( PDF ) Avaliação de um teste in house de PCR-colorimétrico em placa para o diagnóstico de Tuberculose Pulmonar

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MARTHA GABRIELA CELLE RIVERO

Avaliação de um teste in house de PCR-colorimétrico em placa para

o diagnóstico de Tuberculose Pulmonar

Tese apresentada à Universidade Federal de São

Paulo - Escola Paulista de Medicina para obtenção

do Título de Doutor em Ciências.

São Paulo

2008

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MARTHA GABRIELA CELLE RIVERO

Avaliação de um teste in house de PCR-colorimétrico em placa para

o diagnóstico de Tuberculose Pulmonar

Tese apresentada à Universidade Federal de São

Paulo - Escola Paulista de Medicina para obtenção

do Título de Doutor em Ciências.

Orientador: Prof. Dr. Antonio Carlos Campos

Pignatari

Disciplina de Infectologia - Universidade Federal de

São Paulo - UNIFESP

Co-orientador: Prof

. Dr

. Sylvia Cardoso Leão

Disciplina de Microbiologia - Universidade Federal

de São Paulo - UNIFESP

Este trabalho foi realizado com auxílio financeiro

fornecido pelo Conselho Nacional para o

Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq).

São Paulo

2008

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iii

RIVERO, Martha Gabriela Celle

Avaliação de um teste in house de PCR-

colorimétrico em placa para

o diagnóstico de Tuberculose Pulmonar.

Martha Gabriela Celle

Rivero - São Paulo, 2008. xxiv, 116f.

Tese (Doutorado) -

Universidade Federal de São Paulo. Escola

Paulista de Medicina. Programa de Pós-graduação em Infectologia.

Título em inglês: Evaluation of microwell Colorimetric PCR in house

for pulmonar tuberculosis diagnosis.

Key-words: 1.Tuberculose Pulmonar, 2. PCR colorimétrico in house,

3.Mycobacterium tuberculosis.

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO PAULO

ESCOLA PAULISTA DE MEDICINA

DISCIPLINA DE INFECTOLOGIA

Chefe do Departamento:

Prof. Dr. Angelo Amato Vincenzo de Paola

Coordenador do curso de Pós-graduação:

Prof. Dr. Ricardo Sobhie Diaz

São Paulo

2008

MARTHA GABRIELA CELLE RIVERO

Avaliação de um teste in house de PCR-colorimétrico em placa para

o diagnóstico de Tuberculose Pulmonar

BANCA EXAMINADORA:

Titular: Prof. Dr. Antonio Carlos Campos Pignatari

Titular: Prof. Dr. Afranio Lineu Kritski

Titular: Dr

. Antonia Maria de Oliveira Machado

Titular: Prof. Dr. Eduardo Alexandrino Servolo de Medeiros

Titular:

Prof

. Dr

. Maria Lúcia Rossetti

Suplente: Prof. Dr. Katsumi Osiro

Suplente: Dr

. Lucilene Ferrazoli

Aprovada em: 10/06/2008

DEDICATÓRIA

À MEMÓRIA DOS MEUS PAIS MARIA MARTHA E DANIEL

AUGUSTO.

AO MEU ESPOSO ALBERTO, PELO APOIO,

COMPANHEIRISMO, INCENTIVO E, MAIS QUE NADA, PELO

AMOR.

AOS MEUS FILHOS ALBERT, TELMA, FABIOLA, RICARDO,

COMO ESTÍMULO NESSA LUTA CONSTANTE POR

ALCANÇAR NOSSOS SONHOS.

vii

AGRADECIMENTOS

viii

Ao Prof. Dr. ANTONIO CARLOS CAMPOS PIGNATARI, Professor Titular da

Disciplina de Infectologia, Orientador deste trabalho, pela confiança, pelos seus

ensinamentos, pelo estímulo........muito obrigada pelo carinho e preocupação

com seus alunos.

À Profa. Dr

. SYLVIA CARDOSO LEÃO, Professora Adjunta da Disciplina de

Microbiologia do Departamento de Microbiologia, Imunologia e Parasitologia,

Co-Orientadora deste trabalho; por ter-me acolhido no seu laboratório, apoiado

e colaborado com muita dedicação.

Às estagiárias Luciana Cirilo e Cristiana Glicetti, e a aluna de Mestrado

Fernanda Inoue do Laboratório Especial de Microbiologia Clínica (LEMC), pela

colaboração na fase da seleção das amostras.

Ana Paula Toledo da Silva e Luiza Reis responsáveis pelo setor de

micobactérias da seção de Microbiologia do Laboratório Central do Hospital

São Paulo, pelo apoio e ajuda na coleta dos resultados.

À Dr

. Dea Rosa Sperhacke, pelo treinamento técnico, amizade e preocupação

durante o desenvolvimento deste trabalho.

À Dr

Maria Lúcia Rossetti e todos seus colaboradores do Centro de

Desenvolvimento de Ciências e Tecnologia-CDCT, Fundação Estadual de

Produção e Pesquisa em Saúde-FEPPS/RS, Porto Alegre; em especial à

Candice Michelon, por ter-me recebido no seu laboratório para a realização do

PCR colorimétrico em placa.

À Rosana Capecce, secretária do LEMC/ALERTA, pela colaboração constante

nos detalhes administrativos e sobre tudo pela grande amizade.

À minha amiga, Mirian Silva do Carmo, aluna de pós-doutorado do

LEMC/ALERTA, pela revisão e ajuda na discussão deste trabalho.

A Rodrigo Cayô, querido amigo, sempre prestativo, pelo auxilio na formatação

do trabalho e por suas maravilhosas sugestões.

Aos meus colegas e amigos do laboratório LEMC/ALERTA, Dra. Ana Cristina

Gales, Dra. Soraya Sgambatti, Suzane Silvert, Andrea Pereira, Jussimara

Monteiro, Thaís Ávila, Fernanda Marques, Paulo Bispo, Pedro D`Azevedo

Liana Carballo, Itacy Siqueira, Anderson Fernandes, Adriana Nicoletti, Renata

Picão, Danilo Xavier, Maria Cecília Cergole Novella, Kelly Santiago, Eloísa

Campana, Alinne Guimarães, Loren Paschoal, Adryella Luz, Lorena Feldberg,

Raquel Girardello, Amilton Mouro, Paula Koga, Marco Zonta, Vinícius Gomes,

Bruna Teixeira, Paula Barbosa, Paula Perabo, Andréia Penteado, Juliana

Gugel, Juliana Bertoli, Roberto Chirotto, Kátia Kiyota, Jéssica Sanches, Jacira

Donizeti, Lilian D’Alamo.

À Renata Volpi, Agda do Carmo Vinagre, Mirella Carla Baretta, Ana Paula

Veschi e Roseli Sampaio, funcionárias do Laboratório de Microbiologia do

IDIPA, pelo carinho e amizade.

À Dr

. Antonia Maria de Oliveira Machado, chefe da seção de Microbiologia do

Laboratório Central do Hospital São Paulo, à Eliete A. Miranda, Fernando P.

Pinto, Thomas Chagas Neto, Clarice Matsumoto, Neide Ferreira Yonashiro,

Lisete L.M. Pires, Elza Maria Silva e Mara Paes, pelo apoio e amizade.

À Cristina Viana Niero e Michelle Rabelo, alunas de pós graduação da Dr

Sylvia C. Leão, pelo auxilio.

SUMÁRIO

ÍNDICE DE ABREVIATURAS E SIGLAS .........................................................xiv

ÍNDICE DE TABELAS.....................................................................................xvii

ÍNDICE DE FIGURAS .......................................................................................xx

RESUMO.........................................................................................................xxii

ABSTRACT.................................................................................................... xxiii

1. INTRODUÇÃO ...............................................................................................1

2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA........................................................................... 4

2.1. Epidemiologia......................................................................................... 5

2.2. Programa Nacional de Controle da Tuberculose - PNCT.....................10

2.3 - Diagnóstico ......................................................................................... 11

2.4 - Baciloscopia........................................................................................ 12

2.5 - Cultura................................................................................................. 14

2.6 - Testes Rápidos ................................................................................... 19

2.7 - Técnicas de Biologia Molecular........................................................... 19

3.OBJETIVOS.................................................................................................. 25

4. MATERIAL E MÉTODOS.............................................................................27

4.1 - Seleção de Pacientes.......................................................................... 28

4.1.1 - Critérios de Inclusão ..................................................................... 28

4.1.2 - Critérios de Exclusão .................................................................... 28

4.2 Parâmetros Clínicos e Epidemiológicos - Coleta de Dados .................. 28

4.3 - Coleta e Armazenamento do Material Biológico.................................. 29

4.4 - Baciloscopia e Cultura......................................................................... 29

xii

4.5 - Procedimentos Moleculares................................................................ 29

4.5.1 - Extração de DNA ........................................................................... 30

4.5.2 - Amplificação por PCR da região IS6110 de M. tuberculosis.......... 31

4.5.2.1 - Detecção dos Produtos Amplificados em Gel de Agarose.......32

4.5.2.2 - Detecção dos Produtos Amplificados por Colorimetria em Placa

Amino Link ................................................................................................33

4.6 - Análise Estatística dos Dados............................................................. 34

5. RESULTADOS............................................................................................. 35

5.1 - Análise Descritiva................................................................................ 36

5.2 - Análise Correlacional .......................................................................... 51

5.3 - Análise Inferencial............................................................................... 54

6. DISCUSSÃO ................................................................................................ 60

7. CONCLUSÕES ............................................................................................ 77

8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS............................................................. 79

9. ANEXOS ...................................................................................................... 99

Anexo 1. Protocolo Clínico........................................................................ 100

Anexo 2. Parecer do Comitê de Ética em Pesquisa – CEP/UNIFESP...... 101

Anexo 3. Protocolo e POP do Setor de Micobactérias da Seção de

Microbiologia do Laboratório Central do Hospital São Paulo – HSP.........102

10. APÊNDICES............................................................................................. 104

Apêndice 1. Grupo de pacientes com diagnóstico clínico de TBP sem

associação a outras doenças.................................................................... 105

Apêndice 2. Grupo de pacientes com diagnóstico clínico de TBP associado

a outras doenças ...................................................................................... 106

xiii

Apêndice 3. Grupo de pacientes com diagnóstico clínico de TBP associado

ao HIV....................................................................................................... 108

Apêndice 4. Grupo de pacientes com outros diagnósticos clínicos........... 110

xiv

ÍNDICE DE ABREVIATURAS E SIGLAS

AMT - Amplificação mediada por transcrição

ANP - Amostra Não Processada

BAAR - Bacilos Ácido-Álcool Resistentes

BCG - Bacilo Calmette-Guérin

EMB - Etambutol

CD4 - Linfócito TCD4

CDC - Center for Disease Control and Prevention

CDCT- FEPPS - Centro de Desenvolvimento Científico e Tecnológico-

Fundação de Pesquisa e Produção em Saúde

CNE - Controle Negativo de Extração

CNR - Controle Negativo de Reação

CPE - Controle Positivo de Extração

CPR - Controle Positivo de Reação

CVE - Centro de Vigilância Epidemiológica

DR - Direct Repeat

ELISA - Enzyme Linked Immune Assay

EtBr - Brometo de Etídio

EUA - Estados Unidos da América

FDA - Food and Drug Administration

FIND - Foundation for Innovantive New Diagnostic

HA - Hidroxilamina

HIV - Human Immunodeficiency Virus

HSP - Hospital São Paulo

INH - Isoniazida

IS - Insertion Sequence

LBA - Lavado Broncoalveolar

LJ - Löwenstein-Jenssen

MAC - Complexo Mycobacterium avium

MGIT - Mycobacteria Growth Indicator Tube System®

NASBA - Amplificação baseada na seqüência de ácidos nucléicos

ODM - Objetivos de Desenvolvimento do Milênio

OMS - Organização Mundial de Saúde

PCR - Polymerase Chain Reaction

PGRS - Polymorphic Guanine-Cytosine Rich Repetitive Sequence

PNB - Ácido р-nitrobenzóico

PNCT - Programa Nacional de Controle da Tuberculose

POP - Protocolo Operacional de Procedimentos

PZA - Pirazinamida

REDE-TB - Rede de Estudos em Tuberculose do Brasil

RFLP - Restriction Fragment Length Polymorphism

RIF - Rifampicina

SAME - Serviço de Arquivo Médico

SDA - Amplificação por transferência de fita

SIDA - síndrome de imunodeficiência adquirida

SM - Estreptomicina

ST - Solução Tampão

SVS - Serviço de Vigilância Sanitária

TBP - Tuberculose Pulmonar

xvi

TCH - Thiophene-2-Carboxylic Hydrazide

TE - Tampão Tris-EDTA

TMB - Tetrametilbenzidina

USA - United States of America

xvii

ÍNDICE DE TABELAS

Tabela I - Resultado da baciloscopia direta de acordo com o tipo de amostra ........

Tabela II - Resultado da PCR colorimétrica da ANP de acordo com o tipo

espécime clínico.........................................................................................................

Tabela III - Resultado do método baciloscopia do sedimento de acordo com o tipo

de amostra.................................................................................................................

Tabela IV - Resultado da PCR colorimétrica do sedimento de acordo com o tipo

de amostra.................................................................................................................

Tabela V - Resultado da cultura de acordo com o tipo de amostra..........................

Tabela VI -

istribuição do número de pacientes de acordo com o diagnóstico

clínico.........................................................................................................................

Tabela VII - Resultados de baciloscopia direta da amostra de acordo com o

diagnóstico clínico......................................................................................................

Tabela VIII - Resultado da PCR colorimétrica da ANP de acordo com o

diagnóstico clínico......................................................................................................

Tabela IX - Resultado da baciloscopia do sedimento de acordo com o diagnóstico

clínico.........................................................................................................................

Tabela X - Resultado da PCR colorimétrica do sedimento de acordo com o

diagnóstico clínico......................................................................................................

Tabela XI - Resultado da cultura para M. tuberculosis, de acordo com o

diagnóstico clínico .....................................................................................................

xviii

Tabela XII - Distribuição dos pacientes de acordo com o diagnóstico clínico,

considerando a ocorrência de tratamento prévio ou não...........................................

Tabela XIII - Resultado da baciloscopia direta de acordo com o diagnóstico

clínico, considerando tratamento prévio e sem tratamento.......................................

Tabela XIV - Resultado da PCR colorimétrica da ANP de acordo com o

diagnóstico clínico, considerando tratamento prévio e sem tratamento....................

Tabela XV - Resultado da baciloscopia do sedimento, de acordo com o

diagnóstico clínico, considerando ocorrência de tratamento prévio ou não.............

Tabela XVI - Resultado da PCR colorimétrica do sedimento de acordo com o

diagnóstico clínico, considerando tratamento prévio e sem tratamento....................

Tabela XVII - Resultado da cultura de acordo com o diagnóstico clínico,

considerando tratamento prévio e sem tratamento................................................... 49

Tabela XVIII - Resumo dos resultados das análises descritas.................................

Tabela XIX - Distribuição das amostras com relação às avaliações pelos métodos

de PCR colorimétrica e baciloscopia direta...............................................................

Tabela XX - Distribuição das amostras com relação às avaliações pela PCR

colorimétrica e baciloscopia do sedimento................................................................

Tabela XXI - Distribuição da amostra com relação às avaliações pelos métodos

de PCR colorimétrica da ANP e da cultura................................................................

Tabela XXII - Distribuição da amostra com relação às avaliações pelos métodos

de PCR colorimétrica do sedimento e da cultura.......................................................

xix

Tabela XXIII - Resultados do estudo de concordância entre a PCR colorimétrica

da ANP e os outros testes.........................................................................................

Tabela XXIV - Resultados do estudo de concordância entre a PCR colorimétrica

do sedimento e os outros testes................................................................................

Tabela XXV - Medidas de eficácia diagnóstica da PCR colorimétrica

da ANP em

relação à Cultura........................................................................................................

Tabela XXVI - Medidas de eficácia diagnóstica da PCR colorimétrica do

sedimento em relação à Cultura................................................................................

Tabela XXVII - Resultado do estudo de concordância entre os métodos utilizados

e o Diagnóstico Clínico de TBP.................................................................................

Tabela XXVIII - Medidas de eficácia diagnóstica dos métodos utilizados no estudo

em que a Prevalência TBP foi de 23,9% (35/146).....................................................

ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1 - Forma inalatória de transmissão da tuberculose em humanos...............

Figura 2 - Tendência a diminuir a incidência de TB em 9 regiões do mundo........

Figura 3 - Identificação de bacilos ácido-

álcool resistentes pela técnica de

coloração Ziehl-Neelsen............................................................................................

Figura 4 - Cultura de M. tuberculosis........................................................................

Figura 5 - Eletroforese em gel de agarose (1,5%)....................................................

Figura 6 - Resultados da detecção colorimétrica em placas de ELISA....................

Figura 7 - Nomograma de Fagan.............................................................................

xxi

xxii

RESUMO

As técnicas mais utilizadas no diagnóstico laboratorial de rotina para

tuberculose pulmonar (TBP) apresentam sensibilidade variável. Diversos testes

de amplificação de ácidos nucléicos têm sido propostos para o diagnóstico

rápido da tuberculose pulmonar em associação com a pesquisa de BAAR,

cultura e o diagnóstico clínico. Neste estudo avaliamos o desempenho de um

teste in house de PCR colorimétrico utilizando a seqüência IS6110 em

amostras de escarro, lavado brônquio alveolar e aspirado traqueal de 150

pacientes internados com suspeita clínica de TBP em um Hospital Geral

Universitário no período de março a dezembro de 2005. Foi realizada a PCR

colorimétrica em amostras não processadas (ANP) e em sedimentos. A

validade do teste foi estimada em comparação com a baciloscopia, cultura e

diagnóstico clínico de TBP. A sensibilidade do teste in house PCR colorimétrico

foi de 41,93% (ANP) e 48,38% (sedimento) e a especificidade de 98,21%

(ANP) e 97,67% (sedimento) em comparação com a cultura. O teste in house

PCR colorimétrico teve uma boa concordância, kappa = 0,6, em comparação

com a baciloscopia e kappa = 0,5 quando comparado à cultura. Com respeito

ao diagnóstico clínico a sensibilidade foi de 28,6% (ANP e sedimento) e a

especificidade de 98,2% (ANP) e 97,3% (sedimento) Os valores preditivos

positivo e negativo obtidos foram de 83,3% e 81,1% para ANP e de 76,9% e

81,2% para sedimento, respectivamente. O teste in house de PCR

colorimétrico apresentou baixa sensibilidade, mas demonstrou ser altamente

específico para o diagnóstico de TBP, além de apresentar boa concordância

com os demais métodos utilizados na rotina laboratorial em um Hospital Geral

Universitário para o diagnóstico de TBP. Em relação ao diagnóstico clínico

observamos alto valor preditivo (positivo e negativo) e alta probabilidade

positiva pós-teste.

xxiii

ABSTRACT

The techniques most widely used in the routine laboratory diagnosis of

pulmonary tuberculosis (PTB) show variable sensitivities. Various nucleic acids

amplification tests have been proposed for the rapid diagnosis of PTB in

association with the acid-fast bacillus staining, culture and clinical diagnosis.

