( PDF ) "α-Amilases intestinais da larva de Diatraea saccharalis: clonagem e seqüenciamento dos cDNAs correspondentes, expressão e propriedades

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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

INSTITUTO DE QUÍMICA

Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas (Bioquímica)

Lucas Offenbecker Guerra

α-Amilases intestinais da larva de Diatraea saccharalis:

clonagem e seqüenciamento dos cDNAs correspondentes,

expressão e propriedades

São Paulo

Data do Depósito na SPG:

06/03/2008

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Lucas Offenbecker Guerra

α-Amilases intestinais da larva de Diatraea saccharalis:

clonagem e seqüenciamento dos cDNAs correspondentes,

expressão e propriedades

Dissertação apresentada ao Instituto de

Química da Universidade de São Paulo para

obtenção do Título de Mestre em Ciências

(Bioquímica)

Orientadora: Dra. Clélia Ferreira

São Paulo

2008

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Índice

Agradecimentos...................................................................................................4

Resumo.................................................................................................................5

Abstract.................................................................................................................6

Lista de Abreviações............................................................................................7

1- Introdução.........................................................................................................9

1.1- Considerações Iniciais..........................................................................9

1.2- O tubo digestório dos insetos..............................................................11

1.3- As α-amilases.....................................................................................13

1.4- α-Amilases de insetos........................................................................16

1.5- Inibidores de α-amilases.....................................................................19

1.6- Diatraea saccharalis............................................................................21

1.7- Objetivos desse trabalho.....................................................................22

2- Materiais e Métodos........................................................................................23

2.1- Criação de animais..............................................................................23

2.2- Dissecção de animais..........................................................................23

2.3- Determinação do pH do lúmen intestinal de D. saccharalis................23

2.4- Meios de cultura para crescimento de bactéria e tampões usados nas

técnicas de biologia molecular....................................................................24

2.5- Desenho de iniciador degenerado específico para amilases de

insetos.........................................................................................................24

2.6- Desenho de iniciadores específicos para amplificação do cDNA

completo das α-amilases de D. saccharalis...............................................24

2.7- Desenho de iniciadores de expressão.................................................25

2.8- Reação em cadeia com DNA polimerase em termociclador (PCR).....26

2.9- Eletroforese em gel de agarose para DNA..........................................27

2.10- Purificação de DNA do gel de agarose..............................................27

2.11- Dupla digestão de DNA usando enzimas de restrição.......................27

2.12- Ligação de fragmentos de DNA a plasmídeos vetores......................28

2.13- Preparação de bactérias competentes...............................................29

2.14- Transformação de bactérias competentes.........................................29

2.15- Preparação de plasmídeos a partir de cultura de bactérias...............30

2.16- Reação de seqüenciamento de DNA.................................................30

2.17- Análise e montagem das seqüências.................................................31

2.18- Comparação das seqüências e montagem de um cladrogama.........32

2.19- Digestão do plasmídeo pGenT usando a enzima de restrição EcoRI32

2.20- Digestão dos vetores de expressão com Sac I..................................32

2.21- Transformação e expressão de proteínas recombinantes em Pichia

pastoris.........................................................................................................33

2.22- Desenho de iniciadores específicos para PCR quantitativo...............35

2.23- Desenho de iniciadores para clonagem de genes constitutivamente

expressos.....................................................................................................35

2.24- Amplificação dos cDNAs dos genes constitutivos..............................35

2.25- Determinação da concentração de proteínas.....................................35

2.26- Diálises...............................................................................................36

2.27- Eletroforese em gel de poliacrilamida para separação de proteínas em

condições desnaturantes (SDS-PAGE).......................................................36

2.28- Detecção de proteína nos géis...........................................................36

2.29- Cromatografia de filtração em gel.......................................................36

2.30- Cromatografia de troca iônica em baixa pressão...............................37

2.31- Cromatografia de troca iônica em sistema de alta pressão................37

2.32- Detecção da atividade de α-amilase e α-glicosidase.........................38

2.33- Ensaios de estabilidade ao congelamento.........................................38

2.34- Detecção da atividade inibitória de IC1..............................................38

2.35- Determinação do pH ótimo das enzimas............................................39

2.36- Estabilidade ao pH..............................................................................39

2.37- Inativação térmica das amilases.........................................................40

2.38- Modificação com EDC........................................................................40

2.39- Determinação da constante de Michaelis (Km) para diferentes

substratos.....................................................................................................40

2.40- Medida da processividade (grau de ataque múltiplo).........................40

2.41- Cromatografia em camada delgada dos produtos de ação

enzimática...................................................................................................41

2.42- Determinação da sensibilidade das amilases recombinantes a

diferentes inibidores.....................................................................................41

2.43- Modelagem estrutural de DSA1.........................................................42

3- Resultados e discussão..................................................................................43

3.1- Instalação da cultura de D. saccharalis no laboratório e verificação de

seu crescimento em dietas modificadas......................................................43

3.2- Determinação do pH do lúmen intestinal de D. saccharalis.................45

3.3- Clonagem do cDNA codificante das α-amilases de D. saccharalis e seu

sequenciamento..........................................................................................45

3.4- Construção dos vetores de expressão e transformação de Picchia

pastoris........................................................................................................53

3.5- Expressão das α-amilases recombinantes em Pichia pastoris............55

3.6- Expressão dos inibidores de cana-de-açucar recombinantes em Pichia

pastoris........................................................................................................59

3.7- Clonagem de cDNAs codificantes de proteínas constitutivas.............61

3.8- Estabilidade das amilases recombinantes..........................................68

3.9- Semi-purificação de DSA1..................................................................68

3.10- Efeito de detergentes na atividade de DSA1....................................71

3.11- Efeito do pH e da temperatura nas α-amilases de D. saccharalis....71

3.12- Propriedades cinéticas das α-amilases de D. saccharalis.............. .75

3.13- Modelagem molecular de DSA1.......................................................77

3.14- Comparação entre as seqüências das α-amilases de insetos..........79

4- Considerações Gerais..................................................................................81

5- Conclusão......................................................................................................82

6- Bibliografia....................................................................................................83

Curriculum.........................................................................................................95

Agradecimentos

Agradeço,

Aos meus pais que sempre me apoiaram nas escolhas, nos momentos

difíceis e em toda a vida.

À minha irmã, pelo amor e carinho.

À Dra. Clélia Ferreira, pela orientação e paciência durante todos os anos

que estive no laboratório.

Ao Prof. Dr. Walter R. Terra, pelo apoio e conversas inspiradoras.

Ao Prof. Dr. J. R. P. Parra, por ter cedido as larvas de D. saccharalis para

cultura.

Ao Dr. Alexandre H. P. Ferreira, que me ensinou os primeiros passos nos

caminhos da ciência.

Ao Prof. Dr. Sandro Marana e ao Dr. Fernando A. Genta, que muito

contribuíram para a realização desse trabalho.

Aos colegas de laboratório, que me agüentaram e colaboraram

imensamente.

Aos amigos, pela eterma companhia, alegria e força.

À FAPESP pelo apoio financeiro.

Resumo

(Guerra L. O.) α-Amilases intestinais da larva de Diatraea saccharalis:

clonagem e seqüenciamento dos cDNAs correspondentes, expressão e

propriedades. 2008. 96p. . Dissertação (Mestrado) -

Programa de Pós-Graduação

em Bioquímica. Instituto de Química, Universidade de São Paulo, São Paulo.

No intestino médio de larvas de Diatraea saccharalis criada em dieta artificial há

três α-amilases, sendo que uma delas tem maior atividade.

Utilizando uma biblioteca de expressão feita a partir do epitélio do intestino

médio da larva, clonamos e seqüenciamos três cDNAs diferentes que codificam α-

amilases.

As enzimas foram expressas em Picchia pastoris e recuperadas com

atividade. Elas foram denominadas DSA1, DSA2 e DSA3.

DSA1, DSA2 e DSA3 possuem respectivamente massas moleculares

calculadas a partir da sequencia de 54.505; 54.488 e 54.522 e pIs teóricos de 6,4;

5,5; e 6,4. Utilizando preparações semi-purificadas das enzimas recombinantes

verificamos que elas têm afinidades semelhantes por amido, amilopectina e

glicogênio. Seus pHs ótimos estão entre 8,0 e 9,0 e todas apresentam baixa

processividade (entre 0,8 e 2,0), sendo classificadas como liquefadoras.

Inativações térmicas das três enzimas recombinantes e do material

presente no intestino médio do animal mostraram que, nas condições em que a

larva é criada, a amilase predominante é DSA1.

Um cladograma feito com seqüências de amilases de insetos mostrou que

as três amilases de D. saccharalis são semelhantes a outras amilases de

Lepidoptera e que as seqüências de DSA1 e DSA3 são mais parecidas entre si do

que com DSA2. Isso se reflete em suas propriedades, que são mais próximas do

que aquelas apresentadas por DSA2.

As três seqüências obtidas por nós podem ser usadas em futuros estudos

sobre alteração na expressão de amilases devido a presença de diferentes

inibidores na dieta.

Palavras-chave: amilase, enzimas digestivas de insetos, Diatraea saccharalis,

clonagem, expressão.

Abstract

(Guerra L. O.) α-Amilases intestinais da larva de Diatraea saccharalis:

clonagem e seqüenciamento dos cDNAs correspondentes, expressão e

propriedades. 2008. 96p. .

Masters Thesis ou PhD Thesis – Graduate Program in

Chemistry ou Biochemistry. Instituto de Química, Universidade de São Paulo, São

Paulo.

The larva of Diatraea saccharalis reared in artificial diet presents three α-

amylases in their midguts One of the enzymes is more active than the other two.

Using an expression library made from the midgut epithelium, we cloned

and sequenced three cDNAs that code for three different α-amylases. The

enzymes were expressed with activity in Pickia pastoris and named DSA1, DSA2

and DSA3.

DSA1, DSA2, and DSA3 have, respectively, predicted molecular weights

and pIs of 54,505 (6.4); 54,488 (5.5) and 54,522 (6.4).

Using semi-purified enzymes, we showed that they have similar catalytical

efficiency against starch, amylose and glycogen. They have optimum pHs between

8 and 9 and exhibit low processivity (from 0.8 to 2), thus being saccharifying

amylases.

Thermal inactivation of the recombinant enzymes and of the soluble material

present in midgut lumen reveals that the enzyme more stable at 50

C is DSA1 and

that DSA1 is the main enzyme present in the midgut of larvae fed on artificial diets.

A cladogram was done using insect α-amylase sequences. It shows that the

enzymes we expressed are similar to other Lepidoptera amylases and that DSA1

and DSA3 are more similar to one another than to DSA2. The same is true for their

physical and catalytical properties.

The three sequences we obtained may be used in future studies to detect

changes in their expression due to the presence of different amylase inhibitors in

diets.

Keywords: amylase, insect digestive enzymes, Diatraea saccharalis, cloning,

expression.

Lista de Abreviações

APS persulfato de amônio

αAI1 inibidor tipo 1 de Phaseolus vulgaris

αAI2 inibidor tipo 2 de Phaseolus vulgaris

BLAST "Basic Local Aligment Serch"

BMM meio mínimo de cultura, tamponado, contendo metanol

BMMY meio de cultura complexo, tamponado, contendo metanol

BSA albumina sérica bovina

CAPS (3-[ciclohesilamino]-1-ácido propanosulfônico)

Da Dalton

DO densidade óptica

dNTP desoxiribonucleotídeos trifosfato

DTT ditiotreitol

EDC 1-etil-3(Dimetilaminnopropil)Carbodiimida

g gravidade

Gly glicina

HEPES ácido 4-(2-hidroxietil)piperazina-1-etanosulfônico

IPTG isopropiltiol beta D galactopiranosídeo

IT-1 inibidor comercial de trigo tipo 1 (SIGMA A1520)

IT-3 inibidor comercial de trigo tipo 3 (SIGMA A3535)

LB meio de cultura de Luria-Bertani

MD meio de cultura mínimo dextrose

MES ácido 2-(N-Morfolino)etanosulfônico

mRNA RNA mensageiro

PAGE eletroforese em gel de poliacrilamida

PCR reação em cadeia da polimerase

pb pares de bases

pI ponto isoelétrico

PIPES piperazina-N'N'-bis(2-etano ácido sulfônico)

PM peso molecular

SDS dodecil sulfato de sódio

TAE tampão tris acetado EDTA

TAPS ácido N-[Tris(hidroximetil)metil]-3-aminipropanosulfônico

Tm temperatura de anelamento

U unidades

UV ultravioleta

V volts

Xgal 5-bromo-4-cloro-3-indoil beta D galactopiranosídeo

YPD meio de cultura dextrose, peptona, extrato de levedura

W Watts

1- Introdução

1.1- Considerações Iniciais

Os insetos correspondem à cerca de 75% das espécies animais conhecidas

(figura 1). Embora haja insetos benéficos, os demais causam grandes prejuízos ao

homem. Os insetos são transmissores de doenças e causam danos a qualquer

coisa que o homem tente cultivar ou construir. Devido a sua grande diversidade,

eles ocupam os mais variados nichos ecológicos. Essa capacidade de viver nos

ambientes mais variados se deve em parte a possibilidade que esses organismos

tem de utilizarem diversos tipos de alimentos.

Pelo exposto acima, fica claro que o estudo dos insetos é interessante tanto

do ponto de vista acadêmico (para conhecer as características que levaram a um

sucesso tão grande) quanto prático (para conseguir controlar e minimizar os danos

causados por esses organismos). Um exemplo disso foi a introdução de um

parasitóide da broca-da-cana, Diatraea saccharalis, no estado de São Paulo, que

reduziu em 80% os prejuízos causados pela praga (Parra et al., 2002).

Uma interessante abordagem nos estudos com insetos é o seu processo

digestivo. Além de compreender melhor as estratégias fisiológicas que levaram os

insetos a conseguir se adaptar a tamanha diversidade de alimentos, podemos

desenvolver estratégias para o controle de pragas visando desorganizar alguma

de suas funções digestivas. O tubo digestório é a mais frágil superfície de contato

entre os insetos e o meio ambiente, por ser a única superfície do animal a não ser

recoberta por quitina. Isso o torna um interessante alvo para controle. Sendo

assim, suas características precisam ser conhecidas em detalhe. Um enfoque é o

estudo das enzimas digestivas do animal. Conhecê-las nos permite atuar sobre a

metabolização e absorção dos nutrientes da dieta. É possível inibir enzimas

chaves através de inibidores protéicos ou agentes químicos, dificultando de

inúmeras formas a captação de nutrientes.

Minimizar a ação de enzimas que atuam no início do processo digestivo

certamente acarretará prejuízo ao inseto alvo. Como exemplo temos as α-

amilases, que atuam na hidrólise do amido, fonte essencial de energia para

diversas espécies. Sem a ação dessa glucanase, as glicosidases responsáveis

pela hidrólise das porções menores geradas por ela não poderiam atuar,

reduzindo assim drasticamente a captação de glicose pelo animal, prejudicando

seu desenvolvimento.

1.2- O tubo digestório dos insetos

Quando observamos o tubo digestório dos insetos, percebemos uma

enorme diversidade morfológica (figura 2), apresentando diferenças entre as

ordens maiores até que as observadas em mamíferos. Essa diversidade ocorre

em inúmeras outras características, sendo sempre necessários estudos

aprofundados para possibilitar qualquer generalização para o grupo. No tubo

digestório dos insetos, a parte mais importante da digestão ocorre no intestino

médio. Nesse é secretada a maior parte das enzimas digestivas. Ele é todo

recoberto por uma membrana semi-permeável chamada membrana peritrófica,

que divide o tubo intestinal em dois ambientes distintos, a região endoperitrófica e

a ectoperitrófica. Essas duas regiões distintas apresentam composição de

enzimas diferente porque algumas moléculas passam através dos poros da

membrana peritrófica e outras não, dependendo de seu tamanho (ver Terra e

Ferreira, 1994, 2005).

Nos Lepidoptera o intestino médio é um cilindro de igual diâmetro, chamado

de ventrículo, O intestino médio dos Lepidoptera não possui cecos gástricos, que

aparecem em algumas ordens de insetos (Figura 3). O pH do conteúdo intestinal

de Lepidoptera é bastante alcalino. Foi proposto que essa alta alcalinidade teria o

papel de evitar a ligação de taninos a proteínas dietéticas, o que reduziria a

eficiência da digestão (Berenbaum, 1980). Como insetos tais como gafanhotos e

besouros possuem pHs bem mais baixos e são resistentes a taninos (Bernays et

al, 1981; Fox e Macauley, 1977), esse não deve ser o verdadeiro papel do pH

alcalino. A real importância desse pH deve ser possibilitar a extração de hemi-

celuloses de paredes vegetais, que são digeridas mesmo por insetos incapazes de

hidrolisar celulose (Terra,1988).

1.3- As α-amilases

As α-amilases são enzimas estudadas há muitos anos, provavelmente

devido ao fato delas estarem amplamente distribuídas entre os seres vivos, tendo

muitas vezes alta atividade.

No que diz respeito a aplicações práticas as amilases são enzimas que

foram primeiro comercializadas e são atualmente utilizadas em vários processos.

Elas tem sido utilizadas na indústria de massas há muitos anos, mas seu maior

mercado é na produção de hidrolisados de amido para a industria alimentícia.

Essas enzimas são também utilizadas na indústria têxtil e de papel, onde

produzem amido de baixa viscosidade que preenche os poros do tecido ou do

papel, o que protege o material contra danos mecânicos durante a fabricação. As

amilases estão também presentes em detergentes. Os detergentes que contém

enzimas agem em condições mais brandas e não danificam roupas delicadas. As

amilases são componentes de detergentes desde 1975 e pelo menos 90% de

todos os detergentes líquidos mais modernos contém essa enzima (ver Gupta et

al, 2003)

As α-amilases clivam ligações glicosídicas α-1,4, preferencialmente em

glucanas de cadeias longas como amido ou glicogênio, catalizando uma endo-

hidrólise das ligações. As exo-enzimas que agem sobre amido tem classificações

distintas, chamando-se amilases maltogênicas (EC 3.2.1.133), maltotriohidrolase

(EC 3.2.1.116), maltotetrahidrolase (EC 3.2.1.60) e maltohexahidrolase (EC

3.2.1.98), quando produzem α-maltose, maltotriose, maltotetraose e

maltohexaose, respectivamente.

As α-amilases pertencem a família 13 e 57 das glicosídeo hidrolases

(www.cazy.org

, Coutinho e Henrissat, 1999). Na família 57 são encontradas

somente enzimas de Archeae e bactérias, sendo que todas as α-amilases de

eucariotos são membros da família 13.

A família 13 das glicosídeo hidrolases forma o Clã H, junto com as famílias

70 e 77. Em um clã encontram-se famílias que possuem a mesma estrutura

tridimensional no módulo catalítico, embora as seqüências entre uma família e

outra sejam bem diferentes (Mc Gregor, 2005). A família mais complexa do Clã H

é a família 13, contendo hidrolases, transferases e isomerases com 28

especificidades diferentes (Svenson et al, 2002).

Todas as enzimas do Clã H tem, no módulo catalítico, um (α/β)

barril,

também chamado de barril TIM, devido à primeira enzima em que ele foi descrito,

a triose fosfato isomerase (Mc Gregor, 2005).

