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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
INSTITUTO DE QUÍMICA
Programa de pós-graduação em Ciências Biológicas (Bioquímica)
JULIO CESAR LEVANO GARCIA
Caracterização bioquímica e imunológica das
enzimas recombinantes ATP-difosfohidrolases
1 e 2 do parasita Schistosoma mansoni
São Paulo
15/01/2008
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ii
JULIO CESAR LEVANO GARCIA
Caracterização bioquímica e imunológica das
enzimas recombinantes ATP-difosfohidrolases
1 e 2 do parasita Schistosoma mansoni
Tese apresentada ao Instituto de
Química da Universidade de São Paulo
para obtenção do Título de Doutor em
Ciências (Bioquímica)
Orientador: Prof. Dr. Sergio Verjovski de Almeida
São Paulo
2008
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iii
AGRADECIMENTOS
A Deus, que está sempre presente.
Agradeço ao Prof. Sergio Verjovski pela oportunidade de fazer doutorado e ter me
apoiado e pela sua paciência. Agradeço muito por que sei que aprendi algumas
coisas no seu laboratório e muitas outras que ainda preciso aprender, falando mais
precisamente de virtudes.
Agradeço também a minha família que sempre me dá aquela forcinha. A meu pai
Alejandro que sempre me aconselhou, a minha mãe pelo seu carinho e exemplo de
pessoa, as minhas caras irmãs Miryam e Gladys, e ao meu grande irmão Ruben e
os meus sobrinhos Bruno e Sebastian.
Aos Profs. Eduardo Moraes Reis e Ricardo DeMarco por seus conselhos e
companheirismo. Aos meus colegas de laboratório. Ao Helder, Rodrigo e Thiago por
serem bons amigos e os considero como irmãos. A Ana Claudia uma grande amiga
e ótima colega de bancada, a Ana Paula por ter paciência comigo e ser muito gentil,
a Katia e Giulliana por ser boas colegas, a Aninha Tahira, Ana Ayupe e Lauren. Um
especial agradecimento a Camila que considero uma boa amiga, e sem esquecer da
Ângela e Anna. Aos meninos Felipe, Carlos, Yuri, Renato e Jefferson. Um
agradecimento muito especial a Erica Barroso, a minha namorada por ser ótima
companheira e pela paciência comigo.
Agradeço também a Leonardo, Daniela e Henrique, membros do laboratório da
Prof.ª Luciana Leite do Instituto Butantã, pela sua grande colaboração no meu
iv
projeto de pesquisa, e sobre tudo por suas amizades. Agradeço também ao Prof.
Paulo Lee Ho, Henrique, Leonardo e Silvia por sua hospitalidade, e por me deixar
usar o espectropolarímetro dali.
Ao Prof. Renato Mortara da Escola Paulista de Medicina e Dra. Cybele Gargioni do
Instituto Adolfo Lutz, por colaborarem com o meu projeto de pesquisa. Ao Prof. Alan
Wilson e Simon Braschi da Universidade de York pela sua contribuição neste
projeto.
Agradeço aos meus colegas do Instituto de Química, todas as pessoas que
freqüentei, sobretudo aos funcionários da secretaria de pós-graduação da
Bioquímica por serem bem atenciosos e pacientes comigo. Aos meus amigos
peruanos Celso, Ricardo, Priscilla, Marcos, Miguel, César, Paola, Erick, Cesti, Juan,
Fer, Mito e Diego. Aos meus amigos Brasileiros Diorge, Milton, Antero, Blenis, Paulo
PCR, Paulinho, Marcelo e Miguelito.
A FAPESP, pelo seu apoio financeiro durante todo esse período.
Com isto só me resta dizer MUITO OBRIGADO.
v
Posso ter defeitos, viver ansioso e ficar irritado algumas vezes, mas
não esqueço que a minha vida é a maior empresa do mundo. E que
posso evitar que ela vá à falência. Ser feliz é reconhecer que vale a
pena viver, apesar de todos os desafios, incompreensões e períodos de
crise. Ser feliz é deixar de ser vítima dos problemas e se tornar um
autor da própria história. É atravessar desertos fora de si, mas ser
capaz de encontrar um oásis no recôndito da sua alma. É agradecer a
Deus a cada manhã pelo milagre da vida. Ser feliz é não ter medo dos
próprios sentimentos. É saber falar de si mesmo. É ter coragem para
ouvir um "não". É ter segurança para receber uma crítica, mesmo
que injusta. Pedras no caminho? Guardo todas, um dia vou construir
um castelo..."
Fernando Pessoa
vi
RESUMO
Levano-Garcia, J. Caracterização bioquímica e imunológica das enzimas
recombinantes ATP-difosfohidrolases 1 e 2 do parasita Schistosoma mansoni.
2008. 107p. Tese Doutoral. Programa de Pós-graduação em Bioquímica. Instituto de
Química, Universidade de São Paulo, São Paulo.
ATPDases ou ATP-difosfohidrolases são enzimas que clivam o ATP e o ADP
a AMP e Pi e estão envolvidos em inibição da agregação plaquetária. No parasita
Schistosoma mansoni nosso grupo identificou e clonou o gene da ATPDase1, e a
proteína foi localizada na superfície do tegumento. Recentemente, clonamos o gene
da ATPDase2 usando a informação do banco de dados de ESTs de S. mansoni e
imunolocalizamos a sua proteína também no tegumento. ATPDase2 foi encontrada
em ambas as membranas do tegumento basal e apical juntamente com a
ATPDase1, entretanto ATPDase2 somente foi encontrada no espaço sincicial do
tegumento. A presença de ambas as enzimas sobre a superfície externa do
tegumento sugere um maior papel sobre a regulação de abundância de
nucleotídeos. Análise da expressão de ambos os genes foram realizadas por RT-
PCR em tempo real usando RNA de ovos, miracídeo, cercária, esquistossômulo e
verme adulto. Os resultados mostraram que o gene da ATPDase1 foi mais expresso
em ovos (7 vezes), adulto (6 vezes), cercária (3,5 vezes) e esquistossômulo (1,5
vezes) quando comparado ao miracídio, que foi tomado como referência. O gene
da ATPDase2 foi mais expresso em ovos (16 vezes), cercária (11 vezes), miracídio
(7 vezes) e verme adulto (2 vezes) quando comparado a esquistossômulo,
mostrando que ambos os genes são modulados ao longo de seus estágios de ciclo
de vida . Para maior caracterização destas enzimas, elas foram expressas
heterologamente na levedura Pichia pastoris como proteínas de fusão com cauda de
6 histidinas e as proteínas recombinantes foram purificadas por cromatografia de
afinidade com resina de Ni-NTA. As ATPDases recombinantes foram obtidas de
forma ativa e medições de atividade enzimática foram realizadas. ATPDase1
mostrou atividades ATPásica e ADPásica em torno de 650 e 160 nmoles Pi.min
-
1
.mg
-1
, respectivamente. ATPDase2 teve atividades ATPásica e ADPásica na faixa
de 1050 e 250 nmoles Pi.min
-1
.mg
-1
, respectivamente. Adicionalmente, atividades
vii
UTPásica e UDPásica também foram encontradas nestas enzimas. Estudos de
dicroísmo circular com estas duas enzimas elucidaram suas estruturas secundárias.
Com isto, ATPDase1 (S
66
to Q
507
) teve alfa-hélice (7 %), folha-beta (45 %) e
estrutura randômica (48 %), e a ATPDase2 (N
83
a K
564
) mostrou conter alfa-hélice
(14 %), folha-beta (33 %) e estrutura randômica (53 %). Nós mostramos que a
ATPDase2 é secretada pelo parasita no meio, de forma similar como descrito para
as ATP-difosfohidrolases humanas CD39L2 e CD39L4. Adicionalmente, em ensaios
de inibição de penetração (cercária em camundongo) usando anticorpo anti-
ATPDase1 foi mostrada uma redução em 20 % da capacidade de penetração
através da pele das cercárias previamente incubadas com o anti-soro. Devido a que
a expressão do gene da ATPDase2 estava mais alta em miracídio e cercária,
estágios que infectam caramujos e humanos, respectivamente, postulamos que
ATPDase2 poderia ajudar no processo de invasão do parasita. No estágio ovo
ambos os genes estão altamente expressados sugerindo um possível envolvimento
das ATPDases na resposta de proteção contra o sistema imune humano. Ensaios
de proteção contra S. mansoni em camundongos, usando as ATPDases 1 e 2 como
antígenos, resultaram em uma baixa proteção obtendo-se não mais que 20% na
redução da carga parasitária.
Palavras chave: S. mansoni, ATP-difosfohidrolase, proteína recombinante, P.
pastoris, anticorpo.
viii
SUMMARY
Levano-Garcia, J. Biochemical and immunological characterization of ATP-
diphosphohydrolases 1 and 2 from Schistosoma mansoni parasite. 2008. 107p.
PhD Thesis - Graduate program in Biochemistry. Instituto de Química, Universidade
de São Paulo, São Paulo.
ATPDases or ATP-diphosphohydrolases are enzymes that cleave ATP and
ADP to AMP and Pi and are involved in inhibition of platelet aggregation. In the
parasite Schistosoma mansoni our group had identified and cloned the ATPDase1
gene and localized the protein on the tegument surface. Recently, we cloned the
ATPDase2 gene using S. mansoni EST databank information and we
immunolocalized it also in the tegument. ATPDase 2 was found on both the apical
and basal tegument membranes together with ATPDase1, but only ATPDse2 was
found in the syncytium space of the tegument. The presence of both enzymes on the
tegumental outer surface suggests a major role in regulation of nucleotides
abundance. Expression analysis of both genes was performed by Real Time RT-
PCR using RNA from eggs, miracidia, cercariae, schistosomula and adult worms.
The results showed that ATPDase1 gene was more expressed in eggs (7-fold),
adults (6-fold), cercariae (3.5-fold) and schistosomula (1.5-fold) when compared to
miracidia, which was taken as the reference. ATPDase2 gene was more expressed
in eggs (16-fold), cercariae (11-fold), miracidia (7-fold) and adult worms (2-fold) when
compared to schistosomula, showing that both genes are modulated along the life
cycle stages. For further characterization of these enzymes, they were expressed
heterologously in the yeast Pichia pastoris as fusion proteins with hexa-histidine tags
and the recombinant proteins were purified by Ni-NTA affinity chromatography. The
recombinant ATPDases were obtained in active form and activity measurements
were performed. ATPDase1 did show ATPase and ADPase activities about 650 and
160 nmoles Pi.min
-1
.mg
-1
, respectively. ATPDase2 had ATPase and ADPase
activities in the range of 1050 and 250 nmoles Pi.min
-1
.mg
-1
, respectively. These
results were obtained in the presence of calcium as cofactor. Additionally, UTPase
and UDPase activities were found for both enzymes. Circular dichroism studies with
these enzymes elucidated their secondary structures; ATPDase1 (S
66
to Q
507
) has
ix
alpha helix (7%), beta sheet (45%) and random coil (48%), whereas ATPDase2 (N
83
a K
564
) showed alpha helix (14%), beta sheet (33%) and random coil (53%). We
found that ATPDase2 was secreted by the parasite to the medium, similar to what
has been described for human CD39-L2 and CD39-L4 ATP-diphosphohydrolases.
Additionally, a penetration assay (cercaria to mice) using antibody anti-ATPDase1
did show a decrease of 20% in the penetration capacity through mice skin of cercaria
previously incubated with this antiserum. Because ATPDase2 gene expression was
increased in miracidia and cercariae, the stages that infect snail and human,
respectively, we postulate that ATPDase2 may help the parasite’s invasion process.
In the egg stage both genes were highly expressed suggesting a possible
involvement of the ATPDases in the protection response of eggs against the human
immune system. Assays of protection against S. mansoni in mice, using
recombinant ATPDase1 and 2 as antigens, resulted in low protection obtaining no
more than 20% of parasite burden reduction.
Keywords: S. mansoni, ATP-diphosphohydrolases, P. pastoris, recombinant
protein, antibody
x
ABREVIATURAS
AOX1 alcoolálcool oxidase gene 1
CFA adjuvante de Freund completo
Cy3 fluoróforo fluorescente vermelho da família das cyanines
dNTP deoxi-nucleostídeo trifosfatotrifosfatado
DTT dithiothreitol
EDTA ácido etilenodiamino tetra-acético
ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
EST expression expressed sequence tag (etiqueta de sequência
expressa)
F faraday
FITC Fluoresceine isothiocyanate, fluoróforo fluorescente verde
g gravidades
G418 antibiótico similar a canamicina
GFP green fluorescent protein
His
+
células complementadas com o gene histidine dehidrogenase
HPR horsedarish peroxidase (peroxidase de rabanete)
IFA adjuvante de Freund incompleto
IgG imunoglobulina G
IPTG isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside
kDa quilodálton (s)
kV quilovolts
LB meio meio luria –broth
M molar
xi
ml mililitro
mRNA RNA mensageiro
mU miliunidades
NDP nucleosídeo difosfatodifosfatado
ng nanogramas
N-terminal amino-terminal
NTP nucleosíideo trifosfatotrifosfatado
ºC graus Celsius
OD densidade óptica
OPD o-phenylenediamine
ORESTES Open Reading frame ESTs (ORESTES)
ORF open reading frame (fase aberta de leitura)
PAGE poliacrilamide polyacrylamide gel de electroforesiselectrophoresis
(eletroforese em gel de poliacrilamida)
pb pares de bases
PBS solução salina tamponada com fosfato
PCR reação de polimerase em cadeia
pDNA DNA plasmidial
pH potencial de hidrogênio
Pi fosfato inorgânico
PMSF fluoreto de fenilmetilsulfonila
RACE rapid amplification cDNA ends
Real time RT-PCR PCR em tempo real
RNA ácido ribonucléico
RNase ribonuclease
xii
Rpm rotações por minuto
RT-PCR transcrição reversa e PCR
s.c. subcutânea
SDS dodecil sulfato de sódio
SDS-PAGE eletroforese em gel de poliacrilamida com SDS
TAE tris, acetato, EDTA
TE tris, EDTA
TEMED N,N,N´,N´,-tetrametiletinelodiamida
Tris tris-hidroximetilaminometano
Triton X-100 polietilenglicol-terc-octilfenil éter
Trx tioredoxina
Tween 20 monolaurato de polioxietilenosorbitana
UTR região não traduzida do mRNA
V volt
X-Gal 5-bromo-4-cloro-3-indol-β-D-galactopiranosideo
YNB yeast nitrogen base (meio mínimo de suplemento de nitrogênio
para levedura)
YPD yeast extract peptone dextrose (meio contendo extrato de
levedura, peptona, dextrose)
β-ME mercaptoetanol
µg microgramas
Ω ohms
xiii
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Nomenclatura da família E-NTPDase de membros mamíferos...................8
Tabela 2. Metodologias de lavagens de corpos de inclusão....................................20
Tabela 3. Ensaio de proteção com SmATPDase 1: resposta humoral.....................74
Tabela 4. Desafio de camundongos C57BL/6 imunizados com a proteína
recombinante Apirase com diferentes adjuvantes.....................................................78
Tabela 5. Ensaio de proteção usando as SmATPDases 1 e 2 com o adjuvante
completo de Freund...................................................................................................81
Tabela 6. Ensaio de proteção usando vacina de DNA.............................................82
xiv
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Schistosoma mansoni e áreas endêmicas com esquistossomose no
Brasil............................................................................................................................1
Figura 2. Ciclo de vida do Parasita Schistosoma mansoni.........................................2
Figura 3. Catabolismo de nucleotídeos extracelular localizados na superfície celular
e ativação de receptores por nucleotídeos (P2 receptores) e adenosina
(P1 receptores)............................................................................................................6
Figura 4. Árvore filogenética hipotética com 22 membros da família E-NTPDase
(NTPDase1 a NTPDase8)............................................................................................9
Figura 5. Expressão heteróloga de SmATPDase1 em E coli....................................39
Figura 6. Análise de expressão de APIRH em BL21(DE3)pLys sob diferentes
temperaturas..............................................................................................................39
Figura 7. Re-enovelamento e purificação de SmATPDase1....................................41
Figura 8. Análise de Expressão e purificação de APIRH-His8x em C41(DE3).........43
Figura 9. Construção da fusão GFP-SmATPDase1..................................................44
Figura 10. Amplificação, reenovelamento e purificação de SmATPDase2. ............44
Figura 11. Amplificação da seqüência DNA que codifica Tioredoxina......................45
Figura 12. Co-expressão de SmATPDase2 com tioredoxina usando baixa
temperatura................................................................................................................46
Figura 13. Expressão de SmATPDase1 em P. pastoris
GS115...............................47
Figura 14. Expressão e purificação de SmATPDase2 recombinante em P. pastoris
...................................................................................................................................49
Figura 15. Análise de glicosilação das enzimas recombinantes SmATPDase1 e 2
...................................................................................................................................50
Figura 16.
Efeito de compostos sobre a atividade ATPásica da enzima
SmATPDase2............................................................................................................51
Figura 17. Atividade NTPásica das apirases recombinantes de S. mansoni............52
Figura 18A. Atividade NDPásica da apirase recombinante SmATPDase1..............53
Figura 18B. Atividade NDPásica da apirase recombinante SmATPDase2..............54
xv
Figura 19 A. Efeito de cátions divalentes sobre a atividade ATPásica de
SmATPDase 1...........................................................................................................55
Figura 19B. Efeito de cátions divalentes sobre a atividade ATPásica de
SmATPDase 2...........................................................................................................56
Figura 20. Efeito do pH na velocidade de hidrólise do substrato..............................57
Figura 21. Amplificação e coexpressão da seqüência de DNA que codifica para a
chaperona PDI...........................................................................................................58
Figura 22. Espectros CD de SmATPDase1 em 3 condições diferentes...................60
Figura 23. Espectros CD de SmATPDase2 em 3 condições diferentes
...................................................................................................................................61
Figura 24. Formação de dímeros por tratamento com glutaraldeido....................... 62
Figura 25. Níveis de expressão de SmATPDase 1 e 2 em diferentes formas do ciclo
de vida de S. mansoni determinado por Real-Time PCR..........................................63
Figura 26A. Alinhamento de seqüências de aminoácidos de SmATPDase2 com
outras apirases...........................................................................................................65
Figura 26B. Árvore filogenética com várias ATP-difosfohidrolases de diferentes
organismos....................................................................... .........................................66
Figura 27. Amplificação e expressão dos fragmentos de DNA APIMEM e APISOL
...................................................................................................................................67
Figura 28. Purificação negativa de antisoros Anti-SmATPDase1 e 2.......................68
Figura 29. Detecção de SmATPDase 1 e 2 em frações solúvel e insolúvel do
tegumento do parasita...............................................................................................69
Figura 30A. Co-imunolocalização de SmATPDase1 e 2 em parasitas S. mansoni
inteiros permeabilizados e cortes histológicos...........................................................71
Figura 30B. Desenho de co-imunolocalização das SmATPDase1 e 2 em parasitas
S. mansoni em corte histológico...............................................................................72
Figura 31. Detecção de SmATPDase2 no sobrenadante de culturas in vitro de
vermes adultos S. mansoni........................................................................................73
Figura 32. Ensaio de proteção com SmATPDase1: resposta humoral.....................74
Figura 33. Produção de anticorpos IgG anti-Apirase em camundongos imunizados
com a proteína SmATPDase1 recombinante.............................................................75
Figura 34. Relação título de anticorpos-números de parasitas.................................76
xvi
Figura 35A. Isotipagem das IgG1 da sangria 4 de camundongos imunizados com
SmATPDase1 recombinante......................................................................................77
Figura 35B. Isotipagem das IgG2a da sangria 4 de camundongos imunizados
com SmATPDase1 recombinante. Titulação de IgG2a (resposta celular).................78
Figura 36. Ensaio de proteção 2...............................................................................79
Figura 37. Titulação de IgG do ensaio de proteção 3.............................................. 80
Figura 38. Ensaio de proteção 3...............................................................................81
Figura 39. Ensaio preliminar de proteção usando vacina de DNA............................82
Figura 40. ELISPOT dos animais imunizados com a vacina de DNA.......................84
Figura 41. Efeito da concentração de apirase recombinante no ELISPOT dos
animais imunizados com a vacina de DNA................................................................84
Figura 42. Determinação do número de células produtoras de IFN- , a partir da
cultura de esplenócitos de camundongos imunizados com a vacina de DNA...........85
Figura 43. Gráfico de correlação entre a porcentagem de redução da carga
parasitária em função da polarização da resposta imune obtida...............................86
Figura 44. Gráfico de correlação entre a porcentagem de redução da carga
parasitária e o número de células secretoras das citocinas IL-4 e IFN-γ...................87
Figura 45. Inibição da penetração de cercárias pela pele de camundongos, mediada
pelo anti-soro anti-SmATPDase1...............................................................................89
xvii
ÍNDICE
1. INTRODUÇÃO.........................................................................................................1
1.1 - A esquistossomose................................................................................1
1.2 - Nucleotídeos extracelulares como moléculas sinalizadoras..............5
1.3 - As Ecto-nucleosídeo trifosfato difosfohidrolases (E-NTPDases).....7
1.4 - ATP-difosfohidrolases (ATPDases) de Schistosoma mansoni........11
2. OBJETIVOS...........................................................................................................14
3. MATERIAIS E METODOS.....................................................................................15
3. 1 - Manutenção de parasitas....................................................................15
3. 2 - Hospedeiros..........................................................................................15
3. 3 - Vetores..................................................................................................16
3. 4 - Amplificação e clonagem de SmATPDase1 ......................................16
3. 5 - Expressão de SmATPDase1 recombinante em E. coli....................18
3. 6 - Lavagem e desnaturação de corpos de inclusão.............................19
3. 7 - Re-enovelamento de Proteínas desnaturadas..................................21
3.7.1 - Re-enovelamento por diálise de proteínas desnaturadas em
Guanidina.....................................................................................................21
3.7.2 - Re-enovelamento por diluição de proteínas desnaturadas com
Guanidina.....................................................................................................21
3.7.3 - Re-enovelamento ligado a uma matriz.............................................21
3. 8 - Amplificação e clonagem da SmATPDase2.......................................22
3. 9 - Clonagem e expressão da tioredoxin (Trx).......................................23
3. 10 - Clonagem e expressão de fragmentos recombinantes da
proteína SmATPDase contendo baixa identidade entre SmATPDase1 e 2
........................................................................................................................24
xviii
3. 11 - Purificação de proteínas recombinantes em E. coli.......................25
3. 11. 1 - Cromatografia de afinidade.............................................................25
3. 11. 2 - Cromatografia de troca iônica.........................................................25
3. 12 - Expressão de proteínas recombinantes em Pichia pastoris
........................................................................................................................25
3. 13 - Purificação de SmATPDase1 e 2 do sobrenadante da cultura de
P. pastoris......................................................................................................27
3. 14 - Clonagem e expressão da proteína dissulfeto isomerase (PDI)
........................................................................................................................27
3. 15 - Caracterização enzimática de SmATPDases 1 e 2 recombinantes
de S. mansoni................................................................................................28
3. 16 - Dicroísmo circular..............................................................................29
3. 17 - Western blot........................................................................................29
3. 18 - Deglicosilação de apirase recombinante .......................................30
3. 19 - Imunização de camundongos e desafio com cercárias.................31
3. 19. 1 - Imunização com Proteínas..............................................................31
3. 19. 2 - Imunização com plasmídeo (vacina de DNA).................................32
3. 20 - ELISA...................................................................................................33
3. 21 - PCR em Tempo Real (Real Time PCR)............................................34
3. 22 - Imunofluorescência de parasitas inteiros e cortes histológicos
........................................................................................................................34
3. 23 - Cultura in vitro de vermes adultos de S. mansoni..........................35
3. 24 - Ensaio de inibição de penetração pela pele....................................37
3. 25 - Cross-linking com glutaraldeido......................................................37
4. RESULTADOS .....................................................................................................38
4.1 - Clonagem, expressão, purificação de SmATPDase1 .......................38
4. 1. 1 - Construção I: Apirase recombinante com cauda de histidina............38
4. 1. 2 - Re-enovelamento de proteínas..........................................................40
xix
4. 1. 3 - Construção II : Proteína recombinante com cauda de histidina.........42
4. 1. 4 - Construção III: Proteína recombinante de fusão com GFP................43
4. 2 - Amplificação e expressão de SmATPDase2 .....................................44
4. 3 - Construção do vetor de expressão com Tioredoxin (Trx) ..............45
4. 4 - Co-expressão de SmATPDase2 com Tioredoxina em E. coli..........46
4. 5 - Expressão e purificação de SmATPDase 1 e 2 recombinante
no sistema P. pastoris..................................................................................47
4. 6 - Deglicosilação de proteínas recombinantes.....................................49
4. 7 - Atividade enzimática............................................................................50
4. 8 - Construção do vetor de expressão com Proteína dissulfeto
isomerase e co-expressão com SmATPDase1 em P. pastoris
.........................................................................................................................58
4. 9 - Análise da estrutura secundaria das SmATPDases recombinantes
por dicroísmo circular..................................................................................59
4. 9. 1 - SmATPDase 1 e SmATPDase 2 formam dímeros.........................61
4. 10 - Análises dos níveis de expressão de SmATPDases 1 e 2............62
4. 11 - Análise filogenética de SmATPDase2..............................................63
4. 12 - Expressão de fragmentos de SmATPDAse1 e 2 com baixa
similaridade...................................................................................................66
4. 13 - Western Blot e imunolocalização de SmATPDases 1 e 2 de S.
mansoni..........................................................................................................68
4. 14 - SmATPDase2 é secretada pelo parasita no meio...........................72
4. 15 - Ensaios de Proteção contra Schistosoma usando
SmATPDase1 e 2..........................................................................................73
4. 15. 1 - Ensaio de proteção usando SmATPDase recombinante:
resposta humoral e ensaio funcional.........................................................73
4. 15. 1. 1 - Ensaio de proteção 1.......................................................74
4. 15. 1. 2 - Ensaio de proteção 2.......................................................76
xx
4. 15. 1. 3 - Ensaio de Proteção 3.......................................................79
4. 15. 2 - Ensaio de proteção usando SmATPDase1 como Vacina de
DNA...........................................................................................................82
.
