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SANDRA PEREIRA DA SILVA
ESTRUTURA GENÉTICA DE Tibouchina papyrus (Pau-papel)
EM ÁREAS NATURAIS DE CAMPO RUPESTRE NO CERRADO
Dissertação apresentada ao mestrado de
Genética da Universidade Católica de
Goiás, para a obtenção do título de
Mestre em Genética, área de
concentração: Genética de populações de
Plantas.
Orientadora: Profª. Dra. Mariana Pires de Campos Telles
Goiânia, GO - Brasil
2008
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SANDRA PEREIRA DA SILVA
ESTRUTURA GENÉTICA DE Tibouchina papyrus (Pau-papel)
EM ÁREAS NATURAIS DE CAMPO RUPESTRE NO CERRADO
Dissertação DEFENDIDA e APROVADA em 28 de Março de 2008, pela Banca
Examinadora constituída pelos membros:
__________________________________
Profª. Drª. Mariana Pires de Campos Telles
Orientadora – UCG
__________________________________
Profº. Dr. Lázaro José Chaves
Membro da banca - UFG
__________________________________
Profª. Drª. Daniela Melo
Membro da banca - UCG
Goiânia, Goiás
Brasil
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A todas as pessoas que lutam por um sonho por mais difíceis que sejam os
obstáculos.
Ofereço
A Minha mãe que sempre esteve comigo em todas as horas
Dedico.
4
Agradecimentos
Agradeço a todos aqueles que de algum jeito me ajudou, a chegar até
aqui. Agradeço a DEUS, pela oportunidade de realizar esse sonho que é
concluir o Mestrado em Genética. A minha mãe Maria do Carmo que sempre
acreditou em mim, incentivando-me a nunca desistir, é um exemplo de uma
grande mulher e mãe, também ao meu pai Altamiro por me ajudar com suas
palavras de apoio, AMO MUITO VOCÊS. Ao meu esposo Rogério, agradeço
pelo apoio, AMO VOCÊ.
Aos meus irmãos Wagner, Edson e Márcio, as cunhadas (Eliane, Eliene,
Fabiana e Flávia) aos cunhados (Ueliton e José Uires), as minhas sobrinhas
(Yasmin, Emilly, Anny Karolinny e Júlia), aos meus sobrinhos (Yuri, Felipe e
Pedro), aos meus sogros Maria das Graças e Pedro, que de uma forma ou
outra me apoiaram e não deixaram através de um gesto, um sorriso, uma
palavra amiga que eu desistisse de meu objetivo, OBRIGADA.
A minha madrinha Valdir, vizinha Alice, a minha tia Francis, Ruth,
Marivone e Siony, aos meus alunos e pelos novos amigos de fé que fiz durante
esta fase da minha vida, José Olímpio e Milza, pelo grande apoio, OBRIGADA.
Agradeço minha orientadora, Mariana Pires de Campos Telles, pela
compreensão e paciência nos momentos difíceis em que passei durante o
mestrado e pelos ensinamentos que obtive, sinceramente é uma pessoa a
quem se pode espelhar como profissional, mãe e pessoa humana, MUITO
OBRIGADA.
Agradeço os colegas que me ajudaram no laboratório, especialmente a
Juliana, que contribuiu muito para a obtenção dos dados no laboratório e,
portanto, para a realização deste trabalho, muitíssimo obrigada! Às colegas
Thannya e Lucileide muito obrigada pelos ensinamentos. Aos bolsistas de
iniciação científica Felipe, Dayane, Eliane, Marivan, Vivian entre outros que
passaram por lá, agradeço pela disposição em sempre ajudar e cooperar
OBRIGADAAAAA...
Aos professores do mestrado em Genética da Universidade Católica de
Goiás e aos colegas do curso, obrigada!
Pelo apoio financeiro da Pró-Reitoria de Pós-graduação e Pesquisa da
UCG, o CNPq/PRONEX um agradecimento muito especial.
SUMÁRIO
Lista de figuras...................................................................................................vi
Lista de tabelas................................................................................................. vii
RESUMO......................................................................................................... viii
ABSTRACT........................................................................................................ix
1. Introdução.....................................................................................................10
2. Objetivos.......................................................................................................12
3. Revisão de Literatura....................................................................................13
3.1. Características gerais do bioma Cerrado...............................................13
3.2. Endemismo em plantas..........................................................................20
3.3. Características gerais da espécie Tibouchina papyrus (Pohl) Toledo....22
3.4. Marcador molecular e variabilidade genética em populações................25
4. Material e Métodos .......................................................................................32
4.1. Caracterização da Área..........................................................................32
4.2. Obtenção das amostras e extração de DNA..........................................34
4.3. Amplificação e obtenção dos dados moleculares...................................35
4.4. Análise estatística dos dados.................................................................36
4.4.1 Variabilidade e estrutura genética.....................................................36
4.4.2 Estimativa indireta do fluxo gênico....................................................39
4.4.3 Divergência genética e padrão espacial...........................................39
5. Resultados e discussão................................................................................41
5.1. Variabilidade genética............................................................................41
5.2. Estrutura genética populacional e fluxo gênico......................................45
5.3. Divergência genética e padrão espacial.................................................46
6. CONCLUSÕES.............................................................................................52
7. Bibliografia....................................................................................................53
Apêndice..........................................................................................................64
vi
Lista de figuras
Figura 1. Mapa resultante da classificação das imagens MODIS mostrando as
áreas desmatadas na parte central do Cerrado e os principais blocos
remanescentes de vegetação nativa. Fonte: (Machado et al. 2004).................13
Figura 2. Hotspots mundiais de diversidade biológica propostos por Myers et
al. 2000.............................................................................................................14
Figura 3. Biomas Brasileiros. Fonte: IBGE (2003). ..........................................15
Figura 4. Esquema adaptado das principais fitofisionomias do bioma Cerrado,
segundo Ribeiro & Walter (1998). Fonte: Ribeiro & Walter (2001). ..................16
Figura 5. Diagrama de perfil (1) e cobertura arbórea (2) de um Campo
Rupestre representando uma faixa de 40 m de comprimento por 10 m de
largura. (Notar a vegetação nascendo entre as rochas). Ilustração: Wellington
Cavalcante. Fonte: (Ribeiro & Walter, 1998).....................................................18
Figura 6. Aspecto rúpicola da planta Tibouchina papyrus e do ritidoma
escamado. ........................................................................................................22
Figura 7. Tibouchina papyrus de Serra Dourada. ............................................23
Figura 8. Diagrama indicando o perfil genético multiloco obtido com o marcador
RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA). .................................................27
Figura 9. Esquema demonstrando a base genética do padrão de “dominância”
do marcador RAPD em espécie diplóide. ........................................................28
Figura 10. Localização do Parque Estadual da Serra Dourada e Parque
Estadual dos Pirineus.......................................................................................32
Figura 11. Perfil eletroforético dos fragmentos RAPD amplificados utilizando o
iniciador OPB-05 com indivíduos de Tibouchina papyrus. As colunas M 100bp,
indicam o marcador de peso molecular (100 base pair ladder, Pharmacia). ....42
Figura 12. Perfil eletroforético dos fragmentos RAPD amplificados utilizando o
iniciador OPM-13 com indivíduos de Tibouchina papyrus. As colunas M 100bp
indicam o marcador de peso molecular (100 base pair ladder, Pharmacia). ....42
Figura 13. Distribuição dos valores da Diversidade genética (h) dos 147 locos
RAPD analisados nas populações de Tibouchina papyrus...............................43
Figura 14. Evento de polinização em uma flor de Tibouchina papyrus por um
indivíduo da espécie Bombus sp. .....................................................................44
Figura 15. Padrão de divergência genética entre seis populações de
Tibouchina papyrus, definido pelo agrupamento por UPGMA, com base nas
distâncias genéticas (Φ
ST
). Correlação cofenética igual a 0,78. .......................48
Figura 16. Distribuição das seis populações de Tibouchina papyrus no espaço
bidimensional obtido pelo NMDS, a partir das distâncias genéticas (Φ
ST
).
O valor de stress foi igual a 0,00007.................................................................48
Figura 17. Relação entre distância genética (Φ
ST
) e distância geográfica (r =
0,715 - P = 0,015, com 1000 permutações) entre 6 populações de Tibouchina
papyrus.............................................................................................................49
vii
Lista de tabelas
Tabela 1. Número de espécies de vertebrados e plantas que ocorrem no
Cerrado, porcentagem de endemismos do bioma e proporção de riqueza de
espécies do bioma em relação à riqueza de espécies no Brasil.......................20
Tabela 2. Locais de coleta de seis populações de Tibouchina papyrus (pau-
papel), com suas respectivas coordenadas geográficas. .................................33
Tabela 3. Esquema de análise de variância molecular (AMOVA) hierárquica
para os dados binários......................................................................................38
Tabela 4. Relação dos iniciadores RAPD, suas respectivas seqüências de
bases (5’→3’) e o número de locos gerados por iniciador selecionados para
análises genéticas de Tibouchina papyrus. ......................................................41
Tabela 5. Relação do número de indivíduos por população (N), número de
locos polimórficos (NLP), porcentagem de locos polimórficos (LP%) e
Diversidade genética de Nei (h), em populações Tibouchina papyrus, para seis
iniciadores RAPD..............................................................................................43
Tabela 6. Quadro de análise de variância molecular (AMOVA) para seis
populações de Tibouchina papyrus com dados de 109 locos RAPD................45
Tabela 7. Valores de
Φ
ST
par a par entre as seis populações de Tibouchina
papyrus, com base em 109 locos RAPD...........................................................47
Tabela 8. Conjunto de espécies de plantas do Cerrado que apresentam
resultados de estudos utilizando marcadores RAPD em populações. Relação
do número de populações (NP), número total de indivíduos (NTI), número de
iniciadores RAPD (NIn), porcentagem de locos polimórficos (LP%), valor da
estatística-F utilizada (E-F) e referências bibliográficas....................................50
viii
RESUMO
Silva SP. Estrutura genética de Tibouchina papyrus (Pau-Papel) em áreas
naturais de campo rupestre no Cerrado. [Dissertação de Mestrado em
Genética] – Departamento de Biologia. Goiânia: Universidade Católica de
Goiás; 2008
1
.
(Estrutura genética de Tibouchina papyrus (Pohl) Toledo (pau-papel) em áreas
naturais de campo rupestre no Cerrado). O presente trabalho teve como
objetivo conhecer a variabilidade genética de populações de Tibouchina
papyrus (Pohl) Toledo, provenientes da região de Serra Dourada e Serra dos
Pirineus, no Estado de Goiás. Os seis iniciadores RAPD produziram um total
de 147 locos, variando entre 23 e 26 por iniciador. A avaliação hierárquica da
estruturação da variabilidade genética, realizada pela a AMOVA, considerando
a existência de duas regiões (Serra dos Pirineus e Serra Dourada) apresentou
uma estimativa de Φ
ST
=0,3439. O valor do componente entre regiões (
Φ
CT
) foi
igual a 18,96% e a variação entre populações dentro de regiões igual a
15,43%. As estimativas de fluxo gênico indicam a existência de uma baixa
proporção de migrantes entre populações. As análises multivariadas (UPGMA
e NMDS) indicam que existe uma relação entre distância genética e espaço
geográfico, hipótese esta que foi confirmada por uma análise de padrão
espacial utilizando o teste de Mantel (r = 0,71; P = 0,015 com 1000
permutações aleatórias). Os resultados indicam assim que esta estrutura tenha
se originado seguindo um modelo de diferenciação estocástica (neutro) entre
regiões e por um balanço entre fluxo gênico a curtas distâncias e deriva
genética nas populações dentro das regiões. Os valores de diversidade
genética obtidos apóiam a hipótese de que a espécie Tibouchina papyrus é
uma espécie xenógama facultativa. Para fins de conservação de germoplasma,
com base nestes resultados preliminares, pode-se sugerir a coleta de
sementes do maior número possível de populações, e nas duas regiões
avaliadas, pois cada uma contém um componente singular da variação
genética total.
