impressão digital”, o que leva a espectroscopia na região do infravermelho ter
extensa aplicação na identificação dos compostos e na análise quantitativa de
misturas de compostos. Como a intensidade de uma banda de absorção é
proporcional à concentração do componente que causou esta banda, a quantidade
73
de um composto presente em uma amostra pode ser determinada por meio de uma
curva de calibração (intensidade da banda versus concentração) construída a partir
de amostras com concentrações conhecidas do composto em questão. No entanto,
quanto mais complexa é a amostra ou quanto maior o número de interferentes
presentes, mais difícil se torna a construção de uma calibração univariada confiável,
sendo necessário lançar mão de cálculos estatísticos mais trabalhosos, que
permitam a utilização de vários comprimentos de onda para determinação de uma
única propriedade, obtendo-se, assim, uma calibração multivariada.
2.9.1 Espectroscopia na região do infravermelho por transformada de Fourier
(FTIR)
A técnica de infravermelho por transformada de Fourier (FTIR) utiliza uma
configuração diferenciada na construção do equipamento, conhecida como
Interferômetro de Michelson. O interferograma é formado pela soma de todas as
ondas de diferentes amplitudes e das freqüências que chegam ao interferômetro e
possui todas as informações espectrais da amostra, sob um dado conjunto de
condições. Porém, a forma com que essa informação se apresenta não é muito útil
para o analista e usa-se do tratamento matemático por transformada de Fourier para
converter esta informação em espectro, relacionando-se as intensidades com as
respectivas freqüências.
As principais vantagens da espectroscopia FTIR são:
a) Melhores precisão e exatidão em termos de comprimento de onda;
b) Todos os sinais da fonte alcançam o detector simultaneamente. Essa
característica torna possível a obtenção de todo o espectro de uma só
74
vez (2 a 3 s) e com essa economia de tempo é possível aumentar o
número de varreduras (“scans”) para aumentar a razão sinal/ruído (a
melhora na relação sinal-ruído é proporcional a raiz quadrada do
número de scans);
c) O instrumento apresenta poucos elementos ópticos e não necessita de
fenda. A potência da radiação que chega ao detector é maior do que
nos instrumentos dispersivos e maiores relações sinal/ruído são
observadas;
d) Equipamento sempre acoplado a um computador, facilitando a
visualização, tratamento dos dados e comparação de espectros.
2.9.2 Espectroscopia de reflectância total atenuada (ATR)
A espectroscopia de reflectância total atenuada (ATR) é uma técnica que
requer nenhuma ou uma mínima e rápida preparação da amostra viabilizando a
obtenção de espectros no infravermelho de amostras que são relativamente
espessas e fortemente absorventes para serem analisadas por espectroscopia de
transmitância. Pode ser aplicada na obtenção de informações sobre as propriedades
da superfície de um material, incluindo identificação, modificação e adsorção em
superfícies. Atualmente tem sido aplicada com vantagens para qualquer amostra
sólida ou líquida e também em análise quantitativa.
A ATR baseia-se no fato de que quando um feixe de radiação passa de um
meio mais denso (cristal da janela do dispositivo de ATR, geralmente ZnSe ou Ge)
para um meio menos denso (amostra), ocorrem eventos de refração e/ou reflexão. A
fração do feixe de luz incidente que é refletida aumenta conforme o ângulo de
75
incidência, e quando excede um determinado ângulo crítico a reflexão é completa.
No ponto de reflexão, o feixe atua como se penetrasse a uma pequena distância
dentro da amostra, de forma que esta componente da radiação (designada de onda
evanescente) pode ser absorvida pela amostra em contato com a superfície da
janela (neste caso, refere-se à radiação como “atenuada”). É possível fazer com
que a radiação sofra diversas reflexões internas e conseqüentes atenuações,
aumentando a sensibilidade da técnica que, de qualquer forma, não é grande, dado
o curto “caminho ótico” proporcionado pelas ondas evanescentes.
Como desvantagens podem ser citadas a redução do sinal que atinge o
detector para 15-20% do valor original quando do uso da transmitância, mas que
pode ser compensada pelo aumento do número de reflexões, e o custo elevado para
aquisição do acessório ATR.
76
3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Material
As amostras de óleo de pinho foram adquiridas de quatro empresas
fabricantes, neste trabalho, denominadas como empresas B, D, S e Y.
Uma amostra de óleo bruto (óleo que foi coletado antes do processo de
destilação industrial) foi doada pela empresa Dierberger.
Padrões analíticos de α-pineno, β-pineno foram adquiridos da marca Fluka e
de terpinoleno, α-terpineol, β-terpineol, γ-terpineol da marca Merck, foram utilizados
nas análises de CG-DIC.
Os derivados fenólicos utilizados neste trabalho foram o o-benzil p-clorofenol
(OBCP), o-fenil fenol (OPP) e o p-cloro m-cresol (PCMC), todos doados pela
empresa Lanxess.
Para elaboração do sistema tensoativo, a solução de laurato de trietanolamina
e sódio foi preparada a partir da neutralização do ácido láurico 99% (Cognis) com
hidróxido de sódio a 50% e trietanolamina (Oxiteno). Uma amostra de ácido linear
alquilbenzeno sulfônico a 96%, adquirida da empresa Stepan, foi neutralizada com
hidróxido de sódio a 50%. A alfa olefina sulfonada foi doada pela empresa Stepan
com o nome comercial de Bioterge AS40, contendo 39% de ingrediente ativo. Todas
as percentagens indicadas foram p/p.
3.2 Métodos
3.2.1 Avaliação olfativa
77
Na avaliação de caracterização olfativa dos óleos de pinho e das frações de
destilação, foram utilizadas fitas olfativas, que tiveram uma de suas pontas
impregnada com a amostra-teste. Duas analistas previamente treinadas nesta
metodologia realizaram a análise sensorial das fitas, imediatamente após a
impregnação, para a avaliação das notas de saída, e após 5 minutos, para que as
notas mais pesadas pudessem ser sentidas olfativamente.
A classificação das notas olfativas foi atribuída segundo classificação
consagrada pela literatura (DALLIMORE, 1992, ASCHAR, 2001) e utilizada pelos
fabricantes de essências. A seguir é apresentado um pequeno glossário das
descrições de odores e suas notas olfativas (DALLIMORE, 1992).
Aldeídico: característico de aldeídos com cadeia alifática entre C8 e C12.
Ambarado: doce, quente levemente animálico, baunilha.
Amendoado: doce, oleoso, odor natural de amêndoa.
Animálico: impregnação de odor animal inclui civet, musk, ambergris e
castoreum.
Balsâmico: quente, doce e resinoso com fraco aspecto medicinal, polvorosa;
Canforado: reminiscência de cânfora e eucalipto.
Cítrico: fresco, volátil, difusivo, sparkling. Odor da lima, limão, bergamota,
laranja, mandarina, grapefruit, tangerina capim cidreira.
Couro: fenólico, quente, animálico.
Doce: pesado, típico da baunilha e notas de açúcar.
Flora: característico do odor de flores como a do jasmim, rosa, tuberosa, ylang-
ylang, flor de laranjeira e violeta.
78
Fresh: termo usado subjetivamente dependendo da sensação e experiência
individual para as notas cítricas, florais, verdes e frutais;
Frutal: quente, doce, frutal. Odor característico de uva (antranilato de metila),
framboesa (oxifenilon ou frambinone, p-hidroxibenzil acetona, CAS 5471-51-2),
pêra (verdural extra, cis-3-hexenyl acetate, CAS 3681-71-8), abacaxi (ciclohexil
propionato de alila, CAS 7493-74-5) melão (helional, α-metil-1,3-benzodioxol-5-
propanal, CAS 1205-17-0).
Herbal: odor de planta fresca, odor característico da erva doce, sálvia, alecrim,
eucalipto glóbulos, pinho, agulhas de pinho, menta.
Leve: descrição usada para os odores (notas) florais, verdes, cítricos ou
combinações destes.
Madeira (amadeirado): notas naturais de madeira como sândalo, cedro, vetiver,
patchouly, cashmeran (CAS 33704-61-9) e o musgo de carvalho.
Medicinal: fenólico, canforado, herbal, freqüentemente pungente.
Musgoso: odor de terra, madeira, fenólico, verde.
Picante ou especiarias: pungente, quente e culinário. Odor característico do
cuminho, gengibre, canela, pimenta, cardamomo, salsão, cravo e noz moscada.
Pinho: redolente da madeira, agulhas e resina do pinho.
Polvoroso: leve, confortável, frequentemente balsâmico e musk.
Quente: tipicamente ambarado, animálico, balsâmico e doce.
Químico: duro, agressivo e de odor “básico”, exemplificada pelo odor do álcool
amílico, acetofenona e difenil óxido.
Resinoso: quente, doce, balsâmico, agudo nas notas de topo (saída).
Verde: leve intensidade, redolente, folheado, gramíneo. Odor do gálbano, folhas
de violeta, lírio do vale, mimosa, cassis.
79
3.2.2 Índice de refração
Medidas de índice de refração foram realizadas no aparelho da marca
Quimes modelo WYA-15 ABBE Refractomer. Um banho térmico com circulação de
água foi utilizado para controle da temperatura das medidas realizadas a 20 e 25
o
C.
3.2.3 Espectroscopia de absorção na região do infravermelho (IV)
Os espectros de absorção na região do infravermelho foram obtidos no
equipamento Spectrum Bx, FTIR System da Perkin Elmer utilizando-se cela ATR
(DuraSamplIR) de nove reflexões, no intervalo de 4000 a 700 cm
-1
, utilizando 16
scans e resolução de 2 cm
-1
.
Antes da obtenção de cada espectro das amostras foi realizado um ensaio de
branco (cela limpa, sem amostra) visando diminuir a interferência da atmosfera
sobre o espectro das amostras. As amostras foram aplicadas diretamente sobre o
elemento de diamante. O software utilizado para aquisição dos dados foi o Spectrum
v.2.0 (Perkin Elmer).
3.2.4 Termogravimetria (TG) e termogravimetria derivada (DTG)
As curvas TG/DTG para caracterização de amostras de óleo de pinho foram
obtidas utilizando termobalança, modelo TGA 50 (Shimadzu), sob atmosferas
dinâmicas de nitrogênio ou ar sintético (50 mL min
-1
) taxa de aquecimento () de
10°C min
-1
e cadinho de Pt contendo massa de amostra entre 38 e 42 mg.
80
3.2.5 Cromatografia Gasosa (CG)
A cromatografia gasosa foi empregada neste trabalho na caracterização das
amostras de óleo de pinho e das frações obtidas na destilação a pressão reduzida.
3.2.5.1 Cromatografia Gasosa com detector de chama (CG-DIC)
Para avaliações CG-DIC, devido à indisponibilidade de equipamentos, foram
utilizados dois equipamentos em etapas diferentes do projeto. Os primeiros estudos
foram realizados com a metodologia que foi denominada como “Programação 1 da
CG-DIC”, utilizado cromatógrafo modelo 5890 HP, munido de uma coluna de sílica
DB-5 (30 m x 0,25 mm x 0,25 µm; 5% fenil metilsiloxano/95% polidimetilsiloxano). A
temperatura inicial no forno era de 60°C, com um incremento de temperatura de 2°C
min
-1
, até atingir-se 70°C. Após atingir-se esta temperatura, foi utilizado um segundo
incremento de 5°C min
-1
, até 170°C. As temperaturas do injetor e detector foram
mantidas a 220°C. O gás de arraste utilizado foi H
2
, no detector os gases foram H
2
e
ar sintético e como “make up” o N
2
. Pressão: 33,1 kPa; Vazão: 1 mL min
-1
. As
análises foram realizadas com uma solução de óleo de pinho a 1% (p/p) em etanol.
Na “Programação 2 da CG-DIC”, foi utilizado cromatógrafo da marca Agilent
modelo 7890A, munido de uma coluna de sílica DB-5 (30 m x 0,25 mm x 0,25 µm;
5% fenil metilsiloxano/95% polidimetilsiloxano). A temperatura inicial no forno era de
60°C, ficando nesta temperatura por 2 min. Aplicou-se uma rampa de temperatura
com um incremento de 2°C min
-1
, até atingir-se 140°C, após a qual, foi utilizado um
segundo incremento de 5°C min
-1
, até 180°C e permanência nesta temperatura por 2
minutos. As temperaturas do injetor e detector foram mantidas a 220°C. O gás de
81
arraste utilizado foi H
2
, pressão na coluna: 46,2 kPa, Vazão: 0.25 mL min
-1
; relação
de split 1:100. No detetor, o N
2
foi utilizado como “make up” (26 ml min
-1
), H
2
(35 ml
min
-1
) e ar sintético (350 ml min
-1
). Foram analisadas soluções de óleo de pinho e
suas frações diluídas a 10% (p/p) em etanol.
A identificação dos principais componentes das amostras de óleo de pinho foi
realizada por meio da técnica de adição de padrão, também conhecida como
Spiking. Para isso, foram utilizados padrões analíticos Merck e Fluka de alguns
terpenos comuns em óleos voláteis como α-pineno, β-pineno, β-terpineol,
terpinoleno, γ-terpineno e γ-terpineol.
Utilizou-se como matriz de referência uma amostra de óleo de pinho do
fabricante B. Obteve-se o cromatograma típico desta matriz de referência e dos
terpenos padrões. Pequenas amostras da matriz foram aditivadas com os padrões
analíticos dos terpenos em estudo e, para cada padrão adicionado, observou-se no
cromatograma o tempo de retenção onde havia aumento do sinal analítico.
Confrontando todos os resultados, determinou-se o tempo de retenção nas
condições de análise empregada para os terpenos em estudo.
Os ensaios cromatográficos foram feitos com correção de linha base, não se
empregando a técnica de padrão interno, uma vez que o foco deste trabalho não foi
a quantificação dos componentes.
3.2.5.2 Cromatografia Gasosa acoplada ao espectrômetro de massa (CG-EM)
Para avaliações CG-EM, foi utilizado cromatógrafo marca HP modelo 5890
com espectrômetro de massa da HP modelo 5973, munido de coluna HP5 (30 m x
0,25 mm x 0,25 µm), temperatura inicial do forno de 80
o
C mantida por 3 minutos,
82
com incremento de temperatura de 10
o
C até atingir 300
o
C, mantendo-se esta
temperatura por 7 minutos. Temperatura do injetor 250
o
C e da interface de 300
o
C.
Split 1:100 e injeção de 0,3 µL da amostra tal qual. Para identificação dos
componentes, utilizou-se uma biblioteca NIST MS Search 2.0.
3.2.6 Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE)
O teor de derivados fenólicos (OPP, OBCP e PCMC) contido nas amostras de
desinfetante formuladas foi determinado por meio de ensaios de cromatografia
líquida de alta eficiência. O equipamento utilizado nestes ensaios foi um
cromatógrafo líquido, marca Shimadzu modelo LC-10AD com sistema de injeção
automático modelo SIL 20A detector de UV-VIS modelo SPD 10A, coluna Zorbax
SB-C 18,5 µm (4,6 x 250 mm). O comprimento de onda selecionado foi 280 nm. Os
ensaios foram realizados em condições constantes onde a fase móvel foi composta
de acetonitrila, água acidificada com ácido fosfórico (0,3 mL por litro de FM, para pH
2,6) na proporção 65:35 (v/v). Volume de injeção de 20 µL e vazão de 1 mL min
-1
.
Para obtenção das curvas de calibração foram utilizadas amostras de OPP,
OBCP e PCMC de purezas conhecidas e apresentadas em laudo de análise do
fabricante. As soluções foram preparadas nas concentrações de 20, 30, 50, 80 e 100
mg L
-1
, usando a fase móvel como diluente.
As determinações do teor de derivado fenólico, nas formulações biocidas,
foram feitas em amostras recém-preparadas e em amostras envelhecidas após
exposição a 45
o
C por doze semanas na realização do ensaio de estabilidade. Foram
preparadas soluções com concentrações de aproximadamente 60 mg L
-1
, usando a
fase móvel como diluente.
83
As amostras foram filtradas antes das análises em membrana com 0,22 µm
de poro (Durapore, Millipore
®
).
O processo de validação do método analítico foi iniciado com a realização da
verificação da linearidade, intervalo, precisão instrumental e robustez, seguindo os
critérios propostos pela resolução da ANVISA RE n
o
899, de 29/05/2003 (ANVISA,
2003).
3.2.7 Destilação a pressão reduzida
A destilação de uma amostra de óleo de pinho bruto foi conduzida em sistema
a pressão reduzida, variando a pressão de 20 a 1 mmHg em diversas etapas.
