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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
INSTITUTO DE QUÍMICA
Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas (Bioquímica)
THAIS GUARATINI
Antioxidantes de Macroalgas Marinhas:
Caracterização Química e Atividade in vitro
São Paulo
Data do Depósito na SPG:
29/02/2008
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THAIS GUARATINI
Antioxidantes de Macroalgas Marinhas:
Caracterização Química e Atividade in vitro
Tese apresentada ao Instituto de Química da
Universidade de São Paulo para obtenção do
Título de Doutor em Ciências (Bioquímica)
Orientador: Prof. Dr. Pio Colepicolo
São Paulo
2008
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Thais Guaratini
Antioxidantes de Macroalgas Marinhas: Caracterização Química e Atividade in vitro
Tese apresentada ao Instituto de Química da
Universidade de São Paulo para obtenção do
Título de Doutor em Ciências (Bioquímica).
Aprovado em: ____________
Banca Examinadora
Prof. Dr. _______________________________________________________
Instituição: _______________________________________________________
Assinatura: _______________________________________________________
Prof. Dr. _______________________________________________________
Instituição: _______________________________________________________
Assinatura: _______________________________________________________
Prof. Dr. _______________________________________________________
Instituição: _______________________________________________________
Assinatura: _______________________________________________________
Prof. Dr. _______________________________________________________
Instituição: _______________________________________________________
Assinatura: _______________________________________________________
Prof. Dr. _______________________________________________________
Instituição: _______________________________________________________
Assinatura: _______________________________________________________
Carlos Drummond de Andrade
Ao Beto, por tudo que representa na minha vida.
Anônimo
Aos meus pais e à minha irmã, por ser quem são.
Aos meus sogros e cunhados, minha segunda família
Marthin Luther King
A todas as pessoas “boas”,
Que não medem esforços, nem esperam nada em troca e
Que nunca desistem.
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RESUMO
Guaratini, T. Antioxidantes de Macroalgas Marinhas: Caracterização
Química e Atividade in vitro. 2008. 141p. Tese (Doutorado) - Programa de
Pós-Graduação em Ciências (Bioquímica). Instituto de Química, Universidade de
São Paulo, São Paulo.
Uma das maneiras de obtenção de extratos comercialmente viáveis é a
utilização dos procedimentos clássicos de maceração. Apesar de várias
substâncias serem extraídas por esses métodos, moléculas mais sensíveis à
degradação oxidativa podem não resistir. Neste trabalho foi avaliada a atividade
antioxidante de diferentes extratos de espécies de macroalgas marinhas, obtidos
por meio das marchas fitoquímicas clássicas. Os extratos não mostraram
atividade significante nos modelos experimentais utilizados. Além disso, os
ácidos graxos e esteróides das algas estudadas foram analisados por
cromatografia gasosa. Os resultados indicaram uma maior quantidade de ácidos
graxos insaturados e algumas das algas apresentaram o colesterol como o
esteróide majoritário. Apesar de ser verificada a presença de carotenóides
remanescentes, estes foram encontrados em concentrações baixas e nenhuma
outra molécula resistente aos métodos de extração empregados foi detectada.
Desta maneira, partiu-se para o desenvolvimento de metodologias de análise de
carotenóides, que são substâncias com conhecida atividade antioxidante. Para
isso, foi padronizado um método por HPLC-UV-EC, que separou um total de 16
pigmentos e os dados obtidos em ambos detectores foram comparados. Apesar
do detector eletroquímico ser geralmente mais sensível, obteve-se melhores
resultados utilizando-se o detector DAD. Com a metodologia padronizada, foi
possível obter o perfil de pigmentos de cada espécie deste estudo.
Dando continuidade ao desenvolvimento de metodologias para a análise
de carotenóides, padrões dessa classe de substâncias, além de outras
moléculas contendo polienos em sua estrutura, foram estudados por
espectrometria de massas, elucidando-se seus mecanismos de ionização por
diferentes fontes. Um balanço entre a formação de íons radicalares e
protonados foi proposto para as xantofilas quando ionizadas por ESI, enquanto
que nessa mesma fonte foram obtidos íons protonados para retinóides e
moleculares para o β-caroteno. Ao lado de cálculos teóricos de energia de
ionização, sugere-se que a formação do íon molecular, exceção para as
análises em ESI, é dependente da extensão da conjugação e está relacionada à
presença de oxigênio na molécula. Estudos utilizando-se a fonte nanoSpray
mostraram resultados opostos, obtendo-se maior intensidade do íon protonado
para as xantofilas, mesmo na ausência de ácido.
Visando suportar os resultados obtidos em ESI, moléculas sintéticas com
cadeia poliênica de diferente extensão e uma porção flavonoídica foram
analisadas. Aquela com maior número de conjugações apresentou baixa
intensidade do íon molecular e reações de dissociação na fonte, de maneira
análoga ao que é observado para o β-caroteno, enquanto que a estrutura com a
menor cadeia poliênica apresentou um íon molecular mais estável. Além disso, a
energia de ionização calculada para a molécula maior foi menor, corroborando
com os dados experimentais, o que sugere que o “Caro-Flavo” com maior
cadeia poliênica deve apresentar atividade antioxidante mais próxima ao β-
caroteno que o de cadeia curta.
Essas mesmas substâncias sintéticas, ao lado de astaxantina e
epicatequina, foram testadas quanto à sua atividade em inibir a lipoperoxidação
induzida por radiação UVA ou UVB, sendo que o “Caro-Flavo” de cadeia maior
atuou como melhor antioxidante quando irradiado com UVB, apresentando
maior atividade na menor dose de radiação. Porém, quando irradiado com UVA,
apresentou atividade pró-oxidante mais pronunciada ainda que a da astaxantina.
Nestes experimentos, foi verificada atividade atividade pró-oxidante em todas as
condições de radiação para o “Caro-Flavo” menor. Outras moléculas sintéticas,
derivadas do α-tocoferol também foram testadas e não apresentaram diferenças
estatisticamente significantes desta vitamina.
Palavras-chave: Estresse Oxidativo, Antioxidantes, Carotenóides, Algas,
Espectrometria de Massas, Produtos Naturais.
ABSTRACT
Guaratini, T. Antioxidants from Marine Macroalgae: Chemical
Characterization and in vitro Activity. 2008. 141p. PhD Thesis - Graduate
Program in Biochemistry. Instituto de Química, Universidade de São Paulo, São
Paulo.
Classic maceration is one of the most used processes to obtain
commercially viable extracts. Despite several substances can be extracted by
using these methods, molecules that are susceptible to oxidative degradation
may not resist. In this work it was evaluated the antioxidant activity of extracts of
different species of marine macroalgae, obtained through phytochemistry classic
methods. The extracts showed no significant activity in the experimental models
used. In addition, fatty acids and steroids from algae were analyzed by gas
chromatography. Results indicated greater amount of unsaturated fatty acids and
some of the algae showed the cholesterol as the major steroid. Although some
carotenoids remained in the algae extract, they were found in low concentrations
and no other molecule resistant to the methods of extraction employed was
detected. Thus, it was turned to the development of methodologies for
carotenoids analysis, which are known substances with antioxidant activity. A
method was standardized by HPLC-UV-EC, which separated a total of 16
pigments and the data obtained in both detectors were compared. Even though
the electrochemical detector is generally more sensitive, better results were
obtained using the DAD detector. With a standardized methodology, it was
possible to obtain the profile of pigments for each species studied.
To continue the development of methodologies for carotenoids analysis,
standards of this class of substances and other polyene-containing molecules
were studied by mass spectrometry. Ionization mechanisms were elucidated by
using different sources. A balance between the formation of radical and
protonated ions was proposed for xanthophylls when ionized by ESI. When ESI
was used to ionize retinoids and carotenes, only protonated and radical ions,
respectively, were found. Besides theoretical calculations of ionization energy, it
was suggested that the formation of the molecular ion, except for the analyses in
ESI, is dependent on the conjugation extension and is related to the presence of
oxygen in the molecule. Studies using the nanoSpray source showed opposite
results. In this case, it was obtained higher intensity of the protonated ions for
xanthophylls, even in the absence of acid.
To support the results obtained in ESI, synthetic molecules containing
different length of polyene chain and a flavonic portion were analyzed. Those
with the greatest conjugation chain showed low intensity of the molecular ion and
decoupling reactions at the source. This effect was similar to that observed for β-
carotene in the same conditions. The structure with the smaller polyene chain
presented a more stable molecular ion. Furthermore, the ionization energy
calculated for the larger molecule was lower, corroborating with the experimental
data and suggesting that the larger "Caro-Flavo" should present a better
antioxidant activity.
These synthetic substances, along with astaxanthin and epicatechin, were
tested according to their activity in inhibiting UVA or UVB induced
lipoperoxidation. The largest "Caro-Flavo" showed better antioxidant activity
when UVB-irradiated in the lowest irradiation dose. Nevertheless, when this
molecule is UVA-irradiated, a pro-oxidant activity is even more pronounced than
the astaxanthin pro-oxidant activity. In these experiments, a pro-oxidant activity
for the smallest "Caro-Flavo" was verified for all irradiation conditions. Other
synthetic molecules, derived from α-tocopherol were also tested and showed no
statistically significant differences, when compared to this vitamin.
Keywords: Oxidative Stress, Antioxidants, Carotenoids, Algae, Mass
Spectrometry, Natural Products.
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ABAP 2,2’-azobis(2-amidinopropano)
AcEt Acetato de Etila
AP Afinidade Protônica
APCI Atmospheric Pressure Chemical Ionisation
BHT Butil-Hidróxi-Tolueno
ButOH Butanol
CarH β-caroteno
CAT Catalase
DAD Arranjo de Diodos
DPPH 1,1-difenil-2-picrilhidrazil
DPR Desvio Padrão Relativo
EC Eletroquímico
EI Energia de Ionização
ERO Espécie reativa de Oxigênio
ESI Electrospray Ionisation
FID Ionização em Chamas
GC Gás Chromatography
GP
x
Glutationa Peroxidase
GSH Forma Reduzida da Glutationa
GSSG Forma Oxidada da Glutationa
Hexano Hexano
Hex:AcEt Hexano:Acetato de Etila
HPLC High Performance Liquid Chromatography
k’ Fator de Capacidade
M
+
/ M
-
Íon Molecular
[M+H]
+
Molécula Protonadoa
[M-H]
-
Molécula Desprotonada
[(M+H)-H
2
O]
+
Molécula Protonada menos Água
MDA Malonaldeído
MeOH Metanol
MS Espectrometria de Massas
MS/MS Espectrometria de Massas acoplada
MS
n
Espectrometria de Massas Seqüencial
NOS Óxido Nítrico Sintase
P
n
Número do Pico
R
Radical Lipídico
RH Lipídeo
RO
2
Radical Peroxila
ROOH Hidroperóxido Lipídico
R
t
Tempo de Retenção
SDS Dodecil sulfato de sódio
SOD Superóxido Dismutase
TBA Thiobarbituric Acid
UV Ultravioleta
α Fator de Separação
λ
max
Comprimento de Onda Máximo
ÍNDICE
1. INTRODUÇÃO________________________________________________ 8
1.1.
Espécies Reativas de Oxigênio __________________________________9
1.2.
Radiação Ultravioleta _________________________________________13
1.3.
Antioxidantes ________________________________________________16
1.3.1.
Carotenóides ___________________________________________________ 19
1.3.2.
Vitamina E _____________________________________________________ 22
1.4.
Algas como fonte de substâncias bioativas _______________________25
2. OBJETIVOS_________________________________________________ 32
3. MATERIAIS E MÉTODOS______________________________________ 34
3.1.
Coleta e Cultivo de Algas ______________________________________35
3.2.
Obtenção dos Extratos ________________________________________38
3.3.
Avaliação da Atividade Antioxidante dos Extratos _________________39
3.3.1.
Inibição do radical DPPH __________________________________________ 39
3.3.2.
Inibição de lipoperoxidação em micelas ______________________________ 40
3.4.
Análises dos Extratos _________________________________________41
3.4.1.
Cromatografia Líquida ____________________________________________ 41
3.4.1.1.
Preparo das Amostras para Análise de Pigmentos____________________ 44
3.4.1.2.
Identificação dos Picos _________________________________________ 44
3.4.1.3.
Análises Quantitativas __________________________________________ 45
3.4.2.
Cromatografia Gasosa ____________________________________________ 45
3.4.2.1.
Análise de Ácidos Graxos _______________________________________ 46
3.4.2.2.
Análise de Esteróides __________________________________________ 47
3.4.3.
RMN __________________________________________________________ 48
3.5.
Estudo de Polienos por Espectrometria de Massas_________________48
3.5.1.
Moléculas Estudadas _____________________________________________ 48
3.5.2.
Equipamentos utilizados __________________________________________ 49
3.5.3.
Cálculos Teóricos________________________________________________ 52
3.5.3.1.
Energia de Ionização e afinidade protônica para carotenóides e retinóides_ 52
3.5.3.2.
Energia de Ionização para os “Caro-Flavos”_________________________ 52
3.6.
Avaliação da Atividade Antioxidante de Substâncias Sintéticas ______53
3.6.1.
Substâncias testadas _____________________________________________ 53
3.6.2.
Preparo dos Sistemas Biomiméticos _________________________________ 55
3.6.3.
Quantificação de MDA ____________________________________________ 56
3.6.4.
Medida de Fosfolipídeos __________________________________________ 57
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO _________________________________ 58
4.1.
Obtenção dos Extratos ________________________________________59
4.2.
Atividade Antioxidante dos Extratos _____________________________60
4.2.1.
Inibição do Radical DPPH _________________________________________ 60
4.2.2.
Inibição de Lipoperoxidação em Micelas induzida por ABAP ______________ 65
4.3.
Análises dos extratos _________________________________________68
4.3.1.
Cromatografia Líquida ____________________________________________ 68
4.3.1.1.
Padronização da Metodologia para Análise de Pigmentos______________ 70
4.3.1.2.
Análise Quantitativa e Qualitativa de Pigmentos nas Algas _____________ 79
4.3.2.
Cromatografia Gasosa ____________________________________________ 85
4.3.2.1.
Análise de Ácidos Graxos _______________________________________ 85
4.3.2.2.
Análise de Esteróides __________________________________________ 89
4.4.
Estudo dos Polienos por Espectrometria de Massas _______________95
4.4.1.
Mecanismos de Ionização _________________________________________ 99
4.5.
Atividade Antioxidante de Substâncias Sintéticas_________________116
4.5.1.
Carotenóides e Flavonóides ______________________________________ 116
4.5.2.
Tocoferóis_____________________________________________________ 120
5. CONCLUSÕES _____________________________________________ 124
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS _____________________________ 127
7. SÚMULA CURRICULAR______________________________________ 142
____________________________________________________________________________
8
1. INTRODUÇÃO
____________________________________________________________________________
9
A aplicação tópica ou administração oral de antioxidantes tem sido uma das
maneiras de prevenção aos danos desencadeados pelo estresse oxidativo. Neste
contexto, muitos estudos têm se desenvolvido visando a busca de antioxidantes
eficazes, sendo que as algas mostram-se organismos promissores como fonte de
novas biomoléculas.
Este trabalho tratará da busca de substâncias antioxidantes provenientes de
algas marinhas. Neste contexto, é importante discorrer sobre a origem e os efeitos
das espécies reativas de oxigênio, bem como sobre a importância dos antioxidantes,
que atuam para manutenção da homeostasia.
1.1. Espécies Reativas de Oxigênio
Reações de oxidação e redução são essenciais no metabolismo normal de
todos os organismos. Na cadeia transportadora de elétrons, por exemplo, o oxigênio
é o aceptor final, recebendo quatro elétrons da citocromo c oxidase, em um sistema
de transporte que possibilita a biossíntese de ATP (Voet et al., 2002). Porém, em
algumas situações pode ocorrer a transferência univalente desses elétrons,
originando espécies intermediárias, as chamadas espécies reativas de oxigênio
(ERO), como mostra o Esquema 1.
____________________________________________________________________________
10
O
2
O
2
2H
+
e
-
e
-
HO
H
2
O
H
+
e
-
H
2
O
2
H
+
e
-
H
2
O
Esquema 1: Transferência univalente de elétrons que pode ocorrer durante a cadeia
transportadora de elétrons, gerando espécies reativas de oxigênio.
O desequilíbrio entre a formação e a remoção das ERO, e seu conseqüente
acúmulo, gera um quadro de estresse oxidativo. Este quadro é caracterizado por
modificações moleculares, que são desencadeadas pelas reações iniciadas por
essas espécies (Sies, 1986). Dentre as ERO que podem ser formadas, destaca-se
aquelas que são radicais de oxigênio, como o ânion superóxido (O
2
−
), o radical
hidroxila (HO
) e o peroxila (RO
2
); e aquelas não radicalares, como o peróxido de
hidrogênio (H
2
O
2
) e o oxigênio singlete (
1
O
2
).
O O
2
−
é uma espécie radicalar originada da adição de um elétron no orbital π
anti-ligante do O
2
. Este radical não atravessa membranas, exceto por alguns canais
específicos, ou quando apresentado em sua forma protonada
(Esquema 2) (Halliwell
& Gutteridge, 2006). Pode ser gerado espontaneamente em condições controladas
nas células, por diferentes processos, tais como oxidação de hemoglobinas nos
eritrócitos, atividade oxidativa do citocromo P
450
, reações de catálise realizada pela
xantina oxidase, bem como pelo próprio processo de respiração mitocondrial, entre
outros (Zangar et al., 2004).
H
+
H
+
+HO
2
O
2
pKa= 4,8
Esquema 2: Equilíbrio químico do radical O
2
−
.
____________________________________________________________________________
11
Por suas características químicas, o O
2
−
pode induzir desprotonações ou
transferência de elétrons, além de atuar como um potente nucleófilo. Porém, sua
velocidade de reação com DNA, lipídeos e aminoácidos em solução aquosa
(pH=7,4) é muito baixa, sendo que os danos biológicos pelo qual é responsável,
freqüentemente envolvem sua reação com outros radicais, com grupamentos ferro-
enxofre de proteínas, ou por induzir indiretamente a formação do radical hidroxila
(HO
) pela redução de metais de transição como ferro ou cobre (Esquema 3)
(Fenton, 1894; Halliwell & Gutteridge, 2006).
O
2
Fe
3+
/ Cu
2+
+
Fe
2+
/ Cu
+
+
O
2
O
2
pode reciclar os metais de
transição para a reação
Fe
2+
/ Cu
+
+
H
2
O
2
+ HO HO+
Reação de Fenton
Fe
3+
/ Cu
2+
O
2
+
H
2
O
2
Fe
2+
/Cu
+
O
2
+ HO + HO
Reação de Haber-Weiss
Esquema 3: Reações de O
2
−
e H
2
O
2
contribuindo para a formação de HO
•
.
A dismutação espontânea ou catalisada enzimaticamente de O
2
−
, assim como
o metabolismo mitocondrial e a atividade de algumas enzimas como xantina, urato e
aminoácidos oxidases podem originar peróxido de hidrogênio (H
2
O
2
). Esta espécie é
um fraco agente oxidante e redutor, que não reage diretamente com DNA, lipídeos e
a maioria das proteínas (Thorn et al., 2001; Halliwell & Gutteridge, 2006). Entretanto,
é difusível entre membranas e também pode originar o radical HO
•
, pela reação de
Fenton (Esquema 3). Além disso, seus alvos diretos incluem enzimas como a
gliceraldeído-3-fosfato-desidrogenase, cetoácidos como o piruvato e o oxoglutarato
e grupos heme (Halliwell & Gutteridge, 2006).
____________________________________________________________________________
12
O radical HO
•
, por sua vez, é bastante reativo, podendo abstrair hidrogênios de
outras moléculas, reagir com compostos por adição, ou ainda transferir seus
elétrons. Este também está envolvido nos danos genéticos provocados pela
radiação UV, podendo gerar modificações mutagênicas, e estando assim envolvido
nos mecanismos de indução do câncer (Podda et al., 1996; Pelle et al., 2003).
O
1
O
2
é outra ERO envolvida em processos fisiológicos e patológicos. Esta
espécie eletronicamente excitada pode ser produzida por diversas reações químicas
e fotoquímicas, e devido à sua eletrofilicidade, pode reagir com compostos
insaturados, sulfetos e aminas. Os ácidos graxos insaturados, DNA e proteínas
representam importantes alvos biológicos para o
1
O
2
(Ravanat et al., 2004; Schieke
et al., 2004; Miyamoto et al., 2007).
A reação das ERO com componentes celulares pode resultar em
lipoperoxidação, oxidação de proteínas e de DNA (Stadtman, 1992; Linton et al.,
2001; Hwang & Kim, 2007). A indução da peroxidação de ácidos graxos pode
converter vários deles em hidroperóxidos, por reações em cadeia (Esquema 4). Um
dos produtos formados destas reações é o malonaldeído (MDA), capaz de atacar
fosfolipídeos e grupamentos amino de proteínas, podendo ativar uma resposta auto-
imune
(Draper & Hadley, 1990; Ishii et al., 2006). Os aldeídos formados pela
lipoperoxidação podem ainda interagir com o DNA, formando adutos que têm sido
associados com o câncer (Chaudhary et al., 1994; Munnia et al., 2006).
Início
RH
+ HO
R
+
H
2
O
R
+
O
2
ROO
Propagação
RH
+
LOO
R
+
ROOH
Esquema 4: Mecanismo de início e propagação da lipoperoxidação (RH: ácido graxo
insaturado; R
: radical lipídico; ROO
: radical peroxila e ROOH: hidroperóxido
lipídico).
____________________________________________________________________________
13
Os danos diretos ou mediados pelas ERO, que ocorrem ao DNA, disparam
respostas celulares como ativação de sistemas de reparo e enzimas controladoras
do ciclo celular. Além disso podem reagir com eletrófilos celulares, alguns dos quais
iniciam um processo de sinalização celular, modificando a expressão gênica
(Goodman, 2002; Heck et al., 2004).
1.2. Radiação Ultravioleta
Dentre os fatores exógenos que podem iniciar ou contribuir para alterações na
homeostasia celular, destaca-se a exposição à radiação solar, por seus efeitos
cumulativos (Ichihashi et al., 2003). Da energia emitida pelo sol, apenas 7% atinge a
superfície da Terra (o que é denominado de espectro solar terrestre), uma vez que
aproximadamente 93% são retidos pela atmosfera (Figura 1). Apesar da disparidade
na literatura, o espectro solar terrestre em um dia de verão, sem nuvens às 12hs é
composto por aproximadamente 50% de infra-vermelho (IV), 5% de UV e 45% de luz
visível (vis).
Figura 1: Radiação solar na superfície da Terra versus na atmosfera.
____________________________________________________________________________
14
A radiação emitida pelo sol, entre 100 e 800nm é chamada de ultravioleta (UV)
(Esquema 5). UVB (280-320 nm) e UVA (320-400 nm), em especial, são
componentes da luz solar com menores comprimentos de onda que atingem a
superfície da Terra, e que podem causar estresse oxidativo às células (Scharffetter-
Kochanek et al., 2000). Estas radiações podem ser danosas à várias biomoléculas,
como por exemplo DNA, proteínas e lipídeos, causando disfunções estruturais e
funcionais (Gabrielska et al., 2005).
Esquema 5: Divisão da radiação ultravioleta.
A pele é o órgão mais externo e conseqüentemente, a interface entre o corpo e
o meio ambiente. Assim, é a pele quem está constantemente exposta à radiação UV,
acreditando-se ser este, o maior mediador exógeno de danos (Masaki et al., 1995;
Jurkiewicz & Buettner, 1996; Yasui & Sakurai, 2000; Yamamoto, 2001; Chang et al.,
2002). Muitos fatores devem ser considerados quando se avaliam os efeitos da
radiação UV na pele, tais como o comprimento de onda incidente, a dose e
características cutâneas como a susceptibilidade genética individual (Heck et al.,
2004). Apesar da radiação UVB ser muito mais danosa que a UVA, ao comparar-se
ambas em condições de exposição igual, a UVA é mais penetrante e está presente o
dia todo, o que leva alguns pesquisadores a sugerir que esta é a responsável pelos
maiores danos causados pela luz solar (Halliwell & Gutteridge, 2006).
400
700
100 200 320
UVC
U
V
B
UVA
Visible UV
UV
vacuum
280
400
700
100 200 320
UVC
U
V
B
UVA
Visible UV
UV
vacuum
280
____________________________________________________________________________
15
A primeira resposta observada na pele após exposição ao sol é a inflamação,
caracterizada por eritema, edema e calor, e pela elevação dos níveis de
prostaglandinas e leucotrienos. Células especializadas como neutrófilos são
recrutados e estimulados, seguido da ativação do sistema NAD(P)H oxidase,
gerando uma série de ERO (Hruza & Pentland, 1993; Clydesdale et al., 2001; Wilgus
et al., 2002). Como resultado, há uma alteração no sistema imunológico, diminuindo
sua capacidade em eliminar células alteradas, devido às mudanças na produção de
citocinas pelos queratinócitos e outras células cutâneas, alterações na expressão de
moléculas de adesão e perda de funções celulares (Krutmann & Grewe, 1995;
Clydesdale et al., 2001).
As ERO podem ser formadas ainda por reações da luz com
fotosensibilizadores endógenos cutâneos, como por exemplo, o ácido urocânico na
presença de O
2
(Haralampus-Grynaviski et al., 2002; Menon & Morrison, 2002). Há
evidências de que em peles com exposição crônica ao sol há uma maior incidência
de mutações no gene supressor de tumor p53, pelo estresse oxidativo ocasionado
(Renzing et al., 1996; Einspahr et al., 1999). Mutações neste gene, responsável pela
manutenção da integridade genômica por bloquear a replicação do DNA em
resposta a danos, ou induzir o seu reparo (Smith et al., 1995), reduzem a
capacidade em disparar a morte programada de células (apoptose), resultando em
maior proliferação celular (Ziegler et al., 1994). Sugere-se ainda, que
independentemente dos danos causados ao DNA, o desequilíbrio redox provocado
pela radiação UV pode interferir na apoptose (Lawley et al., 2000; Chang et al.,
2002; Giannetti et al., 2004).