We evaluated the performance of an in-house colorimetric PCR test using the

IS6110 sequence in samples of sputum, broncho-alveolar lavage and tracheal

aspirate from 150 patients with clinical suspicion of PTB admitted to a General

University Hospital in the period from March to December 2005. The

colorimetric PCR test was applied to non-processed samples (NPS) and to the

sediment. The validity of the test was estimated in comparison with culture and

clinical diagnosis of PTB. The sensitivity of the in house colorimetric PCR test

was 41.93% (NPS) and 48.38% (sediment) and specificity 98.21% (NPS) and

97.67% (sediment). The in house colorimetric PCR test had a good agreement,

kappa = 0.6, in comparison to the acid-fast staining and kappa = 0.5 when

compared to culture. Considering the clinical diagnosis, sensitivity was 28.6%

(NPS and sediment) and specificity 98.2% (NPS) and 97.3% (sediment). The

positive and negative predictive values were 83.3% and 81.1% for NPS and

76.9% and 81.2% for sediment, respectively. The in house colorimetric PCR

test showed low sensitivity, high specificity and good agreement compared with

acid-fast bacillus staining and culture used for diagnosis of PTB in a routine

microbiology laboratory at a General University Hospital The test also showed

high predictive values (positive and negative) and high positive post-test

probability when the clinical diagnosis was considered.

INTRODUÇÃO

1. INTRODUÇÃO

INTRODUÇÃO

A tuberculose é uma doença grave, mas o tratamento leva à cura, desde

que o diagnóstico seja feito com rapidez e os medicamentos sejam tomados

regularmente e de maneira adequada. O tratamento correto dos pacientes

bacilíferos é prioridade do programa de controle da doença, pois permite a

quebra da cadeia de transmissão (Ministério da Saúde, 1997).

O raciocínio diagnóstico da tuberculose pulmonar desenvolve-se a partir

do exame clínico, dos dados epidemiológicos e da interpretação dos resultados

de exames complementares. Uma forte suspeita clínica é a condição sine qua

non para qualquer tentativa de diagnóstico precoce da tuberculose (Schluger,

Kinney & Rom, 1994). Sintomas de tosse persistente, febre, dor torácica,

sudorese noturna, perda de peso, inapetência e hemoptise são todos

sugestivos, mas pouco específicos para a confirmação da tuberculose

pulmonar. Devemos estar atentos para os grupos de pacientes em que a

tuberculose é mais freqüente, que incluem pacientes infectados pelo Vírus da

Imunodeficiência Humana (HIV), idosos, etilistas, pessoas vivendo ou residindo

em locais onde a tuberculose é comum, contactantes de pessoas com

tuberculose em atividade, pacientes com neoplasia, diabetes mellitus ou

imunosuprimidos. A partir das informações obtidas com a anamnese do

paciente podemos estabelecer o diagnóstico clínico-epidemiológico, e caminhar

na investigação tentando sua confirmação (Wolinsky, 1994).

O exame microscópico para o diagnóstico da tuberculose pulmonar é um

componente essencial do Programa de Controle da Tuberculose; já a cultura é

necessária para a detecção das formas paucibacilares da tuberculose

pulmonar (pacientes imunodeprimidos ou crianças) e das formas

extrapulmonares. Mas ao utilizar a cultura são necessárias em torno de oito

INTRODUÇÃO

semanas para o fornecimento do resultado final ao paciente. A realização do

teste de sensibilidade às drogas ou a identificação das demais espécies do

gênero aumenta esse tempo em duas semanas, e no caso de espécimes

biológicos com baciloscopia negativa o tempo pode ser mais longo.

Diversos testes de amplificação e detecção de ácidos nucléicos de

bactérias do complexo M. tuberculosis têm sido propostos para o diagnóstico

rápido da tuberculose (alguns disponíveis comercialmente e outros in house). A

verificação da validade desses testes é efetuada em comparação com a cultura

e ou diagnóstico clínico do paciente.

O presente trabalho teve o intuito de avaliar o desempenho de um novo

teste in house de PCR colorimétrico quando aplicado em codições de rotina

laboratorial em um Hopital Geral Universitário, estimando a sua validade com

respeito ao diagnóstico clínico de tuberculose pulmonar.

REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

Historicamente a tuberculose constitui inusitado fenômeno de

interpenetração cultural com diversas formas da manifestação humana, por ter

vitimado cientistas, literatos, poetas, músicos, pintores e monarcas, interferindo

inclusive no curso político de países. Na época anterior à moderna

quimioterapia os tratamentos foram bizarros, danosos, bárbaros, românticos e

eróticos. O pneumotórax foi o primeiro tratamento racional. Nos sanatórios, os

dramas dos doentes, os internamentos por longos anos despersonalizavam os

pacientes, criando-se o denominado "Hominis Sanatorialis". Após a descoberta

do bacilo por Koch, criaram-se a histeria contra o escarro e ambiente propício

ao charlatanismo. Nas estâncias climatéricas, havia aspectos peculiares de

assimilação dos tísicos e paralelamente o desencadeamento de quadros

dantescos, de miséria dos doentes amontoados em verdadeiras mansardas.

Os tisiólogos dessa época foram heróis idealistas e humanitários,

ajudando os pacientes e lutando contra a doença praticamente de mãos vazias.

O apogeu da integração da tuberculose no romantismo, dos dramas e

dos lirismos de tuberculosos célebres ocorreu no século 19 e primeira metade

do século 20, contrastando com a imensa massa humana anônima dizimada

pelo Mycobacterium tuberculosis, cujos sofrimentos permaneceram ignorados

restando apenas frios números estatísticos (Rosemberg, 1999).

2.1. Epidemiologia

A tuberculose (TB) é uma das doenças mais antigas já descritas, sendo

que existem relatos de lesões tuberculosas observadas em esqueletos datados

de 2000 anos a.C. (Arriaza et al., 1995). Mycobacterium tuberculosis, o agente

REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

etiológico da tuberculose, foi isolado e cultivado em 1882, pelo médico alemão

Robert Koch e chamado desde então de bacilo de Koch.

Apesar de antiga, esta doença possui mecanismos imunopatogênicos

pouco conhecidos. Sabe-se que a bactéria é um patógeno intracelular

facultativo, que pode sobreviver e reproduzir-se dentro de células fagocitárias,

especialmente nos macrófagos. No trato respiratório, os microrganismos

inalados (Figura 1) são apreendidos no muco, transportados para a parte

posterior da orofaringe pela ação ciliar e, finalmente, eliminados na maioria dos

casos. No entanto, alguns microrganismos podem atingir os alvéolos e então

ser fagocitados por macrófagos locais.

Figura 1. Forma inalatória de transmissão da tuberculose em humanos

(Adaptado do Programa para Capacitación de Laboratórios, México 2000).

Cerca de 10% dos indivíduos infectados com tuberculose desenvolvem a

doença ativa ao longo da vida, o restante mantém o bacilo sob a forma latente

(Comstock, 1982; Kato-Maeda et al., 2001). Fatores como a baixa resistência

do hospedeiro, o grande número de bactérias, o grau de ativação dos

REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

macrófagos alveolares, e a presença de proteínas e glicolipídeos localizados

na parede bacteriana expressos pela micobactéria causam condições para a

doença progredir.

O bacilo da TB mata mais indivíduos que qualquer outro agente

infeccioso sozinho. Os óbitos representam 25% de toda a mortalidade evitável

nos países em desenvolvimento, onde se registram 95% dos casos e 98% dos

falecimentos causados pela doença. A maioria dos casos (75%) ocorre no

grupo etário economicamente produtivo (15-50 anos) e é a principal causa de

morte por infecção de mulheres jovens. Assim, fatores sociais como condições

precárias de alimentação, transporte, educação, moradia (por exemplo,

aglomerados populacionais), síndrome de imunodeficiência adquirida (SIDA),

movimentos migratórios, envelhecimento da população e a piora na qualidade

dos programas de controle de TB sob a coordenação dos gestores públicos

condicionam à maior predisposição para a infecção (WHO, 2002).

A taxa de mortalidade da tuberculose associada à SIDA é superior

àquela observada na tuberculose isoladamente, independente da contagem de

linfócitos CD4

(Whalen et al., 1995). Como conseqüência, temos pessoas com

infecção prolongada, sofrendo, morrendo e colocando em risco a população, os

profissionais da saúde e outros pacientes. Jones e colaboradores (1993)

descreveram uma relação entre o grau de imunodeficiência, avaliado pela

contagem de CD4

, e a apresentação clínica e radiológica da tuberculose. A

presença de tuberculose extrapulmonar foi mais freqüente nos pacientes com

contagem de CD4

menor que 100 células/mm

. Em geral, pacientes com

contagem de CD4

maior que 200 células/mm

apresentaram doença com

padrão da tuberculose “clássica” do adulto ou pós-primária, enquanto naqueles

REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

com contagem menor a apresentação foi “atípica” para adultos, ou típica da

doença primária, tal qual ocorre nos casos pediátricos.

Segundo a Organização Mundial de Saúde (OMS), estima-se que em

2006 houve 14,4 milhões de casos prevalentes de Tuberculose Pulmonar

(TBP) e 1,7 milhões de óbitos, sendo que 0,2 milhões correspondiam ao grupo

de pacientes infectados pelo HIV. Em 2007, 202 de 212 paises notificaram 5,1

milhões de casos novos, dos quais 2,5 milhões eram casos bacilíferos novos.

Do total, 83% dos casos foram diagnosticados nas regiões da África, Ásia Sul-

oriental e Pacífico Ocidental (WHO, 2008).

O Brasil ocupa o 16° lugar na lista dos 22 países onde se estima que

ocorram 80% dos casos de TB do mundo. Estima-se uma incidência de

60/100.000 hab/ano, dos quais são notificados apenas cerca de 90 mil casos,

em sua maioria em grandes centros urbanos. O coeficiente de mortalidade, em

2006, foi de 7,8/100.000 /hab/ano; o percentual de detecção de casos foi igual

a 67% e o de curas, 72% (Duarte, 2006). O Estado de São Paulo anualmente

notifica cerca de 21.000 casos, representando em números absolutos o maior

contingente de casos do Brasil. No entanto, o coeficiente de incidência de

casos do Estado situa-se próximo da média nacional de 44,1 por 100.000

habitantes em 2004. O coeficiente de incidência do Estado foi de 43,9 casos

por 100.000 hab/ano e o coeficiente de incidência de pacientes bacilíferos de

22,5 casos por 100.000 hab/ano (SVS, 2005). No Rio Grande do Sul observou-

se associação entre fatores de risco, apresentados por cerca de 40% dos

casos, e características demográficas e clínico-laboratoriais, obedecendo ao

padrão descrito para regiões em desenvolvimento (Mattos et al., 2006).

REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

O percentual de abandono do tratamento está em torno de 12% no País,

chegando, em algumas capitais, ao valor de 30 a 40%, o que demonstra

elevadas taxas de não aderência ao tratamento. A avaliação do perfil de

resistência aos medicamentos anti-TB é realizada em menos de 5% dos casos

diagnosticados. Os fatores limitantes para o controle efetivo da TB estão

relacionados à baixa efetividade de atuação dos serviços de saúde em

prevenção, diagnóstico, tratamento e a má qualidade dos mesmos. Somado a

isso, de um lado, há a ausência da sociedade civil como parceira no

monitoramento das ações governamentais, e de outro, a escassez de

conhecimentos básicos da biologia do bacilo e da relação parasito-hospedeiro,

que poderiam fornecer novos alvos de intervenção para o controle da TB, como

novas vacinas, novos fármacos e novos métodos diagnósticos.

A OMS espera que as taxas de prevalência e mortalidade por TB

publicadas em 1990 (Figura 2a) sejam reduzidas até o 2015 (Figura 2b), meta

que está incluída no ODM6 dos Objetivos de Desenvolvimento do Milênio

(ODM) como programa de controle à tuberculose (WHO, 2008).

REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

Figura 2. Tendência a diminuir a incidência de TB em 9 regiões do mundo*

(Stop TB Working Group, 2008). * Gráfico publicado por WHO, 2002.

2.2. Programa Nacional de Controle da Tuberculose - PNCT

Atualmente, a prevenção da TB é feita com a vacina BCG, que é a mais

utilizada entre todas as vacinas disponíveis. Entretanto, sua efetividade é

extremamente controversa por variar entre 0% e 80% e apresentar pouco

impacto nos indicadores epidemiológicos da TB nos adultos, em âmbito

mundial (SVS,2002). Torna-se imperioso, portanto, o desenvolvimento de

novas vacinas à luz da tecnologia pós-genoma.

O PNCT tem como propósito fundamental promover o controle da TB no

Brasil. Busca a interrupção da transmissão da doença e a conseqüente

diminuição dos riscos de adoecer e morrer por ela. Para isso, procura

identificar de maneira oportuna todos os doentes de TB, e principalmente os da

forma pulmonar bacilífera (principais transmissores da doença), garantindo seu

tratamento até o final.

REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

Toda a população brasileira tem direito ao diagnóstico e tratamento

gratuitos no Sistema Único de Saúde. A maioria dos casos ocorre em pacientes

do sexo masculino e em idade produtiva, prejudicando ainda mais as condições

de vida das famílias carentes, maiores vítimas da TB. A pobreza gera a

tuberculose, que gera mais pobreza

(http://portal.saude.gov.br/portal/svs/visualizar_texto.cfm?idtxt=21446).

2.3 - Diagnóstico

O diagnóstico clínico precoce da doença é bastante complicado,

sobretudo quando a TB está associada a outras enfermidades (infecção pelo

HIV, neoplasias malignas, pós-transplante, etc), quando então o diagnóstico

laboratorial é de extrema importância. Entre os métodos utilizados no

diagnóstico da TB podemos citar os métodos bacteriológicos (baciloscopia e

cultura; métodos de detecção do crescimento micobacteriano, automatizados

ou não); testes imunosorológicos; prova tuberculínica; métodos radiológicos e

métodos de biologia molecular (Katoch, 2004).

Nos pacientes em que há uma suspeita clínica de TB, o primeiro passo

na investigação deve ser uma combinação de exame radiográfico de tórax e

pesquisa de micobactérias no escarro. Apesar de algumas apresentações

radiológicas serem sugestivas de TB pós-primária (velamento nos segmentos

apicais e posteriores do lobo superior, com ou sem cavitações), as

manifestações radiológicas da TB são geralmente muito variadas, incluindo

cavitações, infiltrados alveolares, intersticiais, nodulação miliar e derrame

pleural. A apresentação radiológica da tuberculose pode variar mais ainda nos

pacientes infectados pelo HIV. Fraser e colaboradores (1991) descreveram 17

REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

padrões radiológicos possíveis para as doenças pulmonares. A tuberculose

pode manifestar-se radiologicamente, através de 12 desses padrões, o que dá

a idéia da pouca especificidade do exame radiológico convencional para

confirmação diagnóstica. O padrão radiológico da TBP, normalmente variável,

sofre a influência dos diferentes graus de imunodeficiência impostos pela co-

infecção do HIV e na TBP da criança (Brasil, 1995; Kritski et al., 2000).

Pitchenik & Rubinson (1985) em estudo comparativo e representativo de

pacientes com SIDA em fase avançada, mostraram que 60% destes tinham

adenopatia hiliar ou mediastinal, 29% apresentavam infiltrados localizados nos

terços médios e inferiores dos pulmões e 12% apresentaram exame radiológico

de tórax normal. No grupo de pacientes sem SIDA, a freqüência destes

achados foi de 3%, 3% e 0%, respectivamente. Além disso, enquanto 67% dos

pacientes sem SIDA apresentaram cavidades pulmonares, nenhum dos

pacientes com SIDA apresentou essa alteração. Somente 18% dos pacientes

com SIDA apresentaram velamento apical, comparados com 97% do grupo

sem SIDA.

O diagnóstico clínico definitivo e a identificação do microrganismo

causador da infecção a partir de amostras clínicas iniciam-se com a análise das

amostras de escarro para identificação de bacilos ácido-álcool resistentes

(BAAR) que apresenta sensibilidade em torno de 50% (Figura 3) (Chakravorty

et al., 2005).

2.4 - Baciloscopia

“O método bacteriológico é o recurso mais importante para o diagnóstico

e controle de tratamento da tuberculose, pois permite a detecção do agente

REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

etiológico por meio da baciloscopia e/ou da cultura” (Ministério da Saúde,

1994).

Figura 3. Identificação de bacilos ácido-álcool resistentes pela técnica de

coloração Ziehl-Neelsen (Adaptado do Programa para Capacitación de

Laboratórios, México 2000).

A baciloscopia fundamenta-se na propriedade conhecida como álcool-

ácido resistência. Por causa da grande quantidade de lipídeos na parede

celular das micobactérias, esta, após ser corada com carbolfucsina, não perde

a coloração sob a ação de álcool-ácido (Wayne & Kubica,1986).

Este exame é apenas presuntivo, pois permite a visualização dos BAAR

presente no espécime em quantidade igual ou superior a 10

bacilos/mL, mas

não a sua identificação. É efetuado nos esfregaços dos espécimes (direto ou

sedimento) em lâminas que depois de secos e fixados são corados pelos

métodos de Ziehl-Neelsen ou Kinyoun. Em alguns laboratórios, adota-se

também o método com Auramina-O. Quando são utilizados os dois primeiros

métodos, a leitura é realizada em microscópio óptico comum usando objetiva

de imersão. Quando os esfregaços são corados com Auramina-O, são

REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

examinados em microscópio de fluorescência com objetiva 40X (Martins,

2000).

