ads:
0
TATIANA TAKIISHI
CARACTERIZAÇÃO DA RESPOSTA INFLAMATÓRIA NO
ENXERTO SINGÊNICO E ALOGÊNICO EM MODELO
EXPERIMENTAL DE TRANSPLANTE DE PELE
Dissertação de Mestrado apresentada ao
Instituto de Ciências Biomédicas da
Universidade de São Paulo para obtenção do
Título de Mestre em Ciências (Imunologia).
São Paulo
2008
ads:
Livros Grátis
http://www.livrosgratis.com.br
Milhares de livros grátis para download.
1
TATIANA TAKIISHI
CARACTERIZAÇÃO DA RESPOSTA INFLAMATÓRIA NO
ENXERTO SINGÊNICO E ALOGÊNICO EM MODELO
EXPERIMENTAL DE TRANSPLANTE DE PELE
Dissertação de Mestrado apresentada ao
Instituto de Ciências Biomédicas da
Universidade de São Paulo, para obtenção do
Título de Mestre em Ciências.
Área de concentração:
Imunologia
Orientador:
Dra. Luciana Vieira de Moraes
São Paulo
2008
ads:
2
3
4
5
DEDICATÓRIA
Ao meu pai Antonio que sempre foi o meu
modelo de perseverança e luta e à minha
mãe Lucia, exemplo de dedicação e
paciência.
Muito Obrigada
6
AGRADECIMENTOS
À Dra. Luciana Vieira de Moraes pela sua orientação e por ter dedicado seu
tempo a me ensinar assim que entrei no laboratório. Obrigada por ter me apresentado
a esse mundo tão fascinante e desafiador que é a imunologia dos transplantes.
Ao Prof. Dr. Luiz Vicente Rizzo, que foi meu orientador durante parte do
mestrado, por ter permitido a minha entrada em seu laboratório. Agradeço pelas
críticas honestas e sem rodeios que possibilitaram o amadurecimento deste trabalho.
Ao Prof. Dr. Niels Olsen Saraiva Câmara por suas palavras de motivação e por
sempre manter suas portas abertas para que esclareçam dúvidas ou simplesmente se
tenha uma conversa amiga.
Ao Dr. Orlando que nos contagia com seu entusiasmo científico e com quem é
possível discutir sobre os mais diversos assuntos sempre de maneira muito
interessante.
Aos professores Niels, Orlando, Lourdes e Sônia que fizeram parte de minha
banca de qualificação e cujas críticas construtivas foram muito importantes para o
aprimoramento deste trabalho.
Aos membros da minha banca de defesa por sua participação na etapa final
deste trabalho e que sem dúvida contribuirão para que a conclusão desta tese seja a
melhor possível.
Ao Rafael que sempre foi muito solicito e carinhoso, me ensinando a técnica de
transplantes quando entrei no laboratório.
Aos meus colegas de laboratório Julieta, Jean, Natália, Thaís e Alessandra que
nestes anos se tornaram mais do que colegas, mas companheiros e amigos.
7
À minha família que é a base de todas as minhas forças e cuja estrutura permite
com que eu me apóie nas horas difíceis. Obrigada por me estimular a sempre lutar
pelos meus sonhos.
Aos meus grandes amigos Carla, Danilo, Gabriela e Renato que sempre
estiveram ao meu lado para me apoiar e motivar nas horas de insegurança. Sempre
me lembrarei dos momentos especiais que dividimos durante estes anos.
Ao Marcel que foi verdadeiramente um companheiro durante esta etapa e que é
uma pessoa muito especial para mim.
Às amizades formadas no departamento e durante o cursão que tornaram o
trabalho bem mais animado e estimulante. Vanessa, Juciane, Rebecca, Patrícia,
Layra, Débora, Andrea, Daniel, Rafinha, Julieta, Natália, Carol, Josias, Cíntia, Paulo,
Cristian,Janine, Welbert e Jean, desejo muito sucesso a todos.
Aos professores da pós-graduação que muitas vezes não facilitaram essa
jornada, mas que sem dúvida contribuíram para o meu amadurecimento acadêmico.
À Cristina, técnica do laboratório, um exemplo de competência e sem a qual a
vida no laboratório seria bem mais difícil.
À Áurea, também técnica do laboratório, cujas pequenas tarefas do dia-a-dia
facilitam muito o trabalho de todos.
A todos os funcionários do departamento sem os quais nada disso seria
possível.
À CAPES e ao CNPq que financiaram este projeto.
8
“What is a scientist after all? It is a curious man
looking through a keyhole, the keyhole of nature,
trying to know what´s going on.”
Jacques Yves Cousteau
9
RESUMO
Takiishi T. Caracterização da resposta inflamatória no enxerto singênico e alogênico
em modelo experimental de transplante de pele [Dissertação]. São Paulo: Instituto de
Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo; 2008.
A inflamação é um evento intrínseco ao transplante, que induz o recrutamento de
células inflamatórias ao sítio do enxerto, se uma amplificação dessa reposta
inflamatória ocorrer, mecanismos efetores da resposta imune podem levar à
destruição do tecido. No presente trabalho realizou-se a caracterização fenotípica e
funcional das células inflamatórias presentes no enxerto, após o transplante alogênico
ou singênico de pele em camundongos. Os resultados obtidos mostraram diferenças
significativas na produção de citocinas pró e anti-inflamatórias entre o transplante
alogênico e singênico já nas primeiras 24 horas após o transplante. Observamos que
houve produção aumentada de IL-10 no enxerto singênico em relação ao enxerto
alogênicos neste ponto, por isso, avaliamos a importância da IL-10 no aceite de
enxertos. Para tal, camundongos IL-10 competentes (C57Bl6/IL-10
+/+
) ou IL-10
deficientes (C57Bl6/IL-10
-/-
) foram transplantados. Na ausência de IL-10, a rejeição de
enxertos alogênicos foi acelerada e surpreendentemente 61% dos enxertos
singênicos não foi aceita. Além disso, a fonte de produção de IL-10 parecer influenciar
o aceite dos transplantes singênicos, uma vez que os enxertos provenientes de
doadores C57Bl6/IL-10
+/+
apresentaram aceite melhor do que enxertos provenientes
de doadores C57Bl6/IL-10
-/-
. Como esses dados apontam a existência de uma
regulação da resposta inflamatória no enxerto singênico, foram realizados
experimentos em que a pele singênica foi transplantada, simultaneamente ou com um
intervalo de 24 horas, junto à pele alogênica em um mesmo receptor. De fato, foi
observado que quando o transplante simultâneo dos enxertos era realizado, houve
um aumento de sobrevida do enxerto alogênico em comparação com transplantes
alogênicos transplantados sozinhos (16 dias x 8,5 dias) enquanto que com um
intervalo de 24 horas entre os transplantes não houve aumento significativo da
sobrevida do enxerto alogênico. Esses dados sugerem que, dentro de um intervalo de
24 horas pós-transplante, mecanismos reguladores da resposta imune ao enxerto
singênico poderiam modular a resposta inflamatória e/ou aos aloantigenos e retardar
o processo de rejeição.
Palavras-chave: Transplante. Rejeição. Células Inflamatórias. IL-10.
10
ABSTRACT
Takiishi T. Characterization of the inflammatory response in the singeneic and
allogeneic graft in an experimental model of skin transplantation. [Master thesis]. São
Paulo: Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo; 2008.
Inflammation is an intrinsic event in transplantation which is ignited by the damage
caused during surgery. When an amplification of the inflammatory response occurs,
effector mechanisms of the immune response this could lead to graft destruction due
to. Studying the inflammatory context developed after transplant is of the upmost
importance for a better understanding of its participation in the rejection of grafts. In
the present work, functional and phenotypical characterization of inflammatory cells
present in the graft was performed, after alogeneic or syngeneic skin transplantation in
mice. The data shows that as early as 24 hours after transplant, significant differences
in the production of pro and anti-inflammatory cytokines can be observed between the
allogeneic and syngeneic grafts, being that a higher production of IL-10 was observed
in the syngeneic graft when compared to the allogeneic graft at this point of 24. In
order to evaluate the importance of IL-10 in the acceptance of grafts, IL-10 competent
mice or IL-10 deficient mice were grafted. In the absence of IL-10, rejection of
allografts was faster and surprisingly 61% of syngeneic grafts were not accepted.
Furthermore, the production of IL-10 by cells that are present in the graft seems to be
more important for acceptance, than the production of IL-10 by the receptor, once
grafts provenient from C57Bl6/IL-10
+/+
donors presented better acceptance than grafts
provenient from C57Bl6/IL-10
-/-
mice. This data suggests that there is a regulatory
response of inflammation within the syngeneic graft, therefore, to investigate whether it
would be possible to modulate the immune response against the allogeneic graft, the
singeneic graft was transplanted, simultaneously or with a 24 hour interval, with the
allogeneic graft into the same receptor. When transplanted simultaneously to the
syngeneic graft, the allograft showed prolonged survival in comparison to allogenic
grafts transplanted alone (16 x 8,5 days), this was not observed when there was a 24
hour interval between transplants. This data indicates that, within 24 hours post-
transplantation, regulatory mechanisms of the immune response against the
syngeneic grafts could have a modulatory effect over the inflammatory respose and/or
alloantigens, delaying the rejection process.
Key words: Transplantation. Rejection. Inflammatory cells. IL-10.
11
LISTAS DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1. Número de pacientes à espera de transplantes nos Estados
Unidos.........................................................................................................................15
Figura 2. Sobrevida do enxerto renal em pacientes...............................................16
Figura 3. Modelo experimental utilizado..................................................................32
Figura 4. Modelo experimental de transplantes simultâneos................................33
Figura 5. Fenotipagem de células emigrantes do enxerto.....................................43
Figura 6. Representação de células inflamatórias após transplante singênico ou
alogênico.....................................................................................................................44
Figura 7. Produção de citocinas e nitrito no sobrenadante de culturas de
enxertos.......................................................................................................................48
Figura 8. Sobrevida de transplantes na ausência de IL-10....................................53
Figura 9. Aspecto macroscópico de cortes de enxertos na ausência de IL-10....54
Figura 10. Tratamento de enxertos com IL-10 recombinante................................55
Figura 11. Controle de camundongos C57Bl6/IL-10
-/-
.............................................56
Figura 12. Fenotipagem de células infiltrantes do enxerto após transplante
alogênico em camundongos C57Bl6/IL-10
-/-
............................................................59
Figura 13. Fenotipagem de células infiltrantes do enxerto após transplante
singênico em camundongos C57Bl6/IL-10
-/-
............................................................62
Figura 14. Fenotipagem de células infiltrantes do enxerto após transplante
singênico em combinaçãoes de doador ou receptor C57Bl6/IL-10
-/-
.....................65
Figura 15. Sobrevida do enxerto alogênico e singênico quando transplantados
em um mesmo receptor.............................................................................................68
Figura 16. Aspecto macroscópico do enxerto alogênico e singênico quando
transplantados em um mesmo receptor..................................................................69
12
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO..........................................................................................................15
2 OBJETIVOS..............................................................................................................29
3 MATERIAL E MÉTODOS.........................................................................................31
3.1 Animais de experimentação................................................................................31
3.2 Abordagem experimental....................................................................................31
3.3 Transplante de Pele..............................................................................................33
3.4 Histologia..............................................................................................................33
3.5 Obtençãos de células emigrantes do enxerto...................................................34
3.6 Tratamento com IL-10 recombinante..................................................................34
3.7 Extração de DNA para genotipagem..................................................................35
3.8 Genotipagem.........................................................................................................35
3.9 Análise de citocinas.............................................................................................36
3.10 Dosagem de nitrito.............................................................................................36
3.11 Caracterização celular.......................................................................................37
3.11.1 Citocentrifugação............................................................................................37
3.11.2 Citometria de Fluxo.........................................................................................37
3.12 Análise Estatística..............................................................................................38
4 RESULTADOS..........................................................................................................40
4.1 Caracterização Fenotípica e funcional das células emigrantes do enxerto
alogênico e singênico................................................................................................40
4.1.1 Caracterização Fenotípica................................................................................40
4.1.2 Caracterização Funcional.................................................................................45
4.2 Avaliação da influência de Il-10 na progressão do transplante singênico e
alogênico.....................................................................................................................49
4.2.1 Sobrevida de enxertos alogênicos e singênicos...........................................49
4.2.2 Sobrevida do enxertos singênico em combinações doador-receptor IL-
10
+/+
IL-10
-/-
ou IL-10
-/-
IL-10
+/+
...............................................................................51
13
4.2.3 Caracterização de células inflamatórias........................................................57
4.2.3.1 Caracterização de células inflamatórias no transplante alogênico..........57
4.2.3.2 Caracterização de células inflamatórias no transplante singênico em
combinações doador-receptor IL-10
-/-
IL-10
-/-
ou IL-10
+/+
IL-10
+/+
..................60
4.2.3.2 Caracterização de células inflamatórias no transplante singênico em
combinações doador-receptor IL-10
-/-
WT ou WT
IL-10
+/+
.............................63
4.3 Avaliação da sobrevida do enxerto alogênico e singênico transplantados em
um mesmo receptor...................................................................................................66
5 DISCUSSÃO.............................................................................................................71
6 CONCLUSÕES.........................................................................................................86
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS............................................................................88
14
1 INTRODUÇÃO
15
1.1 Dados Mundiais e Nacionais de transplantes
Muitas vezes o transplante é a única solução para pacientes cujos órgãos
sólidos estão em estágio final de funcionamento. O número de pacientes
transplantados tem aumentado a cada ano, e esse é um procedimento que tem se
tornado cada vez mais comum para o tratamento de algumas doenças. Apesar do
aumento no número desses procedimentos, ele ainda é insuficiente conforme pode
ser visto na figura 1 e muitos pacientes morrem durante a espera.
Figura 1- Número de pacientes à espera de transplante no Brasil no ano de 2005.
FONTE: Registro Brasileiro de Transplantes, 2003.
Segundo dados da World Health Organization (WHO, 2003), cerca de 70000
transplantes de órgãos sólidos são realizados anualmente, dos quais 50000 são
transplantes de rim. No Brasil, segundo os dados da Associação Médica Brasileira
(AMB, 2003) o número de transplantes de órgãos sólidos realizados em 1997 foi de
2.127 e cresceu para 3.916 em 2001, enquanto que só no primeiro semestre de 2006
esse número foi de 4825 transplantes segundo os dados do Registro Brasileiro de
Transplantes (RBT, 2006). O transplante de tecidos também é uma prática crescente
e em 1999 nos Estados Unidos, cerca de 750.000 pessoas receberam tecido humano,
o dobro de 1990. Estima-se que centenas de milhares de transplantes sejam
16
realizados anualmente, dentre os quais o transplante de medula e pele representam
um número significativo (WHO, 2003).
Apesar de o transplante ter se tornado um procedimento médico relativamente
comum que foi possibilitado graças ao desenvolvimento de drogas e terapias
imunossupressoras, a rejeição crônica continua sendo um problema. Conforme pode
ser visto na figura 2, a maior parte dos transplantades perde a funcionalidade e são
rejeitados com a progressão dos anos, tornando necessária uma nova intervenção
cirúrgica.
Figura 2- Sobrevida do enxerto renal em receptores: Parente distinto (n=365), não-relacionado
(n=361) e doador cadáver (n=3728), 1987-1995).
FONTE: Cia-EPM/UNIFESP.
1.2 História dos transplantes
Devido ao seu grande potencial terapêutico a imunologia dos transplantes vem
sendo estudada há muito tempo. Os estudos na área de transplantes são muito
antigos. Existe o relato de que em 800 a.C. um cirurgião indiano chamado Susrata
realizava transplantes a partir de pedaços de pele na tentativa de reparar narizes que
haviam sido cortados como forma de castigo (Deschamps et al., 2005). Durante
séculos cirurgiões realizaram diversos tipos de tentativas de transplante, sem obter
sucesso (Kulinna-Cosentini e Bankier, 2007). Em 1597 um famoso cirurgião chamado
Gaspare Tagliocozzi disse algo que indicava a razão para esse fracasso: “(...) o
caráter singular do indivíduo nos dissuadiu completamente de tentar esse trabalho
(transplante de tecidos) em outra pessoa (...)”. Esse comentário realizado séculos
17
antes da Primeira Guerra Mundial foi extremamente avançado para a época, pois
somente na década de 20 os geneticistas mendelianos começaram a esclarecer as
bases de da histocompatibilidade genética (Silverstein, 1989; Youssef et al., 2004)
É interessante observar que os primeiros trabalhos que possibilitaram desvendar
os fatores relacionados à rejeição não foram realizados por cientistas da área de
transplantes. A descoberta do complexo MHC, na década de 30, foi possibilitada
graças aos estudos realizados por pesquisadores na área de tumores. Ao inocular
células tumorais em camundongos, esses cientistas verificavam que havia rejeição
dos tumores, dentre esses cientistas figuraram George Snell e Peter Gorer. Na
Inglaterra, Peter Gorer descobriu um anticorpo de hemaglutinina que estava
associado com a rejeição dos tumores, o antígeno responsável por desencadear essa
resposta humoral recebeu o nome de Gorer antigen II. Nos Estados Unidos, George
Snell criou os camundongos congênicos, que são camundongos que diferem entre si
em apenas um lócus; ele descobriu que esse locus estava associado à rejeição dos
tumores e por isso nomeou esse locus “H” (de histocompatibilidade). Posteriormente,
foi identificado que o gene responsável pela produção do antígeno descoberto por
Gorer estava localizado no locus de Snell, e todo o complexo de histocompatibilidade
de genes murinos ficou conhecido como H-2 (Silverstein, 1989).
Em 1943, Peter Medawar e Thomas Gibson publicaram seu primeiro estudo
sobre o problema da rejeição de peles alogênicas, iniciando a era moderna dos
estudos sobre transplante. Quinze anos depois Medawar, Brent e Billingham
publicaram o primeiro trabalho em que foi mostrada a obtenção da tolerância a peles
transplantadas na ausência de imunossupressores, através da inoculação de alo-
antigenos no receptor em seu período de desenvolvimento embrionário.
1.3 Rejeição
Desde então mais de 60 anos se passaram e apesar do desenvolvimento de
drogas e terapias imunossupressoras mais eficientes ainda não se conseguiu atingir
um nível satisfatório de aceite e tolerância aos transplantes. A rejeição crônica,
principalmente, é um problema recorrente dos transplantes. Além disso, existem
efeitos colaterais graves causados pela terapia de imunossupressão a longo prazo
(Kingsley et al., 2007).
18
No caso do transplante de pele, especificamente, por se tratar de um órgão
muito imunogênico, o aceite de peles alogênicas é extremamente difícil e apesar dos
diversos estudos na área, os mecanismos que tornam a pele mais susceptível à
rejeição ainda não são totalmente claros (Horner et al., 2008).
Em 2001 Jones et al realizou um trabalho comparando a susceptibilidade de
enxertos alogênicos de coração, peles e ilhotas pancreáticas à rejeição mediada por
células T. Seu trabalho mostra que 1x10
3
linfócitos T antígeno-específicos eram
capazes de mediar a rejeição de enxertos de pele e ilhotas enquanto para rejeição do
coração eram necessários 6x10
6
linfócitos T. O seu trabalho, no entanto, não foi
capaz de elucidar a razão pela qual esse número tão pequeno de linfócitos T foi
capaz de mediar rejeição aos enxertos de pele e ilhotas, quando, ao contrário do
esperado, a detecção dessas células nestes órgãos foi mais tardia em comparação
com os enxertos cardíacos (3 dias x 7 dias) e não foi detectada proliferação de células
T aloreativas no baço doas animais após transplantes de pele ou ilhotas enquanto
após o transplante cardíaco a proliferação destas células foi alta (Jones et al., 2001).
Alguns trabalhos sugerem que a grande quantidade de células de langerhans na
pele contribuiria para sua maior susceptibilidade à rejeição. Após o transplante, essas
células se ativariam e migrariam para linfonodos drenantes onde promoveriam a
estimulação e ativação de linfócitos T (Larsen et al., 1990; Richters et al., 1999). Outro
fator que pode contribuir para sua imunogenicidade é a presença de queratinócitos,
estas células podem secretar uma série de citocinas inflamatórias e expressar
moléculas de adesão, além de uma alta concentração de glicoproteínas da matriz
extracelular que podem facilmente atrair e fixar células T ativadas (Barclay e Mason,
1982; Berg et al., 1991; Kupiec-Weglinski et al., 1997).
Apesar de todas as questões envolvendo a rejeição de peles, em novembro de
2007 foi realizado o primeiro transplante parcial de face que 18 meses após a cirurgia
ainda mantinha-se viável. Este, no entanto já sofreu dois episódios de rejeição aguda
que foram contornados com imunossupressores, portanto é importante considerar de
que este tipo de transplante se trata de um caso único e não está livre de
complicações; o enxerto apresenta eritema e hiperplasia e, além disso, o regime
inicial de imunossupressão provocou diminuição das funções renais da paciente
(Dubernard et al., 2007).
Fenômenos como hiperplasia e contração do enxerto causada por fibrose são
complicações comuns após transplantes de pele e podem levar a perda parcial ou
19
total da funcionalidade do enxerto (Leibovitch et al., 2005). Em 1943, Medawar já
relatara o fenômeno de contração e formação de tecido granuloso em parte de
enxertos de pele autólogos transplantados em uma paciente (Gibson e Medawar,
1943).
1.4 Neutrófilos
O processo de rejeição envolve mecanismos complexos e populações celulares
diversificadas. O início desse processo ocorre através de sinais de perigo induzidos
por danos teciduais durante o processo cirúrgico. Esse dano induz a produção de
proteínas induzidas por estresse (stress-inducible proteins) (Andrews e Smyth, 2008)
e citocinas pró-inflamatórias como a IL-1 e o TNF-, que por sua vez ativam as
células do endotélio (Ando et al., 2007). As células do endotélio quando ativadas
produzem quimiocinas como a IL-8, Cytokine-induced neutrophil chemoattractant
(CXCL-1) e Macrophage inflammatory protein (MIP-2) que levam ao influxo de
neutrófilos para o enxerto (el-Sawy et al., 2002).
Em geral, a presença de neutrófilos é considerada deletéria para os enxertos,
pois estas células produzem e liberam uma série de substâncias que podem causar
dano tecidual, dentre elas: espécies reativas de oxigênio e enzimas proteolíticas.
Além disso, produzem quimiocinas que atraem e ativam APCs e elas próprias já
foram descritas como capazes de processar antígenos e expressar moléculas de
MHC bem como moléculas coestimulatórias, comportando-se como APCs (Potter e
Harding, 2001; Reali et al., 1996). Há trabalhos que indicam que a depleção de
neutrófilos resulta em aumento da sobrevida de enxertos alogênicos (El-Sawy et al.,
2004; Hirayama et al., 2006).
No caso de enxertos de pele, no entanto, os neutrófilos podem ter um importante
papel na neovascularização desses tecidos. Trabalhos recentes têm correlacionado a
entrada de neutrófilos ao processo de angiogênese, sendo relatado que a depleção
de neutrófilos resulta na redução do fator de crescimento vascular endotelial (VEGF) e
conseqüentemente numa diminuição significativa do processo de ativação de
angiogênese (Nozawa et al., 2006). Dados semelhantes também foram observados
por (Ohki et al., 2005) em tecidos submetidos ao processo de isquemia-reperfusão,
nestes tecidos há promoção de angiogênese quando células tronco ou células
20
progenitoras endoteliais ativadas por G-CSF são estimuladas por VEGF secretado por
neutrófilos.