Palavras-chave: Cerrado, Tibouchina papyrus, variabilidade genética.
1
Orientadora: Profª. Dra. Mariana Pires de Campos Telles. UCG.
ix
ABSTRACT
Silva SP. Estrutura genética de Tibouchina papyrus (Pau-Papel) em áreas
naturais de campo rupestre no Cerrado. [Dissertação de Mestrado em
Genética] – Departamento de Biologia. Goiânia: Universidade Católica de
Goiás; 2008
1
(Genetic structure of Tibouchina papyrus (Pohl) Toledo (“pau-papel”) in natural
areas of Cerrado rupestrian fields). This paper has the aim describe the genetic
of variability of Tibouchina papyrus (Pohl) Toledo local populations, from the
regions of “Serra Dourada” and “Serra de Pirineus”, in Goiás State, Central
Brazil. The six RAPD primers generated a total of 147 loci, varying from 23 to
26 per primer. The hierarchical evaluation of genetic variability, performed using
an Analysis of Molecular Variance (AMOVA) considering the local populations
within the two regions (i.e., “Serra dos Pirineus” and “Serra Dourada”), showed
an estimate of overall diversity among populations equal to Φ
ST
=0,3439. The
value of divergence between regions (
Φ
CT
) was equal to 18,96%, so that the
variation among local populations within regions was equal to 15,43%.
Estimates of gene flow indicates a small number of migrants among local
populations per generation. Multivariate analyses (UPGMA and NMDS)
indicated that a relationship between genetic and geographical distances exists,
which was confirmed by a spatial pattern analysis using Mantel test (r = 0.71; P
< 0.015 with 1000 random permutations). Thus, this structure was originated
from a stochastic neutral model of population differentiation, in which drift within
populations is counteracted by short distance gene flow. Despite strong levels
of population structure (i.e., high divergence among populations within regions),
the diversity observed support the hypothesis that Tibouchina papyrus is a
facultative xenogamous species. For conservation ends of germplasm with
base in the preliminary results, it can be suggested the collection of seeds of
the most possible number of populations, and in the two appraised areas,
because each one contains a singular component of the total genetic variation.
Key words – Cerrado,Tibouchina papyrus, genetic variability.
1
Orientadora: Profª. Dra. Mariana Pires de Campos Telles. UCG.
1. Introdução
O Cerrado Brasileiro ocupa uma área de aproximadamente 2 milhões de
Km² (Mendonça et al. 1998; Brasil,1999), abrangendo cerca de 22% do
território nacional , sendo o segundo bioma do Brasil, distribuído principalmente
nos Estados de Goiás, Minas gerais, Mato Grosso, Mato grosso do Sul, Bahia,
Piauí, Maranhão, Distrito Federal e Tocantins (Silva et al. 2001). Por volta de
57% de sua vegetação original já foi alterada, principalmente pela introdução
de sistemas agropastoris e por extrativismo (Ribeiro & Silva, 1996; Klink &
Machado, 2005), possui uma vegetação com ramos tortos, caules contorcidos,
cascas grossas e com baixa altura das árvores. Por muito tempo, não foi
considerada como uma área prioritária para conservação, mas a partir dos
anos oitenta iniciou-se um esforço de pesquisa, mostrando que o Cerrado com
sua biodiversidade vem se destacando como abrigo de diversidades, incluindo
várias espécies endêmicas (Ribeiro & Walter, 1998).
As transformações ocorridas no Cerrado também trouxeram grandes
danos ambientais – fragmentação de habitats, extinção da biodiversidade,
invasão de espécies exóticas, erosão dos solos, poluição de aqüíferos,
degradação de ecossistemas, alterações nos regimes de queimadas,
desequilíbrios no ciclo do carbono e possivelmente modificações climáticas
regionais (Klink & Machado, 2005). Muitas espécies da flora do Cerrado estão
sendo ameaçadas de extinção, principalmente as de interesse madeireiro e
medicinal (Vieira et al. 2000), outras, porém, são endêmicas e apresentam
áreas de distribuição restrita a determinadas regiões no Cerrado, e, portanto
estão mais vulneráveis às modificações nos seus habitats.
A taxa anual de desmatamento do bioma foi estimada em 1,5%, ou três
milhões de hectares ao ano, taxa dez vezes maior que a estimada para a
floresta Atlântica (Machado et al. 2004). Devido ao endemismo e da atual
velocidade de devastação, o Cerrado é considerado, desde o ano 2000, uma
das 25 áreas críticas do mundo para a conservação da biodiversidade e forma
desde então denominadas hot spots de diversidade (Myers et al. 2000).
A Tibouchina papyrus é uma espécie da família melastomataceae que,
por suas características peculiares é considerada ornamental. Apresenta uma
11
floração abundante com flores alvas, casca do tronco escamado em lâminas
finíssimas, sua ocorrência se limita ao Cerrado, nas regiões de Serra Dourada
e Serra dos Pireneus nas cidades de Goiás e Pirenópolis ambas no Estado de
Goiás (Almeida et al. 1998; Montoro & Santos, 2004a).
A perda de variabilidade genética pode ocorrer em diversas espécies
nativas do Cerrado em decorrência de alguns fatores ecológicos e
microevolutivos tais como flutuações demográficas, endogamia, deriva
genética, além de modificações e/ou flutuações nas características do
ambiente (Primack & Rodrigues, 2001). Estudos que se propõe avaliar a
variabilidade genética de espécies endêmicas do Cerrado permitem a obtenção
de informações que contribuam para a avaliação da probabilidade de
persistência das populações locais dessas espécies, contribuindo em última
análise para a conservação da espécie e do bioma no qual ela está inserida.
A caracterização genética de populações utilizando marcadores
moleculares é fundamentada na análise das diferenças nos perfis genéticos e,
ocasionalmente, para identificação de alelos específicos de cada população.
Atualmente existe uma grande variedade de marcadores moleculares
disponíveis na literatura, que apresentam considerável polimorfismo e,
portanto, permitem analisar a variabilidade genética dentro e entre populações.
O RAPD (Random Amplified Polymorfic DNA) é um marcador molecular
que pode ser indicado para uma avaliação prévia da diversidade genética em
populações de espécies que ainda são pouco conhecidas do ponto de vista
científico, como é o caso do pau-papel, pois não são marcadores espécie-
específico. A técnica RAPD é relativamente simples de ser executada no
laboratório, rápida na obtenção dos dados, com custo relativamente baixo
quando comparado a outras técnicas moleculares (Caixeta & Borém, 2006).
A conservação da diversidade genética é uma condição para a
manutenção de todos os níveis de biodiversidade e é um componente
essencial da sustentabilidade das populações (Boyle, 2000; Namkoong et al.
2002). Nesta perspectiva, espécies endêmicas como a Tibouchina papyrus,
merecem uma atenção especial mesmo estando com parte de suas
populações dentro de áreas legalmente protegidas, como em parques ou
reservas ecológicas.
12
2. Objetivos
O objetivo geral do trabalho foi conhecer a variabilidade genética existente
em populações de Tibouchina papyrus (Pohl) Toledo, provenientes da região
de Serra Dourado e da Serra de Pirineus, no Estado de Goiás. Mais
especificamente, procurou-se:
1. Avaliar a diversidade genética dentro das populações;
2. Estimar a magnitude e a distribuição da variabilidade genética entre e
dentro das populações e entre regiões;
3. Avaliar, de maneira indireta, o fluxo gênico entre as populações;
4. Estimar a divergência genética entre as populações;
5. Verificar se a variabilidade genética está estrutura espacialmente.
Pretende-se ainda contribuir com informações que poderão ser
relevantes para traçar estratégias de conservação mais adequadas para esta
espécie que, além de ser endêmica no Cerrado, apresenta distribuição
geográfica restrita. Por outro lado, o resultado deste trabalho também poderá
ser útil na proposição de um modelo que explique melhor como os fatores
microevolutivos atuam em espécies que apresentam essas características de
endemismo e área de distribuição restrita.
13
3. Revisão de Literatura
3.1. Características gerais do bioma Cerrado
O Cerrado, apesar de ocupar uma área de quase 2 milhões de km
2
e
conter uma elevada Biodiversidade (Mendonça et al. 1998, Brasil, 1999), tem
sido pouco valorizado em termos de conservação (Figura 1). As áreas de
conservação do Cerrado equivalem a aproximadamente 2% da região.
Comparando-se o esforço conservacionista do Estado com relação a
Amazônia, que conta com 12% de sua área protegida na forma de unidades de
conservação, o Cerrado é carente em áreas protegidas (IBGE, 2002). Myers e
colaboradores (2000) consideraram o Cerrado como um dos 25 ecossistemas
do planeta, com alta biodiversidade e endemismo, que estão ameaçados, e
que foram, portanto, denominados “hotspots” de diversidade biológica,
contendo regiões prioritários para a conservação (Figura 2).
Figura 1. Mapa resultante da classificação das imagens MODIS mostrando as áreas
desmatadas na parte central do Cerrado e os principais blocos
remanescentes de vegetação nativa. Fonte: (Machado et al. 2004).
14
Figura 2. Hotspots mundiais de diversidade biológica propostos por Myers et al. 2000.
O Cerrado é um bioma que se encontra na América do Sul no Planalto
Central, em altitudes que variam de 300 a 1600 metros, possui quantidades
significativas de água, que formam as principais bacias do continente:
Amazônica, do São Francisco, do Paraná/Prata, do Doce, do Jequitinhonha, do
Parnaíba, dentre outras (Pimentel, 1977). Possui áreas de contato com quase
todos os outros biomas Brasileiros (Figura 3), tais como a Floresta Amazônica,
Caatinga, Mata Atlântica, Mata de Araucária e Pantanal. É considerado o
segundo maior bioma em área, correspondendo ao tamanho da Europa
Ocidental. Este bioma se distribui pelas seguintes unidades da Federação
Brasileira: Minas Gerais, Goiás, Distrito Federal, Mato Grosso do Sul, Mato
Grosso, Tocantins, Pará, Bahia, Piauí, Maranhão, Ceará, São Paulo e
Rondônia, alcançando até uma pequena área no nordeste da Bolívia (Alto
Mamoré) (Ribeiro, 2007).
15
Figura 3. Biomas Brasileiros. Fonte: IBGE (2003).
Quando comparado com outros ecossistemas existentes no planeta, o
Cerrado é conhecido como “savana brasileira”, por existir grande semelhança
de fitofisionomia com outras formações vegetais existentes na faixa intertropical
do globo que são encontradas no norte da América do Sul, em uma larga área
do centro da África, litoral da Índia e norte da Austrália (Ribeiro & Walter, 1998).
