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f|Ää|É ftÇàtÇt WÉÄtuxÄÄt
ESTUDO COMPARATIVO DA PATOGENICIDADE
E VIRULÊNCIA DE Entamoeba dispar COM
AMOSTRAS DE Entamoeba histolytica
Belo Horizonte, MG
2007
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Livros Grátis
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I
Universidade Federal de Minas Gerais
Instituto de Ciências Biológicas
Departamento de Parasitologia
ESTUDO COMPARATIVO DA PATOGENICIDADE
E VIRULÊNCIA DE Entamoeba dispar COM
AMOSTRAS DE Entamoeba histolytica
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em
Parasitologia do Instituto de Ciências Biológicas da
Universidade Federal de Minas Gerais, como parte dos
requisitos para obtenção do grau de Doutor.
f|Ää|É ftÇàtÇt WÉÄtuxÄÄt
Orientador: Prof. Dr. Edward Félix Silva
Belo Horizonte, MG
2007
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II
043
D659e
Dolabella, Silvio Santana.
Estudo comparativo da patogenicidade e virulência de
Entamoeba dispar com amostras de Entamoeba histolytica
[manuscrito] / Silvio Santana Dolabella. – 2007.
xviii, 120 f. : il. ; 29,5 cm.
Orientador: Edward Félix Silva.
Tese (doutorado) – Universidade Federal de Minas Gerais,
Departamento de Parasitologia.
1. Entamoeba dispar - Teses. 2. Entamoeba histolytica – Teses. 3.
Amebíase/patogenicidade – Teses. 4. Amebíase/virulência- Teses I. Silva,
Edward Félix. II. Universidade Federal de Minas Gerais. Departamento de
Parasitologia. III. Título.
III
Trabalho realizado no Laboratório de Amebíase e
Protozoários Intestinais do Departamento de Parasitologia,
Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal
de Minas Gerais e nos Laboratórios de Patologia Geral
e Biologia Celular do Centro de Investigação e Estudos
Avançados do Instituto Politécnico Nacional-México, com o
auxílio financeiro da Coordenadoria de Aperfeiçoamento
de Pessoal de Nível Superior (CAPES) e Fundação de
Desenvolvimento e Amparo à Pesquisa do Estado de Minas
Gerais (FAPEMIG).
IV
À min ha famíl ia .
V
AGR A DE C IMENTOS
Ao Profes s o r Edward Félix Sil va pe l a ori e nt a ção, incen ti v o, cari nh o e
pela s incera e v aliosa amizade.
Ao Progr ama de P ós-Gra duação em P a r asitol o gi a pela con fi an ça,
apoi o, cob r anças e f acilidad e s conc e d id as para a r eali z a ç ã o deste
trab a l h o.
A C AP ES (Coordenadori a de Ap e rfeiço ame nt o de P essoal de Nível
Superi or), p el a conc e s s ão d a bolsa d e d o u torado e pel a op ort uni d ade d e
estuda r em outro pa í s , através do Progr a m a de Dout o r ado co m Estági o
no Ex t e rior ( P D E E).
A Rosária, qu e nov amente aceit ou minha s longa s noite s em fr e nte ao
comp ut ad o r, pela co m pre e ns ão nos m om entos de au s ência e pelo
incent ivo.
Ao s am i gos do Laborat ó rio de Am ebí ase, Edna Ma ria Pires e João da
Cost a Via n a, pel o ap oio i nco ndicional , pac i ência e c o n s t ante
dispo n i bilidad e na realiz a ç ão dos ex perim e nt os.
A Michell e Ri bei r o , am i ga de toda uma jorna d a, pel o ca r inho, ap oio,
ami z a d e e alegri as co mp arti lhadas.
Ao am i go Fran cesco Iu d i ci Neto, po r sua am iz a de e est ímulos.
Ao s ami gos de Pó s -Graduação Haendel G onçal ves e H e l en C ris tin e,
pelo com p anheirismo.
VI
Ao s P ro fesso res Orival do A lv es Rocha e Anilton C e sar Vasco n c elos,
do Dep a rtamento de Pat ologia do IC B / U F MG, pel a valios a col abora ç ão
na p a rt e de p at ol o gia.
Ao Profes s or R i cardo Wagn er de Alme i d a V ito r, por seu exem plo e
cons id eração.
Ao s Drs . Mi n eko Shibayama e Vi ctor Tsut su mi , pe s quisadores d o
Depart amento d e Pat ol o gi a Experi men t al do Ce nt ro d e Inves t i g ação e
Est udos Ava n ç ados do Institut o Poli t é c nico Naci on a l – Méx i co
(CINVES TAV), pel a at enção e ori e nt ação no desenvol viment o de part e
dest e t ra b alho.
Ao s demais i nt e gra n t es d o D e p a rtamen to d e P atologia Ex perim e ntal do
Centro d e In v e s t i gação e Es tudos Avançados do Insti tut o P oli t é cnico
Nacio n al – México, que me pro porcion aram um est á gi o tranqui l o e um
ótim o am bi ent e d e t r a b alho: Sil vi a G a l i n do G ómez, An g é lica Silv a
Oli var e s, M ire ya S ánchez Pal o m ero, D a goberto Carr a s co, J u dith
Pach e c o Yép ez , M a rth a Du eñas e Jesú s Serran o Lu na. Um carinho
especi al aos amigo s que a vida m e d e u a o po rtunid ade de c onhecer:
Isaac C ervant e s Sandov al , Juan M a nuel Gu ti érr ez Meza e M a ría
Fer n and a López G óm ez, os l ev o em m eu coração .
Ao Dr. Fernando Na v a r r o Garcí a, pesq ui sa do r d o Depart a mento d e
Biol ogi a Cel ular do CINVE S T AV, que tão gentilm ent e m e aux i liou nos
ex peri m e ntos com cult ivos de célu l as M DCK. Um a gradecimento
especi al a Rocí o Hu ert a Can t illo, aux i liar d e in v est i gaçã o e que me
acomp anhou em gran de p art e do s experim e ntos neste l a b o r atório, m uito
obri ga d o .
A Prof e ssora Al an e Beatriz Verm elho, qu e gentilm ent e m e abriu as
port as de seu lab ora t ó rio e m e apoiou n os ex perim entos de p rot e a ses e a
toda a equip e do La b o r a t óri o de Pro t eas es de Micr o organ is mos: An a
Mari a M az otto de A l m e id a, Barb a r a Gabri ela B r u n de P ai v a Lopes,
VII
Edi lma P arag u ai de Souza Di as, Ana Crist i n a No gu ei r a de Me l o , Ana
Lúci a V azquez Villa e T h alita R o d rigue s Du arte.
A t od os o s p r o fes s o r es do c u rs o de P ós -Gr a duação em P aras it ologi a,
pela contribu i çã o em m i nh a form ação acadêm i ca .
A S um ar a A p arec i d a Guilherm e, secr e t ár i a de P ós -G r a duação, p el a
dispo n i bilidad e , ince n t ivo e co m p r e ens ão, m uito ob ri gado.
A t od os aqu eles que, direta o u indi r etament e, p arti ci p aram dest e
trab a l h o e não foram cit a dos.
A Força S uperi o r, q u e t o d os os di as gui a m eu s pass os e me d á fo r ç as
para t rilhar o c amin h o es c olhido.
VIII
“Nos sas dúvidas sã o traid oras e nos f a zem perder
o q u e, c o m frequ ên ci a, podería mos g anh a r,
por s i mpl es medo d e arrisc a r.”
Will ia m Shak esp ea r e
IX
Í N D I C E
Li s t a de Figu ras e Tabel as ... .. .. . . . ......... . . ...... .. .. . . ...... .. . . . .. ...... . .
X I I
Li s t a de Abrev i aturas . .. . . ...... .. . . .......... ...... . . ...... .. . . ........ . . . ...... .
X V I I
Resum o ...... .. . . ...... ... .. .. . . ...... .. . . ........ . . . ...... .. . . ...... .. .. . . ......... ..
X I X
1. IN T R ODUÇÃO .. . .. . . ...... .. .. . . ...... .. . . . .. ...... . . ...... .. . . ...... ..... .. .... 1
1 .1 . His t ó rico .. . . ........ .. ...... . . ........ . . . ...... .. . . ...... .. .. . . ......... .. ..
2
1 .2 . Prev a lência M u ndi al .. . . .......... ...... . . ...... .. . . ........ . . . ...... .. . 6
1 .3 . Morfol o gia e Bi ol o gia d a E . h i s t o l y t i c a / E . d i s p a r . . ...... .. . .
7
1.3. 1. T rofozo ít o s d e E . h i s t o l y t i c a ...... . . ......... . . ......... .. ...
7
1.3. 2. Pré-ci st o s....... . . ...... .. . . ......... .. ...... .. . . ...... .. . .. .. . . .....
9
1.3. 3. Cistos . ...... .. . . ...... .. .. . . ......... .. ...... . . ........ .. . ...... .. . . . 9
1.3. 4. M etaci st o s ..... . . ...... .. ... . ...... .. . . ........ .. ...... . .. . . ...... .
10
1.3. 5. Ciclo Bi o lógico . .. . . .......... . . ...... .. .. . . ...... .. . . . .. ...... . . .
10
1.3. 6. E n t a m o e b a d i s p a r ......... ...... . . ........ .. ...... . . . ........ .. ..
11
1 .4 . Pat oge ni a e Vi r ulência ...... ........ . . ........ .. ...... . . ......... .. ...
14
1 .5 . Est ud o s Experi m ent ais de Vi rulên ci a . ...... . . ...... .. . .. .. . . ..... 21
1.5. 1. I n v i t r o ...... .. .. . . ...... .. . . ... ...... . . ...... .. . . ...... .. ... .. . . .... 2 1
1 . 5 .1.1. Fagocit os e . .. ...... ... . ...... .. . . ........ .. ...... . .. . . ...... 21
1 . 5 .1.2. E f eito C i t o p ático . ....... .. .. . . ...... .. . . ......... . . ...... 23
1 . 5 .1.3. P rot eases . ...... .. . . ........ .. ...... . . ...... .. . . ......... . . .. 23
1.5. 2. I n v i v o ........ .. ...... . . ...... . . ........ . . ...... .. . . ...... ..... .. .... 24
2. JUS T IF IC A T IV A . ...... .. . . ...... .. .. . ....... .. . . ........ .. ...... . . . ........ .. . 25
3. OBJE T IV O S . .. ... . ...... .. . . ........ .. ...... . .. . . ...... .. .. . . ...... .. . . . .. ...... . 27
3 .1 . Obje t i vo Ge r a l ...... .. ...... . . ..... . .. . . ........ .. ...... . . ......... .. .....
28
3 .2 . Obje t i vos E spec í fi cos . .. . .. .. . ....... .. . . ........ .. ...... . . . ........ .. . 28
4. MAT ER IA L E M É T O DOS ... .. ......... . . . ...... .. . . ...... .. .. . . ......... .. ...
29
4 .1 . Cepas utiliz ad a s ...... . . ...... .. . ......... .. ...... . . ...... .. . . . ........ . . .
30
X
4 .2 . Est ud o s de vi rul ência . .. . . ...... . . ........ .. ...... .. . . ...... ... .. .. . . .. 31
4.2. 1. E studo s i n v i v o ..... . . ...... ... .. . . ........ .. ...... . . ......... .. ...
31
4 . 2 .1.1. P r eparo dos inócul o s .. .. ...... . . ...... .. ... .. . . ..... 31
4 . 2 .1.2. In o culação intra -hepáti ca em hamster. . . . 3 2
4.2. 2. E studo s i n v i t r o ..... .. ..... . . . ........ .. ...... . . ...... ... .. .. . . ...
33
4 . 2 .2.1. E r itrofago citose . ........ . . ........ .. ...... . . ......... .. ...
33
4 . 2 .2.2. A ti vidade P roteo l ít i ca em Géi s de
Poli acrilamida ....... .. . . ...... .. . . ........ .. . ...... .. . . ...... .. .. . . ......... .. ....
34
4 . 2 .2.3. Determ i n ação Q u a ntitati va d a A ti vidade
Proteol ítica c om Az u r e e Azoco ll ... .. ... .. . . ...... .. .. . . ...... .. . .. .. . . ....
35
4 . 2 .2.4. E f eito C i t o p ático sobre C é lulas MD C K ........ .. . 36
4 . 2 .2.5. M e dida da R esist ênc i a Transepi t elial (R Te) .....
37
4 . 2 .2.6. Prep a r o d e antico rpo s poli cl o n ais a nti-
E . d i s p a r em c o elho s . . . ........ .. ...... . . ......... .. ...... . . ........ .. . ...... .. . . .
38
4 . 2 .2.7. Im unohistoq u ímica . . . ...... .. . . ........ .. ....... .. . . .....
38
4 .3 .Estu do s d e ult raestrutura . ...... . . ........ . . ...... .. . . ...... ..... .. .....
39
4.3. 1. Micros c opia El et rô ni ca de T r ansmiss ão . ...... . .. . . ...... 39
4.3. 2. Micros c opia El et rô ni ca de V a r r edura . .......... ...... . . .. 4 0
5. RES U LTADOS . . ...... .. .. . . ...... .. . . . .. ...... . . ...... .. . . ...... ..... .. .... 42
5 .1 . Est ud o s de vi rul ência . .. . . ...... . . ........ .. ...... .. . . ...... ... .. .. . . ...
43
5.1. 1. Es t u dos i n v i v o - Ci n étic a da Form a ç ão d as Les ões
Hepát i cas em Hamsters ..... . . ........ ........ . . ...... .. . . ........ .. . ...... .. . .
43
5 . 1 .1.1. C e pa IC B - A D O poli x êni ca (E . d i s p a r ) . ... .. . . .... 4 3
5 . 1 .1.2. C e pa IC B - E G G mon o x ê nica (E . h i s t o l y t i c a ) .... .
54
5 . 1 .1.3. In o culação d e meio d e cult ura .. ...... .. . . . ........ .. 6 7
5 . 1 .1.4. Inocul a ção de b actérias da cepa ICB-ADO
pol ixên i c a .... .. . . ......... .. ...... .. . . ...... .. . . . .. ...... . . ...... .. . . ...... ..... .. ....
68
5 . 1 .1.5. Inoculação d e trofoz oí tos fi x ado s c om
gl utaral d eído . . . ..... ... .. . . ...... .. .. . . ...... .. . .. .. . . ...... .. . . ........ .. . ...... .. . .
68
5.1. 2. E studo s i n v i t r o ...... .. ..... . . . ........ .. ...... . . ...... ... .. .. . . ...
69
5 . 1 .2.1. E r itrofago citose ...... .. ...... .. . . ...... .. . . . ........ . . ..
69
XI
5 . 1 .2.2. A tividade Proteo l íti ca e m Géis de
Poli acrilamida . ......... .. . . ...... .. . . ........ .. . ...... .. . . ...... .. .. . . ......... .. ....
5 . 1 .2.3. Determ i n ação Quanti t ativa d a Ativida d e
Proteol ítica c om Az u r e e Azoco ll ..... .. ... .. . . ...... .. .. . . ...... .. . .. .. . . ....
70
73
5 . 1 .2.4. E f eito C i t o p ático sobre C é lulas MD C K ........ .. . 78
5 . 1 .2.5. M e dida da R esist ênc i a Transepi t elial (R Te) ......
78
5 . 1 .2.6. Im unohistoq u ímica . . . ...... .. . . ........ .. ....... .. . . .....
80
5 .2 .Estu do s d e ult raestrutura . ...... . . ........ . . ...... .. . . ...... ..... .. .....
82
5.2. 1. Micros c opia El et rô ni ca de V a r r edura . .......... ...... . . ...
82
5.2. 2. Micros c opia El et rô ni ca de T r ansmiss ão . ...... . .. . . ...... 87
6. DISC USSÃO... ........ . . ...... .. . . ........ .. . ...... .. . . ...... .. .. . . ......... .. .... 90
6 .1 .Estu do s i n v i v o - C i n éti ca da Formação das Le s ões
Hepát i cas em Hamsters . ...... . . ........ ........ . . ...... .. . . ........ .. . ...... .. . .
91
6 .2 . Est ud o s i n v i t r o ..... . . ........ .. ...... . . ...... .. . . ........ .. ....... .. . . .. 95
6 . 2 .1. Eri trofagoc itose .. . . ........ .. ...... . . ...... .. . . ......... . . .. 95
6 . 2 .2. Ativi dad e P r ot eolít ica e m Géis d e
Poli acrilamida e D e terminaçã o Quanti t a tiva da Ativid a d e
Proteol ítica c om Az u r e e Azoco ll .. .. ... .. . . ...... .. .. . . ...... .. . .. .. . . ....
96
6 . 2 .3. E feit o Citopáti co sobre Célul as M DC K e
Medi da d a Resis t ê ncia Tran s epitel i al (RTe) . ........ .. ...... .. . .. . . ......
99
6 . 2 .4. Im un o h istoquí m i ca .. . . . ...... .. . . ........ .. ....... .. . . ..... 101
6 .3 . Est ud o s de Ult ra e strutura ...... . .. .. . . ...... .. . . ........ .. . ...... .. . . . 102
7. CO NC LU S ÕES . . . ........ .. ...... . . ........ . . . ...... .. . . ...... .. .. . . ......... .. .. 104
8. RE F ERÊ NCIA S B IB LIOGR Á F ICAS ....... .. ...... . . ........ .. . ...... .. . . .
106
XII
L I S T A D E F I G U R A S E T A B E L A S
Figu r a 1: Ci clo bi oló gico d a E . h i s t o l y t i c a / E . d i s p a r ... ... .. .. . . ... 1 3
Figu r a 2 : Mo nt age m da c âmara T ranswel l
®
em p o ço d e placa
Cost a r 3 524 . . ...... ..... .. ...... . . ...... .. . . ......... . . ...... .. . . ...... .. ... .. . . ......
38
Figu r a 3 . Aspect o h istopato l ó gi co de l esões em fí gado de ham st er
uma hora pós-i nocul ação com 5,0x 1 0
5
t rofozo í tos da cepa IC B-
ADO p o lix êni ca d e E . d i s p a r .. .. . . ..... . .. .. . . ...... .. . . ........ .. . ...... .. . . ..
44
Figu r a 4. As p e cto h is t o p atológi co d e lesõ es em fígado d e ham ster
três ho r as pós -i no c ul a ção co m 5,0x10
5
trofoz o ít os d a c ep a ICB-
ADO p o lix êni ca d e E . d i s p a r .. .. . . ..... . .. .. . . ...... .. . . ........ .. . ...... .. . . ..
46
Figu r a 5 . Aspect o h istopato l ó gi co de l esões em fí gado de ham st er
seis horas pós-i no cul a ç ão co m 5 , 0x10
5
t ro f o zoítos da c e p a IC B-
ADO p o lix êni ca d e E . d i s p a r .. .. . . ..... . .. .. . . ...... .. . . ........ .. . ...... .. . . ..
48
Figu r a 6. As p e cto h is t o p atológi co d e lesõ es em fígado d e ham ster
doz e horas pós -ino c ulação com 5 ,0x10
5
tro foz oítos da c e p a IC B-
ADO p o lix êni ca d e E . d i s p a r ... .. . . ..... . .. .. . . ...... .. . . ........ .. . ...... .. . . ..
49
Figu r a 7 . Aspect o h istopato l ó gi co de l esões em fí gado de ham st er
24 h oras pós - inoculaç ã o com 5,0x 10
5
tro f o zoítos da c e p a IC B-
ADO p o lix êni ca d e E . d i s p a r ... .. . . ..... . .. .. . . ...... .. . . ........ .. . ...... .. . . ..
51
Figu r a 8 . Aspect o h istopato
lógico d e lesões em fígado de ham ster
48 h o r as pós - inoculaç ã o com 5,0x 10
5
tro f o zoítos da c e p a IC B-
ADO p o lix êni ca d e E . d i s p a r ... .. . . ..... . .. .. . . ...... .. . . ........ .. . ...... .. . . ..
52
XIII
Figu r a 9 . Aspect o h istopato l ó gi co de l esões em fí gado de
ham s t er
uma hora pós-i nocul ação com 5,0x 1 0
5
t rofozo í tos da cepa IC B-
EGG m o nox ênica de E . h i s t o l y t i c a ..... . .. . . ........ .. ...... . . ......... .. ......
55
Figu r a 10. As p e cto hi s to patoló g i co d e l e s ões e m fí gado de
hams t e r três ho ra s pó s -inocul ação com 5 ,0x 1 0
5
t ro fozoít os da
cepa ICB-EGG mo no x ên i ca de E . h i s t o l y t i c a ...... . . ........ .. . ...... .. . . ..
57
Figu r a 11. A specto hi stopat ol ó gi co de l esõ es e m fíga d o de h a mster
seis ho ras p ó s-inoc u l aç ã o com 5,0x 10
5
trofoz oítos da cep a IC B-
EGG m o nox ênica de E . h i s t o l y t i c a ..... . .. . . ........ .. ...... . . ......... .. ......
59
Figu r a 12. A specto hi stopat ol ó gi co de l esõ es e m fíga d o de h a mster
doz e ho ras pós-in o c ulação c om 5,0x 1 0
5
t rof ozoítos da cepa ICB-
EGG m o nox ênica de E . h i s t o l y t i c a .... . .. . . ........ .. ...... . . ......... .. ......
60
Figu r a 13. A specto hi stopat ol ó gi co de l esõ es e m fíga d o de h a mster
24 ho ras pós-in ocul ação com 5, 0x10
5
trofoz o ítos d a cepa IC B-EGG
monox ê ni ca de E . h i s t o l y t i c a .. .. ...... . . ......... . . ...... .. . . ...... .. ... .. . . .....
62
Figu r a 14. A specto hi stopat ol ó gi co de l esõ es e m fíga d o de h a mster
48 ho ras pós-in ocul ação com 5, 0x10
5
trofoz o ítos d a cepa IC B-EGG
monox ê ni ca de E . h i s t o l y t i c a . .. ...... . . ......... . . ...... .. . . ...... .. ... .. . . .....
64
Figu r a 15. A specto hi stopat ol ó gi co de l esõ es e m fíga d o de h a mster
sete d ia s pó s - inoculaçã o c om 5,0x10
5
tr o fozoítos a cep a ICB-EGG
monox ê ni ca .. . . ......... .. ...... . . ........ .. ....... .. . . ...... .. .. . . ...... ... .. .. . . ....
66
Figu r a 16 . Dist ri bu ição do s om at ó r io das áreas de n ecros e e
infilt r ado inflamató r io em di f e rent es perí od os de in fecção p or
cepas de E . h i s t o l y t i c a (ICB-EGG mon o x ê nica) e E . d i s p a r
(IC B - A D O poli x ê nica) .. .. ...... . . ...... .. ... . ...... .. . . ........ .. ...... . .. . . ...... .
67
XIV
Figu r a 1 7. Fagocitose de eri t r ócitos hum ano s po r c e p as de
E . h i s t o l y t i c a (E. h.) e E . d i s p a r (E . d .). Foi u t ilizada um a r e l a ç ão de
um tr o fozoíto p ar a 100 erit r ócitos ...... ... .. . . ...... .. .. . . ...... .. . .. .. . . ......
69
Figu r a 18. P orc e nt agem de t rofoz oíto s de cepas d e E . h i s t o l y t i c a
(E.h . ) e E . d i s p a r ( E .d . ) qu e fagocit ar a m eritrócit o s humanos após
30 mi n utos de i nt era ç ã o .... .. . . ........ .. ....... .. . . ...... .. .. . . ...... ... .. .. . . ...
70
Figu r a 1 9. Ativid ad e proteo l ít ica de ex t r atos t ot ai s d a c ep a HM1-
IMS S de E . h i s t o l y t i c a e efei t o d e inib idores d e p ro t eases em S DS -
PAGE a 12% c opoli mer i z ado co m 0,1% d e gelati n a de pel e por c ina
e cora do pelo az ul de Coom a ssie . . . ..... ... .. . . ...... .. .. . . ...... .. . .. .. . . ......
71
Figu r a 2 0 . A tividad e p r oteolí t i ca de extrato s t ot ais da c e p a IC B-
EGG monox ê nica de E . h i s t o l y t i c a e e feito de ini bi dores de
prot eas e s em SDS -PAGE a 12% co p olimeriz a do com 0,1% d e
ge l a t i n a de p e l e porcin a e corado pelo az u l de Co om as s i e ..... .. . . .....
72
Figu r a 2 1 . A tividad e p r oteolí t i ca de extrato s t ot ais da c e p a IC B-
ADO pol ix ên ica de E . d i s p a r e efeito de inibi d o r es de proteas es em
SDS-P AG E a 12% c o polimeriz ado com 0, 1% d e gela ti n a de p ele
porci n a e cor a do pel o az ul d e Coo mas sie ... .. . . ...... .. .. . . ..... . .. . . ........
73
Figu r a 2 2. A tividad e prot eo l ítica d e extrato total de t rofoz oí t os de
E . hi s t o l y t i c a (cepas IC B-EGG) e E . di s p a r (cep as IC B - A D O ) com
subst r at o az o c oll . ..... .. ...... . . ...... .. . . ......... . . ...... .. . . ...... .. ... .. . . ......
74
Figu r a 2 3. A tividad e prot eo l ítica d e extrato total de t rofoz oí t os de
E . hi s t o l y t i c a (cepas IC B-EGG) e E . di s p a r (cep as IC B - A D O ) com
subst r at o az u r e .... . . . ...... .. . . ........ .. ....... .. . . ...... .. .. . . ...... .. . .. .. . . .....
74
XV
Figu r a 2 4. Ativi d ad e prot e olítica de m ei o c ondici o n a do de
E . hi s t o l y t i c a (cepas IC B-EGG) e E . di s p a r (cep as IC B - A D O ) com
subst r at o az o c oll .. ..... .. ...... . . ...... .. . . ......... . . ...... .. . . ...... .. ... .. . . ......
75
Figu r a 2 5. Ativi d ad e prot e olítica de m ei o c ondici o n a do de
E . hi s t o l y t i c a (cepas IC B-EGG) e E . di s p a r (cep as IC B - A D O ) com
subst r at o az u r e .... . . . ...... .. . . ........ .. ....... .. . . ...... .. .. . . ...... .. . .. .. . . .....
76
Figu r a 26. Ini bição da ativi d ad e proteolí t ica de extrato s to t ais de
trofo zo ítos d e E . h i s t o l y t i c a (c epa ICB-EGG m onoxê n i ca) e E .
d i s p a r ( c epa ICB- A D O mono x ên i ca ), uti l i zando com o substrato
azocoll .... .. . . ...... .. . .. .. . . ...... .. . . ........ .. . ...... .. . . ...... .. .. . . ......... .. .....