Iniciou-se a destilação utilizando-se balão de fundo redondo com três bocas e
com capacidade de 2 L e 500 mL, conforme quantidade de material a ser destilado.
Na boca central do balão acoplou-se uma coluna de destilação recheada com
espiras de vidros - esta coluna tem 1 metro de altura e 0,5 cm de diâmetro interno,
com altura de recheio de 90 cm. Em outra boca do balão foi colocado um
termômetro para medida da temperatura do meio e na terceira boca acoplou-se uma
tampa para colocação e retirada de material sem a necessidade da desmontagem
da coluna. Na parte superior da coluna foi conectado um condensador total, no qual
existia um dedo frio e uma torneira para a regulagem da vazão de condensado,
retirado como destilado, e o restante retornando como refluxo para a coluna. Neste
condensador estava inserido um termômetro para a verificação da temperatura do
vapor no topo da coluna.
84
Na saída do destilador foi conectado um tubo graduado com torneira para a
verificação da vazão e retenção de destilado e na saída deste um balão de 50 mL
para a coleta do destilado.
Uma bomba de vácuo foi conectada por um sistema ao tubo graduado,
evitando o arraste de gotas e vapor. O aquecimento foi controlado por manta de
aquecimento.
Após os experimentos as amostras de destilado foram armazenadas em
vidros âmbar com vedante e tampa e mantidas sob refrigeração, a fim de evitar-se
degradação pela luz e eventual perda de componentes por volatilização.
3.2.8 Preparo das formulações biocidas
Foram preparadas 42 formulações considerando níveis de teor de biocida de
0, 0,7 e 1,0% (p/p) e níveis de tensoativo de 1,5 e 5% (p/p). Foram previamente
preparadas solução do linear alquilbenzeno sulfonato de sódio 10% e uma solução
20% da mistura de laurato de trietanolamina e sódio (1:1 p/p). A alfa olefina
sulfonada foi usada tal qual. Para melhorar a solubilidade do derivado fenólico no
sistema formulado, foram adicionados 15,4% (p/p) de etanol. Todas as amostras
tiveram o pH ajustado entre 7 e 8 com solução de hidróxido de sódio. A Tabela 16
apresenta os tipos de biocidas, tensoativos, solventes e as concentrações utilizadas
na elaboração das formulações.
As amostras foram acondicionadas em frascos de PET de 30 mL,
identificadas e submetidas a teste de estabilidade a 4, 25 e 45
o
C por doze semanas.
Foram feitas avaliações de pH, cor, odor, aparência nas 2ª, 4ª, 8ª e 12ª semanas. Os
ensaios de atividade antimicrobiana para as amostras recém-preparadas foram
85
realizados no início e para as amostras expostas a 45
o
C no final do ensaio de
estabilidade (12 semanas de exposição).
Tabela 16 - Parâmetros utilizados na elaboração das formulações biocidas
Parâmetro Variações
Tipos de biocidas OPP, OBCP, PCMC
Teor de biocida 0%; 0,7% e 1,0% (p/p)
Tipo de tensoativo Laurato de sódio e trietanolamina (Laurato de
Na/TEA)
Linear alquilbenzeno sulfonato de sódio (NaLAS)
Alfa olefina sulfonada de sódio (AOS)
Teor de tensoativo 1,5 e 5% (p/p)
Teor de etanol 15,4% (p/p)
Teor de água q.s.p. 100% (p/p)
pH (T
ambiente
) 7-8
3.2.9 Determinação da tensão superficial
A determinação da tensão superficial foi realizada nas amostras recém-
preparadas dos desinfetantes formulados. A determinação foi feita pelo método da
gota pendente utilizando aparelho OCAH 200 High Speed Contact Angle, com
agulha de diâmetro interno de 1,37 mm e externo de 1,65 mm, tamanho 38,1 mm.
3.2.10 Metodologia do disco de difusão para determinação da atividade
bacteriostática
Este ensaio foi realizado para avaliação da atividade bacteriostática das
amostras de óleo de pinho e das frações de destilação. O princípio deste método
baseia-se na formação de um halo de inibição frente ao microrganismo teste
previamente inoculado no meio de cultura onde são colocados discos de papéis
86
impregnados com uma solução das amostras das quais se deseja investigar a
atividade antimicrobiana. As substâncias impregnadas nos discos de papel
difundem-se no meio de cultura e, caso a amostra em questão apresente atividade
inibitória sobre o microrganismo testado, formar-se-á um halo de inibição (ausência
de crescimento microbiano) ao redor do disco impregnado. Após o período de
incubação, respeitadas as condições específicas para o microrganismo, é medido o
diâmetro da zona de inibição em volta de cada disco. A metodologia recomendada
pela ANVISA é baseada na metodologia M2-A8 do NCCLS (ANVISA, 2003) e o
método No 65.3210.006 do INCQS (2007) da placa de ágar.
3.2.10.1 Preparo do método de disco de difusão
Os testes foram feitos com as cepas padrões Staphylococcus aureus ATCC
6538 e Salmonella choleraesuis ATCC 10708. A partir da cultura estoque foram
feitos três repiques consecutivos a cada 24 horas e incubados a uma temperatura
entre 35 e 37
o
C, onde em cada repique uma alçada do meio foi transferida para 10
mL de caldo nutriente, e o terceiro repique de 24 horas foi utilizado para o teste.
O meio de cultura utilizado para o teste de atividade bacteriostática foi o Ágar
Mueller-Hinton (MERCK
®
) - preparado a partir do meio desidratado de acordo com a
recomendação do fabricante. Para cada 100 mL de meio fundido e a uma
temperatura entre 45 e 48
o
C foi adicionado 1 mL de inóculo. Esta mistura foi
transferida para uma placa de Petri e deixou-se solidificar. Em cada placa de Petri
distribuiu-se 5 discos de papel de filtro Whatman 41 com 5 mm de diâmetro,
umedecidos com 3 µL da amostra teste.
87
As placas foram incubadas a uma temperatura entre 35 e 37
o
C, durante 24
horas para primeira leitura e mais 24 horas para a segunda leitura. Em cada leitura
as placas foram inspecionadas quanto à presença de halo de inibição (medidos em
mm). Todos os ensaios foram realizados em triplicata e tiveram como controle
negativo água estéril.
O aparecimento de zona clara de inibição ao redor do disco de papel indica que
a amostra teste possui propriedades inibitórias, porém a dimensão do diâmetro
formado sofre influência da permeabilidade da amostra-teste no ágar.
3.2.11 Método de suspensão para determinação da atividade bactericida
Método de suspensão também conhecido como reducional ou Time Kill Test é
o teste destinado a determinar a atividade bactericida de um produto e foi
empregado nas avaliações das formulações biocidas. O microrganismo teste é
exposto ao produto, sendo analisado quantitativamente a intervalos de tempo
definidos, para a contagem dos microrganismos sobreviventes. Este ensaio permite
estabelecer importantes parâmetros de sanificação, tais como dosagem do
antimicrobiano, tempo de contato e eficácia sobre o microrganismo-alvo. A
metodologia usada foi baseada na metodologia Nº 960.9 da Association of Official
Analytical Chemists.
3.2.11.1 Preparo do método de suspensão
Os testes foram feitos com as cepas padrões Staphylococcus aureus ATCC
6538 e Salmonella choleraesuis ATCC 10708. O meio de cultura utilizado para
88
cultivo, subcultivo e manutenção das bactérias foi o caldo nutriente (DIFCO®). Foram
feitos 3 repiques consecutivos a cada 24 horas, incubados a uma temperatura entre
35 e 37
o
C. A padronização da suspensão foi feita em solução tampão de fosfato,
utilizando-se a escala McFarland n
o
3.
Este ensaio foi realizado nas amostras desinfetantes recém-preparadas e em
amostras envelhecidas após exposição a 45
o
C por doze semanas na realização do
ensaio de estabilidade.
As amostras de produtos testes foram distribuídas, em duplicata, em tubo
estéril - 9,9 mL de produto. Em cada tubo adicionou-se 0,1 mL da suspensão de
microrganismo, e após intervalos de 5 e 10 minutos foram transferidas alíquotas de 1
mL para tubos contendo 9 mL de caldo nutriente com 0,5% de Tween 80. Destes
tubos foram transferidas alíquotas de 0,1 mL para tubos contendo 9,9 mL de solução
tampão diluída. Após esta diluição alíquotas de 1mL e 0,1 mL foram transferidas, em
duplicata, para placas de Petri estéreis nas quais foi adicionado meio ágar extrato de
triptone glucose (TGE). Após resfriamento e solidificação do ágar as placas foram
invertidas e incubadas a uma temperatura entre 35 e 37
o
C por 48 horas. A avaliação
de crescimento de colônias foi realizada com auxílio de um equipamento com lente
de aumento. O esquema para condução do método de suspensão para a amostra
teste está representado na Figura 9 e no APENDICE D são apresentadas algumas
fotos que ilustram o procedimento.
89
Figura 9. Esquema para condução do teste de suspensão
Para controle da contagem da suspensão de microrganismo, uma alíquota de
0,1 mL da suspensão foi adicionada a um tubo estéril com 9,9 mL da solução
tampão e foram realizadas outras duas diluições consecutivas seguindo estas
condições. Alíquotas de 0,1 mL e 1 mL foram transferidas, em duplicata, para placas
de Petri estéreis nas quais foi adicionado meio TGE. Após resfriamento e
solidificação do ágar as placas foram invertidas e incubadas a uma temperatura
entre 35 e 37
o
C por 48 horas. A avaliação de crescimento de colônias foi realizada
com auxílio de lente de aumento. A Figura 10 ilustra este método.
9,9 mL de
Produto Teste
Suspensão MO
McFarland No3
0,1 mL
9,0 mL de CN +
Tween 80
9,0 mL de CN +
Tween 80
Após 5 min.
Transferir 1 mL
Após 10 min.
Transferir 1 mL
0,1 mL
9,9 mL Solução
Tampão
0,1 mL
0,1 mL
9,9 mL Solução
Tampão
0,1 mL
1,0 mL
1,0 mL
TGE
Aguardar o agar solidificar.
Inverter as
placas e incubar a 35-37
o
C por 48 horas
Fazer a contagem das colônias
90
Figura 10. Esquema do método de controle de contagem
1,0 mL
Aguardar o ágar solidificar. Inverter as
placas e incubar a 35-37
o
C por 48 horas
Fazer a contagem das colônias
0,1 mL
9,9 mL Solução
Tampão
0,1 mL
TGE
9,9 mL Solução
Tampão
Suspensão MO
McFarland N
o
3
0,1 mL
0,1 mL
9,9 mL Solução
Tampão
91
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 Aspectos gerais das amostras de óleo de pinho
Neste estudo as amostras de óleo de pinho foram recebidas em embalagem
plástica de PE opaca, acompanhadas de laudo de análise e ficha de segurança.
Cerca de 50 g de amostra foi transferida para frasco de vidro âmbar e armazenada
sob refrigeração.
Para um maior conhecimento das amostras selecionadas para o estudo,
procedeu-se a caracterização organoléptica, determinações do índice de refração,
caracterização por espectroscopia na região do infravermelho, avaliação do
comportamento térmico por TG/DTG e análises por cromatografia gasosa, utilizando
detector de ionização de chama (CG-DIC) e acoplada ao espectrômetro de massa
(CG-EM).
4.2 Caracterização física e organoléptica das amostras de óleo de pinho
Inicialmente, foram avaliadas as propriedades físicas e organolépticas das
amostras de óleo de pinho a 50% de alcoóis terpênicos total, obtidas de 4
fabricantes (B, D, S, Y) e ainda a amostra de óleo de pinho bruto.
O óleo do fabricante B apresentou-se líquido, cor amarela clara e odor
característico de pinho com notas olfativas verdes e secas, levemente canforadas.
92
Para os óleos do fabricante D, a amostra a 50% apresentou-se líquida,
incolor, com odor característico com notas olfativas de pinho, verdes secas e
canforadas.
As notas canforadas foram mais intensas para os óleos do fabricante S, que
também apresentou notas de pinho, verdes e secas, aparência líquida e de cor
amarela.
A amostra procedente do fabricante Y apresentou-se líquida, incolor com odor
característico de pinho com notas de saída levemente frutais e notas de corpo
verdes e secas.
E por último, a amostra de óleo bruto apresentou-se líquida, com cor amarela,
odor característico de pinho com notas frutais de saída e um corpo verde seco e
canforado.
4.3 Determinação do índice de refração das amostras de óleo de pinho
A determinação do índice de refração não apresentou uma boa correlação
com o teor de alcoóis terpênicos totais, conforme dados apresentados na Tabela 17.
Como o óleo de pinho é uma mistura de hidrocarbonetos e alcoóis terpênicos, a sua
denominação comercial de teor é referente ao teor de alcoóis terpênicos total. Existe
um grande número de combinações possíveis entre seus componentes que possa
atender a uma mesma especificação. Ainda, devem ser consideradas as variações
entre os teores de hidrocarbonetos que, usualmente não são especificados.
Pode-se observar na Tabela 17 que a especificação do fabricante S para o
óleo de pinho a 65 e 75% é a mesma, o que confirma a consideração dada acima.
93
Tabela 17 - Índice de Refração de amostras de óleo de pinho (fabricantes B, D, S e Y) com
diferentes TATT*
Fabricante TATT(%) n
20
n
25
Especificação
Fabricante n
20
B 50 1,4778 1,4759 ne
B 50 1,4780 1,4757 ne
D 50 1,4769 1,4745 ni
D 65 1,4777 1,4757 1,477-1,482
D 80 1,4795 1,4773 1,481**
S 50 1,4760 1,4742 1,476-1,480
S 65 1,4795 1,4774 1,479-1,483
S 65 1,4807 1,4781 1,479-1,483
S 65 1,4814 1,4792 1,479-1,483
S 75 1,4825 1,4807 1,479-1,483
S 75 1,4792 1,4777 1,479-1,483
Y 50 1,4751 1,4726 1,4775**
Y 50 1,4785 1,4768 ni
Y 50 1,4776 1,4754 1,4777**
Y 65 1,4764 1,4756 1,4797**
Y 65 1,4784 1,4762 1,4803**
Y 75 1,4791 1,4764 1,4799**
*TATT = Teor de alcoóis terpênicos total; **resultado obtido pelo fabricante, dado de laudo; n
20
= índice de
refração a 20
o
C; n
25
= índice de refração a 25
o
C; ni = não informado; ne = não especificado
4.4 Determinação dos espectros de absorção na região do infravermelho das
amostras de óleo de pinho
Na avaliação por espectroscopia de absorção na região do infravermelho as
variações dos TATT foram evidenciadas pelas diferenças das intensidades das
bandas de absorção ou transmitância principalmente a partir da banda de
estiramento -OH em torno de 3370 cm
-1
. A Figura 11 exemplifica estas variações
para amostras de óleo de pinho do fabricante S com 50, 65 e 75% de TATT. O
espectro de absorção na região do infravermelho para a amostra de óleo bruto
94
utilizada para fracionamento pelo processo de destilação a pressão reduzida está
ilustrado na Figura 12.
Figura 11. Espectro de absorção na região do infravermelho para três amostras de óleo de
pinho do fabricante S com 50, 65 e 75% de TATT
Figura 12. Espectro de absorção na região do infravermelho para amostra de óleo bruto
Absorvância
50 % Al
coóis Terpênicos Totais
65 % Alcoóis Terpênicos Totais
75 % Alcoóis Terpênicos Totais
Número de onda (cm
-
1
)
4000.0
3600
3200
2800
2400
2000
1800
1600
1400
1200
1000
800
700.0
0.000
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
0.35
0.40
0.45
0.50
0.55
0.60
0.65
0.70
0.75
0.80
0.85
0.90
0.95
1.000
A
3379.
2963
2834
2726
1677.
1644
1596
1512
1438.
1376.
1365.
1291
1247
1221
1157.
1128.
1110
1080
1043
1020.
981.
949
913.
886.
836
799
787.
774
726.
29
21
Número de onda (cm
-
1
)
Absorvância
4000 3600 3200 2800 2400 3000 800 1600 1400 1200 1000 800 700
95
Apesar do óleo de pinho ser uma matriz complexa contendo vários
componentes, são sugeridas as seguintes atribuições vibracionais para as bandas
principais:
Entre 700 e 1600 cm
-1
são evidenciadas diversas bandas de deformação
angular C-C e C-H alifático;
Bandas com dois ápices em 1157 e 1128 cm
-1
referentes do estiramento C-OH
de álcool secundário;
Banda com dois ápices em 1376 e 1365 cm
-1
, caracterizam metilas geminais;
Banda em 1438 cm
-1
pode ser atribuída a metila, deslocada para este
comprimento possivelmente por estar ligada a um anel e próxima à dupla
ligação (considerando que absorção normal de metilas e metilenos nesta região
é em torno de 1450-1460 cm
-1
);
Bandas em 1644 e 1677 cm
-1
referente à deformação axial C=C;
Bandas na região entre 2970 e 2850 cm
-1
, C-H de carbono alifático saturado
sp
3
, com intensidade alta característica do esqueleto terpênico;
Banda em 3376 cm
-1
estiramento -OH.