Além do papel dos neutrófilos na angiogênese, foi relatado que neutrófilos
também podem participar do início da resposta de reparação tecidual. Em um modelo
de dano muscular em que se estudou regeneração de fibras musculares, bloqueou-se
a entrada de neutrófilos no local danificado. Foi observado que embora tenha ocorrido
diminuição de dano tecidual, também ocorreu um retardo no reparo tecidual (Toumi et
al., 2006). Portanto, os neutrófilos possuem funções diversificadas e não se pode
concluir que a presença de neutrófilos no enxerto seja sempre prejudicial.
1.5 Células Th17
Recentemente foi descrita uma população de células que foi relacionada ao
recrutamento de neutrófilos e a uma série de doenças inflamatórias. Essas células
foram chamadas de Th17, por serem um subtipo de linfócitos T CD4 que secretam IL-
17 (Harrington et al., 2006).
Apesar dos estudos sobre essa população celular serem recentes, os fatores
que levam a geração e manutenção dessas células parece estar bem estabelecido. A
IL-6 juntamente com o TGF
β
são importantes para a diferenciação de células Th0
para Th17 (Veldhoen et al., 2006), enquanto IL-2 e IFN
γ
suprimem a geração dessas
células, induzindo respectivamente a expressão de Forkhead box protein 3 (FOXP3) e
signal transducer and activator of transcription (STAT 4) (Laurence et al., 2007; Nakae
et al., 2007). Outra citocina importante para as células Th17 é a IL-23 que além de
estar envolvida na manutenção e proliferação dessas células, é um forte indutor de IL-
22 e IL-17 nas células Th17 (Bettelli et al., 2006; Kebir et al., 2007; Liang et al., 2007).
O fato de que parece existir uma regulação entre a geração de células Treg e
células Th17 dependendo do balanço de citocinas no linfonodo, indicam que se o
contexo inflamatório gerado no transplante tender para a geração de células Th17,
provavelmente haveria grande recrutamento de neutrófilos nos enxertos e isso
aumentaria as chances de rejeição. Como já é bem estabelecido que existe
participação de neutrófilos na rejeição é muito provável que células Th17 tenham
participação nesse processo.
Em concordância com essa teoria, há evidências de que o aumento de IL-17
está relacionado à rejeição de enxertos (Antonysamy et al., 1999; Loong et al., 2002),
21
no entanto o papel das células Th17 em transplantes ainda não é muito claro e serão
necessários um maior número de estudos para esclarecer esta questão.
1.6 Macrófagos
Além dos neutrófilos, os macrófagos são um tipo celular que exercem funções
diversificadas, dependendo do meio em que se encontram podem secretar
substâncias pró-inflamatórias ou anti-inflamatórias. Portanto dependendo da função
que exercem, podem contribuir para o processo de rejeição ou auxiliar no controle da
resposta inflamatória contribuindo para o aceite dos enxertos.
Os macrófagos compõem uma população celular que está continuamente
presente no tecido ou órgão transplantado (Hancock et al., 1983). Em transplantes
renais a dinâmica de entrada destas células é bem estabelecida. Logo após o
transplante há grande influxo destas células devido ao processo inflamatório gerado
pela isquemia-reperfusão. Após 24 horas já é possível observar essa população no
enxerto e no transplante alogênico ela aumenta e acumula, sendo que em rins que
sofreram rejeição aguda, elas compõem entre 38 a 60% do infiltrado celular (Hancock
et al., 1983). Já em transplantes alogênicos não-rejeitados, conforme ocorre
resolução da resposta inflamatória há diminuição do número de macrófagos, mas
ainda é observada persistência dessas células no enxerto (Grimm et al., 1999).
O duplo papel dos macrófagos durante a inflamação é bastante discutido na
literatura. Macrófagos podem induzir inflamação através da liberação de espécies
reativas de oxigênio, enzimas hidrolíticas, citocinas pro-inflamatórias e citotóxicas,
além de óxido nítrico (Laskin e Pendino, 1995; Sharma et al., 2007; Zhang et al.,
2007). No entanto, essas células também promovem resolução da inflamação,
promovendo o reparo e a cicatrização tecidual através da secreção de colagenase,
promoção da angiogênese e a fagocitose de células mortas (Fadok e Chimini, 2001;
Polverini et al., 1977; Werb e Gordon, 1975). Quanto ao processo de fagocitose de
células mortas, há trabalhos mostrando que a fagocitose de células apoptóticas e de
células necróticas ocorre por mecanismos diferentes (de Oliveira et al., 2006; Krysko
et al., 2006), e embora os dados ainda não sejam claros, existem indícios que a
fagocitose de células apoptóticas induz a produção de citocinas anti-inflamatórias nos
macrófagos, enquanto a ingestão de células necróticas leva a produção de citocinas
pró-inflamatórias (Fadok et al., 1998; Krysko et al., 2006).
22
Durante o processo inflamatório que segue o transplante, os macrófagos
exercem diferentes funções, atuando tanto na indução do processo inflamatório
quanto em sua resolução. Esses papéis foram mostrados em um modelo de
isquemia-reperfusão renal, no qual se observou que logo após a isquemia-reperfusão
havia produção local de Macrophage inflammatory protein 1 alpha (MIP-1α) e
Monocyte chemotactic protein 1 (MCP-1), grande infiltração de macrófagos e dano
tecidual baixa. Enquanto que em tempos mais tardios após a isquemia havia alta
produção local de IL-10 e a regeneração era dependente de macrófagos (Vinuesa et
al., 2008).
1.7 Óxido Nítrico
Dentre os produtos liberados por macrófagos, o óxido nítrico é um produto de
grande interesse, pois ele atua na modulação de diversas respostas do sistema
imune. Os primeiros trabalhos definiram esse composto como sendo um produto
liberado por macrófagos que possuía função tumoricida e antimicrobiana (Nathan,
1992). Atualmente essa definição se expandiu razoavelmente, especialmente devido
ao fato de se ter descoberto que além dos macrófagos, existem diversos tipos
celulares que produzem óxido nítrico bem como respondem ao seu estímulo (Bogdan,
2001). Essa descoberta ampliou muito o espectro de atuação do óxido nítrico no
sistema imune.
No caso dos transplantes altas concentrações de óxido nítrico podem auxiliar no
processo de rejeição dos enxertos por causar aumento da fibrose e necrose de
tecidos (Kolb e Kolb-Bachofen, 1998; Pfeilschifter et al., 2001). Além disso, existem
diversos trabalhos associando a produção aumentada de óxido nítrico durante a
rejeição de enxertos alogênicos (Holan et al., 2002; Holan et al., 2005; Vos et al.,
2000; Winlaw et al., 1995; Worrall et al., 1997).
Conforme mencionado anteriormente, apesar de promoverem a inflamação, os
macrófagos também possuem uma importante função para resolução deste processo
(Leibovich e Ross, 1975), promovendo o reparo e a cicatrização tecidual através da
secreção de colagenase (Werb e Gordon, 1975), promoção da angiogênese (Polverini
et al., 1977) e a fagocitose de células apoptóticas (Fadok e Chimini, 2001). Os
macrófagos também produzem um composto que é de suma importância para a
regulação da resposta inflamatória é a IL-10 (de Waal Malefyt et al., 1991).
23
1.8 IL-10
A IL-10 foi inicialmente descrita como “cytokine synthesis inhibitory factor” (CSFI)
sendo reconhecida por sua capacidade de inibir a ativação e produção de citocinas
por células Th2 (Fiorentino et al., 1989). Sua principal função parece, de fato, ser
limitar e terminar respostas inflamatórias, papel que pode ser demonstrado pelo
desenvolvimento espontâneo ou maior susceptibilidade a doenças inflamatórias em
camundongos IL-10 deficientes (Johansson et al., 2001; Kuhn et al., 1993). A IL-10
também regula o crescimento e/ou diferenciação de um amplo espectro de células,
como células B, células Natural killer, células dendríticas, queratinócitos e células
endoteliais (Moore et al., 2001).
Como dito anteriormente, os macrófagos são importantes produtores de IL-10,
mas existem diversos tipos celulares que também produzem esta citocina. Na pele,
mais especificamente, existem importantes fontes de produção de IL-10, dentre elas
as próprias células epiteliais, células endoteliais, células dendríticas, células de
Langerhans e também queratinócitos, sendo que este último grupo celular compõe
uma parcela significativa das células presentes na epiderme e também podem ser
uma importante fonte de IL-10 (Enk et al., 1993).
Devido ao papel da IL-10 na supressão de respostas celulares, muitas tentativas
têm sido realizadas quanto ao emprego dessa citocina na terapia de transplantes,
tentando-se induzir tolerância em enxertos alogênicos (Moore et al., 2001).
Os resultados obtidos nestes trabalhos, no entanto, são bastante contraditórios.
Existem casos em que se observa aumento da sobrevida e casos em que não há
alteração ou há diminuição da sobrevida do enxerto. Alguns trabalhos mostraram que
enxertos de fígados alogênicos, tratados com IL-10 recombinante ou transfectados
com o gene de IL-10, apresentaram aumento de sobrevida (Fabrega et al., 1996;
Shinozaki et al., 2000; Shinozaki et al., 1999; Zou et al., 1998). Já no transplante
cardíaco são relatados casos em que o tratamento resulta em aumento de sobrevida
(Fischbein et al., 2003; Oshima et al., 2007) ou em rejeição acelerada com agravantes
de doença arterial (Furukawa et al., 1999; Qian et al., 1996) e no caso de ilhotas
pancreáticas o tratamento com IL-10 não aumenta a sobrevida dos enxertos, sendo
que em alguns casos parece acelerar a rejeição (Kuttler et al., 2007; Zheng et al.,
1995)
24
O motivo pelo qual esses efeitos diversos são observados ainda não é muito
bem compreendido, mas parece ter relação com a quantidade de IL-10 produzida
localmente (Moore et al., 2001) e o tipo de tecido transplantado (Jones et al., 2001);
portanto não é possível admitir que a simples administração de IL-10 poderá suprimir
a resposta imune contra os enxertos alogênicos.
1.9 Linfócitos T CD4 e T CD8
Além da contribuição de neutrófilos e macrófagos para o processo da rejeição,
existe também uma grande participação de linfócitos neste processo.
Apesar dos inúmeros trabalhos investigando o papel das células T CD3
+
CD4
+
e
células T CD3
+
CD8
+
no processo de rejeição dos transplantes, os dados à respeito da
contribuição relativa de cada população celular neste processo ainda são
controversos.
Alguns trabalhos afirmam que a presença de células T CD3+CD4+ seria
fundamental para a rejeição de enxertos alogênicos (Krieger et al., 1996; Zhao et al.,
2000), enquanto outros indicam que células T CD3
+
CD8
+
são capazes de mediar
rejeição sem a presença de células T CD3
+
CD4
+
(Bishop et al., 2001).
Há trabalhos indicando que células T CD4
+
teriam participação maior na rejeição
de enxertos quando há disparidade entre o receptor e o doador no MHC classe II,
enquanto que células T CD8
+
participariam da rejeição mediada por disparidades no
complexo MHC classe I, esses trabalhos sugeriam que a presença de ambos tipos
celulares seria fundamental para ocorresse a rejeição (Christianson et al., 1993;
Rosenberg et al., 1987). Outros trabalhos descreviam que células T CD8
+
não seriam
capazes de mediar a rejeição, sem a presença de células T CD4
+
(Bradley et al.,
1992; Rees et al., 1990).
No entanto, Rosemberg et al (1987, 1988, 1992) mostraram que a presença de
apenas um dos subtipos celulares era capaz de induzir rejeição aos transplantes
alogênicos e mostraram que células T CD8
+
não só podem mediar a rejeição, mas
também podem exibir dupla função atuando como células citotóxicas ou auxiliares.
Em 2004, Youssef e cols (Youssef et al., 2004) mostraram que a participação de
células T CD4
+
ou CD8
+
depende do tecido transplantado e do grau de disparidade
antigênica. A pele é rejeitada tanto por células T CD4+ ou CD8+ em qualquer grau de
incompatibilidade genética, porém na ausência de células T CD4+ a pele alogênica
25
apresentava aumento de sobrevida. Já o enxerto alogênico cardíaco apresentava
aceite, quando havia graus menores de incompatibilidade genética, na ausência de
células T CD4
+
ou T CD8
+
(Rosenberg et al., 1988; Rosenberg e Singer, 1992).
1.10 IFN
Ao se discutir a participação de células T CD8
+
na rejeição é imprescindível que
se discuta também sobre o papel do IFN
γ
nesse processo. Esta citocina além de ser
um potente ativador de células T CD8
+
, aumenta a apresentação de antígenos por
estar envolvida em cascatas proteolíticas que asseguram o processamento correto de
peptídeos necessários para a apresentação via MHC classe I (Strehl et al., 2005).
Além disso, a produção de IFN
por células T CD8
+
infiltrantes no enxerto podem
estimular os neutrófilos a produzirem quimiocinas, como a CXCL9, CXCL10 e
CXCL11 que, por sua vez recrutam linfócitos T ativados (Morita et al., 2001).
Outro mecanismo de rejeição mediado por IFN
γ
ocorre através da produção
dessa citocina por célulasT CD8
+
de memória. Há evidências de que a presença de
células T CD8
+
CD62L
low
a produção de IFN
γ
em pacientes pré-transplantados, levam
à um maior risco de rejeição pós-transplante (Heeger et al., 1999). Em camundongos,
foi demonstrado o recrutamento precoce de linfócitos T CD8
+
CD62L
low
pré-existentes
induz o recrutamento de células polimorfonucleares e aumenta necrose do enxerto
(El-Sawy et al., 2004). Há ainda, evidências apontando que a presença de células T
de memória pode ser responsável pela falha em induzir tolerância ao enxerto
alogênico, tanto em animais quanto em humanos, pois essas células são
extremamente resistentes à apoptose (Brook et al., 2006).
1.11 Mecanismos diversos envolvidos na rejeição
Indubitavelmente, a incompatibilidade entre o enxerto e o receptor, determinada
pelos antígenos do complexo principal de histocompatibilidade (MHC) é fator de
enorme importância para a indução da rejeição, muito embora antígenos não ligados
ao MHC também possam induzir resposta alogênica (Hildemann et al., 1970).
Durante um longo período atribuiu-se ao sistema imune adaptativo a
responsabilidade de gerar respostas específicas que levariam a rejeição ou tolerância
do órgão transplantado e que o compartimento inato seria apenas a primeira linha de
26
defesa contra microorganismos. Entretanto, esse tipo de visão vem sendo
questionado e atualmente há trabalhos que demonstram a importância do sistema
imune inato e também de danos não-específicos que podem levar a rejeição.
O descobrimento dos Toll-like-receptors (TLRs) foi um importante evento que
permitiu que indicou a existência de uma interação entre o sistema imune inato e
adaptativo (Medzhitov e Janeway, 2002). Tendo em vista que a ativação do sistema
imune adaptativo depende não somente da apresentação de antígenos dependente
do MHC, mas também da indução de moléculas acessórias em APCs, Snare et al
(2001) criou a hipótese de que TLRs expressadas em APCs poderia regular os sinais
acessórios (co-estimuladores e citocinas) e conseqüentemente controlar a ativação
de respostas adaptativas antígeno-específicas. Seus estudos mostraram que
camundongos nocaute de MyD88, uma importante proteína adaptora para a
sinalização via TLRs (Muzio et al., 2000), apresentavam deficiências em respostas
Th1 antígeno-específicas (Schnare et al., 2001).
Em transplantes, em um modelo de isquemia-reperfusão renal foi mostrado
expressão aumentada de RNAm de TLR 2 e TLR4 (Wolfs et al., 2002), em
transplantes de pulmão e rins, observou-se também que pacientes com polimorfismos
no gene de TLR-4 apresentavam menos episódios de rejeição aguda (Nogueira et al.,
2007; Palmer et al., 2003) e em transplantes de pele, mostrou-se que a estimulação
de TLR7 era capaz de aumentara rejeição mediada por células T efetoras (Zhong et
al., 2008).
Quanto aos mecanismos de rejeição que não são antígeno-específicos, ainda
existem muitas questões a serem respondidas, como por exemplo, por que o
transplante renal de doadores vivos com complexo de histocompatibilidade principal
(MHC) não compatível ao do receptor progride melhor do que o rim de doador-
cadáver com MHC compatível, ou por que certos órgãos têm um aceite melhor que
outros (Andrade et al., 2005).
Sabe-se que alguns fatores podem contribuir para a perda do enxerto, por
exemplo a própria diferença de susceptibilidade à rejeição entre tecidos ou células de
diferentes naturezas; a pele, o intestino delgado e pulmões são mais susceptíveis à
rejeição, enquanto que ilhotas pancreáticas, coração, rins e fígados são
progressivamente melhor aceitos (Davis et al., 1980; Jones et al., 2001; Nash et al.,
1977). Além disso, fatores como a vascularização (Gibson e Medawar, 1943;
Medawar, 1944) e o tamanho dos enxertos (He et al., 2004). Conforme discutido
27
anteriormente, muitas das células envolvidas na inflamação possuem um papel duplo.
Sendo que a inflamação pode contribuir para a rejeição, no caso de uma resposta
com intensa produção de substâncias pró-inflamatórias, mas também pode atuar no
processo de reparação tecidual e cicatrização contribuindo para o aceite de enxertos.
O papel da inflamação em transplantes ainda não é muito claro, especialmente
no que se refere ao aceite de enxertos. Um trabalho desenvolvido em nosso próprio
laboratório mostra que uma regulação apropriada da resposta inflamatória é muito
importante para o aceite de enxertos. (Larocca et al., 2008) mostraram que o
transplante de peles singênicas em linhagens de camundongos selecionados para
máxima (AIR
MAX
) ou mínima resposta inflamatória aguda (AIR
MIN
) resultou em melhor
aceite em receptores AIR
MAX
do que em receptores AIR
MIN
, que não aceitaram
totalmente os enxertos.
Ainda existem muitas questões a serem respondidas acerca do papel da
imunidade inata no transplante. É importante estudar o contexto inflamatório
desenvolvido após o transplante para a melhor compreensão da sua relevância na
rejeição dos enxertos.
Neste estudo investigou-se diferenças entre o perfil da resposta inflamatória no
enxerto singênico e alogênico. Para isso, realizou-se a caracterização fenotípica e
funcional das células inflamatórias presentes no enxerto de pele após o transplante
alogênico ou singênico em camundongos.
28
2 OBJETIVOS
29
O estudo proposto teve como objetivos caracterizar a resposta inflamatória no
enxerto singênico e alogênico de pele em camundongos e avaliar a participação da
IL-10 na modulação da resposta ao transplante. Mais especificamente os objetivos
foram:
1-Caracterizar fenotipicamente e funcionalmente as células inflamatórias que
migram ao enxerto, após o transplante singênico ou alogênico, na presença ou
ausência de IL-10.
2- Avaliar a participação da IL-10 no doador ou receptor para o aceite ou rejeição
de enxertos singênicos ou alogênicos.
3- Avaliar a sobrevida do enxerto alogênico quando transplantado juntamente
com o enxerto singênico em um mesmo receptor.
30
3 MATERIAL E MÉTODOS
31
3.1 Animais de experimentação
Camundongos machos de 8 à 10 semanas da linhagem BALB/c (H-2
d
),
C57Bl6/IL-10
+/+
(H-2
b
), C57Bl6/IL10
-/-
(H-2
b
) e NZW (H-2
z
) foram obtidos e mantidos no
biotério do Instituto de Ciências Biomédicas da universidade de São Paulo. Os
animais de experimentação foram mantidos em unidades microisoladoras. Os
procedimentos realizados estão de acordo com os princípios da Comissão de Ética
em experimentação Animal (CEEA).
3.2 Abordagem experimental
Camundongos BALB/c (H-2
d
), C57Bl/6 IL-10
+/+
(H-2
b
) e C57Bl/6 IL-10
-/-
(IL-10
-/-
)
foram transplantados com a pele da cauda do doador alogênico NZW (H-2
z
) ou
singênico. Os animais foram sacrificados e o enxerto foi removido em diferentes
períodos após o transplante: 7, 24, 72 horas, 7 ou 9 dias. Para obtenção das células
inflamatórias que migraram ao enxerto utilizou-se protocolo descrito em Larocca et al
(2008). Os enxertos foram colocados em placas de 48 poços e incubados em 500 µl
de meio de cultura completo por 24 horas. Após esse período, as células que
emigraram do enxerto foram recolhidas e o sobrenadante da cultura foi analisado
quanto à produção de citocinas. As células foram contadas em câmara de Newbauer
e as populações celulares avaliadas por contagem diferencial em lâmina corada após
o procedimento de cito-centrifugação ou por análise de citometria de fluxo. No
sobrenadante foram dosadas citocinas pró e anti-inflamatórias por meio da técnica de
ELISA, e óxido nítrico por GRIESS (Figura 3).
32
A
Sobrenadantes
ELISA: IL-10, TGF
β
, IFNγ,
IL-6, IL-23,IL-22, IL-17
Griess: Óxido Nítrico
Células
Citocentrifugação:
Mononucleares
Polimorfonucleares
Citomêtria de Fluxo
Linfócitos: CD3
+
CD8
+
, CD3
+
CD4
+
Macrófagos: CD11b
+
GR1
low
Neutrófilos: CD11b
+
GR1
high
Enxertos são
removidos e
colocados em cultura
7h, 24h, 72h,
7d ou 9 dias
24 horas
Singênico AlogênicoDoadores:
Receptores:
BALB/c (H-2
d
)
(H-2
d
)
NZW(H-2
z
)
B
Receptores:
Doadores:
Singênico
WT(H-2
b
)
WT(H-2
b
)
IL-10
-/-
(H-2
b
)
WT
IL-10
-/-
(H-2
b
)
IL-10
-/-
(H-2
b
)
NZW(H-2
z
)
Alogênico
WT(H-2
b
) IL-10
-/-
(H-2
b
)
Figura 3- Modelo experimental utilizado. A) Camundongos BALB/c foram transplantados com
pele singênica ou alogênica. Em diferentes tempos pós-transplante os enxertos foram
removidos e colocados em cultura por 24 horas. As células que emigraram do enxerto
foram recolhidas e caracterizadas após citocentrifugação ou citometria de fluxo, a
produção de citocinas e nitrito foi medida no sobrenadante das culturas por ELISA e
GRIESS, respectivamente. B)Foram realizados transplantes singênicos e alogênicos
em animais C57Bl6/IL-10
-/-
(IL-10
-/-
) ou C57Bl6/IL-10
+/+
(WT); nos transplantes
singênicos foram transplantadas peles provenientes de camundongos IL-10
-/-
ou KO,
nos transplante alogênico foram transplantadas peles provenientes de camundongos
NZW.
Em outros experimentos camundongos foram transplantados simultaneamente
com a pele alogênica (NZW) e singênica em seus dorsos ou a pele alogênica foi
transplantada 24 horas após a pele singênica. A sobrevida dos enxertos foi
acompanhada visualmente e por tato. Deste modo, comparou-se o tempo de rejeição
dos enxertos; em camundongos transplantados simultaneamente com o enxerto
singênico e alogênico, em camundongos com enxertos transplantados com um
intervalo de 24 horas, e em camundongos transplantados com um único enxerto
alogênico ou dois enxertos alogênicos (Figura 4).