4. 15. 3 - Avaliação da resposta humoral em animais imunizados com a
vacina de DNA SmATPDase1/pTARGET..................................................83
4. 15. 4 - Avaliação da resposta celular em animais imunizados com
SmATPDase1/ pTARGET (ELISPOT).......................................................83
4. 16 - Ensaio de inibição de penetração pela pele...................................88
5. DISCUSSÃO..........................................................................................................90
6. CONCLUSÃO........................................................................................................99
7. REFERÊNCIAS...................................................................................................100
LISTA DE ANEXOS
-Sumula curricular
-Artigo publicado
1
1. INTRODUÇÃO
1. 1 - A esquistossomose
A esquistossomose é uma doença parasitária crônica, debilitante e, em cerca
de 10% dos casos, fatal. Afeta principalmente indivíduos em áreas rurais, sendo
endêmica em países tropicais e subtropicais. Ela constitui, na atualidade, um dos
maiores problemas de saúde pública em termos globais, afetando em torno de 200
milhões de pessoas, e colocando em risco de infecção outras 650 milhões (WHO
2002). Esta doença é causada por um platelminto do gênero Schistosoma, sendo a
espécie Schistosoma mansoni a única encontrada no Brasil (figura 1). Mesmo
assim, estima-se que mais de 6 milhões de indivíduos estejam infectados, só neste
país (http://www.fiocruz.br). Esta espécie também é encontrada na África e no
Oriente médio.
Fig 1. Schistosoma manson
i
e áreas endêmicas com esquistossomose no Brasil. (A) Distribuição
geográfica de áreas endêmicas com esquistossomose. Fonte: GT-Esquistossomose/CDTV/CGDT/SVS/MS.
(Guia de vigilância epidemiológica) (Brasil 2005) (B) Microscopia eletrônica de varredura do parasita
Schistosoma mansoni. Fonte: http://www.usuhs.mil/mic/Davies/Research.html.
2
Espécies deste gênero são encontradas em todo o mundo, como
Schistosoma haematobium na África e leste do Mediterrâneo e Schistosoma
japonicum, no sudeste Asiático e no Pacifico Ocidental.
No ciclo de vida deste parasita, é necessária a passagem por dois hospedeiros,
sendo o hospedeiro intermediário um gastrópode terrestre do gênero Biomphalaria e
o definitivo, o ser humano. No caramujo, o parasita evolui da forma de miracídio à
forma de cercária, passando por uma fase intermédia chamada esporocisto. Neste
último estágio, o parasita consegue penetrar ativamente, através da pele, no
hospedeiro humano, migrando até seus vasos sanguíneos, onde se desenvolverá
até sua forma adulta, podendo viver ali por vários anos (Vermund et al. 1983).
Figura 2. Ciclo de vida do Parasita Schistosoma mansoni. Fonte:
(
Pessoa e Martins 1977
)
Ada
p
tado.
3
A doença tem uma fase aguda e outra crônica. Na fase aguda, pode
apresentar manifestações clínicas como coceiras e dermatites, febre, inapetência,
tosse, diarréia, enjôos, vômitos e emagrecimento. Na fase crônica, geralmente
assintomática, episódios de diarréia podem alternar-se com períodos de obstipação
(prisão de ventre); e a doença pode evoluir para um quadro mais grave com
aumento do fígado (hepatomegalia) e cirrose, aumento do baço (esplenomegalia),
hemorragias provocadas por rompimento de veias do esôfago, e ascite ou barriga
d’água, isto é, o abdômen fica dilatado e proeminente porque escapa plasma do
sangue. As manifestações patológicas estão predominantemente relacionadas à
deposição de numerosos ovos dos parasitas nos tecidos do hospedeiro, levando à
resposta granulomatosa (Cheever et al. 2000).
O parasita possui um sofisticado sistema de escape de seus hospedeiros
envolvendo expressão de antígenos de superfície e modificação da resposta imune
do hospedeiro (Salzet et al. 2000). Foi demonstrado também que o parasita secreta,
em diferentes fases de seu ciclo de vida, substâncias que induzem a apoptose de
células T do hospedeiro (Fallon et al. 1998). Antígenos do próprio hospedeiro, tais
como imunoglobulinas (Ig), produtos MHC, componentes do complemento e
lipoproteínas de baixa densidade são incorporados ao tegumento para
mascaramento de possíveis antígenos de superfície do parasita. Entretanto, o
parasita sintetiza de forma endógena moléculas semelhantes às presentes no
hospedeiro, que apresentam imuno-reatividade cruzada com antígenos do
hospedeiro (Abath e Werkhauser 1996). Em esquistossômulos ocorre uma
renovação constante da membrana do tegumento, a qual estaria associada ao
mecanismo de escape do parasita do sistema imune (Pearce et al. 1996). Contudo,
4
estes mecanismos ainda não são bem conhecidos, sendo sua elucidação muito
significante para o entendimento da relação parasita-hospedeiro.
Atualmente, existem medicamentos efetivos contra o parasita, como é o caso
de Praziquantel cuja ação está associada à indução do influxo de cálcio através da
membrana do tegumento. Este influxo causa uma rápida contração muscular e
vascular do tegumento, matando desta forma o parasita (Kohler 2001). A
esquistossomose tem progressão lenta e, na maioria dos casos, as pessoas
infectadas procuram assistência médica apenas quando exibem a condição de
hepatosplenomegalia, sendo, neste ponto, ineficaz o uso de medicamentos (Wilson
e Coulson 1999). Outro aspecto fortemente negativo do tratamento por drogas é que
o uso de medicamento evidentemente não impede a re-infecção dos indivíduos que
vivem em áreas endêmicas. Além disso, em regiões onde foram realizados
tratamentos em larga escala, já foram detectadas cepas resistentes ao Praziquantel
(Ismail et al. 1996; Liang et al. 2001), embora o mecanismo de seleção de vermes
resistentes em campo esteja sob discussão (Doenhoff et al. 2002).
Até hoje não se desenvolveu ainda nenhuma vacina efetiva contra a
esquistossomose e existem atualmente vários candidatos a vacina, como
gliceraldeido 3-P desidrogenase (GAPDH) (Argiro et al. 2000), glutationa-S-
transferase (GST) (Capron et al. 2001), a triose fosfato isomerase (TPI) (Reynolds et
al. 1994), a sm23 (Da'dara et al. 2001), a sm14 (Tendler et al. 1996) e tetraspanin
(TSP) (Tran et al. 2006); embora estes candidatos tenham demonstrado resultados
positivos em testes com animais, ainda não foi demonstrada sua eficácia em
humanos.
5
Nas plaquetas foi observada uma ação contra esquistossômulo (Bout et al.
1986). A função do ADP como mediador primário de ativação de plaquetas já foi
descrita, sendo que o ADP com efeito agregatório pode ser liberado na circulação
sanguínea após danos nos tecidos (Marcus et al. 1997). Por outro lado, enzimas
capazes de degradar o ADP exógeno têm sido encontradas na superfície externa de
células do endotélio vascular e células sanguíneas como leucócitos, eritrócitos e
plaquetas (Cote et al. 1991) tendo uma implicação na limitação da agregação
plaquetária (Enjyoji et al. 1999).
1.2 - Nucleotídeos extracelulares como moléculas sinalizadoras
Nucleotídeos extracelulares possuem muita importância para o hospedeiro
por representarem a substância de sinalização mais abundante entre células. Além
disso, estas substâncias produzem respostas fisiológicas em cada tecido, sendo que
estes exercem sua função através de receptores purinérgicos localizados na
superfície celular (Chen et al. 1995). Isso demonstraria que no caso do ATP
extracelular este tem diferentes efeitos em muitos processos biológicos, sendo os
principais: contração do músculo liso, neurotransmissão, resposta imune, inflamação
e dor (Ralevic e Burnstock 1998; Sitkovsky 1998; Sneddon et al. 1999; Ding et al.
2000). Estes nucleotídeos também são liberados de células em processo de morte
celular ou células lisadas, e quando estas são submetidas a condições fisiológicas
normais ou patológicas do meio extracelular (Ralevic e Burnstock 1998). Entretanto,
já foi demonstrado que o ATP extracelular pode matar diferentes classes de células,
com exceção daquelas que tem uma alta capacidade de quebra do ATP na sua
superfície (Filippini et al. 1990).
6
Os nucleotídeos ATP e ADP podem ativar os neutrófilos e estimular a
liberação de óxido nítrico (NO) de células endoteliais. No entanto, outros estudos
mostraram que estes mesmos nucleotídeos secretados por plaquetas, glóbulos
brancos e células endoteliais danificadas, mediam o processo de inflamação e
trombose vascular observados durante rejeição a órgãos estranhos (Imai et al.
2000). Em muitos tecidos, concentrações extracelulares de ATP e ADP, assim como
de outros nucleosídeos di e trifosfatados, parecem ser reguladas pela ação de um
grupo de enzimas ligadas à membrana que hidrolisam nucleotídeos sendo uma
destas a enzima ecto-ATP difosfohidrolase ou ecto-apirase (Zimmermann 1996).
Essencialmente cada tipo celular em um organismo pode liberar estes mediadores,
os quais vão sinalizar através de receptores para adenosina ou outros nucleotídeos
localizados na superfície celular (figura 3).
Ao todo, duas famílias de receptores distintos estruturalmente têm sido
identificadas e caracterizadas: os receptores acoplados à proteína G (P2Y) ou
metabotrópicos, e os receptores com canais iônicos (P2X) ou ionotrópicos
Figura 3 .Catabolismo de nucleotídeos extracelular localizados na superficie celular e ativação
de receptores por nucleotídeos (P2 receptores) e adenosina (P1 receptores). A figura mostra as
principais propriedades catalíticas dos membros da família E-NTPDases e ecto- 5´-nucleotidase. ATP
pode ativar ambos os receptores, P2X e os subtipos de receptores P2Y, enquanto UTP ativa somente
subtipos de receptores P2Y. Após degradação, ADP ou UDP podem ativar adicionais subtipos de
receptores P2Y. Fonte: (Robson et al. 2006).
7
(Fredholm e Altiok 1994; Buell et al. 1996; Atkinson et al. 2004). Os receptores P2X
respondem a ATP, receptores P2Y podem ser ativados por ATP, ADP, UTP, UDP,
ITP, e açúcares de nucleotídeos (Lazarowski et al. 2003) (figura 3).
1.3 – As Ecto-nucleosídeo trifosfato difosfohidrolases (E-NTPDases)
E-NTPDases (EC 3.6.1.5) ou também chamadas ATP-difosfohidrolases,
ATPDases ou Apirases, são ecto-enzimas que hidrolisam nucleosídeos di e
trifosfatados extracelulares e têm um definido perfil farmacológico. Elas são ativadas
por elevadas concentrações de Ca
2+
ou Mg
2+
e não são inibidas pelos inibidores
clássicos de ATPases intracelulares como as do tipo P, tipo F e tipo V ou fosfatase
alcalina (Vasconcelos et al. 1993; Plesner 1995; Zimmermann 1996).
Diferentemente das ATPases que hidrolisam apenas ATP, as apirases geralmente
hidrolisam tanto ATP quanto ADP. Os produtos da hidrólise de ATP por apirase são
AMP e dois ânions ortofosfato. A cadeia ou cascata ectonucleotidásica, iniciada por
NTPDases, pode ser terminada pela ecto-5´-nucleotidase (CD73; EC 3.1.3.5) com
hidrólise de nucleosídeos monofosfatados (Zimmermann 1992).
Oito genes diferentes de ENTPD (tabela 1) codificam para membros da
família de proteínas NTPDase humanas. Quatro membros das NTPDases são
enzimas tipicamente localizadas na superfície celular com um sítio ativo exposto ao
meio extracelular (NTPDases 1, 2, 3 e 8). NTPDases 5 e 6 mostraram localização
intracelular e são secretadas depois de expressão heteróloga. NTPDases 4 e 7 são
completamente localizadas intracelularmente e expostas ao lúmen das organelas
citoplasmáticas. A presença de atividade hidrolisante de ATP e/ou ADP na superfície
de muitos tipos celulares tem sido reconhecida (Zimmermann 2000). O membro
8
protótipo desta família de enzimas foi primeiro clonado e identificado como um
antígeno de ativação celular linfóide (CD39) com função desconhecida (Maliszewski
et al. 1994).
Tabela 1. Nomenclatura da família E-NTPDase de mamíferos.
Subtipos de NTPDases tem diferenças em localização e propriedades
funcionais. Com isso, quatro tipos foram localizados na superfície da célula
(NTPDase1, 2, 3 e 8), os quais podem ser diferenciados de acordo à preferência
pelo substrato, cátion divalente e formação de produto. Todas as NTPDases
localizadas na superfície precisam dos íons Ca
2+
ou Mg
2+
na faixa milimolar para ter
máxima atividade, e são inativas na ausência destes (Kukulski et al. 2004). Estas
enzimas hidrolisam nucleosídeos trifosfatados incluindo os fisiologicamente ativos
Nome da
proteína
Nome adicional Nome do gene
humano, e de
camundongo
Número de acesso
humano, e de
camundongo
NTPDase 1 CD39, ATPDase,
ectoapirase
ENTPD1, Entpd1
U87967,
NM_009848
NTPDase 2 CD39L1, ecto-ATPase
ENTPD2, Entpd2
AF144748,
AY376711
NTPDase 3 CD39L3, HB6
ENTPD3, Entpd3
AF034840,
AY376710
NTPDase 4 UDPase, LALP70
ENTPD4, Entpd4
AF016032,
NM_026174
NTPDase 5 CD39L4, ER-UDPase,
PCPH
ENTPD5, Entpd5
AF039918,
AJ238636
NTPDase 6 CD39L2
ENTPD6, Entpd6
AY327581,
NM_17217
NTPDase 7 LALP1
ENTPD7, Entpd7
AF269255,
AF288221
NTPDase 8 hATPDase
ENTPD8, Entpd8
AY430414,
AY364442
A informação foi obtida do genoma humano do GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) e do
sítio de informática do genoma de camundongo (MGI) para o genoma de camundongo
(http://www.informatics.jax.org/
)
9
ATP e UTP. Notavelmente, a velocidade de hidrólise para nucleosídeos difosfatados
varia consideravelmente entre subtipos (figura 4).
Adicionalmente, dados experimentais mostraram que enzimas do tipo
NTPDase1 hidrolisam ATP e ADP em iguais proporções, e enzimas NTPDase3 e 8
revelaram ter maior hidrólise sobre ATP do que ADP (figura 4). Enzimas do tipo
NTPDase2 tem uma elevada preferência pelos nucleosídeos trifosfatados, embora
tenha sido classificada anteriormente como uma ecto-ATPase (Kirley et al. 2006).
Com tudo, é muito possível que as diferenças entre suas seqüências e também
entre suas estruturas secundária, terciária ou quaternária tenham influencia sobre as
variações nas propriedades catalíticas dos subtipos de enzimas.
Figura 4. Árvore filogenética hipotética com 22 membros da família E-NTPDase
(NTPDase1 a NTPDase8). Esta árvore está baseada no alinhamento de seqüência de
aminoácidos de NTPDases de rato (r), humano (h), e camundongo (m ). O gráfico mostra uma
clara separação entre NTPDases localizadas na superfície (acima) e localizadas
intracelularmente (abaixo) (Robson et al. 2006).
10
As seqüências de identificação de todas as NTPDases são os cinco domínios
altamente conservados conhecidos como “apyrase conserved regions” (ACR), os
quais são chamados ACR1 até ACR5 (Handa e Guidotti 1996; Vasconcelos et al.
1996). Uma das primeiras enzimas desta família a ser caracterizada foi a apirase de
batata, uma enzima de 49 kDa (Traverso-Cori et al. 1965). Enzimas ATP-
difosfohidrolases ou apirases têm sido encontradas também na saliva de insetos
hematófagos, onde estas enzimas possuem propriedades anti-hemostáticas (Reno e
Novak 2005). Estudos com a ATP-difosfohidrolase de placenta humana
(Christoforidis et al. 1995) mostraram que esta proteína era idêntica ao antígeno de
ativação celular linfóide (CD39) (Maliszewski et al. 1994); esta mesma proteína
CD39 foi encontrada inicialmente na superfície de células endoteliais e células
derivadas de macrófagos (Kansas et al. 1991). A relação entre a proteína CD39 e a
atividade ATP-difosfohidrolase foi demonstrada por estudos onde a expressão
heteróloga de CD39 em células COS-7 levou a um incremento nas atividades
ATPásica e ADPásica dependentes de Ca
2+
ou Mg
2+
(Kaczmarek et al. 1996; Wang
e Guidotti 1996).
Entretanto, pouco é conhecido acerca da função das endo-apirases sendo
sugerido envolvimento na glicosilação de proteínas (Gao et al. 1999; Uccelletti et al.
2007), e virulência do patógeno Legionella pneumophila (Sansom et al. 2007).
Estudos mostraram que estas ecto-apirases de mamíferos (CD39) são proteínas
integrais de membrana com dois domínios transmembrana (um domínio em cada
extremo, amino e carboxilo, da proteína), dois pequenos segmentos amino e
carboxilo terminal no citoplasma, e um comprido domínio central extracelular
(Maliszewski et al. 1994) com atividade enzimática (Wang e Guidotti 1996); é
11
caracterizada como uma proteína tetramérica não covalente (Wang et al. 1998) que
hidrolisa os dois substratos ATP e ADP com igual eficiência, enquanto a enzima
ATPase somente hidrolisa o ATP (Atkinson et al. 2006).
1.4 - ATP-difosfohidrolases (ATPDases) de Schistosoma mansoni
No parasita Schistosoma mansoni foi possível purificar e caracterizar
parcialmente uma proteína de superfície de aproximadamente 63 kDa no tegumento,
que mostrava uma atividade ATP-difosfohidrolase (apirase, EC 3.6.1.5) sendo a
primeira demonstração da presença deste tipo de enzima na superfície de um
endoparasita (Vasconcelos et al. 1996; DeMarco et al. 2003). Esta enzima foi
localizada na superfície externa do tegumento do parasita, e baseado na
importância do ADP no processo de ativação das plaquetas foi proposto que a
enzima ATP-difosfohidrolase poderia participar do mecanismo de escape do parasita
à resposta do hospedeiro clivando ATP ou ADP, os quais poderiam ser liberados por
plaquetas ativadas (Vasconcelos et al. 1993) ou linfócitos T citotóxicos.
Interessantemente, outros estudos mostraram a importância da presença de
enzimas que clivam nucleotídeos na superfície de patógenos na relação com o seu
hospedeiro, mostrando a presença de uma enzima com atividade ecto-ATPase,
dependente de magnésio, na superfície externa do parasita Leishmania tropica
(Meyer-Fernandes et al. 1997). Uma enzima similar a ATP-difosfohidrolase foi
também demonstrada ser secretada no vacúolo celular de Toxoplasma gondii
(Bermudes et al. 1994). Adicionalmente, foi descrita uma ecto-nucleotídeo
difosfohidrolase em células de Entamoeba histolytica (Barros et al. 2000) e uma
ATP-difosfohidrolase em Trichomonas vaginalis (de Aguiar Matos et al. 2001). A
12
ATP-difosfohidrolase 1 de S. mansoni compartilha várias características estruturais e
funcionais com outras ATP-difosfohidrolases de diferentes origens, tendo
especificidade por diferentes nucleotídeos (Vasconcelos et al. 1993; Vasconcelos et
al. 1996).
Em nosso laboratório, foi possível clonar a seqüência de DNA que codifica a
enzima ATP-difosfohidrolase 1 do parasita S. mansoni (DeMarco et al. 2003). Nesta
enzima foi predita uma topologia com duas regiões transmembrânicas localizadas
próximas às pontas amino e carboxilo terminal, mantendo similaridade com a
topologia descrita para as proteínas CD39. Além disso, foi sugerido também que a
região hidrofílica, localizada entre estas duas regiões transmembrana, estaria
voltada para o lado externo da membrana.
Entretanto, a seqüência primária da ATP-difosfohidrolase 1 de S. mansoni possui
uma região amino-terminal um pouco maior que as proteínas CD39, se for
considerada a primeira metionina como o início da proteína. Nesse aspecto ela seria
semelhante a CD39L2 humana, a qual possui uma seqüência sinal para os primeiros
78 aminoácidos (Chadwick e Frischauf 1998) ou com a apirase lisossomal humana
que tem duas regiões transmembrana preditas (Biederbick et al. 1999). Além disso,
se fosse considerada a segunda metionina como o aminoácido inicial, teria, em
teoria, o início da proteína no mesmo ponto que as proteínas CD39 que foram
alinhadas. No momento, ainda não foi possível saber qual das duas predições de
início da tradução é a correta. Pela razão de existir apenas uma pequena diferença
entre elas (30 aminoácidos, aprox. 3300 Da), não foi possível fazer uma distinção
entre as duas possibilidades a partir do tamanho da proteína nativa, detectada
anteriormente em gel de poliacrilamida com SDS (Vasconcelos et al. 1996).
13
Uma importante característica das ecto-apirases de vertebrados é a
sensibilidade de sua atividade enzimática a muitos detergentes. As atividades
enzimáticas de ATPases tipo E solúveis, incluindo a apirase de batata (S.
tuberosum) (Kettlun et al. 2005) e as ecto-ATPases de parasitas (Smith et al. 1997)
não são afetadas por detergentes, sendo a principal diferença entre as estruturas
das ecto-apirases de mamíferos (sensíveis a detergente) e as apirases solúveis
(resistentes a detergente) a presença de segmentos transmembrana, o que sugere
que a interação dos domínios transmembrana com detergentes determina a sua
sensibilidade.
Muitos trabalhos com apirases mostram que estas são proteínas glicosiladas
(Plesner 1995; Mulero et al. 2000), sendo encontrados 7 e 6 potenciais sítios de N-
glicosilação na ATP-difosfohidrolase de cérebro e ecto-apirase CD39 humana,
respectivamente. Experiências com a apirase de cérebro humano mostraram que a
deglicosilação da enzima tinha como conseqüência a perda de sua atividade (Smith
et al. 1997; Murphy e Kirley 2003; Wu et al. 2005), mas por outro lado, foi mostrado
que a ATP-difosfohidrolase da placenta humana manteve sua atividade enzimática
quando esta foi tratada com a enzima N-glicosidase F (Christoforidis et al. 1996). Na
ATP-difosfohidrolase 1 de S. mansoni foram preditos 5 potenciais sítios de N-
glicosilação, sendo que 3 sítios se encontrariam na região hidrofílica.
14
2. OBJETIVOS
Expressão heteróloga da região hidrofílica da SmATPDase1 no hospedeiro E.
coli.
Expressão heteróloga da região hidrofílica da SmATPDase1 no hospedeiro
Pichia pastoris
Clonagem de uma segunda isoforma de ATPDase do S. mansoni
Co-imunolocalização das duas SmATPDases no tegumento do parasita.
Análise de expressão dos genes SmATPDase1 e 2 nos diferentes estágios do
parasita.
Purificação das SmATPDases 1 e 2 recombinantes
Caracterização enzimática das proteínas purificadas
Caracterização imunológica das duas SmATPDases recombinantes usando o
sistema murino: Teste de proteção.
15
3. MATERIAIS E MÉTODOS
3. 1 - Manutenção de parasitas
S. mansoni cepa BH foram mantidos por sucessivas infecções em
camundongos com injeções subcutâneas de cercárias. Vermes adultos foram
obtidos por perfusão de camundongos após 7-8 semanas de infecção. Os ovos
foram obtidos a partir de fígados de camundongos infectados, e os miracídios foram
obtidos a partir destes ovos purificados (Dalton et al. 1997). As formas cercárias
foram obtidas após 30 dias de infecção de caramujos do gênero Biomphalaria. As
formas esquistossômulo foram obtidas de culturas de cercárias in vitro por 7 dias
(Basch 1981). Os parasitas em suas formas ovo, miracídio, cercária e
esquistossômulo foram obtidos em nosso laboratório em colaboração com as
doutorandas Kátia C. Oliveira e Giulliana Tessarini Almeida. Os parasitas adultos
foram fornecidos pela Dra. Cybele Gargioni do Instituto Adolfo Lutz (Secção de
enteroparasitoses).