4.5 Avaliação do comportamento térmico das amostras de óleo de pinho
Para a avaliação do comportamento térmico de amostras de óleo de pinho
foram selecionadas aquelas de procedência do fabricante S com teores de alcoóis
terpênicos total de 50, 65 e 75%.
A Figura 13 ilustra as curvas TG/DTG das amostras com diferentes TATT.
Essas curvas evidenciam que a perda de massa inicia-se à temperatura ambiente,
96
chegando à perda praticamente total a 165, 170 e 176
o
C, respectivamente, para as
amostras com 50, 65 e 75% de alcoóis terpênicos totais.
Entre as amostras de diferentes concentrações observou-se que a
temperatura de decomposição térmica e/ou volatilização eleva-se com o aumento do
teor de alcoóis terpênicos totais e não sofre influência da atmosfera utilizada.
Figura 13. Sobreposição das curvas TG/DTG obtidas a 10°C min
-1
e sob atmosfera
dinâmica de nitrogênio, de amostras de óleo de pinho 50, 65 e 75% de TATT
Os resultados estão coerentes, pois os óleos com teores mais altos de alcoóis
terpênicos apresentam maiores teores de componentes com ponto de ebulição e/ou
volatilização mais altos.
A Figura 14 ilustra as curvas TG/DTG das amostras com os mesmos TATT´s,
porém de diferentes fabricantes. Observa-se que existem diferenças no perfil das
curvas TG/DTG para os óleos de pinho de diferentes fabricantes por estes
100
200
300
50
%
5.00
mg/min
65%
75 %
50%
Derivada primeira (mg min
-
1
)
Temperatura (
o
C)
Massa (%)
97
apresentarem diferenças na composição, tal como evidenciado pelo estudo de
análise cromatográfica.
Figura 14. Curva TG e detalhe da curva DTG obtidas a 10°C min
-1
, sob atmosfera dinâmica
de ar para amostras de óleos de pinho a 50% provenientes dos fabricantes B,
D, S e Y
4.6 Determinação da composição de algumas amostras de óleo de pinho por
cromatografia a gás
Amostras de óleo de pinho produzidas nos anos de 2004 e 2005 por 3
fabricantes (B, D e Y) contendo aproximadamente 50% de alcoóis terpênicos totais,
foram analisadas por CG-DIC utilizando a “programação 1 da CG-DIC” e
comparadas de acordo com o percentual relativo da área integrada para cada pico.
Foram assinalados 20 componentes principais do óleo de pinho, presentes na
maioria das amostras testadas. Para cada componente, foram calculados os tempos
de retenção médios e as concentrações típicas, de acordo com o fabricante. A
200
300
100
Temperatura (
o
C)
Fabricante S
Fabricante Y
Fabricante B
Fabricante D
-
0
50
100
Massa (%)
100 200
300
5.0 mg/min
Temperatura (
o
C)
mg/min
DrTGA
DTG (mg min
-
1
)
98
identificação dos componentes utilizando a CG-DIC foi realizada segundo a técnica
de adição de padrão, possibilitando a identificação de β-pineno, α-pineno,
terpinoleno, α-terpineol, β-terpineol e γ-terpineol.
As concentrações médias para cada componente foram relacionadas entre si
por meio de um gráfico de matriz, ilustrado na Figura 15, possibilitando identificar
visualmente os componentes que melhor permitem a separação e classificação das
amostras do óleo de acordo com a origem.
As amostras de óleo de pinho do fornecedor B foram diferenciadas das
amostras das demais procedências pelo teor do componente eluido no tempo de
retenção de 8,13 min, nenhum dos padrões utilizados apresentou eluição neste
tempo de retenção, não sendo possível nesta fase fazer a identificação deste. Estas
amostras apresentaram teores deste componente na faixa de 3,0 a 3,3%, em área
de pico, enquanto as amostras de outras procedências apresentaram teores
variando de 1,9 a 2,5%.
Para as amostras manufaturadas pela empresa S os teores entre 15,1 e
15,7% de terpinoleno (tr 11,11 min) permitiram diferenciar este material das demais
procedências que apresentam menores teores de terpinoleno (9,7 a 11,3%).
Os teores de α-pineno (tr 4,47 min) variando de 15,0 a 17,0% nas amostras
manufaturadas pela empresa D possibilitaram diferenciar esse material em relação
as amostras das empresas S e B que apresentaram teores entre 8,5 a 9,5%.
Apenas uma amostra da empresa S apresentou teor de 15,8% de α-pineno.
99
(*) identificado por adição de padrão, (**) atribuição comparativa pela ordem de eluição e percentagem dos
dados obtidos por CG-DIC e CG-EM
Figura 15. Diagrama de Matriz para principais componentes do óleo de pinho
Tais conclusões referenciam um painel de produção de óleo de pinho de
aproximadamente um ano. Deve-se contemplar que alterações nestes valores
podem ocorrer caso ocorra negociações das empresas fabricantes de óleo de pinho
com novos fornecedores de goma-resina, o que acarretaria mudanças da
composição do material de partida. A introdução de alterações nas rotas de reações
ou nos processos de destilação também pode alterar a especificação dos produtos.
Porém, deve-se considerar que uma empresa fornecedora de um insumo deve
*
0,7515
1,1068
5,81
Basf
Dierberger
Socer
Column 1
8
9
9,5
8,04
*
2,0055
3,0815
8,13
9
11
13
11,11
2
3
4
13,34
*
1,0579
1,0661
15,06
30
33
36
15,65
8,00 14,00
4,47
* 0,7515
5,81
8 8,5 9,5
8,04
* 2,1364
8,13
9 11 13
11,11
2 3 4 5
13,34
* 1,0639
15,06
%
TR
TR %
B
D
S
β
-
pineno*
α-pineno*
terpinoleno*
1
-
terpineol**
4
-
terpineol**
100
previamente comunicar e acordar com seus clientes a introdução de qualquer
mudança de especificação dos insumos negociados entre elas.
Objetivando a identificação de um maior número de componentes existentes
na composição do óleo de pinho, foi empregada a CG-EM e o uso de uma biblioteca
eletrônica, que possibilitou a identificação de 22 componentes. Neste estudo foram
avaliadas amostras de óleo de pinho com teores totais de alcoóis terpênicos
variando de 50 a 80% adquiridas das empresas D (amostras com 50, 65 e 80%), S
(amostras com 50, 65 e 75%) e Y (amostras com 50, 65 e 75%). Foi conduzida, ao
mesmo tempo, a análise por CG-DIC utilizando a “programação 2 da CG-DIC” e os
resultados foram comparados de acordo com o percentual relativo da área integrada
para cada pico, considerando a ordem de eluição dos componentes. No APÊNDICE
A, estão apresentadas as Tabelas 34 e 35 com os resultados obtidos pelas duas
técnicas. Os compostos terpênicos estão distribuídos conforme as suas respectivas
ordens de eluição. Observa-se que as técnicas utilizadas apresentaram, em alguns
casos, diferenças nos teores determinados de algum componente específico, porém
as injeções não foram feitas em replicatas, o que poderia minimizar estas diferenças.
A Figura 16 ilustra os cromatogramas obtidos pelo emprego por CG-EM e
CG-DIC (programação 2 da CG-DIC) para a amostra de óleo de pinho bruto que foi
utilizada como material de partida para a destilação a pressão reduzida.
101
a)
Figura
16
.
Cromatogramas de uma amostra de óleo de pinho bruto. a) CG-EM e b)
CG
-
DIC
4.7 Destilação de uma amostra de óleo de pinho bruto e avaliações físico-
químicas das frações
A massa de aproximadamente 1,2 kg da amostra de óleo de pinho bruto foi
submetida ao processo de destilação, que permitiu coletar 61 amostras de
destilados, as quais foram denominadas frações de destilação. Durante o processo,
Minutes
0 5 10 15 20 25 30
0
1000
2000
4.690
5.087
6.536
6.986
7.482
7.818
8.007
8.079
9.376
10.852
12.082
13.335
13.899
15.026
15.760
16.834
17.142
23.685
25.088
Front Signal
Retention Time
50
0
1000
2000
Tempo (min)
Sinal do detector (Volts)
Tempo de retenção
b)
102
em intervalos de tempo distintos, também foram coletadas quatro amostras do balão
de destilação, que foram denominadas resíduos de destilação.
A caracterização físico-química dessas amostras foi realizada por CG-DIC,
CG-EM, espectroscopia no infravermelho, TG/DTG e avaliação do caráter olfativo.
Algumas frações coletadas seqüencialmente apresentaram semelhanças
qualitativas e em alguns casos quantitativas. Isto se deve ao fato de que as coletas
foram realizadas não apenas quando se observava uma alteração na temperatura
de ebulição do destilado como também quando da ocorrência de alguma
perturbação da pressão do sistema, interrupção do processo ou quando o volume do
destilado atingia 20 mL.
4.7.1 Avaliação olfativa
Como o óleo de pinho é muitas vezes utilizado como fragrância ou faz parte
da composição de uma fragrância, foi realizada a caracterização olfativa das frações
de destilação.
A avaliação olfativa das frações evidenciou que há diferenças qualitativas
entre elas. A mudança de caráter olfativo foi, sensorialmente, percebida entre as
frações coletadas no decorrer da destilação, como é apresentado na Tabela 18.
As notas canforadas (devido à presença de canfeno) foram, sensorialmente,
observadas com alta intensidade para as frações mais leves, as notas mais oleosas
e resinosas foram características das frações intermediárias e as notas de pinho e
herbais ficaram mais pronunciadas nas frações mais pesadas.
103
Tabela 18 - Caracterização olfativa de algumas frações de óleo de pinho
Fração Caracterização olfativa
F1 Madeira, verde seca, oleosa (resinosa)
F9, F10 Madeira, verde, canforada fresca
F13, F14, F15, F18 Madeira, adocicada, canforada
F16, F17 Madeira, canforada, resinosa
F22 Resinosa, sintética (solvente)
F24 Resinosa, seca, picante leve ranço
F32, F33 e F34 Mentolada, levemente resinosa, seca, sintética (solvente)
F35, F36, F37 Aromática, verde, seca, resinosa
F38, F39, F40, F41 Saída cítrica, verde. Corpo resinoso, verde picante
F42 Madeira, verde, levemente mentolado, suave
F43, F44, F45 Madeira, verde, pinho
F46 Verde, pinho, rançosa, sintética (solvente)
F47, F48, F49 Saída aromática, anis. Corpo verde e fresco
F50, F51 Herbal, pinho, canforada
F53, Saída floral (pétalas de rosas), corpo verde herbal
(capim), pinho
F61 Verde floral, herbal, pinho
Resíduo final da destilação Tabaco, madeira queimada
4.7.2 Determinação dos espectros de absorção na região do infravermelho das
frações de destilação
Os espectros de absorção na região do infravermelho, para das frações estão
apresentados no APÊNDICE B.
As bandas características das frações são as mesmas que estão presentes
nas amostras de óleo de pinho e foram discutidas na seção 4.4 . Ressaltando que
em alguns espectros algumas frações apresentaram banda em torno de 3080 cm
-1
referente ao estiramento =C-H olefínico, não evidenciado nas amostras de óleo.
104
4.7.3 Avaliação do comportamento térmico das frações de destilação
A avaliação do comportamento térmico das frações obtidas na destilação do
óleo de pinho bruto foi realizada por meio da técnica de termogravimetria.
A Figura 17 ilustra as curvas TG/DTG para o óleo de pinho bruto, as frações
de destilação F1, F24 e F61 e o resíduo final de destilação.
As curvas TG/DTG do óleo de pinho bruto apresentam duas etapas de perdas
de massa, a primeira ocorrendo entre a temperatura ambiente e 165
o
C, com uma
variação de massa de 73,5% (T
pico
DTG = 142
o
C) e a segunda que apresenta uma
variação de massa de 26% (T
pico
DTG = 175
o
C), atingindo perda de massa
praticamente total até 250
o
C.
No caso da fração mais leve F1, as curvas TG/DTG evidenciam perda de
massa em uma única etapa desde 25
o
C. A velocidade de perda de massa é máxima
na temperatura de 141
o
C (T
pico
DTG) a 160
o
C, praticamente ocorre volatilização
total da amostra.
As curvas TG/DTG evidenciam que a fração F24 apresenta, inicialmente, um
comportamento térmico muito similar ao da amostra do óleo de pinho bruto. A
velocidade máxima de perda de massa ocorre a 152
o
C (T
pico
DTG) e na temperatura
de 300
o
C, praticamente não deixa resíduo.
Para a fração F61 as curvas TG/DTG evidenciam que a amostra é
termicamente estável até cerca de 60
o
C. A perda de massa ocorre em apenas uma
etapa entre 60 e 230
o
C (T
pico
DTG = 201
o
C) e atinge perda de massa, praticamente,
total a 250
o
C.
As curvas TG/DTG evidenciam claramente que o resíduo final de destilação
apresenta componentes mais pesados, visto que o processo de decomposição
105
térmica e/ou volatilização se inicia próximo a 80
o
C, ocorre em pelo menos três
etapas e finaliza acima de 560
o
C.
Esses resultados sugerem que a termogravimetria pode ser empregada para
monitorar o processo de destilação, visto que permite avaliar, comparativamente, o
comportamento térmico das diferentes frações coletadas. O comportamento térmico
evidenciado para o óleo de pinho bruto indica que é possível obter curvas TG/DTG
com multi-etapas de perdas de massa empregando baixas razões de aquecimento
ou em equipamentos que permitam ajustar a razão de aquecimento com a perda de
massa (termogravimetria de alta resolução). Possivelmente, em cada etapa de perda
de massa pode-se associar uma determinada fração ou grupo de fração de
destilação.
Figura 17. Curva TG e detalhe da curva DTG obtidas a 10°C min
-1
, sob atmosfera dinâmica
de ar para a amostra de óleo de pinho bruto, frações F1, F24 e F61 e o resíduo final da
destilação
0
100
200
300
400
500
600
0
50
100
Temperatura (
o
C)
Massa (%)
F24
Óleo Bruto
F1
F61
Resíduo
Temperatura (
o
C)
DTG (mg min
-
1
)
100 200 300
10.0 mg/min
106
4.7.4 Determinação da composição de algumas frações de óleo de pinho bruto
por cromatografia a gás
Na Tabela 19 estão listados os resultados obtidos por CG-EM com a
identificação de alguns componentes para amostra de óleo de pinho bruto e as
frações F1, F19, F24, F31, F39 e F58. Observa-se que a fração F1 é constituída
predominantemente de α-pineno (86,4%) e canfeno (10,8%), pois estes possuem
menor temperatura de ebulição (T
eb
= 156,2 e 161
o
C, respectivamente), sendo os
primeiros componentes a serem destilados. A fração F19 ainda apresenta teores de
α-pineno (17,6%) e canfeno (12,2%), porém, apresenta também componentes mais
pesados como β-pineno (T
eb
= 166
o
C), α-felandreno (T
eb
= 171
o
C), 1,4-cineol (T
eb
=
172
o
C) e limoneno e eucaliptol, os quais não foram detectados separadamente (T
eb
175-176 e 176,3
o
C). As frações F24, F31 e F39 apresentaram maiores teores de
eucaliptol+limoneno(41, 55,5 e 58%). A fração F58, por ser a fração mais pesada
entre estas, apresentou 79,3% de α-terpineol (T
eb
= 220
o
C) e 11,0% de γ-terpineol
(T
eb
= 218
o
C).
A análise de CG-DIC conduzida para as frações de destilação foi realizada
em diferentes dias e pequenas variações no tempo de retenção foram obtidas, por
esse motivo são apresentados da Tabela 20 até Tabela 24 valores de tr
médio
para
cada componente das frações analisadas.