33
Figura 4- Modelo experimental de transplantes simultâneos. A) Camundongos BALB/c foram
transplantados com pele alogênica e singênica simultaneamente. B) Camundongos
BALB/c foram transplantados com pele singênica e 24 horas depois a pele alogênica
foi transplantada. C)Camundongos foram transplantados com um enxerto alogênico
ou dois enxertos alogênicos. A sobrevida dos enxertos foi acompanhada.
3.3 Transplante de pele
A pele da cauda do doador foi removida e cortada em quadrados com cerca de
1cm
2
sendo seus cantos abaulados com auxílio de bisturi. A pele foi mantida em PBS
à temperatura ambiente até o momento de sua utilização. Os receptores foram
anestesiados com 300 L (via intraperitonial) de uma solução de cloridrato de
ketamina (0,5%) e cloridrato de xilazina (0,3%) em PBS. Em seguida, os animais
tiveram seu dorso tricotomizados e a assepsia local foi realizada com etanol 70%. A
cama para o enxerto foi preparada removendo-se uma área da derme e epiderme até
o nível do músculo intrínseco, no tamanho do enxerto. O enxerto foi colocado na
cama e suturado com fio de nylon 6.0 com agulha triangular e o local foi coberto com
band-aid. Os enxertos foram monitorados diariamente por exame visual e pelo tato,
para análise de seu tamanho, nascimento de pêlos, aderência ao receptor e formação
de áreas hemorrágicas e crostas. A rejeição dos enxertos foi estabelecida quando
uma área maior ou igual a 80% do tecido havia sido destruída, segundo trabalhos já
publicados (Joffre et al., 2008; Kroemer et al., 2008; Peng et al., 2008) .
3.4 Histologia
As lâminas para análise histológica foram confeccionadas pelo Setor de
Histologia do Departamento. Para análise histológica, os enxertos foram removidos e
fixados por 24 horas em formaldeído e em seguida, incluídos em parafina. Em
NZW(H
-
2
d
)
A
BALB/c (H
-
2
d
)
Alogênico
Singênico
(H
-
2
d
)
NZW(H
-
2
d
)
24 horas
Singênico
(H
-
2
d
)
Alogênico
NZW(H
-
2
d
)
Alogênico
C
B
34
seguida foram feitos cortes seriados de 3 µM utilizando aparelho Leica RM 2135 a
partir da peça incluída em parafina. Os cortes foram coletados em lâminas e corados
com Hematoxilina-Eosina para análise patológica ou com Tricrômio de Masson com
azul de anilina e fast green para exame de produção de colágeno. Os resultados da
coloração hematoxilina-eosina são: núcleos em azul; citoplasma, fibras colágenas,
elásticas e neurofibrilas em vermelho. Para Tricrômio de masson: núcleos em negro;
citoplasma, fibrina e fibrilas nervosas em vermelho brilhante. Colágeno, cartilagem e
muco ácido em azul ou verde (Michalany, 1981).
3.5 Obtenção das células emigrantes do enxerto
Os enxertos foram removidos 7, 24, 72 horas, 7 e 9 dias após o transplante.
Cada enxerto foi cortado em 4 partes e colocado em uma placa de 48 poços, em 500
µl de meio completo (DMEM suplementado com 0.1 mM de aminoácidos não
essenciais, 0.1mM de vitaminas, 2 mM L-glutamina, 100 g/ml de gentamicina, 0.05
mM 2-mercaptoetanol, 1 mM de piruvato de sódio, todos da Gibco BRL (Rockville,
EUA) e 5% de soro fetal bovino (SFB)). Os enxertos foram mantidos em estufa
contendo 5% de CO
2
à temperatura de 37
o
C por 24 horas. As células que emigraram
do enxerto foram removidas e contadas e o sobrenadante foi recolhido e estocado
para a avaliação da produção de óxido nítrico e citocinas.
3.6 Tratamento com IL-10 recombinante
Camundongos IL-10
-/-
transplantados com a pele de IL-10
-/-
foram tratados
diariamente com 500 pg de IL-10 recombinante (obtido através de cultura de células
COS transfectadas com IL-10 murino) por 6 dias, sendo essa dose estabelecida a
partir dos experimentos em que se mediu produção de IL-10 pelas células emigrantes
do enxerto no ponto de 24 horas pós-transplante (Figura 7). O tratamento se deu
através de injeções no local do transplante. Foram injetados 100µL de solução de IL-
10 diluído em PBS (5 µg/mL) a partir do dia 0.
35
3.7 Extração de DNA para genotipagem
Camundongos C57Bl6/IL10
-/-
e camundongos C57Bl6/IL-10
+/+
tiveram 1 cm de
suas caudas cortadas. O material foi congelado em nitrogênio líquido e mantido à
temperatura de -80º C até a extração de DNA. Para extração as caudas foram
maceradas sobre uma placa de metal gelada e o material foi colocado em eppendorfs
com 200 µL de Tampão de lise com proteinase K (Tris 5mM pH=8,0; EDTA 10mM
pH=8,0; SDS 0,5%; proteinase K 1,5mg/mL). O material foi incubado por 2 horas à
65º C e após esse período foram acrescentados mais 200 µL de tampão de lise sem
proteinase K. As amostras foram centrifugadas à 18000 g por 20 minutos e o
sobrenadante foi recolhido, ao sobrenadante foram acrescentados 800 µL de etanol
absoluto gelado+40 µL de acetato de sódio. Em seguida as amostras foram
centrifugadas por 5 minutos à 12000 g. O sobrenadante foi descartado e as amostras
foram lavadas com 500 µL de etanol 70%, os tubos foram invertidos e deixados a
temperatura ambiente por 18 horas para que as amostras secassem, ao fim desse
período 200 µL de tampão TE (Tris 50 mM, EDTA 1 mM, ph=8,0) foi acrescentado às
amostras e o DNA foi quantificado.
3.7 Genotipagem
O loci do gene de IL-10 foi amplificado via reação de polimerase em cadeia
(PCR) utilizando-se Taq polimerase, 0,5 mM de primers e 1,5 mM de tampão
magnésio. A reação constitui-se de 12 ciclos de 94º C por 20 segundos, 64º C por 30
segundos com decréscimo de -0,5º C a cada ciclo e 72º C por 35 segundos, 25 ciclos
de 94º C por 20 segundos, 58º C por 30 segundos e 72º C por 35 segundos. O
primeiro ciclo precedeu de uma denaturação de 3 minutos a 94º C e o último ciclo foi
seguido de um período anelamento de 72º C por 2 minutos. Os produtos de PCR
foram separados em gel de agarose 1,5%.
Peso molecular de IL-10= 200bp
Peso molecular de IL-10
-/-
= 450bp
“IL10T 2.2” Anti sense IL-10 primer 5´-GTG GGT ATT GTC TTC CCG-3´
“IL-10T 1.4” Sense IL-10 primer 5´- GCC TTC AGT ATA AAA GGG GGA CC- 3´
IL-10
-/-
“NEO 5” anti sense strand 5´- CCT GCG TGC AAT CCA TCT TG-3´
36
3.8 Análise de citocinas
A produção de citocinas foi avaliada no sobrenadante das culturas através da
técnica de ELISA “sanduíche”, utilizando-se os “kits” comerciais da Endogen (Woburn,
MA, EUA) ou da BD Biosciences (San Diego, CA, EUA) para a dosagem da IL-10,
TGF-, IFN-, IL-6, IL-23, IL-22 e IL-17. Placas duras com propriedade de “alta
ligação” (high binding) (Corning- New York,NY, EUA) foram sensibilizadas com 50 l
do primeiro anticorpo diluído em tampão carbonato/bicarbonato (pH 9,6) por 16 horas
à 4
o
C. Após esse período, os poços foram bloqueados por 2 horas com 150 l de
PBS contendo 10% de soro fetal bovino inativado (SFB). Após o bloqueio, as placas
foram lavadas 3 vezes com PBS-10%SFB e a cada poço foram adicionados 50l das
amostras ou do recombinante murino em diluições seriadas, em meio completo. As
placas foram incubadas por 3 a 4 horas à temperatura ambiente e após o período de
incubação, foram realizadas 3 lavagens com PBS-T (Solução salina tamponada com
fosfato contendo 0,05% de Tween 20). Foram adicionados 50l do anticorpo
biotinilado aos poços e estes foram incubados por um período de 2 horas à
temperatura ambiente. As placas foram novamente lavadas com PBS-T (3 vezes) e
80l do conjugado enzimático (estreptoavidina marcada com peroxidase; Sigma
Chemical Co., MO, EUA), na diluição 1:4000 com PBS, foram adicionados e
incubados por 1 hora. Após esse período, foram realizadas 3 lavagens com PBS-T e
aos poços foram adicionados 100l da solução substrato: 3% de H
2
0
2
, o cromógeno
2,2’-azino-bis-3-ethyllbenzthiazoline-6-sulfonic acid (ABTS; Sigma Chemical Co.) a 0,5
mg/ml dissolvido em tampão citrato/fosfato (citrato 0,028M e fosfato de sódio 0,044M,
pH 5,2). A reação foi interrompida, após aproximadamente 30 minutos, com uma
solução 0,2M de ácido cítrico. A leitura foi realizada em espectrofotômetro a 450 nm.
3.9 Dosagem de nitrito de sódio
A determinação indireta da produção de óxido nítrico foi realizada através da
produção de nitrito acumulado no sobrenadante da cultura pelo método de Griess.
Para isso, amostras ou o padrão NaNO
2
(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, EUA)
em diferentes concentrações que variam entre 1,6M e 50M foram colocados em
poços da placa de 96 poços (Corning, NY, EUA) no volume final de 50l. Em seguida
37
foi adicionado o reagente de Griess (1g de sulfanilamida (Sigma Chemicals Co., St
Louis, MO, EUA) , 0,1g de N-(1-naftil) etilenodiamina di-hidroclorado (Sigma
Chemicals Co.), 2,5 ml de ácido fosfórico e água destilada q.s.p. 100 ml). As amostras
e o padrão foram incubados por 10 minutos em câmara escura, em temperatura
ambiente. A leitura da densidade óptica foi realizada em espectrofotômetro
Spectramax 190 (Molecular Devices, CA., EUA) no comprimento de onda de 540 nm.
3.10 Caracterização de células
3.10.1 Citocentrifugação
As células que emigraram do enxerto foram recolhidas dos poços, contadas e
1x10
5
células e colocadas em caçapas da citocentrífuga (Bio Research) em um
volume total de 300 L de PBS. As células foram centrifugadas por 4 minutos a 30g.
As laminas foram deixadas para secar a temperatura ambiente por 20 minutos. Em
seguida foram fixadas em metanol por 30 segundos e coradas com hematoxilina-
eosina utilizando-se o kit Protocol Hema 3 (biochemical sciences inc).
3.10.2 Citometria de Fluxo
Para a avaliação da expressão dos receptores de superfície nas células dos
camundongos transplantados as células que emigraram dos enxertos foram
recolhidas das placas, contadas e ressuspendidas em PBS contendo 3% de SFB,
foram então incubadas com o anticorpo anti-CD16/32 purificado (bloqueador do
receptor FcII e FcIII; Pharmingen, San Diego, CA, EUA) durante 15 minutos a 4
o
C.
Em seguida, as células foram incubadas com os anticorpos monoclonais conjugados
com fluorocromo por 30 minutos à 4
o
C. Os anticorpos utilizados foram os seguintes:
anti-CD3-FITC (145-2C11), anti-CD4-PE ou FITC (RM4-5), anti-CD8-PE ou FITC (53-
6.7), todos da Pharmingen, San Diego,CA, EUA. Após o período de incubação, as
amostras foram lavadas com PBS/SFB a 3% e fixadas com PBS/paraformaldeído
0,5%. A aquisição e análise das amostras foram realizadas em citômetro de fluxo
FACScan (Becton & Dickinson, Mountain View, CA, EUA), equipado com 15mW laser
de argônio e filtros para FITC (530 nm) e PE(585 nm), utilizando-se o software
CellQuest (Apple). A região estabelecida para o processamento das amostras,
38
utilizando-se os parâmetros de dispersão da luz (FSC e SSC), excluirá as hemácias e
as células não viáveis. O número de eventos captados será, no mínimo, 10.000.
3.11 Análise Estatística
Para as análises comparativas entre os grupos foi empregado o teste estatístico
t de Student; ou o ANOVA paramétrico (teste posterior de Tukey ou Dunnett), quando
os dados se aproximaram de uma distribuição Gaussiana. As curvas de sobrevida do
enxerto foram comparadas através do teste logrank pelo programa Prisma 4.0. Para
todos os testes foi estabelecido o nível de significância de 5%, rejeitando a hipótese
da nulidade quando p<0,05. Os dados relativos à sobrevivência do enxerto serão
apresentados como mediana do tempo de sobrevida. Os demais resultados serão
apresentados como média ± o desvio padrão.
39
4
RESULTADOS
40
4.1 Caracterização fenotípica e funcional das células do enxerto alogênico e
singênico
4.1.1 Caracterização fenotípica
Com o intuito de se avaliar comparativamente a dinâmica de infiltração de
células inflamatórias e as populações celulares no transplante de pele alogênico e
singênico, camundongos BALB/c foram transplantados com enxertos singênicos ou
alogênicos. Os enxertos foram retirados em diferentes tempos após o transplante (24,
72 horas, 7 ou 9 dias) e incubados em meio de cultura completo por 24 horas. As
células que emigraram do enxerto foram recolhidas, fenotipadas através da marcação
de receptores de superfície com anticorpos fluorescentes direcionados ao GR-1,
CD11b, CD3, CD4 ou CD8 (Figura 5A) ou transferidas para lâminas por
citocentrifugação e caracterizadas como mononucleares ou polimorfonucleares
(Figura 5B).
Comparou-se assim, através de ambos os métodos, a saída de células
inflamatórias nos enxertos alogênicos e singênicos.
Ao analisar o número total de células inflamatórias no enxerto alogênico,
observou-se um aumento progressivo das mesmas ao longo do tempo (Figura 6A)
sendo que o pico de infiltração foi observado no nono dia pós-transplante, período
esse em que se já se observa rejeição de enxerto (Figura 6B). Em contrapartida, o
pico de infiltração celular no enxerto singênico ocorreu no tempo de 24 horas,
decrescendo ao longo do tempo pós-transplante. No sétimo e nono dias pós-
transplante, conforme pode ser observado na figura 6C houve maior infiltrado celular
nos enxertos alogênicos quando comparados aos enxertos singênicos.
Segundo o trabalho de Lagasse e Weissman (Lagasse e Weissman, 1996), as
células polimorfonucleares (PMN) e os macrófagos foram caracterizados pela alta
expressão de GR-1 (GR-1
high
) e expressão baixa ou negativa da molécula GR-1(GR-
1
neg-low
) na população CD11b
+
, respectivamente (Figura 6C-D). Durante todo o
período pós-transplante tanto no transplante alogênico quanto singênico, foi verificado
que a população de células inflamatórias é composta majoritariamente por neutrófilos
(células GR1
high
CD11
b
+
), não sendo observadas diferenças entre as porcentagens de
neutrófilos nos transplantes alogênicos e singênicos em nenhum dos pontos avaliados
(Figura 6C).
41
Embora não tenha sido encontrada diferença na porcentagem de neutrófilos em
nenhum momento quando os enxertos alogênicos e singênicos foram comparados
entre si, o número de células PMN mostrou-se diferente. O número de neutrófilos no
enxerto alogênico ainda se encontra elevado nos sétimo e nono dias pós-transplante
(33,63±7,20 e 36,22±72,34 x10
4
células, respectivamente), enquanto que no
transplante singênico há apenas 12,89±3,45 x10
4
e 3,95±1,72 x10
4
células no sétimo
dia e no nono dia, respectivamente (Figura 6C).
Quanto à população de macrófagos (células GR1
neg-low
CD11b
+
), houve aumento
da porcentagem dessa população conforme a progressão do tempo pós-transplante.
No transplante singênico, essa população compunha inicialmente 5,9% da população
total aumentando para 39,4% no nono dia. No transplante alogênico também ocorreu
aumento da porcentagem de macrófagos ao longo do tempo, no ponto de 7 horas
essa população representava 5% e no nono dia passou a representar 24,9% da
população total (Figura 6D).
Analisando o número de macrófagos no transplante singênico o pico de
infiltração dessas células foi de 6,53±2,08x10
4
células em 72 horas, reduzindo-se para
1,48±0,25x10
4
células no nono dia. No transplante alogênico ocorreu aumento
progressivo de macrófagos ao longo do tempo, isto é, foram observadas
0,47±0,11x10
4
células 7 horas pós-transplante sendo que no dia 9 esse número
aumentou para 12,57±2,83x10
4
(Figura 6D).
Comparando o transplante singênico e alogênico quanto à presença de linfócitos
T CD3
+
CD4
+
e T CD3
+
CD8
+
nos enxertos, verificou-se que estas populações
aumentaram nos enxertos alogênicos no sétimo e nono dia pós-transplante. Antes
desses pontos essas populações celulares apresentaram-se em quantidades baixas
tanto nos enxertos singênicos quanto alogênicos.
Outro ponto observado foi a quantidade de células T CD3
+
CD4
+
e CD3
+
CD8
+
nos enxertos. No transplante alogênico foram encontrados 10,50±0,80x10
3
e
16,20±3,40x10
3
células T CD3
+
CD4
+
em 7dias e 9 dias, respectivamente, enquanto
que as células T CD8
+
foram encontradas em quantidades menores em relação às T
CD4
+
: apenas 4,41±0,38x10
3
e 8,06±0,30x10
3
células T CD3
+
CD8
+
para os mesmos
tempos pós-transplante (Figura 6E e F).
No transplante singênico ocorreu um aumento do número de células T
CD3
+
CD4
+
no sétimo dia, dia no qual foram encontradas 5,58±1,37x10
3
células; no
nono dia esse número caiu para 1,55±0,30x10
3
. Em comparação com o número de
42
células T CD3
+
CD4
+
, o número de células T CD3
+
CD8
+
encontrados no sétimo e nono
dia foram mais baixos, foram encontrados respectivamente 0,71±0,01x10
3
e
1,41±0,03x10
3
células T CD3
+
CD8
+
(Figuras 6E e F).
Nesta série de experimentos, concluímos que até o ponto de 72 horas pós-
transplante há número similar de células inflamatórias nos transplantes singênicos e
alogênicos. No entanto, partir do sétimo dia pós-transplante, observa-se aumento de
células no enxerto alogênico e diminuição no singênico. Também verificamos que os
neutrófilos representam a parcela majoritária do infiltrado celular do enxerto e que a
porcentagem de macrófagos aumenta conforme o tempo.
43
B
7º dia pós-transplante
alogênico
24 horas pós-transplante
alogênico
1000X
400X
400X
1000X
GR1
CD11b
A
CD4
CD3
CD8
Figura 5- Fenotipagem de células emigrantes do enxerto. Em diferentes tempos pós-transplante (24h,
72h, 7dias) os enxertos foram removidos e colocados em cultura, as células foram
recolhidas e caracterizadas como polimofornucleares ou mononucleares. A- Representação
da população de neutrófilos ou macrófagos através da expressão dos marcadores de
superfície GR1
high
CD11b
+
ou GR1
neg-low
CD11b
+
. B- Imagens de células emigrantes do
enxerto 24 horas e 7 dias pós-transplante, lâminas obtidas por citocentrifugação, setas
apontam para células mononucleares, coloração hematoxilina-eosina. Resultados
representativos de 3 experimentos.
44
Células GR1
high
CD11b
+
Células GR1
neg
-
low
CD11b
+
7h 24h 72h 7 dias 9 dias
0
5
10
15
***p=0.0001
*p=0.05
Tempos pós-transplante
Número de Células (x10
3
)
7h 24h 72h
7dias
9dias
0
5
10
15
20
25
*p=0.01
**p=0.002
Tempos pós-transplante
Número de Células (x10
3
)
Células CD3
+
CD4
+
Células CD3
+
CD8
+
F
E
7h 24h 72h 7 dias 9 dias
0
10
20
30
**p=0002
**p=0.007
Tempos pós-transplante
Células (x10
4
)
7h 24h 72h 7 dias 9 dias
0
20
40
60
***p=0.0001
*p=0.05
Tempos pós-transplante
Células (x10
4
)
7h 24h 72h 7 dias 9 dias
0
25
50
75
Porcentagem (%)
0 5 10 15 20
0
20
40
60
80
100
***p=0,0001
Singênico
Alogênico
Dias
Porcentagem (%)
A
7h 24h 72h 7dias 9dias
0
20
40
60
80
100
*p=0.02
*p=0.01
Singênico
Alogênico
Tempos pós-transplante
Número de Células (x10
4)
7h 24h 72h 7dias 9dias
0
20
40
60
80
100
Porcentagem (%)
D
C
B
Figura 6- Representação das células inflamatórias presentes nos enxertos. A)Representação do
número total de células infiltrantes do enxerto após 7h, 24h,72h, 7 ou 9 dias do
transplante, após transplantes alogênicos ou singênicos . B)Sobrevida de enxertos
alogênicos ou singênicos , n=8. C)Número total e Porcentagem de células GR1
high
CD11b
+
D)Número total e porcentagem de células GR1l
neg-low
CD11b
+
. E)Número total de
células CD3
+
CD4
+
. F)Número total de células CD3
+
CD8
+
. Valores expressos em
média±desvio padrão (n=4/animais ponto). Resultados de 3 experimentos
independentes.
45
4.1.3 Caracterização funcional: produção de citocinas e óxido nítrico
Com o intuito de se avaliar comparativamente o aspecto funcional das células do
enxerto alogênico e singênico, quantificou-se a produção de citocinas (método de
ELISA) e óxido nítrico (método de GRIESS) no sobrenadante das células emigrantes
do enxerto. Foi avaliada a produção de IL-10, IFN
γ
e devido a presença de grandes
quantidades de neutrófilos nos enxertos, foram dosadas também citocinas envolvidas
na geração das células Th17 como o TGF
β
e a IL-6; a IL-23 que tem função
importante na manutenção dessa população, e as citocinas efetoras das células Th17:
IL-17 e IL-22 (Weaver et al., 2007).
Observou-se que tanto no transplante alogênico quanto no singênico houve
produção de TFG
β
em quase todos os tempos pós-transplante. No transplante
singênico a produção de TGF
β
foi de 1667,25±38,81pg/mL no ponto de 7 horas; esta
produção aumentou ao longo do tempo atingindo seu pico no sétimo dia, quando
foram produzidos 3050,00±502,64pg/mL e no nono dia a produção dessa citocina
reduziu-se para 1996,00±237,68pg/mL. No transplante alogênico a produção de TGF
β
também apresentou aumento de 1830±50,78pg/mL no ponto de 7 horas, para
4139,00±420,68pg/mL no sétimo dia. Entretanto essa produção diminui drasticamente
no nono dia pós-transplante, quando esta encontrou-se diminuída em relação à
produção no enxerto singênico (Figura7A).
A produção de IL-6 foi maior no transplante alogênico em praticamente todos os
tempos pós-transplante, com exceção do ponto de 9 dias em que a produção foi
semelhante em ambos grupos. É interessante observar que houve uma tendência à
maior produção de IL-6 no transplante alogênico entre 7 e 72 horas (Figura 7B).
A produção de IL-23 também foi analisada, sendo que no transplante alogênico
ocorreu produção significativamente maior do que no transplante singênico. Enquanto
que no transplante singênico houve pequena produção de apenas 61,00±72,12pg/mL
no ponto 24 horas, este mesmo ponto representou o pico de produção de
267,00±63,5pg/mL do transplante alogênico; além disso, ocorreu produção do
composto no ponto de 7 e 72 horas também (Figura 7C).