Ribeiro e Walter (1998) descreveram para o Cerrado 11 tipos
fitofisionômicos (Figura 4), dos quais alguns podem apresentar subtipos, são
eles: formações florestais (Mata Ciliar, Mata de Galeria, Mata Seca e
Cerradão), savânicas (Cerrado sentido restrito, Parque Cerrado, Palmeiral e
Vereda) e campestres (Campo Sujo, Campo Rupestre e Campo Limpo).
O Cerrado é um bioma marcado por duas estações bem definidas: uma
chuvosa (de outubro a março), quando ocorrem mais de 90% das
precipitações, e outra seca (de abril a setembro). Grande parte do Cerrado
(86%) recebe entre 1.000 e 2.000 mm de chuva por ano, estando sua média
pluviométrica anual entre 1.300 e 1600 mm, sendo muito superior, portanto, à
da Caatinga, que se situa entre 500 e 700 mm, mas também bastante inferior
16
às da Mata Atlântica (2.000 a 2500 mm) e da Floresta Amazônica (2.000 a
3.000 mm). A temperatura média anual é de 20,1ºC, sendo inferior a todos os
demais biomas brasileiros, exceto aos dos Campos e das Florestas Meridionais
(Ribeiro & Walter,1998).
Figura 4. Esquema adaptado das principais fitofisionomias do bioma Cerrado,
segundo Ribeiro & Walter (1998). Fonte: Ribeiro & Walter (2001).
A flora do Cerrado se formou sobre solos muito antigos, com recorrentes
intemperismos, tornado-os ácidos, com poucos nutrientes, porém com
elevadas concentrações de alumínio que se acumulam nas folhas de muitos
arbustos e árvores nativas desta região (Haridasan, 1982). No entanto, apesar
do solo do Cerrado possuir pouca quantidade de nutrientes, muitos produtores
agrícolas não vêm isto como obstáculos para suas extensas plantações ou
formações de pastagens, já que adicionam ao solo fertilizantes e calcário. A
flora do Cerrado é característica e diferenciada dos biomas adjacentes, embora
muitas fisionomias compartilhem espécies com outros biomas. Além do clima,
outros fatores como a química e física do solo a disponibilidade de água,
nutrientes, a geomorfologia, topografia, presença de queimadas freqüentes e
profundidade do lençol freático, diversas ações antrópicas têm influenciado a
cobertura vegetal da região nos últimos anos (Sano et al. 1998).
Entretanto, a flora do Cerrado é pouco conhecida, havendo grandes
incertezas sobre sua composição. Este fato deve ter ocorrido devido à grande
extensão deste bioma e aos inúmeros eventos de especiação ocorridos
durantes os períodos glaciais e interglaciais do Quaternário, além da sua
17
enorme variedade de paisagens e tipos fisionômicos (Mendonça et al. 1998;
Oliveira-Filho & Ratter, 2002).
Essa vegetação ocorre geralmente em solos ácidos, pobres em
nutrientes ou nas frestas dos afloramentos rochosos (Figura 5). Normalmente a
disponibilidade de água no solo é restrita, já que as águas pluviais escoam
rapidamente para os rios, devido à pequena profundidade e reduzida
capacidade de retenção do solo. A flora em áreas de campo pode variar muito
em poucos metros de distância, e a densidade das espécies depende do
substrato, da profundidade e fertilidade do solo, da disponibilidade de água, da
posição topográfica, etc (Ribeiro & Walter, 1998).
Nos afloramentos rochosos, por exemplo, as árvores concentram-se nas
fendas das rochas, como é o caso da espécie Tibouchina papyrus, onde a
densidade pode ser muito variável. Existem locais em que os arbustos
praticamente dominam a paisagem, enquanto em outros a flora herbácea
predomina. Também são comuns agrupamentos de uma única espécie, cuja
presença é condicionada, entre outros fatores, pela umidade disponível no
solo. Algumas espécies podem crescer diretamente sobre as rochas
(rupícolas), sem que haja solo, como ocorre com algumas Aráceas e
Orquidáceas. Pela dependência das condições restritivas do solo e do clima
peculiar, a flora é típica, contendo muito endemismo e espécies raras. Entre
essas espécies a presença de inúmeras características xeromórficas (presença
de estruturas que diminuem a perda de água), tais como folhas pequenas,
espessadas e com textura de couro (coriáceas), além de folhas com disposição
opostas cruzadas, determinando uma coluna quadrangular escamosa (Ribeiro
& Walter, 1998)
A biodiversidade do Cerrado é elevada, porém geralmente
menosprezada. Estima-se que sua fauna seja composta por 935 espécies de
aves, 298 de mamíferos e 268 de répteis (Costa, 1981), 150 de anfíbios e
1.000 de peixes, além de mais de 90.000 de insetos (Dias, 1996). Um estudo
de mais de 20 anos, liderado por pesquisadores da Universidade de Brasília
(UnB), vem revelando a cada dia mais informações sobre o Cerrado. Desta
vez, os cientistas chegaram a um número inédito sobre a quantidade de
plantas: são pelo menos 12 mil, quantidade catalogada por um grupo que inclui
18
docentes da UnB, da Embrapa e do Instituto Brasileiro de Geografia e
Estatística (IBGE), ( Agrosoft Brasil, 2008).
A destruição do ecossistema Cerrado continua de forma acelerada,
segundo um estudo feito em 2002 que utilizou imagens via satélite MODIS que
permitiu verificar que 55% do Cerrado já foi desmatado ou teve alguma tipo de
ação antrópica (Machado et al. 2004), o que comparado a região da Amazônia
equivale a 880.000Km
2
quase 3 vezes a área desmatada da Amazônia (Klink &
Moreira, 2002).
Figura 5. Diagrama de perfil (1) e cobertura arbórea (2) de um Campo Rupestre
representando uma faixa de 40 m de comprimento por 10 m de largura.
(Notar a vegetação nascendo entre as rochas). Ilustração: Wellington
Cavalcante. Fonte: (Ribeiro & Walter, 1998).
As alterações ocorridas no bioma Cerrado trouxeram muitos danos ao
meio como a fragmentação de habitats, extinção da biodiversidade, invasão de
espécies exóticas, erosão do solo, poluição de aqüíferos, degradação do
ecossistema, alterações no ciclo de queimadas. Apesar de o Cerrado ser
adaptado ao fogo (pois muitas espécies de plantas precisam do fogo para
rebrotar), o desequilíbrio destas queimadas causa o empobrecimento de
nutrientes do solo, além de causar erosões no solo, degradação da biota nativa
19
e alterando as condições climáticas da região o que pode ser prejudicial à flora
e fauna da região (Klink & Moreira, 2002).
No Cerrado, a fitofisionomia denominada campo rupestre é detentora de
diversas espécies endêmicas e de distribuição geográfica restrita tal como a
Tibouchina papyrus ((Pohl) Toledo). Essa espécie é encontrada somente neste
tipo fitofisionômico, onde a vegetação predominantemente é herbáceo-
arbustiva, com a presença eventual de arvoretas pouco desenvolvidas de até
dois metros de altura. Agrupa paisagens em microrrelevos com espécies
típicas, ocupando trechos de afloramentos rochosos. Geralmente ocorre em
altitudes superiores a 900 metros, em áreas onde ocorrem ventos
constantemente, além de variações extremas de temperatura, com dias
quentes e noites frias (Rizzo, 1981).
Os campos rupestres se localizam, principalmente em pontos elevados,
como em serras. Na Serra dos Pireneus, o relevo goiano apresenta três
ramificações: a primeira segue em direção à Bahia, formando a Serra Geral do
Paraná, a Serra da Mantiqueira e a Serra de Goiás. A segunda ramificação
segue em direção ao norte do Estado, entre os rios Tocantins e Araguaia,
formada por elevações reduzidas; a terceira dirige-se até os limites com o
Estado de Mato Grosso destacando-se as serras: Dourada, Divisão e Caiapós.
Principalmente na Chapada dos Veadeiros, Pireneus, Serra Dourada, ocorrem
os Campos Rupestres do Estado de Goiás (Rizzo, 1981).
De acordo com Ribeiro e Walter (1998) as espécies mais freqüentes no
campo rupestre pertencem às seguintes famílias e gêneros: Asteraceae
(Baccharis, Calea, Lychnophora, Wunderlichia e Vernonia – sensu lato),
Bromeliaceae (Dyckia, Tillandsia), Cactaceae (Melocactus, Pilosocereus),
Cyperaceae (Bulbostylis, Rhynchospora), Eriocaulaceae (Eriocaulon, Leiothrix,
Paepalanthus, Syngonanthus), Gentianaceae (Curtia, Irlbachia), Iridaceae
(Sisyrinchium, Trimezia), Labiatae (Eriope, Hyptis), Leguminosae (Calliandra,
Chamaecrista, Galactia, Mimosa), Lentibulariaceae (Genlisea, Utricularia),
Lythraceae (Cuphea, Diplusodon), Melastomataceae (Cambessedesia,
Miconia, Microlicia), Myrtaceae (Myrcia), Orchidaceae (Cleistes, Cyrtopodium,
Epidendrum, Habenaria, Koellensteinia, Pelexia), Poaceae (Aristida, Axonopus,
Panicum, Mesosetum, Paspalum, Trachypogon), Rubiaceae (Chiococca,
20
Declieuxia), Velloziaceae (Barbacenia, Vellozia), Vochysiaceae (Qualea) e
Xyridaceae (Xyris).
3.2. Endemismo em plantas
Na região de Cerrado cerca de 44% das espécies da flora são
endêmicas (Tabela 1), sendo considerado a maior savana, em termos de
biodiversidade, do mundo (Klink & Machado, 2005). O endemismo reflete, sem
dúvida, a existência daquela grande diversidade de condições ambientais, as
quais criaram isolamentos geográficos e/ou ecológicos e possibilitaram, assim,
o surgimento de taxas distintas de macroevolução ao longo do tempo
(Toscano, 2007). Na região de Cerrado existe uma grande diversidade de
habitats e alternância de espécies. Um inventário florístico revelou que das 914
espécies de árvores e arbustos registradas em 315 localidades de Cerrado,
somente 300 espécies ocorrem em mais do que oito localidades, e 614
espécies foram encontradas em apenas uma localidade (Ratter et al. 2003).
A diversificação da flora do Cerrado tem importantes conseqüências nos
planejamentos de estratégias de conservação desse bioma, pois torna-se
necessário o estabelecimento de muitas áreas protegidas em toda a extensão
do Cerrado para que essa riqueza florística seja conservada (Ratter et al.
1997), além de toda essa biodiversidade a região de Cerrado é rica em
recursos hídricos pois nele se encontra as três maiores bacias hidrográficas da
América do Sul a do rio São Francisco, Amazonas e o da Prata (Pires &
Santos, 2000).
Tabela 1. Número de espécies de vertebrados e plantas que ocorrem no Cerrado,
porcentagem de endemismos do bioma e proporção de riqueza de espécies
do bioma em relação à riqueza de espécies no Brasil.
Fonte: (Klink & Machado, 2005).
