( PDF ) Caracterização de cepas de Entamoeba histolytica isoladas de diferentes casos clínicos no Brasil: análise da expressão de genes possivelmente envolvidos com a patogenicidade

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS

INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

DEPARTAMENTO DE PARASITOLOGIA

CARACTERIZAÇÃO DE CEPAS DE Entamoeba histolytica ISOLADAS DE

DIFERENTES CASOS CLÍNICOS NO BRASIL: ANÁLISE DA EXPRESSÃO DE GENES

POSSIVELMENTE ENVOLVIDOS COM A PATOGENICIDADE

Michelle Aparecida Ribeiro de Freitas

Belo Horizonte

2007

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CARACTERIZAÇÃO DE CEPAS DE Entamoeba histolytica ISOLADAS

DE DIFERENTES CASOS CLÍNICOS NO BRASIL: ANÁLISE DA

EXPRESSÃO DE GENES POSSIVELMENTE ENVOLVIDOS COM A

PATOGENICIDADE

Michelle Aparecida Ribeiro de Freitas

Tese apresentada à Pós-Graduação em

Parasitologia do Instituto de Ciências

Biológicas, Universidade Federal de

Minas Gerais, como requisito parcial

para a obtenção do título de Doutor

em Parasitologia.

Orientadora: Dra. Maria Aparecida Gomes- Laboratório Amebíase

Co-orientador: Dr.Egbert Tannich- Inst. de Medicina Tropical

Bernhard Nocht

Colaborador: Dr. Jorge Luís Pesquero – Departamento de Biofísica-

UFMG

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Trabalho realizado no Laboratório de Amebíase do

Departamento de Parasitologia do Instituto de Ciências

Biológicas da Universidade Federal de Minas Gerais, Belo

Horizonte (MG) e no Instituto de Medicina Tropical Bernhard

Nocht Institute, Hamburg, Alemanha sob a orientação da Profa.

Maria Aparecida Gomes e Dr. Egbert Tannich, com auxílio

financeiro da Coordenadoria de Aperfeiçoamento de Pessoal de

Nível Superior (CAPES)/ DAAD

Dedico este trabalho a Dra Márcia

Cury, sem o qual nada disso teria

sido possível. Márcia, Obrigada por

ter acreditado em mim e por ter

tornado esse sonho possível.

AGRADECIMENTO ESPECIAL

Ao programa de Pós-graduação em Parasitologia do Instituto de

Ciências Biológicas da UFMG, minha gratidão, pela oportunidade de

formação e aprendizado, pelas cobranças, pela confiança e pelas

facilidades concedidas para realização deste trabalho.

AGRADECIMENTOS

A Cidinha, por todos esses anos de amizade e ensinamentos, por ter me

recebido em seu laboratório e me transformado em uma pesquisadora. Eu

fui a sua primeira e pra mim, você será sempre a única! Te adoro e jamais

esquecerei tudo que fez!

Ao Pesquero, pela amizade, pelo carinho, pelos momentos de descontração

e por acreditar na minha capacidade;

Ao Dr. Egbert Tannich pela especial colaboração neste trabalho e pela

agradável estadia em Hamburgo;

Ao professor Edward Félix, pela amizade, pelos ensinamentos e pelo

carinho;

Aos professores da Pós-Graduação do Departamento de Parasitologia do

ICB pelas sugestões, conselhos e ensinamentos.

Ao Joãozinho e a Edna, pelo aprendizado e pelo carinho; sem vocês a

realização desse trabalho não seria possível!

A Sumara pela disponibilidade e competência na realização de

procedimentos que facilitaram a realização deste trabalho;

Aos colegas e funcionários do Departamento de parasitologia ICB/UFMG

pelo apoio e incentivo diários;

Aos meus amigos de laboratório e todos que aqui passaram, Haendel, Jú,

Elisa, Rodolfo, Paulinha, Fred, Filipe, Renata, pelos bons momentos, pela

convivência e pelo carinho.

A minha amiga e companheira de trabalho, Ângela, por todos os bons

momentos e pelas horas de sufoco. Aprendemos muito juntas e não sei se

teria conseguido sem você!

As minhas amigas Carina, Adriana, Veruska, por todos os momentos,

pelas longas horas de conversa e pelo carinho;

Ao Sílvio Dolabella, pela inestimável amizade e pelos sete anos de

convivência e carinho;

A Helen, pela disponibilidade e ajuda imprescindíveis na fase final de

minha tese, pelas horas de conversa, pela amizade e carinho;

Aos amigos que conheci na Alemanha, Kathrin, Leandro, Luciano, Taís,

Manuela e Henriete, apesar do pouco tempo, estarão guardados sempre

em minha lembrança,

Aos meus pais, Paulo Cézar e Nadja, pelos ensinamentos, pela força,

incentivo e pelo amor incondicional que sempre nos uniu;

Aos meus irmãos, Paola e Kiko, que mesmo de longe, sempre me apoiaram

e me deram muito amor;

Ao meu marido, Alexandre por todo amor e carinho que sempre me deu e

principalmente por ter sido um companheiro paciente e sempre

incentivador, tornando essa caminhada mais leve;

A todos que contribuíram direta e indiretamente para realização desse

trabalho;

E finalmente á Deus, pelo amor, pela força e coragem para enfrentar os

momentos difíceis, e por me permitir conhecer pessoas maravilhosas que

tornaram mais agradável essa caminhada.

SUMÁRIO

1. Introdução ..........................................................................

1.1 Amebíase......................................................................... 01

1.2 Morfologia e Biologia........................................................ 02

1.3 Histórico e classificação................................................... 05

1.4 Epidemiologia e prevalência............................................. 07

1.5 Patogenia e virulência...................................................... 10

1.5.1 O processo invasivo..................................................

1.5.2 Fatores moleculares envolvidos com virulência da

ameba......................................................................

1.6 Microarray....................................................................... 15

1.7 PCR em Tempo Real......................................................... 17

1.8 Supressão por hibridização subtrativa..............................

2. Justificativa........................................................................ 20

3. Objetivos............................................................................. 21

4. Material e métodos............................................................. 23

4.1 Cepas de E. histolytica......................................................

4.2 Axenização das cepas polixênicas.....................................

4.3 Inoculação em fígado de hamster..................................... 24

.4.4 Efeito citopático............................................................... 25

4.5 Atividade de cisteil proteinase.......................................... 26

4.6 Microarray....................................................................... 27

4.7 PCR em tempo real.......................................................... 32

4.8 Supressão por hibridização subtrativa..............................

4.9 Clonagem dos cDNAs....................................................... 41

4.10 Sequenciamento.............................................................

4.11 RT-PCR.......................................................................... 44

5. Resultados...........................................................................

5.1 Inoculação em fígado de hamster..................................... 46

5.2 Efeito citopático............................................................... 47

5.3 Atividade de cisteil proteinase.......................................... 48

5.4 Microarray....................................................................... 49

5.5 PCR em Tempo Real ........................................................ 52

5.6 Supressão por hibridização subtrativa..............................

5.6.1. Obtenção de populações de cDNAs específicos............

5.7 Clonagem........................................................................ 54

5.8 Sequenciamento.............................................................. 56

5.9 cDNAs que possivelmente codificam proteínas..................

5.10 Análise por RT- PCR......................................................

6. Discussão........................................................................... 59

7. Conclusão............................................................................

8. Referências bibliográficas.................................................. 71

9. Anexos.................................................................................

LISTA DE FIGURAS

Figura 1- Cisto e trofozoíto de Entamoeba histolytica.................................03

Figura 2- Seqüências dos adaptadores e iniciadores utilizados na realização

da técnica SSH..........................................................................................35

Figura 3. Esquema da técnica SSH............................................................38

Figura 4- Mapa circular do vetor pGEM-T easy e pontos de referência na

seqüência...................................................................................................43

Figura 5 – Fígados de hamster inoculados com trofozoítos das cepas 452,

EGG e DRP de E. histolytica.......................................................................47

Figura 6- Percentagem de monocamadas de células CHO após inoculação

com trofozoítos de E. histolytica (EGG, DRP, HM1, 32, 452)........................48

Figura 7- Gráficos de Normalização para os canais verde e vermelho em

todos os arrays..........................................................................................50

Figura 8- Gel de agarose a 0,8% em TBE 1X representando os produtos

digeridos com RsaI, antes e depois do processo de subtração,

respectivamente...................................................... ..................................54

Figura 9- Gel de poliacrilamida 5% corado pela prata mostrando os

resultados do PCR das colônias de bactérias transformadas com fragmentos

selecionados por SSH da cepa EGG............................................................55

Figura 10- Gel de poliacrilamida 5% corado pela prata, mostrando os

produtos de restrição EcoR1 dos plasmídeos obtidos nas mini preparações

das diferentes colônias...............................................................................55

Figura 11- Estudo da expressão das quatro proteínas diferencialmente

expressas em gel de poliacrilamida 5% mostrando os amplicons gerados pela

técnica de RT-PCR para cada uma das proteínas........................................58

LISTA DE QUADROS E TABELAS

Quadro 1- Cepas de E. histolytica* e suas formas clínicas.........................23

Quadro 2- Distribuição das cepas de E. histolytica quanto a sua coloração

(cye3 e Cye5), nas lâminas de microarray..................................................28

Tabela 1- Desenvolvimento da lesão no fígado de hamster (Mesocricetus

auratus) inoculados com trofozoítos de E. histolytica mantidas em cultivo

axênico......................................................................................................46

Tabela 2- Atividade específica de cisteil proteinase (mU/mg) nas diferentes

cepas analisadas.......................................................................................48

Tabela 3- Gene diferencialmente expresso nas cepas de E. histolytica EGG

em comparação com a cepa HM1...............................................................51

Tabela 4- Confirmação dos resultados PCR em tempo real........................52

Tabela 5- Identificação das possíveis proteínas codificadas pelos cDNAs

específicos de cada uma das cepas de E. histolytica...................................57

Lista de Abreviaturas

BAC

Primer direto e reverso da β- actina

CD Colite disentérica

cDNA DNA complementar obtido apartir do mRNA

CHO Células do ovário de hamster chinês

CP Cisteil proteinase

cp1,cp2,cp5 Cisteil proteinase 1, cisteil proteinase 2 e 5

CPf Primer cisteil proteinase forward (direto)

CPr Primer cisteil proteinase reverso

Cye3 Corante cyanine 3

Cye5 Corante cyanine 5

DEPC dietilpirocarbonato

DNA Äcido desoxirribonucléico

dNTPs Deoxynucleoside triphosphate: dATP+dGTP+dCTP+dTTP

dUTP Deoxyuracyle triphosphate

EDTA Ethyl-enediaminetetraacetic acid

ESTs Expressed Sequence Tags

Gal/GalNAc Lectina de superfície amebiana,

IgA Imunoglobulina da classe A

IgG Imunoglobulina da classe G

IPTG

Isopropil-β- D- Tiogalactopiranosídeo

KCl Cloreto de potássio

M Massa moleular

MgCl2 Cloreto de magnésio

mRNA Äcido ribonucléico mensageiro

NaCl Cloreto de sódio

NaOH Hidróxido de sódio

pb Pares de bases

pH Potencial hidrogeniônico

PBS Phosphate Buffered Saline

PCR Polymerase Chain Reaction

PM Peso molecular

SAGE Serial Analysis of Gene Expression

SSH Suppression Subtractive Hibridisation

RT-PCR Transcriptase reversa - Polymerase Chain Reaction

TAE Tampão Tris acetato EDTA

TBE Tampão Tris borato EDTA

TE Tampão Tris EDTA

X-gal

5 bromo-4-cloro-3-indolyl β- galactosídeo

WHO World Health Organization

RESUMO

A amebíase é uma infecção humana causada pela Entamoeba

histolytica, um parasita patogênico e invasivo que causa morte de cerca de

100.000 indivíduos por ano, causando principalmente, uma colite

fulminante. Um dos aspectos mais interessantes na biologia amebiana é a

grande variabilidade no potencial virulento das mesmas. A E. histolytica

tem uma notável habilidade de destruir tecidos, apresentando assim um

comportamento patogênico. Como esse comportamento não se estende por

todas as cepas, as bases moleculares do processo de citotoxicidade têm

sido muito investigadas. Dados da literatura sugerem que as Cisteil

proteinases (CP) tem uma importante contribuição na invasão e destruição

de tecidos pela E. histolytica.

Este trabalho tem como objetivo a caracterização da virulência em

cepas de E. histolytica isoladas de diferentes casos clínicos e análise da

expressão diferencial de genes possivelmente envolvidos com a virulência,

utilizando as técnicas de supressão por hibridização subtrativa (SSH) e

microarray.

Para isto, as cepas foram mantidas em cultura axênica e

caracterizadas quanto a capacidade de produzir lesão em fígado de

hamster, efeito citopático em células CHO e atividade de CP.

A expressão dos genes que codificam a CP das cepas foi analisada

através da técnica de microarray, utilizando a cepa HM1 como controle,

para esse estudo foram selecionadas duas cepas de E. histolytica isoladas

de pacientes assintomáticos (452 e 32) e três cepas isoladas de pacientes

sintomáticos (EGG, HM1 e DRP). Os resultados do microarray foram

confirmados pela técnica de PCR em tempo real. Para a análise da

diferença de expressão pela técnica de SSH foram utilizadas a cepa mais

virulenta, EGG e a menos virulenta, 452. Esta metodologia combina o

hibridização de cDNA com a técnica de PCR e permite a seleção de genes

com expressão diferenciada nas amostras analisadas.

Nossos resultados demonstraram que a caracterização das cepas,

tanto, in vivo quanto in vitro, concordavam com os sintomas clínicos dos

pacientes de onde as cepas foram obtidas. Foi observada uma grande

variação na virulência entre as cinco cepas analisadas, no entanto, nossos

resultados demonstraram diferença estatística na expressão apenas no

gene CP1, para as cepas EGG e HM1.

Em nossos resultados de subtração identificamos 9 fragmentos de

cDNAs, os quais apresentaram alta homologia a genes já previamente

seqüenciados do genoma de E. histolytica. Mas apenas quatro destes genes

foram confirmados pela RT- PCR. Dentre eles estão duas proteínas

hipotéticas e uma proteína rica em cisteína, sendo expressos na cepa EGG

e a proteína Grainin 2 expressa na cepa 452.

Os resultados do microarray sugerem que as funções de avaliação

da virulência realizadas neste estudo têm pouca relação com a expressão

de cisteil proteinase. A técnica de SSH foi uma boa ferramenta para

identificação rápida de novos genes diferencialmente expressos e a análise

desses genes pode expandir a compreensão sobre a patogênese amebiana,

identificando genes que podem constituir alternativas como alvo para o

desenvolvimento de novos fármacos e novas técnicas de diagnóstico.

ABSTRACT

Amoebiasis is a human infection caused by Entamoeba hystolytica,

an invasive pathogenic parasite that causes the death of 100.000 of people

per year, mainly by fulminant colitis. One of the most important aspects of

this parasite biology is the great variability in the virulent potential of

them. The E. histolytica have a notable capacity of destroy tissues,

presenting a pathogenic behavior. Because this behavior is not shared by

all strains, the molecular basis of the cytotoxity process had been

exhaustively investigated. Data from the literature suggest that the

cysteine proteases (CP) have a great importance in the tissues invasion

and destruction by the E. histolytica.

This work have as main objective the E. histolytica strains virulence

characterization isolated from different patients and analyses of differential

expression of genes that probably are involved in the E. histolytica

virulence using Suppression subtractive hybridization (SSH) and

microarray techniques. To perform this work, the strains were kept in

axenic cultures and characterized by their damage capacity in the guinea

pig liver, cytopathic effect in CHO cells and CP activity.

The genes expression that codify the CP from studied strains were

analyzed by microarray technique, using HM1 strain as control. We

selected two strains from asymptomatic patients (452 and 32) and tree

strains isolated from symptomatic patients (EGG, HM1 and DRP). The

microarray results were confirmed by real time PCR. To analyze the

differential expression by SSH technique, we used the most (EGG) and the

less (452) virulent strains. This methodology combines the cDNA

hybridization with the PCR technique and permits the genes selection with

differential expression in the analyzed samples.

Our results demonstrated that strains characterization as in vivo as

in vitro, agreed with the patients clinical symptoms from where the strains

were obtained. We noted a great variation in the virulence among the five

analyzed strains, nevertheless, our results showed statistical differences in

the expression only in the CP1 gene to EGG and HM1 strains.

Our subtraction results identified nine fragments from cDNAs that

represent a high homology in previously sequentiated genes from E.

histolytica genome. However, just four genes were confirmed by RT-PCR.

Among them we found two hypothetic proteins, one protein rich in cysteine

been expressed in the EGG strains and the Grainin 2 protein expressed in

the 452 strain. Results from microarray technique suggest the virulence

present a low relation with Cisteil proteases relation. The SSH technique

was a great tool to a quick identification of new genes differentially

expressed and we believe that analysis of these genes can expand the

comprehension about the amebiasis pathogenesis, identifying genes that

can constitute new targets to development of drugs and diagnostic

techniques.

1. INTRODUÇÃO

1.1. Amebíase

A Entamoeba histolytica é o agente etiológico da amebíase hepática

(abscesso amebiano) e da colite amebiana, sendo causadora de infecções

humanas em escala global culminando em sofrimento e morte.

Anualmente cerca de 50 milhões de pessoas apresentam doença na forma

invasiva, resultando em 100.000 óbitos, sendo assim, a segunda causa

mais comum de morte por doenças parasitárias em humanos (WHO,

1997).