A produção de IL-17 no transplante alogênico ocorreu entre 72 horas e 9 dias,
sendo que dentro deste período ocorreu aumento de produção de 56,00±65,28pg/mL
para 221,50±26,61pg/mL no nono dia. Esta produção foi sempre maior quando
comparada ao transplante singênico, uma vez que no transplante singênico só
46
ocorreu produção desta citocina no sétimo dia e esta produção foi baixa quando
comparada ao mesmo ponto do transplante alogênico (Figura 7D).
Quanto à produção de IL-22, não foi detectada produção desta citocina nos
enxertos singênicos ou alogênicos entre os pontos de 7 horas e 72 horas. No entanto,
mostrou-se alta de IL-22 no sétimo e nono dia pós-transplante alogênico em relação
ao transplante singênico (Figura 7E).
Com relação à produção de IFNγ, no transplante singênico esta manteve-se
baixa em todos os pontos sendo que o nível máximo de produção dessa citocina foi
652,16±457,77pg/mL, no dia 9 pós-transplante. No transplante alogênico a produção
dessa citocina manteve-se baixa entre 7 e 72 horas pós-transplante, com produção
média de apenas 112,60±177,8pg/mL; porém no sétimo dia pós-transplante houve
grande produção de IFNγ atingindo o pico de 3993,77±1260pg/mL, no nono dia a
produção de IFNγ ainda manteve-se alta sendo detectados 2066,57±527,36pg/mL no
sobrenadante da cultura (Figura 7F).
Quanto à produção de IL-10, verificou-se que no tempo de 7 horas não houve
diferenças entre o transplante alogênico e singênico, porém houve uma tendência de
maior produção do composto no enxerto singênico. No ponto de 24 horas essa
tendência foi confirmada ocorrendo maior produção de IL-10 no transplante singênico
em relação ao transplante alogênico: 136,14±17,61pg/mL e 60,37±5,25pg/mL,
respectivamente. Em seguida, no ponto de 72 horas foi observada uma inversão na
produção de IL-10 sendo que as células do enxerto alogênico passaram a produzir
níveis mais elevados de IL-10 do que as células do transplante singênico (Figura 7G).
No transplante singênico, a produção de óxido nítrico não foi detectada antes de
72 horas. Nesse período foram produzidos 3,60±0,38µM/mL de nitrito e observou-se
uma queda de produção no sétimo dia (2,88±1,04µM). No dia 9 pós-transplante a
queda foi ainda maior, com produção de 0,39±0,34 µM/mL. Já no transplante
alogênico a produção desse composto foi sempre maior quando comparada ao
transplante singênico. Para os 3 tempos descritos foi detectada produção de
7,38±1,88µM/mL;13,73±2,78µM/mL e 5,47±1,78µM/mL, respectivamente (Figura 7H).
Esses resultados mostram uma dinâmica de produção diferencial de IL-10 e
citocinas pró-inflamatórias já nas primeiras 24 horas pós-transplante quando os
transplantes alogênicos e singênicos são comparados. Esses dados sugerem que a
amplificação da resposta inflamatória observada no transplante alogênico pode ser
conseqüência de menor modulação da mesma, ao contrário do que se observa no
47
transplante singênico, onde a IL-10 é precocemente produzida em maiores
quantidades sendo esta candidata a citocina reguladora nesse modelo.
48
A
B
C
D
E
F
G
7 horas 24 horas 72 horas 7 dias 9 dias
0
50
100
150
200
250
300
***p<0,0001
**p=0,004
Tempos pós-transplante
IL-17 (pg/mL)
7 horas 24 horas 72 horas 7 dias 9 dias
0
50
100
150
200
250
300
350
400
*p=0,02
**p=0,005
*p=0,03
Tempos pós-transplante
IL-23(pg/mL)
7 horas 24 horas 72 horas 7 dias 9 dias
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
*p=0,04
***p=0,05
Tempos pós-transplante
TGF
(pg/mL)
7 horas 24 horas 72 horas 7 dias 9 dias
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
*p=0,01
*p=0,01
Tempos pós-transplante
IFN (pg/mL)
7 horas 24 horas 72 horas 7 dias 9 dias
0
200
400
600
800
1000
*p=0,03
*p=0,04
Singênico
Alogênico
Tempos pós-transplante
IL-6 (pg/mL)
7 horas 24 horas 72 horas 7 dias 9 dias
0
200
400
600
800
1000
**p=0,002
*p=0,02
Tempos pós-transplante
IL-22 (pg/mL)
7 horas 24 horas 72 horas 7 dias 9 dias
0
50
100
150
200
250
300
350
400
** p=0,005
**p=0,006
Tempos pós-transplante
IL-10 (pg/mL)
7 horas 24 horas 72 horas 7 dias 9 dias
0
5
10
15
20
25
**p=0,001
*p=0,01
*p<0,05
Tempos pós-transplante
NO
2
-
(
M)
H
Figura 7- Produção de citocinas e nitrito no sobrenadante de culturas de enxertos removidos em
diferentes tempos pós-transplante alogênico ou singênico . Os enxertos foram
cultivados por 24horas em 500µL de meio completo e as citocinas avaliadas por ELISA.
Produção de TGF
β
(A); IL-6 (B); IL-23 (C); IL-17 (D); IL-22 (E) IFNγ(F); IL-10 (G) e nitrito(H).
Valores expressos em média±desvio padrão (n=4 animais/ponto). Resultados
representativos de 3 experimentos independentes.
49
4.2 Avaliação da influência da IL-10 na progressão do transplante singênico e
alogênico
4.2.1 Sobrevida de enxertos alogênicos e singênicos em combinações doador-
receptor IL-10
-/-
IL-10
-/-
ou IL-10
+/+
IL-10
+/+
Os resultados anteriores mostraram que no enxerto singênico houve produção
de IL-10 em todos os tempos pós-transplante e, comparado ao transplante alogênico,
houve maior produção dessa citocina no transplante singênico no ponto de 24 horas,
sugerindo que a produção da IL-10 nos tempos iniciais pós-transplante possui um
papel importante para o aceite da pele singênica. Dessa forma, resolveu-se investigar
a influência dessa citocina na progressão do transplante alogênico e singênico. Para
isso, camundongos C57Bl6/IL10
+/+
(WT) e C57Bl6/IL-10
-/-
(IL-10
-/-
) foram
transplantados com a pele de camundongos NZW ou com a pele de animais WT ou
IL-10
-/-
, respectivamente, segundo o desenho experimental explicitado em material e
métodos (Figura 3).
Os resultados mostram que há diminuição da sobrevida do enxerto alogênico,
quando o receptor é deficiente de IL-10, em relação aos receptores IL-10
competentes (Figura 8A). Em relação ao transplante singênico, foi interessante
observar que na ausência completa de IL-10 no receptor e no doador (IL-10
-/-
IL-
10
-/-
), 61% dos camundongos não aceitaram o enxerto, enquanto 100% dos
camundongos C57Bl6/IL10
+/+
transplantados com enxertos C57Bl6/IL10
+/+
(WTWT)
foram aceitos (Figura 8B).
Outro fato relevante a ser considerado é que a área do tecido singênico não foi
totalmente aceita nos animais C57Bl6/IL-10
-/-
, apenas cerca de 20% do total de tecido
transplantado foi aceito nestes animais. Além disso, em exame macroscópico,
também foi observado que estes enxertos possuíam aspecto fibrosado em
comparação ao tecido aceito nos animais controle (Figura 8C).
Cortes histológicos destes enxertos foram corados com tricômio de massom
para que fossem analisadas a deposição e disposição das fibras de colágeno nestes
cortes. Através da análise histológica do tecido singênico aceito nos receptores
C57Bl6/IL-10
-/-
, observou-se junção dermo-epidermal linear, epiderme mais espessa e
queratinizada e diminuição ou quase ausência de glândulas. Por outro lado, nos
50
receptores IL-10 competentes observou-se papilas dérmicas e organização frouxa e
em rede das fibras de colágeno, típicas de peles normais (Eming et al.).
Esses dados sugerem que a IL-10 tem um papel crucial na sobrevida de
transplantes, pois na ausência dessa citocina a sobrevida do enxerto alogênico é
menor em relação aos animais controle. Além disso, a IL-10 também é importante
para a sobrevida de enxertos singênicos, visto que na ausência de IL-10, grande
porcentagem dos camundongos não aceitou os enxertos ou ainda, a área da pele
transplantada não foi completamente incorporada e apresentaram aspecto de fibrose.
A destruição do tecido singênico na ausência da IL-10 indica que há grande
contribuição do processo inflamatório para a rejeição de enxertos. Esses dados
apontam para a importância da IL-10 na modulação da resposta inflamatória e seu
papel crucial na aceitação de enxertos singênicos.
51
4.2.2 Sobrevida de enxerto singênico em combinações doador-receptor IL-10
+/+
IL-10
-/-
ou IL-10
-/-
IL-10
+/+
Para melhor compreender o papel da IL-10 no aceite do enxerto singênico
resolveu-se investigar se a fonte de produção de IL-10 poderia influenciar de modo
diferencial o aceite do enxerto. Para isso, foram realizados experimentos em que a
pele proveniente de doador IL-10 competente foi transplantada em receptor deficiente
de IL-10. Em outros experimentos, camundongos C57Bl6/IL-10
+/+
foram receptores da
pele proveniente de doador C57Bl6/IL-10
-/-
.
Como pode ser visto na figura 8B, enquanto 85% dos enxertos pertencentes a
doadores selvagens transplantados em animais C57Bl6/IL-10
-/-
foram aceitos
(WTIL-10
-/-
), apenas 40% dos enxertos de doadores C57Bl6/IL-10
-/-
foram aceitos
em animais selvagens (IL-10
-/-
WT). Foi visto também que a ausência de IL-10 no
doador resultou em enxertos que não foram completamente aceitos; nestes animais
em média apenas 27% do total de área do tecido transplantado foi aceito. Em
contrapartida, quando a pele transplantada provinha de animais IL-10 competentes
ocorreu melhora no aceite dos enxertos, em média 59% da área total do tecido
transplantado foi aceito muito embora o receptor fosse C57Bl6/IL-10
-/-
(Figura 8C).
Para melhor avaliar o aspecto destes enxertos foram realizadas análises
histológicas em lâminas coradas com tricrômio de masson. Como pode ser observado
na figura 9C, os enxertos IL-10
-/-
transplantados em receptores selvagens
apresentaram aspecto muito semelhante aos transplantes realizados na ausência
completa de IL-10 (IL-10
-/-
WT e IL-10
-/-
IL-10
-/-
, respectivamente), isto é
espessamento da epiderme e junção dermo-epidermal linear. Observou-se também
grande deposição de colágeno, mas aparentemente em menor intensidade do que na
ausência completa de IL-10 (IL-10
-/-
IL-10
-/-
).
Quando peles de doadores C57Bl6/IL10
+/+
foram transplantadas em receptores
C57Bl6/IL-10
-/-
(WTIL-10
-/-
), os enxertos apresentaram aspecto semelhante a um
epitélio integro com papilas dérmicas, epiderme fina e disposição de fibras de
colágeno em forma de rede, embora se tenha observado deposição levemente
aumentada de colágeno (Figura 9C).
Em seguida, sabendo-se que a manipulação genética da qual os animais
C57Bl6/IL-10
-/-
são provenientes talvez resultasse em alterações que poderiam ter
52
influenciado os resultados obtidos, foram realizados experimentos para se descartar a
possibilidade de que a rejeição das peles ocorreria devido às características
intrínsecas nos animais transgênicos e não necessariamente devido à ausência de IL-
10. Para isso, camundongos C57Bl6/IL-10
-/-
transplantados com pele IL-10
-/-
foram
tratados diariamente com IL-10 recombinante no local do transplante durante 6 dias.
O tratamento com IL-10 resultou na melhora significativa no aceite dos enxertos.
Observou-se que em média, 33% da área do enxerto foi aceita enquanto que os
enxertos não-tratados não obtiveram sequer 1% de área aceita (Figura 10).
Com intuito de se certificar que os animais IL-10
-/-
utilizados nos experimentos
não produziam IL-10, macrófagos intraperitoniais de animais IL-10
-/-
transplantados e
de animais naive (BALB/c e C57Bl/6) foram cultivados por 72 horas sob estímulo ou
não de LPS. Não se observou produção detectável de IL-10 por macrófagos dos
animais IL-10
-/-
, conforme esperado, enquanto que macrófagos dos animais selvagens
produziram altas quantidades de IL-10, especialmente sob estímulo de LPS (Figura
11A). Interessante a observação de que os macrófagos de animais IL-10
-/-
transplantados com a pele de camundongos C57Bl6/IL-10
+/+
também não mostraram
níveis detectáveis dessa citocina. Esses dados sugerem que macrófagos produtores
de IL-10 presentes no enxerto permanecem no local do transplante e possivelmente
não migram para a periferia. Outro método utilizado para a certificação dos animais
transgênicos utilizados foi o PCR para o gene de IL-10, para este fim alguns
camundongos C57Bl6/IL10
-/-
ou C57Bl6/IL10
+/+
utilizados nos grupos experimentais
tiveram parte de suas caudas cortadas e estas foram utilizadas para extração de
DNA. Foi visto que a banda obtida nos animais C57Bl6/IL10
-/-
utilizados de fato
corresponde à banda de 450bp como esperado nos animais transgênicos enquanto
os animais C57Bl6/IL10
+/+
apresentaram bandas de 200bp, segundo descrito pela
Jackson Laboratory de onde os animais foram obtidos (JAX, 2008; Laboratory,
2008)(Figura 11B).
Esses dados indicam que a IL-10 produzida por células residentes da pele do
doador possui um papel essencial no aceite de enxertos. A ausência dessa citocina
na pele transplantada acarreta em maior destruição e fibrose do tecido transplantado.
53
A
B
0 2 4 6 8 10 12 14
0
25
50
75
100 NZWWT
NZWIL-10
-/-
*p=0.01
Dias pós-transplante
Porcentagem de Sobrevida
0 10 20 30
0
20
40
60
80
100
IL-10
-/-
IL-10
-/-
WTWT
IL-10
-/-
WT
WTIL-10
-/-
*p=0,02
***p=0,0004
Dias pós-transplante
Porcentagem de Sobrevida
IL-10
-/-
IL-10
-/-
WT
WT IL-10
-/-
WT WT
IL-10
-/-
0
20
40
60
80
100
***p<0,0001
Porcentagem de área aceita
**p=0,006
C
Sobrevida de enxertos Singênicos
Sobrevida de enxertos alogênicos
Figura 8- Sobrevida de transplantes na ausência de IL-10. A- Sobrevida de enxertos alogênicos em
receptores IL-10
-/-
; n=12 animais/grupo. B- Sobrevida dos enxertos singênicos; na presença
de IL-10 no doador e receptor (WTWT), na presença de IL-10 somente no doador
(WTIL-10
-/-
), na presença de IL-10 somente no receptor (IL-10
-/-
WT) ou na ausência
completa de IL-10 (IL-10
-/-
IL-10
-/-
). C- Porcentagem de área aceita dos enxertos
singênicos em diferentes combinações de doadorreceptor IL-10 competente ou Il-10
deficiente. IL-10
-/-
IL-10
-/-
, n=17; WTWT, n=17; IL-10
-/-
WT, n=13; WTIL-10
-/-
, n=19.
Resultado de 3 experimentos independentes.
54
12º Dia pós
-
transplante
WT
WT IL-10
-
/
-
IL-10
-
/
-
A
WT
IL-10
-
/
-
IL-10
-
/
-
WT
IL-10
-
/
-
IL-10
-
/
-
B
WT
WT
400X
100X
d
e
d
e
400X
d
e
d
e
100X
e
d
e
d
400X
100X
400X
e
d
e
d
IL-10
-
/
-
WT WT
IL-10
-
/
-
C
100X
Figura 9- Aspecto macroscópico e cortes histológicos dos enxertos. A- Aspecto macroscópico de
transplantes singênicos no 12ºdia pós-transplante. B- Corte histológico do enxerto, na
presença de IL-10 no receptor e no doador (WTWT) ou na ausência completa de IL-10
(IL-10
-/-
IL-10
-/-
) no 12ºdia pós-transplante. C- Corte histológico do enxerto, na presença de
IL-10 somente no doador (WTIL-10
-/-
) ou somente no receptor (IL-10
-/-
WT) no 30ºdia
pós-transplante; coloração em tricrômio de massom: núcleos em negro; citoplasmas, fibrina
e fibrilas nervosas em vermelho; colágeno em azul. e-epiderme, d- derme, aponta para
junção dermo-epidermal.
55
Figura 10- Tratamento de enxertos com IL-10 recombinante e verificação de produção de IL-10 em
camundongos IL10
-/-
. A-Porcentagem e B- área aceita de enxertos IL-10
-/-
tratados com
doses diárias de 500pg de IL-10 por 6 dias (n=8 animais/grupo). Resultados de 2
experimentos.
56
A
B6
BALB/c
B6
B6
KO C1
KO
KO C3
KO
B6
BALB/c
KO
B6
KO C1
KO
KO C3
KO
0
500
1000
1500
2000
B6
BALB/c
B6KO
KOKO
+LPS
IL-10(pg/mL)
B6/10
+/+
BALBc/10
+/+
WTIL-10
-/-
IL-10
-/-
IL-10
-/-
B6/10
+/+
BALBc/10
+/+
WTWT
IL-10
-/-
IL-10
-/-
C1
IL-10
-/-
IL-10
-/-
C3
BALBc/10
+/+
B6/10
+/+
WTWT
IL-10
-/-
IL-10
-/-
C1
IL-10
-/-
IL-10
-/-
C3
B
450bp
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
200bp
Figura 11- Produção de IL-10 e genotipagem de camundongos C57Bl6/IL-10
+/+
ou C57Bl6/IL-10
-/-
. A-
Macrófagos intraperitoniais de camundongos C57Bl/6 , BALB/c e animais IL-10
-/-
transplantados com pele IL-10
-/-
ou pele de B6 foram recolhidos e estimulados ou não
com LPS e a produção de IL-10 foi quantificada. B- Figura representativa de gel com
produtos de PCR para o gene de IL-10, linhas 1 a 11 representam camundongos C57Bl6/IL-
10
-/-
e linha12 representa camundongo C57Bl6/IL-10
+/+
.
57
4.2.3 Caracterização de células inflamatórias
4.2.3.1 Caracterização de células inflamatórias no transplante alogênico
Para examinar se havia diferença na freqüência e tipo de células inflamatórias
no transplante do enxerto alogênico entre receptores C57Bl6/IL-10
-/-
e C57Bl6/IL-
10
+/+
, os camundongos tiveram os enxertos removidos 24 horas, 72 horas e 7 dias
após o transplante e colocados em cultura por 24 horas. As células que emigraram do
enxerto foram identificadas como neutrófilos (CD11b
+
GR-1
high
), macrófagos
(CD11b
+
GR-1
low
) e células T CD3
+
CD4
+
ou células T CD3
+
CD8
+
.
Foi verificado que tanto nos enxertos alogênicos transplantados nos animais
C57Bl6/IL-10
+/+
quanto nos enxertos alogênicos transplantados em animais
C57Bl6/IL-10
-/-
ocorreu aumento do número de células totais ao longo do tempo,
sendo que o pico de emigração celular ocorreu no sétimo dia pós-transplante em
ambos os grupos. Não foram observadas diferenças no número de células emigrantes
do enxerto entre os grupos em nenhum dos pontos avaliados (Figura 12A).
Em seguida avaliou-se a porcentagem e o número de células GR1
high
CD11b
+
presentes no enxerto. Foi visto que a população de neutrófilos representa a
porcentagem majoritária de células inflamatórias presentes no enxerto em todos os
pontos avaliados em ambos os grupos. No sétimo dia pós-transplante, foi observado
que a porcentagem destas células é maior no grupo C56Bl6/IL-10
+/+
em relação ao
grupo C57Bl6/IL-10
-/-
. Em relação ao número de neutrófilos, existe um aumento do
número de células ao longo do tempo pós-transplante, sendo no sétimo dia o pico de
infiltração celular em ambos os grupos. Não foram encontradas diferenças
estatísticas entre os grupos em relação ao número de neutrófilos nos diferentes
tempos pós-transplante (Figura 12B).
Do mesmo modo que a população de neutrófilos foi analisada, também foram
analisados a porcentagem e número de macrófagos nos enxertos. A porcentagem de
macrófagos nos enxertos dos camundongos C56Bl6/IL-10
+/+
não sofre variações
significativas entre 24 horas e 7 dias pós-transplante, em contrapartida nos
camundongos C56Bl6/IL-10
-/-
existe um aumento da porcentagem dessa população
entre 24 horas e 7 dias pós-transplante. Avaliando o número de macrófagos nos
grupos, foi visto que existe um aumento de macrófagos no sétimo dia pós-transplante
58
tanto nos camundongos C56Bl6/IL-10
+/+
quanto nos camundongos C56Bl6/IL-10
-/-
, no
entanto não foram observadas diferentes estatísticas entre os grupos.
Quanto ao número de células T CD3
+
CD4
+
e células T CD3
+
CD8
+
presentes nos
enxertos, observou-se aumento significativo de ambos tipos celulares entre 24 horas
e o sétimo dia pós-transplante tanto nos camundongos C57Bl6/IL-10
+/+
quanto nos
camundongos C57Bl6/IL-10
-/-
. Quando comparados os grupos observou-se diferença
significativa somente no ponto de 24 horas, ponto em que foi encontrado maior
número de células T CD3+CD8+ nos camundongos IL-10 deficientes (IL-10
-/-
) em
relação aos camundongos IL-10 competentes (WT) (Figura 12E).
O conjunto desses dados mostra que não existem diferenças significativas entre
o número de células encontrados nos enxertos alogênicos de camundongos
C57Bl6/IL-10
+/+
e C57Bl6/IL-10
-/-
, com exceção do ponto de 24 horas em que há maior
número de células T CD3+CD8+ nos camundongos C57Bl6/IL-10
-/-
. Esses resultados
indicam que a rejeição acelerada do enxerto alogênico nos camundongos IL-10
deficientes provavelmente não ocorre devido ao aumento de células inflamatórias no
enxerto, mas por outro mecanismo.
59
Figura 12- Fenotipagem de células infiltrantes do enxerto após transplantes alogênicos em animais
C57Bl6/IL10
-/-
(NZWIL-10
-/-
) ou controles C57Bl6/IL-10
+/+
(NZWWT) . A-
Representação do número total de células infiltrantes do enxerto. B- Número total e
Porcentagem de células CD11b
+
GR1
high
C- Número total e porcentagem de células
CD11b
+
GR1l
low
. D- Número total de células CD3
+
CD4
+
. E- Número total de células
CD3
+
CD8
+
. Valores expressos em média±desvio padrão, n=4.