A Tabela 20 apresenta os dados obtidos por CG-DIC para as frações F1 a
F13. A fração F1 apresentou dois picos, com tr
médio
= 3,65 e 4,04 min que não foram
detectados nas análises do óleo bruto e pelo método CG-EM utilizado,
possivelmente por estarem presentes no óleo bruto a uma concentração baixa não
sendo detectado pela metodologia utilizada. Comparando os resultados de CG-DIC
107
com a CG-EM para os outros picos desta fração, pode-se dizer que o pico em tr
médio
= 4,16 é referente ao α-pineno e o tr
médio
= 4,48 min é referente ao canfeno. Entre as
frações F1 e a Fração F14 (esta última apresentada na Tabela 21) o teor do
componente com tr
médio
= 4,16 min apresentou gradativa redução de 91 a 84%, por
outro lado, o pico tr
médio
= 4,48 min teve sua percentagem de área crescente de 7,5 a
12,7%. As frações F5 e F11 apresentaram picos com tr
médio
até 6,85 min, porém
somando percentagem total de área menor que 2%. Possivelmente, durante o
processo de destilação deve ter ocorrido pequena perturbação na temperatura ou
pressão do sistema durante a coleta destas frações.
Tabela 19 - Percentagem relativa dos componentes de uma amostra de óleo de pinho bruto
e de seis frações de destilação. Resultados obtidos por CG-EM
Componentes tr
(min)
Óleo Bruto
F1
F19
F24
F31
F39
F58
α-pineno 4,38 14,0
86,4
17,6
0,6
0,1
1,0
nd
canfeno 4,56 2,4
10,8
12,2
0,1
nd
0,2
nd
beta pineno 5,08 0,6
0,1
7,3
4,1
0,8
0,1
nd
α-felandreno 5,34 1,8
nd
9,9
9,0
3,5
nd
nd
1,4 – cineol 5,46 2,1
nd
25,2
22,0
16,6
0,6
nd
careno-2 5,54 2,1
nd
nd
9,4
4,6
nd
nd
p-cimeno 5,58 1,2
nd
nd
8,3
14,7
29,7
nd
eucaliptol +
limoneno
5,76 9,9
nd
21,1
41,0
55,5
58,0
nd
α-terpineno 6,18 1,2
nd
0,1
0,1
0,6
0,4
nd
terpinoleno 6,70 8,6
nd
nd
nd
nd
1,1
nd
fenchol 7,01 1,0
nd
nd
nd
nd
nd
nd
1-terpinenol 7,32 2,3
nd
nd
nd
nd
nd
1,1
β-terpinol 7,46 2,1
nd
nd
nd
nd
nd
1,9
borneol 7,84 0,8
nd
nd
nd
nd
nd
nd
4 – terpinenol 8,03 1,3
nd
nd
nd
nd
nd
1,6
α-terpineol 8,32 37,8
nd
0,4
nd
nd
nd
79,3
γ-terpineol 8,39 6,6
nd
nd
nd
nd
nd
11,0
hidrato de Terpin 9,78 0,9
nd
nd
nd
nd
nd
nd
terpin 10,08 0,8
nd
nd
nd
nd
nd
nd
outros - 2,5
2,7
6,2
5,4
3,6
8,9
5,1
nd = não determinado
1
08
Tabela 20 - Percentagem relativa dos componentes das frações F1 a F13 obtida por CG-
DIC
tr médio
(min)
F1
F2
F3
F4
F5
F6
F7
F8
F9
F10
F11
F12
F13
3,65
0,32
4,04
1,29
1,08
1,08
1,05
0,60
0,63
0,71
0,63
0,61
0,52
0,42
0,44
0,56
4,16
90,92
91,05
91,05
90,93
87,4
88,99
89,35
88,97
89,2
88,73
85,72
87,23
89,40
4,48
7,47
7,88
7,88
8,02
10,97
10,39
9,94
10,39
10,19
10,75
12,19
12,01
10,04
4,53
0,27
6,02
0,26
0,35
6,42
0,4
0,57
0,31
6,85
0,36
0,49
A percentagem relativa das áreas dos picos detectados para as frações de
F14 a F26 estão apresentados na Tabela 21. Pode-se observar que para estas
frações os teores de componentes mais voláteis, que apresentaram tr
médio
em 4,16 e
4,48 min foram diminuindo significativamente durante as coletas das frações e
deixaram de ser detectados a partir da F26. Entre tr
médio
4,53 e 4,99 min foram
detectados picos somente até a F23. As maiores percentagens destas frações foram
para os componentes com tr
médio
= 5,21 min (variando aproximadamente entre 4 a
9%); 6,02 min (≈ 5 a 17%); 6,42 min (≈ 6 a 37%) e 6,85 min (≈ 6 a 41%).
Comparando estes resultados obtidos para as frações F19 e F24 com aqueles
obtidos por CG-EM para estas frações e para as amostras de óleo comercial, pode-
se sugerir que os picos com tr
médio
= 5,21; 6,02; 6,42 min são referentes ao β-pineno,
α-felandreno e 1,4-cineol, respectivamente. Na avaliação destas frações por CG-EM
não foi possível fazer a separação do limoneno e do eucaliptol. No entanto, nos
ensaios realizados para as amostras de óleo de pinho, foi possível separá-los e
identificá-los (Tabela 34 e Tabela 35). Os tr
médio
foram 6,85 e 6,91 min,
respectivamente.
109
Tabela 21 - Percentagem relativa dos componentes das frações F14 a F26 obtida por CG-
DIC
tr médio
(min)
F14
F15
F16
F17
F18
F19
F20
F21
F22
F23
F24
F26
4,04 0,35
4,16 84,04
37,18
77,8
49,74
37,19
20,44
4,55
2,27
0,57
4,48 12,66
17,79
20,36
19,96
17,78
12,18
4,03
2,55
0,35
0,54
4,53 0,30
3,14
0,78
2,6
3,14
3,43
2,13
2,00
0,95
4,74
0,52
0,71
0,97
0,87
0,98
0,91
0,78
4,99 0,30
0,71
0,28
3,26
5,21
4,95
4,95
7,37
7,12
8,32
8,63
8,94
4,54
4,46
5,64
0,46
0,32
0,46
0,72
0,84
0,91
1,08
1,11
0,62
0,62
6,02 0,50
7,40
0,30
5,00
7,43
10,50
11,67
15,31
17,23
17,54
10,18
12,69
6,17
0,24
0,38
0,39
6,42 0,86
13,40
0,47
8,83
13,4
20,18
26,23
30,33
35,31
37,40
29,14
34,87
6,69
1,82
1,22
1,80
3,33
6,51
4,47
4,22
4,21
8,86
6,51
6,85 0,99
9,90
6,31
9,89
14,49
35,62
32,87
22,36
19,98
34,35
40,86
6,91
3,25
2,24
3,24
5,02
8,59
8,78
9,86
A Tabela 22 apresenta os resultados obtidos pela CG-DIC da fração F29 até
a fração F40. Observa-se que estas frações apresentam três componentes
principais nos tr
médio
em 6,02; 6,69 e 6,85 min. A fração F36 apresentou teor de
aproximadamente 74% do componente no tr
médio
6,86 min (limoneno). A partir da
F37 os componentes nos tr
médio
entre 6,91 e 9,19 min já são detectados.
Tabela 22 - Percentagem relativa dos componentes das frações F29 a F40
tr médio
(min)
F29
F31
F32
F33
F34
F35
F36
F37
F39
F40
4,99
0,29
5,21
1,79
0,45
5,64
0,29
6,02
6,97
2,74
2,23
1,85
1,20
0,39
6,42
30,64
21,26
16,48
16,89
12,12
6,14
2,97
1,42
0,46
0,24
6,69
9,85
14,5
15,33
15,90
17,63
19,80
21,93
22,04
21,16
15,92
6,85
50,17
60,78
64,83
63,22
68,81
72,70
73,77
73,05
66,71
32,32
6,91
0,21
0,41
0,59
7,96
1,62
4,77
12,58
9,19
1,67
6,49
37,64
outros
0,26
0,67
0,43
0,73
0,72
110
As frações entre F41 e F49 apresentaram maior diversidade de componentes.
Foi possível detectar mais de 30 picos nos cromatogramas, como pode ser
observado na Tabela 23, que apresenta a porcentagem relativa das áreas destes
picos. O pico em tr
médio
9,19 min apresenta maior percentagem em área para as
frações F1 (63%), F42 (89%), F43 (85%), F44 (90%) e F45 (49%), a partir da qual o
pico no tr
médio
= 10,49 min representando aproximadamente 33% na F46 e 29% nas
frações F48 e F49 e o pico no tr médio = 11,4 min com 20% para F46 e 17% para
F48 e F49.
Considerando as atribuições dadas na CG-EM estas frações apresentam
desde o componente que elui no tr
médio
= 6,69 mim, atribuído como sendo careno-2
(T
eb
= 167,5
o
C), até o eluido no tr
médio
= 20,25 min, considerado como hidrato de
terpin (T
eb
= 265
o
C). Desta forma, pode-se inferir que não se conseguiu controlar
adequadamente as condições de temperatura e pressão durante a destilação destas
frações, a fim de promover a melhor separação dos componentes.
Algumas observações e considerações durante o processo de destilação
destas frações podem ser destacadas:
Entre as frações F38 e F40 a pressão de trabalho aplicada na coluna de
destilação foi de 3 mmHg, a temperatura do banho variou de 97 a 103
o
C
e no bulbo o vapor chegava a uma temperatura variando de 45 a 49
o
C;
Para não elevar a temperatura do banho acima de 110
o
C, a partir da
coleta da fração F40, a pressão na coluna foi reduzida a 1 mmHg e nesta
condição foi difícil controlar a destilação, ocorrendo algumas vezes
refluxo de líquido no topo da coluna;
As frações de F41 a F47 (esta última não foi analisada por CG-DIC)
foram coletadas após o controle do refluxo da coluna;
111
A partir da fração F48 a pressão de trabalho foi de 2 mmHg, o que
favoreceu uma melhor separação, como pode ser visto na Tabela 24.
Tabela 23 - Percentagem relativa dos componentes das frações F41 a F49 e do resíduo
final da destilação
tr médio
(min)
F41
F42
F43
F44
F45
F46
F48
F49
Resíduo
Final
6,69
0,81
0,95
1,47
0,84
0,89
0,41
0,33
6,85
1,18
0,55
0,68
0,41
vários picos
0,25
2,36
7,96
4,61
5,71
1,54
0,34
vários picos
0,45
3,27
9,19
63,49
88,95
85,01
90,20
48,8
12,77
0,56
0,77
9,52
0,25
0,27
0,23
0,23
0,27
9,55
1,14
0,44
9,74
0,26
0,31
1,48
0,78
10,21
2,58
0,53
0,67
0,69
0,40
10,28
1,63
0,87
0,32
0,28
10,32
0,41
10,39
0,94
1,40
3,08
4,93
0,26
10,44
9,88
10,49
0,22
0,94
19,85
32,67
29,40
29,27
10,55
0,39
0,29
0,6
0,51
0,29
10,62
1,15
0,56
0,79
0,80
0,47
10,80
3,05
0,45
2,04
1,60
0,31
0,28
11,06
0,38
0,31
0,28
11,17
3,04
11,26
2,31
0,35
2,52
12,79
16,40
11,39
1,33
0,38
0,28
11,58
0,82
2,23
2,28
1,88
11,74
0,86
0,26
20,18
17,32
17,39
12,00
0,27
1,03
1,11
12,20
0,49
0,58
0,43
12,70
1,36
0,23
0,83
0,79
1,70
13,33
0,35
0,34
6,56
7,56
13,70
15,36
2,16
0,39
0,50
0,35
14,00
3,83
14,27
2,77
1,25
9,46
7,51
63,99
14,53
0,22
13,54
13,00
8,85
15,85
0,61
16,68
0,85
0,23
0,37
0,44
17,89
0,85
1,64
18,20
0,42
18,71
1,33
19,17
1,45
19,56
0,73
0,36
0,67
20,25
0,69
0,22
0,75
20,39
7,22
20,70
4,72
outros
0,20
0,32
0,52
1,06
0,41
3,02
112
As frações F50 a F60 apresentaram teores do componente com eluição no
tr
médio
igual a 14,27 min variando de 61 a 81%, pela CG-EM este componente foi
determinado como sendo o α-terpineol.
O processo de destilação foi interrompido após a coleta da fração F61 porque
o resíduo da destilação apresentava uma alta viscosidade e volume muito reduzido,
tornando difícil a agitação.
Tabela 24 - Percentagem relativa dos componentes das frações F50 a F60
tr médio
(min)
F50
F52
F53
F54
F56
F57
F58
F60
10,49
3,04
0,44
0,36
0,52
0,44
0,25
10,62
0,26
11,26
8,79
3,63
2,82
3,98
3,60
2,42
1,31
1,00
11,74
7,99
4,52
3,75
4,98
4,72
3,45
2,18
1,74
12,00
0,63
0,37
0,30
0,42
0,37
0,26
12,70
3,21
3,41
3,22
3,38
3,57
3,62
3,00
2,87
13,05
0,34
0,36
0,29
0,33
0,33
0,26
0,23
13,33
4,50
2,76
2,23
3,22
2,93
2,05
1,24
1,01
13,70
0,40
0,46
0,45
0,38
0,54
0,61
14,27
61,49
73,83
76,29
72,63
73,54
77,06
81,29
81,54
14,53
9,73
10,27
10,26
10,09
10,14
10,33
10,72
10,81
19,56
0,21
4.8 Avaliação microbiológica de amostras de óleo de pinho e suas frações
Obtidas as frações de destilação, os testes microbiológicos foram conduzidos
objetivando a seleção de possíveis frações que possuiam atividade antimicrobiana e
que, em trabalhos futuros, possam ser estudadas em associação aos fenólicos como
componente de um sistema antimicrobiano de uma formulação de desinfetante mais
eficiente.
O teste de disco de difusão foi realizado em amostras de óleo de pinho dos
fabricantes (B, S e Y), uma amostra de óleo de pinho bruto, suas frações e o resíduo
final, ambos, obtidos pelo processo de destilação a pressão reduzida. Todas as
113
amostras de óleos dos fabricantes B, S e Y apresentaram ação inibitória para
Staphylococcus aureus ATCC 6538 e Salmonella choleraesuis ATCC 10708, como é
ilustrado na Figura 18. Estes dados comprovam a reconhecida ação antimicrobiana
do óleo de pinho. Com a comprovação da ação bacteriostática da amostra de óleo
de pinho bruto foi possível conduzir o estudo com esta amostra, a fim de caracterizar
a ação antimicrobiana de suas frações isoladas pelo processo de destilação.
Figura 18. Fotos ilustrativas da formação do halo de inibição para alguns óleos e frações do
óleo bruto (leituras após 24h de incubação)
A Tabela 25 apresenta os resultados das leituras dos halos de inibição
formados e no APÊNDICE C, estão ilustradas algumas fotos deste teste. As frações
mais leves foram divididas em três grupos. O primeiro grupo compreendendo as
frações de F1 a F4 que não apresentaram ação inibitória para os microrganismos
testados. O segundo grupo com as frações entre F5 e F14 que apresentaram ação
inibitória com formação de halo de inibição bem definido para S. aureus e halos não
Salmonella
Staphylococcus
Óleo
Bruto
F14
114
definidos, que foram denominados halos difusos, para S. choleraesuis. Entre estes
dois grupos observou-se um aumento do teor de canfeno, sendo que as frações que
continham teor superior a 9,9% deste composto apresentaram ação inibitória,
sugerindo que o canfeno possua uma atividade antimicrobiana nas condições
testadas. E o terceiro grupo, das frações entre F15 e F26, foi observada a inibição
para os dois microrganismos testados. Estas frações apresentaram diversidade na
composição e ampla variação na concentração destes compostos, não sendo
possível atribuir a atividade antimicrobiana a um ou mais componentes específicos.