Em muitas infecções de E. histolytica o parasito vive como comensal

no intestino, sendo o indivíduo infectado considerado portador

assintomático. Os pacientes sintomáticos apresentam formas invasoras,

que são responsáveis por alterações intestinais e extraintestinais (Que &

Reed, 1997), caracterizadas por uma grande diversidade de quadros

clínicos. A amebíase intestinal pode determinar colite não disentérica,

colite disentérica, amebomas, apendicite e amebíase extra-intestinal,

podendo, algumas vezes, ocorrer infecção de órgãos como pulmão, cérebro,

baço, rim e outros.

A colite amebiana não disentérica é característica da forma

intermediária da amebíase (Cunha et al., 1977). Nesta, as manifestações

clínicas são marcadas por evacuações diarréicas ou não, em alternância

com períodos de funcionamento normal do intestino. A colite amebiana

disentérica é caracterizada por cólicas intestinais e diarréia muco-

sanguinolenta, acompanhadas de tenesmo e tremores de frio. O indivíduo

é acometido de diarréia com evacuações freqüentes, chegando a mais de

dez vezes por dia, com fezes líquidas e muco-sanguinolentas. As formas

agudas, fulminantes de colite disentérica, podem ser resultado da

confluência das úlceras com necrose de grandes porções, muitas vezes

com contaminação por bactérias do trato intestinal, culminando em

perfurações múltiplas.

A apendicite por ameba é decorrente da ulceração ceco-apendicular,

seguida de processo inflamatório do apêndice. O ameboma é encontrado

no ceco, geralmente em lesão única, resultante da junção de várias

úlceras, formada por massas granulomatosas que podem ser confundidas

com neoplasias.

A manifestação extraintestinal mais comum da doença ocorre no

fígado, onde a E. histolytica provoca necrose de expansão lenta,

erroneamente chamada de abscesso, pois não há formação de membrana

piogênica e de pus. Há sim uma necrose coliquativa do parênquima em

conseqüência da ação enzimática das amebas, com cavidades contendo

um líquido amarelado, esverdeado ou amarronzado, pelo pigmento biliar

(Silva, 1997). A necrose amebiana do fígado pode provocar dores brandas

na base do pulmão e no fígado, hepatomegalia, febre, tosse e dores

abdominais (Petri et al., 2002; Stanley, 2003). Esta fase é caracterizada por

anorexia, anemia leve, leucocitose sem eosinofilia, altas taxas de

eritrócitos, entre outros (Stanley, 2003). Os indivíduos infectados podem

apresentar a doença hepática meses ou anos após a infecção, sendo que

geralmente não apresentam cistos nas fezes e nem infecção no intestino.

1.2. Morfologia e biologia

A E. histolytica apresenta em seu ciclo de vida quatro estágios

evolutivos, trofozoítos, pré-cistos, cistos e metacistos. Os cistos e

trofozoítos são fases bem definidas do parasito e os pré-cistos e metacistos,

fases intermediárias. O pré-cisto é uma forma intermediária entre o

trofozoíto e o cisto, são ovais e menores que o trofozoíto e o metacisto é o

estágio anterior à formação dos trofozoítos maduros.

Os cistos (fig. 1-A) são esféricos e medem de 8 a 20 µm de diâmetro,

apresentam em seu envoltório uma parede refratária, formada de quitina,

bastante rígida. Os núcleos variam em número de um a quatro,

apresentam vacúolo de glicogênio, corpos cromatóides em forma de

bastonetes. O núcleo é vesicular e esférico, sendo regularmente revestido

com grânulos de cromatina, apresentando cariossoma pequeno e situado

no centro do núcleo.

Figura 1- Cisto (A) e trofozoíto (B) de Entamoeba histolytica.

O metacisto é uma ameba tetranucleada, liberada pelo cisto por um

mecanismo ainda não elucidado, que após uma série de divisões nucleares

e citoplasmáticas irá originar quatro e depois oito amebas uninucleadas,

denominadas de trofozoítos metacísticos. Os trofozoítos da E. histolytica

(figura 1- B), ao contrário dos cistos, são móveis, unicelulares e seu

tamanho varia entre 10 a 40 µm, podendo chegar a 60 µm nas formas

invasivas. Apresentam geralmente um só núcleo, que mede de 4 a 7 µm,

com cariossoma também central, membrana nuclear delgada e cromatina

uniforme sob a forma de finos grânulos na periferia da carioteca. São

pleomórficos e muito ativos na captação de alimentos (fagocitose). O

citoplasma é diferenciado em ectoplasma claro e hialino e endoplasma

granuloso, contendo vacúolos. Quando isolado de infecções invasivas seu

citoplasma pode se apresentar repleto de eritrócitos.

A locomoção das amebas se dá através de pseudópodes e a energia

para a constante movimentação provém da conversão anaeróbica da

glicose e piruvato para, principalmente, etanol (Stanley, 2003). A ingestão

de alimentos se dá por fagocitose e pinocitose (Martinez-Palomo, 1988).

Os estudos sobre a ultraestrutura dos trofozoítos mostraram que a

E. histolytica não apresenta retículo endoplasmático, complexo de golgi,

centríolos, microtúbulos e mitocôndria clássica, sendo a energia derivada

de processo fermentativo (Stanley, 2005). Mesmo assim, a E. histolytica é

considerada uma célula eucariótica, pois apresenta o DNA confinado

envolto em uma membrana nuclear. Interessantemente os ribossomos são

arranjados em hélices no citoplasma, sendo denominados de corpos

cromatóides (Lohia, 2003).

Como alguns protozoários parasitas, a E. histolytica tem o ciclo de

vida simples e apresenta, como hospedeiro natural, somente o homem e

outros primatas (Stanley, 2003). A infecção geralmente começa através da

ingestão de cistos junto com água e/ou alimentos contaminados com fezes

de humanos. Os cistos sobrevivem à ação do suco gástrico e chegando ao

final do intestino delgado ou início do grosso, onde a tensão de oxigênio é

baixa, através de uma pequena fenda na parede cística, liberam o

metacisto que sofre sucessivas divisões nucleares e citoplasmáticas, dando

origem a quatro e depois oito trofozoítos, chamados trofozoítos

metacísticos. Estes normalmente residem no intestino grosso, aderidos ao

muco colônico e às células epiteliais. A E. histolytica geralmente persiste

por meses ou anos no intestino como comensais, no entanto,

ocasionalmente o parasita penetra na mucosa do intestino, induzindo a

colite ou se disseminando para outros órgãos.

Ao contrário de alguns protozoários parasitas, a invasão de tecidos

por E. histolytica não parece fazer parte do seu ciclo de vida. Nos tecidos, o

trofozoíto não se diferencia em cisto e não é transmitido a outros

hospedeiros.

Para completar o ciclo normal, os trofozoítos se desprendem da

mucosa e caem na luz intestinal, se diferenciando em pré-cistos. O

encistamento ocorre no cólon e o ciclo de vida se completa quando o cisto

infeccioso é eliminado juntamente com as fezes para o meio ambiente. Os

fatores que determinam o encistamento não são bem conhecidos.

Os cistos, dependendo das condições ambientais, permanecem

infectantes de semanas a meses (Ravdin, 1988). Os trofozoítos não têm

importância na transmissão da amebíase, pois, são destruídos quando

expostos a enzimas e ao ácido clorídrico do trato gastrointestinal

(Martinez-Palomo, 1988). Os trofozoítos se multiplicam por reprodução

assexuada e foram, por um longo tempo, classificados como amitóticos. No

entanto, com o projeto genoma da E. histolytica descobriu-se que existem

genes homólogos àqueles requeridos na mitose de organismos eucariotos,

surgindo assim, mais uma questão a ser resolvida na amebíase (Lohia,

2003; Stanley, 2005).

1.3. Histórico e classificação

Lambl, em 1860, registrou pela primeira vez a infecção de humanos

por ameba, tendo a encontrado em fezes de uma criança com disenteria.

Depois, em 1871, Cunnigham isolou esse protozoário das fezes diarréicas

de um indivíduo com cólera, na Índia, associando o mesmo a essa

enfermidade. Posteriormente, Lösch também encontrou amebas nas fezes

de um camponês que apresentava disenteria, diarréia, dor abdominal e

febre, e infectou cães com as fezes deste paciente. A autópsia dos cães

revelou amebas e um intenso processo ulcerativo no intestino grosso dos

mesmos. Estas foram denominadas de Amoeba coli (Lösch, 1875).

No século 19, Kartulius e Koch, estudando pacientes com quadro de

disenteria tropical, atribuíram essa enfermidade às amebas (Kartulius,

1886; Köch & Graffki, 1887).

A descrição patológica da invasão do intestino e do fígado pelas

amebas foi realizada por Coucilman e Lafleur, que foram os primeiros

pesquisadores a usarem as expressões “abscesso amebiano do fígado” e

“disenteria amebiana” (Councilman & Lafleur, 1891).

Os cistos do parasito foram descritos por Quincke e Ross, que

atribuíram aos mesmos a forma infectante da Entamoeba, além de terem

identificado diferentes espécies de amebas que poderiam viver no cólon

humano (Qunicke & Ross, 1893). Em 1903, Schaudinn demonstrou a

existência de dois tipos de ameba infectando o homem, uma patogênica e

outra não, denominando a forma não patogênica de Entamoeba coli e a

patogênica de Entamoeba histolytica, devido a sua extraordinária

habilidade de lisar tecidos (Schaudinn, 1903). No entanto, esta habilidade

não se estende a todas as cepas do parasito. Ao contrário, na maioria das

infecções o parasito se comporta como não invasivo.

Assim, várias postulações foram feitas para explicar esta

variabilidade da virulência amebiana. As três hipóteses mais importantes

foram:

• Teoria unicista (Dobell, 1919) - Postula que toda E. histolytica seria

invasiva, ou seja, capaz de produzir lesões no tecido. Entretanto,

algumas amebas pouco invasivas causariam sintomas pouco

intensos que passariam desapercebidos pelo indivíduo infectado.

• Teoria dualista (Brumpt, 1925) – Postula a existência de duas

espécies morfologicamente semelhantes, a E. dysenteriae,

patogênica, responsável pela forma sintomática da doença e a E.

dispar, comensal. Esta teoria não foi muito aceita na época, devido

a inexistência de métodos para distinguir as espécies.

• Teoria neodualista ou pluralista (Hoare, 1961)- Postula que a E.

histolytica possui uma variabilidade no seu potencial patogênico e

que existem cepas com diferentes graus de virulência, causando

desde infecções assintomáticas até formas graves da doença.

Dentre as teorias propostas a pluralista era a mais aceita até o

século XX. Depois dessa época a teoria dualista começou a ganhar

adeptos, devido a observações feitas por Sargeaunt e colaboradores que

observaram diferenças no perfil enzimático de isolados patogênicos e não

patogênicos, sendo correlacionados com a forma clínica e parâmetros

biológicos de E. histolytica (Sargeaunt, 1982).

Outros autores estabeleceram diferenças entre isolados patogênicos

e não patogênicos, principalmente em nível molecular, levando o comitê de

peritos da Organização Mundial de Saúde (WHO, World Health

Organization) em 1997, a apoiar a teoria dualista.

Apesar da E. histolytica e da E. dispar serem morfologicamente

idênticas, filogeneticamente relacionadas (aproximadamente 98% do RNA

ribossômico-rRNA é idêntico) e apresentarem hospedeiros e estágios de

desenvolvimento semelhantes, estas duas espécies são muito diferentes

considerando a patogenicidade in vivo. Ambas colonizam o intestino

humano, mas somente a E. histolytica é capaz de causar a doença, sendo a

E. dispar não patogênica (MacFarlane et al., 2005). Portanto, a maioria dos

casos assintomáticos de infecção por amebas tetranucleadas, antes

considerados como sendo causados pela E. histolytica, são agora

atribuídos à E. dispar (WHO, 1997). A confirmação da existência da

Entamoeba dispar é talvez uma das constatações mais importantes

atualmente na pesquisa em amebíase.

1.4. Epidemiologia e prevalência

Estimava-se que aproximadamente 10% da população mundial

estivesse infectada com E. dispar ou E. histolytica (Rakel, 1998).

Entretanto, estudos epidemiológicos indicam que a maioria dos indivíduos

infectados com E. histolytica/E. dispar não desenvolvem a doença na

forma invasiva. Aproximadamente 90% são assintomáticos, 10%

apresentam colites amebianas e 1% desenvolvem o abscesso amebiano no

fígado (Gathiram & Jackson, 1985; Walsh, 1986).

A colite amebiana tem sido geralmente reportada em crianças e

adultos de ambos os sexos. No entanto o abscesso amebiano é mais

prevalente em homens na faixa de 18 a 50 anos. A razão para essas

diferenças na taxa de infecção da amebíase hepática não é conhecida, mas

especula-se que efeitos hormonais e o alto consumo de álcool sejam

possíveis fatores (Stanley, 2003).

A prevalência de E. histolytica na população homossexual é alta,

variando de 20 a 30% nos homens.

A amebíase possui distribuição cosmopolita, com maior prevalência

nas regiões tropicais e subtropicais, onde ocorre com maior gravidade.

Essa incidência parece não estar relacionada com os fatores climáticos,

mas sim com as precárias condições de higiene e educação sanitária, fruto

do subdesenvolvimento dessas regiões. Em regiões subdesenvolvidas, onde

as barreiras entre fezes humanas, água e comida são inadequadas, a

amebíase constitui um alto risco à saúde. De acordo com a WHO (1997),

estima-se que na América existam aproximadamente 95 milhões de

infectados, 10 milhões de enfermos e até 30 mil mortes anuais. A

amebíase constitui problema de saúde pública no México, Índia,

Bangladesh, leste e sul da África, Vietnam e América do Sul (Zlobl, 2001).

Atualmente, a verdadeira prevalência e incidência da E. histolytica é

especulativa, devido à existência da E. dispar e das dificuldades ainda

presentes na diferenciação das duas espécies. No México, 15% dos casos

de crianças com disenteria aguda estão associados a E. histolytica

(Gutierrez, 1986), sendo a população deste país a mais atingida pela

doença tanto na forma intestinal quanto assintomática (Biagi & Beltran,

1969; Sepulveda, 1976). E, de acordo com Crevenna e colaboradores

(1972), o abscesso amebiano no fígado chegou a ocupar o 4º lugar entre as

causas de morte na cidade do México.

Nos EUA, muitos dos casos de amebíase, resultaram de imigrantes

de áreas endêmicas. Em 1993, 2970 casos de amebíase foram relatados

nos EUA, destes 33% de imigrantes vindos do México, América Central e

do Sul e 17% vindos da Ásia e Ilhas do Pacífico (Stanley, 2003). Barwick e

colaboradores (2002) relataram um surto epidêmico ocorrido recentemente

na República da Geórgia, através de contaminação fecal na rede pública de

abastecimento de água.

A Ásia é o continente com maior número de pessoas infectadas

apresentando 300 milhões de infectados e até 50 mil mortes anuais (WHO,

1997). Em Hue, uma cidade com aproximadamente 1 milhão de pessoas

no Vietnam, foram identificados, em um único hospital, 1500 casos de

amebíase hepática no intervalo de 5 anos (Pham et al., 1996).

A África apresenta uma alta incidência de amebíase invasiva,

apresentando 85 milhões de infectados e até 20 mil mortes por ano

(Guerrant, 1986).

O subdesenvolvimento e o clima podem favorecer, mas não

determinar a ocorrência de casos mais graves nestas regiões, pois países

como o Brasil, subdesenvolvidos e de clima tropical, apresentam

prevalência maior de amebíase assintomática. De acordo com Cunha

(1975) as formas de colite disentérica são pouco freqüentes no Brasil,

havendo predominância da forma de colite não disentérica. Assim, é

provável que a E. dispar seja mais freqüente que a E. histolytica em nosso

meio, sendo que a prevalência varia de 4 a 40% dos casos de amebíase

(Braga et al., 2001; Silva et al., 2005). No entanto, considerando a alta

percentagem de assintomáticos infectados com E. histolytica no Brasil

(Gomes et al., 1999) as distribuições da E. dispar e da E. histolytica devem

ser determinadas. No sul e sudeste do país, a prevalência de amebíase

varia de 2,5 a 11%. Já na região Amazônica, ocorrem casos mais graves da

infecção e estes chegam a representar 19% entre os infectados (Araujo et

al., 1988).

No hospital universitário Getúlio Vargas de Manaus (AM) foram

relatados vários casos de amebíase hepática, sendo maior a predominância

dos casos sintomáticos de colite não disentérica (65,2%) que os casos

assintomáticos (34,8%). Também em Manaus, Benetton e colaboradores

(2005) encontraram uma prevalência de 21,5% de indivíduos infectados

por E. histolytica/E. dispar e destes apenas 1,5% foram por E. histolytica.

Recentemente, foi encontrada, na grande Belém/PA, uma prevalência de

29,35% de E. histolytica, tendo sido demonstrada uma relação significativa

entre a presença de E. histolytica e o desenvolvimento de diarréia e cólicas

intestinais em pacientes residentes nesta cidade (Silva et al., 2005).

1.5. Patogenia e virulência

Há décadas atrás, Walker e Sellards (1913), demonstraram

diferenças na resposta individual de voluntários infectados com cistos

provenientes de um único paciente com disenteria amebiana. Ocorreram

manifestações clínicas, que variaram de assintomáticas a colites

disentéricas. Desde então, investigadores têm questionado porque alguns

hospedeiros são mais susceptíveis a amebíase que outros. Hoje se sabe

que a citotoxicidade observada nas cepas de E. histolytica é

indiscutivelmente, um evento multifatorial. Várias teorias têm sido

propostas para tentar explicar a disparidade entre as diferentes

manifestações clínicas. Sabe-se que o potencial patogênico das cepas de E.

histolytica e a resposta imune dos hospedeiros contribuem para a

gravidade da doença. De acordo com Petri (2002), interações entre

trofozoítos de E. histolytica com glicoproteínas da mucosa intestinal

humana e com a microbiota bacteriana residente no intestino também são

importantes.