A
24 horas 72 horas 7 dias
0
25
50
75
100
*p=0,01
Porcentagem (%)
24 horas 72 horas 7 dias
0
10
20
30
40
*p=0,01
Porcentagem (%)
24 horas 72 horas 7 dias
0
60
120
180
240
300
Tempos pós-transplante
Células (x10
4
)
24 horas 72 horas 7 dias
0
5
10
15
20
25
30
35
Tempos pós-transplante
Células (x10
4
)
24 horas 72 horas 7 dias
0.00
0.25
0.50
0.75
1.00
1.25
1.50
1.75
2.00
**p=0,007
Tempos pós-transplante
Células (x10
4
)
24 horas 72 horas 7 dias
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
Tempos pós-transplante
Células (x10
4
)
24 horas 72 horas 7 dias
0
30
60
90
120
150
180
210
240
270
300
NZWWT
NZWIL-10
-/-
Tempos pós-transplante
Células (x10
4
)
B
C
D E
Células GR1
high
CD11b
+
Células GR1
low
-
neg
CD11b
+
Células CD3
+
CD4
+
Células CD3
+
CD8
+
60
4.2.3.2 Caracterização de células inflamatórias no transplante singênico em
combinações doador-receptor IL-10
-/-
IL-10
-/-
ou IL-10
+/+
IL-10
+/+
Para examinar se havia diferença na freqüência e tipo de células inflamatórias
no transplante singênico na total ausência de IL-10 (IL-10
-/-
IL-10
-/-
) ou no controle
IL-10 competente (WTWT), os enxertos foram removidos 24 horas, 72 horas e 7
dias após o transplante e colocados em cultura por 24 horas. As células que
emigraram do enxerto foram identificadas como neutrófilos (CD11b
+
GR-1
high
),
macrófagos (CD11b
+
GR-1
low
) e células T CD3
+
CD4
+
ou células T CD3
+
CD8
+
.
Foi visto que no tempo de 24 e 72 horas, o número de células no enxerto de pele
proveniente de camundongos IL-10
-/-
foi menor em relação aos controles; no entanto
no sétimo dia houve grande aumento no número de células inflamatórias no
transplante IL-10
-/-
, sendo esta saída maior em relação ao controle (Figura 13A).
Tanto no controle quanto no enxerto IL-10
-/-
, os neutrófilos representaram a
porcentagem majoritária do infiltrado celular e por isso sua dinâmica de infiltração no
enxerto refletiu os dados anteriores em relação ao número total de células. Isto é,
observou-se menor número de células no enxerto IL-10
-/-
em relação ao controle entre
24 e 72 horas e aumento do número de células no sétimo dia. No sétimo dia foram
encontradas 124,84±62,28x10
4
células nos camundongos C57Bl6/IL-10
-/-
enquanto
nos camundongos IL-10 competentes foram encontradas somente 31,10±25,11 x10
4
células (Figura 13B).
Quanto à população de macrófagos foi visto que ocorreu aumento do número e
porcentagem dessas células ao longo do tempo pós-transplante, tanto no enxerto de
camundongos controle quanto nos animais IL-10
-/-
. No transplante IL-10
-/-
ocorreu
aumento de 2,87±2,36x10
4
células, no tempo de 24 horas para 41,09±34,51 células
no sétimo dia e no controle houve aumento de 5,18±1,83x10
4
células para
11,08±6,32x10
4
células (Figura 13C).
Ao comparar o número de células T CD3
+
CD4
+
entre os grupos, observou-se
que há aumento significativo desta população celular no grupo IL-10
-/-
em relação ao
grupo WT no sétimo dia pós-transplante, foram encontradas 2,28±1,28x10
3
células e
0,55±0,34x103 células, respectivamente (Figura 13D).
No grupo IL-10 deficiente existe uma tendência para o aumento do número de
células T CD3
+
CD8
+
no sétimo dia pós-transplante, no entanto não foi observada
diferença significativa em relação ao grupo IL-10 competente. (Figura 13E).
61
Os dados permitem concluir que há participação significativa de neutrófilos e
células T CD3
+
CD4
+
no processo inflamatório que segue o transplante. A ausência de
IL-10 no transplante provoca uma dinâmica de migração diferencial de células
inflamatórias no enxerto, sendo observado aumento do número de células no sétimo
dia em relação ao controle. É possível que a ausência de IL-10 influencie no controle
da resposta inflamatória aumentando a infiltração celular no enxerto, no entanto para
que isso seja esclarecido será necessária a realização de experimentos
caracterizando a cinética de produção de citocinas pró ou anti-inflamatórias.
62
24 horas 72 horas 7 dias
0
70
140
210
IL-10
-/-
IL-10
-/-
*p=0,03
*p=0,01
*p=0,03
WTWT
Tempos pós-transplante
Células (x10
4
)
24 horas 72 horas 7 dias
0
50
100
150
200
*p=0,03
*p=0,02
*p=0,02
Tempos pós-transplante
Células (x10
4
)
24 horas 72 horas 7 dias
0
20
40
60
80
**p=0,007
Tempos pós-transplante
Células (x10
4)
A
B
24 horas 72 horas 7 dias
0
1
2
3
4
*p=0,04
Tempos pós-transplante
Células (x10
3
)
24 horas 72 horas 7 dias
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
Tempos pós-transplante
Células (x10
3
)
D
E
24 horas 72 horas 7 dias
0
20
40
60
80
100
Porcentagem (%)
24 horas 72 horas 7 dias
0
20
40
60
Porcentagem (%)
C
Figura 13- Fenotipagem de células infiltrantes do enxerto após transplantes singênicos em animais
IL10
-/-
(IL-10
-/-
IL-10
-/-
) ou controles (WTWT) . A- Representação do número total de
células infiltrantes do enxerto. B- Número total e Porcentagem de células CD11b
+
GR1
high
C-
Número total e porcentagem de células CD11b
+
GR1l
low
. D- Número total de células
CD3
+
CD4
+
. E- Número total de células CD3
+
CD8
+
. Valores expressos em média±desvio
padrão, n=4.
63
4.2.3.3 Caracterização de células inflamatórias no transplante singênico em
combinações doador-receptor IL-10
+/+
IL-10
-/-
ou IL-10
-/-
IL-10
+/+
Em seguida, foi avaliada a freqüência e tipo de células inflamatórias no
transplante singênico quando o doador apresentava deficiência de IL-10 (IL-10
-/-
WT) ou quando o doador era IL-10 competente e o receptor IL-10 deficiente (WT
IL-10
-/-
). Os enxertos foram removidos 24 horas, 72 horas e 7 dias após o transplante
e colocados em cultura por 24 horas. As células que emigraram do enxerto foram
identificadas como neutrófilos (CD11b
+
GR-1
high
), macrófagos (CD11b
+
GR-1
low
) e
células T CD3
+
CD4
+
ou células T CD3
+
CD8
+
.
Em relação ao número total de células, foi visto que na ausência de IL-10 no
doador foi encontrado maior número de células inflamatórias em relação grupo que
recebeu enxertos WT em todos os tempos avaliados (Figura 14A).
Em ambos os grupos os neutrófilos representaram a porcentagem majoritária do
infiltrado celular, entretanto no ponto de 24 horas a porcentagem de neutrófilos é
maior no grupo que recebeu o enxerto WT em relação ao grupo que recebeu o
enxerto IL-10
-/-
. Apesar de, no ponto de 24 horas, ter-se encontrado maior
porcentagem de neutrófilos no grupo que recebeu o enxerto WT, em termos de
número de células GR1
high
CD11b
+
encontrados nos enxertos, o grupo que recebeu o
enxerto IL-10
-/-
apresentou número aumentado de neutrófilos em relação ao grupo
que recebeu o enxerto IL-10 competente. Nos pontos de 72 horas e 7 dias o número
de neutrófilos também foi maior no grupo que recebeu o enxerto IL-10
-/-
em relação ao
grupo que recebeu o enxerto WT (Figura 14B).
Avaliando a porcentagem de macrófagos presentes nos enxertos não foi visto
diferença entre os grupos em nenhum dos tempos pós-transplante, entretanto,
analisando o número destas células presentes nos enxertos, verificou-se que existe
maior número de macrófagos nos enxertos IL-10
-/-
em relação aos enxertos WT, no
ponto de 24 horas e 72 horas (Figura 14C).
Em seguida, os grupos foram analisados quanto ao número de células T
CD3
+
CD4
+
e células T CD3
+
CD8
+
infiltrantes nos enxertos. Não foram observadas
diferenças significativas no número de células T CD3
+
CD4
+
entre os grupos, muito
embora no sétimo dia pós-transplante ocorra uma tendência de aumento do número
destas células nos camundongos que receberam o enxerto IL-10
-/-
(Figura 14D). Já
em relação ao número de células T CD3
+
CD8
+
, foi encontrado aumento do número
64
destas células no grupo que recebeu o enxerto IL-10
-/-
em relação ao grupo que
recebeu o enxerto WT no sétimo dia pós-transplante (Figura 14E).
Os dados mostram que há maior infiltrado de células inflamatórias nos enxertos
quando os doadores são IL-10 deficientes em relação à doadores IL-10 competentes.
Isso indica que a produção de IL-10 por células presentes no enxerto pode ser
importante para controlar a reação inflamatória local e prevenir o influxo de células
inflamatórias no local do transplante.
65
24 horas 72 horas 7 dias
0
5
10
15
20
Porcentagem (%)
24 horas 72 horas 7 dias
0
10
20
30
40
IL-10
-/-
WT
WTIL-10
-/-
*p=0,02
*p=0,03
*p=0,01
Tempos pós-transplante
Número de Células (x10
4
)
24 horas 72 horas 7 dias
0
10
20
30
40
*p=0,02 *p=0,02
*p=0,03
Tempos pós-transplante
Células (x10
4
)
24 horas 72 horas 7 dias
0.0
0.2
0.4
0.6
Tempos pós-transplante
Células (x10
3
)
24 horas 72 horas 7 dias
0
1
2
3
4
**p=0,002
*p=0,03
Tempos pós-transplante
Células (x10
4
)
A
D E
24 horas 72 horas 7 dias
0
25
50
75
100
*p=0,02
Porcentagem (%)
24 horas 72 horas 7 dias
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
*p=0,01
Tempos pós-transplante
Células (x10
3
)
B C
Figura 14- Fenotipagem de células infiltrantes do enxerto após transplantes singênicos de enxertos IL-
10
-/-
em camundongos WT (IL-10
-/-
WT) ou de enxertos WT em animais IL10
-/-
(WTIL-
10
-/-
) . A- Representação do número total de células infiltrantes do enxerto. B- Número
total e porcentagem de células CD11b
+
GR1
high
C- Número total e porcentagem de células
CD11b
+
GR1l
low
. D- Número total de células CD3
+
CD4
+
. E- Número total de células
CD3
+
CD8
+
. Valores expressos em média±desvio padrão, n=4.
66
4.3 Avaliação da sobrevida do enxerto alogênico e singênico transplantados em
um mesmo receptor
Ao avaliar os dados sobre a cinética de produção de citocinas nos transplantes
singênicos e alogênicos, observou-se que ocorre modulação da resposta inflamatória
nos tempos iniciais pós-transplante, já sendo encontrada produção de citocinas anti-
inflamatórias no enxerto singênico e produção de citocinas pró-inflamatórias no
enxerto alogênico, no ponto de 24 horas pós-transplante. Tendo em vista esses
dados, questionamos se seria possível modular a resposta inflamatória ao se
transplantar a pele singênica juntamente com a pele alogênica. Ou se ao transplantar
a pele singênica anteriormente a pele alogênica poder-se-ia criar um ambiente anti-
inflamatório com produção de TGF
β
e IL-10 que propiciaria um aumento de sobrevida
do enxerto alogênico.
Com tal intento, foram realizados experimentos em que o enxerto singênico foi
transplantado simultaneamente com o enxerto alogênico em um mesmo receptor ou
se alterou o intervalo de transplante dos dois enxertos: o enxerto singênico foi
transplantado 24 horas antes do enxerto alogênico, conforme explicitado na figura 4
em material e métodos.
Os dados mostram que, quando o enxerto singênico foi transplantado
simultaneamente ao enxerto alogênico (Alo+Sin), ocorre um aumento na sobrevida do
enxerto alogênico em relação aos controles (Alo; p=0,006 e Alo+Alo; p=0,003). Como
controle foi comparada a rejeição entre animais transplantados com um único enxerto
alogênico (Izcue et al.) e animais transplantados com dois enxertos alogênicos
(Alo+Alo). Isso foi realizado para que se eliminasse a possibilidade de que a
disponibilidade de mais de um enxerto acarretasse em aumento de sobrevida do
transplante, devido a presença de uma quantidade maior de tecido que as células
efetoras teriam que eliminar. Observou-se que o tempo de rejeição entre 1 único
enxerto alogênico ou dois enxertos alogênicos foi o mesmo, sugerindo que o fato de
se transplantar 1 enxerto ou 2 enxertos não afeta a sobrevida dos mesmos e portanto
o prolongamento da sobrevida do enxerto alogênico no transplante simultâneo se deu
devido à influência do enxerto singênico e não porque houve um aumento da área de
tecido transplantado (Figura 15A).
A sobrevida do enxerto singênico não foi afetada quando houve o transplante
simultâneo com a pele alogênica, sendo que as peles singênicas foram aceitas
67
conforme o esperado. Não foram observadas diferenças estatísticas na sobrevida dos
enxertos singênicos quando comparados os grupos que receberam transplante
simultâneo (sin+Alo) e os que foram transplantados somente com a pele singênica
(Sin) (Figura 15B).
Quando o transplante alogênico foi realizado 24 horas após o transplante
singênico (Alo24hSin), não foi observado aumento de sobrevida do enxerto alogênico.
As peles alogênicas transplantadas 24 horas após o enxerto singênico (Alo24hsin)
foram rejeitadas no mesmo período do grupo controle, sendo que o grupo controle
consistiu em camundongos transplantados apenas com a pele alogênica (Izcue et al.).
Neste mesmo experimento um grupo de camundongos foi transplantado
simultaneamente com peles alogênicas e singênicas e nesta situação, como era
esperado, a pele alogênica (Alo+Sin) apresentou aumento de sobrevida em relação
aos outros grupos (Alo, p=0,01 e Alo24hSin; p=0,01) (Figura 15C).
A sobrevida do enxerto singênico também foi avaliada e não houve diferença
entre a sobrevida dos enxertos singênicos transplantados 24 horas antes dos
enxertos alogênicos (Sin24hAlo), dos enxertos singênicos transplantados
simultaneamente com os enxertos alogênicos (Sin+Alo) ou de enxertos singênicos
transplantados sozinhos em receptores (Sin), todos os enxertos singênicos foram
aceitos (Figura 15D).
Concluímos assim que o transplante simultâneo de enxertos alogênicos e
singênicos prolonga a sobrevida dos enxertos alogênicos. Provavelmente ocorre uma
modulação da resposta imune pelo enxerto singênico que resulta no aumento de
sobrevida do enxerto alogênico e que para que ocorra aumento de sobrevida do
enxerto alogênico, o transplante singênico deve ser realizado em conjunto com o
enxerto alogênico.
68
A
0 5 10 15 20
0
20
40
60
80
100
Alo
Alo+Alo
Alo+Sin
***
Dias pós-transplante
% Sobrevida
0 5 10 15 20
0
20
40
60
80
100
Sin+Alo
Sin
Dias pós-transplante
% Sobrevida
B
0 5 10 15 20
0
20
40
60
80
100
Sin+Alo
Sin24hAlo
Sin
Dias pós-transplante
% Sobrevida
Transplante simultâneo
Transplante
com intervalo de 24 horas
C
D
0 5 10 15 20
0
25
50
75
100
Alo+Sin
Alo24hSin
Alo
*p=0,01
Dias
% Sobrevida
Figura 15- Sobrevida do enxerto de pele em receptores do transplante alogênico (NZW) ■ e/ou
singênico (BALB/c) ●. Os camundongos foram transplantados simultaneamente ou não
com pele alogênica e/ou singênica. A-Sobrevida do enxerto alogênico ■, no transplante
simultâneo com o enxerto singênico (Alo+Sin) , no transplante de dois enxertos
alogênicos (Alo+Alo) ou no transplante de 1 enxerto alogênico (Alo) . B-Sobrevida de
enxertos singênicos ●, no transplante simultâneo com o enxerto alogênico ou no
transplante de 1 enxerto singênico ; somatórias de animais(n=17). Somatória de 3
experimentos C- Sobrevida dos enxertos alogênicos, quando a pele alogênica foi
transplantada 24 horas após a singênica (Alo24hSin) , no transplante simultâneo
(Alo+Sin) ou no transplante de 1 único enxerto alogênico (Alo) D- Sobrevida de enxertos
singênicos, no transplante simultâneo (Sin+Alo), no transplante com intervalo de 24 horas
(Sin24hAlo) ou no transplante de 1 único enxerto singênico (Sin) (n= 6).
69
7 dias pós-transplante
A
9 dias pós-transplante
14 dias
pós
-
transplante
B
7 dias pós-transplante
Transplante simultâneo
Transplante com intervalo de
24 horas
Transplante
Alogênico
Figura 16- Aspecto macroscópico do enxerto singênico e alogênico transplantados em um único
receptor. A) Aspecto dos enxertos alogênicos e singênicos quando houve transplante
simultâneo nos tempos de 7, 9 e 14 dias pós-transplante. B) Aspecto dos enxertos
alogênicos e singênicos quando camundongos foram transplantados com pele singênica e
24 horas depois com pele alogênica ou transplantados simultaneamente com enxertos
alogênicos e singênicos, no sétimo dia pós-transplante.
70
5 DISCUSSÃO
71
O objetivo deste estudo foi analisar e comparar a resposta inflamatória no
transplante de pele alogênica e singênica em camundongos. Procurou-se avaliar
alguns eventos da resposta inflamatória no enxerto, por isso analisamos a população
celular infiltrada na pele transplantada e as citocinas que eram produzidas por elas ao
longo do tempo de transplante.
Analisando-se a cinética do número de células inflamatórias encontradas nos
enxertos alogênicos e singênicos transplantados em camundongos BALB/c,
observou-se que no período entre 7 horas e 72 horas pós-transplante, o número de
células presentes no enxerto alogênico e singênico foi muito similar. Dados esses
esperados, uma vez que o dano tecidual provocado pela cirurgia gera resposta
inflamatória.
No enxerto alogênico o número de células aumenta progressivamente sendo
observado pico de infiltração celular no nono dia pós-transplante. Essa amplificação
da resposta inflamatória no transplante alogênico pode ocorrer em virtude da
migração de linfócitos T CD4 e T CD8, essas células são ativadas no linfonodo por
células apresentadoras de antígenos do doador que migram a esse órgão (Karman et
al., 2006; Young et al., 2007), posteriormente a produção de citocinas pró-
inflamatórias por estes linfócitos induz o recrutamento de células inflamatórias ao local
do transplante (Lovegrove et al., 2001; Richards et al., 2004; Waldmann, 1999).
Em contrapartida, no enxerto singênico ocorreu pico de infiltração celular no
ponto de 24 horas e após esse período houve diminuição do número de células até o
nono dia. Isso também era esperado, por causa da natureza da combinação doador-
receptor em que não há diferenças quanto aos antígenos do MHC e, portanto,
ausência de estimulação aloantigênica. Nestas circunstâncias, não é esperado que
ocorra diferenciação dos linfócitos T em células efetoras, a não ser que haja quebra
da tolerância aos antígenos próprios. Dessa forma, na ausência desse estímulo a
resposta imune decorrente da cirurgia diminuiria gradualmente e seria esperado que o
transplante fosse aceito. É possível observar um efeito similar após a isquemia e
reperfusão de tecidos próprios, após o tecido ser submetido à isquemia por um
determinado período, em geral ocorre a elevação de marcadores inflamatórios e
aumento de células inflamatórias, estes porém retornam a níveis basais após cerca
de 24 horas (Herskowitz et al., 1995; Platz et al., 1998).
Curiosamente, a população majoritária presente em todos os tempos pós-
transplante, tanto no transplante singênico quanto alogênico, foi a de neutrófilos. A
72
porcentagem destes foi sempre acima de 70% da população total, sendo que com 7
horas e 24 horas pós-transplante 95% da população celular era de neutrófilos tanto no
enxerto singênico quanto alogênico. Essas observações indicam que os neutrófilos
têm participação muito importante no processo de rejeição de enxertos alogênicos,
mas também levantam a possibilidade de que essas células tenham um papel no
aceite de enxertos singênicos.
No enxerto alogênico foi observado aumento significativo do número de
neutrófilos ao longo do tempo pós-transplante. Essa população pode contribuir para a
rejeição dos enxertos de diversas maneiras; liberam espécies reativas de oxigênio e
substâncias proteolíticas e também produzem quimiocinas que atraem e ativam
células apresentadoras de antígenos (Buonocore et al., 2004; Nathan, 2006). Alguns
trabalhos mostram que neutrófilos podem realizar a apresentar antígenos à células T
por vias alternativas de processamento de antígenos (Nathan, 2006; Potter e Harding,
2001; Reali et al., 1996) e que em determinados pacientes que sofrem de doenças
inflamatórias crônicas, neutrófilos humanos podem expressar MHC de classe II e
poderiam atuar como APCs (Fanger et al., 1997; Radsak et al., 2000), indicando outro
mecanismo pelo qual neturófilos poderiam contribuir para a rejeição. Outros trabalhos
mostraram que existe uma correlação entre a presença de neutrófilos e a rejeição
aguda (Hirayama et al., 2006; Surquin et al., 2005), sendo que Morita et al já havia
demonstrado em 2001 que a depleção de neutrófilos resulta na sobrevida de enxertos
cardíacos alogênicos de 8-10 dias para 21 dias.
No transplante singênico, nos tempos de 7 e 9 dias pós-transplante houve
diminuição do número de células inflamatórias, mas a porcentagem de neutrófilos que
compunha esse infiltrado celular foi alta. Como a presença de neutrófilos no enxerto
singênico não acarretou em destruição tecidual e os enxertos foram aceitos, os dados
sugerem que a presença dos neutrófilos nos enxertos singênicos não foi deletéria. É
possível que a presença de neutrófilos seja inclusive benéfica para o aceite de
enxertos de pele. Existem trabalhos mostrando que os neutrófilos são importantes
para a neovascularização tecidual e início do reparo de tecidos que sofreram lesão
(Ohki et al., 2005; Toumi et al., 2006).
De modo geral, a presença de células polimorfonucleares é considerada um
mau-prognóstico para o aceite de transplantes. No entanto no caso de transplantes de
pele, para os quais o processo de neovascularização é importante, os neutrófilos
possuem um papel importante para o aceite dos enxertos. Experimentos realizados
73
em nosso laboratório mostraram que a depleção de neutrófilos não atenuou a
rejeição, mas resultou em ausência de neovascularização na pele, provocando a
morte dos enxertos por hipoxia (dados não publicados).
Outra população celular que foi avaliada em nosso estudo foram os macrófagos.
A presença de macrófagos em órgãos transplantados é bem descrita na literatura,
pois esta população celular está sempre presente no enxerto (Hancock et al., 1983). A
dinâmica de entrada dessas células é bem estabelecida no caso de transplantes
renais (Grimm et al., 1999; Hancock et al., 1983; Wyburn et al., 2005; Wyburn et al.,
2005). Nossos estudos com transplante de pele mostraram resultados compatíveis
com esses estudos prévios, foi observado aumento contínuo do número de
macrófagos até o nono dia pós-transplante nos enxertos alogênicos. No caso do
transplante singênico, observou-se infiltração de macrófagos nos tempos iniciais pós-
transplante, isto é até 72 horas e após esse ponto o número de macrófagos diminuiu.