Essa cascata de respostas induzidas pela radiação UV como transduções de
sinais, mutações em genes específicos, alterações na proliferação celular e no
____________________________________________________________________________
16
mecanismo de apoptose, podem exemplificar os passos do complexo processo
carcinogênico, que é a principal preocupação quanto à exposição à radiação UV e
seus metabólitos. Tendo em vista então a prevenção ou terapias para o câncer de
pele, que é um dos tipos de câncer de maior ocorrência, mecanismos para o
restabelecimento do equilíbrio redox são muito discutidos. O uso de antioxidantes
tanto com aplicação tópica ou oral nesses casos é uma alternativa, que tem sido
amplamente utilizada, apesar das divergências encontradas (Nunez-Selles, 2005).
1.3. Antioxidantes
O equilíbrio entre a formação e a remoção das ERO pode sofrer ação de
agentes exógenos ou endógenos, induzindo a um estado de estresse oxidativo, que
pode por sua vez, ser restabelecido pelos sistemas antioxidantes presentes nos
tecidos (Valko et al., 2007). Os mecanismos celulares para manutenção da
homeostasia celular neste caso envolvem:
1- a prevenção da formação de ERO, que inclui de uma maneira geral, a
quelação de íons metálicos por proteínas ou substâncias não-protéicas
específicas (Grill et al., 1985);
2- a intercepção ou inativação das ERO por sua transformação em produtos
não ativos e/ou transferência para outros compartimentos celulares menos
sensíveis à oxidação;
3- ou ainda o reparo dos danos já provocados (Sies, 1993).
Os antioxidantes podem ser divididos em duas classes principais: os
enzimáticos e as substâncias de baixo peso molecular. Alguns exemplos de
____________________________________________________________________________
17
antioxidantes enzimáticos são a glutationa peroxidase (GPx), a catalase (CAT) e a
superóxido dismutase (SOD) (Kohen et al., 1997). A SOD, que contribui para um dos
mecanismos antioxidantes mais eficientes, converte O
2
−
em H
2
O
2
, prevenindo os
danos que poderiam ser causados por este radical (Esquema 6). Várias isoformas
de SOD são descritos na literatura, podendo estar localizadas no citosol, em
organelas celulares específicas ou extracelularmente, e cujos sítios ativos podem
conter diferentes íons.
O
2
+
2H
+
H
2
O
2
+
O
2
SOD
Esquema 6: Esquema da dismutação do O
2
−
pela enzima superóxido dismutase (SOD).
A CAT e a GPx são as principais responsáveis pela remoção imediata de
H
2
O
2
. A CAT, encontrada em peroxissomos, catalisa a decomposição específica de
H
2
O
2
gerando moléculas de água e oxigênio (Esquema 7) (Fridovich, 1998). A GPx,
por sua vez, é fundamental no metabolismo de H
2
O
2
e de outros peróxidos, pois
catalisa reações de doação de elétrons, no qual utiliza-se da glutationa reduzida
(GSH) como agente redutor, formando a glutationa oxidada (GSSG) (Rover
et al.
,
2001) (Esquema 7).
2 H
2
O
2
+
CAT
2 H
2
O O
2
H
2
O
2
+
2 GSH
GPx
2 H
2
O
+
GSSG
ROOH
+
2 GSH
GPx
2 H
2
O
+
GSSG
+
ROH
Esquema 7: Degradação enzimática de H
2
O
2
e de peróxidos orgânicos (GSH: glutationa
reduzida; GSSG: glutationa oxidada; ROOH: hidroperóxido lipídico e ROH: o
produto de redução correspondente).
____________________________________________________________________________
18
Os antioxidantes não-enzimáticos, ou de baixo peso molecular, também
contribuem com a manutenção do balanço redox celular. Nesta classe inclui-se um
vasto número de compostos, sintetizados in vivo ou obtidos exogenamente, que
previnem danos oxidativos por interações diretas ou indiretas com as ERO (Bialy et
al., 2002).
Dentre as substâncias endógenas pode-se destacar alguns hormônios, como
estradiol e estrógeno que apresentam atividade antioxidante semelhante à vitamina
E, devido, provavelmente, às suas porções fenólicas, comuns a ambas moléculas
(Kvam & Dahle, 2003) e a melatonina, regulador do relógio biológico nos mamíferos
que também apresenta atividade antioxidante, além de induzir a síntese de
antioxidantes enzimáticos in vivo como a GPx (Reiter et al., 1997; Slominski et al.,
2002). Destacam-se também o ácido lipóico, um cofator essencial em vários
complexos enzimáticos que apresenta atividade antioxidante e que pode atuar como
regenerador de formas oxidadas de glutationa, ascorbato e α-tocoferol (Podda et al.,
2001) (Figura 2).
Estrógeno
Estradiol
Ácido Lipóico
Melatonina
OH
HO
O
HO
S
S
O
OH
N
H
H
N
O
O
Figura 2: Estrutura química de alguns dos antioxidantes cutâneos sintetizados
in vivo
.
Além de todo o sistema antioxidante endógeno exemplificado, a pele conta
também com antioxidantes exógenos, normalmente obtidos pela dieta, como por
____________________________________________________________________________
19
exemplo as vitaminas C e E, carotenóides, flavonóides, entre outros, que tem sido
considerados fundamentais no equilíbrio redox.
1.3.1. Carotenóides
Atuando sinergisticamente com as vitaminas C e E (Wrona et al., 2003),
estão os carotenóides, que constituem uma ampla classe de isoprenóides,
caracterizados estruturalmente por uma longa cadeia de duplas ligações
conjugadas, podendo ser divididos em 2 grandes grupos: os carotenos, compostos
apenas por carbonos e hidrogênios e as xantofilas, que são derivados oxigenados.
Algumas dessas estruturas estão exemplificadas na Figura 3.
____________________________________________________________________________
20
O
O
OH
HO
OH
HO
OH
HO
O
OH
HO
O
O
OH
O
OH
OH
O
HO
O
OH
O
O
OH
O
OH
O
HO
OH
HO
OH
OH
HO
O
O
O
HO
O
O
OH
O
O
O
O
OH
O
HO
O
OH
HO
O
O
O
O
β
ββ
β-Caroteno
Cantaxantina
Luteína
Zeaxantina
Anteraxantina
Violaxantina
Licopeno
Neoxantina
β
ββ
β-Criptoxantina
Astaxantina
Fucoxantina
Peridinina
Prasinoxantina
Diatoxantina
19'-Hexenoil-fucoxantina
Aloxantina
Etil-8'-apo-β
ββ
β-caroteno-8'-oato
Bixina
Diadinoxantina
HO
OH
O
O
OH
Figura 3: Estruturas de alguns carotenóides.
____________________________________________________________________________
21
Os carotenóides são biossintetizados por plantas, algas e alguns
microrganismos, sendo que já foram descritos mais de 750 estruturas diferentes,
isoladas de fontes naturais (Britton et al., 2004). Nesses organismos que os
sintetizam, exercem a função principal de pigmento antena, captando a energia na
região espectral em que as clorofilas absorvem pouco. Por outro lado, exercem
inúmeras funções nos organismos que os adquirem, normalmente pela dieta.
Uma das principais características dos carotenóides é a sua velocidade de
desativação de
1
O
2
, que pode acontecer pela transferência física de sua energia
e/ou por sua reação química. Em condições normais no organismo, 95% da
desativação do
1
O
2
é física, restando somente 5% para reagir quimicamente, o que
torna os carotenóides antioxidantes mais efetivos (Mordi et al., 1993; Burri, 1997;
Palace et al., 1999). Além disso, podem atuar também como seqüestradores dos
radicais peroxila, gerando um radical estabilizado por ressonância e inibindo assim,
processos oxidativos (Mordi et al., 1993; Barreiros et al., 2006). O mecanismo
completo de oxidação dos carotenóides foi sugerido por Woodall e colaboradores,
que elucidaram a atividade desse grupo de moléculas frente aos radicais peroxila e
ao
1
O
2
(Woodall et al., 1997b; Barreiros et al., 2006).
A eficácia dos carotenóides como antioxidantes está relacionada à sua
polaridade e ao número de ligações duplas conjugadas, sendo o licopeno o mais
eficiente (Di Mascio et al., 1989; Tapiero et al., 2004). Aqueles que contêm
grupamentos polares em seus anéis terminais são efetivos na prevenção da
lipoperoxidação, sendo que ficam posicionados nas membranas de tal maneira, que
estão em contato mais próximo com a fase aquosa, reagindo com os radicais que a
penetram. Os carotenóides apolares, por sua vez, como o licopeno e o -caroteno,
____________________________________________________________________________
22
combatem os radicais formados com mais eficiência no interior da membrana, sendo
mais regeneradores que preventivos (Woodall et al., 1997a).
Sua atividade antioxidante é dependente também da tensão parcial de O
2
presente no meio. Em baixas pressões de O
2
, como a encontrada na maioria dos
tecidos, inibe a oxidação. Por outro lado, pode ser pró-oxidante em maiores
concentrações deste gás (Lowe et al., 1999). O efeito pró-oxidante observado pode
estar relacionado aos efeitos adversos detectados em suplementações com altas
doses de β-caroteno (Palozza et al., 2002), ou ainda, aos produtos de degradação
do β-caroteno, não sendo elucidado o mecanismo completo desta toxicidade (Wang
& Russell, 1999). Contudo, apesar dos resultados parecerem contraditórios na
literatura, o uso como suplemento oral é muito difundido. Assim, são necessários
ainda estudos para desvendar os mecanismos pró- e antioxidantes para um uso
seguro e eficaz dessas substâncias.
1.3.2. Vitamina E
A vitamina E é uma classe de compostos fenólicos lipossolúveis que
consistem em 8 diferentes moléculas, entre 4 tocoferóis e 4 tocotrienóis (Figura 4).
Além de estabilizar as bicamadas lipídicas no estrato córneo, é um dos mais
importantes inibidores da peroxidação lipídica em animais, por capturar os radicais
RO
2
•
(Traber & Sies, 1996; Burton et al., 1998). Glândulas sebáceas são as
responsáveis pela sua secreção na superfície cutânea (Podda et al., 1996), sendo
que a região facial apresenta maior concentração desta substância, coerente à
maior exposição a agentes externos nesta área (Thiele et al., 1999).
____________________________________________________________________________
23
O
CH
3
R
1
HO
R
2
CH
3
O
CH
3
R
1
HO
R
2
CH
3
CH
3
HCH
3
H
CH
3
CH
3
CH
3
CH
3
CH
3
CH
3
Tocotrienol
Tocoferol
R
1
R
2
α
αα
α
CH
3
CH
3
β
ββ
β
CH
3
H
γ
γγ
γ
H CH
3
δ
δδ
δ
H H
Figura 4: Estruturas da Vitamina E.
α, β, γ
ou
δ
são determinadas de acordo com a posição
do grupamento metila.
Inúmeros são os trabalhos relatando que a vitamina E e seus derivados
podem atenuar o estresse oxidativo, principalmente por proteger membranas contra
a lipoperoxidação (Nachbar & Korting, 1995; Roxborough et al., 2000; Passi et al.,
2002; Vaule et al., 2004; Cerecetto & Lopez, 2007). Assim, por ter sua eficácia
comprovada, esta vitamina é muito utilizada na prevenção de doenças ou do
fotoenvelhecimento da pele, sendo veiculada tanto em suplementos orais, como em
produtos de uso tópico. Em suplementos orais, sua biodisponibilidade cutânea após
a ingestão deve ser considerada. Além da biotransformação que pode ocorrer
durante a digestão, outros fatores como a composição da dieta, podem interferir na
biodisponibilidade dos suplementos administrados por via oral. No caso desta
vitamina, por ser uma molécula lipossolúvel, a ingestão concomitante de gordura é
fundamental para que seja absorvida e assim possa exercer sua atividade. Estudos
mostram que voluntários suplementados com cápsulas de α-tocoferol deuterado
(150 mg por dia), juntamente com ingestão de lipídeos, têm a vitamina detectada na
pele após 7 dias. Os vários passos bioquímicos e fisiológicos necessários para a
liberação cutânea do α-tocoferol não são ainda conhecidos (Vaule et al., 2004).
____________________________________________________________________________
24
Produtos fotoprotetores ou para aplicação após exposição ao sol são
encontrados no mercado contendo o α-tocoferol, ou seu éster, como princípio ativo
coadjuvante, por inibir não somente a lipoperoxidação como também a formação de
dímeros de timina e a imunossupressão (Mcvean & Liebler, 1997; Campos et al.,
2006). Em contrapartida, recentemente foi verificado que esta vitamina (e o seu
éster), em concentrações abaixo ainda da encontrada em tais formulações, pode
inibir a glutationa-S-transferase (GST), sendo que a ausência desta enzima, que é
responsável pela detoxificação de compostos citotóxicos, como os aldeídos
resultantes da lipoperoxidação, aumenta o risco de câncer de pele (Van Haaten et
al., 2001). Estes dados confirmam os dados obtidos por Mitchel & McCann, que
detectaram uma atividade promotora de tumor pela vitamina E (Mitchel & Mccann,
1993).
Outros metabólitos da vitamina E, como quinonas ou produtos da oxidação
de sua cadeia (Thornton et al., 1995; Van Haaten et al., 2001), também foram
identificados e estudados, sendo que o risco do uso desta substância por via oral ou
tópica deve ser considerado, e a relação custo-benefício avaliada antes de seu uso
indiscriminado.
A administração de antioxidantes em combinação parece ser uma
estratégia de tratamento mais efetivo. Este sinergismo pode ser muito bem
exemplificado pelo uso concomitante das vitaminas A, E (Guaratini et al., 2006) e C.
A vitamina C (ácido ascórbico), cofator de diversas enzimas e essencial na síntese
de colágeno, regenera o radical tocoferila (Figura 5) formado na reação do α-
tocoferol com radicais e atua como um antioxidante in vivo, fazendo parte da linha de
defesa hidrossolúvel (F'guyer et al., 2003). Em estudos com voluntários foi verificado
que o uso da vitamina E apresenta maiores efeitos benéficos quando administrada
____________________________________________________________________________
25
em conjunto com a vitamina C, aumentando efetivamente a atividade antioxidante
total da pele (Fuchs & Kern, 1998; Keller & Fenske, 1998; Mireles-Rocha et al.,
2002).
O
R
2
HO
R
3
CH
3
CH
3
R
1
O
R
2
O
R
3
CH
3
CH
3
R
1
ROO
ROOH
Vitamina C
Radical Ascorbila
Figura 5:
Reação do
α
-tocoferol (sendo R
1,2,3
, a sua cadeia lateral) com radicais peroxila
(ROO
), formando hidroperóxidos lipídicos (ROOH) e sua regeneração pela
vitamina C, originando o radical ascorbila.
1.4. Algas como fonte de substâncias bioativas
Do início da civilização até final do século XIX, os produtos de origem natural,
em geral, constituíam a principal fonte de medicamentos e cosméticos (Seidl, 2002).
Posteriormente, com o desenvolvimento dos processos sintéticos, os produtos
naturais foram parcialmente substituídos e nas últimas décadas seu uso foi
retomado principalmente em razão da complexidade estrutural de alguns de seus
princípios ativos. Atualmente, fazem parte de uma grande parcela no processo de
desenvolvimento de novas substâncias para uso na área farmacêutica (Cragg et al.,
1997). As substâncias isoladas ou frações ativas, quando exploradas de vegetais,
podem ser originárias tanto do metabolismo primário, ou seja, decorrentes do
metabolismo essencial como ácidos graxos, carotenóides, vitaminas, esteróides,
quanto do metabolismo secundário, que está relacionado à produção de moléculas
____________________________________________________________________________
26
induzida por algum estímulo externo, como os flavonóides, as lactonas, os
alcalóides, entre outros (Veiga et al., 2005).
Assim como descrito para os vegetais, substâncias extraídas de algas
provenientes de diferentes ambientes têm despertado a atenção dos pesquisadores,
pela capacidade de fornecimento de novos princípios ativos (Tringali, 1997; Burja et
al., 2001; Mayer & Hamann, 2004). Esses organismos, pertencentes a uma imensa
variedade de nichos ecológicos, são induzidos a se adaptar, pelo ambiente
competitivo em que vivem, cuja estratégia pode ser a biossíntese de moléculas por
diferentes caminhos metabólicos (Puglisi et al., 2004; Cardozo et al., 2007). Além
disso, o fato da possibilidade de cultivo relativamente fácil e rápida desses
organismos, quando comparado às plantas, também tem atraído o interesse da
cadeia produtiva em explorar essas matérias-primas não somente nas indústrias
alimentícias, como nas farmacêuticas, e cosméticas (Gombotz & Wee, 1998).
A exploração comercial das algas tem movimentado valores que ultrapassam
alguns bilhões de dólares anuais (Armisen, 1995) sendo que por ano,
aproximadamente quatro milhões de toneladas desses organismos são coletados
mundialmente (Vidotti & Rollemberg, 2004). Os principais produtores são os
chineses e japoneses, seguidos pelos norte-americanos e noruegueses. No Brasil, a
maior exploração de espécies de algas, com fins comerciais localiza-se na região
costeira do nordeste. Nesta região, são coletadas algas vermelhas, principalmente
do gênero Hypnea e Gracilaria, para produção de carragenana e ágar,
respectivamente. Além disso, entre o estado do Espírito Santo e a região de Búzios-
RJ, bancos de algas calcáreas têm despertado o interesse para a produção de
adubos e aditivos de rações (Vidotti & Rollemberg, 2004).
____________________________________________________________________________
27
Apesar do crescente número de novas substâncias bioativas extraídas de
algas, estas ainda representam uma parcela muito pequena dentre as matérias-
primas não sintéticas disponibilizadas comercialmente. Sendo a probabilidade do
desenvolvimento de um novo produto farmacêutico proporcional ao número de
screenings realizados, a baixa contribuição das algas pode ser conseqüência do
limitado número de estudos com esses organismos. Assim, as algas ainda
representam um promissor grupo de estudos e de busca de substâncias com
atividade biológica (Apt & Behrens, 1999).
A literatura sobre a obtenção de extratos de algas e a determinação de sua
atividade biológica tem aumentado significativamente. Estudos relatando a atividade
antioxidante, antiinflamatória (Mao et al., 2005) antiproliferativa (Wu et al., 2005)
(Kwon et al., 2007), antimicrobiana (Zainuddin et al., 2002; Rizvi & Shameel, 2005;
Zubia et al., 2007), fotoprotetora (Conde et al., 2000), entre outras, têm sido
publicados. Tratando-se da atividade antioxidante, vários screenings já foram
realizados, como no trabalho de Zhang e colaboradores, onde foram testados
extratos de 28 algas, entre clorófitas, rodófitas e feófitas, e detectou-se maior
atividade no extrato da alga vermelha Symphycocladia latiuscula (Zhang et al.,
2007). Destaca-se ainda o trabalho de Zubia e colaboradores, que testaram a
habilidade de extratos de outras 48 macroalgas marinhas em inibir o radical DPPH e
detectaram maior atividade na alga parda Lobophora variegata, seguido da verde
Avrainvillea longicaulis e da vermelha Chondria baileyana (Zubia et al., 2007).
Porém, trabalhos com isolamento e caracterização das substâncias
responsáveis pela atividade ainda são escassos. Em revisão recente, Dembitsky
descreve inúmeros lipídeos acetilênicos com atividade anti-câncer, sendo que
destaca a diversidade estrutural e as diferentes atividades biológicas apresentadas
____________________________________________________________________________
28
por aqueles provenientes de ambientes aquáticos, como é o caso do caulerpenino
(Figura 6A), encontrado na família de algas verdes Caulerpaceae (Dembitsky,
2006a).
Alguns compostos aromáticos com possível atividade antioxidante foram
descritos para a alga parda Undaria pinnatifida (Figura 6B) (Shin, 2003), a vermelha
Hypnea musciformis e a verde Enteromorpha compressa (Figura 6C) (Dembitsky,
2006b). Em outro estudo, Nahas e colaboradores analisaram extratos de diferentes
macroalgas e detectaram maior atividade para a alga parda Taonia atomaria.
Seguindo-se o fracionamento dos extratos mais ativos, foram isolados e testados
seis compostos (Figura 6D a I), sendo que o taondiol (Figura 6D) e o isoepitaondiol
(Figura 6E) mostraram-se os mais ativos (Nahas et al., 2007).
Polifenóis isolados de algas pardas (Figura 6J a N), por sua vez, já foram
testados in vivo. Estes foram administrados na pele de camundongos SKH-1
hairless, que apresentaram diminuição da inflamação cutânea quando irradiados por
UVB (Hwang et al., 2006).
____________________________________________________________________________
29
OH
OH
O
O
O
O
OO
(A)
(B)
(C)
(D)
O
OH
HO
H
O
OH
HO
H H
H
(E)
HO
(G)
O
HO
O
OH
O
O
(F)
O
O
O
HO
(H)
(I)
HO OH
O
O
O
OH
OH
OH
HO
HO OH
O
O
O
OH
OH
OH
O
O
OHHO
O
O
OH
OH
OH
HO
(J)
(K)
O
O
OH
OH
OH
HO
O
OHHO
O
O
O
O
O
O
H
O
OH
HO
HO
OH
O
O
O
OH
OH
OH
HO
HO OH
(L)
O
O
OHHO
HO
OH
OH
(M)
OHHO
(N)
OH
Figura 6: Estruturas de moléculas encontradas em diversas espécies de algas. (A)
caulerpino (Dembitsky, 2006a); (B) composto aromático com possível atividade antioxidante
(Shin, 2003); (C) composto aromático com possível atividade antioxidante (Dembitsky,
2006b); (D) taondiol; (E) isoepitaondiol; (F) a (I) compostos isolados do extrato com
atividade antioxidante da alga parda
Taonia atomaria
além de taondiol e isoepitaondiol
(Nahas
et al.
, 2007); (J) a (N) polifenóis isolados de algas pardas (Hwang
et al.
, 2006).
Além dos compostos acima exemplificados, as algas são produtoras de
imensa variedade e quantidade de carotenóides, moléculas conhecidamente
antioxidantes, como explicado no item
1.3.1. Esses polienos apresentam picos de
absorção entre 400 nm e 500 nm, podendo transferir a energia absorvida para as
____________________________________________________________________________
30
clorofilas, e destas para os centros de reação fotossintética. Quando um organismo
fotossintetizante sofre excessiva incidência de luz, a energia absorvida pelos
pigmentos satura as vias fotoquímicas, sendo necessário dissipar esse excesso. Se
não transferem rapidamente o excesso de energia, as moléculas de clorofila podem
reagir com oxigênio molecular, originando o
1
O
2
(Voet et al., 2002). Assim, os
carotenóides protegem contra o excesso de luz incidente, absorvendo rapidamente a
energia desses estados excitados, voltando ao estado fundamental emitindo a
energia absorvida na forma de calor, por interações rotacionais e vibracionais com o
sistema solvente, devido aos seus longos polienos conjugados (Moore et al., 1982;
Frank & Brudvig, 2004).
A concentração e a distribuição dos pigmentos nas algas apresenta uma
variação sazonal e circadiana (Cardozo et al., 2002). O aumento da intensidade
luminosa possui também um efeito significante na biossíntese dessas moléculas
(Yuan et al., 1997). No caso das macroalgas, há ainda uma variação entre o tipo de
tecido estudado, sendo que já foi demonstrado uma maior concentração de β-
caroteno nos tecidos reprodutivos quando comparado aos vegetativos (Bianchi et al.,
1997).
Para comparar a atividade antioxidante de extratos de algas rico em
carotenóides com moléculas isoladas sintéticas, um estudo foi realizado
administrando-se em ratos pré-tratados com CCl
4
, as mesmas doses de β-caroteno
sintético ou do extrato de Dunaliella salina, uma alga verde rica em β-caroteno. Os
resultados mostraram um efeito superior do extrato em inibir a lipoperoxidação e
restaurar os níveis de atividade das enzimas hepáticas CAT, SOD e GPx, quando
comparado ao β-caroteno sintético, o que pode ser devido à maior biodisponibilidade
do β-caroteno quando presente no extrato que o sintético, e/ou ainda à presença de
____________________________________________________________________________
31
outros pigmentos e formas isoméricas do β-caroteno no extrato, visto que este é
composto por uma mistura complexa (Murthy et al., 2005).
De maneira semelhante, a atividade de um extrato de alga rico em astaxantina,
frente aos danos causados pela radiação UVA em três linhagens de células, foi
comparada à da astaxantina sintética. Porém, neste estudo, a astaxantina sintética
foi mais eficaz no combate ou prevenção aos danos causados pelo estresse
oxidativo induzido pela radiação UVA, que o extrato de alga, especulando-se desta
vez que outros componentes do extrato poderiam estar envolvidos na redução da
biodisponibilidade da astaxantina (Lyons & O'brien, 2002).
Apesar de que em ambos trabalhos citados foram demonstradas as atividades
benéficas dos carotenóides estudados, é nítido que mais estudos são necessários
para analisar as causas das diferenças entre os pigmentos naturais de extratos e
aqueles sintéticos avaliados isoladamente. Vários parâmetros devem ser
considerados, principalmente a espécie de alga utilizada e os carotenóides contidos
em seu extrato, além de outras biomoléculas, para melhor avaliação dos efeitos
sinérgicos e possíveis interferências na biodisponibilidade, sendo fundamental a
análise qualitativa dos extratos antes de uma conclusão final.