1.5.1. O processo invasivo

A invasão do tecido pela E. histolytica se inicia quando lectinas de

superfície interagem com resíduos de carboidratos, aderindo-se na mucosa

do intestino do hospedeiro. Através de movimentos amebóides os

trofozoítos atravessam a mucosa degradando a matriz extracelular (Keene

et al., 1986; Reed et al., 1989; Scholze et al., 1986). Depois, atingem a

submucosa e deslocam-se longitudinalmente através da mesma. Tal

deslocamento gera uma grande zona de necrose liquefativa que acaba por

promover o deslocamento da mucosa e o surgimento de uma úlcera. O

desprendimento de várias áreas de mucosa normal promove a coalescência

de várias úlceras. Mediadores químicos, liberados pelos tecidos normais e

necrosados, estimulam a migração principalmente de neutrófilos,

macrófagos e linfócitos, que se acumulam nas bordas da lesão dando

início a uma cascata de eventos, que leva a destruição e morte de células

do hospedeiro.

1.5.2. Fatores moleculares envolvidos com a virulência da ameba

Utilizando uma ampla variedade de modelos experimentais in vivo e

in vitro, diferentes tipos de moléculas amebianas têm sido sugeridos como

agentes indutores de destruição celular, a saber: adesinas, amebaporos,

colagenases, cisteil proteinases (CPs), serino proteinases e fosfatases

(Leippe et al., 1993; Lopez-Vancell et al., 2000; Que & Reed, 2000; Tavares

et al., 2005). Essas proteínas e outros antígenos de superfície do parasita

são potenciais alvos para vacinas.

Gal/GalNac lectina

A lectina de superfície amebiana Gal/GalNAc é responsável pelo

reconhecimento do açúcar galactose e N-acetyl galactosamina nas células

do hospedeiro (Stauffer & Ravdin, 2003). Essa lectina é composta de três

subunidades, uma subunidade leve de 31-35 kDa, uma pesada de 170

kDa, ambas ligadas por pontes dissulfeto e uma intermediária de 150 kDa

ligada não-covalentemente. A sub-unidade pesada é uma cadeia

transmembrana que consiste de um domínio extracelular dividido em três

regiões baseadas na sua seqüência de aminoácidos, e um domínio

citoplasmático carboxi-terminal formado por 41 aminoácidos. Tem sido

demonstrado, in vitro, que a cadeia transmembrana participa da aderência

do trofozoíto a várias células-alvo (Ankri et al., 1999a; Pacheco et al.,

2004).

Outras proteínas que participam da aderência também têm sido

identificadas (Huston, 2004), mas a lectina Gal/GalNac tem sido

considerada o maior fator de virulência da E. histolytica, definindo o

momento da invasão (Tavares et al., 2005).

Amebaporos

A partir da década de 80 foi descoberto que a ameba produz um

peptídeo capaz de formar canais de íons ou poros em membranas lipídicas

e de despolarizar as células alvo, denominado amebaporo. São peptídeos

membranolíticos de 77 aminoácidos, massa molecular em torno de 13

kDa, armazenados no interior de grânulos citoplasmáticos dos trofozoítos

(Leippe, 1997). Quando liberada ao meio de cultivo tem capacidade de

incorporar-se às bicamadas lipídicas, sem a necessidade de um receptor

específico, formando poros permeáveis a íons (Lynch et al., 1982).

A inibição da expressão do amebaporo em trofozoítos de E.

histolytica reduziu expressivamente a capacidade lítica sobre hemácias e

células renais de hamster, bem como a capacidade de produzir zonas de

necrose liquefativa em hamster (Bracha et al., 1999).

Cisteil proteinases

Outro grupo de proteínas muito estudado nas amebas é o das cisteil

proteinases, que são enzimas proteolíticas presentes nos organismos

eucariontes. São as principais enzimas encontradas nos lisados de E.

histolytica e consideradas como um dos fatores mais importantes de

virulência (Que & Reed, 2000). Têm sido associadas a citoaderência,

hemólise, citotoxidade, degradação de componentes da matriz extracelular,

evasão da resposta imune e aquisição de nutrientes (Ocadiz et al., 2005).

Tais enzimas hidrolizam o colágeno, elastina, fibrinogênio e

laminina, eliminando obstáculos mecânicos para que os trofozoítos

possam invadir os tecidos. As cisteil proteinases também ativam a via

alternativa do complemento através da hidrólise do componente C3. Estas

proteinases degradam C3a e C5a, além de IgA e IgG. A escassez de

neutrófilos ao redor das zonas de necrose liquefativa pode ser explicada

pela hidrólise de C3a e C5a (Que et al., 2002). Outros mecanismos eficazes

de evasão e inativação utilizados pelos trofozoítos são a inibição da

ativação de macrófagos e da expressão do complexo maior de

histocompatibilidade da classe II (MHC-II) (Huston, 2004). A adição de

laminina em cultura de trofozoítos de E. histolytica bloqueia a ligação de

CPs à matriz extracelular, reduzindo significativamente a formação de

lesões hepáticas (Li et al., 1995).

Vários dados experimentais indicam que as CPs parecem ser

realmente responsáveis por um número de efeitos considerados

importantes para a patogenicidade da E. histolytica. Keene e colaboradores

(1990) demonstraram, através de estudo citopático, utilizando-se de ZFA-

F, um inibidor específico de CPs, que a patogenicidade da E. histolytica

está diretamente relacionada à atividade de enzimas desta família. Stanley

e colaboradores (2001) também demonstraram que o tratamento com o

inibidor de CPs E-64 bloqueou ou reduziu significativamente a formação

de abscesso hepático em ratos. Além disso, as CPs ativam a enzima

conversora de interleucina 1 (IL-1), estimulando sua produção e

contribuindo para o desenvolvimento da resposta inflamatória (Zhang et

al., 2000). A inibição da expressão das CPs não afeta o efeito citopático ou

a atividade hemolítica dos trofozoítos de E. histolytica, mas inibe sua

capacidade de fagocitar (Ankri et al., 1998). Esta inibição também interfere

no ciclo biológico e no metabolismo do parasito, sugerindo que as CPs tem

papel importante na fisiologia e são essenciais para sobrevivência do

mesmo (Olivos-Garcia et al., 2003).

Até 2003 apenas 8 genes que codificam para cisteil proteinase

tinham sido indentificados (cp1 a cp7 e cp112)(Bruchhaus et al., 1996b;

Garcia-Rivera et al., 1999; Reed et al., 1993). Em 2003, Bruchhaus e

colaboradores, encontraram 12 novos genes de CPs em E. histolytica, e

através de análises de Northern Blot comparativo, avaliaram os 20 genes

de CP existentes e detectaram que somente alguns são expressados em

culturas de trofozoítos. Sendo os genes que codificam para cp1, cp2 e cp5,

além de mais altamente expressos, responsáveis por no mínimo 90% da

atividade total das cisteil proteinases na cultura de E. histolytica.

Os genes cp2, cp3, cp4 e cp6 foram encontrados tanto em E.

histolytica como em E. dispar com uma similaridade de 95% em suas

seqüências. Já os genes cp1 e cp5 não foram inicialmente, encontrados na

E. dispar quando analisados pelo método de Southern blot (Bruchhaus et

al., 1996a). De acordo com outros autores (Freitas et al., 2004; Wilihoeft et

al., 2001), o gene cp5 na E. dispar está altamente degenerado e não

contém estruturas do tipo “open reading frame” (ORF), sugerindo que ele

esteja não funcional por um considerável período de tempo na evolução

das amebas não patogênicas. A localização da cp5 na superfície da ameba,

associada a sua ausência na E. dispar, faz com que ela seja uma excelente

candidata à molécula chave na capacidade invasiva da E. histolytica

(Jacobs et al., 1998). De acordo com Ankri (1999a), trofozoítos de amebas

transfectadas com DNA antisense do gene que codifica para cp5

apresentaram uma redução de 90% na atividade total de CPs, o que

amenizou o desenvolvimento de lesões hepáticas intensas em fígado de

hamsters e reduziu a capacidade de eritrofagocitose amebiana. Uma

interessante hipótese para a função primária de todas as CPs pode ser a

digestão de nutrientes. Entretanto, a cp5 e a cp112, que são localizadas na

superfície e excretadas pela ameba, podem ser importantes na invasão de

tecidos do hospedeiro pelo trofozoíto (Que et al., 2002).

Mais recentemente, com a descrição do genoma da ameba, dez novas

CPs com N-terminais preditos como ancoras de membranas, foram

identificadas na E. histolytica (Loftus et al., 2005). Assim, existem mais de

30 genes ligados a CP neste organismo (Sato et al., 2006). Entretanto

pouco se sabe a respeito de suas posições na membrana.

Trabalhos recentes têm demonstrado que cepas de E. histolytica com

diferentes graus de virulência apresentam diferentes níveis de expressão

entre cisteil proteinases (Bruchhaus et al., 1996b; MacFarlane & Singh,

2006; Que & Reed, 1997; Tannich, 1998).

A despeito desses e outros estudos, concluímos que muito ainda

falta ser elucidado sobre a citotoxicidade amebiana. Estudos de análise da

expressão e diferenciação gênica em amebas isoladas de diferentes casos

clínicos podem contribuir para uma melhor compreensão da biologia deste

parasita. O desenvolvimento de “projetos genoma” proporcionou o avanço

no conhecimento do genoma de vários organismos, possibilitando a

utilização de técnicas de identificação e quantificação de seqüências

gênicas específicas. Além disso, a construção da biblioteca genômica da E.

histolytica possibilitou a identificação de vários genes que podem ser

importantes como fatores de virulência.

Várias metodologias para a análise da expressão diferencial de genes

vêm sendo empregadas para identificar genes envolvidos no processo da

invasão amebiana. E novas técnicas de expressão diferencial de genes

estão sendo descritas como a análise comparativa de ESTs (“Expressed

Sequence Tags”), SAGE (“Serial Analysis of Gene Expression”), Geneship, a

hibridização subtrativa e o microarray. Para isto utilizaremos no presente

trabalho, duas novas técnicas de determinação da expressão diferencial de

genes, o microarray e a supressão por hibridização subtrativa (SSH).

1.6. Microarray

O microarray tem revolucionado a era pós-genômica. Esta técnica foi

descrita no final da década de 90 e se tornou o método de escolha no

monitoramento da expressão gênica de larga escala (Granjeaud et al.,

1999). É utilizada para se determinar padrões de expressão diferencial,

comparando diferenças nos níveis de RNAm entre células idênticas

submetidas a diferentes estímulos ou entre diferentes tipos celulares ou

estágios de desenvolvimento. Esta técnica apresenta uma série de

características vantajosas, tendo se tornado o método mais comumente

usado para comparar padrões de expressão gênica (MacFarlane et al.,

2005). O microarray tem sido utilizado em diversas linhas de estudo

incluindo interação parasito-hospedeiro, doenças auto-imunes,

investigações de processos celulares, etc. Vários estudos de expressão

gênica, empregando o microarray, foram desenvolvidos em células

humanas (Loftus et al., 1999; Yang et al., 1999), de plantas (Schena et al.,

1995), camundongos (Tanaka et al., 2000), animais domésticos (Araújo,

2003) entre outros.

Cada gene representado na lâmina é denominado de elemento e se

constitui em uma sonda (probe) de um experimento do microarray. O

cDNA obtido a partir do RNAm de duas diferentes amostras é marcado

com moléculas repórteres fluorescentes diferentes e empregado na

hibridação comparativa na lâmina onde se encontram depositados os

fragmentos de genes conhecidos, arranjados em forma de matrizes (spots).

Após período de hibridização, a lâmina é iluminada com luz (lazer ou luz

branca filtrada) na freqüência que excita os corantes (um de cada vez) e o

resultado da excitação é digitalizada para formar a imagem do microarray.

A imagem é segmentada e a intensidade dos pixels de um determinado

grupo de fragmentos do mesmo gene é usado para estimar a quantidade

do gene hibridizado em cada spot. Após isso se faz a análise matemático-

estatística dos dados gerados utilizando-se um programa de análise das

imagens, determinando-se o nível de expressão dos genes.

O microarray é já foi utilizado na análise de genes de parasitas como

Trypanosoma brucei (El-Sayed et al., 2000), Trypanosoma cruzi

(Bartholomeu, 2002) e Entamoeba histolytica (Debnath et al., 2004;

MacFarlane et al., 2005). Macfarlane e colaboradores (2005), utilizaram

esta técnica para obter um perfil de expressão gênica comparativa entre E.

histolytica e E. dispar. Amebas expostas a colágeno e cálcio apresentaram

baixa expressão dos genes que codificam as proteínas Hsp70, amebaporos

e cisteil proteinases. O grupo de Guillen do Instituto Pasteur, desenvolveu

um microarray baseado em seqüências de cDNAs de aproximadamente

1300 genes da ameba e têm usado o mesmo no desenvolvimento de um

perfil transcripcional de E. histolytica durante a invasão hepática. Os

resultados desses experimentos demonstraram o potencial do microarray

nos estudos do genoma funcional e a possibilidade da sua aplicação nos

estudos dos mecanismos moleculares envolvidos com a patogenicidade

(Weber et al., 2006).

1.7. PCR em Tempo Real

O PCR em tempo real é, das técnicas recentes de genética molecular

a que mais tem permitido levar esta disciplina para as bancas do

Laboratório de análises Clínicas. As suas principais vantagens são a

grande rapidez, se executado em equipamentos “fast-cycling” e a enorme

sensibilidade e especificidade. Com o PCR-em-tempo-real, é possível

detectar a existência de um patógeno, ou de um gene humano, quantificar

o patógeno, ou o número de cópias do transcrito humano numa dada

amostra, bem como caracterizar a presença de mutações/polimorfimos no

patógeno ou no genoma do individuo em estudo. Outras aplicações

especialmente úteis para PCR é a clonagem de um determinado fragmento

de DNA que pode ser um gene e o conhecimento do DNA codificante

(cDNA) obtido á partir da molécula de RNA, o que permite o estudo da

expressão de genes. Além disso, alguns pesquisadores como Davis e

colaboradores (2006) e Weber e colaboradores (2006), têm utilizado essa

técnica como validação de resultados de técnicas que comparam padrões

de expressão gênica como microarray. No presente trabalho utilizaremos

esta técnica com o mesmo intuito desses autores, confirmar a diferença de

expressão entre os genes analisados no microarray.

1.8. Supressão por hibridização subtrativa

A técnica de supressão por hibridização subtrativa (SSH),

começou a ser utilizada em 1996 por Diatchenko e colaboradores, se

baseia na identificação de genes que são expressos apenas em células e

tecidos de interesse, combinando hibridizações de cDNA com a reação em

cadeia da polimerase (PCR). É uma técnica com uso ainda restrito. Tem

sido utilizada como importante ferramenta na caracterização de genes

diferencialmente expressos em células e tecidos e representa uma

importante metodologia para caracterização e entendimento da patogênese

ao nível de espécie, podendo ser utilizada para identificação de genes

específicos que possam determinar virulência, resistência a drogas,

infecciosidade, patogenicidade, entre outros. A SSH possibilita que genes

expressos em altos níveis não sejam clonados e que genes específicos de

determinadas estruturas, geralmente pouco expressos, sejam selecionados

(Diatchenko et al., 1999).

Utilizando-se desta metodologia, Akopyants e colaboradores (1998)

estudaram genes diferentemente expressos em cepas patogênicas de

Helicobacter pylori. Charlab e colaboradores (1999) foram capazes de

selecionar e identificar genes específicos de glândulas salivares de

Lutzomyia longipalpis. Hufton e colaboradores (1999) identificaram genes

diferentemente expressos em células cancerosas em comparação com

células normais e Spielmann e Beck (2000) isolaram genes estágio-

específicos em Plasmodium falciparum. Atalay e colaboradores (2002)

identificaram genes diferencialmente expressos em células cancerosas em

comparação com células normais. Além disso, alguns pesquisadores

estudaram, em certos organismos, genes que são expressos mediante

determinados estímulos. Desta forma, Kuang e colaboradores (1998)

demonstraram a expressão diferencial de genes em células cancerosas

(câncer de mama) induzida pela adição de estrógeno. Hao e colaboradores

(2001) descreveram genes envolvidos na expressão de peptídeos

antimicrobianos em Glossina morsitans morsitans. Lockyer e colaboradores

2006 descreveram genes envolvidos com a interação Schistosoma-

caramujo, comparando linhagens de caramujo Biomphalaria glabrata

resistentes e susceptíveis quando expostos a Schistosoma mansoni e

também uma linhagem de caramujo resistente exposta e não exposta ao

Schistosoma.

2. JUSTIFICATIVA

Nos últimos anos, técnicas de genética molecular e novos modelos de

estudo de doenças têm esclarecido muito sobre a patogênese da amebíase.

De acordo com a literatura, vários argumentos justificam a

patogenicidade da E. histolytica e apesar da relevância de cada um dos

mecanismos analisados, questões fundamentais sobre a diferença entre E.

histolytica virulenta e a não virulenta ainda persistem.

Na tentativa de elucidar alguns fatores relacionados com a virulência

e a patogenicidade da E. histolytica, pretendemos caracterizar, quanto à

virulência, algumas cepas deste parasita, isoladas de diferentes casos

clínicos, além de analisar possíveis genes diferencialmente expressos,

através da técnica SSH e avaliar os níveis de expressão de cisteil

proteinases através da técnica de microarray.

Estes estudos podem fornecer informações a respeito da patogênese

da amebíase, além de identificar genes que possam constituir alternativas

como alvo no desenvolvimento de novos fármacos e novas técnicas de

diagnóstico.