Segundo os nossos resultados, podemos inferir que o ponto de 72 horas parece
ser um momento importante para o encaminhamento do aceite ou rejeição dos
transplantes em nosso modelo. Nesse período observou-se aumento da concentração
de citocinas inflamatórias e entrada de linfócitos no enxerto alogênico, enquanto que
no enxerto singênico foi observado diminuição do número de células inflamatórias e
diminuição de produção de citocinas pró-inflamatórias.
Analisando o conjunto desses dados, é possível que os macrófagos participem
do direcionamento da resposta inflamatória nos enxertos. No enxerto alogênico, o
aumento dessas células poderia resultar em aumento da produção de substâncias
pró-inflamatórias. Foi mostrado que a lesão decorrente da cirurgia, no caso do
transplante, ativa o endotélio e a liberação de substâncias inflamatórias; essas
substâncias podem ativar os macrófagos e induzí-los à produzir citocinas pró-
inflamatórias e óxido nítrico (Morital et al, 2001; Wyburn, 2005). Desta maneira, nos
tempos inicias pós-transplante a ação dos macrófagos pode, de fato, ser danosa ao
tecido transplantado. No enxerto singênico, os macrófagos poderiam participar no
controle da resposta inflamatória e auxiliar na reparação tecidual, por meio de
produção de IL-10, TGF
β
, enzimas proteolíticas, prostraglandina D2 e fagocitose de
células necróticas e em apoptose (Ayala et al., 2003; Hays et al., 2008; Maderna e
Godson, 2003).
O duplo comportamento dos macrófagos é bem descrito na literatura. Em 1998,
(Erwig et al., 1998) descreveram que essa população de células adquire
74
características pró ou anti-inflamatórias dependendo do meio em que se encontram;
essa modulação é dependente do contato inicial destas células com citocinas
presentes no meio.
Outras populações avaliadas em nosso estudo foram as células T CD4
+
e T
CD8
+
. Foram avaliadas a dinâmica e proporção de entrada dessas células nos
enxertos. Esse tipo de análise é importante, pois apesar do grande número de
estudos procurando-se avaliar ao papel dessas células na rejeição (Bueno e Pestana,
2002; Christianson et al., 1993; Krieger et al., 1996; Youssef et al., 2004), ainda
existem dúvidas quanto à contribuição relativa pela qual células T CD4
+
ou T CD8
+
seriam responsáveis pela rejeição.
Em relação à presença de células T CD4
+
e T CD8
+
em nosso estudo, nossos
resultados mostram grande infiltração destas células nos enxertos alogênicos no
sétimo e nono dia pós-transplante em comparação com o transplante singênico. Um
fato que deve ser observado é que a quantidade de células T CD4
+
encontradas no
enxerto foi maior em relação às células T CD8
+
. Esses dados sugerem que existe
grande participação de células T CD4
+
na rejeição e que provavelmente existe
colaboração de ambas as populações nesse processo (Haskova et al., 2000; Tanaka
et al., 2001; Zhai et al., 2007). Neste caso, as células T CD4
+
devem contribuir para a
rejeição, especialmente devido ao seu papel na produção de citocinas pró-
inflamatórias que ativam células efetoras e ativam células T CD8
+
citotóxicas. Outra
forma pela qual estas células poderiam participar da rejeição seria através da
liberação de granzima/perforina, contribuindo para a destruição tecidual do enxerto
(Hombach et al., 2001).
Em razão da presença significativa de células polimorfonucleares e macrófagos
nos enxertos e sabendo-se que o óxido nítrico é um composto produzido por essas
células, avaliou-se a produção de óxido nítrico no enxerto. Os resultados obtidos em
nosso trabalho mostram que existe maior produção de óxido nítrico no enxerto
alogênico quando comparado ao enxerto singênico. Estes resultados estão de acordo
com dados da literatura, pois diversos trabalhos já demonstraram a correlação entre a
produção de óxido nítrico e a rejeição de aloenxertos (Holan et al., 2002; Holan et al.,
2005; Vos et al., 2000; Winlaw et al., 1995; Worrall et al., 1997). Altas concentrações
de óxido nítrico podem auxiliar no processo de rejeição dos enxertos por causar
destruição tecidual, esse composto induziria dano tecidual através do aumento a
fibrose e necrose de tecidos (Kolb e Kolb-Bachofen, 1998; Pfeilschifter et al., 2001).
75
Além disso, a indução de iNOS está relacionada ao aumento de efeitos inflamatórios
citotóxicos no enxerto, sendo que a inibição dessa enzima resulta em prolongamento
da sobrevida do enxerto alogênico (Vos et al., 2000).
Nos enxertos singênicos apesar de ser observada produção de óxido nítrico,
essa produção parece não prejudicar o aceite destes enxertos. A produção desse
composto foi baixa nos enxertos singênicos e talvez tenha sido insuficiente para
induzir dano ou algum estímulo pró-inflamatório. Entretanto, é importante lembrar que
os efeitos desse composto no sistema imune são muito variáveis e podem atuar de
acordo com a sua concentração ou tempo de exposição sobre as células (Kolb e
Kolb-Bachofen, 1998; Tripathi et al., 2007), portanto não se pode descartar a
possibilidade de que no transplante singênico o óxido nítrico possa atuar de forma
positiva para o aceite. Alguns dados corroboram com essa hipótese, como seu efeito
regulador sobre a inflamação; ele é capaz de diminuir a expressão de moléculas de
adesão no endotélio, como por exemplo, de selectinas e com isso diminuir a entrada
de células inflamatórias no enxerto; também pode diminuir a proliferação de linfócitos
T e B; e inibir a produção de anticorpos (Bogdan, 2001); em transplantes já foi
descrito que a liberação contínua de óxido nítrico pode prevenir a hiperplasia intimal e
formação de trombose na superfície do endotélio (Lee et al., 1999).
Conforme citado anteriormente, observou-se que neutrófilos representaram a
parcela majoritária das células inflamatórias nos enxertos. Em razão de pesquisas
que demonstraram a existência de uma população de células, denominada Th17,
capaz de secretar IL-17 e induzir o recrutamento de neutrófilos(Bettelli et al., 2006;
Harrington et al., 2006), foi investigada a produção de citocinas relacionadas as
células Th17.
Em 2006, (Veldhoen et al., 2006) mostraram que as citocinas IL-6 e TGF
β
eram
responsáveis pela geração das células Th17. Portanto, decidimos investigar a
produção destas citocinas nos enxertos singênicos e alogênicos.
Em relação à IL-6, observamos maior produção de IL-6 no transplante alogênico
entre 24 horas e 7 dias, sendo que no ponto de 7 horas pós-transplante já foi possível
observar maior tendência de produção de IL-6 em relação ao transplante singênico.
Além disso, a produção desta citocina parece ser maior nos tempos iniciais pós-
transplante, isto é até 72 horas. A participação de IL-6 na rejeição de enxertos
alogênicos já foi descrita anteriormente (Jerin et al., 2003; Liang et al., 2007; Min et
al., 2001),assim como foi observado em nosso estudo, no trabalho de Liang et al
76
também detectou-se produção de IL-6 em períodos muito iniciais pós-transplante, a
IL-6 foi detectada no soro de animais que receberam transplantes cardíacos
alogênicos no ponto de 6 horas pós-transplante.
Um fato intrigante mostrado no trabalho de Liang et al é que para o processo de
rejeição a produção de IL-6 parece mais importante no doador e não no receptor; seu
grupo demonstrou que o transplante de enxertos alogênicos de animais IL-6
-/-
resulta
em aumento de sobrevida, mas peles alogênicas transplantadas em receptores IL-6
-/-
não apresentam aumento de sobrevida. Um possível mecanismo de rejeição por meio
da IL-6 seria através da supressão de células T reguladoras (Treg) permitindo maior
ativação de células T (Pasare e Medzhitov, 2003).
Outra citocina avaliada em nosso estudo foi o TGF
β
, pois, como dito
anteriormente, essa citocina em conjunto com a IL-6 é uma importante indutora de
células Th17, promovendo também a expressão do receptor de IL-23 nestas células
(Mangan et al., 2006). No entanto, é importante lembrar que o TGF
β
é uma citocina
primariamente descrita como uma potente imunossupressora, pois além de suprimir
diferenciação de células Th1 e Th2, também é um indutor de células Treg FOXP3
+
(Fantini et al., 2004). Sendo assim, torna-se evidente que o TGF
β
possui um papel
duplo no direcionamento da resposta imune dependendo das citocinas às quais se
associa, podendo encaminhar a resposta dos linfócitos para um perfil inflamatório ou
para um perfil supressor.
Comparando-se a produção dessa citocina nos enxertos singênicos e
alogênicos, foi observado que houve alta produção de TGF
β
em praticamente todos
os tempos pós-transplante tanto no transplante alogênico quanto singênico. Nos
enxertos alogênicos ocorreu produção de TGF
β
concomitantes com produção de IL-6,
indicando que nesse contexto seria possível a geração de células Th17. De fato foi
observada produção alta produção de IL-17 nestes enxertos a partir de 72 horas,
indicando uma alta probabilidade de que realmente haja participação de células Th17
na rejeição dos enxertos alogênicos.
Em contrapartida, no transplante singênico, no qual também ocorreu alta
produção de TGF
β
e a produção de IL-6 foi muito baixa, praticamente não houve
produção de IL-17. O único ponto em que foi observada IL-17 no transplante
singênico foi no de 9 dias, é possível que essa produção de IL-17 seja decorrente do
aumento do número de célulasT CD4
+
no sétimo dia pós-transplante. Existem alguns
77
trabalhos indicando que células Th2 também podem produzir IL-17 e nesse caso a IL-
17 possuiria atividade imunossupressora (Owyang et al., 2006; Starnes et al., 2002).
Talvez ainda mais importante que o seu papel na geração de células Th17, o
papel local do TGF
β
no enxerto atuando na cicatrização e fibrose seja de fundamental
importância para o aceite ou rejeição do enxerto. Existe uma correlação, já bem
estabelecida entre a produção excessiva de TGF
β
, por macrófagos em locais de dano,
e uma maior deposição de colágeno e fibrose (Hays et al., 2008; Verrecchia e
Mauviel, 2007; Wyburn et al., 2005). TGF
β
é uma citocina reguladora chave na
remodelagem e construção da matriz extracelular e por isso o seu papel da na
cicatrização tem sido ostensivamente estudado.
Outra citocina relacionada às células Th17 que foi estudada foi a IL-23, uma vez
que tem sido demonstrado que a IL-23 é importante para amplificação e sobrevivência
de células Th17 (Bettelli et al., 2006; Veldhoen e Stockinger, 2006). Além disso, a
relevância da IL-23 nos processos inflamatórios não é restrita somente à manutenção
das células Th17 tem sido ao recrutamento de neutrófilos e macrófagos em doenças
inflamatórias (Cua et al., 2003).
Em nosso estudo foi comparada a produção de IL-23 entre transplantes
singênicos e alogênicos. Como indicado nos resultados foi visto que há maior
produção de IL-23 nos transplantes alogênicos até 72 horas pós-transplante,
enquanto no transplante singênico ocorreu pequena produção de IL-23 apenas no
ponto de 24 horas. A produção de IL-23 nos enxertos alogênicos pode ser
responsável pelo aumento do número de macrófagos, observado a partir de 72 horas
(Figura 5F). Conforme visto nos trabalhos de Cua et al (2002) e (Wiekowski et al.,
2001) parece haver uma correlação entre a produção de IL-23 e o aumento de
macrófragos no sítio de inflamação.
Em 2001, Lira et al mostraram que a expressão ubíqua ou em múltiplos tecidos
de um epítopo da IL-23, quando elevada em camundongos, resultou em fenótipos de
inflamação sistêmica, falha de crescimento, infertilidade, morte acelerada e maior
índice de camundongos natimortos. Além disso, os animais eram anêmicos e tinham
números aumentados de neutrófilos no sangue, no soro destes animais havia níveis
elevados de IL-1 e TNF. No mesmo trabalho, foi observado que nestes animais vários
tecidos apresentavam grande infiltração de linfócitos, macrófagos e neutrófilos, a pele
possuía infiltração de neutrófilos e macrófagos na derme e epiderme, além de
acantose (espessamento da epiderme), acompanhada de ulceração e necrose. As
78
características da pele com expressão elevada de IL-23 foram muito semelhantes às
das peles IL-10
-/-
aceitas no transplante singênico (Figuras 8 e 9).
Conforme mencionado anteriormente houve maior produção de IL-17 nos
enxertos alogênicos quando comparado aos enxertos singênicos. Além disso,
também foi observado produção de IL-22 nos enxertos alogênicos enquanto no
enxerto singênico não houve detecção dessa citocina. Tanto IL-22 quanto IL-17 foram
produzidas em maior quantidade no sétimo e nono dia pós-transplante, quando é
observado maior infiltração de linfócitos nos enxertos alogênicos.
O papel efetor da IL-22 ainda não está claro, mas parece ser importante em
doenças inflamatórias da pele, como a psoríase, que se trata de uma doença crônica
inflamatória que tem como característica a infiltração de leucócitos na derme e
epiderme e hiperplasia da epiderme (acantose). Em 2007, Zheng et al descreveram
que a produção de IL-22 em orelhas de camundongos provocava acantose e grande
infiltração celular, enquanto que o bloqueio de IL-22 resultava em diminuição da
infiltração de macrófagos e neutrófilos, mas especialmente de neutrófilos. Baseado
nesses dados e nos resultados obtidos em nosso laboratório pode-se sugerir que no
caso do transplante de pele, a IL-22 parece ter um papel bastante importante para a
rejeição de enxertos alogênicos, contribuindo para o aumento de infiltração de células
polimorfonucleares.
A produção de IL-22 e IL-17 em conjunto com a expressão de IL-6, TGF
β
e IL-23
nos transplantes alogênicos é um forte indício de que há participação de células Th17
no processo de rejeição da pele. A relação entre produção de IL-22 e IL-23 e a
indução de processos inflamatórios na pele é um dado muito interessante, uma vez
que induziu fenótipos semelhantes à psoríase na pele de camundongos (Wiekowski et
al., 2001; Zheng et al., 2007) e esse fenótipo foi muito similar ao encontrado nos
transplantes singênicos na ausência total de IL-10 ou na ausência de IL-10 no doador
(IL-10
-/-
IL-10
-/-
ou IL-10
-/-
WT). Possivelmente a ausência da IL-10 provoca uma
falha na regulação do processo inflamatório na pele; nessa situação macrófagos
ativados produziriam TGF
β
e se houvesse produção de IL-6 poderia ocorrer indução
de células Th17. A produção de IL-22 e IL-17 pelas células Th17 provocaria os
fenótipos observados nesses transplantes: acantose e infiltração de células
inflamatórias.
Com relação à produção de IFN
γ
, nossos experimentos mostram que a produção
dessa citocina foi sempre maior no enxerto alogênico em relação ao enxerto
79
singênico. Já no ponto de 7 horas foi possível observar produção de IFN
γ
no enxerto
alogênico, enquanto que no enxerto singênico essa citocina não foi detectada. Essa
produção precoce de IFN
γ
sugere que células T de memória poderiam estar
participando do ínicio do processo de rejeição. A participação de células T de
memória produtoras de IFN
γ
já foi descrita na literatura como um fator que favorece a
rejeição dos enxertos (El-Sawy et al., 2004; Heeger et al., 1999).
Foi interessante observar que nos tempos de 7 dias e 9 dias pós-transplante,
houve alta produção de IFN
γ
ao mesmo tempo em que também houve alta produção
de IL-17. Poder-se-ia esperar que a produção de IFN
γ
diminuísse a produção de IL-
17, uma vez que, em 2005 o grupo de Weaver et al e o grupo de Yang et al,
publicaram trabalhos nos quais foi mostrado que IFN
γ
suprimia a diferenciação de
células T naïve em Th17.
Possivelmente não foi observado diminuição na produção de IL-17 quando
ocorreu aumento de IFN
γ
nos enxertos alogênicos, uma vez que a produção dessas
citocinas não foi medida no linfonodo (local onde ocorre a diferenciação de linfócitos T
naïve para os perfis Th1 ou Th17), mas sim pelas células presentes nos enxertos.
Teoricamente, a maior parte das células encontradas no enxerto já foram
diferenciadas e exercem um papel efetor, portanto mesmo que ocorresse aumento da
produção de IFN
γ
no enxerto, essa produção poderia não afetar a produção de IL-17
pelas células Th17. Outra possibilidade seria a presença de células Th17 duplo
positivas para IFN
γ
e IL-17 no enxerto. Essas células já foram descritas em células
humanas (Chen et al., 2007; Wilson et al., 2007).
No transplante singênico também foi observada produção de IFN
γ
no nono dia
pós-transplante, embora em pequena quantidade. É importante lembrar que IFN
γ
além
de induzir a resposta citotóxica de células T CD8
+
também possui um papel regulador.
No caso do transplante singênico, a produção de IFN
γ
poderia ser importante para
regular a resposta inflamatória e não atuaria necessariamente como uma citocina pró-
inlamatória. Existem trabalhos mostrando que a produção de IFN
γ
protege contra a
necrose de enxertos (Halloran et al., 2001) e é um importante regulador da
homeostase de célulasT CD4 e CD8, induzindo apoptose nessas células (Seder e
Ahmed, 2003; Yang et al., 2005).
Outra citocina que possui uma importante função reguladora da resposta imune
é a IL-10. No caso de transplantes, há resultados contraditórios à respeito da terapia
80
empregando-se IL-10 na tentativa de prolongar a sobrevida de enxertos alogênicos
em modelos de transplantes em animais.
Esses dados controversos relativos ao tratamento de enxertos alogênicos com
IL-10 ainda não são bem compreendidos, mas altas quantidades de IL-10 parecem
ser deletérias enquanto que baixas quantidades de IL-10 parecem ser benéficas para
a sobrevida do enxerto alogênico (Moore et al., 2001). Esta última observação feita
no trabalho de Moore et al (2001) parece bastante pertinente em relação aos dados
obtidos em nosso trabalho, onde foi observada produção de IL-10 em todos os
tempos pós-transplante do enxerto singênico, embora não em níveis muito elevados.
Em nossos estudos, o pico de produção de IL-10 no enxerto singênico foi em
24 horas, e os níveis dessa citocina foram menores em relação aos dos enxertos
alogênicos cujo pico ocorreu em 72 horas. Esses dados indicam que pequenas
variações de IL-10 assim como o momento em que a mesma é produzida poderiam
influenciar na resposta ao transplante, favorecendo ou prejudicando o aceite do
enxerto. Essa última idéia foi reforçada pelos experimentos onde se observou
aumento da sobrevida do enxerto alogênico no modelo em que a pele singênica foi
transplantada ao mesmo tempo em que a pele alogênica; esse efeito se perdeu
quando houve intervalo de 24 horas entre o transplante da pele singênica e da pele
alogênica.
Para melhor investigar o papel da IL-10 no aceite de transplantes, foram
realizados transplantes alogênicos e singênicos na ausência ou presença de IL-10.
Os experimentos mostraram que não somente a produção de IL-10 é essencial para o
aceite de enxertos singênicos, mas também que a IL-10 produzida pelas células
presentes no enxerto parece ser fundamental para o aceite do transplante. Como
pode ser visto na figura 9B e C, quando a pele do doador IL-10 competente é
transplantada em camundongos IL-10
-/-
observa-se que o aceite do enxerto ocorre de
forma muito similar ao ocorrido em combinações doador-receptor providos de IL-10.
Por outro lado, a presença de IL-10 no receptor não foi suficiente para favorecer o
enxerto de pele de camundongos IL-10
-/-
. O fato de que a porcentagem de aceite de
enxertos providos de IL-10 seja significativamente maior em relação aos enxertos
provenientes de animais IL-10
-/-
, mesmo que estes sejam transplantados em animais
IL-10 competentes, apontam que a produção local de IL-10 é extremamente
importante para esse processo. Na literatura há evidências de que nem sempre o
tratamento dos enxertos com IL-10 resulta em melhora da sobrevida (Kuttler et al.,
81
2007; Li et al., 1999; Qian et al., 1996; Zheng et al., 1995) e nota-se que, dentre essas
tentativas, tratamentos que utilizam a administração sistêmica de IL-10 são menos
bem sucedidos (Qian et al., 1996; Furukawa et al., 1999). Baseando-se em nossos
resultados podemos inferir que a regulação mediada por IL-10 é complexa. Portanto
para que se obtenham resultados positivos ao utilizar essa citocina no tratamento de
transplantes, é necessário que se compreenda melhor em que momento a IL-10 deve
ser introduzida no tratamento, quais as concentrações apropriadas que devem ser
utilizadas e a duração do tratamento.
Com o intuito de investigar se a ausência de IL-10 poderia acarretar um aumento
da resposta inflamatória nos enxertos, caracterizamos as células infiltrantes nos
enxertos singênicos e alogênicos na ausência de IL-10 nos pontos de 24 horas, 72
horas e 7 dias pós-transplante. No caso dos enxertos alogênicos, ao contrário do
esperado, não foram observadas diferenças significativas em relação ao número de
células inflamatórias entre os receptores IL-10
-/-
ou WT em nenhum dos pontos
avaliados. Esperávamos encontrar maior quantidade de células inflamatórias nos
camundongos C57Bl6/IL-10
-/-
em comparação com os camundongos C57Bl6/IL-10
+/+
,
uma vez que os receptores IL-10 deficientes apresentaram rejeição acelerada do
aloenxerto. Esses dados sugerem que a rejeição acelerada dos aloenxertos na
ausência de IL-10 não seja decorrente de um aumento do número de células
inflamatórias no enxerto. Pode-se ainda considerar que, apesar da semelhança
quanto ao número de células entre os grupos, as células inflamatórias encontradas
nos camundongos C57Bl6/IL-10
-/-
estariam mais ativadas e produzindo maior
quantidade de fatores pró-inflamatórios prejudicando a aceitação do enxerto.
Quanto aos transplantes singênicos realizados na ausência ou presença de IL-
10, foi visto que existe aumento do número de células inflamatórias nos enxertos IL-
10
-/-
(IL-10
-/-
WT ou WT IL-10
-/-
), conforme observado nas figuras 13 e 14. Esse
aumento é mais evidente no sétimo dia pós-transplante, quando são encontrados
maior número de neutrófilos, macrófagos e linfócitos T CD4
+
e T CD8
+
.
Existem trabalhos mostrando que em doenças autoimunes a porcentagem de
células T antígeno-específicas presentes no sítio inflamatório é muito pequena (Xiao e
Link, 1999) e alguns estudos sugerem que essa pequena parcela de células T
antígeno-específicas poderia regular células não-específicas direcionando-as para um
perfil pró-inflamatório (Brocke et al., 1996; Steinman, 1996). No caso do número
aumentado linfócitos T encontrados nos enxertos singênicos na ausência de IL-10,
82
seria improvável de que se tratassem de linfócitos T antígeno-específicos ativados,
pois teoricamente os epítopos expressos nestes tecidos são próprios e dessa forma,
não seria esperado que estas células T mediassem destruição do enxerto a não ser
que houvesse alguma falha na tolerância aos antígenos próprios ou se fosse possível
que estas células fossem ativadas devido à grande concentração de fatores
inflamatórios no local. É mais provável que o fato de se encontrar número aumentado
de linfócitos T seja decorrente do aumento do número de macrófagos e neutrófilos,
essas populações celulares poderiam secretar citocinas inflamatórias e quimiocionas
e conseqüentemente causar o recrutamento de linfócitos T CD4
+
e T CD8
+
(Buonocore et al., 2004). Esses dados sugerem que a produção de IL-10 pelas
células presentes no tecido doado deve ser importante para controlar a reação
inflamatória local e restringir o influxo de células no enxerto. No entanto, permanece a
questão se estes linfócitos participam da destruição tecidual do enxerto.