21
Alguns fatores podem alterar a distribuição das espécies de plantas no
Cerrado, como o clima, fertilidade, pH do solo, disponibilidade de água,
geomorfologia, topografia, latitude, freqüência de fogo e fatores antrópicos,
além da interação complexa entre estes fatores (Oliveira-Filho & Ratter, 2002).
A grande surpresa da nova lista de Hotspots foi à inclusão do Cerrado
em 2000. É a segunda maior eco região do Brasil, cobrindo 20% do território.
Com uma flora considerada entre as mais ricas das savanas tropicais, o
Cerrado possui alto grau de endemismo. De suas 10.000 espécies de plantas,
44% são endêmicas, incluindo quase todas as gramíneas. A diversidade de
espécies de vertebrados também é consideravelmente alta, estando em quarto
lugar no mundo em variedade de aves (Neto, 2003). Preservado durante a
colonização do país, o Cerrado passou a sofrer maior ameaça a partir da
década de 50 com a construção de Brasília.
Nas décadas de 70 e 80, inúmeros financiamentos foram destinados
para transformar a região num centro de agricultura. O grande crescimento
destas atividades econômicas já fizeram com que 67% das áreas de Cerrado
sejam consideradas como "altamente modificadas". Apenas 20% encontram-se
em seu estado original. Apesar de sua extensão e de sua importância para a
conservação da biodiversidade, infelizmente o Cerrado é fracamente
representado em áreas protegidas. Apenas 3% de sua extensão original estão
protegidos em parques e reservas federais e estaduais. Para agravar a
situação, a maioria das áreas protegidas do Cerrado tem tamanho reduzido,
inferior a 100.000 hectares, o que coloca em evidência o grau de fragmentação
do ecossistema. (Neto, 2003).
Atualmente, tanto a Mata Atlântica quanto o Cerrado estão incluídos
entre os 25 “hotspots” mundiais. Os “hotspots” são áreas que abrigam extrema
diversidade biológica e elevados índices de endemismo, sendo, portanto,
urgente o estabelecimento de estratégias eficientes de conservação para as
espécies naturais destas áreas (Mittermeier et al. 1999).
22
3.3. Características gerais da espécie Tibouchina papyrus (Pohl) Toledo
A Tibouchina papyrus (Pohl) Toledo é uma espécie de planta endêmica
da região do bioma Cerrado, encontrada somente na Serra dos Pireneus em
Pirenópolis, Serra Dourada na cidade de Goiás e em Natividade no Tocantins.
A espécie pertence à família Melastomataceae, que é constituída por 166
gêneros e aproximadamente 4500 espécies. É a sexta maior família dentre as
angiospermas que possui 68 gêneros e mais de 1500 espécies, que estão
distribuídas desde a Amazônia até o Rio Grande do Sul. As espécies dessa
família apresentam grande diversidade de hábitos, desde herbáceo até
arbustivos, possui alguns representantes nas formações rupestres do Brasil e
alguns gêneros são restritos a determinados tipos de fitofisionomia ou regiões
geográfica (Romero et al. 2002).
A Tibouchina papyrus é uma árvore que pode atingir até 3m de altura
(Figuras 6 e 7) e que apresenta um grande potencial paisagístico reconhecido,
no decreto do Governo do Estado de Goiás (Diário oficial de 8 de dezembro de
1972), como árvore símbolo de Goiás. Por possuir um aspecto do ritidoma
escamado em lâminas finíssimas que lembra papel de seda recebeu o nome
popular de pau-papel (Rizzo, 1991).
Figura 6. Aspecto rúpicola da planta Tibouchina papyrus e do ritidoma escamado.
23
Figura 7. Tibouchina papyrus de Serra Dourada.
Um dos primeiros trabalhos publicados sobre a morfologia dessa
espécie foi realizado por Palma em (1972), onde aspectos anatômicos dos
órgãos vegetativos e morfológicos da flor foram avaliados. A raiz foi
classificada como tetrarca e, em estrutura secundária, apresentando uma
periderme delicada. O caule jovem, em estrutura secundária, é provido de
endoderme com espessamento em U. O floema apresenta-se em duas faixas,
uma externa e outra interna; feixes floemáticos ocorrem no parênquima
medular. O lenho, em caules de estrutura secundária mais avançada, é
constituído de elementos de vaso com perfuração simples, traqueídes,
fibrotraqueídes e fibras septadas. A região nodal é unilacunar, com 3
suprimentos vasculares. No pecíolo, os feixes têm o formato de arcos ou de
cilindros, sendo que estes últimos ocupam posição lateral. A folha é provida de
sete nervuras, das quais cinco são visíveis macroscopicamente. As epidermes
adaxial e abaxial diferem quanto ao tamanho das células. Os estômatos
24
anomocíticos ficam em criptas, restritos à face inferior. Idioblastos com drusas
de oxalato de cálcio ocorrem em todos os orgãos vegetativos, bem como nos
orgãos florais. Tricomas escamiformes estão presentes no caule jovem, nas
folhas e no cálice. Os primórdios foliares, em estágios iniciais são portadores
de tricomas capitados (Rizzo, 1991).
Suas folhas são simples, opostas e pecioladas, possui inflorescência do
tipo panícula, com flores de coloração lilás, hermafroditas, actinomorfas de
aproximadamente 1,5 cm, ovário pentacarpelar, pólen granular prolato,
possuíndo 3 colpos e 3 pseudocolpos, fruto com sementes cocleares e secos
em cápsula rúptil (Rizzo, 1991b; Almeida et al. 1998). Tanino e sílica foram
encontrados no caule e na folha dessa espécie (Rizzo, 1991).
Foram feitos trabalhos sobre a fenologia e reprodução por (Chaves-
Filho, 1997; Montoro & Santos, 2004a) da Tibouchina papyrus da família
melastomataceae, realizados no campo rupestre de Serra Dourada (próximo a
cidade de Goiás) e no Parque Estadual da Serra dos Pireneus (nos municípios
de Pirenópolis e Cocalzinho, no Estado de Goiás). Os autores observaram os
eventos fenológicos de brotação, caducifólia, floração e frutificação. Os
resultados obtidos sugerem que a espécie é xenógamo facultativa, ou seja, é
caracterizada pela separação espacial entre o estigma e os estames nas flores,
o que explica a baixa formação de frutos a partir de autopolinização tendo uma
maior formação de frutos por polinização cruzada (45%) do que por
autopolinização (12%).
As flores que foram emasculadas para verificar a ocorrência de
agamospermia que é um tipo de reprodução assexual (pomixia) em que há
formação de esporófito por meio de sementes, porém, sem fusão e formação
de gametas. Pode ocorrer com ou sem alternância morfológica de gerações e
um tipo de apomixia em que as sementes são formadas por meios assexuais,
não formaram frutos. Como resultado desses trabalhos, os autores concluíram
que: 1) houve baixa formação de frutos controle (30%), o que pôde ser
explicado pela escassez dos visitantes florais (polinizadores); 2) a emissão da
radícula ocorreu entre o 7
o
e 8
o
dia com 55,3% de germinação; 3) a floração
estendeu-se de março a abril (estação chuvosa) e o amadurecimento dos
frutos entre maio e junho, coincidindo a dispersão das sementes com a queda
foliar (estação seca). Esses estudos forneceram informações importantes para
25
o melhor entendimento do processo reprodutivo da espécie Tibouchina
papyrus, que é endêmica destas regiões e ainda muito pouco estudada em seu
hábitat natural.
Romero e colaboradores (2002) realizaram um estudo no Parque
Nacional da Serra da Canastra em Minas Gerais e verificaram a ocorrência de
espécies da família Melastomataceae em quase toda a região. Após uma
análise comparando localidades dos Estados de Minas Gerais, Goiás e Bahia,
verificaram a ocorrência de formações vegetais semelhantes, com alguns
gêneros em comum, entre eles Tibouchina, apresentando 13 espécies, sendo
uma delas a Tibouchina sp. nov., também endêmica da região de campos
rupestres, no entanto, ainda não estudada.
3.4. Marcador molecular e variabilidade genética em populações
Todo e qualquer fenótipo molecular oriundo de um gene expresso, como
no caso de isoenzimas, ou de um segmento específico de DNA
(correspondentemente a regiões expressas ou não do genoma), são
considerados marcadores (Borba, 2002). Os marcadores moleculares, que são
características de herança mendeliana simples, possibilitam a inferência do
genótipo a partir do fenótipo do individuo, permitindo que a segregação do
marcador seja acompanhada (Alfenas, 2006). O ponto do genoma identificado
pelo marcador molecular é conhecido como ‘loco’ e suas formas alternativas
são os ‘alelos’. Esses por sua vez resultam do polimorfismo (diferenças no
tamanho do fragmento de DNA amplificado ou na seqüência de nucleotídeos)
existente no loco, e são utilizados na diferenciação dos indivíduos (Brondani,
2004). A análise de segregação depende, no mínimo, de duas formas alélicas,
isto é, a existência de polimorfismo no loco marcador (Snnucks, 2000;
Regitano, 2001). Assim, marcador molecular é um sítio de heterozigose para
uma variação neutra de DNA – não associada a nenhuma variação fenotípica
mensurável (Griffiths et al. 2001). Após grandes avanços nas áreas de
pesquisa utilizando marcadores, observou-se um aumento significativo na
literatura e, portanto, nos conhecimentos oriundos das áreas de genética de
26
populações, conservação e evolução, por ser possível avaliar a diversidade
genética no nível de DNA (Lacerda et al. 2002).
A técnica da reação em cadeia da polimerase (PCR, do inglês,
Polymerase Chain Reaction) concebida pelo bioquímico Kary Mullis durante a
década de 80, causou uma verdadeira revolução na biologia (Ferreira e
Grattapaglia, 1995; Newton et al. 1999). O desenvolvimento dessa técnica
aumentou a eficiência de detecção de polimorfismos no DNA ou RNA,
representando uma redução do tempo de execução dos experimentos, do seu
custo e da sua complexidade. Essa técnica permite a amplificação in vitro de
segmentos de DNA, utilizando-se oligonucleotídeos iniciadores que hibridizam
com as fitas opostas do DNA alvo, em regiões que flanqueiam o segmento a
ser amplificado (Matioli & Passos-Bueno, 2001). Essa síntese enzimática de
milhões de cópias de um segmento específico de DNA é um ciclo que envolve
três etapas (desnaturação do DNA alvo, anelamento e extensão enzimática de
um par de oligonucleotídeos que delimitam a seqüência de amplificação do
DNA alvo de fita dupla) e requer a presença de uma enzima DNA polimerase
(Ferreira & Grattapaglia, 1998).
Na década de 90, três grupos de pesquisa propuseram, ao mesmo
tempo e independentemente, modificações para a utilização da técnica de
PCR, com algumas diferenças entre eles e que mais tarde foram classificadas
em tipos de marcadores moleculares distintos. Primeiramente, Welsh &
McClelland (1990) desenvolveram, a partir de pequenas modificações do que
havia sido proposto para a PCR, o marcador molecular denominado AP-PCR
(Arbitrarily Primed - PCR). A essência da técnica era a mesma, mais o proposto
foi utilizar sempre, na reação de PCR, iniciadores de seqüência arbitrária com
aproximadamente 20 nucleotídeos. No mesmo ano, Williams e colaboradores
(1990), propuseram outra variação da PCR, também a partir da utilização de
iniciadores de seqüência arbitrária, únicos e curtos (aproximadamente 10
nucleotídeos). Essa técnica foi denominada RAPD (Random Amplified
Polymorphic DNA).