77
Figu r a 27. Ini bição da ativi d ad e proteolí t ica de extrato s to t ais de
trofo zo ítos de E . h i s t o l y t i c a (cepa ICB-EGG pol ix êni c a ) e E . d i s p a r
(cepa IC B-ADO polixêni c a ) , uti l i zando com o subst rat o azocoll ..... .
77
Figu r a 28. Ef eit o de trofozoi to s de E . d i s p a r (IC B - A D O
monox ê ni ca) e E . h i s t o l y t i c a (IC B -E G G monox ênic a ) na resi st ênc ia
tran s ep i t elial de c élulas M DC K e m mon ocam adas .. . . ...... ... .. .. . . ....
79
Figu r a 29. Efei to de t r ofozoit o s d e E . d i s p a r (ICB-ADO poli x ê ni ca)
e E . h i s t o l y t i c a (IC B-EGG polix ên ica) na res i stência tra n s epitel i al
de célul as MDC K em monoc a m adas ......... .. ...... . . ...... .. . . . ........ . . ..
79
Figu r a 30. Interação i n v i v o em di f ere n t es tem p os pó s -i n o culações
de trofo z o ítos de E . d i s p a r (cep a ICB-ADO polix ên i ca) c om
hepat ó citos d e ham s t e rs, utilizando perox i dase ma rcada contra
anti co r po s pol icl o nais de E . d i s p a r . .. . . . .. ...... . . ...... .. . . ...... ..... .. ......
81
Figu r a 31. Mi c roscopi a el etrôni ca de varred u ra de t rofozoít os d a
cepa IC B - A D O poli x ê nica (E . d i s p a r ), apres e nt ando d elgados
fil op ód i o s ( fi) aderidos ao s u bstrat o ..... .. .. . . ...... .. . . ........ . . . ...... .. . .
83
XVI
Figu r a 32. Mi c roscopi a el etrôni ca de varred u ra de t rofozoít os d a
cepa ICB-EGG po l ixênica ( E . h i s t o l y t i c a ) ..... .. . . ...... .. . . ........ .. ......
84
Figu r a 33. Mi c roscopi a el etrôni ca de varred u ra de t rofozoít os d a
cepa ICB-ADO mo n oxênica ( E . d i s p a r ) ...... . . ...... .. .. . . ..... . .. . . ........ ..
85
Figu r a 34. Mi c roscopi a el etrôni ca de varred u ra de t rofozoít os d a
cepa ICB-EGG mo no x ên i ca (E . h i s t o l y t i c a ) ....... .. . . .......... ...... . . ....
86
Figu r a 35. E l etromi c rofot ografi a d e trofozo í to s da cepa IC B-ADO
pol ixên i c a (E . d i s p a r ) . . ...... .. . . .......... ...... . . ...... .. . . ........ . . . ...... .. . .
87
Figu r a 36. E l etromi c rofot ografi a d e trofozo í to s da cepa IC B-ADO
monox ê ni ca (E . d i s p a r ) .. . . ...... .. . . ......... . . ...... .. . . ...... .. .. . . . ........ .. ..
88
Figu r a 3 7 . Elet romicro fot ogr a fia de trofozo í to s d a c e pa IC B - E G G
pol ixên i c a (E . h i s t o l y t i c a ) .. .. .. . . ...... . . ........ .. ...... .. . . ...... ... .. .. . . .....
88
Figu r a 3 8 . Elet romicro fot ogr a fia de trofozo í to s d a c e pa IC B - E G G
monox ê ni ca (E . h i s t o l y t i c a ) ... .. ...... . ......... .. ...... . . ...... .. . . . ........ . . ..
89
Tabel a 1: Efeit o c i t opático de c epas de E . h i s t o l y t i c a ( E .h.) e
E . d i s p a r (E.d . ) sobre mo n ocamad as de cél ul a s MDC K . . ....... .. .. . . ...
78
XVII
L I S T A D E A B R E V I A T U R A S
AHA – ab c esso h epá ti co ameb i a no
cf – C r i t h i d i a f a s c i c u l a t a
CHO - c h i n e s e h a m s t e r o v a r y c e l l s (cél ulas )
CINVE S TAV – Centro de Investigação e Est u d os Avan ç a dos
CP – cis t eíl-p r o t einases
DAB – di amino b enzidina
E-64 - L - t r a n s - e p o x y s u c c i n y l - l e u c y l a m i d e - ( 4 - g u a n i d o ) - b u t a n e
E.d. – E n t a m o e b a d i s p a r
E.h. – E n t a m o e b a h i s t o l y t i c a
EDTA – á cido etilenodi ami notetra c ético
fe – f ormações es f eroidai s
fi – f ilopódi os
Gal/ Gal N a c - ga l a ctose/ N-acetil-ga l act osamina
GPI – glicose f os fato isom erase
g – gra m a (peso )
HE – h e m atoxil ina-eosina
HK – h exoquinas e
ICB – Institut o de Ciênci as Biológi c as
IgA – im unogl o b ulina A
IgG – im unogl o b ulina G
kDa – q uilodál t o ns
kg – quil o gram a
M – m o l a r
ma – est oma de m ac r o pinoci t os e
MDC K - M a d i n - D a r b y c a n i n e k i d n e y c e l l s (cél ul as)
ME – e nzima m ál i ca
MEM – m ei o e ssencial mínimo
MET – m i croscopia elet rô nica de t r ansmis s ã o
MEV – mi croscopia ele t rô ni c a de v arredura
mg – m iligram a
XVIII
mi – es toma d e micropi n o citos e
min – minuto
mL – m ililit ros
mM – m ilimol ar
nm – n anômetro
PBS – s ol uçã o s ali n a tampo nad a
PGM – fo sfo glico m u t ase
pH – p ot en c ial hi dro geniôni co
PHMB – á cido p -h id r oximerc u riobenzói co
PMN - polimorfon ucleares
PMSF – fluoret o d e feni l m etilsufonil
SDS – dodecil su l f ato de s ó dio
SDS-P AG E – s o d i u m d o d e c i l s u l p h a t e – p o l y a c r y l a m i d e g e l
e l e c t r o p h o r e s i s
SFB – s o ro fetal bov in o
TCA – á cido tri cloro a c éti co
TER – resi stência transepi telial
Tris -OH – trism a bas e – tri s (hidrox i metil)am i nomet ano
UFMG – U niversidade Fed e r al de Mi nas Ger ai s
UFRJ – Univers i d ade Fed e r al do Ri o de Janei ro
V – vo lt
VERO – A f r i c a n g r e e n m o n k e y k i d n e y e p i t h e l i a l c e l l s (cél u l as )
WHO – Organiza ç ão Mun di al d e Saúde
µ g – m i cr o gram a
µ L – mi cr ol itro
µ m – m i c rômet ro
XIX
RESUMO
Nest e t r ab alho, aspecto s d a p atoge n i ci d ade e vi ru l ên cia d a c e pa
ICB-ADO polixêni ca d e E n t a m o e b a d i s p a r fo ram abo rdado s, visand o um
mel ho r con h ecimen t o dos mecanismos de a gressão q u e essa ce p a
aprese nta.
Consi d e r ada u m a es p é cie não-pa togênica , E . d i s p a r t em s i d o
isol a d a de paci entes brasi l ei ros com colite não disentér i ca e
demo ns t r a do capacidade de ocas i on ar l esõ es em a nim ais d e
ex peri m e nt ação, quand o associ a d a à flora d a mic r obiot a i ntestinal de
seus h os p ed eiros.
Est udos i n v i v o uti liz an do hamsters como model o ex p eriment al ,
veri f i caram di fere nças na cin éti ca das l esõ es h epát icas o casiona d as p ela
cepa IC B -ADO p ol ix ênica d e E . d i s p a r , di f e rindo subst an cialmen t e d o
obs ervad o p ara as c ep as IC B-EGG e HM1 - IMSS de E . h i s t o l y t i c a .
Apesa r de oc a si onar lesõ e s ext ensas ap ós s et e di as de inocu laç ã o, a
cepa ICB-ADO dem onstra um a capaci d ade de l e sar mais lent am e nt e os
teci d o s.
Est udos i n v i t r o de m on s t r aram ser a cepa IC B - A D O d e E . d i s p a r
capaz de oc asionar a de s t ruição e a queda d a medid a da resi s t ência
tran s ep i t elial de cé l ul as MDCK e m m o n o c amad as, embora d e fo rma
mai s l enta e gradu a l que c e pas d e E . h i s t o l y t i c a . A cepa IC B-ADO
pol ixên i c a a presen tou t ambém um a m ai o r at i v idade de pro t e ases quan do
comp arad a com a cepa HM 1 - IM SS de E . hi s t o l y t i c a , d e vendo a relação
bacté r ias/am ebas s er m elh or est u dada, objet i v ando conh e c e r m ais
profu n d amente as a l terações que elas caus am nos t rofozoí to s quando em
asso ci a ç ã o.
1
1. INTRODUÇÃO
2
1.1. Histórico
De ac o r do com a O r ganizaç ã o Mundi al d e S aúde (WHO, 199 7)
amebí as e é a pr e s ença do protozoári o E n t a m o e b a hi s t o l y t i c a
(Sch aud i n n, 1 9 03) no organ i sm o h um a no c om ou sem m a nifestaçõ es
clí ni cas .
A amebías e é uma parasi t ose que atin g e c e r ca d e 1 0 % a 2 0 % d a
popul a ç ão m un dial, s endo mais comum em reg iões t r opicais e
subtro pi c ais, ond e a pop u l a ç ão é mais caren t e, com baixo nível só cio-
econô m i co e higiên ico s an i t á rio (St a n l e y, 2 0 0 3; Stauffer & R avdin,
2003). Caract e riza-se como uma doença comume nt e crô n i c a e a f ebri l
que envolv e a p arede do intesti no gros so , podend o est e nd er-se a out ros
órgã o s e tecid os do orga nismo hum ano (Muñoz et al . , 1985).
Em 1860 Lambl publ ico u a i d entifi ca ç ã o d e um micro o r gani smo
que en controu ao estudar as fez es d e um garo to com d isenter i a; por é m ,
cons id ero u que este protozo ário não era patogê ni co, em b o r a aparecesse
asso ci a do a c asos d e p at ologi a intesti n a l com o a do gar ot o em
refer ê nci a. C unningh a m , em 1 87 1 , ao isolar o prot oz o á ri o das fezes d e
pacie nt es que a p r esent av a m diarréi a p o r causa d a cóler a e st abel eceu
que e r a um orga nismo ass o ci ado a e sta enfe r midade.
Lös h ( 1 8 75) descrev e o m esmo m i cr oorgani s m o ao obser v á -l o nas
fezes d e um campesin o d e 24 anos p r o c eden t e d e São P et es bu rgo que
aprese ntava diarréi a, disen t er ia, do r abdo mi nal , feb re e d e bilidade
ge n e r a lizada. Após a m o rte do p aci ente, Lö s h r eali z a uma n ecróp si a e
ao ex aminar o inte s ti n o gross o en contra ú l ceras c ontendo o m esmo
microo r ganism o que antes h avia id e n tificado nas fez es do enferm o . Ao
realiz a r o exame hi stopat ol ógi c o d a s l es õ es, observ a a o n í v el d a
submu c os a um i nfi l t rado cel u l a r com a p res e nça de am e bas idên t i c as às
obs ervad as a nt es. P osteri o rm ente, Lö s h inocul a p o r vi a oral e r et al o
mat eri a l o btido d as úl c eras a qu atro c ã es , sendo q u e um d os a nimais
desen v o lveu u m q uadro d e di s ent eri a aguda. A necróps i a deste anim al
demo ns t r ou a p resença d e ul cer a ções n a mucos a i ntesti n a l com a
presen ç a d e ameb as n a s les õ es e n as fez es. Ele então deno min ou o
3
prot oz o á rio enco ntrado co m o A m o e b a c o l i , p oré m não atri bu iu a ele a
verdad eira caus a da di s e nteria.
Por sua v ez, Kartu l is ( 18 86) e Köch (1887 ) , at r avés d e estudos
com paci e ntes apre s e ntando q uad ros de disen t er i a t ropi cal , at ri buíram
pato ge ni c idade às am e bas, res po ns abil izando-as p e los quadros
obs ervad os.
Councilman & La fl e u r , em 1891, d enom inaram o paras ito causad o r
da amebías e como E n t a m o e b a d y s e n t e r i a e , s e ndo os p rim eiros a
empr e garem o s t er m os “d i s e nteria amebi an a ” e “absc e s s o hep át i co
amebi an o ”, su g e rindo tam bém a ex i stência de uma outra ameba , q ue não
seri a p atogêni c a.
Em 1893 Q uincke e Roos identi fi caram a exi stência de di ferent es
espéci es d e am ebas q u e po di am viv er n o cólon humano e desc r e v eram o
cicl o biológi c o do que ag ora conhecem os co m o E n t a m o e b a h i s t o l y t i c a ,
incl u si v e a iden ti ficação da forma infect ant e d o p a r asito e a
demo ns t r a ç ão d a sua cap a cidad e de infecç ão ao s er in ge r id o o ci sto. O
nom e d e fin it i v o des t e p r otozoári o foi d ado em 1903 por Schaud i n n, qu e
veri f i cou a exist ên c i a de dois tipos d e am ebas no intestin o human o:
uma pato gênica, que de nominou de E . h i s t o l y t i c a , e outra não
pato gê ni c a, cha m ada então de E n t a m o e b a c o l i .
Prowaz ek (1 9 12) des creveu um a ameba morfo logi camen te
semel h a nte à E . h i s t o l y t i c a , em b o r a m e nor, d en ominand o - a E n t a m o e b a
h a r t m a n n i .
Em 1913 Walk e r & S elard s confirm aram q u e cistos o ri u n dos d e
pess oas sem si ntomas di sent é ricos p o d e ri am pro du zi r infecçõ e s
assi nto m áticas ou causar disen t e ria, ao pas so que amebas pro v enient es
de di sent e ria agu d a eram capa z es d e ocasion ar infecçõ es
assi nto m áticas .
Crai g em 1917 e p o st e riorm e nt e D o b ell e m 1 9 1 9 formulam a
Teori a Unici sta, na q u a l a E . h i s t o l y t i c a consti tui uma úni c a es p é cie,
parasit o o b rigató ri o d os t e cidos e sempre caus ando lesões. Seus
segu id or e s (Faus t et a l . , 1946 e D ’ A n t o ni, 1 95 2 ) adm item q ue e st e
parasit o, em mu itas r e giões d o pl a n et a, v i v a em estado de e quilíb rio
4
com seu hosp edei ro, on d e a s les õ es o c a sionadas por aqu e l e pod em ser
rege n e r ad as, nã o havendo a ssim m anifestações clínicas.
Porém, ou tra teori a surgiu em 1 92 5 ( Brumpt ) que procura expl icar
as d i ferenças geográfi cas n as f o rmas cl íni cas d a doenç a e o grande
núm ero de indiv í d u os in f ectad os assi nto m áticos. Es ta teo ria foi
deno m inada Dualis ta e p ropõe a exi stênci a de duas espécies
morfo l o gicamen t e indist i n g uíveis : E . di s p a r , um or ganismo nã o
pato gê ni c o e E . d y s e n t e r i a e ( = E . h i s t o l y t i c a ), que s eria a fo rma
pato gê ni c a. Como n ã o ex istiam meios de dis ti n gui r os dois or ganismos ,
as i dé i as d e Brum pt tivera m pouca acei tação.
Com o advent o do c u l t iv o de am ebas p o r Boech & Drbo h l a v em
1925 novo s est ud o s foram real i z ados, com import ância m arcant e na
hist ó ri a d a ame bí a se.
Uma no v a teori a foi prop osta po r Hoare em 1 961 que a f i rmava
ex ist ir cepas d e E . h i s t o l y t i c a com di fere ntes gr aus de vir ul ê ncia,
causan do d esd e i nfecções a ssint om át i c as até f o rmas ma i s gr aves d a
doen ç a . Essa teoria fico u conheci d a como T eori a Plu r ali s t a. En t r etanto,
ela n ão ex plica o f a to de ser a am eb í as e invasi v a m ais frequ e nt e em
país es d e clima t r opical d o que naq u eles de clima t em p era d o ou fri o .
Na décad a de 70 , utiliza nd o conca n avalina-A (Con-A), Martínez -
Pal omo et al. (1973 ) e Triss l et al . (1977) demon st raram di fer e n ç as n a
agl u t in ação ent re c e p a s d e E . h i s t o l y t i c a is ol ad a s d e i ndivídu os
sint o m áti cos e a quel es co m infecç ã o assi nt o m ática.
O co n c eit o de Brumpt de du as e s p é cies morfolo g i c amente
idên t i c as f oi ret omado 50-60 anos mai s tarde, quando a tecn ol o gia
tornou p ossív el i nvesti ga r essa t eo ri a.
A p rova def i nitiva oco r r eu em 1978 qu and o S a r geaun t et al .
revel a r am que E . h i s t o l y t i c a pod eri a s e r d ividi da em dois gr u p os
atrav é s da el e trofor e s e de is o enzim as, ve r ifi cand o difere n ç a s no pe r fil
isoenz im ático (zi mod ema) de isolado s ameb i a nos cl assifi c a dos com o
“pato g ênicos” e “nã o - p atogê n i c os”, pod endo s er co rrel acionado s com a
form a cl íni c a e com parâm e t r os biológi cos , sen d o q u e e s ta t écnica foi
apli cad a a cen te n as de amo s t ras is ol adas em vário s conti nentes.
5
Est es auto res demos t ra r am existir perfi s di st i ntos d e b a ndas entre
cult u r a s de ameb a s p roveni e nt es d e i n divíduo s s intomát i co s e
assi nto m áticos, qu a nd o s u b m etidas à eletro fo r ese de i s o enzimas
fosfo gl i c omutas e (P GM), gl i c os e fo s fato isomer a s e (GPI) , e nzima
mál ica (ME) e enzi ma h exoqui n as e (HK). Foram d es c ritos m a is de 21
zim od emas e, de um m od o geral, a aus ê n cia da b and a α e a pre s ença da
band a β em P GM, assim c om o as b andas d e co r rida r á pida e m HK, s ã o
cons id erad os m arc ad o res de pat o genicidad e pa r a E . hi s t o l y t i c a
(Sarge aunt, 19 8 5 ) .
Est a d ivisão t e ve su p orte com a descob e rta em 198 8 d e di f e r enças
anti gên i c as entre os i solados de dois grupos (Strach a n et a l . , 19 88 ) e
em 19 89 p el as dife r e n ç as subs t a n ciais d os níveis d e DNA (Ta nni ch
et al . , 1989).
O prob l e ma surgi do p el a classi fica ç ão da E . h i s t o l y t i c a e m f ormas
“pato g ênicas ” e formas “não-p at o gê ncias” por divers o s p es quisad o res
foi revis ad o po r Spice & A c k e rs ( 1992). Eles foram os prim ei r o s a
indaga r s e a ameba r e s po nsáv el por um a infecçã o as sintomát i c a deveri a
ser co ns iderad a c o mo uma es p é cie di f erente, com háb ito s
ex clus i v amente d e comens al.
Post eri o rm ente, a c l a ssifica ç ã o entre form a s “patogê n i ca s ” e
“não-p ato gêni cas ” pôde ser e f etuada a n ível mo l e c ular, le v ando vá ri os
pesq ui sa do r es e a O r ganização Mun di al d e S aúde a a poiarem a t eori a
dual i st a (Sarge au nt, 19 86 ; Diamond, 1 9 9 2; Diam o nd & C l a r k, 199 3;
WHO, 1 9 97). A a c eitação d a E . h i s t o l y t i c a e E . d i s p a r c o mo espéci es
dist i n tas tro uxe mudanças grad u a is, po rém profun d as , no ent end i m ento
da ep i d emiol ogia, cont r o l e e trat amento da am ebías e.
Desde 1 9 8 6, S arge a u nt sugeriu que a n o men cl atura p rop o s t a por
Bru mpt – E . h i s t o l y t i c a e E . d i s p a r – fo s s e novam e nt e util iza d a.
6
1.2. Pr evalên ci a Mund ial
A am ebíase é co ns iderad a u m a i nfecção de distribui ç ão
cosm op ol it a. W alsh ( 1986) r elat a que, e m es cal a m u nd i al, cerca d e 5 00
milh õ es de pess o as est ão infect ada s, com 8 a 10% ap r esentan d o form as
clí ni cas s intomáti ca s c omo coli t e , diarr é i a e a bcesso he p á t i co, ent re
out ros . Co m a acei taç ã o da ex i s t ência d a E . d i s p a r , adm it e-s e que a
mai ori a d as in f ecçõ e s as si nt o m áticas seja devid a a ess a e s p éci e (C l a rk,
1998; E spinosa-C antell ano & M a rtinez -P alo mo, 20 00 ).
Algum a s regiões s e d estacam no c enário m u ndial na pre v a lênci a
da amebíase, sen do que a pr op orção d e i ndiví du os que manifestam a
doen ç a não é unifo r m e n as d iferent es á r e as ge o g ráficas: nas A m érica s
estim a -se que exis tam 95 mil hõ e s d e i nf e ctados, 10 milhões d e
enferm os e 1 0 a 30 m il morte s anuai s (WHO, 1997). O Méx i co é u m dos
país es do mundo qu e mai s s ofre co m a enfermi d ad e, apresent an do um a
alt a i n c idência de f o r m as intest i n ais e a s s intomáti cas, sendo q u e o
abcess o hepáti co chego u a ocupar o 4º l u g a r entre as ca u s as de m o r t es
no Hospit al da Cidade do México (C rev e nna e t al . , 1 9 7 2). Ainda na
Améri ca La t i n a , C o l ômbia e V e nez u e l a (C ort ez -M endonz a, 1956 )
aprese ntam u m a ma i or freq u ênci a da f o rma inv asiva. Na Á sia, onde o
prob le m a é grave , ex istem 300 mil hões de in fectados, 20 a 30 m i l h õ es
de enferm os e 20 a 50 mil mo rtes, sen do o conti nente que ap r esent a o
mai or n úmero de pessoas infect ad a s p e l a E . h i s t o l y t i c a (WHO, 19 97);
na Índ i a (S ubramanian, 19 68), T a i l â ndia, S in gapura e Ind o c h ina
(Els do n- D e w, 1 968) as f o rmas graves da am ebíase são f r e q u ent es. A
África , po r sua vez, apresent a um a alt a i n cidênci a d a amebías e i nvasiv a
na região su bs ahariana com cerca d e 85 mi l h õ e s d e i n fectad os , 10
milh õ es d e en f e rmos e 1 0 a 2 0 mil m ort es . Fat ores c o m o p recári as
cond i çõ es de hi gi e n e e san e amento básico, ed u c ação d eficient e e
ex ist ênci a de linh agens virulen tas do p a r a sito co nt rib u em para t o r n ar a
amebí as e um pro bl em a so cial e d e s a úde públ i c a (Guerrant , 1986;
Mart i n ez -Palom o , 1988 ).
Segund o a Orga nização Mundi a l d e S aú d e (W HO, 1 9 97 ) a
amebí as e é a s e gund a causa de morte p or doenças pa r a sitár i as cau sad a s
7
por pro t ozoários a n ív el m un d i al, com c e r ca de 10 0 mil ca s os fatais p or
ano. Além disso, a d o e n ç a é resp on sável por p rolon ga dos p eríodos de
incap a cid ade d as pessoas a f etad a s, ne c e s sitando assistên c i a médi ca e,
às v ez es , até m esm o hospital iz a ç ão.
No Brasil , o número d e infect ado s p o r E . h i s t o l y t i c a v a ria de
regi ã o p ara região, apresent a nd o p e rcentuai s extre m amente vari ávei s
(Sil v a et al., 1 997; Braga et al . , 1998; Pinhei ro et al., 200 4; A r aujo &
Fer n and ez, 20 05; B e n e tt on et al ., 20 05) . Observ a -se alta p r evalên cia
nas r e giões n o rte e nordest e e bai x a preval ên cia nas r egiões sul e
sudest e, s endo qu e e st es caso s n ã o aprese nt am a gr a v i da d e e
inten si d ade d aquele s obs erv a dos n o M éx i c o e em algu ns p aíses da
África e d a Á sia. Na r e gi ão ama z ô ni c a, os cas o s de amebías e
sint o m áti ca ou invasiva são m ais frequen t es e grav es qu e nas d e mai s
regi õ es do Brasil (Cu nh a e t al ., 1977; de Menez es , 1986 ;
Chaves , 1991).
1.3. Mo rfolog ia e Bi ol og ia da E . h i s t o l y t i c a /E . d i s p a r
O ci clo bioló gi c o da E . h i s t o l y t i c a / E . d i s p a r é monox ênico , n ão
necessi tando ass im de um h o spedeir o interme di ário pa r a o seu
desen v o lviment o. C onsiste de quat ro estági os evol u tivos: trof ozoítos,
pré-ci stos, ci s tos e met acistos.
Das quatro fases do ciclo d as amebas , os t rofozoí t os e o s cistos
cons ti t u em fases bem defini d as do parasi to. O s pr é - cisto s e metaci stos
são, por o ut ro lado , fas es interm edi ári as ou t ran sitória s : a pr i m eira,
antes da di ferencia ç ão c omplet a em cistos e a se gunda, ant es d a
form a ç ã o dos t r ofozoít o s m aduros .
1.3.1. T rofoz oí tos de E . h i s t o l y t i c a
Os trofoz oítos são not a v elment e m óvei s e muit o a ti vos n a
capta ç ã o d e a limen to s (fago citose), se ndo s ensívei s a m ud an ças
fisico químicas do ambien t e, o cor r e ndo o mesmo c om va r i a ções l o c ais
8
de p H, osmolaridade e p ot enci al de óx ido-red u ç ão. Os parasi t o s o b tidos
de fezes di sent é rica s o u de l esõ es h epáticas ou in tes tinais t ê m some nt e
um núcl e o, s ão pleo mórfi c os, medi n do entre 20 a 40 µ m. As ameba s em
cult i vo s medem entre 7 a 30µ m , em bo r a em al g umas o casiões p od em os
obs ervar tro f ozoítos med in do até 50µ m . Se m o v em c om r el ativa rapid ez
medi an t e a fo rmaç ã o d e pseudó p odes (lob o p ódios) q u e aparecem
brus cam e nt e em qualquer área d a superfí ci e d o c o rpo e com m aio r
frequê n cia na z ona anter io r dos t r o fozo ít os .