Destaca-se a importância do desenvolvimento de metodologias sensíveis para
a análise de carotenóides, visando além da identificação e quantificação desses
pigmentos nos organismos que os sintetizam, os estudos de farmacocinética, para
avaliação dos parâmetros de absorção, distribuição, metabolismo e eliminação, além
dos toxicológicos nos organismos que os adquirem, e de farmacotécnica para
garantir a qualidade das formulações farmacêuticas e/ou cosméticas que contêm
essas substâncias.
_____________________________________________________________________________
32
2. OBJETIVOS
_____________________________________________________________________________
33
Os principais objetivos deste trabalho foram:
1. Obtenção de extratos de diferentes polaridades de quatro macroalgas,
utilizando-se das técnicas clássicas de maceração;
2. Análises destes extratos quanto à sua atividade antioxidante;
3. Desenvolvimento de metodologias por cromatografia líquida e gasosa para
análises dos extratos;
4. Desenvolvimento de metodologia analítica por cromatografia líquida
acoplada a diferentes detectores (UV e eletroquímico), para caracterização
e quantificação dos pigmentos das algas objeto de estudo;
5. Estudos de moléculas contendo polienos, incluindo carotenóides, por
diferentes equipamentos de espectrometria de massas, visando a
elucidação de seus mecanismos de ionização;
6. Análise antioxidante e fotoprotetora de moléculas sintéticas, derivadas de
carotenóides e flavonóides e de tocoferóis.
_________________________________________________________________
34
3. MATERIAIS E MÉTODOS
_________________________________________________________________
35
3.1. Coleta e Cultivo de Algas
A macroalga vermelha Kappaphycus. alvarezii (Doty) Doty ex Silva
(Gigartinales, Rodophyta) foi coletada no Instituto de Pesca – Ubatuba, onde é
rotineiramente cultivada para fins comerciais (Figura 7, A-C). A coleta foi realizada
às 10 horas da manhã, no mar com temperatura de 24
o
C. O material foi então
congelado em freezer a -5
o
C até ser levado para o Instituto de Química-SP, em gelo
seco, onde ficou armazenado a -80
o
C até sua extração.
As algas Gracilaria domingensis (Kützing) Sonder ex Dickie (Gracilariales,
Rhodophyta) e Gracilaria birdiae Plastino & Oliveira (Gracilariales, Rhodophyta)
foram coletadas na praia de Cotovelo, em Natal-RN, e levadas ao laboratório, onde
também foram estocadas a -80
o
C até sua extração. A Figura 8 ilustra as algas em
seu ambiente natural, de onde foram coletadas pela Prof
a
Dr
a
Eliane Marinho-
Soriano, da Universidade Federal do Rio Grande-RN.
A macroalga Hypnea spinella (C. Agardh) Kützing (Gigartinales, Rodophyta)
(Figura 9) foi cultivada em incubadoras no laboratório, ajustadas para 19 ± 1
o
C, com
ciclos de 12h de luz e 12h de escuro alternados, sendo a intensidade luminosa
durante o período diurno (claro) de 7,2 x 10
15
quanta. seg
-1
.cm
-2
(ou 69 mmol.m
-2
.s
-1
),
calibrada por um quantameter. O meio de cultura utilizado foi o meio Guillard f/2
(Guillard, 1975), com aeração, como descrito na Tabela 1.
_________________________________________________________________
36
A)
B)
C)
Figura 7: Fotos do cultivo de
K. alvarezii
no mar. A) Linhagem marrom; B) Foto submarina;
C) Cultivo no mar em Ubatuba
visto da costa
.
Figura 8: Fotos das algas em maré baixa, na praia de Cotovelo em Natal-RN (fotos: Profa
Dra Eliane Marinho-Soriano).
G. domingensis
G.
birdiae
_________________________________________________________________
37
Figura 9: Foto da alga
H. spinella
sendo cultivadas em incubadora no laboratório.
Tabela 1: Meio de cultura da alga marinha
H. spinella
(Guillard f/2)
em água do mar 80%.
Nutrientes Guillard f/2
(mg.L
-1
)
NaNO
3
1500
KH
2
PO
4
. 3H
2
O 40
MgSO
4
. 7H
2
O 75
CaCl
2
. 2H
2
O 36
Ácido cítrico 6
FeCl
3
. 6H
2
O 6
EDTA 1
Na
2
CO
3
20
H
3
BO
3
2,86
MnCl
2
. 4H
2
O 1,81
ZnSO
4
. 7H
2
O 0,222
Na
2
MoO
4
. 2H
2
O 0,39
CuSO
4
. 5H
2
O 0,079
Co(NO
3
)
2
. 6H
2
O 0,0494
O meio de cultura era trocado semanalmente e as algas repicadas, sendo que
parte delas era congelada em nitrogênio líquido e estocado a -80
o
C até que fossem
processadas para extração.
_________________________________________________________________
38
3.2. Obtenção dos Extratos
O mesmo procedimento básico de extração foi aplicado a todas as algas. As
algas congeladas foram trituradas em liquidificador com nitrogênio líquido e em
seguida com metanol. O material triturado foi então extraído exaustivamente. O
extrato metanólico resultante foi rota-evaporado, restando o extrato aquoso, que por
sua vez, foi particionado com acetato de etila e em seguida com butanol (ButOH),
como mostra o Esquema 8. O extrato proveniente da partição com acetato de etila
foi submetido a uma coluna filtrante de sílica-gel 60, eluído em seqüência por:
hexano (Hex), hexano:acetato de etila (1:1) (Hex:AcEt), acetato de etila (AcEt) e
metanol (MeOH).
Esquema 8: Metodologia de obtenção dos extratos das algas
K. alvarezii, G. domingensis,
G. birdiae
e
H. spinella.
(Hex: hexano; Hex:AcEt: acetato de etila; AcEt: acetato
de etila; MeOH: metanol; ButOH: butanol).
Extrato Metanólico
Extrato AquosoExtrato Acetato de Etila
Fração Hex Fração AcEt
Coluna Filtrante de Sílica Gel 60
Eluição- Hex; Hex:AcEt (1:1), AcEt, MeOH
Alga triturada com nitrogênio líquido
Repetidas extrações com MeOH
Rotaevaporação
Extrato Aquoso
Partição com Acetato de Etila
Partição com ButOH
Fração Butanólica Fração Aquosa
Fração Hex:AcEt Fração MeOH
Extrato Metanólico
Extrato AquosoExtrato Acetato de Etila
Fração Hex Fração AcEt
Coluna Filtrante de Sílica Gel 60
Eluição- Hex; Hex:AcEt (1:1), AcEt, MeOH
Alga triturada com nitrogênio líquido
Repetidas extrações com MeOH
Rotaevaporação
Extrato Aquoso
Partição com Acetato de Etila
Partição com ButOH
Fração Butanólica Fração Aquosa
Fração Hex:AcEt Fração MeOH
_________________________________________________________________
39
3.3. Avaliação da Atividade Antioxidante dos Extratos
3.3.1. Inibição do radical DPPH
Para avaliar a atividade inibitória do radical DPPH pelos extratos, que
ocorre pela capacidade em doar hidrogênios das moléculas presentes, foram
preparadas soluções de DPPH (1,1-difenil-2-picrilhidrazil) 1mM em metanol e
soluções de concentração conhecida do extrato a ser analisado, em metanol ou
metanol:água (1:1). Em uma microplaca de 96 poços foram adicionados 10µL da
solução de DPPH 1mM, diferentes volumes da solução antioxidante para obtenção
de concentrações de 0,1; 0,5; 1,0; 1,5 e 2,0 mg/mL em um volume final de 100µL,
sendo este completado com metanol. Para cada concentração do antioxidante eram
descontados os brancos (amostras sem a solução de DPPH), e para comparação da
propriedade captadora de hidrogênio, amostras ausentes de qualquer antioxidante
foram utilizadas (controle negativo). Após o preparo, as amostras foram levadas ao
leitor de Elisa a 25
o
C no escuro. Primeiramente algumas amostras foram incubadas
por diferentes intervalos de tempo (10 a 130 minutos, com intervalos de 10min), e
então padronizou-se o mesmo tempo de reação para todos os extratos. Foram
realizadas triplicatas de cada concentração e as leituras foram feitas em 517nm
(Yokozawa et al., 1998; Pellati et al., 2004).
Com as leituras de absorbância obtidas, foram calculadas as
porcentagens de inibição do radical DPPH, dada pela equação:
% Inibição = (Abs.
controle negativo
– Abs.
amostra
) . 100
Abs.
controle negativo
_________________________________________________________________
40
Foram testados as frações e extratos de diferentes polaridades de G.
birdiae, G. domingensis
e
H. spinella. Padrões de vitamina E, dos flavonóides rutina
e a mistura de quercetina e isoquercetrina também foram avaliados nas mesmas
condições para comparação com os extratos das algas. Além disso, testou-se a
fração aquosa do fitoterápico Guaco Spreng. (Asterales, Tracheophyta).
3.3.2. Inibição de lipoperoxidação em micelas
Foram realizados experimentos para a análise da atividade antioxidante
dos diversos extratos das algas em sistemas lipídicos (Burton & Ingold, 1981; Pryor
et al., 1993; Foti et al., 1996; Chicaro et al., 2004). Para isso, foram preparadas
micelas de ácido linolênico 2,6mM com Docedil Sulfato de Sódio (SDS) 0,1M em
tampão fosfato de sódio 0,01M, pH= 7,4. Adicionou-se 10µL de solução metanólica
do antioxidante a ser testado em diferentes concentrações a 2mL da suspensão
lipídica, em cubeta de quartzo. Após 10 minutos de incubação a 50
o
C, a
lipoperoxidação foi iniciada com 10µL de 2,2’-azobis(2-amidinopropano) (ABAP) a
0,07M preparado também em tampão fosfato. A cinética de formação de
lipoperóxidos foi acompanhada em espectrofotômetro a 234nm, por 15 min (Chicaro
et al., 2004).
Como padrão de comparação utilizou-se o α-tocoferol, sendo que os
resultados foram mostrados em porcentagem de inibição em relação à inibição
exercida pela vitamina E. Os extratos de K. alvarezii, G. birdiae, G. domingensis
e
H.
spinella, bem como o extrato aquoso do fitoterápico M. glomerata e padrões dos
_________________________________________________________________
41
favonóides rutina e a mistura de quercetina e isoquercetrina foram testados neste
modelo experimental.
3.4. Análises dos Extratos
3.4.1. Cromatografia Líquida
O perfil cromatográfico dos extratos ativos foi obtido em um sistema
Shimadzu SCL-10AVP, constituído por duas bombas LC-10AD, com injetor
automático SIL-10ADVP e detector Diode Array SPD-M10AVP. A coluna utilizada foi
uma C18 (Shimadzu, 250 x 4,6 mm, 5 µm), com pré-coluna e fluxo de 1,0 mL.min
-1
.
os cromatogramas foram obtidos nos comprimentos de onda de 250 a 800nm.
Diferentes fases móveis foram testadas até a padronização daquela que
obteve o maior número de picos separados das algas estudadas. O solvente A
consistiu de tampão acetato de sódio 20mM pH=5,1 e o B de acetonitrila. Depois de
determinado o gradiente de eluição (Tabela 2), 20µL das amostras foram injetadas e
os dados adquiridos foram analisados no Software Origin 6.0.
Tabela 2: Gradiente utilizado nas análises dos extratos.
Tempo (min) % B
0 40
30 100
35 100
Para análise qualitativa e quantitativa dos carotenóides das algas, novos
extratos foram feitos e uma nova metodologia foi desenvolvida. Estas análises foram
conduzidas no mesmo sistema acima, sendo que ao detector de UV acoplou-se
_________________________________________________________________
42
ainda um detector eletroquímico. O detector eletroquímico Coulochem III (ESA) é
equipado com uma cela guarda modelo 5021 e uma cela analítica modelo 5010,
composta por eletrodo de trabalho de platina. A coluna utilizada foi uma C
30
(Ultracarb, 250 x 4,6mm, 5µ, Phenomenex), injetando-se 50µL de amostra, em fluxo
de 1mL.min
-1
. Vários métodos foram testados, baseando-se inicialmente pelo
descrito por Ferruzzi e colaboradores, que utiliza tampão acetato de amônio
1,0mol.L
-1
pH=4,6 como fonte de eletrólitos, sendo a fase móvel composta por: A=
metanol:metil-tert-butil-éter:tampão (95:3:2) e B= os mesmos solventes (25:73:2) em
gradiente de eluição como descrito na Tabela 3 (Ferruzzi et al., 1998). A partir deste,
a metodologia foi otimizada, sendo finalmente utilizado o método descrito na Tabela
4.
Tabela 3: Gradiente utilizado para separação de carotenóides
em amostras de plasma, tecido cervical e cenoura
(Ferruzzi
et al.
, 1998).
Tempo (min) % B
0 12,5
5 12,5
25 35
30 35
Tabela 4: Gradiente utilizado na separação de carotenóides e
clorofilas neste trabalho.
Tempo (min) % B
0 5
15 10
25 10
35 15
40 40
42 45
62 45
63 100
68 100
_________________________________________________________________
43
Parâmetros cromatográficos como k’ e α, foram calculados para avaliar a
eficiência de separação do método aplicado. O fator de capacidade (k’) (Figura 10),
de um componente é a medida do quanto este componente é retido na coluna em
relação ao componente que não é retido (elui com o volume morto da coluna). O
parâmetro de seletividade (α), por sua vez, é a medida do intervalo de tempo de
retenção entre dois picos e indica o quanto os picos estão separados, sendo
calculado por:
α
αα
α= k
2
’/k
1
’
Figura 10: Fator de capacidade (k’). t
R
= tempo de retenção em minutos do pico de
interesse; t
0
= tempo de retenção em minutos do pico que não tem interação com
a coluna.
Depois de padronizado o método, o potencial de oxidação de maior
resposta foi testado, a partir da construção dos voltamogramas hidrodinâmicos. Para
isso, as amostras foram avaliadas em potenciais variando de +200 a +700mV, no
modo DC, em intervalos de 50mV, e de +700 a +900mV, em intervalos de 100mV,
sendo que sempre no segundo canal o potencial era de 0mV. Os cromatogramas
provenientes do detector diode-array, por sua vez, foram obtidos em comprimentos
de onda de 200 a 800nm. Os dados adquiridos em ambos detectores foram
analisados no Software Origin 6.0.
_________________________________________________________________
44
3.4.1.1. Preparo das Amostras para Análise de Pigmentos
Para análise dos carotenóides das algas K. alvarezii, G. birdiae, G.
domingensis, e H. spinella, otimizou-se uma metodologia de extração a fim de obter
um extrato seco com maior quantidade desses pigmentos. As algas congeladas
foram maceradas com nitrogênio líquido e este macerado foi seco em speed-vac
(SpeedVac
, Savant, City, USA). O macerado seco obtido foi pesado e a ele
adicionou-se acetona:metanol [1:1], que foi considerado a melhor mistura de
solventes para extração e posterior secagem. O solvente foi mantido em contato
com o macerado por 15 minutos em banho de ultra-som com controle de
temperatura, não ultrapassando 20
o
C. Após centrifugação, o extrato foi filtrado em
membrana de 0,45µm (Millex HN nylon, 13mm, Millipore). Alíquotas dos extratos (4
mg.mL
-1
) foram injetadas em HPLC, e a concentração de pigmentos calculada em µg
por mg de peso seco.
3.4.1.2. Identificação dos Picos
Soluções estoque de aloxantina (1,04 mgL
-1
), anteraxantina (0,625
mgL
-1
), cantaxantina (0,559 mgL
-1
), diadinoxantina (1,197 mg L
-1
), diatoxantina
(0,935 mgL
-1
), fucoxantina (1,438 mgL
-1
), luteína (1,296 mgL
-1
), neoxantina
(1,137 mgL
-1
), peridina (0,984 mgL
-1
), prasinoxantina (1,281 mgL
-1
), violaxantina
(0,814 mgL
-1
), e zeaxantina (0,591 mgL
-1
) em etanol, foram obtidas da DHI Water &
Environment (Copenhagen, Denmark) e estocadas a -80
o
C. β-Caroteno, astaxantina
e clorofilas a e b foram obtidas da Sigma (St. Louis, USA).
Os picos das amostras de algas foram identificados por
comparações dos tempos de retenção e dos espectros de UV com os padrões.
_________________________________________________________________
45
3.4.1.3. Análises Quantitativas
As curvas analíticas foram obtidas por diluições das soluções
estoque ou preparo das mesmas, e análise nos detectores de UV e EC. A precisão,
expressa como desvio padrão relativo (DPR) foi calculada segundo a fórmula:
DPR = desvio padrão x 100
concentração média determinada
A exatidão do método, por sua vez, expressa pela relação entre a
concentração média determinada experimentalmente e a concentração teórica
correspondente, foi calculada utilizando-se da fórmula:
Exatidão = concentração média experimental x 100
concentração teórica
Os ensaios de precisão e exatidão foram realizados em um mesmo
dia (intradia) e em dias diferentes (inter-dias), com 5 injeções sucessivas ou em 5
dias diferentes, respectivamente.
3.4.2. Cromatografia Gasosa
As análises por cromatografia a gás (GC) foram realizadas para a
determinação de ácidos graxos e esteróides das algas em questão, a fim de
caratcterizar seus extratos apolares.
Amostras das diferentes espécies foram maceradas em nitrogênio líquido
e em seguida este macerado foi liofilizado. Estes materiais secos foram então
extraídos com diclorometano no banho de ultra-som por 30 minutos e por três vezes
_________________________________________________________________
46
e o extrato obtido foi seco em atmosfera de nitrogênio após filtração. Esse mesmo
procedimento inicial foi realizado tanto para extração de ácidos graxos quanto de
esteróides.
3.4.2.1. Análise de Ácidos Graxos
Para análise dos ácidos graxos, o extrato seco obtido foi
ressuspendido em solução metanólica de metóxido de sódio 1M para sua
transesterificação. Os tubos foram fechados e mantidos a 65
o
C por 5 min. Após
resfriado a temperatura ambiente, adicionou-se água destilada e clorofórmio por três
vezes. Os tubos foram agitados por 1 min, centrifugados e a fase clorofórmica
resultante foi seca em atmosfera de nitrogênio e ressuspendida novamente para
análise.
Os ácidos graxos metilados foram cromatografados como metil-
ésteres em coluna de sílica fundida (DB-Wax, 30m X 0,25 mm X 0,25 µm, Agilent).
As análises foram realizadas em cromatógrafo a gás, acoplado a espectrômetro de
massas com ionização por impacto de elétrons. A temperatura de injeção foi de
220
o
C, volume de 1µL, no modo Splitless. O fluxo foi de 1,3mL/min e o gradiente de
temperatura utilizado está apresentado na Tabela 5.
_________________________________________________________________
47
Tabela 5: Gradiente de temperatura utilizado para as
análises dos ácidos graxos metilados em GC-MS.
Temperatura (
o
C) Tempo (min)
50 0
200 10
200 15
230 21
230 61
Além das amostras, foram injetados padrões dos ácidos metilados:
láurico, mirístico, pentadecanóico, palmítico, margárico, esteárico, oléico, linoléico,
linolênico, eicosapentenóico e docosahexenóico.
3.4.2.2. Análise de Esteróides
Para a análise dos esteróides das algas, o mesmo procedimento
inicial de extração foi seguido, sendo que após secos, os extratos foram
ressuspendidos em 100µL de hexano. Em seguida, a amostra foi misturada a 10mg
de sílica-gel para coluna (Merck, 230-80 mesh), para formação de uma pastilha, que
foi colocada no topo de uma micro-coluna de sílica (Alltechg-Sílica-gel, 200mg,
3mL). A coluna foi eluída com 10mL de hexano e 10mL de clorofórmio. As frações
foram coletadas separadamente e secas sobre atmosfera de nitrogênio. A fração
clorofórmica, que continha os esteróides, foi então ressuspendida em 200µL de
hexano para análise cromatográfica.
Os esteróides foram analisados em cromatógrafo a gás, equipado
com detector por ionização em chamas (FID), com H
2
como gás de arraste (42cm/s,
a 250
o
C) e N
2
como gás auxiliar. A coluna utilizada foi de metil-silicone (HP-1 30m X
0,25mm X 0,25 µm). O gradiente de temperatura está apresentado na Tabela 6. A
_________________________________________________________________
48
temperatura do injetor foi de 260
o
C com split de 1:40, detector a 300
o
C, H
2
a 46cm/s
a 200
o
C e volume de injeção de 1µL. Como padrão interno foi utilizado o 5α-
colestane. Foram injetados também os padrões de campesterol, estigmasterol e β-
sitosterol.
Tabela 6: Gradiente de temperatura para eluição dos
esteróides em GC-FID.
Temperatura (
o
C) Tempo (min)
250 0
250 12
280 17
280 47
3.4.3. RMN
Quando pertinente, foram realizadas análises de
1
H (500 MHz) e
13
C (125
MHz) dos extratos, substâncias isoladas ou em mistura. Para isso, foi utilizado o
espectrômetro da Brucker DRX 500. As amostras foram solubilizadas em solventes
deuterados (Merck, Alemanha).
3.5. Estudo de Polienos por Espectrometria de Massas
3.5.1. Moléculas Estudadas
Foram obtidos espectros de MS, MS/MS e MS
n
de baixa, alta e ultra-
resolução nos equipamentos com diferentes fontes das seguintes substâncias
poliênicas: carotenóides, retinóides e moléculas sintéticas mistas (“caro-flavos”). Os
carotenóides estudados foram: licopeno, β-caroteno, astaxantina, etil-8'-apo-β-
_________________________________________________________________
49
caroteno-8'-oato, bixina, (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA), cantaxantina,
anteraxantina, β-criptoxantina, prasinoxantina, diatoxantina, diadinoxantina,
peridinina, 19'-hexenoil-fucoxantina, luteína, zeaxantina, violaxantina, neoxantina,
fucoxantina e aloxantina (DHI Water & Environment, Copenhagen, Denmark) (Figura
3). Os retinóides foram o retinaldeído e o ácido retinóico (Sigma-Aldrich, St. Louis,
USA) (Figura 11) e os “caro-flavos” (Figura 12), foram sintetizados e cedidos pelo
grupo do Prof. Dr. Hans Dieter Martin (Institut für Organische Chemie und
Makromolekulre Chemie, Heinrich-Heine-Universität, Düsseldorf, Alemanha).
O
O
OH
r
e
t
i
n
a
l
á
c
i
d
o
r
e
t
i
n
ó
i
c
o
Figura 11: Estrutura dos retinóides estudados: ácido retinóico e retinal.
O
OH
O
"Caro-Flavo"
(cadeia poliênica menor)
O
O
OH
"Caro-Flavo"
(cadeia poliênica maior)
Figura 12: Estrutura das moléculas sintéticos, codificadas como “Caro-Flavo”, de diferentes
tamanhos de cadeias poliênicas.
3.5.2. Equipamentos utilizados
Os equipamentos para essas análises, bem como suas condições
encontram-se descritos na Tabela 7. As soluções objeto de estudo foram
_________________________________________________________________
50
adicionadas de 0,05% de ácido fórmico, quando necessário. Alguns destes
experimentos foram realizados na Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão
Preto-USP e outros na Universidade de Bristol, durante estágio realizado, com
orientação do Prof Dr Norberto P. Lopes e do Dr Paul J. Gates.
_________________________________________________________________
51
Tabela 7: Equipamentos de baixa-, alta- e ultra-resolução (Resol.) utilizados nas análises de
massas dos polienos e suas condições experimentais.
RESOL.
DESCRIÇÃO
FONTE
CONDIÇÕES
PREPARO E
INJEÇÃO DAS
AMOSTRAS
Baixa triplo
quadrupolo
(Quattro-LC,
Micromass)
ESI Gás secante a 250
o
C, 0,1 a
4kV de voltagem do capilar,
20V de energia no cone
etanol:água
[80:20%v/v].
Injeção: bomba de
infusão 10µL min
-1
triplo
quadrupolo
(Quattro-LC,
Micromass)
APCI Capilar a 250
o
C, 6kV de
energia na coroa, 20V de
energia no cone extrator
etanol:água
[80:20%v/v].
Injeção: bomba de
infusão 10µL min
-1
Alta híbrido triplo
quadrupolo e
tempo de vôo
(UltrOTOF-Q
Brücker-
Daltonics)
ESI Gás secante a 250
o
C, 3kV
de voltagem, 20V de
energia de extração de íon
etanol:água
[80:20%v/v].
Injeção: bomba de
infusão 10µL min
-1
híbrido triplo
quadrupolo e
tempo de vôo
(Qq-TOF
QStar XL -
Applied
Biosystems)
NanoSpray
5
µ
L da solução aspirada e
nebulizada por chip
Nanomate 400 a 1,45V com
pressão de nitrogênio de
0,4psi.
Parâmetros da fonte: 2700V
de voltagem no spray de
íons, 75V de potencial de
declustering
, focalizador a
280V, N
2
como gás secante
metanol:água
[80:20%v/v],
concentração final:
0,1
µ
g mL
-1
MALDI-
TOF/TOF (ABI
4700
Proteomics
Analyser,
Applied
Biosystems).
MALDI
Laser Nd:YAG (355 nm) a
200 Hz de pulso com
duração de 500ps
Ácido di-
hidróxibenzóico a
10mg mL
-1
(50%
MeOH:água mais
0,1 % TFA) foi
utilizado como
matriz.