A estrutura das α-amilases é caracterizada pela presença de 3 domínios

distintos: A, B e C. O domínio A, central, contém o N-terminal e consiste de um

(α/β)

barril e tem os resíduos do sítio ativo. O domínio B é formado quase

exclusivamente por folhas β e exibe a maior variabilidade estrutural. Esse domínio

forma uma grande parte da fenda de ligação do substrato e acredita-se que seja

importante para a especificidade da enzima (ver, Nielsen e Borchert 2000).

O domínio C, situado do lado oposto ao domínio B, tem a conformação de

chave grega e contém o C-terminal. O domínio C é o que possui a seqüência mais

variável (Bayer et al, 1995). Esse domínio por muito tempo não teve uma função

clara. Pensava-se que ele poderia estabilizar o domínio A, escondendo os

resíduos do domínio A do solvente (ver Mc Gregor et al, 2001). Cada vez mais

evidências apontam que esse domínio tem uma função importante por possuir um

segundo sitio de ligação do substrato. A presença desse outro sítio de ligação do

polímero já foi observado em vários tipos de glicosidases que possuem o sítio

ativo em forma de fenda e não possuem domínios de ligação do carbohidrato.

Esses outros sítios de ligação do substrato foram observados em amilases (Robty

e French, 1957; Bozonnet et al, 2007), β-agarase (Allouch et al, 2004), K-

carragenase (Allouch et al, 2004) e β-1,3-glucanase (Genta et al, 2007).

Evidências recentes indicam que esses sítios adicionais são importantes

para o grau de ataque múltiplo (ou processividade) apresentado pelas enzimas. O

grau de ataque múltiplo (como é chamado em amilases) ou processividade (nome

que o fenômeno recebe quando acontece em β-glucanases) é o número de

ligações hidrolisadas após a primeira, durante a formação de um complexo

enzima-substrato.

Na α-amilase de cevada, Bozonnet e colaboradores (2007) mostraram que

a mutação de um resíduo de tirosina presente no sítio de ligação do amido do

domínio C leva a uma menor ligação de inibidores e a uma redução no ataque

múltiplo. Genta et al (2007), mostraram que a processividade de uma β-1,3-

glucanase é perdida quando o substrato está ligado tanto no sítio catalítico quanto

nesse outro sítio.

Nas carboidrases, os sub-sítios de ligação de glicose são numerados a

partir do local onde a ligação do substrato é quebrada. Aqueles que ficam em

direção a porção não redutora do substrato são numerados com algarismos

negativos, enquanto aos que ficam em direção a porção redutora do substrato são

atribuídos valores positivos. Nos dois casos, os sub-sítios tem valores maiores em

módulo, conforme eles estão mais distantes do ponto onde o substrato é

hidrolisado (Davies et al, 1997). Nas α-amilases há dois ou três sub-sítios positivos

(+1, +2, +3) e os negativos variam de dois a sete (ver Nielsen e Borchert, 2000).

As α-amilases são enzimas retentoras, ou seja, a configuração do carbono

anomérico presente no substrato é conservada no produto. Nessas enzimas um

dos grupos carbonila faz uma catálise ácida protonando o oxigênio glicosídico

concomitantemente com a quebra da ligação. O outro grupo carbonila age como

nucleófilo, formando uma glicosil-enzima intermediária. No segundo passo o

carboxilato desprotona uma molécula de água que ataca o centro anomérico e

desloca o açúcar (Zechel e Withers, 2000).

No mecanismo de catálise de α-amilases, atua uma tríade catalítica

semelhante à descrita para proteinases. Na amilase de Tenebrio molitor, esses

aminoácidos catalíticos são o Asp 185, Glu 222 e Asp 287 (Strobl et al, 1998). Glu

222 é o doador de prótons, Asp 185 o nucleófilo e Asp 287 é importante, mas não

está diretamente envolvido na catálise. Tem-se proposto que seu papel é elevar o

pK do doador de prótons (ver Nielsen, 2000).

Todas as α-amilases da família 13 cuja estrutura é conhecida, possuem um

sítio de ligação Ca

, localizado na interface entre os domínios A e B. O Ca

essencial para a estabilidade e atividade da enzima, tendo um papel na

manutenção da sua estrutura (ver, Nielsen e Borchert 2000).

Muitas α-amilases possuem um sítio de ligação de cloreto no domínio A

(D’Amico et al, 2000). Esse é formado por três resíduos que são, na amilase

pancreática humana, Arg 195, Asp 298 e Arg 337. Em algumas α-amilases

dependentes de Cl

, a Arg 337 é substituída por Lys (Numao et al, 2002). Os dois

primeiros resíduos são conservados em muitas α-amilases não dependentes de

cloreto, enquanto a ocorrência do terceiro resíduo básico é específico para todas

as α-amilases animais dependentes de cloreto e portanto é o resíduo chave para a

ligação do íon (D’Amico et al, 2000).

Mutações nos dois resíduos não essenciais para a ligação do cloreto (R195

e N298 na α-amilase pancreática humana), mostraram que a R195 tem papel

crucial na orientação dos dois ácidos carboxílicos catalíticos, provavelmente

modulando seus pKas. A N298 interage com resíduos do sítio ativo auxiliando na

catálise (Numao et al, 2002). Provavelmente a importância desses papéis é que

faz com que esses resíduos sejam muito conservados, mesmo nas α-amilases

não dependentes de cloreto.

O papel do íon cloreto nas α-amilases não é muito claro. A presença do íon

alarga o perfil de atividade versus pH da enzima, deslocando-o para o lado

alcalino. Entretanto há organismos que tem α-amilases com pH ótimo alcalino e

que não ligam cloreto.

Aghajari et al (2002) mutaram o resíduo chave para a ligação de cloreto na

α-amilase de um microorganismo por Gln. Essa mutação levou a uma diminuição

mas não a perda da atividade, o que levou os autores a concluírem que a

presença do íon não é essencial para a atividade da enzima.

O papel proposto para o cloreto é de neutralizar carga do resíduo básico

que é seu principal ligante. Na ausência de cloreto esse resíduo (Lys ou Arg)

formaria uma ponte salina com um dos resíduos ácidos catalíticos (Numao et al,

2002). Quian et al (2005) mostraram que a substituição do resíduo básico por Gln,

como feito por Aghajari et al (2002) não leva a rotação do resíduo catalítico e

portanto não o desposiciona. Desse modo, a conclusão que é o íon Cl- não é

essencial para a atividade das α-amilases dependentes de cloreto não é correta.

1.4- α-Amilases de insetos

As α-amilases são em geral encontradas solúveis nos espaços endo e

ectoperitróficos. Elas também se localizam no papo e nos cecos gástricos

anteriores, quando o tubo digestório tem essas regiões. A presença da membrana

peritrófica permite um mecanismo que leva a uma circulação endo-ectoperitrófica

de enzimas digestivas, entre elas amilase, que permite que as hidrolases de

polímeros não sejam excretadas junto com o alimento (Terra e Ferreira, 1994,

2003, 2005). Por esse mecanismo, as enzimas digestivas ligam-se aos seus

substratos na região anterior do espaço endoperitrófico e continuam nesse

compartimento até que o tamanho do complexo enzima-substrato diminua e

permita sua passagem para o espaço ectoperitrófico. Enquanto o bolo alimentar

avança para as regiões posteriores do ventrículo, há um contra fluxo de fluidos no

espaço ectoperitrófico, que leva as enzimas e os nutrientes para as regiões

anteriores do ventrículo e/ou cecos gástricos e as despolimerases penetram no

espaço endoperitrófico e ligam-se novamente a seus substratos (Terra e Ferreira,

1981).

Essa reciclagem leva a remoção de oligômeros do espaço ectoperitrófico,

aumentando a eficiência da digestão, pois os oligômeros podem inibir a digestão

dos polímeros. O aumento da eficiência da digestão inicial pela remoção de

oligômeros foi confirmada utilizando-se sacos de diálise que continham o conteúdo

luminal de larvas de Spodoptera frugiperda com o polímero a ser digerido. Esses

sacos de diálise permaneciam envoltos por tampão com e sem agitação do meio

de diálise e a atividade detectada foi comparada com aquela obtida em um tubo

de ensaio que permaneceu pelo mesmo tempo nas mesmas condições . Quando

a diálise foi feita com agitação a atividade foi 210% e sem agitação 160% daquela

determinada no tubo de ensaio (Bolognesi, Terra e Ferreira, manuscrito em

preparação).

Foi mostrado que a secreção de amilase em Lepidoptera ocorre em

vesículas exocíticas comuns na região posterior e por um mecanismo secretor

peculiar, que só ocorre na região anterior do ventrículo de Lepidóptera (Jordão et

al, 1999; Bolognesi et al, 2001). Na porção anterior do ventrículo formam-se

pequenas vesículas que caminham pelo interior das microvilosidades, brotam

lateralmente como vesículas de membrana dupla ou fundem-se ao topo das

microvilosidades.

Utilizando um anticorpo anti-amilase de T. molitor que reage com amilase

de S. frugiperda concluiu-se que a α-amilase desse organismo é secretada em

parte ligada às membranas dessas pequenas vesículas e em parte solúvel em seu

conteúdo (Bolognesi et al, 2001).

A utilização de anti-corpos gerados contra preparação de microvilosidades

de intestino médio de S. frugiperda foram utilizados para varrer uma biblioteca de

expressão (Ferreira et al, 2007). Os clones reativos foram seqüenciados e

detectou-se a presença de três amilases semelhantes a transportadores de

aminoácidos presentes nessas membranas (Ferreira et al, 2007).

Os transportadores de aminoácidos neutros são proteínas não catalíticas

relacionadas à família das α-amilases do ponto de vista estrutural e evolutivo.

(Janecek et al, 1997; Janecek, 2002). Esses transportadores não possuem o

doador de prótons catalítico e pelo menos um dos resíduos que ligam Ca

. Por

outro lado, as três proteínas presentes nas microvilosidades intestinais de S.

frugiperda possuem todos os resíduos necessários à uma α-amilase ativa (Ferreira

et al, 2007). A atividade de α-amilase detectada nas membranas microvilares de

S. frugiperda e seu modo de secreção precisam ser reavaliados para verificar qual

a contribuição dessas amilases semelhantes a transportadores de aminoácidos.

Essas amilases são portanto diferentes de tudo o que já foi descrito até o

momento, pois tem a estrutura dos transportadores que pertencem à família 13,

mas com os aminoácidos catalíticos. Esses resultados indicam que a enzima de

Spodoptera pode ser um intermediário na evolução das proteínas pertencentes à

família 13.

As α-amilases de insetos tem massas moleculares na faixa de 48-60 kDa,

pI entre 3,5 e 4,0 e valores de Km para amido solúvel ao redor de 0,1%. O seu pH

ótimo normalmente corresponde ao encontrado no tubo digestório do inseto de

onde ela foi isolada. Todas elas são dependentes de Ca

e a maioria é ativada

por cloreto (Terra e Ferreira, 1994, 2005). A única α-amilase de insetos cuja

estrutura tridimensional já foi analisada é a do Coleoptera T. molitor, que possui

todos os resíduos responsáveis pela catálise e ligação de Ca

e Cl

. A maior

diferença entre essa enzima e a enzima de mamíferos é a presença de alças

adicionais na vizinhança do sítio ativo nas enzimas de mamíferos (Strobl et al,

1998). A maioria das amilases ativadas por cloreto possuem Arg no resíduo

variável (ver item 1.3). As amilases de Lepidoptera possuem Gln nessa posição o

que faz com que não sejam afetadas por esse ânion (www.cazy.org

As poucas α- amilases presentes em outras ordens e que são descritas

como independentes de cloreto precisam ser revistas (Terra e Ferreira, 1994). É

possível que outro ânion esteja substituindo o cloreto como ativador, como

mostrado para algumas amilases de Hemiptera (Hori, 1972).

O grau de ataque múltiplo foi determinado em poucas amilases de insetos.

A enzima de Rhynchosciara americana tem um grau de ataque múltiplo

intermediário entre o da amilase de Bacillus subtilis (1,7) e o da pancreática de

porco (6). Amilases de larvas e adultos de Sitophilus zeamais, Sitophilus granarius

e Sitophilus oryzae e a larva de Bombyx mori tem padrões de ação similares aos

da amilase pancreática de porco (Terra e Ferreira, 2005).

1.5- Inibidores de α-amilases

Para se defenderem dos herbívoros, os vegetais produzem várias

substâncias. Elas podem ser metabólitos secundários ou peptídeos e atuam nas

mais diversas reações metabólicas e vias de sinalização vitais. Entre essas estão

os inibidores de enzimas digestivas (como as α-amilases) que são, na sua

maioria, protéicos. Como, para muitos insetos, a captação de glicose proveniente

do amido é essencial para o seu desenvolvimento, inibidores de α-amilase são

muito comuns em vegetais. São exemplos de vegetais que contém esses

inibidores o feijão comum (Phaseolus vulgaris) e o trigo (Triticim aestivum ) (Hilder

e Boulter, 1999; Carlini e Grossi-de-Sá, 2002).

Inibidores protéicos de plantas atuam de diferentes maneiras. Dados

cristalográficos e ensaios de inibição mostraram que os inibidores de α-amilase

sempre se associam ao sitio ativo da enzima e apresentam diferentes

especificidades (Terra e Ferreira, 2005).

Há 6 classes de inibidores protéicos de α-amilases que são produzidos por

vegetais. Eles são agrupados segundo sua estrutura terciária. São eles: 1) Os

inibidores semelhantes as lectinas, isolados de feijões. São os melhores descritos

e atuam sobre mamíferos, insetos e patógenos. 2) As proteínas que tem um

dobramento de "knottin", onde pelo menos 3 pontes dissulfeto estão presentes.

São os menores inibidores de α-amilases conhecidos e são muito semelhantes a

proteínas presentes em toxinas de cobras e aranhas. 3) Os inibidores produzidos

por cereais. 4) Os inibidores do tipo Kunitz. 5) Os inibidores semelhantes a

taumatina, que atuam sobre insetos mas não sobre mamíferos e 6) Os inibidores

semelhantes a γ-purotioninas, que atuam principalmente sobre insetos (Ver Franco

et al, 2002; Svensson et al, 2004).

O estudo dos inibidores protéicos é interessante pois existe a possibilidade

de se introduzir os genes codificantes deles no genoma de cultivares predados por

pragas suscetíveis aos inibidores, tornando assim a planta resistente, ou menos

nutritiva ao inseto (Carlini e Grossi-de-Sá, 2002).

Diferentes inibidores afetam em variadas intensidades as amilases de um

mesmo inseto. Por sua vez, as amilases presentes em diferentes insetos são

afetadas em graus variados por um mesmo inibidor (Warchalewski et al, 2002).

A interação de α-amilases de insetos com inibidores produzidos por

vegetais tem sido estudada em detalhe somente em Coleoptera (ver Franco et al,

2000, 2002).

Muitos inibidores de α-amilases não agem sobre as enzimas de Lepidoptera

porque o pH vigente em seu tubo digestório é muito alcalino (Terra e Ferreira,

2005). Inibidores bem conhecidos, como aqueles presentes no feijão, não se ligam

à enzima em pHs elevados (Kluh et al, 2005).

Assim, os inibidores de feijão αAI1 e αAI2, entre outros, não inibem

amilases de Lepidoptera (Kluh et al, 2005), enquanto em trigo foram encontrados

inibidores eficazes para α-amilases desses insetos (Markwick et al, 1996).

No trigo, três diferentes inibidores de α-amilases são encontrados. Eles são

geralmente classificados pelo número de subunidades que os compõe

(monomérica, dimérica e tetramérica). Já foi observado na literatura que esses

inibidores têm diferentes especificidades para as α-amilases de insetos e que

diferentes lepidópteros têm sensibilidade variada a cada um desses inibidores

(Gutierrez et al, 1993).

Embora muitos trabalhos tenham estudado a interação inseto-planta, o

conhecimento existente sobre ela é ainda incipiente. Quanto mais ela for

conhecida, mais fácil será o desenvolvimento de métodos efetivos de controle

para combater insetos praga com produtos naturais, desenvolvendo novas

variedades de plantas com defesas químicas aumentadas.

Os mecanismos fisiológicos (e moleculares) que permitem que alguns

insetos consigam se alimentar de dietas contendo inibidores de α-amilases

efetivos contra suas enzimas é outro aspecto ainda pouco estudado. Já foram

observados casos onde o inseto é capaz de secretar uma enzima resistente ao

inibidor presente na dieta (Silva et al, 2001). Também já foram observados casos

onde ocorre a super expressão das α-amilases, quando inibidores para elas são

adicionados na dieta (Markwick et al, 1998). Porém quais os mecanismos que

controlam a expressão diferencial das α-amilases ainda não é conhecido.

Análise do transcriptoma da cana-de-açúcar mostrou que há inibidores de

amilase que são expressos na folha e no colmo (Falco et al, 2001), onde se

desenvolvem as larvas de Diatraea saccharalis (ver 1.6). Não se sabe se os

inibidores não afetam esse inseto ou se ele desenvolveu alguma proteção que

permite que ele continue ingerindo esse alimento.

1.6- Diatraea saccharalis

D. saccharalis é a principal praga da cana-de-açúcar. As lagartas

alimentam-se inicialmente do parênquima das folhas, depois de sua bainha e

então penetram no colmo pela gema. As larvas causam prejuízo direto pela

abertura de galerias, que leva a perda de peso e morte das gemas. Os prejuízos

indiretos são ainda maiores, uma vez que pelos orifícios abertos penetram fungos

que danificam a planta.

As infestações por D. saccharalis diminuem muito utilizando-se parasitóides

dessas larvas, que pertencem a ordem Díptera e Himenóptera (Gallo et al, 1988).

Como a industria da cana envolve uma grande quantidade de dinheiro, qualquer

pequeno decréscimo no ataque feito à planta representa um grande lucro.

1.7- Objetivos desse trabalho

As larvas de Diatraea saccharalis tem grande importância econômica. Elas

apresentam em seu intestino várias amilases, embora alimentem-se do colmo da

cana, que aparentemente expressa inibidores para esses enzimas.

Seria interessante verificar porque há expressão de mais de uma amilase.

Elas podem ter especificidades diferentes preferindo cadeias mais longas ou

oligossacarídeos menores. A presença de várias amilases pode também ocorrer

por apresentarem respostas diferentes aos inibidores vegetais.

Nosso objetivo nesse trabalho é obter a seqüência das α-amilases

intestinais de D. saccharalis, conseguir formas recombinantes ativas e iniciar a sua

caracterização.

2- Materiais e métodos

2.1- Criação de animais

Inicialmente os animais estudados eram provenientes do laboratório do

prof. J.R.P. Parra (ESALQ-USP). Alguns indivíduos foram trazidos para São Paulo

e mantidos em ambiente climatizado (temperatura média de 25 ºC, umidade do ar

ambiente e fotoperíodo de 11 horas claro/13 escuro) para iniciar uma cultura. As

larvas são mantidas em dieta descrita por Parra e Mishfeldt, 1992.

A fim de observar a indução da expressão de amilases algumas larvas foram

mantidas em dietas variadas: dieta padrão contendo 1% de amido solúvel (m/v),

dieta padrão com 2,5% de amido e dieta com 50% da sacarose padrão mais 2,5%

de amido.