Em su a superfíci e n o t am-se pseudóp od es, e stomas/ citósto mas e um
urói de post e rior (Gonz ál ez - Robles & Mart ínez -P alomo , 198 3 ). D e ntre
as p ropried ades de s u p e rfíci e mais i mportant e s q u e ap r esent am as
ameba s, enco nt r am-s e a a glutin ação c o m a l ecit i n a co n c an aval i n a A
(Martí n ez -Palo m o et al . , 1973 ) e a cap a c idade de form a r “cappi n g”, q u e
é a r edist ri b u ição d os comp o n e ntes m em b ran osos e o ac ú mulo des tes
comp on ent es e m u m pólo da superf í cie amebi ana ( o u r óid e). Es ta
prop ri e d ade permi t e a am eba l i b e r ar a n t i corpos uni do s à sua mem brana
(Cal der ón et al., 1 980 ) ou realizar a s u a endoci t o s e (Ketti s &
Sundq v ist, 1978). Além do mais , apresent am em sua superfí c ie
gl ico pro t e ínas (considerad a s como fat o r e s de viru l ên cia) c o m o a l e ctina
Gal/ Gal N a c 26 0 kDa (P etri & R avdi n, 1 99 1), a l ectina de 220 kDa
(Rosal es-Enci n a et al., 1 987) e a ad esi n a de 112 kD a (Arro yo &
Oroz co , 1987).
O ci toplas m a apre s ent a duas á r eas que n ão estão claram e nt e
separa d as. O ect o pl asma é em geral hiali n o, livre de es t r uturas
mem bran os as o u v acuol ares e e stá a s sociado aos ps eudó po des e a outras
ex tens õ es citop l asm áticas c omo os f il opódi os . No endoplasm a s e
encon t r am múlti p los vacúo l os ou vesícu l a s d e difer ent es t ama nhos
rodead as de u ma matriz ci t oplasmáti ca rel a tivament e homogênea .
Uma grande parte d o vo l um e citoplasm áti co está o cupada por
vacúo l o s mem b ranosos, e m su a mai o r ia es féri cos, com uma grand e
vari a ç ã o de t a m anho .
O cont eúd o do s vacúolos amebi anos é vari ável e d epende da
origem d o s t ro foz o í t os; aquele s obti dos d e p aci e nt es e d e cult i v o s
9
pol ixên i cos po s s uem pouc os vac úo los, enq u anto am ebas cul tivadas
ax enicam e nte mo s tram um a m ai o r quan tida d e deles .
Trofoz oítos o btidos de bi ópsia d e p ac i e nt e c om am e bí ase co ntêm
nos va c úolos e ritró c i tos, cél ul as i nflamat óri as e cél ul as do t e cid o q ue
invadi r am ( G riffi n & J un ip er, 1 97 1 ; P i ttman et al., 1973) ; o mes mo
ocorre com as amebas r e cuperad as d e anim ai s exp e rim ent alm en t e
infec t ad os (Tak e u chi & P hi l l ips, 197 5).
Os p r im eiro s estudos s o bre a u ltraes trut u ra dos t ro foz oít os de
E . h i s t o l y t i c a m ostrara m que estes parasi t o s n ã o apres entam o rgan e l as
típi c a s b e m d ifere n c i ad as como mi tocô ndrias, aparel ho d e G o l gi,
retí culo endopl as mático r u gos o, cent ríolos e microtú b ulos. Porém , como
aprese nta s eu D N A confin a do por u m a m embran a n u clear, é consi der a da
uma cél ul a eucar iótica.
1.3.2. Pré-ci st os
Os precist os são formas interm edi ária s entre os t rofoz o í t os e os
cisto s, se nd o o v ais ou li gei ram e nt e arredond a do s e m e nores que os
trofo zo ítos.
1.3.3. Cistos
Os cistos s ão estrutu r as e s fér i cas ou o v ais com a pared e císt i ca
rígid a , conten d o ini ci alm en te soment e um núcl eo, que após um a s éri e de
divis õe s nu cleares s e t ransfor m am em cistos t e t ranucl eados. Têm , em
médi a, 12 µ m d e d i âmetro, com v a riaçõ es ent re 8 a 2 0 µ
m
(Chav ez et al ., 1978). S o m ente o s cis tos t êm i m p o rtânci a n o p roces so
de t ran smissão da do ença, s en do as ún i c as form as infectant es.
Em fezes hum a nas, sem coran tes, se ob ser v am c omo corpos
hial i no s c om uma parede refri n gente, c o m núcl e os p ouco visív eis , assim
como os c o rp os c r om atóides . Em amost ras coradas com i odo o u lugo l os
cisto s se apres e ntam com u m a quat r o núcl e os. Qu ando co radas com
hemat oxilina férri ca, o ci to plasm a d est a form a do p arasito s e ap r esent a
10
vacuo l ar com corp os cromatói d es de cor az ul escu ro, em form a d e
barras cilíndr i ca s (Pro c t o r & Gregor y, 1 97 3 ).
1.3.4. M etaci st o s
Os cist o s a pós inge s tão e por um pro cess o ai nd a n ão total m e nte
eluci d a do, l ibertam u m a ameba tet ran ucleada denom i n ada metacist o qu e
irá o rigin ar, atra v é s d e u m a série d e d ivisões nucl eares e
cit op las m á ti cas, pr i m e iro a quatro e fi nalmen te a oi t o am ebas
uni nucl e a d as, de nominad a s trofoz oítos met a císticos .
1.3.5. Ciclo bi o lógico
O c i clo ge r alment e s e inicia com a ingest ão d e águ a ou alimen t os
cont am i n a dos c om ci stos m a duros, prov enien t e s de fez es de indi v íduos
parasit ados. A tran s m i ssão homem a h om em real iz a -se habitu al m ente
atrav é s de m ãos s uj as co nt aminada s e t amb ém atrav és de prát i cas
sex u ai s .
Os ci stos pas sam e n t ão pel o estôm ago resis t in do à ação d o suco
gá s t ri co e at ingem o fi nal do i nt es t ino d e l ga do o u i nício do i n t estino
gr o s so , onde ocorre o d esen c istamento e a sa í d a do met ac i s to at r av és de
uma peq u en a f enda na parede cís t i ca. Em seguid a, o met acist o s ofre
suces s ivas div i s ões n ucl e a r es e c it oplasm á t i c as ori g inando q u atro e
pos ter i o rmente oi to trofoz o ítos met ací sticos que migr a m pa r a o
intes t ino gros so ond e s e fix am. Em certas cir c unstância s não m ui t o b em
conh e cid as, despree n d em-se da mucos a intest i n al e t ra nsformam -s e em
pré-ci stos e posteriorment e cistos que s e r ão eliminado s junt am e nte com
as fez e s formad as (figura 1 ).
Algum a s c e pas de E . h i s t o l y t i c a p odem viver co m o c omensai s na
luz int estinal, n ã o causand o si ntomas clí n i cos no hos p ed eiro. Po rém,
out ras cepas podem causar danos, com i nvasão d e t e cidos e f o r m ação d e
úlcer a s, às vez e s a ti n gindo t a mbém o ut ros ó r g ãos, p ri n cipalm en t e o
fígad o , c aus and o “a b s cesso hepático ” e, ain d a, os pulmõ es e mais
raram ent e o cér e b ro .
11
Apesa r da alt a m ort al i d a d e (cerc a de 1 00.00 0 p ess oas /a no ) , muitos
casos de in f ecção assi nt o mática s ão regi st rado s . Tem -se ob s e rvad o que
a grande m ai o ria d a s inf e c ções p o r E . h i s t o l y t i c a é c o mpletamente
assi nto m ática.
1.3.6. E n t a m o e b a d i s p a r
Com r elação a E . d i s p a r , admite-s e q u e s eja m o r fologi cam ente
indis t in guível d a E . h i s t o l y t i c a , pelo meno s à micr o scopia d e l uz.
Porém, c om a ax e nização d e u m a cepa d e E . d i s p a r por C l ar k (1995),
aspecto s ultra-e st ruturai s dessa am eba puderam s er comp a r ados com
aquel es da E . h i s t o l y t i c a (Esp i no s a-Can tel l a no et al ., 1998), sendo
obs ervad as diferenças n a est rut ur a d a m embrana nu clear e no as p ect o d a
superfí cie das d u as a m e b as, onde s e desta c a um notáve l uróide (r egião
de al t a ades ividad e geralme nt e localizada n a regi ão op os t a à d a direçã o
do pseudóp od o , obs e r v ando-s e resto s celul are s e bactérias, o s qua is são
parci a lm ente eliminados no subst rato – Mart i nez-P a l omo, 1982),
raram ent e pres ent e em E . h i s t o l y t i c a .
Atrav é s da mi croscop ia e l etrôni c a de t r a nsmis são observa- se
num ero s o s vacú ol os q ue t endem a concen tr a r em d et e rmin adas áreas do
cit op las m a da E . di s p a r , enqua nt o áreas li v res de va cúolo s apresentam
met acrom asia qu ando corad as com azul de toluid i n a dev i do à pr e s ença
de l a r gos d epósi tos de glicogê ni o, r a r amente encon tr a do em
E . h i s t o l y t i c a . N a E . h i s t o l y t i c a es tes v acúolos são menores e estão
dist r i b uídos d e forma un ifo rme no citoplasm a (Espi n o s a -Cante l l ano
et al . , 1998).
Difere n ç as e ntre trofozoí t o s d e E . h i s t o l y t i c a e E . d i s p a r são
evid enc i adas quando observa dos através de micros copia ópti ca com
tecnol o gi a NOMAR S K I. A f o rm a d os tro foz o í t os de E . d i s p a r é
alon ga d a, com um ps eudó po d e anterio r p r o emine nt e e l a r go e um
not ável u róide po sterior. Em cont r aste, t r o fozoít os d e E . h i s t o l y t i c a
tend em a ser gl oboso s c om vár i o s pe q u enos p s e udópod es e u m u r óide
meno s com umente v isto, o núcl e o apres ent a g rânul os fi n o s periféri c os e
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um anel c romáti co mai s d enso que o ob s erv a do e m E . d i s p a r (E sp i nos a-
Cantell ano et a l., 1998) .
Provav e lm ent e a d i ferença mais acen tuad a ent re es tes dois
parasit os é q u e a m em b r ana celul ar d e E. d i s p a r most r a u m a camada
mai s de l g ada e em algumas ocasiões i nt erromp i d a, dife r e ntement e da
E . hi s t o l y t i c a qu e possui u m a mem b ra n a ma i s gr o s s a e u ni f orme
(Esp in os a-C ant ell an o e t al., 1 99 8 ).
Ao micr o s c ópio elet r ônico, C háv ez -Mungu í a et al. (2000)
descre v e ram a presença de est rut u r as semelh a nt es ao complex o d e Gol gi
em E . d i s p a r .
E . d i s p a r parece s e r m enos cap az de obter n utrie n t es po r
pinocit ose do q u e a E . h i s t o l y t i c a , o q u e pode expli c ar su a d i ficuld a d e
em crescer em meio ax êni co (C l ark, 1 998). Além di ss o, E . d i s p a r
prod uz menos prot e as es ( Brucchau s et al ., 1996) e t em u m g licocálix
mai s fino (Esp i nosa-Cas t e ll ano et al., 1998), t end o l i gação mais fraca e
meno s t óxi ca co m as cél u l as (Dod so n et al., 1 9 97).
13
Figura 1 : Ciclo biológico da E. histolytica/E. dispar (adaptado de Haque et al., 2003)
14
1.4. Patogen ia e Virulênc ia
Pérez - T ama yo (1986) utili z o u a p alav r a p a t o genia p ara se referi r
aos meca nismos par ticipan t es n a in i ciação , evo l u ç ão e resul t a do final
do process o patol ó gico. N a amebía s e t ai s mecan ismos não e stão
limi t a dos ao h osped e iro o u a o p a r asi to, poré m são um a consequ ê n ci a d a
interrel a ção d e a mbos e su a express ão con j u nt a no p roce sso pat ol ó gi co.
A p a t o genici d ade é a capacid ade do parasit o d e pro d uzir ou não
enfermid ade em uma relação pa r a sito-h os ped eiro e s pec ífi ca. A
virul ê n cia é o gra u com o qual s e expressa a pat o geni cidade, que
tam bém d e pende t an t o do ho sp e d ei ro co mo d o p ar a sito.
A vari ad a express ão d e viru l ên cia da E . h i s t o l y t i c a é um dos mai s
interes santes aspec t o s da amebías e hum ana, onde observam os desd e
form a s assint o m áticas at é formas i n vasivas l e t ais, a p r esent an d o ainda
gr a n d e diversi d ade de m ani festações c lí nicas.
Ex pli car a m eno r i n cidênci a d a d o en ça invasi v a em h um anos
infec t ad os co m E . h i s t o l y t i c a tem ocupad o a at en ção de ge r a ç ões d e
investi gadores clí ni cos e n ão - clíni cos . W alsh ( 1986) e stim ou q ue m enos
de 10% ( 36 m i lhões) das p essoas i nfectad a s com E . h i s t o l y t i c a (480
milh õ es de pes so as) des env olvem si n tom as cl í ni cos, da s quais 10 0 mil
morre m anualm e nt e.
A amebía s e i n t estinal afet a e é m ai s l etal nos extre m os d a vida,
enqu a nt o o abces so h e p ático é m ais frequen te em home ns e ntre 30 e 45
anos , t en d o uma alta mort alidade.
Ameb í as e invas i v a devid o a E . h i s t o l y t i c a é m ais comum em
país es em desen volv im en t o , ond e c ondiçõ es v a riada s (s ócio-ec o n ômicas
e hi gi ên i co -sanit árias) favo r e c em a t r ansmiss ã o f ecal-o r al do pa r a sito.
Apesa r d e s e conhecer a gran d e c ap acida d e d es tru ti va do s
trofo zo ítos d e E . h i s t o l y t i c a e que esta caract e rístic a se observ a
claram ent e n os t ecido s a fetad o s , p ri ncipalm e nt e n o i nt es t ino g r osso e
no fí ga d o , a tualme n t e p ouco se c o n h e ce a resp eit o dos mecani s mos
intrí n s e cos das ame b a s e dos fato r es do hospedei ro q ue co n duzem a
prod ução de l esões. Embora estu do s sobre a m orfologia , bi ologi a
celul ar, im unolo g ia, gen éti ca e b iologi a m ol e cular t e n ham cont ri b uído
15
para o entend im ent o de al guns asp e ctos da pato geni a da am ebías e, a
mai ori a d e stes es tudos t em s id o real iza d a d e forma isolad a e p o u co
integr ativa.
Cunha ( 1977) cl assi fica d o is grup os p r i n cipais d e p acien t es com
amebí as e: ass i nt omático s e sintomá ti c os. No gr u p o d e pacien tes
sint o m áti cos podem os o bservar as for m as i ntesti n a is (co lite d i s entérica ,
amebom a , apen d i cite p o r am eba e col it e n ão d is en t ér i ca) e as form as
ex tra-i nt estinais (hepáti c a, cut â n ea, pu l m on ar e ce r ebral).
A am ebíase i n t estinal é a f o rm a m ais fr e quente da i n fecção
sint o m áti ca p or E . h i s t o l y t i c a , mas os s intom as observ a dos n ã o s ão
especí fi cos desta doença. Compreen d e des d e a colo n iz a ção luminal até
a invas ã o d a muco s a. Os sinto m a s podem a p a recer em um a o u duas
seman as após a i n fecção.
A col i t e disen t é rica é a manifest a ção ex p r essiva da amebí as e
agu d a não co m p licada, t en do c omo sint om as do minant es a di arréi a ,
dores abdo mi na i s e t e nesmos . O indivíd u o p arasit a do p el a E . h i s t o l y t i c a
é acometi d o d e di ar r é i a com e vacuações f r equent e s, c hegando a d ez ou
mai s v ezes ao dia, com fezes líquidas e mu co-s a nguinolen t a s, j á
trad u zi ndo um a l esão ulce r ativa e i n flamação do int e s tino.
O amebo m a - r esultant e d e u m a r espos t a i n flamat ó ri a inte n s a, c om
reaçã o fi b ro elás ti ca e form a ç ã o de granul om a - geral m ente é com post o
por uma l es ão ú nica r e s u l tante da junç ã o d e v á rias ú lce ras, formad a po r
massas granul om atos as que pod em ser confun di das com neopl as i as .
A ap endicit e decor r e de ulceração ceco-ap e ndicul ar segu i da de
process o infl ama tório do ap êndice.
Embora al gu ns autores n ao aceite m a exi stênci a da colit e não
disent é rica (C ND), esta tem com o ca r act erís t i c as evacu a ç õ es do ti po
diar r éico ou não al tern ad as por perí o d o d e f unci on amento norm al d o
intes t ino ou mesmo con st i p ação in t es t inal, p o d e ndo ser a c ompanha d as
de dore s ab dominai s em cólica, periumbil ica i s , flatul ência e sens a ç ã o
de d esco n fo rt o a bdomi na l, s e ndo d eno m i n ad a p or Cunha et al. (1977)
como f o rm a inte r medi ária da amebías e.
Por su a vez , Espin os a-C a nt ellano & M a r tínez -P al om o (2 000)
clas s i ficam em quat ro fo r m as clíni ca s a am e bíase i nt es t inal invasi v a:
16
disent e ria o u diarréia s a n guinol ent a (90%) , coli te fulm i n ante,
apend i cite amebi ana e am eboma do cólon .
A l es ão m ais preco ce des sa invasão é r e p r e sentada por pequen as
eleva ç õ es nodu l ar es em cabe ç a d e al fi net e. Há uma d epleção d o mu co
intes t inal e rupt u r a da barrei r a epi t elial como res ultado da de gradação
da m at riz ex t race lular, o que o corre em parte d evido a ação d as cisteíl -
prot ei n as es liberad as pel o p a r asito. S u b s eqüen tem ent e, tro foz oí tos
invadem a s célul as ep it el i a is e en cont ra n do m aio r r esi st ênci a d a c amada
muscul a r, estendem sua ação l atera lm e nte, f orman do as cham adas
úlcer a s em "bot ã o de camisa" (Qu e & Reed , 2 00 0) .
No i ní cio d o p ro cesso i nvasivo t r ês ev ent o s consecu ti vos oco r r em:
erosão f o c al s uperfi ci al d a m u cosa, peq u en o f o co glandul a r d e
microi nv asão e l eve a moderad o infi l trado da lâmina próp r ia ( Es pinos a-
Cantell ano & M artínez -P al om o, 2 000).
Est udos i n v i t r o r evel aram que a at i vidade lí tica d a E . h i s t o l y t i c a
resul t a ndo em doen ça i n v a siva req uer a d e rênci a ao muco, cit ólis e de
célul as epitel i a is intest inais e c élulas i mun es efetoras ap ós cont a to e
modul a ç ão das funções i m unes do hosped e i ro (Chadee e t al . , 19 88;
Mart í n ez -Palom o et al. , 1989; C am pb el l & C had ee, 1997).
Os trofozoítos co lo nizam o int es tino h um ano a pós a ade r ê n cia às
gl ico pro t e ínas d a m u cina c olônica através de uma l e citin a especí f ica, a
Gal/ Gal N Ac de 260 k D a. A d estruição das cél ul as d o hos p edei ro r equ er
cont at o via parasito-leciti n a (R avd i n et al . , 1989; P etri & Si n gh, 199 9 ).
A a d e r ência à s célu l as do hos p e d eiro é u m pr é-requ i sito p a r a a
dest ru i çã o teci dual, um a vez qu e é nece s s á rio um ínti m o contato ent re
os t ro fozoít os e as célul a s alvo. A ad e rência é também import a nt e para
a col o n ização i ntestinal, c omo cit a do anter iorment e . D e forma
interes sante, amb as as fo rmas de ad erênci a parecem s er med i a d as pelo
mesmo recep t o r d e s up erfíci e , u m a lecitina que pod e se r inibi d a p el a
Gal/ Gal N Ac.
Compa r a ções entre E . h i s t o l y t i c a e E . d i s p a r re vel aram que ambas
pos suem receptores para esta l ecit ina, a qual liga com a mesma
efici ê nci a as célul as al vo e a muci na colônica ( Dodson et a l., 19 97 ) .
17
Ameb a po r os são peptí de os form ado res de poros que modi fi cam os
canai s iôni c os da m embran a celu l ar das células- a lvo e induz e m a
modif i ca çõ es hidroel etrol í t i c as no citopl asm a d a cél u l a ( L yn c h et al.,
1982). Têm a c a pacidad e de incopor a r - s e às bi cam adas lipídicas e
form a r po r os p ermeávei s a í o n s. T a nt o E. h i s t o l y t i c a co m o E . d i s p a r
pos suem a ati v id ade de formar p o ros, porém a ativ i d a de da E . d i s p a r é
80% men o r quando comparad a à E . h i s t o l y t i c a .
As cist eíl -p r ot einases (CP) s ão as p rin cip ai s enz i m a s pro t eol íticas
encon t r ad as em grande qu antidad e em l i s ados d e E . h i s t o l y t i c a e
capaz es de clivar co láge no , e l astina, fibrin o gênio e l amin ina, elem entos
da m atri z extracelul ar, p ermi tin do a penetr a ç ã o de tro f ozoítos p ara
causar a ssim a form a invasiv a d a doença (Keene e t al., 1990 ) . Em
adiçã o, CP interfer em com a f u n ç ão d o sistem a -imune do h os p edei ro,
cli van d o C 3 e degradando IgA e IgG , possi vel m e nte prote g en d o assim a
ameba da opson i zação (H a que et al ., 2003).
Cepas de E . h i s t o l y t i c a apresentando di fer e ntes graus de
virul ê n cia apresent am di ferentes ní v eis d e expressão entre as ci steíl-
prot ei n as es (Que & R eed, 19 97; Tannic h et al, 198 9 ).
Evi dên ci as do p apel d as CP como fator de vi rulên ci a in cluem a
prod ução e liberação d e dez a 1 000 vez es m ais quan ti da d es d estas
subst â nci as po r cél ul as l i s adas d e E . h i s t o l y t i c a do qu e por c élulas
lisad a s de E . d i s p a r (Reed et al., 1 9 89 ). D esta form a, E . d i s p a r
aprese nta um a men o r a tividad e desta s enzi mas , aparen t em en t e co mo
resul t a do de u m m enor n ú m ero de genes ex p ressando est as substân ci as.
A medid a da r e sistênci a t r ansepi t elial (TER ) d e célul a s M D CK
tem sido util iz ada para aval i a r a vi rulênci a d e cep as de E . h i s t o l y t i c a .
Ess a t é cnica é a l ta m ent e s ens í v el p ara d e t ec t ar o d ano inicial
prod uz i d o por t rofozoít os amebi anos à s c é lulas em cul tivo. Es t u do s
realiz ados por O rozco el al. (1982), M art í n ez-Pal om o et a l . (1985) e
Oli vos-
Garci a et al. (2004) demon s t r a ram qu e t r o fozoít os d e
E . h i s t o l y t i c a s ão capaz es d e red uzir dras ti cament e a resistênci a
tran s ep i t elial apó s 6 0 mi nutos de i nteração co m célul as MDCK. P o r
out ro lado, Esp inosa-C ant ellano et al. (1998 ) demon st rara m qu e
18
E . d i s p a r t ambém é cap az de promo v e r a redução da TER , por ém de
form a m ais l ent a que aq uel a observ ada com a E . h i s t o l y t i c a .
Embora E . h i s t o l y t i c a possa in f e ctar qualqu er órgão do corp o , a
form a m ais f r e quent e de am ebí as e extr a - intest i n al é o abcesso h e p ático
amebi an o, sen do dez vez e s mai s comum em adul t os e t r ês vez es m ais
freque nte em ho m ens qu e em mulh eres.
A a mebíase ex t ra - int estin al é rara em nosso meio, porém já foram
assi nal ad os v ári os c a sos d e abs cesso s h ep á ti cos am ebiano s na região
amaz ô ni ca, so br e tudo n os est ado s do P ará e A m az onas ( C u nha et al.,
1977; d e Menez es, 1 986). No entanto , este qu adro é mais co m um em
país es com o M éxico , Áf r ica do S ul , Ta ilândia e Egi to, onde s e constit ue
em u m a const ant e e sev e r a compl i c a ç ão da am ebí ase (W HO, 1984).
Nas suas fo rmas i n v asivas a a m eb í ase é uma enfermi d ad e
pot enci alm ente l etal , s endo q u e a mo rtal i d ade en t re a q u el es c om
abcess o he p ático pode ch egar a 10% e at in gir 70% nos casos de colite
fulmi n ante ( G uerran t, 1 986). Além de s e r um a d o ença potenci alment e
let al, a am e bí ase inv a siva tem i m p o r tantes c on s equên cias s o ciais e
econô m i c as, haja vista sua frequen te o c o r rênci a em i ndiv í d uos do sexo
mascu l in o n a e t apa m ais p roduti v a de s ua vida, entre os 20 e 5 0 ano s d e
idad e, po d endo l evar à i ncapaci t a ç ão t em p o r á ria e r equeren do , muitas
vez es, v á ri os di as o u semana s d e ho sp i talização .
O absce s s o h epáti co a m ebi ano é uma c o m pli c ação d a amebías e em
três a nove p o r c ento do s casos d e c olite a m ebi ana (B a r bour & J uniper,
1972), pred o minantem e nt e l ocaliz ad o no lóbulo dire i to. Ap esar do
term o j á co nsagrad o , na am ebí ase não ocorre propri am e nte ab c esso com
a f o rmação d e i nfl a m a ç ão p u r ulenta circuns c ri ta. Há si m uma n ec r ose
coli q u ativa do parên qu im a em cons eq u ência da ação enz imát i c a das
ameba s, co m c avidades cont en do l í q uido am arelad o, a c h o colatad o ou
esverd e ado devido à presen ç a de pi gmento bi l i a r. O mat e rial necró ti co
pode ser sóli d o , macio ou semi-líq uido, freque ntement e espess o e um
pouco mucói d e. O t am a nh o d os a b cessos varia des d e l esões p untifo rm es
até m ass as enorm e s d e m ateri al n ec rótico q ue p od em subs t ituir at é
cerca d e 90% do ó rgã o n o r mal.
19
As principai s manifest a ções clí nicas do abcess o hepáti co
amebi an o são r epresent ados pel a tríad e dor, f ebre e h epato m e galia. A
dor s e lo cali z a n o quadrant e supe r io r direit o d o abdome, c om
hepat o m e galia d o lorosa em 9 0 % d o s p a cient e s. In clui , en t r e outro s
sint o m a s, febre int ermitent e e i r r e gular , v ari ando de 38ºC a 40 ºC com
calafrio, ano rex i a e perd a de pes o.