3. OBJETIVOS

3.1. GERAL

Caracterização da virulência de cepas de E. histolytica isoladas de

diferentes casos clínicos no Brasil e análise da expressão diferencial de

genes possivelmente envolvidos com a virulência.

3.2. ESPECÍFICOS

♦ Axenizar duas cepas de E. histolytica, mantidas em cultivo

monoxênico;

♦ Avaliar a capacidade dos trofozoítos das diferentes cepas em lesar

tecidos “in vivo”, através da inoculação em fígado de hamster;

♦ Determinar o efeito citopático das diferentes cepas sobre células de

ovário de hamster chinês (CHO);

♦ Determinar a atividade de cisteil proteinases nas cepas estudadas;

♦ Avaliar a expressão diferencial de 36 genes de cisteil proteinases,

utilizando o microarray;

♦ Validar os resultados obtidos no microarray utilizando a técnica de

PCR em tempo real;

♦ Isolar genes diferencialmente expressos através da técnica de

supressão por hibridização subtrativa; cloná-los e seqüênciá-los;

♦ Validar os resultados obtidos na subtração através da técnica de RT-

PCR.

4. MATERIAL E MÉTODOS

4.1. Cepas de E. histolytica

Foram selecionadas cinco cepas de E. histolytica duas mantidas em

cultivo monoxênico, em meio TYI-S-33 (Diamond et al., 1978a) contendo

aproximadamente 10

/mL Chrithidia fasciculata no laboratório de

amebíase do Departamento de Parasitologia, ICB/UFMG e três mantidas

em cultivo axênico também em meio TYI-S-33 (Diamond et al., 1978a).

Estas cepas (quadro 1) foram isoladas e são mantidas no laboratório de

amebíase do Departamento de Parasitologia, ICB/UFMG, com exceção da

cepa HM1-USA isolada por De La Torre (1972), no México. O quadro a

seguir mostra a relação das cepas de E. histolytica utilizadas e a forma

clínica apresentada pelo paciente ao isolamento.

Quadro 1

Cepas axênicas de E. histolytica* e suas formas clínicas

*Gomes et al., (1999). CD = colite disentérica.

Pelo fato de estas cepas estarem mantidas em cultivo por longo

período e por estarem em constante manipulação, fez-se necessária a

caracterização da virulência, para procedermos às análises funcionais das

CPs.

4.2. Axenixação das cepas monoxênicas

Dentre as cepas estudadas somente a EGG e a DRP eram mantidas

em cultivo monoxênico, sendo necessária a axenização das mesmas para

uso no microarray e para um melhor perfil de comparação.

Para isso foram inoculados 1 x 10

trofozoítos em fígado de hamster

em um volume de 0,10 a 0,15 mL. Seis dias após a inoculação, os animais

foram sacrificados e abertos para exame macroscópico do fígado, os

trofozoítos foram então extraídos do fígado e mantidos em cultura axênica

contendo meio TYI-S-33, tratados com antibiótico (ofloxacina 40µg/mL) e

mantidos com repiques constantes por aproximadamente um mês, até sua

total axenização.

4.3. Inoculação em fígado de hamster

As culturas axênicas foram crescidas em 15 mL de meio de cultura

TYI-S-33. Os tubos foram transferidos para banho de gelo por 10 minutos.

Após esse período, os tubos foram centrifugados a 7000xg por 10 minutos,

o meio sobrenadante foi descartado, o sedimento ressuspendido em 1 mL

de PBS, feita a contagem em câmara de Neubauer e ajustadas as

concentrações desejadas do inóculo. Foram utilizados seis hamsters

(Mesocricetus auratus) com aproximadamente um mês de idade (cerca de

70 gramas). Os animais foram anestesiados com uma dose de 30 mg/kg de

pentobarbital sódico 3% (Hipnol

). A inoculação foi feita diretamente no

lobo esquerdo do fígado em um procedimento de laparotomia. O inóculo

consistiu de 1 x 10

trofozoítos em um volume de 0,10 a 0,15 mL. Seis

dias após a inoculação, os animais foram sacrificados e abertos para

exame macroscópico do fígado. Foram determinadas as incidências de

animais com lesão e estas foram classificadas em graus de 0 a IV de

acordo com Diamond et. al. (1974), como descrito a seguir: (Diamond et al.,

1974b)

Grau 0 - Fígado normal, fibrose no local ou lesão bacteriana menor que 4

mm (ausência de amebas, confirmada por cultivo do fragmento da lesão);

Grau I – Lesão no ponto de inoculação menor que 15 mm de diâmetro;

Grau II – Lesão maior que 15 mm, sem metástase;

Grau III – Lesão no lobo primário, algumas metástases para outras áreas;

Grau IV – Lesão extensa, com metástase, mínimo de 50% do fígado

comprometido.

Um fragmento de cada lesão foi macerado em PBS pH 7,2 entre

lâmina e lamínula, para verificação microscópica da presença de

trofozoítos.

4.4. Efeito citopático

A interação dos trofozoítos com células de ovário de hamster chinês

foi determinada pelo método modificado de Bracha e Mirelman (1984).

Foram estudados o efeito das cepas HM1, 452, 32, EGG e DRP de E.

histolytica sobre as células CHO, cultivadas in vitro em 50 ml de meio

Ham´s F-12 com L-glutamina, suplementado com 5% de soro fetal bovino.

As células foram semeadas em placas de 20 orifícios em uma concentração

aproximada de 1 x 10

células/poço e permaneceram durante 48 horas em

estufa à 37ºC com 5% de CO

para crescerem. As células foram então,

lavadas com meio Ham´s F-12 sem soro, para remover todo o soro fetal

bovino. Os trofozoítos de cada uma das cepas foram contados e colocados

sobre as células na concentração de 1 x 10

amebas/poço e levados para

estufa a 37ºC com 5% de CO

por 50 minutos. Após esse tempo, as placas

foram colocadas em banho de gelo por 20 minutos para desprender as

amebas aderidas às células. Os trofozoítos foram retirados com auxílio de

pipeta Pasteur e as placas foram cuidadosamente lavadas 2 vezes com

meio Ham´s F-12 gelado, sem soro, fixados com formaldeído 4% em PBS e

lavados uma vez com PBS. As células que permaneceram na placa foram

coradas com azul de metileno 0,1 M. O excesso de corante foi removido por

uma lavagem com borato de sódio 0,01 M e o corante incorporado às

células foi extraído com a adição de HCl 0,1 M em cada poço. A quantidade

de células CHO aderidas à placa após a incubação com os trofozoítos de E.

histolytica foi proporcional à coloração do azul de metileno; sendo que a

quantidade de cor extraída das monocamadas de células CHO que não

tiveram interação com trofozoítos (incubadas com PBS) e as que

interagiram com tripsina serviram como controle (0% e 100% de

destruição, respectivamente). A intensidade de cor foi medida pela leitura

da intensidade óptica a 660 nm. Os experimentos foram feitos em

duplicatas e repetidos cinco vezes. A análise estatística foi realizada

através do teste não paramétrico ANOVA ONEWAY, com o nível de

significância de 5% (p<0,05).

4.5. Atividade cisteil proteinase

Após o cultivo de 72 horas, os trofozoítos foram ajustados a uma

concentração de 1 x 10

trofozoítos/mL em meio de cultura. Após

centrifugação a 1200xg, o sobrenadante foi descartado, o sedimento

colocado em banho de gelo por 10 minutos e em seguida lavado duas vezes

com PBS (com centrifugação a 1200xg por 5 minutos) com descarte do

sobrenadante. O sedimento foi ressuspendido em 200 µL de PBS e o

rompimento da membrana celular foi realizado por ação mecânica de

congelamento e descongelamento. Posteriormente os tubos foram

centrifugados a 1200xg por 30 minutos à 4º C. O sobrenadante foi então

transferido para outro tubo e a dosagem de proteína total foi realizado pelo

kit “BCA protein assay” da Perbio Science.

A atividade cisteil proteinase foi determinada pela associação de 5 µL

do sobrenadante obtido como descrito acima, diluídos em 985 µL de

tampão fosfato de potássio 0,1 M pH 7,0 contendo EDTA 2 mM e DTT 1

mM, e 10 µL do peptídeo sintético benziloxicarbonil-L-arginil-L-arginil-p-

nitroanilina (Z-Arg-Arg-pNA) 4 mM, que foi usado como substrato

(Bruchhaus et al., 1996). A densidade óptica foi determinada a 405 nm e a

atividade específica (moles do produto formado/min/mg proteína)

calculada através da variação da densidade óptica, considerando-se o

coeficiente de extinção como sendo 8,8 M

-1

4.6. Microarray

4.6.1. Produção das lâminas

Neste trabalho foram identificados e comparados 36 genes de cisteil

proteinases descritos no site “The Institute for Genomic Research-TIGR”

(Tabela 1- Anexos). Os oligonucleotídeos de 60 bases foram desenhados e

sintetizados pela companhia Eurogentec (Alemanha). Cada

oligonucleotídeo foi impresso em quadruplicatas nas lâminas de vidro

(Advalytix Epoxy AD100) a partir de soluções nos quais encontravam-se

numa concentração de 50 µM. As lâminas do microarray foram preparadas

na Universidade de Marburg, Alemanha (Genomic Solutions Omnigrid).

4.6.2. Extração do RNA

A extração de RNA total foi realizada utilizando-se sistema Trizol

(Life Technologies), seguindo as instruções do fabricante. Após o cultivo

por 72 horas, os trofozoítos foram ajustados a uma proporção de 1 x 10

trofozoítos/mL em meio de cultura. Após centrifugação a 1.200xg, o

sobrenadante foi descartado, o sedimento colocado em banho de gelo por

10 minutos e em seguida lavado 2 vezes com PBS (com centrifugação a

1200xg por 5 minutos) com descarte do sobrenadante. O sedimento foi

então ressuspendido em 1 mL de Trizol e incubado por 5 minutos à

temperatura ambiente. Após a lise das células, o RNA foi extraído com 200

µL de clorofórmio e centrifugado a 10000xg por 15 minutos a 4º C. A fase

aquosa foi então coletada e adicionada a 500 µL de isopropanol, para

precipitação do RNA que foi separado por centrifugação a 12.000xg por 10

minutos. O sobrenadante foi descartado e o sedimento lavado com etanol

70% e centrifugado a 7.500xg. O sobrenadante foi novamente descartado e

o sedimento incubado à temperatura ambiente para evaporação de todo

etanol. O sedimento foi então ressuspenso em água tratada com

dietilpirocarbonato (água DEPC) e incubado a 55º C por 15 minutos para

inativação de RNAses. Após quantificação, o RNA foi submetido à

eletroforese em gel de agarose.

4.6.3. Separação das amostras para microarray

Foram preparados 5 µg do RNA total de cada uma das cepas, estas

foram analisadas comparativamente de duas a duas, formando quatro

grupos, como mostrado no quadro 2 abaixo:

Quadro 2

Distribuição das cepas de E. histolytica quanto a sua coloração (Cye3 e

Cye5) nas lâminas de microarray.

Cada grupo continha duas cepas e estas foram analisadas em duas

lâminas, sendo que para uma das cepas o cDNA foi sintetizado com dUTP

marcado com a fluorescência cyanine-5 (Cye5) e para a outra cepa com

cyanine-3 (Cye3) enquanto na outra lâmina os cDNAs foram sintetizados

com os marcadores invertidos. A análise foi feita por etapas e todas as

cepas foram comparadas com a HM1-USA, utilizada como controle.

4.6.4. Síntese de cDNA

A síntese do cDNA foi realizada utilizando-se o kit Atlas Superscript

Fluorescent Labeling (TakaRa). Foram utilizadas duas réplicas biológicas

incluindo experimentos de troca das colorações (dye swap). Para cada

amostra, foram utilizados 5 µg de RNA que foram homogeneizados em 10

µL de água deionizada e 0,4 µL de random hexamer (5 µg/µL de pd(N

Pharmacia). A solução foi incubada por 5 minutos a 70ºC e depois a 42°C

por 3 minutos para equilíbrio da reação. Nesta fase foram adicionados, a

cada tubo, uma mistura contendo 4 µL de tampão de síntese de cDNA 5x,

2 µL do mix de dNTP 10 mM, 2 µL de DTT, 1 µL de água deionizada e 1 µL

da enzima Powerscript RT 5 U/µL, para cada amostra. Essa mistura foi

incubada por 60 minutos a 42°C para que ocorresse a síntese do cDNA,

depois a 70°C por 5 minutos para inativação da transcriptase e,

posteriormente a mistura foi incubada por 45 minutos a 37°C para o

tratamento com 0,2 µL de Rnase H (10 U/µL). Após essa etapa foram

adicionados 0,5 µL de EDTA (0,5 M pH 8) para inibição da RNAse H e 2 µL

de QuickClean resin, utilizada para limpeza dos sais da reação, que,

posteriormente, por centrifugação, foram depositados no “spin filter” 0,22

µm. O filtro foi então descartado e ao sedimento foram adicionados 2,2 µL

de acetato de sódio 3M. Após homogeneização foram acrescentados 55 µL

de etanol 100% gelado (-20° C). A amostra foi então incubada a –20° C por

1 hora ou pernoite. Após esse tempo o tubo contendo a reação foi

centrifugado por 20 minutos a 13.000xg a 4°C, o sobrenadante foi

descartado e o sedimento ressuspenso em 200 µL de etanol 70%. Nova

centrifugação foi realizada por 10 minutos a 13600xg e o sobrenadante

novamente descartado. O tubo contendo o sedimento foi então colocado

em uma centrífuga a vácuo por alguns minutos e, após secagem, o

sedimento foi dissolvido em 10 µL de fluorescent labeling buffer e incubado

por 10 min a 70° C para reação de marcação com as moléculas

fluorescentes.

4.6.5. Reação de marcação (Cye – cDNA)

Durante a marcação reversa, empregou-se dNTP modificado,

responsável pela ligação à molécula fluorescente Cye3 e Cye5.

Posterormente foi feita a marcação do cDNA com as moléculas

fluorescentes empregando-se o kit Cye Mono-Reative Dye Pack PA25001

da Amersham Biosciences. Após incubação com o tampão Fluorescent

Labeling a solução foi dividida em dois tubos, um contendo o cDNA-Cye3 e

o outro contendo o cDNA-Cye5 e a cada tubo adicionou-se 10 µL da reação

de cyanine-DMSO que foi incubada por 1 hora ao abrigo da luz. Após esse

tempo foi acrescentado 2 µL de acetato de sódio 3 M e 50 µL de etanol

100% gelado. Em seguida, incubou-se por 2 horas a –20° C. Após esse

tempo a amostra foi centrifugada a 13.000xg a 4° C, o cDNA sedimentado

foi ressuspendido em 200 µL de etanol 70% e novamente centrifugado por

10 minutos. O sedimento foi ressuspendido em 100 µL de água deionizada

e colocado ao abrigo da luz. A amostra estava assim, marcada e pronta

para ser purificada.

4.6.6. Purificação dos Cye-cDNAs

Após a marcação, os Cye-cDNAs foram purificados utilizando-se o

kit QIAquick PCR Purification (Qiagen). A purificação se iniciou com a

adição do tampão às amostras que posteriormente foram depositadas na

coluna QIAquick e centrifugadas. O líquido foi então descartado ficando

somente o filtro, que foi lavado três vezes com 600 µL do tampão para

eliminação de todo o etanol da etapa anterior. Posteriormente, o filtro foi

lavado mais duas vezes com 50 µL de água deionizada a 70°C, incubado ao

abrigo da luz e centrifugado.

4.6.7. Pré-hibridização e hibridização

As amostras foram concentradas em filtros para centrífuga Microcon

YM-30 (milipore) por 10 minutos a 14000xg num volume final de 20 µL.

Ambas amostras foram misturadas (Cye3 e Cye5),adicionadas a 40 µL do

tampão pré-hibridização (5X SSC, 0,1 mg/mL DNA de esperma de salmão,

30% formamida, 0,1% SDS) e desnaturadas a 95ºC por 5 minutos. As

lâminas foram lavadas com tampão de pré-hibridização (5X SSC, 0,1 %

BSA, 0,1% SDS), água e isopropanol. A hibridização foi realizada pernoite

a 42ºC. Após a hibridização, a lavagem e a secagem das lâminas, foi

realizada a leitura das mesmas.

4.6.8. Análise dos resultados do microarray

A análise foi feita utilizando o scanner ScanArray Gx (Perkin Elmer),

equipado com dois tubos laser, que permitem a leitura simultânea nos

comprimentos de onda 550 e 650 nm, referentes às fluorescências Cye3 e

Cye5, respectivamente. Na análise foi utilizado o programa ScanArray,

versão 3.0, da Perkin Elmer. A análise da expressão gênica envolveu 4

lâminas, incorporando 2 réplicas biológicas e dye swaps de cada uma das

amostras.

Os dados foram inspecionados em busca de viéses espaciais nos

canais verdes e vermelhos (background e sinal) e viés intensidade-

dependente usando o pacote do ScanArray. Para o cálculo, a média da

intensidade dos sinais (pixel) menos background local (pixel) de cada

“spot” foi utilizado. “Spots” com baixa intensidade foram eliminados. Para

a normalização dos dados foram utilizados dois métodos: Normalização

pelos genes totais e normalização pelos genes “housekeeping”. No primeiro

método a intensidade do sinal de cada spot da amostra experimental , bem

como de cada controle foi totalizado. A soma da amostra experimental

sobre a soma do controle dá o fator de normalização. Para a normalização

dos genes housekeepings, o cálculo foi feito da mesma forma, tendo como

base a intensidade dos spots dos genes housekeping como controle. Os

spots com intensidade (pixels) ≤300 foram excluídos da análise dos dados.

Os genes com a razão maior que 2 e menor que 0,5 foram considerados

como diferencialmente expressos.