2.2- Dissecção de animais

Os animais foram anestesiados em gelo. O intestino médio foi retirado, e o

epitélio separado da membrana peritrófica (com o conteúdo). O procedimento foi

realizado usando uma solução de NaCl 125 mM. Esses materiais foram

congelados a –20 ºC até o uso. O material contendo membrana peritrófica mais

conteúdo foi homogeneizado em água MilliQ gelada ou em tampão MES 20 mM

pH 6.0, com o auxilio de um homogeneizador tipo Potter-Elvejhm e centrifugado a

9.000 g por dez minutos a 4 ºC. O sobrenadante foi filtrado em lã de vidro e

centrifugado a 20.000 g por 30 minutos. O sobrenadante foi recolhido e teve o

volume final elevado com água MilliQ, de forma a se obter uma concentração de

20 animais por mL. Esse material foi acrescido de PMSF para uma concentração

final de 1mM e mantidos a –20 ºC até o uso. Nos experimentos com as diferentes

dietas foram usados 20 animais em cada uma delas.

2.3- Determinação do pH do lúmen intestinal de D. saccharalis

O pH do lúmen intestinal de D. saccharalis foi medido a partir do conteúdo

do intestino médio do animal dividido em três porções de tamanhos iguais:

anterior, média e posterior. O material foi diluído em 100 µL de indicador de pH

universal Merk (pH 4,0 a 10,0), a coloração resultante foi comparada com escala

colorida e o resultado determinado visualmente. Foram utilizados 10 animais.

2.4- Meios de cultura para crescimento de bactéria e tampões usados nas

técnicas de biologia molecular

Os meios de cultura para o crescimento de células e os tampões utilizados

nas técnicas de biologia molecular foram preparados como descritos por

Sambrook et al. (1989) ou de acordo com o manual para “Pichia Expression Kit”

(Invitrogen).

2.5- Desenho de iniciador degenerado específico para amilases de insetos

Foram selecionadas seqüências de nucleotídeos codificantes de α-amilases

de outros insetos, depositadas em bancos de dados. Para isso foi feita uma

consulta ao "National Center for Biotechnology Information"

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov). Foi realizado um alinhamento múltiplo, usando o

programa Clustal X (1.64b) na sua condição padrão.

O iniciador específico para α-amilases de insetos foi desenhado a partir de

região conservada nessas seqüências (figura 4).

A1- TGG TGG GAR MGS TAY CAR CC

2.6- Desenho de iniciadores específicos para amplificação do cDNA

completo das α-amilases de D. saccharalis

Para amplificação dos cDNAs completos foram desenhados iniciadores

baseados na região não codificante dos fragmentos (após o stop códon), região

não conservada entre elas, sendo eles específicos para cada uma das α-amilases

clonadas (figura 5).

A2- 5' GGT CTT GAT TCC TCA AAT TC 3'

A3- 5' ATA TGC GAA TAC ATT TAT TC 3'

A4- 5' CAG CCA ATT TGA ACA GGA TC 3'

2.7- Desenho de iniciadores de expressão

Três α-amilases de D. saccharalis partir de uma biblioteca de cDNA do

intestino médio do inseto e tiveram suas seqüências depositadas em bancos de

dados. São elas: DSA1 (AY330289), DSA2 (AY333762) e DSA3 (AY333761).

Foram identificadas em colaboração do Dr. Márcio de Castro Silva Filho da

ESALQ-USP duas seqüências possivelmente codificantes de inibidores de α-

amilases na cana-de-açúcar. Essas seqüências foram provenientes do Projeto

Genoma Cana, e foram denominadas IC1 (SCEPSD2071B03.g) e IC2

(SCCCCL6C03G01.g). Os clones contendo os cDNAs codificantes para essas

seqüências foram adquiridas do Brazilian Clone Collection center (Jaboticabal).

Visando a expressão dessas seqüências, foram desenhados cinco pares de

iniciadores, específicos para cada um dos cDNAs, sendo um iniciador para cada

uma das extremidades. Neles foram introduzidas seqüências especificas das

extremidades, sítios de ligação para enzimas de restrição e os prolongamentos

indicados pelo fabricante das enzimas (New England Biolabs). Quando a enzima

de restrição era a Xho I, uma porção do vetor de expressão era perdida, sendo

esta também inserida no iniciador para manter a integridade do vetor após a

construção.

Os iniciadores construídos foram:

Para a extremidade 3´de DSA1 e DSA2: 5´ CCG CTC GAG AAA AGA GAG GCT TAC

AAG AAT CCC CAC TAT GCA C 3´

Para a extremidade 5´de DSA1: 5´ ATA AGA ATG CGG CCG CTT ACA GTC TTG

ACT GAT CAC C 3´

Para a extremidade 5´de DSA2: 5´ ATA AGA ATG CGG CCG CTT AAA GAC GAC

TCT CAG TTC C 3´

Para a extremidade 3´de DSA3: 5´ GGA ATT CTA CAA AAATCC CCA CTA TGC AC

3´

Para a extremidade 5´de DSA3: 5´ ATA AGA ATG CGG CCG CTT ACA ACC TCG

ACT CAT CAC C 3´

Para a extremidade 3´de IC1: 5´ GGA ATT CAG GAC TAA CTG GTG CGA GCC AG

3´

Para a extremidade 5´de IC1: 5´ ATA AGA ATG CGG CCG CTT AAT CGG TTG TTG

TTT GTT C 3´

Para a extremidade 3´de IC2: 5´ CCG CTC GAG AAA AGA GAG GCT GCA GCG

CTG CCG GTG TAC GAC 3´

Para a extremidade 5´de IC2: 5´ GGA ATT CTT ACA GAA GCA CCG CTT CCG G 3´

2.8- Reação em cadeia com DNA polimerase em termociclador (PCR)

As reações de PCR foram realizadas em tampão Tris-HCl 10 mM pH 8,4

contendo KCl 50 mM, gelatina 0,01 % (p/v), Triton X-100 0,1 % (p/v), MgCl

1,5

mM e dNTP 0,2 mM. Os iniciadores foram usados em uma concentração final de 1

µM juntamente com 5 U de Taq DNA Polimerase. As reações foram realizadas em

um termociclador 9700 (Applied Biosystems). A reação é iniciada por um

aquecimento por 2 minutos a 94 ºC, seguida de trinta ciclos de 94 ºC por 45

segundos, 57 ºC por 30 segundos e 72 ºC por 90 segundos, e concluída com 10

minutos a 72 ºC para finalizar o alongamento das fitas amplificadas. Como DNA

molde foram usados biblioteca de cDNA de D. saccharalis, plasmídeos purificados

onde o cDNA de interesse estava clonado, ou então a partir de colônias de

bactérias transformadas com o plasmídeo contendo o fragmento de DNA de

interesse. Quando a biblioteca ou colônias eram usadas para a reação havia

primeiro uma incubação de 10 minutos a 94 ºC para promover a lise dos fagos ou

das bactérias.

Quando foi utilizado o iniciador degenerado A1, foram usadas temperaturas

variadas (45 à 55ºC) para anelamento, buscando o produto mais específico. A1 foi

usado em conjunto com um dos iniciadores T3 (5´ ATT AAC CCT CAC TAA AGG

GA 3´) e T7 (5´ TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG 3´) que anelam nos braços do

fago vetor da biblioteca nas vizinhanças do sítio múltiplo de clonagem.

Para a realização dos PCRs para clonagem do cDNA completo das amilases

foram usados os iniciadores T3 e T7 e um dos iniciadores específicos (A2, A3 e

A4).

Nos PCRs para clonagem em vetor de expressão o inserto de interesse for

amplificado usando os pares de primers específicos para cada um, descritos na

sessão 2.5.

2.9- Eletroforese em gel de agarose para DNA

Os fragmentos de DNA derivados da amplificação por PCR ou da digestão de

plasmídeos com enzimas de restrição foram analisados em eletroforeses em gel

de agarose. Os géis foram preparados na concentração final de 1 % (p/v) de

agarose em tampão TAE (Tris-Acetato 8 mM, EDTA 0,4 mM, pH 8,5) e as

amostras de DNA eram resolvidas em uma diferença de potencial de 80-100 V.

Ao material a ser separado por eletroforese foi adicionado um tampão de amostra

(0,1 volumes da amostra) contendo azul de bromofenol. Este último era usado

para monitorar a migração da amostra e determinar o encerramento da

eletroforese. Após a eletroforese, o DNA era evidenciado utilizando-se brometo de

etídio (0,5 mg/mL) e visualizado em transiluminador de luz UV (312 nm).

2.10- Purificação de DNA do gel de agarose

Os fragmentos de DNA foram recuperados diretamente dos géis de agarose

usando um protocolo de extração QIAEX II (Quiagen), o qual baseia-se na

dissolução da agarose em um tampão de alta força iônica e ligação do DNA a uma

resina de troca iônica. O DNA era eluído da resina de troca iônica usando 10 µL

de água Milli-Q autoclavada, com pH previamente acertado para 7,0-8,0.

2.11- Dupla digestão de DNA usando enzimas de restrição

As seqüências dos cDNAs a serem clonados foram analisadas usando o programa

Webcutter 2.0 (http://rna.lundberg.gu.se/cutter2), permitindo a escolha de duas

enzimas de restrição que agissem no sítio de clonagem do vetor, mas que não

teriam ação nos cDNAs clonados.

A seqüência de nucleotídeos reconhecida pela enzima escolhida foi

adicionada no iniciador específico, antes da região seqüência específica. Isso

possibilita conseguir um cDNA contendo esses sítios de restrição nas duas

pontas, e após digestão torná-la coesiva com o sítio de clonagem do vetor

digerido. Os produtos de PCR purificados de gel de agarose, e o plasmídeo pPIC9

sofreram digestão por duas enzimas de restrição simultaneamente.

Os produtos de PCR resultantes da amplificação dos cDNAs codificantes

para DSA1 e DSA2, assim como 8 µg de pPIC9 foram digeridos com 10 U das

enzimas de restrição XhoI e NotI em tampão 3 contendo BSA (enzimas e tampão

fornecidos pela New England BioLabs).

Os produtos de PCR resultantes da amplificação dos cDNAs codificantes

para DSA3 e IC1, assim como 8 µg de pPIC9 foram digeridos com 10 U das

enzimas de restrição EcoRI e NotI em tampão para EcoRI contendo BSA ( New

England BioLabs).

O produto de PCR resultante da amplificação do cDNA codificante para IC2,

assim como 4 µg de pPIC9 foram digeridos com 10 U das enzimas de restrição

XhoI e EcoRI em tampão para EcoRI contendo BSA (New England BioLabs).

Todas as digestões foram realizadas por 16 horas a 37 ºC. Os produtos de

digestão foram então resolvidos em gel de agarose 1 % (p/v) e purificados do gel

como descrito anteriormente.

2.12- Ligação de fragmentos de DNA a plasmídeos vetores

Para clonagem de fragmentos de DNA obtidos de amplificações por PCR,

sem fazer uso de extremidades coesivas, foi utilizado o Kit de ligação pGenT-Easy

vector Sistem I (Promega). Nesse foi usada uma mistura que consistia em 1 µl de

T4 DNA ligase, 1 µg de plasmídeo, o produto de PCR purificado e tampão

apropriado. Essa mistura foi encubada por 16 h a 4 ºC. O produto de ligação foi

usado para transformar bactérias competentes.

Para ligação de fragmentos de DNA obtidos por dupla digestão com enzima

de restrição, 4 ug de pPic9 e os fragmentos codificantes das proteínas a serem

expressas, todos contendo extremidades coesivas, pois sofreram uma dupla

digestão com as mesmas enzimas de restrição, foram ligados usando a enzima T4

DNA ligase (New England BioLabs). Foi montada uma reação contendo uma

proporção de plasmídeos: inserto de 1:1. A mistura de reação continha 200 U de

T4 DNA ligase em tampão fornecido pela New England BioLabs juntamente com a

enzima. Essa mistura foi incubada por 16h a 37 ºC. O produto de ligação foi usado

para transformar bactérias competentes.

2.13- Preparação de bactérias competentes

Uma colônia isolada da Escherichia coli da linhagem Xl1-Blue MRF' foi

crescida em LB-Líquido durante 16h, a 37 ºC sob agitação de 250 rpm. Em

seguida 400 mL de LB líquido eram inoculados em 4 mL desta cultura inicial e

mantidos nas mesmas condições anteriores de crescimento até que atingisse uma

DO à 600nm de até 0,375. As células eram então transferidas para tubos de

centrífuga previamente resfriados e mantidos no gelo por 10 minutos. Em seguida,

eram precipitadas por centrifugação (1.600x g; 7 minutos; temperatura ambiente).

O sobrenadante foi descartado e o precipitado contendo as células era

ressuspendido em 10 mL de solução previamente autoclavada de CaCl

60mM em

tampão PIPES 10 mM, pH 7,0 e contendo glicerol 15% (v/v). Esse material era

novamente precipitado por centrifugação (1.000x g; 5 minutos; temperatura

ambiente), o precipitado ressuspendido em solução CaCl

descrita anteriormente

e mantido no gelo por 30 minutos. Após essa incubação realizava-se uma nova

centrifugação (1.000x g; 5 minutos; temperatura ambiente), as células eram

ressuspendidas em 2 mL de solução CaCl

, aliquotadas e mantidas a -80 ºC.

Essas alíquotas continham células prontas para transformação

2.14- Transformação de bactérias competentes

Para a transformação de bactérias foi usada linhagem XL1-blue MRF' de

Escherichia coli competente. Foi adicionado 30 µL de células competentes a um

volume de 10 µL do meio de reação de ligação descrito acima. Essa mistura foi

mantida em gelo por 30 minutos e, em seguida, as células foram submetidas a um

choque térmico a 42 ºC por 2 minutos e retornavam ao gelo por mais 3 minutos.

Adicionou-se então 200 µL de LB-líquido e as células foram mantidas a 37 ºC por

1 h para a recuperação de sua parede celular e expressão do gene de resistência

a ampicilina. Em seguida, 100 µL da mistura de células transformadas eram

adicionados em placas de 100 mm de diâmetro contendo LB-ágar mais ampicilina

(50 mg/mL). As células foram espalhadas nas placas com auxílio de uma alça de

Drigalski e mantidas a 37 ºC durante 16 h.

2.15- Preparação de plasmídeos a partir de cultura de bactérias

As preparações em grande escala de plasmídeos eram feitas a partir de

100 mL de cultura, usando o protocolo Plasmid Midi Kit (QIAGEN). O rendimento e

a pureza das amostras de plasmídeos eram avaliados através de determinação da

absorbância a 260 nm e 280 nm.

As preparações em pequena escala de plasmídeos foram preparados a

partir de 3 mL de cultura de bactérias, crescidas em meio líquido, seguindo o

protocolo "Wizard Miniprep" (Promega).

2.16- Reação de seqüenciamento de DNA

O seqüenciamento de DNA foi feito usando o procedimento baseado no

método de interrupção da reação de polimerização do DNA com o uso de

didesoxiribonucleotídeos (Sanger et al., 1977).

Os iniciadores usados para o seqüenciamento das construções em

plasmídeos pGenT foram SP6 (5´ ATT TAG GTG ACA CTA TAG 3´) para um dos

braços do plasmídeo e pGen (5´ AAC GAC GGC CAG TGA ATT G 3´) ou T7 para

o outro. Para sequenciar a porção central dos cDNAs das amilases clonadas, foi

desenhado durante o processo de clonagem, um iniciador (A5) complementar a

uma região interna das sequencias, cuja seqüência é 5´ GTG GGC CAG CTT

CAG 3´.

No seqüenciamento dos plasmídeos pPIC9 com inserto, foram usados os

iniciadores 3´AOX1 e 5´AOX1, conforme indicado no manual “Pichia Expression

Kit” (Invitrogen) e mais A5 para a porção central dos insertos. A reação de

seqüenciamento foi realizada em uma mistura de reação contendo: 1 µL de

preparação de plasmídeo; 3 µL de iniciador na concentração de 3,2 µM; 2 µL de

"Terminator Ready Reaction Mix" versão 3 (Applied Biosystems); 3 µL de tampão

Tris-HCl 200 mM, pH 9,0; e 5 mM MgCl

para um volume final de 15 µL As

reações foram realizadas em termociclador em um método de 35 ciclos de

incubações seqüenciais de: 45 segundos a 96 ºC, 30 segundos a 50 ºC e 4

minutos a 60 ºC.

Após reação de seqüenciamento, os produtos gerados foram precipitados

adicionando-se 25 µL de acetado de sódio 110 mM, pH 5,2 e contendo 37 µg/mL

de glicogênio em etanol 92 % (v/v). A solução foi agitada e mantida no gelo por 15

minutos. Em seguida o material foi centrifugado (2.000 x g, 30 minutos,

temperatura ambiente). O sobrenadante foi descartado e o precipitado lavado com

etanol 70 % (v/v) gelado. A centrifugação foi repetida (como anterior) e o

sobrenadante descartado. O precipitado foi seco colocando o tubo em placa

aquecida a 90 ºC por 1 minuto. As amostras eram então ressuspensas em 10 µL

de formamida “High dye” (Applied Biosystems). As amostras ressuspensas foram

submetidas ao seqüenciamento no aparelho 3100 Genetic Analyzer (Applied

Biosystems). Nessa técnica de seqüenciamento automático cada um dos quatro

didesoxiribonucleotídeos usados apresentavam-se ligados a grupos fluorescentes

distintos, o que facilita a detecção dos produtos da reação de seqüenciamento na

separação por eletroforese capilar.

2.17- Análise e montagem das seqüências

Os cromatogramas obtidos do seqüenciamento dos diversos clones foram

processados automaticamente para definir a qualidade das bases seqüenciadas,

remover as de baixa qualidade e o vetor. As seqüências de alta qualidade foram

montadas usando o algorítimo Phred-Phrap

(www.phrap.org/phredphrapconsed.html

) (Edwin et al, 1998; Edwin e Green,1998).

Essa montagem consistiu basicamente no alinhamento de seqüências por

similaridade. Alinhamentos só eram considerados se esses tivessem uma

sobreposição de pelo menos 40 bases e uma identidade de pelo menos 95%. Dos

alinhamentos de seqüências era então definida uma seqüência consenso

(somatória de todas as seqüências presentes em um alinhamento) denominada de

cluster. As seqüências resultantes eram comparadas com as depositadas em

bancos de dados, e a porção do plasmídeo próxima ao inserto era comparada

com a seqüência encontrada no manual, para assegurar a integridade das

construções realizadas.

2.18- Comparação das seqüências e montagem de um cladrogama

As seqüências obtidas nesse trabalho foram comparadas com outras

presentes em banco de dados. Para isso, elas foram traduzidas usando o

programa do expasy tools (www.expasy.org/tools/dna.html

) e em seguida utilizou-

se o programa Blastp (www.ncbi.nlm.nih.gov

), nas condições do programa. Com

esse procedimento podemos determinar as % de identidade e similaridade entre

as seqüências.

Para a obtenção do cladrogama foi utilizado o progama Mega 4

(www.megasoftware.net

) (Tamura et al, 2007) e a montagem foi feita por “neighbor

joining”.

2.19- Digestão do plasmídeo

pGenT usando a enzima de restrição EcoRI

Amostras (1 µL da preparação de plasmídeos) foram digeridas com EcoRI

(Promega) usando o tampão e o número de unidades indicadas pelo fabricante. A

mistura de reação era incubada a 1 h a 37 ºC e os produtos separados em gel de

agarose 1 % (p/v).