Quand o E . h i s t o l y t i c a at i n g e o fí ga d o hu man o , obs e rva-s e
inici alm ente l e sõ es mu it o peq u en as e múltipl a s que tende m a un i r-se e
dar l ugar aos ab c essos hepáti c os amebian os . E stes abces sos costumam
ser ún i c os e geral m e nt e local iz ados n o l ób u l o direi to d o fí g ad o (85%
dos cas o s), ap r esentan d o taman h os vari a dos (S il v a, 19 9 7 ). Não é
comu m a invasão bact eri ana, mas quando oc o r re, agr a v a o quad r o.
Em i nf e c ç õ es experi ment a is, a l esão h e p ática amebian a é
carac t er izada p or u m in filtrad o inflam at ó rio e lise de célul as
inflam ató rias e m t em po s i ni ci ais, s e g uida p el a fo rmação d e gr a n ul omas
e produção de n e c rose tissul a r de tipo coagu lat ivo c om escass a fi bro s e
(Tsu ts um i et al ., 1984; Ts ut sumi & Martínez -Palom o, 1 9 8 8 ).
São n umerosas as v a riáveis e n volv i d a s na p atogeni ci d ad e e
virul ê n cia da E . h i s t o l y t i c a , as quai s r e l a cionam -s e co m o hosp e d ei ro,
com o paras ito e com o m eio . Aspec t os como l o c ali z aç ão ge o g r áfi ca,
raça, s exo, idade, respo s t a imu n e, estad o nutricio n al, d i eta, clima, flora
bacte r iana ass oc i ada e p a ssagens s ucessiv a s do p arasito em divers o s
hos ped e i r os, dent re ou tro s aspect o s, são resp onsávei s p ela m ai or o u
meno r p at o genici dade d a d o ença.
Infecções assi nt omáticas po r E . h i s t o l y t i c a p o d em oc o r r e r em
algu ns p acient es, i d ent ificad os através de s o r ologi a p o sitiva para o
parasit o (Gath i r am & J a ckson, 1 98 7; Car v al ho et a l . , 1991 ).
Sargea unt et al. (1 9 8 2 ) estudara m 147 p a cien t es c om parando 8 0
com a m ebíase invas iva e 67 assi nt om á ti cos co m cis t os na s f ez es. To dos
os 80 p aci entes e stavam in fect ados com E . h i s t o l y t i c a , en q uanto aqu eles
assi nto m áticos est a v a m i n fectad o s com a f orm a não invas iv a d a
amebí as e . O uso da e l et r oforese de isoen zi m as confi rmou a existênci a
de d i f e rentes t i pos de am ebas.
20
Atual m ent e a ceita-s e que a m aio ria das f o rmas assint om áticas da
doen ç a sej a o casion a d a pela E . d i s p a r (Brumpt, 1925 ) . Est a ameba é
cons id erad a um com ens al do int est ino gr o ss o - embo r a alguma cep as
pos sam irri t a r a mucosa intes t i nal s e m i n v adi-la , o ca s io nando um a
coli t e n ão -di sen térica - sendo morf ol o gicame nt e semel h ant e à
E . h i s t o l y t i c a (Diam on d & Cl a r k, 1 993; Cl ark, 1998 ; M art í n ez-Pal om o
& Espin o s a -Can tel lano, 1 99 8 ).
A E . d i s p a r par e c e s e r c a p az d e induzir l e sões i ntesti n ais focais
em an i m ais experimentai s e d est ruir c é l ul as epi t eli ais em m ono camad as
i n v i t r o , sendo e ntão p or d e finição, um patóge no (Chadee et al. , 1 9 85;
Espin os a -Cantell ano et al ., 1997; Espi nosa- Cantel l an o et al., 1 9 98;
Cost a et al., 2 0 06).
Est udos real iza do s p o r C os ta et al . (2 0 0 0 ) e Furst et al. (2000)
demo ns t r a r am ser a E . d i s p a r capaz de pro duzir lesõ es hepáti cas em
hams t e r s qu ando as sociada à flo ra o r i g inal do s e u ho spedeiro . A
pos sibi l id ade d a E . d i s p a r s er cap az de i n duzir m ud ança s patol ógi c a s no
cólo n humano, embora não ne c e ssaria m e nt e le sõ es in v asivas, não po de
ser ex cluída (D i amond & Clark, 1 99 3 ).
O efeito citopát i co da E . d i s p a r analiz a do p el a perd a gradual da
resi s t ê ncia elétri ca t r a nsmural de células M DCK é m ui to l ent o.
Enquan to a f a gocitose por E . h i s t o l y t i c a d e c élulas epiteliais tem um
impor t ante p apel na p a togeni c i d ade aos ho sped eir os , tro f ozoítos de
E . d i s p a r ra r amente m o s t ram evid ên cias de fago citose (Es pi n osa-
Cantell ano et a l., 1998) .
E . h i s t o l y t i c a e E . d i s p a r p o d em ser separad as po r vári os test es
não dispo ní ve is rot ineiram e nt e em laborat ó rios d e an ál ises clín ica s:
pesq ui sa d e copro an tí genos (Haq ue et a l . , 1 993; Go n z alez-Ru i z et al.,
1994), a nális e d e is o enz i mas (S a r geau n t & Willi am s, 197 8 ; Mi r elm an et
al., 19 8 4 ; Blanc, 19 92), a nticorp os m ono clo nai s (T orian et al. , 1987;
Strach a n e t a l., 1988; Reed , 19 92 ) e m é todos com o R F LP e PCR
basead o em g en es do rRNA (Tanni ch e t a l. , 1991; T anni c h & Burchard,
1991; T achib ana et al. , 1 9 91; Acu n a-Soto et al., 19 93 ).
Tecni c amente, entre t anto , a d i f erenci ação ent r e as d u as e s péci es
cont i nua u m desaf i o . O diagnóst i co da E . h i s t o l y t i c a é trad i c ion alm ent e
21
realiz ado a t r av és de ex ame mi croscóp i co d e fez es f rescas o u fi x ad as ,
aprese ntando vári as l imitaçõ es (Gonzalez-R u iz et al ., 1994), send o a
mai s imp ort ante a i n c apaci d ad e de d istingu i r E . h i s t o l y t i c a
de
E . d i s p a r , po r s e r em morfologicam ent e s emel han t e s.
Embora métod os d e m i c ros cop i a d e luz apo ntem p ar a duas a m eb as
morfo l o gicamen t e semel h a ntes, es t as apres e ntam p r opriedad es
bioló g i c as q u e s e co rrel a cionam c om a form a clínica dos indi v í duos d os
quai s s ã o pro v en ien tes (Sargeau nt et al ., 19 80 ) . Assim sendo, E . d i s p a r
não d eve r ia ser diagnosti c a d a em in d ivíduos s i ntomáti co s. Ent r et anto,
Cost a et al. (2006) i d e ntifi caram ge n et icamen t e com o E . d i s p a r amebas
isol a d as de p a cient e s com co l ite n ão-disentéri c a. E s t as a m e bas, q u ando
em culti vo mist o com b a ctéri as , p roduzira m les ões tão s everas em
anim ai s d e experi mentação quanto E . h i s t o l y t i c a .
Apesa r d e al g u ns a u to r es a f i r m arem s e r E . d i s p a r in capaz d e
causar sin t o mas no ho mem , traba lhos realiz ad os p o r Cha d e e et al.
(198 5) e Barral d e Ma r tinez e t al . (19 9 6) sugeriram que n o v o s estudo s
devem s e r realiz ados para esclarec e r ta l q u estão.
1.5. Estudos Experime n ta is de Vi rulência
1.5.1. I n v i t r o
1.5.1. 1. Fagoc i t ose
A fago citose foi defi ni da c o mo um pro c e sso m edi an te o qual
algu m a s cél u l a s são capaz es de in geri r partí c ul as qu e se e n contram em
seu mei o (Stos sel , 1 97 4) ; no caso d e o r gani smos unicelul a res
heter ot róficos como E . h i s t o l y t i c a esse p roc e sso é utiliz ado p a r a a
obt ençã o d e nu trientes . P or o utro l ado , em org an ismos m ul t i ce lulares, a
fago c it ose é re aliz a d a un i cament e por al gumas de suas cél ulas e tem a
função d e defes a.
Uma d as p r o p riedad es bi ológi cas das am e b as q ue mais s e t em
estuda d o i n v i t r o é a fagocit ose. Esta s e caract eriz a p ela in gestão d e
22
célul as mortas, fr agment os ce l u lares, p a rtículas in ertes ou vivas . Em
ge r a l , o fenô m eno d a fagocit o s e implica três e t apas: a p r i m eira é a
adesão d a p a rtí cul a ou cél u l a a s u perfíci e da a m eb a , a s e gunda é a
ingest ão ou int erna liz ação a o i nt erio r do cit o plasma, e n volta co m a
mem bran a plasm ática d ando o ri gem ao fago s som a, e a tercei ra etapa
cons is t e na form a ção de u m a nova e s trutura d en ominad a fago l i sossoma.
O conteú d o do mes m o é degr adado pelas enz imas q u e a c él ula possue
nos l iso s s omas.
A fago c i t os e d e hemácias h um anas por trofoz oítos de
E . h i s t o l y t i c a foi descrita h á m ai s d e 100 anos p o r Lö sch (1875), s endo
cons id erad a um crit éri o v ál i d o p ara a s e p a ração de cep as “pat o g ênicas ”
e “não-p ato gênicas ” . É conside r a d a um a propri e dade bioló g i c a dos
trofo zo ítos de E . h i s t o l y t i c a q ue s e rela c i o n a não apenas com v irulênci a
(Tri s s l et al., 1978 e O rozco et al., 1982a) mas também com o
mecan ismo de p at ogenicidad e do t rofozoíto.
Nas infecç õ es h umanas, a p r esença de eritró c i tos n o cit o p l asma da
ameba é u m a fort e i ndi cação da invas ã o dos tecido s pel o protoz o á rio
(Rav d i n & Guerrant, 19 8 2 ) .
Embora s e tenh a d ado gran d e import ânci a a ati vi d a d e
erit rof a gocíti ca, os trofoz o ítos de E n t a m o e b a h i s t o l y t i c a t amb ém s ão
capaz es de f a go citar uma grande vari edade de c élulas e pa r tí c ulas como
bacté r ias (R o s embau m & Witt n e r , 1970 ; Anaya - V e l á z q u ez et al ., 19 97 ) ,
out ros p ro t oz oários co m o T r y p a n o s o m a cr u z i (P hi ll ips, 19 5 3 ) , diversas
linha s cel ul ares em culti vo com o cé l u l as C HO (Ravdi n & G u errant,
1980), MDCK (Ma r tí n ez-P alom o et al., 19 85), grânulo s de amido,
lipos om as (Tru del & G i cq u aud, 1 985 ) e esferas de l átex ( B ailey et a l .,
1990), entre o u t ros.
Tris sl et al. (1 97 8 ) d emonst rar a m q u e di f erent e s cepas de
E n t a m o e b a h i s t o l y t i c a s ão capaz e s d e f a gocitar erit ró citos humanos i n
v i t r o ; e les o bs e rvar a m que a ati vid ade fagocí t i c a fo i mai or em ce pas d e
E . hi s t o l y t i c a isolad as de caso s de disent eri a hu m an a do qu e em cep as
obt idas d e p ort ad o res as sinto m á ti cos. Os result ad os d emonst raram q u e a
ati vi dad e fagocí t i ca e m c e p a s viru l e ntas é um proc e ss o mais rápido e
efici e nt e que em cep as n ão - vi rul ent as .
23
1.5.1. 2. Efei t o Citopáti co
O ef e ito cit opático é de f inido co mo a capacid ad e dos trofoz oí tos
dest ru i re m células em cultivo c onstituin d o , juntam ent e com a ades ão e
a fago c it ose, um f a t or import a nt e nos mecani sm os p a t o gênicos da
E . h i s t o l y t i c a (O rozco e t al., 19 82b e Pet ri & Ravdin, 19 87). Há
inici alm ente um a di minuição da resistênci a el é tri c a t ransepit eli al,
segu id a d a ruptu ra das un i õ es entr e a s cél u l a s com co nsequent e
desp rendi mento do s ubstrat o, o q ue result a na lise e f a gocitose das
célul as p elos t ro f ozoítos ( M ar tinez -P a l omo et al. , 1985 ).
1.5.1. 3. Prot eas e s
As pr ot eases s ão um g ru po d e enzim as líticas envol vi das em u m a
gr a n d e q u antidade d e v i a s m et aból i c as e q u e a presen tam div ersas
funçõ e s em to d os os organis m os . Estas enzi m a s cat aliz a m a rupt u r a de
ligaçõ e s pe pt ídicas , par t i cipando na manufatu r a e edição de novas
prot eí n as at é a degradação d e p r oteína s que c umprir a m sua vida média.
Tamb ém parti ci p am no s meca ni smos de d efesa das célu l as do sist ema
imune , incl u siv e no processamen to de antígen os po r cél ul as
aprese ntadoras de an tígeno . E s t as proteí n as sã o cl assifi ca d a s conforme
sua com p osi ção, estrutu r a bioquím i c a e mec a nismo d e a ção.
A p rincip al cl assificação d a s protea s e s se refe r e ao tipo de
ami no ácid o p resen t e n o sítio ati vo da e nz im a. Des t a forma , o sistem a d e
clas s i ficação está comp o s to p or qu atr o grupo s pri n ci p ais: seri no -
prot eas e s, cis t e íl -pro te a s es, meta lo -pro t eas es e asp a rtato-p rot eas es.
Nos o r ganismos p at ó genos fo i demonstra do em div ersa s ocasiões
que a ação de pr ot e ases tem um efei t o d ireto sob re a p atogênes e d a
doen ç a (R osent hal et al. , 1987; Bouvie r et a l, 1 9 89; M cKerrow et al.,
1991; M c K errow et al. , 19 9 3; Serran o-Luna et al., 2 0 06).
24
1.5.2. I n v i v o
A uti l iz a ç ão de m o d elos an im ai s em algum a s p aras ito s es é
realiz ado com o o bjetivo fundamen t al d e s e con hecer os m ecan ismos d e
pato ge ni a . Na amebías e ex peri m e ntal com mo d elos animai s se uti l iza
princi p alment e roed o r es d evido a uma s éri e de v a nt agen s como cust o,
alt a repro du t ibilida d e das l esõ es e acessi b ilidade e unifo rm i d a de deste
anim ai s d e laborat óri o.
Apesa r d e não ex i st i r um mo del o experi m ental i n v i v o q ue
reprod uza fi elment e o ci clo compl eto o bs ervado na enfermi d ad e
amebi an a no s er hu m a no, os model os ani m ais nos têm pe r miti do
conh e c e r diversos as p e cto s da f is iopat o l o gia da am e bí ase e d a r es posta
imune do hospede iro, além de serem util izados com outros pro pósit os ,
como a d e t er minaçã o do e f eito f armac o l ó gico d e a l gun s m e di c ament os
ou pro vas d e substância s pot enci al m ent e útei s co mo ameb ici d a s ou na
prod ução de vaci nas.
Desde 1 930 q ua nd o Clev e l an d & S a nd ers ini ciaram o estudo
ex peri m e nt al da am ebí as e h e pática em gat os, diferentes invest igad o r es
util i z aram uma grande var i edade de espéc i es a ni mais para
ex peri m e nt ação, co mo cã es, ratos , c o elhos, répt eis, hamsters e
ge r b i l ín eos.
Hams te r s e gerbil í n eos s ã o os a nimais de l a borat ór i o m ais
suscep tív eis à produção ex perimen t al d o abcesso h e p át ico amebi ano.
Cam un do n go s são p o u cos uti l iz ados, pois a m aioria das linh a gens
ex ist ent es s ã o r esis t ent es a p rodução d e l e sões no fígad o ( Tsutsum i &
Shib a yama, 200 6).
Os mo delos intest in ais , diferen t em ente dos he p ático s , nã o es tão
claram ent e est ab eleci do s , uma vez q u e a prod ução das les ões
ulcer a tivas não é const ant e n e m un i fo rme e requerem con di ções e
mani p ul ação es peci ai s dos animais de ex perimen tação. E m ger al , as
lesões int est inais produz i das em h am s t e rs, r atos ou gerbilíneo s são
tem po rai s, au t olimitad as e tendem a curar-s e es p o ntaneamente
(Meero vitch & C h adee, 19 88 ).
25
2. JU S TI FI C A T I VA
26
Morfo l o gi cament e s em elhan te a E n t a m o e b a h i s t o l y t i c a porém
incap az de invadir a m uco s a intest i n al, E . d i s p a r , ant e ri o rmen te
descrit a c omo fo rma “não pato g ên i ca” da E . h i s t o l y t i c a , soment e fo i
acei t a com o esp écie di sti n t a qu ando estudo s demonst r a ram diferen ç as
nos p adrões i so enz im á ticos entr e as cepas consi d e rada s pat ogêni cas
- isolad as d e p acientes com doenç a invasi v a - e as c e p as n ão
pato gê ni c as - i soladas d e paci ent es a s si ntomát i cos (S arge a u nt e t al. ,
1978). Essa t eori a foi r e forçada p or trabal ho s q u e evidenc i ar a m
difer e n ças an ti gênic a s e g en éti cas entre as du a s esp é cies (Strachan et
al., 1 98 8 ; Tanni ch et al. , 1 9 89).
Nos últim o s vi nte anos grande parte d o s est udos b i oquímico s ,
molecu l ares e epide miológico s tentam elucid a r , sem muito su cesso , s e
E . h i s t o l y t i c a c ompreen d e d u as espécies ou apenas um a cap az d e
modul a r a ex p re s s ão d e s u a vi rul ênci a. T rab alhos recen t e s
demo ns t r a r am q u e c e p a s de E . d i s p a r i s ol adas d e paci en t es no Bra s il
(Furst et al., 2 0 00; Cost a e t a l., 20 06 ), quando c ultivad a s e m associ ação
com bact é rias d a m ic r ob iota i nt es t inal do hosp e d ei ro, s ã o c a p azes de
ocasi o n a r les õ es he p á ti c as em animai s de lab orató rio (p r i n cipalm ent e
hams t e r s) e apre s ent am ef eito citotóx i co em m o no cama d a s de c élulas
VERO.
Dest a form a , no s s o t rab alho visa o estudo m ais detalh a do da cepa
ICB-ADO polixênica de E . d i s p a r , i sol ada po r C osta em 1 9 97 e m ant i d a
no Lab o r a tório de A m ebí ase e P ro t ozoários In t e stinai s do D ep artam e n to
de P arasi tologia do IC B/ U FMG. Também optamos por es t u dar a cepa
ICB-EGG m o n oxênica de E . h i s t o l y t i c a q ue, apesar de iso l ad a po r S i l v a
em 19 88 e not ave lm ente v i rulent a, p ou co s e conh ece s o b r e s e us
mecan ismos de p atoge n i cidade.
27
3. O B J E TI VO S
28
3.1. Ob j etivo Geral
Determi n ar a pato genicid a d e e a v i rulên cia de cepas de E n t a m o e b a
d i s p a r e E n t a m o e b a h i s t o l y t i c a em condi çõ e s de cult i vo monox ênic o e
pol ixên i co, c ompar a n d o - as com a c e p a pat o g ê nica d e E . h i s t o l y t i c a
HM1-IMSS.
3.2. Ob j etivos Espec ífi cos
1. Com parar o grau de vi rul ên ci a de c e p a s d e E . d i s p a r e
E . h i s t o l y t i c a at r avés de t estes i n v i v o , anali sad o atr a v é s d a les ão
prod uz i d a em fíga do de h ams t e rs.
2. Estud a r a s a lteraç õ e s h i stopat ol ó gicas das les õ e s fo rmadas n o
fígad o de hams t e rs infe c t ados ex p e rimentalm e nt e.
3. Estu da r a c in ética de form a ção das les ões atr a v é s de
micros c opia d e luz.
4. Com parar o grau de vi rul ên ci a de c e p a s d e E . d i s p a r e
E . h i s t o l y t i c a at ravés d e t es tes i n v i t r o :
4 .1 . Anál ise d a eri t rofagoci t ose at ravés d e par âm etros
qual i t ativos e q uantitat i vos;
4 .2 . Análi s e d a atividad e p roteolí t ica em gel de po l i acri l a mida
e com s ubstrat o s azure e azocol l ;
4 .3 . Det e rmi naç ã o do efei to citopático sobre células MDC K e
medi d a da resi s t ênci a t ransepit eli al .
5. R e aliz ar o e studo ultrae st rutural de t r ofozo íto s de E . d i s p a r
(cepa IC B - A D O ) e E . h i s t o l y t i c a (cep a ICB-EGG) e m c ul tivos
monox ê ni co e poli x ê n i co através de m ic r o s co pi a elet rôn i ca de varred u ra
e mi cro s copia el e trôni ca d e trans m iss ão.
29
4. M ATERI A L E M ÉTOD O S
30
4.1. C epas Uti li zadas
Foram utiliz adas quatro cepas de p arasitos: t r ês cepas d e
E . h i s t o l y t i c a e uma cepa de E . d i s p a r .
ICB-ADO (E . d i s p a r )
Cepa i s ol ada em 1 9 9 7 a part i r de cist os obt idos das fez es d e um
pacie nt e de 2 1 an os d o sex o masculi no p roced ente d a Res erva In d í gen a
de X a c riab á , muni cí pio d e It a c a r a mbi - M G. O paci ente a presen t a v a
diar r éia e dor abdom i n al alternad o s co m perí od os de normal i d a d e. Essa
cepa se ap r e senta co m pe r fil isoen z i mático tip o I, n ã o - p ato gêni co e v em
send o m ant ida em cultivo s pol ixênico (com E s c h e r i c h i a c o l i e
S h i g e l l a s p .) e mo noxênico (com C . f a s c i c u l a t a ) .
ICB-EGG (E . h i s t o l y t i c a p atogên i c a)
Cepa is ol ad a em 19 8 8 das fezes m uco - s an guinolent a s de paciente
sint o m áti co d o s exo m a s cul ino procede n t e de M an aus, conten do cistos e
trofo zo ítos de E . hi s t o l y t i c a . O paci en t e apres ent ava col i t e dis ent érica
e a b s cesso hep ático . A cepa v em se n d o manti d a nas con di ções de
cult i vo p olixêni co (com bact é rias da microbiota i ntesti n al do
hos ped e i r o ) e mo noxênico (com C . f a s c i c u l a t a ) e c riop reser v ada em
nitro gênio lí qui do, a p r e sentand o zi modema X IX - pat o gênico.
HM1-IMSS (E . h i s t o l y t i c a p atogê n ica)
Cepa i solada po r De l a T o r re e t a l . (1971) n a Cida d e do Méx i co a
part i r d e um p acient e com dise nt e ria am e bi ana. Ess a c e p a é ampl am ent e
util i z ad a para e studos c om o patol o gi a, imunolo gi a , biol ogi a celul ar e
molecu l ar, e nt r e out ro s . Manti da e m cult i v o axênico , apresenta
zim od ema X IX – p at o gênico .
ICB-452 (E . h i s t o l y t i c a não - patogên i ca)
Cepa isolada em 1983 a part i r de cisto s obtidos d as fez es d e
estuda nte d o c urs o pri m á rio, assin t o mático , re siden te em Belo
Hori z o n te. Es t a cep a f oi mon ox e niz ada e p o s t eriorm en t e ax e nizad a
31
diret am ent e d e cisto s s em o c ulti vo com b a ctérias. Apesar de a p r esentar
zim od ema II ( p a t o gênico), a cepa n ão in f ecto u n em prod uziu les õe s em
anim ai s de ex p erimen taç ã o ( h amsters e rat os). Foi ut i l izada nos e s t udos
de eritrofo g o citose, em cult ivo monoxêni c o (com C . f a s c i c u l a t a ) e
ax ênico .
As c e p as s ão m ant idas em cul t iv o e em n i t rogêni o líquido no
Laborató rio d e Amebías e e P r otoz oári o s Int estinai s do In s t itut o de
Ciênci as B iológicas da Uni v e rsidade Federal d e Minas G e r a is . As c epas
ICB-EGG e IC B - 452 f o ram isolad a s p or S i l v a (19 97 ) , IC B-ADO foi
isol a d a por Co s t a et al . (2006).
4.2. Estudos d e Virulên ci a
4.2.1. E studo s i n v i v o
Para os estudo s i n v i v o fo ram u ti lizados ha msters (M e s o c r i c e t u s
a u r a t u s ) fornecidos pelo bio t é rio de criação do D epart amen t o d e
Parasi tologia do In stituto de Ciên c ias Biológi c a s d a UFMG e p elo
bioté r io d e cr i a ção do C entro de In v es tigação e Estu d o s A v ançados
(CINVES TAV) do In stituto P olitécn ico Nacion al - M éx i co.
O present e p r oj eto foi env i a do ao Comitê de Ét ic a em
Ex perim en tação Animal (CETEA/ U FMG) e o b t e v e apro vação e m 15 de
dez em bro d e 2004, s ob o n úm ero 1 19/04 .
4.2.1. 1. Preparo dos inó c ulos
Os t rofoz oí tos m antido s em culti vo ax ênico ou m onoxê n i co em
mei o TYI-S - 33 com C . f a s c i c u l a t a fo r am o btidos a par ti r d e diverso s
tubos de cul tu ra em c r esci m ent o ex p onencia l com 4 8 /72 h o r as. As
cult u r a s fo ram colo c a d as em banho d e g e l o p o r d ez m inutos par a o
desp reen diment o das a m eb a s d os tubos e centr i fu gadas a 2 0 0 g por cinco
minut o s. D e s p r ezou - s e o s sobrenad antes e a pó s a homoge n e i zação, os
32
trofo zo ítos do s edimento foram contados em c âmara d e Neu b auer,
obs ervan do sua via b i li d ade at r avés d o azul d e tri p an o u eo sina a
0,125% e ajus ta d o s à c o n c e ntração d es e jada, d e m od o a perm i ti r que o s
inóculos esti pu l a dos p o s s am ser f eitos e m volum e n ã o mai or qu e 0 ,2mL.
Para as i noculaçõ e s com culturas pol ix ênicas, est a s foram
cult i v adas em g arrafas de cultiv o d e célul as C orning
T M
de 30mL at é o
esgo ta m ent o dos grão s d e ami d o n o meio de cult ivo (mei o P avl ova) e no
interi or do s tro foz o í t os. O meio sobrenadant e foi r etirad o e substi t uído
por PBS pH 7,2 a 37
0
C, agit ando -s e levemen t e a garrafa pa r a lav ar os
trofo zo ítos a d eridos . Est e pr o c edimen t o foi r e petido m ais u m a vez e a s
ga r r a f as transferidas p ara banho de gelo po r 1 0 mi nutos. Ao t é rmino
dess e perío do, os t rofoz oí tos foram tran s f e ridos para t u bos de
centr í fu gação e centri fu gados a 2 00 g p o r 1 0 minut os . O s t rofoz oítos
sedi m e nt ados fo ram diluí do s em P BS pH 7,2 de mo do a ajust a r as
concentrações d esejadas.