Esses últimos dados somados aos resultados anteriores que mostram maior
produção de IL-10 nos enxertos singênicos em relação aos enxertos alogênicos no
ponto de 24 horas sugerem que células do próprio enxerto, mediante o estímulo
inflamatório no local do transplante, produziriam IL-10 para regular a resposta
inflamatória local. Essas células poderiam ser ativadas mediante o processo
inflamatório desencadeado pelo dano da cirurgia e na ausência de estímulos de alo-
antígenos, produziriam IL-10. Condizente com essa hipótese Clark et al (2007)
descreveram a presença de Treg na pele, que são ativadas mediante processos
inflamatórios e produção de IL-15 (Clark e Kupper, 2007). Portanto, é possível que a
população celular envolvida nesse processo inclua a de células Treg do doador,
produtoras de IL-10. Além disso, existem outras importantes fontes de produção de
IL-10 na pele dentre elas as próprias células epiteliais, as células endoteliais, células
dendríticas, células de Langerhans, macrófagos (de Waal Malefyt et al., 1991) e
também queratinócitos, sendo que este último grupo celular compõe uma parcela
significativa das células presentes na epiderme e também podem ser uma importante
fonte de IL-10 (Enk et al., 1993).
Pela análise histológica, a pele singênica IL-10
-/-
transplantada apresenta um
aspecto muito semelhante às peles de indivíduos que sofrem de psoríase. À luz das
informações de que grandes quantidades de IL-22 e IL-23 podem induzir um fenótipo
de psoríase em peles sadias além do fato de que a IL-22 é uma citocina efetora de
células Th17 e capaz de estimular a proliferação de queratinócitos (Ma et al., 2008) e
83
que o bloqueio de IL-10 resulta em aumento de IL-17 na mucosa intestinal (Jarry et
al., 2008), é bem provável que células Th17 estejam participando da destruição
tecidual observada no transplante singênico IL-10
-/-
.
Uma hipótese é de que a IL-10 provavelmente iniba a ação das células Th17 e
conseqüentemente deve inibir a produção de IL-22 por estas células. Para investigar
se a ausência de IL-10 provoca um aumento de citocinas relacionadas às células
Th17, seria interessante avaliar a produção de IL-6, TGF
β
, IL-23, IL-17, IL-22 nos
transplantes com peles de camundongos IL-10
-/-
.
Outra possibilidade é a de que a produção de TGF
β
influencie o aspecto de
fibrose observado nos enxertos singênicos na ausência de IL-10 no doador (IL-10
-/-
IL-10
-/-
e IL-10
-/-
WT), uma vez que foi observada maior quantidade de macrófagos
no sétimo dia dos transplantes IL-10
-/-
IL-10
-/-
em relação ao controle WTWT. O
aumento de macrófagos poderia indicar maior produção de TGF
β
nestes enxertos. Se
em excesso, o TGF
β
é capaz induzir uma produção exacerbada de colágeno e
inibidores de proteases provocando o rearranjo anormal da matriz extracelular e
contribuindo para a formação de cicatrizes ao invés de um tecido de reparo sem
danos (Hays et al., 2008; Verrecchia e Mauviel, 2007; Wyburn et al., 2005). Para
confirmar essa hipótese será
necessário dosar a produção dessa citocina nos
enxertos.
A participação da IL-10 na modulação da resposta ao enxerto alogênico também
pode ser sugerida no modelo de transplante simultâneo. Embora não tenhamos
avaliado a sobrevida do enxerto alogênico na ausência da IL-10, nesse modelo, a
observação de que houve aumento de sobrevida da pele alogênica quando
transplantada ao mesmo tempo em que se realizou o transplante singênico, sugere
que a IL-10 produzida precocemente no enxerto singênico foi capaz de suprimir a
resposta imune aos antígenos alogênicos. É possível que o período entre 7 horas e
24 horas onde se observa, em experimentos anteriores, aumento da produção de IL-
10 no enxerto singênico, quando comparado ao alogênico, seja crucial para que se
tenha modulação da resposta imune aos aloantígenos. Essa hipótese se apóia
também na observação de que quando a pele alogênica foi transplantada 24 horas
após a singênica, a sobrevida não foi prolongada em relação ao controle alogênico.
Em 2006 Fucs et al mostraram que era possível induzir tolerância a enxertos
alogênicos através do aumento da frequência de células T CD4
+
CD25
+
reguladoras;
além disso a indução dessas células era dependente do reconhecimento cruzado de
84
epítopos próprios e alogênicos em células apresentadoras de antígeno (APC).
Portanto, é possível que o aumento da sobrevida do enxerto alogênico transplantado
simultaneamente com o enxerto singênico ocorra devido à geração de Tregs, sendo
que para a indução dessa população celular seja necessário que ocorra a
apresentação de antígenos próprios e alogênicos por uma mesma APC.
Além disso, especula-se que a produção de IL-10 pelo transplante singênico nas
primeiras 24 horas pós-transplante seja importante para regular a apresentação de
antígenos pelas APCs e contribuir para geração de Tregs. De maneira que quando
houve intervalo de 24 horas entre os transplantes singênico e alogênico, não ocorreu
aumento da sobrevida do enxerto alogênico. Para melhor elucidar essa hipótese,
poder-se-ia avaliar a população de células Treg quando o transplante simultâneo de
enxertos singênicos e alogênicos fosse realizado; assim seria possível verificar se há
aumento de Tregs nesta situação.
Resumindo, os resultados obtidos na caracterização de cinética de células
inflamatórias nos transplantes alogênicos e singênicos, mostram que em 7 horas já
ocorre produção diferencial de citocinas pró e anti-inflamatórias entre o enxerto
alogênico e o enxerto singênico. Isso indica que há um direcionamento precoce da
resposta imune para a rejeição ou aceite, logo nos tempos iniciais pós-transplante.
Conseqüentemente, é possível que ocorra discriminação de próprio e não próprio logo
após o transplante pois já existe um direcionamento da resposta imune no ponto de 7
horas pós-transplante.
O direcionamento da resposta imune pode ser decorrente do reconhecimento
dos antígenos próprios e não próprios por células T. Provavelmente as células
responsáveis pelo reconhecimento de antígenos próprios no enxerto singênico são
células Treg, já presentes no tecido que mediante o estímulo inflamatório são ativadas
e produzem IL-10. No enxerto alogênico pode ocorrer reconhecimento do alo-
antígeno por célulasT de memória que estimulam a resposta inflamatória através da
produção de IFN
γ
.
Além disso, os experimentos com camundongos IL-10 deficientes apontam que
a produção local de IL-10 nos enxertos é de extrema importância no processo de
aceite de enxertos, provavelmente regulando a entrada e atividade de células
inflamatórias no local do transplante.
85
6 CONCLUSÕES
86
1. O infiltrado celular no transplante alogênico aumenta progressivamente
enquanto que no enxerto singênico há progressiva diminuição das células
inflamatórias. Em 24 horas pós-transplante já é possível verificar tendência a um
perfil pró-inflamatório em resposta ao enxerto alogênico e anti-inflamatório no
enxerto singênico.
2. A produção de IL-10 é fundamental para o aceite de enxertos singênicos, sendo
que a produção dessa citocina pelas células presentes no tecido do doador
parece ser crucial nesse processo.
3. A IL-10 produzida no enxerto parece ser importante na regulação da resposta
inflamatória, diminuindo a entrada de células inflamatórias no local do
transplante. Em transplantes singênicos a ausência total de IL-10 ou a ausência
de IL-10 no doador acarreta em aumento do número de células inflamatórias no
enxerto e é observada destruição e maior fibrose do tecido transplantado.
4. A da resposta imune contra enxertos alogênicos parece ser modulada de através
de uma regulação exercida pelo transplante de pele singênica, além disso, essa
modulação aparente ser possível somente em um intervalo inferior à 24 horas
pós-transplante. Observamos que o transplante simultâneo de enxertos
alogênicos e singênicos acarreta em maior sobrevida do enxerto alogênico.
87
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
88
1
AMB. Transplantes de órgãos no Brasil. Revista da Associação Médica Brasileira.
2003;49(1):1.
Ando T, Langley RR, Wang Y, Jordan PA, Minagar A, Alexander JS, et al.
Inflammatory cytokines induce MAdCAM-1 in murine hepatic endothelial cells and
mediate alpha-4 beta-7 integrin dependent lymphocyte endothelial adhesion in vitro.
BMC physiology. 2007;7:10.
Andrade CF, Waddell TK, Keshavjee S, Liu M. Innate immunity and organ
transplantation: the potential role of toll-like receptors. American Journal of
Transplantation. 2005;5(5):969-75.
Andrews DM, Smyth MJ. Stress gets under your skin. Nature immunology.
2008;9(2):119-20.
Antonysamy MA, Fanslow WC, Fu F, Li W, Qian S, Troutt AB, et al. Evidence for a
role of IL-17 in organ allograft rejection: IL-17 promotes the functional differentiation of
dendritic cell progenitors. Journal of immunology. 1999;162(1):577-84.
Ayala A, Chung CS, Grutkoski PS, Song GY. Mechanisms of immune resolution.
Critical care medicine. 2003;31(8 Suppl):S558-71.
Barclay AN, Mason DW. Induction of Ia antigen in rat epidermal cells and gut
epithelium by immunological stimuli. The Journal of experimental medicine.
1982;156(6):1665-76.
Berg EL, Yoshino T, Rott LS, Robinson MK, Warnock RA, Kishimoto TK, et al. The
cutaneous lymphocyte antigen is a skin lymphocyte homing receptor for the vascular
lectin endothelial cell-leukocyte adhesion molecule 1. The Journal of experimental
medicine. 1991;174(6):1461-6.
Bettelli E, Carrier Y, Gao W, Korn T, Strom TB, Oukka M, et al. Reciprocal
developmental pathways for the generation of pathogenic effector TH17 and
regulatory T cells. Nature. 2006;441(7090):235-8.
Bishop DK, Chan Wood S, Eichwald EJ, Orosz CG. Immunobiology of allograft
rejection in the absence of IFN-gamma: CD8+ effector cells develop independently of
CD4+ cells and CD40-CD40 ligand interactions. Journal of immunology.
2001;166(5):3248-55.
1
De acordo com:
International Committee of Medical Journal Editors. Uniform requirements for manuscripts submitted to Biomedical Journal:
sample references. c2003 – [updated 2005 June 15; cited 2006 May 16]. Available from:
http://www.nlm.nih.gov/bsd/uniform_requirements.html.
89
Bogdan C. Nitric oxide and the immune response. Nature immunology.
2001;2(10):907-16.
Bradley JA, Sarawar SR, Porteous C, Wood PJ, Card S, Ager A, et al. Allograft
rejection in CD4+ T cell-reconstituted athymic nude rats--the nonessential role of host-
derived CD8+ cells. Transplantation. 1992;53(2):477-82.
Brocke S, Gijbels K, Allegretta M, Ferber I, Piercy C, Blankenstein T, et al. Treatment
of experimental encephalomyelitis with a peptide analogue of myelin basic protein.
Nature. 1996;379(6563):343-6.
Brook MO, Wood KJ, Jones ND. The impact of memory T cells on rejection and the
induction of tolerance. Transplantation. 2006;82(1):1-9.
Bueno V, Pestana JO. The role of CD8+ T cells during allograft rejection. Brazilian
journal of medical and biological research = Revista brasileira de pesquisas medicas e
biologicas / Sociedade Brasileira de Biofisica [et al. 2002;35(11):1247-58.
Buonocore S, Surquin M, Le Moine A, Abramowicz D, Flamand V, Goldman M.
Amplification of T-cell responses by neutrophils: relevance to allograft immunity.
Immunology letters. 2004;94(3):163-6.
Chen Z, Tato CM, Muul L, Laurence A, O'Shea JJ. Distinct regulation of interleukin-17
in human T helper lymphocytes. Arthritis and rheumatism. 2007;56(9):2936-46.
Christianson SW, Shultz LD, Leiter EH. Adoptive transfer of diabetes into
immunodeficient NOD-scid/scid mice. Relative contributions of CD4+ and CD8+ T-
cells from diabetic versus prediabetic NOD.NON-Thy-1a donors. Diabetes.
1993;42(1):44-55.
Clark RA, Kupper TS. IL-15 and dermal fibroblasts induce proliferation of natural
regulatory T cells isolated from human skin. Blood. 2007;109(1):194-202.
Cua DJ, Sherlock J, Chen Y, Murphy CA, Joyce B, Seymour B, et al. Interleukin-23
rather than interleukin-12 is the critical cytokine for autoimmune inflammation of the
brain. Nature. 2003;421(6924):744-8.
Davis WC, McKenzie IF, Melvold RW. A comparison of skin and heart graft rejection
patterns in H-2 mutant mice. Transplantation. 1980;29(3):189-92.
de Oliveira SI, Fernandes PD, Amarante Mendes JG, Jancar S. Phagocytosis of
apoptotic and necrotic thymocytes is inhibited by PAF-receptor antagonists and affects
LPS-induced COX-2 expression in murine macrophages. Prostaglandins & other lipid
mediators. 2006;80(1-2):62-73.
90
de Waal Malefyt R, Abrams J, Bennett B, Figdor CG, de Vries JE. Interleukin 10(IL-10)
inhibits cytokine synthesis by human monocytes: an autoregulatory role of IL-10
produced by monocytes. The Journal of experimental medicine. 1991;174(5):1209-20.
Deschamps JY, Roux FA, Sai P, Gouin E. History of xenotransplantation.
Xenotransplantation. 2005;12(2):91-109.
Dubernard JM, Lengele B, Morelon E, Testelin S, Badet L, Moure C, et al. Outcomes
18 months after the first human partial face transplantation. The New England journal
of medicine. 2007;357(24):2451-60.
el-Sawy T, Fahmy NM, Fairchild RL. Chemokines: directing leukocyte infiltration into
allografts. Current opinion in immunology. 2002;14(5):562-8.
El-Sawy T, Miura M, Fairchild R. Early T cell response to allografts occurring prior to
alloantigen priming up-regulates innate-mediated inflammation and graft necrosis. The
American journal of pathology. 2004;165(1):147-57.
Eming SA, Werner S, Bugnon P, Wickenhauser C, Siewe L, Utermohlen O, et al.
Accelerated wound closure in mice deficient for interleukin-10. The American journal of
pathology. 2007;170(1):188-202.
Enk AH, Angeloni VL, Udey MC, Katz SI. Inhibition of Langerhans cell antigen-
presenting function by IL-10. A role for IL-10 in induction of tolerance. Journal of
immunology. 1993;151(5):2390-8.
Erwig LP, Kluth DC, Walsh GM, Rees AJ. Initial cytokine exposure determines function
of macrophages and renders them unresponsive to other cytokines. Journal of
immunology. 1998;161(4):1983-8.
Fabrega AJ, Fasbender AJ, Struble S, Zabner J. Cationic lipid-mediated transfer of the
hIL-10 gene prolongs survival of allogeneic hepatocytes in Nagase analbuminemic
rats. Transplantation. 1996;62(12):1866-71.
Fadok VA, Bratton DL, Konowal A, Freed PW, Westcott JY, Henson PM.
Macrophages that have ingested apoptotic cells in vitro inhibit proinflammatory
cytokine production through autocrine/paracrine mechanisms involving TGF-beta,
PGE2, and PAF. The Journal of clinical investigation. 1998;101(4):890-8.
Fadok VA, Chimini G. The phagocytosis of apoptotic cells. Seminars in immunology.
2001;13(6):365-72.
Fanger NA, Liu C, Guyre PM, Wardwell K, O'Neil J, Guo TL, et al. Activation of human
T cells by major histocompatability complex class II expressing neutrophils:
proliferation in the presence of superantigen, but not tetanus toxoid. Blood.
1997;89(11):4128-35.
91
Fantini MC, Becker C, Monteleone G, Pallone F, Galle PR, Neurath MF. Cutting edge:
TGF-beta induces a regulatory phenotype in CD4+CD25- T cells through Foxp3
induction and down-regulation of Smad7. Journal of immunology. 2004;172(9):5149-
53.
Fiorentino DF, Bond MW, Mosmann TR. Two types of mouse T helper cell. IV. Th2
clones secrete a factor that inhibits cytokine production by Th1 clones. The Journal of
experimental medicine. 1989;170(6):2081-95.
Fischbein MP, Yun J, Laks H, Irie Y, Oslund-Pinderski L, Fishbein MC, et al.
Regulated interleukin-10 expression prevents chronic rejection of transplanted hearts.
The Journal of thoracic and cardiovascular surgery. 2003;126(1):216-23.
Furukawa Y, Becker G, Stinn JL, Shimizu K, Libby P, Mitchell RN. Interleukin-10 (IL-
10) augments allograft arterial disease: paradoxical effects of IL-10 in vivo. The
American journal of pathology. 1999;155(6):1929-39.
Gibson T, Medawar PB. The fate of skin homografts in man. Journal of anatomy.
1943;77(Pt 4):299-310 4.
Grimm PC, McKenna R, Nickerson P, Russell ME, Gough J, Gospodarek E, et al.
Clinical rejection is distinguished from subclinical rejection by increased infiltration by a
population of activated macrophages. Journal of the American Society of Nephrology.
1999;10(7):1582-9.
Halloran PF, Miller LW, Urmson J, Ramassar V, Zhu LF, Kneteman NM, et al. IFN-
gamma alters the pathology of graft rejection: protection from early necrosis. Journal
of immunology. 2001;166(12):7072-81.
Hancock WW, Thomson NM, Atkins RC. Composition of interstitial cellular infiltrate
identified by monoclonal antibodies in renal biopsies of rejecting human renal
allografts. Transplantation. 1983;35(5):458-63.
Harrington LE, Mangan PR, Weaver CT. Expanding the effector CD4 T-cell repertoire:
the Th17 lineage. Current opinion in immunology. 2006;18(3):349-56.
Haskova Z, Usiu N, Pepose JS, Ferguson TA, Stuart PM. CD4+ T cells are critical for
corneal, but not skin, allograft rejection. Transplantation. 2000;69(4):483-7.
Hays PL, Kawamura S, Deng XH, Dagher E, Mithoefer K, Ying L, et al. The role of
macrophages in early healing of a tendon graft in a bone tunnel. The Journal of bone
and joint surgery. 2008;90(3):565-79.
He C, Schenk S, Zhang Q, Valujskikh A, Bayer J, Fairchild RL, et al. Effects of T cell
frequency and graft size on transplant outcome in mice. Journal of immunology.
2004;172(1):240-7.
92
Heeger PS, Greenspan NS, Kuhlenschmidt S, Dejelo C, Hricik DE, Schulak JA, et al.
Pretransplant frequency of donor-specific, IFN-gamma-producing lymphocytes is a
manifestation of immunologic memory and correlates with the risk of posttransplant
rejection episodes. Journal of immunology. 1999;163(4):2267-75.
Herskowitz A, Choi S, Ansari AA, Wesselingh S. Cytokine mRNA expression in
postischemic/reperfused myocardium. The American journal of pathology.
1995;146(2):419-28.
Hildemann WH, Morgan M, Frautnick L. Immunogenetic components of weaker
histoincompatibility systems in mice. Transplantation proceedings. 1970;2(1):24-31.
Hirayama S, Shiraishi T, Shirakusa T, Higuchi T, Miller EJ. Prevention of neutrophil
migration ameliorates rat lung allograft rejection. Molecular medicine (Cambridge,
Mass. 2006;12(9-10):208-13.
Holan V, Krulova M, Zajicova A, Pindjakova J. Nitric oxide as a regulatory and effector
molecule in the immune system. Molecular immunology. 2002;38(12-13):989-95.
Holan V, Pindjakova J, Zajicova A, Krulova M, Zelezna B, Matousek P, et al. The
activity of inducible nitric oxide synthase in rejected skin xenografts is selectively
inhibited by a factor produced by grafted cells. Xenotransplantation. 2005;12(3):227-
34.
Hombach A, Heuser C, Marquardt T, Wieczarkowiecz A, Groneck V, Pohl C, et al.
CD4+ T cells engrafted with a recombinant immunoreceptor efficiently lyse target cells
in a MHC antigen- and Fas-independent fashion. Journal of immunology.
2001;167(2):1090-6.
Horner BM, Randolph MA, Huang CA, Butler PE. Skin tolerance: in search of the Holy
Grail. Transplant international : official journal of the European Society for Organ
Transplantation. 2008;21(2):101-12.
Izcue A, Hue S, Buonocore S, Arancibia-Carcamo CV, Ahern PP, Iwakura Y, et al.
Interleukin-23 restrains regulatory T cell activity to drive T cell-dependent colitis.
Immunity. 2008;28(4):559-70.
Jarry A, Bossard C, Bou-Hanna C, Masson D, Espaze E, Denis MG, et al. Mucosal IL-
10 and TGF-beta play crucial roles in preventing LPS-driven, IFN-gamma-mediated
epithelial damage in human colon explants. The Journal of clinical investigation.
2008;118(3):1132-42.
JAX. Il10tm1Cgn, Version 1. 2008 11 Jun 2008 [cited 2008 13 Jun 2008]; Available
from: http://jaxmice.jax.org/pub-
cgi/protocols/protocols.sh?objtype=protocol&protocol_id=346
93
Jerin A, Pozar-Lukanovic N, Sojar V, Stanisavljevic D, Paver-Erzen V, Osredkar J.
Balance of pro- and anti-inflammatory cytokines in liver surgery. Clinical chemistry and
laboratory medicine 2003;41(7):899-903.
Joffre O, Santolaria T, Calise D, Al Saati T, Hudrisier D, Romagnoli P, et al. Prevention
of acute and chronic allograft rejection with CD4+CD25+Foxp3+ regulatory T
lymphocytes. Nature medicine. 2008;14(1):88-92.
Johansson AC, Hansson AS, Nandakumar KS, Backlund J, Holmdahl R. IL-10-
deficient B10.Q mice develop more severe collagen-induced arthritis, but are protected
from arthritis induced with anti-type II collagen antibodies. Journal of immunology.
2001;167(6):3505-12.
Jones ND, Turvey SE, Van Maurik A, Hara M, Kingsley CI, Smith CH, et al. Differential
susceptibility of heart, skin, and islet allografts to T cell-mediated rejection. Journal of
Immunology. 2001;166(4):2824-30.
Karman J, Chu HH, Co DO, Seroogy CM, Sandor M, Fabry Z. Dendritic cells amplify T
cell-mediated immune responses in the central nervous system. Journal of
Immunology. 2006;177(11):7750-60.
Kebir H, Kreymborg K, Ifergan I, Dodelet-Devillers A, Cayrol R, Bernard M, et al.
Human TH17 lymphocytes promote blood-brain barrier disruption and central nervous
system inflammation. Nature medicine. 2007;13(10):1173-5.
Kingsley CI, Nadig SN, Wood KJ. Transplantation tolerance: lessons from
experimental rodent models. Transplant international : official journal of the European
Society for Organ Transplantation. 2007;20(10):828-41.
Kolb H, Kolb-Bachofen V. Nitric oxide in autoimmune disease: cytotoxic or regulatory
mediator? Immunology today. 1998;19(12):556-61.
Krieger NR, Yin DP, Fathman CG. CD4+ but not CD8+ cells are essential for
allorejection. The Journal of experimental medicine. 1996;184(5):2013-8.