2.20- Digestão dos vetores de expressão com Sac I

Os plasmídeos pPIC9 contendo os insertos de interesse (aproximadamente

20 µg) foram digeridos com 20 U de enzimas de restrição Sac I em tampão 1

contendo BSA (New England BioLabs). A digestão foi realizada por 16 horas a 37

ºC. Em seguida foram adicionados mais 20 U de enzima de restrição e a mistura

incubada por mais 2 horas a 37 ºC. O produto de digestão foi purificado usando o

“QIAquick PCR Purification Kit (250) (Quiagen)”. O Plasmídeo linearizado foi

eluído em 10 µL de tampão TE. O produto de digestão purificado foi usado no

protocolo de transformação de Pichia pastoris.

2.21- Transformação e expressão de proteínas recombinantes em Pichia

pastoris

A transformação e expressão de proteínas recombinantes em P. pastoris foi

feita de acordo com o manual: “Pichia Expression Kit” (Invitrogen). Para a

expressão de proteínas recombinantes foi usada a linhagem GS115 de P.

pastoris. A transformação foi feita com auxílio de eletroporador Gene Pulser (Bio

Rad) usando aproximadamente 20 µg de plasmídeo pPic-9 linearizado com a

enzima de restrição Sac I. Foram usados plasmídeos contendo os cDNAs das três

diferentes α-amilases clonadas de D. saccharalis e dos dois clones de inibidores

da cana-de-açúcar.

Os cDNAs foram clonados ligando os sítios de restrição presentes nos

iniciadores de expressão específicos, com os encontrados no plasmídeo pPic-9,

em fase de leitura com o peptídeo de secreção do fator α, gerando leveduras

transformadas que secretam a proteína codificada pelo inserto no meio, quando

induzidas.

As colônias transformadas foram plaqueadas em meio mínimo sólido MD-

ágar. As placas foram incubadas por 72 horas a 28 ºC. Somente colônias

transformadas se desenvolvem nesse meio, carente em aminoácidos essenciais,

pois o plasmídeo pPIC9 usado na transformação codifica as enzimas

responsáveis pela síntese de histidina (aminoácido que a levedura não

transformada é incapaz de sintetizar).

Noventa e seis colônias de cada transformação foram repicadas para

placas YPD-ágar contendo o antibiótico geneticina na concentração de 1 mg/mL.

Essas placas eram quadriculadas e numeradas, de forma a identificar as colônias

transformadas. Elas foram então incubadas por 48 horas a 30 ºC. As colônias que

cresceram nessa condição foram replaqueadas em uma placa YPD-ágar contendo

geneticina em uma maior concentração (2 mg/mL). Esse procedimento foi repetido

até atingir a concentração de 4 mg/mL.

As colônias expressando a proteína de interesse foram selecionadas

através de protocolos de mini-expressão. Nesse, 10 tubos contendo 20 mL de

meio líquido YPD foram inoculados com diferentes colônias transformadas com

pPic-9 contendo o fragmento de cDNA de interesse escolhidas ao acaso dentre os

selecionados na maior concentração de antibiótico. Isso foi repetido para cada um

dos cDNAs. O meio foi então incubado por cerca de 24 horas a 28 ºC sob agitação

em agitador orbital.

Após as células terem crescido (DO

600

em cerca de 1.0), o meio de cultura

foi centrifugado (1.900 x g, a temperatura ambiente). O precipitado foi

ressuspenso em água Milli-Q autoclavada e novamente centrifugado (como

anteriormente). Esse último passo foi repetido por mais uma vez. Finalmente, as

células precipitadas foram ressuspensas em 20 mL de meio líquido BMMY , foram

adicionados 200 µL de metanol 100% (v/v) e colocadas a 28 ºC sob agitação em

agitador orbital. A cada 12 horas foram adicionados mais 200 µL de metanol 100%

(v/v). Nesse mesmo período, a cada 24h foram retiradas alíquotas de 1 mL de

meio. Essas alíquotas foram centrifugadas (8.000 x g, a 4 ºC, por 5 minutos) e o

sobrenadante (contendo azida 0,02%) usado para analisar a expressão da

proteína de interesse. A indução foi acompanhada por 120 horas.

Depois de selecionada a colônia de P. pastoris expressando em maior

quantidade a proteína de interesse, foi realizado protocolo de maxi-expressão, em

meio rico (BMMY) e meio mínimo (BMM). Inicialmente foram inoculados 20 mL de

meio líquido YPD. Esse meio foi incubado a 28 ºC sob agitação até alcançar uma

600

de 1.0-2.0. Esse meio foi usado para inocular mais 1 L de meio líquido YPD

que, por sua vez, foi incubado por cerca de 16 horas a 28 ºC sob agitação. Após

incubação, o meio de cultura foi centrifugado (8.000 x g, a 4 ºC, por 5 minutos). O

precipitado foi ressuspenso em água Milli-Q autoclavada e novamente

centrifugado (como anterior). Esse passo foi repetido mais uma vez. Finalmente o

precipitado foi ressuspenso em 1 L de BMMY, adicionados 10 mL de metanol

100% (v/v) e colocado para crescer a 28 ºC sob agitação. A cada 12 horas eram

adicionados mais 10 mL de metanol 100% (v/v). Nesse mesmo período, a cada

24h foram retiradas alíquotas de 1 mL de meio. Essas alíquotas foram

centrifugadas (8.000 x g, a 4 ºC, por 5 minutos) e o sobrenadante (após adição de

azida para uma concentração de 0,02%) usado para analisar a qualidade da

expressão da proteína de interesse. Depois de 96 horas de indução, o meio de

cultura foi centrifugado (8.000 x g, a 4 ºC, por 5 minutos) e o sobrenadante usado

como fonte de proteína recombinante. Esse protocolo foi repetido usando como

meio indutor o BMM. Ambos os meios foram testados nos pHs 6,0, 7,0 e 8,0. Os

materiais resultantes foram mantidos a –20 ºC até o uso.

2.22- Desenho de iniciadores específicos para PCR quantitativo

As seqüências das três α-amilases foram alinhadas usando o programa

ClustalX 1.83 (Thompson, 1997). As regiões escolhidas foram usadas no desenho

de iniciadores que tiveram sua seqüência analisada no programa GeneRunner

3.05 (Lowe,1994) para confirmar a qualidade do iniciador e sua T

2.23- Desenho de iniciadores para clonagem de genes constitutivamente

expressos

Foram buscadas seqüências depositas em bancos de dados, de genes

escolhidos como possíveis normalizadores na reação de PCR quantitativo.

Aquelas pertencentes aos organismos mais próximos à Diatraea saccharalis foram

alinhadas no programa ClustalX. Foram escolhidas regiões conservadas a uma

distância de até 1500 bases da extremidade 3´. Essas foram usadas na

construção de iniciadores degenerados cuja qualidade e T

foram analisadas no

programa GeneRunner (Hastings Software, Inc.).

2.24- Amplificação dos cDNAs dos genes constitutivos

A biblioteca de cDNA de D. saccharalis foi amplificada utilizando os

iniciadores desenhados e T7. A reação de PCR foi realizada utilizando as

condições padrões sugeridas no manual da enzima Taq DNApolimerase. Para

cada iniciador foi realizado um gradiente de temperaturas de anelamento, de 47

até 58 ºC.

2.25- Determinação da concentração de proteínas

A determinação da concentração de proteína presente na amostra foi feita

usando o método descrito por Bradford (1976), com uma curva padrão de

albumina de ovo.

2.26- Diálises

As diálises foram feitas para eliminar o sal presente nas amostras ou para

alterar o tampão do meio. Essas foram feitas contra 200 volumes de água Milli-Q

ou tampão apropriado por três horas, sendo realizadas três trocas da água ou

tampão do banho. A membrana utilizada tinha o limite de exclusão de 12.000 Da.

2.27- Eletroforese em gel de poliacrilamida para separação de proteínas em

condições desnaturantes (SDS-PAGE)

As amostras a serem separadas eletroforeticamente, tiveram o sal retirado,

foram liofilizadas em Speed Vac, ressuspensas em 40 µL de tampão de amostra

(Tris-HCl 62,5 mM, pH 6,8; SDS 2 % p/v; 2-β-mercaptoetanol 0,36 M; glicerol 10 %

v/v; azul de bromofenol 0.0025 % p/v) e, finalmente, mantidas por 3 min em banho

em ebulição.

A eletroforese foi realizada em placa fina de poliacrilamida na presença de

SDS utilizando-se o sistema descontínuo de tampões descrito por Laemmli (1970).

Foram usados géis de corrida na concentração de poliacrilamida de 12% e o gel

de empilhamento na concentração de 4 %, ambos contendo SDS 0,1 %. A

eletroforese foi realizada em voltagem constante de 200 V à temperatura

ambiente. A eletroforese era terminada quando o azul de bromofenol, utilizado

como marcador de frente, estivesse na borda inferior da placa.

2.28- Detecção de proteína nos géis

O gel a ser corado foi fixado em solução contendo metanol 50 % (v/v), ácido

acético 12 % (v/v) e formaldeído 0,025 % (v/v) e submetidos ao método de

coloração desenvolvido por Blum et al. (1987).

2.29- Cromatografia de filtração em gel

A fim de trocar o tampão onde se encontrava a proteína induzida, foi

realizada uma cromatografia de filtração em gel, sendo o meio rico proveniente da

indução de IC1 utilizado como amostra.

A cromatografia foi realizada manualmente, com o uso de seringas. Foi

usada uma coluna HighTrap Dessalting e tampão CAPS 100mM pH 9,5 ou PIPES

100mM pH7,0. Inicialmente, a coluna foi equilibrada com 10 mL de tampão. Em

seguida, 1,5 mL de amostra foi aplicada. Por fim foram aplicados mais 10 mL de

tampão, para eluição, onde foram coletados os dois primeiros mililitros.

2.30- Cromatografia de troca iônica em baixa pressão

A cromatografia foi realizada em sistema AKTA (Pharmacia) à temperatura

ambiente em tampão CAPS 20 mM, pH 10,5. Foi utilizada a coluna HighTrap Q

(Amersham Biociences) de 5 mL de volume. A coluna foi inicialmente equilibrada

com tampão em quantidade igual a 5 volumes da coluna.

Após a aplicação da amostra no mesmo tampão, o material foi eluído com

um gradiente de concentrações crescentes de NaCl. Primeiramente, a coluna foi

lavada com 20 mL de tampão inicial, sendo retiradas proteínas que não se ligaram

à resina. Em seguida, o material retido foi eluído em um gradiente de 100 mL de 0

a 1 M de NaCl em tampão. Finalmente, a coluna foi lavada com 20 mL de tampão

contendo 1 M de NaCl no intuído de retirar qualquer proteína ainda ligada à

coluna. Em todos os passos foram coletadas frações de 2 mL.

2.31- Cromatografia de troca iônica em sistema de alta pressão

A cromatografia foi realizada em sistema AKTA (Pharmacia) à temperatura

ambiente em tampão CAPS 20 mM, pH 10,5. Foi utilizada uma coluna Resource Q

(Pharmacia) de 1 mL de volume. A coluna foi inicialmente equilibrada com tampão

em quantidade igual a 5 volumes da coluna.

Após a aplicação da amostra no mesmo tampão, a coluna foi eluída com

um gradiente de concentrações crescentes de NaCl. Essa cromatografia tem

basicamente 4 fases. Na primeira a coluna foi lavada com 5 mL de tampão inicial,

sendo retiradas proteínas que não se ligaram à resina. Na segunda, proteínas

foram eluídas com um gradiente de 22 mL de 0 a 500 mM de NaCl em tampão,

aonde foi retirada da coluna a proteína de interesse. Em seguida, a coluna foi

lavada com um gradiente de 3 mL de 500 mM a 1 M de NaCl. Finalmente, a

coluna foi lavada com 5 mL de tampão contendo 1 M de NaCl no intuído de retirar

qualquer proteína ainda ligada à coluna. Desde o momento da aplicação da

amostra até o lavado final, todo material eluído da coluna foi coletado em frações

de 0,4 mL.

2.32- Detecção da atividade de α-amilase e α-glicosidase

Ensaios de amilase foram realizados usando amido solúvel a 0,5% como

substrato, NaCl 10 mM, CaCl

1mM e a concentração de tampão 100mM no pH

apropriado. Foram realizados ensaios de 4 tempos ou um só tempo (para

determinação de atividade após cromatografias), a 30 ºC. A clivagem do substrato

foi medida pela quantificação de grupos redutores formados, usando o reagente

ácido dinitrosalicílico (DNS; Noelting & Bernfeld, 1948).

A α-glicosidase foi ensaiada a 30ºC, por quatro tempos, utilizando p-

nitrofenil-α-D-glicosídeo 1,25 mM como substrato, em tampão Gly-NaOH pH 9,0. A

reação foi interrompida como descrita por Terra et al (1979).

2.33- Ensaios de estabilidade ao congelamento

Meio mínimo proveniente da indução de DSA1 e DSA2 foram aliquotados

em seis tubos. Esses foram congelados (-20 ºC) e descongelados

sucessivamente, de forma que cada um deles tenha sido congelado diferentes

vezes (de zero a cinco). Ao término do procedimento a atividade remanescente foi

medida em cada tubo.

2.34- Detecção da atividade inibitória de IC1

A atividade do inibidor expresso foi verificada ensaiando o meio proveniente

da indução de IC1 após troca de tampão por cromatografia de filtração em gel com

diferentes α-amilases. Foram elas: as amilases recombinantes de D. saccharalis

(DSA1, 2 e 3 ), α-amilase pancreática de porco, α-amilase salivar humana, e α-

amilase bacteriana (Bacillus sp).

Os ensaios foram feitos em tampão CAPS pH 9,5 (DSA1) e PIPES pH 7,0

(as demais) usando as mesmas condições dos ensaios padrão de atividade. A

quantidade de enzima usada foi tal que na ausência do inibidor (controle) a

absorbância máxima obtida no ensaio seja 1,000. As enzimas foram diluídas no

tampão apropriado e foram misturados 12,5 µL de enzima com 12,5 µL do inibidor.

Isso foi incubado a 30 ºC por uma hora. Em seguida foram adicionados 25 µL de

substrato (amido 1%, NaCl 20 mM e CaCl

2mM em tampão CAPS ou PIPES) e a

atividade amilásica foi medida. Todos os tampões tinham uma concentração de

100 mM.

Foi utilizado também meio de cultura proveniente da indução de IC1

concentrado duas vezes em membrana centriplus com limite de exclusão de 3.000

Da, após troca de tampão com uso de uma coluna HighTrap Dessalting para

CAPS 100 mM, pH 9,5.

2.35- Determinação do pH ótimo das enzimas

Os ensaios para determinação do efeito do pH foram realizados com

solução tampão 100 mM. Para valores de pH de 5,5 a 6,5 foi usado tampão MES;

de pH 6,5 a 7,5 PIPES; de 7,5 a 8,0 HEPES; de 8,0 a 8,5 TAPS; de 8,5 a 10,5 Gly-

NaOH ; de 10,0 a 11,0 CAPS. Os pHs dos tampões foram medidos nas misturas

de reação a 30ºC. Esse cuidado é necessário porque o pKa de alguns grupos são

alterados pela temperatura.

2.36- Estabilidade ao pH

Para determinar a faixa de pH em que as enzimas estudadas são estáveis

por um período de tempo que possibilite a realização dos experimentos, na

temperatura em que esses são realizados, DSA1 e DSA3 foram incubadas em

diferentes pHs, a 30 ºC por 1,5 e 3 horas. Material proveniente da indução e

previamente dialisado contra tampão 20 mM no pH ótimo foi diluído 2 vezes em

tampão 200 mM para os diferentes pHs, incubado, diluído no mínimo 10 vezes em

tampão 100 mM no pH ótimo e ensaiado.

2.37- Inativação térmica das amilases

As enzimas recombinantes e a fração solúvel do conteúdo do ventrículo

foram incubadas a 50ºC em em tampão Gly-NaOH 100mM pH 9,0. Após

diferentes períodos de tempo alíquotas foram removidas e a atividade

remanescente determinada.

2.38- Modificação com EDC

As enzimas recombinantes DSA1 e DSA3, assim como o homogeneizado

do conteúdo do ventrículo do animal, após diálise, foram mantidos por diferentes

períodos de tempo na presença de 1-etil-3-(dimetilamino-propil)-carbodiimida

(EDC) 20 mM e glicina-etil-ester 100 mM. A reação de modificação foi

interrompida pela adição de citrato de sódio 200 mM e teve a atividade residual

determinada.

2.39- Determinação da constante de Michaelis (Km) para diferentes

substratos

Em todas as determinações mediu-se a velocidade inicial de hidrólise em

dez concentrações diferentes do substrato. Os valores da constante de Michaelis

foram calculados pelo método dos mínimos quadrados usando o software Enzfitter

2.0 (LeatherBarrow, R.J., Elsevier-Biosoft, 1987). Os substratos usados foram

amilose, amido e glicogênio. Como amilose é insolúvel em água, foi utilizado

DMSO para solubilizá-la, estando o solvente presente em uma concentração final

de 5%. Para efeitos de comparação, o Km para amido foi determinado na

presença e ausência de DMSO.

2.40- Medida da processividade (grau de ataque múltiplo)

O grau de ataque múltiplo de uma glicosidase é definido como o número de

ligações glicosídicas hidrolisadas após a primeira, durante a existência de um

único complexo enzima-polissacarídeo (Robyt and French, 1967). Ensaios

realizados sobre amido de acordo com o item 2.32 foram misturados com 20

volumes de etanol. A mistura foi então incubada a –20 ºC por 1 hora, sendo então

centrifugada a 4 ºC por 10 minutos a 15.000g. Separou-se o sobrenadante do

precipitado e posteriormente evaporou-se o solvente dos materiais sob vácuo à

temperatura ambiente. Após a liofilização, a quantidade de grupos redutores

presentes em cada fração foi quantificada com a técnica do ácido dinitrossalicílico

(Noelting e Bernfeld, 1948).

2.41- Cromatografia em camada delgada dos produtos de ação enzimática

Foi realizado ensaio enzimático das α-amilases recombinantes, usando

amilose como substrato. Esses foram tratados como no ítem 2.40, sendo utilizada

apenas a fração solúvel em etanol. O material liofilizado foi ressuspendido em 10

µL de água MilliQ, sendo aplicado 2 µL em uma placa de cromatografia delgada

de sílica ALUGRAM

SIL G (MACHEREY-NAGEL, Germany). A fase móvel usada

para a separação foi butanol:etanol:água 50/30/20 (v/v/v), sendo a cromatografia

realizada em atmosfera saturada com a fase e ao longo de 15 cm da placa

cromatográfica. Os carboidratos presentes foram evidenciados pela técnica do

fenol-ácido sulfúrico (Stahl, 1969).

2.42- Determinação da sensibilidade das amilases recombinantes a

diferentes inibidores

Foram utilizados αAI1 e αAI2 de feijão comum semi-purificados, cedidos

pela prof. Fátima Grossi-de-Sá (CENARGEN). Também foram usados os

inibidores de α-amilase do trigo (Triticum aestivum) tipo I (IT1) e tipo III (IT3),

comprados da SIGMA. Os inibidores de feijão foram usados na concentração de

0,5 mg/mL e os de trigo 0,125 mg/mL.