3. 2 - Hospedeiros
A cepa E. coli DH10B (Gibco BRL) foi usada para transformação e
propagação de plasmídeos recombinantes. As cepas E. coli BL21(DE3),
Origami(DE3) (Novagen), C41(DE3) (Avidis) e ArcticExpress (DE3)RIL (Cpn10-
Cpn60) foram usadas para estudos de expressão em hospedeiro procarionte.
As leveduras P. pastoris cepa GS115 (Invitrogen) e S. cerevisiae foram
usadas para estudos de expressão em eucariontes e como fonte de DNA para
amplificação do gene PDI, respectivamente
16
3. 3 - Vetores
O vetor pGEM-T (Promega) foi usado para a clonagem dos produtos de PCR,
e os vetores pET21b, pET36b (Novagen) e pAZ foram usados para a expressão
intracelular em E. coli das seqüências que codificam para as regiões hidrofílicas e
região com baixa similaridade entre ambas as SmATPDases 1 e 2. O vetor
recombinante pAE-Trx codificando para Tioredoxina foi usado para co-expressão
junto a SmATPDase2 em E. coli. O vetor pPIC9K (Invitrogen) foi usado para a
expressão e secreção no meio de cultura das SmATPDases 1 e 2 recombinantes, e
o vetor pPICHOLI-1 (Mobitech) foi usado para a expressão intracelular da seqüência
que codifica para a proteína dissulfeto isomerase (PDI) em P. pastoris, e foi usado
em testes de co-expressão com ambas as SmATPDases1 e 2. O vetor pTARGET
(Promega) foi usado para a expressão intracelular das seqüências que codificam
para as SmATPDases 1 e 2 inteiras (incluindo regiões transmembrana) em células
de mamífero.
3. 4 - Amplificação e clonagem de SmATPDase1
As construções feitas contendo a seqüência de DNA que codifica para o
domínio hidrofílico de SmATPDase1 (APIRH) foram realizadas usando como molde
a construção pMIclone4/pET21b (apirase inteira), feita previamente no nosso
laboratório (DeMarco et al. 2003). A seqüência de DNA que codifica a região
hidrofílica (S
66
até Q
507
) foi amplificada usando os oligos 5´-
GTCCATATGAGTAGTAACAT TCCA-3´ e 5´-TCGGTACCTTGTGTACTGACAGA-3´
os quais continham os sítios de restrição para Nde I e Kpn I (sublinhados)
respectivamente, para a clonagem no vetor pET36b. Outra amplificação da APIRH
foi realizada com os oligos 5´-AGGTACCGATGACGATGACAAAG-3´ e 5´-
17
TGAATTCTTATTGTGTACTGACAGA-3´ os quais continham os sítios de restrição
(sublinhados) para Kpn I e EcoR I respectivamente, para a clonagem no vetor pAZ
(em fusão com GFP). Adicionalmente, foram usados os oligos 5´-
GCGTACGTAAGTAGTAACATTCC-3´ (“forward”), 5´-TAGAATTCTTAGTGGTGGT
GGTGGTGGTGTTGTGTACTGACAGA-3´ (“reverse”) os quais continham os sítios
SnaB I e EcoR I para amplificação de APIRH e clonagem no vetor pPIC9K. As
amplificações foram realizadas com a Advantage 2 polymerase (Clontech) usando,
20 pmol de cada oligo e 200 µM de dNTPs nas seguintes ciclagens: 95°C (1 min);
30 ciclos de 95°C (30 seg), 55°C (30 seg) e 68°C (3 min), seguido de uma extensão
final de 68°C (3 min). A segunda amplificação de APIRH, para clonagem no vetor
pAZ, foi com passo inicial de 95°C (1 min); 30 ciclos de 95°C (30 seg), 60°C (30 seg)
e 68°C (3 min), seguido de uma extensão final de 68°C (3 min). A terceira e quarta
amplificações foram realizadas usando as mesmas condições para a segunda
amplificação, e os produtos clonados no vetor pPIC9K. Os produtos de PCR foram
purificados de gel de agarose 1% usando o QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen).
Os oligos usados nas amplificações foram sintetizados pelo laboratório de síntese
de DNA do departamento de patologia da Universidade de Yale (USA).
Os produtos de PCR purificados foram ligados no vetor pGEM-T easy
(Promega) a 4°C por 16 hrs. Células competentes E. coli DH10B foram
transformadas por eletroporação (Dower et al. 1988) com as reações de ligação, e
os clones foram selecionados no meio LB agar (10% Triptona, 5% extrato de
levedura, 5% NaCl, 1,5% agar) contendo ampicilina (100 µg/ml), 0,5 mM IPTG e 80
µg/ml X-Gal e incubadas a 37°C. Os clones resistentes de cor branca foram
selecionados e extraídos seus plasmídeos a partir de pequenas culturas (4 ml)
usando o método de lise alcalina (Sambrook & Russell, 2001). Os plasmídeos
18
recombinantes foram selecionados por análise de restrição com as enzimas de
restrição Nhe I/Kpn I, Kpn I/EcoR I e SnaB I/EcoR I (New England Biolabs),
respectivamente. Os insertos dos plasmídeos foram seqüenciados automaticamente
usando o Mega BACE 1000 DNA analysis system (Amersham Life Sciences) de
acordo com o método de dideoxinucleotídeos (Sanger et al. 1977), utilizando
ddNTPs modificados com uma molécula fluorescente diferente para cada base
nitrogenada.
Os insertos dos plasmídeos recombinantes selecionados foram ligados em
vetores de expressão, e as células E. coli DH10B transformadas com as novas
construções. Os novos transformantes foram selecionadas no meio LB agar
ampicilina (100 µg/ml) para construções no vetor pAZ, e LB agar canamicina (50
µg/ml) para construções nos vetores pET36b e pPIC9K. Em seguida, os plasmídeos
recombinantes foram extraídos, e os clones foram selecionados por análise de
restrição.
3. 5 - Expressão de SmATPDase1 recombinante em E. coli
Durante os ensaios de expressão da enzima recombinante, foram testadas as
cepas BL21(DE3) e BL21(DE3)pLysS contendo a construção APIFRA6/pET21b a
qual tem clonada a seqüência de DNA que codifica para a região hidrofílica (L
65
até
L
515
) da apirase SmATPDase1 (DeMarco et al. 2003). Neste sistema as bactérias
foram cultivadas no meio LB/ ampicilina (100 µg/ml) a 37
o
C com rotação em um
volume pequeno (pre-inóculo de 5 ml) até saturação, para logo este volume ser
adicionado a um volume maior de cultura (100-250 ml) mantido nas mesmas
condições descritas anteriormente. Quando chegada à absorbância OD
600
0,5 –1,0
19
foi adicionado o IPTG (1 mM) para a indução da expressão da proteína; as bactérias
foram coletadas após 6 horas de indução e lisadas com French Press (SIM-
AMINCO) a 20 000 psi.
Em seguida foram testadas diferentes temperaturas de incubação da cultura
durante a expressão. Partiu-se de uma cultura de 50 ml com a cepa
BL21(DE3)pLys, a qual foi inoculada em um litro de meio de cultura, que foi
incubado nas mesmas condições mencionadas anteriormente. A cultura foi dividida
em 4 erlenmeyers (1L capacidade) com 250 ml de cultura cada, e incubado sob
indução de IPTG (1mM) a 15
o
C, 20
o
C, 30
o
C e 37
o
C respectivamente por 6 horas. As
células foram coletadas por centrifugação e normalizadas as concentrações de
células de cada cultura com 20 mM Tris-HCl pH 7,5 de acordo com as OD
600
obtidas
antes da coleta das bactérias. Os lisados celulares foram separados por
centrifugação a 10 000 g por 30 min, e amostras das frações solúvel é insolúvel
foram analisadas por SDS-PAGE 10%. Posteriormente foi usada a construção
APIRH5-II/pET36b para expressar no hospedeiro E. coli C41(DE3), e a expressão
de APIRH em fusão com a proteína GFP (N-terminal) foi realizada com células E.
coli Origami(DE3) e BL21(DE3) usando as mesmas condições descritas
anteriormente.
3. 6 - Lavagem e desnaturação de corpos de inclusão
Uma cultura de E. coli cepa BL21(DE3) contendo o vetor recombinante
APIFRA6/pET21b foi induzida em 500 ml de meio LB. A fração insolúvel foi obtida
após centrifugação do lisado total bacteriano na presença do tampão 50 mM Tris-
HCl pH 8,0; 2 mM PMSF. Para minimizar os contaminantes que possam interferir
20
com o processo de re-enovelamento e purificação, as proteínas recombinantes
obtidas como corpos de inclusão foram submetidas a uma série de lavagens com
diferentes tampões. Para aperfeiçoar este procedimento foram testadas algumas
metodologias já descritas (I-VII; tabela 2).
Todas as centrifugações foram feitas a 10 000g por 20 min a 4
o
C, e em
seguida as amostras dos corpos de inclusão foram analisadas em SDS-PAGE 10%.
Em seguida, foi selecionado o melhor método de lavagem pela observação do perfil
de bandas nos géis, e para a solubilização dos corpos de inclusão foram testados
os seguintes desnaturantes: 6M Guanidina e 8M Uréia .
I Ressuspendido em 20 ml de 50 mM Tris-HCl pH 8,0, 2 mM EDTA, 100
µg/ml Lisozima, 0,1% Triton X-100. Incubado por 30 min a 37ºC (Gu et
al. 2002), coletado por centrifugação e feitas 3 lavagens com 50 mM
Tris-HCl pH 8,0.
II Ressuspendido em 20 ml de 50 mM Tris-HCl pH 8,0, 5 M Uréia, 2%
Triton X-100. Incubado com rotação à temperatura ambiente por 30 min
(Misawa e Kumagai 1999), coletado por centrifugação e feitas 3
lavagens com 50 mM Tris-HCl pH 8,0.
III
Ressuspendido em 20 ml de 50 mM Tris-HCl pH 8,0, 100 µg/ml
Lisozima; incubado por 30 min à temperatura ambiente, em seguida
adicionados DNAse e MgCl
2
com concentrações finais de 10 µg/ml e 3
mM respectivamente, incubado 30 min à temperatura ambiente. Em
seguida foi adicionado Triton X-100, EDTA e NaCl para concentrações
finais de 6%, 20 mM e 1,5 M respectivamente, e incubado por 30 min
com rotação à temperatura ambiente (Richter et al. 2002), em seguida
coletado por centrifugação e feitas 3 lavagens com 50 mM Tris-HCl pH
8,0.
IV Ressuspendido em 20 ml de 50 mM Tris-HCl pH 8,0, 2 M Uréia,
incubado por 30 min com rotação à temperatura ambiente (Middelberg
2002). Em seguida coletado por centrifugação e feitas 3 lavagens com
50 mM Tris-HCl pH 8,0.
V Ressuspendido em 20 ml de 20 mM Tris-HCl pH 8,0, 2 M Uréia, 0,5 M
NaCl. Incubado por 30 min com rotação à temperatura ambiente
(Lemercier et al. 2003). Em seguida coletado por centrifugação e feitas 3
lavagens com 50 mM Tris-HCl pH 8,0.
VI Ressuspendido em 20 ml de 50 mM Tris-HCl pH 8,0 e feitas mais duas
lavagens com o mesmo tampão.
VII Ressuspendido em 20 ml de 20 mM Tris-HCl pH 7,5 e feitas mais duas
lavagens com o mesmo tampão.
Tabela 2. Metodologias de lavagens de corpos de inclusão
21
3.7 – Re-enovelamento de Proteínas desnaturadas
Com a finalidade de obter a proteína recombinante APIRH desnaturada em
forma solúvel, foram testados alguns métodos de re-enovelamento das proteínas,
descritos a seguir:
3.7.1 - Re-enovelamento por diálise de proteínas desnaturadas em Guanidina
Proteína desnaturada em 6M Guanidina foi dialisada contra 50 volumes da
solução 100 mM Tris-HCl pH 8,0, 0,5 M NaCl, 10% glicerol à temperatura ambiente
(Sorensen et al. 2003).
3.7.2 – Re-enovelamento por diluição de proteínas desnaturadas com Guanidina
Proteína solubilizada (~23 mg/ml) em 2,5 ml de 6M Guanidina foi diluída em
500 ml de 100 mM Tris-HCl pH 8,5, 20% glicerol, Chaps 20µM. Foi adicionado ao
tampão de re-enovelamento CuSO
4
(1µM) e mantido nas mesmas condições de
incubação como descrito anteriormente.
3.7.3 – Re-enovelamento ligado a uma matriz
Proteínas solubilizadas em 8M uréia, 20 mM Tris-HCl, pH 8,5 foram
incubadas por 12-16 hrs em uma coluna de Ni-NTA (10 x 1,5 cm) a 4 °C,
previamente equilibrada com a mesma solução desnaturante. Proteínas
desnaturadas ligadas na coluna foram lavadas com 3 volumes de coluna de cada
tampão com decrescentes concentrações de uréia (6M, 4M, 2M, 0M) e em seguida
purificadas nas mesmas condições para proteínas nativas usando imidazol (Li e
Huang 2007).
22
3. 8 - Amplificação e clonagem da SmATPDase2
O mRNA de parasitas adultos foi obtido de vermes conservados em
RNALater (Ambion) por extração do tecido com MAC mRNA isolation kit (Miltenyi
Biotec). O cDNA completo foi obtido com o método RACE (“rapid amplification of
cDNA ends”), usando 200 ng de mRNA e os kits 3´-RACE ou 5´-RACE (Gibco), com
oligos específicos para o gene ATPDase2 de S. mansoni. Os oligos foram
desenhados baseados na seqüência de um cluster derivado de ESTs obtidos no
projeto de seqüenciamento em larga escala de transcritos de S. mansoni (Verjovski-
Almeida et al. 2003) (SmAE608642.1, accessível em http://bioinfo.iq.usp.br/schisto/);
as mini-bibliotecas de EST foram obtidas com oligos não-degenerados aleatórios e o
método RT-PCR de baixa estringência (ORESTES) (Dias Neto et al. 1997). O passo
de PCR nos experimentos RACE foi realizado com a Advantage II polymerase
(Clontech), com o tampão fornecido pelo fabricante, 200 µM dNTPs e 200 nM de
cada oligo usando a seguinte ciclagem: 95
o
C (5min); 30 ciclos de 95
o
C (30 seg),
60
o
C (30 seg), e 68
o
C (3 min); e extensão final de 68
o
C (3 min).
Os oligos 5´- TGCTAGCAATCATGTTAATAAATTTACA-3´ (“forward”) e 5´-
TGAGCTC
TTTATGATACATTTCTGA-3´ foram usados para amplificação e
clonagem da seqüência de DNA que codifica para a região hidrofílica (N
83
até K
564
C-terminal) da SmATPDase2 no vetor pET21b pelos sítios Nhe I e Sac I
(sublinhados), e os oligos 5´-CGTACGTAAATCATGTTAATAAATTTACA-3´
(“forward”) e 5´-TAGAATTCTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGTTTATGATACAT TTC-
3´ (“reverse”) foram usados para amplificação e clonagem no vetor pPIC9K pelos
sítios SnaB I e EcoR I (sublinhados).
23
3. 9 - Clonagem e expressão da tioredoxin (Trx)
A seqüência que codifica para a tioredoxina foi reamplificada por PCR a partir
do vetor pET32a (Novagen) usando os oligos 5´-GAATTCTAATACGACTC
ACTATAG-3´ (“forward”) e 5´-AAGCTTGGCCAGGTTAGCGTCG-3´ (“reverse”),
clonada no vetor pGEM-T e seqüenciada. O fragmento de DNA Trx foi subclonado
no vetor de expressão pET36b (resistência a canamicina) pelos sítios Eco RI e Hind
III. Após varredura de clones E. coli DH10B contendo o vetor de expressão
recombinante, foi selecionado o clone contendo a construção Trx(1)/pET36b.
Células competentes ArcticExpress(DE3) RIL (co-expressa as chaperonas Cpn10 e
Cpn60 da bactéria Oleispira antarctica) foram co-transformadas com as construções
Trx(1)/pET36b e ATPDase2/pET21b por eletroporação e selecionadas no meio LB
agar contendo ampicilina (100 µg/ml), canamicina (50 µg/ml) e gentamicina (20
µg/ml). Foi feito um pre-inóculo (5 ml) com os transformantes selecionados e
adicionado a 1L de meio de LB contendo 1% glicose, com rotação de 210 rpm e
incubado a 30ºC até atingir uma OD
600
de 2.
As células coletadas por centrifugação foram ressuspendidas em 1 litro do
meio LB contendo 0,3 mM de IPTG, mantendo todos os antibióticos descritos e
incubadas por 20 hrs a 12ºC. Após este período as células foram coletadas por
centrifugação (4 000 g por 20 min) e lisadas com ajuda da French press em uma
solução tampão contendo 20 mM Tris-HCl pH 8,5, 0,5 M NaCl, 10% glicerol e 2 mM
PMSF. A fração solúvel do lisado foi obtida por centrifugação (8 000 g por 30 min) e
carregada em uma coluna de Ni-NTA.
24
3. 10 - Clonagem e expressão de fragmentos recombinantes da proteína
SmATPDase contendo baixa identidade entre SmATPDase1 e 2.
A seqüência do cDNA de SmATPDase2 foi traduzida para aminoácidos in
silico e alinhada contra a seqüência de aminoácidos de SmATPDase1. A região com
muito baixa identidade entre estas seqüências foi determinada (18% de identidade
sobre 149 aminoácidos) e os cDNAs de ambos os genes codificando para esta
região foram usados como molde para clonagem e expressão como proteínas
recombinantes. Para isto, nós amplificamos por PCR o trecho do cDNA
correspondente a SmATPDase1 (S
280
a K
444
) e SmATPDase2 (H
352
a N
500
) usando
os seguintes oligos e condições: SmATPDase1, 5´-GGAATTCCATATGTCGGAAT
TTGAAAGACG- 3´ (“Forward”), 5´-TCCGAGCTCGATTTAGCAGTAAACCCTTGG-
3´ (“Reverse”), SmATPDase2, 5´- GGAATTCCATATGCATTTCAAGTTAATTACC-3´
(“Forward”), 5´-TCCGAGCTCGAATTTTGAAAATCATTCACTG-3´ (“Reverse”). Nos
oligos foram introduzidas as seqüências para as enzimas de restrição Nde I e Sac I
(sublinhadas), resultando na presença destes sítios nos extremos 5´ ou 3´ de cada
amplicon. O PCR foi realizado com Advantage II polymerase (Clontech) com o
tampão fornecido pelo fabricante, 200 µM dNTPs, e 400 nM de cada oligo usando a
seguinte ciclagem: 95 °C (5 min); 30 ciclos de 95 °C (30 seg), 61 °C (30 seg), e 68
°C (1 min); e uma extensão final de 68 °C (1 min). Em cada caso, o produto do PCR
resultou em uma única banda a qual foi visualizada por gel de agarose, e este
produto foi posteriormente purificado e clonado no vetor pGEM-T (Promega) sendo
após seqüenciado para confirmar sua identidade. Clones resultantes foram digeridos
com as enzimas Nde I e Sac I para gerar insertos com extremos coesivos, os quais
foram ligados aos sítios Nde I e Sac I do vetor pET21b (Novagen). Os resultantes
plasmídeos de expressão bacteriano (ATPDase1-mem/pET21b e ATPDase2-
25
sol/pET21b) permitiram a expressão dos fragmentos recombinantes SmATPDase1 e
SmATPDase2 em fusão com uma cauda de histidinas no extremo carboxilo terminal.
3. 11 - Purificação de proteínas recombinantes em E. coli
3. 11. 1 - Cromatografia de afinidade
Fração solúvel de lisado bacteriano foi passada por uma coluna de Ni-NTA
(1,5 x 8 cm) equilibrada com 20 mM Tris-HCl pH 8,5, 500 mM NaCl, 10% glicerol e
lavada com dez volumes do tampão de equilíbrio contendo 20 mM de imidazol.
Proteínas ligadas foram eluidas com o tampão contendo 500 mM de imidazol. As
proteínas re-enoveladas na coluna de afinidade foram purificadas sob as mesmas
condições.
3. 11. 2 - Cromatografia de troca iônica
As frações com as proteínas parcialmente purificadas foram dialisadas contra
o tampão 20 mM Tris-HCl pH 9,0, 20 mM NaCl, 10% glicerol e 1 mM DTT, e
passadas por uma coluna Q-sepharose high performance (Amersham Biosciences)
equilibrada com o mesmo tampão usando uma bomba peristáltica Pump P-1. As
proteínas foram eluídas com uma crescente concentração de NaCl até 1 M, usando
um aparelho FPLC (Pharmacia Biotech).
3. 12 - Expressão de proteínas recombinantes em Pichia pastoris
Os fragmentos de DNA que codificam para as regiões hidrofílicas das
enzimas SmATPDase1 e SmATPDase2 foram clonados no vetor de expressão
pPIC9K através dos sítios SnaB I e EcoR I. Os resultantes vetores de expressão
26
selecionados SmATPDase1-(20)/pPIC9K, SmATPDase1-(16)/pPIC9K e
SmATPDase2-(9)/pPIC9K foram linearizados com a enzima Sac I, e os produtos
digeridos foram usados para transformar a levedura P. pastoris GS115 por
eletroporação (Cregg et al. 1985) separadamente, usando os seguintes parâmetros:
25 F, 400 Ω, 1,5 kV. Os transformantes resultantes His
+
selecionados no meio MD
agar (1,34 % YNB, 4x10
-5
% biotina, 1 % dextrose, 1,5 % agar) passaram por uma
segunda triagem no meio YPD agar (1 % extrato de levedura, 2 % peptona, 2 %
sucrose e 1,5 % agar) com 4 mg/ml de G418 sulfato (Invitrogen) e incubadas por 72
– 96 hrs a 30°C (Scorer et al. 1994). Os transformantes resistentes a esta alta
concentração do antibiótico sugerem a presença de elevado número de cópias da
construção inseridas no genoma da levedura.
Em seguida, transformantes multicópia foram selecionados para testes de
expressão em pequena escala (10 ml); para isso cada transformante foi inoculado
em tubos falcon de 50 ml com 10 ml do meio BMG (1,34 % YNB, 4x10
-5
% biotina,
100 mM fosfato de potássio pH 6.0, 1 % glicerol) e os inóculos cultivados a 30ºC por
48 hrs com rotação de 210 rpm. As células foram coletadas por centrifugação e
ressuspendidas em 5 ml do meio BMM (BMG sem glicerol) contendo 0,5 % ou 1 %
de metanol, o qual foi suplementado a cada 24 hrs. As culturas foram induzidas por
96 -120 hrs a 25ºC com agitação de 210 rpm. Os meios de cultura foram analisados
através de SDS-PAGE e western blot. Para culturas em maior escala os inóculos
foram feitos em 1L de meio BMG e induzidos em 350 ml de meio BMM, usando as
mesmas condições de incubação. O uso de 1 % sorbitol como fonte alternativa de
carbono e de 5-10 mM EDTA como inibidor de proteases foram testados durante a
indução.
27
3. 13 - Purificação de SmATPDase1 e 2 do sobrenadante da cultura de P.
pastoris
Após 5 dias de cultura, o meio foi coletado por centrifugação (4 000 g por 20
min) e o sobrenadante foi concentrado 30- 40 vezes por ultrafiltração, e depois
dialisado contra 100 vezes o tampão de equilíbrio (20 mM Tris-HCl pH 8.5, 10 %
glicerol, 500 mM NaCl) por 16 hrs a 4ºC, e depois foi carregada numa coluna de Ni-
NTA (1,5 x 5 cm). A coluna foi lavada com o tampão de equilíbrio incluindo 10 mM
imidazol e as proteínas foram eluídas com o mesmo tampão contendo 500 mM de
imidazol. A proteína eluída foi analisada por SDS-PAGE 10%. As frações contendo
apirase recombinante foram juntadas e concentradas por ultrafiltração usando filtros
Amicon – ultra /10 000MWCO (Millipore). A concentração de proteína foi estimada
pelo método de Bradford.