4.7 PCR Tempo Real

Para validar os resultados do experimento de microarray, os genes

que apresentaram diferença de expressão foram analisados também pela

técnica de PCR em Tempo Real. A actina foi utilizada como controle

interno e normalização.

A expressão dos genes foi comparada de acordo com o seguinte

protocolo: Os cDNAs de cada uma das cepas analisadas foram

amplificados utilizando o kit SYBR GREEN PCR core Reagents da PE

Biosystems (Warrington, UK), mantendo-se as concentrações usuais de

reagente num volume final de reação de 15 µL. Resumidamente, a reação

consiste de: 6,65 µL de água para PCR (SF); 1,5 µL de tampão (10x SYBR

Green PCR); 1,2 µL da mistura de dNTP (200 µM cada); 1,5 µL de MgCl

(25

mM); 3 µL da mistura de iniciadores CP1 (1,5 pmol de CPf e 1,5 pmol CPr)

ou 3 µL de da mistura de iniciadores BAC (senso e antisenso - 1,5 pmol

cada); 0,15 µL (5 U/µL) de enzima AmpliTaq Gold

e 1 µL de cDNA de

cada uma das cepas. Os controles negativos foram feitos substituindo-se

as amostras pelo mesmo volume de água na reação. A reação em tempo

real foi realizada no aparelho ABI Prism 7000 SDS no seguinte ciclo termal:

[estágio 1] um ciclo de 52°C/2 min.; [estágio 2] um ciclo a 95°C/10 min.;

[estágio 3] 40 ciclos de 95°C/0,15 min. e 1 minuto na temperatura de

anelamento dos iniciadores do gene analisado. Para confirmação do

tamanho dos fragmentos amplificados por PCR em Tempo Real foi

realizada uma curva de dissociação como parte do programa estabelecido

no ABI Prism 7000 SDS e os fragmentos amplificados também foram

visualizados através de eletroforese em gel de poliacrilamida corado com

nitrato de prata. Os iniciadores utilizados nesta reação estão listados na

tabela 2 de Anexos.

4.8. Supressão por hibridização subtrativa

A técnica de subtração por hibridização e supressão ou SSH

(“Suppression Subtractive Hybridization”), que tem como fundamento a

amplificação seletiva de genes diferencialmente expressos, foi utilizada

como ferramenta para comparação de duas cepas de E. histolytica. Um

esquema mostrando como funciona o processo de subtração é apresentado

no item 4.8.4. As cepas escolhidas foram a EGG e a 452, por apresentarem

maior e menor virulência, respectivamente, através de métodos

anteriormente descritos. O procedimento foi realizado de acordo com as

instruções presentes no manual do “kit” Clontech PCR-Select cDNA

Subtraction.

4.8.1. Obtenção do RNA

A extração de RNA foi realizada utilizando-se sistema Trizol (Life

Technologies, EUA), seguindo as instruções do fabricante e semelhante ao

descrito no item 4.6.2. As amostras de RNA foram submetidas à ação da

enzima Dnase I, para degradação de possíveis traços de DNA.

4.8.2. Síntese e digestão de cDNA

Os cDNAs foram sintetizados a partir de 2 µg de RNA extraídos dos

dois tipos de células utilizando-se o Kit PCR-select cDNA subtraction

(CLONTECH



), de acordo com as instruções do fabricante. Para a síntese

dos cDNAs utilizou-se o iniciador de síntese de cDNA (2 µM) e a

transcriptase reversa AMV (4 unidades). A síntese da segunda fita foi

realizada com a T4 DNA polimerase (6 unidades) de acordo com as

instruções do fabricante. O sedimento resultante da produção dos cDNAs

foi ressuspendido em 50 µL de água deionizada estéril e digeridos com a

enzima de restrição RsaI (0,3 unidades) por 1,5 h a 37

C, em tampão RSA I

(bis-tris propano-HCl 100 mM pH 7,0 contendo MgCl

100 mM e dititreitol

1 mM). A digestão dos cDNAs gerou fragmentos de até 600 pares de bases

(pb) com extremidades cegas. Embora este procedimento não seja ideal

para a obtenção de cDNAs “full-length” específicos, a clivagem destas

populações de cDNA em fragmentos menores oferece duas vantagens

importantes: primeiro, fragmentos longos poderiam formar extensos

emaranhados que dificultariam a formação de híbridos em etapas

posteriores da técnica SSH; segundo, a divisão de uma população de cDNA

em fragmentos menores poderia proporcionar que genes distintos

(derivados de uma mesma família de genes) fossem selecionados, uma vez

que possíveis hibridizações cruzadas devido a um elevado grau de

homologia interna poderiam eliminá-los do processo final de subtração

(DIATCHENKO et al., 1999). Em seguida os cDNAs resultantes das duas

reações de síntese foram submetidos a purificação pelo método fenol-

clorofórmio-alcool isoamílico (24:24:1) precipitados com etanol 95% e,

finalmente, dissolvidos em água deionizada estéril.

Foram realizados tanto a subtração direta como a reversa, em que se

obteve seqüências diferencialmente expressas nas amostras EGG e 452,

respectivamente. Dessa forma, na subtração direta o cDNA da amostra

EGG foi utilizado como cDNA “tester” (cDNA de interesse, para o qual se

procura selecionar genes específicos) e o cDNA da amostra 452 como cDNA

“driver” (utilizado como cDNA comparativo para subtrair seqüências

homólogas e se obter portanto, as seqüências específicas do cDNA

“tester”). Já na subtração reversa, o cDNA utilizado como “tester” foi da

amostra 452 e o cDNA considerado como ”driver”, o da EGG. Como

controle, uma outra subtração foi feita utilizando-se uma mistura de

cDNAs de músculo esquelético com DNA φX174/Hae III, fornecido pelo kit.

4.8.3. Ligação de adaptadores aos cDNAs

Para realização desta etapa, foi utilizado apenas o produto da

digestão com a enzima RsaI obtido anteriormente. Um microlitro do

produto final da digestão do cDNA de cada uma das amostras EGG e 452

foram diluídos separadamente em 5 µL de água deionizada estéril. Na

subtração direta, 2 µL do cDNA “tester” (amostra EGG), foram utilizados

para ligação, separadamente, aos adaptadores 1 e 2R (figura 2). Para esta

reação adicionou-se 2 µL de tampão de ligação 5X (tris-HCl 250 mM pH

7,8 contendo MgCl

50 mM, ditiotreitol 10 mM e albumina de soro bovino

(BSA) a 0,25 mg/mL) em volume final de 10 µL, seguindo-se um período de

incubação de cerca de 16 horas a 16

C utilizando-se a enzima T4 DNA

ligase (40 unidades). Esta etapa produz duas sub-populações de cDNAs

ligadas a um adaptador diferente.

Figura 2. Seqüências dos adaptadores e iniciadores utilizados na realização da

técnica SSH. Quando os adaptadores são ligados aos cDNAs digeridos pela

enzima de restrição Rsa I, o sítio de ligação a esta enzima é restaurado (Kit PCR

Select cDNA Subtraction – CLONTECH)

Após a ligação, a enzima DNA ligase foi inativada por aquecimento a

C durante 5 minutos na presença de EDTA 0,2 M e glicogênio (1

mg/mL). As extremidades destes adaptadores não possuem grupamento

fosfato, sendo que apenas uma fita de cada adaptador se liga a uma fita na

extremidade 5’ do cDNA. Os dois adaptadores (1 e 2R) possuem regiões

idênticas ao iniciador P1 (adaptador 1 da figura) e aos iniciadores internos

1 e 2R (nested). Isso permite a criação de sítios de anelamento para esses

iniciadores após o preenchimento das extremidades de cada adaptador

pela DNA polimerase. Nenhum tipo de adaptador é ligado à população de

cDNA da amostra 452 (cDNA “driver”). Para a realização do processo de

subtração reverso, o cDNA da amostra 452 digerido com a enzima Rsa I

foi igualmente separado em duas sub-populações e ligado aos adaptadores

de maneira análoga ao descrito acima. Um microlitro de cada sub-

população de cDNA da amostra EGG e 452 ligados aos adaptadores 1 e 2R

foram diluídos em 1 mL de água estéril deionizada e estocados a -20

Estes cDNAs não foram submetidos ao processo de subtração, sendo

posteriormente utilizados como molde em reações de PCR.

No processo de subtração controle, foram utilizados cDNA de

músculo esquelético e DNA φX174/Hae III. Cinco microlitros do DNA

φX174/Hae III (1,5 ng/µL) foram misturados com 1 µL de cDNA de

músculo esquelético (1 µg/µL), obtendo-se o controle a ser utilizado na

subtração. Seguindo um procedimento análogo ao descrito anteriormente,

2 µL do controle foram adicionados em dois tubos, colocando-se, em

seguida, o adaptador 1 no primeiro tubo e o adaptador 2R no segundo

tubo. Em seguida, foram adicionados 2 µL de tampão de ligação 5X e 40 U

de T4 DNA ligase para um volume final de 10 µL em cada tubo. Após

homogeneização, 2 µL do conteúdo de cada tubo foram misturados em um

terceiro tubo denominado de controle não subtraído. Os tubos foram

centrifugados brevemente e incubados a 16°C durante a noite. A reação foi

interrompida adicionando-se em cada tubo 1 µL de solução de

glicogênio/EDTA (0,2 M) e aquecimento a 72 °C durante 5 minutos para

inativação da T4 DNA ligase.

4.8.4. Hibridizações

Todo o processo de hibridização foi realizado segundo as instruções

descritas no Kit PCR-select cDNA subtraction (Clontech



). Na subtração

direta, durante a primeira hibridização, 1,5 µL do cDNA “driver” (amostra

452) foram adicionados a cada um dos dois tubos contendo 1,5 µL do

cDNA “tester” (amostra EGG) ligados aos adaptadores 1 e 2R. Após adição

de 1 µL do tampão de hibridização 4X, as soluções foram cobertas por uma

gota de óleo mineral, com posterior desnaturação por 1,5 minutos a 98

permitindo-se o re-anelamento por 10 horas a 68ºC. Nesse processo, um

excesso de cDNA “driver” foi adicionado a cada uma das duas populações

de cDNA “tester”. O re-anelamento lento permitiu a produção de 4 tipos de

moléculas (a, b, c e d) em cada amostra (Figura 3). Nesta etapa, o re-

anelamento é mais lento para cDNAs diferencialmente expressos de rara

abundância (tipo a), quando comparado com os transcritos mais

abundantes representados pelo tipo b. Moléculas comuns entre cDNAs das

populações de interesse e de referência são representados pelas moléculas

de tipo c. As moléculas tipo d são moléculas do cDNA “driver” que

hibridizaram com elas mesmas.

Figura 3. Esquema da técnica SSH. As linhas sólidas representam os cDNAs de

interesse ou de referência. As caixas pretas nas extremidades representam a

parte externa dos adaptadores 1 e 2R, que contém seqüência idêntica à do

iniciador 1. A caixa em branco corresponde à parte interna do adaptador 1,

idêntica a seqüência do iniciador interno 1. A caixa em cinza corresponde à parte

interna do adaptador 2R, idêntica a seqüência do iniciador interno 2R. (Kit PCR

Select cDNA Subtraction – CLONTECH)

Após a primeira hibridização, as duas amostras resultantes foram

misturadas sem sofrer desnaturação e 1 µL de cDNA da amostra 452,

previamente desnaturado, foi adicionado juntamente com 1 µL de tampão

de hibridização. As amostras foram novamente hibridizadas durante 10

horas a 68ºC. O produto final dessa hibridização foi diluído em 200 µL de

tampão de diluição (HEPES-HCl 20 mM pH 8,3 contendo NaCl 50 mM e

EDTA 0,2 mM), aquecido a 68ºC por 7 minutos e estocado a -20ºC. Após

esta etapa, são produzidos os mesmos tipos de moléculas formados na

primeira hibridização, entretanto apenas as moléculas de cDNA de

interesse, representados pelas moléculas tipo a, podem se reassociar,

dando origem a um novo tipo de híbrido (molécula tipo e), o qual possui os

dois tipos de adaptadores localizados em suas extremidades. Após o

preenchimento das extremidades de todas as moléculas pela DNA

polimerase, somente as moléculas tipo e apresentam os sítios de

anelamento para os iniciadores internos 1 e 2R em suas extremidades

(Diatchenko et al., 1999).

4.8.5. Amplificações por PCR

Após as reações de hibridizações, as populações de cDNAs (cDNA da

amostra EGG e cDNA da amostra 452) obtidas antes e após o processo de

subtração foram utilizadas em reações de PCR. Nessa etapa, somente as

seqüências com diferentes adaptadores (moléculas tipo e) e

diferencialmente expressas, são amplificadas exponencialmente. Para isto,

1µL dos cDNAs obtidos foram adicionados separadamente a 24µL de uma

mistura para PCR contendo 0,4 µM do iniciador 1, 0,2 mM de cada dNTP e

0,5 µL da enzima Advantage cDNA polimerase Mix 50X (CLONTECH)

contendo tris-HCl 40 mM (pH 7,5), KCl 50 mM, (NH

)SO

25 mM, EDTA 0,1

mM, thesit 0,25% (v/v), glicerol 50% (v/v), Klentaq-1 DNA polimerase e

anticorpo TaqStart a 1,1 µg/µL e ainda 2,5 µL de tampão de PCR 10X

(tricina-KOH 400 mM pH 9,2, acetato de potássio 150 mM, acetato de

magnésio 35 mM e BSA a 37,5µg/mL) fornecidos pelo Kit PCR-select cDNA

subtraction (CLONTECH



). A reação se processou de acordo com os

seguintes passos: ciclo inicial a 75 ºC durante 5 minutos para extensão da

fita complementar dos adaptadores 1 e 2R, seguindo-se 27 ciclos de

desnaturação a 94ºC durante 30 segundos; anelamento a 66 ºC durante

30 segundos e extensão a 72ºC durante 1,5 minutos. Um ciclo adicional de

extensão foi realizado a 68

C durante 7 minutos. Posteriormente 3 µL dos

produtos da PCR foram diluídos em 27 µL de água deionizada estéril e

estocados a -20

Um microlitro dos produtos da primeira reação de PCR foi utilizado

como molde para uma segunda reação de PCR, que foram adicionados

separadamente a 24µL de uma mistura para PCR contendo 0,4 µM dos

iniciadores internos 1 e 2R, 0,2 mM de cada dNTP e 0,5 µL da enzima

Advantage cDNA polimerase Mix 50X (CLONTECH) contendo tris-HCl 40

mM (pH 7,5), KCl 50 mM, (NH

)SO

25 mM, EDTA 0,1 mM, thesit 0,25%

(v/v), glicerol 50% (v/v), Klentaq-1 DNA polimerase e anticorpo TaqStart a

1,1 µg/µL e ainda 2,5 µL de tampão de PCR 10X (tricina-KOH 400 mM pH

9,2, acetato de potássio 150 mM, acetato de magnésio 35 mM e BSA a

37,5µg/mL) fornecidos pelo Kit PCR-select cDNA subtraction

(CLONTECH



), seguindo-se

10 ciclos de desnaturação a 94

C durante 30 segundos; anelamento

a 68

C durante 30 segundos e extensão a 72

C durante 1,5 minutos.

Cinco microlitros dos produtos de PCR obtidos foram analisados em gel de

poliacrilamida 5%, posteriormente corado por nitrato de prata.

Durante essas reações, as moléculas do tipo a e d não são

amplificadas, pois não apresentam sítios de anelamento dos iniciadores.

As moléculas tipo b possuem extremidades com seqüências invertidas e

homólogas que induzem a formação de uma estrutura em grampo, que não

permite a amplificação por PCR. As moléculas tipo c apresentam apenas

um sítio de ligação dos iniciadores e por isso são amplificadas linearmente.

Somente as moléculas do tipo e possuem os dois sítios de anelamento dos

iniciadores, podendo ser amplificadas de forma exponencial (figura 3).

4.9. Clonagem dos cDNAs

4.9.1. Seleção e purificação dos cDNAs diferencialmente expressos

As amostras subtraídas foram aplicadas em gel de agarose “low

melt” 0,8%. Após coloração com brometo de etídeo (0,1 µg/mL) e

visualização em transluminador de luz ultravioleta, cada banda foi cortada

e purificada utilizando o Kit Wizard® SV gel and PCR clean-Up System

(Promega), de acordo com instruções do fabricante. Após a purificação as

amostras foram estocadas a 4ºC.

4.9.2. Reação de ligação

Aproximadamente 4 µL dos produtos obtidos na purificação foram

adicionados a 1 µL do vetor pGEM-T Easy Vector (Promega), 1 µL de T4

DNA ligase e 1 µL tampão de T4 DNA ligase (Tris-HCl 30 mM pH 7,8,

contendo MgCl

10 mM, ditiotreitol 10 mM e ATP 0,5 mM). O volume foi

ajustado para 10 µL com água e a mistura foi incubada a 4

C por 16

horas.

4.9.3. Transformação e plaqueamento das bactérias

Os produtos da reação de ligação foram utilizados para

transformação de bactérias competentes, Escherichia coli linhagem DH5-α

(Invitrogen), de acordo com o método já estabelecido (Hanahan et al.,

1991). Estes produtos foram incubados com aproximadamente 100 µL de

bactérias competentes em gelo, por 30 minutos, e em seguida submetidos

a um choque térmico a 42

C por 30 segundos. As bactérias foram

novamente incubadas em gelo por 2 minutos e a seguir foram

acrescentados ao incubado 450 µL de meio LB (triptona 10 g/L, extrato de

levedura 5,0 g/L, NaCl 5,0 g/L e pH ajustado para 7,4). Esta mistura foi

incubada a 37

C por aproximadamente 1 hora em termomixer (Eppendorf,

Alemanha) com agitação.