As enzimas foram incudadas com os inibidores por uma hora a 30 ºC e em

seguida teve a atividade de amilase medida. Para melhor ilustrar a atividade dos

inibidores, foram realizados ensaios com as amilases salivar humana e

pancreática de porco, da mesma forma que as com as enzimas expressas.

2.43- Modelagem estrutural de DSA1

A seqüência de aminoácidos da proteína DSA1 de D. saccharalis foi

analisada com o programa Signal IP (Nielsen et al, 1997), disponível no ExPASy

Proteomics Server (www.expasy.org), para predição de possíveis regiões de

Clivagem para peptídeo sinal.

A seqüência correspondente a proteína madura de DSA1 foi submetida à

modelagem estrutural por homologia no SWISS-MODEL Protein Modelling Server

(http://swissmodel.expasy.org), nas condições padrão do programa. O modelo

gerado no formato pdb foi visulizado e analizado usando o programa Swiss-

PdbViewer, disponível no mesmo servidor (Schwede et al (2003), Guex e

Peitsch(1997) Peitsch (1995)).

3- Resultados e Discussão

3.1- Instalação da cultura de D. saccharalis no laboratório e verificação de

seu crescimento em dietas modificadas

Os indivíduos provenientes de Piracicaba levaram aproximadamente 40

dias para atingir o estágio de pupa. Esse período é um pouco maior do que o

observado em seu local de origem onde levam em torno de 30 dias. Isso pode ser

explicado por uma diferença das temperaturas médias onde as culturas são

mantidas. No laboratório ela é controlada e mantida próxima dos 25 ºC. Em

Piracicaba a temperatura é ambiente, podendo ser mais elevada.

As pupas transformaram-se em adultos saudáveis, que foram colocados em

gaiolas para acasalamento. Os ovos depositados foram coletados e eclodiram em

aproximadamente sete dias. As larvas foram colocadas em dietas normais, a fim

de dar continuidade a cultura. Essa geração repetiu o padrão de desenvolvimento

da anterior.

Larvas também foram criadas em dietas experimentais, visando observar se

dietas com concentrações variadas de sacarose e amido alteram o padrão de

desenvolvimento dos animais e a expressão de α-amilases. Os animais das

diferentes dietas e controle foram retirados após 30 dias, anestesiados em gelo,

pesados e dissecados. Foi contado o número de larvas e de pupas e foi

determinado o peso das larvas e a atividade de amilase no seu intestino médio

(Tabela 1).

Não há diferença significativa no peso das larvas e as diferenças

observadas quanto ao número de pupas e de mortos não é muito grande. Esses

resultados mais atividade de α-amilase estão apresentados na Tabela 1.

Aparentemente não houve grande diferença no desenvolvimento das larvas

nas várias dietas. Quando o conteúdo luminal mais a membrana peritrófica foram

homogeneizados em água, a atividade de amilase encontrada nas dietas com

maior quantidade de amido foi menor que na dieta controle (Tabela 1). Entretanto,

quando a homogeneização foi feita em pH 6,0, a atividade amilásica é claramente

dependente da quantidade de amido presente na dieta, não sendo influenciada

pela diminuição da quantidade de sacarose (Tabela 1).

O homogeneizado feito em água estava na concentração de 20 intestinos

médios por mL, o que provavelmente fez com que o pH ficasse perto do

fisiológico, no qual as amilases interagem com o substrato e sedimentam junto

com esse quando é feita a centrifugação. A recuperação de amilase no sedimento

após centrifugação do conteúdo luminal já foi vista em S. frugiperda (Ferreira et al,

1994) e em Musca domestica (Terra et al, 1990). Quando o homogeneizado do

intestino médio de D. saccharalis foi obtido em pH 6,0, provavelmente as enzimas

não ligam-se mais ao substrato e são recuperadas na fração solúvel.

Embora nós não tenhamos utilizado essas dietas com amido para outros

experimentos, quizemos deixar o resultado registrado para que o dado possa ser

usado em experimentos futuros. O aumento na atividade amilásica pode ser

vantajoso no laboratório, para experimentos feitos com esse animal, mas não

parece causar nenhuma vantagem para o desenvolvimento das larvas. Talvez a

possibilidade de obter mais energia da degradação do amido (e posterior absorção

de glicose) seja contrabalançada por um aumento na viscosidade do bolo

alimentar, o que dificultaria a sua digestão (Adeola e Bedford, 2004; Palander et al

2005).

3.2- Determinação do pH do lúmen intestinal de D. saccharalis

Os valores de pH encontrados para as três diferentes regiões do intestino

médio de D. saccharalis foram: 8,7±0,6 na porção anterior, 9,0±0,4 na porção

média e 8,7±0,3 na porção posterior, coerente com o esperado em lepidópteros

(Terra e Ferreira, 2005).

3.3- Clonagem do cDNA codificante das α-amilases de D. saccharalis e seu

seqüenciamento

O alinhamento das seqüências de α-amilases de insetos depositadas em

bancos de dados mostrou diversas regiões conservadas. Para o desenho do

iniciador degenerado foi escolhida a região conservada mais próxima da

extremidade 5' da fita codificante das α-amilases de insetos (Figura 4), a fim de

obter um fragmento de maior tamanho possível. Para tal, a extremidade 3' do

iniciador está voltada para a extremidade 3' da fita codificante. O fragmento

amplificado teria tamanho aproximado de 1500 pb, tendo como base a α-amilase

de T. molitor (Strobl et al, 1997). O iniciador desenhado apresenta degenerações

pois a região escolhida não é completamente conservada.

Na amplificação da biblioteca de D. saccharalis, usando os iniciadores A1 e

os que anelam no braço do fago (T3 ou T7, pelo fato da biblioteca ser não

direcional, estando o inserto ligado em ambos os sentidos) observou-se após

eletroforese, um único material majoritário com tamanho próximo ao esperado

(Figura 5).

O produto do PCR que se mostrou mais específico (usando o inciador T7 e

53 ºC de temperatura de anelamento) foi purificado do gel , ligado em plasmídeo

pGenT e usado para transformação de bactérias competentes. Os plasmídeos

foram purificados e digeridos com EcoRI. O produto da digestão foi analisado em

gel de agarose e mostrou a presença de insertos de diversos tamanhos. Foram

selecionados para seqüenciamento insertos que apresentaram tamanhos

próximos ao previsto (1500 pb) e aleatoriamente alguns de menor peso molecular

(Figura 6).

Nas reações de seqüenciamento, foram usados os iniciadores que anelam

no braço do plasmídeo SP6 e pGen, sendo uma reação para cada clone e para

cada iniciador.

Dos fragmentos de cDNA seqüenciados, dez codificavam α-amilases

diferentes. Entre eles, cinco codificavam uma delas, quatro codificavam outra e

apenas um codificava a terceira sendo esse de tamanho menor (750 pb). Essas

seqüências foram chamadas de DSA1, DSA2 e DSA3 respectivamente.

As seqüências de aminoácidos das proteínas que supostamente são

codificadas por esses cDNAs foram comparadas entre si, levando a acreditar que

realmente se tratavam de três proteínas diferentes já que mesmo as mais

semelhantes apresentam apenas 95% de identidade e 97% de similaridade

(Tabela 2).

Com base nos fragmentos obtidos, foram desenhados iniciadores

específicos para cada uma das seqüências (Figura 7). Foram realizadas

amplificações com os iniciadores específicos contra T3 e T7, usando como DNA

molde alíquotas da biblioteca de D. saccharalis. O produto de PCR foi então

separado em gel de agarose. Os cDNAs amplificados (Figura 8, raias R1 a R6)

mostraram-se maiores que os fragmentos inicialmente clonados (raias C1 a C3),

evidenciando que eles poderiam efetivamente conter a extremidade 5' do cDNA.

A banda mais evidente em cada amplificação com o iniciador T3 foi

recortada do gel e purificada, para clonar apenas os produtos de interesse.

O produto da purificação foi usado para ligação em plasmídeo pGen-T e

transformação de bactérias competentes. Após a transformação, parte das células

das colônias selecionadas serviu de molde em um PCR para se verificar os

insertos contidos em seus plasmídeos (Figura 8). Foram selecionados os insertos

que teriam o tamanho esperado (aproximadamente 2000 pb) uma vez que teriam

maior probabilidade de ser uma seqüência completa de cDNA codificante da α-

amilase.

Outra parte das células das colônias selecionadas foram crescidas em meio

líquido (LB+ampicilina), tiveram seus plasmídeos purificados e então

seqüenciados. Nesse seqüenciamento foram usados os iniciadores T7 e SP6.

Esse seqüenciamento resultou em três seqüências completas codificantes

de α-amilases (Figura 9). Todas as α-amilases clonadas apresentam alta

homologia com outras já seqüenciadas, principalmente de lepidópteros e demais

insetos (Tabela 2). Quando comparadas com a seqüência da amilase de T. molitor

(Stroebl et al, 1997) observamos que os resíduos catalíticos, bem como os de

ligação a Ca

são conservados. Já dentre os resíduos de ligação à Cl

um dos

resíduos de arginina de T. molitor é substituído por glutamina nas três amilases

clonadas (Figura 9). Isso é um indicativo de que elas não sejam ativadas por esse

íon, como já foi observado em outras amilases de Lepidoptera (Terra e Ferreira,

2005).

Para predizer a massa molecular e o pI das proteínas a partir da seqüência

foi utilizado o programa Compute pI/MW, do expasy tools. A massa molecular

predita a partir das seqüências é muito semelhante para DSA1, DSA2 e DSA3:

54.505; 54.488 e 54523, respectivamente. Os pIs teóricos preditos foram de 6,44;

5,53 e 6,41 (DSA 1, 2 e 3 respectivamente). DSA2 não apresenta nenhum sítio de

n-glicosilação, enquanto DSA1 apresenta 1 e DSA3 apresenta dois desses sítios.

3.4- Construção dos vetores de expressão e transformação de Pichia

pastoris

Para assegurar a qualidade dos cDNAs usados como molde para

amplificação com os iniciadores de expressão, foram realizados seqüenciamentos

dos plasmídeos contendo os insertos de interesse. Eles estavam clonados no

plasmídeo pGenT, que possui regiões para ligação dos iniciadores T7 e SP6, nas

extremidades do inserto. Além desses iniciadores, também foi usado o iniciador

A5, desenhado para amplificar a região interna dos cDNAs codificantes para as α-

amilases, descrito anteriormente. Os insertos codificantes dos inibidores IC1 e IC2

estavam clonados em pSport1, e foram seqüenciados usando os iniciadores SP6

e T7. O cromatograma desses seqüenciamentos não se mostrou com qualidade

confiável, porém demos continuidade aos experimentos.

Os plasmídeos que se mostraram íntegros foram então amplificados com os

iniciadores de expressão por PCR. Os iniciadores de expressão desenhados para

amplificar as α-amilases se mostraram eficientes. O produto do PCR com os pares

de iniciadores específicos tendo o clone cujo cDNA codifica a enzima de interesse

como DNA molde, apresentou uma única banda quando resolvido em gel de

agarose (Figura 10). Os iniciadores de expressão desenhados para amplificar IC1

também se mostraram eficientes, porém IC2 apresentou diversas bandas, sendo

então recortada do gel a de tamanho esperado para clonagem.

Para clonagem dos produtos em pPIC9, os mesmos foram resolvidos em

gel de agarose e purificado do gel. O produto de PCR purificado e o plasmídeo

pPIC9 sofreram uma dupla digestão e foram ligados. O produto da ligação foi

usado na transformação de E. coli, que foram usadas para realizar preparações de

plasmídeos. Esses foram seqüenciados e tiveram suas seqüências analisadas,

sendo evidenciada a integridade da construção, estando a seqüência inserida em

fase correta de leitura e não apresentando mutações. Apenas na construção de

IC2 foi seqüenciado um inserto que não correspondia ao cDNA de interesse, não

sendo usado na transformação. Um esquema das construções geradas pode ser

observado na figura 11. De cada tipo de célula transformada, 96 colônias foram

repicadas em placas contendo o antibiótico geneticina, e tiveram a incorporação

do inserto em seu DNA genômico confirmada por PCR utilizando as células

lisadas e os mesmos iniciadores específicos que foram usados na clonagem.

3.5- Expressão das α-amilases recombinantes em Pichia pastoris

As colônias transformadas com cada uma das construções foram

selecionadas com geneticina até a concentração de 4 mg/mL e então crescidas e

induzidas em meio rico (mini-expressão). Os clones transformados com DSA1 e

DSA2 apresentaram diversos transformantes com atividade em seu meio de

cultura (Tabela 3). Essa atividade é proveniente da secreção da α-amilase

expressa. Confirmamos a atividade α-amilásica através de um controle negativo

(P. pastoris transformada com plasmídeo sem inserto), que não apresentou em

seu meio de cultura atividade sobre amido. Para cada um dos grupos de clones,

aquele que apresentou a maior atividade em seu meio, foi selecionado para uma

maxi-expressão. Nesse processo as alíquotas retiradas tiveram a atividade

medida e o total de proteína quantificado, para calcular a atividade específica

(Tabela 4). Além disso as aliquotas foram resolvidas em SDS-PAGE (resultado

não mostrado).

DSA1 é expressa tanto no meio mínimo quanto no meio rico em

quantidades semelhantes. Decidimos utilizar para estudo dessa enzima a

expressão em meio mínimo porque ela é obtida com o dobro da atividade

específica (tabela 4). Para estudos cinéticos será utilizado meio após três dias de

indução, período em que a atividade específica no meio chega no máximo.

Quando a levedura é transformada com cDNA que codifica DSA2, só foi

possível encontrar atividade de α-amilase com expressão em meio rico de

expressão. No meio mínimo toda a atividade é perdida, enquanto no meio rico a

maior parte da atividade é mantida. Foi observada uma alta atividade enzimática

no meio rico após 5 dias de indução, porém observa-se uma maior contaminação

de proteínas após o terceiro dia de indução, não sendo essa estratégia ideal para

produzir proteína recombinante para estudo.

Visando melhorar o rendimento e qualidade das proteínas expressas,

tentamos induzir a expressão em diferentes pHs. Tendo a informação do

fabricante do kit de expressão que a levedura usada (P. pastoris) se desenvolve

bem entre os pHs 6,0 e 8,0, foram realizados experimentos para verificar a

quantidade de proteína expressa que se encontra ativa no meio de cultura durante

a indução nos pHs 6,0, 7,0 e 8,0. O pH das alíquotas foi medido assim como a

atividade enzimática das α-amilases por 72 horas. Os pHs não se alteraram

durante a indução, com exceção dos meios em pH 8,0, que estavam em torno de

7,5 após 72 horas de indução.

As medidas de atividade estão apresentadas na Tabela 5. DSA1 apresenta

atividade tanto em meio rico quanto em mínimo, nos pHs 6,0 e 7,0, a partir de 24

horas de indução. Em pH 8,0 apenas após 72 horas é observada atividade. DSA2

apresenta atividade a partir de 24 horas de indução em meio rico pH 7,0, e nos

demais a partir de 48 horas de indução, com exceção dos meios em pH 8,0 que

não apresentaram atividade. Para ambas as enzimas o pH 7,0 foi aquele em que

se observou maior atividade. Como em meio mínimo DSA2 se inativa após

congelamento, mesmo ajustando o pH para 8,0 (onde foi verificada a estabilidade

da enzima ao congelamento quando em meio rico) usaremos meio rico para DSA2

e meio mínimo para DSA1, ambos em pH 7,0, para obtenção das enzimas.

Os clones transformados com DSA3 não apresentaram atividade α-

amilásica em seu meio. Isso pode ter ocorrido por alguma falha na construção

usada na transformação, que não foi detectada na análise do seqüenciamento ou

por expressão da proteína inativa. O protocolo foi repetido desde a clonagem no

vetor de expressão, apenas para DSA3.

Nessa segunda tentativa, foram observados clones com atividade, e aquele

com maior atividade foi escolhido para maxi-expressão. Como as três enzimas

tem seqüência muito conservada, e provavelmente propriedades físicas

semelhantes, foi feita a maxi-expressão em pH 7,0, pois foi o mais adequado para

as outras duas amilases, sendo testados tanto o meio rico quanto mínimo. Foi

observada atividade muito maior (em torno de cinco vezes) em meio rico sendo

então usado este, após três dias de indução, como fonte de enzima para os

estudos posteriores.

Em todos os meios de cultura, após indução da expressão das amilases foi

feito ensaio para detectar atividade de α-glicosidase com p-nitrofenil-α-glicosídeo.

No ensaio utilizou-se uma concentração de enzima 100 vezes maior que a

utilizada no ensaio de amilase e não foi detectada atividade.

3.6- Expressão dos inibidores de cana-de-açúcar recombinantes em Pichia

pastoris

Os clones transformados com IC1 tiveram inicialmente sua expressão

testada por um ensaio de inibição de α-amilases. Nenhuma das enzimas testadas

foi inibida, nem com o inibidor concentrado. A ineficiência na inibição pode ter

ocorrido por uma série de fatores, como baixa concentração de inibidor no meio,

pH impróprio para a ligação enzima-inibidor, inespecificidade do inibidor para as

enzimas testadas, ou expressão de inibidor inativo. Para confirmar a presença de

proteína expressa, os meios de cultura induzidos foram resolvidos em SDS-PAGE

(Figura 12). Como o meio usado na expressão é rico em proteínas de baixo peso

molecular (proveniente da peptona), e como a proteína expressa teria massa

molecular esperada de 14 kDa, não foi possível identificar com clareza a presença

de uma banda correspondente ao inibidor.

Devido aos problemas durante a expressão, fizemos estudos mais

aprofundados na sequencia (teórica) dos inibidores comprados e do plasmídeo

recebido.

Foi realizado o alinhamento das sequências dos inibidores IC1 e IC2 com

aquelas disponíveis em bancos de dados, afim de classifica-los dentro das

diversas clases de inibidores de amilase. A partir destas análises foi possível

observar que o inibidor IC1 é semelhante ao inibidor bifuncional encontrado em

RAGI (Panicum miliaceum). Esse inibidor é capaz de atuar sobre amilase e

tripsina, incluindo as amilases de coleóptera (ver Strobl et al, 1998). A expressão

de IC2 é especialmente interessante, pois ele é um inibidor presente em caule

(Falco et al 2001), que é fonte de alimento para a D. saccharalis e ele é um

inibidor semelhante ao inibidor bifuncional RASI, presente em arroz (Orizia sativa),

que atua em pH alcalino (Yamagata et al, 1998) e semelhante ao inibidor de trigo,

que inibe amilases de lepidópteros (Markwick et al, 1996).

Na tentativa de analisar as sequências dos clones codificantes dos

inibidores de cana-de-açúcar, as preparações de plasmídeos foram refeitas e

resequenciadas. Novamente não conseguimos obter resultados de boa qualidade.

Tentamos então excisar o inserto do plasmídeo por digestão com enzimas de

restrição. Conseguimos apenas linearizar o plamídeo. Em contato telefônico com o

Brazilian Clone Collection center (Jaboticabal), recebemos a informação que

alguns dos clones tiveram sua construção alterada, não sendo possível saber

quais seriam as enzimas de restrição ou iniciadores que deveríamos usar. Com

essa informação abandonamos os experimentos com os inibidores de cana-de-

açúcar.