Tabela 25 – Resultado da leitura do halo de inibição (mm) formado na avaliação qualitativa
da atividade antimicrobiana de algumas amostras de óleo de pinho e suas
frações de destilação
Fração
Staphylococcus
aureus ATCC
6538
Salmonella
choleraesuis
ATCC 10708
Fração
Staphylococcus
aureus ATCC
6538
Salmonella
choleraesuis
ATCC 10708
24h 48h 24h 48h 24h 48h 24h 48h
Óleo de
B
8 9 9 9 F36 0 (8) 0 0
Óleo de
S
11
11
9
9
F37
(8)
(8)
0
0
Óleo de
Y
8
9
9
9
F39
0
0
0
0
Óleo Bruto
10
10
9
9
F40 0 0 0 0
F1 0 0 0 0 F41 8 (8) 9 9
F 2, 3 e 4 0 0 0 0 F42 (8) (8) 0 0
F5 7 8 (18) (19) F43 8(13) 8(15) 8(12) 8(17)
F 6, 7 e 8 8 8 (24) (27) F44 11 8(15) 8(12) 8(15)
F 9 e 10 7 8 (20) (25) F45 14 (13) 8(14) 15
F11
7
8
(24)
(27)
F46
10
(14)
8(12)
8(10)
F12 7 7 0 (26) F48 9 9 10 10
F13 7 7 (25) (26) F50 11 10 12 13
F14 8 7 (20) (26) F51 9 10 10 14
F15 e 18 8 8 (8) (27) F52 11 10 11 12
F16 6 6 0 (21) F53 11 11 10 12(30)
F17 8 8 0 (22) F54 11 11 12 13
F19 0 0 0 0 F55 11 11 10 13
F20
14
11(17)
14
15
F56
11
11
10
10
F21
8
8
(9)
(9)
F57
10
10
11
16
F22 8 9 0 0 F58 11 11 11 11(36)
F23 11 12 10 10 F59 11 11 11 15(40)
F24 e 26 11 12 9 14 F60 10 10 12 13
F29 8 8 0 0 F61 10 10 11 12
F31 (8) (9) 0 0
Resíduo F19
8 8 10 9
F32 (8) 0 0 0
Resíduo F28
9 9 9 9
F33
(9)
(9)
0
0
Resíduo F44
9
10
11
12
F34
(8)
(8)
0
0
Resíduo final
9
9
9
9
F35 0 (8) 0 0
Terpinoleno
11 12 10 10
Os resultados representam a média dos diâmetros dos halos de inibição em milímetros (mm).
(θ) os valores entre parênteses indicam o diâmetro em mm de um halo difuso.
Resíduo Fn = resíduo retirado após a coleta da fração Fn
115
As frações intermediárias de F29 a F40, onde as concentrações relevantes
são para os compostos 1-4 cineol, careno-2 e limoneno, apresentaram ação
inibitória para a bactéria Gram positiva S. aureus, mas não para a Gram negativa
testada.
A seqüência que abrange as frações de F41 a F48, apresentou boa ação
inibitória para ambos os microrganismos, devido à grande dispersão da composição
entre estas frações, não sendo possível indicar quais compostos seriam os mais
relevantes ou ainda se há uma combinação destes que favoreça a atividade
antimicrobiana.
O último grupo representado pelas frações F50 a F60 apresentaram halos
bem definidos para ambos os microrganismos testados e nestas frações os teores e
tipos de alcoóis terpênicos (1-terpineol, β-terpineol, borneol, 4-terpineol, α-terpineol e
γ-terpineol) são os compostos que mais se destacam.
O resíduo obtido no final da destilação também foi avaliado e apresentou
atividade antimicrobiana para as bactérias testadas. Este resíduo tem em sua
composição uma alta concentração de α-terpineol.
Embora a maioria das frações estudadas demonstrasse uma linearidade no
perfil de atividade bacteriostática na seqüência em que se apresentava se observou
que algumas delas, apesar de apresentar uma composição próxima às de suas
imediatamente antecedentes e posteriores, divergiram quanto as suas atividades
antimicrobianas, como exemplo pode-se citar as frações F12, F19, F22, F26, F39,
F40 e F42. No APENDICE C a Figura 64 ilustra o comparativo entre os dados
cromatográficos e a formação de halos de inibição para algumas frações.
Para se obter uma melhor compreensão do perfil da atividade antimicrobiana,
sugere-se a identificação dos compostos que apresentaram tr
médio
em 10,49 e 13,70
116
min. Para as frações que apresentaram halo difuso um estudo de cada componente
relevante poderia ser realizado a fim de se comprovar sua ação bacteriostática. Para
os componentes que tenham esta ação comprovada, sugere-se a determinação da
CIM.
4.9 Avaliação da estabilidade das formulações biocidas
Objetivando o estudo da ação de sistema tensoativos na atividade
antimicrobiana, foram preparadas as formulações de desinfetante conforme
apresentado na seção 3.2.8. Considerando que uma formulação deve ter atividade
antimicrobiana não apenas logo após o seu preparo como também deve manter esta
propriedade e suas propriedades organoléticas e de aparência até o fim do prazo de
validade, realizou-se o estudo de estabilidade das formulações.
Após o preparo das formulações, foram realizadas medidas de pH, tensão
superficial, teor de ativo fenólico e avaliações organolépticas (cor, odor, aparência)
Na avaliação olfativa evidenciou-se a predominância do odor característico do
componente fenólico empregado envolvido com notas alcoólicas do etanol. Ao final
do teste de estabilidade foi evidenciada uma leve perda de intensidade do odor do
produto, porém sem alteração de caráter olfativo.
Para as amostras preparadas com NaLAS observou-se durante o teste de
estabilidade alteração da cor da base de incolor para castanha, atingindo maior
intensidade quando do uso do PCMC. As formulações expostas a 5
o
C contendo este
tensoativo combinado com o emprego do OBCP apresentaram-se turvas na
avaliação realizada na 12ª semana, e tornando-se límpida na temperatura ambiente.
117
Os sistemas com AOS e laurato de Na/TEA, apresentaram boa estabilidade
não apresentando separação de fases ou alteração de cor e odor. As amostras
expostas a 5
o
C apresentaram-se turvas, porém quando as amostras atingiram a
temperatura ambiente, em torno de 25
o
C, tornaram-se límpidas.
Com relação à interação das formulações com a embalagem (frascos de
PET), em alguns casos, as embalagens expostas a 45
o
C ficaram com as paredes
foscas, evidenciando um ataque da formulação. Não foi possível fazer uma
associação entre os tipos de tensoativos, mas sim com a concentração destes. Uma
maior concentração favorece uma maior solubilização micelar do ativo fenólico, não
o deixando livre, por exemplo, para interagir com a embalagem. Quando se tem um
aumento da temperatura de uma solução tensoativa aniônica há uma maior
solubilização dos monômeros que passam a agregar em maiores valores de cmc, o
que equivale dizer que em relação a uma temperatura mais baixa, a solubilização
micelar é reduzida, já que uma maior fração de moléculas tensoativa estará presente
na forma monomérica.
Os ativos fenólicos possuem solubilização por pontes de hidrogênio. Ao
aumentar-se a temperatura da solução, a solubilidade do fenólico em água fica
reduzida e este tende a migrar para a micela. Porém, conforme explanado
anteriormente, o aumento da temperatura favorece a forma monomérica em
detrimento à fórmula micelar, sendo que o resultado líquido destes fenômenos é a
redução de solubilidade dos ativos fenólicos no sistema aquoso com conseqüente
migração destes para a superfície da embalagem.
As medidas de tensão superficial e as faixas de pH das formulações avaliadas
variaram conforme valores demonstrados na Tabela 26. Não foram observadas
influências na tensão superficial referentes ao tipo e/ou teor de derivado fenólico
118
utilizado. Como as concentrações empregadas estavam acima da cmc dos
tensoativos somente o tipo de tensoativo influenciou nas variações das medidas.
Tabela 26 – Faixa de tensão superficial e pH para as formulações biocidas agrupadas pelo
tipo de tensoativo utilizado
Sistema Tensoativo
Faixa de Tensão Superficial
(dyna cm
-2
)
Faixa de pH
Laurato de Na/TEA 28 - 30 7,34 - 7,8
NaLAS 30 - 32 7,33 - 7,54
AOS 32 - 34 7,36 - 7,49
O acompanhamento das variações de pH foi realizado em todas as
avaliações programadas, e as percentagens de variações de pH com referência ao
pH inicial da amostra estão ilustradas na Figura 19 para amostras expostas a 5
o
C,
na Figura 20 para amostra mantida à temperatura ambiente e na Figura 21 para
amostras que foram submetidas a aquecimento em estufa a 45
o
C.
Figura 19. Gráfico da Percentagem de variação de pH - Teste de estabilidade a 5
o
C
-55,0
-45,0
-35,0
-25,0
-15,0
-5,0
5,0
15,0
1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41
2a Semana
4a semana
8a semana
12a semana
% de variação de pH
Número da amostra
119
Figura 20. Gráfico da Percentagem de variação de pH - Teste de estabilidade a
Temperatura Ambiente
Figura 21. Gráfico da Percentagem de variação de pH - Teste de estabilidade a 45
o
C
Entre as amostras expostas a 5
o
C e a temperatura ambiente, o perfil de
variação de pH apresentou semelhanças, sendo que as percentagens de variações
dessa medida ficaram: entre 0,1-6,6% para AOS; 0,8-8,5% para Laurato de Na/TEA
e 6,1-17% para NaLAS.
-55,0
-45,0
-35,0
-25,0
-15,0
-5,0
5,0
15,0
1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41
2a Semana
4a semana
8a semana
12a semana
-55,0
-45,0
-35,0
-25,0
-15,0
-5,0
5,0
15,0
1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29 31 33 35 37 39 41
2a Semana
4a semana
8a semana
12a semana
% de variação de pH
% de variação de pH
Número da amostra
Número da amostra
120
Observa-se na Figura 21 uma variação progressiva do pH entre a segunda
semana e a décima segunda semana do teste de estabilidade. A maior variação de
pH foi para as amostras com 1,5% de AOS e PCMC, atingindo valores de 24,5%
quando o PCMC estava presente a 0,7% e 45% quando do uso de 1% deste
fenólico. Porém, os sistemas com NaLAS apresentaram maior instabilidade de pH,
observando-se influência do tipo de fenólico empregado: variações entre 11,0-19,2%
para OPP, 16,6-25,1% para OBCP e 32,4-47,6% para PCMC.
O sistema tensoativo com Laurato de Na/TEA apresentou maior estabilidade
no pH com variações entre 0,1-6,6% para as amostras expostas a 45
o
C por doze
semanas.
Nas formulações com NaLAS e sem adição de fenólico a variação de pH foi
de 12,1 e 14,1% para amostra com 1,5 e 5% de ativo aniônico, respectivamente.
4.10 Determinação de derivados fenólicos por CLAE
A determinação do teor de um componente considerado como ativo de uma
formulação com ação antimicrobiana deve ser realizada logo após o preparo da
formulação, durante os testes de estabilidade, no final do prazo de validade do
produto e sempre que se achar necessário a fim de se ter o controle do ativo
antimicrobiano e conseqüentemente a garantia de sua atividade.
A seguir são apresentados os resultados obtidos nas etapas de
desenvolvimento para uma metodologia de determinação do teor de PCMC, OPP e
OBCP via CLAE.
Para verificação do sinal-ruído da fase móvel a mesma foi injetada nas
condições de análise das amostras-teste. O sinal-ruído variou de -0,040 a +0,025
mV como pode ser observado na Figura 22.
121
Figura 22. Cromatograma da fase móvel (acetonitrila/ água 65:35 (v/v); pH 2,6 (H
3
PO
4
))
As matrizes (bases sem derivados fenólicos) foram injetadas e os
cromatogramas obtidos estão apresentados na Figura 23 para o sistema com AOS,
na Figura 24 para o sistema com NaLAS e o sistema com laurato de Na/TEA está
representado na Figura 25 .
Figura 23. Cromatograma base matriz do sistema com 5% de AOS e 15,4% de etanol
Tempo (min)
Resposta do detector (mV)
Tempo (min)
Resposta do detector (mV)
122
Figura 24. Cromatograma base matriz do sistema 5% de NaLAS e 15,4% de EtOH
Figura 25. Cromatograma da base matriz do sistema 5% de laurato de Na/TEA e 15,4% de
EtOH
O sinal-ruído entre 3,8 e 7,5 minutos (período onde ocorre a eluição dos
derivados fenólicos) para os sistemas com AOS e laurato de Na/TEA apresentou
valores abaixo de 0,10 mV e para o sistema com NaLAS abaixo de 0,30 mV.
Tempo (min)
Resposta do detector (mV)
Tempo (min)
Resposta do detector (mV)
123
Figura 26. Cromatogramas típicos de (a) PCMC; (b) OPP e (c) OBCP
Observando as diferenças dos tempos de retenção dos derivados fenólicos,
representados nos cromatogramas da Figura 26, optou-se por fazer a curva de
calibração com os três fenólicos em uma mesma solução otimizando o tempo de
(c)
mV
mV
mV
tempo (min)
(b)
(a)
OPP
OBCP
PCMC
124
obtenção desta. A Figura 27 representa o cromatograma da amostra padrão
(empregadas no levantamento da curva de calibração) contendo 100 mg mL
-1
de
cada um dos ativos fenólicos.
Figura 27. Cromatograma de uma solução contendo três derivados fenólicos (PCMC, OPP e OBCP)
na concentração de 100 mg mL
-1
, na FM acetonitrila: água (65:35 v/v, pH 2,6 (H
2
PO
3
))
As análises para construção das curvas de calibração foram repetidas em três
dias, no dia 1 e no dia 2 foi utilizada a mesma fase móvel e para as análises do dia 3
foi preparada uma nova fase móvel. Foram feitas triplicatas das injeções para cada
concentração analisada.
A utilização da fase móvel preparada no terceiro dia provocou aumento nos
tempos de retenção principalmente para o OBCP (Tabela 27). Isto pode ter ocorrido
devido a uma pequena redução no teor de acetonitrila durante o preparo. Thompson
(2001) relatou que a alteração na fase móvel na relação acetonitrila/água de 55:45
para 65:35 (v/v), conduziu a uma redução no tempo de retenção (24 para 12 min) do
triclosan. A Tabela 27 apresenta os valores do coeficiente de correlação (r),
inclinação e intercepto para a curva média e o tempo de retenção de cada padrão.
Considerando que segundo a ANVISA (2003), o critério mínimo aceitável do
PCMC
OPP
OBCP
Resposta do detector (mV)
Tempo (min)
125
coeficiente de correlação (r) de ser igual a 0,99 para que uma metodologia analítica
atenda o requisito linearidade da validação de métodos analíticos, a metodologia
proposta está de acordo com este critério para determinações de PCMC, OPP e
OBCP em concentrações entre 20 e 100 mg L
-1
. Entende-se por linearidade a
capacidade de uma metodologia analítica de demonstrar que os resultados obtidos
são diretamente proporcionais à concentração do analito na amostra, dentro de um
intervalo especificado.
Tabela 27 - Dados da curva média da calibração para PCMC, OPP e OBCP obtidas em três
dias diferentes
PCMC OPP OBCP
Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 1 Dia 2 Dia 3
t
r
(min) 4,08 4,08 4,18 4,90 4,92 5,10 6,99 7,07 7,45
Coef. de
correlação (r)
0,9994 0,9986
0,9951
0,9993 0,9985
0,9950
0,9996 0,9985
0,9952
inclinação 7,558 e
-11
7,715e
-11
7,626e
-11
3,607e
-11
3,702e
-11
3,662e
-11
8,145e
-11
8,113e
-11
8,045e
-11
intercepto -1,101e
-6
-2,254e
-6
-3,582e
-6
-1,299e
-6
-2,572e
-6
-4,188e
-6
-1,358e
-6
-1,619e
-6
-3,377e
-6
Na avaliação da precisão instrumental foram realizadas seis injeções de uma
amostra constituída de uma mistura dos três fenólicos em um sistema tensoativo
com 5% de AOS. A Tabela 28 apresenta a área dos picos obtidos para cada injeção,
a sua média, o desvio padrão e o coeficiente de variação (CV%) que apresentou
para as determinações da área e percentagem de ativo, valores em torno de 1%,
atendendo o critério de aprovação da ANVISA (2003) que é no máximo de 5%.
126
Tabela 28 - Áreas dos picos referentes a replicatas de injeção de uma amostra com PCMC,
OPP e OBCP em um sistema com 5 % de AOS
Injeção e
resultados
PCMC OPP OBCP
Área
Conc. (%)
Área
Conc. (%)
Área
Conc. (%)
1 1088381
0,967 2401630
1,022 1049538 0,999
2 1089750
0,969 2408940
1,025 1053892 0,993
3
1089339
0,968
2409750
1,025
1054785
0,994
4 1088840
0,968 2406171
1,024 1053431 0,992
5
1107742
0,986
2449882
1,044
1072800
1,012
6 1107612
0,986 2449260
1,044 1073775 1,013
Média 1095277
0,974 2420939
1,031 1059704 0,999
Desvio Padrão 9616
0,009 22360
0,010 10679 0,011
C.V. (%)
0,878
0,944
0,924
0,996
1,008
1,056
A robustez de um método analítico é a medida de sua capacidade em resistir
a pequenas e deliberadas variações dos parâmetros analíticos. Indica sua confiança
durante o uso normal. Visando o reconhecimento da suscetibilidade do método às
variações nas condições analíticas foram realizadas injeções em condições
diferentes de vazão da fase móvel (0,9 e 1,1 mL min
-1
), temperatura do forno (38 e
42
o
C) e fase móvel preparada por analistas diferentes, porém com a mesma
composição.