Foram plaqueados 150 µL da suspensão de bactérias em placas de

Petri contendo ágar a 1,5%, ampicilina 100 µg/mL, isopropil-beta-D-

galactopiranisideo (IPTG, 200µg/mL) e 5-bromo-4-cloro-3-indolyl-beta-D-

galactosídeo (Xgal, 65µg/mL) em meio LB com posterior incubação a 37°C

durante 16 horas.

4.9.4. Amplificação dos insertos e isolamento do DNA

Dez colônias brancas foram selecionadas e pinçadas das placas com

auxilio de palitos de madeira esterilizados, e submetidas diretamente a

reações de PCR para confirmação da presença do inserto. Para tal,

utilizou-se os iniciadores 1 e 2R que se anelam aos adaptadores ligados às

extremidades das seqüências diferencialmente expressas. As reações de

PCR se processaram na presença de tampão (Tris-HCl 10 mM pH 9,0,

MgCl

1,5 mM, 0,2 mM de dNTPs, Triton X-100 0,1%), 0,1 U de Taq

polimerase (Promega) e água Milli-Q para um volume final de 10 µL. A

mistura foi submetida a 25 ciclos compostos dos seguintes passos:

desnaturação a 94°C durante 45 segundos, anelamento a 68°C durante 45

segundos e extensão a 72°C durante 1,5 minutos.

Para os clones que apresentaram insertos foi feito o isolamento do

DNA plasmidial utilizando-se o Kit Wizard



Plus SV Minipreps (DNA

Purification System - Promega), a partir de culturas bacterianas crescidas

em 4 mL de meio LB contendo ampicilina 100 µg/mL e incubadas a 37

por 16 horas. A confirmação do isolamento do plasmídeo e da presença do

inserto foi realizada a partir de reações de digestão utilizando a

endonuclease de restrição Eco R1 (5 U), seguindo instruções do fabricante

(Promega). A figura 4 mostra um desenho esquemático do plasmídeo

pGEM-T (3015 pb) utilizado como vetor nos experimentos de clonagem. O

sítio de ligação do inserto no vetor e o ponto de corte de endonuleases de

restrição estão evidenciados nesta figura.

Figura 4- Mapa circular do vetor pGEM-T easy e pontos de referencia na

seqüência (PROMEGA).

4.10. Sequenciamento

As reações de sequenciamento foram realizadas segundo método

descrito originalmente por Sanger e colaboradores (1977), utilizando-se o

DYEnamic

ET dye terminator kit MegaBACE

(Amershan Biosciences,

EUA). Em tubos de 0,5 mL, em volume final de 10 µL, foram adicionados

os iniciadores a 0,5 µM, direto (5’ CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC 3’) e

reverso (5’ TCACACAGGAAACAGCTATGAC 3’), 200 ng de DNA plasmidial,

4 µL de Etkit (premix para sequenciamento) e água ultrapura suficiente

para completar o volume. As reações foram realizadas em termociclador

(Mastercycler - Eppendorf) com 30 ciclos a 95

C por 20 segundos, 50

por 15 segundos e 60

C por 1 minuto. Posteriormente, os nucleotídeos

não incorporados foram precipitados pela adição de 1 µL de acetato de

amônio (7,5 M) e 25 µL de etanol 95% (Merck). Após incubação a 25

C por

15 minutos, seguido de centrifugação a 4000xg por 45 minutos a 25

C, o

sobrenadante foi descartado e 150 µL de etanol 70% (Merck) adicionado ao

sedimento, que foi agitado para ressuspensão, seguido de uma

centrifugação a 4000xg por 15 minutos a 25

C. O sedimento foi

ressuspendido por agitação em vórtex com 10 µL do tampão de

ressuspensão contendo 70% de formamida e EDTA 1 mM. Os produtos do

sequenciamento foram submetidos à leitura no sequenciador automático

capilar Mega BACE 1000

sequencing system com uma injeção de 2 kv

por 100 segundos e corrida de 6 kv por 230 segundos.(Sanger et al., 1977)

4.10.1. Análise das seqüências em bancos de dados

As seqüências foram obtidas em forma de cromatograma e a edição

das ambigüidades foi realizada de acordo com os resultados do

sequenciamento da fita complementar de cada cDNA.

As seqüências parciais de cDNA assim obtidas foram submetidas a

análise de homologia utilizando-se principalmente o servidor BLAST 2.0

(“Basic Local alignement Search Tool”) (Altschul et al., 1990) do “National

Center for Biotechnology Information” (NCBI) da biblioteca Nacional de

Medicina do NIH (“National Institute of Health”), Maryland, EUA. Foi

verificado a existência de seqüências homólogas de DNA (BLASTN) ou

homologias entre a possível seqüência de aminoácidos codificada pelos

cDNAs das amostras de E. histolytica (EGG e 452) e as seqüências de

proteínas depositadas nos bancos de dados (BLASTP). As mesmas

seqüências foram analisadas também com relação ao banco de dados

disponível referente à E. histolytica do softer Omniblast do Instituto

Sanger. A tradução dos cDNAs e a identificação e possíveis domínios foram

realizadas utilizando-se o servidor Scanprosite (http://ca.expasy.org).

4.11. RT-PCR

Para obter a confirmação de que os cDNAs subtraídos pela técnica

SSH estão realmente presentes em apenas uma das amostras analisadas,

foi utilizada a técnica de RT-PCR. Nesse procedimento, foi feita a extração

de RNA total das amostras EGG e 452, empregando-se o reagente Trizol

(Invitrogen) seguindo-se as instruções do fabricante. Alíquotas contendo de

1,0 a 3,0 µg de RNA total das amostras EGG e 452 foram utilizadas como

molde para a produção de cDNA utilizando-se o sistema da Amersham de

transcrição reversa (RT).

O RNA total foi então incubado em um volume final de 20 µL da

reação constituída de tampão de primeira fita (tris-HCl 50 mM pH 8,3

contendo KCl 75 mM, MgCl

3mM), 10 µM de DTT, 2,5 U de ramdon

hexamer, 2 U de inibidor de RNase, 0,5 mM dNTPs, 10 U da enzima M-

MULV e água-DEPC para completar o volume. A mistura foi submetida à

temperatura de 20 °C por 10 minutos, 42 °C por 45 minutos, 95 °C por 5

minutos. Em seguida, foi realizada a PCR utilizando 3 µL do produto de

RT, iniciadores específicos (10 µM) construídos a partir da seqüência das

proteínas em que os fragmentos subtraídos encontraram homologia

(Anexo- Tabela 3), tampão (tris-HCl 10 mM pH 9,0 contendo MgCl

1,5

mM, 0,2 mM de dNTPs, triton X-100 0,1%), 0,1 U de Taq DNA polimerase

(Promega) e água Milli-Q para um volume final de 10 µL. A mistura foi

submetida a 30 ciclos de 95 ºC por 45 segundos, 72 ºC por 90 segundos e

1 minuto com a temperatura de anelamento adequada para cada iniciador.

Utilizou-se como controle da reação 1µL de cada iniciador do gene

constitutivo da actina.

Os produtos da amplificação obtidos na PCR foram submetidos à

eletroforese em gel de poliacrilamida a 5% e corado pela prata.

5. RESULTADOS

5.1 Inoculação em fígado de hamster

Para caracterização da virulência das cepas estudadas foi avaliada

sua capacidade de produzir lesões em fígado de hamster. A tabela a seguir

apresenta o resultado da inoculação das diferentes cepas de E. histolytica

nestes animais.

Tabela 1

Desenvolvimento da lesão no fígado de hamster (Mesocricetus auratus)

inoculados com trofozoítos de E. histolytica mantidas em cultivo axênico*.

CD= colite disentérica, *Inoculo de 1,0 x 10

trofozoítos, **Diamond et al.

(1974)

Das seis cepas analisadas apenas as cepas 452 e 32 não produziram

lesão (grau 0), o restante das cepas apresentou virulência variada. As

lesões causadas pelas cepas HM1, EGG e DRP apresentaram graus de

virulência de I a IV, com aspecto amarelado e áreas de destruição do

parênquima substituídas por necrose. Na maioria dos casos as lesões eram

múltiplas, acometendo somente o lobo inoculado (figura 5).

Figura 5 – Fígados de hamster inoculados com trofozoítos das cepas 452, EGG e

DRP de E. histolytica e os respectivos graus de lesão observados 0, III e IV.

Além da observação macroscópica, foram retirados fragmentos dos

fígados lesados, para verificar a presença de trofozoítos. Estes fragmentos

foram macerados com PBS e observados ao microscópio ótico, sendo a

presença de trofozoítos detectada em todos os exames, com exceção para

as cepas 452 e 32.

5.2. Efeito citopático

Caracterizamos as cepas quanto ao efeito citopático pela incubação

dos trofozoítos de E. histolytica com células do ovário de hamster chinês

(CHO).

No gráfico da figura 6 estão representadas as médias da

percentagem de monocamadas de células CHO após incubação com os

trofozoítos de cada uma das cepas de E. histolytica. As cepas HM1, EGG e

DRP apresentaram índice de destruição de células CHO igual a 60%,

significativamente maior (p<0,05) que as cepas 452 e 32, que foi de 22%

(Figura 6). Estes resultados estão em concordância com a forma clínica

dos pacientes dos quais foram obtidas as cepas. Concordância também foi

observada nos ensaios in vivo, onde a cepa EGG isolada de paciente

sintomático com abscesso hepático apresentou maior destruição das

monocamadas e a 452, isolada de assintomático, o menor índice de

destruição.

100

PBS 452 32 HM1 DRP EGG

Figura 6. Percentagem de monocamadas de células CHO após incubação com

trofozoítos de E. histolytica. A análise estatística foi realizada através do teste não

paramétrico ANOVA ONEWAY, com o nível de significância de 5% (p<0,05).

5.3. Atividade cisteil proteinase

Os níveis de atividade cisteil proteinase encontrados na diferentes

cepas estão mostrados na tabela 2.

Tabela 2

Atividade específica de cisteil proteinase (mU/mg) nas diferentes cepas

analisadas.

As cepas não apresentaram diferença significativa nos níveis de

atividade cisteil proteinase, mostrando que não há correlação entre

atividade desta família de enzimas e a virulência da cepa. Esse resultado

mostra que a atividade de cisteil proteinase total é grande em cepas de E.

histolytica; agora resta ver se as CPs que possivelmente estariam

relacionadas com a virulência (cp1, cp2, cp5, cp112) seriam encontradas

em maiores níveis nas cepas EGG, DRP e HM1.

5.4. Microarray

Os RNAs extraídos das cepas de E. histolytica foram avaliados e

quantificados usando espectrofotômetro para que pudéssemos certificar

que os RNAs eram de qualidade e em quantidade suficiente. Para averiguar

se houve degradação das amostras, também corremos as amostras em gel

de agarose desnaturante. O resultado do gel mostrou para todas as

amostras uma banda única sem presença de perfil típico de degradação

(foto não incluída). O RNA marcado foi então hibridizado nas lâminas de

microarrays, as imagens adquiridas inspecionadas e os spots com

qualidade ruins excluídos. Os dados foram extraídos das imagens

utilizando o software ScanArray, versão 3.0, da Perkin Elmer. Os

resultados de cada uma das lâminas foram então inspecionados para

procurar presença de viés espacial, viés de intensidade ou backgrounds

excessivamente altos antes e depois da normalização. Como se pode

observar na figura 7, a distribuição empírica analisada (smoothed

empirical densities) para os canais verde e vermelho em todos os arrays é

consideravelmente diferente antes da normalização e tornam-se

praticamente iguais após esta, demonstrando a eficácia deste

procedimento.

Figura 7– Os gráficos mostram uma distribuição empírica atenuada (smoothed

empirical densities) para os canais verde e vermelho em todos os arrays, estes são

consideravelmente diferentes antes da normalização e tornam-se praticamente

iguais após a mesma.

Os resultados da análise estatística foram resumidos na tabela 3,

mostrando os valores da razão da intensidade normalizados. Esses

resultados mostram o único gene de CP diferencialmente expresso

encontrado nesse estudo, o gene cp1. Este apresentou uma intensidade de

sinal maior na cepa HM1 que na cepa EGG, apresentando log da diferença

(fold change) entre as cepas, duas vezes maior na cepa HM1 que na cepa

EGG, mostrando uma maior expressão na cepa HM1 quando comparada

com a cepa EGG. O transcrito é estatisticamente diferente, apresentando

p<0.001.

Outros genes como cp4 e cp6 apresentaram uma probabilidade alta

de serem diferencialmente expressos entre as cepas DRP e HM1, mas como

os resultados foram muito variáveis e não apresentaram diferença maior

que dois não foram estatisticamente diferentes.

Tabela 3

Gene diferencialmente expresso nas cepas de E. histolytica EGG em

comparação com a cepa HM1

Acesso ao

gene

Nome do

gene

Intensidade do sinal

HM1 / cepa de interesse

(pixel)

Fold change p-value

Expressão de HM1 / EGG

XM_645064 Cp1

7.300 → 3.700 2.0 x decrease(↓)

0.0006

Os genes que codificam para cp1, cp2, cp3, cp5, cp11 e cp17 foram

expressos em todas as cepas analisadas, sendo que os genes que codificam

para cp1, cp2 e cp5 apresentaram os maiores níveis de expressão.

5.5. PCR em tempo real

Os resultados obtidos no microarray foram confirmados pelo PCR em

tempo real. A tabela 4 mostra o perfil de expressão dos mRNAs

diferencialmente expressas em E. histolytica, concordando com o resultado

obtido no microarray onde a cp1 apresentou-se duas vezes menos expressa

em EGG que HM1 e na cp5 não houve diferença de expressão. Além disso,

são apresentados na tabela 4 dois outros genes diferencialmente expressos

(sp9-2 e mp48) presentes nas lâminas de microarray, que apesar de não

terem sido analisados nesse trabalho, são apresentados para validação da

semelhança dos resultados entre as duas técnicas.

Tabela 4

Confirmação dos resultados por PCR em tempo real.

Acesso ao

gene

Nome do

Gene

Dados do PCR em tempo real

Expressão relativa (gene/actina)

HM1 EGG

actina 1 1

XM_ 645845

cp5 0,243 0,239

XM_645064 cp1 0,853 0,426

XM_650130 sp 9-2 0,035 0,098

HM1 DRP

XM_651374 mp48-1 0,020 0,104

Para o PCR em tempo real a análise foi feita com todos os primers

em duplicata. Duas replicas biológicas foram investigadas. A expressão da

actina foi normalizada como sendo 1. A expressão relativa dos vários genes

foi relacionada a expressão do gene da actina.

A quantificação relativa foi executada pelo software Rotor–Gene,

utilizando o método delta delta ct (Livak & Schmittgen, 2001) e a

normalização do RT-PCR foi feito com o gene da actina de E. histolytica. As

curvas de calibração demonstraram 100% de eficiência na PCR em tempo

real para todos os amplicons.

5.6. Supressão por hibridização subtrativa

5.6.1. Obtenção de populações de cDNAs específicos

Quatro populações de cDNAs foram produzidas pela técnica SSH

como descrito na seção 4.8. Estas populações correspondem aos cDNAs

das amostras de E. histolytica (cepas EGG e 452) obtidos antes e depois do

processo de subtração. Para confirmar a realização do processo de seleção,

essas populações de cDNAs foram analisadas em gel de agarose. A

diferença no padrão de bandas antes e depois do processo de subtração

indica que o processo foi bem sucedido (figura 8). Em um processo de

subtração bem sucedido, o padrão de bandas apresentado pelo DNA de

uma determinada célula ou tecido antes do processo de subtração deve ser

diferente daquele observado após a realização do mesmo. O perfil de

bandas obtido após a reação de subtração mostra que para a EGG foram

observadas, aproximadamente, seis seqüências (bandas) diferencialmente

expressas. Já para a 452 observou-se proximadamente cinco bandas. Os

DNAs destas bandas foram purificados conforme descrito na seção 4.9.1 e

estocados a 4ºC.

Figura 8 - Gel de agarose/EtBr a 0,8% em TBE 1X mostrando os produtos

digeridos com Rsa I, antes e depois do processo de subtração. No segundo quadro

são apresentados os produtos da segunda reação de PCR da técnica de SSH, para

as cepas EGG e 452. M, Marcador de massa molecular ϕ-X174 DNA/HaeIII.

Foram aplicados 10 µL do produto da PCR de cada amostra e 10 µL do marcador.

5.7. Clonagem

As seqüências subtraídas foram purificadas e clonadas conforme

descrito na seção 4.9.1 4.9.2 e 4.9.3. De cada seqüência clonada foram

selecionadas 10 colônias brancas para confirmação da presença do inserto

e posterior purificação do DNA plasmidial. A figura 9 mostra os produtos

da reação de PCR utilizando os iniciadores 1 e 2R a partir de algumas

colônias bacterianas obtidas no processo de clonagem.

Antes

Depois

Kpb

1.3

0,9

0,6

0,3

Figura 9- Gel de poliacrilamida 5% corado pela prata mostrando os resultados do

PCR das colônias de bactérias transformadas com fragmentos selecionados por

SSH da cepa EGG. Marcador 100 pb DNA ladder. Foram aplicados 2 µL do

produto da PCR e 2 µL do marcador.

Os DNAs plasmidiais foram isolados e os tamanhos dos insertos

foram confirmados através de reações de digestão utilizando a

endonuclease de restrição Eco RI. A figura 10 mostra alguns dos produtos

obtidos após a restrição.