A baciloscopia é considerada o exame básico para o diagnóstico da

tuberculose pulmonar, sendo indicada para pesquisa direta do bacilo no

escarro, por ser um método simples, de fácil implantação e de baixo custo. No

caso de outros tipos de espécimes, há necessidade de cautela ao avaliar

resultados de baciloscopia, pois micobactérias saprofíticas podem estar

presentes transitoriamente (Martins, 2000).

Na execução do exame bacteriológico, são importantes tanto a

qualidade como o transporte e conservação adequados do espécime, assim

como o uso de técnicas laboratoriais precisas. Diversos espécimes biológicos

podem ser analisados para detecção de M. tuberculosis e de outras espécies

de micobactérias e são divididos em:

a) originalmente não estéries (em razão da presença de flora bacteriana)

como escarro, lavado brônquico, lavado gástrico, secreções em geral,

fezes, urina, biópsias de pele;

b) originalmente estéreis como sangue, gânglio, secreção de gânglio,

biópsia de tecido interno e líquidos pleural, ascítico, sinovial,

cefalorraquidiano (Ministério da Saúde,1994).

2.5 - Cultura

Muitos métodos de cultura, seletivos ou não, estão disponíveis para

detecção e isolamento de micobactérias (Figura 4). Os meios não seletivos

podem ser caldos e meios sólidos com base de ovo ou com base de ágar

(Nolte & Metchock, 1995).

REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

Figura 4. Cultura de M. tuberculosis (Adaptado do Programa para Capacitación

de Laboratórios, México 2000).

Os caldos mais utilizados são o de Middlebrook 7H9 e Dubos Tween

albumina. Atualmente o meio líquido Middlebrook 7H9 é o mais utilizado nos

sistemas semi automatizados ou automatizados e é também utilizado no BBL

Mycobacteria Growth Indicator Tube System® (MGIT) (Becton-Dickinson)

(Hanna et al., 1999).

O meio sólido com base de ovo mais utilizado é o de Löwenstein-Jensen

(LJ); o de Petragnani tem uma concentração de verde malaquita maior que o

LJ, e é mais adequado para inoculação de amostras mais contaminadas. Os

meios com base de ágar são mais indicados para detecção precoce de

colônias microscópicas sendo possível detectá-las de 10-12 dias após a

semeadura (Nolte & Metchock, 1995; Mejia et al., 1999; Palomino & Portales,

2000).

Uma desvantagem dos meios com base de ágar em relação ao meio LJ

é a sua durabilidade, após seu preparo, que é no máximo de um mês sob

refrigeração. A exposição à luz poderá resultar em deterioração com produção

REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

de formaldeídos, que são tóxicos para as micobactérias (Miliner, Stottmeier &

Kubica, 1969).

O método radiométrico BACTEC TB 460 (Beckton Dickinson

Microbiology System) usa meio líquido contendo ácido palmítico marcado com

C (Bloom, 1994). O crescimento pode ser detectado em 7 a 15 dias pela

mensuração de

O método BACTEC-MGIT 960, comercializado pela

mesma empresa, não usa material radioativo e a detecção do crescimento é

feita utilizando fluorometria (Hanna et al., 1999; Somoskovi et al., 2003). Ambos

os métodos dependem de aparelhos importados e são de alto custo.

O isolamento da bactéria em cultura possibilita o uso de provas

bioquímicas para identificação das espécies de micobactérias e a realização de

testes de susceptibilidade in vitro para verificação da resistência da cepa de M.

tuberculosis aos tuberculostáticos A cultura requer de 4-6 semanas devido ao

crescimento lento das micobactérias. Dessa forma a determinação da

susceptibilidade às drogas requer de 3-6 semanas adicionais levando a atraso

na emissão do resultado final.

O International Working Group on Micobacterial Taxonomy (IWGMT) em

1974-1976, aceitou 11 testes altamente reprodutíveis para o uso em estudos

de sistemática do gênero Mycobacterium e também utilizados nos laboratórios

de Saúde Pública para identificação de espécies (Wayne et al., 1974; Wayne et

al.,1976). Os testes mínimos para identificação de micobactérias são:

crescimento a 25°C, 30°C, 33°C, 37°C, 42°C e 45°C, analise da presença de

pigmentação, resistência a isoniazida (INH) (2 e 20 µg/mL), hidrazida do ácido

tiofeno-2-carboxílico (TCH) (2 µg/mL), hidroxilamina (HA) (500 µg/mL), ácido р-

nitrobenzóico (PNB) (500 µg/mL, cloreto de sódio (ClNa) (5%), tiacetazona (20

REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

µg/ml), ácido pícrico (0,2%) e ácido oleico (250 µg/ml) teste de catalase,

hidrólise do Tween, urease, produção de niacina, redução de nitrato, fosfatase

ácida, arilsulfatase, pirazinamidase e atividade da esterease.

No Setor de Micobactérias do Instituto Adolfo Lutz as cepas recebidas

do Estado de São Paulo são submetidas aos testes de susceptibilidade e

identificação da espécie. Os aspectos macroscópicos e microscópicos da

cultura são considerados para direcionamento das cepas aos testes

adequados, por exemplo, uma cultura com colônias rugosas, acromógenas e

com bacilos formando cordas à microscopia é presuntiva de M. tuberculosis e,

portanto, o isolado é submetido a testes de susceptibilidade às drogas. São

utilizados PNB, TCH, INH, Rifampicina (RIF), Etambutol (EMB), Estreptomicina

(SM) e Pirazinamida (PZA). A espécie M. tuberculosis é susceptível ao PNB e

resistente ao TCH, e com exceção dos casos resistentes, apresenta

susceptibilidade a EMB, RIF, SM, PZA e INH.

As culturas resistentes a TCH e PNB são submetidas a testes para

identificação de micobactérias não tuberculosas (Chimara et al., 2008). Os

testes bioquímicos são feitos com as bactérias de cultivos frescos e as

condições de realização são importantes para que os resultados sejam

confiáveis e reprodutíveis, pois os mesmos variam de acordo com a

concentração do substrato, tempo de reação, composição do tampão,

comprimento de onda selecionado para detectar a reação, reagentes

colorimétricos, etc.

As técnicas são tradicionais e, portanto, já não se questiona o custo e

benefício de sua aplicação rotineira, porém existem algumas desvantagens. A

identificação requer a semeadura da micobactéria em diversos meios para

REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

provas de pigmentação e de crescimento em diversas temperaturas, para

pesquisa de susceptibilidade a determinadas drogas e para verificação da

utilização de substratos químicos. Para a interpretação do crescimento da

micobactéria em meios com drogas, é necessário um treinamento prolongado

e, mesmo assim, em alguns casos pode ser subjetiva. Vários testes para

identificação de uma espécie são necessários, o que dificulta a implantação da

técnica em laboratórios regionais. A realização dos testes baseados na

expressão de certas características bacterianas que podem ser variáveis

requer o crescimento abundante da micobactéria em cultura, o que leva em

torno de uma a quatro semanas. A leitura é feita depois de três semanas da

semeadura nos meios específicos, sendo, portanto, requerido um longo tempo

para obtenção do resultado (Martins, 2000).

Na última década, a utilização destes testes tem sido questionada, pois

no momento atual é importante a identificação rápida da espécie

micobacteriana para orientar o tratamento, e esses testes só fornecem a

identificação após três a oito semanas (Kusunoki et al., 1991; CDC, 1996;

Shikama et al., 1999).

Springer e colaboradores (1996) mencionaram que os métodos

fenotípicos não são capazes de separar espécies muito similares como as do

Complexo Micobacterium avium (MAC) que contém pelo menos quatro

espécies e é citado por Guerrero e colaboradores (1995) como a “zona

cinzenta” da taxonomia da micobactérias e por Kirschner & Böttger (1992)

como a “dor de cabeça” dos taxonomistas, porque obscurece a interpretação

de estudos médicos e veterinários de infecções causadas por M. avium.

REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

2.6 - Testes Rápidos

Testes imuno-sorológicos para detecção rápida de TB ativa têm sido

propostos, como hemaglutinação, fluorescência direta, radioimunoensaio e

ELISA, mas até o momento não se mostraram úteis do ponto de vista clínico

(Daniel et al., 1987; Alzahrani et al., 2000; Conde et al., 2000).

A prova tuberculínica é usada ainda hoje como método auxiliar no

diagnóstico da TB, mas, estima-se uma taxa de 25% de resultados falso-

negativos em pessoas com tuberculose ativa (Holden et al., 1971).

2.7 - Técnicas de Biologia Molecular

Os avanços técnico-científicos, nas últimas décadas, deram origem a

vários testes diagnósticos promissores. No entanto, houve muito pouco

progresso no entendimento de como operacionalizar tais técnicas em

condições de rotina nos Serviços de Saúde, bem como avaliar seu impacto em

termos de custo-efetividade no controle da TB de maneira global.

Partindo-se do pressuposto de que o genoma de qualquer organismo é o

que de mais específico existe para sua identificação, técnicas de biologia

molecular, especialmente as técnicas baseadas na amplificação de ácidos

nucléicos, passaram a ser utilizadas para o diagnóstico de diversas doenças,

inclusive para TB, com a vantagem de poderem oferecer o resultado em tempo

muito curto (algumas horas). Os métodos de diagnóstico de TB baseados em

amplificação de ácidos nucléicos são:

i) Reação em cadeia da polimerase (PCR)

ii) Amplificação mediada por transcrição (AMT)

iii) Amplificação baseada na seqüência de ácidos nucléicos (NASBA)

REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

iv) Amplificação por transferência de fita (SDA).

v) Amplificação Qβ replicase

O primeiro desafio para a utilização destas técnicas foi identificar

sequências de DNA que poderiam não só separar as micobactérias de outras

bactérias patogênicas, mas que pudessem distinguir entre espécies de

micobactérias. Muitos alvos do genoma das micobactérias foram identificados,

dentre eles podemos citar os genes que codificam as proteínas de 32 kDa

(Soini et al., 1992), 38 kDa (Miyazaki et al., 1993), 65 kDa (Brissoa-Nöel et al.,

1989) e os genes dnaJ (Takewaki et al., 1993) e mtp40 (Parra et al., 1991).

Alguns destes genes são gênero ou complexo específicos, e para identificação

das espécies seria necessária a realização de hibridação ou uso de enzimas de

restrição.

O alvo mais freqüentemente utilizado para diagnóstico molecular é a

seqüência de DNA denominada IS6110, seqüência que tem significado

funcional desconhecido, capaz de auto replicação e que pode estar

permanentemente integrada ao genoma do hospedeiro (Eisenach et al., 1990).

A IS6110 consiste em uma seqüência de 1.355 pares de bases (pb)

contendo 28 pb idênticos, mas com seqüência invertida em ambas as

extremidades e é encontrada exclusivamente em cepas pertence ao complexo

M. tuberculosis (M.tuberculosis, M. bovis, M. microti, M. africanum, M caprae,

M. canettii, M. pinnipedii) (Thierry et al., 1990).

Durante as últimas décadas, têm sido desenvolvidos vários métodos de

detecção direta e identificação de M. tuberculosis a partir de amostras clínicas.

Esses métodos são capazes de reduzir o tempo de diagnóstico de semanas

para dias, tendo assim uma grande relevância nos laboratórios de diagnóstico.

REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

Os testes comerciais com reagentes padronizados são submetidos à

aprovação pelo Food and Drug Administration (FDA-USA), para que possam

ser usados para diagnóstico e ao estarem disponíveis comercialmente

simplificam a utilização das técnicas moleculares, possibilitando maior

reprodutibilidade de resultado.

Os testes disponíveis comercialmente até o momento são AMTD



EMTD



(Gen-Probe Inc., San Diego, CA), Amplicor



e Cobas Amplicor

(Roche Molecular Systems, Brancburg, NJ), o último de uma geração com

automatização completa, e SDA



(Biosciences, Sparks, Md). Entretanto,

apenas o AMTD



, o Amplicor



e o EMTD



foram aprovados pelo FDA, e

exclusivamente para amostras respiratórias, com baciloscopia positiva. Cabe

ressaltar que o EMTD



foi aprovado para amostras com baciloscopia negativa

também. Todos esses testes foram aprovados para uso em casos com

suspeita clínica de TB pulmonar em pacientes adultos, não infectados pelo HIV

e sem tratamento prévio nos 12 meses que antecederam o evento atual (Mello

et al., 2002).

Dependendo do “padrão ouro” considerado, estudos mostram que a

sensibilidade do PCR varia entre 77% e 95% e a especificidade é maior que

95% em amostras com baciloscopia positiva (Kivihya-Ndugga et al., 2004;

Flores et al., 2005).

Segundo o Center for Disease Control and Prevention - CDC (1996), os

testes de amplificação preparados em laboratório (in house) devem ser

utilizados para o diagnóstico com muito critério, pois as variáveis são inúmeras,

o que dificulta sua avaliação. A padronização da técnica, principalmente da

extração do DNA, é fundamental no sucesso dos testes in house. Rossetti e

REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

colaboradores (1997) padronizaram um método de extração de DNA a partir de

amostras clínicas, utilizando sílica. O método foi utilizado por outros autores

que comprovaram sua eficácia para a remoção de possíveis inibidores da Taq

DNA polimerase presentes no sangue, escarro e outros materiais biológicos

(Al-Soud, 2000; Almeda et al., 2000; Boddinghaus, 2001). Por outro lado, a

acuidade da PCR depende da seqüência alvo escolhida e da realização do

teste em cepas isoladas ou em amostras clínicas. Ogusku e colaboradores, em

2004, selecionaram amostras clínicas de pacientes com suspeita de TBP no

estado de Amazonas e aplicaram a técnica de PCR utilizando primers

específicos para os seguintes alvos: IS6110 e genes codificadores das

proteínas 65 kDa, 38 kDa e MPB64 e concluíram que o protocolo utilizado no

processamento das amostras clínicas e os primers específicos utilizados para

amplificação do fragmento de 123pb da seqüência IS6110 demonstraram maior

eficiência no diagnóstico de tuberculose pulmonar paucibacilar. Bollela e

colaboradores (1999) utilizaram os mesmos primers complementares à

seqüência IS6110 no trabalho realizado em 1999, com o intuito de padronizar

uma reação que pudesse ser realizada (in house) de maneira simplificada e

que fosse facilmente reproduzida em laboratórios com recursos mínimos para a

realização do teste.

A PCR é capaz de detectar até uma cópia de um fragmento de DNA de

M. tuberculosis, como já foi demonstrado por Eisenach e colaboradores (1990).

Bollela (2000) detectou até 3 bacilos em uma solução-padrão o que confirma a

extrema sensibilidade da técnica em amplificar sequências genômicas de M.

tuberculosis.

REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

Sperhacke e colaboradores (2004) no estudo de padronização de um

método de diagnóstico colorimétrico para TB incluíram controles negativos de

extração e amplificação, os quais foram processados com as amostras clínicas,

como sugerido por Noordhoek e colaboradores (1996) bem como a utilização

de procedimento operacional padrão (POP), que possibilita uma melhor

performance dos técnicos e uma confiável avaliação do controle de qualidade

dos métodos que utilizam a amplificação de ácidos nucléicos.

Existe variação da acurácia entre os diferentes laboratórios que utilizam

métodos in house, e alguns estudos indicam que resultados falso-negativos

ocorrem na etapa de detecção e não durante a reação da PCR (Suzuki et al.,

1992). Vários métodos de detecção têm sido relatados; os mais usuais

envolvem a eletroforese em gel de agarose utilizando brometo de etídio ou

visualização dos produtos amplificados usando sondas radioativas. Mais

recentemente têm sido utilizados métodos onde o DNA amplificado é detectado

em fase sólida com sistemas não radioativos. Sperhacke e colaboradores

(2003) padronizaram uma metodologia de PCR in house com detecção

colorimétrica usando suporte sólido.

Apesar da elevada sensibilidade e especificidade das metodologias

moleculares, a análise de custo e real contribuição na prática clínica merece

um especial destaque. Os custos atuais de ensaios comerciais de amplificação

de ácidos nucléicos impossibilitam a inclusão destes no diagnóstico de rotina.

Os países pobres são mais sobrecarregados com os mais elevados números

de casos e, portanto, é pouco provável que se beneficiem de tecnologias caras.

Percebendo isso, agências como a Foundation for Innovantive New Diagnostic

(FIND), a OMS e a Stop TB Working Group for New Diagnostic incentivam as

REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

iniciativas de criar e implementar novas tecnológicas acessíveis e disponíveis

em países em desenvolvimento, para detectar a TB e outras doenças

negligenciadas (Ling et al., 2008).

Em 2001 o custo do teste de amplificação de ácidos nucléicos era de

aproximadamente US$50 a US$100 (Schluger et al., 2001). O custo do método

desenvolvido por Sperhacke e colaboradores em 2003 foi estimado em

aproximadamente US$10 para o processamento de 14 amostras clínicas, sem

considerar outros custos não relacionados à execução do teste molecular. O

tempo requerido para o procedimento foi de aproximadamente 8 horas.

OBJETIVOS

3.OBJETIVOS

OBJETIVOS

 Avaliar o desempenho do teste in house de PCR colorimétrico no

diagnóstico de tuberculose pulmonar quando aplicado em

condições de rotina laboratorial em um Hospital Geral

Universitário;

 Estimar a validade do teste com respeito ao diagnóstico clínico de

tuberculose pulmonar.

MATERIAL E MÉTODOS

4. MATERIAL E MÉTODOS

MATERIAL E MÉTODOS

4.1 - Seleção de Pacientes

4.1.1 - Critérios de Inclusão

Todos os pacientes com suspeita de tuberculose pulmonar que

estiveram internados em diferentes unidades do Hospital São Paulo (HSP) e

com amostras (escarro, lavado bronco-alveolar, aspirado traqueal e liquido

pleural) enviadas ao Laboratório Central do Hospital São Paulo (LCHSP) no

período de março a dezembro de 2005 foram incluídas neste estudo. O número

de amostras coletadas por paciente variou de acordo com a requisição médica.

4.1.2 - Critérios de Exclusão

Pacientes que não puderam ser avaliados para a definição do

diagnóstico (pacientes transferidos para outras unidades de saúde, por

exemplo) foram excluídos do estudo.