Em seguida, Caetano-Anólles e colaboradores (1991) publicaram um
trabalho propondo uma metodologia muito parecida que foi denominada DAF
(DNA Amplification Fingerprinting). Essa metodologia propõe a utilização, na
reação de PCR padrão, de iniciadores (primers) um pouco menores, entre 5 e 8
27
nucleotídeos (Weising et al. 2005). No entanto, embora todas as três
metodologias sejam muito semelhantes, a que acabou se tornando mais
popular na literatura científica foi a do RAPD (Random Amplified Polymorphic
DNA).
O marcador molecular RAPD consiste na amplificação de DNA
genômico, via PCR, utilizando iniciadores (primers) de seqüência arbitrária com
cerca de 10 nucleotídeos. Durante a reação de PCR, o iniciador deve se ligar à
seqüência complementar na fita do DNA alvo e, assim, com a presença dos
outros componentes da reação de PCR, ocorrerá a amplificação in vitro do
novo segmento de DNA (banda ou “alelo”), com o auxílio da enzima Taq
polimerase. Esse segmento só poderá ser amplificado se estiver situado entre
duas regiões adjacentes que possuam a seqüência complementar ao iniciador
(primers) e que possua tamanho compatível com a capacidade de síntese da
enzima Taq polimerase. Este procedimento permite a amplificação de regiões
de diferentes cromossomos, gerando um perfil multiloco (fingerprint), conforme
esquematizado na (Figura 8).
Figura 8. Diagrama indicando o perfil genético multiloco obtido com o marcador RAPD
(Random Amplified Polymorphic DNA).
28
O polimorfismo detectado por meio do marcador RAPD é de natureza
“dominante, ou seja, binário, pois um determinado fragmento (banda ou “alelo”)
deve estar presente ou ausente no indivíduo, quando visualizado no gel
(Ferreira & Grattapaglia,1995). Esses fragmentos exibem diferenças de
tamanho, sendo cada tamanho considerado como um “loco” diferente (Lacerda
et al. 2002). Neste sentido, existe a premissa de que todos os “locos” obtidos
por este tipo de marcador podem apresentar, nó máximo, dois “alelos”, sendo a
presença considerada o “alelo 1” e a ausência o “alelo 2”. Por este motivo, os
marcadores RAPD exibem o padrão de herança “dominante”, existindo,
portanto, dois fenótipos (presença e ausência de banda no gel) e três genótipos
possíveis: a) indivíduos homozigotos para a presença da banda (“dominantes”);
b) indivíduos heterozigotos, que exibem a banda no gel, portanto, são
indistinguíveis dos indivíduos homozigotos “dominantes”; e c) indivíduos
homozigotos para ausência da banda (“recessivos”), como pode ser observado
no esquema da (Figura 9).
Figura 9. Esquema demonstrando a base genética do padrão de “dominância” do
marcador RAPD em espécie diplóide.
29
De acordo com Ferreira e Grattapaglia (1995), a detecção de polimorfismo
pela visualização direta de uma grande quantidade de bandas no gel torna a
técnica RAPD mais ágil e prática em relação aos demais marcadores
moleculares disponíveis. Um único conjunto de iniciadores (primers) arbitrários
pode ser usado para qualquer organismo e, por serem arbitrários, possibilita a
amostragem de diversas regiões no DNA, permitindo o estudo de espécies
sobre as quais não se tem nenhum tipo de informação genética. Além disso,
somente uma pequena quantidade de DNA torna-se possível analisar
genotipicamente um indivíduo ou uma população. O fato da técnica de RAPD
demandar uma quantidade mínima de DNA por reação (cerca de 10 a 25 ng),
torna esta análise especialmente atraente para o estudo genético de plantas,
dado às dificuldades encontradas para a obtenção DNA em grande quantidade
e de boa qualidade para as amplificações em muitas espécies (Romano &
Brasileiro, 1999).
O baixo conteúdo de informação genética por loco constitui a principal
limitação dos marcadores RAPD, assim como a impossibilidade de se
discriminar genótipos heterozigotos de homozigotos. Segmentos não
amplificados ou de bandas fracas no gel podem ser resultado de uma menor
estabilidade de pareamento entre o iniciador e o sítio de complementaridade no
DNA molde, principalmente quando se leva em conta o tempo da fase de
anelamento. Muito sensível a fatores como qualidade e concentração do DNA,
o ensaio de RAPD pode ser de baixa repetibilidade (Perez-Sweeney et al.
2003).
Os marcadores RAPD têm sido criticados, desde o seu surgimento, pelo
seu baixo potencial de repetibilidade ou reprodutibilidade. Esta característica
deve ocorrer devido à sensibilidade a pequenas mudanças nas condições da
reação de PCR, tais como a marca da enzima Taq polimerase utilizada, a
concentração de DNA e cloreto de Magnésio, além de outras características do
próprio termociclador (Williams et al., 1990; Ellsworth et al. 1993; Schweder et
al. 1995). No entanto, alguns autores têm argumentado que quando as
condições de amplificação podem ser controladas durante o experimento, a
maioria das bandas repete, tornando-se uma poderosa ferramenta que poderá
ser utilizada quando os devidos cuidados forem tomados (Williams et al. 1990;
Arnold et al. 1991; Perez et al. 1998; Goulão et al. 2001; Kajolner et al. 2004).
30
No entanto, apesar de algumas críticas e limitações, a técnica RAPD tem
sido utilizada com sucesso para a análise da diversidade genética e estrutura
molecular em populações naturais de plantas (Sawazak et al. 1998; Telles et al.
2001; Lacerda et al. 2002; Nybom, 2004; Reis & Grattaglia, 2004; Wadt et al.
2004; Wang et al. 2005; Torimaru et al. 2005; Soares et al. 2008).
A técnica RAPD também pode ser interessante para o estudo de espécies
ameaçadas, raras, endêmicas ou de distribuição restrita, pois pode fornecer
informações genéticas relevantes, revelando a diversidade e a estrutura
genética das populações. A estrutura genética de uma espécie pode ser
entendida como a ocorrência de uma estruturação entre e dentro de uma
população ou em populações (Wadt, 2001), que resulta da combinação de
diferentes fatores tais como mutação, migração, seleção e deriva genética, nas
quais podem levar à diferenciação da variabilidade genética presente nessas
populações (Futuyma, 1993; Hamrick, 1994; Ridley, 2006).
Em populações naturais a distribuição da variabilidade pode ser
influenciada por diversos fatores, entre eles pode-se ressaltar o modo de
reprodução, tamanho da população, distribuição geográfica, intensidade do
fluxo gênico (Hamrick, 1982; Hamrick, 1994). Diferentes marcadores
moleculares permitem utilizar metodologias de análise estatísticas diversas
para quantificar a variação genética dentro de uma população. Umas das
formas clássicas de conhecer essa variação é a estimativa da proporção de
locos polimórficos para o conjunto de populações (dentro da espécie) e dentro
de cada população, além de diversas medidas de diversidade genética que
estão disponíveis na literatura (Alfenas et al. 2006).
A análise da estrutura genética das populações avalia os níveis de
diversidade e a distribuição da variabilidade genética entre e dentro das
populações avaliadas. Existem disponíveis hoje diversos algorítimos e
ferramentas computacionais de livre acesso, que disponibilizam as diferentes
estatísticas que podem ser utilizadas para obtenção dessas respostas, sendo a
maioria delas baseada, e consideradas análogas às estatísticas-F proposta por
Wright (1951). As mais utilizadas e conhecidas são: 1) Análise de Variância de
Freqüências Alélicas proposta por Cockerham (1969) para dados “co-
dominantes” e a porposta por Hardy (2003) para dados “dominantes”; 2)
Análise de diversidade genética posposta por Nei (1973); e 3) Analise de
31
Variância Molecular (AMOVA) posposta por Excoffier (1992) primeiramente
para dados binários e/ou “dominantes” e posteriormente ampliada para outros
tipos de dados moleculares (Excoffier & Heckel, 2006).
No entanto, apesar da importância dessas estatísticas para a
caracterização genética de populações naturais, elas permitem apenas uma
descrição geral da heterogeneidade da variabilidade existente ao longo da
distribuição geográfica das populações (Telles et al. 2001). A variabilidade
genética, além de estar estruturada entre e dentro de populações pode também
apresentar uma correlação com o espaço geográfico. Essas características,
juntamente com outras da espécie, pode fornecer subsídios para aumentar a
eficiência de programas de conservação de germoplasma, auxiliando na
definição de unidades evolutivamente estáveis (UEE) ou unidades de manejo
(UM) (Telles et al. 2001).
Os estudos sobre a variabilidade genética das espécies endêmicas do
Cerrado, especialmente a Tibouchina papyrus tornam-se muito importantes,
pois, além de contribuir para o aumento do conhecimento sobre a flora deste
bioma, tal estudo fornece suporte tanto para o planejamento de estratégias de
preservação in situ, quanto para futuros programas de coleta de germoplasma
para conservação ex situ, domesticação e uso como planta ornamental.
32
4. Material e Métodos
4.1. Caracterização da Área
A área de ocorrência da Tibouchina papyrus (Pohl) Toledo, se limita a
matas e matas de galeria do Cerrado e sua distribuição é restrita a região do
Parque Estadual dos Pirineus, localizado nos municípios de Pirenópolis,
Cocalzinho de Goiás e Corumbá de Goiás e na região do Parque Estadual da
Serra Dourada, localizado nos municípios de Goiás, Mossâmedes e Buriti de
Goiás (Figura 10) e (Tabela 2)
.
Figura 10. Localização do Parque Estadual da Serra Dourada e Parque
Estadual dos Pirineus.
33
Tabela 2. Locais de coleta de seis populações de Tibouchina papyrus (pau-papel),
com suas respectivas coordenadas geográficas.
Coordenadas
População
Local
Latitude Longitude
Altitude
SD1 Serra Dourada 16º 04',716 50º 11',303 993
SD2 Serra Dourada 16° 04',410 50° 10',587 1005
P1 Pirenópolis 15°47,' 738 48°58',722 1242
P2 Pirenópolis 15º 48’,130 48º 52’,220 1311
P3 Pirenópolis 15º 48’,500 48º 51’,280 1301
P4 Pirenópolis 15º 48’,110 48º 50’,320 1250
O Parque Estadual da Serra Dourada compreende uma área total de
30.000,00 ha, criado pelo decreto nº 5.768 de 05/06/2003. A cidade de Goiás é
circundada pela APA (Área de Proteção Ambiental) da Serra Dourada, que tem
35 mil hectares e abrange outros municípios, como o município de
Mossâmedes, abriga uma das formações rochosas mais antigas do planeta
(Kianek, 2006).
O Parque Estadual dos Pirineus compreende uma área total de 2.833,26
ha, criado pela lei no 10.321 de 20/11/1987; decreto no 4.830 de 15/10/1987.