Ultra
Fourier-
transform ion
cyclotron
resonance
(FTICR) (7
Tesla Apex IV,
Brüker-
Daltonics)
ESI Voltagem do capilar: 4,6kV,
gás secante a 200
o
C
metanol:
acetonitrila:água
[50:25:25%v/v/v],
Concentração final:
0,1mg mL
-1
.
Injeção: bomba de
infusão, 100
µ
L h
-1
.
_________________________________________________________________
52
3.5.3. Cálculos Teóricos
3.5.3.1. Energia de Ionização e afinidade protônica para
carotenóides e retinóides
Os resultados obtidos para as energias de ionização e afinidade
protônica dos carotenóides e retinóides foram realizados por Ricardo Vessecchi,
durante o desenvolvimento de seu projeto de mestrado na Faculdade de Ciências
Farmacêuticas de Ribeirão Preto, sob orientação do Prof. Dr. Norberto P. Lopes.
A otimização da geometria para as xantofilas foi realizada
empregando-se o método semi-empírico AM1 (Dewar et al., 1985; Stewart, 1990)
pelo programa MOPAC 7.0 interfaceado ao software Chem2Pac (Cyrillo & Galvão,
1999).
As energias de ionização (EI) foram computadas como sendo a
diferença entre o cátion radical formado (M
+•
) e a molécula neutra (M):
EI = E(M
+•
) – E (M)
A afinidade protônica (AP) é o negativo da entalpia para a reação de
protonação de uma molécula neutra (M):
M + H
+
= MH
+
(equação de protonação)
AP = - ∆H = -[∆
f
(MH)
+
– (∆H
f
(H
+
) + ∆H
f
(M))]
3.5.3.2. Energia de Ionização para os “Caro-Flavos”
Os resultados obtidos para as energias de ionização dos caro-flavos
foram realizados por Ricardo Vessecchi, doutorando da FFCLRP-USP, sob
orientação do Prof. Dr. Sérgio Galembeck.
Os caro-flavos (Figura 13) tiveram suas geometrias otimizadas no
nível B3LYP/6-31+G(d,p) (Becke, 1993; Woodall et al., 1997b) interfaceado ao
_________________________________________________________________
53
programa Gaussian 03 (Petersson et al., 1988). Um mínimo na superfície de energia
potencial foi caracterizado pelos valores positivos das freqüências vibracionais. A
energia de ionização foi computada como a diferença entre a energia do radical e
molécula neutra, como demonstrado na equação:
EI = E(M
+•
) – E(M).
3.6. Avaliação da Atividade Antioxidante de Substâncias
Sintéticas
Diferentes substâncias sintéticas foram testadas quanto à sua habilidade
em inibir a lipoperoxidação induzida por radiação ultravioleta. Para isso, foram
construídos sistemas biomiméticos como um modelo simples de membrana.
3.6.1. Substâncias testadas
As substâncias estudadas foram enquadradas em dois diferentes grupos
para facilitar suas análises comparativas: carotenóides e flavonóides, que incluía a
astaxantina (Figura 3), a epicatequina (Figura 13) e compostos sintéticos que
apresentam em porções de carotenóides e flavonóides sua estrutura (“Caro-Flavos”)
(Figura 12); e tocoferóis, que incluía o α-tocoferol e alguns análogos sintéticos da
vitamina E (Figura 4 e Figura 14).
_________________________________________________________________
54
O
OH
OH
HO
O
H
OH
Epicatequina
Figura 13: Estrutura do flavonóide estudado.
O
HO
F
E
B
L
4
5
O
HO
O
O
O
FEBL 70
O
HO
O
O
OH
OH
O
HO
N
H
O
OH
OH
FEBL 80
FEBL 82
Figura 14: Estruturas dos derivados sintéticos de vitamina E estudados, codificados como
FEBL 45, FEBL 70, FEBL 80 e FEBL 82.
Compostos híbridos de carotenóides e flavonóides (Figura 12) foram
sintetizados pelo grupo do Prof. Dr. Hans-Dieter Martin (Institut für Organische
Chemie und Makromolekulre Chemie, Heinrich-Heine-Universität, Düsseldorf,
Alemanha) e cedidos para o grupo dos Profs. Dr. Helmut Sies e Dr. Wilhelm Stahl,
com quem a aluna realizou seu estágio sanduíche (Institut für Biochemie und
Molekularbiologie I, Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf, Alemanha).
Os derivados de α-tocoferol, por sua vez, foram sintetizados e fornecidos
para o laboratório, resultante de uma colaboração dos Profs. Dr. Helmut Sies e Dr.
Wilhelm Stahl (Institut für Biochemie und Molekularbiologie I, Heinrich-Heine-
_________________________________________________________________
55
Universität Düsseldorf, Alemanha), com o Prof. Dr. Stefano Manfredini (Dipartimento
di Scienze Farmaceutiche, Università di Ferrara, Ferrara, Itália).
3.6.2. Preparo dos Sistemas Biomiméticos
Os lipossomas foram preparados utilizando-se fosfatidilcolina extraída de
gema de ovo (Sigma). O lipídeo foi pesado, suspendido em diclorometano e rota-
evaporado para a formação de um filme homogêneo. Em seguida, foi adicionado
tampão fosfato de sódio 100 mmol.L
-1
pH=7,4 em volume suficiente para obtenção
de 5mg de fosfolipídeo/mL. A suspensão foi sonicada por 20 minutos, obtendo-se
então lipossomas multilamelares. Para a obtenção de lipossomas unilamelares, a
suspensão foi extrusada, ou seja, submetida a passagens por uma membrana
Avestin de 0,4µm, por meio de seringas conectadas entre si. Para o teste de
substâncias apolares, estas foram ressuspendidas em diclorometano em
concentrações pré-estabelecidas, juntamente com a fosfatidilcolina. Por outro lado,
quando substâncias polares foram testadas, essas foram dissolvidas no tampão de
formação da suspensão.
Depois de preparadas, as soluções contendo os lipossomas com ou sem
as substâncias a serem testadas foram distribuídas em cubetas de quartzo fechadas
e submetidas à radiação UVB nas doses de 0,5 J/cm
2
ou 1,5 J/cm
2
, ou ainda UVA
nas doses de 10 J/cm
2
ou 27,5 J/cm
2
. A câmara de radiação (Bio-Sun UV irradiation
system) possuía controle de temperatura, sendo que esta não ultrapassava 35
o
C.
Além disso, os tempos de exposição para as determinadas doses eram calculados
automaticamente, de acordo com a lâmpada.
_________________________________________________________________
56
3.6.3. Quantificação de MDA
O malonaldeído (MDA), um dos produtos resultantes da oxidação de
lipídeos, foi quantificado por HPLC com detector de fluorescência, baseando-se em
metodologias descritas anteriormente (Fukunaga et al., 1998; Yang et al., 1997).
Para isso, os lipossomas foram rompidos e a eles adicionados uma solução
contendo ácido tiobarbitúrico (TBA) para a derivatização de MDA, ou seja, para a
formação do complexo MDA-TBA, que é fluorescente (Figura 15).
N
N
O
H
H
S
OH
OO
H H
MDATBA
N
N
S
O
H
OH
N
N
OH
S
H
H
O
complexo MDA-TBA
2 H
2
O
+
95
o
C
20 min
+
Figura 15: Reação de MDA com TBA.
Os padrões foram preparados a partir de uma solução de
tetrametoxipropano (Sigma), que nas condições experimentais gera quantidades
equimolares de MDA. As soluções para a construção da curva analítica foram
diluídas em metanol 30% (grau HPLC). Para a derivatização tanto dos padrões
quanto da amostra, foram adicionados 200 µL de TBA (0,4% em ácido clorídrico 0,2
M) e 20 µL de BHT (Butil-Hidróxi-Tolueno) 0,5% em metanol (antioxidante utilizado
para bloquear subseqüentes oxidações no sistema) a 50µL das soluções padrões ou
da amostra. O meio reacional foi mantido a 95 °C durante 20 minutos. Após este
período, o analito derivatizado foi injetado (50µL) em HPLC com detector por
fluorescência. O método otimizado foi o sistema isocrático com metanol:tampão
fosfato 25mmol.L
-1
(pH=6,5) (2:3). A coluna utilizada foi uma RP
18
(LiChrospher®
_________________________________________________________________
57
100, 250 x 4,6 mm, 5 µm) e os comprimentos de onda de excitação e de emissão
foram 513 e 553 nm, respectivamente. O fluxo foi de 1mL/min e o tempo de corrida
total de 6 minutos.
Os valores de MDA obtidos em cada sistema foram indicados como µmol
por grama de fosfolipídeo presente na amostra.
3.6.4. Medida de Fosfolipídeos
Para a normalização dos resultados de MDA obtidos, calculou-se a
quantidade de fosfolipídeos de cada amostra. Foi utilizado um kit comercial
(Phospholipid B, Wako) que contém fosfolipase D, colina oxidase, peroxidase, 4-
aminoantipirina, fenol, cloreto de cálcio e tampão Tris 0,05M pH=8,0. Os
fosfolipídeos presentes na suspensão contendo os lipossomas foram adicionados à
mistura de reação, onde sob a ação de fosfolipase D originam colina livre. Esta, por
sua vez, sob a ação de colina oxidase resulta em betaína e peróxido de hidrogênio,
que na presença de 4-aminoantipirina e fenol produz uma substância que absorve
no UV (505nm). A quantificação foi realizada utilizando-se uma solução padrão de
concentração conhecida, fornecida também comercialmente.
________________________________________________________________
58
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
________________________________________________________________
59
4.1. Obtenção dos Extratos
Neste trabalho, quatro espécies de algas vermelhas foram estudadas. Todas
elas já vêm sendo cultivadas ou exploradas no litoral brasileiro visando a produção
de ágar e de carragenana. Sendo assim, estudos químicos poderiam conduzir a
elucidação de outras substâncias comercialmente interessantes que poderiam ser
extraídas além desses ficocolóides, aumentando o aproveitamento final dos cultivos.
Para exploração, as algas são coletadas e secas ao sol para posterior
comercialização, o que pode resultar em degradação principalmente das substâncias
susceptíveis à oxidação. Seguindo-se os objetivos iniciais deste trabalho foram
obtidos os extratos de diferentes polaridades das algas K. alvarezii, G. birdiae, G.
domingensis e H. spinella por meio das marchas fitoquímicas clássicas, não
evitando-se o contato com o ar (Correa & Vieira, 2007), para que fossem testados
quanto à sua atividade antioxidante. Nem todas as algas resultaram em extratos com
massas suficientes em cada fracionamento. A Tabela 8 mostra os rendimentos
aproximados de cada extração.
Tabela 8: Rendimentos aproximados (% do peso fresco inicial) de cada extrato seco de
alga, partindo-se do fracionamento de uma extração inicial com metanol.
Extratos
K. alvarezii G. birdiae G. domingensis H. spinella
Hexano 0,035 0,015 - -
Hex:Ac - 0,03 0,04 0,12
Acetato 0,1 0,007 0,02 0,075
Butanol - 0,3 0,1 0,45
Metanol 0,15 - 0,02 0,08
Água 10 6 7 5
-: extrato não obtido
________________________________________________________________
60
Optou-se por obter os extratos por meio de procedimentos clássicos, pois
estes permitem estudos com custo relativamente baixo. Esta abordagem permitiria a
incorporação dos resultados científicos na escala produtiva destas algas estudadas.
(Dos Santos et al., 2006.).
Os procedimentos clássicos são conduzidos em sistemas abertos, ou seja,
sem controle da presença de oxigênio ou de temperatura, normalmente com fases
estacionárias polares como, por exemplo, a sílica (Correa & Vieira, 2007). Destaca-
se que os metabólitos secundários provenientes da biossíntese do ácido chiquímico,
de biossíntese mista ou ainda de algumas classes da via do acetato normalmente
são estáveis às marchas fitoquímicas clássicas, possibilitando seu isolamento e
posterior avaliação biológica a partir de organismos tanto do ambiente terrestre
como aquático e, que várias moléculas com atividade antioxidante têm sido isoladas
a partir destas técnicas (Hwang et al., 2006; Amin & Buratovich, 2007)
4.2. Atividade Antioxidante dos Extratos
Obtidos os extratos, estes foram testados para avaliação de sua atividade
antioxidante por dois métodos distintos: inibição do radical DPPH e inibição da
lipoperoxidação induzida pelo iniciador radicalar ABAP.
4.2.1. Inibição do Radical DPPH
O sistema DPPH é um procedimento estável de geração de radical muito
utilizado em estudos preliminares, principalmente para ensaios de extratos, pois é
uma metodologia rápida e ao mesmo tempo sensível (Yokozawa et al., 1998).
________________________________________________________________
61
Moléculas doadoras de hidrogênio, presentes no extrato, podem reagir com o radical
DPPH, causando uma diminuição na intensidade de absorção em 517nm (Figura
16). Desta maneira, é possível localizar extratos com propriedades anti-radicalares.
N
N
NO
2
O
2
N
NO
2
N
NH
NO
2
O
2
N
NO
2
+ InH
DPPH (517nm)
+ In
Figura 16: Reação do radical DPPH com molécula antioxidante doadora de hidrogênio
(InH).
Essa reação é ainda dependente do tempo de exposição, como
exemplifica a Figura 17, que apresenta as porcentagens de inibição em função de
crescentes concentrações de extrato, cujas reações foram medidas após diferentes
intervalos de tempo. A partir desses dados, foi estabelecido um tempo de reação de
30 minutos para teste de todos os extratos.
Todos os extratos das algas, preparados em soluções de diferentes
concentrações, foram então testados frente à sua capacidade em inibir o radical
DPPH, medindo-se o decaimento deste radical em espectrofotômetro. Os resultados
podem ser vistos na Figura 18.
________________________________________________________________
62
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Tempo de Incubação
100 minutos
110 minutos
120 minutos
130 minutos
% de inibição
Concentração (mg mL
-1
)
10 minutos
23 minutos
30 minutos
40 minutos
50 minutos
60 minutos
70 minutos
80 minutos
90 minutos
Figura 17: Influência do tempo nas reações de inibição da formação do radical DPPH por
crescentes concentrações do extrato bruto de
G. birdiae
.
G. birdiae
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 1,8 2,0
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Concentração (mg mL
-1
)
% de inibição
Hexano
Hexano: Acetato de Etila
[1:1]
Acetato de Etila
Butanol
Água
G. domingensis
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 1,8 2,0
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
% de inibição
Concentração (mg mL
-1
)
Hexano: Acetato de Etila (1:1)
Acetato de Etila
Metanol
Butanol
Água
H. spinella
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 1,8 2,0
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
% de inibição
Concentração (mg mL
-1
)
Hexano: Acetato de Etila (1:1)
Acetato de Etila
Metanol
Butanol
Água
K. alvarezii
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 1,8 2,0
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
% de inibição
Concentração (mg mL
-1
)
Hexano
Acetato de Etila
Metanol
Água
Figura 18: Inibição do radical DPPH pelas crescentes concentrações dos diferentes extratos
de
G. birdiae, G. domingensis, H. spinella
e
K. alvarezii.
________________________________________________________________
63
Desta maneira, obtiveram-se as concentrações mínimas necessárias para
inibir quantidades determinadas do radical DPPH no meio reacional após 30
minutos. Os valores de IC
30
e IC
50
(concentração mínima inibitória de 30 ou 50% do
radical, respectivamente) estão apresentados na Tabela 9.
Tabela 9: Cálculo das concentrações mínimas requeridas (mg.mL
-1
) para inibir 30 ou 50%
(IC
30
e IC
50
, respectivamente) do radical DPPH formado.
G. birdiae G.
domingensis
H. spinella K. alvarezii
Extratos
IC
30
IC
50
IC
30
IC
50
IC
30
IC
50
IC
30
IC
50
Hexano 0,387 0,610 nt nt nt nt nd nd
Hex:Ac 0,486 0,833 nd nd nd nd nt nt
Acetato 0,665 1,193 nd nd nd nd nd nd
Butanol 0,372 1,466 1,432 nd nd nd nt nt
Metanol nt nt 1,551 nd 1,903 nd nd nd
Água nd nd nd nd nd nd nd nd
nd
: não determinado
nt
: não testado
Alguns dos extratos apresentaram atividade muito baixa frente a esse
teste, não sendo possível determinar uma concentração mínima inibitória nem
mesmo de 30% do radical presente no meio reacional, nas concentrações do extrato
utilizadas. Neste modelo experimental, os extratos mais apolares de G. birdiae
mostraram-se os mais ativos entre os analisados.
Visando uma comparação com dados obtidos com um extrato estável às
marchas fitoquímicas clássicas, testou-se a atividade neste mesmo modelo
experimental da fração aquosa do fitoterápico guaco (Figura 19) e as concentrações
de IC
50
foram determinadas como pode ser obervado na Tabela 10. Este produto é
comercializado com um extrato rico em cumarinas e compostos fenólicos, com alta
atividade antioxidante. É obtido comercialmente por secagem com spray-drier
________________________________________________________________
64
(sistema de secagem contra-fluxo de ar aquecido). Contudo, suas moléculas
bioativas são termicamente estáveis. Foram testados ainda, padrões dos flavonóides
rutina e da mistura de quercetina e isoquercetrina, cujos resultados podem ser vistos
também na Figura 19 e na Tabela 10.
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45
0
20
40
60
80
100
Concentração (
µ
g.mL
-1
)
% de Inibição de DPPH
.
.
.
.
Extrato de Guaco
Rutina
Quercetina
Figura 19: Inibição do radical DPPH pelas crescentes concentrações da fração aquosa do
fitoterápico
guaco
e dos flavonóides rutina e da mistura de quercetina e
isoquercetrina
.
Tabela 10: Cálculo das concentrações mínimas requeridas (mg.mL
-1
)
para inibição de 50% (IC
50
) do radical DPPH.
Substância ou Extrato testado IC
50
Extrato aquoso de guaco 0,010
Rutina 0,076
Quercetina 0,026
Enquanto a fração mais ativa das algas foi a hexânica da macroalga G.
birdiae, requerendo aproximadamente 0,6 mg.mL
-1
de extrato para inibição de 50%
do radical DPPH formado, o extrato aquoso do fitoterápico analisado necessitou de
apenas 0,01 mg.mL
-1
, ou seja, quase 60 vezes menos, para inibir a mesma
quantidade do radical (Tabela 10). Isso confirma que este ensaio é aplicável à
análise de extratos e ainda sugere que os baixos resultados de atividade
________________________________________________________________
65
antioxidante das amostras de algas é devido à baixa concentração de substâncias
capazes de doar H
+
para o radical DPPH, o que pode ser resultado da degradação
na obtenção dos extratos ou mesmo da ausência de moléculas com esta atividade.
Visando corroborar com esses dados, os extratos foram ensaiados utilizando-se
outro modelo experimental: a capacidade inibitória de lipoperoxidação.
4.2.2. Inibição de Lipoperoxidação em Micelas induzida por ABAP
A peroxidação lipídica é iniciada por qualquer espécie capaz de abstrair de
um lipídeo, um átomo de hidrogênio de um grupo metilênico (-CH
2
-) (Halliwell &
Gutteridge, 2006), sendo os ácidos graxos, principalmente os poli-insaturados, os
principais alvos. Vários são os métodos disponíveis para medida da lipoperoxidação,
bem como da sua inibição. No método utilizado neste trabalho, micelas de ácido
linolênico e SDS em tampão foram construídas e desafiadas com o iniciador
radicalar ABAP, medindo-se a cinética de formação de lipoperóxidos, segundo a
Figura 20, a 234 nm por 15 min. Quando substâncias antioxidantes são inseridas
neste sistema, há uma conseqüente diminuição na formação dos lipoperóxidos
(Figura 20) e, portanto, do coeficiente angular da reta desta cinética (Chicaro et al.,
2004). Os coeficientes angulares das retas de formação de lipoperóxidos foram
plotados versus as concentrações testadas de cada extrato, para obtenção de uma
única reta. Estes coeficientes foram comparados com aquele obtido nos ensaios
com o α-tocoferol. A partir desses dados, foi determinada a atividade antioxidante
relativa de cada extrato, frente à atividade do α-tocoferol (como descrito
anteriormente no item 3.3.2).
________________________________________________________________
66
R N N R
∆
ROO
.
ROOH + L
.
L
.
+ O
2
LOO
.
LOO
.
+ LH LOOH + L
.
2 LOO
.
Produto não radicalar
LOO
.
+ InH LOOH + In
.
LOO
.
+ In
.
Produto não radicalar
R
.
+ O
2
ROO
.
+ LH
2 R
.
+ N
2
Início
Propagação
Término
Figura 20: Esquema da lipoperoxidação iniciada por ABAP (R-N=N-R – ABAP; LH –
lipídeo; InH - antioxidante).
A Figura 21 (A e B), mostra as curvas de inibição da lipoperoxidação
obtidas utilizando-se o α-tocoferol como antioxidante, que foi escolhido como padrão
de comparação.
A) B)
Figura 21: Curvas de inibição da lipoperoxidação pelo
α
-tocoferol A) em diferentes
concentrações e B) especificamente nas concentrações onde este ainda não está
saturada.
As curvas foram construídas para os extratos testados e com os
coeficientes obtidos, foi calculada a porcentagem de atividade antioxidante dos
extratos, considerando a atividade exercida pelo α-tocoferol como 100%, conforme
apresentado na Tabela 11.
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
0,00000
0,00002
0,00004
0,00006
0,00008
0,00010
Coeficiente angular das cinéticas de reação
Concentração (mg mL
-1
)
Vitamina E
α-tocoferol
0,00 0,01 0,02 0,03 0,04 0,05
0,00002
0,00004
0,00006
0,00008
0,00010
Concentração (mg mL
-1
)
Coeficiente angular das cinéticas de reação
Vitamina E
Coeficiente angular = -168.10
-5
α-tocoferol
________________________________________________________________
67
Tabela 11: Porcentagem de inibição da lipoperoxidação induzida por ABAP pelos extratos,
relativa à inibição exercida pelo
α
-tocoferol.
Extratos
K. alvarezii G. birdiae G. domingensis H. spinella
Hexano 0,28 3,5
nt
nt
Hex:Ac
nt
2,4 1,3 1,24
Acetato 0 0,75 1,0 1,36
Butanol
nt
1,02 1,4 0,7
Metanol 1,83
nt
0,74 1,1
Água 1,05 0,29 0 0,12
nt
: não testado
Nestes ensaios, as maiores atividades também foram detectadas nos
extratos mais apolares da alga G. birdiae, como no ensaio com DPPH. Em trabalho
recente, Nahas e colaboradores também observaram maior atividade para os
extratos menos polares ao testarem diferentes espécies de algas (Nahas et al.,
2007).
Para comparação com o potencial antioxidante de um extrato de planta,
como descrito para o teste com DPPH, testou-se a atividade neste mesmo modelo
experimental da fração aquosa do fitoterápico guaco (Tabela 12). Os flavonóides
rutina e a mistura de quercetina e isoquercetrina também foram testados (Tabela
12).
Tabela 12: Cálculo da porcentagem da atividade antioxidante
das diferentes amostras frente ao
α
-tocoferol.
Substância ou Extrato testado % de Inibição
Extrato de guaco 65
Rutina 73
Quercetina e isoquercetrina 85
Esses dados revelam que o extrato de planta testado possui atividade
antioxidante comparável à atividade de rutina e de quercetina e isoquercetrina, que
________________________________________________________________
68
são flavonóides comumente presentes em plantas. Os extratos das algas,
preparados por meio das marchas de fitoquímica clássica, mostraram-se bem menos
ativos, como no ensaio com DPPH.
Com base nos resultados obtidos em ambos testes para avaliação da
capacidade antioxidante e nas análises da literatura, sugere-se que as algas em
questão ou possuem metabólitos com atividade antioxidante e passíveis de
isolamento nas marchas fitoquímicas clássicas em concentrações muito baixas, ou
que apesar do trabalho em sistema aberto, sem controle de oxigênio e temperatura,
parte de compostos conhecidamente antioxidantes como carotenóides (Junghans et
al., 2000) ainda estejam intactos após os fracionamentos, o que pode estar
colaborando para o efeito antioxidante observado.
4.3. Análises dos extratos
Partindo-se da hipótese que substâncias conhecidamente antioxidantes de
baixa estabilidade frente as marchas clássicas podem ainda estar presentes nos
extratos exercendo determinada atividade, estes foram analisados por metodologias
analíticas como cromatografia líquida e gasosa.
4.3.1. Cromatografia Líquida
A detecção pelo sistema de arranjo de diodos (DAD) após separação por
HPLC oferece algumas informações estruturais, pelos espectros de UV que podem
ser construídos. Apesar de limitadas, essas informações podem indicar algumas
classes de compostos, especialmente os carotenóides, que possuem espectros bem
________________________________________________________________
69
característicos. Para obter informações sobre os constituintes dos extratos
preparados como descreve o item 3.2, estes foram analisados por HPLC-UV. A
Figura 22 mostra o cromatograma do extrato hexânico de G. birdae analisado a
445nm e alguns dos espectros de UV de seus picos.
Figura 22: Cromatograma do extrato hexânico de
G. birdiae
em HPLC-UV e os espectros
de UV dos picos detectados (gráficos apresentados em unidade de absorbância
versus
comprimento de onda). Coluna C
18
, fase móvel A-tampão acetato de sódio
20mM pH=5,1 e B- acetonitrila, gradiente descrito na Tabela 2.
Analisando os espectros de UV e os cromatogramas obtidos, é possível
verificar que os extratos ainda continham substâncias como carotenóides, o que
explica a maior atividade antioxidante destes extratos, visto a conhecida atividade
exercida por esta classe de substâncias (Cardozo et al., 2007). Ou seja, apesar da
metodologia de extração utilizada, alguns carotenóides se mantiveram intactos.