4.2 Parâmetros Clínicos e Epidemiológicos - Coleta de Dados

Os dados foram obtidos através da análise dos prontuários médicos dos

pacientes solicitados ao Serviço de Arquivo Médico e Estatístico (SAME) do

HSP. Foram obtidos dados de anamnese, exame físico, exames laboratoriais e

radiológicos de cada prontuário de acordo com ficha clínica adaptada pelos

pesquisadores da Rede de Estudos em Tuberculose do Brasil (REDE-TB)

(Anexo 1). Após coleta dos dados dos prontuários, as fichas clínicas foram

avaliadas por um infectologista.

O estudo foi aprovado pela Comissão de Ética em Pesquisa da

Universidade Federal de São Paulo-Hospital São Paulo (Anexo 2).

MATERIAL E MÉTODOS

4.3 - Coleta e Armazenamento do Material Biológico

Para execução deste trabalho foram utilizadas 210 amostras (escarro,

aspirado traqueal, lavado brônquio-alveolar e liquido pleural), coletadas pelo

serviço de enfermagem do Hospital São Paulo. As amostras foram enviadas ao

Laboratório Central do Hospital São Paulo, Seção de Microbiologia, Setor de

Micobactéria para pesquisa de BAAR e cultura.

As amostras recebidas pelo laboratório foram identificadas e

processadas de acordo com o Protocolo Operacional de Procedimentos (POP)

do laboratório (Anexo 3). Uma alíquota da amostra não processada (ANP) e

uma alíquota do sedimento obtido após descontaminação e centrifugação (que

denominamos sedimento) foram mantidas congeladas a -20ºC até o momento

de sua utilização.

4.4 - Baciloscopia e Cultura

Foram realizadas no Laboratório Central do Hospital São Paulo, Seção

de Microbiologia, Setor de Micobactérias .

4.5 - Procedimentos Moleculares

Para realização do PCR colorimétrico em placa para detecção de M.

tuberculosis, as amostras foram processadas e avaliadas sem o conhecimento

dos resultados de baciloscopia e cultura, assim como da história clínica do

paciente. Os protocolos de extração de DNA, reação de PCR e detecção por

colorimetria em placa foram padronizados e cedidos com o kit fornecidos pela

Dra. Maria Lucia Rossetti e colaboradores, do Centro de Desenvolvimento

Científico e Tecnológico/Fundação de Pesquisa e Produção em Saúde (CDCT-

MATERIAL E MÉTODOS

FEPPS) contendo todos os reagentes usados nos testes. Todas as etapas

foram realizadas conforme o protocolo descrito em cada kit.

4.5.1 - Extração de DNA

Preparou-se o Controle Negativo de Extração (CNE), calculou-se o

volume de Solução de Tampão (ST) e Solução hidroalcoólica a ser utilizado de

acordo com o número de amostras. Uma alíquota de 500 µL de cada amostra

clínica foi centrifugada por 10 min a 1290 g (12000 rpm), o sobrenadante

desprezado e o sedimento foi lavado duas vezes com 200 µL de ST. Os tubos

foram agitados em vórtex por 5 seg e centrifugados por 5 min a 1290 g (12000

rpm).

Os tubos foram colocados em termobloco a 100°C por 10 min incluindo o

Controle Positivo de Extração (CPE) proporcionado no kit e depois foram

centrifugados por 20 seg. O sobrenadante foi transferido para outro microtubo

contendo 5 µL de resina de sílica e agitado de forma manual e

seqüencialmente durante 5 min. Depois da centrifugação por 1 min a 1290 g

(12000 rpm) o sobrenadante foi descartado e 200 µL de solução hidroalcoólica

foram adicionados ao sedimento que foi então agitado manualmente e

centrifugado a 1290 g (12000 rpm) por 1 min. O sobrenadante foi retirado e

descartado, os microtubos foram invertidos sobre papel absorvente até secar a

resina.

Os sedimentos foram ressuspendidos em 33 µL de ST, agitados

manualmente e centrifugados a 1290 g (12000 rpm) por 1 min. O sobrenadante

foi transferido para um microtubo novo previamente identificado, e

armazenados a -20°C até o momento de processar a PC R.

MATERIAL E MÉTODOS

4.5.2 - Amplificação por PCR da região IS6110 de M.

tuberculosis

A reação de amplificação foi realizada utilizando os primers biotinilados

INS-1CGTGAGGGCATCGAGGTGGC e INS-2 CGCTAGGCGTCGGTGACAAA

derivados da seqüência de inserção IS6110 (Hermans et al.,1990). Na etapa

de detecção colorimétrica foi utilizada uma sonda aminada complementar ao

produto amplificado. Os primers e a sonda foram sintetizados pela empresa

Invitrogen (Molecular Biology Incorporating Life Technologies

and ResGen

Brand).

Os tubos da reação foram preparados com 40 µL da MIX-PCR fornecido

no Kit e 10 µL de DNA previamente extraído das amostras e dos controles de

extração (CNE e CPE). Dois tubos adicionais foram preparados com 40 µL da

MIX-PCR e 10 µL dos controles de reação (Controle Positivo de Reação - CPR

e Controle Negativo de Reação - CNR).

Os tubos foram colocados no termociclador Gene Amp® PCR System

9700 (Applied Biosystems) programado com as condições de amplificação

descritas no protocolo que acompanha o kit: desnaturação a 94°C por 5 min, 35

ciclos a 94°C por 2 min, 68°C por 2 min, 72°C por 2 min, e uma extensão final a

72°C por 5 min, estabilização e parada de reação a 4°C.

Após o término da PCR os microtubos foram guardados a -20°C até o

momento da detecção por gel e placa.

MATERIAL E MÉTODOS

4.5.2.1 - Detecção dos Produtos Amplificados em Gel de

Agarose

O gel pronto foi proporcionado com o kit. Utilizou-se tampão TBE 1X

(não incluído no kit) para a eletroforese programando a fonte para 5 volts/cm de

gel por um período de aproximadamente 30 min. As amostras foram

preparadas adicionando-se tampão de amostra na proporção de 1:5 do volume

total. Após a eletroforese, o gel foi visualizado em transiluminador UV. Para a

confirmação do tamanho de fragmentos de DNA utilizou-se padrão de peso

molecular de 100 pb ou de um kb.

Figura 5. Eletroforese em gel de agarose (1,5%). Análise dos produtos de PCR

amplificados a partir do DNA de M. tuberculosis extraído de amostras clínicas.

Padrão de peso molecular de 100 pb; 1 - controle negativo de extração; 2 -

controle positivo de extração; 3 - controle negativo de reação; 4 - controle

positivo de reação; 5 - amostra positiva; 6 - amostra negativa e 7 - controle

positivo de reação.

245 pb

600 pb

λ 1 2 3 4 5 6

100 bp

300 pb

800 pb

1000 pb

MATERIAL E MÉTODOS

4.5.2.2 - Detecção dos Produtos Amplificados por Colorimetria

em Placa Amino Link

A etapa de detecção colorimétrica dos produtos amplificados por PCR foi

realizada no CDCT-FEPPS. Segue um resumo da metodologia utilizada.

A detecção dos produtos amplificados biotinilados foi realizada por

hibridização utilizando placa de ELISA. Uma sonda aminada foi previamente

fixada aos micropoços. Etapas de lavagem posteriores a hibridização foram

utilizadas. Posteriormente, o conjugado enzimático estreptavidina peroxidase

foi adicionado. Como revelador da reação foi utilizado TMB (3,3´,5,5´-

tetrametilbenzidina). A reação foi interrompida pela adição de ácido sulfúrico.

Os resultados foram observados através de leitura em equipamento Leitor de

ELISA em comprimentos de onda de 450nm e re-filtro de 620nm.

O valor do controle negativo foi subtraído de cada valor da leitura,

considerando-se resultado positivo a partir de 0,275.

Figura 6. Resultados da detecção colorimétrica em placas de ELISA. A)

Visualização dos resultados após a adição do substrato TMB; B) Visualização

dos resultados após a adição da solução de parada. Nesta etapa foi realizada a

leitura dos resultados em equipamento leitor de placas de ELISA.

MATERIAL E MÉTODOS

4.6 - Análise Estatística dos Dados

O passo inicial da análise dos dados consistiu na descrição geral dos

mesmos, a partir de tabela de dados utilizando o programa de planilha

Microsoft Excel e SSPS 13.0 for Windows. Foram construídas tabelas de

contingência com os dados de interesse na pesquisa (AgrestiI, 2000). Em

seguida, para avaliar as concordâncias do ponto de vista estatístico, empregou-

se a estatística kappa. Foram calculadas a sensibilidade e a especificidade

como medidas de eficácia diagnóstica do PCR colorimétrico com respeito à

cultura. Para estimar a validade do teste com respeito ao diagnóstico clínico

calculamos os valores preditivo positivo e negativo.

Os cálculos estatísticos foram realizados utilizando o programa

estatístico DAG_Stat (Kraemer 1992) e o programa estatístico Probabilitas

contido na página web http://www.vademecum.com.br/iatros/index.htm.

Utilizamos o nomograma de Fagan para os cálculos de probabilidade pós-teste

(Greenhalg, 1997).

RESULTADOS

5. RESULTADOS

RESULTADOS

5.1 - Análise Descritiva

Neste estudo foram incluídas amostras clínicas de 150 pacientes

internados no Hospital São Paulo, com suspeita clínica de tuberculose, no

período de Março a Dezembro de 2005. Foram coletas amostras clínicas de

todos os pacientes, sendo que para cada caso foi coletada a amostra mais

indicada pelo médico, a saber: escarro, lavado bronco-alveolar (LBA), aspirado

traqueal, ou líquido pleural. Todos os pacientes realizaram pelo menos uma

vez a coleta de amostra, sendo que 42 pacientes realizaram duas, 17

realizaram três e apenas um único paciente realizou quatro coletas. Devido ao

diferente número de coletas realizadas pelos pacientes, foram avaliadas no

presente estudo 210 amostras clínicas.

Dentre as 210 amostras coletadas a distribuição foi de 148 escarros

(70,5%), 47 LBA (22,4%), 14 aspirados traqueais (6,7%) e uma única amostra

de líquido pleural (0,5%).

A baciloscopia direta foi realizada em 197 amostras clínicas das 210

incluídas no estudo (93,8%). Os resultados são mostrados na Tabela I. Treze

amostras (6,2%) não foram processadas, uma vez que foi solicitada apenas

cultura.

RESULTADOS

Tabela I. Resultado da baciloscopia direta de acordo com o tipo de amostra

Amostra clínica Positivo Negativo Total

n (%) n (%) n (%)

Escarro

15 (7,6) 129 (65,5)

144 (73,1)

LBA

2 (1,0) 40 (20,3)

42 (21,4)

Aspirado traqueal

1 (0,5) 9 (4,6)

10 (5,1)

Líquido pleural

0 (0,0) 1 (0,5)

1 (0,5)

Total 18 (9,1) 179 (90,9) 197 (100,0)

A PCR colorimétrica da ANP foi realizada com 206 amostras e 4 (1,9%)

não foram avaliadas por esse método por insuficiência de material. Os

resultados obtidos são mostrados na Tabela II.

Tabela II. Resultado da PCR colorimétrica da ANP de acordo com o tipo

amostra

Amostra clínica Positivo Negativo Total

n (%) n (%) n (%)

Líquido pleural

0 (0,0)

1 (0,5)

Aspirado traqueal

1 (0,5) 12 (5,8)

13 (6,3)

Escarro

12 (5,8) 134 (65,0)

146 (70,8)

LBA

3 (1,5) 43 (20,9)

46 (23,4)

Total 16 (7,8) 190 (92,2) 206 (100,0)

RESULTADOS

A baciloscopia e a PCR colorimétrica também foram realizadas

utilizando-se o sedimento. De todas as 210 amostras, a partir de uma alíquota

do produto descontaminado e concentrado, procedimento este que antecedeu

à cultura. Vinte e quatro (11,4%) amostras apresentaram resultado positivo na

baciloscopia do sedimento, como pode ser visto na Tabela III.

Tabela III. Resultado do método baciloscopia do sedimento de acordo com o

tipo de amostra

Amostra clínica Positivo Negativo Total

n (%) n (%) n (%)

Líquido pleural

0 (0,0) 1(0,5)

1 (0,5)

Aspirado traqueal

1 (0,5) 13 (6,2)

14 (6,7)

Escarro

21 (10,0) 127 (60,5)

148 (70,5)

LBA

2 (1,0) 45 (21,4)

47 (22,4)

Total 24 (11,4) 186 (88,6) 210 (100,0)

Com a PCR colorimétrica realizada a partir do sedimento foram obtidos

19 (9,0%) resultados positivos (Tabela IV).

RESULTADOS

Tabela IV. Resultado da PCR colorimétrica do sedimento de acordo com o tipo

de amostra

Das 210 culturas realizadas, 7 (3,3%) não puderam ser analisadas por

estarem contaminadas e foram descartadas das análise. A tabela V mostra que

31 (15,3%) culturas foram positivas. Em 29 das culturas foi identificada M.

tuberculosis e em 2 (1,0%) culturas houve crescimento de M. fortuitum e M.

avium respectivamente (Tabela V).

Tabela V. Resultado da cultura de acordo com o tipo de amostra

Amostra clínica Positivo Negativo Total

n (%) n (%) n (%)

Líquído pleural

0 (0,0) 1 (0,5)

1 (0,5)

Aspirado traqueal

1 (0,5) 12 (5,9)

13 (6,7)

Escarro

*25 (12,3) 117 (57,6)

142 (70,5)

LBA

5 (2,5) 42 (20,7)

47 (22,4)

Total 31 (15,3) 172 (84,3) 203 (100,0)

* M. fortuitum e M. avium

Amostra clínica Positivo Negativo Total

n (%) n (%) n (%)

Líquido pleural

0 (0,0) 1 (0,5)

1 (0,5)

Aspirado traqueal

3 (1,4) 11 (5,2)

14 (6,7)

Escarro

15 (7,1) 133 (63,3)

148 (70,5)

LBA

1 (0,5) 46 (21,9)

47 (22,4)

Total 19 (9,0) 191 (90,1) 210 (100,0)

RESULTADOS

O diagnóstico clínico definitivo de 146 (97,3%) pacientes foi obtido pela

análise dos prontuários e quatro (2,7%) não foram localizados. O diagnóstico

de 35 (24%) pacientes foi definido como (TBP), dentre os quais 12 (34,3%) não

apresentaram associação a outra doença de base, 6 (17,1%) pacientes

apresentaram TBP associado a outra doença de base (não portadores do HIV,

porém com câncer, Doença Pulmonar Obstrutiva Crônica,DPOC, e Pneumonia,

entre outras) e 17 (48,6%) tiveram diagnóstico de TBP associado ao HIV

(Tabela VI).

Tabela VI. Distribuição do número de pacientes de acordo com o diagnóstico

clínico

Diagnóstico Pacientes

TBP

TBP+ doença base

TBP + HIV

Outro diagnóstico

111

Total 146

Para construção das tabelas a seguir, nos casos em que os pacientes

tiveram coleta de mais de uma amostra, considerou-se só um resultado final,

prevalecendo o resultado positivo.

Como poderser visualizado em destaque na Tabela VII, 24(17,5%)

pacientes com diagnóstico clínico de TBP associado ou não a outras doenças

apresentaram baciloscopia direta negativa. Amostras de 9 pacientes não

tiveram resultado por ter sido solicitada só cultura.

RESULTADOS

Tabela VII. Resultados de baciloscopia direta de acordo com o diagnóstico

clínico

A PCR colorimétrica da ANP foi realizada nas amostras de 144

pacientes, pois em 2 casos não houve material suficiente para a extração do

DNA. Em destaque, 25 (17,36%) amostras correspondentes ao grupo com

diagnóstico de TBP apresentaram resultado negativo. Em duas (1,3%)

amostras correspondentes a pacientes com outros diagnósticos, o resultado foi

positivo (Tabela VIII).

Diagnóstico Positivo Negativo Total

n (%) n (%) n (%)

TBP

5 (3,6) 7 (5,1)

12 (8,8)

TBP+ doença base

3 (2,2) 3 (2,2)

6 (4,4)

TBP+HIV

3 92,2) 14 (10,2)

17 (12,4)

Outro diagnóstico

0 (0,0) 102 (74,5)

102 (74,5)

Total 11 (8,0) 126 (92,0) 137 (100,0)

RESULTADOS

TabelaVIII. Resultado da PCR colorimétrica da ANP de acordo com o

diagnóstico clínico

Diagnóstico Positivo Negativo Total

n (%) n (%)

n (%)

TBP

6 (4,2) 6 (4,2)

12 (8,3)

TBP+ doença base

2 (1,4) 4 (2,8)

6 (4,2)

TBP+HIV

2 (1,4) 15 (10,4)

17 (11,8)

Outro diagnóstico

2 (1,4) 107 (74,3)

109 (75,7)

Total 12 (8,3) 132 (91,7) 144 (100,0)

Em relação à baciloscopia do sedimento, obtive-se resultado negativo

em 20 (13,6%) amostras de pacientes diagnosticados clinicamente como

portadores de TBP (Tabela IX).

Tabela IX. Resultado da baciloscopia do sedimento de acordo com o

diagnóstico clínico

Diagnóstico Positivo Negativo Total

n (%) n (%)

n (%)

TBP

8 (5,5) 4 (2,7)

12 (8,2)

TBP+ doença base

3 (2,1) 3 (2,1)

6 (4,1)

TBP+HIV

4 (2,7) 13 (8,9)

17 (11,6)

Outro diagnóstico

0 (0,0) 111 (76,0)

111 (76,0)

Total 15 (10,3) 131 (89,7) 146 (100,0)

Vinte e cinco (17,1%) amostras, referentes ao grupo de pacientes com

diagnóstico clínico de TBP, apresentaram resultado negativo ao PCR

RESULTADOS

colorimétrico do sedimento. No grupo de pacientes com outros diagnósticos

clínicos, 3 (2,1%) apresentaram resultado positivo (Tabela X).

Tabela X. Resultado da PCR colorimétrica do sedimento de acordo com o

diagnóstico clínico

Diagnóstico Positivo Negativo Total

n (%) n (%)

n (%)

TBP

5 (3,4) 7 (4,8)

12 (8,2)

TBP+ doença base

3 (2,1) 3 (2,1)

6 (4,2)

TBP+HIV

2 (1,3) 15 (10,2)

17 (11,5)

Outro diagnóstico

3 (2,1) 108 (74,0)

111 (76,1)

Total 13 (8,9) 133 (91,1) 146 (100,0)

No total foram analisadas 146 culturas, das quais duas culturas estavam

contaminadas, restando as 144 apresentadas na Tabela XI. Embora

correspondam ao grupo de pacientes com diagnóstico clínico de TBP, 16

(11,1%) culturas apresentaram resultado negativo, como pode ser visto na

Tabela XI. Por outro lado, duas (1,3%) amostras de pacientes com outro

diagnóstico, apresentaram cultura positiva.