4.2.1. 2. In ocul ação intra - hepáti ca em hams t e r
Uti liz o u -s e 21 ham st ers c om ap rox im adam ente um m ês d e id ad e
(90-1 0 0 g). O s ani m ais f o r am a n estes iad o s com pent ob a r bital s ó dico
(Hip no l
®
- 4 0mg/k g de p eso ), l a parat o mizados e inocu l ados di r etament e
na face diafragm ática d o lóbul o e sq u e rdo d o fígad o c o m 5,0x10
5
trofo zo ítos em 0,2m L d e v olume, utiliz an d o uma s ering a de in su li n a
para in ocu l ação. F o r a m e m p r egad a s nest e ex perimento a s c e p as
ICB-ADO polix ên ica e IC B-EGG monox êni ca.
Três anim ai s f o r am s a c rifi cad os em interv a lo s de 1, 3 , 6, 1 2, 2 4 e
48 horas e ao 7 º dia de expe r i m ento. Grup o s control e de t rês ani m ais
inocul ados co m meio d e cul tura s omente ou com b a c térias f o ram
sacri fi cados apó s 6 e 24 horas e t am b ém ao 7º di a. P rocedim e nto
semel h a nte foi r eali z a do com t ro f ozoítos f i x ados em gl utural d eí do.
Frag m e ntos d o fíga d o foram coleta d o s e fix ad os em formol
tam po nad o a 1 0 % em P BS pH 7 ,2 e p ro cessad o s rot i neirament e par a
33
ex ames histopat ológi c o s, obt en d o - s e c o rtes d e 5µ m q u e foram corad os
com hem at ox ilin a-eo si n a (HE ) .
Três l âminas de c ada te m p o foram u tilizadas para a q u antifi ca ç ã o
das ár e a s necró ti ca s e d e infi ltrad os inflam ató rios. As image n s fo ram
digit aliz ad as em mi c rocâme r a JVC TK - 1 2 7 0/JGB e su bmetidas par a a
análi s e morfom é t rica com o so ftware K o nt ron KS3 0 0 v.2.0 - Ko n t ron
Elet ro n i cs, Carl Ze i s s (Caliar i , 1 99 7), pert en c e nt es ao Laboratório d e
Morfo m e tria do D epart a m ent o d e P at ologia Geral d o ICB/ U FMG. Foram
iden t i fi c adas , delimitad a s e q u a ntifi cadas todas a s áreas com necro se e
infilt r ado infl a matóri o d e cada lâm i n a . Os resu l tados for a m
aprese ntados com m é dia ± e rro p a drã o , utiliz an do - se o teste t p ara
comp arar os doi s grupos ( c epa ADO polixêni c a e EGG mo n oxênica ) .
4.2.2. E studo s i n v i t r o
4.2.2. 1. Eritr o f a gocit os e
Para estes ex p erim entos foram util iza d as as cepas IC B-452
ax ênica e mono x êni ca, IC B-EGG monox êni ca e p olixêni c a e H M 1-IM SS
ax ênica de E . h i s t o l y t i c a e a cep a ICB-ADO p ol ixênica de E . d i s p a r .
Ajust o u -se o nú m ero d e t r ofozoít o s vi san do obter uma concen tração de
1x 10
6
tro foz oítos/mL em s ali na t a mponada p H 7,2 (PBS). Em s e guida
0,4mL d a suspensão de trofoz oí t os foi incub ado com o m e smo v olume
de erit r ó citos humanos (tipo san guíneo B
+
) h eparin i z ados n a
concentração d e 1x10
8
erit rócit os/mL, o b t end o- s e um a r el a ção de 100
erit róc it os po r am eba (Tri ss l et al . , 197 8 ).
As di f erent es a most r as for a m incubada s em t ri p li cata, em es tufa a
37
0
C p o r 10, 20 e 3 0 mi nut o s, send o o ex p e riment o repet i d o trê s v ezes.
A i nt era ç ão tro f ozoítos/ e ri trócit o s foi int erromp id a pel a a d i ção d e água
dest i l ad a ao s tubo s - p a r a lisar os eritró ci t o s l i vres e aquel es a d eridos à
superfí cie das am ebas. Os tu b os foram ent ão centrifugad os a 200 g p or
três minut os e o s t r ofozo íto s, junt am ente c om o s e ritróci t os
fago c it a dos, fix ado s com glut a r aldeído 2,5% em PBS por trinta
34
minut o s, à t emperat u ra ambien t e . R etir o u -s e o exces so de g l u t a raldeí do
lavan d o -se os trofoz oí t os tr ês vezes c o m PBS . Os eritrócito s in gerido s
foram c ontrastad os com diami nobenz idina 25mg% em PBS adici o n a dos
de 5 00 µ L d e H
2
O
2
4 0 volum e s, segui do de in c ub ação p o r c i nco minut os
à tem p e r atura am biente (Si lva, 1 9 9 7 ).
Os trofozoítos fo ram l a v ados no vam ente com PBS e cen t rifugad o s
a 200g po r cin co minuto s. Foram contad o s os eri t r ócito s ingerid os por
100 am eb a s escolh i d as ao acaso . R e alizou-s e o cálcu l o d a
erit rof a gocito se c om r elação ao núm e ro d e eri t ró cit os po r a m eba (méd ia
± desvio padrã o ) e à po r c ent age m d os trofoz o ítos q ue f agoci tar am
erit róc it os (comp arados p e lo tes t e de Krus k al -Wall is ).
4.2.2. 2. Ativ id ade P roteol í tica em G éis de Po liacril am ida
Para ex ami nar a ativida d e p ro t eolíti ca das c epas estu dad a s, fo ram
realiz ados ensai os de eletro forese em S DS-PAGE a 12 % ( Laemml i,
1970), copol i m erizados com ge latin a d e p ele su ína (S i gm a) a
concentração fi n al de 0,1% ( H eus sen & Do w dl e, 1 980). F oram
util i z ad as 20µ g d e proteí na s d o ex t rato celul a r d e cada cepa, obt idas
atrav é s de cicl o s d e congel amento-d es c ongelam ento empregan do
nitro gênio líquido e quanti ficadas pelo mét od o de Bradfo r d (1 97 6 ). A
elet r o fo r ese foi r ealiz ada a 1 0 0 V em um b anh o de gelo p a r a evi t a r a
prot eó l ise. P o sterio r m ente os géis foram l avados em T r iton X-1 00 a
2,5% d u rante 30 minuto s para e l iminar o SDS, um a ve z q u e es se
deter gente in t erfer e com a ativi dad e pro teol ítica da m aio ri a d as
prot eas e s. Os géis f o r am i nc ub ados em um t ampão d e ati vaçã o (100m M
Tris -OH e 10m M de C aCl
2
) por t o d a a n o ite, s endo e ntão corados po r
soluçã o de C oomassi e Azul Bri lhante R - 250 a 0,5% po r 30 minutos e
desco r ados em uma solução de met anol:á c id o acético:águ a (4 5: 10 :4 5)
até o apare cimento d as b a ndas prot eo l ít i cas com o b a ndas c l aras onde
não se observa cor, devi do a degr a d a ç ão d a gel atina d u r ante a
incu baç ã o.
35
Para o bserv ar o efe it o de i nibidores , estes foram adi cion a dos ao s
ex trato s e i n cubado s à te m p e r atura ambien t e po r 1 ho r a ant e s de ini ciar
a eletro fo rese. Fora m ut iliz ados os segu i nt es inibi d o res: 10µ M de E-64,
5mM de fl u o r eto de fenil m etilsufo nil (PMSF), 1 0µ M de pepstat i n a e
2mM de ácid o e til enodi a minotet racético (EDTA), o s qu a is s ão
inibi d o r es para ci s t eílpro te a s e, s erinap ro t eas e, aspárt icop r otease e
met alo pr ot e ase, r especti v a mente.
4.2.2. 3. De t er minaç ã o Quanti tativ a da Ativid ade Prot eo l ítica com Azure
e Az oco ll
Foram u tiliz ados ext rato s totais e mei o condici o nado para
deter m inar quant i tativam ent e a ati vi d a d e p roteolí ti ca medi an t e en s ai os
com Az u r e Hide P owder e Azocol l (Si gma-Al d ri ch), os q u ais s ão
subst r at os c romógenos p a r a p roteases . E s t e s su bstrato s sã o insol ú v e is;
ao o correr a prote ó l ise, o s r esíduos de amin oácidos se d issolvem e
ge r a m um sob renadante col o ri do, o qual pode ser li do em um
espect rofotôme t ro . A a bs orbân c i a res ul tante é diret am e n te p roporci o n al
à ati v idade p r ot eolít ica d as am os tr a s.
Os extrat o s t otais das diferen tes cepas foram ob ti d os p el a l i s e de
trofo zo ítos por cicl o s de con ge l am ento e d escon ge l am ento, empreg an do
nitro gênio líquido . A q u antidad e de prot eí n a fo i quan t i fi cada pelo
mét od o d e B r a dford (1 976). P ara o estudo com m eio con dicion ado,
3x 10
6
trofoz oí tos foram transferidos p ara u m tubo contendo 3mL de
mei o li vr e d e soro e incub ados por 2 4 horas.
Dois miligram a s d e Azu re Hide P owder ou Az o coll fo r am
adici o n ados a tu bos d e Eppendo r f (1,5mL) co m 100µ g de e x t ra to total
ou 10 0µ L de meio condici o n ado e o vo lu me fi n al aj us t ado pa r a 50 0µ L
com tampão de ativação (1 0 0mM T r is-OH e 1 0 m M d e CaCl
2
). As
amos t r a s fo ram incubad a s a 36
o
C durant e 16 horas . A r e ação foi
interrompida c om 5 0 0µ L d e áci do t ricloac é tico 1 0 % (TC A) e os t ubos
mant i do s em r epouso p o r 5 m i n utos. Dep ois foram cen tr i f u gados a
4500g po r cin c o m i nutos. O sobre n a dante foi cole t ado e lid a a
abso rbân cia em um espect ro fotômetr o a 600nm p a r a o s ensaios c om
36
Azure e a 54 0 nm p ara Azocoll . Os experimentos fo r am real iz a dos em
tri pl i c a ta para c ad a amo st ra.
Para o bserv ar o efe it o de i nibidores , estes foram adi cion a dos ao s
ex trato s e i ncu b ados à tem per a tu r a ambient e p o r 1 h o r a antes de
adici o n a r o sub st ra t o . Par a cal cu l ar a p o r c e nt agem da i ni bição de
ati vi dad e prot e olítica, foi to mad o como 100% d e ativid a d e o val o r
obt ido dos extratos to tais incubad os s e m i n ibidores . Fo r am u t ilizados
os segui n t es inibi d o r es: 10mM d e á c i d o p -hidro x im ercuri o b e nzói co
(PHMB) , 5mM de fluoret o d e feni l m etilsu f o n il (P M S F) e 2mM d e á cido
eti len odi a minot et r acético (EDT A), o s quai s s ã o i nibidores p a r a
cisteíl p rotease, seri n apro teas e e meta l op roteas e, respectivament e. Os
ex peri m e ntos foram r e aliz ado s em t ripli cat a e r epetid o s t rês vez es . A
análi s e es t atística foi r e ali z ad a uti lizando o t est e de B o n f e r roni p a r a as
difer e n ças ob s erv adas nas ati vidades p roteo lít i ca s.
4.2.2. 4. Efei t o Citopáti co sobre C élulas M DC K
Para ob s ervar o efe i t o cito pát i c o de t ro foz oít os d as diferentes
cepas u t ilizadas , re a lizaram -s e i n teraç õ e s co m a l inh a celul ar M DC K.
As c élulas M DCK foram c ultivada s em atmosfe r a de 5% de CO
2
a 3 7
o
C
em Mei o E ss encial Mín i mo (MEM – Gib c o In v itrogen Co. USA)
suplem entado com soro fetal bovino a 2 0 % (S FB – Gibco) até a
form a ç ã o de 80% da m o no camada, em câmaras para culti v o celul a r d e 8
poço s ( N u n c In c . , U S A) . U m a vez estabelecid a a monocam a d a, sob r e el a
foram a di cionados 3x 10
5
t rofozoí t o s e in cubad o s por p eríod os d e 1 5 , 30
e 60 mi n u tos a 37
o
C. Durante o t e mpo d e inc ubação, foi utiliz ad o MEM
sem SF B para impedir a regeneraç ão cel u lar. Apó s a inc u b a ç ão, f o ram
realiz ados t rês l a vados co m MEM sem S F B. As c élulas f o r am fi x adas
com m et anol a 70 % recém prepa r a do e, posteri o rmente , coradas com
Giem sa a 5 % durante 40 m inutos e m ontadas em resi na. C o mo contro les,
as bactéria s ass o ciadas às culturas e C . f a s c i c u l a t a (1x1 0
6
fo rmas/ mL)
foram p r eparada s para a interação .
Imagens micro s cópi cas f o ram d igit alizad as at ravés de u m a
microcâm e ra J VC T K - 1 270/JGB e s ubmeti d as p ar a a an á li se
37
morfo m étrica com o so ftware K on t ron KS 30 0 v.2.0 - Kontr on
Elet ro n i cs, Ca r l Zei ss (Caliari , 1997) , pert ence ntes a o labor a tó rio de
Morfo m e tria d o D e p a rtamento de P at ol ogi a do IC B/UFMG. As
difer e n ças d e efeito cit op áti co entre as c ep as f o r am a v alia d a s pelo t este
de Kr us k all-W all is .
4.2.2. 5. Medid a d a R esi s tência T r ans epitel i al (RTe)
Cél ul as MDCK foram cultivad a s e m mei o MEM suplement ado com
20% d e S F B em es tufa a 37
0
C e at mosfera de 5% de C O
2
. Foram
util i z ad as câmaras T r a ns w ell
®
(Tran s w ell
®
Cell Cul ture Permeabl e
Suppo rt s – C orn i ng In c. C o st ar, US A ) com m em bran as cober t as com
colágeno com poros d e 3µ m . As c âmar a s foram colo c adas d ent ro d e uma
placa multipo ço (C ostar 35 2 4 ) forma n d o , assim , d oi s co mp arti men tos
indepen dentes ( fi gu ra 2 ) .
Após ati n gi r a conf l uência (ap r oximad a m ent e 100. 00 0 cé l ul as po r
poço ) , as células fo r am lavadas d u a s vezes com M E M s em S FB e
recol o c adas n a pl aca, a qual foi a d i cionada meio MEM s em S FB p ara
evit ar a r e generação celular. R ealizou- s e e nt ão a m edida d a resistênci a
tran s ep i t elial bas al utili z and o um v oltímet ro epitel i a l - E V OM, World
Preci s ion Inst r uments Inc., USA (Mart í n ez-Palo mo et al., 1 9 85; Lero y
et al . , 2000).
Após est e proced i m ento, a di ciono u -se aos T r answ e ll
®
os
trofo zo ítos de E . h i s t o l y t i c a e E . d i s p a r
na propo r ç ão
1:2 t rof o zo íto/cé l ulas. A resi s t ência t ra n s epiteli al fo i medid a aos 5, 1 5,
30 e 60 mi n ut os. Todas as dos agen s fo r am r e aliz adas em t ripli cat a s e a
difer e n ça entr e elas av ali ada p el o teste d e ANOVA.
38
Figu r a 2: M ont a gem d a câmara Tra nswell
®
em p o ço de pl aca Co s t ar 3524
4.2.2. 6. Preparo d e antico r po s poli cl o n a is anti -E . d i s p a r cepa IC B - A D O
em co el hos
Coelh o branco Nova Zelândia com peso d e 2 a 3 kg f oi i m unizado
por via su b cu t ân ea com 0,5m L de ex trato amebi a no (3mg de proteí na ),
emul s i o n ado c om i gu al volu me d e a d j u v ante c ompleto d e Freu nd e
imuni z ado nov amen t e d u as s e manas d epois com adj uvan te incompl et o
de F reund . Após duas sem anas , o animal foi s a crificad o p or punção
cardí a c a e o s oro obtido f oi aliqu o t ado e c ongelad o p a ra u s o .
4.2.2. 7. Im unohis toquí mica
Hams te r s co m aprox i m adam ent e um mês d e idad e (9 0 - 100g) foram
util i z ados para a inoculaç ã o de 5,0x1 0
5
t ro f ozoítos d e E . d i s p a r c e pa
ICB-ADO p olix ênica e s a c rificad os em i nterv al o s d e 3 , 1 2 e 24 horas
após in ó c ulo. F r agm ent os do fí gado fo r am fix a dos em fo rmaldeí do
tam po nad o a 10% e , pos t e riormen t e, e m b ebidos em paraf i na e obtidos
cort e de 5µ m. Após d esparafi n a r os c o rt es (58
o
C por uma n oite), as
amos t r a s foram desidrat ad a s em xi l ol e, po steriorm en t e, em álcool
abso lu t o po r cinco m in utos (em v aso kopl in ). A s p e rox i das es en dó genas
foram bloqu e adas com met anol-p eróxido ( 45:5) p or 1 hora . As amostras
foram hidratad as em concent raç õ es des c e ndentes d e ál coois (90 %, 80% ,
70%, 60%, 50% e P BS durant e 5 minut o s ). As u niõe s inespe c íficas
39
foram b l oqu eadas com soro fet al bovino (S FB) a 10 % em PBS-T w e en
0,05% duran t e 1 h o ra, a t em p e ratur a ambien te. A s l âm i n a s foram
lavad as d u as v ez es com PBS-Twe e n e s e cas o m el h o r po ssível , sem
tocar o t ecido. In c ubou-s e então as amostras com antico r po p ol i clonal
primário a nti-am eba (p r eparad o em coelho) diluído em S FB a 5% em
PBS -Twe e n 0, 05% (diluição 1: 2 5) d u r ante 2 h ora s, a temp e r atura
ambi en t e. As l âmina s f o ra m l av adas 2 v ezes em P B S-Tween, agr e gou-se
o ant i c o rpo s e c undário a nt i-IgG d e coelho p e r oxidad o (Sigma Imm uno
Chemi c als) em SFB 5 % em PBS-T w e en 0, 05 % (diluição 1:300) e
incu bo u-s e dura nte 9 0 minutos a te m per a tura ambi ent e. As lâmi n as
foram n ovament e lavadas em PBS -T ween e foi adicio nad o o subst rato
para a p eroxi dase (DAB+ H
2
O
2
), na dil u i ç ão d e 1: 1 0, p r eparada no
momen to de u so , durant e 15 m in utos. A s lâmin as foram lavadas em P BS
e co ntra-co r adas co m hematoxilina durant e 10 m i nutos. Finaliz a do esse
tem po , as amo s t r as f o r am l av a das e m água corren te e de s id rat adas em
uma séri e de ál c oo is ascen d entes. Fi n almente, m ontada s em r e sina e
secas a t emperat u ra a m biente.
4.3. Estudos d e Ultraest rutura
4.3.1. Microsco pi a E l et rô nica de T r ansmiss ão
Trofoz oítos de culturas mo nox ênica e p olixên ica ( c epas IC B - A DO
e IC B - E G G ) cu l ti vados em garraf as Co rni ng
T M
de 30mL po r 4 8 horas
foram fix a do s e m gl ut araldeído 2 % em t ampão cacod il ato de sódio 0,1M
pH 7 ,2 p o r 1 h o r a a t empera tura a mb i ente. Foram então l a v ados t rês
vez es em cacodil ato de sódio 0,1M . Segui u -s e a p ós-fix a ç ã o em Os O
4
1% em c a codil a t o d e sódi o 0,1M por 1 ho r a a 4
o
C e n o vamente lav ados
três vezes em cacodilat o 0,1M. As c élulas fo r am d esidra t a das em um a
séri e ascend e nte d e ál c oois (70%, 80%, 9 0% e 100% duran t e 1 5 mi nuto s
em c ad a ál cool ) e p o r úl t i mo e m óxi do d e pro p ileno por 4 0 m i n u tos,
sempre em agi t ação . Posteri orm ent e, as amos t r a s for am i n cl uídas em
resi n a e os cor t es s em ifinos obtidos corad os co m azul de
40
tolui d ina/borat o de s ód i o para a s e leção de á r eas adequadas à
ultrami crotomi a. Os cortes ul trafi no s f o r am co rados co m a cetat o d e
urani l a (Wat s on, 1 9 58) e citrat o de chumbo (R eyn o ld s, 1 963) e
anali s a dos em m i c roscópi o elet rôn ic o de tran smissão Zeiss EM -10 .
4.3.2. Microsco pi a E l et rô nica de V a r red u ra
Trofoz oítos de culturas mo nox ênica e p olixên ica ( c epas IC B - A DO
e IC B - E G G ) cu l ti vados em garraf as Co rni ng
T M
de 30mL po r 4 8 horas
foram fix ados em gl ut araldeído a 2% em tam p ã o c acod i l ato 0,1M pH 7 ,2
durant e 1 h o r a a temperatu r a am bi ent e. Posteri o rmente foram l av ado s
duas v ezes no mesmo tampão e pós fixado s por uma hora em solução de
tet róx i d o de ósmio a 1% e m tamp ão caco dilato 0,1M p H 7,2 a
tem peratura amb i en t e. Real iz ou-se n ovament e a lavage m do mat eri al em
tam pão c acodi l a to e d esidrat ou-se as am o s tras e m séri e c r escen t e de
álcooi s (50% , 6 0%, 70%, 80% e 90% du r a nt e 1 0 m inuto s e m cad a álcoo l
e três vezes em á l c ool absol u to durante 1 0 m i nutos). Em s egu i da,
realiz ou -se a secagem em apa r elho de po n t o cr ítico S amd ri-780A
(Tou s im is R esearch C orp .). A pós fix a ç ã o d a s am ostras e m s up o rt es d e
alum í ni o, o ma t erial foi re cobert o c o m ouro e m aparel ho Dento n
Vacuum D eskII (Denton Vacu u m In c . ) p o r p e ríodo de 6 0 s e gundo s e
obs ervad o ao m icr o s c ópio el et rônico d e v a rredu r a Jeol J S M 35-C.
O pro cess am ento e o e s tudo his t o p atol ógi c o foram realizados com
a colabora ç ã o d o P ro f . Orivaldo Alves R och a , d o Dep a rtam ent o de
Pat ologi a do IC B/UFMG, Dr. Victor Ts utsumi e D r a . M ineko
Shib a yama, d o Departament o d e P atolo g i a Ex p erimen t al , C i nvestav -
Méx i co .
A de t erminação da at i vi dade p r ot e olítica em géi s de
pol iacri l amida foi r e alizad a c om a col aboração do Dr. Victor T sutsu mi
e Dra. M i neko S hi bayama e da P ro f
a
. Al ane B e atriz V e rmelho, d o
Depart amento d e Microbi o l o gia G e r al, UFRJ .
A det ermi n a ção q uantit at i v a da ati v idade p r ot eolít i c a com az u r e e
azocoll , os estudo s de im unohis t oq uímica e o s es tudo s de ultraest rutura
41
tiveram a col abor a ç ã o do D r. Vic t or T sutsu mi e D r a . M ineko
Shib a yama.
O e s t u do do e f e ito ci t o p ático s obre cé l ul as MDC K e a medi d a da
resi s t ê ncia t rans epitelia l foram rea lizados com a col abor a ç ã o do
Dr. V i ctor Tsutsum i e Dr a . Mi n eko S h i b a ya m a e do Dr. Fern ando
Navarro , do Dep ar tamento d e Biologi a C elular , Cinvest a v-Méx ico .
42
5. R E S U L T A D O S
43
5.1. Estudos d e Virulên ci a
5.1.1 Estudo s i n vi v o - Cinética da Fo r mação d a s Le s õ es Hepáti c as em
Hams te r s
5.1.1. 1. Cepa ICB-ADO polix ênica (E . d i s p a r )
Uma h or a : M acros c op icamen t e n ão ob s e rvou-s e lesão, apenas n a borda
do l ó b ulo es q u e rdo uma modera d a congest ão na t ram a sinusoi d al.
Micro s c opicame nt e, o bservou- s e reação inf l am at ória a gu da, com vários
focos i n flamató ri o s e l i g eira con gestão vas cu l ar em ramos da vei a -
port a, c om h emo rragi a l ev e . Foram v is u aliz adas po ucas ameb as em
sinus ó ides, en v olt as por c amada de leucócit os PMN ( figur a 3 ).
44
Fi gura 3. Aspect o h is t o patológi co de l esõ es em fí g ad o de h am ster u m a
hora pós-i n o culaçã o co m 5, 0x 10
5
t rofoz oí t os d a c e p a IC B-ADO
pol ixên i c a de E . d i s p a r . a) Obs ervam - s e pequeno s fo cos infl amatóri os
no t e cido h epát ico (s etas), al ém d e l i geira c ongest ão em r amos d a veia-
port a (cab e ç a s de set a ) . b) Em al gu ns foco s infl am ató rios, vis u a lizam-
se t ro fozoít os e m sinus ói d e s r ecobe rtos p o r camadas de P MN ( s eta).
Objet ivas: (a) 2 0x, ( b ) 6 0x. C ol or a ç ã o HE.
45
Três h o r as : Obs e rvou -s e , m acroscop i c am ent e, pequ enos pont os
esbran quiçados no l óbulo ino cul ado . Micros c opicam e nte, ob s ervo u-s e
ex tens a necrose com re a ç ão inflamat ória ac e ntuada e pr esença de
trofo zo ítos. Vis u a lizaram -s e num e rosos foco s i nfl am at ó rios com am ebas
no p arênqui m a hepático, c om al guns t r o fozoí to s aparentem ente
dest ru í d os. Em ou tras ár e a s, tro foz oítos f o ram enco nt rado s em con t a to
diret o c om o p a r ênquim a hep ático, com proce ss os d e ge n e r ativos nos
hepat ó citos (fi gu r a 4).
46
Fi gura 4. Aspect o hist o pa tológico de lesões em fígado de hamster três
horas pó s-i n o culaç ã o co m 5, 0x 10
5
t r o fozoít o s da c e p a ICB-ADO
pol ixên i c a d e E . d i s p a r . a) Obs e rva-se reação inflam at ó ria c om área de
necros e marcan t e e presença d e hem o rr a gia (se t a). b) Em algum as
zonas , v i su alizam -s e t rofozoítos em cont at o diret o com o parênqui ma
hepáti c o (cabeças de s et a ) a l ém de focos d e i n filtração d e PMN (s etas ).