Os resultados obtidos demonstraram que os procedimentos fitoquímicos
clássicos não forneceram um extrato com alta atividade antioxidante e que outra
extratégia deveria ser adotada. Visando analisar e quantificar a presença de
0 3 6 9 12 1 5 18 21 24 27 3 0 33 36
0
30000
60000
90000
120000
150000
180000
210000
240000
270000
E xtrato H e xânico
G racilaria birdiae
A b sorvâ ncia (44 5n m )
T e m p o (m in u tos)
30 0 3 60 420 480 54 0 6 00
0
500 0
100 0 0
150 0 0
200 0 0
250 0 0
300 0 0
25 ,8 m in
3 0 0 3 6 0 4 2 0 4 8 0 5 4 0 6 0 0
-5 0 0 0
0
5 0 0 0
1 0 0 0 0
1 5 0 0 0
2 0 0 0 0
2 7 , 0 m in
3 0 0 3 6 0 4 20 4 8 0 5 40 6 0 0
0
5 0 00
1 0 0 00
1 5 0 00
2 7 ,3 m in
30 0 3 60 4 2 0 4 80 5 40 6 00
-5 000
0
50 00
10 00 0
15 00 0
20 00 0
25 00 0
30 00 0
2 7,7 m in
30 0 3 6 0 4 20 4 80 5 40 6 00
0
50 00 0
1 00 00 0
1 50 00 0
2 00 00 0
2 50 00 0
3 00 00 0
3 0 ,3 m in
Extrato Hexânico
Gracilaria birdae
Absorbância, 445nm
0 3 6 9 12 1 5 18 21 24 27 3 0 33 36
0
30000
60000
90000
120000
150000
180000
210000
240000
270000
E xtrato H e xânico
G racilaria birdiae
A b sorvâ ncia (44 5n m )
T e m p o (m in u tos)
30 0 3 60 420 4 80 54 0 6 00
0
500 0
10 00 0
15 00 0
20 00 0
25 00 0
30 00 0
25 ,8 m in
3 0 0 3 6 0 4 2 0 4 8 0 5 4 0 6 0 0
-5 0 0 0
0
5 0 0 0
1 0 0 0 0
1 5 0 0 0
2 0 0 0 0
2 7 , 0 m in
3 0 0 3 6 0 4 20 4 8 0 5 40 6 0 0
0
5 0 00
1 0 0 00
1 5 0 00
2 7 ,3 m in
30 0 3 60 4 2 0 4 80 5 40 6 00
-5 000
0
50 00
10 00 0
15 00 0
20 00 0
25 00 0
30 00 0
2 7,7 m in
30 0 3 6 0 4 20 4 80 5 40 6 00
0
50 00 0
1 00 00 0
1 50 00 0
2 00 00 0
2 50 00 0
3 00 00 0
3 0 ,3 m in
Extrato Hexânico
Gracilaria birdae
0 3 6 9 12 1 5 18 21 24 27 3 0 33 36
0
30000
60000
90000
120000
150000
180000
210000
240000
270000
E xtrato H e xânico
G racilaria birdiae
A b sorvâ ncia (44 5n m )
T e m p o (m in u tos)
30 0 3 60 420 4 80 54 0 6 00
0
500 0
10 00 0
15 00 0
20 00 0
25 00 0
30 00 0
25 ,8 m in
3 0 0 3 6 0 4 2 0 4 8 0 5 4 0 6 0 0
-5 0 0 0
0
5 0 0 0
1 0 0 0 0
1 5 0 0 0
2 0 0 0 0
2 7 , 0 m in
3 0 0 3 6 0 4 20 4 8 0 5 40 6 0 0
0
5 0 00
1 0 0 00
1 5 0 00
2 7 ,3 m in
30 0 3 60 4 2 0 4 80 5 40 6 00
-5 000
0
50 00
10 00 0
15 00 0
20 00 0
25 00 0
30 00 0
2 7,7 m in
30 0 3 6 0 4 20 4 80 5 40 6 00
0
50 00 0
1 00 00 0
1 50 00 0
2 00 00 0
2 50 00 0
3 00 00 0
3 0 ,3 m in
Extrato Hexânico
Gracilaria birdae
Absorbância, 445nm
________________________________________________________________
70
possíveis carotenóides nas algas, uma nova metodologia de extração foi
desenvolvida para que fosse mantida a integridade dessa classe de compostos. Foi
utilizada a mistura de acetona : metanol (1:1), já que acetona é muito mais volátil,
facilitando a posterior secagem do extrato para quantificação. Em seguida,
desenvolveu-se também nova metodologia de análise de pigmentos.
4.3.1.1. Padronização da Metodologia para Análise de Pigmentos
Os métodos testados basearam-se inicialmente naquele descrito por
Ferruzzi e colaboradores, que utilizou o detector eletroquímico após separação por
HPLC nas análises de β- e α-carotenos, luteína, zeaxantina e criptoxantina (Ferruzzi
et al., 1998). Para o uso deste detector, um eletrólito na fase móvel é necessário
para a condução de corrente, sendo muito comum na literatura o uso de tampões ou
soluções salinas nas fases móveis. Neste trabalho, optou-se pela utilização do
tampão acetato, já que este oferece o benefício adicional de reduzir perdas ou
degradações por minimizar a acidez dos grupamentos de silanol livres presentes na
sílica (Ladislav et al., 2005).
Além da utilização do detector eletroquímico, o HPLC foi acoplado
também ao detector de UV, para obtenção de maiores informações qualitativas dos
picos (Frank & Brudvig, 2004). Foram realizadas análises comparativas dos
resultados obtidos em ambos detectores.
Em todos os testes de fases móveis, utilizou-se uma coluna C
30
como
fase estacionária, visto que esta tem sido empregada na separação de carotenóides,
pois oferece um aumento na resolução dos picos, como discutido anteriormente na
literatura (Schlatterer & Breithaupt, 2006). Após o teste de inúmeras composições e
combinações de fases móveis, bem como de gradientes de eluição, o método
________________________________________________________________
71
descrito na Tabela 4 foi selecionado, por resolver um total de 16 pigmentos, como
mostra o cromatograma obtido no detector de UV, na Figura 23.
Figura 23: Cromatograma dos padrões de pigmento obtido no detector de UV. Coluna C
30
,
fase móvel A-
metanol:metil-tert-butil-éter:tampão (95:3:2) e B- os mesmos
solventes (25:73:2), gradiente descrito na Tabela 3. Picos: (1) peridinina;
(2) fucoxantina; (3) neoxantina; (4) prasinoxantina; (5) violaxantina;
(6) astaxantina; (7) diadinoxantina; (8) anteraxantina; (9) aloxantina;
(10) diatoxantina; (11) luteína; (12) zeaxantina; (13) cantaxantina; (14) clorofila-
b
;
(15) clorofila-
a
e (16)
β
-caroteno.
A avaliação da eficiência de separação dos picos foi verificada
discutindo-se dois parâmetros importantes em cromatografia: k’ e α. Os valores de k’
e α estão mostrados na Tabela 13, juntamente com os tempos de retenção e
comprimentos de onda máximos (λ
max
). Uma boa seletividade da fase móvel é obtida
quando os valores de k’ são maiores que 1. Valores de α entre 0,5 e 20, indicam que
a força apropriada do solvente foi mantida (Inbaraj et al., 2006).
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
0
4000
8000
12000
16000
20000
24000
28000
16
15
14
13
12
11
10
9
8
7
6
5
4
3
1
2
Absorbance (mV)
Time (minutes)
Tempo (minutos)
Absorbância, 445nm
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
0
4000
8000
12000
16000
20000
24000
28000
16
15
14
13
12
11
10
9
8
7
6
5
4
3
1
2
Absorbance (mV)
Time (minutes)
Tempo (minutos)
Absorbância, 445nm
________________________________________________________________
72
Tabela 13: Padrões dos pigmentos analisados. Número do pico (P
n
.), Tempo de retenção
(R
t
), Comprimento de Onda Máximo
(λ
max
), Fator de separação (
α
) e de
capacidade (
k’
) (entre os picos indicados entre parêntesis).
Pigmentos P
n
R
t
(min)
λ
λλ
λ
max
(nm)
α
k’
Peridina 1 7.3 475 2.5 1.7 (1/2)
Fucoxantina 2 10.9 450 4.2 1.2 (2/3)
Neoxantina 3 12.8 435 5.1 1.2 (3/4)
Prasinoxantina 4 15.4 459 6.3 1.1 (4/5)
Violaxantina 5 17.1 438 7.1 1.3 (5/6)
Astaxantina 6 21.2 476 9.1 1.1 (6/7)
Diadinoxantina 7 22.9 445 9.9 1.2 (7/8)
Anteraxantina 8 26.5 445 11.6 1.2 (8/9)
Aloxantina 9 30.5 451 13.5 1.2 (9/10)
Diatoxantina 10 36.2 450 16.2 1.1 (10/11)
Luteína 11 38.3 445 17.2 1.0 (11/12)
Zeaxantina 12 40.1 450 18.1 1.1 (12/13)
Cantaxantina 13 44.8 474 20.3 1.1 (13/14)
Clorofila-b 14 48.9 459 22.3 1.2 (14/15)
Clorofila-a 15 56.5 420 25.9 1.2 (15/16)
β-Caroteno
16 66.8 451 30.8 -
Para determinar o potencial de maior resposta de cada pigmento no
detector eletroquímico, estes foram injetados em HPLC e avaliados em potenciais
crescentes e em corridas consecutivas. Com esses dados, foi possível construir
seus respectivos voltamogramas hidrodinâmicos, como pode ser visto na Figura 24
para β-caroteno, luteína e clorofila-a.
________________________________________________________________
73
Figura 24: Voltamogramas hidrodinâmicos de
β
-caroteno, luteína e clorofila-
a
.
Como os carotenóides e clorofilas analisados apresentaram
respostas máximas em potenciais próximos, foi padronizado +650mV na primeira
cela e +850mV na segunda. Em estudos anteriores, Ferruzzi e colaboradores
também determinaram o potencial de resposta máxima de vários carotenóides em
detector eletroquímico, pela construção de voltamogramas hidrodinâmicos (Ferruzzi
et al., 1998). Porém, obtiveram resultados diferentes, utilizando-se de um sistema de
300 400 500 600 700 800
0
100000
200000
300000
400000
500000
600000
700000
Potencial (mV)
Área do Pico
Luteína
Potencial (mV)
Área do Pico
300 400 500 600 700 800
0
100000
200000
300000
400000
500000
600000
700000
Potencial (mV)
Área do Pico
Luteína
Potencial (mV)
Área do Pico
100 200 300 400 500 600 700 800
0
100000
200000
300000
400000
500000
Área do Pico
Potencial (mV)
β
ββ
β
-caroteno
Potencial (mV)
Área do Pico
100 200 300 400 500 600 700 800
0
100000
200000
300000
400000
500000
Área do Pico
Potencial (mV)
β
ββ
β
-caroteno
Potencial (mV)
Área do Pico
300 400 500 600 700 800
0
3000000
6000000
9000000
12000000
15000000
18000000
Área do Pico
Potencial (mV)
Clorofila a
Potencial (mV)
Área do Pico
300 400 500 600 700 800
0
3000000
6000000
9000000
12000000
15000000
18000000
Área do Pico
Potencial (mV)
Clorofila
a
Potencial (mV)
Área do Pico
________________________________________________________________
74
várias celas eletroquímicas em seqüência (8, 12 ou 16 canais). Este sistema multi-
canal oferece a possibilidade da construção do voltamograma hidrodinâmico em
uma única corrida, pela passagem do eletrólito em celas com potenciais crescentes.
Contudo, a resposta máxima obtida por este sistema pode ser subestimada. Ao
analisar-se, por exemplo, o voltamograma hidrodinâmico do β-caroteno, verifica-se
que a partir de +400mV, este já é detectado, sendo que quanto mais o potencial
aumenta, maior é o seu nível de oxidação e, portanto, de detecção, até atingir o
máximo entre +600 e +700mV. Como as reações de oxidação e redução nas celas
eletrolíticas são processos irreversíveis, ao utilizar-se de um sistema com eletrodos
em série, uma determinada quantidade (x) de β-caroteno será oxidada em uma
primeira cela, sendo que a próxima irá detectar uma outra quantidade (y), que na
realidade, se não estivessem em série, seria correspondente à quantidade detectada
no primeiro mais no segundo (x+y) e assim por diante para as próximas celas.
Portanto, a resposta máxima obtida desta maneira não corresponde exatamente à
resposta máxima real. Apesar das celas conectadas em série ser de grande utilidade
para determinadas análises, deve-se avaliar caso a caso, visto que há a
possibilidade de diminuição da sensibilidade, quando os potenciais de oxidação e
redução dos analitos apresentarem valores muito próximos.
Para quantificação dos pigmentos, curvas analíticas foram
construídas injetando-se diferentes concentrações de cada substância e plotando-se
os dados obtidos em ambos detectores. Os espectros e as curvas analíticas obtidas
no detector de UV de cada padrão estudado podem ser observados nas Figura 25 a
Figura 28. Valores de exatidão e precisão inter- e intra-ensaios foram calculados
para os dois detectores, como mostra a Tabela 14, para os pigmentos
prasinoxantina, anteraxantina, diatoxantina e zeaxantina.
________________________________________________________________
75
OH
O
O
O
O
OH
O
OH
O
O
OH
O
OH
O
HO
OH
OH
O
HO
OH
Figura 25: Espectros de UV (gráficos apresentados em unidade de absorbância
versus
comprimento de onda) e curvas analíticas de peridinina, fucoxantina,
neoxantina e prasinoxantina obtidas no detector de UV (445nm).
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
0
20000
40000
60000
80000
100000
120000
140000
160000
180000
200000
Concentração (µg mL
-1
)
Absorbância
Peridinina
y= 195289,66689. x + 5705,63572
R
2
= 0,999
Absorbância (mAU)
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
0
20000
40000
60000
80000
100000
120000
140000
160000
180000
200000
Concentração (µg mL
-1
)
Absorbância
Peridinina
y= 195289,66689. x + 5705,63572
R
2
= 0,999
Absorbância (mAU)
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6
0
100000
200000
300000
400000
500000
600000
700000
Absorbância
Concentração (µg mL
-1
)
Fucoxantina
y= 464808,00629. x - 1900,78261
R
2
= 0,99495
Absorbância (mAU)
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6
0
100000
200000
300000
400000
500000
600000
700000
Absorbância
Concentração (µg mL
-1
)
Fucoxantina
y= 464808,00629. x - 1900,78261
R
2
= 0,99495
Absorbância (mAU)
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2
0
50000
100000
150000
200000
250000
300000
350000
Absorbância
Concentração (
µ
g mL
-1
)
Neoxantina
y= 296095,29809. x + 2494,02439
R
2
= 0,9976
Absorbância (mAU)
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2
0
50000
100000
150000
200000
250000
300000
350000
Absorbância
Concentração (
µ
g mL
-1
)
Neoxantina
y= 296095,29809. x + 2494,02439
R
2
= 0,9976
Absorbância (mAU)
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4
0
100000
200000
300000
400000
500000
600000
Absorbância
Concentração (
µ
g mL
-1
)
Prasinoxantina
y= 467001,12336. x - 2083,53049
R
2
= 0,99908
Absorbância (mAU)
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4
0
100000
200000
300000
400000
500000
600000
Absorbância
Concentração (
µ
g mL
-1
)
Prasinoxantina
y= 467001,12336. x - 2083,53049
R
2
= 0,99908
Absorbância (mAU)
________________________________________________________________
76
OH
HO
O
O
OH
O
HO
O
HO
O
OH
N N
N
Mg
N
O
C
O
O
Figura 26: Espectros de UV (gráficos apresentados em unidade de absorbância
versus
comprimento de onda) e curvas analíticas de violaxantina, astaxantina,
diadinoxantina e clorofila
a
obtidas no detector de UV (445nm).
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
0
100000
200000
300000
400000
500000
Absorbância
Concentração (µg mL
-1
)
Violaxantina
y= 496339,14947. x - 863,91549
R
2
= 0,99178
Absorbância (mAU)
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
0
100000
200000
300000
400000
500000
Absorbância
Concentração (µg mL
-1
)
Violaxantina
y= 496339,14947. x - 863,91549
R
2
= 0,99178
Absorbância (mAU)
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
0
10000
20000
30000
40000
50000
60000
70000
Absorbância
Concentração (
µ
g mL
-1
)
Astaxantina
y= 68068. x + 1004,66667
R
2
= 0,99786
Absorbância (mAU)
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
0
10000
20000
30000
40000
50000
60000
70000
Absorbância
Concentração (
µ
g mL
-1
)
Astaxantina
y= 68068. x + 1004,66667
R
2
= 0,99786
Absorbância (mAU)
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2
0
100000
200000
300000
400000
500000
600000
700000
800000
900000
Diadinoxantina
y= 666275,36585. x + 13068,36585
R
2
= 0,99711
Concentração (
µ
g mL
-1
)
Absorbância
Absorbância (mAU)
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2
0
100000
200000
300000
400000
500000
600000
700000
800000
900000
Diadinoxantina
y= 666275,36585. x + 13068,36585
R
2
= 0,99711
Concentração (
µ
g mL
-1
)
Absorbância
Absorbância (mAU)
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
0
5000
10000
15000
20000
25000
Concentração (µg mL
-1
)
Absorbância
Clorofila a
y= 25832,53182. x - 4858,61245
R
2
= 0,98091
Absorbância (mAU)
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
0
5000
10000
15000
20000
25000
Concentração (µg mL
-1
)
Absorbância
Clorofila a
y= 25832,53182. x - 4858,61245
R
2
= 0,98091
Absorbância (mAU)
________________________________________________________________
77
OH
HO
HO
OH
OH
HO
N N
N
Mg
N
O
C
O
O
O H
Figura 27: Espectros de UV (gráficos apresentados em unidade de absorbância
versus
comprimento de onda) e curvas analíticas de aloxantina, diatoxantina,
luteína e clorofila
b
obtidas no detector de UV (445nm).
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2
0
100000
200000
300000
400000
500000
600000
700000
800000
Aloxantina
y= 746031,73257. x - 12495,56098
R
2
= 0,9967
Concentração (µg mL
-1
)
Absorbância (mAU)
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2
0
100000
200000
300000
400000
500000
600000
700000
800000
Aloxantina
y= 746031,73257. x - 12495,56098
R
2
= 0,9967
Concentração (µg mL
-1
)
Absorbância (mAU)
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
0
50000
100000
150000
200000
250000
300000
350000
400000
450000
Concentração (
µ
g mL
-1
)
Diatoxantina
y= 450735,51986. x - 1748,60976
R
2
= 0,99848
Absorbância
Absorbância (mAU)
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5
0
200000
400000
600000
800000
1000000
1200000
1400000
1600000
Absorbância
Concentração (µg mL
-1
)
Luteína
y= 474159,49219. x - 26137,67419
R
2
= 0,9986
Absorbância (mAU)
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5
0
200000
400000
600000
800000
1000000
1200000
1400000
1600000
Absorbância
Concentração (µg mL
-1
)
Luteína
y= 474159,49219. x - 26137,67419
R
2
= 0,9986
Absorbância (mAU)
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
0
10000
20000
30000
40000
50000
60000
Concentração (
µ
g mL
-1
)
Absorbância
Clorofila b
y= 56795,09587. x - 283,16734
R
2
= 0,99882
Absorbância (mAU)
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
0
10000
20000
30000
40000
50000
60000
Concentração (
µ
g mL
-1
)
Absorbância
Clorofila b
y= 56795,09587. x - 283,16734
R
2
= 0,99882
Absorbância (mAU)
________________________________________________________________
78
OH
HO
O
O
OH
HO
O
Figura 28: Espectros de UV (gráficos apresentados em unidade de absorbância
versus
comprimento de onda) e curvas analíticas de zeaxantina, cantaxantina,
anteraxantina e
β
-caroteno
obtidas no detector de UV (445nm).
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2
0
100000
200000
300000
400000
500000
600000
Absorbância
Zeaxantina
y= 505170,36181. x - 17888,63415
R
2
= 0,99927
Concentração (µg mL
-1
)
Absorbância (mAU)
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2
0
100000
200000
300000
400000
500000
600000
Absorbância
Zeaxantina
y= 505170,36181. x - 17888,63415
R
2
= 0,99927
Concentração (µg mL
-1
)
Absorbância (mAU)
0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6
0
50000
100000
150000
200000
250000
Concentração (µg mL
-1
)
Cantaxantina
y= 417669,53183. x - 1315,36585
R
2
= 0,99959
Absorbância
Absorbância (mAU)
0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6
0
50000
100000
150000
200000
250000
Concentração (µg mL
-1
)
Cantaxantina
y= 417669,53183. x - 1315,36585
R
2
= 0,99959
Absorbância
Absorbância (mAU)
0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7
0
50000
100000
150000
200000
250000
300000
350000
Absorbância
Concentração (
µ
g mL
-1
)
Anteraxantina
y= 544619,70732. x + 279,65854
R
2
= 0,99935
Absorbância (mAU)
0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7
0
50000
100000
150000
200000
250000
300000
350000
Absorbância
Concentração (
µ
g mL
-1
)
Anteraxantina
y= 544619,70732. x + 279,65854
R
2
= 0,99935
Absorbância (mAU)
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
0
20000
40000
60000
80000
100000
120000
140000
160000
180000
200000
Concentração (µg mL
-1
)
Absorbância
β
ββ
β
-caroteno
y= 189975,16729. x - 3179,20446
R
2
= 0,99963
Absorbância (mAU)
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
0
20000
40000
60000
80000
100000
120000
140000
160000
180000
200000
Concentração (µg mL
-1
)
Absorbância
β
ββ
β
-caroteno
y= 189975,16729. x - 3179,20446
R
2
= 0,99963
Absorbância (mAU)
________________________________________________________________
79
Tabela 14: Valores de precisão e exatidão intra- e inter-ensaios (n=5) obtidos nos
detectores de UV (445nm) e EC (+650mV).
445 nm +650mV
Precisão (%) Exatidão (%) Precisão (%) Exatidão (%)
Intra- Inter- Intra- Inter- Intra- Inter- Intra- Inter-
Prasinoxantina
3,1 2,5 1,3 1,1 10,8 10,4 1,5 0,9
Anteraxantina 3,2 4,5 0,4 0,4 8,4 7,1 0,4 0,4
Diatoxantina 4,4 3,9 1,1 0,8 9,7 2,1 0,7 0,8
Zeaxantina 5,1 3,8 1,3 1,2 16,6 1,8 5,8 1,2
Comparando-se os resultados apresentados, é possível concluir que
quando os padrões foram analisados pelo detector de UV, o método mostrou-se
mais preciso e mais exato que quando analisado pelo EC. Apesar do detector EC
ser geralmente mais sensível, este grupo de moléculas apresenta grande absorção
no UV, decorrente da extensa cadeia de duplas ligações conjugadas, o que explica a
maior sensibilidade quando utilizado o UV como detector. Além disso, o EC é muito
sensível a variações na fase móvel, principalmente quando voltagens mais altas são
aplicadas (Wang & Russell, 1999).
4.3.1.2. Análise Quantitativa e Qualitativa de Pigmentos nas Algas
Depois de padronizada a metodologia, os pigmentos das algas G.
domingensis, G. birdiae, H. spinella e K. alvarezii foram extraídos e analisados. As
Figura 29, Figura 30, Figura 31 e Figura 32 mostram o perfil cromatográfico de cada
alga, bem como os espectros de UV dos seus picos. Os picos identificados foram
enumerados de acordo com a Tabela 13 e os não identificados foram nomeados
com letras.
________________________________________________________________
80
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70
0
20000
40000
60000
80000
100000
120000
140000
160000
180000
200000
15
8
16
Tempo (minutos)
Absorbância (mAU), 445nm
9
5
12
Gracilaria birdiae
400 500 600 700 800
0
3000
6000
9000
12000
15000
Absorbância (mAU)
comprimento de onda (nm)
5- Violaxantina
17,26 min
400 500 600 700 800
0
15000
30000
45000
60000
comprimento de onda (nm)
Absorbância (mAU)
8- Anteraxantina
26,4 min
400 500 600 700 800
0
1000
2000
3000
4000
5000
comprimento de onda (nm)
Absorbância (mAU)
9- Aloxantina
30,1 min
400 500 600 700 800
0
12000
24000
36000
48000
comprimento de onda (nm)
Absorbância (mAU)
12- Zeaxantina
39,4 min
400 500 600 700 800
0
100000
200000
300000
400000
comprimento de onda (nm)
Absorbância (mAU)
15- Clorofila a
56,3 min
400 500 600 700 800
0
30000
60000
90000
120000
comprimento de onda (nm)
Absorbância (mAU)
β
16- -caroteno
66,9 min
Figura 29:
Perfil cromatográfico dos pigmentos da alga
G. birdiae
e espectros de UV
(gráficos apresentados em unidade de absorbância
versus
comprimento de onda)
dos picos (Tabela 13)
.
Coluna C
30
, fase móvel A-
metanol:metil-tert-butil-
éter:tampão (95:3:2) e B- os mesmos solventes (25:73:2), gradiente descrito na
Tabela 3.