Na Serra dos Pireneus as primeiras pesquisas sobre a flora da região foram
realizadas nos séc. XVIII e XIX por vários pesquisadores (Saint Hilaire, Pohl,
Spix e Martius), porém a maior quantidade de coleções realizadas nesta área
foi efetuada pela equipe de Howard Irwin (Jardim Botânico de Nova York)
durante as décadas 1960 -1970. Outras importantes coleções das plantas da
Serra dos Pireneus foram efetuadas por Rizzo e Barbosa durante o período
1970-1971, onde foram coletadas 397 espécies distribuídas em 135 gêneros e
78 famílias, as quais se encontram depositadas no herbário da Universidade
Federal de Goiás. De acordo, com Rizzo e Barbosa considera que boa parte da
área ainda não foi ainda metodicamente coletada, o levantamento florístico da
Serra dos Pireneus poderia facilmente superar as 500 espécies (Agetop, 2005).
Na área em estudo o Cerrado Rupestre ocorre nos domínios do
compartimento superior do relevo, associado às outras fitofisionomias em
especial ao Cerrado Ralo e às vezes às formações campestres, incluindo o
34
campo Rupestre, constituindo um mosaico de formações predominantemente
abertas. Apresenta uma cobertura arbórea de baixa densidade, entre 5 e 15%,
destituídas de vestígios de interferência antrópica significativa, em especial no
entorno dos afloramentos rochosos. Porém são evidentes os sinais de
queimadas (Agetop, 2005).
O clima de Pirenópolis é classificado como tropical subúmido, definido
por dois períodos distintos: um chuvoso e quente, que abrange os meses de
outubro a março e outro seco e frio, ocorrendo nos meses de abril a setembro.
A Serra dos Pireneus é considerada marco de divisões de duas das mais
importantes bacias hidrográficas do Brasil: a Bacia Platina, a Bacia
Tocantinense. A abundância de águas e nascentes na região é responsável
pelos mananciais de rios como: o Rio das Almas, das Pedras, o Santa Rita, o
Maranhão, o Verde, dos Patos, etc (Souza et al. 2006).
4.2. Obtenção das amostras e extração de DNA
Os dados moleculares para este trabalho foram obtidos no Laboratório
de Genética & Biodiversidade da Universidade Católica de Goiás, em Goiânia.
Foram coletadas folhas de indivíduos dos dois locais de ocorrência da
espécie no Estado de Goiás, Parque Estadual da Serra Dourada – Goiás e
Parque Estadual dos Pirineus – Pirenópolis. Essas folhas foram colocadas em
saquinhos de papel, identificadas e transportadas em caixa de isopor com gelo
para conservar seu bom estado até chegar ao laboratório. No momento da
coleta todos os pontos foram georeferenciados para as análises espaciais.
O DNA foi extraído das folhas de 327 plantas, distribuídas em seis
populações, sendo quatro em Pirenopólis, denominadas P1, P2, P3 e P4 e
duas da Serra Dourada, chamadas de SD1 e SD2. A extração do DNA foi
realizada conforme o protocolo para tecido vegetal descrito por Ferreira &
Grattapaglia (1998). Este protocolo consiste em minipreparações de DNA
diretamente em microtubos, a partir de alguns miligramas (aproximadamente
250) de tecido vegetal, utilizando o CTAB (Cationic hexadecyl trimethyl
ammonium bromide) como detergente para a solução tampão da primeira
etapa da extração.
35
Após a extração, o DNA total de cada uma das plantas (alíquotas de 3µI)
foi submetido à eletroforese horizontal utilizando-se gel de agarose 1% imerso
em tampão TBE (Tris Borato EDTA) na concentração de 1X, com o auxílio do
marcador de peso molecular Low DNA Mass, fornecido pela Invitrogen. O gel,
depois de corado, foi visualizado em um transiluminador de luz ultravioleta e
fotografado com o fotodocumentador KODAK EDAS 120. Com base na
comparação do padrão do marcador com a amostra de DNA no gel, com o
auxílio do programa da KODAK EDAS 120, foi estimada a quantidade de DNA
em cada amostra de DNA (em nanogramas por microlitro - ng/µL). Em seguida,
a solução estoque de DNA foi diluída para uma concentração final de trabalho
de aproximadamente 3ng/µL.
4.3. Amplificação e obtenção dos dados moleculares
Para a amplificação dos locos foram utilizados seis iniciadores (primers)
RAPD (OPB-4, OPB-5, OPB-10, OPM-3, OPM-5, OPM-13) que haviam sido
selecionados por Telles et al. em (2003). As amplificações para um
determinado primer sempre foram conduzidas em um mesmo termociclador,
para as seis populações, minimizando, desta forma os possíveis riscos com
relação à mudança nas condições de amplificação que pode gerar problemas
de repetibilidade. O programa de amplificação utilizado apresenta a
temperatura de anelamento do iniciador RAPD igual 37°C, que é um pouco
mais alta do que o comumente utilizado, aumentando assim a especificidade
do pareamento do iniciador (primer) à região alvo, o que conseqüentemente
melhora o produto amplificado pela enzima Taq DNA polimerase.
As reações de PCR para um volume final de 20µl foram montadas da
seguinte maneira: 3µL de DNA (~3ng/µL); 2,0µL de primer (~10ng/µL); 2,6µL
tampão da enzima (10X); 0,78µL de MgCl
2
(50mM); 2,08µL de d’NTP (2,5mM);
0,2µL da enzima Taq-Polimerase (5 unidades/µL - Amersham Pharmacia
Biotech), completando o volume com 9,34µL de H
2
O Milli-Q.
A amplificação dos fragmentos de DNA, via reação em cadeia da
polimerase (PCR), no termociclador, foi conduzida com um programa que
36
possui os seguintes passos: (1º) desnaturação do DNA a 96ºC por 3 minutos e
(2º) a 92ºC por 1 minuto; (3º) anelamento do iniciador RAPD (primer) a 37ºC
por 1 minuto; extensão da molécula pela enzima Taq polimerase a 72ºC por 1
minuto; (5º) 40 ciclos seguindo do 2º ao 4º passo; (6º) passo final de extensão
de 3 minutos a 72ºC para finalizar os produtos amplificados. A eletroforese do
produto amplificado foi conduzida em gel de agarose 1,4%, de acordo com o
exposto no item anterior.
A codificação dos géis de RAPD foi realizada como se faz usualmente,
atribuindo presença (1) ou ausência (0) da banda, por loco, para cada
indivíduo. O marcador de peso molecular 100bp (Invitrogen) foi inserido nas
duas extremidades de cada gel, com o intuito de nortear a codificação,
permitindo a identificação da altura correta de cada loco entre os géis. Os locos
codificados foram os que apresentaram bandas mais nítidas no gel, para
facilitar a distinção entre elas e minimizar erros de codificação entre os géis.
Além disso, foi respeitada uma faixa determinada de tamanho dos fragmentos
(altura de locos nos géis), que não ultrapassou os limites em pares de bases de
2600 (superior) e 200 (inferior) pois, os géis foram repetidos e em todos foram
verificados que o aparecimento de banda não ultrapassaram a altura dos
limites mencionados anteriormente. Desta codificação foi obtida uma matriz de
dados binários que foi utilizada para as análises genético-populacionais.
4.4. Análise estatística dos dados
4.4.1 Variabilidade e estrutura genética
A variabilidade genética dos locos RAPD foi estimada, a partir da matriz
de dados binários resultante da análise dos géis conforme descrito em Weir
(1996), Alfenas et al. (2006) e Freeland (2005). Inicialmente, a variabilidade
genética foi avaliada, para cada iniciador RAPD, por meio da estimativa do
polimorfismo presente nos locos, considerando-se todas os indivíduos
simultaneamente e, em seguida, cada população separadamente. Portanto, foi
estimado o número e proporção de locos (ou bandas) polimórficos, em que:
37
coslodetotalºn
cosórfilimpocoslodeºn
P =
A diversidade genética (h), para cada população, foi avaliada conforme
descrito por Nei em 1973, sendo calculada seguinte maneira:
∑
−=
=
m
i
i
xh
1
2
1
Onde,
2
i
x
é a freqüência do alelo i e m é o número de alelos encontrado
em cada loco Freeland (2005). Essa teoria para estimar parâmetros
populacionais a partir de dados de RAPD parte de dois pressupostos básicos:
1) as bandas são inequivocadamente identificadas no gel e cada banda pode
ser associada a um loco com dois alelos, sendo que o caráter “dominante” do
marcador impede a distinção entre os genótipos heterozigoto e homozigoto
“dominante”. 2) As populações devem estar em equilíbrio de Hardy-Weinberg.
A avaliação da proporção da variabilidade genética que está entre e
dentro das populações foi obtida pelo método mais comumente utilizado para
dados de marcadores “dominantes”, a Análise de Variância Molecular
(AMOVA) proposta por Excoffier et al. (1992). Esse procedimento foi realizado
no programa Arlequin versão 2.000 (Schneider et al. 2000). Essa metodologia
permite desdobrar a distância entre e dentro de populações locais ou regiões,
utilizando uma estratégia semelhante à realizada na ANOVA convencional,
mas parte de uma matriz de distância euclidiana calculada entre indivíduos
com base na presença (1) e ausência (0) das bandas RAPD. O modelo
matemático que descreve a AMOVA é um modelo hierárquico que considera os
níveis de regiões, de populações e de indivíduos dentro de população,
conforme a seguinte equação:
ijkjkkijk
cbaxx +++=
em que x é a média geral, a é o efeito de regiões, b de populações e c de
haplótipos dentro de população, dentro de regiões, sendo que esses efeitos são
aditivos, aleatórios e independentes, associados aos componentes de variância
2
a
σ
,
2
b
σ
e
2
c
σ
, respectivamente e a variância total (
2
t
σ
) é obtida pela soma
38
destes. O quadro de análise de variância molecular hierárquica obedece à
estrutura apresentada na Tabela 3.
Tabela 3. Esquema de análise de variância molecular (AMOVA) hierárquica para os
dados binários.
Fonte de Variação
Graus de
liberdade
Soma de
quadrados
Componentes de
variância
Entre regiões (ER) R - 1 ER
222
cba
nn σ+σ+σ '''
Entre populações/ dentro de
regiões (EP/DR)
P- R EP/DR
22
cb
n σ+σ
Dentro de populações (DP) N - P DP
2
c
σ
Total (T)
N - 1 T
2
t
σ
No quadro, R refere-se ao número de regiões; P o número de
populações e N o número total de indivíduos.
O componente de variância inter-regional e inter-populacional pode ser
extraído por equações das esperanças de quadrado médio (QMD), análogo à
análise de variância convencional das freqüências alélicas, utilizadas para
estimar o F
ST
(Cockerham 1969, 1973). O mesmo procedimento pode ser
empregado com base no desdobramento da soma de quadrado entre as
distâncias, utilizando as chamadas estatísticas-Φ. Como na ANOVA
convencional, pode-se reescrever essas equações em termos das estatísticas
Φ
entre as regiões e entre as populações locais, de modo que:
2
2
T
a
CT
σ
σ
=Φ
,
22
2
cb
b
SC
σ+σ
σ
=Φ
e
2
22
T
ba
ST
σ
σ+σ
=Φ
A significância associada a cada uma destas estimativas foi obtida
utilizando-se 5000 permutações da seguinte maneira:
• para
2
c
σ
e
ST
Φ permutando-se indivíduos entre populações entre regiões;
• para
2
b
σ
e
SC
Φ permutando-se indivíduos entre populações dentro regiões;
• para
2
a
σ
e
CT
Φ permutando-se populações entre regiões.