Figura 10- Gel de poliacrilamida 5% corado pela prata, mostrando os produtos

de restrição EcoR1 dos plasmídeos obtidos nas mini preparações das diferentes

colônias. Foram aplicados 2 µL do produto da PCR e 2 µL do marcador PM- ϕ-X-

174

100-

200-

300-

500-

5.8. Seqüenciamento

Os clones que apresentaram inserto foram avaliados quanto a sua

integridade em gel de agarose 1% e encaminhados para reações de

sequenciamento no Mega BACE 1000

sequencing system. As seqüências

obtidas foram analisadas por comparação com seqüências já descritas em

bancos de dados de domínio público. Através da análise das seqüências de

nucleotídeos dos cDNAs selecionados, bem como dos possíveis

polipeptídios codificados pelos mesmos, foi possível a identificação e

caracterização destes cDNAs utilizando-se os servidores OminiBlast do

Instituto Sanger e BLASTX do NCBI.

5.9 cDNAs que possivelmente codificam proteínas

Foram obtidas um total de 9 seqüências que mostraram homologia

significante com genes conhecidos de Entamoeba histolytica (Loftus et al.,

2005). A tabela 5 apresenta a caracterização dos clones obtidos dos

fragmentos subtraídos e a identificação das possíveis proteínas

correspondentes. As seqüências das proteínas homólogas estão

demonstradas na tabela 4 (Anexos).

Tabela 5

Identificação das possíveis proteínas codificadas pelos cDNAs específicos

de cada uma das cepas de E. histolytica.

Clone Acesso

Genebank

Tamanho

(pb)

Proteína

homóloga

Nº F/Nº P* S (%) I (%) e-value

EGG 1 XP_649196.1 286 Família

GTPase-

Rab 7A

30/622 100 96 1e-11

EGG 2 XP_649888.1 302 Prot.

hipotética

263.t00003

100/474 100 100 5e-47

EGG 3 Gb/AAM22200.1

219 Gal/GalNAc

lectin heavy

subunit

210/1194 100 100 9e-35

EGG 4 XP_655273.1 224 Prot. L21

ribosomal

60S

80/501 100 99 4e-35

EGG 6 XP_654688.1 144 Prot. rica

em cisteína

39/425 92 92 2e-11

EGG 9 XP_657103.1 235 Prot. S17

ribosomal

40S

78/354 100 100 1e-31

EGG

XP_652703.1 199 Prot.

hipotética

108.t00008

59/442 100 100 1e-18

EGG

XP_657397.1 272 Fator de

iniciação de

tradução

HM1 eIF-5A

155/408 99 99 1e-79

452

XP_650371.1 157 Grainin 2 20/636 100 90 0.006

NF/NP= Nº de aa do fragmento/ Nº de aa da proteína, S= similaridade, I= Identidade

e= probabilidade

5.10. Análise por RT-PCR

Para confirmar se os cDNAs selecionados pela técnica de SSH e

seqüenciados são exclusivos de uma das cepas de E. histolytica estudadas,

reações de RT-PCR foram realizadas a partir do RNA total extraído das

duas amostras (EGG e 452). Após a obtenção do cDNA, iniciadores

específicos construídos baseados na seqüência codificante de cada cDNA

selecionado (Anexos-Tabela 3) foram utilizados para amplificar fragmentos

de DNA específicos de cada cepa.

Dos 9 genes diferencialmente expressos apenas quatro foram

confirmados pela RT-PCR, sendo um da cepa não virulenta 452 (grainin 2)

e três da cepa virulenta EGG (Proteínas hipotéticas 1 e 2 e uma proteína

rica em cisteina. A figura 11 mostra essa confirmação, onde os cDNAs

obtidos pela técnica SSH, correspondentes as três proteínas descritas para

EGG estão presentes na cepa EGG e ausentes na 452. O cDNA, obtido pela

técnica de SSH, correspondente a grainin 2 está presente na 452 e ausente

na EGG. Como controle foram utilizados iniciadores que codificam para

um gene de 300 pb da actina.

Figura 11- Estudo da expressão dos quatro cDNAs diferencialmente expressos

mostrando os amplicons gerados pela técnica de RT-PCR para cada uma das

proteínas. Foram aplicadas 5 µL do produto da PCR de cada amostra e a actina

foi utilizada como controle do PCR. Gel de poliacrilamida 5% corado pela prata.

tina

442

474

425

636

6. DISCUSSÃO

A E. histolytica é um organismo intrigante, capaz de causar doença

preferencialmente em indivíduos residentes em determinadas regiões. Nas

regiões onde a infecção é preferencialmente assintomática entra em cena,

a E. dispar. Não sabemos se as regiões de confinamento da doença clínica

apresentam índices importantes de infecções assintomáticas, seja por E.

dispar ou E. histolytica, pois ainda não estão estabelecidos se as infecções

assintomáticas podem evoluir para sintomáticas e como o sistema imune

está envolvido no desenvolvimento da doença.

É certo que a E. histolytica possui uma excepcional capacidade de

lisar tecidos. Capacidade esta, que lhe conferiu o nome. Nesta habilidade

lítica devem estar envolvidas enzimas da família das cisteil proteinases

(CPs). O conhecimento do perfil destas enzimas em cepas de E. histolytica

isoladas de diferentes casos clínicos pode fornecer informações

importantes a respeito da fisiopatologia da doença. Tentando contribuir

neste sentido, avaliamos o perfil de 36 CPs pela técnica de microarray.

Nesta técnica a utilização de amostras puras é requerida para que a

expressão diferencial de uma determinada proteína seja atribuída ao

isolado em questão (Bruchhaus et al., 2003). Utilizamos cinco cepas de E.

histolytica, duas estavam sendo mantidas em cultivo monoxênico. O passo

inicial foi trabalhar na axenização destas cepas. Após algumas tentativas

as cepas foram axenizadas. A partir daí iniciamos os trabalhos para avaliar

o perfil das CPs das diferentes cepas.

6.1. Caracterização quanto à virulência das cepas de E. histolytica

estudadas

As metodologias empregadas em estudos de caracterização de

qualquer organismo apresentam vantagens e desvantagens em sua

utilização. A escolha de uma determinada técnica depende basicamente

dos objetivos que se pretende alcançar. Neste trabalho, a escolha das

técnicas utilizadas se baseou em dados da literatura que mostravam a

aplicabilidade das mesmas na caracterização da virulência da E.

histolytica.

Em geral, os estudos que incorporam ambos, dados biológicos e

moleculares, levam a uma melhor descrição e interpretação da diversidade

do organismo do que aqueles que focalizam apenas uma destas

características. Na caracterização de nossas cepas associamos aos

parâmetros biológicos, parâmetros de biologia molecular e bioquímicos.

As diferenças na virulência entre cepas de E. histolytica tem sido

amplamente estudadas e vários modelos experimentais in vivo e in vitro,

vem sendo utilizados para se caracterizar as amebas. Entre eles, a

inoculação em fígado de hamster e atividade citopática são amplamente

utilizadas (Ankri et al., 1998; Ankri et al., 1999b; Bruchhaus et al., 2002;

Gomes et al., 1997; Hellberg et al., 2001) e foram os métodos escolhidos

para a caracterização de nossas cepas.

As cepas HM1, EGG, DRP, 452 e 32 são cepas já bem

caracterizadas, mas mesmo assim foi necessário repetir os experimentos

de caracterização das mesmas, pois, pelo fato destas cepas estarem

mantidas em cultivo por longo período e estarem em constante

manipulação, pode ter ocorrido diminuição ou perda da virulência das

mesmas. Além disso, as cepas EGG e DRP ainda não haviam sido

estudadas em cultivo axênico.

O processo de axênização foi bem sucedido e assim foram iniciados

os testes de virulência das cepas. Estes resultados mostram que as cinco

cepas analisadas apresentam diferentes graus de virulência, sendo assim,

importantes modelos de estudo para procura das bases moleculares do

processo de citotoxicidade amebiano.

De acordo com os resultados obtidos na inoculação das mesmas em

fígado de hamsters foi encontrada concordância com a forma clínica dos

pacientes dos quais se obteve as cepas, confirmando a hipótese que as

cepas de ameba provenientes de indivíduos assintomáticos não se

apresentam virulentas para animais de experimentação. A mesma

concordância nos resultados foi encontrada ao analisarmos o efeito

citopático das cepas de E. histolytica sobre células do ovário de hamster

chinês (CHO), mostrando que a capacidade destas cepas de E. histolytica

em degradar células concorda com a gravidade dos sintomas clínicos dos

indivíduos parasitados pelas respectivas cepas.

6.2. Atividade e expressão de cisteil proteinase e virulência de E.

histolytica

Um grande número de trabalhos vem sendo publicados

recentemente indicando que as cisteil proteinases são de grande

importância para a patogenicidade da E. histolytica. (Bruchhaus et al.,

2002; Leippe et al., 1995; Que & Reed, 2000; Stanley et al., 1995). Até o

momento, foram encontrados aproximadamente 30 genes que codificam

para cisteil proteinases, mas somente uma pequena parte deles é expresso

nas amebas durante o cultivo in vitro e muito pouco se sabe sobre os

mesmos (Bruchhaus et al., 2003). Estudos da expressão de cisteil

proteinase mostram que mais de 90% dos transcritos de cisteil proteinase

e 95% das proteinases secretadas pelos trofozoítos in vitro são de

responsabilidade de apenas 3 genes: cp1, cp2 e cp5 (Bruchhaus et al.,

1996b; Bruchhaus et al., 2003; Davis et al., 2007; Hirata et al., 2007). Até

o momento, não se sabe ao certo a verdadeira contribuição dos genes de

CP para a virulência da E. histolytica e sua expressão nas diferentes cepas.

Na tentativa de contribuir para o conhecimento da função das CPs na

virulência da ameba, determinamos a atividade e expressão de CPs em

cepas de E. histolytica isoladas de diversos casos clínicos, desde

assintomáticos até uma forma rara da doença, o ameboma.

Não observamos diferença na atividade de CPs total entre as cepas

estudadas, não havendo correlação entre atividade cisteil proteinase e

virulência da cepa. Isto pode ter ocorrido porque nesse experimento foi

determinada a atividade total de cisteil proteinases. Sabe-se que existem

diversos tipos de CPs e somente algumas são relacionadas com a

virulência.

Considerando que não houve diferença na atividade de cisteil

proteinase total nas cepas de E. histolytica verificamos se haveria diferença

na expressão de CPs específicas. Dentre estas encontram-se enzimas já

estudadas e relacionadas a virulência das amebas como cp1, cp2, cp5 e

cp112 (Bruchhaus et al., 1996b; Que et al., 2002). Além dos genes que

codificam para estas enzimas, avaliamos a expressão de outros genes de

CPs recentemente descritos (Bruchhaus et al., 2003; Loftus et al., 2005).

Para tal, utilizamos um microarray contendo 36 “spot” com 60

oligonucleotídeos em cada, codificando para genes de cisteil proteinases

obtidos do genoma de E. histolytica depositado no banco de dados do

Sanger Institute. Foram analisadas duas réplicas biológicas e duas

réplicas técnicas (dye swaps) para cada uma das cepas analisadas. Os

resultados obtidos nas quatro cepas experimentais (EGG, DRP, 452 e 32)

quando comparadas com a cepa controle (HM1-USA) mostram que apenas

o gene cp1 apresentou diferença significativa na expressão entre as cepas

HM1 e EGG, sendo essa diferença duas vezes maior em HM1 que em EGG

com resultado significativo apresentando p <0.001. A expressão diferencial

de cp1 foi confirmada pelo PCR em tempo real, onde foi observada

diferença significativa na expressão de cp1 da cepa HM1 em comparação

com a EGG.

A cp1 é um gene considerado importante na patogenicidade da E.

histolytica, por não apresentar um gene homólogo em E. dispar, ser

liberado em grande quantidade em cultura e constituir um dos genes de

CPs mais expressos (Bruchhaus et al., 1996b; Davis et al., 2007).

Contrariando essa hipótese, nossos resultados demonstraram que a cepa

HM1, menos virulenta que a EGG em todos os ensaios de virulência,

apresentou maior nível de expressão de cp1.

Recentemente, MacFarlane e Sing (2006), utilizando um microarray

baseado em DNA analisaram 2110 genes de E. histolytica e encontraram

vários genes diferencialmente expressos comparando a cepa HM1 de E.

histolytica com E. dispar e a cepa Rahman de E. histolytica (pouco

virulenta). Entre eles, o gene cp1 se mostrou diferencialmente expresso

entre a cepa HM1 e a E. dispar, mas não foi encontrada diferença entre as

cepas HM1 e Rahman. Concordando com resultado encontrado por Davis e

colaboradores (2006) que utilizando um array com 6209 genes de E.

histolytica encontraram 353 genes diferencialmente expressos entre HM1 e

Rahman, mas o gene da cp1 também não mostrou diferença de expressão

(Davis et al., 2007). Apesar de termos encontrado diferença de expressão

entre as cepas EGG e HM1, quando comparamos a cepa HM1 com as

cepas não virulentas encontramos resultado semelhante aos encontrados

por MacFarlane e Davis. Além disso, em todos os três trabalhos a cp1 se

mostrou responsável por grande parte da expressão total de cisteil

proteinase.

Estes trabalhos reforçam nossa hipótese de que cp1 não seja um

gene relacionado à invasão de tecidos em E. histolytica. As cepas 452 e 32

isoladas de casos assintomáticos e avirulentas em todos os ensaios

biológicos e bioquímicos, apresentaram níveis semelhantes de expressão

de cp1 com a cepa HM1 e DRP, virulentas.

Ao analisarmos a expressão dos genes verificamos que cp1, cp2, cp3,

cp5, cp11 e cp17 foram expressos em todas as cepas analisadas e os genes

que codificam para cp1, cp2 e cp5 apresentaram os maiores níveis de

expressão, concordando com Bruchhaus e colaboradores (2003) que

também encontrou expressão destes genes na cepa HM1 mantida em

cultivo axênico e altos níveis de expressão para os três últimos genes.

Os genes cp1, cp2 e cp5 estão localizados nos vacúolos digestivos da

ameba, mas somente o gene da cp5 é também encontrado na superfície da

ameba. Por isso e pelo fato dele ser altamente expresso e estar ausente em

E. dispar (Freitas et al., 2004; Willhoeft et al., 2001), este gene tem sido

considerado como molécula chave na invasão dos tecidos pela E.

histolytica. Apesar disto, a expressão do gene cp5 foi similar para todas as

cepas de E. histolytica estudadas. Estes resultados estão em discordância

com a idéia de molécula chave na invasão dos tecidos, já que das cepas

estudadas três produziram lesão em animais de experimentação e duas

não. O PCR em tempo real confirmou este resultado. Dentre as cepas

analisadas não foi observada diferença significativa na expressão do gene

cp5 (dados mostrados apenas para cepa HM1 e EGG)

Estes resultados sugerem que a cp1 e cp5 avaliadas neste estudo

não estão relacionadas à capacidade de produzir lesão in vivo ou destruir

tecidos in vitro. Outra hipótese a ser aventada diz respeito à manutenção

em cultivo das amebas. Talvez em cultivo axênico a expressão diferencial

das CPs seja inibida, havendo necessidade do contato da ameba com a

célula a ser lesada para induzir a maior expressão dos genes envolvidos

com a lesão tecidual. Neste caso pode ter ocorrido um mascaramento da

verdadeira função destas enzimas nos estudos de microarray. Outra

hipótese a considerar diz respeito ao envolvimento de outra enzima, que

não uma CP ativando a cp5. Assim, diferenças na expressão desta enzima

estariam relacionadas a virulência da cepa, apesar da cp5 estar em níveis

similares entre as amostras comparadas.

Outros genes como cp4 e cp6 apresentaram uma probabilidade alta

de serem diferencialmente expressos entre as cepas DRP e HM1, mas como

os resultados foram muito variáveis e não apresentaram diferença maior

que dois não foram estatisticamente diferentes. Talvez estes e outros genes

sejam diferencialmente expressos, se considerarmos que a análise da

expressão diferencial de genes mostra o momento do gene estudado.

Assim, devemos levar em conta, o meio onde o organismo está sendo

mantido, o cultivo axênico no nosso caso. Neste cultivo, a sobrevivência do

parasito é segura, se compararmos com as amebas que estão infectando

ou invadindo tecidos do hospedeiro. No estado de parasitismo, a

sobrevivência da E. histolytica é sempre ameaçada ou por substâncias

químicas, produtos do metabolismo de outros microorganismos ou

produtos da reação de lesão tecidual produzida pela própria ameba. Neste

contexto, poderíamos explicar a similaridade de expressão das CPs entre

as diferentes cepas. Talvez estas enzimas estejam relacionadas à

sobrevivência das amebas nos tecidos.

Outro ponto a ser considerado é a possibilidade das cp1, cp2, cp5 e

cp112, tidas como importantes nos mecanismos de lesão tecidual

amebiana, não terem papel determinante, na virulência. Nossos resultados

confirmam esta hipótese, já que as cepas HM1, EGG e DRP foram

virulentas em todos os ensaios in vivo e in vitro. Estes ensaios são

confiáveis, sendo utilizados há muitos anos e foram capazes de discernir

entre as cepas isoladas de indivíduos sintomáticos e assintomáticos. Além

disto, os resultados dos ensaios biológicos e bioquímicos corroboraram

com a forma clínica dos pacientes dos quais foram isoladas as cepas.

Assim, concluímos que estas enzimas poderiam estar relacionadas com

outras funções amebianas que não a de invasão dos tecidos já que não se

mostram diferencialmente expressas entre as cepas sintomáticas e

assintomáticas. Reforçando esta hipótese, Bruchhaus e colaboladores

(1996) e Garcia-Rivera e colaboradores (1999) demonstraram que os genes

cp1, cp2 e cp5 além de serem os mais expressos, são responsáveis por no

mínimo 90% da atividade total das cisteil proteinases em E. histolytica.