3. 14 - Clonagem e expressão da proteína dissulfeto isomerase (PDI)
O mRNA de uma cultura de Saccharomyces cerevisiae foi extraído usando o
kit MAC RNA isolation (Miltenyi Biotec). O cDNA foi obtido por transcrição reversa
usando oligo(dt)
12-18
a partir de 100 ng de mRNA. A amplificação por PCR da
seqüência que codifica a PDI foi feita usando os oligos 5´- TGAATTC
CAAA
CGATGAAGTTTTCTGCT-3´ (“forward’) e 5´-TGCGGCCGCTTACAATTCATCGTG
AAT-3´ (“reverse”), e a Advantage II polymerase (Clontech) usando a seguinte
ciclagem: 95ºC (5 min); 30 ciclos de 95ºC (30 seg), 60ºC (30 seg), 68ºC (3 min) e
extensão final de 68ºC (3 min). O produto do PCR foi purificado de gel de agarose,
clonado no vetor pGEM-T (Promega), e em seguida seqüenciado. O fragmento
inserido no vetor pGEM-T foi subclonado no vetor de expressão epissomal pICHOLI-
28
1 (Mobitech) através dos sitios Not I e EcoR I; a expressão está sob controle do
promotor do gene AOX1 que é induzido pelo metanol. O vetor resultante foi
introduzido em E. coli DH10B por eletroporação e feita análise de restrição dos
plasmídeos extraídos dos clones obtidos, para a seleção daqueles clones que
continham o vetor de expressão recombinante.
Os clones SmATPDase1(16)/pPIC9K e SmATPDase2(9)/pPIC9K foram
selecionadas pela resistência ao antibiótico G418 sulfato (4mg/ml) para a expressão
das apirases recombinantes em fusão com uma cauda de histidina na região
carboxilo terminal; células competentes foram transformadas por eletroporação com
o vetor de expressão recombinante PDI/pICHOLI-1. Os novos transformantes foram
selecionados no meio enriquecido YPD agar (1% extrato de levedura, 2% peptona,
2% glicose 1,5% agar) contendo G418 sulfato (4mg/ml) e Zeocina (100 µg/ml) e as
placas incubadas a 30ºC por 4 dias. Foram selecionados aleatoreamente alguns
clones para testes de expressão em pequena escala no meio mínimo BMG como
descrito anteriormente. Os sobrenadantes das mini-culturas foram concentrados por
ultrafiltração e as proteínas resolvidas em SDS-PAGE 10%.
3. 15 - Caracterização enzimática de SmATPDases 1 e 2 recombinantes de S.
mansoni.
Atividade apirásica foi determinada como descrito previamente (Schadeck et
al. 1989); 134 µl de amostra contendo 0,2 µg de enzima foram incubados em tubos
eppendorf 1,5ml com 166 µl de tampão de atividade 3x (150mM Tris-HCl pH 7.5,
12mM KCl, 15mM glicose, 15mM CaCl
2
,) e 200 ul de 7.5mM de nucleotídeo (NTP ou
NDP) a 37ºC por 20 min. O fosfato inorgânico liberado (P
i
) foi quantificado
colorimetricamente (Fiske e Subbarow 1929). Cada ensaio foi feito em triplicata e
29
uma unidade de atividade enzimática foi definida como a quantidade de enzima
necessária para liberar 1 µmol de P
i
/min a 37ºC. A atividade da enzima purificada foi
ensaiada testando diferentes substratos: ATP, CTP, GTP, UTP, ADP, CDP, GDP,
UDP e IDP; além disso foram avaliadas as atividades enzimáticas na presença dos
cátions divalentes CaCl
2
, CoCl
2
, MgCl
2
, MnCl
2
, HgCl
2
, ZnCl
2
e EDTA.
3. 16 - Dicroísmo circular
As proteínas recombinantes purificadas SmATPDase1 e 2 em concentrações
de 0,33 mg/ml e 0,56 mg/ml respectivamente foram dialisadas “overnight” a 5 ºC, no
tampão 10 mM NaH
2
PO
4.
Para cada enzima foram preparadas 3 amostras, uma em
tampão e as outras 2 em tampão com 5 e 10mM de MgSO
4
respectivamente. Os
espectros de CD foram obtidos como a média de 5 leituras feitas pelo
espectropolarímetro JASCO-810 (Instituto Butantã) a 20ºC entre os comprimentos
de onda 190-260 nm, usando uma cubeta de 0,1cm. Os dados foram expressos
como elipticidade média residual. Os valores de elipticidade molar residual [θ] (deg x
cm
2
x dmol
-1
) foram calculados utilizando a seguinte fórmula:
[elipticidade θ (mdeg) x massa molecular da proteína (Da)]
[10 x caminho da cubeta (cm) x concentração da prot. (mg/ml) x (nº de aminoácidos – 1)]
3. 17 - Western blot
O tegumento foi obtido de vermes adultos recém coletados por incubação em
PBS a 37 °C seguido de forte agitação em vortex por 10 seg. Vermes inteiros foram
separados por decantação e o sobrenadante submetido a ultra-centrifugação a
100,000 g por 1 h. O material precipitado foi ressuspendido em 0,3 ml de 5 mM
30
Tris-HCl, pH 7,4, 8 % sacarose, 0,5 µg/ml leupeptin, 0.1 µg/ml pepstatin, 0,05 µg/ml
inibidor de tripsina, e 8,7 µg/ml PMSF. Estas amostras foram estocadas em
nitrogênio liquido até posterior uso. Amostras de tegumento foram previamente
esquentadas antes do seu uso e solubilizadas com a solução contendo 40 mM Tris
pH 7,4, 7 M ureia, 200 mM β-ME, 2 % Chaps e 1 % SDS, logo as frações solúvel e
insolúvel foram separados por ultra-centrifugação a 100,000 g. Amostras foram
resolvidas em SDS-PAGE 12 % e transferidas a uma membrana de nitrocelulose.
A membrana foi bloqueada 12-16 hrs com a solução blotto (PBS, 5 % leite em pó
desnatado, pH 7.4) e incubado separadamente por 4h com o anti-soro anti-
SmATPDase1 ou anti-SmATPDase2 (1:500 v:v), seguido de quatro lavagens de 5
min cada com PBS-Tween 20 e incubado posteriormente com o anticorpo
secundário anti-mouse IgG ou anti-rabbit IgG (1: 2000 v:v) , HPR-linked (Amersham
Biosciences) em solução blotto por 2 h. A IgG ligada foi detectada por
quimioluminescência usando o kit ECL Western Blotting Detection reagents
(Amersham Biosciences).
3. 18 - Deglicosilação de apirase recombinante
Enzima purificadas de SmATPDase1 e SmATPDase2 (concentração final de
165 µg/ml e 280 µg/ml, respectivamente) foram incubadas em 50 mM de fosfato de
sódio pH 7,5, 100 mU de N-glicosidase F (Boehringer Mannheim) por 4 hrs a 37 ºC.
Para a O-deglicosilação das enzimas, estas foram tratadas com 20 mU de O-
glicosidase em 50mM de fosfato de sódio pH 7,5 e incubadas nas mesmas
condições usadas para a outra glicosidase. Uma terceira reação misturou ambas as
glicosidases com cada enzima recombinante. Após deglicosilação enzimática, as
amostras foram resolvidas em SDS-PAGE 10% e coradas com Coomasie blue.
31
3. 19 - Imunização de camundongos e desafio com cercárias.
3. 19. 1 - Imunização com Proteínas
Inicialmente, para avaliar a resposta imunogênica da SmATPDase1, a
proteína purificada foi obtida através de eletroforese seguida de eletroeluição de
acordo com as recomendações do fornecedor Hoefer GE 200 Gel Eluter
(Amersham Pharmacia Biotech). Posteriormente, proteínas purificadas das duas
isoformas foram obtidas por re-enovelamento (E. coli) ou do sobrenadante da cultura
de P. pastoris (solúvel e ativa). Foram testados neste ensaio os adjuvantes hidróxido
de alumínio e de Freund.
Protocolo:
Camundongos fêmeas Balb/c de 4-6 semanas receberam 3 doses de 10µg de
proteína s.c (dorso) de 7 em 7 dias. Foi realizado o desafio com 110
cercárias (s.c. abdomen). A perfusão foi realizada após 7 semanas. As
proteínas testadas foram apirase recombinante desnaturada obtida por
eletroeluição, apirase recombinante re-enovelada por diluição e o controle
positivo com Sm14 recombinante.
Camundongos fêmeas C57BL/6 de 4-6 semanas receberam 3 doses de 30
µg de proteína s.c (dorso) de 14 em 14 dias. Neste ensaio, em cada dose
injetada a proteína recombinante foi combinada com alumínio (10 µg Al
3+
µg
-1
proteína) ou com CpG ODN (1 µg CpG ODN µg
-1
proteína) combinada com
IFA, e a dose formulada no mesmo volume do adjuvante IFA. O oligo CpG
ODN 1826 tem a seqüência 5´-TCCATGACGTTCCTGACGTT-3´, e foi
sintetizado com pontes fosfodiester modificadas para “phosphorothioate”,
sendo resistente a nucleases. Os grupos testados com os adjuvantes foram:
grupo 1 (prime com alumínio, 3 reforços de alumínio), grupo 2 (prime com
32
CpG, 3 reforços de CpG), grupo 3 (prime com alumínio, 3 reforços de CpG),
grupo 4 (prime com CpG, 3 reforços com alumínio), grupos 5 e 6 são os
controles negativos para Alumínio e CpG, respectivamente.
Camundongos fêmeas C57Bl/6 de 5-7 semanas de idade (10 animais por
grupo) receberam 3 doses. Um prime de 25 µg de proteína em PBS (1x)
formulada no mesmo volume de adjuvante (CFA) por via subcutânea, e dois
reforços com intervalo de 15 dias com 25 µg de proteína em PBS
(1x), formulados no mesmo volume de adjuvante (IFA) (Sigma), via
subcutânea. Os grupos testados foram SmATPDAse1 (grupo 1),
SmATPDase2 (grupo 2) e SmATPDase1 + SmATPDase2 (grupo 3), grupo
controle. Foi realizado o desafio com 110 cercárias (s.c. abdomen), e o
sacrifício dos camundongos, seguido da perfusão do fígado para coleta de
parasitas, foi realizado após 7 semanas.
3. 19. 2 - Imunização com plasmídeo (vacina de DNA)
Protocolo: Camundongos fêmeas Balb/c ou C57B/6 de 4-6 semanas,
receberam 50 µl em cada músculo quadríceps de uma solução 10 µM de
cardiotoxina (Latoxan). Decorrido 5 dias da injeção de cardiotoxina, o DNA
plasmidial (50 µg) foi injetado intramuscularmente com uma seringa de 1 ml e agulha
Dia 70
Desafio
110 cercárias
Sangria
Pré-imune
Dia 1
1° dose
Dia 14
3° dose
Dia 7
2° dose
Dia 119 Perfusão
Dia 6
Sangria 1
Dia 13
Sangria 2
Dia 60
Sangria 3
33
com calibre de 29G. O volume total foi de 100 µl, com 50 µl injetado em cada
músculo quadríceps. Os animais receberam um reforço 21 dias após a primeira
dose.
3. 20 - ELISA
Microplacas de fundo chato foram revestidas com 0,5 µg/poço das proteínas
recombinantes em tampão carbonato - bicarbonato 0,05 M (pH 9,6), durante 16
horas a 4°C. As placas foram lavadas em seguida 3 vezes com tampão fosfato
salina (PBS) contendo 0,05% de Tween 20, e bloqueadas com 200 µl de uma
solução 10% leite desnatado em PBS, por pelo menos 1 hora a 37°C. Depois de
lavadas com PBS Tween 20 0,05%, 100 µl de uma diluição seriada do soro dos
animais imunizados ou controles foram adicionados em cada poço, sendo a diluição
inicial 1:20. As placas foram incubadas a 37°C durante 2 horas e depois lavadas três
vezes com PBS Tween 20 0,05%. A seguir, 100 µl do anticorpo secundário
conjugado a peroxidase foram adicionados em uma diluição 1:15 000 e incubados
por 1 hora a 37°C. As placas foram então lavadas três vezes com PBS Tween 20
0,05%, e 100 µl do substrato OPD foi adicionado em cada poço. As placas foram
lidas a 492 nm em um leitor de Elisa Labsystem.
Dia 50
Desafio
130 cercárias
Sangria
Pré-imune
Dia 1
1° dose
Dia 21
2° dose
Dia 99
Perfusão
Dia 20
Sangria 1
Dia 48
Sangria 3
34
3. 21 - PCR em Tempo Real (Real Time PCR)
Os mRNAs das formas ovo, miracídio, cercária, esquistossômulo e verme
adulto do parasita foram obtidas por extração de tecidos com MAC mRNA isolation
kit (Miltenyi Biotec) usando amostras conservadas em RNALater (Ambion). Tres
microgramas de mRNA foram tratadas com RQ1 RNAse-free DNAse (Promega),
usando 1U em 10 µl de reação por 30 min a 37°C. Posteriormente, a DNase foi
inativada a 65°C por 10min. Os produtos resultantes foram submetidos à transcrição
reversa com “random hexamer primer” usando o protocolo do Superscript first strand
system (Invitrogen) para RT-PCR. Foram usados como controle reações sem adição
de transcriptase reversa as quais foram corridas em paralelo, e posteriormente
usadas como molde para o controle negativo do PCR. Oligos para o Real-Time PCR
foram desenhados usando a ferramenta Primer express program version 2.0.0
(Applied Biosystems). As reações do Real-Time PCR foram realizadas usando o
reagente SYBR Green PCR master mix (Applied Biosystems) e os oligos específicos
para SmATPDase2 5´-ACAAAATCCTGTTGAAGGTGATGTAA-3´ (“Forward”), 5´-
TTGTTGGGTGGATATCTGATAACATT-3´ (“Reverse”) e SmATPDase1 5´-
GGAAAACAATTACATTTGATTCGAAA-3´ (“Forward”), 5´-TGCCCAGCTAACTGA
TTTACCA-3´ (“Reverse”) usando o GeneAmp 5700 Sequence Detection System
(Applied Biosystems). Os valores de significância (P-value) foram calculados usando
o teste-t de Student. Todas as amostras foram usadas em triplicata e o gene alfa
tubulina foi usado como um controle interno.
3. 22 - Imunofluorescência de parasitas inteiros e cortes histológicos
Vermes adultos, fixados em álcool 70%, foram reidratados, submergidos em
parafina, e cortados em secções de 4 µm de espessura. Secções foram aderidas
35
nas lâminas de vidro previamente tratadas poli-L-lisina e fixadas com acetona por 30
min a -20 °C. Após secagem, as secções foram bloqueadas por incubação em PBS
contendo 1 % BSA e 0.1 % Tween 20 (solução de permeabilização) “overnight” a
temperatura ambiente. Secções foram logo incubadas com os antisoros anti-
SmATPDase1 e 2 (1:100 v:v) “overnight” a 5 °C. Após três lavagens com o tampão
PBS, o anticorpo secundário anti-rabbit IgG conjugado com FITC (verde) e o
anticorpo anti-mouse IgG conjugado com Cy3 (vermelho) (1:50 v:v) foram
adicionados à solução de permeabilização com amostras por 1 h a temperatura
ambiente. Secções foram lavadas, e montadas na solução glicerol 90 %, 50 mM
Tris-HCl pH 9,0. Imagens foram obtidas usando o sistema confocal BioRad
1024UV conectado a um microscópio Zeiss Axiovert 100 equipado com uma lente
objetiva de imersão 40x N.A 1.2 plan-apochromatic com contraste de interferência
diferencial. O programa LaserSharp 1024 version 3.2T da Bio-Rad foi usado para a
captação de imagens e o Adobe Photoshop 4.0 para o processamento destas. Os
antisoros pre-immunes de coelho e camundongo foram usados como controle
negativo. Formas inteiras de miracídio, cercária e esquistossômulo foram fixadas em
metanol gelado por 10 min e incubadas “overnight” na solução de permeabilização
PBS, 1 % BSA, 0,1% Tween 20; os passos seguintes foram realizados usando o
mesmo procedimento descrito para cortes histológicos de vermes adultos.
3. 23 - Cultura in vitro de vermes adultos de S. mansoni
Vermes adultos coletados de camundongos Balb/c previamente infectados
com cercárias foram lavados três vezes usando o meio de cultura sem antibióticos,
contendo o advanced RPMI 1640 medium (Invitrogen), 1% BSA and 10 mM Hepes
7,4. Os vermes foram colocados em tubos falcon de 50 ml junto com 30 ml do meio
36
de cultura com o antibiótico antimicótico (Invitrogen) contendo 100 units/ml de
Penicilina G, 100 µg/ml de Streptomicin sulfato, 0,25 µg/ml de anfotericin B e
incubado por 48 hrs a 37ºC sob 5% CO
2
. Meio de cultura com antibióticos e sem
vermes foi usado em paralelo como controle negativo (30 ml). Experimentos foram
realizados em duplicata (60ml) contendo um total de 1790 vermes. Após incubação
de 48 hrs, o meio de cultura foi separado dos vermes por filtração usando papel
filtro (Amersham Bioscience).
Os meios de cultura, das culturas de vermes adultos ou do controle, foram
concentrados aproximadamente 5 vezes usando Amicon ultra filters 10000 MWCO
(Millipore) e dialisados “overnight” contra 100 volumes do tampão de equilíbrio (50
mM Tris-HCl pH 7.5, 10% glicerol, 5 mM MgCl
2
, 20 mM NaCl) em baixa temperatura
(5ºC). As amostras dialisadas foram centrifugadas a 20 000g por 60 min a 5ºC. Os
sobrenadantes foram passados separadamente por colunas de afinidade Reactive
Red RR120 (Sigma) contendo 4 ml de resina previamente equilibradas com o
tampão de diálise. Estas condições usadas foram previamente otimizadas em nosso
laboratório para a purificação da isoforma SmATPDase1 por cromatografia de
afinidade, a qual foi expressada em P. pastoris. As colunas foram lavadas com dez
volumes do tampão de equilíbrio, e proteínas ligadas foram eluídas com três
volumes do tampão de equilíbrio contendo 5 mM ADP e 5 mM ATP. As frações
eluídas de cada coluna foram dialisadas por 24 hrs em cem volumes do tampão 50
mM Tris-HCl, 5 % glicerol, 50 mM NaCl a 5 ºC e logo concentradas
aproximadamente 30 vezes usando Amicon ultra filters 10 000 MWCO (Millipore);
posteriormente as proteínas totais recuperadas foram quantificadas pelo método de
Bradford. Para o SDS-PAGE e western blot foram usados 140 µg de proteína de
cada amostra.
37
3. 24 - Ensaio de inibição de penetração pela pele
O ensaio de inibição de penetração foi adaptado de uma metodologia já
descrita (Williamson et al. 2003). Resumidamente, 100-130 cercárias (em 100 µl)
foram incubadas com 50 µl de soro de camundongos imunizados com a proteína
apirase, ou 50 µl de soro de animais não imunizados. Após 1 h de incubação a
37°C, as cercárias juntamente com o anti-soro foram aplicadas em 850 µl de água
corrente desclorada, para penetração pelo método do anel em camundongos
anestesiados que tiveram seus abdomens previamente depilados. As cercárias
foram deixadas penetrar durante 30 min à temperatura ambiente; após este período
as larvas que não penetraram foram removidas da superfície dos animais e
contadas. Para determinar se houve diferenças entre os grupos realizamos o teste-t
de Student.
3. 25 - Cross-linking com glutaraldeido
As proteínas, 5 µM cada, foram incubadas à temperatura ambiente em 20 mM
triethanolamine, pH 8,0, 100 mM NaCl e 0,2% glutaraldeido. Após 1 hora de
incubação, a reação foi parada pela adição de Tris-HCl pH 7,5, na concentração
final de 100 mM. As amostras foram resolvidas por SDS-PAGE 10%.
38
4. RESULTADOS
4. 1 – Clonagem, expressão, purificação de SmATPDase1
4. 1. 1 - Construção I: Apirase recombinante com cauda de histidina
Inicialmente, com a construção APIFRA6/pET21b(+) contendo a seqüência de
DNA que codifica a região hidrofílica da enzima SmATPDase1 (L
65
até L
515
), foram
realizados ensaios de expressão obtendo-se os seguintes resultados:
E. coli BL21(DE3): Usando este hospedeiro se obteve uma significativa
expressão como observado no gel SDS-PAGE 10% (figura 5A). Usando a
temperatura de 37
o
C e 1 mM IPTG para indução, foi produzida a proteína
recombinante sempre como corpos de inclusão. Estes corpúsculos foram
encontrados nas frações insolúveis dos lisados bacterianos, não se observando
bandas (no gel) do mesmo peso molecular na fração solúvel (figura 5A).
E. coli BL21(DE3)pLysS: Usando esta cepa, foi possível determinar um
nível de indução da expressão através do tempo usando as mesmas condições de
expressão com a cepa BL21(DE3). Observou-se que os níveis de expressão entre 2
até 4 hrs de indução não apresentavam diferença significativa quando visualizados
no SDS-PAGE 10% (figura 5B). Usando esta cepa de E. coli obteve-se uma boa
expressão da enzima apirase, mas ainda com a característica de se encontrar na
forma insolúvel, como corpos de inclusão.
39
Visando aumentar a expressão da enzima na fração solúvel, foi feito o
crescimento de culturas com diferentes temperaturas durante a indução, usando a
cepa BL21(DE3)pLys. A proteína recombinante SmATPDAse1 foi expressada nas
quatro temperaturas de incubação, embora com baixa produção a 15 e 20
o
C (figura
6). Entretanto, mesmo nas temperaturas mais baixas ainda não foi observada
expressão na fração solúvel (figura 6). Usando uma menor concentração do indutor
(0,5 mM) não obtivemos a produção de enzima solúvel com esta cepa (não
mostrado).
Figura 6. Análise de expressão de APIRH em BL21(DE3)pLys sob diferentes temperaturas. SDS-
PAGE 10% mostrando o nível de expressão da apirase recombinante com cauda de histidinas
em 4
temperaturas diferentes de incubação. Mostra-se nas canaletas os resultados obtidos das frações
solúveis (FS) e frações insolúveis (FI) dos lisados das culturas. As comparações foram feitas com as
frações insolúveis.
28,4
40,0
68,8
1 2 3 4
F. S F. I
kDa
28,4
40,0
68,8
1 2 3 4
F. S F. I
kDa
Api
Ctrl
Api
Ctrl
Api
Ctrl
Api
Ctrl
Api
Ctrl
68,8
40,0
28,4
0 hrs 1 hrs
2 hrs 3 hrs 4 hrs
kDa
Api
Ctrl
Api
Ctrl
Api
Ctrl
Api
Ctrl
Api
Ctrl
68,8
40,0
28,4
0 hrs 1 hrs
2 hrs 3 hrs 4 hrs
Api
Ctrl
Api
Ctrl
Api
Ctrl
Api
Ctrl
Api
Ctrl
68,8
40,0
28,4
0 hrs 1 hrs
2 hrs 3 hrs 4 hrs
kDa
Figura 5. Expressão heteróloga de SmATPDase1 em E coli. (A) Análise de expressão de
apirase recombinante usando a cepa BL21(DE3). (B) Análise de expressão de apirase através
do tempo usando a cepa BL21(DE3)pLys. Fração solúvel (F.S), fração insolúvel (F.I), vetor
recombinante (Api), vetor vazio (Ctrl), canaletas 1 e 3 (Api), canaletas 2 e 4 (Ctrl).
A B
F S F I F S F I FS F I F S F I
15
o
C 20
o
C30
o
C37
o
C
28,4
40,0
68,8
kDa F S F I F S F I FS F I F S F I
15
o
C 20
o
C30
o
C37
o
C
28,4
40,0
68,8
kDa F S F I F S F I FS F I F S F I
15
o
C 20
o
C30
o
C37
o
C
28,4
40,0
68,8
kDa F S F I F S F I FS F I F S F I
15
o
C 20
o
C30
o
C37
o
C
28,4
40,0
68,8
kDa
40
4. 1. 2 - Re-enovelamento de proteínas
Testamos os métodos de re-enovelamento da enzima por diálise, por diluição,
e ligada a uma matriz para tentar recuperar a proteína de forma solúvel. Prévio ao
passo de re-enovelamento foram testadas várias metodologias de lavagem de
corpos de inclusão, observando-se que a metodologia 3 (ver métodos) conseguiu
remover um pouco mais de impurezas (figura 7A); em seguida foram avaliados os
desnaturantes 6 M guanidina e 8 M uréia, sendo a guanidina o desnaturante mais
eficiente no processo de solubilização.
Inicialmente, testamos o re-enovelamento por diálise usando 15 ml de
proteína desnaturada em 6 M guanidina e reduzida com 10 mM de β-
mercaptoetanol, contra 50 volumes da solução 100 mM Tris-HCl pH 8,0, 0,5 M
NaCl, 10% glicerol à temperatura ambiente. Foi observada uma rápida formação de
precipitados, devido à elevada concentração de proteína total (~7mg/ml). Outros
trabalhos sugerem a diminuição na concentração de proteína total com mais
desnaturante antes da diálise (Murphy e Kirley 2003). Em seguida foi testado o
protocolo de re-enovelamento por diluição (Gulnik et al. 2002; Tsumoto et al. 2003).