Kroemer A, Xiao X, Degauque N, Edtinger K, Wei H, Demirci G, et al. The Innate NK
Cells, Allograft Rejection, and a Key Role for IL-15. Journal of Immunology.
2008;180(12):7818-26.
Krysko DV, D'Herde K, Vandenabeele P. Clearance of apoptotic and necrotic cells and
its immunological consequences. Apoptosis. 2006;11(10):1709-26.
Krysko DV, Denecker G, Festjens N, Gabriels S, Parthoens E, D'Herde K, et al.
Macrophages use different internalization mechanisms to clear apoptotic and necrotic
cells. Cell death and differentiation. 2006;13(12):2011-22.
94
Kuhn R, Lohler J, Rennick D, Rajewsky K, Muller W. Interleukin-10-deficient mice
develop chronic enterocolitis. Cell. 1993;75(2):263-74.
Kulinna-Cosentini C, Bankier AA. Solid Organ Transplantation: Past, Present, and
Future Challenges. Imaging in Transplantation. 2007:1-9.
Kupiec-Weglinski JW, Colto AJ, Van De Water L. Extracellular matrix proteins and
their interactions with the cellular repertoire of transplant recipients. Transplantation
proceedings. 1997;29(6):2601-2.
Kuttler B, Wanka H, Kloting N, Gerstmayer B, Volk HD, Sawitzki B, et al. Ex vivo gene
transfer of viral interleukin-10 to BB rat islets: no protection after transplantation to
diabetic BB rats. Journal of cellular and molecular medicine. 2007;11(4):868-80.
Laboratory TJ. Il10tm1Cgn, Version 1. 2008 11 Jun 2008 [cited 2008 13 Jun 2008];
Available from: http://jaxmice.jax.org/pub-
cgi/protocols/protocols.sh?objtype=protocol&protocol_id=346
Lagasse E, Weissman IL. Flow cytometric identification of murine neutrophils and
monocytes. Journal of immunological methods. 1996;197(1-2):139-50.
Larocca R, Marguti I, Cabrera W, Ribeiro OG, Rizzo LV, de Moraes LV. Maximal
inflammatory response benefits syngeneic skin graft acceptance. Inflammation
research : official journal of the European Histamine Research Society [et al]. 2008.
Larsen CP, Steinman RM, Witmer-Pack M, Hankins DF, Morris PJ, Austyn JM.
Migration and maturation of Langerhans cells in skin transplants and explants. The
Journal of experimental medicine. 1990;172(5):1483-93.
Laskin DL, Pendino KJ. Macrophages and inflammatory mediators in tissue injury.
Annual review of pharmacology and toxicology. 1995;35:655-77.
Laurence A, Tato CM, Davidson TS, Kanno Y, Chen Z, Yao Z, et al. Interleukin-2
signaling via STAT5 constrains T helper 17 cell generation. Immunity. 2007;26(3):371-
81.
Lee PC, Shears LL, 2nd, Billiar TR. Role of inducible nitric oxide synthase in transplant
arteriosclerosis. Clinical and experimental pharmacology & physiology.
1999;26(12):1013-5.
Leibovich SJ, Ross R. The role of the macrophage in wound repair. A study with
hydrocortisone and antimacrophage serum. The American journal of pathology.
1975;78(1):71-100.
Leibovitch I, Huilgol SC, Hsuan JD, Selva D. Incidence of host site complications in
periocular full thickness skin grafts. The British journal of ophthalmology.
2005;89(2):219-22.
95
Li W, Fu F, Lu L, Narula SK, Fung JJ, Thomson AW, et al. Differential effects of
exogenous interleukin-10 on cardiac allograft survival: inhibition of rejection by
recipient pretreatment reflects impaired host accessory cell function. Transplantation.
1999;68(9):1402-9.
Liang Y, Christopher K, Finn PW, Colson YL, Perkins DL. Graft produced interleukin-6
functions as a danger signal and promotes rejection after transplantation.
Transplantation. 2007;84(6):771-7.
Loong CC, Hsieh HG, Lui WY, Chen A, Lin CY. Evidence for the early involvement of
interleukin 17 in human and experimental renal allograft rejection. The Journal of
pathology. 2002;197(3):322-32.
Lovegrove E, Pettigrew GJ, Bolton EM, Bradley JA. Epitope mapping of the indirect T
cell response to allogeneic class I MHC: sequences shared by donor and recipient
MHC may prime T cells that provide help for alloantibody production. Journal of
Immunology. 2001;167(8):4338-44.
Ma HL, Liang S, Li J, Napierata L, Brown T, Benoit S, et al. IL-22 is required for Th17
cell-mediated pathology in a mouse model of psoriasis-like skin inflammation. The
Journal of clinical investigation. 2008;118(2):597-607.
Maderna P, Godson C. Phagocytosis of apoptotic cells and the resolution of
inflammation. Biochimica et biophysica acta. 2003;1639(3):141-51.
Mangan PR, Harrington LE, O'Quinn DB, Helms WS, Bullard DC, Elson CO, et al.
Transforming growth factor-beta induces development of the T(H)17 lineage. Nature.
2006;441(7090):231-4.
Medawar PB. The behaviour and fate of skin autografts and skin homografts in rabbits:
A report to the War Wounds Committee of the Medical Research Council. Journal of
anatomy. 1944;78(Pt 5):176-99.
Medzhitov R, Janeway CA, Jr. Decoding the patterns of self and nonself by the innate
immune system. Science (New York, NY. 2002;296(5566):298-300.
Michalany J. Técnica histológica em anatomia patológica 1981.
Min CK, Lee WY, Min DJ, Lee DG, Kim YJ, Park YH, et al. The kinetics of circulating
cytokines including IL-6, TNF-alpha, IL-8 and IL-10 following allogeneic hematopoietic
stem cell transplantation. Bone marrow transplantation. 2001;28(10):935-40.
Moore KW, de Waal Malefyt R, Coffman RL, O'Garra A. Interleukin-10 and the
interleukin-10 receptor. Annual review of immunology. 2001;19:683-765.
96
Morita K, Miura M, Paolone DR, Engeman TM, Kapoor A, Remick DG, et al. Early
chemokine cascades in murine cardiac grafts regulate T cell recruitment and
progression of acute allograft rejection. Journal of Immunology. 2001;167(5):2979-84.
Muzio M, Polntarutti N, Bosisio D, Prahladan MK, Mantovani A. Toll like receptor
family (TLT) and signalling pathway. European cytokine network. 2000;11(3):489-90.
Nakae S, Iwakura Y, Suto H, Galli SJ. Phenotypic differences between Th1 and Th17
cells and negative regulation of Th1 cell differentiation by IL-17. Journal of leukocyte
biology. 2007;81(5):1258-68.
Nash JR, Peters M, Bell PR. Comparative survival of pancreatic islets, heart, kidney,
and skin allografts in rats, with and without enhancement. Transplantation.
1977;24(1):70-3.
Nathan C. Neutrophils and immunity: challenges and opportunities. Nature reviews.
2006;6(3):173-82.
Nathan C. Nitric oxide as a secretory product of mammalian cells. Faseb J.
1992;6(12):3051-64.
Nogueira E, Ozaki KS, Macusso GD, Quarim RF, Camara NO, Pacheco-Silva A.
Incidence of donor and recipient toll-like receptor-4 polymorphisms in kidney
transplantation. Transplantation proceedings. 2007;39(2):412-4.
Nozawa H, Chiu C, Hanahan D. Infiltrating neutrophils mediate the initial angiogenic
switch in a mouse model of multistage carcinogenesis. Proceedings of the National
Academy of Sciences of the United States of America. 2006;103(33):12493-8.
Ohki Y, Heissig B, Sato Y, Akiyama H, Zhu Z, Hicklin DJ, et al. Granulocyte colony-
stimulating factor promotes neovascularization by releasing vascular endothelial
growth factor from neutrophils. Faseb J. 2005;19(14):2005-7.
Ohki Y, Heissig B, Sato Y, Akiyama H, Zhu Z, Hicklin DJ, et al. Granulocyte colony-
stimulating factor promotes neovascularization by releasing vascular endothelial
growth factor from neutrophils. The FASEB journal : official publication of the
Federation of American Societies for Experimental Biology. 2005;19(14):2005-7.
Oshima K, Cui G, Tung T, Okotie O, Laks H, Sen L. Exogenous IL-10 overexpression
reduces perforin production by activated allogenic CD8+ cells and prolongs cardiac
allograft survival. American journal of physiology. 2007;292(1):H277-84.
Owyang AM, Zaph C, Wilson EH, Guild KJ, McClanahan T, Miller HR, et al. Interleukin
25 regulates type 2 cytokine-dependent immunity and limits chronic inflammation in
the gastrointestinal tract. The Journal of experimental medicine. 2006;203(4):843-9.
97
Palmer SM, Burch LH, Davis RD, Herczyk WF, Howell DN, Reinsmoen NL, et al. The
role of innate immunity in acute allograft rejection after lung transplantation. American
journal of respiratory and critical care medicine. 2003;168(6):628-32.
Pasare C, Medzhitov R. Toll pathway-dependent blockade of CD4+CD25+ T cell-
mediated suppression by dendritic cells. Science (New York, NY.
2003;299(5609):1033-6.
Peng Q, Li K, Anderson K, Farrar CA, Lu B, Smith RA, et al. Local production and
activation of complement up-regulates the allostimulatory function of dendritic cells
through C3a-C3aR interaction. Blood. 2008;111(4):2452-61.
Pfeilschifter J, Eberhardt W, Beck KF. Regulation of gene expression by nitric oxide.
Pflugers Arch. 2001;442(4):479-86.
Pfeilschifter J, Eberhardt W, Huwiler A. Nitric oxide and mechanisms of redox
signalling: matrix and matrix-metabolizing enzymes as prime nitric oxide targets.
European journal of pharmacology. 2001;429(1-3):279-86.
Platz KP, Mueller AR, Heckert C, Hausler M, Guckelberger O, Lobeck H, et al. Nitric
oxide production after syngeneic and allogeneic small bowel transplantation.
Transplantation proceedings. 1998;30(6):2662-4.
Polverini PJ, Cotran PS, Gimbrone MA, Jr., Unanue ER. Activated macrophages
induce vascular proliferation. Nature. 1977;269(5631):804-6.
Potter NS, Harding CV. Neutrophils process exogenous bacteria via an alternate class
I MHC processing pathway for presentation of peptides to T lymphocytes. J Immunol.
2001;167(5):2538-46.
Potter NS, Harding CV. Neutrophils process exogenous bacteria via an alternate class
I MHC processing pathway for presentation of peptides to T lymphocytes. Journal of
Immunology. 2001;167(5):2538-46.
Qian S, Li W, Li Y, Fu F, Lu L, Fung JJ, et al. Systemic administration of cellular
interleukin-10 can exacerbate cardiac allograft rejection in mice. Transplantation.
1996;62(12):1709-14.
Radsak M, Iking-Konert C, Stegmaier S, Andrassy K, Hansch GM. Polymorphonuclear
neutrophils as accessory cells for T-cell activation: major histocompatibility complex
class II restricted antigen-dependent induction of T-cell proliferation. Immunology.
2000;101(4):521-30.
RBT. Registro Brasileiro de Transplantes: Associação Brasileira de Transplantes;
2006 Janeiro/Junho 2006.
98
Reali E, Guerrini R, Moretti S, Spisani S, Lanza F, Tomatis R, et al.
Polymorphonuclear neutrophils pulsed with synthetic peptides efficiently activate
memory cytotoxic T lymphocytes. Journal of leukocyte biology. 1996;60(2):207-13.
Rees MA, Rosenberg AS, Singer A. T cell subsets mediating rejection of established
fetal pancreas grafts and failure to observe graft adaptation. Transplantation.
1990;49(6):1130-3.
Richards DM, Dalheimer SL, Ehst BD, Vanasek TL, Jenkins MK, Hertz MI, et al.
Indirect minor histocompatibility antigen presentation by allograft recipient cells in the
draining lymph node leads to the activation and clonal expansion of CD4+ T cells that
cause obliterative airways disease. Journal of Immunology. 2004;172(6):3469-79.
Richters CD, van Gelderop E, du Pont JS, Hoekstra MJ, Kreis RW, Kamperdijk EW.
Migration of dendritic cells to the draining lymph node after allogeneic or congeneic rat
skin transplantation. Transplantation. 1999;67(6):828-32.
Rosenberg AS, Mizuochi T, Sharrow SO, Singer A. Phenotype, specificity, and
function of T cell subsets and T cell interactions involved in skin allograft rejection. The
Journal of experimental medicine. 1987;165(5):1296-315.
Rosenberg AS, Mizuochi T, Singer A. Cellular interactions resulting in skin-allograft
rejection. Annals of the New York Academy of Sciences. 1988;532:76-85.
Rosenberg AS, Singer A. Cellular basis of skin allograft rejection: an in vivo model of
immune-mediated tissue destruction. Annual review of immunology. 1992;10:333-58.
Schnare M, Barton GM, Holt AC, Takeda K, Akira S, Medzhitov R. Toll-like receptors
control activation of adaptive immune responses. Nature immunology. 2001;2(10):947-
50.
Seder RA, Ahmed R. Similarities and differences in CD4+ and CD8+ effector and
memory T cell generation. Nature immunology. 2003;4(9):835-42.
Sharma JN, Al-Omran A, Parvathy SS. Role of nitric oxide in inflammatory diseases.
Inflammopharmacology. 2007;15(6):252-9.
Shinozaki K, Yahata H, Hayamizu K, Tashiro H, Fan X, Okimoto T, et al. Adenovirus-
mediated allograft transduction of interleukin-10: role in the induction phase of liver
allograft acceptance. Transplantation proceedings. 2000;32(2):247-8.
Shinozaki K, Yahata H, Tanji H, Sakaguchi T, Ito H, Dohi K. Allograft transduction of
IL-10 prolongs survival following orthotopic liver transplantation. Gene therapy.
1999;6(5):816-22.
Silverstein A. Transplantation and Immunogenetics. A history of Immunology 1989.
99
Starnes T, Broxmeyer HE, Robertson MJ, Hromas R. Cutting edge: IL-17D, a novel
member of the IL-17 family, stimulates cytokine production and inhibits hemopoiesis.
Journal of Immunology. 2002;169(2):642-6.
Steinman L. A few autoreactive cells in an autoimmune infiltrate control a vast
population of nonspecific cells: a tale of smart bombs and the infantry. Proceedings of
the National Academy of Sciences of the United States of America. 1996;93(6):2253-
6.
Strehl B, Seifert U, Kruger E, Heink S, Kuckelkorn U, Kloetzel PM. Interferon-gamma,
the functional plasticity of the ubiquitin-proteasome system, and MHC class I antigen
processing. Immunological reviews. 2005;207:19-30.
Surquin M, Buonocore S, Le Moine A, Flamand V, Goldman M, Abramowicz D. [The
role of neutrophils during allograft rejection]. Nephrologie & therapeutique.
2005;1(3):161-6.
Tanaka K, Sonoda K, Streilein JW. Acute rejection of orthotopic corneal xenografts in
mice depends on CD4(+) T cells and self-antigen-presenting cells. Investigative
ophthalmology & visual science. 2001;42(12):2878-84.
Toumi H, F'Guyer S, Best TM. The role of neutrophils in injury and repair following
muscle stretch. Journal of anatomy. 2006;208(4):459-70.
Tripathi P, Tripathi P, Kashyap L, Singh V. The role of nitric oxide in inflammatory
reactions. FEMS immunology and medical microbiology. 2007;51(3):443-52.
Veldhoen M, Hocking RJ, Atkins CJ, Locksley RM, Stockinger B. TGFbeta in the
context of an inflammatory cytokine milieu supports de novo differentiation of IL-17-
producing T cells. Immunity. 2006;24(2):179-89.
Veldhoen M, Stockinger B. TGFbeta1, a "Jack of all trades": the link with pro-
inflammatory IL-17-producing T cells. Trends in immunology. 2006;27(8):358-61.
Verrecchia F, Mauviel A. Transforming growth factor-beta and fibrosis. World journal of
gastroenterology 2007;13(22):3056-62.
Vinuesa E, Hotter G, Jung M, Herrero-Fresneda I, Torras J, Sola A. Macrophage
involvement in the kidney repair phase after ischaemia/reperfusion injury. The Journal
of pathology. 2008;214(1):104-13.
Vos IH, Joles JA, Schurink M, Weckbecker G, Stojanovic T, Rabelink TJ, et al.
Inhibition of inducible nitric oxide synthase improves graft function and reduces
tubulointerstitial injury in renal allograft rejection. European journal of pharmacology.
2000;391(1-2):31-8.
100
Waldmann H. Transplantation tolerance-where do we stand? Nature medicine.
1999;5(11):1245-8.
Weaver CT, Hatton RD, Mangan PR, Harrington LE. IL-17 family cytokines and the
expanding diversity of effector T cell lineages. Annual review of immunology.
2007;25:821-52.
Werb Z, Gordon S. Secretion of a specific collagenase by stimulated macrophages.
The Journal of experimental medicine. 1975;142(2):346-60.
WHO. Human organ and tissue transplantation: World Health Organization; 2003 May
2003.
Wiekowski MT, Leach MW, Evans EW, Sullivan L, Chen SC, Vassileva G, et al.
Ubiquitous transgenic expression of the IL-23 subunit p19 induces multiorgan
inflammation, runting, infertility, and premature death. Journal of Immunology.
2001;166(12):7563-70.
Wilson NJ, Boniface K, Chan JR, McKenzie BS, Blumenschein WM, Mattson JD, et al.
Development, cytokine profile and function of human interleukin 17-producing helper T
cells. Nature immunology. 2007;8(9):950-7.
Winlaw DS, Schyvens CG, Smythe GA, Du ZY, Rainer SP, Lord RS, et al. Selective
inhibition of nitric oxide production during cardiac allograft rejection causes a small
increase in graft survival. Transplantation. 1995;60(1):77-82.
Winlaw DS, Smythe GA, Keogh AM, Schyvens CG, Spratt PM, Macdonald PS. Nitric
oxide production and heart failure. Lancet. 1995;345(8946):390-1.
Wolfs TG, Buurman WA, van Schadewijk A, de Vries B, Daemen MA, Hiemstra PS, et
al. In vivo expression of Toll-like receptor 2 and 4 by renal epithelial cells: IFN-gamma
and TNF-alpha mediated up-regulation during inflammation. J Immunol.
2002;168(3):1286-93.
Worrall NK, Boasquevisque CH, Botney MD, Misko TP, Sullivan PM, Ritter JH, et al.
Inhibition of inducible nitric oxide synthase ameliorates functional and histological
changes of acute lung allograft rejection. Transplantation. 1997;63(8):1095-101.
Wyburn K, Wu H, Yin J, Jose M, Eris J, Chadban S. Macrophage-derived interleukin-
18 in experimental renal allograft rejection. Nephrology, dialysis, transplantation :
official publication of the European Dialysis and Transplant Association - European
Renal Association 2005;20(4):699-706.
Wyburn KR, Jose MD, Wu H, Atkins RC, Chadban SJ. The role of macrophages in
allograft rejection. Transplantation. 2005;80(12):1641-7.
101
Xiao BG, Link H. Antigen-specific T cells in autoimmune diseases with a focus on
multiple sclerosis and experimental allergic encephalomyelitis. Cellular and molecular
life sciences. 1999;56(1-2):5-21.
Yang YG, Wang H, Asavaroengchai W, Dey BR. Role of Interferon-gamma in GVHD
and GVL. Cellular & molecular immunology. 2005;2(5):323-9.
Young JW, Merad M, Hart DN. Dendritic cells in transplantation and immune-based
therapies. Biology of blood and marrow transplantation : journal of the American
Society for Blood and Marrow Transplantation. 2007;13(1 Suppl 1):23-32.
Youssef AR, Otley C, Mathieson PW, Smith RM. Role of CD4+ and CD8+ T cells in
murine skin and heart allograft rejection across different antigenic desparities.
Transplant immunology. 2004;13(4):297-304.
Zhai Y, Wang Y, Wu Z, Kupiec-Weglinski JW. Defective alloreactive CD8 T cell
function and memory response in allograft recipients in the absence of CD4 help.
Journal of Immunology. 2007;179(7):4529-34.
Zhang Z, Fauser U, Schluesener HJ. Expression of RhoA by inflammatory
macrophages and T cells in rat experimental autoimmune neuritis. Journal of cellular
and molecular medicine. 2007;11(1):111-9.
Zhao Y, Swenson K, Wekerle T, Rodriguez-Barbosa JI, Arn JS, Sykes M. The critical
role of mouse CD4+ cells in the rejection of highly disparate xenogeneic pig thymus
grafts. Xenotransplantation. 2000;7(2):129-37.
Zheng XX, Steele AW, Nickerson PW, Steurer W, Steiger J, Strom TB. Administration
of noncytolytic IL-10/Fc in murine models of lipopolysaccharide-induced septic shock
and allogeneic islet transplantation. Journal of Immunology. 1995;154(10):5590-600.
Zheng Y, Danilenko DM, Valdez P, Kasman I, Eastham-Anderson J, Wu J, et al.
Interleukin-22, a T(H)17 cytokine, mediates IL-23-induced dermal inflammation and
acanthosis. Nature. 2007;445(7128):648-51.
Zhong J, Hadis U, De Kluyver R, Leggatt GR, Fernando GJ, Frazer IH. TLR7
stimulation augments T effector-mediated rejection of skin expressing neo-self antigen
in keratinocytes. European journal of immunology. 2008;38(1):73-81.
Zou XM, Yagihashi A, Hirata K, Tsuruma T, Matsuno T, Tarumi K, et al.
Downregulation of cytokine-induced neutrophil chemoattractant and prolongation of rat
liver allograft survival by interleukin-10. Surgery today. 1998;28(2):184-91.
Livros Grátis
( http://www.livrosgratis.com.br )
Milhares de Livros para Download:
Baixar livros de Administração
Baixar livros de Agronomia
Baixar livros de Arquitetura
Baixar livros de Artes
Baixar livros de Astronomia
Baixar livros de Biologia Geral
Baixar livros de Ciência da Computação
Baixar livros de Ciência da Informação
Baixar livros de Ciência Política
Baixar livros de Ciências da Saúde
Baixar livros de Comunicação
Baixar livros do Conselho Nacional de Educação - CNE
Baixar livros de Defesa civil
Baixar livros de Direito
Baixar livros de Direitos humanos
Baixar livros de Economia
Baixar livros de Economia Doméstica
Baixar livros de Educação
Baixar livros de Educação - Trânsito
Baixar livros de Educação Física
Baixar livros de Engenharia Aeroespacial
Baixar livros de Farmácia
Baixar livros de Filosofia
Baixar livros de Física
Baixar livros de Geociências
Baixar livros de Geografia
Baixar livros de História
Baixar livros de Línguas
Baixar livros de Literatura
Baixar livros de Literatura de Cordel
Baixar livros de Literatura Infantil
Baixar livros de Matemática
Baixar livros de Medicina
Baixar livros de Medicina Veterinária
Baixar livros de Meio Ambiente
Baixar livros de Meteorologia
Baixar Monografias e TCC
Baixar livros Multidisciplinar
Baixar livros de Música
Baixar livros de Psicologia
Baixar livros de Química
Baixar livros de Saúde Coletiva
Baixar livros de Serviço Social
Baixar livros de Sociologia
Baixar livros de Teologia
Baixar livros de Trabalho
Baixar livros de Turismo