Sendo assim, os outros genes desta família estariam sendo pouco

transcritos, devido talvez as condições de cultivo requererem mais as

proteínas codificadas pelos genes cp1, 2 e 5. (Bruchhaus et al., 1996b;

Garcia-Rivera et al., 1999)

6.3. Supressão por hibridização subtrativa

Está claramente demonstrado na literatura que a hibridização

subtrativa (SH), e particularmente a supressão por hibridização subtrativa

(SSH), está sendo amplamente utilizada como ferramenta para

identificação de novas regiões genômicas diferencialmente expressas. A

validade desta técnica e seus resultados vêm reforçar o fato que a

hibridização subtrativa tem efetiva evidência na identificação de regiões

previamente implicadas com a virulência e não há dúvida que esta técnica

é capaz de identificar genes relacionados com a patogenicidade, sendo essa

aplicação uma das mais interessantes e utilizadas até agora. Alguns

autores vem demonstrando esse resultado, entre eles estão Janke e

colaboradores (2001) que encontraram 22 genes específicos para cepa

patogênica 536 de Escherichia coli quando comparada com a cepa não

patogênica K12-MG1655 e Akopyants e colaboradores (1998) que

estudaram genes diferentemente expressos em cepas patogênicas de

Helicobacter pylori.

Assim, com o intuito de continuar caracterizando nossas cepas

virulentas e avirulentas, foram selecionados, duas cepas de E. histolytica,

com diferentes perfis de patogenicidade (EGG e 452), para comparação dos

genes diferencialmente expressos, através da técnica de SSH. Estas cepas

foram escolhidas por terem constituído opostos extremos nos testes de

virulência A caracterização de tais genes pode contribuir para o

entendimento de mecanismos de infecciosidade utilizados pelo parasita,

além de promover a descoberta de alvos potenciais para o desenvolvimento

de drogas contra a amebíase.

Utilizamos trofozoítos provenientes de cultura das amostras que se

encontravam criopreservadas em nosso laboratório. Vale lembrar que as

duas amostras estudadas foram obtidas de pacientes com amebíase, sendo

a EGG isolada de um indivíduo com amebíase hepática e a cepa 452

isolada de indivíduo assintomático; ambas as cepas são cultivadas em

meio axênico. Quando estudadas com relação ao comportamento em

hamster, observamos que, ao contrário da cepa EGG, a cepa 452 não foi

capaz de infectar esses animais. Observação semelhante foi obtida quando

as duas cepas foram avaliadas com relação ao efeito citopático sobre

células do ovário de hamster chinês.

Em nossos resultados de subtração identificamos 9 fragmentos de

cDNAs, os quais apresentaram alta homologia a genes já previamente

seqüenciados do genoma de E. histolytica (Loftus et al., 2005). Entre os

genes diferencialmente expressos identificados, alguns estão envolvidos

com diversos processos fisiológicos incluindo metabolismo, endocitose,

biossíntese de proteínas, transdução de sinal e outros com função ainda

desconhecida. Apenas quatro destes genes foram confirmados pela RT-PCR

como sendo diferencialmente expressos. Dentre eles estão duas proteínas

hipotéticas e uma proteína rica em cisteína, sendo expressos na cepa EGG

e a proteína grainin 2 expressa na cepa 452.

A grainin 2 foi recentemente descrita por Nickel e colaboradores

(2000), como uma proteína ligada ao cálcio com função ainda

desconhecida, sendo encontrada nos grânulos de E. histolytica. Embora

numerosas funções sejam atribuídas por hipótese a esta proteína, a mais

plausível pode ser o controle das vias de endocitose e descarga granular

dependente da concentração de cálcio. Davis e colaboradores (2006),

também encontraram a proteína grainin sendo mais expressa em cepas

com reduzida virulência. Bruchhaus e colaboradores (2002) encontraram

um baixo nível de expressão de grainin 1 quando comparou a cepa HM1

recém isolada de fígado de hamster com a mesma cepa mantida em

cultura por um longo período. Posteriormente Gilchrist e colaboradores

(2006) obtiveram uma expressão diminuída de grainin em trofozoítos de

HM1 isolados do cólon de camundongos, dado também obtido por Davis e

colaboradores (2006), comparando trofozoítos de cólon humano com

trofozoítos mantidos em cultura. Nossos dados confirmam esses

resultados e com isso podemos levantar a hipótese que a expressão de

grainin 2 pode estar associada com a reduzida virulência, servindo assim

como marcador para um baixo potencial patogênico.

Dois fragmentos de cDNAs, obtidos da cepa EGG, apresentaram

homologia com genes de E. histolytica, depositados no banco de dados do

servidor BLAST, que codificam proteínas com funções ainda

desconhecidas. Com o sequenciamento do genoma de E. histolytica em

2005, Loftus e colaboradores (2005) demonstraram que, dentre os genes

codificadores de proteínas do genoma deste parasito, 41% correspondem a

proteínas hipotéticas, com funções ainda não caracterizadas. Como essas

proteínas têm ainda funções desconhecidas, talvez possam contribuir para

o sucesso da invasão tecidual pela ameba ou para sua sobrevivência no

tecido lesionado já que foram encontradas na cepa virulenta.

Foi também expressa somente em EGG uma proteína de 447 pb rica

em cisteína, possivelmente encontrada dentro de um grupo de 32

proteínas ricas em cisteínas com dominantes contendo repetições CXC.

Outros genes foram subtraídos na técnica de SSH, mas não foram

confirmados pela RT-PCR. Dentre estes cDNAs, dois apresentaram alta

homologia com proteínas ribossomais, um com proteína Rab7A da família

GTPase e um com o fator de iniciação de tradução (EIF 5A), todos são

preditos como altamente conservados em células eucariotas.

Após a caracterização funcional desses genes diferencialmente

expressos poderemos obter alguns esclarecimentos para entender a nível

molecular o funcionamento amebiano. Nossos resultados confirmam

estudos anteriores em que a técnica de SSH é citada como uma boa

ferramenta para identificação rápida de genes diferencialmente expressos

entre cepas de uma mesma espécie. Nesta identificação, encontramos

tanto genes conhecidos como outros de função desconhecida, que podem

estar relacionados com a patogenicidade do parasita ou com a

susceptibilidade do hospedeiro, expandindo assim a compreensão sobre a

patogênese amebiana. Neste contexto, outras ferramentas podem estar

sendo utilizadas pelas amebas na invasão dos tecidos, havendo

necessidade de outros estudos para confirmar a importância destas

proteínas na patogênese da amebíase.

7. CONCLUSÃO

♦ Os parâmetros utilizados para caracterização da virulência

mostraram-se eficientes para esse tipo de análise, apresentando

concordância com a forma clínica dos pacientes dos quais se obteve

as cepas;

♦ Identificamos fragmentos de cDNAs diferencialmente expressos pela

técnica de Supressão por hibridização subtrativa, sendo eles

possivelmente envolvidos com diversos processos fisiológicos

incluindo metabolismo, endocitose, biossíntese de proteínas,

tradução de sinal e outros com função ainda desconhecida; dentre

eles alguns foram confirmados pela técnica de RT-PCR, sugerindo a

possibilidade do envolvimento dos mesmos na patogênese amebiana;

♦ Nossos resultados confirmam que as técnicas de microarray e

supressão por hibridização subtrativa (SSH) são boas ferramentas

para identificação de genes diferencialmente expressos entre cepas

de uma mesma espécie, possibilitando a identificação de genes

relacionados com a patogenicidade do parasita, expandindo assim a

compreensão sobre a patogênese da doença.

8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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9. ANEXOS

Tabela 1. Lista de oligonucleotídeos utilizados nas lâminas do microarray

Nome

proteina

Pos

ição

do spot

No.

acesso

Seqüência de Oligonucleotídeos (5’—3’)

1 Actina

CTACATTCCAAAACATGTGGATTACCAAGGAAGAATATGATGAATCTGGACCAGCTATTG

cp-1

A6 XM_645064

TCACTGTCATTTTGATGTTTTATATTGGATATGGGATTGATTTCAATACATGGGTTGCCA

cp-2

A7 XM_645550

ATGTTTGCTTTTATTTGTTTACTTGCTATTGCAAGTGCTATTGATTTCAATACATGGGCT

cp-3

A8 XM_648162

CAACAACATGTGTGGTATTGGAAGAGATTCTAACTATCCAACCGGAGTCAAGTTAATTTA

cp -4

A9 XM_651510

TTCACTCCAAAAGTTCAAACTACTGGTTTAACTCATGTTACTCCAACTGAAGAAGCTTTA

cp -5

A10 XM_645845

TGCTGTTAAAATTACTGGACAAAAATTAGTTAGACCAGGAAGTGAAAAAGCACTTATGCG

7 cp-6 A11 XM_652272

ATGTTTGGTTTACTCTTTGTTACTCTCATTTCATTGAGCAATGCTATTAGCTTTGATAAA

cp-7

B2 XM_652354

AATGTCCAGAAATAAGAATAATCAATGTGGTATTTGCACAGGAATTTCATTCCCAGTTGG

cp-8

B3 XM_650583

ATCAACCTGTAGCAGTATCTATTGATTCCTCACAACTAAGTTTTCAATTTTATGAAGGGG

cp-9

B10 XM_646598

GTAATAGTTGGGGTGATTGGAAATGGGGAGAAGATGGATATATGAGACTTTATAGAGGAG

cp-10

C1 XM_646598

CTTACTCGTGAAGAAAGTGTGGCTATTGCACAAGGAATTCATATAGACAAATCTGATCTT

cp-11

C5 XM_648731

CCAATTAAATCAAGTGGAACAAGATATTTTGAAGCAACAATTGATGGTATTGAAGCAGCA

cp-12

D2 não

anotado

CATAAATCGTACACCAACAAAGCAGAGTATCTTTATCGTCTCGCCGTCTTCTTAGACAAC

cp-13

B1 XM_646489

ACTGTTGATGGTTATGGAGAATGTGATGGACATAAATTCCTTTGGGTAAGAAATTCATGG

cp-14

B4 AY156069

GTGGATGTGGAGGAGGATTTGCTGAAGATGTTCTTGATTCTGTAGATGGAATTTATTATG

cp-15

B5 XM_651655

CTTGTGGGTCATGTTATTGTGTAAGTAATGCTCTTGCTCTTCAATTAAAATGGGCTAATC

cp-16

B6 XM_643409

AGAATAGTTATTATTGTGAGGGAGGTACTTCAGATGAACCGTTAATGTCTTCTCATTACG

cp-17

B7 XM_647579

CTGCTAAGTTATCTGCTGACAGTTTATGTGGAATAGGAAATTGTGATGGTGAGAATGTTC

cp-18

B8 XM_647373

AAACATCAAGCATTCAGCACACAACAAATCATTGATTGTTCAAACAATAATGGGTGTAGT

cp-19

B9 XM_645308

AGAGAATCACAACGATGTTATTCATGTAAAAGGTTCTATCGACTAAATCAATATTCTTGT

cp-20

B11 XM_645957

ACCATGGATAGTCGTGGTATGTGTTTAGATAATTCTTATCCTTCAATTCCAGAAGATGCT

cp-21

E5 XM_647901

CTCAAAGCATTGCGTTTAATCTAGAACTCCCCGTAGACAAATTGTTTATTCAGTTCAAAA

cp-22

C3 XM_643214

ACATTAAAATGTTCTGCTTGTAAAGCAAATACTACTCTTGATGCAAGAGGAATGTGTGTT

cp-23

D7 XM_642921

AAAGAGTATTTGACTATGATGAGAGAGCACAATGCAAAAGGAAGTTCTTATAGAATGGGA

cp-24

C2 XM_649361

ACTTTTAAACGTGGGGTATGCAAAACTAGAGAGATGGGAGATGGACTTATTGTTTATCTA

cp-25

C4 XM_651540

TCAGCATATGTTATTCCTGAAAATAGAATCACTCCAGTTAAAGGACAATTAGCTAGAGGT

cp-26

C6 XM_650036

CGTTCAACTTGTTGGTCTTTTGTTACTTCTGGTTTCTTAGAGTCTGCCTATAATTCTGAG

cp-27

C7 XM_650708

TATCCTCAATAAACATTTACCATTCTGGGGAGGGTATGTTGGAAGTCATTTTGAAATTGA*

cp-28

C8 XM_649708

TGCACCATTTATCAAAGAGAATGAAATAGTATCGACGTTTGAAAAGTCTGTAGGAAATGT

cp-29

C9 XM_646461

ACTTGTGGAGCATTTATTATTAGAGATTCTACTGATGATACTCTTGTTTATGGCAGTCAT

cp-30

C10 XM_652181

AATGGTATTAGAAAAGGATTTCTTAAAGAAAATGAATATCTTAGACTATCACCTCAAGCA

cp-31

C11 XM_652181

AGAAAGTTCATATAGAGCTTATGGTCTTCGACATAATCTTCTTAACTCAACAGAGTATGT

cp-32

D1 XM_649919

GTACCATGTCCATCATCTTTAGGAGGGGATTGTGTTGTACTTACTTTTAATCCATATTCC

cp-33

D3 XM_649737

TGCACCATTTATCAAAGAGAATGAAATAGTATCGACGTTTGAAAAGTCTGTAGGAAATGT

cp-34

D4 XM_642991

TGGGTGTCGAGATTTAGAAACGATAAATAAGTCATTTGATCCAGATTTTGCTCCTTCATT

cp-35

D5 XM_645737

TTAGTTCGTAACGAATTTCAAGGTGATTGTATTAATGACCAACTTAAAAGTGAGTGTCAA

cp-36

D6 XM_651464

GCTACCATTGGTCTTTTGGAACAATCATATAGAGATAATGACTATCACCTCAAGCATATG

Tabela 2 – Lista de iniciadores utilizados no PCR em Tempo Real

Nome da

proteina

No. do acesso Iniciador 1 (5’) Iniciador 2 (3’)

1 cp-A1 XM_645064 TGCATCATCTGTTCAATTCC CAACACCATATCCAACAGCA

2 cp-A5 XM_645845 GTTGCTGCTGAAGAAACTTG GTACCATAACCAACTACTGC

3 mp 48-1 XM_643678 GGTAATCATCAATTAGCAAG TTGCTTGTATTCGTTCTACA

4 sp 9-2 XM_651453 GTTGATGATGCATGTGGATG TTCAAGACCAGCATGAATTG

5 Actina AAGCTGCATCAAGCAGTGAA GGAATGATGGTTGGAAGAGG

Tabela 3 – Lista de iniciadores utilizados no RT- PCR

Nome da

proteína

N de acesso no

GeneBank

Iniciador 1 (sense) Iniciador 2 (antisense)

1 Actina GCTGCATCAAGCAGTGAA

GAATGATGGTTGGAAGAG

2 Grainin 2 XP_649888.1 GTCTTTGTTTGCTATCC GTTCTTGCACTTTCAGG

3 Rab7- GTPase XP_650371.1 TGCAGGGAAAAAGATTC AACAAGGGCAATCAGAC

4 Rib. 60S XP_655273.1 ACTTCACATTAGCCCAG TAATAGCAACCATACCG

5 Hip.108.t00008

XP_654688.1 TCAGCATGTGCTCAATC TTCCATGTCCAATTCTC

6 Hip.263.t00003

XP_657103.1 TGGGTCTCTTCAGACAG ATAACTTTTCCACCTCC

7 Cisteína XP_652703.1 TGTCAGGAACACCAATC CTACAGAACTTTCCTCC

8 Rib 40S- S17 XP_657397.1 GGAGTCAGAACTAAAAC AGCATTTTGAGAGTAAC

9 Eif – 5A emb/CAA82856.1

AATGCTGAACATTCTGG GCTTCAATACCCATAGC

Gal/GalNac Gb/AAM22200.1 GGATTTCTTGGTTTTGG AGCATTTTGAGAGTAAC

Tabela 4 – Lista das seqüências das possíveis proteínas codificadas

pelos cDNAs específicos de cada uma das cepas de E. histolytica

Proteína

homóloga

Seqüência das proteínas

Família

GTPase-

Rab

gctgcagggaaaaagattcttttaaaagtaattattcttggtgattcaggtgttggaaaa

acttctttaatgaaccaatttgttaatcataaatatagttctgtctataaagcaactatt

ggtgctgacttcttaacaaaagatcttgttgttgataatcatgaagtaacaatgcaaatt

tgggatactgccggaaatgaacgattccaatcccttggagttgctttctacagaggtgca

gattgttgtgctctttgttatgatgtcaatgacccaaaaacatttgagtctttaaacaac

tggagagaagaattccttgttcaagcttcaccaaagaaccaagaccaattcccatttgtt

gttttaggaaataaagttgatacttatgaaggaagtcctgatgctattaagaagaaggct

gaacaatggtgttcagaacatttcaatattcctttcttcgaaacttctgctaaaaatgct

accaatgtagatgctgctttccaatcaattgcccaagctgctattgctcaaaagggaact

gatactgatatttatgtcatgaaccaagttaatattgatcagcctgctcctcaagctcaa

aagtctgattgcccttgttga

Prot.

hipotética

263.t00003

tgggtctcttcagacaggggcaatcagcgccattgataaagagacaaaatatcttgcaga

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agctgctactgttgcttttggaaatagaatagtttcaggaggtggaaaagttat

Gal/GalNAc

lectin

heavy

subunit

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Prot. L21

ribosomal

60S

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Proteína

rica em

cisteína

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Prot. S17

ribosomal

40S

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Prot.

hipotética

108.t00008

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Fator de

iniciação

tradução

HM1 eIF-5A

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Grainin 2 gtctttgtttgctatccaagctgctgctgatgcttttgtcacccaaatgattcaagctgct

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ttaccaaaagactttcaatatgaagagagaagaaattgataatgctgaattcgataagttc

gttaatttagttcttgcactttcagg

(Lambl, 1860)

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