Neste caso a proteína solubilizada em 2,5 ml de 6 M guanidina com uma
concentração de ~23,94 mg/ml foi re-enovelada por diluição em 500 ml de Tris-HCl
100mM pH 8,5, glicerol 20%, chaps 20µM, obtendo-se uma concentração final de
proteína total ~119,7 µg/ml, a qual estava próxima à concentração sugerida em
outros trabalhos de re-enovelamento de proteínas (Rudolph et al. 1997), tendo sido
observada pouca precipitação de agregados. Após purificação por afinidade em
resina de Ni-NTA foi observada recuperação de proteína solúvel (figura 7B). O
método de re-enovelamento ligado a uma matriz ou “on column” foi testado usando
a coluna de Ni-NTA: a proteína desnaturada em guanidina foi incubada na resina e
41
lavada com decrescentes concentrações de uréia e 20 mM Tris-HCl pH 8,5; obteve-
se proteína purificada (figura 7C) de uma forma mais rápida, entretanto não foi
reproduzível o resultado quando usada guanidina na fase de diluição na mesma
coluna, devido a uma possível danificação desta pela guanidina.
Em seguida, usando a Uréia 8M como desnaturante na presença de calor (50
ºC) por 20 min foi possível solubilizar os corpos de inclusão. Após re-enovelamento
foi possível obter proteína recombinante com um ótimo rendimento (figura 7D).
Entretanto em todas as frações de eluição obtidas não foi possível detectar atividade
enzimática. Nossos resultados sugerem que algumas pontes dissulfeto poderiam ser
C
A
D
B
Figura 7. Re-enovelamento e purificação de SmATPDase1. (A) Teste de vários métodos de
lavagem de corpos de inclusão (M1-M7= métodos), (B) Cromatografia de afinidade da fração solúvel do
re-enovelamento por diluição. (C) Re-enovelamento em coluna de Ni-NTA usando GndHCl 6M e Uréia
8M. (D) Re-enovelamento em coluna de Ni-NTA usando Uréia 8M.
47,0
36,0
26,0
85,0
kDa
E1 E2 E3 E4 E5 E6
47,0
36,0
26,0
85,0
kDa
E1 E2 E3 E4 E5 E6
W1 W2 W3 E1 E2 E3 E 4 E 5 E 6
68,8
40,0
28,4
kDa
W1 W2 W3 E1 E2 E3 E 4 E 5 E 6
68,8
40,0
28,4
kDa
F I F T W F 1 F 2 F 3 F 4 F 5 F 6
68,8
40,0
28,4
kDa
F I F T W F 1 F 2 F 3 F 4 F 5 F 6
68,8
40,0
28,4
kDa
M 1 M 2 M 3 M 4 M 5 M 6 M 7
68,8
40,0
28,4
kDa
M 1 M 2 M 3 M 4 M 5 M 6 M 7
68,8
40,0
28,4
kDa
42
essenciais para manter a atividade enzimática, devido ao fato da SmATPDase1
apresentar um elevado número de cisteínas (9 resíduos).
Com isso, a formação de pontes dissulfeto erradas possivelmente afetou a
estrutura, e conseqüentemente a sua atividade. Dados na literatura demonstram que
a presença de um menor número de cisteínas facilita o re-enovelamento (Murphy e
Kirley 2003). Assim, foi observado que uma apirase de um inseto hematófago
produzida como corpos de inclusão em E. coli foi recuperada eficientemente devido
à presença de apenas 2 cisteínas (Murphy et al. 2003).O método de “reshuffling” de
pontes dissulfeto usando cistina e cisteina (Winter et al. 2002) foi testado nos
tampões de re-enovelamento por diluição, causando grande interferência na ligação
das proteínas na resina Ni-NTA, não sendo adequado para este método.
4. 1. 3 - Construção II : Proteína recombinante com cauda de histidinas
A expressão de apirase recombinante usando a construção APIRH5-
II/pET36b foi feita para produzir a enzima com uma cauda de 8 histidinas no extremo
C-terminal. Este vetor oferece resistência ao antibiótico canamicina, e foi usado o
hospedeiro E. coli cepa C41(DE3), a qual tem resistência ao antibiótico ampicilina.
Usando esta cepa foi possível detectar após purificação com Ni-NTA uma pequena
quantidade de apirase recombinante solúvel (figura 8A) obtida na condição 0,5 mM
IPTG, 30°C e 2-3 hrs de indução. A presença de apirase recombinante na fração de
eluição foi confirmada por western blot usando anticorpo anti-his (figura 8B). Mesmo
assim, foi pouca a quantidade de proteína obtida observada no gel SDS-PAGE. A
interação com outras proteínas foi observada após passar a fração de eluição de Ni-
NTA na coluna de troca iônica Q-sefarose (figura 8C). Diferente do descrito
43
anteriormente com a cepa BL21(DE3), com a cepa C41(DE3) conseguiu-se agora
expressar uma pequena quantidade de apirase solúvel visível em gel corado com
Coomasie blue.
4. 1. 4 - Construção III: Proteína recombinante em fusão com GFP
A proteína SmATPDase1 em fusão com a proteína Histag-GFP foi
expressada em E. coli BL21(DE3) em baixa temperatura (25ºC) por 12 horas. Foi
possível observar que a fusão foi expressada na bactéria por causa da coloração
verde. Após purificação com Ni-NTA, as frações de eluição foram resolvidas por
SDS-PAGE e observou-se uma banda forte de ~30 kDa e uma banda fraca de ~80
kDa que corresponde à fusão Histag-GFP-SmATPDase1 (figura 9 A e B). Este
resultado sugere que aconteceu uma clivagem inespecífica da fusão durante o
crescimento da cultura, possivelmente no sítio para clivagem específica com
enteroquinase, que se encontrava na junção das duas proteínas (Histag-GFP e
apirase). A maior parte da apirase expressada provavelmente perdeu-se durante a
purificação com Ni-NTA, por ter sido clivada e separada da proteína Histag-GFP.
A
B
C
Figura 8. Analise de Expressão e purificação de APIRH-His8x em C41(DE3). (A). fração de eluição
de cromatografia de afinidade (Ni-NTA), onde observa-se uma pequena quantidade de apirase com um
peso molecular de ~50kDa. (B) Detecção de SmATPDase1 na fração de eluição por western blot
usando anticorpo anti-histidina. (C) Cromatografia de troca iônica da fração de eluição de Ni-NTA
mostrando pouca resolução devido a uma forte interação de outras proteínas contaminantes.
85,0
47,0
36,0
kDa
85,0
47,0
36,0
kDa
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
36,0
47,0
85,0
kDa
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
36,0
47,0
85,0
kDa
47,0
E
36,0
85,0
44
4. 2 – Amplificação e expressão de SmATPDase2
A seqüência DNA que codifica a região hidrofílica (N
83
até K
564
) de uma
segunda isoforma de ATP-difosfohidrolase do parasita foi amplificada (~1,5 kbp).
Após clonagem no vetor de expressão, esta foi em seguida expressada na cepa
BL21(DE3) sendo que sempre foram obtidos corpos de inclusão desta. De forma
similar ao descrito anteriormente, a proteína SmATPDase2 foi re-enovelada em
coluna de afinidade (Ni-NTA), com prévia desnaturação desta em 8 M uréia (figura
10). Após purificação, atividade enzimática não foi detectada nesta amostra.
85,0
47,0
36,0
kDa
26,0
E1 E2 E3 E4 E5
85,0
47,0
36,0
kDa
26,0
E1 E2 E3 E4 E5
N
C
Cauda
Histag
GFP APIRASE
Ek
N
C
Cauda
Histag
GFP APIRASE
Ek
Figura 9. Construção da fusão GFP-SmATPDase1. (A) Desenho
da construção GFP-SmATPDase1 no vetor pAZ; observa-se um sitio
de clivagem para enteroquinase. (B) Ensaio western blot com
anticorpo anti-his. Observa-se a banda robusta de ~30kDa produto da
clivagem da fusão durante a cultura.
A
B
5,0
2,0
1,0
0,5
kbp
60ºC 57ºC
5,0
2,0
1,0
0,5
kbp
60ºC 57ºC
Figura 10 . Amplificação, reenovelamento e purificação de SmATPDase2. (A) Produto de PCR
de ~1,5 kbp obtido a partir de cDNA de S. mansoni. (B) Re-enovelamento e purificação de
SmATPDase2 na coluna de Ni-NTA; observa-se uma banda de ~50kDa.
E1 E2 E3 E4 E5 E6 E7 E8 E9kDa
118,0
87,0
47,0
36,0
26,0
19,0
E1 E2 E3 E4 E5 E6 E7 E8 E9kDa
118,0
87,0
47,0
36,0
26,0
19,0
A B
45
4. 3 - Construção do vetor de expressão com Tioredoxina (Trx)
Com o objetivo de facilitar a quebra e a formação correta de pontes dissulfeto,
e possivelmente permitir a produção de apirase recombinante funcional em
bactérias, testamos a co-expressão com Tioredoxina. A seqüência de DNA que
codifica a proteína tioredoxina foi re-amplificada a partir do molde pET32a, obtendo-
se um amplicon de ~300 bp, de acordo com o tamanho esperado de 327 bp (figura
11A) que codificaria uma proteína de 109 aminoácidos. O fragmento de DNA de Trx
clonado em pGEM-T foi subclonado no vetor de expressão pET36b e selecionado
com o marcador de resistência a canamicina contido neste (figura 11B). O
fragmento clonado ficou sob controle do promotor Lac.
Figura 11. Amplificação da seqüência de DNA que codifica Tioredoxina. (
A
) O produto de
amplificação por PCR foi especifico e teve banda única de ~300 bp. Após clonagem em pGEM-
T esta seqüência de DNA foi sub-clonada no vetor de expressão pET36b. (B) Mapa do vetor
de expressão pET36b o qual serviu para co-expressar a tioredoxina quando induzido pelo IPTG
nas culturas de E. coli.
A
B
0,25
0,5
0,75
2,5
3,0
kbp
46
4. 4 - Co-expressão de SmATPDase2 com Tioredoxina em E. coli
A proteína SmATPDase2 recombinante foi expressada na cepa ArcticExpress
(DE3) RIL em co-expressão com a chaperona Tioredoxina contida no vetor
pET36b. Após indução a 12ºC, efetivamente foi visualizada no gel SDS-PAGE a
expressão da proteína recombinante solúvel usando as frações de purificação com
Ni-NTA (figura 12). Na fração de eluição é possível observar a SmATPDase2
recombinante com um peso de ~50kDa, co-purificada junto à chaperona Cpn60
(~60 kDa) e tioredoxina (~ 12 kDa). Neste procedimento foi evitado o uso de
detergentes, entretanto quando foi realizada uma troca iônica usando a resina Q-
sefarose não foi possível separar a chaperona da enzima recombinante, sendo esta
forte interação um impedimento para a purificação da enzima usando este sistema
procarionte.
Figura 12. Co-expressão de SmATPDase2 com tioredoxina usando baixa temperatura. A
fração solúvel do lisado de bactérias foi aplicada em uma coluna de afinidade Ni-NTA. O gel mostra
as frações recolhidas durante a lavagem da coluna (W1 a W3) e durante a eluição com imidazol
(E1 a E4). SmATPDase2 foi expressada de forma solúvel como visto no gel SDS-PAGE 10% (~50
kDa, seta preta): nas frações W3 e E2 é possível visualizar esta proteína embaixo da banda de
~60kDa que corresponde a uma outra chaperona Cpn60; e com um tamanho de 12 kDa pode-se
observar a expressão de Tioredoxina (seta preta).
W1 W2 W3 E1 E2 E3 E4
117,0
85,0
47,0
36,0
26,0
19,0
kDa
W1 W2 W3 E1 E2 E3 E4
117,0
85,0
47,0
36,0
26,0
19,0
kDa
47
4. 5 - Expressão e purificação de SmATPDase 1 e 2 recombinante no sistema
P. pastoris.
O clone selecionado inicialmente para a expressão da primeira isoforma de
ATPDase de S. mansoni foi o SmATPDase1(16)/pPIC9K, o qual foi cultivado em
maior escala como descrito em métodos. Após concentração do sobrenadante por
ultrafiltração foi possível observar no gel SDS-PAGE várias bandas, a maioria acima
de 50 kDa (figura 13B). Uma banda com aparente peso molecular de 55 kDa foi
observada e confirmada como SmATPDase1 recombinante após western blot
usando o anticorpo anti-SmATPDase1 gerado em camundongo (não mostrado).
Figura 13. Expressão de SmATPDase1 em P. pastoris GS115. (A) Gel SDS-PAGE 10% mostrando a
purificação por Ni-NTA de apirase recombinante (isoforma 1). Observa-se uma banda de ~55 kDa nas frações
de lavagem (W) e de eluição (E1), e uma banda de menor tamanho de ~45 kDa, que seria produto de
degradação. (B) Gel SDS-PAGE 10% mostrando o efeito do EDTA em duas concentrações nas culturas
como indicado na figura. Na concentração de 10mM de EDTA pode-se observar um pouco menos produto de
degradação. (N.A: sem aditivos) (C) Gel SDS-PAGE 10% mostrando a purificação por Ni-NTA de apirase
recombinante (isoforma 1): observa-se uma banda de ~55 kDa nas frações de lavagem (W) e de eluição (E1),
e uma banda de menor tamanho de ~45 kDa, que seria produto de degradação. Nesta amostra obtida na
presença de 10 mM EDTA a banda de 45 kDa tem muito menor intensidade que no experimento mostrado em
(
A
)
.
117
85
49
34
25
19
W1 E1
N. A.
117
85
49
34
25
19
A
117
85
49
34
25
19
W1 E1
N. A.
117
85
49
34
25
19
A
117
85
49
34
25
19
N. A.
EDTA (10mM)
EDTA (5mM)
1 2 3
117
85
49
34
25
19
B
117
85
49
34
25
19
N. A.
EDTA (10mM)
EDTA (5mM)
1 2 3
117
85
49
34
25
19
B
117
85
49
34
25
19
W1 E1
EDTA (10mM)
117
85
49
34
25
19
C
117
85
49
34
25
19
W1 E1
EDTA (10mM)
117
85
49
34
25
19
C
48
Após cromatografia de afinidade com Ni-NTA esta mesma banda foi
recuperada na fração de eluição E1 (figura 13A), e um produto de degradação de
~45kDa também é observado. Foi realizado um teste para avaliar o efeito de
inibidores de proteases como EDTA ou PMSF na cultura durante o período de
indução, e foi observado que os produtos de degradação (proteínas abaixo de
~50kDa no SDS-PAGE) foram reduzidos quando a cultura tinha como aditivo 10mM
EDTA (canaleta 2, Figura 13B), ou 5mM EDTA + 4mM PMSF (canaleta 3, Figura
13B). Isto ficou mais evidente quando a enzima produzida na presença de 10 mM
EDTA foi purificada (Figura 13C, canaleta E1). A proporção do produto de
degradação (banda de ~45kDa) em relação a SmATPDase1 não clivada (banda de
55 kDa) reduziu-se bastante, como pode ser visto pela comparação com a figura
13A, canaleta E1.
Em seguida passamos aos testes de expressão de SmATPDase2 em P.
pastoris. Após PCR foi obtido um amplificado de ~1,5 kbp o qual foi clonado no
pGEM-T e posteriormente subclonado no vetor de expressão pPIC9K, o qual possui
uma seqüência que codifica um peptídeo sinal de secreção em fusão com
SmATPDase2. O clone SmATPDase2(9)/pPIC9K (transformante multicópia),
selecionado após triagem de resistência a G418, foi cultivado a 25ºC no meio
mínimo BMM usando como indutor o metanol na concentração inicial de 0,5 %,
tendo sido mantida esta concentração a cada 24 hrs. O sobrenadante foi coletado,
concentrado e passado por uma coluna de Ni-NTA. Após cromatografia de afinidade
dos sobrenadantes concentrados foi possível visualizar no gel SDS-PAGE uma
banda de ~60 kDa na fração de eluição obtida.
49
A partir de uma cultura de 700 ml obteve-se um rendimento de 2.9 mg de
enzima recombinante após purificação (figura 14). A pureza da proteína foi de
aprox. 90 %, como revelado no gel.
4. 6 - Deglicosilação de proteínas recombinantes
As proteínas recombinantes produzidas em P. pastoris GS115 foram
submetidas a uma reação de deglicosilação. No caso da SmATPDase1 foi
observada uma redução no peso molecular após digestão com N-glicosidase (figura
15A). Estes resultados estão de acordo com as análises in silico feitas previamente,
as quais sugeriam a presença de 5 potenciais sítios de N-glicosilação em
SmATPDase1, usando o programa NetNGlyc 1.0 (seqüências: NLSQ, NISL, NDTI,
NPSD, NGTG, onde as Asn (N) destes motivos encontram-se nas posições 7, 22,
119, 223 e 350 respectivamente da proteína). Sítios de O-glicosilação não foram
Figura 14. Expressão e purificação de SmATPDase2 recombinante em P. pastoris. O
sobrenadante da cultura de levedura foi concentrado e aplicado em coluna de afinidade Ni-NTA. O gel
SDS-PAGE com as frações recolhidas na cromatografia mostrou que o clone SmATPDase2(9)/pPIC9K
é um bom produtor da proteína recombinante, e foi possível obter quase 3 mg de proteína recombinante
purificada. O tamanho de ~60kDa está dentro do esperado, sabendo que a enzima tem sítios de
glicosilação. (FT: flow through, W: fração de lavagem, E: fração eluição).
117
85
49
34
25
FT W E
kDa
117
85
49
34
25
kDa
117
85
49
34
25
FT W E
kDa
117
85
49
34
25
kDa
50
preditos in silico, o que está de acordo com o resultado de ausência de efeito da O-
glicosidase, obtido após tratamento com esta enzima.
No caso da SmATPDase1 foi observada igualmente uma redução no peso
molecular após digestão com N-glicosidase (figura 15B). As análises de N-
glicosilação para a proteína SmATPDase2 somente mostraram 2 potenciais sítios
nas posições 348 (NATE) e 371 (NVTI). Além disso, usando o preditor de O-
glicosilação não foi achado sítio para este tipo de glicosilação, o que está de acordo
com o resultado de ausência de efeito da O-glicosidase, obtido no gel de SDS-
PAGE.
4. 7 - Atividade enzimática
Os ensaios enzimáticos das duas isoformas de apirase do parasita S.
mansoni mostraram dados interessantes acerca das características destas enzimas.
Figura 15. Análise de glicosilação das enzimas recombinantes SmATPDase1 e 2. (A) Digestão
de SmATPDase1 com ambas glicosidases, mostrou diminuição do tamanho para quase 48kDa quando
digerida com N-glicosidase (marcado N). Digestão com O-glicosidase não modificou o tamanho
(marcado O). (B) Digestão de SmATPDase2 com N-glicosidase mostrou também uma diminuição do
tamanho e não mostrou ser afetada pela O-glicosidase. N: tratado com N-glicosidase; O: tratado com
O-glicosidase
117
85
49
34
25
kDa
117
85
49
34
25
kDa
N
- + - +
O
- - + +
A
117
85
49
34
25
kDa
117
85
49
34
25
kDa
N
- + - +
O
- - + +
A
117
85
49
34
25
kDa
N
- + - +
O
- - + +
117
85
49
34
25
kDa
B
117
85
49
34
25
kDa
N
- + - +
O
- - + +
117
85
49
34
25
kDa
B
51
Inicialmente baseados em várias publicações nós testamos diversos tampões de
atividade descritos, sendo que em todos os casos foi possível ter valores
significantes de atividade usando a enzima SmATPDase2 como mostrado na figura
16.
A maior atividade conseguida foi usando o tampão IV, que somente contem
Tris-HCl e CaCl
2
. Com este resultado pode-se observar que a atividade enzimática
aumenta nos tampões com ausência dos sais NaCl e KCl. Com os dados obtidos
sobre a influência da composição de sais dos tampões sobre a atividade enzimática
deu-se continuidade aos ensaios de caracterização enzimática das duas isoformas.
50mM Tris-HCl pH 7,5
+ + + + +
100mM NaCl
+ - - - +
4 mM KCl
+ + - - -
50mM Glicose
+ + + - -
5mM CaCl
2 + + + + +
I II III IV V
0
500
1000
1500
2000
2500
nmoles/mg/min
Tampões
média
50mM Tris-HCl pH 7,5
+ + + + +
100mM NaCl
+ - - - +
4 mM KCl
+ + - - -
50mM Glicose
+ + + - -
5mM CaCl
2 + + + + +
I II III IV V
0
500
1000
1500
2000
2500
nmoles/mg/min
Tampões
média
Figura 16. Efeito de compostos sobre a atividade ATPásica da enzima SmATPDase2. O
gráfico mostra os valores de atividade ATPásica usando diferentes tampões. Com o tampão IV a
enzima foi mais ativa.
52
Os resultados de atividade mostraram que ambas as enzimas tem um mesmo
perfil de atividade sobre os diversos substratos trifosfatados, como observado nas
figuras 17A e 17B. Ambas as enzimas tiveram uma maior atividade de clivagem
sobre o UTP seguido pelo CTP. Foi muito evidente a baixa atividade sobre o
substrato GTP.
ATP CTP GTP UTP
0
200
400
600
800
1000
1200
nmoles/mg/min
Atividade NTPase SmATPDase1
média
ATP CTP GTP UTP
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
1800
2000
nmoles/mg/min
Atividade NTPase SmATPase 2
média
A
B
Figura 17. Atividade NTPásica das apirases recombinantes de S. manson
i
. Os ensaios de
atividade das enzimas SmATPDase1 e 2 sobre os nucleosídeos trifosfatados na presença de CaCl
2
mostraram uma maior atividade catalítica sobre o UTP. (A) Atividade NTPase de SmATPDase1, (B)
Atividade NTPase de SmATPDase2. Os valores cinéticos foram determinados com 0,2 ug de proteína
em 50mM Tris pH 7,5, 5mM CaCl
2
e 3mM de NTP. Incubado por 20 min a 37 ºC (n=3); os dados são
mostrados como médias +
sd em nmoles/mg/min.
53
Estes resultados de hidrólise de nucleosídeos trifosfatados são consistentes
com os resultados obtidos com a E-NTPDase 8 humana produzida em cultura de
células humanas HEK293 (Knowles e Li 2006). Por outro lado, as características
enzimáticas relacionadas com atividade NDPásica das duas isoformas mostraram
haver uma pequena diferença na preferência pelo substrato. A SmATPDase1
preferencialmente hidrolisou IDP = UDP > GDP, com uma menor hidrólise de ADP
(figura 18A).
Por outro lado, a SmATPDase2 hidrolisou IDP >UDP > CDP, sendo o ADP o
substrato com a menor velocidade de hidrólise entre os nucleotídeos testados
(figura 18B). Como observado, ambas as ATPDases mostraram maior preferência
pelo IDP e a mais baixa preferência pelo ADP. De maneira similar à maioria das
apirases descritas na literatura, a atividade ATPásica é maior que a atividade
ADPásica, como no caso da CD39 ( ATP ~ 100% e ADP ~58%) (Wang e Guidotti
ADP CDP GDP UDP IDP
0
100
200
300
400
500
600
700
nmoles/mg/min
Atividade NDPase SmATPDase1
média
A
Figura 18A. Atividade NDPásica da apirases recombinante SmATPDase 1. Os ensaios de
atividade das enzimas sobre os nucleosídeos difosfatados na presença de CaCl
2
mostraram uma
maior atividade catalítica sobre o UDP e IDP. Os valores cinéticos foram determinados com 0,2 ug
de proteína em 50mM Tris pH 7,5, 5mM CaCl
2
e 3mM de NDP. Incubado por 20 min a 37 ºC (n=3);
os dados são mostrados como médias +
sd em nmoles/mg/min.
54
1996). Entretanto, a atividade ADPásica descrita para CD39-L2 foi 10 vezes maior
que a atividade ATPásica (Ivanenkov et al. 2003).
Por outro lado, a SmATPDase2 hidrolisou IDP >UDP > CDP, sendo o ADP o
substrato com a menor velocidade de hidrólise entre os nucleotídeos testados
(figura 18B). Como observado, ambas as ATPDases mostraram maior preferência
pelo IDP e a mais baixa preferência pelo ADP. De maneira similar à maioria das
apirases descritas na literatura, a atividade ATPásica é maior que a atividade
ADPásica, como no caso da CD39 ( ATP ~ 100% e ADP ~58%) (Wang e Guidotti
1996). Entretanto, a atividade ADPásica descrita para CD39-L2 foi 10 vezes maior
que a atividade ATPásica (Ivanenkov et al. 2003).
ADP CDP GDP UDP IDP
0
200
400
600
800
1000
1200
nmoles/mg/min
Atividade NDPase SmATPDase2
média
B
Figura 18B. Atividade NDPásica da apirases recombinante SmATPDase 2. Os ensaios de
atividade das enzimas sobre os nucleosídeos difosfatados na presença de CaCl
2
mostraram uma
maior atividade catalítica sobre o IDP. Os valores cinéticos foram determinados com 0,2 ug de
proteína em 50mM Tris pH 7,5, 5mM CaCl
2
e 3mM de NDP. Incubado por 20 min a 37 ºC (n=3), os
dados são mostrados como médias +
sd em nmoles/mg/min.