3.7- Clonagem de cDNAs codificantes de proteínas constitutivas

Com o intuito de quantificar a expressão das diferentes α-amilases de D.

saccharalis no intestino médio, foram desenhados iniciadores específicos para

cada uma das seqüências. Eles foram planejados respeitando os requisitos

necessários para a realização de experimentos de PCR em tempo real. Todos

os iniciadores devem ter temperatura de anelamento próximas, pois todas as

reações são realizadas simultaneamente. Devem também amplificar um

fragmento de tamanho entre 100 e 200 pares de base, e ser totalmente

específicos, segundo recomendações do fabricante dos reagentes a serem

utilizados (SYBR Green chemistry, Qiagen).

Foi difícil encontrar regiões distintas entre as seqüências codificantes das

α-amilases, sendo que a maior diferença encontrada foi de quatro nucleotídeos

ao longo de regiões onde se ligariam possíveis iniciadores. Por esse motivo

optou-se por utilizar os iniciadores usados na clonagem, que se mostraram

específicos para os diferentes cDNAs (uma vez que apenas um iniciador

específico seria suficiente para garantir a especificidade da reação), e um

iniciador no interior da seqüência, a uma distância adequada desse primeiro.

Uma porção do alinhamento das duas seqüências mais parecidas (porção

interna) pode ser observada na Figura 13, onde se nota pouca diferença entre

elas, e regiões onde possíveis iniciadores se anelariam. Na Figura 13 se observa

o alinhamento da extremidade 3´ das seqüências, com as regiões onde ligam-se

os iniciadores de clonagem e as regiões para onde os novos iniciadores foram

desenhados.

Para realização dos experimentos de PCR em tempo real, é necessário

conhecer a seqüência de genes que seriam expressos sem alteração nas

diferentes condições estudadas. Esses genes seriam amplificados da mesma

forma que os genes de interesse e seriam usados como normalizadores entre os

diferentes experimentos. Poucos genes de D. saccharalis foram depositados em

bancos de dados e nenhum deles seriam bons constitutivos, pois ou são

regulados, ou são mitocondriais (o que não é interessante, já que estamos

estudando genes nucleares), ou são ribossomais, que são expressos em

quantidade muito maior que os genes estudados (aproximadamente 98% do RNA

da célula é rRNA), dificultando assim a comparação.

Nessa situação foi necessária a clonagem de genes constitutivamente

expressos de interesse. Os genes mais frequentemente usados nesse tipo de

experimento descritos na literatura foram buscados em bancos de dados e

alinhados (α e β-actina, β−tubulina). Eles não se mostraram muito conservados, o

que tornaria difícil a construção de um iniciador degenerado que pudesse ser

usado para amplificar o gene de interesse na biblioteca de D. saccharalis.

Partimos então para escolha de genes bastante conservados e que não

sofressem regulação diferenciada nas diferentes condições de estudo. Foram

escolhidos os genes codificantes das subunidades catalíticas das DNA

polimerases envolvidas em síntese (DNA polimerases α, ∆ e γ) e o gene

codificante da proteína ribossomal S6 (RPS6), utilizado em experimentos de PCR

semi-quantitativo em Spodoptera frugiperda por Bolognesi et al., 2005. Foram

buscadas nos bancos de dados as seqüências codificantes desses genes em

organismos mais próximos evolutivamente à D. saccharalis e alinhadas. As

seqüências usadas nos alinhamentos de cada um dos genes e seus respectivos

códigos de acesso podem ser observadas na Tabela 6. Regiões conservadas

foram usadas no desenho de iniciadores degenerados. Essas regiões estão

destacadas na Figuras 14. Os iniciadores desenhados e suas características são

apresentados na Tabela 7.

Os iniciadores desenhados foram usados para amplificar uma biblioteca de

cDNA de D. saccharalis. Foram observadas diferentes temperaturas de

anelamento ótimas para cada um deles. Pol_α e RPS6 têm um Tm ótimo em 53

ºC, pol_∆ de 50 ºC e pol_γ 47 ºC . Os iniciadores pol_∆, pol_γ e RPS6 geraram

uma única banda, pol_α gerou uma série de produtos de diferentes tamanhos

(resultado não mostrado). As bandas de tamanho próximo ao produto previsto

para pol_α, assim como as bandas geradas pelos demais iniciadores foram

purificadas do gel e clonadas em plasmídeo pGenT. As construções foram

usadas para transformação de bactérias competentes e as colônias

transformadas foram seqüenciadas. Para evitar realizar inúmeras preparações de

plasmídeos foram feitas reações de PCR usando as colônias como fonte de DNA

e os produtos dessas reações usados como fonte de DNA no seqüenciamento.

Este foi realizado da mesma forma que descrito no item 08 dos matérias e

métodos, porém usando os iniciadores SP6 e pGem. As seqüências obtidas

foram analisas usando o programa phredPhrap e os contigs gerados comparados

com o banco de dados do NCBI usando a ferramenta BlastX.

Apenas o iniciador RPS6 se mostrou específico para o gene alvo, gerando

uma seqüência de 525 nucleotídeos, cuja seqüência deduzida de aminoácidos

apresentou alta similaridade com os mesmos genes de outros insetos,

principalmente lepidópteros (Figura 15). Os demais iniciadores não

apresentaram um produto específico. Na tentativa de amplificar com sucesso os

outros genes de interesse a reação de PCR deve ser realizada numa condição

de anelamento mais específica.

Esse resultado, apesar de não ideal, já que apenas um dos genes

constitutivos foi clonado com sucesso, nos permite iniciar os experimentos de

PCR em tempo real. Poderemos padronizar a técnica e, se o gene RPS6 se

mostrar constitutivamente expresso, até mesmo obter os resultados de

quantificação de expressão, já que muitos dos experimentos descritos na

literatura usam apenas um gene normalizador (Loureço et al., 2005; Claeys et al.,

2005).

Embora não tenhamos verificado a expressão diferencial das α-amilases

de D. saccharalis, decidimos relatar o que foi feito e quais os resultados obtidos

para auxiliar outras pessoas que desejem realizar esse tipo de estudo com algum

gene de D. saccharalis.

3.8- Estabilidade das amilases recombinantes

DSA1 se apresentou bastante estável em meio mínimo, não tendo sua

atividade alterada significativamente após vários congelamentos em diferentes

pHs (Tabela 8). Já DSA2 mostrou-se muito instável em meio mínimo e com uma

estabilidade maior em meio rico. Em pH 6,0 a estabilidade é baixa e a enzima não

resiste ao congelamento. A estabilidade ao congelamento cresce a medida que o

pH aumenta, chegando aquela apresentada pela DSA2 em pH 8,0 (Figura 16).

3.9- Semi-purificação de DSA1

Vários tipos de colunas cromatográficas foram tentadas para purificar a

DSA1, sem resultado. Optamos por utilizá-la semi-purificada, o que é obtido

satisfatoriamente após dois passos cromatográficos em coluna de troca iônica

(Figura 17A e B). Após eluição da segunda cromatografia, observa-se após

eletroforese uma banda majoritária de 57 kDa (Figura 17C). Esse valor é muito

semelhante ao predito a partir da seqüência para as três enzimas (cerca de

54.500 kDa). A SDS-PAGE não tem discriminação suficiente para que possamos

dizer que o valor ligeiramente superior encontrado foi devido à glicosilações na

enzima.

Deve-se ressaltar que nas diferentes raias da Figura 17C, foram aplicados

volumes diferentes das frações da cromatografia, para normalizar a quantidade de

proteína, e por isso a banda da amilase é praticamente igual em todas elas.

3.10- Efeito de detergentes na atividade de DSA1

Outros membros de nosso laboratório que estudaram tripsinas e

quimotripsinas de lepidópteros verificaram que elas tem sua atividade estabilizada

por SDS 1%. Além disso, as α-amilases ficavam ligadas à matriz de

cromatografias hidrofóbicas, só sendo eluídas quando a coluna era lavada com

detergentes (dados não mostrados).

Pelo exposto acima decidimos verificar o efeito de Triton X-100 e SDS nas

amilases de Diatraea saccharalis, com o intuito de aumentar sua estabilidade e

talvez facilitar a sua purificação.

Três amostras diferentes de sobrenadante de conteúdo luminal foram

incubadas por cinco tempos diferentes com Triton X-100 ou SDS 0,1% ou 1%. Os

resultados (não mostrados) revelaram que SDS 1% abole completamente a

atividade da enzima, enquanto com SDS a atividade cai 30%. Esses resultados

mostram que as amilases de D. saccharalis não se comportam como as

proteinases de Lepidoptera. Triton X-100, nas duas concentrações testadas não

afeta a atividade da enzima.

3.11- Efeito do pH e da temperatura nas α-amilases de D. saccharalis

DSA1 e DSA3 apresentaram um pH ótimo em torno de 9,0, enquanto para

DSA2 esse valor está próximo a 8,0 (Figura 18). Levando-se em consideração o

valor dos pHs luminais, DSA1 e DSA3 apresentariam plena atividade, enquanto

DSA2 teria cerca de 50 a 85% de sua atividade, dependendo da região do

ventrículo que é considerada (ver item 3.2).

DSA1 aparentemente é um pouco mais estável a pHs extremos que DSA2

(Figura 19). DSA1 é perfeitamente estável no pH vigente no lúmen pelo menos até

um período de três horas.

Uma inativação térmica das enzimas recombinantes a 50ºC é mostrada na

figura 20. A meia-vida de inativação para DSA1, DSA2 e DSA3 foi,

respectivamente, de 115 min, 6 min e 45 min. Quando o mesmo experimento é

feito utilizando-se o sobrenadante do conteúdo luminal, obtém-se a mesma curva

que a apresentada por DSA1 (resultados não mostrados).

3.12- Propriedades cinéticas das α-amilases de D. saccharalis

As enzimas de D. saccharalis não foram inibidas pelos inibidores protéicos

de feijão αAI1 e αAI2 como esperado, pois eles não atuam sobre enzimas de

Lepidoptera devido ao pH do ensaio (Tabela 9) (Franco et al, 2002). DSA1 e DSA2

são inibidas de modo semelhante pelo inibidor de trigo IT1 (SIGMA A1520), que

inibe menos DSA3 do que as duas outras amilases. IT3 (SIGMA A3535) é o único

inibidor que tem efeito variado nas três enzimas, não afetando DSA1 e causando a

maior inibição em DSA2 (ver tabela 9). A atividade dos inibidores do trigo contra α-

amilases de lepidópteros já tinha sido descrita na literatura (Marwick et al, 1996;

Gutierrez et al, 1993).

As enzimas de mamífero foram utilizadas como controle para verificar se a

ação dos inibidores era a esperada. A amilase pancreática de porco é inibida pelo

αAI1 (Konkiekolo et al, 1999) e não é inibida pelo αAI2 (Franco et al, 2002). Não

conseguimos observar nenhuma inibição com os inibidores de feijão testados. O

resultado obtido com a amilase salivar humana está de acordo com o descrito por

Franco e colaboradores (2002), porém esse resultado é controverso pois também

pode ser observado na literatura a sua inibição por ambos os inibidores de feijão

(LeBerre et al,1998). Foi observada a inibição das α-amilases de mamífero pelos

inibidores de trigo IT1 e IT3,como esperado (Franco et al, 2002).

A afinidade apresentada pelas várias enzimas aos diferentes substratos não

difere muito (Tabela10). Os Kms para amido e glicogênio não diferem em

nenhuma das amilases. Somente quando amilose é utilizada,um Km um pouco

menor é observado para DSA2 e DSA3 e um pouco maior para DSA1.

O grau de ataque múltiplo apresentado pelas enzimas DSA1, DSA2 e DSA3

é bastante baixo (2,0; 1,5 e 0,8; respectivamente). Esses valores indicam que

DSA1 e DSA2, em média, clivam 3 ligações quando há a formação do complexo

enzima substrato, enquanto DSA3 cliva 2. Esses valores classificam essas

amilases como liquefadoras. Essas enzimas são assim chamadas porque

decrescem rapidamente o peso molecular do polímero e portanto a viscosidade da

solução. As amilases que clivam várias ligações a cada formação do complexo

enzima-substrato são chamadas de sacarificantes.

Quanto ao padrão de ação, as α-amilases de D. saccharalis são mais

semelhantes as de R. americana (Diptera) do que as de Sitophilus (Coleoptera) ou

mesmo a do Lepidoptera B. mori (ver introdução).

A partir da hidrólise do amido, DSA1 produz predominantemente maltose,

maltotriose e maltotetraose, enquanto DSA2 forma, aparentemente maltotriose e

maltotetraose (Figura 21). Enzimas que geram altas quantidades de maltose e

maltotetraose supostamente possuem cinco sub-sítios para ligação de glicose (-3

a +2), o que foi muitas vezes confirmado por determinação da estrutura por raios X

da enzima complexada a um oligossacarídeo ou inibidor e em alguns casos um

sexto sub-sítio, na posição +3 pode ocorrer (ver McGregor et al, 2001). Desse

modo, pelos resultados obtidos, DSA1 deve ter pelo menos 5 e DSA2 talvez tenha

6 sub-sítios de ligação de glicose.

3.13- Modelagem molecular de DSA1

Dados sobre estrutura tridimensional são encontrados principalmente para

as amilases dependentes de Cl

. Das 20 amilases que tiveram sua estrutura

resolvida só são independentes de cloreto aquelas encontradas em cevada

(Hordeum vulgarea, GenBank AAA32929.1) e algumas de fungos e bactérias.

Nenhuma amilase animal independente de cloreto teve sua estrutura resolvida.

A seqüência de aminoácidos da proteína DSA1 de D. saccharalis foi

analisada com o programa Signal IP (Nielsen, 1997), disponível no ExPASy

Proteomics Server (www.expasy.org), para predição de possíveis regiões de

clivagem para peptídeo sinal. Foi previsto uma região de 16 aminoácidos que seria

referente a um possível peptídeo sinal.

A seqüência da α-amilase sem a porção referente ao peptídeo sinal previsto

teve seu modelo estrutural gerado por homologia, com o uso do SWISS-MODEL

Protein Modelling Server (http://swissmodel.expasy.org), nas condições padrão do

programa. O modelo foi gerado baseado na estrutura das α-amilases de T. molitor

e pancreática de porco. Os códigos das estruturas resolvidas e depositadas no

formato de arquivo pdb que foram usadas na comparação são: 1viwA, 1jae, 1clvA,

1tmqA e 1ose. O modelo gerado foi analisado com o uso do programa Swiss-

PdbViewer está apresentado na Figura 22.

A modelagem mostra que há grande identidade na estrutura geral das três

enzimas, e os locais onde esta estrutura difere não são regiões críticas para a

estabilidade e/ou função da enzima, tais como sítio ativo, sub-sítios de ligação do

substrato, sítio de ligação de cloreto ou cálcio.

Entretanto, diferenças em menor escala podem ocorrer, tais como as

relacionadas ao elevado pH ótimo da enzima de D. saccharalis em relação à de T.

molitor e a ausência de ativação por cloreto na amilase da D. saccharalis.

3.14- Comparação entre as seqüências das α-amilases de insetos

A maioria das seqüências completas de α-amilases de insetos depositados

em bancos de dados foram utilizadas para obter-se um cladograma, que está

apresentado na Figura 23. Quando no banco de dados havia muitas seqüências

pertencentes a um só gênero, elas não foram utilizadas.

Se o cladograma é feito incluindo a seqüência da α-amilase de Spodoptera

frugiperda semelhante a transportador de aminoácidos de mamíferos (Ferreira et

al, 2007), essa seqüência fica completamente separada das outras, indicando que

ela realmente é uma proteína diferente de todas as outras α-amilases de insetos já

seqüenciadas.

No clodograma apresentado na Figura 23, as seqüências de α-amilase de

Euroghyphus maynei e de Dermatophagoides pteronyssinus , que são ácaros,

foram utilizados para servirem de grupo externo.

As ordens principais estão agrupadas, principalmente os Coleoptera e os

Lepidoptera. Entre os últimos, somente a separação da amilase de S. frugiperda

de DSA1 e DSA3 não é confiável, uma vez que o valor da “bootstrap” é baixa (49).

Por esse clodograma, DSA1 e DSA3 são mais semelhantes entre si e entre as

demais amilases de Lepidoptera do que DSA2. A maior semelhança entre DSA1 e

DSA2 já era esperada pela comparação das seqüências apresentada na Tabela 2.

Entretanto, o resultado obtido em relação aos demais Lepidoptera não era tão

evidente.

4- Considerações Gerais

Nesse trabalho nós clonamos três cDNAs que codificam α-amilases a partir

da biblioteca de expressão feita com material proveniente do intestino médio da

larva de Diatraea saccharalis. As respectivas proteínas foram expressas em

sistema heterólogo, apresentando propriedades distintas. Quando o sobrenadante

do conteúdo luminal do intestino da larva de D.saccharalis é submetido a uma

cromatografia líquida em alta pressão (Resouse Q – Pharmacia), três atividades

enzimáticas são separadas.

Esses resultados indicam que nós fomos capazes de obter de forma

recombinante, todas as amilases expressas no intestino da larva criada nas

condições descritas anteriormente, que podem ser utilizadas em estudos futuros.

Nós tentamos comparar algumas de suas propriedades com o intuito de

desvendar qual o papel que poderia ser exercido por cada uma dessas enzimas.

Pelo menos nas características analisadas por nós não há diferenças

marcantes e outros estudos precisam ser feitos para elucidar se essas enzimas

desempenham um papel distinto no intestino médio da larva de D. saccharalis.

5- Conclusão

O intestino médio da larva D. saccharalis criada em dieta artificial expressa

três amilases, sendo uma delas predominante.

A partir de uma biblioteca de expressão feita com o epitélio do intestino

médio da larva de D. saccharalis é possível obter três cDNAs que codificam três

amilases deferentes,chamadas DSA1, DSA2 e DSA3.

A amilase predominante no intestino médio da larva criada em dieta artificial

é DSA1.

As três amilases recombinantes foram expressas e apresentam massas

moleculares similares (em torno de 54.500 kDa) e pIs teóricos que variam entre

5,53 e 6,44.

As três amilases hidrolisam amido, amilose e glicogênio com afinidades

semelhantes, possuem o pH ótimo entre 8.0 e 9.0 e apresentam baixa

processividade (entre 0,8 e 2).

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Curriculum

DADOS PESSOAIS

Nome: Lucas Offenbecker Guerra

Local e data de nascimento: São Paulo, 27 de maio de 1982.

EDUCAÇÃO

Colégio Benjamin Constant, São Paulo, 1999.

Universidade de São Paulo, Instituto de Biociêcias, São Paulo, 2003, Bacharel em

Ciências Biológicas.

OCUPAÇÃO

Bolsista de Mestrado, FAPESP, 2004 a 2006.

Pesquisador, Allergisa Pesquisa Dermatocosmética LTDA. 2006 até hoje.

PUBLICAÇÕES

Artigos Publicados

A.H.P. Ferreira, P.T. Cristofoletti, D.M. Lorenzini, L.O. Guerra, P.B. Paiva, M.R.S.

Briones, W.R. Terra and C. Ferreira, Identification of midgut microvillar proteins

from Tenebrio molitor and Spodoptera frugiperda by cDNA library screenings with

antibodies, Journal of Insect Physiology (2007), doi:10.1016/j.jinsphys.2007.06.007

Resumos publicados em anais de congressos

GUERRA, L. O.; Marana S.; Genta F.A.; Ferreira, A. H. P. ; Ferreira, C. ; Terra, W.