RESULTADOS

Tabela XI. Resultado da cultura para M. tuberculosis de acordo com o

diagnóstico clínico

Diagnóstico Positivo Negativo Total

n (%) n (%) n (

TBP

9 (6,3) 3 (2,1)

12 (8,3)

TBP+ doença base

3 (2,1)

6 (4,2)

TBP+HIV

7 (4,9) 10 (6,9)

17 (11,8)

Outro diagnóstico

2 (1,4)

107 (74,3)

109 (75,7)

Total 21 (14,7) 123 (85,4) 144 (100,0)

Cultura identificada como

M. fortuitum e

M. avium

Uma informação clínica considerada importante foi a ocorrência de

tratamento prévio ou não à internação. A Tabela XII mostra que dos 35

pacientes diagnosticados como TBP isolada ou associada a outra doença, 12

(34,3%) foram tratados previamente para TBP.

Tabela XII. Distribuição dos pacientes de acordo com o diagnóstico clínico,

considerando a ocorrência de tratamento prévio ou não

Tratamento

Prévio

TBP

TBP+ doença

base

TBP+HIV

Outro

diagnóstico

Total

Sim

4 (2,7) 1 (0,7) 7 (4,8) 0 (0,0)

12 (8,2)

Não

8 (5,5) 5 (3,4) 10 (6,8) 111 (76,0)

134 (91,8)

Total 12 (8,2) 6 (4,1) 17 (11,6) 111 (76,0) 146 (100,0)

RESULTADOS

Como pode ser visto na Tabela XIII, 5 pacientes com diagnóstico de

TBP, 2 com TBP + doença de base e 7 com TBP + HIV não receberam

tratamento prévio e apresentaram resultado negativo na baciloscopia direta.

Dois pacientes com diagnóstico de TBP que receberam tratamento prévio

apresentaram resultado positivo na baciloscopia.

Tabela XIII. Resultado da baciloscopia direta de acordo com o diagnóstico

clínico, considerando tratamento prévio e sem tratamento

Diagnóstico Tratamento prévio Positivo Negativo Total

sim

2 2 4

não

3 5 8

TBP

Total 5 7 12

sim

0 1 1

não

3 2 5

TBP+ doença base

Total 3 3 6

sim

0 7 7

não

3 7 10

TBP+HIV

Total 3 14 17

sim

0 0 0

não

0 102 102

Outro diagnóstico

Total 0 102 102

Considerando a realização de tratamento prévio, em relação ao

resultado da PCR colorimétrica da ANP, pode-se observar que entre os

pacientes com diagnóstico de TBP 3 pacientes sem tratamento apresentaram

RESULTADOS

resultado negativo, o mesmo resultado foi encontrado em 3 pacientes com TBP

+ outras doenças de base e em 8 com TBP + HIV (Tabela XIV).

Tabela XIV. Resultado da PCR colorimétrica da ANP de acordo com o

diagnóstico clínico, considerando tratamento prévio e sem tratamento

Diagnóstico Tratamento prévio Positivo Negativo Total

sim

1 3

não

5 3

TBP

Total 6 6 12

sim

0 1

não

2 3

TBP+ doença base

Total 2 4 6

sim

0 7

não

2 8

TBP+HIV

Total 2 15 17

sim

0 0

não

2 107

109

Outro diagnóstico

Total 2 107 109

Na Tabela XV observamos que 2 pacientes diagnosticados como

portadores de TBP e com TBP + outras doenças de base e 6 pacientes com

TBP + HIV sem tratamento apresentaram resultado negativo para baciloscopia

do sedimento. Já entre os pacientes que haviam recebido tratamento prévio,

apenas 2 com TBP apresentaram baciloscopia positiva.

RESULTADOS

Tabela XV. Resultado da baciloscopia do sedimento de acordo com o

diagnóstico clínico, considerando ocorrência de tratamento prévio ou não

Diagnóstico Tratamento prévio Positivo Negativo Total

sim

2 2

não

6 2

TBP

Total 8 4 12

sim

0 1

não

3 2

TBP+ doença base

Total 3 3 6

sim

0 7

não

4 6

TBP+HIV

Total 4 13 17

sim

0 0

não

0 111

111

Outro diagnóstico

Total 0 111 111

Entre os resultados negativos encontrados na PCR colorimétrica do

sedimento, verificou-se que, entre os pacientes sem tratamento prévio, 4

tinham TBP, 2 apresentavam TBP + doença de base e 8 foram diagnosticados

como TBP + HIV. Resultado positivo foi observado em apenas 1 paciente que

apresentava TBP e havia realizado tratamento prévio (Tabela XVI).

RESULTADOS

Tabela XVI. Resultado da PCR colorimétrica do sedimento de acordo com o

diagnóstico clínico, considerando tratamento prévio e sem tratamento

Diagnóstico Tratamento prévio Positivo Negativo Total

sim

1 3

não

4 4

TBP

Total 5 7 12

sim

0 1

não

3 2

TBP+ doença base

Total 3 3 6

sim

0 7

não

2 8

TBP+HIV

Total 2 15 17

sim

0 0

não

3 108

111

Outro diagnóstico

Total 3 108 111

Quanto aos resultados da cultura, houve ausência de crescimento de

micobactérias no material de 1 paciente com TBP, 2 com TBP + doença de

base e 5 com TBP + HIV os quais não haviam recebido tratamento prévio. Por

outro lado a cultura apresentou-se positiva para amostras de 2 pacientes com

TBP e 2 com TBP + HIV que haviam recebido tratamento prévio e no material

de 2 pacientes com outro diagnóstico e sem tratamento para TBP (Tabela

XVII).

RESULTADOS

Tabela XVII. Resultado da cultura de acordo com o diagnóstico clínico,

considerando tratamento prévio e sem tratamento

Diagnóstico Tratamento prévio Positivo Negativo Total

sim

2 2

não

7 1

TBP

Total 9 3 12

sim

0 1

não

3 2

TBP+ doença base

Total 3 3 6

sim

2 5

não

5 5

TBP+HIV

Total 7 10 17

sim

0 0

não

2 107

109

Outro diagnóstico

Total 2 107 109

RESULTADOS

Tabela XVIII. Resumo dos resultados das análises descritas

Método de Análise

Resultado

Amostras TBP

positivas

nº % (%T)

Amostras TBP

negativas

nº % (%T)

Pacientes com

TBP

nº % (%T)

Pacientes sem

TBP

nº % (%T)

Total de

amostras

nº %

Positivo 18,0 33,3 (09,1) 0,0 0,0 (0,0) 11 31,4 (5,6) 0,0 0,0 (0,0) 18,0 9,1

Negativo 36,0 66,7 (18,3) 140 100,0 (71,1) 24 68,6 (12,2) 102 91,9 (51,8) 179 90,9

Baciloscopia direta

Total 54,0 100,0 (27,4) 140 100,0 (71,1) 35 100,0 (17,8) 111* 100,0 (56,3) 197 100,0

Positivo 14,0 25,5 (06,8) 02 01,3 (1,0) 10 28,6 (4,8) 02 01,8 (01,0) 16,0 7,8

Negativo 41,0 74,5 (19,9) 145 96,0 (70,4) 25 71,4 (12,1) 107 96,4 (51,9) 190 92,2

PCR colorimétrica do ANP

Total 55,0 100,0 (26,7) 151* 100,0 (73,3) 35 100,0 (16,9) 111* 100,0 (53,9) 206 100,0

Positivo 24,0 43,6 (11,4) 0,0 0,0 (0,0) 15 42,9 (7,1) 0,0 0,0 (0,0) 24,0 11,4

Negativo 31,0 56,4 (14,8) 151 100,0 (71,9) 20 57,1 (9,5) 111 100,0 (52,9) 186 88,6

Baciloscopia do

sedimento

Total 55,0 100,0 (26,2) 155* 100,0 (71,9) 35 100,0 (16,6) 111 100,0 (52,9) 210 100,0

Positivo 16,0 29,0 (07,6) 03 1,9 (1,4) 10 28,6 (4,7) 03 02,7 (01,4) 19,0 9,0

Negativo 39,0 71,0 (18,6) 148 95,48 (70,5) 25 71,4 (11,9) 108 97,3 (51,4) 191 91,0

PCR colorimétrica do

sedimento

Total 55,0 100,0 (26,2) 155* 100,0 (73,8) 35 100,0 (16,6) 111 100,0 (52,9) 210 100,0

Positivo 29,0 52,7 (14,3) 02 1,3 (01,0) 19 54,3 (9,3) 02 01,8 (01,0) 31,0 15,3

Negativo 24,0 43,6 (11,8) 144 97,3 (70,9) 16 45,7 (7,8) 107 96,4 (52,7) 172 84,3

Cultura

Total 55,0 100,0 (27,1) 148* 100,0 (72,9) 35 100,0 (17,2) 111* 100,0 (54,7) 203 100,0

*A soma não corresponde ao total uma vez que nesses casos algumas amostras não foram processadas, por falta de material.

RESULTADOS

Os resultados negativos da baciloscopia direta e baciloscopia do

sedimento correspondem a 86,3% (126/146) e 89,7% (131/146) dos pacientes,

respectivamente. Além disso, 85,4% (123/144) dos pacientes também

apresentaram culturas negativas. Com base nos dados clínicos conclui-se que

apenas 23,9% (35/146) dos 150 pacientes incluídos no nosso estudo,

apresentaram alguma forma de TBP (Tabela XII).

Quando os resultados dos testes microbiológicos foram analisados em

relação aos pacientes com diagnóstico clínico de TBP (35/146), 68,6% (24/35)

dos resultados de baciloscopia direta, 57,1% (20/35) da baciloscopia do

sedimento e 45,7% (16/35) da cultura foram negativos.

Os resultados das 210 amostras analisadas foram negativos em 90,1%

(179/197), 88,6% (186/210) e 84,3% (172/203) em relação à baciloscopia

direta, do sedimento e cultura, respectivamente.

A análise de 206 ANP e 210 sedimentos por PCR colorimétrica

apresentou resultados negativos em 92,2% (190/206) e 91,0% (191/210),

respectivamente. Em relação ao número de pacientes (n=146), foram obtidos

88,6% e 84,3% resultados negativos para a PCR colorimétrica da ANP e do

sedimento, respectivamente. Se considerarmos ainda apenas os 35 pacientes

com diagnóstico clínico de TBP, os resultados negativos foram de 71,4%

(25/35) para ambos os experimentos (Tabela XVIII).

5.2 - Análise Correlacional

Comparando a baciloscopia direta com a PCR colorimétrica, podemos

observar que houve uma pequena discrepância entre os resultados. Como

podemos observar em destaque na Tabela XIX a baciloscopia apresentou 7

RESULTADOS

resultados positivos, não detectados pela PCR colorimétrica e a PCR

colorimétrica apresentou 5 resultados positivos não detectados na baciloscopia

direta.

Tabela XIX. Distribuição das amostras com relação às avaliações pelos

métodos de PCR colorimétrica e baciloscopia direta

Baciloscopia direta

PCR colorimétrica

Positivo

Negativo

Sem resultado

Total

Positivo

11 5 0

Negativo

7 170 13

190

Sem resultado

0 4 0

Total 18 179 13 210

A Tabela XX também demonstra uma pequena diferença entre os

resultados da baciloscopia do sedimento versus PCR colorimétrica. Essa

diferença é observada para os resultados negativos.

Tabela XX. Distribuição das amostras com relação às avaliações pela PCR

colorimétrica e baciloscopia do sedimento

Baciloscopia do sedimento

PCR Colorimétrica

Positivo Negativo Total

Positivo

15 4

Negativo

9 182

191

Total 24 186 210

RESULTADOS

A comparação entre a PCR colorimétrica da ANP versus cultura e PCR

colorimétrica do sedimento versus cultura podem ser observados na Tabelas

XXI e XXII, respectivamente.

Tabela XXI. Distribuição das amostras com relação às avaliações pelos

métodos de PCR colorimétrica da ANP e da cultura

Cultura

PCRc. ANP

Positivo Negativo Contaminada Total

Positivo

13 3 0

Negativo

18 165 7

190

Sem resultado

0 4 0

Total 31 172 7 210

Tabela XXII. Distribuição das amostras com relação às avaliações pelos

métodos de PCR colorimétrica do sedimento e da cultura

Cultura

PCRc sedimento

Positivo Negativo Contaminada Total

Positivo

15 4 0

Negativo

16 168 7

191

Total 31 172 7 210

RESULTADOS

5.3 - Análise Inferencial

Considerando as 210 amostras, de acordo com o critério da estatística

Kappa, podemos afirmar que a PCR colorimétrica, tanto da ANP como do

sedimento, apresenta uma boa concordância com respeito à cultura (Tabelas

XXIII e XXIV).

Tabela XXIII. Resultados do estudo de concordância entre a PCR colorimétrica

da ANP e os outros testes

Kappa Intervalo de confiança

B. direta 0,6131

0,4130 0,8132

Cultura 0,5

0,3247 0,6829

Tabela XXIV. Resultados do estudo de concordância entre a PCR colorimétrica

do sedimento e os outros testes

Kappa Intervalo de confiança

B.sedimento 0,6637

0,4940 0,8334

cultura 0,5481

0,3191 0,6977

A especificidade da PCR colorimétrica (ANP e sedimento) em relação à

cultura foi de 98%. Essa estimativa pode ser visualizada nas Tabelas XXV e

XXVI, respectivamente. Outro resultado relevante que ainda podemos verificar

RESULTADOS

nestas tabelas é que a sensibilidade para a PCR colorimétrica da ANP e

sedimento em relação à cultura foi de 41% e 48%, respectivamente.

Tabela XXV. Medidas de eficácia diagnóstica da PCR colorimétrica da ANP em

relação à Cultura

Estimativa Intervalo de confiança

Especificidade 0,9821

0,9487 0,9963

Sensibilidade 0,4193

0,2485 0,6092

Tabela XXVI. Medidas de eficácia diagnóstica da PCR colorimétrica do

sedimento em relação à Cultura

Estimativa Intervalo de confiança

Especificidade 0,9767

0,9415 0,9931

Sensibilidade 0,4838

0,3015 0,6694

A concordância do teste PCR colorimétrico com respeito ao diagnóstico

clínico de TBP é fraca (kappa=0,34 e 0,33 com IC=[0,1677-0,5205 e 0,1522-

0,5070], respectivamente) tanto para a PCR colorimétrica da ANP quanto para

a PCR colorimétrica do sedimento (Tabela XXVII).

RESULTADOS

Tabela XXVII. Resultado do estudo de concordância entre os testes utilizados

e o Diagnóstico Clínico de TBP

Kappa Intervalo de confiança

B. direta 0,406

0,2320

0,5793

PCR colorimétrica da ANP 0,344

0,1677 0,5205

B. sedimento 0,533

0,3646 0,7010

PCR colorimétrica do sedimento

0,330

0,1522 0,5070

Cultura 0,607

0,4475 0,7664

Em relação ao diagnóstico clínico de TBP observamos que os resultados

de sensibilidade (28,6%), especificidade (98,2%) tanto para a PCR

colorimétrica da ANP como para o sedimento. Os valores preditivo positivo

foram de 83,3% e 76,9% para a PCR colorimétrica da ANP e sedimento e os

valores preditivo negativo foram de 81,1% e 87,0%, respectivamente para

ambos os testes (Tabela XXVIII).

RESULTADOS

Tabela XXVIII. Medidas de eficácia diagnóstica dos métodos utilizados no estudo em que a Prevalência TBP foi de 23,9%

(35/146)*.

Métodos

Sensibilidade (%)

Especificidade (%)

Valor Preditivo Positivo

(%)

Valor Preditivo

Negativo (%)

Probabilidade Pré-teste

(%)

Probabilidade Pós-

teste (%)

Acurácia

Verossimilhança

Kappa

Conceito da análise

estatística

Proporção de

indivíduos

doentes com

teste positivo

Proporção

indivíduos

sadios com

teste

negativo

Se resultado

positivo, qual

probabilidade do

paciente ter

realmente a

doença

Se resultado

negativo, qual

probabilidade

do paciente não

ter a doença

(Prevalência)

proporção de

pessoas com a

doença em

estudo, em uma

população de

risco

chance do teste

estar correto

Proporção de

testes

verdadeirame

nte.positivo e

verdadeirame

nte negativo,

em relação o

total de

resultados

Quantas vezes é

provável encontrar

resultado + em

pessoas doentes

comparado com

não doentes ou –

em não doentes

comparados com

doentes

Grau de

concordância

(0,2=pobre

0,21-0,4=

fraca;

0,41-0,6=

moderada;

0,61-0,8=

boa;

>0,8=muito

boa)

fórmulas

a/a+c d/b+d a/a+b x100 d/d+c x100 a+c/a+b+c+d

Positivo

Negativo

a+d/a+b+c

Vr(+) =S/1-E

Vr(-) =1-S/E

Positivo

Negativo

- P

/1- P

Baciloscopia

direta

31,4 100,0 100,0 81,0 25,5 - - 82,5 - 0,70 0,41

PCRc da ANP

28,6 98,2 83,3 81,1 24,3 83,3 18,9 81,3 15,6 0,70 0,34

Baciloscopia

sedimento

42,9 100,0 100,0 84,7 24,0 - - 86,3 - 0,60 0,53

PCR c do

sedimento

28,6 97,3 76,9 81,2 24,0 76,9 18,8 80,8 10,6 0,70 0,33

Cultura

54,3 98,2 90,5 87,0 24,3 90,5 13,0 87,5 29,6 0,47 0,61

* resultado válido para o grupo de pacientes incluídos neste trabalho. Cálculos baseados em: http://www.vademecum.com.br/iatros/index.htm

RESULTADOS

A prevalência de TBP, para o nosso grupo de pacientes, foi de 23,9%

este é um índice importante porque nos ajuda a compreender melhor o

desempenho do teste sob o prisma da clínica uma vez que a sensibilidade,

especificidade, VPP e VPN podem variar de acordo com a prevalência do local.