55
Em seguida foi medido o efeito dos íons divalentes sobre as atividades das
proteínas recombinantes. A SmATPDase1 é uma enzima que, em sua forma nativa,
está ancorada no tegumento do parasita por duas regiões transmembrana. Esta
enzima apresentou atividade na ausência de cátion divalente adicionado, e manteve
ou aumentou a atividade na presença de todos os íons divalentes usados (figura
19A). Verificamos que esta enzima mostra maior atividade ATPásica na presença
do íon cálcio (figura 19A). Os íons Mn (manganês) e Hg (mercúrio) também
mostraram ter um efeito positivo sobre a atividade desta enzima. Observa-se que o
cálcio duplica a atividade ATPásica desta enzima em comparação com a ausência
de íon divalente adicionado, ou quando usado o magnésio como cofator.
CaCl2 CoCl2 MgCl2 MnCl2 HgCl2 ZnCl2 Controle
0
100
200
300
400
500
600
nmoles/mg/min
Cations divalentes
média
Figura 19A. Efeito de cátions divalentes sobre a atividade ATPásica de SmATPDase 1. O
cálcio foi o cátion que mais estimulou a atividade na concentração de 5mM. Incubado por 20
min a 37 ºC na presença de 3mM de ATP (n=3); os dados são mostrados como médias + sd
em nmoles/mg/min. Controle na ausência de íon divalente adicionado.
56
A SmATPDase2 é uma apirase com uma estrutura primária similar às
proteínas CD39-L2 e CD39-L4 humanas, as quais são enzimas secretadas. Neste
ensaio foi observado que a maior atividade ATPásica da SmATPDase 2 foi obtida na
ausência de cátion divalente adicionado (figura 19B). No caso da SmATPDase 2
parece que o “cofator” agiria como inibidor com respeito ao controle, no qual o
ensaio foi realizado somente na presença de 50mM Tris-HCl pH 7,5. Esta enzima
curiosamente demonstrou ter maior atividade enzimática quando usados os íons
magnésio e manganês, entretanto o íon cálcio não teve o mesmo efeito como com a
smATPDase1.
CaCl2 CoCl2 MgCl2 MnCl2 HgCl2 ZnCl2 controle
0
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
1100
nmoles/mg/min
cations divalentes
média
Figura 19B. Efeito de cátions divalentes sobre a atividade ATPásica de SmATPDase
2. O magnésio e manganês foram os cátions com os quais a atividade se apresentou
mais alta, quando testados na concentração de 5 mM. Contudo, a atividade mais alta foi
obtida na ausência de cátion divalente adicionado. Incubado por 20 min a 37 ºC (n=3) e 3
mM de ATP, Os dados são mostrados como médias +
sd em nmoles/mg/min.
57
Observando a figura 19 A e B nota-se que para a SmATPDase 1 o controle
também tem atividade sem nenhum cátion divalente adicionado, entretanto o nível
de atividade ATPásica é menor que a obtida usando CaCl
2
ou MgCl
2
. Este resultado
seria uma característica muito interessante que difere a enzima SmATPDase 2 da
SmATPDase 1.
Em seguida foi realizada a caracterização funcional das SmATPDases 1 e 2
em soluções com diferentes pHs. Interessantemente foi visto que SmATPDase1
manteve a sua velocidade de hidrólise do ATP do pH 5 até o pH 8, entretanto nos
pHs 9 - 10 a enzima teve seus valores mais altos de hidrólise (figura 20 A)
mostrando o melhor desempenho em ambientes alcalinos.
A SmATPDase2 apresentou aumento nítido de hidrólise do ATP no pH 8,0,
sendo muito clara a influencia deste pH na velocidade de hidrólise (figura 20B). De
forma similar, ambas SmATPDase1 e 2 funcionam bem em pHs alcalinos.
pH 5 pH 6 pH 7 pH 8 pH 9 pH 10
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
nmoles/mg/min
SmATPDase1
media
pH 5 pH 6 pH 7 pH 8 pH 9 pH 10
0
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
nmoles/mg/min
SmATPDase 2
media
Figura 20. Efeito do pH na velocidade de hidrólise do substrato. (A) O gráfico indica que
SmATPDase1 tem maior velocidade de hidrólise do ATP em condições alcalinas. (B) A
SmATPDase2 teve uma alta na sua velocidade de hidrólise no pH 8. As SmATPDAses 1 e 2
tiveram como cofatores o cálcio e magnésio respectivamente.
B A
58
4. 8 - Construção do vetor de expressão com Proteína dissulfeto isomerase e
Co-expressão com SmATPDase1 em P. pastoris
Em seguida testamos se a co-expressão de SmATPDase1 com PDI poderia
aumentar a expressão heteróloga e a secreção da apirase no meio de cultura. A
partir do cDNA de S. cerevisiae foi possível amplificar por PCR a região que codifica
para a chaperona PDI, obtendo-se uma banda de ~ 1,5 kbp a qual corresponde ao
tamanho esperado de 1566 bp. O melhor Tm para a amplificação mais específica
foi de 60ºC; foi testado o PCR em paralelo com 56ºC (figura 21A). Este produto de
PCR foi clonado no vetor de expressão pICHOLI-1 para prévia confirmação de sua
seqüência.
O clone de P. pastoris SmATPDase1(16)/pPIC9K, o qual contem várias
cópias do vetor de expressão recombinante inseridas no genoma da levedura, foi
co-transformado com o vetor de expressão epissomal PDI/pICHOLI-1. Após seleção
Figura 21. Amplificação e coexpressão da seqüência de DNA que codifica para a
chaperona PDI. (A) Produtos de PCR obtidos usando 2 Tm diferentes; com 60
o
C obteve-
se maior especificidade, como mostrado no gel de agarose 1%, e o tamanho obtido foi de
~1,5 kbp o qual corresponde ao tamanho esperado de 1566 bp . (B) Varredura de
subclones de P. pastoris SmATPDase1(16)/pPIC9K co-expressando PDI. Western blot
usando-se o sobrenadante de cada cultura de levedura, revelado com anticorpo anti-
SmATPDase1.
0,25
0,5
0,75
2,0
3,0
0,25
0,5
0,75
2,0
3,0
60°C60°56°C56°C
0,25
0,5
0,75
2,0
3,0
0,25
0,5
0,75
2,0
3,0
60°C60°60°C60°56°C56°C56°C56°C
1 2 3 4 5 6 71 2 3 4 5 6 7
8 9 10 11 12 13 14 8 9 10 11 12 13 14
A
B
59
no meio seletivo contendo G418 e zeocina, foram selecionados aleatoriamente
alguns transformantes e feito um ensaio de expressão com estes clones. Os
sobrenadantes de cada cultura (5 ml) foram concentrados, e foi detectada a
produção da proteína SmATPDase1 por western blot como mostrado (figura 21B).
Entretanto, observamos que não houve diferença significativa na quantidade de
SmATPDase1 com ou sem chaperona adicional, quando o resultado desrte ensaio
foi comparado com os resultados descritos nas seções anteriores.
4. 9 - Análise da estrutura secundária das SmATPDases recombinantes por
dicroismo circular
As análises da estrutura secundária de cada enzima recombinante usando
dicroísmo circular mostraram que ambas as proteínas têm maior conteúdo de
estrutura “random coil” e folha beta. Ambas as proteínas foram analisadas usando 3
condições (0 mM MgSO
4
, 5 mM MgSO
4
e 10 mM MgSO
4
), e foram obtidos os seus
espectros.
Com a SmATPDase1 pode-se observar algumas mudanças conformacionais devido
à presença do cofator magnésio (figura 22). Com os dados de elipticidade obtidos,
foi utilizada a ferramenta “neural network K2d” e deduzida a composição da
estrutura secundária desta enzima da seguinte forma: sem MgSO
4
(alfa hélice:
7%, folha beta: 45%, randômica: 48%), com 5 mM MgSO
4
(alfa hélice: 5%,
folha beta: 47%, randômica: 48%), com 10 mM MgSO
4
(alfa hélice: 8%, folha
beta: 44%, randômica: 48%).
60
SmATPDase1 recombinante mostrou ter nas 3 condições uma proporção
quase 1:1 de folha beta com estrutura randômica. Curiosamente, ocorreu uma
mudança de 2% nas estruturas (alfa hélice e folha beta) quando esteve presente o
cofator na concentração de 5 mM, e uma mudança de 1% quando em presença de
10 mM de magnésio. Entretanto, as estruturas “random coil” não mostraram
mudanças em nenhuma das condições.
Baseados nos dados de elipticidade obtidos com a enzima recombinante
SmATPDase2 (figura 23), as deconvoluções dos espectros geraram os seguintes
resultados : sem MgSO
4
(alfa hélice: 14%, folha beta: 33%, randômica: 53%), 5
mM MgSO
4
(alfa hélice: 16%, folha beta: 33%, randômica: 51%) e 10 mM
MgSO
4
(alfa hélice: 15%, folha beta: 33%, randômica: 51%).
Espectros CD de SmATPDase1 recombinante
-2500
-2000
-1500
-1000
-500
0
500
1000
150 0
2000
190 200 210 220 230 240 250
Cunprimento de onda (nm)
[0] (deg cm dmol )
0 mM MgSO4
5 mM M gSO4
10 mM M g S O 4
[θ] (deg cm² dmol־¹)
Espectros CD de SmATPDase1 recombinante
-2500
-2000
-1500
-1000
-500
0
500
1000
150 0
2000
190 200 210 220 230 240 250
Cunprimento de onda (nm)
[0] (deg cm dmol )
0 mM MgSO4
5 mM M gSO4
10 mM M g S O 4
[θ] (deg cm² dmol־¹)
Figura 22 Espectros CD de SmATPDase1 em 3 condições diferentes. No gráfico observa-se
pequenas mudanças estruturais devido à presença do magnésio em duas concentrações.
61
Os espectros gerados para esta enzima mostraram uma pequena mudança
de conformação na estrutura alfa e randômica quando a enzima esteve na presença
do cofator magnésio. A estrutura folha beta em todos os casos manteve a estrutura,
sugerindo que a estrutura secundária da enzima SmATPDase2 pode ser mais
estável que a da SmATPDase 1, onde mudanças um pouco maiores aconteceram
nas estruturas alfa e folha beta, na presença do cofator.
4. 9. 1 - SmATPDase 1 e SmATPDase 2 formam dímeros
Realizamos o ensaio de “cross-linking” usando glutaraldeido, o qual estabiliza
conformações diméricas, formando ligações cruzadas entre cadeias laterais de
aminoácidos Lisina das proteínas (Mukasa et al. 2005). As duas isoformas de
ATPDases foram tratadas com glutaraldeido, após prévia incubação das proteínas
com ou sem DTT e CaCl
2
como observado na figura 24. Pode ser observada a
formação de dímeros em todas as condições, porém em maior abundância naquelas
Figura 23. Espectros CD de SmATPDase2 em 3 condições diferentes. No gráfico observa-se
muito poucas mudanças estruturais sob o efeito do magnésio em duas concentrações.
Espectros CD de SmATPDase 2 recombinante
-8000
-6000
-4000
-2000
0
2000
4000
6000
8000
190 200 210 220 230 240 250
Cumprimento de onda (nm)
[0] (deg. cm. mol )
0 mM MgSO4
5 mM M gSO4
10 mM M g S O 4
[θ] (deg cm² dmol־¹)
Espectros CD de SmATPDase 2 recombinante
-8000
-6000
-4000
-2000
0
2000
4000
6000
8000
190 200 210 220 230 240 250
Cumprimento de onda (nm)
[0] (deg. cm. mol )
0 mM MgSO4
5 mM M gSO4
10 mM M g S O 4
[θ] (deg cm² dmol־¹)
62
condições em que as enzimas não foram pré-incubadas com o agente redutor DTT
(5 mM). A presença de monômeros é observada, mas em baixa abundância. Isto
demonstra a característica dimérica destas proteínas, sobretudo da SmATPDase2 a
qual é secretada para o meio (Levano-Garcia et al. 2007).
4. 10 - Análises dos níveis de expressão de SmATPDases 1 e 2
Nós realizamos análises da expressão das SmATPDases 1 e 2 por Real-Time
PCR para avaliar o nível de transcrição de ambos os genes ao longo do ciclo de vida
do parasita. O gene SmATPDase2 mostrou significantemente (p-value < 0,05) maior
expressão em ovo, cercária e miracídio quando comparado à forma com menor
expressão, o esquistossômulo. Os níveis de expressão foram 16 vezes, 8 vezes e 5
vezes maiores, respectivamente (figura 25 A). Expressão de SmATPDase2 em
vermes adultos foi somente 1.8 vezes maior que em esquistossômulo. Em contraste,
SmATPDase1 teve significantemente (p-value <0.05) a maior expressão nas formas
47
35
85
118
monomero
dimero
oligomero
SmATPDase1 + - + - + - + - -
DTT - - - - + + + + +
CaCl2 - - + + - - + + -
Glutaraldeido + + + + + + + + -
SmATPDase2 - + - + - + - + +
47
35
85
118
monomero
dimero
oligomero
SmATPDase1 + - + - + - + - -
DTT - - - - + + + + +
CaCl2 - - + + - - + + -
Glutaraldeido + + + + + + + + -
SmATPDase2 - + - + - + - + +
Figura 24. Formação de dímeros por tratamento com glutaraldeido. As SmATPDases 1 e 2
formam dímeros em condições não redutoras e redutoras, na presença de glutaraldeido.
Observa-se uma banda de ~55 kDa (monômero) e ~110kDa (dímero). Acima deste último peso
observam-se formações oligoméricas. DTT (5mM), CaCl
2
(5mM).
63
ovo e verme adulto quando comparado com a forma com mais baixo nível de
expressão, chamado miracídio. Os níveis de expressão foram 6 vezes e 5 vezes
respectivamente (figura 25 B).
Os maiores níveis de expressão para ambos os genes foram detectados na
forma ovo, sugerindo um importante papel destas ATPDases na manutenção dos
ovos. Interessantemente, os níveis de expressão de SmATPDase2 nas formas
miracídeo e cercária foram elevados, sugerindo uma função no processo de invasão
em caramujos e humanos, respectivamente.
4. 11 - Análise filogenética de SmATPDase2
Comparações da seqüência primária deduzida contra o banco de dados do
GenBank usando BlastP mostrou que o melhor “match” (E value = 0.0) foi com uma
proteína ortóloga NTPDase6-like de S. japonicum (GenBank accession AAW26231)
Figura 25. Níveis de expressão dos mRNAs de SmATPDase 1 e 2 em diferentes formas do
ciclo de vida de S. mansoni determinado por Real-Time RT-PCR. (A-B)
Os gráficos mostram
o “fold change” de expressão (normalizado pelo valor da forma com menor nível de expressão) de
ambos os genes nas formas indicadas do ciclo de vida de
S. mansoni. (*) indica p-value < 0,05, em
comparação à forma com menor nível de expressão.
64
com 73% de identidade e 81% de similaridade, com cobertura de 550 aminoácidos.
SmATPDase2 também teve bons “matches” contra CD39-L2 humana (GenBank
accession NP_001238.1) com 35% de identidade e 51% de similaridade, com
cobertura de 447 aminoácidos (E value = 4x10
-65
), e CD39-L4 humana (GenBank
accession NP_001240.1) com 33% de identidade e 49% de similaridade, com
cobertura de 443 aminoácidos (E value = 1x10
-62
). Interessantemente, o alinhamento
das duas ATPDases de S. mansoni mostrou um baixo nível de identidade (26%) e
similaridade (42%) com cobertura de 465 aminoácidos (E value = 3x10
-20
), sugerindo
que um antigo evento de divergência gerou estas duas isoformas.
A seqüência de aminoácidos de SmATPDase2 foi alinhada com outros
membros da família apirase (figura 26A) usando o programa Clustal X (Thompson
et al. 1997), e o alinhamento mostra as 5 regiões conservadas, descritas
previamente para esta família. Outras análises in silico da topologia de
SmATPDase2 permitiram a identificação de somente uma região transmembrana
amino terminal (TM1, figura 26A), como descrito também para CD39-L2 e CD39-
L4.
Em contraste, SmATPDase1 possui 2 regiões transmembrana, uma no amino
terminal e outro no carboxilo terminal, como nas proteínas humanas CD39, CD39-L1
e CD39-L3 (TM1 e TM2, figura 26A). Análises filogenéticas usando o método
“Neighbor-Joining” (Saitou e Nei 1987) com membros da família ATP-
difosfohidrolase geraram a árvore mostrada na figura 26B. Esta análise mostra que
SmATPDase2 está mais relacionada com as proteínas CD39-L2 e CD39-L4 do que
a proteína SmATPDase1, a qual está localizada em outro braço contendo as
proteínas humanas CD39, CD39-L1 e CD39-L3.
65
A
Figura 26
A
. Alinhamento de seqüências de aminoácidos de SmATPDase2 com outras apirases. Todas as
5 regiões conservadas ACR características da família apirase são indicadas dentro de caixas, e as regiões
transmembrana (TM1 e TM2) são indicadas por linhas descontinuas escuras. As regiões com elevada identidade
e similaridade entre seqüências apirase são mostradas como colunas pretas e cinzas, de acordo com o algoritmo
Clustal X.
66
4.12 - Expressão de fragmentos de SmATPDAse1 e 2 com baixa similaridade.
Fragmentos de SmATPDases 1 e 2 foram selecionados em uma região de
baixa conservação compreendendo 149 aminoácidos que mostrou somente 18% de
Figura 26B. Árvore filogenética com várias ATP-difosfohidrolases de diferentes organismos.
Esta árvore foi construída usando Clustal com o método Neighbor Joining excluindo posições com gaps.
Os números representam a confiabilidade dos ramos, determinada pelo método de
bootstrap (com 1000
amostragens). Os números de acesso GenBank das seqüências são: Nova ATPDase2 de
S. mansoni
identificada neste trabalho, DQ868522;
T. gondii NTPase1, Q27893; T. gondii NTPase2, Q27895; P.
sativum
NTPase, CAA83655; G. soja apyrase, AAG32960; A. thaliana apyrase, NP_197329; S.
tuberosum
apyrase, P80595; H. sapiens CD39L4, AAC39885; H. sapiens CD39L2, AAC39883; M.
musculus
CD39, AAB92259; R. novergicus CD39, NP_072109; H. sapiens CD39, AAB32152; B. taurus
CD39, AAB62382;
S. scrofa CD39, NP_999318; H. sapiens CD39L3, NP_001239; G. gallus CD39,
O93295;
S. mansoni ATPDase1, AAP9473; S. cerevisiae Golgi apyrase, NP_010920; H. sapiens
lysosomal Apyrase, NP_004892;
C. albicans Apyrase, XP_715624; T. brucei GDA1/CD39, AAX70552;
T. cruzi NTPDase1, AAS75599; S. japonicum NTPDase6-like protein, AAW26231; A. gambiae
GDA1/CD39, XP_320057;
L. pneumophila pneumophila str. Philadelphia1 GDA1/CD39, AAU27975; S.
neurona
SnNTP, AAP88692; H. sapiens ENTPD4, AAH34477; H. sapiens ENTPD3, AAH29869; D.
melanogaster
NTPase-isoform B, AAF51181; C. elegans GDA1/CD39, NP_508994; H. sapiens
ENTPDase7, NP_065087;
N. caninum NTPase, BAA31454.
B
67
identidade entre suas seqüências (ver métodos). Seqüências DNA que codificam
para estes fragmentos foram amplificadas (figura 27A), clonadas e em seguida
expressadas como proteínas recombinantes em fusão com um tag de 6 histidinas no
extremo carboxilo terminal. Grandes quantidades de cada proteína foram obtidas
como corpos de inclusão em E. coli. Estas proteínas foram solubilizadas com uréia,
seguido de re-enovelamento em colunas de níquel com gradiente de uréia
decrescente, e os processos de lavagens e eluição foram realizados com crescentes
concentrações de imidazol.
Em cada caso, SDS-PAGE das frações de eluição (E1 e E2) mostrou uma
simples banda purificada (figura 27B-C). Cada proteína foi usada para imunizações
de camundongo (fragmento de SmATPDase1) e coelho (fragmento de
SmATPDase2).
Figura 27. Amplificação de DNA e expressão dos fragmentos da SmATPDase2 (APIMEM) e
SmATPDase1
(APISOL). (A) Amplificação por PCR dos fragmentos de DNA que codificam para os
trechos com baixa similaridade entre as apirases, denominados de APISOL e APIMEM.
(B) Frações
com fragmentos SmATPDase1 (APIMEM) purificados com coluna de Ni-NTA.
(C) Frações com
fragmentos SmATPDase2 (APISOL) purificados com coluna de Ni-NTA.
26,0
36,0
47,0
kDa
E1 E2
A
26,0
36,0
47,0
kDa
E1 E2
A
kDa
26,0
36,0
47,0
E1 E2
B
kDa
26,0
36,0
47,0
E1 E2
kDa
26,0
36,0
47,0
E1 E2
B
A
B C
0,6
0,3
A
P
I
S
O
L
A
P
I
M
E
M
0,6
0,3
0,6
0,3
2,0
8,0
Kbp
M
A
P
I
S
O
L
A
P
I
M
E
M
68
4. 13 - Western Blot e imunolocalização de SmATPDases 1 e 2 de S. mansoni
Anti-soros obtidos de camundongo e coelho contendo anticorpos específicos
para cada uma das duas isoformas de SmATPDase foram negativamente
purificados utilizando lavagens com lisados de E. coli (Gruber e Zingales 1995), ver
figura 28A. Nesta purificação, os anticorpos com reação cruzada foram eliminados
por incubação de cada antisoro com corpos de inclusão da isoforma oposta. A
especificidade de cada anticorpo foi testada por western blot de cada antisoro contra
as duas isoformas de proteínas recombinantes, indicando a especifidade dos
mesmos (figura 28B).
Lisado bacteria
(pET vazio)
SmATPDase1
(fragmento)
SmATPDase2
(fragmento)
Lisado bacteria
(pET vazio)
SmATPDase1
(fragmento)
SmATPDase2
(fragmento)
Anti-ATPDase1 Anti-ATPDase2
1 : 16 000
1 : 32 000
Lisado bacteria
(pET vazio)
SmATPDase1
(fragmento)
SmATPDase2
(fragmento)
Lisado bacteria
(pET vazio)
SmATPDase1
(fragmento)
SmATPDase2
(fragmento)
Anti-ATPDase1 Anti-ATPDase2
1 : 16 000
1 : 32 000
1 : 2 000
Lisado bacteria
fração soluvel
Lisado bacteria
fração insoluvel
SmATPDase1
(fragmento)
SmATPDase2
(fragmento)
Anti-ATPDase1
Lisado bacteria
fração soluvel
Lisado bacteria
fração insoluvel
SmATPDase1
(fragmento)
SmATPDase2
(fragmento)
Anti-ATPDase2
1 : 2 000
Lisado bacteria
fração soluvel
Lisado bacteria
fração insoluvel
SmATPDase1
(fragmento)
SmATPDase2
(fragmento)
Anti-ATPDase1
Lisado bacteria
fração soluvel
Lisado bacteria
fração insoluvel
SmATPDase1
(fragmento)
SmATPDase2
(fragmento)
Lisado bacteria
fração soluvel
Lisado bacteria
fração insoluvel
SmATPDase1
(fragmento)
SmATPDase2
(fragmento)
Anti-ATPDase1
Lisado bacteria
fração soluvel
Lisado bacteria
fração insoluvel
SmATPDase1
(fragmento)
SmATPDase2
(fragmento)
Anti-ATPDase2
Lisado bacteria
fração soluvel
Lisado bacteria
fração insoluvel
SmATPDase1
(fragmento)
SmATPDase2
(fragmento)
Lisado bacteria
fração soluvel
Lisado bacteria
fração insoluvel
SmATPDase1
(fragmento)
SmATPDase2
(fragmento)
Anti-ATPDase2
A
B
Figura 28. Purificação negativa de antisoros Anti-SmATPDase1 e 2. (A) Ensaio de
especificidade dos antisoros por western blot, após a primeira lavagem com lisado bacteriano
desnaturado.
(B) Ensaio de especificidade após segunda lavagem dos antisoros com proteína
recombinante (corpos de inclusão).
69
Ensaios western blot com proteínas do tegumento de verme adulto resultaram
em detecção de somente uma banda específica de diferente peso molecular para
cada antisoro (figura 29). O anti-soro anti-SmATPDase1 revelou uma banda de
aproximadamente 63 kDa como esperado (DeMarco et al. 2003), na fração solúvel
com detergente, enquanto o anti-soro anti-SmATPDase2 revelou uma banda de
aproximadamente 55 kDa na fração insolúvel com detergente (figura 29).