________________________________________________________________
81
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70
0
20000
40000
60000
80000
100000
120000
140000
160000
180000
16
15
12
5
8
Absorbância (mAU), 445nm
Tempo (minutos)
Gracilaria dominguensis
400 500 600 700 800
-1000
0
1000
2000
3000
Comprimento de onda (nm)
Absorbância (mAU)
5- Violaxantina
17,6 min
400 500 600 700 800
0
5000
10000
15000
20000
25000
Comprimento de onda (nm)
Absorbância (mAU)
8- Anteraxantina
26,9 min
400 500 600 700 800
0
8000
16000
24000
32000
Comprimento de onda (nm)
Absorbância (mAU)
12- Zeaxantina
39,8 min
400 500 600 700 800
0
80000
160000
240000
320000
Comprimento de onda (nm)
Absorbância (mAU)
15- Clorofila a
56,4 min
400 500 600 700 800
0
30000
60000
90000
120000
Comprimento de onda (nm)
Absorbância (mAU)
β
16- -caroteno
66,9 min
Figura 30:
Perfil cromatográfico dos pigmentos da alga
G. domingensis
e espectros de UV
dos picos (Tabela 13)
.
Coluna C
30
, fase móvel A-
metanol:metil-tert-butil-
éter:tampão (95:3:2) e B- os mesmos solventes (25:73:2), gradiente descrito na
Tabela 3.
________________________________________________________________
82
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70
0
2000
4000
6000
8000
10000
12000
Tempo (minutos)
Absorbância (mAU), 445nm
8
12
15
16
Kappaphyccus alvarezii
400 500 600 700 800
-500
0
500
1000
1500
Absorbância (mAU)
Comprimento de onda (nm)
8- Anteraxantina
26,2 min
400 500 600 700 800
0
2000
4000
6000
8000
10000
12000
Comprimento de onda (nm)
Absorbância (mAU)
12- Zeaxantina
39,0 min
400 500 600 700 800
0
7000
14000
21000
28000
35000
Comprimento de onda (nm)
Absorbância (mAU)
15- Clorofila a
56,7 min
400 500 600 700 800
0
5000
10000
15000
Comprimento de onda (nm)
Absorbância (mAU)
β
16- -caroteno
66,9 min
Figura 31:
Perfil cromatográfico dos pigmentos da alga
K. alvarezii
e espectros de UV dos
picos (Tabela 13). Coluna C
30
, fase móvel A-
metanol:metil-tert-butil-éter:tampão
(95:3:2) e B- os mesmos solventes (25:73:2), gradiente descrito na Tabela 3.
________________________________________________________________
83
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70
0
30000
60000
90000
120000
150000
180000
210000
240000
270000
300000
330000
16
15
11
Absorbância (mAU), 445nm
Tempo (minutos)
Hypnea spinella
400 500 600 700 800
0
1000
2000
3000
Absorbância (mAU)
Comprimento de onda (nm)
11- Luteína
38,6 min
400 500 600 700 800
0
15000
30000
45000
60000
75000
90000
Comprimento de onda (nm)
Absorbância (mAU)
15- Clorofila a
56,4 min
400 500 600 700 800
0
5000
10000
15000
Comprimento de onda (nm)
Absorbância (mAU)
β
16- -caroteno
66,9 min
Figura 32:
Perfil cromatográfico dos pigmentos da alga
H. spinella
e espectros de UV dos
picos (Tabela 13)
.
Coluna C
30
, fase móvel A-
metanol:metil-tert-butil-éter:tampão
(95:3:2) e B- os mesmos solventes (25:73:2), gradiente descrito na Tabela 3.
Os pigmentos identificados foram então quantificados, como mostra a
Tabela 15.
Em trabalho recente, foram identificados e calculados a porcentagem dos
carotenóides em relação à quantidade de carotenóides total, das algas G. birdiae, G.
domingensis e K. alvarezii, como pode ser visto na Tabela 16 (Andersson et al.,
2006).
________________________________________________________________
84
Tabela 15:
Quantificação dos pigmentos (
µ
g/mg de alga seca) identificados nas algas
G.
birdiae, G. domingensis, K. alvarezii
e
H. spinella
.
Pigmentos P
n
G. birdiae
G. domingensis
K. alvarezii H. spinella
Violaxantina 5 0,044 0,021 nd nd
Anteraxantina
8 5,031 0,224 0,007 nd
Aloxantina 9 0,09 0,01 nd nd
Luteína 11 nd nd nd 6,868
Zeaxantina 12 0,445 0,249 0,119 nd
Cantaxantina 13 nd nd nd nd
Clorofila-a 15 10,537 9,869 4,332 5,127
β-Caroteno
16 0,365 0,166 0,186 4,415
nd: não determinado
Tabela 16:
Dados da literatura para os pigmentos das algas
G. birdiae, G. domingensis
e
K.
alvarezii
(Andersson et al., 2006).
Pigmentos
G. birdiae
G. domingensis
K. alvarezii
Violaxantina 5-25% 1-5% nd
Anteraxantina
> 25% > 25% nd
Luteína nd nd 5-25%
Zeaxantina 5-25% 1-5% 5-25%
Criptoxantina 1-5% 1-5% nd
α-Caroteno
nd nd 1-5%
β-Caroteno
5-25% 5-25% 5-25%
nd: não determinado
É possível verificar algumas diferenças dos dados obtidos neste trabalho,
com dados encontrados na literatura (Andersson et al., 2006). Algumas diferenças
são explicadas pelos diversos parâmetros que podem variar as análises quanti e
qualitativas dos carotenóides como a linhagem estudada, a época e a hora de
coleta, bem como o tecido analisado, entre outros. Além disso, no trabalho de
Andersson e colaboradores, foram calculados valores de porcentagens, que no caso
das análises de UV não é totalmente real, pois desconsidera a diferença de
absortividade molar de cada substância.
________________________________________________________________
85
4.3.2. Cromatografia Gasosa
A presença de carotenóides e a relativa baixa atividade antioxidante das
frações apolares sugerem uma alta concentração de outras moléculas. A fim de
avaliar-se esta hipótese, os extratos hexânicos das algas foram fracionados e, além
disso, novos extratos foram feitos para análise de seus ácidos graxos e esteróides
por GC-FID e GC-MS.
4.3.2.1. Análise de Ácidos Graxos
Os ácidos graxos das algas foram analisados por GC-MS. Essas
análises possibilitaram além da identificação por comparação com os tempos de
retenção dos padrões, identificação de outros compostos por comparação dos seus
espectros (MS/MS) com espectros de bibliotecas.
O cromatograma dos padrões de ácidos graxos metilados injetados
em GC-MS está ilustrado na Figura 33 e o perfil cromatográfico dos extratos em
diclorometano das algas, na Figura 34.
As porcentagens dos ácidos graxos para cada alga, identificados por
ambas ferramentas disponíveis encontram-se na Tabela 17.
________________________________________________________________
86
8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32
0
500000
1000000
1500000
2000000
2500000
3000000
∆
∆∆
∆
∆
∆∆
∆
∆
∆∆
∆
∆
∆∆
∆
∆
∆∆
∆
C22:6 4,7,10,13,16,19
C20:5 5,8,11,14,17
C18:3 9,12,15
C18:2 9,12
C18:1 9
C18
C17
C16
C15
C14
C12
Intensidade
Tempo (min)
Figura 33:
Cromatograma dos padrões dos ácidos graxos metilados injetados em GC-MS.
8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32
0
5
10
15
20
25
30
35
K. alvarezii
H. spinella
G. birdiae
G. domingensis
Intensidade (.10
6
)
Tempo (minutos)
Figura 34:
Cromatogramas em GC-MS dos extratos em diclorometano das algas
K.
alvarezii, H. spinella, G. birdiae
e
G. domingensis.
________________________________________________________________
87
Tabela 17:
Porcentagem de ácidos graxos das algas
K. alvarezii
(K.a.),
H. spinella
(H.s.),
G.
birdiae
(G.b.) e
G. domingensis
(G.d.). Os tempos de retenção (Rt) e os índices
de similaridade (Sim.) dados pelas bibliotecas (%) quando não injetado o padrão,
foram semelhantes para todas as algas analisadas.
%
Rt Sim
.
Ácidos Graxos
K.a. H.s. G.b. G.d.
7,36
-
Láurico (C12)
nd
nd
0,13
nd
8,63
-
Mirístico (C14) 2,16 6,02 3,55 4,43
9,45
-
Pentadecanóico (C15)
0,95 2,61 1,03 2,68
10,52
-
Palmítico (C16)
13,67
28,94
10,75
29,98
10,77
91
Palmitoléico (C16:1 ∆7)
1,29
nd
0,18 2,88
10,84
97
Palmitoléico (C16:1 ∆9)
2,02 28,68
0,67 4,70
11,04
90
Palmitoléico (C16:1 ∆11)
21,14
1,60 0,06 2,80
11,83
-
Margárico (C17)
0,95
nd
0,80
nd
12,63
90 Ciclopentaniltridecanóico
15,60
1,03
nd
9,10
13,53
-
Esteárico (C18)
2,51 2,03 1,94 1,91
13,93
-
Oléico (C18:1 ∆9)
7,61 11,40
12,88
14,00
14,04
96
Octadecenóico (C18:1 ∆11)
3,50 2,26 2,77 2,10
14,27
96
Octadecenóico (C18:1 ∆13)
3,64
nd
nd
nd
14,73
-
Linoléico (C18:2 ∆9,12)
0,88 1,46 1,43
nd
15,28
89
Octadecatrienóico (C18:3 ∆6,9,12)
0,45 0,37 0,22
nd
15,87
-
Linolênico (C18:3 ∆9,12,15)
0,16
nd
0,24 1,40
17,03
94 Eicosanóico(C20)
0,35 0,14 0,13 0,66
17,40
94
Eicosenóico (C20:1 ∆11)
1,03 0,14 0,51 0,47
18,23
96
Eicosadienóico (C20:2 ∆11,13)
0,27 0,20 2,16 0,82
18,72
92
Eicosatrienóico (C20:3 ∆6,9,12)
1,50 1,29 5,90 2,76
19,17
94
Araquidônico (C20:4 ∆5,8,11,14)
6,15 4,58 52,86
13,26
20,48
-
Eicosapentenóico (C20:5 ∆5,8,11,14,17)
4,05 6,91 0,31 0,39
20,65
93 Docosanóico (C22)
0,23 0,23 0,38 0,27
21,14
91
Docosenóico (C22:1, ∆13)
0,41 0,20 0,11 0,58
23,03
83 Tricosanóico (C23)
nd
nd
0,22
nd
25,99
92 Lignocérico (C24)
0,41 0,23 0,31 0,54
-
: confirmado pelo tempo de retenção do padrão, além da biblioteca.
nd
: não detectável.
Nestas análises foi possível separar e identificar inúmeros ácidos
graxos, inclusive alguns isômeros, como os do ácido octadecenóico, diferenciando-
se as posições de suas duplas (∆9, 11 ou 3). Além disso, foi observada a presença
de outras moléculas apolares como hidrocarbonetos, aldeídos, cetonas e álcoois,
alguns dos quais em grande concentração, como o fitol, que foi encontrado como o
________________________________________________________________
88
pico majoritário de algumas das algas. Destaca-se ainda a presença de moléculas
halogenadas e do esqualeno em todas as algas analisadas.
As algas são organismos muito ricos em ácidos graxos. Vários
trabalhos na literatura descrevem a composição desses metabólitos primários
nesses organismos (Apt & Behrens, 1999; Cardozo et al., 2002; Sanina et al., 2004;
Arendt et al., 2005). É discutido ainda, porém com muitas críticas, que o perfil de
ácidos graxos pode ser utilizado como um agente quimiotaxonômico para a
identificação de algas pardas, vermelhas e verdes (Xu et al., 1998; Dawczynski et
al., 2007). Um estudo comparativo entre algas dessas três divisões verificou a
predominância de ácidos graxos saturados nas vermelhas, enquanto que as pardas
analisadas foram as mais ricas em insaturados (Sanchez-Machado et al., 2004). Em
nossas análises, foi possível observar predominância de ácidos graxos insaturados
na maioria das algas vermelhas estudadas, sendo a proporção de saturados para
insaturados de 2:3, 2:3, 1:4 e 1:1 para K. alvarezii, H. spinella, G. birdiae e G.
domingensis, respectivamente.
O ácido palmítico (C16) foi encontrado como um dos majoritários (12
a 30%) em todas as algas, o que corrobora com resultados encontrados na literatura
para outras macroalgas vermelhas (Dawczynski et al., 2007). Altos teores do ácido
araquidônico (C20:4 ∆5,8,11,14), um ácido graxo essencial que compõe a família
dos ω-6 já foram descritos para algumas espécies de Gracilaria (46 a 62%)
(Khotimchenko, 2005). Nas duas espécies de Gracilaria estudadas neste trabalho,
uma delas, a G. birdiae, apresentou este ácido graxo em grande quantidade (52%),
enquanto que G. domingensis, apesar de coletada nas mesmas condições, continha
apenas 13%. Destaca-se ainda a presença de ácidos que compõe a família dos ω-3
e 9, alguns dos quais, em quantidades relevantes como o ácido oléico (C18:1 ∆9)
________________________________________________________________
89
presente como 7 a 14% do total de ácidos graxos analisados e o eicosapentenóico
(C20:5 ∆5,8,11,14,17) como 6 a 7% do total em K. alvarezii e H. spinella.
Em trabalho recente, Fayaz e colaboradores descreveram a
composição dos ácidos graxos de K. Alvarezii e encontraram a relação de 37% de
ácidos graxos saturados para 44,5% de insaturados, semelhante aos resultados
desta pesquisa. Porém, o ácido graxo de maior abundância no trabalho de Fayaz e
colaboradores foi o heptadecanóico (C17:1), enquanto no trabalho atual, identificou-
se o palmitoléico (C16:1 ∆11) como o majoritário (Fayaz et al., 2005). Dois ácidos
graxos por Fayaz e colaboradores identificados não foram encontrados nestas
análises (C14:1 e C15:1). Por outro lado, o presente método resultou na
caracterização de 25 ácidos graxos. Resultados divergentes são explicados pela
utilização de metodologias de extração e separação diferentes, além de outras
variáveis como a linhagem de K. alvarezii utilizada para os estudos, a temperatura e
a composição do meio onde a alga estava sendo cultivada, sua fase de crescimento,
entre outros (Floreto et al., 1993; Sanina et al., 2004).
4.3.2.2. Análise de Esteróides
O subseqüente fracionamento do extrato hexânico de K. alvarezii
resultou em sólido branco que foi ressuspendido em clorofórmio deuterado para
obtenção dos espectros de RMN de
1
H e
13
C, como mostra as Figura 35 e Figura 36.
A análise de
1
H revelou a presença de um dubleto largo em 5,34 ppm provavelmente
relativo a um sistema insaturado, um multipleto em 3,54 ppm relativo a hidrogênio
carbinólico, e sinais de 5 metilas, além de vários outros sinais relativos a grupos
metilênicos e metínicos de cadeia alifática ou cíclica (Figura 35). Estes sinais
característicos sugerem a ocorrência de esteróides, dado este suportado pela
________________________________________________________________
90
literatura (Bultel-Ponce et al., 2002). A análise comparativa de
13
C dos dados do
colesterol da literatura e da substância isolada (Figura 36 e Tabela 18) confirmam a
estrutura como sendo o colesterol (Figura 37) (Silverstein et al., 1991).
0.1005
1.0000
0.9294
2.1006
0.6268
0.4213
1.2512
3.1996
0.9660
2.8292
1.1069
1.0270
0.2907
5.2305
10.482
2.9138
0.0185
Integral
7.2667
5.3601
5.3337
3.6004
3.5719
3.5478
3.5192
3.4951
3.4732
3.4644
3.4447
2.2840
2.2621
2.2313
2.1545
2.0405
2.0251
1.9966
1.9812
1.9637
1.9242
1.8671
1.8145
1.7486
1.5841
1.5490
1.5314
1.5161
1.4108
1.3603
1.3340
1.3208
1.2835
1.2550
1.1277
1.1190
1.1080
1.0817
1.0575
1.0049
0.9281
0.8952
0.8798
0.8469
0.6758
0.0702
-0.0000
(ppm)
-0.50.00.51.01.52.02.53.03.54.04.55.05.56.06.57.07.58.08.59.0
Figura 35:
RMN
1
H (200MHz) do sólido branco obtido após fracionamento do extrato
hexânico de
K. alvarezii.
ppm
________________________________________________________________
91
140.7353
121.7196
121.6377
77.6229
77.0000
76.3607
71.7379
56.7221
56.1155
50.0830
42.2800
39.7391
39.4768
37.2146
36.4605
36.1491
35.7556
31.8542
31.5919
28.1985
27.9691
24.2479
23.7889
22.7889
22.5266
21.0349
19.3956
19.3136
18.6907
11.8549
11.7729
(ppm)
0102030405060708090100110120130140
Figura 36:
RMN
13
C do sólido branco obtido após fracionamento do extrato hexânico de
K.
alvarezii.
Tabela 18:
Dados da literatura e experimentais de RMN
13
C do colesterol isolado de
K.
alvarezii
.
C
Experimental Literatura C
Experimental Literatura
1 37,2 37,5 15
24,2 24,3
2 31,6 31,6 16
39,7 40,0
3 71,7 71,3 17
56,1 56,5
4 42,3 42,4 18
11,8 12,0
5 140,7 141,2 19
19,3 19,4
6 121,7 121,3 20
35,7 35,8
7 31,9 32,0 21
18,7 18,8
8 31,9 32,2 22
36,2 36,4
9 50,1 50,5 23
23,8 24,1
10
36,4 36,5 24
39,5 39,6
11
21,0 21,2 25
28,0 28,0
12
28,2 28,3 26
22,5 22,5
13
42,3 42,4 27
22,8 22,8
14
56,7 56,9
ppm
________________________________________________________________
92
Figura 37:
Estrutura química do colesterol.
Essa mesma amostra, caracterizada como colesterol pelos métodos
anteriores, foi analisada também por GC-MS no método descrito para esteróides
(item 3.4.2.2), obtendo-se dois únicos picos no espectro (Figura 38). Esses dados
foram comparados com os dados contidos nas bibliotecas de GC-MS. O pico
majoritário correspondeu ao colesterol, com índice de similaridade de 99% e o pico
minoritário pode ser o esteróide 4,6-colestadien-3β-ol, porém, neste caso não é
possível afirmar com total segurança pelo índice de similaridade obtido (85%) entre
os espectros MS/MS da molécula analisada e os da biblioteca.
A presença de colesterol e dehidrocolesterol como esteróides
predominantes de quatro espécies diferentes de Hypea foi anteriormente relatada
(Afaqhusain et al., 1992). Outros estudos já mostraram também que o colesterol está
presente em maior concentração nas algas vermelhas, quando comparado às
pardas e verdes (2 a 76% da mistura total de esteróides) (Kamenarska et al., 2003).
HO
H
H
H
1
2
3
4
5
7
6
8
9
10
11
12
13
17
15
16
14
18
19
21
20
22
23
24
25
26
27
________________________________________________________________
93
Figura 38:
GC-MS da fração do extrato hexânico de
K. alvarezii
, que se refere ao colesterol
(pico 2) e seu derivado (pico 1).
Depois de identificado este esteróide, novas análises qualitativas
foram realizadas, para determinação de outros nas algas K. alvarezii e H. spinella.
Como padrão interno para cálculos de retenção relativa utilizou-se do 5α-colestane.
Os padrões de esteróides disponíveis, campesterol, estigmasterol e β-sitosterol,
também foram injetados. (Figura 39).
Nessas condições experimentais foi possível verificar que os
esteróides estigmasterol e β-sitosterol estão presentes em H. spinella, e apenas o
estigmasterol em K. alvarezii (Figura 40).
Tempo (minutos)
Intensidade
Tempo (minutos)
Intensidade
________________________________________________________________
94
Figura 39:
Cromatograma em GC-FID dos padrões de esteróides disponíveis. O padrão
interno utilizado foi o 5
α
-colestane.
K. alvarezii
H. spinella
Figura 40:
Cromatogramas CG-MS dos esteróides das algas. O padrão interno utilizado foi
o 5
α
-colestane.
Padrão Interno
Campesterol
Estigmasterol
Sitosterol
Padrão Interno
Campesterol
Estigmasterol
Sitosterol
Intensidade
Tempo (minutos)
Padrão Interno
Estigmasterol
Sitosterol
Padrão Interno
Estigmasterol
Sitosterol
Tempo (minutos)
Tempo (minutos)
Intensidade
Intensidade
________________________________________________________________
95
Recentemente, três moléculas diferentes (Figura 41, A-C) foram
encontradas em Hypnea musciformis, sendo uma delas inédita e com atividade anti-
elastase quando testada em elastase de pâncreas de porco (Bultel-Ponce et al.,
2002). Trabalhos mais antigos também descrevem a presença dessa classe de
compostos em rodófitas (Morisaki et al., 1976; Palermo et al., 1990).
Figura 41:
Esteróides extraídos de
H. musciformis(Bultel-Ponce et al., 2002) .
A) 20-hidroxi-
colest-4,22-dieno-3,6-diona; B) 6
α
-hidroxi-colest-4-eno-3-ona; C) 6
α
-hidroxi-
colest-4,22-dieno-3-ona.
4.4. Estudo dos Polienos por Espectrometria de Massas
Dentre as inúmeras técnicas utilizadas para análise quantitativa e qualitativa de
moléculas de diferentes naturezas, a espectrometria de massas vem ganhando
espaço. Em recente artigo de revisão é apresentada a sistematização, por áreas de
aplicação, dos artigos publicados entre 1993 a 2003 (5.000 artigos), mostrando o
enorme campo para pesquisa empregando a espectrometria de massas na análise
de matrizes complexas, biologicamente ativas (Figura 42) (Crotti et al., 2006).
O
O
OH
H
H
H
A)
O
O
OH
H
H
H
A)
O
OH
H
H
H
B)
O
OH
H
H
H
B)
O
OH
H
H
H
C)
O
OH
H
H
H
C)
________________________________________________________________
96
17
38%
12
5%
15
2%
16
2%
10
9%
9
2%
6
3%
7
1%
5
3%
4
5%
3
3%
2
4%
1
3%
8
3%
14
2%
13
4%
11
11%
Figura 42:
Utilização da espectrometria de massas por área do conhecimento. (1) Química
Inorgânica, (2) Análise ambiental, (3) Química de alimentos, (4) Química de fase
gasosa, (5) Estudos sobre metabolismo, (6) Toxicologia, (7) Polímeros, (8)
Técnicas acopladas, (9) Microorganismos, (10) Peptídeos, (11) Proteínas, (12)
Biomoléculas, (13) Genética, (14) Síntese orgânica, (15) Análises clínicas, (16)
Produtos naturais, (17) Outras aplicações. Figura retirada, com autorização dos
autores (Crotti
et al.
, 2006).
Esta técnica apresenta como grande vantagem a alta sensibilidade e curto
tempo de análise, aliado ao fato de fornecer importantes informações sobre a
estrutura e a composição do analito, mesmo a partir de quantidades muito reduzidas
de amostra (da ordem de 10
-9
g).
Apesar da espectrometria de massas datar do início do século XX, com os
prêmios Nobel de Joseph John Thomson, particularmente a análise de carotenóides
por esta técnica começou a surgir timidamente na literatura em meados da década
de 1970. Com o desenvolvimento de métodos de ionização mais brandos e maior
popularização da técnica, os trabalhos envolvendo análises de carotenóides por
espectrometria de massas têm aumentado exponencialmente (dados retirados da
base de dados Web of Science, <www.isiknowledge.com>, com os termos
“carotenoids and mass spectrometry”, em 17 de janeiro de 2008).
________________________________________________________________
97
É necessário destacar que ao descrever espectrometria de massas, deve-se
considerar os diferentes passos percorridos pelo analito, principalmente os métodos
de ionização e separação dos íons (analisador), como mostra a Figura 43.
Figura 43:
Componentes de um espectrômetro de massas e os possíveis métodos de
ionização e separação dos íons.
Dentre os métodos de ionização utilizados para análise de carotenóides, o
APCI (Atmospheric Pressure Chemical Ionisation) é um dos mais citados. Este é um
método no qual há transferência de carga por um gás reagente sob condições de
pressão atmosférica, sendo possível a análise de substâncias termicamente
instáveis. A solução do analito é introduzida em um nebulizador e dessolvatada em
um tubo de quartzo aquecido antes de interagir com a corona de descarga, onde os
íons serão gerados (Figura 44) (Prakash et al., 2007).
Entretanto, este método tem como principal desvantagem a necessidade de
alto fluxo de solvente e conseqüentemente, de maior quantidade de amostra, o que
pode ser um fator limitante para o seu uso em alguns casos. Por outro lado, a
ionização por ElectroSpray (ESI) não possui esta desvantagem e seu uso nas
análises de carotenóides é crescente, possibilitado pelos mecanismos de reações
em fase gasosa que têm sido elucidados (Guaratini et al., 2004).
Analisador
Analisador
Separação
dos íons
Detector
Detector
Detecção
dos íons
Manipulação
dos dados
Fonte
Fonte
Ionização
Introdução
da amostra
Saída dos
dados
Espectro de massas
Sistema
de dados
•EI
•CI
•ESI
•APCI
•MALDI
•Quadrupolo
•Ion Trap
•TOF
•FT
Analisador
Analisador
Separação
dos íons
Detector
Detector
Detecção
dos íons
Manipulação
dos dados
Fonte
Fonte
Ionização
Introdução
da amostra
Saída dos
dados
Espectro de massas
Sistema
de dados
•EI
•CI
•ESI
•APCI
•MALDI
•Quadrupolo
•Ion Trap
•TOF
•FT
Analisador
Analisador
Separação
dos íons
Detector
Detector
Detecção
dos íons
Manipulação
dos dados
Fonte
Fonte
Ionização
Introdução
da amostra
Saída dos
dados
Espectro de massas
Sistema
de dados
•EI
•CI
•ESI
•APCI
•MALDI
•Quadrupolo
•Ion Trap
•TOF
•FT
Analisador
Analisador
Separação
dos íons
Detector
Detector
Detecção
dos íons
Manipulação
dos dados
Fonte
Fonte
Ionização
Introdução
da amostra
Saída dos
dados
Espectro de massas
Sistema
de dados
•EI
•CI
•ESI
•APCI
•MALDI
•Quadrupolo
•Ion Trap
•TOF
•FT
________________________________________________________________
98
Figura 44:
Componentes da fonte de APCI. Figura fornecida pelo autor (Gates, 2004).