A razão de verossimilhança ou Likelihood Ratio (Vr ou LR) é uma

ferramenta importante para a prática clínica e laboratorial na análise de um

teste diagnóstico, definida como a possibilidade do resultado de um teste em

particular para uma pessoa com a doença de interesse, dividido pela

probabilidade daquele resultado de teste para uma pessoa sem a doença de

interesse. A aplicação na clínica fica facilitada quando se usa o nomograma de

Fagan (Figura 7) que permite estimar a probabilidade pós-teste (83.3% e

76,9%) quando determinada a probabilidade pré-teste (24.3% e 24,0%) e Vr

(15,9 e 10,6). Ajuda a definir quantas vezes aumentou ou diminuiu a chance do

paciente que tem um teste positivo ou negativo realmente ser portador da

doença em questão.

RESULTADOS

Figura 7. Nomograma de Fagan

PCRc sedimento

PCRc do ANP

Cultura

DISCUSSÃO

6. DISCUSSÃO

DISCUSSÃO

A detecção rápida e precisa de M. tuberculosis tem um forte impacto no

cuidado e tratamento de pessoas infectadas e no controle da tuberculose na

população. Ante o crescente número de casos de tuberculose multiresistente à

drogas, o CDC (1992) definiu, no início da década de 90, alguns objetivos para

o diagnóstico microbiológico da TBP, que incluem: a comunicação do resultado

da baciloscopia ao clínico em 24 horas; detecção do BAAR em 14 dias por

cultura ; identificação da espécie em 17 a 21 dias e disponibilidade do resultado

do teste de sensibilidade aos antimicrobianos em 28 dias.

Também o isolamento dos pacientes internados com TBP ativa é

importante para evitar a transmissão da tuberculose hospitalar. Recomenda-se

dentro da instituição o isolamento de todos os pacientes potencialmente

contagiosos em quarto-leito individual o com pressão negativa. Os doentes

devem permanecer em isolamento até que sejam obtidos 3 resultados

negativos da baciloscopia ou até que apresentem boa resposta clínica ao

tratamento além de 3 baciloscopias negativas (Wisnivesky et al., 2005).

A aplicação destas orientações tem-se traduzido em diminuição da

transmissão de tuberculose em algumas instituições. A diminuição das taxas de

TBP nos EUA e menores taxas de hospitalização de pessoas com tuberculose

conduziram a baixa prevalência de TBP entre doentes isolados por causa da

suspeita da doença. Embora seja elevado o número de isolamentos de doentes

com baixo risco de TBP, a identificação demorada dos pacientes com TBP é

um grande problema.

É comum a identificação de pacientes com TBP pelos resultados da

baciloscopia, porém a sensibilidade deste teste não é alta (50-60%) (Chan et

DISCUSSÃO

al., 2000) e já foi reportada a transmissão de TBP por pacientes com

baciloscopia negativa (Anderson et al.,1995; Behr et al., 1999).

A utilização de recursos rápidos e eficientes na identificação dos doentes

com baixo risco de TBP poderia ajudar a reduzir os custos hospitalares. Esses

critérios devem basear-se na presença de fatores de risco, achados físicos e

radiografia torácica, embora se deve considerar que a associação de TBP com

SIDA trouxe profundas modificações nas características de apresentação da

doença. O diagnóstico da tuberculose em pacientes com SIDA é geralmente

mais difícil do que no paciente imunocompetente, pela rápida evolução e

apresentação menos característica. Por isso, vários casos são diagnosticados

tardiamente, e muitas vezes não se confirma o diagnóstico (Kramer et al.,

1990); além do mais a infecção pelo HIV esteve presente em mais de 80% de

6 surtos de tuberculose multiresistente a drogas ocorridos em 1990 a 1992, nos

EUA (Ellner et al., 1993).

Nos casos de suspeita de tuberculose extrapulmonar, além desses

testes, são utilizados também métodos anátomo-patológicos, citológicos,

sorológicos, bioquímicos e de biologia molecular, conforme a disponibilidade

nos serviços de saúde e laboratórios de referência (Ministério da Saúde, 1994;

Ministério da Saúde, 1997).

A baciloscopia é o exame mais empregado na rotina diagnóstica da

tuberculose em função da sua simplicidade, rapidez e baixo custo (Ministério

da Saúde, 1997). A baciloscopia tem algumas limitações, dentre as quais

podemos citar o grande número de bacilos necessário para a positividade do

teste. O exame só é positivo em amostras com pelo menos 10.000 bacilos/mL,

o que limita a sensibilidade do teste. Consequentemente se deduz que apenas

DISCUSSÃO

lesões razoavelmente extensas, com grande população bacilar, podem

apresentar baciloscopia positiva. Outro inconveniente é o fato de o resultado

apenas identificar o microrganismo como BAAR, portanto, a interpretação

dependerá da prevalência da tuberculose e de outras micobacterioses no local

onde o teste é empregado, visto ser ele incapaz de diferenciar espécies de

micobactérias, o que pode influenciar negativamente na sua especificidade

(Ministério da Saúde, 1994).

A sensibilidade e especificidade da baciloscopia têm sido avaliadas

periodicamente em várias revisões e, embora seus valores variem

consideravelmente nos diferentes estudos, é claro que a baciloscopia continua

sendo um passo imprescindível na avaliação diagnóstica da tuberculose

(Chakravorry et al., 2005). Levy e colaboradores (1989) num estudo de 2560

escarros provenientes de 727 pacientes do Hospital Hilbrow reportaram

sensibilidade de 53,1% e especificidade de 99,8%, com valor preditivo positivo

de 98,5%. Gordin & Slutkin (1990) revisando os resultados de baciloscopia no

Hospital Geral de São Francisco encontraram sensibilidade variando entre

45,75 e 55,3% num período de 8 anos. A especificidade sempre foi de 99%, e o

valor preditivo positivo ficou entre 91,5% a 98% no período estudado.

Kim e colaboradores (1984) demonstraram sensibilidade de até 74,4%,

uma vez que 727 de 977 pacientes com tuberculose pulmonar tiveram

baciloscopia positiva antes de iniciar o tratamento.

A sedimentação combinada com a citocentrifugação aumenta a

sensibilidade na detecção dos bacilos ácido-álcool resistentes nos esfregaços

de escarro. Fodor (1995) estudou a eficácia da sedimentação combinada com

a citocentrifugação do escarro na preparação de esfregaço para a detecção de

DISCUSSÃO

micobactérias. Obteve 32 esfregaços positivos para BAAR, sendo que em 26

casos os resultados foram melhores que com a baciloscopia direta. Encontrou-

se mais bacilos em 20 casos, e em 6 casos o resultado foi positivo só com o

método de citocentrifugação. A diferença no número de bacilos foi de 100 a

200 vezes em 5 amostras e de 10 vezes em 12 amostras comparadas com a

baciloscopia direta concluindo que a técnica aplicada é adequada para o cultivo

e para a baciloscopia a partir do mesmo sedimento.

Em nosso estudo na rotina laboratorial de um Hospital Geral

Universitário sem seleção prévia dos pacientes por critério clínico, no total de

210 amostras obtivemos positividade em 33,3% na baciloscopia direta e 31,4%

quando consideramos as amostras dos pacientes com diagnóstico clínico de

TBP. Por outro lado, a positividade na baciloscopia do sedimento foi de 43,6%,

e 42,9%, respectivamente. Nossos resultados da baciloscopia do sedimento

confirmam os achados da literatura em que a detecção de BAAR é mais

eficiente que a observada com a baciloscopia direta.

De acordo com a literatura, variações observadas nos resultados da

baciloscopia podem ser explicadas pela apresentação da doença (cavitária ou

miliar), espécie de micobactéria e sua prevalência, eficácia da

descontaminação e concentração, espessura e extensão do esfregaço, tipo de

coloração, descoloração, o treino e a experiência de quem vai avaliar a lâmina

(Pfaller, 1994). Wobeser e colaboradores (1996) em estudo de 1480 espécimes

no Canadá, evidenciaram crescimento de micobactérias em 218, o que

representa 14,7%. Deste total, 170 (78%) foram isolados de escarro ou lavado

broncoalveolar e, destes espécimes, 63 (37%) foram positivos na baciloscopia.

Das 63 amostras clínicas com baciloscopia e cultura positivas, em 40 (63%) foi

DISCUSSÃO

isolado M. tuberculosis, em 15 (24%) MAC, e 8 (13%) outras micobactérias.

Portanto, numa região onde 37% das amostras respiratórias positivas à

baciloscopia são micobactérias não tuberculosas, a especificidade e o valor

preditivo positivo deste teste podem estar comprometidos.

Greenbaum e colaboradores (1980) reportaram baciloscopia positiva em

52% dos pacientes com cavitações e 32% entre aqueles com infiltrados locais.

Klein e colaboradores (1989) demonstraram que a sensibilidade da

baciloscopia em pacientes com SIDA foi de 45% contra 81% no grupo controle

sem SIDA. Tem sido reportado um menor rendimento da baciloscopia em

pacientes infectados pelo HIV e espera-se que a sensibilidade seja menor

quanto maior a imunodepressão (Klein et al., 1989; Daniel, 1990). Smith e

colaboradores (1994), no entanto, desafiam esse conceito, com resultados que

mostram a mesma sensibilidade da baciloscopia para 100 infectados pelo HIV

e 76 não infectados (60% e 57%, respectivamente).

Nas tabelas XII e XIII mostramos que 10 das baciloscopias diretas

apresentaram resultado negativo. No grupo de pacientes, 34,3% (12/35)

estavam em tratamento ou o receberam previamente, o que poderia estar

contribuindo para uma baixa sensibilidade da baciloscopia.

A demonstração de BAAR pela microscopia direta no escarro é

altamente sugestiva de tuberculose pulmonar, no entanto, a confirmação

depende do cultivo do M. tuberculosis naquela amostra. Ambas as técnicas

estão sujeitas a erro do tipo falso positivo ou falso negativo. Apesar da alta

sensibilidade, a cultura pode não detectar até 20% dos bacilos em amostras de

casos de tuberculose (Ling, 2008). Vários fatores podem estar relacionados

com essa ocorrência, dentre eles podemos destacar amostras com menos de

DISCUSSÃO

10 a 100 bacilos/mL, que geralmente são negativas no cultivo. A

descontaminação com soda pode inviabilizar o crescimento dos bacilos; a

contaminação com fungos e bactérias de crescimento rápido, o uso prévio de

drogas tuberculostáticas e problemas técnicos e operacionais também podem

interferir no desempenho da cultura. De acordo com os nossos resultados, a

sensibilidade da cultura considerando o total de amostras foi de 52,7% e

segundo o diagnóstico clínico de TBP foi de 54,3%.

Em uma pesquisa realizada no setor de Microbiologia do Laboratório

Central do HSP, Machado (1998) avaliou o desempenho do meio de cultura

líquido (MGIT) e do meio sólido (LJ) e concluiu que a média de tempo para

detecção de micobactérias em escarro utilizando MGIT foi significantemente

menor quando comparada a do LJ, embora a sensibilidade e a especificidade

fossem similares para ambos os testes.

A sensibilidade da cultura varia entre 80% e 100%, e a especificidade de

98% a 100% (Bollela, 1999). O cultivo do M. tuberculosis também pode ser

afetado pela apresentação clínica da doença. Por outro lado, podemos ter

resultados falsos-positivos na cultura, implicando em queda na especificidade

da técnica. A ocorrência deste fato pode decorrer da contaminação da amostra

com M. tuberculosis, manipulação indevida após a coleta, manuseio da

amostra no laboratório ou por erro na identificação das amostras.

A leitura da cultura e o fornecimento dos resultados positivos devem ser

efetuados semanalmente. Em razão do crescimento lento das micobactérias

(geralmente em torno de 30 dias), a duração do processo desde o recebimento

da amostra até o fornecimento do resultado positivo ou negativo da cultura

efetuada com métodos tradicionais é de quatro a seis semanas e a

DISCUSSÃO

determinação da sensibilidade às drogas antituberculosas e ou a identificação

da espécie isolada pode adicionar de três a oito semanas ao processo

(Ministério da Saúde, 1994; Collins et al., 1997).

Em nosso estudo, as 210 amostras foram submetidas à cultura, das

quais 31 resultaram positivas, representando total de 15,3%. É importante

ressaltar que dos 35 pacientes com TBP, 12 estavam usando drogas

tuberculostáticas ou a usaram num intervalo curto de tempo antes da coleta

das amostras clínicas. Além disso, 7 (3,3%) culturas estavam contaminadas,

impedindo a sua avaliação adequada.

As técnicas convencionais e as alternativas discutidas mostraram

grandes limitações para atingir o objetivo do diagnostico rápido e preciso

(Pfaller, 1994). Brisson-Nöel e colaboradores (1991) reportaram que em 514

amostras variadas (escarro, aspirado gástrico, líquido pleural, urina, líquor)

97,3% tiveram resultados de PCR concordantes com os dados microbiológicos

e/ou clínicos. Os autores analisaram uma grande variedade de espécimes, mas

não foi informado quais foram os critérios clínicos utilizados para a definição da

tuberculose.

Clarridge III e colaboradores (1993) avaliaram 5000 espécimes clínicos

diferentes quanto à presença de micobactérias usando como DNA alvo o

elemento IS6110. Os resultados foram comparados com os da cultura

resultando em sensibilidade de 83,5%, especificidade de 99% e valor preditivo

positivo de 94,2%. A sensibilidade da PCR em amostras com baciloscopia

negativa e cultura positiva foi de 62%. Outros trabalhos foram desenvolvidos,

tendo como alvo o elemento IS6110 (Abe et al., 1993; Forbes & Hicks, 1993;

Miyazaki et al., 1993; Nolte et al., 1995; Beige et al.,1995), sendo que a

DISCUSSÃO

sensibilidade da PCR oscilou entre 74 e 98%, e a especificidade entre 66 e

100%.

Na tentativa de otimizar os resultados da PCR, principalmente nas

amostras paucibacilares, Forbes & Hicks (1994) descreveram a detecção de M.

tuberculosis diretamente em meio de cultura 12B do BACTEC 460. Os

resultados mostraram sensibilidade de 100% e especificidade de 99,7%. É

importante ressaltar que 42% das culturas apresentaram resultados de

baciloscopia negativo, mas apresentaram resultados positivos na PCR.

Sperhacke e colaboradores (2004) analisaram 80 amostras clínicas

(pulmonares e extrapulmonares) usando PCR colorimétrico in house (PCR dot-

blot). A detecção do produto amplificado foi feita por hibridização com sonda

marcada com biotina em suporte sólido (membrana de nitrocelulose) e com a

visualização do produto amplificado por migração em gel de agarose. Os

autores consideraram como padrão ouro a cultura combinada com achados

clínicos e verificaram sensibilidade de 90% e 95% para detecção em gel

agarose e membrana, respectivamente e especificidade de 97% para ambas as

formas de detecção. Assim, concluíram que os resultados de sensibilidade e

especificidade obtidos com a PCR dot-blot justificavam estudos subseqüentes

de efetividade e posterior avaliação de sua real aplicabilidade na rotina de

diagnóstico na rede de saúde pública.

A utilização de técnicas moleculares no diagnóstico da tuberculose tem

atraído grande interesse, particularmente pela possibilidade de redução do

tempo necessário para detecção e identificação do M. tuberculosis em

espécimes clínicos. A disparidade entre o rendimento da baciloscopia e da

cultura de escarro indica que o número considerável de diagnóstico potencial

DISCUSSÃO

de tuberculose, em amostras de escarro, não tem sido feito ou têm demorado

em demasia, por falta de ensaios mais rápidos e sensíveis (Schluger, 1996).

O significado funcional das seqüencias de DNA não é relevante para seu

uso como alvo de amplificação na PCR, desde que seja específica do

organismo que se pretende estudar. O elemento IS6110 foi encontrado

somente em bactérias do complexo M. tuberculosis (M.tuberculosis, M. bovis,

M. microti e M. africanum). Tanto M. tuberculosis quanto M. bovis podem

causar tuberculose em humanos. No entanto, as rotas de infecção e a

apresentação clínica geralmente são diferentes, sendo que a doença causada

por M. tuberculosis é muito mais prevalente. IS6110 tem uma única cópia na

maioria das cepas de M. bovis e até 18 cópias em algumas cepas de M.

tuberculosis (Van Soolingen et al., 1993), porém raros isolados no sudeste

asiático não possuem esta seqüencia de inserção no seu genoma (Yuen et al.,

1993). Outros alvos de amplificação para PCR são possíveis e com vantagens

teóricas. Tem sido comum o uso de seqüencias de rRNA como alvo de

amplificação podendo ser transcritas reversamente a um DNA como alvo da

PCR (Böddinghaus et al., 1990).

Um dos primeiros trabalhos sobre a aplicação da PCR no diagnóstico da

tuberculose diretamente no escarro foi feito por Eisenach e colaboradores

(1990), com a amplificação de um fragmento de 123 pares de bases da região

IS6110 em 162 amostras. A sensibilidade e especificidade encontradas foram

de 96%. O trabalho demonstrou que a PCR foi capaz de diagnosticar

efetivamente casos de tuberculose pulmonar, além da capacidade de

diferenciar M. tuberculosis das micobactérias não tuberculosas. Uma limitação

DISCUSSÃO

deste trabalho foi não ter incluído grande número de amostras com

baciloscopia negativa e cultura positiva.

Trabalhos publicados para analisar a sensibilidade a especificidade da

PCR no diagnóstico de TBP foram elaborados a partir de amostras de

pacientes com diagnóstico definido (Cheng et al., 2004).

Recentemente, Scherer e colaboradores (2007) avaliaram o

desempenho dessa PCR in house (PCR dot-blot) para diagnosticar TBP a partir

de amostras de escarro com resultado de baciloscopia negativa em pacientes

portadores do HIV e com alta suspeita de TBP, obtendo 90% de sensibilidade e

71% de especificidade. Os resultados encontrados por esses autores estão de

acordo com a literatura, mostrando que os métodos moleculares podem

contribuir de forma efetiva para o diagnóstico de TBP nestes pacientes.

Tanto Sperhacke e colaboradores (2004) como Scherer e colaboradores

(2007) avaliaram a eficácia da PCR in house tendo como foco a detecção dos

produtos amplificados através de colorimetria em suporte sólido. No nosso

trabalho, usando o mesmo protocolo de PCR in house padronizado por

Sperhacke, a detecção dos produtos amplificados foi feita em placa amino link,

para avaliar sua aplicabilidade na rotina diagnóstica da rede de saúde pública.

Este trabalho é o primeiro à apresentar a aplicabilidade do teste na rotina de

um Hospital Geral Universitário.