Fração sol uvel
Fração i nsol uvel
Cont raol posi t i vo
Anti-ATPDase1
Fração sol uvel
Fração i nsol uvel
Cont raol posi t i vo
Anti-ATPDase2
Fração sol uvel
Fração i nsol uvel
Cont raol posi t i vo
Anti-ATPDase1
Fração sol uvel
Fração i nsol uvel
Cont raol posi t i vo
Anti-ATPDase2
Fração sol uvel
Fração i nsol uvel
Cont raol posi t i vo
Anti-ATPDase1
Fração sol uvel
Fração i nsol uvel
Cont raol posi t i vo
Anti-ATPDase2
Fração sol uvel
Fração i nsol uvel
Cont raol posi t i vo
Anti-ATPDase1
Fração sol uvel
Fração i nsol uvel
Cont raol posi t i vo
Anti-ATPDase1
Fração sol uvel
Fração i nsol uvel
Cont raol posi t i vo
Anti-ATPDase2
Fração sol uvel
Fração i nsol uvel
Cont raol posi t i vo
Anti-ATPDase2
Fração sol uvel
Fração i nsol uvel
Cont raol posi t i vo
Anti-ATPDase1
Fração sol uvel
Fração i nsol uvel
Cont raol posi t i vo
Anti-ATPDase2
Fração sol uvel
Fração i nsol uvel
Cont raol posi t i vo
Anti-ATPDase1
Fração sol uvel
Fração i nsol uvel
Cont raol posi t i vo
Anti-ATPDase1
Fração sol uvel
Fração i nsol uvel
Cont raol posi t i vo
Anti-ATPDase2
Fração sol uvel
Fração i nsol uvel
Cont raol posi t i vo
Anti-ATPDase2
Figura 29. Detecção de SmATPDase 1 e 2 em frações solúvel e insolúvel do tegumento do
parasita.
(A-B) Detecção de SmATPDase1 (~63 kDa) na fração solúvel e seu correspondente gel
SDS-PAGE. (C-D) Detecção de SmATPDase2 (~50kDa) na fração insolúvel do tegumento do
parasita e seu correspondente gel SDS-PAGE.. Observa-se que os anticorpos foram muito
específicos para cada isoforma.
A
B
C
D
70
Curiosamente, a proteína SmATPDase2 tem um tamanho estimado menor do
que foi predito a partir de sua seqüência primária (63kDa), o que sugere que a
proteína pode estar sujeita a processamento proteolítico após sua síntese.
Experimentos de co-imunolocalização foram realizados por incubação dos tecidos
com os dois anti-soros diferentes, específicos para a SmATPDase1 ou 2. As
imagens de microscopia de fluorescência confocal de cortes histológicos de verme
adulto e de miracídio, cercária e esquistossômulo permeabilizados foram obtidas
(figura 30A).
Em adultos, SmATPDase1 foi co-imunolocalizada com SmATPDase2 em
ambas as membranas do tegumento, basal e apical (figura 30B, amarelo). Em
contraste, SmATPDase2 foi encontrada ao longo do sincício do tegumento e partes
das membranas basal e apical (figura 30B, verde). A presença de baixa
intensidade de fluorescência em secções internas do verme indica pouca
abundância em algumas estruturas internas em comparação com o tegumento
(figura 30A, painel m).
Esquistossômulo mostra as duas isoformas uniformemente distribuídas
através do tegumento (figura 30A, painel i), sugerindo que incluso em etapas
iniciais de infecção uma atividade ATPDase deve ser importante para o parasita.
SmATPDase2 estava mais concentrada na região caudal no miracídio,
especialmente na junção corpo/cauda (figura 30A, painel a). Na forma cercária,
SmATPDase2 foi localizada principalmente nas regiões apical (ventosa oral e boca)
e caudal (figura 30A, painel c).
71
Anti-SmATPDase1 (vermelho)
Anti-SmATPDase2 (verde) Controle negativo
------------------------------------------------- -------------------------------------------------
MiracídeCercária Es
q
uistossômu
Verme Adulto
Corte histológico
Figura 30A. Co-imunolocalização de SmATPDase1 e 2 em parasitas S. manson
i
inteiros
permeabilizados e cortes histológicos.
Imagens de microscopia confocal de fluorescência (Flúor) e suas
correspondentes imagens de contraste de interferência diferencial (DIC) de diferentes formas do ciclo de
vida de
S. mansoni são mostradas. Anti-soros purificados anti-SmATPDase1 e anti-SmATPDase2, e
anticorpos secundários conjugados a FITC (verde) ou Cy3 (vermelho) foram usados para detecção de
SmATPDase1 ou SmATPDase2, respectivamente, em (a) miracídio, (e) cercária, (i) esquistossômulo e (m)
corte histológico de verme adulto. Soros pré-imune de camundongo e coelho foram usados como controles
negativos para cada forma do parasita (painéis
c, g, k e o respectivamente).
72
4. 14 - SmATPDase2 é secretada pelo parasita no meio
Vermes adultos foram cultivados por 48 hrs nas condições descritas em
métodos, e os sobrenadantes foram separados por filtração e centrifugação seguido
de concentração como descrito em métodos. O sobrenadante concentrado foi sujeito
a cromatografia de afinidade usando a resina Reactive Red 120, usando um
procedimento previamente otimizado em nosso laboratório para a purificação de
SmATPDase1 produzida heterologamente em Pichia pastoris.
Assim, proteínas ligadas na coluna foram eluidas com 5 mM de ADP e 5 mM
ATP (figura 31B-D). Western blot da fração eluida foi realizado usando anticorpo
primário anti-SmATPDase2 (1: 500) (figura 31A) ou anti-SmATPDase1 (1:500)
(figura 31C). Com isso, é claramente visível que SmATPDase2 foi detectada no
sobrenadante.
Figura 30B. Desenho de co-imunolocalização das SmATPDase1 e 2 em parasitas S. manson
i
inteiros permeabilizados e cortes histológicos.
Lado esquerdo, detalhe da imagem de
fluorescência do verme adulto do painel (m) da Figura 30A mostrando a localização de somente
SmATPDase2 (verde) nas membranas basal e apical do tegumento. Lado direito, um esquema
mostrando os componentes estruturais do tegumento.
73
4. 15 – Ensaios de Proteção contra Schistosoma usando SmATPDase1 e 2.
4. 15. 1 - Ensaio de proteção usando SmATPDase recombinante: resposta
humoral e ensaios funcionais
Figura 31. Detecção de SmATPDase
2
no sobrenadante de culturas in vitro de vermes adultos S.
mansoni.
Vermes adultos foram mantidos por 48 hrs no meio de cultura e em seguida coletado o
sobrenadante; depois de filtração e centrifugação, seguido de concentração, o material foi submetido a
cromatografia de afinidade com Reactive Red 120. Em paralelo, meio de cultura sem vermes foi
processado como controle. SDS-PAGE 10% e western blot foram realizados usando as frações de eluição
concentradas obtidas da cromatografia.
Painéis A e B: western blot usando anticorpo primário anti-
SmATPDase2 (1:500) e seu respectivo SDS-PAGE corado com azul de coomasie.
Painéis C e D:
Western blot usando anticorpo anti-SmATPDase1 (1:500) e seu respectivo SDS-PAGE corado com azul
de coomasie. Setas pretas apontam para a SmATPDase2. Uma robusta banda de ~50kDa foi detectada
como um produto de secreção no sobrenadante do meio de cultura com vermes. Controles positivos, são
fragmentos de SmATPDase obtidos de expressão heteróloga em
E coli, cada um com um peso molecular
de ~20kDa.
Anti-SmATPDase2
M
e
i
o
d
e
c
u
l
t
u
r
a
C
o
n
t
r
o
l
e
n
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Anti-SmATPDase1
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Anti-SmATPDase2
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Anti-SmATPDase1
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o
74
4. 15. 1. 1 - Ensaio de proteção 1
Foi realizado o ensaio de proteção usando como antígeno a proteína
recombinante obtida com a construção APIFRA6/pET21b. Camundongos BALB/c
foram imunizados com a proteína recombinante apirase (10 µg/dose contendo 1000
µg de AlOH
3
- 3 doses com intervalos de 7 dias). Os resultados obtidos após o
primeiro desafio mostram inicialmente uma baixa porcentagem de proteção de
apirase (19%), usando como controle a proteína Sm14 que teve neste ensaio ~27 %
de proteção (figura 32, tabela 3). Contudo, para todos os casos os P-values não
foram estatisticamente significantes.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
Salina AlOH Sm14 (Hen) Api. Eno. SWAP Api. De.
Worm burden
Figura 32. Ensaio de proteção com SmATPDase1: resposta humoral. O gráfico mostra as médias
de parasitas obtidos em cada grupo avaliado após desafio com cercárias. Api. Eno. (apirase
enovelada), Api.De (apirase desnaturada)
Tabela 3. Ensaio de proteção com SmATPDase 1.
media desvio
%
proteção
p value
Salina 34 4,6
AlOH 35 4,7
Sm14 25 3,2 27,62 0,23
Apirase enovelada 28 4,3 19,05 0,48
Swap 30 3,3 15,36 0,51
Apirase denaturada 32 4,0 9,21 0,7
75
Com isto, mostra-se também que apirase recombinante desnaturada foi
menos eficiente que apirase re-enovelada. Baseado neste resultado acredita-se que
a resposta imune poderia ser melhorada aumentando a concentração das doses de
10 para 30 µg de proteína por injeção, como é usualmente usada em outros testes
de candidatos a vacina (Tran et al. 2006).
Os níveis de anticorpos IgG totais induzidos contra a proteína apirase foram
determinados por ELISA, através da análise de um pool dos soros dos animais
imunizados. Pode-se observar que o soro dos animais imunizados reconheceu a
proteína recombinante, sendo titulado na diluição de 1:1280 (figura 33). Não foi
detectada a presença de anticorpos anti-apirase no soro de animais imunizados com
cercárias irradiadas e animais com infecção crônica.
Curiosamente nos ensaios de ELISA realizados para analisar a resposta
imune individual de cada um dos camundongos deste experimento, foi observada
uma correlação entre o título de anticorpo IgG anti-apirase e o número de parasitas
recuperados em cada camundongo (figura 34).
Figura 33 – Produção de anticorpos IgG anti-
A
pirase em camundongos imunizados com a
proteína SmATPDase1 recombinante
. Os níveis de anticorpos IgG total foram analisados em
amostras do soro coletadas 60 dias após a primeira dose da proteína apirase. Foram analisados
ainda soros de animais imunizados com cercárias irradiadas (Cer. Irr) e soro de animais com
infecção crônica (Inf. Crônica).
0
2
4
6
8
10
12
Al(OH)3 Apirase Exp1 Cerc.Irr. Inf. Crônica
Log
2
do Título
76
Observa-se que dois camundongos apresentaram um elevado título de
anticorpos, observando-se ao mesmo tempo nestes animais o menor número de
parasitas, o que sugeriu um possível efeito neutralizante destes anticorpos contra as
cercárias (figura 34). Com isso, também se mostrou que o uso de somente 10 µg
de proteínas por injeção provavelmente está no limite para produzir uma boa
resposta imune, já que quase todos os camundongos não tiveram títulos altos de
anti-SmATPDase 1 (figura 34).
4. 15. 1. 2 - Ensaio de proteção 2
Camundongos fêmeas C57BL/6 de 4-6 semanas receberam 3 doses de 30
µg de proteína s.c (dorso) de 14 em 14 dias. Neste ensaio em cada dose injetada a
proteína recombinante foi combinada com os adjuvantes: alumínio (10 µg Al
3+
µg
-1
proteína) ou CpG ODN (1 µg CpG ODN µg
-1
proteína) junto com IFA (“Incomplete
Freund´s adjuvant”), esta dose foi formulada no mesmo volume do adjuvante IFA.
Quatro grupos diferentes G1 a G4, receberam as doses como indicado na legenda
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
1.6
1.8
2
Mice
Abs (492 nm)
0
10
20
30
40
50
60
70
Worm Burden / Mouse
40
80
160
320
640
1280
2560
5120
Worm Burden
Serial Dilution
Figura 34. Relação título de anticorpos-números de parasitas. Os círculos indicam o número de
parasitas recuperados em cada camundongo, que está indicado no eixo vertical da direita. As barras
coloridas indicam a medida de densidade ótica, do ensaio de titulação de anticorpos anti-apirase,
mostrada no eixo da esquerda. A comparação do título de anticorpos com o número de parasitas
recuperado mostra uma relação quase linea
r
entre a presença de anticorpos anti-apirase e a baixa
77
da figura 35A e nos métodos. O oligo CpG ODN tem a seqüência 5´-
TCCATGACGTTCCTGACGTT-3´, e foi sintetizado com pontes fosfodiester
modificado “phosphorothioate”, sendo resistente a nucleases. Previamente ao
desafio com cercárias, nos grupos de camundongos imunizados foram analisados
os níveis de IgG e o tipo de resposta obtida (Th1 ou Th2) após o terceiro reforço.
Os resultados de isotipagem dos anticorpos com ELISA mostraram que os grupos 1
e 3 tiveram os mais altos títulos de IgG1 (Th2), característico de resposta humoral
(figura 35A).
A titulação das IgG2a (Th1) mostrou que o grupo 2 (imunizado com o
adjuvante CpG) mostrou o mais alto titulo, correspondendo a uma resposta imune
do tipo celular mais alta, e os grupos 3 e 4 tiveram uma resposta mista Th1-Th2
quase no mesmo nível (figura 35B).
Titulação de IgG1 (Th2) sangria 4
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1/500 1/1 000 1/2 000 1/4 000 1/8 000 1/16 000
Diluições
Abs OD 492 nm
G1
G2
G3
G4
A
Figura 35A. Isotipagem das IgG1 da sangria 4 de camundongos imunizados com
SmATPDase1 recombinante
. Titulação de IgG1 (resposta humoral). Quatro grupos de animais
foram testados (G1 a G4, em cores diferentes), cada um com um esquema de imunização
diferente: G1 (apirase + alumínio; reforço com aluminio), G2 (apirase + CpG oligo; reforço com
CpG), G3 (apirase + alumínio; reforço com CpG oligo), G4 (apirase + CpG; reforço com alumínio).
78
A análise dos dados do desafio do segundo experimento (tabela 4, figura
36), revelou que houve redução da média da carga parasitária em alguns grupos
quando comparados aos animais naive. Infelizmente, não observamos diferenças
estatísticas significativas. Podemos, portanto, apenas apontar para uma tendência
de redução da carga parasitária dos animais imunizados com a proteína
SmATPDAse1 nas diferentes formulações.
Média de Vermes Proteção frente P Proteção
recuperados ao Naive (teste - t) específica
(NMV +
DP) (%) (%)
Naive (5) 42 +
10
CpG IFA (12) 41 +
2,6 1,8 0,89
Apirase CpG IFA (12) 41 +
9,1 2,6 0,86 0,9
Apirase CpG IFA- Apirase Alum (11) 39 +
18,4 8,2 0,67 6,7
Alum (11) 35 +
11,8 16,7 0,28
Apirase Alum (11) 33 +
11,5 22,1 0,11 6,5
Apirase Alum - Apirase CpG IFA (10) 36 +
7,8 13,8 0,24 -3,4
Titulação de IgG2a(Th1) sangria 4
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1/500 1/1 000 1/2 000 1/4 000 1/8 000 1/16 000
Diluições
Abs OD 492 nm
G1
G2
G3
G4
B
Figura 35B. Isotipagem das IgG2a da sangria 4 de camundongos imunizados com SmATPDase1
recombinante
. Titulação de IgG2a (resposta celular). Quatro grupos de animais foram testados (G1 a
G4, em cores diferentes), cada um com um esquema de imunização diferente: G1 (apirase + alumínio;
reforço com aluminio), G2 (apirase + CpG oligo; reforço com CpG), G3 (apirase + alumínio; reforço com
CpG oligo), G4 (apirase + CpG; reforço com alumínio).
Tabela 4. Desa
f
io de camundongos C57BL/6 imunizados com a proteína
recombinante apirase com diferentes adjuvantes. (n)-número de
animais por grupo
79
Assim, a imunização dos camundongos com a proteína SmATPDase1
formulada em hidróxido de alumínio pareceu ser a mais efetiva, com uma redução
de 22,1 % na média da carga parasitária e com menor valor de p (0,11). O grupo
imunizado com SmATPDase1 em hidróxido de alumínio e reforçado com
SmATPDAse1 mais oligos CpG apresentou uma redução média de 13,8 %, e é de
muita importância notar que apenas com oligos CpG, não parece ter havido efeito
protetor algum (2,6 %).
4. 15. 1. 3 - Ensaio de Proteção 3
Um novo ensaio de proteção contra Schistosoma mansoni foi desenhado
desta vez usando as duas isoformas separadamente e em conjunto. Baseado na
estratégia descrita para ensaio com Tetraspanin (Tran et al. 2006), as proteínas
foram injetadas junto com o adjuvante completo de Freund (CFA) (ver materiais e
métodos). O ensaio possui 4 grupos: grupo 1 (SmATPDase1), grupo 2
0
10
20
30
40
50
60
70
NAIVE CpG IFA Apirase
CpG IFA
Pr ime A pi
(CpG IFA)
Boost
Alum
Alum Apirase
Alum
Pr ime A pi
(Alum)
Boost CpG
IFA
Figura 36. Ensaio de proteção 2. O gráfico mostra as médias de parasitas obtidos em cada grupo
avaliado após desafio com cercárias.
CpG IFA (Oligos CpG combinado com adjuvante incompleto
de Freund),
Alum
(Hidróxido de alumínio)
80
IgG total
0
50000
100000
150000
200000
250000
300000
350000
400000
450000
500000
controle CFA
Api1
Coating Api1
soro Api2
controle CFA
Coating Api2
soro Api1
Api2
Coaring
Api1+Api2
soro Api1+2
Concentração (ng/mL)
(SmATPDase2), grupo 3 (SmATPDase1 + SmATPDase2), grupo 4 (controle, apenas
CFA).
A produção de IgG usando a segunda isoforma (SmATPDase2 expressada
em levedura e glicosilada) foi 4 vezes menor que a primeira isoforma. Observa-se
também (figura 37A) que não existe reação cruzada detectável para ambas as
SmATPDases. A isotipagem dos anticorpos mostrou que SmATPDase1 gerou uma
resposta mista th1 e th2, sendo levemente maior a resposta th1. No caso da
0
20000
40000
60000
80000
100000
120000
140000
160000
Api1 Api2 coating Api1+2 e soro
Api1+2
Concentração IgG1 IgG2a (ng/mL)
IgG1
IgG2a
Figura 37. Titulação de IgG do ensaio de proteção 3 usando adjuvante completo de Freund.
(A)
Determinação do titulo de IgG totais dos antisoros dos camundongos imunizados com
SmATPDase1 (Api1), SmATPDase 2 (Api2) ou com as duas em conjunto. Como controle usamos o
soro de animais inoculados apenas com o adjuvante completo de Freund (CFA). Nos três ensaios
da esquerda os poços da placa de ELISA foram cobertos com Api1, nos três seguintes com Api2, e
no último com uma mistura de Api1+Api2.
(B) Caracterização dos dois isotipos de IgG (cores
diferentes) da resposta imune contra a SmATPDase 1 (esquerda), SmATPDase 2 (centro), ou
contra as duas em conjunto (direita).
A
B
81
SmATPDase2 esta desencadeou uma resposta quase totalmente Th2 ou humoral
(figura 37B). Neste experimento, é interessante notar o fato que usando o mesmo
adjuvante (CFA), cada uma das duas isoformas da enzima gerou respostas imunes
diferentes (figura 37B, esquerda e centro). A imunização simultânea com as duas
isoformas mostrou uma predominância do isotipo IgG1, ou seja novamente uma
resposta quase totalmente Th2 ou humoral (figura 37B, direita).
Os resultados de proteção usando as duas SmATPDases 1 ou 2 como
antígenos mostraram, no caso da SmATPDase1, uma redução da carga parasitária
de ~20% com respeito ao contrôle naive, e de ~12 % de redução com respeito ao
adjuvante CFA (Tabela 5, figura 38). No caso da SmATPDase2 e das duas em
conjunto, não foi detectada redução da carga parasitária (Tabela 5).
Média
Proteção c/
Naive
Test-t
Proteção c/
CFA
Test-t
APIRASE 1
34,8 20,650 0,001014 12,260 0,21
APIRASE 2
42,8 2,410 0,764011 -7,899
AP1 + AP 2
39,55 9,808 0,243849 0,280
CONT. CFA
39,66 9,555 0,377014
CONT. NEG
43,85
Tabela 5. Ensaio de proteção usando as SmATPDases 1 e 2 e adjuvante
completo de Freund (CFA).
0
10
20
30
40
50
60
70
APIRASE 1 APIRASE 2 AP1 + AP 2 CONT. CFA CONT. NEG
Figura 38. Ensaio de proteção 3. O gráfico mostra as médias de parasitas obtidos em cada grupo
avaliado após desafio com cercárias. Camundongos imunizados com SmATPDase1 mostraram a
maior redução de carga parasitaria (~ 20 %), com respeito ao grupo naive (cont.neg).
82
4. 15. 2 - Ensaio de proteção usando SmATPDase1 como Vacina de DNA
Foi realizado um ensaio de proteção usando a forma de vacina de DNA, na
qual o cDNA que codifica para a enzima completa foi inoculado, usando-se um
protocolo de imunização similar ao usado com a proteína recombinante isolada. Foi
observada uma proteção de 18% (figura 39) a qual é baixa em termos de proteção,
entretanto estes valores analisados com o teste-t mostram significância estatística
(tabela 6). Neste ensaio somente foram aplicadas duas doses, sendo necessário
avaliar três doses e uma maior concentração de DNA.
.
0
20
40
60
80
100
120
140
160
Naive Apirase
Worm burden / Mice
media % de prot teste-t desvio padrão
Naive 114 137 138 108 107 101 100 115 16.06238
Apirase 89 98 93 106 62 91 107 84 109 106 95 82 18 0.014531 0.049046 14.35464
Figura 39. Ensaio preliminar de proteção usando vacina de DN
A
. O resultado mostra a
contagem de parasitas recuperados de camundongos desafiados com cercárias após duas doses
de transfeção com o vetor de expressão contendo o gene
SmATPDase1 (Apirase), comparado com
a contagem de parasitas em camundongos controle transfectados com o vetor sem o gene (naive).
Tabela 6. Ensaio de proteção usando vacina de DN
A
.
83
4. 15. 3 - Avaliação da resposta humoral em animais imunizados com a vacina
de DNA SmATPDase1/pTARGET
Os soros dos animais imunizados com a vacina de DNA contendo o antígeno
SmATPDase1 foram analisados por ELISA; mas como não foi possível detectar
produção de anticorpos (IgG total) (dados não apresentados), decidimos investigar o
envolvimento do baço na resposta celular nestes animais, como mostrado a seguir.
4. 15. 4 - Avaliação da resposta celular em animais imunizados com
SmATPDase1/ pTARGET (ELISPOT).
O ensaio de Imunospot com uma enzima conjugada (ELISPOT) é uma
técnica utilizada para detectar e analisar in vitro células individuais que secretam
substâncias como citocinas. Medindo a freqüência de linfócitos que secretam uma
dada citocina frente a um determinado estímulo, e comparando-se com os
respectivos controles, podemos inferir o tipo de resposta imune instruída por estes
linfócitos. Grupos de quatro camundongos C57BL/6 foram imunizados com a vacina
de DNA SmATPDase1/pTARGET ou com o vetor vazio (controle negativo) (3 doses
de 50 µg com intervalos de 15 dias).
Após 21 dias, os animais foram sacrificados e os esplenócitos separados. A
capacidade dos linfócitos produzirem as citosinas IFN-γ e IL-4 foi analisada por
ELISPOT nas seguintes condições: sem estímulo ou estimulados com 5 µg/ml ou 15
µg/ml de proteína recombinante SmATPDase1. Após 20 horas de incubação das
células com estímulo procedeu-se ao processamento da placa e a análise do
número de células (“spots”) secretando as citocinas para cada tratamento (figuras
40-42).
84
**
0
50
100
150
200
250
Estímulo 5 ug de
Proteína Apirase
Estímulo 15 ug de
Proteína Apirase
Número de "spots" / 5X10
5
células
Vetor Vazio Vacina de DNA Apirase
Vetor Vazio
Vetor Vazio
Vacina de DNA Apirase
Vacina de DNA Apirase
10
5
5x10
5
5x10
5
Número de células por poço
Esplenócitos estimulados
com
p
roteína A
p
irase
5ug
15 ug 15 ug
Figura 41
–
Efeito da concentração de proteína recombinante no ELISPOT dos animais
imunizados com a vacina de DNA.
Foram testadas duas concentrações de proteína nos ensaios in
vitro, mostrando que 5 ug são suficientes para estimular a resposta de secreção de IFN-gama
(aparecimento de “spots”) nas células do baço isoladas dos animais transfectados com vacina de DNA
de Apirase (barras escuras), comparadas com o controle (barras claras).
Figura 40
–
ELISPOT dos animais imunizados com a vacina de DNA. Neste ensaio foi medida a
capacidade dos esplenócitos (Linfócitos do baço) de secretar a citocina IFN-gama, a qual é um
marcador de resposta celular.