Objet ivas: (a) e (b) 6 0x . C oloração HE.
47
Sei s horas : Ob s er v ou-se p equenas área s de l esõ es esbranq u i ç adas no
síti o de i no culação que alcança f a c e v isceral , o nde se visual iza melho r
os f o cos in flamatór i o s. Mi croscop icam ente, o b s e rvou-se reação
inflam ató ria p eriport al de inten si dad e vari áve l co m conge st ão
moderad a. O bserva r am -se áreas com necrose e hemorragi a i ntensa.
Pres ença de am eb a s envol t a s por l eucócit os p ol im o rfon ucl e a r es
(figu ra 5).
48
Fi gura 5 . As pect o h istopatol ó gi co de lesõ es em fíga do d e h am s t e r s eis
horas pó s-i n o culaç ã o co m 5, 0x 10
5
t r o fozoít o s da c e p a ICB-ADO
pol ixên i c a de E . d i s p a r . a) Observa-se aumen to acen t u ado das áreas de
necros e e h emorragia ( s eta). b) T r ofozoít os (setas ) são encont r a dos
cerca do s por P M N. Obj eti v as: (a) 20x, (b) 60x. Co l o r a ção H E.
49
Doze horas : M acroscopi cam ente, o bservar a m-s e nu m e rosos po n t os
esbran quiçados em face diafragm á ti ca e vi s c e ral. Micro s co pi c ament e,
obs erva- s e p r esen ça d e n umero so s foco s in fl a m atórios de i nt ensi d ade
eleva d a com a us ência de trofoz oítos de E . d i s p a r . Out r o s fo c os
asso ci a do s à tr o foz oítos e am pl a área d e necro s e também fo r am
visualiz ados (f i gu ra 6 ).
Fi gura 6. As p e cto h i st o patol ó gi co de l e sões em fí ga d o de ham st er d o ze
horas pó s-i n o culaç ã o co m 5, 0x 10
5
t r o fozoít o s da c e p a ICB-ADO
pol ixên i c a de E . d i s p a r . Ext e nsas área s de necro s e no tecido hepático .
Numer o s os infilt rados fo c ais de PMNs (s etas). Objeti va 2 0x.
Color a ç ão HE.
50
Vin te e quatro horas : Le s ã o e sbranqui ç ada local iz ada em face
diaf r a gm ática, no l ób ulo h epátic o esqu e rdo. M i c roscopi cam e nte,
visualiz aram-s e extens as áreas d e necro s e co m mat e ri al basófil o (rest o s
celul are s ), algumas ár e as com restos a m ebi anos e o utras com ameb as
aparen t emente v iáveis, as vez e s em contato di r eto com hep at ó citos
(figu ra 7 ). O bserv ou- s e um a r e ação de t i po granu l o m atosa com
trofo zo ítos aparen t em ent e norm ais e ex t ens a li se d e células
inflam ató rias . Em a l gu m a s zonas escassos n eutró fi l o s e macrófag os.
Tamb ém foi p ossível visualizar á r eas d e ram o s d a veia- p o rta c om
presen ç a de am e b as e co n gestão .
51
Fi gura 7. As pe c to hi stop at ológi co d e les õe s em fí gado de ham s t er
24 horas pós-i no cu l a ção c om 5 , 0x10
5
t rofozo í tos d a cepa IC B - A D O
pol ixên i c a de E . d i s p a r . a ) Ex t ensas ár e a s d e n ecrose com PMNs li sad os
(set a ) e presen ç a de am e b as. b) Tr ofozoít o s (setas) em cont at o diret o
com o par ê nquim a h e p ático. O bj etivas: (a ) 20x, (b) 6 0x. C o l oração HE .
52
Qu aren ta e oito horas : F í g ado c om lesões d e ti po nodular,
esbran quiçadas e dura s ao cort e. Mi cros copicam ent e , observ o u -se
necros e t i po liqu e fativa com p r esen ç a d e m ater i al b a sófil o e h emo rragi a
(figu ra 8) c om num ero s as amebas , al g u mas com morf ologi a tí p i c a. Em
algu m a s áreas n o t avam-se n eutrófi l os e macró fa gos.
Fi gura 8. As pe c to hi stop at ológi co d e les õe s em fí gado de ham s t er
48 horas pós-i no cu l a ção c om 5 , 0x10
5
t rofozo í tos d a cepa IC B - A D O
pol ixên i c a de E . d i s p a r . Ex te ns a s área s d e n ecrose c o m p resença de
inten so infiltrado inflamatório e perda da a rqui tet u r a tec i du al. O bj eti va
20x . Co l o r a ção H E.
53
Sete dias : Fí gad o ad e rido à face diaf r a gm ática e vis c eral, com am pla
área p ál i d a o cupan do mai s d a m etad e do órg ão em todo o lób u lo
esqu erdo e part e d o lóbulo m éd i o . Presen ça d e uma grande lesão
esbran quiçada e d u r a , locali z ada nas faces di a fragmá t i c a e visceral,
com consis t ên cia fi rme ao c o rte. Micros copicam e nt e , ob s ervo u-s e
ex tens a s áreas de necro se , pra t i c amente não visual i zaram- s e tro fozoítos
de E . d i s p a r , som ent e restos am ebianos ou al gum as am e b as co m
morfo l o gia atípica. H a v i a tam bém hemorr a gi a i ntensa, com nú cleos de
hepat ó citos pi cnót i c os . Não foi in cluída figura por ser e l a m ui t o
semel h a nte à anterio r .
54
5.1.1. 2. Cepa ICB-EGG mo n ox ênica (E . h i s t o l y t i c a )
Uma hora : Macros c opicament e , o fíga d o apres en t o u-se conges to, com
num ero s o s p on tos es b r anqui ç a dos, alguns t amb ém na face visce r al.
Micro s c opicame nt e, v ários fo cos d e in filtrad os i nfl am atórios , com
ameba s envol tas por P MN , al gumas a p r esent an do erit r ó citos e m s eu
interi or. Tam bém visual iz a r am-se am ebas em s inusóid e s (figura 9 ).
55
Fi gura 9. Aspect o h is t o patológi co de l esõ es em fí g ad o de h am ster u m a
hora p ós-inocul a ção com 5, 0 x 10
5
trofo zo ítos da c e p a IC B- E G G
monox ê ni ca d e E . h i s t o l y t i c a . a) Nume r o so s f o cos inflam at ó ri os (s etas )
disper sos pel o tecido he p ático. b) Tro f ozoítos bem pr eservado s (set as )
em cont at o d i re to com hep a t ó citos. O b j etivas : (a) 20x , (b) 60x.
Color a ç ão HE.
56
Três horas : Fígado ap resent an do pequ enos p ontos inflam a tó rios, que
se e n c ontram princi pal m e nte em face d i afragm áti c a e p ouco n a vis ceral.
Micro s c opicame nt e, os foco s inflama t ó r ios aum e nt a r am no tav elm ente
em tamanh o e número , co m a m eb as p r esen tes nos focos . Áreas de
necros e com presença d e am e bas, aprese n t a ndo erit ró c itos em seu
interi or (fi g u r a 1 0). Alguns t r o fozoít o s foram visualiz ados c om
erit róc it os f a go cit a d os. Observo u -s e t amb ém cordões de h epatóci t os
com vac uolização do ci t op l asma.
57
Figu r a 1 0 . A s p ec t o his t o p at oló g ic o d e l e s õ es e m f í gado d e h a mst e r t r ê s
h or a s p ó s -i n o c ul a ç ã o c o m 5 ,0 x 1 0
5
t r o f oz o í t os da c e p a I CB-E G G mo n o xê ni c a
d e E . h i s t o l y t i c a . ( a ) T r of o zo í tos c erc a d o s p or PMNs ( s e t a s) . (b) Área d e
n ecr o se , apr e s e nta n d o t r ofo z o í to cont e ndo e r i t róc i t o s e m se u i nte r i or ( se t a ).
Obj et i v as: ( a) 4 0x , ( b) 60 x . C ol o r ação H E .
58
Sei s horas: Fígad o apres e nt ando l esões p untifo rm es e s b r anqui ç a das,
que tendem a s e u n ir e origin a r l e sõ es m ai ores, presentes
princi p alment e em fa ce di a f r a gmáti ca. Micr os copi came nte, o infilt r ado
de P M Ns est á m ais i n t enso ( fi gura 1 1 ) co m au mento d as áre as de
necros e dos h e p atócit o s e pres en ç a de t rofozoí to s p róximos a essas
áreas .
59
Fi gura 11. As p e cto hi stopat ol ó gi co de l esõe s em f í g ado de h a m s t er s ei s
horas p ós-ino cul aç ão c om 5,0 x 1 0
5
trofoz oítos da c e p a ICB-E GG
monox ê ni ca de E . h i s t o l y t i c a . a) e b) Numeros os foco s infl am a tó rios
(set a s ) dispers os pelo t ecido h e p átic o , com t rofozoí t o s (cabeças de
seta) envolto s p o r P MN. Obj eti v as: (a) 4x, (b) 1 0x. Col o ração HE.
60
Doze ho ras: M a croscopi cam ent e, o b s e rvaram -s e les ões pu ntiform es
esbran quiçadas e m face d i a f ragmát i ca e v iscer a l . Micro s co pi c ament e,
encon t r ou-se au m en to con si der á v el d as á r e as de n e c r ose, com
confl u ê n cia de algum as áreas l e sionad a s e d e strui ç ã o de hepat ó cit os,
além d a pres ença de algun s fo c os hem o r r ágicos ( figura 1 2 ) .
Fi gura 12. A spect o histop at ológi co de l es ões em fígad o de h am s t er
doz e horas p ós -inoc u l ação com 5,0x 10
5
t ro f o zoítos da c ep a ICB-EGG
monox ê ni ca de E . h i s t o l y t i c a . Obs e rva - s e grande á r ea de n e c rose, com
dest ru i çã o de hepató citos e nu m er os os PM Ns (se t as ). (a) 10x . C ol o r a ç ão
HE.
61
Vin te e quatro horas : F í g a do com lesões esb ranqu i çadas, à s v ezes
averm e lh adas, n ão confluen t e s, p rinci pal m e nte em face d iafr a gm ática.
Micro s c opicame nt e, obs erv a r am-se num eros os f o cos inflam at ó rios d e
gr a n d e t aman ho , alguns r odeado s por amp las á reas co n fluent es de
necros e com numeroso s t r ofozoít o s (figu r a 13), c om áreas apresent ando
hemo rragia peri v ascular , p a renq u i matosa e n a cáps ul a d e Glisson.
62
Fi gura 13. A spect o histop at ológi co de l es ões em fígad o de h am s t er
24 horas p ós -i n o culaçã o com 5 , 0x10
5
t rof ozoítos da c e p a ICB-EGG
monox ê ni ca d e E . h i s t o l y t i c a . a) Exte ns a área d e necr o s e n o p arên quima
hepáti c o. b ) Num ero so s tro fozoít o s em áreas n e cróticas (set as).
Objet ivas: (a) 1 0x, ( b ) 4 0x. C ol or a ç ã o HE.
63
Qu aren ta e oito horas : Áreas de hemorragi a i n tensa c o m ne crose e
conge s t ão v a s cular. Próx i mo a cáp s ula observaram -se l esõ es n ecróti cas
com n um eroso s t rofoz oí t os (algu n s com eri t r ó citos ) e resto s d e célul as
inflam ató rias ( f i g ura 14).
64
Fi gura 14. As p e cto h i stopatol ó gico d e lesões em fí ga d o de ham s t er 48
horas p ós-ino cul aç ão c om 5,0 x 1 0
5
trofoz oítos da c e p a ICB-E GG
monox ê ni ca d e E . h i s t o l y t i c a . a) Exte ns a área d e necr o s e n o p arên quima
hepáti c o, p róximo à c á p sul a d e Glis s on. b) Extens a área de n e c rose com
num ero s o s P MNs ( s et a ) e p r esença d e h emorra g i a ( cabeça d e s et a ).
Objet ivas: (a) 4 0x, ( b ) 1 0x. C ol or a ç ã o HE.
65
Sete dias : Le s ã o firm e ao c orte, de cor branca, local i z ada n o l ó b ulo
esqu erdo nas faces vis c e r al e diaf ragmáti ca, ocup a ndo praticam en te
todo o l ó b ulo. M i cr oscopica m ente, o bservou- s e nec r o s e d e tipo
lique f ativa com n u m e rosos t rofozoí t os e debri s baso fí licos. Em ár eas
próx im as à necro s e visualizou -se i ntensa f ibropl asi a com n eo formação
de fibroblastos e fi b r a s coláge n a s. N umeroso s t rof ozoítos e p rol i f e r ação
de condu tos bi li ares . P res e nça d e h e pató cit os de neoform a ç ão. P r esença
de t eci d o conect i vo intens o ( fibrob las tos e col á geno). Not am-s e cé lulas
inflam ató rias d e t i po agud o e crô ni co , com h emorrag i a moderad a e
num ero s o s t r o fozoitos a s so ci a dos à i n flamação c r onifica d a e também
livres em áreas de li se (fi gu ra 15 ).
66
Fi gura 15. A spect o histop at ológi co de l es ões em fígad o de h am s t er
sete dias pós -i n o culação com 5,0x 10
5
trofo z o ítos a c ep a ICB-EGG
monox ê ni ca. a) Extensa área de necros e cont en do nu m e r osos trofoz o í tos
e pro l i f e ração d e du ctos bi l i ar e s (seta) . b) Trofo z o ítos em áreas de li se
cont end o he m á cias e m s e u i nteri or (s et as). Ob jet i v as: (a) 1 0x. (b ) 40x .
Color a ç ão HE.
67
At r avés da análi s e morfo m ét rica foi pos sível qu antifi c a r a área
total de necro s e e in fil t r ado in f l amat óri o e m difere n t es períod o s
pós -infecção, onde v e rificou -s e qu e a c epa IC B - A D O p olix êni ca d e
E . d i s p a r é capaz de ocas i o n ar lesões tão ex tensas qu anto à c e pa
ICB-EGG monox êni c a d e E . h i s t o l y t i c a ao s se t e di as pó s -i n o culaçã o.
Porém, o d esenvo l v i m ento das l es õ es acont e c e d e form a m a is l enta n os
tem po s i ni ci ais, c onfo rme d emo nstrado n a figura 16.
0 6 12 18 24 30 36 42 48
0
1
2
3
4
ICB-EGG Monoxênica
07 dias
ICB-ADO Polixênica
Tempo (horas)
Área (x10
6
µ
m
2
)
Fi gura 16. Dis t r ibuição d o s om atóri o das ár e a s de n ecrose e i n filtrado
inflam ató rio em di fe r e ntes p e ríodo s de infecção por cepas de
E . h i s t o l y t i c a (ICB-EGG mono x ênica) e E . d i s p a r (ICB-ADO
pol ixên i c a).
5.1.1. 3. In ocul ação de meio de cu l tu r a
Sei s horas : Fí gado com col o r a ç ão e aspec t o n o rm ais.
Micro s c opicame nt e, ob ser vou -se d i screto i n filtrado perivascul ar de
PMNs, p rincip a l m ente em v eias cen t rolob ul ares .
Vin te e qu a t r o h o ras: As car a ct e rísti cas encontrad as f o ram
semel h a ntes a s eis horas .
07 dias: N ã o se o bservou alter ações a nív el mac r o s có pi co o u
micros c ópico.
68
5.1.1. 4. In ocul ação de bact é rias d a cep a IC B-ADO pol ixêni ca
Sei s h o ras: F í gado a p r esent an do pequen os pont os e sbran qui ç ados n o
lóbul o i no c ul ado, som ent e em f a c e diafragm á ti ca. Mi cro s copicam ent e,
visualiz aram-s e foco s i n fl amat ór i o s e ligei r a congest ão v ascular em
ramo s d a veia-p orta.
Vin te e qu a t r o h o ras: As car a ct e rísti cas encontrad as f o ram
semel h a ntes a s eis horas .
Sete dias : Fí gado c om coloração e aspec t o n o rm ais.
Micro s c opicame nt e, obs ervou-se discret os foco s infl a m atóri os
peri v as c ul ares d e PMNs.
5.1.1. 5. In ocul ação de tr o fozoít os fi x ados co m glutara l d eído
Sei s h o ra s : Fí gad o aprese nt a ndo num e rosos po ntos esb r anquiçad os no
lóbul o i n o culado, s omente vi s u aliz ad os em f a c e diafr a gm ática.
Micro s c opicame nt e, o s t rof o zoítos apresentavam-s e r o dead os po r
camad a s d e P MNs, s em presen ç a de n ec r o s e.
Vin te e qu a tro horas: Ob servo u-se, m acro s copicam en t e, p e quenos
ponto s es branqui ça d os no lóbu l o inoculado , q u e não a t in gi am f a ce
visceral. Micro s copicam e nt e, obser v ou-se num erosos pont os de
infilt r ado in flam ató r i o , com a m eb a s des truídas l ocaliz adas n o ce ntro do
foco i n flamat ó ri o.
Sete dias: Fíg ad o co m aspecto macros c ópi co no rmal.
Micro s c opicame nt e, ob s er vou -se es casso s f o cos i nf l am atórios
dist r i b uídos p elo par ê n q uim a he p ático, s e m presen ça d e amebas.
69
5.1.2. E studo s i n v i t r o
5.1.2. 1. Eritr o f a gocit os e
Uti liz an d o a t é cnica d escrit a por Tris sl et al . (1978), foi
obs ervad a um a m aior capaci d ade d e erit rof a go citose nas c e p a s ICB-4 52
monox ê ni ca e ICB-EGG m onoxêni ca de E . h i s t o l y t i c a , enquan t o a cepa
ICB-ADO p o l ix ênica de E . d i s p a r a p resen to u baixa atividade
fago c it á ria ( fi gura 1 7 ) . Em m é di a, foi encon trada a segu i nt e r elação
erit róc it os/trofoz oíto para as cep a s e s tu da d as aos 30 m inutos: 12,78
para a cep a IC B -452 m on oxênica (E . h i s t o l y t i c a não virulent a ), 11 , 5 8
para a cepa HM1-IM S S ax ê nica (E . h i s t o l y t i c a v irulent a) , 9, 24 p a r a a
cepa IC B - E G G mon o x ê nica (E . h i s t o l y t i c a virul e nt a), 5,81 pa ra a cepa
ICB-452 ax ê ni c a (E . hi s t o l y t i c a n ão v i rulenta), 5, 1 3 p a r a a c e p a
ICB-EGG p ol ixênica ( E . h i s t o l y t i c a v i rul e nta) e 0,30 para IC B-ADO
pol ixên i c a (E . d i s p a r vi rul ent a).
Eritrofagocitose
0 10 20 30 40
0
5
10
15
Cepa EGG Polixênica (E.h.)
Cepa EGG Monoxênica (E.h.)
Cepa HM1-IMSS (E.h.)
Cepa 452 Axênica (E.h.)
Cepa 452 Monoxênica (E.h.)
Cepa ADO Polixênica (E.d.)
Tempo (minutos)
No. Eritrócitos/Trofozoíto
Fi gura 17. Fagocitos e d e erit rócito s humanos p o r cep as d e
E . h i s t o l y t i c a ( E.h.) e E . d i s p a r (E.d.). Foi ut il iz a d a uma relação de um
trofo zo íto para 100 eri t rócitos .
70
Quand o se co m p ara a porcent agem d e t r ofoz o í tos q ue r e alizar am a
fago c it ose de erit ró c i tos humano s (f i gura 18), ob ser v a -se que o núm ero
de t rofo z o ítos d e E . h i s t o l y t i c a q ue f a gocitaram h emáci a s foi superi or
ao d e E . d i s p a r , p orém sem d iferenç a s s i gni ficativ as ent re as diferent es
cepas de E . h i s t o l y t i c a .
0
25
50
75
100
452 Monox. (E.h.)
HM1-IMSS (E.h.)
EGG Monox. (E.h.)
452 Axen. (E.h.)
EGG Polix. (E.h.)
95%
93%
85%
90%
10%
*
ADO Polix. (E.d.)
93%
Eritrofagocitose (%)
Fi gura 18. Por c e nt agem de t r o fozoít o s de cep as d e E . h i s t o l y t i c a (E.h.)
e E . d i s p a r (E. d.) q ue f a gocit aram eritr ó cit os hum an os ap ós 3 0 minutos
de i nt eraç ão. (* = p <0.05)
5.1.2. 2. Ativ id ade P roteol í tica em G éis de Po liacril am ida
Foram en co nt r adas diferen ças entre os padrõ es p roteol í ti cos em
gé i s d e p ol iacri lam i d a d os extrat os tota i s da c e p a IC B-EGG monox ên ica
de E . h i s t o l y t i c a e da cepa IC B - A D O polix êni ca de E . d i s p a r quando
comp arad os com o padrão prot eo l íti co d a cep a HM1-
IMSS de
E . h i s t o l y t i c a . E nquanto as c epas de E . h i s t o l y t i c a m o st raram perfi s
semel h a ntes d e proteas es (figuras 19 e 2 0), a c epa d e E . d i s p a r
(figu ra 21) somente apresent o u duas band as (97 e 55 kDa). E m toda s as
amos t r a s, o i nibid or d e c isteínaprot e ase E- 6 4 in ibiu a ativi d a d e
prot eo l íti ca p r e sente no s extrato s totais.
71
Fi gura 1 9. Ativ idad e proteo l íti ca de ex tratos t otais da cepa HM1- IM SS
de E . h i s t o l y t i c a e e f e ito de ini bi dores de p r ot e ases em SDS-P AGE a
12% copo l imeriz ado c om 0,1 % de gelat in a de p el e p o rcina e corad o
pelo az ul de Co om assie.
72
Fi gura 20. At iv id ad e p roteolí ti ca d e ex tratos totais d a cepa IC B-EGG
monox ê ni ca de E . h i s t o l y t i c a e e f eito de i n ibidores de p roteases em
SDS-P AG E a 12 % copo l im e riz ado com 0,1% d e gelat i n a de pele po r ci na
e cora do pelo az ul de Coom a ssie.
73
Fi gura 21. Ati vi dade p roteol í t i c a d e ex tratos tot ais da cepa IC B - A D O
pol ixên i c a de E . d i s p a r e e f eit o de inibid o r es de p roteases em SDS -
PAGE a 12% cop ol im eriz ad o com 0, 1 % d e gelatin a de p e l e p o r cina e
corado p elo az u l de Coom assie.
5.1.2. 3. De t er minaç ã o Quanti tativ a da Ativid ade Prot eo l ítica com Azure
e Az oco ll
Obser vo u -se nos extrat o s t ot ais das cepas IC B-
EGG
(E . h i s t o l y t i c a ) e IC B-ADO (E . d i s p a r ) monox ê ni cas, um a menor
ati vi dad e p ro t eolítica q uan d o c omparada c o m a c epa HM1:IM SS
(E . h i s t o l y t i c a ) . P o r ém, ext rato s p roven ien t e s de c ultiv os pol ixên i cos
aprese ntaram uma m aio r ativi dad e pro teol ítica (fi guras 22 e 2 3 ). Os
dado s o btidos represent am a médi a ± dp de t r ês ex p e riment o s
indepen dentes r e aliz ad os em triplicat a.
74
H
M
1-
I
MSS
EG
G
Mo
no
x
.
AD
O
Mo
no
x
.
EG
G
Po
li
x
.
AD
O
Po
li
x
.
Ba
c
t
.
AD
O
0.00
0.25
0.50
0.75
1.00
*
*
*
*
*
Abs 540nm.
Fi gura 22 . Ati v idade prote ol ítica de ex t ra to t otal de t ro f ozoít os de
E . h i s t o l y t i c a (cepas ICB-E GG) e E . d i s p a r (cepas IC B - A D O ) com
subst r at o az o c oll. (* = p <0.05)
H
M
1-
I
MSS
EG
G
Mo
no
x
.
AD
O
Mo
no
x
.
EG
G
Po
li
x
.
AD
O
Po
li
x
.
Ba
c
t.
ADO
0.00
0.25
0.50
0.75
1.00
Abs 600nm.
*
*
*
*
*
Fi gura 23 . Ati v idade prote ol ítica de ex t ra to t otal de t ro f ozoít os de
E . h i s t o l y t i c a (cepas ICB-E GG) e E . d i s p a r (cepas IC B - A D O ) com
subst r at o az u r e . (* = p <0 .0 5 )
75
Resul t ados s emelhan t es fo r am o b s e rvados quand o util izados m eios
cond i ci o n ados ( figuras 24 e 25) porém apresent ando v alores m ais
baix os d e at i vidad e. Os m e ios c ondici onado s obt i dos d e cult iv os
pol ixên i cos a p rese n t am um a maior ativi da d e p ro t eolítica, quando
comp arad a com cult i vos mo noxêni cos. D eve-s e dest ac a r que, nest e
caso, a c e p a ICB-ADO p olix ênica apres e ntou a m ai or at ividade
prot eo l íti ca, ou sej a, e s s a c epa é a que libera m ai o r es qu antid a d es d e
prot eas e s ao m ei o .
H
M
1-
I
MSS
EG
G
Mo
no
x
.
AD
O
Mo
no
x
.
EG
G
Po
li
x
.
AD
O
Po
li
x
.
Ba
c
t.
ADO
0.00
0.25
0.50
0.75
1.00
*
*
*
Abs 540nm
*
Fi gura 24.
Ati vidade p roteol í t ica de m e io con di cionado de
E . h i s t o l y t i c a ( c e pas ICB-EGG) e E . d i s p a r ( c epas IC B-A D O ) c om
subst r at o az o c oll. (* = p <0.05)
76
H
M
1-
I
MSS
EG
G
Mo
no
x
.
AD
O
Mo
no
x
.
EG
G
Po
li
x
.
AD
O
Po
li
x
.
Ba
c
t.
ADO
0.0
0.1
0.2
0.3
*
*
*
ABS 600nm
*
Fi gura 25
. At i vi dade p roteolíti c a d e m e i o con di ci o n a do d e
E . h i s t o l y t i c a (cepas ICB-E GG) e E . d i s p a r (cepas IC B - A D O ) com
subst r at o az u r e . (* = p <0 .0 5 )
Para av al i a r a n aturez a da ati v idade p r o t e olít ica ob serv a d a n os
ex trato s t o t ais, inib idore s d e cisteí na, s eri n a e met al opro te a s es fo ram
util i z ados. Em p r e gou-se o s ubstrat o azocoll p ara to dos os i ni bid o r es. O
inibi d o r p a r a c isteí nap r o t e ase PHMB aboliu de forma e fetiva a
ati vi dad e prot eoliti ca pres e nt e n o s ext r atos das cepas polix ên i c a s
(figu ra 27). O mesmo o correu co m os extrat o s das cep a s mo nox ênicas,
porém d e forma m en o s intens a (fi gu r a 2 6). Os inibido r es PMSF e E DTA
não apresen t aram reduçõ es s i gn i ficat i v as n a s at i vidades prot eol íti cas
em estudo. O s dad os obti dos represent am a média ± dp de três
ex peri m e ntos in de pendente s r ealizad o s em t rip l i cata.