Nas Tabelas 29, 30 e 31 são indicados, respectivamente para PCMC, OPP e
OBCP, os desvios padrão e os coeficientes de variações das áreas obtidas nas
injeções para cada condição avaliada. Em uma mesma condição, as variações entre
injeções não são significativamente diferentes ao nível de 95% de confiança. Porém,
na análise comparativa entre as condições proposta e variações na vazão da fase
móvel os valores das áreas obtidas apresentaram significativa diferença. Assim
sendo, a vazão da fase móvel deve ser um parâmetro de controle constante durante
a execução deste método.
127
Tabela 29 - Avaliação da robustez do método de dosagem de PCMC quanto a variação de
FM, vazão e temperatura do forno (Área dos Picos)
Dados
Atuais
FM nova Vazão 0,9
mL min
-1
Vazão 1,1
mL min
-1
Temp.
Forno 38
o
C
Temp.
Forno 42
o
C
1
1088381
1084060
1202483
984834
1079074
1072602
2 1089750 1082074 1194911 987576 1021858 1070696
3 1089339 1081059 1195708 985911 1071794 1069224
4 1088840 1084498 1083207 1065865
Média
1089078
1082923
1197701
986107
1063983
1069597
Desvio Padrão 595 1630 4161 1381 28477 2846
C.V. (%)
0,055
0,150
0,347
0,140
2,676
0,266
Interações entre colunas
Média 1086000 1135630 1044947 1076530 1079337
Desvio Padrão 3480 58113 55047 22970 10585
C.V. (%)
0,320
5,117
5,268
2,134
0,981
t
r
(min) 4,083 4,18 4,639 3,819 4,229 4,149
Tabela 30 - Avaliação da robustez do método de dosagem de OPP quanto variação de FM,
vazão e temperatura do forno (Área dos Picos)
Dados
Atuais
FM nova
Vazão 0,9
mL min
-1
Vazão 1,1
mL min
-1
Temp.
Forno 38
o
C
Temp.
Forno 42
o
C
1 2401630
2395667
2662768
2176090
2385401
2372694
2 2408940
2391449
2640856
2182111
2261639
2366180
3 2409750
2389955
2642283
2179186
2371538
2363745
4 2406171
2396260
2392270
2354213
Média
2406623
2393333
2648636
2179129
2352712
2364208
Desvio Padrão 3664
3108
12260
3011
61325
7660
C.V. (%) 0,152
0,130
0,463
0,138
2,607
0,324
Interações entre colunas
Média
2399978
2510343
2309125
2379667
2385415
Desvio Padrão 7769
129581
121641
49476
23343
C.V. (%)
0,324
5,162
5,268
2,079
0,979
t
r
(min) 4,923
5,091
5,649
4,653
5,169
5,043
128
Tabela 31 - Avaliação da robustez do método de dosagem de OBCP quanto variação de
FM, vazão e temperatura do forno (Área dos Picos)
Dados
Atuais
FM nova Vazão 0,9
mL min
-1
Vazão 1,1
mL min
-1
Temp.
Forno 38
o
C
Temp.
Forno 42
o
C
1 1049538
1055954
1162686
953383
1044836
1039885
2 1053892
1047957
1161883
959614
993336
1043091
3 1054785
1050628
1162836
* 1042156
1042612
4
1053431
1052248
1045480
1038210
Média 1052912
1051697
1162468
956499
1031452
1040950
Desvio Padrão 2318
3344
512
4406
25451
2309
C.V. (%) 0,220
0,318
0,044
0,461
2,468
0,222
Interações entre colunas
Média 1052304
1099864
1020774
1042182
1046931
Desvio Padrão
2742
58584
49859
20285
6743
C.V. (%) 0,261
5,326
4,884
1,946
0,644
t
r
(min) 7,070
7,474
8,246
6,802
7,516
7,336
* valor não integrado pelo software do equipamento
As amostras recém-preparadas foram avaliadas com base na curva de
calibração individual de cada ativo e após o período de estabilidade, por meio da
curva de calibração contendo os três fenólicos. A escolha de se fazer as
determinações do teor de ativo nas amostras expostas a 45
o
C, foi realizada em
consideração ao fato desta ser, entre as condições avaliadas, a mais agressiva para
promoção de alguma instabilidade do sistema.
A Tabela 32 apresenta os teores de ativo fenólico determinado pelo cálculo
das massas pesadas dos componentes da formulação e considerando a teor de
ativo do componente fenólico conforme o laudo do fabricante. São também
apresentados os teores determinados por CLAE nas determinações realizadas nas
amostras recém-preparadas e após a estabilidade a 45
o
C. São expressas as
variações entre o teor da amostra e o teor determinado na análise via CLAE bem
129
como a variação do teor de ativo entre as amostras recém-preparadas e após o
teste de estabilidade.
Tabela 32 – Resultados das determinações do teor de ativo fenólicos por CLAE das
amostras recém-preparadas e após estabilidade e suas variações com
relação ao teor inicial
Tensoativo Ativo Fenólico Teor
Inicial
CLAE
inicial
Variação
Teor
Inicial
vs
CLAE
inicial
Teor
CLAE
final
Variação
Teor
inicial
vs
CLAE
final
Variação
CLAE
inicial
vs
CLAE
final
Tipo
Teor
(%)
Tipo Teor (%) (%) (%) (%) (%) (%)
NaLAS 5,0 OPP 0,987 0,998 1,04
0,930 -5,80
-6,78
Laurato
5,0
OPP
0,696
0,691
-
0,71
0,712
2,36
3,09
AOS
5,0
OPP
0,996
1,001
0,45
0,956
-
4,02
-
4,45
NaLAS 5,0 OBCP 0,976 0,949 -2,80
0,929 -4,81
-2,14
Laurato 5,0 OBCP 0,683 0,695 1,70
0,652 -4,63
-6,25
AOS 5,0 OBCP 0,683 0,663 -3,02
0,655 -4,08
-1,19
NaLAS 5,0 PCMC 0,999 1,008 0,93
1,007 0,83
-0,11
Laurato 5,0 PCMC 0,699 0,711 1,59
0,708 1,28
-0,33
AOS 5,0 PCMC 0,998 0,997 -0,12
0,978 -2,02
-1,90
NaLAS
5,0
OBCP
0,684
0,659
-
3,80
0,661
-
3,28
0,40
Laurato 5,0 OBCP 0,975 0,949 -2,82
0,952 -2,39
0,35
AOS 5,0 OBCP 0,992 0,972 -2,03
0,901 -9,15
-7,31
Amostras que apresentaram alto decaimento do teor de ativo fenólico
NaLAS 1,5 OPP 0,698 0,641 -8,79
0,489 -29,86
-23,69
NaLAS 1,5 OPP 0,996 0,830 -19,98
0,591 -40,61
-28,75
AOS 1,5 OPP 0,697 0,603 -15,63
0,548 -21,44
-9,16
AOS
1,5
OPP
0,993
0,812
-
22,31
0,549
-
44,74
-
32,41
Laurato
1,5
OPP
0,697
0,665
-
4,83
0,488
-
30,07
-
26,70
Laurato 1,5 OPP 0,995 0,854 -16,52
0,513 -48,50
-40,00
NaLAS 1,5 OBCP 0,678 0,583 -16,31
0,475 -29,99
-18,58
Laurato 1,5 OBCP 0,683 0,619 -10,45
0,389 -43,11
-37,17
NaLAS 1,5 OBCP 0,976 0,779 -25,28
0,508 -47,95
-34,79
AOS 1,5 OBCP 0,976 0,663 -47,17
0,390 -59,99
-41,12
AOS 1,5 PCMC 0,999 0,957 -4,43
0,797 -20,23
-16,70
Laurato
1,5
PCMC
0,699
0,686
-
2,01
0,621
-
11,25
-
9,46
NaLAS 1,5 PCMC 0,701 0,667 -5,21
0,620 -11,65
-7,05
Do total de vinte e cinco amostras avaliadas, doze apresentaram variação
menor de 4% entre o teor de ativo e o determinado via CLAE. Observou-se que
todas essas amostras apresentaram teor de ativo aniônico de 5%. Dez amostras,
das que tinham teor de ativo aniônico de 1,5%, apresentaram variações entre o teor
de ativo fenólico e o determinado via CLAE maior que 5%, e foi evidenciado que
130
estas variações aumentaram nas determinações após o teste de estabilidade,
atingindo percentagens de 40%.
Estas variações no teor de ativo endossam a explanação dada anteriormente
de que uma maior temperatura (estabilidade a 45
o
C) causa uma maior
insolubilização dos ativos com a conseqüente e referida migração para a superfície
interna da embalagem.
4.11 Estudo da ação antimicrobiana das formulações
Na avaliação da ação antimicrobiana pelo método de suspensão, todas as 36
amostras avaliadas que continham os agentes fenólicos (OBCP, PCMC ou OPP)
apresentaram efeito microbicida (EM) maior que 3, isto é uma redução superior a
99,9% da contagem microbiana inicial. Desta forma, pode-se considerar que nas
concentrações estudadas de tensoativo (1,5 e 5%) e de fenólicos (0,7 e 1,0%)
qualquer interação que exista entre estes, não apresenta impacto negativo quando
se avalia uma redução logarítmica de 3 ordens de magnitude na contagem do
inoculo, pelo contrário evidencia uma atividade antimicrobiana complementar.
Considerando os resultados obtidos na determinação do teor dos fenólicos via
CLAE, pode-se observar que algumas amostras apresentaram no fim do teste de
estabilidade teores de ativo na ordem de 0,4% e EM maior que 3 nos testes
microbiológicos. Este resultado sugere uma continuidade do estudo na investigação
de sistema com menores teores de derivado fenólico.
Objetivando a avaliação da eficácia da base alcoólica de tensoativo contra as
bactérias Salmonella e Staphylococcus, na ausência de componentes fenólicos, o
teste reducional foi realizado em uma base contendo somente tensoativo, álcool e
131
água nas concentrações apresentadas previamente na Tabela 16. Também, foram
avaliadas as amostras nas formas frescas e envelhecidas (após exposição a 45
o
C
por 12 semanas) e os resultados estão apresentados na Tabela 33.
Tabela 33 - Resultados dos testes reducionais para avaliação dos sistemas tensoativos
(média das leituras)
Salmonella choleraesuis
ATCC 10708
Staphylococcus aureus
ATCC 6538
Inicial Envelhecida Inicial Envelhecida
t
c
EM %Red. EM %Red. EM %Red. EM %Red.
AOS 1,5% 5 -0,08 16,29 -0,26 45,54 -2,70 98,68 -1,90 98,75
10 -0,28 47,71 -0,55 71,86 -3,83 99,99 -2,32 99,52
AOS 5,0% 5 -3,32 99,95 -4,01 99,99 -2,86 99,86 -3,81 99,98
10 -3,32 99,95 -4,01 99,99 -2,86 99,86 -3,81 99,98
NaLAS 1,5% 5 0,61 -311,43
N.A. N.A. -2,86 99,86 N.A. N.A.
10 0,60 -295,24
N.A. N.A. -2,86 99,86 N.A. N.A.
NaLAS 5,0% 5 -0,15 28,59 -0,44 63,63 -2,38 98,66 -3,81 99,98
10 -0,38 56,06 -1,28 88,98 -2,51 99,69 -3,81 99,98
Laurato 1,5% 5 -3,32 99,95 -4,01 99,99 -2,86 99,86 -3,81 99,98
10 -3,32 99,95 -4,01 99,99 -2,86 99,86 -3,81 99,98
Laurato 5,0% 5 -3,93 99,98 -4,01 99,99 -3,83 99,98 -3,81 99,98
10 -3,93 99,98 -4,01 99,99 -3,83 99,98 -3,81 99,98
t
c
= tempo de contato; N.A. = não avaliada; %Red.= percentagem de redução; EM= efeito microbicida
A base alcoólica com 1,5% de AOS, não apresentou efeito antimicrobiano
satisfatório contra a bactéria Gram negativa testada (Salmonella choleraesuis).
Porém quando a concentração de tensoativo foi elevada a 5% o efeito microbicida
(EM) foi superior a 3, isto é, redução superior a 99,9%. Para a bactéria Gram positiva
(Staphylococcus aureus) a base alcoólica com 1,5% de AOS apresentou EM de 3 na
amostra fresca e 2 para amostras envelhecidas, quando avaliadas em um tempo de
contato de 10 minutos.
Na contagem realizada para as placas com Salmonella choleraesuis, após o
teste com base alcoólica com 1,5% de NaLAS a leitura final (8,64x10
6
e 8,30x10
6
132
UFC mL
-1
, para tempo de contato de 5 e 10 minutos, respectivamente) foi maior que
a leitura inicial (2,10x10
6
UFC mL
-1
), porém na mesma potência, podendo assim
considerar que não houve aumento da população microbiana e o sistema testado
apresentou efeito antimicrobiano nulo para Salmonella. Por outro lado, apresentou
atividade contra Staphylococcus aureus com EM de 2. No teste de estabilidade, este
sistema apresentou-se instável, turvo e com separação de fase, por esses motivos
não foram conduzidos testes microbiológico na amostra envelhecida para este
sistema.
Estes resultados estão de acordo com a literatura (COZZOLI, 1996,
GLOXHUBER e KÄSTNER, 1980), apresentando aos ativos aniônicos estudados
uma fraca atividade antimicrobiana para as bactérias Gram negativas e relevante
atividade antimicrobiana para as bactérias Gram positivas.
A base alcoólica com laurato apresentou redução de pelo menos 99,9% para
ambos os microrganismos testados mesmo depois de envelhecida.
Estes resultados podem ser explicados pelo fato que tensoativos mais
hidrofóbicos (menor cmc) possam ter atuação antimicrobiana secundária, mais
efetiva em relação aos tensoativos mais solúveis.
Praticamente todas as variações de soluções tensoativas quanto aos tipos e
concentrações de tensoativos testados, tiveram atuação antimicrobiana significativa
frente à bactéria Gram negativa avaliada, devido às características da parede
hidrofóbica desta apresentar grande afinidade pelos tensoativos, isto é, pouca
seletividade.
Para as bactérias Gram positivas a espessura da camada hidrofóbica da
parede celular, por ser menor, torna o microrganismo menos sensível (mais seletivo)
aos tensoativos em relação ao tipo e a concentração deste.
133
Comparando os resultados dos teores de ativos fenólicos no final da
estabilidade e os ensaios de eficácia antimicrobiana, observa-se que apesar da
redução do teor de ativo fenólico em algumas amostras ter atingido a níveis de
perda de aproximadamente 40%, estas amostras apresentaram redução microbiana
maior que 99,9%, independente do ativo empregado.
Estes resultados ilustram a importância da realização do estudo de
estabilidade de um produto conduzido na embalagem final na qual este será
comercializado e, também, reforçam a necessidade do desenvolvimento de
formulações robustas capazes de resistirem às interações no sistema e que possam
ocorrer durante o seu prazo de validade e, ainda, manterem sua eficácia
antimicrobiana.
134
5 CONSIDERAÇÕES FINAIS
A partir do estudo de caracterização físico-química, organoléptica e
microbiológica de amostras de óleo de pinho e suas frações isoladas por destilação
foi possível concluir que:
A composição do óleo de pinho apresenta diversidade de componentes com
atividade antimicrobiana inibitória. Diferenças das concentrações destes
componentes na composição de uma amostra de óleo de pinho podem ser
provenientes do tipo de goma-resina empregada, condições de reação de hidratação
dos monoterpenos e do processo de destilação do produto de reação.
Frações mais leves do óleo de pinho contendo acima de 9,9% de canfeno
apresentaram ação antimicrobiana. Individualmente as frações, na composição em
que foram separadas, apresentaram melhor atividade bacteriostática para a bactéria
Gram positiva testada, porém a associação destas na composição do óleo de pinho
proporcionou ação bacteriostática para ambas as bactérias testadas.
A continuidade do estudo, por meio da determinação da CIM das frações que
apresentaram ação inibitória, poderá dar indicação da melhor composição de um
óleo de pinho considerando o parâmetro ação antimicrobiana.
Mudanças nas concentrações dos teores de monoterpenos presentes no óleo
de pinho alteram diretamente o caráter olfativo deste.
A termogravimetria pode ser empregada, tanto em escala piloto como
industrialmente como ferramenta de controle no processo de destilação.
No que diz respeito ao estudo da ação de sistemas tensoativos na atividade
antimicrobiana de ativos fenólicos foi possível concluir que:
135
Os tensoativos estudados (AOS, NaLAS e laurato de Na/TEA), apresentam
ação antimicrobiana e influenciam na atividade dos ativos fenólicos.