Quando comparamos os resultados laboratoriais relacionados ao

diagnóstico clínico verificamos que dos 111 (76,0%) pacientes com outro

diagnóstico clínico (diferente de qualquer apresentação de TBP) 2 (0,01%)

pacientes apresentaram resultado positivo na PCR colorimétrica da ANP sendo

que nas baciloscopias e cultura os resultados foram negativos.

DISCUSSÃO

Por outro lado, 3 pacientes apresentaram resultado positivo na PCR

colorimetrico do sedimento sendo que com os outras métodos o resultado foi

negativo (Apêndice 4). Dois pacientes apresentaram resultado positivo na

cultura com resultados negativos com os outros métodos utilizados. Dentre os

grupos com diagnóstico de TBP associado ou não a outra doença, os

resultados dos outros métodos aplicados nas amostras foram negativos nos

pacientes nº 11, nº 30, nº 123 e nº 124 (Apêndices 1 e 2). Encontrou-se ainda

resultados negativos com pelo menos um dos métodos, nos seguintes

pacientes: nº 64, nº 94, nº 102, nº 104, nº 131 e nº 136 (Apêndices 1 e 2).

Resultados falso-positivos foram observados na seguinte proporção:

1,8% para a PCR colorimétrica da ANP e cultura e 2,7% na PCR colorimétrica

do sedimento. Os resultados falso-negativos foram mais discrepantes em todos

os métodos, como se segue: 68,6% na baciloscopia direta, 71,4% na PCR

colorimétrica da ANP e do sedimento, 57,1% na baciloscopia do sedimento e

45,7% na cultura. Para evitar esses problemas vários autores recomendam

monitorar as seguintes situações: a) inibição da Taq polimerase, b) distribuição

não homogênea dos bacilos nas amostras paucibacilares, c) volume e

quantidade dos espécimes analisados (Martins, 2000).

Saboor e colaboradores (1992) relataram resultados de PCR positivo

para M. tuberculosis em pacientes com sarcoidose e salientaram que esta é

uma doença granulomatosa de causa não definida, mas com características

histológicas similares a da tuberculose. Mitchell e colaboradores (1992) em um

estudo sobre detecção de rRNA de micobactérias em sarcoidose sugeriram

que um agente micobacteriano poderia contribuir para a patogenia da doença.

DISCUSSÃO

Possíveis resultados falso-positivos já foram relatados por Reischl e

colaboradores (1998) em amostras extrapulmonares de pacientes com suspeita

de TB, porém com diagnóstico clínico de câncer e em pacientes que faziam

uso de quimioterápicos. Outros autores também relataram resultados falso-

positivos presentes em espécimes de biópsia de pulmão e linfonodos e

aspirados provenientes de pacientes com leucemia, câncer ou pacientes

imunocomprometidos (coinfectados com HIV, transplantados, e tratados com

corticosteróides). Estes sítios como pulmão e linfonodos podem albergar M.

tuberculosis na sua forma latente, onde a reativação e a replicação são

favorecidas em pacientes com este perfil (Hellyer et al., 1996; Honoré-

Bouakline et al., 2003).

As reações de PCR colorimétrica da ANP e do sedimento, apresentaram

resultados positivos nas amostras de 10 pacientes (4,8% e 4,7,

respectivamente). O teste apresentou sensibilidade de 28,6% [índice de

confiança (IC)= 13,6-43,5], nas reações preparadas sobre ANP e sedimento.

Com relação à especificidade apresentou melhor resolução [98,2%, IC= 95,6-

100,7] nas reações realizadas com sedimento. Conclui-se que a PCR

colorimétrica é pouco sensível, mas muito específica e tem acurácia de 81,3%

e 80,8% para as reações sobre ANP e sedimento, respectivamente (Tabela

XXVIII).

A estimativa de indivíduos realmente portadores de TBP, calculada pelo

valor preditivo positivo foi de 83,3% (PCR colorimétrica de ANP) e 76,9% (PCR

colorimétrica do sedimento) (IC= 54,0-104,4) e a estimativa de indivíduos

realmente negativos foi calculada pelo valor preditivo negativo que resultou em

81,1% (IC=74,4-87,8), para a ANP e sedimento em ambos os cálculos.

DISCUSSÃO

A razão das probabilidades ou de verossimilhança (Vr) que indica a

possibilidade do resultado do teste apresentar o resultado mais condizente com

a verdade foi de Vr positivo=15,6 e 10,6, respectivamente para teste sobre

ANP e sedimento. Quanto maior o valor de Vr positivo, maior a sua capacidade

de diagnosticar a doença em pacientes com teste negativo, sendo considerado

bons os valores superiores a 1,0, valores entre 1,0 e 0 diminuem a

probabilidade da doença, e quanto mais próxima de zero for a VR negativo

para a presença do achado, mais forte o argumento contra a doença.

A fim de proporcionar dados mais substanciais sobre a validade

diagnóstica de um teste, atualmente, recomenda-se que além dos valores de

especificidade e sensibilidade, sejam calculados a razão de probabilidade

(likelihood ratio) e as probabilidades pré e pós-teste. A razão de probabilidade

indica o número de vezes que o exame é positivo entre portadores da doença

em questão, em relação a falsos positivos. A probabilidade pré-teste estima a

chance do exame ser positivo levando-se em consideração a prevalência.

Considera-se dessa forma que quando o teste de PCR colorimétrica foi

realizado com a ANP as chances de que um paciente com teste positivo,

aumentou de 24,3% para 83,3,% (Figura 7).

Os índices de positividade do teste in house PCR colorimétrico foram

menores para diagnóstico de TBP com respeito aos outros testes (cultura e

baciloscopia) (p=0,00), conforme verificado pelo teste do X

(dados não

mostrados). Uma vez que o valorde p não foi significativo o valor do coeficiente

kappa, considerando o total de amostras clínicas apresentou boa concordância

(kappa = 0,6 e 0,5 para PCR colorimétrica ANP e PCR colorimétrica do

sedimento, respectivamente), mas quando calculamos a concordância do teste

DISCUSSÃO

com respeito ao diagnóstico clínico de TBP obteve-se fraca concordância.

(coeficiente kappa = 0,41 e 0,33 para PCR colorimétrica ANP e PCR

colorimétrica do sedimento, respectivamente).

Atualmente é possível adquirir kits comerciais, para realizar o

diagnóstico de tuberculose pela técnica de PCR, no entanto o custo desses kits

é elevado. A implementação da PCR in house, além de diminuir o custo,

introduz o uso de novas tecnologias que possibilitam avanços no estudo das

micobactérias, considerando as inúmeras aplicações que podem oferecer,

como por exemplo, em estudos de susceptibilidade as drogas do M.

tuberculosis, pesquisa epidemiológica e molecular de surtos, testes

diagnósticos e avaliação da resposta ao tratamento, entre outras. Ainda, se

considerarmos o custo da internação de um paciente sem diagnóstico e o risco

de transmissão da doença, principalmente no ambiente hospitalar, a PCR terá

boa relação custo-benefício se bem indicada (Bollela, 2000).

Kritski e colaboradores (1998) afirmaram que a interpretação clínica de

um resultado de PCR positivo para TB no escarro, bem como a sua utilidade

em outros tipos de espécimes clínicos ainda não estariam bem estabelecida.

Se interpretarmos os resultados de acordo com a doença pré-teste os

pacientes com elevada suspeita clínica de TBP, com baciloscopia direta

negativa e teste PCR positivo, teriam indicação de início de terapia anti-TB, de

isolamento respiratório (quando internados em hospital geral) e avaliação dos

contatos intradomiciliares. Nos casos com baixa suspeita clínica de TBP,

exame baciloscópico positivo e teste PCR negativo, deve-se realizar

investigação maior na direção de uma micobactéria não tuberculosa.

DISCUSSÃO

Em 1998, Foulds e O`Brien pronunciaram-se no programa global de

tuberculose da WHO com o objetivo de estimular e facilitar os estudos de

novos testes para o diagnóstico da tuberculose. Como este programa enfatiza

a implementação do diagnóstico da tuberculose paucibacilar. Martins e

colaboradores (2000) sugeriram estudos regionais, em grupos específicos de

pacientes, para definir as situações em que seria útil implantar a técnica de

amplificação de ácidos nucléicos. Os laboratórios funcionariam como centros-

pilotos e deveriam ser de nível II ou III, conforme indicado no “Workshop”

relatado pela American Thoracic Society (1997). Estes deveriam possuir área

exclusiva para os testes de amplificação de ácidos nucléicos e contar com

profissionais para atuar na área de isolamento, identificação e teste de

sensibilidade de micobactérias e outros profissionais para realizar os testes de

amplificação de ácidos nucléicos.

De acordo com Bollela (2000), a PCR deve ser considerada e estaria

indicada em algumas situações, tais como pacientes com forte suspeita de TBP

em que foi preciso internação para confirmação diagnóstica, pacientes graves,

especialmente com SIDA, com suspeita de tuberculose, pacientes

paucibaciliferos em que se considere o início da terapêutica empírica,

pacientes infectados pelo HIV, particularmente aqueles com níveis de células

CD4

menores que 100 células/mm

, em que, apesar da baciloscopia positiva,

exista dúvida entre infecção por M.tuberculosis e /ou outras micobactérias.

É importante lembrar que a sensibilidade e especificidade do teste

diagnóstico não dependem da população, ou localidade em que o teste será

utilizado, pois são características do teste. Se realizado conforme

padronização, espera-se resultados reprodutíveis e constantes. No entanto, os

DISCUSSÃO

valores preditivos positivo e negativo são variáveis dependentes da prevalência

da doença na população onde o teste será empregado. O conhecimento sobre

essa questão é fundamental na avaliação de um teste que se pretenda

implantar na rotina diagnóstica da doença (Arias et al., 2007).

Quando se analisa um novo método, o desempenho do teste padrão é

um parâmetro crítico. Para a detecção do M. tuberculosis, a cultura pode ser

considerada o “gold standard”, por ter especificidade de 100% e sensibilidade

de aproximadamente 90% (Bates, 1979). No entanto em nosso caso a

sensibilidade da cultura foi de 54,3% e especificidade de 98,2% quando

considerado o diagnóstico clínico. Este trabalho demonstrou que um teste de

PCR colorimétrico foi capaz de detectar (em amostras clínicas pulmonares, em

que poderiam estar presentes várias substâncias inibidoras da PCR) 28,6%

das amostras com especificidade de 98,2% e 97,3% quando aplicado na ANP e

sedimento, respectivamente.

As técnicas de PCR para diagnóstico de micobactérias se constituem em

metodologias importantes para o diagnóstico da TBP, uma vez que os

benefícios da rapidez com que podem identificar um caso justificam a sua

implantação e uso rotineiro, associada aos métodos clássicos, em unidades

com alta demanda e em pacientes com TBP de difícil diagnóstico.

Nossos resultados demonstraram que a técnica de PCR in house com

detecção colorimétrica é importante como complemento para o diagnóstico da

tuberculose, pois apresenta resultados de sensibilidade adequados quando

comparados com a baciloscopia e/ou cultura e possibilita maior rapidez no

resultado. Este teste poderia ser útil para implementar o diagnóstico rápido da

tuberculose paucibacilar, que geralmente apresenta, baciloscopia negativa.

CONCLUSÕES

7. CONCLUSÕES

CONCLUSÕES

 O teste in house de PCR colorimétrico apresentou uma boa

concordância com os métodos de bacterioscopia e cultura

utilizados na rotina laboratorial em um Hospital Geral Universitário

para o diagnóstico de TBP, com baixa sensibilidade e alta

especificidade;

 O teste in house de PCR colorimétrico em relação ao diagnóstico

clínico evidenciou boa acurácia, elevados valores preditivos

(positivo e negativo) e alta probabilidade positiva pós-teste.

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8 - REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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ANEXOS

9. ANEXOS

ANEXOS

100

Anexo 1. Protocolo Clínico

Observação 0 sim 1 não 9 ignorado

Paciente: RH:

Sexo: M F Idade: anos Enfermaria:

Admissão no PS: Horário: Transferência: local ?

amostras colhidas

. fonte Data solicitação: Data coleta: Data resultado:

BAAR: (+) (-) Cultura: (+) (-) identificação

. fonte Data solicitação: Data coleta: Data resultado:

BAAR: (+) (-) Cultura: (+) (-) identificação

. fonte Data solicitação: Data coleta: Data resultado:

BAAR: (+) (-) Cultura: (+) (-) identificação

Isolamento respiratório 0 1 9

Início da terapêutica: / / Drogas:

Co-morbidades e hábitos: 0 1 9

Etilismo 0 1 9 Tabagismo 0 1 9 DM S N I 0 1 9

UDEV 0 1 9 Corticoterapia 0 1 9

imunossupresora

TX – especificar 0 1 9

HIV colhido (0 1 9) Positivo (0 1 9) em / / Uso ARV (0 1 9)

Quais:

CD4: em / / CV: ou Log em / /

Doença oportunista associada ao HIV:

Queixa principal: e tempo em semanas

Tosse 0 1 9 Febre 0 1 9 Hepatoesplenomegalia 0 1 9

Expectoração 0 1 9 Sudorese noturna 0 1 9 SNC 0 1 9

Hemoptise 0 1 9 Cefaléia 0 1 9 Irritação meníngea 0 1 9

Emagrecimento 0 1 9 Confusão 0 1 9 Outros:

Dispnéia 0 1 9 Adenomegalia 0 1 9

PPD realizado 0 1 9 Se realizado: mm

Forma Clínica

Disseminada 0 1 9 Pulmonar bacilífera 0 1 9 Pulmonar não bacilífera 0 1 9

Uro-genital 0 1 9 SNC 0 1 9 Óssea 0 1 9

Ganglionar 0 1 9 Pleural 0 1 9 Articular 0 1 9

Pulmonar miliar 0 1 9 HMC 0 1 9 Outra 0 1 9

Diagnóstico:

Baciloscopia 0 1 9 Baciloscopia e Cultura 0 1 9 Anátomo patológico 0 1 9

Cultura 0 1 9 Clínico - tto de prova 0 1 9 Exames / imagem 0 1 9

QC / imagem 0 1 9

RX:

Normal 0 1 9

Caverna 0 1 9

Padrão Típico

Padrão Atípico Padrão Compatível

Anátomo – Patológico: 0 1 9

Inflamatório inespecífico 0 1 9 Granuloma sem necrose caseosa 0 1 9

Granuloma com necrose caseosa 0 1 9 Outro

Evento atual:

Primeiro episódio 0 1 9 Falha terap. 0 1 9 Tto após abandono 0 1 9 Novo episódio 0 1 9

qdo qdo qdo Qdo

Complicações durante a internação: descrever

Data da Alta: Óbito: 0 1 Data do óbito: / /

Preenchido por: Data: / /

Universidade Federal de São Paulo

Hospital São Paulo

Escola Paulista de Medicina Ficha de Acompanhamento / TB

ANEXOS

101

Anexo 2. Parecer do Comitê de Ética em Pesquisa – CEP/UNIFESP

ANEXOS

102

Anexo 3. Protocolo e POP do Setor de Micobactérias da Seção de

Microbiologia do Laboratório Central do Hospital São Paulo – HSP

BACILOSCOPIA

Principio da Metodologia

As micobactérias possuem uma parede celular constituída de ácidos micólicos

resistentes à descoloração por álcool-ácido, elas possuem uma notável propriedade:

dificilmente tomam os corantes básicos de anilina, mas, uma vez coradas, fixam-nos

de tal forma que não se descoram pela ação diferenciadora do álcool-ácido (álcool e

ácidos numerais fortes diluídos). Essa é a propriedade que se conhece por álcool-

ácido resistente.

Essa coloração é o método mais rápido para a detecção de micobactérias em

amostras clínicas.

Tipo de amostras

As amostras são obtidas de material orgânico do trato respiratório inferior, tecidos,

líquidos em geral, fezes, linfa de lóbulo de orelha, mucosa nasal, lavado gástrico,

escarro, líquidos orgânicos, biópsias de tecidos e urina.

Rejeição

Frasco com salivas.

Liberação do resultado:

Resultado negativo: não foram observados bacilos álcool-ácido resistentes na amostra

analisada. Reportar: Pesquisa de BAAR negativa.

Resultado positivo: presença de bacilos álcool-ácido resistentes na amostra analisada.

(consultar Tabela 1).

Tabela 1. Guia para liberação do resultado pela Coloração Ziehl-Neelsen.

Ziehl-Neelsen Resultado

0/100 campos

Não foram encontrados BAAR em 100 campos observados.

menos de 1 bacilo/100 campos

+ Presença de menos de 1 BAAR em 100 campos

observados.

1 a 10 bacilos/50 campos

++ Presença de 1 a 10 BAAR em 50 campos observados.

Mais de 10 bacilos/20 campos

+++ Presença de mais de 10 BAAR em 20 campos

observados.

PETROFF

Princípio do Teste

A digestão do material permite a concentração do BAAR por sedimentação e a

descontaminação permite o crescimento sem alteração do pH do meio.

Critérios de Rejeição da Amostra:

Escarro  saliva ou em temperatura ambiente por mais de 6 horas.

Urina  urina de 24 horas ou em temperatura ambiente por mais de 6 horas.

Biópsia  em formol ou em temperatura ambiente por mais de 6 horas.

ANEXOS

103

Lavado brônquico alveolar  em temperatura ambiente por mais de 6 horas.

Líquidos orgânicos  em temperatura ambiente por mais de 6 horas.

Secreções em geral  em temperatura ambiente por mais de 6 horas.

Secreções em culturete.

Líquidos orgânicos, sangue e medula óssea  em frasco Bactec de aeróbio ou

anaeróbio.

CULTURA E IDENTIFICAÇÃO (NIACINA)

Procedimento (passo a passo):

- Os frascos de meio LJ ficam na estufa por 8 semanas e as leituras são feitas uma

vez por semana até completar 2 meses.

- Observar se tem crescimento, caso tenha, separar para identificação e repicar.

- Fazer uma lâmina de Ziehl Neelsen da colônia para observar se é bacilo álcool ácido

resistente.

- Crescimento sugestivo de micobactéria: colônia bege à palha e com tempo de

crescimento à partir de 3 semanas.