77
EG
G
Mo
no
x
.
PH
MB
PMSF
ED
TA
AD
O
Mo
no
x
.
PH
MB
PMSF
ED
TA
0.00
0.05
0.10
0.15
Abs 540nm
*
*
Fi gura 26. In i bi ç ão d a at i vi dade p rot eo líti ca de extra t o s t o tais de
trofo zo ítos de E . h i s t o l y t i c a (c ep a ICB-EGG mo
nox êni ca) e
E . d i s p a r (cepa ICB-ADO m o nox êni ca), utiliz an d o como su b strato
azocoll . (* = p <0.05 )
EG
G
Po
li
x
.
PH
MB
PMSF
ED
TA
AD
O
Po
li
x
.
PH
MB
PMSF
ED
TA
0.00
0.25
0.50
0.75
1.00
*
Abs 540nm
*
Fi gura 27. In i bi ç ão d a at i vi dade p rot eo líti ca de extra t o s t o tais de
trofo zo ítos d e E . h i s t o l y t i c a (cepa ICB-
EGG polixên i c a) e
E . d i s p a r ( c epa IC B - A D O polixêni c a ), u t ilizando como substrato
azocoll . (* = p <0.05 )
78
5.1.2. 4. Efei t o Citopáti co sobre C élulas M DC K
Quand o utiliz o u -s e a r elação d e dois t r ofozoít o s/ c élula M DC K,
obs ervo u -s e a d estruiçã o total das cé l ul as em mono c am ad as após 15
minut o s d e int eração . D esta form a, a p r o p orção foi i n vertida para 1 :2
trofo zo íto/cél u las, sendo as sim possível o bservar em t empos ini ci a i s a
interação de t r o fozo ítos com cél u las M DC K e m monocam a d as.
As c ep a
s H M1:IM S S axêni c a e EGG m on oxênic a (ambas
E . h i s t o l y t i c a p atogênicas) apres e ntara m grau s e melhante de dest r uição
aos 30 e 60 m in ut os de int e r a ç ão. J á a c e p a ICB-ADO m on ox ê ni ca
(E . d i s p a r ) o c a sionou um d ano m e n o r às c élulas em monocam adas,
aprese ntando m enos d e 50% do t o t al de área d estruí d a quan do
comp arad o com a cepa HM1: IMS S ( t a bela 1). As ce p a s ICB-ADO
pol ixên i c a (E . d i s p a r ) e IC B-EG G polix ênica (E . hi s t o l y t i c a )
aprese ntaram d anos men ores, p orém n ão meno s signi fi cat iv os.
Tabel a 1. Efeit o ci top áti co de cepas de E . h i s t o l y t i c a ( E. h.)
e
E . d i s p a r (E.d . ) sobre mo n ocamad as de cél ul a s MDC K.
5.1.2. 5. Medid a d a R esi s tência T r ans epitel i al (RTe)
A q u e d a da R T e ut iliz ando a c e p a IC B-A DO (E . d i s p a r ) é mais
lent a, qu ando compar a d a com as c ep as de E . h i s t o l y t i c a . A o s 30
minut o s, a m edid a da RTe das cepas IC B - A DO monox ênica e p olixênic a
é maior que aquel a o b s er v ada para a s cepas H M 1 : IMSS e ICB-EGG
(figu ras 2 8 e 29). Porém, aos 60 minuto s de intera ç ã o, todas as cepas
aprese ntaram u m a perda total d a RTe, c om ex ceção d a c e p a IC B-ADO
pol ixên i c a de E . d i s p a r .
Cepa % destruição da monocamada
15 min 30 min 60 min
HM1-IMSS (E.h.) 27 55 89
EGG Monox. (E.h.) 19 58 94
ADO Polix. (E.d.) 17 31 60
EGG Polix. (E.h.) 19 42 71
ADO Monox. (E.d.)
13 18 37
79
0 10 20 30 40 50 60
0
20
40
60
80
100
HM1-IMSS Axênicaegend
ICB-EGG Monoxênica
ICB-ADO Monoxênica
Tempo (min.)
RESISTÊNCIA (%)
Figura 28. Efeito de trofozoitos de E. dispar (ICB-ADO monoxênica) e E. histolytica
(ICB-EGG monoxênica) na resistência transepitelial de células MDCK em monocamadas.
0 10 20 30 40 50 60
0
20
40
60
80
100
HM1:IMSS Axênica
ICB-EGG Polixênica
ICB-ADO Polixênica
Tempo (min.)
RESISTÊNCIA (%)
Figura 29. Efeito de trofozoitos de E. dispar (ICB-ADO polixênica) e E. histolytica
(ICB-EGG polixênica) na resistência transepitelial de células MDCK em monocamadas.
80
5.1.2. 6. Im unohis toquí mica
Não obs e r vou-se a difus ã o d e antígenos amebi anos nos tecidos
estuda d os. Enquant o os t ro fozoí tos s e m a r c avam fortem e nt e p ela
perox i d ase, o mes mo não o co rreu com as células end ot el i ais ,
parênq uima h e p ático o u PMNs p r esentes no s f o cos i nfl am at órios
(figu ra 30). Em áre a s onde havia g r ande n úmero de amebas d es t ruídas,
not ou-se um a fo rte m arcaçã o d o tec i do , resu l t ado d a d ispersão de
antí gen o s liberad os pel a lise d os trofoz o í tos.
81
Fi gura 30. Int eração i n v i v o em d i f erent es t empos p ós -inocul a ções de
trofo zo ítos d e E . d i s p a r ( c epa IC B -ADO po l ix ênica) c om h e p atócit o s de
hams t e r s, u tilizan do p e roxid ase marcad a c ontra antico rpos policl onai s
de E . d i s p a r . a) t r ês horas. O b s e rva-s e dois t rofo zo ítos (ca b e ç a d e set a)
cerca do s por camad as de P MN s (seta). b) 12 ho r as. Trofo z o ítos
fort e m ente m arcado s (cab e ç a d e s et a) porém, infil t r ado de PMN sem
imunom a r cação (se t a ). c) 24 hora s . Também nã o foram ob s er v adas
marcas e m PMN ( s eta ) ou em hepató ci t os adjacen t e s a zona d e
inflam a ç ão. d) Amebas l is ada s, s eis ho ras pós-i no cu l a ção, com forte
mar
cação do tecid o hepáti co (setas) . Objet ivas: 40x.
Color a ç ão Hemat oxilin a.
82
5.2. Estudos d e Ultraest rutura
5.2.1. Microsco pi a E l et rô nica de V a r red u ra
As cep as est u d adas a p r esentar a m-se bastant e pleomórf i ca s.
Trofoz oítos d e E. d i s p a r (cepa IC B -ADO) p o ssuiam as p e cto m ais
alon ga d o e com um maior n ú m e ro de filopó dios quan do co mp arados com
trofo zo ítos de E . h i s t o l y t i c a (ce p a IC B-EGG), pri n c ipalme nt e qu ando
oriund os de cul tivo s polixênicos (figu ras 31 e 32 ) . A ce p a IC B-EGG,
cont i nha escass o s filopódi os, que l o calizavam- s e p rincip alm ent e n a
regi ã o do u róide (fi guras 3 3 e 34 ). E st ruturas co mo fo rmaçõ e s
esfero id ais e estomas de micro e macropi nocito s e pod em s er
visualiz ados em a lgumas fo r m as.
83
Fi gura 31. Mi cros co pia el etrôni c a de varred u ra de trofozoíto s da cep a
ICB-ADO p o l ix ênic a (E . d i s p a r ) apres e ntando delgad os fil op ó d io s (fi )
aderi do s ao substrat o. Inúmeras b actéri a s enco nt r am-s e aderidas ao
subst r at o e às mem b ranas d as ameba s (s e tas). Barra: (a ) 1µ m , ( b)
e (c) 10µ m.
fi
fi
84
Fi gura 32. Mi cros co pia el etrôni c a de varred u ra de trofozoíto s da cep a
ICB-EGG p olixênica ( E . h i s t o l y t i c a ). Nota-se bac t ér ias aderidas às
mem bran as d as am eb as (set as). m i = es toma d e micro pi no ci t o s e,
fi = fil opódios. B a rra: (a) e (b) 1 µ m.
mi
fi
85
Figura 33. Mi c ro s copia el etrôni c a de v a r r edura d e trofoz oítos da cepa
ICB-ADO m onox ênica (E . d i s p a r ). Nota-se na su pe r fície do par a sito
estom a s d e m i crop inocit ose (mi), m acro pinoci to se (ma) e form a ç ões
esfero id ais (fe). Barra: ( a ), (b) e (c) 10 µ m.
ma
ma
mi
fe
fe
86
Fi gura 34. Mi cros co pia el etrôni c a de varred u ra de trofozoíto s da cep a
ICB-EGG m o noxên i c a (E . h i s t o l y t i c a ), onde obse r v a-se a regi ã o do
urói de (set a) com a presença de microfi l o pódio s. Nota - s e n um ero sos
estom a s de micropi n o citose ( mi) n a superfí cie d e al guns trofoz oí tos,
além d e al gumas f o rmas d e C r i t h i d i a f a s c i c u l a t a ( c f ), u m
tri pan o s om atí deo adici o n ado ao m eio d e c ul tivo. Barra: (a), (b)
e (c) 10µ m.
cf
mi
87
5.2.2. Microsco pi a E l et rô nica de T r ansmiss ão
Foram obser v adas difer e n ças entre as cepas IC B - E G G polix êni ca e
monox ê ni ca d e E . h i s t o l y t i c a e as cepas ICB-ADO p o lix ênica e
monox ê ni ca d e E . d i s p a r , atrav és d a micro sco p i a elet rô n i c a de
tran s missão. Os núcleos de trofoz oítos mantido s em cultivo pol ix ênico
aprese ntaram-s e irregu l a r es, c om uma c r omatin a m ais f ro uxa e m enos
orga niz ad a, ta mbém for a m visu ali z a d as grand e s quanti d ades d e
gl ico gê n i o n o c itop las m a d e c epas polix ê ni c as (figuras 3 5 a 3 7). Tanto
cepas p olix êni c as c o m o monox ê nicas ap r e sentaram vacuól os de
difer e nt es for m as e t amanh os , di stribuí do s por to d a a m at riz
cit op las m á ti ca, p orém cu lt i vo s poli x ê nicos ap r esentara m um men or
núm ero de va c úolos quand o c om p ara d os com c epas pr o v enientes de
cult i vo s mo noxênicos, tanto p ara a cep a IC B - A D O d e E . d i s p a r , como
para a c epa IC B-EGG d e E . h i s t o l y t i c a .
Fi gura 35. Elet rom icrofo t o grafia d e trofoz oítos da cepa IC B-ADO
pol ixên i c a ( E . d i s p a r ). O b servar rest os de bactérias ( b a ct) nos vacú o l os
fago c íticos. Bact ér i as s ão encont r adas em c o ntato direto com o
cit op las m a d a cél ul a (cab eç a s d e s et a). Numeros os grâ nulos de
gl ico gê n i o pod em se r o b servad os di spersos pelo citop l asma (se t as ).
Ampli a ç ão: (a) 6. 000x, ( b ) 10.000x .
bact
88
Fi gura 36. Elet rom icrofo t o grafia d e trofoz oítos da cepa IC B-ADO
monox ê ni ca (E . di s p a r ). Ob s e rva-s e restos de C . f a s c i c u l a t a dentro de
um vacú o lo fagocí t i c o ( c abeça de s e ta) . Tam b ém ob s e rva- s e a um ento d e
gl ico gê n i o n o citop las m a d o pa r asito (set a s ). A mpliaçã o : (a ) e ( b)
4.000x .
Fi gura 37. El etromic r o fotografi a de t r o foz oít os d a ce p a IC B-EGG
pol ixên i c a (E . h i s t o l y t i c a ). Ba ct érias p o dem s er encontradas no i nterior
de v a cúolos f a gocít i c os (set as), as sim com o debris r e sultantes d a li se
dess as b act éria s ( cabeça d e seta). Ampliação : (a) e ( b ) 4.000 x .
89
Fi gura 38. El etromic r o fotografi a de t r o foz oít os d a ce p a IC B-EGG
monox ê ni ca (E . h i s t o l y t i c a ). O bs erva-s e r e stos d e C . f a s c i c u l a t a den tr o
de vacúolo s fagocí t i cos (c abeça de s et a ). Am p liação : (a) 4.000x e
(b) 8 . 0 00x.
90
6. D I S C USS Ã O
91
6.1. Estud os i n v i v o - Cinética da Formação das Lesõ es H epáticas e m
Hamsters
A i n o culação intra- h ep ática d e t ro f o zoítos em anim ais d e
ex peri m e nt ação é um p r o c edi men t o ú t il para est udos de v irulênc i a
e da re sposta im un e (Tsut su m i, 1984 ; Ts u tsumi, 198 8; Mee r ovitch &
Chadee, 1988; T sutsumi & S hib ayama, 2006) e m b ora não seja a via
comu m d a chegada d o p a r asito a es te órgão. Em noss os mode los
ex peri m e nt ais u tilizou-s e inicial m e nte a c o n c e nt r ação de 2 ,5 x 10
5
trofo zo ítos em 0,2 0m L d e meio, in oculados em ha m sters prov enien t e s
do bi otério d e criaç ão do D e p artament o de P arasit ol ogi a do ICB/UFMG.
Est es animais apres ent av a m aproximadam en t e 45 dia s d e i dad e e
pesav am entre 9 0 - 100g. Q u ando t r a balhamo s c om h am sters pr ov enientes
do biotério de criação do Ce ntro de Inves ti ga ç ã o e Es tu d os Av ançados
(CINVES TAV) do In s titut o Polit é c ni co N acion al – Méxic o , est a rel ação
foi aumentad a p ara 5 , 0 x 10
5
t r ofo z o ítos em 0 ,20mL de meio . O
aument o da qu a ntidade d e trofoz oítos ad m inistrada foi ne c essári o para
se cons egui r u m p adrão de lesão h e p át ica semel h a nte ao observ a do nos
anim ai s fo rnecido s p e lo biot éri o d e c r i a ç ão do ICB/UFMG. Isso se
deve, p ro v avelmen t e, a uma m elhor al imenta ç ã o dos ani m a i s
prov eni ent es do C INVES TAV, além d o control e mais rigoro so do
manej o e t r atam ent o des s e s animai s ( c o m o c o ntrol e d e t emperat ur a,
lumi n o si dade, ecto e endopar a sitos). A mudan ç a do s re a gentes que
comp õem o mei o de c ultivo t a mbém p od em es t a r relaci on ados a
alt eração d a v i rulência da c epa. No CIN V E S TAV , ut iliz amos s oro
comer c ial bo vi no (G i b co -In v i t rogen Corp.), e nriqueci d os com v it ami nas
de Diam on d (SAFC Bios c i en ces), enq u an to no IC B/UFM G ut il izamos
soro obt idos d i r etamente d e s a n g ue bov in o, além de p r epararm o s a
mist ura d e vitam inas par a s er adi cio n ada a o m eio de cu ltivo. D e ssa
form a , o meio d e cult i vo u tilizad o em nosso labo r ató rio no ICB/UFMG
pode apres e ntar-se m a i s r i co em nutri en t es, o q ue acarret a ria um
aument o d a vi rul ên c i a das cepas p atogêni c as, s end o n e cessári o u m a
quan t idade men o r de tro foz oítos p ara ocasi o n a r lesõ e s sign ifi cat i v a s.
92
A c e p a HM1-
IMS S é co ns i d e r ada u m a cepa de referência de
E . h i s t o l y t i c a a ní vel m undial , send o utiliz ada na mai or part e das
investi gações s o bre a m ebí ase. Es s a cepa f oi is ol ada d e l a To r re et al.
(197 1), sen d o d e sde então subm e tida a di versas con d i ções de culti v o em
divers os l ab oratóri o s, c om o objeti vo d e m a nt e r a s u a v iru l ê n cia e
pato ge ni c idade.
Uti liz an d o a cepa H M 1 - IM S S, Tsut sumi et al . (1984) es t udaram a
sequ ênci a d e even t o s morfoló g i cos dura n t e a produção do abces so
hepáti c o am ebiano (AHA) , desde o a l oj am ento das a m eb as n o s
sinus ó ides h epáti cos at é a necros e ext ensa d o fígado . O b s ervara m que
em tem pos inici ais (1 -1 2 h oras) h á um infilt r ado de PMN rodea n do os
trofo zo ítos. Os h e p atócit o s p róximos aos focos inflamató rios
aprese ntaram mudan ças dege n e r ativas e foi r a ro o b s ervar o c on t ato
diret o e ntre h e p atócito e a m eba. Depois d e 12 horas d e inocula ç ã o
dimi n u íram os PMN , s en do substit u ídos por cél ul as mono nuc l ea r es; com
três di as de in ocul a ç ão , ob s erv a r am a p r esença d e células ep it el ió i d es
com formaçã o de gra n u lomas e áreas d e necro se, que a u m entaram
progres sivamen t e . Os aut o r es conclu íram que n a formação do A H A, o
dano ao teci do he pático não é por con t ato di reto com os t r ofozo ít o s e
sim, resu l t ado d a lis e d os leu có c itos e macróf a gos presen t e a o r edor das
ameba s, que liberam grandes quanti dades de enz i m a s lí t icas ao meio e
isto , i n diretam e nt e, afet a aos he p at ó cito s.
Em nosso trabalho foram u tilizadas as c epas ICB-EGG de
E . h i s t o l y t i c a e IC B-ADO de E . d i s p a r p a r a o estu do da cinética das
lesões , em culti vos m onoxênico (com C . f a s c i c u l a t a ) e p o l ix ênico ,
respec tivament e .
A inocul a ç ão da cepa ICB-ADO p ol ix ên i ca r esult ou em les ões
hepáti c as grav e s, u l t r apassan do em 4 0 % o p eso t o t al d o órgão. Esse
resul t a do nos lev ou a ques ti o n a r os event os celu l ares que ant ecedem a
form a ç ã o d as l esões, culmi n a ndo no estudo da cinéti c a das l e sões, como
realiz ado ant eri ormente po r Tsut sum i et al. (1 984).
Na anális e da s equên cia dos event o s cel ul ares e histol ógicos
aprese ntados p el a i nocul a ç ão da c e pa IC B-ADO polixê n i ca , algum as
93
difer e n ças fo r am ob serv a das qu an do comparad a s co m o m odelo des c rit o
por Ts u t sumi el al. (19 84 ) .
Em temp os inici ai s (1-12hs .) t ambém observo u -s e,
micros c opicam e nt e, focos inflam atóri os que t endem a aument ar de
tam anh o , p o r ém o número d e t ro fozoí tos a s s o ciados a e s s es fo cos foi
pequ e no , estan do gr a n d e p arte del es l i s ados. O aparecim ento e
predom ínio d e polim o rf onu cleares (PMN) c a r a cteri zo u sempr e os
tem po s cu rt os de i n fecção. Out r o fat o im portant e f oi a pres e n ça de
trofo zo ítos em cont ato di ret o com hepat óc i t os após s e is horas de
inocul a ç ão, s endo tam bém enco n t rado 24 horas após o d es afio
amebi an o. Es te achado d i f e r e d o m odelo ant e riorm e nt e d e s cr ito,
indic a ndo q u e a ameba pode estar lis ando diretam ente os hepatóc i t os
com os quais e s tá em c o n t ato e as sim, con tribuin do para o dano
hepáti c o ocasio n ado p ela lis e d e cé lul as i n fl am atórias . T ambém não
foram v i su alizad o s granul om as t í pi cos confo rm e r eport ad o p o r Tsutsum i
et al., haven d o sim uma reação i nfl amat ória m ais intens a na qual não há
tem po p a ra a form a ç ão d o gran ul oma, resultan do em ext ensas áreas
necróti c as. A med ida qu e a lesão au m enta de tamanho , as ár e as
ocup a d as por c élulas i nfl am ató rias li s adas são m ais abund a nt es e
ex tens a s.
Outro f at o observ ado foi a a us ência de erit róci t os no inte r io r d os
trofo zo ítos d e E . d i s p a r , c epa ICB-ADO polix ênica. Ape s a r d a gran d e
virul ê n cia dessa c e p a , em nenhum d o s t em po s o bserv ado s f o r am
encon t r ados t r o fozoít o s com e ritró c i tos fago citados . Esse d ado
comp ro v a a b aixa c a p a cidad e de eri trofagocitose obs erv a d a par a es s a
cepa, refo r ç a ndo a i déia de que esta propri eda d e, p rovavelm en t e, n ão
está co r r elaci on ada di r etam ent e com a vi rul ên cia.
A c e p a IC B - E GG mo nox ênica apresent ou um a cinét i c a de
form a ç ã o d e l e s õ es semelh a nt e à descr it a p o r Ts u tsumi et al . e, assi m
como a ce p a IC B - A D O poli x ên i ca , em tem po s ini ciais t am b ém
obs ervo u -s e uma hepati t e focal e di ss em i n ada com fo c os d e P MNs
disper sos pelo parên q ui m a h epátic o po r ém c om am ebas bem d efi ni d as e
cons erva d as. T ambém não observ am os a f orm ação d e abs c e ss os
hepáti c os am ebian os b em c a racter izados, tal vez pel a ráp i d a d e st ruiçã o e
94
necros e q ue ess a cepa ocasio n a n o fí gado d e s eu hosped e i ro, não
haven do tempo p a ra a o r ganização c elular e post eri or orga n i z a ç ão do
gr a n ul oma ameb i ano.
Macros copicam ent e, entre a pri m eira h ora e 2 4 horas a pós a
inocul a ç ão das a mebas, obs ervou-se pequ eno s pontos de cor bran c a no
lóbul o i no cul ad o, os quai s or i g inaram les õ es exten s as a parti r de 48
horas a pós a i no cul a ç ão dos t r o fozoíto s. Devem o s r e cord a r que ambas
as cepas foram recentement e i s ol adas (ICB-EGG – 1 988; IC B-ADO –
1997) e pouco m a nuseadas d e sde ent ã o. Diferen t emente d a c e pa
HM1-IMSS, n ã o é n e c essária a pas sa gem cons tant e da c e p a IC B-EGG
(E . h i s t o l y t i c a ) por fígad o d e hamster para m a nt er a v i rul ê n cia. E s s e
difer e n cial pode exp licar as difer e n ç as e n contrad a s ent r e as c e p as, não
estan d o as cepas IC B - E GG e IC B-ADO alterad a s e adapta d a s ao sistem a
imune do hosp e d ei ro co mo o c orre com a HM1-IMSS.
Alguns est udos suge r e m qu e t rof ozoítos de E . h i s t o l y t i c a em
cult i vo p o l ix ênico poderi am sofrer m u d a n ças molecu lares, resul t a ndo
em au m ent o da res i s t ên cia a lis e pel o co mplemen t o e/ou m o d ificaçã o de
antí gen o s de sup erf í cie da am e b a, al t e r ando a c a p a cidad e do s is t e ma
imune de reco nh ecer e eliminar o paras i t o (B h attachar ya e t al. , 1992 ;
Cam po s-R o d ri gues & J ari l l o - Luna, 2 0 05 ). Este fato p o de ex p l icar a
presen ç a de t r o fozoítos d a cepa ICB-ADO p olixêni ca em cont ato di reto
com hep at ó citos após seis h o r as de inocul ação .
A inocul ação d as bactéria s as sociada s a o cu l ti vo polix êni c o d a
cepa IC B -ADO d iretam ent e ao fíga d o de anim ais exp e rim ent ais não
resul t ou em l esões signi fica t ivas, sen do ob serv ados pequ e nos foco s
inflam ató rios per i p o rtais após set e d i as, descart a n do assim sua a ç ã o
diret a s o bre a fo rmação d as l esões .
95
6.2. Estudos i n v i t r o
6.2.1. E ritrofa gocito se
A erit rof a gocito se é u m a das m ais dest a c adas at ivi d ad es
desem p e nhadas pel o s t rofoz oít o s de E . h i s t o l y t i c a d uran t e o p rocesso
invasiv o de teci dos. Mu ito s autores di sco rd am que e s sa ati vidade
estar i a c o r r elacionada c om a vir u l ência de cepas d e E . h i s t o l y t i c a .
Tris sl e t a l. (197 8 ) e Silva (1 9 97) dem o n st raram q ue a at ividad e
fago c ítica em c epas v i rulent as é um p r o c ess o m ais ráp id o e efi c iente
que em cep a s n ão virul e ntas. Or o z co et al . (198 3), util izan do clone s d e
E . h i s t o l y t i c a d e fi cient es em fago citose , dem o nstraram que e ss e i sol ado
era i n c apaz de pr o d uzir ab c essos hepáti c os , me s m o com i n ó culos
eleva dos. Este s p e squisad o r e s aind a a firmaram que a f a gocito se
depen d eri a de outro s f a tores com o co n d i ções d e culti vo , pH,
tem peratura, presença de carboi d r atos e c o n c entração de Ca
2 +
no meio
de c ultivo. P or sua vez, M ontfort et al. (1992) descrev e ram c ulti vo s de
E . h i s t o l y t i c a que, mesmo perd endo sua pat ogen i cid ade (com o a
capaci d ade de produz i r a b cess o h epáti co), a inda m antiveram um alt o
gr a u de er i t rofagocit o s e. No mesmo ano, T s utsumi et al. (1992 )
util i z ando t r ês li nhas da c e p a H M 1 - IM S S, a fi rmara m que a
erit rof a gocito se po d e s e r considerad a soment e como u m m a r cador
qual i t ativo d a pat og en i cidade d e cep as ax ê nicas d e E . h i s t o l y t i c a e não
um in d i c ador q u antitati vo d o grau de vi rul ênci a i n v i v o .