Para obter uma distribuição nula dessas estatísticas, foram utilizados
procedimentos de aleatorização, por permutações aleatórias das fileiras (e
39
colunas correspondentes) da matriz de distâncias quadráticas (Mantel, 1967).
Os componentes de variância foram estimados para cada uma das matrizes
permutadas (cerca de 5000 permutações). Os locos que apresentaram acima
de 10% de dados perdidos (missing) foram excluídos da análise de variância
molecular (AMOVA).
4.4.2 Estimativa indireta do fluxo gênico
Com o intuito de obter uma estimativa indireta do fluxo gênico entre
essas populações, foi utilizada a abordagem proposta em Freeland (2005), que
se baseia na teoria das estatísticas-F proposta por Wright em 1951. Esta
proposta parte da premissa de que existe uma relação simples entre
divergência genética, medida pelo F
ST
(ou análogos), e a intensidade de fluxo
gênico entre essas populações é dada por:
( )
14
1
+
=
mN
F
e
ST
onde
e
N é o tamanho efetivo de cada população e
m
é a taxa de migração
entre as populações. Portanto, mN
e
é a proporção de adultos reprodutivos
migrantes. A partir desta equação anterior, pode-se, portanto, calcular o valor
de mN
e
, como sendo:
4
1
1
−
=
ST
e
F
mN
.
Nesse estudo a proporção de adultos reprodutivos migrantes foi avaliada
utilizando o Φ
ST
, análogo à estimativa F
ST
.
4.4.3 Divergência genética e padrão espacial
A divergência genética entre as populações foi avaliada com base na
matriz de distância genética obtida pela AMOVA (
ST
Φ par a par), que é a que
apresenta um menor número de pressupostos em relação ao equilíbrio de
Hardy-Weinberg, tamanho amostral e padrão de herança do marcador, pois foi
40
desenvolvida para este tipo de dado. Após a estimativa da divergência
genética, vários métodos multivariados podem ser aplicados. Neste estudo, a
matriz de distâncias genéticas foi analisada, inicialmente, a partir de uma
análise de agrupamento tipo UPGMA (unweighted pair-group method by
arithmetic averages), que produz um arranjo hierárquico de classificação das
populações, representado por um dendrograma. A representatividade deste
dendrograma foi testada por meio da correlação entre as distâncias genéticas
originais e as distâncias entre as populações no dendrograma (correlação
cofenética) (Legendre & Legendre 1998).
Apesar de o agrupamento pelo método do UPGMA ser uma das técnicas
mais utilizadas neste tipo de estudo, ele pode não representar adequadamente
as distâncias genéticas, indicando um falso arranjo hierárquico entre as
populações, quando existe entre elas, de fato, um padrão contínuo ou
reticulado. Em função desses problemas, as distâncias genéticas também
foram analisadas por uma técnica de ordenação que visa representar
graficamente a dissimilaridade entre as populações, o escalonamento
multidimensional não-métrico (non-metric multidimensional scaling) (Lessa,
1990). Esta técnica parte de uma configuração inicial de pontos (populações)
alocados ao acaso em um número reduzido de dimensões, normalmente 2-D
ou 3-D. Com base na distribuição ao acaso das populações são calculadas
novas distâncias e estas são comparadas com as distâncias genéticas
originais, através de um procedimento iterativo, com o objetivo de minimizar as
diferenças entre as matrizes. Essa minimização é mensurada, ao longo do
processo iterativo, por uma estatística denominada estresse (S). Quanto mais
próximo de zero for o valor de S, menor a distorção e, portanto, melhor a
representatividade das distâncias genéticas (Manly, 1997).
Com intuito de analisar os padrões de variação espacial, em um
contexto multivariado, foi realizado o teste de Mantel. Para tanto, foi feita a
estimativa do coeficiente de correlação de Pearson (r) entre as matrizes de
distâncias genéticas e as distâncias geográficas entre as populações
(Epperson, 2003). Para se testar a significância das correlações matriciais
foram utilizadas 1000 permutações aleatórias (Manly, 1997).
41
5. Resultados e discussão
5.1. Variabilidade genética
Dos 332 indivíduos coletados, somente 327 foram utilizados nas
análises, por apresentarem boa quantidade e qualidade de DNA. A matriz de
dados binários proveniente da codificação dos seis iniciadores RAPD gerou um
total de 147 locos, variando entre 23 e 26 por iniciador (Tabela 4). Nas figuras
11 e 12 observa-se o perfil de amplificação de algumas amostras de DNA dos
indivíduos das populações de Tibouchina papyrus, utilizando-se os iniciadores
OPB-05 e OPM-13, respectivamente. Exemplos dos padrões de amplificação
de outros iniciadores RAPD estão listados no apêndice 1.
Tabela 4. Relação dos iniciadores RAPD, suas respectivas seqüências de bases
(5’→3’) e o número de locos gerados por iniciador selecionados para
análises genéticas de Tibouchina papyrus.
Iniciador
(
primer
)
NL
OPM-03 G G G G G A T G A G 25
OPM-05 G G G A A C G T G T 23
OPM-13 G G T G G T C A A G 23
OPB-04 G G A C T G G A G T 26
OPB-05 T G C G C C C T T C 24
OPB-10 C T G C T G G G A C 26
Total 147
Sequência 5'
→
3'
As seis populações de Tibouchina papyrus apresentaram uma
variabilidade genética consideravelmente alta, que foi observada para os seis
iniciadores RAPD, nos 327 indivíduos analisados. O número de locos
polimórficos, para o total dos iniciadores RAPD, variou entre 121 (P2) e 143
(P1), com um total igual a 147 locos, considerando o total de indivíduos
avaliados. Quando todos os locos foram considerados, a porcentagem de locos
polimórficos foi igual a 100% e, nas populações, variou entre 82% (P2) e 97%
42
(P1). A diversidade genética (h) ou heterozigose esperada (Nei, 1973), quando
avaliada para os 147 locos e em todos os 327 indivíduos, apresentou uma
distribuição de freqüência que variou entre 0 e 0,5 (Figura 13), sugerindo que
existem locos que apresentam a máxima diversidade esperada para um loco
com dois alelos (h = 0,499) e outros que já perderam variabilidade genética,
praticamente fixando um dos alelos (h = 0,025). A diversidade genética geral,
considerando todos os locos simultaneamente em todos os indivíduos, foi alta e
igual a 0,34, variando nas populações entre 0,24 (P2 e P4) e 0,33 (P1) (Tabela
5).
Figura 11. Perfil eletroforético dos fragmentos RAPD amplificados utilizando o
iniciador OPB-05 com indivíduos de Tibouchina papyrus. As colunas M
100bp, indicam o marcador de peso molecular (100 base pair ladder,
Pharmacia).
Figura 12. Perfil eletroforético dos fragmentos RAPD amplificados utilizando o
iniciador OPM-13 com indivíduos de Tibouchina papyrus. As colunas M
100bp indicam o marcador de peso molecular (100 base pair ladder,
Pharmacia).
43
Tabela 5. Relação do número de indivíduos por população (N), número de locos
polimórficos (NLP), porcentagem de locos polimórficos (LP%) e Diversidade
genética de Nei (h), em populações Tibouchina papyrus, para seis
iniciadores RAPD.
População N NLP LP(%)
h
SD1 71 136 93 0,25
SD2 69 140 95 0,30
P1 67 143 97 0,33
P2 36 121 82 0,24
P3 42 122 83 0,25
P4 42 126 86 0,24
média 55 131 89 0,27
total 327 147 100 0,34
Diversidade genética ( h)
Número de observações
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5
Figura 13. Distribuição dos valores da Diversidade genética (h) dos 147 locos RAPD
analisados nas populações de Tibouchina papyrus.
44
Dessa forma, pode-se verificar que apesar de ser uma espécie
endêmica e com distribuição geográfica restrita, para os locos avaliados nesse
trabalho, pôde-se verificar a existência de uma grande quantidade de
variabilidade genética, provavelmente em função das estratégias reprodutivas
adotadas pela espécie ao longo de sua evolução. Provavelmente, a atuação
dos agentes polinizadores (abelhas da espécie Bombus sp.) é de extrema
importância para garantir este processo, uma vez que os mesmos são
responsáveis por grande parte da fecundação cruzada que acontece entre os
indivíduos, garantindo, desta forma, a possibilidade de aparecimento de novas
combinações gaméticas (ou seja, genéticas) oriundas das divisões meióticas,
seguidas de fertilização entre gametas de diferentes indivíduos (Figura 14).
Figura 14. Evento de polinização em uma flor de Tibouchina papyrus por um indivíduo
da espécie Bombus sp.
Os valores de diversidade genética, encontrados neste trabalho,
corroboram a hipótese de que a espécie Tibouchina papyrus é uma espécie
xenógama facultativa, com maior formação de frutos por polinização cruzada
do que por autopolinização, conforme descrito na literatura (Chaves-Filho,
1997; Montoro & Santos, 2004b). Sugerem, portanto, que existem mecanismos
que estão evitando de alguma maneira, a ocorrência de elevadas quantidades
45
de endogamia, que poderia ter um efeito deletério em médio e longo prazo.
Essa estratégia reprodutiva, provavelmente, tem garantido a persistência de
suas populações com níveis consideráveis de variabilidade genética nas
regiões onde a espécie Tibouchina papyrus é endêmica e restrita.
5.2. Estrutura genética populacional e fluxo gênico
A avaliação da estruturação da variabilidade genética, realizada pela a
AMOVA, (Tabela 6), que forneceu uma estimativa global de Φ
ST
= 0,3439 (P <
0,0001, com 5000 permutações), ou seja 34,39% da variação total se encontra
entre as populações, sendo que destes, 18,96% referem-se à variação entre
regiões (
Φ
CT
) e 15,43% à variação entre populações dentro de regiões. Deste
modo, pode-se verificar que 84,57% da variância genética se encontram no
componente intrapopulacional. Se for desconsiderado o efeito da região o
componente da variância genética intrapopulacional passa a assumir um valor
igual 65,6%.
Tabela 6. Quadro de análise de variância molecular (AMOVA) para seis populações
de Tibouchina papyrus com dados de 109 locos RAPD.
Fonte de Variação
Graus de
liberdade
Soma de
quadrados
Componentes
de variância
% Variação
Entre regiões (ER) 1 965,06 4,52 Va 18,96
Entre populações/ dentro
de regiões (EP/DR)
4 824,71 3,68 Vb 15,43
Dentro de populações (DP)
321 5019,97 15,64 Vc 65,61
Total (T) 326 6809,75 23,84 -
Estatísticas
Φ
:
Φ
CT
= 0,1896***
Φ
ST
= 0,3439**
Φ
SC
= 0,1543.**
Os valores elevados de estruturação da variabilidade genética entre
regiões estão de acordo com o esperado, uma vez que as mesmas são
distantes o bastante para impedir a ocorrência de fluxo gênico atual entre as
46
populações dessas regiões. Neste sentido, uma explicação provável para a
similaridade genética compartilhada entre as populações dessas regiões é o
efeito fundador da variabilidade genética das populações ancestrais, que está
refletindo, portanto, um fluxo gênico histórico. Quando os valores de
estruturação entre e dentro de populações são considerados dentro de cada
região, embora considerado moderadamente alto (15,43%), esses valores são
muito semelhantes aos encontrados na literatura para outras espécies de
plantas do Cerrado (Zucchi, 2002; Mendonça, 2006; Soares et al. 2008).