ESI é uma técnica de ionização semelhante a APCI por ocorrer em pressão
atmosférica, mas neste caso, a diferença de potencial entre o capilar e o cone, com
uma rápida, porém delicada dessolvatação é que provoca a ionização do analito, de
maneira análoga a uma célula eletrolítica (Figura 45) (Crotti et al., 2006).
Figura 45:
Componentes da fonte de ESI. Figura fornecida pelo autor (Gates, 2004).
Este tipo de ionização é considerado uma ionização branda, restando uma
parcela pequena de energia residual no íon formado, característica interessante em
________________________________________________________________
99
análises biológicas, por manter a intensidade do íon precursor relativamente alta. Em
contrapartida, a desvantagem deste método é a baixa fragmentação produzida.
Porém, sistemas hifenados (MS/MS) resolvem este problema por fragmentarem o
íon precursor em uma célula de colisão após o choque com um gás inerte (CO
2
, Ar,
N
2
). Esta transferência leva, portanto, a uma fragmentação que possibilita o emprego
em determinação estrutural (Crotti et al., 2006; Prakash et al., 2007).
Apesar da disponibilidade de diferentes fontes, estudos básicos sobre os
fenômenos de ionização e as reações de fragmentação em fase gasosa ainda são
necessários para melhor entendimento e assim melhor aproveitamento da técnica,
em virtude ainda da reduzida literatura no assunto e modelos mais generalistas
(Lopes et al., 2002; Lopes et al., 2004).
4.4.1. Mecanismos de Ionização
Nas primeiras análises de β-caroteno por ESI, em condições padrão, suas
moléculas protonadas ou cationizadas não foram observadas. Van Berkel & Zhou
detectaram um íon positivo, proveniente do β-caroteno, duplamente carregado,
também por ESI-MS, utilizando-se de uma solução oxidante (Vanberkel & Zhou,
1994). Além disso, em outro trabalho foram observados processos similares de
oxidação em hidrocarbonetos policíclicos aromáticos em presença de agentes
oxidantes (Vanberkel et al., 1992), concluindo-se que a formação desses íons ocorre
na solução ou na interface entre o capilar e a solução, na fonte ESI. Assim, estudos
dos mecanismos químicos que poderiam estar envolvidos durante a ionização de
compostos poliênicos, por diferentes ionizadores e em soluções sem agentes
oxidantes foram iniciados. Para isso, β-caroteno, bixina, retinol e ácido retinóico
foram avaliados em diferentes fontes de ESI com analisadores de baixa resolução, e
________________________________________________________________
100
de MALDI com analisador de alta resolução. As intensidades relativas dos íons
moleculares (M
+
) (molécula menos um elétron) obtidas em diferentes condições da
fonte foram comparadas com os potenciais de oxidação determinados por cálculos
teóricos.
A habilidade de uma molécula orgânica neutra ser oxidada é governada
pela energia dos orbitais moleculares ocupados (HOMO - Highest Occupied
Molecular Orbital), que pode ser estimada pelo cálculo de seu potencial de oxidação
ou de sua energia de ionização em fase gasosa (Jayaweera et al., 1990; Ikonomou
et al., 1991; Vanberkel & Zhou, 1995). Para avaliar as possíveis diferenças de
energia necessária para protonação ou ionização radicalar do β-caroteno, bem como
do retinol, que possui uma cadeia poliênica mais curta em sua estrutura, cálculos
semi-empíricos foram realizados (Tabela 19).
Tabela 19:
Cálculos de potenciais de ionização e afinidade protônica (kcal mol
-1
) do
β
-
caroteno e retinol.
β
ββ
β-Caroteno
Retinol
∆H
neutro
59 -31
∆H
íon
223 140
∆H
protonado
205 121
IP
K
176 188
IP
HF
165 171
PA 221 207
Em ambos casos, o processo de ionização por retirada de um elétron
parece ser experimentalmente favorecido. Essas análises semi-empíricas sugerem
que os diferentes comportamentos experimentais do β-caroteno e do retinol podem
ser devido a diferenças energéticas existentes na presença de solventes protônicos,
na fonte de ionização.
________________________________________________________________
101
Ao analisar os compostos β-caroteno, bixina, retinol e ácido retinóico por
ESI-MS, verificou-se que dependendo da variação energética e da presença de
água (ou outro solvente prótico), dois íons diferentes podem ser observados: [M
•+
]
ou [M+H]
+
. Em condições normais para a fonte ESI, o que significa voltagem do
capilar entre 2 a 5kV e potencial no cone de 20eV, o retinol e o retinal produzem
como íons majoritários, o íon protonado ([M+H]
+
) e o íon protonado menos água
([(M+H)-H
2
O]
+
), sendo que nenhum íon para β-caroteno e bixina é detectado nessas
condições (dados obtidos na fonte ESI do tipo Z, Micromass). Contudo, variando-se
o potencial do capilar há o surgimento do íon [M
•+
] para todos os compostos
estudados, mas em diferentes condições para cada, sendo que os íons [M
•+
] dos
retinóides ocorrem como sinais de baixa intensidade (1 a 5%) entre 0,1 a 4kV, e os
íons [M
•+
] do β-caroteno e da bixina ocorrem em potenciais entre 0,1 e 0,7kV. Por
outro lado, os íons [M+H]
+
do β-caroteno são detectados apenas em 0,5kV com
intensidade de 50% do total de íons, sendo que a 0,7kV, essa intensidade diminui
para 10%. Nenhum espectro de massas foi obtido em potenciais superiores a 1kV
para o β-caroteno, provavelmente devido à degradação deste ou à ocorrência de
reações radicalares cruzadas.
Para definir a influência do sistema solvente e a energética envolvida nos
processos, os mesmos compostos foram analisados em ESI e APCI utilizando-se de
solventes apróticos, como já descrito anteriormente (Kauppila et al., 2002). Nesses
experimentos, os retinóides mostraram padrões de ionização semelhantes aos
obtidos com solventes próticos, apresentando apenas diferença na intensidade dos
íons [M
•+
], de 1 a 5% para mais de 10%. Porém, os carotenóides (em análises com
voltagens na fonte ESI entre 1 a 2kV e potencial no cone de 20eV) apresentaram
________________________________________________________________
102
íons [M
•+
] para ambos e [(M+H)-H
2
O]
+
para a bixina. Em APCI não foram observados
fenômenos de abstração de elétron, uma vez que a amostra não é submetida a um
campo elétrico e toda a ionização ocorreu pelo esperado sistema ácido-base. As
análises de β-caroteno em solventes apróticos em APCI e ESI, bem como a análise
em MALDI são mostrados na Figura 46, exemplificando a influência da voltagem no
capilar sobre os espectros.
Figura 46:
Espectros de massas do
β
-caroteno, obtidos por A) APCI, B) ESI com voltagem
no capilar de 2kV, C) ESI com voltagem de 4kV, mostrando também o íon M
2+
, e
D) MALDI.
Em APCI, o mecanismo de ionização é baseado num processo de
transferência de energia altamente eficiente e em rápida nebulização do analito,
(A)
(B)
(C)
(D)
m/z
________________________________________________________________
103
resultando em um espectro composto por moléculas protonadas. Por outro lado, em
ESI utilizando-se de solventes apróticos e capilar com voltagens de 2kV, a energia é
suficiente para abstrair um elétron, e com voltagens de 4kV, já é possível observar a
abstração de 2 elétrons, sendo que os dados obtidos por MS podem ser
correlacionados com a existência de dois potenciais de oxidação para o β-caroteno.
Deve-se ficar claro nessa discussão que a natureza do processo eletrolítico que
ocorre no capilar da fonte ESI é análoga àquela que ocorre numa cela eletrolítica de
corrente controlada, como esquematizado na Figura 47 (Vanberkel et al., 1992;
Vanberkel & Zhou, 1994; Crotti et al., 2006). Ou seja, o potencial no capilar, que é o
determinante se uma molécula irá sofrer os processos redox, é função da corrente
aplicada na fonte, do potencial redox relativo e das concentrações das várias
espécies no sistema solvente (Vanberkel et al., 1992; Vanberkel & Zhou, 1994).
Assim, a possibilidade de formação de íons M
•+
ou [M+H]
+
sem a adição de agentes
oxidantes pode ser correlacionada com o baixo potencial de oxidação ou com a
energia de ionização calculada.
________________________________________________________________
104
Figura 47:
Analogia entre célula eletrolítica (1) e a fonte de ionização linear por ESI (2). (a)
bomba injetora de fluxo; (b) célula-fluxo; (c) bomba de infusão; (d) capilar IES e
(e) região entre cone extrator e “skimmer”. O analito é inserido através de (c),
onde sofre a influência do potencial aplicado ao capilar (d). Em células
convencionais, o contra-eletrodo pode ser um fio de Pt. Figura cedida pelo autor
(Crotti
et al.
, 2006).
As análises por MALDI utilizam-se de um feixe de laser para promover a
dessorção da amostra e posterior reação ácido-base, ou seja, um mecanismo de
ionização distinto de APCI e ESI. Quando os polienos foram analisados por MALDI,
íons M
•+
foram obtidos, como exemplificado com o espectro do β-caroteno na Figura
46D, que mostra claramente o M
•+
em m/z de 536. As intensidades de m/z 537 e m/z
538 são de 45,3 e 10,1%, respectivamente, o que corresponde à distribuição
isotópica natural (m/z 537 e m/z 538 de 44,5 e 10,5%, respectivamente). As massas
exatas de cada íon confirmaram a ocorrência de ionização radicalar, como mostra a
Tabela 20. Comparando-se com a ionização por ESI, os íons M
•+
obtidos em MALDI
apresentam-se como majoritários para os carotenóides e em maiores intensidades
que os observados em ESI, para os retinóides. Esses dados foram a evidência da
________________________________________________________________
105
total ausência de formação do íon [M+H]
+
para bixina e β-caroteno e a prova final
para a presença de M
•+
, demonstrando ainda as diferenças no balanço entre íons
M
•+
e [M+H]
+
entre carotenóides e retinóides (provavelmente devido ao tamanho da
cadeia poliênica) e, a influência da fonte e das condições da fonte no espectro de
polienos (Guaratini et al., 2004).
Tabela 20:
Íons observados em análises dos polienos por MALDI-MS. (O erro em ppm para
as massas observadas encontra-se entre parênteses)
Íons Fórmula
molecular
Intensidade
(%)
Massa
observada
β
ββ
β-caroteno M
•+
C
40
H
56
100 536,4387 (+5)
[M+H]
+
C
40
H
57
Não observado
bixina
M
•+
C
25
H
30
O
4
40 394,2147 (+3)
[M+H]
+
C
25
H
31
O
4
Não observado
retinol
M
•+
C
20
H
30
O 48 286,2294 (-2)
[MH-H
2
O]
+
C
20
H
29
97 269,2264 (-5)
[M-18]
+
C
20
H
29
100 268,2181 (-10)
retinal
M
•+
C
20
H
28
O 87 284,2145 (+5)
[M+H]
+
C
20
H
29
O 100 285,2220 (+2)
[MH-H
2
O]
+
C
20
H
27
15 267,2118 (+5)
Com esses dados, o próximo passo foi verificar as reações decorrentes do
processo de ionização de xantofilas, na ausência de agentes oxidantes, para
correlação do balanço entre a formação dos íons M
•+
e [M+H]
+
com a presença e o
número de heteroátomos. Um estudo sistemático de várias xantofilas revelou
potenciais de oxidação inferiores a 1,0V versus Ag/AgCl
sat
(Liu et al., 2000),
indicando a possível formação de M
•+
em ESI. Além disso, uma previsão
especulativa utilizando-se de cálculos semi-empíricos de afinidade protônica (AP) e
energia de ionização (EI) de anteraxantina, luteína, neoxantina, violaxantina e
zeaxantina foi aplicada para avaliar as possíveis diferenças na energia necessária
________________________________________________________________
106
para ionizar as xantofilas por ESI. Os dados obtidos estão apresentados na Tabela
21.
Tabela 21:
Cálculos semi-empíricos de energia de ionização (EI) e afinidade protônica (AP).
Molécula
EI ([M
•
••
•+
]) (eV)
AP (Kcal.mol
-1
)
Luteína 7,88 106
Neoxantina 7,94 141
Violaxantina 7,95 146
Zeaxantina 7,86 129
Anteraxantina 7,88 15
β-caroteno
7,83 221
Como esperado, os cálculos mostram que as xantofilas aqui estudadas
podem ser oxidadas mais facilmente que o β-caroteno, provavelmente devido à
presença do oxigênio com seu par de elétrons que pode ser utilizado para estabilizar
o cátion radicalar. Diferentemente dos dados com β-caroteno (em metanol:água),
anteraxantina, zeaxantina e luteína em soluções etanol:água puderam ser ionizadas
nas condições normais da fonte de ESI (3kV), não sendo observada sua degradação
nem reações cruzadas (Figura 48). Além disso, soluções hidroalcoólicas de
anteraxantina, neoxantina, violaxantina e de zeaxantina (voltagem do capilar entre 2
a 4kV e potencial no cone de 30eV) produziram M
•+
como íon majoritário (na
expansão da região de interesse), sendo que a luteína foi a única exceção entre as
xantofilas estudadas, exibindo o íon referente à perda de água da molécula
protonada [(M+H)-H
2
O]
+
como íon majoritário, assim como os retinóides nesse
sistema solvente. Porém, os retinóides exibiram [M
•+
] com baixa intensidade (1-5%),
em voltagens entre 0,1 e 4kV, enquanto que para luteína, este sinal representou
cerca de 80% da intensidade do íon majoritário (Figura 48c).
________________________________________________________________
107
Figura 48:
Espectro de ESI-MS de anteraxantina (a), zeaxantina (b) e luteína (c) em solução
etanol:água
________________________________________________________________
108
Em resumo, os dados obtidos com estes experimentos sugerem que os
carotenos e algumas xantofilas sofrem preferencialmente processos radicalares
quando ionizados por ESI, perdendo um ou dois elétrons, enquanto que os
retinóides são normalmente ionizados por reações ácido-base. Os retinóides não
foram observados nas algas objeto deste estudo. Apesar disso, foram novamente
analisados como substâncias de comparação devido à extenção de suas cadeias
poliênicas. Partindo deste objetivo, foi decidido estender as análises comparativas a
nanoSpray-MS utilizando o retinaldeído, o ácido retinóico, juntamente com todos os
carotenóides.
Com base nos resultados obtidos por ESI-MS, era esperado que a
diferença de potencial que é aplicado em fonte de ESI e nanoSpray
(aproximadamente 1,5kV) pudesse induzir também a formação de íons noleculares
de alguns carotenóides e não de retinóides. De fato, o ácido retinóico quando
analisado por nanoSpray-MS tanto em modo positivo quanto em negativo resultou
apenas íons protonados ou desprotonados ([M+H]
+
ou [M-H]
-
). Por outro lado, os
espectros obtidos para o retinal mostraram um comportamento inesperado, sendo
que o balanço entre os íons moleculares e protonados foi de aproximadamente 1:1,
o que é contrário ao resultado obtido na ionização por ESI, onde o íon radicalar
representa geralmente sinal inferior a 5% em relação ao sinal do íon protonado
(Figura 49).
________________________________________________________________
109
A)
B)
Figura 49:
Espectro de massas do retinal em modo positivo ionizado por (A) ESI e (B)
nanoSpray .
Intensidade
Intensidade
________________________________________________________________
110
O sistema de ionização por nanoSpray requer potenciais na fonte muito
inferiores aos potenciais aplicados por ESI, utilizando-se ainda de fluxo mais baixo
de gás e temperatura ambiente, o que o torna uma fonte de ionização mais branda.
Estas diferenças nas condições podem, portanto estar refletindo na maneira em que
os mecanismos de formação dos íons radicalares e protonados ocorrem. Alguns
trabalhos na literatura já discutem mecanismos de ionização (Vanberkel et al., 1997).
Contudo, para este tipo de resultado, mais análises são necessárias, cabendo a um
trabalho conjunto entre engenheiros e químicos experientes em mecanismos de
funcionamento das fontes e química em fase gasosa para uma explicação desses
mecanismos inesperados.
Este tipo de comportamento para os retinóides, indicando que a cadeia
poliênica poderia ter pouco efeito sobre a ionização por nanoSpray , estimulou uma
avaliação detalhada dos espectros obtidos para os carotenóides, sendo que neste
caso, era esperado a formação apenas dos íons moleculares, de acordo com os
dados obtidos anteriormente por ESI. Contudo, nas análises do β-caroteno foi
verificado a presença da molécula protonada (m/z = 537) como os mais abundante
(Figura 50).
________________________________________________________________
111
Figura 50:
Espectro do
β
-caroteno obtido por
nanoSpray
-MS.
A presença de heteroátomos no retinal poderia explicar o comportamento
de ionização diferente entre essas moléculas. Por outro lado, os espectros das
xantofilas, que são carotenóides oxigenados, mostraram também a formação de íons
protonados, não justificando esta proposição. A Figura 51 mostra os espectros de
anteraxantina em ESI e nanoSpray obtidos no mesmo equipamento, demonstrando
claramente esse efeito. Com os dados obtidos em ESI e nanoSpray foi possível a
construção da Tabela 22, que demonstra que é mais fácil obter íons protonados em
soluções neutras por nanoSpray, que em soluções adicionadas de ácido por ESI.
Como pode ser visto, apenas zeaxantina mostrou balanço diferente (Tabela 22),
sendo que isso se explica pela intensa formação do íon ([M+H]
+
− H
2
0).
Intensidade
m/z
________________________________________________________________
112
Figura 51:
Análises comparativas dos espectros de ESI (a) e nanoSpray (b) de
anteraxantina em soluções neutras.
Tabela 22:
Balanço entre os íons moleculares e protonados de carotenóides em solução
ácida (0,5% de ácido fórmico) obtidos em ionizações por ESI e
nanoSpray .
ESI-FT-MS NanoSpray -TOF Compostos
M
•
••
•+
[M+H]
+
M
•
••
•+
[M+H]
+
Anteraxantina 5 100 nd 100
Astaxantina 2 100 10 100
β-caroteno
75 100 nd 100
β-criptoxantina
100 40 5 100
Bixina 100 55 100 100
Cantaxantina 80 100 nd 100
Diatoxantina 50 100 30 100
19’-hexenoil-fucoxantina nd nd 20 100
Fucoxantina 0 100 2 100
Luteína 100 50 100 100
Neoxantina 25 100 25 100
Peridina nd 100 nd 100
Prasinoxantina nd 100 nd 100
Violaxantina 3 100 25 100
Zeaxantina 60 100 100 80
nd :
não detectado
Intensidade
Intensidade
________________________________________________________________
113
Sendo assim, o diferente balanço entre a formação de íons moleculares e
protonados de carotenóides e retinóides em nanoSpray quando comparados à
ionização por ESI corroboram com a idéia de que as diferenças na fonte de
nanoSpray podem estar ocasionando esses processos inesperados, ou ainda que o
efeito de formação de radicais, de maneira geral é dependente do sistema capilar
similar à célula de voltametria cíclica.
Considerando os resultados obtidos em ESI-MS, sugere-se que moléculas
com propriedade mais próximas ao β-caroteno poderão não fornecer nenhum íon na
região de [M
•+
] nas condições básicas de operação da fonte ESI em presença de
solvente prótico ou ainda levar a formação de íons duplamente carregados pela
abstração de dois elétrons. Além disso, pode-se especular que a maior
probabilidade de ocorrer o íon molecular em ESI em relação à molécula protonada
pode estar correlacionada com a maior atividade antioxidante de uma molécula com
este tipo de estrutura, considerando ainda a extensão das cadeias poliênicas.
Porém, para confirmação desta teoria, novos estudos são necessários.
Apesar dessa sugestão ainda necessitar de maior amostragem para sua
comprovação, duas moléculas sintéticas (“Caro-Flavos”), derivadas de sistemas
poliênicos semelhantes ao dos carotenóides e com uma porção terminal flavonoídica
(Figura 12), foram submetidas à análise por ESI-MS na fonte Z (Micromass). Para
essa análise foi estabelecido o valor da energia do capilar em 2,5 eV. Utilizando-se
esta energia, o íon molecular do β-caroteno normalmente não é observado. A Figura
52 mostra que a estrutura com menor cadeia poliênica (A) apresentou um íon
molecular mais estável, enquanto que a estrutura com a cadeia poliênica maior (B)
revelou a presença do íon molecular em baixíssima intensidade e ainda foi maior a
quantidade de reações de dissociação na fonte, de maneira análoga ao que é
________________________________________________________________
114
observado para o β-caroteno. Esses resultados sugerem que a o “Caro-Flavo” com
maior cadeia poliênica deve apresentar atividade antioxidante mais próxima ao β-
caroteno que o de cadeia curta.
A)
100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800
m/z
0
100
%
584.5
560 568 576 584 590
m/z
0
100
%
584.5
B)
150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700
m/z0
10
0
%
650.5
630 640 650 660 670
m/z
0
100
%
650.5
Figura 52:
Espectros de ESI-MS (fonte Z, Micromass) do “Caro-Flavo” de cadeia curta (A) e
longa (B) (Figura 12).
________________________________________________________________
115
Para melhor compreensão da formação dos íons radicais destes “Caro-
Flavos” durante o processo de ionização por ESI, as EI foram calculadas para
ambas as moléculas, empregando-se B3LYP/6-31+G(d,p) (item
3.5.3), que originou
os modelos apresentados na Figura 53.
A)
B)
Figura 53:
Estrutura otimizadas no nível B3LYP/6-31+G(d,p) do “Caro-Flavo” de cadeia
curta (A) e longa (B) (Figura 12).
Para comparação entre as energias obtidas com a facilidade em que cada
molécula tem de ser oxidada (formar cátion radical), os dados foram relacionados à
EI experimental do β-caroteno. Os dois derivados estudados possuem valores de EI
menores que o 10eV, sendo que o “Caro-Flavo” de cadeia maior possui valor
aproximadamente 1eV menor que o valor experimental do β-caroteno, indicando sua
facilidade em oxidar durante o processo de ionização. Os dados obtidos
teoricamente estão de acordo com os resultados observados nos espectros de
massas.
________________________________________________________________
116
Tabela 23:
Enerigas de Ionização (EI) calculada por B3LYP/6-
31+G(d,p) para os “Caro-Flavos”.
Molécula EI (eV)
“Caro-Flavo” 5,45
“Caro-Flavo” small 8,80
β-caroteno
*
6,5
* valor experimental
4.5. Atividade Antioxidante de Substâncias Sintéticas
Para avaliação da atividade antioxidante das moléculas sintéticas frente à
radiação ultravioleta, foram utilizados lipossomas, que constituem modelos
miméticos de membrana, como descrevem os procedimentos a seguir.
4.5.1. Carotenóides e Flavonóides
A habilidade dos carotenóides em atuar como antioxidante depende de
uma série de fatores. Assim como o sistema de ligações duplas conjugadas é
fundamental para a atividade dessas moléculas, este também interfere na sua
incorporação nas membranas, o que altera o mecanismo no qual eles reagem com
as espécies reativas (Kiokias & Gordon, 2004). Sua eficácia também é dependente
da maneira com a qual interage com outros antioxidantes.
Por outro lado, os carotenóides podem perder sua atividade quando
presentes em altas concentrações ou alta pressão parcial de oxigênio, sendo que
além da perda da atividade, podem apresentar atividade pró-oxidante (Palozza,
1998; Kiokias & Gordon, 2004). Esta atividade pró-oxidante é influenciada pela
estrutura da molécula, principalmente pelos seus grupamentos terminais, pela
extensão da cadeia e pelo número de grupos metila, bem como sua posição (Martin
________________________________________________________________
117
et al., 1999). Em estudos anteriores, ao testarem-se diversos carotenóides naturais e
sintéticos frente à atividade antioxidante, foi proposto que o β-caroteno é capaz de
reagir como um hidrocarboneto com um átomo de hidrogênio alílico ativo que pode
ser removido pelos radicais. Por outro lado, o β-caroteno também pode se ligar aos
radicais peroxila, e ambos os processos combinados podem resultar na formação de
epóxidos e de compostos carbonílicos, sendo possível propor uma seqüência de
abstrações radicalares, adições de oxigênio e clivagens, o que resulta em uma
reação radicalar em cadeia (Figura 54) (Martin et al., 1999; Haila et al., 2000). Em
contraste, a astaxantina parece não seguir o mesmo mecanismo proposto na Figura
54, ou então a velocidade de reação é muito baixa, em comparação ao β-caroteno.
Este fato se explica pela presença da função oxo, que é capaz de estabilizar o
radical por ressonância, resultando em menor contribuição pró-oxidante (Martin et
al., 1999).
CarH + ROO
•
→ Car
•
+ ROOH
Car
•
+ O
2
→ Car-O
2
•
Car-O
2
•
+ CarH → Car-O
2
-CarH
•
Car-O2-CarH• → Car-O
•
+ Epóxido
Car-O
•
+ CarH → Car-O-CarH•
Car-O-CarH
•
+ O
2
→ Car-O-CarH-O
2
•
Car-O-CarH-O
2
•
+ CarH → Car-O-CarH-O
2
-CarH
•
Car-O-CarH-O
2
-CarH
•
→ Car-O-CarH-O
•
+ Epóxido
Car-O-CarH-O
•
→ Car
•
+ 2 Carbonilas
Figura 54:
Esquema de auto-oxidação do
β
-caroteno (CarH). Reações de adição radicalar,
fragmentação e abstração de hidrogênio são propostas (Martin
et al.,
1999).