R.. Expression of two different alpha-amylases from Diatraea saccharalis

(Lepidoptera). In: XXXIV Reunião Anual da SBBq, 2004, Caxambú. XXXIV

Reumião Anual Resumos, 2004.

GUERRA, L. O.; Ferreira, A. H. P. ; Ferreira, C. ; Terra, W. R. . Cloning and

Sequencing Diferent Digestive alpha-Amylases from Diatraea saccharalis. In:

XXXIII Reunião Anual da SBBq, 2004, Caxambú. XXXIII Reumião Anual Resumos,

2004.

Ferreira, A. H. P. ; GUERRA, L. O. ; Terra, W. R. ; Ferreira, C. ; Paiva, P. B. ;

Briones, M. R. S. . Identification of cDNAs encoding for proteins associated with

microvillar membranes from Tenebrio molitor (Coleoptera) and Spodoptera

frugiperda (Lepidoptera) midgut. In: XXXII Reunião Anual da SBBq, 2003,

Caxambú. XXXII Reumião Anual Programa e Resumos, 2003.

Ferreira, A. H. P. ; GUERRA, L. O. ; Terra, W. R. ; Ferreira, C. . Cloning cDNAs

encoding for microvilar membrane proteins from Tenebrio molitor and Spodoptera

frugiperda midut. In: XXXI Reunião Anual da SBBq, 2002, Caxambú. XXXI

Reunião Anual Programa e Resumos, 2002.

Figura 1 – Distribuição relativa do número de espécies em diferentes

grupos animais.

Figura 2- Morfologia do tubo digestório de diferentes insetos. AV, ventriculo anterior;

C,papo; Co, cólon; E, esofago; G, cecos gastricos; M, túbulos de Malpighi; PV,

ventriculo posterior; R, reto; V, ventriculo. Retirado de: Terra e Ferreira (2005)

Figura 3- Esquema de um tubo digestivo geral de inseto (tirado de Terra e

Ferreira, 2005). Nos Lepidoptera não há papo e o intestino médio é um

cilindro com diâmetro regular, sem cecos gástricos.

110±4100±1070±740±8

Amilase

(um/animal) – B

11±27,5±112±125±1

Amilase

(um/animal) – A

3211Nº de pupas

22202024Nº de larvas

5895Nº de mortos

145±33135±26178±46165±20

Massa

(mg/animal)

com 50% sacarose

+ 2,5% amido

+ amido 2,5%+ amido 1%Controle

Tabela 1- Efeito de diferentes dietas na atividade de α-amilase e no crescimento das

larvas de D. saccharalis

1- 30 larvas recém eclodidas foram colocadas nas diferentes dietas e permanesceram por 30 dias antes de

serem analisadas.

2- A atividade de amilase foi determinada no sobrenadante do conteúdo luminal mais membrana peritrófica

homogeneizado em água (A) ou em tampão pH 6,0 (B).

Figura 4: Parte do alinhamento de α-amilases de diferentes insetos depositadas em

bancos de dados, buscando região conservada próxima à extremidade 5´ das

seqüências analisadas. Em vermelho a região escolhida para desenho do iniciador

(A1).

1 2 3 4 5 6 PM

TºC 45 47 50 53 55 45 47 50 53 55 PM

T7-A1 T3-A1

Figura 5- Eletroforese de material amplificado por PCR. Raias 1 a 3, as reações

continham somente um iniciador, respectivamente A1, T3 eT7. Rais 4 e 5, reações sem

DNA molde, com iniciadores T3+A1 e T7+A1, respectivamente. Raia 6, PCR usou

como molde clone de α-amilase de T. molitor. Raias 45 a 55, reações feitas com a

biblioteca de D. saccharalis como molde e os iniciadores T7+A1 ou T3+A1, nas

temperaturas indicadas. PM- padrão de massa molecular.

Controles

2000

1500

1000

750

500

250

2000

1500

1000

750

500

250

Figura 6- Eletroforese do produto de digestão de plasmídeos mais inserto com

EcoRI para seleção dos clones. Setas vermelhas indicam os clones selecionados

por tamanho e as azuis os escolhidos aleatoriamente.

PMPM

2000

1500

1000

750

500

250

2000

1500

1000

750

500

2000

1500

1000

750

500

250

2000

1500

1000

750

500

250

79 / 8972 / 8279 / 89S. frugiperda

60 / 7561 / 7660 / 75TMA

52 / 6849 / 6552 / 66HPA

53 / 6750 / 6554 / 68HSA

55 / 6851 / 6755 / 69PPA

63 / 7661 / 7463 / 76A. gambiae

75 / 8567 / 8075 / 85Bombix mori

81 / 8975 / 8682 / 90O. Nubilaris

75 / 8595 / 97DSA3

75 / 8575 / 85DSA2

95 / 9775 / 85DSA1

DSA3DSA2DSA1

Tabela 2- Porcetagens de identidade/similaridade entre DSA1(AAP92665.1),

DSA2 (AAP97393.1) e DSA3 (AAP97394.1). Elas foram comparadas com outras

α-amilases de insetos cujas sequencias encontram-se depositadas no GenBank,

sendo: lepidópteros (O. nubilaris e Spodoptera frugiperda - AAO13754.1 e

Bombyx mori - AAA17751.1), diptero (Anopheles gambiae), coleóptero (TMA-

Tenebrio molitor - Swissprot PS6634). Também foram usadas as α-amilases

pancreática de porco (PPA), salivar humana (HSA) e pancreática humana (HPA).

PM T3 T7 A2 R1 R2 C1

PM A3 R3 R4 C2 A4 R5 R6 C3 PM

Amilase 1 Amilase 2 Amilase 3

Figura 8- Eletroforese dos produtos de PCR realizados com iniciadores específicos para

cada seqüência de α-amilase. T3, T7, A2, A3 e A4, controles usando somente iniciador

indicado. C1, C2, C3: controles usando como molde o respectivo fragmento de cDNA e

como iniciadores C1, C2 ou C3 mais SP6. R1 a R6, amplificação usando como molde a

biblioteca de D. saccharalis. R1 R3 e R5, iniciador T3 mais respectivamente o iniciadores

A2, A3 e A4. R2, R4 e R6, iniciador T7 mais, respectivamente, os iniciadores A2, A3 e A4.

PM, marcador de massa molecular.

2000

1500

1000

750

500

250

2000

1500

1000

750

500

250

DSA1 GTTGGTAATGATGGTCGTGCTCACATATCCGTTGGAGCCAATGACTACGATATGATGCTTGCTATTCATAGGGGTGATCAGTCAAGACTG

DSA3 GTTGGTAACGACGGTCGTGCTCACATCTCCGTTGGAGCTAATGACTACGATATGATGCTTGCCATTCACAGGGGTGATGAGTCGAGGTTG

DSA2 GTTGGCAATGACGGGCGCGCGATTATTAATGTCGGTGCCCTTGACTACGATATGATGCTGGCCATACACATTGGAACTGAGAGTCGTCTT

***** ** ** ** ** ** ** ** ** ** ****************** ** ** ** * ** * ** * *

DSA1 TAACATCAGAATTTGAGGAATCAAGAC

AAACAACTTCACAATAAATGCACTCAAAAATCG-----------------------------

DSA3 TAACTTTCATCAGTGTTTGAAGAAACAAGACTACAAACATATTCAGAATAAATGTATTCGCATAT

CGAAAAAAAA--------------

DSA2 TGATCCTGTTCAAATTGGCTG

AAAAATATCTAACTTTGATGCAACGTATAATGGAAATAAATTTATTGATCAATACTTAAACCTCGTGC

* * ** * ** *

Figura 7- Alinhamento da porção 5’ das sequencias das α-amilases parcialmente

clonadas. Em vermenho está a região não codificante. Negrito indica o stop códon.

Regiões grifadas foram usadas para desenho de iniciadores específicos.

*:.::*.**. ********:*** ***.:* *:****:*****

DSA1

--MFRVFLLLTATALAFGYKNPHYAPGRSTMVHLFEWKWDDIAAECERWLGPRGFGGIQISPP 61

DAS3

--MFRVFLLLTATALAIGYKNPHYAPGRSTMVHLFEWKWDDIAAECERWLGPRGFGGIQISPP 61

DAS2

MVKLLIVALVALAVFANAYKNPHYAPGRSVNVHLFEWKWDDIATECENFLGPRGFGGIQISPP 63

TMA

------------------QKDANFASGRNSIVHLFEWKWNDIADECERFLQPQGFGG

QISPP 45

ruler

1.......10........20........30........40........50........60...

** : .*********:** :.****: *:.* ****..********:****** :

DSA1

NENLIIWQHNRPWWERYQPMSYQLSTRSGNAQQFANM

RRCNN

RIY

DAIINHMTGTWNE 124

DAS3

NENLVIWTHNRPWWERYQPMSYHLSTRSGNEQQFASM

RRCNNAG

RIY

DAIINHMTGTWNE 124

DAS2

NENVVLWTYNRPWWERYQPMSYLLDTRSGDEAQFADMLRRCNSAG

RIY

INHMTGEPPE 126

TMA

NE--YLVADGRPWWERYQPVSYIINTRSGDESAFTDMTRRCNDAG

RIY

INHMTG--MN 104

ruler

.....70........80........90.......100.......110.......120......

.***.*.:* .. .*****: .*: * * :: . .****:* **:****..::*

DSA1

NVGTGGNTANFGQFSYPAVPYGRNDFNWPECYIQPHDYGCCPER

RNCQLSGLKDLNQGTEH

187

DAS3

NVGTGGNTANFGQFSYPAVPYGRNDFNWPECYIQPNDYRCCPER

RNCQLSGLKDLNQSSEH

187

DAS2

NVGTAGSTATFSQWDYPAVPFTWEHFNWPHCVIDGMDY

NDAWR

RNCEL

GLKDLNQANEH

189

TMA

GVGTSGSSADHDGMNYPAVPYGSGDFHSP-CE

NN---YQDADN

RNCEL

GLRDLNQGSDY

163

ruler

.130.......140.......150.......160.......170.......180.......19

* :::::** :*.:******:****** * ** :*:. *.**** :**. .***:*******

DSA1 RRMIVDFMNGLIDMGVAGFRIDAAKHMWPGDLR

IYDRLHNLNTAHGFPSGARPYIYQE

IDL 250

DAS3

RRMIVDFMNRLIGMGVAGFRIDAAKHMWPGDLR

IYDRLDNLNTAHGFPSGARPYIYQE

IDL 250

DAS2

RNMIVNFMNHLIDLGVAGFRIDAAKHMWPHDLEIIYNRLNNLNTAHGFPANARPYIYQE

IDY 252

TMA

RGVLIDYMNHMIDLGVAGFRVDAAKHMSPGDLS

IFSGLKNLNTDYGFADGARPFIYQE

IDL 226

ruler

0.......200.......210.......220.......230.......240.......250..

****:*::*** :..* **:.*:.*..** *.***: * .***:*.** *::.*:*****:

DSA1

GGEAVSRDEYTPLAAVTEFKFGMELSRAFLGGNQLRWLANWGPQWNLLASADSL

FIDNHDNQ 313

DAS3

GGEAVSRDEYTPLAAVTEFKFGVELSRAFQGGNQLRWL

NWGPQWNLLASADSL

FIDNHDNQ 313

DAS2

GGEAISRDEYTPIGAVTEFKVGMELSRAFRGNNQLKWLESWGPQWGLLEHSDALTFIDNHDNE 315

TMA

GGEAISKNEYTGFGCVLEFQFGVSLGNAFQGGNQLKNLANWGPEWGLLEGLDA

DNHDNQ 289

ruler

.....260.......270.......280.......290.......300.......310.....

* .*. :**** .:**: ****:****** .::***: * :.: *** : *::***.**.

DSA1

RGHGAGGNILTYKQARPYKAAIAFMLAHPYGEPQLMSSFGFQNTEAGPPMDNRGDLISPSINS 376

DAS3

RGHGAGGNILTYKLARPYRAAIAFMLAHPYGEPQLMSSYGFQNTEAGPPMDSRGDLISPSINS 376

DAS2

RGHGGGGAMLTYKEPRPYKGAIAFLLAHPYGEPQIMSSFAFHDSEIGPPMNHLGQIISPSINS 378

TMA

R--TGGSQILTYKNPKPYKMAIAFMLAHPYGTTRIMSSFDFTDNDQGPPQDGSGNLISPGIND 350

ruler

..320.......330.......340.......350.......360.......370.......3

*.:*.**::*:*****:: **.***.. .* :::**.*. .****.**.:.*:**.* . ***

DSA1

DNTCGNGWICEHRWRQIYQMVAFRNVAGSTTINDWWDNGSSQIAFCRGGQAFIAFNNDSWDLN 439

DAS3

DNTCGNGWICEHRWRQIFQMVAFRNVAGSTTINDWWDNGSSQIAFCRGGQGFIAFNNDSWDLN 439

DAS2

DGSCGNGWVCQHRWRQVFAMVAFRNVAGNTGLNDWWSNGFNQIAFCRGGNAF

AFNNDSWDLN 441

TMA

DNTCSNGYVCEHRWRQVYGMVGFRNAVEGTQVENWWSNDDNQIAFSRGSQGF

AFTN-GGDLN 412

ruler

80.......390.......400.......410.......420.......430.......440.

*.*:* **** ******* :*.:****:****::* * *.:*: : * :**** . ::*

DSA1

QTLQTCLPAGRYCDVISGFKSGNSCTGKTVTVGNDGRAHIS

GANDYDMMLAIHRGDQSRL 500

DAS3

QTLQTCLPAGRYCDVISGVKSGNSCTGKTVTVGNDGRAHIS

GANDYDMMLAIHRGDESRL 500

DAS2

QNLQTCLPAGRYCDVISGVKAGNTCTGKTVTVGNDGRAIIN

GALDYDMMLAIHIGTESRL 502

TMA

QNLNTGLPAGTYCDVISGELSGGSCTGKSVTVGDNGSADISLGSAEDDG

LAIH

N--AKL 471

ruler

......450.......460.......470.......480.......490.......500..

Figura 9- Alinhamento das seqüências de aminoácidos das α-amilases de D. saccharalis

(DSA) e T. molitor (TMA, proteína madura). Setas vermelhas indicam os resíduos

catalíticos; setas pretas os resíduos ligantes de Ca

e as setas azuis os resíduos ligantes

de Cl

. Caixa amarela indica região do peptídeo sinal.

Peptídeo sinal

Figura 10- Eletroforese em agarose 1% de produtos de PCR. MW-

marcadores de peso molecular. A1, A2 e A3 – produtos de PCR usando

iniciadores de expressão e moldes específicos para DSA1, DSA2 e DSA3,

respectivamente.

1,5 Kb

3,0 Kb

PM A1 A2 A3

Figura 11 – Representação esquemática dos plasmídeos de expressão construídos.

AOX1, gene codificante da Álcool oxidase. HIS4, gene para síntese do aminoácido

histidina. Amp

, gene de resistência ao antibiótico ampicilina. Kan gene de resistência

ao antibiótico kanamicina (gene modificado que congere resistência a geneticina para

leveduras). Pep. Sinal, peptídeo sinalizador para excressão da proteína recombinante

expressa.

Amp

3´ AOX1

Inserto

HIS4

promotor

5´ AOX1

Origem de

replicação

Pep. sinal

Kan

DSA2

dia 5

nº cloneMMMRMMMRMMMRMR

1 6 8 212 344 645 507 3

2 13 28 353 560 1072 561 0

3 11 5 208 417 564 458 3

4 4 6 319 366 581 391 0

5 6 11 257 382 565 567 8

6 8 12 306 508 748 549 29

7 9 31 305 461 724 1127 8

8 9 32 284 798 518 1112 0

9 9 6 451 293 541 349 9

10 0 6 195 253 137 100 0

11 0 5 106 305 111 152 0

12 0 7 125 351 135 236 1

13 0 2 131 249 198 128 36

14 0 11 99 392 124 150 14

15 0 13 165 461 201 277 0

16 0 21 191 830 154 169 3

17 0 1 113 231 60 0 0

18 0 9 36 385 42 2 0

19 0 0 80 152 47 19 0

20 3 6 243 351 47 60 0

dia 1dia 3dia 5

DSA1

Tabela 3- Amilase (mU/mL) presente no meio de cultura mínimo (MM) ou rico (MR),

aonde cresciam células de P. pastoris transformadas com cDNA codificante de

DSA1 ou DSA2 após indução. Os clones transformados com cDNA codificante de

DSA2 só apresentaram atividade significativa após 5 dias de indução em meio rico.

Em vermelho estão indicados os clones selecionados para maxi-indução.

DSA1 MM DSA1 MR DSA2 MR

dia 1 6,69 3,55 0,37

dia 2 5,70 4,01 0,21

dia 3 8,23 3,88 0,15

dia 4 8,27 3,91 0,14

dia 1 161 312 27

dia 2 215 457 19

dia 3 471 540 17

dia 4 559 646 16

Atividade Enzimática (mU/mL)

Atividade Especifica (mU/mg)

Tabela 4- Atividade e atividade específica de amilases expressas em

células de P. pastoris crescidas em meio mínimo (MM) ou em meio rico

(MR). DSA2 em meio mínimo não aparece na tabela pois não é

observada atividade alfa-amilásica.

dia

123123

6,0

0 45 162 23 95 297

7,0

27 90 333 45 189 594

8,0

00270027

6,0

002302359

7,0

932991468185

8,0

000000

DSA1

MM MR

DSA2

Tabela 5- Atividade amilásica (mU/mL) determinado no meio mínimo (MM) e no

meio rico (MR) após expressão da enzima. Os meios foram feitos em pHs 6, 7 ou

8 e a atividade foi determinada a cada 24h. Observa-se a maior atividade em pH

7,0 e uma expressão irrisória em pH 8,0. Em vermelho está destacada a

condição escolhida para se obster a enzima.

MW 1 2 3 4 5 6 7 8 9

31,0

66,2

45,0

14,4

21,5

kDa

Figura 12- Eletroforese em gel de poliacrilamida 12% do meio de cultura

(BMMY) aonde cresciam células de P. pastoris transformadas com cDNA que

codifica IC1. MW- padrão de peso molecular. 1-9- diferentes clones induzidos

por 72h.