Fazer o teste de niacina:

Procedimento:

a) adicionar 1mL de água destilada estéril no tubo de LJ com 4 semanas de

crescimento, fazendo alguns cortes no meio com auxilio da alça, a fim de favorecer a

liberação da niacina;

b) deixar o tubo em posição horizontal durante 10 minutos, e após este período,

transferir 0,6 mL, desta solução (procure não aspirar colônia) para um tubo com tampa

de rosca, de 90x120 mm;

c) introduzir a fita de niacina na suspensão, com a parte plástica para cima. Agitar

suavemente o tubo na vertical, mantendo-o nesta posição durante 20 minutos;

d) realizar a leitura, observando a mudança de coloração na suspensão: o

aparecimento de coloração amarela indicará teste positivo (fazer juntamente com o

teste um controle positivo e um negativo: para o controle negativo ATCC M. bovis;

para o controle positivo usar a cepa ATCC 25177 M. tuberculosis;

e) o teste de niacina deve ser realizado em tubo hermeticamente fechado, a fim de

evitar a saída de cloreto crianogênico, que é um gás volátil e constitui um dos

principais elementos da reação.

Leitura do teste da niacina:

Depois do tempo esperado, realizar a leitura, observando a mudança de coloração na

suspensão. O aparecimento de coloração amarela indica teste POSITIVO, e

transparente NEGATIVO.

Teste Positivo: Mycobacterium tuberculosis

Teste Negativo: Micobactérias não complexo M. Tuberculosis.

APÊNDICES

104

10. APÊNDICES

APÊNDICES

105

Apêndice 1. Grupo de pacientes com diagnóstico clínico de TBP sem associação a outras doenças

0: resultado positivo; 1: resultado negativo; 4: diagnóstico clínico de TBP

• nº 30 e nº 124, que de acordo com a ficha clínica tiveram antecedente de TBP tratada em 1998 e 2003, respectivamente.

Paciente

Baciloscopia

direta

colorimétrico

ANP

Baciloscopia

sedimento

colorimétrico do

sedimento Cultura Dx.TBP TBPHIV+/- Dx.clínico

Tratamento

prévio

4 0 0 0 0 0 0 4 TBP 1

8 0 0 0 0 0 0

TBP 1

20 1 0 0 0 0 0

TBP 1

30 1 1 1 1 1 0

TBP 1

64 1 1 0 1 0 0

TBP 1

65 0 0 0 0 0 0

TBP(reativada) 0

94 1 0 1 1 0 0

TBP 1

102 1 1 0 0 0 0

TBP 1

104 0 0 0 1 0 0

TBP 1

124 1 1 1 1 1 0

TBP(reativada) 0

131 1 1 0 1 0 0

TBP tratada há 3

meses 0

136 0 1 1 1 1 0

TBP(reativada) 0

APÊNDICES

106

Apêndice 2. Grupo de pacientes com diagnóstico clínico de TBP associado a outras doenças

Paciente

Baciloscopia

direta

colorimétrico

ANP

Baciloscopia

sedimento

colorimétrico do

sedimento Cultura Dx.TBP TBPHIV+/- Dx.clínico

Tratame

nto

prévio

11 1 1 1 1 1 0 2 TBP+DPOC 1

28 0 1 0 1 0 0 2 TBP \neoplasia pancreas 1

33 0 0 0 0 0 0 2 TBP/DPOC/Pneumonia 1

84 1 0 1 0 1 0 2

TBP/pancreatite

crônica/diabetes

123 1 1 1 1 1 0 2 TBP /linfoma de hodgkin 0

139 0 1 0 0 0 0 2 TBP/ TBganglionar 1

0: resultado positivo; 1: resultado negativo; 2: diagnóstico clínico de TBP associado a outras doenças

• o paciente nº 11, diagnosticado como DPOC e seqüela de TBP (primeiro episódio em 1992);

• o paciente nº28 apresentou resultado da PCR colorimétrica (ANP e sedimento) mas com cultura positiva que foi

identificada com Mycobacterium fortuitum. No momento da internação apresentava tosse, dispnéia e adenomegalia. O

Rx de tórax demonstrou infiltrado intersticial nodular difuso e pneumotórax; com o suporte de exames específicos foi

diagnosticado como sepse grave, pneumonia hospitalar e TBP;

• o paciente nº 84, gênero masculino, de 52 anos, etilista, tabagista foi internado por apresentar tosse, expectoração

emagrecimento, dispnéia e febre. O Rx de tórax revelou grande cavitação, sugestiva de TBP, foi diagnosticado como

portador de pancreatite, diabetes e TBP;

APÊNDICES

107

• o paciente nº123, diagnosticado com Linfoma de Hodgkin e com início de tratamento para TB em agosto de 2005 sendo

que foi incluido no estudo na internação de setembro 2005;

• o paciente 139 foi internado por apresentar emagrecimento, dispnéia, febre, sudorese noturna, cefaléia e adenomegalia

cervical. O Rx de tórax mostrou alargamento mediastinal e infiltrado pulmonar reticular difuso. Foi solicitada biópsia de

gânglio cervical, que foi positiva para presença de BAAR; para amostra de escarro só a PCR colorimétrica da ANP

apresentou resultado negativo;

APÊNDICES

108

Apêndice 3. Grupo de pacientes com diagnóstico clínico de TBP associado à infecção pelo HIV

Paciente

Baciloscopia

direta

colorimétrico

ANP

Baciloscopia

sedimento

colorimétrico do

sedimento Cultura

Dx.

TBP

TBPHIV

+/- Dx.clínico

Tratamento

prévio

12 1 1 1 1 1 0 3 TBP/SIDA 1

15 1 1 1 1 1 0 3 TBP/SIDA 1

40 1 1 1 1 1 0 3 SIDA/TBP /Pneumonia 0

49 0 0 0 0 0 0 3 TBP/TB ganglionar/SIDA 1

60 1 1 0 1 0 0 3 TBP/SIDA/HCV 1

66 1 1 1 1 1 0 3 TBP/SIDA 0

68 1 1 1 1 0 0 3 SIDA/TBP/pneumonia 0

69 0 0 0 0 0 0 3 SIDA/TBP 1

71 1 1 1 1 1 0 3 SIDA/TBP 1

80 1 1 1 1 1 0 3 SIDA/TBP

101 1 1 1 1 0 0 3 SIDA/TBP

109 1 1 1 1 1 0 3 SIDA/TBP /Meningite 0

111 1 1 1 1 1 0 3

SIDA/HCV/HTLV/TBP em

tratamento 0

121 1 1 1 1 1 0 3 SIDA/TBP 0

128 1 1 1 1 0 0 3 SIDA/TBP/TB gnglionar 1

143 1 1 1 1 1 0 3 SIDA/HBVC/TBP 1

147 0 1 0 1 0 0 3 SIDA/TBP 1

0: resultado positivo; 1: resultado negativo; 3: diagnóstico clínico de TBP + HIV

APÊNDICES

109

• os pacientes nº 12, nº 15, nº 40, nº 66, nº 71, nº 80, nº 109, nº 111, nº 121, nº 143 constituem um grupo que têm em

comum serem portadores de HIV, apresentarem no momento da internação outras infecções e TBP diagnosticada.

Alguns dos casos tiveram tratamento interrompido por complicações hepáticas;

• e os pacientes n° 60, nº 68, nº 101, nº 128, nº 14 7 que têm em comum serem portadores do HIV com diagnóstico

anterior de TBP e que quando foram internados apresentavam outra infecção concomitante com TBP.

APÊNDICES

110

Apêndice 4. Grupo de pacientes com outros diagnósticos clínicos

Paciente

Baciloscopia

direta

colorimétrico

ANP

Baciloscopia

sedimento

colorimétrico do

sedimento

Cultura Dx.TBP TBPHIV+/- Dx.clínico Tratamento prévio

1 1 1 1 1 1 1 DPOC 1

2 1 1 1 1 1 1

Insuficiencia renal

aguda 1

3 1 1 1 1 1 1 1 Pneumonia 1

5 1 1 1 1 1 1 1 Pneumonia 1

6 1 1 1 0 1 1 1

Insuficiciência renal

crônica 1

7 1 1 1 1 1 1 1 Pneumonia 1

9 1 1 1 1 1 1 1 SIDA/pneumonia 1

10 1 1 1 1 1 1 1

Neoplasia

pulmonar 1

13 1 1 1 1 1 1 1 Linfoma não-Hodgkin 1

14 1 1 1 1 1 1 1

Aneurisma Aorta

Abdominal 1

16 1 1 1 1 1 1 1 Pneumonia 1

17 1 1 1 1 1 1 1

IInsuficiêmcia

Cardíaca

18 1 1 1 1 1 1 1 Espondilite aquilosante

19 1 1 1 1 1 1 1 DPOC 1

21 1 1 1 1 1 1 1 Cisto intracerebelear 1

22 1 1 1 1 1 1 1 Pneumonia 1

23 1 1 1 1 1 1 1 Linfoma de Hodgkin 1

24 1 1 1 1 0 1 1 Tumor de laringe 1

25 1 1 1 1 1 1 1 Neoplasia de prostata 1

26 1 1 1 1 1 1 1 DPOC 1

27 1 1 1 1 0 1 1 SIDA/TBganglionar 1

29 1 1 1 1 1 1 1 Pneumonia 1

31 1 1 1 1 1 1 1 SIDA/PNF 1

APÊNDICES

111

Paciente

Baciloscopia

direta

colorimétrico

ANP

Baciloscopia

sedimento

colorimétrico do

sedimento

Cultura Dx.TBP TBPHIV+/- Dx.clínico Tratamento prévio

32 1 1 1 1 1 1 1 Neoplasia de próstata. 1

34 1 1 1 1 1 1 1 Bronquiolite 1

36 1 1 1 1 1 1 1 Tb gantiglionar 1

37 1 1 1 1 1 1 1 TB urogenital 1

38 1 1 1 1 1 1 1 Isuficiência cardíaca 1

39 1 1 1 1 1 1 1 Bronquiectasia 1

41 1 1 1 1 1 1 1 Neoplasia de bexiga 1

42 1 1 1 1 1 1 1 SIDA/pneumocistose 1

43 1 1 1 1 1 1 1 SIDA/Pneumocistose 1

44 1 1 1 1 1 1 1 Sepsis 1

45 1 1 1 0 1 1 1 DPOC 1

46 1 1 1 1 1 1 1 Pneumonia 1

47 1 1 1 1 1 1 1 Broncoespasmos 1

48 1 0 1 1 1 1 1

Insuficiencia renal

crônica/pneumonia 1

50 1 1 1 1 1 1 1 Porfiria 1

51 1 1 1 1 1 1 1 SIDA/Sepse 1

52 1 1 1 1 1 1 1 DPOC 1

53 1 1 1 1 1 1 1 Pneumonia 1

54 1 1 1 1 1 1 1 Sepse 1

55 1 1 1 1 1 1 1 Lúpus/pneumonia 1

56 1 1 1 1 1 1 Insuficiência cardíaca 1

57 1 1 1 1 1 1 1 TBurogenital/ sepse 1

58 1 1 1 1 1 1 1 Bronquite 1

59 1 1 1 1 1 1 1 DPOC 1

61 1 1 1 1 1 1 1 Neoplasia de pulmão 1

62 1 1 1 1 1 1 1 Pneumonia 1

63 1 1 1 1 1 1 Lúpus 1

APÊNDICES

112

Paciente

Baciloscopia

direta

colorimétrico

ANP

Baciloscopia

sedimento

colorimétrico do

sedimento

Cultura Dx.TBP TBPHIV+/- Dx.clínico Tratamento prévio

67 1 1 1 1 1 1 1 DPOC 1

70 1 1 1 1 1

Hemorragia digestiva

alta 1

72 1 1 1 1 1 1 1 SIDA 1

73 1 1 1 1 1 1 1 SIDA 1

74 1 1 1 1 1 1 1 SIDA/Asma 1

75 1 1 1 1 1 1 1 Neoplasia de ovário 1

76 1 1 1 1 1 1 1 TB pleural 1

77 1 1 1 1 1 1 1

Laringotraqueo

bronquite 1

78 1 1 1 1 1 1 1 SIDA/Pneumocistose 1

79 1 1 1 1 1 1 Asma 1

81 1 1 1 1 1 1 1 Neoplasia de pulmão 1

82 1 1 1 1 1 1 1 Asma 1

83 1 1 1 1 1 1 1 Linfoma de Hodgkin 1

85 1 1 1 1 1 1 1 SIDA/Pneumonia 1

86 1 1 1 1 1 1 1 Neoplasia de pulmão 1

87 1 1 1 1 1 1 1 DPOC 1

88 1 0 1 1 1 1 1 Neoplasia de laringe 1

89 1 1 1 1 1 1 1 Pneumectomia 1

90 1 1 1 1 1 1 1 Bronquiectasia 1

91 1 1 1 1 1 1 Neoplasia de pulmão 1

92 1 1 1 1 1 1 1

SIDA+TB

gaglionar(M.avium) 1

93 1 1 1 1 1 1 1 Diabetes 1

95 1 1 1 1 1 1 1

Isuficiência renal

crônica 1

96 1 1 1 1 1 1 1 DPOC 1

97 1 1 1 1 1 1 1 SIDA/pneumonia 1

98 1 1 1 1 1 1 sepse 1

APÊNDICES

113

Paciente

Baciloscopia

direta

colorimétrico

ANP

Baciloscopia

sedimento

colorimétrico do

sedimento

Cultura Dx.TBP TBPHIV+/- Dx.clínico Tratamento prévio

99 1 1 1 1 1 1 1 Neoplasia hepáica 1

100 1 1 1 1 1 1 1 Isuficiência cardíaca 1

103 1 1 1 1 1 1 1 DPOC 1

105 1 1 1 1 1 1 Insuficiência cardíaca 1

106 1 1 1 1 1 1 1 DPOC 1

107 1 1 1 1 1 1 1 SIDA/TB gnaglionar 1

108 1 1 1 1 1 1 1

Insuficiência renal

crônica 1

110 1 1 1 1 1 1 Pneumonia 1

112 1 1 1 1 1 1 1 Ppneumectomia 1

113 1 1 1 1 1 1 1 DPOC 1

114 1 1 1 1 1 1 1 Pneumonia 1

115 1 1 1 1 1 1 1 SIDA// Choque séptico

116 1 1 1 1 1 1 1 Pneumonia 1

117 1 1 1 1 1 1 1 Linfoma de Hodggkin 1

118 1 1 1 1 1 1 1 Lobectomia pulmonar 1

119 1 1 1 1 1 1 1 Neoplasia de pulmão 1

120 1 1 1 1 1 1 1

HIV/

Pneumocistose 1

122 1 1 1 1 1 1 1 Bronquiectasia 1

125 1 1 1 1 1 1 1 SIDA/Pneumocistose 1

129 1 1 1 1 1 1 1

Hepatite auto-

imune/pneumonia

130 1 1 1 1 1 1 1 Lúpus 1

132 1 1 1 1 1 1 1

SIDA/INeoplasia

urogenital. 1

133 1 1 1 1 1 1 1 Pneumonia 1

134 1 1 1 1 1 1 1

Insuficiência renal

crônica 1

135 1 1 1 1 1 1

Leucemia mielóide

aguda/ sepse 1

APÊNDICES

114

Paciente

Baciloscopia

direta

colorimétrico

ANP

Baciloscopia

sedimento

colorimétrico do

sedimento

Cultura Dx.TBP TBPHIV+/- Dx.clínico Tratamento prévio

137 1 1 1 1 1 1 1 Pneumonia 1

140 1 1 1 1 1 1 1 SIDA/pneumocistoseT 1

141 1 1 1 1 1 1 1

SIDA/Abcesso

hepático 1

142 1 1 1 1 1 1 1 Embolia pulmonar 1

144 1 1 1 1 1 1 1 Neoplasia de pulmão 1

145 1 1 1 1 1 1 1

estenose de

traquéia/sepse 1

146 1 1 1 1 1 1 1 SIDA 1

148 1 1 1 0 1 1 1 DPOC 1

149 1 1 1 1 1 1 1 Lúpus/sepse 1

150 1 1 1 1 1 1 Pneumonia/ sepse 1

0: resultado positivo; 1: resultado negativo; 1: diagnóstico clínico não TBP

• paciente de nº 6 gênero masculino, 56 anos, tabagista internado por apresentar tosse, expectoração, dispnéia e febre. Foi

solicitado baciloscopia que resultou negativa e Rx com de discreto infiltrado na base pulmonar Esquerda. Odiagnostico final

foi de sepse, com foco pulmonar, e Insuficiência Respiratória;

• paciente nº 24, gênero masculino, de 61 anos com diagnóstico de tumor na corda vocal esquerda;

• paciente nº 27, gênero feminino, de 26 anos, portadora do HIV, internada por apresentar febre, adenomegalia e

emagrecimento. A baciloscopia resultou negativa e o Rx de tórax revelou presença de infiltrado intersticial bilateral e

velamento da base pulmonar esquerda, sendo o diagnóstico final de Tuberculose Ganglionar (TBG+SIDA);

• paciente nº 45 gênero feminino de 80 anos, foi internada por apresentar tosse, dispnéia, edema de membro inferiores.

Solicitou-se baciloscopia que resultou negativa. Este resultado complementado com outros exames específicos levou ao

APÊNDICES

115

diagnóstico final de Pneumonia, Doença Pulmonar Obstrutiva Crônica (DPOC), Diabetes Mellitus e Insuficiência Renal

Crônica;

• o paciente nº 48, gênero masculino, 34 anos, etilista, tabagista e usuário de drogas foi internado por apresentar tosse,

dispnéia e febre. Foi solicitado, além da baciloscopia, o exame de sorologia para HIV que resultou negativo, Rx de tórax

evidenciando cardiomegalia e Tomografia Computadorizada de Tórax com laudo de infiltrado peribrônquico-vascular. O

diagnóstico conclusivo foi de Pneumonia com Insuficiência Respiratória;

• o paciente nº 88, gênero masculino, 46 anos, etilista, tabagista foi internado por apresentar abscesso cervical, tosse,

expectoração, emagrecimento, febre, cefaléia, adenomegalia. Com antecedente de laringectomia total foi solicitada

baciloscopia de escarro que resultou negativa. O diagnostico clínico foi de Câncer de laringe;

• paciente nº 148, gênero masculino, 64 anos, tabagista em uso de corticosteróides no momento da internação apresentou

tosse e febre sendo diagnosticado Enfisema pulmonar. Solicitou-se baciloscopia que resultou negativa e o diagnóstico final

foi de úlcera duodenal, broncopneumonia e DPOC.

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