A interação físico-química dos componentes de uma formulação e desta com
a embalagem, na qual será armazenada, deve ser avaliada por meio do estudo de
estabilidade.
O sistema tensoativo empregando o laurato de Na/TEA como tensoativo
apresentou melhor estabilidade e indicou ter influência positiva na atividade
antimicrobiana da formulação.
O grau de influência dos tensoativos na ação antimicrobiana dos fenólicos
pode ser mais bem evidenciado empregando menor concentração de biocida. Por
outro lado, pôde-se identificar a influência do teor de tensoativo na estabilização do
derivado fenólico em um sistema exposto na temperatura de 45
o
C e armazenado em
embalagem de PET.
A CLAE apresentou-se como um método promissor na determinação de
derivados fenólicos em produtos acabados.
136
6 PERSPECTIVAS
- Determinar as CIM para as frações de óleo de pinho que apresentaram ação
inibitória.
- Empregar as frações de óleo de pinho que apresentam melhor atividade
antimicrobiana associada a outros tipos de biocidas em uma formulação de
desinfetante.
- Identificar os componentes das frações com atividade antimicrobiana que não
foram identificados neste trabalho.
-Identificar óleos essenciais que apresentam teores consideráveis dos
componentes do óleo de pinho com atividade antimicrobiana e que também
poderiam ser empregados em associação com outros biocidas.
- Avaliar a estabilidade dos derivados fenólicos frente a uma maior variação de
concentração de tensoativo e em diferentes tipos de embalagem (vidro, PEAD,
PEBD, PP).
- Validar a metodologia de determinação dos derivados fenólicos via CLAE e
empregá-la na avaliação de amostras comerciais de desinfetantes de uso doméstico
e institucionais.
- Caracterizar o óleo de pinho e suas frações utilizando a termogravimetria de alta
resolução.
- Utilizar a técnica DSC para determinação da temperatura de fusão e de ebulição
das frações de destilação, proporcionando melhor caracterização destas.
137
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, v.65, n.7,
p.881
-
8
84, 2004.
146
GLOSSÁRIO
Alcatrão de hulha
É um líquido escuro e viscoso constituído essencialmente de
hidrocarbonetos aromáticos, tais como benzeno, fenóis, naftaleno,
cresóis, antraceno e piche. Trata-se da mais importante fonte
natural de compostos aromáticos de grande importância para a
indústria (mais de duzentos compostos podem ser obtidos).
Alfa olefina Olefinas com a dupla no início da cadeia de carbonos.
Autólise Autofagia. Autodestruição de célula e de organelas citoplasmáticas
pelas suas próprias enzimas hidrolisantes; autodigestão.
Bioacumulação
É o nome genérico do processo de captação e retenção de uma
substância (contaminante) por um organismo a partir de qualquer
fonte (água, sedimento, outro organismo), via qualquer rota (dieta,
pele), e se constitui em efeito nocivo quando induz resposta
biológica adversa. O termo bioacumulação tem sido aplicado
quando organismos vivos estão envolvidos, e biosorção é o termo
mais adotado para o uso de organismos mortos.
Cápsula Camada limosa ou polissacarídeo extracelular.
Citoplasma Duas áreas distintas são visualizadas através de microscopia
eletrônica: uma matriz amorfa (contém ribossomos, grânulos,
metabólitos, enzimas, etc.) e o nucleóide, uma região estruturada
pela presença do DNA bacteriano.
CLAE
-
ge
l filtração
É o tipo de cromatografia líquida por exclusão de tamanho na qual o
enchimento é hidrofílico. É usada para separação de substâncias
polares.
CLAE-gel
permeação
É o tipo de cromatografia líquida por exclusão de tamanho na qual o
enchimento é hidrofóbico. É usada para separação de substâncias
não polares.
Coeficiente de
variação
É uma medida adimensional, útil para comparar resultados das
amostras cujas unidades podem ser diferentes. Uma desvantagem
do coeficiente de variação é que ele deixa de ser útil quando a
média é próxima de zero, pois
X
s
CV 100
onde s é o desvio padrão para a amostra.
Desinfetante
É um produto que mata todos os microrganismos patogênicos, mas
não necessariamente todas as formas microbianas esporuladas em
objetos e superfícies inanimadas.
Desodorizante Produto que tem em sua composição substância com atividade
antimicrobiana capaz de controlar odores desagradáveis.
Desvio Padrão O desvio padrão é uma medida do grau de dispersão dos valores
em relação ao valor médio (a média). Indica os limites prováveis
dentro dos quais se situam certas proporções das observações.
147
68% das observações estão distantes da média em 1 desvio
padrão, 95% em 2 e 99,7 em 3 desvios padrões.
1
,
22
n
Xx
s
n
Xx
ii
onde significa o desvio padrão da população e s significa o desvio
padrão da amostra.
Endósporos
(esporos)
Estruturas celulares altamente desidratadas.
Escala Mc Farland A escala nefelométrica de Mc Farland é o padrão de turvação mais
freqüentemente utilizado nos laboratórios de microbiologia para
determinar a intensidade da multiplicação bacteriana em meios
líquidos de cultivo.
Essa multiplicação é evidenciada pela turvação ou opacidade do
meio de cultura e quanto maior o número de bactérias, maior será a
opacidade do meio de cultura. Consiste em uma série de 11 tubos
numerados de 0,5 a 10, com diferentes quantidades de cloreto de
bário e ácido sulfúrico, para se obter diferentes concentrações de
sulfato de bário, que correspondem a diferentes contagens
bacterianas. A equivalência dessas contagens será expressa na
seguinte tabela:
Tubo Nº 0.5
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Nº aprox.
Bact(x10
8
)
1.5
3 6 9 12
15 18
21
24 27 30
Assim o tubo N° 0,5 corresponde a 150 milhões de bactérias por ml
de meio e o tubo N° 10 cor- responde a 3 bilhões de bactérias por
ml de meio.
PROCEDIMENTO:
Comparar a olho nu os tubos do NEFELOBAC com o tubo de
cultura bacteriana. Antes, agitar vigorosamente os tubos do
NEFELOBAC, pois em repouso o sulfato de bário tende a precipitar.
Também homogeneizar o tubo com a cultura bacteriana, para ter
uma suspensão (turvação) uni- forme. Recomendamos fazer a
leitura comparativa dos tubos, colocando-os contra um texto
impresso, de forma que a maior ou menor claridade das letras vistas
através dos tubos indique maior ou menor turvação.
Fator de
bioacumulação
(FBA)
Relação entre a concentração de uma substância nos tecidos
versus a sua concentração na água, em condições nas quais os
organismos na cadeia alimentar se encontram expostos.
Filamentos axiais
(endoflagelos)
Presentes exclusivamente nas espiroquetas são os responsáveis
pela promoção dos seus típicos movimentos em espiral.
Fímbrias e/ou Pili São apêndices superficiais rígidos. As fímbrias desempenham papel
de aderência bacteriana, e as fímbrias sexuais são responsáveis
pela ligação das células doadoras e receptoras na conjugação
bacteriana. São receptores específicos de certas partículas virais.
Flagelos
São apêndices responsáveis pela
motilidade de bactérias. De
acordo com o seu número e posição, são classificados em
monotríquias, lofotríquias, anfitríquias ou peritríquias.
148
Fungicida É um produto letal para todas as formas de fungos.
Germicida É um produto de ação letal sobre os microrganismos, especialmente
os patogênicos (germes).
Glicocálice Polímero viscoso e gelatinoso produzido por algumas bactérias.
Situa-se externamente à parede celular.
Gram negativas
As bactérias Gram negativas não são coradas pelo corante cristal
violeta, mas são coradas com o corante safranina e aparecem
coradas de vermelho.
Gram positivas
B
actérias cujas paredes celulares
são tipicamente compostas por
cerca de 20 camadas de peptidoglicanos (polímeros de
polissacarideos ligados a proteínas), que retêm o corante cristal
violeta e aparecem coradas em violeta-escuro.
Grânulos ou
Corpúsculos de
Inclusão:
Partículas revestidas ou não de membrana lipídica, contêm reservas
nutricionais (glicogênio, lipídios, fosfato, ferro, dependendo do
organismo).
Homeostase
Propriedade auto
-
reguladora de um sistema ou organismo que
permite manter o estado de equilíbrio de suas variáveis essenciais
ou de seu meio ambiente.
Hulha É um carvão mineral. O carvão mineral é formado por troncos,
raízes, galhos e folhas de árvores gigantes que cresceram há 250
milhões de anos em pântanos rasos. Essas partes vegetais, após
morrerem, depositaram-se no fundo lodoso e ficaram encobertas. O
tempo e a pressão da terra que foi se acumulando sobre o material
transformaram-no em uma massa negra homogênea – as jazidas de
carvão-, um enriquecimento no teor de carbono.
Índice Kováts
É um índice de retenção que descreve o comportamento de
retenção do composto comparativamente ao de uma mistura de
alcanos de diferentes números de átomos de carbono. Este índice
de retenção fornece informação sobre a seqüência de eluição do
composto e varia em função da fase estacionária e da temperatura,
sendo independente das condições experimentais (JAZANTTI,
2003).
Longifoleno
Quím. Sesquiterpeno tricíclico, com estrutura em ponte e uma
ligação dupla, que ocorre nas resinas de certos pinheiros.
CAS 475-20-7; C15H24; decahidro-4,8,8-trimetil-9-metileno.
Membrana Interna,
Plasmática ou
Citoplasmática
Estrutura dinâmica, flexível, formada por uma bicamada de
fosfolipídios e proteínas. Está envolvida em vários processos
celulares, como: na biossíntese da parede celular, no transporte de
nutrientes, na respiração e na divisão celular. Esta membrana é a
barreira mais importante existente entre o microrganismo e o meio
ambiente.
Micobactéria 1.Gênero de bactérias da família
Mycobacteriaceae
(v.
micobacteriáceas), que se apresentam como bastões gram-
149
positivos retos, ou ligeiramente encurvados, aeróbicos,
acidorresistentes, sendo a maioria delas de crescimento lento.
2.Qualquer espécie desse gênero, como, p. ex., a Mycobacterium
tuberculosis, o agente causador da tuberculose, e a M. leprae, o
agente causador da lepra.
3.Qualquer espécime desse gênero.
Motilidade
1.Faculdade de mover(
-
se).
2.Força motriz.
3.Fisiol. Capacidade de mover-se espontaneamente.
Notas olfativas As notas são percepções olfativas dos perfumes. No processo de
evaporação, seja na pele, na fita olfativa ou no próprio frasco, a
fragrância sofre progressivamente uma série de mudanças sutis e
harmoniosas. Para descrever esses momentos, é usados em
perfumaria o termo Notas Olfativas, e estas classificam-se em três
tipos:
- Notas de saída ou de cabeça: são voláteis e são a primeira
impressão da fragrância (duram de 0 a 10 min). São exemplo
destas, as notas características da bergamota, laranja, tangerina,
lavanda, estragão, louro e manjericão.
- Notas de corpo: são liberadas em seguida (duram até 4 horas) e
denotam a personalidade de quem usa, são produzidas por
elementos denominados de modificadores, que é onde se
encontram estas essências. Exemplos: essência de rosa, gerânio e
neroli.
- Notas de fundo: dão peso e nos indicam o tempo de duração na
pele (podem durar acima de 4 horas). Como exemplo, temos
essência de jasmim, sândalo, patchuli, vetiver, musgo de carvalho,
civette, almíscar, âmbar e baunilha. São as últimas percepções
olfativas de um perfume.
Nucleóide ou Região
Nuclear:
Área de concentração do DNA cromossômico (membrana nuclear
ausente). DNA geralmente circular, dupla-fita, associado a proteínas
básicas.
Olefina
Hidrocarbonetos insaturados, possuem uma ligação dupla na cadeia
(-C=C- ).
Organoléptico
Fisiol. Diz
-
se de propriedade demonstrada
por um corpo, ou por
uma substância, e que impressiona um ou mais sentidos
Preservativo
Bacter. Substância(s) que se adiciona(m) a um produto e que
visa(m) a nele destruir ou impedir a proliferação de microrganismos.
Produto de uso
institucional
Produto destinado à venda e utilização sob responsabilidade de
pessoa jurídica, não sendo necessária a aplicação por
pessoa/entidade especializada.
Produto de uso
profissional
Produto que por seu risco ou uso específico deve ser
aplicado/manipulado exclusivamente por pessoa especializada.
QSAR
Sigla do inglês
Quantitative Structure
-
Activity Relationship
(relação
quantitativa entre estrutura química e atividade) correlacionam,
entre séries congêneres de compostos, afinidades de ligantes a
150
seus sítios de ligação, seja proteína ou receptor de membrana,
constantes de velocidade e outras atividades biológicas; com certas
características estruturais (análise de Free Wilson) ou com
propriedades moleculares, de grupo ou atômicas, tais como
lipofilicidade, polarizabilidade, propriedades eletrônicas e estéricas
(análise de Hansch).
Ribossomos
Muito parecidos com os ribossomos dos eucariotos. As duas
subunidades compostas por proteínas e RNA são menores.
Sanificação Ato de sanificar.
Sanificar Tornar são ou salubre; desinfetar, sanear.
Sanitizante É um agente/produto que reduz o número de bactérias a níveis
seguros de acordo com as normas de saúde.
Sanitização Hig. Conjunto de procedimentos usados na indústria de produtos
alimentares e que visam à manutenção das condições de higiene
indispensáveis à obtenção de materiais de primeira qualidade.
Tween 80 Nome comercial para Oleato de Sorbitan Etoxilado 20 EO.
Vacúolos Gasosos Membranas rígidas, impermeável a água, são compostas de
unidades repetidas de proteína, e incluem gases em procariotos que
flutuam em lagos ou mares.