DSA3 CTGAATGTTACATCCAACCTAACGATTACAGGTGCTGCCCTGAACGGGTCCGCAACTGTC

DSA1 CTGAATGTTACATCCAACCTCACGATTATGGATGCTGCCCTGAGCGGGTACGTAACTGTC

******************** ******* * *********** ***** ** *******

DSA3 AACTCTCCGGTCTAAAAGATTTAAACCAAAGCTCTGAACATGTCCGTCGAATGATCGTTG

DSA1 AACTCTCCGGTCTAAAAGATTTAAACCAAGGCACTGAACATGTCCGTCGAATGATCGTTG

***************************** ** ***************************

DSA3 ACTTTATGAACCGTCTCATCGGCATGGGCGTTGCTGGATTTAGGATTGACGCGGCAAAGC

DSA1 ACTTTATGAACGGTCTCATTGATATGGGCGTTGCTGGATTCAGGATTGACGCAGCCAAGC

*********** ******* * ***************** *********** ** ****

DSA3 AGACTTTACAGACCTGTTTACCTGCCGGTAGATATTGTGATGTGATCTCCGGTGTCAAGA

DSA1 AGACTCTTCAGACTTGTTTACCTGCCGGTAGATATTGTGATGTGATCTCCGGTTTTAAGA

DSA2 AGAATTTACAGACATGTCTCCCAGCAGGCAGATACTGTGACGTCATATCCGGAGTAAAAG

*** * * ***** *** * ** ** ** ***** ***** ** ** ***** * **

DSA3 GTGGCAACAGCTGCACAGGCAAGACAGTTACAGTTGGTAACGACGGTCGTGCTCACATCT

DSA1 GTGGCAACAGCTGCACAGGCAAGACAGTGACGGTTGGTAATGATGGTCGTGCTCACATAT

DSA2 CTGGCAACACTTGCACCGGCAAGACGGTGACGGTTGGCAATGACGGGCGCGCGATTATTA

******** ***** ******** ** ** ***** ** ** ** ** ** **

DSA3 CCGTTGGAGCTAATGACTACGATATGATGCTTGCCATTCACAGGGGTGATGAGTCGAGGT

DSA1 CCGTTGGAGCCAATGACTACGATATGATGCTTGCTATTCATAGGGGTGATCAGTCAAGAC

DSA2 ATGTCGGTGCCCTTGACTACGATATGATGCTGGCCATACACATTGGAACTGAGAGTCGTC

** ** ** ****************** ** ** ** * ** * ** *

DSA3 TGTAACTTTCATCAGTGT--TTGAAGAAA--CAAGACTACAAACATATT-CAGAATAAAT

DSA1 TGTAA----CATCAGAAT--TTGAGGAAT--CAAG---ACAAACAACTT-CACAATAAAT

DSA2 TTTGATCCTGTTCAAATTGGCTG

AAAAATATCTAACTTTGATGCAACGTATAATGGAAAT

* * * *** * *** ** * * * ** * * ****

DSA3 GTATTCGCATAT

CGAAAAAAAAA--------

DSA1 GCACTCAAAAATCG-----------------

DSA2 AAATTTATTGATCAATACTTAAACCTCGTGC

* * ***

Figura 13- Alinhamento parcial das seqüências de nucleotídeos das α-amilases

D. saccharalis. A- parte do alinhamento das duas amilases mais similares (DSA1

e DSA3). Destacadas em azul: regiões onde possíveis iniciadores se anelariam.

B- porção 3´ do alinhamento das três seqüências. Estão destacadas as regiões

onde se anelariam os iniciadores para realização de PCR em tempo real. As

regiões usadas na construção dos iniciadores utilizados nos experimentos de

clonagem estão grifadas.

AY961549Lysiphlebus testaceipesRPS6

AY769320Bombyx moriRPS6

XM_963302Tribolium castaneumRPS6

U64795Manduca sextaRPS6

AF429980Spodoptera frugiperdaRPS6

EAA00974Anopheles gambiae

DNA polimerase α

XM_416792Gallus gallus

DNA polimerase α

XP_687096Danio rerio

DNA polimerase α

BAA14340Drosophila melanogaster

DNA polimerase α

AB178526Trachemys scripta

DNA polimerase α

XM_623792Apis mellifera

DNA polimerase ∆

XM_320778Anopheles gambiae

DNA polimerase ∆

NM_079375Drosophila melanogaster

DNA polimerase ∆

XM_962197Tribolium castaneum

DNA polimerase ∆

XM_964107Tribolium castaneum

DNA polimerase γ

XM_315205Anopheles gambiae

DNA polimerase γ

NM_079738Drosophila melanogaster

DNA polimerase γ

XM_393171Apis mellifera

DNA polimerase γ

códigoorganismoGene

59-64ºC850 pb

5´ GA(C/T) AA(A/G) ATG GA(T/C) TGC AA(A/G) GG 3´

DNApol_∆

5´ G(C/A)C ACT C(T/A/C)T G(C/T)T ACA GAC C 3´

5´ T(A/G)C T(T/A/C)T A(C/T)G ATC C(T/G)G CTT T 3´

5´ ATA GT(G/A/C) CG(G/T/A) (C/A)G(C/A) GA(C/T) TGG T 3´

Seqüência

49-61ºC600 pbRPS6

53-61ºC1300 pb

DNApol_γ

58-70ºC1550 pb

DNApol_α

TmProdutoIniciador

Tabela 6- Genes dos diferentes organismos escolhidos para alinhamento e

posterior desenho de iniciador degenerado para clonagem. São descritos os

nomes das proteínas que eles codificam, o nome dos organismos e os

respectivos códigos de acesso no banco de dados do NCBI.

Tabela 7- Iniciadores desenhados para clonar genes constitutivamente expressos de D.

saccharalis. Estão descritas as seqüências dos iniciadores estando entre parênteses as

diferentes bases nas posições degeneradas, o tamanho do produto previsto para uma

amplificação por PCR e as faixas de temperatura de anelamento, levando em considerasão

as possíveis combinações de base (degenerações) de cada iniciador.

Figura 14- Parte dos alinhamentos das seqüências codificantes dos diferentes

genes constitutivos, descritas na tabela 8. Asteriscos indicam os nucleotídeos

conservados. A caixa vermelha indica a região escolhida para desenhar o iniciador

de clonagem para cada gene, descritos na tabela 9. A- Alinhamento das

seqüências codificantes da subunidade catalítica da DNA polimerase α. B-

Alinhamento das seqüências codificantes da subunidade catalítica da DNA

polimerase ∆. C- Alinhamento das seqüências codificantes da subunidade

catalítica da DNA polimerase γ. D- Alinhamento das seqüências codificantes da

proteína ribossomal S6 (RPS6).

Trachemys AATTGAAAGGATTGGACATAGTCCGAAGAGACTGGTGTGACCTTGCAAAA

Galus AACTGAAAGGGTTGGATATAGTCCGAAGAGACTGGTGTGATCTTGCAAAA

Danio AGCTCAAAGGCCTGGACATTGTGCGTAGAGATTGGTGCGACCTCGCCAAG

Drosophila AGCACAAGGGCCTGGATATAGTACGTCGCGATTGGTCTCAGCTGGCTGTA

Anopheles AGCTCAAGGGGCTGGACATAGTGCGGCGCGACTGGTCGCGCATTGCCGTG

* ** ** **** ** ** ** * ** **** * **

Drosophila GATCGTGCACTTCTATCGATGGGTGCGCTCCAGTAATGCACTACTCTATGATCCTGCTTTG

Anopheles AATCATCCACTTTTACCGTTGGGTACGGTCCAGTCGCGCTCTGCTATACGATCCTGCTTTA

Tribolium AGTCGTTCATTTCTATCGGTGGTTGCGGGCGCCTAAAGCCCTGCTTTACGATCCGGCTTTG

Apis AATTATACATTTTTACAGATGGTTGCGTTCACCTAACGCTTTACTTTACGATCCTGCTTTA

* * ** ** ** * *** * ** * * ** * ** ** ***** *****

Drosophila TACCTACGATAAAATGGATTGCAAGGGCATAGAAACCGTGAGGAGAGATAACTCTCCGCT

Anopheles CCGGTACGACAAGATGGACTGCAAGGGCATCGAGACGGTGCGGCGCGACAACTCGCCGCT

Apis CAAATATGATAAAATGGATTGCAAAGGTCTAGAAACTGTACGAAGAGATAATTGTCCATT

Tribolium TAAATACGACAAAATGGATTGCAAAGGTATTGAAACCGTACGAAGGGATAATTGTACATT

** ** ** ***** ***** ** * ** ** ** * * ** ** * * *

Spodoptera AACAGCCGTGTTCGTTTGTTGATGTCAAAGGGCCACTCTTGCTACAGACCCCGTCGTGAT

Bombyx AACAGCCGTGTTCGTCTTCTGATGTCAAAGGGCCACTCATGTTACAGACCGCGCCGCGAT

Manduca AACAGCCGTGTTCGTTTATTGATGTCAAAGGGCCACTCATGCTACAGACCGCGTCGTGAT

Lysiphlebus AATGGTCGTGTACGTCTTTTACTTTCAAAGGGACACTCATGCTACAGACCACGTCGTACT

Tribolium AACAGCCGCGTTCGCCTTCTCCTCTCAAAGGGCCACTCCTGCTACAGACCCCGGCGTGAC

** * ** ** ** * * * ******** ***** ** ******** ** **

Bombyx_mori MKLNVSYPATGCQKLFEVVDEHKLRIFYEKRMGAEVEADQLGDEWKGYVL

Manduca_sexta MKLNVSFPATGCQKLFEVVDEHKLRIFYEKRMGAEVEADLLGDEWKGYVL

Spodoptera_frugiperda MKLNVSFPATGCQKLFEVVDEHKLRIFYEKRMGAEVEADQLGDEWKGYVL

Diatraea _saccharalis --------------------------------------------------

Bombyx_mori RVAGGNDKQGFPMKQGVLTNSRVRLLMSKGHSCYRPRRDGERKRKSVRGC

Manduca_sexta RVAGGNDKQGFPMKQGVLTNSRVRLLMSKGHSCYRPRRDGERKRKSVRGC

Spodoptera_frugiperda RIAGGNDKQGFPMKQGVLTNSRVRLLMSKGHSCYRPRRDGERKRKSVRGC

Diatraea _saccharalis -----------------------------CHSCYRPRRDGERKRKSVRGC

********************

Bombyx_mori IVDANLSVLALVIVRKGAQEIPGLTDGNVPRRLGPKRASKIRKLFNLSKE

Manduca_sexta IVDANLSVLALVIVRKGEQEIPGLTDGNVPRRLGPKRASKIRKLFNLSKE

Spodoptera_frugiperda IVDANLSVLALVIVRKGEQEIPGLTDGNVPRRLGPKRASKIRKLFNLSKE

Diatraea _saccharalis IVDANLSVLALVIVRKGTQEIAGLTDGNVPRRLGPKRASKIRKLFNLNKE

***************** ***.*************************.**

Bombyx_mori DDVRRYVVKRVLPAKEGKENAKPRHKAPKIQRLVTPVVLQRRRHRLALKK

Manduca_sexta DDVRRYVVKALLPAKEGKENAKPRYKAPKIQRLVTPVVLQRRRHRLALKK

Spodoptera_frugiperda DDVRRYVVKRLLPAKEGKENAKPRYKAPKIQRLVTPVVLQRRRHRLALKK

Diatraea _saccharalis DDVRRYVVKRLLPAKEGKENAKPRYKAPKIQRLVTPAVLQRRRHRLALKK

********* :*************:***********.*************

Bombyx_mori KRLAKRKSSEAEYAKLLAQRKKESKVRRQEKIKRRRSASMRDSKSSSQSA

Manduca_sexta KRLAKRKSAEADYAKLLAQRKKESKVRRQEEIKRRRSASMRDSKSSNQSA

Spodoptera_frugiperda KRLAKRKQSENDYAKLLAQRKKESKVRRQEELKRRRSASMRDSKSSDKSA

Diatraea _saccharalis KRLAKRKSSEAEYAKLLAQRKKESKVRRQEEIKRRRSASMRDSKSSDKSA

*******.:* :******************::**************.:**

Bombyx_mori PQK

Manduca_sexta PQK

Spodoptera_frugiperda PQK

Diatraea _saccharalis PQK

***

Figura 15- Alinhamento das seqüências de aminoácidos da proteína ribossomal

S6 de diferentes Lepidoptera incluindo a deduzida a partir do cDNA clonado de D.

saccharalis. Observa-se uma alta similaridade entre as seqüências indicando que

o cDNA clonado codifique a proteína de interesse.

y = -5,7222x + 98,97

100

120

0123456

nº congelamentos

Atividade remanescente (%)

Figura 16 – Estabilidade de DSA2 ao congelamento em pH 8,0. O gráfico

mostra a porcentagem da atividade remanescente após cada congelamento. É

observada uma tendência de perda de atividade, de 5,7% a cada

congelamento.

pH 7,0 pH 9,5

449 275

389 224

459 378

402 299

375 225

398 325

nº de congelamentos

Tabela 8- Atividade de DSA1 (mU/mL), ensaiada em pH 9,5; após

congelamentos seqüenciais em pHs 7,0 e 9,5.

HighTrap Q cromatography

0,2

0,4

0,6

0,8

1,2

1,4

1,6

1,8

0 1020304050607080

Fraction

Abs 550n

100

120

NaCl (%)

Abs 550 nm

% NaCl

Resource Q cromatography

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

0 10203040506070

Fraction

Abs 550nm

100

NaCl (%)

Abs 550 nm

% NaCl

21 22 23 24 25 26 27 28 HT MW

31.0

66.2

45.0

14.4

21.5

97.4

kDa

57 kDa

Figura 17- Semi-purificação de DSA1. O meio de cultura de P. pastoris após indução da

expressão de DSA1 foi submetido a uma cromatografia em HighTraoQ (A). As frações

mais ativas dessa cromatografia foram reunidas e aplicadas em uma cromatografia em

ResouseQ (B). As frações com atividade amilásica dessa cromatografia foram aplicadas

em SDS-PAGE (mesma quantidade de proteína por raia) para evidenciar o grau de

pureza da proteína de interesse (C). As raias (21 – 28) estão numeradas com o número

da fração correspondente em B. A banda majoritária tem massa molecular semelhante

ao previsto para DSA1.

DSA2

100

5,0 6,0 7,0 8,0 9,0 10,0

% Atv.

MÊS

PIPES

HEPES

TAPS

GLY

CAPS

DSA3

100

5,0 6,0 7,0 8,0 9,0 10,0 11,0

% Atv.

MÊS

PIPES

HEPES

TAPS

GLY

CAPS

DSA1

100

5,0 6,0 7,0 8,0 9,0 10,0 11,0 12,0

% Atv.

MÊS

PIPES

HEPES

TAPS

GLY

CIS

CAPS

ARG

Figura 18- Efeito do pH na atividade enzimática. O gráfico mostra a

porcentagem da atividade remanescente das enzimas recombinantes

DSA1, DSA2 e DSA3 em função do pH.

Homogeneizado

100

120

4,0 5,0 6,0 7,0 8,0 9,0 10,0 11,0

atv (%)

1,30 horas

3,0 horas

DSA1

100

120

4,05,06,07,08,09,010,011,0

atv (%)

1,30 horas

3,0 horas

DSA2

100

120

4,0 5,0 6,0 7,0 8,0 9,0 10,0 11,0

atv (%)

1,30 horas

3,0 horas

Figura 19- Estabilidade de DSA1, DSA2 e da atividade amilásica presente no

homogeneizado do conteúdo intestinal de D. saccharalis em diferentes pHs. Os

gráficos mostram a atividade remanescente em cada um dos materiais após

incubações de 1,30 e 3 horas a 30ºC , na ausência de substrato. As linhas

indicam a faixa de pH onde a atividade é estável (patamares) e as tendências

de perda de atividade.

100

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200

min

% Atividade remanescent

DSA3

DSA2

DSA1

Figura 20- Inativação térmica das amilases recombinantes à 50 ºC. O gráfico

mostra o log da porcentagem da atividade remanescente pelo tempo em que os

materiais permaneceram incubados. Foram ensaiadas as três enzimas

recombinantes DSA1, DSA2 e DSA3. Observa-se diferentes t

1/2

: 125 min para

DSA1, 6 min para DSA2 e 45 min para DSA3.

Tabela 10- Afinidade das amilases recombinantes por diferentes substratos.

Os valores estão expressos em % (p/v).

0,15 ± 0,02

0,10 ± 0,010,08 ± 0,005

Glicogênio

0,10 ± 0,01

0,10 ± 0,010,17± 0,01Amilose em DMSO

0,15 ± 0,01

0,16 ± 0,010,12± 0,01Amido em DMSO

0,12 ± 0,01

0,08 ± 0,010,08 ± 0,01

Amido

DSA3DSA2DSA1

Substrato

Enzima

Tabela 9 – Sensibilidade das α-amilases recombinantes de D. saccharalis,

DSA1, DSA2 e DSA3, e das comerciais, salivar humana (HSA) e

pancreática de porco (PPA), a diferentes inibidores. Foram utilizados os α-

Ai1 e 2 de feijão na concentração 0,5 mg/mL, e os inibidores comerciais de

trigo tipo 1 e 3 na concentração 12,5 mg/mL. Os valores da tabela são as

atividades remanescentes (%) em relação a um ensaio sem inibidor. ÑI

indica a ausência de inibição.

3436ÑIÑIDSA2

1010

ÑIÑIDSA3

ÑI31ÑIÑIDSA1

ÑI61ÑI15PPA

913ÑIÑIHSA

IT-3IT-1

α-AI2α

-AI1

Enzima

Figura 21- Cromatografia em camada

delgada dos produtos da ação de DSA1 e

DSA2 após ensaio de atividade com amido

como substrato. PD- padrão de

oligosacarídoeos. G1 a G6: glicose,

maltose, maltotriose, maltotetraose,

maltopentaose e maltohexaose,

respectivamente. DSA1- produtos de

hidrólise de DSA1. DSA2- produtos de

hidrólise de DSA2.

PD DSA1 DSA2

Figura 22- Modelo da estrutura de DSA1 gerado a partir do SWISS-MODEL e

visualizada com o progama Swiss-PdbViewer. Regiões em azul indicam alta

similaridade entre a sequencia de DSA1 amilase de T. molitor e amilase

pancreática de porco, que foram usadas como modelo para a modelagem

estrutural. Regiões em vermelho e verde são regiões de baixa similaridade.

Figura 23- Cladrogama de seqüências de α-amilases de insetos depositadas

no GenBank. Euroguyphus maynei (ácaro, AAD38943.1), Dermatophagoides

pteronyssinus (ácaro, AAD38942.1), Aedes aegypti (Diptera, AAA29343.1 e

AAB60934.1), Anthonomus grandis (Coleoptera, AAN77139.1 e AAN77138.1),

Anopheles merus (Diptera, AAA03323.1), Apis melifera melifera (

Hymenoptera, AAM20738.1), Biblio marci (Diptera, AAL92553.1 e

AAA29343.1), Blaps macronata (Coleoptera, AAO14612.1), Blatella

germânica (Dictyoptera, ABC68516.1), Bombyx mori. (Lepidoptera,

AAA17751.1), Callifora vormitoria (Diptera, AAY88831.1 e AAY88830.1),

Callosobrucus chinensis (Coleoptera, BAB72257.1), Ceratitis capitata

(Diptera, AAO13691.1), Culex tarsalis (Diptera, AAO03350.1), Diabrotica

virgifera virgifera (Coleoptera, AAF20998.1), Diatraea saccharalis

(Lepidoptera, DSA1 AAP92665.1 , DSA2 AAP97393.1 e DSA3 AAP97394.1),

Drosophila bocki (Diptera, BAA95436.1, BAA95435.1, BAA95434.1 e

BAA95433.1), Lutzomia longipalpis (Diptera, AAD032192.1), Ochlerotatus

atropalpus (Diptera AAA03322.1), Phaedon cochleariae (Coleoptera,

CAA76926.1), Sarcophaga carnaria (Diptera, AAY88849.1), Spodoptera

frugiperda (Lepidoptera, AAO13754.1), Tenebrio molitor (Coleoptera,

Swissprot PS6634), Thaumatomyia notata (Diptera, AAY88858.1), Tribolium

castaneum (Coleoptera, AAA03708.1, AAA03709.1 e CAA300009.1),

Zabrotes subfasciatus (Coleoptera, AAF3435.1. O cladrogama foi obtido com

o programa Mega 4 (Takamura et al, 2007).

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