Podem os afirm a r, d e acordo com os result ado s obtid o s em n ossos
ex peri m e ntos, que a eritrofago citos e n ão se co rrela c iona direta m ente
com a virulê n cia da c epa. Em nossos estudo s a c e p a ICB-452
monox ê ni ca de E . h i s t o l y t i c a foi a que apres e ntou m aior q uant idade de
erit róc it os f a goci tad os (média d e 1 2,78 a os t rinta minu to s), porém é
uma cepa qu e não ocasi o n a les õ es nos animais i n o culad os . Es s e f ato
pode ser exp licado p e l a p r esença con s tante de C . f a s c i c u l a t a no meio de
cult i vo , o q ue f acilit ari a a fa gocito s e d e célul as ma i ores quand o
present es, porém nã o oca si onari a aumen to da virulê n cia da c epa quando
inocul ada em an i mais de ex peri ment ação (Si lva, 19 9 7 ) . E ss e v alo r caiu
96
aprox i m adament e 50% quando utili z am os a c epa ICB-452 ax ênica
(méd i a de 5, 8 1 a os trin ta min u tos), de m on s t r ando ass i m a im portânci a
do t ripano ss omatíd eo p r esente no m eio d e c ultivo para a maior
fago c it ose. Essa mesma cara cteríst ica a inda pode ser observa d a n as
cepas m on ox ê ni c a e p o li x ê nica de IC B - E GG, am b as pato gêni cas p a r a
anim ai s d e exp erim ent ação . A c epa m onoxêni ca com C . f a s c i c u l a t a
aprese ntou uma m éd i a de 9, 24 t rofozoí t os/ ameb a , e nq u ant o a polix ênica
apenas 5 ,13.
Por out ro la do, a c e p a polixêni ca IC B-ADO de E . d i s p a r
aprese ntou uma b aix a capacidade d e eritrof a gocito se (média d e a p enas
0,30 aos tri nt a min u to s ). Essa cepa oca s i o na lesões severas em h amsters
quan d o inocul ad a dire t am ente ao fígad o dos animai s, o que no s leva a
ques ti o n a r, n o v amen te, o pap el da as sociação b actér i as/trofoz oítos no
cult i vo poli x ên i c o.
Quand o compar a mos a po r cent a gem d e trofozoí t o s que r eali z a r am
a f a gocitose d e eri t r ócitos h u manos, o bservamo s não h aver di f erenças
signi fi c ativas entre as cepas d e E . h i s t o l y t i c a , m esmo e nt re a quelas que
fago c it a ram m enores qu antid a d es d e hemáci a s. Ess es result ado s , em
conj un t o, com p r ovam q u e a virul ên cia d a cep a não t em r e l a ção d ireta
com o gr a u d e eri t rofago ci tose ap r esentad o p ela me sm a.
6.2.2. Ativi dad e Pro teo l ítica em Géi s d e Poliac r il amida e Determi n a ção
Quant itativa d a Ativid a d e Proteol ítica c om Az ure e Az oco l l
Protea s es s ão enzim as p roteol í ti cas c apazes d e cat alizar a
degr a d a ç ão de l i gações peptí dicas em pro teínas e peptídeos,
ampl am ent e encontradas nos r einos veget al e an i mal. Ent r e as
princi p ais f unçõ es desemp e nh ad as po r essas enzim as p o demos citar:
invasã o de t ecidos d o hosped ei r o, f a cil itad a p el a degr a d ação de teci d os
conecti vos; ev asão d o sistema i mun e atrav é s d a de gradaçã o ou at iv ação
de m olécul a s i mune s do hosped e i ro; mudança s morfoló gi cas do p arasi t o
entr e um estági o e outro ; degr a d a ção d e p r ot eín as do citoesq u eleto
durant e a inv asão ou ru ptura d e c élulas do hosp edeiro (N o rth et al.,
1990).
97
Protea s es liber a d as p or trofoz o í tos d e E . h i s t o l y t i c a p o d em
ocasi o n a r d anos às célul a s e t e cidos , contr i b ui ndo para d es t r uição dos
teci d o s do ho spedeiro e i nv asã o do m esm o pel o p ar a sito (McKerr o w,
1992). Estudos realiz ados p o r div ers os aut ores ident i fi caram
cisteí naprotea s es como e nzimas de maior ati vi da d e em E . h i s t o l y t i c a ,
estan d o correl a c ionada com a vi rulên c i a da c e p a (Gad as i & Kob i l er,
1983; Ke e ne e t al , 1986 ). R e ed et al . (1989) observar am que pa cientes
com amebí as e invas iva apresentav am a ntic o r po s contra
cisteí naprotea s e, correl aci o n a ndo o n í v el d e ativ idade dessa enzi ma
com a s everidad e da do ença ocasion ada pel o parasit o .
Com o objet iv o de conh e c e r o p erfil zimográfi co das cep as
ICB-EGG m ono x ên i ca d e E . h i s t o l t y i c a e ICB-ADO p o lixêni ca de
E . d i s p a r , f o r am confecc io n ados g éis d e poliacrilamid a p a r a ob serv a r
pos síveis diferen ças e n tre os padrõ es pro teolí t i cos dos ex trat o s t otais
das duas c epas. Enquan to a c e p a ICB-EGG m o noxêni ca ap rese nt ou um
perfi l muit o s emelh a nt e à c epa H M1-IM S S d e E . h i s t o l y t i c a , c om u m
quad r o de a p roxim adam ente s eis bandas d e 2 5 a 112kDa, a cep a
ICB-ADO a p r e s ento u um perfil basta n t e di st i nt o, c om s om e nte du as
band a s visív eis n o gel de poliacril am ida ( 55 e 9 7 k D a ). Em amb os os
casos , o efeit o pro t eol ítico foi parci alm ent e ini bi do pela adiçã o d e
E-64 , um inib id or d e cis teí n a p rotease.
Apesa r do meno r n úm e ro de b a ndas o b s ervad as no s géi s d e
pol iacri l amida, a cepa IC B-A D O po l ix ênica, ao lad o da cepa IC B- E G G
pol ixên i c a, apresentou as mai ore s atividades p ro t eolít i c as t ant o para os
ex trato s t ot ais , qu anto para o s m ei os cond i cio n ados, quan d o s e utiliz ou
Azure Hide Powder e Az oco l l, substrato s cromó g en os para p roteases.
Ess e foi u m res u ltado surpreen d e nte, uma vez q u e d ados d a lit erat u r a
apon t am a E . d i s p a r c omo uma m á s ecretor a d e protea s e s ( Talam ás -
Rohana et al ., 1999 ) . Porém , devemos lembrar que a cepa d e E . d i s p a r
util i z ad a p o r aqu eles p esquis ado r es era u m a cep a ax ênic a (cepa SAW)
incap az de ocasi onar l e sões em anim ais ex p e rimentai s.
Outro dado inte r e ssante su rge quando c om p aramo s as atividad es
prot eo l íti cas d as cep as mo noxêni c a e p o l i x ênica IC B -
EGG d e
E . h i s t o l y t i c a . A cepa polixêni c a ap resento u, assi m com o n o ca so d a
98
cepa ICB-A D O polixên i c a de E . d i s p a r , um a mai or c a p a cidade de
degr a d a ç ão dos substra to s q uando comparad a à cep a mo n ox ênica,
novam ent e colocand o em evid ênci a o p apel das b a ctéria s p r esentes no
mei o de c ultivo.
Muito se tem es p ecu l ado sobre o pap el q ue a bacté r i a ex erce sobre
os trofoz o ítos de E. hi s t o l y t i c a ma ntid os em culti vo poli x ên i c o (Silva,
1997). V á rios est u d os têm p ro p o sto que a associaçã o b a ctéri a/ E .
h i s t o l y t i c a tem um p rofundo e f eito n o comportam en t o d a ameba,
modul ando mu d anças f e notípi c a s e d e s uas p ropried a des d e virul ên cia
(Bh att ach a r ya et al., 1 992; S pice & A c k e r s , 1 9 93; Silva, 1997;
Bhatt a char ya et a l ., 1998). Po r ém, es t udos empre gando cepas
pol ixên i c as de E . d i s p a r são escas s os n a literat ura cientí fi ca (Furst et
al., 20 00; Costa et a l ., 2006) e, ainda m ais raras , s ão as t ent ativas d e
tent ar cor r elaci o n ar ou expl i c a r a influên ci a d a s b actér i a s s obre ess as
cepas.
Trabalho p ubl i cado por Spice & A ckers ( 1993) d emons t ro u que
cepas axêni c as d e E . h i s t o l y t i c a p roduzem maiores qu a ntidades d e
enz imas proteolíticas quando compar a d a s com c epas polix ê ni cas. Em
nos so es tudo , u tilizan do s ub st rato s inespecí fi cos para p r ot e ases como
Azure e Azocool , o bs e rvamo s que a ativida d e p rot eolítica da cepa
pol ixên i c a de E . h i s t o l y t i c a foi s uperior à quela d as c epas ax êni ca ou
monox ê ni ca c om C . f a s c i c u l a t a . O m esmo s e sucede c o m a cepa
ICB-ADO polix ên ica de E . d i s p a r o n d e, em b o r a a com p aração visual
das b andas com a c e p a HM1 -IMSS n os géis de po l iacri l a mida es tej a
mai s tênue, a a tividade prot eolíti ca com Azure e Azocoo l se mostro u
mai s forte , t a nto com os extrat o s b r u tos quanto co m o s m eios
cond i ci o n ados. R ea lm ente, as bact éri a s par e c em ex ercer uma press ão
pos iti v a na vi r ulência das cepas, tanto d e E . h i s t o l y t i c a com o de
E . d i s p a r . En quan to S pi ce & A ckers s e bas ea r am a p e n as na s
obs ervaç õ es visu a i s o btidas das géis de poli acr ilami da, n os sos dados
foram co rro borados pela do sa gem da ati vidade pro t e olít ica e, em bora
aprese ntando um número meno r de bandas nos géis, a cepa ICB-A D O
pol ixên i c a d e E . d i s p a r ap r es entou uma m aior atividad e pro t eol ítica
quan d o comparad a com a c e p a HM1-IM S S .
99
Nossos es tu dos suge r em que a associaç ão d e algumas ba ctérias da
flora bact eri ana exerce um profun d o efeito n o compor t amento
fisio l ó gico das amebas, in flu en cian d o suas pro p ri edades de vi r ulênci a.
Est udos moleculares m ais a p ro fundados t êm que s er re aliz ados , vis a ndo
conh e c e r quais genes se to rnam ati v o s na pres ença d as b a ctérias qu e
tornam poss í v el um a m aio r express ão de s u a vi rul ên c i a, pri n ci palmen t e
nas cepa s de E . d i s p a r .
6.2.3. E f eito Cito pático sobr e C élul as MDCK e Medi d a da Resistê n cia
Trans e pitelial (RTe)
MDC K é um a lin h a epitel i al de o rigem ren al est a b el ecida e m 1958
(Shann on, 1972) amplam ent e c a r acter iz ada quant o a s uas propri e dades
morfo l ó gicas, b i o químicas e f isiológi c as. Em ger al , é simi la r a t odo
epit él i o permeáv el de tr anspor t e e em particul a r ao epi télio i ntestina l.
Assim s end o , e pelo fato de ter sido amplam ent e ut ilizad a em estudos
de r e l ação p arasit o-hosped ei r o em E . h i s t o l y t i c a (O r oz co et al., 1 980;
Oroz co et al . , 1982 b), a esco lh emos como m odelo expe r im e ntal para
investi gar o dano ep it elial com t ro foz o í t os de E . h i s t o l y t i c a e E . d i s p a r .
A medi d a d a r esistên ci a elétri ca t ransep i t elial (RTe) é um a técni ca
alt ament e s e nsível p ara d et e ctar o dano i ni ci al pro d uzido pel os
trofo zo ítos amebi anos em c élulas d e c u l tivo ( Orozco et al. , 1982b ). O
dano à m o n o c amad as c elulares d ep ende da cep a e d a r e l a ç ã o entre
trofo zo ítos/cél ul as ep it eli a is que é utilizada .
Ini ci a lmente, fo i utili z ada a p roporção 2: 1 de t r ofozoít os/ célu la s .
Porém, o bserv am o s que o c o rri a a des truição d a m o nocam a d a em tem p os
inici ais d e i n t eraçã o (15 mi nut os ) . In v e r t e n do a p ro po rção p ara 1 :2
trofo zo ítos/cél ul as f o i pos síve l obs erva r a c i n ética d a i nteração até uma
hora pós -in t e r a ção. Foi o bs ervado que as cepas HM1-IM S S e IC B-EGG
monox ê ni ca ( amb as E . h i s t o l y t i c a p a togêni cas) a p r esentaram g r au
semel h a nte de d es t r u ição nos t empos o bs ervad os (15 , 30 e 6 0 minuto s ).
As cep a s pol ix ênica s IC B-ADO ( E . d i s p a r ) e ICB-EGG (E . h i s t o l y t i c a )
aprese ntaram d a n o s m enores aos observ a dos, poré m não men os
signi fi c ativos. A ad e s ão é uma pro p riedade i m po rtante e p r ov av elm ent e
100
indis pe ns áv el p a r a a p r odução d e d ano celu l ar por p a rte do s tro foz oí tos
de E . h i s t o l y t i c a (Ravdi n & Gu errant, 1982; S ilv a, 19 97). A pres en ç a
das b acté r ias recob r indo part e d o s trofozoí to s t al vez p o ssa expli car a
meno r de st ruição o bservada qu ando u t ilizam os cepa s polixêni c as.
Dest rui ção es s a que foi ainda m en o r q u ando utiliz ad a a c e p a ICB-ADO
monox ê ni ca d e E . d i s p a r , que não apre s e nt a b a ctéri as ass oci adas ao s eu
cult i vo . Esse re sultado r e força a i déia q ue s om ente a a d e são n ão é
sufi ci ent e p ara ini ci ar o p rocess o l e sivo, s end o ne cessári o o ut ros
fato r e s p a r a que o dano celul a r possa ter iní cio. A compa r a ç ão entre as
cepas d e E . d i s p a r uti lizadas n ov am e nte su ge r e a influ ê n cia das
bacté r ias n a expres sã o de s u a pato geni ci d ad e. Estes res ultados
demo ns t r am um nít i d a correlaç ão ent re o efeito citop át ico e a v ir u l ê n cia
das cep a s. T r abal h o s emelhan t e foi reali z a do por Cos ta e t al. (20 0 6 ),
porém c om cul t u ras de cél ulas VER O, obt en do val or e s m enores d e
dest ru i çã o tant o para a cep a IC B-ADO monoxêni ca quanto p ara a cepa
ICB-ADO p o l ixênica d e E . d i s p a r . E s s as d i f e rença s pod em ser
ex pli cadas p ela maior f o r ç a d e uniã o e nt re as cél ula s V ER O em
monocam adas utilizad as p elos a ut o res, um a vez qu e mes mo entre
cult u r a s d iferentes d e c é lu l as MDCK i s so po d e ser obs ervado . C o m
base nos r esultad o s ant e riores, se r ealizou a m e dida da r e sistênci a
tran s ep i t elial d a s m onocam ad a s d e célul as M DC K , vis and o det ermin ar a
perda d a i ntegrid ade funci o n al do epi t é lio que ocor r e, primei r amente,
atrav é s d a s aberturas dos espaço s inter c e lulares devid o à separaç ão
gr a d u al das células adj acent es a pó s a adição dos t r ofoz o í tos. A través
dos regi st r os elet ro fisiol ógi c os da R T e foi poss í v el ob serv a r que os
dano s ocas ionados p e lo s t rofoz o í tos foram progr e ssivos at rav é s d o
tem po e máximos p a r a as cepas de E . h i s t o l y t i c a e E . di s p a r a p ó s uma
hora d e i nteração , com exceção da cepa ICB-ADO monoxêni c a de
E . d i s p a r . Trabal h o s realiz ados por Es pinos a-C a nt ellano et a l. (19 98 ),
util i z ando u ma cepa axêni c a d e E . d i s p a r ( S AW) dem o n st raram q u e
trofo zo ítos dessa ce p a ap r e sentam um discret o efeit o ci t opático sobre
célul as MDCK, d emo rand o o d obro d o tempo o b s e rvad o p ara cep a s
virul e nt as d e E . h i s t o l y t i c a p a r a romp er a resist ên c i a t rans epi tel i al d a
monocam ada d e cél ul as M DC K. E s se fato t am b ém foi o b s e r v ado em
101
nos sos exper im ent os , tanto para a cepa IC B - A D O mo nox ên i ca
(avi r ul enta) c omo p a r a a cepa IC B-ADO polix êni c a (virul en t a) de
E . d i s p a r , p orém a cepa mono x ên i ca n ã o consegui u abo l i r totalm e nte a
resi s t ê ncia t r a ns epitel i al após 60 minut os .
6.2.4. Imunohi s to quími ca
Diver s o s aut or e s de m on s t r aram que m olécu las de E . h i s t o l y t i c a
como p rot eas es (Que & Reed, 19 97 ; T alamas- R o h ana et al. , 19 99 ),
prot eí n as formado ras de po ro s – ameb apo r os ( Le i pp e , 1997), a d esinas
(Arroyo & Oroz co, 1987), l ectina s (P et ri et al. 1 990) e col age n ases
(Muñ oz et al . , 19 82) p o dem parti ci p ar n a ag ressão h epáti c a e c ontribuir
para a f o rmação do a b c e ss o amebi an o . Trabal h o r ealizado p o r V ent ura-
Juaréz et al . (2 0 02) confirmou qu e molécu l a s li b eradas po r trofozoí t o s
de E . h i s t o l y t i c a p od em c ausar da n os he p áticos em an i m ais de
labo rat ório. Em s eu trab alho, as 3, 6 , 12 e 2 4 horas p ós-ino c u l a ç ão, foi
pos sível de t ec t ar molécu l as l i b e radas p or tro foz oí tos f o r m a n do um
padrão radial até as célu l as viz i nh as , sen do d etecta d as em PM Ns e
hepat ó citos vizinho s às á r e as de ne cros e. E s s as m ol écu l as di fundidas
causar i am efei to s c it otóxico e infl am at ó ri o indu zi ndo a s ecreção de
enz imas ou citocinas i n flamató ri a s em outras célul as como l eucóci t os,
macró f a gos e célula s en dot e liais . Pensamo s que a c e p a p ol ixênica d e
E . d i s p a r , p o r ser uma c epa qu e ocasi o n a exte ns o d a no hep ático,
tam bém aprese ntasse essa caract e rísti c a. P o rém, embora os trofoz oí tos
tenh am se mar c a do pela imu no peroxidas e, o mesm o n ã o o c o r reu com as
célul as en d oteli ai s e PM N s, não havendo assi m d i fus ão de ant í ge no s de
ex trato total como o b s e r v ado p a r a cepas de E . h i s t o l y t i c a . D e s t a form a ,
obs ervamo s que o c o m p ortament o da c e p a ICB-ADO d e E . d i s p a r é
difer e nt e d o o b s ervad o para E . h i s t o l y t i c a . Podem os propo r que, ape s a r
de ex istirem grandes qu antidad e s de p ro t eas es, c omo o b s e rvado n os
ex peri m e ntos anteri o r e s, h á p equenas quanti d ades de lectin a,
ameba poros e d e o utras moléculas que possa m at ivar célul a s
inflam ató rias e as s im de st ruir o teci d o hepático. De vem os c on siderar
tam bém que, co m o p r oposto por Tsut sumi et al. (198 4 ) , a s b a ctérias
102
present es no cultiv o p ol ixênico po de r i am s e r um fator atrati vo de
célul as i n f lamató rias, as quai s cont ribuiri am p ara o d es envolvim en to d a
lesão , p r opiciando u m a mbiente adeq u ado p ara a mult ip l i cação dos
trofo zo ítos e p r o gressão d as lesõ es.
6.3. Estudos d e Ultraest rutura
Espin os a -Cantell ano et al. (1 998) através de est ud os
ultraestrutu rai s compar a t ivos en t re E . h i s t o l y t i c a e E . d i s p a r , amb as as
cepas obtidas d e c u l tivos ax ê ni c os, d emon st rar a m exi sti r di f erenças
morfo l ó gicas entre as du as es pécies: atrav és da mi crosco p i a el et r ô nica
de v arredura (MEV) ob servar a m que trofoz oít o s de E . h i s t o l y t i c a
aprese ntavam-s e mai s arred o n d ados e c om u róide pouco freque nt e;
trofo zo ítos de E . d i s p a r , p o r sua vez , a p r e s entavam -s e mai s al o n gados,
com a regi ão ant erior rica em ps eudó p odes e u rói de ge r a lmente bem
visí v el . Na micro s co pia el etr ô n i ca de t ransm issão (M ET), est es a uto res
obs ervar a m q u e em t rofoz oítos d e E . h i s t o l y t i c a a m em brana pl a smáti ca
aprese ntava-se unifo r me, com va cúol os dis t ri b uídos unifo r m e m ente por
todo o c i t oplasma e nú cleo c om cromati na mais espessa, enqu anto
trofo zo ítos d e E . d i s p a r poss u í am u ma m e mbran a plasmáti c a
interrompida em di fe r e ntes área s , com uma pe qu en a quant i d ade de
vacúo l o s concen t rados e m a l gum as regi ões c it oplasm át i c a s e nú cleo
com c r om ati na m enos d e ns a, al é m d a ex ist ê n ci a de ár eas no c it oplasm a
cont end o l a r gos depós i tos d e g rânulos de gli cogên io. Piment a e t al .
(200 2) es tudar a m, através da MET, as intera ç õ es ent re cepas de
E . h i s t o l y t i c a (SAW 7 55 C R, zimodem a XIV ) e E . d i s p a r (S AW 760R R,
zim od ema I) com ba c térias originais da flora intest i n al do hos ped eiro:
em E . d i s p a r obse rvaram va c úolos c ont endo n ão mais de um a ba ctéri a,
além d a presença d e bactéri a s em c o nt ato direto com o ci to pl as m a
amebi an o. Al gum as ba ctéri as se enco n t r avam em pr o cess o de digest ão,
enqu a nt o ou t ras p ar eci am estar s e d iv id indo no interio r dos vacúol o s.
Em E . h i s t o l y t i c a , os vacúol o s observa d os frequ ent em e nte tinham mais
de u ma b a ctéri a, além de não s erem observ adas b actéri a s em c o n t ato
103
diret o com o citopl asm a do paras i to. O u tro d ado obs erv a do p o r ess es
auto res foi o maior número de vacúol o s em E . h i s t o l y t i c a , quando
comp arad a com a ce p a de E . d i s p a r .
Gonz alez -Robles & Martinez -P alomo ( 19 92) demon s traram que
trofo zo ítos d a cep a H M 1 - IM SS a p r esen t av am f i l op ódios basai s escas so s
se l ocaliz an do fu ndam ent alm e nte n a reg i ã o do ur ói d e, s endo que o rest o
da s up e r fície ce lular apr e s entava p o ucas prol o n gações f il iformes .
Atrav é s da M E V obs e r v amos qu e as c epas IC B-ADO m onox ên ica e
pol ixên i c a d e E . d i s p a r também apr esentaram -se com trofoz oí tos m ais
alon ga d o s que aqueles ob t id os das cepa s ICB-EGG de E . h i s t o l y t i c a . Os
trofo zo ítos das cepas polix êni c as possu í am m ais fi l op ódios que aq u el es
prov eni ent es de c ultivos m onoxêni co s. Utili z an do a MET , observ amos
que trofoz oítos or i un do s d e cultiv o s po lixêni co s a presentav am um
meno r nú m e r o de v acúo lo s citoplasm áticos, s ejam el e s d a e spéci e
E . hi s t o l y t i c a ou E . d i s p a r . A o contrári o d o rep ort ado p or Espi n o s a -
Cantell ano et al . ( 1 998), não obs ervamos di ferenças qu a nto à
quan t idade d e v a cúolos entr e as cepas m o n oxênicas de E . h i s t o l y t i c a ou
de E . d i s p a r estudad as, t alv ez pelo fa t o de st as cepas s er e m c ultivad as
monox ê ni camen t e co m o t ripano s s om atí deo C . f a s c i c u l a t a ; porém , co m o
relat a do po r es tes autores , ob serv am os ta mbém nas ce p as ICB-ADO de
E . d i s p a r est u d adas , ár e as no citopl asm a c om m aio r qu antid a d e de
depó s it os d e glicogênio, q u ando compar a d as com as cep as ICB-E GG de
E . h i s t o l y t i c a . Cepa s polix ê ni c as também ap r esentaram um nú cleo com
crom a t ina menos densa e organiz ada.
Finalm e nte os aut or e s r e c onhecem qu e em b ora a E . d i s p a r e st eja
bem ca r a cter i z ad a co m um a espéc i e disti nt a através de es tudo s de
biolo g i a mo l ec ular e bioq uí micos, alguns asp ectos d e sua
pato ge ni c idade e v i rulênci a nece ssitam d e n o vos e studos . Pesq ui sas
com um m aior número de cepas i sol a d as d e p a cientes c o m difere nt es
form a s clínica s b em caract e rizadas são necessári as. Outro aspecto
intri g ante que mere ce no vos estudo s é a i n t e r a ç ão ent re d e t e rminad as
cepas d e E . d i s p a r e al gu ns ti po s d e bact éri as pres e ntes na flora
origi n al do ho s p edei ro e m antidas em culti vo p olix ênico .
104
7. C O NCLU S Õ ES
105
1. Nas inocul a ções experi m e nt ais em fígado de h a m s t ers, as c epas
HM1-IMSS e ICB-EGG m on oxênica d e E . h i s t o l y t i c a apresen t am um
padrão sem el h ant e d e les õ es; a ce p a IC B - A DO polix êni ca de E . d i s p a r
aprese nta um d esen v o lvimento m ai s l e nto e gradual das le sõ es, porém
não m en o s agres s ivo ao s set e di as pós -i noculação .
2. Em ex p erim entos d e erit r ofago ci tose, a cep a ICB-ADO pol ix ên ica de
E . d i s p a r apres e nt a índice de fago cit ose s i gnifi cati v amen t e m eno r que o
obs ervad o para as cepas HM1-IM SS, ICB-EGG e IC B -
452 de
E . h i s t o l y t i c a , i ndepend e nt e da v i rul ência d essas cep a s.
3. As cepas poli x ê nicas IC B -ADO d e E . d i s p a r e IC B-EGG de
E . h i s t o l y t i c a a p resentam um a maio r a tividade p r oteolí t i ca q u ando
comp arad a s c om cultu ras m on ox ê nicas com C r i t h i d i a f a s c i c u l a t a e
ax ênicas . A a ç ão p r ot eolít i ca é p a r cial men t e inib i d a pela adição de
E-64 e P H M B, ini bidores p ara cist e ínaprot e ase.
4. A cepa IC B-ADO de E . d i s p a r oca s i o na a destrui ção e a q u e d a da
medi d a da resi s t ê ncia t r ansep i telial de célul as MDCK em monocam adas
de fo rm a mais l e nta e gr adual q u e as cepas de E . h i s t o l y t i c a estudadas .
5. Em inocul ações e x p e rimentai s i ntra-hep á ti cas em ha m st ers c om a
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