Os compostos híbridos de carotenóides e flavonóides (Figura 12) foram
testados quanto à sua atividade antioxidante, induzindo-se uma lipoperoxidação por
radiação UVB ou UVA. A astaxantina foi o carotenóide escolhido para comparação
________________________________________________________________
118
com as moléculas sintéticas, visto que sua atividade pró-oxidante é bem menor que
a do β-caroteno, e pelo fato de ser mais facilmente inserida nas membranas em
diferentes concentrações. A epicatequina, por sua vez, foi o flavonóide de escolha
também para comparação com os resultados com os “caro-flavos”. Os espectros de
UV de cada substância testada estão apresentados na Figura 55.
Os lipossomas com e sem as diferentes substâncias incorporadas foram
irradiados com duas doses de UVB ou UVA. Em seguida foram extraídos e
quantificou-se o MDA formado em cada sistema, que é indicador de lipoperoxidação.
Foram quantificados também os fosfolipídeos de cada amostra, sendo que
expressaram-se os resultados como quantidade de MDA por massa de fosfolipídeos
(µmol/g) nos lipossomas (Figura 56).
Nestes experimentos, o controle representa o estresse oxidativo induzido
no lipossoma sem nenhuma substância inserida. Assim, resultados abaixo do
controle representam atividade antioxidante, enquanto que resultados acima do
controle representam atividade pró-oxidante, já que a quantidade de MDA formada
com a incorporação de determinada substância superou a quantidade de MDA do
lipossoma sem adição de outras moléculas. A astaxantina apresentou atividade
antioxidante em baixas concentrações, sendo que há aumento da atividade com o
aumento da concentração até determinado ponto em que começa a atuar como pró-
oxidante. Este mesmo efeito foi verificado por Junghans e colaboradores, utilizando-
se um iniciador radicalar como fonte de estresse oxidativo, ao invés da radiação UV
(Junghans et al., 2000).
________________________________________________________________
119
200 250 300 350 400 450 500 550
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
1.6
1.8
2.0
2.2
2.4
Absorbância
Comprimento de onda (nm)
"Caro-Flavo"
Epicatequina
Astaxantina
Figura 55:
Espectros de UV de astaxantina, epicatequina e da substância sintética derivada
de carotenóides e flavonóides com cadeia poliênica longa (“caro-flavo”).
Estruturas mostradas na Figura 12 e na Figura 13.
Figura 56:
Concentração de MDA formado a partir da lipoperoxidação nos lipossomas
contendo diferentes concentrações de astaxantina, epicatequina e “caro-flavos”
(estruturas na Figura 12 e na Figura 13), induzida por diferentes doses de UVB e
UVA. A legenda acima da figura é referente aos quatro gráficos apresentados. As
diferentes estruturas de “Caro-Flavo” são aqui apresentadas como “Caro-Flavo”
para aquela com a cadeia mais longa e “Caro-Flavo
small
”
para aquela com a
cadeia mais curta. O controle representa somente os lipossomas irradiados.
________________________________________________________________
120
A epicatequina não apresentou atividade pró-oxidante no modelo
experimental utilizado, e apesar de absorver somente na região do UVB (Figura 55),
é capaz de proteger as membranas também quando submetida à radiação UVA, o
que indica que atua também como antioxidante, além de absorvedora de radiação.
O “caro-flavo” de cadeia maior testado (Figura 13), quando inserido nos
lipossomas em diferentes concentrações apresentou um comportamento
interessante. Quando o sistema lipossomal foi irradiado com UVB, este atuou como
antioxidante, apresentando maior atividade na menor dose de radiação. Porém,
quando irradiado com UVA, apresentou atividade pró-oxidante mais pronunciada
ainda que a da astaxantina, sendo que a atividade da porção carotenoídica da
molécula se sobressaiu nessas condições, enquanto que a atividade da porção
flavonoídica se sobressaiu quando o estresse foi causado pela radiação UVB.
O mesmo experimento foi realizado com o “caro-flavo” de cadeia poliênica
menor, que possui menor número de ligações duplas conjugadas (Figura 12). Neste
caso, verificou-se a atividade pró-oxidante em todas as condições de radiação.
4.5.2. Tocoferóis
Na natureza, os tocoferóis estão presentes em sementes, folhas e em toda
a parte verde das plantas superiores (Rani et al., 2007). Por não serem sintetizados
por animais, estes os adquirem pela dieta. Porém, quando utilizados como
suplementos alimentares ou aplicados topicamente, são pouco ativos devido a
diversos fatores, como sua baixa estabilidade e biodisponibilidade (Manfredini et al.,
2000). Assim, têm sido feito investimentos na área de síntese para a obtenção de
análogos, que superem essas desvantagens, sem perder a atividade (Manfredini et
al., 2000).
________________________________________________________________
121
Desta maneira, diferentes substâncias derivadas do α-tocoferol (Figura 14)
foram sintetizadas e testadas. O espectro de UV de cada um dos diferentes
tocoferóis sintéticos, bem como do α-tocoferol está mostrado na Figura 57. Como
pode ser observado, todos possuem o mesmo padrão de absorção no UV, resultante
do mesmo cromóforo encontrado nas diferentes moléculas.
Cada uma das substâncias foi separadamente incorporada em
lipossomas, em diferentes concentrações. Depois de irradiados, as suspensões
lipossomais foram então congeladas e armazenadas a -80
o
C até análise de MDA e
fosfolipídeos. Os resultados foram apresentados em µmol MDA/g fosfolipídeos, para
as diferentes irradiações (Figura 58).
Quando aplicadas as doses mais baixas (tanto de UVB quanto de UVA),
as menores concentrações já são eficazes. Contudo, nas doses mais altas é
necessário maior quantidade do antioxidante para que haja atividade (Figura 58).
Ainda analisando a Figura 58, ao compararem-se todas as substâncias entre si,
constata-se que não houve diferenças estatisticamente significantes, no modelo
experimental aplicado. Além disso, esses compostos não se mostraram tóxicos,
quando testados previamente em cultura de fibroblastos. Assim, a próxima etapa a
fim de dar continuidade com os estudos envolvendo essas moléculas, será avaliar a
biodisponibilidade, visto que esta pode ser uma das vantagens no uso destas novas
moléculas.
________________________________________________________________
122
210 220 230 240 250 260 270 280 290 300 310 320 330
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
1,4
1,6
1,8
2,0
2,2
α
-tocoferol
FEBL 45
FEBL 70
FEBL 80
FEBL 82
Absorvância
Comprimento de Onda (nm)
Figura 57:
Espectro de UV do
α
-tocoferol e dos tocoferóis sintéticos estudados. As siglas
são indicativas das estruturas mostradas na Figura 14.
Figura 58:
Concentração de MDA formado a partir da lipoperoxidação nos lipossomas
contendo diferentes concentrações de
α
-tocoferol e seus derivados sintéticos
(estruturas na Figura 14), induzida por diferentes doses de UVB e UVA. A
legenda acima da figura é referente aos quatro gráficos apresentados. O controle
representa somente os lipossomas irradiados.
________________________________________________________________
123
Na literatura encontram-se descritos outros derivados sintéticos do α-
tocoferol, como é o caso da molécula apresentada na Figura 59 (Palozza et al.,
2002). Este novo antioxidante foi sintetizado combinando o anel cromano do α-
tocoferol com um fragmento do licopeno, consistindo em quatro ligações duplas
conjugadas. Diferentemente das moléculas testadas neste trabalho, este composto
apresentou maior atividade antioxidante que o α-tocoferol. Tal eficiência pareceu,
portanto ser dependente da presença concomitante do anel cromano e da cadeia fitil
na molécula, que devido às ligações duplas conjugadas pode ocasionar uma maior
mobilidade e distribuição uniforme na membrana celular (Palozza et al., 2002).
O
HO
Figura 59:
Substância sintética derivada do
α
-tocoferol e licopeno, com quatro ligações
duplas conjugadas (Palozza
et al.
, 2002).
___________________________________________________________________________
124
5. CONCLUSÕES
___________________________________________________________________________
125
Com os dados experimentais deste trabalho e suas discussões, pode-se inferir
as seguintes conclusões:
• As técnicas clássicas de extração utilizadas não resultaram em extratos
com atividade antioxidante significativa, sendo sugerido que os
carotenóides remanescentes nos extratos foram os responsáveis por tal
atividade;
• Utilizando-se da cromatografia gasosa, foi possível obter um perfil dos
ácidos graxos e esteróides de diferentes algas. Um maior teor de ácidos
graxos insaturados que saturados foi observado e o colesterol é o esteróide
majoritário detectado;
• Uma metodologia para separação de 16 pigmentos foi padronizada por
HPLC-UV-EC. Parâmetros como precisão e exatidão foram calculados para
ambos detectores, obtendo-se melhores resultados com o detector UV.
Com esta metodologia foi possível traçar o perfil quali- e quantitativo dos
pigmentos das algas estudadas;
• Os mecanismos de ionização por ESI-MS de diferentes moléculas contendo
cadeias poliênicas em sua estrutura foram elucidados. Ao lado de cálculos
teóricos de energia de ionização, sugere-se que a formação do íon
molecular, exceção para as análises em ESI, é dependente da extensão da
conjugação e está relacionada à presença de oxigênio na molécula;
• Os mecanismos de ionização por nanoSpray-MS também foram estudados,
sendo que apesar da semelhança ao ESI, resultados opostos foram
conseguidos, obtendo-se maior intensidade da molécula protonado para as
xantofilas na ausência de ácido, que na presença deste em ESI;
___________________________________________________________________________
126
• Os estudos por ESI dos “Caro-Flavos” corroboraram com os mecanismos
de ionização propostos para os carotenóides. O “Caro-Flavo” com maior
número de conjugações apresentou baixa intensidade do íon molecular e
reações de dissociação na fonte, de maneira análoga ao que é observado
para o β-caroteno, enquanto que a estrutura com a menor cadeia poliênica
apresentou um íon molecular mais estável. Além disso, a energia de
ionização calculada para a molécula maior foi menor. Com os dados
experimentais e teóricos, sugere-se que o “Caro-Flavo” com maior cadeia
poliênica deve apresentar atividade antioxidante mais próxima ao β-
caroteno que o de cadeia curta;
• Essas mesmas substâncias sintéticas, ao lado de astaxantina e
epicatequina, foram testadas quanto à sua atividade em inibir a
lipoperoxidação induzida por radiação UVA ou UVB, sendo que o “Caro-
Flavo” de cadeia maior atuou como melhor antioxidante quando irradiado
com UVB, apresentando maior atividade na menor dose de radiação.
Porém, quando irradiado com UVA, apresentou atividade pró-oxidante mais
pronunciada ainda que a da astaxantina. Nestes experimentos, foi
verificada atividade atividade pró-oxidante em todas as condições de
radiação para o “Caro-Flavo” menor. Outras moléculas sintéticas, derivadas
do α-tocoferol também foram testadas e não apresentaram diferenças
estatisticamente significantes desta vitamina.
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127
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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activities of spirulina and chlorella water extracts. Journal of Agricultural and Food
Chemistry, v.53, n.10, May 18, p.4207-4212, 2005.
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species from southeast Australia. Phytochemistry, v.48, n.8, Aug, p.1335-1339,
1998.
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Journal of Dermatological Science, v.27, Aug, p.S1-S4, 2001.
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oxygen species in live mouse skin exposed to UVA. Biochemical and Biophysical
Research Communications, v.269, n.1, Mar 5, p.131-136, 2000.
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I. Study on the inhibitory effect of tannins and flavonoids against the 1,1-diphenyl-2-
picrylhydrazyl radical. Biochemical Pharmacology, v.56, n.2, Jul 15, p.213-222,
1998.
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chlorophylls in Haematococcus lacustris by high-performance liquid chromatography
photodiode array detection. Journal of Agricultural and Food Chemistry, v.45, n.5,
May, p.1952-1956, 1997.
ZAINUDDIN, E. N.; MUNDT, S.; WEGNER, U.; MENTEL, R. Cyanobacteria a
potential source of antiviral substances against influenza virus. Medical
Microbiology and Immunology, v.191, n.3-4, Dec, p.181-182, 2002.
ZANGAR, R. C.; DAVYDOV, D. R.; VERMA, S. Mechanisms that regulate production
of reactive oxygen species by cytochrome P450. Toxicology and Applied
Pharmacology, v.199, n.3, Sep 15, p.316-331, 2004.
ZHANG, W. W.; DUAN, X. J.; HUANG, H. L.; ZHANG, Y.; WANG, B. G. Evaluation of
28 marine algae from the Qingdao coast for antioxidative capacity and determination
____________________________________________________________
!"#
141
of antioxidant efficiency and total phenolic content of fractions and subfractions
derived from Symphyocladia latiuscula (Rhodomelaceae). Journal of Applied
Phycology, v.19, n.2, Apr, p.97-108, 2007.
ZIEGLER, A.; JONASON, A. S.; LEFFELL, D. J.; SIMON, J. A.; SHARMA, H. W.;
KIMMELMAN, J.; REMINGTON, L.; JACKS, T.; BRASH, D. E. Sunburn and P53 in
the Onset of Skin-Cancer. Nature, v.372, n.6508, Dec 22, p.773-776, 1994.
ZUBIA, M.; ROBLEDO, D.; FREILE-PELEGRIN, Y. Antioxidant activities in tropical
marine macroalgae from the Yucatan Peninsula, Mexico. Journal of Applied
Phycology, v.19, n.5, Oct, p.449-458, 2007.
7. SÚMULA CURRICULAR
DADOS PESSOAIS
Thais Guaratini
Jundiaí-SP, 19 de janeiro de 1979
EDUCAÇÃO
1985-1993: Centro Educacional SESI 409, Jundiaí-SP
1994-1996: Colégio Leonardo da Vinci, Jundiaí-SP
1997-2001: Graduação em Farmácia-Bioquímica, Modalidade de Fármacos e
Medicamentos, Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto –
USP, Ribeirão Preto-SP
2002-2004: Mestrado em Ciências Farmacêuticas, Área de Fármacos e Medicamentos,
Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto – USP, Ribeirão
Preto-SP. Bolsa: FAPESP
2004-2008: Doutorado em Ciências, Área de Bioquímica, Instituto de Química – USP,
São Paulo-SP. Bolsa: FAPESP
OCUPAÇÃO
Bolsista de Doutorado, FAPESP, 2004-2007.
ESTÁGIOS
No Exterior:
06-10/2001:
Fungicide Resistance Group, Plant-Pathogen Interactions Division, IACR-
Rothamsted, Harpenden,
Inglaterra, sob a orientação do Dr. Bart A.
Fraaije.
11-11/2004: Bruker Daltonics, EUA, treinamento em espectrômetro de massas do tipo
Ion Trap
07-08/2005: Departamento de Química, da Universidade de Bristol, Inglaterra, sob
orientação do Dr. Paul J. Gates. Bolsa: FAPESP
05-11/2006: Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular, da Universidade
Heinrich-Heine
, Düsseldorf, Alemanha, sob a orientação dos Profs. Drs.
Helmut Sies e Wilhelm Stahl. Bolsa: CAPES
No País:
1998-2000: Laboratório de Química Analítica, do Departamento de Física e Química da
Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto - USP, sob a
orientação do Prof. Dr. Roberto Santana da Silva. Bolsa: CNPq
1997-1998: Laboratório de Farmacotécnica, do Departamento de Ciências
Farmacêuticas de Ribeirão Preto - USP, sob a orientação do Prof. Dr.
Newton Lindolfo Pereira
PUBLICAÇÕES
Artigos completos:
1- Tfouni E,
et al.
Conformational isomers of cis-chloro(nitrosyl)(1,4,7,10-
tetraazacyclododecene)ruthenium(II), cis-[(RuCl)-Cl-II(imcyclen)(NO+)](2+). Oxidation
of the coordinated 1,4,7,10-tetraazacyclododecane (cyclen) ligand.
Inorg. Chem.
Comm.,
7, 204-8, 2004
2- Guaratini T,
et al.
New chemical evidence for the ability to generate radicalmolecular
ions of polyenes from ESI and HR-MALDI massspectrometry.
The Analyst,
129,
1223-1226, 2004
3- Carvalho AM,
et al.
Circadian protection against oxidative stress in marine algae.
Hypnos,
1, 142-157, 2004
4- Guaratini T,
et al.
Balance of xanthophylls molecular and protonated molecular ions
in electrospray ionization.
Journal of Mass Spectrometry,
40, 463-468, 2005
5- Guaratini T,
et al.
Radical ion and protonated molecule formation with retinal in
electrospray and nanospray.
European Journal of Mass Spectrometry,
12, 71-74,
2006
6- Guaratini T,
et al.
Stability of cosmetic formulations containing esters of Vitamins E
and A: Chemical and physical aspects.
International Journal of Pharmaceutics,
327,
12-16, 2006;
7- Guaratini T,
et al.
Mechanism for the elimination of aromatic molecules from
polyenes in tandem mass spectrometry.
Chemical Communications,
41, 4110-4112,
2006;
8- Garla R,
et al.
Serological characterization in species of sharks.
Arquivos de
Ciências do Mar,
39, 89, 2006;
9- Cardozo KHM,
et al.
Metabolites from algae with economical impact.
Comparative
Biochemistry and Physiology. C, Toxicology & Pharmacology,
146, 60-78, 2007;
10- Vessecchi R,
et al.
Radical ion generation processes of organic compounds in
electrospray ionization mass spectrometry.
Mini-Reviews in Organic Chemistry
, 4,
281-290, 2007;
11- Guaratini T,
et al.
Antioxidantes na manutenção do equilíbrio redox cutâneo: uso e
avaliação de sua eficácia.
Quimica Nova,
30, 1, 206-213, 2007;
12- Guaratini T,
et al.
Differential Ionisation of Natural Antioxidant Polyenes in ESI and
NanoESI Mass Spectrometry.
Rapid Communications in Mass Spectrometry
, v. 21, p.
3842-3848, 2007.
13- Gobbo-Beto L,
et al.
Eco-geographical influence on the
Lychnophora ericoides
secondary metabolites profiles and bioactivity.
Phytochemistry
, submetido, 2007;
14- Guaratini T,
et al.
HPLC-DAD-ECD method for identification and quantification of
pigments from algae.
Analytical Biochemistry
, submetido, 2008;
15- Cardozo KHM,
et al
. The application of nanospray mass spectrometric technique in
the structural characterization of sunscreen compounds.
European Journal of Mass
Spectrometry,
em redação;
Capítulos de Livro:
1- Dos Santos MD, Guaratini T.; Lopes, J.L.C.; Colepicolo, P.; Lopes, N.P. Plant cell
and microalgae culture: Perspectives for the production of pharmaceuticals and
cosmetics.
In: Modern Biotechnology in Medicinal Chemistry and Industry,
editor:
Traft CA. Ed.: Research Signpost, Kerala, Índia, 2006.
2- Barros MP, Colepicolo P, Guaratini T. The multifaceted antioxidant behavior of
carotenoids: Scavenging radicals and quenching species in the aqueous milieu and in
membranes.
In: Catalysis and Phytochemistry in Heterogeneous Media
, editor:
Nantes IL, Brochsztain S. Ed.:Research Signpost, Kerala, Índia, 2007.
3- Guaratini T, Cardozo KHM, Pavanelli DD, Colepicolo P, Pinto E. Ecotoxicologia.
In:
Fundamentos de Toxicologia,
editor: Oga S. Editora Atheneu, 2007.
Resumos em Congressos:
1- Guaratini T
et al
. Evidence for the ability to generate carotenoids radical molecular
ions from ESI and MALDI mass spectrometry.
XXXIII Reunião Anual da Sociedade
Brasileira de Bioquímica e Biologia Molecular
, Caxambú-MG, 2004;
2- Guaratini T
et al.
Influência das condições de estocagem nos estudos de estabilidade
de formulações cosméticas. Trabalho apresentado oralmente no
18
o
Congresso
Brasileiro de Cosmetologia
, São Paulo-SP, 2004;
3- Barros MP
et al.
Antioxidant efficiency of astaxanthin in phosphatidylcholine
liposomes as a pH-dependent event. Trabalho apresentado oralmente pelo Prof. Dr.
M.P. Barros, no
International Conference on Antioxidants & Free Radicals in Health-
Nutrition & Radio-Protectors,
Bangalore, Índia, 2005;
4- Guaratini T
et al.
Bioguided chemical investigation of antioxidant extracts from
Kappaphycus alvarezii.
IV Meeting of the South American Group of the Society for
Free Radical Biology and Medicine
, Águas de Lindóia-SP, 2005;
5- Guaratini T
et al.
Antioxidant properties and fatty acids contents of the marine red
algae
Kappaphycus alvarezii
and
Hypnea spinella
.
XXXIV Reunião Anual da
Sociedade Brasileira de Bioquímica e Biologia Molecular
, Águas de Lindóia-SP,
2005;
6- Cardozo KHM
et al.
Investigation of the Antioxidant Properties of Mycosporine-like
amino acids in the Marine Red Algae
Gracilaria tenuistipitata
.
XXXIV Reunião Anual
da Sociedade Brasileira de Bioquímica e Biologia Molecular
, Águas de Lindóia-SP,
2005;
7- Mano CM
et al.
pH-dependent antioxidant efficiency of astaxanthin in
phosphatidylcholine liposomes.
XXXIV Reunião Anual da Sociedade Brasileira de
Bioquímica e Biologia Molecular
, Águas de Lindóia-SP, 2005
8- Guaratini T
et al.
Xanthophylls protonated molecule and molecular ion in ESI-MS.
Trabalho apresentado oralmente no
14
th
International Symposium on Carotenoids
,
Edimburgo, Escócia, 2005;
9- Guaratini T
et al.
Carotenoids from algae cultivated in Brazil.
14
th
International
Symposium on Carotenoids
, Edimburgo, Escócia, 2005;
10- Guaratini T
et al.
Eliminação pericíclica aromática na fragmentação de polienos
naturais ionizados por ESI e APCI. Trabalho apresentado oralmente no
I BrMass
(Congresso Brasileiro de Espectrometria de Massas)
, Campinas-SP, 2005;
11- Guaratini T
et al
. Antioxidant Properties and Fatty Acids Contents of the Brazilian
Algae
Hypnea musciformis. 5th CIFARP
(
International Congress of Pharmaceutical
Sciences
), Ribeirão Preto-SP, 2005;
12- Colepicolo P
et al.
Resposta antioxidante de algas marinhas e cianobactérias
expostas a poluentes metálicos e caracterização de substâncias bioativas. Trabalho
apresentado oralmente no
XI CBFic (Congresso Brasileiro de Ficologia)
, Itajaí-SC,
2006;
13- Guaratini T
et al.
Aplicação de detector eletroquímico na bioprospecção de
substâncias antioxidantes de algas brasileiras. Trabalho apresentado oralmente no
XI CBFic (Congresso Brasileiro de Ficologia)
, Itajaí-SC, 2006;
14- Guaratini T
et al.
Inhibition of UV induced lipid peroxidation by natural and synthetic
compounds.
Seminários SFB 663 – Molekulare Antwort nach elektronischer
Anregung,
Bad Honnef, Alemanha, 2006;
15- Nivoloni R
et al.
Antioxidant activity of different Brazilian algae extracts and the
characterization of their carotenoids content.
XXXV Reunião Annual da SBBq
, Águas
de Lindóia-SP, 2006;
16- Guaratini T
et al.
A study of the different ionization characteristics of carotenoids
and xantophylls in electrospray and nanospray mass spectrometry.
IMSC
(International Mass Spectrometry Congress)
, Praga, República Tcheca, 2006;
17- Guaratini T
et al.
A study of carotenoids and xanthophylls ionisation and
fragmentation, in electrospray or nanospray MS.
XXXVI Reunião Anual da Sociedade
Brasileira de Bioquímica e Biologia Molecular
, Salvador-BA, 2007;
18- Guaratini T
et al.
Padronização de método por HPLC-UV-ECD para identificação e
quantificação de pigmentos em algas.
30ª Reuniao Anual da Sociedade Brasileira de
Química,
Águas de Lindóia-SP, 2007;
19- Guaratini T
et al.
Characterization of the pro- and antioxidant behaviors of novel
organic conjugates structures in biomimetic systems exposed to UV radiation.
V
Meeting of the SFRBM- South American Group,
Montevidéu-Uruguai, 2007;
20- Barros MP
et al.
Astaxanthin exerts pH-dependent inhibition of lipoperoxidation in
zwitterionic and anionic liposomes oxidized by peroxynitrite-modified cytochrome c.
Trabalho apresentado oralmente
no V Meeting of the SFRBM- South American
Group,
Montevidéu-Uruguai, 2007;
21- Cardozo
et al.
Development of a new method to analyze antioxidants from algae.
V
Meeting of the SFRBM- South American Group,
Montevidéu-Uruguai, 2007.
OUTROS
- melhor trabalho apresentado no
International Congress on Carotenoids,
em
Edimburgo-Escócia
(07/2005);
- co-autora do trabalho que recebeu o quarto lugar entre os mais lidos da revista
Comparative Biochemistry and Physiology
(04/2007)
- mérito científico e social pela Fundação O Boticário de Proteção à Natureza
(03/2005);
- homenagem pelo sucesso na organização das atividades de comemoração dos 15
anos de pós-graduação na FCFRP-USP (03/2004);
Livros Grátis
( http://www.livrosgratis.com.br )
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