A estimativa da proporção de migrantes, por geração, calculada com
base no Φ
ST
(0,34), resultou num N
e
m igual a 0,48 indivíduos. No entanto,
como foi verificado que há um elevado e significativo componente de variação
genética entre regiões, a estimativa da proporção de migrantes por geração,
torna-se melhor estimada a partir da proporção de variação entre populações
dentro de regiões (Φ
SC
= 0,15), que passa a assumir um valor de N
e
m igual a
1,37 indivíduos. Com base nesses resultados, pode-se inferir que a estimativa
de fluxo gênico, obtida a partir do Φ
ST
, reflete com mais intensidade um
componente histórico e o obtido com base no Φ
SC
, se aproxime mais às taxas
atuais de fluxo gênico.
5.3. Divergência genética e padrão espacial
Com base nas análises de variabilidade genética entre e dentro das
populações descritas anteriormente pode-se observar que existe diferenciação
significativa entre as populações. Neste sentido, pode-se observar que as
distâncias genéticas (Φ
ST
) entre as populações (Tabela 7) variaram entre 0,095
(SD1 e SD2) e 0,453 (SD1 e P2).
No sentido de visualizar o padrão de divergência entre as populações de
Tibouchina papyrus, a análise de agrupamento por UPGMA da matriz de
distância genética, embora tenha apresentado um valor da correlação
cofenética não muito elevado (r = 0,78), permitiu verificar que as ligações no
dendrograma refletem corretamente os padrões multivariados de distâncias
genéticas entre as populações (Figura 13). Esse resultado também confirma a
levada estruturação genética encontrada entre regiões, uma vez que o
47
agrupamento permite a visualização de dois grandes grupos, um contendo as
duas populações de Serra Dourada (SD1 e SD2), mais semelhantes
geneticamente, e o outro as demais populações da Serra dos Pirineus (P1, P2,
P3 e P4).
Tabela 7. Valores de
Φ
ST
par a par entre as seis populações de Tibouchina papyrus,
com base em 109 locos RAPD.
SD1 SD2 P1 P2 P3 P4
SD1
0,000
SD2
0,095 0,000
P1
0,284 0,183 0,000
P2
0,453 0,384 0,305 0,000
P3
0,422 0,348 0,297 0,135 0,000
P4
0,384 0,296 0,196 0,199 0,204 0,000
O padrão de divergência genética entre as populações de Tibouchina
papyrus, também avaliado pelo escalonamento multidimensional não-métrico
(NMDS), apresentou um valor de stress em duas dimensões igual a 0,00007
(Figura 16). As duas abordagens possibilitaram a mesma interpretação e
indicão que deve haver uma relação direta entre distância genética e
geográfica, pois as populações de Serra Dourada (SD1 e SD2) estão sempre
mais similares geneticamente em relação às demais que são oriundas da Serra
de Pirineus (P1, P2, P3 e P4). Outro ponto interessante de ser observado é
que, nas duas análises, a P1 (da Serra de Pirineus) está mais diferente
geneticamente das demais da mesma região (P2, P3 e P4) e, de fato, o local
de coleta destes indivíduos da P1 é em uma região na base da Serra, enquanto
as demais foram coletadas no topo da Serra, muito semelhante à configuração
das populações obtida na área de coleta (Figura 15).
48
Distância genética
0.10 0.16 0.22 0.28 0.34
S1
S1
S2
P1
P4
P2
P3
Figura 15. Padrão de divergência genética entre seis populações de Tibouchina
papyrus, definido pelo agrupamento por UPGMA, com base nas distâncias
genéticas (Φ
ST
). Correlação cofenética igual a 0,78.
Eixo I
-1.20 -0.63 -0.05 0.52 1.10
Eixo II
-0.49
-0.22
0.05
0.32
0.59
S1
S2
P1
P2
P3
P4
Figura 16. Distribuição das seis populações de Tibouchina papyrus no espaço
bidimensional obtido pelo NMDS, a partir das distâncias genéticas (Φ
ST
).
O valor de stress foi igual a 0,00007.
Ainda no sentido de investigar o padrão espacial da variabilidade
genética presente nessas populações, o teste de Mantel apresentou uma
49
correlação matricial entre distância genética (Φ
ST
) e geográfica igual a 0,715 (P
= 0,015, com 1000 permutações) (Figura 17). Esses resultados mostram que,
de fato, a distância geográfica desempenha um papel significativo que permite
explicar o padrão espacial da variabilidade genética entre essas populações de
Tibouchina papyrus, que sabidamente estão localizadas em duas regiões
descontínuas e isoladas. Essa análise de padrão espacial sugere que esta
estrutura tenha se originado seguindo um modelo de diferenciação estocástica
(neutro), ou seja, por um balanço entre fluxo gênico a curtas distâncias e deriva
genética nas populações. Esses resultados confirmam o que foi assinalado nas
análises de estruturação da variabilidade genética reforçando a influência do
isolamento geográfico entre as populações das duas regiões e provável
interrupção do fluxo gênico atual.
0 20 40 60 80 100 120 140 160
Distância geográfica (Km)
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
0,35
0,40
0,45
0,50
Distância genética (Φ
ST
)
r = 0,715
P = 0,015
Figura 17. Relação entre distância genética (Φ
ST
) e distância geográfica (r = 0,715 - P
= 0,015, com 1000 permutações) entre 6 populações de Tibouchina
papyrus.
50
Diversos estudos, disponíveis na literatura, que utilizaram marcadores
RAPD em populações de espécies de plantas nativas do Cerrado (Tabela 8),
em média apresentam valores de estruturação genética bem inferiores aos
encontrados neste trabalho. No entanto, a maioria dessas espécies possui
hábito arbóreo e ampla distribuição geográfica de suas populações nas áreas
de Cerrado, reforçando a hipótese de que espécies endêmicas e de
distribuição restrita, como é o caso da
Tibouchina papyrus
(pau-papel), exibem
um modelo de evolução das suas populações muito peculiar, que necessita
melhor compreensão, antes que se proceda qualquer tipo de intervenção
humana. Outro ponto importante é que as comparações dos valores de
estruturação devem ser realizadas com cautela, pois os trabalhos são
conduzidos de maneira muito diferentes, exibindo muita variação no número de
populações, indivíduos dentro de populações e locos, além de escalas
espaciais muito distintas.
Tabela 8. Conjunto de espécies de plantas do Cerrado que apresentam resultados de
estudos utilizando marcadores RAPD em populações. Relação do número
de populações (NP), número total de indivíduos (NTI), número de
iniciadores RAPD (NIn), porcentagem de locos polimórficos (LP%), valor da
estatística-F utilizada (E-F) e referências bibliográficas.
Nome da espécie NP
NTI
NIn NL
LP (% ) E-F Referências
Plathymenia reticulata
6 117
10 72 71 0,12
Lacerda et al. 2001
Myracrodruon urundeuva
10
192
27 83 - 0,03 Reis & Grattapaglia, 2004
Eugenia dysenterica
13
152
6 45 83 0,09 Trindade & Chaves, 2005
Eugenia dysenterica
10
114
8 74 73 0,27 Zucchi et al. 2005
Zeyheria montana
8 167
35 105
60 0,16
Bertoni et al. 2007
Dipteryx alata
10
309
5 45 89 0,16
Soares et al. 2008
A melhor estratégia para proteção em longo prazo da diversidade
biológica é a preservação de comunidades e populações no ambiente natural,
conhecida como preservação in situ ou preservação local. Somente na
natureza as espécies são capazes de continuar o processo evolutivo e ter
capacidade de adaptação para um ambiente em mutação dentro de suas
comunidades naturais. Em princípio, a conservação in situ pode não ser tão
51
eficiente, por exemplo, no caso de pequenas populações ou no caso da maioria
das populações remanescentes estarem fora das áreas protegidas.
A partir dos resultados obtidos neste estudo é possível fazer alguma
consideração a respeito de recomendações de estratégias para a conservação
e o manejo da espécie. No contexto de conservação in situ, para fins de
conservação de germoplasma, pode-se sugerir a coleta de sementes do maior
número possível de populações encontradas, nas duas regiões avaliadas, pois,
cada uma contém um componente particular da variação genética total, já que
elas são encontradas em regiões de parques e áreas de conservação o que de
certa forma, facilita a persistência destas espécies nestas regiões já que são
endêmicas e de regiões restritas.
52
6. CONCLUSÕES
As populações de Tibouchina papyrus (Pau-papel) oriundas da Serra
Dourada e Serra dos Pirineus apresentam altos níveis de diversidade
genética, com base nos 147 locos RAPD analisados;
Os valores de diversidade genética encontrados apóiam a hipótese de
que a espécie Tibouchina papyrus é uma espécie xenógama facultativa;
Existe elevada estruturação genética entre regiões (18,96%), entre
populações (34,39) e entre populações dentro de regiões (15,43%);
As estimativas indiretas do fluxo gênico sugerem a existência de uma
baixa proporção de migrantes entre populações;
A análise de padrão espacial revelou que a variabilidade genética está
estruturada no espaço e sugere que esta estrutura tenha se originado
seguindo um modelo de diferenciação estocástica (neutro) entre regiões
e por um balanço entre fluxo gênico a curtas distâncias e deriva genética
nas populações dentro das regiões;
Para fins de conservação de germoplasma, com base nestes resultados
preliminares, pode-se sugerir a coleta de sementes do maior número
possível de populações, e nas duas regiões avaliadas, pois cada uma
contém um componente singular da variação genética total.
53
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APÊNDICES
65
Apêndice A. Alguns géis selecionados para as análises de dados.
66
Apêndice B. Projeto/arquivo de entrada de dados para análises no programa
Arlequim versão 2000.
[Profile]
Title="MOV-Grupos rueiro"
N Smples=10
DtType=RFLP
GenotypicDt=0
LocusSeprtor=NONE
GmeticPhse=0
RecessiveDt=0
Recessivellele=null
MissingDt='?'
Frequency= S
CompDistMtrix=1
FrequencyThreshold=1.0e-7
EpsilonVlue=1.0e-12
[Dt]
[[Smples]]
SmpleNme="PopSD1"
SmpleSize=71
SmpleDt={
p01 1 010000010010010101010010000100000001000000100000001111010000010010100000010110010011010000010100000000010101100100010000010001000000110010010110010
p02 1 111110010010010101010010000101000001010000100000001111010000010100100000010100111011000000010100000000010100100100010000010001100000010000010010100
p03 1 110110010010010101010010000101110001010000100000101111010110010100100001010110010111001000110110000000000100100110010010010100000000100000101000100
p04 1 110110010010010101010010001001100010010010100000101111010100010100100000010110010011001000110110000000000000100110010000010100000001101000101000100
p05 1 111000010010010101010010001001100010010010000000011111010010010100100000010110010011011000110110000000000010100110010000010100101000101000101000000
p06 1 111000001010000101010010001001100010011000000000101111010000010000100000010110110011010000010100000000000010100110010000010100101001100000101010100
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[[Structure]]
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73
Apêndice C. Arquivo de entrada de dados para análises no programa Popgene versão 3.2
/* Diploid RAPD Data Set */
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Locus name :
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