85
Os resultados obtidos mostram que os esplenócitos dos animais imunizados
com a vacina de DNA pTARGET-SmATPDase1 apresentam uma quantidade de
linfócitos que secretam a citocina IFN-gama cinco vezes superior aos animais
imunizados com o vetor vazio, após o estímulo com a proteína recombinante
SmATPDAse1 (Apirase).
Com relação ao número de linfócitos que secretam a citocina IL-4, não
observamos diferença entre os animais imunizados com a vacina de DNA-
SmATPDase1 e o grupo imunizado com o vetor vazio (controle negativo) (dados não
apresentados). A capacidade de secretar IFN-gama pelos linfócitos dos animais
imunizados com a vacina de DNA, quando estes são estimulados in vitro com a
proteína recombinante, sugere a indução de uma resposta imune celular nestes
animais.
Em função dos resultados positivos com a vacina de DNA e de posse da
proteína recombinante purificada a partir de E. coli, realizamos vários ensaios
visando testar o efeito protetor da proteína SmATPDase1. Apesar de não termos
0
50
100
150
200
250
IFN-gama Apirase "spots" / 5X10
5
células
Vetor Vazio
Vacina de DN
A
Figura 42
–
Determinação do número de células produtoras de IFN- , a partir da cultura de
esplenócitos de camundongos imunizados com a vacina de DNA.
Grupos de camundongos
foram imunizados com vetor recombinante pTARGET-Apirase e Vetor Vazio, após estimulo com
apirase (5
µg/ml) no ensaio de ELISPOT. Os baços foram extraídos após 21 dias da última dose. (**)
diferença estatística significativa (
p < 0,00001) em relação ao vetor vazio, (⊥) desvio padrão.
86
observado diferenças estatísticas significativas na redução da carga parasitária
entre os grupos testados, investigamos a possibilidade de que o tipo de resposta
imune que foi induzido pudesse estar correlacionado com os níveis de proteção
observados. Isto porque sabemos que em humanos e camundongos existem quatro
subclasses de anticorpos IgG (IgG1, IgG2a, IgG2b e IgG3), os quais possuem
diferentes funções efetoras. Para avaliar a possível correlação, representamos em
um gráfico a porcentagem de redução da carga parasitária observada, em função da
razão das subclasses IgG1/IgG2a, que indiretamente é um indicativo do tipo de
resposta imune Th1 ou Th2 induzida (figura 43). Com isto observamos que a
redução da carga parasitária foi maior no pólo Th2.
A razão das subclasses de anticorpos IgG1/IgG2a é apenas uma medida
indicativa do tipo de resposta imune induzida pelo antígeno nas diferentes
formulações. Uma maneira mais direta de caracterizar este tipo de resposta é
através da dosagem de diferentes citocinas secretadas pelos linfócitos T destes
animais, in vitro, frente ao estímulo com o antígeno. Para tanto, grupos de três
0,5
1
2
4
0
5
10
15
20
25
Razão IgG1/IgG2a - "Polarização da resposta imune"
% de redução da carga
parasitária
Th1 Th1/Th2 Th2 +Th2
Figura 43
–
Gráfico de correlação entre a porcentagem de redução da carga parasitária em
função da polarização da resposta imune obtida. Os valores numéricos mostrados próximo aos
pontos se referem às razões entre os isotipos IgG1 /IgG2a.
87
camundongos C57BL/6 foram imunizados com a proteína SmATPDase1 formulada
em hidróxido de alumínio (pólo Th2) ou formulada com oligos CpG (resposta mista
Th1/Th2) (3 doses subcutâneas de 30 µg da proteína SmATPDase1, administradas
em intervalos de 15 dias), ou ainda com a vacina de DNA pTARGET-SmATPDas1
(pólo Th1) (3 doses de 50 µg com intervalos de 15 dias). Após 21 dias da última
dose, os animais foram sacrificados e os esplenócitos separados. A capacidade dos
linfócitos produzirem as citocinas IFN-γ e IL-4 foram analisadas por (ELISPOT) nas
seguintes condições: sem estímulo e estimulados com 5 µg/mL de proteína
SmATPDase1 (figura 44).
Os resultados apresentados na figura 44 confirmam que foi possível modular
o tipo de resposta imune induzida com o uso de adjuvantes. Os animais imunizados
com a vacina de DNA pTARGET-SmATPDase1 apresentam linfócitos-T que
secretam majoritariamente IFN-γ e muito pouco IL-4, o que poderia explicar o fato de
não termos observado a formação de anticorpos anti-SmATPDase1 com esta
vacina. Já os animais que receberam a proteína formulada com hidróxido de
alumínio apresentam não só um número maior de células-T secretoras de IL-4 em
0
5
10
15
20
25
Vacina de DNA Apirase Proteína Apirase CpG Proteína Apirase Alum
% de redução da carga
parasitária
0
25
50
75
100
125
150
175
200
225
250
Apirase "spots" / 5 x 10
5
células
IL-4 INF-gama % de Redução da Carga Parasitária
Figura 44– Gráfico de correlação entre a porcentagem de redução da carga parasitária e o
número de células secretoras das citocinas IL-4 e IFN-γ determinadas pelo ensaio de ELISPOT.
88
relação aos demais grupos, mas também uma proporção entre células-T que
secretam IL-4 e IFN-γ mais favorável a uma resposta Th2. Este resultado é
correlacionado com a razão 4 observada entre os isotipos IgG1/IgG2a.
Para o grupo de animais imunizados com a proteína formulada com
oligonucleotídeos CpG, observamos uma proporção inversa entre as quantidades de
células secretando as citocinas IL-4 e INF-γ, com um predominância desta última
citocina, o que é indicativo de uma resposta Th1, mas ainda com um componente
Th2 significativo.Quando comparamos porcentagem de redução da carga parasitária
com o número de células secretoras de IL-4 e IFN-γ, podemos observar que os
grupos mais protetores estão nos pólos da resposta imune Th1 ou Th2 (figura 44).
Cabe ressaltar que, apesar dos valores de redução de carga parasitária nos pólos
Th1 e Th2 serem semelhantes, 18% e 22%, respectivamente, somente para a
vacina de DNA esta redução foi significativa, onde esta polarização mostrou-se mais
acentuada.
4. 16 - Ensaio de inibição de penetração pela pele
Para verificar se os anticorpos produzidos contra a proteína SmATPDase1
recombinante teriam algum efeito sobre a penetração do parasita através da pele,
realizamos um ensaio adaptado (Williamson et al. 2003) como descrito em Materiais
e Métodos. Observamos uma significativa inibição da penetração de cercárias pré-
tratadas com anticorpos anti-SmATPDase1 na pele de camundongos, quando
comparado com cercárias pré-tratadas com soro de animais controle (naive) ou pré-
tratadas apenas com água (figura 45).
89
Figura 45
–
Inibição da penetração de cercárias pela pele de camundongos, mediada pelo
anti-soro anti-SmATPDase1
. Para estes ensaios, 100 cercárias de S. mansoni foram incubadas
com os anti-soros (Naive ou Apirase) ou água e depois diluídas em água e deixadas para
penetrar a pele de camundongos anestesiados. O número médio de parasitas que não
penetraram foi tomado como uma medida de inibição da penetração. * Estatisticamente diferente
da Água; ** estatisticamente diferente do soro naive (
p < 0,04), (⊥) desvio padrão.
0,0
5,0
10,0
15,0
20,0
25,0
30,0
35,0
40,0
Agua Soro naive Soro Anti-Apirase
Média do número de cercárias que não
penetraram
*
**
*
90
5. DISCUSSÃO
ATPDases ou ATP-difosfohidrolases são enzimas que clivam ATP e ADP até
AMP e Pi, e estão envolvidas nos humanos, entre outras funções, na inibição da
agregação plaquetária. No parasita Schistosoma mansoni nosso grupo identificou a
enzima (Vasconcelos et al. 1993; Vasconcelos et al. 1996), clonou o gene
ATPDase1 e localizou a proteína na superfície do tegumento (DeMarco et al. 2003),
gerando o interêsse de sua purificação e caracterização cinética. A abundância da
proteína SmATPDase1 parece ser bastante baixa, o que pode ser avaliado pela
dificuldade de detectá-la por western blot em um extrato total de S. mansoni e pela
dificuldade em purificá-la parcialmente, diretamente do parasita (Vasconcelos et al.
1996). Isto gerou o interêsse de obter a proteína SmATPDase1 purificada, obtida por
expressão heteróloga.
Para a expressão heteróloga da enzima SmATPDase1 do parasita
Schistosoma mansoni cataliticamente ativa e funcional testamos diversos
hospedeiros procarióticos sem sucesso, mas obtivemos sucesso com o sistema de
expressão eucariótico Pichia pastoris (Cregg et al. 2000) que já havia sido usado
para secretar proteínas recombinantes no meio de cultura, simplificando o processo
de purificação. Durante nosso trabalho constatamos que não foi possível atingir esse
objetivo inicialmente usando o sistema de expressão procarionte E. coli (BL21(DE3),
Origami (DE3) ou C41(DE3)) para a produção destas enzimas de forma solúvel e
com atividade enzimática. Foram experimentadas muitas metodologias de re-
enovelamento descritas na literatura para recuperar, a partir dos corpos de inclusão,
uma proteína solúvel e com atividade enzimática. Entretanto, por esta via não foi
possível obter a enzima funcional. Uma das razões que dificultam à bactéria produzir
esta enzima de forma solúvel é provavelmente o número de cisteínas (8 para o
91
domínio hidrofílico da isoforma 1, e 6 para o da isoforma 2). Sabe-se que usando os
hospedeiros Pichia pastoris ou Saccharomyces cerevisiae é possível produzir muitas
proteínas recombinantes na sua forma nativa com sucesso, devido ao auxílio de
chaperonas tal como a PDI (cataliza a formação de pontes dissulfeto) e ao processo
de glicosilação que ajuda a estabilizar a proteína.
Recentemente, nosso grupo clonou o gene da ATPDase2 usando
informações do banco de dados de ESTs de Schistosoma (Verjovski-Almeida et al.
2003), e conseguimos imunolocalizar esta também no tegumento (Levano-Garcia et
al. 2007). SmATPDase2 foi encontrada nas membranas basal e apical do tegumento
junto à SmATPDase1, entretanto SmATPDase2 somente foi localizada no sincício
do tegumento. A presença de ambas as enzimas na superfície do tegumento sugeriu
um maior envolvimento desta família de enzimas na regulação de abundância de
nucleotídeos extracelulares. SmATPDase2 contem os mesmos domínios funcionais
conservados (ACR), porém, esta segunda isoforma é diferente da primeira isoforma,
por que é secretada para o meio externo do parasita, como já demonstrado (Levano-
Garcia et al. 2007). Devido à provável importância destas enzimas anticoagulantes
para o parasita, é de grande interesse biológico e biotecnológico caracterizar estas
enzimas de forma isolada. Como mencionamos anteriormente, a caracterização da
atividade apirásica de proteínas do tegumento do parasita havia sido parcial, e
somente demonstrada essa atividade para a enzima SmATPDase1.
Com o sistema eucariótico de expressão em P. pastoris, inicialmente nós
conseguimos gerar clones multicópias para a expressão e secreção da enzima
SmATPDase1. Assim, identificamos o clone SmATPDase1(16)/pPIC9K o qual é um
92
transformante com 7-12 cópias do vetor de expressão inserido dentro do seu DNA
genômico, como estimado pela resistência apresentada ao antibiótico G418 sulfato
na faixa de concentração de 4 mg/ml. Este clone tem secretado continuamente a
enzima recombinante no meio de cultura, obtendo-se um rendimento moderado de
~1,6 mg de proteína purificada a partir de uma cultura de 700 ml. Recentemente
nós conseguimos gerar um clone (SmATPDase2(9)/ pPIC9K) que expressa a
enzima SmATPDase2, sendo que este tem a capacidade de secretar mais enzima
recombinante que o clone secretando a primeira isoforma; no ensaio de expressão
com uma cultura de 700 ml foi obtido ~2,9 mg de proteína purificada com Ni-NTA.
Uma mudança nas condições de cultura foi feita com o uso do EDTA como
aditivo, onde a concentração final de 10 mM no meio diminuiu a degradação das
proteínas recombinantes causada pelas proteinases secretadas pelas leveduras no
meio de cultura (ver figura 13B-C). O efeito deste aditivo foi claramente visível após
cromatografia de afinidade, onde foi possível visualizar uma banda com muito pouca
degradação (lane E1, figura 13C), diferente das proteínas recombinantes obtidas a
partir de um meio de cultivo sem a presença do EDTA em tal concentração (Lane
E1, figura 13A). É muito possível que no cultivo de P. pastoris com EDTA (10 mM)
outras proteínas de menor peso molecular (abaixo de ~40kDa) não sejam
degradadas por causa do agente quelante, por isso foram observadas proteínas de
menor peso (abaixo de 30 kDa) somente nesta condição no gel SDS-PAGE. A
adição de EDTA foi baseada no trabalho com o hormônio recombinante hPTH, onde
a secreção de proteína recombinante não degradada em P. pastoris aumentou
quando adicionado EDTA na cultura, sugerindo que as metalopeptidases
extracelulares ou associadas à parede foram as responsáveis pela instabilidade do
hormônio recombinante hPTH (Vad et al. 2005).
93
As análises de glicosilação mostraram que ambas as SmATPDases
recombinantes estavam N-glicosiladas, em concordancia com o que tinha se predito.
Assim, ambas as proteínas não tratadas com deglicosilases mostraram ter um peso
molecular similar de ~ 55 kDa no gel SDS-PAGE, e após deglicosilação ambas as
proteínas mostraram ter pesos moleculares similares de ~ 47 kDa. Sendo que as
predições dos pesos moleculares in silico baseadas nas sequências primárias de
aminoácidos indicavam que estas teriam ~52 kDa (SmATPDase1) e ~54 kDa
(SmATPDase2), sugere-se que possívelmente haja uma pequena migração
anômala. Estes mesmos pesos moleculares foram observados nas SmATPDases
recombinantes produzidas em E. coli (figuras 7A-D e 10B). Este cDNAs codificam as
enzimas recombinantes nas regiões S
66
a Q
507
(SmATPDase1) e N
83
a K
564
(SmATPDase2).
Recentes publicações mostraram que a super-expressão de proteínas como
Kar2p, Sec63, YDJ1p, Ssa1p e PDI (proteína dissulfeto isomerase) aumentaram a
secreção de proteínas recombinantes usando P. pastoris (Zhang et al. 2006). Novos
estudos sugerem que a super-expressão de uma proteína exógena em P. pastoris
pode resultar em proteínas com “folding” errado (não nativa) sobrecarregando o
sistema do hospedeiro. Assim uma acumulação de proteínas com o “folding” errado
no retículo endoplásmico poderia explicar baixos níveis de expressão (Rapoport et
al. 1996). Recentemente foi demonstrado que o uso da chaperona PDI aumentou a
secreção de proteína exógena em P. pastoris (Inan et al. 2006; Zhang et al. 2006).
Sabe-se que esta proteína PDI catalisa as reações de formação de pontes disulfeto
e rearranja aquelas mal feitas.
Os dados da literatura citados acima nos sugeriram que uma co-
transformação dos clones multicópias produtores de apirases recombinantes com
94
um vetor expressando a PDI potencialmente poderia incrementar a sua capacidade
de secreção das proteínas recombinantes. Baseado nisso, realizamos o teste de
co-expressão do clone P. pastoris SmATPDase1(16)/pPIC9K contendo o vetor de
expressão episomal PDI/pICHOLI-1, ambos induzidos pelo metanol. Os resultados
não mostraram uma melhoria da secreção de SmATPDase1 ao meio.
As estruturas secundárias de ambas as ATPDases de S. mansoni
expressadas na levedura Pichia pastoris foram elucidadas pelo dicroísmo circular.
Com isto, foi vista uma pequena diferença na estrutura secundária entre ambas as
enzimas, baseada na porcentagem de alfa hélice e folha beta. Verificamos que
SmATPDase 1 apresentou alfa hélice: 7%, folha beta: 45%, randômica: 48%,
enquanto SmATPDase2 mostrou ter alfa hélice: 14%, folha beta: 33%, randômica:
53%. A SmATPDase2, segundo alinhamento de aminoácidos, é mais similar às
proteínas CD39L2 e CD39L4 humanas, mas observa-se que a CD39L2 humana
(NTPDase6) possui a seguinte estrutura secundária: alfa hélice: 33%, folha beta:
18% e randômica: 49% (Ivanenkov et al. 2003), ou seja, um conteúdo bastante
distinto daquele da SmATPDase2.
Realizamos um ensaio de “cross-linking” com as duas SmATPDases usando
glutaraldeido, o qual estabiliza conformações diméricas, triméricas e oligoméricas.
Os resultados mostraram que estas enzimas na ausência do agente redutor (DTT)
formaram dímeros em maior abundância que monômeros, e na presença do DTT
formaram-se dímeros em baixa abundância (figura 24) o que sugere que as
conformações diméricas estariam se formando ou se estabilizando através de
pontes entre cisteínas livres. As SmATPDases 1 e 2 apresentam 9 e 10 cisteínas,
respectivamente, em suas sequências primárias completas, das quais 4 estariam
95
formando duas pontes dissulfeto, hipótese que está sustentada no alinhamento de
várias seqüências de aminoácidos de NTPDases nas quais estão conservadas 4
cisteínas. Com isto, sugere-se que a SmATPDase2, que é secretada, estaria no
meio extracelular na conformação dimérica mais que como monômero.
As apirases recombinantes de Schistosoma mansoni mostraram uma alta
atividade sobre os nucleotídeos UDP e UTP, o que sugere que reduziriam a
resposta imune via degradação destes nucleotídeos sinalizadores. As SmATPDases
1 e 2 de forma similar às NTPDases2 tiveram maior atividade ATPásica que
ADPásica (Wang et al. 2005), entretanto estas apirases de S. mansoni mostraram
maior atividade UTPásica que ATPásica, o que nas outras NTPDases2 não foi
observado, já que os níveis de atividade ATPásica estão acima dos níveis de
hidrólise de outros nucleosídeos difosfatados e trifosfatados. Estas características
enzimáticas de preferência pelo UTP observadas são compartilhadas com a E-
NTPDase 8 humana, a qual mostrou uma maior atividade sobre o UTP em presença
de cálcio mais que com o magnésio (Knowles e Li 2006). Curiosamente a atividade
ATPásica da E-NTPDase 8 (menor que UTPásica) mostrou ser maior na presença
de Magnésio que com cálcio (3,55 +
0,23 e 2,89 + 0,09 umol/mg/min
respectivamente). Nos ensaios enzimáticos a SmATPDase1 mostrou ter maior
atividade ATPásica na presença de cálcio, e a SmATPDase2 na presença de
magnésio ou manganês. As atividades NTPásicas entre ambas as SmATPDases
recombinantes foram similares, com o mesmo perfil de preferência pelos substratos.
As atividades NDPásicas entre estas apresentaram algumas diferenças na
preferência pelos substratos testados, mas em ambos os casos a maior atividade
observada foi com IDP e UDP; esta mesma preferência pelo nucleosídeos
96
difosfatados foi observada em CD39L4 (NTPDase5) (Murphy-Piedmonte et al.
2005). Como esperado, SmATPDase1 mostrou maior atividade na presença de
cálcio que de magnésio, sendo que outros cátions divalentes também serviram
como cofatores na seguinte ordem de preferência Ca > Mn > Hg> Co> MG > Zn. No
caso de SmATPDase 2 foi observado que esta enzima teve maior atividade na
ausência de cofator, por que na presença deste sua atividade enzimática foi
reduzida; entretanto comparando as atividades na presença dos vários cátions, esta
teve maior preferência pelo magnésio e manganes. A preferência pelos cátions foi a
seguinte Mg > Mn > Co > Ca > Zn > Hg. Adicionalmente foi observado que as
apirases recombinantes mostravam maior velocidade de hidrólise dos nucleotídeos
nos pHs alcalinos (figura 20 A-B).
Nucleotídeos têm um papel importante não somente dentro da célula, mas
também no meio extracelular, por que estes podem ser liberados através de
diferentes mecanismos. Nucleotídeos extracelulares têm efeito estimulante sobre
duas subfamílias de receptores de membrana plasmática, chamados receptores P2:
os metabotrópicos P2Y acoplados à proteína G e os ionotrópicos P2X canais iônicos
(Dubyak e el-Moatassim 1993; Di Virgilio et al. 2001). O ATP liga-se a ambas as
subfamílias de receptores com alta afinidade, enquanto ADP ativa P2Y
1
e P2Y
12
,
UTP primariamente interage com P2Y
2
e P2Y
4
, e UDP liga-se ao subtipo P2Y
6
(von
Kugelgen e Wetter 2000). Sabe-se que o UDP induz a secreção de IL-8 de
eosinófilos humanos o qual é um importante fator quimiostático e um mediador
central em inflamação, estimulando resposta celular em outras células (Mukaida
2000; Baggiolini 2001). Interessantemente foi encontrada na apirase do parasita
trematodo Trichinella spiralis uma elevada atividade UDPásica (Gounaris 2002).
Estas características descritas podem indicar que as NTPDases podem interferir
97
com a sinalização por receptores P2, o que se somaria à característica principal
deste tipo de enzima, que seria a inibição da agregação plaquetária devido à
atividade ADPásica que ambas as SmATPDases apresentam (Atkinson et al. 2006).
Sabe-se que durante a infecção de humanos com S. mansoni, os parasitas
interferem com a resposta imune (Carvalho et al. 2006; Pearce et al. 2006),
dependendo da carga parasitária e da fase da infecção: a infecção aguda aumenta a
resposta alérgica do hospedeiro, enquanto a infecção crônica diminui esta resposta
(Carvalho et al. 2006). É possível que as SmATPDases tenham um papel modulador
da resposta imune do hospedeiro mediada pelo parasita, ao interferir com a
concentração dos nucleotídeos sinalizadores de receptores purinérgicos.
Finalmente, nosso trabalho gerou a possibilidade de ser testada a
cristalização da proteína SmATPDase, ao mostrarmos que foi possível obter vários
miligramas de SmATPDase1 e SmATPDase2 purificadas solúveis, estáveis e com
atividade catalítica, usando-se a expressão heteróloga em P. pastoris. Devido ao
potencial de uso das NTPDases como alvo para tratamento de infarte do miocárdio,
existe um imenso interesse em se conhecer o padrão de folding desta família de
nucleotidases, para a qual até hoje não se obteve a cristalização e a estrutura com
resolução atômica para nenhum membro da família, em nenhuma espécie. A
estrutura com resolução atômica de um membro da família de apirases chamada
SCAN (Soluble Calcium Activated Nucleotidase) já foi obtida (Dai et al. 2004; Yang
et al. 2006), porém esta família é totalmente diversa, já que não possui nenhum dos
5 domínios conservados da família das NTPDases, e na realidade não possui
nenhuma similaridade de sequência primária com as NTPDases. Sabe-se que as
NTPDases estão envolvidas na proteção à injúria causada por isquemia e
reperfusão no intestino (Guckelberger et al. 2004), em rim (Grenz et al. 2007) e no
98
coração (Kohler et al. 2007), e recentemente foi mostrado que existe indução da
transcrição do gene e da proteína NTPDase 1 (CD 39) no endotélio e nos miócitos,
em modelo animal de isquemia miocárdica durante o precondicionamento in situ
(Kohler et al. 2007). Conhecer os detalhes atômicos da estrutura molecular das
NTPDases pode ajudar na identificação dos fatores responsáveis pelas diferenças
cinéticas e funcionais dos diversos membros da numerosa família das NTPDases de
mamíferos, e pode ajudar também na utilização desta enzima para tratamento de
isquemia, como recentemente proposto (Grenz et al. 2007; Kohler et al. 2007). Um
próximo passo de nosso grupo será tentar a cristalização dos domínios hidrofílicos
das SmATPDases 1 e 2, visando a possível utilização destes cristais para
desvendar a estrutura molecular com resolução atômica das NTPDases.
99
6. CONCLUSÕES
As ATP-difosfohidrolases ou NTPDases de Schistosoma mansoni foram
produzidas de forma recombinante com sucesso utilizando a levedura Pichia
pastoris como hospedeiro. Nós identificamos uma segunda isoforma de ATPDase e
conseguimos clonar e purificar a enzima com atividade. Purificamos em paralelo a
primeira isoforma, e caracterizamos ambas. Comprovamos que tanto SmATPDase1
quanto SmATPDase2 hidrolisam ATP e ADP, e adicionalmente foi observado que
estas tem uma maior velocidade de catálise sobre os nucleotídeos UTP, UDP e IDP,
o que sugere que as duas enzimas localizadas no tegumento possam interferir e
atenuar os processos de sinalização do sistema imune através da via de receptores
purinérgicos. Vários experimentos foram realizados para determinar a
imunogenicidade destas enzimas e o possível efeito protetor. Entretanto,
camundongos imunizados com as SmATPDases 1 e 2 não apresentaram uma
significativa proteção, já que só foi possível uma redução de até 20% na carga
parasitária em ensaios de desafio, quando usadas as SmATPDases recombinantes
como candidatos vacinais.
100
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