151
APÊNDICE
APÊNDICE A
Tabelas comparativas entre análise CG-EM e CG-DIC
Tabela 34 – Comparativo da composição de quatro óleos de pinho analisados por CG-DIC e CG-EM
Y50 Y75 D80 D65
Componente* t
r
DIC t
r
MS % DIC % MS % DIC % MS % DIC % MS % DIC % MS
α-pineno 4,16 4,43 19,86 16,00 4,51 4,10 2,67 2,50 7,68 6,80
canfeno 4,48 4,65 1,62 1,60 0,31 1,70 0,44 0,40 1,23 1,20
β- pineno 5,21 5,08 5,99 5,20 1,56 1,40 nd 0,10 0,34 0,30
β-mirceno 5,64 5,19 0,44 0,50 nd 0,10 nd 0,10 nd 0,20
α- felandreno 6,02 5,49 0,75 0,90 nd 0,30 0,42 0,50 0,90 1,00
1,4 cineol 6,42 5,67 2,15 0,00 0,63 0,30 1,25 0,60 2,43 2,60
careno 2 6,69 5,7 0,68 1,50 0,44 0,40 0,81 0,70 1,24 nd
limoneno 6,85 5,94 4,87 5,50 3,23 3,30 3,61 3,90 6,48 7,10
eucaliptol 6,91 5,99 0,80 nd 0,32 nd 0,59 nd 1,00 nd
α-terpineno 7,96 6,39 0,62 0,70 0,65 0,70 0,88 0,90 1,26 1,40
terpinoleno 9,19 6,97 6,47 7,10 8,44 8,80 6,73 6,70 8,53 8,80
fenchol 10,21 7,38 1,09 1,10 1,77 1,70 1,63 1,60 1,50 1,50
1-terpineol 11,26 7,71 1,49 1,50 1,25 1,20 2,78 2,80 2,46 2,50
β-terpineol 11,74 7,89 2,24 2,20 3,11 2,90 3,47 3,40 3,00 2,90
boneol 12,70 8,27 1,86 2,10 2,72 2,90 2,60 2,90 2,17 2,40
4 terpineol 13,33 8,43 1,13 1,20 1,52 1,60 2,01 2,00 1,72 1,80
α-terpineol 14,27 8,8 37,67 39,00 58,51 56,40 60,88 61,50 50,38 51,30
γ-terpineol 14,53 8,86 5,70 4,60 6,52 3,80 8,82 6,70 7,33 5,20
p-ment-1 em-8 ol
17,89 9,62 2,42 2,80 3,33 3,70 nd 0,20 nd nd
n.i 19,56 nd nd nd nd nd 0,42 nd 0,34 nd
Terpin 20,25 10,37 0,60 0,60 nd 0,20 nd 0,20 nd 0,20
Acetato de
terpinila
21,50 10,97 nd 1,20 nd 0,90 nd nd nd nd
Etoxi-citronelal 23,03 11,17 0,90 0,80 0,69 0,60 nd nd nd nd
n.i 24,20 - 0,66 nd 0,48 nd nd nd nd nd
outros nd 3,50 nd 2,70 nd 2,30 nd 2,80
* sequência da ordem de eluição; t
r
DIC= tempo de retenção na CG-DIC; %DIC = percentagem relativa pela
CGDIC; t
r
MS = tempo de na CG-MS; %MS= percentagem relativa pela CG-MS; nd= não determinado; n.i.= não
identificado;Y50 = óleo de pinho 50%, fabricante Y; Y75= óleo de pinho 75%, fabricante Y; D80= óleo de pinho
80%, fabricante D; D65= óleo de pinho 65%, fabricante D
152
Tabela 35 - Comparativo da composição de cinco óleos de pinho analisados por CG-DIC e CG-EM
S50 Y65 D50 S75 S65
Componente*
t
r
DIC t
r
MS % DIC % MS % DIC % MS % DIC % MS % DIC % MS % DIC % MS
α-pineno 4,16 4,43 10,13
8,40 6,41 5,30 9,57 8,20 2,35 2,20 2,44 2,30
canfeno 4,48 4,65 2,12 1,90 0,52 0,50 2,09 1,90 0,63 0,60 0,55 0,50
β- pineno 5,21 5,08 1,32 1,20 2,32 2,00 0,38 0,40 nd nd nd nd
β-mirceno 5,64 5,19 0,34 0,40 nd 0,20 0,43 0,50 nd nd nd nd
α- felandreno 6,02 5,49 0,84 0,90 0,51 nd 1,54 1,80 nd 0,10 0,70 0,70
1,4 cineol 6,42 5,67 4,45 2,50 1,98 0,60 4,65 nd 1,24 1,30 2,93 1,50
careno 2 6,69 5,7 1,19 2,00 0,55 0,90 2,33 5,00 0,38 nd 0,58 1,40
limoneno 6,85 5,94 8,38 7,70 4,70 1,10 13,36
12,90
2,21 2,00 5,34 4,60
eucaliptol 6,91 5,99 2,23 2,40 0,89 5,10 nd nd 0,99 1,00 1,64 1,80
α-terpineno 7,96 6,39 1,37 1,40 0,93 1,00 1,92 2,10 0,60 0,70 0,96 1,00
terpinoleno 9,19 6,97 14,89
15,00
9,58 9,50 10,94
11,70
10,60
11,20
12,25
12,10
fenchol 10,21 7,38 2,04 1,90 1,50 1,50 1,46 1,40 2,77 2,70 2,57 2,50
1-terpineol 11,26 7,71 4,04 3,90 3,54 3,40 3,09 3,00 5,80 5,70 5,74 5,50
β-terpineol 11,74 7,89 2,99 2,70 2,88 2,80 2,83 2,60 3,96 3,70 3,75 3,60
n.i 12,26 nd 0,61 nd 0,32 nd nd nd 1,00 nd 0,72 nd
boneol 12,70 8,27 2,00 1,50 2,46 2,70 1,64 1,80 3,02 3,20 2,80 3,00
4 terpineol 13,33 8,43 1,60 1,60 1,59 1,60 1,68 1,60 2,30 2,30 2,14 2,10
α-terpineol 14,27 8,8 31,75
32,90
44,87
46,10
36,41
36,70
51,07
51,10
43,86
44,90
γ-terpineol 14,53 8,86 6,14 5,50 8,55 5,80 5,69 4,70 8,75 6,30 8,48 6,10
n.i 16,68 nd nd nd nd nd nd nd 0,34 nd nd nd
p-ment-1 em-8 ol 17,89 9,62 nd nd 3,95 4,40 nd nd nd nd nd nd
n.i 18,20 - nd nd 0,29 nd nd nd nd nd nd nd
n.i 19,56 - nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd
Terpin 20,25 10,37 0,62 0,80 0,34 0,40 nd 0,10 0,49 0,50 0,98 1,10
Acetato de terpinila
21,50 10,97 nd 1,10 nd 1,10 nd nd nd 1,80 nd 1,40
Etoxi-citronelal 23,03 11,17 0,96 nd 0,84 0,60 nd nd nd nd nd nd
n.i 23,43 - nd nd nd nd nd nd 1,52 nd 1,22 nd
n.i 24,20 - nd nd 0,50 nd nd nd nd nd nd nd
n.i 26,04 - nd nd nd nd nd nd nd nd 0,35 nd
n.i 33,15 - nd nd nd nd nd nd nd nd nd nd
outros nd 2,90 nd 3,40 nd 3,60 nd 3,60 nd 3,90
* sequência da ordem de eluição; t
r
DIC= tempo de retenção na CG-DIC; %DIC = percentagem relativa pela
CGDIC; t
r
MS = tempo de na CG-MS; %MS= percentagem relativa pela CG-MS; nd= não determinado; n.i.= não
identificado; S50 = óleo de pinho 50%, fabricante S; Y65= óleo de pinho 65%, fabricante Y; D50= óleo de pinho
50%, fabricante D; S75= óleo de pinho 75%, fabricante S; S65= óleo de pinho 65%, fabricante S
153
APÊNDICE B
Espectros de absorção na região do infravermelho para as frações e resíduos
obtidos no processo de destilação de uma amostra óleo de pinho bruto.
Figura 28. Espectro de absorção na região do infravermelho para Fração F1
Número de onda (cm
-
1
)
Absorvância
154
Figura 29. Espectro de absorção na região do infravermelho para Fração F6
Figura 30. Espectro de absorção na região do infravermelho para Fração F11
Número de onda (cm
-
1
)
Absorvância
Número de onda (cm
-
1
)
Absorvância
155
Figura 31. Espectro de absorção na região do infravermelho para Fração F13
Figura 32. Espectro de absorção na região do infravermelho para Fração F19
Número de onda (cm
-
1
)
Absorvância
Número de o
nda (cm
-
1
)
Absorvância
156
Figura 33. Espectro de absorção na região do infravermelho para Fração F20
Figura 34. Espectro de absorção na região do infravermelho para Fração F22
Número de onda (cm
-
1
)
Absorvância
Número de onda (cm
-
1
)
Absorvância
157
Figura 35. Espectro de absorção na região do infravermelho para Fração F23
Figura
36
.
Espectro de absorção na região do infravermelho para Fração F24
Número de onda (cm
-
1
)
Absorvância
Número de onda (cm
-
1
)
Absorvância
158
Figura
37
.
Espectro de absorção na região do infravermelho para Fração F27
Figura
38
.
Espectro de absorção na região do infravermelho para
Fração F29
Número de onda (cm
-
1
)
Absorvância
Número de onda (cm
-
1
)
Absorvância
159
Figura
39
.
Espectro de absorção na região do infravermelho para Fração F31
Figura
40
.
Espectro de absorção na região do infravermelho para Fração F34
Número de onda (cm
-
1
)
Absorvância
Número de onda (cm
-
1
)
Absorvância
160
Figura
41
.
Espectro de absorção na região do infravermelho para Fração F39
Figura
42
.
Espectro de absorção na região do infravermelho para Fração F43
Número de onda (cm
-
1
)
Absorvância
Número de onda (cm
-
1
)
Absorvância
161
Figura
43
.
Espectro de abs
orção na região do infravermelho para Fração F47
Figura
44
.
Espectro de absorção na região do infravermelho para Fração F50
Número de onda (cm
-
1
)
Absorvância
Número de onda (cm
-
1
)
Absorvância
162
Figura
45
.
Espectro de absorção na região do infravermelho pa
ra Fração F56
Figura
46
.
Espectro de absorção na região do infravermelho para Fração F61
Número de onda (cm
-
1
)
Absorvância
Número de onda (cm
-
1
)
Absorvância
163
Figura 47. Espectro de absorção na região do infravermelho para o resíduo de
destilação de uma amostra retirada após a Fração F19
Figura
48
.
Espectro de absorção na região do infravermelho para o resíduo da
destilação amostra retirada após a Fração F28
Número de onda (cm
-
1
)
Absorvância
Nú
mero de onda (cm
-
1
)
Absorvância
164
Figura
49
.
Espectro de absorção na região do infravermelho para uma amostra de
resíduo final de destilação amostra retirada após a Fração F61
Número de onda (cm
-
1
)
Absorvância
165
APÊNDICE C
Fotografias das placas do teste de halo de inibição realizado para as frações e
algumas amostras de óleo de pinho e terpinoleno. Leitura realizada após 24h.
a)
b)
Figura
50
.
Halo de inibição para as frações F1, F234,
α
-
terpineol e óleo do fabricante B
(leitura após 24h). a) Salmonella choleraesuis e b) Staphylococcus aureus
a)
b)
Figura
51
.
Halo de inibição para as frações F5, F567, F10 e F11
(leitura após 24h). a)
Salmonella choleraesuis e b) Staphylococcus aureus
166
a)
b)
Figura
52
.
Halo de inibição para as frações F16, F17, F19 e o terpinoleno (leitura após
24h). a) Salmonella choleraesuis e b) Staphylococcus aureus
a)
b)
Figura
53
.
Halo de inibição para as frações F20, F21, F22 e F23 (leitura após 24h). a)
Salmonella choleraesuis e b) Staphylococcus aureus
167
a)
b)
Figura
54
.
Halo de inibição para as frações F28, F29, resíduo F19 e óleo bruto (leitura após
24h). a) Salmonella choleraesuis e b) Staphylococcus aureus
a)
b)
Figura
55
.
Halo de inibição para as frações F31, F32, F33 e resíduo F28 (leitura após 24h).
a) Salmonella choleraesuis e b) Staphylococcus aureus
168
a)
b)
Figura
56
.
Halo de inibição para as frações F39, F40, F42 e F44 (leitura após 24h). a)
Salmonella choleraesuis e b) Staphylococcus aureus
a)
b)
Figura 57. Halo de inibição para as frações F46, F48, F50 e resíduo F44 (leitura após 24h).
a) Salmonella choleraesuis e b) Staphylococcus aureus
169
a)
b)
Figura 58. Halo de inibição para as frações F52, F54, F56 e F58 (leitura após 24h). a)
Salmonella choleraesuis e b) Staphylococcus aureus
a)
b)
Figura 59. Halo de inibição para as frações F41, F45, F60 e resíduo Final (leitura após
24h). a) Salmonella choleraesuis e b) Staphylococcus aureus
170
a)
b)
Figura 60. Halo de inibição para as frações F45, F51, F57 e F61 (leitura após 24h). a)
Salmonella choleraesuis e b) Staphylococcus aureus
a)
b)
Figura 61. Halo de inibição para as frações F53, F55, F59 e terpinoleno (leitura após 24h).
a) Salmonella choleraesuis e b) Staphylococcus aureus
171
a)
b)
Figura
62
.
Halo de inibição para as frações F39, F40, F42 e F44 (leitura após 48h). a)
Salmonella choleraesuis e b) Staphylococcus aureus
a)
b)
Figura
63
.
Halo de inibição para as frações F45, F57, F58 e F61 (leitura após 48h). a)
Salmonella choleraesuis e b) Staphylococcus aureus
172
Frações 1 2 5 13 14 19 20 21 22 24 26 31 32 35 36 37 40 41 42 43 45 46 48 49 50 57 58 60
S. Aureus - - + + + - + + + + + +- +- +- +- +- - +- +- + +
+ + + + + + +
S. choleraesuis - - +- +- +- - + +- - + + - - - - - - + - + +
+ + + + + + +
Legenda
-
+-
+
Presença de halo difuso
Presença de halo
Ordem de eluição
Ausência
Figura 64. Resumo ilustrando dados cromatográficos e formação de halo de inibição
173
APÊNDICE D
Detalhes do teste de suspensão
a)
b)
Figura 65. Fotos do teste de suspensão (a) tubos de repique das cepas, (b) acerto da
escala Mc Farland
Figura 66. Tubos com a amostra-teste, 2 tubos com CN + Tween 80 e 2 tubos com solução
tampão
174
a)
b)
c)
d)
e)
f)
Figura
67
.
Tes
te de suspensão (a) Transferência de alíquota, (b) agitação do tubo, (c)
plaqueamento, (d) adição de Agar, (e) incubação, (f) placa com crescimento
ANEXO
SÚMULA CURRICULAR
DADOS PESSOAIS
Nome: FLORIPES FERREIRA DE OLIVEIRA
Local e data de nascimento: São Paulo, 31 de janeiro de 1970
EDUCAÇÃO
E.S.PS.G. Antonio Raposo Tavares, Osasco, 1985
Faculdade de Tecnologia de São Paulo, São Paulo, 1990
Tecnologia em Construção Civil – Modalidade: Edifícios
Faculdade de Tecnologia de São Paulo, São Paulo, 1991
Licenciada na Parte de Formação Especial do Currículo do Ensino de 2
o
Grau
Universidade de São Paulo, São Paulo, 1995
Bacharel em Química com Especialização Industrial
Universidade de São Paulo, São Paulo, 1998
Curso de Extensão em Administração Industrial
Universidade de São Paulo, São Paulo, 2003
Mestrado em Química (Química Analítica)
Instituto Racine, São Paulo, 2008
Cursando Pós- Graduação em Gestão Tecnologia Cosmética-Engenharia Cosmética
FORMAÇÃO COMPLEMENTAR
Nanomateriais e Nanotecnologia USP 32 Horas (2008)
Desenv. de Liderança JBS 12 Horas (2006)
Desenv. de Saneantes Freedom 16 horas (2006)
Coaching and Feedback Colgate-Palmolive 14 Horas (2004)
Audit Skill Colgate-Palmolive 20 Horas (2003)
Valuing People Colgate-Palmolive 16 Horas (2003)
On-Shelf Quality C olgate-Palmolive 24 Horas (2001)
TG/DSC Vários treinamentos 40 Horas (1998-2003)
Management Develop. Colgate-Palmolive 54 Horas (1999)
Segurança em Lab. Vários treinamentos 26 Horas (1997-2004)
Detergentes ABQ 15 Horas (1995)
CG-HPLC Vários treinamentos 51 Horas (1991-2000)
OCUPAÇÃO
Consultora na área de pesquisa e desenvolvimento e controle de qualidade para
produtos saneantes e cosméticos. 2007 – atual.
PUBLICAÇÕES
OLIVEIRA, F.O.; PAOLA, M.V.R.V., MATOS, J.R. Estudos Exploratórios do
Comportamento Térmico de Diferentes amostras Comerciais de Batons. In:
PAN AMERICAN,1, BRAZILIAN CONGRESS ON THERMAL ANALYSIS AND
CALORIMETRY,2, Poços de Caldas, 20002. P.168.
OLIVEIRA, F.O.; PAOLA, M.V.R.V., MATOS, J.R. Análise térmica de diferentes
amostras comerciais de batons. In: CONGRESO LATINO AMERICANO E
IBERICO DE QUÍMICOS COSMÉTICOS, 15, Buenos Aires, 2001
RODRIGUES, P.R.; OLIVEIRA, F.O., AGOSTINHO, S.M.L., Efeito do dodecil sulfato
de sódio (SDS) no comportamento eletroquímico do aço inoxidável 304 em
meio de H2SO4 2M. In: REUNIÃO ANUAL DA SOCIEDADE BRASILEIRA DE
QUÍMICA, 17, SIMPÓSIO NACIONAL DE QUÍMICA INORGÂNICA, 7,
Caxambu, 1994. EQ-12.
MICHELI, L.D.; OLIVEIRA, F.O., AGOSTINHO, S.M.L., Estudo de inibidores
orgânicos na corrosão por pites no aço inoxidável 304 em meio de cloreto de
sódio. In: REUNIÃO ANUAL DA SOCIEDADE BRASILEIRA DE QUÍMICA, 17,
SIMPÓSIO NACIONAL DE QUÍMICA INORGÂNICA, 7, Caxambu,
1994.EQ.14.
OLIVEIRA, F.O., MACIEL, J.M.; AGOSTINHO, S.M.L., Obtenção de cobre eletrolítico
e sulfato de zinco a partir de sucata de latão. In: REUNIÃO ANUAL DA
SOCIEDADE BRASILEIRA DE QUÍMICA, 17, SIMPÓSIO NACIONAL DE
QUÍMICA INORGÂNICA, 7, Caxambu, 1994. EQ-03.
OLIVEIRA, F.O., SALINAS, R.K.; FELICISSIMO, A.M.P., Síntese, purificação e
caracterização de materiais estratégicos com aplicação em catálise. In:
REUNIÃO ANUAL DA SOCIEDADE BRASILEIRA DE QUÍMICA, 17,
SIMPÓSIO NACIONAL DE QUÍMICA INORGÂNICA, 7, Caxambu, 1994. QI-92
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